96Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013 [609540]

96Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI ÎN EV ALUAREA
POTENȚIALULUI DE REZISTENȚĂ A
FLORII-SOARELUI LA MANA
Șestacova Tatiana
Centrul universitar Biologie Moleculară,
Universitatea Academiei de Științe a Moldovei
Rezumat
Markerii moleculari și selecția asistată de markeri prezintă instrumente efi ciente de
selectare a genotipurilor cu potențial de rezistență, în scopul utilizării acestora în di-
verse programe de ameliorare, care vizează rezistența la patogeni. Articolul include date
privindscreening -ul molecular al genei Pl1 – o genă de rezistență majoră, care conferă
rezistența la mană (rasa 100). Aplicarea tehnicii CAPS pentru analiza locusului Ha-4W2
a demonstrat prezența fragmentului asociat cu rezistența la 36 genotipuri din cele 74
studiate.
Cuvinte-cheie: genaPl1 –screening molecular – fl oarea-soarelui – mana – rezistența.
Depus la redacție 30 aprilie 2013
–––––––––––––––––––––––––––––––––––
Adresă pentru corespondență: Șestacova Tatiana, Universitatea Academiei de
Științe a Moldovei, str. Academiei 3/2, MD 2028 Chișinău, Republica Moldova;
E-mail: [anonimizat]; tel. (+37322) 737431.
Introducere
Rezistența fl orii-soarelui la mană este specifi că, întrucît se manifestă prin
interacțiuni clasice „genă-pentru-genă”, care au fost descrise de Flor (1956) [4]. Genele
de rezistență la mana Plsunt gene majore, dominante, organizate în cadrul genomului
în clustere sau prezente separat [8].
Evoluția și apariția raselor noi de mană Plasmopara halstedii F. Berl et de Toni,
datorită variabilității patogenului și presiunii selective, determină utilizarea genotipurilor
rezistente și prelucrarea semințelor cu fungicide. Totuși, una dintre cele mai efi ciente
metode de control și combatere a patogenului se consideră a fi obținerea genotipurilor
cu un nivel înalt de rezistență specifi că, asigurată de gene Pl.
Ameliorarea privind rezistența la P. halstedii include utilizarea diferitor surse ge-
netice și poate fi accelerată prin aplicarea metodelor de selecție asistată de markeri
(Marker-assistedselection – MAS ). Piramidizarea genelor pentru rezistența la mană
prezintă o tehnologie destul de efi cientă în ameliorarea fl orii-soarelui, însă utilizarea
acestei metode este limitată din cauza numărului crescător al isolatelor patogenului și
difi cultatea distincției între genele Pl, care deseori manifestă o reacție similară la mai
multe rase [2].Genetica, Biologia moleculară și Ameliorarea

97Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
Pînă în prezent se cunosc 36 rase ale patogenului și au fost descrise 18 gene (Pl)
de rezistență față de acest pathogen [6, 7]. Unele surse de rezistența au fost studiate și
caracterizate din punct de vedere genetic, însă doar un număr limitat de loci ( Pl1, Pl2,
Pl5, Pl6, Pl7, Pl8 ș.a.) a fost asociat cu markeri moleculari [8]. Astfel, pentru selecția
asistată de markeri sunt recomandați markerii CAPS pentru gena Pl1[5],SCAR pentru
genaPl2 [2], markeri STS pentru locusul Pl5/Pl8 [10], markerii STS și CAPS pentru
genaPl6 [1, 9] etc.
În contextul celor expuse, scopul cercetărilor a constat în stabilirea prezenței/
absenței genei Pl1 la 74 genotipuri investigate, utilizînd markerul CAPS
pentru gena Pl1.
Materiale și metode de cercetare
Pentru efectuarea screening -ului molecular au fost utilizate 74 genotipuri de fl oar-
ea-soarelui, care includ linii materne (ASC), linii paterne (Rf), hibrizi F1 comerciali și
experimentali și linii de perspectivă. Materialul semincier a fost oferit cu amabilitate de
către compania AMG „Magroselect”.
Extragerea ADN-ului s-a efectuat din plantule etiolate, utilizînd CTAB după proto-
colul standart cu unele modifi cări [3]. Pentru determinarea prezenței genei Pl1în geno-
tipurile investigate a fost utlizat markerul CAPS linkat cu genă Pl1(fi g. 1).
Figura 1. Harta genetică pentru grupul de
linkaj 8 a fl orii-soarelui ( Helianthus annuus
L.) elaborată în urma analizei descendenților
HA370 × HA372 F2. Harta include locusul
Pl1 de rezistența la rasa 100 (rasa 1) mana ( P.
halstedii (Farl.) Berl. & de Toni) și markeri
RFLP, sau CAPS pentru candidați de gene de
rezistență (loci cu prefi xul HR), și cartați an-
terior RFLP markeri (loci cu prefi xul ZVG și
UB) [5].
Amplifi carea locusului Ha-4W2 cu primeri specifi ci s-a realizat în volum de 20
μl a mediului de reacție: tampon 1x, dNTP 200 μM, MgCl22,5 mM, 1,0 U DreamTaq
Polimerase ( Fermentas ), 0,3 μM de fi ecare primer, 50 ng ADN. Pentru reacția PCR s-a
folosit programul: 3 min – 95° C; 40 de cicluri – 30 sec – 94° C, 30 sec – 53° C, 45 sec –
72° C; 3 min – 72° C și GeneAmp® PCR System 9700 ( Applied Biosystems ). Restricția
produsului de amplifi care cu enzima TasI (Tsp509I) ( Fermentas ) a fost efectuată con-
form recomandărilor producătorului (timp de incubare 120 min la 65° C).Genetica, Biologia moleculară și Ameliorarea

98Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
Vizualizarea produșilor de amplifi care s-a realizat în gel de agaroză de 1 % în soluție
tampon TAE (Tris-acetat EDTA) și a fragmentelor restricționate în gel de poliacrilamidă
de 8 % în soluție tampon TBE (Tris-borat EDTA). Masa moleculară a fragmentelor s-a
stabilit în baza markerului GeneRulerTM Plus DNA Ladder ( Fermentas ).
Rezultate și discuții
GenaPl1 este prima gena de rezistență la mana, descoperită de Vrânceanu (1970)
în linia consangvinizată AD-66 obținută la Fundulea [12, 13]. Actualmente, pentru
identifi carea prezenței genei Pl1 sunt disponibili mai mulți markeri moleculari, inclu-
siv markerul CAPS pentru locusul Ha-4W2 linkat cu gena Pl1 [5] și markerii SSR
(ORS1043 și ORS166) [11].
Screeening -ul molecular al rezistenței față de mana (rasa 100) a 74 genotipuri de
fl oarea-soarelui a demonstrat prezența fragmentului de 363 pb la toate genotipurile stu-
diate după amplifi carea cu primeri specifi ci pentru locusul Ha-4W2 (fi g. 2).
Figura 2. Vizualizarea
produsului de amplifi care a lo-
cusului Ha-4W2 cu primeri spe-
cifi ci (363 pb). M – marker; A –
genotipuri F1, Rf, ASC și FS.
Restricția ulterioară a ampliconului cu enzima TasI (Tsp509I) a generat fragmente
de 88 pb, 93 pb, 188 pb și 276 pb (fi g. 3), rezultate care corespund cu datele obținute
de către alți cercetători [5]. Astfel, combinația de trei fragmente 88, 93 și 188 pb a
fost asociată de către Gedil și colaboratorii cu susceptibilitatea la rasa 100 de mana
fl orii-soarelui și prezența a patru fragmente 88, 93, 188 și 276 pb cu rezistența. Lini-
ile susceptibile s-au caracterizat prin lipsa fragmentului de 276 pb, fi indu-i atribuită
semnifi cația de marker dominant [5].
Figura 3. Restricția produsului
de amplifi care a locusului Ha-
4W2 cu Tas509I. S – susceptibil;
R – rezistent.
În cadrul cercetărilor noastre, după restricție, fragmentul de 276 pb (tabelul 1;
fi g. 3; 4) a fost stabilit doar pentru 36 din cele 74 genotipuri studiate, indicând astfel
rezistența acestora la mană.
Ampliconul de 276 pb, care indică rezistența la rasa 100 a manei, a fost identifi cat
la 14 hibrizi F1 comerciali și experimentali incluși în analiză. Doar în cazul hibridu-
lui Drofa F1 nu s-a detectat prezența acestui fragment. Ampliconul așteptat a fost pus
în evidența la opt dintre zece genotipuri paterne (Rf) și la patru (LC 40; LC SW 38;
LC 391; LC 075/1) dintre cele 18 linii cu androsterilitate citoplasmatică. În cazul celor
cinci linii isogene (după gena orfH522) fragmentul de 276 pb nu s-a constatat. La liniile
de perspectivă prezența acestuia a fost identifi cat în 11 din cele 27 genotipuri analizate
(tabelul 1, fi g. 4).Genetica, Biologia moleculară și Ameliorarea

99Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
Figura 4. Analiza CAPS
a ampliconilor obținuți cu
primeri specifi ci pentru lo-
cusul Ha-4W2 lincat cu gena
Pl1.M- marker; 1-LC 40 ASC
x LC Raus Rf; 2-Drofa F1;
3-Drofa ASC x LC Raus Rf;
4-Drofa ASC x LC 637 Rf;
5-Drofa ASC x LC 7 Rf; 6-LC
SW 38 ASC x LC 637 Rf; 7-LC
SW 38 ASC x LC 4 Rf; 8-Dro-
fa ASC x LC 39 Rf; 9-Xenia
ASC x LC 39 Rf; 10- Xenia
F1; 11-LC 40 ASC x Xenia Rf;
12-Favorit F1; 13-Olea F1; 14-
Oxana F1; 15-Drofa Rf; 16-LC
Raus Rf; 17-LC 637 Rf; 18-LC
7 Rf; 19-LC 39 Rf; 20-LC 583
Rf; 21-LC 044 Rf; 22-LC 43
Rf; 23-LC 41 Rf; 24-LC Cium
Rf; 25-LC 42 ASC; 26- Drofa
ASC; 27-LC 40 ASC; 28-LC
SW 38 ASC; 29-LC 391A ASC;
30-Xenia ASC; 31-LC 075/1
ASC; 32-LC 075/2 ASC; 33-36
– ASC 1 – ASC 4; 37-42 – ASC
6 – ASC 11; 43-20A; 44-20B;
45-393A; 46-058A; 47-058B;
48-74 – FS1-FS27.
Astfel, aproximativ 93,33 % dintre hibrizii F1, 80,0 % din linii Rf, 22,22 % din linii
ASC și 40,74 % din linii de perspectivă analizate posedă fragmentul asociat cu gena
Pl1 de rezistență la mana. Hibrizii F1 și liniile paterne Rf au manifestat un potențial de
rezistență mai înalt decât liniile materne.
Tabelul 1 . Repartizarea genotipurilor în funcție de prezența și absența markerului
asociat cu gena de rezistență Pl1.
Genotipuri
incluse în
analizăRezistente Susceptibile
Hibrizii F1LC 40 ASC x LC Raus Rf; Drofa ASC x LC Raus
Rf; Drofa ASC x LC 637 Rf; Drofa ASC x LC 7
Rf; LC SW 38 ASC x LC 637 Rf; LC SW 38 ASC
x LC 4 Rf; Drofa ASC x LC 39 Rf; Xenia ASC
x LC 39 Rf; Xenia F1; LC 40 ASC x Xenia Rf;
Favorit F1; Olea F1; Oxana F1;Drofa F1
Linii RfLC Raus; LC 637; LC 7; LC 39; LC 583; LC 43;
LC 41; LC Cium;Drofa; LC 044Genetica, Biologia moleculară și Ameliorarea

100Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
Tabelul 1. (Continuare).
Linii ASC LC 40; LC SW 38; LC 391A; LC 075/1;Drofa; LC 42; Xenia; LC 075/2;
ASC 1; ASC 2; ASC 3; ASC 4;
ASC 6; ASC 7; ASC 8; ASC 9;
ASC 10; ASC 11;
Linii isogene 20A; 20B; 393A; 058A; 058B;
Linii de
perspectivăFS 9; FS 11; FS 12; FS 14 – FS 18; FS 21; FS 25;
FS 26;FS1-FS 8; FS10; FS 13; FS 19;
FS 20; FS 22 – FS 24; FS 27.
36 genotipuri 38 genotipuri
Datele obținute pot fi utile la etapa incipientă de selectare a liniilor parentale în amel-
iorarea fl orii-soarelui pentru rezistență, oferind posibilitatea de aplicare a piramidizării
genelor pentru obținerea hibrizilor rezistenți la mană.
Concluzii
Screening -ul genei Pl1 prin utilizarea markerului molecular CAPS a demonstrat
prezența fragmentului asociat cu rezistența la 36 genotipuri din 74 incluse în cercetare.
Datele respective pot fi utilizate de către amelioratori pentru selectarea formelor paren-
tale de perspectivă în ameliorarea fl orii-soarelui pentru rezistență la mana.
Cercetările au fost realizate în cadrul proiectului instituțional 11.817.04.19F Aspecte
funcționale și genetico-moleculare ale genomului la floarea-soarelui ( Helianthus an-
nuus L.). Autorul aduce mulțumiri conducătorului științifi c acad. Maria Duca și conf.
univ. Angela Port pentru sugestiile valoroase în realizarea studiului.
Bibliografi e
Bouzidi M.F., Badaoui S., Cambon F. et al.1. Molecular analysis of a major locus for
resistance to downy mildew in sunfl ower with specifi c PCR-based markers. // TAG, 2002, vol.
104, p. 592–560.
Brahm L., Röcher T., Friedt W.2. PCR-based markers facilitating marker assisted selec-
tion in sunfl ower for resistance to downy mildew. // Crop Sci., 2000, vol. 40, p. 676–682.
Doyle J., Doyle J.3. Isolation of plant DNA from fresh tissue. // Focus, 1990, vol. 12,
p.13–15.
Flor H.4. The current status of the gene-for-gene concept. // Annu Rev Phytopathol,
1971, vol. 9, p. 275−296.
Gedil M.A., Slabaugh M.B., Berry S. et al.5. Candidate disease resistance genes in sun-
fl ower cloned using conserved nucleotide binding site motifs: genetic mapping and linkage to
downy mildew resistance gene Pl1. // Genome, 2001, vol. 44, p. 205–212.
Gulya T.J.6. Distribution of Plasmopara halstedii races from sunfl ower around the
world. // In: Advances in Downy Mildew Research, Palacky University and JOLA Publishers,
2007, vol. 3, p. 121–134.
Molinero-Ruiz M.L., Melero-Vara J.M., Dominguez J.7. Inheritance of resistance to two
races of sunfl ower downy mildew ( Plasmopara halstedii ) in twoHelianthus annuus L. lines. //
Euphytica, 2003, vol. 131, p. 47–51.
Mulpuri S., Liu Z., Feng J. et al.8. Inheritance and molecular mapping of a downy mil-
dew resistance gene, Pl13 in cultivated sunfl ower ( Helianthus annuus L.). // TAG, 2009, vol.
119, p. 795–803.
Panković T.D., Radovanović T.N., Jocić T.S. et al.9. Development of co-dominant ampli-
fi ed polymorphic sequence markers for resistance of sunfl ower to downy mildew race 730. //
Plant Breed., 2007, vol. 126, p. 440–444.Genetica, Biologia moleculară și Ameliorarea

101Buletinul AȘM. Științele vieții. Nr. 1(319) 2013
Radwan O., Bouzidi M. F., Nicolas P. and Mouzeyar S.10. Development of PCR markers
for thePl5/Pl8 locus for resistance to Plasmopara halstedii in sunfl ower Helianthus annuus L.
from complete CC-NBS-LRR sequences. // T AG, 2004, vol. 109, p. 176–185.
Slabaugh M.B., Yu J.K., Tang S. et al.11. Haplotyping and mapping a large cluster of
downy mildew resistance gene candidates in sunfl ower using multilocus intron fragment length
polymorphisms. // Plant Biotechnol. J., 2003, vol. 1, p. 167–185.
Vrânceanu V., Stoenescu F.12. Immunity to sunfl ower downy mildew due to a single
dominant gene. // Probleme Agric., 1970, vol. 22, p.34–40.
Vrânceanu A.13. Floarea-soarelui hibridă. // București, Ceres, 2000. 520 p.Zoologia