MASTER BIOCHIMIE ȘI BIOLOGIE MOLECULARĂ EFECTUL ANTIOXIDANT AL UNOR EXTRACTE VE GETALE ASUPRA LINIEI CELULARE CACO -2 Coordonator științific: Prof…. [615874]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
MASTER BIOCHIMIE ȘI BIOLOGIE MOLECULARĂ

EFECTUL ANTIOXIDANT AL UNOR
EXTRACTE VE GETALE ASUPRA LINIEI
CELULARE CACO -2

Coordonator științific:
Prof. Dr. Anca Dinischiotu

Îndrumător științific:
Dr. Sorina Nicoleta Petrache -Voicu

Masterand: [anonimizat]
2017

1
CUPRINS
CUPRINS ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 1
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 6
PARTEA TEORETICĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 7
CAPITOLUL I ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 7
COMPUȘI BIOACTIVI DE ORIGINE VEGETALĂ ………………………….. …………………………. 7
1.1.Generalități. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 7
1.2. Ribes nigrum . ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 9
1.3. Thuja occidentalis …………………………… ………………………….. ………………………….. ……… 11
1.4. Filipendula ulmaria . ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 13
CAPITOLUL II ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 16
STRESUL OXIDAT IV ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 16
2.1. Stresul oxidativ și radicalii liberi. ………………………….. ………………………….. ……………… 16
2.2. Sisteme antioxidante de apărare împotriva radicalilor liberi. ………………………….. …….. 19
2.3. Superoxid dismutaza (SOD). ………………………….. ………………………….. ……………………. 20
2.4. Catalaza. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 21
2.5. Glutation peroxidaza (GPx). ………………………….. ………………………….. …………………….. 22
2.6. Glutation reductaza (GR). ………………………….. ………………………….. ………………………… 23
2.7. Glutationul redus (GSH). ………………………….. ………………………….. …………………………. 25
2.8. Malondialdehida (MDA). ………………………….. ………………………….. ………………………… 27
2.9 .Condiții care sporesc apariția stresului oxidativ. ………………………….. ……………………… 28
PARTEA EXPERIMENTALĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. 31
CAPITOLUL III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 31
MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 31
3.1. Obținerea extractelor vegetale. ………………………….. ………………………….. …………………. 31
3.2. Cultivarea liniei celulare Caco -2 și tratamentul acesteia cu extractele vegetale. ………. 32
3.3. Obținerea lizatului celular. ………………………….. ………………………….. ………………………. 33
3.4. Determinarea viabilității celulare prin testul MTT. ………………………….. ………………….. 33
3.5. Determinarea concentrației proteice prin metoda Bradford. ………………………….. ……… 34
3.6. Dozarea conținutului de Glutation Redus (GSH). ………………………….. ……………………. 35
3.7. Dozarea activității Malondialdehidei (MDA). ………………………….. …………………………. 37
3.8. Evaluarea capacității de generare a speciilor rea ctive de oxigen (ROS). …………………. 38

2
CAPITOLUL IV ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 39
REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 39
4.1. Testul de viabilitate celulară MTT. ………………………….. ………………………….. …………… 39
4.2. Determinarea concentrației de glutation redus (GSH) la nivelul celor trei tincturi
selectate. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 41
4.3. Determinare a nivelului de malondialdehidă (MDA) la nivelul celor trei tincturi
selectate. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 43
4.4. Evaluarea speciilor reactive de oxigen (ROS ) la nivelul liniei celulare Caco -2. ………. 45
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 48
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 49

3
ABREVIERI

ADN – acid deoxiribonucleic
Ala – alanină
ATP – adenozin trifosfat
BSA – albumină serică bovină
CaCo2 – linia celulară intestinală de enterocite like
CAT – catalaza
Cd – cadmium
CO 2 – dioxidul de carbon
Cu – cupru
Cys – cisteină
DCF – 2',7' dicloro -dihidro -fluorescein
DMEM – Dulbeco Modified Eagle Medium
DPPH – 2,2-difenil -1-picrilhidrazil
DTNB – 5,5’-ditiobis (2 -acid nitrobenzoic)
EDTA – acid etilendiaminotetraacetic
FAD – flavin adenină nicotinamidică
FADH- – flavin adenin dinucleotidă
Fe2+ – fier feros (II)
Fe3+ – fier trivalent (II)
GABA – γ-aminobutiric acid
Gln – glutamina
Glu – acid glutamic
Gly – glicină
GPx – glutatión peroxidaza
GPx1 – glutation peroxidaza 1

4
GPx2 – glutation peroxidaza 2
GPx3 – glutation peroxidaza 3
GPx4 – glutation peroxidaza 4
GR – glutation reductaza
GSH – glutation redus
GSNO – S-nitrozoglutation
GSR – glutation -disulfid reductaza
GS-SG – glutation disulfid
GSSG – glutationul oxidat
H2DCFDA – 2',7' dicloro -dihidro -fluorescein diacetat
H2O2 – peroxidul de hidrogen
hGSH – homoglutationul
IC50 – jumătatea concentrației maxime inhibitorie
IL-2 – interleukină -2
KOH – fosfat de potasiu
MDA – malondialdehida
Mn – magnan
MTT – 1-bromură de 3 -(4,5-dimetiltiazol -2-yl)-2,5-difeniltetrazolium
NADP – nicotin adenin dinucleotid fosfat
NADPH – nicotin amidă adenozină dinucleotidă fosfat
NADPH – nicotin amidă adenozină dinucleotidă fosfat
NO- – oxidul nitric
NO 2- – nitritul
NO 3- – nitratul
O2- – anionul superoxid
O2- – ionul peroxid
O2 – oxigenul singlet

5
O22- – ionul superoxid
O3 – ozonul
OH- – ionul hidroxil
PBS – tampon fosfat salin
ROS – specii reactive de oxigen
RuBisCO – ribuloza -1,5-bifosfat carboxilaza
SA – acidul salicilic
Ser – serină
SH – gruparea tiol
SO 2 – dioxidul de sulf
SOD – superoxid dismutaza
TBA – acid tiobarbituric
TNB – 4-tio-2-acid nitrobenzoic
TRIS – 2-amino -2-(hidroximetil)propan -1,3-diol
Zn – zinc

6
INTRODUCERE

Medicina tradițională reprezintă o alternativă terapeutică care are la bază utilizarea
plantelor cu scopul de a trata bolile organismului uman, fără efecte adverse. Plantele au fost
folosite de secole întregi de către mari civilizaț ii precum egipiteană, chineză, indiană,
tibeteană, persană pentru tratarea bolilor corpului uman. Primele înregistrări privind utilizarea
plantelor în tratamentul diferitelor afecțiuni datează din jurul anului 2600 î.Hr. și fac referire
la uleiurile din speciile de Cedrus , Papaver somniferum , Cupressus sempervirens sau
Glycyrrhiza glabra , folosite și astăzi pentru tratarea tusei, răcelii, infecțiilor și inflamațiilor. Ȋn
prezent, deși au fost realizate numeroase progrese în domeniul chimiei de sinteză și
semisinteză, plantele rămân în continuare o sursă importantă ce furnizează substanțe cu
potențial terapeutic.
Stresul oxidativ al celulelor reprezintă echilibrul dintre oxidanți și antioxidanți, iar
perturbarea acestora în favoarea oxidanților conduce la apariția acestuia. Stresul oxidativ este
implicat în fiziopatologia multor afecțiuni, inclusiv în cea a cancerului de colon. Prin urmare ,
speciile react ive de oxigen s -au dovedit a fi dăunătoare deoarece , se produc în mod continuu
în celule, fiind derivați ai metabolismului și pot determina apariția stresului oxidativ,
conducând la degradarea de lipide, proteine, ADN. Acestea sunt asociate cu apariția unor
maladii precum cancer, boli cardiovasculare, diabet, ateroscleroză, poliart rită reumatoidă , boli
neurodegenerative, dar și cu procesul de îmbătrânire. Pentru aceasta, exi stența unor compuși
denumiți antioxidanți este foarte importantă datorită rolului esențial pe care îl au pentru
atenuarea sau prevenirea oxidării moleculelor care sunt mai ușor oxidate. Antioxidanții se
găsesc în special în extractele de plante, în uleiur i esențiale, în substanțele pure, naturale
izolate din plante , dar și în suplimentele alimentare . Există foarte multe substanțe care pot
acționa ca antioxidanți, iar cele mai cunoscute sunt vitamina C, vitamina E, beta -carotenul,
acidul lipoic, fenolii, fl avonoidele și multe altele. Principala caracteristică a unui antioxidant
este aceea de a acționa ca un donor de electroni.
Lucrarea de față își propune să studieze capacitatea antioxidant ă a tincturilor vegetale
de Ribes nigrum , Thuja occidentalis și Filipendula ulmaria asupra lin iei celulare uma ne de
adenocarcinom de colon Caco -2, prin evaluarea viabilității și a stresului oxidativ.

7
PARTEA TEORETICĂ
CAPITOLUL I
COMPUȘI BIOACTIVI DE ORIGINE VEGETALĂ
1.1. Generalități .
Considerate de milenii cea mai importantă sursă de substanțe cu potențial terapeutic ,
plantele au fost și sunt foarte studiate datorită propietăților farmacologice pe care acestea le
posedă . Anual, sunt identificați peste 1500 de compuși noi în diferite specii de plante , iar cu
ajutorul progreselor înregistrate în domeniul biologiei moleculare există mari șanse ca aceștia
să fie utilizați în tratamentul numero aselor patologii. Pe lângă industria farmaceutică,
compușii fitochimici furnizați de către pl ante pot fi folosiți și în alte ramur i industriale precum
cele alimentare, cosmetice sau agrochimice pentru obținerea de uleiuri industriale, parfumuri,
arome, pesticide, rășini, coloranți, surfactanți și alți compuși , (Balandrin și Klocke, 19 88).
Pe lângă metaboliții primari reprezentați de proteine, grăsimi, hidrați de carbon care sunt
esențiali pentru supraviețuirea plantei, plantele sintetizează și metaboliți secundari (Tabelul 1)
precum terpene, fenoli, polifenoli, steroizi, antrachinone, etc. Aceștia sunt prezenți doar la
anumite specii de plante și oferă un avantaj selectiv speciilor. Metaboliții secundari pot fi
identificați într-un anumit stadiu al dezvoltării plantei sau pot fi activați în condiții de stres
cauzate de lipsa nutrienților, variații de temperatură, atacul anumito r microorganisme.
Majoritatea metaboliților secundari sunt compuși chimi ci non-proteici cu masa moleculară
mică, putând fi extrași din materialul vegetal cu ajutorul solvenților organici sau apoși sau
prin distilare cu aburi , (Neamțu, 1983).
Rolul com pușilo r secundari bioactivi de origine vegetală este extrem de diversificat.
Aceștia asigură rezistența plantelor la atacul microorganismelor, constituind arme de apărare
ale plantelor împotriva ierbivorelor, insectelor, dar și împotriva altor dăunători. De asem enea,
compușii secundari contribuie la adaptarea plantelor la mediu înconjurător, prin stabilirea
unor intreacții complexe între plante și mediu. Anumiți compuși secundari cum sunt
flavonoidele și carotenoidele absorb energia luminoasă, participând la proc esul de fotosinteză,
în timp ce alți compuși precum eterii, esterii determină gustul și aroma fructelor și legumelor.
Astfel, datorită numeroaselor roluri pe care aceștia le exercită, compușii bioactivi de origine
vegetală sunt foarte utilizați în industri a farmaceutică, alimentară și cosmetică , (Wink, 1988) .

8
Tabelul 1 . Principalele clase de compuși vegetali secu ndari, (Neamțu și colab. , 1983 ).
Clasa de
compuși Nr.
aproximativ
de compuși Distribuirea compușilor vegetali Acțiunea fiziologică
A.Compuși cu
azot
Alcaloizi 5.500 Larg răspândiți în Angiospermae,
în special în rădăcini, frunze și
fructe Majoritatea sunt
toxici, cu gust amar.
Glucozide 75 Cruciferae și alte familii Gust amar și acid
Glicozide
cianogenetice 30 Sporadice, în special în frunze și
fructe Otrăvitoare
B.Terpenoide
Monoterpene 1000 Larg răspândite în uleiuri eterice Plăcut mirositoare
Diterpene 1000 Răspândite în latex și în rășinile
plantelor Unele sunt toxice
Saponine 500 Identificate în peste 700 de familii
de plante Produc hemoliza
globulelor sanguine
Carotenoide 400 Răspândite în frunze, adesea în
flori și fructe Substanțe colorate
Cucurbitacin 50 Predomină în Cucurbitaceae Gust amar, sunt
toxice
Limonoide 100 Prezente în Rutaceae, Meliaceae
și Simaroubaceae Gust amar
C.Fenoli
Flavonoide 1000 Universal răspândite în
Angiospermae, Gimnospermae și
Ferigi Adesea coloranți
Chinone 500 Larg răspândite, predomină în
Rhamnaceae Coloranți
D.Alți
compuși
Poliacetilene 650 Predomină în Compisitae și
Umbeliferae Unele toxice

9
1.2. Ribes nigrum .
Ribes nigrum sau Coacazele negru (Figura 1), este un fruct originar din Europa Centrală și
de Nord și Asia de Nord , fiind o importantă sursă de compuși fenolici , precum antocianuri ,
acizi hidroxicinamic și flavonoli. Ȋncadrat în regnul Plantae , ordinul Saxifragales , familia
Grossulariaceae , genul Ribes , coacăzele negru este un arbust de dimensiune medie, cu frunze
alternative, simple, late și lungi cu margini zimțate, (Jia și colab., 2014).

Figura 1 . Ribes nigrum , (https ://en.wikipedia.org/wiki ).
Acesta conține apoximativ 18 compuși fenolici, ceea ce îl face să prezinte cele mai bune
propietăți antioxidante, spre deosebire de multe alte fructe. Cei mai importanți contribuitori în
ceea ce privește activitatea antiox idantă sunt antocianinele (Fig ura 2 ).

Figura 2 . Structura chimică a antocianinelor, (Quoc și colab., 2007).
Ribes nigrum prezintă cantități importante de antocianine, cele mai importante fiind
pelargonidin 3 -glicozidă, cianidin 3 -glicozidă și delfinidin 3 -glicozidă (Tabelul 2), care pe

10
lângă propietățile oxidante, acestea mai posedă și propietăți antiinflmatorii și
chemopre ventive (Slimestad și Solheim, 2002).
Tabelul 2 . Antocianine, (Quoc și colab., 2007).
Denumire R1 R2
Pelargonidin 3 -glicozidă H H
Cianidin 3 -glicozidă H OH
Delfinidin 3 -glicozidă OH OH

Fiind utilizat ca și antioxidant în industria alimentară, coacăzele negru exercită
numeroase efecte biologice. Astfel, extractele de coacăze negru pot inhiba proliferarea unor
celule canceroase, cum ar fi celule de cancer de colon HT -29/HCT -116, cel ule de cancer
mamar MCF -7 și celule de cancer gastric SGC -7901. Astfel, în cazul celulelor de cancer
gastric SGC -7901 s -a constat că după incubarea acestora cu extract de Ribes nigrum de
concentrație 10 mg/ml timp de 10 ore, caracteristicile acestor celule s -au schimbat în mod
remarcabil și anume, s -a observat condensarea citoplasmei și formarea filamentelor
citoplasmatice. Mai mult decât atât, la concentrații și mai crescute de extract aceste fenomene
au fost mult mai pronunțate, celulele prezentând o detașare parțială, iar atunci când intervalul
de timp a fost prelungit la 24 de ore, celulele au suferit apoptoză. Așadar, proliferarea
celulelor a fost inhibată de extractul de Ribes nigr um într-o manieră dependentă de
concentrația de extract, dar și de intervalul de tratament al celulelor cu acest extract, (Jia și
colab., 2014).
Apoptoza joacă un rol important în dezvoltarea și creșterea celulelor normale, însă în
cazul celulelor canceroase de cele mai multe ori aceasta este dereglată. S -a constat faptul că,
extractele bogate în antocianină, prezintă efecte pro -apoptotice în cazul multor tipuri de celule
cultivate in vitro . Se pare că antocianinele induc apoptoza atât prin căi int rinseci, cât și prin
căi extrinseci. Ȋn cazul căilor extrinseci, antocianinele modulează expresia lui Fas, receptor al
apoptozei prezent pe suprafața celulelor, și a liganzilor acestuia în celulele canceroase
conducând la apoptoză. Ȋn calea intrinsecă însă , acestea sunt capabile să stimuleze potențialul
membranei mitocondriale, promovând eliberarea citocromului c și modulând dependența de
caspază a proteinelor pro și anti -apoptotice, (Wang și Stoner, 2008).

11
1.3. Thuja occidentalis .
Thuja occidental is (Figura 3 ) cunoscută și ca arborele vieții sau cedru alb, este un arbore
ce a fost inițial cultivat în America, având o înălțime de 15 -20 m. Fiind încadrat în regnul
Plantae , clasa Pinopsida , ordinul Pinales , familia Cupressaceae , acesta este un conifer cu
ramuri scurte și dese, cu ramificare aplatizată și cu conuri mici de culoare brun -deschis.
Prezintă frunze de culoare verde, solziforme și preferă soluri calcaroase, bine drenate,
dezvoltându -se bine în plin soare și în semiumbr ă.

Figura 3 . Thuja occidentalis , (Naser și colab., 2005).
Ȋn stare proaspătă, Thuja occidentalis , conține 0.6% ulei uri esențiale, 1.31% agenți
taninici, 1.67% acizi liberi, 2.07% zaharuri, 2.11% minerale solubile în apă, și 4.9%
polizaharide solubile în apă. Uleiul esențial prezent în frunzele proaspete, prezintă 65%
thujone, 8% izothujone, 8% fenchonă, 5% sabine și 2% α -pinen ca principale monoterpene,
compuși organici formați din 10 atomi de carbon cu diferite funcț ii. Cu toate acestea,
compușii cu masă moleculară mare precum glicoproteinele și polizaharidele sunt cei mai
importanți pentru activitatea biologică a plantei , (Neth și colab., 1995).
Este utilizată ca plantă medicinală în tratamentul unor boli precum cistită, psoriazis,
carcin oame uterin e, amenoree și reumatism. De as emena, poate fi folosită ocazional pentru
tratarea unor maladii ale pielii, sângelui, tractul gastro -intestinal, rinichiului, creierului. Unul
dinte motivele pentru care Thuja occidentalis este utilizată ca plantă medicinală se datorează
conținutului său în ulei esențial, la care 60% este reprezentat de thujonă . Thujona este o
cetonă, ce face parte din clasa monoterpenelor, care se găsește în natură sub formă de

12
diastereomeri ( -) – α-thujone și (+) -β-thujone , (Fig ura 4 ). Aceasta are rolul de a inhiba
activarea receptorului GABA, ceea ce poate conduce la spasme musculare și convulsi i, (Hold
și colab., 2000).
A) B)
Figura 4. Structura chimică pentru (-) – α-thujone (A) și (+) -β-thujone (B), (Hold și colab.,
2000).
Propietățile farmacologice ale Thujei occidentalis , au fost studiate atât in vitro , cât și in
vivo. Astfel, polizaharidele prezente la nivelul acestei plante, s -au dovedit a fi extrem de
mitogene leucocitelor din sângele periferic. Acestea detremină proliferarea și diferențierea
celulelor T, în celule CD4 -pozitive T -helper, împreună cu o creștere a concentrației de
interleukină -2 (Il-2). Datorită activării celulelor T are loc declanșarea expresiei receptorilor
pentru IL -2, dar și producerea de IL -2 la nivelul celulelor T -helper CD -4+, (Gohla și colab.,
1986).
Extractul proaspăt de Thuja occidentalis prezintă efecte anti -tumorale asupra liniei de
celule ale melanomului uman, A375. S -a dovedit faptul că , activitatea anti -tumorală este
mediată prin activarea semnalizării pro -apoptotice prin intermediul activării proteinei Bax, dar
și prin activarea caspazei -3 și citocromului c. Pentru aceasta a fost studiat potențialul anti –
tumoral asupra liniei de celule canceroase A375 atât al extractului proaspăt de Thuja
occidentalis , cât și al extractelor bogate în fracții de thujonă și s -a constat că potențialul anti –
tumoral cel mai puternic îl au extractele bogate în fracții de thujonă, acest lucru fiind
important pentru dezvoltarea unor medicamente anti -cancer din surse naturale, (Raktim și
colab., 2010).
Datorită potențialului său farm acologic care a fost demonstrat prin numeroase studii
realizate in vivo , dar și in vitro , Thuja occidentalis este foarte utilizată în fitoterapie și în
homeopatie. Principalul compus pentru care aceasta este considerată a fi o plantă medicinală
este thujona, a cărei concentrație depinde de metoda de extracție, astfel percolarea cu etanol

13
30% reduce semnificativ conținutul în thujonă în comparație cu cea cu etanol 90% (Raktim și
colab., 2010).
1.4. Filipendula ulmaria .
Filipendula ulmaria (Figura 5 ), cunoscută și sub denumirea populară de crețuscă sau
pepenică, este o plantă medicinală erbacee, perenă, a cărei flori albe sunt dispuse în corimb.
Ȋncadrată în regnul Plantae , clasa Magnoliopsida , ordinul Rosales , familia Rosaceae , aceasta
este frecvent întâlnită în zonele cu umiditate crescută din Europa și Asia. Componentele de la
nivelul plantei utilizate în scop medicinal sunt florile uscate, frunzele și rizomii. Acestea
conțin un număr de 76 de compuși fenoli ci, precum acizi fenolici (acid galic, acid salicilic,
etc.), flavonoide, taninuri hidrolizabile și condensate. Acțiunea farmacologică a acestei plante
se datorează conținutului său bogat în compuși fenolici, aceaștia având efecte antiinflamatorii,
anti-reumatice, analgezice, antipiretice, astringente și diuretice. Florile acesteia sunt utilizate
în medicina tradițională pentru febră, gută și infecții urinare, fiind o componentă importantă a
unor ceaiuri pe bază de plante mixte folosite ca remedii pentru gr ipă, reumatism sau boli la
nivelul vezicii urinare, (Katanic și colab., 2015).

Figura 5 . Filipendula ulmaria , (Katanic și colab., 2015).
Conținutul în compuși fenolici pentru Filipendula ulmaria , s-a dovedit a fi mult mai
bogat la nivelul rădăc inei spre deosebire de structurile aeriene ale acesteia. Se pare că
extractul vegetal de la nivelul rădăcinei prezintă un conținut ridicat de taninuri condensate și
galotanine, în timp ce în cazul extractului vegetal de la nivelul structurilor aeriene ale acesteia
se găsesc cantități mult mai mari de flavonoide și flavonoli. Ȋn extractul structurilor aeriene, s –

14
au identificat cinci compuși polifenolici precum acidul galic, catechina, epicatechina, rutină și
spiraeozid. Concentrația cea mai mare de epicatech ină a fost identificată în extractele
provenite din structurile aeriene ale plantei, în timp ce în cazul extractului de la nivelul
rădăcinei a fost identificată cea mai mare concentrație de catechină, (Barros și colab., 2013).
Epicatechina (Figura 6 A), este un flavonol, care face parte din grupul de flavonoizi,
fiind un puternic antioxidant a cărei acțiune este asemănătoare acțiunii insulinei și care
îmbunătățește sănătatea inimii. De asemnea, aceasta exercită un rol protector asupra
fragilității osmotice a celulelor, iar în celulele roșii ale bolnavilor de diabet epicatechina
determină o creștere a activității acetilcolinesterazei, care are rol în transmiterea influxului
nervos. Mai mult, acest flavonol reduce peroxidarea lipidelor, inhibă agregar ea plachetară,
provocând dilatarea vaselor de sânge prin reglarea oxidului nitric , (Fecka, 2009).
Catechina (Fig ura 6 B) este un fenol natural, ce face parte din familia flavonoidelor cu
activitate antioxidantă. Stuctura chimică a catechinei prezin tă două inele benzenice și un
heterociclu piran. Datorită structurii chimice, aceasta are patru diastereoizomeri, doi dintre
aceștia sunt în configurație trans și sunt denumiți catechine, în timp ce ceilalți doi sunt în
configurație cis și sunt denumiți ep icatechine. Atunci când se află în concentrație mare in
vitro , catechinele pot avea acțiune antioxidantă, însă spre deosebire de alte flavonoide,
potențialul acestora este destul de scăzut. Consumată în doze mari, catechina împreună cu
metaboliții ei poate conduce la anemie hemolitică și la insuficiență renală, deoa rece aceasta
poate induce în organism eliberarea de proteine imune care distrug anumite țesuturi și organe
interne. Catechina are un rol benefic în tratarea maladiilor cardiovasculare, având efect asupra
vasodilatării endoteliului, ceea ce duce la reglarea fluxului sangvin, (Ellinger și colab., 2012).
A) B)
Figura 6 . Structura chimică a epicatechinei(A) și a catechinei (B), (Fecka, 2009).
Filipendula ulmaria posedă o capacitate antioxidantă care se datorează conținutului
său mix de antioxidanți diferi ți, în special compuși polifenolici ce prezintă diferite mecanisme

15
de acțiune. Pentru evaluarea capacității sale antioxidante au fost realizate numeroase studii in
vitro , în care s -au utilizat mai multe metode, precum analiza totală a capacității antioxida nte,
metode pentru DPPH, teste de captare a radicalul superoxid, dar și metode pentru evaluarea
inhibiției peroxidării lipidice. Astfel, a fost evaluată capacitatea antioxidantă atât a extractului
vegetal de la nivelul rădăcinei, cât și a extractului veget al de la nivelul structurilor aeriene ale
acesteia și s -a constat că, capacitatea antioxidantă totală este foarte crescută pentru ambele
extracte. Spre deosebire de antioxidantul sintetic hidroxitoluen butilat, dar și de compuși
naturali fenolici antioxida nți, extractele de Filipendula ulmaria prezintă valori foarte bune
privind activitatea de captare a radicalului DPPH pentru IC 50, acesta fiind concentrația unui
inhibitor în care răspunsul este redus la jumătate. Acest lucru se datorează conținutului bogat
de fenoli cu acțiune antioxidantă, (Katanic și colab., 2015).
Extractele vegetale de Filipendula ulmaria prezintă activitatea de protecție în ceea ce
privește oxidarea lipidelor, principala cauză a deteriorării calității alimentelor în industria
alimentar ă. Pentru a evita pierderea calității alimentelor, în industria alimentară sunt utilizați
aditivi cu activitate antioxidantă, care au ca scop încetinirea sau inhibarea acestui proces. Cei
mai utilizați aditivi cu activitate antioxidantă sunt hidroxianisol butilat și hidroxitoluen butilat,
însă aceștia pot induce degradarea ADN și carcinogeneza. Ȋn urma studiilor realizate s -a
demonstrat faptul că extractul din rădăcina de Filipendula ulmaria a prezentat propietăți mult
mai bune împotriva peroxidării lipidel or comparativ cu extractul din părțile aeriene ale
acesteia. Mai mult decât atât, se pare că extractele de Filipendula ulmaria au propietăți
antioxidante mult mai bune spre deosebire de aditivii cu activitate antioxidantă utilizați în
industria alimentară, hidroxianisol butilat și hidroxitoluen butilat, fără ca acestea să inducă
degradarea ADN sau carcinogeneză, acest lucru datorându -se compușilor polifenolici
existenți la nivelul extractelor vegetale care prezintă o termostabilitate înaltă și propietăți
antioxidante crescute, (Niki și colab., 2005).
Așadar, compoziția fitochimică a exctractelor de Filipendula ulmaria se caracterizează
printr-o concentrație crescută de flavonoide la nivelul părților aeriene, urmată de o cantitate
mărită de taninuri la nive lul rădăcinilor, acestea putând fi încorporate în diferite alimente
pentru a spori beneficile pentru sănătate ale dietei umane, datorită propietăților antimicrobiene
și capacitășii antioxidante care s -a dovedit a fi mult mai bună comparativ cu compușii nat urali
fenolici, precum acidul ascorbic, quercetina și antioxidantul sintetic hidroxitoluen butilat. Cu
toate acestea, încă mai sunt necesare studii suplimentare în ceea ce privește toxicitatea acestor
extracte, precum și activitatea acestora in vivo , (Kata nic și colab., 2015).

16
CAPITOLUL II
STRESUL OXIDATIV

2.1. Stresul oxidativ și radicalii liberi.
Stresul oxidativ este un proces celular bazat pe pr oducerea de molecule distrugătoare
de oxigen numite radicali liberi ș i implicit pe in ițierea unor reacț ii de oxidare care au drept
rezultat agresarea membranelor ș i a organitelor celulalare, degradarea peretelui celular,
perturbarea metabolismului celular și a activității enzimatice. Stresul oxidativ mai poate fi
definit și ca dezechilibrul care favorizează oxidanții în fața antioxidanților, având un potențial
distructiv și patogenetic. Astfel, evoluția proceselor metabolice aerobe precum respirația,
fotosinteza a condus la apariția speciilor reactive de oxigen (ROS) în mitocondrii, cloroplaste
și peroxizomi , (Apel și Hirt, 2004).
Radicalii liberi sunt reprezentați de către substanțe care derivă din compuși oxidați
incomplet ce conțin în structura lor grupări de oxigen capabile să inițieze reacții agresive de
oxidare și care provin din procese ce se petrec fie în organism, fie în mediul exterior. Aceștia
prezintă o mare instabilitate chimică, fiind foarte activi din punct de vedere biochimic.
Radicalii liberi provin din două surse majore : endogenă și exogenă. Ȋn cazul sursei endogene,
formarea radicalilor li beri are loc în organism în cadrul unor fenomene metabolice sau
fiziologice, în timp ce în cazul sursei exogene (Fig. 7), radicalii liberi pătrund în organism din
mediul extern în urma unor procese precum poluarea, iradierea, fumatul de țigarete, etc.,
(Apel și Hirt, 2004).

Figura 7. Surse exogene de radicali liberi, (imagine preluată din
http://www.creeaza.com/familie/medicina/Aspecte -generale -privind -stres231.php ).

17
Radicalii liberi au capacitatea de a distruge proteinele, lipidele membranare, ducând
chiar și la degradarea materialului genetic. Cei mai activi radicali liberi sunt ionii superoxid
(O22-), peroxid (O 2-), hidroxil (OH-), oxid nitric (NO-), nitritul (NO 2-), nitratul (NO 3-),
oxigenul singlet (O 2), ozonul (O 3). Cel mai răspândit radical liber este anionul superoxid (O 2-
), deorece acesta este capabil să reacționeze cu peroxidul de oxigen (H 2O2), conducând la
formarea de hidroxil (OH-), care este mai puternic decât anionul superoxid (O 2-), (Apel și
Hirt, 2004).
Pentru a deveni reactiv chimic, o xigenul molecular trebuie sa fie activat fizic sau
chimic. Procesul de activare fizică, constă în transferul energiei de excitație de la un pigment
fotoactivat, precum o moleculă de clorofilă excitată, la oxigenul molecular, care absoarbe
suficientă energi e, având drept rezultat inversarea spinului unui electron. Astfel, oxigenul în
stare singlet este o specie reactivă, înalt difuzabilă și capabilă să reacționeze cu molecule
organice ducând la degradarea membranelor fotosintetice. Activarea chimică, pe de c ealaltă
parte, este un proces care presupune reducerea oxigenului molecular la apă, fiiind necesari
patru electroni și patru protoni. Astfel, toți cei trei radicali rezultați, radicalul superoxid (O 2-),
peroxidul de hidrogen (H 2O2) și radicalul hidroxil (O H-) sunt reactivi si toxici din punct de
vedere biologic. Toxicitatea este dată de timpul scurt de înjumătățire, înainte ca aceștia să
reacționeze cu alte componente celulare, (Rafael Per -Treves și Avihai Perl, 2002).
Radicalul superoxid este primul produ s de reacție, capabil atât de oxidare cât și de
reducere. Acesta poate reacționa conducând la producerea de alte specii reactive de oxigen și
poate suferi mutații spontane enzimatice ducând la formarea de peroxid de hidrogen , (Badger
M.R., 1985) .
Peroxid ul de hidrogen, nu este un radical liber, însă participă ca și oxidant sau
reducător în multe reacții celulare. Este înalt difuzabil prin membrane și prin alte
compratimente hidrofile, putând inactiva enzime la concentrații mici. De asemenea, acesta
este m ult mai stabil spre deosebire de radicalul superoxid și mai puțin toxic decât alte specii
reactive de oxigen. Producerea peroxidului de hidrogen are loc în urma unei reacții catalizate
de către superoxid dismutaza, în timp ce degradarea acestuia are loc la nivelul cloroplastelor,
sub acțiunea peroxidazei si cu ajutorul ascorbatului, ca și donor de electron , (Asada și Badger,
1984) .
Radicalul hidroxil, este cel mai puternic oxidant din sistemele biologice, deorece
acesta poate iniția peroxidarea lipidelor, poate ataca ADN, proteine și alte molecule mici.

18
Acesta se poate forma în urma unor reacții la care participă atât peroxidul de hidrogen, cât și
radicalul superoxid. Spre sfârțitul secolului 19, Fenton a descris potențialul oxidativ al
peroxidului de hidr ogen cu săruri de fier. Patruzeci de ani mai târziu, radicalul hidroxil a fost
identificat de către Haber și Weiss ca spe cie oxidantă în aceste reacții :
Fe2+ +H 2O2 → Fe3+ +OH- + OH-
Fe3+ + O 2- → O 2 + Fe2+
Reacția Haber -Weiss :

Astfel, în prezența ionilor de fier, superoxidul și peroxidul de hidrogen vor conduce la
formarea radicalului hidroxil care inițiază oxidarea substratelor organice. Ionii de fier, în
aceste reacții pot fi înlocuiți de ioni metalici precum Cu+, Cu2+, etc., (Arora și colab., 20 02).
Tabelul 3 . Formarea ș i caracteristicile ale celor mai importante specii reactive de oxigen,
(Rafael Per -Treves și Avihai Perl, 2002).
Reacția ΔG
kcal/mol Specii reactive Timpul de
înjumătățire
(370), sec
Oxigenul elementar

Activarea fizică
Clorofilă + O 2 → clorofilă + O 2

Activarea chimică
O2 + e- → O 2•-

O2• + e- + 2H+ → H 2O2

H2O2 + e- + H+ → HO +H 2O

+22.0

+7.6

-21.7

-8.8 Oxigenul molecular (•O -O•)

Oxigenul singlet (O -O׃)

Radicalul superoxid (•O -O׃)

Peroxid de hidrogen (H ׃O-׃H)

Radical hidroxil (H ׃O) >100

1 x 10-6

1 x 10-6

1 x 10-9

19
2.2. Sisteme antioxidante de apărare împotriva radicalilor liberi.
Există numeroase mecanisme prin care celulele se pot apăra de atacul radicaliilor
liberi. Aceste mecanisme de apărare se împart în mecanisme enzimatice și neenzimatice. Din
categoria mecanismelor de aparare enzimatice fac parte o serie de enzime antioxidante,
precum superoxid dismutaza (SOD), glutation p eroxidaza (GPx) s i catalaza, în timp ce în
categoria mecanismelor de apă rare neenzimatice intră un număr mic de molecule antioxidante
reprezentate de glutation, acid ascorbic (vitamina C), tocoferonul (vitamina E), acidul uric,
bilirubina, etc ., (Rafael Per -Treves și Avihai Perl, 2002) .
Un alt antioxidant important este acidul uric (Figura 8 A). Acesta este un marker
important în stresul oxidativ datorită faptului că asigură protecție față de reacțiile de nitrozare
rezultate în urma acțiunii peroxinitritului în cazul miocardului afectat de hipoxie (Sautin și
Johnson, 2008 ).
La fel ca ș i acidul nitric și coenzima Q denumită și ubiquinona (Figura 8 B) poate fi
considerată un antioxidant important. Localizată la nivelul membranelor plasmatice și în
lipoproteinele cu densitate mică, conezima Q acționează în mod specific la ni velul lanțului
respirator, având rol de purtător/transportor de electroni, acceptor de electroni sau transportor
de protoni , (Muta -Takada și colab., 2009) .
A) B)
Figura 8. Structura chimică a acidului uric (A) si a ubiquinonei (B),
(https ://en.wikipedia.org/wiki ).
Cu toate că au fost realizate numeroase studii cu privire la modul de acțiune al
antioxidanțiilor, complexitatea, dar și varietatea acestora, creează mari dificultăți în
înțelegerea mecanimsului lor de acțiunea în apărarea împotriva radicalilor liberi.

20
2.3. Superoxid dismutaza (SOD).
Descoperită pentru prima dată în anul 1968, de către Joe McCord și Irwin Friedovich,
superoxid dismutaza face parte din categoria metaloenzimelor, asigurând protecție
organismului față de acțiunea anionilor superoxid. Aceasta are capacitatea de a transforma
O2•- în H 2O2 împiedicând formarea de HO- de către anionul superoxid, conform reacției : 2 O 2•-
– + 2H+ → O 2 + H 2O2 . Viteza de di smutare a superoxidului în H 2O2 este accelerată de către
superoxid dismutaza de până la 1000 de ori, (Bannister și colab., 1987).
Superoxid dismutaza face parte din primele enzime care au rol în apărarea împotriva
stresului oxidativ datorită faptului că, anionul superoxid este primul produs rezultat în urma
reacției de reducere a oxigenului, dar și prima specie oxidativa care se formează în multe
sisteme biologice. Biosinteza enzimei este stimulată de către concentrații crescute de O 2, dar
inhibată de căt re Fe. Această enzimă se găsește în toate celulele aerobe, dar și în bacteriile
facultativ aerobe, (Bannister și colab., 1987).
Ȋn cazul plantelor, există trei clase de superoxid dismutze, în funcție de metalul localizat
în situsul catalitic act iv. Prima clasă de superoxid dismutaze, Fe2+ – SOD, este considerată a fi
cea mai veche clasă, fiind prezentă atât la organismele procariote, cât și la cele eucariote.
Enzima Fe2+ – SOD este formată dintr -un homodimer care conține 1 -2 g de Fe și dintr -un
tetramer care conține 3 -4 g Fe. Cea de -a doua clasă, Mn2+ – SOD, este formată dintr -un
homodimer și un homotetramer, fiecare conținând câte un atom de Mn(III) per subunitate.
Această clasă de enzime este prezentă la nivelul mitocondri lor și peroxizomilor. C ea de -a
treia clasă, Cu2+, Zn2+ – SOD, prezintă la nivelul situsului catalitic activ două metale Cu2+ și
Zn2+ care îndeplinesc roluri diferite. Cuprul participă la actul catalitic, în timp ce zincul
asigură stabilitate centrului catalitic al enzimei. Aces te enzime se găsesc în cloroplaste,
citosol, dar și în câteva spații extracelulare. Enzima Cu2+, Zn2+ – SOD, spre deosebire de
dismutaza Fe2+ – SOD, conferă mai puțină protecție împotriva acțiunii radicalilor liberi,
(Palma și colab., 1986).
Ȋn afară de cataliza reacției de dismutare a anionului superoxid, superoxid dismutaza
are capacitatea de a inhiba producerea de oxigen singlet, dar și peroxidarea acizilor grași
polinesaturați, în mod indirect. Ȋn sindroamele de ischemie -reperfuzie, inflamații acute ș i
cronice, diabet, neoplazii, afecțiuni hepatice și pulmonare, în care stresul oxidativ are un rol
bine stabilit, superoxid dismutaza poate fi testată ca potențial agent terapeutic, (Segui și
colab., 2004).

21
2.4. Catalaza.
Catalaza face parte din categoria mecanismelor de apărare enzimatice împotriva
radicalilor liberi, fiind o enzimă al cărui rol este de a cataliza descompunerea peroxidului de
hidrogen (H 2O2) în apă și oxigen, conform reacției : 2 H2O2 → 2 H 2O + O 2 . Aceasta este o
heteroproteină formată di n patru catene polipeptidice, fiecare catenă conținând peste 500 de
aminoacizi și o grupare prostetică de tip porfirinic, al cărei sarcină este de a permite reacția
enzimei cu peroxidul de hidrogen. Catalaza este o enzimă prezentă la toate organimsmele
expuse la oxigen, precum bacterii, plante și animale, cu cel mai mare turnover: o moleculă de
catalază poate converti milioane de molecule de peroxid de hidrogen în apă și în oxigen în
fiecare secundă, (Chelikani și colab., 2004).
Ȋn cazul mamiferelor, cata laza este localizată atât la nivelul citosolului, cât și la nivelul
peroxizomilor. La plante însă, aceasta se găsește le nivelul peroxizomilor. Peroxizomul este
un organit celular delimitat de o singură membrană și care conține pe langă catalză și alte
enzime generatoare de peroxid de hidrogen, fiind astfel implicat în procese metabolice,
precum beta -oxidarea acizilor grași cu catenă foarte lungă. Izoenzimele catalazei diferă în
ceea ce privește propietățile lor biochimice. Astfel, unele dintre ele sunt imp licate în procesul
de germinare, principalul rol fiind în conversia acizilor grași, în timp ce altele sunt implicate
în lignificare, fotorespirație, dar și în procese de senescență, (Kendall și colab., 1983).
Ȋn condiții de stres, precum căldura excesivă, lumina, temperatura scăzută, catalaza
suferă un proces de inactivare și necesită sinteză de novo. Inactivarea acesteia poate fi
completată de către descreșterea producției de peroxid de hidrogen, dar și de creșterea
concentrației de ascorbat și glutation. Atât catalaza, cât și peroxidul de hidrogen sunt implicați
în reacția hipersenzitivă și în răspunsul la infecția patogenă a plantelor prin intermediul
acidului salicilic care inhibă catalaza, astfel încât concentrația crescută de peroxid de hidrogen
este implicată în activarea genelor implicate în apărare. Acidul ascorbic inhibă de asemenea și
enzima ascorbat peroxidaza, aceasta fiind o altă enzimă cheie al cărei rol este de a cataliza
peroxidul de hidrogen. Inhibiția acesteia de către acidul ascorbic pare însă să fie reversibilă.
Astfel, atât inhibiția catalazei, cât și a ascorbat peroxidazei de către acidul ascorbic este
implicată în medierea răspunsurilor de apărare prin concentrația crescută de peroxid de
hidrogen și prin perturbările reacțiilor redox c are au loc la nivel celular, (Durner și Klessig,
1995).

22
2.5. Glutation peroxidaza (GPx).
Descoperită în anul 1957 de către Gordon C. Mills, glutation peroxidaza este o enzimă
a cărei funcție biochimică este de a reduce peroxidul de hidrogen la apă, con form reacției:
2GSH + H 2O2 → GS -SG + 2H 2O, unde GSH reprezintă monomerul de glutation redus, iar
GS-SG este glutation disulfid. Ȋn această reacție are loc oxidarea seleniului de la nivelul unui
rest de selenocisteină de către peroxidul de hidrogen. Apoi, o a doua moleculă de glutation
reduce compusul intermediar format, GS -SeR, rezultând glutationul disulfid, (Bhabak și
Mugesh., 2010).
Izoenzimele glutation peroxidazei variază atât în ceea ce privește localizarea în diferite
compartimente celulare, cât și în specificitatea de substrat. Până în prezent au fost identificate
8 izoenzime ale glutation peroxidazei. Izoenzimele GPx1, GPx2, GPx3 și GPx4 întâlnite la
mamifere conțin seleniu, acesta având un rol foarte important în mecanismul antioxidant.
Astfel, g lutation peroxidaza 1 (GPx1), este cea mai răspândită izoenzimă, aceasta fiind
localizată în citoplasma mamiferelor și al cărei substrat preferat este peroxidul de hidrogen.
Glutation peroxidaza 2 (GPx2), este o enzimă ce se întâlnește la nivelul intestinu lui, având
localizare extracelulară, în timp ce glutation peroxidaza 3 (GPx3) se găsește în cantitate mare
în plasmă. Atât GPx2, cât și GPx3, sunt enzime cu structură homotetramerică. O altă
izoenzimă cunoscută cu structură monomerică este glutation peroxi daza 4. Aceasta are ca și
substrat preferat hidroperoxidul lipidic, fiind exprimată în aproape fiecare celulă de la
mamifere, dar la nivele mult mai scăzute, (Muller și colab., 2007).
Glutation peroxidaza este implicată în apariția unor maladii. Studiile clinice realizate
au demonstrat că nivelele scăzute de glutation peroxidază în plasmă sunt întâlnite în cazul
pacienților cu diabet de tip 2. De asemenea, concentrații scăzute de glutation peroxidază
măsurate la nivelul serului pot contribui și la apariția maladiei vitiligo, aceasta fiind o boală a
pielii și a mucoaselor, ce se caracterizează prin apariția unor pete albe care contrastează cu
pielea de culoare normală, (Zedan și colab., 2015).
Ȋmpreună cu superoxid dismutaza, glutation peroxidaza joacă un rol important în
apariția bolii celiace care este o afecțiune autoimună declanșată de ingestia glutenului
alimentar, ce se caracterizează prin alterarea de către sistemu l imunitar al organismului a
stratului mucos de la nivelul intestinului subțire. Se par e că frecvența polimorfismului
afectează structura celor două enzime a căror concentrații depi nd de nivelul de stres oxidativ ,
(Katar și colab., 2014).

23
2.6 .Glutation reductaza (GR).
Glutation reductaza este o flavoproteină, care la oameni este codificată de către gena
glutation -disulfid reductaza (GSR). Purificată pentru prima dată de către Racker, această
enzimă catalizează reducerea glutationului oxidat (GSSG) la glutation redus (GSH), care este
o moleculă ce joacă un rol important în rezistența la stre sul oxidativ și în menținerea mediului
reducător al celulei. Funcționând ca o oxidoreductază dimerică disulfurică, glutation
reductaza, utilizează o grupare prostetică, flavin adenină nicotinamidică (FAD) și o grupare
nicotinamidă adenozin nicotinamidică f osfat (NADPH), pentru a reduce un echivalent molar
de GSSG la doi echivalenți molari de GSH, conform următoarei reacții: GSSG + NADPH →
2 GSH + NADP+. Prezența unui rest de cisteină (Cys) la nivelul situsului activ al glutation
reductazei catalizează redu cerea glutationul oxidat la glutation redus, în timp ce gruparea
FAD inițiază reacția de reducere a glutationului oxidat prin intermediul atacului nucleofilic
asupra GSSR cu ajutorul anionului FADH- tranzitoriu, (Creissen și colab., 1994).
Ȋn majoritatea plantelor, glutation reductazele sunt homodimeri (Figura 9 ), având o
masă moleculară cuprinsă între 100 și 150 kDa și conținând o grupare FAD per monomer.

Figura 9. Homodimerul glutation reductazei, (Sarvajeet și colab., 2013).

24
Deși majoritatea glutation reductazelor sunt homodimeri, având o configurație 2α,
acestea se pot găsi și ca monomeri la Chalmydomonas reinharditii , dar și ca heterodimeri la
Pisum sativum și Zea mays. Dimerii glutation peroxidazei pot fi transformați în te trameri sau
chiar pot trece în stări superioare de agregare, iar gradul de superioritate al stării este
dependent de pH și de temeperatură decât de substrat sau de produșii de reacție. Acesta
reprezintă unul dintre mecanimsmele de reglare a activității cat alitice a glutation reductazei,
(Sarvajeet și colab., 2013).
Glutation reductaza este prezentă la toate regnurile. Dacă la bacterii, drojdii și animale
există o singură genă care codifică pentru glutation peroxidază, în genomul plantelor se
găsesc două gen e care codifică pentru această enzimă. Glutation reductaza a fost purificată și
bine caracterizată din frunzele unor plante precum Zea mays , Spinacia oleracea și Pisum
sativum . Tot în cazul plantelor, glutation reductaza prezintă cea mai crescută activita te la
nivelul cloroplastelor, aceasta fiind prezentă și la nivelul mitocondriei, dar și la nivelul
citosolului. Cel mai important rol al glutation reductazei la plante, este de a contribui la
răspunsul plantelor la stresul abiotic, precum salinitatea, sece ta, metalele grele care limitează
productivitatea prin inducerea supraproductivității speciilor reactive de oxigen. Astfel,
glutation reductaza convertește glutationul oxidat (GSSG) la glutation redus (GSH),
menținând un raport ridicat de GSH/GSSG sub infl uența stresului abiotic. Creșterea activității
glutation reductazei a fost observată la mai multe specii de plante, cum ar fi Cucumis sativus ,
Phaseolus aureus , Nicotiana tabacum și Zea mays, în condiții de temperatură crescută. De
asemenea, și în condiții de temperaturi scăzute a fost observată creșterea activității glutation
reductazei, în cazul unor plante precum Oryza sativa , Cucumis melo , Citrullus lanatus și
Crocus sativus. Numerose studii realizate au arătat faptul că, ozonul joacă un rol important în
ceea ce privește modularea activității GR în cazul speciilor de plante Oryza sativa și Beta
vulgaris . Astfel, sub acțiunea radiațiilor UV, s -a observat o creștere a activității GR la diferite
specii de plante, precum Cucumis sativus , Arachis hypogaea și Acorus calamus , (Rao și
Reddy, 2008).
Ȋn ceea ce privește semnificația clinică, GR este un antioxidant celular cheie care joacă
un rol major în procesul de metabolizare al xenobioticelor electrofile. Mai mult, această
enzimă este o țintă foarte bună pent ru unele medicamente anti -malarie deoar ece, GR a
parazitului malariei Plasmodium falciparum are o pliere mult mai bună decât GR de la
mamifere. Astfel, prin dezvoltarea unor medicamente specifice acestui parazit poate fi

25
posibilă inducerea stresului oxidat iv la nivelul acestuia, fără a fi afectată gazda, (Sarma și
colab., 2003).
2.7. Glutationul redus (GSH).
Glutationul este o tripeptitidă constituită din glutamat (Glu), cisteină (Cys) și glicină
(Gly), având o masă moleculară mică. Aproape omniprezent, acesta lipsește în câteva
organisme care utilizează diferiți cofactori tiol precum coenzima A, micotol sau ergotionină.
La nivelul țesuturilor plantelor, glutationul poate exista atât în formă redusă (GSH) având o
grupare tiol liberă, cât și în formă oxidată (GSSG), în care două molecule de glutation sunt
legate printr -o punte disulfidică. Cea mai mare concent rație de glutation se găsește la nivelul
cloroplastelor, dar acesta poate fi găsit și î n mitocondrie, peroxizomi, reticul endoplasmatic,
apoplast. Ȋn celulele și țesuturile sănătoase, mai mult de 90% din totalul de glutation se
găsește în formă redusă și m ai puțin de 10% se află în stare oxidată. O creștere a raportului
GSSG la GSH este considerată o indicație a stresului oxidativ. Astfel, datorită prezenței
cisteinei, reactivității chimice și înaltei solubilități în apă a grupării tiol ( -SH), glutationul e ste
un metabolit vital implicat în numeroase procese precum creșterea, dezvoltarea și modularea
răspunsurilor plantelor la factorii de stres din mediu, (Sarvajeet și colab., 2013).
Există numeroși omologi ai glutationului prezenți la câteva plante, în spe cial la
legume. Cel mai frecvent este homoglutationul (hGSH) prezent la nivelul legumelor. Similar
cu glutationul, acesta prezintă un rest de β -alanină în loc de un rest de glicină. S inteza acestuia
necesită prezent a unei sintetaze hGSH specifice. Un alt o molog al glutationului este
hidroximetilglutationul. Ȋn acest caz, restul de glicină este înlocuit cu un rest de serină. Acest
compus se găsește în plante precum orezul, grâul și orzul, (Rouheir și colab., 2008).
Biosinteza glutationului are la bază două reacții ATP -dependente, catalizate de către
două enzime, gama -glutamil -cistein sintetaza și GSH sintetaza. Cele două reacții se
desfășoară atât la nivelul cloroplastelor, cât și în alte organite celulare. Astfel, în prima reacție
gama -glutamil -cistein sint etaza catalizează reacția cisteinei cu glutamatul rezultând γ -Glu-
Cys. Ȋn cea de -a doua reacție, GSH sintetaza catalizează reacția dintre glicină și γ -Glu-Cys,
formându -se în final GSH. Sinteza GSH la plante poate fi reglată atât de concentrația de
cistein ă cât și de glicină în unele condiții. Resturile de Cys reactive permit glutationului să își
mențină în condiții de stres grupările tiol în stare nativă. Creșterea biosintezei de GSH în
unele plante precum Nicotiana tabcum și Arabidopsis thaliana este infl unețată de
concentrațiile ridicate de cisteină. De asemenea, biosinteza de GSH la plante este modulată și

26
de alți factori importanți cum ar fi concentrația de ATP, oxidul de azot (NO), acidul salicilic
(SA), lumina, dioxidul de carbon (CO 2), ozonul și oxig enul, (Mendoza -Cozatl și colab.,
2005).
Glutationul prezintă numero ase funcții. Ȋn stare redusă, gruparea tiol a cisteinei, are
capacitatea de a dona un echivalent redus (H+, e-) altor molecule cum ar fi speciilor reactive
de oxigen cu scopul de a le neu traliza sau proteinelor care conțin grupare Cys pentru a
menține forma lor redusă. De asemenea, interacțiile glutationului cu alte molecule cu
electrofilicitate relativ mare are drep t consecință scăderea concentra ției de GSH din interiorul
celulei. Glutati onul are un rol important și în progresia celulară, inclusiv în moartea celulară.
Prin urmare, concentrația de GSH reglează modificările redox ce au loc la nivelul proteinelor
nucleare necesare pentru diferențierea celulară. Diferențe în ceea ce privește c oncentrațiile de
GSH determină de asemenea moartea celulelor fie prin apoptoză, fie prin necroză, (Sarvajeet
și colab., 2013).
Ȋn cazul plantelor, glutationul are un rol extrem de important în ceea ce privește
rezistența la stres sub acțiunea factorilor biotici și abiotoci. Acesta constituie un buffer redox
care menține mediul intracelular redus. De asemenea, glutationul este implicat în detoxifierea
speciilor reactive de oxigen. GSH poate fi oxidat la GSSG de către unele specii reactive de
oxigen, precum peroxidul de hidrogen, poate reacționa cu oxidul nitric pentru a forma derivați
GSNO, și poate participa în ciclul glutation/ascorbat, în care GSH permite regenerarea
ascorbatului redus, un alt antioxidant important la plante, (Rouheir și colab., 2008).
Glutationul este precursor de fitochelatine. Localizate la nivelul vacuolelor,
fitochelatinele sunt oligomeri de glutation care chelatează metale grele precum cadmium.
Acestea sunt caracterizate de o structură generală de tipul (γ -Glu-Cys) n-Gly, dar în une le
plante restul de Gly terminal este înlocuit de un rest de Ala, Gln, Glu sau Ser, conducând la
formarea de isofitochelatine.Glutationul asigură o protecție eficientă împotriva agenților
patogeni la numeroase plante precum Pseudomonas syringae și Phytopht hora brassicae . De
asemenea, glutationul este utilizat ca donor de electroni de către adenil -sulfat -reductaza, o
enzimă implicată în asimilarea sulfului. Alte enzime care utilizează glutationul ca substrat
sunt glutaredoxinele. Acestea sunt oxidoreductaze care participă la dezvoltarea florilor,
acidului salicilic, fiind implicate și în mecanismele de apărare la plante. Ȋmpreună cu
glutationul, aceste enzime participă la răspunsul la stresul oxidativ prin regenerarea enzimelor
implicate în reducerea peroxidu lui și metionin sulfoxidului, (Rouheir și colab., 2008).

27
2.8. Malondialdehida (MDA).
Fiind principalul produs rezultat în urma peroxidării acizilor grasi polinesaturați,
malondialdehida este o specie electrofilă reactivă care conduce la apariția stresului oxidativ la
nivel celular. Aceasta participă la sinteza de tromboxan A2, compus de na tura eicosanoidică
cu rol important în tromboză, unde ciclooxigenaza 1 sau ciclooxigenaza 2 metabolizează
acidul arahidonic la prostaglandina H2. Ȋn stare fiziologică, la pH neutru, malondialdehida
prezintă o reactivitate chimică scăzută, (Daniele Del Rio și colab., 2005).
Malondialdehida poate interacționa cu bazele azotate ale acidului nucleic, conducând
la formarea de diferiți compuși. Principalul produs al acestei reacții este pirimido -[1,2-a]-
purin10(3H) -onă deoxiriboză sau M 1dG. Ȋn funcție de secvenț ă, M 1dG, este capaiblă să
inducă mutații și substituții de perechi de baze la nivelul celulelor bacteriilor și mamiferelor.
Tot la nivelul acidului nuclei c, malondialdehida are capacitatea de a conduce la formarea unor
legături încrucișate cu potențiale ef ecte biologice. Astfel, malondialdehida poate genera
legături încrucișate între ADN și proteine. Au fost observate formarea de legături între ADN
și histone mediate de malondialdehidă în condiții de pH fiziologic. S -a constatat faptul că,
MDA reacționează mai întăi cu fracția proteică, după care are loc formarea legăturii
încrucișate, însă dacă aceasta reacționează mai întâi cu acidul nucleic, nu are loc formarea
unei legături încrucișate. Toate aceste activități potențial genotoxice ale malondialdehidei au
ca și rezultat apariția unor mutații care ulterior vor conduce la cancer, (Voitkun și Zhitkovich,
1999).
Fiind un compus toxic, malondialdeida este un marker important al peroxidării
lipidelor și prin urmare este considerată unul dintre factorii principa li în ceea ce privește
apariția cancerului. Astfel, în cazul cancerului la plămâni s -au observat concentrații ridicate
de malondialdehidă la nivelul plasmei. Concentrații ridicate de malondialdehidă au fost
observate și în cazul cancerului cervical, dar și în cancerul gastric. Ȋn cazul paciențiilor cu
cancer cervical concentrațiile crescute de MDA au fost determinate la nivelul eritrocitelor, în
timp ce pentru pacienții cu cancer gastric, concentrații ridicate de MDA au fost observate la
nivelul plasmei. De asemenea, s -a observat faptul că, concentrația de MDA crește odată cu
stadiul bolii, (Bakan și colab., 2002).
Ȋn concluzie, malondialdehida este mai mult decât un simplu marker, care poate fi
derivat prin peroxidarea lipidelor, dar poate fi generat și în urma metabolismelor fiziologice,
fiind un compus extrem de mutagen, (Da niele Del Rio și colab., 2005).

28
2.9. Condiții care sporesc apariția stresului oxidativ.
Poluanții se numără printre cei mai răspândiți factori care favorizează apariția stresului
oxidativ. Astfel, poluanții atmosferici, precum ozonul (O 3) sau dioxidul de sulf (SO 2), sunt
implicați în formarea radicaliilor liberi, făcând parte din principalii factori care contribuie la
dispariția pădurilor. Ozonul, care provine în urma degradării fotoch imice a oxidului de azot
(NO), este mult mai nociv pentru plante, spre deosebire de dioxidul de sulf. Fitotoxicitatea
acestuia se datorează capacității sale de oxidare și generării ulterioare a radicalilor liberi. S -a
demonstrat faptul că, la nivelul spați ilor intercelulare ale aerului din frunze, concentrația de
ozon este foarte scăzută. Astfel, este puțin probabil ca ozonul să ajungă la cloroplaste, dar cu
toate acestea el provoacă oxidarea pigmentului, dar și peroxidarea lipidelor. De asemenea, s -a
demon strat faptul că în urma expunerii la tratamentul cu ozon, este stimulată sinteza și
degradarea proteinei PSII -DI, complex proteic implicat în reacțiile dependen te de lumină ale
fotosintezei, la molid, în timp ce în cazul plopului s -a observată o scădere a cantității și
activității enzimei RuBisCO (ribuloza -1,5-bifosfat carboxilaza), enzimă implicată în fixarea
carbonului, proces prin care dioxidul de carbon este convertit de către plante în molecule
bogate în energie precum glucoza, (Ajay, Sairam și Srivast ava, 2002).
Un alt tip de factori care conduc la generarea radicalilor liberi sunt erbicidele. Astfel,
compuși precum paraquat cunoscut și sub denumirea de viologen de metil participă la
oxidarea dependentă de lumină la plante. Datorită caracterului dica tionic, este facilitată
reducerea acestora la radicali cation. Reducerea mediată de PSI a paraquatului, conduce la
formarea unui radical mono -cationic ce reacționează cu oxigenul molecular generând O 2-,
conducând ulter ior la producerea de specii reac tive cum ar fi H 2O2 și OH-, (Elstner, Wagner și
Schultz, 1988).
Metalele sunt compuși fitotoxici care rezultă în urma activitățiilor industriale și
agricole. Zn, Cu și Cd sunt metale larg răspândite care inhibă creșterea, determinând cloroză
și necroză. S -a demonstrat faptul că ionii de cupru (Cu2+) determină peroxidarea lipidelor
mediată de lumină, oxidarea pigmenților la secară și scăderea concentrației de catal ază
endogenă. Ionii de cupru sunt activi redox, catalizând reacții de tip Fenton care duc la
forma rea de OH-. Spre deosebire de Cu2+, cadmiul favorizează scăderea contrațiilor de
clorofilă și hem a boabelor de fasole care germinează prin inducerea lipooxigenazei împreună
cu inhibarea simultană a enzimelor antioxidante precum SOD și CAT, care rezultă în urma

29
legării metalului la enzime care are ca și consecință creșterea acțiunii fitotoxice a metalului,
(Ajay, Sairam și Srivastava, 2002).
Toxinele fotosensibilizatoare fac și ele parte din categoria factorilor care sporesc
apariția stresului oxidativ. Ac estea fac ca plantele să devină sensibile la lungimi de undă
vizibile, inițiând reacții fitotoxice. Cel mai cunoscut fotosensibilizator fungic este toxina
cercosporin. Ciuperca Cercospora conduce la distrugerea unor specii importante de cultură
precum poru mbul, sfecla de zahăr, tutunul, cafeaua și soia. Toxina acesteia este un metabolit
secundar de culoare roșie. Activat de lumină, acesta reacționează cu oxigenul ducând la
formarea 1O2 și la degradarea membranei. Prin degradarea membranei sunt furnizate
substanțele nutritive necesare pentru creșterea și sporularea fungiilor în gazdă, (Daub și
Hangartner, 1983).
Seceta este un alt factor favorizant al stresului oxidativ. Plantele răspund la secetă prin
sintetizarea de poliamine, dar și de proteine. Ȋn condi ții de secetă, disponibilitatea dioxidului
de carbon este redusă pentru procesul de fotosinteză, conducând la generarea de specii
reactive de oxigen prin direcționarea greșită a electronilor în sistemul fotosensibil. S -a
observat faptul că, activitatea glu tation reductazei a crescut în condiții de secetă în cazul
grâului și bumbacului, făcând ca NADP să fie disponibl pentru a minimiza formarea ionului
superoxid. Astfel, în cazul speciilor care prezintă toleranță la secetă concentrația enzimelor
glutation re ductază și ascorbat peroxidază este crescută. Modificările induse de secetă în ceea
ce privește peroxidarea lipidică și activitatea enzimelor SOD și catalază au fost comparate în
cazul a două specii de mușchi, o specie tolerantă la secetă, Tortula ruralis , și o specie
sensibilă la secetă, Cratoneuron filicinum . Astfel, pe parcursul sresului indus prin expunerea
la condiții de secetă, specia tolerantă la secetă a prezentat nivele scăzute ale peroxidării
lipidelor, dar și concentrații crescute ale celor două enzime, SOD și catalază, în timp ce în
cazul speciei sensibile la secetă, aceasta a prezentat un nivel ridicat al peroxidării lipidice
împreună cu o concentrație scăzută ale celor două enzime, (Dhindsa și Matowe, 1981).
Ȋn concluzie, plantele sunt expuse zilinic la numeroase schimbări de mediu, însă ele au
dezvoltat un spectru larg de răspunsuri biochimice la factorii de stres precum, poluanții,
metalele, erbicide, toxine fotosensibilizatoare, secetă, (Ajay, Sairam și Srivastava, 2002).

30
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

Scopul
Scopul studiului de față este evaluarea capacităț ii antioxidante a extractelor vegetale
asupra liniei celulare Cac o-2. Astfel, evaluarea capacit ății antioxidante a extractelor vegetale
s-a realizat prin expunerea liniei celular e Cac o-2 la tratamente diferite ș i anume: testarea
viabilității celulare prin testul MTT ș i a stresului oxidativ prin determinarea nivelului de ROS
și a concentratiei de MDA ș i GSH.
Obiective
Lucrarea de față își propune atingerea următoar elor obiective:
 Evaluarea viabilităț ii celulare prin testul MTT .
 Determinarea nivelului de specii reactive de oxigen (ROS). Nivelul ROS intracelular
se va determina prin fluorescență cu ajutorul 2',7' dicloro -dihidro -fluorescein diacetat
(H2DCFDA) .
 Determinarea concentrației de malondialdehidă (MDA) și glutation redus (GSH).
MDA este un marker al peroxidării lipidice și se va determina printr -o metodă
fluorimetrică . De asemenea, nivelul GSH, cel mai important antioxidant ne -enzimatic,
se va determi na în lizate celulare deproteinizate cu soluție de acid sulfosalicilic.

31
PARTEA EXPERIMENTALĂ
CAPITOLUL I II
MATERIALE ȘI METODE

Extractele vegetale au fost obținute și sintetizate de către compania PlantExtrak t cu
sediul la Radaia, la 14 km departare de Cluj Napoca, care are o experiență de peste 20 de ani
în prelucrarea plantelor cu realizarea de preparate fitoterapeutice, gemoterapice si
medicamente homeopatice. Ȋn acest studiu au f ost testate 3 tipuri de tinc turi vegetale care au
fost obținute din următoarele specii vegetale : Thuja occidentalis, Ribes nigrum, și Filipendula
ulmaria .

3.1. Obținerea extractelor vegetale.
Extractele vegetale au fost obținute din tinctura mamă, prin prelucrarea în stare
proaspătă și extracție la rece, în felul acesta păstrându -se nealterat fitocomplexul responsabil
de acțiunea terapeutică. Tinctura mamă este o formă specială de extracte hidroalcoolice ce se
obțin pentru a fi diluate succesiv și potentențate după metode specifice homeopatiei.
Caracteristica principală a tincturii mamă constă în faptul că aceasta este obținută din plante
în stare proaspătă, în timp ce tincturile clasice sunt obținute exc lusiv din plante prelucrate în
stare uscată. Obținerea tincturilor mamă se realizează pe baza unor metode specifice,
standardizate, compendiale, preluate și descrise în Farmacopeea Europeană (FE), ediția a -8a,
capitolul Preparate Homepatice, monografia 01/ 2011 :2371 respectiv 01/2012:2029. Ȋn funcție
de starea lor de prelucrare și de conținutul de compuși activi , tincturile mamă se pot obține
prin mai multe metode. Solventul de extracție utilizat este alcoolul etilic a cărui concentrație
poate varia de la 18 și 90% volum sau alcool etilic absolut. Astfel, tincturile mamă din materii
prime vegetale au fost obținute prin metoda 1 din Farmacopeea Homeopată Germană (FHG)
care a pre supus obținerea de suc din materialul vegetal proaspăt, ce este apoi stabilizat pri n
amestecarea cu alcool etilic 90% vol. în proporție de 1 :1. Etapele de prelucrare utilizate în
procesul tehnologic de obținere a tincturilor mama au fost:

32
1. Selectarea, etapă care se realizează manual și care a presupus sortarea produsului
vegetal pentru el iminarea p ărților străine de plante, a unor specii străine sau a unor
indivizi atacați de boli sau de degradare.
2. Mărunțirea materialului vegetal proaspăt în vederea presării, etapă realizată în
tocătoare speciale pentru materialul vegetal proaspăt.
3. Extracț ia propriu -zisă prin presarea materialului vegetal cu obținerea unui suc care
conține apa din materialul vegetal și toți compușii bioactivi solubili în acesta, etapă ce
a preupus utilizarea de prese hidraulice, la presiuni cuprinse între 250 și 300 atm.
4. Amestecarea sucului obținut cu solventul – alcool etilic de 90% vol., proporție 1 parte
suc – 1 parte solvent, conform prevederilor din farmacoopei, urmat de omogenizare. Ȋn
această etapă are loc conservarea sucului, care în timp ar fermenta fără acțiunea
conservantă a alcoolului etilic.
5. Stabilizarea extractului prin menținerea tincturii mamă obținute în repaus, la maxim
250C și ferit de lumină. Ȋn această fază orice balast sau compus care nu se poate
menține pe timp îndelungat în soluție va precipita. Timpul ne cesar este de 10 zile.
6. Filtrarea clarifiantă a tincturii mamă care se realizează cu filtre presă ce folosește ca și
material filtrant hârtie presată cu diferite porozități. Scopul acestei etape este de a
transforma tinctura mamă într -un produs vra c finalizat, care apoi se poate ambala în
ambalaje finale destinate pieței.

3.2. Cultivarea liniei celulare Caco -2 și tratamentul acesteia cu extractele vegetale.
În cadrul acestui studiu a fost utilizată linia celulară de enterocite Caco -2 (American
Type Cell Culture, ATCC; cod CCL -2102), obținută din colon. Linia celulară a fost menținută
la 370C în atmosferă de 5% CO 2 și cultivată î n mediul de cultură DMEM cu 10 % ser fetal
bovin. În vederea evaluării efec tului antioxidant al extractelor vegetale, celulele au fost tratate
cu diferite concentrații (5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, si 100 μg/mL) la intervale de 12, 24 si
48 de ore ( pentru testul MTT) , în timp ce pentru testele de stres oxidativ (MDA, GSH si
ROS) s -au ales concentraț iile de 25 si 100 μg/mL la intervalele de 24 si 48 de ore. Ȋn cazul
celor trei tincturi luate în studiu, stresul oxidativ a fost testa t atât în prezenț a cât și în absenț a
agentului oxidant (150μM H 2O2). Pentru fiecare experiment a fost ales un eșantion de celule
netratate (control netratat) și un eșantion de celule tratate cu agentul oxidant (control H 2O2
150 μM).

33
S-au utilizat două loturi experimentale:
Lot I: Celulele Caco -2 au fost tratate cu extractele vegetale simple la concentrații de 25
si 100 μg/mL având ca eșantion celule netratate (control netratat) ;
Lot II: Celulele au fost tratate timp de 1 oră cu agentul oxidant (150 μM H2O2), după
care a fos t îndepărtat și adăugat tratamentul cu extracte la concentrații de 25 și 100 μg/mL
timp de 24 respectiv 48 de ore.

3.3. Obținerea lizatului celular.
Lizatele celulare obținute î n urma tratamentului cu extractele vegetale au fost
dezghețate și au fost sonicate pe gheață, timp de 30 secunde de 3 ori cu sonicatorul UP50H
Hielscher -Ultrasound Technology . Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 40C, la
5000 rpm, iar supernatantul a fost alicotat și păstrat la -800C în vederea analizării principalilor
markeri ai stresului oxidativ.

3.4. Determinarea viabilității celulare prin testul MTT.
Testul MTT este un test colorimetric , ce a fost descris pentru prima dată de către
Mossma n (Mossman, 1983), fiind utilizat pentru determinarea citotoxicității și a proliferării
celulare (James M.McKim Jr., 2010).
Această metodă constă în reducerea compusu lui MTT (1-bromură de 3 -(4,5-
dimetiltiazol -2-yl)-2,5-difeniltetrazolium) de culoare galbenă (Figura 10), la cristale de
formazan violet, de către enzimele (succinat dehidrogenaze mitocondriale – NAD(P)H
dependente) celulelor active metabolic. Formarea formazanului și apariția culorii violet este
un marker pentru celulele viabile. Ulterior, formazanul este solubilizat cu izopr opanol 100% ,
iar concentația este determinată spectrofotometric la lungimea de undă 595 nm.

34

Figura 10. Structura compusului MTT și a produsului său de reducere, formazanul.
În vederea evaluării efectului citotoxic al extractelor vegetale la nivelul liniei celulare
Caco-2, celulele au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri la o densitate de 5×104
celule/mL. După apl icarea tratamentului cu extractele vegetale la concentrații de 5, 25 , 50 si
100 µg , celulele au fost incubate timp de 12, 24 și respectiv 48 de ore. Drept control s -au
folosit godeuri cu c elule netratate cu extracte vegetale. La 12, 24 și respectiv 48 de ore se
îndepărtează mediul de cultură și se spală cu 1 ml PBS/ godeu după care se îndepărtează PBS –
ul și se adaugă 500 µL MTT (1 mg/ml). După 2 ore de incubare se îndepărtează MTT -ul și se
solubilizează cristalele de formazan cu soluție de izopropano l 100%. Viabilitatea celulară a
fost determinat ă spectrofotometric la lungimea de undă 595 nm.

3.5. Determinarea concentrației proteice prin metoda Bradford.
Metoda Bradford este o tehnică spectrofotometrică (Bradford M.M, 1976) care se
bazează pe determinarea concentrației proteice din lizatele celulare printr -un procedeu simplu
și rapid , ce presupune atașarea neconvalentă a colorantului Coomassie Brilliant Blue (G -250)
în formă anionică la resturile de aminoacizi ale proteinelor (Bradford, 1976). Colorantul din
alcătuirea reactivului Bradford interacționează în special cu resturile de arginină și într -o
măsură mai mică cu resturile de histidină, lizină, tirozină, triptofan și fenilalanină. Reactivul
Bradford , în lipsa interacțiunii cu proteinele , are culoarea roșu pal și prezintă o absorbanță
maximă în jurul valorii de 465 nm. Culoarea acestuia se modi fică în alb î n urma atașării la
proteine , iar absorbanța maximă se înregistrează la o lungime de undă de 595 nm. Datorită
faptului că această metodă prezintă o sensibilitate sporită la albumina serică bovină (BSA),
curba etalon s -a realizat pornindu -se de la o soluție stoc standard de 3 mg/ ml BSA în PBS.

35
Au fost utilizate plăci cu 96 de god euri în care s -au pipetat câte 250 µl reactiv
Bradford și câte 5 µl din lizatul celular diluat corespunzător. Ulterior, p laca s -a incubat 15
minute la întuneric, la temp eratura camerei. Citirea absorbanțelor s -a realizat la instrumentul
FlexStation 3 Multi -Mode Microplate Reader de la Molecular De vices LLC și soft -ul
SoftMax Pro la o lungime de undă de 595 nm. Absorbanțele au fost citite atât pentru fiecare
punct din curb a etalon cât și pentru pr obele de interes și s -a realizat un grafic în care s -a
exprimat concentrația proteică în funcție de valorile absorbanței probelor de BSA. Pe graficul
curbei etalon s -au extrapolat densitățile optice ale probelor de interes, determi nându -se astfel
concentrațiile lor proteice.

3.6. Dozarea conținutului de Glutation Redus (GSH).
Principiul metodei
Dozarea concentrației de glutation redus se bazează pe o analiză cinetică în care
cantități catalitice (nmoli) de GSH determină o reducere continuă a 5,5’ -ditiobis (2 -acid
nitrobenzoic) (DTNB) la TNB, iar GSSG format este refăcut de către glutation reductaza și
NADPH. Rata de reacție este direct proprotională cu concentrația glutationului până la 2 µM.
Ȋn urma reacției, produsul galben obținut , 4-tio-2-acid nitrobenzoic (TNB) , este măsurat
spectrofotometric la 412 nm. Drept standard se utilizează o curbă de calibrare realizată cu
GSH 10 mM pentru a determina concentrația de glutation din probe.
Soluții și reactivi folosiți:
1) SSA 5% – 0.5 g într -un volum final de 10mL apă distilată ;
2) GSH standard: 10mM (sto ck) – se diluează 200x într -un volum final de 1 mL de
SSA 5% ;
3) Assay Buffer 100 mM, pH=7 – Tampon fosfat de p otasiu: KOH+1 mM EDTA ;
4) Soluție de DTNB (acid 5,5` -ditiobis -2-nitrobenzoic) ;
5) Mix de reacție realizat cu: Assay Buffer 8mL+ soluț ie DTNB 228 µL .
Se trasează curba standard folosind următorii reactivi/soluț ii din Tabelul 4 :

36

Tabelul 4 . Modul de lucru pentru determinarea curbei utilizată în analiza GSH.
Nr. Crt. µL SSA 5% µL GSH Conc. GSH
(µM) nmoli
1 0 50 50 0.5
2 25 25 din 1 25 0.25
3 25 25 din2 12.5 0.125
4 25 25 din 3 6.25 0.0625
5 25 25 din 4 ( -25
µL) 3.125 0.0315

 Ȋntr-o placă cu 96 de godeuri se adaugă 10 µL probă + 150 µL mix de reacție (în 8
mL Assay Buffer se adaugă o soluție diluată de glutation reductază (diluție 4x) +
soluție de DTNB (1.5 mg/mL) . Assay Buffer conține tampon fosfat de potasiu 100
mM, pH 7 ș i EDTA 1 mM.
 Se incubează 5 minute la temperatura camerei .
 Iar absorbantele se citesc la instrument ul FlexStation 3 Multi -Mode Microplate Reader
de la Molecular Devices LLC și soft -ul SoftMax Pro la 412 nm. Pentru blank s -a
utilizat 10 µL SSA 5%.
Calculul rezultatelor:
Pentru a calcula numărul de nmoli de GSH din probele analizate s -a utilizat următoarea
formula:
Nmoli GSH/ml proba = ΔA 412/min (proba) x dil.4x/ ΔA 412/min (1nmol) x volum ,
Unde:
ΔA 412/min (proba) = valoarea generată de probă după scăderea blank -ului
ΔA 412/min (1nmol) = valoarea calculată din curba standard pentru 1 mol GSH
Vol = volumul de proba din reacție

37
3.7. Dozarea activității Malondialdehidei (MDA).
Principiul metodei
Dozarea activității m alondialdehidei presupune interacț iunea acidului tiobarbituric
(TBA) cu malonildialdehida (MDA) . Ȋn urma acestei interacții rezultă un produs roșu care are
un maxim de absorbție la 532 nm și un coeficient molar de extincție de 1,56 x 105 cm2
mmol1.
Soluții și reactivi:
1) Stock MDA 1 mM/ HCl 0,1 M diluat 10x (10 µM);
100 µl MDA + 900 µl HCl
2) Soluție TBA 0,025 M: 0,18 g TBA (144,5) + 0,1 g TRIS (pentru solubilizare) la 50
ml (în apă distilată) .
Mod de lucru:
Se traseaza curba standard folosind următorii reactivi/soluții din Tabelul 5 :
Tabel ul 5. Modul de lucru pentru determinarea curbei etalon utilizată în analiza MDA.
Nr.crt. µl MDA (1mM) µl HCl 0,1N µM
1 0 200 0
2 10 190 0.5
3 20 180 1
4 30 170 1.5
5 50 150 2.5
6 100 100 5

 Se pun în tuburi de 2 ml câte 200 µl probă (diluată corespunzator) .
 Se adaugă 700 µl HCl 0,1N .
 Se vortexează .
 Se incubează 20 de minute la temperatura camerei .
 Se adaugă 900 µl TBA 0,025 M.
 Se incubează 65 de minute la 37 °C.

38
 Se adaugă 400 µl tampon fosfat salin (PBS) în probe, iar în curba 400 µl BSA (de
concentrație corespunzătoare concentrației proteice a probelor de analizat).
 Se citește la fluorimetru 520/em.549 .

3.8. Evaluarea capacității de generare a speciilor reactive de oxigen (ROS) .
Pentru determinarea capacității de generare a ROS în celulele tratate cu tincturi
vegetale am folosit metoda descrisă de Cathcart și colab . (1983), ce utilizează compusul 2',7'
dicloro -dihidro -fluorescein diacetat (H 2DCFDA). Datorită formei ester acetice a compusului ,
acesta are capacitatea de a trece prin membrana celulară. Odată pătruns în celulă, sub acțiunea
esterazelor celulare, acest compus trece în unul non -fluorescent ca re rămâne captiv în celulă.
Ȋn urma oxidării compusului non -fluorescent de către speciile reactive de oxigen (ROS),
acesta este convertit la 2',7' dicloro -dihidro -fluorescein (DCF) – un compus puternic
fluorescent. Pentru măsurarea nivelului de specii reactive de oxigen, celulele au fost
însămânțate în plăci cu 6 godeuri și incubate în condiții de creștere timp de 24 si 48 de ore.
După tratamentul cu tincturile vegetale , celulele au fost incubate 45 min la 37°C cu
H2DCFDA 10 µM. Mediul în care a fost pus compusul a fost apoi îndepărtat și celulele au
fost spălate de 2 or i cu PBS. Intensitatea fluorescenței a fost citită la 488 nm excitație și 515
nm emisie la un aparat de tip Jasco Spectroflormeter FP -750 cu software Spectra Manager.
Analiza statistică a datelor
Rezultatele obținute au fost analizate din punct de vedere statistic cu ajutorul testului
Student (Microsoft Excel) și exprimate ca valori medii ± SD (n=3). O valoare a lui p mai mică
de 0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic. Datele au fost
reprezentate în grafic relativ față de cont rol (exprimat ca fiind 100%).

39
CAPITOLUL IV
REZULTATE ȘI DISCUȚII

În cadrul acestui experiment au fost realizate atât teste de viabilitate celulară, cât și
evidentierea stresului oxidativ. Evaluarea viabilității la nivelul liniei celulare Caco -2 în
prezența celor trei extracte vegetale ( Thuja occidentalis , Ribes nigrum și Filipendula ulmaria )
a fost determinată cu ajutorul testului MTT, în timp ce stresul oxidativ , a fost măsurat atât în
prezența cât și în absența agentului oxidant și a extractelor vegetale luate în studiu prin analiza
mai multor markeri biochimici: nivelul de ROS generate, concentrația de GSH și nivelul de
malondialdehidă (MDA).
4.1. Testul de viabilitate celulară MTT.
În vederea evaluării viabilității extractelor vegetale la nivelul liniei celulare Caco -2,
celulele au fost tratate t imp de 12, 24, respectiv 48 de ore cu diferite concentrații de extracte.

Figura 11 . Viabilitatea celulară ev aluată prin testul MTT după incubarea celulelor Cac o-2
intestinale timp de 12, 24 și 48 ore cu diferite concentrații (5, 25, 50 și 100 µg/ml) î n prezenț a
tincturii Thuja occidentalis . Barele verticale reprezintă deviația standard. 020406080100120
12h 24h 48hViabilitate celulara (%) Thuja occidentalis
Control
5ug/mL
25ug/mL
50ug/uL
100ug/mL

40

Figura 12 . Viabilitatea celulară evaluată prin testul MTT după incubarea celulelor intestinale
timp de 12, 24 și 48 ore cu diferite concent rații (5, 25, 50 și 100 µg/ml) în prezenț a tincturii de
Ribes nigrum . Barele verticale reprezintă deviația standard.

Figura 13. Viabilitatea celulară evaluată prin testul MTT după incubarea celulelor intestinale
timp de 12, 24 și 48 ore cu diferite concent rații (5, 25, 50 și 100 µg/ml) în prezenț a tincturii
Filipendula ulmaria .
Rezultatele obținute în urma testului MTT (Figura 11, Figura 12, Figura 13 ) a pus în
evidență valori ale viabilității celulare apropiate de cele ale controlului pentru tincturile
obținute din Thuja occidentalis, Ribes nigrum și Filipendula ulmaria , indiferent de timpul de
incubare.
Viabilitatea celulelor Ca co-2 a fost studiată și de către Lautenschlager și colab. în anul
2014. Astfel, celulele au fost incubate timp de 24 de ore cu extract de șofran (Crocus sa tivus 020406080100120
12h 24h 48hViabilitate celulara (%) Ribes nigrum

Control
5ug/mL
25ug/mL
50ug/uL
100ug/mL
020406080100120
12h 24h 48hViabilitate celulara (%) Filipendula ulmaria Control
5ug/mL
25ug/mL
50ug/uL
100ug/mL

41
L.) hidroalcoolic (0,5 -1 mg/ml) și cu crocin -1 (250 -1000 µM). Ȋn urma experimentului
realizat, s -a observat faptul că nu există modificări semnificative în ceea ce privește
viabilitatea celulelor. La concentrația de 10 µM, trans -crocin nu a indus o scădere a viabilității
celulare, în timp ce la concentrații mari de 40 -160 µM, aceasta a determinat o scădere
semnificativă a viabilității celulare. Compusul său numit crocin este un carotenoid care inhibă
creșterea celulelor canceroase, fiind utilizat în tratamentu l formelor de cancer colorectal și
pulmonar , (Lautenschlager și colab.) .
Efectul protector al extractului de Ribes nigrum a fost analizat și de către Gosh și
colaboratori. Se pare că la concentrații de 0,075 până la 0,25 µg mL-1, antocianinele din
extractul vegetal de Ribes nigrum , prezintă un grad ridicat de protecție pentru celulele de
neuroblastom uman , SH -SY5Y, tratate cu H 2O2. Astfel, extractele vegetele nu prezintă
citotoxicitate celulară , (Gosh și colab., 2006) .
4.2. Determinarea concentrației de glutation redus (GSH) la nivelul celor trei tincturi
selectate.
Glutationul, (γ -glutamil -cisteinil -glicină; GSH) este cel mai abundent tiol cu greutate
moleculară mică, 85 -90% fiind prezent în citosol, iar restul în diverse or ganite: mitocondrii,
reticulul endoplasmatic, peroxizomi, matrice nucleară.

Figura 14. Concentrația relativă de glutation redus (GSH) exprimată în procente în celulele
Caco -2 în urma tratamentului cu Thuja occidentalis (în absența și prezența agentului oxidat)
la concentrații de 25 și 100 µg/mL pentru două intervale de timp de 24 ore, respectiv 48 de ** **
** **
050100150200250
Control
netratatT25 T100 C H2O2 T25+H2O2 T100+H2O2Nivelul de GSH (%) Thuja occidentalis 24h
48h

42
ore. Barele verticale reprezintă deviația standard. Asterixurile reprezintă semnificația statistică
obținută prin testul Student, astfel: p < 0.01 ** (dis tinct semnificativ).

Figura 15. Concentrația relativă de glutation redus (GSH) exprimată în procent e în celulele
Caco -2 în urma tratamentului cu Ribes nigrum (în absența și prezenț a agentului oxidat) la
concentrații de 25 si 100 µg/mL pentru două intervale de timp de 24 ore, respectiv 48 de
ore. Barele verticale reprezintă deviația standard. Asterixurile reprezintă semnificația statistică
obținută prin testul Student, astfel: p < 0.01 ** (distinct semnificativ).

Figura 16. Concentrația relativă de glutation redus (GSH) exprimată în procente , în celulele
Caco -2 în urma tratamentului cu Filipendula ulmaria (în absenta și prezența agentului oxidat) **
** **
**
** ** ** **
020406080100120
Control
netratatR25 R100 CH2O2 R25+H2O2 R100+H2O2Nivelul de GSH (%) Ribes nigrum
24h
48h
020406080100120
Control netratat F25 F100 CH2O2 F25+H2O2 F100+H2O2Nivelul de GSH (%) Filipendula ulmaria
24h
48h

43
la concentrații de 25 si 100 µg/mL pentru două intervale de timp de 24 ore, respectiv 48 de
ore. Barele verticale reprezintă deviația standard.
În urma trată rii celulelor Caco -2 cu tinctura Thuja occidentalis (Figura 14 ) nivelul de
GSH după intervalul de 48 de ore crește semnificativ la toate concentraț iile luate în studiu atât
în absența cât și în prezenț a agentului oxidant , în timp ce la 24 de ore nivelul de GSH rămâ ne
aproape de control. Ȋn cazul celulelor tratate cu tinctura Ribes nigrum (Figura 15 ) nivelul de
GSH scade semnificativ dupa ambele intervale de timp ( atât în prezența cât și în absenț a
agentului oxidant) . Pentru tinctura de Filipendula ulmaria (Figura 16) nivelul de GSH rămâ ne
aproape de nivelul controlului .
4.3. Determinarea nivelului de malondialdehidă (MDA) la nivelul celor trei tincturi
selectate.
Peroxidarea lipidică este un mecanism major de apariție a leziunilor celulare și
presupune oxidarea acizilor grași polinesaturati cu formarea unor specii reactive și produși
toxici. Într -o celulă în care se acumulează radicalii liberi, acizii grași, care în mod normal ar fi
supuși β -oxidării în mitocondrii, vor urma calea peroxidarii lipidice în urmă căreia rezultă ca
produs final malondialdehida (MDA).

Figura 17. Determinarea nivelului de malondialdehidă (MDA) rezultat în urma peroxidării
lipidice, în celulele Caco -2 în urma tratamentului cu Thuja occidentalis (în absența și prezența
agentului oxidat) la concentrații de 25 și 100 µg/mL pentru două intervale de ti mp de 24 ore, * *
020406080100120140
Control
netratatT25 T100 CH2O2 T25+H2O2 T100+H2O2Nivelul relativ de MDA (%) Thuja occidentalis
24h
48h

44
respectiv 48 de ore. Barele verticale reprezintă deviația standard. Asterixurile reprezintă
semnificația statistică obținută prin testul Student, astfel: p < 0.05 * (semnificativ).

Figura 18. Determinarea nivelului de malondialdehidă (MDA) rezultat în urma peroxidării
lipidice, în celulele Caco -2 în urma tratamentului cu Ribes nigrum la concentrații de 25 și 100
µg/mL pentru două intervale de timp de 24 ore, respectiv 48 de ore. Barele verticale
reprezintă deviația standard.

Figura 19. Determinarea nivelului de malondialdehidă (MDA) rezultat în urma peroxidări i
lipidice, în celulele Caco -2 în urma tratamentului cu Filipendula ulmaria la concentrații de
25 și 100 µg/mL pentru două interval e de timp de 24 ore, respectiv 48 de ore. Barele verticale
reprezintă deviația standard. 020406080100120140
Control
netratatR25 R100 Ch2O2 R25+H2O2 R100+H2O2Nivelul relativ de MDA (%) Ribes nigrum
24h
48h
020406080100120140
Control
netratatF25 F100 Ch2O2 F25+H2O2 F100+H2O2Nivelul relativ de MDA (%) Filipendula ulmaria
24h
48h

45
Rezultatele obținute î n urma analizei nivelului de malondialdehidă de la nivelul
celulelor Caco-2 expuse la extractele vegetale la diferite concentrații au arătat o ușoară
creștere pentru tinctura de Thuja occ identalis (Figura 17 ) în cazul concentrației de 25 µg, atât
în absența cât și în prezența agentului oxidant după intervalul de 24, respectiv 48 de ore. Ȋn
cazul tincturii de Ribes nigrum (Figura 18) nivelul cel mai ridicat de MDA se observă după 24
ore, pe ntru ambele concentrații luate în studiu, iar după 48 de ore revine la nivelul controlului.
Nivelul MDA în prezența tincturii de Filipendula ulmaria (Figura 19) rămâne aproape de
valorile controlului netratat.
4.4. Evaluarea speciilor reactive de oxigen (ROS) la nivelul liniei celulare Caco -2.
Speciile reactive de oxigen (ROS) sunt generate în timpul metabolismului oxidativ
mitocondrial, precum și în răspunsul celular la xenobiotice, citokine, și ca urmare a invaziei
bacteriene, acestea fiind responsab ile pentru alterarea macromoleculelor. Oxidanții puternici,
cum ar fi diferitele molecule de ROS, dintre acestea amintim: radicalii superoxid (O 2•-) sau
hidroxil (OH•), precum și alte molecule cu caracter oxidant deși nu sunt radicali: apa
oxigenată (H 2O2) sau peroxinitritul (ONOO-) ce pot deteriora alte molecule și structurile
celulare din care fac parte, o acumulare excesivă a acestora putând determina inducerea unu i
proces denumit stres oxidativ .

Figura 20. Analiza speciilor reactive de oxigen (ROS) la nivelul celulelor intestinale Caco -2
în urma tratamentului cu Thuja occidentalis la concentrații de (25 si 100 µg/mL ) pentru diferite
intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale reprezintă deviația standard. 020406080100120140
Control
netratatT25 T100 CH2O2 T25+H2O2 T100+H2O2Nivelul relativ ROS (%) Thuja occidentalis
24h
48h

46

Figura 21. Analiza nivelului speciilor reactive de oxigen la nivelul celulelor intestinale Caco –
2 în urma tratamentului cu Ribes nigrum la concentrații de (25 si 100 µg/mL.) pentru diferite
intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale reprezintă deviația standard.

Figura 22. Analiza nivelului speciilor reactive de oxigen la nivelul celulelor intestinale
Caco -2 în urma tratamentului cu Filipendula ulmaria la concentrații de (25 si 100 µg/mL.)
pentru diferite intervale de timp (24 si 48 de ore). Barele verticale reprezintă deviația
standard.
În ceea ce priveș te generarea speciilor reactive de oxigen (ROS) în urma tratamentului
cu cele trei t incturi vegetal e s-a observat că, atât î n prezenț a cât și în absența agentului
oxidant, nivelul ROS rămâ ne la nivelul controlului. Concentrația de apă oxigenată utilizată a 020406080100120
Control
netratatR25 R100 CH2O2 R25+H2O2 R100+H2O2Nivelul relativ ROS (%) Ribes nigrum
24h
48h
020406080100120
Control netratat F25 F100 CH2O2 F25+H2O2 F100+H2O2Nivelul relativ ROS (%) Filipendula ulmaria
24h
48h

47
indus generarea unui nivel scăzut de specii reactive de oxigen ceea ce ar putea permite
celulelor inițierea unui răspuns protector pentru a promova supraviețuirea lor.
Gosh și colab., au evaluat efectul protector al antocianinelor și al co mpușilor fenolici
din tincturile de Ribes nigrum și Rubus loganbaccus la nivelul liniei celulare de neuroblastom
uman, SH-SY5Y, cu ajutorul compusului 2’7’-dicloroflurosecein. Concentrația intracelulară
de ROS la nivelul celulelor SH-SY5Y a crescut de nouă ori după expunerea acestora la H 2O2.
Ȋnsă, în urma adăugării simultane a celor două tincturi vegetale, creșterea concentrației
intracelulare de ROS a fost inhibată în cazul tuturor concentrațiilor de tincturi utilizate în
cadrul experimentului. Deși extractele de antocianine din cadrul ambelor specii vegetale au
prezentat nivele de protecție simi lare la concentrații variind de la 0,5 până la 0,125 µgmL-1,
gradul de protecție cel mai ridicat împotriva ROS , l-a prezentat tinctura de Ribes nigrum la
concentrația de 0,065 µgmL-1, care a fost semnificativ mai mare decât aceeași concentrație de
Rubus loganbaccus , (Gosh și colab., 2006) .

48

CONCLUZII

 În ceea ce privește evaluarea viabilității celulare în urma incubării cu tincturile
selectate, s -a evidențiat faptul că acestea nu au efecte citotoxice la nivelul celulelor
intestinale Caco -2, pu tând fi folosite în continuare pentru următoarele teste biochimice
de stres oxidativ .
 Pentru generarea speciilor reactive de oxigen nu s -au obse rvat modificări, nivelul ROS
rămâ ne aproape de valorile control ului.
 Prin determinarea nivelului de MDA în cazul tincturilor de Thuja occidentalis și Ribes
nigrum s-au observat modifică ri semnificative , în timp ce în prezenț a tincturii de
Filipendula ulmaria nu s-au observa t modifică ri semnificative in urma tratamentului .
 În urma evaluării concentrației de gl utation redus (GSH) s -a observat că , pentru
tinctura de Thuja o ccidentalis , nivelul de GSH crește semnificativ după intervalul de
48 de ore, în timp ce pentru tinctura de Ribes nigrum nivelul de GSH scade
semnificativ după ambele intervale de timp, iar pentru tinctura de Filipendula ulmaria
nivelul de GSH rămâ ne aproape de nivelul controlului.

49
BIBLIOGRAFIE

1. Ajay Arora, Sairam R.K. ș i Srivastava G.C., 2002. Oxidative stress and antioxi dative
system in plants. Curr. Sci. 82, 1227 -1238.
2. Apel K. și Hirt H., 2004. Reactive oxygen species metabolism, oxidative stress and
signal transduction. Anuu . Rev. Plant . Biol. 55, 373 -99.
3. Asada K. ș i Badger M. R., 1984. Photoreducion of 18 O 2 and H 2 18 O 2 with
concomitant evolution of 16 O 2 in intact spinach chloroplasts evidence for scaveging of
hydrogen peroxide by peroxidase. Plant Cell P hysiol . 25, 1169 -1179.
4. Badger M.R., 1985. Photosynthetic Oxygen Echange. Annu. Rev. Plant. Physiol . 36,
27-53.
5. Bakan E., Taysi S., Polat M.F., Delga S., Umudum Z., Bakan N., 2002. Nitric oxide
levels and lipid peroxidation in plasma of patients with gastric cancer. Jpn. J. Clin.
Oncol . 32, 162 -166.
6. Balandrin M. F. și Klocke J. A., 1988. Medicinal, Aromatic and Indu strial Materials
from Plants. Biotechnol. Agric. For. 4, 191 -199.
7. Bannister J.V., Bannister W.H. ș i Rotilio G., 1987. Aspects of the strcuture, function,
and application of superoxide dismutase. Rev. Biochem ., 22, 111 -180.
8. Barros L., Santos -Buelga C., Ferreira I.C.F.R., 2013. Characterization of phenolic
compounds in wild medicinal flowers from Portugal by HPLC -DAD -ESI/MS and
evaluation of antifungal properties. Ind. Crops. Prod . 44, 104 -110.
9. Belal Naser, Cornelia Bodinet, Martin Tegtmeier, Ulrike Lindequist, 2005. Thuja
occidentalis (Arbor vitae): A review of its Pharmaceutical, Pharmacological and
Clinical Properties. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2, 69-78.
10. Bhabak K.P. și Mugesh G., 2010. Functional mimics of glut atione peroxidase
bioinspired synthetic antioxidants. Acc. Chem. Res. 43, 1408 -1419.
11. Bradford M.M., 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein -Dye Binding. Anal.
Biochem. 72, 248 -254.
12. Chelikani P., Fita I. și Loewen P.C., 2004. Diversity of structures and properties
among catalases. Cell. Mol. Life Sci. 61, 192 -208.

50
13. Creissen G. P., Broadbent P., Kular B., Reynolds H., Mullineaux P., 1994.
Manipulation of glutathione reducta se in transgenic plants implications for plants
responses to environmental stress. Proc. R. Soc. Edinburgh 2, 167 -175.
14. Daniele Del Rio, Amanda J Stewart și Nicoleta Pellegrini, 2005. A review of recent
stduies on malondialdehyde as toxic molecule and biolo gical marker of oxidative
stress . Nutr. Metab. Cardiovas. 15, 316 -328.
15. Daub M.E. și Hangartner R.P., 1983. Light -induced production of singlet oxygen and
superoxide by the fungal toxine, cercosporin. Plant Physiol . 73, 856 -857.
16. Durner J. Și Klessig D.F., 1995. Inhibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid
and 2,6 -dichloroisonicotinic acid, two inducers of plant defense responses. Proc. Natl.
Acad. Sci . 92, 11312 -11316.
17. Ellinger S., Reusch A., Ste hle P., Helfrich H. P. , 2012. Epicatechin ingested via coca
products reduces blood pressure in humans: A nonlinear regression model via a
Bayesian approach. Am. J. Clin. Nutr. 95, 1365 -1377.
18. Elstner E.F., Wagner G.A. și Schutz W., 1988. Activated oxygen in green plants in
relation to stress situations. Plant . Biochem . Physiol . 7, 159 -187.
19. Gavril Neamțu, Ionela Popescu, St. Lazăr, I. Brunea, I brad, Gh. Câmp eanu, T.,
Galben, 1983. Chimie ș i biochimie vegetală. Editura Didactică și Pedagogică,
București, 260 -282.
20. Ghosh Dilip, Mc Ghie K Tony, Zhang Jingl, Adaim Aselle, Skinner Margot, 2006.
Effects of anthocyanins and other phenolics of boysenberry and balckcurrant as
inhibitors of oxidative stress and damage to cellular DNA in SH -SY5Y and HL -60
cells. J. Sci. Agric . 86, 678 -686.
21. Gohla SH, Haubeck HD, Schrum S, Soltau H, Neth RD, 1986. Activation of CD4 –
positive T cells by polysaccharide fractions isolated from the Cupressaceae Thuja
occidentalis L. (Arborvitae). J. Allergy . Clin. Immunol . 77, 268 -272.
22. Hold KM, Sirisoma NS, Ikeda T., Narahasi T., Casida JE, 2000. Alpha -thujone (the
active component of absinthe): gamma -aminobutyric acid type A receptor modulation
and metabolic detoxification. Proc. Natl. Acad. Sci . 97, 3826 -3831.
23. Izabela Fecka, 2009. Qual itative and quantitative determination of hydrolysable
tannins and other polyphenols in herbal products from meadowsweet and dog rose.
Phytochem. Anal . 20, 177 -190.

51
24. James M . McKim, 2010. Building a Tiered Approach to In Vitro Predictive Toxicity
Screening A Focus on Assay with In Vivo Relevance. Comb. Chem. High Throughput
Screen. 13, 188 -206.
25. Jelena Katanic, Tatjana Boroja, Nevena Stankovic, Vladimir Mihailovic, Milan
Mladenovic, Samo Kreft, Miroslav M. Vrvic, 2015. Bioactivity, stability and phenolic
characterization of Filipendula ulmaria (L.) Maxim. Food Funct. 12, 1 -34.
26. Katar M., Ozugurlu A.F., Ozyurt H., Benli I., 2014. Evaluation of glutathione
peroxidase and superoxide dismutase enzyme polymorphisms in celliac pacients.
Genet. Mol. Res. 13, 1030 -1037.
27. Kendall A.C., Keys A.J., Turner J.C, Lea P.J., Miflin B.J., 1983. The isolation and
characterization of a catalase -deficient mutant of barley (Hordeum vulgare). Planta
159, 501 -511.
28. Lautenschlager M., Sendker J., Huwel S., Galla H.J., Brandt S., Dufer M ., Riehemann
K., Hensel A., 2014. Intestinal formation of trans -crocetin from saffron extract
(Crocus sativus L.) and in vitro permeation through intestinal and blood brain barrier.
Phytomedicine 22, 36 -44.
29. Mendoza -Cozatl D., Loza -Tavera H., Hernandez -Nava rro A., Moreno -Sanchez R.,
2005. Sulfur assimilation and glutathione metabolism under cadmium stress in yeast,
protists and plants. FEMS Microbiol. Rev. 29, 653 -671.
30. Mossman BT, 1983. In vitro approches for determining mechanisms of toxicity and
carinogenicity by asbestos in the gastrointestinal and respiratory tracts. Environ.
Health Perpesct. 53, 155 -161.
31. Muller F.L., Lustgarten M.S., Jang Y., Richardson A., Van Remmen H., 2007. Trends
in oxidative agind theories. Free Radic. Biol. Med. 43, 477 -503.
32. Muta -Takada K., Terada T., Yamanishi H., Ashida Y., Inomata S., Nishiyama T.,
Amano S., 2009. Coenzyme Q10 pr otects against oxidative sress -induced cell death
and enhances th synthesis of basement membrane components in dermal and
epidermal cells . Biofactors 35, 435 -441.
33. Na Jia, Tiejing Li, Xinping Diao, Baohua Kong, 2014. Protective effects of black
currant (Rib es nigrum L.) extract on hydrogen peroxide -induced damage in lung
fibroblast MRC -5 cells in relation to the antioxidant activity. J. Funct. Foods 2, 142 –
151.
34. Neth R., Drize N., Gohla S., Offe rgeld R., Reski R., Schruhm S., 1995.
Phytotherapeutische Forschu ng Thuja occiden talis. Allgemeinmed 71, 522 -530.

52
35. Niki E., Yoshhida Y., Saito Y., Noguchi N., 2005. Lipid peroxidation: mechanisms,
inhibition, and biological effects. Biochem . Biophys . Res. Commun . 9, 668 -676.
36. Palma J.M., Sandalio L.M. și del Rio L.A., 1986. Manganse superoxide dismutase in
higher plant chloroplasts a reapprisal of a controverted cellular localization. J. Plant
Physiol. , 125, 427 -439.
37. Rafael Per -Treves și Avihai Perl, 2002. Oxidative stress an introduction. Oxidative
stress in plant s Taylor and Francis London, 1-32.
38. Rajinder S. Dhindsa și Wandekayi Matowe, 1981. Drought tolerance in two mosses
correlated with two enzymatic defence against lipid peroxidation. J. Exp. Bot. 32, 79 –
91.
39. Raktim Biswa s, sushil Kumar Mandal, Suman Dutta, Soumaya Sundar Bhattacharyya,
Naoual Boujedaini, Anisur Rahman Khuda -Bukhsh, 2010. Thujone -Rich Fraction of
Thuja occidentalis demonstrates major anti -cancer potentials: evidences from in vitro
studies on A375 cells. Evid. Based Complement Alternat. Med. 2011, 1 -17.
40. Rao A.C., Reddy A.R., 2008. Glutathione reductase a putative redox regulatory
system in plant cells. Springer 28, 111 -147.
41. Rouheir N., Lemaire S.D., Jacquot J.P., 2008. The role of glutathione in
photosynthet ic organisms emerging functions for glutaredoxins and glutathionylation.
Annu. Rev. Plant. Biol. 59, 143 -1466.
42. Sarma G.N., Savvides S.N., Becker K., Schimer M., Schimer R.H., Karplus P.A.,
2003. Glutathione reducatse of the malarial parasite Plasmodium falciparum: crystal
structure and inhibitor development. J. Mol. Biol . 328, 893 -907.
43. Sarvajeet Singh GILL, Naser A . Anjum, Mirza Hasanuzzaman, Ritu Gill, Dipesh
Kumar Trivedi, Iqbal Ahmad, Eduarda Pereira, Narendra Tuteja, 2013. Glutathione
and glutathione reductase a boon in disguise for plant abiotic stress defense operations.
Plant Physiol . Biochem. 70, 204 -212.
44. Segui J., Gironella M., Sans M., Granell S., Gil F., Gimeno M., Coronel P., Pique
J.M., Panes J., 2004. Superoxide dismutase ameliorates TNBS -induced colitis by
reducing oxidative stress, adhesion molecule expression, and leukocyte recruitment
into the infl amed intestine. J. Leukoc. Biol. 76, 537 -544.
45. Slimestad R. și Solheim H., 2002. Anthocyanins from black currants ( Ribes nigrum
L.). J. Agric. Food. Chem. 50, 3228 -3231.
46. Voitkun V. și Zhitkovich A., 1999. Analysis of DNA -protein cross -linking activity of
malondialdehyde in vitro. Mutat . Res., 424, 97 -106.

53
47. Wang L.S., Stoner G.D., 2008. Anthocyanins and their role in cancer prevention.
Cancer Lett. 269, 281 -290.
48. Wink M., 1988. Plant breeding importance of plant secondary metabolits for
protection against phatogens and herbivores. Theor. Appl. Genet ., 75, 225 -233.
49. Yuri Y. Sa utin și Richard J. Johnson, 2008. Uric acid : The oxidant -antioxidant
paradox. Nucleosides Nu cleotides Nucleic Acids 27, 608 -619.
50. Zedan H., Abdel -Motaleb A., Kassem N., Hafeez H., Hussein M., 2015. Low
glutathione peroxidase activity levels in patients with vitiligo. J. Cutan. Med. Surg. 19,
144-148.

Referinț e internet :
http://www.creeaza.com/familie/medicina/Aspecte -generale -privind -stres231.php
https ://en.wikipedia.org/wiki/