REZIDENȚIAT SPECIALIZAREA: LABORATOR FARMACEUTIC MODULUL 6: FARMACOLOGIE EXPERIMENTALĂ BIOETICA EXPERIMENTULUI PE ANIMALE VERTEBRATE VII Coordonator… [610186]

UNIVERSITATEA ”OVIDIUS” DIN CONSTANȚA
FACULTATEA DE FARMACIE
REZIDENȚIAT SPECIALIZAREA: LABORATOR
FARMACEUTIC
MODULUL 6: FARMACOLOGIE EXPERIMENTALĂ

BIOETICA EXPERIMENTULUI PE ANIMALE
VERTEBRATE VII

Coordonator Științific:
Conf. univ. dr. Bucur Laura Adriana

Rezident:
Farm. Oh îi Clementina

CONSTANȚA
2019

1
Cuprins

Rezumat ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 2
1. Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 3
2. Principiul celor 3 R: Reduction, Refinement, Replacement ………………………….. ……… 4
2. Alternative la experimentele pe animale vertebrate vii ………………………….. …………. 7
3.1 Vertebrate inferioare ………………………….. ………………………….. …………………………. 7
3.1.1 Danio rerio (Zebra fish) ………………………….. ………………………….. ………………….. 7
3.1.2 Xenopus laevis și Xenopus tropicalis ………………………….. ………………………….. .. 8
3.2. Nevertebrate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 9
3.2.1 Artemia sa lina ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 10
3.2.2. Daphnia magna ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 11
3.2.3 Drosophila melanogaster. ………………………….. ………………………….. ……………… 12
3.2.4 Caenorhabditis elegans. ………………………….. ………………………….. ………………… 12
3.3. Microorganisme ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 13
3.3.1. Saccharomyces cerevisiae. ………………………….. ………………………….. ……………. 13
3.4. Plante: Allium cepa ………………………….. ………………………….. ………………………… 14
3.5. Culturi celulare ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 14
3.6. Simulări în silico ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 15
4. Concluz ii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 17
Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 18

2

Rezumat
Utilizarea animalelor în scopul cercetării e strâns legată de progresul științelor
biologice, începând din antichitate și până în zilele noastre. În secolul al XVIII -lea,
omenirea a început să conștientizeze faptul că și animalele pot suferi. Cu toate acestea,
numărul animalelor utilizate în cercetare a crescut odată cu avansarea cercetării și
dezvoltarea tehnologiei medicale.
În ultimele două decenii, s-a concretizat bioetica animală, subramură a
bioeticii, cu referire la relația omului cu lumea animală și la responsabilitatea sa morală
în procesul de creștere și de folosire a animalelor .
Astfel, p entru utilizarea în laborator a animalelor este aplicată o strategie a
celor 3 R (adică reducere, îmbunătățire și înlocuire) , iar p entru implementarea acestei
strategii se aplică diferite metode și organisme alternative. În continuare, sunt prezentate
astfel de alternative, precum și avantajele asociate acestora.
 Cuvinte-cheie: animal ethics , animal experimentation, 3R principle, alternative
organism

3
1. Introducere
Dezvoltarea științelor medicale este strâns legată, din cele mai vechi timpuri,
de utilizarea animalelor în cercetarea experimentală.
În Antichitate , Aristotel și Hippocrate au efectuat disecții pe animale , apoi
Galen a efectuat experimente fiziologice asupra porcilor, maimuțelor și câinilor . La
începutul Renașterii, Vesalius a efectuat studii anatomice pe animale, iar, mai târziu, s –
au efectuat și studii fiziologic e. René Des cartes (1596 -1650) a declarat că animalele
sunt mai degrabă mașini , dar Jeremy Bentham (1789) se opune viziunilor lui Descartes,
arătând că animalele nu p ot gândi sau vorbi, dar pot suferi. În 1859, în Originea
speciilor, Darwin expune asemănările biolog ice dintre om și animal, iar Claude
Bernard public ă în 1865 cartea sa intitulată "Introduction à l'étude de la médecine
expérimentale" [1].
Dezvoltarea unor discipline biomedicale ca farmacologia, toxicologia,
microbiologia și imunologia a cauzat o creșter e accentuată a utilizării animalelor în
secolul XX . Astăzi, milioane de vertebrate sunt utilizate anual în cercetare și testare.
Criticile la care sunt supuse e xperimentele pe animale se concentrează, în
general, pe chestiunea etică dacă omul are dreptul să folosească animale și pe
fiabilitatea și necesitatea acestor experimente. Istoria a demonstrat că rezultatele
obținute la animale nu pot, intotdeauna, să fie extrapolate în mod fiabil omului și în
ciuda seriilor de experimente pe animale și studii cli nice la om, efectele secundare ale
medicamentelor nu pot fi recunoscute din cauza unei incidențe prea scăzute sau a
efectelor nedetectabile la animale, cum ar fi dureri de cap sau halucinații minore .
Interesul crescut și îngrijorarea cu privire la aspectele legate de bunăstarea
animalelor au condus la reglementări legislative în multe țări. La nivel European, în
1986, Parlamentul a argumentat necesitatea unei legislații armonizate privind testarea pe
animale, adoptând o Directivă care a fost revizuită și consolidată în 2010, ca directiva
2010/63 / UE. Directiva cuprinde dispoziții privind cazarea și îngrijirea animalelor
experimentale, competența cercetătorilor și a personalului de animale, alternative le la
experimentele pe animale, anestezia, eutanasia, statisticile privind experimentarea pe
animale și furnizarea de animale [2].
Utilizarea animalelor în cercetare este necesară și utilă, dar omul de știință
trebuie să respecte viața animalului de labora tor, care nu este doar un ,,instrument de
lucru”, ci s -a dovedit că este inzestrat cu sensibilitate și memorie.

4
2. Principiul celor 3 R: Reduction, Refinement, Replacement
Animalele „de laborator”, cum sunt șoarecii, cobaii, iepurii sau șobolanii , au
fost considerate mute sonor , din cauza necunoașterii comportamentului și a sensibilității
acestor specii, fiind frecvent maltratate. Se credea, în mod greșit, că aceste specii nu
produc țipete de disperare, dar, în realitate, nu animalele sunt mute sonor , ci omul nu
percepe mesajele ultrasonore de durere și alarmă ale acestor specii. În fapt, omul
percepe sunete frecvența cuprinsă între 20 Hz și 20 kHz, iar diferite specii de animale
percep și emit sunete având o frecvență de până la 60 kHz [3].
La mijlocul secolului trecut, în 1957, Charles Hume și William Russell , la
Universities Federation for Animal Welfares (UFAW), au pus pentru prima dată
problema inlocuirii animalelor în cadrul experimentelor și folosirea de metode
alternative [4 ]. Mai târziu, la Congresul Internațional de Standardizare Biologică ( San
Antonio, Texas, 1979) s -a convenit acceptarea conceptului celor 3R (fig.1) , formulat
inițial de Russel și Burch , în 1959, și care vorbea de umaniza rea experimentelor pe
animale [3 ].

Figura 1. Principul celor 3 R

În ultimele două decenii, se vorbește de bioetica animală, subramur ă a bioeticii ,
cu referire la relația omului cu lumea animală și la responsabilitatea sa morală în
procesul de creștere și de folosire a animalelor [3].

5

2.1 Reduc tion
Conceptul se referă la reducerea numerică , adică la evitarea sau eliminarea
experimentelor care au o utilitate îndoielnică pentru binele oamenilo r și progresul
cunoașterii și la reducerea numărului de animale implicate în experimentele justificate,
până la limita care permite asigurarea statistică [3].
O soluție sunt culturile celulare in vitro , care sunt un bun mod de a examina
compușii în stadiile incipiente ale cercetării. Folosirea unei culturi de hepatocite umane
oferă informații despre modul în care un medicament ar fi metabolizat și eliminat din
organism. Includerea unei astfel de metode în proiectarea studiului ajută la eliminarea
compușilor necorespunzători încă din stadiile preliminare și minimizează utilizarea de
animale în testări ulterioare [4].
Animale le vii și embrionii sunt utilizați pentru a studia efectele anumitor
compuși asupra dezvoltării embrionilor . Testele pe culturi de celule stem embrionare in
vitro ajută la reducerea numărului de embrioni vii folos iți și al compușilor toxici față de
embrionul în curs de dezvoltare [4 ]. Tehnicile de imagistică, cum ar fi ultrasonografia
tridimensională de înalt a frecventa sau imagistica prin rezonanta magnetica pot fi
folosite la femelele de șoareci, pentru a evita sacrificarea acestora în timpul gestației.
Totusi, chiar dacă abordărilor imagistice sunt considerate "neinvazive", sunt necesar e
sedarea și imobilizarea șoarecilor prin inhalare a unui anestezic , ceea ce ar putea
interfera cu rezultatul experimental ș i provoacă stres pentru șoareci [5 ].
Se urmărește, de asemenea, și reducerea numărului de animale sacrificate
pentru obținerea mediilor de cultură, necesare pentru culturile microbiene. Acestea
conțin pepto nă ca sursă nutritivă de proteine / peptide / amino acizi, produsă adesea
prin proteoliza cărnii animalelor de crescătorie. Astăzi se poate obține peptonă din surse
vegetale sau din drojdii. Aceste medii de cultură sunt bine definite chimic, au o mai
mare productivitate a creșterii microbiene, nu prezintă risc de encefalopatie bovină
spongiformă, sunt folosite pentru experimente mai bine controlate și cu o
reproductibili tate mai bună a rezultatelor [6 ].
De asemenea, împărtășirea sau furnizarea datelor descoperite (cum ar fi
caracteristicile excipienților pentru un medicament testat) evită necesitatea studiilor pe
animale [4].

6
2.2 Refine ment
Este vorba despre îmbunătățire a, perfecțion area metodelor biologice folosite,
pentru diminuarea sau eliminarea suferinței, atât în beneficiul condițiilor psiho -somatice
de experimentare, dar și în scopul promovării unei atitudini umane față de ființele pe
care se experimentează [3 ].
Metodele de imbun ătățire pot fi cel mai usor de implementat, încep ând cu
măsuri simple, cum ar fi extragerea șoarecilor din cu ști prin luarea lor in palmele făcute
căuș sau folosind o cu șcă tunel, în loc de scoaterea lor din cușcă prin apucarea de coadă.
S-a demonstrat că aceste manipulări mai blânde reduc anxietatea la șoar eci [5].
De asemenea, procedurile de administrare a substanțelor care pot provoca
durerea și disconfortul trebuie reevaluate frecvent în ceea ce privește opțiunile de
imbun ătățire. Acestea includ, dacă este posibil și aplicabil în setările experimentului,
utilizarea formulării cel mai puțin iritante a substanțelor și vehicule lor pentru preparate
injectabile, alte căi de aplicare, evitarea locurilor de injectare care sunt extrem de
dureroase, reducerea durerii asociate injectării prin utili zarea de ace noi ș i ascuțite cu cel
mai mic gabarit posibil pentru fiecare inje cție și folosirea celui mai mic posibil volum
injectabil [5].
Condițiile de locuit pot îmbunătăți în mod semnificativ starea de bine a
animalelor de cercetare, cum ar fi rozătoarele, prin asigura rea de refugii și material de
cuibărit și accesul liber la apă și alimente. T oți factorii de stres, cum ar fi zgomotul
produs de sistemele de ventilație sau muzica ascultată de îngrijitorii animalelor, trebuie
reduși la un nivel minim, iar t emperatura mediului ar trebui să fie adecvat ă pentru
fiziologia animalelor. Dacă astfel de nevoi de co mportament nu sunt îndeplinite,
animalele pot suferi stres mental și fizic , care ar putea pune în pericol rezultatul
experimental. Astfel, strategiile de rafinare ajuta nu numai pentru bunăstarea animalelor
de cercetare, dar ș i pentru a îmbunătăți calitatea și reproductibilitatea experimentului
științific [5 ].
Spre exemplu, în timpul unui studiu referitor la boala Huntington, s -a observat
că la șoarecii dintr -o cușcă în care aveau posibilitatea de a -și face culcuș , a se ascunde
sau de a roade , boala a progresat mai încet decât la șoarecii în cușcă steril ă. De
asemenea, s -a descoperit că acești șoareci mimează mai fidel progresul bolile umane ,
astfel c ă reprezint ă un model foarte bun pentru a studia boala [4].

7
2.3 Replace ment
Se urmărește înlocuire a metodelor de testare pe animale cu alte metode , în
toate situațiile când acestea satisfac cerințele impuse [3 ].
Au fost sugerate alternative la utilizarea animalelor, cum ar fi modelele in
vitro, culturile celulare, modelele computerizate și noi tehnici de imagistică / analiză [4].
Modelele in vitro oferă posibilitatea de a studia răspunsul celular într -un sistem
închis, unde sunt menținute condițiile experimentale [4], astfel că pot avea și avantajul
preciziei sau al elim inării variabilității biologice [3 ]. Astfel de modele oferă informații
preliminare pentru rezultatul unui experiment in vivo . De exemplu, modelele
computer izate au fost folosite pentru a studia funcționa rea inimii și a selecta potențiale
medicamente. În multe țări, culturile celulare in vitro au înlocuit testul de iritare a pielii
și testul de iritare a ochilor Draize si folosirea animalelor la acestea [4].
Un alt exemplu este extracția insulinei din panc reasul porcilor și vacilor, dar
care acum este obținută din culturile bacteriene. Această insulină extrasă trebuie să fie
verificată pentru puritate, eficacitate și doză. Pentru verificări nu se mai utilizează
animale, ci se fol osesc tehnici de cromatografie pentru verificarea purității, a eficacității
și a calculării dozajului medicamente lor [4 ].
În experimentele în care animalele nu pot fi, deocamdată, înlocuite cu alte teste
fizico -chimice, serologice, imuno -enzimatice sau pe culturi de celule se recomandă
înlocuirea animalelor superioare, în special a primatelor, a câinilor și a pisicilor cu
vertebrate inferioare sau, dacă se poate, c u nevertebrate [3 ].

3. Alternative la experimentele pe animale vertebrate vii
3.1 Vertebrate inferioare
Utilizare a experimentală a vertebratele inferioare pune mai puține probleme
etice și reprezintă o opțiune atractivă datorită legăturii genetice cu vertebratele
superioare, inclusiv cu mamiferele.
3.1.1 Danio rerio (Zebra fish)
Danio rerio, denumit în mod obișnuit pește le zebră, este un pește de apă dulce,
cu o lungime aproximativă de 2-4 cm. Corp ul său este aproap e transparent în timpul
dezvoltării timpurii, permi țând accesul vizual facil la anatomia interioară (fig. 2).

8

Figura 2. Transparența Zebrafish permite vizualiza rea anatomiei interioare (sursa
https://www.flickr.com/photos/nichd/17104754320 )
Claritatea optică permite observarea directă a etapele de dezvoltare,
identificarea trăsăturilor fenotipice în timpul mutagenezei , scr eening ușor, evaluarea
efectului final al toxicității , testarea și observarea directă a expresiei ge nelor prin
microscopia luminoas ă. Dimensiunea redus ă, ciclu l de viață scurt și fecunditate a
ridicată favorizează utilizarea în laborator. Spațiul de lucru, costul soluțiilor de
laborator, substanțele chimice de testare și forța de muncă implicată sunt reduse prin
alegerea lui Zebra fish ca o alternativă la animale.
Disponibilitatea întregii secvențe a genomului face Zebra fish o opțiune
atractivă pentru cercetare a moleculară și genetică . Se folosește într-o varietate de
aplicații: în studii toxicologice asupra produselor chimice și farmaceutice, în cercetarea
cancerului, boli lor cardiace, disfuncții lor neurologice, boli lor comp ortamentale și pentru
observa rea mutațiilor și problemelor de dezvoltare a organelor datorate expunerii la
moleculele testat e [4].
3.1.2 Xenopus laevis și Xenopus tropicalis
Modelul amfibian Xenopus a fost utilizat pe scară largă în ultimul secol pentru
a studia aspect diverse ale biologiei celulare și ale dezvoltării embrionare umane [7, 8 ].
Xenopus este eficient din punct de vedere al costurilor, ceea ce este esențial pentru
evaluarea numărului mare de gene care apar în studiile genomice umane la pacienții cu
malformații congenitale [7] și oferă avantaje le unui sistem non -mamifere, cum ar fi
fecunditate a ridicată, cerinț e simple de locuire, cu avantajul suplimentar ale embrionilor

9
mari și relații apropiate evo lutive cu vertebratele mai mari [8 ]. Există două specii
principale de Xenopus utilizate în cercetarea biomedicală, Xenop us laevis și Xenopus
tropica lis [8].

Figura 3. Xenopus laevi s (st ânga) și Xenopus tropicalis (sursa:
https://www.xenbase.org/anatomy/intro.do )
X. laevis a fost specia predominantă Xenopus studiată începând cu anii 1950,
datorită dimensiunilor sale mari, capacității de ovulație pe tot parcursul anul ui și
robusteții experimentale. Aceasta este preferată de mulți cercetători biomedicali,
inclusiv cei care folos esc modelul de ouă Xenopus pentru a studia electrofiziologia
canalului ionic, biochimia proteinelor celulare, biologia ciclului celular și dinamica
citoscheletică, precum și cei care folo sesc modelul de embrion Xenopus [8 ]. Un model
pentru tulburările de neurodezvoltare, în care mormolii Xenopus laevis au fost expu și la
acid valproic în timpul unui moment critic în dezvoltarea creierului , la care se produce
neurogeneza și formarea circuitului neura l pentru procesarea senzorială, a fost folosit
pentru studierea tulbur ărilor din spectrul autismului [9].
În ultimii ani, X. tropicalis a devenit din ce în ce mai mult folosit ca model
genetic deoarece oferă aceleași beneficii embriologice ca X. laevis, dar are un timp de
generare mai scurt, o dimensiun e mai mică și un genom diploid [8 ].
3.2. Nevertebrate
Organismele nevertebrate sunt utilizate pe scară largă ca alternativă pentru în
animalele de laborator. Au fost folosite pentru a studia diverse afecțiuni cum ar fi boala
Parkinson, disfuncțiile endocrine și de memorie, distrofia musculară, vindecarea rănilor,

10
îmbătrânirea celulară, moartea celulară programată, biologia retrovirus urilor, diabetul și
toxicologia. Nevertebratele au un sistem de organe nedezvolt at și nu au un sistem
imunitar adaptabil , ceea ce reprezintă unele limitări pentru utilizarea lor în studiul
bolilor umane [4 ]. Avantajele sunt reprezentate de caracteristicile organismelor mici,
cum ar fi genomul complet secventiat, dim ensiunea redusa, durata scurta de viata si
biologia genetica si evolutiva bine caracterizata [10 ], un număr mare de nevertebrate
putând fi studiate într -un singur experiment, într-o perioadă scurtă, cu mai puține
probleme etice, cu costuri de întreț inere evident mai mic i comparativ cu cele ale
animalelor [4].
3.2.1 Artemia salina
Speciile de crustacee Artemia salina sunt utilizate în prezent în descoperirea
medicamentelor pentru a examina efectul toxic al diferitelor substanțe.
Testul de letalitate pentr u creveți de apă sărată este un instrument preliminar și
important de screening pentru citotoxicitate. Substanța toxică ucide culturile de larve de
laborator (nauplii, fig. 4)

Figure 4 Artemia salina, stare larva ră (sursa https://www.semanticscholar.org/paper/
Toxicological -evaluation -of-the-plant-products -L.)-Hamidi -Jovanova/
3f1ac05fdb55ca8db65c3bb0b66de544ee3235a9/figure/2 )
Naupliile, prima etapă larvară a multor crustacee, au un corp nesegmentat, cu o
lungime de aproximativ 22 mm, și un singur ochi. Sunt destul de mari ca să poată fi
obser vate și suficient de mici, ca să nu ocupe mult spațiu în laborator. Cele mai
importante materiale și echipamente necesare pentru a efectua analiza citotoxică a

11
crevetelor saline includ sa re de masă, ouă de creveți (câte va grame), cilindru de
măsurare (I000mL), spatulă, balanță analitică, pompă de aer, sursă de lumină, tuburi de
testare, pipetă Microtip, pipetă Pasteur [11].
3.2.2. Daphnia magna
Daphnia magna, un microcrustaceu de apă dulce, care se găsește în la curi, râu ri
și bazine stâncoase, este folosit în testarea toxicității apei . Are un corp transparent , care
permite efectuarea unor teste neinvazive pentru a investiga modificările organism ului în
timpul pr ocesului toxic [12 ].

Figura 5 Dapnia magna (sursa: https://fineartamerica.com/featured/8 -water -flea-
daphnia -magna -ted-kinsman.html)
Prezența crescândă a poluanților genotoxici în mediul înconjurător cauzează
îngrijorarea cu privire la potențialele efecte dăunătoare ale acestui tip de xenobiotice
asupra sănătății umane și există un mare interes în dezvoltarea unor metode noi și mai
sensibile pentru evaluarea riscului mutagenic / carcinogen . Prin testele efectuate pe
Dapnia magna, cercet ătorii încearc ă determinarea motivului pentru care aceste specii
sunt sensibile, pentru a putea prezice sensibilitatea altor specii, precum si pentru a
înțelege mai bine când concentrațiile pot atinge niveluri critice pentru om [13].
Răspunsurile genotoxice variază însă între speciile de animale. De exemplu,
printre amfibieni, pleurodele au prezentat un răspuns diferit față de xenopus, iar l a
mamifere, aceeași substanță chimică poate induce o magnitudine diferită a răspunsului
geno toxic între șobolani și șoareci. Aceste rezultate arată că nu ne pu tem baza pe o
singură specie pentru a evalua răspunsul la substantele genotoxice [14].

12

3.2.3 Drosophila melanogaster.
Drosophila melanogaster, cunoscută și sub numele de musculi ța de o țet, este
una dintre cele mai studiate nevertebrate în cercetare. Studiul genomul ui său permite
studiul mecanismelor moleculare care stau la baza bolilor umane. Aproape 75% din
genele implicate în bolile umane se crede că au un omolog funcțional în musculi ță. D.
melanogaster necesită costuri extrem de mici de întreținere și produce rezultate foarte
rapid, datorită unui ciclu de viață scurt. Musculi ța de o țet posedă patru etape în ciclul de
viață – embrionul, larva, pupa și adultul. Fiecare etapă a dezvoltării are propriul său
avantaj, musculi ța fiind considerată ca un model multiplu pentru a studia diferite
concepte. Embrionul este folosit frecvent pentru a studia dezvoltarea neuronală sau
organogeneza, iar larva este folosită pentru a studia procesele fiziologice și de
dezvoltare și comportamente le precum căutarea hranei. M usca adult ă este un organism
foarte complex. Funcțiile diferitelor structuri cum ar fi inima, plămânii, intestinul,
rinichii și tractul reproductiv sunt echi valente cu cele ale mamiferelor [4].
Răspunsul muștelor la multe medicamente care acționează asupra SNC este
similar cu cel observat la mamifere. Creierul mu ștei adulte este extraordin ar, deoarece
mai mult de 100.000 de neuroni formează circuitele discrete, care mediază diferite
comportamente complexe cum ar fi ritmurile circadiene, învățarea și memoria , hrănirea,
somn ul, curte, agresivitatea , îngrijire a și navigarea în zbor. Un număr de instrumente
moleculare și genetice au fost puse la dispoziție pentru studiu l Drosophila. Datorită
numeroaselor similitudini în dezvoltare și activitățile comportament ale, musculi ța de
oțet serve ște ca model unic și sensibil pentru stu diul geneticii și bolilor umane.
Musculi țele servesc ca instrument important pentru investigarea bolilor
neurodegenerative cum ar fi Alzheimer, Parkinsons și boala Huntington [4].
3.2.4 Caeno rhabditis elegans.
Caenorhabditis el egans este un nematod eucariot, de aproximativ 1 mm în
lungime. Ciclul complet de viață al acestui hermafrodit este de aproximativ 2 – 3
săptămâni. Este transparent, maleabil genetic și ar e complexitate celulară simplă.

13

Figura 6. Caenorhabditis elegans (sursa: http://www.socmucimm.org/overview -model –
organism -c-elegans/ )
Acesta este unul dintre organisme le model cele mai utilizate în mod obișnuit în
scopuri de cercetare. Informațiile obținute pot fi aplicabile organismelor mai complexe,
cum ar fi oamenii. Ca model, C. elegans a fost folosit pentru a studia tulburări
neurologice cum ar fi boala Huntington, Parkins ons, Alzheimer, diverse afecțiuni
imune, cancer sau diabet. A servit la dezvoltare a și testarea agenților terapeutici pentru
tratamentul acestor boli [4].
3.3. Microorganisme
3.3.1. Saccharomyces cerevisiae.
Saccharomyces cerevisiae , drojdia de bere, este o ciupercă unicelular ă, folosită
ca model de organism datorită creșterii sale rapide (timpul de generare este foarte scurt,
de aproximativ 90 de minute ), celulelor dispersate și sistemul ui genetic bine definit.
Drojdii le pot fi cultivate în medii solide sau lichide și se pot izola colonii derivat e dintr –
o singură celulă , pe suporturi solide [4 ].
Cu un genom bine caracterizat și studiat, S. cerevisiae este unul dintre
microorganisme le eucariote ideale pentru studiile biologice. Prezența unei arhitecturi
celulare similare și ciclul de viață asemănător cu cel al eucariotelor multicelulare
constituie un avantaj. Numeroase le organ ite celulare, cum ar fi nucleul, peroxizomii,
mitocondriile și organitele căi lor secret oare, imi tă funcțiile celulelor mamifere . Drojdi a
de bere este folosit ă pentru a înțelege moartea programată a celulelor, reg larea morții
celulare la om și este foarte util ă în cercetarea cancerului . S. cerevisiae ajută la

14
înțelegerea aspectelor fundamentale ale biologiei celulare în bolile neurodegenerative
cum ar fi Alzheimer, Parkinson și Huntington , prin studierea proteinelor care stau la
baza acestor boli [4].
3.4. Plante : Allium cepa
Testul Allium cepa este utilizat pentru evaluarea citotox icității, genotoxicității
și mutagenicității compușilor sintetici și naturali [ 15]. Rezultatele sunt corelate cu
răspunsurile obținute din testele pe mamifere [16]. Eventualele efecte toxice / citotoxice
se observă ușor, prin urmărirea parametrilor macroscopici, cum ar fi întârzierea sau
inhibarea creșterii rădăcinii și apariția rădăcinilor de răsucire [ 15], iar pentru evaluarea
genotoxicității se poate utiliza testul COMET, pentru detectarea leziunilor A DN [ 16].
Testul Allium cepa se folosește cu precădere pentru testarea poluanților mediului, cum
ar fi ierbicide, pesticide, dar și pentru aditivii alimentari – coloranți, conservanți,
compuși din plante (ex: gingerol) [ 15], sau chiar pentru medicamente: ome prazole, vit.
A, vit. C [ 16], tiabendazol și griseofulvină [ 17].

3.5. Culturi celulare
Utilizarea culturilor celulare și a țesuturilor in vitro , care implică o creștere a
celulelor în afara corpului, în mediul de laborator, poate fi o alternativă importantă
pentru experimentele pe animale.
Aceste metodologii sunt utilizate în mod obișnuit pentru screening -ul
preliminar al potențialelor molecule de medicamente , substanțe chimice sau produsele
cosmetice, pentru a le verifica toxicitatea și eficacitatea. De exemplu, pentru testul
iritabilității ochilor, se folosea testul Draize, care necesită animale (în special iepuri).
Acest test este foarte dureros și de fiecare dată se folosește un animal nou. Ca
alternativă, se utilizează cultura de organe corneene bovine. Corneea bovină este
cultivată până la trei săptămâni în laborator și sunt utilizate metode analitice variate
pentru evaluarea efectului toxicologic și iritabili tății chimice [4 ].
Astăzi, unele modele de țesuturi sunt realizate folosind culturi celulare 3D,
precum și ,,cipuri” care conțin modele de organe. Aceste modelele sunt construite, în
general, cu ajutorul celulelor umane, ceea ce le face mai potrivite pentru aplicațiile la
om. Pe lângă alternativele la experimentarea pe animale, această tehnologie, în
combinație cu celulele stem pluripotente induse (IPSC), se îndreaptă către realizarea de
organe și țesuturi implantabile [6 ].

15
Modele de sisteme multi -organe, cum ar fi inimă, m ușchi, piele, creier, testicul,
măduvă, intestin, rinichi, plămâni, ficat, precum și organe individuale au fost realizate
în canalele microfluidice care recreează micro -medii fizice și chimice. Aceste tehnici ,
denumite și sisteme microelectromecanice biome dicale sau biologice (Bio -MEMS) sau
,,laborator pe un cip” (lab-on-a-chip, LOC) și sistemele de analiză micro -totală ( TAS)
vor înlocui testarea pe animale în laboratoarele din domeniul farmaceutic,
biotehnologiei, chimiei și chimiei p rotecția mediului [6].
Culturile de celule umane se fac într -un mediu care conține adesea ser fetal de
vițel. Procesul de producere a serului fetal de vițel implică suferință extremă a
animalului (vaca gestantă), care este operată pentru a se scoate fătul și apoi a se recol ta
ser din sângele acestui făt. Acest ser fetal de vițel nu este expus la antigeni sau agenți
patogeni, astfel încât este utilizat pentru cultura celulară pentru a evita contaminarea și
reacțiile imunologice, precum și a obține tot amestecul de nutrienți n ecesari pentru
creșterea celulelor. Identificarea nutrienților și factorilor necesari pentru creșterea
diferitelor tipuri de celule face posibilă cultivarea aproape oricărei linii celulare, în
mediu bine definit chimic, fără nici un produs animal. Rezultat ele experimentelor
folosind mediile definite chimic sunt mai reproductibile decât cele obținute în mediile
serice animale, deoarece compoziția serului poate varia de la lot la lot în funcție de
sănătatea animalelor, sex, vârstă, bagajul genetic și condiți ile climatice. Aproape toate
liniile celulare folosite în cercetare pot fi cu ltivate în medii sintetice [6 ].
3.6. Simulări în silico
Termenul in silico este un termen modern folosit pentru experimentarea
efectu ată de calculator și este legat de termeni i biologici mai cunoscuți in vivo și in
vitro. Simulările pot reduce numărul de experimente necesare , deși nu le pot înlocui
complet , deoarece nu sunt cunoscute toate principiile care guvernează un sistem, și
simulările utilizează aproximări la un anumit ni vel de detaliu datorită limitării
computerului. Simulare a și informatica devin esențiale în toate domeniile de cercetare
științifică pentru utilizarea eficientă a cunoștințelor existente în proiectarea
experiment ului. Modelele computer izate au fost constr uite astfel încât să modeleze
metabolismul uman, pentru a studia acumularea de plăci de aterom și riscul
cardiovascular sau pentru a evalua toxicitatea medicamentelor , studii pentru care erau
utilizate animalele. Toxicitatea și absorbția, distribuția, me tabolismul și excreția

16
poluanților mediu lui, precum și ale produselor cosmetice , pot fi prezise folosind
programe computerizate pentru modelarea bio -cinetică baz ată pe fiziologie (PBBK) [4].
În mod similar, la diferite scări de detalii, proteinele, recep torii, celula
bilaterală a lipidelor, cre ierul sunt adesea simulate, pentru a prezice comportamentul sau
răspunsul lor la condițiile fizice, stimulare sau substanțe c himice [6 ].
Metodele de simulare c omput erizată și informatică au redus numărul de
animale sacrificate în descoperirea de medicamente prin micșorarea numărului
moleculelor de potențial e medicamente. Simulări generate de calculator sunt utilizate
pentru a prezice posibilele efecte biologice și toxice ale unei substanțe chimice sau ale
unui potenț ial medicament fără disecția animalelor. Numai cele mai promițătoare
molecule obținute de la screening -ul primar sunt utilizate pentru experimentarea in vivo.
De exemplu, pentru a cunoaște situsul de legare a receptorului unui medicament, este
necesară exp erimentarea in vivo. Software -ul cunoscut sub numele de CADD
(Computer Aided Drug Design ) este folosit pentru a prezice site -ul de legare a
receptorului pentru o potențială moleculă de medicament. Cu ajutorul CADD se
identifică site -ul probabil de legare și, prin urmare, se evită testarea substanțelor
chimice nedorite, care nu au activitate b iologică , iar în stadiul final se face testarea pe
animale pentru a confirma rezultatele . Prin urmare, numărul total de animale
experimentale este redus [4].
Programele computerizate SAR ( Structure Activity Relationship ) prezic
activitatea biologică a medicamentului pe baza prezenței fragmentelor chimice atașate la
compusul inițial. QSAR ( Quantitative Structure Activity Relationship ) este descrierea
matematică a relației dintre propr ietățile fizico -chimice ale unei molecu le de
medicament și activitatea sa biologică. Activități precum carcinogenitatea și
mutagenitatea unui potențial medicament sunt bine prezise de baza de date
computerizată [4].
În mod similar, s-a redus și numărul de experimente pe animale necesare în
științele biologice prin utilizarea eficientă a cunoștințelor existente. Modele anatomice
3D de înaltă definiție au fost dezvolta te până la nivelul de detalii care le permite să
înlocui ască disecția animale lor pentru predarea anatomiei [6 ].

17
4. Concluzii
Din cele mai vechi timpuri, animalel e au fost folosite în cercetare sau în
predarea științ elor biologice, dar aceasta ridică multe probleme etice.
Trebuie depuse eforturi pentru înlocuirea și reducerea numărului de animale de
cercetare și perfecționarea condițiile experimentale. Au fost pro puse diverse alternative
la utilizarea animalelor, începând cu înlocuirea mamiferelor cu vertebrate inferioare sau
nevertebrate, până la folosirea culturilor celulare sau a modelelor computerizate. Cu
toate acestea, cel puțin deocamdată, nu este total posibilă eliminarea cercetării pe
animale.
Revizuirea etică a experimentelor pe animale va aduce beneficii animalelor și
va îmbunătăți calitatea cercetării pe animale, deoarece bunăstarea animalelor este o
condiție prealabilă pentru obținerea unor rezulta te experimentale sigure , deci de
bunăstarea animalelor va depinde și bunăstarea omului .

18
Bibliografie

1. V Baumans , Use of animals in experimental research: an ethical dilemma?,
Gene Therapy 11, S64–S66 (2004)
2. Thomas Hartung, Research and Testing Without Animals: Where Are
We Now and Where Are We Heading?, Animal Experimentation : Working Towards a
Paradigm Change / Herrmann, Kathrin; Jayne, Kimberley – Leiden : Brill , 2019. –
(Human -Animal Studies ; 22). 673 -687.
3. Mihai Decun, Alina Bodnariu, Experimentarea pe animale în România,
analizată din perspectivă europeană, Revista Română de Bioetică, Vol. 7, Nr. 3, Iulie –
Septembrie 2009
4. Sonali K. Doke, Shashikant C. Dhawale, Alternatives to animal testing: A
review, Saudi Pharmaceutical Journal (2015) 23, 223 –229
5. Petra Clara Arck, When 3 Rs meet a forth R: Replacement, reduction and
refinement of animals in research on reproduction, Journal of Reproductive
Immunolo gy 132 (2019) 54 –59
6. Jagdish Rai, Kuldeep Kaushik, Reduction of Animal Sacrifice in Biomedical
Science & Research through Alternative Design of Animal Experiments, Saudi
Pharmaceutical Journal 26 (2018) 896 –902
7. Dipankan Bhattacharya , Chris A.Marfo , Davis Li , Maura Lane , Mustafa K.
Khokh , CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human
disease genes in Xenopus , Developmental Biology , Volume 408, Issue 2 , 15 December
2015, Pages 196 -204
8. Panna Tandon Frank Conlon , J. David Furlow , Marko E. Horb ,
Expanding the genetic toolkit in Xenopus : Approaches and opportunities for human
disease modelling, Developmental Biology , Volume 426, Issue 2, 15 June 2017, Pages
325-335
9. Eric J. James, Jenny Gu, Carolina M. Ramirez -Vizcarrondo, Mashfiq Hasan,
Torrey L.S. Truszkowski, Yuqi Tan, Phouangmaly M. Oupravanh, Arseny S.
Khakhalin, Carlos D. Aizenman, Valproate -Induced Neurodevelopmental Deficits in
Xenopus laevis Tadpoles, Journal of Neuroscience 18 February 2015, 35 (7) 3218 -3229
10. Shiwangi Dwivedi , Sumit Singh Verma , Clinton D'Souza , Nikee
Awasthee , Anurag Sharma , Subash Chandra Gupta , Biomarkers in Toxicology

19
(Second Edition) , Chapter 7 – Potential of Small Animals in Toxicity Testing: Hope
from Small World 2019, Pages 129 -142
11. Wali Muhammad, Naimat Ullah, Mehmand Khan, Waqar Ahmad,
Muhammad Qasim Khan, Bilal Haider Abbasi, Why Br ine shrimp (Artemia salina)
larvae is used as a screening system for nanomaterials? The science of procedure and
nano -toxicology: A review, International Journal of Biosciences , Vol. 14, No. 5, p.
156-176, 2019
12. Margherita Lavorgna ,Chiara Russo , Brigida D'Abrosca ,Alfredo Parrella ,
Marina Isidori , Toxicity and genotoxicity of the quaternary ammonium compound
benzalkonium chloride (BAC) using Daphnia magna and Ceriodaphnia dubia as model
systems, Environmental Pollution , Volume 210 , March 2016, Pages 34 -39
13. Chiara Russo, Marina Isidori, Jessica A.Deaver, Helen C. Poynton,
Toxicogenomic responses of low level anticancer drug exposures in Daphnia magna,
Aquatic Toxicology , Volume 203 , October 2018, Pages 40 -50
14. S. Barka , Z. Ouanes , A. Gharbi , I. Gdara , S. Mouelhi , A. Hamza –
Chaffai , Monitoring genotoxicity in freshwater microcrustaceans: A new application of
the micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis , Volumes 803 –804, June 2016, Pages 27 -33
15. Rosália Maria Tôrres de Lima, et al., Toxic, cytogenetic and antitumor
evaluations of [6] -gingerol in non -clinical in vitro studies, Biomedicine &
Pharmacotherapy , Volume 115 , July 2019, 108873
16. Antonio Lima Braga, et al., Toxicogenetic study of omeprazole and the
modulatory effects o f retinol palmitate and ascorbic acid on Allium cepa, Chemosphere
Volume 204 , August 2018, Pages 220 -226
17. Nancy B. Andrioli, Sonia Soloneski , Marcelo L. Larramendy , Marta D.
Mudry , Induction of microtubule damage in Allium cepa meristematic cells by
pharmaceutical formulations of thiabendazole and griseofulvin, Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis , Volume 772 , 15
September 2014, Pages 1 -5

20