SPECIALIZAREA GENETICĂ MOLECULARĂ LUCRARE DE DISERTAȚIE Coordonator științific, Candidat, Conferențiar dr. VÂNTU SMARANDA RESPINCIUC ANDREEA -OTILIA… [612679]

1
UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA GENETICĂ MOLECULARĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific, Candidat: [anonimizat]
2020

2
UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA GENETICĂ MOLECULARĂ

LUCRARE DE DISERTAȚIE

MICROPROPAGAREA PRIN
CULTURI DE MERISTEME LA
LILIUM CANDIDUM L.

Coordonator științific, Candidat: [anonimizat]
2020

3

CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 5
I. MICROPROPAGAREA – METODĂ NECONVENȚIONALĂ DE MULTIPLICARE
VEGETATIVĂ ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………………. 6
1. Tipuri de culturi ale țesuturilor vegetale ………………………….. ………………………….. ………….. 6
2. Compoziția mediului de cultură ………………………….. ………………………….. ……………………. 12
3. Etapele micropropagării ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 16
4. Embriogeneza somatică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 18
5. Organogeneza in vitro ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 19
6. Avantajele și dezavantajele micropropagării in vitro ………………………….. ……………………. 21
II. CONSIDERAȚII TAXONOMICE, MORFOLOGIA ȘI BOTANICA ASUPRA SPECIEI
LILIUM CANDIDUM L . ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 22
1. Istoric ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 22
2. Descrierea speciei ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 23
3. Compoziția chimică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 24
4. Ecologie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 24
5. Înmulțirea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 24
6. Utilizare ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………… 26
III. ASPECTE ALE CULTIVĂRII IN VITRO LA LILIUM CANDIDUM L . …………………… 28
SCOPUL LUCRĂRII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 32
IV. MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. …………………………. 33
1. Abordări eficiente pentru înmulțirea in vitro a speciei Lilium candidum L. cu acces constant
și sigur pe tot parcursul anului și aclimatizarea plantelor în c ondiții de climă mediteraneană . 33
2. Activitatea antitumorală a speciei Lilium candidum L. prin inducerea apoptozei mediate de
p53 asupra liniei celulare MCF -7 în cancerul de sân ………………………….. ………………………….. 34
3. Micropropagarea speciei Liulium candidum L. ………………………….. ………………………….. .. 36

4
4. Proliferarea în masă a crinului alb ( Lilium candidum L. ) în condiții in vitro ……………….. 36
5. Furnizarea de materii prime către industria cosmetică utilizând tehnica micropropagării in
vitro a speciei Lilium candidum L . ………………………….. ………………………….. ………………………. 37
V. REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………… 39
1. Abordări eficiente pentru înmulțirea in vitro a speciei Lilium candidum L . cu acces constant
și sigur pe tot parcursul anului și aclimatizarea plantelor în c ondiții de climă mediteraneană . 39
2. Activitatea antitumorală a speciei Lilium candidum L. prin inducerea apoptozei mediate de
p53 asupra liniei celulare MCF -7 în cancerul de sân ………………………….. ………………………….. 39
3. Micropropagarea speciei Liulium candidum L ………………………….. ………………………….. … 41
4. Proliferarea în masă a crinului alb ( Lilium candidum L.) în condiții in vitro ……………….. 42
5. Furnizarea de materii prime către industria cosmetică utilizând tehnica micropropagării in
vitro a speciei Lilium candidum L . ………………………….. ………………………….. ………………………. 43
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 45
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 46

5
INTRODUCERE

Lilium candidum L . (crinul alb) este o plantă perenă ce se încadrează în genul Lilium ,
familia Liliaceae. Această plantă fost cunoscută în jurul anilor 2800 î nainte de Hristos și cultivată
în America de Nord, Asia, Europa. Din Asia Mică, această plantă a fost adusă de către turci și în
România și cultivată aici în anul 1545. Crinul alb se numără printre cele mai îndrăgite f lori de
grădină, fiind apreciat datorită frumuseții sale, dar și a mirosului să u.
Extractul de Lilium candidum L. este cunoscut în cadrul medicinii populare ca fiind benefic
pentru tratamentul arsurilor, ulcerelor, inflamațiilor, etc . (Kapaskova și colab ., 2012 ; Bhatia,
2015 ).
Plantele pot fi propagate prin 2 căi: calea sexuată și calea asexuată. În cazul multiplicării
sexuate, plantele noi apar în urma fuziunii gameților parentali și se dezvoltă din embrioni zigotici.
De cele mai multe ori răsadurile vo r fi variabile, iar fiecare va reprezenta o nouă combinație de
gene, formată în timpul formării gameților (diviziunea celulelor meiotice) și fuziunea acestora. În
cazul multiplicării asexuate caracteristicile unice ale unei plante utilizate pentru înmulțir e (planta
mamă) Aceste caracteristici sunt de regulă perpetuate, deoarece în timpul mitozei genele sunt
copiate. Fiecare plantă ce rezultă în urma înmulțirii asexuate poate fi considerată o extensie a liniei
celulare somatice a plantei mamă (Pollard și Wal ker, 1990).
Micropropagarea este o propagare rapidă vegetativă (asexuată) in vitro cu intensitatea
ridicată a luminii, temperatură controlată și cu un mediu nutritiv definit. Speciile pe cale de
dispariție sau rare s -au propagat cu succes prin micropropag are datorită ratei mari de înmulțire cu
un număr redus de plante utilizate pentru inițierea culturilor. Adesea , micropropagarea este
asociată cu producția în masă la un preț viabil. Gottlieb Haberlandt este pionerul culturilor de
țesuturi vegetale. El a fo st prima persoană ce a izolat celulele vegetale (Krikorian și Berquam,
2003).
Micropropagarea prezintă diferite avantaje cum ar fi: înmulțirea rapidă a genotipurilor
valoroase, eliberarea rapidă a soiurilor îmbunătățite, producția de plante fără boli, pro ducția pe tot
parcursul anului.

6
I. MICROPROPAGAREA – METODĂ NECONVENȚIONALĂ DE
MULTIPLICARE VEGETATIVĂ

Cultura țesuturilor vegetale este definită ca și cultivarea semințelor, organelor, explantelor,
țesuturilor, celulelor sau protoplastelor pe un mediu nutritiv sintetic definit chimic în condiții
sterile și controlate de lumină, temperatură și umiditate (Hussain și colab., 2012; Kumar și Loh,
2012).
Metodele de micropropagare au fost folosite în anul 1960 de către cercetătorul George
Morel cu scopul de a produce plante de orhidee la nivel comercial. Acest tip de propagare se referă
la înmulțirea copiilor identice genetic ale plantelor mamă.

1. Tipuri de culturi ale țesuturilor vegetale
Cultura țesuturilor vegetale este definită ca și cultura in vitro a protoplastelor plantelor,
celulelor, țesuturilor sau organelor în condiții aseptice controlate care duc la înmulțirea celulelor
sau la regenerarea organelor sau a plantelor întregi. Este u na dintre cele mai bune abordări pentru
a exprima potențialul de totipotență și pentru a induce o manipulare genotipică și fenotipică în
celulele plantelor (Kumar și Loh, 2012; George și colab., 2008).
a. Culturile de țesuturi organizate
Creșterea organizat ă constă în formarea și menținerea unei structuri vegetale bine definite.
Acest tip de creștere se realizează în momentul în care diferite organe ale unei plante, spre exemplu
vârfurile de creștere ale lăstarilor sau rădăcinilor (meristemele apicale), prim ordiile foliare, muguri
floriferi, etc., transferate pe medii de cultură își continuă creșterea. Această creștere organizată se
poate efectua și atunci când organele rezultate în mod direct dintr -un fragment de țesut aflat pe
mediul de cultură (din explant ) sau dintr -o masă de celule inițial neorganizată (din timpul
procesului de regenerare). Procesul de regenerare se numește organogeneză (formarea unui organ
vegetal) sau morfogeneză ( oferă forma organului respectiv ) (George și colab., 2008; Bhatia, 2015).
• Culturile de meristeme
Cultura de meristeme reprezintă acel tip de cultură unde porțiuni de dimensiuni mici ale
vârfului de creștere (0,5 -1 mm) , respectiv domul meristematic cu una sau două primordii foliare
sunt izolate în condiții aseptice din planta ma mă și crescute pe mediul de cultură. Acest tip de
cultură duce la formarea unei plante unice ( Bhatia, 2015 ).
Țesuturile meristematice sunt țesuturile tinere ale plantei. Acestea se mai găsesc și sub
numele de țesuturi de diviziune sau formative, întrucâ t celule ce formează acest tip de țesut se
divid încontinuu. Aceste celule sunt de dimensiuni mici, cu pereții celulari subțiri, prezintă

7
citoplasmă densă, bogată în ribozomi, iar nucleul este mare și dispus central. Principalul rol al
acestor celule sunt în diviziune.
În funcție de locul unde se află, meristemele sunt de 3 tipuri : apicale, laterale și
intercalare . Meristemele apicale se găsesc pe vârfurile rădăcinilor, tulpinilor și a ramificațiilor
acestora, având rol în creșterea acestora. Meristemele l aterale se află lateral față de axa organului,
au formă de cilindri și determină creșterea în grosime a organului respectiv. Meristemele
intercalare se află la baza internodurilor și a limbului foliar . Acestea au o activitate limitată și ajută
la creșterea în lungime. De asemenea, meristemele intercalare se pot prezenta sub forma unor
celule izolate în interiorul epidermei formând meristemoidele ce vor da naștere stomatelor, perilor
protectori, etc (Bhatia, 2015; Hussain și colab., 2012).
În funcție de gradul de dezvoltare, meristemele se clasifică în: primordiale, primare și
secundare. Meristemele primordiale rezultă din diviziunea zigotului, ele fiind situate în vârful
rădăcinii și a tulpinii. La răd ăcină, meristemele primordiale sunt acoperite de caliptră, iar la cele
de la nivelul tulpinii sunt acoperite de primordiile frunzei. Meristemele primare rezultă din
meristemele primordiale. Meristemele primare sunt alcătuite din caliptrogen, protodermă,
meristem fundamental și procambiu. Din protodermă rezultă rizoderma (la rădăcină) și epiderma
(la tulpină). Meristemele secundare rezultă din țesuturi definitive prin procesul de dediferențiere.
Acestea sunt reprezentate de cambiu și felogen (zone generatoar e) (Krikorian și Berquam, 2003;
Stănică, 2004).

Fig.1 – Tipuri de merist eme
(https://www.onlinebiologynotes.com/meristematic -tissue -characteristics -types -function/ )

8
• Cultur ile de noduri
În cazul acestui tip de cultură, nodurile sunt izolate în condiții a septice din mugurii laterali,
fiecare nod fiind un purtător de fragment mic de tulpină (aprox. 1 cm). Din acest tip de cultură
rezultă 1 -2 lăstari (Stănică, 2004).

Fig. 2 – Nodurile unei plante
(https://smartyplants.com.au/2012/09/whats -a-node/ )
• Cultur ile de lăstari
În acest tip de cultură se inițiază mugurii laterali sau vârfurile ramificațiilor laterale. Aceste
vârfuri sunt de dimensiuni ușor mai mari față de culturile de meristeme (1 -2 cm). D in aceste tipuri
de culturi rezultă lăstari multipli.

Fig.3 – Lăstar
(https://www.cartiagricole.ro/inmultirea -plantelor -cum-trebuie -sa-procedezi -corect/ )
• Cultur ile de embrioni zigotici
Acest tip de cultură constă în disecția aseptică a semințelor fertil izate sau nu ce provin din
fructele imature sau mai puțin dezvoltate și creșterea lor pe mediul de cultură până la faza de
plantulă. Cultura izolată a embrionilor poate ajuta la producerea rapidă a răsadurilor din semințe
care au o perioadă de latență prelungită și permite producerea răsadurilor atunci când genotipul
(de exemplu, rezultat al unor încrucișări interspecifice) transmite o viabilitate scăzută a

9
embrionului sau semințelor. Cultura embrionilor zigotici este diferită de cultura embrionilor
somatic i (Krikorian și Berquam, 2003).
• Cultu rile de rădăcini izolate
Rădăcinile plantelor se introduc în condiții aspetice pe un mediu de cultură nutritiv. Acest
fel de cultură ajută la obținerea unui sistem radicular ramificat. Cultura de rădăcini izolate nu este
același lucru cu culturile de tip ,,hairy roots” (culturi tumorale).
b. Culturile de țesuturi neorganizate
Creștere a neorganizată nu este frecventă în natur ă, însă ea poate să se realizeze cu succes
în condiții in vitro prin cultura lor pe un mediu specific. Din acest tip de creștere va rezulta un țesut
ce nu prezintă o structură bine definită ce poate fi identificată. Acest tip de culturi oferă un număr
limitat de celule specializate sau diferențiate ce sunt caracteristice plantei mamă.
Celula diferențiată este acea celulă care prezintă o morfologie specifică și/sau o funcție
specializată. Țesutul diferențiat reprezi ntă agregarea acestor tipuri de celule. Este dificil de obținut
doar un singur tip de celule diferențiate, întrucât formarea lor în cultură poate fi controlată pentru
o perioadă de timp. Pe de altă parte țesuturile neorganizate permit menținerea lor, prin mai multe
transferuri pe medii nutritive, pe o durată de timp mai mare (Pollard și Walker, 1990; Kumar și
Loh, 2012).
Aceste procese de diferențiere ce se induc in vitro pot fi cercetate pentru descrierea din
punct de vedere botanic a formării organelor d istincte în timpul morfogenezei.
• Culturile de calus
Calusul constă dintr -o masă amorfă de celule parenchimatoase cu pereți subțiri, care provin
din celulele prolifera te ale țesutului părinte . Frecvent, ca urmare a unei răni, se formează un calus
la capătu l tăiat al tulpinii sau rădăcinii. Acesta e ste un țesut mai mult sau mai puțin neorganizat
care conține material diferențiat (de bază pentru inducerea calusului, de exemplu, frunze, rădăcină,
vârfuri, flori, etc.), precum și celule nediferențiate (Kumar și Loh, 2012; Stănică, 2004).
Masa celulară a calusului este compusă din celule parenchim atoase nespecializate. Celulele
parenchimatoase prezente în explante suferă de obicei această diferențiere . Prin urmare , calusul
poate fi definit ca un țesut parenchima tos neorganizat și mai puțin diferențiat. Acest țesut amorf
este format în general atunci când celulele plantelor proliferează într -un mod nesistematic. Astfel,
culturile de calus sunt în esență grupuri de celule crescute datorită proliferării dezorganizat e a
celulelor din segmentul organelor vegetale.
În această tehnică, celulele plantelor se propagă pe medii adecvate pentru a forma grup ări
de celule nediferențiate numite calus. Când calusul conține celule diferențiate prezente în explante
izolate, atunc i dediferențierea trebuie să aibă loc înainte de a putea diviza celula .

10
Dacă explantele conțin țesut meristematic numai atunci când sunt izolate, atunci diviziunea
celulară are loc fără dediferențiere. În timpul procesului de dediferențiere, celulele adul te mature
sunt capabile temporar să revină de la adult la starea juvenilă. Celulele întinerite au o potențial de
creștere și divizare mai mare. Aceste celule în circumstanțe speciale sunt capabile să regenereze
organe și / sau embrioni. Prin urmare, dedife rențierea este un pas proeminent de luat în considerare
în timpul propagării in vitro a plantelor. Inițierea calusului este însoțită de obicei de suplimentarea
hormonilor de inducție a calusului adecvați (Pollard și Walker, 1990).
Calusul este o masă orga nizată și în funcție de condițiile de mediu (în natură și în condiții
in vitro) dobândesc o morfologie diferită. În funcție de potențialul lor de regenerare a organelor
există diferite tipuri de calus.
Cultura de calus prezintă 3 etape: inducerea formării calusului, proliferarea calusului și
faza de diferențiere.
• Culturile d e suspensii celulare
În 1958 Muir a arătat faptul că celulele vegetale pot fi cultivate în medii de cultur ă lichide
(în suspensie) asemenea microorganismel or. Cu toate acestea, celulele individuale ale plantelor
într-o populație de celule cultivate prezintă variații citogenetice și metabolice, în funcție de stadiul
ciclului de creștere și de condițiile de cultură. Acest tip de variabilitate se numește eterogenitate
spați ală (Kumar și Loh, 2012; Pollard și Walker, 1990).
Celulele pot fi izolate fie prin mijloace mecanice , din materialul vegetal in vivo, fie prin
digestie enzimatică și formează calus indus din orice explante. Culturile de suspensie celulară pot
fi inițiate din orice parte a plantei, la fel ca și în cazul culturii de calus.
Pentru inițierea suspensiilor celulare, trebuie utilizate inoculuri relativ mari, astfel încât
concentrația eliberată să crească rapid. Astfel de tipuri de celule reprezintă un nivel de organizare
mai mic decât țesutul sau cultura calusului și sunt adesea numite culturi celulare. Mediul lichid
este de obicei similar în compoziție cu cel pe care este crescut calusul. Cu toate acestea, poate fi
necesară ajustarea concentrației de hormoni și săruri anorganice. Este necesară agitarea mediului
pentru culturile de suspensie în trei scopuri:
– servește la dezbinarea agregatelor celulare;
– menține o distribuție uniformă a celulelor de diferite dimensiuni și forme;
– grupurile de celule din mediu asi gură un schimb gazos pentru celule pentru a susține
respirația celulară în mediul lichid.

11

Fig. 4 – Inițierea culturilor de calus și a culturilor de suspensii celulare
(George și colab., 2008)
• Culturile de pr otoplaste
Protoplastul este “acea parte din celul ă care poate fi plasmolizat ă și izolat ă înlăturând
peretele celular prin procedee mecanice sau enzimatice. Protoplastul este deci o celula nud ă, a
cărei protoplasm ă este înconjurat ă numai de membrana plasmatic ă, capab ilă să regenereze peretele
celular, s ă creasc ă și să se divid ă”(Pollard și Walker, 1990; Krikorian și Berquam, 2003 ).
Protoplastele se pot izola prin procedee standard ce constau în tratarea celulelor sau a
țesuturilor cu diferite amestecuri enzimatice ce degradează peretele celular. Protoplastele din
culturile de suspensie celulară sunt, în general, cele mai ușor obținute și, de obicei, se regenerează
în celule divizante la o frecvență rezonabilă. Mai mult, dacă regenerarea plantelor este posibilă din
celulele culturii de suspensie, același lucru este adesea valabil și pentru celulele regenerate din
protoplastele derivate din cultură.
Pe lângă furnizarea de material pentru studierea proceselor celulare de bază, protoplastele
au servit ca și gazde receptoa re pentru transformarea prin ADN recombinant și sunt necesare în
hibridizarea somatică prin fuziunea protoplastului. Hibrizii somatici simetrici pot fi obținuți prin
fuziunea a doi genomi nucleari intac ți din două specii diferite (Krikorian și Berquam, 200 3; Kumar
și Loh, 2012)
Tot la nivelul acestor “celule” se poate realiza și selec ția liniilor rezi stente la diferi ți agen ți
patogeni, la compu și toxici produ și de unele bacterii și ciuperci, la diferi ți agen ți stresan ți: erbicide,
salinitate și antibiotice.
• Culturile de antere
În cadrul acestor tipuri de culturi se izolează anterele plantelor care conțin microspori
imaturi pentru a obține plante haploide. Acestea rezultă în urma dezvoltării embrionilor somatici

12
din pol en. Se mai poate vorbi despre cultura de polen, care se realizează prin scoaterea polenul ui
din antere.

Fig. 5 – Cultură de antere
(https://irrecenvhort.ifas.ufl.edu/plant -prop-glossary/09 -tissue -culture/01 -types/01 -tctypes –
anther.html )
2. Compoziția mediului de cultură
Un rol important în culturile de explante vegetale este reprezentat de compoziția chimică
a mediului de cultură. Încă din momentul efectuării primelor încercări de cultivare pe medii
aseptice a explantelor vegetale , pe baza cercetărilor de nutri ție s-au făcut tatonări pentru a elucida
rolul jucat de diferite elemente chimice, compu și și concentra țiile optime în care acest ea trebuie
să fie prezente în mediile de cultură (Kumar și Loh, 2012; Hussain și colab., 2012).
Principala condiție ce trebuie sa o îndeplinească un mediu de cultură este aceea de a putea
să hrănească corect și suficient explanta ce se află în diverse sta dii de micropropagare (de la inițiere
la înrădăcinare) și să îi asigure acesteia condiții optime de dezvoltare în ceea ce privește necesitățile
ei fiziologice (pH, presiune osmotică, umiditate, echilibru ionic).
Compozi ția mediului de cultură difer ă de la o specie la alta, iar de la începuturile
micro propagării până a zi au fost elaborate multe diverse rețete , odată cu acumularea informa țiilor
despre specia în discu ție, cu evolu ția fiziologiei și a biologiei moleculare, domeniul nefiind nici
pe depart e închis cercetării.

a. Substanțe anorganice
• Macroelementele
Cele mai des întâlnite macroelemente în compoziția mediului de cultură sunt: Ca, Mg, N,
P, K, S . Prezen ța acestora este foarte importantă pentru plantel e crescute pe medii de cultură

13
datorită rol ului lor structural și func țional în sinteza proteinelor, sinteza nucleotidelor, sinteza
peretelui celular, co -factor enzimati c și integritatea membranei celulare (Mg). Sărurile utilizate
pentru prepararea mediilor de cultură trebuie să prezinte un înalt g rad de puritate (George și colab.,
2008; Bhatia, 2015).
Calciul (Ca) acționează ca și co -factor pentru majoritatea enzimelor și este important în
procesul de biosinteză a peretelui celular. Scăderea nivelului de Ca din mediul de cultură conduce
la necroza rea vârfurilor de creștere, iar suprimarea sa duce la moartea celulară. În cazul culturilor
de meristeme nevoile de Ca sunt mai reduse.
Magneziul (Mg) are un rol de bază în funcționarea normală a enzimelor. De asemenea face
parte și din structura clorofilelor. Astfel, carența magneziului din mediu determină perturbări în
funcționarea frunzei, astfel ducând la moartea explantului.
Prezența azotului (N) în mediul de cultură este foarte importantă, întrucât acesta ajută la
creșterea și dezvoltarea normală a plantei. În marea majoritate azotul anorganic este transformat
în aminoacizi, după care în proteine. În mediile de cultură azotul se regăsește sub for mă de săruri
organice și/sau anorganice (ionii de amoniu și nitrat). Ionul de nitrat (NO 3-), cu rol oxidant, se
adaugă în concentra ții de 25 -40 mM , iar cel de nitrat (NH 4+), cu rol reducător, se adaugă în
concentrații de 2-20 mM .
Azotul se poate adăuga în mediu și sub formă organică ca aminoacizi cum sunt: glicina, l –
glutamină, asparagin a, tirozin a, l-arginin a sau cistein a, hidrolizate (cazeina hidrolizată) sau acizi
organici . Avantajul de a folosi form ele organice se datorează faptului că majoritatea form elor sunt
deja reduse la forme tipice din plante, astfel că pot fi asimilate mult mai repede la nivel celular .
Lipsa azotului din mediul de cultură determină acumularea antocianilor în vacuole și astfel
moartea celulară (George și colab., 2008; Hussain și colab., 2012).
Fosforul (P) prezintă un rol important în metabolismul explantelor prin formarea
compușilor nucleotidici cu valoare energetică (ADP și ATP) care realizează captarea,
înmagazinarea și energiei chimice. De asemenea, acești compuși nucleotidi ci sunt implicați în
biosinteza acizilor nucleici (ADN și ARN). În general, fosforul este utilizat sub formă de fosfați
(PO 4-).
Potasiul (K) prezintă rol important în reglarea permeabilității membranei celulare și a
vâscozității protoplasmei. Acesta prezi ntă o activitate mai intensă în cadrul schimburilor de ioni
de la nivelul membranei celulare. S -a observat faptul că explantele tinere cer prezența potasiului
întrucât ajută la diviziunea celulară. Carența sau lipsa potasiului din mediul de cultură duce la
necrozarea celulelor.

14
Sulful (S) intră în structura multor aminoacizi esențiali și este nelipsit din compoziția
mediului de cultură. Acesta se regăsește adesea sub formă de ion sulfat (SO 42-). Carența de sulf
produce o clorozare a țesuturilor in vitro (Hussain și colab., 2012; Stănică, 2004).
• Microelementele
Cele mai utilizate microelemente în mediile de cultură sunt: Bo, Mn, Cu, I, Fe, Mo, Zn, Ni,
Co, Al, etc. Microelementele sunt de nelipsit din mediul de cultură, întrucât acestea au un rol foarte
important în dezvoltarea țesuturilor vegetale , constituind co -factori enzimatici de bază plantelor
(citocromoxidaza, peroxidaza) . Scăderea sau suprimarea microelemen telor din mediul de cultură
conduce la reducerea creșterii plantelor cu aproximativ 40%.
Borul (Bo) are un rol important în activitatea enzimatică care este cuplată de biosinteza
ligninei și metabolismul acizilor fenolici. Se adaugă în mediu sub formă de acid boric , iar carența
lui duce la moartea meristemelor și a vârfurilor de cre ștere.
Manganul (Mn) este foarte important în reacțiile enzimatice, mai ales în procesele
respiratorii și în fotosinteză, fiind implicat în sinteza proteinelor. Carența manganu lui din mediul
de cultură poate determina blocarea sintezei ARN -ului.
Cuprul (Cu) se regăsește în culturi sub formă de sulfat cupric și are rol în creșterea
rădăcinilor. Acesta reprezintă un factor critic în reac ția a diferitelor enzime, inclusiv în sistemul
de oxidare al citocromului (Stănică, 2004; Krikorian și Berquam, 2003).
Fierul (Fe) este un factor foarte important din compoziția mediului de cultură, având un rol
major în sinteza proteinelor. De asemenea fierul este necesar at ât pentru sinteza clorofilei c ât și
pentru majoritatea reac țiilor de oxidare și reducere. Ionii de fier sunt ușor de asimilat de celulele
vegetale. Pentru a se asimila cu ușurință se utilizează chelatul de fier (NaFeEDTA). Acesta se
pregătește din sulfatul feros ( FeSO 4 x7 H 2O) și sare disodică a acidului etilen -diamino -tetra-acetic
(Na 2ETDA x2 H2O ).
Prezența zincului (Zn) și a molibdenului (Mo) este importantă în activitatea enzimatică.

b. Substanțe organice
În prepararea diverselor medii de cultură sunt utilizate o varietate de substanțe organice.
Acestea au rol în stimularea creșterii plantelor (gluci de, vitamine, acizi organici, etc.).
În culturile in vitro, glucidele (carbohidrații) se utilizează ca sursă de carbon și de energie.
Celulele vegetale își preiau cantitatea de energie necesară creșterii și dezvoltării prin hidroliza
carbohidraților. Cel mai des glucid utilizat în culturile vegetale in vitro este zaharoza. În diverse
cercetări s -au utilizat: fructoza, rafinoza, maltoza, dextrina și amidonul. Un alt rol important al
carbohidraților este de a regla presiunea osmotică a mediului de cultură (Hussain și colab., 2012;
Krikorian și Berquam, 2003)

15
Aminoacizii sunt utilizați ca surse suplimentare de azot organic. De asemenea, s -a constatat
faptul că aminoacizii prezintă un rol în formarea calusului.
În dezvoltarea explantelor in vitro o importanță majoră o joacă și prezența vitaminelor.
Principalele vitamine c e se folosesc sunt:
– Vit. B 1 (tiamina, aneurina) → stimulează creșterea vegetativ ă și ajută la creșterea biomasei;
– Vit. B 2 (riboflavina) → inhibă creșterea rădăcinilor și prezintă rol în metabolismul celular;
– Vit. B 6 (piridoxina) → este precursor al unei e nzime ce catalizează reacțiile din cadrul
metabolismului aminoacizilor;
– Vit. C (acidul ascorbic) → este un puternic antioxidant și induce diviziunea celulară și
elongarea;
– Vit. E ( α – tocoferol ul) → are acțiune antioxidantă și ajută la creșterea și dezvolt area
biomasei celulare;
– Inozitolul → este foarte important în diviziunea celulară;
– Vit. H (biotina) → stimulează creșterea țesuturilor meristematice.
Apa este foarte importantă în creșterea și dezvoltarea normală a celulelor vegetale. Aceasta
reprezintă aproximativ 95% din compoziția mediului de cultură. Apa este un element important în
medierea majorității proceselor metabolice ce au loc în explantele cul tivate in vitro. În culturi, apa
urmează un circuit închis întrucât aceasta este preluată de către plante, apoi este eliminată prin
procesul de transpirație, se condensează și astfel reintră în circuit. În culturi, apa folosită este o apă
distilată. O altă utilitate a apei este și înainte de cultura explantului. Aceasta este folosită și la
etapele de sterilizare.

c. Fitohormonii
Auxinele se regăsesc adesea în muguri, frunze tinere și vârfurile lăstarilor. Auxinele
intervin în procesele de diviziune celulară și elongare, intervin în permeabilitatea membranelor
celulare, stimulează producerea calusului și dezvoltarea rădăcinii, induce embriogeneza somatică
și prin stimularea sintezei ARNr influențează sinteza proteinelor.
Citokininele prezintă un rol fitoreglator în cadrul proceselor de creștere și dezvoltare a
țesuturilor vegetale. Citochi ninele ajută la formarea lăstarilor adventivi, inhibă creșterea
rădăcinilor, stimulează diviziunea celulară, reglează inițierea și dezvoltarea calusu lui și întârzie
îmbătrânirea celulară și determină creșterea conținutului de clorofilă (Hussain și colab., 2012;
Krikorian și Berquam, 2003)
Giberelinele sunt mai puțin folosite în culturile in vitro, însă acestea stimulează creșterea
în lungime a lăstari lor, stimulează germinarea semințelor, este implicat în procesul de formare a
florilor și inhibă formarea lăstarilor și a rădăcinilor adventive.

16
Etilena are rol în stimularea dezvoltării fructelor, determină îmbătrânirea frunzelor și a
florilor, dar și a căderii acestora (Krikorian și Berquam, 2003; Stănică, 2004) .

d. Agenți de solidificare
Mediile de cultură in vitro pot fi solide sau lichide. În cazul mediilor de cultură solide sunt
necesari agenții de solidificare. Aceștia leagă apa și absorb toți ceilal ți componenți ai mediului de
cultură. Pentru ca un agent de solidificare să fie acesta trebuie să fie inert, să nu fie contaminat,
să permită difuzia apei, vitaminelor, substanțelor minerale, etc., să prezinte o stabilitate chiar și
după autoclavare și da că este posibil să fie și ieftin.
Cel mai adesea se folosește ca agent de solidificare agarul. Agarul este un polizaharid cu o
greutate moleculară mare, ce se obține din alge marine și se leagă foarte ușor cu apa. Cu toate
acestea, creșterea plantelor in vitro poate fi afectată negativ dacă concentrația de agar este prea
mare. La concentrații mai mari, mediul cu agar devine dur și nu permite difuz ia substanțelor
nutritive în țesuturi. Se adaugă în mediu l de cultură în concentrații cuprinse între 0,5% –1% (6–8
g / L). Agarul este preferat față de alți agenți de gelifiere, cum ar fi agaroza și fitagelul, deoarece
este inert . Acesta nu reacționează nici cu constituenții medi ului de cultură și nici nu este digerat
de enzimele plantelor (Pollard și Walker, 1990 ).
În mediile de cultură se mai utilizează: agaroza, acidul alginic, phytagelul, argagelul, etc.

3. Etapele micropropagării

Fig. 6 – Etapele micropropagării
(https://microbenotes.com/micropropagation -stages -types -applications -advantages -limitations/ )

17
a. Etapa 0 – Selecția plantelor
Primul pas în micropropagar e este selectarea plantelor stoc sau de elită cu caractere le dorit e
pentru înmulțirea lor pe scară largă. După selectarea plantelor, acestea sunt menținute în condiții
de mediu controlate cu umiditate scăzută, irigare și în condiții aseptice pentru o perio adă de
apoximativ 3 luni pentru inițierea culturii.
b. Etapa 1 – Inițierea și stabilizarea culturii
Al doilea pas în procesul de micropropagare este obținerea unei culturi aseptice a
materialului vegetal selectat. Succesul în această etapă presupune în primul rând ca explantele să
fie transferate în mediul de cultură , fără a conține contaminanți microbien i. În general, este
sugerată aplicarea combinată a produselor bactericide și fungicide. Selecția produselor depinde de
tipul de explant c e urmează să fie intr odus. Sterilizarea de suprafață a explantelor în soluții chimice
este un pas important pentru eliminarea contaminanților cu deteriorarea minimă a celulelor
plantelor. Dezinfectanții cel mai des folosiți sunt hipocloritul de sodiu, hipocloritul de calciu,
etanolul și clorura mercurică (HgCl 2) (Bhatia și Sharma, 2015; Torres, 1989).
c. Etapa 2 – Faza de multiplicare
Această etapă cuprinde mai multe faze și se întinde pe mai multe subculturi timp de 3/4
săptămâni. În această etapă, scopul este de a mări rata de m ultiplicare. Această creștere se poate
obține prin stimularea vârfurilor lăstarilor, a lungimilor lăstarilor sau chiar prin ambele metode.
d. Etapa 3 – Germinarea embrionului somatic sau înrădăcinarea lăstarilor
Lăstarii sau plantele derivate din etapa a II -a sunt mici și încă nu sunt capabile să se auto –
susțină în creșterea solului. În etapa a III -a, se iau măsuri pentru creșterea individuală sau a
grupurilor de plantule, capabile să efectueze fotosinteza și supraviețuirea fără o alimentare
artificială de carbohidrați. Câteva specii formează rădăcini adventive pe lăstari pe parcursul etapei
III, dar, de obicei, este necesar să se adopte o procedură se parată de înrădăcinare folosind medii
speciale sau metode, pentru a induce formarea rădăcinilor. Un lucru nedorit c e poate să apară in
aceast ă etapă este senescen ța culturii și epuizarea ei. Acest lucru a re diverse cauze : caren țe din
mediul de cultură, scăderea proprietă ților mediilor de cultură sau chiar toxicizarea mediului de
cultură (Bhatia și Sharma, 2015).
e. Etapa IV – Transferul în mediul ex vitro și aclimatizarea
Această se referă la transferarea plantelor din recipientele de cultură în mediul natura l.
Această etapă constă în deschiderea flacoanelor, scoaterea plantelor înrădăcinate, spălarea
resturilor de mediu de pe rădăcini și plantarea acestora în amestec de pământ. În primele zile de
aclimatizare, plantele se men țin acoperite pentru a fi proteja te, fiind udate cu o solu ție nutritivă .
Treptat soluția se dilu ează astfel că în final, plantele ajung să fie udate doar cu apă de la robinet.

18
În acest moment f actorul critic (de adaptare) îl constituie func ționarea cat mai normală a
rădăcinilor. Este necesară protejarea micilor tulpini împotriva uscăciunii din atmosferă. Acest
stadiu poate fi prelungit p ână la 4 luni. O importan ță deosebită trebuie acordată momentului
transferării plantulelor, din condi țiile in vitro, în condi ții naturale de via ță, precum și modului în
care se realizează această trecere (Torres, 1989).

4. Embriogeneza somatică
Embriogeneza somatică este procesul prin care celulele somatice, în condiții adecvate
pentru inducție, generează celule em brionare , care trec p rintr-o serie de modificări morfologice și
biochimice și rezultă o structură autonomă ce nu mai are legătură prin intermediul sistemului
vascular, cu nici o altă structură ini țială.
Embrionii somatici sunt formați din celule vegetale care nu sunt implicate în mod normal
în dezvoltarea de embrioni zigotici, adică țesut vegetal obișnuit. În jurul unui embrion somatic nu
se formează niciun endosperm sau strat de semințe (Sahijram și Bahadur, 2015).
Aplicațiile acestui proces includ :
– propagarea clonală a mater ialului vegetal uniform genetic;
– eliminarea virusurilor;
– furnizarea de țesut sursă pentru transformare genetică;
– generarea plantelor întregi din celule unice numite protoplaste;
– dezvoltarea tehnologiei de semințe sintetice etc.

Fig. 7 – Embriogeneza somatică și ciclul de viață al plantelor
(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982217305626 )

19
Embriogeneza somatică regăsește la nivelul calusului, în culturile de celule derivate din
calus sau din culturile de protoplaști, la nivelul epidermei, la explante le din fragmente de tulpini,
segmente uninodale , dar și la fragmente de pistil, hipocotile sau cotiledoane. Embriogeneza
somatică poate fi directă sau indirectă (Singh, 2015).
Embriogeneza somatică directă constituie formarea embrionilor somatici sau a țesuturilor
embrionare direct din explantul utilizat inițial. În embriogeneza somatică directă embrionii sunt
formați direct di ntr-o celulă sau un grup mic de celule, cum ar fi nucelul, stilurile sau polenul, fără
producerea unui calus intervenient. Pentru a induce și a studia embriogeneza somatică se utilizează
culturile de embrioni zigotici imaturi. De asemenea, cele mai folosit e medii de cultură sunt cele
care au în compoziție auxine (Iliev și colab., 2010).
Embriogeneza somatică indirectă constituie regenerarea unor embrioni somatici din calus.
După obținerea și dezvoltarea calusului acesta este transferat pe un mediu unde se v a realiza
inducția și formarea embrionilor (Singh, 2015; Iliev și colab., 2010).
Sunt cunoscuți mai mulți factori ce influențează inducția embriogenezei somatice și
maturarea embrionilor somatici astfel formați. Principalii dintre aceștia sunt:
• genotipul p lantei;
• tip de plantă (specia);
• gradul de dezvoltare al explantului;
• starea fiziologică a plantei / explantului (inclusiv nivelurile endogene de regulatori de
creștere a plantelor);
• mediul extern al explantului, adică compoziția mediului de cultură (chimic) și a condițiilor
de cultură fizică (temperatura de incubare, cantitatea, calitatea, durata luminii) .

5. Organogeneza in vitro

Fig. 8 – Căile de regenerare ale unei plante
(http://www.brainkart.com/article/Plant -Regeneration -Pathway_38253/ )

20
Organog eneza reprezintă formarea adventivă a rădăcinilor și a lăstarilor . Organogeneza in
vitro depinde de echilibrul auxine lor și cito chininelor și de capacitatea țesutului de a răspunde la
fitohormon i în timpul dezvoltării . Organogeneza are loc în trei faze. În prima fază celulele devin
competente; în continuare, acestea se diferențiază , iar în ce a de a treia fază, morfogeneza se
desfășoară independent de fitohormon i. Există 2 tipuri de organogeneză: directă și indirectă
(Singh, 2015; George și colab., 2008).

Fig. 9 – Organogeneza directă VS Organogeneza indirectă

Atunci când meristemele axilare sau apicale sunt dificil de obținut în cultură, metoda
organogenezei directe se poate dovedi utilă pentru micropropagare. Orice țesut d in explan t prin
această metodă va produce lăstari în mod direct. Celulele explante produc plantule prin supunerea
directă a organogeneze i.
Formarea organelor platelor prin calus se numește organogeneză indirectă . Inducerea
plantelor c e utilizează această tehnică nu asigu ră fidelitatea clonală, dar ar putea fi un sistem ideal
pentru selectarea variantelor somaclonale ale caracteristicilor dorite și, de asemenea, pentru
înmulțirea în masă. Inducerea plantelor prin faza calusului a fost utilizată pentru producerea
plantelor transgenice în care calusul este transformat și planta regenerată (Singh, 2015; George și
colab., 2008).
Caulogeneza reprezintă procesul de creștere și dezvoltare a mugurașilor și a tulpinelor.
Caulogeneza este stimulată de un raport între auxine și citoc hinine . Caulogeneza este foarte
importantă atunci când se urmărește „reconstituirea” unei noi plante ori a unui genotip, generat
prin hibridare somatică. Factorii externi cum ar fi: lumina, temperatura, calitățile fizice ale
mediului) sunt controversați în ceea ce privește efectele lor asupra caulogenezei. Acțiunea acestora
depinde foarte mult de tipul inoculilor și de etapele parcurse anterior (Torres, 1989).
Rizogeneza reprezintă apariția și dezvoltarea rădăcinilor. În cadrul rizogenezei, pe lângă
factori i endogeni, o importanță majora o au fitohormonii.

21
6. Avantajele și dezavantajele micropropagării in vitro
a. Avantaje
❖ În cantități mici, ț esutul vegetal este suficient pentru a produce milioane de clone într -un an
utilizând tehnica micropropag ării. Folosind me tode convenționare acest lucru ar dura mult mai
mult timp. Plantele în număr mare pot fi produse într -o perioadă scurtă. Orice soi particular
poate fi produs în cantități mari, iar timpul de dezvoltare a soiurilor noi este redus cu 50%.
❖ Cantități mari de p lante pot fi menținute în spații mici. Acest lucru ajută la salvarea speciilor
pe cale de dispariție și la depozitarea germoplasmei.
❖ Metoda micropropag ării produce plante lipsite de boli. Prin urmare, prin această tehnică se
obțin soiuri fără boală prin utilizarea culturii de vârf uri de meristem.
❖ Proliferarea stocurilor in vitro se poate face în orice moment al anului. De asemenea, o
pepinieră poate produce fructe, ornamente și specii de copaci pe tot parcursul anului.
❖ Se obține un randament crescut de plante și o vigoare sporită la speciile de floricultură.
❖ Este oferit un schimb internațional rapid de materiale vegetale fără riscul introducerii bolii .
❖ Tehnica micropropag ării este utilă și pentru producția de semințe în anumite culturi, deoarece
necesitatea conservării genetice într -un grad ridicat este importantă pentru producția de
semințe.
❖ Întrucât micropropagarea are diverse avantaje față de metod ele convenționale de propagare,
această metodă păstrează un domeniu de aplicare și un viitor mai bun pentru producerea de
fitofarmaceutice pe bază de plante.
❖ Independent de disponibilitatea plantelor, micropropagarea oferă o abordare alternativă
lucrativă a metodelor convenționale în producerea de cantități controlate de produse
biochimice. Prin urmare, eforturile intense și continue în acest domeniu vor conduce direct o
producție controlată și de succes de substanțe chimice vegetale valoroase, specifice și totuși
nedescoperite.

b. Dezavantaje
❖ În diverse situații, este redusă stabilitatea genetică a materialului vegetal.
❖ Uneori, plantele înmulțite in vitro pot prezenta defecte caracteristice cum ar fi: juvenilitate
accentuată, prezența spinilor, lăstari advent ivi nedoriți, fructificare întârziată, etc.
❖ Se poate ca rizogeneza să fie greoaie sau chiar imposibilă. În general, rădăcinile ce se formează
în condiții in vitro prezintă o funcționalitate redusă .
❖ Necesită multe proceduri, facilități și abilități avansate costisitoare și specializate .
❖ Plantele pot necesita o fază de tranziție înainte de creșterea independentă in mediul ex vitro.
❖ Capacitatea de regenerare a plantelor poate să se reducă prin culturile repetate.

22
II. CONSIDERAȚII TAXONOMICE, MORFOLOGIA ȘI BOTANIC A
ASUPRA SPECIEI LILIUM CANDIDUM L.

Fig. 10 – Crin alb de grădină
(https://www.gardenexpert.ro/flori/plante -perene/crin -alb.html )
1. Istoric
Lilium candidum L. (crin alb de grădină, crinul Fecioarei, white lily , madonna lily ) este o
plantă perenă ce face parte din genul Lilium , familia Liliaceae . Genul Lilium cuprinde între 80 și
100 de specii, originare din zonele temperate ale emisferei nordice. Crinii sunt apreciați ca plante
ornamentale și de -a lungul anilor au fost hibridizați pe scară largă.
Ea fost cunoscută în jurul anilor 2800 î.H și cultivată în America de Nord, Asia, Europa.
Din Asia Mică, această plantă a fost adusă de către turci și în România și cultivată în anul 1545.
Crinul alb se numără printre cele mai îndrăgite flori de g rădină, fiind apreciat datorită frumuseții
sale , dar și a mirosului său. Crinul simbolizează puritatea pentru romano -catolici (Șelaru, 2007;
Săvulescu, 1966).
Frunzele de crin se utilizau pe tăieturi, arsuri, răni pentru a grăbi vindecarea. Petalele, care
erau unse cu miere se puneau pe tăieturi sau pe buba neagră (boală infecțioasă contagioasă cauzată
de infectarea cu Bacillus anthracis ). De asemenea pentru a tratarea afecțiunilor bucale se fierbeau
petalele de crin în lapte și se ținea laptele în cavitat ea bucală. Durerile de ochi se tratau cu apa de
crin. Această apă rezulta în urma introducerii petalelor și staminelor de crin într -un recipient de
sticlă peste care se adăuga apa și se lăsa la macerat.
Petele pigmentare de pe față se vindecau cu petale de crin ce au fost ținute într -o soluție de
alcool. Din floarea întreagă se pregătea o tinctură ce ameliora durerile interne. Tot din florile de
crin se consuma ceai, care avea rolul de a curăța sângele.

23
Bulbul de crin fie era fiert și se utiliza pe umflăt uri, furuncule, fie era pisat și folosit pentru
creșterea sprâncenelor.
2. Descrierea speciei
Bulbul este ovoidal, galben sau albicios, neapendicular la vârf și are în circumferință 20 –
25 cm. Acesta prezintă solzi foarte cărnoși, îngust ovoidali. Rădăcinile principale de la baza
bulbului sunt numeroase, unele adesea contractile. Este foarte important ca bulbul să își păstreze
intacte rădăcinile și turgescența solzilor. Aceștia nu trebuie să fie expuși uscării. În cazul acestei
specii, bulbul începe să vegetez e în jurul lunii august (Săvulescu, 1966).
Tulpina este erectă, plină, verde. Ea măsoară 60 -180 cm înălțime și de o grosime cuprinsă
între 4 -10 mm. Frunzele sunt glabre, verticilate și sunt lungi de 20 -35 cm și late de 20 -40 mm.
Frunzele bazale sunt dis puse în rozetă, alungit pețiolate, iar cele tulpinale sunt alterne,
pețiolate și sesile.

Fig. 11 – Bulb, frunze și tulpină Lilium candidum L.
(https://www.bigstockphoto.com/image -80875031/stock -photo -lilium -candidum )
Florile sunt albe, imaculate, mari (5-8 cm) , grupate câte 4 -20 în racem terminal lung de 60-
100 mm. Florile sunt puternic odorante. Florile inferioare sunt erect patule mai mult sau mai puțin
nutante, iar cele superioare sunt erecte. Pedicel ele sunt lungi (25 -60 mm) sunt situați la subțioara
bracteelor filiforme, sunt ascendente, drepte. La vârf, sub floare sunt înclinate și de obicei cu o
bractee foliacee situată la mijloc (Ciocîrlan , 1990).
Androceul este alcătuit din 6 stamine cu filamente liniar filiforme și antere mari galbene.
Gineceul cu ovar lung (12 -18 mm), stil lung (50 -55 mm) și stigmat capitat, mare.

24

Fig. 12 – Lilium candidum (Crin alb) Fig. 13 – Floare de crin alb
(https://www.easytogrowbulbs.com/products/lilium -candidum -madonna –
lilly?variant=42686306124 )
3. Compoziția chimică
Crinul alb nu este pe deplin înțeles, iar compoziția sa chimică completă nu a fost încă
stabilită. Conform rezultatelor studiilor efectuate, se poate vorbi despre prezența în plantă a
următoarelor substanțe: uleiuri esențiale, linalol, p -hidroxi -m-metoxitoluen, terpineol, kaempferol,
iatrofin, alcool feniletil, carotenoide, amidon, fitostero li, polizaharide, acid miten -glutamic,
alcaloizi de pirol, tanini și saponiți (Ciocîrlan, 1990; Săvulescu, 1966).
4. Ecologie
Lilium candidum L. este o specie mezotermă, heliofilă, mezotrofă și slab acido -neutrofilă.
Aceasta este iubitoare de lumină, vegeteaz ă foarte bine pe terenuri însorite. Această plantă preferă
solurile ușoare, nisipoase.
5. Înmulțirea
La această specie sau la genul Lilium înmulțirea are loc atât pe cale sexuată, cât și pe cale
vegetativă.
a. Înmulțirea sexuată
La majoritatea speciilor de crini plantarea bulbilor se realizează toamna. Excepție de la
această regulă fac: Lilium candidum L. ce se plantează în luna august și Lilium speciosum ce se
plantează primăvara. Plantele se plantează la o distanță de 20 -40 cm unele față de altele, iar în
adâncime între 15 -20 cm. O condiție esențială este asigurarea unei bune drenări a apei.
Lucrările de îngrijire includ: afânarea solului cu grijă, pentru a nu atinge și leza bulbul,
udarea cu generozitate în perioada dezvoltării tulpinilor, administrarea de îngrășăminte, fixarea
tulpinii de arac în momentele în care nu se pot susține singure datorită greutății florilor. Toamna

25
este de preferat să se aplice un strat de materie organică format din paie, frunze uscate sau resturi
vegetale pentru a proteja bulbii de gerurile puternice (Strid, 2016).
Pe lângă culturile perene (bulbii rămân în sol pentru mai mulți ani) din ce în ce mai mult
se practică plantarea bulbilor în lăzi, creșterea acestora în seră pentru o anumită perioadă de timp
și ulterior transferarea lor în mediul natural.
b. Înmulțirea asexuată (vegetativă)
Procedee de înmulțire vegetativă:
• Înmulțirea prin bulbi
Acest tip de cultură se realizează atunci când plantele intră în repaus, respectiv când
tulpinile florale încep să se usuce. Bulbii se scot din pământ și se separă cu atenție pentru a nu se
desprinde sau a nu răni solzii. În cazul acestei specii ( Lilium candidum L.), înmulțirea se face în
luna august, pentru a oferi bulbilor posibilitatea de a forma o rozetă de frunze nouă până vine
frigul. Tran sferul bulbilor se realizează imediat după separare (Pârvu, 2002).
• Înmulțirea prin solzi
Această cultură se realizează în special la Lilium candidum L.. După înflorire, se desprind
solzii bulbului și se plantează în lădițe cu ni sip la 3 -5 cm distanță. Aceasta se realizează toamna.
Temperatura optimă de înrădăcinare este de aproximativ 20 °C. După o perioadă de 5 -6 săptămâni ,
la baza solzului se pot observa rădăcinile și un bulb foarte mic. În primăvara următoare, în jurul
lunii mai, bulbii astfel formați se pot planta pe teren (Pârvu, 2002).
• Înmulțirea prin frunze și fragmente de tulpină
Aceasta se realizează toamna sau primăvara. Temperatura necesară acestui proces este de
20°C. Butașii se înrădăcinează formând la bază mici bulbi. După o perioadă de 3 luni, butașii sunt
stabili pentru a putea fi plantați în ghivece, însă pentru a deveni f loriferi vor avea nevoie de o
perioadă de 2 ani.
• Înmulțirea prin bulbili aerieni
La speciile Liulium candidum, Lilium tigrinum și Lilium bulbiferum se formează la
subsoarele frunzelor niște formațiuni ce poartă denumirea de bulbili. Aceștia sunt de mărime a unui
bob de mazăre. După recoltare se plantează imediat în răsadniță sau în pământ pe teren normal.
Plantele obținute sunt capabile să înflorească abia după 3 -4 ani.
• Înmulțirea prin semințe
În acest caz se disting 2 grupe de crin i, în funcție de modul de germinare al semințelor:
– Specii cu germinație hipogee (din sămânță se dezvoltă un cotiledon care rămâne în sol până
în momentul în care se formează un bulb mic; frunzele se formează în anul următor);

26
– Specii cu germinație epigee (din sămânță se dezvoltă un cotiledon subțire ce va ieși din
pământ după 3 -6 săptămâni de la însămânțare; frunzele se formează în câteva săptămâni).
Semănatul se imediat după ce se recoltează semințele într -un sol ușor, nisipos. Temperatura
optimă de germinare este de 25°C. Primele flori apar după 3 -4 ani (Pârvu, 2002).

6. Utilizare
În general, crinii albi ( Liulium candidum L.) se cultivă, în special, pentru flori. Aceștia se
folosesc ca plante ornamentale în decorul grădinilor și al parcurilor . Floarea de crin alb se
utilizează în cer emoniile religioase de peste 2000 de ani. La greci și la romani ea era dedicată zeiței
frumuseții.
Cultura crinului alb cunoaște astăzi o dezvoltare fără precedent. Olanda, Japonia și Statele
Unite ale Americii sunt cunoscute ca mari producătoare de bulbi și creatoare de culturi noi.
De la Lilium candidu m L. se culeg petalele albe în jurul lunii mai, atunci când florile se
deschid, iar bulbii în jurul august, atunci când planta prezintă o perioadă de repaus. Petalele florii
se usucă la umbră, fiind așezate într -un strat subțire, apoi se păstrează în recipiente de sticlă. Bulbii
se usucă la soare și se păstrează în aceleași condiții ca și florile (Strid, 2016; Pârvu, 2002).
Extractele de Liulium candidum L. prezintă proprietă ți de regenerare a pielii, datorită
prezenței mucilagiilor de protecție și de hidratare, cu taninuri și steroli. Acestea prezintă efect
antiinflamator și de calmare. Substanțele flavonoide prezintă o acțiune vasoprotectoare și
antioxidantă. Bulbul de crin alb este recunoscut pentru proprietățile sale expectorante și diuretice.
Se poate utiliz a atât pentru uz extern, cât și în prepararea și îmbunătățirea unor produse cosmetice.
În prezent bulbii de crini albi se utilizează pentru a trata afecțiunile dermatologice. În
industria dermatologică, din bulbii de crin alb se realizează o serie de produ se ce au efect calmant
asupra pielii iritate, a rănilor și a arsurilor, iar petalele albe se folosesc la tratarea eczemelor,
pruritului și dermatitei (Șelaru, 2007).
Petalele de la florile de Lilium candidum L. se utilizează la obținerea unei tincturi, ce ajută
la tratarea mâncărimilor puternice care apar în cazul unor afecțiuni de piele. Se pot folosi bulbi de
crin alb proaspeți sau fierți și apoi zdrobiți, acoperiți cu tifon și aplicați local pe zonele cu
probleme. Pentru a calma mâncărimile și a reduce i nflamațiile, acest tratament se repetă de mai
multe ori pe zi.
Crinii albi sunt folosiți și pentru d urerile de diferite origini, inclusiv articulații și migrene,
sunt eliminate cu preparate pe bază de crin alb. Lilium canid idum L. ajută la blocarea impuls urilor
nervoase și astfel la stoparea durerii. În plus, dacă durerea este cauzată de un proces i nflamator,
floarea ajută la vindecarea acesteia, ceea ce permite eliminarea chiar și a cauzei durerii.

27
Pentru a trata inflamațiile căilor respiratorii superioar e exteriorizate prin tuse uscată se
folosește un decoct din 10 g de bulbi de crin la 250 ml de apă. Se bea acest decoct de 2 ori pe zi
după masa principală (Strid, 2016; Șelaru, 2007).
Pentru durerile de ochi se folosește extracția din tepalele de crin alb . Tepalele se pun într -o
sticlă, peste care se adaugă apă rece, după care se lasă la macerat 8 -10 ore. Ulterior se strecoară și
se folosește lichidul pentru spălături.

28
III. ASPECTE ALE CULTIVĂRII IN VITRO LA LILIUM CANDIDUM
L.

În decursul anilor s -au efectuat diverse studii asupra speciei Lilium candidum L. Cele mai
multe cercetări s -au realizat asupra bulbului de crin alb , dar și a florilor și fru nzelor. Aceste studii
au fost efectuate în urma propagării in vitro prin diferite metode a acestei plante.
În cadrul articolului ,, Convolvulus galaticus, Crocus antalyensis , and Lilium candidum
Extracts Show Their Antitumor Activity Through Induction of p53 -Media ted Apoptosis on Human
Breast Cancer Cell Line MCF -7 Cells”, cercetătorii au avut ca material bulbi și frunze din diferite
specii, printre care și Lilium candidum . În urma experimentului s-a observat faptul că extractele
de Convolvulus galaticus, Crocus an talyensis și Lilium candidum L. au efecte citotoxice puternice
asupra proliferării celulare, asupra celulelor MCF 7 ale liniei de cancer de sân uman și că aceste
efecte provin din inducerea apoptozei prin acumularea de p53. Aceste date indică faptul că ac este
trei specii de plante pot conține compuși activi c e pot fi îmbunătățiți ca agent terapeutic pentru
cancerul de sân (Tokgun și colab., 2012).
Un alt studiu ce a avut ca scop evidențierea potențialului carcinogenic și activitatea
inhibitorie a compușilo r din Lilium candidum L. a arătat că substanțele extrase din bulb și din flori ,
cum ar fi saponine le steroidiene de tip spirostan, jatropham și, eventual, glucozidul său pot servi
ca inhibitori ai transformării celulare maligne și creșterii tumorii (Vacha lkova și colab., 2000).
Există o necesitate pentru dezvoltarea unui protocol de micropropagare a crinului alb care
să servească în mod eficient atât pentru înmulțirea comercială, cât și pentru protecția instalației.
Daneshvar R .S. și-a propus să dezvolte o strategie pentru un sistem eficient de propagare a
plantelor in vitro folosind cultură lichidă statică, tratamente seismomorfogene cu cultură lichidă
mixtă și mediu de cultură semi -solidă folosind explante la scară unică. Primele două tehnici nu au
reuși t să regenereze noi bulb i în mod eficient, însă tehnica ulterioară a indus o regenerare 100%
pe toate tratamentele. Extinderea acestui studiu în mod intenționat poate ajuta la înmulțirea acestei
plante cu acces nelimitat constant și sigur pe tot parcursul anului (Daneshvar , 2019).

29

Fig. 14 – Regenerarea bulbilor de Liulium candidum L.
(Daneshvar , 2019 )
În cadrul studiului efectuat de Burun și Sahin, aceștia au observat micropropagarea in vitro
a speciei Lilium candidum L. În urma cercetării s -a constatat faptul că pentru o mai bună dezvoltare
in vitro a solzilor din bulbul de Lilium candidum L. este necesară adăugarea în mediu l Murashige
și Skoog a unor regulatori de creștere . Plantele regenerate au fost transferate în se ră pentru adaptare
unde au înflorit după doi ani (Burun și Sahin, 2013).
În anul 2005, K hawar și colaboratorii săi au studiat efectele compusului BAP -IBA în
proliferarea în masă a crinului alb în condiții in vitro. În cazul jumătăților inferioare de bulb a portul
de IBA a fost unul foarte important. Frecvența inducerii calusului a fost mai mare cu cât
concentrația de IBA a fost mai mare. Cu toate acestea, subcultivarea pe mediu ulterior nu numai
că a încurajat creșterea și dezvoltarea calusului, dar a produs și 8-10 bul bili în cazul fiecărui
explant. Fiecare dintre ele a fost separat pentru o creștere și dezvoltare ulterioară (Khawar, 2005).

Fig. 15 – Bulbili (fotografie personală)

30
În cazul jumătăților superioare de bulb nu s -a observat o regenerare a țesutului rănit.
Calusul nu s -a dezvoltat nici după creșterea concentrației de BAP -IBA. Rezultatele susțin
descoperirile lui Bacchetta și colab., (2003) care nu au observat nicio regenerare din părțile
superioare ale explantelor frunzelor de Lilium longiflorium (Bacchetta și colab., 2003).
În cazul explantelor din frunze rezultatele au arătat variații ale capacității de regenerare.
Această variație s -ar putea datora potențialului de regenerare a explantului sau a cond ițiilor de
cultură (Khawar, 2005).
În 2013, Saadon și Zaccai au studiat: propagarea culturii de țesuturi a bulbilor de Lilium
candidum L., dezvoltarea timpurie a bulbilor și efectul temperaturii și a greutății bulb ililor asupra
creșterii bulb ililor și a plantelor și asupra dezvoltării meristemului. Investigați a efectului tipului și
temperaturii explantului asupra propagării bulbil or in vitro a arătat că solzi au fost cele mai
eficiente explante pentru propagarea in vitro și că expunerea bulbil ilor regenera toare la 15°C
pentru 4 săptămâni a crescut greutatea bulb ilului , dar a redus numărul de bul bili produ și. Pentru
bulbilii planta ți în sol după 12 săptămâni de expunere la 15°C sau 25°C, cea mai rapidă creștere a
fost observată la bulbilii care au fost expu și la 15°C și care au o dimensiune inițială mai mare
(Saadon și Zaccai, 2013).
Examenul histologic a arătat că bulbilii tineri in vitro au avut un meristem rudimentar c e
cuprinde a puține celule fără organizare în straturi. După 12 săptămâni de creștere, to ți bulbilii au
arătat un meristem stratificat, indiferent de dimensiunea bulbililor sau de expunerea la 15°C. Cu
toate acestea, o cantitate crescută de primordi i ale frunzelor a fost detectată în bul bilii mai mari.

Fig. 16 – Bulbilii după 4 săptămâni (stânga) și după 15 săptămâni (dreapta)
(Saadon și Zaccai, 2013 )

31
Mai mult, examenul histologic a arătat că în cazul speciei Liulium candidum L., spre
deosebire de alte specii de crin, nu a existat o „modificare de fază” reală în meristem și că
schimbarea de fază de la adult la vegetativ a avut loc într -un stadiu mult mai târziu (Saadon și
Zaccai, 2013).
Un alt studiu ce a avut în vedere producerea de crin alb într -un timp mai scurt. În cadrul
acestui studiu s -au utilizat pentru micropropagarea in vitro solzii bulbilor de Lilium candidum L.

Fig. 17 – Bulb de Lilium candidum L. Fig. 18 – Evoluția explantului după 21 de zile
(Daneshvar și colab., 2014 )
În final Daneshvar și colaboratorii săi au concluzionat faptul că prin micropropagarea
acestei specii în mediul MS ( Murashige și Skoog ) rata de regenerare, creștere și dezvoltare s -a
mărit de 3 ori. Adică in decursul unui singur an se pot obține 3 serii de crini albi, ce vor fi utilizați
fie ornamental, fie în prepararea diferitelor produse cosmetice sau medicamente ( Daneshvar și
colab., 2014).
Papp și colaboratorii săi au studiat în 2019 activitatea antioxidantă a mai multor specii de
plante, printre care și Lilium candid um, plante utilizate în România, în medicina populară.
Produsele vegetale studiate provenind de la Lilium candidum, Plantago media, Rhinanthus
serotinus, Thymus serpyllum , și Veronica beccabunga au prezentat valori ridicate ale capacității
antioxidante pri n fiecare metodă, în timp ce Impatiens noli -tangere a prezentat valori scăzute.
Aceste studii subliniază valorile fitochimice promițătoare ale plantelor utilizate în medicina
populară, în România (Papp și colab., 2019).

32
SCOPUL LUCRĂRII

Scopul aces tei lucrări este studiul asupra posibilităților de micropropagare ale speciei
Lilium candidum L ., plantă cu valoare ornamentală , dar și cu valențe farmaceutice.
Întrucât pe parcursul anilor, crinul alb ( Lilium candidum L .) a prezentat diverse roluri
benef ice în tratarea și ameliorarea diferitelor afecțiuni, această plantă a fost studiată îndelungat
pentru extragerea acelor compuși importanți.
Principalii compuși sunt: flavonoide ( quercetină, izorhamnetină, kaempferol ), carotenoizi,
alcaloizi steroizi, alca loizi piroli, steroizi, saponine, taninuri, polizaharide, acizi organici și
aminoacizi.
Studiile efectuate asupra acestei specii au fost bazate în principal pe dezvoltarea de masă
vegetală într -o perioadă mult mai scurtă de timp. Această masă vegetală a pu tut fi dezvoltată
datorită tehnicilor de micropropagare in vitro. Cele mai multe cercetări s -au realizat asupra
bulbului de Lilium candidum L , dar și a florilor și frunzelor sale.
Materia primă utilizată a fost procurată cel mai adesea din Turcia , din regiunea Dalyan –
Muğla .
De asemenea, prin creșterea productivității de Lilium candidum L. are loc și creșterea
vânzărilor, iar costurile micropropagării necesare sunt mai scăzute.

33
IV. MATERIALE ȘI METODE

1. Abordări eficiente pentru înmulțirea in vitro a speciei Lilium candidum L. cu acces
constant și sigur pe tot parcursul anului și aclimatizarea plantelor în condiții de climă
mediteraneană
Bulbi i de Lilium candidum L. au fost obținuți din habitatul natural din Dalyan, provincia
Muğla din regiunea mediteraneană a Turciei. La scurt timp după colectare, ace știa au fost spăla ți
în apă de la robinet pentru a îndepărta noroiul și murdăria și a urmat uscarea și învelirea lor în
pungi de hârtie.
Ulterior, au fost a duși la laborator și incuba ți la 8°C timp de 6 săptămâni. Sterilizarea
bulbilor a început prin tratarea lor cu etanol de 96% , timp de 15 -30 de secunde. Aceasta a fost
urmată de sterilizare în decolorant comercial 50% (NaClO 2,5%) timp de 10 minute și apoi clătirea
acestora de 3 ori câte 5 min în apă distilată sterilizată. Ulterior, s -au cultivat solzi i intac ți (izolați
de bulbi) în cultura lichidă staționară , în mediu MS (Murashige și Skoog) .
Acest ui mediu conține i s-a adăugat 5 combinații de tidiazuron ( TDZ) și acid naftal en
acetic (NAA) cu 3 g/l cărbune activ și 30 g/l zaharoză (Fig. 1 9). Toate culturile au fost incubate la
4°C timp de 9 zile. Ulterior , aceste culturi au fost tratate la 24 ± 1°C .

Fig. 19 – Etape ale regenerării bulbilor de Lilium candidum L.
(Daneshvar , 2019 )
Bulbilii au fost cultiv ați pe mediu MS conținând 30 g/l zaharoză timp de 28 de zile, urma ți
de vernalizarea lor pe mediu MS conținând 60 g/l zaharoză cu 30 de zile de incubare la 5 ± 1°C la
întuneric . Plantele din toate ghivecele au fost dezrădăcinate cu atenție, fără a deteriora aparatul
radicular pentru a observa modificări morfologice referitoare dimensiunea și rădăcinile bulbului.

34
Acestea au fost spălate cu atenție în apa d e la robinet de la temperatura camerei , pentru a îndepărta
orice urmă de gel de agar aderent la rădăcini.
După aceea, to ți bulbilii au fost transfera ți în ghivece de 1 litru conținând 0,850 ± 20 ml
turbă și introduse în camera de creștere cu 80% umiditate timp de 4 săptămâni. Ulterior, plantele
aclimatizate au fost mutate în seră. După ce plantele au început să se dezvolte , umiditatea a fost
redusă treptat la 40% în 15 zile. Vasele au fost transferate într -un loc umbrit și apoi în câmpuri
deschise , unde au fost udate (100 ml apă/plantă) în fiecare zi timp de 4 sătămâni. . După aceea,
udarea plantelor a fost efectuată în funcție de necesitățile acesteia .

2. Activitatea antitumorală a speciei Lilium candidum L. prin inducerea apoptozei mediate
de p53 asupra liniei celulare MCF -7 în cancerul de sân
a. Materialul vegetal
Planta Lilium candidum L. a fost colectată de la o altitudine de 30 m deasupra nivelului
mării, din Turcia.
b. Prepararea extractului vegetal
După colectarea eșantioanelor, b ulbii uscați și frunzele au fost mărunțite și s-au preparat
extracte folosind o soluție de metanol. În acest studiu, pentru fiecare probă s -au utilizat 10 g de
plantă uscată și 100 ml de solvent metano l. Amestecul a fost extras după ce a fost încălzit într -o
baie de apă la 55°C. După ce a fost obținut ca rezultat al extracției, amestecul a fost filtrat prin
hârtie filtrantă și ulterior solvenții au fost evaporați într -un evaporator rotativ la 48 -49°C. Apa din
fiecare extract a fost înghețată într -o mașină d e uscare prin congelare și extrasă.
c. Liniile celulare și cultura
Celulele MCF -7 au fost cultivate în mediu RPMI 1640 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO,
SUA) , completat cu 10% ser fetal de bovină (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA) la 37°C într -un
incubator umidific at cu un aport de 5% CO 2.
d. Analiza proliferării celulare
Mediul a fost aspirat atunci când celulele MCF -7 au crescut până la aproximativ 90%
confluență. Celulele au fost spălate cu soluție salină fosfatată și tripsină, numărate cu un
hemocitometru și însămâ nțate în plăci cu 96 de godeuri (3 – 104 celule/ml).
După o incubare timp de 24 de ore la 37°C într -un incubator cu 5% CO 2, mediul a fost
îndepărtat , iar celulele au fost tratate cu extracte de plante adăugate la mediu în diferite concentrații
(0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5,0, 10,0 și 20,0 lg/ml) timp de 72 ore. Pentru grupul de control netratat,
celulele nu au fost tratate cu niciun extract.
Concentrațiile de e xtract vegetal au fost preparate în mediu RPMI 1640 care a inclus 10%
ser fetal de vițel și apoi sterilizate prin trecerea printr -un filtru (dimensiunea porilor 0,2 µm). La

35
sfârșitul perioadelor de incubație, mediul a fost îndepărtat și citotoxicitatea în grupele de control
tratate cu extract de plante și în cele netratate a fost măsurată prin metoda luminometrică folosind
un kit CytotoxGlo (Promega, Madison, WI, SUA). Valorile pentru concentrația la care s -a produs
inhibarea de 50% (IC 50) au fost calculate pentru toate extracte le de plante.
e. Analiza apoptozei cu marcarea capetelor dUTP transferazei terminale (Test TUNEL)
Celulele MCF -7 au fost tripsinizate, numărate cu un hemocitometru, apoi însămânțate în
baloane (3 · 104 / ml). Pentru detectarea inducerii apoptozei fiecărui extract de plantă, celulele
MCF -7 au fost tratate cu valorile IC 50 ale fiecărui extract de plantă (1,06l g/ml pentru Lilium
candidum L.). La sfârșitul perioadei de incubație, evenimentele apoptotice au fost analizate prin
testul TUNEL . Celulele apoptotice au fost numărate la microscop.
f. Analiza Western Blot
La sfârșitul perioadei de incubație, lizatele de celule MCF -7 tratate cu valorile IC 50 ale
fiecărui extract de plantă au fost preparate într -un tampon RIPA . Resturile celulare au fost
îndepărtate prin centrifugare la 5000 RPM timp de 5 min la 4°C.
Proteinele au fost supuse electroforez ei în gel de SDS-poliacrilamidă folosind geluri de
poliacrilamidă de 2 –15% sau 7,5% . Proteinele au fost imunoblocate pe membra nele difluorurii de
polivinilidenă Hybond (Amersham -PharmaciaBiotech, Piscataway, NJ, SUA) și au fost marcate
cu anticorpi înrudiți.
Anticorpii p53 au fost obținuți din tehnologia de semnalizare celulară (Danvers, MA,
SUA). Gl liceraldehida 3 fosfat dehidrogenaz a (GAPDH) și anticorpi secundari marcați cu
peroxidază au fost obținuți din Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA, SUA). Bloturile primare și secundare de marcare a anticorpului au fost tratate cu substrat
chemiluminescent Super Pest West West (Pierce), expus la Hyperfilm ECL (Amersham –
PharmaciaBiotech) și dezvoltat.
g. Analiza RT -PCR
Analiza RT-PCR a fost aplicată pentru a determina nivelurile relative de ARN m atât în
grupele de control cât și în grupele trat ate cu extractele plantelor . La sfârșitul perioadei de
incubație, celulele grupului de control tratate cu extract de plante și cele netratate au fost spălate
cu soluție salină tamponată cu fosfat, iar apoi a fost extras ARN -ul total din linia celulară MCF -7.
Expresia genei p53 și a genelor sale țintă pentru proteinele p21 și BAX a fost evaluată prin analiza
cantitativă RT -PCR folosind un kit PCR QuantiTect Probe (Qiagen, Hilden, Germania) și un
sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7900HT (Aplicat Biosy stems, Foster City, CA, SUA)
în conformitate cu protocoalele furnizorului.
Seturile de sondă TaqMan și primerii au fost achiziționa ți de la Applied Biosystems. Pentru
testarea amplificării unui fragment de ADNc – GAPDH, a fost utilizat un control endogen de testare

36
TaqMan a unui kit GAPDH (Applied Biosystems). Nivelurile relative de ARNm au fost calculate
utilizând metoda C t comparativă. Au fost evaluate nivelurile de transcriere p21, BAX și p53.
Nivelul de transcriere al GAPDH a fost utilizat ca referință.

3. Micropropagarea speciei Liulium candidum L.
Bulbii de Lilium candidum L. cultiva ți în acest studiu au fost colecta ți din regiunea Dalyan –
Muğla. În plus, pentru comparație, s-au utilizat explante de bulbi de Lilium longiflorum , de
asemenea, cultivate in vitro. E xplantele au fost cultivate pe mediu MS (Murashige și Skoog)
conținând diferite doze și combinații de NAA, acid boric , azidă de potasiu și 2iP. S -a adăugat
zaharoză 30 g/l, pH -ul a fost ajustat la 5,5 și apoi s -au adăugat 6 g/l agar. Culturile au f ost incubate
pentru 8 ore la întuneric și 16 ore în lumina zilei . Temperatura medie a fost de 20 -22°C și
umiditatea a fost de 50% pe parcursul incubării . Metoda de sterilizare a fost modificată la
concentrația soluției de hipocolorură de sodiu în doze de 1 și 2% timp de 20 min.
Explantele de bulb cultivate pe mediu MS suplimentate cu diferite regulatoare de creștere
a plantelor au format direct bulbili . Au fost observate atât formarea bulbilor, cât și înrădăcinarea.
Dar în cazul multor explante (40%) se poa te observa doar înrădăcinarea.

4. Proliferarea în masă a crinului alb (Lilium candidum L.) în condiții in vitro
Bulbii tineri de Lilium candidum L ., colectați din provincia Erzurum din sudul Turciei, au
fost presterilizați prin spălarea lor în apă de la robi net timp de jumătate de oră pentru a îndepărta
noroiul și urmele de murdărie . Din bulbi s-au preluat solzii ușor din punctele de atașament. Solzii
bulbului au fost steriliza ți în continuare în 60% înălbitor comercial timp de 10 minute, urmat de
clătire în apă distilată sterilă de 4 ori pentru a îndepărta urmele de înălbitor. După aceea, au fost
excizate orizontal în jumătăți superioare și inferioare și s -au cultivat în mediu de regenerare în cutii
Petri sau Magenta, care conțin mediu bazal MS (Murashige & Skoog), suplimentate cu 0,50 mg
de 6 benzilaminopurină (BAP) cu 0,20 -0,6 mg de indol 3 acid butiric (IBA ) (Tabelul 2). S-a reglat
pH-ul la 5,6 –5,8 cu 1N KOH sau 1N HCl înainte de a se autoclav a la 121 °C, timp de 20 min.

37
Tabel 2 – Efectul diferitelor concentrații de BAP -IBA asupra regenerării bulbilor de
Lilium candidum L.
După obținerea unui număr suficient de rădăcini, plantele au fost transferate în ghivece
care conțin nisi p și argilă în proporție de 9:1 și așezate în camera de creștere pentru adaptare. În
stadiile inițiale, umiditatea a fost menținută la 90%, care a fost redusă treptat la 40% în timp de 15
zile. Temperatura camerei de creștere a rămas 24 ± 2oC sub lumină fl uorescentă albă rece cu 16
ore de zi și 8 ore întuneric. Plantele adaptate au fost transferate în seră, unde au fost menținute
condițiile de temperatură și creștere ambientale.

5. Furnizarea de materii prime către industria cosmetică utilizând tehnica micropropag ării
in vitro a speciei Lilium candidum L.
Bulbii folosi ți în cadrul experimentului a fost obținut de la producătorii de cultură de crini
albi din regiunea Balıkesir și a fost ținu ți la 4oC învelit în pungi de hârtie timp de 6 săptămâni.
Pentru sterilizarea explantului, bulbul a fost curățat de solzii uscați din exterior, apoi spălat cu apă
cu detergent și apoi clătit sub apă curentă de la robinet. Bulbul clătit s -a scufundat în 70% etanol
timp de 3 secunde.

Fig. 20 – Bulb de Lilium candidum L . utilizat ca material vegetal
(Daneshvar și colab., 2014)
Pe baza studiilor anterioare, a fos t supus sterilizării timp de 10 minute în decolorant comercial
50%. Bulbul sterilizat a fost clătit de 3 ori cu apă distilată sterilă timp de 5 minute. Sărurile
minerale și vitaminele din mediul MS au fost utilizate ca medii nutritive principale . Apa disti lată
a fost utilizată la prepararea mediului și carbonul activ a fost adăugat în mediul nutritiv în diferite
concentrații atunci când a fost necesar. După ajustarea pH -ului mediului nutritiv între 5,6 și 5,8
folosind 1N NaOH sau 1N HCl, presiune atmosferic ă a fost menținută 1,2 și temperatura la 121°C
timp de 20 minute. Toate culturile au fost incubate la 24°C la 16 ore la lumină de zi și 8 ore
întunecate sub lumină fluorescentă albă.

38
S-a adăugat 0,3 carbon activ, 30 mg zaharoză la diferite concentrații de TDZ și NAA și s –
a solidificat cu 13 g agar. Pentru a mări diametrele superficiale obținute, expl antele din a doua
subcultură au fost cultivate în medii care conțin 50 și 60 g zaharoză. pH-ul mediului a fost ajustat
la 5,6 -5,7. Au fost efectuate încercări d e regenerare pe 3 serii de probe . Evaluarea statistică a
datelor obținute din studiu a fost făcută cu testul Duncan .

39
V. REZULTATE ȘI DISCUȚII

1. Abordări eficiente pentru înmulțirea in vitro a speciei Lilium candidum L. cu acces
constant și sigur pe tot parcursul anului și aclimatizarea plantelor în condiții de climă
mediteraneană
Studiul de față raportează impactul TDZ și NAA în construirea unui s istem de regenerare
a bulbilor de Lilium candidum L. in vitro. S -a descoperit că regenerarea productivă a bulbilor in
vitro poate fi dobândită cu ușurință folosind TDZ individual sau în combinație cu ace ști
fitohormon i. Tratamentele de control ( doar cu mediu MS) fără fitohormoni nu au reușit să inducă
bulbili noi.
S-a remarcat că , în cazul în care explantele au fost recult ivate prin subcultură după
recoltarea bulbilor acestea au indus bulb ili noi de fiecare dată fără nici o dificultate de aproximativ
6 ori indiferent de tratament și au indus 35 bul bili de la un singur bulb în 12 luni.
Bulbilii au putut să se înrădăcineze numai atunci când au atins o greutate ≥ 2,5 g și un
diametru 0,5 cm. To ți bulbilii ce nu îndepline au aceste criterii nu aveau nicio încli nație spre
proliferarea rădăcinilor .
Acest studiu este de o importanță enormă pentru regenerarea Lilium candidum L., făcând
posibilă micropropagarea pe scară largă. Problem a reală a plantelor ce sunt cultivate in vitro este
întâlnirea lor cu șocul de transfer , care ar putea fi evitat în mod semnificativ prin acoperirea lor cu
folii de polietilen sau prin menținerea umidității ridicate după tran sfer.

2. Activitatea antitumorală a speciei Lilium candidum L. prin inducerea apopt ozei mediate
de p53 asupra liniei celulare MCF -7 în cancerul de sân
Figura 21 indică clar că extractele totale de metanol de Lilium candidum L. au efecte
citotoxice asupra proliferării celulare MCF -7.

Fig. 21 – Efectul citotoxic al extractului de Lilium candidum L. asupra liniei celulare MCF -7

40
Testul TUNEL a fost dezvoltat ca o metodă de identificare a celulelor individuale care au
fost supuse apoptozei prin marcarea capetelor ADN -ului degradat cu deoxinucleotidil transferaz a
terminală a polimerazei. Figura 2 2 arată că extractele de Lilium candidu m L. au capacitatea de a
induce apoptoza în liniile celulare MCF -7.

Fig. 22 – Inducerea apoptozei celulelor MCF -7 de extractele de Lilium candidum L.
Gena supresoare a tumorii p53 reglează progresia ciclului celular și supraviețuirea celulelor
ca răspuns la stresul celular. Deteriorarea ADN sau stresul oncogen induce niveluri de proteine
p53, permițând eliminarea celulelor tumorale incipiente prin apo ptoză. Analizele Western Blot au
arătat că nivelurile de proteine p53 supresoare tumorale au crescut semnificativ după incubarea de
24 de ore cu extracte de Lilium candidum L. în celulele MCF -7 (Fig. 21).

Fig. 23 – Inducerea acumulării de p53 de extra ctele de Lilium candidum L.

41
Figura 24 arată faptul că nivelurile de ARNm din cadrul genelor p53, p21 și BAX au crescut
în urma tratamentului cu extract de Lilium candidum L.

Fig. 24 – Expresia ARNm al genelor p53, p21 și BAX sub acțiunea extractelor de
Convovulus galacticus, Crocus antalyensis și Lilium candidum L .

Rezultatele indică faptul că aceste extracte vegetale induc apoptoza prin inducerea
acumulării celulare de p53 în linia celulară MCF -7. Aceste date indică faptul că Lilium candidum
L. poate conține compuși activi ce pot fi îmbunătățiți ca agent terapeutic în tratarea cancerul ui de
sân.

3. Micropropagarea speciei Liulium candidum L
În mediul MS suplimentat cu 0,1 mg/l NAA + 0,01 mg /l BA, s -a observat formarea
bulbililor la toate explantele (părți bazale, medii, distale ale bulbului) (în medie 88,2%), dar cea
mai mare formare de bulbil și înrădăcinare a fost în cazul părților bazale și mijlocii (100%).
Aproape toți bulbilii dezvoltați aveau frunze și înrădăcinarea era normală. Au f ost obținute
maximum 8 bulbili din explanții părților mijlocii de Lilium candidum L. (numărul mediu de
bulbili/explant este 2,9) și 7 bulbili din partea bazală a Lilium longiflorum . Înrădăcinarea și
formarea bulbililor au fost observate la toate explantele (în medie 86,3%) în mediu suplimentat cu
0,1 mg / l NAA + 0,01 mg / l Kn. Numărul bulbilor obținuți/explant a fost de maxim 3 pentru
Lilium candidum .
În general, bulb ilii s-au format pe părțile bazale ale solz ilor de bulb în mediu MS
suplimentat cu 1,0 mg / l 2iP. Rata de înrădăcinare fără bul bili a fost de 20% pentru Lilium

42
longiflorum . Media formării bulb ililor a fost de 82,9% în mediul suplimentată cu 0,1 mg / l NAA
+ 1,0 mg / l 2iP.
Dezvoltarea in vitro a fost mai bună pentru Lilium longiflorum decât la Lilium candidum
în toate mediile MS suplimentate cu regulatori de creștere a plantelor în diferite combinații. În
cazul speciei Lilium candidum , formarea bulb ililor a fost diferită , în funcție de doza și combinațiile
regulatorului de creștere a plantel or, dar în cazul speciei Lilium longiflorum , toate dozele și
combinațiile de regulator de creștere a plantelor nu au fost semnificative statistic (tabelul 1) .

Tabel 1 – Rata de formare a bulbilor în mediul MS suplimentat cu diferiți regulatori de
creștere
În urma cercetării s -a constatat faptul că pentru o mai bună dezvoltare in vitro a solzilor
din bulbul de Lilium candidu m L. este necesară adăugarea în mediul MS a unor regulatori de
creștere. Plantele regenerate au fost transferate în seră pentru adaptare unde au înflorit după doi
ani.

4. Proliferarea în masă a crinului alb (Lilium candidum L.) în condiții in vitro

Fig. 2 5 – Proliferarea în masă a crinului alb (Lilium candidum L ) cu jumătatea inferioară de
la solz ii de bulb în condiții in vitro : (a) dezvoltarea primordiei după 10 zile; (b) dezvoltarea
grupurilor de bulb ili; (c) înrădăcinare a pe mediu care conține 0,5 mg l -1 NAA ; (d) plante
adaptate în condiții de seră ; (e) înflorire după doi ani de cultură

43

În cazul jumătăților inferioare de bulb aportul de IBA a fost unul foarte important.
Frecvența inducerii calusului a fost mai mare cu cât concentrația de IBA a fost mai mare. Cu toate
acestea, subcultivarea pe mediu ulterior nu numai că a încurajat creșterea și de zvoltarea calusului,
dar a produs și 8 -10 bul bili . Fiecare a fost separat pentru o creștere și dezvoltare ulterioară
În cazul jumătăților superioare de bulb nu s -a observat o regenerare a țesutului rănit.
Calusul nu s -a dezvoltat nici după creșterea conc entrației de BAP -IBA.
În cazul explantelor din frunze rezultatele au arătat variații ale capacității de regenerare.
Această variație s -ar putea datora potențialului de regenerare a explantului sau a condițiilor de
cultură .

5. Furnizarea de materii prime căt re industria cosmetică utilizând tehnica micropropag ării
in vitro a speciei Lilium candidum L.
În acest studiu, solzii bulb ilor de Lilium candidu m L. cultiva ți s-au dezvoltat după 14 zile
și de asemenea după 21 de zile s -a observat apariția frunzelor la capătul solzilor . La sfârșitul a 21
de zile, explantele au fost transferate în mediul MS și timp de 28 de zile , explantele care au devenit
mai mari și mai evidente. Acesta a fost subcultivat în mediu MS conținând 50 și 60 g zaharoză
pentru a p ermite creșterea diametrului bulbilor .

Fig. 2 6 – Evoluția explantului după 14 zile Fig. 2 7 – Evoluția explantului după 21 de zile

Fig. 2 8 – Explant menținut în mediu MS Fig. 2 9 – Explant în mediu MS
conținând 50 /60g zaharoză
(Daneshvar și colab., 2014)

44

În urma experimentului s -a concluzionat faptul că prin micropropagarea acestei specii în
mediul MS rata de regenerare, creștere și dezvoltare s -a mărit de 3 ori. Adică in decursul unui
singur an se pot obține 3 serii de crini albi, ce vor fi utilizați fie ornamental, fie în prepararea
diferitelor produse cosmetice sau medicamente

45
CONCLUZII

În urma cercetării efectuate putem observa că această planta Lilium candidum L . nu
prezintă doar importanță ornamentală, ci și o importanță în domeniul farmaceuticii.
Crinul alb se numără printre cele mai îndrăgite flori de grădină, fiind apreciat datorită
frumuseții sale, dar și a parfumul său. De asemenea, extractele obținute din Lilium candidum L .
se pot utiliza la prepararea diverselor produse cosmetice sau chiar î n prepararea unor medicamente.
Principala metodă de obținere a unei cantități mai mari de plantă, implicit de extract vegetal
o reprezintă tehnica micropropagării in vitro.
Cel mai adesea, ca material vegetal s -au folosit bulbii de Lilium candidum L , dar s-au
folosit și florile sau frunzele. Astfel, obsărvam faptul că activitatea meris temelor apical e din vârful
rădăcinilor este mai intensă, față de alte organe ale plantei.
Studiile efectuate pe această specie utilizând metoda micropropagării in vitro au ar ătat că:
se poate obține masă vegetală mai mare cu costuri mai scăzute decât în mod natural (implicit și o
cantitate mai mare de extract), putem obține plante pe tot parcursul anului, chiar și 3 serii pe an ,
de asemenea se pot obține crini hibrizi sau se p ot îmbunătăți caracterele morfologice ale acestora
și se poate induce o manipulare genotipică și fenotipică în celulele plantelor.

46
BIBLIOGRAFIE

1. Bacchetta, L., Remotti P.C., Bernardini C. și Saccardo F., 2003 – ,,Adventitious shoot
regeneration from leaf explants and stem nodes of Lilium” , Plant Cell Tissue, Vol. 74,
Ed.Springer (37-44);
2. Bhatia S., 2015 – ,,Modern Applications of Plant Biotechnology in Pharamceutical
Sciences” , Ed. Elsevier (31-107; 361 -367);
3. Burun B. și Sahin O., 20 13 – ,, Micropropagation of Lilium candidum l.: a rare and native
bulbous flower of Turkey” , Bangladesh Journal of Botany (185-187);
4. Ciocîrlan V., 1990 – ,,Flora ilustrată a României” , Ed. Ceres (400-401);
5. Daneshvar S.R., 2019 – ,,Efficient Approaches to i n vitro Multiplication of Lilium
candidum L. with Consistent and Safe Access throughout Year and Acclimatization of Plant
under Hot -Summer Mediterranean (Csa Type) Climate” , Notulae Botanicae Horti
Agrobotanici Cluj -Napoca , Ed. Academic Pres (734-742);
6. Daneshvar S.R., Pehlivan E.C., Teykin E.E. și Çiftçi H.S., 2014 – ,, Lilium Candidum
L.’da In Vitro Mikroçoğaltım ile Kozmetik Sanayisine Ham Madde Temini” , Turkish
Journal of Agricultural and Natural Sciences (1911 -1915) ;
7. George E.F., Halt M.A. și De Klerk G.J., 2008 – ,,Plant Propagation by Tissue Culture” ,
Vol. 3, Ed. Springer (29-60);
8. Hussain A., Qarshi I.A., Nazir H. și Ullah I., 2012 – ,,Plant Tissue Culture: Current
Status and Opportunities” , Recent Advances in Plant in vitro Culture, Ed. Intechopen (1-
28);
9. Iliev I., Gajdo šova A., Labiakov á G. și Jain S.M., 2010 – ,,Plant Micropropagation” ,
Plant Cell Culture, Ed. John Wiley&Sons (1-43);
10. Khawar K.M., Cocu S., Parmaksiz I., Sarihan E.O. și Özcan S., 2005 – ,,Mass
prolif eration of Madonna lily (Lilium candidum L.) under in vitro conditions” , Pakistan
Journal of Botany (243-248);
11. Kopaskova M., Hadjo L., Yankulova B., Jovtchev G., Galova E., Sevcovicova A.,
Mucaji P., Miadokova E., Bryant P. și Chankova S., 2012 – ,,Extra ct of Lillium
candidum L. can modulate the genotoxicity of the antibiotic zeocin” , Molecules, Vol. 17
(80-97);
12. Krikirian A.D. și Berquan D.L., 2003 – ,,Plant cell and tissue culture: the role of
Haberlandt” , Plant Tissue Culture – 100 years since Gottlieb Haberlandt, Ed. Springer
(25-53; 115 -127);

47
13. Kumar P.P. și Loh C.S., 2012 – ,,Plant tissue culture for biotechnology” , Plant
Biotechnology and Agriculture, Ed. Academic Press (131-138);
14. Papp N., Sali N., Csepregi R., Toth M., Gyergyák K., Denes T., Bartha S .G., Varga
E., Kaszas A. și Koszegi T., 2019 – ,,Antioxidant Potential Of Some Plants Used In Folk
Medicine In Romania” , Farmacia, Vol.67 (323-328);
15. Pârvu C., 2002 – ,,Enciclopedia plantelor. Plante din flora României” , Vol.1, Ed. Tehnică
București (869-871);
16. Pollard J.W. și Walker J.M., 1990 – ,,Methods in Molecular Biology” , Vol. 6, Ed.
Humana Press (1-12; 65 -92);
17. Saadon S. și Zaccai M., 2013 – ,, Lilium candidum bulblet and meristem development” ,
In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant , Vol. 49, Ed. Springer (313-319);
18. Sahijram L. și Bahadur B., 2015 – ,,Somatic Embriogenesis” , Plant Biology and
Biotechnology, Vol. 2, Ed. Springer (315-327);
19. Săvulescu T., 1966 – ,,Flora Republicii Socialiste România” , Vol. 1 1, Ed. Academiei
Republicii Socialiste România (269-276);
20. Singh A., 2015 – ,, Micropropagation of Plants” , Plant Biology and Biotechnology, Ed.
Springer (329-346);
21. Stănică F., 2004 – ,,Microînmulțirea plantelor horticole”, Ed. INVEL Multimedia (95-
180);
22. Strid A., 2016 – ,,Atlas of the Aegean Flora”, Vol.1, Ed. Botanic Garden and Botanical
Museum Berlin” (388-389);
23. Șelaru E., 2007 – ,,Cultura florilor de grădină” , Ed. Ceres (529-535);
24. Tokgun O., Akca H., Mammadov R., Aykurt C. și Deniz G., 2012 – ,, Convolvu lus
galaticus, Crocus antalyensis, and Lilium candidum Extracts Show Their Antitumor
Activity Through Induction of p53 -Mediated Apoptosis on Human Breast Cancer Cell Line
MCF -7 Cells” , Journal of Medicinal Food, Ed. Mary Ann Liebert (1-8);
25. Torres K.C., 1989 – ,,Stages of Micropropagation” , Tissue Culture and Techniques for
Horticultural Crops, Ed. Springer (52-65);
26. Vachalkova A., Eisenreichova E., Haladova M., Mucaji P., Jozova B. și Novotny L.,
2000 – ,,Potential carcinogenic and inhibitory activi ty of compounds isolated from Lilium
candidum L.” , Neoplasma (313-317);
27. https://www.onlinebiologynotes.com/meristematic -tissue -characteristics -types -function/;
28. https://www.cartiagricole.ro/inmultirea -plantelor -cum-trebuie -sa-procedezi -corect/;
29. https://irre cenvhort.ifas.ufl.edu/plant -prop-glossary/09 -tissue -culture/01 -types/01 –
tctypes -anther.html;

48
30. https://microbenotes.com/micropropagation -stages -types -applications -advantages –
limitations/;
31. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960982217305626;
32. http://www.brainkart.com/article/Plant -Regeneration -Pathway_38253/;
33. https://www.gardenexpert.ro/flori/plante -perene/crin -alb.html ;
34. https://www.bigstockphoto.com/image -80875031/sto ck-photo -lilium -candidum ;
35. https://www.easytogrowbulbs.com/products/lilium -candidum -madonna –
lilly?variant=42686306124 ;
36. https://smartyplants.com.au/2012/09/whats -a-node/ .

49
DECLARAȚIE
privind originalitatea conținutului lucrării de disertație

Subsemnatul (a) (numele, inițiala tatălui, prenumele) RESPINCIUC L.A. ANDREEA –
OTILIA cu domiciliul stabil în (adresa din actul de identitate) Strada Manejului, Nr.1, Bl. B2, Et.3,
Ap. 34, Rădăuți, Jud. Suceava , absolvent(ă) al (a) Universității „Alexandru Ioan Cuza” din Iași,
Facultatea de Biologie , ciclul II (master), specializarea GENETICĂ MOLECULARĂ , promoția
2018 -2020 , declar pe propria răspundere, cunoscând consecințele falsului în declarații în sensul
art. 326 din Noul Cod P enal și dispozițiile Legii Educației Naționale nr. 1/2011 art. 143 al. 4 și 5
referitoare la plagiat, că lucrarea de disertatie cu titlul (majuscule):
,, MICROPROPAGAREA PRIN CULTURI DE MERISTEME LA LILIUM CANDIDUM L”.
Elaborată sub îndrumarea d -nei / d -nului (funcția, numele și prenumele cadrului didactic)
Conf. dr. VÂNTU SMARANDA pe care urmează să o susțin în fa ța comisiei este originală, îmi
aparține și îmi asum conținutul său în întregime.
De asemenea, declar că sunt de acord ca lucrarea mea de dis ertație să fie verificată prin
orice modalitate legală pentru confirmarea originalității consimțind inclusiv la introducerea
conținutului său într -o bază de date în acest scop.
Am luat la cuno ștință despre faptul că este interzisă comercializarea de lucrăr i științifice în
vederea facilitării falsificării de către cumpărător a calității de autor al unei lucrări de disertație și
în acest sens, de clar pe proprie răspundere că lucrarea de față nu a fost copiată ci reprezintă rodul
cercetării pe care am întrepri ns-o.

Data: 23.06.2020 Semnătură absolven t: