Deparatmentul de Biochimie si Farmacologie DOCTORAND : ȘCHIOPU C. CRISTIAN CĂTĂLIN TEZĂ DE DOCTORAT METODE GLICOMICE MODERNE DE DEPISTARE ȘI ANALIZĂ… [609071]

I
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
“VICTOR BABE Ș” DIN TIMIȘOARA
MEDICINĂ GENERALĂ
Deparatmentul de Biochimie si Farmacologie

DOCTORAND: [anonimizat] 2 0 1 7

II

III
CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. …………………………. XVI
PARTEA GENERALĂ ………………………….. ………………………….. ……………………. 1
1. ASPECTE BIOMEDICALE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ ………………………….. …………. 1
1.1. CELULARITATE ȘI TUMORIGENEZA ………………………….. ………………………….. ….. 1
1.2. TUMORI BENIGNE ALE CREIERULUI ………………………….. ………………………….. …. 7
1.2.1. EPIDEMIOLOGIE ………………………….. ………………………….. ………………………. 8
1.2.2. CLASIFICARE ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 9
1.3. METASTAZE CEREBRALE ………………………….. ………………………….. ……………… 10
2. ASPECTE BIOCHIMICE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ ………………………….. ………….. 12
2.1. SPECTROMETRIA DE MASĂ ………………………….. ………………………….. ………….. 12
2.2 LIPIDE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 13
2.3. GANGLIOZIDE ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 14
2.3.1. INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ……………………….. 14
2.3.2. STRUCTURA GANGLIOZIDELOR ………………………….. ………………………….. ….. 15
2.3.3. NOMENCLATURA GANGLIOZIDELOR ………………………….. ……………………….. 20
2.3.3.1. Nomenclatura ionilor fragment folosită pentru a determinarea secvența
gangliozidică ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 21
2.3.4. LOCALIZAREA GANGLIOZIDELOR ÎN ORGANISM ………………………….. …………. 23
2.3.5. ANALIZA GANGLIOZIDELOR ………………………….. ………………………….. ………. 24
2.3.6. BIOSINTEZA GANGLIOZIDELOR ………………………….. ………………………….. ….. 25
2.3.6.1. Seria Gala ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 27
2.3.6.2. Gangliozide derivate din glucozilceramidă ………………………….. ……………… 28
2.3.7. DEGRADAREA GANGLIOZIDELOR ………………………….. ………………………….. .. 30
2.3.8. PATOBIOCHIMIE ………………………….. ………………………….. …………………….. 32
2.3.8 .1. Aspecte funcționale ………………………….. ………………………….. ……………… 33
2.4. PROTEINE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 36
PARTEA SPECIFIC Ă ………………………….. ………………………….. …………………… 37
3. MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………… 37
3.1. REACTIVI ȘI MATERIALE DE LABORATOR ………………………….. ……………………… 37

IV
3.2. SELECTAREA ȘI DESCRIEREA MATERIALULUI DE LUCRU. ANALIZA AMESTECURILOR
COMPLEXE DE GANGLIOZIDE EXTRASE DIN ȚESUT CEREBRAL ………………………….. … 38
3.3. PLATFORME ANALITICE UTILIZATE ………………………….. ………………………….. … 39
3.3.1. SPECTROMETRU L DE MASĂ NANOESI CUPLAT CU ROBOTUL NANOMATE
PENTRU INFUZARE ȘI IONIZARE AUTOMATĂ ………………………….. …………………….. 39
3.3.2. SPECTROMETRUL DE MASĂ HIBRID QUADRUPOL E TIME -OF-FLIGHT -QTOF ….. 42
3.3.3. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN CIOCNIRE (COLLISION INDUCED DISSOCIATION -CID)
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………. 44
3.3.4. DISOCIEREA INDUSĂ PRIN TRANSFER DE ELECTRONI (ELECTRON TRANSFER
DISSOCIATION – ETD) ………………………….. ………………………….. ………………………. 44
3.4. PLATFORM E INFORMATICE ………………………….. ………………………….. …………. 45
4. REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………….. ………………………….. …………………. 47
4.1.STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL HEMANGIOMULUI CEREBRAL
COMPARATIV CU ȚESUTUL CEREBRAL SĂNĂTOS, DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL,
PRIN CHIP NANOESI HCT MS ………………………….. ………………………….. ……………… 47
4.1.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI ………………………….. ………….. 47
4.1.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE ………………………….. ………………………….. ……….. 48
4.1.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE
DE ȚESUT CEREBRAL ………………………….. ………………………….. ……………………….. 49
4.1.4. SCREENINGUL MS2 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFIC ATE DIN PROBELE
DE ȚESUT CEREBRAL ………………………….. ………………………….. ……………………….. 56
4.1.5. CONCLUZII DE ETAPĂ ………………………….. ………………………….. ………………. 60
4.2. STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL MENINGIOMULUI CEREBRAL DIN PUNCT
DE VEDERE STRUCTURAL, PRIN CHIP NANOESI QTOF MS………………………….. ………. 61
4.2.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI ………………………….. ………….. 61
4.2.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE ………………………….. ………………………….. ……….. 62
4.2.3. SCREENINGUL MS A L GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE
DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM ………………………….. ………………………….. …. 65
4.2.4. SCREENINGUL MS/MS AL GANGLIOZIDELOR EX TRASE ȘI PURIFICATE DIN
PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM ………………………….. …………………. 68
4.2.4. CONCLUZII DE ETAPĂ ………………………….. ………………………….. ………………. 73
4.3. STUDIUL PROFILULUI GANGLIOZIDIC AL METASTAZEI CEREBRALE A
ADENOCARCINOMULUI PULMONAR, COMPARATIV CU ȚESUTUL CEREBRAL SĂNĂTOS,
DIN PUNCT DE VEDERE STRU CTURAL PRIN CHIP NANOESI QTOF MS ……………………. 75
4.3.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI ………………………….. ………….. 75
4.3.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE ………………………….. ………………………….. ……….. 76

V
4.3.3. SCREENINGUL MS1 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI PURIFICATE DIN PROBELE
DE ȚESUT CEREBRAL ………………………….. ………………………….. ……………………….. 79
4.3.4. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI GD3 (D 18:1/18:0) ASOCIATĂ CU METASTAZA
CEREBRALĂ A ADENOCARCINOMULUI PULMONAR ………………………….. ……………. 90
4.3.5. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI FUC -GM1 (D18:1/18: 0) DIN PROBA DE ȚESUT
CEREBRAL SĂNĂTOS ………………………….. ………………………….. ……………………….. 92
4.3.6. CONCLUZII DE ETAPĂ ………………………….. ………………………….. ………………. 94
4.4. SOFTWARE ORIGINAL GANGLIOBASE DE IDNTRIFICARE A GANAGLIOZIDELOR
OBȚINUTE PRIN SCREENING -UL MS ………………………….. ………………………….. ……. 96
4.5. STUDIU PILOT PENTRU TESTAREA FEZABILITĂȚII METODELOR DE SPECTROMETRIE
DE MASĂ DEZVOLTATE PENTRU STUDIUL INTERACȚIUNILOR FUNCȚIONALE PROTEINE –
GLICOCONJUGAȚI ………………………….. ………………………….. …………………………. 102
4.5.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI ………………………….. ………… 102
4.5.2. REACTIVI ȘI MATERIALE ………………………….. ………………………….. …………. 103
4.5.3. TESTE DE INTERACȚIUNE ALE β -LG-Glc 6………………………….. ………………….. 104
4.5.3.1. Interacțiunea β -LG-Glc 6 în acetat de amoniu/acid formic …………………….. 105
4.5.3.2. Interacțiunea β -LG-Glc 6 în apă ………………………….. ………………………….. . 110
4.5.4. CONCLU ZII DE ETAPĂ ………………………….. ………………………….. …………….. 111
5. CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚII PERSONALE ………………………….. ……………………… 114
BIBIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 119
ANEXE ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. I

VI
Lista lucrărilor științifice
I. Articole publicate „în extenso” în reviste de specialitate

1. Robu AC, Vukelić Ž, Schiopu C , Capitan F, Zamfir AD. Mass spectrometry
of gangliosides in extracranial tumors: Application to adrenal neuroblasto ma.
Analytical biochemistry. 2016 Sep 15;509:1 -1. Factor de impact (2016): 2,243;
Număr de citări : 2
2. Capitan F, Robu AC, Schiopu C , Ilie C, Chait BT, Przybylski M, Zamfir AD.
β-Lactoglobulin detected in human milk forms noncovalent complexes with
maltoo ligosaccharides as revealed by chip -nanoelectrospray high -resolution
tandem mass spectrometry. Amino acids. 2015 Nov 1;47(11):2399 -407. Factor
de impact (2015): 3,196
3. Schiopu C , Vukelić Ž, Capitan F, Kalanj ‐Bognar S, Sisu E, Zamfir AD.
Chip‐nanoelectro spray quadrupole time ‐of‐flight tandem mass spectrometry of
meningioma gangliosides: A preliminary study. Electrophoresis. 2012 Jul
1;33(12):1778 -86. Factor de impact (2012): 3.261 ;
Număr de citări : 12
4. Zamfir AD, Serb A, Vukeli Ž, Flangea C, Schiopu C , Fabris D, Kalanj –
Bognar S, Capitan F, Sisu E. Assessment of the molecular expression and
structure of gangliosides in brain metastasis of lung adenocarcinoma by an
advanced approach based on fully automated chip -nanoelectrospray mass
spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2011
Dec 1;22(12):2145 -59. Factor de impact (2011): 4,002 ;
Număr de citări : 23
5. Schiopu C , Flangea C, Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Kalanj -Bognar S, Sisu
E, Przybylski M, Zamfir AD. Determination of ganglioside composition and
structure in human brain hemangioma by chip -based nanoelectrospray
ionization tandem m ass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry.
2009 Dec 1;395(8):2465 -77. Factor de impact (2009): 3.48;
Număr de citări : 28

VII
II. Lucrări prezentate la conferințe științifice naționale și internaționale

1. Robu AC, Capitan F, Schiopu C , Chait BT, Zamfir AD. Assessment of the
noncovalent interaction between β -lactoglobulin detected in human milk and
maltooligosaccharides by chip -nanoelectrospray high resolution tandem mass
spectrometry. 3rd Middle Eastern and Mediterranean Sea Region Countr ies
Mass Spectrometry Conference MED MS III, June 28th – July 2nd 2015,
Athens, Greece, Book of abstracts P3.08 pg.7

2. Pascariu M, Gruia A, Medeleanu M, Božin L, Șchiopu C, Șișu E. Anchimeric
Assistance in Mass Spectrometry Fragmentation of Long Chain
Glycoderivatives , Proceedings of The 20th International Symposium on
Analytical and Environmental Problems, 22 septembrie 2014, Szeged,
Ungaria, pag. 63 -66;

3. Serb AF, Vukelic Z, Flangea C, Schiopu C, Sisu E, Zamfir AD –
Investigation of Oligosaccharides fr om Biological Matrices Using Modern Mass
Spectrometric Methods – A Preliminary Study – Zilele Academice Timisene, ed.
XIII- Noi tendinte si strategii în chimia materialelor avansate cu relevantă în
sisteme biologice, tehnică si protectia mediului 13 -14 iunie 2013, Timisoara,
Romania

4. C.Schiopu ,F.Capitan,Z.Vukelic,E .Sisu,A.Zamfir – Deciphering the
composition and structure of glicolipids in human meningioma by advanced
mass spextrometry -Zilele Academice Timisene, ed. XIII -Sectiunea medicina,
23 Mai,2013,Timisoara,Romania

5. Flangea C, Schiopu C , Capitan F, Mosoarca C, Manea M, Sisu E, Zamfir A.
A Novel Platform for Top -Down Proteomics: Chip -Based Nanoelectrospray
Combined with Electron Transfer Dissociation Mass Spectrometry. Poster
Presentation, Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and
German Mass S pectrometry Society -2012, Boob of abstracts ISBN 978 -83-
7712 -064-4, pag.240, 4 -7 March 2012, Poznan, Poland

6. Schiopu C , Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Sisu E, Zamfir A Molecular
Expression and Structure of Gangliosides in Brain Metastasisof Lung
Adenocar cinoma by NanoMate -QTOF MS and MS/MS. Poster Presentation,
Joint Conference of Polish Mass Spectrometry Society and German Mass
Spectrometry Society -2012, Boob of abstracts ISBN 978 -83-7712 -064-4,
pag.240, 4 -7 March 2012, Poznan, Poland

VIII
III. Referate d e cercetare științifică prezentate pe parcursul doctoratului

Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al hemangiomului cerebral
comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural, prin
chip nanoESI HCT MS

Șchiopu C. Studiul profilul ui gangliozidic al meningiomului cerebral din punct
de vedere structural, prin chip nanoESI QTOF MS

Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al metastazei cerebrale a
adenocarcinomului pulmonar, comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din
punct de veder e structural prin chip nanoESI QTOF MS

IX
Lista de abrevieri:

Ac – acetil/acetilare
ADN – acid dezoxiribonucleic
ARN – acid ribonucleic
Cer – ceramidă
CFH – cortex frontal cu hemangiom
CFN – cortex frontal normal (sănătos)
CID – disocieri induse prin ciocnire (collision -induced dissociation)
ECD – disocieri prin captură electronică (electron capture dissociation)
ESI – ionizare prin electropulverizare (electrospray ionization)
ETD – disocieri prin transfer de electroni (electron tr ansfer dissociation)
Fuc – fucoză/fucozilare
Gal – galactoză
Gal – galactoză
GalNAc – N-acetilgalactozamină
Glc; G – glucoză
Glc 6 – maltohexaoză
GSL – glicosfingolipidele
HCT MS – spectrometru de masă cu capcană ionică de mare capacitate (high
capacity ion trap mass spectrometer)
HPTLC – cromatografia în strat subțire de înaltă performanță (high
performance thin layer chromatography)
LM-HM – Low Mass -High Mass (domeniul de rezoluție)
m/z – raportul între masa moleculară și sarcina electrică a ionului
MetaADK – metastaza adenocarcinomului
MS – spectrometrie/spectrometru de masă (mass spectrometry/spectrometer)
MS/MS – spectrometrie de masă în tandem
MSn – fragmentare în stagii multiple
NanoESI – ionizare prin nanoelectropulverizare (nanoelectrospray)
Neu5 Ac – acid N-acetil neuraminic
QTOF MS – spectrometru/spectrometrie de masă cuadrupolar cu timp de zbor
(quadrupole time -of-flight mass spectrometer/spectrometry)
β-LG – Beta-lactoglobulină

X
Lista figurilor :
Figura 1 . Microevoluția celulelor maligne Pag. 4
Figura 2 . Proprietăți unice de metastazare ale tumorilor heterogene Pag. 6
Figura 3 . Acidul sialic Pag. 15
Figura 4 . Structura chimică a gangliozidei GM1(a) Pag. 17
Figura 5 . Schema de biosinteză a gangliozidelor Pag. 18
Figura 6 . Structura chimic ă a gangliozidei GQ1b Pag. 19
Figura 7 . A, B, C. Nomenclatura scindărilor într -o secvență
oligozaharidică Pag. 22
Figura 8 . Structura chimică a gangliozidei GM3 Pag. 29
Figura 9 . Structura chimică a hematozidelor Pag. 29
Figura 10 A. Polii lizozomali ai membrane i Pag. 30
Figura 10 B. Bis (monoacilglicero) fosfat Pag. 31
Figura 11 . Spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare
capacitate HCT Ultra cuplat cu robotul NanoMate Pag. 41
Figura 12 . Spectrometrul de masă hibrid cuadrupolar cu timp de
zbor, QTOF și sursa de ionizare prin nano electropulverizare
(nanoelectrospray nanoESI) Pag. 43
Figura 13 . Spectrul de masă ( -)nanoESI chip HCT MS al
amestecului nativ de gangliozide extrase din cortexul frontal cu
hemangiom Pag. 50
Figura 14 . Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide
conținute în amestecul nativ extras din cortexul frontal cu
hemangiom Pag. 52
Figura 15 . Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute
în amestecul nativ extras din cortexul frontal cu hemangiom Pag. 52
Figura 16 . Spectrul de masă ( -)nanoE SI chip HCT MS al
amestecului nativ de gangliozide extrase din cortexul frontal normal Pag. 53
Figura 1 7. Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide
conținute în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos Pag. 55
Figura 18 . Distribuția n umerică a speciilor de gangliozide conținute
în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos Pag. 55
Figura 19 . Fragmentarea MS a ionului [M−2H]2− at m/z 1,077.00
corespunzător speciei de gangliozide GT1(18:1/20:0) detectate în
amestecul de gangliozi de HFC. a) Spectrul de fragmentare ( -)
nanoESI – nanoESI chip HCT MS2; b) Schema de fragmentare
corespunzătoare izomerului GT1c detectat în proba de hemangiom Pag. 57
Figura 20 . Fragmentarea MS a ionului [M -2H + Na] – la m/z
1.886,20 corespunzător speciei d e gangliozide GD1(18:1/20:0)
detectate în amestecul de gangliozide HFC. a) Spectrul de
fragmentare ( -) nanoESI chip HCT MS2; b) Schema de
fragmentare corespunzătoare izomerului GD1b. Pag. 59
Figura 21 . Spectrul de masa ( -) nanoESI chip -QTOF MS al Pag. 65

XI
amest ecului de gangliozide extrase din maningiomul angioblastic.
Figura 22 . Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute
în amestecul nativ extras din țesut cerebral cu meningiom Pag. 67
Figura 23 . A. Spectrul de masa ( -)nanoESIchip -QTO F CID MS/MS
al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 detectati în
amestecul naiv de gangliozide din meningiomul angioblastic Pag. 69
Figura 23 . B. Spectrul de masa ( -)nanoESIchip -QTOF CID MS/MS
al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 dete ctati în
amestecul naiv de gangliozide din meningiomul angioblastic, izolati
și fragmentati simultan: m/z (680-1100 ) Pag. 70
Figura 23 . C. Spectrul de masa ( -)nanoESIchip -QTOF CIDMS/MS
al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z 1628,22 detectati în
amestec ul naiv de gangliozide din meningiomul angioblastic, izolati
și fragmentati simultan: m/z (1100 -1700). Inserata: Schema de
fragmentare a izomerului GM1a Pag. 71
Figura 24 A și B.Schemele de fragmentare ale: (A) Cer (d18:1/24:
1) și (B) Cer (d18:1/24: 0). Pag. 72
Figura 25 . a, b, c. Cromatografie în strat subțire de înaltă
performanță a gangliozidelor extrase din (a) țesutul cerebral
sănătos și (b) metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar;
(C) cuantificarea densitometrică a fracțiilor de gangli ozide din
metastaza cerebrală a adenocarcinomului Pag. 78
Figura 26 . Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al
amestecului nativ de gangliozide izolate din metastazele cerebrale
ale adenocarcinomului pulmonar Pag. 80
Figura 27 . Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute
în amestecul nativ extras din țesut cerebral cu metastază a
adenocarrcinomului pulmonar Pag. 84
Figura 28 . Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al
amestecului nativ de gangliozide izolate din proba de cerebel
sănătos Pag. 85
Figura 29 . Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute
în amestecul nativ extras din țesut cerebral sănătos Pag. 89
Figura 30 . Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al ionului
simplu incarcat cu m/z 1471,29 care corespun de la
GD3(d18:1/18:0) din amestecului nativ de gangliozide izolate din
metastazele cerebrale ale adenocarcinomului pulmonar. Inserat:
schemele de fragmentare ale miezului oligozaharidic și
fragmentului de ceramidă Pag. 91
Figura 31 . Spectrul de masă (−)C hip-nanoESI QTOF CID MS/MS
al ionului simplu incarcat cu m/z 1690,95 care corespunde la Fuc –
GM1(d18:1/18:0) extras din țesutul cerebral sănătos Pag. 93
Figura 32 . Schema de fragmentare prin CID MS/MS a gangliozidei
Fuc-GM1(d18:1/18:0) extras din țesut ul cerebral sănătos Pag. 94
Figura 33 . Print screen al bazei de date Access folosită de program Pag. 97

XII
Figura 34 . Print screen al interfațării primei variante de software Pag. 98
Figura 35. Print screen din momentul scrierii programului Pag. 99
Figura 36 . A. Print screen al interfațării software -ului și
exemplificarii modului de operare -1 Pag. 100
Figura 36 . A. Print screen al interfațării software -ului și
exemplificarii modului de operare -2 Pag. 101
Figura 37 . Reprezenatrea schematică a algori tmului de
desfășurare a studiului interacției necovalente dintre β -LG și Glc 6 Pag. 103
Figura 38 . Spectrul de masă (+)Chip -nanoESI QTOF MS al BLG
extras din laptele uman Pag. 105
Figura 39 . Spectrul de masă (+) Chip -nanoESI QTOF MS a
produselor de reacț ie β-LG-Glc 6 după 1 min de incubare în soluție
tampon la 37°C Pag. 106
Figura 40 . Spectrul de masă (+)Chip -nanoESI QTOF MS a
produselor de reacție β -LG-Glc 6 după 5 min de incubare în soluție
tampon la 37°C Pag. 107
Figura 41 . Spectrul de masă (+) Chip -nanoESI QTOF MS a
produselor de reacție β -LG-Glc 6 după 10 min de incubare în soluție
tampon la 37°C Pag. 108
Figura 42 . Spectrul de masă (+)chip -nanoESI QTOF CID MS/MS
(top-down) a [Complex + Na+ + 6H+]7+ detectat la m/z 2750,09,
corespunzător complexului noncovalent β -LG-Glc 6. Pag. 109
Figura 43 . Spectrul de masă (+)Chip -nanoESI QTOF CID MS/MS a
[Glc 6 + Na+]+ detectat la m/z 1013.85 prin screening -ul MS a lui
Glc 6 în buffer Pag. 110
Figura 44 . Spectrul de masă (+) Chip-nanoESI QTOF MS a
produselor de reacție β -LG-Glc 6 după 50 min de incubare în apă la
37°C Pag. 111

XIII
Lista tabelelor:
Tabelul 1. Clase majore de glicosfingolipide Pag. 16
Tabelul 2. Nomenclatura gangliozidelor conform sistemului
Svennerholm Pag. 20
Tabelul 3 . Nomenclatura ganglio zidelor. Comparație între sistemul
Svennerholm și IUPAC -IUB Pag. 21
Tabelul 4 . Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate
în amestecul de gangliozide extrase din țesut cerebral cu
hemangiom Pag. 51
Tabelul 5. Desemnarea speciilor ionice mole culare majore detectate
în amestecul de gangliozide extrase din țesut cerebral sănătos Pag. 54
Tabelul 6 . Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate
în amestecul de gangliozide extrase din țesut de meningiom; d, baza
dihidroxi sfingoid; t, ba za trihidroxi sfingoidă Pag. 66
Tabelul 7. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide
extrse din proba de metastază cerebrală a unui adenocarcinom
pulmonar, detectate prin analiza (−)chip -nanoESI QTOF MS a
amestecului nativ complex Pag. 81
Tabelul 8. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide
extrse din proba de cerebel sănătos, detectate prin analiza (−)chip –
nanoESI QTOF MS a amestecului nativ complex Pag. 86

XIV
Mulțumiri

Se spune că atunci când se termină un drum, începe altul… De
asemenea, se spune că atunci când finalizezi o lucrare sau duci la bun sfarșit
un plan, e bine să nu uiți oamenii care te -au ajutat. În consecință, aflându -mă
acum la finalul ciclului de studii doctorale, mă opresc câteva momente pentru a
privi înapoi și pentru a mulțumi celor care au contribuit la finalizarea acestei
teze de doctorat.
Mulțumesc mentorului meu, doamn ei Prof. Univ. Dr. Alina Diana Zamfir,
pentru cunoștiințele împărtășite și sprijinul oferit necondiționat cu antenție la
detalii. Dân sa este omul care m -a orientat spre certetare și a vâzut în mine
potențial, pe care, în timp și cu un mare talent didactic, a reușit să îl șlefuiască.
La o laltă cu multitudinea de cunoștințe predate în plan științific, Doamna
Profesor Zamfir mi -a învătat lecții de viață valoroase, pe care nu le poți învăța
în școală. M -a învățat ofer și apoi să cer, să citesc mai mult ca să pot ridica
ștacheta și, poate cel mai important, să respect ca să fiu respectat. Totodată, îi
mulțumesc pentru faptul că mi -a oferit t oată finanțarea necesară acestui studiu
și pentru sprijinul inanciar oferit pentru deplasări la conferințe din numeroaselor
granturi de cercetare obținute prin intermendiul UEFISCDI și în care dânsa a
avut calitatea de director sau partener: PN-II-41001/20 07, PN-II-ID-PCE-2011 –
3-0047 , PN-II-IDPCE – 2011 -3-0047, PN -II-PCCA -2011 -142, PN -II-PCCA -2014 –
191.
Mulțumesc coordonatorului meu, domnului Prof. Univ. Dr. Șișu Eugen
în primul rând pentru onoarea de a mă înscrie la doctorat, sub tutela Dânsului.
Totodată, îi mulțu mesc pentru răbdarea cu care m -a instruit și m -a sfătuit de
fiecare dată când i -am cerut ajutorul. Îi sunt recunoscător pentru că a crezut în
mine, m -a încurajat și nu m -a lăsat niciun moment să abandonez lupta.
Mulțumesc domnului Conf. Univ. Dr. Ioan Ovidiu Sîrbu pentru sfaturile
prețioase, evaluarile pertinente și obiective, dar și pentru că mi -a ofeit o
prietenie prețioasă și necondiționată.
Mulțumesc doamnei Prof. Univ. Dr. Zeljka Vukelić și Facultății de
Medicină a Universității din Zagreb (Croația), pentru toate p robele biologice
puse la dispoziție în vederea realiz ării obiectivelor propuse la începutul acestiu
amplu studiu.

XV
Multumesc conducerii și colegilor Institutul ui Național de Cercetare –
Dezvoltare în Electrochimie și Materie Condensată din Timișoara pentru
căldura cu care m -au primit în colectiv și pentru ajutorul acordat în perioada
doctoratului.

Multumesc domnului Dr. Ing. Andrei Lihu pentru ajutorul neprețuit pe
care mi l -a acordat în dezvoltarea software -ului GanglioBase.

Multumesc soției mele și tuturo r persoanelor apropiate din viața mea,
care m -au ajutat de -a lungul timpului, oferindu -mi sprijin moral și insuflându -mi
curajul de a merge mai departe și de a continua, în ciuda obstacolelor inerente.

Nu cred că există post -doc care să nu -și amintească cu nostalgie micile
neajunsuri care eventual au condimentat etapa doctoratului. La sfârșit de
etapă, îmi focusez atenția doar asupra lucrurilor pozitive, asupra cunoștințelor
acumulate și a oamneilor minunați pe care am avut placerea și onoare să îi
cuno sc în toți acești ani.

Tuturor, vă mulțumesc din suflet!

XVI
INTRODUCERE

În ultimii 15 ani, progresele tehnologice majore au permis continuarea
adâncirii cuno științelor la nivel molecular al matricilor vegetale și animale prin
folosirea metodel or de analiz ă rapide, eficiente și ieftine .
Noutatea și importanța acestui studiu const ă în primul rand în faptul
că se înscrie în trendul general al caracteriz ării majorit ății constituenților, a dică
"om-ul" unui element dat (celulă , țesut , organ) ca de e xemplu genele, a c ăror
cercetare intensiv ă a condus la cartarea complet ă a genomului uman . În al
doilea rând, mărimea seturilor de date experimentale a implicat utilizarea pe
scara larg ă a programelor expert la interfa ța masin ă-utilizator, la timpi și viteze
de procesare ne închipuite în precede ntele decade . În al treilea rând, metodele
"omics " (cu a noastră modestă contribuție în glicomică și lipidomică) devin din
ce în ce mai targetate, conducând la direcții de cercetare independente ce se
dezvoltă rapid precum genomul, transcriptomul, proteomul și metabolomul.
Faptul că majoritatea cazurilor de degenerări maligne prezintă un anumit grad
de heterogenitate intratumorală este larg acceptat [1]. Cu toate acestea,
suntem încă departe de a înțelege pe deplin me canismele de funcționalitate
interdependente ale subpopulațiil or tumorale . Există s tructuri le localizate la
nivelul suprafeței externe a membranelor plasmatice care sunt responsabile de
comunicarea și semnalizarea celulară, cu o distribuție largă în organi sm [1, 2].
Studiul în amănunt al componentelor membranare cum sunt
glicosfingolipidele pot oferi detalii importante despre patologia tumorală.
Detectarea unor noi tipuri de marker i tumorali joacă un rol important în
diagnosticul clinic precoce, dar și în e valuarea tratamentului pentru pacienții cu
anumite patologii tumorale. Dezavantajele tehnicilor convenționale de
detectare a markerilor tumorali în ser conduc la o cerință urgentă pentru
dezvoltarea unor metode noi, fiabile, cu co nsum scăzut de prob ă, de m are
viteză și în timp real pentru screening -ul pe scară largă a bolilor neoplazice .
Glicosfingolipidele sialilate sau gangliozidele sunt în mod special
abundente în creier, unde se regăsesc în substan ța cenușie de aproximativ 5
ori mai des decât în substan ța albă. În creierul uman adult, valorile variază de
la 2 la 14 μg de acid sialic legat de lipide/mg de lipide [1]. Acestea participă
activ în diverse procese biologice responsabile pentru maturarea fetală,
îmbătrânirea celulară, dar și în degenerările m aligne [2]. Gangliozidele prezintă
o diversitate și o complexitate structurală foarte mare, astfel, sunt necesare
tehnici ultraperformante capabile să le identifice, să le izoleze și să le
descifreze compoziția structurală. Una dintre cele mai fiabile tehn ici,

XVII
disponibilă astăzi pentru a îndeplini acest scop, este spectrometria de masă
(MS). Capacitatea MS de a efectua bioanalize structurale de mare sensibilitate
a crescut considerabil după dezvoltarea tehnicii de ionizare prin electrospray
care permite det ectarea și identificarea biopolimerilor de la produși metabolici
cu structuri mici până la glicani, lipide, acizi nucleici, peptide și proteine cu
mase moleculare mari și/sau oricare dintre interacțiunile lor funcționale.

Importanța și actualitatea tem ei de cercetare este desprinsă din
conceptul modern și inovativ al studiului în ansamblul său, dar și de metodele
ultraperformante cu ajutorul cărora s -au efectuat analizele.
Introducerea recentă a tehnicilor de fragmentare bazate pe stagii
multiple de MS (MSn), fie folosind disocierea indusă prin ciocnire (CID),
transfer de electroni/captare/detașare (ETD, ECD, EDD) a oferit posibilitatea
de a fragmenta specii ionice complexe și a dezvălui elementele lor structurale
de mare finețe. În proteomic ă, glicomic ă, lipidomic ă și în studiul interacțiunilor
noncovalente dintre biomolecule, nanoESI MS și MSn s-au dovedit a fi capabile
de a fragmenta, identifica și caracteriza structural cantități mici (până la femto –
și atomoli) de material biologic. În asociere cu m etode de separare off -sau on –
line, cum ar fi HPLC, nanoESI MS și MSn este capabilă de o analiză
compozițională și structurală detaliată a speciilor individuale în amestecuri
complexe precum cele extrase din probe de țesut prelevate de la subiecți
umani. De zvoltarea și rafinarea continuă a tehnicilor ESI MS, a culminat cu
construirea de dispozitive de măsurare miniaturizate și automatizate pentru
măsurători în regim high-throughput , bazate pe realizările nanotehnologiei în
chipuri și robotică.
În combinație cu spectrometre de masă de înaltă rezoluție sau
instrumente capabile de a efectua fragmentarea succesivă, în stagii multiple,
chip-electrospray a demonstrat capacitatea sa unică de a oferi o caracterizare
structurală a speciilor de gangliozide minore în a mestecuri complexe, care s –
au dovedit a reprezenta posibili biomarkeri valoroși.
Platformele miniaturizate, integrate care funcționează pe conceptul
"lab-on-a-chip" sau sisteme de analiză micro -totale au fost introduse în
spectrometria de masă ca tehnolo gii pentru sursa de ioni ESI. Având la
dispoziție astfel de sisteme pentru livrarea și ionizarea robotizată a probei
bazată pe chip, poate fi atinsă o creștere fără precedent a sensibilității,
fiabilității și eficienței analizei, cu reducerea la minimum a volumului de probă
și a manipulării.
Microfluidica pentru electrospray în combinație cu instrumente
avansate de MS capabile de a efectua fragmentarea în mai multe stagii au fost

XVIII
introduse de către grupul din care fac parte și care este condus de doamna
Prof. Dr. Zamfir.
Motivația acestui studiu a avut la bază ideea dezvolt ării unei metode
performante bazată pe MS pentru studiul gangliozidelor din diverse tumori
cerebrale și de a găsi, izola și caracteriza unele structuri cu rol de biomarker
specific pentru fiecare tip de tumoră în parte. Atât la nivel internațional cât și,
mai ales la nivel național studiile de glicomică bazată pe chip electrospray MS
sunt încă în fază incipientă, iar cele asupra gangliozidelor din tumori cerebrale
umane care fac obiectivul acestiei teze și se înscriu în glicolipidomică, se
număra printre primele din lume. Din 2006 pană în prezent, o parte din studiile
demarate de acest grup s -au focusat pe studiul gangliozidelor [ 3-16], pentru
determinarea expresiei și structurii gangliozi delor din diferite regiuni ale
creierului normal și tumoral, de diferite vârste. Pe de altă parte, ca urmare a
generării de către chip -MS a unui set mare de date și având în vedere
complexitatea probei, procesarea informației relevante a devenit condiție
obligatorie și indispensabilă pentru a îmbunătăți fiabilitatea rezultatului
interpretării și de a face tehnologia mai rapidă și ușor de utilizat.

Plecând de la aceste premize obiectivul general al prezenței tezei de
doctorat este funcționalizarea și optim izarea tehnicilor ultramoderne bazate pe
spectrometrie de masă de înaltă rezoluție asociate cu metode de infuzie
robotică, pentru detectarea și cartografierea unor structuri gangliozidice
complexe de tip biomarker în diferite tumori cerebrale. De aici, obiectivele se
ramifică și se etapizează căpătând un contur științific pentru fiecare activitate
în parte. Astfel în această teză sunt incluse 3 studii care au avut ca scop
cartarea gangliozidelor în tumori cerebrale în comparație cu țesut cerebral
sănătos, u n studiu privind interacțiunile necovalente proteo -zahardice și un
studiu informatic ce are ca produs finit programul unic și original denumit
GanglioBase.

Primul studiu are ca obiective următoarele:
 Angrenarea platformei analitice bazată pe spectrometr ie de masă cu
capcană ionică de mare capacitate și ionizare prin electropulverizare
(chip-nanoESI HCT MS ) și optimizarea acesteia în scopul elucidării
expresiei gangliozidelor într -o tumoră cerebrală benignă și anume
hemangiom versus țesut cerebral sănătos;
 Analiza gangliozidelor extase din hemangiom comparativ cu țesut ul
sănătos;

XIX
 Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei unice
GanglioBase
 Interpretarea rezultatelor în corelație cu studiile științifice de literatură
 Publicarea rezulta telor într -o revistă prestigioasă din domeniu [ 3]

Al doi -lea studiu fixează următoarele obiective:
 Implicarea și optimizarea, de această dată, a unei alte platforme
analitice bazată chip -nanoESI QTOF MS în scopul elucidării expresiei
gangliozidelor într -o tumoră cerebral benignă și anume meningiom
 Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS pentru
studiul gangliozidelor din meningiom;
 Analiza gangliozidelor extase din meningiom;
 Investigarea detaliată a compoziției gangliozidelor, urmată de analiza
de fragmentare a speciilor individuale regăsite în meningiom utilizând o
metodă avansată de spectrometrie de masă bazată pe nanoESIchip
QTOF MS și CID MS/MS
 Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei
Gangliobase și interpretarea rezultatelor obținute
 Publicarea rezultatelor într -o revistă prestigioasă din domeniu [ 4]

Al trei -lea studiu își propune următoarele obiective:
 Funcționalizarea platformei chip -nanoESI QTOF MS în vederea
analizei compoziționale și structurale a expresiei gangliozidelor în
metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar (metaADK)
versus țesut cerebral sănătos;
 Cartografierea gangliozidelor extase din metaADK comparativ cu țesut
sănătos;
 Analiza statistică a datelor obținute și interpretarea re zultatelor
 Publicarea rezultatelor într -o revistă prestigioasă din domeniu [ 5]

Al patru -lea studiu , care s -a focusat pe interacțiunile necovalente proteo –
zahardice și care trasează următoarele obiective:
 Elaborarea unei metodologii inovatoare care să inc ludă ionizarea
complet automată bazată pe Chip nanoESI, cuplată cu spectrometrie
de masă de înaltă rezoluție pe un instrument quadrupole time -of-flight
(QTOF MS) în vederea evaluarea interacțiunilor necovalente dintre
maltohexaoză (Glc 6) și β-lactoglobulin ă;.
 Să surprindă formarea complexului în soluție tampon de acetat de
amoniu (pH 6,0) și apoi în apă pură.

XX
 Publicarea rezultatelor cercetării într -o revistă importantă [ 15]

Ultimul studiu este de fapt punerea în practică a unui concept informatic
care să d eservească nevoile impuse de cerințele actuale – analiza datelor
obținute să fie precisă și să fie obținută într -un timp cât mai scurt. Desigur, și
această etapă a solicitat timp, studiu individual și ajutor din partea unor
specialiși. Cu toate acestea, re zultatul final a fost pe măsura așteptărilor și este
acum folosit de rutină pentru identificarea structurilor gangliozidice oferite prin
MS.
Cum am subliniat și în capitolul final al acestei teze, obiectivele au fost
multe și îndrăznețe iar factorul timp n u a fost un aliat. Cu eforturi intense și
susținute dar și cu un ajutor imens primit din partea mentorilor, a echipei de
cercetare din care fac parte și a tuturor celor implicați în acest proiect, am
reușit să îndeplinesc aceste obiective. Astfel, rezultat ele acestei teze de
doctorat se pot regăsi sub forma a 4 lucrări stiințifice ce fost publicate în jurnale
ISI cu factor de impact ridicat și au fost apreciate la nivel național și
internațional. Ca urmare, aceste 4 lucrări au colectat până în prezent un nu măr
de 63 de citări, au fost prezentate la numeroase conferințe internaționale și au
generat idei valoroase pentru cercetarea viitoare în acest domeniu.
Folosind una dintre cele mai moderne metode pe care medicina moleculară
le are astăzi la dispoziție: io nizarea complet automată a probei printr -un robot
NanoMate cuplat cu MS și fragmentare automată prin mai multe stagii MS
(MSn) am putut colecta și valorifica date importante privind compoziția specifică
de gangliozide, secvența de carbohidrați și structura ceramidei selectate. De
asemenea, rezultatele prezentate în cadrul tezei au constituit un punct de
plecare pentru desemnarea unui kit de biomarkeri specifici pentru diverse tipuri
de tumori.
În final, aceste rezultate atestă fezabilitatea și eficiența ace stor metode ce
pot fi considerate sistemele ideale în acest sens, datorită faptului că sunt
capabile să manipuleze volume de probă de ordinul nanolitrilor și oferă un
randament sporit experimentelor, informații compoziționale și structurale
precise la conc entrații subpicomolare.

1
PARTEA GENERAL Ă

1. ASPECTE BIOMEDICALE ÎN PATOLOGIA
TUMORALĂ

Într-un context științific larg , viața poate fi definită ca fenomenul c e
rezultă din interacți unea reciprocă a particulel or de materie anorganică
organizat ă în molec ule, în interiorul celulelor [ 16].

1.1. CELULARITATE Ș I TU MOR IGENE ZA

“Întregul este mai mare decât suma părților sale”
Aristotel

Acest citat celebru al filozofului grec antic Aristotel poate să nu fie
aplicabil în toate situațiile, dar cu siguranță se d ovede ște a fi adevărat în
domeniu l oncologie i.

Sistemele vii sunt structuri complexe, modulare și ierarhice. Într -adevăr,
un organism multicelulular constă în molecule, cum ar fi acidul
dezoxiribonucleic (ADN), acidul ribonucleic (ARN), proteinele, lipid ele și o
gama larga de alti metaboliți implicați în reacțiile chimice și structurile celulelor.
Celulele sunt organizate în țesuturi care formează organe cu funcții specifice
necesare pentru sănătatea organismului. Proprietățile sistemice apar la fiecare
nivel, de exemplu homeostazia și răspunsul la stimuli într -o singură rețea
intracelulară, metabolismul, creșterea, adaptarea, reproducerea într -o singură
celulă. Informațiile care definesc un organism și capacitatea acestuia de a
reacționa la mediul său sun t codificate în ADN și sunt exprimate diferenția t în
spațiu și timp de -a lungul vieții. Studiile tipice în domeniul biologiei au folosit
recent abordarea reductivistă și au a tins aspecte specifice care folosesc una
sau mai multe tipuri de molecule la scară mică, fiecare aruncând lumină doar
asupra unei mici parți a acestor fenomene extrem de complexe [16]. Unele

2
descoperiri au fost remarcabile, cum ar fi des cifrarea structurii ADN -ului și mai
târziu a modului în care informațiile genetice stocate în ADN sun t transcrise în
ARN-ul mesager ( mARN), apoi translatate în proteine, componente esențiale
ale mașinilor celulare și ale motoarelor vieții. Acumularea unor astfel de
cunoștințe asupra moleculelor și a mecanismelor a condus la abordarea "de
jos în sus" în mo delarea sistemelor biologice . Ace st fapt a fost complementar
viziunii "de sus în jos" a unui organism, ca sistem fiziologic care integrează
informații din diferitele sale componente și interacțiunea lor cu mediul.
Având la îndemână acestea, împreună cu alt e discipline cum ar fi imagistica ,
cercetarea farmaceutică și chem oinformatică, biblioteci ale compușilor ,
screening de mare viteză și date clinice [ 17, 18 ], se poate încerca acum
descifr area interacțiunil or dintre diferitele elemen te ale unui sistem biolo gic –
interactomica – pentru a înțelege comportamentul său pe mai multe nivele într-
o manieră holistică, în țesuturi sănăt oase, dar și în cele afectate de boală.
Înțelegerea fiecărei componente a unui sistem complex izolat nu este
suficientă pentru a carac teriza sistemul. Într -adevăr, proprietățile sistemului nu
sunt definite numai prin adăugarea simplă a funcțiilor elementare, ci și prin
interacțiunile dintre elemente [ 19, 20, 21 ].
Aceste proprietăți emergente sunt studiate prin implicarea rețelelor de
interacțiuni dintre constituenți – genele, proteinele, liganzii și prin
deslu;irea mecanismelor lor de regl are. Datorită numărului foarte mare de
elemente din aceste rețele, un astfel de efort se bazează pe concepte definite
în cadrul teoriei sistemelor comple xe [22]. Genomica este studiul secvenței,
structurii și conținutului genomului, în special a genelor și a numărului,
structurii, funcției și organizării lor de -a lungul genomului. Genomica
funcțională este studiul funcției genelor și reglarea expresiei lor la nivelul
celulei, organului sau organismului, spațial și la momente diferite de timp și/ sau
starea de sănătate, prin descifrarea dinamicii transcrierii genetice, a translației
și a interac țiilor proteină – proteină pe o scara larg ă a genomului, ut ilizan d
tehnologii cu performanță ridicat ă. Principalele instrumente experimentale
utilizate pe scară largă pentru studiul epigeneticii (epigenomică) și a expresiei
genice (transcrip tomică) au implicat până în prezent microarray -uri și, mai
recent, secvențierea de generație viitoare.
Celulele canceroase sunt celule aberante – cu alte cuvinte, ele nu mai răspund
la multe dintre semnalele care controlează creșterea și moartea celulară.
Celulele canceroase provin din țesuturi normale iar pe măsură ce cresc și se
divid, deviază din ce în ce mai mult de la normalitate. În timp , aceste celule
devin din ce în ce mai rezistente la controalele care mențin țesutul normal – și,
ca rezultat, se divi d mai rapid decât progenitorii lor și devin mai puțin

3
dependenț e de semnalele provenite din alte celule. Celulele canceroase evită
chiar moartea celulară programată, în ciuda faptului că anomaliile lor multiple
le-ar transforma, în mod obișnuit, în obiective principale pentru apoptoză. În
stadiile t ardive ale cancerului, celulele depășesc limitele normale ale țesuturilor
și metastazează ( se răspândesc) în diferite locuri din organism. În celulele
normale, sute de gene controlează în mod compl ex procesul de diviziune
celulară . Creșterea normală necesită un echilibru între activitatea acelor gene
care promovează proliferarea celulelor și cele care o suprimă. Totodată, se
bazează pe activitățile genelor care semnalează când celulele deteriorate
trebuie supuse apopto zei [18].
Celulele devin maligne după ce mutații le se acumulează în dife ritele gene care
controlează proliferarea celul ară. Potrivit rezultatelor cercetărilor, majoritatea
celulelor canceroase posedă 60 sau mai multe mutații [20, 21] . Provocarea
pentru cercetători este de a identifica care dintre aceste mutații sunt
responsabi le pentru anumite tipuri de cancer. Di verse tipuri de cancere au
diferite semnături mut aționale . Cu toate acestea, compararea stiintifica a mai
multor tipuri de tumori a aratat ca anumite gene poasedă muta ții în celulele
canceroase mai des decat altele.
De exemplu, genele care promovează creșterea, cum ar fi gena pentru
proteina semnaliza toare Ras, sunt printre cele mai frecvent mutante în celulele
canceroase, devenind super -active și producătoare de celule care sunt prea
puternic stimulate de receptorii d e creștere. Unele chimioterapi ce lucrează
pentru a contracara aceste mutații prin blocarea acțiunii proteinelor de
semnalizare a creșterii. Astfel , medicamentul pentru cancer de sân Herceptin,
blochează receptorii tirozin -kinazelor (RTK), iar medicamentul Gleevec
blochează o kinază de semnalizare mutantă asociată cu leucemia mielogenă
cronică [17]. Alte mutații legate de cancer inactivează genele care suprimă
proliferarea celulelor sau cele care semnalează necesitatea apoptozei. Aceste
gene, cunoscute sub n umele de gene supresoare tumorale, funcționează în
mod normal ca frâne pe proliferare, iar ambele copii în interiorul unei celule
trebuie mutate pentru a avea loc divizarea necontrolată [21, 22] . Multe celule
canceroase poartă două copii mutante ale genei care codifică p53, o proteină
multifuncțională care s esizează în mod normal deteriorarea ADN -ului și
acționează ca un factor de transcri pție pentru genele de control . Mutațiile
genetice se acumulează în timp ca urmare a unor evenimente independente.
În con secință, calea spre malignitate implică mai mulți pași [23].
De fapt, mulți oameni de știință văd progresul cancerului ca un proces
microevoluțional.

4

Figura 1. Microevoluția celulelor maligne , adaptare după [23]
https://www.nature.com/scitable/content/m icroevolution -of-a-cancer -cell-14707728

O populație normală, sănătoasă de celule se poate schimba în timp,
într-o populație de celule invazive, canceroase. Figura 1 prezintă cinci grupuri
diferite de celule, care sunt etichetate astfel: aspect normal, hip erplazie,
hiperplazie atipic ă, carcinom in situ și carcinom microinvaziv. Populația din
partea stanga sus este reprezentată de celule de aspect normal. Acestea sunt
dispuse într -un singur strat pentru a forma un inel închis, cu interiorul gol. În
cea de -a doua populație – hiperplazia, un grup de celule pe partea stângă a
inelului începe să se dividă și să crească la număr, formând un al doilea și al
treilea strat de celule în interiorul inelului. În hiperplazia atipică, cele trei straturi
de celule din part ea stângă a inelului s -au extins pentru a forma o mică
cantitate de celule (colorate purpuriu și albastru ) cu proliferare rapidă. Celulele
nu mai sunt organizate în rânduri, iar unele sunt chiar așezate una peste alta.
În carcinom ul in situ, masa mic ă de celule s -a extins și mai mult pentru a forma
o populație densă de culoare albastru și violet, celule maligne care ocupă cea
mai mare parte a spațiului din interiorul inelului de celule sanatoase normale.
În populația de celule finală, forma microinvazivă, a pare o ruptură în partea
stângă a inelului de celule sănătoase, și mai multe celulele maligne maracte
violet, sunt prezentate de versând din masa densă celulară.
Deși cancerul a fost studiat ca o boală c ronică timp de mai multe
decenii [24], unele studii fo arte timpurii ale tumorilor mamare la șoarece au
arătat că subpopulațiile celulare din diferite secțiuni ale aceleiași tumori variază
prin ritmul de creștere, imunogenitate, răspunsul la medicament și capacitatea

5
de metastaz are, demonstrând astfel heteroge nitate funcțion ală și fenotip ică
[25].
Există dovezi tot mai concludente ce atestă faptul că celulele
canceroase se comportă ca și comunități, iar atenția tot mai mare se îndreaptă
acum către comportamentul cooperativ al subclonelor , care pot influența
progresia bolii. După cum era de așteptat, aceste interacțiuni pot adăuga un
grad mai mare de complexitate intervențiilor terapeutice în tumorile
heterogene, ceea ce duce adesea la un prognostic mai prost .
Aplicarea ipotezelor centrale ale lui Charles Darwi n pentru dezvoltarea
și progresia cancerului a fost inițial propusă formal de Nowell [26]. În teoria
darwinistă clasică, diversitatea ereditară la nivel de populație oferă un substrat
pentru adaptare și selecție, provocat de concurența pentru resursele de mediu
limitate. Este adevărat că forțele de evoluție darwiniană acționează asupra
fenotipurilor ereditare și nu a genotipurilor, dar pentru că variabilitatea
fenotipică funcțională în mediul tumoral a fost dificil de studiat la pacienți,
majoritatea studii lor de heterogenitate tumorală s -au concentrat mai degrabă
pe heterogenitatea genetică decât pe cea fenotipică ce apare datorită forțelor
de selecție a le mediului tumo ral [25]. Heterogenitatea intratumorală a fost
recunoscută ca o proprietate inerentă a mu ltor tipuri de tumori murine încă din
anii ‘70. Deși aceste constatări au fost inițial întâ mpinate cu neîncredere și
critici copleșitoare față de adepții principali ai ipoteze lor legate de origine
clonică a cancerului, foarte curând heterogenitatea tumoral ă a început să fie
acceptată ca o parte a evoluției maligne.

6

Figura 2. Proprietăți unice de metastazare ale tumorilor heterogene (adaptare după [27])

Tumorile primare omogene sau cele constituite din populații non-
cooperative pot avea o capacitate limi tată de a forma metastaze în organele
îndepărtate. Dimpotrivă, potențialul metastatic al tumorilor primare heterogene
compuse din populațiile de celule canceroase coopera tive (partea de jos)
poate fi modificat în diferite moduri, mai ales dacă una dintre clone (albastru
deschis) este un promotor de metastază non -celular autonom ă care crește
potențialul metastatic al populațiil or învecinate (Fig. 2) [ 27, 28, 29 ]. Leziunile
metastatice rezultate pot fi monoclonale sau policlonale.
Din punct de vedere ipotet ic, cooperarea clonală poate de asemenea
să modifice potențialul metastatic al populațiilor individuale, astfel încât fiecare
dintre ele să colonizeze diferite organe secundare.
O serie de mutații într -o celulă o determină să prolifereze mai mult
decât celulele din imediata ei vecinătate. Deoarece grupul de celule divizate
crește în timp, mutațiile ulterioare transformă hiperplazia atipică într -un
carcinom . Răspândirea celulelor canceroase în alte țesuturi și organe
(metastaze) apare atunci când celule canc eroase se de sprind de pe substrat și
sunt capabile să călătorească cu ușurință spre locații noi [27].
Atunci când o mutație oferă unei celule maligne un avantaj de creștere,
aceasta se poate replica mult mai rapid decât o celulă normal ă. De asemenea,

7
desce ndenții ei pot depăși performanțele celulelor sănătoase în competiția
pentru resurse. Mai târziu, o a doua mutație ar putea oferi celulei canceroase
un alt avantaj reproductiv, care, la rândul său, își intensifică avantajul
competitiv și mai mult. În cazul în care punctele de control cheie sunt pierdute
sau dacă genele repara torii sunt deteriorate, atunci rata acumulării daunelor
crește și mai mult. Acest proces continuă cu fiecare nouă mutație care oferă
asemenea beneficii și este o forță motrice în evoluț ia lucrurilor vii – nu doar a
celulelor canceroase. În stadiile incipiente ale cancerului, tumorile sunt de
obicei benigne și rămân limitate la țesut ul normal . Pe măsură ce tumorile cresc
și devin maligne, totuși, ele dobândesc capacitatea de a sparge aces te limite și
de a invada țesuturile adiacente. Celulele canceroase invazive deseori secretă
proteaze care le permit să degradeze matricea extracelulară la limita țesutului.
Proteazele dau, de asemenea, celulelor canceroase capacitatea de a crea noi
căi de trecere în țesuturi. De exemplu, e le pot rupe joncțiunile care unesc
celulele , obținând astfel acces la noi teritorii [25].

1.2. TUMOR I BENIGNE ALE CREIERULU I

O tumo ră benignă este o masă de celule care nu are capacitatea de a
invada ț esutul vecin sau de a metastaz a. De asemenea, tumorile benigne au în
general o rată de creștere mai mică decât tumorile maligne iar celulele
tumorale sunt de obicei mai diferențiate (celul ele au caracteristici normale) [30-
33]. Tumorile benigne sunt în mod obișnuit înconjura te de o suprafață
exterioară (teacă fibroasă a țesutului conjunctiv) sau rămân pesuprafața
epitelială [34]. Tumorile benigne sunt de cele mai multe ori compuse din celule
care au o asemănare puternică cu tip ul de celulă normal ă a organul lor de
origine. Ac este tumori sunt denumite după celulă sau tipul de țesut din care
provin, urmate de sufixul " -om" (dar nu carcinom, sarcom sau blastom, care
sunt în general maligne ). De exemplu, un lipom este o tumo ră obișnuită
benignă a celulelor grase ( adipocite ), iar o condroză este o tumoră benignă a
celulelor care formează cartilagii (condrocite). Adenoamele sunt tumori
benigne ale celulelor forma toare de glande și de obicei sunt menționate mai
departe prin celula sau organul lor de origine, ca în adenomul hepatic (o
tumo ră benign ă a hepatocit elor) [31].
Deseori cuvântul "benign" este utilizat pentru a defini tumorile
considerate a fi non -viitoare sau non -agresive. Acest lucru nu este absolut

8
corect în cazul tumorilor cerebrale, deoarece ele pot comprima țesutul cerebr al
și alte structuri din interiorul cutiei craniene și pot provoca complicații grave de
sănăt ate, indiferent de clasificarea acestora. În interiorul comunității medicale,
inclusiv al Organizați ei Mondial e a Sănătății (OMS), s-a luat în considerare
înlocuir ea cuvâtului "benign" cu "non-malign" sau "inferior" pentru a defini
tumorile care nu sunt agresive [35, 36] .
O tumo ră cerebrală reprezintă o creștere a celulelor anormale fie în
interiorul sau în jurul structurii cerebrale . Termenii alternativi utilizați pentru a
descrie tumorile includ leziunea sau proliferarea, iar acești termeni sunt
adesea utilizați atunci când patologia unei tumori este necunoscută. Tumorile
cerebrale sunt clasificate sau categorizate pentru a ajuta la identificarea
originii, comport amentului și tipului lor. Tumorile cerebrale pot fi de natură
primar ă sau secundar ă și sunt denumite benigne, non -maligne sau maligne.
OMS clasifică tumorile cerebrale după originea celulară și după
comportamentul celulel or, de la cel mai puțin la cel mai agresiv. Unele tipuri de
tumori sunt atribuite unei clase pentru a indica ritmul lor de creștere și pentru a
ajuta la prezicerea comportamentului.

1.2.1. EPIDEMIOLOGIE

Datele publicate de Central Brain Tumor Registry of the United States
(CBTRUS) – Registrul Central al Tumorilor Creierului din Statele Unite au
estimat un total de 43.800 de cazuri noi de tumori primare ale creierului și ale
sistemului nervos central (malign și benign) diagnosticate în Statele Unite în
ultima decadă [35]. De asemenea, a u raportat o rată de incidență de 14,8
cazuri la 100.000 de persoane/an dintre care aproximativ jumătate sunt
malign e, reprezentân d aproximativ 7,4 cazuri la 100. 000 de persoane/an . The
American Cancer Society (Societatea Americană e Oncologie) a estimat c ă în
Statele Unite au fost diagnosticate 18.500 de cazuri noi de tumori maligne ale
creierului și ale sistemului nervos central, reprezentand un procent de
aproximativ 1% din toate cazurile de cancer malign primar diagnosticate în
acel an (CBTRUS 2005 -2006).
Tumorile cerebrale primare sunt una dintre cele mai devastatoare boli
cu care se confruntă medicina modernă. Deși sunt r are comparativ cu alte
tipuri de cancer, ele reprezintă puțin mai mult de 1% din cancerele maligne
primare (CBTRUS 2005 -2006)

9
Multe tum ori non -maligne sunt clasificate la gradul I sau II; Cu toate
acestea, pot fi regăsite și tumori mixte.

1.2.2. C LASIFICARE

Potrivit OMS , tumori le cerebrale se încadrează astfel : [36]

Tumoră de Gradul I:
 Creșterea lentă
 Aparență aproape normală în sub m icroscop
 Cel mai puțin malign
 De obicei asociat cu supraviețuirea pe termen lung
Exemplu: Neuromul acustic (schwanomul vestibular), meningiom tipic

Tumoră de Gradul II:
 Celule cu creștere relativ lentă
 Aspect ușor anormal sub microscop
 Pot invada ț esuturile sănătoase din apropiere
 Poate da recurență devenind o tumoră de grad mai înalt
Exemplu: meningiomul atipic

Tumoră de Gradul III:
 Reproducerea activă a celulelor anormale
 Aspect anormal sub microscop
 Afectează țesuturile sănătoase din apropie re
 Tumora tinde să reapară, adesea devenind o tumoră de grad mai înalt
Exemplu: astrocitom anaplazic

Tumoră de Gradul IV: Celule anormale care se reproduc rapid
 Aspect foarte anormal sub microscop
 Formează vase de sânge noi și capilare de neoformație pentru a
menține o creștere rapidă Zone de celule moarte în centru (necroză)
Exemplu: glioblastomul multiform (GBM)

Distincția dintre tumori le benigne și cele maligne poate fi o provocare.
Unele tumori benigne pot fi la fel de grave ca cele clasificate ca maligne dacă
sunt inoperabile sau într -o locație inaccesibilă, cum ar fi trunchiul cerebral. În
schimb, unele tumori maligne pot fi tratate cu succes. Există 120 de tipuri

10
diferite de tumori cerebrale primare și deși fiecar ui tip i se va atribui o anum ită
clasificare sau categorie, tumorile cerebrale sunt specifice fiecărui individ și,
prin urmare, planurile de tratament vor varia, la fel ca semnele și simptomele
Semne și simptome comune cauzate de o tumo ră cerebrală benignă :
 Schimbări comportamentale
 Modificări cognitive
 Amețeli sau instabilitate
 Vedere dublă sau încețoșată
 Frecvente dureri de cap
 Insuficiență auditivă
 Greață și vărsături dimineața
 Convulsii
 Slăbiciune sau paralizie

1.3. ME TASTAZE CEREBR ALE

Metastaza – originea etimologică a acestui cuvant provine din limba
greacă și înseamnă literalmente " îndepărtare sau schimbare " – este una dintre
stadiile terminale ale cancerului. În această etapă, celulele canceroase intră în
fluxul sanguin sau în sistemul limfatic și călătoresc spre o nouă locație din
corp, unde încep să se dividă și să pună fundația pentru tumori secundare. Nu
toate celulele canceroase pot metastaza. Pentru a se răspândi în acest fel,
celulele trebuie să aibă capacitatea de a penetra barierele normale ale
corpului, ast fel încât să poată intra și ieși din sânge sau vasele limfatice. Chiar
și celulele canceroase care se deplaseaz ă metastatic se confrunt ă cu
provocari atunci c ând incearc ă să creasc ă în zone noi .
Mutațiile genetice pot provoca cancer prin accelerarea ratel or de
diviziune celulară sau prin inhibarea controalelor normale ale sistemului, cum
ar fi stoparea ciclului celular sau moartea celulară programată. Pe masur ă ce o
masă de celule canceroase cre ște, se poate transforma într-o tumor ă. De
asemenea , celulele canceroase pot să invadeze țesuturile vecine și, uneori,
chiar să se desprindă și să se deplaseze în alte părți ale corpului, ducând la
formarea de noi tumori la aceste locuri [37].
Spre deosebire de tumorile benigne, structura ce lulară a unei tumori
cerebrale maligne este semnificativ diferită de cea a celulelor cerebrale
normale. Tumorile maligne tind să crească mai repede și pot fi mai invazive
decât tumori le benigne. Tumorile maligne pun în pericol viața pacienților .

11
Uneori, tumorile maligne ale creier ului sunt denumite cancer cerebral ,
deși nu împărtășesc toate caracteristicile cancerului. În special, cancerul se
caracterizează prin capacitatea de a se răspândi de la un organ la altul. Este
foarte rar pentru o tumo ră cerebrală primară să se răspândeasc ă dincolo de
creier sau coloană vertebrală.

12
2. ASPECTE BIOCHIMICE ÎN PATOLOGIA
TUMORALĂ

2.1. SPECTR OMETR IA DE MAS Ă

În domeniul biomedical, s pectrometria de masă (MS) este utilizată pe
scară largă pentru a studia prot einele (proteomica ), metaboliții (metabolomica),
lipidele (lipidomic a) etc. Progresele tehnologice au condus, de asemenea, la
dezvoltarea unor instrumente computaționale care să le gestioneze și să
analizeze rezultatele [38].
Principiul de funcționare al M S se bazează pe ionizarea
atomilor/moleculelor probei de analizat . Mai a poi, ionii astfel generați trec prin
analizor unde sunt separati în funcție de raportul masă/sarcină. După ce au
fost separați, ionii ajung la detector, unde se va determina valoarea r aportului
m/z și abundența relativă pentru fiecare ion. Computerul de care este conectat
MS va înregistra datele provenind de la instrument și le va transforma în valori
de masă și intensități ale semnalelor. Cu ajutorul acestor informa ții, este
obținut un spectru, care poate fi reprezentat sub formă grafică sau tabelară. În
cadrul spectrului de masa de tip grafic, semnalele ionilor sunt prezentate ca
niște linii verticale aflate la valori m/z corespunzatoare și ale căror înaltime este
proporțională cu int ensitatile (abundențele) ionilor. Din motive practice, aceste
abundente sunt recalculate în funcție de semnalul cel mai intens (numit și pic
de bază), caruia i se atribuie intensitatea de 100%. Metodele de ionizare pot fi
dure sau mai puțin dure . Ionizarea dură introduce o cantitate mare de energie
în molecule , având ca rezultat fragmentarea și astfel, ajută la identificarea
compusului, dar spec trele rezultate rareori conțin i onul molecular. Tehnica
ionizării prin electrospray (ESI) utilizează tensiune ridi cată pentru a dispersa și
ioniza macromoleculele printr -o duză de pulverizare. Este moale (soft) ,
limitează fragmentarea și produce ioni multipli încărcați, permițând detectarea
compușilor mar i la o valoare mai mică a masei/sarcină și, prin urmare, mărește
domeniul (range -ul) de masă a l analizorului . ESI MS este adesea cuplat cu
LC/MS. Amestecurile care conțin molecule nevolatile pot fi, de asemenea,
analizate prin bombardament rapid de atomi (FAB) și prin ionizare/desorbție cu
laser de pe o matrice (MALDI) .
MALDI este folosit pentru a analiza molecule extrem de mari, de până
la 200.000 Da, adesea folosind analizoare ToF MS (Time -of-Flight – Timp de
zbor). Spectrometria de masă cu ionizare cu desorbție laser la suprafață

13
(SELDI -MS) separă subseturile de prot eine fixate pe o suprafață în funcție de
proprietățile biofizice specific e. Astfel, analiza proteinelor, peptidelor și
nucleotidelor poate fi efectuată cu ESI, SELDI, MALDI și FAB [ 39]. Există mai
multe tipuri de analizoare. Într -un analizor de masă quad rupol ar (QMS), ionii
sunt deflectați prin câmpurile electrice oscilante pozitive și negative. Un tripl u-
QMS conține trei QMS unul după altul, în cazul în care primul QMS permite
identificarea compușilor cunoscuți, a doua fragmentare și a treia identificare a
fragmentelor, elucidând astfel structura compusului. Alte tipuri de analizoare
includ capcana de ioni, ToF, Orbitrap și transformata fourier a frecventei de
rezonanta din ciclotron (a ionilor) (FT-ICR) c u rezoluție și precizie în detectarea
masei molecul are crescătoare. Ca o comparație, s pectrometrele de masă de
tip Orbitrap au un preț mai scăzut, sunt mai robuste și au o performanță mai
mare decât cele de tip FT -ICR. Tandem -MS implică mai mulți pași de selecție
a compusului utilizând MS. Metodele MS menț ionate mai sus variază în ceea
ce privește capacitatea de producție, robustețea, sensibilitatea, selectivitatea și
ușurința utilizării [ 39].

2.2 LIP IDE

Termen ul de lipide descrie un grup larg de molecule c u caracter fie
hidrofob fie amfifil , inclusiv acili grași , glicerolipid e, glicerofosfolipide, lipide,
steroli și sfingolipide care sunt larg distribuite și asociate cu o serie de funcții
biologice, inclusiv componente structurale [ 40]. Lipidele joacă un rol important
în semnalizare, stocarea energiei , proliferarea celulelor, migrația și apoptoza
[41]. Ele sunt, de asemenea, principalele componente ale membranelor
celulare, împreună cu proteinele membranare. Funcții importante în
semnalizarea celulară sunt atribuite familiei s fingolipidelor cu subclasele
majore ceramide și sfingozine. Aceste molecule au o mare importanță în
reglarea permeabilității celulare, a apoptozei și a transformării celulare.
Acești compuși mențin astfel arhitectura celulară și mediază traficul
membranar, permițând asamblarea mașin ăriilor proteice, cum ar fi, de
exemplu, în grupuri dinamice care adună proteine specifice în p unți lipidice
[42]. Lipidele sunt foarte diverse în ceea ce privește structura, proprietățile
fizice și cantitatea lor. Scheletul de bază al s fingoidului este disp onibil prin
sinteza de novo din serină și un acizd gras cu lanț lung, acil -CoA, sau prin
scindarea sfingomielinei [43]. Lipidomii, lipidele prezente în structurile
biologice, sunt în că insuficient înțelese [ 44]. Lipidomul uman poate conține mii
de specii [ 45], în timp ce doar 20% din toate lipidele au putut fi detectate cu

14
tehnologiile existente [ 46]. Studiile ce privesc lipidomi ca țintesc să
caracterizeze conținutul de lipide, localizarea și activitatea în celule și țesuturi
[47].
Marea majoritate a lipide lor sunt extrase din celule și țesuturi lizate și analizate
cu MS fie direct în metoda shotgun, adică lipidomică "de sus în jos" cu
analizoare de înaltă rezoluție, cum ar fi Orbitrap, sau prin lipidomică de ”jos în
sus”, prin LC -MS/MS, pentru a distinge li pidele cu un raport m/z identic [ 48].
Lipidele au fost, de asemenea, analizate cu MALDI IMS [ 49]. Datele MS brute
de lipidomica pot fi analizate cu instrumente utilizate pentru metabolomică,
cum ar fi XCMS [ 50] și MZmine 2 [ 51]. Lipidele sunt identificate și cuantificate
utilizând prelucrarea datelor brute și analiza statistică, urmată de analiza și
modelarea căilor [ 52]. Inițiativele majore ale lipidomi cii includ "Strategia
metabolitilor și a căilor lipidice" (LIPID MAPS), care a stabilit standarde și a
permis o cuantificare absolută, mai degrabă decât relativă [ 53], și Mouse
Macrophage Lipidome [ 54]. În viitor, lipidomica are ca scop determinarea
profilului lipidic al unui sistem dat și integra rea acest or informații în genomică,
transcriptomică și proteom ică [55]. În ciuda progreselor considerabile în ceea
ce privește dezvoltarea metodelor și a instrumentelor, acest lucru nu se
realizează încă pentru glicosfingolipide. Datorită complexității structurale a
glicosfingolipidomului, chiar și o analiză globală a glicosfingolipidelor este încă
o provocare și nu este posibilă în cadrul activității analitice de rutină. Progrese
promițătoare în domeniu includ cercetări care să coreleze profilurile
subseturilor glicosfingolipidice cu bolile umane care abordează distr ibuția
spațială a analiților, precum și extinderea activității analitice către speciile mai
rare și cu potențial regulator [56].

2.3. GAN GLIOZID E

2.3.1. INTRODUCERE

Gangliozidele sunt glicosfingolipide care conțin acid sialic și sunt
formate dintr -o parte hidrofobă, reprezentată de ceramidă situată la interior
(adică în dublul strat lipidic ) și un rest oligozaharidic hidrofil, orientat
extracelular permițând interacționarea cu alte molecule extracelulare solubile
[38]. Acestea apar mai ales pe suprafețe le celulare ale celulelor neuronale,
unde formează un model complex, dar se găsesc și în multe alte tipuri de

15
celule. Împreună cu glicoproteinele și glicozami noglicanii, glicosfingolipidele
(GSL) sunt componente ale glicocali xului care acoperă suprafețele celulare
eucariote. Gangliozidele conțin o bază sfingoidă și unul sau mai multe zaharuri
[57]. Acizii sialici (Fig . 3) sunt zaharuri cu 9 atomi de carbon alcătuite
biosintetic din N -acetilman osamină și fosfoenolpiruvat . Cu o valoare medie pKA
de aproximati v 2,6, e i sunt mai aci zi decât majoritatea acizilor c arboxilici și sunt
încărcați negativ la cele mai multe valori fiziologice ale pH -ului. Numele de
"gangliozidă" a fost folosit prima dată de biochimistul german Klenk (1896 –
1971) și atribuit unui grup de GSL acide pe care el le -a izolat din celulele
ganglionare [ 58] și din creierul pacienților care au suferit de așa -numita
tulburare amaurotică [ 59].
Acidul sialic (Fig. 3) a fost izolat pentru prima dată din mucina
submaxilară în 1936 [ 60]. Structura sa a fost elucidată în anii '50 d e diverse
grupuri și s -a constatat că este identică cu cea a acidului N -acetilneuraminic
izolat de Klenk și Faillard. Prima structură a unui gangliozid a fost elucidată în
1963 de către Kuhn și Wiegandt [ 61]. În 1962, Svennerhol m a sugerat o
nomenclatură a gangliozidelor cerebrale [62, 63 ]. Defectele biochimice care
stau la baza bolilor cunoscute anterior ca idio patie amaurotică, gangliozidoza
GM1, Tay -Sachs și boala Sandhoff au fost identificate de Sandhoff și alții în
anii ‘60.

Acidul N-acetil -α-neuraminic Acidul N-glicolil -α-neuraminic
(Neu5Ac) (Neu5Gc)
Figura 3. Acidul sialic

2.3.2. STRUCTURA GANGLIOZIDELOR

Structural, gangliozidele combină un glican și o porțiune lipidi că și
contribuie la formarea lipidomul ui și glicomului celular [ 64]. GSL, inclusiv

16
gangliozide le, conțin o varietate mare de secvențe de carbohidrați [65]. Deși
conțin resturi de carbohidrați de diferite structuri, l egături și configurații
anomere, numai u n număr limitat de serii cu secvențe de carbohidrați
caracteristice se găsesc în organismele vii (Tab. 1). Dintre acizii sialici, acidul
N-acetilneuraminic este cel mai frecvent găsit la om, iar acidul N –
glicolilneuraminic este abundent la multe alte speci i [38].

Tabelul 1. Clase majore de glicosfingolipide
SERIE STRUCTURA
Arthro GlcNAcβ1,3Manβ1,4Glcβ1,1’Cer
Gala Galα1,4Gal β1,1’Cer
Neogala Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,1’Cer
Ganglio Galβ1,3GalNAc β1,4Galβ1,4Glcβ1,1’Cer
Globo GalNAcβ1,3Galα1,4Gal β1,4Glcβ1,1’Cer
Isoglobo GalNAcβ1,3Galα1,3Gal β1,4Glcβ1,1’Cer
Lacto Galβ1,3GlcNAc β1,3Galβ1,4Glcβ1,1’Cer
Neolacto Galβ1,4GlcNAc β1,3Galβ1,4Glcβ1,1’Cer
Muco Galβ1,3Galβ1,4Galβ1,4Glcβ1,1’Cer
Mollu Fucα1,4GlcNAc β1,2Manα1,3Man β1,4Glcβ1,1’Cer
Schisto GalNAcβ1,4Glcβ1,1’Cer
Spirometo Galβ1,4Glcβ1,3Galβ1,1’Cer

Au fost descriși mai mult de 50 de acizi sialici diferiți [ 66]. Ace știa pot fi
O-acetila ți în pozițiile 4, 7 sau 9 [ 67], dar și N -deacetila ți, O-metilați , sulfata ți
sau modifica ți prin lactonizare [ 68]. Două sisteme de nomencla turi de
gangliozide sunt utilizate în prezent pentru a atribui nume structurilor
corespunzătoare. Majoritatea cercetărilor preferă nomenclatura scurtă ,
conform Svennerholm, care a fost inițial bazată pe ordinea de migrație a
gangliozidel or din seria ganglio în cromatografie lichidă [62]. Ulterior, a fost

17
extins ă la alte structuri rădăcină. Sistemul IUPAC mai cuprinzător [ 69] este
aplicat mai puțin fr ecvent.
Potrivit lui Svennerholm, o structură miez formată din zahar uri neutr e
definesc nu mele seri ei respective, în care formele piranoz ice ale D-galacto zei
(Gal), D -N-Acetil-glucozamin ei (GIcNAc), sau D -N-Acetylgalactosamine i
(GalNAc) sunt atașate în ordine a definit ă și legate de lactozilceramidă
(Galβ1,4Glcβ1Cer) sau β -galactozilceramidă (Ga lβ1Cer). Denumirile conțin
informații despre serie ("G" = ganglio, "L" = lacto), numărul acizilor sialici ("A" =
0, "M" = 1, "D" = 2; , "Q" = 4, "P" = 5, "H" = 6, "S" = 7) și, indirect, numărul de
carbohidrați neîncărcați . Inițial s -a presupus că acest num ăr nu poate depăși 5,
astfel încât numele "gangliozidă GM1" indică faptul că ace astă specie conține
zaharuri neutre (5 – "1" = 4) din seria ganglio [38].

Această serie este definită de secvența Galβ1 -3GalNAcβ1 -4Galβ1 –
4GlcCer. Acizii sialici pot fi atașați o dată, de două ori, sau de mai multe ori, în
diferite poziții din cadrul structurilor de bază. Cel mai adesea, ele se găsesc
legate în poziția α2,3 cu restul galactozil "interior" sau "exterior" și în poziția
α2,8 cu alți acizi sialici. Gangliozida GM1 p oartă o porțiune de acid sialic
conectată la gruparea 3 -OH a restului de galactozil în poziția II a
gangliotetraoze i (Fig. 4).

Figura 4. Structura chimică a gangliozidei GM1(a)

Gangliozide din seria ganglio pot fi, de asemenea, derivate din schema
de biosinteză a gangliozidelor. În general, G GZ-urile din seria 0 nu conțin acizi
sialici atașați de galactoză în poziția II, cei din seria a conțin unul, din seria b
doi, iar cele din seria c poart ă trei reziduuri de acid sialic . Cu toate acestea,
GM1b și G D1c au numele "b" și "c", deși ambele sunt gangliozide din seria 0
(Fig. 5).

18
Un derivat modificat al GM2 care conține taurină în legătură amidică cu
grupul carboxyl al acidului sialic a fost identificat în creierul pacienților cu boală
Tay-Sachs [ 70]. Grup urile GSL de tip hibrid și gangliozidele cu modificări
postglicozila re adaugă o complexitate suplimentară acestei clase de substanțe
[71]. Majoritatea gangliozidelor găsite la mamiferele adulte aparțin seriilor
ganglio, gala, lacto și neolacto. În timpul d ezvoltării, se formează, de
asemenea, gangliozide cu alte structuri de bază, cum ar fi antigenul embrionar
SSEA -4, o gangliozidă din seria globo [ 72].

Figura. 5. Schema de biosinteză a gangliozidelor, adaptare după [ 73]

Figura 6 prezintă structura gangl iozidei GQ1b, una dintre cele mai
abundente gangliozide din creierul uman adulți (G = seria ganglio, Q = 4 acizii
sialici, 5 – 1 = 4 reziduuri de carbohidrați neutri și seria b = 2 acizi sicilici atașați
la galactoza internă ).

19

Figura. 6. Structura chim ică a g anglio zidei GQ1b

Această clasă de gangliozid e pot apărea în neuronii măduvei spinării
[74, 75] și poate determina formarea de autoanticorpi , ca răspuns la diferitele
forme de sindrom Guillain -Barr'e [ 76, 77 ] sau ale altor neuropatii [ 78]. La adulț i,
gangliozidele seriilor globo apar pe eritrocite le umane [ 79], în rinichi [ 80] și pe
diferite celule stem [ 81]. De exemplu, SSEA -4 este exprimat în celulele stem
mezenchimale derivate din sângele din cordonul ombilical [ 82]. Cu excepția
echinodermelor (o rganisme marine de simetrie tipic pentadiale), gangliozidele
sunt de obicei absente în organismele nevertebrate lor. În neuronii de cultură,
gangliozidele echinodermice prezintă activități neuritogene și inhibitoare ale
creșterii. În acest sens, ele sunt ma i puternice decât alte gangliozide [ 83, 84 ] și
potențează efectul neuritogen al factorului de creștere a l nervilor.
Heterogeneitatea nu se găsește numai în partea glicanului, ci și în partea de
ceramidă. Aceasta poate fi alcătuită din diferite baze sfingoi de [85], sfinganină,
sfingozină și fitosfingo zină cu lungimi diferite ale lanțului, care pot fi modificate
în continuare prin O-acetilare [ 86]. La animalele mai mari, sfingo zinele C18- și
C20- sunt cele mai abundente baze sfingoide ale gangliozide lor. Aciz ii grași
aflați în porțiunea ceramid ică a gangliozidelor sunt în mare parte saturați. Acizii
grași α -hidroxilați [ 87] nu se găsesc atât de frecvent în gangliozidele cerebrale,
dar sunt mai abundenți în gangliozide le din intestin, ficat , rinichi și în GM4.
Pentru a specifica lipoforma unui gangliozid, se fo losesc denumiri cum ar fi
(d18:1/18: 0) GM3 pentru un II3Neu5AcLacCer cu o sfingozină (d = dihidr oxi, 1
= o legătură dublă, (18: 0) rest de acid stearic în porțiunea de ceramidă.
Consecințele funcționale ale heterogenităților în componenta lipidică
sunt în mare parte necunoscute, dar partea lipidică poate masca funcția
recepto rilor gangliozidici prin interacțiunea cu colesterolul membran ar [88, 89 ].
Ca un alt exemplu, porțiunea ceramidic ă a GM1 dictează trans portul retrograd

20
al toxinei holer ice legată la GM1 . Secvențializarea gangliozidelor în ceea ce
privește structurile glican ilor și ceramid elor este din ce în ce mai imoprtantă în
analiza gangliozidelor.

2.3.3. NOMENCLATURA GANGLIOZIDELOR

Deși au fost înce rcate și alte alternative de denumire, nomenclatura
dezvoltată de Svennerholm [90] (Tab. 2) este încă cel mai frecvent utilizată
datorită raționalității, simplității sale și ușurinței de memorare .

Acest sistem prevede următoarele reguli de bază :
Tabelul 2. Nomenclatura gangliozidelor conform sistemul ui Svennerholm
Litera G Literele
M, D, T, Q, P, H , S Numerele
1, 2, 3, 4 Literele
a, b, c
Se atribuie
gangliozidei Se referă la numărul
resturilor de acid
sialic care se află
atașat la structura
oligozaharidi că,
respectiv mono -, di-,
tri-, tetra -, penta -,
hexa – și hepta –
sialogangliozide Reprezintă ordinea
de migrare a
gangliozidelor
supuse
cromatografiei în
strat subțire. De
exemplu, ordinea
de migrare a mono –
sialogangliozidelor
este:
GM4>GM3>GM2>
GM1
(adică RF GM4>
RF GM3> RF
GM2> RF GM1). Simbolizeză calea prin
care molecula a fost
sintetizată, poziția de
legare a acizilor sialici
fiind diferită în cele 3
căi:
– de exemplu în GM1b,
restul de acid sialic este
legat de un rest de
galactoză de la capătul
termi nal al lanțului
oligozaharidic;
– în cazul GM1a, acidul
sialic este legat de restul de
galactoza internă

Comisia IUPAC -IUB a stabilit o nomenclatură mai detaliată și mai
complexă a gangliozidelor [91] (Tab.3) . Numerele roman e I-IV indică p oziția
față de c eramidă a restului glucidic de care se leagă acidul sialic. P oziția
grupării hidroxil a restul ui glucidic care form ează legături α-glicozidice cu acidul
sialic este indicată de către un corespondent în cifre arabe al numărului roman.

21

Tabelul 3. Nomencl atura gangliozidelor. Comparație între sistemul Svennerholm [90] și IUPAC -IUB [91]
Nomenclatura Svennerholm Nomenclatura IUPAC -IUB
LacCer Galβ4Glcβ1Cer
GA2, Gg3Cer GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer
GA, Gg4Cer Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer
nLc4Cer Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Gl cβ1Cer
Lc4Cer Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer
GM4 I3-α-Neu5Ac -GalCer
GM4 I3-α-Neu5Ac -GlcCer
GM3 II3-α-Neu5Ac -LacCer
GM3 II3-α-Neu5Gc -LacCer
GD3 II3-α-(Neu5Ac)2 -LacCer
GD3 II3-α-(Neu5Gc)2 -LacCer
GD3 II3-α-(Neu5Ac, Neu5Gc)2 -LacCer
GT3 II3-α-(Neu5Ac)3 -LacCer
GM2 II3-α-Neu5Ac -Gg3Cer
GD2 II3-α-(Neu5Ac)2 -Gg3Cer
GM1a II3-α-Neu5Ac -Gg4Cer
GM1b IV3-α-Neu5Ac -Gg4Cer
GalNAc -GM1b IV3-α-Neu5Ac -Gg5Cer
LM1 IV3-α-Neu5Ac -Lc4Cer
LM1 IV3-α-Neu5Gc -Lc4Cer
GD1a IV3-α-Neu5Ac,II3 -α-Neu5Ac -Gg4Cer
GD1b II3-α-(Neu5Ac)2 -Gg4Cer
LD1 IV3-α-(Neu5Ac)2 -Lc4Cer
GT1a IV3-α-(Neu5Ac)2,II3 -α-Neu5Ac -Gg4Cer
GT1b IV3-α-Neu5Ac,II3 -α-(Neu5Ac)2 -Gg4Cer
GT1c II3-α-(Neu5Ac)3 -Gg4Cer
GQ1b IV3-α-(Neu5Ac)2,II3 -α-(Neu5Ac)2 -Gg4Cer
GQ1c IV3-α-Neu5Ac,II3 -α-(Neu5Ac)3 -Gg4Cer
GP1b IV3-α-(Neu5Ac)3,II 3-α-(Neu5Ac)2 -Gg4Cer
GP1c IV3-α-(Neu5Ac)2,II3 -α-(Neu5Ac)3 -Gg4Cer

2.3.3 .1. Nomenclatura ionilor fragment folosită pentru a determinarea
secvența gangliozidică

Pentru d eterminarea secvenței polizaharidice se utilizează convenția de
notare stabilită de Domon și Costello [ 92]. Fiecare polizaharid este alcătuit
dintr-un capăt reducător și unul nereducător, care poate fi legat de o proteină

22
sau un lipid (Fig. 7) . Partea neglucidică a lanțului polizaharidic este denumită
aglicon . Fragmentele rezultate după scindarea acestor legături se notează cu
Z și Y dacă conțin capătul reducător (agliconul) și cu B și C dacă conțin
capătul nereducător . Se notează cu Z i, Y i fragmentele care conțin ceramida,
respectiv cu B 1, C 1 fragmentele care conțin capătul nereducător . Fragmentelor
Zi, Y i care aparțin secvenței oligozaharidice liniare celei mai lungi, primesc
indicativul α, iar cele care conțin ramificația mai scurtă li se adaugă indicativul
β. Fragmentele de inel se notează ca și în cazul glicoconjugaților cu X i, dacă
conțin ceramida și cu A i, dacă conțin capătul oligozaharidic, însoțite de
asemenea de indici prezentaț i mai sus . Atât în notația lui A cât și a lui X apar
indici superiori care indică în dreptul cărei legături din heterociclu are loc
scindarea. De exemplu 2,4A2 – această notație se interpreteaz ă astfel :
fragmentul respectiv aparține capătului nereducător, legăturile dintre atomii de
carbon numerotați cu 2 și 4 s-au scindat la nivelul celui de -al doilea zah ar.

A
B

23
Figura 7. A, B, C. Nomenclatura scindări lor într -o secvență oligozaharidică (adaptare după [ 92])

2.3.4. LOCALIZAREA GANGLIOZIDELOR ÎN ORGANISM

În creier, expresia gangliozidelor se corelează cu neurogene za,
sinaptogenez a, transmi trea sinaptică și proliferare a celulară [ 93, 94 ]. În
neuronii muri ni ai hipocamp usului axonogeneza (dar nu și dendritogeneza )
este însoțită de o creștere a sintezei gangliozidelor complexe și de o trecere de
la seria a la seria b [95]. În țesuturile extran eurale , conținutul de gangliozide
este de până la de două ori mai mic decât în creier . Concentrațiile relativ
ridicate de gangliozide din seria ganglio se găsesc în măduva osoasă,
eritrocite, intestin, ficat, splină , testicul și rinichi. Gangliozidele celulare
formează complexe cu tipare specific de glicani. Acestea nu sunt stabile în
timp, ci se schimbă odată cu procese le fiziologice și patofiziologice, cum ar fi
creșterea celulelor, diferențierea, transformarea virală, oncogeneza,
embriogeneza [ 96, 97], lactația sau progresia tumor ală [98]. Gangliozidele din
seria gan glio se găsesc în special în sistemul nervos, unde contribuie la 10 –
12% din conținutul de lipide [ 99]. În timpul dezvoltării creierului, modelul
gangliozidelor se modifică de la prevalența gangliozidelor simple GM3 și GD3
la cele mai complexe cum ar fi GD1 a și GT1b [ 100]. Conținutul de gangliozide
și compoziția creierului se schimbă și în timpul îmbătrânirii . În ciuda acestui
fapt, concentrațiile GQ1b, GT1b și GD1b cresc cu vârsta în detrimentul GM1 și
GD1a [ 101]. Există doar supozi ții privind consecințele funcționale ale acestor
schimbări [ 102].
Gangliozidele se găsesc, de asemenea, în ser. Aici se regăsesc în
special GM3, GD3, GD1a, GM2, GT1b, sialilneolactotetraosilceramidă (Figura
9), GD1b și GQ1b, unde 98% dintre aceștia sunt transporta te prin lipoprot eine
serice, predominant prin LDL (66% ), HDL ( 25%) și VLDL (7%) [ 103]. Celular,
majoritatea gangliozidelor se află în membrana plasmatică [ 104]. Cu toate C

24
acestea, gangliozidele apar de asemenea în membranele organel are, cum ar fi
mitocondrii le, unde GD3 reglează apoptoza [ 105] și în nucleu, unde s unt
implica te în echilibrul Ca2+ [106]. Gangliozide le ce contin acizii sialici O -acetilați
apar în special în celulele și țesuturile în creștere și sunt considera te markeri
oncofetali prezenți pe diferite tumori [107]. Ele servesc, de asemenea, ca
receptori pentru virusurile gripale C sau coronavirusuri [ 108]. Un alt acid sialic
modificat este acidul N -glicolil neuraminic (Neu5Gc) . Cu excepția anumitor
tumori și a fătului, acesta se găsește numai în cantități mici în țesuturile umane
[109]. Determinarea gangliozidelor care conțin Neu5Gc și Neu5Ac este
realizată fie prin tehnici clasice cromatografice combinate cu anticorpi marcați
[110], fie prin tehnici de o mai mare sensibilitate – cromatografie cuplată cu
ESI-MS [111]. O aplicație potențială este detectarea imunochimică a [Neu5Gc]
GM3 ca biomarker al cancerului pulmonar cu celule nemodulate [ 112]. De
asemenea, lactonele au fost detectate în diferite țesuturi, de exemplu, GD3
lactona în creierul de șoarece [ 113] și GD1b lactona în creierul uman [ 114].
Lactonele sunt mai imunogene decât gangliozidele [ 115] și se găsesc
pe celulele tumorale, cum ar fi melanomul, ca antigeni asociați tumorii.
Diferențele temporale și spațiale sunt de asemenea observate pentru partea
lipidică a gangliozidului. În culturile de celule neuronale nediferențiate,
gangliozidele cu sfingozină C20 sunt prezente doar în cantități mici, dar
conținutul acestora crește odată cu debutul diferențierii celulelor [ 116]. În
creierul de șobolan, fracțiune a de gangliozide care conțin sfingozină C20
crește od ată cu vârsta [ 117] în cerebel [ 118] și creierul frontal.
Diferențele spațiale în ceea ce privește lungimea lanțului de bază a
bazei sfingoidice au fost, de asemenea detectate la șoareci . În timp ce
gang liozidele conținând specii C18 au fost distribuite uniform în creierul frontal,
speciile C20 sunt selectiv localizate de -a lungul proi ecțiilor hipocampului
entorhinal [ 119]. Compoziția de bază a acidului gras și a bazei sfingoidice este
de asemenea diferit ă între nervii senzoriali și motori uman i [120].

2.3.5. ANALIZA GANGLIOZIDELOR

În prezent, analiza cantitativă și calitativă a gangliozidelor este
întegrată în cadrul lipidomicii utilizând spectrometria de masă drept tehnologie
cheie pentru analiza acest ora [121]. În general, gangliozidele sunt izolate din
țesuturi și fluide ale corpului prin extracție cu cloroform -metanol [1 22, 123].
Eficacitatea de extracție poate crește atunci când cantități mici de apă sunt
adăugate în solventul de extracție [ 90] utilizând amestecul cloroform: metanol:

25
apă (5: 5: 1) [ 124]. Atunci când extracția este urmată de repartitie , cum este
protocolul dezvoltat de Folch et al. [ 125], gangliozide – în contrast cu
majoritatea celorlalte clase de lipide – se separă în faza apoasă s uperioară. De
acolo, ele pot fi izolate printr -o extracție în fază solidă și separate de GSL
neutre prin cromatografie cu schimb de ani oni [1 26], cum ar fi cu DEAE
(dietilaminoetil) Sephadex [ 127]. O-acetilarea acizilor sialici și, de asemenea,
lactonizare a gangliozidelor [ 128] sunt modificări care se pierd în condiții
alcaline. Acestea sunt adesea aplicate pentru a îndepărta glicerofosfolipidele
care conțin legături ester ice cu acizi grași [1 29]. Dacă se dore sc informații
despre aceste modificări, ganglioz idele din țesuturi pot fi determinate fără
tratament alcalin, de ex emplu, după extracția cloroform/ metanol într -un raport
de 1: 2 și o etapă de partiție ulterioară [1 30]. Separarea gangliozidelor în funcție
de compoziția lor de glicani se realizează prin cr omatografie în strat subțire
(TLC) [1 31] și prin HPLC și alte tehnici care pot fi cuplate cu spectrometria de
masă [1 32].
Aceste cupl ări facilitează identificarea lor prin spectrometrie de masă și
sunt necesar e pentru caracterizarea lor prin colorarea cu a nticorpi adecvați
[133, 134], lectine sau alte proteine [135]. Cuantificarea poate fi obținută prin
colorare și densitometrie sau , dacă sunt disponibile substanțe standard
adecvate , prin spectrometrie de masă. Deoarece căile de biosinteză
generează heterog enități atât în partea lipidică, cât și în cea a glicanului,
analiza cuprinzătoare a gangliozidelor este o sarcină foarte solicitantă în cadrul
lipidomicii [ 136]. În plus față de glicoforme care sunt, de asemenea, bine
cunoscute din analiza glicoproteine i, "lipoformele" [ 137] devin tot mai
importante pentru a înțelege metabolismul și funcția gangliozidelor. Au fost
elaborate diferite protocoale de determinare a gangliozidelor prin spectrometrie
de masă [1 36]. Ele se bazează în mare măsură pe spectrometria de masă prin
electrospray ca tehnică de ionizare deși și ionizarea prin MALDI joacă un rol
important . Metodele disponibile variază de la cele preanal itice la manipularea
datelor bioinformatice și includ metode de imagistică utilizând MALDI și
spectrometri a de masă ionică secundară (SIMS) pentru a determina distribuția
spațială a anali ților [136]. În plus față de constituția lor, puțin se știe despre
conformația gangliozidelor în mediul lor natural, legat e de membrană.

2.3.6. BIOSINTEZA GANGLIOZIDELOR

Diversitatea glican ilor de pe suprafaț a celulară, inclusiv cea a
gangliozidelor, este generată în aparatul Golgi [1 38], iar heterogenitățile din

26
partea ceramidelor rezultă din biosinteza ceramidei la nivelul reticulul
endoplasmatic (ER). Sinteza de novo a g angliozidelor poate fi diferențiată de
procesele de salvare [ 139], în care se reciclează acizii sialici, zaharurile, acizii
grași și bazele s fingoide . Ultimul proces poate predomina de departe în celule
diferențiate.
Biosinteza gangliozidică începe cu form area ceramidei la nivelul
stratului citoplasmatic al membranei RE [ 140]. Prima etapă, condensarea L –
serinei și a unui acid gras activat prin coenzima A (CoA) este catalizată de
serinpalmitoiltransferaza piridoxal fosfat dependent ă (SPT ) [141]. Încorporarea
L-serinei în GSL poate fi utilizată pentru a monitoriza biosinteza lor de novo ,
folosind L -serină radiomarcată în poziția 3 (carbonul din poziția 1 este pierdut
ca dioxid de carbon). În creier, furnizarea externă de L -serină de către astrocite
este esenți ală pentru biosinteza lipidelor neuronale și dezvoltarea creierului
[142]. În concordanță cu această observație, rozătoarele modificate genetic cu
deficit de fosfoglicerat dehidrogenază necesare pentru formarea de L -serină
din D -glucoză prezintă niveluri a le gangliozidelor drastic reduse, defecte ale
morfogenezei creierului și o durată de viață mult scăzută [ 143]. Următoarea
etapă în biosinteza bazei sfingoide este reducerea dependentă de NADPH a 3 –
cetofinganinei la s finganină cu 3 -cetosfinganin -reductază, urmată de acilarea
sfinganinei la dihidroceramide cu lungimi diferite ale lanțurilor [1 44]. Totodată,
alte baze s fingoide sunt acilate cu N -aciltransferaze ale familiei lass. Lass 1
codifică ceramid -sintaza 1, care este exprimată în creier și implicată în
formarea ancorei membranare a gangliozidelor. La șoareci, mutațiile spontane
recesive din gena lass1 sunt asociate cu ataxie cerebelară și degenerare cu
celule Purkinje [1 45]. Deși partea ceramidică a gangliozidelor cerebrale conține
în majoritate acizi gr ași nehidroxilați, aparent toți membrii familiei lass sunt de
asemenea capabili să transfere acizii grași di -hidroxi corespunzători [1 46].
Dihidroceramidele sunt dehidrogenate la ceramidă prin dihidroceramid –
desaturaza des1, [1 47] sau hidroxilate la fitoce ramide prin des2. Ceramida
este precursorul comun al GSL și sfingomielinei și este transportat la aparatul
Golgi, cel puțin parțial, prin intermediul unor proteine , mai precis, de proteina
de transport CERT [ 148].
Sinteza GSL continuă prin transferul trep tat al unităților de
monozaharide activate de nucleotide, mai întâi pe ceramidă și apoi la GSL cu
lanțuri crescătoare de glicani . Gangliozidele complexe și glicoform ele GSL pe
suprafețele celulare eucariote sunt generate numai de câteva enzime care
acțione ază într -o cale biosintetică combinatorie [14 9]. Primele
glicoziltransferaze implicate în biosinteza gangliozidelor au fost caracterizate în
laboratoarele Roseman și Basu [1 50]. Conform numărului de acizi sialici

27
conectați la restul galactozilic "intern", gangliozidele sunt clasificate în mem brii
seriei 0, a, b și c . Seria B de gangliozide conține secvența
Neu5Acα2.8Neu5Ac, care de obicei nu se găsește în glicoproteine. M embrii
mai vechi ai acestor sub serii diferite pot fi formați prin acțiunea acelorași
glicoziltransferaze, care au mai puțin ă specificitate decât cele care acționează
inițial [151].
Glicozil și sialiltransferaze le [152] din calea biosintetic ă a gangliozid elor
sunt exprimate într -o celulă tip după un model dependent de dezvoltare.
Tiparul g angliozid elor se schimbă în timpul dezvoltării creieru lui [15 3] aceste
diferențe putând fi oservate comparativ, între diferite tipuri de celule neuronale
[154]. În plus, modelele de gangliozide variază între diferitele tipuri de celule și
se schimbă odată cu diferențierea acest ora. GSLs inclusiv gangliozide le sunt
formate prin biosinteză la membranele intracelulare de unde acestea sunt
transportate în membrana plasmatică prin difuziune membran ară [155]. O
diferență principală între biosinteză gangliozid elor în aparatul Golgi și
degradării acestora în compartimentul endol izozomal este aceea că, în timpul
formării GSL, gl icoziltransfera za legată de membrană interacționează cu
substraturi le glicolipidice ale acestora prin difuziune în două planuri
dimensionale ale bi-stratului lipidic. Prin urmare, vitezele reacți ilor pot deveni
independente de volumul de reacție și se supun cinetic ii enzimatic e
bidimensional e. Ca o consecință, glicoziltransferazel e cărora le lipsește
domeniul transmembranar pierd cea mai mare part e din activitatea lor față de
substrat ele legate de membrană [15 6]. În timpul degradării în endozomi și
lizozomi, glicozidazele sunt enzime solubile, iar substraturile sunt legate de
membrană. În plus față de biosinteza gangliozidelor în aparatul Golgi, ex istă,
de asemenea, indicii de formare a gangliozidelor prin intermediul
glicoziltransferazelor asociate membranei plasmatice [15 7].

2.3.6.1. Seria Gala

În clasa monoglicozilceramide lor, gluco zilceramida (GlcCer) și
galactozilceramida (GalCer), numite cerebrozide, resturile hexozil sunt
prezente în configurația β -anomerică. GalCer -urile cu configurație a lfa apar
doar la organismele inferioare [ 158] și sunt foarte imunogene pentru mamifere
[159]. Cele mai multe gangliozide sunt derivate biosintetic din G lcCer; numai
gangliozidul GM4 este derivat din GalCer. Gangliozid a GM4 este o
componentă minoră a gangliozidelor creierului uman [16 0], unde este
localizat ă în mielină [16 1]. Apare, de asemenea, în eritrocite, rinichi și intestin

28
și este frecventă la unele specii de pești. Cu toate acestea, membrii cei mai
des întâlniți în seria gala sunt GalCer și sulfatida (GalCer -3-sulfat) în
oligodendrocite, ce lule Schwann, rinichi, testicul și intestin. Acestea sunt
prezente în concentrații mari în straturile multilame lare ale mielinei, unde sunt
necesare pentru aderența glială [16 2], aparent prin interacțiunea glucidică între
sulfatid ă și GalCer ale diferite lor straturi de mielină [16 3]. Lipidele mielinice
conțin în cea mai m are parte acizi grași 2 -hidroxi [164], prezenta lor în GSL din
seria gala contribui nd la interacțiunile glican -glican [165]. Spre deosebire de
GalCer -sintaza, GlcCer -sintaza pare a fi dispensabila pentru oligodendrocite
[166]. Etapele biosintezei GSL [167] din seria gala – formarea sulfatidei,
digalactosilceramid ei și gangliozid ei GM4 au loc în lumenul aparatului Golgi
[168]. Spre deosebire de cele mai multe glicoziltransferaze , care sunt proteine
transmembranare de tip II, galactoziltransferaz a ceramid ei este o proteină
transmembranară tip I cu do meniul catalitic pe partea luminală a RE [1 69].
Conform datelor obținute în urma experime ntelor pe peștii zebră și
șoareci, se poate concluziona că GM4 poate fi format ă acțiunea ST3Gal V,
care poate să producă GM3 (Fig. 8) . Formarea GM4 și GM3 pare să depi ndă
de disponibilitatea precursorilor lor, GalCer și LacCer [17 0]. Se știe puțin
despre funcția GM4 , dar s -a demonstrat ca poate interacționa cu proteina din
compozitia mielin ei, prezintă proprietăți imunosupresoare și poate preveni
encefalomielita alergic ă experimentală la cobai [17 1].

2.3.6.2. Gangliozide derivate din glucozilceramidă

Primul pas în biosinteza celor mai multe gangliozide este transferul
unui re st de glucoză de la UDP -glucoză la ceramidă catalizată de UDP –
glucoză: glucosiltransferaza [ 172]. Deși sinte tazele GlcCer și GalCer
catalizează reacții similare, cADN -urile lor nu prezintă nici o omologie de
secvență. Glucosiltransferaz a ceramidei este o proteină transmembranară de
tip III. Formează dimeri sau oligomeri necovalenți [17 3] cu domenii le lor
catalitice C-terminale în cito sol [17 4]. Deoarece formarea GlcCer are loc pe
fața citoplasmatică [17 5] și cea a LacCer pe situsul luminal al membranei Golgi
[176], glucozilceramida trebuie translocată de -a lungul membranei. Aceasta
este mediată de o flippază de identitate necunoscută: transportorii ABC, ABC –
B1 și -C1, translocă analogii GlcCer cu lanț scurt prin membrana Golgi [ 177].
Translocarea transversală poate fi efectuată după transportul GlcCer de către
proteina de transfer al l ipidelor citopl asmatice FAPP2 fie la RE [1 78], unde
aceasta ar pute a fi translocată printr -o flipp ază ne caracterizată încă [1 79], fie
prin aparatul Golgi [18 0].

29
Biosinteza gangliozidelor superioare are loc pe fața luminală a
aparatului Golgi [18 1], astfel încât lanțuril e de glicani sunt orientate
extracitopla smatic. LacCer este sintetizată prin intervenția
galactoziltransferaz ei I, care transferă un re st de galactoză din galactoză -UDP
la glucosilceramidă [18 2]. Alte resturi de carbohidrați sunt transferate treptat
spre l anțurile de glicani.
LacCer și derivații săi sialilați, hematozidele (Fig. 8, 9) GM3, GD3 și
GT3 servesc drept precursori pentru gangliosidele complexe ale seriilor 0 -, a-,
b-, și c -. Aceste serii diferite nu conțin nici un rest de acizi (seria 0), un res t
acidic (a -serie), două resturi (din seria b) sau trei reziduuri de acizi saliți legați
la poziția 3 a restului galactozil "intern". La creierul de mamifer adult,
gangliozidele din seriile 0 și c se găsesc numai în cantități mici.

Figura 8. Structura chimică a gangliozidei GM3

Figur a 9. Structur a chimică a hemato zidelor

În boala Parkinson, lipidele anionice și mai ales GM1 inhibă agregarea α –
synucleinei la fibrili citotoxici [ 183]. Șoarecii cu deficit de ST8Sia I (GD3 –
sintază) nu sunt capabili să f ormeaze gangliozide GD3 și niciuna din seriea b.
Ei au o durată normală de viață și nu au defecte detectabile de dezvoltare

30
[183] . Când acești șoareci au fost încrucișați cu șoareci care poartă o genă
întreruptă B4GalNT I, au rezultat șoareci dublu mutanț i care exprimau numai
gangliozida GM3 ca gangliozidă majoră. Acești șoareci ce posedă doar GM3,
sunt extrem de susceptibili la stimuli auditivi, dezvoltă crize letale și afișează
un fenotip de moarte subită [ 184]. Șoarecii dublu -knockout deficienți în
B4GalNT I și ST3Gal V (GM3 -sintază) nu sunt capabili să formeze niciun
gangliozid din seria ganglio. Aceste animale sunt grav bolnave și prezintă
nivele crescute de LacCer, LacCer -sulfat și doar urme de alte gangliozide care
se regăsesc și în creierul normal [184].

2.3.7. DEGRADAREA GANGLIOZIDELOR

Degradarea constitutivă a gangliozidelor are loc în endozomi și
lizozomi. În plus, sialidaza asociată membr anei plasmatice Neu3 [ 185] poate
degrada gangliozidele și este puternic exprimată în celulele melanomului [ 186].
Chiar și plicul nuclear conține sialidaze, cu Neu3 la interior și Neu1 în
membrana nucleară exterioară [187 ]. Degradarea gangliozidelor lizozomale
are loc după endocitoza unor părți ale membranei plasmatice la membranele
intraendozomale, intralisozom ale și agregatele lipidice asociate. Acest lucru
necesită prezența glicozidazelor adecvate [ 188], cu un pH adecvat, în unele
cazuri și a proteinelor responsabile de transferul lipidic dar și a unei compoziții
adecvate a membranelor ce conțin gangliozide [ 189].
După cum s -a propus în 1992, în endozomii și lizozomii există două
grupuri diferite de membrane [ 190, 191 ] (Fig. 10).

Figura 10 A. Polii lizozomali ai membranei (a daptare după [ 191])

31
Acestea diferă în ceea ce privește compoziția și funcția lipid elor dar și a
proteinelor. În timp ce membrana luminală derivată din membrana plasmatică
este degradată, membrana perimetrală este protejată prin diferite mijloace
[192]. Aceast fapt asigură integritatea compartimentului, care poate fi eliminat
în timpul a poptozei [ 192]. O lipidă marker care se găsește exclusiv în
membranele luminale [ 193] este bis (monoacilglicero) fosfat ( Fig. 10B),
incorect denumit chimic și acid lizobisfosfatidic (LBPA). BMP joacă un rol cheie
în degradarea membranei [ 194] și se formeaz ă din fosfatidilglicerol [ 195].
Datorită configurației sale, sn1 este degradată lent numai prin lipaze și
persistă pe membranele interioare, unde poate ajunge până la 70% din totalul
fosfolipidelor [ 196].

Figura 10 B. Bis (monoacilglicero) fosfat

Cu o valoare pKA estimată de aproximativ 2, BMP este încărcat negativ
chiar și la pH lizosomal. Studiile in vitro arată că sunt necesare lipide încărcate
negativ pentru legarea proteinelor lizozomale la membrane. Deși alte lipide
încărcate negativ, cum ar fi do lichol fosfat sau fosfatidilinozitol, pot fi prezente
pe membranele luminale, BMP pare a fi factorul cheie care distinge această
membrană de schimb de membrana perimetrală. Pe de altă parte, membrana
perimetrală a endozomilor și a lizozomilor prezintă o co mpoziție lipidică și
proteică total diferită. Este protejată de un glicocalix format din proteine
integrale membranare înalt N -glicozilate [ 197], iar gangliozida GM3 prezentă în
această membrană este rezistentă la degradare [ 198]. Degradarea
gangliozidelor începe cu acțiunea enzimelor care scindează unitățile de
monozaharide situate la capătul nereducător al lanțurilor de glicani ai
gangliozidelor. Acest lucru se întâmplă într -o manieră secvențială, ceea ce
explică diferitele boli umane asociate cu defecte le acestei căi.
Glicozidazele sunt enzime solubile și se găsesc în lumenul endozomilor
și lizozomilor. Ca substratu ri de glicozidază, GSL cu patru sau mai puține
resturi carbohidrate necesită prezența suplimentară a glicoproteinelor lipidice
mici de legare , fie proteina activatoare de GM2, fie una din cele patru sapozine
A-D. Acestea acționează în parte ca proteine de transfer al lipidelor care extrag

32
substraturile legate de membrană și le prezintă hidrolazelor. Acestea au
diferite specificități și mecanism e de acțiune [ 199]. În cazul gangliozidelor, cel
puțin proteina GM2 -activatoare și sapozina -B participă la degradarea GM1,
GM2 și GM3. Sapozina -A [200] și sapozina -B [201] extrag lipidele membranare
mult mai bine din membranele care sunt bogate în BMP și s ărace în colesterol.
De asemenea, BMP mărește capacitatea activatorului GM2 de a solubiliza
lipidele [2 02] și stimulează hidroliza membranei legate de GM1 prin GM1 β –
galactozidază [2 03] și a gangliozidei GM2 cu β -hexosaminidaza A [2 02]. BMP
stimulează, de asemenea, hidroliza sulfatidei renale cu seria ganglio -GS2 SM2
(sulfat de gangliotriaosilceramidă -II3) cu β -hexosaminidazele A și S în prezența
activatorului GM2 [ 204]. Colesterolul, care este cunoscut pentru rolul său în
stabilizarea bistraturilor lipidic e, trebuie transportat din membranele
intraendozomale la proteina NPC1 rezidentă în membrana perimetrală
endozomală de către proteina NPC2. In vitro, acest transfer este puternic
stimulat de BMP și puternic inhibat de sfingomielină [2 05].

2.3.8. PATOBIOCH IMIE

Degradarea gangliozidelor este afectată în gangliozidoze și secundar și
în alte boli de stocare a sfingolipidelor [2 06]. Principiile care reglementează
patogeneza [ 207] și terapia sfingolipidozelor [ 208] sunt valabile și pentru bolile
de depozitare a gangliozidelor. Factorii cheie sunt activitatea reziduală a
sistemului de degradare, care determină evoluția bolii [ 209] și expresia celulară
specifică a materialului de stocare. Datorită expresiei celulare de tip specific a
gangliozidelor, sistemul nervo s central este în special afectat în gangliozidoze.
În general, în sphingolipidoze, lipidele de stocare coprecipită alte substanțe
hidrofobe prezente în compartimentul endolizozomial, lipide și proteine, ca
produse de stocare secundară [2 06]. În boala Niem ann-Pick, tipul C, care este
un defect primar al transportului colesterolului endosomal, se observă o
acumulare secundară de sfingomielină și de gangliozide, care are și relevanță
terapeutică [ 210].
Depozitarea secundară a gangliozidelor GM2 și GM3 apare ș i în boala
Hurler [2 11] (mucopolizaharidoza de tip I; deficiență de α -Liduronidază).
Depozitarea lipidelor produce un fel de blocaj [ 212], care interferează cu
transportul lipidic și funcția lizozomală. Substanțele primare și secundare
depozitate pot afect a furnizarea de nutrienți prin intermediul sistemului
endolizozomal. Pe mode le experimentale de șoareci cu GM1 și GM2
gangliozidoză și boala Sandhoff, homeostazia fierului este afectată. La aceste

33
animale, suplimentarea cu ioni fier au crescut speranța de viață cu aproape
40% [2 13]. Degradarea gangliozidelor este afectată în gangliozidoze. Într -o
altă boală, galactosialidoza, defectul primar al carboxipeptidazei A (proteină
protectoare), duce la o pierdere secundară a β -galactozidazei și a Neu1
sialidazei, însoțită de depozitarea GM1 [ 214]. Gangliozidoza este cauzată de
defecte ale genelor care codifică glicozidazele sau a proteinelor responsabile
de transferul lipidic care sunt necesare pentru degradarea lizozomală a
gangliozidelor. Baza teoretică a abordă rilor terapeutice în cazul
gangliozidozelor este "teoria pragului" [2 15], care precizează că raportul
afluxului de substrat în lizozomi și capacitatea de degradare determină evoluția
bolilor. Ambii parametri pot fi abordați prin diferite moduri terapeutice [216].
În plus față de bolile moștenite, concentra țiile gangliozidelor pot fi de
asemenea modificate în mai multe boli dobândite [ 217]. De exemplu,
gangliozidele joacă roluri imoprtante în bolile neurologice cum ar fi boala
Alzheimer [ 218], Parkinson sau boala Huntington [ 219]. În cancer, expresia
gangliozidelor poate fi de asemenea modificată în celulele tumorale cu impact
asupra semnalizării și a interacțiunilor tumoră -gazdă [ 220]. [Neu5Gc] GM3
[221], GD2, GD3, GM2 și fucosilGM1 sunt considerate antigen e asociate
tumorii [ 222] și sunt ținte pentru imunoterapie în cancer [ 223]. De asemenea,
mai multe neuropatii, incluzând forme variate de sindrom Guillain -Barr'e și
Miller -Fisher sunt cauzate de anticorpi serici împotriva gangliozidelor [ 224]. În
trecut, g angliozide izolate din creierul bovin au fost investigate și apoi aplicate
la subiecți umani pentru îmbunătățirea reparării neuronale și pentru tratamentul
accidentului vascular cerebral [ 225]. De asemenea, a fost evaluată aplicarea
directă a gangliozidei GM1 în creierul pacienților cu boala Alzheimer [ 226].
Inhibarea biosintezei gangliozidelor în tratamentul rezistenței la insulină [ 227],
interferența legării microbiene la gangliozide [ 228] sau reducerea
neurotoxicității cu Liga20 [ 229] au fost de asemenea procese studiate și
prezentate în literatură .

2.3.8 .1. Aspecte funcționale

O mulțime de funcții au fost atribuite ganglio zelor de -a lungul timpului .
În general, gangliozidele își mediază funcția prin interacțiunea cu molecule de
legare extra membranare din afara celulei (interacțiunea "trans") sau prin
influențarea proprietăților proteinelor de pe aceeași membrană (interacțiunea
"cis") [ 230]. Interacțiunile "trans" se produc între partea glicanică a
gangliozidelor pe de o parte iar pe alta, cu lectinele. De asemenea,
gangliozidele contribuie la formarea " codului glicomic " de înaltă densitate al

34
suprafețelor celulare . De exemplu, GM1 poate fi recunoscut de galectina -1
[231] și acizii sialici cuplati α2,3 sunt recunoscuți de lectinele Siglec -4, α2,6-
sialoz idele de Siglec -2 și α2,8 – sialozide de Siglec -7 [232]. De asemenea,
interacțiunile carbohidrați -carbohidrați pot juca un rol important [ 165]. Deși
interacțiunile dintre resturile individuale de carbohidrați sunt slabe, gruparea de
gangliozide oferă posib ilitatea interacțiunilor multivalente [165]. Se pare că
GM3 situata pe membrana celulelor B16 ale melanomului de șoarece poate
media adeziunea celulară la celulele limfomului L5178 de șoarece prin legarea
la GA2 (gangliotriaosilcerami da, GalNAcβ1,4Galβ1,4G lcβ1,1Cer ) [233]. În
sistemul nervos, gangliozidele acționează în mod "trans" cu glicoproteina MAG
asociată cu mielina. MAG recunoaște NeuAcα2 -3Galβ1 -3GalNAc terminal de
pe gangliozidele axonale, o interacțiune care este esențială pentru stabilitatea
axon-mielină și regenerarea axonului [ 234]. Interacțiunile "Cis" se pot realiza
printr -o interacțiune directă sau indirectă prin proprietățile membranare [ 235].
Astfel, gangliozidele influențează activitățile receptorilor tirozin kinazelor în
membrana plasmatic ă, cum ar fi receptorii factorului de creștere a epidermului,
factorul de creștere a nervilor și insulina și, prin urmare, semnalizarea celulară
[235]. De exemplu, GM1 îmbunătățește activarea receptorului neurotrofinei
TrkA într -o manieră "Cis" [ 236]. Deo arece caracterizarea microdomeniilor
lipidice în celulele vii este dificilă, unele concluzii se pot trage din
experimentele in vitro. Alt exemplu: GM3 inhibă autofosforilarea EGFR
purificată reconstituită în proteolipozomii compozițiilor lipidice definite, dar nu și
legarea EGF [ 237]. Există indicii că gangliozidele nu pot acționa numai într -o
manieră autonomă, dar ar putea, de asemenea, să susțină formarea unor faze
distincte de membrană, deși dezbaterea rămâne deschisă în ceea ce privește
măsura prin car e acest lucru operează in vivo. Se crede că gangliozidele nu
sunt distribuite omogen pe suprafața celulară, ci segregă în domenii de
membrană împreună cu proteine ancorate cu GPI, sfingomielină și colesterol.
Astfel de "plute" (sau "pontoane") ar fi trebui t să fie statusul fiziologic al multor
proteine membran are, deși nu au fost furnizate dovezi solide care s ă pledeze
pentru existența lor. Gangliozidele joacă probabil încă multe roluri neexplorat e
pentru structura membranei [ 238]. Datorită grupărilor mari hidratate, ele
stabilizează zonele membranare cu curbură pozitivă [ 239]. Mai multe rapoarte
propun o poziționare a gangliozidelor și a altor GSL dimpreună cu proteine
ancorate GPI și colesterol în platformele lipidice cunoscute sub denumirea de
"plute" sau "pontoane" localizate pe fata externa a membranel or celulelor vii
[240, 241 , 242 ]. Din considerente termodinamice, este clar că proceduri
precum extracția în prezen ța detergenților pot conduce la rezultate artificiale și
nu sunt potrivite pentru caracteri zarea acestor agregate [243]. Deși s -a

35
demonstrat că tratamentul membranelor celulare cu detergenți , în timpul
extractiei gangliozidelor, cauzează redistribuirea gangliozidelor și proteinelor
ancorate cu GPI [ 244], aceste tehnici sunt încă aplicate și nu î ntotdeauna
examinate critic. Experimentele facute pe celulele vii utilizând microscopia
STED [ 245] și alte tehnici de vizualizare [ 246] indică o limită superioară a
duratei de viață și a dimensiunilor acestor domenii situate la aproximativ 20 ms
și 20 nm. În plus, acizii sialici și oligosialici prezenți pe gangliozide modulează
densitatea de încărcare a suprafeței membranei, pH -ul la suprafața membranei
și potențialul membranei [ 247]. În bistraturile lipidice, gangliozida GD1a poate
crește excitabilitatea c analelor de sodiu dependente de tensiune [ 248].
Gangliozidele fiind produse genetice secundare , funcția lor poate fi analizat ă
prin experimente knock -out, unde în celule, tesuturi sau organisme, sinteza
sau degradarea lor este întrerupt ă de strategii genom ice, posttranscrip ționale
sau chimice. Au fost deosebit de valoroase experimentele pe șoarecii
modificați genetic cu defecte în biosinteza gangliozidelor [ 249], care au relevat,
de exemplu, rolul gangliozidelor în homeostazia calciului, repararea neurală
sau bolile neurologice . De asemenea, investigațiile efectuate pe subiecți umani
[250], mamifere modificate genetic [ 251] și alte organisme [ 252] au permis
înțelegerea diferitelor aspecte ale metabolismului și transportului
gangliozidelor. Sistemele in vitro , cum ar fi lipozomii sau monost ratele planare,
permit investigațiile dificil de realizat în celule. De exemplu, atunci când GM3
este încorporat în lipozomi, separarea fazelor în faze bogate în GM3 și sărace
în GM3 se produce peste un anumit conținut GM3 [ 253]. În condiții
experimentale, biosinteza gangliozidelor poate fi modulată prin inhibitori [ 254].
De asemenea, amplificarea biosintezei gan gliozidelor poate fi utilizată chimic
sau prin introducerea ADNc care codifică glicoziltransferaza în celulele de
cultură [255]. Un enantiomer al inhibitorului de glucozilceramid -sintetaz a D-
threo -PDMP (PDMP = 1 -fenil-2-decanoilamino -3-morfolino -1-propanol), Lthreo –
PDMP , acționează ca amplificator al biosintezei gangliozidelor prin reglarea
glicoziltransferazelor avînd ca rezultat creșterea neuronilor [ 256, 257]. În timp
ce sistemele complexe precum celulele cultivate pot supraviețui fără GSL, ele
sunt necesare pentru dezvoltarea organismelor multicelulare [ 258]. În ciuda
dezvoltării rapide a instrumentelor analitice și biofizice, determinarea analitică
a modului de organizare al gangliozidelor, rezoluția lor spațială și corelarea lor
cu funcția rîmâne încă o provocare. Cu atât mai mult, o caracterizare
convingătoare a domeniilor membranare care conțin gangliozid e în cel ulele vii
și a rolurilor lor la nivel celular ar constitui un progres considerabil în acest
domeniu de cercetare , iar frontiera pan ă recent inexpugnabil ă a interac țiunilor
de suprafa ță constituie deja o țintă ce așteapt ă să fie dobor âtă.

36
2.4. PR OTEINE

Proteinele sunt macromolecule construite prin concatenarea ordonata,
conform informatiei codificate la nivel de ADN, respectiv ARNm, a mai multor
specii de L -α-aminoacizi proteinogeni diferiți. Cu exceptia prolinei, toți
aminoacizii proteogeni au caract eristici structurale comune, cum ar fi o grupare
amino in pozitia α – fata de gruparea carboxil și un lanț lateral variabil [ 259].
Uneori proteinele conțin atașate grupuri non -peptidice, care pot fi numite
grupuri protetice sau cofactori. Proteinele pot luc ra împreună pentru a realiza o
anumită funcție și adesea se asociază pentru a forma complexe proteice
stabile. Diferitele proteine difera nu numai la nivelul secventei primare dar si la
nivelul modului de impachetare primara, secundara si tertiara, cu efec te
importante asupra interactiunii cu alte specii proteice sau alte tipuri de
molecule, cum ar fi carbohidratii. Conceptul interactiunii carbohidrați – proteine
se conformează principiului "lacăt -cheie" avansat de Emil Fisher încă din 1894
[260] pentru a i lustra complementaritatea/interactiunea specifica specifică
dintre un glicozid și o enzimă. Apariția unor tehnici moderne de elucidare a
structurii biomoleculelor a permis intelegerea detaliată a mecanismelor care
guvernează fenomenul de recunoaștere molec ulară, oferind o înțelegere
aprofundată a bazelor fizico -chimice care stau la baza interacțiunii receptor –
ligand.
Tehnicile recente de LC-MS produc seturi de date cu dimensiuni de
pana la 100GB si pana la un milion de spectre, de unde pot fi identificate p ână
la 8.000 de proteine [ 261]. Interacțiunile proteină -proteină și cascadele de
semnalizare celulară sunt studiate în principal prin tehnici de microarray,
cromatografia de imunoafinitate și spectrometria de masa (SM) [ 262]. SM
presupune ionizarea speciil or proteice/peptidice si sortarea fragmentelor
ionizate functie de raportul masa/incarcare urmata de prelucrarea spectrelor
brute, filtrarea zgomotului de fond cu substracția liniei de bază, detectarea
varfurilor si calibrarea și alinierea spectrelor.
Analiza unui spectru MS urmează patru etape distincte: (1) identificarea
secvențelor de aminoacizi, a peptidelor și a proteinelor în Peptide -Spectrum
Match (PSM), (2) detectarea, cuantificarea, adnotarea și alinierea
caracteristicilor, (2) analiza semnificație i peptidelor și a proteinelor,
descoperirea și predicția de clasă și (4) integrarea datelor și analiza căii.
Identificarea secvențelor de aminoacizi implică în principal interogarea bazelor
de date ale spectrelor obținute experimental sau a spectrelor prez ise din
secvențe genomice folosind digestia în silico și raportarea PSM folosind cele
mai bune scoruri.

37

PARTEA SPECIFIC Ă

3. MATERIALE ȘI METODE

3.1. RE ACTIV I Ș I MATER IALE DE LAB OR ATOR

Reactivii folosiți în acest studiu au avut un grad înalt de pur itate
analitică. Metanolul, cloroformul, acetonitrilul, et anolul au avut puritate de
99,9% și au fost achiziționati de la firma Merck (Darmstadt, Germania) și
utilizați fără o purificare suplimentară. Soluțiile stoc ale probelor au fost
păstrate în tuburi de plastic „Safe -Lock Tube” de 1.5 mL de la firm a Eppendorf
(Hamburg, Germania). Tot de aici au fost cumpărate și pipetele automate cu
volume diferite, între 0.5 -1000 μl, însoțite de tips -uri pentru pipetarea și
infuzarea soluțiilor în spectrometrul de mas ă. Pentru pregătirea probelor s -a
folosit apă distilată și deionizată. Probele solide au fost cântărite în prealabil
folosind balanța analitică cu precizie de 0.001 g și interval de măsurare între
0.02-220g Kern Ew 220 de la firma Kern & Sohn (Balingen, Ge rmania). Pentru
dizolvare și omogenizare probele uscate au fost dizolvate în solvenți, iar
ulterior diluțiile lor, au fost vortexate într -un aparat vortex cu o capacitate de
până la 2500 rpm – Heidolph Reax Control (Schwabach, Germania). Toate
soluțiile su puse screeningului MS au fost apoi centrifugate timp de 1,5 – 2 ore
într-o centrifugă Roth cu 6 locașuri pentru tuburile Eppendorf și viteza de
rotaâie de 6000 rpm (Carl Roth, Karlsruhe, Germania) respectiv în centrifuga
SIGMA 2 -16 de la firma Sartorius G mbH (Göttingen, Germania). Pentru
concentrare sau uscare soluțiile au fost supuse liofilizării cu ajutorul unui
evaporator SpeedVac Concentrator SPD 111V – 230 (Thermo Electron
Corporation, Asheville, NC, SUA) atașat la o pompă de vid PC 2002 Vario cu
CVC 2000 Controler (Vaccubrand, Wertheim, Germania). În urma procedurilor
de extracție și purificare, probele de gangliozide pot avea un coținut crescut de
săruri. Pentru eliminarea sărurilor, soluțiile probelor au fost dializate în apă
folosind membrane de t ip „cut off” de 500 Da, Micro Dispo Dialyze MWCO 500
(Holliston, Massachusetts, SUA). Până în momentul când au fost analizate prin
MS, toate probele au fost păstrate în congelator la -20oC. Spectrometrul de

38
masa utilizat a fost calibrat de fiecare dată îna intea efectuării măsurătorilor
utilizând soluții standard de calibrare „tuning mix”. Pentru calibrare, s -a folosit
un amestec standard de gangliozide extrase din creier bovin "Cronassial",
disponibil comercial de la Laboratoarele Fidia (Abano Terme, Itali a) și
standardul de calibrare G2421A – Agilent Technologies (Santa Rosa, CA,
Statele Unite ale Americii). Experimentele de tip chip nanoESI s -au desfășurat
prin injectarea automată a probelor folosind robotul NanoMate prin intermediul
chip-urilor de silici u ce conțin 400 de orificii și care au fost procurate de la firma
Advion Biosciences (Ithaca, NY, USA). Plăcile de microtitrare cu cele 96 de
godeuri și placa -suport conținând vârfurile de infuzie a probelor au fost
achiziționate de la firma Advion. Gazul de desolvatare (azotul) și gazele
folosite pentru fragmentarea ionilor (heliul și argonul) au fost comandate de la
firma Linde, Romania (grad de puritate 5.0, echivalent cu 99.999 % vol). La
experimentele de tip QTOF s -au folosit capilare de sticlă cu pereț ii interiori ce
au formă de omega și care au fost achiziționate de la firma Analytik Vertrieb
(Germania) și care, în prealabil au fost dimensionate și pregătite pentru infuzia
probelor.

3.2. SELECTARE A ȘI DESCRIERE A MATER IALULU I DE
LUCRU. AN ALIZA AMESTEC URILOR C OMPLEXE DE
GANGLIOZIDE EXTR ASE D IN ȚESUT CEREBRAL

Amestecurile complexe de gangliozide native din probele de tumori
cerebrale prelevate de la pacienți precum și cele de țesut cerebral sănatos au
fost inițial extrase și purificate. Toate probele au fost obținute de la
Universitatea de Medicină din Zagreb, Croatia în urma colaborării știintifice cu
grupul de cercetare al Prof. Dr. Željka Vukelić. Toate experimentele au
respectat cu strictețe codurile de etic ă în cercetarea biomedicală. Astfel, au
fost respectate prevederil e Legii nr. 206/2004 cu privir e la conduita în
cercetarea stiin țifică, dezvoltare tehnologic ă și inovare .
Activitatile desfasurate in cadrul studiilor au respectat reglementarile
internationale in domeniu precum si legislatia spec ifica a Uniunii Europene .
Permisiunea pentru experimente ce implică subiecți umani în scopuri științifice
a fost obținută din partea Comisiei de Etică a Facultății de Medicină din
Zagreb, în cadrul Proiectului nr. 108120, finanțat de Ministerul Croat al Șt iinței
și Tehnologiei. Proba de hemangiom cerebral localizat în emisfera dreapta a
cortexului cerebral frontal a fost obținută în timpul procedurii chirurgicale de
extirpare a tumorii de la un pacient adult de sex masculin, în vârstă de 42 de

39
ani. Mostra d e țesut normal frontal cerebral cortical (NFC) de la un subiect de
sex masculin de aceeași vârstă, decedat într -un accident de circulație, a fost
disecat pentru a servi pentru comparație; această probă a fost
obținut ă de la Departamentul de Medicină Legal ă, Facultatea de Medicină,
Zagreb, Croația. La fel s -a procedat și pentru celelalte probe, respectiv o probă
de țesut cu meningiom și o probă de țesut conținând o tumoră metastatică a
unui adenocarcinom pulmonar și corespondentul acesteia (țesut cerebral
sănătos provenit de la un pacient de aceeași vârstă). Până la demararea
procedurii de extracție a gangliozidelor, toate probele au fost cântărite și
depozitate la -20°C. Ulterior, amestecurile native de gangliozide au fost extrase
și purificate respectând p rotocoalele descrise anterior [263,264,9,6,3] în
condiții identice, după metodele dezvoltate de Svennerholm și Fredman [ 90] și
modificatede Vukelić et. al [265]. Înaintea procedurii de extracție a
gangliozidelor, fiecare țesutul a fost omogenizat în apă re ce (+1oC). Lipidele au
fost extrase de două ori folosind un amestec de cloroform: metanol ( raport
volumetric 1: 2) urmat de partiție și repartiție prin adăugarea de cloroform,
metanol și apă până la un raport volumetric final de 1: 1: 0,8 . Fazele
superioar e care conțin eau gangliozide au fost colectate. Extractul brut de
gangliozid e fost purificat în mai multe etape: precipitarea complecșilor de
protein e-sare au fost precipita ți, etap ă urmată de centrifugare; contaminanții cu
greutate moleculară mică au fos t îndepărtați prin gel filtrare p e coloană de
Sephadex G -25 și mai apoi soluțiile au fost dializate în apă (au fost lăsate
peste noapte la 4° C). În final, extractul pur a fost evaporat până la des hidratare
completă folosind un evaporator SpeedVac (SPD 111V – 230, Thermo
Electron, Asheville, NC, SUA) cuplat la o pompă de vid (PC 2002 Vario cu
CVC 2000 controler, Vaccubrand, Wertheim, Germania). Probele uscate astfel
obținute au fost cântărite și depozitate la -27o C până la efectuare analizelor
prin MS .

3.3. PLATFORME AN ALITICE UTILIZATE
3.3.1. SPECTROMETRUL DE MASĂ NANOESI CUPLAT CU ROBOTUL
NANOMATE PENTRU INFUZARE ȘI IONIZARE AUTOMATĂ

Aparținând erei post-genomic e, spectrometria de masa dobândește un
avânt constant și este considerată una dintre cele mai puternice tehnici
analitice de elucidare a compozi ței și structur ii molecul are din diverse matrici
umane, cum este sangele, lichidul cefalorahidian , saliva, urina, lapte, precum

40
și țesuturile s ănătoase și patologice . În acest e studii elaborate în cadru l tezei
de doctorat s-au folosit 2 tipuri de spectrometre de masă de înaltă
performanță , ambele cuplate cu un robot NanoMate pentru automatizarea
infuziilor.

În ultimii ani, chip nanoESI MS s -a dovedit a fi o tehnică de încredere,
puternică și eficientă pentru cercetări din domeniul glicomicii. Această tehnică
a fost dezvoltată, optimizată și aplicată în studiul amestecurilor glucidice și
glicopeptidice extrase din diverse matrici biologice, normale și patologice
(tumori cerebrale).
Astfel, pentru scre eningul de masă al hemangiomului ( și țesutului cere bral
sănătos aferent) s -a folosit platforma nanoESI HCT MS, iar pentru pentru
screeningul MS al meningiomului și al metastazei adenocarcinomului pulmonar
(împreună cu țesutul cere bral sănătos corespondent ) s-a folosit platforma
nanoESI QTOF MS. Căteva experimente de spectrometrie de masă s -au
derulat folosind un spectrometru de masă cu capcană ionică de mare
capacitate (HCT Ultra PTM Discovery) de la firma Bruker Daltonics (Bremen,
Germania) ( Fig. 11). HCT MS cu disociere indusa prin ciocnire -CID, cu
disociere prin transfer de electroni -ETD si kit de reactie cu transfer de protoni
(PTR), kituri si software -ul corespunzator functionand pâna la MS11 in modul
manualul si MS5 in cel automat de selectare si fragm entarea a ionilor a fost
utilizat ca echipament principal pentru caracterizarea exhaustiva a
gangliozidelor din țesut cerebral cu hemangiom și țesut cerebral sănătos.
Astfel, am obținut date valoroase cu privire la compozitia si structura
(secventa oligozaharidic ă, profil sialilare structura fragmentelor de lipide,
caracterizarea modificarilor existente) acestor mo lecule. HCT este interfațat cu
un computer pe care se rulează pachetul integrat Compass 1.2, incluzând
modulele Hystar 3.2.37 și Esquire 6.1.512 pentru funcționalizarea aparatului și
achiziționarea spectrelor de masă, a cromatogramelor și un software Data
Analysis 3.4.179 pentru stocarea cromatogramelor, spectrelor dar și pentru
procesarea datelor de MS.

41

Figura 11. Spectrometrul de masă cu capcană ionică de mare capacitate HCT Ultra cuplat cu robotul
NanoMate (indicat de săge ată în dreapt a)

Rezoluția ș i precizie optim ă în determinarea masei moleculare, viteza
de achiziție , sensibilitatea înaltă (infuzi a unei cantități de probă de ordinul
zecilor de nL/min) și capacitatea ridicată de stocare a ionilor, precum și
posibilitatea unică de a efectua stadii mu ltiple de fragmentare reprez intă
caracteristicile de performanță ale acestui spectrometru de masă. Încă o
trăsătură importanată a spectrometrului de masă HCT Ultra este versatilitatea
acestuia prin posibilitatea cuplajului cu diverse surse de infuzie.
Pentru infuzia automată bazată pe chip -nanoelectrospray s -a utilizat robotul
NanoMate BiVersa care încorporează tehnologia ESI chip 400 (Advion
Biosciences, Ithaca, NY, USA), controlat și manipulat prin software -ul ChipSoft
8.1.3 operând în Windows XP.
Robotu l NanoMate a fost primul sistem din lume complet automat
pentru pulverizara probelor prin ESI în MS. Robotul are încorporată o placă de
microtitrare pentru probe cu 96 de godeuri și cu o placă -suport cu 96 vârfuri
pentru pipeta conductivă care realizează a spirarea și infuzia probei. Un volum
între 5 -50 μL din soluția probei de lucru a fost încărcată pe placa de
microtitrare cu 96 godeuri, după care robotul a fost programat să aspire
volumul de probă necesar măsurătorii , urmat de 2 μl aer în vârful pipetei. După
aspirare, proba a fost plasată pe fața cu orificii a microchipului de siliciu, apoi
infuzată prin orificiul microchipului în MS. Cuplajul cu spectrometrul de masă
HCT Ultra s-a realizat printr -un sistem de interfațare original realizat în cadrul
labor atorului (Fig. 11). Astfel, sursa convențională de ionizare prin electrospray
a MS a fost detașată și toate setările MS și conexiunile electrice au fost

42
readaptate pentru funcționarea sistemului NanoMate într -un regim ESI,
decuplat de MS. Robotul a fost pu s pe trei suporturi ajustabile pe direcția O –
xyz și conectat la conducta care furnizează azot spectrometrului. De
asemenea, și poziția chipului pentru electrospray a fost ajustată respectând
poziția contraelectrodul ui conic prin care se transferă probele. Electrosprayul a
fost inițiat prin aplicarea unei tensiuni de 0.8 kV pe vârful pipetei conductive și
a unei presiuni asupra tubului de infuzie de 0.6 p.s.i., ambii parametri fiind
optimizați pentru a asigura ionizarea și transferul adecvat al speciilor ion ice din
probă în MS.

3.3.2 . SPECTROMETRUL DE MASĂ HIBRID QUADRUPOLE TIME -OF-
FLIGHT -QTOF

Pentru studiul gangliozidelor extrase din țesutul cerebral cu metastaza
a adenocarcinomului pulmonar, țesutul cerebral sănătos folosit pentru
comparație și țesutul c erebral cu meningiom s -a folosit MS cuadrupolar cu timp
de zbor (QTOF) Micro (Micromass/Waters, Manchester, UK) (Fig . 12). Aceast
tip de spectrometru hibrid MS/MS combină simplicitatea quadrupolului cu
eficiența ridicată a analizorului cu timp de zbor (Tim e of Flight, TOF) cu
accelerare ortogonală (QTOF). Punând laolalt ă performanțele analitice ale
acestui sistem cu capacitățile extraordinare de prelucrare a rezultatelor
experimentale obținute (prin intermediul aplicației software dedicate MassLynx)
rezulta te au fost generate în cel mai scurt timp și la un nivel de precizie foarte
ridicat. Capilarele de sticlă folosite pentru probele analizate cu ajutorul
spectrometrul ui QTOF au fost aciziționate de la firma Analytik Vertrieb
(Germania) . Datorită formei de „omega” și a diametru lui interior de numai 20-
30 μm a pereților interni ai capilarelor, se evită formării bulelor de aer.
Dimensionarea capilarelor s -a realizat cu ajutorului unui trăgător de capilare
vertical cu filamentul în formă ”omega”, model 720 (Dav id Kopf Instruments,
Tujunga, CA, SUA). Rolul său este de a încălz i capilarul de sticlă, care mai
apoi se alungește și se rupe sub acțiunea unei greutăți atașate. Astfel se obțin
două capilare cu vârf ascuțit și deschis. După ce se pozițio neaz ă capilaru l de
sticlă pe firul metalic, se centreză față de contraelectrod pe axele Oxyz cu
ajutorul dispozitivel or de reglare . Poziționarea acestuia se urmărește în timp
real pe un monitor care transmite imaginile de la o cameră conectată la sursa
de ionizare. Acest t ip de MS înglobează două tipuri diferite de analizoare:
analizorul cuadrupolar și un analizor cu timp de zbor. Combinând cele două
analizoare în spectrometrul hibrid QTOF se crește performanța și putere de

43
rezoluție a MS . Astfel, se obțin măsurători cu gra d înalt de sensibilitate și
exactitate în determinarea masei moleculare a speciilor prezente în probele
analizate . În plus, spectrometrul QTOF este dotat și cu o cameră de ciocnire
de tip hexapol (hexapole collision cell), care împreună cu analizorul
cuadr upolar formează analizorul MS1. Fiind un sistem hibrid, spectrometrul de
masă QTOF funcționează atât în modul MS, cât și în modul MS/MS. Acesta
este conectat la un PC ce rulează programul MassLynx versiunea 4.1 ce
controlează instrumental, achiziționează ș i prelucrează datele obținute.
Totodată, cu ajutorul acestui program se poate selecta tehnica de analiză
dorită: operarea în tehnica de detectie a ionilor negativi sau pozitiv i
(positive/negative ion mode), în funcție de felul de ionizare al probei selecta te
spre analiză. De asemenea, programul permite selecția modului de operare,
MS sau MS/MS, precum și ajustarea unor parametri: tensiunea pe capilar sau
pe contraelectrod, energiea de ciocnire, temperatura de desolvatare.

Figura 12. Spectrometrul de mas ă hibrid cuadrupolar cu timp de zbor, QTOF și sursa de ionizare prin
nanoelectropulverizare (nanoelectrospray nanoESI)

44
3.3.3. DISOCIER EA INDUS Ă PRIN CIOCNIRE (COLLI SION INDUCED
DISSOCIATION -CID)

O caracteristică importantă a tehnicii de ionizare ESI o re prezintă
posibilitatea de a genera ioni macromolecular i intacți în fază gazoasă , oferind
informații prețioase referitoare la masa moleculară a compuților selectați .
Experimentele efectuate pentru fragmentare a și elucidare a structurală a
moleculelor s electa te s-au realizat prin tehnica CID, procedeu în urma căruia
ionii moleculari interacți onează cu gaze inerte ( heliu pentru HCT și argon
pentru QTOF) , realizându -se distribuția energiei vibraționale de-a lungul
legăturilor covalente.
Pentru ca ionii p recurso ri să ajungă metastabili , necesită o creștere a energiei
lor interne . Acest fenomen poate fi realiza t în urma activării lor prin ciocnire.
CID permite creșterea numărului de ioni precursori care se pot fragmenta în
zona de reacție. Aceasta se desfășoară în doi pași ce cuprind : 1). ciocnirea
ionului precursor cu moleculele gazului inert, în urma căreia se obține
creșterea energiei interne a ionului și 2). disocierea unimoleculară a a ionului
activat [ 266]. Atunci când energia internă a ionilor crește peste v aloarea prag
la care se produce scind area unei anumite legături, are loc procesul de
fragmentare ce duce la formarea cu precâdere a ionilor de tip B și Y. Dacă ne
referim la valorile energiei de ciocnire aplicate, există CID la energii joase
(low-energy C ID sub 100 eV ) și CID la energii înalte (high -energy CID și
utilizează energii de accelerare aflate în domeniul keV ). Deși CID este cea mai
simplă tehnică de fragmentare, aceasta nu se aplică cu succes în cazul
studiului modificărilor post -translaționale . Datorită faptului că aceste modificări
sunt labile există riscul fragment ării în surs ă sau poat apărea pierder i neutr e de
apă și amoniac .

3.3.4. DISOCIEREA IN DUSĂ PRIN TRANSFER DE ELECTRONI
(ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION – ETD)

Ionii precursori pot fi supuși fragmentării în urma unor reacții fizice sau
chimice, în urma interacțiunii cu un gaz inert. Formarea ionilor de fragmentare
se poate realiza nu numai in urma reacției de disociere induse prin coliziune
CID, ci si in urma disocierilor prin captură electronică (Electron Capture
Dissociation ECD) și prin transfer electronic (Electron Transfer Dissociation
ETD). Folosind aceste reacții se poate determina structura moleculară exactă
a ionului selectat, prin identificarea fragmentelor obtinute și elucid area modului

45
de legare a acestora . Totodată, se poate face distincție între izomeri sau se
poate stabili exact poziția de legare a diferiților radicali (ex. fragmente de tip O –
Acetil , OAc) din interiorul structurii analizate, uneori prin fragmentări de ine l,
cum se întampl ă în cazul gangliozidelor.
Aplicate împreună sau alternativ ETD și/sau CID ar putea crește
semnificativ acoperirea secvențelor și ar putea adăuga un plus de încredere
identificării secvențelor peptidice/ proteice și a caracterizării modif icărilor post –
tranzaționale ale acestora chiar și pe instrumente cu rezoluție redusă.

3.4. PLATFORME INFORMATICE

Odată cu introducerea cadrului dot NET, Microsoft a inclus un nou
limbaj denumit C#. Limbajul de programare C # (pronunțat "C sharp") este
conceput pentru a construi o varietate de aplicații ca re rulează pe .NET
Framework. C # este proiectat să fie un limbaj de programare simplu, modern,
cu scop general, orientat spre obiect dar și spre componente, împrumutând
concepte -cheie din mai multe limbaj e, mai ales Java. Multe inovații din C #
permit dezvoltarea rapidă a aplicațiilor, păstrând în același timp expresivitatea
și eleganța limbajelor în stilul C. Acest limbaj permite dezvoltarea de aplicații
robuste, durabile care să deserveasă orice domeniu. La aceste trăsături
generale se pot suplimenta și alte le cum ar fi suportul pentru internaționalizare
(utilizarea aplicațiilor în zone diferite ale globului unde se vorbesc limbi
diferite), fără să necesite schimbări majore ale arhitecturii software -ului. În
strânsă conexiune cu arhitectura .NET (.NET Framework) pe care
funcționează, C# gestionează în mod automat memoria utilizată. Eliberarea
memoriei ocupate (garbage collection) de către obiectele reziduale ale
aplicației, este o facilitate remarcabilă a l imbajului. Nu mai este necesar ca
programatorul să decidă singur care este locul și momentul în care obiectele
să fie casate, așa cum se procedează în C++. În C# se pot crea totodată
aplicații pentru sisteme complexe ce rulează sub o mare varietate de sist eme
de operare, dar și pentru sisteme dedicate (embeded systems). Acestea din
urmă se întind pe o arie largă, de la dispozitive portabile cum ar fi ceasuri
digitale, telefoane mobile, MP3 playere, până la dispozitive staționare ca
semafoare de trafic, sau controlere pentru automatizarea producției. Din punct
de vedere sintactic C# derivă din limbajul C++, dar include și influențe din alte
limbaje, mai ales Java. Programarea orientată pe obiect are ca punct de
plecare o serie de principii de bază de care am ținut cont la conceperea
acestui program: 1. posibilitatea de reutilizare ulterioară a codului sursă, 2.
posibilitatea de a fi actualizat cu ușurință, 3. încapsularea proprietăților și

46
comportamentului obiectelor, 4. mentenabilitatea acestuia. Cu toate ace stea, a
fost destul de anevoios de elaborat un astfel de concept de software, datorită
complexității și diversității rezultatelor generate. Totuși, avand cunoștințede
bază despre acest limbaj informatic de programare și cu ajutorul unor ingineri
specialișt i în IT, am conceput un software cababil să ruleze o bază de date
Access care să ușureze calculul rezulatelor generate prin MS. În primul rând
am alcătuit o bază de date cu ajutorul programului Microsoft Excel 2007 care a
conținut toate sturcturile teoreti ce de gangliozide, respectând anumite reguli
chimice și nomenclatura acestora. A rezultat un fișier Excel cu peste 35000 de
mase moleculare teoretice , iar programul poate genera mai mult de 150000 de
structuri atribuite gangliozidelor.
Acest program este unic în lume, fiind special conceput pentru a se
mula strict pe domeniul de studiu (glicosfingolipidomică) și activit ate al grupului
de cercetare din care fac parte.

47
4. REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1.STUD IUL PROFILULU I GANGLIOZID IC AL
HEM AN GIOMULU I CEREBR AL C OMP AR A TIV CU ȚESUTUL
CEREBRAL SĂN ĂTOS , DIN PUNCT DE VEDERE
STRUCTURAL, PR IN CHIP N ANOES I HCT MS

4.1.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

În general, hemangiomul reprezintă o acumulare anormală , de obicei
benign ă, a vaselor sa nguine la nivelul pielii sau organelor interne. Cauza
exactă a acestei patologii nu încă pe deplin cunoscută. La nivel mondial, se
depun eforturi pentru elucidarea cauzelor și implicit a dezvoltării unor platforme
sigure și eficiente de detecție a tumorilo r în stadii incipiente. MS este una
dintre cele mai noi și promitatoare tehnici de analiză a structurilor chimice a
glicosfingolipidelor cu rol de biomarker în patologia tumorală și nu numai [38].

Plecând de la aceste premize, cercetarea personală își pr opune să
realizeze următoarele obiective :

 Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS;
 Analiza expresiei gangliozidelor în hemangiom versus țesut cerebral
sănatos;
 Mappingul gangliozidelor extase din hemangiom comparativ cu țesut
cerebral sănătos;
 Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei unice și
originale Gangliobase 2.1 și interpretarea rezultatelor în corelație cu
studiile științifice din domeniu.

Pentru acest studiu s -au selectat : 1). o probă de țesut tumoral provenit din
lobul frontal cortical al unui subiect diagnosticat cu hemangiom cerebral (cortex
frontal cu hemangiom – CFH) ; 2). o prob ă de țesut cerebral sănătos provenită
de la un subiect de aceeași vârstă, decedat în urma unui accident rutier (cortex
fronatal normal – CFN). După procesul de extragere și purificare a
gangliozidelor din probele descrise mai sus aceste sunt supuse screeningului
Chip-NanoESI HCT MS .

48
4.1.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Pentru analiza chip -nanoESI MS, soluția stoc a fiecărui extract nativ de
gangliozide (aproximativ 0,5 mg/ml) a fost preparat prin dizolvarea materialului
uscat în metanol pur stocat la -27°C. Alicoturile de lucru, la o concentrație de
aproximativ 0,5 pmol/l (calculată pentru o masă moleculară medie a
amestecului de ga ngliozide de aproximativ 2000) au fost obținute prin diluarea
soluției stoc în metanol pur.
Analiza prin MS a probelor s -a efectuat utilizând sistemul complet
automat bazat pe chip nanoelectrospray în combinație cu un analizorul cu
capcană ionică de mare capacitate (Ult ra HCT) de la Bruker Daltonics,
Bremen, Germania. Toate spectrele de masă au fost obținute în intervalul de
masă 100 -3.000 m/z cu o viteză de scanare de 8000 m/z pe secundă.
Experimentele MS2 realizarea prin CID a folosit drept gaz de coliz iune
heliu. Pentru secvențializare MS în tandem, ionii precursori au fost selectați și
izolați în intervalul 2u. Pentru o fragmentare optimă, cu grad de precizie
crescut, pe toată secvența moleculară selectată, fiecare spectru de
fragmentare a fost obținut prin acumularea scanărilor la amplitudini variabile
ale semnalului RF, în intervalul 0.6 – 1.0 V.
Atribuirea unei compozitii specifice ionilor moleculari obtinuti a fost
făcută prin calcularea masei moleculare exacte. Postulările legate de structura
și legaturile chimice ale lanțurilor oligozaharidice s -au bazat pe informațiile
obținute anterior [ 11] și pe principiile căii de biosinteză a gangliozidelor.
Desemnarea ionilor de fragmentare s -a realizat utilizand nomenclatura
introdusă de Domon și Costello [92] și revizuită de Costello et al. [267]. Pentru
ambele probe s -au folosi t condiții identice de analiză și screening al
amestecului nativ de gangliozide.
Pentru analiza prin MS a prob elor, Robotul NanoMate a fost cuplat cu
spectrometru de masa Ultra HCT printr -un sistem de montare la comanda,
care permite poziționarea O -xyz a robotului respectând contraelectrodul HCT
așa cum a fost descris anterior [ 3,6,268 ]. Poziția de electropulverizare a fost
ajustat ă în raport cu conul de eșantionare pentru a realiz a un transfer optim al
speciilor ionice în MS. Robotul a fost programat să aspire de fiecare dată
volumul întreg (câte 5 μL ) din fiecare probă și apoi 2 μL de aer prin vârful
pipetei și să pulverizeze proba pe partea anterioară a microchip -ului dotat cu
400 de orificii. Sistemul NanoMate HCT MS a fost setat pentru a opera în
tehnica de detectie a ionilor negativi , demonstrată anterior ca fiind cea mai
adecvat ă modalitate de ionizare pentru analiza gangliozidelor [6, 9, 268].
Pentru ambele probe, parametrii d e ionizare prin chip electrospray au fost

49
setați prin aplicarea unui voltaj inițial de -0.85 kV la vârful pipetei și o presiune
a azotului de 0.60 p.s.i. Blocul sursei a fost menținut la o temperatura
constanta de 200° C. Pentru a se preveni pe cât posibil apariția fragmentării
ionilor în sursă, tensiunea pe capilar a fost de -0.30 V. Încălzirea blocului sursă
a furnizat o desolvatare optimă a picăturilor generate fără a fi nevoie de gaz
desolvatare. Pentru a preveni contaminarea încrucișată sau supraîncarca rea,
vârful pipetei a fost schimbat cu unul nou după fiecare infuzie și analiză MS.
Fiecare orificiu a avut un diametru intern de 2,5 μm și a asigurat un ritm de
curgere de aproximativ 50 nL/min, în condițiile date. După setarea și aplicarea
acestor para metri, s -a obținut un semnal ESI stabil pe tot parcursul
măsurătorilor, atât pentru experimentele MS cât și pentru cele MS2. Ambele
probe au fost supuse analizei prin MS. Atât parametri tehnici c ât și condițiile de
obținere a soluțiilor probelor au fost id entice pentru ambele tipuri de țesuturi
supuse screeningului.

4.1.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI
PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESU T CEREBRAL

Amestecul de gangliozide purificate și extrase din țesutul cortical, lob
frontal normal și hemangio m a fost supus screening -ului prin nanoESI chip MS
prin tehnica de detectie a ionilor negativi , rezoluția și parametri instrumentali
fiind identici pentru ambele probe . Spectrele obținute sunt prezentate în figurile
13 și 16, în timp ce identificarea st ructurilor gangliozid ice sunt prezentate în
tabelele 4 și respectiv 5. Examinar ea comparativă a spectrelor obținute în
condiții instrumentale identice au evid ențiat, în primul rând, o diferență
semnificativă a numărului structurilor de gangliozide exprimat e în hemangiom
(Tab. 4) față de țesutul normal ( Tab. 5). Țesutul CFN pare să conțină o
diversitate mai mare de structuri gangliozid ice care diferă prin statusul lor d e
sialilare, prin structura por țiunii oligozahari dice, conținând atât lanțuri scurte,
mono salilate (GM) cât și lanturi mari, polisialilate ( până la GQ) și de asemenea
prin prezen ța modifica rilor prin atașamente periferice labile ale O-Ac și
GalNAc.

50

Figura 13. Spectrul de masă ( -)nanoESI chip HCT MS al amestecului nativ de gangliozide ex trase din
cortexul frontal cu hemangiom. Solvent: MeOH; concentrația probei: 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție: 0.5
min; Chip ESI: -0.85 kV; tensiunea pe capilar: -30 V [3]

51
Tabelul 4. Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectat e în amestecul de gan gliozide ex trase
din țesut cerebral cu hemangiom [3]
Numărul
de
structuri Masă moleculară
experimentală ( m/z)
(monoizotopic) Masă moleculară
teoretică ( m/z)
(monoizotopic) Tipul ionului
molecular Structura desemnată
1. 733.57 732.96 [M–2H]2− GM2(d18:1/24: 0)
2. 749.58 749.07 [M–2H]2−(–2H2O) GM2(d18:1/29:1)
3. 793.61 793.43 [M−H]2−(–H2O) GD2(d18:0/13:0)
4. 827.41 827.45 [M−H]2−(–H2O) GD2(d18:1/18:0)
5. 839.80 839.91 [M−H]2−(–H2O) GM1(d18:1/29:0)
6. 863.35 863.49 [M−H]2− GD2(d18:1/22:1)
7. 875.00 875.15 [M+ Na –2H]2− GM1(d18:0/31:0)
8. 917.41 917.49 [M−H]2− GD1(d18:1/18:0)
9. 922.00 922.51 [M+ Na –2H]2− GD1(d18:0/17:0)
10. 956.05 956.51 [M+ Na –2H]2− GD1(d18:1/22:0)
11. 983.07 983.61 [M−H]− GM4(d18:1/16:3)
12. 987.42 987.64 [M−H]− GM4(d18:1/16:1)
13. 1,034.08 1,033.81 [M−H]− GM4(d18:0/19:0)
14. 1,062.54 1,061.86 [M−H]− GM4(d18:0/21:0)
15. 1,077.00 1,077.05 [M–2H]2− GT1(d18:1/20:0)
16. 1,151.76 1,151.71 [M−H]− GM3(d18:0/16:1)
17. 1,186.26 1,185.78 [M−H]− GM3(d18:1/19:4)
18. 1,214.45 1,214.00 [M+2Na –3H]− GM4(d18:1/29:1)
19. 1,216.44 1,216.11 [M−H]− O-Ac-GM4(d18:0/29:0)
20. 1,306.03 1,306.06 [M−H]− GM3(d18:1/27:0)
21. 1,555.98 1,555.81 [M−H]−(–2H2O) GD2(d18:0/12:0)
22. 1,634.04 1,633.93 [M−H]− GD2(18:0/15:0)
23. 1,698.04 1,698.06 [M−H]−(–H2O) GD2(d1 8:1/21:0)
24. 1,748.82 1,748.96 [M+3Na –4H ]− GM1(d18:1/28:1)
25. 1,786.28 1,786.16 [M−H]− O-Ac-GD2(d18:1/23:0)
26. 1,816.52 1,816.17 [M+ Na –2H]− GD2(d18:1/27:3)
27. 1,858.17 1,858.18 [M−H]− GT3(d18:1/25:1)
28. 1,886.20 1,885.99 [M+ Na –2H]− GD1(d18:1/20:0 )
29. 1,909.31 1,909.98 [M+2Na –3H ]− GD2(d18:0/20:0)

Dintr-un total de 29 de structuri identificate în proba de hemangiom, 13
sunt specii monosalilate de tip GM1, GM2, GM3 și GM4 și 13 sunt specii
disialia te de tip GD1 și GD2 având în componență ceramide cu structur ă
variabilă (Fig. 14 și Fig. 15) . În spectrul din figura 13 s-au detectat numai două
structuri GT gangliozide: un GT1 având compoziți a ceramid ei (d18:1/20:0) și
un GT3 cu ceramidă (d18:1/25:1). Interesant, niciuna dintre aceste tipuri de
gangli ozide trisialilate nu a fost detectată în CFN, ceea ce arată că aceste
componente sunt fie absente, fie exprimate în concentrații sub limitele de
detecție ale instrumentului în CFN. Prin urmare, ele par să fie asociate mai
degrabă cu CFH, decât cu CFN.

52

Figura 14. Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din
cortexul frontal cu hemangiom

Figura 15. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din cortexul
frontal cu hem angiom

Conform studiilor anterioare, expresia gangliozidelor polisialilate este
reglată într -un mod dependent de creștere și dezvoltare [ 269] și asociată cu
tipul de stare normală/aberantă a țesutului cerebral. De exemplu, s -a raportat
anterior că un conț inut mai mic de specii sialilate a apărut în gliosarcom în
comparație cu țesutul cerebral normal [ 130]. Constatările noastre actuale sunt
în concordanță cu datele obținute prin analiza chip -ESI MS a gliosarcomului

53
cerebral și susțin rolul sialilării în dez voltarea și progresia tumorală. Spre
deosebire de gliosarcomul investigat anterior [ 130], au fost observate două
structuri gangliozidice modificate în amestecul de gangliozide extras din CFH.
Conform calculului de masă, ionul [M -H] cu m/z 1,786,28 este co mpatibil cu o
structură de O-Ac-GD2 (d18:1/23:0) în timp ce [M -H] cu m/z 1,216,44
corespunde O-Ac-GM4 (d18:0/29:0). Aceleași specii de O-Ac-GD2
(d18:1/23:0) au fost identificate și în țesutul normal al cortexului frontal, într -o
abundență mai mare decât în CFH, dar nu au putut fi găsite în tumori maligne
precum gliosarcomul [ 130], neindentificându -se variantele O-Ac-GD2. Acest
lucru sugerează că structurile O-Ac-GD2 ar putea fi markeri pentru tumorile
cerebrale benigne .

Figura 16. Spectrul de masă ( -)nanoESI chip HCT MS al amestecului nativ de gangliozide ex trase din
cortexul frontal normal. Solvent: MeOH; concentrația probei: 0.5 pmol/μL; timpul de achiziție: 0.5 min;
Chip ESI: -0.85 kV; tensiunea pe capilar: -30 V [3]

54
Tabelul 5. Desemnarea speciilor i onice moleculare majore detectate în amestecul de gangliozide ex trase
din țesut cerebral sănătos [3]
Numărul de structuri Masă moleculară
experimentală ( m/z)
(monoizotopic) Masă moleculară
teoretică ( m/z)
(monoizotopic) Tipul ionului
molecular Structura de semnată
1. 917.11 917.49 [M−2H ]2− GD1(d18:1/18:0)
2. 933.63 933.57 [M−2H 2O−2H]2− GD1(d18:1/23:1)
3. 955.66 955.50 [M+ Na−3H]2− GD1(d18:1/22:1)
4. 1,033.81 1,033.96 [M−2H ]2− GalNAc -GD1(d18:1/20:0)
5. 1,063.67 1,063.04 [M−2H ]2− GT1(d18:1/18:0)
6. 1,077. 77 1,077.77 [M+2Na−3H]− GM4(d18:0/19:0)
7. 1,089.60 1,089.05 [M+ Na−3H]2− GT1(d18:0/20:0)
8. 1,153.96 1,153.96 [M−H]− O-Ac-GM4(d18:1/25:2)
9. 1,185.95 1,185.78 [M+2Na−3H]− GM4(d18:1/27:1)
10. 1,306.06 1,306.06 [M−H]− GM3(d18:1/27:0)
11. 1,318.76 1,318. 76 [M−2H 2O−H]− GM2(d18:1/16:0)
12. 1,352.87 1,352.78 [M−H]− GM2(d18:1/16:1)
13. 1,419.91 1,420.02 [M−H]− O-Ac-GM3(d18:0/32:0)
14. 1,453.03 1,453.03 [M−H]− GM2(d18:1/23:0)
15. 1,518.95 1,518.86 [M−H]− GM1(d18:0/16:0)
16. 1,556.87 1,556.96 [M−H]− GM1(d1 8:1/19:1)
17. 1,566.86 1,566.86 [M+ Na−2H]− GM1(d18:1/18:0)
18. 1,580.95 1,580.95 [M−H]− GD3(d18:1/26:1)
19. 1,596.88 1,596.88 [M+2Na−3H]− GD3(d18:1/24:1)
20. 1,619.13 1,619.13 [M+ Na−2H]− GD3(d18:1/27:0)
21. 1,633.93 1,633.93 [M−H]− GD2(d18:0/15:0)
22. 1,685.03 1,685.03 [M−H]− GM1(d18:1/28:0)
23. 1,719.21 1,719.21 [M+ Na−2H]− GM1(d18:1/29:1)
24. 1,776.04 1,776.04 [M−H]− GT3(d18:1/19:0)
25. 1,786.16 1,786.16 [M−H]− O-Ac-GD2(d18:1/23:0)
26. 1,806.10 1,806.10 [M−H]− GT3(d18:0/21:0)
27. 1,846.04 1,846. 04 [M−H]− GD1(d18:1/19:2)
28. 1,874.06 1,874.06 [M−H]− GT3(d18:1/26:0)
29. 1,886.00 1,885.99 [M+ Na−2H]− GD1(d18:1/20:0)
30. 1,942.34 1,942.34 [M−H]− GT3(d18:1/31:1)
31. 2,019.06 2,019.06 [M−H]− GT2(d18:1/22:1)
32. 2,157.08 2,157.08 [M+2Na−3H]− GT1(d18 :1/17:0)
33. 2,167.00 2,167.00 [M+2Na−3H]− GT1(d18:1/18:2)
34. 2,181.11 2,181.11 [M−H ]− GT1(d18:1/22:1)
35. 2,211.16 2,211.16 [M−H]− GT1(d18:1/24:0)
36. 2,235.16 2,235.16 [M−H]− GT1(d18:1/26:2)
37. 2,265.21 2,265.21 [M−H]− GT1(d18:1/28:1)
38. 2,306.1 3 2,306.04 [M−H]− GQ1(d18:1/10:0)
39. 2,376.16 2,376.16 [M−H]− GQ1(d18:1/15:0)
40. 2,387.22 2,387.22 [M+3Na−4H]− GT1(18:1/32:1)
41. 2,432.26 2,432.26 [M−H]− GQ1(d18:1/19:0)
42. 2,446.19 2,446.19 [M−H]− GQ1(d18:1/20:0)
43. 2,460.32 2,460.32 [M−H]− GQ1( d18:1/21:0)

55

Figura 17. Distribuția procentuală a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut
cerebral sănătos

Figura 18. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut
cerebr al sănătos

Din cele 43 de specii distincte de gangliozide regăsite în proba de țesut
cerebral sănătos , 13 sunt monosalilate, în timp ce 30 de structuri conțin mai
mult de un fragment de acid sialic atașat la nucleul oligozaharidic (Fig. 17 și
Fig. 18) . Astfel, pe baza calculului exact al masei, s -au identificat 11 structuri
di-, 14 tri – și 5 pentasalilate. Nouă din cele 14 gangliozide trisialilate prezintă

56
sunt molecule de tip GT1 legat de structuri variate ale ceramidei. În cazul
structurilor tetrasialila te, toate cele cinci sunt tetrasialotetroze (tip GQ1). Au
fost descoperite trei tipuri de gangliozide acetilate semnificative din punct de
vedere biologic și o specie modificată prin legarea GalNAc de o gangliozidă.
Acestea reprezintă variantele O-acetila te ale GM4 (d18:1/25:2) detectat ca un
ion monodeprotonat simplu încărcat cu m/z 1153,96, GM3 (d18:0/32:0)
detectat de asemenea ca un ion monodeprotonat simplu încărcat cu m/z
1419,91, GD2 (d18:1/23:0) corespunzând ionului monodeprotonat simplu
încărcat cu m/z 1786,16 și GD1 modificat prin ata șarea GalNAc (d:18:1/20:0)
detectat ca ion dublu deprotonat cu m/z 1033,81.
Astfel, amestecul de gangliozide extras din CFH este în esență dominat
de specii cu lanțuri scurte de oligozaharide și care prezintă un conținu t global
de acid sialic redus.

4.1.4. SCREENINGUL MS2 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI
PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESU T CEREBRAL

Datorită faptului că structurile O-Ac-GD2 ar putea fi markeri pentru
tumorile cerebrale benigne, i onul dublu încărcat la m/z 1077,00 care, conform
calculului de masă c orespunde speciei GT1(d18:0/20:0), a fost izolat și supus
analizei de fragmentare prin CID MS2.
Spectrul de masă obținut este prezentat în figura 19a, în timp ce
schema care ilustrează cele mai probabile căi de fragm entare, împreună cu
desemnarea ionilor care susțin elucidarea structurii moleculei , este prezentată
în figura 19b.

57

Figura 19. Fragmentarea MS a ionului [M−2H]2− at m/z 1,077.00 corespunzător speciei de gangliozide
GT1(18:1/20:0) detectate în amest ecul de gangliozide HFC. a) Spectrul de fragmentare ( -) nanoESI –
nanoESI chip HCT MS2; b) Schema de fragmentare corespunzătoare izomerului GT1c detectat în proba
de hemangiom. CID la amplitudini ale semnalului RF variabile încadrate în intervalul 0,6 -1,0 V . Timp de
achiziție 0,5 min [3]

58
Așa cum este vizibil în figura 19 , chiar și pentru astfel de ioni precursori
de joasă intensitate, HCT CID MS2 prezintă un raport remarcabil
semnal /zgomot și un nivel de zgomot de bază aproape nul. Această
caracteristică be nefică a fragment ării ionilor în analizorul HCT, fie prin CID, fie
prin ETD, fie alter nând CID /ETD, raportată adesea [6, 270 ], demonstrează
creșterea sensibilității oferită de noua generație de MS cu capcană ionică cu si
capacitate de stocare înaltă. Un a spect interesant îl dezvăluie spectrul din
figura 3 b și anume prezența izomerului GT1c mai puțin frecvent în amestecul
de gangliozide extras din CFH. Cinci fragmente de ioni difer iți cu m/z 836,80 ;
998,80 ; 1017,80 ; 1034,00 și 1214,60, toți monodeprotonați , simplu încărcați,
prezintă o structură ceramidică de tip (d18:0/20:0) a speciei GT1c susținută de
ionul Z 0- cu m/z 594,20. Conform calculului de masă, ionul cu m/z 836,80
corespunde elementului trisialo deshidratat care arată că trei resturi Neu5Ac
sunt l egate între ele, molecula put ând avea constiu ții diferite , specific e
glicoformelor GT1c sau GT1d. Aceste două structuri sunt susținute și de ionii
de la m/z 1017,80 alocați fragmentului Z 2α/Y1-, m/z 998,80 alocați fragmentului
Z2α/Y1 și m/z 1034,00 coresp unzător fragmentului Z2a/Y1-, toate având
compoziția (GalNeu5Ac3)-. Cu toate acestea, detectarea ionului Z 2α/Y0 destul
de abundent la m/z 1244,60 este o dovadă incontestabilă privind apariția
izomerului GT1c. Acest ion, având compoziția (Gl cGalNeu5Ac3)-
demonstrează faptul că la unii dintre izomerii izolați și fragmenta ți simultan,
elementul trisialo este cu siguranță conectat la restul galactozei interne, o
constiutie corespunzatoare glicoformei GT1c.
Pe de altă parte, ionul de fragmentare cu m/z 906,40 desemnat ca
Y2α/Y0/B1β- confirmă prezența speciilor GT1c și GT1b. Din cauza simetriei
lanțului Gal -GalNAc -Gal, structur ile corespunzătoare GT1a și GT1d nu po t fi
discriminată prin ioni specifici de fragmentare . Cu toate acestea, apariția
acestor izomeri nu poate fi exclusă. În consecință, presupunem că toți cei patru
izomeri GT1a, GT1b, GT1c și GT1d sunt prezenți în amestecul nativ de
gangliozide din hemangiom. Totuși, deoarece prezența GT1c este susținută de
cel mai mare număr de ioni de fragmentare , am ales să ilustrăm în schema din
figura 19b calea de fragmentare experimentată de ionul corespunzător acestui
izomer. Pentru a confirma acest concept discutat mai sus, ionul sodiat
monodeprotonat simplu încărcat, detectat în spectrul amestecului de
gangliozid e CFH la m/z 1886,20 a fost supus CID MS2 în condiții identice de
fragmentare . Conform calculului de masă, acest ion corespunde unei structuri
GD1 având aceeași structur ă ceramidic ă (d18:0/20:0) a GT1 analizata anterior,
dar cu un rest mai puțin de Neu5Ac.

59
Spectrul CID MS2 este prezentat în figura 20a în timp ce schema de
fragmentare corespunzătoare izomerului GD1b este prezentată în figura 20b.
Elementul disialo detectat ca ion B 2β la m/z 603,40 este o indicație puternică a
prezenței izomerului GD1b (d18:0/2 0:0) în CFH. Această structură moleculară
care prezintă acizii sialici legați la galactoza internă este de asemenea
documentată de prezenta ionului de la m/z 1503,00 desemnat ca Z2α- (Na)
având compoziția (Neu5Ac2GalGlcCer)-.
În mod similar, doar datorită faptului că nu s -a detectat niciun ion exclusiv de
diagnostic pentru GD1a, prezența acestui tip de izomer nu poate fi exclusă.
Aceste similarități în căile de fragmentare sugerează că GD1b (d18:0/20:0) ar
fi putut fi supus transformării tumorale în GT1c ( d18:0/20:0) prin alfa 2,6 –
sialiltransferaza care adaug ă un acid sialic în timpul proceselor de modificare a
țesutului.

60

Figura 20. Fragme ntarea MS a ionului [M -2H + Na]- la m/z 1.886,20 corespunz ător speciei de gangliozide
GD1(18:1/20:0) detectate în amestecul de gangliozide HFC. a) Spectrul de fragmentare ( -)nanoESI chip
HCT MS2; b) Schema de fragmentare corespunzătoare izomerului GD1b. CID la amplitudini ale
semnalului RF variabil în intervalul 0,6 -1,0 V. Timp de achiziție 0,5 min [3]

4.1.5. CONC LUZII DE ETAPĂ

Conform cunoștințelor noastre, acesta este primul studiu preliminar al
gangliozidelor într -o tumor ă cerebrală de tip hemangiom definit din punct de
vedere histopatologic . De asemenea, este pentru prima dată când s -a folosit
metod a avansată de MS complet automatizat ă bazată pe chip -nanoESI cuplat
direct la HCT și CID MS2 pentru mapping -ul gangliozidelor din hemangiom ul
cerebral . Compoziția gangliozide lor identificat ă în hemangiom a fost modificată
în comparație cu cea din creierul uman normal . În timp ce în CFH prevalează
gangliozidele monosalilate scurte, în CFN gangliozidele mono – și polisializate
precum și componentele O-acetilate au fost regăsite ca specii dominante .
Presupunem că acest model alterat în hemangiom față de țesutul sănătos
folosit ca și control este rezultatul unei rate de biosinteză globală diferită,
datorită modificării expresiei anumitor glicoziltransferaze. Cu toate acestea, în
CFH, am reușit totuși să detectăm o specie O-Ac-GM4 și o specie O-Ac-GD2
și să corelam prezența O-Ac-GD2 cu caracterul benign al tumorii cerebrale
investigate. În plus, o specie GT1 (d18:0/20:0) detectat ă ca ion de intensitate
scăzută, părea a fi un alt marker găsit numai în CFH. Aplicând procedura CID
MS2 pe ionul molecular corespunzător GT1 (d18:0 /20:0) , această tehnică a
furnizat dovezi despre existenț a izomerului GT1c mai puțin obișnuit. Această

61
trăsătură structurală interesantă a fost susținută și prin analiz a CID MS2 a
ionului GD1 (d18:0/20:0).
În cele din urmă, un aspect notabil este reproduct ibilitatea, viteza de
lucru și sensibilitatea analizei. În aceleași condiții experimentale, metoda a
oferit reproductibilitate aproape de 100%. Deoarece sistemul robotizat a
pulveriz at cu o viteză de 50 nL/min și luând în considerare o concentrație a
probei de 0,5 pmol/pl, achiziționarea semnalului timp de 1,5 minute pentru un
screening MS al CFH și a două screeninguri CID MS2 a dus la un consum de
probă sub 40 fmoli. Din cunoștințele noastre, aceasta este cea mai mare
sensibilitate raportată până în prezen t în analiza gangliozidelor prin ESI MS .
Aceste rezultate inițiale indică fezabilitatea metodelor MS ultrasensibile și
precise pentru determinarea unei compoziții modificate a gangliozidelor
cerebrale. Datorită sensibilității ridicate pentru detectarea și identificarea
structural ă a speciilor minore de carbohidrați în amestecurile complexe, viteza
de analiză și alte avantaje demonstrate aici, nanoESI HCT MS și CID MSn
bazate pe chip au potențialul de a fi introduse ca metode de diagnostic medical
pentru ana liza comparativ ă a structurilor și compozi ției glicoconjuga ților
biologici omolo gi din țesuturi sau fluide ale corpului. Prin urmare, deja se
acordă o atenție deosebită îmbunătățirii continue a sistemului, combinației on –
line cu cromatografie lichidă și e lectroforeză capilară pentru punerea în
aplicare în cadrul unor investigații clinice axate pe descoperirea unor markeri
biochimici specifici pentru diagnosticarea precoce și terapia proliferărilor
benigne și maligne.

4.2. S TUDIUL PROFILULU I GAN GLIOZID IC AL
MENIN GIOMULU I CEREBRAL D IN PUNCT DE VEDERE
STRUCTURAL, PR IN CHIP N ANOES I QTOF MS

4.2.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Meningioamele sunt c el mai frecvente tipuri de tumo ri care provin din
sistemul nervos central. Acest t ip de tumoră se for mează la nivelul meningelui
cranio -spinal [271] . Aceste tumori au adesea o creștere lentă, 90% din ele fiind
benigne. Adesea, meningioamele nu produc simptome și nu necesită
tratament imediat, dar creșterea în dimensiune poate provoca probleme grave.
În un ele cazuri, o astfel de creștere poate fi fatală. Unele meningioame sunt

62
clasificate ca fiind atipice. Acestea nu pot fi considerate clar benigne dar nici
maligne , dar, în timp și în funcție de mai mulți factori, ele pot deveni maligne.
Un număr mic de me ningioame sunt maligne și tind să crească rapid. De
asemenea, ele se pot răspândi în alte părți ale creierului și dincolo de acesta,
adesea în plămâni.

Ca și în studiul hemangiomului , studiul de față urmărește să atingă
următoarele obiective :

 Dezvoltarea și optimizarea platformei analitice bazată pe MS pentru
studiul gangliozidelor din meningiom;
 Mappingul gangliozidelor extase din meningiom;
 investigare detaliată a compoziției gangliozidelor, urmată de analiza de
fragmentare a speciilor individuale regăs ite în meningiom utilizând o
metodă avansată de MS bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID
MS/MS
 Analiza statistică a datelor obținute prin intermediul platformei
Gangliobase 2.1 și interpretarea rezultatelor în concordanță cu datele
de literatură

Tumora a fost prelevată intraope rator, de la un pacient de sex masculin, în
vârstă de 54 de ani, care în antecedente prezenta parestezie în brațul stâng și
pierderea conștiinței. În urma efectuării tomografiei computerizate s -a detectat
o leziune hiperdensă cu dime nsiunile 52 × 41 × 33 mm în regiunea cerebrală
parietală dreaptă. Conform examinării histopatologice a țesutului tumoral
extirpat neurochirurgical, tumora a fost diagnosticată ca fiind meningiom
angioblastic. La fel ca și în cazul celorlalte tumori studiat e și ca urmare a
colaborării cu Facultatea de Medicină din Zagreb, permisiune pentru
experimente cu țesuturi umane în scopuri științifice a fost obținută din partea
Comisiei de etică a universității. De asemenea s -a primit consimțământul
informat al pacien tului.

4.2.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Extracția gangliozidelor din țesutul cerebral cu meningiom s-a efectuat
conform metodei Svennerholm și Fredman [ 90], modificată de Vukelic și colab.
[265]. Pe scurt, țesutul de meningiom a fost cântărit și omogenizat în apă
distilată rece pentru a obține un omogenat 10% (greutate /volum). S -au

63
adăugat cloroform, metanol și apă (cloroform: metanol: apă în raport 1: 2: 0,75)
pentru a se extrage lipidele. Extracția a fost efectuată de două ori. În
continuare s -a efectuat partiția urmat ă de reparti ție prin care în extract s -a
adăugat cloroform, metanol și ap ă până la raportul de volum final 1: 1: 0,8 și
au fost colectate faze superioare conținând gangliozide polare. Extractele brute
de gangliozide au fost purificate în mai multe etape: precipitarea complecșilor
de proteină -sare urmată de centrifugare; contaminanții cu masă moleculară
scăzută au fost îndepărtați prin gel filtrare, pe coloană Sephadex G -25 și
dializați în apă (peste noapte la 4° C).
După extracție și purific are, gangliozide le au fost evaporate până la
deshidratarea completă și au fost cântărite. Au fost folosite părți de amestec
nativ de gangliozide purificat atât pentru separarea HPTLC, cât și pentru
analiza prin MS.
Pentru experimentele nanoESIchip -QTOF MS s-a preparat o soluție
stoc de extract nativ de gangliozide dintr-o concentrație de aproximati v 0,5
mg/ml prin dizolvarea extractului uscat în metanol pur urmat ă de vortexare .
Soluți a stoc a fost depozitată la -27°C. Proba de lucru având o concentra ție de
aproximativ 2 pmol /L (calculată pentru o greutate moleculară medie a
gangliozidelor de 2000) a fost obținută prin diluarea soluției stoc în metanol.
Înainte de analiză, soluția probă / metanol a fost centrifugată timp de 2 ore într –
o centrifugă model Sigma 2-16 de la Sartorius (Gottingen, Germania).
Supernatantul a fost colectat și supus analizei MS/MS (-) nanoESIchip -QTOF
și CID MS/MS. Experimentele MS și CID MS/ MS au fost efectuate pe un
instrument QTOF Micro (QTOFTM Waters, Manchester, UK). Spectrometrul de
masă QTOF MS este conectat la un PC care rulează software -ul MassLynx
pentru a controla instrumentul, achiziționa și procesa date MS rezultate. Pentru
toate achizițiile, instrumentul a fost reglat pentru înregistrarea datelor la o
viteză de scanare de 2 scanări/ s. Instrumentul a fost reglat pentru a funcționa
în tehnica de detectie a ionilor negativi , deoarece gangliozidele , fiind molecule
sialilate, se ionizează mai bine în modul ion ilor negativ i. Pentru o ionizare
eficientă și o fragmentare minimă în sursă, tensiunea conului a variat în
intervalul 30 -60 V. Pentru toate experimentele, debitul gazului de desolvatare a
fost setat la 50 L/ h. Temperatura bloc ului sursă a fost setată la 100° C și
păstrată la această valoare în timpul tuturor experimentelor. A naliza MS/ MS a
fost efectuată prin CID la energii de accelerare redus e a ionilor folosind argon
ca gaz de coliziune , ionii fiind izolați într -o fereastră 2u.
Energia de coliziune și presiunea gazului au fost modificate treptat în
timpul experimentelor MS/M S pentru a induce o disociere optimă și o acope rire
înaltă a ionilor de fragment are. Spectrul de ioni al produsului reprezi ntă o sumă

64
de scanări combinate, achiziționat e la o energie de coliziune variabilă în
intervalul 30 -80 eV (El ab). În modul ion ilor negativ i, proba a furnizat un spectru
cu o acoperire mare a intervalului m/z scanat atât în MS, cât și în experimente
MS/MS CID. Ionii corespunzăto ri fragmentelor de carbohidrați au fost atribui ți
conform nomenclaturii introduse de Domon și Costello [ 92], în timp ce ionii
care au apărut ca o consecință a fragmentării ceramidelor au fost desemnați în
acord cu nomenclatura stabilită de Ann și Adams [ 272]. Infuzia prin
NanoESIchip a fost realizat ă utilizând un robot NanoMate 400 complet
automatizat care încorpor ează tehnologia ESI Chip (Advion BioSciences,
Ithaca, SUA). Robotul NanoMate a fost montat pe spectrometrul de masă
QTOF, cu ajutorul unui suport comercial produs de Advion BioSciences.
Acesta a fost controlat și manipulat de software -ul ChipSoft 8.1.1 car e
funcționează sub sistemul Windows. Pentru obținerea unui transfer optim al
speciei ionice în MS, alinierea fină a cipului de electrospray în raport cu conul
de eșantionare a fost realizată utilizând programul ChipSoft. Pentru a preveni
orice contaminare , pentru toate experimentele a fost utilizată o placă de
microtitrare acoperită cu sticlă. Cinci probe din soluțiile de lucru au fost
încărcate pe placa cu 96 de godeuri. Robotul a fost programat să aspire
întregul volum de probă, urmat de 2 μL de aer în v ârful pipetei, pentru a
preveni scurgerea eșantionului în timpul manipulării și apoi a livra mostra pe
partea de intrare a microcipului. Fiecare orificiu (nozzle) are un diametru
interior de 2,5 μm și în condițiile date a asiguratt un debit de circa 70 nL /min.
Procesul NanoESI a fost inițiat prin aplicarea tensiunilor între 1,3 -1,9 kV , o
presiune de 0,3-0,8 psi iar tensiunea conului s-a situat în intervalul 30 -60 V.
După inițierea pulverizări i, parametri de infuzie , cum ar fi tensiunea la vârful
pipetei, tensiunea conului și debitul gazului de desolvare au fost optimizate în
intervalele specificate pentru a spori pulverizarea stabilă, descompunere a
adecvată a clusterelor analit/ solvent, generarea de ioni multiplu încărcați și
minimizarea fragmentării în surs ă a reziduurilor instabile de Neu5Ac. După
infuzarea probei și analiza MS, vârful pipetei a fost evacuat iar pentru fiecare
probă s -a folosit un vârf și un orificiu nou , prevenind astfel orice contaminare
încrucișată. Deviația masei moleculare nu depășește 20 ppm (părți per million ),
care este în intervalul normal pentru acest tip de instrument de o înaltă
rezoluție și a curatețe.

65
4.2.3. SCREENINGUL MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI
PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM

Ionii detecta ți, împr eună cu atribuirea lor structurală pot fi observați în
figura 21 și sunt enumera ți în tabelul 6. Identificarea structurilor a fost efectuată
prin calculul masei și pe baza cunoștințelor dobândite anterior de spre acest tip
de molecule și respectând căile de biosinteză.

Figura 21 . Spectrul de masa ( -) nanoESI chip-QTOF MS al amestecului de gangliozide extrase din
maningiomul angioblastic. Solvent: MeOH; concentrația probei 2 pmol / μL; timp de achiziție: 2 min;
tensiunea pe capilar: 30 -60 V [4]

66
Tabelu l 6. Desemnarea speciilor ionice moleculare majore detectate în amestecul de gangliozide ex trase
din țesut de meningiom ; d, baza dihidroxi sfingoid ă; t, baza trihidroxi sfingoidă
Numărul de
structuri Masă
moleculară
experimentală
(m/z)
(monoizotopic) Tipul ionului
molecular Structura desemnată
1. 787.37 [M-H]− LacCer (d18:1/11:2)
2. 834.26 [M-H]− LacCer (d18:0/14:0)
3. 884.32 [M-H]− LacCer (d18:1/18:2)
4. 891.06 [M-H]− LacCer (d18:0/18:0)
5. 995.86 [M-H]− GA2 (d18:0/11:0)
6. 1041.10 [M-H]− GM4 (d18:1/ 20:2)
7. 1149.99 [M-H]− GM3 (d18:1/16:1)
8. 1151.98 [M-H]− GM3 (d18:1/16:0)
9. 1167.70 [M-H]− GM3 (t18:1/16:0)
10. 1177.96 [M-H]− GM3 (d18:1/18:1)
11. 1233.93 [M-H]− GM3 (d18:1/22:1)
12. 1259.90 [M-H]− GM3 (d18:1/24:2)
13. 1261.91 [M-H]− GM3 (d18:1/ 24:1)
14. 1275.82 [M-H]− GM3 (t18:1/24:2)
15. 1277.80 [M-H]− GM3 (t18:1/24:1)
16. 1437.65 [M-H]− GM2 (d18:1/22:1)
17. 1462.61 [M-H]− GM2 (d18:1/24:2)
18. 1489.55 [M-H]− GD3 (t18:0/18:0)
19. 1514.44 [M-H]− GD3 (d18:0/21:0) sau O-Ac-GD3 (d18:0/18:0)
20. 1542.41 [M-H]− GM1 (d18:1/18:1)
21. 1570.45 [M-H]− GM1 (d18:1/20:1)
22. 1598.40 [M-H]− GM1 (d18:1/22:1)
23. 1626.23 [M-H]− GM1 (d18:1/24:1) sau GM1 (d18:0/24:2)
24. 1628.22 [M-H]− GM1 (d18:1/24:0)
25. 1640.35 [M-H]− GM1 (d18:1/25:1)
26. 1644.31 [M-H]− GM1 (d18:0/25:0)
27. 1659.32 [M-H]− GM1 (t18:1/25:0)
28. 1792.69 [M-H]− GD1 (d18:1/15:1)
29. 1833.98 [M-H]− GD1 (d18:1/18:1)
30. 1861.95 [M-H]− GD1 (d18:1/20:1)
31. 1915.07 [M-H]− GD1 (d18:1/24:3)
32. 1916.92 [M-H]− GD1 (d18:1/24:2)
33. 1919.86 [M-H]− GD1 (d18:1/24:0) sau GD1 (t18:1/23:1)

67
Așadar , în urma screeningului MS s -a obținut un model bogat de ioni
moleculari, demonstrând prezența unui număr mare și o diversitate
neașteptată de glicoform e, unele din acestea continand ceramide mai puțin
obișnuite pentru anumite componente. 33 de specii de gangliozide , au fost
identificate, mai mult decât cele raportate până acum la alte cazuri de
meningi om (Fig. 22) . Evident, setul optimizat de condiții experimentale a
permis detectarea gangliozidelor cu un grad ridicat de sensibilitate, fără a
compromite ionizarea componentelor minore. Mai mult decât atât, este clar că
folosind nanoESIchip MS , pierdere a de ioni în sursă a fost evitată și timpul de
screening MS a fost redus semnificativ. O altă caracterist ică interesantă este
expresia exclusivă a gangliozidelor cu lanțuri carbohidrate mai scurte, în
special a celor cu conținut redus de acid sialic; NanoESIchip -QTOF MS nu a
furnizat dovezi privind gangliozidele cu un grad crescut de sialilare (>2). Cu
excepț ia GD2 identificat prin HPTLC, s-au detectat toate fracțunile indicate prin
această metodă . În plus, a fost identificat ă și clasa GM4, care nu a fost
obtinuta prin HPTLC. Conform valorilor m/z, toate speciile de gangliozide
prezintă baze cu catenă lungă (L CBs) cu 18 atomi de carbon, în timp ce
lungimea acidului gras variază de la C11 (pentru speciile asialo gangliozide )
până la C25. Așa cum a fost anticipat, cel mai mare număr de ioni și câte va
semnale, cum ar fi cele la m/z 1149.99, 1233.93 și 1261.91, car e sunt printre
cele mai intense din spectru, aparțin grupului GM3. Nouă ioni diferiti au fost
atribuiti variantelor GM3; șase dintre aceștia au baze dihidroxi și trei baze
sfingoid e saturate trihidroxi și aci zi grași cu C16, C18, C22 și C24 în
ceramid ele lor.

Figura 22. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut
cerebral cu meningiom

68
Un consens similar între proporția mare de fracți uni detectate de
HPTLC și numărul speciilor exprimate este documentat și pentru GD1. S -au
identificat structural șase gangliozide de tip GD1 care prezintă diferite structuri
Cer. Surprinzător, nanoESIchip MS a dezvăluit o mare diversitate de
glicoforme GM1 în țesutul de meningiom analizat. GM1 (d18:1/24:1) și/ sau
GM1 (d18:0/24 :2) detectati ca [M-H]- la m/z 1626 ,23 și GM1 (d18:1/24:0)
detectat ca [M -H]- la m/z 1628 ,22 au prezentat cea mai mare abundență în
ceea ce prive ște ionizarea . De intensitate considerabilă sunt , de asemenea,
semnalele la m/z 1598,40 core spunzătoare GM1 (d1 8:1/22:1), precum si cele
de la m/z 1570,45 și m/z 1640,35 atribuite GM1 (d18:1/20:1) și GM1:1/25:1). În
total, opt picuri care corespund la nouă structuri GM1 au fost identificate prin
determinarea precisă a masei. Aceste co nstatări indică faptul că deși
comparativ cu controlul ales, proporția globală a grupului GM1 este redusă
drastic, diversitatea formelor GM1 exprimate este mai mare decât se aștepta.
O discrepanță similară între proporția fracțiunii și numărul speciilor identificate
este vizibilă și pen tru clasa GM4. Această specie fiind în cantitate foarte mică
nu a putut fi detectată prin HPTLC. Pe de altă parte, analiza MS a evidențiat
cinci componente neutre de glicosfingolipid e (asialo): patru specii LacCer care
diferă prin compoziția ceramidelor și o specie GA2, toate vizibile în spectru ca
ioni abund enți din punct de vedere al ioniz ării în intervalul (880 -1050) m/z. Deși
analiza HPTLC a indicat faptul că anumite gangliozide migrează în vecinătatea
GD2, MS nu le-a confirmat prezența. Acest aspect ne cesită o clarificare
suplimentară deoarece glicoformele GD2, care apar în creierul uman sănătos ,
au fost găsite și în gliosarcom [130], hemangiom [ 3] și metastază cerebrală a
adenocarcinomului pulmonar , care va fi prezentat pe larg în subcapitolul
următor [5].

4.2.4. SCREENINGUL MS/MS AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI
PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESUT CEREBRAL CU MENINGIOM

MS/MS s -a concentrat pe ionii cei mai ab undenți, considerați de
interes . Conform calculului de masă, compozițiile cele mai probabile ale ioni lor
la m/z 1626,23 și m/z 1628,22 sunt GM1 (d18:1/24:1) sau GM1 (d18:0/24:2) și
GM1 (d18:1/ 24:0). Având în vedere valorile lor m/z apropiate, ionii la m/z
1626,23 și 1628,22 au fost izolați simultan în celula de coliziune prin setarea
parametrilor de izola re HM și LM la 8 și, respectiv, 8. Spectrul ionilor de
fragmentare este prezentat în figura 23 A , B și C.

69

Figura 23 A. Spectrul de mas ă (-)nanoESIchip -QTOF CID MS/MS al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z
1628, 22 detecta ți în amestecul nativ de gangl iozide din meningiom ul angioblastic, izola ți și fragmenta ți
simultan: m/z(60-660). Inserat ă: Schema de fragmentare a izomerului GM1b. Timp de achiziție 2 min;
energ ie de coliziune 30 -80 eV (Elab) . Denumirea fragmentelor carbohidrate și ceramidelor este realizată
conform nomenclaturii publicate [32] și [33]; ionii de fragmentare de diagnostic Y * și Z * pentru
GM1(d18:1/24:1), ionii de fragmentare de diagnostic Y # și Z # pentru GM1 (d18:1/24:0); N.a., nea tribuit
[4]

70

Figura 23 B. Spectrul de masa ( -)nanoESIchip -QTOF CID MS/MS al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z
1628, 22 detectati în amestecul naiv de gangliozide din meningiom ul angioblastic, izolati și fragmentati
simultan: m/z (680-1100). Timp de achiziție 2 min; energ ie de coliziune 30 -80 eV (El ab) [4]

71

Figura 23 C .Spectrul de mas ă (-)nanoESIchip -QTOF CIDMS/MS al ionilor [M -H]− cu m/z 1626,23 și m/z
1628, 22 detectati în amestecul nativ de gangliozide din meningiom ul angioblastic, izola ți și fragmenta ți
simultan: m/z (1100 -1700). Inserat ă: Schema de fragmentare a izomerului GM1 a. Timp de achiziție 2 min;
energ ie de coliziune 30 -80 eV (Elab) . Denumirea fragmentelor carbohidrate ob ținute și ceramidelor s-a
facut conform nomenclaturii publicate [32] și [33]; ionii de fragmentare cu rol diagnostic Y * și Z * pentru
GM1(d18:1/24:1), ionii de fragmentare cu rol diagnostic Y # și Z # pentru GM1 (d18:1/24:0); N.a., nealocat
[4]

72
După cum se observă în spectrul din figura 2 3 pentru a mbele specii, s –
au generat ioni i de fragment are sialila ți care sunt di agnostic i pentru apariția
izom erului GM1b. Astfel, ionii la m/z 1261,27 și m/z 1263,84 corespund
fragmentelor Y2* și respectiv Y2#. Ei au o compoziție generală de
Neu5AcGalGlcCer- și sunt caracteristici pentru locația Neu5Ac la galactoza
internă. Totodată , pe lângă ionii rezulta ți în urma fragment ării scheletului
zaharid ic, s-au observat semnale care indică scindări interne a le ambelor
ceramide. Aceste rezultate sunt compatibile cu o structură a izomerului GM1b
(Fig. 23 A ) pentru ambele specii fragmentate . În urma CID MS/MS s -a obținut
un număr crescut de ioni de fragmentare utili pentru stabilirea secvenței
monozaharidelor din ambele monosialotetraoze, precum și pentru
caracterizarea părților lipidice. Pentru a distinge ionii Y și Z care conțin un
aglicon diferit (Cer), se notează cu (#) pentru GM1 (d18:1/24:0) și cu (*) pentru
GM1 (d18:1/24:0) sau GM1 (d18:0/24:2). Acești ioni au fost ușor de recunoscut
datorită diferenței de 2u în masa lor. Este necesar a se sublinia faptul că
energie de coliziune a fost ajustata astfel încat s -a reușit să se prevină
desialilarea exhaustivă, care, datorită labilității Neu5Ac, apare în majoritatea
experimentelor CID. Datorită simetriei lanțului Gal -GalNAc -Gal (Fig. 23 C),
prezența structurii GM1a nu a putut fi confirmată pr in ioni de diagnostic
specifici. Cu toate acestea, având în vedere incidența ridicată a GM1a în
tumorile cerebrale și în creierul sănătos, prezența acestui izomer nu poate fi
exclusă și este probabil prezent și în meningiom.

73

Figura 24 A și B .Schemele de fragmentare ale: (A) Cer (d18:1/24: 1) și (B) Cer (d18:1/24:0). Denumirea
ionilor de fragmentare este în conformitate cu nomenclatura publicata [33], [4]

Ionii cu m/z 238,43 și 263 ,28 corespund fragmentel or de tip P și
respectiv Q caracteristice pentru baza sfingoid ă (d18:1) ( Fig. 24 A și B ).
Deoarece nu s -au găsit semnale care să susțină o bază s fingoid ă diferită,
există o mare probabilitate ca cele două fragmente Cer să prezinte LCB -uri
identice (d18: 1). Ionii la m/z 350,13 și m/z 390,04 sunt d iagnosti ci pentru un
acid gras saturat C24 și corespund ionilor de fragment are V# și, respectiv, T#
(Fig. 24 B). Acești ioni sunt însoțiți de semnale la valori m/z mai mari de 2u,
348,21 și 388,12, provenind de la un acid gras mononesaturat C24 ca ioni de
fragment are V* și T * (fig. 4A). În consecință, specia GM1 la m/z 1626.23 este
mult mai probabil să aibă structura ceramidei (d18:1/24:1) .

4.2.4. CONCLUZII DE ETAPĂ

În aceast studiu s-a efectuat o investigație detaliată a compoziției
gangliozide lor urmată de analiza prin fragmentare a speciilor individuale într -o
probă de țesut cerebral cu meningiom utilizând o metodă avansată de MS
bazată p e nanoESIchip QTOF MS și CID MS/ MS, paltformă dezvoltat în
laboratorul nostru . Analizele HPTLC și densitometrice au f ost utilizate în mod
complementar pentru a detecta profil ul fracției gangliozide lor și pentru a evalua
din punct de vedere cantitativ proporțiil e acestora în meningiom. HPTLC și
densitometria au indicat faptul că, cantitatea de gangliozide din această tumo ră
este d e aproximativ 20 de ori mai mic ă decât în țesutul cereb ral sănătos

74
raportat anterior de noi. Deși profil ul HPTLC a relevat doar șase fracții majore,
MS nanoESIchip -QTOF a furnizat date despre 34 de specii diferite de
gangliozide , numărul total de structuri identificate în acest eșantion particular
de meningiom fiind semnificativ mai mare decât cel raportat anterior pentru
meningioame. În comparație cu alte tumori, structurile identificate prezintă
lanțuri oligozaharidice mai scurte, cu un grad de s ialilare de până la doi. În
meningiomul supus analizelor MS, n u s-au descoperit modificări de tip O-
fucozilare, O-acetilare sau O -GalNAc utilizând MS chip-nanoESI așa cum s -au
găsit în alte tumori cerebrale [ 130,3,5 ] sau în creiere afectate de tulburări
neurodegenerative [6, 35 din meningiom]. În mod remarcabil, nanoESIchip MS
a evidențiat faptul că, în ciuda procentului redus a fracțiun ii GM1, un număr de
opt ioni au rezultat prin fragmentarea a nouă glicoforme GM1. Pentru a elucida
structura celor mai ab undenti ioni, care, conform calculului de masă,
corespund GM1 (d18:1/24:1) și GM1 (d18:1 /24:0) s-a efectuat f ragmentarea
simultană a acestor ioni prin CID MS/ MS. Datele obținute au arătat că pentru
fiecare GM1 (d18:1/24:1) și GM1 (d18:1/24:0), atât izomer ii a cât și izomerii b
sunt exprimați în meningiom. Aceste constatări legate de GM1 sugerează că,
în afară de aceasta, speciile GM3 sunt în general recunoscute ca un marker
incontestabil pentru acest tip de tumori . Cu atât mai mult, rolul GM1 justifică
explorarea și examinarea lor în continuare din această privință. În plus,
implicarea din pun ct de vedere fiziologic a variabilității relativ ridicate a
structurilor ceramidei rămâne un aspect deschis dezbater ii și investig ării. Din
punct de vedere metodologic , acest studiu preliminar efectuat folosind un
singur specimen de meningiom a demonstrat c ă nanoESIchip QTOF MS și
CID MS/ MS este metoda de elecție pentru analiza amestecurilor complexe de
gangliozide extrase din acest tip de tumori. Rezultatele obținute i lustrează
avantajele MS baz ate pe microfluidic a ultra-sensibilă în obținerea unei viziuni
mai realiste a expresi ei gangliozidelor din tumorile cerebrale, precum și în
descoperirea de structuri minore care pot fi relevante ca bio markeri și/ sau ținte
specifi c tumor ale. Considerăm că acest concept general introdus aici va servi
în mod benefic studiilor viitoare privind implementarea nanoESIchip MS pentru
descoperirea biomarkerilor gangliozidici și detectarea timpurie a acestui tip de
tumoră .

75
4.3. S TUDIUL P ROFILULU I GAN GLIOZID IC AL
METASTAZE I CEREBRALE A ADEN OC ARCIN OMULUI
PULMON AR , C OMP AR ATIV CU ȚESUTUL CEREBRAL
SĂN ĂTOS , DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL PRIN
CHIP N AN OES I QTOF MS

4.3.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Adenocarcinomul este o formă hi stologică comună a cancerului pulmonar
care conține anu mite caracteristici distincte ale țesutului malign din punct de
vedere arhitectural, citologic sau molecular [273] . Carcinomul pulmonar cu
celule mari , cea mai frecventă cauz ă a deceselor provocate de cancer în multe
țări, prezintă un risc crescut de metastazare cerebrală atingând un procent de
aproximativ la 44% din cazuri [ 274]. În comparație cu alte tipuri de cancer
primar, unde răspândirea la distanță este de obicei o complicație ulterioară,
cancer ul pulmonar dezvoltă metastaze intracraniene relativ timpuriu și este
adesea însoțit de simptome neurologice încă de la primul diagnostic [ 275].

Plecând de la aceste premize, cercetarea personală își propune să
realizeze următoarele obiective :

 Funcțional izarea platformei analitice bazată pe MS în vederea analizei
compoziționale și structurale a expresiei gangliozidelor în metastaza
cerebrală a adenocarcinomului pulmonary (metaADK) versus țesut
cerebral sănatos;
 Cartografierea gangliozidelor extase din met aADK comparativ cu țesut
sănătos;
 Analiza statistică a datelor obținute și interpretarea rezultatelor

La trei ani după operația de eliminare a tumorii primare pulmonare, un
pacient de sex masculin (73 de ani) prezintă simptome neurologice, cum ar fi
dureri de cap în zona occipitală, amețeli, greață și coordonare defectuoasă.
Prin tomografie computerizată a fost detectată o formațiune hiperdensă având
dimensiunile estimate 40 × 40 × 20 mm în vermisul cerebelar. Îndepărtarea
neurochirurgicală a masei tumora le și examinarea histopatologică a țesutului
tumoral (Departamentul de Neurochirurgie, Spitalul Universitar, Zagreb,
Croația) a evidențiat structuri glandulare și papilare căptușite cu celule
epiteliale coloidale anaplazice, multe dintre ele manifestând ac tivitate mitotică.
Aceste constatări au confirmat diagnosticul de metastază cerebrală a

76
adenocarcinomului pulmonar. Proba de cerebel uman sănătos care a servit
drept control (bărbat de 79 de ani) a fost prelevat în timpul necropsiei de la un
pacient deceda t, fără patologii cerebrale. A ceasta a fost obținut ă de la
Departamentul de Medicină Legală, Facultatea de Medicină, Universitatea din
Zagreb, Croația. Probele de țesut utilizate pentru analizele biochimice au fost
cântărite și depozitate la -20°C după înd epărtarea atentă a vaselor de sânge și
a elementelor necrotice. Ulterior pregătirii probelor (extragerea și purificarea
gangliozidelor) aceste sunt supuse analizei compoziționale și structurale prin
Chip-NanoESI QTOF MS.

4.3.2. CONDIȚII EXPERIMENTALE

Amestecurile de gangliozide izolate și purificate din metastazele
cerebrale ale adenocarcinomului pulmonar și ale țesutului cerebral normal au
fost analizate comparativ . Absorbanțele probelor și Neu5Ac utilizate ca
standard într -o gamă de concentrații cunosc ute au fost determinate la 580 nm;
concentrațiile aci dului sialic legat de gangliozide (GG-SA) au fost exprimate în
micrograme GG -SA pe gram de țesut proaspăt. Analiza calitativă a fost
efectuată prin separarea HPTLC a fracțiilor de gangliozide individuale pe
plăcile HPTLC de sticlă (silicagel 60, 0,2 mm, 10 x 10 cm, Merck, Germania).
Plăcile au fost introduse într -un sistem de solvenți conținând cloroform,
metanol și soluție apoas ă de CaCI 2 (58: 40: 9, în raport volume tric). După
uscare, placa a fost pulve rizată cu reactiv resorcinol ic și încălzită timp de 30 -45
minute până când fracțiunile gangliozidice au apărut ca benzi albastre. În cele
din urmă, fracțiile gangliozidice separate și vizualizate HPT LC au fost supuse
scanării densitometrice (LKB 2202 Laser Ultrascan, LKB, Bromma, Suedia) la
580 nm, așa cum s -a descris anterior [276], permițând o cuantificare relativă a
fracțiilor gangliozidice individuale, exprimată ca proporție relativă %) intr -o
probă. MS a fost efectuată pe un spectrometru QTOF Micromass (Waters,
Manchester, UK). Acesta este conectat la un calculator care rulează software –
ul MassLynx pentru a controla instrumentul, achiziționa și procesa date le MS.
Pentru toate achizițiile, instrumentul a fost reglat pentru înregistrarea datelor la
o vite ză de scanare de 2,1 scanări/ s. Toate spectrele de masă au fost obținute
în modul ion ilor negativ i, deoarece glicolipidele sialilate, cum ar fi
gangliozidele , prezintă o ionizare crescut ă în acest mod de operare . Pentru o
ionizare eficientă și o fragmentar e minimă în sursă, tensiunea conului variază
în intervalul 40 -50 V. Pentru toate experimentele, debitul gazul ui de
desolvatare a fost reglat în limita a 50 L/ h în timp ce temperatura sursei de ioni

77
a fost stabilită la 100°C și păstrate la această valoare î n timpul întregului
experiment. Tandem ul MS /MS a fost efectuat prin CID la energii joase folosind
argon ca gaz de coliziune. Pentru izolarea ionică, parametrii LM și HM au fost
setați ambii la valoarea 10. Aceste valori au oferit un compromis corect între
izolarea ionilor precursori și sensibilitatea la măsurare. Energia de coliziune și
presiunea gazului au fost reajustate de mai multe ori în timpul experimentului
MS/MS în curs de desfășurare pentru a induce o fragmentare optimă a
speciilor de gangliozide. Spectrele ionilor de fragmentare obtinu ți la o energie
de coliziune variabilă într -o gamă de 40 -70 eV (Elab). Toate spectrele de masă
au fost calibrate folosind ca si calibrator un amestec nativ disponibil din comerț
de gangliozide cerebrale bovine "Cronas sial", de la Fidia Research
Laboratories (Abano Terme, Italia). Proba comerciala standard a furnizat , prin
tehnica de detectie a ionilor negativi, un spectru cu o acoperire ionică
echitabilă a intervalului m/z scanat în atat in experimentele MS c ât și CID
MS/MS. Ionii fragmentelor de carbohidrați au fost atribuite conform
nomenclaturii introduse de Domon și Costello [92], în timp ce ionii
corespunzători fragmentării ceramidei au fost desemnați în acord cu
nomenclatura Ann și Adams [272]. Infuzia prin Chip-nanoESI complet
automatizat a fost efectuat ă pe un robot Nano -Mate 400 care încorporează
tehnologia cu cip ESI (Advion BioSciences, Ithaca, NY, SUA) montat pe
spectrometrul de masă QTOF. Robotul a fost controlat și manipulat de
software -ul ChipSoft care fun cționează în sistem Windows.
În urma analizei calitative prin HPTLC a probelor extrase se observa
migrarea fractiunilor GM3, GM2 GT1b, GD1b, GD2, GD3 și GM1. Fracțiunea
minoră suplimentară X1 cu proprietăți migratorii TLC a structurii monosialo -GG
a fost o bservată numai prin scanare densitometric ă (Figura 25).

78

Figura 25 a, b, c . Cromatografie în strat subțire de înaltă performanță a gangliozidelor extrase din (a)
țesutul cerebral sănătos și (b) metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar; (C) cuan tificarea
densitometrică a fracțiilor de gangliozide din metastaza cerebrală a adenocarcinomului [5]

Proporțiile fracțiunilor gangliozidice individuale separate prin HPTLC, care s -au
cuantificat prin analiza densitometrică, prezinta în mare măsură diferen te între
metastazele cerebrale (tabelul 1) și țesutul cerebral sanatos [ 263]. În proba
obținută din metastazele cerebrale, fracția gangliozidic ă cu proprietăți de
migrare corespunzatoare fracției GM3 a fost cea mai importantă, reprezentând
52,27% din conți nutul total de gangliozide urmat de GM2 cu 34,81%, în timp ce
proporțiile structurilor mai complexe (GM1, GD1a, GD1b, Și GT1b) au fost mai
mici compara tiv cu țesutul cerebral sanatos . Profilul caracteristic al
gangliozidelor având GM3 și GM2 ca cele mai ab undente fracțiuni seamănă
profilele gangliozidelor din țesutul pulmonar s ănătos și ale adenocarcinomului
pulmonar, după cum s -a raportat anterior [ 277].

79
4.3.3. SCREENINGUL MS1 AL GANGLIOZIDELOR EXTRASE ȘI
PURIFICATE DIN PROBELE DE ȚESU T CEREBRAL

Amestecuri le de gangliozide native purificate și extrase din metastaz a
cerebral ă de adenocarcinom pulmonar localizat în cerebel și din țesutul
cerebral sanatos au fost supuse screeningului nanoESI QTOF MS utilizand
conditii și parametri instrumentali identi ci. Fiecare spectru de masă a
reprezentat suma a 20 de scanări, obținute în numai 1 minut.
Spectrele de masă obținute sunt prezentate în figurile 26 și respectiv 28, în
timp ce ionii moleculari ai gangliozidelor detectați sunt enumerați în tabelele 7
și 8, împreună cu desemnarea structurală a acestora. În timp ce în spectrul de
masa din proba de metastază cerebrală sunt prezenți numai ioni simplu
încărcați, profilul MS al extractului gangliozidelor din proba de tesut cerebral
sanatos este caracterizata pri n prezența ionilor simplu, dublu și chiar triplu
încărcați. Analiza comparativ ă a spectrelor din figurile 2 6 și 28, obținute în
condiții experimentale identice, a evidențiat o diferență considerabilă în ceea
ce prive ște numărul și tipul structurilor gangl iozidice expri mate în metastazele
cerebrale (Tab. 7 ) față de țesutul cerebral sănătos (Tab. 8 )

80

Figura 26. Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al amestecului nativ de gangliozide izolate din
metastaz a cerebral ă a adenocarcinomului pulmonar. Solven t: MeOH; Concentrația prob ei 2,5 pmol/μL;
Timp de achiziție 1 min; Chip ESI: 1,5 kV; Tensiunea conului: 45 V [5]

81
Tabelul 7. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide ex trse din proba de metastază cerebrală
a unui adenocarcinom pulmonar, dete ctate prin analiza (−)chip -nanoESI QTOF MS a amestecului nativ
complex
Masă moleculară
teoretică ( m/z)
(monoizotopic) Masă
moleculară
experimentală
(m/z)
(monoizotopic) Acuratețea
(ppm)
Ion Molecular Structura propusă
875.19 874.91 33 [M–H]– LacCer(d18:1 /17:0)
933.31 932.99 35 [M–H]– LacCer(d18:0/21:0)
947.34 947.19 16 [M–H]– LacCer(d18:0/22:0)
949.22 949.24 21 [M + 2Na –3H]– LacCer(d18:0/19:0)
964.24 963.90 35 [M–H]– GM4(d18:0/14:0)
982.19 981.94 25 [M + Na –2H ]– GM4(d18:1/14:1)
984.21 983.87 34 [M + Na–2H ]– GM4(d18:1/14:0) sau GM4(d18:0/14:1)
1122.48 1122.23 22 [M–H]– GA2(d18:0/20:0)
1138.44 1138.15 25 [M–H]– Fuc-GM4(d18:0/16:0)
1138.48 29 GA2(t18:0/20:0)
1150.49 1150.17 28 [M–H]– GA2(d18:1/21:0)
1150.40 20 [M–H]– GM3(d18:1/16:1)
1168.42 1168.01 35 [M–H]– GM3(t18:0/16:0)
1178.46 1178.14 27 [M–H]– GM3(d18:1/18:1)
1179.74 1180.10 30 [M–H]– GM3(d18:1/18:0)
1182.49 1182.21 24 [M–H]– GM3(d18:0/18:0)
1184.37 1184.08 24 [M–H]– O-Ac-GA1(d18:1/10:0)
1194.50 1194.15 29 [M–H]– GM3(d18:1/19:0) sau GM3(d18:0/19:1)
1206.51 1206.33 15 [M–H]– GM3(d18:1/20:1)
1206.64 26 [M–H]– GA2(d18:0/26:0)
1222.51 1222.19 26 [M–H]– O-Ac-GM3(d18:1/18:0)
1222.55 29 [M–H]– GM3(d18:0/21:1) sau GM3(d18:1/21:0)
1234.56 1234.22 27 [M–H]– GM3(d18:1/22:1)
1234.52 24 O-Ac-GM3(d18:1/19:1)
1248.55 1248.18 33 [M–H]– O-Ac-GM3(d18:1/20:1)
1248.59 30 GM3(d18:1/23:1)
1248.59 1249.02 34 [M–H]– GM3(d18:1/23:0)
1260.60 1260.33 21 [M–H]– GM3(d18:1/24:2)
1262.62 1262.35 21 [M–H]– GM3(d18:1/24:1)
1264.63 1264.19 35 [M–H]– GM3(d18:1/24:0)
1276.61 1277.01 31 [M–H]– O-Ac-GM3(d18:1/22:0)
1276.64 29 [M–H]– GM3(d20:1/23:1)
1276.69 25 [M–H]–(−H 2O) GM3(d18:0/26:0)
1278.66 1278.21 35 [M–H]– GM3(d20:1/23:0)
1278.61 31 [M–H]– O-Ac-GM3(d18:1/22:0) sau O-Ac-GM3(d18:0/22:1)
1288.6 7 1289. 04 29 [M–H]– GM3(d18:1/26:2) sau GM3(d18:2/26:1)
1288.67 29 [M–H]– GM3(d20:1/24:2)
1292.68 1292.23 35 [M–H]– GM3(d18:1/26:0) sau GM3(d18:0/26:1)
1296.54 1296.24 23 [M–H]– Fuc-GM3(d18:1/16:1)
1296.59 27 [M–H]– O-Ac-GA1(d18:1/18:0)
1296.61 28 [M–H]– GA1(d18:0/21:0) sau GA1(d18:0/21:0)
1405.65 1405.21 31 [M + Na –2H ]– GM2(d18:1/18:0)
1420.68 1420.80 8 [M–H]– O-Ac-GM2(d18:2/18:2)
1435.59 1435.21 26 [M + Na –2H ]– GD3(d18:1/14:1) sau GD3(d18:0/14:2) sau
GD3(d18:2/14:0)
1441.66 1441.19 33 [M–H]– GD3(d18:1/16:1) sau GD3(d18:0/16:2) sau
GD3(d18:2/16:0)
1471.73 1471.28 31 [M–H]– GD3(d18:1/18:0)
1493.71 1493.23 32 [M + Na –2H ]– GD3(d18:1/18:0)
1515.69 1515.29 26 [M + 2Na –3H]– GD3(d18:1/18:0) sau GD3(d18:0/18:1)
1515.74 30 [M–H]– GM1(d18:1/16:1) sau GM1(d18:0/16:2) sau

82
GM1(d18:2/16:0)
1515.78 32 [M–H]– O-Ac-GD3(d18:0/18:0)
1515.71 1516.01 20 [M + Na –2H ]– GD3(d18:1/20:2) sau GD3(d18:0/20:3) sau
GD3(d18:2/20:1)
1515.75 17 [M–H]– GM1(d18:2/16:0) sau GM1(d18:1/16:1) sau
GM1(d18:0/16:2)
1527.83 1528. 16 22 [M–H]– GD3(d18:0/22:0)
1541.79 1542. 19 26 [M–H]– GM1(d18:1/18:2) sau GM1(d18:2/18:1) sau
GM1(d18:0/18:3)
1569.78 1570.29 32 [M + 2Na –3H]– GD3(d18:1/22:0) sau GD3(d18:0/22:1)
1569.83 29 [M–H]– GM1(d18:1/20:1) sau GM1(d18:0/20:2) sau
GM1(d18:2/ 20:0)
1569.77 33 [M + Na –2H ]– GD3(d18:0/24:2) sau GD3(d18:1/24:1) sau
GD3(d18:2/24:0)
1597.88 1598.09 13 [M–H]– GM1(d18:0/22:2) sau GM1(d18:1/22:1) sau
GM1(d18:2/22:0)
1611.77 1612.17 25 [M + 2Na –3H]– GM1(d18:1/20:2)
1625.89 1625.40 30 [M + 2Na –3H]– GD3(d18:1/26:1) sau GD3(d18:0/26:2) sau
GD3(d18:2/26:0)
1624.92 30 [M–H]– GM1(d18:1/24:2)
1627.90 1627.41 30 [M + 2Na –3H]– GD3(d18:0/26:1) sau GD3(d18:1/26:0)
1626.93 29 [M–H]– GM1(d18:0/24:2) sau GM1(d18:1/24:1) sau
GM1(d18:2/24:0)
1629.92 1629.42 31 [M–H]– GM1(d18:0/24:1) sau GM1(d18:1/24:0)
1628.94 29 [M–H]– di-O-Ac-GM1(d18:1/18:0)
1659.79 1660.18 23 [M + 3Na –4H]– GM1(d18:1/22:3) sau GM1(d18:0/22:4) sau
GM1(d18:2/22:2)
1674.87 1675.23 21 [M + Na –2H ]–
(−H 2O) GD2 (d18:1/18:2)
1748.97 1749.39 24 [M + Na –2H ]– GD2 (d18:1/22:1)
1766.97 1767.28 18 [M–H]–(−H 2O) GT3 (d18:1/20:1)
1785.07 1785.37 17 [M–H]– O-Ac-GD2(d18:1/23:0) sau O-Ac-GD2(d18:0/23:1)
1833.81 1833.28 29 [M–H]– GT3(d18:0/23:0)
1833.07 11 [M–H]– O-Ac-GT3 (d18:0/20:0)
1861.12 1861.24 6 [M–H]– O-Ac-GT3-lactone(d18:0/22:0)
1861.12 6 [M–H ] (−H 2O) O-Ac-GT3(d18:0/22:0)
1879.09 1879.39 16 [M + Na –2H ]– O-Ac-GT3 (d18:2/22:1)
1879.10 15 [M–H]–(−H 2O) Fuc-GT3(d18:0/17:0)
1879.99 32 [M–H]– GT2(d18:1/12:1) sau GT2(d18:2/12:0)
1909.16 1909.03 7 [M–H]– GD1 (d18:1/22:0)
1960.21 1959.84 19 [M–H]–(−2H 2O) GT2(d18:0/20:0)
1960.12 14 [M–H]– GT2(d18:1/18:3) sau GT2(d18:2/18:2)
1990.17 1989.78 20 [M + Na –2H ]– GT2(d18:0/18:0)
1990.19 21 [M–H]– GT2(d18:0/20:3) sau GT2(d18:1/20:2) sau
GT2(d18:2/20:1 )
1990.19 1990.83 32 [M–H]– GT2(d18:1/20:1) sau GT2(d18:0/20:2) sau
GT2(d18:2/20:0)
2005.20 2005.63 21 [M–H]– Fuc-GD1(d18:1/20:2)
2006.19 28 O-Ac-GT2(d18:1/18:1)
2048.23 2048.80 28 [M–H]– di-O-Ac-GT2(d18:0/18:0)
2048.10 34 [M–H]–(−H 2O) GT1(d18:2/14 :2) sau GT1(d18:3/14:1)

În contrast cu țesutul cerebral sănătos, în amestecul gangliozidelor
extras e din metastaza cerebral ă a adenocarcinomului pulmonar s -au detectat
mai ales specii gangliozidice cu lanțuri oligozaharidice scurte și cu conținut
redus de acid sialic. Mai mult de jumătate din totalul de 59 de ioni diferiți
detectați și corespunzând celor 125 de structuri posibile din țesutul metast atic

83
cerebral, reprezintă specii monosalilate de tip GM1, GM2, GM3 și GM4. Pe
lângă numărul mare de componen te monosalilate, sunt prezente opt sp ecii
asialo de tip GA1 și GA2 avand ceramide cu structură variabilă. GD1, GD2 și
GD3, precum și GT1, GT2 și GT3 cu catene scurte de carbohidrati, care conțin
diferite tipuri de ceramidă au fost de asemenea identificate în amestec.
Componentele gangliozid ice modificate prin fucozilare sau O-acetilare
au fost totodată detectate, dar ăn proporții diferit e față de cele din țesutul
cerebral sănătos; majoritatea gangliozidelor O-acetilate sunt specii
monosialilate de GM3, prec um și trisialilate GT3 – și tip GT2 – toate având lanțuri
carbohidrate scurte, în timp ce structurile modificate prin fucozilare sunt specii
monosialilate de tip GM3 și GM4, disialilate și trisialilate GD1 și GT3 care
prezintă în structurile ceramidei hete rogenitate mare .
Cei mai abunden ți ionii simplu încarcați cu m/z 1150,17; 1168,01;
1515,29 și 1627,41 sunt atribui ți structurilor GA2(d18:0/22:0) sau
GM3(d18:1/16:1); GM3(t18:0/16:0), ionul sodiat GD3 cu ceramida (d18:1/18:0)
sau (d18:0/18:1); GM1 cu ceram ida (d18:1/16:1) sau (d18:0/16:2) sau
(d18:2/16:0); O-Ac-GD3(d18:0/18:0) și GD3 sodiat cu ceramida (d18:1/26:0)
sau (d18:0/26:1); GM1 cu ceramida (d18:0/24:2) sau (d18:1/24:1) sau
(d18:2/24:0).

84

Figura 27. Distribuția numerică a speciilor de gangliozi de conținute în amestecul nativ extras din țesut
cerebral cu metastază a adenocarrcinomului pulmonar

85

Figura 28. Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al amestecului nativ de gangliozide izolate din
proba de cerebel sănătos . Solvent: MeOH; Concent rația prob ei 2,5 pmol/μL; Timp de achiziție 1 min; Chi p
ESI: 1,5 kV; Tensiunea pe capilar : 45 V [5]

86
Tabelul 8. Principalele specii de gangliozide și asialogangliozide ex trse din proba de cerebel sănătos,
detectate prin analiza (−)chip -nanoESI QTOF MS a a mestecului nativ complex
Masă
moleculară
teoretică ( m/z)
(monoizotopic) Masă moleculară
experimentală
(m/z)
(monoizotopic) Acuratețea
(ppm)
Ion Molecular Structura propusă
708.35 708.38 4 [M–3H]3– GT1(d18:1/18:0)
714.42 714.40 3 [M–3H]3– GT1(t18:0/18:0)
[M + Na –4H ]3– GT1(d18:1/18:2)
717.58 717.54 5 [M–3H]3– GT1(d18:1/20:0) sau GT1(d18:0/20:1)
734.91 735.12 29 [M–2H]2– GD3(d18:1/18:0) sau GD3(d18:0/18:1)
756.38 756.30 11 [M–2H]2– O-Ac-GD3(d18:1/18:0)
771.95 771.93 3 [M–2H]2– GM1(d18:0/18:1) sau GM1(d18:1/18:0)
822.05 822.06 1 [M + Na –4H ]3– GQ1(d18:1/20:0) sau GQ1(d18:0/20:1)
835.95 835.69 31 [M–2H]2– GD2(d18:1/18:1) sau GD2(d18:0/18:2) sau GD2(d18:2/18:0)
844.96 844.69 32 [M–2H]2– O-Ac-GD2(d18:0/16:0)
850.47 850.22 29 [M–2H]2– GD2 (d18:1/20:0)
863.51 863.21 35 [M–2H]2– Fuc-GM1(d18:1/22:2) sau Fuc-GM1(d18:0/22:3) sau Fuc-
GM1(d18:2/22:1)
863.00 24 [M–2H]2– GD2(d18:0/22:3) sau GD2(d18:1/22:2) sau GD2(d18:2/22:1)
862.99 26 [M + Na –3H ]2– GD2(d18:0/20:0)
878.03 877.88 17 [M–2H]2– GD2(d18:1/24:1)
886.03 885.78 28 [M–2H] –- O-Ac-GD2(d18:1/22:0) sau O-Ac-GD2(d18:0/22:1)
890.97 890.76 24 [M + Na –3H ]2– GT3(d18:1/18:1)
905.01 905.11 11 [M + Na –3H ]2– GT3(d18:1/20:0)
917.48 917.44 4 [M–2H]2– GD1(d18:1/18:0) sau GD1(d18:0/18:1)
924.49 924.76 29 [M–2H]2– GD1(d18:1/19:0)
924.53 25 [M + 2Na –4H]2– O-Ac-GT3(t18:1/20:0) sau O-Ac-GT3(d18:0/20:1)
931.49 931.45 4 [M–2H]2– GD1(d18:1/20:0) sau GD1(d18:0/20:1)
940.50 940.46 4 [M–2H]2– GD1(t18:0/20:0)
940.19 29 [M + 2Na –4H]2– GD1 (d18:1/18:0) sau GD1(d18:0/1 8:1)
945.51 945.50 1 [M–2H]2– GD1(d18:1/22:0)
952.52 952.50 2 [M–2H]2– O-Ac-GD1 (d18:1/20:0) sau O-Ac-GD1 (d18:0/20:1)
968.03 968.34 32 [M–3H]3– GH2(d18:1/24:0) sau GH2(d18:0/24:1)
991.56 991.27 29 [M + Na –3H ]2– GT2(d18:1/18:2) sau GT2(d18:0/18:3) sau GT2(d18:2/18:3)
1005.58 1005.28 30 [M + 2Na –4H]2– GT2 (d18:0/18:0)
1019.02 1019.36 33 [M–2H]2– GalNAc -GD1(d18:0/18:0)
1024.62 1024.68 6 [M–2H]2– di-O-Ac-GT2 (d18:1/18:0)
1024.57 11 [M + 2Na –4H]2– O-Ac-GT2 (d18:1/18:1)
1034.24 1033.94 29 [M + 2Na –3H] – GM4 (d18:1/16:0) sau GM4 (d18:0/16:1)
1042.60 1042.51 9 [M–2H]2– GT1 (t18:1/14:1)
1042.66 14 [M–2H]2– GalNAc -GD1(t18:0/20:0)
1046.59 1046.46 12 [M + Na –3H ]2– GT1(d18:1/14:0) sau GT1(d18:0/14:1)
1049.62 1049.51 10 [M–2H]2– GT1(d18:1/16:0) sau GT1(d18 :0/16:1)
1059.61 1059.28 31 [M + Na -3H ]2– GT1(d18:1/16:1)
1063.03 1063.35 30 [M–2H]2– GT1(d18:1/18:0) sau GT1(d18:0/18:1)
1074.02 1074.05 3 [M + Na –3H ]2– GT1(d18:1/18:0)
1077.04 1077.37 31 [M–2H]2– GT1(d18:1/20:0)
1097.18 1096.81 34 M–2H]2– O-Ac-GT1(d 18:1/20:1) sau O-Ac-GT1(d18:0/20:2) sau O-Ac-
GT1(d18:2/20:0)
1097.04 21 [M + Na –3H ]2– GT1(t18:0/20:0)
1110.70 1110.36 31 [M–2H]2– O-Ac-GT1(d18:1/22:2)

87
1118.49 1118.56 6 [M–H]– GM4(t18:1/24:0)
1180.47 1180.09 32 [M–H]– GM3(d18:1/18:0) sau GM3(d18:0/18: 1)
1228.51 1228.61 8 [M–H]– GA1(d18:0/16:0)
1228.49 10 [M + Na –2H ]– GM3(d18:1/20:1) sau GM3(d18:0/20:2)
1232.55 1232.12 35 [M–H]– GM3(d18:1/22:2) sau GM3(d18:0/22:3) sau GM3(d18:2/22:1)
1232.52 32 [M + Na –2H ]– GM3(d18:0/20:0)
1241.29 1240.86 35 [M + Na–3H ]2– O-Ac-GQ1(d18:1/18:0)
1252.58 1252.19 31 [M–H]– O-Ac-GM3(d18:0/20:0)
1252.60 33 GM3 (d18:0/23:0)
1264.54 1264.12 33 [M–H]– di-O-Ac-GM3(d18:1/18:0)
1284.60 1284.36 19 [M + Na –2H ]– GM3(d18:1/24:1)
1382.82 1382.87 4 [M–H]– GM2(d18:1/18:0) sau GM2(d18:0/18:1)
1409.70 1410.19 35 [M–H]– GM2(d18:1/20:0) sau GM2(d18:0/20:1)
1467.69 1467.86 12 [M–H]– GD3(d18:1/18:2)
1467.67 13 [M + Na –2H ]– GD3(d18:0/16:0)
1492.81 1492.89 5 [M + Na –2H ]– GD3(d18:1/18:0)
1509.73 1509.71 1 [M–H]– O-Ac-GD3(d18:1/18: 1)
1509.79 5 Fuc-GM2 -lactone (d18:1/18:1)
1513.76 1513.29 31 [M–H]– O-Ac-GD3(d18:1/18:0)
1516.84 1517.30 30 [M–H]– GM1(d18:1/16:0) sau GD3(d18:2/20:2)
1517.71 27 [M + Na –2H ]– Fuc-GM2(d18:2/16:2)
1537.72 1537.26 30 [M + Na –2H ]– GM1(d18:1/16:1)
1541 .73 1541.21 33 [M + 2Na –3H]– GD3(d18:1/20:0)
1544.87 1544.92 3 [M–H]– GM1(d18:1/18:0) sau GM1(d18:0/18:1)
1561.80 1561.36 28 [M–H]– O-Ac-GM1(d18:0/16:0)
1566.85 1566.68 11 [M + Na –2H ]– GM1(d18:1/18:0) sau GM1(d18:0/18:1)
1572.90 1572.92 1 [M–H]– GM1(d1 8:1/20:0) sau GM1(d18:0/20:1)
1589.83 1589.28 35 [M–H]– Fuc-GD3(d18:1/16:0)
1593.82 1594.16 21 [M + Na –2H ]– GM1(d18:1/20:0)
1599.89 1600.23 21 [M–H]– GM1(d18:0/22:0)
1629.88 1629.32 34 [M–H]– di-O-Ac-GM1(d18:1/18:0)
1648.88 1648.32 34 [M–H]– GD2(d18:0 /16:0)
1656.90 1656.88 1 [M–H]– GD2-lactone (d18:1/18:0)
1662.82 1663.16 20 [M + Na –2H ]– GD2(d18:2/16:2)
1674.92 1674.33 35 [M–H]– GD2(d18:1/18:0) sau GD2(d18:0/18:1)
1690.93 1690.95 1 [M–H]– Fuc-GM1(d18:1/18:0)
1700.96 1701.42 27 [M–H]– GD2(d18:1/20 :0) sau GD2(d18:0/20:1)
1708.88 1709.36 27 [M + Na –2H ]– O-Ac-GD2 (d18:1/16:1)
1716.94 1716.91 2 [M–H]– Fuc-GM1 (d18:1/20:1)
1717.98 1718.48 29 [M–H]– Fuc-GM1 (d18:1/20:0)
1729.01 1729.62 35 [M–H]– GD2(d18:1/22:0) sau GD2(d18:0/22:1)
1741.87 1741.27 34 [M + Na –2H ]– Fuc-GM1 (d18:0/20:0)
1746.92 1746.38 31 [M + 2Na –3H]– GD2(d18:0/20:0)
1775.04 1775.57 30 [M + Na –2H ]– GD2(d18:2/24:3)
1787.98 1787.76 12 [M + 2Na –3H]– Fuc-GM1(d18:1/22:1)
1796.07 1796.50 24 [M + Na –2H ]– Fuc-GM1(d18:1/24:0)
1803.02 1803 .64 34 [M–H]– O-Ac-GT3(d18:1/18:1)
1835.96 1835.91 3 [M–H]– GD1(d18:1/18:0) sau GD1(d18:0/18:1)
1857.02 1857.59 31 [M + Na –2H ]– GD1(d18:0/18:0)
1863.10 1863.61 27 [M–H]– GD1(d18:1/20:0)
1873.07 1872.68 21 [M+ Na -2H]– GD1(d18:1/19:0)
1879.93 1879.91 1 [M + 2Na –3H]– GD1(d18:1/18:0)

88
1887.79 1886.98 5 [M–H]– Fuc-GT3-lactone(d18:1/18:2)
Fuc-GT3-lactone(d18:0/18:3)
Fuc-GT3-lactone(d18:2/18:1)
1895.96 1896.06 5 [M + 2Na –3H]– GD1(d18:0/19:0)
1901.05 1901.71 35 [M + 2Na –3H]– O-Ac-GT3(d18:1/22:1)
1910.07 1909.43 34 [M–H]– GT2(d18:0/14:0) sau GT2(d18:0/14:1)
1915.17 1915.78 31 [M–H]– GD1(d18:1/24:2)
1925.14 1925.77 33 [M + Na –2H ]– GD1(d18:1/23:1)
1937.15 1937.80 34 [M + Na –2H ]– GD1(d18:1/24:2) sau GD1(d18:0/24:3) sauGD1(d18:2/24:1)
1964.16 1964.8 4 35 [M–H]– GT2(d18:0/18:0)
1983.20 1982.55 33 [M–H]– Fuc-GD1(d18:1/18:0)
2005.20 2004.61 30 [M–H]– Fuc-GD1(d18:1/20:2)
2010.16 2010.78 31 [M + Na –2H ]– GT2(d18:1/20:2) sau GT2(d18:0/20:3) sau GT2(d18:2/20:1)
2032.23 2032.63
20
[M–H]–
O-Ac-GT2(d18:1/ 20:1) sau O-Ac- GT2(d18:0/20:2) sau O-Ac-
GT2(d18:2/20:0)
2032.14 24 [M + 2Na –3H]– GT2(d18:1/20:2) sau GT2(d18:0/20:3) sau GT2(d18:2/20:1)
2050.24 2049.75 24 [M–H]– di-O-Ac-GT2 (d18:1/18:0)
2059.27 2059.78 [M + Na –2H ]– Fuc-GD1(d18:1/22:0)
2076.24 2076 .85 29 [M–H]– GQ3(d18:1/20:2) sau GQ3(d18:0/20:3) sau GQ3(d18:2/20:1)
2106.27 2105.78 23 [M–H]– (−H 2O) GT1(d18:1/18:2)
2166.32 2165.56 35
[M–H]–
O-Ac-GT1(d18:1/18:2) sau O-Ac- GT1(d18:0/18:3) sau O-Ac-
GT1(d18:2/18:1)
2165.03 24 [M + Na –2H ]– GT1(t18: 1/18:0)
2166.29 34 O-Ac-GT1(d18:1/16:0)
2172.19 2172.04 7 [M + 2Na –3H]– O-Ac-GT1(t18:1/14:1)
2188.38 2187.62 35 [M+ Na –2H]–(−H 2O) GT1(d18:1/22:0)
2188.39 35 [M + Na –2H ]– GT1(d18:1/21:1)
2198.31 2198.08 10 [M + 2Na –3H]– GT1(d18:1/20:0)
2214.25 2215. 78 24 [M + Na –2H ]– O-Ac-GT1(d18:1/20:2)

S-a descoperit că țesutul cerebral sănătos conține o varietate mai mare
de structuri gangliozidice care diferă prin gradul lor de sialilare, de la catene
scurte, monosalilate (GM) la catene lungi de carbohidrați po lisialilate (GH) și
de asemenea lanțuri de gangliozide modificate cu O -acetil (O -Ac) si fucozil
(Fuc) atașat. Speciile GM1 cu ceramida (d18:1/18:0) sau (d18:0/18:1), GM1 cu
ceramida (d18:1/20:0) sau GM1(d18:0/20:1) si Fuc -GM1(d18:1/18:0) au fost
detectati ca ioni abunden ți simplu încărcați la m/z 1544,92, 1572,92 și,
respectiv, 1690,95. Pe lângă aceste specii, ionii dublu încărcați foarte
abundenți observa ți la m/z 917,44 și 931,45 sunt alocați structurilor GD1
disialilate cu ceramida (d18:1/18:0) sau (d1 8:0/18:1) și cu ceramida
(d18:1/20:0) sau (d18:0/20:1). Aparent, proba de țesut cerebral s ănătos este
dominat ă de structuri mono -, di- și trisialilate. Astfel, 28 de semnale m/z
distincte corespund celor 44 de specii posibile de tip GM, 44 de semnale m/z
corespund la 63 de specii posibile de tip GD, iar 32 semnale m/z sunt atribuite
la 59 de specii de tip GT (Fig. 29) . Majoritatea acestor structuri au un nucleu
tetrazaharidic și prezintă o heterogenitate ridicată în porțiunea de ceramidă. În

89
plus, pot fi de tectate șase posibile structuri tetrasialilate (GQ) și o singură
specie asialo (GA). Se remarcă prezența unei specii GH2 hexasialilate având
constitutia ceramidei (d18:0/24:1) sau (d18:1/24:0). Această specie a fost
detectată ca [M -3H]3- la m/z 968,34 și n u s-a regăsit în proba de țesut
patologic. S -au identificat și 18 specii de gangliozide modificate prin fucozilare,
precum și 30 de variante posibile de gangliozide O-acetilate. Majoritatea
structurilor fucozilate sunt de tip GM1 și GD1 cu compoziții difer ite de acid gras
și/sau bază sfingoid ă în structura ceramidei. Spre deosebire de fucozilare, O-
acetilarea a fost identificat ă pentru o varietate mai mare de glicoforme precum
GM3, GM1, GD3, GD2, GD1, GT3, GT2, GT1 și GQ1, care diferă nu numai
prin compoziț ia lanțului oligozaharid, ci și prin statusul lor de sialilare.
Interesant este faptul c ă s-au detectat, de asemenea, patru variante posibile
de specii modificate prin di-O-Ac. Acestea apar țin tipurilor GT2, GM1 și GM3 .

Figura 29. Distribuția numerică a speciilor de gangliozide conținute în amestecul nativ extras din țesut
cerebral sănătos

90
4.3.4. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI GD3 (D18:1/18:0) ASOCIATĂ CU
METASTAZA CEREBRALĂ A ADENOCARCINOMULUI PULMONAR

Pentru a obține o caracterizare structurală completă a speci ei
GD3(d18:1/18:0) asociat ă cu metastazele cerebrale ale adenocarcinomului
pulmonar, specia monodeprotonată de la m/z 1471,29 poate fi atribuit ă în urma
calculul ui de masă la GD3(d18:1/18 :0). Aceasta a fost izolată și supusă
fragmentării utilizând C ID la energii joase. Rezultatele MS/MS obținute sunt
prezentate în figura 30, împreună cu o schemă care prezintă calea de
fragmentare a ionilor precursori. Tehnica chip -nanoESI MS/MS a fost capabil ă
să ofere ioni de fragmentare utili pentru o desemnare exa ctă a întregii
secvențe de carbohidrați a speciilor disialilate, precum și pentru caracterizarea
structural ă a porțiunii de ceramidă. Pierderea unui Neu5Ac terminal este
evidențiată de prezența ionului de fragment are Y3 abundent la m/z 1178,69
însoțit de f orma corespunzătoare Z 3 deshidratată la m/z 1160,67 și Y 3-/CO 2 la
m/z 1134,62. Monodesialilarea ulterioară este documentată de fragmentul
asialo Y 2 la m/z 888,19 și de asemenea B 1- (Neu5Ac-) la m/z 290,16, B 2-
(Neu5Ac 2-) la m/z 581,24, B 2-/CO 2 la m/z 537,21, B 2-/CO 2/H2O la m/z 519,20 și
C2- la m/z 599,26. Scindarea porțiunii de ceramidă a generat ionul Y 0 simplu
încărcat la m/z 564,00. Acest ion fragment împreună cu ionii simplu încărcați:
Y1- la m/z 726,51 (GlcCer), contrapartea lui deshidratată Z 1-
la m/z 708,45, Y 2-
la m/z 888,45 (GalGlcCer) B 3-/CO 2 la m/z 700,26 și C 3-/CO 2 la m/z 717,22
caracterizează secvența de carbohidrați și confirm ă structura ceramidei ca fiind
(d18:1/18:0). Această structură a ceramidei este susținută și de ionii de
fragment are derivați din ceramid ă la m/z 238,38; 265,40; 266,41; 282,28;
308,32 și 324,28 care pot fi atribui ți ionilor de tip P, Q, V, U, T și S (schema de
fragmentare este inserat ă în figura 30).

91

Figura 30. Spectrul de masă ( -) Chip -nanoESI QTOF MS al ionului simp lu încarcat cu m/z 1471,29 care
corespunde glicoformei GD3(d18:1/18:0) din amestecului nativ de gangliozide izolate din metastaz a
cerebral ă a adenocarcin omului pulmonar. Timp de achiziție 1 min Inserat : schemele de fragmentare a le
miezului oligozaharidic ș i porțiunii de ceramidă [5]

92
4.3.5. ANALIZA CID MS/MS A SPECIEI FUC-GM1 (D18:1/18:0) DIN PROBA
DE ȚESUT CEREBRAL SĂNĂTOS

Figura 31 prezintă spectrul de fragmentare al ionului simplu încărcat cu
m/z 1690.95 ob ținut prin analiza QTOF CID MS/MS, si care, con form calculului
de masa, a fost atribuit speciei Fuc-GM1(d18:1/18:0). Pentru determinarea
compoziției porțiunii oligozaharidice și a celei ceramidice , precum și pentru
colectarea datelor specifice după determinarea situsului de atașare al Neu5Ac
și Fuc, co ndițiile MS/MS au fost optimizate pentru a furniza cât mai multi ioni
posibili. În consecință, spectrele din figura 31 prezintă un număr mare de ioni.
Astfel, ionul Y 1- corespunz ător m/z 726,46 și omologul său deshidratat Z 1-
corespunz ător m/z 708,47, Y 2α- corespunz ător m/z 1325,81 și Y 3α-
corespunz ător m/z 1382,97 împreună cu Z 3α- corespunz ător m/z 1364,87
obținut după eliminarea apei corespunde structurii Gal -GalNAc -Gal-Glc-Cer-.
Inevitabil, acești ioni abundenți sunt însoțiți de ionii derivați prin pie rderea
uneia sau a ambelor atașamente labile ale Fuc și Neu5Ac. Cu toate acestea, o
comparație cu modelul de fragmentare al GM1(d18:1/18:0) din tesutul cerebral
sanatos, obținut anterior [278] pe un instrument QTOF MS în condiții CID
similare, indică fapt ul că în spectrul din figura 31 un număr de ioni deplasați cu
Δm = 146u (masa restului de Fuc), sunt diagnostic i pentru fucozilare. Gruparea
Fuc atașată la galactoza intern ă (așa cum se observ ă în figura 32) a fost
identificata și bine documentat ă de fragm entul Y 3α- cu m/z 1382,97 și
contrapartea lui deshidratată Z 3α- corespunz ător m/z 1364 ,87, Y 2α-
corespunz ător m/z 1325 ,81, Y 3α-/Y1β-
corespunz ător m/z 1091,80 care susțin
secvenț a Gal -NAc-Gal(Fuc) -Glc-Cer- (d18:1/18: 0) și Z 3α- /Y1β-
complement
corespunz ător m/z 1073,77. Atașamentul Fuc la galactoza intern ă este
rezultatul acțiunii α1 -2 sau α1 -6 fucoziltransferazei [ 279]. S-au găsit, de
asemenea, un număr de ioni de fragment are diagnostici p entru localizarea
fragmentului Neu5Ac legat la galactoza interna a scheletului oligozaharidic al
monosialotetraozei legat ă de Cer (d18:1/18:0). Acestia sunt: Y 2α-
corespunz ător m/z 1325,81 care susține secvenț a Neu5Ac -Gal(Fuc) -Glc-Cer-
(d18:1/18:0), Y 2α-/Y1γ- corespunz ător m/z 1179,85 care susține secvența
Neu5Ac -Gal-Glc-Cer (d18:1/18:0) împreună cu echivalentul său deshidratat
Z2α-/Y1γ- corespunz ător m/z 1161,83; Y 3α- corespunz ător m/z 1382.97, GalNAc
-Gal(Fuc)(Neu5Ac) -Glc-Cer- (d18:1/18:0) împreună cu echivalentul său
deshidratat Z3α- corespunz ător m/z 1364,87. Aceste d ate oferă dovezi solide
privind prezența izomerului structural GM1a în țesutul cerebral sănătos ( Fig.
32). Pe lângă caracterizarea completă a secvenței oligozaharidice a moleculei

93
GM1 și identificarea izomerului structural GM1a, fragmentarea MS/MS a
furniz at date despre constituția (d18:1/18:0) a ceramidei, care este direct
susținută de ionii Y0 și Z 0 detectați la m/z 564,16 și, respectiv la m/z 546,06,
precum și de prezen ța ionilor P, Q, V, U, T și S ( schema de fragmentare
corespunzatoare este inserată în figura 30).

94
Figura 31. Spectrul de masă (−)Chip -nanoESI QTOF CID MS/MS al ionului simplu încarcat cu m/z
1690 ,95 care corespunde structurii Fuc-GM1 (d18:1/18:0) ex tras din țesutul cerebral sănătos [5]

Figura 32. Schema de fragmentare prin CID MS/MS a gangliozidei Fuc -GM1(d18:1/18:0) extras ă din
țesutul cerebral sănătos [5]

4.3.6. CONCLUZII DE ETAPĂ

Combinând o metodă MS de înaltă performanță bazată pe chip –
nanoESI cu HPTLC și scanare densitometrică, abordarea prezentă a permis
detectarea și identi ficarea structurală a 125 de specii gangliozidice distincte
posibile în metastaz a cerebral ă a adenocarcinomului pulmonar, precum și
caracterizarea structurala a unei singure gangliozide din amestecul nativ
complex. Analiza cromatografică și densitometrică a indicat o scădere de 14
ori a conținutul ui total de gangliozide în metastaz a cerebral ă față de tesut ul
cerebral sănătos analizat pentru comparatie. Compoziția gangliozide lor din
proba de metastază cerebrala s -a dovedit a fi foarte modificată în comparați e
cu compoziția tesutului cerebral sănătos. Astfel, abundențele relative ale
fracțiunilor GM3 și GM2 au fost mai mari de 22,5 și respectiv 5,5 ori, în timp ce
fracțiunile GM1, GD1b și GT1b au prezentat abundențe relativ scăzute de
25,5, 17 și respectiv de 2,1 ori mai mici. Aceste rezultate sunt în concordanță
cu datele din literatură care arată că GM3 a fost principala componentă a
gangliozidelor în toate tumorile metastatice ale creierului uman de diferite

95
origini precum si faptul ca procentul redus al gan gliozidelor complexe, adică
GM1, GD1b, GD1a și GT1b este comun pentru multe tipuri de celule
transformate malign, în special pentru celulele tumorale metastatice [280]. În
condiții experimentale identice, analiza MS a eșantionului de țesut normal față
de c el metastatic a relevat, de asemenea, o variație vizibilă a profilului
gangliozidelor. În timp ce metastazele cerebrale se caracterizează prin specii
de gangliozide cu lanturi oligozaharidice scurte, cu conținut redus de acid sialic
și cu prevalența glicof ormelor de tip GM, țesutul cerebral sănătos este dominat
de structuri mono – până la hexasialilate cu o abundenta mai mare a structurilor
de tip GD și GT.
Reducerea conținutului total de gangliozide și a profilului modificat al
acestora în metastazele cereb rale față de țesutul sănătos analizat ar putea fi
rezultatul a ratei scăzute de biosintez ă, datorită modificării expresiei anumitor
glicozil și sialiltransferaze. O expresie crescut ă a sialiltransferazei I (GM3
sintaza) și II (GD3 sintaza) și o expresie re dusă a galactoziltransferazei II ar
putea, în par te, sa explice abunde nțele crescute ale GM3 și GD3 și
abund ențele sc ăzute ale GM1 și GD1b. Datele MS au indicat prezența în
țesutul metastatic a mai multor specii monosialilate neobișnuit e modificate prin
fucozilare sau O-acetilare cum ar fi Fuc -GM4, Fuc -GM3, di-OAc-GM3 și O-Ac-
GM3. Aceste specii au fost raportate anterior ca gangliozide asociate cu
creierul fetal , care sunt doar componente minore ale creierului normal [ 263]. S-
a raportat că GD3 (d18:1/18:0) ar putea spori proliferarea celulelor tumorale,
invazia și metastazarea într -o varietate de tumor i cerebrale, în special în gliom
și neuroblastom [ 281]. GD3 influențează angiogeneza și metastazele tumorale
prin stimularea eliberării VEGF din celulele tumo rale [ 282], prin urmare
caracterizarea sa structurală este de importanță biologică ridicată. Prin MS în
tandem utilizând CID, nucleul oligozaharidic al speciei GD3(d18:1/18:0) asociat
cu metastaza cerebrală a fost elucidat structural. În același timp, un n umăr de
ioni de fragment are ai Cer au permis, de asemenea, postularea compoziției
porțiunii lipidice. Condițiile MS/MS optimizate au permis evaluarea structurală a
Fuc-GM1(d18:1/18:0) detectată în tesutul sănătos. S -a descoperit că Fuc –
GM1(d18:1/18:0) iden tificat ă este un izomer atipic care poartă restul labil de
Fuc labil la molecula internă de Gal împreună cu un Neu5Ac atașat la aceeași
monozaharidă. Cu toate acestea, prezența izomerului cu Fuc atașată la Gal
externă a lanțului carbohidrat nu poate fi nic i exclusă, nici demonstrată.

Datorită simetriei lanțului oligozaharidic , nu există nicio posibilitate de
formare a ionilor de fragment are diagnostic i capabili să susțină fără echivoc
atașamentul Fuc la Gal. Prin urmare, prezența acestui izomer nu poate f i

96
exclusă, deși abordarea prezentă a permis o determinare lipsită de
ambiguitate a localizării Fuc la Gal internă dezvoltata de platforma NanoMate
în combinație cu fragmentarea în mai multe etape (MSn) pentru a se face o
diferență între tipurile posibile de legături glicozidice ( α-1-2) și ( α-1-6). În cele
din urmă, trebuie remarcat faptul că chip -nanoESI QTOF MS și CID MS/MS a
fost capabil să furnizeze o caracterizare structurală și compozitionala a
amestecurilor de gangliozide native din tumori cerebrale secundare, cu o
viteză și o sensibilitate de analiză remarcabilă. Din punct de vedere al debitului
furnizat de chip -nanoESI, care în condițiile aplicate a fost de aproximativ 100
nL/min, timpul de achiziție de 1 min la o concentrație de probă de numai 2,5
pmol/p L corespunde unui consum de 250 fmol de extract biologic. Astfel, un
screening -ul MS urmat de CID MS/MS necesit ă doar 500 fmoli de material. Din
toate aceste motive, platforma bioanalitică prezentată aici pentru determinarea
markerilor moleculari de tip GSL din tumorile cerebrale are perspective reale
de dezvoltare într -o metodă de rutină, ultrarapidă și sensibilă aplicabilă și altor
tipuri de cancer.

4.4. SOFTWARE ORIGINAL GANGLIOBASE DE IDNTRIFICARE A
GANAGLIOZIDELOR OBȚINUTE PRIN SCREENING -UL MS

Principiile de funcționare și definirea limbajul de programare C# au fost
descrise la capitolul Materiale și metode, subcapitolul Platforme Informatice. În
continuare vo i prezenta programul GanglioBase, cu variantele sale, modul cum
a fost conceput și avan tajele funcționării acestuia.
Acest software a fost scris cu ajutorul programului Visual Studio 2013,
Versiunea 12.0 și care folosește varianta 4.5.1 de .NET Framework . Microsoft
Visual Studio este un mediu de dezvoltare integrat (integrated development
environment – IDE) creat de Microsoft. Acesta poate fi folosit pentru a dezvolta
aplicații tip consolă și aplicații cu interfață grafică pentru toate platformele
supo rtate de Microsoft Windows (ex . NET Framework, Windows Mobile etc).
Datorită complexității s tructurale ale gangliozidelor, la o diferență
extrem de mică de masă, pot exista mai multe structuri teoretice. Astfel, după
generarea de către MS a spectrelor de masă ce conțin ionii detetați dintr -un
amestec complex, este dificil și anevoios de calculat și desemnat fiecare
structură în parte. Inițial am conceput o bază de date care să cuprindă cât mai
multe structuri teoretice posibile respectând formulele, regulile de calcul în
funcție de masele atomice ale elementelor componente și nomenclaturile
gangli ozidelor. În timp, această bază de date a cuprins peste 35000 de specii

97
teoretice distincte, făcând procesul de desemnare și caracterizare a ionilor
regasiți puțin mai ușor. Această bază de date pilot a fost alcătuită în Microsoft
Office Excel 2003. Totuși , timpul de prelucrare analitică a spectrelor era destul
de lung, chiar dacă datorită acestei baze de date desemnarea structuril or erau
mai ușor de realiza t. Atunci am început să ma documentez și să trasez un
concept de aplicație capabilă să ruleze această bază de date nou creată.
Pentru a putea fi utilă, această aplicație trebuia să îndeplinească
următoarele funcții: să citească o bază de date cu structuri teroretice, să
conțină comanda de selectare a ionului în funcție de masa moleculară dată, să
genereze toate variantele teoretice posibile pentru masa dată, cu o marja de
eroare de +/ – o unitate, să fie compactă și ușor de folosit, codul sursă al
aplicației să rămână deschi s pentru viitoarele îmbunătățiri, să poată fi instalată
pe orice sistem de operare i ar rezulatatele generate să fie de încedere. În
Visual Studio, limbajul C#, fiecare aplicație nou creată este însoțită de un cod
unic, denumit cod sursă. Pentru orice modificare ulterioară a programului, este
important ca acest cod să nu fie închis (finali zat).

Figura 33. Print screen al bazei de date Access folosită de program

Figura 33 reprezintă prima bază de date în format Microsoft Office
Access și care conținea doar 4 câmpuri și anume: ID -ul sau num ărul de ordine
al structurii, raportul masa/sarci na m/z, desemnarea ionului molecular și

98
structura propriu zisă. Pe această bază s -a construit prima aplicație denumită
generic „Cătălin” și care este prezentată în figura 34.

Figura 34. Print screen al interfațării primei variante de software

După in droducerea de către utilizator masei moleculare experimentale,
această variantă a fost capabilă să caute în baza de date prezentată mai sus și
să genereze toate variantele teoretice posibile, inclusiv ionul molecular și
structura propusă. Pe parcurs, aceas tă variantă s -a dovedit utilă, dar doar
până la o limită. Dintre minusurile acestei variante se pot aminti următoarele:
1). masa moleculară nu este afișată cu zecimale iar în spectrometria de masă
(în special când se folosesc aparate cu rezoluție înaltă ge n QTOF sau FTICR )
diferențele de ordinul zecimalelor pot fi importante; 2). conținea doar 3
câmpuri, deci complexitat ea reuzultatelor generate era redusă; 3). la instalarea
acestei variante pe o altă unitate PC/laptop apareau erori de
instalare/dezinstalar e. Au mai existat 2 variante intermediare ale acestei
aplicații dar fiecare cu plusurile și minusurile aferente.
După mai mulți ani de documentări și studiu în domeniul IT, dar și MS,
necesitățile apărute în practică ne -au orientat spre varianta la zi a s oftware -ului
care îndelpinește cel mai bine cerințele actuale. În primul rând am actualizat
baza de date adăugând câmpuri ce conțineau detalii despre starea de
încărcare a ionilor ( Fig. 33, Fig. 34 ), afișarea ionilor după tehnica de detectie a

99
ionilor (negativi sau pozitiv i) și combinații ale acestora. Pentru atestarea
faptului că acest program este unic și original, figura 35 reprezintă un print
screen din momentul scrierii programului (al codului sursă a programului).

Figura 35. Print screen din moment ul scrierii programului (al codului sursă a programului)

Așa cu m se poate observa din figura 36 A și B , principiul de operare al
acestei aplicații s -a dorit a fi unul simplu, eficient și care poate fi folosit de
rutină. Fiind conceput ca un fișier de tip .exe, după accesarea acestuia se
deschide o fereastră de operare, iar utilizatorul poate introduce masa
moleculară dorită în unul din cîmpurile libere. În figura 36 A , am încercuit
primul câmp pentru a marca spațiul liber destinat introducerii masei
molecu lare. Pentru a prezenta modul de funcționare, am ales aleator ionul
teoretic la m/z 2431 și am apasat butonul “Cauta!”. Programul a generat toate
variantele teoretice posibile, cu două zecimale și cu o marjă prestabilită de +/ –
o unitate. Astfel se poate p roceda pentru orice masă moleculară care apare pe
spectrul de masă și despre care dorim să aflam detalii structurale.

100

Figura 36. A. Print screen al interfațării software -ului și exe mplificarii modului de operare -1

Un alt exemplu este prezentat în fi gura 36 B, unde am ales opțiunea de
căutare în funcție de starea de încârcare și de modul de ionizare, respectiv
doar ion dublu încărcat , tehnica de detectie a ionilor negativi . Astfel am obținut
stucturi teoretic posibile de gangliozide cu mase de aproxim ativ 3000 ceea ce
reprezintă ionul de la 1500 dublu încărcat, t ipul ionului molecular și structura
posibilă (GP/GH).

A

101

Figura 36. B). Print screen al interfațării software -ului și exe mplificarii modului de operare -2

În concluzie, această ulti mă variantă de program s -a dovedit utilă și
fiabilă, fiind testată de specialiști în domeniu și care i -au atribuit calificative
excelente pentru modul de rulare și pentru rezultatele generate. Desigur, am
gandit pe viitor o variantă care să ruleze în acela și timp și o altă bază de date
separată care să conțină structurile posibile ale ceramidelor precum și
posibilitățile de fragmentare ale gangliozidelor respectând nomenclaturile
[92,153 ].

B

102
4.5. STUD IU P ILOT PENTRU TESTARE A FE ZAB ILITĂȚII
METODELOR DE SPECTR OMETR IE DE MAS Ă
DEZV OLTATE PENTRU STUD IUL INTER ACȚIUN ILOR
FUNCȚION ALE PR OTE INE – GLICOC ONJU GAȚI

Alergia la proteinele laptelui de vacă apare și la sugarii exclusiv alăptați
la sân dacă mama consuma lapte de vacă și/sau produse derivate. Aceasta
este princ ipala cauză a intoleranței alimentare în primele 6 luni de viață și este
dependentă de alimentația mamei. β -Lactoglobulina (BLG) – o proteină
prezentă în laptele de vacă este unul dintre cei mai agresivi alergeni pentru
nou-născut și poate declanșa o imagi ne clinică complexă. Deoarece nu este
disponibil un tratament profilactic, găsirea în prezent a unor liganzi capabili să
lege β -LG și astfel sa -i reducă alergenitatea este în prezent subiectul
cercetării. Studiile anterioare efectuate în acest domeniu [283, 284] au sugerat
că unele clase de oligozaharide leagă β -LG și astfel, pot reduce alergenicitatea
acesteia.
Acest studiu face parte dintr -un proiect mai amplu pe care grupul de
cercetare din care fac parte îl desfășoară și care se va extinde în viitor. S tudiul
complecșilor biomoleculari au o importanță deosebită datorită diverselor roluri
biologice pe care aceștia le pot îndeplini. Fie că este vorba de legaturi
protetină -proteină sau proteina -zaharuri sau gangliozide, însemnătatea
funcțională este demnă d e a fi inclusă în studiu.

4.5.1. IPOTEZA DE LUCRU ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

În cadrul acestui studiu a fost elaborată o metodologie inovatoare care
cuprinde ionizarea complet automată bazată pe Chip nanoESI, cuplată cu
spectrometrie de masă de înaltă rezo luție pe un instrument QTOF MS .
Această platformă a fost utilizată pentru evaluarea interacțiunilor necovalente
dintre maltohexaoză (Glc 6) și beta -lactoglobulin ă – o proteină extrasă din
laptele uman, după un aport deliberat de lapte de vacă. Experimentele au fost
efectuate în modul pozitiv (+) ESI, utilizând prima dată soluții tampon de acetat
de amoniu (pH 6,0) și apoi apă pură. În ambele cazuri, analiza MS a evidențiat
formarea complexului β-LG-Glc 6, care a fost caracterizat prin fragmentarea MS
în tande m (MS/MS) în varianta top -down utilizând CID. Constatările noastre au
un impact biomedical semnificativ, indicând faptul că Glc 6 leagă β-LG în
condiții care modeleaz ă mediul in vivo și, prin urmare, ar putea reprezenta un
ligand, capabil să reducă alergen icitatea acestuia. În acest context, în studiul

103
de față a fost imaginat un test inovator microfluidic – MS pentru caracterizarea
interacțiunii necovalente dintre maltooligozaharide și β -lactoglobulina extrasă
din laptele uman, în urma unui aport deliberat de lapte de vacă. Proteina a fost
incubată cu Glc 6 și posibilii produși de reacție au fost supuși unei analize
compoziționale și structurale detaliate prin chip -nanoESI MS complet
automatizat. Studiul MS al produ șilor de reacție a evidențiat formarea unui
complex necovalent β-LG -Glc 6, care a fost caracterizat structural printr -un
experiment de fragmentare top-down bazat pe CID (Fig. 37).

Figura 37. Reprezenatrea schematică a algoritmului de desfășurare a studiului interacției necovalente
dintre β -LG și Glc 6

4.5.2. REACTIVI ȘI MATERIALE

Acetatul de amoniu, acidul acetic și acidul formic de calitate analitică au
fost achiziționate de la Merck, Darmstadt, Germania. Apa distilată și deionizată
provenită din sistemele de apă Milli -Q, Millipore, Bedford, MA, SUA, a fost
utilizată pentru prepararea soluțiilor. SpeedVac SPD 111 V -230 pentru
concentrarea probelor a fost achiziționat de la Thermo Electron, Asheville, NC,
SUA. Aparatul a fost cuplat la o pompă de vid PC 2002 Vario cu controler CVC
2000 de la Vaccu brand, Wertheim, Germania. Dializa a fost efectuată utilizând
sisteme Micro DispoDialyzer de la Harvard Apparatus, Holliston, MA, SUA.

104
Termomixerul utilizat pentru agitare a fost un Eppendorf Thermomixer de la
Eppendorf, Hamburg, Germania, Glc 6 (Mr 990.86) și β-LG standard (90%) a u
fost achiziționat e de la Sigma -Aldrich Ltd. (St. Louis, MO, SUA) și utilizat e fără
purificare suplimentară. PH -ul a fost măsurat utilizând un pH -metru de la
Mettler -Toledo, AG, Schwerzenbach, Elveția. Extragerea β-LG din l aptele
uman a fost efectuată urmând protocolul descris de Cohen și Chait [285] și
Schneider și colab. [286]. Spectrometria de masă a fost efectuată în mod ion
pozitiv pe un spectrometru de masă cuadrupolar cu timp de zbor (QTOF MS,
Waters, Manchester, UK), co ntrolat de software -ul MassLynx v. 4.1, cuplat la
un robot NanoMate (Advion BioSciences, Norfolk, Marea Britanie) prin
intermediul unui suport de montare special conceput. Chip-ul nanoESI utilizat
prezintă 400 de orificii cu diametrul interior de 2,5 μm. F olosind software -ul
ChipSoft, robotul a fost programat să aspire întregul volum de probă, urmat de
2 μL de aer pentru a împiedica scurgerea eșantionului în timpul manipulării. În
cazul studiului interacțiunii β-LG-Glc 6 folosind ca soluție tampon acetatul d e
amoniu/acid formic, Chip nanoESI a fost setat la 1,8 kV pe vârful pipetei,
tensiunea conului de 40 V, cu o presiune a nebulizatorului de azot de 60 psi.
Pentru desolva tarea optim ă a picăturilor de probă, blocul sursă a fost menținut
la 80°C. Fragmentarea de tip top -down a complexului format a fost efectuată
prin CID la energie variabilă, folosind argonul drept gaz de coliziune.
Nomenclatorul ionilor fragmentului oligozaharidic a urmat recomand ările lui
Domon și Costello [92] . În toate figurile sunt prezen tate masele monoizotopice.
Reproductibilitatea de rulare a experimentului în timpul funcționării a fost
situată între 98 și 100%, în timp ce reproductibilitatea probă -probă a fost de
aproape 95%.

4.5.3. TESTE DE INTERACȚIUNE ALE β-LG-Glc 6

Solventul util izat pentru studierea interacțiunilor necovalente a fost 10
mM acetat de amoniu apos, ajustat cu 98% acid formic la pH 6,0. Deși o
concentrație ionică mai mare a influențat în mod pozitiv gradul de interacțiune,
concentrația de 10 mM de acetat de amoniu la pH 6,0 s -a dovedit a fi un
compromis corect între formarea complexului și cerințele impuse de ionizarea
prin electrospray . Interacțiune a proteină -ligand (oligozaharidic) a fost
efectuată, în condiții care să respecte mediul natural într -un termomixer
Eppendorf, prin incubarea la 37°C a soluției β -LG în soluție tampon la o
concentrație de 5 pmol μL-1 cu o soluție tampon de Glc 6 la o concentrație de 10
pmol μL-1. S-au colectat alicote de 5 μL după 1, 5, 10, 15, 20, 25 și 30 de

105
minute de incubare și s -au sup us analizei MS. În urma un or serii de proceduri
de optimizare, s -a constatat că stoichiometria de 1:2,5 Glc 6: β-LG este cea mai
potrivită atât pentru formarea completă, cât și pentru detectarea acesteia de
către MS. Pentru a minimiza interferența în proces ul de reacție în timpul
procedurii de colectare, flaconul nu a fost îndepărtat din termomixer. Pentru
analiza interacțiunii efectuată în apă pură, cele mai bune rezultate s -au obținut
prin incubarea timp de 50 min la 37°C a 30 μL de soluție β-LG la o
conce ntrație de 5 pmol uL -1 cu 6 μL de soluție Glc 6 la o concentrație de 10
pmol-1.

4.5.3. 1. Interacțiunea β-LG-Glc 6 în acetat de amoniu/acid formic
β-LG extras și purificat din laptele uman după consumul de lapte de
vacă a fost uscat și ulterior dizolvat în acetat de amoniu apos 10 mM, ajustat
cu 98% acid formic (pH 6,0) până la o concentrație finală de 5 pmol μL -1. S-au
încărcat 5 μL β-LG/soluție tampon în godeul plăcii de microtitrare a robotului
NanoMate. Proba a fost infuzată automat în QTOF MS hibrid, pr in intermediul
chip-nanoESI în modul pozitiv. Spectrul, achizi ționat în numai 2 minute, este
prezentată în figura 38.

Figura 38. Spectrul de masă (+)Chip -nanoESI QTOF MS al BLG extras din laptele uman. Concentrație, 5
pmol μL -1 în 10 mM acetat de amoniu /acid formic, pH 6,0. Tensiunea NanoESI,1,8 kV; tensiunea aplicată
conului 40 V; presiunea nebulizatorului 60 psi; timpul de achiziție, 2 min [15]

106
O evaluare detaliată a spectrului arată că soluția tampon de acetat de
amoniu/acid formic la pH 6,0 a indus o ionizare corectă a β-LG. S -au detectat
cinci semnale de intensitate ridicată, formând anvelopele specifice proteinei la
m/z 2026,63; 2279,86; 2605,38; 3039,41 și 3647,00. Utilizând funcția de
deconvoluție a software -ului MassLynx v. 4.1, semnalele au fos t atribuite seriei
de molecule β-LG protonate, de la [ β-LG + 5H+]5+ până la [ β-LG + 9H+]9+.
Conform calculului, masa moleculară monoizotopică determinată experimental
(Mr) a β-LG din laptele uman este (18,230.50 ± 0,2) Da. După incubarea β-LG
și Glc 6, alicotele din masa de reacție au fost colectate la 1, 5 și 10 min. După 1
min, s -au colectat 5 μL și s -au încărcat direct pe placa robotului NanoMate.
Spectrul MS, rezultat în urma achiziți ei timp de 2 minute în modul ion pozitiv,
este prezentată în figura 39.

Figura 39. Spectrul de masă (+) Chip -nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc 6 după 1 min
de incubare în soluție tampon la 37°C. Alte condiții de MS s unt identice cu cele din fig. 38 [15]

Pe lângă anvelopa caracteristic ă diverselor stadii de p rotonare a β -LG
(de la 5+ la 9+ ), spectrul de masă prezentat în figura 39 mai prezintă un
semnal la m/z 2750,10. Acest m/z corespu nde unuei mase moleculare de
19242,51 Da la o stare de încărcare 7+. Pe baza calculului, această valoare ,
sugerează un complex necovalent al β-LG cu Glc 6 monosodiat si
hexaprotonat . În screening -ul MS al Glc 6, forma sodiată a Glc 6 a fost găsită ca

107
cel mai abundent ion la m/z 1013,85. Spectrul produșilor de reacție, colectați
după 5 min de incubare , este prezentat în figura 40. În comparație cu spectrul
din figura 39, se observă o singură diferență. Intensitatea semnalului ionic,
care corespunde complexului β-LG cu Glc 6, este mai mare decât cea a ionilor
omologi.

Figura 40. Spectrul de masă (+)Chip -nanoESI QTOF MS a produselor d e reacție β-LG-Glc 6 după 5 min de
incubare în soluție tampon la 37°C. Alte condiții de MS sunt identice cu cele din fig. 38 [15]

Acest fapt sugerează că, între min 1 și min 5, reacția a fost încă în
desfășurare. Pe baza acest ei remarci , s-a hotarat ca proc esul sa fie
monitorizat în continuare. Prin urmare, la 10 min după incubare, s -au colectat 5
μL și s -au supus screening -ului chip nanoESI QTOF MS în modul pozitiv și în
condiții identice. Spectrul înregistrat este prezentat în figura 41.
În comparație cu celelalte două experimente, spectrul din figura 41
prezintă o intensitate mult mai mare a semnalului, corespunzând complexului
necovalent la m/z 2750,09. Spectrele probelor colectate în continuare, până la
30 de minute cu un interval de timp de 5 minute, n u au prezentat modificări
semnificative.

108

Figura 41. Spectrul de masă (+) Chip -nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β-LG-Glc 6 după 10 min
de incubare în soluție tampon la 37°C. Concentrație, 5 pmol μL -1 în apă la pH 7,0 . Tensiunea
NanoESI,1, 9 kV; te nsiunea aplicată conului 60 V; presiunea azotului 0,40 psi; presiunea nebulizatorului
60 psi; timpul de achiziție, 2 min [15]

Pentru a studia în detaliu complexul format al β-LG cu Glc 6, ionul
detectat la m/z = 2750,09 a fost izolat într-o fereastră de iz olare de 2 u.a.m. și
supus fragmen tării prin CID, la energii variabile. În figura 42, este prezentată
analiza top -down efectuată folosind ca precursor ionul corespunzător
complexului detectat în proba colectată după 10 minute.
Fragmentarea în condiții ide ntice ale aceluiași ion precursor după 1 și 5 min de
reacție a condus la rezultate aproape identice. Inspectarea spectrului în figura
42 prezintă un număr de ioni de fragment diagnostic pentru complexul β-LG –
Glc 6 (Na).
Mai mult decât atât, modelul de fra gmentare documentează faptul că
au apărut două evenimente în cadrul aceluiași experiment: (1) scindarea
legăturii necovalente β-LG -Glc 6, susținută de [Glc 6 + Na+]+ la m/z 1013.86 și
seria de ioni la m/z 2026,65; 2279.86; 2605.42; 3039,46 și 3647,06, legat e de
diferite stări de încărcare ale proteinei, variind de la 5+ până la 9+; (2)
secvențializarea Glc 6 cu formarea ionilor produs în regiunea m/z joasă,
fenomen caracteristic formei sodiate a Glc 6 (inse rată în figura 42). Pentru
comparație, în figura 43, CID MS/MS a [Glc 6 + Na+]+ detectat la m/z 1013,85

109
prin screening -ul MS al Glc solubil în soluția tampon este prezentat împreună
cu schema de fragmentare. Evident, căile de fragmentare determinate
experimenta l pentru [Glc 6 + Na+]+ în cele două abordări sunt similare, ceea ce
susține formarea complexului necovalent al β-LG cu Glc 6.

Figura 42. Spectrul de masă (+)chip -nanoESI QTOF CID MS/MS (top -down) a [Complex + Na+ + 6H+]7+
detectat la m/z 2750,09, corespunzător complexului noncovalent β -LG-Glc6. Energie de coliziune
variabilă, între 40 -100 eV; timp de achiziție, 5 mi n; alte condiții nementionate ale MS sunt ca cele
prezentate în fig. 38. Schema de fragmentare a Glc 6 este inserată în partea de sus a spectrului [15]

110

Figura 43. Spectrul de masă (+)Chip-nanoESI QTOF CID MS/MS a [Glc 6 + Na+]+
detectat la m/z 1013.85 prin screening -ul MS a lui Glc 6 în buffer. Concentrație,10 pmol μL −1 in 10 mM
acetat de amoniu/ acid formic, pH 6.0. NanoESI voltaj, 1.8 kV; voltajul conului, 60 V; Energie de coliziune
variabil ă, între 40 -100 eV ; timp de achiziție , 2 min. Schema de fragmentare a Glc 6 în buffer este inserată
în partea de sus a spectrului [15]

4.5.3. 2. Interacțiunea β-LG-Glc 6 în apă
5 μL de probă conținând produsele de reacție β-LG-Glc 6 au fost
colectate la min 1, 5, 10 și 30 după incubare în apă și încărcate în godeurile
plăcii de microtitrare a robotului NanoMate. În toate cele patru cazuri, analiza
chip-nanoESI MS a dezvăluit numai caracteristicile de anvelopare ale β-LG cu
stări de încărcare 5+ la 9+ ale ion ilor moleculari. Din acest motiv, s-a extins
timpul de observare, amestecul de reacție fiind monitorizat în continuare. În
figura 44, este prezentat spectrul produselor de reacție colectate după 50 de
minute de incubare. Pe lângă β-LG, spectrul din figura 44 prezintă un semnal
la m/z 2750,12 care, conform calculului (ținand cont de starea sa de încarcare
electric ă), corespu nde unuei mase moleculare de 19 243,84 Da. Această
valoare este atribuită complexului noncovalent al β-LG cu forma sodică a Glc 6.
Având î n vedere această caracteristică a interacțiunii necovalente efectuate în

111
apă, probele au fost colectate suplimentar până la 3 ore cu un interval de timp
de 30 de minute între colecții. Analizele MS ale tuturor celorlalte probe nu au
adus nicio diferență se mnificativă.

Figura 44. Spectrul de masă (+) Chip-nanoESI QTOF MS a produselor de reacție β -LG-Glc6 după 50 min
de incubare în apă la 37°C. Alte condiții de MS sunt identice cu cele din fig . 38 [15]

4.5.4. CONCLUZII DE ETAPĂ

Literatura de specialitate [287,288] mentionează existen ța a doi izomeri
β-LG în laptele de vacă: izomerul A de 18.363 Da și izomerul B, de 18.276 Da.
Aceste valori ale masei moleculare au fost determinate prin mai multe metode
cum ar fi ESI MS, electroforeză capilară și cromatograf ia lichidă de înaltă
performanță (HPLC) cuplată cu MS. Conform calculului bazat pe secvența de
aminoacizi, β-LG are o masă moleculară de 18.400 Da [289,290]. O varianta
având (18.230,50 ± 0,2) Da nu a fost niciodată raportată anterior.
Prin urmare, consid erăm că proteina regăsită în laptele uman suferă
modificări structurale. Acest aspect oferă perspective interesante pentru
cercetarea ulterioară, cu scopul de a determina astfel de modificări prin ESI
MS/MS fie prin abordări de tip bottom -up (de jos în sus ) sau top -down (de sus

112
în jos) . Un rezultat interesant al testelor de interacțiune este că legarea
necovalentă β-LG-Glc 6 în acetat de amoniu/acid formic este un proces rapid,
comparativ cu alte interacțiuni proteină -oligozaharidă studiate în aceeași
soluți e tampon [291]. În acetat de amoniu, complexul necovalent β-LG-Glc 6 a
fost format și detectat prin MS după doar 1 min de incubare.
Spectrele de masă ale produșilor de reacție colectate la fiecare 5
minute timp de o jumătate de oră au evidențiat o creștere semnificativă a
abundenței ionului molecular corespunzător. Prin urmare, utilizarea robotului
chip-nanoESI complet automatizat ce oferă randament și performanțe ridicate,
a fost crucială pentru evaluarea produșilor de interacțiune aproape în timp real,
fără a periclita condițiile de reacție. Într -un studiu anterior [291] privind analiza
interacțiunii proteină -oligozaharidă, folosind analiza prin nanoESI Q TOF MS
au fost acumulate 2850 de scanări, echivalente cu aproape 100 de minute,
pentru a se putea rea liza fragmentarea prin CID MS/MS.
În experimentele noastre , având în vedere eficiența ridicată a ionizării
oferite de chip -nanoESI, 2 minute pentru un spectru de masă de screening și 5
min pentru experimentul top -down au fost suficiente pentru o caracteri zare
completă a complexului necovalent. Un consum redus de probă și o viteză
mare de analiză a permis investigarea protein ei prezentă în laptele uman într -o
cantitate foarte mică. Pentru a imita mediul in vivo și a evalua dacă complexul
ar putea fi format și detectat de ESI MS în astfel de condiții, în a doua fază a
cercetării, soluția tampon de acetat de amoniu a fost înlocuit cu apă pură.
Remarcabil, complexul format poate fi detectat prin ESI MS la o valoare
a pH -ului sub 7,0. Totuși, deoarece concentra ția partenerilor de reacție și
condițiile de incubare au fost aceleași ca și atunci când s -a folosit soluție
tampon, în raport cu datele obținute folosind apă pură, putem concluziona
următoarele: (1) așa cum s -a așteptat, β-LG extrasă din laptele uman și G lc6
prezintă un grad scazut de ioniza re. Ca o consecință, în spectrul din figura 44
nu s-au format toate stările de încărcare ale β-LG vizibile în urma analizei
acelora și parteneri în soluția tampon ; în plus, ionii Glc 6 nu sunt detectabili; (2)
un raport s emnal/zgomot mai mic a fost obținut în apă pură, comparativ cu
tamponul acetat de amoniu; (3) procesul de formare a complexului necovalent
este mult mai lent în apă. Complexul a fost detectat numai după 50 de minute
de reacție, dar a rămas stabil pentru câ teva ore; (4) ionii corespunzători β-LG-
Glc 6 prezintă o intensitate destul de scăzută, ceea ce a făcut ca rezultatele
experimentului top -down să fie considerate mai puțin fiabile. Această
caracteristică ar putea fi consecința ionizării reduse, a unei conce ntrații
scăzute a complexului format în apă sau a ambelor.

113
Conform rezultatelor anterioare [292], chiar și urmele de β -LG în laptele
uman provoacă alergii la unii sugari. De asemenea, sa demonstrat că unele
clase de oligozaharide [284] determină reducerea alergenității β -LG.
Din acest punct de vedere, rezultat ele experimentelor efectuate au o
conotație biologică și clinică aparte . Datele noastre sugerează că, prin
formarea unui complex noncovalent cu β-LG în condiții care să imite parametrii
in vivo, Glc 6 ar putea fi printre glicanii ce pot contribui la reducerea alergenității
β-LG. Pe baza acestor constatări, pot fi efectuate studii clinice pentru testarea
nivelului de alergenitate al complexului β-LG-Glc 6.

114
5. CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚ II PERSONALE

Complexitatea și originalitatea acestei teze de doctorat se datorează
faptului că aceasta reunește domenii importante de cercetare și anume
medicina, biochimia, fizica și informatica. Încă de la început, fixarea
obiectivelor s -a realizat într -o notă modernă, îndrăzneață și pragmatică
totodată. Este dificil să realizezi lucruri mărețe, care au potențial de a ajunge
modele de referință pentru proiecte de cercetare viitoare, fără o tehnologie
performantă și o echipă solidă și unită care să spriji ne aceste demersuri.

Având aceste cerințe minime și obligatorii asigurate, lucrarea de față se
dorește a fi o contributie onesta la cercetarea fundamenal ă în sfera
glicolipidomicii utilizand spectrometria de masă. O astfel de abordare plaseaz ă
prezenta c ontribu ție în cate goria tezelor ce au la bază cercetarea
fundamentală și este diferită de tot ce poate oferi cercetarea clinică, unde
numarul cazurilor incluse în lot primează asupra rezultatelor obținute.

Astfel, această teză de doctorat a contribuit pri n rezultatele sale la
dezvoltarea și aplicarea în practică a două metode diferite de spectrometrie de
masă, optimizate pentru screening -ul gangliozidelor extrase din tumori
cerebrale și analizarea lor, comparativ cu cele extrase din țesut cerebral
sănătos .

Prima metodă a utilizat un spectrometru de masă cu analizor cu
capcană ionică de mare capacitate, HCT MS cuplat cu sistemul automat
NanoMate de infuzie a probei prin chip, pentru screening -ul de masă al
gangliozidelor extrase din hemangiom și din țesut ului cerebral sănătos.

Cea de -a doua tehnică a avut la bază spectrometria de masă cu
analizor cuadrupolar hibrid cu timp de zbor (QTOF MS), ionizare prin nanoESI
și fragmentare prin CID MS/MS și a fost aplicată pentru analiza gangliozidelor
extrase dintr -o probă de meningiom cerebral și dintr -o probă de metastază
cerebral a unui adenocarcinom pulmonar (împreună cu țesutul cerebral
sănătos corespondent). De asemenea, această metodă s -a aplicat și pentru
studiul complecșilor proteo -zahardici și care a fost prezentat ca și subcapitol
referitor la prespectivele viitoare de cercetare. Din rezultatele prezentate în
această teză se desprind următoarele concluzii:

115
1). Cercetare de față a avut ca rezultat dezvoltarea unei metodologi i moderne
pentru investigarea ex presiei și structurii gangliozidelor într -o tumoră benignă a
creierului uman. La momentul publi cării rezultatelor, acesta a fost primul
studiu consacrat gangliozidelor dintr -un hemangiom cerebral.
2). Refreritor la aceeasi contributie, putem afirma că pentru prima dată s -a
folosit metoda avansată de spectrometrie de masă complet automatizată
bazată pe chip -nanoESI cuplat direct la HCT și CID MS2 pentru elucidarea
gangliozidelor din hemangiom cerebral.
3). Modificarea compoziției gangliozidelor analizate din hemangiom în raport
cu expresia gangliozidelor din creierul uman sănătos a fost relevantă prin
următorul aspect: CFH afișează gangliozidele monosalilate scurte, în timp ce
în CFN apar ca specii majore gangliozidele mono – și polisializate precum și
componentele O-acetilate. Cu toate acestea, în proba de hemangiom s -a
detectat o specie O-Ac-GM4 și o specie O-Ac-GD2. Astfel, prezența O-Ac-GD2
se poate asocia cu gradul redus de malignitate al tumorii cerebrale investigate.
4). Totodată, GT1 (d18:0/20:0) detectat ca un i on de intensitate scăzută, pare
a fi un alt marker găsit doar în CFH și nu în cortexul sănătos.
5). Un aspect notabil este utilizarea metodelor MS ultrasensibile și precise
pentru determinarea compoziții lor modificate a le gangliozidelor ce rebrale aflate
uneori sub limita de detec ție a altor metode spectrometrice. De asemenea
trebuie subliniată reproductibilitatea (aproape de 100%), viteza și sensibilitatea
analizei, consumul unei cantități reduse de probă și nu în ultimul r ând costul
redus al uni analize .
6). NanoESI HCT MS și CID MSn bazate pe chip oferă posibilitatea de a fi
introduse ca metode de diagnostic medical pentru analiza comparativă a
structurilor și compoziției glicoconjugaților omologi și din alte țesuturi sau
fluide ale organ ismului.
Cea de a doua direcție de cercetare a vizat investigarea în detaliu a
compoziției gangliozidelor într -o probă de țesut cerebral cu meningiom urmată
de analiza prin fragmentare a speciilor individuale utilizând o metodă avansată
de spectrometrie de masă bazată pe nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS
referitor la care se desprind urmatoarele concluzii

7). Prin MS nanoESIchip -QTOF se identifică un număr mult mai mare de
structuri decât cele raportate anterior de literatura de specialitate. Astfel, acest

116
studiu a furnizat date despre 34 de noi specii diferite de gangliozide , ceea ce
depășește cu mult pe cele raportate anterior pentru meningioame.

8). În meningiomul studiat, comparativ cu alte tumori, structurile identificate
prezintă lanțuri oligozahari dice mai scurte, cu un grad de sialilare nu mai mare
de doi. Nu s -au descoperit modificări de O-fucozilarea, O-acetilarea sau O –
GalNAc așa cum s -au găsit în hemangiom .

9). Pentru a elucida structura celor mai abundenti ioni, s -a efectuat
fragmentarea sim ultană a acestor ioni prin CID MS/MS. Datele obținute în
urma fragmentării au arătat că pentru fiecare GM1(d18:1/24:1) și
GM1(d18:1/24:0), izomerii a cât și izomerii b sunt exprimați simultan .

10). Datele noastre sugereaz ă că speciile GM1 și speciile GM3 pot fi în
general recunoscute ca un marker incontestabili pentru acest tip de tumori. Cu
atât mai mult, posibilul rol al GM1 justifică explorarea și examinarea l ui în
continuare (ținand cont de diversitatea relativ ridicată a ceramidelor din
compozitia sa ) urmand ca studiile viitoare sa certifice rolul prezumat .

11). Experimentele efectuat e folosind un singur specimen de meningiom a u
demonstrat că nanoESIchip QTOF MS și CID MS/MS pot fi metod ele de
elecție pentru analiza amestecurilor complexe de ganglio zide cu probleme
majore de ionizare .

A treia directie de cercetare a fost legat ă de investigarea gangliozidelor din
metastaza cerebrală a adenocarcinomului pulmonar, referitor la care se
desprind urmatoarele concluzii:

12). Combinând MS de înaltă perfor manță bazată pe chip -nanoESI cu HPTLC
și scanare densitometrică a fost posibilă detectarea și elucidarea structurală a
125 de specii distincte de gangliozide exprimate în metastaza cerebrală a
adenocarcinomului pulmonar.

13). S -a constatat de asemenea o s cădere de 14 ori a conținutului total de
gangliozide în acest tip de metastază comparativ cu țesutul cerebral sănătos
(compoziția gangliozidelor din proba de metaADK fiind evident modificată în
comparație tesutul cerebral sănătos).

117
14). MetaADK este car acterizată de specii scurte de gangliozide cu conținut
redus de acid sialic și cu prevalență de tip GM, în timp ce țesutul cerebral
sănătos este dominat de structuri de la mono – până la hexasialilate cu o
expresie mai mare a structurilor de tip GD și GT.

15). Datele MS au pus în evidență prezența în metaADK a mai multor specii
monosialilate neobișnuit modificate prin fucozilare sau O-acetilare. Prin MS
tandem utilizând CID, componenta oligozaharidica a speciei GD3(d18:1/18:0)
asociată cu metastaza cerebra lă a fost elucidată structural. În același timp, un
număr de ioni amprentă pentru ceramidă au permis, descifrarea structurii
componentei lipidice.

16). În cadrul experimentelor de analiza a gangliozidelor din metaADK s -a
atins performanța ca screening -ul MS urmat de CID MS/MS să necesite doar
500 fmoli de material la un debit de aproximativ 100 nL/min, timpul de achiziție
de 1 min, o concentrație de probă de numai 2,5 pmol/pl ceea ce corespunde
la un consum de 250 fmol de extract biologic). Aceste date s ingure, fac din
platforma bioanalitică utilizată o metodă de rutină, ultrarapidă și sensibilă
aplicabilă altor tipuri de cancer și markeri moleculari.

A patra direcție de cercetare din cadrul tezei a constituit -o conceperea și
elaborarea de programe afe rente interpretărilor de date structurale furnizate de
metodele și tehnicile de spectrometrie de masă, în acest sens concluzionând
ca și contributii originale urmatoarele:

17). Elaborarea și implementarea unui software original denumit GanglioBase,
capabi l să calculeze, analizeze și afișeze toate variantele structurale de
gangliozide care corespund unui ion pseudomeolecular dat de utilizator.
Avantajele utilizării sale sunt numeroase, cele mai importante fiind timpul redus
de analiză a rezultatelor generat e de MS și exactitatea acestora. Software -ul
este de 3 ani la dispoziția tuturor cercetătorilor ce lucreaza țn lipidomică,
glicomică și glicolipidomică.

O a cincea direcție de studiu a prilejuit -o analiza prin spectrometrie de masa a
posibilității de for mare a unor complecși necovalenți între proteine și
oligozaharide, în particular între β -LG și Glc 6 reținându -se urmatoarele
contribuții :

118
18). Folosind platforma chip -nanoESI QTOF MS a fost pus în evidență
complexul β -LG-Glc 6 sub forma sa monosodiată și he xaprotonată; s -a pus în
evidență complexul atât în soluție tampon cât și în soluție apoasă efectuându –
se un studiu complet privind concent rația versus timpul de reacție. Pentru
demonstarea existenței complexului în experimente de CID -MS au fost
suficiente 2 minute pentru obținerea unui spectru de masă elocvent care să
evidențieze complexul format și doar 5 min pentru experimentul top -down de
caracterizare completă a complexului necovalent.

19). Ca urmare a întregii expertize dobândite de -a lungul studiilo r de analiză a
gangliozidelor și a complexelor necovalente se poate certifica faptul că chip –
nanoESI QTOF MS și CID MS/MS a fost capabilă să furnizeze o caracterizare
structurală și compozitionala complet ă cu o viteză și o sensibilitate de analiză
remarcab ilă și la un preț de cost redus. Dacă la aceste performanțe se adaugă
un consum de consumabile extrem de redus, realizăm că utilizarea pe viitor , în
cadrul unor trialuri clinice focusate pe detectarea unor markeri biochimici
specifici pentru diagnosticul precoce al neoplaziilor , poate fi cheia spre succes
în managementului acestor cazuri.

20). În ultimul timp se discută tot mai des conceptul de medicină personalizată
și posibilitățile pe care aceasta le poate oferi pacienților. MS a fost utilizată în
mod obișnuit în medicina de laborator , în special în contextul testelor
toxicologice și al monitorizării terapeutice a medicamentelor. Cuantificarea
medicamentelor din sânge pentru a personaliza dozarea în funcție de
variabilele farmacocinetice individuale și verificarea conformității (monitorizarea
terapeutică a medicamentelor) se face pentru un număr tot mai mare de
compuși în special pentru bolile psihiatrice și infecțioase.

21). MS este o tehnică unică prin faptul că poate analiza direct orice moleculă
biologică susceptibilă la ionizare. Evoluția tehnologică constantă a MS oferă
beneficii cumulative din punct de vedere analitic (de exemplu, îmbunătățiri ale
sensibilității și selectivității) dar și funcțional , avand ca rezultat p otențial
extinderea și implem entarea acestei tehnici pentru a deservi un număr cât mai
mare de specialități clinice medicale .

119

BIBIOGRAFIE

[1] Kraĉun I, Rösner H, Ćosović C, Stavljenić A. Topographical atlas of the gangliosides of the
adult human brain. Journal of neu rochemistry. 1984 Oct 1;43(4):979 -89;
[2] Ono M, Hakomori S. Glycosylation defining cancer cell motility and invasiveness.
Glycoconjugate journal. 2003 Feb 1;20(1):71 -8;
[3] Schiopu C , Flangea C, Capitan F, Serb A, Vukelić Ž, Kalanj -Bognar S, Sisu E, Prz ybylski
M, Zamfir AD. Determination of ganglioside composition and structure in human brain
hemangioma by chip -based nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical
and bioanalytical chemistry. 2009 Dec 1;395(8):2465 -77;
[4] Schiopu C , Vu kelić Ž, Capitan F, Kalanj ‐Bognar S, Sisu E, Zamfir AD.
Chip‐nanoelectrospray quadrupole time ‐of‐flight tandem mass spectrometry of meningioma
gangliosides: A preliminary study. Electrophoresis. 2012 Jul 1;33(12):1778 -86;
[5] Zamfir AD, Serb A, Vukeli Ž, F langea C, Schiopu C , Fabris D, Kalanj -Bognar S, Capitan F,
Sisu E. Assessment of the molecular expression and structure of gangliosides in brain
metastasis of lung adenocarcinoma by an advanced approach based on fully automated chip –
nanoelectrospray mass s pectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry.
2011 Dec 1;22(12):2145 -59;
[6] Almeida R, Mosoarca C, Chirita M, Udrescu V, Dinca N, Vukelić Ž, Allen M, Zamfir AD.
Coupling of fully automated chip -based electrospray ionization to high -capacity ion trap mass
spectrometer for ganglioside analysis. Analytical biochemistry. 2008 Jul 1;378(1):43 -52;
[7] Ghiulai RM, Sarbu M, Vukelić Ž, Ilie C, Zamfir AD. Early stage fetal neocortex exhibits a
complex ganglioside profile as revealed by high res olution tandem mass spectrometry.
Glycoconjugate journal. 2014 Apr 1;31(3):231 -45;
[8] Mosoarca C, Ghiulai RM, Novaconi CR, Vukelić Ž, Chiriac A, Zamfir AD. Application of chip –
based nanoelectrospray ion trap mass spectrometry to compositional and structu ral analysis of
gangliosides in human fetal cerebellum. Analytical letters. 2011 Mar 29;44(6):1036 -49;
[9] Serb A, Schiopu C , Flangea C, Vukelić Ž, Sisu E, Zagrean L, Zamfir AD. High -throughput
analysis of gangliosides in defined regions of fetal brain by fully automated chip -based

120
nanoelectrospray ionization multi -stage mass spectrometry. European Journal of Mass
Spectrometry. 2009 Aug;15(4):541 -53;
[10] Sarbu M, Dehelean L, Munteanu CV, Vukelić Ž, Zamfir AD. Assessment of ganglioside age –
related and topog raphic specificity in human brain by Orbitrap mass spectrometry. Analytical
biochemistry. 2017 Mar 15;521:40 -54.
[11] Serb AF, Sisu E, Vukelić Ž, Zamfir AD. Profiling and sequencing of gangliosides from
human caudate nucleus by chip ‐nanoelectrospray mass s pectrometry. Journal of mass
spectrometry. 2012 Dec 1;47(12):1561 -70.
[12] Zamfir AD, Fabris D, Capitan F, Munteanu C, Vukelić Ž, Flangea C. Profiling and sequence
analysis of gangliosides in human astrocytoma by high -resolution mass spectrometry. Analytic al
and bioanalytical chemistry. 2013 Sep 1;405(23):7321 -35.
[13] Robu AC, Vukelić Ž, Schiopu C, Capitan F, Zamfir AD. Mass spectrometry of gangliosides
in extracranial tumors: Application to adrenal neuroblastoma. Analytical biochemistry. 2016 Sep
15;509:1 -1.
[14] Flangea C, Fabris D, Vukelić Ž, Zamfir AD. Mass spectrometry of gangliosides from human
sensory and motor cortex. Australian Journal of Chemistry. 2013 Aug 14;66(7):781 -90.
[15] Capitan F, Robu AC, Schiopu C , Ilie C, Chait BT, Przybylski M, Zamfir AD. β -Lactoglobulin
detected in human milk forms noncovalent complexes with maltooligosaccharides as revealed
by chip -nanoelectrospray high -resolution tandem mass spectrometry. Amino acids. 2015 Nov
1;47(11):2399 -407.
[16] Gayon J, Malaterre C, Morange M, Raulin -Cerceau F, Tirard S. Defining life: conference
proceedings. Origins of Life and Evolution of the Biosphere. 2010 Apr 1;40(2):119.
[17] Lowe JA, Jones P, Wilson DM. Network biology as a new approach to drug discovery.
Current opinion in drug discove ry & development. 2010 Sep;13(5):524 -6;
[18] Pujol A, Mosca R, Farrés J, Aloy P. Unveiling the role of network and systems biology in
drug discovery. Trends in pharmacological sciences. 2010 Mar 31;31(3):115 -23.
[19] Auffray C, Imbeaud S, Roux -Rouquié M, Hood L. From functional genomics to systems
biology: concepts and practices. Comptes rendus biologies. 2003 Nov 30;326(10):879 -92.
[20] Van Regenmortel MH. Reductionism and complexity in molecular biology. EMBO reports.
2004 Nov 1;5(11):1016 -20.;
[21] Boog erd F, Bruggeman FJ, Hofmeyr JH, Westerhoff HV, editors. Systems biology:
philosophical foundations. Elsevier; 2007 Mar 20.
[22] Wolkenhauer O. Systems biology: The reincarnation of systems theory applied in biology?.
Briefings in bioinformatics. 2001 Sep 1;2(3):258 -70.
[23] https://www.nature.com/scitable/content/microevolution -of-a-cancer -cell-14707728
[24] Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 1976 Oct
1;194(4260):23 -8.
[25] Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 1984, (44):2259 –65
[26] Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? JNCI: Journal of
the National Cancer Institute. 1990 Jan 3;82(1):4 -7.
[27] Tabassum DP, Polyak K. Tumorigenesis: it takes a village. Nature Reviews. Cancer. 201 5
Aug 1;15(8):473.
[28] Marusyk A, Tabassum DP, Altrock PM, Almendro V, Michor F, Polyak K. Non -cell
autonomous tumor -growth driving supports sub -clonal heterogeneity. Nature. 2014 Oct
2;514(7520):54.

121
[29] Calbo J, van Montfort E, Proost N, van Drunen E, Beverloo HB, Meuwissen R, Berns A. A
functional role for tumor cell heterogeneity in a mouse model of small cell lung cancer. Cancer
cell. 2011 Feb 15;19(2):244 -56.
[30] Grant A, Waugh A. Ross Jand Wilson anatomy and physiology in health and illness.
Edinb urgh: Churchill Livingstone. Edition: 10th edition 2006, pp. 53 –54. ISBN 0 -443-10101 -9
[31] Loda M, Mucci L, Mittelstadt ML, Van Hemelrijck M, Cotter MB. Pathology and
Epidemiology of Cancer. Springer; 2016 Sep, ISBN 978 -3-319-35151 -3
[32], Silverstein LN,A Silverstein, VB Silverstein,. Cancer. Brookfield 2006 , Conn: Twenty -First
Century Books. pp. 11 –12. ISBN 0 -7613 -2833 -5
[33] Rubin R, Strayer DS, Rubin E, editors. Rubin's pathology: clinicopathologic foundations of
medicine. Lippincott Williams & Wilk ins; 2008, . pp. 138 –139. ISBN 0 -7817 -9516 -8.
[34] Martini FH, Nath JL, Bartholomew EF. Fundamentals of Anatomy and Physiology. 2001.
Pentice Hall: New Jersey. 2015:538 -57.
[35] Ray SK. Glioblastoma: Molecular Mechanisms of Pathogenesis and Current Therape utic
Strategies. Springer Science & Business Media; 2009 Oct 31 , DOI 10.1007/978 -1-4419 -0410 –
2_2
[36] Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, Scheithauer BW,
Kleihues P. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervou s system. Acta
neuropathologica. 2007 Aug 1;114(2):97 -109.
[37] O’Connor CM, Adams JU, Fairman J. Essentials of cell biology. Cambridge, MA: NPG
Education. 2010;1.
[38] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al hemangiomului cerebral comparativ cu țesu tul
cerebral sănătos, din punct de vedere structural, prin chip nanoESI HCT MS. Referat de
cercetare științifică
[39] Dunn WB. Mass spectrometry in systems biology an introduction. Methods Enzymol. 2011
Jan 1;500:15 -35.
[40] Wenk MR. The emerging field o f lipidomics. Nat Rev Drug Discov. 2005 Jul 4(7):594 -610
[41] Wymann MP, Schneiter R. Lipid signalling in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Feb
9(2):162 –176
[42] van Meer G, Voelker DR, Feigenson GW. Membrane lipids: where they are and how they
behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008 Feb 9(2):112 –124
[43] Susan PY. Sphingosine 1 -phosphate signalling in mammalian cells. Biochemical Journal.
2000 Jul 15;349(2):385 -402.
[44] Shevchenko A, Simons K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature review s.
Molecular cell biology. 2010 Aug 1;11(8):593 -98
[45] Quehenberger O, Armando AM, Brown AH, Milne SB, Myers DS, Merrill AH,
Bandyopadhyay S, Jones KN, Kelly S, Shaner RL, Sullards CM. Lipidomics reveals a
remarkable diversity of lipids in human plasma. J ournal of lipid research. 2010 Nov
1;51(11):3299 -305.
[46] Wishart DS, Knox C, Guo AC, Eisner R, Young N, Gautam B, Hau DD, Psychogios N, Dong
E, Bouatra S, Mandal R. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic acids
research. 2008 Oct 25;37(su ppl_1):D603 -10.
[47] Han X, Gross RW. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of
biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of lipid research.
2003 Jun 1;44(6):1071 -9.

122
[48] Jung HR, Sylvänne T, Ko istinen KM, Tarasov K, Kauhanen D, Ekroos K. High throughput
quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular and Cell
Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):925 -34.
[49] Chaurand P, Cornett DS, Angel PM, Caprioli RM. From whole -body sections down to
cellular level, multiscale imaging of phospholipids by MALDI mass spectrometry. Molecular &
Cellular Proteomics. 2011 Feb 1;10(2):O110 -004259.
[50] Nordström A, O'Maille G, Qin C, Siuzdak G. Nonlinear data alignment for UPLC− MS and
HPLC− MS based metabolomics: quantitative analysis of endogenous and exogenous
metabolites in human serum. Analytical chemistry. 2006 May 15;78(10):3289 -95.
[51] Pluskal T, Castillo S, Villar -Briones A, Orešič M. MZmine 2: modular framework for
proces sing, visualizing, and analyzing mass spectrometry -based molecular profile data. BMC
bioinformatics. 2010 Jul 23;11(1):395.
[52] Orešič M. Informatics and computational strategies for the study of lipids. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) -Molecular and C ell Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):991 -9.
[53] Schmelzer K, Fahy E, Subramaniam S, Dennis EA. The lipid maps initiative in lipidomics.
Methods in enzymology. 2007 Dec 31;432:171 -83.
[54] Dennis EA, Deems RA, Harkewicz R, Quehenberger O, Brown HA, Milne SB, Myers DS,
Glass CK, Hardiman G, Reichart D, Merrill AH. A mouse macrophage lipidome. Journal of
Biological Chemistry. 2010 Dec 17;285(51):39976 -85.
[55] Do Yup Lee BP, Northen TR. Mass spectrometry –based metabolomics, analysis of
metabolite -prote in interactions, and imaging. Biotechniques. 2010 Aug;49(2):557.
[56] Farwanah H, Kolter T. Lipidomics of Glycosphingolipids. Metabolites. 2012 Feb 2, 2(1):134 –
64.
[57] Fahy E, Subramaniam S, Brown HA, Glass CK, Merrill AH, Murphy RC, Raetz CR, Russell
DW, Seyama Y, Shaw W, Shimizu T. A comprehensive classification system for lipids. Journal of
lipid research. 2005 May 1;46(5):839 -62.
[58] Klenk E. Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden.
Hoppe -Seyler´ s Zeitschrift für phy siologische Chemie. 1942;273(1 -2):76 -86.
[59] Klenk E. Über die Ganglioside des Gehirns bei der infantilen amaurotischen Idiotie vom Typ
Tay‐Sachs. European Journal of Inorganic Chemistry. 1942 Feb 10;75(12):1632 -6.
[60] Blix G. Über die Kohlenhydratgruppe n des Submaxillarismucins. Hoppe -Seyler´ s Zeitschrift
für physiologische Chemie. 1936;240(1 -2):43 -54.
[61] Kuhn R, Wiegandt H. Die Konstitution der Ganglio ‐N‐tetraose und des Gangliosids GI.
European Journal of Inorganic Chemistry. 1963 Mar 1;96(3):866 -80.
[62] Svennerholm L. Chromatographlc separation of human brain gangliosides. Journal of
neurochemistry. 1963 Sep 1;10(9):613 -23.
[63] Svennerholm L. The gangliosides. Journal of lipid research. 1964 Apr 1;5(2):145 -55.
[64] Cohen M, Varki A. The sialome —far more than the sum of its parts. Omics: a journal of
integrative biology. 2010 Aug 1;14(4):455 -64.
[65] Robert K Y, Tsai YT, Ariga T, Yanagisawa M. Structures, biosynthesis, and functions of
gangliosides -an overview. Journal of oleo science. 2011;60(10):5 37-44.
[66] Angata T, Varki A. Chemical diversity in the sialic acids and related α -keto acids: an
evolutionary perspective. Chemical reviews. 2002 Feb 13;102(2):439 -70.
[67] Schauer R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Cur rent opinion
in structural biology. 2009 Oct 31;19(5):507 -14.

123
[68] Kohla G, Schauer R. Sialic acids in gangliosides: origin and function. Neuroglycobiology.
2005:133.
[69] Chester MA. Nomenclature of glycolipids (IUPAC Recommendations 1997). Pure and
Appli ed Chemistry. 1997 Jan 1;69(12):2475 -88.
[70] Li Y T, Maskos K, Chou CW, Cole RB, Li SC. Presence of an unusual GM2 derivative,
taurine -conjugated GM2, in Tay -Sachs brain. Journal of Biological Chemistry. 2003 Sep
12;278(37):35286 -91.
[71] Zimmermann P, Som mer R, Bär T, Schmidt RR. Azidosphingosine glycosylation in
glycosphingolipid synthesis. Journal of Carbohydrate Chemistry. 1988 May 1;7(2):435 -52.
[72] Kannagi R, Cochran NA, Ishigami F, Hakomori SI, Andrews P, Knowles BB, Solter D.
Stage -specific embryon ic antigens (SSEA -3 and -4) are epitopes of a unique globo -series
ganglioside isolated from human teratocarcinoma cells. The embo journal. 1983;2(12):2355 -61
[73] Kolter T, Proia RL, Sandhoff K. Combinatorial ganglioside biosynthesis. Journal of
Biological Chemistry. 2002 Jul 19;277(29):25859 -62.
[74] Yoshino H, Ariga T, Suzuki A, Robert KY, Miyatake T. Identification of gangliosides
recognized by IgG anti -GalNAc -GD1a antibodies in bovine spinal motor neurons and motor
nerves. Brain research. 2008 Aug 28;122 7:216 -20.
[75] Kaida K, Sonoo M, Ogawa G, Kamakura K, Ueda -Sada M, Arita M, Motoyoshi K, Kusunoki
S. GM1/GalNAc -GD1a complex A target for pure motor Guillain -Barré syndrome. Neurology.
2008 Nov 18;71(21):1683 -90.
[76] Ang CW, Yuki N, Jacobs BC, Koga M, Van Doorn PA, Schmitz PI, Van Der Meché FG.
Rapidly progressive, predominantly motor Guillain -Barré syndrome with anti -GalNAc -GD1a
antibodies. Neurology. 1999 Dec 1;53(9):2122
[77] Yuki N, Hartung HP. Guillain –Barré syndrome. New England Journal of Medicine. 2012 Jun
14;366(24):2294 -304.
[78] Yamazaki T, Suzuki M, Irie T, Watanabe T, Mikami H, Ono S. Amyotrophic lateral sclerosis
associated with IgG anti -GalNAc -GD1a antibodies. Clinical neurology and neurosurgery. 2008
Jul 31;110(7):722 -4.
[79] Levery SB, Sal yan ME, Steele SJ, Kannagi R, Dasgupta S, Chien JL, Hogan EL,
Vanhalbeek H, Hakomori SI. A revised structure for the disialosyl globo -series gangliosides of
human erythrocytes and chicken skeletal muscle. Archives of biochemistry and biophysics. 1994
Jul 1 ;312(1):125 -34.
[80] Stapleton AE, Stroud MR, Hakomori SI, Stamm WE. The globoseries glycosphingolipid
sialosyl galactosyl globoside is found in urinary tract tissues and is a preferred binding receptor
in vitro for uropathogenic Escherichia coli expressin g pap -encoded adhesins. Infection and
immunity. 1998 Aug 1;66(8):3856 -61.
[81] Suila H, Pitkänen V, Hirvonen T, Heiskanen A, Anderson H, Laitinen A, Natunen S, Miller –
Podraza H, Satomaa T, Natunen J, Laitinen S. Are globoseries glycosphingolipids SSEA -3 and-
4 markers for stem cells derived from human umbilical cord blood?. Journal of molecular cell
biology. 2010 Dec 12;3(2):99 -107..
[82] Ghaderi D, Zhang M, Hurtado -Ziola N, Varki A. Production platforms for biotherapeutic
glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non -human sialylation. Biotechnology and
Genetic Engineering Reviews. 2012 Jan 1;28(1):147 -76..

124
[83] Kaneko M, Yamada K, Miyamoto T, Inagaki M, Higuchi R. Neuritogenic activity of
gangliosides from echinoderms and their structure –activit y relationship. Chemical and
pharmaceutical bulletin. 2007;55(3):462 -3..
[84] Kaneko M, Kisa F, Yamada K, Miyamoto T, Higuchi R. Structure of a New
Neuritogenic ‐Active Ganglioside from the Sea Cucumber Stichopus japonicus. European
Journal of Organic Chemi stry. 2003 Mar 1;2003(6):1004 -8..
[85] Pruett ST, Bushnev A, Hagedorn K, Adiga M, Haynes CA, Sullards MC, Liotta DC, Merrill
AH. Thematic Review Series: Sphingolipids. Biodiversity of sphingoid bases (“sphingosines”)
and related amino alcohols. Journal of lipid research. 2008 Aug 1;49(8):1621 -39..
[86] Dasgupta S, Levery SB, Hogan EL. 3 -O-acetyl -sphingosine -series myelin glycolipids
characterization of novel 3 -O-acetyl -sphingosine galactosylceramide. Journal of lipid research.
2002 May 1;43(5):751 -61..
[87] Hama H. Fatty acid 2 -Hydroxylation in mammalian sphingolipid biology. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) -Molecular and Cell Biology of Lipids. 2010 Apr 30;1801(4):405 -14..
[88] Mahfoud R, Manis A, Binnington B, Ackerley C, Lingwood CA. A major fraction o f
glycosphingolipids in model and cellular cholesterol -containing membranes is undetectable by
their binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 2010 Nov 12;285(46):36049 -59..
[89] Lingwood CA, Manis A, Mahfoud R, Khan F, Binnington B, Mylvaganam M. New aspects of
the regulation of glycosphingolipid receptor function. Chemistry and physics of lipids. 2010 Jan
31;163(1):27 -35..
[90] Svennerholm L, Fredman P. A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.
Biochimica et Biophysica Act a (BBA) -Lipids and Lipid Metabolism. 1980 Jan 18;617(1):97 -109.
[91] IUPAC -IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur J Biochem. 1998
257:293 –98
[92] Domon B, Costello CE. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB –
MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate journal. 1988 Dec 31;5(4):397 -409.
[93] Rahmann H. Brain gangliosides and memory formation. Behavioural brain research. 1995
Jan 23;66(1):105 -16..
[94] Wang B. Sialic acid is an essential nutrient for brain develo pment and cognition. Annual
review of nutrition. 2009 Aug 21;29:177 -222..
[95] Hirschberg, K., Zisling, R., van Echten -Deckert, G. and Futerman, A.H., 1996. Ganglioside
Synthesis during the development of neuronal polarity major changes occur during
axonog enesis and axon elongation, but not during dendrite growth or synaptogenesis. Journal of
Biological Chemistry , 271(25), pp.14876 -14882.
[96] Yamashita T, Wada R, Sasaki T, Deng C, Bierfreund U, Sandhoff K, Proia RL. A vital role
for glycosphingolipid synth esis during development and differentiation. Proceedings of the
National Academy of Sciences. 1999 Aug 3;96(16):9142 -7..
[97] Kwak DH, Seo BB, Chang KT, Choo YK. Roles of gangliosides in mouse embryogenesis
and embryonic stem cell differentiation. Experime ntal & molecular medicine. 2011 Jul
31;43(7):379.
[98] Hakomori SI. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo (glyco) lipid
metabolism. Cancer research. 1996 Dec 1;56(23):5309 -18.
[99] Posse de Chaves E, Sipione S. Sphingolipids and ga ngliosides of the nervous system in
membrane function and dysfunction. FEBS letters. 2010 May 3;584(9):1748 -59.

125
[100] Robert KY, Nakatani Y, Yanagisawa M. The role of glycosphingolipid metabolism in the
developing brain. Journal of lipid research. 2009 Apr 1;50(Supplement):S440 -5.
[101] Segler -Stahl K, Webster JC, Brunngraber EG. Changes in the concentration and
composition of human brain gangliosides with aging. Gerontology. 1983;29(3):161 -8.
[102] Ando S. Neuronal dysfunction with aging and its ameliorati on. Proceedings of the Japan
Academy, Series B. 2012 Jun 11;88(6):266 -82.
[103] Senn HJ, Orth M, Fitzke E, Wieland H, Gerok W. Gangliosides in normal human serum.
The FEBS Journal. 1989 May 1;181(3):657 -62.
[104] Miller -Podraza H, Bradley RM, Fishman PH. B iosynthesis and localization of gangliosides
in cultured cells. Biochemistry. 1982 Jul;21(14):3260 -5.
[105] Garofalo T, Tinari A, Matarrese P, Giammarioli AM, Manganelli V, Ciarlo L, Misasi R,
Sorice M, Malorni W. Do mitochondria act as “cargo boats” in t he journey of GD3 to the nucleus
during apoptosis?. FEBS letters. 2007 Aug 21;581(21):3899 -903.
[106] Ledeen R, Wu G. New findings on nuclear gangliosides: overview on metabolism and
function. Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):714 -20.
[107] Kohla G, Stockfleth E, Schauer R. Gangliosides with O -acetylated sialic acids in tumors of
neuroectodermal origin. Neurochemical research. 2002 Aug 1;27(7):583 -92.
[108] Schwegmann -Weßels C, Herrler G. Sialic acids as receptor determinants for
coronaviruses. G lycoconjugate journal. 2006 Feb 27;23(1):51 -8.
[109] Malykh YN, Schauer R, Shaw L. N -Glycolylneuraminic acid in human tumours. Biochimie.
2001 Jul 31;83(7):623 -34.
[110] Diaz SL, Padler -Karavani V, Ghaderi D, Hurtado -Ziola N, Yu H, Chen X, Brinkman -Van der
Linden EC, Varki A, Varki NM. Sensitive and specific detection of the non -human sialic Acid N –
glycolylneuraminic acid in human tissues and biotherapeutic products. PLoS One. 2009 Jan
21;4(1):e4241.
[111] Zarei M, Müthing J, Peter -Katalinić J, Bindila L. Separation and identification of GM1b
pathway Neu5Ac -and Neu5Gc gangliosides by on -line nanoHPLC -QToF MS and tandem MS:
Toward glycolipidomics screening of animal cell lines. Glycobiology. 2009 Sep 30;20(1):118 -26.
[112] Blanco R, Rengifo CE, Cedeño M, Fró meta M, Rengifo E, Carr A. Immunoreactivity of the
14F7 Mab (raised against N -glycolyl GM3 ganglioside) as a positive prognostic factor in non –
small -cell lung cancer. Pathology research international. 2012 Feb 26;2012.
[113] Gross SK, Williams MA, McCluer RH. Alkali ‐Labile, Sodium Borohydride ‐Reducible
Ganglioside Sialic Acid Residues in Brain. Journal of neurochemistry. 1980 Jun 1;34(6):1351 -61.
[114] Riboni L, Sonnino S, Acquotti D, Malesci A, Ghidoni R, Egge H, Mingrino S, Tettamanti G.
Natural occurre nce of ganglioside lactones. Isolation and characterization of GD1b inner ester
from adult human brain. Journal of Biological Chemistry. 1986 Jun 25;261(18):8514 -9.
[115] Nores GA, Dohi T, Taniguchi M, Hakomori SI. Density -dependent recognition of cell
surface GM3 by a certain anti -melanoma antibody, and GM3 lactone as a possible immunogen:
requirements for tumor -associated antigen and immunogen. The Journal of Immunology. 1987
Nov 1;139(9):3171 -6.
[116] Sonnino S, Chigorno V. Ganglioside molecular species containing C18 -and C20 –
sphingosine in mammalian nervous tissues and neuronal cell cultures. Biochimica et Biophysica
Acta (BBA) -Reviews on Biomembranes. 2000 Sep 18;1469(2):63 -77.
[117] Palestini P, Masserini M, Fiorilli A, Calappi E, Tettamanti G. Age ‐Related Changes in the
Ceramide Composition of the Major Gangliosides Present in Rat Brain Subcellular Fractions

126
Enriched in Plasma Membranes of Neuronal and Myelin Origin. Journal of neurochemistry. 1993
Sep 1;61(3):955 -60.
[118] Valsecchi M, Palestini P, C higorno V, Sonnino S, Tettamanti G. Changes in the
Ganglioside Long ‐Chain Base Composition of Rat Cerebellar Granule Cells During
Differentiation and Aging in Culture. Journal of neurochemistry. 1993 Jan 1;60(1):193 -6.
[119] Sugiura Y, Shimma S, Konishi Y , Yamada MK, Setou M. Imaging mass spectrometry
technology and application on ganglioside study; visualization of age -dependent accumulation of
C20-ganglioside molecular species in the mouse hippocampus. PLoS One. 2008 Sep
18;3(9):e3232.
[120] Ogawa‐Goto K , Funamoto N, Abe T, Nagashima K. Different ceramide compositions of
gangliosides between human motor and sensory nerves. Journal of neurochemistry. 1990 Nov
1;55(5):1486 -93.
[121] Farwanah H, Kolter T. Lipidomics of glycosphingolipids. Metabolites. 2012 Feb 2;2(1):134 –
64.
[122] Lacomba R, Salcedo J, Alegría A, Lagarda MJ, Barberá R, Matencio E. Determination of
sialic acid and gangliosides in biological samples and dairy products: a review. Journal of
pharmaceutical and biomedical analysis. 2010 Jan 20;51 (2):346 -57.
[123] Wang WQ, Gustafson A. Ganglioside extraction from erythrocytes: a comparison study.
Acta Chemica Scandinavica. 1995 Dec 1;49(12):929.
[124] Byrne MC, Sbaschnig -Agler M, Aquino DA, Sclafani JR, Ledeen RW. Procedure for
isolation of ganglio sides in high yield and purity: simultaneous isolation of neutral
glycosphingolipids. Analytical biochemistry. 1985 Jul 1;148(1):163 -73.
[125] Folch J, Lees M, Sloane -Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of
total lipids from anima l tissues. J biol Chem. 1957 May 1;226(1):497 -509.
[126] ] Manzi AE, Hayes BK. HPLC methods for the fractionation and analysis of negatively
charged oligosaccharides and gangliosides. Current Protocols in Molecular Biology. 2001
May:17 -21.
[127] Robert KY , Ledeen RW. Gangliosides of human, bovine, and rabbit plasma. Journal of
lipid research. 1972 Sep 1;13(5):680 -6.
[128] Riboni L, Sonnino S, Acquotti D, Malesci A, Ghidoni R, Egge H, Mingrino S, Tettamanti G.
Natural occurrence of ganglioside lactones. Iso lation and characterization of GD1b inner ester
from adult human brain. Journal of Biological Chemistry. 1986 Jun 25;261(18):8514 -9.
[129] Jiang X, Cheng H, Yang K, Gross RW, Han X. Alkaline methanolysis of lipid extracts
extends shotgun lipidomics analyse s to the low -abundance regime of cellular sphingolipids.
Analytical biochemistry. 2007 Dec 15;371(2):135 -45.
[130] Vukelić Ž, Kalanj -Bognar S, Froesch M, Bîndilă L, Radić B, Allen M, Peter -Katalinić J,
Zamfir AD. Human gliosarcoma -associated ganglioside co mposition is complex and distinctive
as evidenced by high -performance mass spectrometric determination and structural
characterization. Glycobiology. 2007 Feb 9;17(5):504 -15.
[131] Scandroglio F, Loberto N, Valsecchi M, Chigorno V, Prinetti A, Sonnino S, T hin layer
chromatography of gangliosides, Glycoconjugate Journal , 2009 Nov 26, (8)961 – 973
[132] Sisu E, Flangea C, Serb A, Rizzi A, Zamfir AD. High ‐performance separation techniques
hyphenated to mass spectrometry for ganglioside analysis. Electrophoresis . 2011 Jun
1;32(13):1591 -609.

127
[133] T. Tai, I. Kawashima, and K. Ogura, “Anticarbohydrate antibodies,” in Comprehensive
Glycoscience, J. P. Kamerling, J. P. Kamerling, G. J. Boons et al., Eds., vol. 3, pp. 765 –783,
Elsevier, Oxford, UK, 2007.
[134] Meisen I, Mormann M, Müthing J. Thin -layer chromatography, overlay technique and mass
spectrometry: a versatile triad advancing glycosphingolipidomics. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) -Molecular and Cell Biology of Lipids. 2011 Nov 30;1811(11):875 -96.
[135] Valdes‐Gonzalez T, Goto ‐Inoue N, Hirano W, Ishiyama H, Hayasaka T, Setou M, Taki T.
New approach for glyco ‐and lipidomics –Molecular scanning of human brain gangliosides by
TLC‐Blot and MALDI ‐QIT‐TOF MS. Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):678 -83.
[136] Gallala HD, Sandhoff K. Principles of microdomain formation in biological membranes -Are
there lipid liquid ordered domains in living cellular membranes?. Trends in Glycoscience and
Glycotechnology. 2008 Jan 1;20(116):277 -95.
[137] Levery SB. Glycosphi ngolipid structural analysis and glycosphingolipidomics. Methods in
enzymology. 2005 Dec 31;405:300 -69.
[138] Varki A. Evolutionary forces shaping the Golgi glycosylation machinery: why cell surface
glycans are universal to living cells. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2011 Jun
1;3(6):a005462.
[139] Tettamanti G. Ganglioside/glycosphingolipid turnover: new concepts. Glycoconjugate
journal. 2003 Jun 1;20(5):301 -17.
[140] Merrill Jr AH. Sphingolipid and glycosphingolipid metabolic pathways in the era of
sphingolipidomics. Chemical reviews. 2011 Sep 26;111(10):6387 -422.
[141] Ikushiro H, Hayashi H. Mechanistic enzymology of serine palmitoyltransferase. Biochimica
et Biophysica Acta (BBA) -Proteins and Proteomics. 2011 Nov 30;1814(11):1474 -80.
[142] Hirabayashi Y, Furuya S. Roles of l -serine and sphingolipid synthesis in brain development
and neuronal survival. Progress in lipid research. 2008 May 31;47(3):188 -203.
[143] Hirabayashi Y. A world of sphingolipids and glycolipids in the brain —Novel functi ons of
simple lipids modified with glucose —. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 2012 Apr
11;88(4):129 -43.
[144] Mullen TD, Hannun YA, Obeid LM. Ceramide synthases at the centre of sphingolipid
metabolism and biology. Biochemical Journal. 2012 Feb 1;441(3):789 -802.
[145] Zhao L, Spassieva SD, Jucius TJ, Shultz LD, Shick HE, Macklin WB, Hannun YA, Obeid
LM, Ackerman SL. A deficiency of ceramide biosynthesis causes cerebellar purkinje cell
neurodegeneration and lipofuscin accumulation. PLoS genetics. 2011 May 19;7(5):e1002063.
[146] Mizutani Y, Kihara A, Chiba H, Tojo H, Igarashi Y. 2 -Hydroxy -ceramide synthesis by
ceramide synthase family: enzymatic basis for the preference of FA chain length. Journal of lipid
research. 2008 Nov 1;49(11):2356 -64.
[147] Fabrias G, Muñoz -Olaya J, Cingolani F, Signorelli P, Casas J, Gagliostro V, Ghidoni R.
Dihydroceramide desaturase and dihydrosphingolipids: debutant players in the sphingolipid
arena. Progress in lipid research. 2012 Apr 30;51(2):82 -94.
[148] Olayioye M A, Hausser A. Integration of non -vesicular and vesicular transport processes at
the Golgi complex by the PKD –CERT network. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular
and Cell Biology of Lipids. 2012 Aug 31;1821(8):1096 -103.
[149] Maccioni HJ, Quiroga R , Ferrari ML. Cellular and molecular biology of glycosphingolipid
glycosylation. Journal of neurochemistry. 2011 May 1;117(4):589 -602.

128
[150] Basu SC. The serendipity of ganglioside biosynthesis: pathway to CARS and HY -CARS
glycosyltransferases. Glycobiolog y. 1991 Nov 1;1(5):469 -75.
[151] Iber H, Zacharias C, Sandhoff K. The c -series gangliosides GT3, GT2 and GP1c are
formed in rat liver Golgi by the same set of glycosyltransferases that catalyse the biosynthesis of
asialo -, a-and b -series gangliosides. Glyc obiology. 1992 Apr 1;2(2):137 -42.
[152] Audry M, Jeanneau C, Imberty A, Harduin -Lepers A, Delannoy P, Breton C. Current trends
in the structure –activity relationships of sialyltransferases. Glycobiology. 2010 Nov 22;21(6):716 –
26.
[153] Svennerholm L, Rynma rk BM, Vilbergsson G, Fredman P, Gottfries J, Månsson JE, Percy
A. Gangliosides in human fetal brain. Journal of neurochemistry. 1991 May 1;56(5):1763 -8.
[154] Kotani M, Kawashima I, Ozawa H, Terashima T, Tai T. Differential distribution of major
gangliosi des in rat central nervous system detected by specific monoclonal antibodies.
Glycobiology. 1993 Apr 1;3(2):137 -46.
[155] Daniotti JL, Iglesias ‐Bartolomé R. Metabolic pathways and intracellular trafficking of
gangliosides. IUBMB life. 2011 Jul 1;63(7):513 -20.
[156] Zhu G, Allende ML, Jaskiewicz E, Qian R, Darling DS, Worth CA, Colley KJ, Young Jr
WW. Two soluble glycosyltransferases glycosylate less efficiently in vivo than their membrane
bound counterparts. Glycobiology. 1998 Aug 1;8(8):831 -40.
[157] Cresp o PM, Demichelis VT, Daniotti JL. Neobiosynthesis of glycosphingolipids by plasma
membrane -associated glycosyltransferases. Journal of Biological Chemistry. 2010 Sep
17;285(38):29179 -90.
[158] Itonori S, Sugita M. Glycophylogenetic aspects of lower animals . Comprehensive
Glycoscience. 2007;3:253 -84.
[159] Banchet -Cadeddu A, Hénon E, Dauchez M, Renault JH, Monneaux F, Haudrechy A. The
stimulating adventure of KRN 7000. Organic & biomolecular chemistry. 2011;9(9):3080 -104.
[160] Kuhn R, Wiegandt H. Further ga ngliosides from the human brain. Zeitschrift fur
Naturforschung. Teil B, Chemie, Biochemie, Biophysik, Biologie und verwandte Gebiete. 1964
Mar;19:256.
[161] Ledeen RW, Yu RK, Eng LF. Gangliosides of human myelin: sialosylgalactosylceramide
(G7) as a major component. Journal of neurochemistry. 1973 Oct 1;21(4):829 -39.
[162] Jackman N, Ishii A, Bansal R. Oligodendrocyte development and myelin biogenesis:
parsing out the roles of glycosphingolipids. Physiology. 2009 Oct 1;24(5):290 -7.
[163] Boggs JM, Gao W, Zhao J, Park HJ, Liu Y, Basu A. Participation of galactosylceramide
and sulfatide in glycosynapses between oligodendrocyte or myelin membranes. FEBS letters.
2010 May 3;584(9):1771 -8.
[164] Maldonado EN, Alderson NL, Monje PV, Wood PM, Hama H. FA2H is resp onsible for the
formation of 2 -hydroxy galactolipids in peripheral nervous system myelin. Journal of lipid
research. 2008 Jan 1;49(1):153 -61.
[165] Stewart RJ, Boggs JM. A carbohydrate -carbohydrate interaction between
galactosylceramide -containing liposome s and cerebroside sulfate -containing liposomes:
dependence on the glycolipid ceramide composition. Biochemistry. 1993 Oct;32(40):10666 -74.
[166] Saadat L, Dupree JL, Kilkus J, Han X, Traka M, Proia RL, Dawson G, Popko B. Absence
of oligodendroglial glucosy lceramide synthesis does not result in CNS myelin abnormalities or
alter the dysmyelinating phenotype of CGT ‐deficient mice. Glia. 2010 Mar 1;58(4):391 -8.

129
[167] Schulte S, Stoffel W. Ceramide UDPgalactosyltransferase from myelinating rat brain:
purificatio n, cloning, and expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993
Nov 1;90(21):10265 -9.
[168] Tennekoon G, Zaruba M, Wolinsky J. Topography of cerebroside sulfotransferase in Golgi –
enriched vesicles from rat brain. The Journal of cell biolo gy. 1983 Oct 1;97(4):1107 -12.
[169] Sprong H, Kruithof B, Leijendekker R, Slot JW, van Meer G, van der Sluijs P. UDP –
galactose: ceramide galactosyltransferase is a class I integral membrane protein of the
endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemis try. 1998 Oct 2;273(40):25880 -8.
[170] Chisada SI, Yoshimura Y, Sakaguchi K, Uemura S, Go S, Ikeda K, Uchima H, Matsunaga
N, Ogura K, Tai T, Okino N. Zebrafish and mouse α2, 3 -sialyltransferases responsible for
synthesizing GM4 ganglioside. Journal of Biol ogical Chemistry. 2009 Oct 30;284(44):30534 -46.
[171] Mullin BR, Patrick DH, Poore CM, Smith MT. Prevention of experimental allergic
encephalomyelitis by ganglioside G M4. Brain research. 1984 Mar 26;296(1):174 -6.
[172] P. Paul, Y. Kamisaka, D. L. Marks, and R. E. Pagano, “Purification and characterization of
UDP -glucose:ceramide glucosyltransferase from rat liver Golgi membranes,” The Journal of
Biological Chemistry , vol. 271, no. 4, pp. 2287 –2293, 1996
[173] Marks DL, Wu K, Paul P, Kamisaka Y, Watanabe R, Pagano RE. Oligomerization and
topology of the Golgi membrane protein glucosylceramide synthase. Journal of Biological
Chemistry. 1999 Jan 1;274(1):451 -6.
[174] Marks DL, Dominguez M, Wu K, Pagano RE. Identification of Active Site Residues in
Glucosylce ramide Synthase A NUCLEOTIDE -BINDING/CA TALYTIC MOTIF CONSERVED
WITH PROCESSIVE β -GLYCOSYLTRANSFERASES. Journal of Biological Chemistry. 2001 Jul
13;276(28):26492 -8.
[175] Coste H, Martel MB, Got R. Topology of glucosylceramide synthesis in Golgi membranes
from porcine submaxillary glands. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Biomembranes. 1986
Jun 13;858(1):6 -12.
[176] Lannert H, Bünning G, Jeckel D, Wieland FT. Lactosylceramide is synthesized in the
lumen of the Golgi apparatus. FEBS letters. 1994 Mar 28;34 2(1):91 -6.
[177] van Helvoort A, Smith AJ, Sprong H, Fritzsche I, Schinkel AH, Borst P, van Meer G. MDR1
P-glycoprotein is a lipid translocase of broad specificity, while MDR3 P -glycoprotein specifically
translocates phosphatidylcholine. Cell. 1996 Nov 1;8 7(3):507 -17.
[178] Halter D, Neumann S, van Dijk SM, Wolthoorn J, De Maziere AM, Vieira OV, Mattjus P,
Klumperman J, van Meer G, Sprong H. Pre -and post -Golgi translocation of glucosylceramide in
glycosphingolipid synthesis. J Cell Biol. 2007 Oct 8;179(1):1 01-15.
[179] Chalat M, Menon I, Turan Z, Menon AK. Reconstitution of Glucosylceramide Flip -Flop
across Endoplasmic Reticulum IMPLICA TIONS FOR MECHANISM OF GLYCOSPHINGOLIPID
BIOSYNTHESIS. Journal of Biological Chemistry. 2012 May 4;287(19):15523 -32.
[180] D'angelo G, Polishchuk E, Di Tullio G, Santoro M, Di Campli A, Godi A, West G, Bielawski
J, Chia -Chen C, van der Spoel AC, Platt FM. Glycosphingolipid synthesis requires FAPP2
transfer of glucosylceramide. Nature. 2007 Sep 6;449(7158):62.
[181] Kolter T. Ganglioside biochemistry. ISRN biochemistry. 2012 Dec 19;2012
[182] Takizawa M, Nomura T, Wakisaka E, Yoshizuka N, Aoki J, Arai H, Inoue K, Hattori M,
Matsuo N. cDNA cloning and expression of human lactosylceramide synthase. Biochimica et
Biophysica Acta ( BBA) -Molecular and Cell Biology of Lipids. 1999 May 18;1438(2):301 -4.

130
[183] Martinez Z, Zhu M, Han S, Fink AL. GM1 specifically interacts with α -synuclein and inhibits
fibrillation. Biochemistry. 2007 Feb 20;46(7):1868 -77.
[184] Yamashita T, Wu YP, Sandhof f R, Werth N, Mizukami H, Ellis JM, Dupree JL, Geyer R,
Sandhoff K, Proia RL. Interruption of ganglioside synthesis produces central nervous system
degeneration and altered axon –glial interactions. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the Uni ted States of America. 2005 Feb 22;102(8):2725 -30.
[185] Wang Y, Yamaguchi K, Wada T, Hata K, Zhao X, Fujimoto T, Miyagi T. A close
association of the ganglioside -specific sialidase Neu3 with caveolin in membrane microdomains.
Journal of Biological Chemist ry. 2002 Jul 19;277(29):26252 -9.
[186] Miyata M, Kambe M, Tajima O, Moriya S, Sawaki H, Hotta H, Kondo Y, Narimatsu H,
Miyagi T, Furukawa K, Furukawa K. Membrane sialidase NEU3 is highly expressed in human
melanoma cells promoting cell growth with minimal changes in the composition of gangliosides.
Cancer science. 2011 Dec 1;102(12):2139 -49.
[187] Wang J, Wu G, Miyagi T, Lu ZH, Ledeen RW. Sialidase occurs in both membranes of the
nuclear envelope and hydrolyzes endogenous GD1a. Journal of neurochemistry. 20 09 Oct
1;111(2):547 -54.
[188] Ito M, Degradation of glycolipids, in Comprehensive Glycoscience , Eds., vol. 3, pp. 193 –
208, Elsevier, Oxford, UK, 2007
[189] Kolter T, Sandhoff K. Lysosomal degradation of membrane lipids. FEBS letters. 2010 May
3;584(9):1700 -12.
[190] Fürst W, Sandhoff K. Activator proteins and topology of lysosomal sphingolipid catabolism.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Lipids and Lipid Metabolism. 1992 Jun 5;1126(1):1 -6.
[191] Rich JR, Cunningham AM, Gilbert M, Withers SG. Glycosphingo lipid synthesis employing
a combination of recombinant glycosyltransferases and an endoglycoceramidase glycosynthase.
Chemical Communications. 2011;47(38):10806 -8.
[192] Johansson AC, Appelqvist H, Nilsson C, Kågedal K, Roberg K, Öllinger K. Regulation of
apoptosis -associated lysosomal membrane permeabilization. Apoptosis. 2010 May 1;15(5):527 –
40.
[193] Möbius W, Van Donselaar E, Ohno ‐Iwashita Y, Shimada Y, Heijnen HF, Slot JW, Geuze
HJ. Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bod ies harbor most of
the cholesterol found in the endocytic pathway. Traffic. 2003 Apr 1;4(4):222 -31.
[194] Gallala HD, Sandhoff K. Biological function of the cellular lipid BMP —BMP as a key
activator for cholesterol sorting and membrane digestion. Neurochem ical research. 2011 Sep
1;36(9):1594 -600.
[195] Scherer M, Schmitz G. Metabolism, function and mass spectrometric analysis of bis
(monoacylglycero) phosphate and cardiolipin. Chemistry and physics of lipids. 2011 Sep
30;164(6):556 -62.
[196] Kobayashi T, Be uchat MH, Chevallier J, Makino A, Mayran N, Lebrand C, Cosson P,
Kobayashi T, Gruenberg J. Separation and characterization of late endosomal membrane
domains. Journal of Biological Chemistry. 2002 Aug 30;277(35):32157 -64.
[197] Saftig P, Schröder B, Blanz J. Lysosomal membrane proteins: life between acid and
neutral conditions.
[198] Henning R, Stoffel W. Glycosphingolipids in lysosomal membranes. Hoppe -Seyler´ s
Zeitschrift für physiologische Chemie. 1973;354(2):760 -70.

131
[199] Kolter T, Sandhoff K. Principl es of lysosomal membrane digestion: stimulation of
sphingolipid degradation by sphingolipid activator proteins and anionic lysosomal lipids. Annual
review of cell and developmental biology. 2005 Oct 7;21.
[200] Locatelli -Hoops S, Remmel N, Klingenstein R, Breiden B, Rossocha M, Schoeniger M,
Koenigs C, Saenger W, Sandhoff K. saposin a mobilizes lipids from low cholesterol and high bis
(monoacylglycerol) phosphate -containing membranes patient variant saposin a lacks lipid
extraction capacity. Journal of Bio logical Chemistry. 2006 Oct 27;281(43):32451 -60.
[201] Remmel N, Locatelli ‐Hoops S, Breiden B, Schwarzmann G, Sandhoff K. Saposin B
mobilizes lipids from cholesterol ‐poor and bis (monoacylglycero) phosphate ‐rich membranes at
acidic pH. The FEBS journal. 20 07 Jul 1;274(13):3405 -20.
[202] Werth N, Schuette CG, Wilkening G, Lemm T, Sandhoff K. Degradation of Membrane –
bound Ganglioside GM2 by β -Hexosaminidase a stimulation by GM2 activator protein and
lysosomal lipids . Journal of Biological Chemistry. 2001 Apr 20;276(16):12685 -90.
[203] Wilkening G, Linke T, Uhlhorn -Dierks G, Sandhoff K. Degradation of Membrane -bound
Ganglioside GM1 STIMULA TION BY BIS (MONOACYLGLYCERO) PHOSPHATE AND THE
ACTIVATOR PROTEINS SAP -B AND GM2 -AP. Journal of Biological Chemistry. 2000 N ov
17;275(46):35814 -9.
[204] . Sandhoff R, Hepbildikler ST, Jennemann R, Geyer R, Gieselmann V, Proia RL, Wiegandt
H, Gröne HJ. Kidney sulfatides in mouse models of inherited glycosphingolipid disorders
determination by nano -electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Biological
Chemistry. 2002 Jun 7;277(23):20386 -98.
[205] Abdul -Hammed M, Breiden B, Adebayo MA, Babalola JO, Schwarzmann G, Sandhoff K.
Role of endosomal membrane lipids and NPC2 in cholesterol transfer and membrane fusion.
Journal of lipid research. 2010 Jul 1;51(7):1747 -60.
[206] Walkley SU, Vanier MT. Secondary lipid accumulation in lysosomal disease. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) -Molecular Cell Research. 2009 Apr 30;1793(4):726 -36.
[207] Cox TM, Cachón ‐González MB. Th e cellular pathology of lysosomal diseases. The Journal
of pathology. 2012 Jan 1;226(2):241 -54.
[208] Platt FM, Lachmann RH. Treating lysosomal storage disorders: current practice and future
prospects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular Cell Res earch. 2009 Apr
30;1793(4):737 -45.
[209] Leinekugel P, Michel S, Conzelmann E, Sandhoff K. Quantitative correlation between the
residual activity of β -hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting
lysosomal storage disease. Human g enetics. 1992 Mar 1;88(5):513 -23.
[210] Zervas M, Somers KL, Thrall MA, Walkley SU. Critical role for glycosphingolipids in
Niemann -Pick disease type C. Current Biology. 2001 Aug 21;11(16):1283 -7.
[211] Campos D, Monaga M. Mucopolysaccharidosis type I: cur rent knowledge on its
pathophysiological mechanisms. Metabolic brain disease. 2012 Jun 1;27(2):121 -9.
[212] Aridor M, Hannan LA. Traffic jams II: an update of diseases of intracellular transport.
Traffic. 2002 Sep 1;3(11):781 -90.
[213] Jeyakumar M, Willia ms I, Smith DA, Cox TM, Platt FM. Critical role of iron in the
pathogenesis of the murine gangliosidoses. Neurobiology of disease. 2009 Jun 30;34(3):406 -16.
[214] Settembre C, Fraldi A, Rubinsztein DC, Ballabio A. Lysosomal storage diseases as
disorders of autophagy. Autophagy. 2008 Jan 1;4(1):113 -4.

132
[215] Conzelmann E, Sandhoff K. Partial enzyme deficiencies: residual activities and the
development of neurological disorders. Developmental neuroscience. 1983;6(1):58 -71.
[216] Kolter T, Sandhoff K. Sphingoli pid metabolism diseases. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) -Biomembranes. 2006 Dec 31;1758(12):2057 -79.
[217] Kolter T. A view on sphingolipids and disease. Chemistry and physics of lipids. 2011 Sep
30;164(6):590 -606.
[218] Yanagisawa K. Pathological sign ificance of ganglioside clusters in Alzheimer’s disease.
Journal of neurochemistry. 2011 Mar 1;116(5):806 -12.
[219] Robert KY, Tsai Y T, Ariga T. Functional roles of gangliosides in neurodevelopment: an
overview of recent advances. Neurochemical research. 2 012 Jun 1;37(6):1230 -44.
[220] Prinetti A, Prioni S, Loberto N, Aureli M, Nocco V, Illuzzi G, Mauri L, Valsecchi M, Chigorno
V, Sonnino S. Aberrant Glycosphingolipid Expression and Membrane Organization in Tumor
Cells: Consequences on Tumor –Host Interactio ns. InThe Molecular Immunology of Complex
Carbohydrates -3 2011 (pp. 643 -667). Springer US.
[221] Fernandez LE, Gabri MR, Guthmann MD, Gomez RE, Gold S, Fainboim L, Gomez DE,
Alonso DF. NGcGM3 ganglioside: a privileged target for cancer vaccines. Clinical a nd
Developmental Immunology. 2010 Oct 27;2010.
[222] Heimburg -Molinaro J, Lum M, Vijay G, Jain M, Almogren A, Rittenhouse -Olson K. Cancer
vaccines and carbohydrate epitopes. Vaccine. 2011 Nov 8;29(48):8802 -26.
[223] Durrant LG, Noble P, Spendlove I. Immun ology in the clinic review series; focus on cancer:
glycolipids as targets for tumour immunotherapy. Clinical & Experimental Immunology. 2012 Feb
1;167(2):206 -15.
[224] Uncini A. A common mechanism and a new categorization for anti -ganglioside antibody –
mediated neuropathies. Experimental neurology. 2012 Jun 30;235(2):513 -6.
[225] Uncini A. A common mechanism and a new categorization for anti -ganglioside antibody –
mediated neuropathies. Experimental neurology. 2012 Jun 30;235(2):513 -6.
[226] Svennerholm L, Br åne G, Karlsson I, Lekman A, Ramström I, Wikkelsö C. Alzheimer
disease –effect of continuous intracerebroventricular treatment with GM1 ganglioside and a
systematic activation programme. Dementia and geriatric cognitive disorders. 2002;14(3):128 –
36.
[227] Inokuchi JI. Inhibition of ganglioside biosynthesis as a novel therapeutic approach in
insulin resistance. InDiabetes -Perspectives in Drug Therapy 2011 (pp. 165 -178). Springer Berlin
Heidelberg.
[228] Thomas RJ. Receptor mimicry as novel therapeutic treatme nt for biothreat agents.
Bioengineered bugs. 2010 Jan;1(1):17.
[229] Bachis A, Mocchetti I. Semisynthetic sphingoglycolipid LIGA20 is neuroprotective against
human immunodeficiency virus ‐gp120‐mediated apoptosis. Journal of neuroscience research.
2006 Apr 1;83(5):890 -6.
[230] Todeschini AR, Hakomori SI. Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in
control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA) -General Subjects. 2008 Mar 31 ;1780(3):421 -33.
[231] Kopitz J, von Reitzenstein C, Burchert M, Cantz M, Gabius HJ. Galectin -1 is a major
receptor for ganglioside GM1, a product of the growth -controlling activity of a cell surface
ganglioside sialidase, on human neuroblastoma cells in c ulture. Journal of Biological Chemistry.
1998 May 1;273(18):11205 -11.

133
[232] Lopez PH, Schnaar RL. Gangliosides in cell recognition and membrane protein regulation.
Current opinion in structural biology. 2009 Oct 31;19(5):549 -57.
[233] Kojima N, Hakomori SI . Specific interaction between gangliotriaosylceramide (Gg3) and
sialosyllactosylceramide (GM3) as a basis for specific cellular recognition between lymphoma
and melanoma cells. Journal of Biological Chemistry. 1989 Dec 5;264(34):20159 -62.
[234] Schnaar RL . Brain gangliosides in axon –myelin stability and axon regeneration. FEBS
letters. 2010 May 3;584(9):1741 -7.
[235] Inokuchi J, Kabayama K. Receptor modifications in glycobiology, in Comprehensive
Glycoscience , Kamerling JP, Boons GJ, Lee YC, Suzuki A, Tani guchi N, Voragen AGJ , Eds.,
vol. 3, pp. 733 –743, Elsevier, Oxford, UK, 2007
[236] Schnaar RL. Neural functions of glycolipids, in Comprehensive Glycoscience , Kamerling
JP, Boons GJ, Lee YC, Suzuki A, Taniguchi N, Voragen AGJ, Eds., vol. 4, pp. 323 –337,
Elsevier, Oxford, UK, 2007
[237] Coskun Ü, Grzybek M, Drechsel D, Simons K. Regulation of human EGF receptor by
lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011 May 31;108(22):9044 -8.
[238] Cantù L, Del Favero E, Sonnino S, Prinetti A. Gangliosid es and the multiscale modulation
of membrane structure. Chemistry and physics of lipids. 2011 Nov 30;164(8):796 -810.
[239] Sonnino S, Mauri L, Chigorno V, Prinetti A, Kudo T, Fujii T, Ikegami S, Inokuchi K,
Takayama Y, Ikehara Y, Nishihara S. Gangliosides as components of lipid membrane domains.
Glycobiology. 2007;17(10):1030.
[240] Lippincott -Schwartz J, Phair RD. Lipids and cholesterol as regulators of traffic in the
endomembrane system. Annual review of biophysics. 2010 Jun 9;39:559 -78.
[241] Simons K, G erl MJ. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nature reviews.
Molecular cell biology. 2010 Oct 1;11(10):688.
[242] Gallala HD, Sandhoff K. Principles of microdomain formation in biological membranes -Are
there lipid liquid ordered domains in living cellular membranes?. Trends in Glycoscience and
Glycotechnology. 2008 Jan 1;20(116):277 -95.
[243] Pike LJ. Rafts defined: a report on the Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell
Function. Journal of lipid research. 2006 Jul 1;47(7):1597 -8.
[244] Heffer -Lauc M, Lauc G, Nimrichter L, Fromholt SE, Schnaar RL. Membrane redistribution
of gangliosides and glycosylphosphatidylinositol -anchored proteins in brain tissue sections
under conditions of lipid raft isolation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Molecular and Cell
Biology of Lipids. 2005 Jan 5;1686(3):200 -8.
[245] Eggeling C, Ringemann C, Medda R, Schwarzmann G, Sandhoff K, Polyakova S, Belov
VN, Hein B, von Middendorff C, Schönle A, Hell SW. Direct observation of the nanoscale
dynamics of membra ne lipids in a living cell. Nature. 2009 Feb 26;457(7233):1159 -62
[246] Brameshuber M, Weghuber J, Ruprecht V, Gombos I, Horváth I, Vigh L, Eckerstorfer P,
Kiss E, Stockinger H, Schütz GJ. Imaging of mobile long -lived nanoplatforms in the live cell
plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 2010 Dec 31;285(53):41765 -71.
[247] Janas T, Janas T. Membrane oligo -and polysialic acids. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) -Biomembranes. 2011 Dec 31;1808(12):2923 -32.
[248] Salazar BC, Castaño S, Sánchez JC, R omero M, Recio -Pinto E. Ganglioside GD1a
increases the excitability of voltage -dependent sodium channels. Brain research. 2004 Sep
24;1021(2):151 -8.

134
[249] Furukawa K, Tajima O, Okuda T, Tokuda N, Furukawa K. Knockout mice and glycolipids.
Comprehensive Gl ycoscience from Chemistry to Systems Biology. 2007:149 -57.
[250] Xu YH, Barnes S, Sun Y, Grabowski GA. Multi -system disorders of glycosphingolipid and
ganglioside metabolism. Journal of lipid research. 2010 Jul 1;51(7):1643 -75.
[251] Sabourdy F, Kedjouar B , Sorli SC, Colié S, Milhas D, Salma Y, Levade T. Functions of
sphingolipid metabolism in mammals —lessons from genetic defects. Biochimica et Biophysica
Acta (BBA) -Molecular and Cell Biology of Lipids. 2008 Apr 30;1781(4):145 -83.
[252] Rao RP, Acharya JK. Sphingolipids and membrane biology as determined from genetic
models. Prostaglandins & other lipid mediators. 2008 Feb 29;85(1):1 -6.
[253] Matuoka S, Akiyama M, Yamada H, Tsuchihashi K, Gasa S. Phase behavior in
multilamellar vesicles of DPPC containing ga nglioside GM3 with a C18: 1 sphingoid base and a
24: 0 acyl chain (GM3 (18, 24) observed by X -ray diffraction. Chemistry and physics of lipids.
2003 Mar 31;123(1):19 -29.
[254] Wennekes T, van den Berg RJ, Boot RG, van der Marel GA, Overkleeft HS, Aerts JM.
Glycosphingolipids —nature, function, and pharmacological modulation. Angewandte Chemie
International Edition. 2009 Nov 9;48(47):8848 -69.
[255] Dong Y, Ikeda K, Hamamura K, Zhang Q, Kondo Y, Matsumoto Y, Ohmi Y, Yamauchi Y,
Furukawa K, Taguchi R, Furukawa K. GM1/GD1b/GA1 synthase expression results in the
reduced cancer phenotypes with modulation of composition and raft ‐localization of gangliosides
in a melanoma cell line. Cancer science. 2010 Sep 1;101(9):2039 -47.
[256] Inokuchi JI. Neurotrophic and neurop rotective actions of an enhancer of ganglioside
biosynthesis. International review of neurobiology. 2009 Dec 31;85:319 -36.
[257] Wu G, Lu ZH, Xie X, Li L, Ledeen RW. Mutant NG108 ‐15 cells (NG ‐CR72) deficient in
GM1 synthase respond aberrantly to axonogenic stimuli and are vulnerable to calcium ‐induced
apoptosis: they are rescued with LIGA ‐20. Journal of neurochemistry. 2001 Feb 1;76(3):690 –
702.
[258] Kolter T, Magin TM, Sandhoff K. Biomolecule function: no reliable prediction from cell
culture. Traffic. 200 0 Oct 1;1(10):803 -4.
[259] Nelson DL, Cox MM (2005). Lehninger's Principles of Biochemistry (4th ed.). New York,
New York: W. H. Freeman and Company
[260] Fischer E. Einfluss der Configuration auf die Wirkung der Enzyme. Ber. Dt. Chem. Ges.
1894;27:2985 –2993
[261] Matthiesen R, Azevedo L, Amorim A, Carvalho AS. Discussion on common data analysis
strategies used in MS ‐based proteomics. Proteomics. 201 1 Feb 1;11(4):604 -19.
[262] Hutchins JR, Toyoda Y, Hegemann B, Poser I, Hériché JK, Sykora MM, Augsburg M,
Hudecz O, Buschhorn BA, Bulkescher J, Conrad C. Systematic analysis of human protein
complexes identifies chromosome segregation proteins. Science. 2010 Apr 30;328(5978):593 -9.
[263] Zamfir A, Vukelić Ž, Bindila L, Peter -Katalinić J, Almeida R, Sterling A, Allen M. Fully –
automated chip -based nanoelectrospray tandem mass spectrometry of gangliosides from
human cerebellum. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2004 Nov
30;15(11):1649 -57.
[264] Serb AF, Sisu E, Vukelić Ž, Zamfir AD. Profiling and sequencing of gangliosides from
human caudate nucleus by chip ‐nanoelectrospray mass spectrometry. Journal of mass
spectrometry. 2012 Dec 1;47(12):1561 -70.

135
[265] Vukelic Z, Metelmann W, Müthing J, Kos M, Peter -Katalinic J. Anencephaly: structural
charac terization of gangliosides in defined brain regions. Biological chemistry. 2001 Feb
12;382(2):259 -74.
[266] De Hoffmann E, Stroobant V. Mass spectrometry: principles and applications. John Wiley
& Sons; 2007 Oct 29.
[267] Costello CE, Juhasz P, Perreault H . New mass spectral approaches to ganglioside
structure determinations. Progress in brain research. 1994 Dec 31;101:45 -61.
[268] Serb A, Schiopu C , Flangea C, Sisu E, Zamfir AD. Top –down glycolipidomics:
fragmentation analysis of ganglioside oligosaccharid e core and ceramide moiety by
chip‐nanoelectrospray collision ‐induced dissociation MS2 –MS6. Journal of mass spectrometry.
2009 Oct 1;44(10):1434 -42.
[269] Saito M, Sugiyama K. Tissue -specific expression of c -series gangliosides in the
extraneural system. B iochimica et Biophysica Acta (BBA) -General Subjects. 2000 Mar
6;1474(1):88 -92.;
[270] Serb A, Schiopu C , Flangea C, Vukelić Ž, Sisu E, Zagrean L, Zamfir AD. High -throughput
analysis of gangliosides in defined regions of fetal brain by fully automated chip -based
nanoelectrospray ionization multi -stage mass spectrometry. European Journal of Mass
Spectrometry. 2009 Aug;15(4):541 -53..
[271] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al meningiomului cerebral din punct de vedere
structural, prin chip nanoESI QTO F MS. Referat de cercetare științifică
[272] Ann Q, Adams J. Structure determination of ceramides and neutral glycosphingolipids by
collisional activation of [M+ Li]+ ions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry.
1992 Mar 1;3(3):260 -3.
[273] Șchiopu C. Studiul profilului gangliozidic al metastazei cerebrale a adenocarcinomului
pulmonar, comparativ cu țesutul cerebral sănătos, din punct de vedere structural prin chip
nanoESI QTOF MS. Referat de cercetare științifică
[274] Sørensen JB, Hansen H H, Hansen M, Dombernowsky P. Brain metastases in
adenocarcinoma of the lung: frequency, risk groups, and prognosis. Journal of Clinical
Oncology. 1988 Sep;6(9):1474 -80.
[275] Gow CH, Chien CR, Chang YL, Chiu YH, Kuo SH, Shih JY, Chang YC, Yu CJ, Yang CH,
Yang PC. Radiotherapy in lung adenocarcinoma with brain metastases: effects of activating
epidermal growth factor receptor mutations on clinical response. Clinical Cancer Research. 2008
Jan 1;14(1):162 -8.
[276] Trbojević -Čepe M, Kračun I. Determination of g angliosides in human cerebrospinal fluid by
high-performance thin -layer chromatography and direct densitometry. Clinical Chemistry and
Laboratory Medicine. 1990;28(11):863 -72.
[277] Narasimhan RA, Murray RK. Neutral glycosphingolipids and gangliosides of h uman lung
and lung tumours. Biochemical Journal. 1979 Apr 1;179(1):199 -211.
[278] Metelmann W, Vukelić Ž, Peter ‐Katalinić J. Nano ‐electrospray ionization time ‐of‐flight
mass spectrometry of gangliosides from human brain tissue. Journal of mass spectrometry .
2001 Jan 1;36(1):21 -9.
[279] Vukelić Ž, Zamfir AD, Bindila L, Froesch M, Peter -Katalinić J, Usuki S, Robert KY.
Screening and sequencing of complex sialylated and sulfated glycosphingolipid mixtures by
negative ion electrospray Fourier transform ion cycl otron resonance mass spectrometry. Journal
of the American Society for Mass Spectrometry. 2005 Apr 30;16(4):571 -80.

136
[280] Ruggieri S, Mugnai G, Mannini A, Calorini L, Fallani A, Barletta E, Mannori G, Cecconi O.
Lipid characteristics in metastatic cells. Clinical and Experimental Metastasis. 1999 Jun
1;17(4):271 -6.
[281] Petro KA, Schengrund CL. Membrane raft disruption promotes axonogenesis in n2a
neuroblastoma cells. Neurochemical research. 2009 Jan 1;34(1):29 -37.
[282] Koochekpour S, Merzak A, Pilkingto n GJ. Vascular endothelial growth factor production is
stimulated by gangliosides and TGF -β isoforms in human glioma cells in vitro. Cancer letters.
1996 Apr 19;102(1 -2):209 -15.
[283] Bu G, Luo Y, Lu J, Zhang Y. Reduced antigenicity of β -lactoglobulin by c onjugation with
glucose through controlled Maillard reaction conditions. Food and agricultural immunology. 2010
Jun 1;21(2):143 -56.
[284] Yoshida T, Sasahara Y, Miyakawa S, Hattori M. Reduced T cell response to β –
lactoglobulin by conjugation with acidic o ligosaccharides. Journal of agricultural and food
chemistry. 2005 Aug 24;53(17):6851 -7.

[285] Cohen SL, Chait BT. Mass spectrometry of whole proteins eluted from sodium dodecyl
sulfate –polyacrylamide gel electrophoresis gels. Analytical biochemistry. 1997 May
1;247(2):257 -67.
[286] Schneider SS, Aslebagh R, Wetie AG, Sturgeon SR, Darie CC, Arcaro KF. Using breast
milk to assess breast cancer risk: the role of mass spectrometry -based proteomics.
InAdvancements of Mass Spectrometry in Biomedical Research 201 4 (pp. 399 -408). Springer
International Publishing.
[287] Ding X, Yang Y, Zhao S, Li Y, Wang Z. Analysis of α -lactalbumin, β -lactoglobulin A and B
in whey protein powder, colostrum, raw milk, and infant formula by CE and LC. Dairy science &
technology. 201 1 Apr 1;91(2):213 -25.
[288] Zsila F, Bikádi Z, Simonyi M. Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β –
lactoglobulin studied by circular dichroism, electronic absorption spectroscopy and molecular
modeling methods. Biochemical pharmacology. 2 002 Dec 1;64(11):1651 -60.
[289] Rachagani S, Gupta ID, Gupta N, Gupta SC. Genotyping of β -Lactoglobulin gene by PCR –
RFLP in Sahiwal and Tharparkar cattle breeds. BMC genetics. 2006 May 25;7(1):31.
[290] Ohtomo H, Konuma T, Utsunoiya H, Tsuge H, Ikeguchi M. Structure and stability of
Gyuba, a β ‐lactoglobulin chimera. Protein Science. 2011 Nov 1;20(11):1867 -75.
[291] Cederkvist FH, Zamfir AD, Bahrke S, Eijsink VG, Sørlie M, Peter ‐Katalinić J, Peter MG.
Identification of a High ‐Affinity‐Binding Oligosaccharide by (+) Nanoelectrospray Quadrupole
Time‐of‐Flight Tandem Mass Spectrometry of a Noncovalent Enzyme –Ligand Complex.
Angewandte Chemie International Edition. 2006 Apr 3;45(15):2429 -34.
[292] Panel NS. Guidelines for the diagnosis and management of food alle rgy in the United
States: report of the NIAID -sponsored expert panel. Journal of Allergy and Clinical Immunology.
2010 Dec 31;126(6):S1 -58.

I

Anexe