Lp1 Farmacie Ro [607164]

1
1. ORGANIZAREA LABORATORULUI DE BIOCHIMIE

Laboratorul de biochimie este prevăzut cu instalați i și aparatură
specifică, care trebuie întreținută și verificată p ermanent; prezintă o serie de
particularități datorate utilizării materialului bi ologic și aparaturii specifice,
necesare pentru studiul și demonstrarea proceselor metabolice.

1.1. Reguli generale de lucru în laboratorul de bio chimie

Experimentele care se realizează urmăresc corelarea aspectelor
teoretice cu metodele experimentale și cu procedeel e biochimice, iar profitul
maxim se poate obține numai printr-o pregătire prea labilă a
experimentatorului cu asimilarea teoriei corespunză toare. Pregătirea
adecvată îi permite experimentatorului să pună în v aloare experiența în
conformitate cu sensul ei, fără de care execuția de vine strict mecanică iar
câștigul este minim.
Diferite operații care se execută în practica labor atorului de biochimie
pot deveni adevărate pericole în mâna acelora care nu sunt conștienți de
natura materialelor pe care le utilizează și nu sun t atenți la manipulările
acestora. Împotriva accidentelor cea mai bună preca uție care se poate lua
este pregătirea în detaliu a oricărui experiment și o masă de laborator
îngrijită, curată și bine organizată.
Nerespectarea normelor de protecție a muncii în la borator pune în
pericol nu numai sănătatea și integritatea experime ntatorului ci și a
persoanelor din jurul său. De asemenea se pot provo ca prejudicii și pagube
materiale care sunt greu de precizat la prima veder e.
Preîntâmpinarea situaților neplăcute care se pot i vi necesită
respectarea cu strictețe a următoarelor recomandări generale :
1. Experimentatorul trebuie să se găsească întotdeauna într-o stare fizică
bună.
2. Întreg personalul care lucrează în laborator este o bligat să poarte
halate curate iar în unele situații ochelari de pro tecție.
3. Dacă vreo substanță chimică intră în ochi, gură sau cade pe piele, locul
trebuie imediat clătit cu foarte multă apă rece de la robinet. În această
privință trebuie operat rapid , deoarece o intervenție imediată poate
preveni o leziune severă. Cazul se relatează imediat conducătorului
de lucrări care decide dacă trebuie continuat vreun tratament.
4. Aparatele alimentate cu curent electric (centrifuge , termostate, băi de
apă, reșouri, frigidere, spectrofotometre, etc.) tr ebuie să aibă prizele
pământate și izolarea electrică perfectă. Fixarea l or în priză se face
numai cu mâna uscată, cu o mână ținând corpul prize i, iar cu cealaltă
apucând ștecherul.
5. Nu se va gusta niciodată o substanță chimică, iar d upă fiecare ședință
de laborator se spală mâinile.

2
6. Dacă se răstoarnă vasele sau se produc stropiri cu substanțe chimice,
locul trebuie imediat curățat. Se procedează în fel ul următor:
a. Dacă un acid cade pe îmbrăcăminte se clătește cât m ai eficient
posibil locul cu apă, apoi cu o soluție de bicarbon at de sodiu și în
final din nou cu apă.
b. Dacă o bază cade pe îmbrăcăminte, se clătește locul cât mai
eficient cu apă, apoi cu o soluție de acid acetic d iluat și din nou cu
apă. Halatul de bumbac oferă o protecție eficientă hainelor.
c. Dacă un acid sau o bază cad pe masă, se diluează cu apă, apoi
se neutralizează acidul cu bicarbonat de sodiu soli d iar baza cu
acid acetic diluat. Se spală apoi locul cu apă și s e șterge bine.
7. Se citesc cu atenție, înainte de întrebuințare, eti chetele de pe sticlele
de laborator. Trebuie cunoscut cu exactitate de ce substanță chimică
avem nevoie iar atunci când este vorba de soluții d e ce anume
concentrație. Confundarea din greșeală a anumitor s oluții care se
amestecă poate avea consecințe grave.
8. Volumele determinate de lichide se măsoară adesea c u pipeta. Nu se
permite aspirarea cu gura. Se folosește un sistem d e aspirare adecvat
(pară de cauciuc, trompă de apă).
9. Toate experimentele care au loc cu eliberare de sub stanțe nocive se
execută numai sub nișă.
10. Se notează și se etichetează probele, reactivii și soluțiile pentru a nu
se produce substituiri de materiale.
11. Vasele de laborator nu se utilizează pentru mâncat sau băut.
12. Atunci când există îndoieli ori nelămuriri asupra d esfășurării corecte a
unei operații sau reacții, se solicită îndrumări co nducătorului de lucrări.
13. Se interzice păstrarea de alimente precum și consum ul acestora în
interiorul laboratorului.
14. Se interzice a se pune pe masa de laborator: țigări , mâncare ori
obiecte care nu se folosesc în decursul lucrării.
15. Pentru a mirosi o substanță, vaporii trebuie îndrep tați spre manipulant
prin mișcarea lentă a mâinii, cu precauție, fără a inspira adânc aerul în
plămâni.
16. Manipularea substanțelor deosebit de toxice sau per iculoase se face
numai după o instruire specială a persoanelor care execută lucrarea.
17. Lichidele inflamabile și volatile se păstrează numa i în vase închise iar
pe masa de lucru și în laborator se țin doar în can tități mici.
18. Lichidele inflamabile și volatile nu se depozit ează și nici nu se
manipulează în apropierea focului sau a altor surse de căldură.
19. Nu se efectuează nici un fel de experiențe și încer cări care nu au fost
autorizate de conducătorul de lucrări.
20. La terminarea activității se spală cu apă și clăteș te cu apă distilată
sticlăria folosită, se controlează dacă aparatura e lectrică a fost scoasă
din prize și dacă robinetele de apă sunt închise.

3
21. Se interzice păstrarea alimentelor în frigidere cu produse biologice sau
chimicale pentru a evita pericolul de infectare sau contaminare.
22. Laboratorul trebuie să fie dotat cu mijloace portab ile de stins incendii,
cu o trusă de prim ajutor, cu medicamente și materi al sanitar strict
necesar pentru intervenții rapide.

1.2. Primul ajutor în caz de intoxicații, arsu ri chimice și arsuri termice

1. În caz de intoxicații se vor lua următoarele măsuri :
a. Intoxicatul va fi scos imediat din laborator și va fi culcat într-o încăpere
bine aerisită.
b. Va fi dezbrăcat de haine pentru a nu i se împiedica respirația, se va
desface gulerul, centura, etc.
c. La nevoie se recurge la respirație artificială.
d. Dacă au fost stropite îmbrăcămintea și corpul cu su bstanțe toxice, se
recurge la spălarea pielii.
e. Intoxicatul trebuie învelit și la nevoie se încălze sc mâinile și picioarele
cu sticle cu apă caldă.
f. Se stabilește agentul toxic pentru a se comunica me dicului.
2. Dacă produșii corosivi au atins pielea, se procedea ză la neutralizare
astfel:
a. La arsurile cu acizi, locul atins se spală cu o sol uție de bicarbonat de
sodiu 2% și apoi cu apă.
b. La arsurile mai adânci cu acizi se aplică pe rană o pastă formată din
bicarbonat de sodiu și puțină apă care se menține c irca 10 minute după
care se spală cu apă; dacă rana mai este acidă se r epetă procedura.
c. La arsurile cu alcalii se folosește ca neutralizant o soluție de acid boric
2% sau acid acetic 2%, fie pentru spălare, fie prin aplicarea sub formă
de tampoane.
d. La arsurile cu alte substanțe corosive sau toxice, care se resorb prin
piele, acestea se îndepărtează imediat prin șterger e cu tampoane de
vată uscate sau îmbibate cu un dizolvant potrivit, după care se
neutralizează.
3. În cazul în care substanța corosivă pătrunde în och i se procedează
imediat la o spălare abundentă cu apă și apoi cu o soluție de bicarbonat
de sodiu 2% în cazul acizilor, sau cu o soluție de acid boric 2% în cazul
alcaliilor. Îndepărtarea substanței se face cu un p ăhărel pentru spălarea
ochilor.
4. În cazul accidentelor cu agenți corosivi este foart e important să se
procedeze cu mare rapiditate, prevenind în acest fe l desfigurarea sau
pierderea vederii.
5. În cazul accidentelor prin arsuri termice pe supraf ețe mici, cu răni puțin
profunde, se aplică o soluție concentrată de tanin. Pentru suprafețe mai
mari se aplică creme speciale, apoi se pansează.

4
6. În toate cazurile, chiar aparent puțin grave, accid entatul este bine să fie
examinat de către medic. Examinarea medicală este o bligatorie pentru
toate accidentele care afectează ochii.

1.3. Practica de laborator

Pentru ca activitatea practică să se desfășoare arm onios, trebuie
respectate anumite reguli de ordine interioară și a nume:

Reactivi
Se va avea grijă ca reactivii din sticle sau borca ne să nu se impurifice
iar din acestea se va scoate numai cantitatea stric t necesară.
a. Sticlele de reactivi nu se mută de la locul lor dec ât în momentul
întrebuințării lor iar imediat după aceasta se pun din nou la loc.
b. Pentru manipularea substanțelor solide se va folosi o spatulă curată.
c. Într-o sticlă de reactiv nu se introduce decât o pi petă curată și uscată.
Mai corect este ca din sticlă să se pună într-un al t vas cantitatea de
reactiv estimată și din acesta să se măsoare apoi c u pipeta.
d. Chimicalele rămase neutilizate nu se pun niciodată înapoi în sticla
sau borcanul din care au fost scoase.
e. Dopurile sticlelor se păstrează curate și se îndepă rtează doar pentru
momentul în care se scoate din reactivul dorit, ime diat după aceasta
dopul se pune obligatoriu la loc.

Reziduuri
a. Sticlele sparte și alte reziduuri solide se pun în coșuri speciale.
b. Resturile lichide se aruncă la chiuvetă concomitent cu curgerea apei
sau se colectează în recipiente speciale.

Apa distilată. Calitatea apei
Cel mai comun solvent folosit în laboratorul de bio chimie este apa.
Niciodată nu se va folosi apă de la robinet pentru prepararea vreunei soluții !!!
Calitatea apei este cel mai adesea exprimată prin c onductivitatea ei
specifică, exprimată în micro Siemens/cm ( S cm -1). Mai poate fi utilizată și
valoarea reciprocă, numită rezistența electrică spe cifică. Deoarece
conductivitatea apei depinde de numărul de specii i onice, deci de prezența
electroliților, valorile mici ale acesteia (respect iv valori mari ale rezistenței
electrice) indică o concentrație mică de electroliț i. Pentru comparație se
prezintă în tabelul 1 conductivitatea pentru divers e tipuri de apă utilizate în
laborator.

5

Tabel 1. Conductivitatea pentru diverse tipuri de a pă
Tip de apă Conductivitatea
S cm -1
Apă de la robinet 290
Apă distilată 5
Apă dublu distilată (sticlă) 1
Apă dublu distilată (cuarț) 0,5
Apă demineralizată 0,2
Apă demineralizată și distilată < 0.2

Se observă din acest tabel că apa demineralizată și distilată are
conductivitatea cea mai mică.
Există numeroase metode de preparare a apei deminer alizate, unele
dintre ele destul de ieftine. Apa demineralizată pr ezintă un dezavantaj major:
de regulă ea nu este sterilă. Din acest motiv ea tr ebuie utilizată imediat, nu se
păstrează. În mod normal impuritățile bacteriene nu interferă în investigațiile
analitice, apar probleme doar la analiza enzimelor. Pentru prepararea
soluțiilor standard se recomandă folosirea apei dem ineralizate distilate.
Multe laboratoare de biochimie sunt echipate cu apa rate de purificat
apa prin schimbători de ioni, osmoză inversă sau di stilare.
Apa deionizată are o concentrație mică de ioni metalici dar este
contaminată cu substanțe organice care sunt spălate de pe rășinile
schimbătoare de ioni. Acești contaminanți vor creșt e absorbție în UV a apei.
În cazul în care urmează să se realizeze o determin are în UV, este necesar
să se folosească apa distilată în locul celei deion izate.
Apa distilată se poate produce în distilatoare confecționate din metal
sau sticlă. În mod normal apa distilată produsă în vase de metal va conține
ioni metalici dar va avea un conținut foarte mic de substanțe organice (dacă
viteza de distilare este relativ mică).
Pentru cele mai multe experimente biochimice este s uficientă folosirea
apei distilate în vase de sticlă. Apa de la robinet determină în timp depunerea
unui strat de săruri pe peretele interior al distil atorului. Acest depozit se
elimină prin spălare periodică cu soluție de HCl 10 %. Evitarea contaminării cu
compuși organici se poate face prin menținerea proc esului de distilare la o
viteză relativ mică. În unele determinări de absorb anță sau fluorescență este
necesară folosirea unei ape distilate ultrapure. În acest caz se recomandă
distilarea în prezență de permanganat de potasiu (u n gram la un litru de apă
și 1 mililitru acid fosforic 85%) care va îndepărta substanțele organice.

1.4. Caietul de laborator

Este deosebit de important ca fiecare persoană să p ăstreze înregistrat
clar și concis rezultatele lucrării experimentale. Acest lucru se face în mod

6
normal într-un caiet de laborator permanent și este important ca
experimentatorul să-și noteze observațiile exact în momentul în care au fost
făcute și să le și dateze. Nu este indicat a se uti liza în nici o ocazie foi volante
pentru a înregistra datele experimentale.
Observațiile, calculele și rezultatele se vor înreg istra astfel încât
constatările făcute și interpretarea lor să permită înțelegerea atât pentru
persoana care a lucrat cât și pentru o altă persoan ă, chiar dacă se vor
consulta ulterior.
Fiecare experiment se finalizează sub forma unui re ferat. Referatul
trebuie să descrie teoria și metodologia experiment ală aplicată și să rezume
faptele experimentale și să genereze concluzii. Un referat mai extins va
conține și o descriere critică a rezultatelor cu co mentarii privind erorile
posibile și limitele metodei experimentale.

1.5. Materiale, ustensile și aparatură

Instalațiile de apă, gaze, lumină trebuie să fie re alizate în condiții
optime și să deservească toate locurile de muncă.
Reactivii de laborator se găsesc în sticle etanșe, prevăzute cu etichete,
care se păstrează în dulapuri adecvate. Reactivii p e a căror etichetă se
specifică depozitarea la +4 C sau 20 C, vor fi păstrați obligatoriu în spații
reci corespunzătoare. La majoritatea lucrărilor de laborator, soluțiile necesare
unei analize sunt gata preparate pe mesele de lucru și grupate împreună cu
sticlăria și aparatura necesară într-un punct de lucru .
Mesele de laborator sunt faianțate, prevăzute cu utilități (apă, curent
electric) și menținute permanent perfect curate, pe ntru evitarea contactului
pielii și îmbrăcămintei cu substanțele chimice.
Ustensilele și aparatura de laborator cele mai uzu ale sunt 
 Sticlăria de laborator cuprinde ustensile de sticlă sau plastic necesare
lucrului cu soluții și care permit manipularea, agi tarea și măsurarea
soluțiilor de reactivi. Cele mai folosite sunt 
 eprubetele, de diferite dimensiuni, din sticlă sau material plastic. În
eprubete se introduc cantități măsurate de diferiți reactivi, se face
omogenizarea acestora, iar amestecul astfel realiza t se poate termostata sau
introduce în diverse aparate (termostat, centrifugă , spectrofotometru)
 vase pentru măsurarea volumelor de lichide care cu prind  cilindrii
gradați, baloane cotate, pipete și biurete.
Cilindrii gradați sunt confecționați din sticlă groasă sau plastic și sunt
prevăzuți cu diviziuni care indică volumul în cm 3. La partea superioară este
marcată capacitatea totală, la temperatura de lucru . Nivelul lichidelor
transparente care udă vasul se citește la gradația în dreptul căreia se află
limita inferioară a meniscului lichidului, privind de la înălțimea acestuia. La
lichidele intens colorate sau la mercur citirea niv elului se face la diviziunea
din dreptul meniscului superior. Măsurătorile cu ci lindrul gradat sunt comode,

7
dar mai puțin exacte, de aceea se utilizează la pre pararea soluțiilor cu
concentrație aproximativă.
Baloanele cotate au formă de sferă sau pară cu fundul plat prevăzut e
cu dop șlefuit, având un gât lung și îngust pe care se află un semn circular
(cotă), care indică volumul pentru valoarea nominal ă (între 5 și 2000 de
mililitri). Ele ca de altfel toate vasele de măsura t volume sunt gradate pentru
temperatura de 20 C. Sunt folosite pentru prepararea soluțiilor de
concentrație foarte exactă. Pentru aceasta, substan ța se cântărește la
balanța analitică, se trece în balon cu ajutorul un ei pâlnii suspendată de un
inel, spălând vasul de cântărire și pâlnia de mai m ulte ori cu solventul folosit.
Se adaugă solventul până la dizolvarea solvitului a poi, după ce lichidul a
ajuns la temperatura camerei, se completează la cot ă cu solvent, se pune
dopul și se omogenizează conținutul prin răsturnare de mai multe ori.
Pipetele servesc la măsurarea rapidă și exactă a unor volum e de
lichide. Se împart în două categorii  manuale și automate. După felul cum
sunt calibrate se divizează în pipetele cu volum fix și cu volum variabil .
Cele cu volum fix au marcat un singur semn sau două pentru volume
cuprinse, în general, între 0,10 și 100 ml. Ele pot măsura numai volumul
pentru care au fost calibrate. Cele cu volum variab il au gradații intermediare
care pot fi cuprinse între 0,01 și 25 mililitri (pe tipodimensiuni: pipete de 0,10;
1,0; 2,0; 5; 10 și 25 mililitri). Ele pot măsura or ice volum pe intervalul calibrat.
Micropipetele sunt marcate în sutimi de mililitru și au capacită ți între 0,01 și
0,02 mililitri.
Măsurarea corectă a unui volum de lichid cu pipeta se face astfel  se
introduce pipeta în lichid și se aspiră până când n ivelul lichidului trece puțin
peste semnul volumului dorit, apoi se obturează rap id gura pipetei cu degetul
arătător. Se scoate pipeta din lichid și se șterge exteriorul ei introdus în lichid,
cu hârtie de filtru. Se aduce marginea inferioară a meniscului la nivelul
ochiului, ținând pipeta perfect verticală, cu vârfu l fixat pe interiorul vasului din
care s-a scos lichidul. Se lasă să se scurgă lichid ul până la nivelul marcat și
se trece apoi în alt vas volumul de lichid astfel m ăsurat. La pipetele cu
scurgere totală, se trage cu vârful pipetei pe marg inea vasului în care se
introduce soluția ( nu se suflă picătura rămasă în vârful pipetei niciodată,
aceasta rămâne în pipetă ).
Pipetele automate tind să le înlocuiască tot mai mult pe cele manuale .
Ele sunt calibrate pentru un volum fix sau reglabil , umplerea și golirea
realizându-se pe principiul unei pompe de aspirație cu piston. La capătul
opus pistonului se adaptează un vârf din material p lastic, de unică folosință,
în care se aspiră volumul de soluție corespunzător volumului pipetei. Golirea
se face prin apăsarea pistonului. Mânuirea este foa rte ușoară, putând fi
făcută și de persoane necalificate după un scurt in structaj.
Biuretele sunt tuburi de sticlă gradate, care au la partea in ferioară un
dispozitiv pentru reglarea scurgerii (robinet sau t ub de cauciuc prevăzut cu
clemă Mohr). Biuretele sunt calibrate pentru diferi te volume  1, 2, 10, 25, 50,

8
100 mililitri. Pentru analize la scară micro se uti lizează microbiurete de 1, 2, 5
mililitri, divizate în sutimi de mililitri. Biurete le se fixează în poziție perfect
verticală, pe stative de metal, cu ajutorul unor cl eme. Soluția se introduce în
biuretă pe la partea superioară, iar cu ajutorul di spozitivului de reglare a
curgerii lichidului (robinet sau clemă) se aduce ni velul acestuia tangent la
planul orizontal al diviziunii 0, cu partea inferio ară a meniscului dacă lichidul
este incolor sau cu partea superioară dacă lichidul este colorat. Lichidul se
lasă să curgă din biuretă încet, în picături, până la diviziunea necesară.
Citirea diviziunii până la care a curs lichidul se face ținând ochiul la înălțimea
meniscului lichidului. Imediat după utilizare se re comandă golirea și spălarea
biuretei, iar pentru evitarea depunerii de praf să se acopere partea superioară
cu un vas corespunzător. La biuretele cu robinet, a cesta trebuie uns periodic
pentru a se evita înțepenirea lui.
 pahare de laborator tip Berzelius, vase conice Erl enmeyer
 pâlnii de sticlă, baghete de sticlă, cristalizoare , exicatoare, mojare cu
pistil creuzete, pisete, sticle picurătoare, fiole de cântărire, vase de trompă,
pâlnii de extracție, tuburi de sticlă etc.
 ustensile diverse ca  dopuri, tuburi de cauciuc, linguri și spatule pent ru
manevre asupra substanțelor solide, trepiede de met al, site cu azbest,
becuri de gaz Teclu sau Bunsen, stative pentru pipe te și eprubete, cleme
metalice, perii pentru spălat eprubete
 etuvă electrică pentru uscat substanțe și sticlări e
 baie de apă electrică
 baie termostat reglabilă
 instalație de apă distilată și bidistilată
 termometre, cronometre, ceasuri de laborator
 balanțe pentru cântărirea substanțelor. În funcție de gradul de exactitate
urmărit sunt necesare 
 balanțe analitice, la care se poate cântări cu o p recizie de 10 -4, 10 -5 grame.
 balanțe farmaceutice, la care se poate cântări cu o precizie de 10 -1-10 -3
grame.
 spectrofotometre UV-Vis
 centrifuge de masă, balanțe pentru echilibrarea ep rubetelor.

2. PREGĂTIREA MATERIALULUI BIOLOGIC ÎN VEDEREA
ANALIZELOR DE LABORATOR

În laboratorul clinic, investigarea componentelor d in diferitele lichide
biologice (sânge, urină, lichid cefalo-rahidian, sa livă, suc gastric, etc.) este
necesară pentru completarea și certificarea diagnos ticului clinic.

9

1. Sângele. Recoltare. Conservare. Analiză
Sângele este principalul produs biologic testat în laborator. Acesta
reprezintă 6-8% din greutatea totală a organismului , un adult sănătos având
în jur de 5 litri de sânge. Modificarea compoziției sale poate fi rezultatul unei
stări patologice sau fiziologice.
Sângele este un țesut lichid, eterogen, alcătuit di n două faze:
1. lichidă – plasma – 50-60% din volumul sanguin – este un lichid
transparent, ușor gălbui, alcătuit din apă , substanțe anorganice (ioni de
sodiu, potasiu, calciu, magneziu, fosfat, clorură, zinc, fier, bicarbonat
ș.a.), substanțe organice azotate (proteine, uree, creatinină, bilirubină,
ș.a.) și substanțe organice neazotate (glucoză, colesterol, trigliceride,
acizi grași liberi, fosfolipide, ș.a.), tamponate la pH = 7,35.
2. solidă – elemente figurate – 40-45% din volumul sanguin – sunt
reprezentate de: leucocite, eritrocite, trombocite , suspendate în faza
lichidă.

Recoltarea sângelui
Se poate recolta sânge venos, capilar, arterial (m ai rar).
a. Sângele venos se recoltează, în general, din venele plicii cotul ui (la
adult), din venele jugulare (la copii mici), sau di n fontanele (la sugar).
b. Sângele capilar se recoltează din pulpa degetului, lobul urechii s au
călcâi (la copii mici).
Sângele se recoltează în general dimineața, pe nemâ ncate, după un
post de 10 – 12 ore. Micul dejun influențează valor ile glicemiei, lipidelor
serice, aminoacidemiei, a fosforului anorganic. Apr oape toate celelalte
determinări se pot efectua și în timpul zilei.
Determinările efectuate în paralel pe sânge venos ș i arterial au dovedit
că nu există diferențe semnificative pentru majorit atea componenților organici
sau anorganici. Se remarcă glucoza care are valori mai mici în sângele
venos decât în cel arterial, piruvatul și lactatul au valori mai mari în sângele
venos decât în cel arterial.
Toate materialele (recipiente, seringi, ace) utiliz ate la recoltarea
sângelui sunt sterile și de unică utilizare. Recipi entele (tuburile) utilizate la
recoltarea sângelui sunt vidate și au dopuri de dif erite culori (vacutainere), în
funcție de conținutul lor și de tipul analizei care urmează a fi efectuată din
sângele recoltat.

Tipurile de recipiente utilizate la recoltarea sâng elui pentru efectuarea
analizelor biochimice sunt următoarele:
A. Fără anticoagulant – pot fi utilizate pentru aproape orice analiză
biochimică :
– tub de sticlă cu dop roșu – activează coagularea î n mod natural;
– tub de plastic cu dop roșu – conține siliciu ca ac tivator al coagulării;

10
– cu dop cafeniu – conține activator al coagulării s i gel de acril care
separă serul de cheagul de sânge;
– cu dop portocaliu (conține ca activator al coagulă rii trombina) – reduce
procesul de coagulare la 5 min.
B. Cu anticoagulant:
– cu dop verde (conține heparinat de litiu) – poate fi utilizat pentru
aproape orice analiză biochimică
– cu dop verde deschis (conține heparinat de litiu s i un gel care separă
plasma de elementele figurate) – poate fi utilizat pentru aproape orice
analiză biochimică
– cu dop gri (conține KF si Na 2 EDTA) -utilizat la determinarea glucozei
Pentru alte tipuri de analize de laborator se utili zează recipientele:
– cu dop mov (conține ca anticoagulant EDTA) – se ut ilizează pentru
analizele hematologice din sânge integral (hemogram a, grupe
sanguine) dar și pentru determinarea hemoglobinei g licozilate
(parametru de evaluare a metabolismului glucidic)
– cu dop albastru (conține ca anticoagulant citratul de Na) – se utilizează
pentru testele de coagulare
– cu dop negru (conține ca anticoagulant citratul de Na) – se utilizează
pentru VSH
Pentru stocarea sângelui de la donatori se folosest e recipientul cu dop
galben, care conține ca anticoagulant ACD.
Recolatrea sângelui în vederea analizelor de labora tor se poate realiza:
 cu ajutorul siringii
 utilizand sistemul holder si recipiente vidate (va cutainere) – în prezent,
acest sistem tinde să înlocuiască recoltarea sângel ui cu seringa

Anticoagulanți

Anticoagulanții sunt substanțe care împiedică proce sul de coagulare a
sângelui. În procedurile de laborator clinic se uti lizează anticoagulanți sau
conservanți specifici pentru diferite determinări, deoarece unii pot să
interfereze pe parcursul testărilor, sau să modific e caracteristicile morfologice
ale elementelor figurate. Cei mai utilizați antico agulanți sunt prezentați în
tabelul 3.

Tabel 2. Anticoagulanți utilizați în tehnicile de laborator clinic
Anticoagulant Împiedică
coagularea prin: Potrivit pentru
determinarea de: Interferențe în
determinarea de:
Oxalat de Na, K,
Li legarea calciului fibrinogen, metaboliți Insulina, amilaza,
LDH, fosfataza acidă,
fosfatul anorganic,
electroliți, pH
Citrat de K, Na legarea calciului fibrinogen , VSH enzime, electroliți, pH

11
Anticoagulant Împiedică
coagularea prin: Potrivit pentru
determinarea de: Interferențe în
determinarea de:
EDTA sodic legarea calciului fibrinogen, metaboliți electroliți, calciu,
fosfataza alcalină,
creatinf osfokinaza
NaF, KF legarea calciului Glucoză (inhibă glicoliza
eritrocitară) electroliți, uree
Soluție ACD
(conține acid
citric, citrat
trisodic, glucoză legarea calciului enzime eritrocitare,
fosfataza acidă,
conservarea sângelui de la
donatori electroliți, glucoză,
metaboliți
heparinat de Na,
K, Li, sau
amoniu
(75 unități/ml
sânge) anticoagulant
natural metaboliți, enzime amoniac sanguin,
electroliți, timol,
tiroxina
fosfataza acidă

Prelucrarea sângelui pentru testarea biochimică
Testele biochimice sunt efectuate din sânge integral (exemplu,
hemoglobina glicozilată) sau din supernatantul sepa rat în urma centrifugării
eșantionului de sânge. Supernatantul separat prin c entrifugare poartă
denumirea de ser , dacă sângele a fost recoltat fără anticoagulant ș i se
numește plasmă , dacă sângele a fost recoltat pe anticoagulant. Sp re
deosebire de plasmă, în ser nu se găsesc factorii c oagulării (de exemplu,
fibrinogenul), deoarece aceștia au fost consumați î n procesul de formare a
cheagului de sânge.

Surse de eroare legate de recoltarea și prelucrare a sângelui
a) prerecoltare
– alimentația pacientului (recoltarea se face după u n post alimentar de
cel puțin 10 ore, cafeina crește glucoza și scade t impul Quick);
– medicația administrată (acidul ascorbic interferă cu determinarea
glucozei);
– felul sângelui recoltat (glucoza are valori mai mi ci în sângele venos
decât în sângele arterial, piruvatul și lactatul au valori mai mari în
sângele venos față de cel arterial);
– recoltarea de pe cateter este interzisă;
– anticoagulantul folosit.
b) postrecoltare
– timpul prelungit scurs de la recoltare și până la e fectuarea determinării;
– conservarea necorespunzătoare a serului sau a plasm ei;
– neefectuarea deproteinizării atunci când condițiile o impun;
– hemoliza (liza hematiilor), importantă pentru deter minările acelor
componente a căror concentrație diferă în ser față de eritrocite (lactat
dehidrogenaza, fosfataza acidă, ALAT, ASAT, potasiu ). Pe de altă
parte, culoarea hemoglobinei poate produce interfer ențe în cazul unor

12
determinări colorimetrice (bilirubină, colesterol). Hemoliza poate apărea
în: stări patologice, recoltare defectuoasă a sânge lui, separarea
defectuoasă a elementelor figurate de ser sau plasm ă;
– plasma sau serul icteric. Culoarea caracteristică a cestora interferă
semnificativ în determinările colorimetrice care se efectuează în
domeniul 400-500 nm (se face o probă martor a seru lui de a cărei
extincție se ține seama la determinare);
– plasma sau serul lipemic. Când concentrația lipidel or neutre din ser
depășește valoarea de 700 mg% serul apare opalescen t sau
lactescent. Dacă opalescența nu dispare în cursul d eterminării, citirea
extincției la spectrofotometru va fi eronată. În ac est caz se vor evita
determinările turbidimetrice (timol), iar pentru re stul determinărilor se va
se face o probă martor a serului de a cărei extincț ie se ține seama la
determinare.

Conservarea serului sau a plasmei sanguine
– se recomandă ca analizele biochimice să se efectuez e pe ser sau
plasmă provenite din sânge proaspăt recoltat;
– la temperatura laboratorului, timp de 4 – 6 ore de la recoltare, nu se
produc modificări notabile ale concentrației metabo liților și ale activității
enzimelor;
– serul sau plasma se pot conserva la + 4°C timp de 2 4 -36 ore, fără să
se producă modificări semnificative;
– pentru o conservare mai îndelungată serul și plasma se congelează
sau se liofilizează.
–
Deproteinizarea
O serie de metode de dozare a constituenților sangu ini necesită
obținerea unor lichide fără proteine. Deproteinizar ea se poate realiza prin
metode fizice și/sau chimice. În practica curentă d e laborator se realizează
deproteinizarea sângelui total, a plasmei sau a ser ului prin precipitarea
proteinelor sub formă de săruri insolubile.
Proteinele sunt ioni polivalenți, care se comportă la un pH < pH-ul
izoelectric ca și cationi, reacționând cu anionii. La pH > pH-ul izoelectric se
comportă ca și anioni, reacționând cu cationii. Pe această proprietate se
bazează deproteinizarea plasmei sau a serului. Func ție de pH-ul izoelectric al
proteinei se folosește:
– la pH < pI, acid tricloroacetic (TCA), acid perc loric, molibdat,
wolframat, etc.
– la pH > pI, diferiți cationi ai metalelor grele (zinc, bariu, mercur).
În ambele cazuri se obțin săruri insolubile. După deproteinizare se
procedează la filtrare sau centrifugare. Se obțin f iltrate neutre, acide sau
bazice, în funcție de reactivul utilizat. De exempl u:
a. Filtrat neutru – după Folin -Wu
Se folosește soluții de wolframat de sodiu 10% și a cid sulfuric 2/3N.

13
Modul de lucru: în eprubetă se pipetează:
– 1 vol. sânge, ser sau plasmă
– 7 vol. apă distil.
– 1 vol. wolframat 10%
– 1 vol. acid sulfuric 2/3N
Se agită bine, se lasă în repaus 5 minute, se centrifughează sau se
filtrează.
Filtratul se utilizează la dozări de uree, acid uri c, creatinină, glucoză,
aminoacizi, clor, azot restant.
b. Filtrat acid
Se folosește: acid tricloroacetic (TCA) 10% sau 20 %.
Modul de lucru: în eprubetă se pipetează:
a) – 1 vol. sânge, ser sau plasmă
– 4 vol. apă dist.
– 5 vol TCA 20%, sau:
b) – 1 vol. plasmă
– 1 vol. TCA 10%.
Se agită bine, se lasă în repaus 5 minute, se centrifughează sau se
filtrează.
Filtratul se utilizează la dozări de fosfor, sodiu, insulină, azot restant,
etc.
c. Filtrat alcalin după Somogy
Se folosește: ZnSO 4.7H 2O 10% și NaOH 0,5N (2%)
Modul de lucru: în eprubetă se pipetează:
– 1 vol. sânge
– 7 vol. apă dist.
– 1 vol. ZnSO 4.7H 2O 10%
– 1 vol. NaOH 0,5N
Se agită bine, se lasă în repaus 5 minute, se centrifughează sau se
filtrează.
Filtratul se utilizează la dozări de azot restant d eoarece precipitatul
înglobează acidul uric (și glutationul).
d. Deproteinizarea cu alcool – eter
Modul de lucru: In balon cotat de 25 ml se introdu c:
– 15 ml alcool / eter (3/1)
– 1 ml ser, adăugat în picături sub agitare.
Amestecul se plasează câteva secunde în baia de ap ă fierbinte. Se
răcește, apoi se completează la semn cu amestecul d e alcool / eter. Se
filtrează.
Filtratul se utilizează în special la determinări de lipide: acizi grași,
colesterol, lecitine, cefaline, etc.

Aplicație practică

14
a. Obținerea plasmei sanguine
Plasma sanguină este un lichid de culoare alb-gălb uie care se obține
prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat pe un anticoagulant .
Centrifugarea se face 10 minute la max. 2500 rpm. S edimentul este constituit
din elementele figurate iar supernatantul din plasmă.

Plasma = sânge – elemente figurate

Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se pipetează 3 ml sân ge recoltat pe
anticoagulant, se centrifughează 10 minute la 1500 rpm. Sedimentul obținut
este constituit din elementele figurate, iar supern atantul este reprezentat de
plasma sanguină.

b. Obținerea serului sanguin
Serul sanguin este un lichid limpede de culoare ga lben aurie. Spre
deosebire de plasma sanguină, acesta nu conține fib rinogen.

Ser sanguin = plasmă sanguină – fibrinogen

Serul sanguin se obține prin centrifugarea sângelui proaspăt recoltat
fără anticoagulant.

Mod de lucru
Într-un vacutainer care conține accelerator de coag ulare se pipetează 3
ml sânge și se centrifughează 10 minute la 1500 rpm . Sedimentul obținut
este constituit din cheag (format din rețeaua de fibrină și elementele figur ate),
iar supernatantul este reprezentat de serul sanguin . În unele situații, când
intervalul de timp dintre momentul recoltării în pr ezența acceleratorului de
coagulare și cel al efectuării analizelor din serul sanguin este mare,
realizându-se o separare perfectă a cheagului de se r, nu mai este necesară
efectuarea centrifugării.

15

Figura 36. Componentele sângelui, separate prin cen trifugare

În general, determinările biochimice efectuate pe s er sau plasmă sunt
asemănătoare, cu excepția unor enzime (fosfataza ac idă, LDH, aldolaza,
GOT, GPT) și a unor ioni (Mg 2+ , Ca 2+ , K +, Cl -) care se eliberează în timpul
coagulării din elementele figurate.

c. Deproteinizarea cu acid tricloracetic (TCA) 10%

Principiu
Proteinele din sânge, ser sau plasmă precipită cu T CA.
Reactivi
1. Soluție acid tricloracetic (TCA) 10%

Mod de lucru
Î ntr-o eprubetă de centrifugă se pipetează: 1 ml pla smă și 2 ml soluție
TCA 10%, se agită, se lasă în repaus 5 minute după care se centrifughează
10 minute la 2500 rpm. Supernatantul obținut se tre ce în eprubete de 160/16
mm prin aspirare cu pipeta sau prin decantare. Se f olosește la determinări de
fosfor, insulină, sodiu, fosfatază acidă, azot rest ant.

2. Urina. Recoltare. Conservare.

Urina este un lichid biologic, produs al excreție r enale, cu o compoziție
complexă, alcătuită din apă, substanțe minerale, su bstanțe organice. etc.
Compoziția urinii depinde de o serie de factori cum sunt: aportul exogen
(alimentație), metabolismul intermediar, starea de funcționare a unor organe
(rinichi, ficat), medicație etc. Urina excretată în condiții de funcționare
normală (fiziologică) a organismului are o compoziț ie și caracteristici fizico-
chimice bine determinate, acestea modificându-se, m ai mult sau mai puțin
profund, odată cu modificarea factorilor menționați . De aceea un examen de

16
laborator al urinii poate furniza clinicianului dat e utile privind atât explorarea
metabolismului intermediar cât și a funcției divers elor organe.
În decursul a 24 de ore compoziția urinei se modifi că, astfel încât există
mai multe modalități de recoltare a probelor de uri nă, în funcție de examenul
solicitat.
Colectarea urinii se face în recipiente de unică folosință, care, pe ntru
examenul bacteriologic, trebuie să fie sterile. Une ori este necesară utilizarea
unor recipiente închise la culoare deoarece unele s ubstanțe pe care vrem să
le determinăm (ca de exemplu, bilirubina, porfirine le) sunt sensibile la lumină,
iar expunerea lor conduce la rezultate false.

Astfel, în laboratorul clinic se pot analiza:
A. Prima urină de dimineața
 se folosește pentru determinările calitative (proteine, glucoză,
bilirubină, urobilinogen, corpi cetonici) în cadrul examenului sumar
de urină;
 este lipsită de influențele determinate de aliment ație și de eforturile
fizice;
 este mult mai concentrată decât urina din timpul z ilei, astfel încât
unele elemente anormale din urină care sunt prezent e în
concentrație redusă nu vor fi omise;
 nu se recoltează de la pacienții cu tratament diur etic intensiv datorită
diluției masive;
 se recoltează după toaleta organelor genitale exte rne cu apă și
săpun, evitând substanțele dezinfectante care pot l iza elemente ale
sedimentului urinar;
Mod de recoltare:
 prima parte a jetului urinar se aruncă în toaletă, deoarece poate fi
contaminată cu elemente celulare și bacteriene de l a nivelul tractului
urinar extern și de la nivelul organelor genitale e xterne (primul jet
este important pentru diagnosticul unor afecțiuni u retrale);
 din jetul mijlociu se recoltează o cantitate de cc a. 50 ml direct într-un
recipient special pentru examenul urinar, de unică folosință;
 în perioada menstruală, la femei, se recomandă fol osirea
tampoanelor intravaginale pentru a evita contaminar ea probelor de
urină cu eritrocite;
 la copii recoltarea probelor de urină se face în p ungi de plastic, de
unică folosință, prevăzute cu un dispozitiv adeziv.
B. Urina recoltată pe un interval de 24 h
 se folosește pentru determinările cantitative (proteine totale
urinare, glucide, electroliți, ș.a) pentru că subst anțele excretate sau
secretate de rinichi nu au același ritm de producer e în cursul zilei, iar
analiza unui eșantion de urină proaspătă nu este co ncludentă;

17
Mod de recoltare:
 se începe recoltarea dimineața la trezirea pacient ului și se termină a
doua zi la la aceeași oră
 prima urină de dimineață se aruncă în toaletă;
 întreaga cantitate de urină emisă ulterior se cole ctează într-un
recipient de volum mare, din polietilenă;
 a doua zi dimineață, prima urină se colectează sep arat, dar volumul
său se ia în calcul la stabilirea diurezei
 pentru a evita alterarea urinei se pot utiliza con servanți (ex. 5 ml
soluție timol în izopropanol 10 %);
 vasul se etichetează cu numele pacientului, ora la care a început și
s-a terminat recoltarea, analizele solicitate, volu mul de urină/24h;
 din volumul total de urină se eșantionează 50 ml ș i se predau
separat laboratorului, cu mențiunea volumului de ur ină emis în cele
24 ore (diureza).
C. Urină recoltată prin puncție suprapubiană – se folosește pentru
examenul bacteriologic și determinarea cantitativă a tuturor compușilor
biochimici.
Conservarea probelor de urină
 se recomandă analiza eșantionului de urină în max. 2-3 ore de la
recoltare, pentru a evita contaminarea bacteriană, distrugerea
cilindrilor și a elementelor sedimentului urinar;
 dacă nu se poate analiza în acest interval de timp , probele se pot
păstra la +4°C timp de 24-36 ore (se poate produce precipitarea
fosfaților și a uraților) sau se pot congela imedia t la -20°C,
păstrându-se timp mai îndelungat;
 substanțele conservante (ex. timol (1-2 g), toluen , xilen, cloroform (5-
10 ml), soluție timol 10% în cloroform (5-10 ml), f ormaldehida,
glutaraldehida) pot conserva probele de urină timp de câteva
săptămâni sau chiar luni de zile. Ele se introduc î n vasele în care se
colectează urina. Nu se utilizează cloroformul dacă se determină
glicozuria sau acetonuria, cloroformul fiind reducă tor.
 urina de 24h se poate depozita la frigider sau înt r-un container cu
gheață sau se pot utiliza conservanți.
 în cazul unui examenului bacteriologic (urocultura ) nu se pot utiliza
conservanți.
 Se utilizează conservanți speciali în funcție para metrii care urmează
a fi determinați: azidă de Na (10 mmol/l) – utilizată atunci când se
urmărește determinarea proteinelor, glucozei, amila zei, creatininei,
ureei (pH<7), acidului uric (pH>8); HCl 6 mmol/l sau timol 1% – în
determinarea fosfatului anorganic.

18
Aplicatie practica. Clarifierea urinii tulburi

Principiu
În cazul unor concentrații crescute de urați și/sau fosfați în urină,
aceștia vor forma un sediment după 24 h. În cazul î n care se efectuează
determinarea unor analiți din urină prin metode spe ctrofotometrice este
necesară clarifierea urinii, acest lucru realizându -se prin centrifugarea
acesteia.

Mod de lucru
Într-o eprubetă de centrifugă se introduc 10 ml uri na proaspătă și se
centrifughează 10 minute la 1500 rpm. Sedimentul ob ținut este constituit din
urați și/sau fosfați, iar supernatantul este reprez entat de urina limpede.