Teza De Doctorat Tihauan B Varianta 1 [609940]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
ȘCOALA DOCTORALĂ ÎN BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

SISTEME NATURALE ȘI MIXTE DE
CONSERVARE PENTRU FORMULĂRI TOPICE
INOVATIVE

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:
PROF. UNIV. DR. VERONICA LAZĂR

DOCTO RAND:
TIHĂUAN (CIUBUCĂ) BIANCA – MARIA

BUCUREȘTI
2018

CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 1
PARTEA TEORETICĂ
CAPITOLUL 1. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 3
Clasificarea principalilor compuși vegetali cu activitate antimicrobiană ………… 3
1.1 Compuși fenolici ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 3
1.1.1 Acizi fenolici ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 6
1.1.2 Quercetina ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 6
1.1.3 Taninurile ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 6
1.2. Alcaloizi ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 7
1.3. Poliacetilene ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 8
1.4. Uleiuri esențiale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 8
1.5. Lectine si polipeptide ………………………….. ………………………….. ………………………….. 10
CAPITOLUL 2. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 11
Activitatea antimicrobiana a compusilor naturali si mecanisme de rezistenta
bacteriana ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 11
2.1. Sinergisme, antagonisme si relatii aditive in activitatea EO sau a
componentelor acestora ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 14
CAPITOLUL 3. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 16
Actiunea anti – patogenica a eo sau a componentelor acestora …………………….. 16
3.1 Actiunea anti -patogenica a EO sau a componentelor majoritare a acestora … 16
3.1.1 Inhibitia quorum sensing si a pompelor de eflux ………………………….. ………… 21
3.1.2 Modularea profilului de antibiorezistenta ………………………….. ………………….. 25
CAPITOLUL 4. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 28
Avantajele utilizării extractelor vegetale în industria cosmetică ………………….. 28
4.1. Conservarea naturală a produselor consmetice ………………………….. ………………. 29
CAPITO LUL 5. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 35
Dirijarea funcționalității principiilor cu activitate antimicrobiană din plante în
formulări topice ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 35
5.1 Sisteme col oidale de tip emulsii de uz cosmeceutic – macro -, micro – și nanoemulsii de
uz cosmeceutic ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 35

2
5.1.1 Macromulsii ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 36
5.1.2 Microemu lsii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 38
5.1.3 Nanoemulsii ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 38
5.1.4. Consideratii teoretice legate de transferul ingredientelor active prin straturile
tegumentar e ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 41
5.2 Sisteme coloidale pe bază de amestecuri de specii macromoleculare de uz bio -medical
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 44
PARTEA EXPERIMENTALĂ
Scop și obiective ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 45
CAPITOLUL 6. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 46
Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ……………………….. 46
6.1 Izolarea și caracterizarea complexă a unor tul pini microbiene izolate de la
pacienți cu infecții cutanate (plăgi infectate cu tulpini microbiene multirezistente) si
realizarea unei colecții de tulpini microbiene) ………………………….. ………………………….. . 46
6.2 Identificarea bioc himică pe baza sistemelor multitest/ automate a unor tulpini
microbiene virulente și multirezistente izolate din probe clinice ………………………….. … 47
6.3 Determinarea capacității de aderență la substrat inert/ ce lular a tulpinilor
bacteriene patogene ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 48
6.4 Caracterizarea fenotipică a factorilor de virulență solubili ai tulpinilor bacteriene
izolate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 49
6.5 Caracterizarea genotipică a factorilor de virulență utilizând metodele simplex și
multiplex PCR ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 52
6.6 Obținerea și caracterizarea fizico -chimică a extractelor vegetale ………………………… 53
6.6.1 Obținerea uleiurilor volatile prin hidrodistilare ………………………….. ………………….. 53
6.6.2 Caracterizarea fizico -chimică a extractelor vegetale ………………………….. …………… 54
6.7 Screening -ul activității antimicrobiene a unor componente selecționate pentru
sisteme de conservare mixte ………………………….. ………………………….. ……………………… 55
6.7.1 Determinarea cali tativă si cantitativă a spectrului antimicrobian al extractelor
vegetale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 55
6.7.2 Studiul influenței asupra capacității de aderență la substrat inert a unor tulpini
bacteriene prin testul prod ucerii de slime ………………………….. ………………………….. ……… 57
6.7.3 Studiul influenței asupra sesnsibilității la antibiotice a tulpinilor studiate ………….. 58
6.7.4 Influența asupr a sintezei factorilor de virulență solubili (toxine formatoare de pori,
exoenzime) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………… 58
6.8 Selectia unor componente pe baza analizei cantitative a extractelor vegetale ……. 58

3
6.9 Studiul influenței combinațiilor selecționate, în concentrații subinhibitorii, asupra
virulentei si rezistentei tulpinilor microbiene izolate de la pacienti cu infecții
cutanate/ plagi septice ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 58
6.10 Evaluarea prin citometrie în flux a mecanismului de acțiune pentru
componentele/ amestecurile cu activitate antimicrobiană demonstrată prin metode
convenționale ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 58
6.11 Evidențierea influenței uleiurilor volatile și a unor fracții ale acestora asupra
expresiei unor gene codificatoare ale unor factori de virulență și molecule implicate în
semnalizarea intercelulară ………………………….. ………………………….. ………………………….. 59
6.12 Evaluarea prin citometrie in flux a efectului anti -inflamator al combinatiilor
selectionate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 59
6.13 Selectarea componentelor cu efect antimicrobi an și non -citotoxic …………………… 59
6.14 Formulare in silico si experimentala a unui produs topic cu efect antimicrobian
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 59
6.15 Testatarea u nor combinatii optimizate, cu efect antimicrobian, utilizabile ca
sisteme de conservare a formulelor topice ………………………….. ………………………….. ……. 62
6.16 Testarea unor combinatii optimizate cu efect antimicrobian/ anti -inflamator …. 62
6.17 Dezvoltarea experimentala a formulei topice cu efect antimicrobian ………………. 62
6.18 Caracterizarea formulei topice (microscopic, prin citometrie in flux,
microbiologică) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 62
6.18.1 Metode de testare a eficacității produselor finite. Evaluarea non -invaziză a
pielii în industria cosmetică ………………………….. ………………………….. ……………………… 62
6.18.2 Peisajul fiziologic, morfologic și imunologic al pielii: de la interior la exterior … 62
6.18.3 Microbiota normală a pielii ………………………….. ………………………….. ………………. 62
6.19 Optimizarea activitatii antimicrobiene prin obținerea unor nanosisteme
funcționalizate cu compuși naturali, pentru industria cosmetică ………………………….. .. 62
6.20 Obținer ea si caracterizarea fizico -chimică a unor materiale nanostructurate
hibride anorgano -organice cu proprietăți antimicrobiene ………………………….. …………. 62
6.21 Evaluarea activitatii antimicrobiene a nanosistemelor funct ionalizate ……………. 62
CAPITOLUL 7. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 62
Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ……………………….. 62
7.18.1. M etode de testare a eficacității produselor finite. Evaluarea non -invaziză a pielii
în industria cosmetică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 62
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 69
CONCLU ZII GENERALE ………………………….. ………………………….. ……………… 69
Lista de lucrări publicate pe parcursul elaborarii tezei ………………………….. ….. 69

4
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 70

1
INTRODUCERE

În conformitate cu studiile actuale de biochimie, se poate afirma că fiecare
specie are un metabolism specific direcționat asupra organismului de supraviețuire
într-un echilibru dinamic cu mediul său. Aceasta este premisa diversității chimice în
natură. Este deja cunoscut potențialul uriaș al plantelor superioare de a sintetiza
compuși organici, cei mai multi dintre ei ca metaboliți secundari, care prezintă un
interes special pentru industria farmaceutică, ali mentara sau cosmetica. Se estimeaza
ca intre 40000 -70000 de plante medicinale descrise, sau 250000 de compuși naturali
izolați sunt utilizați în scopuri terapeutice [1]. Descoperita întâmplător, în secolul al
XVII -lea, chinina a fost primul compus natural, izolat din rădăcina arborelui de
cinchona, utilizat în tratamentul unei boli infecțioase, fiind cea mai buna obtiu ne de
tratament pentru malarie până in 1920 cand, au fost produse medicamente
antimalarie sintetice, cu un indice terapeutic superior (de exemplu clorochina).
Pierre Joseph Pelletier și Joseph Caventou au izolat și purificat compusul activ din
pulberea de scoarță de copac cinchona. Alături de chinina, alti trei alcaloizi cu efect
antimalarie, si anume, cinconină, cinconidină și chinidina au fost izolati din coajă de
copac cinchona [2].
Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a emis linii directoare privind
evaluarea calității medicamentelor pe bază de plante și definirea acestor produse,
precum și criterii necesare pentru a le distinge de constituenții izolați. În 1996, OMS
a emis definiția medicamentelor pe bază de plante, numindu -le: " produse medicinale
finite, etichetate care contin ingrediente din părțile aeriene sau subterane ale
plantelor sau alte materiale vegetale, fie în stare brută sau sub formă de preparate
din plante". Această definiție face distincția între medicamentele pe bază de plante și
subs tanțele definite chimic, sau compuși izolați din matrici fitochimice [3].
Medicina tradițională și remediile din plante reprezinta o o pțiune de tratament în
anumite țări din Asia, Africa și America Latină, fiind utilizate într -o proporție
majora în comparație cu medicina alopata (80%, conform OMS, 2002)[3]. Este bine
cunoscut faptul că fito -componentele reprezintă molecule model pentru s inteza
chimică farmacologică, acestea stau la baza a mai mult de 25% a monografiilor
medicamentoase din farmacopee [4]. Fitochimicale cu proprietati antimicrobiene
aparțin mai multor clase majore de compuși chimici: flavone, fenolii, terpenoide și
uleiuri esențiale, alcaloizi, lectine și polipeptide, și poliacetilene [5], [6], [7].

2
In ultimii ani s-a observat un interes crescut pentru compusii naturali de
origine vegetala ca o sursa de molecule farmacologic active. Compusii naturali sunt
cunoscuti pentru activitatea lor bactericida, virulic ida, fungicida, datorata
proprietatilor medicinale și actiuni manifestate impotriva unei game largi de
microorganisme patogene. Ca urmare, utilizarea lor in combaterea intectiilor
microbiene si controlul microorganismelor rezistente la medicamente reprezi nta o
abordare promitatoare in fata unor p robleme precum rezistenta microbiana la
substantele antibiotice existente si declinul in formularea de noi antibiotice.
CEVA DESPRE INDUSTRIA COSMETICĂ …BLA BLA BLA FORMULARI
TOPICE…
Scopul prezentei lucrări a fost de a …

3

PARTEA TEORETICĂ
_____________________________________________________________________

CAPITOLUL 1.
Clasificarea principalilor compuși vegetali cu activitate antimicrobiană

Compușii naturali de origine vegetala, desi, in anumite parti ale lumii precum
Asia sau Egipt, sunt utilizati de secole in diverse scopuri curative, au reintrat in
atentia cercetatorilor datorita declinului suferit de antibiotice si datorita nevoii de
noi solutii terapeutice necesare pentru con tracararea incidentei tulpinilor MDR.
Principalele clase de compusi naturali cu activitate antimicrobiana sunt:
1.1 Compuși fenolici
Compusii fenolici, agliconi a heterozidelor fenolice, acizi fenolici liberi sau
constituenti ai uleiurilor esențiale, sunt unele dintre cele mai simple fitochimicale
bioactive, fiind metaboliti secundari implicati in principal in mecan ismele defensive
ale plantelor. Un vast grup de compusi cu diferite stari oxidative sau grade de
hidroxilare diferite pot fi mentionati drept reprezentanti. Clasificarea in functie de
natura agliconului si in functie de atomul de legatura a heterozidelor f enolice
include: (1) – C6 – derivati de hidroquinona; (2) – C6-C1 – derivati din saligenol,
aldehida salicilica, acid salicilic, acid galic; (3) – C3-C6 – derivati ai acidului
cafeic, cumarine, furanocrome si ligani; (4) – C6-C3-C6 – flavone si derivati,
antocianozide, proantocianozide si taninuri catechice; (5) – taninuri – galic,
amestecat si sintetice.
Caracterul lipofil (lipofilicitatea), capacitatea de a interacționa cu partea
fosfolipidica a membranelor microbiene, precum și refractivitatea molara, o măsură
a polarizabilitatii totale a unei molecule, sunt principalii factori ce confera
proprietăți antimicrobiene compusilor fenolici. Capacitatea compusilor fenolici de a
forma radicali liberi este un mecanism specific de acțiune dovedit a fi implicat în
activitatea antimicrobiană a acestor compuși. Descriptorii fizico -chimici ai
moleculelor și modelarea QSAR au fost folosite pentru a descrie mecanismul de
acțiune mentionat anterior [8]. De asemenea, așa cum a fost citat, fenolii ar putea
acționa ca inhibitori de enzime împotriva microorganismelor, afectând prin legături

4
chimice grupările sulfhidril, sau participand la formarea de legaturi intermoleculare
nespecifice cu anumite molecule proteice [9], [10], [5].
Existența pompelor de eflux reprezintă un factor important în rezistența
microbiană intrinsecă, dar mutații sau supra expresia genelor care codifică pentru
pompele de eflux induce un nivel mai ridicat de rezistență la diferiți agenți
antimicrobieni care sunt substraturi ale pompei respective. [11]. Mutațiile
punctiforme care schimbă un singur aminoacid pot modifica activitatea pompelor de
eflux, acestea devin mai eficiente în eliminarea unui anumit compus antimicrobian
din celula prin pomparea activă a acestuia din citoplasmă în spațiul extracelul ar.
Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al
rezistenței bacteriene, dar și a celulelor neoplazice. De exemplu, în celulele
canceroase umane, rezistenta la chimioterapia antitumorală este mediată de
pompe de eflux tipice , cum ar fi pompa glicoproteinei P (Pgp), prezenta,
de asemenea, la bacteriile patogene rezistente la antibiotice și antiseptice.
Pompele de eflux reprezintă aproape 18% din proteinele de transport care
acționează ca mecanism de protecție a celulei bact eriene, și au rolul de a proteja
celula bacteriana de concentrații mari de molecule mici, care tind să pătrundă în
celulă prin transport activ sau prin difuzie liberă. Condițiile de mediu și existența
unei presiuni selective pot creste activitatea unei pom pe de eflux care, conferă un
nivel ridicat de rezistență la antibiotice pentru bacteriile sensibile anterior. Supra –
exprimarea activității pompelor de eflux, asociată cu o permeabilitate redusă a
membranelor, conferă bacteriilor Gram -pozitive, Gram -negativ e și micobacteriilor
rezistență la antibiotice și au o contribuție semnificativă la apariția unor tulpini
bacteriene Gram -negative multidrug resistant. Specificitatea de actiune a
pompelor de eflux (transportatori) este variabila: cei mai mulți transport atori au un
spectru restrâns de acțiune, fiind specifici unui anumit medicament / antibiotic
(de exemplu TetB în E. coli conferă rezistență la tetraciclină si unei game restranse
de analogi ai acesteia), în timp ce alții pot transporta o mare varietate de
medicamente și, prin urmare, au fost numite pompe de tip MDR. În general,
pompele de eflux sunt codificate de gene localizate pe elemente genetice mobile
(pompa Tet în E. coli) și ar putea fi diseminate pe orizontală, de asemenea, ar putea
fi codificate de gene cromozomiale. Sistemele de eflux multiple au o semnificație
clinică majoră: achiziționarea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la o gamă

5
largă de agenți chimioterapeutici. Rezistența mediată prin pompe de eflux
membranare a fost descoperita in ițial la o tulpină de E. coli rezistenta la tetraciclină.
Ulterior, pompele de eflux au fost descrise și la Streptococcus
mutans (CDM), Stenotrophomonas spp. (Fua ABC), K. pneumoniae (Kex D), S.
aureus (Lmrs) [11].
Toate bacteriile adăpostesc mai multe gene cu localizare cromozomiala ce
codifica pentru pompele de eflux MDR, dar unele dintre ele sunt mobilizate și devin
plasmidiene, ceea ce le face mai ușor transferabile între celule. În funcție de sursa de
energie utilizată de pompe, sistemele de eflux ar putea fi sisteme de transport activ
primare (caseta de legare ATP (ABC)) și sisteme de transport activ
secundare. Transportatorii secundari sunt clasificați în 4 superfamilii.
Un număr de agenți patogeni ai plantelor au fost studiati pentru evaluarea MDR
ca pompe bacteriene – mediatori ai plantelor cu semnificație ecologică în biosfera
solului, care mediază interacți unile bacterii – plantă. Compuși precum quercetina și
izoflavonele, vast intalnite în plante și identificate a fi implicate în apărarea
antiinfecțioasă, sunt eliminate în timpul proceselelor de detoxifiere prin efluxul
activ. Mai mult decat atat s -a desco perit ca acidul salicilic este un inductor ce
favorizeaza supra -exprimarea genelor bacteriene care codifica sistemele de eflux
AcrAB si EmrAB.
In ceea ce priveste patogenul uman Burkholderia cepacia , derivată
ecologic, a fost identificat un mecanism simi lar. Navas și colab. 2007, citat de
Martinez și colab., a concluzionat că pentru anumite microorganisme oportuniste
caracteristicile de virulență au fost implicate inițial în interacțiunile ecologice în
mediile non -umane [12], [13]. O rezistență încrucișată indusă de către
sistemul de eflux MexAB -Oprm în sistemul de eflux MexAB -Oprm la P.
aeruginosa a fost identificata ca fiind caracteristica esențială a rezistenței și / sau
toleranței la antibiotice, solvenți și la compuși naturali ant imicrobieni acumulati în
frunzele de Melaleuca alternifolia [13]. Salicilat ul, un medicament anti -inflamator
non-steroidian, induce, în concentrațiile subinhibitorii, activarea
factorului de transcriere MarA la E. coli, care este implicată ca modulator de
activitate pentru anumite gene corelate pozitiv cu antibiorezistenta și vir ulența [14].
Activitatea pompele de eflux este un mecanism bine cunoscut pentru rezistența
microbiană la antibiotice, si ar putea fi un obiectiv adecvat pentru combaterea
acestui fenomen [15].

6
În ceea ce privește activitatea impotriva Campylobacter a compusilor fenolici
și anume a acidului carnosic și rozmarinic, a fost mentionat sinergismul de acțiune
cu inhibitori ai pompei de eflux (β -naftilamidă fenilalanină -arginină) precum și
activarea pompei de eflux CmeABC [9], [10], [5].
1.1.1 Acizi fenolici
Acizi fenolici, și anume acizii ferulici și p -cumarici, sunt legati în structuri
polizaharidice complexe, asigurand rigiditatea peretelui celular. Eliberati din aceste
structuri, sunt metabolizati de catre enzimele decarboxilazei acidului fenolic (PAD
phen olic acid decarboxylase ), care, de asemenea, poate conferi rezistenta la acesti
compusi la microorganisme precum Bacillus pumilus, Lactobacillus
plantarum și Sacharomyces cerevisiae. FADaza (decarboxilaza acidului
ferulic), care aparține familiei FAD, s -a dovedit a fi implicata în rezistența
Enterobacter sp. la toxicitatea acizilor fenolici [16]. În cazul tulpinilor de E. coli un
mecanism diferit a fost descris, acesta implică inducerea unui operon mar, un
locus de reglare / control a rezistentei plurimedicamentoase. Sistemul de detoxifiere
necesită ca o etapă cheie sinteza proteinei MarA , care controlează ulterior eliminarea
compușilor toxici din celula [17].
1.1.2 Quercetina
Flavonoizii ( de exem plu, crizol, biacalien, luteolin, lucenin, apigenina,
saponarin, vitexin, miricetină, datiscetin, kaempferol, quercetin și flavone) au un
spectru semnificativ de activitate antibacteriană. Escherichia coli, Enterobacter
cloacae, Klebsiella pneumoniae, Prot eus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa, precum si S. aureus, Bacillus subtilis au fost menționate ca fiind
sensibile la acești compuși, inclusiv tulpini MDR, cum ar fi MRSA – Staphylococcus
aureus rezistent la meticilină și VRE – enterococi rezistenți la vancomicină. Mai mult
decât atât, flavonoidele poate potența sau actiona sinergic cu agenți antimicrobieni
[18].
1.1.3 Taninurile
Taninuri, un grup cuprinzator de substanțe fenolice polimerice, au fost
desemnate drept agenți anti -infecțioși. Activitatea antimicrobiană a acestor compuși
se datorează capacității lor de a interacționa cu proteinele, prin urmare, inactivand
adezinele mic robiene, enzimele, proteinele de transport ale învelișului celular

7
etc. În ceea ce privește rezistența microbiană la taninuri, au fost identificate două
mecanisme intrinseci: caracteristica specială a microorganismelor Gram -negative, si
anume, peretele cel ular, iar producția de tanaze intalnita la speciile
de Aspergillus și Penicillium, raportată de asemenea la Lactobacillus
plantarum. Bacteriile Gram pozitive sunt sensibile la taninuri, cu excepția bacteriilor
lactice acide și Campylobacter jejuni.
Studiil e efectuate pe bacterii
precum Str. caprinus sau Sel. ruminantium K2, au arătat că aceste
bacterii se adapteza și tolereaza taninurile in perioada de latență crescută necesară
pentru sinteza galat decarboxilazei sau tanin acil -hidrolaza si producerea unui
glicocalix protector. Rezistența la prezența acidului taninic sau catachin galat ar
putea fi mediată de producerea de pirogalol din galat [19], [20].
1.2. Alcaloizi
Alcaloizii sunt compuși azotati heterociclici versatili cu activitate
antimicrobiană dovedită în numeroase studii care reflectă potențialul farmacologic al
acestor compuși și care le justifică reputația lor de „Blestem și Binecuvântarea a
naturii". Alcalo izii sunt clasificati în funcție de structura chimică și de origine.
În ceea ce privește activitatea lor antimicrobiană, alcaloizi pot fi considerati
substanțe cu efect microbicid direct, exprimat într – o manieră
dependentă de concentrație, care afectează bacteriile Gram -pozitive, Gram -negative
si fungi, si care actioneaza ca enhancer pentru antibioticele utilizate în mod obișnuit
în clinică și țintesc spre virulența microbiana. Printre substanțele antimicrobiene
deja stabilite cu origine semisintetică și naturală, sunt chinolonele, metronidazolul,
linezolidul și trimetoprimul. Mecanismele de actiune ale alcaloizilor au tinte
multiple, cum ar fi membrana exterioara – perturbari citoplasmatice ale membranei,
inhibarea respiratiei celulare, perturbarea inelu lui Z si a sintezei acizilor nucleici /
inhibarea diviziunii celulare [21]. Pompele de eflux s – au dovedit a fi implicate în
rezistența la alcaloidul reserpina [22], [23].
Implicația pompelor de eflux în rezistența încrucișată la antibiotice și
substanțe naturale justifică eforturile depuse pentru dezvoltarea de inhibitori ai
pompelor de eflux (EPI efflux pumps inhibitors ). Această direcție de cercetare este
extrem de importanta, deoarece aceasta ar putea restabili potențialul farmacologic al
antibioticelor utilizate în prezent precum și al agenților anticancerigeni, prevenind

8
totodata apariția rezistenței la noi agenți terapeutici naturali și sintetici. Cu toate
acestea, riscurile potențiale pentru selectarea rezistenței încrucișate la medicamente
și EPI trebuie să fie evaluate cu atenție.
1.3. Poliacetilene
Poliacetilene sunt produse naturale cu gruparea functionala alchinil cu una
sau mai multe legaturi de carbon, cu structuri non -polimerice. Mai mult de 2000 de
poliacetilene sunt cunoscute, în special cele din
familia de plante Asteraceae, depășind 1100 de derivați, C -17 poliacetilene alifatice,
inclusiv falcarindiol [24]. Caracteristica principală a acestor compuși este
instabilitatea chimică, fiind sensibi la oxidare, fotoliză, sau descompunerea
dependentă de pH, toate aceste caracteristici fiind provocari in izolarea si
caracterizarea lor [25].
Activitatea antimicrobiană ampla împotriva bacteriilor Gram -pozitive, Gram –
negative și fungi, a fost raportată pentru compușii poliacetilenici cu grupe
funcționale oxigenate (dioli, acizi carboxilici) [25], [26], [27]. Cu toate acestea,
Estevez -Braun și colab. 1994, au obținut un compus poliacetilenic cu o structura
C17 din Bupleurum salicifolium și au menționat o activitate antimicrobiană selectivă
a plantelor, împotriva bacteriilor Gram -pozitive S. aureus și B.subtilis, dar
nu și impotriva celor Gram -negative sau a levurilor [28].
1.4. Uleiuri esențiale
Uleiurile esențiale sunt amestecuri complexe de compuși, în principal
terpenoide, urmate de constitu enți aromatici și alifatici [29], [30]. Compușii cu
potențial antimicrobian, componenți ai uleiurilor volatile, aparțin mai multor clase
de substanțe precum: (1) hidrocarburi monoterpenice; (2) fenoli și metil -eterii
acestora; (3) alcooli monoterpenici; ( 4) lactone sesquiterpenice; (5) aldehide și
cetone monoterpenice; (6) eteri; (7) oxizi monoterpenici; (8) ftalide [6], [29], [30].
În general, aceste componente majore stau la baza proprietăților biologice ale
uleiurilor volatile, ele fiind împărțite în două grupe principale de origini biosintetice
diferite: terpene și compuși aromatici. Proprietățile biologice reprezentă un criteriu
de clasificare a acestor componente în: (1) antibacteriene; (2) antimicotice; (3)
antivirale; (4) antiparazi tare [6].
În ceea ce privește activitatea antimicrobiană a componentelor uleiurilor
esențiale, caracterul lipofil al scheletului de hidrocarburi și caracterul hidrofil al

9
grupelor funcționale sunt cele mai importante trăsături. Ierarhia activității
antimicrobiene a componentelor uleiurilor esențiale este: fenoli > aldehide > cetone
>alcooli > eteri > hidrocarburi. Cea mai ridicată activitate antimicrobiană a fost
raportată pentru fenoli – timol, carvacrol și eugenol, fapt explicat de natura acidă a
grupări hidroxil, care formează o legătură de hidrogen cu centrul a ctiv al unei
enzime. Prin urmare, uleiurile esențiale la care sunt întâlniți fenolii în compoziție,
exprima cea mai ridicată activitate antimicrobiană, având cel mai larg spectrul de
activitate [31].
Bacteriile pot utiliza componentele din ul eiurile esențiale, în special
monoterpenele, ca unică sursa de carbon și energie. Mai multe căi metabolice sunt
implicate în degradarea acestor compuși [32], [33]. Activitatea antimicrobiană a fost
studiată extensiv și a fost demonstrata împotriva unei varietăți de
microorganisme, care vizează diferite situsuri din celulele microbiene, într – o
manieră dependentă de concentrație, și nu datorată specificității microbi ene sau a
uleiului esențial. La bacteriile Gram -pozitive a fost observată o sensibilitate mai
mare la uleiurile esentiale, semnificativ diferita în ceea ce privește structura
peretelui celular comparativ cu cele Gram -negative. Întrucât membrana exterioara
conține lipopolizaharide, a fost menționată ca fiind o barieră naturală pentru
moleculele antimicrobiene, inclusiv pentru uleiurile esențiale [34], [35], [36].
O directie importanta a cercetarii ce se dezvolta rapid o reprezinta utilizarea
de uleiuri esențiale în formulările fito -farmaceutice ca o soluție cu potențial
antimicrobian [35], [37]. Pe de altă parte, o preocupare specială a apărut, și anume
posibilitatea inducerii toleranței bacteriene la anumiți compuși, prin utilizarea
lor pe scară largă în scopuri clinice. În acest sens, Yap și colab. 2014, au recomandat
o investigație sistematică și extensivă a amplorii prin care bacteriile se dezvoltă
rezistența la componentele uleiurilor esențiale [35]. De exemplu, incepand cu anul
1920, uleiul de arbore de ceai a fost utilizat in Australia, în mediul clinic ca agent
antiinfecțios, aparent fără consecințe legate de dobandirea rezistenței microbiane.
Studiile de inducție a rezistenței furnizează date contradictorii cu privire la
posibilitatea de a obține o rezistență la uleiuri esențiale, dar datele inconsistente pot
proveni de la metodologia de testare, tipul tulpin ii, sau ulei esential utilizat. Cu toate
acestea, expunerea repetată a tulpinilor de MRSA la ulei de arbore de ceai a permis
izolarea de sub -populații rezistente [38], [39]. Un studiu amplu cu pasaje specifice a
fost efectuat pe izolate clinice și tulp ini de colectie prin utilizarea uleiului

10
esential de oregano și scorțișoară si a condus la obtinerea de putine dovezi
referitoare la aparitia resistentei in condițiile date, pentru doar trei specii (Serratia
marcescens, Morganella morganii, și Proteus mira bilis) după expunerea la ulei
esential de oregano [40].
Cu toate acestea, s – a sugerat că complexitatea amestecului de compuși
contribuie semnificativ la mecanismul de acțiune cu tinte multiple, depășind
posibilitatile specifice de adaptarea a microorganismelelor la anumite substanțe
antimicrobiene. Mai mult decât atât, afectarea indusă membranei de către acesti
fitocompusi sustine ideea că există șanse minime de a dezvolta rezistență la uleiuri
esențiale [35], [41], [42].
1.5. Lectine si polipeptide
Cu un număr impresionant de molecule descrise deja din surse naturale (peste
1000 -2000 conform diferitilor autori) [1], [43], [44], [45], peptidele
catio nice mentionate sunt: defensine (mici proteine încărcate pozitiv), catelicidine
(polipeptide cu anumite activități imunologice) și trombocidine (proteine cu
activitate microbicidă); acestea s-au dovedit a fi implicate in apararea împotriva
bolilor infecțio ase. La nivel epitelial, acestea protejează gazda împotriva
microorganismelor patogene. Prin activitatea lor chemotactica, aceste molecule ar
putea acționa ca neutrofile sau activatori trombocitari [46]. Caracteristicile – cheie
care au fost acceptate pentru peptidele antimicrobiene sunt de la plante care aparțin
diferitelor familii, și anume prezența unor reziduri ale aminoaciz ilor, ca cisteină și
glicină, legăturile disulfidice care conferă proprietăți structurale pentru rezistenta la
stresul mediului inconjurator, precum și sarcina pozitivă a aminoacizilor, cum ar fi
arginină sau lizină, dar, de asemenea, acizii aspartic și gl utamic. Mecanismul
principal de acțiune este denaturarea membranei prin formarea de pori, ceea ce duce
la dezechilibru electrolitic, pierderea metabolitilor, urmand o cascada de evenimente
care conduc la moarte celulara [47]. Poate fi remarcat faptul că bacteriile, cum ar
fi Staphylococcus aureus, Salmonella enterica și alți agenți patogeni
bacterieni au răspuns la această presiune selectivă prin modificări structurale și
chimice, prin dezvoltarea unor mecanisme de rezistență s pecifice, cum ar fi
rezistența inductibila prin degradarea proteolitică, modificarea structurii membranei,
activarea efluxului si reglarea expresiei peptidelor aantimicrobiene sau rezistenta
constitutivă (ecranare electrostatica a membranei sau potențiale modificări prin
legare covalentă de molecule ca acizii teicoici, fosfolipidele sau lipidul A, reducand

11
sarcina negativa generala de pe suprafata bacteriana, precum și formarea
biofilmului) [46], [48], [49], [50], [18].
Lectine sunt clustere de glicoproteine care recunosc și leaga glicoconjugate
asociate carbohidratilor. Aceste reacții sunt specifice și reversibile [51], [52].
Recunoașterea lectina -carbohidrați ar putea avea ca rezultat in vitro aglutinare a
celulara, lectinele fiind capabile sa precipite glicoconjugatele. Sunt vast raspandite
drept compusi naturali ce pot fi intalnite in organisme ce formeaza bacterii la
animale. Cu toate acestea, plantele din familia Leguminaceae sunt printre cele mai
boga te surse de l ectine. Interacțiunea lor specifică cu carbohidrați este de asemenea
implicata în rolul lor antimicrobian – prevenirea adeziunea bacteriana / penetrarea în
citoplasma celulei gazdă, blocând bacteriile mobile sau prin inhibarea
caracteristicilor virulente a le bacteriilor, cum ar fi functionarea adezinelor LECA și
LecB prezente pe membrana exterioara a tulpinilor de P. aeruginosa ce induc leziuni
pulmonare [51], [53]. Cu toate acestea, rezistența naturală la lectine a fost
menționată la tulpinile virulente de Pseudomonas solanacearum , care au scăpat de
recunoașterea specifică mediată de lectină și au infectat cartofi [51].

CAPITOLUL 2.
Activitatea antimicrobiana a compusilor naturali si meca nisme de rezistenta
bacteriana

Extractele din plante au fost utilizate de secole in interesul sanatatii umane, in
mod special in Asia. Scopul era accelerarea procesului de vindecare a ranilor sau
tratarea bolilor infectioase comune. Astfel de remedii tra ditionale sunt inca utilizate
in tratamentul de rutina al diverselor boli. Spre exemplu, utilizarea sucului de mure
(Arctostaphylos uvaursi) si merisoare ( Vaccinium macrocarpon ) in tratarea
infectiilor tractului urinar, sau utilizarea uleiului esential d e arbore de ceai
(Melaleuca alternifolia ) sub forma de ingredient activ in multe formulari topice
pentru tratarea infectiilor cutanate. Uleiul esential de Hydrastis canadensis si din
specii de Echinacea sunt utilizate in tratarea tuberculozei [1].
Datorita potentialului lor curativ, extractele din plante au fost investigate in
scopul dezvoltarii de noi substante de control a infectiilor bacteriene. Dintre
numeroasele medicamente care au la baza plantele, doar cateva sunt utilizate ca

12
substante antimicrobiene, bacteriile si fungii sunt c u precădere sursele principale ale
terapiilor antimicroniene. Totusi, problemele legate de toxicitate si rezistență au
crescut interesul in produsele provenite din alte surse, in mod special asupra
metabolitilor secundari din plante (substante fitochimice ). Datorita cresterii gradului
de constientizare cu privire la problema rezistentei la antibiotice, auto -medicatia cu
o multitudine de produse din plante, se bucura de o popularitate demna de luat in
considerare. WHO ( World Health Organisation ) a remarcat ca majoritatea populatiei
utilizaeaza medicina traditionala in asistenta medicala primara. Intr -adevar, in 2010
comertul cu amanuntul al suplimentelor dietetice botanice a fost estimat la mai mult
de 25 de miliarde de dolari, in Statele Unite ale Americii, conform studiilor
publicate de Universitatea din Illinois, Chicago la National Institutes of Health
Center for Botanical Dietary Suppliments Research. [54].
Substantele fitochimice care au o concentratie minima inhibitorie cuprinsa
intre 100-1000 μg/mL -1 in testele in vitro de susceptibilitate, pot fi clasificate drept
substante antimicrobiene. Multe dintre aceste substante sunt produse de plante ca un
mecanism defensiv de raspuns la distrugerea tesuturilor rau atacul patogenilor.
Acestea sunt, de obicei clasificate drept fitoalexine. Alte substante, cunoscute ca si
fitoanticipine, sunt prezente in mod constitutiv intr -o forma inactiva, conferind
plante miros caracteristic (asemanator terpenelor), o pigmentatie distictiva ( quinone
si tani nuri) si o aroma (de exemplu capsaicina din ardeiul iute).
Alcaloizii, flavonoidele, lactonele, polifenolii, glucosteroizii, diterpenele,
triterpenele si naftoquinonele sunt cele mai cunoscute clase de substante fitochimice.
Unele dintre aceste substante produse de plante pot lupta cu succes impotriva
infectiilor. Raritatea aparitiei bolilor infectioase la plantele salbatice indica eficienta
mecanismelor defensive innascute ale acestora. Prin urmare, se considera ca acele
substante fitochimice actioneaza s inergic cu celelalte substante intrinseci, ca de
exemplu cu inhibitorii pompelor de eflux, astfel avand un rol important in sistemul
defensiv al plantei impotriva infectiilor [32].
Multe studii au indicat ca o gama larga de extracte din plante actioneaza
impotriva m ecanismelor de rezistenta bacteriana. Majoritatea studiilor s -au
concentrat pe combinatiile dintre extractele din plante si antibiotice pentru
screening -ul RMA.
Efectul bactericid si bacteriostatic al biocidelor vegetale poate influenta
senisibilitea tulp inilor resistente la substantele antibiotice. Tintele de actiune includ,

13

Figura 1. Mecanisme de acțiune și rezistență a principalelor clase compuților activi din plante ca si in cazul antibioticelor, interferenta cu sinteza peptidoglicanului, inhibitia
activitatii pompelor de eflux si destabilizarea membranei externe. In cazul uleiurilor
esentiale ac estea pot inhiba expresia factorilor de virulenta in celulele microbiene. In
general activitatea bactericida a uleiurilor esentiale este mai mare la bacteriile Gram
pozitive fata de cele Gram negative d eoarece prezenta lipopolizaharidelor din
membrana exte rna a bacteriilor Gram negative confera rezistenta la uleiuri volatile si
alte bactericide [50].
Numeroase extracte din plante au activitate antimicrobiana directa, dar de
asemenea si activitati de modulare sau modificare a profilului de rezistenta la
antibiotice (ac tiune antipatogenica). Agentii de modificare a rezistentei ar putea
inhiba mecanismele de rezistenta plurimedi camentoasă (Figura 1). Screening -ul
sistematic poate conduce la descoperirea de noi compusi activi ce atenueaza
simultan numeroase efecte secundare care, de cele mai multe ori, sunt asociate cu
substantele antimicrobiene conventionale.

14
2.1. Sine rgisme, antagonisme si relatii aditive in activitatea EO sau a
componentelor acestora

Termenul de “ulei esential” a fost folosit pentru prima data in secolul al XVI –
lea de catre Paracelsus von Hohenheim, care se referea la componenta activa a unei
substan te “Quinta essential” . Primele informatii legate de utilizarea uleiurilor
esentiale in scopuri terapeutice au fost regasite in papisurul Ebers.
Primele investigații sistematice privind identificarea constituenților uleiurilor
esentiale sunt atribuite chimistului francez M. J. Dumas (1800 -1884), ale cărui
rezultate au fost publicate în 1833. Cele mai importante studii de pionierat asupra
uleiurilo r esentiale au fost legate de numele celebrului chimist german Friedrich
Kekule, principalul fondator al teoriei structurii chimice, ai cărui colaboratori au
contribuit la identificarea și caracterizarea unor compuși naturali, derivați terpenici,
hidrocar buri și derivați oxigenați ai acestora.
În ceea ce privește activitatea biologică a uleiurilor esențiale, trebuie avut în
vedere faptul că acestea sunt mixuri complexe de numeroase molecule, așadar,
inevitabil, apar întrebări referitoare la efectele lor b iologice: ar putea fi rezultatul
sinergismului tuturor moleculelor sau se reflectă doar asupra principalelor molecule
prezente în concentrații ridicate?
În majoritatea cazurilor întâlnite în literatură, doar constituenții principali ai
uleiurilor esenția le, precum eugenol, timol, carvacrol, eucaliptol, linalol,
cinamaldehida, au fost analizați. În general, doar în cazul componentelor principale
s-a constatat că reflectă foarte bine caracteristicile biofizice și biologice ale
uleiurilor esențiale din care au fost izolate, amplitudinea efectelor fiind dependentă
doar de concentrația la care au fost testate [55].
Totuși, funcțiile sinergice ale diverselor molecule care compun uleiurile
esențiale în comparație cu activitatea unuia sau a mai multor componente majore din
ulei, rămâne sub semnul îndoielii. Cu toate acestea este posibil ca activitatea
componentelor pr incipale să fie modulata de moleculele mici întâlnite în uleiurile
esențiale [56]–[58].
Au fost investigate interacțiunile sinergice dintre diferite mixuri de uleiuri
esențiale și mixuri de componente majoritare întâlnite în uleiuri dar, cu toate acestea
magnitudinea sinergismului a fost mică, neavând nici o importanță practică [59]. În
mod contrar, un sinergism puternic s -a observat între uleiuri volatile și aditivi
alimentari, fapt care poate duce la utilizarea unor cantități mai mici de arome și

15
conservanți alimentari, acest aspect este foarte important, deoarece utilizarea
uleiurilor volatile în industria alimentară este destul de limitată [60].
A fost observat sinergism între carvacrol și hidrocarburi monoterpene, precum
α-pinen, camfen, mircen, p -cimen, care în mod normal au proprietăți antimicrobiene
reduse. Capacitatea hidrocarburilor de a interacționa cu celulele membranei
facilitează penet rarea carvacrolului în celulă [61], [62] . R.S. Pei și colab . au emis
ipozeza conform căreia efectele sinergice dintre eugenol și carvacrol precum și
eugenol și timol ar putea fi datorate carvacrolului și timolului care dezintegrează
membrana externă la E.coli , ceea ce facilitează patruderea eugen olului în citoplasmă
și combinarea cu proteinele. De asemenea a fost observat un efect sinergic între
eugenol și cinamaldehida, care poate fi rezultatul interacției acestor componente cu
diverse proteine sau enzime [63].
În scopul de a reduce rezistenta microorganismelor prin menținerea eficienței
antibioticel or dar, fără a le crește concentrațiile, a fost luată în calcul utilizarea
uleiurilor esențiale, deoarece acestea prezintă o activitate antimicrobiană
promițătoare. Studiile au arătat că uleiurile esențiale pot acționa sinergic cu
antibioticele. Combinare a unor componente ale uleiurilor esențiale, ca de exemplu
1,8-cineol, linalol sau terpinen -4-ol, cu antibiotice a inhibat puternic creșterea unor
microorganisme precum E.coli , Staphylococcus spp . și Pseudomonas spp [64].
Mulți autori au sesizat activitatea antimicrobiană a uleiurilor volatile și au încercat
să o coreleze sau să o compare cu cea a componentelor individuale ale uleiurilor
testate, alți autori au testat doar combinațiile componentelor principale cu scopul de
a identifica posibile efecte sinergice [65]. Unul dintre cele mai interesante studii de
acesta natura corelează structura și proprietățile moleculare a 60 de terpenoizi cu
activitatea lor antimicrobiana [66]. Majoritatea studiilor s -au axat pe monoterpene,
doar câteva pe sesqui – și diterpene și cu atât mai puține pe compuși non -terpenici.
Majoritatea componentelor uleiurilor esențiale sunt compuși chirali, enantiomerii
acestora prezintă foarte rar activități biologice diferite [65].
Există un motiv general datorită căruia analiza compoziției și a ctivității
biologice a uleiurilor esențiale s -a efectuat intensiv în ultimii ani: sănătatea umană.
Medicamentele de natură chimică și conservanții sunt considerați a fi agenți
carcinogeni și teratogeni cu toxicitate reziduală. Consumatorii sunt suspicioși cu
privire la aditivii chimici, fapt care a intensificat cererea de agenți naturali pentru
protejarea oamenilor de boli și a mâncărurilor de alterare și dăunători, așadar este

16
importantă utilizarea componentelor uleiurilor esențiale în sistemele alimentar e,
deoarece acestea necesită concentrații reduse dar au un randament al activității
antimicrobiene similar cu cel al conservanților de natură chimică. Mai mult decât
atât, cu recenta creștere a infecțiilor rezistente la antibiotice, cercetarea de
medicamen te noi și soluții alternative de combatere a infecțiilor este absolut
necesară [65], [67] .

CAPITOLUL 3.
Actiunea anti – patogenica a eo sau a componentelor acestora

3.1 Actiunea anti -patogenica a EO sau a componentelor majoritare a acestora
Creșterea rezistenței microorganismelor la substanțele chimice și
medicamentele convenționale reprezintă o problemă serioasă și evidentă la nivel
mondial care a determinat cercetarea și identificarea de noi biocide cu activitate
extinsă. Plantele și derivaț ii acestora, cum ar fi uleiurile esențiale (EO), sunt adesea
folosite în medicina populară. În natură, uleiurile esențiale joacă un rol important în
protecția plantelor. Uleiurile esențiale conțin o mare varietate de metaboliți
secundari care pot inhiba sa u încetini creșterea bacteriilor, drojdiilor și
mucegaiurilor. Uleiurile esențiale și componentele acestora au activitate împotriva
unei varietăți de ținte, în special asupra membranei și a citoplasmei și, în unele
cazuri, modificând complet morfologia cel ulelor.
În general, bacteriile Gram -negative sunt mai rezistente la EO decât bacteriile
Gram -pozitive [68]. Înainte de a examina efectele EO asupra bacteriilor, este
necesară o recapitulare a difere nțelor structurale dintre pereții celulari ai bacteriilor
Gram -pozitive și Gram -negative. Aproximativ 90% – 95% din peretele celular al
bacteriilor Gram -pozitive este format din peptidoglicani, la care sunt legate alte
molecule, cum ar fi acidul teicoic și proteine. Structura peretelui celular la bacteriile
Gram -pozitive permite moleculelor hidrofobe să penetreze cu ușurință celulele și să
acționeze atât la nivelul peretelelui celular, cât și la nivelul citoplasmei. Compușii
fenolici, care sunt de asemenea prezenți în EO, prezintă în general activitate
antimicrobiană împotriva bacteriilor Gram -pozitive. Efectul lor depinde de cantitatea
de compus prezentă; la concentrații scăzute, pot interfera cu enzime implicate în
producerea de energie și, la concentrații mai mari, pot denatura proteinele [69]. Pe
de altă parte, peretele celular al bacteriilor Gram -negative este mai complex. Are un

17
strat de peptidoglicani cu o grosime de 2 -3 nm, care este mai subțire decât cel al
peretelelui celular al bacteriilor Gram -pozitive și reprezintă aprox imativ 20% din
greutatea uscată a celulei. O membrană exterioară (ME) se află în afara stratului
subțire de peptidoglican. Peptidoglicanul și ME sunt strâns legate de lipoproteinele
Braun; această proteină este legat covalent la peptidoglican și este încor porat în ME.
Prezența unei ME este una dintre caracteristicile care diferențiază Gram -negative de
bacteriile Gram -pozitive. Aceasta este compusă dintr -un dublu strat fosfolipidic care
este legat de membrana interioară de lipopolizaharide (LPS). Stratul pep tidoglican
este acoperit de o ME care conține diferite proteine, precum și LPS. LPS sunt
formate din lipidele A, polizaharide de bază și lanțul lateral O, care oferă "core -ul"
care permite bacteriilor Gram -negative să fie mai rezistente la EO și alte extra cte
naturale cu activitate antimicrobiană. Soluții hidrofili mici sunt capabili să treacă
prin ME prin intermediul proteinelor porinice abundente care servesc drept canale
transmembranare hidrofilice și acesta este un motiv pentru care bacteriile Gram –
nega tive sunt relativ rezistente la antibioticele hidrofobe și medicamente [70], [71] .
ME este, însă, aproape, dar nu total impermeabilă la moleculele hidrofobe, dintre
care unele pot trece încet prin porine [72].
Mecanismele de acțiune ale EO și a componentelor acestora depind de
compoziția lor chimică. De exemplu, timolul și carvacrolul au efecte antimicrobiene
similare, dar au mecanisme diferite de acțiune împotriva bacteriilor Gram -pozitive și
Gram -negative. Poz iția unuia sau a mai multor grupuri funcționale la nivelul acestor
molecule poate afecta activitatea lor antimicrobiană. Timolul este analog structural
cu carvacrolul, dar poziția grupurilor hidroxil diferă între cele două molecule. Cu
toate acestea, acest e diferențe nu afectează activitatea acestor doi agenți
antimicrobieni. Activitatea antimicrobiană a altor molecule, cum ar fi limonenul și
p-cymenul, depinde de gruparea alchil. Astfel, în unele cazuri, limonenul poate fi
considerat mai eficient decât p -cymenul [72]. EO sau constituenții acestora pot avea
o singură țintă sau mai multe ținte de acțiune. De exemplu, trans -cinnamaldehida
poate inhiba creșterea E. coli și S. typhimirium fără dezintegrarea ME sau epuizarea
ATP -ului intracelular. Similar cu timol și carvacrol, trans -cinnamaldehida are acces
la periplasm și porțiuni mai profunde ale celulei. În schimb, carvona nu are o acțiune
notabilă asupra ME și nu afecte ază ATP -ul celular [73].
Activitatea antimicrobiană a majorității terpenoidelor este legată de grupurile
lor funcționale, iar gruparea hidroxil a terpenoidelor fenolice și prezența electronilor

18
delocalizați sunt elemente importante ale acțiunii lor antimicrobiene. De exemplu,
carv acrolul este mai eficient decât alte EO, cum ar fi p -cymenul [72]–[74].
Schimbul dintre gruparea hidroxil și un eter metilic în carvacrol îi poate afecta
hidrofobicitatea și activitatea antimicrobiană. Poziția grupării hidroxil în moleculă
fenolică nu afectează tendința acțiunii antimicrobiene. În comparație cu carvacrolul,
timolul are o activitate antimicrobiană similară la B. cereus , S. aureus și P.
aeruginosa , chiar dacă gruparea hidroxil este localizată într -o poziție diferită [61].
Timolul și carvacrolul au proprietăți de dezintegrare a ME proeminente. Cu toate
acestea, timolul și carvacrolul nu acționează direct ca agenți de permeabilizare a ME
(spre deosebire de EDTA sau de polietilenimină, care dezintegrează ME la
concentrații s ubletale) [71], [73] .
Carvacrolul este una dintre puținele componente ale unui EO care are un efec t
de dezintegrare a ME la bacteriile Gram -negative [75]. Acesta provoacă eliberarea
LPS și, de asemenea, acționează asupra membranei citoplasmatice pentru a modifica
transportul ionilor. Activitatea carvacrolului pare să fie legată de prezența unei
grupări hidroxil care poate funcționa ca un purtător transmembranar al cationilor
monovalenți prin transportul H + în citoplasma celulară și transportul K + înapoi
[61], [74] .
Activitatea antimicrobiană a fenilpropenelor depinde, de asemenea, de tipul și
numărul de substituenți la inelul aromatic și similar celor mai multe EO, asupra
tulpinii microbiene și a condițiilor în care EO este testat [73].
Spre exemplu, isoeugenolul este mai activ împotriva bacteriilor decât
eugenolul și este, de asemenea, eficace împotriva drojdiilor și mucegaiurilor.
Interesant este faptul că eugenolul și izoeugenolul prezintă o activitate mai mare
împotriva bacteriilor Gram -negative decât împotriva bacteriilor Gram -pozitive [76].
Cinnamaldehida este, în general, mai puțin puternică decât eugenolul [77], dar
atunci când este utilizată împotriva E. coli și S. typhimurium , activitatea sa este
similară cu timolul și carvacrolul, cele mai puternice EO. Eugenolul modifică
membrana, afectează transportul ionilor și ATP -ului și modifică profilul de acizi
grași al diferitelor bacterii. De asemenea, acționează îm potriva unor enzime
bacteriene precum ATPaza, histidina carboxilaza, amilaza și proteaza.
Cinnamaldehida are cel puțin trei mecanisme de acțiune împotriva bacteriilor (inhibă
acțiunea enzimelor implicate în interacția citokinelor, inhibitor de ATPază sau
distruge membrana celulară), în funcție de concentrația la care este folosită [73].

19
Mecanismul de acțiune al EO depinde de compoziția lor chimică, iar
activitatea lor antimicrobiană nu poate fi atribuită unui mecanism unic, ci unei
cascade de reacții care implică întreaga celulă bacteriană [78]; împreună, aceste
proprietăți sunt denumite "versatilitatea uleiurilor esențiale". În general, EO
acționează pentru a inhiba creșterea celulelor bacteriene și, de asemenea, inhibă
producerea de metaboliți bacterieni toxici.
Este dificil de prezis s ensibilitatea la EO a unei anumite specii sau a unei
tulpini în cadrul aceleiași specii.. De Martino et al. [79] a observat că două tulpini
de Bacillus cereus s-au comportat diferit atunci când au fost expuse la aceleași EO și
componentele lor singulare. Înțelegerea pe deplin a activității antimicrobiene a EO și
a modului de ațiune necesită mult studiu asupra materiei prime precum și extinderea
cunoștințelor de bază despre moleculele prezente în EO. Posibilele mecanisme de
acțiune anti -patogenica ale EO sunt:
a) Distrugerea membranei celulare – efectele toxice asupra structurii și
funcției membranei sunt menționate, în general, pentru a explica activitatea
antimicro biană a EO. De fapt, mecanismele de acțiune ale EO includ degradarea
peretelui celular [80], [81], deteriorarea membranei citoplasmatice, coagularea
citoplasmei [73], deteriorarea proteinelor membranare, creșterea permeabilității ceea
ce duce la scurgerea conținutului celular[20,30], reducerea forței motrice protonice
[61], reducerea volumului de ATP intracelular prin scăderea sintezei de ATP și
hidroliza augmentată care este separată de permeabilitatea crescută a membranei și
reducerea potențialului membranei prin intermediul permeabilității membranare
crescute [78].
b) Modificarea profilului lipidic de la nivelul membranei celulare – datorită
naturii lor hidrofobe, EO și componentele acestora pot afecta procentajul de acizi
grași nesaturați (UFA) și modifica structura lor. Adapt area celulelor la prezența
acestor compuși la o concentrație mai mică decât MIC ar putea duce la o creștere a
procentului de UFA responsabili de fluiditatea membranei, ceea ce poate indica un
anumit mecanism de acțiune împotriva învelișul celulei exterioar e care ar putea
provoca modificări structurale ale membranei (observabile la SEM). Profilul lipidic
al celulelor în repaus arată reorganizarea după tratamentul cu compuși EO și mulți
autori au descris calea de sinteză a acizilor grași bacterieni drept țint ă optimă a
multor agenți antibacterieni [73], [82] .

20
c) Perturbă activitatea proteinelor – EO sau componentele acestora pot
perturba activ itatea proteinelor bacteriene în mai multe feluri si pot afecta diviziunea
celulară. Spre exemplu, cinnamaldehida este capabilă să inhibe separarea celulară la
B. cereus. Timolul afectează proteinele implicate în metabolismul energetic
(enolaze, dPGM, glic erardehid 3 -fosfat dehidrogenaza A), precum și enzimele
implicate în transportul glutaminei [73].
d) Acțiune nocivă asupra ATP -ului și a ATPazei – producția de ATP la
procariote are loc atât în peretele celular cât și în citosol prin glicoliză și s -a
demonstrat o corelație între concentrația ATP intracelulară și extracelulară. EO
perturbă membrana celula ră modificând echilibrul ATP intracelular și extern, astfel
încât ATP se pierde prin membrana afectată [72], [83], [84] .
Alte evenimente intracelulare pot contribui la scăderea ATP -ului intracelular; de
exemplu, fosfatul anorganic poate fi pierdut prin trecerea prin membrana permeabilă
compromisă [83], sau forța motricei protonului și schimbările în echilibrul unor ioni
esențiali, cum ar fi K + și H +, pot fi întrerupți. Tratamentul unor agenți patogeni,
cum ar fi E. coli și E. coli L. monocytogenes, cu eugenol, cinamaldehidă și
carvacrol, a inhibat generarea de adenozin trifosfat din dextroză și a perturbat
membrana celulară. O analiză a nivelu rilor ATP intracelulară și extracelulară a
celulelor tratate cu eugenol, cinamaldehidă și carvacrol a sugerat că acești compuși
ar putea inhiba activitatea ATPază a celulelor bacteriene [73].
e) Acțiune asupra metabolomului – metabolomia intracelulară și extracelulară
au câteva avantaje fundamentale prin faptul că pot furniza informații importante
despre genomica funcțională, ingineria metabolică, caracterizarea tulpinilor și
mecanismu l de comunicare celulară. Metaboliții microbieni își pot schimba
răspunsul la condițiile de mediu [85], [86] . Recent, cât eva metode analitice standard
puternice, incluzând RMN, microarray, GC -MS, LC -MS, au fost folosite pentru a
analiza metabolomul bacteriilor supuse stresului de mediu [73]. Fiecare met abolit
individual răspunde diferit la diferite doze de EO sau de componentele acestora. De
exemplu, unele efecte pot să apară la cantități mici de carvacrol, altele numai la doze
mai mari. Picone și colab. [87] a observat că ma joritatea semnalelor obținute prin
RMN s -au schimbat în intensitate ca răspuns la cantități crescute de carvacrol în E.
coli. Ei au descoperit că glucoza tinde să se acumuleze atunci când celulele
microbiene sunt tratate cu carvacrol, iar incapacitatea cel ulelor de a metaboliza
glucoza duce la o pierdere de viabilitate. În contrast, acizii organici, cu excepția

21
formatului, au prezentat o scădere semnificativă a concentrației care a fost invers
proporțională cu doza de carvacrol.
f) Afectează morfologia celu lară –activitatea EO și a componentelor acestora
diferă în funcție de forma bacteriilor studiate, iar celulele bacteriene în formă de tijă
au fost raportate a fi mai sensibile la EO decât celulele coccoide. În general, S.
typhimurium și E. coli au o formă normală a tijei cu o suprafață netedă, în timp ce
M. luteus și S. aureus au o formă normală de coccoidă. După 24 de ore de tratament
cu EO de mentă, deteriorarea celulară a bacteriilor de tijă a fost observată de către
Hafedh și colab . [88], în timp ce deteriorarea a fost mai puțin evidentă la bacteriile
coccoide. Aceste rezultate sunt în concordanță cu rezultatele obținute de
Kalchayanad și colab. [89], care au prezentat modificări morfologice ale doi agenți
patogeni (E. coli 0157: H7 și S. typhimurium) atunci când au fost expuși stresului de
presiune hidrostatică și bacteriocinelor și cu rezultatele experimentelor efectuate de
Braga și Ricci [90] asupra celulelor E. coli tratate cu cefodizimă. Aceste rezultate au
condus la ipoteza că exopolizaharidul de pe celulele OM a fost detașat și eliberat sau
că peptidoglicanul și membrana citoplasmică au fost perturbate [73].
Alte studii au arătat că tratamentul cu carvacrol poate crește expunerea
componentelor OM (de exemplu, proteine și lipide), determinând o creștere a
rugozității. Cu toate acestea, în bact eriile Gram -pozitive, carvacrolul se deplasează
prin stratul peptidoglican și apoi acționează asupra membranei citoplasmatice.
Modificările structurale ale membranei, cum ar fi modificarea fluidității, ar putea
conduce la o ușoară modificare a suprafeței e xterne a peretelui celular Gram -pozitiv,
astfel încât acestea să apară mai puțin dur, dar mai greu decât bacteriile Gram –
negative [73].
3.1.1 Inhibitia quorum sensing si a pompelor d e eflux
a. Inhibiția quorum sensing cu ajutorul unor compusi naturali de origine
vegetală
Bacteriile coordonează ambele tipuri de interacțiuni, atât bacteriene –
bacteriene, cât și asocierea cu organisme superioare prin intermediul sistemelor de
comunicare intercelulară cunoscute sub denumirea de sisteme de detectare a
cvorumului (QS).
QS poate reglementa o serie de activități, cum ar fi expresia factorului de
virulență, bioluminescența, sporularea, formarea biofilmului și împerecherea.
Expresia genelor QS are ca rezultat producerea moleculelor chimice de semnalizare

22
care sunt cunoscute ca autoinducții sau feromoni bacterieni. Aceste molecule sunt
produse deoarece populația bacteriană crește până când se atinge o concentrație de
prag percepută de către bacte rii, rezultând activarea sau reprimarea genelor
specifice. Acumularea unei cantități stimulatoare a moleculelor QS poate să apară
numai atunci când există un număr specific de celule, denumite cvorum [91].
Cercetătorii investighează din ce în ce mai mult produsele din plante în
căutarea unor noi agenți terapeutici și anti -patogeni care ar putea acționa ca
inhibitori netoxici ai QS, control ând astfel infecțiile fără a încuraja apariția
tulpinilor bacteriene rezistente [73]. EO pot reprezenta cel mai bogat rezervor de
terapii noi. QS bacterian poate fi inhibat prin mecan isme diferite, incluzând (1)
inhibarea sintezei AHL, (2) inhibarea transportului și / sau secreției AHL, (3)
sechestrarea AHLs, (4) acțiunea antagonistă și (5) inhibarea țintelor în aval de
legarea receptorului AHL [23], [73].
Diferitele EO din plantele ornamentale au fost observate ca fiind eficiente
împotriva biofilmel or formate de Salmonella, Listeria, Pseudomonas,
Staphylococcus și Lactobacillus spp . Componentele organice volatile, cum ar fi cele
produse de bacteria rizosferică Pseudomonas fluorescens B-4117 și Serratia
plymuthica IC1270, pot inhiba rețeaua QS de comu nicație celulară mediată de
molecule de semnalizare produse de diverse bacterii, cum ar fi Agrobacterium,
Chromobacterium, Pectobacterium și Pseudomonas . EO de lavandă, trandafiri,
mușețe, cuișoare și rozmarin sunt, de asemenea, capabile să inhibe QS, în t imp ce
EO de portocale și de ienupăr par să nu aibă proprietăți anti -QS [92]–[94].
Una dintre cele mai bine studiate componente EO este cinamaldehida.
Efectele sale au fost investigate din diverse puncte de vedere și au fost examinate
multiple mecanisme de acțiune. Niu și Afre [95] au observat că expunerea lui V.
harveyi BB886 (bioluminiscența acestei tulpini este indusă de 3 -hidroxi -C4-HSL) la
o concentrația de 60 μM cinamaldehidă a determinat o reducere cu 55% a
bioluminescenței microbiene și 60% din bioluminescența lui V. harveyi BB170
(mediată de AI -2) a fost redusă la 100 μM, demonstrând din nou că activitatea
extractelor de plante să fie specifice tulpinilor și pot depinde de molecula QS
implicată. Folosind modelul nematod Caenorhabditis elegans , Brackman și colab.
[96] au demonstrat capacitatea 3,4 -diclorocinnamaldehidei de a scădea virulența V.
anguillarum, V. harveyi și V. vulnificus prin afectarea capacității de legare a ADN a
LuxR.

23
Majoritatea testelor bacteriene sunt realizate pe celule care se presupune a fi
solitare, aflate în stare libera, denumita și stare planctonica. Însă microorganismele
co-există în comunități aderente la suprafete, cunoscute drept biofilme. Biofilmele
sunt, de cele mai multe ori, dificil de eradicat și substanțial mai puțin susceptibile
agenților antimicrobieni comparativ cu omologii lor planctonici. Mai multe studii
demonstrează că EO pot fi active împotriva biofilmelor, alte studii indicand chiar ca
activitatea inhibitoarea a EO este specifica formarii biofilmelor si nu este datorata
inhibitiei generale a cresterii bacteriene [97].
Uleiul de rozmarin si de menta au avut efect inhibitor, la concentratii de 0.02
respectiv 0.08%, importriva formarii de biofilme la Streptococcus mutans . Uleiul de
oregano, timolul si carvacrolul au inhivat formarea de biofilme la S. aureus si S.
epidermidis . Formarea de biofilme la C. albicans a fost inhibata de uleiul de
eucalipt, menta si cuisoare, precum si de compusi precum timol, carvacrol, 1,8 –
cineol, eugenol, cineol, farnesol, linalool, mentol sau α -pinen. In cazul uleiului de
oregano, a timolului si a carvacrolului, s -a fost demonstrat capacitatea de eradicare a
biofilmelor existente [97]
Un factor critic in dezvoltarea biofilmelor il reprezinta mecanismele de
comunicare si semnaliza re intra -celulara cunoscute drept quorum sensing (QS).
Producerea si secretia de catre microorganisme a diferite molecule de semnalizare
este importanta pentru comutarea tip on-off a diferitelor proprietati precum factorii
de virulenta sau producerea de bi ofilme. Pentru sesquiterpena farnesol s -a
demonstrat ca reduce productia de PQS ( Pseudomonas quinolone signal), care este
implicata in QS la P. aeruginosa [98], [97]. Farnesolul pare sa regleze si
morfogeneza la Candida dubliniensis, reduce producerea de hife si pseudohife.
Cinamaldehida interfera cu QS la Vibrio harveyi [97].
Abilitatea unui organism de a adera la o suprafata est e deasemenea importanta
in formarea de biofilme si este influentata, intr -o oarecare masura, de
hidrofobicitatea celula -suprafata. Carveolul si carvona au redus hidrofobicitatea
celula -suprafata la R. Erythropolis ; deoarece reducerea caracterului hidrofob este
corelata cu reducerea capacitatii de formare de bioflme, acesta poate fi unul dintre
mecanismele prin care formarea de biofilme poate fi inhibata.
M. Dal Sasso si co au demonstrat capacitatea timolului de a inhiba aderenta in vitro
la celule umane a t ulpinilor de S. aureus si E. coli , sugerand ca suprafata celulara
poate fi alterata in asa fel incat aderenta bacteriana sa fie redusa [97].

24
Toate aceste date indica capacitatea EO precum si a componentelor majoritare
din EO de a inhiba eficient formarea de biofilme prin interferarea cu semnalele QS si
diminuarea hidrofobicitatii celula -suprafata.

b. Inhibitori naturali ai pompelor de eflux obtinuti din surse vegetale

Identificarea componentelor vegetale, respectiv a plantelor capabile să inhibe
activitatea pompelor de eflux este importantă deoarece acestea au un mare potențial
în vederea optimizării și utilizării lor în viitor în combinație cu un agent
antimicrobian existent dar considerat a fi ineficient datorită pom pelor MDR atât în
cazul bacteriilor Gram -pozitive cât și în cazul celor Gram -negative [99].
În literat ura de specialitate este raportat un aspect important referitor la
combaterea rezistenței și anume că acesta se poate face prin vizarea mecanismului
responsabil pentru dobândirea rezistenței , în acest caz prin dezvoltarea unor
inhibitori specifici împotriv a pompelor de eflux [100] . Compușii care ar putea
interacționa cu proteine specifice pompelor de eflux ar putea restabili
susceptibilitatea organismului la agenti antimicrobieni declarați ineficienți, la
antibiotice sau alte tipuri de medicamente. Această abordare ar putea contrac ara
agenții patogeni care prezintă pompe de eflux, iar compuși, inhibitorii ai pompelor
de eflux (EPI) pot fi utilizați ca agenți chimioterapeutici împreună cu antibioticele.
Deoarece pompele de eflux coferă atât rezistență înnăscută, cât și rezistență la
antibiotice la bacterii, EPI -urile ar trebui să crească în mod ideal activitatea unui
antibiotic în celule multidrug -resistant [101] , ceea ce indică importanța dezvoltării
inhibitorilor de molecule mici împotriva pompelor de eflux. EPI pot crește în mod
eficient concentrațiile intracelulare ale medicamentului la nivelul esențial pentru
activitatea sa și, prin urmare, au capacitatea de reducere a concentrației minime de
inhibiție necesară pentru ca a ntibioticul să omoare organismele rezistente.
Fenilalanina arginil p -naftilamida (PAbN; MC -207110) a fost primul EPI
identificat pentru tulpina Pseudomonas care conține o pompă MexAB -OprM; acest
compus peptidomimetic are un mecanism competitiv de inhibare [102] . Car bonil
cianură m -clorfenilhidrazonă (CCCP) este un EPI dependent de energie care
deenergizează membranele spre deosebire de PAβN, care este mai specific
substratului [103] . CCCP nu este denumită exact ca un EPI deoarece este implicată
în forța motrice protonă necesară pentru funcționarea pompelor de tip RND, prin

25
aceasta inhibând indirect mecanismul de eflux [104] . Cu toate acestea, ambii acești
compuși nu sunt aplicabili pentru utilizarea clinică datorită proprietăților lor toxice.
Fito-chimicalele, compușii naturali produși de plante au un efect
antimicrobian foarte slab, dar încă a u capacitatea de a lupta împotriva agenților
patogeni din plante. Acest lucru se datorează unui mecanism numit sinergie adoptat
de plante [105] . Aceste substanțe fitochimice au o toxicitate minimă sau sunt
aproape lipsite de toxicitate atunci când sunt utilizate clinic și ar putea fi utilizate
pentru depășirea rezistenței la medicament în bacterii prin blocarea pompelor
multifazice de eflux.
Un ex emplu bine cunoscut este reserpina de alcaloid de plante izolată din
rădăcinile Rauwolfia vomitoria Afz care a prezentat activitate EPI împotriva pompei
de eflux Bmr de la Bacillus subtilis [106] . Klyachko și colab . au demonstrat că
reserpina interacționează direct cu proteina Bmr la nivelul aminoacizilor
fenilalanină -143, valină -286 și fenilalanină -306, și formează un situs de legare a
reserpinei [107] . Porofirinul porfirinic , silybinul , flavonii met oxilați și isoflavona
sunt unele dintre produsele fitochimice care au demonstrat activitate sinergică
împotriva pompei de eflux NorA de la tulpini de Staphylococcus aureus [106] . Toți
acești compuși sunt EPI ai bacteriilor Gram pozitive, în special pentru S. aureus , dar
pentru microorganismele Gram -negative cum ar fi P. aeruginosa , E. coli și
Acinetobacter , este dificil de identificat compuși cu activitate EPI datorită
rezistenței lor intrinseci și a prezenței membranei exterioare lipofile [106] .
3.1.2 Modularea profilului de antibiorezistenta
Multe rapoarte au descris apariția microorganismelor care sunt rezistente la
diferiți agenți antimicrobieni, frecvențele și mecanismul molecular al rezistenței la
antibiotice [35], [108] . Extractele din diferite părți ale plantelor au fost explorate pe
larg în multe studii privind capacitatea lor de a modula rezistența la medicamente
bacteriene și aceste studii ar putea servi drept referință pentru a oferi direcții
posibile pentru studii viitoare privind inversarea rezistenței microbiene (Tabelul 1).
Tabel 1. Extracte din plante care modifică rezistența antibioticelor împotriva unui grup de
microor ganisme.
Familia Partea
utilizată Microorganismul Modularea
rezistenței Metoda Bibliograf
ie
Rosmarinus
officinalis Părți aeriene S. aureus Inhibarea
efluxului MDR Analiza
efluxului
bromurei de
etidiu [35]

26
Lycopus
europaeus N/A S. aureus – – [109]
Fissistigma
cavaleriei Rădăcină P. aeruginosa Inhibitor de
lactamaze Testul de
inhibare a
lactamazei [35]
Cardiospermu
m
grandiflorum Frunze S. aureus – – [35]
Momordica
charantia L. Frunze MRSA Inhibiția
pompelor de
eflux Testul de
inhibiție a
pompelor de
eflux [35]
Mentha
arvensis L. Frunze E. coli – – [35]
Turnera
ulmifolia L. Frunze MRSA – – [35]
Catha edulis Frunze Streptococcus
oralis,
Streptococcus
sanguis,
Fusobacterium
nucleatum – – [35]
Punica
granatum Fruct MRSA Inhibiția
pompelor de
eflux Kill time ,
detecția
producției de
lactamază,
testul de eflux
al bromurii de
etidiu [35]

Combinația dintre agenții antimicrobieni convenționali și uleiurile esențiale
este un concept nou; în tabelul de mai jos sunt descrise câteva exemple (tabelu l 2).
Tabelul 2. Amestecuri de uleiuri esențiale / antibiotice care prezintă efecte sinergice împotriva unui
grup de microorganisme
Amestecuri Microorganism Metodă Interacție Bibliografie
Eremanthus
erythropappus/
ampicilină S. aureus Time -kill assay Sine rgism [110]
Oregano/
fluoroquinolone
Oregano/ doxiciclină
Oregano/ lincomicină
Oregano/ maquindox E. coli Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Pelargonium
graveolens/ norfloxacin S. aureus, B. cereus Diluții în agar Metoda
Checkerboard Sinergism [111]
Lantana montevidensis/
aminoglicoside E. coli Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [112]
Eugenol/ vancomicină
Eugenol/ -lactams E. coli, E.
aerogenes, P.
vulgaris,
P. aeruginosa,
S. typhimurium Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Croton zehntneri/
gentamicină S. aureus,
P.aeruginosa Testul difuzimetric cu
discuri (contact
indirect al EO) – [110]

27
Rosmarinus officinalis/
ciprofloxacin K. pneumoniae Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Eucalyptus/
chlorhexidine
digluconate Staphylococcus
epidermidis Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Zataria multiflora/
vancomicină S. aureus (MRSA și
MSSA) Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Aniba rosaeodora/
gentamicină
Pelargonium
graveolens/ gentamicină Bacillus cereus,
Bacillus subtilis,
S. aureus, E. coli,
Acinetobacter
baumannii,
Serratia
marcescens,
Yersinia
enterocilitica Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [111]
Citrus limon/ amikacin
Cinnamomum
zeylanicum/ amikacin Acinetobacter spp Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]
Coriander/
chloramphenicol

Coriander/ciprofloxacin
Coriander/gentamicină
Coriander/ tetraciclină A. baumannii Microdiluții în agar
Metoda Checkerboard Sinergism [35]

Uneori, uleiurile esențiale s -au dovedit a fi agenți de intensificar e – sinergici,
nu pot produce toate efectele inhibitorii semnificative atunci când sunt utilizați în
monoterapie, dar atunci când sunt utilizați în combinație cu medicamentele standard,
efectul combinator depășește performanțele lor individuale și produce o activitate
antimicrobiană îmbunătățită [109] . Activitatea sinergică exercitată cu ajutorul
uleiurilor esențiale s -a descoperit că reduce doza minimă eficientă de antibiotice în
tratamentul infecțiilor, fiind astfel reduse și efectele adverse ale antibioticelor. Cel
mai important, asocie rea de antibiotice cu uleiuri esențiale care vizează bacterii
rezistente poate avea un mecanism diferit de acțiune și poate duce la noi alegeri în
depășirea atacului rezistenței microbiene. Exploatarea uleiurilor esențiale în
prevenirea rezistenței bacteri ene este considerată a fi mai promițătoare.
Uleiul esențial de Pelargonium graveolens a fost raportat că reduce doza
minimă eficientă de norfloxacină împotriva Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
Escherichia coli și Staphylococcus aureus [111] .
Uleiul esențial de Lantana camara în amestec cu amikacina a fost utilizat
împotriva unor tulpini de S. aureus și P. aeruginosa . Microorganismele au fost
expuse la constituenții volatili prin contact indirect în timpul testului de difuzie pe
disc și s -a raportat că activitatea amikacinei a crescut cu 65% [112] . Rodrigues și

28
colab . au raportat că uleiul esențial al frunzelor de Croton zehntneri este capabil să
sporească activitatea gentamicinei cu 42,8% împotriva tulpinilor de P. aeruginosa
(prin contact gazos), sugerând că uleiul posedă un potențial de utilizare drept
adjuvant în terapia cu antibiotice [110] . Aceste investigații promițătoare indică
faptul că combinația de uleiuri esențiale cu antibiotice convenționale oferă
promisiuni și un potențial semnificativ pentru dezvoltarea de noi terapeutice și
tratamentul bolilor infecțioase cauzate de microorganisme MDR.
În concluzie , rezistența la compușii naturali din plante poate fi evaluata
folosind aceleași modele experimentale utilizate pentru studiul rezistenței
microbiene la biocide. În acest sens, ținând cont de multiplele obiective, precum și
lipsa de specif icitate observata în mecanismul de acțiune pentru biocide naturale, se
poate afirma că rezistența la acești compuși este mai degrabă legată de mecanismele
care provoacă scăderea concentratiei intracelulare de biocid. Cu toate acestea, o mai
bună valorifica re a potențialului valoros al compușilor naturali impune aprofundarea
și structurarea informațiilor disponibile se apropie de fenomenul rezistenței induse la
biocide naturale.

CAPITOLUL 4.
Avantajele utilizării extractelor vegetale în industria cosmetică
Main Benefits and Applicability of Plant Extracts in Skin
Care Products
În ciuda faptului că nu are valoare juridică, termenul cosmeceutic este utilizat în mod
obișnuit pentru a defini produsele cosmetice cu ingrediente active care promovează beneficii
de tip medicamentos. Astfel, în compoziția lor există ingrediente cu proprietăți medicinale
care manifestă acțiuni topice benefice și oferă protecție împotriva afecțiunilor degenerative
ale pielii, îmbunătățește aspectul, tonul pielii, textura și strălucirea prin furnizarea de nutrienți
necesari pentru pielea sănătoasă. Cosmece uticele reprezintă segmentul aflat în creștere rapidă
în industria îngrijirii personale [3,4]. Deși ingredientele naturale au fost utilizate în mod
tradițional timp de secole pentru îng rijirea pielii, acestea devin din ce în ce mai răspândite în
formulările contemporane [5]. Termenul "natural" este definit ca fiind un ingredient produs
de natură sau întâlnit în natură și care este extras direct din plante sau produse de origine
animală [ 6]. Sursele de ingrediente naturale pot include ierburi, fructe, flori, frunze, minerale,
apă și pământ [5]. Efectul ingredientelor naturale asupra produselor de îngrijire a pielii
depinde de eficacitatea lor in vitro și in vivo și de tipul de bază dermato -cosmetică în care

29
sunt încorporate [5]. Utilizarea plantelor în scopuri medicinale este l a fel de veche ca
umanitatea și, în anii următori, este probabil să vedem continuarea apariției pe piață a unor
noi produse care conțin uleiuri naturale și plante med icinale. Plantele au fost principala sursă
a tuturor produselor cosmetice înainte de utilizarea substanțelor sintetice cu proprietăți
similare [7]. Moleculele naturale ale plantelor rămân deosebit de interesante pentru
cercetările noi.
Cu toate acestea, ut ilizarea extractelor necesită o atenție specială metodelor de
extracție, a raportului dintre plante și solvenți și conținutului de ingrediente active [8]. În
plus, utilizarea extractelor de plante în produsele de îngrijire a pielii este evidențiată de
cererea consumatorilor, care sunt din ce în ce mai preocupați să cumpere produse ecologice
[9]. Consumatorii nu sunt adesea conștienți de faptul că produsele naturale sunt un amestec
complex de compuși chimici care pot fi responsabili pentru dezvoltarea reacți ilor adverse.
Pentru a depăși această problemă potențială, cercetătorii trebuie să caracterizeze chimic
extractele din punct de vedere al compoziției . În plus, potențialul citotoxic in vitro al
extractelor ar putea fi testat pe mai multe linii celulare uma ne, înainte de utilizarea la om și
potențialul iritant al formulărilor cosmetice pot fi examinate. Aceste proceduri pot constitui
un avantaj în asigura rea siguranței consumatorilor care aleg să utilizeze produsele naturale și,
în consecință, acceptabilitat ea produsului comercializat.
4.1. Conservarea naturală a produselor consmetice
În zilele noastre, uleiurile esențiale fac obiectul unei cercetări științifice
intensive și, de asemenea, atrag atenția industriilor cosmetice și farmaceutice
datorită potenția lului lor de a putea fi utilizate drept compuși farmacologici activi
sau conservanți naturali. Diversitatea enormă din acest grup de compuși naturali și
spectrul larg de proprietăți biologice îi face atractivi pentru multe industrii, multe
domenii de aplic are fiind încă nedescoperite. Se estimează că mai mult de 3000 de
uleiuri esențiale au importanță comercială și se utilizează în industria aromelor și
cosmeticelor [65]. Comerțul cu cele mai populare uleiuri, cum ar fi cele de eucalipt
sau de lamaie, a fost calculat la pes te 1000 de tone pe an, iar valoarea estimată este
de câteva sute de milioane de euro [123] .
Siguranța microbiană a produselor cosmetice a fost întotdeauna de interes
deos ebit pentru industrii, deoarece unele aspecte distructive ale microorganismelor
pot duce la degradarea produsului și pot cauza un risc pentru sănătatea
consumatorilor. Compoziția bogată a produselor cosmetice moderne, în combinație
cu formularea apoasă și expunerea directă la microflora pielii bacteriene, conferă

30
mediul ideal pentru creșterea microorganismelor. Luând în considerare riscul ridicat
de contaminare și, prin urmare, riscu pentru sănătatea consumatorilor, utilizarea
conservanților este o necesita te. Mai mult, contaminarea bacteriană schimbă
proprietățile fizice și chimice ale produselor cosmetice, care are ca rezultat, de
obicei, separarea fazelor, decolorarea și eliberarea mirosurilor etc. Sistemele de
conservare previn și controlează creșterea m icroorganismelor de la posibilitatea de
contaminare în timpul procesului de fabricație, la depozitare sau utilizarea efectivă
de către consumator [124] .
Sistemele de conservare includ în mod obișnuit diverse combinații de biocide
care operează pe un spectru larg de bacterii și fungi. Acestea oferă o eficacitate
antimicrobiană ridicată și, prin urmare, prelungesc durata de viață a produselor, cu
toate acest ea, multe dintre ele pot provoca reacții adverse la nivelul pielii. Parabenii
(PHB) sunt conservanții cei mai utilizați în produsele cosmetice. S -a demonstrat că
parabenii au proprietăți estrogenice slabe [125] . Descoperirea parabenilor în celulele
tumorale mamare și în țesutu rile din jurul acesora a provocat o discuție privind
evaluarea siguranței parabenilor și a sugerat o corelație între cancerul de sân și
parabeni [126] . Deși rezultatele studiilor de toxicitate detaliate au demonstrat în cele
din urmă că paraben ii sunt noncarcinogeni [127] , consumatorii au fost îngrijorați și
neîncrezători în legătură cu acestea. PHB și conservanții care eliberează
formaldehidă, cum ar fi imidazolidinil și diazolidinil -uree, cauzează adesea iritația
pielii și provoacă reacții alergice [128] , [124] .
În plus, problema tulpinilor bacteriene rezistente la conservanți convenționali
a fost observată în ultimii ani. Toți acești factori au contribuit la necesitatea
descoperirii unor sisteme alternative de conservare. Ideea utilizării conservanților
naturali pare a fi foarte promițătoare și practică deoarece co mpușii derivați din
plante sunt ușor disponibili și ecologici.
Eficacitatea conservanților în formulările cosmetice este evaluată printr -un
challenge test realizat în conformitate cu cerințele Farmacopeei Europene (EP).
Challenge test -ul este o procedură standard care implică contaminarea artificială a
produselor cosmetice cu un număr predeterminat de bacterii și fungi (105-106 celule
viabile ml-1 sau g-1 de produs), precum și îndepărtarea periodică a probelor la ora
fixă pentru numărarea microorganismel or viabile prezente în formulare în timpul
testului [129] . Microorganismele utilizate în test provocare includ tulpini bacteriene
precum: Staphyllococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli și

31
fungi: Aspergillus niger și Candida albicans . Conform EP, un preparat topic este
bine conservat dacă numărul de bacterii recuperate pe gram este redus cu un factor
de 103 (criteriul A) și 102 (criteriul B) în decurs de 2 zile de la test, fără proliferare
celulară la a 7 -a zi până la a 28 -a zi. Pentru ciuperci, factorul este 102 pentru
criteriul A și 101 pentru criteriul B în termen de 14 zile de la initierea testului [130] .
Un studiu privind eficacitatea uleiului esen tial de Thymus vulgaris utilizat în
formularea a doua creme, a evidențiat la challenge test un efect nesatisfăcător din
punct de vedere al calității conservării [129] . Criteriile necesare au fos t
satisfăcătoare împotriva tulpinilor bacteriene și parțial satisfăcătoare împotriva
drojdiei (numai formularea W / O), dar nu împotriva lui Aspergillus niger în ciuda
concentrației ridicate de ulei de cimbru (3%). Probele de ulei conțin concentrații
ridic ate de timol (38,6% și 43%), dar au fost relativ scăzute în carvacrol (9,8% și
2,2%). Autorii au presupus că probabil raportul optim dintre constituenții fenolici ai
uleiurilor ar fi mai eficient în obținerea activității antifungice. Comportamentul
diferit al uleiului de cimbru contra C. albicans în cazul celor două formulări (O / W
– ulei în apă și W / O – apă în ulei) a fost datorat biodisponibilitatății reduse a apei și
pH-ului ridicat în formula W / O – aceste aspect putând favoriza un efect fungicid
mai bun.
Un studiu privind uleiurile esențiale de Artemisia afra , Pteronia incana ,
Lavandula officinalis și Rosmarinus officinalis a demonstrat eficacitatea acestora în
reducerea contaminării microbiene într -o formulare de cremă apoasă [131] .
Populația de microorganisme testate a fos t limitată și controlată semnificativ până în
a șaptea zi de testare – a fost îndeplinit criteriul A și B al challenge test-ului. Cel
mai eficient, la toate concentrațiile (0,5%, 1,0% și 1,5%) a fost uleiul de A. afra
bogat în thujonă (53%). Autorii au obs ervat că folosirea EDTA drept chelator a
contribuit la viabilitatea redusă a bacteriilor și fungilor. Datorită rezultatelor
obținute, s -a concluzionat că utilizarea unui sistem combinat de conservare compus
din uleiuri esențiale, EDTA, conservanți sintetic i sau surfactanți este un subiect
demn de inclus în studii suplimentare, preconizându -se obținerea unui grad de
eficacitate mai ridicat comparativ cu utilizarea acestor componente per se.
Nostro A. și colab. (2002) au observat că efectul amestecului dintr e uleiului
esențial de Calamintha officinalis (1,0%) și EDTA 2 mM, încorporat într -o
formulare topică utilizabilă în tratarea eczemelor, a dus la îndeplinirea criteriilor
impuse de Farmacopeea Europeană privind conservarea ( challenge test) [132] .

32
Conservarea eficientă s -a realizată datorită adăugării de EDTA – care facilitează
penetrarea uleiului în celulele bacteriene și concentrației ridicate de carvonă
(64,3 %), care este un constituent principal al uleiurilor esențiale, având puternice
proprietati antibacteriene. Pentru confirmarea rezultatelor obținute, autorii au
continuat studiul efectului de conservare, incluzând în doua tipuri de formulări
(cremă și șamp on) doar uleiului esențial de Calamintha officinalis (1% și 2%).
Rezultatele au arătat eficiența acestuia doar la concentrația de 2 %, fiind îndeplinit
criteriul A al challenge test-ului pentru cremă și criteriul B pentru șampon.
Efectul sinergic al uleiu rilor esențiale ( Laurus nobilis, Eucalyptus globulus și
Salvia officinalis ) cu adăugarea unui conservant sintetic (metil -p-hidroxibenzoat –
MPB) și fără aceasta în preparatele cosmetice a fost studiat de Maccioni [133] .
Uleiurile esențiale, la diverse concentrații (0,025% și 0,0125%), au fost aplicate
singure, împreună și în combinație cu MPB în trei formulări: cremă (fiind inclus
polimerul carbopol – agent de emulsionare, stabilizare, îngroșare și gelifiere – (O /
W), hi drogel cu carbopol și o cremă hidratantă. Conservantul MBP a fost utilizat la o
concentrație scăzută (0,01% și, respectiv, 0,001%), de la 20 până la 200 de ori mai
scăzută decât valoarea obișnuită (0,2%). Cu toate acestea, efectul de conservare a
fost atin s pentru variante cu MPB în amestec cu două sau trei uleiuri esențiale, dar
nu împotriva tuturor microorganismelor. Candida albicans a persistat în formulărea
de cremă cu carbopol și cremă hidratantă în ciuda prezenței MPB. Cu toate acestea,
efectul sinerg etic al uleiurilor a fost confirmat în cazul bacteriilor Gram -pozitive, în
special în cazul cremei hidratante. Rezultatele acestui studiu au demonstrat că
utilizarea unor sisteme de conservare combinate, formate din uleiuri esențiale și
conservanți sinteti ci, are avantajul reducerii semnificative a cantității de conservanți
sintetici în preparatele cosmetice.
Kunicka -Styczyńska A și colab . (2009) au realizat un studiu comparativ a unui
sistem complex de conservare format din uleiuri esențiale de lavandă, ceai și uleiuri
esențiale de lămâie, precum și conservanți sintetici (1,3 -dimetilol -5,5-
dimetillhidantoină și 3 -iodo -2-propinil butil carbamat) într -un lapte de corp (W / O).
A fost demonstrat clar efectul sinergetic al sistemului de conservare compus, ace sta
făcând posibilă reducerea nivelului conservanților sintetici cu până la 8,5 ori [31].
Efectul conservanților sintetici, testați în absenț a uleiurilor esențiale, la o
concentrație mai scăzută (0,1%) nu a fost eficient față de Ps. aeruginosa și Candida
sp. în cadrul challenge test -ului. Cresterea concentrație (0,3%) a determinat

33
sterilizarea laptelui corporal în decurs de 14 zile. Aceeași ef icacitate de conservare a
fost obținută în testele pe amestecul de levănțică și ulei de arbore de ceai (0,5%
fiecare) și conservanți sintetici la concentrație de 0,1%.
Un studiu comparativ al eficacității unor conservanți extrași din plante, a unor
uleiur i esențiale ( Lavandulla officinalis, Melaleuca alternifolia și Cinnamonium
zeylannicum ) și a metilparabenului, a demonstrat o activitate inhibitorie mai mare a
uleiurilor esențiale decât cea a conservantul sintetic și a extractelor în emulsia
cosmetică [134] . Uleiul din scorțișoară (2,5%) a fost cel mai puternic inhibitor al
creșterii S. aureus , E. coli și C. albicans . În funcție pe tulpinile microbiene testate,
activitatea antimicrobiană a uleiurilor esențiale (2,5%) a fost în unele cazuri de 3,5
ori mai mare decât cea a metilparabenului (0,4%). Acest studiu a demonstrat că este
posibilă înlocuirea conservanților sint etici cu ulei esențial, totuși, în concentrații
relativ mari.
Un studiu recent a analizat o formularea antimicrobiană pe bază de hidrolizat
de colagen ți a demonstrat că formularea care conține 2% ulei esențial de Thymus
onites a fost eficace împotriva ba cteriilor testate și a fungilor prin metoda de difuzie
a discurilor [135] . Autorul a observat că formularea cu efect antimicrobian a avut o
vâscozitate favorabilă.
Cele mai multe studii indică o performanță mai bună a EO în combinație cu
conservanții sintetici, chelatori sau agenți de solubili zare. Adăugarea de EO la
concentrații relativ scăzute sau amestecul EO cu solubilizanți permite reducerea
concentrației de conservanți sintetici. Atunci când uleiul este agăugat singur într -o
formulare, activitatea sa antimicrobiană este de obicei insufici entă, fiind necesare
concentrații mai mari pentru obținerea efectului scontat. Concentrațiile ridicate de
EO conduc la numeroase probleme cum ar fi: separarea fazelor, vâscozitatea
nefavorabilă a formulării și miros nedorit puternic. Fiecare formulă cosmet ică are
nevoie de o compoziție și o proporție specială de uleiurile esențiale selectate și
aditivii sintetici, precum și concentrații adecvate tuturor constituenților pentru a
obține un efect sinergic. Combinația dintre EO și conservanții sintetici permit e o
reducere a concentrațiilor ambelor agenți de conservare și pare a fi un compromis
rezonabil. Studiile mai sus menționate demonstrează efectul biostatic al combinației
dintre conservanții de sinteză și EO în diferite formulări cosmetice. Principalul
beneficiu al unei astfel de abordări îl reprezintă reducerea concentrațiilor
ingredientelor potențial alergogene, fiind obținută astfel o siguranță sporită a

34
produselor. În plus, concentrația mai scăzută de EO determină o mai bună acceptare
a parfumurilor cos metice de către consumatori [31], [124] .
În zilele noastre, studiile s -au concentrat asupra determinării amestecului
optim între EO și conservanți sintetici sau agenți tensioactivi [136] , precum și
descoperirea de noi formulări cosmetice îmbunătățite. S -au realizat inclusiv încercări
de aplicare a nanotehnologi ei în încapsularea uleiurilor esențiale [137], [138] .
Wattanasatcha și colab. (2012) [139] a efectuat evaluarea eficacității
antimicrobiene a timolului nanoîncapsulat și a timolului liber. În studiul comparativ
a inclus utilizarea timolului liber, a timolului încapsulat (nanoparticule acoperite cu
etilcluloză / metilceluloză) și metilparabenul în diverse formulări cosmetice (
loțiune, gel și cremă). Tiolul incapsulat a fost un conservant eficient la fel de bun ca
și metilparaben (4 mg / ml), chiar și atunci când a fost utilizat la 12 -25 ori
concentrații mai mici, efect consecvent în toate formulările cosmetice. Aces t studiu a
demonstrat eficacitatea antibacteriană a nanoparelor cu timol în preparatele
cosmetice și a confirmat că nanoparticulele nu au dezactivat proprietățile
antibacteriene din material. Mai mult, nanoparticulele s -au dizolvat foarte bine în
apă [124] . Rezultatele promițătoare au furnizat o soluție favorabilă privind utilizarea
nanotehnologiei în formularea cosmetică, însă sunt necesare studii aprofundate
pentru aplicarea cu succes la scară largă a acestui tip de tehnologie, nefiind încă bine
cunoscute e fectele biologice ale utilizării nanoparticulelor în formulare.
În concluzie , consumatorii manifestă un interes crescând pentru produsele
cosmetice cât mai naturale. Multe studii fac referire la avantajele extractelor din plante, cum
ar fi capacitatea ant ioxidantă, inhibarea tirozinazei și activitatea antimicrobiană, care pot fi
benefice pentru atenuarea și prevenirea diferitelor afecțiuni ale pielii.
Având în vedere potențialul economic inerent în exploatarea resurselor naturale din
ecosisteme, extractele de plante pot fi folosite în știința cosmetică pentru a proteja,
înfrumuseța și menține echilibrul fiziologic al pielii umane. Pe de altă parte, în comparație cu
ingredientele cosmetice sintetice, produsele din plante sunt ușoare și biodegradabile și
prezintă toxicitate scăzută. Pe scurt, multe extracte de plante, după ce au fost studiate în mod
corespunzător, pot fi o alternativă sigură, eficace și rentabilă la produsele sintetice.

35

CAPITOLUL 5.
Dirijarea funcționalității principiilor cu activitate antimicrobiană din plante în
formulări topice

Dintre ingredientele de uz cosmetic naturale, capabile sa aduca un aport cert, demonstrat
stiintific, masurabil, in ceea ce priveste efectul antimicrobian, hidratarea, efectul antioxidant,
efectul anti acneic, efectul antiinflamator ori efectul citoprotector asupra celulelor pielii, se
remarca produsele vegetale din categoria extracte polare (in glicerina sau propilen glicol)
imbogatite in polifenoli vegetali, indeosebi flavonozide (derivati ai apigeninei, luteo lului si
kaempferolului), respectiv extracte nepolare din categoria uleiuri grase si uleiurile volatile.
Tabelele numarul 3, 4 și 5 prezinta produse si extracte vegetale, polare (extracte in apă,
alcool, glicerina ori propilen glicol) si nepolare (uleiuri grase si uleiuri esentiale) cu efect
antimicrobian, calmant, citoprotector, hidratant, antioxidant și antiinflam ator, respectiv
ingrediente active utilizabile pentru obtinerea de produse dermatocosmetice noi și inovative.

5.1 Sisteme coloidale de tip emulsii de uz cosmeceutic – macro -, micro – și nanoemulsii de uz
cosmeceutic

Compoziția și formularea produselor de rmato -cosmetice devine un proces din ce în ce
mai complex. Tendința actuală este orientată către dezvoltarea unor produse cosmetice active
destinate nu doar îmbunătățirii aspectului fizic, dar și cu rol funcțional în ameliorarea unor
statusuri pato -fiziolo gice specifice (exemplu produsele pentru ten acneic, infecții cutanate,
iritații, inflamații) sau estomparea anumitor imperfecțiuni. Acestă abordare funcțională a dus
la diversificarea și dezvoltarea produselor cosmetice de o calitate mai bună și o eficaci tate
mai mare.
În prezent, produsele cosmetice vizează aspecte precum hidratarea pielii, reducerea
sau încetinirea semnelor de îmbătrânire, precum și protejarea dermului de multitudinea de
factori nocivi care intră în contact cu acesta, prin folosirea uno r ingrediente active. Cu toate
acestea, utilizarea unor compuși activi nu este suficientă pentru ca produsele dermato –
cosmetice să poată sprijini în totalitate obiectivele impuse, astfel încât materiile prime se
extind spre o serie de substanțe auxiliare p recum și materiale și recipiente de condiționare
care au ca principal scop obținerea unei formule finale hipoalergenice, care să nu genereze

36
comedoane, să prevină contaminarea produsului, să nu irite pielea, să aibă un termen de
garanție extins și stabilit ate la oxidare.
Concepția modernă a emulsiilor nu se limitează la un sistem dispers format din două
faze nemiscibile, ci la sisteme disperse formate din mai multe faze nemiscibile (sisteme bi –
sau polifazice) care formează un conținut omogen și stabil în prezența unui agent emulsifiant.
Substanțele auxiliare sunt incluse în produsele dermato -cosmetice, indiferent de
forma de prezentare, cu scopul a influența favorabil manifestarea efectului terapeutic al
principiilor active și de a îmbunătăți eficacitatea de ansamblu a utilizării produsului respectiv.
Ingredientele active au fost utilizate dintotdeauna în produsele cosmetice, dar
corelația eficacitate – compoziție formulată este esențială în dezvoltarea de produs. Pentru a
putea obține produse cu eficacit ate previzibilă, este necesară evaluarea mecanismelor de
transport la țintă dependente de concentrația substanței active, dar și de formulare. Diversele
gradiente identificate de polaritate, stabilesc etapele determinante de viteză, dar și eficacitatea
mecanismelor de transport la țintă. Astfel, discutăm de jocul de polarități între actorii cheie ai
transportului, ingredientele active, stratul cornos și faza uleioasă a formulei, care definesc
indicele de polaritate relativă, măsură cuantificabilă implicată în explicarea fenomenelor de
transport și corelată cu eficacitatea produselor cosmetice și dermato -cosmetice.
Ingredientele active sunt susținute de rezultate in -vitro care indică eficacitatea
acestora, numărul de ingrediente pentru care există dovezi in -vitro fiind în creștere.
Presupunând că datale obținute la testele in -vitro sunt corecte, apar întrebări referitoare la
procesul de dezoltare a formulărilor, care asigură transformarea în produse cosmetice active.
În cele mai multe cazuri, companiile au un număr standard de formulări, în care sunt
încorporate noi ingrediente active. Testarea stabilității acestor ingrediente este urmată de
încercări/ studii clinice realizate cu scopul de a evalua eficacitatea afirmată a ingredientului
activ.
Formulările cos metice sunt amestecuri complexe și complete (produse finite cu
termen de valabilitate), iar experimentele au arătat că utilizând diferite sisteme de
emulsionare, componentele unei formulari cosmetice pot să aibă un impact asupra
direcționării ingredientelo r active către stratul de piele potrivit cu efectul scontat.
5.1.1 Macromulsii
Emulsiile sunt preparate obținute din două lichide nemiscibile, dispersate și stabilizate
cu ajutorul emulgatorilor. Emulsiile pot fi considerate sisteme polidisperse monoforme ,
deoarece ordinul de mărime al particulelor dispersate poate fi foarte diferit, iar forma lor este
sferică.

37
Dimensiunile particulelor dispersate din emulsii variază între 0.1 – 100 μm, deci
ordinul lor de mărime se găsește în domeniul vizibil microscopic .
În structura emulsiilor se deosebesc trei componente, și anume: (1) lichidul dispersat
sau emulsionat sub formă de picături foarte fine, denumit și faza dispersată, internă,
discontinuă; (2) lichidul dispersant sau mediul de dispersie, faza dispersantă, continua sau
externă; (3) emulgatorul sau agentul emulsiv, care favorizează dispersarea fazei interne și
asigură stabilitatea emulsiei pentru o anumită perioadă de timp.
Pentru obținerea emulsiilor, lichidele care intră în compoziția lor trebuie să difer e din
punct de vedere al structurii chimice, respectiv prin tipul legăturilor intramoleculare. Una
dintre faze este constituită întotdeauna dintr -un lichid polar (ca de exemplu apă), iar cealaltă
fază dintr -un lichid nepolar (uleiuri vegetale diverse, sau uleiul de parafină).
Emulsiile, în funcție de faza dispersată, pot fi de mai multe feluri: (1) emulsii de apă
în ulei (A/U) în care faza dispersată este apă și mediul de dispersie este uleiul; (2) emulsii de
ulei în apă (U/A) în care faza dispersată este u leiul și mediul de dispersie apa. În afară de
aceste două tipuri de emulsii simple, se pot întâlni tipuri de emulsii mult mai complexe în
care faza internă să fie ea însăși formată dintr -o dispersie binară.
Calitățile esențiale ale emulsiilor sunt:
 stabil itatea termodinamică;
 gradul de dispersie;
 conservabilitatea proprietăților substanțelor active;
 conservabilitatea produsului în ambalajul primar.
Se consideră că emulsiile sunt sisteme instabile din punct de vedere termodinamic,
deoarece dispersarea și di vizarea unei faze lichide este însoțită de o creștere apreciabilă a
suprafeței de separare dintre fazele nemiscibile și implicit de o creștere a energiei superficiale
libere. Prin urmare trebuie redusă intensitatea tensiunii superficiale dintre faze, ceea ce se
realizează cu ajutorul emulgatorilor. În lipsa unui emulgator, se micșorează mărimea
suprafeței de separare dintre faze, ajungându -se la separarea completă a fazelor.
Emulsiile pot fi preparate utilizând diferite metode care se aleg în funcție de na tura
emulgatorului și de raportul fazelor nemiscibile.
· Metoda de preparare prin suspendare se aplică în special la prepararea emulsiilor de
tip U/A și atunci când emulgatorul utilizat este guma arabică sau tragacanta. Metoda este
cunoscută și sub denumi rea de „4 – 2 – 3” deoarece, pentru reușita operației de emulsionare
este necesară respectarea unui anumit raport între cele trei componente ale emulsiei.

38
Metoda de preparare prin dizolvare. Emulgatorul se dizolvă în faza externă a emulsiei
și în soluția obținută se emulsionează faza internă. Această metodă se aplică la prepararea
emulsiilor de tip A/ U.
Metoda de preparare prin formarea emulgatorului în timpul emulsionării constă în
amestecarea celor două faze nemiscibile. În urma unei reacții chimice dintre componentele
celor două faze rezultă agentul emulsiv, care sub acțiunea agitării determină stabilizarea
emulsiei. Metoda este aproape exclusiv utilizată la prepararea linimentelor -emulsii.
Metoda solventului comun constă în dizolvarea fazei intern e și a emulgatorului într –
un solvent comun ambelor componente. Soluția obținută se emulsionează apoi în faza
externă. Pentru această metodă, solventul comun trebuie să fie miscibil cu faza externă.
Emulsiile sunt preparate care necesită consevare, utilizar ea de conservanți fiind absolut
necesară, fiind astfel evitată alterarea emulsiilor de către microorganisme [1](I. Stoian și co.,
1974).
5.1.2 Microemulsii
În ultimele decenii au fost făcute numeroase cercetări asupra utilizării nano – și
microparticule lor/ dimensiunilor nano – și micro – în formularea cosmetică. Majoritatea
formulărilor care utilizează această tehnologie, pentru obținerea de micro – și nanoemulsii sunt
apreciate doar în funcție de mărimea particulelor dispersate, micro – și nanoemulsii, car e se
pot diferenția și în funcție de sursă și procesul de stabilizare (N. Anton și co., 2008; N.
Sharma și co., 2010).
Microemulsiile pot fi definite ca dispersii omogene, transparente, stabile
termodinamic, a două lichide nemiscibile, stabilizate de o p eliculă de surfactant. În cazul
microemulsiilor, dimensiunea picăturilor (particulelor dispersate) este de 500 nm și necesită
mai puțină energie în formularea de emulsii, care este spontană atunci când microparticulele
intră în contact cu componentele apoa se, uleioase sau amfifilice. Mai mult, costul de
producție este mai scăzut comparativ cu cel al nanoemulsiilor. Dezavantajul major al
microemulsiilor este legat de necesitatea utilizării concentrațiilor ridicate de surfactanți,
componente cu potențial irit ant și/ sau toxic. [2](V. Ghosh și co., 2012; L -C. Peng și co.,
2010; T. Tadros și co., 2004).
5.1.3 Nanoemulsii
Nanoemulsiile sunt dispersii fine ulei -în-apă (U/A), sunt sisteme neechilibrate care au
o tendință spontană de a se separa în fazele constitue nte. Cu toate acestea, nanoemulsiile au o
înaltă stabilitate cinetică ce se extinde pe perioade îndelungate (câțiva ani), datorită
dimensiunii lor mici, aceasta fiind o consecință a stabilizări sterice dintre particulele

39
dispersate (picături). Mărimea par ticulelor dispersate poate fi cuprinsă între 10 și 500 nm. S -a
demonstrat că sistemele de nanoemulsii prelungesc perioada de retenție în organism a
substanțelor biologic active, prin urmare le este intensificată biodisponibilitatea, putând fi
redusă cantit atea de substanță necesară obținerii efectului/ acțiunii terapeutice (N. Sharma și
co., 2010; JM. Gutiérrez și co., 2008).
Nanoemulsiile pot fi preparate prin sonicare, omogenizare sub presiune, sau prin
autoasamblare la temperatura de inversie a fazelor, tehnicile de formulare a emulsiilor fiind
tehnici pretențioase prin necesarul de echipamente de formulare speciale (N. Sharma și co.,
2010).
Studiile au arătat că micro – și nanoemulsiile pot fi utilizate că agenți antimicrobieni în
soluții dezinfectante, conservanți pentru hrană, sau sisteme de transport a ingredientelor
active pentru cosmetice (V. Ghosh și co., 2013; U. Buranasuksombat și co., 2011).
Proprietățile antimicrobiene ale micro – și nanoemulsiilor se consideră că se datorează
particulelor de ul ei de dimensiuni mici care prezintă o tensiune superficială ridicată, putând
fuziona și distruge membrana celulelor procariote izolate, a virusurilor sau a fungilor. Se
poate obține un efect sinergic prin includerea în formulă a substanțelor care posedă o
puternică activitate antimicrobiană, fiind redus astfel costul/ concentrația diferitelor materii
prime (U. Buranasuksombat și co., 2011).
Faza hidrofilă a sistemului reprezintă una dintre fazele lichide nemiscibile cu celelalte
faze asociate într -o emulsi e, în care sunt dizolvate sau suspendate diverse substanțe active,
emulgatori, conservanți, antioxidanți, aromatizanți sau coloranți. Natura chimică a fazei
hidrofile este caracterizată de polaritatea lichidelor: apă distilată sau solvenți hidrofili din
categoria alcoolilor (etanol, izopropanol, alcool benzilic) și poliolilor (glicerol, butilenglicol,
propilenglicol, polietileniglicoli). Apa se utilizează doar distilată sau demineralizată, deoarece
prezența ionilor de Ca2+ și Mg2+ din apa dură poate influen ța stabilitatea emulsiei.
Glicerolul se poate utiliza ca dizolvant pentru alcooli, polioli, zaharuri, săruri minerale și
organice, oxizi metalici. Polietilenglicolul prezintă o capacitate de dizolvare sperioară
glicerinei și este utilizată penru dizolvarea substanțelor greu solubile în apă sau pentru
substanțe care hidrolizează în mediul apos.
Faza lipofilă prezintă o serie de avantaje față de cea hidrofilă: viscozitate crescută,
stabilitate mare și conferă componentelor o stabilitate crescută la degradare a hidrolitică.
Selectarea fazei lipofile a emulsiilor se realizează în funcție de calea de administrare,
consistența emulsiei și toleranță. În multe dintre cazuri, faza lipofilă este răspunzătoare de
eficacitatea produsului, spre exemplu prin folosirea ule iurilor vegetale, care sunt lipsite de

40
toxicitate și conțin o cantitate de proteine, vitamine și elemente minerale utile. Pentru
prepararea emulsiilor administrate topic în scop terapeutic sau cosmetic se utilizează diverși
produși naturali sau de sinteză care sunt stabili la oxidare. Industria de cosmetice utilizează
mai ales parafina lichidă și solidă care au numai rol de vehicul pentru agentul activ și în
diferite propporții, ele dirijează consistența emulsiei și sunt foarte stabile, datorită marii
inerții chimice. Aceste emulsii formează un film coerent pe suprafața pielii, se etalează ușor.
Capacitatea formatoare de film poate fi modificată prin asocierea cu ceruri sau alcooli
grași superiori. Filmul continuu format pe piele este destul de rezistent și flexibil pentru a
împiedica contactul dintre piele și unele substanțe iritante din faza hidrofilă. Preparatele
moderne de tipul „ulei în apă” sau „apă în ulei” conțin uleiuri de siliconi, care au o capacitate
hidrofilă excepțională, formând o barieră lipo filă. Un alt aspect important pentru produsele
topice îl reprezintă caracteristicile fazei lipofile: în mod normal, o emulsie de tipul U/ A lasă
un reziduu uleios pe piele, după evaporarea apei. În componența fazei lipofile mai pot intra și
alte substanțe ca: miristat de izopropil, lanolina, ceara, vaselina, alcooli grași și acizi grași
superiori. Compoziția chimică a uleiurilor vegetale este foarte importantă, deoarece unii
compuși de autooxidare pot degrada substanțele active din faza lipofilă; pentru a e vita acest
proces se pot adăuga antioxidanți, iar pentru a evita dezvoltarea microorganismelor se
utilizează conservanți.
Emulgatori. Emulgatorul este, pe lângă un component esențial al emulsiilor, factorul
cel mai important care determină stabilitatea ac estor sisteme disperse eterogene. Emulgatorii
acționează prin scăderea tensiunii interfaciale (la interfața ulei -apă) – favorizând divizarea,
respectiv emulsionarea fazei interne – și prin interacțiunea cu mediul de dispersare –
determinând o creștere a vâ scozității prin care influențează favorabil stabilitatea sistemului.
Clasificarea emulgatorilor se poate face din mai multe puncte de vedere:
(1) tipul de emulsie: emulgatori U/A și A/U;
(2) structură chimică: ionogeni și neionogeni. Emulgatorii ionogen i la rândul lor pot fi:
anioactivi, cationactivi și amfoteri sau amfolitici;
(3) mecanismul de acțiune: emulgatori veritabili, pseudoemulgatori sau cvasiemulgatori;
(4) utilizarea emulsiilor obținute: emulgatori pentru uz extern și emulgatori pentru uz i ntern.
Emulgatorii utilizați în emulsiile de uz extern sunt:
(1) emulgatori anionactivi: săpunuri alcaline, săruri de sodiu, potasiu și amoniu ale acizilor
grași superiori, săpunuri de amine, esteri ai alcoolilor superiori cu acidul sulfuric, derivați
sulfonați ai acizilor grași; (2) emulgatori cationactivi: combinații de amoniu cuaternar, numite
și săpunuri inverse. Dintre substanțele aparținând acestei grupe menționăm clorura de

41
benzalconiu (Zefirolul) și bromura de cetilpridiniu (Cetazolinul); (3) emulg atori neionogeni:
alcooli superiori, esteri ai acizilor grași cu polialcooli, esteri ai acizilor grași cu sorbitanul,
esteri și eteri ai polietilenglicolilor. Emulgatorii reprezintă ingrediente cheie într -o emulsie,
permițând amestecarea stabilă și omogenă a fazei apoase cu cea uleioasă prin caracterul
amfifil pe care îl prezintă.
Surfactanți sintetici și semisintetici . În general, surfactanții pentru uz cosmetic pot fi grupați
în următoarele categorii: agenți de curățare, agenți de emulsifiere, agenți de spumare, agenți
de solubilizare și suspendare și majoritatea produselor cosmetice sunt formulate prin
utilizarea acestor surfactanți. În funcție de sarcina electrică pe care o prezintă surfactantul,
acești emulgatori se împart în patru grupe:
a. Surfactanț i anionici – în soluție apoasă disociază formând anionul încărcat negativ, care
este direct răspunzător de capacitatea de emulsionare. Acești emulgatori se folsoesc pe scară
largă, datorită faptului că sunt ieftini, dar din cauza toxicității lor se foloses c doar pentru ux
extern.
b. Surfactanți cationici – sunt compuși ce conțin în molecula lor un cation cu lanț lung, ca
sărurile de amine sau N4+; se mai numesc săpunuri cationice. Activitatea de suprafață se
datorează cationului, încărcat cu sarcină electri că pozitivă, care conferă proprietăți
emulgatoare
c. Surfactanți neionici – acești produși nu disociază în soluție și nu poartă sarcină electrică.
Molecula lor cuprinde grupări polare ca lanțurile hidrocarbonate, saturate sau nesaturate, iar
grupele polare sunt: glicoli, esteri, eteri, amine, acizi sulfonici, polioxietilenice. Sunt cei mai
utilizați surfactanți datorită avantajelor de a fi stabili, solubili sau insolubili în apă, formând
emulsii de ambele tipuri H/L sau U/ A.
d. Surfactanți amfoteri

5.1.4. Consideratii teoretice legate de transferul ingredientelor active prin straturile
tegumentare
Berry a descris procesul de penetrare a pielii ca pe o serie de pași consecutivi, fiecare
dintre aceștia având posibile etape determinante de viteză. Etapele ide ntificate au fost:
(i) difuzia din interiorul formularii la suprafata pielii;
(ii) distribuția în stratul cornos superficial;
(iii) difuzia prin stratul cornos;
(iv) difuzia prin celulele epidermale;
(v) difuzia prin derm;

42
(vi) stocare în hipoderm;
(vii) redistribuire prin intermediul capilarelor la limita dintre derm și epiderm.
Astfel, definiția coeficientului de permeabilitate include parametri specifici de partiție
și difuzie, în funcție de grosimea stratului tegumentar străbătut:
,
în care k p repre zintă coeficientul de permeabilitate, K oct/apa coeficientul de partiție octanol/
apă, D este coeficientul de difuzie și L este lungimea căii de difuzie a moleculei ce penetrează
pielea.
Potts si Guy au demonstrat faptul că permeabilitatea unui compus chim ic/
fitocomplex dintr -o soluție apoasă poate fi estimată cu ajutorul a doi parametri, coeficientul
de partiție octanol/ apă și greutatea moleculară. Dintre cele două, ponderea coeficientului de
partiție este mai mare în estimarea matematică a ecuației flux ului de substanță ce străbate
straturile tegumentare:
log k p (cm s – 1) = – 6.3 + 0.71 log K oct/apa – 0.0061 MW,
în care MW este greutatea moleculară a moleculei ce patrunde in piele.
Se observă proporționalitatea directă între lipofilicitatea moleculei (exprimată prin
coeficientul de separare octanol/ apă) și estimarea fluxului de penetrare a straturilor
tegumentare pentru o substanță dată și proporționalitatea inversă cu greutatea moleculară a
acesteia .
Pentru ca un produs chimic să străbată straturil e tegumentare, acesta trebuie să se
separe din formulare în stratul cornos, așa cum indică coeficientul de partiție. Coeficientul de
partiție strat cornos/ formulare, este definit ca:
Ksc/formulare =

în care Cpenetrant reprezintă solubilitat ea moleculei care pătrunde în stratul cornos în raport cu
cea din formulare. Prin urmare, cantitatea moleculelor care patrund în stratul cornos poate fi
crescută odată cu creșterea solubilității acestor molecule, sau prin reducerea solubilității lor în
formulare. In acelasi timp, Cpenetrant din formulare este necesar să fie mai mare pentru a creste
J (fluxul), așa cum se reflecta in formula care descrie fluxul sau cantitatea de patrundere /
penetrare pe unitatea de suprafata si timp:
J= k p

în care
reprezintă gradientul de concentrație a moleculei care pătrunde în stratul cornos,

43
respectiv diferența de concentrații dintre formulare și stratul cornos profund. Cu cât această
diferență de concentrații este mai mare, cu atât fluxul pri n stratul cornos este mai bun.
Pe baza acestor estimări de transfer de masă, se poate specifica infleunța diverșilor
paramentri, precum k p, K, D, solubilitatea în stratul cornos vs formulare și K oct/apa , asupra
îmbunătățirii sistemului de livrare prin st raturile tegumentare a unei substanțe, corelând acest
fapt cu eficacitatea produsului.
Astfel, formularea sistemului de livrare dictează parametri precum:
(1) cantitatea totală (concentrația) de ingrediente active din formulările disponibile pentru
prepa rate topice;
(2) polaritatea formulării comparativ cu cea a stratului cornos.
Controlul și optimizarea rapoartelor de combinare între cei doi parametri pot fi
realizate prin estimarea Indicelui de Polaritate Relativa (IPR). In această abordare
sistemati că, este esențial ca stratul cornos să fie considerat ca un alt solvent cu propria sa
polaritate. Se pare că stratul cornos se comportă similar din punct de vedere al indicelui de
polaritate cu 1 -butanolul. Log K octanol/apa determinat experimental pentru 1 -butanol este de
0.88. Astfel, polaritatea stratului cornos s -a estimat ca fiind 100.8 , asa cum a fost exprimata de
coeficientul de partiție octanol/ apă, a fost estimat la 6.3. Acest numar indica faptul ca stratul
cornos este de 6.3 ori mai „solubil” in 1-octanol decât în apă.
IPR permite comparația polarității unui ingredient activ cu aceea a stratului cornos și
cea a componentelor emoliente din formularea cosmetică. Prin estimarea IPR se poate decide
asupra selecției tipului de emulsie pentru formular ea produsului și asupra componentelor
fazei lipofile a sistemului de livrare.
IPR este definit de trei parametri:
(1) polaritatea stratului cornos, stabilită arbitrar conform polarității 1 -butanolului la 0.8 (în
realitate această valoare variază în func ție de gradul de hidratare a tegumentului și de factori
de mediu, temperatura ambientală și umiditatea);
(2) polaritatea moleculei care pătrunde în piele/ moleculei penetrant;
(3) polaritatea formulării (pentru formulările multifazice este vorba de polar itatea fazei în
care ingredientul activ este dizolvat).
Acești parametri se înscriu pe scala de evaluare IPR, scală logaritmică și pot fi
diferențiate trei scenarii/ cazuri diferite:
– cazul I – polaritatea ingredientului activ este egală cu cea a strat ului cornos;
– cazul II – polaritatea molculei penetrante este mai mică decât cea a stratului cornos;
– cazul III – polaritatea moleculei penetrante este mai mare decât cea a stratului cornos.

44

Studiul teoretic al cazurilor prezentate conduce la concluzia că gradientul de polaritate dintre
formulare și ingredientul activ crește forța motrice de transfer al ingredientului activ în piele,
în același timp polaritățile echivalente între stratul cornos și ingredientul activ asigurând
livrarea substanței active și stabilirea unei concentrații tisulare eficiente la situsul vizat.
Optimizarea formulelor sistemelor de livrare utilizând conceptul IPR se realizează în 3 etape:
1. Optimizarea solubilității prin selectarea emolientului primar sau a solventului
2. Opti mizarea forței motrice prin selectarea emolientului sau solventului secundar
3. Selecția emulgatorului

5.2 Sisteme coloidale pe bază de amestecuri de specii macromoleculare de uz bio -medical

45
PARTEA EXPERIMENTALĂ
__________________ ___________________________________________________

Scop și obiective
Oportunitatea studiului compușilor naturali cu acțiune terapeutică este evidentă în
contextul nevoii acute de soluții terapeutice pentru rezolvarea problemei rezistenței la
antibiotice și a toxicității/efectelor secundare caracteristice substanțelor xenobiotice utilizate
ca medicamente. În acest context, scopul tezei a fost:
Dezvoltarea unor sisteme complexe, mixte și naturale de conservare a unor
formulări topice inovatoare, folosind metode alternative și complementare ecologice, de
prevenire a infec țiilor microbiene, cu aplicații în industria dermatocosmetică , bazate pe
valorificarea unor compuși naturali sau a unor molecule biologic active prin obținerea
de sisteme coloidale fluide și poroase cu efect antimicrobian.
Obiectivele după care s -a condus studiul au fost:
a) Caracterizarea fenotipică și genotipică a unor tulpini microbiene izolate din infec ții
acneice, cutanate sau plăgi septice;
b) Obținerea și caracterizarea fizico -chimic ă a unor extracte vegetale;
c) Evaluarea calitativă și cantitativă a activită ții antimicrobiene, a mecanismelor de
acțiune ale compușilor naturali asupra celulelor microbiene în suspensie și a celor aderate la
un substrat;
d) Testarea influen ței extractel or și componentelor selectate pe baza activită ții
antimicrobiene asupra celulelor eucariote;
e) Obținerea unor amestecuri de specii macromoleculare și nanosisteme hibride
funcționalizate anorgano -organice cu activitate antimicrobiană pe bază de compuși nat urali.

46
CAPITOLUL 6 .
Materiale și metode

6.1 Izolarea și caracterizarea complexă a unor tulpini microbiene izolate de la pacienți cu
infecții cutanate (plăgi infectate cu tulpini microbiene multirezistente) si realizarea unei
colecții de tulpini mi crobiene )

Tulpini microbiene izolate din probe clinice. Pentru stabilirea efectului
antimicrobian al compușilor naturali de origine vegetală s-au utilizat tulpini bacteriene
aparținând speciilor S. aureus și S. epidermidis . Pentru realizarea colecției de tulpini
microbiene au fost incluse 30 de tulpini de S. aureus MDR și 15 tulpini de S. epidermidis
MRD. Probele au fost însămânțate pe medii îmbogățite neselective (geloză sânge) și au fost
incubate timp de 24h – 7 zile la 37oC, în aerobioză și anaerobioză , pentru izolarea speciilor
prezente.
Testul catalazei
Principiu: catalaza este o hemoproteină care descompune peroxidul de hidrogen în apă și
oxigen. Bacteriile care o produc se protejează astfel de efectele letale ale peroxidului de
hidrogen apărut ca me tabolit intermediar al reducerii oxigenului în cursul respitației aerobe
(Buiuc și Neguț, 2008).
Producerea de catalază a fost evidențiată prin adăugarea de soluție H 2O2 3% peste un
fragment de cultură bacteriană de 24h depus pe o lamă de sticlă, reacția pozitivă fiind
vizualizată prin apariția efervescenței ca urmare a eliberării O 2 (Lazăr și colab., 2004).
Testul oxidazei determină tipul respirator al tulpinilor microbiene analizate. Se bazează
pe o reacție biochimică produsă de speciile numite oxidazo -pozitive de a produce enzime
cum ar fi citocrom c oxidaza (enzimă din catena respiratorie) sau indofenol oxidaza, enzime
care au capacitatea de a transfera electroni de la un donor de electroni (de obicei NADH) la
un acceptor de electroni, de obicei oxige nul atmosferic, în cursul respiratiei aerobe, la speciile
microbiene aerobe, ca si aerobe facultativ anaerobe.
Pentru realizarea acestui test se folosesc benzi de hârtie de filtru de tip cromatografic
impregnate într -o soluție apoasă de N,N,N’N’ tetrameth yl 1 -4, phenylendiammonium
dichlorid (substanță cu rol de indicator redox, donor artificial de electroni, incoloră în stare
redusă și colorată în albastru spre brun, în stare oxidată), aplicate cu pensa pe o lama de
sticlă și umectate ușor cu câteva picăt uri de apă distilată. Probele de testat, reprezentate de
fragmente dintr -o colonie izolată prelevate cu ansa de platină sau cu un vârf de pipetă Pasteur

47

au fost aplicate pe o suprafață de bandă de 2 -3 mm, urmărind apariția rapidă a reacției de
culoare, dat orată prezenței oxidazei și formării indophenolului; reacția pozitivă este indicată
de apariția culorii albastre în 10 -20sec.
În funcție de caracteristicile de cultură, morfologia celulelor (determinată prin analiza
dimensiunilor ), pigmenților sintetizați, formei și modului de dezvoltare a coloniilor și
rezultatele testelo r enzimatice rapid e pentru oxidază și catalază, a fost selectat sistemul
multites t API pentru identificarea de certitudine a tulpin ilor. După etapele de caracterizare
utilizând tehnici de microbiologie clasică, tulpinile au fost pregătite pentru conserv area pe
termen lung in propilen glicol.

Figura … . În stânga – testul catalazei pozitiv pentru tulpinile de S. aureus și S. epidermidis și control negativ
În dreapta – mediu cromogen Manitol Salt Agar, S. aureus fermenzează manitolul și determin ă schimbarea
culorii indicatorului Fenol Roșu de la roșu la galben; S. epidermidis nu fermentează manitolul, nu schimbă
culoarea indicatorului.

6.2 Identificarea biochimică pe baza sistemelor multitest/ automate a unor tulpini
microbiene virulente și mul tirezistente izolate din probe clinice
Identificarea tulpinilor s -a realizat cu ajutorul sistemelor microtest API 20Staph și
confirmate cu ajutorul sistemului automat Vitek 2 . În acest studiu s -au utilizat 30 tulpini de
ÎS. aureus și 15 de S. epidermidis selectate dintr -o colecție de tulpini Multi Drug Resistant
izolate din infecții cutanate, de plagă, între anii 2015 – 2017, furnizate de Laboratorul de
Microbiologie al Institutului Clinic Fundeni din București.
Principiul metodei : Testele API BioMérieux sunt sisteme micro -test utilizate pentru
identificarea biochimică a tulpinilor microbiene.
API Staph este un sistem standardizat pentru identificarea speciilor aparținînd
genurilor Staphylococcus, Micrococcus și Kocuria . Galeriile API Staph constau în 20
microtuburi conținând substraturi deshidratate. Aceste microtuburi sunt inoculate cu o
suspensie bact eriană, preparată în mediu API Staph. În timpul incubării, în urma
metabolizării substraturilor biochimice, se produc schimbări de culoare care sunt fie
spontane, fie evidențiate prin adăugarea ulterioară de reactivi. Se pregătește o cutie de

48
incubare (tav iță și capac) și se repartizează aproximativ 5 ml de apă distilată sau
dimineralizată sau orice fel de apă fără aditivi sau compuși chimici care pot produce gaze (de
ex. Cl 2, CO 2 etc.) în godeurile alveolare ale tăviței pentru a crea o atmostferă umedă. Cu
ajutorul unei pipete sau PSIpette se umplu microtuburile cu Mediu API Staph inoculat numai
în porțiunea de tub a microbuturilor, nu și în godeuri; se asigură condiții de anaerobioza în
godeurile testelor ADH și URE prin umplerea godeurilor cu ulei mineral . Suspensia
bacteriană folosită pentru inocularea tubului cu Mediu API Staph este reprezentată de o
suspensie bacteriană omogenă cu o turbiditate echivalentă cu standardul 0,5 McFarland dintr –
o cultură pură a unei specii din Fam. Staphylococcus. După perioada de incubare (18 -24h, la
360C ± 20C) se realizează citirea galeriei, iar la unele dintre teste se adaugă diver și reactivi
pentru vizualizarea reacțiilor, conform indicați ilor din prospect.
Rezultatele se convertesc într -un cod numeric din șapte cifre cu ajutorul căruia se face
identificarea utilizând software -ul API W eb 10 .

Figura …. . Identificarea biochimică cu ajutorul testelo r API 20 Staph – aspectul unei galerii poz itivate pentru o
tulpina de S. aureus; legenda ingredientel or active în godeurile testului: URE – Uree; ADH – L-arginina; ODC –
L-ornitină; ESC – esculină; GLU – glucoză; FRU – fructoză; MNE – D-manoza; MAL – D-maltoză; LAC – D-
lactoză; TRE – D-trehaloză; MAN – D-manitol; RAF – D-rafinoză; RIB – D-riboză; CEL – D-celobioză; NIT –
nitrat de potasiu ; VP – piruvat de sodiu; βGAL – 2-naftil -β-D-galactopiranozid; ArgA – L-arginin, β –
naftilamidă; PAL – 2-fosfat de naftil; PyrA – acid piroglutamic, β -naftilamidă; NOVO – novobiocin; SAC – D-
zaharoză; NAG – N-acetilglucozamină; TUR – D-turanoză; ARA – L-arabinoză; βGUR – 4-nitrofenil -β-D-
glucuronid .
Controlul calității se realizează utilizând tulpinile Staphylococcus epidermidis ATCC
12228 și Staphylococcus aureus ATCC 29213.
6.3 Determinarea capacității de aderență la substrat inert/ celular a tulpinilor bacteriene
patogene
Aderența la substratul inert
Capacitatea de aderență la substrat inert a fost evaluată prin testul producerii de slime
prin metoda cantitativă. Termenul de slime desemneaz ă materialul care constituie matricea
biofilmelor, un material lax, u șor de separat prin centrifugare, constituit din exopolizaharide,
glicoproteine hidrofile secretate de unele tulpini și care favorizează aderența celulelor
bacteriene la suprafețe inerte, abiotice. Reprezint ă un indicator al gradului de

49
rezistență/toleran ță și al capacității de supraviețuire a tulpinilor bacteriene în mediul extern,
constituind îns ă și un factor de virulență la bacteriile oportuniste/patogene în cursul infecției
unui organism gazda, prin efectul s ău antifagocitar mai ales.
Testul slime s-a utilizat pentru evi dențierea capacității de aderență la substratul inert
reprezentat de materialul polimeric din care sunt confecționate plăcile cu 96 de godeuri .
Suspensiile bacter iene au fost inoculate în bulion și incubate pentru 24h la 370C. După
incubare, plăcile au fost golite de cultura bacteriană, spălate de 3 ori cu ser fiziologic steril,
fixate cu metanol timp de 5minute și colorate cu cristal violet timp de 15 -20 minute.
Capacitatea de aderență la su bstratul inert, direct proporțională cu intensitatea culorii, a fost
determinată spectrofotometric pentru materialul biologic resuspendat la 490 nm (Norouzi și
colab. , 2010).
Aderența la substratul celular
Acest test s -a realizat prin metoda Cravioto, adaptată, utilizând ca substrat celular
linia celulară Hep -2 (Human Epithelioma ). Celulele Hep -2 au fost cultivate 24h la 37oC în
MEM (Eagle Minimal Essential Medium ) cu adaos de 10% ser fetal bovin (Gibco BRL),
0.1mM aminoacizi (Gibco BRL) și 0.5ml soluție de gentamicină (50 μg/ml) (Gibco BRL).
Monostraturile de celule Hep -2 obținute în plăci de plastic cu șase godeuri au fost spălate de
trei ori cu TFS (Tampon Fosfat Salin), și apoi s -a adăugat 1 ml de suspensie bacteriană în
fiecare godeu. Plăcile astfel inoculate au fost incubate 2h la 37oC.
După incubare monostraturile au fost spălate de 3 ori cu TFS, fixate cu metanol rece
timp d e 5 minute și colorate cu 1ml soluție Giemsa (1:20) timp de 15minute. Plăcile au fost
spălate, uscate la temperatura camerei, examinate la microscop cu obiectivul de imersie
(100X) pentru determinarea semicantitativă a nivelului de aderență și respectiv a pattern -ului
de aderență (localizat, difuz sau agregativ). Indicele de aderență a fost calculat ca fiind egal
cu procentul de celule cu bacterii aderate din 100 de celule numărate (Laz ăr, 2003).

6.4 Caracterizarea fenotipică a factorilor de virulență solubili ai tulpinilor bacteriene
izolate
Enzimele din echipamentul enzimatic bacterian pot juca rol de factori de virulență,
direct , intervenind în diferite etape ale procesului infecțios (colonizare, invazie, protecție față
de efectorii sistemului imunitar), cum ar fi: toxinele formatoare de pori, gelatinaza, DN -aza,
esculinaza sau indirect , prin conferirea unor avantaje competitive pentru ocuparea unei
anumite nișe ecologice, multiplicarea rapidă și colonizarea acesteia (amilaze, cazeinază), iar

50
evidențierea lor prin teste biochimice permite aprecierea
potențialului patogen și a gradului de virulență al tulpinii izolate
din probe cli nice (Lazăr, 2004).
Au fost efectuat e teste pentru eviden țierea lecitinazelor,
lipazelor, proteazelor (cazeinază și gelatinază), hidroliz ei
esculinei, și amilazelor microbiene.
Lecitinazele și lipazele sunt enzime implicate în
patogeneza unor tulpini bacteriene prin capacitatea lor de a
induce formarea de pori la nivelul membranei celulelor
eucariote și prin alterarea conținutului lipidic al acestora
(Chifiriuc și colab., 2011).
Pentru evidențierea producerii de lecitinază , tulpinile
au fost însămânțate în spot pe mediu solid cu adaos de gălbenuș
de ou și incubate la 37o C până la 7 zile, reacți a pozitiv a fiind
indicata de aparitia în jurul culturii a unui halou și/sau
opacifiere a mediului . Clarificarea rezultă din eliberarea lecitinei
mai solubile din complexul lipidic, iar zona opacă apare datorită
formării de fosfat -diacilgliceride insolubile. (Zarnea și Popescu ,
2011).
Pentru evidențierea producerii lipazei tulpinile au fost
însămânțate în spot pe mediu solid cu adaos de Tween 80
(polioxietilen sorbitan monooleat) în concentrație finală de 1%
și incubate la 37o C până la 7 zile. Prezența unei zone opace (de
precipitare) în jurul coloniilor a indicat producer ea de lipază
(Chifiriuc și colab., 2011).
Proteazele sunt enzime extra -celulare cu specificitate
scăzută, care hidrolizează proteinele la peptide și aminoacizi ,
implicate în distrugerea țesuturilor gazdei, în special a celor
devitalizate și în progresia infecției. Pentru evidențierea
producerii proteazelor, tulpinile au fost însămânțate în spot pe
medii solide cu adaos de cazeină sau de gelatină, și incubate 24
h la 37oC. Prezența unei zone de precipitare/clarificare în jurul
ariei de creștere a indicat proteoliza cazeinei/gelatinei (prezența
cazeinazei/gelatinazei ) (Chifiriuc și colab., 2011) Medii de cultură pentru realizarea
testelor calitative de evidențiere a
factorilor de virulență
 Mediu pentru determinarea
lecitinazei
Într-un volum de 20 ml geloză simplă
(extract de carne 10g; peptonă 10g;
NaCl 5g; agar 20g; apă distilată 1000
ml; pH= 7,4± 0,2 la 250C; Sterilizare:
20 minute la 1210C) răcită în
prealabil la 450C – 500C se adaugă 1
ml emulsie gălbenuș, iar apoi mediul
este repartizat în plăci Petri, în mod
steril. Pentru satisfacerea exigențelor
nutriționale ale tulpinil or anaerobe s –
a adăugat la mediul de bază 5µg/ml
hemină și 1µg/ml vitamina K.

 Mediu pentru determinarea lipazei
Componentele mediului ( peptonă
10g; NaCl 5g; CaCl 2 0,1g; agar 25g;
apă distilată ad 1000 ml) sunt
adăugate în apă distilată, se ajustează
pH-ul la 7,4 și se sterilizează 30
minute la 1100C. Mediul este răcit la
450C – 500C și se adaugă 1%
TWEEN 80 sterilizat în prealabil 20
minute la 1210C. Pentru satisfacerea
exigențelor nutriționale în cazul
tulpinile anaerobe s -a adăugat la
rețeta de bază 5µg/ml hemină și
1µg/ml vitamina K.

 Mediu pentru determinarea
cazeinazei
Într-un volum de 200 ml geloză
simp lă (extract de carne 10g; peptonă
10g; NaCl 5g; agar 20g; apă distilată
ad 1000 ml; pH= 7,4± 0,2 la 250C ;
Sterilizare: 20 minute la 1210C)
răcită în prealabil la 450C – 500C se
adaugă 100 ml lapte cu 0,1% grăsime
steril, iar apoi mediul este repartizat
în plăci Petri. Pentru satisfacerea
exigențelor nutriționale în cazul
tulpinile anaerobe s -a adăugat la
rețeta de bază 5µg/ml hemină și
1µg/ml vitamina K.

51

Hidroliza esculinei . Esculina (un glucozid) este
hidrolizată la glucoză și esculetol. În prezența citratului de Fe
(FeC 6H5O7) (FeIII) din mediu, esculetolul eliberat sub acțiunea
unei β-glucozidaza (esculinaza) generează formarea unui
precipitat negru de esculetină ferică, compus cu Fe2+, fenolic cu
structură chimică incertă. S -a demonstrat că esculetolul poate
fixa chelator ii de fier (de tipul transferinei), furnizând astfel
ionii de Fe necesari celulelor bacteriene pentru activarea unor
gene și exprimarea unor factori de virulență. Rolul esculetolului
este foarte important la bacteriile patogene extracelulare,
deoarece în m ediul extracelular, cantitățile de Fe liber sunt
foarte reduse, majoritatea ionilor de Fe circulând în forma
legată. Pentru testarea acestui factor de virulență tulpinile
microbiene au fost însămânțate pe mediu cu esculină, prezența
unui precipitat negru î n jurul culturii microbiene a indicat un
rezultat pozitiv (Chifiriuc și colab., 2011).
Producerea de DN -ază. DN-azele bacteriene
acționează asupra ADN bacterian eliberând mono – sau
dinucleotidele. Tulpinile au fost însămânțate în spot pe agar cu
ADN (Merck, Germania) și incubate la 37oC, 24h. După
incubare, plăcile au fost inundate cu soluție de HCl 1N, care a
precipitat ADN nedegradat conținut în mediu, producând
opaciefierea acestuia, cu excepția zonelor din jurul spot-urilor
de cult ură ale tulpinilor pozitive, care au rămas transparente,
datorită degradării anterioare a lanțului de ADN la
mononucleotide (Lazăr și colab., 2004). .
Amilazele sunt exoenzime secretate de microorganisme
pentru hidroliza extracelulara a amidonului, un polizaharid,
homopolimer de glucoză cu masă moleculară mare care nu
poate fi trasportat prin membrană intracelular. Amilazele s -au
detectat utilizând geloză nutritivă la care s -a adăugat amidon de
orez, iar după incubarea 3 -5 zile în condiții de temperatură și

 Mediu pentru determinarea
gelatinazei
Componentele mediului ( peptonă
10g; extract de drojdie 1g; taurocolat
de Na 10g; gelatină 30g; agar 15g;
apă distilată ad 1000 ml) sunt
adăugate în apă distilată, se ajustează
pH-ul la 8 și se sterilizează 30 minute
la 1100C. Pentru tulpinile anaerobe s –
a adăugat la rețeta de bază 5µg/ml
hemină și 1µg/ml vitamina K.

 Mediu pentru determinarea
hidrolizei esculinei
Componentele mediului ( peptonă 8g;
săruri biliare 20g; citrat feric 0,5g;
esculină 1g; agar 15g; apă distilată ad
1000ml) sunt adăugate în apă
distilată, se ajustează pH -ul la 7,1 ±
0,2 la 250C și se sterilizează 15
minute la 1210C. În cazul tulpinile
anaerobe s-a adăugat la rețeta de bază
5µg/ml hemină și 1µg/ml vitamina
K.

 Mediu pentru determinarea DN -azei
Componentele mediului ( digest
enzimatic de cazeină 15g; digest
enzimatic de țesut animal 5g; NaCl
5g; acid deoxiribonucleic 2g; agar
15g; apă distilată 1000 ml) sunt
adăugate în apă distilată, se ajustează
pH-ul la 7,3 ± 0,2 la 250C și se
sterilizează 15 minute la 1210C.
Pentru satisfacerea exigențelor
nutriționale în cazul tu lpinile
anaerobe s -a adăugat la rețeta de bază
5µg/ml hemină și 1µg/ml vitamina
K.

 Mediu pentru determinarea amilazei
Într-un volum de 900 ml geloză
simplă ( extract de carne 10g;
peptonă 10g; NaCl 5g; agar 20g; apă
distilată 1000 ml; pH= 7,4± 0,2 la
250C ; Sterilizare: 20 minute la
1210C) răcită în prealabil la 450C –
500C se adaugă steril 100 ml apă
distilată în care au fost dizolvate 10g
amidon, iar apoi mediul este
repartizat în plăci Petri. Pentru
tulpinile anaerobe s -a adăugat la
rețeta de bază 5µg/ml hemină și
1µg/ml vitamina K.

52
atmosferă particulare izolatelor, hidroliza amidonului s -a pus in evidenta prin inundarea cu
soluție Lugol (inel galben în jurul spotului de cultură, în timp ce restul mediului s -a colorat in
albastru). (Lazăr și colab., 2004).

6.5 Caracterizarea genotipică a factorilor de virulență utilizând metodele simplex și
multiplex PCR

Extrac ția ADN bacterian
Obținerea ADN bacterian pentru screening -ul genelor s -a realizat utilizând metoda de
extracție alcalină a ADN -ului. Metoda presupune preluarea a 1-5 colonii din culturile
bacteriene de 24 ore, care au fost suspend ate în 20 µl soluție NaOH + SDS, termostatarea la
95°C 5 min, urmată de adăugarea a 180 µl solu ție tampon TE1x în fiecare tub și centrifugare
3 min. la 13000 r.p.m. apoi păstrare a la -4șC. Verificarea produsului obținut s -a realizat prin
electroforeză în gel de agaroză 1,5% și 2%, 45min la 90V, colorat cu bromură de etidiu
3,5µg/ml.
Reac ția PCR ( Polymerase Chain Reaction = Reacția de polimerizare în lanț) este o
metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN. Din punct de
vedere chimic, reacția PCR constă din cicluri succesive de replicare a ADN in vitro , folosind
2 primeri oligonucleotidici c are hibridizează cu cele două catene ale matriței. Diferența
esențială între o asemenea reacție de replicare și un proces de replicare ADN in vivo , este
reprezentată de faptul că în reacția PCR etapa de desfacere a dublului he lix matriță și
respectiv, cea de atașare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor
trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacție este o ADN polimeraz ă
dependentă de ADN (Vassu și colab., 2001).
Detectarea genelor de virulență la tulpinile de S. aureus
Caracterizarea la nivel molecular a prezenței genelor care codifică pentru patru factori
de virulență la tulpinile de S. aureus studiate a fost real izată cu ajutorul tehnicii PCR. Toate
reacțiile PCR au fost efectuate cu ajutorul Thermal Cycler Corbet .
S. aureus prezintă câteva adezine MSCRAMMs redundante (de exemplu există două
proteine de legare a fibronectinei [FnbpA și FnbpB] și trei proteine car e leagă fibrinogenul
(factorii clumping A și B [ClfA și ClfB] și proteina de legare a fibrinogenului [Fib/Efb]). În
plus, unele molecule MSCRAMMs pot lega mai multe tipuri de molecule ale matrixului
extracelular (de exemplu, FnbpA se leagă atât la fibronec tină, cât și la fibrinogen). Din acest

53
motiv PCR reprezintă o metodă ce poate fi utilizată cu succes pentru detectarea genelor care
codifică pentru aceste adezine. Astfel, tehnica PCR a fost utilizată pentru detectarea a opt
gene care codifică pentru princ ipalele adezine MSCRAMMs la tulpinile de S. aureus.
Secvențele de nucleotide ale genelor ebpS (codifică pentru proteina de legare a elastinei),
fnbB (codifică pentru proteina B de legare a fibronectinei), fib (codifică pentru proteina de
legare a fibrinoge nului), clfA și clfB (codifică pentru factorii clumping A și B), și bbp
(codifică pentru proteina de legare a sialoproteinei osului) obținute din GenBank au fost
comparate și evaluate cu ajutorul programelor software Blast și ClustalX pentru a identifica
regiunile unice ale fiecărei gene, cu temperaturi similare de atașare. Amplificarea genelor bbp
și ebpS s-a realizat printr -o reacție PCR multiplex. De asemenea, o reacție PCR multiplex a
fost utilizată pentru detectarea genelor fnbB , fib, clfA și clfB. Det ectarea genei fnbA (codifică
pentru proteina A de legare a fibronectinei) s -a realizat printr -un PCR simplex cu primeri
specifici. Un PCR simplu a fost utilizat și pentru detectarea genei cna (codifică pentru
proteina de legare a cola genului) (Cotar și col ab., 2008; Cotar, 2009).
Secvențele primerilor specifici fiecărei gene care codifică pentru factorii de virulență
mai sus menționați, precum și programele de amplificare folosite sunt listate în tabelele 8 și
9. Produșii de amplificare pentru fiecare reac ție PCR (multiplex/simplex) au fost verificați
prin electroforeza în gel de agaroză 1.5% colorat cu bromură de etidiu (10µg/ml) și
identificați pe baza dimensiunilor caracteristice cu ajutorul unor markeri de greutate
moleculară specifici. Gelurile au fost fotografiate cu instrumentul de documentare pentru
geluri UVP.

6.6 Obținerea și caracterizarea fizi co-chimică a extractelor vegetale
6.6.1 Obținerea uleiurilor volatile prin hidrodistilare
Principiul metodei : plasarea materialului vegetal în contact direct cu apa și aducerea
amestecului la temp eratura de fierbere, urmată de separarea uleiului volatil datorită diferenței
de densitate dintre apa de cohobație și ulei.
Tehnica este specifică dozării conținutului de uleiuri volatile din produsele vegetale.
Plantele achizi ționate de la furnizori locali ( Eugenia carryophyllata – fructe uscate,
Rosmarinus officinalis herba , Salvia officinalis herba ) au fost identificate înainte de a fi
utilizate pentru extrac ția uleiurilor volatile. Probele de material vegetal uscat/ au fost
hidrodistilate într -un aparat de tip Neo -Clevenger timp de 4 h (Farmacopeea Română, ed. a –
X-a). Pentru îndepărtarea urmelor de apă, înainte de analiza cromatorgrafică, uleiul volatil a
fost uscat cu MgSO4 anhidru. Păstrarea probelor de ulei reunite (extracții/ specie) s -a realiza t

54
în recipient brun, 4˚C până la efectuarea analizei cromatografice și evaluarea activității
biologice.
6.6.2 Caracterizarea fizico -chimică a extractelor vegetale
Analiza GC -MS, determinarea densității probelor de uleiuri volatil e. Probele de
ulei vol atil comerciale și probele extrase au fost diluate pentru analiza GC -MS în hexan.
Probele de ulei volatil au fost diluate în hexan (0.4µg/mL) și au fost analizate prin
cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă, cu ajutorul analizorului 7890A –
5975C Agilent Series System (fig. …). Pentru analiza cantitativă s -au construit curbe de
calibrare pentru standardele analitice: eugenol, β-pinen, 1,8 -cineol, d -limonen. Intervalele de
concentrații pentru curbele de cali crare se regăsesc în tabelul nr. ….

Fig. … Gaz-cromatograf cuplat cu spectrometru de masă (7890A -5975C Agilent Series System)

Parametri de achiziție :

coloană cromatografică DB-5 MS (60m x 0.25mm x
0.25µm – fază staționară din poli -fenil-arilen, nepolară );
 eluție cu gradient de temperatură; p rogram de temperatură: 50ș
C izoterm 3min, 5 ș C până la 300 °C;
 injecție automată, în modul split, rată de splitare 1:200
 volum de injecție 1µL,
 debit 1mL/min
 simplu quadrupol
 scanare în intervalul 50 -400 uam.

55

Tabel nr. 1 Intervalul de concentrații pentru curbele de calibrare
Standard
analitic Masa cântărită
(mg) Intervalul de concentrații pentru curbele de calibrare µg/mL
C1 C2 C3
eugenol 10,36 239 119,5 23,9
β-pinen 2,4 1161 580,5 116,1
1,8-cineol 7,93 792 396 79,6
d-limonen 11,01 1036 518 103,6
C 1-3 – nivel de calibrare
Prelucrarea datelor s -a realizat cu ajutorul software -ului ChemStation Agilent
Technologies (Santa Clara, CA, USA). Identificarea compușilor detectați s -a realizat pe baza
comparării spectrelor lor de masă cu cele din baza de date NIST. Analiza calitativă a permis
raportarea compoziției uleiurilor volatile analizate în % arie relativă.
Pentru uleiurile volatile extrase s -a măsurat densitatea prin raportarea greutății
măsurate la balanța analitică (precizie cinci zecimale) la volum ul luat în lucru, 30µL . Pentru
acuratețe, masa a fost măsurată folosind un program statistic al balanței, cu 10 determinări,
fiind calculată automat deviația standard a setului de măsurători.

6.7 Screening -ul activității antimicrobiene a unor componente selecționate pentru sisteme
de conservare mix te
6.7.1 Determinarea calitativă si cantitativă a spectrului antimicrobian al extractelor vegetale
Determinarea calitativă a activității antimicrobiene a uleiurilor volatile – metoda
difuzimetrică adaptată

Screening -ul calitativ al sensibilității bacteriene față de uleiurile volatile cu potențială
acțiune antimicrobiană s -a realizat prin metoda difuzimetrică adaptată. Au fost supuse
screening -ului calitativ uleiurile volatile din Eugenia eucariofilata (fructe uscate ), Salvia
officinalis herba și Rosmarinus officinalis herba , alături de standardele analitice –
fenoxietanol, sorbat de potasiu, eucaliptol, eugenolul și β-pinen, componente ale uleiurilor
volatile; acid salicilic – substanță cu acțiune antiacneică cunos cută; solvenții dimetil sulfoxid

56
(DMSO) și propilenglicol. Suspensiile bacteriene au fost realizate din culturi tinere de 18 -24
h, cultivate pe mediu Müller -Hinton și ajustate la o densitate de 1,5*108 UFC/mL, utilizând
standardul nefelometric 0,5 McFarl and. Dispunerea uleiului volatil și a standardelor analitice
s-a realizat folosind tehnica în spot. Spoturile au avut volum de 10µL și au fost realizate din
soluții diluate 1:1 ulei volatil/ standard analitic:DMSO, pentru facilitarea difuziei în mediul
de cultură a componentelor nepolare (fig. 3).

Fig. 3 Distribuția spoturilor în plăci – metoda difuzimetrică adaptată

Metoda nu poate fi considerată semicantitativă, datorită absenței studiilor care să
ateste profilul de difuzie al compușilor prin mediu și stabilirea concentrațiilor descrescătoare,
invers proporțional cu diametrul de difuzie. Efectul bactericid, adică inh ibiția creșterii
bacteriene, a fost cuantificat prin apariția unor zone lipsite de creștere microbiană în jurul
spotului.
Determinarea cantitativă a activității antimicrobiene a uleiurilor volatile –
metoda microdiluțiilor
Suspensiile bacteriene au fost realizate din culturi tinere de 18 -24 h, cultivate pe
mediu Müller -Hinton și ajustate la o densitate de 1,5*108 UFC/mL, utilizând standardul
nefelometric 0,5 McFarland. Analiza cantitativă s -a realizat prin tehnica micro diluțiilor
seriale . S-au obținut diluții binare în mediu lichid (bulion Müller -Hinton), iar concentrația
minime inhibitorie (CMI) este concentrația minimă de ulei volatil capabilă să inhibe creșterea
microbiană, apreciată macroscopic prin absența turbidității mediului de cult ură cu conținut de
ulei volatil, după însămânțare și incubare 24h. Volumul final din fiecare godeu a fost de
225µL, iar volumul de suspensie microbiană de 25µL. Schema diluțiilor seriale pentru fiecare
dintre uleiurile/ standardele testate este redată în tabel ul nr. 2.

57

Tabelul nr. 2 Intervalul diluțiilor seriale binare realizate

După incubarea plăcilor cu 96 de godeuri pentru stabilirea CMI se observă, în cazul
uleiului de cuișoare și a standardului β-pinen, interacțiunea cu materialul godeurilor și
apariția turbidității mediului, care împiedică atât citirea spectrofotometrică a d ensității optice
a CMI (fig. 4).

Fig. 4 Metoda microdiluțiilor – la testarea CMI eugenol și β-pinen interacțiunea cu materialul godeurilor

Pentru evitarea stabilirii unor rezultate fals negative rezultatele CMI au fost
confirmate în acest caz prin cuantificarea numărului de celule viabile din probele (VCC –
viable cells count) CMI și martor pozitiv .
6.7.2 Studiul influenței asupra capacității de aderență la substrat inert a unor tulpini
bacteriene prin testul producerii de slime

Capacitatea de aderență la substrat inert (metoda este detaliată la capitolul 6.3) a
tulpinilor bacteriene de interes aflate în contact cu compuții naturali vegetali a fost
determinată în plăci cu 96 de godeuri. Densitatea optică a materialul ui biologic resuspendat a
fost determinată spectrofotometric la 490 nm (Norouzi și colab. , 2010).

58
6.7.3 Studiul influenței asupra sesnsibilității la antibiotice a tulpinilor studiate
6.7.4 Influența asupra sin tezei factorilor de virulență solubili (toxine formatoare de pori,
exoenzime)
6.8 Selectia unor componente pe baza analizei cantitative a extractelor vegetale
6.9 Studiul influenței combinațiilor selecționate, în concentrații subinhibitorii, asupra
virulen tei si rezistentei tulpinilor microbiene izolate de la pacienti cu infecții cutanate/
plagi septice

6.10 Evaluarea prin citometrie în flux a mecanismului de acțiune pentru componentele/
amestecurile cu activitate antimicrobiană demonstrată prin metode con venționale

Principiul metodei : o suspensie de particule este injectată într -un lichid de învelire
(sheat fluid ) și trece sub forma unei secvențe aliniate de particule individuale prin fața unei
surse de lumină (laser – Argon, HeNe, HeCd), ortogonal; la intersecția fluxului de particule
cu radiația de excitație produsă de laser are loc împrăștierea înainte și în lateral (la 90 ̊) a
luminii .
Detecția luminii împrăștiate și a fluorescenței particulelor marcate permite analiza
simu ltană a caracteristicilor moleculare și fizice ale acestora, precum: mărime și
granularitate; intensitatea fluorescenței.
Studiul mecanismului de acțiune s-a realizat în două experimente diferite, (1) pentru
uleiuri volatile/ standarde analitice (acid salicilic și conservanți) și (2) pentru combinațiile
sinergice combinații compusi naturali: acid salicilic și compuși naturali : sisteme de
conservare s -a realizat pentru concentrații CMI și CMI/2. Marcare a probelor analizate s -a
realizat cu 2 fluorocromi, iodură de propidiu (PI) și bromură de etidiu (EB), pentru corelarea
a două acțiuni la nivelul celulelor microbiene, integritatea învelișurilor celulare, respectiv
activitatea pompelor de eflux.
Probele s -au analizat cu ajutorul citometrului BD FACS Ver se (Fig. 5), dotat cu laser
Argon de 488nm, utilizând filtrele FL3 (670LP) pentru probele marcate cu iodură de propidiu
și respectiv FL2 (585/42) pentru probele marcate cu bromură de etidiu.

59

Fig. 5 Citometru FACS Verse

6.11 Evidențierea influenței uleiurilor volatile și a unor fracții ale acestora asupra
expresiei unor gene codificatoare ale unor factori de virulență și molecule implicate în
semnalizarea intercelulară

6.12 Evaluarea prin citometrie in flux a e fectului anti -inflamator al combinatiilor
selectionate
6.13 Selectarea componentelor cu efect antimicrobian și non -citotoxic
6.14 Formulare in silico si experimentala a unui produs topic cu efect antimicrobian
Formularea asistată de calculator a unei creme cu efect antiacneic cu sistem de
conservare mixt

În cazul formulărilor cosmetice, obiectivul principal este pătrunderea în straturile
pielii a substanțelor active și încetinirea cineticii de eliberare transdermala. Modalitatea
practică de realizare a acestui obiectiv este creșterea coeficientului de partiție și nu a celui de
difuzie. Coeficientul de partiție definește solubilitatea substanței active în stratul cornos și în
formulare .
Software -ul Formulator® (fig. 6) abordează sistematic etapele formulării, pentru
optimizarea transferului transdermic al substanțelor active lipofile. Programul calculează
compoziția optimă a fazei lipofile din formulare pentru o substanță lipofilă dată, ingredient
activ, la o concentrație cunoscută, astfel încât această concentrație să fie cât mai aproape de
maximum de solubilitate/ partiție a substanței active în stratul cornos, ceeea ce permite
valorificarea activității farmacologice a substanței active.

60

Fig. 6 Schema descriptivă a programului de formulare

Utilizând acidul salicilic ca substanță acitivă pentru formularea cu acțiune antiac neică,
s-a realizat modelarea in silico a variantei optime de emulsie.

Formularea experimentală a unui produs topic

Formula propusa a urmarit atingerea obiectivelor legate de calitatea produsului
dermato -cosmetic si managementul tratamentului anti -acneic. Selecția ingredienților s -a
realizat pe baza proprietatilor organoleptice (aspect, culoare, miros, etalare), fizico -chimice
(pH, vascozitate, stabilitate termodinamica), si farmacologice – pentru imbunatatirea
echilibrului hidrolipidic la nivelul tesutului cutanat, actionand complementar si sinergic cu
ingredientii activi (acidul salicilic, substanță cu efect antiacneic demonstrat). De o deosebită
importanță în formularea dermato -cosmetică pentru produse adjuvante în tratamentul acneei
vulgare este selecția unor ingredienți cu proprietăți non -ocluzive.
Proba de laborator s -a realizat cu ajutorul omogenizatorului IKA® RET control/1 cu
termometrul electronic de contact IKA® ETS – D5 (fig. 7 ).

61

Fig. 7 IKA® RET control/1

Etapele preparării emulsiei sunt redate în figura 8.

Fig. 8 Etapele formulării emulsiei

62
6.15 Testatarea unor combinatii optimizate, c u efect antimicrobian, utilizabile ca sisteme
de conservare a formulelor topice
6.16 Testarea unor combinatii optimizate cu efect antimicrobian/ anti -inflamator
6.17 Dezvoltarea experimentala a formulei topice cu efect antimicrobian
6.18 Caracterizarea for mulei topice (microscopic, prin citometrie in flux, microbiologică)
6.18.1 Metode de testare a eficacității produselor finite. Evaluarea non -invaziză a pielii în
industria cosmetică
6.18.2 Peisajul fiziologic, morfologic și imunologic al pielii: de la int erior la exterior
6.18.3 Microbiota normală a pielii
6.19 Optimizarea activitatii antimicrobiene prin obținerea unor nanosisteme
funcționalizate cu compuși naturali, pentru industria cosmetică
6.20 Obținerea si caracterizarea fizico -chimică a unor materia le nanostructurate hibride
anorgano -organice cu proprietăți antimicrobiene
6.21 Evaluarea activitatii antimicrobiene a nanosistemelor functionalizate

CAPITOLUL 7 .
Rezultate și discuții

7.18.1. Metode de testare a eficacității produselor finite . Evaluar ea non -invaziză a pielii în
industria cosmetică
Multe companii cosmetice formulează ingredientele active în câteva sisteme de livrare
standard, înainte de a efectua testări ale eficacității produselor finite. Modalitatea de
optimizare a formulării este di ctată de balanța hidrofil -lipofilă a sistemelor de livrare, care
dictează stabilitatea termodinamică și proprietățile senzoriale ale formulei.
În demersurile experimentale care vor fi realizate în prezenta lucrare se va aborda
formularea pentru eficacitat ea estimată și demonstrată a produsului finit. Acest lucru se va
putea realiza cu ajutorul unui sistem coerent de tip platformă de cercetare, care va integra
etapele de formulare și testare a produselor dezvoltate.
În această etapă de lucru s -au studiat parametrii biomecanici relevanți pentru
evaluarea statusului pato -fiziologic al pielii, cu scopul evidențierii necesarului de testare
pentru formulele dezvoltate, care poate evidenția eficacitatea formulelor dezvoltate.

63
Evaluarea structurii suprafeței și a proprietăților funcționale ale pielii în scopul
formulării revendicărilor privind eficacitatea produselor de îngrijire a pielii este o parte
esențială a cercetării și dezvoltării produselor cosmetice. Principiile care reglementează
studiile clinice în in dustria produselor de consum sunt similare cu studiile clinice terapeutice
privind medicamentele. Astfel, siguranța și clearance -ul etic al produselor, procedurile care
urmeaza a fi utilizate, instruirea cercetătorilor și monitorizarea și auditarea studiil or sunt
considerate importante atât pentru siguranța subiecților înscriși în studii, cât și pentru
validitatea rezultatelor obținute. Alegerea subiecților, proprietățile pielii, etnia, vârsta, sexul,
absența altor factori de confuzie, boala, ingestia de me dicamente etc. care vor invalida
rezultatele, toate acestea fiind asigurate de elaborarea cu atenție a criteriilor de includere și
excludere a subiecților în studiu.
Parametrii funcționali, structurali și de frumusețe care sunt în general măsurați în
indus tria cosmetică sunt:
1. Statusul de sănătate a pielii/ status fiziologic: conținutul de apă (hidratarea), rata de
pierdere transepidermală a apei (o măsură a funcției de barieră a pielii) și pH -ul pielii;
2. Proprietățile suprafeței pielii: textură, eleme nte de descuamare, fricțiune, conținutul de
sebum, oxigenul transcutanat și dioxidul de carbon, spectrofluorimetria și coeficientul de
elasticitate;
3. Culoarea pielii – pentru estimarea efectelor de creștere a luminozității și a statusului
inflamator la n ivel tegumentar.

HIDRATAREA PIELII
Conținutul de apă al stratului cornos influențează și alte caracteristici ale pielii cum ar
fi funcția de barieră a tegumentului, pătrunderea/ absorbția medicamentului/ substanței active
și proprietățile mecanice (suple țe/ delicatețea softness, elasticitate, etc.). Există trei metode
principale folosite pentru a evalua umiditatea pielii folosind instrumente neinvazive și
evaluarea următorilor parametri: capacitanță, conductivitate și impedanță.
Capacitanță
Principiul d e măsurare se bazează pe principiul fizic al unui condensator comun, care
este un complex de două plăci, izolat de un mediu care acționează ca un dielectric. Un
condensator are capacitatea de a stoca încărcătura electrică atunci când un câmp încărcat se
află în proximitate. Mai exact, măsurarea se bazează pe constanta dielectrică foarte diferită a
apei (81) și a altor substanțe (în cea mai mare parte <7). Aceasta înseamnă că majoritatea
materialelor măresc capacitatea unui condensator cu un factor de 7, în timp ce apa crește

64
capacitatea cu un factor de aproximativ 81. Prin urmare, aceasta înseamnă că, capacitanța este
direct proporțională cu conținutul de umiditate al eșantioanelor.
Instrumentele care utilizează metoda capacitanței: Corneometer® (Courage & K hazaka
GmbH, Germania). Conform producătorului, un avantaj al măsurătorilor de capacitanță față
de măsurătorile de impedanță este că nu există o relație galvanică între dispozitiv și obiectul
de măsurare sau polarizare, prin urmare substanțele chimice sau lamele de produse care se
aplică pe piele nu influențează citirile.
Conductanța
Metoda de măsurare a conductivității se bazează pe modificările proprietăților
electrice ale stratului cornos. Stratul cornos uscat are conductivitate electrică slabă, în timp ce
stratul cornos hidratat este mai sensibil la câmpul electric, determinând o creștere a constantei
dielectrice. Proprietățile electrice ale pielii sunt exprimate în termeni de rezistență (ohmi),
conductanță (curent/ rezistență, Siemens) sau impedanță (oh mi la o frecvență fixă). O creștere
a constantei dielectrice duce la scăderea impedanței și la creșterea conductivității și a
capacitanței. Echipamentul Skicon® 200 (I.B.S. Company, Japonia) permite estimarea
hidratării tegumentare folosind o frecvență de 3,5 MHz. Electrozii apropiați ai sondei mențin
câmpul electric în porțiunea superficială a pielii, conducând la o măsurare neinvazivă a
conținutului de apă.

Impedanța
Alte variații față de metodele de mai sus includ Nova ™ Dermal Phase Meter și
Monitorul de Impedanță de Caracterizare a Suprafeței. În Nova Dermal Phase Meter, sunt
integrate măsurători la frecvențe diferite ale curentului alternativ aplicat, ceea ce permite
citirea capacității de impedanță. Probele sunt măsurate de -a lungul unui timp de cre ștere
controlat până la 1 MHz. Aceasta este diferența principală față de Corneometru, care
utilizează frecvențe variabile la un interval mai mic (40 -75 kHz) sau Skicon 200, care
utilizează o frecvență fixă (3,5 MHz). Monitorul de Impedanță de Caracterizare a Suprafeței,
impedanța electrică, atât magnitudinea cât și faza, sunt măsurate la 31 de frecvențe până la
cinci adâncimi selectabile sub sondă, permițând așadar, realizarea spectroscopiei de
impedanță electrică a straturilor selectate ale pielii.

PIERDE REA TRANS -EPIDERMALĂ DE APĂ
Pierderea trans -epidermală de apă (TEWL) se referă la cantitatea totală de vapori de
apă pierduți prin piele. Acesta poate fi utilizat pentru a caracteriza funcția de barieră a

65
tegumentului, atât în condiții fiziologice cât și p atologice, pentru a efectua teste de predicție
asupra eventualului potențial iritant al unei formule și pentru a evalua eficacitatea
tratamentelor terapeutice pe pielea bolnavă. Măsurătorile in vivo ale TEWL pot fi realizate
utilizând tehnici diferite. Dis tante și Berardesca au descris cele trei tehnici:
1. Metoda cu cameră închisă: Aceasta metodă presupune aplicarea unei capsule pe
piele si colectarea vaporilor de apă de pe suprafața pielii. Umiditatea relativă din interiorul
capsulei este înregistrată cu un higrosensor electronic. Metoda camerei închise nu permite
înregistrarea continuă TEWL deoarece, atunci când aerul din interiorul camerei este saturat,
evaporarea încetează.
2. Metoda camerei ventilate: O cameră în care se află un gaz cu conținut de apă
cunoscut se aplică pe piele. Apa este preluată de gaz și măsurată cu ajutorul unui higrometru.
Această metodă permite măsurarea continuă a TEWL, dar dacă gazul purtător este prea uscat,
crește în mod artificial evaporarea.
3. Metoda cu cameră deschisă: Me toda cu cameră deschisă are capsula pielii deschisă
în atmosferă. TEWL se calculează pe panta furnizată de doi higrosenzori cu orientare precisă
în cameră. Mișcarea și umiditatea aerului sunt cele mai mari dezavantaje ale acestei metode
atunci când se efec tuează studii in vivo.
Deoarece măsurătorile TEWL urmează legile difuziei, atunci rezultatele TEWL depind direct
de umiditatea relativă a mediului, integritatea barierei stratului cornos, temperatură, grosimea
stratului cornos. Instrumentele care măsoară T EWL identificate sunt: Tewameter® (Courage
& Khazaka GmbH), Servo Med Evaporimeter (Servo Med AB, Suedia) și Vapometru (Delfin
Technologies, Finlanda).

pH-UL PIELII
pH-ul acid de la suprafața tegumentului este dictat de secreția glandelor sebacee și sudo ripare
și oferă protecția pielii prin tamponare chimică, detoxifiere și funcții bacteriostatice.
Intervalul normal de pH este de la 4,5 la 6,5. Acesta este menținut de un sistem tampon
lactat -bicarbonat, care poate neutraliza cantități mici de acizi sau al calii.
Măsurarea pH -ului folosește procesele de interfață electrochimică între metal sau sticlă și
soluții.

TOPOGRAFIA DE S UPRAFAȚĂ A PIELII / RUGOZITATE
Există mai multe metode de analiză a rugozității pielii. Prima metodă este
profilometria mecanică. Recent, s -au dezvoltat metode optice pentru evaluarea acestui

66
parametru. Topografia suprafeței pielii poate fi analizată utilizând replici (în mod normal,
replici de silicon) sau prin sisteme de imagistică (contact sau fără contact). Exemple de
sisteme im agistice sunt Visioscan (Courage & Khazaka GmbH) și PRIMOS (GFM,
Germania). Un exemplu de imagistică de contact este Visioscan. Visioscan este o cameră
video cu lumină UVA cu un senzor video alb -negru de înaltă rezoluție. Două lumini halogen,
dispuse pe la turi opuse, luminează uniform zona de piele (6 × 8 mm). Imaginea pielii este
preluată de o cameră CCD încorporată. Software -ul însoțitor oferă funcții de procesare a
imaginii și calcule statistice pentru evaluarea parametrilor texturii, înălțimea și lățime a
leziunilor etc.

DESCUAMAREA
Pielea uscată duce la curațare excesivă și descuamare prematură. Eliminarea
corneocitelor de pe suprafața pielii poate fi cuantificată prin separarea unei porțiuni din
suprafața stratului cornos de la țesutul subiacent și mă surarea ulterioară a proprietăților
componentelor endogene sau exogene prin analiza chimică/ biochimică. Evaluarea se
realizează cu metode optice.

CONȚINUTUL DE SEBUM
Sebumul este un amestec semi -lichid de lipide și reziduuri celulare excretate de
gland ele sebacee, care se găsesc în cele mai ridicate concentrații la nivelul feței și scalpului.
Funcția sebumului poate fi speculativă numai. Producția de sebum este în mare măsură
controlată de nivelurile endogene ale hormonilor. Nivelurile sunt cele mai rid icate în anii
adolescenței, scăzând la femei după menopauză și rămânând relativ neschimbate la bărbați.
Producția în exces de sebum poate contribui inducerea blocajelor ocluzive la nivel folicular și
formarea comedanelor. De aceea, evaluarea conținutului d e sebum și estimarea proceselor de
control al sebumului pentru o formulă dezvoltată, sunt elemente importante în aprecierea
eficacității unei formulări, în special pentru tenul acneic.
Sebumeter . Principiul de măsurare al acestui instrument se bazează pe observația că o
placă de sticlă măcinată cu o anumită opacitate devine translucidă atunci când suprafața
acesteia este acoperită de lipide. Transluciditatea sau creșterea transmisiei de lumină este
proporțională cu cantitatea de lipide de pe suprafață. Seb umeterul folosește o bandă de plastic
opacă de unică folosință în locul plăcii de sticlă. Această bandă este înfășurată într -o casetă
de film din plastic și trece printr -un cap proeminent care facilitează colectarea de sebum.
Capul este presat, cu o presiu ne fixă, pe piele timp de 30 de secunde. Pelicula devine

67
transparentă datorită sebumului absorbit, iar creșterea transparenței este măsurată printr -o
metodă optoelectronică. Citirea afișajului cu cristale lichide corespunde cantității de sebum
de pe supraf ața pielii, în micrograme pe centimetru pătrat.

ESTIMAREA CULORII pentru evaluarea efectului de luminozitate sau a statusului eritematos
Indicațiile vizuale au importanță primară în diagnosticarea corectă a leziunilor
cutanate sau a altor afecțiuni ale p ielii (de exemplu, culoarea). Ochiul uman este extrem de
sensibil în clasificarea diferitelor intensități de culoare, mai ales atunci când există o
comparație disponibilă alături. Cu un ochi expert, poate fi evaluată o afecțiune a pielii,
dimensiunea/ supr afața, culoarea, gradul de eritem și edem, rugozitatea suprafeței etc. În plus,
un expert de gradare vizualizează automat un situs de piele stereoscopic, prin mișcarea usoară
a capului subiectului și prin modificarea atât a unghiurilor de observare cât și a iluminării
pentru a ajunge la o "clasificare expert".
Deși ochiul uman este suficient de sensibil pentru a distinge diferențele subtile dintre
două culori, clasificarea rămâne subiectivă. Există diferențe mari în ceea ce privește notarea
dintre medici, c eea ce face imposibilă evaluarea într -o manieră cantitativă a diferenței
absolute între două culori. În plus, ochiul uman nu poate memora exact o culoare. Ca atare,
compararea a două culori similare prezentate la perioade diferite de timp este greu de real izat.
Deoarece percepția culorilor este foarte subiectivă, au fost dezvoltate dispozitive neinvazive
de măsurare a culorilor și au devenit foarte populare în utilizarea în cercetarea
dermatocosmetică.
Majoritatea organizațiilor de cercetare clinică sau a c entrelor de testare au în mod
normal cel puțin unul dintre instrumentele care completează clasificarea clinică. Deși este
imposibil ca orice instrument să abordeze evaluarea clinică, măsurătorile instrumentale au
avantaje reale. Acestea includ obiectivitat ea măsurării și răspunsul linear în detectarea
luminii, în timp ce ochiul este un detector logaritmic. Evaluarea instrumentală oferă astfel un
număr sau o serie de numere care descriu aspectul pielii. Deoarece rezultatele instrumentale
sunt în mod normal c ontinue, pot fi aplicate instrumente statistice de evaluare.
Măsurători de reflexie. Aceste instrumente se bazează pe diferența de absorbție a
melaninei și a hemoglobinei. Hemoglobina are o absorbție maximă a luminii la 560 nm
(lumină verde) și absoarbe puț ină lumină în gama de lungimi de undă de la 650 la 700 nm
(lumină roșie). Spectrul de absorbție al melaninei are un maxim la 450nm și un minim la 700
nm. Selectând cu atenție lungimea de undă a luminii incidente și măsurarea luminii reflectate,
respectiv c ontribuția hemoglobinei și melaninei la reflexia totală poate fi măsurat un indice

68
de eritem pentru hemoglobină și un indice de melanină pentru melanină. Instrumentele de
vârf care utilizează această metodă de măsurare includ DermaSpectrometer (Cortex
Tech nology, Hadsund, Danemarca), metode de eritem/ melanin (DiasStron Ltd., Andover,
U.K.), Mexameter® (Courage & Khazaka GmbH), UV -Optimize (Matik, Danemarca).

69
CONCLUZII

CONCLUZII GENERALE

Lista de lucrări publicate pe parcursul elab orarii tezei

70
BIBLIOGRAFIE
[1] Lew Mander ; Hung -Wen (Ben) Liu, Comprehensive Natural Products , vol. 3.
2009.
[2] J. Achan et al. , “Quinine, an old anti -malarial drug in a modern worl d: role in
the treatment of malaria.,” Malar. J. , vol. 10, p. 144, Jan. 2011.
[3] World Health Organization, “WHO guidelines for assessing quality of herbal
medicines with reference to contaminants and residues,” World Health , p. 118,
2007.
[4] D. da S. Tr entin et al. , “Potential of medicinal plants from the Brazilian semi –
arid region (Caatinga) against Staphylococcus epidermidis planktonic and
biofilm lifestyles,” J. Ethnopharmacol. , vol. 137, no. 1, pp. 327 –335, Sep.
2011.
[5] M. . Cowan, “Plant products as antimicrobial agents.,” Clin. Microbiol. Rev. ,
vol. 12, no. 4, pp. 564 –82, Oct. 1999.
[6] I. Viorica, Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie , II. Bucuresti: Editura
Medicală, 2001.
[7] R. Perumal Samy and P. Gopalakrishnakone, “Therapeutic Potential of Plants
as Anti -microbials for Drug Discovery.,” Evid. Based. Complement. Alternat.
Med. , vol. 7, no. 3, pp. 283 –94, Sep. 2010.
[8] J. S. Dambolena, A. G. López, J. M. Meriles, H. R. Rubinstein, and J. A.
Zygadlo, “Inhibitory effect of 10 natural phenolic c ompounds on Fusarium
verticillioides. A structure –property –activity relationship study,” Food
Control , vol. 28, no. 1, pp. 163 –170, Nov. 2012.
[9] A. Klančnik, S. S. Možina, and Q. Zhang, “Anti -Campylobacter activities and
resistance mechanisms of natural phenolic compounds in Campylobacter.,”
PLoS One , vol. 7, no. 12, p. e51800, Jan. 2012.
[10] K. L. Granger, R. S. Gallagher, E. P. Fuerst, and J. R. Alldredge, “Comparison
of seed phenolic extraction and assay methods,” Methods Ecol. Evol. , vol. 2,
no. 6, p p. 691 –698, Dec. 2011.
[11] D. L. . Mihăescu G., Chifiriuc M.C., Antibiotice și substante
chimioterapeutice antimicrobiene . Editura Academiei Romane, Bucuresti,
2007.
[12] A. Navas, G. Cobas, M. Talavera, J. A. Ayala, J. A. López, and J. L. Martínez,
“Expe rimental validation of Haldane’s hypothesis on the role of infection as
an evolutionary force for Metazoans.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , vol.
104, no. 34, pp. 13728 –31, Aug. 2007.
[13] J. L. Martinez et al. , “Functional role of bacterial multidrug e fflux pumps in
microbial natural ecosystems.,” FEMS Microbiol. Rev. , vol. 33, no. 2, pp. 430 –
49, Mar. 2009.
[14] J. Vila and S. M. Soto, “Salicylate increases the expression of marA and
reduces in vitro biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli b y
decreasing type 1 fimbriae expression.,” Virulence , vol. 3, no. 3, pp. 280 –5,
May 2012.
[15] O. Lomovskaya and W. Watkins, “Inhibition of efflux pumps as a novel
approach to combat drug resistance in bacteria.,” J. Mol. Microbiol.
Biotechnol. , vol. 3, no . 2, pp. 225 –36, Apr. 2001.
[16] W. Gu et al. , “Structural basis of enzymatic activity for the ferulic acid
decarboxylase (FADase) from Enterobacter sp. Px6 -4.,” PLoS One , vol. 6, no.
1, p. e16262, Jan. 2011.
[17] L. Barthelmebs, C. Diviès, and J. . Cavin, “Expression in Escherichia coli of
native and chimeric phenolic acid decarboxylases with modified enzymatic

71
activities and method for screening recombinant E. coli strains expressing
these enzymes.,” Appl. Environ. Microbiol. , vol. 67, no. 3, pp. 1063 –9, Mar.
2001.
[18] M. U. Amin, M. Khurram, B. Khattak, and J. Khan, “Antibiotic additive and
synergistic action of rutin, morin and quercetin against methicillin resistant
Staphylococcus aureus.,” BMC Complement. Altern. Med. , vol. 15, p. 59, Jan.
2015.
[19] J. D. Brooker, L. O. Donovan, I. Skene, and G. Sellick, “Mechanisms of tannin
resistance and detoxification in the rumen,” Proc. 8th Int. Symp. Microb.
Ecol. , pp. 1 –9, 1999.
[20] C. Engels, A. Schieber, and M. G. Gänzle, “Inhibitory spectra and modes of
antimicrobial action of gallotannins from mango kernels (Mangifera indica
L.).,” Appl. Environ. Microbiol. , vol. 77, no. 7, pp. 2215 –23, Apr. 2011.
[21] T. . T. Cushnie, B. Cushnie, and A. J. Lamb, “Alkaloids: an overview of their
antibacterial, antibiotic -enhancing and antivirulence activities.,” Int. J.
Antimicrob. Agents , vol. 44, no. 5, pp. 377 –86, Dec. 2014.
[22] M. I. Garvey and L. J. . Piddock, “The efflux pump inhibitor reserpine selects
multidrug -resistant Streptococcus pneumoniae strains that overex press the
ABC transporters PatA and PatB.,” Antimicrob. Agents Chemother. , vol. 52,
no. 5, pp. 1677 –85, May 2008.
[23] H. T. Richard G. Wax, Kim Lewis, Abigail A. Salyers, Bacterial Resistance to
Antimicrobials , vol. 21. CRC Press, 2001.
[24] M. R. Berenba um, “Chemical Mediation of Coevolution: Phylogenetic
Evidence for Apiaceae and Associates,” Ann. Missouri Bot. Gard. , vol. 88, no.
1, pp. 45 –59, 2001.
[25] R. E. Minto and B. J. Blacklock, “Biosynthesis and function of polyacetylenes
and allied natural pro ducts.,” Prog. Lipid Res. , vol. 47, no. 4, pp. 233 –306,
Jul. 2008.
[26] S. Yamazoe, K. Hasegawa, J. Ito, Y. Mikami, and H. Shigemori, “Hederyne A,
a new antimicrobial polyacetylene from galls of Hedera rhombea Bean.,” J.
Asian Nat. Prod. Res. , vol. 9, no. 6–8, pp. 537 –40, Jan. 2007.
[27] A. K. Patra, Dietary Phytochemicals and Microbes . Dordrecht: Springer
Netherlands, 2012.
[28] A. Estevez -Braun, R. Estevez -Reyes, L. . Moujir, A. . Ravelo, and A. .
Gonzalez, “Antibiotic activity and absolute configuation o f 8S -heptadeca –
2(Z),9(Z) -diene -4,6-diyne -1,8-diol from Bupleurum salicifolium.,” J. Nat.
Prod. , vol. 57, no. 8, pp. 1178 –82, Aug. 1994.
[29] C. . Hammer, K.A.; Carson, “Antibacterial and Antifungal Activities of
Essential Oils,” in Lipids and Essential Oil s as Antimicrobial Agents , H.
Thormar, Ed. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2011, pp. 256 –293.
[30] K. H. C. Baser and G. Buchbauer, Handbook of Essential Oils Science,
Technology, and Applications . 2010.
[31] A. Kunicka -Styczyńska, M. Sikora, and D. Kal emba, “Antimicrobial activity
of lavender, tea tree and lemon oils in cosmetic preservative systems,” J. Appl.
Microbiol. , vol. 107, no. 6, pp. 1903 –1911, 2009.
[32] C.-M. Saviuc, V. Drumea, L. Olariu, M. -C. Chifiriuc, E. Bezirtzoglou, and V.
Lazăr, “Essen tial oils with microbicidal and antibiofilm activity.,” Curr.
Pharm. Biotechnol. , vol. 16, no. 2, pp. 137 –51, Jan. 2015.
[33] R. Marmulla and J. Harder, “Microbial monoterpene transformations -a
review.,” Front. Microbiol. , vol. 5, p. 346, Jan. 2014.
[34] E. . Cole, R. . dos Santos, V. Lacerda Júnior, J. D. . Martins, S. . Greco, and

72
A. Cunha Neto, “Chemical composition of essential oil from ripe fruit of
Schinus terebinthifolius Raddi and evaluation of its activity against wild
strains of hospital origin.,” Braz. J. Microbiol. , vol. 45, no. 3, pp. 821 –8, Jan.
2014.
[35] P. S. X. Yap, B. C. Yiap, H. C. Ping, and S. H. E. Lim, “Essential oils, a new
horizon in combating bacterial antibiotic resistance.,” Open Microbiol. J. , vol.
8, pp. 6 –14, Jan. 2014.
[36] P. R. Murray, K. S. Rosenthal, and M. A. Pfaller, Medical Microbiology .
Elsevier Health Sciences, 2015.
[37] A. Stringaro et al. , “Effects of Mentha suaveolens Essential Oil Alone or in
Combination with Other Drugs in Candida albicans.,” Evid. Based.
Complem ent. Alternat. Med. , vol. 2014, p. 125904, Jan. 2014.
[38] A. O. Davis et al. , “Characterization of Staphylococcus aureus mutants
expressing reduced susceptibility to common house -cleaners,” J. Appl.
Microbiol. , vol. 98, no. 2, pp. 364 –372, 2005.
[39] J. . Gustafson, S. . Cox, Y. . Liew, S. . Wyllie, and J. . Warmington, “The
bacterial multiple antibiotic resistant (Mar) phenotype leads to increased
tolerance to tea tree oil.,” Pathology , vol. 33, no. 2, pp. 211 –5, May 2001.
[40] R. Becerril, C. Nerín, and R. Gómez -Lus, “Evaluation of bacterial resistance
to essential oils and antibiotics after exposure to oregano and cinnamon
essential oils.,” Foodborne Pathog. Dis. , vol. 9, no. 8, pp. 699 –705, Aug.
2012.
[41] W. T. Langeveld, E. J. . Veldhuizen, and S. A. Burt, “Synergy between
essential oil components and antibiotics: a review.,” Crit. Rev. Microbiol. , vol.
40, no. 1, pp. 76 –94, Feb. 2014.
[42] J. G. Hurdle, A. J. O’Neill, I. Chopra, and R. E. Lee, “Targeting bacterial
membrane function: an underexploited mechanism for treating persistent
infections.,” Nat. Rev. Microbiol. , vol. 9, no. 1, pp. 62 –75, Jan. 2011.
[43] W. C. Wimley and K. Hristova, “Antimicrobial peptides: successes, challenges
and unanswered questions.,” J. Membr. Biol. , vol. 239, no. 1 –2, pp. 27–34,
Jan. 2011.
[44] P. Méndez -Samperio, “Recent advances in the field of antimicrobial peptides
in inflammatory diseases.,” Adv. Biomed. Res. , vol. 2, p. 50, Jan. 2013.
[45] D. A. Phoenix, S. R. Dennison, and F. Harris, Antimicrobial Peptides .
Weinheim , Germany: Wiley -VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2013.
[46] A. Peschel, “How do bacteria resist human antimicrobial peptides?,” Trends
Microbiol. , vol. 10, no. 4, pp. 179 –86, Apr. 2002.
[47] R. Nawrot, J. Barylski, G. Nowicki, J. Broniarczyk, W. Buchwald, and A.
Goździcka -Józefiak, “Plant antimicrobial peptides.,” Folia Microbiol.
(Praha). , vol. 59, no. 3, pp. 181 –96, May 2014.
[48] T. Koprivnjak and A. Peschel, “Bacterial resistance mechanisms against host
defense peptides,” Cell. Mol. Life Sci. , vol. 68, no. 13, pp. 2243 –2254, May
2011.
[49] B. Mojsoska and H. Jenssen, “Peptides and Peptidomimetics for Antimicrobial
Drug Design,” Pharmaceuticals , vol. 8, no. 3, pp. 366 –415, Jul. 2015.
[50] M. Carmen Chifiriuc, “Contribution of Antimicrobial Peptides to the
Development of New and Efficient Antimicrobial Strategies,” Curr.
Proteomics , vol. 11, no. 2, Jun. 2016.
[51] W. . Peumans and E. . Van Damme, “Lectins as plant defense proteins.,” Plant
Physiol. , vol. 109, no. 2, pp. 347 –52, Oct. 1995.
[52] A. . Ingale and A . . Hivrale, “Plant as a plenteous reserve of lectin.,” Plant

73
Signal. Behav. , vol. 8, no. 12, p. e26595, Jan. 2013.
[53] C. Chemani et al. , “Role of LecA and LecB Lectins in Pseudomonas
aeruginosa -Induced Lung Injury and Effect of Carbohydrate Ligands,” Infect.
Immun. , vol. 77, no. 5, pp. 2065 –2075, Feb. 2009.
[54] B.-M. Ciubuca, C. -M. Saviuc, M. -C. Chifiriuc, and V. Lazar, “Microbial
resistance to natural compounds : challenges for developing novel alternatives
to antibiotics,” Curr. Org. Chem. , vol. 1, pp . 1–6, 2016.
[55] E. Ipek, H. Zeytinoglu, S. Okay, B. A. Tuylu, M. Kurkcuoglu, and K. H. C.
Baser, “Genotoxicity and antigenotoxicity of Origanum oil and carvacrol
evaluated by Ames Salmonella/microsomal test,” Food Chem. , vol. 93, no. 3,
pp. 551 –556, Dec. 2005.
[56] Gerasimos Franzios, Maria Mirotsou, Emmanouel Hatziapostolou, Jiri Kral,
and Zacharias G. Scouras, and P. Mavragani -Tsipidou*, “Insecticidal and
Genotoxic Activities of Mint Essential Oils,” 1997.
[57] G. Santana -Rios, G. A. Orner, A. Amantana , C. Provost, S. Y. Wu, and R. H.
Dashwood, “Potent antimutagenic activity of white tea in comparison with
green tea in the Salmonella assay.,” Mutat. Res. , vol. 495, no. 1 –2, pp. 61 –74,
Aug. 2001.
[58] S. Hoet, C. Stévigny, M. -F. Hérent, and J. Quetin -Leclercq,
“Antitrypanosomal Compounds from the Leaf Essential Oil of Strychnos
spinosa ,” Planta Med. , vol. 72, no. 05, pp. 480 –482, Feb. 2006.
[59] S. Pattnaik, V. R. Subramanyam, C. R. Kole, and S. Sahoo, “Antibacterial
activity of essential oils from Cymbop ogon: inter – and intra -specific
differences.,” Microbios , vol. 84, no. 341, pp. 239 –45, 1995.
[60] C. C. Tassou, E. H. Drosinos, and G. J. E. Nychas2, “Inhibition of Resident
Microbial Flora and Pathogen Inocula on Cold Fresh Fish Fillets in Olive Oil,
Oregano, and Lemon Juice under Modified Atmosphere or Air.”
[61] A. Ultee, M. H. J. Bennik, and R. Moezelaar, “The phenolic hydroxyl group of
carvacrol is essential for action against the food -borne pathogen Bacillus
cereus.,” Appl. Environ. Microbiol. , vol. 68, no. 4, pp. 1561 –8, Apr. 2002.
[62] G. A. de Azeredo, T. L. M. Stamford, P. C. Nunes, N. J. Gomes Neto, M. E. G.
de Oliveira, and E. L. de Souza, “Combined application of essential oils from
Origanum vulgare L. and Rosmarinus officinalis L. to inhibit b acteria and
autochthonous microflora associated with minimally processed vegetables,”
Food Res. Int. , vol. 44, no. 5, pp. 1541 –1548, Jun. 2011.
[63] R. Pei, F. Zhou, B. Ji, and J. Xu, “Evaluation of Combined Antibacterial
Effects of Eugenol, Cinnamaldehyde , Thymol, and Carvacrol against E. coli
with an Improved Method,” J. Food Sci. , vol. 74, no. 7, pp. M379 –M383, Sep.
2009.
[64] D. Kalemba and A. Kunicka, “Antibacterial and Antifungal Properties of
Essential Oils,” Curr. Med. Chem. , vol. 10, no. 10, pp. 813–829, May 2003.
[65] F. Bakkali, S. Averbeck, D. Averbeck, and M. Idaomar, “Biological effects of
essential oils -A review,” Food Chem. Toxicol. , vol. 46, pp. 446 –475, 2007.
[66] S. G. Griffin, S. G. Wyllie, J. L. Markham, and D. N. Leach, “The role of
structure and molecular properties of terpenoids in determining their
antimicrobial activity,” Flavour Fragr. J. , vol. 14, no. 5, pp. 322 –332, Sep.
1999.
[67] I. H. N. Bassolé and H. R. Juliani, “Essential Oils in Combination and Their
Antimicrobial Propert ies,” Molecules , vol. 17, no. 4, pp. 3989 –4006, Apr.
2012.
[68] D. Trombetta et al. , “Mechanisms of antibacterial action of three

74
monoterpenes.,” Antimicrob. Agents Chemother. , vol. 49, no. 6, pp. 2474 –8,
Jun. 2005.
[69] B. K. Tiwari, V. P. Valdramidis, C. P. O’ Donnell, K. Muthukumarappan, P.
Bourke, and P. J. Cullen, “Application of Natural Antimicrobials for Food
Preservation,” J. Agric. Food Chem. , vol. 57, no. 14, pp. 5987 –6000, Jul.
2009.
[70] H. Nikaido, “Prevention of drug access to bacterial target s: permeability
barriers and active efflux.,” Science , vol. 264, no. 5157, pp. 382 –8, Apr. 1994.
[71] M. Vaara, “Agents that increase the permeability of the outer membrane.,”
Microbiol. Rev. , vol. 56, no. 3, pp. 395 –411, Sep. 1992.
[72] H. J. Dorman and S . G. Deans, “Antimicrobial agents from plants:
antibacterial activity of plant volatile oils.,” J. Appl. Microbiol. , vol. 88, no. 2,
pp. 308 –16, Feb. 2000.
[73] F. Nazzaro, F. Fratianni, L. De Martino, R. Coppola, and V. De Feo, “Effect of
essential oils o n pathogenic bacteria,” Pharmaceuticals , vol. 6, no. 12, pp.
1451 –1474, 2013.
[74] A. Ben Arfa, S. Combes, L. Preziosi -Belloy, N. Gontard, and P. Chalier,
“Antimicrobial activity of carvacrol related to its chemical structure,” Lett.
Appl. Microbiol. , vol. 43, no. 2, pp. 149 –154, Aug. 2006.
[75] A. La Storia, D. Ercolini, F. Marinello, R. Di Pasqua, F. Villani, and G.
Mauriello, “Atomic force microscopy analysis shows surface structure changes
in carvacrol -treated bacterial cells,” Res. Microbiol. , vol. 162 , no. 2, pp. 164 –
172, Feb. 2011.
[76] M. Hyldgaard, T. Mygind, and R. L. Meyer, “Essential Oils in Food
Preservation: Mode of Action, Synergies, and Interactions with Food Matrix
Components,” Front. Microbiol. , vol. 3, p. 12, 2012.
[77] A. O. Gill and R. A . Holley, “Mechanisms of bactericidal action of
cinnamaldehyde against Listeria monocytogenes and of eugenol against L.
monocytogenes and Lactobacillus sakei.,” Appl. Environ. Microbiol. , vol. 70,
no. 10, pp. 5750 –5, Oct. 2004.
[78] S. Burt, “Essential oil s: their antibacterial properties and potential applications
in foods —a review,” Int. J. Food Microbiol. , vol. 94, no. 3, pp. 223 –253, Aug.
2004.
[79] L. De Martino, V. De Feo, and F. Nazzaro, “Chemical Composition and in
Vitro Antimicrobial and Mutagenic Activities of Seven Lamiaceae Essential
Oils,” Molecules , vol. 14, no. 10, pp. 4213 –4230, Oct. 2009.
[80] I. M. Helander et al. , “Characterization of the Action of Selected Essential Oil
Components on Gram -Negative Bacteria,” J. Agric. Food Chem. , 1998.
[81] A. O. Gill and R. A. Holley, “Disruption of Escherichia coli, Listeria
monocytogenes and Lactobacillus sakei cellular membranes by plant oil
aromatics,” Int. J. Food Microbiol. , vol. 108, no. 1, pp. 1 –9, Apr. 2006.
[82] J. W. Campbell and J. E. Cronan, “Bacterial Fatty Acid Biosynthesis: Targets
for Antibacterial Drug Discovery,” Annu. Rev. Microbiol. , vol. 55, no. 1, pp.
305–332, Oct. 2001.
[83] M. Turgis, J. Han, S. Caillet, and M. Lacroix, “Antimicrobial activity of
mustard essential oil against Esche richia coli O157:H7 and Salmonella typhi,”
Food Control , vol. 20, no. 12, pp. 1073 –1079, Dec. 2009.
[84] M. Oussalah, S. Caillet, L. Saucier, and M. Lacroix, “Antimicrobial effects of
selected plant essential oils on the growth of a Pseudomonas putida stra in
isolated from meat,” Meat Sci. , vol. 73, no. 2, pp. 236 –244, Jun. 2006.
[85] S. Carneiro, S. G. Villas -Bôas, E. C. Ferreira, and I. Rocha, “Metabolic

75
footprint analysis of recombinant Escherichia coli strains during fed -batch
fermentations.,” Mol. Biosy st., vol. 7, no. 3, pp. 899 –910, Mar. 2011.
[86] M. J. van der Werf, K. M. Overkamp, B. Muilwijk, L. Coulier, and T.
Hankemeier, “Microbial metabolomics: Toward a platform with full
metabolome coverage,” Anal. Biochem. , vol. 370, no. 1, pp. 17 –25, Nov. 200 7.
[87] G. Picone, L. Laghi, F. Gardini, R. Lanciotti, L. Siroli, and F. Capozzi,
“Evaluation of the effect of carvacrol on the Escherichia coli 555 metabolome
by using 1H -NMR spectroscopy,” Food Chem. , vol. 141, no. 4, pp. 4367 –
4374, Dec. 2013.
[88] U. E. N. C. for E. Assessment, “Biological activities of the essential oils and
methanol extract of tow cultivated mint species (Mentha longifolia and Mentha
pulegium) used in the Tunisian folkloric medicine,” Mar. 2009.
[89] N. Kalchayanand, P. Dunne, A. Sikes , and B. Ray, “Viability loss and
morphology change of foodborne pathogens following exposure to hydrostatic
pressures in the presence and absence of bacteriocins,” Int. J. Food Microbiol. ,
vol. 91, no. 1, pp. 91 –98, Feb. 2004.
[90] P. C. Braga and D. Ricc i, “Atomic force microscopy: application to
investigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to
cefodizime.,” Antimicrob. Agents Chemother. , vol. 42, no. 1, pp. 18 –22, Jan.
1998.
[91] B. L. Bassler, “Small Talk: Cell -to-Cell Communica tion in Bacteria,” Cell,
vol. 109, no. 4, pp. 421 –424, May 2002.
[92] A. A. Zaki, M. I. Shaaban, N. E. Hashish, M. A. Amer, and M. -F. Lahloub,
“Assessment of Anti -Quorum Sensing Activity for Some Ornamental and
Medicinal Plants Native to Egypt,” Sci. Pharm ., vol. 81, no. 1, pp. 251 –258,
2013.
[93] M. Á. Szabó et al. , “Inhibition of quorum -sensing signals by essential oils,”
Phyther. Res. , vol. 24, no. 5, pp. 782 –786, May 2010.
[94] M. S. A. Khan, M. Zahin, S. Hasan, F. M. Husain, and I. Ahmad, “Inhibition
of quorum sensing regulated bacterial functions by plant essential oils with
special reference to clove oil,” Lett. Appl. Microbiol. , vol. 49, no. 3, pp. 354 –
360, Sep. 2009.
[95] C. Niu, S. Afre, and E. S. Gilbert, “Subinhibitory concentrations of
cinnamald ehyde interfere with quorum sensing,” Lett. Appl. Microbiol. , vol.
43, no. 5, pp. 489 –494, Nov. 2006.
[96] G. Brackman, P. Cos, L. Maes, H. J. Nelis, and T. Coenye, “Quorum Sensing
Inhibitors Increase the Susceptibility of Bacterial Biofilms to Antibiotics In
Vitro and In Vivo,” Antimicrob. Agents Chemother. , vol. 55, no. 6, pp. 2655 –
2661, Jun. 2011.
[97] H. Thormar, Lipids and Essential Oils as Antimicrobial Agents . 2010.
[98] V. Lazar, “Quorum sensing in biofilms –how to destroy the bacterial citadels
or their cohesion/power?,” Anaerobe , vol. 17, no. 6, pp. 280 –5, Dec. 2011.
[99] M. Stavri, L. J. V. Piddock, and S. Gibbons, “Bacterial efflux pump inhibitors
from natural sources,” J. Antimicrob. Chemother. , vol. 59, no. 6, pp. 1247 –
1260, Jun. 2007.
[100] F. Van Bambeke, E. Balzi, and P. M. Tulkens, “Antibiotic efflux pumps,”
Biochem. Pharmacol. , vol. 60, no. 4, pp. 457 –70, Aug. 2000.
[101] O. Lomovskaya et al. , “Identification and Characterization of Inhibitors of
Multidrug Resistance Efflux Pumps in Pseudom onas aeruginosa: Novel Agents
for Combination Therapy,” Antimicrob. Agents Chemother. , vol. 45, no. 1, pp.
105–116, Jan. 2001.

76
[102] M. Askoura, W. Mattawa, T. Abujamel, and I. Taher, “Efflux pump inhibitors
(EPIs) as new antimicrobial agents against Pseud omonas aeruginosa ,” Libyan
J. Med. , vol. 6, no. 1, p. 5870, Jan. 2011.
[103] M. L. Nelson, “Modulation of Antibiotic Efflux in Bacteria,” Curr. Med.
Chem. -Anti-Infective Agents , vol. 1, no. 1, pp. 35 –54, 2002.
[104] Y. Hirakata et al. , “Efflux pump inhibi tors reduce the invasiveness of
Pseudomonas aeruginosa,” Int. J. Antimicrob. Agents , vol. 34, no. 4, pp. 343 –
346, Oct. 2009.
[105] S. Hemaiswarya, A. K. Kruthiventi, and M. Doble, “Synergism between
natural products and antibiotics against infectious disea ses,” Phytomedicine ,
vol. 15, no. 8, pp. 639 –652, Aug. 2008.
[106] V. Aparna, K. Dineshkumar, N. Mohanalakshmi, D. Velmurugan, and W.
Hopper, “Identification of natural compound inhibitors for multidrug efflux
pumps of Escherichia coli and Pseudomonas aeru ginosa using In Silico high –
throughput virtual screening and In Vitro validation,” PLoS One , vol. 9, no. 7,
2014.
[107] K. A. Klyachko, S. Schuldiner, and A. A. Neyfakh, “Mutations affecting
substrate specificity of the Bacillus subtilis multidrug transpor ter Bmr.,” J.
Bacteriol. , vol. 179, no. 7, pp. 2189 –93, Apr. 1997.
[108] R. Cantón and M. -I. Morosini, “Emergence and spread of antibiotic resistance
following exposure to antibiotics,” FEMS Microbiol. Rev. , vol. 35, no. 5, pp.
977–991, Sep. 2011.
[109] S. Gibbons, M. Oluwatuyi, N. C. Veitch, and A. I. Gray, “Bacterial resistance
modifying agents from Lycopus europaeus.,” Phytochemistry , vol. 62, no. 1,
pp. 83 –7, Jan. 2003.
[110] F. F. G. Rodrigues, J. G. M. Costa, and H. D. M. Coutinho, “Synergy effects
of the antibiotics gentamicin and the essential oil of Croton zehntneri,”
Phytomedicine , vol. 16, no. 11, pp. 1052 –1055, Nov. 2009.
[111] A. Rosato, C. Vitali, N. De Laurentis, D. Armenise, and M. Antonietta Milillo,
“Antibacterial effect of some essential o ils administered alone or in
combination with Norfloxacin,” Phytomedicine , vol. 14, no. 11, pp. 727 –732,
Nov. 2007.
[112] E. O. de Sousa, F. F. G. Rodrigues, A. R. Campos, S. G. Lima, and J. G. M. da
Costa, “Chemical composition and synergistic interaction between
aminoglycosides antibiotics and essential oil of Lantana montevidensis Briq.,”
Nat. Prod. Res. , vol. 27, no. 10, pp. 942 –945, May 2013.
[113] A. K. Pandey, P. Kumar, P. Singh, N. N. Tripathi, and V. K. Bajpai, “Essential
oils: Sources of antimicro bials and food preservatives,” Front. Microbiol. , vol.
7, no. JAN, pp. 1 –14, 2017.
[114] J. E. Inetianbor, J. M. Yakubu, and S. C. Ezeonu, “Effects of Food Additives
and Preservatives on Man – a Review,” Asian J. Sci. Technol. , vol. 6, no. 2, pp.
1118 –1135 , 2015.
[115] A. A. Smith, K. Seetaramaiah, R. Murali, and R. Manavalan, “Corresponding
Preservatives in Food Products -Review,” 2011.
[116] Z. Sharif and F. y J. Y. Mustapha, “Revisión de métodos de preservación y
conservantes naturales para extender la lo ngevidad de los alimentos,” Ing.
Química … , vol. 19, pp. 145 –153, 2017.
[117] H. A. Abdulmumeen, A. N. Risikat, and A. R. Sururah, “Food: Its
preservatives, additives and applications,” 2012.
[118] S. A. Hayek, R. Gyawali, and S. A. Ibrahim, “Antimicrobi al Natural
Products,” Formatex.Info , no. January, pp. 910 –921, 2013.

77
[119] R. G. Bitencourt, A. M. M. Possas, G. P. Camilloto, R. S. Cruz, C. G. Otoni,
and N. de F. F. Soares, “Antimicrobial and aromatic edible coating on fresh –
cut pineapple preservation,” Ciência Rural , vol. 44, no. 6, pp. 1119 –1125, Jun.
2014.
[120] N. Matan, “Antimicrobial activity of edible film incorporated with essential
oils to preserve dried fish (Decapterus maruadsi),” 2012.
[121] K. Nugboon and K. Intarapichet, “Antioxidant and an tibacterial activities of
Thai culinary herb and spice extracts, and application in pork meatballs,”
2015.
[122] S. Supapvanich, P. Prathaan, and R. Tepsorn, “Browning inhibition in fresh –
cut rose apple fruit cv. Taaptimjaan using konjac glucomannan coatin g
incorporated with pineapple fruit extract,” Postharvest Biol. Technol. , vol. 73,
pp. 46 –49, Nov. 2012.
[123] B. G. Hüsnü can Bașer, K., Handbook of Essential Oils. Science, Technology
and Applications . CRC Press Taylor & Francis Group, 2009.
[124] M. Dre ger and K. Wielgus, “Application of essential oils as natural cosmetic
preservatives,” Herba Pol. , vol. 59, no. 4, 2013.
[125] C. Lemini, R. Jaimez, M. E. Ávila, Y. Franco, F. Larrea, and A. E. Lemus, “In
vivo and in vitro estrogen bioactivities of alkyl p arabens,” Toxicol. Ind.
Health , vol. 19, no. 2 –6, pp. 69 –79, Mar. 2003.
[126] P. D. Darbre, A. Aljarrah, W. R. Miller, N. G. Coldham, M. J. Sauer, and G. S.
Pope, “Concentrations of parabens in human breast tumours,” J. Appl.
Toxicol. , vol. 24, no. 1, pp. 5–13, Jan. 2004.
[127] “Final amended report on the Safety Assessment of Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben, Isopropylparaben, Butylparaben,
Isobutylparaben and Benzylparaben as used in Cosmetics Products,” Int. J.
Toxicol. , vol. 27, pp. 1 –82, 2008 .
[128] C. T. Jong et al. , “Contact sensitivity to preservatives in the UK, 2004?2005:
results of multicentre study,” Contact Dermatitis , vol. 57, no. 3, pp. 165 –168,
Sep. 2007.
[129] I. Manou, L. Bouillard, M. J. Devleeschouwer, and a O. Barel, “Evaluati on of
the preservative properties of Thymus vulgaris essential oil in topically
applied formulations under a challenge test.,” J. Appl. Microbiol. , vol. 84, no.
3, pp. 368 –376, 1998.
[130] E. Pharmacopoeia, “5.1.3. Efficacy of antimicrobial preservation – 5.1.2.
Biological Indicators of Sterilisation,” Eur. Pharmacopoeia , pp. 447 –449,
2005.
[131] N. Y. O. Muyima, G. Zulu, T. Bhengu, and D. Popplewell, “The potential
application of some novel essential oils as natural cosmetic preservatives in an
aqueous cre am formulation,” Flavour Fragr. J. , vol. 17, no. 4, pp. 258 –266,
Jul. 2002.
[132] A. Nostro et al. , “Preservative properties of Calamintha officinalis essential
oil with and without EDTA.,” Lett. Appl. Microbiol. , vol. 35, no. 5, pp. 385 –9,
2002.
[133] A. M. Maccioni, C. Anchisi, A. Sanna, C. Sardu, and S. Dessi, “Preservative
systems containing essential oils in cosmetic products,” Int. J. Cosmet. Sci. ,
vol. 24, no. 1, pp. 53 –59, Feb. 2002.
[134] A. Herman, A. P. Herman, B. W. Domagalska, and A. Młynarczyk , “Essential
oils and herbal extracts as antimicrobial agents in cosmetic emulsion.,” Indian
J. Microbiol. , vol. 53, no. 2, pp. 232 –7, Jun. 2013.
[135] A. Yorgancioglu and E. E. Bayramoglu, “Production of cosmetic purpose

78
collagen containing antimicrobial emulsion with certain essential oils,” Ind.
Crops Prod. , vol. 44, pp. 378 –382, Jan. 2013.
[136] V. Patrone, R. Campana, E. Vittoria, and W. Baffone, “In Vitro Synergistic
Activities of Essential Oils and Surfactants in Combination with Cosmetic
Preservativ es Against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus,”
Curr. Microbiol. , vol. 60, no. 4, pp. 237 –241, Apr. 2010.
[137] C. L. Del Toro -Sánchez et al. , “Controlled release of antifungal volatiles of
thyme essential oil from β -cyclodextrin capsules,” J. Incl. Phenom. Macrocycl.
Chem. , vol. 67, no. 3 –4, pp. 431 –441, Aug. 2010.
[138] Á. Martín, S. Varona, A. Navarrete, and M. J. Cocero, “Encapsulation and Co –
Precipitation Processes with Supercritical Fluids: Applications with Essential
Oils,” Open Chem. E ng. J. , vol. 5, no. 1, pp. 31 –41, May 2014.
[139] A. Wattanasatcha, S. Rengpipat, and S. Wanichwecharungruang, “Thymol
nanospheres as an effective anti -bacterial agent,” Int. J. Pharm. , vol. 434, no.
1–2, pp. 360 –365, Sep. 2012.