Licenta20188888 [611938]
UNIVERSITATEA “ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI
Facultatea de Biologie
Specializarea Biologie
LUCRARE DE LICENȚĂ
Coordonator științific
Conf. dr. habil. Lucian GORGAN
Candidat: [anonimizat]
2018
UNIVERSITATEA ”ALEXANDRU IOAN CUZA” DIN IAȘI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA: BIOLOGIE
EVALUAREA VIALIBILĂȚII ȘI INTEGRITĂȚII
ADN ÎN CULTURI DE CELULE EXPUSE LA PLASMĂ
RECE
Coordonator științific:
Conf. dr. habil. Lucian GORGAN
Candidat: [anonimizat]
2018
CUPRINS
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….1
Capitolul I ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 4
CICLUL CELULAR ȘI APOPTOZA ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 4
1.1.Ciclul celular ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ..4
1.1.1.Etap ele ciclului celular ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 7
1.2. Reglarea ciclului celular ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 16
1.2.1. Ciclinele ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 18
1.2.2.Cicline dependente de kinaze ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 19
1.2.3.Reglarea ciclului celular la nivel genetic ………………………….. ………………………….. ……………….. 21
1.2.4.TGF beta 1 – oprirea ciclului celular și apoptoza ………………………….. ………………………….. ……. 23
1.2.5. Puncte de control ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 23
1.2.6.Controlul mărimii celulelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 24
1.3. Apoptoza ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 25
1.3.1. Apoptoz a- definiție, istoric ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 25
1.3.2. De ce a fost „ inventată” apoptoza? ………………………….. ………………………….. …………………… 28
1.3.3. Modificări biochimice prezente în apoptoză ………………………….. ………………………….. ………… 29
1.3.4.Factori inductor și inhibatori si apoptozei ………………………….. ………………………….. …………….. 30
1.3.4.1. Factori care induc apoptoza ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 30
1.3.4.2. Factorii care inhibă apoptoza ………………………….. ………………………….. ………………………….. 33
1.3.5. Fazele apoptozei ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 34
1.3.6. Căile de realizare a apoptozei ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 37
1.3.7.Apoptoza fiziologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 41
1.3.8. Apoptoza patologică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 42
1.3.9. Alte forme de moarte programată a celulelor ………………………….. ………………………….. ………. 44
Capitolul II ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 46
MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 46
2.1. Culturile celulare ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 46
2.2. Expunerea la plasma rece ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 46
2.3. Extracția ADN ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 47
2.4. Cuantificarea ADN ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 50
2.5. Real -Time PCR ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 51
2.6. Testarea produșilor PCR prin electroforeză în gel de agaroză ………………………….. …………………. 57
2.7. Calculul statistic al datelor experimentale ………………………….. ………………………….. ……………… 58
Capitolul III ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 60
REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 60
3.1. Viabilitate cu iodură de propidiu ………………………….. ………………………….. ………………………….. 60
3.2 . Ciclul celular cu iodură de propidiu ………………………….. ………………………….. ……………………….. 63
3.3. Apoptoza cu annexină ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 66
3.4. Cuantificarea ADN to tal și testarea produșilor PCR ………………………….. ………………………….. …. 72
3.5. Valorile medii ale concentrațiilor medii ale martorilor ………………………….. ………………………….. 77
3.6. Variantele experimentului de expunere la plasmă rece ………………………….. ………………………… 79
3.7. Evaluarea integrității AND prin RT -PCR ………………………….. ………………………….. ………………….. 85
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 86
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 87
1
INTRODUCER E
ADN -ul cuprinde întreaga informație genetică, care ne face să fim diferiți și unici. Un
proces important îl reprezintă menținerea integrității ADN -ului pe toată durata vieții,
deoarece acesta acționează asupra întârzierii procesului de îmbătrânire.
Deoarece ADN -ul este depozitul informațiilor genetice din fiecare celulă vie,
integritatea și stabilitatea ei sunt esențiale pentru viață. ADN -ul, totuși nu este inert, mai
degrabă, este o entitate chimică supusă atacurilor din mediul înconjurător, iar eventualele
daune rezultate, dacă nu sunt reparate, vor conduce la mutații și eventual, la boli. Probabil
cel mai cunoscut exemplu al deteriorării ADN -ului indusă de mediu este cel al cancerului de
piele, care poate fi cauzat de expunerea excesivă la radiațiile UV sub formă de lumină solară.
Un alt exemplu îl reprezintă fumul de tutun, care poate duce la mutații în celulele
pulmonare, provocând ulterior cancer pulmonar. Dincolo de agenții de mediu, ADN -ul este,
de asemenea, supus la leziuni oxidative de la produsele se cundare ale metabolismului, cum
ar fi, radicalii liberi. De fapt, Lodish a estimat că o celulă individuală poate suferi până la un
milion de modificări ale ADN -ului pe zi (Lodish et al, 2005). În plus față de daunele genetice
cauzate de mediul înconjurător , chiar procesul de replicare a ADN -ului este expus la erori în
timpul diviziunii celulare. Rata la care ADN -ul polimeraza adaugă nucleotide incorecte în
timpul replicării ADN -ului este un factor major în determinarea ratei de mutație spontană
într-un orga nism. În timp ce o enzimă recunoaște în mod natural și „corectează”multe dintre
aceste erori, unele mutații supraviețuiesc acestui proces.
Procesele de reparare a ADN -ului există atât în organismele procariote, cât și în cele
eucariote, și multe dintre pr oteinele implicate au fost conservate pe tot parcursul evoluției.
De fapt, celulele au dezvoltat o serie de mecanisme pentru detectarea și repararea
diferitelor tipuri de leziuni care pot apărea la nivelul ADN -ului, indiferent dacă această
deteriorare este cauzată de mediul înconjur ător sau de erori în replicare ( Clancy ,2008).
Analiza integrității ADN -ului a fost caracterizată inițial prin izolarea ADN -ului din
probele de scaun și s -a observat o prezență a tumorii colorectale. Experiențele ulterioare au
arătat ca fragmente mari de ADN au fost eliberate din celulele tumorale prin necroz ă
2
tumorală, facilitând menținerea integrității ADN -ului. Dimpotrivă, moartea celulală în
țesuturile normale este strict reglementată de apoptoză, în care procesarea ADN -ului ar e ca
rezultat fragment e cuprinse între 180 și 210 bp (Hassan , 2011).
O retea care reglementează integritatea ADN -ului a fost identificată în drojdie printr -o
analiză genetică globală a interacțiunilor sintetice de fitness sau a interacțiunii letalității. Î n
cadrul acestei rețele, au fost definite 16 module funcționale pe baza modelelor de
interacțiuni globulare SFL. Modulele sau genele implicate în replicarea ADN -ului, semnalarea
punctului de control al replicării ADN -ului (DRC) și răspunsul stresului oxida tiv au fost
identificați ca protector i majori împotriva daunelor spontane și letale ale ADN -ului, a căror
reparare eficientă necesită funcțiile semnalizării punctului de control al lezării ADN -ului și a
căilor multiple de reparare a ADN -ului. Această rețea de interacțiune genetică la nivelul
genomului a identificat, de asemenea, componente noi (DIA2, NPT1, HST3, HST4 și modulul
CSM1) care contribuie la replicarea ADN -ului mitotic, la stabilitatea genomică și a dezvăluirii
funcțiilo r noi ale genelor bine stu diate (modulul CTF18) în semnalizarea DRC. Această rețea
va ghida o caracterizare mai detaliată a mecanismelor care reglementează integritatea ADN –
ului în drojdii și în alte organisme (Panet al., 2006).
Descompunerile cromozomiale duble (DSB) pot să apară s pontan și pot fi induse de
deteriorarea ADN -ului. În celulele eucariote au fost identificate două căi de reparare DSB a
căror cerințe diferă pentru omologia ADN -ului. Repararea DSB prin recombinarea
corespondentului(HR) are ca rezultat repararea precisă a lezării ADN -ului, dar necesit ă
prezența secvențelor omoloage în altă parte a genomului. Acesta este mecanismul principal
al repară rii DSB în speciile de drojdie.
Organismele au evoluat pentru a răspunde amenințărilor ADN -ului care rezultă fie din
surse end ogene, fie din surse exogene. Sursele endogene de lezare ale ADN -ului includ
hidroliza, oxidarea, alchilarea și nepotrivirea bazelor ADN, pe când sursele de deteriorare
exogene ale ADN -ului includ radiațiile ionizate(IR), radiiațiile ultraviolete(UV) și di feriți agenți
chimici. La nivel celular, ADN -ul deteriorat care nu este corect reparat poate duce la
instabilitate genomică, apoptoză sau senescență, care poate afecta în mod semnificativ
procesul de dezvoltare și de îmbătrânire a organismului. Mai importa nt, pierderea
integrității genomice predispune organismul la imunodeficiență, tulburări neurologice și
cancer (O Driscoll si Jeggo, 2006, subba rao, 2007, Thom et al ., 2007). Prin urmare, este
esențial ca celulele să răspundă în mod eficient la deteriorarea ADN -ului prin coordonare și
puncte de control integrate ale ADN -ului și căi de reparare (Hakem , 2008).
3
Mai mult, la începutul anilor 70 au fost descoperite un grup de enzime responsabile să
mențină integritatea informațională de la nivelul ADN -ului. Ele au rolul de a păstra strâns
informația genetică pe parcursul replicării, trascripției sau recombinării ADN -ului, prin
potențialul lor de a rupe sau de a uni la loc una sau amb ele lanțuri de ADN. Verificarea
accesului la informa ție și păstrarea integrit ății ADN -ului sunt esenț iale pentru menținerea
viabilității celulare .
Descoperirea în care atâtea proteine sunt implicate în repararea ADN -ului denaturat,
deschide o frontieră mol eculară care promite o perspectivă asupra unui spectru de boli. Spre
exemplu, într -o lucrare publicată în Science, grupul lui Elledge, a folosit noua bază de date
pentru repararea ADN -ului pentru a identifica dou ă proteine critice pentru recrutarea genei
BRCA1 la locul de deteriorare a ADN -ului. Gena BRCA1 este cunoscută pentru protecția
împotriva cancerului mamar și ovarian prin suprimarea tumorilor .
Proteinele cunoscute sub numele de ABraxas și RAP80, se leagă de proteina BRCA1 și
formează un complex care reglementează trei moduri esențiale de control al daunelor ADN –
ului: rezistența la distrugeri, punctele gentice care limitează proliferarea celulelor și
repararea ADN -ului. Mai mult, Ellegde afirmă că „trebuie să nu mai gândim că BRCA1 este o
singură enti tate. Există trei complexe care fac asta. A sta trebuie sa se înțeleagă” (Elledge,
2007) .
Mutațiile din ADN -ul unui organism fac parte din viaț ă. Codul nostru genetic este expus
unei varietăți de insule care amenință integritatea. Dar, un mecanism riguros d e verificare
este instalat prin intermediul structurilor de reparare a ADN -ului. Erorile care alunecă prin
fisuri pot fi uneori asociate cu boala, dar ele sunt, de asemenea, o sursă de variație asupra
căreia acționează procese pe termen lung, cum ar fi evo luția (Clancy,2008).
Scopul lucrării este analiza rea viabilității și integrității ADN în culturi de celule tratate la
plasmă rece.
4
Capitolul I
CICLUL CELULAR ȘI APOPTOZA
1.1.Ciclul celular
Ciclul de diviziune celulară este o caracteristică fundamentală a organismelor vii și este
responsabilă pentru menținerea și/sau creșterea atât a dimensiun ii, cât și a numărului
celular . Ciclul celular, cunoscut și sub denumirea de ciclu de diviziune cel ulară, este o serie
bine definită și coordonată de et ape care progresează activ prin împărțirea celulelor
eucariote. În cele din urmă acest proces conduce la o celulă care produce două celule fiice
identice genetic cu celul a-mamă (Figura 1), (Fields, 2016 ).
Figura 1: Procesul divizării ce lulare – ilustrare științifică ( Image Copyright: Mopic / Shutterstock )
5
Studiul ciclului celular se concentrează asupra mecanismelor care reglează timpul și
frecvența dublării ADN -ului și a diviziunii celulare. Ca și concept biologic, ciclul celular este
definit ca perioada dintre diviziunile succesive ale unei celule. În această perioadă, conținutul
celulei trebuie reprodus cu exactitate. Cercet ătorii știau despre diviziunea celulară de mai
bine de o sută de ani, dar în anul 1950, prin efortul depus de Alma Howar d și Stephen Pelc,
au constatat că replicarea ADN -ului a avut loc numai într -o fază specifică a ciclului celular și
că această fază a fost clar separată de mitoză (Tang, Hickey , 2014).
Înainte de epoca genomică timpurie a anilor 1990, reglarea ciclului ce lular a fost
studiată folosind două sisteme principale ca model: manipulări genetice în drojdii și analize
biochimice ale diviziunii celulare embrionare timpurii în ouă de broască. Aceste abordări
tehnice diferite au condus la două modele aparent distincte : modelul de domino în drojdii și
modelul ceasului în ouă de broască. Proteinele identificate recent, care au funcții cruciale
comune celor două modele, ne permit să reconciliem cele două. Această comunitate
evidențiază, de asemenea, principiile fundamenta le ale reglării ciclului celular care au fost
conservate pe tot parcursul evoluției în toate organismele eucariote. Ciclul celular, este o
serie bine definită și coordonată de etape care progresează activ prin împărțirea celulelor
eucariote. În cele din ur mă acest proces conduce la o celulă care produce două celule fiice
identice genetic cu celul a mamă. Este important faptul că există puncte de control distincte
pe tot parcursul ciclului, care au rolul de a asigura faptul că o celulă trece prin etape într -un
mod adecvat. De exemplu, dacă a fost detectată o deteriorare a ADN -ului într -o celulă,
atunci nu se va trece în mod normal la următoarea fază până când aceasta nu a fost
abordată (Fields, 2016 ).
Ciclul celular este un proces extrem de integra t, astfel au apărut domenii distincte de
interes în acest domeniu de studiu. De exemplu, multe gene și proteine care influențează
trecerea de la o fază a ciclului celular la altul au fost identificate. Când expresia lor este
modificată prin mutație sau sunt greșit reglate, acestea sunt de obicei clasificate ca
oncogene. Alte proteine acționează pentru a menține celulele la anumite puncte din ciclu
(puncte de control) și sunt cunoscute sub numele de gene supresoare tumorale. În afară de
cei cu un rol clar de reglemen tare, multe proteine au funcții importante în alte aspecte ale
ciclului celular; unul este replicarea ADN -ului și a organitelor, care este un proces fascinant
ce include propriile sale mecanisme de reparare și auto -editare. Alte domenii se
concentrează în primul rând asupra proceselor mecanice de scindare celulară în două celule
fiice la sfârșitul mitozei și asupra condensării și decondensării cromatinei.
6
Deasemenea, ciclul celular ne afecteaz ă viața de zi cu zi. Într -adevăr, majoritatea
cancerelor sunt re zultatul unei divizări celulare necorespunzătoare, adesea provocat e de
erorile în reglarea ciclului celular normal. Cercetări considerabile sunt direcționate spre
identificarea modificărilor în proteinele de reglare a ciclului celular, ambele ca ținte pent ru
intervenția terapeutică și ca biomarkeri care pot indica prognoza pentru tumori. În plus,
domeniul biologiei celulelor stem este strâns legat de reglarea ciclului celular, deoarece
aceste celule pluripotente se pot diviza lent pe perioade lungi și totuș i, inițiază creșterea și
diferențierea atunci când este necesar. Alte domenii ale cercetării actuale includ investigarea
reglării ciclului celular în creșterea organelor și în regenerare, unde celulele latente pot fi
readuse într -o stare replicativă.
Cum au studiat oamenii de stiin ță ciclul celular? Inițial, studiile asupra ciclului celular
au conservat microscopia, dar astăzi sunt aplicate multe tehnici specifice în plus față de cele
utilizate pe scară largă în biologia celulară și moleculară. Sortarea ce lulelor prin fluorescen ța
activ ă a permis biologilor s ă identifice celulele în anumite puncte ale ciclului celular și să le
izoleze. Este posibil să se monitorizeze modul în care celulele care au fost expuse la diferiți
agenți pot progresa în timpul ciclul ui. Centrul pentru identificarea și izolarea genelor -cheie
are capacitatea de a izola celulele mutante de drojdie, sensibile la temperatură care pot fi
blocate în anumite etape ale ciclului pentru studierea mai aprofundată. Abilitatea de a
sincroniza cult urile astfel încât toate celulele să se afle în același punct al ciclului celular a
fost, de asemenea, un avantaj pentru captarea unei imagini de mecanisme comune și
izolarea proteinelor cheie. Deși acum știm multe despre reglarea ciclului celular, este cl ar că
avem un drum lung de parcurs, în special în înțelegerea complexității interacțiunilor dintre
multitudinea de proteine deja identificate. Cercetările actuale au identificat un număr mare
de căi de semnalizare, multe dintre ele conținând mai multe gene , implicate în reglarea
progresiei prin ciclu. Mai multe dintre aceste căi pot interacționa, iar cunoașterea acestor
interacțiuni va fi vitală pentru dezvoltarea unor strategii eficiente de intervenție în cancer și
alte anomalii de creștere, cum ar fi defo rmările de dezvoltare. În plus, modul în care ciclul
celular răspunde la deteriorarea ADN -ului este o zonă de cercetare activă deoarece erorile
aleatorii în replicare și chiar toxinele de mediu pot afecta componentele ADN vulnerabile. În
cele din urmă, suc cesul terapiilor bazate pe celule stem va depinde de o cunoaștere detaliată
a modului în care celulele pot fi menținute prin mai multe diviziuni fără a -și pierde
potențialul de a se diferenția sau transforma în precursorii tumorilor. Studiul ciclului celul ar
are o relevanță vastă pentru sănătatea, bunăstarea și biologia tuturor organismelor, de la
7
creșterea și dezvoltarea acestor organisme, până la cancer și îmbătrânirea oamenilor, la
potențialul de a trata bolile și rănile prin intermediul terapiilor cu ce lule stem (Tang, Hickey,
2014) .
1.1.1. Etapele ciclului celular
Toate celulele vii de la cele unicelulare la mamiferele superioare sunt produși ai unor
cicluri repetate de creșteri și diviziuni celulare, într -o secvență de evenimente cunoscută sub
denumirea de ciclu celular.
La organismele cele mai simple cum ar fi procariotele, materialul genetic ce constituie
cromozomul este alcătuit dintr -o moleculă de ADN atașată membranei care se duplică
rezultând 2 cromozomi, creșterea celulară sfârșind printr -o sciziune binară.
La organismele pluricelulare sunt necesare multe diviziuni pentru a realiza un nou
individ, iar la adult diviziunea este necesară pentru a înlocui celulele pierdute, constituindu –
se milioane de celule noi în fiecare secundă pentru menținer ea status quo -ului.
Durata ciclului celular variază mult în funcție de tipul de celulă, de la minute la
intervale de ani (ex. celula hepatică se divide într -un an).
Întreruperea diviziunii celulare duce la moartea organismului în câteva zile, așa cum
diviziunea celulară necontrolată poate avea rezultate asemănătoare în timp. O diviziune
corectă, în general, presupune replicarea corectă a materialului genetic (ADN), cromozomii
replicați fiind segregați în cele două celule fiice. Celula își dublează masa și toate organitele
celulare în cursul unui ciclu celular(Dănilă et al., 2002) .
Pentru realizarea diviziunii, o celulă trebuie sa îndeplinească mai multe sarcini
importante: trebuie să crească, să copieze materialul genetic (ADN) și să se împartă fizic în
două celule fiice. Celulele îndeplinesc aceste sarcini într -o serie organizată și previzibilă de
pași care alcătuiesc ciclul celular (Raven et al., 2011) .
Ciclul celular la eucariote este schematizat în imaginea de mai jos (Figura 2). La
microscop cele m ai vizibile evenimente sunt diviziunea nucleului (mitoza) și împărțirea
celulei în două celule fiice (citokineza). Acestea acoperă o mică parte a ciclului celular.
Perioada dintre o fază M și următoarea, perioada cea mai extinsă, o constituie interfaza,
perioada de acumulare de material, de creștere care conține și faza S de sinteză de ADN, în
care celula își dublează cantitatea de material genetic (replicarea ADN). Aceasta este
precedată și urmată de două perioade de gol sintetic gap G, 1 și 2. În mitoză sunt clivate cele
două cromatide surori devenind cromo somii fii, împinși la polii celulei de către fusul de
8
diviziune. Mitoza se desfășoară ca o secvență de evenimente, etapizată astfel: în profază –
cromozomii replicați condensează, se asamblează fusul de diviziune în afara nucleului; în
prometafază: se rupe anvelopa nucleară permițând microtubulilor fusului de diviziune să
contacteze cromozomii, să se lege de ei; în metafază : fusul de diviziune adună toți
cromozomii în zona ecuatorială a fusului; în anafa ză: cele două cromatide surori se despart,
fusul de diviziune orientându -le spre cei doi poli ai celulei; în telofază : membrana nucleară
se reasamblează în jurul fiecărui set de cromozomi sepa rați pentru a forma două nuclee
(Dănilă et al., 2002) .
Figura 2 : Fazele mitozei
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
Faza M presupune în afara segregării cromozomilor, distribuția organitelor,
membranelor interne, citoscheletului și proteinelor solubile între celulele fiice prin
procesului numit citokineză. Aceasta începe în anafază și se termină înainte ca cei doi nuclei
să se formeze.
Între mitoza (M) și sinteză (S) există o perioadă de gol sintetic numită gap – G1, iar între
faza S și M există o altă perioadă de gol sintetic gap -G2. Pauzele sunt foarte importante
deoarece permit sistemului de control al ciclului celular să primească semna le din mediu și
să decidă asupra trecerii la faza următoare, în măsura în care faza anterioară este corect ș i
complet realizată (Dănilă et al., 2002) .
Interfaza : Aceasta este etapa în care o celulă crește și, în cele din urmă, apare
replicarea ADN -ului. E ste alcătuită din trei etape (Figura 3) :
1. Perioada presintetică (G1)
Aceasta este etapa în care celula se pregătește să sprijine replicarea ADN -ului, numită
și prima fază de decalaj. Aceasta implică creșterea celulară a proceselor sale metabolice. De
asemenea, se acumulează proteine și cantități de organite. Această etapă conține un punct
de control G1, pe care o celulă o va trece numai dacă este suficient de pregătit pentru
9
replicare a ADN -ului. Aceasta verific ă dacă celulele au rezerve de energie corespunzăt oare
printre alți factori(Fields, 2016).
Figura 3: Cele trei etape ale interfazei (Imagine by OpenStax College)
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/cell -cycle -phases )
2. Perioada sintetică (S)
Creșterea celulelor și sinteza unor proteine continuă încă în această etapă. Schimbarea
majoră care apare cu toate acestea este repl icarea ADN -ului cromozomial din celulă. Astfel,
această etapă se termină cu o celulă care conține de două ori numărul de cromozomi cu care
a început(Fields, 2016).
3. Perioada postsintetică (G2)
În această etapă, celula continuă să crească și să se pregătească pentru mitoză. Ca și în
cazul fazei G1, și aici există un punct de control G2 pentru a evalua starea celulară, cel mai
important, acest punct de control asigură repetarea exactă a cromozomilor. Faza G 2 se
termină când începe meioza (Fields, 201 6).
Mitoza – este o formă de diviziune celulară care produce două celule fiice cu aceeași
componență genetică ca celula mamă. Cromosomii replicați în timpul fazei S sunt împărțiți
astfel încât să se asigure că fiecare celulă fiică primește o copie a fiecăr ui cromosom. În
divizarea activă a celulelor animale, întregul proces dureaza aproximativ o oră.
Cromosomii replicați sunt atașați la un "aparat mitotic" care le aliniază și apoi separă
cromatidele surori pentru a produce o partajare uniformă a materialului genetic. Această
10
separare a materialului genetic într -o diviziune nucleară mitotică este urmată de o separare
a citoplasmei celulare în tr-o diviziune celulară (citokineză) pentru a produce două celule
fiice.
Mitoza, deși este un proces continuu, este în mod obișnuit împărțită în cinci etape:
profaza, premetafaza, metafaza, anafaza și teofaza (Fields, 2016), ( Figura 4).
Figura 4: Fazele mitozei
(https://www2.le.ac.uk/projects/vgec/highereducation/topics/cellcycle -mitosis -meiosis )
Profaza ocupă peste jumătate din mitoză. Membrana nucleară se descompune pentru
a forma un nu măr de vizicule mici, iar nucleul se dezintegrează. O structură cunoscută sub
numele de cromosom se duplică pentru a forma doi centrosomi. Centrosomii organizează
producț ia de microtubuli care formează fibrele axului care constituie acul mitotic.
Cromosomii se condensează în structuri compacte. Fiecare cromosom replicat poate fi
11
considerat acum compus din două cromatide identice, care sunt ținute împreună de o
structură cunoscuta sub numele de centromere( Figura 4 .1)
Figura 4 .1: Profaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
În p rometafaza , fusul mitotic începe să surprindă și să organizeze cromozomii.
Cromozomii termină condens area, deci sunt foarte compacți. Plicul nuclear se descompune,
eliberând cromozomii. Fusul mitotic crește mai mult și unele dintre microtubuli încep să
"capteze" cromo somi(Raven, et.al.2014), (Figura 4.2) .
Figura 4.2: Prometafaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
12
Microtubulii care leagă un cromozom sunt numiți microtubuli kinetochori. Microtubulii
care nu se leagă de kinetochori se pot apuca de microtubuli din polul opus, stabilizând axul.
Mai multe microtubuli se extind de la fiecare centrosom spre marginea celulei, formând o
structură numită aster (Raven , et.al.2014) (Figura 4.3) .
Figura 4.3: Prometafaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology /mitosis/a/phases -of-
mitosis )
Metafaza este etapa în care structurile din nucleu încep să se separe. În această etapă,
cromosomii se află la starea lor cea mai condensată, fibrele axului se aliniază pe un plan
central echidistant de nucleu numit placa met afazică . La sfârșitul acestei etape este punctul
de control M, care este necesar pentru a asigura alinierea corectă a cromosomilor pe ax.
Cromosomii perechi s -au împărțit la centromere și au migrat spre polii opuși ai celulei
(Fields, 2016) , (Figura 4.4).
13
Figura 4.4: Metafaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
Anafaza este c ea mai scurtă etapă a mitozei . Cromatidele s urori se separă una de alta
și sunt trase către capetele opuse ale celulei. Adezivul proteic care ține împreună
cromatidele s urori este descompus, permițându -le să se despartă. Fiecare este acum
propriul cromozom. Cromozomii fiecărei perechi sunt trase către capetele opuse ale celulei.
Microtubulii care nu sunt atașați la cromozomi se alungă și se îm ping în afară,
separând p olii și făcân d celula mai lungă ( Figura 4.5), (Raven, 2014).
Figuri 4.5: Anafaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
14
Întelofază , celula se prelungește cu ajutorul extinderii microtubulilor polari. O nouă
membrană nucleară acoperă cromosomii noi separați pentru a crea un nou nucleu. Există
acum două nuclee cu proprii lor c romosomi(Fields, 2016), ( Figura 4.6).
Figura 4.6: Telofaza ciclului celular
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
Citokineza sau "mișca rea celulară" este a doua etapă principală a fazei mitotice în
timpul căreia diviziunea celulară este finalizată prin separarea fizică a componentelor
citoplasmatice în două celule fiice. Diviziunea nu este completă până când componentele
celulare nu au fo st repartizate și complet separate în cele două celule fiice. Deși etapele
mitozei sunt similare pentru majoritatea eucariotelor, procesul de citokineză este destul de
diferit pentru eucariotele care au pereți celulari, cum ar fi celulele plante i (Figura 4.7)
15
Figura 4.7 :Citokineza în celula vegetală și în cea animală
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/mitosis/a/phases -of-
mitosis )
La animale, diviziunea celulară apare când o bandă de fibre citoscheletice , numită inel
contractil , se contractă în interior și împarte ce lula în două, proces numit citoch ineză
contractilă. Un inel contractil compus din filamente de actină se formează doar în interiorul
membranei plasmatice de pe placa metafazică formată anterior. Filamentel e de actină trag
ecuatorul celulei spre interior formând o fisură. Această fisură se numește brazda de clivaj .
Grosimea brazdei se adâncește pe măsură ce se contractă inelul de actină, și, eventual,
membrană este scindată în două.
Celulele plantelor sunt m ult mai rigide decât celulele animalelor. E le sunt înconjurate
de un pere te celular rigid și au o presiune internă ridicată. În timpul interfazei, aparatul
Golgi acumulează enzime, proteine structurale și molecule de glucoză înainte de a se rupe în
vezicule și de a se dispersa în întreaga celulă divizată. În timpul telofazei, aceste vezicule
Golgi sunt transportate pe microtubuli pentru a forma un fragmoplast pe placa metafazică.
Acolo, veziculele fuzionează și se coagulează de la centru spre pereții celulari, această
structură se numește placă celulară. Pe măsură ce mai multe vezicule fuzionează, placa
celulară se mărește până când se îmbină cu pereții celulari de la periferia celulei. Enzimele
utilizează glucoza care s -a acumulat între straturile de membrană pentru a construi un nou
perete celular. Membranele Golgi devin părți ale membranei plasmatice de pe ambele părți
ale noului perete celular (Reven et.al ., 2011) .
16
1.2. Reglarea ciclului celular
Cercetările ultimelor decenii au urmărit în special mecanismele de supraveghere care
monitorizează îndeplinirea evenimentelor critice din cursul ciclului celular (intrinseci sau
extrinseci), în lipsa cărora se poate produce proliferarea necontrolată sau moartea celulară.
Sistemul de control al ciclului celu lar este o diviziune biochimică ce operează ciclic,
constituită dintr -un set de proteine ce interacționează, induc și coordonează procesul
secvențial (în cascadă) rezultând duplicarea și diviziunea conținutului celular.
Evenimentele din ciclul celular se d esfăsoară secvențial păstrându -se succesiunea lor,
chiar dacă se întârzie una dintre secvențe (de exemplu tot ADN -ul trebuie replicat înainte ca
nucleul să înceapă să se dividă), rezultă că o fază completă S trebuie să preceadă fazei M.
Există mecanisme de supraveghere a progresiei ciclului celular ce vizează posibilitatea
apariției unor distrugeri la nivelul materialului genetic, ale unor dereglări în apariția fusului
de diviziune, sau etapizarea desfășurării ciclului celular. Aceste mecanisme au primit
denumirea de puncte de control (check points), ceea ce desemnează deopotrivă o barieră
(opri re) și un fenomen (examinarea). Practic, mecanismele intrinseci de control vizează
ordonarea evenimentelor din ciclul celular. Dintre punctele de control , cel mai bi ne înțeles
(la mamifere) este punctul de control al distrucției ADN -ului (din G 1 numit și G 1 check point).
Alături de acesta sunt de amintit punctul de control de la nivelul reglatorilor de kinaze
dependente de cicline (Cdk), punctul de control de la asam blarea fusului de diviziune,
punctul de control de la nivelul fazei G 2.
Pierderea punctelor de control ale ciclului celular poate iniția programul apoptotic, de
moarte celulară programată.
Elucidarea mecanismelor prin care semnalele de control ale ciclului celular sunt
cuplate cu apoptoza sunt de o importanță crucială în înțelegerea progresiei tumorale și
desemnării de noi modele de terapie antitumorală eficientă (Dănilă, 2002).
Studiul acestor faze, proteinele care le reglementează și interacțiunile biochimice
complexe care opresc sau au început replicarea ADN -ului și diviziunea celulară (citokineza)
sunt preocupările principale ale biologilor ciclului celular. Progresul cel mai semnificativ în
acest domeniu de cercetare a venit cu demonstrarea faptu lui că anumite complexe proteice
care implică cicline au fost critice pentru reglarea trecerii celulelor prin ciclul celular.
Deși ciclul celular este un proces extrem de integrat, au apărut domenii distincte de
interes în acest domeniu de studiu. De exemp lu, multe gene și proteine care influențează
trecerea de la o fază a ciclului celular la altul au fost identificate. Când expresia lor este
17
modificată prin mutație sau gre șit reglate, acestea sunt de obicei clasificate ca oncogene.
Alte proteine acționeaz ă pentru a menține celulele la anumite puncte din ciclu (puncte de
control) și sunt cunoscute sub numele de gene supresoare tumorale. În afară de cei cu un rol
clar de reglementare, multe proteine au funcții importante în alte aspecte ale ciclului celular.
Unul este replicarea ADN -ului și a organitelor, care este un proces fascinant ce include
propriile sale mecanisme de reparare și auto -editare. Alte domenii se concentrează în primul
rând asupra proceselor mecanice de scindare celulară în două celule fiice la sfârșitul mitozei
și asupra condensării și decondensării cromatinei.
Deasemenea, ciclul celular ne afecteaz ă viața de zi cu zi. Într -adevăr, majoritatea
cancerelor sunt rezultatul unei divizări celulare necorespunzătoare, adesea provocată de
erorile î n reglarea ciclului celular normal. Cercetări considerabile sunt direcționate spre
identificarea modificărilor în proteinele de reglare a ciclului celular, ambele ca ținte pentru
intervenția terapeutică și ca biomarkeri care pot indica prognoza pentru tumo ri. În plus,
domeniul biologiei celulelor stem este strâns legat de reglarea ciclului celular, deoarece
aceste celule pluripotente se pot diviza lent pe perioade lungi și totuși inițiază creșterea și
diferențierea atunci când este necesar. Alte domenii ale cercetării actuale includ investigarea
reglării ciclului celular în creșterea organelor și în regenerare, unde celulele latente pot fi
readuse într -o stare replicativă.
Inițial, studiile asupra ciclului celular au conservat microscopia, dar astăzi sunt a plicate
multe tehnici specifice în plus față de cele utilizate pe scară largă în biologia celulară și
moleculară. Sortarea celulelor prin fluorescen ță activ ă a permis biologilor sa identifice
celulele în anumite puncte ale ciclului celular și să le izoleze . Este posibil să se monitorizeze
modul în care celulele care au fost expuse la diferiți agenți pot progresa în timpul ciclului.
Centrul pentru identificarea și izolarea genelor -cheie are capacitatea de a izola celulele
mutante d in drojdie, sensibile la te mperatură care pot fi blocate în anumite etape ale ciclului
pentru studierea mai aprofundată. Abilitatea de a sincroniza culturile astfel încât toate
celulele să se afle în același punct al ciclului celular a fost, de asemenea, un avantaj pentru
captarea u nei imagini de mecanisme comune și izolarea proteinelor cheie. Deși acum știm
multe despre reglarea ciclului celular, este clar că avem un drum lung de parcurs, în special
în înțelegerea complexității interacțiunilor dintre multitudinea de proteine deja id entificate.
Cercetările actuale au identificat un număr mare de căi de semnalizare, multe dintre ele
conținând mai multe gene, implicate în reglarea progresiei prin ciclu. Mai multe dintre
aceste căi pot interacționa, iar cunoașterea acestor interacțiuni v a fi vitală pentru
18
dezvoltarea unor strategii eficiente de intervenție în cancer și alte anomalii de creștere, cum
ar fi deformările de dezvoltare. În plus, modul în care ciclul celular răspunde la deteriorarea
ADN -ului este o zonă de cercetare activă deoa rece erorile aleatorii în replicare și chiar
toxinele de mediu pot afecta componentele ADN -ului vulnerabile. În cele din urmă, succesul
terapiilor bazate pe celule stem va depinde de o cunoaștere detaliată a modului în care
celulele pot fi menținute prin m ai multe diviziuni fără a -și pierde potențialul de a se
diferenția sau transforma în precursorii tumorilor. Studiul ciclului celular are o relevanță
vastă pentru sănătatea, bunăstarea și biologia tuturor organismelor, de la creșterea și
dezvoltarea acestor organisme, până la cancer și îmbătrânirea oamenilor, la potențialul de a
trata bolile și rănile prin intermediul terapiilor cu celule stem (Tang , Hickey, 2014).
1.2.1 . Ciclinele
Ciclin ele se numără printre cele mai importante regulatoare ale ciclului celular de bază.
Ciclinele sunt un grup de proteine conexe și există patru tipuri de bază găsite la om și la
majoritatea altor eucariote: cicline G1, cicline G1/S, cicline S și cicline M.
După cum sugerează numele, fiecare ciclină este asociată cu o anumită fază, tranziție
sau set de faze în ciclul celular și ajută la antrenarea evenimentelor acelei faze sau perioade.
De exemplu, ciclina M promovează evenimentele din faza M, cum ar fi dezorgan izarea
membranei nuclear e și condensarea cromozomilor.
Figura 5:Varia ția concentrați ilor ciclinelor (adaptare după WikiMaMa de către OpenStax College)
(https://www.khanacademy.org/science/biology/cellular -molecular -biology/stem -cells -and-
cancer/a/cell -cycle -regulators )
19
Nivelu rile diferitelor cicline variază considerabil pe parcursul ciclului celular (Figura 5) .
O ciclină tipică este prezentă la un nivel scăzut pentru cea mai mare parte a ciclului, dar
crește puternic în stadiul în care este necesar. Ciclina M, de exemplu, atin ge un nivel maxim
la trecerea de la faza G2 la M. Ciclin ele G1 sunt neobișnuit e, deoarece sunt necesar e pentru
o mare parte a ciclului celular (Recee et.al., 2011).
1.2.2 .Cicline dependente de kinaze
Ciclinele dependente de kinaze (Cdks) conțin un nu cleu catalitic specific
serinei/ treoninei și sunt parteneri cu subunități de reglare cunoscute sub denumirea de
cicline, care controlează activitatea kinazei și specificitatea substratului. Complexele
Cdk/ ciclin au fost implicate mai întâi în controlul ciclului celular bazat pe activitatea de
pionierat în drojdie, în care s -a constatat că un singur Cdk promovează tranziții între diferite
faze ale ciclului celular prin interacțiunile sale cu diferite cicline (Beach et.al., 1982 ; Evans
et.al ., 1983 ; Nurse et.al. , 1980 ; Nurse et.al ., 1976 ; Reed et. al ., 1982). În consecință, Cdks
sunt percepute ca motor care conduce progresia ciclu lui celular, în timp ce ciclinele sunt
considera te a fi uneltele care sunt modificate pentru a ajuta tranziția între fazele ciclului.
Activitatea kinazică a comple xilor Cdk /ciclină este reglementată strâns de o mulțime de
inhibitori Cdk (CKI), care servesc ca frâne pentru a opri progresia ciclului celular în condiții
nefavorabile (Morgan, 2007).
Pentru a conduce ciclul celular înainte, o ci clină trebuie să activeze sau să inactiveze
multe proteine țintă din interiorul celulei. Ciclinele conduc evenimentele ciclului celular prin
colaborarea cu o familie de enzime numite cicline dependente de kinaze (Cdks). Un Cdk
singuratic este inactiv, dar legarea unui ciclin îi activează, făcându -i o enzimă funcțională și
permițându -i să modifice proteinele țintă.
Cdks sunt kinaze, enzime care fosforileaz ă proteine țintă specifice. Grupul fosfat atașat
acționează ca un întrerupător, făcând proteina țintă ma i mult sau mai puțin activă. Atunci
când o ciclină se atașează la un Cdk, are două efecte importante: activează Cdk -ul ca o
kinază, dar direcționează Cdk către un set specific de proteine țintă și unul adecvat ciclului
celular controlat de ciclină. De exem plu, ciclinele G 1 / S trimit Cdks către țintele din faza S
(de exemplu, promovarea replicării ADN -ului), în timp ce ciclinele M trimit Cdks la țintele din
fază M (de exemplu, inducerea dezorganizării membranei nucleare ), (Recee et.al.,2014).
În general, ni velele Cdk rămân relativ constante în întregul ciclu celular, dar activitatea
Cdk și proteinele țintă se modifică pe măsură ce nivelele diferitelor cicline cresc și scad. În
20
plus față de nec esitatea unui partener , Cdks trebuie de asemenea să fie fosforilat pe un
anumit sit pentru a fi activ și poate fi de asemenea reglat negativ prin fosforilarea altor situri.
Ciclinele și cdc -urile sunt conservate foarte evolutiv, ceea ce înseamnă că ele se găsesc
în multe tipuri di ferite de specii, de la drojdie, la broaș te și la om. Detaliile sistemului variază
puțin: de exemplu, drojdia are doar un Cdk, în timp ce oamenii și alte mamifere au cdc -uri
multiple care sunt utilizate în diferit e stadii ale ciclului celular. Dar principiile de bază sunt
destul de asemănătoare, astfel încât Cdks și diferitele tipuri de cicline pot fi găsite în fiecare
specie (Recee et.al., 2011).
Până în prezent, membrii familiei Cdk, ciclină și CKI au fost implicați în transcripție,
reparația daunelor ADN, degradarea proteolitică, reglarea epige netică, metabolismul, auto –
reînnoirea celulelor stem, funcțiil e neuronale și spermatogeneza ( Lim, Kaldis , 2013).
În prezent exi stă 20 de membri ai familiei Cdk (Malumbres et al., 2009), fiecare
caracterizată printr -un miez catalitic conservat format dintr -un buzunar de legare a ATP -ului,
un domeniu de legare a ciclinei de tip PSTAIRE și un motiv de loop T activat.
Spre deosebire de familia Cdk, ciclin ele aparțin unui grup remarcabil de proteine
diverse clasificate exclusiv pe existența unei cutii de c iclină care mediază legarea la Cdk
(Gopinathan et al., 2011). Succesiunea de variații în afara casetei cu ciclină permit e o reglare
diferențială și o diversitate funcțională .
În timp ce majoritatea ciclin elor promovează activitatea Cdk, CKI -urile restrâng
activitatea Cdk. CKI sunt împărțite în două clase pe baza structurii și specificității Cdk.
Pe măsură ce au fost adăugați mai mulți membri la familiile Cdk, cicline și CKI, care se
extind, pe baza omologiei secvențelor, a devenit evident că criteriile in ițiale folosite pentru a
clasifica membrii fondatori nu mai sunt valabile. De exemplu, s -a crezut inițial că Cdks
trebuie să colaboreze cu ciclinele pentru a deveni active, că ciclinele sunt doar subunități de
reglare ale Cdk -urilor și că CKI -urile inhibă strict complexele C dk/ciclină. Studiile recente au
furnizat o demonstrație amplă a funcțiilor pentru subunități individuale fără formare
complexă și cu această abatere de la modul tipic de cooperare, Cdks, ciclinele și CKI -urile
sunt acum implicate într -o mare varietate de roluri independente de ciclu celular la
mamifere.
Implicarea regulatorilor de ciclu celular în transcripție a reprezentat o afacere de lungă
durată și unul dintre exem plele cel mai bine caracterizat rămâne în mod intim legat de
contr olul ciclului celular: calea Rb/ E2F (Weinberg, 1995). În starea hipofosforilată, proteinele
de buzunar [proteina retinoblastomului (Rb, cunoscută și ca Rb1), p107 (Rbl1) și p130 (Rbl2)]
21
se leagă și sechestrează membrii familiei de factori de trans cripție E2F (D yson, 1998). Cdk4/ 6
și Cdk2, în asociere cu partenerii lor catalitici, cicline le D și E, sunt responsabile pentru
fosforilarea Rb succesiv, atenuând astfel inhibarea sa asupra E2F și permițând activarea
genelor necesare pentru a promova intrarea în fază S și sinteza ADN (Harbour and Dean,
2000; Trimarchi și Lees, 2002). Prin modularea activității kinazelor G1, CKI -urile sunt, de
asemenea, implicate indirect în reglarea exprimă rii genelor care răspund la E2F ( Lim, Kaldis,
2013).
Deși controlul transcripțional depen dent de kinază al tranziției G1/ S este bine
documentat, evenimentele corespunzătoare care mediază trecerea de la G2 la faza M încep
tocmai să apară. FoxM1 este un membru al superfamiliei cu factori de transcripție
(Hannenhalli și Kaestner, 2009; Myatt și Lam, 2007), la care genele țintă i nclud regulatori
esențiali ai mitozei și componentele punctului de control al ansamblului fusului (Laoukili și
colab. , 2005; Sadasivam și colab., 2012; Wonsey and Follettie, 2005).
Pe lângă regla rea expresiei genice globale, complexele Cdk/ ciclin au fost implicate în
căi transcripționale specifice, dintre care cea mai notabilă este cascada de semnalizare Wnt/
β-catenină. Semnalul Wnt controlează o multitudine de procese de dezvoltare și, fără
îndo ială, activitatea aberantă a căii a fost legată de diferite boli. Cea mai frecventă
manifestare a semnalizării Wnt de reglementa re este cancerul colorectal, în care prevalează
mutațiile pierdute în funcție de gena supresoare tumorale APC, ceea ce duce la
hiperactivarea β -cateninei (Bienz și Clevers, 2000). Prin urmare, suprimarea căii Wnt a
devenit o cale atractivă pentru intervenția terapeutică (Anastas ,Moon, 2013).
În afară de modularea activității transcripționale a β -cateninei în nucleu, regulatorii
ciclului celular își pot exercita de asemenea influența asupra transducției semnalului Wnt de
la distanță la suprafața celulei . Acest lucru este posibil datorită descoperirii recente a
complexelor Cdk 14/ciclin Y, care sunt ancorate la membrana plasmatică ( Jiang et al., 2009).
1.2.3 .Reglarea ciclului celular la nivel genetic
P21. Este un inhibitor al kinazelor dependente de cicline CDK și ai PCNA (proliferating
cell nuclear antigen) ambele cerute de trecerea de la faza G 1 la faza S. Activitatea p21 este
sub controlul p53, ceea ce sugerează că p21 poate promova oprirea în G 1 dependentă de
p53 sau apoptoza. Experimentele pe linii celulare transformate arată că pierderea punctului
de control de șoareci fără p21 duce la multip le runde de replicare a ADN în absența mitozei
(Brugalor et. al, 1995).
22
P53. Induce apoptoza în piele, timocite, celulele epiteliului intestinal ca răspuns la
degradarea ADN.
Apoptoza indusă de oncoproteine virale ca E1A necesită p53.
Apoptoza indusă de p5 3 prin ecpresia proteinelor E1A, E2F sau Myc care conduc
progresia ciclului celular sugerează co apoptoza ca proces rezultă din conflictul între
semnalele de creștere și inhibiție.
p53 activează transcripția p21 -inhibitorilor de CDK.
p53 activează transcri pția genelor pentru receptorul FAS.
p53 inhibă expresia genelor bcl -2 (antiapoptotice). Pierderea p53 duce la progresia
tumorală.
Apoptoza mediată de p53 protejează celula de transformarea prin E1A (care se leagă
de Rb și îi inactivează funcția normală). R ezultă două funcții distincte ale p53: oprirea în G 1
sau apoptoza în funcție de genele activate și de o serie de alți factori, în special cei din
mediul extracelular. De exemplu, timocitele după iradiere suferă apoptoza p53 indusă.
Fibloblastele iradiate s imilar suferă oprirea în G 1 (Di Leonardo et. al, 1994).
C-myc , protooncogenă implicată în proliferarea normală celulară este un factor
transcripțional care formează un heterodimer cu o altă proteină Max -complexul Myc/Max se
leagă de o secvență specifică a ADN și activează transcripțional o țintă care este ornitin –
decarboxilaza. Inducerea progresiei ciclului celular de către c -myc este independentă de
capacitatea acesteia de a induce apoptoza. O altă țintă transcripțională a c -myc este CDC25 –
o fosfatază necesară în ciclul celular pentru activarea kinazelor CDK1 (Rudolph et. al, 1996).
CDC25 poate induce apoptoza, iar apoptoza indusă de c -myc este CDC25 dependentă.
CDC activează ciclina B și tranziția G 2 spre M. Genele CDC25 conțin în primul intron situsur i
de legare Myc/Max. De semnalat este faptul că, CDC25 este țintă pentru TGFbeta
(transforming growth factor) fiind reglată negativ la nivel ARN sau proteic după tratamentul
cu TGF. (Galactinov et. al, 1996).
Un alt aspect important al reglării ciclului ce lular îl constituie probabilitatea de intrare
a celulei în stadiul G 0 de non creștere, probabilitate care se intensifică odată cu numărul de
diviziuni celulare. Este fenomenul de „senescență” constatat în culturile celulare. Interesant
este faptul că, ceea ce este predictibil pentru o linie celulară (număr de diviziuni posibile) nu
este pentru o celulă singulară (unele celule se pot diviza de multe ori altele doar o dată). O
posibilă explicație ar putea fi comportamentul telomerilor (secvențe repetitive de ADN de la
capătul cromozomilor sintetizate în prezența telomerazei, ce funcționează mai puțin exact
23
rezultând crearea unei variații întâmplătoare prin repetarea secvenței telomerice).
Senescența se poate asocia cu o scădere a repetării acestor secvențe (Dănilă et.al., 2002) .
1.2.4 .TGF beta 1 – oprirea ciclului celular și apoptoza
TGF beta este o citokină multifuncțională ce controlează progresia ciclului celular,
diferențierea, morfogeneza. În anumite forme de cancer s -au găsit mutații la nivelul TGF
beta. În anumite tipuri de celule TGF inhibă proliferarea, prevenind fosforilarea Rb de către
kinazele dependente de cicline rezultând oprirea în G 1. (Herrera et. al, 1996).
Un alt punct de control important pentru desfășurarea ciclului celular este cel de la
nivelul asamblării fusului de diviziune. Acesta previne instalarea anafazei până când nu s -a
realizat segregarea corectă a cromozomilor. Se poate discerne la acest nivel cantitatea de
tubulină liberă, lipsa atașării cromozomilor sau semnale generate de kinet ocor (complexe
proteice specializate prin care cromozomii se leagă de microtubulii fusului de diviziune; apar
pe cromozom în profază).
În concluzie, se poate spune că rămân de elucidat o serie de aspecte ale reglării ciclului
celular în special, în ceea ce privește integrarea căilor punctelor de control, cu proliferarea și
dezvoltarea celulară. Ar fi, spre exemplu, de mare importanță înțelegerea contribuției pe
care o are repararea ADN, oprirea ciclului celular și decizia celulei de a intra în apoptoză în
prevenirea cancerului. Desigur, este de presupus importanța cunoașterii punctelor de
control ale ciclului celular în strategiile chimioterapeutice de eliminare a celulelor
canceroase. Majoritatea medicamentelor distrug celulele canceroase prin activarea că ilor
apoptotice mediate de punctele de control sau prin exploatarea sensibilității chimice
datorate pierderii funcționării punctelor de control.
Cercetările actuale sunt departe, totuși, de a fi elucidat elementele decizionale celulare
care duc spre supraviețuirea, proliferarea și diferențierea celulară sau dimpotrivă spre
autodistrucția sa (Dănilă et.al., 2002) .
1.2.5. Puncte de control
Punctele de control ale ciclului celular sunt mecanisme de supraveghere care
monitorizează ordinea, integritatea și fidelitatea evenimentelor majore ale ciclului celular.
Acestea includ creșterea la dimensiunea adecvată a celulelor, replicarea și integritatea
cromozomilor și segregarea lor exactă în mitoză. Multe dintre aceste mecanisme sunt vechi
de origine și foarte conservate și, prin urmare, au fost puternic informate prin studii în
24
organisme simple, cum ar fi drojdiile. Altele au evoluat în organisme superioare și au
controlat soarta alternativă a celulelor cu impact semnificativ asupra supresiei tumorilor.
Aici, l uăm în considerare aceste căi de control diferite și consecințele disfuncției lor asupra
soartei celulelor.
Mașinile centrale care conduc progresia ciclului celular sunt kinazele dependente de
ciclină (CDK). Acestea sunt proteine kinaze de serină/ treonină care fosforilează substraturile
cheie pentru a promova sinteza ADN și progresia mitotică. Subunitățile catalitice sunt în
exces , dar nu sunt activitate până când nu sunt legate de subunitățile ciclinice înrudite, care
sunt bine reglate la ambele niveluri d e sinteză și proteoliză dependentă de ubiquitin. Legarea
de ciclină permite CDK -uri inactive să adopte o configurație activă, cum ar fi kinazele
monomerice și active. În plus, activitatea CDK poate fi reglată negativ prin legarea
proteinelor inhibitoare mici, a CKI -urilor sau a inhibitorilor de fosforilare a tirozinei, care
blochează transferul de fosfat în substraturi .
Punctele de control au apărut ca o serie de dependențe de ciclu celular (Barnum,
O'Connell, 2014).
1.2.6 .Controlul mărimii celulelor
Pent ru a menține dimensiunea celulelor și pentru a se asigura că fiecare celulă fiică
este dotată cu o cantitate adecvată de material genetic și biosintetic, celulele trebuie, în
medie, să își dubleze exact conținutul înainte de divizare. Controlul dimensiunii celulare este
esențial pentru reglarea distribuției nutrienților pentru celulă și pentru reglarea dimensiunii
și funcției organelor în organismele multicelulare. Existența punctelor de control ale mărimii
celulelor a fost propusă pentru a permite celulelo r să coordoneze dimensiunea celulei cu
progresia ciclului celular. Punctele de control ale dimensiunilor celulelor au fost observate la
G1 și G2. Primele dovezi pentru aceste puncte de control au provenit din observațiile
conform cărora dimensiunea celulel or fiice noi după mitoză afectează progresia ciclului
celular: celulele fiice mari acc elerează progresia prin G1 și/ sau G2 și celulele fiice mici
întârzie ieșir ea din aceste faze de creștere . Cu toate acestea, diferite specii și tipuri de celule
variază fo arte mult în locația acestor puncte de control în cadrul ciclului celular și, prin
urmare, în modul în care ciclul celular este afectat ca răspuns la modificarea dimensiunii
celulare .
25
Fără a fi surprinz ător, o mare parte din ceea ce se știe despre punctele de control de
mărime la nivel molecular se bazează pe reglarea proteinelor im plicate în progresia G1 și
G2/M.
Un mecanism propus pentru controlul dimensiunii celulare este prin monitorizarea
traducerii proteinelor. Masa mitologică și, prin urmare, activitatea de translație ar trebui să
se coreleze cu mărimea celulei, deci se crede că există un produs de translație numit
"marimea translațional ă" care crește în abundență cu dimensiunea celulei și care exercită
controlul asupra ciclului celular după ce a acumulat o anumită sumă. Cln3 și Cdc25 sunt
ambii sugeratori de translație. Această ipoteză oferă, de asemenea, o explicație pentru
modul în care dimensiunea celulelor și ciclul celular răspund la starea nutrițională. În drojdie,
mai multe căi de semnal izare, inclusiv căile PKA și TOR, sunt propuse pentru a media
controlul nutrienților asupra ciclului celular, iar caracteristica unificatoare a acestor căi este
aceea de a controla biogeneza ribozomului, astfel încât activitatea translațională servește ca
indicator celular al stării de nutri ție.
Un alt mecanism prin care celulele pot coordona dimensiunea celulei cu progresia
ciclului celular este prin monitorizarea geometriei celulei. Drojd ia de fisiune S. pombe este în
formă de cilindru și crește în lungim e înainte de divizare. O proteină numită Pom1 se
situează la vârfurile celulei și oprește progresia ciclului celular prin reglarea axei Cdr1 -Cdr2 –
Wee1 -Cdc2, plasată central într -o regiune numită nod interfazat. La lungimi mai lungi ale
celulelor, Pom1 nu m ai poate influența acest complex, iar ciclul ce lular poate progresa în
faza M. Deși acest sistem poate depinde de forma relativ unică a celulelor S. pombe, aceasta
ridică problema dacă există mecanisme similare la alte specii.
În timp ce au existat o serie de explicații pentru coordonarea ciclului celular și
dimensiuni celulare, este posibil ca orice număr să funcționeze simultan într -o celulă. Totuși,
modul în care acest ea sunt integrate rămâne neclar (Barnum, O'Connell, 2014).
1.3. Apoptoza
1.3.1 . Apoptoza – definiție, istoric
În condițiile normale de viață o celulă (aparținând unui organism pluricelular, fie
reprezentând un organism monocelular) își urmează ciclul specific de viață, care cel mai
adesea se sfârșește cu diviziunea ei și cu formarea a două celule identice. S -a constatat totuși
că în condiții cultivării in vitro celulele nu se divid la infinit, chiar dacă dispun de condiții
26
optime de creștere( prin suplimentarea mediului nutritiv cu factori de creștere). Astfel, în
timp ce fibroblaste le provenite de la un fetus uman se divid în cultură de 80 de ori, cele
provenite de la un adult în vârstă de 40 de ori se divid numai de 40 de ori, (Dănilă et al.,
1999). Celulele au deci capacitate limitată de proliferare, după care își încetează funcții le
vitale, printr -un mecanism care nu depinde de factorii favorabili sau nefavorabili în care
trăiesc. Într -un organism pluricelular adult, diviziunea și moartea celulară, două procese
contradictorii, asigură mențiunea unui număr constant de celule într -un anumit organ. Acest
echilibru, homeostazia (alții o numesc homeodinamie ), se realizează atunci când într -un
țesut rata mitozei este compensată de rata morții celulare, iar în cazul când acest echilibru
este perturbat, pot avea loc două evenimente importan te și nedorite:
1) fie celulele se divid mai rapid decat cele ce mor și atunci se inițiază un
proces de dezvoltare tumorală;
2) fie celulele se divid mai încet decât cele ce mor și atunci au loc
pierderi de celule
(cazul unor boli neuro -degenerative) .
Prin apoptoză se înțelege moartea programată a celulelor, încetarea funcțiilor lor
vitale, printr -un mecanism care nu depinde de factorii ( favorabili sau nocivi) din mediul
extracelular.
Fenomenul a fost observat, se pare, de pe la jumătatea secolului al X IX-lea, dar a fost
neglijat. După cum arată Dănilă et a l. (1999), încă în 1842 ( la scurt timp după elaborarea
teoriei celulare de organizare a organismelor vii), Vogt avansa ide ea că unele celule mor în
mod natural în cursul dezvoltării lor. În 1864, Weisman n descria moartea celulară pe
parcursul dezvoltării la Dipterae , iar în 1872 Stieda se apropia de înțelesul actual al noțiunii
de apoptoză prin observațiile lui privitoare la moartea condrocitelor în timpul osificării. În
1879 se efectuau primele observați i microscopic e asupra morții celulare, fiind introduși și
unii termini de profil: cariorexie – care înseamna dezintegrarea nucleului și carioliză – care
descria dispariția lui (Cruchten și Broek, 2002). Într -o lucrare publicată în 1964, Lockshin și
William s folosesc termenul de moarte celulară programată pentru a defin i fenomenul de
moarte celulară care apare în zone și în moment e precise pe parcursul dezvoltării fluturelui
de mătase. D oi ani mai târziu, Tata (1996) arăta că moartea celulară normal ă putea fi
contracarată prin intervenția cu inhibatori ai sintezei ARN și a proteinelor, iar Saunders
(1996) evidenția un fapt deosebit de important și anume că această moarte celulară normal ă
27
putea fi provenită de substanțele produse de alte celule și țesu turi, că deci ea putea fi
influențată prin semnale provenite de la alte celule, (Dănăilă et al., 1999). Apoptoza a fost în
cele din urmă recunoscută și acceptată ca modalitate distinct ă și important ă de moarte
celulară programată la animale dupa publicarea rezultatelor obținute de Horvitz (1999) în
studiile sale de acest gen întreprinse la nematodul Caenorhabditis elegans (Ghiorghiță, 2012).
Neglijarea mult timp a apoptozei s -a datorat faptului că ea "este un fenomen criptic, iar
dimensiunile mici ale multor corpi apoptotici, viteza cu care ei sunt dispuși în celulele
adiacente și absența unor exudates inflamatorii au contribuit la ignorarea procesului în
țesuturile adulte normale, unde rata de producer a lui este redusă ", (Kerr, 1999).
Apoptoza este un proce s fiziologic normal, care se produce cu consum de energie,
după un program genetic bine definit înscris în genomul celulei, nedestructiv, care se
finalizează cu moartea celulei, prin care un organism pluricelular elimină unele celule
nedorite, realizându -și astfel homeostazia celulară. Potrivit definiției propuse de Willie et
al.,(1980) „apoptoza este un proces fiziologic strict reglat, caracterizat parțial de condensarea
nucleară și micșorarea volumului celular, cu păstrarea intactă a membranei plasmatice,
culminând cu distrugerea cromatinei nucleare și digestia ADN -ului genomic, ca eveniment
ireversibil ", (Dănilă et al., 1999).
Deși unii specialiști fac distincție între moartea celulară programată (prin care înteleg
moartea celulară fiziologică normal, însc risă în programul genetic) și apoptoză (prin care
înțeleg moartea fiziologică asociată cu fenomenele de condensare a citoplasmei,
fragmentarea AND -ului și formarea corpilor apoptotici), în prezent se consideră că ambele
denumiri desemnează unul și același fenomen, admițându -se sintagma „moartea celulară
programată prin apoptoză ”. Termenul de moarte celulară programată (MCP) a fost folosit
înaintea celui de apoptoză, fiind propus de către Lokshin și Williams (în 1964) în observațiile
acestor autori asupra de zvoltării țesuturilor la insecte. Investigațiile în domeniul apoptozei s –
au bucurat în ultimele decenii de un interes cu totul deosebit și de eforturi de cercetare
însemnate, rezultatele unor specialiști în acest domeniu fiind onorate în anul 2002 cu
Premi ul Nobel pentru Fiziologie și Medicină, acordat cercetătorilor Sydney Brenner (Marea
Britanie), Robert Horvitz (SUA) și John Sulston (Marea Britanie).
Se pare totuși că apoptoza prezintă mai multe fețete, variante, în sensul că în unele
cazuri pot fi întâlnite modificările nucleare tipice apoptozei (apoptoză “ nucleară ”), în timp ce
în altele apar doar modificări în citoplasmă (condensarea ei, umflarea mitocondriilor și
ruperea ribozomilor), lipsind fenomenele de fragmentare a A DN-ului și formarea de ve zicule
28
de cromatină dispuse în partea internă a membrane i nucleare (apoptoză “ citoplasmatică ”),
(Ghiorghiță, 2012).
1.3.2 . De ce a fost „ inventată ” apoptoza?
Celulele somatice proliferează folosind ca mecanism mitoza. T otodată, apoptoza este
un proce s obișnuit în organismele multicelulare și servește la eliminarea celulelor nedorite
sau lezate. Numeroase studii au arătat că în țesuturile care proliferează există un număr
mare de celule care di spar prin apoptoză. Acest proces poate fi observa t în diverse zone ale
organismului precum celulele criptelor intestinale, în spermatogonii, în centrii nodulilor
limfatici, pe parcursul dezvoltării sistemului nervos etc. Este atât de st rânsă legătura dintre
ciclul ce lular și moartea celulară încât unii își pun probl ema dacă apoptoza nu reprezintă o
formă aberantă a mitozei, (Brady și Gil -Gomez, 1999). King și Cidlowski (1995) au denumit
incapacitatea celulei de a progresa în ciclul celular, datorită unei mitoze anormale ce poate
duce la moartea celulei – “catastrofă mitotică ”. Celulele în cauză manifestă o serie de
schimbări morfologice. Așa de exemplu, celulele cultivate de mamifere, care sunt supuse
catastrofei mitotic, devin ne -adezive, se rotunjesc, volumul celular se reduce, iar cromatina
lor se agregă.
Fiind un proces antagonist mitozei, apo ptoza se constituie într -un mec anism de reglare
a homeostaziei celulare, a raportului mitoză/apoptoză și implicit a numărului specific de
celule dintr -un țesut. Se consider ă că în corpul uman sunt produse prin mitoză cca 100.0 00
de celule în fiecare secundă și cam tot atâtea mor prin apoptoză, (Vaux și Korsmeyer, citați
de Gewies, 2003). Apoptoza contribuie atât la eliminarea celulelor în exces, cât și a celulelor
care se dezvoltă anormal (care au, de exemplu, material genetic grav alterat și nereparabil),
a unor celule potențial periculoase (cum ar fi celulele canceroase, celulele autoreactive ale
sistemului imun, celulele infectate cu virusuri etc). Prin apoptoză se modelează forma unui
organism pluricelular, sau a unor organe ale acestuia. Alte exempl e de intervenție a
apoptozei pe parcursul dezvoltării organismelor po t fi: regresia cozii la mormolocul de
broască; dispariția la embrionul de găină a celulelor din partea posterioară a aripii, pentru
modelarea ulterioară a aripil or etc. (Ghiorghiță, 2012).
În cazul țesuturilor somatice adulte la om, apoptoza este implicată în eliminarea
celulelor în cursul refacerii țesutului epitelial, în atrofia prostatei și cortexului adrenal
datorită insuficienței hormonului trofic, în atrofia glandei mamare după lactație, în
eliminarea limfocitelor B sau T la sfârșitul reacțiilor imunologice etc, (Moldoveanu și
29
Popescu, 1999). Prin apoptoză sunt eliminate și celulele care a u leziuni severe ale A DN-ului
ce nu pot fi reparate, celulele autoreactive ale sistemului imun, celulele infectate cu virusuri
etc. Unele disfuncții sau dereglări ale procesului de apoptoză pot conduce la cancer, la boli
autoi mune și la răspândirea infecți ilor virale, după cum apoptoza excesivă poate provoca
tulburări neuro -degenerative, SIDA și boli ischemice (Gewies, 2003).
În majoritatea tipurilor de tumori maligne cunoscute s -a semnalat prezența apoptozei
spontane, fără a se putea efectua aprecieri de o rdin cantitativ (în cancer proliferarea celulară
fiind un process mult mai intens decât cel de apoptoză). S -a constatat totuși că genele
supresoare de tumori și produșii acestora au capacitatea de a induce apoptoza. Unele dintre
aceste gene au atât capacit atea de a induce cancerul cât și apoptoza, tipică în acest sens
fiind oncogena c-myc. Sunt și situații în care apoptoza poate fi alterată sau încetinită, cum ar
fi unele boli neuro -degenerative,hepatita, cardiopatia ischemică sau degenerativă, infecția
cu HIV etc, ceea ce duce la tulburări funcționale importante ale unor țesuturi. Prin urmare,
dereglarea procesului de apoptoză, fie în sensul intensificării lui (bolile neuro -degenerative și
hematologice), fie a inhibării acestuia (procese tumorale), poate du ce la stări patologice.
Potrivit unor cercetări, pentru supraviețuire, celulele au nevoie de factori de creștere,
pentru care ar exista o competiție între celule și în lipsa cărora poate int ra în apoptoză.
Ritmul de producer e a acestor factori trofici într -un țesut influențează raportul
mitoză/apoptoză și implicit numărul optim de celule în țesutul respective (Ghiorghiță, 2012).
1.3.3 . Modificări biochimice prezente în apoptoză
Evenimentele biochimice produse în apoptoză sunt complexe, se petrec după un
anume program și au loc în cascadă. Dintre acestea, degradarea nucleului și a organitelor
celulare, produsă de enzime specifice, reprezintă în fapt procesul biochimic cel mai
important.
Unul din componenții normali ai membrane plasmatice este fosfatidil -serina (PS),
protein ă localizată pe suprafața internă a acesteia (spre citoplasmă). În anumite condiții, are
loc traslocarea acestei protein e de pe fața internă, pe cea externă a membrane i. Este un
fenomen întâlnit frecvent în procesul de transf ormare malignă a celulelor, care a fost
semnalat și în apoptoză (la începutul ei). S -au evidențiat și situații în care apoptoza s -a
produs fără translocarea PS de fața internă pe cea externă a membranei. Translocarea
acestei protein e precede fragmentarea n uclear ă și degradarea organitelor celulare. De
astfel, inhibitorii apoptozei și a enzimelor care au rol esențial în acest proces (caspazele ),
30
inhibă și translocarea PS pe fața externă a membrane i plasmatice. Deși această translocare a
fost semnalată și în alte procese fiziologice și patologice, ea este considerată ca un fenomen
specific în apoptoză, care face ca celula în cauză să fie mai ușor recunoscută și apoi
fagocitată de către macrofage, (Dănilă et al., 1999).
Un eveniment biochimic foarte important, ce se petrece după translocarea fosfatidil –
serinei este, fragmentarea A DN-ului, care face ca moartea celulară prin apoptoză să devină
inevitabilă. Fragmentarea nucleului este precedată, de condensarea și marginalizarea
cromatinei. Inițial se formează fragm ente ale fibrei de cromatină de dimensiuni mai mari, de
300 kbp si 500 kbp și ulterior fragmente de 180 pb sau multipli ai acestui număr (Ghiorghiță,
2012) .
1.3.4 .Factori inductor și inhibatori si apoptozei
1.3.4 .1.Factori care induc apoptoza
Apoptoza poate fi declanșată și sub acțiunea unor agenți externi de natură fizică și
chimică, care provoacă în special alterări ale materialului genetic și indirect modificări ale
proceselor biochimice celulare ( nu se știe dacă apoptoza ar putea fi indusă de agenți i externi
și prin acțiunea lor direct asupra proceselor biochimice din celule). Se pare că și în această
situație decizia intrării în apoptoză a unei celule se ia tot pe baza semnalelor primi te de la
celulele înv ecinate, care au fost probabil „ avizate” de leziunile provocate materialului
genetic al e celulei în cauză, (Dănăilă et al,. 1999). Gama factorilor fizici, chimici și biologici
care pot induce apoptoza este variată: radiații ionizate și neionizate, hipertermia, câmpurile
electromagnetice de frecvență joasă, hipoxia, substanțele chimioterapice, medicamentele
citotoxice, hormonii, interferonul, retinoizii, virusurile, unii anticorpi, limfocitele citotoxice
etc (tabelul 1). Se consider că inducția apoptozei de către unii din factorii ami ntiți depinde
înmare măsură de capacitatea lor de a influența activitatea genelor p53 și bcl -2 (Ghiorghiță,
2012).
Radiațiile ionizate și neionizate . S-a constatat că radiațiile ionizante, în doze mici și
moderate (care nu periclitează supraviețuirea celulelor), se constituie într -un fel de trig leri
(declanșatori) e fectori ai apoptozei prin schimbările induse la nivelul ADN -ului celular. Se
apreciază că produșii genelor p53 (care au rol de monitorizare a integrității genomului
celular) determină (la concentrații ridicate) oprirea ciclului celular în G1, procurând un timp
mai îndelungat de intervenție a proceselor de reparație a ADN -ului lezat, iar în cazul în care
31
aceste leziuni nu pot fi înlăturate, produșii genelor p53 declanșează apoptoza . De asemenea,
a fost demonstrată și posibilitatea ca mărirea concentrației pr odușilor normali ai genelor p53
să inducă apoptoza, dar numai în tumorile derivate din timocite ( Yonish et. al., 1991).
Și radiațiile neionizante (ultraviolete) au capacitatea de a induce apoptoza în țesuturile
sau celulele care vin în contact direct cu ac est tip de radiații. Potrivit unor informații
prezentate de Dănilă et al. (1999), prin iradierea UV a unei cultur i de polimorfonucleare timp
de 15 minute s -a indus moartea prin apoptoză a cca 70 -90% din celule în interval de 4 ore de
la iradiere. S -a const atat de asemenea că iradierea UV a unei cultur i de celule leucemice a
indus dispariția prin apoptoză a cca 50% din celule datorită alterării materialului nuclear,
restul de celule afectate de acest fenomen având ca mecanism activarea caspazei -3. Așa cum
se știe, radiațiile UV au capacitatea de a produce dimeri pirimidinici la nivelul ADN, blocând
transcripția și translația ADN și probabil astfel se explică intrarea în apoptoză a celulelor
afectate (Ghiorghiță, 2012).
Hipoxia . Hipoxia este un factor care poate induce atât apoptoza cât și necroza
celulelor. Hipoxia însoțește frecvent tumorile care depășesc dimensiunea de 1 -2 mm.
Apoptoza apare ca fenomen cert în celulele tumorale hipoxice, dar hipoxia poate fi un factor
care in duce apoptoza și în celulele normale. S-a observant că inactivarea genei p53 sau
prezența în exces a proteinei Bcl -2 reduce frecvența de intrare în apoptoză a celulelor în caz
de hipoxie. În zonele ischemice ale miocardului apoptoza indusă de hipoxie apare ca un
factor distructiv, întrucât contribuie la eliminarea unor miocite, în timp ce distrugerea prin
apoptoză a unor celule tumorale datorită hipoxiei în unele forme de cancer solid apare ca un
mecanism de acțiune antitumorală al organismului, (Dănilă et al., 1999).
32
Tabelul 1: Inductori ai apoptozei ( Thompson , 1995)
I. ACTIVATORI FIZIOLOGICI
1. Familia TNT : FAS ligand , TNF
2. TGF-β
3. Neurotransmițători : Glutamat , Dopamina , N-metil -b-aspartat
4. Retragerea factorilor de creștere
5. Pierderea atașării de matrix
6. Calciu
7. Glucocorticoizi
II. FACTORI CARE PRODUC DISTRUCȚII CELULARE
1. Șocul caloric
2. Infecția virală
3. Toxine bacteriene
4. Oncogene : myc, REL, E1A
5. Gena p53
6. Celulele T citotoxice
7. Oxidanți
8. Radicali liberi de creștere
9. Privarea de factori de nutriție; antimetaboliți
III. AGENȚI TERAPEUTICI
1. Citostatice
2. Radiații gamma
3. Radiațiile UV
IV. TOXINE
1. Etanol
2. Β-amiloid peptidele
Hormonii . Apoptoza este implicată în atrofia normală sau patologică a unor glande, cel
mai tipic exemplu fiind prostata și glandele suprarenale. Scăderea acțiunii hormonilor care
stimulează aceste glande induce apoptoza detectabilă atât nivelul prostatei, cât și la nivelul
glandei suprarenale.
Glucocorticoizii au o acțiune inversă inducând apoptoza în timocite sau în celulele
tumorale din limfoamele maligne (Bansal et. al.,1991).
33
Pe culturi celulare (linii de celule limfoide) s -a demonstrat că rezistența la inducerea
apoptozei de către glucocorticoizi este paralelă cu creșterea produșilor genelor bcl -2
(Alnemri et. al., 1992). Acest fap t ar putea fi un argument în favoarea ideii că rezistența
glandulară la agenții anticancerigeni de tip hormonal este legată de creșterea nivelului
produșilor genelor bcl -2. Este posibil ca în viitor acțiunea diverșilor hormoni asupra
procesului de apoptoză să fie mai bine cunoscută (Dănilă et.al., 2002) .
1.3.4.2. Factorii care inhibă apoptoza
Există mai multe substanțe care au capacitatea de a inhiba apoptoza la diverse nivele,
majoritatea acestor substanțe fiind de origine virală (tabelul 2).
Apoptoza reprezintă un mecanism foarte eficace de apărare a organismelor
pluricelulare împotriva infecției virale, deoarece celulele infectate viral pot intra în apoptoză,
ceea ce duce atât la moartea celulei, dar și la moartea virusului,împiedicându -se practic
propagarea infecției. Virusurile care nu au capacitatea de a se reproduce singure, folosesc
echipamentul enzimatic și molecular al celulei infectate, au neapărată nevoie ca celula
infectată să fie vie. Pentru ca să mențină celula vie, să nu intre în apoptoză, virusurile au
dezvoltat capacitatea de a produce o serie de proteine care inhibă apoptoza celulelor
infectate. Aceste proteine virale au structură aproape identică cu proteinele din lanțul
inductor al apoptozei reușind prin mecanisme substitutive să bloch eze reacțiile chimice
tipice apoptozei. Un exemplu îl constituie proteina FLICE virală, care inhibă transmiterea
semnalului de transducție către enzimele efectoare ale apoptozei. Sau, în cadrul
adenovirusurilor proteina E1B19K interacționează cu proteina celulară Bax blocând efectul
proapoptotic al acesteia (Dănilă et.al., 2002).
34
Tabelul 2: Inhibatori ai apoptozei ( Thompson ,1995)
I. INHIBATORI FIZIOLOGICI
1. Factori de creștere
2. Matrixul extracelular
3. Ligantul CD40
4. Aminoacizi neutri
5. Zinc
6. Estrogeni
7. Androgeni
II. GENE VIRALE
1. E1B (adenovirusuri)
2. p53 (baculovirusuri)
3. IAP (baculovirusuri)
4. CrmA (virusul variolei)
5. BHRF, LMP -1, virusul Epstein -Barr
6. LMW5 -HL (virusul febrei suine africane)
7. Gene ale virusurilor herpetice -γ
III. AGENȚI FARMACOLOGICI
1. Inhibitori ai calpainei
2. Inhibitori ai cistein -proteazelor
3. Promotori tumorali
-PMA
-Fenobarbital
-α-Hexaclorciclohexan
1.3.5. Fazele apoptozei
În cadrul ciclului celular, o celulă poate avea trei opțiuni:
a) Să rămână în stadiul G0 situație în care ea nici nu proliferează, dar nici nu
urmează apoptoza.
b) Sa prolifereze, parcurgând stadiile ciclului mitotic (G0 → G1 → S → G2 →
Mitoza).
35
c) Să intre în moarte celulară, fie programată (G0 → D1 → F → D2 →
fragmentar e celulară apoptotică), fie neprogramată (necroză), [D reprezintă perioada
în care sunt activate gene a căror expresie asigură fragmentarea ADN; F= fragmentarea
ADN; D reprezintă perioada în care celula însăși se fragmentează în corpi apoptotici]
(Ghiorghi ță, 2012), ( Figura 6).
Figura 6: Schemă privind desfășurarea ciclului celular în care sunt ilustrate opțiunile unei celule aflate în
faza G0, (după Petrușca et al.)
Declanșarea procesului de apoptoză are loc, la intervenția unor factori din mediul
intern al celulei, din mediul extracelular și din afara organismului, factori care se cinstituie în
semnale pentru structurile efectoare ale apoptozei. În funcție de modificările care se produc
în celulele care intră în apoptoză, s -au delimitat mai multe f aze ale acestui proces: faza de
inițiere, faza de decizie, faza d e execuți e și faza de eliminare ( Figura 7).
Figura 7: Desfășurarea apoptozei pe faze (după Thompson, citat de Dănilă et al., 1999)
36
Faza de inițiere ( de activare)
Inițierea apoptozei se poate datora unor factori din mediul intern sau extern al celulei,
care pot influența activitatea unor receptori specifici ca Fas, receptorul pentru TNF,
receptorul pu rinergic P22. Dintre stimuli in terni, cel mai important rol pare să -l aibă leziunile
indu se ADN de către agenți externi, dar și unele modificări a ccidentale produse la nivelul
ADN în cursul diviziunii celulare. În cazul apoptozei, decizia de a urma calea apoptotică sau
de a relua ciclul mitotic (dacă reparația ADN -ului este compatibilă cu supr aviețuirea celulară)
revine celulei în cauză. Se pare că intrarea în apoptoză a celulelor depinde de prezența sau
absența unor molecul e represor pentru acest proce s (Ghiorghiță, 2012).
Faza de decizie
După inițierea apoptozei apar semnale molecular (mesageri) de transducție către
nucleu și citoschelet. În această categorie sunt incluse ceramidele, diacil -glicerolul, sau alți
compuși alternativ i cu rol de semnal de transducție cum ar fi inositol -trifostul sau unele
kinaze celulare. O altă modalitate a r fi construită de activarea receptorului P22 (de pe
membrane) care s -ar solda cu apariția unui por membranar prin care sporește aportul de
calciu. Pe toate aceste căi ar avea loc în final activarea endonucleazelor și declanșarea
apoptozei, (Dănilă et al., 1999). Totodată, sub acțiunea radiațiilor ionizante, a citostaticelor
etc, se produce hidroliz a unor protein e specific membrane i celulare (sfingomielina,
fosfatidilcolina), cu obținerea de ceramide și diacil -glicerol, compuși cu efect apoptotic cert
(Ghio rghiță, 2012).
Faza de execuție
După luarea deciziei de intrare în apoptoză în funcție de semnalele provenite din
interiorul și din exteriorul celulei, intervin enzime specific din citoplasm a de degradare a
organitelor celulare și a macromoleculelor, care pregătesc celula pentru fagocitoză. Ea
presupune activarea caspazelor de execuție ale apoptozei (caspazele -3, -6 și -7), care la
rândul lor activează endonucleaze și alte protea ze din celulă care determină degradarea
proteinelor nucleare și ale citoschele tului. Caspazele efectoare, și în special caspaza -3,
clivează diverse substraturi din celulă, cum ar fi PARP, protein ă nuclear ă etc. Ea activează
totodată CAD, prin clivarea ICAD, fapt ce determină degradarea ADN -ului cromosomal,
(Elmore, 2007). De altfel, unul dintre evenimentele celulare foarte importante, care pare a fi
principal cauză a morții celulare, este clivarea ADN -ului nuc lear în fragmente de 180 -200 pb
(Figura 8). Caspaza -3 ar fi responsabilă și de reorganizarea citoscheletului și formarea
corpilor apoptotici (Ghiorghiță, 2012).
37
Figura 8: Efecte nucleare ale apoptozei (după Dash, 2002)
(http://www.ppgorgsistem.ics.ufba.br/arquivos/fatima/Apoptosis.pdf )
Faza de eliminare (de distrugere)
După finalizarea procesului de apoptoză se formează corpii apoptotici urmată de
ingestia acestora de către fagocite și uneori de către celulele învecinate (care posedă această
capacitate), proces care se desfășoară fără a perturba structura și activitatea țesutului
respectiv și fără a fi însoțit de un proces inflamator (eliminare „curată”, fără urme a celulei
afectate de apoptoză). Recunoașterea c orpilor apoptotici de către macrofage s -ar datora
unor produși de pe membranele lor (carbohidrați și alte molecule specifice):
trombospondina, fosfatidilserina (PS), receptorul de suprafața de 75 kDa. Evenimentul cel
mai important care facilitează recunoaș terea celulelor apoptotice de către fagocitele
noninflamatorii este translocarea fosfatidilserinei pe fața externă a membranei plasmatice
(externalizarea PS), (Elmore, 2007).
În final, procesul de apoptoză duce nu numai la moartea celulei, ci și la dispari ția ei fără
urme și fără consecințe pentru celulele din jur și pentru țesutul din care face parte
(Ghiorghiță, 2012).
1.3.6. Căile de realizare a apoptozei
În literatura de profil, au fost identificate două căi ale apoptozei (Figura 9) , și anume:
a) Calea extrinsecă (moartea indusă de semnale ale morții, pe calea mediată de
receptorii morții)
38
b) Calea intrinsecă (moartea indusă de stres, pe calea mediată de mitocondrii),
(Saraste și Pulkki, 2000; fan et al., 2005)
Figura 9:. Prezentarea schematică a căilo r apoptotice (adaptare după Dabbagh și Rajaei, 2013)
(http://hepatmon.com/?page=article&article_id=13162 )
La aceste două căi principale ale apoptozei, unii autori adaugă o a treia și anume cea a
citotoxicității mediată de celulele T – a morții celulare care depinde de perforină/granzimă.
Ar exista și o cale apoptotică mediată de reticulul endoplasmatic (RE), în care ar fi implicată
caspaza -12 (Nakagawa et al., 2000, citați de Van Cruch ten și Van Den Broek, 2002).
Indiferent care ar fi calea urmată, apoptoza se finalizează cu faza de execuție, care
presupune activarea caspazei -3, fragmentarea AND -ului, degradarea proteinelor nucleare și
ale citoscheletului, legarea în cruciș a proteinelo r, formarea corpilor apoptotici, exprimarea
liganzilor pentru receptorii celulelor fagocitare și înghițirea (ingestia) corpilor apoptotici de
către fagocite. Și granzima A este implicată în apoptoza CTL – indusă, activând căi ale MC
independente de caspază, (Elmore, 2007).
Calea extrinsecă (care în principiu înseamnă activarea caspazei -8) este mediată de
activarea receptorilor morții (death receptors) prezenți la suprafața celulelor ce fac parte din
familia TNFR (tumor necrosis factor receptor), care includ: TNFR1, Fas și receptorii DR -4 și
DR-5 ai TRAIL, ( Ashkenazi, 2002; Wang și El -Deiry, 2003; Păunescu, 2006). La rândul lor,
celulele ce urmează calea extrinsecă a apoptozei pot fi, de două categorii I și II. În cazul
celulelor de tip I (timocitele, sau une le cellule ale liniei limfoide, de exemplu), apoptoza este
39
indusă direct, în principal pe calea semnalizării cascadei de caspaze. Prin cuplarea
receptorilor familiei TNFR cu liganzii specifici celulei primește semnalul pentru apoptoză.
La celulele de tip I I (hepatocitele, de exemplu), semnalul ce pleacă de la receptorul
active nu este suficient de puternic pentru a genera cascada de caspaze și el trebuie
amplificat prin intervenția căilor apoptotice dependente de mitocondrii. În acest caz,
caspaza -8 este sl ab activată și incapabilă de a activ a procaspaza -3, de exemplu. Ea poate
totuși active calea mediată de mitocondrii prin activarea proteinei Bid, o proteină pro –
apoptotică din citosol. Legătura dintre activarea cascade de caspaze și calea mitocondrială a
apoptozei este asigurată deci de protein Bid (BH3 – un membru al familiei de protein Bcl -2),
care este clivată (tBid) de caspaza -8 și apoi translocată în mitocondrii (Ghiorghiță, 2012).
Calea intrinsecă (care în principiu înseamnă activarea caspazei -9) a apop tozei are ca
"actor" principal mitocondriile. Ele pot elibera, ca răspuns la anumiți stimuli, factori care pot
promova moartea celulară (factori apoptogeni), cum ar fi: citocromul c, Apaf -1, AIF,
procaspaza -3, Ca2+ și ROS. Eliberarea acestor factori din mi tocondrii s -ar datora unor
protein e pro-apoptotice precum Bax (care ar oligomeriza în membrane mitocondrială
externă), sau a proteinei Bax în asociere cu VDAC sau cu tBid, care induc formarea de pori ce
permit trecerea unor protein solubile (Jan et al., 20 08). Foarte mulți dintre factorii care induc
apoptoza provoacă lezarea pote nțialului trans -membranar mitoc ondrial (Dy) și a
permeabilității de tranziție (PT), ceea ce înseamnă creșterea bruscă a permeabilității
membrane interne a mitocondriilor. Se produce astfel afluxul apei în matrix, care poate duce
la ruperea membrane externe a mitocondriilor și la eliberarea în citoplasmă a proteinelor
pro-apoptotice aflate în spațiul intermembranar mitochondrial, între care cyt. c, factorul de
inducer a apoptozei (AIF ), endonucleaza G, protein Smac/DIABLO, serin -proteaza HtrA2/Omi
(Gewies, 2003) .
40
Se pune problema cum de au mitocondriile un rol atât de important în apoptoză? Dacă
reflectăm un pic asupra originii lor, putem găsi un răspuns probabil. Este în pre zent tot mai
acceptată ipoteza endosimbiozei în serie, elaborată de Margulis și Sagan (1968), cu privire la
originea unor organite celulare ca plastidele și mitocondriile. Dimensiunile acestor organite,
prezența în ele a unui aparat genetic propriu (ADN, ARN, riboz omi) și a unei proteosinteze
autonome au sugerat ide ea că ele provin din bacteri i de dimensiuni mai mici (foste cândva
organism unicelulare libere) care au intrat în simbioză cu bacteria de dimensiuni mai mari,
din care au derivat proto -eucariotele. Celule le eucariote sunt considerate comunități
microbiene coevolutive (Ghiorghiță, 2009). A fost un moment crucial în evoluția viului, dar și
unul delicat: eucariotele primitive depindeau acum de energia furnizată de bacteriile
"înghițite", iar acestea la rândul lor trebuiau să se adapteze noului mediu de viață. În ciuda
acestei simbioze reușite, "celulele eucariote trăiesc într -un echilibru între viață și moarte,
deoarece mitocondriile păstrează încă repertoriul de molecule care poate declanșa moartea"
(cnf. Wik ipedia). Procesul se produce însă doar atunci când este programat (Ghiorghiță,
2012).
Figura 1 0 – Schemă care relevă dispariția (fagocitarea) celulelor apoptotice . (Gogu I. Ghiorghiță, 2012)
(PS = fosfatidil -serină; LPC = liso -fosfatidil -colină; Anx 1 = anexina -1)
Pe una sau alta din căile apoptotice discutate mai sus sunt activate capsazele și se
produc modificările morfologice și biochimie:
• Încetarea diviziunii celulare;
• Redistribuirea fosfatidil -serinei (PS) de pe fața internă pe cea externă a me mbranei
plasmatice;
41
• Fragmentarea nucleului și a citoscheletului și formarea corpilor apoptotici, care
urmează a fi fagocitați de macrofage etc.
Fosfatidil -serina (PS), fosfogliceridă care în mod normal se află pe membrana
plasmatică cu orientare spre cit osol, în ultimul stadiu al apoptozei este redistribuită prin
intermediul scramblazei (o proteină ipotetică, încă neidentificată) pe fața externă a
membranei plasmatice și transmite astfel din partea celulei în cauză semnale "înghite -mă,
distruge -mă!" (Figura 10)
Aceste semnale sunt receptate de către fagocite (de macrofage de exemplu), care vor
elimina resturile celulare, prevenind astfel o reacție inflamatorie. Pe macrofage se pot afla și
receptori pentru asialo -glicoproteine și vitronectină. În procesul de fagoc itare a corpilor
apoptotici, macrofagele pot fi ajutate și de factorul MFG -E8, care se poate lega de fosfatidil –
serina de pe membrana celulelor apoptotice, (conform Wikipedia ).
1.3.7. Apoptoza fiziologică
Rolul apoptozei în fiziologia normală este la fel d e important ca și cel al omologului
său, mitoza. Aceasta demonstrează un rol complementar, dar opus mitozei și proliferării
celulare în reglarea diferitelor populații de celule. Se estimează că pentru a menține
homeostazia în corpul uman adult, aproximativ 10 miliarde de celule sunt produse în fiecare
zi doar pentru a le echilibra pe cele care mor prin apoptoză (Renehan et al., 2001). Și acest
număr poate crește semnificativ atunci când apoptoza este crescută în timpul dezvoltării
normale și a î mbătrânirii sau în timpul bolii ( Elmore , 2007).
Apoptoza este importantă în timpul diferitelor procese de dezvoltare. Ca exemplu, atât
sistemul nervos, cât și sistemul imunitar apar prin supraproducția celulelor. Această
supraproducție inițială este apoi urmată de moa rtea acelor celule care nu reușesc să
stabilească conexiuni sinaptice funcționale sau specificități productive de antigen(Nijhawan
et al., 2000, Opferman și Korsmeyer, 2003).
Apoptoza este, de asemenea, necesară pentru a scăpa corpul celulelor invadate de
patogen și este o componentă vitală a vindecării rănilor prin faptul că este implicată în
îndepărtarea celulelor inflamatorii și evoluția țesutului de granulație în țesutul cicatricial
(Greenhalgh, 1998). Dereglarea apoptozei în timpul vindecării rănilor p oate duce la forme
patologice de vindecare, cum ar fi cicatrizarea excesivă și fibroza. Apoptoza este, de
asemenea, necesară pentru a elimina celulele imunitare activate sau auto -agresive, fie în
42
timpul maturării în organele limfoide centrale (măduva osoas ă și timus), fie în țesuturile
periferice (Osborne, 1996).
În plus, apoptoza este esențială pentru remodelarea la adult, cum ar fi atrezia
foliculară a foliculului postovulator și involuția glandei mamare după înțărcare (Tilly, 1991;
Lund și colab., 1996). Mai mult, deoarece organismele cresc, unele celule încep să se
deterioreze într -un ritm mai rapid și sunt eliminate prin apoptoză. O teorie este că stresul
oxidativ joacă un rol primordial în patofiziologia apoptozei induse de vârstă prin distrugerea
radicalilor liberi acumulați în ADN mitocondrial (Harman, 1992; Ozawa, 1995). Este clar că
apoptoza trebuie să fie strict reglementată, deoarece prea puțină sau prea multă moarte
celulară poate duce la patologie, inclusiv defecte de dezvoltare, boli autoim une,
neurodegenerare sau cancer( Elmore , 2007).
1.3.8. Apoptoza patologică
În ceea ce privește apoptoza patologică, observăm faptul ca, anomaliile prezente în
reglarea morții celulare pot fi o componentă semnificativă a bolilor cum ar fi cancerul,
sindromul lim foproliferativ autoimun, SIDA, ischemia și bolile neurodegenerative cum ar fi
boala Parkinson, boala Alzheimer, boala Huntington și scleroza laterală amiotrofică. Unele
afecțiuni prezintă apoptoză insuficientă, în timp ce altele prezintă apoptoză excesivă.
Cancerul este un exemplu în care mecanismele normale de reglare a ciclului celular
sunt disfuncționale, fie cu o supraproliferare a celulelor și /sau cu scăderea eliminării
celulelor (King și Cidlowski, 1998). De fapt, suprimarea apoptozei în timpul carcin ogenezei se
presupune că joacă un rol central în dezvoltarea și progresia unor cancere (Kerr et al., 1994).
Există o varietate de mecanisme moleculare pe care celulele tumorale le utili zează pentru a
suprima apoptoza ( Elmore , 2007).
Celulele tumorale pot obține rezistență la apoptoză prin exprimarea proteinelor anti –
apoptotice cum ar fi Bax. Expresia ambelor Bcl -2 și Bax este reglată de către gena supresoare
tumorale p53 (Miyashita, 1994).
Anumite celule imune (celulele T și celulele ucigașe naturale) dis trug în mod normal
celulele tumorale prin intermediul căii perforin/ granzimă B sau calea morții -receptor. Pentru
a evita distrugerea imunității, unele celule tumorale vor diminua răspunsul căii receptorului
de moarte la FasL produs de celulele T. Acest luc ru s-a dovedit a apărea într -o varietate de
moduri, incluzând reglarea în jos a receptorului Fas asupra celulelor tumorale. Alte
mecanisme includ expresia receptorului Fas nefuncțional, secreția unor niveluri ridicate de
43
formă solubilă a receptorului Fas c are va sechestra ligandul Fas sau expresia ligandului Fas
pe suprafața celulelor tumorale (Cheng și colab., 1994, Cefai și colab. , 2001; Elnemr și
colab., 2001). De fapt, unele celule tumorale sunt capabile de un "contra atac" mediat de
ligandul Fas carea are ca rezultat epuizarea apoptotică a limfocitelor infiltrării tumorale
activate (Koyama și colab., 2001).
Modificările diferitelor căi de semnalizare celulare pot avea ca rezultat dispariția
apoptozei și conducerea la cancer. Gena supresoare tumorale p5 3 este un factor de
transcripție care reglează ciclul celular (Wang și Harris, 1997). Rolul crit ic al p53 este
evidențiat prin faptul că este mutat în peste 50% din toate cazurile de cancer la om. p53
poate activa proteinele de reparare a ADN -ului atunci c ând ADN -ul a suferit o leziune, poate
menține ciclul c elular în punctul de reglare G1/ S asupra recunoașterii daunelor ADN -ului și
poate iniția apoptoza dacă dauna ADN se dovedește a fi ireparabilă (Pientenpol și Stewart,
2002). Este posibilă apariția de tu mori în cazul în care acest sistem nu funcționează corect.
Dacă gena p53 este deteriorată, suprimarea tumorii este sever redusă. Gena p53 poate fi
afectată de radiații, de diverse substanțe chimice și de viruși, cum ar fi papilomavirusul uman
(HPV). Persoa nele care moștenesc doar o copie funcțională a acestei gene vor dezvolta cel
mai probabil sindromul Li -Fraumeni, care se caracterizează prin dezvoltarea tumorilor la
vârsta adultă (Varley et al., 1997; Gu și colaboratorii, 2001).
După cum sa menționat ante rior, p53 semnalează stoparea creșterii celulei la un punct
de control pentru a permite repararea leziunilor ADN -ului sau poate provoca apoptoza
celulei dacă daunele nu pot fi reparate. Acest sistem poate fi, de asemenea, inactivat printr –
un număr de mecan isme, inclus iv modificări somatice genetice/ epigenetice și expresia
proteinelor virale oncogene, cum ar fi HPV, care conduc la tumorigeneză (Bolt et al., 2005).
Alte căi de semnalizare celulare pot fi, de asemenea, implicate în dezvoltarea tumorii. De
exem plu, suprareglarea căi i fosfatidilinozitol 3 -kinază/ AKT în celulele tumorale le face
independente de semnalele de supraviețuire. Pe lângă reglarea apoptozei, această cale
reglează alte procese celulare, cum ar fi proliferarea, creșterea și rearanjarea cito scheletală
(Vivanco și Sawyers, 2002).
În afară d e cancer, prea puțină apoptoză poate avea ca rezultat, de asemenea,
afecțiuni cum ar fi sindromul limfoproliferativ autoimun (ALPS) (Worth et al., 2006). Acest
lucru se întâmplă atunci când apoptoza insufici entă a celulelor T autoagresive duce la mai
multe boli autoimune. De asemenea, apare o supraproliferare a celulelor B, rezultând
producerea în exces de imunoglobulină, conducând la autoimunit ate. Unele dintre bolile
44
comune ale ALPS includ anemie hemolitică , trombocitopenie mediată de imunitate și
neutropenie autoimună. Diferitele tipuri a aceastei afecțiun i sunt cauzate de mutații
distincte.
Apoptoza excesivă poate fi de asemenea o caracteristică a unor afecțiuni cum ar fi
bolile autoimune, bolile neurodeg enerative și leziunile asociate ischemiei. Sindromul
deficienței autoimune (SIDA) este un exemplu al unei boli autoimune care rezultă din infecția
cu virusul imunodeficienței umane (HIV) (Li et al., 1995). Acest virus infectează celulele T
CD4+ prin legare a la receptorul CD4. Virusul este apoi internalizat în celula T în care se crede
că proteina Tat HIV crește expresia receptorului Fas, rezultând apoptoza excesivă a celulelor
T (Elmore , 2007).
Boala Alzheimer este o afecțiune neurodegenerativă care se pres upune că este
provocată de mutații în anumite proteine, cum ar fi APP (proteina precursor amiloid) și
presenilinele.
Se consideră că apoptoza excesivă joacă un rol important în diferite leziuni asociate
ischemiei. Un exemplu este ischemia miocardică cauza tă de o alimentare insuficientă a
sângelui, ceea ce duce la o scădere a furnizării de oxigen și la moartea ulterioară a
cardiomiocitelor.
1.3.9. Alte forme de moarte programată a celulelor
Există dovezi ale altor forme de moarte celulară programată non -apoptotică, care ar
trebui luate în considerare, deoarece acestea pot duce la noi perspective asupra
programelor de moarte celulară și pot dezvălui rolurile lor potențial unice în dezvoltare,
homeostază, neoplazie și degenerare. S -a constatat din ce în ce ma i mult că mecanismele de
moarte celulară includ o gamă largă de fenotipuri și mecanisme moleculare. Și există dovezi
că modularea unei forme de moarte celulară poate duce la o altă formă. Deoarece alte tipuri
de moarte celulară pot necesita activarea genei și funcția într -o manieră dependentă de
energie, ele sunt, de asemenea, considerate a fi forme de "moarte celulară programată".
Prin urmare, există o anumită rezistență la utilizarea exclusivă a termenului "moartea
celulară programată" pentru a descrie în mod specific apoptoza .
Există fenotipuri necrotice care necesită activarea genei și sinteza proteinelor, astfel
încât acestea sunt, strict vorbind, forme de moarte celulară programată (Proskuryakov et al.,
2003). Aceste forme de moarte celulară care au an umite trăsături morfologice atât ale
necrozei, cât și ale apoptozei, au fost denumite "a ponecroza " (Formigli et al., 2000). Prin
45
afectarea lanțului respirator mitocondrial cu antimicină A, Formigli și colaboratorii au indus
un tip de moarte celulară care p rezintă trăsături dinamice, moleculare și morfologice atât cu
apoptoză, cât și prin necroză .
Au fost, de asemenea, identificate mecanisme independente de caspază ale morții
celulelor neuronale. Acest tip specific de moarte celulară programată poate implica factori
mitocondriali specifici. În modelele experimentale, factorul de inducere a apoptozei (AIF) și
endonucleaza G promovează acest tip d e moarte celulară; totuși, Smac/DIABLO și HtrA2/ Omi
pot contribui de asemenea (Ravagnan și colab., 2002; van Loo și colab., 2002b). Oppenheim
și colegii (2001) au arătat că moartea celulară programată apare la dezvoltarea neuronilor
mamifere lor, chiar și după eliminarea genetică a caspazelor. Alte cercetări au arătat că
inhibarea mașinilor de executare a caspazei poate salva doar temporar neuronii deteriorați și
că caracteristicile apoptotice clasice pot să apară încă în neuronii inhibiți de caspază
(Volbracht et al., 2001). Se pare că mecanismele dependente de caspază și caspaze
independente de moartea celulelor neurona lă pot depinde de regiunea creierului , de tipul
celulei și de vârstă .
În concluzie, a poptoza este considerată ca fiind un proces dependent de energie,
caracterizat prin caracteristici morfologice și biochimice specifice, în care activarea caspazei
joacă un rol central. Deși multe dintre proteinele apoptotice cheie care sunt activate sau
inactive în căile apoptotice au fost identificate, mecanismele moleculare de acțiune sau de
activare a acestor proteine nu sunt pe deplin înțelese și sunt în centrul cerce tărilor continue.
Importanța înțelegerii mecanismului mecanic al apoptozei este vitală, deoarece moartea
celulară programată este o componentă a sănătății și a bolii, fiind inițiată de diverși stimuli
fiziologici și patologici. Mai mult decât atât, implica rea pe scară largă a apoptozei în
patofiziologia bolii se supune intervenției terapeutice la multe puncte de control diferite.
Înțelegerea mecanismelor de apoptoză și a altor variante de moarte celulară
programată la nivel molecular oferă o perspectivă ma i profundă asupra diferitelor procese
ale bolii și poate influen ța astfel strategia terapeutică (Elmore , 2007).
46
Capitolul II
MATERIALE ȘI METODE
2.1. Culturile celulare
Culturile celulare au fost cultivate în mediul DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)
suplimentat cu 10% ser fetal bovin (celulele neoplazice umane HeLa), respectiv cu 2% ser
fetal bovin (celule renale normale prelevate de la maimuță), 100 µg/mL streptomic ină și 100
IU/mL penicilină. Celulele au fost crescute în plăci de culturi celulare cu 24 de
compartimente, fiind inoculate la o densitate de 50.000 de celule/ compartiment și
menținute în incubator la temperatura de 37oC și CO 2 5%.
La 24 de ore de la inoculare, atunci când celulele au ajuns în faza log a dezvoltării lor,
acestea au fost supuse tratamentului cu plasmă rece.
2.2. Expunerea la plasma rece
Protocol de expunere:
Culturilor celulare cu vârsta de 24 de ore li s -a îndepărt at mediul de cultură în
totalitate iar peste filmul celular s -au adăugat 100 µL de TFS, fiind ulterior supuse acțiunii
plasmei reci cu diferite caracteristici. După expirarea duratei de tratament, peste filmul
celular s -a adăugat un volum corespunzător de mediu de cultură proaspăt (DMEM+10%FBS).
Ulterior, culturile de celule au fost menținute pentru încă 24 de ore în incubator.
Expunerile la plasma rece au fost următoarele:
EXP-1: U = 4kV, f = 4 kHz
EXP-2: U = 8kV, f = 1 kHz
EXP-3: U = 8 kV, f=4 kHz
QHe = 3 L/min ; 4 min tratament
Figura 11. Schema jetului de plasmă la presiune atmosferică
47
Figura 12: Aplicarea tratamentului cu plasmă atmosferică rece asupra culturilor celulare
2.3. Extracția ADN
Izolarea ADN total din culturi celulare expuse la plasmă rece , prelevat și conservat în
alcool etilic absolut, s -a desfășurat după protocolul cu fenol : cloroform : alcool izoamilic (25
: 24 : 1) ( Ausubel și colab., 1995). Soluțiile utilizate: tampon pentru liza celulară, soluție Tris –
HCl 1M (pH=8), soluț ie NaOH 10N (100ml), soluție SDS 10% (dodecil sulfat de sodiu); soluție
EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetat -sare disodică – Ref. SIGMA ED2SS).
Tehnica este folosită pentru extragerea ADN total din țesuturi proaspete, congelate
sau păstrate în etanol (Ausub el et al., 1995).
Soluții:
Tampon pentru liza celulară:
Conține: Tris HCl 50mM (pH=8), SDS 1,0%, EDTA 25mM.
Pentru 50ml, într -o eprubetă se introduc 25ml H 2O miliQ (apă distilată filtrată
prin filtru de carbon, schimbător de ioni etc.) autoclavată, la care se adaugă 2,5ml soluție
stoc 1M Tris HCl (pH=8), 5ml 10% SDS, 2,5ml 0,5M EDTA. Se completează volumul cu H 2O
miliQ până la 50ml și se introduce într -un tub Corning nou cu volumul de 50ml, neautoclavat.
Soluții stoc:
1. Soluție Tris -HCl 1M (pH=8): – cantitățile sunt calculate pentru un volum de 100 ml;
se dizolvă 12,11g Tris în 80ml H 2O miliQ;
se corectează pH -ul la 8 cu HCl;
48
se autoclavează.
2. Soluție Tris -EDTA (TE) (pH=8,0): -cantitățile sunt considerate pentru volumul de
100ml;
într-o eprubetă de 100ml se introduce 1ml soluție stoc Tris -HCl 1M (pH=8);
200μl EDTA 0,5M;
se completează cu H 2O-miliQ până la 100ml și se autoclavează.
3. Soluție NaOH 10N (100ml):
se cântăresc 40g NaOH;
se adaugă 70ml H 2O-miliQ autoclavată și se agită până la dizolvare;
se aduce volumul la 100ml;
nu se autoclavează.
4. Soluție SDS 10% (dodecil sulfat de sodiu):
se introduc 10g SDS în 80ml H 2O-miliQ autoclavată și se încălzește soluția la
80șC pentru o mai bună dizolvare;
se ajustează pH -ul la 7,2 (dacă este necesar), utilizând HCl;
se aduce volumul la 100ml cu H 2O-miliQ;
nu se autoclavează.
5. Soluție EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetat·sare disodică)
se cântăresc 18,61g EDTA, peste care se adaugă 80ml H 2O-miliQ;
se agită puternic și se adaugă 1ml soluție NaOH 10M;
se adaugă NaOH până când soluția devine alcalină (pH=8,0), iar EDTA este
dizolvat complet;
se aduce volumul la 100ml cu H 2O-miliQ și se autoclavează;
Modul de lucru:
Se etichetează tuburi Eppendorf de 1,5ml autoclavate, în care se introduc câte
500µl soluție tampon pentru liză. Tuburile se țin închise, până în momentul introducerii
culturilor celulare ;
Se cântăresc 20 -200mg de culturi celulare proaspăte, congelate sau
conservate în alcool etilic 95% .
Se introduc fragmentele de celule în tubul Eppendorf cores punzător, care
conține 500µl soluție tampon pentru liză. Această etapă se repetă pentru toți indivizii;
49
În fiecare tub se introduc 10µl proteinază K (10µl reprezintă echivalentul a
200µg proteinază dintr -o soluție stoc de 20mg/ml care este preparată și con gelată la –
20șC);
Se agită fiecare probă pe vortex și se păstrează peste noapte în etuvă la 37șC;
Notă : Pentru realizarea acestei etape se recomandă să se lucreze cu un număr de probe
echivalent cu numărul de cuve din centrifugă.
În ziua următoare sub niș ă, în fiecare tub se adaugă 600µl de soluție
fenol:cloroform: alcool izoamilic (25:24:1), până la semnul superior al tubului;
Se agită tuburile timp de 30 -60 secunde, apoi se centrifughează (utilizând o
centrifugă de masă), la 8000 rotații/minut, timp de 4 minute;
În timpul centrifugării se etichetează noi tuburi Eppendorf de 1,5ml;
La sfârșitul centrifugării, tuburile prezintă o fază inferioară de culoare gălbuie
care conține solventul organic, o fază superioară care conține ADN și o fază intermediară
unde sunt depozitate toate resturile pe care dorim să le eliminăm din soluția ADN;
Notă : Dacă această fază intermediară este foarte mare, se poate repeta spălarea cu
fenol:cloroform:alcool izoamilic urmată de centrifugare. Dacă fazele sunt bine separate se
trece la etapa următoare.
Se separă faza superioară a fiecărui tub, în noile tuburi Eppendorf etichetate
anterior; pentru acesta se utilizează o pipetă cu ajutorul căreia se extrag 700µl de ADN. Dacă
pipetarea se face repede, iar concentrația de ADN este foarte mare în faza superioară a
tubului, în momentul pipetării, se pot extrage resturi ale fazei intermediare;
După separare, se adaugă 1ml etanol rece 95% (păstrat la – 20șC), până la
semnul superior al fiecărui tub;
Se agită tuburile și se lasă la tempe ratura de – 20șC, timp de 30 -60 minute,
timp în care se va forma un precipitat albicios (ADN total) pe fundul tuburilor;
După precipitarea ADN, se centrifughează tuburile la 10.000 rotații/minut,
timp de 5 minute, pentru sedimentare;
Se elimină supernatantul și se așează tuburile deasupra unei hârtii de filtru,
astfel încât să se scurgă ultimele picături de alcool;
Urmează uscarea peletelor, mutând tuburile deschise într -o centrifugă cu
vacuum, unde sunt menținute timp de 10 minute, cu temperatur a în scădere. Dacă în acest
interval de timp sedimentele nu sunt uscate, se mai lasă tuburile încă 5 minute în centrifugă;
50
După uscarea peletelor, se adaugă în fiecare tub către 80µl soluție TE (pH=8,0)
și se resuspendă manual sau pipetând de câteva ori. P entru o mai bună resuspensie, se pot
lăsa între 15 și 30 minute la temperatura camerei, la 37șC, sau timp mai îndelungat la 4șC;
După resuspendarea peletelor de ADN, conținutul fiecărui tub este repartizat
în trei tuburi de câte 1,5ml (etichetate anterior) , punând câte 50µl din soluția resuspendată.
Din cele trei tuburi ale unei probe, unul se păstrează la 4șC, iar celelalte două se congelează
la – 20șC – – 80șC.
2.4. Cuantificarea ADN
După rehidratarea ADN -ului, s -a realizat analiza cantitativă și calitati vă a acestuia prin
citirea spectofotometrică, cu ajutorul spectofotometrului ACTGene -ASP-3700 (Figura 13) și
migrarea în gel de agaroză.
Figura 1 3: Spectofotometrului ACTGene -ASP-3700
Metoda spectofotometrică se bazează pe faptul că majoritatea substanțelor biologice
au o rată de absorbție caracteristică în domeniul radiațiilor ultraviolete. Astfel, rata de
absorbție de 260 nm corespunde acizilor nucleici, cea de 280 nm proteinelor, iar 230 nm
diferiților contaminanți compuși enolici, tiocianați și polizaharide .
Densitatea optică a fost măsurată la rata de absorbție A 260 nm și A 280 nm, făcând
raportul dintre cele două rate de absorbție. Valoarea rapoartelor 260/280 și 260/230
indică puritatea probelor; pentru ca ADN -ul să aibă o puritate mare es te nevoie ca valorile
acestor rapoarte să fie mai mare de 1,8.
51
Legea lui Beer Lambert arată că există o relație de liniaritate, între concentrația unui
compus și absorbanța sa la o anumită lungime de undă. Pe acest fapt se bazează calcularea
concentrației de ADN, dar se fac și aprecieri asupra purității ADN în raport cu proteinele.
2.5. Real -Time PCR
Dezvoltarea echipamentelor care permit monotorizarea în timp real a fluorescenței
emisă în timpul reacției de polimerizare în lanț a reprezentat un pas foarte important.
Testele de Real -Time PCR pot fi realizate acum într -un timp scurt fără a mai fi nevoie de
ulterioare manipulări sau amplificări, iar identificarea produșilor amplificați este mult mai
precisă comparativ cu analiza mărimii acestora în gelurile e lectroforetice. Semnalul
fluorescent se obține datorită unei substanțe care are proprietatea de a emite fluorescență
atunci când se atașează de ADN.
Spre deosebire de reacția de polimerizare în lanț normală, cea în timp real măsoară
cinetica produșilor car e se acumulează în fiecare tub de reacție. În general, nici un produs nu
este detectat în timpul primelor cicluri de temperatură deoarece semnalul fluorescent se
află sub pragul de detectare al intrumentului. Cuantificarea în Real -Time PCR se face
măsurând numărul de cicluri necesare pentru ca semnalul fluorescent să atingă un anumit
prag pentru a fi înregistrat. Pentru a fi determinat, în primul rând, este stabilit nivelul
fluorescenței de fundal pentru o probă dată. Apoi se folosesc algoritmi specifici pe ntru a
defini pragul fluorescenței de fundal. În final, algoritmul caută datele din fiecare probă
pentru a identifica un punct care depășește pragul inițial. Ciclul la care acest punct este
întâlnit se numește ciclu prag (cycle threshold – Ct). Acesta depi nde de concentrația de ADN
inițială, de eficiența amplificării și de susceptibilitatea detectării. Cu cât sunt necesare mai
puține cicluri pentru a atinge un nivel de fluorescență detectabil cu atât se vor obține
rezultate mai de încredere.
Testele de Rea l-Time PCR au nevoie de o bună optimizare a concentrației de ADN, a
primerilor sau a altor componente ale probelor pentru a obține rezultate cât mai apropiate
de cele dorite. Pe lângă mixurile standard disponibile sau cele realizate în laborator mai sunt
necesare următoarele: o polimerază termostabilă, soluție tampon, dNTP –uri și MgCl 2. O
concentrație insuficientă de polimerază poate duce la o amplificare ineficientă, un nivel de
fluorescență scăzut și implicit la pierderea sensibilității instrumentului, toate rezultând într -o
valoare a ciclului prag mare (Kirstin et al., 2004).
52
Principiul metodei
Tehnica de clonare moleculară presupune multiplicarea unei secvențe cunoscute de
ADN și obținerea de copii multiple ale aceleiași genefolosind un sistem de vect ori de clonare.
Clonarea este frecvent utilizată pentru amplificarea oricărei secvențe ADN mai mari sau mai
mici: gene, fragmente de gene, secvențe promotoare, secvențe necodificatoare,
oligonucleotidele sintetizate chimic și ADN fragmentat aleator.
Apărut ă la începutul anilor 1980, reacția de polimerizare în lanț (PCR) este atât de
utilizată în zilele noastre în nenumărate domenii, încât s -a uitat meritul său revoluționar.
Știința așa numitei reacții de polimerizare în lanț este astăzi foarte bine cunoscut ă și întâlnită
în multe laboratoare. Tehnica PCR este considerată a fi un veritabil „fotocopiator genetic”.
Reacția de polimerizare în lanț permite o rapidă amplificare a secvențelor ADN, chiar și
atunci când materialul de inițiere este un ADN puternic deg radat, acesta fiind utilizat în
studii de antropologie moleculară și paleogenetică, cum ar fi analiza ADN recuperat din oase
fosile, din mumii sau din țesuturi formolizate. Se poate realiza amplificarea ADN chiar și
dintr -o singură celulă. Practic, PCR rep rezintă o formă de clonare in vitro ce poate genera și
modifica fragmente de lungimi și secvențe bine definite într -o simplă reacție automatizată.
(Brown et al., 1979).
Majoritatea polimerazelor recunosc ADN monocatenar ca fiind un posibil model de
amplific are și se leagă temporar la acest lanț, pentru formarea unei duble catene. De
asemenea, polimerazele se leagă și de deoxinucleotidtrifosfații (dNTPs) valabili în mediu și
folosind energia înmagazinată în legăturile triple, catalizează reacția de atașare a
nucleotidelor la a doua catenă de ADN; apoi enzima se mută la sfârșitul porțiunii unde
catena este dublă, iar procesul este repetat de sute sau mii de ori pe secundă.
ADN polimeraza acționează unidirecțional; începe să acționeze de la capătul 3' al
porțiun ii dublucatenare, sinteza decurgând în direcția 5'→3'. Astfel, polimeraza poate începe
să acționeze oriunde găsește o joncțiune de tip ADN monocatenar – bicatenar.
Pentru direcționarea începutului sintezei unui anumit segment de ADN, este necesar
un scurt segment oligonucleotidic (un mic număr de nucleotide unite într -un lanț scurt
complementar unei secvențe de ADN) poziționat chiar deasupra porțiunii dorite pentru
sinteză.
53
Acest fragment oligonucleotidic nu se poate alinia la ADN dublu catenar, în schimb, se
leagă imediat la secvența complementară a ADN monocatenar. Prin încălzire, legăturile
dintre cele două catene ale ADN se rup, formându -se porțiuni monocatenare. Prin urmare,
denaturarea ADN prin căldură, urmată de o ușoară răcire, în prezența oligonucle otidelor
complementare, determină alinierea acestora la macromolecula de ADN monocatenar,
oriunde întâlnesc secvențe similare complementare (Palumbi et al., 1991).
Ciclurile de replicare
Replicarea în reacția de polimerizare în lanț constă în trei faze ma i importante:
denaturare, aliniere și extensie (Figura 14.).
Figura 14: Etapele reacției PCR
(http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html )
Denaturarea
În această fază, căldura este folosită în scopul opririi tuturor reacțiilor enzimatice și
denaturării ADN de la dublu catenar la monocatenar (Figura 15) . De obicei, se folosește o
temperatură de 94°C sau, după metode mai noi 92°C. O temperatură prea joasă sau un timp
de denaturare prea scurt pot fi ineficiente, rămânând porțiuni de ADN bicatenar. Cu toate că
Taq polimeraza este rezistentă la denaturarea termică, nu este totuși imună la acțiunea
căldurii, o încălzire excesivă ducând la o scădere a activității enzimatice. De exemplu, după
54
30 cicluri de replicare cu incubare la 94°C pentru 60 de minute, activitatea enzimei se reduce
la jumătate (Gorgan , 2008) .
Figura 1 5: Etapa de denaturare a ADN din timpul reacției PCR
(http://www.pharmaceutical -technology.com/projects/roche/roche6.html)
Alinierea primerilor
În această fază, temperatura este mai joasă, astfel încât primerii se pot lega în zonele
complementare din catena de ADN (Figura 16) . Aceasta este faza critică a reacției de
amplificare, deoarece dacă primerii se leagă corect doar în zona țintă (zona care urmează a fi
amplificată), atunci există o probabilitate suficient de mare să se obțină produși de calitate.
Alinierea este un proces randomic, care depinde de concentrația primerilor,
disponibilitatea siturilor de legătură și de pre zența zonelor cu similaritate scăzută cu
secvența primerilor, care duc la alinieri nespecifice. Trebuie remarcat și faptul că, dacă
macromolecula de ADN care folosește drept matriță este fragmentată, atunci mici
fragmente din aceasta pot acționa ca primeri , fiecare având o țintă precisă în cadrul
genomului. Acesta este un motiv pentru care molecule de ADN cu greutate moleculară mare
și molecule mici nu trebuie amestecate ca matrițe pentru viitoare amplificări (Palumbi et al.,
1991).
O temperatură mare de al iniere a primerilor sau o concentrație mare a acestora în
mediul de reacție pot determina o blocare a formării legăturilor și, implicit, de aliniere a
primerilor cu matrița de ADN. O temperatură joasă determină o aliniere nespecifică a
primerilor în diferi te porțiuni care prezintă o complementaritate scăzută, generându -se
astfel numeroase artefacte. Dacă temperatura de aliniere este foarte scăzută, catenele de
ADN se vor „realinia” formând structura inițială – ADN dublu catenar.
Timpul de aliniere a primeri lor constituie, de asemenea, o problemă foarte importantă
pentru obținerea unui produs bun. Astfel, un timp de aliniere foarte lung permite primerilor
55
să găsească noi posibile situri de legătură și să se alinieze nespecific. Cu toate acestea, un
timp scurt de aliniere poate determina o mare specificitate de aliniere în PCR.
În general, timpul de aliniere este de 30 -60 secunde, dar poate funcționa la fel de bine
și un timp mai scurt de 15 secunde la temperaturi mari de aliniere cu primeri specifici.
Figur a116 : Atașarea primerilor la matrița de ADN
(http://www.pharmaceutical -technology.com/projects/roche/roche6.html )
Extensia
Faza de extensie sau elongare determină activitatea enzimatică și sinteza segmentului
de ADN. Taq polimeraza funcționează de obicei bine la 72°C, aceasta fiind și temperatura
utilizată de obicei pentru această etapă. Enzima se activează și își începe activitatea la
temperaturi scăzute, ceea ce este foarte important pentru succesul reacției de amplific are.
Majoritatea primerilor au o temperatură de aliniere mai mică de 72°C, astfel încât
majoritatea vor fi foarte slab legați de secvența țintă, odată cu creșterea temperaturii de
extensie. Odată cu creșterea temperaturii de la temperatura de aliniere căt re 72°C, începe și
reacția de polimerizare, dar destul de lent. Oricum, această reacție de polimerizare este
suficientă pentru a adăuga câteva extra -baze, crescând astfel stabilitatea complexului
primer -matriță. Astfel, odată cu trecerea timpului (de obice i 30 de secunde), temperatura de
extensie crește, primerul fiind deja parte componentă a noii catene de ADN.
Timpul de extensie este o altă variabilă importantă. În condiții optime, Taq poate lega
mii de nucleotide pe minut. Prin urmare, produșii PCR cu o lungime mai mică de 500 perechi
de baze (pb) nu necesită mult timp pentru o sinteză completă (aproximativ 30 de secunde
fiind suficiente). În general, un timp de extensie de 30 de secunde este suficient pentru
produși sub 50 pb, pentru produși cu lungimi c uprinse între 500 și 1500 pb sunt necesare 60
56
de secunde, iar pentru produși cu lungimi mai mari sunt necesare 90 de secunde.
Optimizarea timpului de elongare este necesară, deoarece un timp prea mare poate favoriza
apariția de artefacte (alinieri nespecif ice) (Palumbi et al., 1991), (Figura 17).
Figura 17 : Amplificarea exponențială a genei prin metoda PCR
(http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html )
Protocol Promega Corporation, USA:
10 μl GoTaq qPCR Master Mix, (Promega Wi USA) x 13
6 μl Nuclease Free Water, (Promega Wi USA) x 13
1 μl Primer Design TP53 x 13
17 μl/ probă + 3 μl ADNc/ probă
+ 3 μl Nuclease Free Water, Promega Wi USA (No template control)
Volum final/ probă = 20 μl
10 μl GoTaq qPCR Master Mix, (Promega Wi USA) x 13
6 μl Nuclease Free Water, (Promega Wi USA) x 13
1 μl Primer Design GAPDH x 13
17 μl/ pro ba + 3 μl ADNc/ probă
+ 3 μl Nuclease Free Water, (Promega Wi USA), (No template control)
Volum final/ probă = 20 μl
Deoarece gena GAPDH care codifică pentru secreția enzimei cu același nume,
glicerilaldehid 3-fosfat dehidrogenaza, este de multe ori mai stabilă și se exprimă în mod
57
constitutiv la un nivel ridicat în cele mai multe celule și țesuturi, este considerată o genă de
referință. Din acest motiv, GAPDH este utilizat frecvent în laboratoarele de cercetare ca și
control pentru RT -PCR.
Reacția de Real -Time PCR a fost efectuată utilizând programul Rotor Gene Q6000
(Corbett Research, QIAGEN Corporation, GERMANY) în care au fost introduși parametrii
oferiți mai jos:
Tabelul 3: Program pentru Real -Time PCR
Număr de
cicluri Program
standard
Activare 1 95 °C, 2
minute
Denaturare, Aliniere,
Extensie 40 95 °C, 15
secunde
60 °C, 60
secunde
2.6. Testarea produșilor PCR prin electroforeză în gel de agaroză
La sfârșitul fiecărei reacții de amplificare, este necesară o verificare a produșilor
obținuți pentru a observa dacă a avut loc amplificarea, dacă au avut loc amplificări multiple
sau pentru decelarea eventualelor contaminări.
Soluții necesare:
– agaroza SEAKEM;
– tampon TBE: soluție stoc 10X(108 Tris base, 55 acid boric, 40 ml 0,5 M EDTA (pH=8,0),
se completează cu apa bidistilată până la 1l) și 1X soluție de lucru (89mMTrios base, 89mM
acid boric, 2mM EDTA);
– loading buffer: 20% glicerol, 1mg/ml bromfe nol albastru, 1mg/ml xilencianol;
– soluție bromură de etidiu: pentru 1000X soluție stoc, cu o concentrație 0m5 mg/ml
sunt necesare: 50mg bromură de etidiu, 100ml apă bidistilată. Se diluează soluția stoc în
proporție 1:1000;
– marker molecular de 100pb.
Concentrația gelului de agaroză depinde de mărimea fragmentelor de ADN care
urmează a fi evidențiate prin electroforeză. Prepararea gelului a necesitat 900mg de agaroză
58
la 90ml TBE 1X. Astfel, se adaugă soluția de TBE peste agaroză, se amestecă până la
omo genizare și se introduce în cuptorul cu microunde pentru aproximativ 20 de secunde. Se
repetă acest pas până când se observă că agaroza s -a dizolvat. Flaconul ce conține gelul se
răcește sub jet de apă, iar după răcire, se introduc în flacon 1,5 μl bromură de etidiu și se
agită până la dispariția culorii roșii a bromurii.
Se toarnă gelul în suportul (asezat pe o suprafață perfect plană) pentru gel, se
introduce un pieptene și se lasă să se întăreasca. După întărire, se scoate pieptenele prin
culisare și se asează gelul în cuva de electroforeză ce conține tampon TBE. În fiecare probă s –
a adăugat 5 μl de Blue Orange Loading Buffer. Se pregătește de asemenea un marker
molecular de 100pb care se amestecă cu loading buffer. Probele se încarca în gelul de
agaroză , păstrând ordinea, întotdeauna pe ultima poziție disponibilă de încărcare fiind situat
controlul negativ (C -).
Electroforeza produșilor PCR a fost efectuată în câmp electric de 70V, timp de 60 -70
de minute. În funcție de mărimea fragmentelor (Gorgan, 200 7).
2.7. Calculul statistic al datelor experimentale
Aplicând metodele statisticii matematice se poate calcula o valoare cât mai apropiată
de cea reală și se poate estima și gradul de certitudine al respectivelor rezultate, deoarece
este greu ca în practică să se facă un număr foarte mare de determinări. Utilizarea statisticii
matematice în investigațiile experimentale este indispensabilă, deoarece compararea
gradului de corelare și estimare a fenomenelor necesită etaloane precise.
Pentru prelucrarea statistică a datelor am aplicat testul „t” al lui Student . Au fost
calculate:
-media aritmetică (M)
-eroarea standard a mediei (E.S.M.)
Media aritmetică
Reprezintă raportul dintre suma tuturor valorilor individuale și numărul total al
valorilor individual e (n) ale probelor.
unde:
nxi
Mn
i
1
59
xi – valorile individuale,
n – numărul total al valorilor individuale.
Eroarea standard
Deoarece media aritmetică nu scoate în evidență dispersia valorilor individuale în jurul
valorii medii, precum și granițele de variație a șirului statistic, se impune calcularea acestui
indice de dispersie, care este eroarea standard (Es).
unde σ reprezintă abaterea standard și se calculează după formula standard:
unde:
d21 reprezintă pătratul diferențelor dintre media aritmetică și valorile individuale;
n = numărul de determinări.
nEs
12
1
nd
60
Capitolul III
REZULTATE ȘI DISCUȚII
3.1. Viabilitate cu iodură de propidiu
Citometria în flux reprezintă o metodă rapidă și sigură de cuantificare a celulelor
viabile dintr -o suspensie celulară. Determinarea viabilității celulare este critică atunci când se
evaluează răspunsul la medicamente citotoxice sau al altor factori de mediu. În plus, adesea
este necesar să se diferențieze celulele moarte dintr -o suspens ie de celule vii pentru a le
putea exclude din analiză. Celulele moarte pot genera artefacte, ca urmare a legării
nespecifice de anticorpi sau prin asimilarea nedorită a probelor fluorescente. O metodă
pentru evaluarea viabilităț ii celulare este prin exclu dere a culorii. Celulele vii au membrane
intacte care exclud o varietate de coloranți care pot pătrunde cu ușurință membrana
deteriorată, membranele permeabile ale celulelor neviabile.
Iodura de propidiu (PI) este un colorant membranar, în general exclus de la celulele
viabile. Acesta se leagă de ADN -ul dublu catenar prin intercalarea între perechile de baze
azotate. Iodura de propidiu se determină la 488 nm și cu o deplasare Stokes relativ mare,
emite la lungimea de undă maximă de 617 nm. Datorită acestor c aracteristici spectrale, PI
poate fi utilizată în combinație cu alte substanțe fluorescente care se determină la lungimea
de undă de 488 nm cum ar fi izocianat de fluorescină (FITC) sau ficoeritrină (PE).
Viabilitatea celulară la 24 de ore la acțiunea trat amentului cu plasmă atmosferică rece
aplicat asupra celulelor normale Vero și tumorale HeLa poate fi evaluată prin analiza
pictogramelor incluse în figurile 18a și 18b și a datelor corespunzătoare din tabelele 4a și 4b.
61
MARTOR 24 h EXP-1
EXP-2 EXP-3
Figura 18 a: Efectele induse de către aplicarea tratamentului cu plasmă rece asupra viabilității celulare a
culturilor de celule normale Vero (pe verticală iodura de propidiu – PI, pe oriz ontală Annexin V)
62
Tabelul 4a. Reprezentarea procentuală a raportului dintre celulele normale vii / moarte în urma
tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule Vero
% Celule vii % Celule moarte
Media±ES p Media±ES p
Martor 86.61±1.37 13.39±1.37
EXP-1 83.91±1.06 NS 16.09±3.56 NS
EXP-2 80.31±2.50 NS 19.69±6.07 NS
EXP-3 80.71±2.43 NS 19.29±5.95 NS
MARTOR 4 h EXP -1
EXP-2 EXP-3
Figura 18b : Efectele induse de către aplicarea tratamentului cu plasmă rece asupra viabilității celulare a
culturilor de celule tumorale HeLa (pe verticală iodura de propidiu – PI, pe orizontală Annexin V)
63
Tabelul 4b. Reprezentarea procentuală a r aportului dintre celulele tumorale vii/ moarte în urma
tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule HeLa
% Celule vii % Celule moarte
Media±ES p Media±ES p
Martor 92.76±0.50 7.24±0.50
EXP-1 90.68±0.56 <0.05 9.32±2.70 <0.05
EXP-2 89.51±0.94 <0.05 10.49±3.35 <0.05
EXP-3 82.89±2.34 <0.05 17.11±5.78 <0.05
S-a constatat:
Comparativ cu lotul martor care prezintă în componența sa 86,61% celule vii, în cazul
celulelor normale, respectiv 92,76% în cazul celor tumorale, o diminuare a acestora
concomitent cu o creștere a celulelor moarte, valorile procentuale fiind cuprinse între
16,09% -19,29% celule Vero moarte și un procentaj mai mare între 9,32% – 17,11% în cazul
celulelor HeLa;
În urma celor trei expuneri la plasma rece, de câte 4 minute, cu tensiuni și frecvențe
diferite, există o creștere a procentului de celule normale moarte mai intensă dupa prima
expunere (16,09%), comparativ cu expunerile următoare între care există o diferență
procentuală mică de 19,69% și 19,29% ;
În cazul celulelor tumorale s -a constatat o creștere a procentului celulelor moarte în
urma aplicării tratamentului pe durata celor trei expuneri astfel: după prima expunere s -au
înregistrat 9.32% celule moarte, după cea de -a doua, 10,49%, iar după cea de -a treia 17,11% .
3.2. Ciclul celular cu iodură de propidiu
Iodura de propidiu (PI) este un colorant fluorescent care se leagă specific la ADN.
Această proprietate a dus la utilizarea sa comună în evaluarea ciclului celular, aneuploidiei și
apoptozei prin citometrie în flux. Când est e excitată de un laser la 488 nm, iodura de
propidiu emite un semnal care poate fi monitorizat de către detectorul de lungime de undă
roșie specific pentru ficoeritrină (FL2). Iodura de propidiu este exclusă din celulele viabile,
deoarece analiza conținutu lui de ADN din celule necesită o permeabilizare a membranei. În
evaluarea apoptozei, PI este utilizată pentru a distinge celulele necrotice sau celulele aflate
64
în stadii avansate ale apoptozei care au membranele permeabilizate și astfel permit legarea
PI, de celulele viabile sau aflate în apoptoză timpurie unde membranele sunt intacte și PI nu
se poate lega. Analiza ciclului celular dă indicații foarte precise asupra substratului molecular
care stă la baza interacțiunii unor compuși cu celula eucariotă. Ori ce modificare apărută în
integritatea materialului genetic sau în procesele care cordonează desfășurarea strictă a
ciclului celular va conduce la apariția unor blocaje ale celulelor studiate în diferite faze ale
acestui proces. Variațiile ciclului celular la acțiunea tratamentului cu plasmă atmosferică rece
aplicat asupra celulelor normale Vero și tumorale HeLa poate fi evaluată prin analiza
pictogramelor incluse în figurile 19.a și 19. b și a datelor corespunzătoare din tabelele 5.a și
5.b.
MARTOR EXP-1
EXP-2 EXP -3
Figura 19a: Profilurile ciclurilor celulare, înregistrate în condițiile tratamentului culturilor de celule
normale Vero cu plasmă rece(pe verticală iodura de propidiu – PI, pe orizontală Annexin V)
65
Tabelul 5a : Reprezentarea procentuală a raportului dintre celulele normale aflate în cele 3 faze ale
ciclului celular în urma tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule Vero
G0/G1 S G2/M
% celule p % celule p % celule p
Martor 69.12±1.00 15.37±0.32 13.26±0.36
EXP-1 66.99±0.24 NS 14.55±2.48 NS 15.10±0.45 <0.05
EXP-2 70.22±0.41 NS 12.23±2.44 <0.01 13.92±0.87 NS
EXP-3 62.31±0.33 <0.01 16.40±2.50 NS 17.24±0.39 <0.01
MARTOR EXP – 1
EXP-2 EXP-3
Figura 19b: Profilurile ciclurilor celulare, înregistrate în condițiile tratamentului culturilor de
celule tumorale HeLa cu plasmă rece (pe verticală iodura de propidiu – PI, pe orizontală Annexin V)
66
Tabelul 5b: Reprezentarea procentuală a raportului dintre celulele tumorale aflate în cele 3 faze ale
ciclului celular în urma tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule HeLa
G0/G1 S G2/M
% celule p % celule p % celule p
Martor 47.64±2.07 23.46±1.56 16.82±0.61
EXP-1 55.07±0.99 <0.05 25.35±2.25 NS 13.04±0.47 <0.01
EXP-2 58.08±0.33 <0.01 23.91±2.60 NS 12.50±0.21 <0.01
EXP-3 52.22±1.22 NS 27.79±3.24 NS 11.18±0.78 <0.01
S-a constatat:
Comparativ cu lotul martor, tratamentul cu tensiuni și frecvențe diferite ale plasmei
reci conduce la modificări evidente ale distribuției celulelor în cadrul diferitelor faze ale
ciclului celular. Astfel:
Celulele martor, luate ca punct de referință, pre zintă următoarea distribuție: G1 –
69,12%, S – 15,37%, G2 – 13,26% în celulele Vero și G1 – 47,64%, S – 23,46%, G2 – 16,82% în
celulele HeLa;
În cazul celulelor normale, după primele două expuneri la plasma rece se observă o
diminuare a celulelor din faza S și acumularea acestora în faza G2 (G1 – 66,99% / 70,22%, S –
14,55% / 12,23%, G2 – 15,10% / 13.92%), iar la a treia expunere apare o acumulare mai
accentuată a celulelor în faza S (16,40%) a ciclului celular și a celor din faza G2 (17,24%);
În cazul celu lelor tumorale, în urma celor 3 expuneri la plasma rece se constată o
acumulare semnificativă a celulelor în faza S (25,35%, 23,31%, 27,79%) și o diminuare a celor
din faza G2 (13,04%, 12,50%, 11,78%).
3.3.Apoptoza cu annexină
Anticoagulantul vascular uman Annexina V este o proteină de 35 -36 kDa care se leagă
de fosfolipide, calciu -dependentă, având o afinitate mare pentru fosfatidil -serină (PS). În
celulele normale viabile, fosfatidil -serina este situată pe suprafața citoplasma tică a
membranei celulare. Cu toate acestea, în celulele apoptotice, fosfatidil -serina este
translocată de pe partea interioară a membranei citoplasmatice pe cea exterioară, fiind
expusă la mediul extracelular unde poate fi detectată de conjugați ai Annexi nei V. În
67
apoptoza celulelor leucocitare, fosfatidil -serina de pe suprafața exterioară a celulei
marchează celulele pentru recunoașterea și fagocitoza de către macrofage. Conjugații
Annexin V foarte fluorescenți oferă metode de detectare rapidă și sigură p entru studierea
externalizării fosfatidil -serinei, un indicator al stadiilor intermediare ale apoptozei.
Fragmentarea nucleară, fluxul potențial al membranei mitocondriale, și activarea caspazei -3
precedă „răsucirea” fosfatidil -serinei pe durata apoptozei, în timp ce permeabilitatea pentru
iodura de propidiu și distrugerea citoscheletului apar mai târziu. Diferența intensității
fluorescenței dintre celulele apoptotice și cele non -apoptotice marcate cu conjugații
fluorescenți ai Annexinei V, măsurată prin ci tometrie în flux este de obicei de 100 de ori mai
mare.
Conjugații Annexinei V sunt foarte utili pentru citometria în flux și pentru microscopia
confocală sau epifluorescentă, și la fel ca marcarea anticorpilor, poate fi utilizată în
combinație cu alti col oranți, inclusiv pentru acizi nucleici pentru a evalua precis populațiile
mixte de celule apoptotice și non -apoptotice.
Investigarea apoptozei celulare apelează la o serie de metode (biochimice, citometrice,
flowcitometrice, electroforetice), una dintre ce le mai precise, datorită numărului mare de
evenimente analizate, și mai utilizate metode fiind cea flow citometrică care apelează la
fluorocromi cu situsuri de legare diferite pentru a diferenția celulele vii/moarte și
apoptotice/preapoptotice. Astfel, în cazul metodei cu Annexin V și PI (iodura de propidiu)
fiecare dintre cei doi componenți ai mixului de reacție se leagă specific la ținte diferite:
annexina V la fosfatidilserina ce se exprimă plenar la suprafața membranei celulare în
celulele apoptotice și PI care se leagă specific la molecula de ADN, membrana celulelor
viabile fiind impermeabilă pentru acest fluorocrom.
Analiza bivariată a populației de celule marcate cu cei doi compuși va permite
discriminarea dintre celulele vii (negative la ambii fluor ocromi utilizați), celulele moarte
(pozitive pentru PI și negative pentru Annexin V), celulele apoptotice (pozitive pentru
Annexin V și PI) și celulele preapoptotice (pozitive pentru Annexin V și negative pentru PI).
Sensul și amploarea reactivității apopt ozei celulare la acțiunea tratamentului cu
plasmă atmosferică rece, pe culturi de celule normale Vero și tumorale HeLa, pot fi evaluate
prin analiza pictogramelor incluse în figurile 20a și 20b și a datelor corespunzătoare din
tabelele 6a și 6b.
68
a) Celule normale Vero
MARTOR 4 h
EXP-1 EXP-2
MARTOR 24 h
69
EXP-1 EXP-2
Figura 20a . Efectele induse de către expunerea la plasma rece asupra apoptozei culturilor de celule
normale la 4 și 24 ore de la tratament și analiza bivariată Annexin V (orizontal) / PI (vertical) a distribuției
procentuale a celulelor vii, moarte, apoptotice si preapoptotice
Tabelul 6a : Reprezentarea procentuală a raportului dintre celulele normale vii, moarte, apoptotice și
preapoptotice în urma tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule vii Celule moarte Celule apoptotice Celule
preapoptotice
Martor
Vero 4h 91.23±0.19 3.61±0.21 4.22±0.22 0.93±0.17
Exp-1 66.47±20.24 NS 9.62±6.09 NS 22.33±13.98 NS 1.58±0.17 NS
Exp-2 68.23±10.43 NS 5.04±1.04 NS 18.98±5.02 <0.05 7.74±5.80 NS
Martor
Vero 24h 93.55±0.94 3.50±0.63 2.63±1.31 0.32±0.16
Exp-1 86.39±2.58 NS 5.99±0.76 NS 4.61±0.91 NS 3.01±1.13 NS
Exp-2 85.94±2.42 <0.05 5.35±0.61 NS 6.39±1.68 NS 2.32±0.29 <0.01
S-a constatat că:
Comparativ cu lotul martor care prezintă în componența sa 4.22% celule apoptotice
la 4 ore de la tratament, respectiv 2,63% celule apoptotice după 24 de ore de la tratament,
la celulele normale expuse la plasma rece s -a înregistrat o creștere a procentului celulelor
apoptotice mai intensă după 4 ore de la expune re (22,33%, 18,98%) față de datele obținute
după 24 de ore de la expunere (4,61%, 6,39%).
70
b) Celule tumorale HeLa
MARTOR 4 h
EXP-1 EXP -2
MARTOR 24 h
71
EXP-1 EXP -2
Figura 20b . Efectele induse de către expunerea la plasma rece asupra apoptozei culturilor de celule
tumorale la 4 și 24 ore de la tratament și analiza bivariată Annexin V (orizontal) / PI (vertical) a distribuției
procentuale a celulelor vii, moarte apoptotice și preapoptotice
Tabelul 6 b: Reprezentarea procentuală a raportului dintre celulele tumorale vii, moarte, apoptotice și
preapoptotice în urma tratamentului cu plasmă rece aplicat
Celule vii Celule moarte Celule apoptotice Celule
preapoptotice
Martor
HeLa 4h 89.75±0.52 2.78±0.19 4.93±0.22 2.53±0.16
Exp-1 64.29±7.78 <0.05 4.56±1.28 NS 26.18±6.41 <0.05 4.97±0.40 <0.01
Exp-2 85.35±1.86 NS 3.84±0.77 NS 8.40±1.91 NS 2.42±0.33 NS
Martor
HeLa
24h 93.37±0.81 6.53±0.84 0.10±0.03 0.00±0.00
Exp-1 67.43±4.69 <0.01 31.51±5.08 <0.01 0.90±0.33 NS 0.16±0.07 NS
Exp-2 83.39±1.47 <0.01 16.17±1.35 <0.01 0.39±0.13 NS 0.05±0.01 <0.01
S-a constatat că:
Comparativ cu lotul martor care prezintă în componența sa 4,93% celule apoptotice
la 4 ore de la tratament, la celulele tumorale expuse la plasma rece se remarcă o creștere
mai mare a procentului de celule aflate în apoptoză (26,18%) după prima expunere față de
cea de -a doua expunere în care doar un procent de 8,40% din celule au devenit apoptotice;
72
Similar, la 24 de ore de la tratamentul indus s -au înregistrat creșteri ale procentelor
de celule apopt otice după cele două expuneri (0,90% respectiv 0,39%) față de martorul care
prezenta 0.10% celule apoptotice.
3.4. Cuantificarea ADN total și testarea produșilor PCR prin electroforeză în gel de
agaroză
Cuantificarea ADN s -a realizat cu ajutorul spectofotometrului ACT -Gene ASP -3700
utilizând 2 μl/ probă. Au rezultat următoarele concentrații prezentate în Tabelele 7a, 7b.
Tabelul 7a: ADN total celule Vero
Sample ID Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Concentrație
(ng/ul) Tip
VM 0.275 0.149 0.108 1.85 2.55 13.7 ADNdc
VM 0.441 0.227 0.208 1.94 2.12 22 ADNdc
VM 0.754 0.415 0.435 1.82 1.73 37.6 ADNdc
VE1 0.391 0.201 0.259 1.95 1.51 19.5 ADNdc
VE1 0.822 0.429 0.585 1.92 1.41 41.1 ADNdc
VE1 0.426 0.226 0.255 1.88 1.67 21.2 ADNdc
VE2 0.336 0.181 0.264 1.86 1.27 16.7 ADNdc
VE2 0.252 0.124 0.13 2.03 1.94 12.5 ADNdc
VE2 0.29 0.149 0.139 1.95 2.09 14.4 ADNdc
VE3 0.152 0.064 0.089 2.37 1.71 7.6 ADNdc
VE3 0.163 0.094 0.121 1.73 1.35 8.1 ADNdc
VE3 0.204 0.102 0.137 2 1.49 10.2 ADNdc
Concentrațiile determinate de ADN total în celulele Vero variază între 7,6 ng și 41,1 ng.
73
Tabelul 7b : ADN total celule HeLa
Sample ID Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 Concentrație
(ng/ul) Tip
HM 0.433 0.211 0.147 2.05 2.95 21.6 ADN
HM 0.493 0.244 0.181 2.02 2.72 24.6 ADN
HM 0.36 0.155 0.124 2.32 2.9 17.9 ADN
HE1 0.623 0.32 0.273 1.95 2.28 31.1 ADN
HE1 0.474 0.236 0.199 2.01 2.38 23.6 ADN
HE1 0.359 0.174 0.136 2.06 2.64 17.9 ADN
HE2 0.572 0.275 0.211 2.08 2.71 28.5 ADN
HE2 0.713 0.356 0.302 2 2.36 35.6 ADN
HE2 0.495 0.23 0.192 2.15 2.58 24.7 ADN
HE3 0.486 0.243 0.19 2 2.56 24.2 ADN
HE3 0.624 0.315 0.251 1.98 2.49 31.2 ADN
HE3 0.731 0.363 0.304 2.01 2.4 36.5 ADN
Concentrațiile determinate de ADN total în celulele HeLa variază între 17,9 ng și 36,5
ng.
La sfârșitul fiecărei reacții de amplificare, este necesară o verificare a produșilor
obținuți pentru a observa dacă a avut loc amplificarea, dacă au avut loc amplif icări multiple
sau pentru decelarea eventualelor contaminări. Electroforeza a fost realizată în gel de
agaroză 1,5%, 10µl, la 70V, timp de 60 minute (Figura 21).
74
Figura 21: Cuantificarea electroforetică a produșilor PCR rezultați
Produșii PCR rezultați nu prezintă urme de fragmentare și sunt în conformitate cu
datele din literatura de specialitate.
Testarea produșilor PCR prin electroforeză în gel de agaroză s -a realizat pentru a se
verifica lungimea și integritatea fragmentelor de ADN obținute. După cum putem observa în
Figura 22 ampliconii au o lungime mai mică de 100 pb și sunt în conformitate cu datele din
literatura de specialitate, neprezentând urme de fragmentare.
Figura 22 : Cuantificarea electroforetică a produșilor PCR rezultați
75
Ulterior a fost utilizat ADNt, produși PCR de aprox 1140pb și primeri cu secvență
scurtă, pentru a identifica po tențialele efecte ale speciilor reactive de oxigen generate de
plasmă. Probele au fost încarcate într-o placă cu 96 de godeuri, în 3 variante experimentale:
Martor, expunere 1 min ut și expunere 5 minute (Figura23 ).
Figura 23: Probe de ADNt, produși PCR și primeri cu secvență scurtă
Tabelul 8: Cuantificarea spectrofotometrica înainte de expunere
Probă ID Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 concentrație
(ng/ul) Probă
eșantion
ADN total 1,989 0,973 1,253 2,04 1,59 99,4 ADNdc
ADN total 2,02 1 1,297 2,02 1,56 101 ADNdc
ADN total 2,074 1,017 1,289 2,04 1,61 103,7 ADNdc
pUC18 0,282 0,163 0,064 1,73 4,41 14,1 ADNdc
pUC18 0,324 0,182 0,128 1,78 2,53 16,2 ADNdc
pUC18 0,303 0,163 0,091 1,86 3,33 15,1 ADNdc
–
47seqPrimer 0,078 0,074 -0,045 1,05 -1,73 3,9 ADNdc
76
Figura 24: Reprezentarea grafică a concentrațiilor martorilor
În urma analizei probelor înainte de expunerea la plasmă a rezultat o variație a
concentrațiilor de ADN total cuprinsă între 99,4 -103,7 (ng/ul) , deasemenea variația
concentrației probei pUC18 este cuprinsă între 14,1 -16,2 (ng/ul) , iar ultima variație a probei –
47seqprimer este încadrată în int ervalul 3,9 -6,32 (ng/ul) , (Figura 24) .
În prima coloană a tabelului 4, sunt indicați martorii probelor folosite în acest studiu,
următoarele trei coloane conțin valorile absorției la lungimi d e undă diferite (260, 280, 230
nm), coloana a șaptea conține valorile concentrațiilor de ADN în ng/ul, iar ultima coloană
indică tipul probei, și anume, ADN dublu -catenar.
Absorția la lungimea de undă λ=260 nm indică concentrația ADN -ului, cea la λ=280 nm
indică concentrația proteinelor, iar cea la λ=230 nm indică concentrația compușilor fenolici și
a polizaharide lor (Tabel 8).
Valoarea rapoartelor 260/280 și 260/230 indică puritatea probelor. Pentru ca ADN -ul
să aibe o puritate mare, este nevoie ca valorile acestor rapoarte să fie mai mari de 1,8. 99.4 101103.7
14.1 16.2 15.1
3.9 4.8 6.3 6.2-
47seqPrimer 0,098 0,082 -0,036 1,2 -2,72 4,8 ADNdc
–
47seqPrimer 0,127 0,105 -0,026 1,21 -4,88 6,3 ADNdc
–
47seqprimer 0,126 0,096 0,004 1,31 31,5 6,2 ADNdc
77
Raportând la acest lucru, se constată că ADN -ul cu o puritate mare există în cazul probelor
de ADNt, pUC18 și – 47seqPrimer (ADNt și pUC18 în cazul raportului 260/280, iar pUC18 și
-47seqPrimer în cazul raportului 260/230)
3.5. Valorile medii ale concentrațiilor martorilor
Tabel 9: Valorile medii ale concentrațiilor probelor
Cod probă 260/280 260/230 concentrație
(ng/ul) Tip
probă
ADN total 2,033 1,587 101,367 ADN
pUC18 1,790 3,423 15,133 ADN
–
47seqPrimer 1,193 5,543 5,300 ADN
În urma realizării mediei aritmetice dintre cele trei valori ale probei de ADN total a
rezultat o valoare de 101,367 (ng/ul). Media aritmetică a celor trei probe de pUC18 este
15,133(ng/ul), iar ultima valoare medie a celor patru probe de -47seqPrimer este 5,300
(ng/ul), (tabelul 9).
Tabelul 10: Deviația standard
Probă ID 260/280 260/230 concentrație
(ng/ul) Probă
eșantion
ADN total 0,012 0,025 2,173 ADNdc
pUC18 0,066 0,943 1,050 ADNdc
–
47seqPrimer 0,107 17,355 1,158 ADNdc
Deviatia standard (S) a unui set de date (D), ce conține N înregistrări și având valoarea
medie M D, se calculează cu următoarea formulă :
78
Formula pentru deviatia standard
unde :
n ={1…N -1, N }.
MD – valoarea medie a setului de date D
S2 = valoarea varianței
Ținând cont de definiția variației unui set de date D, rezultă că, deviația standard este
rădăcină pătrată din valoarea varianței.
Deviatia standard a unui set de date permite estimarea uniformității valorilor acestuia,
mai precis, cu cât valoarea acesteia este mai mic ă cu atât valorile setului sunt grupate în
jurul valorii medii. Invers, cu cât deviatia standard este mai mare, cu atât valorile setului sunt
mai depărtate față de valoarea medie.
După efectuarea deviației standard a celor trei probe de ADN total a rezultat o
valoarea a concentrației de 2,173 (ng/ul) . Deasemenea, aceleași calcule s -au efectuat si
asupra probelor de pUC18 rezultând o valoare de 1,050 (ng/ul) și pe cele patru probe ale –
47seqPrimer având o valoare de 1,158 (ng/ul), (Tabelul 10).
Tabelul 11: Timpii de expunere a probelor la plasmă rece
Probă ID Abs260 Abs280 Abs230 260/280 260/230 concentrație
(ng/ul) Probă
eșantion
1-ref 0,191 0,055 -0,053 3,47 -3,6 9,5 ADNdc
2-15kv -5min 0,224 0,126 0,292 1,78 0,77 11,2 ADNdc
3-15kv -5min 0,238 0,12 0,324 1,98 0,73 11,8 ADNdc
4-ref-1min 0,236 0,113 -0,056 2,09 -4,21 11,8 ADNdc
5-15kv -1min 0,232 0,082 0,099 2,83 2,34 11,5 ADNdc
6-15kv -1min 0,37 0,166 0,157 2,23 2,36 18,5 ADNdc
7-15kv -1min 0,097 0,018 -0,232 5,39 -0,42 4,8 ADNdc
8-15kv -1min –
apă 0,087 -0,029 -0,247 -3 -0,35 4,3 ADNdc
Efectul plasmei a fost evaluat inițial pe soluții diluate de primer cu lungimi și
concentrații cunoscute, utilizând o putere a sursei de 15Kv, la 2 timpi de 1 și 5 minute.
Prima probă ref netratată are o concentrație de 9,5 (ng/ul).
Pentru probele 2 și 3 care sunt tratate în aceleași condiții, și anume, asupra
amândurora utilizând o sursă de 15 Kv timp de 5 min, s -au obținut aproximativ ace eași
concentrație, cu o diferență între cele de 0,6 (ng/ul). Proba 2 are o valoare a concentrației de
11,2 (ng/ul), pe când proba 3 are o concentrație de 11,8 (ng/ul).
79
Mai mult s -a observat faptul că în cazul probelor 3 și 4 s -a obtinut aceeași concentrați e
de 11,8 (ng/ul) ținând cont de faptul că proba 3 folosește o sursa de 15Kv timp de 5 min,
spre deosebire de proba 4 asupra căreia nu acționează nici o sursă, ea fiind lasată doar 1 min
la plasmă rece.
În urma expunerii probelor 5,6,7 la plasmă rece, într ebuințînd surse de 15Kv timp de 1
min s -a obținut valori diferite ale concentrației. Proba 5 are o concentrație a cărei valoare
este de 11,5 (ng/ul), proba 6 are o valoare mai crescută de 18,5(ng/ul), iar în cazul celei de a
7 probă s -a observat o scădere a concentrație având o valoare de 4,8 (ng/ul).
Ultima probă a constat într -un control utilizând o sursa de 15Kv, timp de un 1 min și a
rezultat o con centrație minimă de 4,3 (ng/ul), (Tabelul 11).
3.6. Variantele experimentului de expunere la plasmă rece
Probă Abs26
0 Abs28
0 Abs23
0 260/28
0 260/23
0 concentrați
e (ng/ul) Probă
eșantion
PrE11 0,079 0,1 0,399 0,79 0,2 3,9 ADNdc
PrE11 0,072 0,101 0,408 0,71 0,18 3,6 ADNdc
PrE11 0,074 0,081 0,419 0,91 0,18 3,7 ADNdc
PrE12 0,091 0,108 0,502 0,84 0,18 4,5 ADNdc
PrE12 0,1 0,129 0,534 0,78 0,19 4,9 ADNdc
PrE12 0,085 0,096 0,518 0,89 0,16 4,2 ADNdc
PrE21 0,209 0,216 1,479 0,97 0,14 10,4 ADNdc
PrE21 0,195 0,21 1,42 0,93 0,14 9,7 ADNdc
PrE21 0,21 0,228 1,449 0,92 0,14 10,4 ADNdc
PrE22 0,073 0,086 0,182 0,85 0,4 3,6 ADNdc
PrE22 0,057 0,075 0,189 0,76 0,3 2,8 ADNdc
PrE22 0,078 0,1 0,217 0,78 0,36 3,8 ADNdc
PrM 0,107 0,097 0,028 1,1 3,82 5,3 ADNdc
PrM 0,1 0,132 0,027 0,76 3,7 5 ADNdc
PrM 0,095 0,096 0,036 0,99 2,64 4,7 ADNdc
pUC18E11 0,307 0,243 0,637 1,26 0,48 15,3 ADNdc
pUC18E11 0,304 0,244 0,653 1,25 0,47 15,1 ADNdc
80
pUC18E11 0,307 0,225 0,629 1,36 0,49 15,3 ADNdc
pUC18E12 0,338 0,243 0,547 1,39 0,62 16,9 ADNdc
pUC18E12 0,333 0,246 0,558 1,35 0,6 16,6 ADNdc
pUC18E12 0,351 0,256 0,583 1,37 0,6 17,5 ADNdc
pUC18E21 0,464 0,373 0,934 1,24 0,5 23,2 ADNdc
pUC18E21 0,503 0,391 0,962 1,29 0,52 25,1 ADNdc
pUC18E21 0,49 0,403 0,955 1,22 0,51 24,4 ADNdc
pUC18E22 0,235 0,203 1,379 1,16 0,17 11,7 ADNdc
pUC18E22 0,216 0,178 1,376 1,21 0,16 10,8 ADNdc
pUC18E22 0,238 0,199 1,426 1,2 0,17 11,8 ADNdc
pUC18M 0,353 0,208 0,217 1,7 1,63 17,6 ADNdc
pUC18M 0,367 0,224 0,25 1,64 1,47 18,3 ADNdc
pUC18M 0,326 0,202 0,212 1,61 1,54 16,2 ADNdc
ADNtotalE1
1 0,343 0,195 0,282 1,76 1,22 17,1 ADNdc
ADNtotalE1
1 0,363 0,215 0,292 1,69 1,24 18,1 ADNdc
ADNtotalE1
1 0,345 0,205 0,291 1,68 1,19 17,2 ADNdc
ADNtotalE1
2 0,291 0,16 0,332 1,82 0,88 14,5 ADNdc
ADNtotalE1
2 0,294 0,16 0,327 1,84 0,9 14,7 ADNdc
ADNtotalE1
2 0,331 0,186 0,356 1,78 0,93 16,5 ADNdc
ADNtotalE2
1 0,314 0,234 0,842 1,34 0,37 15,7 ADNdc
ADNtotalE2
1 0,308 0,239 0,863 1,29 0,36 15,3 ADNdc
ADNtotalE2
1 0,33 0,231 0,901 1,43 0,37 16,4 ADNdc
81
ADNtotalE2
2 0,248 0,133 0,597 1,86 0,42 12,4 ADNdc
ADNtotalE2
2 0,248 0,128 0,586 1,94 0,42 12,4 ADNdc
ADNtotalE2
2 0,26 0,155 0,621 1,68 0,42 12,9 ADNdc
ADNtotalM 0,308 0,174 0,185 1,77 1,66 15,3 ADNdc
ADNtotalM 0,282 0,148 0,143 1,91 1,97 14 ADNdc
ADNtotalM 0,298 0,164 0,155 1,82 1,92 14,8 ADNdc
Figura 25: Reprezentarea grafică a primerului -47seq după cei trei timpi de tratament
Figura 2 5 cuprinde prezentarea grafică a concentrațiilor primerului -47seq, după ce
fiecare probă de primer a fost expusă de trei ori la o putere de 15Kv, timp de trei intervale
de timp.
În urma primei ex puneri care s -a realizat de doua ori, a rezultat o concentrația a
primerul -47seq cu o valoare cuprinsă între 3,6 -4,9 (ng/ul). Cea de a doua expunere a
evidențiat o concentrație cuprinsă între 2,8 -10,4 (ng/ul). Iar ultima expunere a primerului
martor indic ă o variație a concentrațiilor cuprinsă între 4,7 -5,3 (ng/ul). 024681012
PrE11
PrE11
PrE11
PrE12
PrE12
PrE12
PrE21
PrE21
PrE21
PrE22
PrE22
PrE22
PrM
PrM
PrMconcentrație (ng/ul)
82
Figura 26 : Reprezentarea grafică a variației concentrației înainte și după expunere a
primerului -47seq
Conform graficului de mai sus(Figura 2 6) se observă o ușoară variație a concentrație în
prima expunere, având loc o creștere a valorii concentrației în cea de a doua expunere, iar
ultima expunere a primerului martori aduce concentrația la valori apropiate cu cele de
dinainte de expunere.
Figura 27: Reprezentarea grafică a primerului p UC18 după cei trei timpi de tratament
Figura 2 7 cuprinde prezentarea grafică a concentrațiilor primerului pUC18, după ce
fiecare probă a fost expusă de trei ori la o putere de 15Kv, timp de trei intervale de timp. 3.94.86.3 6.2
3.93.6 3.74.54.9
4.210.4
9.710.4
3.6
2.83.85.354.7concentrație (ng/ul)
051015202530
pUC18E11
pUC18E11
pUC18E11
pUC18E12
pUC18E12
pUC18E12
pUC18E21
pUC18E21
pUC18E21
pUC18E22
pUC18E22
pUC18E22
pUC18M
pUC18M
pUC18Mconcentrație (ng/ul)
83
În urma primei expuneri care s -a realizat de doua ori, a rezultat o creștere constantă a
concentrației pUC18 având o valoare cuprinsă între 15,1 -17,5(ng/ul). Cea de -a doua
expunere a evidențiat o scădere a concentrație de la 25,1 -10,8 (ng/ul). Iar ultima expunere a
primerului martor pUC18 indică o variație a concentrațiilor cuprinsă între 16,2 -18,3 (ng/ul).
Figura 28 : Reprezentarea grafică a variației concentrației probei pUC18 înainte de expune și după
expunere
În urma graficului de mai sus(Figura 28 ), se observă inițial ca nivelul concent rației este
aproximativ egal în prima expunere, creștere dupa a doua expunere, după care nivelul
concentrației scade ajungând la valori aproximativ egala cu cele de dinainte de expunere.
Figura 29: Reprezentarea grafică ADN total după cei trei timpi de tratament 14.116.215.1 15.3 15.1 15.316.9 16.617.523.225.124.4
11.710.811.817.6 18.3
16.2concentrație (ng/ul)
02468101214161820
ADNtE11
ADNtE11
ADNtE11
ADNtE12
ADNtE12
ADNtE12
ADNtE21
ADNtE21
ADNtE21
ADNtE22
ADNtE22
ADNtE22
ADNtM
ADNtM
ADNtMconcentrație (ng/ul)
84
Figura 29 cuprinde prezentarea grafică a concentrațiilor de ADN total, după ce fiecare
probă a fost expusă de trei ori la o putere de 15Kv, timp de trei intervale de timp.
Din prima citire a ADN total a rezultat o variație a concentrației cuprinsă între 14,5 –
18,1 (ng/ul). În urma celei de -a doua expunere s -a remarcat o valoare a concentrațiilor
cuprinsă între 12,4 -16,4( ng/ul). Ultima expunere a ADN total martor indică o variație a
concentrațiilor cuprinsă între 14 -15,3 (ng/ul).
Figura 30: Reprezentarea grafică a variației concentrației ADN total înainte de expune și după expunere
În urma analizei graficului din Figura 30 , se observă o evidentă scădere a concentrației
de ADN total după ce a fost expusă la o anumită putere, la timpi dife riți
Figura 3 1 prezintă efectul plasmei cu descărcare în aer asupra soluției de ADN. Analiza
prin spectrofotometrie UV a arătat creșterea absorbției soluției care corespunde
fragmentării moleculelor totale de ADN, unde fragmente mai mici sunt responsabile pentru
o absorbție mai mare. Efectul expunerii plasmatice la ADN a crescut concomitent cu
amplitudinea de tensiune aplicată și timpul de expunere. Analiza spectrofotometrie UV a
fost suplimentată cu analiza fluorometrică a amplonilor de 1140 bp. 99.4 101 103.7
17.1 18.1 17.2 14.5 14.7 16.5 15.7 15.3 16.412.4 12.4 12.9 15.3 14 14.8concentrație (ng/ul)
85
Figura 3 1: Absorbției soluției care corespunde fragmentării moleculelor totale de ADN
3.7. Evaluarea integrității A DN prin RT -PCR
Figura 32 arată că fluorescența medie a probelor expuse a fost mai mică comparativ cu
proba de referință.Cu afinitatea cunoscută aSYBR Green pentru ADN dublu catenar, scăderea
înregistrată a fluorescenței ar putea fi legată de denaturarea ADN -ului cu apariția
fragm entelor singulare catenare sau cu degradarea ADN care conduce la scăderea numărului
de situsuri de legare a fluorochromului.
SYBR Green este un colorant fluorescent frecvent utilizat care leagă moleculele de ADN
dublu catenar prin intercalarea bazelor ADN. Se utilizează în PCR cantitativ, deoarece
fluorescența poate fi măsurată la sfârșitul fiecărui ciclu de amplificare pentru a determina,
relativ sau absolut, cât de mult ADN -ul a fost amplificat.
Figura 32: Fluorescența medie a probelor
86
CONCLUZII
Analiz a distribuției frecvenței celulelor tumorale în diferitele faze ale ciclului celular
relevă, comparativ cu martorul, reducerea frecvenței celulelor în faza G1, progresia și
blocarea acestora în faza S și diminuarea corespunzătoare a frecvenței celulelor di n faza G2.
Substratul molecular, care generează modificările în distribuția ciclului celular, suferă
perturbări datorită alterărilor structurale și funcționale ale mecanismelor intime de reglare a
replicării precise a moleculei de ADN, rezultând acumulare a unui număr crescut de celule cu
erori și care nu primesc undă verde pentru a progresa în etapa următoare a ciclului celular.
Se remarcă, de asemenea, creșterea frecvenței celulelor apoptotice mai intensă la 4
ore după prima expunere la plasma rece (EXP -1 cu tensiunea de 4kVși frecvența de 4 kHz)
atât la celulele tumorale (26,18% față de martor 4,93%), cât și la cele normale (22,33% față
de martor 4,22%).
O analiză generală a datelor obținute în condițiile investigării flowcitometrice a
viabilității celulare, proliferării și ciclului celular a celulelor neoplazice HeLa expuse timp de 4
minute la plasma atmosferică rece, la diferite frecvențe și tensuni, ind ică o perturbare
profundă a desfășurării normale a proceselor celulare, concretizate prin scăderea viabilității
celulare, prin gradul crescut de inhibare a proliferării celulare și prin perturbarea gravă a
distribuției normale a celulelor în cadrul diferit elor faze ale ciclului celular.
Markerii care au rol de monitorizare a integrității genomului celular, determi nă la
concentrații ridicate oprirea ciclului celular în G1, permițând un timp mai îndelungat de
intervenție a proceselor reparatorii ale ADN leza t.
S-a constatat că aplicarea tratamentului cu plasmă non -termică, constituie un fel de
trigger (declanșator) efector al apoptozei, prin schimbările induse la nivelul ADN celular.
In vitro sunt înregistrate modificări asupra moleculelor de acizi nucleici dimensiuni
mari, deci, speciile reactive de oxigen generate de plasmă, pot induce o degenerare a
legăturilor la nivelul macromoleculelor de acizi nucleici, însă la o scară mult redusă
compa rativ cu efectele apoptotice observate in vivo .
87
BIBLIOGRAFIE
1. Alnemri E.S., F ernandes T.F., HALDAR S. 1992 – Et. al.,Involvement of BCL -2 in
glucocorticoid induced apoptosis of human pre -B leukaemias , Cancer Res., 32, 491 -495.c
2. Anastas J. N., Moon R. T .,2013 -WNT signalling pathways as therapeutic
targets in cancer . Nat. Rev. Cancer 13, 11 –26.
3. Ashkenazi A., 2002 – Targeting death and decoy receptors of the tumour –
necrosis factor superfamily. Nat. Rev. Cancer, 2, 6, 420 -430.
4. Bansal N., H oule A., M einykovych G., 1991 – Apoptosis made off cell death
induced in T cell leukemia lines by dexamethasone and other agents , FASEB J., 5, 211 -216
5. Barnum K.J., O'Connell M.J, 2014 – Cell Cycle Regulation by
Checkpoints ,Methods Mol Biol.; 1170: 29–40.
6. Beach D., D urkacz B., Nurse P.,1982 – Functionally homologous cell cycle
control genes in budding and fission yeast. Nature 300, 706 –709
7. Bienz M., Clevers H., 2000 -Linking colorectal cancer to Wnt signaling . Cell 103,
311–320.
8. Brugalos J., C handersckaran C., G ordon J., 1995 -Radiation induced cell cycle
arrest compromised by p21 deficiency , Nature , 377, 552 -557.
9. Clancy S., 2008 – DNA damage & repair: mechanisms for maintaining DNA
integrity , Nature Education https://www.nature.com/scitable/topicpage/dna -damage –
repair -mechanisms -for-maintaining -dna-344
10. Cruchten S., Broeck V. E. W., 2002 – Morphological and biochemical aspects of
apoptosis, oncosis and necrosis . Anat. Histol. Embryol., 31, 214 -223
11. Dănilă L., Alecu M., Coman G., 1999 -Apoptoza. Moartea celulară programată .
Edit. Acad. Române, Buc., 410p.
12. Dănilă L., Alecu M., Coman G., 2002 – Apoptoza. Moartea celulară programată ,
Ediția a II -a, Editura Academiei Române, p. 30 -86
13. DI LeonardoA., Linke S.P., Clarkin K., 1994 -DNA demage triggers a prolonged
p53 dependent G, arrest and long term induction of Cip 1 in normal human fibroblasts , Gene
Dev., 8, 2540 -2551.
14. Dyson N., 1998 -The regulation of E2F by pRB -famil y proteins . Genes Dev. 12,
2245 –2262
15. Elledge S. J., 2008 -Analysis Reveals Extent of DNA Repair Army , Howard
Hughes Medical Institute https://www.hhmi.org/news/analysis -reveals -extent -dna-repair –
army
16. Elmore S., 2007 -Apoptosis: A review of programmed cell death . Toxicologic
Pathology, 35, 4, 495 -516.
17. Evans T., Rosenthal E. T., Youngblom J., Distel D., Hunt T.,1983 -Cyclin: a
protein speci fied by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage
division . Cell 33, 389 –396
18. Fields D., 2016 – The Cell Cycle: An Overview, New Medical Life Sciences
https://www.news -medical.net/life -sciences/The -Cell-Cycle -An-Overview.aspx
88
19. Galactinov K., Chen X., Beach D., 1996 -CDC25 cell cycle phosphatase as a
target of c -myc, Nature, 382, 511 -517.
20. Gewies A., 2003 -Introduction to apoptosis . ApoReview, 23p.
www.celldeath.de/ encyclo/aporev.htm
21. Gopinathan L., Ratnacaram C. K., Kaldis P., 2011 – Established and novel
Cdk/cyclin complexes regulating the cell cycle and development . Results Probl. Cell Differ. 53,
365–389
22. Gorgan D.L., 2007 – Filogenie molecul ară în cadrul genurilor Cyprinus și
Carassius, Editura Universității Alexandru Ioan Cuza, Iași, p.20 -200.
23. Gorgan D.L., 2008 – Introducere în studiul filogeniei și filogeografiei
moleculare, Editura Bioflux, ClujNapoca.Online, p. 96 -158.
24. Greenhalgh DG., 199 8 – The role of apoptosis inwound healing . Int J Biochem
Cell Biol;30:1019 –30.
25. Hakem R., 2008 -DNA -damage repair; the good, the bad, and the ugly , The
EMBO Journal v. 27, p. 589 –605 http s://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2262034/
26. Hannenhalli S., Kaestner K. H. 2009 -The evolution of Fox genes and their role
in development and disease . Nat. Rev. Genet. 10, 233 –240.
27. Harbour J. W., Dean D. C., 2000 – The Rb/E2F pathway: expanding roles and
emerging paradigms . Genes Dev. 14, 2393 –2409.
28. Harbour J. W., Dean D. C., 2000 – The Rb/E2F pathway: expanding roles and
emerging paradigms . Genes Dev. 14, 2393 –2409.
29. Hassan S.T., 2011 – DNA Integrity Index: Future for cancer detection? , New
Medical Life Sciences https://www.news -medical.net/news/20110330/DNA -Integrity -Index –
Future -for-cancer -detection.aspx
30. Herrera R.E., Makela T.P., Weinberg R.A., 1996 -TGFb – induced growth
inhibition in primary fibloblasts requires the Rb protein , Moll. Cell. Biol., 7, 1335 -1342.
31. Jiang M., Gao Y., Yang T., Zhu X., Chen J., 2009 – Cyclin Y, a novel membrane –
associated cyclin, interacts with PFT K1. FEBS Lett. 583, 2171 –2178
32. Kerr F. R. J., 1999 -A personal account of events leading to the definition of the
apoptosis concept . Apoptosis : Biology and mechanisms . Ed. by S. Kumar, Springer, 1 -10.
33. Kimball, John W., 2011 – Frog Embryology , Kimball's Biol ogy Pages. Last
modified May 17, 2011. http://www.biology -pages.info/F/FrogEmbryology.html#cleavage .
34. King KL, Cidlowski JA., 1998 -Cell cycle regulation and apoptosis . Annu Rev
Physiol;60:601 –17
35. Lim S., Kaldis P., 2013 – Cdks, cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle
regulation , Development 140, p. 3079 -3093.
36. Malumbres M., Harlow E., Hunt T., Hunter T., Lahti J. M., Manning G., Morgan
D. O., Tsai L. H., Wolgemuth D. J., 2009 – Cyclin -dependent kinases: a family portrait . Nat. Cell
Biol. 11, 1275 –1276.
37. Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, Wang HG, Lin HK, Liebermann DA,
Hoffman B, Reed JC. , 1994 – Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl -2 and bax gene
expression in vitro and in vivo . Oncogene;9:1799 –805
89
38. Moldoveanu E., Popescu M. L., 1999 -Apoptoza. Mecanisme moleculare . Edit.
Univ. „Carol Davila”, Buc., Ediția a II -a, 165p.
39. Myatt S. S., Lam E. W. F., 2007 – The emerging roles of forkhead box (Fox)
proteins in cancer. Nat. Rev. Cancer 7, 847 –859.
40. Nakagawat T., ZHU H., Morishima N., LI E., XU J., Yankner B. A., Yuan J.,2000 –
Caspase -12 mediates endoplasmic -reticulum specific apoptosis and cytotoxicity by
amiloidbeta . Nature, 403, 6765, 98 -103.
41. Nijhawan D, Honarpour N, Wang X ., 2000 – Apoptosis in neural development
and disease . Annu Rev Neurosci;23:73 –87.
42. Nurse P., Thuriaux P., 1980 -Regulatory genes controlling mitosis in the fission
yeast Schizosaccharomyces pombe . Genetics 96, 627 –637
43. Nurse P., Thuriaux P., Nasmyth K., 1976 – Genetic control of the cell division
cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 146, 167 –178.
44. OpenStax College, Biology, 2015 – Control of the cell cycle . In OpenStax CNX.
Retrieved , http://cnx.org/contents/185cbf87 -c72e -48f5 -b51e –
f14f21b5eabd@9.87:53/Control -of-the-Cell-Cycle .
45. Opferman JT, Korsmeyer SJ., 2003 – Apoptosis in the development and
maintenance of the immune system . Nat Immunol;4:410 –5
46. Osborne BA., 1996 – Apoptosis and the maintenance of homoeostasis in the
immune system. Curr Opin Immunol;8:245 –54.
47. Pan X.,Ping Y., Yuan D. S., Wang X., Based J.S., Boeke J.D., 2006 -A DNA
Integrity Network in the Yeast Saccharomyces cerevisiae , Cell 124, p. 1069 –1081
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867406001188
48. Păunescu V., 2006 -Aspecte actuale în carcinogeneza colo -rectală. Rolul
apoptozei. Jurnalul de Chirurgie, Iași, 2, 4, 344 -351.
49. Raven, P. H., G. B. Johnson, K. A. Mason, J. B. Losos, and S. R. Singer. -"How
Cells Divide ." In Biology . 10th ed. AP ed. (New York, NY: McGraw -Hill, 2011), 192.
50. Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and
Jackson, R. B., 2011 -The cell cycle . In Campbell biology (10th ed.). San Francisco, CA:
Pearson, 244.
51. Reed S. I., Ferguson J., Groppe J. C., 1982 – Preliminary cha racterization of the
transcriptional and translational products of the Saccharomyces cerevisiae cell division cycle
gene CDC28 . Mol. Cell. Biol. 2, 412 –425
52. Renehan AG, Booth C, Potten CS., 2001 -What is apoptosis, and why is it
important? Bmj;322:1536 –8.
53. Rudolph B., Saffrich R., Zwicker J., 1996 – Activation of cyclin dependent
kinases by myc mediates induction of cyclin A but not apoptosis , EMBO. T:, 15, 3065 -3076.
54. Saraste A., PulkkiI K., 2000 – Morphologic and biochemical hallmarks of
apoptosis . Cardiova scular Research, 43, 3, 528 -537.
55. Tang Z., Hickey I., 2014 -Cell Cycle and Cell Division , Scitable by Nature
Education https://www.nature.com/scitable/topic/cell -cycle -and-cell-division -14122649
90
56. Trimarchi J. M., Lees J. A., 2002 – Sibling rivalry in the E2F family . Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 3, 11 –20.
57. Trimarchi J. M., Lees J. A., 2002 – Sibling rivalry in the E2F family . Nat . Rev. Mol.
Cell Biol. 3, 11 –20.
58. Weinberg R. A.,1995 -The retinoblastoma protein and cell cycle control . Cell
81, 323 –330.
59. Yonish -Rouache E., Resitzky. D., Lotem J. Et. al., 1991 -Wild type p53 induces
apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukina 6 , Natura, 58, 196 -208.
60. Zhang, Tong, Bama D., Rouiller I., Lawrence E. J., and Craig A. Mandato, 2011 –
Growth -Arrest -Specific Protein 2 Inhibits Cell Division in Xenopus Embryos
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0024698
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Licenta20188888 [611938] (ID: 611938)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.