Drd. Badea Mădălina Andreea [608109]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific:
Prof. Dr. Dinischiotu Anca

Îndrumător științific :
Drd. Badea Mădălina Andreea

Absolvent: [anonimizat]

2020

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ
Efectul nanoarhitecturilor pe bază de carbon
multifuncționalizate asupra celulelor tumorale mamare

Coordonator ș tiințific:
Prof. Dr. Dinischiotu Anca
Îndrumător științific:
Drd. Badea Mădălina Andreea

Absolvent: [anonimizat]
2020

1
Cuprins

Abrevieri ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 3
Introducere ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 6

Partea teoretică
Capitolul I – Nanoarhitecturile de carbon ………………………….. …………………………. 8
1.1 Principalele tipuri de nanoarhitecturi de carbon și proprietățile lor ………………………….. … 8
1.2 Aplicații ale nanoarhitecturilor de carbon ………………………….. ………………………….. ……. 12
1.3 Utilizarea nanoarhitecturilor de carbon în terapia țintită ………………………….. …………….. 17

Capitolul II – Modele celulare dezvoltate pentru studiul proceselor tumorale
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………. 20
2.1. Principalele tipuri de modele celulare și caracteristicile acestora ………………………….. … 20
2.2. Principalele aplicații și metode de generare a modelelor celulare ………………………….. .. 25

Capitolul III – Efectele biologice ale siste melor pe bază de nanoarhitecturi
de carbon la nivel tumoral ………………………….. ………………………….. ……………………. 28
3.1 Mecanisme de toxicitate induse la nivelul celulelor tumorale. Studii in vitro ……………… 28
3.2 Biodistribuția nanoarhitecturilor de carbon și efectele induse in vivo ………………………… 30
3.3 Studii privind interacțiunea dintre nanoarhitecturile de carbon și modelele celulare
tridimensionale ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 32

Partea experimentală
Capitolul IV – Materiale și metode ………………………….. ………………………….. ………. 35
4.1 Sinteza și caracterizarea nanotuburilor de carbon simple si funcționalizate ……………….. 35
4.2 Cultivarea liniei celulare de adenocarcinom mamar MDA -MB-231 …………………………. 41
4.3 Obținerea modelelor tridimensionale din linia celulară MDA -MB-231 ……………………… 41
4.4 Expunerea modelelor tridimensionale de cancer de sân la nanotuburi de carbon …………. 43

2
4.5 Analiza morfologică a modelelor tridimensionale de cancer de sân expuse la nanotuburi de
carbon ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 43
4.6 Determinarea nivelului de lactat dehidrogenază eliberat în mediul de cultură (LDH) …… 43
4.7 Determinarea producției de oxid nitric prin metoda colorimetrică Griess ………………….. 43
4.8 Obținerea lizatului celular ………………………….. ………………………….. ………………………… 45
4.9 Determinarea concentrației proteice prin metoda Bradford ………………………….. …………. 45
4.10 Determinarea colorimetrică a concentrației de glutation redus (GSH) ………………………. 46
4.11 Determinarea concentrației de malondialdehidă (MDA) ………………………….. …………… 47
4.12 Analiza statistică ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 48

Capitolul V – Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. …………. 49
5.1 Efectul nanotuburilor de carbon asupra morfologiei modelelor tridimensionale ………….. 49
5.2 Citotoxicitatea nanotuburilor de carbon la nivelul modelelor tridimensionale …………….. 50
5.2.1 Nivelul producției de lactat dehidrogenază eliberată în mediul de cultură …….. 50
5.2.2 Evaluarea procesului inflamator prin producția de oxid nitric …………………….. 51
5.3 Modificări induse de stresul oxidativ în prezența nanotuburilor de carbon …………………. 53
5.3.1 Evaluarea concentrației de glutation redus ………………………….. ………………….. 53
5.3.2 Evaluarea nivelului de peroxidare lipidică ………………………….. ………………….. 54

Capitolul V – Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 56

Bibliografie ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………….. 57

3
Abrevieri

A2 – tip de ciclină
ADN – acid dezoxiribonucleic
ARN – acid ribonucleic
BSA – albumină serică bovină
C – carbon
C60 – Buckyball ( tip de fulerenă cu m ai puțin de 300 atomi de carbon )
C70 – tip de fulerenă
C76 – tip de fulerenă
C84 – tip de fulerenă
C240 – tip de fulerenă
C540 – tip de fulerenă
CAS – serviciu l de abstracție chimică
CDV – procedeu de depunere prin cataliză chimică
CH 2 – grupare metilen
CH 3 – grupare metil
CNT – nanotub de carbon
CO 2 – dioxid de carbon
COOH – grupare carboxil
CSTN – cancer de sân triplu negativ
CTAB – bromură de cetiltrimetilamoniu
Cu – cupru
2D – spațiu bidimensional
3D – spațiu tridimensional
DMEM – Dulbeco modified Eagel's medium
DTNB – acid 5, 5' – ditiobis – 2 – nitrob enzoic
ECM – matrice extracelulară
EDTA – acid etilendiaminotetraacetic
EGFR – rata filtrării glomerulare
FET – tranzistoare cu efect de câmp
FTIR – spectroscopie infraroșu cu transformată Fourier
GSH – glutation redus

4
GSSG – glutation oxidat
HCl – acid clorhidric
HER 2 – factor de creștere epidermal uman
HIV – virusul imunodeficienței umane
IR – infraroșu
LDH – lactat dehidrogenază
LE – Lupus Erythe matosus
LOC – metoda liquid -overlay
LPS – lipopolizaharide
MCTS – sferoizi tumorali multicelulari
MD – radioactivitate
MDA – malondialdehidă
MWCNT – nanotuburi de carbon cu mai mulți pereți
MWCNT -COOH – nanotuburi de carbon cu pereți multipli funcționalizate cu grupări carboxil
MWCNT -NH 2 – nanotuburi de carbon cu pereți multipli funcționalizate cu grupări amino
14N – azot
NAD+ – nicotinamida adenin dinucleotidă (forma oxidată)
NADH – nicotinamid adenin dinucleotid (forma redusă)
NADPH – nicotinamid adenin dinucleotid fosfat
NaHCO 3 – bicarbonat de sodiu
NaNO 2 – azotit de sodiu
NED – naftil -etilen -diamină
-NH 2 – grupare amino
NK – „natural killer”
NO – oxid nitric
NOS – oxid nitric sintaze
O – oxigen
-OH – grupare hidroxil
PBS – tampon fosfat salin
PCCO – oxid de cupru praseodim ceriu
pH – potențial de hidrogen
RWV – vase cu perete rotativ
ROS – specii reactive de oxigen
S – sulf

5
SEM – microscopie electronică scanning
SGOT – aspartat aminotransferază
SGPT – alanin aminotransferază
-SH – grupare sulfhidril
SOCl 2 – clorură de tionil
SSA – acid sulfosalicilic
SWCNT – nanotuburi de carbon cu un singur perete
TBA – acid 2 -tiobarbituric
TEM – microscopie electronică de transmisie
THF – tetrahidrofuran
TNB – acid 5-tio-2-nitrobenzoic
UDD – diamante ultradispersate
W – Watt
Z – număr atomic

6
Introducere

Nanotehnologia poate fi prezentată ca un domeniu interdisciplinar cuprinzând elemente
din diferite domenii cum ar fi fizica, chimia, biologia, numeroase elemente din inginerie și
medicină, implicațiile nanotehnologiei atingând toate aceste ramuri. Nanotehn ologia
funcționează la nivel de nanoscală, nanostructurile fiind de dimensuni mai mici de 100 nm , și
având proprietăți total diferite în comparație cu același material analizat la nivel macroscopic.
Este foarte posibil ca pe viitor nanotehnologiile să înr egistreze o pondere destul de mare în
rândul utilizatorilor de tehnologie, anumite produse destinate traiului actual utilizând deja acest
vast domeniu supranumit nanotehnologie. Datorită probabilității ca această tehno logie să fie
utilizată pe o scar ă larg ă în viitor și datorită faptului că aplicațiile cele mai proeminente ale
acesteia sunt legate de electronică, cercetătorii implicați în dezvoltarea nanotehnolog iei au
denumit acest domeniu o “ promisiune a viitorului” concretizată prin realiză ri cum ar fi:
computerul molecular, caroserii de automobile, motoare cu consum redus de combustibil,
precum și aripi de avion ce își pot modifica forma după c erințele aerodinamice momentane și
multe alte implementări. Cu toate acestea, una dintre aplicațiile cele mai im portante este cea
din domeniul medicinei și vizează terapia țintită. Un rol important în terapia țintită le revine
nanotuburilor de carbon, nanoparticule reprezentative pentru nanotehnologie.
Pe lângă dimensiunile mici, proprietățile magnetice, optice și electrice, una din tre
caracteristicile semnificative ale nanotuburilor de carbon, care determină utilizarea acestora în
domeniul medical, este reprezentată de potențialul lor de a fi funcționalizate cu diferite grupări
funcționale și conjugate cu diferite molecule terapeutice, în scopul livrării acestora la nivelul
unui situs țintă.
Cancerul de sân triplu negativ (CSTN) este definit prin lipsa exprimării receptorilor
pentru estrogen, progesteron și a supraexprimării receptorilor HER2, făcând astfel terapi a
biologică ineficientă. Întrucât chimioterapia și chirurgia rămân singurele metode aplicate în
clinică, dar sunt asociate cu rezistență și recidivă în timp, în momentul de față sunt gândite alte
strategii de tratament utilizând terapia țintită prin nanotu buri de carbon. Totodată, în ultimele 3
decade au fost studiate modele celulare experimentale avansate, care mimează cu mai mare
acuratețe situația existentă in vivo . Un astfel de exemplu este reprezentat de modele le
canceroase sferice care pot fi clasificate în sferoizi tumorali multicelulari, sfere tumorale, sfere
tumorale derivate din țesuturi și sferoizi multicelulari organotipici.

7
În acest context, scopul acestei lucrări a fost reprezentat de evaluarea citotoxici tății
nanotuburilor de carbon cu pereți multipli (MWCNT) funcționalizate cu grupări carboxil
(MWCNT -COOH) și grupări amino (MWCNT -NH 2) la nivelul modelelor tridimensionale de
adenocarcinom mamar MDA -MB-231.
Prin urmare, obiectivele acestui studiu au fost reprezentate de:
• Evaluarea caracterului citotoxic al MWCNT funcționalizate prin analiza morfologică a
modelelor tridimensionale și a nivelului de lactat dehidrogenază și oxid nitric eliberate
în mediul de cultură;
• Evaluarea stresului oxidativ în prezența MW CNT funcționalizate prin determinarea
concentrației de glutation redus și malondialdehidă.

8
Partea teoretică
Capitolul I – Nanoarhitecturile de carbon

1.1 Principalele tipuri de nanoarhitecturi de carbon și proprietățile lor
Carbonul, sau C, cum este cunoscut în tabelul periodic al elementelor, are numărul
atomic 6 și se remarcă ca fiind elementul ce se prezintă sub mai multe forme a lotropice, cu două
extreme: cea mai moale formă purtând numele de grafit, și cea mai dură formă cunoscută sub
numele de diamant. Carbonul este un element esențial în Univers, pe Pământ și în viața
organismelor vii, se găsește în Soare, în cea mai mare parte a stelelor, în comete și meteoriți, în
atmosfera terestră, în sol, în apele oceanelor cât și în organismele vii sau în corpul uman în
proporție de 10. 7%, fiind situat pe locul al treilea , ca abundență, după hidrogen și oxigen.
Carbonul se găsește în trei stări naturale reprezentate de diamant, grafit (Figura 1) și carbon
amorf, care au o temperatu ră de topire extrem de ridicată și sunt insolubile în toți solvenții l a
temperaturi normale (www.tabelulperiodic.ro). Carbonul poate forma un număr mare de
compuși chimici în comparație cu alte elemente, din acest motiv este considerat și “ regele
elementelor”, principalele caracteristici ale acestuia fiind prezentate în Tabelul 1
(www.wikipedia.ro).
Figura 1. Grafitul (stânga) și diamantul (dreapta) ( www.wikipedia.ro ).

9
Tabelul 1 . Principalele caracteristici ale carbonului.
Informații generale

Nume, Simbol, Număr Carbon, C, 6
Serie chimică Nemetale
Grupă, Perioadă, Bloc 14, 2, p
Densitate 2267 kg/m³
Culoare Negru
Număr CAS 7440 -44-0

Cei mai stabili izotopi
Simbol Abundență
naturală Timp de
înjumătățire Radioactivitate Energie de
dezintegrare Produsul
dezintegrării
12C 98.9% stabil cu 6 neutroni
stabil cu 7 neutroni 13C 1.1%
14C sintetic 5730 ani β- 0,156 14N

Carbonul, fiind o specie chimică cu o durată de viață foarte scurtă, se stabilizează prin
intermediul unor structuri multi -atomice, cu diferite configurații moleculare, numite alotropi
sau forme alotropice. Formele alotropice ale carbonului sunt reprezentate de diamant, grafit,
fulerenă și nanotub de carbon (Figura 2) (www.wikipedia.ro).

Figura 2. Formele alotropice ale carbonului: a) diamant; b) grafit; c) fulerenă; d) nanotub de
carbon (www.wikipedia.ro).
Dintre formele alotropice ale carbonului, diamantul este utilizat în cea mai mare parte
în zilele noastre ca piatră prețioasă, având un unghi de refracție ridicat, fapt ce î i conferă o
strălucire intensă. De asemenea, poate fi utilizat în medicină, și anume în chirurgie unde o
aplicație tot mai largă este reprezentată de folosirea lamelor de bisturiu acoperite cu un strat de

10
carbon asemănător dia mantului. O particularitate a acestei forme alotropice a carbonului constă
în faptul că, spre deosebire de celelalte pietre prețioase și semiprețioase care reprezintă o
combinație între două sau mai multe elemente, diamantul este singurul compus dintr -un singur
element și anume carbonul. Din punct de vedere chimic, diamantul reprezintă una dintre
formele de existență ale carbonului pur, numele acestuia provenind din limba greacă și
traducându -se prin “indestructibil”. Diamantul cristalizează în sistemul cub ic și poate atinge
duritatea maximă de 10 pe scara Mohs (permite evaluarea durității relative a unor materiale, cu
precădere a nemetalelor), duritatea variind însă în funcție de gradul de puritate a cristalului
(www.wikipedia.ro). Diamantul este de 80 de o ri mai dur decât Corindonul care are gradul de
duritate 9 pe scara Mohs. Din cauza durității ridicate, cristalele de diamant pot fi șlefuite numai
cu pulbere de diamant și fulerenă. Diamantul poate fi zgâriat numai de către un alt diamant și
arde la temper aturi de 850°C, acizii neavând niciun efect asupra lui. Aproape 60% din
diamantele lumii sunt considerate imperfect cristalizate, acestea fiind folosite în scopuri
industriale (www.energiacristalelor.ro).
Grafitul sau plombagina (denumire de specialitate) se găsește sub formă amorfă, fiind
un mineral răspândit în natură și un element stabil datorită structurii simetrice de C 60 cu o
compoziție chimică de carbon pur cristalizând hexagonal. Formele cristaline ale grafitului
prezintă luciu metalic pe când agre gatele amorfe prezintă un luciu diminuat . Totodată, duritatea
sa este cuprinsă între 1 si 2 pe scara Mohs, având o urmă neagră cenușie; este opac și un bun
conducător de căldură și curent electric, neputând fi topit. Având o reactivitate foarte mică,
acest a, alături de diamant, nu reacționează cu niciun alt compus chimic. O caracteristică
deosebită a acestui mineral este anizotropia, ce reprezină o modificare de legături prin
schimbarea direcției (în grafitul cristalin există o structură de straturi bazale, aceste straturi
având legături covalente hexagonale între atomi, în schimb două straturi alăturate sunt legate
între ele prin legături labile). Prin arderea grafitului în oxigen se obține dioxid de carbon
(www.wikipedia.ro).
În ultimii ani, o atenție deos ebită a fost acordată fulerenelor care reprezintă o clasă de
compuși de atomi de carbon ce sunt reprezentate per ansamblu structural fie de forme sferice
de tip dom geodezic, cum ar fi C 60, C 540, fie de forme cilindrice de tip “cușcă” cum ar fi
nanotuburil e. Această clasă de substanțe este considerată o formă alotrop ică distinctă a
carbonului, din punct de vedere al legăturilor chimice dintre atomii de carbon constituenți fiind
înrudite structural cu grafitul. Fulerenele sunt specii reactive, având tendința de a acapara
electroni, ceea ce le face să se combine cu usurință cu parteneri potențiali donori de electroni,
metale electropozitive (alcaline, alcalino -pamântoase sau chiar lantanide), conservând intacte,

11
în urma acestor reacții, nu doar moleculele de f ulerene, ci, în unele cazuri, chiar microcristalele.
Cel mai cunoscut reprezentant al clasei fulerenelor este „Buckyball” (C 60), în a cărui moleculă
atomii sunt aranjați într -o structură icosaedrică (aproape sferică). „Buckyball” a fost descoperit
în anul 1985 de către Richard Smalley și Robert Curl, aceștia primind Premiul Nobel pentru
Chimie în anul 1996. Pe lângă fulerena C 60, există și alte fulerene, cum ar fi C 70, C76, C84, C240.
Fulerenele cu mai puțin de 300 de atomi de carbon sunt denumite frecvent „buckyballs” sau
„buckminsterfullerene” (dupa numele lui Buckminster Fuller), însă există și fulerene cu mai
mult de 300 de atomi de carbon, din această categorie făcând parte și nanotuburile de carbon
(CNT) (Talbot, 1999; Ulloa, 2013).
CNT au fost descope rite în anul 1991 și sunt structuri tubulare unice de diametru
nanometric cu un raport lungime/diametru mare. Nanotuburile pot consta în unul până la zeci
și sute de învelișuri concentrice de carbon, cu o separare a învelișur ilor adiacente de
aproximativ 0 .34 nm. Rețeaua de carbon a învelișurilor este strâns legată de aranjamentul în
fagure al atomilor de carbon din foile de grafit. Proprietățile mecanice și electrice ale
nanotuburilor sunt determinate de structura lor cvasi -unidimensională și de aranjament ul de tip
grafit al atomilor de carbon din învelișuri. Astfel, nanotuburile au o mare rezistență la tracțiune,
ceea ce le face preferabile materialelor compuse cu proprietăți mecanice îmbunătățite. În funcție
de parametrii lor structurali, nanotuburile pot fi metalice sau semiconductoare. Această
proprietate deschide modalități de aplicare a nanotuburilor ca elemente centrale ale
dispozitivelor electronice, inclusiv tranzistoare cu efect de câmp (FET), tranzistoare cu un
singur electrod și diode rectificati ve. Au fost luate în considerare și posibilitățile de utilizare a
nanotuburilor ca medii de stocare a hidrogenului de mare capacitate (Popov, 200 4).
După numărul de straturi din care sunt compuse, CNT pot fi clasificate în nanotuburi de
carbon cu un singur perete (SWCNT) formate dintr -un singur strat de grafenă și nanotuburi de
carbon cu mai mulți pereți (MWCNT) formate din două sau mai multe fâșii grafenice. În urma
studiului CNT, s -a descoperit că acestea dețin proprietăți mecanice, electrice și termice f oarte
bune. Astfel, CNT prezintă o rezistență mecanică foarte ridicată, o bună capacitate de a conduce
curentul electric și stabilitate mare la temperaturi ridicate. Proprietățile electrice, structurale și
termice ale unui CNT depind de lungimea, diametrul și chiralitatea acestuia (Thostenson și
colab., 2001; Qian și colab., 2002).
CNT au fost utilizate inițial ca aditivi pentru diferite materiale structurale în cazul
electronicii, opticii, materialelor plastice și a altor materiale pentru domeniul nanoteh nologiei.
De la începutul secolului XXI, au fost studiate pentru introducerea în farmacie și medicină ca
transportori ai medicamentelor. Datorită suprafeței lor mari, stabilității chimice excelente și

12
structurii poliaromatice electronice bogate, CNT sunt c apabile să adsoarbă sau să se conjuge cu
o mare varietate de molecule terapeutice (medicamente, proteine, ADN, enzime etc.). Acestea
s-au dovedit a fi un vehicul excelent pentru eliberarea de medicamente prin penetrarea directă
în celule și menținerea medi camentului intact fără metabolizare în timpul transportului în
organism. Multe studii au demonstrat că, atunci când sunt atașate de CNT, aceste molecule sunt
livrate mai eficient și mai în siguranță în celule comparativ cu metodele clasice. Această
descope rire a deschis un nou mod de preparare a medicamentelor care este complet diferit față
de tehnicile clasice folosite în trecut în industria farmaceutică și a modificat radical conceptele
anterioare ale farmacologiei (He și colab., 2013).

1.2 Aplicații ale nanoarhitecturilor de carbon
Nanodiamantele au atras o atenție remarcabilă datorită aplicațiilor bioimagistice și
terapeutice, a toxicității lor scăzute la nivelul multor linii celulare, a proprietăților convenabile
ale suprafeței lor și fluorescenței stabile, fără fotooxidare. Noi tehnici sunt aplicate pentru a
spori fluorescența, interesul crescând , de asemenea , în explorarea posibilităților de modificare
a suprafeței nanodiamantului și a funcționalităț ii acestuia în scopul atașării diverselor
biomol ecule de interes pentru interacțiunea cu țintele. Potențialul spectroscopiei Raman și
proprietățile fluorescente ale nanodiamantelor au fost explorate pentru urmărirea bioimagisticii
și a distribuției de medicamente (Perevedentseva și colab., 2016).
Intere sul pentru aplicațiile nanodiamantelor în biologie și medicină se află în creștere în
ultimii ani , iar acest lucru se datorează combinației unice de proprietăți pe care nanodiamantul
le oferă. Dimensiunile mici (~5 nm), costurile reduse, producția scalabil ă, toxicitatea
neglijabilă, inerția chimică a miezului diamantului și structura chimi că bogată a suprafeței
acestuia reprezintă parametrii distinctivi care fac nanodiamantul superior celorlalte
nanomateriale în domeniul biomedical. Cu toate acestea, nanodi amantul oferă mult mai mult:
poate fi folosit pentru a produce dispozitive bioportabile pentru chirurgia osoasă, suporturi de
inginerie tisulară, poate distruge microbii rezistenți la medicamente, ajută organismul în lupta
împotriva virusurilor și livrează materialul genetic în nucleul celular (Schrand și colab., 2009).
Se anticipează că proprietățile atractive ale nanodiamantelor vor fi exploatate pentru
dezvoltarea agenților terapeutici pentru sonde de diagnostic, dispozitive de transport, terapie
genică, tratamente antivirale și antibacteriene, suporturi de țesuturi și dispozitive medicale noi,
cum ar fi nanoroboții. În plus, aplicațiile biotehnologiei au arătat utilizarea potențială a
nanodiamantelor în scopuri bioanalitice, cum ar fi purificarea proteinelor sau biomarcarea
fluorescentă. Utilizarea nanod iamantelor ca agenți anti -cancer și în produsele de îngrijire arată

13
deja rezultate promițătoare pentru dezvoltarea ulterioară. Studii amănunțite vor concluziona cu
privire la viitoarele direcții și provocări implicate în maximizarea potențialului acestor p ietre
prețioase pe bază de carbon în domeniile ingineriei, medicinei și biotehnologiei (Schrand și
colab., 2009).
Grafitul prezintă o mare aplicabilitate în cadrul fabricării minelor de creioane, pentru
confecționarea creuzetelor pentru metalurgie, la fabr icarea electrozilor (fiind rezistenți față de
acțiunea substanțelor chimice), apoi la acoperirea tiparelor în galvanoplastie (datorită
conductibilității lui electrice), la fabricarea periilor colectoare de la motoarele electrice, a
granulelor din microfoan ele telefonice, ca lubrefiant pentru mașini (deoarece în stare coloidală,
adăugat la uleiuri, ameliorează acțiunea lor de ungere) și nu numai. În stare pură este folosit în
reactoare nucleare. S -a reușit obținerea grafitului pe cale sintetică prin coxifica rea (încălzirea
sub un curent de aer la 3000°C) a materialelor bogate în carbon, cum sunt cărbunele brun,
antracitul, petrolul sau unele materiale sintetice, producându -se astfel o transformare a
materialului amorf bogat în carbon în grafit policristalin ( www.wikipedia.ro).
Pentru a face posibil ă utilizarea grafitului în tehnologii industriale , este nevoie de
molecule de grafit cu o grosime de un atom dispuse într -o rețea hexagonală. Cercetătorii de la
Universitatea Manchester, Andre Geim și Konstantin Serg eevich Novosolo au primit Premiul
Nobel în Fizică în 2010 pentru această realizare. Astfel se realizează grafenul care este cel mai
bun conducător de electricitate și căldură cunoscut. Acesta este un material ce poate fi folosit
în nanotehnologie fiind chi ar mai puternic decât diamantul și un conductor electric mai bun
decât cuprul și chiar mai flexibil decât cauciucul (www.celeomiedeutilizarialegrafenului.ro).
Grafenul are o aplicabilitate destul de vastă în zilele noastre, care poate fi exempl ificată
și prin construirea celui mai subțire bec din lume. Cercetătorii din cadrul Universității Naționale
din Seul și a Institutului de Cercetare a Standardelor și Științei din Coreea alături de profesorul
James Hone au realizat că este nevoie de alungirea unui înve liș de grafen cu o grosime de un
atom între doi electrozi metalici care să permită fluxul de curent să treacă prin el. În acest mod,
grafenul devine din ce în ce mai fierbinte și emite lumină. De asemenea, grafenul poate acționa
ca un superconductor, super conductivitatea fiind un fenomen fizic care are loc doar la o
temperatură extrem de mică ( -250°C). Odată atinsă această temperatură critică, rezistența
electrică a materialului dispare complet. În practică, înseamnă că electricitatea creată într -un
inel su perconductor poate fi continuă atât timp cât conductorul este ținut la temperatura
menționată. Deși grafenul nu are proprietăți superconductoare, cuplat cu materialul PCCO
(praseodymium cerium copper oxide) , grafenul poate acționa ca un superconductor. Un
experiment realizat de Georgia Tech arată posibilitatea grafenului de a avea rezistența unui

14
diamant prin plasarea a două învelișuri de grafen unul peste celălalt (Figura 3)
(www.amazinggrapheneapplications.com).

Figura 3. Imagine reprezentativă d emonstrând duritatea grafenului, plasând două învelișuri
unul deasupra celuilalt (www.amazinggrapheneapplications.com).
Imediat ce existența fulerenelor a fost dovedită și sinteza lor în laborator a devenit
posibilă, a fost pusă problema lor utilizări practice, în formă pură sau în compuși. Aplicații
practice spectaculoase ale fulerenelor pure ar putea avea drept punct de plecare unele dintre
proprietățile lor neobișnuite, cum ar fi structura poroasă asociată unor dimensiuni de ordinul
nanomet rilor, conducând astfel la conceptul de CNT ce deschid posibilități imense de aplicare
a acestora în industrie, cum ar fi ranforsarea polimerilor. Faptul că fulerenele pure își modifică
culoarea sub acțiunea iradierii, acestea și -au găsit deja aplicații în fotolitografie, la obținerea
unor lacuri fotosensibile. Proprietatea lor de a sublima este valorificată în procese de creștere
de cristale ca și în depunerea, din vapori de C 60, a unor filme subțiri, cu proprietățile
diamantului, mult mai netede decât cel e obținute prin solidificarea grafitului de vaporizare
(www.fulereneleoprovocarepentruviitor.ro).
Un studiu recent al oamenilor de știință francezi a furnizat rezultate impresionante „anti –
îmbătrânire” în cazul cobailor, rezultate survenite în urma unei diete pe bază de fulerenă C 60.
Studiul cercetătorilor francezi, concentrat asupra toxicității cronice rezultate în urma ingerării
de fulerenă dizolvată în ulei de măsline, a condus la ideea că șoarecii cu vârsta de zece luni care
au ingerat o zecime d e gram de fulerenă C 60 de câteva ori pe săptămână, au prezentat simptome
de longevitate în locul efectelor toxice. Toți șoarecii tratați cu C 60 au supraviețuit cel puțin 59
de luni, cel mai longeviv decedând la vârsta de 66 de luni. Grupul de control s -a încadrat într –

15
o arie a duratei de viață având limitele cuprinse între 17 luni și 37 de luni, în timp ce un grup
adițional, hrănit numai cu uleiul de măsline, dar fără fulerenă, a trăit între 36 și 57 de luni. Deși
acestea din urmă au arătat rezultate promiț ătoare, mamiferele supuse experimentului au fost
supuse într-o stare de semi -înfometare, având o dietă sărăcăcioasă, alimentul principal fiind
reprezentat de uleiul de măsline (www.stiintatehnica.com).
Nanomaterialele carbonice cunoscute sub numele de met alofulerene au atras o atenție
considerabilă datorită proprietăților lor atractive. Caracterul robust al cuștii fulerene "Horse
Trojan" reprezintă o componentă structurală importantă care izolează grupul de metale din
mediul biologic. Nanoparticulele sunt echipate cu proprietăți excepționale care le fac potrivite
pentru aplicații diverse și noi. Fulerenele reprezintă una din tre principalele categorii de
nanomateriale cu aplicații valoroase în domeniul biomedicinei. Acestea dispun de o capacitate
excepțional ă antioxidantă, fapt ce le -a făcut un ingredient promițător în multe produse
dermatologice și de îngrijire a pielii. Cu toate acestea, alte studii au dovedit că fulerenele au
potențialul de a determina o serie de evenimente care duc la moartea sau disfuncț ia celulară
(Mousavi și colab., 2017).
Familia fulerenelor, în special C60, deține proprietăți fotochimice, electrochimice și
fizice interesante care pot fi exploatate în multe domenii biologice diferite. Fulerenele sunt
capabile să se instaleze în interio rul cavității hidrofobe a proteazelor HIV, inhibând accesul
substraturilor la situsul catalitic al enzimei. De asemenea, dacă sunt expuse la lumină, fulerenele
pot produce oxigen singlet în randamente cuantice ridicate (Mousavi și colab., 2017).
De asemene a, CNT au atras atenția cercetătorilor din întreaga lume în ultimii ani datorită
dimensiunilor lor mici, proprietăților fizice, mecanice și electrice și arhitecturii unice, dar și
pentru deținerea unui potențial enorm în nanomedicină ca substraturi biocomp atibile și de
susținere, ca un instrument nou pentru eliberarea moleculelor terapeutice, inclusiv peptide,
ADN, ARN, precum și ca senzori (Beg și colab., 2011).
Împreună cu îmbunătățirea tehnicilor de producție și caracterizare a nanotuburilor, se
înregistrează progrese în aplicarea lor în diverse domenii . Cel mai înalt modul estimat al lui
Young alături de rezistența la tracțiune a nanotuburilor au condus la speculații pentru utilizarea
lor în materiale compozite cu proprietăți me canice îmbunătățite. Nanotuburile sunt potrivite ca
emițătoare de câmpuri electronice datorită nanodimensiunii lor, perfecțiunii structurale,
conductivității electrice înalte și stabilității chimice cu aplicații în afișajele cu ecran plat.
MWCNT au fost ut ilizate în electrocataliză, o reacție de reducere a oxigenului, care este
importantă pentru celulele de combustie. Adsorbția extraordinar de ridicată și reversibilă a
hidrogenului în materialele SWCNT a atras multă atenție din cauza posibilității de a folo si

16
nanotuburile ca medii de stocare de mare capacitate a hidrogenului. A fost propusă utilizarea
nanotuburilor ca elemente centrale ale dispozitivelor electronice, incluzând tranzistoare cu efect
de câmp, tranzistoare cu un singur electrod și diode rectifi catoare și pentru circuite logice
(Popov, 200 4).
În secolul XXI, conceptul de utilizare al unui medicament sigur și eficient cu un
potențial terapeutic ridicat este de o importanță deosebită. Recent, CNT au atras multă atenție
datorită capacității lor de a transporta molecule de medicament la un anumit situs într -o manieră
controlată. Acestea sunt utilizate în eliberarea controlată a medicamentelor, precum și în
livrarea materialului genetic, cum ar fi ADN și genele, anticorpii, medicamentele sau
biomolecul ele putând fi atașate direct pe pereții CNT. S -a presupus că nanotuburile dezvoltă
interacții van der Waals, precum și int eracții hidrofobe , unde interacția van der Waals este în
mod constant mai importantă pentru introducerea moleculelor de medicament. CN T
funcționalizate pot fi utilizate în scopul creșterii biocompatibilității în organism, sporirea
tendinței și solubilității încapsulării și livrarea multimodală a medicamentelor, precum și în
imagistică. CNT au fost , de asemenea , utilizate pentru administr area oculară a agenților
terapeutici. S -a constatat că acestea ajută la direcționarea locală a moleculelor de medicament
către situsul retinei. De asemenea, CNT au abilitatea de a traversa bariera retiniană sanguină,
care este o membrană dură semi -permeabi lă ce restricționează intrarea medicamentelo r, cum ar
fi antibiotice, antic olinergice și midriatice (Beg și colab., 2011).
O altă aplicație a CNT este regăsită în tratarea cancerului. Celulele maligne sunt foarte
greu de tratat sau foarte greu de înlăturat din organism fără a se răspândi între celulele normale.
În mai mult de 99% din cazuri, chimioterapia distruge celulele normale împreună cu cele
canceroase, cu efecte secundare grave. Astfel, nanotuburile ajută foarte mult la tratarea
cancerului. Agenții chimioterapeutici livrați cu CNT ajută la obținerea unei absorbții mai bune
de către celulele maligne, fără a afecta țesuturile colaterale. În consecință, nanotuburile pot
micșora doza de medicament prin localizarea distribuției sale doar la locul tumorii (Beg și
colab., 2011).
Totodată, studii recente au arătat că nanoimagistica mai multor părți ale corpului se
poate face prin administrarea de nanotuburi care încapsulează sistemele video miniaturizate sub
forma unei pilule. Acest sistem poate fi ușor înghițit, ceea ce ajută la imagistica zonei afectate
într-un segment nanometric al unui țesut particular sau al unui organ, în cazul în care tehnicile
precum endoscopia și colonoscopia nu reușesc datorită imaginii lor de dimensiuni mari (He și
colab., 2013).
CNT au fost, de asemenea, utilizate pentr u administrarea de vaccinuri, în cazul în care

17
acestea ajută la îmbunătățirea proprietăților vaccinului datorită acțiunii lor asemănătoare
adjuvantului în creșterea expunerii organismului la antigen și la rezolvarea principalelor
probleme majore asociate c u administrarea vaccinului care includ absorbția necorespunzătoare,
șansele de hipersensibilitate indusă de antigen, reacțiile anafilactice și hipersensibilitatea
datorată adjuvanților de vaccin. S -au încercat mai multe abordări noi pentru îmbunătățirea
administrării vaccinului, incluzând lipozomi, microsfere, nanoparticule și sisteme de
administrare osoasă. Astfel, CNT, atunci când sunt conjugate cu peptide antigenice, pot acționa
ca un nou sistem de livrare sigură și eficientă a vaccinurilor sintetice (He și colab., 2013).
Pentru mărirea gradului de biocompatibilitate și scăderea toxicității, CNT sunt
funcționalizate, proces ce presupune adăugarea de grupări hidrofile pe suprafața acestora.
Solubilitatea CNT funcționalizate face astfel posibilă caracteriz area și studiul proprietăților
acestora. Nanotuburile funcționalizate reprezintă o zonă de cercetare în continuă creștere pentru
țintirea celulelor maligne, în virtutea unei absorbții mai bune de către o populație specifică de
celule maligne, fără a afecta alte țesuturi sănătoase colaterale, ceea ce este un principiu de bază
pentru chimioterapie și livrarea țintită (Beg și colab., 2011). Funcționalizarea CNT a deschis
noi perspective în studiul proprietăților lor biologice. Atașarea unei părți organice la n anotuburi
a făcut posibilă utilizarea lor în diagnosticul pentru imagistică, precum și în scopuri de
administrare țintită a medicamentelor , în special în tratamentul cancerului și al bolilor
infecțioase. Furnizarea medicamentelor cu ajutorul nanotuburilor reprezintă o promisiune
pentru eficacitatea crescută a tratamentului, combinată cu efecte secundare minime pentru
terapia cancerului, utilizând doze scăzute de medicament. În plus, CNT reprezintă cel mai
promițător nanopurtător non -viral în terapia genică umană și administrarea de proteine, peptide,
vaccinuri și acizi nucleici. Chiar dacă CNT joacă un rol important și promițător în domeniul
nanomedicinei, este nevoie de mai multe cercetări pentru a garanta siguranța în livrarea de
medicamente. Studiile de t oxicitate sunt esențiale pentru stabilirea întregului potențial in vivo
al CNT pentru livrarea de medicamente înainte de aplicarea și marketingul lor real, astfel încât
procese fiziologice, fizico -chimice și moleculare trebuie luate în considerare pentru î nțelegerea
toxicității clinice și preclinice a CNT (Sun și colab., 2002).

1.3 Utilizarea nanoarhitecturilor de carbon în terapia țintită
Nanotuburile sunt descrise ca fiind buni purtători pentru livrarea țintită a
medicamentelor în diferite părți ale corpului, ceea ce ar putea ajut a la tratarea mai multor boli.
Astfel , cercetători de la Universitatea Stanford a u dezvăluit noile avantaje ale aplicării CNT
care au importante proprietăți ce pot fi folosite în terapia cancerului. Rezultatele au arătat că

18
nanotuburi le expuse la o sursă de lumină î n infraroșu tind să se încălzească de la 70°C până la
160°C într -un interval de câteva secunde și când sunt pl asate într -un situs al tumorii distrug
ușor celulele maligne ale unei populații specifice. MWCNT special pregătite prin procesul
CoMoCAT, proces care utilizează un reactor fluidizat similar cu cel utilizat la rafinarea
petrolului, prezintă un interes considerabil pentru utilizarea lor în chimioterapie datorită
proprietăților lor rapide de absorbție în infraro șu. Mai exact, nanotuburile CoMoCAT cu o
dimensiune uniformă și un vârf de absorbție îngust la 980 nm sunt candidații ideali pentru o
astfel de abordare. Într -un studiu pentru atingerea unei capacități mai bune de țintire, astfel de
nanotuburi au fost ataș ate la acid folic, care se leagă de receptorul său specific pentru folat, iar
o radiație cu lungimea de undă specifică cu un laser de 980 nm a determinat moartea programată
a celulelor maligne. Mai multe lucrări descriu acest proces de tratare a cancerului drept "terapie
fototermică pentru tratamentul cancerului". Levi -Polyachenko și grupul său au efectuat un
experiment pe MWCNT și au arătat că nanotuburile expuse la radiații IR pentru o perioadă mai
mică de 2 secunde au cauzat hipertermie (încălzirea mediu lui celular) până la 42°C. Acest
studiu a arătat că MWCNT expuse la IR cu lungimi de undă puternice (700 -1100 nm) cauzează
hipertermie (42°C) în celule peritoneale de până la 2 ore, ceea ce ajută în tratamentul
carcinomului colorectal. Medicamente cum ar f i mitomicina C sau oxaliplatina administrat e
celulelor de cancer colorectal conduc la o reducere eficientă a populației de celule maligne
datorită hipertermiei mediate de creșterea absorbției celulare a medicamentelor prin creșterea
permeabilității mem branei celulare. Torti și colaboratorii au raportat că MWCNT dopate cu
azot gazos induc ablația termică cauzând moartea celulelor canceroase la iradierea cu un
fascicul de radiație infraroș ie. Această tehnică este utilizată în tratamentu l celulelor tumorale
renale. S -a concluzionat că activitatea antitumorală a CNT ar putea fi determinată de trasferul
de căldură, ceea ce duce la citotoxicitatea celulară. Au fost raportate câteva variabile care fac
ca această tehnică să fie eficientă, incl usiv lungimea nanotubului. Cu cât CNT ar fi mai lungi,
cu atât mai eficientă ar fi terapia, deoarece ar fi necesar un timp mai redus de expunere cu o
doză minimă de radiații datorită suprafeței mai mari ( Torti și colab., 2007 ).
Similar cu constatările rela tate anterior, MWCNT acoperite cu ADN au prezentat o
acțiune antitumorală mai bună decât MWCNT care nu sunt acoperite de ADN. Astfel, s -a
studiat acțiunea antitumorală a nanotuburilor acoperite cu ADN pe 12 șoareci afectați de cancer
de prostată care au pr imit tratament cu MWCNT cu ADN, MWCNT care nu au fost acoperite
de ADN și MWCNT fără un fascicul laser separat. Rezultatele au arătat o rată mai bună de
vindecare a tumorii cu MWCNT învelite în ADN în urma iradierii cu un fascicul laser de putere
de 3 W pentru 70 de secunde timp de maximum șase zile. Mecanismul de bază sugerat ar putea

19
fi acela că producția crescută de căldură în jurul a două până la trei ori a pragului fiziologic
duce la moartea celulelor maligne. Această abordare are un avantaj față de simpla terapie prin
radiație/căldură pentru a trata tumorile umane din cauza acțiunii selective a nanotuburilor
acoperite de ADN (Guenzel, 2009 ).
Cercetătorii au lucrat, de asemenea , și cu SWCNT pentru eliberarea multor agenți anti –
cancer. Wang și colegii săi au observat că SWCNT funcționalizate sunt eficiente în reducerea
progresiei leucemiei mieloide umane. Această maladie are drept marker un mediator critic,
ciclina A2; un nivel m ai ridicat al acestuia se găsește în celulele tumorale și joacă un rol critic
în perturbarea replicării ADN, a transcripției și reglării ciclului celular. Supraexpresia ciclinei
A2 duce la dezvoltarea mai multor tipuri de cancer, inclusiv leucemi i. Prin ur mare, diminuarea
nivelului de ciclină A2 în organism este o măsură sugerată pentru a preveni progresia tu morală.
Aceasta oferă o nouă direcție de aplicare a nanotuburilor, pentru reducerea multi rezistenței la
medicamente în timpul chimioterapiei mai multor tipuri de cancer (Wang și colab., 2002 ).
În afară de utilizarea nanotuburilor în livrarea de medicamente și acizi nucleici către
celulele maligne, literatura descrie utilizarea lor în radioterapie pentru tratarea cancerului prin
creșterea vitezei de absor bție a oxigenului de către celulele maligne în comparație cu rata
normală de absorbție, ceea ce face radioterapia mai eficientă (Beg și colab., 2011).

20
Capitolul II – Modele celulare de zvoltate pentru studiul proceselor
tumorale

2.1 Principalele tipuri de modele celulare și caracteristicile acestora
Modelele tumorale in vitro reprezintă instrumente importante pentru cercetarea în
domeniul cancerului și servesc drept platforme de screening cu costuri reduse pentru terapiile
cu medicamente. Nevoia de înțeleger e îmbunătățită a progresiei și a tratamentului împotriva
cancerului a determinat creșterea preciziei și a relevanței fiziologice a modelelor tumorale in
vitro . Ca rezultat, modelele tumorale in vitro au crescut în complexita te, iar parametrii lor s -au
diversificat, de când aceste modele au progresat dincolo de stadiile simple de proliferare,
invazie și citotoxicitate și au simulat etapele critice în cascada metastatică, cum ar fi
intravazarea, extravazarea, angiogeneza, remod elarea matricii și latența celulelor tumorale.
Progresele în biologia celulelor tumorale, culturile celulare 3D, ingineria tisulară,
biomaterialele, microfabricarea și microfluidizarea au permis dezvoltarea rapidă a unor noi
modele tumorale in vitro care a desea încorporează mai multe tipuri de celule, matricea
extracelulară, precum și factori solubili spațiali și temporali. Alte inovații includ încorporarea
microvaselor perfuzabile pentru a simula vascularizația tumorală (Katt și colab., 2016).
Modelele experimentale in vitro permit identificarea cancerigenelor, dezvoltarea
terapiilor canceroase, screeningul medicamentelor și furnizarea unei perspective asupra
mecanismelor moleculare ale creșterii tumorii și metastazelor. În seria de etape ce cup rinde
procesul metastatic, celulele canceroase migrează prin micromedii diferite, inclusiv stroma,
endoteliul vaselor de sânge, sistemul vascular precum și alte țesuturi. Capacitatea de a parcurge
cu succes fiecare dintre acești pași depinde de interacțiun ile dintre celula canceroasă și
micromediul loca l. Deși m etastaza este responsabilă pentru mai mult de 90% din decesele
cauzate de cancer, multe detalii ale etapelor din cascada metastazică rămân slab înțelese (Wirtz
și colab., 2011).
În timp ce modelele in vivo surprind complexitatea procesului metastatic într -un sistem
viu, modelele in vitro au o relevanță fiziologică redusă, captând doar aspecte limitate ale
micromediului tumoral, dar permit controlul majorității variabilelor experimentale și analiza
cantitativă. Modelele in vitro ale tumorilor solide variază în complexitate de la liniile de celule
derivate din tumori până la modele tridimensionale (3D) ale micromediului tumoral. Modelele
3D au fost dezvoltate pentru a oferi o perspectivă mecanică asupra creșterii/proliferării tumorii,
migrației, invaziei, remodelării matricei, stării de latență, intravazării, extravazării,

21
angiogenezei și administrării medicamentelor. Modelele variabile includ surse celulare ( celule
ale pacienților, linii celulare disponi bile în comerț, celule stem, celule stromale, celule imune,
etc.), proprietăți biofizice (presiune parțială de oxigen, pH, etc.), matrice extracelulară
(rigiditate, arhitectură, etc.) și indici biochimici (chemoatractanți, factori angiogeni, etc.) (Katt
și colab., 2016).
O componentă cheie a oricărui model tumoral in vitro este sursa celulelor canceroase.
Liniile celulare canceroase sunt ușor de cultivat, permit compararea directă a rezultatelor
experimentale și sunt utilizate pe scară largă pentru a studi a mecanismele moleculare ale
biologiei celulelor tumorale. Grefele tumorale derivate de la pacient surprind eterogenitatea
celulelor dintr -o tumor ă și în unele cazuri, histomorfologia tumorii și profilul global al expresiei
genice; cu toate acestea, grefar ea într -o gazdă de șoarece sau matrice exercită o presiune de
selecție care schimbă compoziția clonală. În plus, eșantioanele derivate de la pacient oferă o
capacitate limitată de comparație a rezultatelor experimentale. Indiferent de sursa de celule,
mode lele experimentale sunt, prin definiție aproximări ale unei tumori, concepute să mimeze
aspecte specifice ale micromediului tumoral (Katt și colab., 2016).
Cultivarea celulelor de mamifere in vitro a dus la numeroase progrese conceptuale în
biologia celul ară și la înțelegerea formării și funcționării țesuturilor, organelor, precum și a
stărilor patologice, cum ar fi cancerul. Cele mai multe dintre aceste descoperiri au fost elucidate
folosind tehnic ile tradiționale de cultură 2D, însă biologia este în mod clar un sistem 3D
complex. Tehnicile de cultivare în sistem 2D a celule lor nu reproduc fidel toate semnalele
mecanice și biochimice prezente in vivo . Tehnicile 2D sunt caracterizate de interacțiuni le
celulă -celulă în timp ce tehnicile 3D favorizează formarea interacțiunilor cruciale celulă -celulă
și celulă -matrice extracelulară (ECM) care constituie baza funcției celulare normale. Modelele
3D au fost utilizate în cercetarea cancerului ca model inter mediar între culturile de linii celulare
de cancer in vitro și tumoarea in vivo . Modelele de cancer sferice reprezintă modele majore 3D
in vitro care au fost descrise în ultimele 3 decenii. Aceste modele au câștigat popularitate în
cercetarea celul elor ste m canceroase folosind tumorosfere. O clasificare rațională a celor patru
modele de cancer sferice cel mai frecvent utilizate în cercetarea cancerului, bazată pe metode
de cultură pentru obținerea lor este: modelul sferoidului tumoral multicelular, descris pentru
prima dată la începutul anilor 70 și obținut prin cultura liniilor de celule canceroase în condiții
neaderente; sfere tumorale , un model de expansiune a celulelor stem canceroase stabilite într –
un mediu fără ser suplimentat cu factori de creștere; s fere tumorale derivate din țesuturi și
sferoizi multicelulari organotipici, obținuți prin disocierea și tăierea mecanică a țesutului
tumoral (Achilli și colab., 2012).

22
Sferoizii tumorali multicelulari (MCTS) reprezintă un sistem celular 3D in vitro
considerat un model pentru faza de creștere a tumorii avasculare și a formării micronodulu lui
tumoral. Acest model combină proprietățile multor tumori solide, cum ar fi: cinetica creșterii,
eterogenitatea celulară, in ducerea semnalelor proliferative , inte racțiunile celulă -celulă,
dezvoltarea structurilor histologice specifice, nivelul secreției moleculelor de semnalizare și
expresia antigenelor. S -a demonstrat că acest model 3D reflectă cel mai bine efectul
microambientului celular asupra dezvoltării micro nodului tumoral in vitro (Yakymchuk și
colab., 2015).
MCTS sunt agregate de celule crescute în suspensie sau încorporate într -o matrice 3D
folosind metode de cultură 3D, reprezentând noduli sau micrometastaze tumorale avasculare.
Deși metoda de generare a modelelor 3D este mai scumpă și necesită mai mult timp în
comparație cu cultura de celule 2D, sferoizii sunt utilizați pe scară largă pentru screeningul
medicamentelor precum și pentru studiul creșterii și proliferării tumorii, interacțiunilor imune,
invaz iei, remodelării matricei și angiogenezei. Sferoizii dau informații despre interacțiunile
celulă -celulă și celulă -matrice extracelulară, precum și despre transportul gazelor și al
nutrienților . Sferoizii mai mari dezvoltă gradien te de oxigen și nutrienți c are duc adesea la
formarea unui centru necrotic similar cu tumorile slab vascularizate. Sferoizii prezintă, de
asemenea, un stra t exterior de celule proliferative urmat de celule aflate în stare de latență care
înconjoară centrul necrotic. Ca urmare a aces tor factori, proteinele și profilurile de expresie
genică ale celulelor tumorale din sferoizi sunt mult mai apropiate de profilurile de expresie
genică detectate clinic și cele întâlnite in vivo decât cele din cultura 2D (Friedrich și colab.,
2009).
Există mai multe metode generale de obținere a sferoizilor, fiecare având avantajele și
dezavantajele sale distincte: metode de cultivare a celulelor pe suprafețe neaderente, metoda
picăturilor în suspensie, metode microfluidice etc. Cultivarea celulelor p e suprafețe neaderente
împiedică atașarea la substrat și promovează formarea sferoizilor. Utilizarea suprafețelor
neaderente este simplă, dar nu permite controlul asupra mărimii și uniformității sferoizilor.
Tehnica picăturilor în suspensie este relativ si mplă și generează sferoizi cu o dimensiune
uniformă, dar are un randament relativ redus datorită necesității manipulărilor manuale ale
mediilor. Metoda picăturilor în suspensie care utilizează dispozitive microfluidice este mai
complexă , dar permit e un con trol mai bun al mărimii și compoziției sferoizilor. Dispozitivele
microfluidice devin din ce în ce mai frecvente, deoarece permit controlul precis al formării
sferoidului însă dezavantajul lor constă în dificultatea colectării celulelor de analizat (Mehta și
colab., 2012).

23
În privința ariilor de aplicabilitate, s feroizii au fost utilizați pentru studiul funcției
celulare într -un microambient tumoral avascular, dezvoltarea de noi terapii și screening -ul
medicament elor, studiul angiogenezei tumorale și studiu l interacțiilor celulare tumorale imune.
De asemenea, sferoizii tumorali au fost utilizați ca model in vitro pentru a imita complexitatea
tumorilor. Sferoizii formați din mai multe tipuri celulare au fost utilizați pentru a studia
interacțiile dintre celul ele tumoral e și cele stromale, celulele din acești sferoizi prezentând
formă, morfologie și profiluri de expresie genică apropiate de cele ale celulelor existente in
vivo. De exemplu, celulele canceroase de sân co -cultivate cu fibroblaste au arătat un fenotip
invaziv și au format un țesut mai asemănător cu țesutul cancerului de sân primar în ceea ce
privește exprimarea proteinelor în celulele canceroase și fibroblastele comparate (Lin și Chang,
2008).
Sferoizii multicelulari oferă multe avantaje față de cultura tradițională a celulelor în
sistem 2D și pot avea un impact important asupra a numeroase fațete ale cercetării biomedicale.
Modelul de MCTS a fost introdus de radiobiologi la începutul anilor 70 și a fost dezvoltat în
principal printr -o largă dive rsitate a liniilor de celule canceroase (Katt și colab., 2016).
Studii timpurii ale sferoizilor s -au concentrat pe simularea tumorilor solide și
caracterizarea cineticii de creștere, compoziție, organizare. Modelele experimentale 3D sunt
utilizate din ce î n ce mai mult în ingineria țesuturilor pentru a modula angiogeneza. În plus,
sistemul imunitar joacă un rol important în răspunsul antitumoral, care este determinat în
principal de celulele NK, celulele dendritice și macrofage. Astfel, r ăspunsul tumoral im un este
evaluat prin cultivarea MCTS cu celulele imune și prin observarea migrației și infiltrării
celulelor imune sau prin formarea de sferoizi din celulele tumorale și celulele imune și
observarea interacțiilor și a efectelor citotoxice ale celulelor imu ne din sferoizii tumorali.
Celulele tumorale secretă adesea factori care induc un mediu imunosupresiv. De exemplu,
mediul bogat în acid lactic care înconjoară tumorile inhibă activitatea citotoxică a limfocitelor
T și reduce migrația monocitelor. Sferoizii tumorali sunt, de asemenea, utilizați pentru a
dezvolta strategii terapeutice pentru a stimula un răspuns imun prin promovarea infiltrării și
citotoxicității diferitelor celule imune (Weiswald și colab., 2015).
Există mai multe tipuri de modele de tumori in vitro care nu pot fi clasificate ca sferoizi.
Acestea includ secțiuni tumorale încorporate in vivo , modele de invazie 3D și modele
microfluidice avasculare. Aceste modele combină complexitatea microambientului tumoral,
menținând în același timp simplita tea relativă a unui model in vitro . Secțiunile tumorale
încorporate in vivo din biopsiile pacienților pot fi utilizate pentru a selecta regimuri
chimioterapeutice individualizate și studii fundamentale de creștere și invazie a tumorii.

24
Modelele de invazie 3D reduc unele dintre complexitățile implicate în probele de biopsie
încorporate, permițând vizualizarea clară a interacțiunilor celulare specifice și descrierea unei
game largi de evenimente în cascada metastatică. Modelele microfluidice avasculare sunt c ele
mai simple din această categorie, dar încă încorporează o gamă largă de tehnici pentru
descrierea migrării celulelor tumorale într -o varietate de geometrii (Katt și colab., 2016).
Secțiuni tumorale încorporate in vivo
Utilizarea biopsiilor tumorale sau a secțiunilor de tumori încorporate într -o matrice
extracelulară a fost utilizată pentru a mima mediul tumoral in vitro . Biopsiile sau secțiunile
tumorale încorporate mențin eterogenitatea subpopulațiilor celulelor tumora le, sprijinind
celulele țesutului și vascularizația tumorii. Deși vascularizația tumorală nu este perfuzabilă în
aceste modele, reprezintă un instrument valoros pentru caracterizare și studiu, deoarece elimină
multe dintre complexitățile in vivo , dar menți ne interacțiunile celulare. Această tehnică este
utilizată în mare măsură pentru caracterizarea morfologiei tumorale, creșterii ș i
chemosensibilității și are potențial ca tehnică de depistare a terapiilor specifice pacientului.
Această tehnică a fost compa rată cu rezultatele pacienților cu o mare varietate de tipuri de
tumori și se află în prezent în studiile clinice ca instrument în tratamentul cancerului (Xu și
colab., 2013).
Modele de invazie 3D
În timp ce sferoidul încorporat ș i modelele de secțiune tumorală încorporate pot fi
utilizate pentru a imagina creșterea globală, formarea proeminenței, detașarea și invazia celulelor
tumorale individuale, modelele de invazie 3D se concentrează în mod special asupra invaziei prin
însămânțarea individua lă sau a grupurilor de celule canceroase într -o ECM, reducând astfel unele
dintre complexitățile microambientului tumoral. Imagistica cu celule vii este utilizată pentru a
determina morfologia celulară și pentru a urmări traiectoriile celulelor individuale care permit
cuantificarea vitezei și persistenței celulelor prin ECM. Aceste modele pot fi utilizate pentru a
studia influența factorilor proangiogeni secretați de celulele tumorale, precum și a
chemoatractanților secretați de celulele endoteliale sau fib roblaste (Krause și colab., 2010).
Modele microfluidice avasculare
Dispozitivele microfluidice avasculare sunt utilizate în principal pentru a evalua
migrația celulelor canceroase. De asemenea, studiile efectuate pe canalele microfluidice au
contribuit la descoperirea genelor necesare pentru migrarea celulelor canceroase și la
identificarea proteinelor, cum ar fi EGFR, care acționează ca și chemoatractanți pentru celulele
canceroase. Modelele microfluidice au fost utilizate pentru a studia aderența celulelo r
canceroase la monostratul de celule endoteliale ca un precursor al extravazării (Fraley și colab.,

25
2010).
Modelele hibride, cum ar fi secțiunile tumorale încorporate in vivo , sunt utile pentru
investigarea creșterii tumorii, invaziei, remodelării matricei și screeningului medicamentelor
folosind biopsii ale pacienților. Modelele de invazie 3D, în care celulele individual e sunt
încorporate într -o ECM , sunt utilizate pentru a studia invazia, remodelarea matricei,
angiogeneza și latența. M odelele microfluidice avasculare sunt utilizate pentru a studia
microambientul tumoral, incluzând migrația și extravazarea. Modelele hibride, în special
secțiunile tumorale încorporate și modelele de invazie 3D, sunt potrivite pentru screeningul
medicament os specific pacientului și pentru a prezice rezultatele. Dezvoltarea sistemului de
cultură tumorală 3D reduce golul dintre metodele in vitro și mediul in vivo pentru screeningul
medicamentelor, deoarece modelele 3D in vitro continuă să se dezvolte pentru a fi indicatori
mai buni ai eficacității medicamentelor in vivo (Katt și colab., 2016) .

2.2 Principalele aplicații și metode de generare a modelelor celulare
Aplicații bazate pe transwell
Metodele transwell sunt utilizate pentru screeningul medicamentelor și pentru a studia
migrația, intravazarea, extravazarea și remodelarea matricei. În majoritatea cazurilor, testele pe
bază de transwell implică numărarea celule lor care sunt capabile să se transloce pe memb rana
poroasă în condiții experimentale. Multe linii celulare tumorale prezintă o creștere de până la
cinci ori a numărului de celule care se translocă pe membrană în comparație cu celulele non –
canceroase , în timp ce terapiile medicamentoase și genice reduc de obicei invazia cu 30 -80%
(Tang și colab., 2010; Lin și colab., 2015; Yang și colab., 2015). Aplicațiile testelor bazate pe
transwell includ studii privind influența chem oatractanților asupra migrației ș i invaziei , studii
despre influența altor tipuri de celule (de exemplu , macrofage și fibroblaste) asupra invaziei
celulelor canceroase , studii ale ratelor relative de invazie, migrație, intravazare și extravazare a
diferitelor tipuri de celule, izolarea celulelor invazive/non -invazive pentru anali za moleculară,
testarea influenței knockdown, transfecției și tratamentului cu anticorpi asupra invaziei și
migrației, evaluarea terapiilor medicamentoase în reducerea invaziei și studii de bază ale rolului
factorilor solubili asupra invaziei. Ca un exempl u de aplicare a testelor bazate pe transwell,
celulele canceroase renale de la pacienții cu metastaze osoase au arătat o creștere de 20 de ori
a migrației de calciu în comparație cu celulele de la pacienții care nu au avut metastază (Katt și
colab., 2016).
Analize de migrație
Testul de migrare implică cultivarea celulelor canceroase pe o membrană poroasă (de

26
obicei cu pori de 8 µm) și cuantificarea numărului de celule care pot migra pe întreaga
membrană spre un chimioatractant. În mod obișnuit, celulele sunt fixate după 24 -72 ore pentru
imagistică. Colorarea fie pentru evidențierea nucleului , fie cu cristal violet este frecvent utilizată
pentru numărarea celulelor migrate . Suprafața inferioară a membranei este descrisă și
cuantificată în mod tipic de celule per câmp imagistic. Deși aceasta este o analiză simplă, gradul
de migrație prin pori către s er oferă un randament ridicat model ui in vitro de intravazare
tumorală prin vasculatura permeabilă, porii din membrană reprezentând golurile din endoteliu
și serul reprezentând fluxul sanguin (Katt și colab., 2016) .
Analize de migrație transendotelială
Testele de migrație transendotelială implică plasarea unor monostraturi confluente de
celule endoteliale pe suportul poros. Acest mod el prezintă complexitatea joncțiunilor celulă –
celulă și celul e endoteliale -ECM . Testele transendoteliale oferă un model bun de extravazare,
deoarece celulele canceroase trebuie să treacă mai întâi prin endoteliu și apoi prin partea
inferioară a membranei . Acest test poate fi, de asemenea, inversat într -un model de intravazare
prin creșterea celulelor endoteliale pe partea inferioară a membranei transwell pentru confluența
și însămânțarea celulelor c anceroase din camera superioară (Katt și colab., 2016).

Platformele sistemelor de culturi celulare 3D utilizate în screeningul medicamentelor anticancer
Datorită avantajelor sistemelor de cultură 3D, au existat multe studii axate pe
dezvoltarea și optimizarea tehnologiilor de cultură de celule 3D. Până în prezent, au existat mai
multe tipuri de modele de cultură 3D, dintre care unele au fost utilizate pentru screeningul
antitumoral .
Tehnica liquid -overlay (LOC)
Este cea mai simpla metodă a culturii de celule 3D. Pentru a genera modele le, plăcile
sau flacoanele de cultură celulară sunt acoperite cu un strat subțire de substraturi inerte, cum ar
fi agar, agaroză, poliHEMA sau Matrigel. Prin prevenirea depunerii matrice i, LOC promovează
cu ușurință formarea agregate lor 3D sau sferoizi lor. Această tehnică are costuri reduse și este
foarte reproductibilă, fără a fi nevoie de echipamente sofisticate. Cu această metodă pot fi co-
cultivate diferite tipuri de celule. Cu toate acestea, este dificil de monitorizat numărul și
dimensiunea sferoizilor formați. Această tehnică are potențialul de a produce un sferoid pe
godeu și este potrivită pentru screeningul cu capacitate medie (Nguyen și colab ., 2016) .
Microtehnologie
În ultimii ani , microtehnologiile au atras atenția oamenilor de știință, în special în ceea
ce privește utilizarea microt ehnicilor pentr u a genera modele de celule 3D. Tehnica

27
fotolitografiei este un exempl u și este utilizată pentru a cr ea plăci de supraf ață micromodelată
cu suprafețe speciale, inclusiv zone de atașare și non -atașare . Celulele însămânțate sunt ghidate
să crească și să formeze structuri 3D în insulele de adeziune. Mărimea și forma sferoizilor se
bazează pe proiectarea locurilor de atașament. Plăcile Microwell sunt proiectate cu partea
inferioară care conține un număr mare de microcamere care variază ca formă, fanta și pori
multipli. Sub acțiunea forțe lor gravitaționale și hidrodinamice, celulele sunt localizate în puțuri
minuscule ș i apoi conc entrate pentru a forma structuri 3D cu dimensiuni și geometrie specifice
fiecărui tip de microwell. Microtehnologiile, inclusiv microwells și suprafețele micromodelate ,
sunt promițătoare pentru producerea în masă a sferoizilor controlați (Nguyen și colab., 2016) .
Bioreactor
Când a fost descoperit rolul important al culturil or 3D în testarea efectelor chimice ale
medicamentelor antitumorale , screeningul de la sca lă de laborator la scară industrială a devenit
un pas important. Bioreactorul a devenit o parte a procesului standard pentru ge nerarea de
sferoizi, deoarece a oferit un control și o reproductibilitate mai mare a producției. Într-un
procedeu tipic, sfero izii sunt formați în bioreactor prin fl uid continuu în mișcare. Condiția de
cultură dinamică este creată î n principal prin agitare (vas spinner) sau rotire (vas cu perete
rotativ NASA). Flaconul de spinner modern a fost dezvoltat pentru prima dată de W. F.
McLimans în 1957. Su spensia celulară era conținută î n sticle proiectate cu două brațe care
puteau fi deschise pentru schimbul de gaze; s -a folosit o bară de agitare pentru agitarea
lichidului. În 1990, vasele cu perete rotativ (RWV) au fost realizate pentru cultura celulară de
către NASA. RWV sunt construite dintr -un cilindru interior , o cameră de cilindri concentric i
rotativ i pentru celulele în creștere și o membrană pentru schimbul de gaze. Mediul de forfecare
scăzut al RWV creează sferoizi de dimensiuni mai mari decât flacoanele de spinner. Sferoizii
HepG2 formați în RWV ating diametrul de 100 µm după 72 de ore de cultură și până la 1 mm
în diametru după cultura pe termen lung. Bioreactorul se caracterizează pr in capacit atea de a
produce un număr mare de sferoizi. Cu toate acestea, sferoizii creați sunt de obicei eterogeni ca
mărime și populație de celule. Prin urmare, o selecție manuală ar fi necesară ulterior pentru a
selecta sferoizi de dimensiuni adecvate pentru a fi repuse pe vasele pentru testel e de screening
a medicamentelor . Deși generarea de sferoizi prin intermediul bioreactorului necesită
instrume nte costisitoare și de înaltă calitate a med iului, avantajele bioreactorului pentru cultura
pe termen lung sunt incontestabile (Nguyen și colab., 2016) .
Screeningul medicamentelor antitumorale reprezintă o componentă importantă în lupta
împotriva cancerului. Numeroase sisteme de culturi celulare 3D au fost dezvoltate ca platforme
adecvate pentru screeningul medicamentelor și servesc ca modele mai de încredere pentru

28
testarea in vitro , în compar ație cu cele 2D, având în vedere că MCTS au o asemănare structurală
mai mare cu tumorile in vivo. Sistemele de model 3D ar trebui să ofere rezultate mai precise
pentru predicția rezultatelor clinice. Astfel , toate sistemele 3D pot fi utilizate pentru cercetarea
cancerului, în sp ecial pentru testar ea noilor agenți antitumorali (Nguyen și colab., 2016).

Capitolul II I – Efectele biologice ale sistemelor pe bază de nanoarhitec turi
de carbon la nivel tumoral

3.1 Mecanisme de toxicitate induse la nivelul celulelor tumorale. Studii in vitro
Nanomaterialele au proprietăți unice în comparație cu cea mai mare parte a materialelor,
cum ar fi : un raport ridicat suprafață/volum, care determină, de asemenea, mecanisme u nice de
toxicitate. În general, cercetătorii au descoperit că toxicitatea provine de la dimensiunea și
suprafața, compoziția și forma nanomaterialului. Reducerea dimensiunii duce la o creștere
exponențială a suprafeței în raport cu volumul, ceea ce face ca suprafața nanomaterialului să fie
mai reactivă . Acumularea de nanomateriale poate provoca, de asemenea, o absorbție crescută
în țesuturi, ceea ce modifică funcția biologică critică a celulelor (Beg și colab., 2011).
S-a demonstrat că CNT afectează viabilitatea celulelor, fapt ce ar putea fi determinat de
puternica tendință a CNT de a se aglomera. Bot tini și colaboratorii au comparat toxicitatea
MWCNT pure și oxidate pe celulele T umane și au constatat că aceste MWCNT au fost mai
toxice provocând pierderi masive ale viabilității celulare prin moartea celul ară programată.
Rotoli și colaboratorii au descris o modificare a permeabilității celulelor epiteliale ale căilor
respiratorii umane după tratamentul cu MW CNT, în timp ce Poland și colaboratorii au dovedit
că MWCNT au dus la un co mportament patogen asemănător az bestului la introducerea acestora
în cavitatea abdominală a șoarecilor ( Bottini și colab., 2006; Rotoli și colab., 2008; Poland și
colab., 2008 ).
Utilizarea nano tehnologiei în obținerea produsel or de consum și în aplicațiile medicale
a ridicat problema efectului său potențial toxic asupra sănătății umane și a mediului . Aplicațiile
potențiale ale acestor nanomateriale variază de la dispozitive biomedicale până la n ano-
electronice și dispozitive nano -mecanice, utilizate în special pentru cercetarea bazată pe sisteme
de instrumente de diagnosticare și furnizare de medicamente (Wong și colab., 2005). SWCNT
și MWCNT au aplicații în multe domenii tehnologice și biomedica le, datorită proprietăți lor lor
unice, precum rezistență mecanică excelentă, conductivitate electrică ridicată, stabilitate
chimică ridicată și suprafață mare, deși acești factori sunt în același timp responsabili pentru

29
potențiala toxicitate. Analiza toxicității CNT a fost atent analizată datorită asemănării structurii
lor cu cea a azbestului. Efectele citotoxice ale MWCNT au fost raportate atât in vivo , cât și in
vitro , folosind o varietate de celule de origine umană și animală (Patlolla și c olab., 2010). Ursini
și colab oratorii au dovedit că MWCNT sunt toxice pentru celulele epiteliale pulmonare umane
(A549), iar odată cu creșterea concentrației de MWCNT, viabilitatea celulară scade (Ursini și
colab., 2012).
Speciile reactive de oxigen (ROS) reprezintă unul dintre factorii importanți nu numai în
procesul de apoptoză, ci și în deteriorarea ADN, a daunelor provocate de stresul oxidativ și
multe alte procese celulare. Inducerea de apoptoză a fost, de asemenea, raportat ă în urma
expunerii experim entale la CNT a diferitelor tipuri celulare, cum ar fi : linii celulare de
hepatocite umane, hepatocite de pește zebra adult , limfocite uman e, fibroblaste umane, celulele
BEAS -2B (celule pulmonare) și limfocitele T. Producția de ROS se realizează și prin activitatea
lanțului mitocondrial de transport de electroni sau datorită funcției mixte a oxidazelor (NADPH
oxidază și xantinoxidază) și acelor cuprinse în superfamilia citocromul ui P450 (Sharma și
colab., 2007). Astfel, producția de ROS a fost indus ă de MWCNT în celulele A549 prin
intermediul unei căi extramitocondriale alternative, și anume, a citocromul ui P450 . Un
mecanism similar a fost raportat pentru S WCNT administrate celulel or LE (Lupus
Erythematosus) .
Inducerea semnificativă a formării corpilor apoptotici și fragmentarea ADN a fost
observată într -o manieră dependentă de concentrație după expunerea MWCNT pentru 72 de
ore. Așadar, s-a observat că MWCN T la concentrații mari joacă un rol semnificativ în inducerea
citotoxicității, a stresului oxidativ și a apoptozei în linia A549 (Srivastava și colab., 2011).
Totodată, s -a demonstrat că expunerea liniei de celule de gliom de șobolan (ce lule C6) la
MWCNT (200 -400 mg/mL ) duce la o apoptoză dependentă de concentrație, blocarea ciclului
celular în faza G1 și citotoxicitate ulterioară.
De asemenea, Jia și colaboratorii au investigat citotoxicitatea in vitro a SWCNT și
MWCNT în macrofagele alveolare și au observat o toxicitate mai mare a SWCNT comparativ
cu MWCNT (Jia și colab., 2005).
Astfel, conform literaturii de specialitate, principalele mecanisme de citotoxicitate
induse de CNT sunt reprezentate de stresul oxidativ prin inducerea de ROS și apoptoză prin
formarea corpilor apoptotici și deteriorarea ADN.

30
3.2 Biodistribuția nanoarhitecturilor de carbon și efectele induse in vivo
Studiile in vivo și in vitro au confirmat că CNT pot provoca citotoxicit ate prin inducerea
stresului oxidativ. De asemenea, s -a confirmat că CNT pot provoca toxicitate cardiovasculară
și pot crește s ensibilitatea la boli cardiovasc ulare, cum ar fi ischemia, precum și o creștere a
ritmului cardiac în repaus. O neurotoxicitate foar te scăzută a CNT a f ost observată de Chen și
colaboratorii , în timp ce Gholamine și colaboratorii au raportat că, în funcție de tipul de CNT,
acestea pot duce la neurotoxicitate împreună cu depresie sau anxietate. A mai fost confirmat
faptul că SWCNT pot p rovoca leziuni oxidative la nivelul rinichilor și creierului. Fujita și
colaboratorii au raportat că SWCNT au ca rezultat inflamația pulmonară persistentă, în timp ce
MWCNT pot provoca inflamația pulm onară tranzitorie (Chen și colab., 2013; Gholamine și
colab ., 2017; Fujita și colab., 2016 ).
Studii realizate in vivo au arătat că u nele doze de CNT (200, 100, 40, 20 și 5 mg/kg ) au
fost asociate cu moartea șoarecilor, în timp ce doze sub 1 mg/kg de CNT nu au determinat
moartea acestora. Greutat ea animalelor tratate nu s -a modificat semnificativ în decurs de 7 zile
după injec tare, comparativ cu grupurile contro l. Pentru a evalua toxicitatea CNT asupra
organelor majore, precum ficatul, rinichiul, inima, plămânii, splina și creierul, aceste organe au
fost studiate la nivel histopatologic. Nu s -au găsit anomalii histologice în țesuturile șoarecilor
tratați, cu excepția ficatului care a prezentat o contracție relativă în unele dintre celulele sale în
comparație cu grupul control. Șoarecii tratați au a vut un volum tumoral mai mic la sfârșitul
celei de -a doua săptămâni în c omparație cu grupul control (Figura 4) . Mai mult, n u a fost
observată nicio diferență semnificativă între grupurile SWCNT și MWCNT în ceea ce privește
volumul tumoral mediu (Kavosi și colab ., 2018).
Șoarecii tratați cu doze de 0.05 și 0.5 mg/kg MWCNT și 0. 25 și 1 mg/kg SWCNT nu
au arătat modificări semnificaive statistic ale greutății la 7 zile post -injectare, comparativ cu
grupul martor. Nivelurile serice mai mari de SGOT (aspartat aminotransferaza) și SGPT (alanin
aminotransferaza) la șoarecii trat ați confirmă faptul că CNT au un efect toxic la nivel hepatic .
Șoarecii tratați cu SWCNT au prezentat niveluri mai ridicate ale acestor doi parametr i în
comp arație cu grupul MWCNT, confir mând că toxicitatea SWCNT poate fi mai accentuată
decat cea a MWCNT. Pe baza acestor date, se poate deduce că MWCNT sunt mai potrivite
pentru aplicațiile medicale. Mai mult, unele dintre celulele hepatice de la șoarecii tratați au
prezentat o contracție re lativă la nivel microscopic, ceea ce indică iniț ierea apoptozei celulare.
Unele studii au raportat că CN T sunt toxice pentru plămâni, acest țesut fiind unul dintre cele
mai sensibile la citotoxicitatea indusă de CNT . În cadrul unui alt studiu, au fost investigate
efectele doxorubicinei ( un puternic medicament antitumoral și unul dintre cei mai activi agenți

31
pentr u tratamentul cancerului de sân) și CNT asupra țesutului tumoral mamar. S -a observat că
șoarecii tratați cu CNT și doxorubicină au avut un volu m tumoral mai mic la sfârșitul studiului,
comparativ cu grupurile control. Volumul tumoral mediu a fost semnificativ mai mic în
grupurile tratate cu SWCNT și MWCNT comparativ cu grupul tratat cu doxorubicină. Totodată,
nu au fost observate diferențe semnif icative între grupurile SWCNT și MWCNT , în privința
acestui parametru . Cancerul de sân este o boală în care o serie de căi de semnalizare care
modulează: apoptoza, proliferarea, angiogeneza, repararea ADN și metastaza pot fi afectate de
nanomateriale. În a ceste căi, o mare varietate de gene incluzând cele pentru supresoare
tumorale, oncogene, pro – și anti -apoptotice și factori de transcripție pot fi modificate. În
cancerul de sân, s -a observat un dezechilibru al reprezentanților pro- și anti -apoptotic i ai
familiei Bcl 2 din cauza multor modificări genetice. De fapt, o scăder e a raportului de expresie
Bcl2/Bax indică î nclinația generală a celulelor să se orienteze spre apoptoz ă. Pe calea
mitocondrială a apoptozei, caspaza -3 determină apoptoza celulară prin clivarea unor proteine
celulare. S-a demonstrat că expunerea la CNT poate inhiba proliferar ea celulelor și induce
desta bilizarea membranei, poate reduce capacitatea d e ade rență a celulelor și provoca stres
oxidativ. La rândul său, stresul oxidativ determi nă activarea căii mitocondriale a apoptozei. În
urma studiului s -a observat că CNT, în special SWCNT, sunt toxice pentru organe în doze mari
și pot provoca moartea organismelor vii, toxicitatea lor scăzând prin reducerea concent rației.
Mai mult, CNT provoacă o contracție mai mare a tumorii la sân decât doxorubicina. Țesuturile
tumorale tratate cu 0. 5 mg/kg MWC NT au arătat scăderea expresiei Bcl2 și creșterea expresiei
Bax, dar nivelul caspaz ei-3 nu a prezentat o diferență semnificativă între grupuri. Un grup tratat
cu doxorubicină nu a arătat modifi cări semnificative în comparație cu grupul control.
Rezultatele studiului au concluzionat că , CNT, în special MWCNT, în doze mai mici, pot fi
utilizate ca sisteme de livrare a medicamentelor pentru terapia ț intită în cancerul de sân,
tratamentul fiind mai eficient și cu mai puține efecte secunda re decât cel cu doxorubicina
(Kavosi și colab., 2018).

32

Figura 4 . Efectele CNT asupra morfologiei tumorii în zilele 14, 21, 29 și 39 după injectarea
celulară la un m odel de animal cu cancer de sân, primele patru poze reprezentând situsul
tumoral , iar următoar ele patru tratarea acestuia cu CNT (Kavosi și colab., 2018).

3.3 Studii privind interacțiune a dintre nanoarhitecturile de carbon și modelele celulare
tridimensionale
Întrucât modelele celulare tridimensionale sunt intens studiate datorită ariilor largi de
aplicabilitate, în prezent sunt urmărite și modificările induse de CNT la nivelul acestora din
punct de vedere morfologic și funcțional. Efectul SWCNT asupra formării MCTS a fost
comparat cu rezultate obținute prin cultivarea celulelor tumorale cu diamante ultradispersate
(UDD). Rezultatele au demonstrat că SWCNT la concentrații cuprinse între 12. 5 și 50 µg/mL
nu au avut influență citotoxică asupra celulelor tumorale. Creșterea concentrației SWCNT de
la 100 până la 200 µg/mL a stimulat proliferarea celulelor tumorale, mai ales în fracțiile de
suspensie. Rezultatul acestei influențe a fost formarea mai multor MCTS în cultura celulară cu
SWCNT în comparație cu UDD și prob ele control. Astfel, SWCNT au redus aderența celulară
la substrat și au stimulat formarea volumului agregatelor de celule tumorale aproape de 7 -10-3
mm3. În același timp, UDD au redus aderența și capacitatea de coeziune a celulelor și au
stimulat generarea volumului de sfe roizi celulari nu mai mult de 4 x 10-3 mm3 (Yakymchuk și
colab., 2015) .

33
Efectul materialelor nanostructurate asupra formării sferoizi lor tumorali multicelulari
Pentru a analiza dependența mărimii și numărului de M CTS de concentrația și tipul
materialelor nanostructurate, au fost generați MCTS în prezența SWCNT. La conce ntrații
scăzute de SWCNT, 12. 5 și 25 µg/mL , s-a format cel mai mare număr de agregate tumorale
mici (volum de 10-4 mm3). Pe măsur ă ce concentrația de SWCNT a crescut , s-a observat
creșterea volumului de M CTS și scăderea numărului lor. Astfel , concentrațiile mici de SWCNT
au stimulat celulele să migreze în suspensie și să genereze M CTS cu un volum de la 0.1 la 0. 3
x 10-4 mm3. Concentrațiile crescânde de SWCNT de la 50 la 200 µg/mL au dus la scăderea
numărului de sferoizi celulari, dar și -au mărit volumul de la 7 la 25 x 10-2 mm3. Această tendință
a fost în special remarcată la conce ntrația de SWCNT la 200 µg/mL . Viabilitatea celulelor
tumorale în suspensie la 200 µg/mL de SWCNT a fost chiar mai mar e decât cea din control.
Drept urmare, volumul de M CTS a fost cel mai mare la 200 µg/mL de SWCNT. O corela ție
pozitivă între c oncentrația de SWCNT și volumul de M CTS a fost confirmată de analizele
statistice. Aceste date pot fi interpretate din do uă perspective. Prima ar fi incubarea celulelor
tumorale cu concentrații sigure de nanotuburi care duc la progresarea tumorii. Acest fapt se
întâmplă după stimularea detașării c elulare de substrat și formarea unui număr mare de sferoizi
tumorali mici (micrometastaze). Așa cu m a fost raportat în literatură, agregatul celular de 0. 1
mm în diametru este deja capabil să migreze în fluxul de sânge și sistemul limfoid și să formeze
o tumoră secundară. Așadar, materialele nanostructurate reprezintă perspective pentru crearea
de senzori biologici, purtători de medicamente și elemente de diagnostic . Efectul nanotuburilor
asupra dezvoltării procesului tumo ral poate apărea la nivelul interacțiunii dintre celul ă-celul ă,
cu matrice a extracelulară. Pe de altă parte , proprietățile chimice și fizice ale SWCNT au
demonstrat un efect citotoxic scăzut asupra structurilor intracelulare. Prin urmare, utilizarea
SWCNT ca bază pentru cr eșterea intensivă a celulelor în suspensie, culturi tridimensional e și
struc turi asemănătoare țesutului par foarte promițătoare. Pentru a compara efectele SWCNT și
UDD asupra formării agregatelor celulare, a fost calculată mediana volumului MCTS la
concentrații adecvate ale acestor nanostructuri . Formarea M CTS este foarte importantă,
deoarece sferoizii tumorali sunt un model bine cunoscut de stadiu avascular al creșterii tumorii
și formării micrometastazelor. Astfel, au fost comparate dimensiunile M CTS care au fost
formate în prezența SWCNT și UDD. S-a constatat că UDD au stimulat formarea M CTS la
concentrații de 12. 5 până la 50 µg/mL . SWCNT au creat condiții mai favorabile pentru creșterea
sferoizilor celulari la concentrații de 100 până la 200 µg/mL . Trebuie menționat că utilizarea
SWCNT în sistemele biologice întâlnește o serie de dificultăți. De exemplu, natura hidrofobă a
SWCNT , precum și a tuturor nanomaterialelor de carbon promovează agregarea rapidă a

34
SWCNT în soluții fiziologice. În același timp , funcționalizarea SWCNT asigură o mai bună
solubilitate și schimbă proprietățile electrochimice ale substanțelor (Yakymchuk și colab.,
2015).
Așadar , nano materialele de ca rbon, cum ar fi SWCNT , pot reprezenta o bază adecvată
pentru matricea extracelulară artificială. Citotoxicitatea scăzută le permit e să fie utile pentru
crearea culturii celulare tridimen sionale. Din păcate, SWCNT pot fi o potențială amenințare
pentru dezvoltarea tumorii, datorită capacității sale de a stimula migrația celulară și de a susține
viabilitatea celulară f ără substrat (Yakymchuk și colab., 2015).

35
Partea experimentală
Capitolul IV – Materiale și metode

4.1 Sinteza și caracterizarea nanotuburilor de carbon simple și funcționalizate
În cadrul acestui studiu au fost testate nanotuburi de carbon cu mai mulți pereți
(MWCNT) funcționalizate cu grupări carboxil (MWCNT -COOH) și amino (MWCNT -NH 2)
sintetizate și caracterizate în cadrul Universității Politehnica, București.
Funcționalizarea nanoarhitecturilor de carbon cu grupări ami no și carboxil
MWCNT au fost achiziționate de la firma Sigma Aldrich având în compoziția sa 90%
carbon și DxL 10 -15 nm x 0. 1-10 µm, fiind obținute prin procedeul de depunere prin cataliză
chimică (CDV).
Pentru a obține funcționalizarea CNT, 3.0 g de MWCNT au fost dispersate în 98% acid
sulfuric concentrat sub ultrasonicare la o temperatura de 50°C timp de 6 h pentru a produce
oxidarea CNT ( MWCNT -COOH – proba 1). După aceasta, probele au fost spălate cu apă
ultrapură în repetate rânduri și uscate la 50°C pentru 12 h. Pentru o mai bună dispers ie a acestora
s-a adăugat dodecil sulfat de sodiu în apă distilată. Proba a fost pipetată pe o plăcuță de cupru
și uscată la 50°C.
Pentru prepararea probei ( MWCNT -NH 2 – proba 2) s-au luat aproximativ 0. 1 mg
MWCNT -COOH și s -au dispersat în 50 mL clorhidat de tionil (SOCl 2), amestecul fiind lăsat la
sonicat timp de 30 de minute. Suspensi a astfel obținută a fost refluxată sub agitare magnetică
la temperatura camerei timp de 48 h și apoi filtrată.
Filtratul obținut a fost spălat cu tetrahidrof uran (THF) și uscat la temperatura camerei
timp de 20 de minute sub vid. MWCNT -SOCl 2 au fost imersate în dimetilamină (EDTA) la
temperatura camerei timp de 10 h. După care amestecul a fost spălat cu THF și filtrat. Filtratul
astfel obținut a fost uscat la 80 °C timp de 10 h, astfel obținându -se funcționalizarea MWCNT
cu gruparea amino. Pro ba a fost pipetată pe o plăcuță de cupru și uscată la 50 °C.
Metode de caracterizare
Tehnicile experimentale utilizate pentru caracterizarea probelor au fost pentru proba 1:
1. FT IR (spectroscopie infraroșu cu transformată Fourier) – prin această analiză s -a determinat
analiza structurală;
2. SEM ( microscopie de scanning electro nic) – prin această analiză s -a determinat morfologia,
topografia probelor;
3. Măsurători Raman;

36
4. Măsur ători de microscopie electronică de transmisie prin baleiere STEM.

Tehnicile experimentale utilizate pentru caracterizarea probelor au fost pentru proba 2:
1. FT IR (spectroscopie infraroșu cu transformată Fourier) – prin această analiză s -a determinat
analiza structurală;
2. SEM ( microscopie de scanning electro nic) – prin această analiză s -a det erminat morfologia,
topografia probelor.

FTIR (spectroscopie infraroșu cu transformată Fourier)
Spectroscopia FTIR este un instrument foarte util pentru detecția unor modificări ale
intensitățiilor benzilor corespunzătoare ionilor : OH-, COO-, C=O, C=C, O=O, CH 2, CH 3.
Pentru proba 1 spectrele au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrometru Perkin Elmer
Spectrum 100, iar intervalul măsurătorilor este înregistrat între 600 și 4500 cm-1. În figura 5A
avem spectrele specifice funcționalizării MWCNT cu gruparea carboxil. Aceste benz i
corespund cu cele din literatura de specialitate.
Figura 5. Spectrele FTIR pentru A. MWCNT -COOH și B. MWCNT -NH 2.
Pentru proba 2 , spectrele au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrometru Perkin Elmer
Spectrum 100, iar intervalul măsurătorilor a fost înregistrat între 600 și 4500 cm-1. În figura 5B
avem spectrele specifice funcționalizării MWCNT cu gruparea amino. Benzile corespu nd cu
cele din literatura de specialitate.

SEM (microscopie electronică scanning )
Probele au fost caracterizate prin microscop ie de scaning la un instrument Hitachi SU
8230 echipat cu un modul EDS. Tensiunea de accelerare a electronilor a fost de 10kV.
A. B.

37

Figura 6. Micrografii SEM pentru P1 – Proba de MWCNT -COOH.
În Figura 6 se observă morfologia CNT pentru proba martor MWCNT -COOH. Acestea
apar sub formă de tuburi încolăcite dispuse pe un suport metalic de cupru.

Figura 7. Micrografii SEM pentru P2 – Proba de MWCNT -NH 2.
În Figura 7 se observă morfologia CNT pentru proba martor MWCNT -NH 2. Acestea
apar sub formă de tuburi (fire) dispuse ca o rețea dantelată pe un suport metalic de cupru.

Măsurători Raman
Studiile Raman ale MWCNT -COOH au fost efectuate la temperatura camerei prin
Spectroscopie Micro -Raman utilizând un sistem Horiba LabRam HR800. Toate spectrele
Raman au fost generate prin expunerea specimenelor timp de 100s la un laser verde (532 nm)
avand putere de 1mW, și dispersând semnalul emis de probe în detectorul CCD folosind un
grating de 600 linii/mm.

38

Figura 8. Spectrul Raman al A. Probei MWCNT; B. Probei MWCNT -COOH.
Amprenta MWCNT în spectrele înregistrate pentru fiecare probă este evidențiată prin
apariția celor două benzi majore D și G, la aproximativ 1340 cm-1, respectiv 1560 cm-1. Raportul
intensităților peak -urilor corespunzătoare benzilor D și G (I D/IG) indică defectele punctuale
induse și gradul de dezordine structurală al CNT. Atașarea grupărilor COOH de structura
MWCNT este confirmată de creșterea valorii raportului I D/IG, care în cazul probei MWCNT –
COOH este 1.31 (Figura 8B), cel pentru MWCNT nefuncționaliza te fiind 1.22 (Figura 8A).

Măsurători de microscopie electr onică de transmisie prin balei aj STEM
O cantitate de 20 µL din soluția de probă d e interes a fost diluată în 1 mL de apă
deionizatã. Pe ntru o dispersie corespunzătoare a fost utilizat un omogeniz ator ultrasonic cu
sondă (Probe -Type Ultrasonic Homogenizer) cu ajutorul căruia soluției i -a fost transferată o
energie de 2000 Jouli. Acest tip de sonicator poate fi utilizat pentru aplicații de tip open beaker,
ca în cazul pregătirii probelor de CNT sau în condiții de procesare continuă în modul flow –
through. Sonda de sonicare permite focusarea directă a unei zone de sonicare intense în
interiorul soluției, ceea ce duce la o dispersie îmbunătățită cu un factor de 1000 comparativ cu
utilizarea unei băi de ultrasunete. Soluția astfel rezultată a fost depusă pe o gr ila TEM de Cu.
Proba P1 – MWCNT -COOH – În imaginile de electroni secundari achiziționate la
diferite magnificări: x80K, x110K (Figura 9) a fost obs ervată prezența MWCNT organizate atât
în mănunchiuri datorită forțelor atractive van der Waals, cât și individual. Diametrul
nanotuburilor prezente se încadrează în intervalul 8 – 12 nm.
A fost achiziționată imaginea de contrast Z (ZC) la magnificarea de x110K (Figura 10)
în aceeași loc ație la nivelul specimenului de unde a fost obținută imaginea SEM la aceeași
magnificare (Figura 11). Aceasta evidențiază omogenitatea probei din punct de vedere al
numărului atomic (Z).

A. B.

39
A. B.
Figura 9. Micrografii SEM obținute pentru proba P1 – MWCNT -COOH la diferite
magnificări: A.x80K; B. X110K.

Figura 10. Imagine de contrast Z (ZC) obținută pentru P1 – proba MWCNT -COOH
magnificarea x110K.

Figura 11. Comparație între imaginile SEM și ZC obținute la aceeași locație la nivelul
specimenului la magnificare de x110K. Zona marcată cu roșu indică zona de unde a fost
prelevată imaginea TEM.
Imaginea de transmisie a fost obținută în zona marcată cu roșu mai sus în imaginile de
ZC și SEM, în care se observă prezența unui nanotub cu 6 pereți (Figura 12).

40

Figura 12. Imaginea de transmisie obținută pentru nanotubul marcat cu roșu în imaginile
SEM și ZC la magnificare de contrast Z (ZC) obținută pentru P1 – proba MWCNT -COOH
magnificarea x3500K.
Măsurătorile efectuate cu ajutorul rezultatelor TEM au determinat o grosime de 10.49
nm a nanotubului, cu un spațiu interior de aproximativ 7 nm și o grosime a pereților de
aproximativ 0.28 nm (Figura 13).

Figura 13. (Stânga) Imagine în care sunt efectuate măsurători pentru a determina grosimea
nanotubului (10.49 nm) și grosimea pe reților (0. 28 nm) și (Dreapta) g rafic ce prezintă
dimensiunea pereților ce corespunde zonei marcate cu chenar în imaginea TEM.

Cu ajutorul analizei de spectroscopie în infrarosu a fos t pus în evidență succesul
funcționaliză rii MWCNT cu grupări –COOH și –NH 2. Morfologia acestora a fost pusă în
evidență cu ajutorul microscopiei electronic e scanning . Proba funcționalizată cu g rupări
carboxil a fost caracterizată prin analize Raman și prin măsur ători de microscopie electronică
de transmisie prin baleiere STEM.

41
4.2 Cultivarea liniei celulare de adenocarcinom mamar MDA -MB-231
Linia celulară MDA -MB-231 (ATCC HTB -26, Manassas, VA, SUA) este reprezentată
de celule epiteliale, de cancer de sân uman, care au fost recoltate de la nivelul unui
adenocarcinom mamar metastatic al unei femei caucaziene de 51 de ani. Linia celulară MDA –
MB-231 este una dintre cele mai utilizate l inii celulare pentru cancerul de sân în laboratoarele
de cercetare medicală, întrucât este reprezentativă pentru cancerul de sân triplu negativ.
Linia celulară MDA -MB-231 (Figura 14) a fost cultivată în mediu de cultură Dulbecco’s
Modified Eagle Medium (DM EM, nr.cat. 31600 -083, Gibco, Regatul Unit) suplimentat cu 3.5
g/L glucoză, 1.5 g/L NaHCO 3, 1% soluție de antibiotic -antimicotic (Penicilină -Streptomicină –
Amfotericină, nr. cat. A5955, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și 10% ser fetal bovin (nr.
cat. 102 70-106, origine America de Sud, Gibco, by Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA).
Celulele au fost cultivate în flaskuri de cultură de 75 cm2 până la 80 -90% confluență, la
37șC în mediu cu 5% CO 2. Mediul de cultură a fost schimbat o dată la două zile, iar c elulele au
fost tripsinizate folosind o soluție 0.25% tripsină/0.53 mM EDTA.

Figura 14. Câmp de celule MDA -MB-231 în cultură. Scală: 100 μm.

4.3 Obținerea modelelor tridimensionale din linia celulară MDA -MB-231
Pentru generarea modelelor tridimensionale (3D), monostratul celular a fost tripsinizat,
iar celulele au fost numărate folosind camera de numărare Burker -Turk (hemocitometru) care
este o lamă de sticlă mai groasă pe care este prezentă o fantă în care este plasat un volum mic
din suspensia celulară de evaluat. Fanta este divizată în nouă secțiuni, dintre care numai cele
patru secțiuni marginale sunt utilizate în numărarea celulelor. Fiecare pătrat al
hemocitometrului corespunde unui v olum total de 0. 1 mm3 permițând determinarea numărului
total de celule din 1 mL suspensie celulară (Figura 15).

42
Etapele numărării sunt:
1. Se spală lama și lamela hemocitometrului cu etanol 70%, existența unor piese perfect
curate fiind critică pentru determinare.
2. Se recoltează cel ulele prin tripsinizarea monostratului celular.
3. Se pipetează circa 10 µL suspensie celulară între lamă și lamelă astfel încât să umple
fanta hemocitometrului.
4. Se utilizează un microscop în contrast de fază cu un obiectiv de 10x și se focalizează pe
liniile grilei din fantă.
5. Se numără celulele din cele patru careuri din vârfuri (fiecare cu 16 păt rate), fiecare cu
un volum de 0. 1 mm3 și se face media.
6. Dacă numărul de celule per careu este mai mare de 100 se repetă operațiile cu o
suspensie celulară dil uată.
7. Numărul celulelor se multiplică cu 104 pentru a exprima valorile în celule/mL
suspensie .
Modelele 3D au fost generate prin tehnica liquid -overlay folosind plăci de cultură
NunclonTMSpheraTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) tapetate cu un polimer
hidrofil care împiedică adeziunea celulelor de substrat. Plăci Nunclon Sphera cu 96 de godeuri
(nr. cat. 12 -556-430, 174925) au fost folosite pentru generarea modelelor 3D individuale în 200
µL mediu de cultură la o densitate celulară de 5000 celule/model 3D, în timp ce modelele 3D
multiple au fost generate în plăci Nunclon Sphera cu 6 godeuri (nr. cat. 12 -556-435, 174932)
în 3 mL mediu de cultură la o densitate celulară de 5*105 celule/go deu.

Figura 15 . Grila hemocitometrului.

43
4.4 Expunerea modelelor tridimensionale de cancer de sân la nanotuburi de carbon
Modelele 3D obținute au fost tratate în a treia zi de cultură cu MWCNT, MWCNT –
COOH și MWCNT -NH 2, de concentrații 0.1, 0.5, 1 și 2 µg/mL timp de 24 și 48 h. Modele 3D
netratate au fost folosite drept control.

4.5 Analiza morfologică a modelelor tridimensionale de cancer de sân expuse la
nanotuburi de carbon
Analiza morfologică a modelelor 3D obținute în placa cu 96 de godeuri s-a realizat după
24 și 48 h de tratament, prin microscopie optică folosind un microscop Olympus IX73
(Olympus, Tokyo, Japonia) echipat cu o cameră Hamamatsu ORCA -03G (A3472 -06,
Hamamastu, Japonia). Imaginile au fost realizate folosind programul Cel lSens Dimension (ver.
1.11, Oly mpus, Tokyo, Japonia).

4.6 Determinarea nivelului de lactat dehidrogenază (LDH) eliberat în mediul de cultură
Activitatea LDH eliberată în med iul de cultură a fost evaluată folosind kit -ul
“Cytotoxicity Detection Kit (LDH)” (ver. 10, nr. cat. 14115700, Roche, Basel, Elveția) bazat
pe reacția dintre lactat și NAD+ cu generare de NADH care participă la formarea formazanului
detectat spectrofotomet ric. Nivelul LDH, considerat un marker al procesului necrotic, a fost
determinat după 24 și 48 h de tratament cu 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și
MWCNT -NH 2. Astfel, un volum de 50 µL mediu de cultură a fost transferat într -o placă cu 96
de godeuri și trat at cu 50 µL mix de reacție (realizat conform kit -ului). După 15 minute la
incubare, absorbanța probelor a fost măsurată la 490 nm folosind un cititor de plăci Flex Station
3 (Molecular Devices, San Jose, CA, SUA). Nivelul LDH din mediul de cultură a fost c alculat
față de cel din control (modele 3D netratate).

4.7 Determinarea producției de oxid nitric prin metoda colorimetrică Griess
Metoda colorimetrică Griess este o metodă cantitativă de determinare a concentrației de
oxid nitric din probă, pe baza deter minării densității optice a produșilor colorimetrici obținuți
(Griess, 1879). Astfel, într -o primă etapă, nitritul este tratat în mediu acid cu un agent de
diazotare S (sulfanilamidă), formându -se o sare de diazoniu instabilă. Această sare de diazoniu
instabilă, în prezență de naftil -etilen -diamină (NED), formează un compus colorat. Producția
de oxid nitric este apreciată indirect, prin cuantificarea nitritului din probă (dat fiind faptul că
oxidul nitric se transformă spontan atât în nitrit, cât și în nitr at, care, la rândul lui, se trans formă
în nitrit) (Griess, 1879).

44
Pentru a determina producția de oxid nitric din probe prin această metodă, celulele au
fost însămânțate la o densitate de 5 x 105 celule/godeu/3 mL mediu de cultură DMEM + 10%
ser fetal și t ratate cu cele trei tipuri de nanoparticule timp de 24 și 48 h după care mediul de
cultură a fost preluat pentru analiză.
Metoda colorimetrică Griess presupune realizarea unei curbe standard, realizată cu
ajutorul unei soluții de NaNO 2 (Tabelul 2 ). În acest scop, s -a realizat o diluție de 500x dintr -o
soluție stoc de NaNO 2 100 mM în DMEM +10% ser fetal.
Soluția standard NaNO 2 100 mM a fost diluată până la 200 µM în mediu de cultură +
10% ser fetal în două etape:
1. 20 µL NaNO 2 100 mM + 380 µL mediu de cult ură (diluție 20x)
2. 20 µL diluție 20x + 480 µL mediu de cultură (diluție 25x)
Tabelul 2 . Schema de realizare a curbei standard în cadrul metodei Griess .
Nr. Crt. Concentrația
(µM) Mediu de cultură +
10% ser fetal (µL) Soluție NaNO 2 200 µM
(µL)
1 100 80 80
2 50 80 80 din 1
3 25 80 80 din 2
4 12.5 80 80 din 3
5 6.25 80 80 din 4
6 3.125 80 80 din 5
7 1.562 80 80 din 6
8 0.781 80 80 din 7
9 0.390 80 80 din 8
10 0.195 80 80 din 9
11 0.097 80 80 din 10 ( -80)
12 0 80 0

Într-o placă cu 96 de godeuri s -au pipetat 80 µL probă (mediu de cultură al modelelor
3D tratate și netratate)/standard și 80 µL soluție amestec NED:S în raport 1:1. În final, s -a citit
absorbanța probelor și a punctelor standard la 540 nm la Flex Station 3 (Molecul ar Devices,
San Jose, CA, SUA).

45
4.8 Obținerea lizatului celular
Modelele 3D tratate și netratate au fost colectate în tuburi. Ulterior, s -a realizat o etapă
de centrifugare la 1500 rotații/minut timp de 5 minute la o temperatură de 20°C. Supernatantul
a fost aruncat iar sedimentul rezultat în urma centrifugării a fost spălat cu PBS (tampon fosfat
salin) și centrifugat. În urma centrifugării, sedimentul a fost resuspendat în PBS. Pentru
obținerea lizatului celular, modelele 3D au fost sonicate pe gheață cu un sonicator UP50H
(Hielscher Ultra sound Technology, Teltow, Germania) la 80% amplitudine, de 3 ori timp de 30
de secunde. Probele au fost centrifugate timp de 10 minute la 3000 de rotații pe minut , la 4°C,
iar supernatantul rezultat a fost utilizat pentru determinările biochimice ulterioar e.

4.9 Determinarea concentrației proteice prin metoda Bradford
Metoda Bradford este o tehnică spectrofotometrică simplă și rapidă de determinare a
conținutului de proteine totale celulare și se bazează pe legarea necovalentă a formei anionice
a colorantului Coomassie Brilliant Blue G -250 (Figura 16) la resturile de aminoacizi.
Coomassie Brilliant Blue G -250 reacționează în principal cu resturile de arginină și mai puțin
cu resturile de histidină, lizină, tirozină, triptofan și fenilalanină. În mo d evident metoda este
mai puțin exactă în cazul dozării unor proteine acide sau bazice. Metoda Bradford este foarte
sensibilă la BSA (albumină serică bovină) comparativ cu celelalte proteine. În absența
proteinelor, reactivul Bradford are o culoare roșu -pal iar după legarea sa la proteine se
generează o culoare albastră cu maxim de absorbție la 595 nm (Bradford, 1976).

Figura 16. Structura chimică a colorantului Comassie Brilliant Blue G -250.
Pentru a determina concentrația proteică prin metoda Bradford, s -a realizat o curbă de
etalonare conform tabelului 3 pornind de la o soluție stoc de 3 mg/mL BSA în PBS. Curba
standard s -a realizat conform tabelului 2. Astfel, într -o placă cu 96 de godeuri s-au pipetat 250
µL reactiv Bradford și 5 µL din lizatul celular diluat corespunzător/punctele curbei etalon.
Apoi, placa a fost incubată 15 minute la întuneric, la temperatura camerei. În final, a fost

46
determinată absorbanța probelor și a punctelor din cu rba etalon prin citire la Flex Station 3
(Molecular Devices, San Jose, CA, SUA) la 595 nm.
Tabelul 3 . Schema de realizare a curbei standard în cadrul metodei Bradford .
Nr. Crt. BSA (µL) Tampon (PBS) (µL) Concentrația BSA
(µg/µL)
1 0 120 0
2 10 110 0.25
3 20 100 0.5
4 30 90 0.75
5 40 80 1
6 60 60 1.5

4.10 Determinarea colorimetrică a concentrației de glutation redus (GSH)
Glutationul redus este o tripeptidă (y -glutamil -cisteinil -glicină) implicată în multe
procese biologice (detoxifiere, îndepărtarea hidroperoxizilor, menținerea stării de oxidare a
proteinelor cu grupări sulfhidril -SH), fiind și principalul antioxidant din celulele animale. În
mediul intracelular glutationul este prezent într -un procent de 90 -95% în formă redusă (GSH)
care prin oxidare devine glutation oxidat (GSSG), compus ce prezintă o punte disulfurică.
Această metodă are la bază o reacție colorimetrică care are loc între glutationul redus (GSH) și
acidul 5,5' -ditiobis -2-nitrobenzoic (DTNB) cu formarea acidului 5 -tio-2-nitrobenzoic (TNB)
care poate fi detectat spectrofotometric, intensitatea absorbanței fiind proporțională cu nivelul
GSH din probă.
2 GSH + DTNB –> GSSG + 2 TNB
Pentru determinarea concentrației de GSH din modelele 3D tratate și netratate, lizatul
celular a fost deproteinizat cu o soluție de acid sulfosalicilic (SSA) 5% (în raport 1:1) (20 µL
probă + 20 µL SSA 5%). Probele au fost cent rifugate timp de 10 minute la 10000 rotații pe
minut la 4°C, iar supernatantul rezultat în urma centrifugării a fost analizat în continuare. În
paralel, s -a realizat o curbă de etalonare conform tabelului 4 . În final, într -o placă cu 96 de
godeuri, s -au pi petat 150 µL mix de reacție corespunzător analizei și 10 µL
supernatant/punctele curbei etalon. După 20 de minute la temperatura camerei a fost
determinată densitatea optică la 405 nm prin citire la multireader.

47
Tabelul 4 . Schema de realizare a curbei eta lon pentru determinarea concentrației de GSH .
Nr. Crt. µL SSA 5% µL GSH Concentrația
GSH nmoli
1 0 50 200 2
2 25 25 din 1 100 1
3 25 25 din 2 50 0.5
4 25 25 din 3 25 0.25
5 25 25 din 4 12.5 0.125
6 25 25 din 5 6.25 0.0625
7 25 25 din 6 ( -25) 3.125 0.03125

4.11 Determinarea concen trației de malondialdehidă (MDA)
Malondialdehida (MDA) este principalul produs al peroxidării lipidice (degradarea
oxidativă a lipidelor). De asemenea, MDA poate fi considerată și un marker al stresului oxidativ
întrucât degradarea oxidativă a lipidelor poate avea loc și în momentul interacției dintre speciile
reactive de oxigen și acizii grași polinesaturați.
La pH scăzut și temperatură ridicată, MDA reacționează cu acidul 2 -tiobarbituric printr –
o reacț ie de cicloadiție nucleofilă generându -se astfel aducți MDA:TBA 1:2 care pot fi detectați
fluorimetric (Figura 17).

Figura 17. Schema reacției de cicloadiție nucleofilă dintre MDA și TBA.
Pentru determinarea concentrației de MDA, s -a realizat o curbă e talon (Tabelul 5 )
folosind o soluție stock de malondialdehidă 1mM care a fost diluată de 100x și ulterior de 10x
în HCl 0.1 N. În urma acestor diluții soluția de MDA a avut o concentrație finală de 1 µM.
Într-o placă cu 96 de godeuri s -au pipetat 50 µL pro bă diluată corespunzător/standard și
175 µL HCl 0.1 N. După 20 de minute de incubare la temperatura camerei, în fiecare godeu s –
au pipetat 225 µL TBA 0.025 M. În următoarea etapă, placa a fost incubată la 37 °C timp de 65
de minute. După acest timp, în prob e s-au pipetat 100 µL PBS, iar în curbă 100 µL BSA de

48
concentrație corespunzătoare probelor de analizat. În final, s -a determinat fluorescența (ex. 520
nm/em. 549 nm) la Flex Station 3 (Molecul ar Devices, San Jose, CA, SUA).

Tabelul 5 . Curba standard realizată în cadr ul dozării concentrației de MDA.
Nr. Crt. µL MDA µL HCL 0. 1 N µM
1 0 200 0
2 10 190 0.05
3 20 180 0.1
4 30 170 0.15
5 50 150 0.25
6 100 100 0.5

4.12 Analiza statistică
Toate datele experimentale au fost reprezentate ca medie a trei replicate. Semnificația
statistică a fost determinată folosind testul T, o valoare P < 0.05 fiind considerată semnificativă.
Toate valorile probelor au fost raportate la control.

49
Capitolul V – Rezultate și discuții

5.1 Efectul nanotuburilor de carbon asupra morfologiei modelelor tridimensionale

Figura 18 . Imagini de microscopie optică care ilustrează modele 3D MDA -MB-231 tratate
cu 0.1, 0.5, 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de (A) 24 h și
(B) 48 h . Controlul este reprezentat de modele 3D netratate. Scală: 200 µm. A.
B.

50
Din imaginile de microscopie optică se poate observa că tratamentul cu cele trei tipuri
de suspensii nu determină modificări morfologice semnificative la nivelul modelelor 3D, în
comparație cu controlul, după 24 h (Figura 18A) și 48 h (Figura 18 B) de expun ere. Totodată,
se poate observa o dispersie mai bună a MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 comparativ cu
MWCNT, fapt ce poate fi explicat prin procedeul de funcționalizare care mărește gradul de
hidrofilie al CNT și dispersia acestora în soluții apoase.

5.2 Citotoxi citatea nanotuburilor de carbon la nivelul modelelor tridimensionale
5.2.1 Nivelul producției de lactat dehidrogenază eliberată în mediul de cultură

Figura 19. Nivelul relativ al activității LDH eliberată în mediul de cultură în urma
expunerii modelelor 3D MDA -MB-231 la 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și
MWCNT -NH 2 timp de 24 h și 48 h. Rezultatele au fost calculate ca medie a trei replicate ±
SD și reprezentate față de control (modele 3D netratate). * p < 0.05, ** p < 0.01 vs.
control.
Nivelul LDH a fost determinat în urma expunerii modelelor 3D la concentrațiile de 1 și
2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de 24 și 48 h. LDH este o enzimă
citoplasmatică prezentă în toate tipurile celulare. În momentul în care membrana plasmatic ă a
celulelor suferă leziuni, LDH este eliberată în mediul extracelular. Analizând Figura 19, se
poate observa o creștere a nivelului activității LDH dependentă de timp în cazul probei
MWCNT -COOH de concentrație 1 µg/mL. Astfel, după 24 h de expunere, nive lul LDH a

51
crescut cu 11.1%, comparativ cu controlul, atunci când modelele 3D au fost tratate cu 1 µg/mL
MWCNT -COOH.
La intervalul de expunere de 48 h, nivelul LDH a crescut cu 21.3% și 42.1%, față de
control, în urma expunerii modelelor 3D MDA -MB-231 la 1 µg/mL și 2 µg/mL MWCNT –
COOH. La același interval de timp, a fost înregistrată o creștere a nivelului LDH și în prezența
ambelor concentrații de MWCNT. Astfel, creșterea nivelului activității LDH poate indica
lezarea membranei plasmatice a celu lelor MDA -MB-231 de la nivelul modelelor 3D, în
prezența MWCNT și MWCNT -COOH, indicând caracterul citotoxic al acestora.
Toxicitatea MWCNT -COOH la nivelul celulelor canceroase de sân MDA -MB-231 a
fost studiată și de Badea și colaboratorii și s -a observat că în urma tratamentului cu 0.5 – 4
µg/mL MWCNT -COOH timp de 24 și 48 h nu s -au înregistrat modificări semnificative ale
nivelului LDH (Badea și colab., 2018).
În literatura de specialitate, sunt studiate interferențele pe care nanoparticulele le pot da
cu testul LDH datorită adsorbției LDH pe suprafața acestora. Într -un studiu realizat de Wang și
colaboratorii în care s -au incubat concentrații cunoscute de LDH sau standarde LDH cu o
cantitate precisă (la diferite concentrații cuprinse între 5 p ână la 100 µg/mL) de SWCNT, s -a
demonstrat scăderea concentrației LDH odată cu creșterea concentrației de CNT (la o lungime
de undă de 490 nm) (Wang și colab., 2012).
De asemenea, într -un studiu realizat de Forest și colaboratorii s -a urmărit ci totoxicitatea
CNT, pierderea integrității membranei fiind evaluată prin cuantificarea LDH. Scopul acestui
studiu a fost de a evalua calitativ și cantitativ interferențele care apar între CNT și testul LDH
utilizat frecvent. Au fost efectuate experimente și fără culturi celulare și s -a demonstrat că au
apărut interferențe. Acestea s -au datorat pe de o parte absorbției intrinseci a CNT, dar și
adsorbției LDH la suprafața CNT (Forest și colab., 2015).

5.2.2 Evaluarea procesului inflamator prin producția de oxid nitric
NO este o moleculă de semnalizare cu viață scurtă, produsă de către enzime cunoscute
sub numele de oxid nitric sintaze (NOS). NO prezintă numeroase roluri la nivelul sistemelor
cardiovascular și nervos, în moartea celulară programată, dar și generarea reacțiilor inflamatorii
(Sharma și colab., 2007). În cadrul studiului de față, producția de NO a fost determinată pentru
a evalua răspunsul inflamator al modelelor 3D în prezența co ncentrațiilor de 1, 2 µg/mL
MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 după 24 și 48 h de incubare.
La intervalul de expunere de 24 h, s -a observat o scădere semnificativă a nivelului NO,
comparativ cu controlul, în cazul tuturor probelor testate la concentrația de 1 µg/mL , în timp ce

52
în prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT -NH 2 s-a înregistrat o creștere cu 17.8% față de
control (Figura 20). O creștere în prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT -NH 2 a fost
înregistrată și la 48 h (creștere cu 22% față de control), în timp ce în cazul celorlalte condiții
experimentale nu s -au obținut modificări semnificative comparativ cu controlul. Creșterea
producției de NO în prezența MWCNT -NH 2 atât la 24, cât și la 48 h, poate indica citotoxicitatea
acestui tip de CNT l a nivelul modelelor 3D MDA -MB-231 prin activarea procesului de
inflamație.

Figura 20. Nivelul relativ de NO eliberat în mediul de cultură în urma expuner ii
modelelor 3D MDA -MB-231 la 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2
timp de 24 h și 48 h. Rezultatele au fost calculate ca medie a trei replicate ± SD și
reprezentate față de control (modele 3D netratate). * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. control.
Într-un studiu pentru evaluarea NO, producția acestuia în supernatantul culturilor
celulare a fost evaluată la 24, 48 și 72 h de incubare cu nanoparticule de carbon prin măsurarea
concentrației de nitriți. S -a observat că eliberarea NO de către macrofagele murine stimulate de
lipopolizaharide (LPS) a fost aceeași cu concentrația înregist rată atunci când celulele, anterior
stimulate de controlul pozitiv LPS, au fost tratate cu fulerene și SWCNT pure. În schimb, atunci
când s -au adăugat concentrații diferite de particule de grafit (15, 30 și 60 µg/mL) la culturile
celulare anterior stimulat e cu LPS, s -a observat că producția de NO de către macrofage murine
a fost semnificativ mai mare decât cea indusă de LPS (Fiorito și colab., 2006).

53
5.3 Modificări induse de stresul oxidativ în prezența nanotuburilor de carbon
5.3.1 Evaluarea concentrație i de glutation redus
Concentrația de GSH a fost evaluată în urma tratamentului modelelor 3D cu 1, 2 µg/mL
MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de 24 și 48 h. La nivel celular, sunt produse
molecule reactive derivate de la oxigen care prezintă viață scurtă ș i sunt cunoscute sub numele
de ROS. ROS participă la procese esențiale precum creșterea și îmbătrânirea celulară sau
moartea celulară programată. În același timp, în anumite condiții, pot fi produse ROS care pot
fi dăunătoare la nivel celular prin țintirea proteinelor, lipidelor și a moleculei de ADN. În acest
scop, celula și -a dezvoltat sisteme de apărare antioxidantă care au rolul de a îndepărta ROS și
de a preveni modificări la nivelul molecu lelor esențiale (Halliwell, 2005 ; Finkel, 2003). Pe
lângă sistemele enzimatice, unul dintre cei mai importanți antioxidanți celulari este GSH, o
tripeptidă alcătuită din acid glutamic, cisteină și glicină. În momentul în care echilibrul dintre
producerea ROS și apărarea antioxidantă este pierdut, iar ROS produse nu mai pot fi
contracarate de către antioxidanți, se instalează stresul oxidativ, caracterizat prin modificări
oxidative la nivelul lipidelor, proteinelor, amino acizilor și ADN (Halliwell, 2005 ).

Figura 21. Nivelul relativ de glutation redus intracelul ar în urma expuner ii modelelor 3D
MDA -MB-231 la 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de 24 h
și 48 h. Rezultatele au fost calculate ca medie a trei replicate ± SD și reprezentate față de
control (modele 3D netratate). * p < 0.05 vs. control.
Din Figura 21 se poate observa că după 24 h de expunere, nu au fost înregistrate
modificări semnificative ale nivel ului GSH. După 48 h, nivelul GSH a scăzut până la 67.5%,

54
față de control, în prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT -COOH, ceea ce poate indica o
instalare a stresului oxidativ în aceste condiții.
Scăderea concentrației de GSH, comparativ cu controlul, în urma tratamentului celulelor
MDA -MB-231 cu 1 și 2 µg/mL MWCNT -COOH timp de 24 h, a fost raportată și de Badea și
colaboratorii, indicând astfel citotoxicitatea CNT prin declanșarea mecanismelor de stres
oxidativ (Badea și colab., 2018).
Efectele SWCNT pu rificate și nepurificate au fost evaluate și la nivelul liniei celulare
RAW 264.7. Urmărind nivelul de peroxidare lipidică indusă de aceste nanoparticule, s -au
evaluat și modificările induse la nivelul antioxidanților, precum GSH. În urma tratamentului s –
a observat o pierdere semnificativă a nivelului de GSH în macrofagele RAW 264.7 stimulate
cu zymosan, în prezența SWCNT nepurificate. De asemenea, în cadrul studiului s -a observat o
protecție la nivelul macrofagelor oferită de enzima catalază, implicată în apărarea intracelulară
împotriva ROS, efectele toxice ale SWCNT fiind a stfel atenuate datorită capacită ții acestei
enzime de a transforma speciile reactive în forme mai puțin reactive (Kagan și colab., 2006).

5.3.2 Evaluarea nivelului de peroxidare lipidică
Concentrația de MDA a fost evaluată în urma tratamentului modelelor 3D cu 1, 2 µg/mL
MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de 24 și 48 h. MDA este produsul final al
acțiunii ROS asupra lipidelor, proces cunoscut și sub numele de peroxidare lipidică (Ayala și
colab., 2014) . După 24 h de tratament cu cele trei tipuri de suspensii, s -a observat o creștere a
concentrației de MDA, față de control, în prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT și
MWCNT -NH 2, respectiv 1 µg/mL MWCNT -COOH. După 48 h de expunere, nivelul MDA a
înregistrat o creștere dependentă de concentrația de CNT aplicată în cazul probei MWCNT –
COOH. Totodată, la același interval de timp, nivelul MDA a crescut și în cazul probei
MWCNT -NH 2, comparativ cu controlul. În prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT,
nivelul MDA a crescut cu 77.9% față de control (Figura 22). Cea mai mare concentrație de
MDA (creștere cu 124.9% față de control), la nivelul modelelor 3D MDA -MB-231, a fost
obținută în cazul concentrației de 2 µg/mL MWCNT -COOH, fapt ce poate fi corelat cu scăderea
nivelului GSH în aceleași condiții experimentale. Astfel, creșterea concentrației de MDA
împreună cu scăderea nivelului GSH pot indica o posibilă instalare a stresului oxidativ la nivelul
modelelor 3D MDA -MB-231 î n prezența MWCNT -COOH.
Un studiu anterior ar ată că SWCNT sintetizate conțin de obicei cantități semnificative
de fier care pot acționa ca un catalizator al stresului oxidativ. Întrucât macrofagele sunt
implicate în generarea răspunsului primar la diferite particule care inițiază și propagă reacțiile

55
inflamatorii și stresul oxidativ, au fost folosite pentru a testa două tipuri de SWCNT: SWCNT
bogate în fier (nepurificate) (26% în greutate de fier) și SWCNT fără fier (pur) (0.23% în
greutate de fier). S -a observat că în urma tratamentului cu SWCNT nepu rificate, nivelul de
peroxidare lipidică din macrofagele murine stimulate cu zymosan a fost mai mare decât al celor
tratate cu SWCNT purificate. Nici SWCNT purificate și nici SWCNT nepurificate nu au
generat producție intracelulară de radicali superoxizi s au oxid nitric în macrofagele RAW
264.7.

Figura 22. Nivelul relativ de malondialdehidă în urma expuner ii modelelor 3D MDA –
MB-231 la 1 și 2 µg/mL MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 timp de 24 h și 48
h. Rezultatele au fost calculate ca medie a trei replicate ± SD și reprezentate față de control
(modele 3D netratate). * p < 0.05, ** p < 0.01 vs. control.
Cu toate acestea, la nivelul macrofagelor RAW 264.7 stimulate cu zymosan, SWCNT
bogate în fier, nepuri ficate, au determinat generarea unui nivel mai mare de radicali hidroxilici
comparativ cu SWCNT purificate. SWCNT bogate în fier au provocat o pierdere semnificativă
de tioli intracelulari cu greutate moleculară mică (GSH) și acumularea de hidroperoxizi li pidici
în macrofagele RAW 264.7 stimulate cu zymosan. Rezultatele studiului arată că prezența
fierului în SWCNT poate fi importantă în determinarea răspunsurilor macrofagelor la stimuli
externi, punând în evidență importanța gradului de purificare a CNT în procedeele de testare in
vitro (Kagan și colab., 2006).

56
Capitolul VI – Concluzii

Prin studiul de față s -a realizat evaluarea toxicității nanotuburilor de carbon cu mai mulți
pereți simple (MWCNT) și funcționalizate cu grupări carboxil (MWCNT -COOH) și amino
(MWCNT -NH 2) la nivelul modelelor 3D de cancer de sân triplu negativ.
Rezultatele obținute în urma realizării testelor de citotoxicitate au arătat un caracter
citotoxic pron unțat al MWCNT -COOH la nivelul modelelor 3D MDA -MB-231 prin
declanșarea mecanismelor de stres oxidativ.

Astfel, în urma testării in vitro a MWCNT, MWCNT -COOH și MWCNT -NH 2 de
concentrații 1 și 2 µg/mL, s -au evidențiat următoarele concluzii principale:
➢ Cele trei tipuri de nano tuburi nu determină modificări morfologice semnificative
la nivelul modelelor 3D MDA -MB-231, comparativ cu modelele 3D netratate;
➢ Nivelul LDH a crescut în urma tratamentului cu 1 µg/mL MWCNT -COOH timp
de 24 h și 1și 2 µg/mL MWCNT și MWCNT -COOH timp de 48 h, indicând
astfel pierderea integrității membranare a celulelor;
➢ Nivelul NO eliberat în mediul de cultură a crescut în prezența concentrației de 2
µg/mL MWCNT – NH 2, față de control, ceea ce sugerează potențialul inflamat or
al acestei probe;
➢ Concentrația de GSH a scăzut în urma expunerii modelelor 3D timp de 48 h la
2 µg/mL MWCNT -COOH;
➢ Concentrația de MDA a crescut în prezența concentrației de 1 µg/mL MWCNT –
COOH și 2 µg/mL MWCNT și MWCNT – NH 2 după 24 h de tratament, precum
și în prezența concentrației de 2 µg/mL MWCNT și a ambelor doze de MWCNT –
COOH și MWCNT -NH 2 după 48 h. Astfel, nivelul scăzut de GSH și creșterea
concentrației de MDA pot indica declanșarea mecanismelor de stres oxidativ în
prezența nanotuburilor testate.

57
Bibliografie

• Achilli T.M., Meyer J., Morgan J. R., 2012. Advances in the formation, use and
understanding of multi -cellular spheroids. Expert Opin. Biol. Ther . 12 (10), 1347 -1360.
• Ayala A., Muñoz M .F., Argüelles S., 2014. Lipid peroxidation: production, metabolism,
and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4 – hydroxy – 2 – nonenal. Oxid .
Med. Cell. Longev. 2014, 360438.
• Badea A .M., Prodana M., Dinischiotu A., Crihana C., Ionita D., Balas M., 2018.
Cisplatin loaded multiwalled carbon nanotubes induce resistance in triple negative
breast cancer c ells. Pharmaceutics. 10(4) , 228.
• Beg S., Rizwan M., Sheikh A. M., Hasnain S.M., Anwer K., Kohli K., 2011.
Advancement in carbon nanotubes : basics, biomedical applications and toxicity. J.
Pharm . Pharmacol . 63, 141-163.
• Bottini M., Bruckner S., Nika K., Bottini N., Belluci S., Magrini A., Bergamaschi A.,
Mustelin T., 2006. Multi -walled carbon nanotubes induce T lymphocyte apoptosis.
Toxicol . Lett. 160, 121-126.
• Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein -dye b inding. Anal . Biochem . 72,
248-254.
• Chen Y -S., Hsuie G. -H., 2013. Directing neural differentiation of mesenchymal stem
cells by carboxylated multiwalled carbon nanotubes. Biomaterials. 34, 4936 -4944.
• Finkel T., 2003. Oxidant signals and oxidative stress. Curr. Opin. Cell. Biol. 15, 247 –
254.
• Fiorito S., Serafino A., Andreola F., Bernier P., 2006. Effects of fullerenes and single –
wall carbon nanotubes on murine and human macrophages. Carbon. 44, 1100 -1105.
• Forest V., Figarol A., Boudard D., Cottier M., Grosseau P., Pourchez J., 2015.
Adsorption of lactate dehydrogenase enzyme on carbon nanotubes: how to get accurate
results for the cytotoxicity of this nanomaterials. J. Am. Chem. Soc . 31, 3635 -3643.
• Fraley S.I., Feng Y .F., Krishnamurthy R., Kim D.H., Celedon A., Longmore G.D.,
2010. A distinctive role for focal adhesion proteins in three -dimensional cell motility.
Nat. Cell. Biol. 12, 598 -U169.
• Friedrich J., Seidel C., Ebner R., Kunz -Schei ghart L.A., 2009. Spheroid -based drug
screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309 -324.

58
• Fujita K. , Fukuda M. , Endoh S., Maru J., Kato H., Nakamura A., Shinohara N., Uchino
K., Honda K., 2016. Pulmonary and pleural inflamation after in tratracheal instillation
of short single -walled and multi -walled carbon nanotubes. Toxicol. Lett. 257, 23 -37.
• Gholamine B., Karime I., Salimi A., Mazdarani P. and Becker L.A., 2017.
Neurobehavioral toxicity of carbon nanotubes in mice: Focus on brain -derived
neurotrophic factor messenger RNA and protein. Toxicol . Ind. Health. 33, 340 -350.
• Griess J.E., 1879. Bemerk ungenzu der Abhandlung der HH. Weselsky und
Benedikt ”Uebereinige Azoverbindungen” Ber. Deutsch Chem. Ges. 12, 426.
• Guenzel J .D.N., 2009. A -coated nanotubes help kill tumors without harm to surrounding
tissue. Eureka alert. [online] www.eurekalert.org/pub_releases/2009 –
08/wfubdnk081909.php .
• Halliwell B., 2005 . Free Radicals and other reactive species in Disease. ELS. 7 pagini.
• He H ., Pham -Huy L.A., Dramou P., Xiao D., Zuo P., Pham -Huy C., 2013. Carbon
nanotubes: a pplications i n pharmacy and m edicine. BioMed Res . Int. 2013, 12 pagini.
• Jia G., Wang H. , Yan L., Wang X., Pei R., Yan T., Zhao Y., Guo X., 2005. Cytotoxicity
of carbon nanomaterials: single -wall nanotube, multi -wall nanotube, and fullerene.
Environ . Sci. Technol. 39, 1378 -1383.
• Kagan V.E., Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Konduru N.V., Potaporeich A.I., Osipov A.N.,
Kisen E.R., Schwegler -Berry D., Meror R., Castranova V., Shedova A.A., 2006. Direct
and indirect effects of single walled carbon nanotubes on RAW 264.7 macrophages:
Rolr of iron. Toxicol. Lett. 165, 88 -100.
• Katt M.E., Placone A.L., Wong A.D., Xu Z.S., Searson P.C., 2016. In vitro tumor
models: advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Front .
Bioeng . Biotech. 4, 12.
• Kavosi A., Saeideh H.G.N., Ma dani S., Khalighford S., Khodayari S., Khodayari H.,
Mirzaei M., Kalhori M.R., Yavarian M., Alizadeh A.M., Falahati M., 2018. The toxicity
and therapeutic effects of single – and multi -wall carbon nanotubes on mice bre ast
cancer. Sci. Rep. 8, 8375.
• Kerksick C., Willoughby D., 2005. The antioxidant role of glutathione and N -acetyl –
cysteine supplements and exercise -induced oxidative stress. J. Int. Soc. Sports Nutr .
2(2), 38 -44.

59
• Krause S., Maffini M.V., Soto A.M., Sonnenschein C., 2010. The microenviro nment
determines the breast cancer cells phenotyp e: organization of MCF7 cells in 3D
cultures. BMC Cancer. 10, 263.
• Lin H.H., Chiang M.T, Chang P.C., Chau L.Y., 2015. Myeloid heme oxygenase -1
promot es metastatic tumor colonization in mice. Cancer Sci. 106, 299 -306.
• Lin R.Z., Chang H.Y., 2008. Recent advances in three -dimensional multi -cellular
spheroid culture for biomedical research. Biotechnol. J. 3, 1172 -1184.
• Mehta G., Hsiao A.Y., Ingram M., Luker G.D., Takayama S., 2012. Opportunities a nd
challenges for use of tumor spheroids a s models to test drug delivery and efficacy. J.
Control Releas e. 164, 192 -204.
• Mousavi S .Z., Nafisi S., Maiback H .L., 2017. Fullerene nanoparticle in dermatological
and cosmetic applications. Nanomedicine . 13(3) , 1071 -1087.
• Nguyen H.T .L., Nguyen S.T., Pham P.V., 2016. Concise Review: 3D cell culture
systems for anticancer drug screening. Biomed . Res. Ther. 3(5), 625-632.
• Patlolla A., Patlolla B., Tchounreou P., 2010. Evaluation of cell viability, DNA damage,
and cell death in normal human dermal fibroblast cells induced by functionalized
multiwalled carbon nanotube. Mol. Cell Biochem. 338(1 -2), 225-232.
• Perevedentseva E., Lin Y.C., Jani M., Cheng C.L., 2013. Biomedical applications of
nanodiamonds in imaging and therapy. Nanomedicine . 8(12) , 2041 -60.
• Poland C.A. , Duffin R ., Donaldson K., 2008. Carbon nanotubes introduced into the
abdominal cavity of mice show asbestos -like pathogenicity in a pilot study. Nat.
Nanotechnol. 3, 423-428.
• Popov N., 2004. Carbon nanotubes: properties and application. Mater. Sci. Eng . R Rep.
61-102.
• Qian D., Wagner G.J., Lui W.K., 2002. Mechanics of carbon nanotubes. Appl. Mech.
Rev. 55, 495 -533.
• Rotoli B.M., Bussolati O., Massimiliano G., Barilli A., Belluci S., Bergamaschi E.,
2008. Non-functionalized multi -walled carbon nanotubes alter the paracellular
permeability of human airway epithelial cells. Toxicol Lett. 178, 95-102.
• Schrand A.M., Ciftan Hens S.A., Shen derova O.A., 2009. Nanodiamond particles:
properties and p erspectives for bioapplications. Crit. Rev. Solid State Mater . Sci. 34, 18-
74.

60
• Sharma S.C., Sarkar S., Periyakawppan A., Barr J., Wise K., Thomas K., Wilson L.B.,
Ramsen T.G., 2007. Single -walled carbon nanotube induces oxidative stress in Rat
Lung epithelial cells. J. Nanosci . Nanotechnol. 7(7), 2466 -2472.
• Srivastava R. K., Aditya B . P., Kashyap M. P., Kumar V., Lohani M., Jonas L., Rahman
Q., 2011. Multi -walled carbon nanotubes induce oxidat ive stress and apoptosis in
human lung cancer cell line -A549. Nanotoxicology. 5(2), 195-207.
• Sun Y., Fu K., Lin Y., Huang W., 2002. Functionalized carbon nanotubes: properties
and a pplications. Acc. Chem. Res. 35, 1096 -1104.
• Talbot C., 1999. Fullerene and nanotube chemistry: an update. Sch. Sci. Rev . 81, 37 -48.
• Tang Z., Geng G., Huang Q., Xu G., Hu H., Chen J., Li J ., 2010. Prognostic significance
of tissue factor pathway inhibitor -2 in pancreatic carcinoma and its effect on tumor
invasion and metastasis. Med. Oncol. 27, 867 -875.
• Thostenson E.T., Ren Z., Chou T. -W., 2001. Advances in the science and technology
of carbon nanotubes and th eir composites: a review. Compos. Sci. Technol. 61, 1899 –
1912.
• Torti S .V., Byrne F., Whelan O., Levi N., Ucer B., Schmid M., Torti F.M., Akman S.,
Liu J., Ajayan P.M., Nalamasu O., Carroll D.L. , 2007. Thermal abla tion therapeutics
based on CN X multi -walled nanotubes. Int. J. Nanomedicine. 2, 707-714.
• Ulloa E., 2013. Fullerenes and their applications in science and t echnology. Introduction
to Nanotechonology.
• Ursini C.L., Cavallo D., Fresegna A.M., Ciervo A., Maiello R., Buresti G., Casciardi S.,
Tombolini F., Belluci S., Iavicoli S. , 2012. Comparative cyto -genotoxicity assessment
of functionalized and pristine multiwalled carbon nanotubes on human lung epithelial
cells. Toxicol. in Vi tro. 26, 831 -840.
• Wang X., Guo J., Chen T., Nie H., Wang H., Zang J., Cui X., Jia G., 2012. Multi -walled
carbon nanotubes induce apoptosis via mitochondrial pathway and scavenger receptor.
Toxicol . in Vitro . 26, 799 -806.
• Wang Y ., Zhang Z., Liu H., Xu X., Pan G., Guo Z., Liu Y., Han X., Lan G., 2002. The
effect of catalyst concentration on the synthesis of single walled carbon nanotubes.
Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 58(10), 2089 -2095.
• Weiswald L. -B., Bellet D., Dangles V .M., 2015. Spherical cancer models in t umor
biology. Neoplasia. 17(1) , 1-15.

61
• Wirtz D., Konstantopoulos K., Searson P.C., 2011. The physics of cancer: the role of
physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer . 11, 512 –
522.
• Wong N, O'Connell M., Wisdom J.A., Dai H., 2005. Carbon nanotubes as multi
functional biological transporters and near -infrared agents for selective cancer cell
destruction. PNAS . 102(3) , 11601 -11605.
• Xu Z., Gao Y., Hao Y., Li E., Wang Y., Zhang J., 2013. Application of a microfluidic
chip-based 3D co -culture to test drug sensitivity for individualized treatment of lung
cancer. Biomaterials. 34, 4109 -4117.
• Yakymchuk O.M., Perepelytsina O.M., Dobrydnev A .V., Syctorenko M.V., 2015.
Effect of single -walled carbon nanotubes on tumor cells viability and formation of
multicellular tumor spheroids. Nanoscale Res . Lett. 10, 150.
• Yang F., Hu M., Lei Q., Xia Y., Zhu Y., Song X., 2015. Nifuroxazide induces apoptosi s
and impairs pulmonary metastasis in breast cancer model. Cell Death Dis. 6(3), e1701.
• http://muhaz.org/ fulerenele -fascinsnte -in-prezent -o-provocare -pentru -viitor.html
• https://stiintesitehnica.com/dieta -cu-fulerene -a-dublat -durata -de-via-a-a-cobailor/
• https://imagazin.ro/cele -o-mie-de-utilizari -ale-grafenului
• https://www.digitaltrends.com/cool -tech/9 -amazing -graphene -applications/?utm
source= feedly&utm medium=web feeds
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Grafit
• https://energiacristalelor.ro/diamant.html
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Fuleren%C4%83
• https://www.scribd.com/doc/121601511/Fulerenele
• https://www.scribd.com/document/208688859/Forme -Alotropice -Ale-Carbonului –
Diamantul -Si-Granitul
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Diamant
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Carbon
• https://www.tabelulperiodic.ro/elemente -tabel -periodic/carbon -definitie -si-informatii –
generale
• https://ro.wikipedia.org/wiki/Nanotehnologie
• https://stiintasitehnica.com/nano tehnologie -interviu -mark -hersam