Ub Doctorat 2018 Porumbel (capdemai) Iuliana [618794]

1
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific
Prof. dr. MARIANA CARMEN CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]

2017

2
București
UNIVERSITATEA DIN B UCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

TEZA DE DOCTORAT

PROFILURI DE REZISTENȚĂ LA ANTIBIOTICE
BETA -LACTAMICE ALE BACILILOR GRAM
NEGATIVI DE IMPORTANȚĂ MEDICALĂ

Coordonator stiintific:
Prof. univ. dr. Mariana -Carmen Chifiriuc

Doctorand: [anonimizat]

2017
București

3
CUPRINS
INTRODUCERE ……………………………………………………………………………… …………………………5
I. PARTEA TEORETICA ……………………………………………………………………. ……………………..7
Capitolul 1. Caracterizarea generala a bacililor Gram negativi (BGN) de importanțǎ medicală
… 1.1. Familia Enterobacteriaceae ………………………………………………….. ………………………8
1.1.1. Genul Escherichia …………………………………………………….. ……………………8
1.1.2. Genul Klebsiella ……………………….. ……………………………. ……………………10
1.2 Bacili Gram negativi nonfermentativi (BGNNF) de importanțǎ medicalǎ………. …12
1.2.1. Genul Pseudomonas ……………………………………………….. …………………… .13
1.2.2. Genul Acinetobacter …………………………………… ………………………………..14
Capitolul 2. Mecanismele rezistenței la antibiotice ale BGN de importanță medicală………..16
2.1. Mecanismele rezistenței naturale…… ………………….. ………………………………………..16
2.2. Mecanismele rezistenței dobândite……………………………………………….. ……………..18
2.2.1. Rezistența mediată cromosomal………………………. …………………………….18
2.2.2. Rezistența mediată plasmidial……………………………………… ……………….18
2.2.3. Rezistența mediată de elemente genice mobile……………………… ………..19
2.3. Mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice…………………. ……………………21
2.4. Mecanismele rezistenței la antibiotice -lactamice ale BGN de importanță
medicală….. …………………………………………………………………………………………………………….. …22
2.4.1. Structura chimică a antibioticelor -lactamice ………………………… ……….22
2.4.2. Clasificarea antib ioticelor -lactamice ……………………………… …………….23
2.4.3. Mecanismele rezistenței enzimatice la antibioticele -lactamice……….. 24
2.4.3.1. Producerea de -lactamaze……………………………………. …………25
2.4.3.1.1. Clasificarea -lactamazelor…………………… ……………25
2.4.4. Mecanismele rezistenței ne -enzimatice la antibioticele -lactamice……28
2.4.4.1. Impermeabilitatea membranei citoplasmatice…. …………………29
2.4.4.2. Rezistența la antibiotice, mediată de pompele de eflux……. …30
2.5. Mecanismele rezistenței la aminoglicozide…………………. ………………………………..31
2.6. Mecanismele rezistenței la quinolone……………………….. ………………………………….32
2.7. Mecanismele rezistentei la nitrofurani……………………………… …………………………..35

4
2.8. Aspecte epidemiologice ale rezistentei la antibiotice ale BGN de importanță
medicală……………………. ………………………………………………………………………………………………35
Capitolul III. Contribuții originale privind studiul markerilor fenotipici și moleculari de
rezistență la antibi otice la bacili Gram -negativi izolate din mediul spitalicesc ……………………36
Obiectivul I……………………………………………………………………………………………………..38
3.1 Materiale si metode
3.2 Rezultate și discuții
Obiectivul II. ……………………………………………………………………………………………………49
3.1 Materiale si metode
3.2 Rezultate și discuții
Obiectivul III. ………………………………………. ………………………………………………………….62
3.1 Materiale si metode
3.2 Rezultate și discuții
Concluzii ……………………………………………………………………………….. ……………………….88
Bibliografie ……………………………………………….. ………………………. ………………………….. 89

5
Introducere

Descoperirea antibioticelor la începutul anilor ‟40 a fost una dintre marile realizări ale
secolului 20.
Acțiunea inhibitorie a substanțelor produse de microorganisme a fost semnalată de
Victor Babeș (1885), care a sugerat că aceste substanțe ar putea fi utilizate în scop terapeutic
pentru distrugerea agenților patogeni. Fenomenul de antibioză, definit ca inhibiția dezvoltării
și multiplicării unui microorganism de către alte microorganisme, a fost descris de către
Pasteur în 1877.
Istoria modernă a a ntibioticelor începe odată cu descoperirea penicilinei (Alexander
Fleming , 1928 ). Penicilina este unul dintre metaboliții secundari ai speciei Penicillium
chrysogenum, ce conferă avantaje selective în competiția cu diverse specii bacteriene pentru
resurs ele nutritive.
Descoperirea antibioticelor a atras sinteza la scară industrială și utilizarea pe scară
largă în terapia infecțiilor , ceea ce a condus la apariția fenomenului de multirezistență.
Multirezistența a devenit un fenomen comun la bacteriile Gr am pozitive, Gram negative, cât
și la tulpinile levurice, în special dobândită în mediul spitalicesc, unde presiunea selectivă
asupra microoganismelor este ridicată, ducând la selecția tulpinilor multirezistente, care
produc infecții nosocomiale cu evoluție severă sau cu tendință spre cronicizare, dificil sau
chiar imposibil de tratat (Mihăescu și colab., 2007).
Infectiile nosocomiale sau "infecții le asociate asistenței medicale" apar la un pacient
sub îngrijire medicală în spital sau chiar după e xternarea pacienț ilor, la care se adaugă
infecțiile profesionale ale personalului medical (WHO, 2016, Khan si colab., 2017).
Incidența crescută a infec tiilor nosocomiale este datorată dispozitivelor invazive,
(cateterele), dar și a ventilaț iei mecani ce din secț iile de terapie intensivă (CDC, 2016).
Infecțiile nosocomiale afectează un număr mare de pacienți la nivel global, cu consecințe
directe: creșterea ratei mortalității și costuri financiare semnificative. Conform estimărilor
raportate d e OMS , aproximativ 15% dintre pacienții spitalizați contractează o astfel de infecție
(Emily si colab., 2011, Khan si colab., 2017). Infecțiile nosocomiale cauzează 4% -56% din
totalul cauzelor de deces la nou -născuți, cu o rată de incidență de 75% în A sia de Sud -Est si
Africa sub-sahariană (WHO, 2016, Khan si colab., 2017).

6
Alegerea acestei teme pentru lucrarea de doctorat a fost motivată de faptul că în
spitalele din București sunt raportate din ce în ce mai frecvent infecții nosocomiale cu agenți
patogeni multirezistenți, pentru care nu mai există altă opțiune terapeutică. Pentru a evita
apariția și diseminarea microorganismelor rezistente trebuie mai întâi cunoscute contextul
epidemiologic local și mecanismele moleculare care determină rezistența la antibiotice și
mediază diseminarea acesteia în mediul spitalicesc si în com unitate , date necesare atât pentru
implementarea unor măsuri de combatere și de supraveg heere și control al rezistenței, cât și
pentru descoperirea de noi strategii antimicrobiene.
În acest context scopul lucrării a fost studiul markerilor fenotipici s i moleculari care
codifică producerea de β -lactamaze la tulpini de enterobacterii și de bacili Gram negativi
nonfermentativi oportuniști , izolate din mediul spitalicesc.

7
Capitolul 1. Caracterizarea generală a bacililor Gram negativi (BGN) de importanțǎ
medicalǎ
1.1 Familia Enterobacteriaceae
Familia Enterobacteriaceae cuprinde bacterii Gram nega tive, larg răspândite în natură
(în sol, în ape, pe plante, în tractul intestinal al omului și al animalelor). Familia include
aproximativ 30 de genuri și 110 specii, majoritatea comensale, dar și specii patogene (produc
diaree, gastroenterite, enterite, dizenterie, adenite mezenterice, febra septicemică) (Chifiriuc și
colab., 2011). Specii rep rezentative pentru această familie sunt: Escherichi a. coli, Klebsiella
sp., Salmonella sp., Shigella dysenteriae, Proteus sp . E. coli, Klebsiella sp. sunt izolate cu
cea mai mare frecvență din infecțiile nosocomiale.
Enterobacteriile sunt bacili Gram negativi scurți, nesporulați. Morfologia tipică pe
mediul solidificat este cea de bacili mobili cu flageli peritrihi sau bacili imobili, dar în probele
clinice este mult mai variată. Unele specii sunt capsulate ( Klebsiella sp.), dar majoritatea sunt
necapsulate. Bacilii genurilor din această familie cresc pe medii uzuale de cultură, majoritatea
formând colonii rotunde, convexe, netede. Pentru diferențierea acestora se folosesc medii
selectiv diferențiale, care conțin unul sau mai multe z aharuri și un sistem indicator pH și
inhibă dezvoltarea fungilor și a bacteriilor Gram pozitive. Pentru identificarea rapidă , tulpinile
se însămânțează pe medii care conțin lactoză (Dorobăț, 2006).
Enterobacteriaceele metabolizează glucoza prin proces fermentativ, cu sau fără
producere de gaz și reduc nitrații la nitriți . Fermentarea zaharurilor, decarboxilarea unor
aminoacizi și producerea altor enzime, fac posibilă diferențierea biochimică a speciilor.
Utilizarea mediilor politrope permite identificarea rapidă a majorității enterobacteriilor de
interes clinic. Galeria d e teste biochimice bazată pe utilizarea mediilor multi -test conține mai
multe medii:
– mediul TSI ( triple sugar iron) care permite evidențierea fermentă rii
lactozei/zaharozei, producerii de acid din glucoză cu sau fără gaz;
– MIU ( mobilitate, indol, uree);
– MILF ( mobilitate, indol, lizina, fenilalanina) (Dorobăț, 2006);
– mediul cu citrat ca unică sursă de carbon.
În funcție de gradul de patogenitate a l tulpinilor de enterobacterii față de organismul
gazdă se disting:

8
 specii înalt patogene (Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Yersinia pestis) ;
 specii moderat patogene (Salmonella sp., Shigella sp., Yersinia sp.);
 specii condiționat patogene sau oportuniste , adică nepatogene în condiții obișnuite, dar
care pot deveni patogene dobândind determinanți genetici de virulență, sau în anumite
condiții de scădere a capacității de apărare a organismului gazdă ( Citrobacter sp.,
Enterobacter sp., E. coli, cu alte localizări decât cea intestinală sau urinară, Klebsiella
sp., Proteus sp., Morganella sp., Providencia sp., Serratia sp.).
 ocazional patogene (Cedeceea sp., Hafnia sp., Kluyvera sp., Pantoea sp. (Chifiriuc si
colab., 2011).
Speciile din fam. Enterobacteriaceae produc infecții cu numeroase localizări:
digestive, urinare, pneumonii, meningite, septicemii, abcese, infecții ale rănilor, fiind cel mai
frecvent izolate dintre bacilii Gram negativi. Prezența bacililor Gram negativi fermentativi
(BGNF) este un indicator al contaminării cu fecale, din punct de vedere igienico -sanitar
(Dorobăț, 2006).
1.1.1. Genu l Escherichia este reprezentat de bac ili care cresc în intestinul uman și animal, în
ileonul terminal și în colon. Sunt bacterii mobile, majoritatea necapsulate (unele tulpini pot
să fie capsulate). În general, fermentează lactoza (fig.1), cu producer e de indol și gaz . Pe
mediul EMB ( Eosine Methylene Blue), coloniile de E.coli au un luciu metalic caracteristic
(fig. 2).

Fig. 1. Colonii de E. coli pe mediu geloză -sânge (stanga) și pe mediu lactozat CLED (dreapta).

9

Fig. 2. Pe mediu EMB , coloniile de E. coli au un luciu metalic. .
Celulele au formă de bacili drepți sau ușor curbați, cu lungimea de 1 -3 µm. Pot fi
mobile, cu flageli peritrichi sau imobili. Unele tulpini sunt fimbriate. Pe baza reacției de
hemaglutinare directă sau a diferențelor morfologice, tulpinile de E. coli pot fi împărțite în mai
multe tipuri fimbriale.
E. coli se dezvoltă bine pe medii nutritive simple. Pe geloză poate forma colonii „S”
convexe, umede, cu suprafața lucioasă, margini netede, sau colonii „R” uscate, cu marginile
crenelate (Chifiriuc si colab., 2011).
Sunt microorganisme aerobe și facultativ anaerobe. Se dezvoltă în limite largi de
temperatură și pH. Cre șterea o ptimă se înregistrează la 370C și pH=7,2 – 7,8.
Capacitatea de a fermenta lactoza permite diferențierea tulpinilor de E. coli de alte
tulpini de Enterobacteriaceae (Salmonella sp., Shigella sp., Proteus sp. etc.), dar există și
tulpini care fermentează lactoza tardiv sau deloc. Unele tulpini de E. coli sintetizează
substanțe cu acțiune antagonista (colicine) (Chifiriuc si co lab., 2011).

Fig. 3 Profilul metabolic al unei tulpini de E. coli.

10
Deși, E.coli este comensală in microbiota normal ă a omului (Chifiuric și colab., 2011),
unele tulpini de E. coli sunt implicate în etiologia unei game largi de infecții, care include
infecții urinare, septicemii, meningite si infecții digestive ( colecisto -pancreatita acută,
peritonita acută severă, peritonita acută difuză, abcese, colecistite) (Dorobăț, 2006, Israil și
colab., 2013). Este un patogen oportunist și poate determina un proces infecțios, depinzând de
densitatea populației bacteriene și de factori predispozanți: compromiterea funcției de apărare
și creșterea permeabilității barierei intestinale. Tulpinile comensale de E. coli supraviețuiesc și
cresc în mediul extern. Sunt rezistente la o varietate de factori fizici și chimici, la care se
adaptează supraviețuind perioade lungi fără creștere. Solul, apa și alimentele sunt habitatele
alternative extraintestin ale ale E. coli (Chifiri uc și colab., 2011).
Tulpinile de E. coli au o serie de determinanți de virulență: hemolizina , prin
intermediul căreia eliberează Fe din eritrocite; enterotoxinele (termostabile, termolabile);
antigenele O si K (cu rol protector față de fagocite și față de liza mediată de complement);
plasmida Col V (codifică factori de virulenț ă, inclusiv rezistența la fagocitoză și sinteza
sideroforului aerobactină ( Fernandez -Beros și colab., 1990, Aguero și col ab., 1984 ). Studii le,
epidemiologice indică faptul că tulpinile de E. coli , frecvent izolate din infecții
extraintestinale de la animale și de la om, sunt pozitive pentru plasmida Col V și mult mai
virulente (Fernandez -Beros și colab., 1990, Aguero și col ab., 1989) . La tulpinile izolate de la
pacienții cu boală diareică sau din infecții urinare sau identificat fimbrii proteice filamentoase
( ) (Dorobăț, 2006).
Fiind una dintre cele mai studiate bacterii Gram negative , în prezent sunt recunoscute
șase patovarietăți inte stinale de E. coli (IPEC): E. coli enteropatogenic (EPEC), E. coli
producătoare de toxine Shiga (STEC), E. coli enteroagregativă (EAEC), E. coli
enterotoxigenică (ETEC), E. coli enteroinvazivă (EIEC) și E. coli cu aderență difuză (DAEC)
(Kaper și colab., 2004 , Delcaru și colab., 2017 ).
1.1.2. Genul Klebsiella reunește bacterii imobile care fermentează glucidele, cu producere de
acid și gaz. K. pneumoniae este specia cea mai răspândită în mediile naturale (apă, sol,
tubul digestiv al omului și al animalelor) (Dorobăț, 2006). Klebsiella este lactozo -pozitiva, pe
mediul CARE formează colonii mucoase , folosește ureea ca unică sursă de azot și citratul ca
unică sursă de carbon ( Dorobăț, 2006).

11
K. pneumoniae a fost descrisă ca agent al pneumoniei Friedländer, o formă severă de
pneumonie lobară cu rate de mortalitate ridicată (Brisse și colab., 2009, Carpenter, 1990).
Genul Klebsiella cuprinde trei specii:
 K. pneumoniae – cea mai importantă pentru patologia umană și animală, agent al unor
pneumonii mortale în perioada 1882 -1884. Provoacă mastite la bovine, abcese la
maimuțe, infecții generalizate, cu mortalitate crescută la lemurieni;
 K. ozaenae produce infec ții ale tractului respirator, adesea cu tendință de cronicizare;
 K. rhinoscleromatis este agentul unor rinite cronice (Chifiriuc si colab., 2011).
Tulpinile de K. pneumoniae cresc foarte bine pe medii simple. Sunt bacterii foarte
răspândite în mediul extern (sol, apă, plante) și prezente la un procent mic de indivizi (5%) pe
epiteliul tractului respirator superior, dar mai frecvent în colon (Chifiriuc si colab., 2011).
Tulpi nile capsulate (cu potențial infecțios, virulente pentru om și animalele de
laborator) formează colonii tipice, cu diametrul de 3 -4 mm, opace, mucoide (M), strălucitoare.
Tulpinile necapsulate sunt avirulente și formează colonii mai mici și translucide (Ch ifiriuc si
colab., 2011).
K. pneumoniae produce o varietate de infecții la om și la animale (Brisse și colab.,
2009). Este un agent patogen nosocomial, cauzator al infecțiilor tractului urinar, tractului
respirator sau al infecțiilor sanguine ( Podsch un, Ullmann, 1998) . Izolatele din spitale sunt
adeseori rezistente la antibiotice (Brisse și colab., 2009, Paterson și colab., 2004, Woodford
și colab., 2007) , genele de rezistenta fiind de cele mai multe ori localizate , în structura unor
elemente gen etice mobile , facilitand astfel diseminarea în populația bacteriană și implicit în
cea umană (Colodner și colab., 2004). Infecțiile nosocomiale , foarte diverse , sunt cauzate de
tulpini K. pneumoniae care pot fi considerate mai curând oportuniste, decât agenți patogeni
propriu -ziși, deoarece afectează în cea mai mare parte pacienții imunodeprimați (Brisse și
colab. , 2006, Brisse și colab., 2009).
Tulpinile de K. pneumoniae virulente pot să producă infecții comunitare grave, la
persoa ne sănătoase: infecții ale tractului digestiv (colecisto -pancreatita acută, peritonita acută
severă, abcese, colecistite) (Israil și colab., 2013).
K. pneumoniae este agentul infecțios al al pneumoniei persoanelor cu
imunodeficiențe: diabetici, alcoolici, cele cu patologie cronic ă pulmonar ă. Pneumonia
produsă de K. pneumoniae este caracterizata ca distructivă (sputa sanguinolentă, zone intinse

12
de necroză și hemoragie). În cazuri severe pot apărea ab cese pulmonare, hemoragii,
hemoptizii, deseori asociindu -se cu pleurite.
K. pneumoniae poate determina infecții extrapulmonare: enterite și meningite la
sugari, infecții urinare la copii și adulți, septicemii. Virulența speciei este corelată cu preze nța
antigenelor O și K , repelenți pentru fagocite și cu sinteza a doi chelatori cu mare afinitate
pentru Fe codificați plasmidial, aerobactin și enterochelin, . Unele tulpini de K. pneumoniae
pot produce diaree, datorită unei enterotoxine asemănătoare cu cea de la E. coli (Dorobăț,
2006).
1.2. Bacili Gram negativi nonfermentativi oportuniști

Bacilii Gram negativi nonfermentativi (BGNNF)
Bacilii Gram negativi nonfermentativi (BGNNF) strict aerobi (nu fermentează glucoza
și nici alte zaharuri, dar le metabolizează pe cale oxidativă) au rol important în patologia
umană, fiind adeseori implicați în etiologia infecțiilor oportuniste și nosocomiale.
Reprezentanții grupului, spre deosebir e de enterobacterii, sunt larg răspândiți în sol și ape, la
animale și pe plante, în special în habitatele umede (Chifiriuc și colab, 2011).
BGNNF au multiple capacități nutriționale: metabolizează substraturi foarte diverse,
ceea ce le permite creșterea pe medii selective (Drigalski, cetrimid) sau minimale (apă,
glucoză, oligoelemente). Pot supraviețui în apă bidistilată, soluție de heparină, soluție de
substanțe antiseptice și dezinfectante. Pot fi transmise clonal prin intermediul aparaturii
medicale. Virulența este mediată de adezine, toxine , de capacitatea de a forma biofilme , de
multirezistența naturală sau dobândită la numeroase antibiotice, ceea ce explică frecvența tot
mai mare a infecțiilor nosocomiale cu Ps. aeruginosa (Chifiriuc și colab., 2011 ).
Familia Pseudomonadaceae cuprinde genul Pseudomonas cu 256 de specii, împărțite
în 4 grupe metabolice și genul Xanthomonas , care alături de Pseudomonas formează grupul
pseudomonadelor . Membrii grupului sunt cunoscuți mai mult ca patogeni ai plantelor decât ai
animalelor, dar trei specii de Pseudomonas sunt patogene pentru om (Chifiriuc și colab.,
2011).
Morfologia variază de la bacili Gram negativi scurți și groși (trapezoizi)
(Acinetobacter ), la bacili lungi și fini ca P. aeruginosa (fig. 4), mobili sau imobili (Chifiriuc și
colab, 2011).

13

1.2.1. Genul Pseudomonas
Cea mai importantă specie este P. aeruginosa , patogen oportunist care determină
infecții, uneori fatale, la persoanel e cu deficiențe ale sistemelor de apărare, la care se adaugă
Alcaligenes xylosoxydans , Burkholderia cepacia , Chryseobacterium meningosepticum ,
Ochrobactrum antrhropi , Pseudomonas fluorescens , Ralstonia pickettii , Acinetobacter
baumannii , Stenotrophomonas maltophilia și genul Xanthomonas . Toate formează grupul
pseudomonadelor (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 4. Ps. aeruginosa pe frotiul colorat Gram, x 1000 .
Izolatele de Ps. aeruginosa pot produce trei tipuri de colonii. Izolatele naturale din sol
sau apă produc colonii mici de tip R. Izolatele clinice, în general, produc una dintre cele două
tipuri de colonii netede (tip S): colonii cu aspect de ou prăjit, mari, netede, cu marginile
aplatizate și cu profil ridicat, sau colonii cu aspect mucoid, izolate de obicei din secrețiile
tractului respirator și urinar, aspect datorat sintezei alginat ului (Chifiriuc și colab., 2011).
Ps. aeruginosa crește pe o mare diversitate de medii și produce un miros caracteristic de flori
de tei. Unele tulpini lizează hematiile. Coloniile sunt netede (S), de culoare verzui –
fluorescentă, datorită piocianinei , un pigment ce difuzează în agar . Ps. aeruginosa este un
agent patogen oportunist , fiind frecvent în mediile umede din spitale (Chifiriuc și colab.,
2011). La om se găsește fără însă a fi colonizator permanent, în mucoasa tractului digestiv,
respirator și pe piele, dar devine patogen pentru persoanele imunodeprimate, la care poate
produce infecții ale tractului urinar, ale aparatului respirator, ale țesutului conjuctiv, dermatite,
bacteriemii și o varietate de infecții sistemice, mai ales la pacienții cu arsuri severe extinse, cu
fibroză chistică sau neoplazici și la pacienții SIDA (Ch ifiriuc și colab., 2011). Ps. aeruginosa
este implicat în patologia infecțioasă umană, cauz ând 10-15% din infecțiile intraspitalicești,

14
fiind cel mai important agent infecțios nosocomial (Chifiriuc și colab., 2011), c u o severitate
deosebită ca urmare a virulenței și multirezistenței la substanțele antimicrobiene (Kiska,
1999). Rata portajului se situează în jur de 6%, cu o incidență mai mare la bolnavii spitalizați
(38%), în special cei aflați în stare critică sau cu imunitatea compromisă datorită spita lizării
prelungite și/sau tratamentului cu antibiotice de spectru larg sau cu citostatice (Moldovan,
2005; Dorobăț, 2006; Orb și colab., 2006) .
Ps. aeruginosa poate fi de asemenea, ocazional, fitopatogen. În ape , Pseudomonas
crește sub formă de biofilme sau de celule libere (Chifiriuc si colab., 2011).
1.2.2 Genul Acinetobacter cuprinde bacterii Gram negative nefermentative, saprobionte în
sol, apă, apă menajeră, comensale ale tegumentului personalului medical și pacienților, dar
sunt de asemenea patogeni nosocomiali importanți, mai ales în unitățile de terapie intensivă.
Datorită versatilității lor metabolice pot avea rol important într -o varietate de procese
industriale, cât și în biodegradarea unor poluanți ai mediului. Sunt bacili Gram negativi în fază
logaritmică, dar devin cocoidali și grupați în diplo – sau în lanțuri de lungimi variabile în faz a
staționară a evoluției culturii . Multe tulpini sunt capsulate. Coloniile sunt de obicei
nepigmentate, dar anumite tulpini formează colonii albe sau crem, ce variază în consistență de
la netede la mucoide (Chifiriuc și colab., 2011).
Toți membrii g. Acinetobacter sunt strict aerobi . Unele tulpini izolate din procese
patologice cresc la temperaturi între 30-42oC, iar cele izolate din medi ile natural e cresc
optim la 20 -30o. Toate tulpinile de Acinetobacter sunt oxidazo -negative (deoarece nu au
citocrom C, dar au citocrom b și ocazional citocrom d și P 450)și catalazo -pozitive. Reacția
oxidazei diferențiază tulpinile de Acinetobacter de alte genuri înrud ite. .
Majoritatea tulpinilor cresc pe medii simple. Unele tulpini produc hemoliza pe geloză
-sânge datorată fosfolipazei C. Majoritatea tulpinilor sunt rezistente la penicilină, iar unele
izolate clinice sunt rezistente la cefalosporine prin supraprod ucerea unei cefalosporinaze
cromosomale (Chifiriuc și colab., 2011).
Speciile g . Acinetobacter contaminează pacienții și personalul medical putând fi
izolate dintr -o mare varietate de surse: praf, echipamente de ventilație, bazine de spălat,
alimente, textile, mobilier (Chifiriuc și colab., 2011).

15
Tulpinile de Acinetobacter pot persista în mediu m ai multe zile până la câteva
săptămâni, chiar în condiții de desicație. Pe lângă Acinetobacter baumannii s-au izolat și alte
specii : A. johnsonii și A. lwoffii (Chifiriuc și colab., 2011).
Cel puțin 25% dintre indivizii sănătoși sunt purtători de tulpini d e Acinetobacter ca
parte a microbiotei normale a tegumentului (Chifiriuc si colab., 2011, Schreckenberger și
colab., 2003).
Frecvența infecțiilor nosocomiale cauzate de Acinetobacter este greu de determinat
deoarece izolarea acestor microorganisme din prob e clinice nu reflectă neapărat infecția, ci
colonizarea ( Chifiriuc si colab., 2011, Schreckenberger și colab., 2003).
Deși speciile de Acinetobacter sunt considerate a avea potențial patogen redus, câteva
caracteristici ale acestui microorganism pot confe ri virulenț ăa tulpinilor implicate în diferite
infecții:
 prezența capsulei polizaharidice formată din L ramnoză, D glucoză, acid D glucuronic,
D manoză;
 aderența la celulele epiteliale mediată de fimbrii și/sau polizaharide capsulare;
 sinteza de lipaze;
 toxicitatea componentelor polizaharidice ale peretelui celular și prezența lipidului A
(Chifiriuc si colab., 2011).
Considerat multă vreme o bacterie cu virulență scăzută, A. baumannii este în prezent
una dintre speciile tot mai des izolată în spitalele din întreaga lume, în special în unitățile de
terapie intensivă, ca patogen nosocomial. Printre cele mai frecvente infecții produse de A.
baumannii se regăsesc: pneumoniile și traheobronșitele, infecții tegumentare ale pl ăgilor
deschise și ale tractului u rinar. Este necesară izolarea și evaluarea sensibilității la antibiotice ,
întrucât tulpini le de A. baumannii au un nivel ridicat de rezistență (Dorobăț, 2006).
A. baumannii este una din tre cauzele principale ale morbidității și mortalității în sectiile de
terapie intensivă. Amploarea infecțiilor cu A. baumannii în secțiile de terapie intensivă se
datorează în cea mai mare parte ventilației mecanice, cateterizării, utilizării antibioticelor de
spectru larg, da r și transmiterii prin contactul tegumentar cu personalul medical ( Dijkshoorn
și colab., 2007, Moisoiu și colab ., 2014). A. baumannii este foarte rezistent la uscăciune, dar
și la dezinfectanți (Huang și colab., 2008, Moisoiu și colab ., 2014). Severita tea infecțiilor pe
care le determină se datorează rezistenței crescute la antibiotice, inclusiv la cele cu spectru

16
larg, cum sunt carbapenemele, rezistență determinată de o multitudine de gene, multe dintre
acestea cu localizare plas midială (Huang și cola b., 2008, Osterburg și colab., 2009, Moisoiu și
colab ., 2014). Pentru unele tulpini multirezistente la antibiotice, numai colistinul (polimixina
E) rămâne unicul antibiotic eficient, deși s -au semnalat tulpini rezistente și la acest antibiotic
(Li și cola b., 2006, Peleg și colab., 2008, Howard și colab., 2012, Munez -Price și colab., 2008,
Moisoiu și colab., 2014). Opțiunile de tratament pentru tulpinile multirezistente sunt
tigeciclina, peptide sintetice și terapia cu fagi (Manchanda și colab., 2010 , Pere z și colab.,
2007, Moisoiu și colab., 2014). Tratamentul infecțiilor cu tulpini multirezistente de A.
baumannii se bazează de asemenea, pe combinații de antibiotice (Howard și colab., 2012,
Durante -Mangoni și colab., 2011, Neonakis și colab., 2011, Moisoiu și colab., 2014).
Numeroase studii arată eficiența asocierii colistinului și rifampinei (Munez -Price și colab.,
2008, Moisoiu și colab., 2014).

Capitolul 2. Mecanismele rezistenței la antibiotice la BGN de importanță medicală
2.1. Mecanismele rezistenței naturale
Pentru ca un antibiotic să fie eficient, trebuie să fie activ față de microorganismul țintă
și să nu producă efecte secundare. Rezistența se definește prin capacitatea unui
microorganism de a crește în prezența concen trației ridicate a unui agent antimicrobian.
Bacteriile au o capacitate remarcabilă de a dezvolta rezistență la fiecare nou antibiotic introdus
în terapia antiinfecțioasă (Lazăr, 2001). Rezistența la antibiotice poate fi naturală (intrinsecă)
sau dobândită prin intermediul genelor de rezistență achiziț ionate prin mecanisme de transfer
sau rezistență mutațională (Jehl și colab., 2010).
Originea genelor de rezistență la antibiotice în populațiile bacteriene este dublă : i) pe
de o parte există, în mod natural, un fond de gene de rezistență, care probabil au apărut în
evoluție în populațiile bacteriene din sol și ape, ca modalități de autoprotecție a producătorilor
de antibiotice sau de protecție a speciilor asociate acestor a și față de substanțele nocive
produse, de exemplu, de speciile vegetale asociate; ii) pe de altă parte , datorită unor mutații ale
unor gene constitutive ce codifică pentru anumite enzime din metabolismul bacterian și care
au evoluat prin extinderea speci ficității de substrat (de exemplu kinazele și acetil -transferazele
care pot modifica aminoglicozidele prin fosforilare și adenilare).

17

Fig. 5. Procentajul rezisten ței tulpinilor de K. pneumoniae – 2015 la carbapeneme
(http://atlas.ecdc.europa.eu/public/index.aspx ).

Fig. 6. Procentajul rezistentei tulpinilor de E. coli -2015 la carbapeneme
(http://atlas.ecdc.europa.eu/public/index.aspx).

Fig. 7 . Procentajul rezistentei tulpinilor de Ps. aeruginosa – 2015 la carbapeneme
(http://atlas.ecdc.europa.eu/public/index.aspx).

18

Fig. 8 . Procentajul rezistentei tulpinilor de A. baumannii – 2015 la carbapeneme
(http://atlas.ecdc.europa.eu/public/index.aspx).
Conform ECDC ( European Centre for Disease Prevention and Control), în 2015 țara
noastră, a ocupat locul I între țările europene în ceea ce priveste rezistența P. aeruginosa, A.
baumannii, E. coli și K. pneumoniae carbapeneme (fig. 5 , 6, 7, 8 ).

2.2. Mecanism ele rezistenței dobândite
Rezistența dobândită se traduce prin scăderea sau pierderea totală a sensibilității unei
tulpini microbiene la unul sau mai multe antibiotic e (Lazăr, 2001). In practică, bacteria este
considerată rezistentă atunci cand se inregistrează un raport subunitar intre nivelul seric mediu
suportat de pacient si concentrațiile minime inhibitorii sau bactericide ale antibioticului
(Todar, 2002). Rezisten ța dobândită la antibiotice poate fi mediată de determinanți genetici
cromosomali; prezența plasmidelor R (de rezistență și multirezistență la antibiotice); secvențe
de ADN (transpozoni, integroni), integrate prin recombinare (Lazăr, 2001) .

2.2.1. Rezist ența mediată de gene cromosomal e (rezistența primară) este datorată unor mutații
ale genei care codifică fie ținta antibioticului, fie sistemul de transport transmembranar care
controlează pătrunderea antibioticului în celula bacteriană (Lazăr, 2001). Muta țiile
cromosomale pot fi spontane sau induse de agenți mutageni (in special de antibio tice)
(Henderson, 1999; Kuhn și colab., 2003), au transmitere pe verticală (realizată și fără contact
cu antibioticul), apar brusc, la un singur antibiotic si sunt defini tive. Totuși, numărul de
mutan te rezisten te va scădea după încetarea expunerii la antibiotic (Swartz, 2000).

2.2.2. Rezistența mediată plasmidial

19
Plasmidele sunt cele mai studiate elemente genetice mobile. Unele poartă gene
codificatoare ale proteinelor necesare asamblării aparatului de conjugare (genele tra). Cele
care nu posedă aceste gene, pot fi pot fi mobilizate de plasmidele conjugative (plasmide
mobilizabile ). Plasmidele neconjugative au dimensiuni mult mai mici decât cele conjugative :
posedă una sau două gene mob care le permit mobilizarea și transferul în evenimente
conjugative inițiate de alte plasmide conjugative (Vassu și colab., 2001).
În funcție de capacitatea lor de a media transferul de material genetic prin conjugare,
plasmidele se îm part în două categorii: i) plasmidele conjugative (transmisibile sau
infecțioase), denumite și factori de sex, conferă celulei proprietatea de donor de material
genetic, în raport cu o celulă care nu posedă o astfel de plasmidă și care se comportă ca
recep tor. Se mai numesc conjugoni , factori de fertilitate sau transferoni . Ele au în structura
genetică, pe lângă genele de replicare autonomă, determinanții genetici de transfer ( tra). Din
această categorie fac parte unele plasmide Col și unele plasmide R; ii) plasmidele
neconjugative nu sunt autotransmisibile deoarece nu conferă celulei purtătoare proprietatea de
donor de material genetic, neavând determianții genetici tra. Din această categorie fac parte
celelalte plasmide Col și R. Ele se pot transfera de la o celulă la alta, fie prin intermediul unui
fag transductor, fie prin procesul de conjugare inițiat de o plasmidă conjugativă, coexistentă în
aceeași celulă (Mihăescu si colab., 2011).
Rezistența plasmidială la antibiotice este multiplă și are capacitatea de a se disemina
atât pe verticală , cât și pe orizontală , prin mecanisme de transfer genetic între diferite specii
patogene, sau de la specii saprobionte la cele patogene. Nivelul rezistenței se poate modifica
sub raport cantit ativ, prin modificarea numărului de copii ale plasmidei. Rezistența
plasmidială nu modifică rata de creștere și nici virulența tulpinilor bacteriene (Mihă escu si
colab., 2011).

2.2.3. Rezistența mediată de elemente genetice transpozabile
Elementele geneti ce transpozabile se pot integra în numeroase regiuni ale
macromoleculei de ADN cromosomal sau plasmidial, dar uneori se inseră preferențial la
nivelul anumitor secvențe sau regiuni. De exemplu transpozonul Tn3 se inseră la nivelul
regiunilor bogate în aden ină și timină. Proteina necesară pentru transpoziție este transpozaza
(Tnp) (Andreotti și colab ., 2003). Tn pot transporta gene pe orice replicon .

20
Secvențele de inserție (SI) sunt cele mai simple elemente transpozabile descrise la
bacterii . Ele conțin circa 1000 pb .
Transpozonii , elemente genetice mobile (2100 -9300 pb), care includ în alcătuirea lor o
serie de gene structurale , constituie al doilea tip de elemente conjugative și sunt localizați în
cromosomul bacterian. Aceștia se pot mobiliza din cromo somul bacterian și se inseră prin
recombinare într -un alt situs cromosomal și, de asemenea , se pot transpoza în plasmide.
Transpozonii se excizează din cromosom și configurația lor devine circulară, covalent închisă
care nu se replică (Andreotti și colab ., 2003).
Transpozonii se pot integra în numeroase regiuni ale macromoleculei de ADN
cromosomal sau plasmidial, dar uneori se inseră preferențial la nivelul anumitor secvențe sau
regiuni. De exemplu transpozonul Tn3 se inseră la nivelul secvențelor bogate în adenină și
timină. Proteina necesară pentru transpoziție este transpozaza ( Tnp) (Andreotti și colab .,
2003). Consecința transpoziției poate fi activarea transcrierii genelor din proximitate, sau,
din contră, blocarea transcrierii.
Transpoz onii conjugativi sunt probabil , mediatorii transferul ui genelor de rezistență
într-o proporție asemănatoare cu cea a plasmidelor, în special la bacteriile Gram pozitive.
Transpozonii se pot transfera între specii bacteriene Gram pozitive, între specii Gram negative,
dar și între celule bacteriene Gram pozitive și Gram negative (Andreotti și colab., 2003).
Integronii sunt secvențe de ADN ce conțin determinanți genetici ai unui sistem de
recombinare cu specificitate de situs . Sunt sisteme de diseminare a genelor bacteriene,
distincte de plasmide și de EGT.
Nu au mobilitate intrinsecă, dar sunt mobilizați de elementele genetice
transpozabile adiacente. Integronii mobilizați de SI mediază deplasarea unor scurte secvențe
mobile de ADN, denumite casete genice (Recchia și Hall, l995). Integronii sunt mediatorii
esențiali pentru dobândirea și expresia majorității genelor de rezistență transferabile la γ –
proteobacterii. Integrarea unei casete genice într -un replicon este reversi bilă. Caseta se
exciz ează ți se integrează în alt replicon. Prin intermediul casetelor genice, complementul
genelor de rezistență poate fi mereu rearanjat și deplasat de pe un replicon pe altul. Integronii
se găsesc în primul rând la bacteriile Gram negative și mediază rezistența multiplă la
antibiotice (MDR): aminoglicozide, peniciline, cefalosporine, trimetoprim, tetraciclină,
eritromicină, cloramfenicol. Spre deosebire de transpozoni, integronii se integrează într -un

21
situs unic și nu poartă gene c odificatoare ale transpozazelor. Integrarea acestora este mediată
de o integrază codificată plasmidial. Plasmidele trebuie de asemenea să fie purtătoare ale unor
secvențe de tip promotor, deoarece majoritatea integronilor conțin gene de rezistență lipsite de
promotori (Andreotti și colab., 2003).

2.3. Mecanismele biochimice ale rezistenței la antibiotice
Rezistența bacteriană la antibiotice a fost recunoscută imediat ce antibioticele au fost
introduse în clinică. Genele codificatoare ale factorilor de rez istență au preexistat momentului
introducerii antibioticelor în clinică deoarece au fost recunoscute în colecțiile bacteriene
alcătuite înainte de utilizarea antibioticelor. Efectul antibioticelor și al agenților chimici
antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme: unele mecanisme sunt
intrinsece bacteriei; altele rezultă din mutațiile genelor ce codifică pentru structurile țintă sau
din dobândirea genelor ce modifică sau hidrolizează antibioticele (Mihăescu și colab., 2011).
Pincipalele me canisme biochimice de rezistență la antibiotice, reprezentate in fig. 9,
sunt:
1) mecanismele enzimatice de rezistență la antbiotice constau în inactivare a antibioticului prin
hidroliză și formarea derivaților inactivi: hidroliza sub acțiunea β-lactamazelor, sau
modificarea chimică a aminoglicozidelor sub acțiunea enzimelor specifice, prin fosforilare,
adenilare sau acetilare ;
2) utilizarea căilor metabolice alternative , de ocolire a căii metabolice inactivată de antibiotic;
3) modificarea țint ei celulare și dobândirea rezistenței la efectul substanțelor toxice: țintele
celulare pot fi alterate prin mutație sau pe cale enzimatică, astfel încât afinitatea lor față de
antibiotic scade;
4) diminuarea ratei de înglobare , datorită scăderii permeabilității membranei externe a
bacteriilor Gram negative și a barierei periferice foarte eficiente a micobacteriilor . Ca urmare ,
difuzia medicamentelor prin învelișuri este redusă. Permeabilitatea membranei externe se
poate diminua prin pierderea po rinelor , dar nu este o cale eficientă de limitare a pătrunderii
antibioticului în celulă;
5) activarea pompelor membranare de eflux , care elimină activ compusul antimicrobian
toxic;
6) utilizarea unei căi metabolice rezistente la acțiunea medicamentului;

22
7) producerea în exces a țintei agentului antimicrobian (Mihăescu și colab., 2011).

Fig. 9. Reprezentarea schematică a principalelor mecanisme biochimice de rezistență la antibiotice
(https://www.britannica.com/science/antibiotic -resistance ).

2.4. Mecanismele rezistenței la antibiotice -lactamice ale BGN de importanță medicală
Din punct de vedere chimic, antibioticele sunt un grup de substanțe foarte heterogene,
fiind clasificate astfel: -lactamice, tetracicline, aminoglicozide, macrolide, glicopeptidice și
polienice .
2.4.1. Structura chimică a antibioticelor -lactamice
Antibioticele -lactamice conțin în structura lor inelul β -lactamic, sunt cele mai
importante și foarte diverse: penicilinele, cefalosporinele, carbapeneme, monobactami.

Structura moleculară a inelului β -lactamic .
Antibioticele β -lactamice acilează situ surile active ale transpeptidazelor PBP
(Penicillin Binding Protein ), ce constituie moleculele țintă ale acestor antibiotice și sunt
implicate în formarea peretelui mureinic. La E.coli există 4 PBP cu gr . mol. mare. Odată ce
antibioticele β -lactamice acționează asupra lor, PBP devin incapabile să catalizeze reacțiile de
polimerizare ale subunităților mureinice, rezultatul fiind liza osmotică a celulei bacteriene .

23
Aceste enzime au secvențe asemănătoare de amin oacizi, dar dar și secvențe de aminoacizi
care leagă penicilina (Chifiriuc și colab., 2011). PBP au afinități diferite pentru peniciline și
fiecare dintre ele poate media un alt efect. Ca urmare a inhibării activității catalitice a acestor
enzime, sint eza peptitoglicanului este blocată prin blocarea formării legăturilor încrucișate
între lanțurile polipeptidice (Dorobăț, 2006).

2.4.2. Clasificarea antibioticelor β -lactamice
Penicilinele semisintetice se obțin din acidul 6 -aminopenicilanic care este u n dipeptid
ciclic obținut prin tratamentul penicilinei cu o amidază. Rezultă un număr mare de peniciline:
oxacilina și derivații săi, ampicilina, amoxicilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina,
ticarcilina.

Structura moleculară de bază a penicilinei.
Cefalosporinele sunt utilizate pentru tratamentul infecțiilor severe și sunt foarte
eficiente. Au un spectru de acțiune mai larg decât penicilinele, sunt sensibile la
cefalosporinază și rezistente la penicilinază .

Structura moleculara de baza a cefalosporinelor.
 cefalosporinele de generația I acționează asupra cocilor Gram pozitivi și a unor bacili
Gram negativi ( E.coli, Klebsiella, Proteus ). Din această categorie fac parte cefalexin,
cefaclor, cefalotină, cefazolină ;
 cefalosporinele de generatia a -II-a au eficiență față de bacilii Gram negrativi. Din
această categorie fac parte cefamadol, cefuroxima, cefatrizina, cefonicid, cefotetan,
cefoxitina.

24
 cefalosporinele de generația a -III-a au un spectru larg de acțiune față de bacilii Gram
negrativi aerobi și cocii Gram negativi. Din această categorie fac parte ceftriaxon a,
cefoperazon a, ceftazidim, cefotaxim, cefixim, cefotetan.
 cefalosporinele de generația a -IV-a au un spectru “ultralarg”: cefepim, ceftibuten,
cefpiromă.
 cefalosporinele d e generația a -V-a: cefperoma, cefepima ; au aceeași activitate in vitro
ca cefotaxima (cefalosporină de generația a III -a) asupra BGN, dar se diferențiază
printr -o bună activitate in vitro față de enterobacteriile producătoare de cefalosporinaze
și față de tulpinile de Ps. aeruginosa multirezistente .
Carbapenemele (imipenem, doripenem, ertapenem, meropenem) sunt antibiotice de
ultimă generație, dar s -au semnalat tulpini de BGN care au dezvoltat rezistență: K.
pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, A. baumannii . Sunt rezistente la acțiunea serin -β-
lactamazelor, dar sunt inactivate de dihidropeptidazele de la nivelul tubilor renali (Chifiriuc și
colab, 2011).
Succesul antibioticelor β -lactamice în tratamentul maladiilor infecțioase se datorează
specificitătii față de țintă (celulele bacteriene) și toxicității scăzu te pentru organismele
eucariote. În ciuda numărului mare de antibiotice și a incidenței izolatelor rezistente la
peniciline, antibioticele β -lactamice sunt cele mai utilizate.

Structura moleculară a carbapenemelor Structura moleculară a monobactamilor
2.4.3. Mecanismele rezistenței enzimatice la antibioticele -lactamice
Antibioticele β-lactamice sunt inactivate de enzime numite β-lactamaze , produse de
BGN, fiind considerate o problemă clinică majoră. Aceste enzime hidrolizează inelul β –
lactamic din structura antibioticelor, inducând rezistența agenților patogeni la antibioticele β-
lactamice.

25
2.4.3.1. Sinteza β -lactamzelor constituie prin cipalul factor de rezistență al bacteriilor Gram
negative la antibioticele β -lactamice.
Termenul de β-lactamază se referă la enzimele produse de microorganisme care
hidrolizează moleculele β-lactamice. Aceste enzime hidrolizează legătura β -lactamică. β-
lactamazele sunt enzime foarte eficiente: o singură moleculă poate hidroliza peste 100 000 de
molecule β -lactamice. Ele formează o familie mare de enzime cu structura unitară, toate având
în comun mecanismul de acțiune: clivează inelul β -lactamic și in activează antibioticul, dar
diferă prin secvența aminoacizilor. Mai mult de 500 de enzime β-lactamază au fost raportate
până în prezent (Bush și Jacoby, 2010).

Situsurile de acțiune ale β-lactamazelor (indicate de săgeți).
2.4.3.1.1 Clasificarea β -lacta mazelor
β-lactamazele au fost clasificate în funcție de substratul pe care -l hidrolizează, de
sensibilitatea la inhibitori, de modul de sinteză (constitutivă sau inductibilă) și de localizarea
cromosomală sau plasmidială a genelor codificatoare.
Unul dintr e primele rapoarte cu privire la rezistența antibioticelor a fost referitor la o
tulpină bacteriană producătoare de –lactamază, o enzimă ce hidrolizează legătura -
lactamică a acestei clase de antibiotice. Această legătură este esențială pentru activitatea
antibioticelor -lactamice, deoarece are rolul de analog al legăturii peptidice ce leagă D -Ala
terminală a peptidului de monomerul peptidoglicanic. -lactamazele diferă pri n secvența
aminoacizilor. Spectrul lor de activitate este restrâns. -lactamazele s -au diversificat prin
mecanismul mutațiilor punctiforme ce se acumulează gradat în genele codificatoare.
În funcție de spectrul de activitate beta -lactamazele se clasifica :
 penicilinaze (cele care acționează asupra penicilinelor);

26
 cefalosporinaze (hidrolizează cefalosporinele); unele au spectru larg de acțiune
(cele care hidrolizează penicilinele și cefalosporinele);
 aztreonamaze (hidrolizează monoba ctamii);
 carbapenemaze (acționează asupra carbapenemelor).

Spectrul de activitate al diferitelor clase de β-lactamaze .
Un alt criteriu de clasificare a β-lactamazelor este secvența de nucleotide a gene lor
codificatoare si secvența de aminoacizi a enzime lor pe care le codifică. Clasificarea pe baza
secvenței de nucleotide a genelor codificatoare recunoaște 4 clase de -lactamaze: A, B, C, D.
Această clasificare este stabilă și reflectă raporturile fundamentale ce nu pot fi modificate de
mutații.
Clasa A de β-lactamaze
Majoritatea BLSE au fost clasificate în clasa Ambler A. BLSE se împart în trei grupe
genetice majore: TEM, SHV și CTX -M (Lavigne și colab., 2007). Aceste enzime includ
bla SHV și bla TEM, care au evoluat spre bla SHV -1 și bla TEM -1, codificate de gene diferite, derivate
prin una sau mai multe mutații punctiforme care au loc în situsul activ al β-lactamazelor
(Paterson și Bonomo, 2005). Diseminarea genelor codificatoare ale BLSE este mediată de
elemente mobile genetice: transpozoni, secvențe de inse rție și integroni. Deși BLSE de tip
TEM și SHV au dominat BLSE în timpul anilor 1990, ocazional au fost raportate infecții
nosocomiale, mai ales cu CTX –M-2 produse de Enterobacteriaceae (Pitout și colab, 2009).
Această situație s -a modificat în ani i 2000 d upă depistarea transcontinentală, a CTX -M-15
produsă de E. coli , agentul cauzator important al ITU ( Infectii de Tract Urinar ) comunitară. Beta -lactamaze de spectru larg
Beta -lactamaze de
spectru extins
Penicilinaze
Peniciline Cefalosporinaze
CGI CGII CGIII CGIV Astreonamaza
Monobactami Carbapenemaze
Carbapeneme

27
 beta-lactamazele cu spectru larg de acțiune (BLSE) sunt active prin mecanismul serin –
esteric , avand serina in centrul activ. Acest mecanism este comun β –lactamazelor claselor
A, C și D.
BLSE sunt un grup de enzime ce hidrolizează și conferă rezistență la peniciline ,
cefalosporine monobactami și cefalosporine ( cefotaxim , ceftazidim , ceftriaxonă , cefuroxim și
cefepim) . Aceste enzime nu hidrolizează unele cefomixine, ( cefoxitin și cefotetan) . BLSE nu
au nicio activitate sau au activitate nesemnificativă față de carbapeneme . Ele sunt inhibate de
inhibitorii clasici a β -lactamazelor : acid clavul anic, sulbactam și tazobactam . Tulpinile
bacteriene care sintetizează BLSE sunt adesea concomitent rezistente la antibiotice din alte
clase, ca aminoglicozide și fluoroquinolone (Lavigne și colab., 2007).

Clasa B de β-lactamaze
Genele codificatoare ale enzimelor de tip bla MBL sunt localizate cromosomal,
plasmidial sau în strucura diferitelor casete genice ale integronilor (Queenan și Bush, 2007).
La P. aeruginosa și A. baumannii au fost descrise până în prezent șapte grupe de
metalo- β-lactamaze dobândite: IMP (,, imipenemase‖ ), VIM (,, Verona imipenemase ”), SPM
(,,Saõ Paolo metallo -β-lactamase ”), GIM (,, German imipenemase ”), NDM (,, New Delhi
metallo -β-lactamase ”), AIM (,, Adelaide imipenmase ”) și SIM (,, Seoul imipenemase ”). În
timp ce enzimelede tip GIM, SIM și AIM au fost limitate numai la anumite regiuni geografice
ale globului, VIM și IMP au distribuție globală (Johnson și colab., 2007).

Clasa B de β-lactamaze
Aceste enzime necesită ionii de Zn la situsul activ, pentru a scinda inelul –lactamic
(metalo -β-lactamaze). Acest mecanism de acțiune este specific -lactamazelor clasei B
(Chifiriuc și colab., 2011). Fac parte din clasa B , fiind complet diferite de B LSE ca secvență
și mecanism de acțiune. β -lactamazele clasei B sunt grupate în 3 subclase: B1 -B3. Subclasele
B1 și B3 leagă doi ioni de Zn, iar enzimele din subclasa B2 leagă unul singur (Wilke și
colab., 2005)

Clasa C de β-lactamaze

28
β-lactamazele AmpC sunt cefalosporinaze importante din punct de vedere clinic,
codificate pe cromosomii multor enterobacterii și a câtorva alte organisme, în care acestea
mediază rezistența la cefalotină, cefazolin, cefoxitină, majoritatea penicilinelor și combinații
de inhibitori ai β-lactamazei . La multe bacterii, enzimele AmpC sunt inductibile și pot fi
exprimate la niveluri ridicate prin mutație. Supraexpresia conferă rezistență cefalosporinelor
cu spectru larg, incluzând cefotaximă, ceftazidimă și ceftriaxonă. Pl asmida purtătoare a
dobândit gene pentru enzimele AmpC, care pot să apară la bacteriile care nu exprimă sau
exprimă la un nivel scăzut gena cromosomală bla AmpC, (E. coli , K. pneumoniae și P.
mirabilis (Jacoby, 2009).

Clasa D de β-lactamaze
Enzimel e acestei clase au fost catalogate inițial ca fiind oxacilinaze, deoarece
hidrolizează oxacilina cu o rată mai înaltă decât enzimele din clasele A sau C (Paterson;
Bonomo, 2005). β-lactamazele de tip OXA pot determina fenotipuri de rezistență la peniciline,
cefalosporine, cefalosporine de spectru extins (BLSE de tip OXA) și carbapeneme. BLSE de
tip OXA sunt caracteristice tulpinilor speciei P. aeruginosa (Weldhagen și colab., 2003), însă
au fost descrise la multe alte specii bacteriene Gram negative.

2.4.4. Mecanismele rezistenței ne -enzimatice la antibioticele -lactamice
2.4.4.1. Impermeabilitatea structurală a membranei plasmatice
Antibioticele pătrund în celulă pe două căi : calea mediată d e lipide și prin intermediul
porinelor . Unele antibiotice pătrund în celulă prin ambele modalități, de expmplu tetraciclina
și quinolonele. Antibioticele hidrofobe pătrund prin membrana plasmatică a bacteriilor Gram
negative pe calea mediată de lipide, iar antibioticele hidrofile pătrund prin porinele
membranei externe ( Delcour, 2009).
Rezistenta prin impermeabilitate este ilustrată de mutația care implică un deficit al
sintezei porinelor D2, ce determină rezistența tulpinilor de P. aeruginosa la ca rbapeneme
(Chifiriuc și colab., 2011). Organismele cu fenotipuri de impermeabilitate față de antibiotic
sunt defective de una sau mai multe porine (Mărculescu și colab, 2007).

29
Membrana externă a P. aeruginosa este o barieră semnificativă în calea pătrun derii
antibioticelor: limitează rata de pătrundere a moleculelor mici, hidrofile și exclud molecule
mai mari. Antibiotice hidrofile mici (β -lactamice și quinolone) pot trece prin membrana
externă pe calea canalelor apoase ale porine lor trimere . P. aer uginosa produce mai multe
tipuri de porine, oprF fiind cea mai importantă . Pierderea oprF nu a fost asociată cu pierderea
rezistenței la antibiotice, probabil pentru că astfel de tulpini au o capacitate limitată de a
prelua nutrienți hidrofili.
ROP este o al tă porină specializată, cu rol în transportul aminoacizilor încărcați
pozitiv (lizina). Pierderea ROP este frecvent asociată cu rezistența la imipenem, care pătrunde
pe calea acestei porine. Pierderea porinei ROP crește valoarea concentrației mi nime inhibitorii
de la 1 -2 până la 8 -32 mg/ L. Interesant, sensibilitatea la meropenemnu nu este modificată de
pierderea ROP, sugerând că cele două carbapeneme, imipenem și meropenem traversează
membrana exernă prin porine diferite (Lambert, 2001).
Amin oglicozidele și colistinul traversează membrana externă prin legarea de
lipopolizaharid (LPS), a cărei permeabilitate o alterează și antibioticel e ajung în contact cu
membran a citoplasmatic .
Aminoglicozidele sunt transportate activ prin membrană, la situsul de acțiune
(riboszomi ). Colistinul alterează permeabilitatea membranei citoplasmatice și exercită
acțiunea sa bactericidă . Rezistența la aminoglicozide și colistin a fost raportată la tulpini de P.
aeruginosa , datorită supraexpresiei unei proteine a membranei exter , oprH , care protejează
LPS de legarea antibiotice lor. Această formă de rezistență nu a fost descrisă pe scară largă la
izolatele clinice (Lambert, 2001).
La E.coli , concentrația minimă inhibitorie pentru peniciline și cefalosporine crește
odată cu nivelul expresiei porinelor OmpC și OmpF. Diminuarea permeabilității membranei
externe este proporțională cu diminuarea expresiei porinelor, la bacteriile Gram negat ive, a
căror membrană externă devine impermeabilă pentru β -lactamine și quinolone. Consolidarea
funcției de barieră a membranei externe prin expresia unei proteine suplimentare, intercalată
în structura ei explică rezistența E. coli la tetraciclină. Dimi nuarea permeabilității prin
pierderea unei proteine a membranei externe duce la apariția rezistenței unor bacterii față de
cloramfenicol. Diminuarea permeabilității bacteriene, este cauza rezistenței la sulfamide,
trimetoprim (Mărculescu și colab, 200 7).

30

2.4.4.2. Rezistența la antibiotice mediată de pompele de eflux
Sistemele de eflux sunt constituite din proteine particulare, cu rol de pompe, fiind
considerate mecanisme importante prin care bacteriile pot expulza substanțele antimicrobiene
în afara celulei. Pompele de eflux sunt adesea codificate cromosomal, dar au fost raportate și
sisteme de eflux codificate plasmidial. S -au identificat 5 familii de sisteme de eflux, dintre
care unele sunt dependente de energie și pot fi sisteme de transport primare de tip ABC (ATP –
binding cassette), ce utilizează energia rezult ată din hidroliza ATP (Li și Nikaido, 2004).
Sistemele de eflux sunt alcătuie din trei proteine componente: o pompă dependentă
de energie situată în membrana citoplasmatică, o porină localizată în membran a extern ă și
oproteină de legare a celor două co mponente ale membranei. Acest aranjament tripartit
formează un sistem de expulzare eficient pentru molecule le toxice din citoplasmă sau din
spațiul periplasmic (Ziha -Zarifi și colab., 1999) .
Rezistența E. coli la un singur sau la mai multe antibiotice , este în mare parte atribuită
expresiei unor transportori de eflux. Mai mult de 37 de gene ce codifică sisteme de eflux s -au
identificat în genomul de E. coli, aparținând la 4 familii diferite, constituind sisteme de
rezistența multiplă, care se numesc p ompe de tip MDR ( -multi -drug -resistance ) (Li și Nikaido,
2004) .
LA P. aeruginosa au fost descrise patru sisteme de eflux diferite: mexAB -Oprm,
mexXY -Oprm, mexCD -oprJ și mexEF -oprN10 ( figura 11 ). Toate clasele de antibiotice cu
excepția polimixinelor sunt susceptibile de expulzare prin una sau mai multe dintre sistemele
de eflux. MexAB -Oprm elimină β-lactamice, quinolone și o serie de dezinfectanți. Genele
pentru sistemele de eflux sunt prezen te la toate tulpinile, dar nu sunt exprimate la niveluri
înalte. Creșterea nivelului de expresie poate rezulta din mutatii ale genelor reglatoare, ca de
exemplu, mexR, care controlează expresia genei mexAB -Oprm (Ziha -Zarifi și colab., 1999).

31

Fig. 11. Locația genelor cromosomale ce codifică sistemele de eflux pentru beta -lactamaze
(Pseudomonas Genome Proiect [http://www.pseudomonas.com]).
2.5. Mecanismele rezistenței la aminoglicozide
Aminoglicozidele sunt zaharuri complexe, conectate prin legături glicozidice . Sunt
sintetizate de bacterii din g. Streptomyces și sunt denumite cu sufixul mycin . Există o strânsă
legătura între doza administrată și nivelul concentrației sanguine . În funcție de concentrație,
ele acționează ca agenți cu efect bacteriostatic sau ba ctericid (Shakil și colab., 2008 ).

Structura moleculara a streptomicinei.
Aminoglicozidele inhibă creșterea unor bacterii Gram pozitive și Gram negative, dar
sunt inef iciente față de bacteriile cu localizare intracelulară. Mecanismul efectului bactericid
constă în inhibiția sintezei proteice prin legarea de subunitatea ribosomală 30S perturbând
integritatea membranei celulei bacteriene (Levison și colab , 2009). Anero bia și cationii
bivalenți le diminuează eficiența. Ele se impart în derivați ai gentamicinei, kanamicinei,
neomicinei.

32
Aminoglicozidele se leagă la subunitatea 30S a ribosomilor, inhibând astfel sinteza
proteinelor. Datorită interacției antibiotic -ribosom, pot induce erori de citire a ARNm, având
ca produs final sinteza de proteină nefuncțională (Mihăescu și colab., 2007).
Cel mai imporant mecanism de rezistență la aminoglicozide este modificarea enzimatică a
antibioticului. Enzimele car e modifică aminoglicozidele produc modificări covalente ale unor
grupări specifice amino sau hidroxil, ducând la modificarea moleculei, care n u se mai poate
lega la ARN 16S. Aceste enz ime sunt încadrate în trei familii: aminoglicozid -acetil -transferaze
(AAC) – utilizează acetil -CoA ca donor al grupării acetil pentru modificarea
aminoglicozidelor la gruparea amino din pozițiile 1 și 3 ale inelului deoxistreptaminei și la
pozitiile 2' și 6' ale inelului 6 -aminohexozei; aminoglicozid -adenilil -transferaze (ANT) și
aminoglicozid -fosfotransferaze (APH) (Jehl și colab., 2010).
La E.coli rezistența la gentamicină s -a considerat a fi mediată de enzimele AAC(3) -I,
AAC(3) -II, AAC(3) -IV (Miller și colab. , 1997). Analiza moleculară (PCR= Polymerase
Chain Reaction) a arătat că gena aacC2 determină re zistența la gentamicină ( Leung și colab.,
2010).

2.6. Mecanismele rezistenței la quinolone
Quinolonele sunt o familie de substanțe antimicrobiene cu rol i mportant în terapeutica
umană, alături de β -lactamice și macrolide. Structura de bază este nucleul quinolinic și au fost
obținute pe cale sintetică. Prima generație a quinolonelor a început cu acidul nalidixic,
comercializat începând cu anul 1962, pentru tratarea infecților urinare. Acidul nalidixic este
un produs intermediar de sinteză a acestora. Mai târziu, majoritatea quinolonelor au fost
substituite cu fluoroquinolonele, care aveau în plus un atom de fluor în poziția a 6 a
heterociclului (Hooper, 2001 ). Fluoroquinolonele (norfloxacin, pefloxacin, ofloxacin,
ciprofloxacin) au un spectru larg de activitate antibacteriană extins atât la bacteriile Gram
negative cât și la cele Gram pozitive.

33
Structura moleculara de baza a quinolonelor.
Mecanismul de acți une în inhibiția sintezei ADN prin inactivarea topoizomerazelor:
ADN -giraza (topoizomeraza II) și topoizomeraza IV localizate în citoplasma bacteriană.
Aceste enzime sunt structural legate una de cealaltă, ambele având o structură
tetramerică cu două p erechi de subunități diferite.
Fluoroquinolonele acționează prin legarea covalentă cu complexul ADN -girază și
stabilizează molecula de ADN în conformație spiralizată . Formarea complexului stabil
enzimă -ADN -fluoroquinolonă omoară celula prin blocarea diviziunii. La procariote,
topoizomerazele de tip II (giraze) și cele de tip IV sunt tetrameri alcătuiți din două subunități.
Subunitatea A a ADN -girazei are activitate de rupere -reunire a catenelor de ADN, iar
subunitatea B catalizează hidroliza ATP. Subunitatea A este ținta acțiunii quinolonelor
Acțiunea . celor două enzime -topoizomeraze este inhibată. Quinolonele se leagă și stabilizează
complexele girază -ADN (quinolona s ingură nu se asociază cu ADN), după clivarea lanțului,
împiedicând acțiunea catalitică a ADN -polimerazei la nivelul bifurcației de replicare.
Complexul generează o rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repară eficient.
Inevitabil, datorită utiliza rii excesive a acestor antibiotice au apărut și tulpinile
rezistente ale unor specii bacteriene de mare importantă medicală.
Mecanismele rezistenței bacteriene la fluoroquinolone sunt datorate modificărilor
enzimelor țintă, alterări care limitează accesu l medicamentelor țintă și activitatea pompelor de
eflux. La bacteriile Gram negative rezistența la aceste antibiotice poate fi indusă prin
modificări ale porinelor din membrana externă asociate cu scăderea permeabilității. Alte
mecanisme care mediază rezis tența la fluoroquinolone sunt mutațiile genelor gyrA și parC, dar
și prin transferul de elemente genetice mobile (plasmidele) (Cheng și colab., 2012).
Fluoroquinolonele au efect bactericid, prin stoparea rapidă a sintezei de ADN și
inhibiția activității to poizomerazei II, dar pentru efectul letal sunt necesare și inhibiția sintezei
ARN și a proteinelor. Ciprofloxacina se folosește în tratamentul infecțiilor respiratorii, ale
tractului urinar și al infectiilor diareice cu tulpini de E.coli .
Mecanismele rezistenței bacteriene la fluoroquinolone (fig. 12 ) sunt de trei categorii: i)
modificări ale enzimelor țintă ale medicamentelor, ii) modificarea țintei antibioticului, iii)
activitatea pompelor de efux. Rezistența la quinolone este, predominant, conseci nța

34
modificărilor enzimei țintă , la situsurile active ale enzimei. La bacteriile Gram negative,
ADN -giraza pare a fi ținta primară pentru toate quinolonele.

Fig. 12. La P aeruginosa rezistența la fluoroquinolone și carbapeneme implică mecanisme codificate de gene
cromosomale. (A) Interacțiunile fluoroquinolonelor și a carbapenemelor cu tulpina de tip "sălbatic" sensibilă de
P. aeruginosa care exprimă nivelurile bazale ale expresiei gyrA, gyrB, parC și parE). Moleculele de
fluoroquinolonă trec p rin membrana externă, peptidoglican, spațiul periplasmic și membrana citoplasmică și
interacționează cu țintele de girazei și topoizomerazei IV (Topo IV) în citoplasmă atunci când aceste enzime sunt
complexate cu ADN. Moleculele de carbapenem trec prin por ina OprD specifică membranei externe și
interacționează cu PBP țintă, localizate pe partea externă a membranei citoplasmatice. (B) mecanisme de
rezistență la fluoroquinolone și carbapeneme codificate cromosomal. Rezistența la fluoroquinolonă este mediată
de (i) supraexprimarea pompelor de eflux de tip RND care expulzează moleculele de medicament din spațiul
periplasmic și citoplasmatic și / sau (ii) modificările mutaționale ale genelor țintă. Locațiile QRDR în genele

35
țintă sunt evidențiate în galben. Rez istența la carbapenem este mediată în primul rând de (i) scăderea sintezei sau
pierderii OprD funcțional în membrana externă și / sau (ii) supraproducția pompelor de eflux cu RND (cu
excepția imipenemului). Creșteri ușoare ale nivelului de rezistență po t fi datorate supraexprimării AmpC
(Lister&co, 2009) .
2.7. Mecanismele rezistentei la nitrofurani
Nitrofuranii sunt agenți antibacterieni a căror structură și mod de acțiune sunt similare
cu cele ale nitroimidazolilor .

Structura moleculară a nitrofuranilor.
Activitaea antibacteriană a nitrofuranilor este legată de reducerea grupării NH 2.
Intreaga cantitate administrată, pe cale orală sau parenterală , rămâne disponibilă acțiunii
antimicrobiene. Perioada de înjumătățire permite administrarea a d ouă doze/zi. Datorită
mecanismului unic de acțiune, nu există fenomene de rezistență încrucișată. Bacilii Gram
negativi posedă rezistență intrinsecă pentru că au pompe de eflux eficiente față de Linezolid .

2.8. Aspecte epidemiologice ale rezistentei la a ntibiotice ale BGN de importanță medicală
Atât enterobacteriile ( E. coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Proteus sp., Serratia
sp.) cât și BGNNF ( Pseudomonas sp., Acinetobacter sp.) sunt agenți patogeni oportuniști
importanți. E. coli este agentul cel mai comun al infecțiilor tractului urinar comunitar și
spitalicesc, fiind principala componentă aerobă /facultative anaerobă a microbiotei mixte în
infecțiile intraabdominale. P. aeruginosa, K. pneumoniae și Enterobacter spp. sunt importante
în pneumonia nozocomială, în special la pacienții cu spitalizare prelungită. A. baumannii
provoacă focare la pacienți imunodeprimați în unitățile de terapie intensivă. Tulpinile
patogene de BGN reprezintă aproximativ jumătate din toate bacteriemiile. În Mare a Britanie,
E. coli este cel mai comun agent de bacteriemie, provocând 30% din toate cazurile, iar P.
aeruginosa, Klebsiella spp., Enterobacter sp. și Proteus sp. reprezintă 4 – 8% din cazuri
(Livermore, 2012, Wilson și colab., 2011).
K. pneumoniae este o bacterie clinică și epidemiologică cu implicare semnificativă
în patologia infecțioas ă. Aceasta este asociată cu bacter iemia (locul doi printre tulpinil e
C H2CNHC
O2N
OCH N NO
O
nitrofurantoi l

36
Gram-negative după E. coli), cu infecțiile urinare și ale tractului respirator. În estul, sudul și
centrul Europei se izolează cu frecvență înal tă tulpini de K. pneumoniae rezistente la diferite
medicamente. România raportează un număr tot mai mare de tulpini K. pneumoniae
rezistente , izolate de infecții invazive în fiecare an. Unul din raportele recente al țării noastre
către Rețeaua Europeană de Supraveghere a Rezistenței Antimicrobiene (EARS -Net) ne -a
plasat printre primele locuri în ceea ce privește rezistența la fluoroquinolone a K. pneumoniae
(locul al treilea după Slovacia și Grecia), cefalosporinele de generația a treia (locul al doilea
după Bulgaria), aminoglicozidele (locul al doilea după Slovacia), carbapenem ele (locul al
treilea după Italia și Grecia), precum și rezistența sa multiplă (locul al treilea după Slovacia și
Grecia) (Gavriliu și colab., 2016; www.ecdc.europa.e u).
Analiza unor studii real izate atât în România, cât și la nivel grobal , a relevat faptul că
BGN sunt printre cele mai izolate tulpini în mediul spitalicesc, fiind responsabile de infecții
nosocomiale (tabelul 1).
Tabelul 1. Rata de izolare a BGN (datele raportate în diverse studii )
Tulpina de BGN izolată Rata de izolare Sursa de izolare Indicație bibliografică

E.coli 54,5% Urocultură

Sadat Moini și colab.,
2015 27,6% Scaun
75,5% Hemocultură venoasă
6,7% Lichid pleural
3,7% Lichid ascetic

K.pneumoniae 52,6% Urocultură
33,6% Scaun
5,2% Hemocultură venoasă
2,6% Lichid pleural
6% Lichid ascetic
33,59% Urocultură

Banu și colab., 2015 28,12% Secreție traheală
26,5% Plagă
8,2% Hemocultură venoasă
3,51% Dispoz itive protetice

38,9% Urocultură

14,77 Abces
13,3% Aspirat tracheal
6,89 Spută

37

Ps. aeruginosa 5,9% Lavaj bron șic
Strateva și colab., 2007 4,43% Hemocultură
0,98% Portaj anal
0,98 Lichid pleural

A. baumannii 68% Aspirat bronșic

Moisoiu și colab., 2014 18,3% Spută
7,5% Lichid pleural
2,9% Hemocultură
2,8% Urocultură
2,3% Puroi de plagă

Din tabelul reiese că tulpinile de BGN sunt izolate atât din siturile sterile ale
organismului uman (urină, sânge, lichid pleural, lichid ascitic și dispo zitive protetice), cât și
din situri nesterile (spută, abcese, puroi de plagă, portaj anal/scaun), cee a ce indică
mutitudinea infecțiilor asociate acestor tulpini.
Partea aII -a Contribuții originale privind studiul markerilor fenotipici și moleculari de
rezistență la antibiotice la bacili Gram -negativi izolate din mediul spitalicesc

Scopul si obiectivele lucrarii

Scopul prezentei lucrari a fost studiul markerilor fenotipici si moleculari care codifică
producerea de β-lactamaze la tulpini microbiene de enterobacterii și bacili Gram negativi
nonfermentativi oportuniști izolate din mediul spitalicesc.

Pentr u indeplinirea prezentului scop au fost urmarite obiectivele:
 O1: Selectarea tulpinilor bacteriene pe baza rezistentei la cefalosporine si carbapeneme
izolate dintr -o unitate spitaliceasca cu acoperire teritoriala reprezentativa.
 O2: Determinarea spectrul ui de sensibilitate la antibiotice β -lactamice si non -β-
lactamice prin metode calitative/cantitative, evidențierea profilurilor de rezistență
BLSE si MBL.
 O3: Evidențierea genelor de rezistenta la antibiotice beta -lactamice si non –
betalactamice prin metoda PCR ( Polymerase Chain Reaction), electroforeza produșilor
de amplificare si determinarea variantei genice pentru gena bla CTX-Mlike.

38
Capitolul III
Obictivul 1
3.1 Selectarea tulpinilor bacteriene pe baza rezistentei la cefalosporine si carbapeneme
izolate spitaliceasca cu acoperire teritoriala reprezentativa.
3.1.1 Materiale si metode
3.1.1.1 Selectarea si identificarea tulpinilor bacteriene izolate din mediul spit alicesc
Tulpinile bacteriene studiate în prezenta lucrare au fost izolate de la pacienți internați
la Institutul de Boli Cardiovasculare „C.C. Iliescu” București, și recoltate în perioada 2015 –
2016. Aceste tulpini se regăsesc în colecția Laboratorului de Microbiologie al Facultății de
Biologie.
Având în vedere faptul că tulpinile provin din secțiile de terapie intensivă, unde
presiunea selectivă asupra bacteriilor este ridicată și că pacienții sunt imunodeprimați, acestea
reprezintă o problemă majoră în c linică, putând produce infecții cu o evoluție severă agravată
de rezistența enzimatică la antibioticele β -lactamice, mediată de β -lactamaze codificate
plasmidial, cu caracter transferabil.
Au fost luate în studiu atât tulpini de enterobacterii ( E.coli si K. pneumoniae ), cât și
tulpini de BGNNF (Ps. aeruginosa si A. baumannii).
Identificarea tulpinilor s-a realizat prin sistemul VITEK®2, sistem automat cu
performanță ridicată, care identifică și testează sensibilitatea la antibiotice a bacteriilor,
folosind cardurile disponibile sistemului VITEK®2 și anume: identificare de bacterii și fungi;
testarea sensibilității la antibiotice a bacteriilor importante din domeniul clinic.
Mod de lucru: se transferă aseptic 3,0 ml soluție salină sterilă (apoasă 0.45% – 0.50%
NaCl, pH 4.5 – 7.0) într -un tub de plastic transparent (polistiren – 12 x 75 mm). Se selectează
colonii izolate din placa primară sau din subcultura de testat care a crescut pe mediul de
cultură adecvat în condițiile de incubare recomandate. Se prepară o suspensie omogenă
bacteriană cu o densitate echivalentă cu 0,5 – 0,63 standard McFarland folosind VITEK®2
DENSICHEK. Tubul cu suspensie se pune în casetă. Se deschide folia în care este introdus
cardul VITEK®2 și se așează în casetă. Transferul inoculul ui în card se face în camera de
umplere VITEK®2 compact și ulterior se mută în camera cititor/incubator. După sigilare,
cardurile sunt încărcate automat în caruselul de incubare, incubarea cardului VITEK ®2 se

39
realizează automat în incubatorul integrat în s istem. Temperatura de incubare este 35,5 °C +
1°C. Citirea cardului se realizează automat.
Metoda de citire:
 turbidimetrică: pentru testarea sensibilității la antibiotice a bacteriilor
 colorimetrică: pentru identificarea speciei bacteriene
Schimbările produ se în creșterea și metabolismul bacteriilor pe timpul incubării rezultă
în schimbările de transmitanță. Fiecare celulă se citește la fiecare 15 minute cu un cititor optic
la o lungime de undă de 430 sau 568 nm. Pentru fiecare citire măsurătorile se realiz ează
automat pe fiecare celulă în 16 puncte diferite de 3 ori consecutiv (în total în 48 puncte).
Citirea cinetică a celulelor permite obținerea unei curbe de creștere/celulă (una per
substrat/test). Interpretarea algoritmului permite obținerea profilului biochimic pentru toate
testele. Rezultatele observate sunt comparate cu rezultatele scontate în baza de date pentru
fiecare taxon pe care cardul îl poate identifica. Scopul este determinat de taxonul care se
potrivește cel mai bine sau are cea mai mare pro babilitate. Interpretarea testelor de identificare
VITEK® 2 se realizează la nivel de gen și specie.
Principiu de identificare: identificarea unui microorganism cu ajutorul sistemului
VITEK®2 utilizează o metodologie bazată pe caracteristicile datelor și c unoștințelor despre
organism și reacțiile analizate. Au fost adunate date suficiente despre tulpini cunoscute pentru
a estima reacțiile tipice ale speciilor și discriminările biochimice. Dacă un pattern unic de
identificare nu a fost recunoscut, apare o li stă de organisme înrudite posibile, de unde rezultă
că respectiva tulpină aparține unui pattern neinclus în panelul bazei de date. Raportul de
laborator imprimat conține sugestii pentru orice test suplimentar necesar în scopul completării
identificării. Da că testele nu sunt suficiente pentru a completa identificarea, atunci se consultă
referințele standard de microbiologie și literatura de specialitate.
La bacteriile Gram -negative: sunt 47 teste biochimice și o celulă cu control negativ.
Celula cu control negativ pentru decarboxilaze (celula 52) se utilizează ca linie de bază de
referință pentru testele de decarboxilază. Rezultatele finale sunt valabile în 2 – 10 ore. Astfel,
sistemul permite identificarea a 159 specii de bacterii Gram -negative.
3.1.1.2 Con servarea tulpinilor bacterine la -800C
Tulpinile izolate și identificate au fost conservate pe termen lung, acestea pastrandu -si
propietatile nutritive, virulente si genomice în vederea utilizării lor ulterioare. Tulpinile au fost

40
izolate pe mediu solid l actozat MacConkey pentru obtinerea de culturi prospete si pure. Au
fost incubate la 350C, 24h.
Din tulpinile de 24h s -au prelevat câte 1 -2 colonii și s -au inoculat în mediu lichid BHI
(Brain Heart Infusion) cu glicerol 20% pentru conservarea la -800C.

3.1.2 Rezultate si discutii:
În perioada 2015 -2016 au fost selectate 152 tulpini bacteriene aparținând familiei
Enterobacteriaceae, 48 tulpini bacteriene de Ps. aeruginosa și 49 tulpini bacteriene de A.
baumannii de la Institutul de Boli Cardiovasculare ,, C. C. Iliescu”, criteriul de selecție fiind
diminuarea sensibilității la cefalosporine de generația III -a și a IV -a și la carbapeneme.
Majoritatea tulpinilor au fost identificate în unitățile spitalicești de proveniență, iar în cadrul
Institutului de Cerce rcetare al Universitatii din Bucuresti (ICUB) au fost identificate doar
tulpinile bacteriene a căror identificare era incertă.
K. pneumoniae este un agent patogen nosocomial proeminent, responsabil în principal
pentru tractul urinar, tractul respirator sau infecțiile sanguine ( Podschun și colab., 1998) .
Analizând figura 13, se poate observa că tulpinile de K. pneumoniae au fost iolate atât
din situsuri sterile urocultura (24%), hemocultura venoasă (9%), catetere contaminate (1%),
cât și din situsuri nesteri le portaj anal (21%), secreție traheală (19%), secreție de plagă (20%),
sputa (1%), exsudat nazal (1%), ceea ce indică răspândirea acestor tulpini bacteriene.

Fig. 13 Distributia surselor de izolare pe tulpinil e de K. pneumoniae 0510152025

41
E. coli uropatogenic este cea mai frecventă cauză a infecțiilor urinare dobândite în
comunitate și în spitale. Izolatele din spitale fără complicații exprimă o varietate de trăsături
virulente care promovează o colonizare eficientă a tractului urinar. În mod cont rast, infecțiile
nosocomiale pot fi cauzate de tulpini de E. coli care diferă în trăsăturile lor de virulență față de
izolatele dobândite în comunitate (Toval și colab., 2014).
Tulpinile de E. coli analizate în prezentul studiu au fost izolate din situsur i sterile:
urocultură (46%) și hemocultură venoasă (3%) și din situsuri nesterile: portaj anal (38%),
secreție de plagă (10%) și spută (3%). Procentul crescut de tulpini de E. coli izolate din
uroculturi este în concordanță cu studiile de specialitate, fii nd principalul agent etiologic al
infecțiilor de tract urinar.

Fig. 14 Distributia surselor de izolare pe tulpinil e de E. coli
În ceea ce privește sursele de izolare (fig. 15) ale tulpinilor de Ps. aeruginosa , s-a putut
constata că majoritatea au fost izolate din situsurile nesterile ale organismului uman, astfel
secreție traheală (55%), secreție de plagă (12%), exsudat nazal (6%) și exsudat faringian
(6%). Tulpinile provenite din situsuri sterile au fost iz olate din uroculturi (21%). 02468101214161820
urocultură portaj anal hemocultură
venoasăspută secreție de
plagă

42

Fig. 15 Distributia surselor de izolare pe tulpinil e de Ps. aeruginosa
A. baumannii a fost considerat multă vreme o bacterie cu virulență scăzută, radicand în
ultimul timp mari probleme terapeutice, prin creșterea nivelului de rezistență la antibiotice.
Amploarea infecțiilor cu A. baumanii în unitățile de terapie intensivă se datorează ventilației
mecanice, cateterizării, utilizării unui număr mare de antibiotice cu spectru larg, dar și
transmiterii prin mâinile personalului medical (Moisoiu și colab., 2014). Analizând figura 16,
se poate observa că de asemenea în prezentul studiu, tulpinile au fost izolate din situsuri sterile
și nesterile, indicând circulația tulpinilor în mediul spitalicesc. Din situsurile sterile, tulpini le
au fost izolate din uroculturi (10%), hemocultură venoasă (10%), catetere contaminate (6%),
în timp ce din situsurile nesterile au fost izolate din secreție de plagă (17%), septicemie (10%),
și exsudat nazal (2%).

Fig. 16 Distributia surselor de izola re pe tulpinil e de A. baumannii 051015202530
secretie
trahealăexsudat
faringiansecretie de
plagaurocultura exsudat nazal
0510152025

43
În tabelul 2 sunt reprezentate tulpinile selectate pentru prezentul studiu, sursele de
izolare și fenotipul de rezistență al acestora.
Tabelul 2. Fenotipurile de rezistența ale tulpinilor luate in studiu.
Cod spital Sursa d e izolare Tulpina Fenotip
992 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1597 Exsudat nazal Ps. aeruginosa MDR
772 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
793 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
780 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
1091 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
1062 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
809 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
805 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
790 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
773 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
774 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
780 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
843 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
861 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1162 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
891 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1128 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
1157 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
824 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1919 Exsudat nazal Ps. aeruginosa MDR
840 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
915 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
870 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
898 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
929 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
904 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1027 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1986 Exsudat faringian Ps. aeruginosa MDR
6689 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1018 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1067 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1024 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1327 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1544 Secreție de plagă Ps. aeruginosa MDR
1775 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
2992 Exsudat faringian Ps. aeruginosa MDR
1392 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1908 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
1389 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
3162 Exsudat nazal Ps. aeruginosa MDR
1112 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1594 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
1113 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1067 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
1489 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
2469 Secreție traheală Ps. aeruginosa MDR
2043 Urocultură Ps. aeruginosa MDR

44
1244 Urocultură Ps. aeruginosa MDR
847 Secreție traheală A. baumannii MDR
1128 Hemocultură venoasă A. baumannii MDR
825 Secreție traheală A. baumannii MDR
1118 Hemocultură venoasă A. baumannii MDR
1089 Secreție traheală A. baumannii MDR
768 Fragment A. baumannii MDR
1027 Secreție traheală A. baumannii MDR
855 Secreție de plagă A. baumannii MDR
870 Secreție traheală A. baumanni MDR
801 Secreție traheală A. baumannii MDR
769 Cateter dializă A. baumannii MDR
876 Secreție traheală A. baumannii MDR
776 Secreție traheală A. baumannii MDR
769 Secreție traheală A. baumannii MDR
1391 Secreție traheală A. baumannii MDR
1908 Urocultură A. baumannii MDR
1444 Secreție traheală A. baumannii MDR
1860 Hemocultură venoasă A. baumannii MDR
1089 Secreție traheală A. baumannii MDR
1445 Secreție traheală A. baumannii MDR
1127 Secreție traheală A. baumannii MDR
1192 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1489 Secreție traheală A. baumannii MDR
1491 Secreție traheală A. baumannii MDR
1506 Secreție traheală A. baumannii MDR
1494 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1330 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1338 Secreție traheală A. baumannii MDR
1327 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1361 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1774 Urocultură A. baumannii MDR
1289 Secreție traheală A. baumannii MDR
1325 Secreție de plagă A. baumannii MDR
1342 Secreție traheală A. baumannii MDR
2041 Urocultură A. baumannii MDR
1368 Secreție traheală A. baumannii MDR
2187 Hemocultură venoasă A. baumannii MDR
1872 Septicemie A. baumannii MDR
2000 Cateter A. baumannii MDR
1846 Cateter A. baumannii MDR
1643 Septicemie A. baumannii MDR
2329 Urocultură A. baumannii MDR
2604 Urocultură A. baumannii MDR
1765 Septicemie A. baumannii MDR
2204 Urocultură A. baumannii MDR
2157 Secreție de plagă A. baumannii MDR
2008 Septicemie A. baumannii MDR
1614 Septicemie A. baumannii MDR
1886 Exsudat nazal A. baumannii MDR
1097 Urocultură K. pneumoniae BLSE
1095 Urocultură K. pneumoniae BLSE
1072 Urocultură K. pneumoniae BLSE
265 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
776 Secreție traheală K. pneumonia MDR

45
1106 Hemocultură venoasă K oxytoca BLSE
756 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1616 Exsudat faringian K. pneumoniae BLSE
869 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1230 Urocultură K. pneumoniae MDR
285 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
840 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
824 Secrețic traheală K. pneumoniae BLSE
1250 Hemocultură venoasă K. pneumoniae BLSE
147 Sputa K. pneumoniae BLSE
992 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
974 Cateter K. pneumoniae BLSE
929 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
893 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
311 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
1216 Urocultură K. pneumoniae BLSE
914 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
869 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
1292 Urocultură K. pneumoniae BLSE
1018 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
1420 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1924 Hemocultură venoasă K. pneumoniae BLSE
1547 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1361 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
1777 Urocultură K. pneumoniae BLSE
2110 Urocultură K. oxytoca BLSE
555 Portaj anal K.oxytoca BLSE
1235 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
1381 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1316 Abces splenic K. pneumoniae BLSE
1548 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
2084 Urocultură K. pneumoniae BLSE
1408 Secreție traheală K. pneumoniae BLSE
1386 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1404 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
444 Portaj anal K. pneumoniae MDR
1562 Urocultură K. pneumoniae BLSE
434 Portaj anal K. pneumoniae MDR,
1443 Secreție de plagă K. pneumoniae MDR
371 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
449 Portaj anal K. pneumoniae MDR
3495 Exsudat faringian K. pneumoniae MDR
1866 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1867 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1870 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
1074 Urocultură K. pneumoniae MDR
449 Portaj anal K. pneumoniae MDR
498 Portaj anal K. pneumoniae MDR
992 Hemocultură venoasa K. pneumoniae MDR
1035 Urocultură K. pneumoniae MDR
1311 Urocultură K. pneumoniae MDR
305 Portaj anal K. pneumoniae MDR
1074 Urocultură K. pneumoniae MDR
444 Portaj anal K. pneumoniae MDR
1071 Urocultură K. pneumoniae MDR

46
1043 Hemocultură venoasa K. pneumoniae MDR
892 Secretie traheală K. pneumoniae MDR
825 Hemoc venoasa K. pneumoniae MDR
641 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
642 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
653 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
831 Urocultură K. pneumoniae MDR
526 Secreție de plagă K. pneumoniae MDR
211 Portaj anal K. pneumoniae MDR
545 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
519 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
397 Secreție de plagă K. pneumoniae MDR
2529 Urocultură K. pneumoniae MDR
1836 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
2146 Urocultură K. pneumoniae MDR
511 Portaj anal K. pneumoniae MDR
2529 Urocultură K. pneumoniae MDR
1836 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
2146 Urocultură K. pneumoniae MDR
1763 Secreție traheală K. pneumoniae MDR
2282 Urocultură K. pneumoniae MDR
512 Portaj anal K. pneumoniae MDR
504 Portaj anal K. pneumoniae MDR
512 Portaj anal K. pneumoniae MDR
3875 Exsudat faringian K. pneumoniae BLSE
571 Portaj anal K. pneumoniae MDR
2346 Hemocultură venoasă K. pneumoniae BLSE
2350 Hemocultură venoasă K. pneumoniae BLSE
1803 Secreție de plagă K. pneumoniae BLSE
503 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
510 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
1723 Fragment K. pneumoniae BLSE
3083 Septicemie K. pneumoniae MDR
641 Portaj anal K. pneumoniae BLSE
2930 Urocultură K. pneumoniae BLSE
2360 Hemocultură venoasă K. pneumoniae BLSE
990 Secreție traheală Proteus sp. BLSE
991 Secreție traheală Proteus sp. BLSE
1486 Secreție de plagă Proteus sp. BLSE
2029 Secreție traheală P. mirabilis BLSE
1228 Urocultură E. coli BLSE
1162 Urocultură E. coli BLSE
289 Portaj anal E. coli BLSE
981 Secreție de plagă E. coli BLSE
302 Portaj anal E. coli BLSE
141 Sputa E. coli MDR
1070 Urocultură E. coli BLSE
1312 Urocultură E. coli BLSE
309 Portaj anal E. coli BLSE/AmpC
1247 Urocultură E. coli BLSE
137 Sputa E. coli BLSE
1104 Hemocultură venoasă E. coli BLSE/AmpC
1313 Urocultură E. coli BLSE
2021 Urocultură E. coli BLSE
444 Portaj anal E. coli BLSE

47
1992 Urocultură E. coli BLSE
1463 Secreție de plagă E. coli AmpC
454 Portaj anal E. coli BLSE
434 Portaj anal E. coli BLSE
489 Urocultură E. coli BLSE
1776 Urocultură E. coli BLSE
1851 Urocultură E. coli BLSE
2041 Urocultură E. coli BLSE
1552 Urocultură E. coli BLSE
2118 Urocultură E. coli MDR
2862 Urocultură E. coli BLSE
503 Portaj anal E.coli BLSE
226 Urocultură E. coli BLSE
555 Portaj anal E. coli BLSE
554 Portaj anal E. coli BLSE
2359 Urocultură E. coli BLSE
553 Portaj anal E.coli BLSE
555 Portaj anal E.coli BLSE
510 Portaj anal E. coli BLSE
2293 Urocultură E. coli AmpC
1640 Secreție de plagă E. coli BLSE
3086 Secreție de plagă E. coli AmpC
3023 Urocultură E. coli BLSE
554 Portaj anal E. coli BLSE
882 Secreție de plagă S. marcescens BLSE
1752 Secreție de plagă S.marcescens BLSE
135 Sputa S. marcescens BLSE
1405 Urocultură S. marcescens BLSE
2108 Secreție de plagă S.marcescens BLSE
1765 Secreție de plagă S.marcescens BLSE
1869 Secreție de plagă S.marcescens BLSE
1752 Secreție de plagă S.marcescens BLSE
856 Secrețic traheală E . cloacae BLSE
267 Portaj anal E . cloacae BLSE /AmpC
1406 Secreție de plagă E . cloacae BLSE
1097 Secreție de plagă E . cloacae BLSE / AmpC
1129 Secrețic traheală E. aerogenes BLSE
776 Secrețic traheală E. aerogenes BLSE / AmpC
3775 Exsudat faringian E. aerogenes BLSE
147 Sputa Citrobacter sp. BLSE / AmpC
1636 Secreție de plagă C. freundii BLSE
555 Portaj anal Enterobacter sp. BLSE
3879 Exsudat faringian E.cloacae BLSE
2951 Urocultură E.cloacae BLSE
1949 Hemocultură venoasă Pantoea spp. BLSE
1387 Lichid Salmonella spp. BLSE
960 Secrețic traheală Delfia spp. BLSE
2580 Urocultură M.morganii MDR
1962 Secrețic traheală E.cloacae BLSE
29119 Urocultură E.cloacae BLSE
3879 Exsudat faringian E.cloacae BLSE

48
Analizând sursele de izolare ale tuturor tulpinilor analizate, au predominat izolatele din
secreție traheală (27%), urocultură (24%), secreție de plagă (18%), portaj anal (15%),
hemocultură venoasă (6%), septicemie (3%) și, în proporție mai redusă, cateter , spută și
exsudat faringian (câte 2%), respectiv exsudat nazal (1%) (Fig.17).

Fig. 17 Distribuția surselor de izolare a tultpinilor bacteriene analizate
Conform tabelulului 2 și fig. 18, cea mai frecvent izolată specie bacteriană a fost K.
pneumoniae, aceasta fiind izolată din urocultură, secreții traheale și de plagă. Acest lucru se
datorează faptului că este agentul etiologic principal în infecțiile nosocomiale, dar și faptului
că tulpinile provin de la pacienți intubați cu risc crescut de infecții al e tractului respirator
inferior cu BGN, cele mai des întâlnite fiind K. pneumoniae , Ps. aeruginosa și A. baumannii.

Secreție traheală
27%
Secreție de
plagă
18%
Spută
2%Urocultură
24%Portaj anal
15%Hemocultură
6%Exsudat nazal
1%Exsudat faringian
2%Cateter
2%
Septicemie
3%Distribuția surselor de izolare a tulpinilor bacteriene
analizate
Ps. aeruginosa
19%
A. baumannii
20%
K. pneumoniae
37%E. coli
16%Proteus spp.
1%Citrobacter spp.
1%S. Marcescens
2%E. cloacae
3%E. aerogenes
1%

49
Fig. 18 Distribuția speciilor bacteriene izolat e

Obiectivul 2
3.2 Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice β -lactamice si non-β-lactamice
prin metode calitative/cantitative, evidențierea profilurilor de rezistență BLSE si MBL.
3.2.1 Materiale si metode
3.2.1.1 Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice la tulpini izolate din mediul
spitalicesc prin metoda disc-difuzimetrica.
Dupa izolare si identificare, tulpinile bacteriene, respectiv enterobacteriile și tulpinile
de Ps. aeruginosa si A. baumannii au fost testate in vederea determinării spectrului de
sensibilitate la antibiotice. Antibiograma s -a realizat prin metoda disc difuzimetrică metoda
difuzimetrică (Kirby -Bauer), care permite determinarea concomitentă a spectrului de
sensibilitate/rezistență a tulpinii testate și determinarea valorii C.M.I. (Concentra ție Minimă
Inhibitorie) , în vederea stabilirii do zelor terapeutice de antibiotice (Chifiriuc și colab., 2011).
Tulpinile au fost insamantate pe mediu de cultura geloză simplă in vederea obținerii de
colonii izolate, cu incubare timp de 16 -18 ore, la 370C. După incubare au fost selectate câteva
colonii iz olate, ce au fost suspendate în soluție de clorură de sodiu sterilă 0,9% pentru
pregătirea inoculului bacterian de 106 UFC/ml, a cărui turbiditate a fost ajustată nefelometric
cu etalon McFarland 0,5. Fiecare suspensie bacteriană astfel obținută a fost ino culată pe câte o
placă cu mediu de cultura Mueller -Hinton agar (BioMérieux) cu un tampon steril ce a fost în
prealabil îmbibat în inoculul bacterian. Plăcile cu mediu Mueller – Hinton după inoculare au
fost lăsate să se usuce înainte de aplicarea discurilo r cu antibiotice. La distanțe egale au fost
plasate discuri impregnate cu soluții de antibiotice de o anumită concentrație care să difuzeze
în mediu, realizând un gradient de concentrație invers proporțional cu diametrul zonei de
difuzie, deci cu distanța față de disc. Plăcile au fost incubate timp de 16 -18h la 35 ± 20C, cu
capacul în jos. Controlul de calitate a fost realizat prin testarea pe o altă placă, în aceleași
condiții, a tulpinii de referință adevate: Ps. aeruginosa ATCC 27853 si E.coli ATCC 25922 .
Citirea rezultatelor s -a realizat prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție generate de
diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. Interpretarea rezultatelor s -a realizat în
funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție, exprimând rezultat ul prin folosirea termenilor de

50
sensibil (S), rezistent (R) sau intermediar (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate
și corespunzătoare metodei de lucru (tabele interpretative CLSI, 2014).
 categoria S înseamnă că există probabilitate mare ca antibioticul să elimine infecția
determinată de tulpina testată (CMI are valori net inferioare celor ale concentrațiilor
umorale obișnuite în urma administrării unei doze obișnuite);
 categoria I semnifică probabilitatea ca antibioticul să fie eficient in v ivo prin
administrare locală sau prin realizarea în mod fiziologic a concentrațiilor mari în organe
sau țesuturi la nivelul cărora este localizat procesul infecțios;
 categoria R înseamnă că, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din
organ ism a microorganismului a cărui sensibilitate a fost testată sau rezultatul
tratamentului este imprevizibil. (Mihăescu și colab., 2007).
S-a ținut cont de faptul că apariția coloniilor bacteriene la marginea sau în interiorul
zonei de inhibiție se poate da tora mai multor factori: cultura luată în lucru a fost mixtă sau
suprainfectată; cultura a fost pură dar a prezentat heterorezistență; apariția mutantelor
heterorezistente; dezvoltarea tardivă a unor celule sensibile (Mihăescu și colab., 2007).
Pentru detectarea fenotipurilor BLSE la enterobacterii, s -a folosit urmatoarea schema
pentru dispunerea discurilor cu antibiotice in placa.

Figura 19. Schema pentru detectarea fenotipului de BLSE la Enterobacteriaceae.
Legendă: CRO/CTX = ceftriaxona; AMC = amoxacilina + acid clavulanic; CAZ =
ceftazidim; IMI/IMP = imipenem; TZP = piperacilina + tazobactam.
Pentru determinarea fenotipului de MBL la tulpinile de Ps.aeruginosa , antibioticele au
fost asazate pe placa, conform figurii 20. IMI/IMP CAZ TZP
CRO/CTX AMC

51

Fig. 20 Dispunerea pe placa Petri a antibioticelor utilizate la tulpini de Ps. aeruginosa
Legenda: CAZ – ceftraiaxona, TZP – piperacilin cu tazobactam; TTC – Ticarcilina cu acid
clavulanic; AK – amikacina; TOB – Tobramicina; LEV – Levofloxacina; MEM –Meropenem;
Cs – Colistin, ATM – Astreonam; NET – Netilmicina; FEP – cefepim. Tazobactam, acidul
clavulanic – inhibitori de β -lactamaze.
3.2.1.2 Testul HODGE modificat
Testul Hodge modificat este recomandat de standar dul CLSI ( Clinical Laboratory
Standards Institute) pentru identificarea tulpinilor producătoare de carbapenemaze. Pentru
confirmare se depune în centrul plăcii însămânțate cu tulpina de E.coli ATCC 25922 (diluție
1/10 din 0.5 Mc. Farland) un disc de carbap enem (imipenem sau meropenem) și se
însămânțează perpendicular pe disc, tulpinile de testat, posibil producătoare de fenotip MBL.
Dacă tulpinile produc aceste enzime in placă va apărea un aspect de „trifoi‟, datorat eliberării
enzimei în jurul striului îns ămânțat, determinând creșterea tulpinii sensibile în jurul celei
rezistente.

3.2.1.3 Metoda E -test (Epsilometer -test) a fost utilizată pentru determinarea valorilor CMI ale
unui antibiotic. Se utilizează benzi de plastic longitudinale (Biomerieux, Marcy l ‟Etoyle,
Franța), fiecare impregnată cu un anumit antibiotic ale cărui concentrații variază exponențial și
sunt înscrise pe banda respectivă. Tulpina microbiană se însămânțează în pânză pe mediu de CAZ TZP TTC
C
IMI AK TOB
LEV MEM CS
ATM
NET FEP

52
cultura Müeller -Hinton, apoi se aplică banda de plastic cu o pensă sterilă. Citirea rezultatului
se face la 18 -20 ore de incubare la 37°C. Valoarea CMI va fi citita în dreptul punctului de
intersectare a elipsei zonei de inhibiție cu banda E -test, în dreptul valorii concentrației de
antibiotic marcată pe bandă.
În prezentul studiu au fost utilizate benzi E -test ce conțin la o extremitate concentrații ale unui
antibiotic β-lactamic (cefotaxim/imipenem), iar la cealaltă extremitate același antibiotic la care
a fost adăugat un inhibitor al activității β -lactamazelor (acid clavulanic/EDTA). Astfel, benzile
E-test cu cefotaxim/cefotaxim+acid clavulanic au fost utilizate pentru confirmarea fenotipului
BLSE, iar benzile E -test cu imipenem/imipenem+EDTA au fost utilizate pentru confirmarea
producerii de MBL.

3.2.2 Rezultate si discuții
Realizarea antibiogramei pe tulpinile bacteriene aparținând fam. Enterobacteriaceae a
evidentiat faptul că tulpinile analizate prezintă atât rezistență naturală, cât și rezistență
dobândită. Toate cele 152 tulpini de enterobacterii pr ezintă rezistență naturală la amoxicilină
cu acid clavulanic. Cea mai izolată specie de enterobacterii a fost K. pneumoniae provenita din
secreție traheala și urocultura, aspect aflat în concordanță cu alte studii realizate în Romania,
inclusiv în cadrul L aboratorului de Microbiologie al Facultății de Biologie, deoarece se
consideră a fi principalul agent etiologic al infecțiilor nosocomiale, alături de tulpinile
apartinand speciei Ps. aeruginosa . Este de remarcat nivelul ridicat de rezistență al tulpinilor
analizate la penicilina, ceea ce demonstrează prezența unui fenotip de rezistență dobandită prin
supraexprimarea genelor pentru penicilinază, tulpinile prezentând rezistența inclusiv la
asociațiile cu inhibitori (acid clavulanic și tazobactam).
Dintre antibioticele non -beta-lactamice, tulpinile de enterobacterii au prezentat
rezistență la quinoloane, aminoglicozide și tetracicline.
Confirmarea fenotipică a mecanismelor de rezistență enzimatică prin sinteza de BLSE
și a carbapenemazelor s -a realizat prin testul disc -difuzimetric folosind următoarele
antibiotice: ampicilină, amoxicilină -acid clavulanic, cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxonă,
cefepim, imipenem și aztreonam (fig.21) și prin teste cantitative: testl Hodge și E-test (fig. 22).

53

Fig. 21 Fenotip d e BLSE evidențiat la o tulpină de K. pneumoniae

Fig. 22 Confirmarea fenotipului BLSE prin E -test K. pneumoniae
Testul Hodge (fig. 23) a fost folosit pentru punerea în evidență a fenotipului MBL,
deoarece în urma citirii antibiogramei s -au detectat tulpini rezistente la carbapeneme.

54

Fig. 23 Confirmarea fenotipului MBL la tulpina K. pneumoniae prin testul Hodge
Realizarea antibiogramei pentru tulpinile bacteriene aparținând fam.
Enterobacteriaceae și a BGNNF a relevat faptul că tulpinile analizate prezintă atât rezistență
naturală, cât și rezistență dobândită.
În figurile 24, 25 se poate observa reprezentarea sc hematică a spectrului de
sensibilitate la antibiotice la tulpinile de K. pneumoniae , respectiv tulpinile de E. coli , astfel
incât se poate observa faptul că toate tulpinile sunt rezistente la antibiotice β – lactamice. De
asemenea se poate observa faptul că tulpinile producatoare de BLSE sunt adesea asociate cu
rezistența la aminoglicozide și quinolone.

55

Fig. 24 Reprezentarea schematică a spectrului de sensibilitate la antibiotice β -lactamice al tulpinilor de
K. pneumoniae analizate
Legenda: Tic – ticarcilin, , Tic/Clav – ticarcilina cu acid cavulanic, Tzp – piperacilină cu
tazobactam, Amox/Tzp – amoxaxilină cu acid clavulanic, Fox – Fosfomicina, Caz –
Ceftazidim, Atm – Aztreonam, IMP –imipenem, MEM – meropenem, CN – gentamicina, Cyp
– cirpofloxacin a, Tob – Tobramicina, Myn – Minociclin, Rif – Rifanpicin, Sxt –
trimetoprimsulfametoxazol, Cs – colistin.

Fig. 25 Reprezentarea schematică a spectrului de sensibilitate la antibiotice β -lactamice al tulpinilor de E.coli
analizate 0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Fenotipul de rezistenta la antibiotice al tulpinilor de K.
pneumoniae
R
S
051015202530354045Fenotipul de rezistenta al tulpinilor de E. coli
R
S

56
Legenda: Tic – ticarci lin, , Tic/Clav – ticarcilina cu acid cavulanic, Tzp – piperacilină cu
tazobactam, Amox/Tzp – amoxaxilină cu acid clavulanic, Fox – Fosfomicina, Caz –
Ceftazidim, Atm – Aztreonam, IMP –imipenem, MEM – meropenem, CN – gentamicina, Cyp
– cirpofloxacina, Tob – Tobramicina, Myn – Minociclin, Rif – Rifanpicin, Sxt –
trimetoprimsulfametoxazol, Cs – colistin.
Spectrul de sensibilitate la antibiotice β -lactamice al tulpinilor de E.coli analizate a
relevat faptul că din totalul de 39 de tulpini analizate, un procen t de 5% au fost rezistente la
carbapeneme. Nu a fost raportată nicio tulpină rezistentă la colistin.
Studii similare au evidențiat faptul că 38% din tulpinile de K. pneumoniae analizate
sunt rezistente de carbapeneme (imipenem, meropenem) și la monobactami (aztreonam). De
asemenea, s -a constat faptul că 23% sunt rezistente la colistin. Studii mai mari de
supraveghere au fost efectuate la un nivel limitat, dar un studiu recent p ublicat cuprinde
izolate de la 31 centre medicale din 13 țări europene in 2011 -2012 plus Turcia și Israel au
demonstrat niveluri mari de rezistență la Klebsiella penumoniae , în timp ce rezistența în Ps.
aeruginosa și E. coli ambele au fost scăzute. Rezist ența acestui raport constă în faptul că toate
tulpinile au fost testate în laboratorul central cu metodologie standard de referință pentru teste
de susceptibilitate. În raportul EARS -Net din 2013, doar 26,4% din toate izolatele cu K.
pneumoniae au avut o s ensibilitate antimicrobiană pentru polimixine (ECDC 2014, Giske
2015). Nu în toate țările au existat date raportate, iar pentru unele țări, izolatele au fost puține
disponibile. În general, 8,8% din izolatele de K. pneumoniae au fost rezistente la polimix ine,
majoritatea acestora fiind izolate în Grecia, Italia, România și Ungaria. Îngrijorător este faptul
că din totalul izolatelor, 32% rezistente la carbapeneme au fost rezistente și la polimixine.
Pentru Acinetobacter spp., au raportat 17 țări rezistența la polimixine conform raportului
EARS -Net 2013. Dintre cele 2217 de tulpini izolate (52% din izolatele raportate), 5% din
tulpinile analizate au prezentat rezistență la polimixine. Mai mult de 80% din tulpinile izolate
analizate au fost raportate în Grec ia și Italia (Giske, 2015).
În urma citirii antibiogramei realizată pe tulpinile de Ps. aeruginosa și A. baumannii s-
a constatat faptul că toate tulpinile analizate prezintă fenotip de MDR ( Multi drug rezistance =
multirezistență) (fig. 26, fig. 27, 28, și fig. 29). Termenul de MDR reprezintă rezistența
concomitentă a unei tulpini la cel puțin un agent antimicrobian din trei sau mai multe clase de
antibiotice, excluzând rezistența intrinsecă a fiecărei specii (Magiorakos și colab., 2012).

57
Rezistența extin să (XDR = Extended drug rezistance ) reprezintă rezistența unei tulpini
microbiene la cel puțin un agent antimicrobian din mai multe clase de antibiotice, cu
conservarea sensibilității la una sau maxim două clase de antibiotice (Magiorakos și colab.,
2012). Tulpinile panrezistente reprezintă tulpinile rezistente la toate substanțele
antimicrobiene pentru care se face testarea în mod current ( Prashanth și Badrinath, 2006).

Fig. 26 Confirmarea fenotipului de MBL la Ps. aeruginosa prin E-test

Fig. 27 Fenotipuri de multirezisten ță la Ps. aeruginosa

58

Fig. 28 Fenotipuri de multirezistență la Ps. aeruginosa

Fig. 29 Confirmarea fenotipurilor MBL la tulpini de Ps. aeruginosa și A. baumannii prin Testul Hodge

59
În urma citirii antibiogramei , dintr -un număr total de 51 de tulpini izolate din bolile
cardiovasculare ale pacienților spitalizați, 37,25% dintre izolate au fost multirezistenți (MDR).
Tulpinile Ps.aeruginosa izolate din bolile cardiovasculare au fost rezistente în
proporții mari l a ticarcilină, cefalosporine de a treia și a patra generație și la ciprofloxacină.
21,56% din tulpini au demonstrat rezistență la imipenem și meropenem (fig.30) și 11,76% din
tulpinile izolate au demonstrat rezistență la colistin, un antibiotic "în ultimă instanță" în
România pentru tratament parental. Un studiu recent din România (Mihai și colab., 2014) a
identificat 4 tulpini de Ps. aeruginosa care prezintă rezistență comparabilă la antibiotice, o
tulpină fiind sensibilă numai la colistin.
Fenotipul săl batic de rezistență la Ps. aeruginosa este legat de producerea unei
cefalosporinaze inductibile de către aminopeniciline și cefalosporinele din prima și a doua
generație, cuplată cu o impermeabilitate și de un sistem de eflux inductibil (Jehl și colab.,
2010). Prezintă rezistență naturală și la asocierea aminopenicilinelor cu inhibitorii de β –
lactamaze. Sunt natural sensibile la carboxipeniciline (carbenicilina, ticarcilina), la
ureidopeniciline (azolcilina, piperacilina), la anumite cefalosporine din gener ația a treia
(ceftazidim, cefsulodină,cefoperazonă), la toate cefalosporinele de generația a patra, la
monobactame și la carbapeneme (imipenem și meropenem) (Jehl și colab., 2010).

Fig. 30 Reprezentarea schematică a spectrului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de Ps. aeruginosa analizate
Mereuță și colab., în 2013 au analizat mecanismele de rezistență la carbapeneme la 106
tulpini de Ps. aeruginosa și A. baumannii rezistente la carbapeneme, izolate de la cinci spitale
din Iași în perioada 2008 -2012. Din totalul de 90 de tulpini de P. aeruginosa rezistente la
ticarcilinpiperacilin
piperacilin+tazobactam3rd cephalosporins 4rd cephalosporinsmeropenemimipenem ertapenemciprofloxacinnorfloxacin gentamicinstreptomicinamikacintobramicincolistin05101520253035404550

60
carbapeneme, 47 de tulpini au fost pozitive la screening -ul prin E-Test pentru producerea de
MBL.
Fenotipurile de MDR obținute la A. baumannii se pot observa în figura 31. Ca și în
cazul tupinilor de K. pneumoniae și Ps. aeruginosa pentru confirmarea fenotipului de MBL s –
a realizat E-test (fig. 32).

Fig. 31 Fenotipuri de multirezistență la tulpini de A. baumannii

Fig. 32 Confirmarea fenotipului de MBL la tulpinile de A. baumannii analizate
În urma citirii antibiogramei la tulpinile de A. baumannii , toate tulpinile (n=49) au fost
rezistente la antibiotice β -lactamice, prezentând atât fenotip de mult irezistență (n=47) si de
panrezistență (n=2), conform figurii 33.

61

Fig. 33 Reprezentarea schematică a spectrului de sensibilitate la antibiotice la tulpini de A. baumannii
analizate
Date similare au fost obținute intr -un studiu efectuat în vestul României, pe 13 tulpini
de A. baumannii izolate în spitale din Timișoara, Arad și Reșița (Bonin și colab., 2011). De
asemeanea, un alt sudiu al lui Cernat și colab., în 2007 a raportat o prev alență crescută a
tulpinilor rezistente la imipenem (n=120) la tulpini de A. baumannii izolate la Institutul de
Cardiologie din Bucuresti în perioada 2003 -2006.

Obiectivul 3

3.3 Evidențierea genelor de rezisten ță la antibiotice beta -lactamice si non-betalactamice
prin metoda PCR, electroforeza produșilor de amplificare si determinarea variantei genice
pentru gena bla CTX -Mlike.
3.3.1 Materiale si metode:
3.3.1.1 Obținerea ADN bacterian prin metoda lizei termice
Obținerea ADN bacterian pe ntru screening -ul genelor de rezistență s -a realizat prin
metoda lizei bacteriene datorată șocului termic. Pentru aceasta tulpinile bacteriene au fost
însămânțate pe mediu de cultura Geloză simpla și incubate la 37șC, 24 ore. A urmat
selectarea a 2 -3 colonii care au fo st inoculate in BHI (Bulion Heart Infusion) cu agitare 0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%
S
R

62
10000 r.p.m (rotații pe minut). În etapa următoare s -a realizat centrifugarea a 1,5 ml din
cultura bacteriană obținută în mediu lichid timp de 15 min. la 10000 r.p.m., s -a îndepărtat
supernatantul, eta pă urmată de adăugarea a 1 ml apă distilată peste sedimentul celular, după
care probele au fost încălzite la 100șC timp de 10 min. și răcite brusc la -20șC. Verificarea
produsului obținut s -a realizat prin electroforeză în gel de agaroză 1% și colorare cu bromură
de etidiu 3,5μg/ml.

3.3.1.2 Evidentierea markerilor moleculari prin reactia PCR
Reacția PCR ( Polymerase Chain Reaction = Reacția de polimerizare în lanț) este o
metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN. Din punct de
vedere chimic, reacția PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro ,
folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele două catene ale matriței. Diferența
esențială între o asemenea reacție de replicare și un proces de re plicare ADN in vivo , este
reprezentată de faptul că în reacția PCR etapa de desfacere a dublului helix matriță și
respectiv, cea de atașare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic ci prin parcurgerea unor
trepte de temperatură, iar singura enzimă folosit ă în reacție este o ADN polimeraza
dependentă de ADN (Vassu și colab., 2001).
În urma observării fenotipurilor bacteriene obținute cu ajutorul testelor anterioare, s -a
realizat verificarea existenței câtorva gene frecvent asociate cu producerea de β-lactamaze :
bla TEM, bla CTX-M, bla OXA -48 și bla NDM pentru detectarea fenotipurilor BLSE. Pentru detectarea
fenotipurilor de MBL asociate tulpinilor de enterobacterii si Ps. aeruginosa au fost testate
genele bla IMP și bla VIM. Pentru tulpinile de A. baumannii s-a urmarit verificarea existenței
genelor bla OXA -23 și bla OXA -24.
Pentru amplificarea genelor de rezistenșă la β-lactamaze și carbapenemaze , au fost
folosiți primeri descriși în literatură, conform tabelului 4. Componentele reacției de
amplifica re sunt prezentate în tabelul 5.
Tabelul 4. Primerii folosiți în realizarea PCR – ului
Gena Primeri Secvența primerilor Nr. bp Referința
bla OXA -23 OXA -23-F
OXA -23-R 5'-ATGAGTTATCTATTTTTGTC -3'
5'-TGTCAAGCTCTTAAATAATA -3' 501 Woodford și colab.,
(2006)
bla IMP IMP-F
IMP-R 5´GGAATAGAGTGGCTTAA(C/T)TCT C 3´
5´GGTTTAA(C/T)AAAACAACCACC 3´ 232 Poirel și colab.,
(2011)
bla NDM NDM -F
NDM -R 5´GGTTTGGCGATCTGGTTTTC 3´
5´CGGAATGGCTCATCACGATC 3´ 621

63
bla TEM TEM -F
TEM -R 5'-ATGAGTTTTCAACATTTTCG -3'
5'-TTACCAATGCTTAATCAG TG -3' 861 Eftekar și colab.,
2005
bla CTX-M CTX-M-F
CTX-M-R 5‟-CGCTGTTGTTAGGAAGTGTG -3‟
5‟-GGCTGGGTGAAGTAAGTGAC -3‟ 730 Israil și colab., 2013
GyrB
GyrB -F
GyrB -R 5‟-GCGCGAGATGACCCGCCGCA -3‟
5‟-CTGGCGGAAGAAGAAGGTCAACA -3‟
Angello și colab.,
2012 ParE
ParE -F
ParE -R 5‟-CGGCGTTCGTCTCGGGCGTGGTGAAGGA -3‟
3‟-TCGAGGGCGTAGTAGATGTCCTTGCCGA -3‟

Tabelul 5. Componentele reacției de amplificare

Gena Concentrația

Volum final Primeri Mix PCR
(Green PCR Master Mix) PCR Water lizat celular
bla TEM

0,6µl

10µl

7,8µl

1µl

20µl bla CTX-M
bla IMP
bla NDM
bla VIM
GyrB
PER
bla OXA -23
bla OXA -24

Programul de amplificare s -a realizat conform următoarelor condiții:
94°C 10 min
94°C 30s
52°C 40s 36 cicluri
72°C 50s
72°C 5 min.

3.3.1.3 Rezultate și discuții
3.3.1.3.1 Evidențierea genelor de rezistenta la antibiotice beta -lactamice si non-
betalactamice prin metoda PCR și electroforeza produșilor de amplificareâ
Epidemiologia enterobacteriilor producatoare de carbapenemaze în Europa variază
între țările nordice și sudice. Un studiu european privind enterobacteriaceele producătoare de
carbapenemază (EuSCAPE) în rândul experților naționali din 39 de țări europene în 2013, a
arătat că acestea continuă să se răspândească în Europa, cu izolate de K. pneumoniae
producătoare de carbapenemaze (KPC) și numărul de izolate producătoare de OXA -48
continuă să crească (Glasner și colab., 2013). În contrast, izolatele producătoare de NDM -1
sunt raportate sporadic, în principal din Marea Britanie. Același raport a constat at, de
asemenea, că 30 dintre cele 39 de țări europene au avut un sistem dedicat de supraveghere
pentru enterobacteriaceele producătoare de carbapenemaze, iar 22 dintre țări au avut

64
recomandări naționale sau orientări specifice pentru controlul infecțiilor (Glasner și colab.,
2013); cu toate acestea, România nu dispune de un astfel de sistem de supraveghere sau de
orientări privind controlul infecțiilor cu enterobacteriaceele producătoare de carbapenemaze.
Pentru a înțelege mai bine mecanismele implicate în producerea de ß-lactamaze , respectiv
carbapenemaze s -au realizat PCR -uri. Pentru evidentierea suportului genetic al fenotiului de
tip BLSE au fost testate genele bla CTX-M, bla TEM și bla OXA -48, în timp ce pentru evidențierea
detectarea suportului genetic responsabil de rezistenta la quinolone a fost necesera testarea
genelor parE, gyrB și qnrS fenotipului de MBL s -a stabilit testarea genelor producatoare de
carbapenemaza bla IMP și bla VIM și bla NDM.
ß-lactamaze au fost studiate din mai multe aspecte, inclu siv clasificarea, profilurile
hidrolitice și proprietățile cinetice, plasticitatea, frecvența și diseminarea. Mai mult, ele au fost
folosite ca un exemplu de evoluție accelerată după paradigma darwiniană, unde presiunea
selectivă puternică a antibioticelor favorizează supraviețuirea celui mai adaptat. Conform unei
analize recente realizată de Davies și Davies în 2010, o creștere dramatică a numărului de
beta-lactamaze a fost descrisă în anii 1980 ai secolului trecut, dar această creștere se datorează
aproap e exclusiv beta -lactamazelor de clasă A și D (Bush și Jacoby, 2010). Beta -lactamazele
aparținând clasei A sunt capabile să hidrolizeze cefalosporine (cum ar fi cefotaximă,
ceftriaxonă, ceftazidimă sau cefepimă) și monobactami (aztreonam), ceea ce reprezint ă o
preocupare de sănătate publică (Coque și colab., 2008, Pitout și Laupland, 2008). BLSE din
clasa A includ în principal enzimele TEM, SHV, CTX -M, VEB și GES. Printre acestea, cel
mai mare număr de variante descrise în ultimii ani corespunde familiei CTX -M (123 variante
până în 2011, ultima aderare din 5 decembrie 2011) 1. Această diseminare explozivă a CTX –
M în întreaga lume a fost menționată ca "pandemia CTX -M" datorită descrierii sale tot mai
mari în întreaga lume (Cantón și Coque, 2006). Deși au fost publicate diferite actualizări
despre beta -lactamazele CTX -M (Bonnet, 2004, Livermore și colab., 2007, Rossolini și colab.,
2008, Hawkey și Jones, 2009, Naseer și Sundsfjord, 2011) clonalitatea izotopilor producătoare
de CTX -M, epidemiologia moleculară, pl asticitatea proteinelor, evoluția și originea genelor
bla CTX-M, influența utilizării antibioticelor și factorii de risc ai pacienților, justifică această
revizuire nouă.
În prezentul studiu s -a urmărit detectarea ß-lactama zelor implicate creșterea
rezistenței la antibiotice în mediul spitalicesc.

65

Fig. 34 Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla CTX-M pe tulpinile de K. pneumoniae
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1- K. pneumoniae 776, 2 – K. pneumoniae 1230, 3 -K. pneumoniae 1095, 4 – K. pneumoniae 285, 5 – K.
pneumoniae 992, 6 – K. pneumoniae 974, 7 – K. pneumoniae 1216, 8 – K. pneumoniae 1898, 9 – K. pneumoniae 929,
10 – K. pneumoniae 147, 11 – K. pneumoniae 265, 12 – K. pneumoniae 1250, 13 – K. pneumoniae 869, 14 – K.
pneumoniae 756, 15 – K. pneumoniae 1616, 16 – K. pneumoniae 869, 17 – K. pneumoniae 824 , 18 – K.
pneumoniae 1072, 19 – K. pneumoniae 840, 20 – K. oxytoca 1106, 21 – K. pneumoniae914, 22 – K. pneumoniae
1097, 23 – K. pneumoniae 311, 24 – K. pneumoniae1018 și 25 – K. pneumoniae 893

Fig. 35 Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla CTX-M pe tulpinile de enterobacterii.
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate mo leculară 100 pb, Promega
UK, 58 – S. marcescens 1405, 59 – Proteus sp. 991, 60 – E. coli 302, 61 -Citrobacter sp. 147, 62 – E. coli 1102,
63- E. aerogenes 776, 65 – K. pneumoniae 1836, 66 – E. coli 1165, 67 – S. marcescens 882, 68 – E.coli 1247, 69
– E. co li 1228, 70 Delfia sp 960, 71 – E. coli 13 13, 72 – E. coli 289, 73 – E.coli 137, 74 –E. cloacae 267, 75 – E.
coli 141, 76 – E. coli 981, 77 – E. coli 1209, 78 – E. coli 1312, 79 – E.coli 1070 și 80 – E.coli 309.
În figurile 34 și 35 se poate observa ampl iconul cu greutatea moleculară 754bp, genă
care a fost detectată pentru 57 de tulpini de enterobacterii din cele 152 analizate, ceea ce
reprezintă un procent de 37,5% de tulpini positive pentru gena bla CTX-Mlike.
Faptul gena bla CTX-Mlike a fost detectată la mai mult de jumătate de tulpini de
Enterobacteriaceae în România, vine în confirmarea studiilor efectuate in ultimii în ultimii 10
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
CTX-M-
754bp
L 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 –
CTX-M-
754bp

66
ani au arătat că, spre deosebire de unele excepții, enzimele CTX -M au depășit prezența altor
BLSE la Enterobacteriaceae , incluzând variantele TEM și SHV (Cantón, 2008, Coque și
colab., 2008, Angel Díaz și colab., 2009, Hawkey și Jones, 2009, Bush, 2010, Rodriguez –
Villalobos și colab., 2011). Acest lucru a apărut nu doar ca o consecință a diseminării
extraord inare a genelor bla CTX-M corespunzătoare în platforme genetice foarte mobile, inclusiv
plasmide și transpozoni, dar și din cauza acestor platforme în clonele de succes (Cantón și
Coque, 2006; Woodford și colab., 2011). Un alt motiv pentru această creștere este fenomenul
de co -rezistență în organismele producătoare de CTX -M, în special la aminoglicozide și
fluorochinolone, care ar putea facilita procesele de co -selecție (Morosini și colab., 2006,
Cantón și Ruiz -Garbajosa, 2011).
Prima recunoaștere a apari ției beta -lactamazelor CTX -M s -a produs aproape
simultan în Europa și America de Sud la începutul anului 1989 (Bauernfeind și colab, 1990,
1992). Prima publicație care a recunoscut o BLSE din grupul CTX -M a fost că raportarea unei
tulpini de E. coli reistentă la cefotaxim, dar sensibilă la de ceftadizim, izolat din urechea unui
copil de 4 luni care suferă de otită medie în München (Germania; Bauernfeind și colab., 1990).
Enzima responsabilă pentru acest fenotip specific BLSE , dar care nu afectează ceftaz idimul a
fost numită CTX -M-1 cu referire la activitatea hidrolitică preferențială față de cefotaximă
(CTX ca acronim, -M din München). Această enzimă a inaugurat un grup de enzime care în
anii 1990 au fost de asemenea grupate ca cefotaximaze datorită profi lului fenotipic și hidrolitic
al acestora (Bonnet, 2004). În America de Sud, primele izolate cu "model de cefotaximază" au
fost detectate la Salmonella typhimurium izolate de la pacienții spitalizați care suferă de
meningită, septicemie sau enterită (Bauer nfeind și colab., 1992). Enzima responsabilă pentru
acest fenotip a avut un punct izoelectric diferit (pI 7,9) decât cel (pI 8,9) descris în Germania
și a fost numit CTX -M-2. Secvența ulterioară a genei bla CTX-M-2 în 1996 a confirmat o
secvență de aminoacizi diferită a acestor două enzime, dar o omologie de 84% (Bauernfeind și
colab, 1996). Aceste beta -lactamaze CTX -M-1 și CTX -M-2 au fost primele enzime CTX -M
raportate, fiind precedate de izolarea în 1986 a unui iz olat E. coli rezistent la cefotaximă
recuperat din microbiota fecală a unui câine de laborator care a fost utilizat pentru studiile
farmacocinetice ale antibioticelor β -lactamice în Japonia (Matsumoto și colab., 1988). Enzima
responsabilă pentru acest feno tip a fost numită FEC -1 (Fecal E. coli), care ulterior a fost
recunoscută ca fiind legată de enzima CTX -M-3 găsită inițial în Polonia (Bonnet, 2004). Mai

67
mult, și la începutul anului 1989, dar în Franța, o tulpină de E. coli cu un fenotip identic a fost
izolat de la un pacient italian (Barthélémy et al., 1992; Bernard și colab., 1992). Beta –
lactamaza, denumită MEN -1 (denumită după pacientul în care a fost izolată), a fost prima
secvență disponibilă a unei beta -lactamaze CTX -M (Barthélémy și colab., 1992). În 1996,
secvențierea ambelor enzime CTX -M, CTX -M-1 și CTX -M-2, a arătat că MEN -1 este identic
cu CTX -M-1 (Bauernfeind și colab., 1992).
Toate aceste descrieri mai timpurii ale enzimelor CTX -M au arătat zonele
predispuse pentru apariția lor (Europa Cent rală, America de Sud și Japonia), care ar putea
reflecta nu numai forțele motrice selective specifice, cum ar fi consumul de antibiotice, ci și
specificitatea geografică pentru diferite enzime care ar putea fi legate de prezența lor în clone
specifice sau abundența organismului de la care derivă. Din nefericire, nu s -a efectuat
clonabilitatea izolatoarelor producătoare de CTX -M ancestrale, precum și caracterizarea
plasmidelor. Aceste studii ar fi fost relevante pentru urmărirea apariției și diseminării prim elor
BLSE de tip CTX -M. Mai mult decât atât, au fost absente sondaje epidemiologice care includ
caracterizarea moleculară la sfârșitul anilor 1980 din alte zone geografice, cum ar fi Asia de
Sud-Est, care este relevantă în prezent pentru beta -lactamazele e mergente, inclusiv
carbapenemazele. Acestea ar fi fost, de asemenea, importante pentru o mai bună înțelegere a
diseminării actuale a CTX -M importante din punct de vedere epidemiologic descrise în 1994,
cum ar fi CTX -M-3, CTX -M-9, CTX -M-14 și CTX -15.

68

Fig. 36 Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla TEMlike pe tulpinile de enterobacterii.
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 58 – S. marcescens 1405, 59 – Proteus sp. 991, 60 – E. coli 302, 61 -Citrobacter sp. 147, 62 – E. coli 1102,
63- E. aerogenes 776, 65 – K. pneumoniae 1836, 66 – E. coli 1165, 67 – S. marcescens 882, 68 – E.coli 1247, 69
– E. coli 1228, 70 Delfia sp 960, 71 – E. coli 13 13, 72 – E. coli 289, 73 – E.coli 137, 74 –E. cloacae 267, 75 – E.
coli 141, 76 – E. coli 981, 77 – E. coli 1209,78 – E. coli 1312, 79 – E.coli 1070 și 80 – E.coli 309.
În figura 36 se poate observa ampliconul cu greutatea moleculară 1080bp, genă care a
fost detectată pentru 21 de tulpini de enterobacterii din cele 152 analizate, reprezantând un
procent de 13,81% din totalul enterobacteriilor analizate.
Prima β -lactamază de tip TEM ( Temoneira, numele pacientei de la care a fost izolată
prima tulpinină rezistentă la peniciline și cefalosporine de primă generație) a fost descrisă în
1966 (Datta și colab., 1996).
În prezent se cunosc 196 variante ale genei blaTEMlike , clasificate în patru grupe după
caracteristicile biochimice (Poirel și colab., 2012).
Studii similare realizate în Europa, au demostrat că rezistența la a treia generație de
cefalosporine este adesea mediată de beta -lactamaze de tip TEM și SHV la
Enterobacteriaceae . Enzimele tip TEM și OXA -1 sunt beta -lactamazele majore din plasmida
implicată în rezistența la amoxicilină cu acid clavulanic în izolatele de E. coli (Colom și
colab., 20013).
De asemenea, în urma unui studiu efectuat în Spania, analiza P CR multiplex a 51 de
izolate E. coli rezistentă la amoxicilină -clavulanat a detectat genele bla TEM și bla SHV în 45 și
respectiv două tulpini și numai o singură tulpină a găzduit o genă bla OXA -1. Douăzeci și trei din
cele 40 de tulpini izolate aparținînd fa miliei Enterobacteriaceae rezistente la cefotaximă au
TEM – 1080bp

L 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

69
produs ampliconi cu dimensiunea compatibilă cu prezența genelor bla TEM (13 tulpini), bla SHV
(șase tulpini) sau asocierea ambelor gene (patru tulpini) (Colom și colab., 2013).
Carbapenemazele de tip NDM sunt de mare preocupare în întreaga lume (Nordaman și
colab., 2011, Cuzon și colab., 2013). Acestea sunt metalo -β-lactamaze care au un profil de
substrat foarte larg, incluzând carbapeneme, dar care păstrează monobactamii. Genele bla NDM
au fost identifi cate mai ales în Enterobacteriaceae ., (Nordman și colab 2011, Cuzon și colab.,
2011), dar și în Acinetobacter sp. (Kaase și colab., 2011, Cuzon și colab., 2013), Pseudomonas
sp. (Jovcic și colab., 2011,Cuzon și colab.,2013) și Vibrio sp. (Wlash și cola., 2011, Cuzon și
colab., 2013). Deși carbapenemazele de tip NDM au fost descrise în întreaga lume, acestea
sunt în principal identificate la pacienții care au avut o relație cu statul indian (Nordman și
colab., 2011, Cuzon și colab., 20 13) și, în unele cazuri, cu statele balcanice (Livermore și
colab., Cuzon și colab. , 2013) și Orientul Mijlociu (P oirel și colab., 2011, Cuzon și colab.,
2013). Au fost descrise cinci variante NDM, care diferă prin câteva modificări ale
aminoacizilor. O p rimă variantă, NDM -2, a fost descrisă într -un izolat clinic A. baumannii din
Germania de la un pacient nativ din Egipt (Kaase și colab., 2011, Cuzon și colab., 2013).
NDM -4, NDM -5 și NDM -6 au fost descrise din izolate de E. coli de la pacienți cu istoric de
spitalizare în India (Nordman și colab., 2012, Hornsey și colab., 2011, Williamson și colab.,
2012, Cuzon și colab., 2013). Carbapenemaza NDM -1 (New Delhi Metallo -β-lactamase) a
fost izolată pentru prim dată în 2008 de la o tulpină de K. pneumoniae în Suedia, de la un
pacient din India (Yong și colab., 2009).

Fig. 37 Electroforeza produșilor de amplificare pentru genele bla OXA -48 și bla NDM pe tulpinile de enterobacterii.
1- K. pneumoniae 1230, 2 – K. pneumoniae 776, 3 -K. pneumoniae 1095, 4 – K. pneumoniae 285, 5 – K.
pneumoniae 992, 6 – K. pneumoniae 974, 7 – K. pneumoniae 1216, 8 – K. pneumoniae 1898, 9 – K. pneumoniae 929,
NDM -621 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 L

70
10 – K. pneumoniae 147, 11 – K. pneumon iae 265, 12 – K. pneumoniae 1250, 13 – K. pneumoniae 869, 14 – K.
pneumoniae 756, 15 – K. pneumoniae 1616, 16 – K. pneumoniae 869, 17 – K. pneumoniae 824, 18 – K.
pneumoniae 1072, 19 – K. pneumoniae 840, 20 – K. oxytoca 1106, 21 – K. pneumonia 914, 22 – K. pneumoniae
1097, 23 – K. pneumoniae 311, 24 – K. pneumoniae1018 și 25 – K. pneumoniae 893, L-Marker de greutate
moleculară 100 pb, Promega UK
În figura 37 se poate observa ampliconul cu greutatea moleculară 621bp, genă care a
fost detectată pentru 1 de tul pină de enterobacterii din cele 152 analizate, fiind regăsită la
tulpina K. pneumoniae 1230.
În România, prima izolare și caracterizare a mai multor tulpini de
Enterobacteriaceae care conțin genele bla NDM -1, bla OXA -48 a fost în 2013. Studiul a fost realizat
între ianuarie 2010 și septembrie 2012, timp în care s -au identificat nouă tulpini de
Enterobacteriaceae producătoare de carbapenemază. Gena bla NDM -1 a fost prezentă în două
tulpini, respectiv E. cloacae , E. coli și două tulpini de K. pneumoniae . Una din aceste tulpini
de K. pneumoniae a inclus, de asemenea, gena bla OXA -181. Trei alte tulpini de K. pneumoniae și
una de S. marcescens au purtat bla OXA -48 (Szekely și colab., 2013).
În urma realizării PCR pentru tulpinile de enterobacterii au fost determinate mai multe
profiluri genice (fig. 38) care indică asocierea antibioticelor β -lactamice cu quinolone și
aminoglicozide, fapt ce demonstrează fenotipurile de multirezistență.

.

Fig. 38 Profiluri genice întâlnite la enterobcterii 024681012

71
Aasocierea antibioticelor β -lactamice cu quinolone și aminoglicozide a devenit o
problemă în mediul spitalicesc în tratarea bolilor cardio -vasculare, astfel încât tratamentul de
ultimă instanță îl reprezintă polimixinele, respective colist inul.
Rezistența la carbapeneme la Ps. aeruginosa provoacă infecții grave, cum ar fi
pneumonia nosocomială, care, pe baza rapoartelor, crește în cazul pacienților spitalizați
(Franco și colab, 2010). Rezistența la carbapeneme este adesea asociată cu produ cerea de
metallo -β-lactamaze (Franco și colab., 2010). Infecțiile nosocomiale cauzate de Ps.
aeruginosa rămân cauza majoră a mortalității, în special datorită apariției tulpinilor
multirezistente la medicamente multirezistente. Tipurile VIM, IMP și SPM sun t cele mai
semnificative din punct de vedere clinic carbapenemaze care sunt codificate de gene blaIMP ,
blaVIM și blaSPM (Liakopoulos și colab., 2013) . Cel puțin 14 VIM -uri diferite și 23 de MBL –
uri IMP diferite au fost identificate până acum. De asemenea, MBL -urile sunt împărțite în mai
multe familii după cum urmează: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, DIM, AIM, KHM, NDM și
KPC. Majoritatea acestora, dacă nu toate, genele care codifică tipurile IMP, VIM și SPM,
precum și GIM se găsesc în casete genetice în integrrone le de clasa 1, deși genele IMP se
găsesc și pe integrronii de clasa 3 ( Liakopoulos și colab., 2013, Rizek și colab., 2014).
În acest context , pentru analiza genotipică a profilurilor de rezistenta la antibiotice la
Ps. aeruginosa s-a realizat PCR pentru genele bla CTX-M, bla TEM pentru evidentierea rezistentei
la cefalosporine și bla IMP și bla VIM pentru evidentierea rezistentei la carbapeneme. Pentru
studierea substratului genotipic al rezistentei la aminoglicozide s -a realizat PCR -uri pentru
genele QnrA, QnrS, GyrB și ParE. Pentru determinarea substratului genetic al factorilor de
virulență și a pompelor de efflux pentru genele plcH, ExoT, AlgD, TCF/TCR, ExoS si gena
ExoU.
Analizând profilele de virulență, analiza molec ulară prin intermediul rețelelor PCR a
arătat că 54,9% din tulpinile analizate au relevat genele plcH și plcN (fig. 39 și 44), 50,9%
genele AlgD (fig. 40 și 44) și ExoT (fig. 42 și 44), 39,21% dintre izolate au exprimat proteaza
IV (TCF / TCR) (fig. 43 și 44), 17,64% a tulpinilor a prezentat gena ExoS și doar 1,9% din
gena ExoU exprimată de Ps. aeruginosa .

72

Fig. 39 Electroforeza genelor plcN și plcH la Ps. aeuruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aerugi nosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginosa 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805, 13 – Ps. aeruginosa 790, 14 –
Ps. aeruginosa 773, 1 5 – Ps. aeruginosa 774
Cele două fosfolipaze ar putea funcționa sinergic, plcH ar promova degradarea
membranei eritrocitare (componentele fosfolipidelor din prospectul exterior: fosfatidilcolina și
sfingomielina), expunând partea interior. Plc -N ar putea apoi să hidrolizeze fosfatidilserina
prezentă în partea interioră. Rezultatele analizei genotipice au arătat că 54,9% din izolatele
Ps. aeruginosa . Rezultatele analizei PCR privind prezența genei algD au arătat că 50,9% din
izolate exprimă această genă, aspect care demonstrează implicarea acestor tulpini în infecții cu
formarea biofilmului (Cotar și colab., 2011) (fig.40 și 44).
PlcN – 466bp

PlcH – 307bp

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

73

Fig. 40 Electroforeza genei AlgD la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aeruginosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginosa 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805, 13 – Ps. aeruginosa 790, 14 –
Ps. aeruginosa 773, 15 – Ps. aeruginosa 774
Unul dintre factorii de virulență Ps. aeruginosa , exoenzima S (ExoS), a fost propus
să acționeze ca un factor antifagocitar ( Frithz -Lindsten și colab.,1997) , permițând astfel
bacteriilor să se sustragă sistemului imunitar gazdă. Mai recent, s -a descoperit că ExoS include
o activitate a proteinei activatoare de GTPază (GAP) care vizează proteinele cu greutate
moleculară mică Rho, Rac1 și Cdc42, care afectează structura citoscheletică a celulelor
eucariote (Goehring și colab. , 1999). Din acest studiu, 17,64% din tulpinile analizate au
exprimat gena ExoS (fig. 41 și 44).

AlgD –
1310bp

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

74

Fig. 41 Electroforeza genei ExoS care codifica exoenzima S la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aeruginosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginosa 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805

Fig. 42 Electroforeza genei ExoT care codifica exoenzima T la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aeruginosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginos a 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805, 13 – Ps. aeruginosa 790

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
ExoT – 152bp

ExoS – 1352bp

75

Fig. 43 Electroforeza genei care codifică proteaza IV (TCR/TCF)
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aeruginosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginosa 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805, 13 – Ps. aeruginosa 790
Expresia exoenximei U este cunoscută că mărește în mare măsură virulența Ps.
aeruginosa in vivo în general (Lin și colab., 2006) și în special în infecțiile pulmonare
(Schulert și colab., 2003). În prezenta teza doar 1,9% din tulpinile analizate au evidențiat gena
ExoU. Se știe că 90% din tulpinile Ps. aeruginosa producătoare de Ex oU sunt asociate cu
infecții severe (Hauser și col ab., 2002). Dintre proteinele de secreție de tip III, ExoU este cel
mai citotoxic. Secreția ExoU este un marker pentru izolatele cu un grad ridicat de virulență la
Ps. aeruginosa obținute de la pacienții cu pneumonie dobândită în spital (Schurlet și colab.,
2003). Pentru această genă nu au existat tulpini pozitive (fig. 44).

Fig. 44 Distribuția genelor de virulență la tulpinile de PS. aeruginosa analizate
051015202530
plcH plcN exoT AlgD exoS exoUD I S T R I B U Ț I A G E N E LO R D E V I R U L E N ȚĂ
L A T U L P I N I L E D E PS. A E R U G I N O S A
A N A L I Z AT E L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
TCF/TCR –
752bp

76
În ceea ce privește carbapenemazele, 21,56% din tulpinile analizate de Ps.
aeruginosa au prezentat bla IMP (fig. 45 și 46). Enzimele IMP au fost descrise în urmă cu 34 de
ani (Cornaglia și colab., 2011) în Japonia și s -au răspândit repede la nivel mondial, ca
reprezentanți ai familiei Enterobacteriaceae și, de asemenea, în nonenterobacteriacee ca și în
P. aeru ginosa. Până în prezent au fost descrise 20 de variante ale genei bla IMP (Cornaglia și
colab., 2011), gena a fost raportată în România, în 2007 ( Walsh si colab., 2005, Cernat și
colab., 2007) cu varianta IMP -1 în izolatele de A. baumannii de la pacienți i Institutului de
Cardiologie din București internați în perioada 2003 -2006; și în 2013 de la izolate clinice de
Ps. aeruginosa de la pacienți din cinci spitale din Iași (Mereuță și colab., 2013) cu varianta
IMP-13.
În figurile 45 și 46 este reprezentată electroforeza produșilor de amplificare pentru
gena bla IMP. În urma analizei electroforegramei s -a constat faptul că ampliconul cu greutatea
molecular de 232bp a fost detectat 21,56% din tulpinile de Ps. aeruginosa analizate.

Fig. 45 Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla IMP pe tulpinile de Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 1 – Ps. aeruginosa 992, 2 – Ps. aeruginosa 1597, 3 – Ps. aeruginosa 772, 4 – Ps. aeruginosa 861, 5 – Ps.
aeruginosa 793, 6 – Ps. aeruginosa 780, 7 – Ps. aeruginosa 1091, 8 – Ps. aeruginosa 891, 9 – Ps. aeruginosa
1062, 10 – Ps. aeruginosa 809, 11 – Ps. aeruginosa 1919, 12 – Ps. aeruginosa 805, 12 – Ps. aeruginosa 790, 13 –
Ps. aeruginosa 773, 14 – Ps. aeruginosa 774.
IMP- 232bp

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151515
14 15

77

Figura 46. Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla IMP pe tulpinile de Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 50 – Ps. aeruginosa 1775, 51 – Ps. aeruginosa 840, 52 – Ps. aeruginosa 843, 53 – Ps. aeruginosa 929, 54 – Ps.
aeruginosa 1986, 55 – Ps. aeruginosa 1392, 56 – Ps. aeruginosa 2992, 57 – Ps. aeruginosa 1389, 58 – Ps.
aeruginosa 3162
La tulpinile de Ps. aeruginosa luate in screening -ul gen otipic al rezistentei nu au fost
detectate genele bla CTX-Mlike, bla TEMlike și bla VIMlike .
Rezistența la carbapeneme se datorează și scăderii absorbției de antibiotice din cauza
lipsei de porină a membranei exterioare, ca OprD, excluderea din celulă prin po mpa de eflux,
scăderea permeabilității membranei exterioare și producția de MBL (Bahar și colab., 2010).
OprD este o porină cu membrană exterioară specifică substratului de Ps. aeruginosa , care
permite difuzarea aminoacizilor bazici, a peptidelor mici și a imipenemului în celulă. Pentru
imipenem, pierderea OprD poate împinge CMI peste punctul de rezistență (Fang și colab.,
2014). Deorece este cunoscut faptul că rezistența dobandită la carbapeneme este adeseori
corelată la BGNNF cu mutații la nivelul porinelor, testarea genelor OprDlike a demonstrat
prezența acestora la 74,5% din tulpinile de Ps. aeruginosa analizate .
În figurile 48 și 49 se poate observa amplic onul de 1412pb.

L 50 51 52 53 54 55 56 57 58 –
IMP- 232bp

78

Fig. 47 Electroforeza genei OprD la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 10 – Ps. aeruginosa 1112, 7 – Ps. aeruginosa 1392, 13 – Ps. aeruginosa 1067, 11 – Ps. aeruginosa 1594, 6 –
Ps. aeruginosa 1908, 9 – Ps. aeruginosa 316 2, 15 – Ps. aeruginosa 2043, 8 – Ps. aeruginosa 1389, 14 – Ps.
aeruginosa 1489, 26- Ps. aeruginosa 992, 27 – Ps. aeruginosa 1027, 28 – Ps. aeruginosa 1128, 29 – Ps.
aeruginosa 805, 30 – Ps. aeruginosa 780,31 – Ps. aeruginosa 824, 32 – Ps. aeruginosa 1597, 33 – Ps. aeruginosa
809, 34 – Ps. aeruginosa 898, 35- Ps. aeruginosa 780, 36 – Ps. aeruginosa 1919, 37 – Ps. aeruginosa 793, 38 –
Ps. aeruginosa 1986, 39 – Ps. aeruginosa 891 ,40 – Ps. aeruginosa 1062

Fig. 48 Electroforeza genei OprD la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb,
Promega UK, 41 – Ps. aeruginosa 1091, 42 – Ps. aeruginosa 878, 43 – Ps. aeruginosa 1157, 44 – Ps. aeruginosa
790, 45 – Ps. aeruginosa 929, 46 – Ps. aeruginosa 6689, 47 – Ps. aeruginosa 773, 548 – Ps. aeruginosa 904, 49 –
Ps. aeruginosa 915, 50- Ps. aeruginosa 1775, 51 – Ps. aeruginosa 840, 52 – Ps. aeruginosa 843, 53 – Ps.
aeruginosa 929, 54 – Ps. aeruginosa 1986, 55 – Ps. aeruginosa 1392, 56 – Ps. aeruginosa 2992, 57 – Ps.
aeruginosa 1389, 58 – Ps. aeruginosa 3162
Analizele rezistenței la gentamicină, sisomicină și fortimicină (astromicină) (1,96%
din tulpinile analizate (fig.49) sunt răspândite în rândul enterobacteriaceelor și în BGNNF
(Shaw și colab., 1993). Alelele aac (3) -I se găsesc pe casetele de gene mobile inserate în
L 10 7 13 11 6 9 15 8 14 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
L 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 –
OprD –
1412b
p

OprD –
1412b
p

79
integronii de clasă 1, o locație care facilitează în mod evident răspândirea lor în diferiți
repliconi și eventual printre tulpini diferite și care probabil explică difuzia acestor gene în
stabilirea clinică.
În figura 49 se poate observa amp liconul de 484bp care a evidențiat rezistența
aminoglicozidică la gena aac3Ia la doar la o tulpină de Ps. aeruginosa din cele 51 analizate.

Fig. 49 Electroforeza genei aac3Ia la Ps. aeruginosa
Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb, Promega
UK, 26 – Ps. aeruginosa 992, 27 – Ps. aeruginosa 1027, 28 – Ps. aeruginosa 1128, 29 – Ps. aeruginosa 805, 30 –
Ps. aeruginosa 780,31 – Ps. aeruginosa 824, 32 – Ps. aeruginosa 1597, 33 – Ps. aeruginosa 809, 34 – Ps.
aeruginosa 898, 35- Ps. aeruginosa 780, 36 – Ps. a eruginosa 1919, 37 – Ps. aeruginosa 793, 38 – Ps. aeruginosa
1986, 39 – Ps. aeruginosa 891 ,40 – Ps. aeruginosa 1062, 41 – Ps. aeruginosa 1091, 42 – Ps. aeruginosa 878, 43
1157, 44 – Ps. aeruginosa 790, 45 – Ps. aeruginosa 929, 46 – Ps. aeruginosa 6689, 47 – Ps. aeruginosa 773, 48
904, 49 – Ps. aeruginosa 915
Pentru screening -ul genelor implicate în rezistența la quinolone au fost realizate PCR –
uri pentru pentru genele GyrB , Per, QnrA și QnrS . La tulpinile de Ps. aeruginosa luate in
screening -ul genotip ic al rezistenței la quinolone au fost detectate genele GyrB (68,62%),
QnrA (23,52%) și QnrS (25,49%). Gena Per nu a fost detectată la nicio tulpina de Ps.
aeruginosa .
În figura 50 e reprezentată distribuția genelor de rezistenta la antibiotice β -lactamic e si
quinolone și a pompelor de eflux la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate .
L 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
aac3Ia –
484bp

80

Fig. 50 Distribuția genelor de rezistență și apompelorde eflux la antibiotice la tulpinile de
Ps. aeruginosa analizate
Ceșterea rezistenței la carbapeneme a fost observată la nivel mondial în ultimul
deceniu, frecvent mediată de producerea de beta -lactamaze de clasa D cu activitate de
carbapenemază. Au fost descrise trei tipuri de beta -lactamaze clasificate D cu grupuri de gene
de carbapenemază în A. baumannii , care corespund genelor asemănătoare cu bla OXA -23, bla OXA –
24/40 și bla OXA -58. Gena bla OXA -23, identificata mai întâi în Scoția, a fost din ce în ce mai
raportată la nivel mondial. Au fost raportate tulpini de A. baumannii rezistente la
carbapeneme și producatoare de OXA -23 în multe țări, precum Bulgaria, China, Brazilia, Irak,
Afganistan. Achiziția genei bla OXA -23 a reprezentat subiectul numeroaselor studii iar
transpozonii Tn2006, Tn2007 și Tn2008 au fost identif icați ca structuri genetice mobile in
structura carora este localizata această gena. În structura Tn2006, gena bla OXA -23 este flancată
de 2 copii ale secvenței de inserție ISAba1, care sunt situate în orientări opuse.
Funcționalitatea Tn2006 a fost recent demonstrată ( Mugnier si colab., 2010). Tn2008 este
similar cu Tn2006 dar nu are a doua copie a ISAba1 și gena bla OXA -23 este asociată cu 1 copie
a ISAba4 (care diferă de ISAba1) în Tn2007. După cum s -a raportat pentru tulpinile din
Emiratele Arabe Unite și Bahrain, gena bla OXA -23 poate fi asociată cu o singură copie a
ISAba1. ( Mugnier si colab., 2010). O alta β -lactamaza este bla OXA -72 izolata pentru prima data
in Romania, in 2016 din probe de secretie provenita din ulcere cronice ale piciorului.
Identif icarea tulpinii a fost efectuata utilizand tehnologia MALDI -TOF -MS. Prezenta genelor
de rezistenta la carbapeneme a fost investigata prin PCR si secventiere. In urma studiului
02040
IMPOprDaac3IaGyrBQnrAQnrSPERDistributia genelor de rezistență si a pompelor de eflux la tulpinile de Ps. aeruginosa analizate

81
realizat la Institutul de Cercetare al Universitatii din Bucuresti, datele obtin ute au sustinut
raspandirea genei bla OXA -72 in Europa de Est. (Georgescu si colab., 2016).
În prezenta lucrare s -a urmarit detectarea genelor bla OXA -23 și bla OXA -24 (fig. 51).

Fig. 51 Electroforeza produșilor de amplificare pentru gena bla OXA -23 și bla OXA -234 pe tulpinile de A.
baumannii. Număratoarea coloanelor corespunde următoarelor probe: L -Marker de greutate moleculară 100 pb,
Promega UK, 1 – A. baumannii 1089, 2– A. baumannii 1118, 3 – A. baumannii 1368, 4 – A. baumannii 1391, 5 –
A. baumannii 1908, 6 – A. baumannii876, 7 – A. baumannii 776, 8 – A. baumannii 769, 9 – A. baumannii 1445,
10 – A. baumannii 847, 11– A. baumannii 1444, 12 – A. baumannii 1027, 13– A. baumannii 1489
În urma realizării MultiplxPCR pentru genele OXA -23 și OXA -24 s -a constatat
prezenta genei OXA -23 la 25 de tulpini din totalul de 49 analizate, în timp ce OXA -24 a fost
detectată la 26 tulpini.
În figura 52 sunt re prezentate profilurile genotipice întâlnite la tulpinile de A.
baumannii.

Fig. 52 Distribuția profilurilor genice pe tulpinile de A. baumannii analizate

051015
OXA -23 OXA -24 OXA -23 ȘI OXA -24Distributia profilurilor genetice la
A. baumanniiOXA -23
501 bp
OXA -24
242 bp L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14 15

82
3.3.1.3.2 Determinarea variantei genice pentru gena bla CTX -Mlike
CTX -M-15 și CTX -M-14 sunt, de cele mai multe ori, cele mai importante în cadrul
CTX -M, practic invadând toate compartimentele umane și animale, precum și mediu l în
întreaga lume (Cantón și colab ., 2008, Hawkey și Jones, 2009). Cu toate acestea, apariția
temporară și penetrarea acestor enzi me în diverse scenarii epidemiologice ar putea explica, de
asemenea, epidemiologia actuală a enzimelor CTX -M. Consumul antibioticelor și factorii de
risc diferiți în diferite zone geografice și grupuri de pacienți și particularitățile diferitelor
compartim ente ar fi putut contribui și la scenariul curent CTX -M (Canton și colab., 2013). În
acest sens, trei perioade diferite de CTX -M pot fi diferențiate. Prima dintre acestea include
apariția diferitelor β-lactamaze CTX -M în diferite zone geografice diferite ș i ar putea să apară
până la mijlocul anilor 1990 ai secolului trecut. Al doilea a fost caracterizat prin apariția celor
mai răspândite enzime CTX -M, incluzând enzime CTX -M-3, CTX -M-9, CTX -M-14 și CTX –
M-15 și s -ar putea să fi avut loc în perioada 1994 -2000. În cele din urmă, a treia perioadă până
în anul 2000 se caracterizează prin dispersia și globalizarea universală a acestor β-lactamaze .
CTX -M-15, identificată inițial în 1999 în izolate enterice prelevate dintr -un spital din New
Delhi, India (Canton și c olab., 2013). dar găsite astăzi în între aga lume (Hawkey și Jones,
2009 ). Aceasta a fost izolată în Regatul Unit în 2001 și probabil în Japonia la începutul anilor
2000 [desemnată ca UOE -1 în GeneBank (număr de acces A Y013478; Livermore și Hawkey,
2005)]. În plus, în Polonia, un studiu retrospectiv al unei colecții de Enterobacteriaceae
rezistente la cefalosporinele cu spectru extins au evidențiat prezența CTX -M-15 în S.
marcescens și E. coli din 1998 (Canton și colab., 2013).
La tulpinile de K. pneumoniae s-a acordat o atenție sporită carbapenemazelor, în
special KPC ( Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) , și implicarea clonei ST258 în
diseminarea lor (Woodford și colab ., 2011). Cu toate acestea, diferite publicații au studiat
implicațiile diferitelor clone în diseminarea enzimelor CTX -M asociate cu K. pneumoniae .
Acesta este de exemplu cazul CC11, care a fost identificat pe scară largă în Asia asociat cu
diferite enzime CTX -M, inclusiv CTX -M-14 și CTX -M-15 (Canton și colab., 2013 ). În
Ungaria, acest CC și ST15 și ST147 au fost răspunzători de difuzarea la nivel național a K.
pneumoniae cu rezist ență la ciprofloxacină CTX -M-15. De asemenea, în regiunea Copenhaga
din Danem arca, o clonă K. pneumoniae ST16 care găzduiește genele blaCTX -M-15 și blaSHV –
28 a fost recunoscută pentru producerea focarelor din spital (Canton și colab., 2013).

83
Având in vedere diseminarea la nivel european a tulpinilor de K. pneumoniae
producatoare de CTX -M-15, s -a realizat secventierea genei bla CTX-M-15.Secvențierea s -a
realizat externalizat în China, Beijing, obținându -se secventele de nucleotide din anexa 1.
În urma analizei secventelor de nucleotide in NCBI blast (fig. 53), s -a observat faptul
că toate secventele au corespondenta, cu un grad de similaritate de 99 -100% cu gena bla CTX-M-
15. Analiza tuturor secventelor, s -a determinat ca in cazul tuturor tulpini lor luate in studiu gena
a prezentat omologie de (99 -100%) cu secvente similar din baza de date NCBI.

Fig. 53 Analiza secventelor de nucleotide in NCBI blast

Tabelul 5 . Corespondența secvențelor genei bla CTX-Mlike analizate
Codul din laborator Specia izolata Numarul de acces Similaritate
>CK4 -CTX -M-15 K. pneumoniae CP016925.1 99%
>CK7 -CTX -M-15 K. pneumoniae CP016925.1 99%
>CK -16-CTX -M-15 K. pneumoniae CP016925.1 99%
>CK -25-CTX -M-15 K. pneumoniae CP016925.1 99%

Anexa 1
>CK4 -CTX -M-15
GATTTTGAGCTAATAAAAAACACACGTGGAATTTAGGGACTATTCATGTTGTTGTT
ATTTCGTATCTTCCAGAATAAGGAATCCCATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAGTTC
ACGCTGATGGCGACGGCAACCGTCACGCTGTTGTTAGGAAGTGTGCCGCTGTATG

84
CGCAAACGGCGGACGTACAGCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAG
GCAGACTGGGTGTGGCATTGATTAACACAGCAGAT AATTCGCAAATACTTTATCG
TGCTGATGAGCGCTTTGCGATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGCGGCCGCG
GTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATC
AAAAAATCTGACCTTGTTAACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCAATGGGA
CGATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGC
GATGAATAAGCTGATTG CTCACGTTGGCGGCCCGGCTAGCGTCACCGCGTTCGCC
CGACAGCTGGGAGACGAAACGTTCCGTCTCGACCGTACCGAGCCGACGTTAAACA
CCGCCATTCCGGGCGATCCGCGTGATACCACTTCACCTCGGGCAATGGCGCAAAC
TCTGCGGAATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGGGCGACAGCCAACGGGCGCAGCTG
GTGACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACT GC
CTGCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCGGTGGCTATGGCACCACCAA
CGATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACT
TCACCCAGCCTCAACCTAAGGCAGAAAGCCGTCGCGATGTATTAGCGTCGGCGGC
TAAAATCGTCACCGACGGTTTGTAATAGCGGAAACGGAATGGGGAAACTCATTCC
GTTTTTGTTTATCGCCTTAGACGGCAAAAGTGC TGTCGCCCACCTGCGCTTGCGCA
TACCAGGCCATAAGCTCCGTGGTTCCTGGTTCTCCTTCCGCTGGAGCCCAGTGCGC
ATAGTCATCGGCAGCC
>CK7 -CTX -M-15
TTTTTGAGCTAATAAAAAACACACGTGGAATTTAGGGACTATTCATGTTGTTGTTA
TTTCGTATCTTCCAGAATAAGGAATCCCATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAGTTCA
CGCTGATGGCGACGGCAACCGTCACGCTGTTGTT AGGAAGTGTGCCGCTGTATGC
GCAAACGGCGGACGTACAGCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAGG
CAGACTGGGTGTGGCATTGATTAACACAGCAGATAATTCGCAAATACTTTATCGT
GCTGATGAGCGCTTTGCGATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGCGGCCGCGG
TGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATCA
AAAAATCTGACCTTGTT AACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCAATGGGAC
GATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGCG
ATGAATAAGCTGATTGCTCACGTTGGCGGCCCGGCTAGCGTCACCGCGTTCGCCC
GACAGCTGGGAGACGAAACGTTCCGTCTCGACCGTACCGAGCCGACGTTAAACAC
CGCCATTCCGGGCGATCCGCGTGATACCACTTCACCTCGGGCAATGGCGCAAA CT

85
CTGCGGAATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGGGCGACAGCCAACGGGCGCAGCTG
GTGACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACTGC
CTGCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCGGTGGCTATGGCACCACCAA
CGATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACT
TCACCCAGCCTCAACCTAAGGCAGAAAGCCGTCG CGATGTATTAGCGTCGGCGGC
TAAAATCGTCACCGACGGTTTGTAATAGCGGAAACGGAATGGGGAAACTCATTCC
GTTTTTGTTTATCGCCTTAGACGGCAAAAGTGCTGTCGCCCACCTGCGCTTGCGCA
TACCAGGCCATAAGCTCCGTGGTTCCTGGTTCTCCTTCCGCTGGAGCCCAGTGCGC
ATAGTCATCGGCAGCC
>CK -16-CTX -M-15
TTTTGAGCTATAAAAAACACACGTGGAATTTAGGG ACTATTCATGTTGTTGTTATT
TCGTATCTTCCAGAATAAGGAATCCCATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAGTTCAC
GCTGATGGCGACGGCAACCGTCACGCTGTTGTTAGGAAGTGTGCCGCTGTATGCG
CAAACGGCGGACGTACAGCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAGGC
AGACTGGGTGTGGCATTGATTAACACAGCAGATAATTCGCAAATACTTTATCGTG
CTGATGAGCGCTTTGC GATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGCGGCCGCGGT
GCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATCAA
AAAATCTGACCTTGTTAACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCAATGGGACG
ATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGCGA
TGAATAAGCTGATTGCTCACGTTGGCGGCCCGGCTAGCGTCACCGCGTTCGCC CG
ACAGCTGGGAGACGAAACGTTCCGTCTCGACCGTACCGAGCCGACGTTAAACACC
GCCATTCCGGGCGATCCGCGTGATACCACTTCACCTCGGGCAATGGCGCAAACTC
TGCGGAATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGGGCGACAGCCAACGGGCGCAGCTGGT
GACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACTGCCT
GCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCG GTGGCTATGGCACCACCAACG
ATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACTTC
ACCCAGCCTCAACCTAAGGCAGAAAGCCGTCGCGATGTATTAGCGTCGGCGGCTA
AAATCGTCACCGACGGTTTGTAATAGCGGAAACGGAATGGGGAAACTCATTCCGT
TTTTGTTTATCGCCTTAGACGGCAAAAGTGCTGTCGCCCACCTGCGCTTGCGCATA
CCAGGCCATAAGC TCCGTGGTTCCTGGTTCTCCTTCCGCTGGAGCCCAGTGCGCAT
AGTCATCGGCAGCC

86
>CK -25-CTX -M-15
TTTTGAGCTAATAAAAAACACACGTGGAATTTAGGGACTATTCATGTTGTTGTTAT
TTCGTATCTTCCAGAATAAGGAATCCCATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAGTTCAC
GCTGATGGCGACGGCAACCGTCACGCTGTTGTTAGGAAGTGTGCCGCTGTATGCG
CAAACGGCGGACGTA CAGCAAAAACTTGCCGAATTAGAGCGGCAGTCGGGAGGC
AGACTGGGTGTGGCATTGATTAACACAGCAGATAATTCGCAAATACTTTATCGTG
CTGATGAGCGCTTTGCGATGTGCAGCACCAGTAAAGTGATGGCCGCGGCCGCGGT
GCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATCAGCGAGTTGAGATCAA
AAAATCTGACCTTGTTAACTATAATCCGATTGCGGAAAAGCACGTCAATGGGA CG
ATGTCACTGGCTGAGCTTAGCGCGGCCGCGCTACAGTACAGCGATAACGTGGCGA
TGAATAAGCTGATTGCTCACGTTGGCGGCCCGGCTAGCGTCACCGCGTTCGCCCG
ACAGCTGGGAGACGAAACGTTCCGTCTCGACCGTACCGAGCCGACGTTAAACACC
GCCATTCCGGGCGATCCGCGTGATACCACTTCACCTCGGGCAATGGCGCAAACTC
TGCGGAATCTGACGCTGGGTAAAGCATTGGGCGA CAGCCAACGGGCGCAGCTGGT
GACATGGATGAAAGGCAATACCACCGGTGCAGCGAGCATTCAGGCTGGACTGCCT
GCTTCCTGGGTTGTGGGGGATAAAACCGGCAGCGGTGGCTATGGCACCACCAACG
ATATCGCGGTGATCTGGCCAAAAGATCGTGCGCCGCTGATTCTGGTCACTTACTTC
ACCCAGCCTCAACCTAAGGCAGAAAGCCGTCGCGATGTATTAGCGTCGGCGGCTA
AAATCGTCACCGAC GGTTTGTAATAGCGGAAACGGAATGGGGAAACTCATTCCGT
TTTTGTTTATCGCCTTAGACGGCAAAAGTGCTGTCGCCCACCTGCGCTTGCGCATA
CCAGGCCATAAGCTCCGTGGTTCCTGGTTCTCCTTCCGCTGGAGCCCAGTGCGCAT
AGTCATCGGCAGCC

87
Concluzii
1. Cele mai izolate specii bacteriene au fost K. pneumoniae , A. baumannii și Ps.
aeruginosa au fost izolate din secreții de tract respirator, un motiv ar putea fi că
tulpinile provin de la pacienți intubați, care prezintă un risc crescut de infecții ale
tractului respirator inferior cu BGN. Tulpinile de E. coli au fost cel mai frecvent izolate
din urocultura, fiind principalul agent etiologic al infecțiilor urinare.
2. Rezultatele ob ținute în cadrul acestui studiu au demonstrat că în mediul spitalicesc,
unde presiunea selectivă e xercitată de antibiotice este ridicată, atât tulpinile de
Enterobacteriaceae, cât și BGNNF dezvoltă rezistență la antibiotice β-lactamice,
mediată enzimatic de β -lactamaze de spectru extins, dar și de mecanisme ne –
enzimatice .
3. Cele mai răspândite BLSE detectate la tulpinile analizate au fost cele de tip CTX -M și
TEM, rezultatele fiind în concordanță cu date similare din literatura de specialitate,
obținute pentru tulpini izolate din alte zone geografice. A fost de a semenea confirmată
carbapenemaza NDM -1 la o tulpină de enterobacterii izolata dintr-un spital din
România .
4. Toate tulpinile de Ps. aeruuginosa și A. baumannii anali zate au prezentat fenotip de
MDR, codificat la 21,56 % dintre tulpinile analizate de Ps. aeruginosa de gena pentru
carbapenemaza de tip bla IMP. La A. baumannii fenotipul MDR a fost codificat 51,02%
de gena bla OXA -23.
5. În urma secvențierii genei CTX -M s-a determinat un grad de similaritate de 99 -100%
cu gena bla CTX-M-15, indicând diseminarea la nivel european a tulpinilor de K.
pneumonia e producatoare de gena bla CTX-M-15.

88
Bibliografie
1. Aguero, M. E., Aron L., DeLuca A. G., Timmis K.N, Cabello F. C., 1984 . A plasmid –
encoded outer membrane protein, TraT, enhances resistance of Escherichia coli to
phagocytosis . Infect. Immun. 46:740 -746.
2. Aguero M. E., De la Fuente G., Vivaldi E.,Cabello F., 1989, ColV increases the
virulence of Escherichia coli Ki strains in animal models of neonatal meningitis and
urinary infection . Med. Microbiol. Immunol. 178:211 -216.
3. Andreotti D., Biondi S., Di Modugno E., 2003, β-lactam antibiotics , Burger‟s
Medicinal Chemistry and Drug Discovery 5:14 .
4. Bahar M.A,. jamali S,. Samadi A., 2010, Imipenem resistant Pseudomonas aeruginosa
strains carry metallo -beta-lactamase gene bla VIM in a level I Iranian burn hospital.
Burn ; 3636: 826 – 830.
5. Barthélémy M., Péduzzi J., Bernard H., Tancrède C., Labia R., 1992, Close aminoacid
sequence relationship between the new plasmid -mediated extended -spectrumbeta –
lactamase MEN -1 and chromosomally encoded enzymes of Klebsiella oxytoca .
Biochim. Biophys.Acta. 1122, 15 –22.
6. Bauernfeind A., Casellas J .M., Goldberg, M., Holley M., Jungwirth R., Mangold P.,
Röhnisch T., Schweighart S., Wilhelm R., 1992, A new plasmidic cefotaximase from
patients infected with Salmonella typhimurium . Infection 20, 158 –163
7. Bauernfeind A., Grimm H., Schweighart S.,1990, A new plasmidic cefotaximase in a
clinical isolate of Escherichia coli . Infection 18, 294 –298.
8. Bauernfeind A., Stemplinger I., Jungwirth R., Ernst S., Casellas J. M., 1996, Sequences
of β-lactamase genes encoding CTX -M-1(MEN -1) and CTX -M-2 and relationship of
their aminoacid sequence s with those of other β -lactamases.
Antimicrob.AgentsChemother. 40, 509 –513.
9. Bonnet R ., 2004. Growing group of extended -spectrum β -lactamases: the CTX -M
enzymes . Antimicrob. Agents Chemother. 48:1-14.
10. Brisse S., Fevre C., Passet V., Issenhuth -Jeanjean S., Tournebize R., Diancourt L.,
Grimont P., 2009, Virulent Clones of Klebsiella pneumoniae: Identification and
Evolutionary Scenario Based on Genomic and Phenotypic Characterization, PLoS
ONE 4(3): e4982 . doi:10.1371/journal.pone.0004982

89
11. Brisse S., Grimont F, Grimont P.A.D., 2006, The genus Klebsiella . In: Dworkin M,
Falkow S ., Rosenberg E ., Schleifer K .-H., Stack ebrandt E., eds. The Prokaryotes ? A
Handbook on the Biology of Bacteria. 3rd edition ed. New York: Springer.
12. Bush K., and Jacoby A. K., Updated functional classification of betalactamases ,
Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54:969 -976.
13. Bush K., Fisher J. F., 2010, Epidemiological Expansion, Structural Studies and
Clinical Challenges of New beta -Lactamases from Gram -Negative Bacteria. Annu Rev
Microbiol.
14. Bush K., 2010, Alarming β -lactamase -mediated resistance in multidrug -resistant
Enterobacteriaceae. Curr. Opin. Microbiol . 13, 558 –564.
15. Cantón R., 2008, Epidemiology and evolution of β -lactamases, in Evolutionary Biology
of Bacterial and Fungal Pathogens , eds F.Baquero, C. Nombela, G.H.Casslel, and J.
A. Gutierrez -Fuentes(Washington: ASM Press),249 –270.
16. Cantón R., Coque T.M., 2006, The CTX -M β -lactamase pandemic .
Curr.Opin.Microbiol. 9, 466 –475.
17. Cantón R., Ruiz -Garbajosa P., 2011 , Co-resistance: an opportunity for the bacteria
and resistance genes. Curr. Opin. Pharmacol. 11, 477 –485.
18. Carpenter J.L., 1990 , Klebsiella pulmonary infections: occurrence at one medical
center and review . Rev Infect Dis 12: 672 –682.
19. CDC, 2016 , Types of healthcare -associated infections. Healthcareassociated infections
(HAIs). [Online] Available from: https://www.cdc.gov/HAI/infectionTypes.html
20. Cheng A. C., Turnidge J., Collignon P., Looke D., Barton M., Gottlieb T. , 2012 ,
Control of Fluoroquinolone Resistance through Successful Regulation, Australia,
Emerging Infectious Diseases, Vol. 18, No. 9, September, DOI:
http://dx.doi.org/10.3201/eid1809.111515
21. Chifiriuc C. M., Mihăescu G., Di țu L. M. , 2011, Microbiologie și virologie medicală ,
Ed.Universității din București.
22. Colodner R, Rock W, Chazan B, Keller N, Guy N, et al., 2004, Risk factors for the
development of extended -spectrum beta -lactamase -producing bacteria in
nonhospitalized patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 23: 163 –167.

90
23. Cornaglia G., Giamarellou H., Rossolini G.M. 2011. Metallo -β-lactamases: a last
frontier for β -lactams ? Lancet Infect Dis. 11:381-93.
24. Cernat R., C. Balotescu, Lazăr V et al . 2007. Genetic characterisation of highly
prevalent MBLs and OXA carbapenemases in multidrug -resistant Acinetobacter
baumannii strains in a Romanian hospital . Clin Microbiol.Infect. 13(s1): O436.
25. Colom K., Perez J., Alonso R., Fernandez -Aranguiz A., Larino E., Cisterna R ., 2003,
Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM,blaSHV and
blaOXA -1 genes in Enterobacteriaceae, FEMS Microbiology Letters 223 147 -151.
26. Cotar A.I., Chifiriuc M.C., Banu O., Lazar V, 2013 , Molecular characterization of
virulence pat terns in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from respiratory and
wound samples . Biointerface Res Appl Chem ., 3, 551 –558.
27. Cuzon C., Bonin R., Nordmann P., 2011 , First Identification of Novel NDM
Carbapenemase, NDM -7, in Escherichia coli in France. Article in PLoS ONE · April
2013 DOI: 10.1371/journal.pone.0061322.
28. Datta N., Richmond M. H., 1966 , The purification and properties of a penicillinase
whose synthesis is mediated by an R -factor in Escherichia coli. Biochem. J. , vol. 98,
no. 1, pp. 204 –9, January.
29. Delcaru C, Podgoreanu P., Aexandru I., Popescu N., Marutescu L., Bleotu C.,
Mogosanu G. D., Chifiriuc M. C., Gluck M., Lazar V., 2017, Antibiotic Resistance
and Virulence Phenotypes of Recent Bacterial Strains Isolated from Urinary Tract
Infecti ons in Elderly Patients with Prostatic Disease, Pathogens, 6, 22;
doi:10.3390/pathogens6020022
30. Delcour A. H., 2009, Outer membrane permeability and antibiotic resistance .
Biochim Biophys Acta, 1794:808 -816.
31. Díaz M. A., Hernández R., Martínez -Martínez L., Baño R, Pascual A., and Grupo de
Estudio de Infección Hospitalaria (GEIH), 2009, Extended -spectrum β -lactamase –
producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Spanish hospitals:2nd
multicenter study ( GEIH -BLEEproject,2006). Enferm.Infecc.Microbiol.Clin. 27, 503 –
510.

91
32. Dijkshoorn L., Nemec A., Seifert H., 2007, An increasing threat in hospitals:
multidrug -resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol . Dec 5 (12): 939 –
951.
33. Dorobăț, O. M. , Mecanisme de acțiune a subsanțelor antimicrobiene , Bacteriologie
medicală, Editura Universității Titu Maiorescu București, 2006, pag. 102 -103
34. Durante -Mangoni E., Zarrilli R., 2011, Global Spread of Drugresistant Acinetobacte
baumannii . Future Microbiol . 6 (4): 407 -422.
35. Eftekhar F., Rastegar M., Golalipoor M., Mansour N., 2012, Detection Extended
Spectrum β -lactamases in urinary Isolates of K.pneumoniaein relation to bla SHV,
bla CTX-M, and bla TEM Gene carriage , Iranian J Publ Health, 41:3, 127 -132
36. Emily R .M., Sydnor T.M.P., 2011, Hospital epidemiology and infection control in
acute -care settings . Clin Microbiol ; 24(1): 141 -73.
37. Fang Z. L., Zhang L. Y., Huang Y. M., Qing Y., Cao KY, Tian G.B., et al., 2014,
OprD mutations and inactivation in imipenem -resistant Pseudomonas aeruginosa
isolates from China . Infect Genet Evol; 21:124 –128.
38. Fernandes -Beros M. E., Kissel V., Lior H., Cabello F. C., 1990, Virulence -Related
Genes in Co1V Plasmids of Escherichia coli Isolated from Human Blood and
Intestines, Journal of cli nical Microbiology, April, p. 742 -746
39. Franco M., Caiaffa -Filho H., Burattini M., Rossi F., 2010, Metallo -betalactamases
among imipenem -resistant Pseudomonas aeruginosa in a Brazilian university hospital.
Clinics (Sao Paulo) , 65, 825 –829.
40. Frithz -Lindsten, E ., Du Y., Rosqvist R., Forsberg A., 1997, Intracellular targeting of
exoenzyme S of Pseudomonas aeruginosa via type IIIdependent translocation induces
phagocytosis resistance, cytotoxicity and disruption of actin microfilaments . Mol
Microbiol . 25, 1125 -1139.
41. Gavriliu L. C., Benea O.E., Benea S., 2016, Antimicrobial resistance temporal trend
of Klebsiella pneumoniae isolated from blood, Journal of Medicine and Life Vol. 9,
Issue 4, October -December, pp.419 -423 doi:10.22336/jml.2016.0417 .
42. Georgescu M., Gheorghe I., , Dudu A., Czobor I., Costache M., Cristea V. C., Lazar
V., Chifiriuc M. C,2016, First report of OXA -72 producing Acinetobacter baumannii
in Romania, New Microbes and New Infect 2016; 13: 87 –88.

92
43. Goehring U. -M., Schmidt G., Pederson K. J., Aktories K., Barbieri J. T., 1999, The N –
terminal domain of Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S is a GTPase activating
protein for Rho -GTPases . J. Biol. Chem . 274 , 36369 – 36372.
44. Hawkey P.M., Jones A.M., 2009, The changing epidemiology of resistance . J.
Antimicrob Chemother. 64, i3 –i10.
45. Hauser A.R., Cobb E., Bodi M., Mariscal D., Valles J., Engel J.N., Rello J., 2002, Type
III protein secretion is associated with poor clinical outcomes in patients with
ventilator -associated pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa . Crit. Care Med.
30, 3, 521 -528
46. Henderson B ., Nair S ., Pallas J ., Williams M . A., Rev. 2011 , Fibronectin: a
multidomain host adhesion targeted by bacterial fibronectin ‐binding proteins . FEMS
Microbiol Jan;35(1):147 ‐200.
47. Henderson D. A., 1999, Ciprofloxacin resistance in Campylobacter jejuni isolates:
detectionof gyrA resistance mutations by mismatch amplification mutation assay PCR
and DNA sequence analysis , Journal of Clin Microbiology, Record 108, 8 -12; 14.
48. Hornsey M., Phee L., Wareham D. W., 201. A novel variant, NDM -5, of the New Delhi
metallo -b-lactamase in a multidrug -resistant Escherichia coli ST648 isolate recovered
from a patient in the United Kingdom. Antimicrob Agents Chemother 55: 5952 –5954.
49. Howard A., O‟Donoghue M., Feeney A., Sleator R., 2012, Acinetobacter baumannii.
An emerging opportunistic pathogen . Land Bioscience . Virulence 3:3, 243 -250.
50. Huang L. Y., Chen T. L., Lu P. L.,Tsai C. A., Cho W. L., Chang F. Y., Fung C. P., Siu
L. K., 2008, Disemination of multiresistant, class 1 integron -carrying Acinetobacter
baumannii isolates in Taiwan , Clin Microbiol Infection , 14: 1010 -1019.
51. Ho P. L., Wong R. C., Lo S. W., Chow K. H., Wong S. S., Que T. K., 2010, Genetic
identity of aminoglycoside -resis tance genes in Escherichia coli isolates from human
and animal sources, Journal of Medical Microbiology, 59, 702 –707
52. Hooper D. C., 2001, Emerging Mechanisms of Fluoroquinolone Resistance , Emerging
Infectious Diseases , Vol. 7, No. 2, March –April
53. Israil A., M., Palade R., S., Chifiuc M., C., Cotar A., 2013, Aspecte clinice si
bacteriologice in infectiile bacteriene asociate urgentelor chirurgicale abdominale,
Ed. Ars Docendi,

93
54. Jacoby G., A., Munoz -Price L.S., 2005, The new β -lactamases , N Engl J Me d;
352:3,380 -391
55. Jacoby G. A., 2009, AmpC β -Lactamases , Clinical Microbiology Reviews, Jan., p.
161–182
56. Jehl F., Chomarat M., Weber M., Gerard A., 2010, De la antibiogramă la prescripție ,
Editura Științelor Medicale, ed. a 3a, București . pp. 139.
57. Jovcic B., Lepsanovic Z., Suljagic V., Rackov G., Begovic J., et al., 2011, Emergence
of NDM -1 metallo -ß-lactamase in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from
Serbia . Antimicrob Agents Chemother 55: 3929 –3931.
58. Johnson J. K., Arduino S. M., Stine O. C. , Johnson J. A., Harris A. D. 2007. Multilocus
sequence typing compared to pulsed -field gel electrophoresis for molecular typing of
Pseudomonas aeruginosa . J Clin Microbiol . 45: 3707 -3712.
59. Kaase M., Nordmann P., Wichelhaus T. A., Gatermann . G., Bonnin R. A., et al., 2011,
NDM -2 carbapenemase in Acinetobacter baumannii from Egypt . J Antimicrob
Chemother 66: 1260 –1262.
60. Khan H. A., Baig F. K, Mehboob R., 2017, Nosocomial infections: Epidemiology,
prevention, control and surveillance , Asian Pac J Trop Biomed 7(5): 478 –482
61. Knothe H, Shah P, Kremery V, Antal M, Mitsuhashi S. Transferable resistance to
cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella
pneumoniae and Serratia marcescens. Infection, 1983 ; 11:315 –7.
62. Kaatz GW: Bacterial efflux pump inhibition . Curr Opin Investig Drugs 2005, 6:191 –
198.
63. Kaper, J.B.; Nataro, J.P.; Mobley, H.L.T., 2004, Pathogenic Escherichia coli . Nat.
Rev. Microbiol, 2, 123 –140.
64. Kiska D. L., Gillian P. H., Barron E. J., Phaller M. A ., Manual of cl inical microbiology
– 7th ed , Amercian Society for Microbiology Washington DC, 1999: 517 -525
65. Kuhn F., Cottagnound M., Acosta F., Flatz L., Enteza J., Cottagnound P., 2003,
Cefotaxine acts synergistically with levofloxacin in experimental meningitis due to
penicillin -resistant pneumococci and prevents selection of levofloxacin resistant
mutants in vivo , Antimicrob Agents Chemother., 47 (8): 2487 -91.

94
66. Lavigne, Marchandian H., Delmas I., 2007, CTX-M beta -lactamase producing E.coli
in French hospitals:prevalence , molecular epidemiologz and risck factors. J Clin
Microbiol, 45:499 -450
67. Lambert P . A., 2002 , Mechanisms of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa .
J R Soc Med; 95 Suppl 41:22 -6.
68. Lazăr V., 2001. Microbiologie medicală. Note de curs și principii de diagnostic
microbiologic . Edit. Universitătii din București. București.
69. Levison M. E., Levison J. l., Phil M., 2009, Pharmacokinetics and
Pharmacodynamics of Antibacterial Agents, Infect Dis Clin North Am. 2009
December; 23(4): 791 –vii. doi:10.1016/j .idc.2009.06.008.
70. Li J., Rayner C.R., Nation R.L., et al., 2006, Heteroresistance to colistin in multidrug –
resistant Acinetobacter baumannii . Antimicrob Agents Chemother ; 50: 2946 -2950.
71. Li X. Z., H. Nikaido, 2004. Efflux -mediated drug resistance in bacteria . Drugs 64:159 –
204.
72. Liakopoulos A., Mavroidi A., Katsifas E., Theodosiou A., Karagouni A.D., Miriagou
V., et al., 2013, Carbapenemase -producing Pseudomonas aeruginosa from central
Greece: molecular epidemiology and genetic analysis of class I integ rons. BMC Infect
Dis, 13, 505, 1 – 7.
73. Lin H. H., Huang S. P., Teng H. C., Ji D. D., Chen Y. S. & Chen Y. L., 2006, Presence
of exoU gene of Pseudomonas aeruginosa is correlated withcytotoxicity in MDCK
cells but not with colonisation in BALB/c mice . J Clin Microbiol 44, 4596 –4597.
74. Lister P. D., Wolter D. J., Hanson N. D., 2009 , Antibacterial -resistant Pseudomonas
aeruginosa : clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded
resistance mechanisms., Clin. Microbiol. Rev. , vol. 22, no. 4, pp. 582 –610, October.
75. Livermore D. M., 2012, Fourteen years in resistance, Volume 39, Issue 4, Pages 283–
294, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2011.12.012
76. Livermore D. M., Woodford N. 2000 , Carbapenemases: a problem in waiting? Curr
Opin Microbiol 3:489 -495
77. Livermore D. M., 2002, Multiple Mechanisms of Antimicrobial Resistance in
Pseudomonas aeruginosa: Our Worst Nightmare? Clinical Infectious Diseases
34:634 –40

95
78. Livermore D. M., 2001, Of Pseudomonas, porins, pumps and carbapeanems . J
Antimicrob Chemother , 47:247 –50
79. Livermore D. M., Canton R., Gnidkowski M., Nordmann P., Rossolini G.M., Arlet G.,
Ayla J., Coque T.M., Kern -Zdanowicz I., Luzzaro F., Poirel L., Woodford N. 2007 .
CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe . J. Antimicrob Chemother. 59: 165 –
174.
80. Livermore D. M., Walsh T. R., Toleman M., Woodford N., 2011, Balkan NDM –
1:escape or transplant? Lancet Infect Dis 11:164.
81. Manchanda V., Sanchaita S., S ingh N. P., 2010 Sep -Dec; Multidrug Resistant
Acinetobacter. Journal of Global Infectious Diseases . 2 (3): 291 -304.
82. Matsumoto Y., Ikeda F., Kamimura T., Yolota Y., MineY., 1988, Novel plasmid –
mediated β -lactamase from Escherichia coli that inactivates oxyiminocephalosporins.
Antimicrob.AgentsChemother. 32, 1243 –1246.
83. Medeiros A., 1997, Evolution and Dissemination of β -Lactamases Accelerated by
Generations of β -Lactam Antibiotics , Clinical Infectious Diseases, 19 -45
84. Mărculescu A, Cernea M., Veturia Nuele anu, Oros N.A., Chereji R, 2007 Rezistenta
microbiană față de antibiotice , Medicamentul Veterinar 1:1,44 -52.
85. Mereuță A.I., Bădescu A.C., Dorneanu O.S., Iancu L.S., Tuchiluș C.G. 2013. Spread
of VIM -2 metallo -beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Ac inetobacter
baumannii clinical isolates from Iași, România . Revista Română de Medicină de
Laborator. 21(4): 389 -396.
86. Mihăescu G., Chifiriuc C. M., Dițu M., 2007, Antibiotice si substanțe
chimioterapeutice antimicrobiene , Ed. Academiei Române .
87. Mihăescu Grigore, Chifiriuc C,, Dițu Mara, 2007, Microbiologie generală,
Ed.Universitații București .
88. Miller G. H., , Sabatelli F. J., Hare R. S., Glupczynski Y., Mackey P., D. Shlaes,
Shimizu K., Shaw K. J. , 1997, The Most Frequent Aminoglycoside Resistanc e
Mechanisms —Changes with Time and Geographic Area: A Reflection of
Aminoglycoside Usage Patterns, Clinical Infectious Diseases; 24(Suppl 1):S46 -62
89. Moisoiu A., Ionită M., Sârbu L., Stoica C., Grigoriu L., 2014, Rezistența la antibiotice
a tulpinilor de Acinetobacter baumannii izolate din specimene clinice în Institutul de

96
Pneumoftiziologie „Marius Nasta―, Pneumologia, Revista Societații Române de
Pneumologie, Vol. 63, Nr. 2.
90. Moldovan R., Licker M., Dan L., 2005: Genul Pseudomonas – Curs de Microbiologie
Medicală – vol. II Lito UMF Timișoara, 114 -122.
91. Morosini M. I., García -Castillo M., Coque T. M., Valverde A., Novais A., Loza E.,
Baquero F., Cantón R., 2006, Antibiotic coresistance in extended -spectrum -β-
lactamase -producing Enter obacteriaceae and in vitro activity of tigecycline.
Antimicrob. AgentsChemother. 50, 2695 –2699.
92. Mugnier P. D., Poirel L., Naas T., Nordmann P., 2010, Worldwide dissemination of the
blaOXA‐23 carbapenemase gene of Acinetobacter baumannii . Emerg Infect Dis.
Jan;16(1):35 ‐40.
93. Munoz -Price S. L., Weinstein A. R., 2008, Acinetobacter Infection. The New England
Journal of Medicine , 12: 1271 -1281.
94. Nordmann P., Dortet L., Poirel L. 2011. Carbapenem resistance in
Enterobacteriaceae: here is the sto rm! Trends. Mol. Med. 18: 263 -72.
95. Nordmann P., Boulanger A., Poirel L., 2012, NDM -4 metallo -ß-lactamase with
increased carbapenemase activity from Escherichia coli . Antimicrob Agents
Chemother 56: 2184 –2186 .
96. Neonakis K. I., Spandilos D. S., Petinaki E., 2011, Confronting multidrug -resistant
Acinetobacter baumannii a review. International Journal of Antimicrobial Agents, vol.
37, Issue 2, February, p. 102 -109.
97. Naseer U., Sundsfjord A., 2011, The CTX -M conundrum: dissemination of plasmids
and Escherichia coli clones . Microb.DrugResist. 17, 83 –97.
98. Orb E. C., Dan L., Licker M., Tutelcă A., Kosa A., Moldovan R., 2006, Fenotipuri de
rezistență a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa izolate dintr -o secție de Anestezie
și Terapie Intensivă , Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 2, Nr. 1, Martie
99. Osterburg A., Gardner J., HyonS., Neely A., Babcock Gg, 2009, Highly antibiotic –
resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates are killed by the green tea
polyphenol( -)-epigallocatechin -3-gallate(EGCG ), Clin Microbiol Infect ; 15: 341 -346.
100. Paterson D.L., Bonomo R.A. , 2005. Extended -spectrum β -lactamases: a
clinical update . Clinical Microbiology Reviews. 18(4): 657 -686.

97
101. Peleg A.Y., Seifert,H., Paters on D.L., 2008, Acinetobacter baumannii :
emergence of a successful pathogen. Clin.Microbiol.Rev . 21, 538 –582.doi:
10.1128/cmr.00058 -57
102. Perez F., Hujer A. M., Hujer M. K., Decker B., Rather N., Bonomo R., 2007.
Global Challenge of Multi -Resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents
Chemoter. 51(10): 3471.
103. Pitout J. D., Gregson D. B., Campbell L., Lampland K.B., Molecular
characteristics of ESBL – producing E. coli in isoldates causing bacteriemia in the
Calgary. Health Region from 2000 to 20 07 emergence of clones as a cause of
comunity acquired infections . Antimicrob agents chemother, 2009, 53(7):2846 -2851
104. Poirel L., Fortineau N., Nordmann P., 2011 , International transfer of NDM -1-
producing Klebsiella pneumoniae from Iraq to France . Antimic rob Agents Chemother
55: 1821 –1822.
105. Poirel L., Bonnin R., Nordmann P. 2012. Genetic support and diversity of
acquired extended -spectrum β -lactamases in Gram negative rods . Infection, Genetics
and Evolution. 12: 883 -893.
106. Queenan A.M., Bush K. 2007. Carbapen emases: the versatile β -lactamases.
Clinical Microbiology Reviews. 20(3): 440 -458.
107. Randall, L. P., C. Clouting, R. A. Horton, N. G. Coldham, G. Wu, F. A.
Clifton -Hadley, R. H. Davies, and C. J. Teale. 2011. Prevalence of Escherichia coli
carrying extended -spectrum beta -lactamases (CTX -M and TEM -52) from broiler
chickens and turkeys in Great Britain between 2006 and 2009 . J Antimicrob
Chemother 66:86 -95
108. Recchia, G. D., Hall R. M.., 1995., Gene cassettes: a new class of mobile
element ., Microbiology 141:3015 –3027.
109. Rizek C., Fu L., Dos Santos L.C., Leite G., Ramos J., Rossi F., Guimaraes T.,
Levin A.S., Figueiredo Costa S., 2014, Characterization of carbapenem -resistant
Pseudomonas aeruginosa clinical isolates, carrying multiple genes coding for this
antibiotic resistance. Ann Clin Microbiol , 13, 1 –5.
110. Rodriguez -Villalobos H., Bogaerts P., Berhin C., Bauraing C., Deplano A.,
Montesinos I., de Mendonça R., Jans B., Glupczynski Y., 2011, Trends in production

98
of extended -spectrum β -lactamases among Enterobacteriaceae of clinical interest:
results of a nationwide survey in Belgian hospitals. J. Antimicrob.Chemother. 66, 37 –
47.
111. Rossolini G.M., D'Andrea M.M., Mugnaioli C. 2008. The spread of CTX -M-
type extended -spectrum β -lactamases . Clin. Microbiol. Infect. 14 (1): 33 -41.
112. Schulert G. S., Feltman H., Rabin S. D., Martin G. C., Battle S. E., Rello J.,
Hauser A. R., 2003, Secretion of the toxin ExoU is a marker for highly virulent
Pseudomonas aeruginosa isolates obtained from patients with hospital -acquired
pneumonia . J Infect Dis., 188, 1695 –1706.
113. Shahid M , Singh A , Sobia F , Rashid M , Malik A , Shukla I , Khan HM .,
bla(CTX -M), bla(TEM), and bla(SHV) in Enterobacteri aceae from North -Indian
tertiary hospital: high occurrence of combination genes. Asian Pac J Trop Med. 2011
Feb;4(2):101 -5.
114. Shakil S., Khan R., Zarri lli R., Khan A. U., 2008, Aminoglycosides versus
bacteria – a description of the action, resistance mechanism, and nosocomial
battleground, Journal of Biomedical Science, 15:5 –14 DOI 10.1007/s11373 -007-9194 –
y.
115. Shaw, K. J., P. N. Rather, R. S. Hare, G. H. Miller. 1993. Molecular
genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the
aminoglycoside -modifying enzymes . Microbiol. Rev. 57:138-163.
116. Strahilevitz J., Jacobz G. A., David C., Hooper, Ari Robicse K, Plasmid
mediated Quinolone R esistance: a Multifaced Threat Clin Microbiol, 2009, 22(4):664 –
670
117. Swartz N. M., 2000, Minireview: Impact of antimicrobial agents and
chemotherapy, from 1972 to 1998 , Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2000 –
2016.
118. Todar K., 2002, Antimicrobial agents used in treatment of infectious disease ,
Textbook of Bacteriology, Wisconsin -Madison
119. Van der Bij A. K., Van Mansfeld R, Peirano G., Goessens v. H., A.Severin J.,
Pitout J.D., Willems R.,. Van Westreenen V., 2011 . Firstoutbreak of VIM -2 metallo –

99
beta-lactamase -producing Pseudomonasaeruginosa in The Netherlands: microbiology,
epidemiology and clinical outcomes. Int J Antimicrob Agents 37:513 -518.
120. Vassu T, Stoica I, Csutak O, Mușat F,2001, Genetica microorganismelor și
inginerie genetică microbiană , Ed. Petrion, București
121. Wilson J, Elgohari S, Livermore DM, 2011, Trends among pathogens reported
as causing bacteraemia in England , 2004 -2008. Clin Microbiol Infect;17:451 -458.
122. Walsh T. R., Toleman M. A., Poirel L., Nordmann P. , Rev. 2005, Metallo -beta-
lactamases: the quiet before the storm? Clin Microbiol ;18(2):306 –25
123. WHO, 2016, The burden of health care -associated infection worldwide .
[Online] Available from: http://www.who.int/gpsc/country_ work/burden_hcai/en/
124. Weldhagen G. F., Poirel L., Nordmann P. 2003. Ambler class A extended –
spectrum beta -lactamases in Pseudomonas aeruginosa: novel developments and
clinical impact . Antimicrob Agents Chemother. 47: 2385 –2392.
125. Williamson D. A., Sidjabat H. E., Freeman J. T., Roberts S. A., Silvey A., et
al., 2012, Identification and molecular characterisation of New Delhi metallo -b-
lactamase -1 (NDM -1)- and NDM -6-producing Enterobacteriaceae from New Zealand
hospitals. Int J Anti microb Agents 39: 529 –533.
126. Wright GD. Bacterial resistance to antibiotics: enzymatic degradation and
modifi cation . Adv Drug Delivery Rev 2005;57(10):1451 -70.
127. Wilke M., Lovering A., Strynadka N., 2005 , β-Lactam antibiotic resistance: a
current structural perspective, Current Opinion in Microbiology, 8:525 –533
128. Woodford N., Ellington M.J., Coelho J.M., Turton J.F., Ward M.E., Brown S et
al. 2006. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in
Acinetobacter spp . Int J Antimicrob Agents. 27(4):351 -353.
129. Woodford N, Reddy S, Fagan EJ, Hill RL, Hopkins KL, et al., 2007, Wide
geographic spread of diverse acquired AmpC beta -lactamases among Escherichia coli
and Klebsiella spp. in the UK and Ireland . J Antimicrob Chemother 59:102 –105.
130. Yong D., Tol eman M. A., Giske C. G., Cho H. S., Sundman K., Lee K., et al.,
2009, Characterization of a new metallo -beta-lactamase gene, bla(NDM -1), and a
novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella

100
pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 5046 –
5054.doi:10.1128/AAC. 00774 -779.
131. Zhao, W. H., G. Chen, R. Ito, and Z. Q. Hu. 2009. Relevance of resistance
levels to carbapenems and integron -bome bla IMP-1, bla IMP-7, bla IMP-10 and bla VIM-2 in
clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. J Med Microbiol 58:1080 -1085 .
132. Ziha-Zarifi I., Llanes C., Kohler T., Pechere J. C., Plesiat P., 1999 In vivo
emergence of multidrug -resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa overexpressing
the active efflux system MexA -MexB -OprM. Antimicrob Agents Chemother; 43:287 –91
133. https://www.britannica.com/science/antibiotic -resistance
134. www.ecdc.europa.eu
135. http://www.pseudomo nas.com