Ș.L. dr. Schröder Verginica [618109]

UNIVERSITATEA “OVIDIUS” DIN CONSTANȚA
FACULTATEA DE FARMACIE
PROGRAMUL DE STUDII FARMACIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Conf. univ. dr. Stoicescu Ramona Mihaela

ÎNDRUMĂTOR ȘTIINȚIFIC:
Ș.L. dr. Schröder Verginica

ABSOLVENT: [anonimizat]
2019

UNIVERSITATEA “OVIDIUS” DIN CONSTANȚA
FACULTATEA DE FARMACIE
PROGRAMUL DE STUDII FARMACIE

Nr. de înregistrare FF….. …
Avizat Data:
Semnătură coordonator:

REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE
A TULPINILOR UROPATOGENE
ALE SPECIEI ESCHERICHIA COLI

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
Conf. univ. dr. Stoicescu Ramona Mihaela

ÎNDRUMĂTOR ȘTIIN ȚIFIC:
Ș.L. dr. Schröder Verginica

ABSOLVENT: [anonimizat]
2019

1
Cuprins
Parte a generală
Introducerea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 3
Capitolul I- Generalit ăți Escherichia coli ………………………….. ………………………… 4
I.1 Escherichia coli – istoric ………………………….. ………………………….. ………………. 4
I.2 Clasificare a științifică ………………………….. ………………………….. …………………. 5
I.3 Habitat ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 5
I.4 Caractere morfologice ………………………….. ………………………….. ……………….. 5
I.5 Caracteristicile culturare ………………………….. ………………………….. …………….. 6
I.6 Structura antigenică ………………………….. ………………………….. ………………….. 6
I.7 Testare a antigenică ………………………….. ………………………….. …………………… 7
I.8 Caractere de patogenitate ………………………….. ………………………….. …………… 7
I.9 Factori de virulență ………………………….. ………………………….. …………………… 14
I.10 Cerințe de cultură ………………………….. ………………………….. ………………….. 15
I.11 Diagnostic de laborator ………………………….. ………………………….. …………… 16
I.11.1 Examenul sângelui ………………………….. ………………………….. ……………… 16
I.11.2 Examenul urinii ………………………….. ………………………….. …………………… 16
I.11.3 Examenul materiilor fecale ………………………….. ………………………….. …… 17
Capitolul II – Infecția tractului urina r(ITU) ………………………….. ………………………. 18
II.1 Generalități ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 18
II.2 Clasificarea infecțiilor tractului urinar ………………………….. ……………………… 20
II.3 Clasificarea factorilor de risc ………………………….. ………………………….. …….. 20
II.4 Factori care favorizează apariția infecției tractului urinar ……………………….. 21
II.5 Simptomele infecției tractului urinar ………………………….. ……………………….. 22
II.6 Prognosti cul unei infecții ale tractului urinar ………………………….. …………….. 23
II.7 Testul imagistic ………………………….. ………………………….. ………………………. 24
II.8 Frecvența specie Escherichia coli în apariția infecțiilor tractului urinar ……… 24
Capitolul III – Izolarea și caracterizarea bacteriei Escherichia coli ………………….. 26
III.1 Izolarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 26
III.2 Contr olul de calitate ………………………….. ………………………….. ……………….. 26
III.3 Confirmarea izolatelor ………………………….. ………………………….. ……………. 27
III.3.1 Testele IMVIC ………………………….. ………………………….. …………………….. 27
III.3.2 Testul indol ………………………….. ………………………….. ………………………… 28
III.3.3 Testul roșu de metil ………………………….. ………………………….. …………….. 28
III.3.4 Testul Voges -Proskauer ………………………….. ………………………….. ………. 29

2
III.3.5 Testul citrat ………………………….. ………………………….. ………………………… 29
III.3.6 Sistemul API 20 E ………………………….. ………………………….. ………………. 29
III.4 Spectometria de masă MALDI -TOF ………………………….. ………………………. 30
III.5 Convergența izolatelor ………………………….. ………………………….. ……………. 30
III.6 Conservarea izolatelor de Escherichia coli ………………………….. …………….. 31
III.7 Serotipizarea ………………………….. ………………………….. ………………………… 32
III.8 Reacția în lanț a polimerazei(PCR) ………………………….. ……………………….. 32
III.9 Secvențierea ADN ………………………….. ………………………….. …………………. 33
III.10 Starea viabilă, dar noncultivabilă ………………………….. ………………………… 33
Capitolul IV – Escherichia coli uropatogenă(UPEC) ………………………….. ………… 35
IV.1 Escherichia coli uropatogenă și virulența acesteia ………………………….. ….. 35
IV.1.1 Adezinele ………………………….. ………………………….. ………………………….. 36
IV.1.2 Adezinele Afa/Dr ………………………….. ………………………….. ………………… 36
IV.1.3 Lipopolizaharidele ………………………….. ………………………….. ………………. 37
IV.1.4 Toxinele ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 38
IV.1.5 Sistemele de achiziție a fierului ………………………….. …………………………. 38
IV.2 Biofilmu l ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 39
IV.3 Capsula ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 39
IV.4 Motilitatea ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 39
IV.5 Mecanisme de auto -apărare ………………………….. ………………………….. …… 40
Capitolul V – Rezistența la antibiotic e și antibioterapia infecțiilor urinare cauzate de
Escherichia coli ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 41
V.1 Antibioticul – Generalități ………………………….. ………………………….. ………….. 41
V.2 Clasificarea antibioticelor ………………………….. ………………………….. ………… 41
V.3 Antibiotice indicate în infecțiile urinare ………………………….. …………………… 43
V.4 Rezistența la antibiotice ………………………….. ………………………….. ………….. 43
V.5 Factori declanșatori ai rezistenței la antibiotice ………………………….. ……….. 44
V.6 Mecanismele rezistenței bacteriene la antibiotice ………………………….. …….. 45
Parte a personal ă
Capitolul VI – Determinarea gradulu i de rezistență la antibiotic e a Escherichia coli
din infecțiile urinare ………………………….. ………………………….. ……………………… 46
VI.1 Material și metodă ………………………….. ………………………….. …………………. 46
VI.2 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ……………….. 50
Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 56
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……… 57

3
Introducere

Infecțiile tractului urinar cauzate într -un pr ocent de 75 -90% de bacteria
Escherichia coli, sunt cele mai întânlite infecții bacteriene umane fiind
responsabile de morbiditatea si mortalitatea substanț ială a indivizilor.
Capacitatea microorganismului de a dezvolta rezistență la acțiunea
antibioticelor este cunoscută încă de la descoperirea agenților antimicrobieni.
Profesioniștii din domeniul medical au ridicat semene de îngrijorare la
acțiunea consumului excesiv de antibiotic în rândul indivizilor. Folosirea
antibioticelor excesiv și fără realizarea unei antibiograme înainte de medicație
oferă bacteriilor rezistentă la tratamentele viitoare, iar antibioticele își pierd din
eficacitate.
În elaborarea acestei lucrări este reprezentată sinteza un or investigații
asupra tulpinilor de Escherichia Coli prin realizarea antibiogramelo r pe tulpinile
izolate din infecțiile urinare. Studiul a fost realizat pe un lot de 5 tulpini de
Escherichia coli , față de care am testat rezistența/sensibilita tea unor antibiotice
specifice: Amoxicilină+acid clavulanic, Ampicilină, Cefaclor, Cefazolin,
Cefotaximă, Piperaciclină+Tazobactam, Trimetoprim/sulfametoxazol, Ceftibuten,
Fosfomicină, Gentamicină, Levofloxacin, Nitrofurantoin și Cefuroxim.

4
Capitolul I- Generalit ăți Escherichia c oli
I.1 Escherichia coli -istoric

Theodor Escherich , microbiologul și pediatrul german în anul 1884 a
început un studiu pe microbii intestinali la copii și rolul lor în digestie și b oli. În
decursul acestui studiu a descoperit o bacterie cu o dezvoltare rapidă pe care a
numit -o Bacterium coli commune, fiind cunoscută în p rezent sub numele de
Escherichia coli în onoarea sa [1].

Figura 1 . Aspect de microscopie electronică Escherichia coli 1000X
(http://cdn.biologydiscussion.com/wp -content/uploads/2016/05/image -39.png )
Escherichia coli a fost izolat ă dintr -o serie variată de infecții, printre care :
infecții urinare, septic emii, endocardite maligne, iar î n ultim a vreme un grup de
cercetători au identificat anumite tipuri serologice de Escherichia coli în etiologia
diareei maligne a nou -născuților și în sindromul toxico -septic epidemic [3].

5
I.2 Clasificarea științifică

Domeniu: Bacteria
Încrengătură:Proteobacteria
Clasă: Gammaproteobacteria
Familie: Enterobacteriaceae
Gen: Escherich ia
Specie: Escherichia coli
I.3 Habitat

Încă din primele ore după naștere, comensal obișnuit Escherichia coli se
găsește în tractul intest inal al omului și al animalelor reprezentând habitatul
principal. Se pot găsi concomitent mai multe tipuri serologice: tipurile tranzitorii
cu o rezistentă pe intervale scurte de timp, în timp ce tipurile rezistente au un timp
mai îndelungat, uneori chiar ani de zile [3].
I.4 Caractere morfologice

Din punct de vedere morfologic , bacteria Escherichia coli este aranjată
individual sau în perechi sub forma unor bastonașe de dimensiuni variabile între 2
și 3µ lungime și 0,4 și 0,6 µ grosime. Prezint ă un polimorfism accentuat, apare
uneori cu forme filamentoase până la 8 µ lungime , după cum poate fi găsit în
form ele scurte, chiar cocoide. Sunt organisme G ram-pozitive , mobile și
nesporulate. Cu toate acestea există de asemenea și organisme imobile sau cu o
mobilitate mai redusă [3].

6
I.5 Caracteristicile culturale

În mod optim, dezvoltarea bacteriei Escherichia coli are loc la o
temperatură de 37ș C. Unele tulpini în condiții de laborator se pot m ultiplica la
temperaturi de până la 49ș C [4]. Escherichia coli se dezvoltă pe orice mediu de
cultu ră care conține: glucoză, fosfat de amoniu monobazic, clorură de sodiu , sulfat
de magneziu , fosfat de magneziu, dibazice și apă. Dezvoltarea bacteriei poate fi
influențată de: respirația anaerobă folosind o varietate de reacții redox , oxidarea
acidului piruvic , acidului formic, hidrogenului, aminoacizi lor și reducerea
substr aturilor [5]. Escherichia coli este clasificat ca un anaerob f acultativ, folosind
oxigenul când este prezent , dar acesta are abilitat ea de a se dezvolta și î n absenț a
oxigenului folosind procesul de fermentare sau respirația anaerobă. Abilitatea de a
conti nua să se dezvolte în absența oxigenului reprezintă un avantaj pentru
Escherichia coli deoarece posibilitatea de supraviețuire este crescută în mediile în
care predomină apa [6].
I.6 Structura antigenică
Proprietăți antigenice: Există mai mult de 1000 de tipuri antigenice ale
bacteriei Escherichia coli [7].
„O”- antigenul somatic (>150 tipuri)
„H”- antigenul flagelar(>50 tipuri)
„K”- antigenul capsular(>90 tipuri)
Heterogenitatea antigenică este reprezentată prin prezența multiplelor
fracțiuni antigenice , flagelare, somatice și a variatelor antigene de înveliș sau
capsulare.
Antigenul somatic „O” este insensibil la ac țiunea că ldurii, rezintând 2 ½
ore la 100 ș C. Din punct de vedere chimic , este de natură glucido -lipido –
polipeptidică. Nu este distrus de alc ool, formol si acid clorhidric.
Antigenul flagelar „H ” este de natur ă proteică , rezistent la acțiunea căldurii
și insensibil l a acțiunea formului. Alcoolul prin rolul său încetini nește sau
împiedică activitatea aglutinantă și capacitatea sa de adsorbție.

7
Antigenul capsular „K” este reprezentat prin 3 factori antigenici „L”, „ A”
și „B”, care de cele mai multe ori nu aparțin ace leași tulpină de Escherichia coli .
Aceste antigene se comportă diferit față de agenți fizici și chimici.
Antigenul „L” este un antig en somatic de înveliș, termolabil. Distrugerea
antigenului „L” se realizează prin încălzire timp de 60 de minute la 100 ș C. De
asemenea alcoolul și acidul clorhidric îl distrug. Fiind așezat l a suprafața corpului
bacterian, determină O -inaglutinabilitat ea germenului. Conferă tulpinilor pe care
îl posedă o patogenitate marcată. Tulpinile de Escherichia coli care au în structură
antigen „L” sunt adesea hemoltice și necrot ice. Inoculat la animale, stimulează
producerea de anticorpi „L” care au rol protecto r.
Antigenul „A” este puternic termostabil, neput ând fi distrus decât de acool
și atunci când este expus la 120 șC timp de 2 ore. Este rezistent la formol și acid
clorhidric. Ca și antigenul L, determină O -inagl utinabi litatea tulpinilor care îl
posedă în structura antigenică . Conferă o reziste nță pronunț ată la bacterioliză și
fagocitoză fiind bacteriofag. Tulpinile de Escherichia coli în care sunt întânlite
antigen ul „A” manifestă o patogenitate redusă dezvoltând colonii voluminoase
,albicioase și opace a semănătoare coloniilor mucoase [3].
I.7 Testarea antigenică
Bacteria Escherichia coli a fost în principal subdivizată într -un număr de
grupuri atigenice „O ” care la rândul lor au fost subdivizate în subgrupuri cu
diferite antigene „K”. Fiecare subgrup incl ude tulpini cu diferite antigene „H”.
Numere separate au fost alocate anterior pentru antigenele „B”, dar ulterior aceste
numere au fost incluse în aceleași serii consecutive ca restul de antige ne „K”.
Astfel o tulpină este înregistrată ca 0111 ;K58;H12 [8].
I.8 Caractere de patogenitate

Escherichia coli este cunoscută ca fiind o bacterie care poat e provoca
infecții intestinale, dar și infecții în afara tractului digestiv. Simptomele pe care le
întâmpinăm într -o infecție cu bacteria Escherichia coli depind de tipul și de locul
unde apare aceasta.

8
 Tulpini comensale de Escherichia coli
 Tulpini patogene intestin ale de Escherichia coli (enteric /diareigen)
care cuprind la r ândul lor următoarele patotipuri :
– Escherichia coli enteropatogen (EPEC)
– Escherichia coli enteroagregativ (EAEC)
– Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC)
– Escherichia coli cu aderență difuză (DAEC)
– Escherichia coli entererohemoragic (EHEC)
 Tulpinile patogene extraintestinale de Escherichia coli ,cele mai
comune tulpini sunt :
– Escherichia coli uropatogenic (UPEC)
-Meningită neonatală Escherichia coli (NMEC)
-APEC(Avian Pathogenic E.coli) – patogen specific păsărilor
– Escherichia coli necrotoxigenic (NTEC)
– Escherichia coli septicemic
Tulpini comensale de Escherichia coli
Escherichia coli este o specie bacteriană versatilă cu un spectru larg
de habitate și fenotipuri. Escherichia coli este prima bacterie care col onizează
intestinul imediat după naștere. Colonizarea este definită ca persistența
nedeterminată a unei anumite populații bacteriene fără reintroducerea acelei
bacterii.
Escherichia coli enteropatogen (EPEC)
Tulpinile intestinale patogene EPEC sunt clasificat e în tulpini tipice
(majoritatea acestor tulpini aparțin serotipu rilor clasice O: H) și atipice. Studiile
epidemiologice recente indică faptul că tulpinile intestinale patogene EPEC –
atipice sunt mai răspândite decâ t cele EPEC -tipice atât în tările dezvo ltate cât și

9
în tările în curs de dezvoltate, găsindu -se atât în diareea endemică pediatrică cât și
în cazurile de diaree acută. Fenotipul distinctiv al tulpinilor EPEC are capacitatea
de a produce atașarea și eliminarea leziunilor (A / E). În leziunea A / E, bacteriile
se atașează strâns de membrana celulei gazdă provocând o perturbare a suprafeței
celulare care duce la eliminarea microvililor [9]. Mecanismul patogen al tulpinilor
intestinale EPEC este reprezentat prin aderarea la mucoasa intestinală, provocând
pierderea microvililor și împiedicând intrarea bacteriilor în mucoasă producând de
asemenea o toxină asemănătoare cu S higella [8].
Escherichia coli enteroagregativ(EAEC)
Tulpinile patogene intestinale EAEC sunt asociate cu cazuri de diaree
acută sau persistentă în rândul copii lor si al adulților , de asemenea reprezintă
cauza dia reei apoase și implicarea în dezvoltarea sindromului de colon iritabil.
Este o cauză frecventă de apariț ie a diareei călătorului . În urma cazurilor
raportate , pacienții nu au prezentat în toate infecțiile cu tulpinile patogene EAEC
simptome, cele mai întănlite sunt durerile abdom inale, greată, vărsături și febră .
Numeroasele variații ale simptomelor clinice ale infecției cu EAEC s e datorează
unor factori precum : susceptibil itatea genetică a gazdei, răspunsul imun al gazdei,
eterogenitatea virulenței dintre tulpinile EAEC și cantitatea de bacterii ingerate de
gazda infectată. Cea mai întânlită afecțiune este diareea apoasă cu sau fără
sânge.La nivelul colonului tulpinile EAE C produc efecte toxice generând
mediatori inflamatorii.
Patogeneza EAEC implică trei etape :
Prima etap ă: aderarea la mucoasa intestinal ă.
A doua etapă: creșterea producției de mucus care încorporează tulpinile de
EAEC pe suprafața ent erocitelor .
A treia etapă: eliberarea toxinelor și determinarea unui răspuns inflamator,
toxicității mucoasei și secreției intestinale [10] .

10
Escherichia coli enteroinvaziv (EIEC)
Tulpinile intestinale patogene EIEC sunt reprezentate de un grup d e agenți
patogeni intracelulari capabili să pătrundă în celulele epiteliale ale colonului, să se
multiplice în interiorul acestora și să se deplaseze între celulele adiacente cu un
mecanism similar toxinei Shigella, egentul etiologic al dezinteriei bacilar e,
caracterizat prin prezența sângelui , mucusului și leucocitelor în scaune . Tulpinile
EIEC sunt distribuite între grupările filogenetice Escherichia coli și corespund
bioserotipurilor găsite în multe serogrupuri ale bacteriei.
Tulpinile intestinale patoge ne EIEC și toxina Shigella își petrec o mare
parte din ciclul lor de viață în celulele eucariote. În mod similar cu toxina
Shigella, majoritatea tulpinilor EIEC nu au capacitatea de a decarboxila lizină și
de a fermenta lactoză. Serotipurile alocate tul pinilor EIEC sunt urmatoarele:
O28ac:H -, O29:H -, O112ac:H -, O115:H -, O121:H -, O124:H -, O124:H7,
O124:H30, O124:H32, O135:H -, O136:H -, O143:H -, O144:H -, O144:H25,
O152:H -, O159:H -, O159:H2, O164:H -, O16 7:H-, O167:H4, O167:H5, O173:H –
și cel mai recent O96:H19. Unele dintre aceste antigene ˶O” asociate tulpinilor
EIEC cum ar fi: O28, O112ac, O121, O124, O143, O144, O152 și O1 67, sunt
identice cu antigenele ˶O“ prezente în toxina Shigella. Evoluția tulpinilor EIEC
este determinat ă în principal prin două mec anisme: primul mecanism are un rol
foarte important în colonizarea unui nou mediu gazdă și cel de al doilea mecanism
contribuie la c onducerea evoluției bacteriilor către un fenotip mai patogen [11].
Escherichia coli cu aderență difuză (DAEC)
În tările în c urs de dezvoltare cea mai frecventă problemă este reprezentată
de diaree a acută. Agenții infecțioși sunt responsabili pentru majori tatea cazurilor .
Cunoașterea cauzei diareei acute este importantă în dezvoltarea planurilor de
prevenire, control și terapie a bolilor. Tulpinile patogene intestinale D AEC se
prezintă la copii fară să producă simptome [12].
Escherichia coli entererohemoragic (EHEC)
Manifestările clinice ale infecției cu tulpinile EHEC diagnostichează
pacienț ii cu diaree sângeroasă și sindrom ure mic hemolitic.

11
Tulpini le EHEC produc toxina Shiga care este respons abilă pentru o mare
parte a morbid ității si mortalității . Toxina Shiga este com pusă din două subunități
majore A și B. Utilizarea antibioticelor convenționale agravează citotoxicitatea
mediată de toxina Shiga. Într -un studiu de ep idemiologie realizat de centrele
pentru controlul și prevenirea bolilor, pacienții tratați cu antibiotice pentru enterită
EHEC aveau un risc mai mare de a dezvolta HUS (sindromul hemolitic uremic).
Antibioticele contribuie la producția de toxine Shiga prin îmbunătățirea replicării
și exprimării genelor stx. Stx este o citotoxină codificată bacteriofag fiind extins ă
dintr -o singură unit ate transcripțională care provoacă daune unei va rietăți de t ipuri
de celule. Stx-urile pot fi împărțite în două grupuri numite Stx1 și Stx2, dar care
nu generează anticorpi cu reacție încrucișată, fiind 56% omol oage în secvențe de
aminoacizi.
Stx are o structură conservată alcătuită dintr -o subunitate A activă
enzimatic (A1) și cinci subunități B identice de legare a receptorului (B5).
Subunitatea B5 se leagă de recept orii gazdă specifici globotriaosilceramidei (Gb3)
sau g lobotetraosilceramidă (Gb4) . După legarea Stx (A1B5) la celula gazdă,
subunitatea A este inte riorizată la citoplas mă. I nhibă sinteza proteinelor prin
îndepărtarea specifică a unui singur rezidu u de adenină din ARN 28S din
subunitatea ribozomală 60S [13].
Colonizarea acestuia se realizeză prin trece rea barierei acide a stomacului .
Tulpinile EHEC au un sistem complex ce le permite supraviețuirea prin mediul
acid al stomacului .Trei sisteme de AR (rezistența la acid) au fost i dentificate în
tulpinile E.coli : sistemul AR 1(reprimat de glucoză sau oxidativ ), sistemul AR 2
(depen dent de glutamat) și sistmul AR 3 (dependent d e arginină) [14].
Escherichia coli uropatogenic (UPEC)
Infecțiile tractului urinar sunt larg răspândite și afectează o mare parte a
populației umane. Studiile de specialitate au estimat că aproximativ 150 de
milioane de oameni dezvoltă în fiecare an un epi sod de infecție al tractului urinar.
Principala cauză aso ciată dezvoltării infecț iei tractului urinar este t ulpina patogenă
extraintestinală Escherichia coli uropatogenă (UPEC).

12
Tulpinile UPEC posedă o mulțime de factori structurali (fimb rii, pili, curli,
flagela), factori de virulență(adezinele, toxinele, polizaharidel e) care contribuie la
capacitatea lor de a provoca infecții ale tractului urinar, deși capacitatea de a adera
la celulele epiteliale gazdă în tractul urinar reprezintă cel mai important
determinant al patogenități [15].
APEC (Avian Pathogenic Escherichia coli) – patogen specific păsărilor
Tulpinile patogene e xtraintestinale APEC provoacă: aerosaculită
(inflam area sacilor aerieni la păsaări), poliserozită, septicemie și alte boli
extraintesti nale în rândul speciilor a viare. Tulpinile APEC se găsesc î n microflora
intestinală a păsărilor sănătoase și majoritatea bolilor asociate acestora sunt
reprezentate de factori mediului si al gazdei . Izolatele tulpinilor APEC aparțin în
mod obișnuit anu mitor serogrupuri: O1, O2 și O78 și unui număr restrâns de
clone. Diagnosticul infecțiilor cu APEC se bazează pe tabloul clin ic, leziunile și
izolarea Escherichia coli. Aceasta poate fi consolidată prin serotiparea și
identificarea factorilor de virulență fo losind me tode imunologice sau moleculare
cum ar fi sondele ADN și PC R. Abordările pentru prevenirea și controlul
infecțiilor APEC includ contr olul contaminării mediului și al parametrilor acestuia
, cum ar fi umiditatea și ventilația. Antibioterapia este u tilizată pe scară largă, deși
tulpinile APEC sunt deseori rezistente la o gamă largă de antibiotice. Vaccinurile
care conțin bacterii virulente ucise sau atenuate protejează împotriva infecției cu
tulpina omologă, dar sunt mai puțin eficiente împotriva tu lpinilor heterologe. Prin
urmare, vaccinarea împotriva colibacilozei nu este practicată pe scară largă din
cauza numeroase lor serogrupu ri implicate în focare de teren [17].
Escherichia coli necrotoxigenic (NTEC)
Tulpinile patogene extraintestinale NTEC au fost definite inițial ca tulpini
Escherichia coli care produc o toxină numită factor de necrotizare citotoxică
(CNF ). Două tipuri de CNF au fost identificate, fiecare dintre ele fiind legate
genetic de markeri de virulență șpecifici, definind două categor ii distincte
omogene de tulpini NTEC numite NTEC -1 și NTEC -2. Tulpinile NTEC -1 pot fi
găsite la om și la toate speciile de mamifere domestice, în timp ce tulpinile
NTEC -2 au fost raportate numai la rumegătoare.

13
Implicarea tulpinilor NTEC a fost clar stabi lită în infecțiile extra –
intestinale ale oamenilor și animalelor, de exemplu în infecțiile tractului urinar
pentru tulpinile NTEC -1. Rolul lor în sindroamele dizenterice severe, atât la om
cât și la animale, este demonstrat de mai multe rapoarte clinice [18].
Bacteria Escherichia coli mai poate provoca și alte infecții :
Meningită neonatală Escherichia coli (NMEC)
Se estimează că apa riția meningitei bacteriene neo natală este provocată de
Escheri chia coli . Copiii prematuri și cei născuți cu o gre utate mai mică prezintă
un risc crescut de a contracta acest tip de meningită. O tulpină de Escherichia coli
numita K1 provoacă marea majoritate a cazurilor de meningită neonatală. Nou –
născuții se pot infecta cu Escherichia coli K1 în timpul nașterii sau d in bacterii
dobândite ulterior. Nou -născuții pot prezenta următoarele simptome: icter,
convulsii, vărsăturii, nervozitate, iritabilitate și letargie [16].
Sepsis
O altă infecție cu b acteria Escherichia coli care prezin tă un risc pentru
nou-născuți și bebel uși este sepsisul neonatal. Sepsisul neonatal este o infecție a
sângelui care apare la copiii cu vârstă mai mică de 90 de zile . Infecția poate fi
obținută de la mamă înainte , în timpul sau după naștere. Semnele și simptomele
sunt următoarele : diaree, glicemie scăzută, convulsii, vărsături. Sepsisul neonatal
reprezintă o problemă gravă și o cauză principală a mortalității infantile [16].
Pneumonia
Streptococcus pneumoniae este cel mai frecvent agresor bacterian al
pneumoniei , dar uneori această infectie p oate fi provocată și de bacteria
Escherichia coli. Cele mai frecvente siptome ale pneumoniei includ: dureri
toracice, tuse, greață, vărsături, diaree, oboseală, frisoane, confuzie (vizează
persoanele cu vârsta peste 65 de ani ), temperatura corporală sub v alorea normală
(sunt predispuse persoanele care un sistem imunitar slăbit) [16].

14
I.9 Factori de virulență

Pili: ajută aderarea organismelor la celulele jejunului și ileonului în caz de
infecție a tractului intestinal; epiteliul tractului urinar în cazul infecțiilor tractului
urinar. Pili se găse sc în organismele gram -negative , sub forma de pr oiecții
minuscule care se exti nd din membrana celulară în mediul extern . Sunt cunoscute
două tipuri generale de Pili:
Pili comun i- prin intermediul acestui pil bact eriile se atașează de receptorii
specifici de pe suprafața celulelor umane , reprezentând primul pas în stabilirea
infecției în unele organisme. Aceștia contribuie la patogenitatea anumitor bacterii
prin capacitatea lor de a produce un dezechilibru al organ ismulu i și prin
accelerarea colonizării.
Pili sexuali – Reprezintă un tip specializat de pili care formează
atașamentul dintre bacteriile masculine (donatoare) și bacteriile feminine
(receptoare ) în timpul conjugării și acționează c a un canal în trecerea A DN-ului.
Acest proces este bine caracterizat în bacilul gram -negativ Escherichia coli .
Capsula : împiedică procesul de fa gocitoză.
Capsulele limitează capacitatea fagocitelor de a îngloba bacteriile. Natura
netedă și încărcarea negativă a capsulei împied ică fagocitul să adere și să
înglobeze celula bacteriană. Dacă o bacterie patogenă pierde capsula îi va pierde
virulența.
Endotoxina (lipopolizaharidă): responabilă pentru mai multe trăsăt uri ale
sepsisului G ram-negativ , cum ar fi febra , hipotensiunea și coagularea
intravasculară diseminată (DIC).
Exotoxinele, de ex. enterotoxina care acționează asupra celulelor jejunului
și ileonului pentru a provoca diaree [7].

15
I.10 Cerințe de cultură

Temperatura optimă : Temperatura care favorizează dezvoltarea bacte riei
Escheric hia coli variază între 10° -40°C , temperature optimă pentru majoritatea
tulpinilor este de 37 ° C .
Mediu de cultură: Există diferite medii de cultură pentru cultivarea
bacteriei Escherichia coli în laboratoarele de specialitate , cele mai util izate medii
sunt mediul celoz ă sânge și mediul MacConkey Agar.
Mediile de cultură :
-Levine EMB Agar (Eosine Methylene –Blue Lactose Agar )
-Mediu solid cu cazeină,magneziu și drojdie
-Drigalski Lactose Agar ( ABTLE)

Figura 2 . Echerichia coli însămânțat ă pe mediul geloză sânge
(https://163602 -560839 -raikfcquaxqncofqfm.stackpathdns.com/wp –
content /uploads/2017/07/E. -coli-on-Blood -Agar.jpg )

16
pH-ul optim: E.coli poate supra viețui la un pH cuprins în intervalul 4,5 –
9,5, cel mai favorizant pH pentru dezvoltar ea bacterei este la un pH neutru.
Oxigen: Escheri chia coli este o bacterie aerobă facultative anaer obă, dar se
poate dezvolta și în tr-un mediu deficitar de oxigen [19].
I.11 Diagnostic de laborator

Realizarea diagnosticului de laborator are la bază izolarea ș i identificarea
microorganismului în produsele patologice. Produsele patologice sunt recoltat e în
funcție de tipul infecției :
-sânge (în stării septice )
-urină (în infecțiile tractului urinar)
-materii fecale (în infecții localizate în tubul digestiv)
-puroi, exsudate (din focare inflamatoare)
-lichid cefalorahidian (în localizări meningi ene)
I.11.1 Examenul sângelui

Sângele este recoltat în condiții speciale, sterile și însămânțat în bulion
nutritiv. Se introduce în termostatul sistemului BacT/Alert pentru maxim 7 zile.
Dacă bacteriile se dezvoltă în mediul bulion nutritiv aparatul trim ite semnale
acustice și vizuale, iar suspensia se trece cu ajutorul unei anse bacteriologice pe
medii de cultură solide de tip geloză sânge si Drigalski Lactose Agar . După care
mediile sunt incubate din nou la o temperature de 37 ș C. Coloniile dezvoltate sunt
identificate pe baza caracterelor morfologice, biochimice și serologice [3].
I.11.2 Examenul urinii
Urina este însămânțată pe mediul geloz ă sânge și pe mediul diferențial Drigalski
Lactose Agar . După incubare la o temperatură de 37ș C, plăcile sunt exa minate
urmând identificare biochimică și antibiograma [3].

17
I.11. 3 Examenul materiilor fecale

Recoltarea se face din scaunul emis spontan sau cu ajutorul sondei
Nelaton. Produsul suspensionat în ser fiziologic este însămânțat pe medii
diferențiale (mediul Drigalski, mediul Vogelsang sau mediul Levin cu alb astru de
metilen -eozină) [3].

18
Capitolul II – Infecția tractului urinar (ITU)
II.1 Generalități

Infecțiile tractului urinar sunt cele mai întânlite tipuri de infecții bac teriene
diagnosticat e astăzi. Studiile de specialiate au arătat că 40 % dintre femei dezvoltă
cel puțin un episod al infecției tractului urinar în timpul vieții și că 11% dintre
femeile cu vârstă pest e 18 ani au un episod al infecției tractului urinar pe an [20 ].
Infecțiile tractului urinar sunt prezente la pacieți i care au un numar de
bacterii î n urină (în general >150/ml).

Figura 3 . Tractul urinar
(http://www.cdt -babes.ro/articole/img/infectie -urinara .jpg)
Susceptibilita tea de a dezvolta un fenotip al infecției tractului urinar este
legată de mai mulți factori cum ar fi: disfuncțiil e tractului urinar și/sau
mecanismele genetice implicate în control ul răspunsului imun la infecții[20 ]
În special sistem ul imunitar înnăscut poate răspunde fie tiparelor UPEC
PAMPs (modelele m oleculare asociate patogenilor ), fie moleculelor derivate din
celulele deteriorate sau moarte DAMPs (paternuri moleculare asociate deteriorări
). Receptori de recunoaștere a modelului (PRR) au recunoscut aceste modele în
celul ele imune specializate , epiteli ile și alte țesuturi. Asamblarea în citozol a
complexelor proteice multimerice (inflamatori) apare d upă detectarea structurilor
modelelor moleculare asociate patogenilor sau paternur ilor moleculare asociate

19
deteriorări care pot fi formate atât în tractul urinar superior cât și în cel inferior.
Acestea declanșeazâ răspunsuri imune înnăscute prin mecanisme care depind sau
nu de produc erea de citokine proinflamatori [20 ].
Aproximativ 20 -30% dintre femei care au prezentat o infecție a tractului
urinar vor prezenta o recidivă în decurs de 3 -4 luni , în timp ce la copii,
aproximativ o treime care se confruntă cu o infecție a tractului urinar înainte de
vârsta de 1 an, vor avea o recurentă în decurs de 3 ani , iar 18% dintre aceștia vor
avea o recurență în câteva luni. Fenomenul de recurentă se produce datorită
bacteriilor care locuiesc în epiteliul vezicii urinare . Întreținerea pacienților care
suferă de infecții urinare recurente este asigura tă prin profilaxia cu antibiotice , în
unele cazuri infecția tractului urinar trebuie tratat ă prin intervenție chirurgicală
[20].
În timpul sarcinii , infecțiile urinare recurente pot fi frecvente și pot
provoca efecte adverse severe pentru mamă și copil, inclusiv nașterea prematură.
Intervențiile în acest cadru pot fi farmacologice (antibiotice) sau non –
farmacologice (remedii alternative). La femeile aflate la menopauză, terapia
hormonală sistemică nu reprezintă o eficacita te și în cele mai multe cazuri,
bacteriuria asimptomatică în această perioadă nu necesită tratament. Riscul
femeilor aflate după menopauză crește în principal prin scăderea nivelului de
estrogeni , simptome care sunt adesea asociate cu a trofia vaginlă. Jumătate dintre
femeile cu vârs ta cup rinsă între 61 -65 de ani au suferit simptome genitale urinare
în timp ce 29% au avut episo ade de incontinenț ă urinară, toate simptomele
asociate cu bacteriurie [20 ].
Unii oameni dezvoltă infecții recurente ale tractului urinar . Infecția
tractului urinar es te definită prin trei sau mai multe episoade ale infecției tractului
urinar în decurs de 12 luni, precum și două sau mai multe recurențe în decurs de 6
luni.

20

II.2 Clasificarea infec țiilor tractului urinar
Clasificarea infecțiilor urinare din punct de vedere al severității :
-uretrita
-sindromul urosepsis
-pielonefrită (infecția tractului urinar superior)
-cistită (infe cția tractului urinar inferior)
Clasificarea infecțiilor urinare din punct de vedere clinic :
-cazuri complicate
-cazuri necomplicate [20]
II.3 Clasificarea factorilor de risc :

Sistemul ORENUC clasifică factorii de risc în funcție de fenotip :
O- fără factori de risc cunoscuții
R- risc de infecții a tractului urinar recurente fără un rezultat mai sever
E- factori de risc extra -urogenital
N- boli nefropatice relevante
U- factor de risc urologic rezolvabil (tranzitoriu)
C- cateterul urinar extern permanent și factori de risc urologici nerezolvați
[20]

21

În general există trei mecanisme pr incipale responsabile pentru infecția
tractului uri nar:
Colonizarea cu răspândire ascendentă
Răspândirea hematogenă
Răspândirea periurogenitală
Virulența bacteriană [15 ].
II.4 Facto ri care favorizează apariția infecției tractului urinar

– Femeile prezință un risc mai mare de a dezvolta o infecție a tractului
urinar decât barbații datorită diferentelor anatomice, uretra la femei este scurtă și
se află în vecinătatea vaginului și orificiului anal .
-malformați ale tractului urinar
-calculi renali
– Menopauza – rata de infecție este ridicată la femeil e aflate în
postmenopauză din cauza prolapsului vezicii urinare sau a uterului care cauze ază
golirea vezicii incomplete, pierderea hormonului estrogen cu modifi cări asociate
cu flora vaginală (în special pierderea lactobacililor ), care permit colonizarea
periuretrală cu aerobi G ram-negativi
– Persoanele cu sistemul imunitar reprimat – situațiile în care sistemul
imunitar este suprimat sunt infecți ile cu HIV/SIDA și diabetul
– Medicamentele imunosupresoare – chimioterapia pentru cancer prezintă
un risc crescu t
– Pacienții care utilizează catetere, acestea însămânțează organismele în
vezică și contribuie la colonizare prin asigurarea unei suprafețe pentru aderarea
bacteriană și provocă iritarea mucoasei [15]

22
– transplantul renal –susceptibilitatea este destul de ridicată în primele două
luni după transplant
– imunosupresia
– diabet – pacienții cu diabet zaharat prezintă un risc crescut de infecții
urinare complicate
– Leziunile ale maduvei spinării(disfuncții în golirea vezicii urinare)
-Administrarea antibioti celor necorespunzător
-Barbati care suferă de adenom de prostată – poate duce la o golir e
incompletă a vezicii urinare crescând astfel riscul infecției
-Femeile însarcinate prezi ntă un risc crescut pentru o infecție a tractului
urinar , prezentând bacteriur ie asimptomatică care poa te provoca complicații
fătului
II.5 Simptomele infecției tractului urinar

Infecția tractului urinar inferior :
– Mucoasa uretrei și a vezicii urinare devine inflamată și iritată
– Disurie – durere sau arsură în timpul urinării
– polakiurie
– Febră
– Urgentă urinară – senzația de a urina de urgență
– Urină tulbure , urât mirositoare
– Hematurie (prezența de sânge în urină)
– Durere abdominală și pelviană

23
Simptomele infecțiilor tractului urinar inferior dispar de obicei în termen
de 2 4 de ore de la î nceperea medicației. Cura comp letă(minim 5 zile) de
antibiotice prescrise trebui luată chiar dacă simptomele au dispărut pe deplin.
Infecția tractului urinar superior :
– febră
– greață
– vărsături
– dureri laculare : durere în spate sau lat eral, de obicei pe o parte ,
aproximativ la nivelul taliei
Simptomele tractului ur inar superior (pielonefrita) durează de obicei mai
mult timp pentru a răspunde la tratament. De obicei, starea pacientul ui se va
îmbunătăți în termen de 24 de ore, dar va dur a adesea mai mult până sunt
ameliorate toate simptomele.
În cazul nou -născuțiilor, copii lor și vârstnicilor, siptomele clasice ale unei
infecții ale tractului urinar pot sa fie absente .
Nou-născuți: febră sau hipotermie (temperatură scăzută), lipsa apeti tului ,icter .
Sugari: vărsături ,diaree, febră, apetit scăzut .
Copi ii: iritabilitate , apetit scăzut, febră, urinări frecvente .
Vârstnicii: febră sau hipotermie, apetit scăzut, letargie [22].
II.6 Prognosticul unei infecții ale tractului urinar:

Pentru pers oanele cu cistită sau pielonefrită necomplicată, tratamentul cu
antibiotice aduce de obicei o rezoluție completă a infecției [22 ].
Cistita bacteriană (denumită și cistită acută) poate să apară atât la femei
cât și la bărbați acea sta prezintă simptome cum ar fi: urinare frecventă și
dureroasă, prezența sângelui în urina și presiune pelviană [21].

24
Dacă nu sunt tratate prompt, infecțiile tractului urinar pot provoca cicatrici
permanente ale tractului urinar.
Infecțiile recurente ale tractului urinar pot deven i o problemă serioasă și
vor necesita monitorizarea atentă din parte a specialiștilor.
Pielonefrita, dacă nu este tratată prompt, se poate răspândi în fluxul
sanguin și poate provoca o infecție foarte severă. Leziunile renale pe termen scurt
și lung pot fi rezultatul pielonefritei [22 ].
II.7 Testul imagistic

Rareori, un test imagistic poate fi indicat pentru a detecta orice problemă
de bază în tractul urinar care ar putea provoca o infecție. Acest lucru este de
obicei necesar numai în infecții repetate sa u circumstanțe speciale (bacterii
neobișnuite, anomalii anatomice suspectate).
O examinare cu ultrasunete poate evalua problemele renale și ale vezicii
urinare .
Urografia evidențiază eventualele malformați ale tractului urinar ce
predispun copi ii la infecț ii.
Pielograma intravenoasă (IVP) este o serie specială de raze X care
folosește un colorant de contrast pentru a evidenția anomalii în tractul urinar.
Cistoscopia implică introducerea unui tub subțire, flexibil, cu o cameră
minusculă la capăt prin uretră în vezică. Aceasta permite detectarea anomaliilor
din interiorul vezicii urinare care ar putea contribui la infecții.
O scanare prin tomografie computerizată oferă o imagine tridimensională
foarte detali ată a tractului urinar [22].
II.8 Frecvența speciei Escherichia coli în apariția infecțiilor tractului urinar

Infecțiile tractului urinar sunt cele mai întânlite tipuri de infecții bacteriene
în rândul indivizilor . Cele mai frecvente bacterii care cauzează aceste infecții sunt

25
Escherichia coli . Aceasta este responsabil într -un procent de 75 -90%
reprezentând una din cauzele principale ale infecției tractului urinar .
Infectarea nu vizează o a numită parte a tractului urinar , orice parte a
tractului urinar poate fi infectată , majoritatea infec țiilor tractulu i urinar cauzate de
Escherichia coli , apar în tractul urinar inferior care include vezica și uretra [16].

26
Capitolul III – Izolarea și caracterizarea bacteriei Escherichia coli
III.1 Izolarea

Procesul de izolare al probelor se realizează d upa ce acestea au f ost
colectate fiind procesate timp de 24 de ore pe medii de cultură solide. Există
diferite procese prin care se poate realiza izolarea, procesul este ales în funcție de
tulpina țintă și de obiectivul de izolare. Mediul MacConkey agar a re capacitatea
de a fermenta lactoză reprezentând o primă opțiune pentru a diferenția bacteria
Escherichia coli de alte bacterii coliforme care nu fermentează lactoza . Suspensia
probei se inoculează pe mediul MacConkey agar la orice contraț ie (5% în soluți e
salină sau soluție tampon fosfat) du pă care urmează să fie incubate timp de 18 -24
ore la o temperature de 37 ș C. După procesul de incubare, dacă pe mediu sunt
raportate colon ii de dimensiuni medii, rotunde și roz sunt raportate ca fiid
suspecte de prezența bacteriei Escherichia coli . Incubarea mediilor de cu ltură
inoculate la o temperatură de 45 °C selectează tulpinile termofile de Escherichia
coli. Rata de creștere a bacteriilor depinde de densitatea celulară initială din
eșantion. Masa mare a eșanti onului crește în mod normal sensibilitatea procedurii
de izolare. În funcție de gradul de densitate al coloniei , o serie de inoculări pot fi
realizate până la obținerea unor colonii pure, unice sau solitare[24] .
III.2 Controlul de calitate

Una dintre mă surile de control în realizarea controlui calități este
reprezentată de incubarea plăcilor cu medii neinoc ulate la o temperature de 37 °C,
lăsate la incubat pe timpul nopții. Dacă dezvoltarea microbiană nu se realiazează ,
se va asigura că izolatele obținut e după inoculare provin din eșantioane și nu
datorită contaminării. Placa cu medii i noculate trebuie să fie incubată simulta n cu
plăcile cu suport inoculat [24].

27
III.3 Confirmarea izolatelor

Confirmarea izolatelor se poate realiza prin metode biochimic e, enzimatice
sau moleculare. Aleger ea metodei depinde de mai mulți factori si de
disponibilitatea resurselor . Metodele biochimice se realizează cu testele IMVIC și
cu sistemele de analiză a profilului analitic 20E (API 20 E) [24].
III.3.1 Testele IMVIC

Testele IMVIC pot fi utilizate pe ntru realizarea confirmăr i biochimice
.Testele IMVIC reprezintă un set de patru teste (testul cu utilizare de indol, testul
roșu de metil, testul Voges -Proskauer și testul citrat) [24].

Figura 4. Testele IMVIC
(https://www.slideserve.com/brad/practical -medical –
microbiology?fbclid=IwAR3jUv7OLMYohKYk4y1INTU0_H3BhKl -Q76oGU50 –
TEUcQx1 dMGd4WgXcco )

28
III.3.2 Testul indol

Testul indol este folost pentru testarea bacteriilor verificându -se
capacitatea acestora de a produce indol din triptofan (aminoacid) folosind enzima
triptofanază. Se formează un amestec (apă de peptonă și triptofan) care este
inoculat cu izolatul de bacterii care trebuie testat. Amestecul este incub at peste
noapte la o temperatură de 37 șC. După ce s -a realizat procesul de incubare se
adaugă câteva picături de reactiv Kovac peste amestec . Dacă în partea de sus a
eprubetei se formează un inel roșu sau roz este o reacți e pozitivă. Bacteriile
Escherichia coli sunt positive la testul indol [24].

Figura 5. Testul indol
(https://microbiologyinfo.com/wp -content/uploads/2015/10/Result –
Interpretation -of-Indole -Test.jpg )
III.3.3 Testul roșu de metil

Testul cu indicatoru l de pH roșu de metil se utilizează pentru a detecta
capacitatea bacteriei de a produce acid din fermentația glucozei. Bacteriile care
trebuies c evaluate sunt inoculate pe mediul bulion glucozo -fostat (MRVP) care
conține glucoză și un tampon fosfat , care timp de 48 de ore este incubat la
temperatura de 37 grade C. După ce s -a realizat procesul de incubare se aduaugă
în proba de analizat trei –cinci picături de reactiv MR .

29
Culorea roșie indică o reacție pozitivă, în timp ce decolorarea de culoare
galbenă i ndică o reacție negative [24] .
III.3.4 Testul Voges -Proskauer

Testul Voges -Proskauer inoculează bacteriile care urmează să fie testate
pe medi ul bulion glucozo -fosfat (MRVP) într-o eprubetă și se incubează timp de
72 de ore . După ce a avut loc procesul d e incubare se adaugă 15 picături în proba
de analizat și se agită bine. După agitare se adaugă 5 picături de hidroxid d e
potasiu 40% (KOH) și se continuă agitarea ca ș i în procesul anterior. Proba de
analizat se lasă în repaus timp de 15 minute, dacă în urma acestui process se
observă o decolorare roșie care persist ă si după o oră nu se observă o schimbare,
izolatul e ste clasificat ca fiind negative [24].
III.3.5 Testul citrat

Testul citrat examineaz ă capacitatea bacteriilor de a folosi citratul ca unică
sursă de carbon și en ergie. Indicatorul de pH este albastru de bromtimol.
Schimbarea culorii în proba de analizat de la verde la alba stru indică o reacție
pozitivă. Dacă culoarea se înclină spre verde aceasta este o carac teristică pentru
testul negativ [24].
III.3.6 Sistemul API 20E

Sistemul API 20E a re la bază teste biochimice uti lizate pentru diferenție rea
bacteriilor G ram-negative din familia Enterobacteriaceea și identificarea rapi dă a
bacteriile deja existente. Înainte de a se efe ctua tes tul trebuie să se confirme
prezența culturii G ram-negative printr -un test rapid de oxida ză (trebuie să fie
negativ). Sistemul API 20E detectează fermentația enzimatică a zahărulu i de către
izolatele de testare [24].

30
III.4 Spectometria de masă MALDI -TOF

Spectometria de masă MALDI -TOF este o metodă rapidă și precisă pentru
identificarea microorganismelor . Supunerea biomoleculelor în câmpul magnetic
sau electric le permite acestora să câștige sau să piardă electroni (ioniza re), în
funcție de raportul masă -sarcină. Spectrul generat este analizat și comparat cu
profilurile care au fost deja stocate folosind programul software. Spectrele sunt
specific e speciilor și pot fi utilizate pent ru a confirma microorganismul. Această
tehnică este utilizată pentru diferen țierea speciilor strâns legate cum sunt bacteria
Gram-negativă Escherichia coli și toxina Shigella [24].
III.5 Convergența izolatelor

Convergența izolatelor bacteriilor Escherichia coli se realizează util izând
diferite metode cum ar fi: rezistența antim icrobiană, caracteristicile genice , reacții
enzimatice și imunogene . Alegerea metodei de izolare convergentă depinde de
mai mulți factori , obiectivele studiului , caracteristicile bacteriilor , abilitatea și
disponibilitatea resurselor. Rezistența la un sing ur agent antimicrobian sau
rezistența combinată la mai mulți agenți antimicrobieni poate fi utilizată pentru a
obține izolarea Escherichia coli cu caracteristici comune. Toate bacteriile
Escherichia coli fermentează în prenzența lactozei, dintre acestea do ar unele pot
fermenta sorbitol . Mediul MacConkey agar cu amestec de sorbitol este utilizat
pentru a diferenția bacteriile Escherichia coli care fermentează și în prezența
sorbitului de cele care fermentează doar lactoză. Cea mai întânlită bacter ie
patogen ă care poate fi vizată prin această procedură este Escherichia coli
O157:H7 și câteva tulpini diarogenice care nu fermentează sorbitolul. Mai mult
decât atât, izolatele de Escherichia coli pot fi reunite prin utilizarea
caracteristicilor antigenice comun e pe care le posedă. Separarea imunomagnetică
(IMS) poate fi utilizată pentru izolarea diferitelor specii bacteriene și fungice. Prin
această procedură pot fi izolate diferite tulpini de Escherichia coli producătoare de
toxine Shiga. Acestea includ toate Escherichia coli producătoare de toxine Shiga
cu antigen somatic : O157, O26, O45, O103, O111, O 113, O121 și O145 [24].

31
III.6 Conservarea izolatelor de Escherichia coli

Conservarea bacteriilor are ca scop încetinerea ritmului reacțiilor
dăun ătoare din cultu ra de bacterii, astfel încât să se mențină viabilitatea și
atributele genetice. Alegerea metodei de conserva re depinde de mai mulți factori:
natura bacteriilor, timpul dorit de depozitare, strategia de analiză și obiec tivele de
studiu.
Liofilizarea este una dintre operațiile care folosite în conservarea celulelor
bacteriene care implică congelarea și uscarea în vid. În procesul de liofilizare (apa
este îndepărtatâ) bacteriile sunt suspendate într -un mediu care conferă bacteriilor
viabili tate. Atât bacteriil e înghețate cât și cele uscate în vid sunt păstrate la o
temperatură de 4 șC timp îndelungat.
Congelarea este o altă metodă folosi tă pentru stocarea bacteriilor care
necesită adăugarea de glicerol sau zaharuri sub formă de crioprotectanți. Cu cât
temperatur a de depozitare este mai rece cu atât cultura va păstra celulele viabile.
Temperaturile de îngheț de -20 până la -40 ° C care sunt obținute de majoritatea
congelatoarelor de laborator, pot fi utilizate pentru conservarea bacteriilor până la
1 an. Temperat ura scăzută de -80 ° C poate păstra bacteriile mai mult de 3 ani, în
timp ce îngheța rea la temperaturi sub -130 ° C de obicei în azot lichid, poate
păstra bacteriile mai mult de 10 ani. Congelarea poate deteriora sau ucide celulele
bacteriilor datorită pro ceselor fizice și chimice rezultate. În timpul înghețării, apa
din celula bacteriilor este transformată în gheață și soluțiile se acumulează în apa
liberă reziduală. Cristalele de gheață formate pot deteriora membrana celulară, iar
concentrația negativă de solut poate denatura biomoleculele celulare.
Crioprotectanții, cum ar fi glicerolul scad punctul de îngheț al suspensiei
bacteriilor și astfel împiedică formarea de cristale de gheață extracelulare și
acumularea concentrației negative de sare. În plus, în ghețarea letală intracelulară
este de obicei evitată prin răcire lentă sau congelare progresivă, care permite să
părăsească suficientă apă din celulă în timpul înghețării lichidului extracelular. O
congelare lentă progresivă la o viteză de răcire de 1 ° C / min poate fi obținută
folosind un congelator controlat cu viteză. În mod alternativ, rezultate similare pot
fi obținute prin „înghețare rapidă”.

32
Celulele bacteriene sunt înghețate prin imersarea suspensiei de celule
glicerol 15% bine marcate, care conți ne criotuburi în gheață uscată sau azot lichid,
înainte de a le depozita la congelator ( -20 până la -80 ° C) sau în rezervorul de
azot lichid (−196 ° C). Cea mai utilizată metodă de conservare este cea profundă
care menține similtitudinea populației de bact erii și supraviețuirea acestora [24].
III.7 Serotipizarea

Prezența componentelor antigenice care caracterizează o tulpină specifică
de Escherichia coli poate fi detectată folosind anticorpi specifici, de exemplu,
prezența antigenului somatic O, antigenul capsular K și flagelul antigen H pot fi
detectate prin teste de aglutinare și folosind antiseruri specifice. Antigenele
somatice și flagelare sunt testate împotriva fiecărui antiserum specific sau sunt
testate mai întâi împotriva bazinelor de antiserici și apoi testate împotriva
fiecăruia dintre antiserale specifice din bazinele pozitive. Numărul de antiseruri
pozitive este utilizat în nomenclatura de antigen O și H, de exemplu, Escherichia
coli O113: H21, O142: H34 și O157: H7. Există mai mult de 180 de an tigene
somatice și mai mult de 50 de antigene H -flagelare care sunt cunoscute și utilizate
ca ref erință în serotipizarea Escherichia coli [21].
III.8 Reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Reacția în lanț a polimerazei este realizată pentru a caracteriza tul pinile de
Escherichia coli prin țintirea diferitelor gene de virulență care codifică diferiți
factori de virulență.
Detectarea factorilor de virulență și relația genetică a izolatelor de E. coli
pot fi, de asemenea, evaluate prin hibridizarea ADN -ului. Ace sta este un fenomen
prin care o singură catenă de ADN se anexează la un fragment complementar de
ADN monocatenar (sondă) pentru a forma un hibrid. Deoarece sonda este
marcată, se detectează formarea unei molecule hibride și, prin urmare, prezintă
prezența catenelor sale de acid nucleic complementare (țintă). În afară de
detectarea genelor virulenței convenționale, hibridizarea ADN -ului poate fi
utilizată ca o completare a PCR pentru a verifica factorii de virulență suplimentari .

33
Analizele factorilor de viru lență suplimentară prin hibridizare pot ajuta la
diferențierea izolatelor strâns legate. De exemplu, patotipurile EPEC a u gena ee și
pot fi diferențiat ă de EPEC și A / CEE clasice prin hibridizarea ADN -ului. EPEC –
ul clasic posedă bfp care codifică pili -ul care formează pachetul (BFP) . Diferite
sonde ADN pot fi utilizate în hibridizare, cum ar fi vtx1, vtx2, eae,
enterohemolizină (ehxA), factorul de aderență la EPEC (EAF) și pilus care
formează pachetul (bfpA) [24].
III.9 Secvențiere ADN

Secvențierea AND caracterizează materialul genetic în scopul identificării
tulpinlor E.coli și compară materialul genetic din diferite surse în asocierea
diferitelor focare de boală. Secvențierea ADN -ului utilizează electroforeza pentru
a separa fragmente le de ADN din benz i. În timpul secvențieri, bazele sunt
etichetate cu c oloranți fluorescenti , fiecare tip de bază producând o culoare
diferită, timină -albastru, citozină -verde, adenină -roșu și guanină -galben. La
amestecul de ADN se vor adaugă baze modificate artificial. Moleculele de ADN
vor fi supuse procesului de copiere în repetate rânduri. În final loturile de ADN
diferite vor avea diferite baze , timină, adenină, guanine și citozină , iar fiecare
dintre acestea va avea o culoare specifică. Analiza și compararea întregului genom
al izolatelor co nduc la o diagnosticare corectă [24].
III.10 Starea viabilă, dar noncultivabilă

În urma studiilor de specialitate care au fost realizate s -a raportat că
bacteria Escherichia coli îsi pierde din viabilitate atunci când celulele sunt expuse
la lumina directă a soarelui, deoarece acestea intră într -o stare viabilă și
necultivabilă pastrându -și capacitatea patogenă. Starea viabilă si nonculturabilă
are la bază o serie de factori , acestia sunt direct sau indirect legati de colectarea ,
stocarea sau prelucrarea eș antionului.

34
Aceșt ia include absența nutrienților , concentrația osmotică cu o valoare
crescută sau sub parame tri normali, concentratia de oxi gen, expunerea la metale
grele sau conservanti alimentari , lumina directă a soarelui și i ncubatia care nu este
cuprinsă în intervalul detemperatură . Aceșt i factori pot duce la rezultate negative,
deoarece bacteria Escherichia coli nu creste pe mediile de labor ator standard
atunci cand sunt î n stare viabila si nonculturabila [24].

35
Capitolul IV Escherichia coli uropatogen ă(UPEC)
IV.1 Escherichia coli uropatogenă și virulența acesteia

Tulpinile uropatogene Escherichia coli reprezi ntă principala cauză de a
dobând i o infecție a tractului urinar[25]. Infecțiile t ractului urinar sunt recurente,
dificil de tratat atunci câ nd se intalează rezistența la antibiotice și pot provoca
leziuni parenchimoase ceea ce duce la insuficiență renală și complicații. În urma
unor studii de specialitate s -a constat că într -un procent de 80 -90%, Escherichia
coli este principala cauză. La majoritatea indivizilor care nu sunt diagnosticați cu
un episod ITU, tractul urinar este steril, pătrunderea microorganismelor exogene
este prevenită prin fluxul de urină, factorii antibacterieni secretați și a sociați cu
țesuturile și activitățile bactericide ale celulelor imune efectoare fiind considerat
primul pas în colonizarea de către bacterii [26]. Diagnosticarea unei infecții ale
tractului uri nar provocate de ( Escherichia coli uropatogen ă) include :
– colon izarea Escherichia coli uropatogen ă a zonelor periuretrale, vaginale
și colonizarea uretrei
– urcarea în lumenul vezicii și dezvoltarea în celulele plactonice în urină
– aderența la suprafață și interacțiunea cu sistemul de apărare al epitelului
vezici i
-formarea biofilmului
-invazia și replicarea prin formarea de comunități bacteriene intracelurare
în vezica urinară, unde rezervoarele intracelulare se formează și locuiesc în
uroteliul subiacent
– colonizarea rinichilor și distrugerea țesutului gazdă cu r isc crescut de
bacterimie/septicemie
Virulența reprezintă abilitatea unui organism de a induce boală și este o
funcție care prezintă trăsături accesorii distincte, numite factori de virulență.
Factori de virulență sunt proprietăți specifice care permit o rganismelor să
depășească și să treacă peste mecan ismul de apărare al gazdei provoacând boala.

36
Replicarea bacteriilor în formarea de comunități bacteriene intracelulare
(CBI) în vezica urinară poate atinge cu ușurință 105 bacterii pe celulă, în
plus,bacte riile din CBI sunt supuse unor modificări morfologice, fluctuează în
afara celulei infectate și înce p să infecteze celulele vecine. Eliminarea urinei
îndepărtează major itatea bacteriilor invadatoare împreună cu celulele epiteliale ale
vezicii exfoliate înc ărcate cu Escherichia coli uropatogen ă.
Escherichia coli uropatogen ă colonizează vezi ca urinară folosind o
varietate de factori de virulență , care, prin urmare joacă un rol critic în patogeneza
infecțiilor tractului urinar. Aceștia includ componente struct urale de suprafață,
cum ar fi lipopolizaharidele (LPS), capsula polizaharidică, flageli, vezicule cu
membrană exterioară, pili, curli, adezine non -plus, proteine de membrană externă,
precum și toxinele secretate, sistemele de secreție și receptorii de prel ucrare a
fierului dependenți incluzând receptorii siderofori. Toate aceste componente sunt
candidați atractivi pentru dezvoltarea de noi medicamente și vaccinuri.
IV.1.1 Adezinele

Adezinele bacteriene se găsesc pe surafața celulelor bacterie ne facilitând
colonizarea tulpinilor Escherichia coli uropatogen ă în tractului urinar prin
atașarea acestora de celulele epiteliale gazdă, devenid astfel rezervorul pentru
infecția ascendentă în tractul urinar. Atașarea de celulele epiteliale gazdă se
realizează prin p rocesul de recunoaștere al receptorilor glicolipidici.
IV.1.2 Adezinele Afa/Dr

Adezinele Afa/Dr sunt capsule filamentoase de pe suprafața celulei [26].
Antigenul este reprezentat de o proteină care se găseș te în membrana globulelor
roșii, localizarea pe factorul de acce larare al degradării (DAF) le protej ează pe
acestea de a fi lezate de completările autologe. Există două tipuri de adezine, cele
fimbriale (F1845 și O75X) ș i cele non -fimbriale (AFA I și AFA II). Imuno –
invazia Escherichia coli uropatogen ă și declanșarea răspunsului imun umoral al
gazdei este me diat de familia de adezine Dr.A.

37
Studiile epidemiologice au constat că tulpinile Escherichia coli
uropatogen ă care exprimă adezinele familiei Afa/Dr sunt implicate în 25 -50% din
cazurile de cistită înt ânlite la copii, iar 30% din cazurile de pielonefrită întânlite la
femeile gravide. Tulpinile Escherichia coli care exprimă adezinele Dr cresc de
două ori riscul de a diagnotica cea de a do ua infecție a tractului urinar. Tulpinile
Escherichia coli uropatog enă care codifică adezina Dr ar putea supraviețui m ai
mult de 1 an în țesul renar, astfel dobândind una din cauzele infecțiilor recu rente
sau cronice [26].
Curli sunt anexe bacteriene de suprafață care secretă subunități din celula
de proteine monomerice so lubile și posedă structura tipică și caracteristicile fizice
ale fibrilor de amiloid, care sunt cunoscute ca fi formate în unele boli degenerative
umane. Bacteriile amiloide pot facilita formarea biofilmului. În Escherichia coli
uropatogen ă, formarea de curli este coordo nată de codificarea proteinlor.
Ambele tipu ri de pili sunt heteropolimeri, alcătuiți dintr -o subunita te
proteică pilus majoră implicați în atașarea inișială a Escherichia coli uropatogen ă
la nivelul mucoase i tractului urinar .
Flageli sunt or ganite care conferă proprietăți invazive și adezive la unele
tulpini Escherichia coli uropatogen ă și joacă un rol important în dinamica
biofilmelor. Marea majoritate a Escherichia coli uropatogen ă izolate de la femeile
cu infecț ii ale tractului urinar acut e, asimptomatice sau recurente arată prezența
motilității mediate de flageli. S-a raporatat recent că în timpul formării biofilmului
, flagelii joacă roluri diferite, cum ar fi aderența, maturizarea, dispersarea și
reglarea gen ei în timpul fazei de crește re.
IV.1.3 Lipopolizaharidele

Lipopolizaharidele sunt molecule cu proprietăți amfipatice constând în
acizi grași căptușiți cu oligozaharidă, care la rândul său este legată de un lanț
polizaharidic lung numic antigenul somatic O. Constituenți structurali m ediază
multiple aspecte ale ciclului de viată al Escherichia coli uropatogen ă inclusiv
capacit atea de a coloniza acut vezica, acumularea de rezervoare și evocarea
răspunsurilor imune înnăscute și adaptative.

38
LPS oferă o rezistență la antibioticele hidrofo be și hipersensibilitate la
moleculele toxice hidrofobe (cum ar fi sărurile biliare și unele antibiotice) se
produce atunci când la suprafața celulei cantitea de lipopolizaharide este scăzută.
IV.1.4 Toxinele

Toxinele joacă diferite rolur i patogene în tim pul infecției. Hemoliza alfa
este asociată cu leziuni renale și cicatrici, induce oșcilați calcice în celulele
epiteliale , tulburare renale, intensifică ascensiunea și colonizarea ureterelor și
parenchimului renal prin perturb area fluxului normal ale urine i[25]. Producția de
hemoliză se găsește cel mai frecvent în tulpinile Escherichia coli uropatogen ă de
la pacienții cu pielonefrită (49%) , urmată de izolatele de cistită. Tulpinile
Escherichia coli uropatogen ă care produc cantități crescute de alfa hemoliză sunt
de asemenea mai rezistente la acțiunea complementară a serului uman în
comparație cu tulpinile care nu sunt hemolitice sau produ c cantități reduse de
hemoliză[26].
Toxinele, adezinele, enzimele, antigeni non -proteici și lipopolizaharidele
sunt eliber ate sub formă de molecule solide, formând vezicule cu membrană
exterioară , care se găsesc pe suprafața bacteriilor Gram -negative în timpul
etapelor de dezvoltare. Formarea de vezicule membranare este considerată o
modalitate de a proteja toxinele bacterien e și un s istem eficient pentru a le
transporta în celula gazdă.
IV.1.5 Sistemele de achiziție a fierului

Achiziția de fier este o condiție esențială pentru supraviețuirea Escherichia
coli uropatogen ă într-un mediu care este limi tat în ceea ce privește fi erul, cum este
tractul urinar[25]. Fierul este necesar pentru transportul și stocarea oxigenului
,sinteza ADN -ului ,transportul electronilor ș i metabolizarea peroxizilor[26].

39
IV.2 Biofilmul

Biofilmul protejează bacteriile de acțiunea antibioticelor și c ontribuie la
instalarea rezistenței .Producția de biofil m în Escherichia coli mediată de co –
exprimarea curlilor și celulozei, suține supraviețuirea pe termen lung a
Escherichia coli uropatogen ă în tractul urinar prin înconjurarea organismului cu o
matrice extracelurară inertă hidrofobă.
Coexpresia de curli și celuloză tinde să scadă în prevalența de la UTI mai
severe până la mai puțin severe, apoi la izolatele comensale, ceea ce sugerea ză că
biofilmul poate facilita progresia de la nivelul tractul ui urinar inferior la superior.
Componentele biofilmului, curli, fimbria și celuloza joacă roluri importante în
adeziunea, invazia și supraviețuirea pe termen lung a Escherichia coli
uropatogen ă în tractul urinar gazdă[26].
IV.3 Capsula

Rolul principal al capsulei este de a asigura protecția bacteriei de diferiți
factori care acționează împotriva acesteia nefavorabil și de sistemul imunitar
gazdă. Capsula are rolul de a proteja bacteria împotriva efectului bactericid
mediat de gazdă, rezistența antim icrobiană și ac tivitatea serică[27].
IV.4 Motilitatea

Motilitatea bacteriei este asigurată de flagel, care joacă un rol importantant
în faza de adeziune initială a formări biofilmului. Studiile au arătat că motilitatea
bacteriană participă la procesul de migrare al in fecției de la vezica urinară la
rinichi. Aproximativ 70 -90% din infecțiile tractului urinar sunt cauzate de
Escherichia coli uropatogen ă flagelată, iar patogeneza implică contactul dintre
bacterii și suprafața celulelor epiteliale ale tractului urinar. Mot ilitatea flagelară
sporește capacitatea Escherichia coli prin răspunsuri adaptative la stimuli de
mediu atrăgători sau respingători[27].

40
IV.5 Mecanisme de auto -apărare

Epiteliul vezicii urinare prezintă mecaniste de auto -apărare fi ind zona cea
mai frecv ent vizitată de infecțiile tractului urinar. Epiteliul tractului urinar este
alcătuit din bariere puternice și prezintă activități antibacteriene. Colonizarea
ascendentă progresivă a bacteriilor contaminează uretra și ca origine aceste
infecții sunt de obicei din intestin. Datorită prezenței urinei , aceasta reprezin tă un
mediu de dezvoltare ideal , bacteriile proliferează într -un interval de timp relativ
scurt , în timp ce elim inarea urinei îndepărtează majori tatea bacteriilor invadatoare
Epiteliul multis tratificat al tractului urinar este de asemenea, cunoscut sub
numele de epiteliu de tranziție ș i este compus din tei straturi : strat cu celule
bazale(5 -10 μm în diametru ), stratul ce lular intermediar (20 μm în diametru ) și
stratul apical superficial cu c elule haxagonale de dimensiuni mari (diametru de
25-250 μm). O membrane bazală se află sub epiteliul bazal. Celulele hexagonale
din stratul apical joacă un rol proeminent în menținerea unei bariere împotriva
majorități substanțelor găsite în urină, prezin tă lipide , membrane cu particule și
unități asimetrice și o plasmalema cu plăci rigide. Aceste plăci pot acoperi până la
90% di n suprafața celulei uroteliale, fiecare placă fiind compusă din aproape
1.000 de subunități. Aceste subunități sunt alcătuite di n protein e care servesc ca
principalii receptori pentru aderarea Escherichia coli uropatogen ă la celula gazdă
și sunt localizate în intestinal plăcilor de pe membranele apicale ale celulelor
mature hexagonale[25].

41
Capitolul V – Rezistența la antibiotice și antibioterapia infecțiilor
urinare cauzate de Escherichia coli
V.1 Antibioticul – Generalității

Antibioticele sunt o clasă de medicamente care sunt utilzate pentru
profilaxia infecțiilor bacteriene. Antibioticele acționează împo triva bacteriilor prin
inhibare în procesul de dezvoltare sau prin distrugerea acestora. Descoperirea
antibioticelor a dus la revoluționarea medicinei, scăzând rata mortalității datorat ă
infecțiilor bacteriene grave. Unele antibiotice pot fi utilizate pentru a trat a o gamă
nume roasă de infecții în timp ce altele sunt utilizate pentru a trata infecțiile cauze
de tipuri specifice de bacterii[28].
V.2 Clasificarea antibioticelor

►Betalactamice
● Peniciline
○ Meticiline
○ Fenoximetilpeniciline
○ Peniciline naturale
○ Peniciline r etard
○ Peniciline rezistente la penicilinaze
○ Izoxa zolilpeniciline
○ Aminopeniciline
○ Carboxipeniciline
○ Acil (amino/ureido) peniciline
●Cefalosporine
○ Cefalosporine orale

42
○ Cefalosporine de generația I
○Cefalosporine de generația a II -a
○Cefalosporine de generația a III -a
○Cefalosporine de generația a IV -a
●Asocieri de betalactamice cu inhibitori de betalactamaze
●Carbapeneme
●Monobactami
○Macrolide(mtlk)
○Aminoglicozide
○Glicopeptide/licopeptide
○(Fluoro)Chinolone
○(Tetra)Cicline
○Fenicoli
○Sulfamide
○Rifamicine
○Azoli
○Oxazolidinone
○Polipeptide ciclice
○Nitrofurani
○Alte antibacteriene

43
V.3 Antibiotice indicate în infecțiile urinare

Antibiotic Calea de administrare Doza de administrare
Acid nalidixic Orală Adult:30 -50mg/kg/zi la 6h
Amoxicilină+acid clavulanic Orală

Intravenoasâ Adult:1,5 -2g/zi la 8 -12h
Copii:20 -40mg A/kg la 8 -12h
Adult:1,8 -3,6g/zi la 8 -12h
Copii: 100-200mgA/kg la 8 -12
h
Ampicilină Orală
Intravenoasă
Intramusculară Adult: 2 -12g/zi la 6 -8h
Copii: 50-200mg/kg la 6-8h
Cefaclor Orală Adult: 0,75-1,5g/zi la 8h
Copii: 20-40mg/kg la 8h
Cefuroxim Intravenoasă
Intramusculară Adult: 3-6g/zi la 8h
Copii: 50-150mg/kg la 8h
Ciprofloxacin Oral
Intravenoasă 1-1,5g/zi la 12h
400-1200mg/zi la 12h
Levofloxacin Orală Priză unic ă 500mg/zi
Nitrofurantoin Orală 200-400mg/zi la 6 -8h
Tabelul 6 . Antibiotice utilizate în infecția urinară
V.4 Rezistenț a la antibiotice

Rezistența la antibiotice se intalează în momentul în care bacteriile sunt
capabile să supraviețuiască și să se dezv olte în prezența a unuia sau a mai multor
antibiotice . Există mai multe procese prin care bacteriile pot dev eni rezistente la
antibiotice. Principalul proces este repr ezentat de presiunea selectivă. Presiunea
selectivă are loc atunci când o parte din bac terii sunt sensibile la antibioticul
administr at pentru combaterea infecției, iar bacteriile supraviețuitoare pot
continua să se înmulțească. Presiunea selectivă creează o populație bacteriană care
este rezistentă la antibioticul la care a fost expusă. Este un proces natural care
poate fi încetinit dar nu și oprit.

44
Excesul de antibiotice sporește accelerarea selecției pentru bacteriile
rezisten te. Rezistența la antibiotice poate f i dobândită de bacterii atunci când se
realiază schimbul de materialul ge netic de la o bacterie la alta. Acest prosces este
realizat de plasmide. Anumite tipuri de plasmide permit bacteriilor să producă o
enzimă care poate face ca antibioticu l să își piardă eficacitatea. În momentul în
care plasmida e ste introdusă în alte bacter ii, rezistența la antibiotice se instalează
și poate fi răspândită ușor și rapid printre bacterii. Bacteriile pot dobândi mai
multe tipuri de rez istență prin diferite mecanisme [28]. Esce richia coli este un
microorganism versatil , trecând de la stadiul de comensal la o bacterie virulentă
oportunistă și specializată cu potențialul de a provoca diferite boli.
V.5 Factori declanșatori ai rezistenței la antibiotice:

– bariera impermeabilă
– pompe de rezistență (protejează celula bacteriană împotriva
moleculelo r toxice )
– mutațiile de rezistență (modifică proteina țintă)
– Inactivarea antibiotic elor [29]
Eficacitatea medicației cu antibiotice depinde de identificarea și modelul
de rezistență antimicrobiană a uropatogenilor responsabili de infecțiile tractului
urinar. Prescrierea antibioticelor pentru combaterea infecțiilor urinare fără
caracterizarea bacteriană a dus la o rezistență crescută în rândul patogenilor și la
scăderea eficacității terapiei. Infecțiile uropatoge cu bacteria Escherichia coli
reprizintă o problemă serioasă pentru sănătatea indivizilor , rezistența crescută la
antibiotiele sintetice și natural e provoacă recur ența și cronicitatea infecției, odată
cu apariția unor complicații ale stării de sănatate. Există strategii directe și
indirecte împotr iva infecțiilor urinare cu Escherichia coli uropatogen ă. Strategiile
directe vi zează viabilitatea bacteriilor, aderența epiteliului vizicii ur inare și
formarea biofilmului, strategiile indirecte generează și îm bunătățesc răspunsurile
immune, prin stimulare a țesuturilor și celulelor infectate să reacționeze la invazia
Escherichia coli uropatogen ă [29].

45
V.6 Mecanismele rezistenței bacteriene la antibiotice (după ONIGANA O,
2003,modificat)

Antibioticul Mecanisme de rezistență ala bacteriilor
Betalactamice Inactivarea enzimatică (C,P)
Modificarea PBP(C,P)
Reducerea permeabilități celulare (C)
Aminoglicozide Inactivarea enzimatic ă(enzime modificatoare
de aminoglicozide) (C,P)
Alterarea proteinei țintă ribozomale(C)
Modificarea sistemelor de transport acti v
prin învelișuri bacteriene (C)
Chinolone Diminuarea afinității țintei de acțiune
(modificarea AND -girazei)(C)
Reducerea permeabilității membrane externe
(C)
Eflux activ al antibioticelor din celula
bacteriană(C,P)
Macrolide Modificarea țintei de acțiu ne (C,P)
Eflux active al antibioticelor din celula
bacteriană
Achiziționarea de către bacterii a unor enzime
modificatoare ale atb.(P)
Lincosamide Modificarea țintei de acțiune (C,P)
Achiziționarea de către bacterii a unor enzime
modificatoare ale atb. ( P)
Vancomicina (Modificarea țintei de acțiune
Tetracicline Eflux activ al antibioticelor din celula
bacteriană(P)
Modificarea proteinei ribozomale (P)
Cloramfenicol Inactivarea enzimatică(cloramfenicol –
acetiltransferază)(P)
Diminuarea permeabilități i peretelui bacterian
(C)
Sulfamide Diminuarea permeabilitâții bacteriene (C,P)
Modificarea unor enzime (C,P)
Hiperproducție de APAB (C)
Trimetoprin Diminuarea permeabilității bacteriene(C,P)
Nitrofurani Diminuarea permeabilității bacteriene
Deficit de activitate a nitrofuran -reductazei
(C)
Nitroimidazoli Diminuarea permeabilității bacteriene
Actibitate insuficientă a nitro -reductazei
Tabelul 7 . Mecanismele de rezistență la antibiotice C- determinarea cromozomială P-
determinarea plasmidelor PBN – proteinele de legare a penicilinei APAB – acidul
paraaminobenzoic

46
Capitolul V I – Determinarea gradului de rezistență la antibiotice
a Escherichia coli din infecțiile urinare
VI.1 Material și metodă

Tehnica orocultoare
Tehnica orucultoare este metoda prin ca re se identifică agenții patogeni
producătorii de infecții bacteriene. Se realizează prin cultivarea și analiza probelor
de urină într -un laborator medical. Prelevarea produsului patologic se realizează
într-un recipient steril numit orocultor de unică fol osință cu capac etanș pentru a
preveni cont aminarea probei . Recoltarea se realizează din prima urină de
dimineață. Înainte de recoltare se face toaleta riguroasă a regiunii urogenitale cu
apă și săpun. Se recoltează o cantitate de aproximativ 20 ml de urin ă, maxim
jumătate de flacon, din jetul mijlociu, primul jet se lasă să curgă în toaletă. Dacă
proba nu poate fi lucrată în maxim 2 ore de când a fost transportată la laborator, se
lucrează în maxim 24 de ore, între timp este ținută la temperatura de 2 -8 ș C.
Urocultura este important să se realizeze înainte de a începe tratamentul cu
antibiotice, deoarece acestea participă la distrugerea florei microbiene și astfel
analizele pot fi influențate într -un rezultat negativ, chiar dacă infecția bacteriană
este pr ezentă.
Investigarea gradului de rezistență la antibiotice s-a realizat cu ajutorul
tulpinilor de Escherichia coli izolate din infecțiile urinare în laboratorul de analize
medicale al clinic ii Medlife din Constanța.

47

Figura 8 . Recipiente cu produs patolog ic pentru examenul de urocultură
(Poză din laboratorul clinic ii Medlife)
Tulpinile de Escherichia coli au fost însămânțate în bulion patologic în
vederea efectuării antibiogramei.T ulpinile sunt incubate timp de 18 -24h la o
temperatură de 37 grade Celsius .
În vederea observăr ii eficienței antibioticelor p e suprafaț a mediilor de
cultură însămânțate cu fiecare tulpină se aplică microcomprimatele de antibiotice
și plăcile . Procesul de incubare al tulpinilor a dus la dezvoltarea acestora pe
mediul Mueller Hinton agar. Cu ajutorul metodei difuzimetrice se realizează
determinarea rezistenței la antibiotice, prin măsurarea diametrului de inhibiție din
jurul fiecărui microdisc. Într-o eprubetă sterilă se introdu c circa 2 ml de bulion
nutritiv , cu ajutorul unei anse s e prelevează de pe cultura sterilă 1-2 colonii. Cu
densitometrul se determină densitatea inoculului care trebuie să ajungă la 0,5, iar
conform CLSI se urmărește diametrul de inhibiție pentru fiecare antibiotic
determinându -se rezistența/sensibilitatea. Datele au fost prelucrate pentru analiză
prin realizarea unor diagrame.

48

Figura 9 . Densitometrul care măsoară turbiditatea în mediul lichid
(Poză din laboratorul clinic ii Medlife)
Antibioticele utilizate sunt:
 Amoxicilină+ A cid clavulanic
 Ampicilină
 Cefaclo r
 Cefazolin
 Cefotaximă
 Piperaciclină+Tazobactam
 Trimetoprim/Sulfametoxazol
 Ceftibuten
 Fosfomicină
 Gentamicină
 Levofloxacin
 Nitrofurantoin
 Cefuroxim

49
Tabelul 10. Valorile de referință utilizate pentru a determina categoria
clinică a susceptibilității
Antibiotic Disk content Intervalul de
inhibiție
s
S r
I I
R
Amoxicilină+acid clavulanic 20/10µg ≥
≥18 1
17-14 ≤
≤13
Ampicilină 10µg ≥
≥17 1
16-14 ≤
≤13
Cefaclor 30µg ≥
≥18 1
17-15 ≤
≤14
Cefazolin 30µg ≥
≥15 –
– ≤
≤14
Cefotaximă 30 µg ≥
≥26 2
25-23 ≤
≤22
Piperaciclină+ Tazobactam 100/10µg ≥
≥21 1
20-18 ≤
≤17
Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75 µg ≥
≥16 1
15-11 ≤
≤10
Ceftibuten 30µg ≥
≥21 1
20-18 ≤
≤17
Fosfomicină 200 µg ≥
≥16 1
15-13 ≤
≤12
Gentamicină 10 µg ≥
≥15 1
14-13 ≤
≤12
Levofloxacin 5 µg ≥
≥31 2
30-21 ≤
≤20
Nitrofurantoin 300 µg ≥
≥17 1
16-15 ≤
≤14
Cefuroxim 30 µg ≥23 22-15 ≤14

50
VI.2 Rezultate și discuții

În urma măsurătorilor diametrelor de inhibiție al antibioticelor prin medota
difuzimetrică, a fost posibilă caracterizarea celor 5 tulpini de Escherichia coli din
punct de v edere al sensibilități/rezistenței la antibiotice.

Figura 11 . Imagine prin care se evidențiază zonele de inhibiție forma te
(Poză din laboratorul clinici i Medlife)

51

Figura 12 . Dia gramă tulpină Escherichia coli nr.1
S-sensibil; R-rezisten ;t i-intermed iar
În figura cu nr.12 putem observa faptul că tulpina Escherichia coli notată
cu numărul 1 este sensibilă la amoxicilină+acid clavulanic(AMC) cu diametrul de
inhibiție de 19mm, la cefaclo r(CEC) cu diametrul de 20 mm , la cefotaximă (CTX)
cu diametrul de 2 8 mm, la piperaciclină+tazobacta m(TPZ) cu diametrul de 24
mm, la trimetoprim/sulfametoxazol(STX) cu diametrul de 22 mm, la ceftibuten
(CTB30) cu diametrul de 23 mm, la fosfomic ină(FF) cu diametrul de 17 mm, la
gentamicină(C N120) cu diametrul de 18 mm, la levofloxacin ă(LEV) cu diametrul
de 33 mm și la nitrofurantoi nă(F) cu diametrul de 21 mm. Este rezinstentă la
ampicilină(AM) cu diametrul de inhibiție de 15 mm și la cefazolină(CZ) cu
diametrul de 9 mm, iar la cefuroxim(CXM) cu diametrul de inhibiție 18mm e ste
intermediară. S
R S
R S
S
S S
S S S
S
I
05101520253035
AMC AM CEC CZ CTX TPZ SXT CTB30 FF CN120 LEV F CXMmm-zonă de inhibiție Escherichia coli 1

52

Figura 13 . Diagramă tulpină Escherichia coli nr.2
S-sensibil
R-rezistent
i-intermediar
În figura cu nr.13 putem obser va faptul că tulpina de Escherichia coli ,
notată cu numărul 2 este sensibilă la ampicilină(AM) cu diametrul de inhibiți e de
18 mm, la cefaclor (CEC) cu diametrul de 20 mm, la cefazolină (CZ) cu diamtrul
de 17 mm, la cefotaximă (CTX) cu diametrul de 19 mm, la
piperaciclină+tazobactam(TPZ) cu diametrul de 23 mm, la
trimetoprim/sulfametoxazol(STX) cu diametrul de 16 mm, la ce ftibuten (CTB30)
cu diametrul de 25 mm, la fosfomicină(FF) cu diametrul de 19 mm, la
gentamicină(CN120) cu diametrul de 16 mm, la levofloxacină(LEV) cu diametrul
de 33 mm și la nitrofurantoină(F) cu diametrul de 21 mm. Este rezistentă la
amoxiciclină+acid clavulanic(AMC) cu diametrul de inhibiție de 10 mm și
intermediară la cefuroxim(CXM) cu diametrul de inhibiție de 22 mm. R S S
S S S
S S
S
S S
S I
05101520253035
AMC AM CEC CZ CTX TPZ SXT CTB30 FF CN120 LEV F CXMmm-zonă de inhibiție Escherichia coli 2

53

Figura 14 . Diagramă tulpină Escherichia coli nr.3
S-sensibil
R-rezistent
I-intermediar
Tulpina de Escherichia coli notată cu numărul 3 din figura cu nr.14
prezintă sensibilitate la cefaclor(CEC) cu diametrul de inhibiție de 19 mm, la
cefotaximă(CTX) cu diametrul 28 mm, la piperaciclină+tazobactam(TPZ) cu
diametrul 24 mm, la ceftibuten(CTB30) cu diametrul 23 mm, la fosfomicină(FF)
cu d iamterul 17 mm, la gentamicină(CN120) cu diametrul 16 mm și la
nitrofurantoină(F) cu diametrul 18 mm. Este rezistenă la ampicilină(AM) cu
diametrul de inhibiție de 7 mm, la cef azolină(CZ) cu diametrul 11 mm, la
trimetoprim/sulfametoxazol(STX) cu diametru l 5 mm și la levofloxacină(LEV) cu
diametrul 19 mm. Intermediară este la cefuroxim(CXM) cu diametrul de inhibiție
de 22 mm și la amoxicilină+acid clavulanic(AMC) cu diametrul 16 mm. I
R S
R S
S
R S
S S R S I
051015202530
AMC AM CEC CZ CTX TPZ SXT CTB30 FF CN120 LEV F CXMmm-zonă de inhibiție Escherichia coli 3

54

Figura 15 . Diagramă tulpină Escherichia coli nr.4
S-sensibil
R-rezistent
I-intermediar
Figura cu numărul 15 reprezintă sensibilitatea tulpinei de Esche richia coli
notată cu numărul 4 , la cefotaximă(CTX) cu diametrul de inhibiție de 27 mm, la
trimetoprim/sulfametoxazol(STX) cu diametrul de 18 mm, la ceftibuten(CTB30)
cu diametr ul de 24 mm, la fosmomicină(FF) cu diametrul 16 mm, la
gentamicină(CN120) cu diametrul de 19mm și la nitrofurantoină(F) cu diametrul
18 mm. Rezistență prezintă la ampicilină(AM) cu diametrul de inhibiție de 12
mm, la cefaclor(CEC) cu diametrul 13 mm, la ce fazolină(CZ) cu diametrul de 11
mm, la piperaciclină+tazobactam(TPZ) cu diametrul 14 mm și la
levoflo xacină(LEV) cu diametrul 10 mm. Tulpina este intermediară la
amoxicilină+acid clavulanic(AMC) cu diametrul de inhibiție de 16mm și la
cefuroxim(CXM)cu diam etrul 17 mm. I
R R
R S
R S S
S S
R S I
051015202530
AMC AM CEC CZ CTX TPZ SXT CTB30 FF CN120 LEV F CXMmm-zonă de inhibiție Escherichia coli 4

55

Figura 16 . Diagramă tulpină Escherichia coli nr.5
S-sensibil
R-rezistent
Tulpina de Escherichia coli cu numărul 5 din figura 16 prezintă
sensibilitate la cefazolină(CZ) cu diametrul de inhibiție de 16 mm, la
piperaciclină+tazobactam (TPZ) cu diametrul 22 mm, la ceftibuten (CTB30) cu
diametrul 27 mm, la fosfomicină(FF) cu diametrul 17 mm, la
gentamicină(CN120) cu diametrul 16 mm și la nitrofurantoină(F) cu diametrul 18
mm. Tulpina este rezistentă la amoxicilină +acid clavulanic (AMC) cu diamet rul
de inhibiție 11 mm, la amp icilină(AM) cu diametrul 12 mm, la cefaclor(CEC) cu
diametrul 8 mm, la cefotaximă(CTX) cu diametrul 19 mm, la
trimetoprim/sulfame toxazol(STX) cu diametrul 9 mm, la levofloxacină(LEV) cu
diametrul 15 mm și la cefuroxim(CXM) cu diametrul 12 mm.

R R
R S R S
R S
S S R S
R
051015202530
AMC AM CEC CZ CTX TPZ SXT CTB30 FF CN120 LEV F CXMmm-zonă de inhibiție Escherichia coli 5

56
Concluzii

 Bacteria Escherichia coli este principala cauză a infecțiilor tractului urinar
într-un procent de 75% pănă 90%.

 Factorii care favorizează apariția infecțiilor urinare sunt: sexul feminin,
calculi renali, menopauza, transpla ntul renal, imunosupresia, diabetul,
administrarea antibioticelor necorespunzător și sistemul imunitar slăbit.

 Cele mai întânlite simptome ale infecției tractului urinar sunt: febră,
disurie, poliurie, urina tulbure si urât mirositoare și hematurie.

 Cele mai frecvente infecții urinare sunt cistita și uretritra (infecții ale
tractului urinar inferior).

 Sindromul urosepsis și pielonefrita sunt grave infecții ale tractului urinar
superior.

 Prescrierea antibioticelor pentru tratarea infecțiilor urinare s e face în mod
corect după efectuarea antibiogramei.

 Tratamentul empiric fără identificarea bacteriilor și a sensibilității la
antibiotice duce la o eficiență scăzută a terapiei și la selecționarea unor
tulpini rezistente.

57
Bibiliografie

[1] Blount, Z. (2015), “The natural history of model organism: The
unexhausted potential of E.coli,” Microbiology and infectious disease, ecology .
[2] Francis, S. (2018), “E.coli,” National Institute of Allergy and Infection
Diseases .
[3] Nestorescu, N. (1965), ”Bac teriologia medicală,” Editura medicală,
București.
[4] Fotadar, U. Zaveloff, P. Terracio, L. (2005), |”Growth of Escherichia
coli at elevated temperatures,” Journal of Basic Microbiology .
[5] Ingledew, W. J. Poole, R.K. (1984), “The respiratory chains of
Escherichia coli,” Microbiological Reviews .
[6] Tortora, G. (2010), “Microbiology: An Introduction”.
[7] Tanskeshwar, A. (2013), “Escherichia coli: Disease, Properties,
Pathogenesis, and Loboratory diagnosis”.
[8] Sangwan A. (2015), “Escherichia Coli (E.col i): Meaning, Morphology
and Characteristics,” Biology Discussion .
[9] Ochoa, J.T. Contreras, A.C. (2012), “Enteropathogenic E.(coli)
infection in children,” Curr opinion Infects dis 2011 .
[10] Kaur, P. Chakraborti, A. Asea, A. (2010), “Escherichia coli: An
Emerging Enteric Food Borne Pathogen,” Interdisciplinary Perspectives on
Infection Diseases.
[11] Pasqua, M. Michellaci, V. Di Martino, M.L. Tozzoli, R. Grossi, M.
Colonna, B. Morabito. Prosseda, G. (2017) “The Intriguing Evolution Journey of
Enteroinvas ive E.coli(EIEC) toward Pathogenicity,“ Frontiers in microbiology .
[12] Sonali, S. (2008), “Diffusely adherent Escherichia coli (DAEC) as
cause of acute diarrhea,” Texas Medical Center Dissertations .

58
[13] Lim, Y.J, Yoon, J.W, Hovde, C.J. (2010), “A Brief O verview of
Escherichia coli O157:H7 And Its Plasmid O157,” Journal of Microb iology and
Biotechnology of KMB
[14] Nguyen,Y. Sperandio,V. (2012), “Enterohemorrhagic E.coli (EHEC)
pathogenesis,” Frontiers in Cellular and Infection Microbiology.
[15] Brush, J . L. (2019), “Urinary Tract Infection (UTI) and Cystitis
(Bladder Infection) in Famales”
[16] Pevzner, H. Laube, J. (2018), “The Connection Between E.coli and
Urinary Tract Infections (UTIs)”
[17] Dho -Moulin, M. Fairbrother, J. M. (1999), “Avian pathogenic
Escherichian coli (APEC),” Pathologie aviarie et parasitology 1999 .
[18] Ryche, J. Milon, A. Oswald, E. (1999), “Necrotoxic Escherichia coli
(NTEC): two emerging categories of human and animal pathogens,” Institut
national de la recherché agronomique et E cole nationale vétérinarie, Toulouse,
France.
[19] Batra, S. (2018), “MORFOLOGY AND CULTURE
CHARACTERISTICS OF ESCHERICHIA COLI (E.COLI),” Paramedics World
Devoted To Incredible Paramedics .
[20] Terlizzi, M. E. Gribaudo, G. Maffei, M. E. (2017), “UroPathog enic
Escherichia coli(UPEC) Infections : Virulence Factors, Bladder Responses,
Antibiotic, and Non -antibiotic Antimicrobial Strategies,” Departament of Life
Sciences and Systems Biology, University of Torino, Italy.
[21]https://www.mayoclinic.org/diseases -conditions/urinary -tract-
infection/symptoms -causes/syc -20353447 .
[22] Balentine, J. R. Stoppler, M. C. (2010), “Urinary Tract Infection
(UTI ) Symptoms & Causes,” WOMEN’S HEALT A -Z LIST.
[23] Lupindu, M. L. (2017), “ Isolation and Characterization of Escherichia
coli from Animals, Humans, and Enviroment,” Recent Advances Pshysiology,
Pathogenesis and Biotechnological Applications, Amidou Samie .

59
[24] Terlizzi, M. E. Gribaudo, G. Maffei, M.E. (2017), “UroPathogenic
Escherichia coli (UPEC) Infection: Virulence Factors, Bladder Responses,
Antibiotic, and Non -antibiotic Antimicrobial Strategias”
[25] Kudinha, T. (2017), “The Pathogenesis of Escheric hia coli Urinary
Tract Infection,” Recent Advances on Psihology, Pathogenesis and
Biotechnological Application, Amidou Samie.
[26] Parvez, A. S. Rahman, D. (2018), “Virulence Factors of
Uropathogenic E.coli,” Microbiology of Urinary Tract Infections – Microbial
Agents and Predisposing Factors, Payam Behzdi .
[27] Brower, M. (2018), “Antibiotic Resistance in Bacteria,” National
Association for Information Destruction.
[28] Alvez, C. H. Cruz. P. F. Assis, P. C. Pessoa, D. C. Travelin, L. C.
Leal, M.A. Sousa, C. P. (2017), “Antibiotic Resistance among Escherichia Coli,”
Recent Advances on Physiology Pathogenesis and Biotechnological Applications,
Amidou Samie.
[30] Angelescu, M. (1998), “Terapia cu antibiotice, “ Editura medical ă,
București .