UNIVE RSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMAC IE GRIGORE T. POPA IAȘI NANOCAPSULE MAGNETICE BIOTINILATE PENTRU APLUCAȚII DE TI P TERANOSTIC Candidat, VLAD… [606392]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
GRIGORE T. POPA IAȘI

LUCRARE DE LICENȚĂ

Candidat: [anonimizat] : BIOINGINERIE
IAȘI, 2019

UNIVE RSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMAC IE
GRIGORE T. POPA IAȘI

NANOCAPSULE MAGNETICE
BIOTINILATE PENTRU APLUCAȚII
DE TI P TERANOSTIC

Candidat: [anonimizat],
Asist. Dr. Bioing. VERA BĂLAN

Facultatea de Bioinginerie Medicală
Specializarea : BIOINGINERIE

IAȘI, 2019

DECLARAȚIE

Subsemnatul, Ursachi Vlad -Constantin, student: [anonimizat], specializarea Bioinginerie ,
Facultatea de Bioing inerie Medicală , declar prin prezenta că lucrarea de licență cu titlul
”Nanocapsule magnetice biotinilate pentru aplicații de tip teranostic i” este scrisă de mine și nu a
mai fost prezentată niciodată la o altă specializare, facultate sau instituție de în vățământ superior
din țară sau străinătate. De asemenea, declar că studiul de literatură și datele experimentale
prezentate în lucrare sunt rezultatul propriei mele activități, iar sursele de informare consultate
sunt indicate în lucrare.

Iași,
Studen t Vlad -Constantin URSACHI

…………………………….
(semnătură în original)

Abrevieri
GDA – grad de deacetilare
RMN – rezonanța magnetică nucleară
TPL – titrarea potențiometrică liniară
1DUVS – spectroscopia ultravioletă derivată
Cs – Chitosan
PCs – Palmitoil ch itosan
CP – Clorură de palmitoil
IR – infraroșu
MM – masa moleculară
HMW – masa moleculară mare
LMW – masa moleculară mica
FDA – Feder ația pentru alimente și medicamente
TC – colesterol total
LDL – lipoproteine cu densitate scăzută
HDL – lipoproteine cu d ensitate ridicată
(a/u) – apă-în-ulei
(a/u/a) – apă-în-ulei-în-apă
ELH – echilibru li pofil/hidrof il
Span 80 – oleat de sorbitan
Span 85 – trioleat de sorbitan
Tween 80 – polisorbat 80 – Polioxietilen (20) sorbitan monooleat
Span 20 – sorbitan monolaurat
BSA – albumină bovină serică
UV – ultraviolet
PLGA – poli(lactidă -co-glicoidă)
PLA – poli(acid lactic)
PCL – poli--caprolactonă
TPP – tripolifosfat de sodiu
PDI- indice de polidispersitat e
Commented [A1]: Denumire IUPAC

CUPRINS

INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 1
CAPITOLUL 1. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 3
CHITOSANUL – POLIMER VERSATIL PENTRU APLICAȚII BIOMEDICALE …………………. 3
1.1 Chitosan. Structură. Proprietăți chimice ………………………….. ………………………….. ………………. 3
1.2 Gradul de deacetilare (GDA) ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 5
1.3 Masa moleculară (M M) ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 7
1.4 Structura moleculară a chitosanului ………………………….. ………………………….. …………………….. 8
1.5 Derivații chitosanului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 9
1.6 P roprietățile biologice ale chitosanului ………………………….. ………………………….. ……………… 10
1.7 Aplicații biomedicale ale chitosanului ………………………….. ………………………….. ………………. 13
1.8 Metode obținere a nanoparticulelor pe b ază de chitosan. ………………………….. ………………… 18
1.9 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 18
CAPITOLUL 2. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 20
OBȚINEREA DE NANO SISTEME PE BAZĂ DE CHITOSAN PRIN TEHNICA DUBLELOR
EMULSII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………… 20
2.1. Duble emulsii: generalități, scurt istoric. ………………………….. ………………………….. …………… 20
2.2. Influența agen ților tensioactivi asupra stabilității dublei emulsii ………………………….. …….. 23
2.3 Impactul agenților tensioactivi asupra eficienței încapsulării ………………………….. …………… 24
2.4. Tipuri de emulsii duble ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 24
2.5 Metode suplimentare de stabilizare a emulsiilor duble ………………………….. …………………… 25
2.6 Sinteza microparticulelor polimerice pr in emusii duble în două etape – metoda evaporării
solventului ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 26
2.6.1 Impactul dimensiunii fazei interne și medii în cazul microparticulelor polimerice ….. 27
2.6.2 Formarea microparticulelor pe baza de chitosan prin metoda dublelor emulsii ……….. 28
2.7 Nanocapsule. Sinteza nanocapsulelor polimerice. ………………………….. ………………………….. . 33
2.7.1 Sinteza nanocapsulelor prin polimerizarea monomerilor ………………………….. ………….. 34
2.7.2 Sinteza nanocapsulelor cu polimer preformat. ………………………….. …………………………. 35
2.8 Nanoparticule cu proprietăți superparamagnetice ………………………….. ………………………….. . 38
2.9 Eliberarea medicamentului ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 38
2.10 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 41 Commented [A2]: Adaptezi tu cuprinsul dupa recomandarile
mele

CAPITOLUL 3 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 43
SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA NANOCAPSULELOR BIOTINILATE MAGNETICE PE
BAZĂ DE CHITOSAN CU POTENȚIALE APLICAȚII DE TIP TERANOSTIC ………………… 43
3.1 Materiale și metode experimentale ………………………….. ………………………….. ……………………. 44
3.1.1 Materiale și reactivi utilizați ………………………….. ………………………….. ………………………. 44
3.1.2 Aparatura utilizată în sinteze ………………………….. ………………………….. ……………………… 46
3.2 Sinteza nanocapsulelor magnetice biotinilate ………………………….. ………………………….. …….. 48
3.2.1 Metoda generală de o bținere a N -palmitoil -chitosanului ………………………….. …………… 48
3.2.2 Obținerea polimerului N -palmitoil chtitosan biotinilat (BPCs) ………………………….. ….. 49
3.2.3 Metoda generală d e preparare a nanoparticulelor magnetice ………………………….. …….. 49
3.2.4 Metoda de preparare a nanocapsulelor ………………………….. ………………………….. ………… 51
3.3 Metode de caracterizare a polimerului ………………………….. ………………………….. ………………. 52
3.3.1 Evaluarea gradului de substituție prin metoda acidului trinitrobenzen sulfonic (TNBS)
………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 52
3.3.2 Evaluarea gradului si biotin ilare prin tehnica HABA -Avidină ………………………….. ….. 53
3.3.3 Testul de solubilitate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 54
3.4 Metode de caracterizare a nanocapsulelor magnetice ………………………….. ……………………… 54
3.4.1 Determinarea dimensiunilor nanocapsulelor ………………………….. ………………………….. .. 54
3.4.2 Determinarea potențialului Zeta ………………………….. ………………………….. …………………. 55
3.4.3 Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FT -IR) ………………………….. ……… 57
3.4.4 Determinarea capacității de eliberare a medicamentului in vitro ………………………….. .. 58
3.5 Rezultate și discuții ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………… 59
3.5.1 Evaluarea gradului de sustituție, de biotinilare și solubilitatea polimerului …………….. 59
3.5.2 Caracterizarea fizico -chimică a polimerului utilizat în formularea emulsiilor …………. 60
3.5.3 Prepararea structurilor de tip nanocapsule prin metoda emulsiei simple si emulsiei
duble. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………. 62
3.6 Concluzii ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 72
CONCLUZII GENERALE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………. 73
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. 75

1
INTRODUCERE

Nanoparticulele sunt adesea definite ca particule solide, coloidale cu masa moleculară
cuprinsă între 10 -1,000 nm. Termenul este un termen colectiv dat pentru orice tip de
nanoparticule de polimer, dar în mod special pentru nanosfere și nanocapsule. Nanotehnologia
este domeniul în cu rs de dezvoltare ce se ocupă cu obținerea de nanostructuri precum și cu
mijloacele necesare pentru a îmbunătăți diagnosticul și terapia deja existente.
Pentru obținerea acestor tipuri de nanosisteme, se utilizează biopolimeri, cel mai
frecvent chitosanul, datorită proprietăților fizico -chimice ale acestuia. Chitosanul este un
copolimer liniar semisintetic obținut prin deacetilarea alcalină a chitinei. Acesta prezintă
proprietăți remarcabile cum ar fi biocompatibilitatea, biodegrabilitatea, nontoxicitatea, activitatea
antibacteriană și mucoadezivitatea, caracteristici ce sunt urmărite în realizarea sistemelor de
eliberare a medicamentelor în condiții de siguranță și reducerea efectelor secundare la
internalizarea acestora în organism. În structura chitosanul ui se găsesc grupările active amino și
hidroxil ce permit modificarea chimică și controlul proprietăților fizice ale acestuia.
Derivații amfifili ai acestui copolimer prezintă un interes deosebit în generarea
sistemelor de eliberare controlată a medicament elor ce pot îngloba o cantitate de medicament
hidrofob precum paclitaxelul. Paclitaxelul este un medicament citostatic și citotoxic, utilizat în
tratarea diferitelor tipuri de cancer. Acesta se poate atașa chimic pe gruparea funcțională a
chitosanului și s e poate elibera într -un loc specific de acțiune.
Mai mult decât atât, un alt avantaj major pe care îl aduc nanocapsulele pe baza de
chitosan este faptului că în interiorul lor se pot introduce structuri nanometrice
superparamagnetice pe baza de oxid de fi er. Cu ajutorul acestor structuri, nanocapsulele
încărcate cu medicament se pot direcționa local cu ajutorul unui câmp magnetic extern.
Scopul lucrării de față este obținerea unor nanocapsule pe baza de N -palmitoil chitosan,
cu proprietăți magnetice prin t ehnică dublelor emulsii, pentru a îngloba în interiorul acestora
principii active terapeutice utilizate în terapia cancerului.
Această lucrare prezintă două părți distincte: partea I , o parte teoretică, unde se găsesc
date și studii care analizează faza ac tuală a cercetărilor privind proprietățile și avantajele
chitosanului în obținerea sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor, punând în evidență
utilizarea a 2 tehnici diferite de obținere, și anume emulsiile simple și emulsiile duble, și partea
a II-a, care redă partea experimentală, prezentând rezultatele originale obținute precum și
noutatea cu care contribuie această lucrare în domeniul nenotehnologiei.

2
Capitolul 1 , intitulat ” Chitosanul – polimer versatil pentru aplicații biomedicale”,
prezint ă informații generale despre obținerea chitosanului, proprietățile sale fizico -chimice și
biologice precum și diferite aplicații ale acestuia în domeniul biomedical.
Capitolul 2 , intitulat ” Obținerea de nanosisteme pe baza de chitosan prin tehnic a
dublelo r emulsii”, descrie tehnică de obținere a nanocapsulelor prin emulsii simple și emulsii
duble precum și tipurile de emulsii studiate până în prezent și metodele de stabilizare a acestora.
În capitolul 3 este redată partea experimentală unde sunt descrise me todele de obținere a
nanostruct urilor, materialele și aparatura utilizată, metodele de caracterizare și rezultatele
obținute î n urma studiului.

3
CAPITOLUL 1 .
CHITOSANUL – POLIMER VERSATIL PENTRU APLICAȚII
BIOMEDICALE

1.1 Chitosan . Structură. Proprietăți chimic e

Chitina este un polimer natural ce ocupă locul doi ca răspândire după celuloză. A fost
izolată pentru prima dată în 1811, din țesutul unei ciperci de catre Braconnot, un botanist
francez, care i -a conferit denumirea de “fungi”. Termenul de “chitină” este găsit ceva mai tărziu
de către O dier care obține un material asemănător, însă cu o duritate mai mare, din exoscheletul
unor insecte. Datorită insolubilității chitinei, aceasta nu prezintă o largă aplicabilitate și ca atare
este supusă unui proc es de deacetilare parțială într -un mediu puternic alcalin. Se obține astfel
chitosanul, o substanță des utilizată în agricultură, industria textilă, papetară,tratamentul apelor
uzate și mai nou în biomedicină sau farmaceutică.1
Chitosanul este un polimer semisintetic generat prin deacetilarea alcalină a chitinei, o
polizaharidă obținută din deșeurile de coajă de creveți, homari, krill și crabi . Acesta a fost utilizat
pe scară largă în aplicațiile medicale si farmaceutice datorită proprietăț ilor sale benefice, cum ar
fi: hidrofili citatea , biodegradabilitatea, biocompatibilitatea și netoxicitatea .2
Chitosanul este u n copolimer liniar conținând N -acetil -D-glucozamină și D –
glucozamină ca unități monomerice legate prin legături glucozidice β-(1-4).3 Extracția
chitosanului din chitină implică un mecanism de deacetilare (Figura 1.1) care implică elimina rea
grupării acetil prin tratarea chitinei cu NaOH concentrat pentru o perioadă lungă de timp, lăsând
în urmă predominant grupă ri (-NH 2). Pentru a ev ita reacțiile secundare nedorite, deacetilarea
chitinei se efectuează de regulă într -un mediu de azot sau prin adăugarea de borohidrură de sodiu
în soluția de NaOH care are un efect similar. Structura chitosanului este foarte asemănătoare cu
cea a celuloze i singura diferență fiind prezența grupării (-NH 2) în locul grupării (-OH) .4
Chitosanul și polizaharidele pot fi modificate chimic prin diverse căi pentru a le
îmbunătăți proprietățile în scopul satisfacerii anumitor cerințe specifice. Chitina și chitosan ul
sunt mai puțin susceptibili la potențiali reactanți decât celuloza, probabil datorită structurii
supramoleculare cristaline caracteristice, cu puternice legături intermoleculare.
Reacțiile chimice la care iau parte aceste două polizaharide se realizeaz ă de obicei cu
dificultate datorită solubilității și reactivității limitate ale acestora. Astfel, de cele mai multe ori,
reacțiile de modificare ale chitinei și chitosanului au loc în condiții heterogene.5 Commented [A3]: ???

4
Acest polimer versatil este comercializat într-o mare varietate de nume și este disponibil
fără prescripție medicală în magazinele pentru produse alimentare de sănătate și suplimente,
precum și pe multe site -uri online. Suplimentele pe bază de chitosan sunt foarte asemănătoare,
dar nu identice. Mai exact, ele diferă în funcție de gradul de deacetilare (GD A) și de greutatea
moleculară, proprietăți care au un impact direct asupra vâscozității soluției de chitosan și asupra
capacității sale de a capta grăsimi.6 În Figura 1.1 sunt ima gini de extracție a le chitinei.

Figura 1.1 Extracția chitinei din crustacee7

Apariția celor două unități de construcție monomerice (N -acetil -glucozamină și D –
glucozamină) este importantă pentru a determina dacă chitosanul este predominant un amfolit
(substanț ă care se poa te comporta atât ca acid, cât și ca baza) sau predominant un polielectrolit la
valori de pH acide. Compoziția chimică nu este importantă doar pentru proprietățile sale de
suprafață, ci și pentru a determina dacă și de ce chitosanul poate suferi o tranziție sol-gel. Mai
multe studii au arătat aplicații ale chitosanului în domeniile biomedicale, de exemplu, în
ingineria tisulară și eliberarea de medicamente dar și modificarea suprafețe lor unor sistemecu
scopul de a forma , stabiliza și destabiliza emulsii.8 În Figura 1.2 este reprezentată obținerea
chitosanului prin deacetilarea chitinei .

5

Figura 1 .2 Obținerea chitosanului prin deacetilare 9

1.2 Gradul de deacetilare (GDA)

În timpul procesului de deacetilare, grupările acetil din lanțul moleculei de chitin ă sunt
înlocuite cu grupări amino, GDA reprezentând numărul de unități de glucopiranoză cu grupări
N-acetil -aminice raportat la numărul de unități glucozaminice. Procesul se realizează progresiv
influențând proprietățile fizico -chimice și biologice.10
Chito sanul este solubil în condiții acide și rămâne în soluție atâta timp cât pH -ul este
menținut sub 6 -6,5. Cu toate acestea, atunci când pH -ul este crescut peste 6.5, chitosanul devine
insolubil și începe să precipite. Acesta este un dezavantaj major pentru a plicațiile biomedicale,
unde sunt necesare soluții apoase. Pentru a crește solubilitatea chitosanului la pH fiziologic,
există doi parametri cheie: greutatea moleculară și gradul de deacetilare . O reducere a greutății
moleculare poate îmbunătăți solubilita tea, dar acest lucru nu este suficient pentru a rezolva pe
deplin problema solubilității slabe sau insuficiente a chitosanului. Impactul gradului de
deacetilare asupra solubilității a fost studiat de Vårum și colab.11
Mai mult, GDA al chitosanului este un f actor determinant în biodegradabilitatea sa. Mai
multe studii au arătat că lizozimele vizează selectiv grupările acetil iar chitosanul cu un GDA
mai ridicat are o viteză de degradare mai lentă comparativ cu un chitosan foarte acetilat care este
degradat fo arte rapid.12 În ultimii ani, studiile de specialitate s -au concentrat asupra preparatelor
din chitosan cu un grad de deacetilare între 70 -95%. Pentru a se obține un grad de deacetilare în

6
acest interval, reacția de deacetilare nu este finalizată, ea se înt rerupe, lăsând o parte din
reziduurile de glucoză acetilata în polimer.13
GDA determină și aplicabilitatea biopolimerului modificându -i acestuia proprietățile
fizice, chimice și biologice. Există o multitudine de metode sigure și rapide de determinare a
GDA cum ar fi: rezonanța magnetică nucleară (RMN), titrarea potențiometrică liniară (TPL)
(Figura I.2.) , testul cu ninhidrină , spectroscopia IR și spectroscopi a ultravioletă derivată
(1DUVS) . Este importantă conversia masei de N -acetil -D-glucozamină și D -glucozamină în moli
deoarece acești monomeri au mase moleculare diferite. Se va calcula procentul de D –
glucozamină prezent în proba de chitosan de analizat pentru a estima mai precis GDA. Dintre
cele cinci metode, există corelație bună între 1DUVS și RMN. Prin urmare se recomandă
utilizarea 1DUVS ca metodă standard pentru determinarea gradului de deacetilare al Cs deoarece
tolerează unele impurități cum ar fi proteinele .14
În Figura 1.3 este prezentată d eterminarea gradului de deacetilare a l chitosanului,
măsu rat prin titrarea potențiometrică.

Figura 1.3 Determinarea gradului de deacetilare a chitosanului, măsurat prin titrarea
potențiometrică: barele verticale pe curbele de titrare reprezintă punctele care au fost acceptate
ca sfârșit al titrării libere de HCI.15

7
1.3 Masa mo leculară (M M)

Masa mol eculară a chitosanului (M M) este un factor important pentru caracterizarea
acestui polimer (Figura 1 .3.), însă slaba sa solubilitate și conținutul și distribuția grupărilor acetil
sunt obstacole majore pentru determinarea cantitativă a valorii acesteia. Din motive
termodinamice, solubilitatea polimerilor neutri scade cu M M. În cazul chitosanului, doi factori
joacă un rol adițional în acest proces: posibilitatea asocierii intercatenare prin legături de
hidrogen și caracterul polielectrolitic. Primul factor joacă un rol preponderent în cazul
chitosanului de M M foarte mare, iar cel de -al doilea explică insolubilitatea chitosanului în soluții
cu pH ridicat. În general, M M cuprinsă între 20 kDa și 190 kDa (LMW) și un GDA mai mic de
75% sunt caracteristicile chitosanului de M M mică, în timp ce chitosanul de M M mare prezintă o
MM cuprinsă între 190 kDa și 375 (HMW) kDa și un GDA mai mare de 75% .16
De asemenea, M M împreună cu gradul de deacetilare al polimerului, sunt r esponsabile
de comportamentul acestuia în mediul biologic în ceea ce privește stabilitatea coloidală, sarcina
de suprafață și mobilitatea electrocinetica. Pentru valori mici ale GDA (<20%) chitosanul
prezintă un comportament hidrofil, ceea ce va duce la fo rmarea unor structuri mai rigide, iar
pentru valori mai crescute ale GDA (>50%), molecula de chitosan devine parțial hidrofobă,
echilibrând interacțiunile de natură hidrofilă și devenind mai flexibilă.17
În Figura 1.4 sunt prezentate datele de difracție cu raze X ale nanocompozitelor pe bază
de aur și chitosan de mase moleculare diferite iar în Fi gura 1.5 sunt redate imaginile de
microscopie electroni că ale pulberilor de chitosan cu mase moleculare și densități diferite.

Figura 1.4 Difracția cu raze X a co mpozitelor pe bază de chitosan și nanoparticule de aur
sintetizate în prezență de chitosan de mase moleculare diferite 18

8

Figura 1.5 Imagini de microscopie electronică ale probelor de pulbere de chitosan;
(A, a) -30 kDa; (B, b) – 30 kDa densitate mare; ( C, c) -890 kDa; (D, d) -2100 kDa; (E, e) -2100 kDa
densitate înaltă.19

1.4 Structura moleculară a chitosanului

Structura moleculară a chitosanului este reprezentata de o grupare amino legata la (C2)
și două grupări hidroxil (C3 și C6), care formează legătur i intermoleculare de hidrogen ce
determină stabilitatea polimerului (Ríos -Donato et al., 2006).20 Datorită structurii semicristaline
a chitinei precum și a procesului de deacetilare parțială, chitosanul prezintă o distribuție
eterogenă a grupelor acetil de -a lungul lanțului polimeric.
În general, chitosanul prezintă trei forme de structură cristalină: chitosan hidratat,
deshidratat și necristalin .21 Structura cristalină a chitosanului hidratat este de dublu helix, care
poate fi convertită la o formă deshidr atată, foarte asemănătoare cu formă hidratată, dar cu
ambalare și conținut molecular de apă destul de diferit. Formă hidratată (antiparalelă) este
stabilizată prin legături de hidrogen intramoleculare22, intermoleculare23 și prin punți de hidrogen
care impli că moleculele de apă. Trecerea de la forma hidratată la forma deshidratată impune
scindarea legăturilor de hidrogen dintre lanțurile moleculare antiparalele și formarea de noi
legături între lanțurile polimerice paralele.24 Comercial, chitsanul este prezent at ca un polimer
solid, semicristalin sub formă de pudră de diverse granulații.

9
1.5 Derivați i chitosanului

Chitosanul este ușor de manipulat structural și la suprafață, în funcție de aplicabilitatea
dorită. Chitosanul și derivații săi sunt considerați pr omotori ai diverselor activități biologice,
incluzând efectele antioxidante, antihipertensive, antiinflamatorii, anticoagulante, antitumorale,
antimicrobiene, hipocolesterolemice și antidiabetice. Deși structura primară a chitosanului este
formată din unit ăți de β -1,4-D-glucozamină acetilate, numele de chitosan este de fapt un termen
colectiv ce definește chitine cu diverse grade de deacetilare și care diferă din punct de vedere al
cristalinității, caracteristicilor optice, gradului de acetilare, conținutul ui de impurități și a masei
moleculare.25
Majoritatea polizaharidelor, printre care și chitosanul, se modifică chimic prin diverse
căi pentru a le îmbunătăți caracteristicile, în funcție de scopul în care urmeaz a fi utilizate.
Chitina și chitosanul sunt ma i utilizați în aplicațiile biomedicale deoarece sunt mai puțin
susceptibili la potențiali reactanți decât celuloza, probabil datorită structurii supramoleculare
cristaline caracteristice, cu puternice legături intermoleculare. Reacțiile chimice la care iau parte
aceste două polizaharide se realizează de obicei cu dificultate datorită solubilității și reactivității
limitate ale acestora. Astfel, de cele mai multe ori, reacțiile de modificare ale chitinei și
chitosanului au loc în condiții heterogene.26,27

Tabelul 1.1 Exemple de aplicații ale derivaților de chitosan 1,5-K. Kurita
R.A.A. Muzzarelli
CHITOSANUL RETICULAT ȘI APLICAȚIILE SALE
Gruparea reticulată Sisteme de eliberare controlată Alte aplicații
Carboximetil Gel injectabil pe ntru eliberarea susținută
a morfinei si cu viteză scăzută a
gentamicinei Agent reparator în reducția
pungilor periodonale.
Filme pentru conservarea
fructelor
Gel sau soluție pentru
prevenirea adeziunii eritoneale
postchirurgicale
Fructoză – Matrice pentru atașarea
hepatocitelor

10
2-hidroxietil
metacrilat Filme sangvino -compatibile pentru
eliberarea controlată a glucozei –
Acid palmitic Hidrogel pentru eliberarea controlată a
Rhodaminei B –
Aldehidă Hidrogeluri pentru eliberarea controlată
de medicamente Adeziv biologic pentru
țesuturi moi
Alchil Hidrogel erodabil pentru eliberarea
controlată de medicamente Stabilizator de emulsii
Poli(etilen glicol) Particule gelifiate pentru eliberarea
insulinei sau a N -fenil-1-naftilaminei –
Acid lactic -glicolic Hidrogeluri pentru eliberarea controlată
de medicamente la nivel gastric –
Poli(etilen glicol) –
galactozil Particule gelifiate utilizate ca
transportori genetici pentru eliberarea
țintită la nivelul hepatocitelor –

1.6 Proprietățile biologice ale c hitosanului

Din punct de vedere al proprietăților biologice, chitosanul este un polimer non -toxic și
biocompatibil aprobat de Feder ația pentru alimente și medicamente (FDA ) pentru utili zarea în
vindecarea leziunilor. 28Acesta are un efect regenerativ asupr a țesuturilor conjunctive gingivale,
poate fi folosit ca imunoadjuvant, are proprietăți antitumorale și accelere ază procesul de
osteogeneză.29 În plus, s -a demonstrat că chitosanul poate fi folosit ca excipient netoxic în
diverse formulări farmaceu tice.30 Atât chitosanul cât și derivații acestuia prezintă activitate
toxică asupra unor bacterii31, fungi32 și paraziți ,33 această proprietate p utând fi exploatată în
tratamentul unor b oli infecțioase.
Biodegrabilitatea chitosanului este o proprietate importantă cu ro l în comportamentul
acestui polimer în interiorul organismului uman, unde chitosanul este supus atât degradării
chimice cât și celei enzimatice. Degradarea chimică are loc în stomac, în prezența acidului
clorhidric în timp ce degradarea enzimatică este rea lizată de lizozim, o enzimă prezentă în
organismul uman. Polimerii biodegradabili sunt utilizați pe scară largă în prepararea
nanoparticulelor, datorită capacității lor de a se degrada în organism. Mecanismul de

11
biodegradare al chitosanului și al derivațil or săi nu este pe deplin elucidat; orice modificare
chimică a chitosanului poate influența biodegradarea enzimatică și biodistribuția acestui polimer
atunci când este utilizat in vivo deoarece anumite modificări ale chitosanului pot duce la
formarea unor c ompuși mai mult sau mai puțin toxici.34
Biocompatibilitatea chitosanului a fost testată de VandeVord și colab. în 2001 în
numeroase studii cu ajutorul unor matrici poroase ce s -au implantat la șoareci. Animalele au fost
sacrificate și analizate la intervale de 1,2,4,8 și 12 săptămâni. Analiza histologică a țesuturilor a
arătat o acumulare de celule neutrofile în zona implantului, acumulare ce a dispărut în timp
(Figura 1.5). Analiza microscopică a arătat că nu există răspunsuri inflamatorii patologice.
Testel e de colorare Gram și limulus nu au evidențiat nici o dovadă de infecție sau endotoxină.
Răspunsurile imunitare celulare au fost determinate cu ajutorul unor analize de proliferare a
limfocitelor și răspunsuri ale anticorpilor, măsurate folosind tehnicile ELISA. În urmă acestor
analize, s -a indicat o incidență foarte scăzută a reacțiilor adverse ale chitosanului. Deși a existat o
migrație a neutrofilelor în zona de implantare, nu a existat nicio reacție inflamatorie asupra
materialului implantat. În concluz ie, chitosanul este un polimer biocompatibil și poate fi utilizat
în dezvoltarea materialelor implantabile.35 În Figura 1.6 este prezentată histologia țesuturilor din
jurul unui implant la anumite interval e de timp .

Figura 1.6 Histologia implanturilor: Pata lui Wright (mărime originală × 10) afișând celulele cu
albastru și chitosanul cu roz la (a) săptămâna 1 și (b) săptămâna 12. Pata de hematoxilina și
eozina Carazzi (mărime originală × 40) la (c) săptămâna 1 și (d) săptămâna 12.27- VandeVord

12
Referitor la citocompatibilitate , sunt studii ce raportează interacțiunea unor filme de
chitosan cu celule de tip keranocite și fibroblaste. Nu s -a raportat nicio alterare morfologică sau
reacție alergică și nici inflamatorie după implantarea, injectarea, administra rea topică sau
ingestia chitosanului.36
Hemocompatibilitatea se referă la toleranța sângelui față de diferite materiale37. Pentru
ca un polimer să fie hemocompatibil, acesta trebuie să fie capabil să mențină controlul proceselor
de coagulare și inflamație la contactul lui cu sângele in condiții hemodinamice.38 Un polimer
hemocompatibil este un material hidrofil, neutru din punct de vedere electric ce posedă legături
acceptoare de hidrogen. În practică, polimerii ce intră în contact direct sau indirect cu sânge le,
rapid sau lent, pot fi dăunători sau chiar letali. Prin urmare un polimer hemocompatibil nu
trebuie să fie trombogenic și non -hemolitic.39 În ultimii ani s -au făcut progrese majore în ceea ce
privește acest domeniu, dezvoltându -se derivati ai chitosanul ui cu hemocompatibilitate crescută
însă utilizarea chitosanului în contact cu sângele este limitată. Majoritatea testelor au rămas la
nivel de laborator întrucât necesită mai multe studii pentru a definitivă acest aspect.40
Exista studii cu privire la toxic itatea in vitro a chitosanului. Acestea au raportat că
toxicitatea chitosanului cu GDA crescut este dependentă de MM și concentrație în timp ce
chitosanul cu GDA mic prezintă o toxicitate mult mai scazută și mai puțin dependentă de MM.41
Hirano și colab. au studiat toxicitatea chitosanului pe o perioadă de 65 zile și au raportat că nu s –
a înregistrat nici un efect toxic asupra organismului după administrarea intravenoasă a
oligozaharidelor. Dozele de oligozaharide administrate au fost cuprinse în intervalul de 7.1 –8.6
mg/kg, timp de 5 zile .42 Rao și colab. nu au observat efecte toxice semnificative după testele de
toxicitate acută la șoareci, nici iritații ale ochilor sau ale pielii la iepuri și respectiv porci de
guineea. Concluziile acestui studiu au fost că chitosanul nu este pirogenic.43
Activitatea antibacteriană a chitosanului a fost observată într -o gamă largă de
microorganisme, inclusiv ciuperci, viruși și bacterii. Există studii privind inhibarea creșterii
Salmonella typhimurium și Staphylococcus aureu s 44, Pseudomonas fluorescens și Escherichia
coli 45 și Listeria monocytogenes .46 Această proprietate a favorizat utilizarea chitosanului în
conservarea alimentelor și în medicină. Totuși, o astfel de proprietate este influențată de diferiți
factori cum ar fi : masa moleculară, GDA, gradul de polimerizare, condițiile mediuliu47. O
caracteristică importantă a chitosanului este încărcătura pozitivă pe care o obține molecula în
medii ușor acide (pH 5,5), aceasta se datorează protonării grupării amino prezente în mo nomerii
de glucozamină, facilitând solubilitatea acesteia în medii apoase și oferindu -i proprietăți
biocide.48

13
Activitate a hipo lipidic ă este proprietatea chitosanului de a reduce nivelul de colesterol
la animale și la oameni. În studiile efectuate pe șobola nii Sprague -Dawley, rezultatele au arătat
că acest biopolimer reduce colesterolul total ( TC) și lipoproteinele cu densitate scăzută (LDL) și
crește cantitatea de lipoproteine cu densitate ridicată HDL .49 Într-un alt studiu in vitro realizat în
tractul gastr ointestinal uman r eplicat, s-a arătat că proprietatea chitosanului de a lega grăsimi este
legată de greutatea sa moleculară și morfologia particulelor de c hitosan.50 De asemenea, s -a
constatat că acesta se leagă în mod eficient la colesterol și sărurile bil iare. Prin urmare,
chitosanul poate fi utilizat în tratamentul obezității la persoanele cu un consum mare de grăsimi ,
însă există studii clinice insuficiente privind utilizarea acestuia ca supliment alimentar pentru
reducerea gre utății corporale .

Tabelul 1.2 Pricipalele proprietăți ale chitosanului în funcție de aplicațiile acestuia51
APLICAȚII BIOMEDICALE PROPRIETĂȚI
Eliberare controlată de medicamente Nontoxicitate, toleranță biologicță
Implanturi dentare Biocompatibilitate
Suturi chirurgicale Biocompa tibilitate
Inginerie tisulară Posibilitatea de înlocuire
Reconstrucție osoasă Formare de filme
Încapsulare de principii active Hidrolizare de către lizozim
Proprietăți de vindecare a rănilor
Eficiență împotriva bacteriilor și virușilor

1.7 Aplicații b iomedicale ale chitosanului

Chitosanul are numeroase aplicații în diverse domenii (agricultură, alimentație, tratarea
apelor, aplicații biomedicale și biofarmaceutice). Acționează ca agent de floculare pentru a
purifica apa reziduală, ajută la îndepărtarea ionilor metalici, acționează ca agent de îngroșare și
stabilizare pentru diverse produse alimentare, este considerat a fi hemostatic și anticoagulant și,
prin urmare este utilizat în suturi chirurgicale, implanturi dentare și substrat pentru p iele
artificială.52
Majoritatea stistemelor ce au ca scop transportul de medicamente, au fost concepute
având un înveliș ce posedă sarcina electrică negativă, care se datorează polim erilor poliesterici
utilizați53 sau compusilor lipidici54. De exemplu, în caz ul unei suspensii apoase, factorul ce ajută

14
la menținerea stabilității sistemului este prezența sarcinii negative la nivelul
particulelor. Alternativa cea mai eficientă pentru a obține o bună interactionare cu organismul și
pentru a facilita capacitatea de transport, este conceperea unui înveliș modificat cu scopul
obținerii unei sarcini pozitive55, sau utilizarea unui polimer cationic pentru conceperea peretelui
extern, așa cum este chitosanul.56
Există anumiți factori limitativi în ceea ce privește utilizar ea și realizarea de noi
materiale bazate pe chitosan cum ar fi: absorbia apei, stabilitatea mecanică, solubilitatea slabă
mai ales în condiții acide, fapt ce compromite funcționalitatea și biocompatibilitatea sa. Pentru a
realiza sisteme mai stabile chimic si mecanic pe bază de chitosan, s-au propus o serie de
modificări. Astfel, proprietățile fizice și chimice ale chitosanului pot fi controlate cu ușurință,
prin modificări chimice sau reticulări, în scopul folosirii acestui polimer în formularea de sisteme
de eliberare controlată a medicamentelor sau cuplarea acestui polimer cu dive rse substanțe
biologice active.57
S-au raportat numeroase studii recente care descriu noi sisteme de eliberare pe bază de
chitosan, acestea concentrându -se pe calea de administr are orală58, parenterală, transdermală,
nazală59, oftalmică, pulmonară60 bucală, oculară, gastrointestinală, transdermală, vaginală,
cervicală și intrauterină. Pentru aplicațiile biomedicale este esențială proprietatea de bioadeziune
a chitosanului, proprieta te care determină prelungirea perioadei de eliberare a principiului
activ.61
Pentru a se obține diferite tipuri de sisteme de eliberare controlată a medicamentelor,
chitosanul poate fi procesat în diferite forme: nanoparticule, nanocapsule, hidrogeluri, fil me,
bureți, nanotuburi, etc.
Nanoparticulele polimerice sunt particule solide, coloidale cu dimensiuni cuprinse
între 10 -1,000 nm Acestea s -au sintetizat utilizând diverse metode în funcție de necesitățile
aplicării și tipului de medicamente care urmează să fie încapsulat. Nanoparticulele polimerice
biodegradabile sunt extrem de utilizate deoarece prezintă multe avantaje , oferind proprietăți cu
eliberare controlată / susținută, dimensiune subcelulară și biocompatibilitate cu țesuturile și
celulele. În plus , acestea sunt stabile în sânge, netoxice, biodegradabile, nontrombogenice,
neimunogenice, neinflamatoare și nu activează neutrofilele .62
În Figura 1 .7 sunt redate n anoparti cule pe bază de chitosan obținut e prin metoda
gelifierii ionice .

15

Figura 1.7 Fotografie TEM a nanoparticulelor de chitosan , obținute prin gelifiere ionică cu
tripolifosfat de sodiu .).63

Nanocapsulele si nanosferele sunt sisteme veziculare vizibile la scară
nanometrica alcătuite dintr -o membrană ce încapsulează un miez lichid în interi or respectiv pe
suprafață . Medicamentul încapsulat poate fi eliberat prin difuzie de la nivelul nanosferelor
acestea având o structura poroasă . În domeniul biomedical, acestea sunt utilizate pentru a îngloba
principii active și pentru a elibera controlat principiul activ . Beneficiile principale ale acestor
nanosisteme îl reprezintă protecția substanțelor înglobate față de mediul exterior și potențialul
de a dirija principiile active local.64 În Figura 1.8 sunt reprezentate 2 tipuri de sisteme de
eliberare controlată a medicamentelor: nanocapsule și nanosfere.

Figura 1.8 Structura diferită a nanocapsulelor și nanosferelor .65
În Figura 1.9 sunt reprezentate 2 mecanisme de încapsulare a medicamentelor . Commented [A4]: Lasi doar referinta

16
În Figura 1.9 sunt reprezentate 2 tipuri de sisteme de el iberare controlată a
medicamen telor: nanocapsule și nanosfere și mecanismele de încapsulare.

Figura 1.9 Mecanisme de încapsulare: medicamentele absorbite în interior și absorbite pe
suprafață. a) nanocapsule b) nanosfere.66

Membranele pe bază de chitosan sunt sisteme de eliberare contr olată a medicamentelor
care sunt folosite datorită proprietăților antibacteriene și de regenerare a țesuturilor chitosanului
și datorită oportunității de a se forma filme. Filmele sunt sisteme cu proprietati mecanice bune
iar structura lor poate prezen ta sau nu porozitate.67
Hidrogelurile sunt rețele tridimensionale alcătuite din polimeri sintetici sau naturali
care conțin cantități mari de apă și pot fi utilizate în diverse domenii. Recent , hidrogelurile
compozite au primit o atenție deosebită datorită costului de producție relativ scăzut și a
capacității mari de adsorbție. Încorporarea materialelor anorganice este o abordare promițătoare
pentru creșterea rezistenței termice, chimice și mecanice a hidrogelurilor, dar trebuie n otat că
aplicabilitatea hidrogelurilor compozite depinde de stabilitatea particulelor încorporate în acest
mediu. De exemplu, majoritatea studiilor arată că, în condiții de pH extrem, nanoparticulele
magnetice se dizolvă într -o oarecare măsură.68
În Figura 1.10 este prezentat starea un ui hidrogel injectabil pe bază de chitosan la
diferite temperaturi.

17

Figura 1.10 Formarea hidrogelului pe bază de chitosan injectabil. (A) Starea soluției la 4 ° C.
(B) Starea hidrogelului la 37 ° C.69

Bureții și matricile pe bază de chitosan reprezintă biomateriale adecvate pentru o serie
de aplicații ale ingineriei tisulare, cum ar fi: substituienții cutanați sau grefele vasculare în timp
ce tuburile din chitosan sunt sisteme de eliberare controlată sub formă de rezervoare ce
încapsulează medicamente fiind plasate la nivelul creierului după rezectia tumorii cerebrale.70
În Figura 1.11 sunt prezentate câteva din posibilele formulări ale chitosanului utilizate
ca sisteme de eliberare controlată.

Figura 1.11 Formulări ale chit osanului utilizate ca sisteme de eliberare controlată.71

18

1.8 Metode obținere a nanoparticulelor pe bază de chitosan.

Metodele de obținere a nanoparticulelor pe bază de chitosan includ: metoda miceliilor
reversibile, ge lifierea ionică, "spray -drying" , metoda reticularii în emulsie, coalescența
picăturilor de emulsie. Aceste metode se aleg în primul rând în funcție de dimensiune, de
stabilitate, de aplicabilitate, biocompatibilitate și de toxicitatea compusilor utilizați. De
asemenea, metoda de preparare se alege în funcție de scopul urmarti și avantajele tehnologice pe
care acestea le aduc. Fiecare proces de sinteză este caracterizat de parametrii specifici.
Tehnica miceliilor reversibile presupune realizarea unei emulsii apă-în-ulei (a/u) dintr -o
fază org anică și una apoasă din care ulterior se extrag particule foarte mici cu o distribuție
dimensională într -un domeniu foarte îngust.72
Metoda gelifierii ionice constă în modificarea chitosanului cationic preparat într -o
soluție acidă cu macromolecule anionice . Gelifierea ionică a chitosanului are loc datorită
form ăriicomplexului dintre macromoleculă anionică și chitosan ul cationic prin forțe
electrostatice. În cele din urmă nanoparticulele sferice se formează prin precipitare.73
Metoda " spray-drying" este utili zată pentru obținerea granulelor și pudrelor. Tehnica
constă în amestecarea unor picături atomizate cu un gaz de uscare pentru a evapora faza lichidă
din picături și totodată formându -se nanoparticule.74
Metoda reticularii în emulsie are la baza prepararea unei emulsii a/u, în care în faza
uleioasă este adăugat ă o soluție apoasă de chitosan , un surfactant adecvat pentru a stabiliza
picăturile din emulsie și un agent de reticulare (ex. g lutaraldehida ). Acest principiu se bazează pe
interacțiunile grupărilor a mino ale chitosanului cu grupările aldehidice.75 Coalescența picăturilor
de emulsie presupune amestecarea a două emulsii a/u (w/o) stabile: una ce conține chitosan cu
medicament iar cealaltă un stabilizator. În timpul amestecării, picăturile ambelor emulsii se
contopesc pentru a forma nanoparticule.76

1.9 Concluzii

În concluzie, chitosanul este un copolimer liniar semisintetic de interes major în
aplicațiile biomedicale datorită proprietăților sale imunologice, de biocompatibilitate,
biodegrabilitate, hemoc ompatibilitate și nontoxicitate. Acest biopolimer deschide orizonturi noi

19
în ceea ce privește evoluția diagnosticarilor și videcarilor multor boli precum cancerul. Gradul de
deacetilare are un rol extrem de important în definirea proprietăților fizico -chim ice și
dimensiunilor nanostructurilor formate. Chitosanul poate fi modificat chimic datorită grupărilor
sale active: -NH2 și -OH diversificând asfel domeniul de aplicabilitate al acestuia.
Acest polimer este foarte versatil și se comercializează într -o gam a largă de nume și este
disponibil fără prescripție medicală în magazine pentru produse alimentare și de sănătate.
Compoziția chimică nu este importantă doar pentru proprietățile sale de suprafață, ci și pentru a
determina dacă și de ce chitosanul poate su feri o tranziție sol -gel.
Masa moleculară este o caracteristică ce nu poate fi trecută cu vederea influențând
comportamentul chitosanului în mediul biologic, în ceea ce privește stabilitatea coloidal, sarcina
de suprafață și mobilitatea electrolitică.
Un alt avantaj major adus de acest polimer este faptul că se pot obține diferite tipuri de
sisteme de eliberare controlată a medicamentelor, putând fi procesat în diferite forme cum ar fi:
nanoparticule, nanocapsule, hidrogeluri, filme, bureți, nanotuburi, me mbrane, pansamente etc.

20
CAPITOLUL 2 .
OBȚINEREA DE NANOSISTEME PE BAZĂ DE CHITOSAN PRIN
TEHNICA DUBLELOR EMULSII

2.1. Duble emulsii: generalități, scurt istoric.

Emulsiile sunt definite ca sisteme lichide multifazice alcătuite din apă, ul ei și
surfactanți. Acestea se constituie în lichide unice, relativ izotropice și stabile din punct de vedere
termodinamic. În general, emulsiile pot fi simple sau multiple, acest aspect fiind stabilit în
funcție de aplicabilitatea acestora. Pentru a se for mula emulsii cu aplicație în eliberare de
medicamente, se urmărește încetinirea destabilizării cinetice cu ajutorul unor agenți tensioactivi
de suprafață deoarece emulsiile sunt structuri cu o stabilitate limitată. Formarea acestor sisteme
este un proces f oarte complex ce implică construcția și stabilizarea unei interfețe între ulei și apă.
Tipul de emulsie este influențat de o serie de factori cum ar fi: tipul agentului tensioactiv utilizat,
cantitatea acestuia, temperatura, surfactantii, raportul apă/ulei .
Există un interes aparte în ceea ce privește emulsiile duble datorită morfologiei unice
ale acestora, făcându -le suporturi generale multifuncționale capabile să încapsuleze atât molecule
hidrofile cât și lipofile în aceleași particule. În ultimul secol, s-au urmat două metode diferite
pentru a pregăti dublele emulsii: așa -numitele procese "într -un singur pas" și "în două etape".
Metoda în "două etape" constă în efectuarea succesivă a două emulsificări diferite, proces ce este
mult mai eficient deoarece es te mai simplu de realizat, optimizat și controlat. În ultimii ani, acest
principiu s -a dezvoltat odată cu apariția noilor tehnologii. Parametrii importanți ce influențează
morfologia, proprietățile și stabilitatea compusului ca sistem de administrare a med icamentelor
precum si pregătirea acestor emulsii sunt: agenții tensioactivi, polimerii amfifili, stabilizarea
interfeței, fracția volumica ș.a.
Discuția a fost extinsă și asupra microparticulelor și nanoparticulelor polimerice
realizate prin difuzie cu so lvenți. În urma numeroaselor studii efectuate, s -a demonstrat că pe
baza emulsiilor duble realizate prin proces în două etape, există și aici parametri ce influențează
formularea și prelucrarea micro și nanoparticulelor formate. De asemenea, proprietățile
polimerilor utilizați în matricea microparticulelor (greutate moleculară, natura chimică) au un
impact major asupra produsului final.77
O astfel de structură s -a demonstrat a fi foarte eficientă deoarece reușește să încapsuleze
molecule uniforme incompati bile foarte diferite (de exemplu: hidrofobe și hidrofile) într -un

21
purtător unic. Aceste sisteme sunt de un interes major în formarea de produse farmaceutice78,
transportul de principii active, substituenți ai sângelui79, vaccinuri80, vitamine81 și enzime82. Au
existat multe încercări și metode de realizare a acestor tipuri de sisteme iar cea mai eficientă s -a
dovedit a fi cea în două etape, de aceea este necesară cunoașterea amănunțită a acestor ''două
etape'' pentru prepararea, adaptarea și optimizarea emulsiil or duble.
În literatură s -au analizat câteva aspecte referitoare la anumiți factori de influență cum
ar fi: stabilitatea structurală83, fenomenul de transport între diferite faze84, duble emulsii bazate
pe polimeri purtători85, formularea microfluidica a dubl elor emulsii86. Emulsiile duble au fost
prezentate în premieră în 1925 de William Seifriz87 ,fiind incluse în lucrările de cercetare ce
investighează impactul densității de ulei asupra tipului de emulsie formată.
În Figura 2.1 este prezentată o dublă emulsie sau emulsie "apă în ulei în apă" (a/u/a).
Aceasta constă în picături de apă dispersate în ulei sau globule de ulei/polimer, care la rândul lor
sunt dispersate într -o faza apoasă.

Figur a 2.1 Structura unei duble emulsii 63 Shukai Ding, Christophe A

Primul model de emulsie dublă raportat a fost preparat din ulei de paie (cu o densitate
de 0,882 kg.L-1) prezentând un comportament atipic deoarece a format un sistem complex
grosier de forma unei emulsi i ulei-în-apă cu globule de ulei de aproximativ 1mm, înc apsulate

22
într-o emulsie fină apă -în-ulei. Aceste picături duble s -au destabilizat rapid și s -au transformat în
emulsii simple, fenomenul fiind considerat o stare tranzitorie instabilă între emulsiile de tip apă –
în-ulei și ulei -în-apă.88 Motivele acestei ins tabilități intrinseci au fost explicate cu ajutorul fizicii,
adică provocată de presiunea osmotică și de presiunea Laplace. Diferența concentrației dizolvate
dintre apa din interior și fazele apoase continue induce o migrare a apei între aceste două faze
pentru a reechilibra presiunea osmotică. Presiunea osmotică mai mare din faza externă duce la
umflarea picăturilor din interior în timp ce presiunea osmotică scăzută din interior duce la
contracția picăturilor.
În concluzie, concentrația și presiunea osmot ică sunt niște parametri cruciali în ceea ce
privește stabilitatea emulsiei duble deoarece presiunea Laplace ( cea care ține de picături) induce
o presiune foarte mare în interiorul picăturilor de apă în comparație cu picăturile de ulei. Această
diferența d uce la o reechilibrare a presiunii și în cele din urmă la ruperea structurii de dublă
emlsie. 89 Cu toate acestea, principalul avantaj al emulsiilor duble constă în posibilitatea pe care o
oferă pentru încapsularea mai multor tipuri de molecule simultan.
În 1976, Matsumoto și colab. au raportat procedura standard de emulsificare în două
etape pentru prepararea emulsiilor duble (figura 2.2). Mai întâi, o emulsie a/u este pregătită în
conformitate cu regula Bancroft, iar apoi emulsia dublă a/u/a este obținută prin utilizarea fostei
emulsii a/u ca fază uleioasă pentru a două etapă de emulsificare. De atunci, metoda de
emulsificare în două etape a devenit metoda cea mai răspândită pentru obținerea de emulsiilor
duble.90 În figura 2.2 este prezentată procedura de emulsificare în două etape.

Figura 2.2 Emulsificarea în două etape . 63 Shukai Ding, Christophe A

23
Pe de altă parte, procedeul obținerii dublei emulsii prin metoda într -un singur pas a atras
întotdeauna atenția datorită simplității procesului de formare cu toate că dezavantajul cel mai
mare este capacitatea scăzută de încapsulare.91

2.2. Influența agenților tensioactivi asu pra stabilității dublei emulsii

În metoda obținerii dublelor emulsii în două etape, alegerea agenților tensioactivi este
una extrem de importantă deoarece aceștia determina stabilitatea produsului final. În principiu,
pentru prepararea emulsiilor primare a/u, trebuie ales un surfactant lipofil / hidrofob caracterizat
printr -o valoare ELH (echilibru liofil/hidrof il) mai mică de 7, în ju r de 3 -4. Se f olosește o valoare
scăzută a ELH -ului deoarece picăturile emulsiei primare sunt adezive și supuse flocularii
(coagulare sub formă de flocoane) și coalescenței (contopire a picăturilor dintr -o emulsie sau a
granulelor dintr -o suspensie coloida lă în picături sau particule mai mari) , fenomene ce le
destabilizează.
Valorile mai mari de 10 se folosesc pentru a stabiliza suprafață externă a picăturilor
după a două etapă de emulsificare, de aceea alegerea agentului tensioactiv este esențială oferind
stabilitate, posibilitatea de a modula dimensiunile lor și eficienț ă de încapsulare. În acest scop a
fost definită așa numita valoare ELH optimă de către Garti și colab. ce oferă cea mai stabilă
emulsie. Aceștia au preparat emulsii stabile a/u pe care le -au obținut prin ajustarea ELH -ului,
valoarea cea mai optimă fiind între 4 și 5, folosind fie o singură parte amfifila Brij 93 cu greutate
8% (oleil eter polietilenglicol) cu ELH=4,9, fie un amestec de Span 80 (oleat de sorbitan) și Span
85 (trioleat de sorb itan) cu greutate 10% și ELH=4.92 Separarea picăturilor de apă din interior de
faza uleioasă a fost raportată după 30 de zile precum și o creștere a acestor picături de la 0,5 μm
la 3μm.93 Pe de altă parte, utilizarea unei cantități mari de su rfactant hidrofo b: Span 80 cu
greutate de 30% duce la migrarea acestuia la interfață exterioară și necesitatea utilizării unei
concentrații mai mari de surfactant hidrofil pentru a echilibra dubla emulsie. De asemenea va
scădea capacitatea de încapsulare și va afecta cont rolul dimensiunii picăturilor.94
Prin urmare, utilizarea surfactantilor hidrofili de concentrații scăzute va duce la
obținerea unor faze mai stabile, a unor picături mai mici și va crește eficiența incapsularii. Aceste
fenomene se explică prin excesul de s urfactant de la interfața picăturilor care afectează
semnificativ echilibrul stabilit între cele trei faze. Rezolvarea acestei probleme a fost găsită în
utilizarea unui amestec de agenți tensioactivi ionici și surfactanti neionici hidrofili.95

24
2.3 Impactul agenților tensioactivi asupra eficienței încapsulării

A doua provocare majoră în ceea ce privește fomarea dublelor emulsii este eficiența
încapsulării care este de fapt legată de stabilitate. Eficiența incapsularii este strâns legată de
valoarea optimă de ELH dintre surfactantii hidrofili și lipofili din faza apoasă și cea uleioasă.
Mai multe studii au arătat o eficientă de incapsulare similară pentru diferite concentrații de
agenți tensioactivi (amestec de Span 20 și Tween 80) cu același amestec global EL H. Acest
concept este similar cu cel utilizat pentru stabilizarea dublei emulsii și anume metoda ELH ce
constă în egalizarea emestecului ELH cu ELH necesar pentru cuplul ulei -apă. Ca urmare s -a
arătat că o eficientă de incapsulare ridicată corespune unei b une stabilități a dublei emulsii.96
Un alt factor notabil care afectează stabilitatea emulsiilor duble este greutatea
moleculară a agentului tensioactiv hidrofob. S -au realizat studii pentru stabilizarea unor emulsii
de tip a/u în care s -au folosit trei sur factanti diferiți: 1) emulgatori clasici cu greutate moleculară
mică, cum ar fi Span 80; 2) emulgatori cu greutate moleculară medie cum ar fi poliglicerol
policricinoleat (ETD sau PGPR) și 3) un agent tensioactiv lipofilic siliconic grefat cu greutate
mole culară mare (Abil EM -90). Așadar cu cât este mai mare masa moleculară, cu atât este mai
mare eficiența de încapsulare: cea mai mare fiind cu Abil EM -90 apoi PGPR și în cele din urmă
Span 80. Explicația este că o masă moleculară mai mare va induce o concent rație mai mare în
ulei și o rată de migrare mai scăzute la interfața externă.97

2.4. Tipuri de emulsii duble

Tipurile de emulsii duble sunt clasificate pe baza numărului de picături de apă din
picăturile totale: a) Microcapsule: picătura de ulei include o singură picătură de apă în interior
(Figura 2.3.A), b) Multivezicule: în care picătura de ulei încorporează numeroase picături apoase
(Figura 2.3.B), c) În final, microsfere: picături duble cu cu o structură interioară complexă în
interiorul picăturilor d e ulei (Figura 2.3.C).
Grupul A.T. Florența a demonstrat că aceste tipuri diferite de emulsii duble se obțin în
funcție de selecția surfactantului hidrofil. Aceștia au realizat trei emulsii duble folosind diferiți
surfactanti: a) polietilen glicol dodecil eter (Briji 30, 20%), b) octil fenol etoxilat (Triton X -165,
2%), c) surfactant combinat din Span 80 și Tween 80 în care Span 80 cu greutate 5% a fost
utilizat în faza de mijloc ca surfactant hidrofob. Aceste trei tipuri de emulsii sunt ilustrate in
Figura 2.3.98

25

Figura 2.3 Trei tipuri de emulsii duble: în stânga scheme cu A -Microcapsule, B -Multvezicule,
C-Microsfere63 Shukai Ding ; în dreapta trei tipuri de emulsii duble văzute la un microscop optic85-
A.T. Florence, ,1980 scara fiind de 10 μm.

În conseci nță, selecția și concentrația agenților tensioactivi se realizează astfel:
1) pentru stabilizarea internă a emulsiilor a/u, este necesar un ELH scăzut, o rigiditate
ridicată a agentului tensioactiv și folosirea unui ulei similar cu partea alifatica a surf actantului. În
plus, o concentrație mai ridicată de surfactant hidrofob, va da naștere unei duble emulsii mai
stabile cu o eficientă de încapsulare mai ridicată (microsfere).
2) pentru formarea dublei structuri a emulsiei a/u/a, principalii parametri de i nfluență
sunt ELH ridicat și/sau concentrația surfactantului hidrofil. Cu toate acestea, creșterea
concentrației de surfactant hidrofil va afecta și dimensiunea și eficiența de incapsulare, probleme
ce apar datorită valorii ELH necesare a uleiului.
3) în cele din urmă, tipurile de surfactanti hidrofili și concentrația surfactantilor
hidrofobi va influența semnificativ tipul de emulsie dublă realizat.

2.5 Metode suplimentare de stabilizare a emulsiilor duble

Chiar dacă stabilizarea dublelor emulsii este o problemă depășită prin ajustarea
concentrației și natura surfactantului folosit, în practică, această abordare ar putea avea limitări.
De aceea, Florence și colab. au propus transformarea fazei apoase într -un gel pentru a îmbunătăți

26
stabilitatea compusul ui. Aceștia au folosit un copolimer bloc polioxietilen -polioxipropilen –
polioxietilen ABA sau acrilamidă adăugate în faza internă sau externă, gelul formându -se prin
polimerizare la copolimerul bloc sau prin iradiere cu UV î n cazul utilizării acrilamidei.99
Formarea unui astfel de gel a crescut stabilitatea dublei emulsii cu toate că există un impact
asupra moleculelor sensibile încapsulate în cazul iradierii cu UV.100
Alte studii au arătat că utilizarea unui acid poliacrilic reticulat sau BSA în faza
interioar ă pentru a crea un complex sub formă de film la suprafață picăturilor cu ajutorul unui
surfactant hidrofob (poloxamer), stabilizează picăturile de apă din interior însă determina o
încetinire a cineticii de eliberare a produsului incapsulat de la 40% la 10 % după doar 6 ore.101
Un alt exemplu similar a propus stabilizarea interfetelor picăturilor utilizând BSA și un
surfactant lipofilic cu greutate moleculară mică (Span 80) ce a urmărit eficiența de încapsulare a
clorurii de sodiu. Rezultatele au evidențiat o creștere a eficienței încapsulării de la 20% până la
80% în final, conservandu -se cu peste 60% după 30 de zile.102
Garti și colab. au ar ătat că utilizarea unui sistem BSA/Span 80 a îmbunătățit
semnificativ stabilitatea emulsiilor duble, oferind o viteză de e liberare de aproximativ 8% în 5
ore și 20% în 20 de ore, valori mult mai mici în comparație cu cele fără stabilizator de
aproximativ 35% în 5 ore respectiv 52% în 20 de ore.103
Un alt efect al adăugării de BSA a fost o dimensiune mai mică a dublelor picături și o
stabilitate ce nu se modifică după 6 săptămâni. Acest efect a fost explicat prin stabilitatea
interfacială conferită de stratul de BSA de la interfața externă dintre ulei și apă, care conferă
rezistență și elsaticitate picăturilor, astfel împiedicând coalescanta și ruperea picăturilor de apă
interioare. Pentru acestea, s -a utilizat un microcristal colidal pe baza de celuloză asociat ca
''stabilizator mecanic''.104
Au existat studii și în formularea de duble emulsii utilizând diferiți biopolimeri pentru
stabilizarea picăturilor interne, utilizând diferite mecanisme precum: gelatinizarea, cazeine,
proteine din zer, chitosan și ciclodextrine.105 106 107 108 109 110 111 – H.J. Yang, I.S. Park –– R. Goubran, N. Garti,

2.6 Sinte za microparticulelor polimerice prin emusii duble în două etape – metoda
evaporării solventului

Datorită avantajelor reale ale polimerilor biocompatibili cum ar fi PLGA, PLA, PCL în
încapsularea și eliberarea controlată a moleculelor hidrofilice (cum ar fi proteinele sau

27
peptidele), s -au realiza t studii conform cărora aceste microparticule au fost preparate cu ajutorul
unei duble emulsii ca matriță.112
Ogawa și colab. au descris procedeul experimental standard ca în figura 2.4: 1)
Polimerul este dizolvat într -un solvent organic, nemiscibil, cu apa în care sunt solubilizate
medicamentele hidrofile. Emulsia a/u este preparată din aceste 2 faze. 2) Ulterior este formată
dubla emulsie a/u/a cu altă faza apoasă externă. 3) Ultima etapă constă în evaporarea solventului
organic, făcând precipitarea polimer ului sub formă de microcapsule solide.113 În figura 2.4 este
reprezentată formularea particulelor prin dublă emulsie.

Figura 2.4 Schema procesului formării în două etape a particulelor polimerice cu ajutorul unei
duble emulsii .63- Shukai Ding, Christophe A . Serra,

Pentru a optimiza proprietățile particulelor polimerice se pot utiliza diferite strategii
cum ar fi gelificarea picăturilor interne folosind gelatină. Acest fapt a arătat o creștere
semnificativă a eficienței încapsulării de la 6,7% la 70,7%. În cele din urmă, indiferent de tipul
dublei emulsii, când se utilizează polimeri, stabilitatea va fi mult mai mare iar eliberarea
medicamentelor va fi legată de morgologia picăturii și de degradarea polimerului.114

2.6.1 Impactul dimensiunii fazei interne și medii în caz ul microparticulelor
polimerice

Rosca și colab. au arătat că în funcție de protocolul urmat în timpul evaporării,
dimensiunile și proprietățile picăturilor pot varia, adică, în principal, în funcție de Di (diametrul
picăturilor interne) și Dg (diametrul globulelor duble). Când Di≈Dg stratul polimeric a fost atât
de subțire încât nu a putut rezista forțelor interioare care provin din presiunea Laplace și
presiunea osmotică dintre fazele interne și cele externe. Astfel, acest strat polimeric a fo st rupt în

28
timpul evaporării solventului și a dus la imposibilitatea formării particulei globale așa cum se
vede în figura 2.5.(I). Când Di este mult mai mic decât Dg, se va forma o barieră polimerică ce
va proteja și va stabiliza picăturile duble ca în fi gura 2.5.(II). Aceste proprietăți ale picăturilor
pot fi controlate prin parametrii de procesare și de formulare a emulsiei cum ar fi: concentrația
polimerului, a agentului activ de suprafață, volumele fazelor, vascozitatile fazelor.115

Figura 2.5 Imagin i ale evoluției de la dublă emulsie l a microparticule solide de PLGA. R elația
dintre diametrele celor două faze și tipul microparticulelor. (I) a. Emulsie dublă în care s -a
utilizat PLGA 10% greutate/volum, 1% greutate/volum, 500 rpm pentru omogenizarea ul timei
faze. (II) a. Emulsie dublă în care s -a utilizat PLGA 5% greutate/volum, 1% greutate/volum,
8000 rpm pentru omogenizarea ultimei faze. În dreapta avem imagini SEM ce corespund
aceloras probe după evaporarea solventului.102- Panos, Ines; Acosta

2.6.2 Formarea microparticulelor pe baza de chitosan prin metoda dublelor
emulsii

Dezvoltarea unor noi sisteme de eliberarea controlată a medicamentelor este unul dintre
cele mai interesante domenii de cercetare din România. Microparticulele pot fi utilizate pentru
eliberarea controlată a medicamentelor, vaccinurilor, antibioticelor și hormonilor. Aceste
structuri sunt acoperite cu un polimer care formează o membrană la suprafață ce are scopul de a
preveni pierderea compusilor încapsulați. În plus, există mai multe proprietăți fundamentale ale

29
polimerilor care sunt utile în rezolvarea problemelor ce apar în livrarea medicamentelor, cum ar
fi solubilitatea, stabilitatea sau permeabilitatea.116
Biocompatibilitatea chitosanului a prezentat un interes major în mai mu lte studii. Este
considerată a fi cea mai sigură metodă de administrare a medicamentelor după cea orală deși în
organism nu există enzime precum chitinaza sau chitosanaza iar chitosanul nu este degradat în
mod specific în organism.117 Rezultatele testelor pe animale (rozătoare) au demonstrat că acest
polimer, a fost inofensiv după administrarea orală. O doză de 15 g / kg la șobolani, timp de 14
zile nu au arătat efecte toxice acute sau modificări patologice.118 Consumul de câteva grame de
chitosan zilnic de căt re oameni, poate provoca diaree deoarece chitosanul absoarbe apa și
lipidele din intestin. Deși este bine tolerat din punct de vedere clinic, nu este recomandat
persoanelor alergice la crustacee.119
Metoda emulsificarii prin evaporarea solventului constă în prepararea unei emulsii, cu o
fază externă diferită în funcție de natura polimerului și a medicamentului utilizat pentru
încapsulare. Evaporarea solventului va duce la formarea ulterioară a microsferelor.120
El-Hameed și Kellaway descriu prepararea unor micr osfere din chitosan prin tehnica
evaporării solventului dintr -o emulsie a/u, utilizate în administ rarea nazală prin insuflare .
Medicamentul hidrofilic a fost dizolvat într -o soluție apoasă de chitosan cu o concentrație finală
de medicament de 1% (g/g). Emu lsia a fost preparată prin turnarea acestei soluții în ulei mineral
care conține un agent de emulsificare adecvat. Odată ce a fost omogenizată, emulsia a fost
încălzită timp de 4 -5 ore pentru îndepărtarea fazei apoase iar uleiul a fost decantat și microsfe rele
formate au fost spălate cu n -hexan de câteva ori și uscate. Aceste microsfere au prezentat o
eficientă scăzută de încapsulare în comparație cu microsferele preparate din carbopol, alcool
polivinilic și hidroxipropil metilceluloza. Prin urmare, microsf erele din chitosan preparate prin
această metodă au avut un procent scăzut de incapsulare.121
Când medicamentul pentru încapsulare este hidrofob, metoda de preparare a emulsiei
trebuie schimbată deoarece este necesar să aibă o fază internă organică. Genta și colab. au
descris încărcarea cu ketoprofen a unor microsfere din chitosan. Aceștia au dizolvat
medicamentul în diclorometan (CH 2Cl2) și au injectat această soluție într-o soluție apoasă de
chitosan. Ulterior, emulsia astfel formată a fost turnată în ulei mineral (1:9 v/v) și apoi agitat.
Pentru a se evapora solventul, emulsia dublă s -a menținut în condiții de temperatură și presiune .
Microsferele au fost centrifugate și spălate cu eter. Această dublă emulsie a fost utilizată și
pentru încapsularea unor substanțe labile cum ar fi asthaxantina pentru a evita degradarea.122
Higuera – Ciapara și colab. au descris prepararea microsferelor într-o emulsie u/a/u încărcate cu
asthazantin și au demonstrat stabilitatea lor.123

30
În F igura 2.6 sunt prezentate microsfere di n chitosan preparate prin metoda de
emulsifiere -evaporare a solventului cu ulei din semințe de bumbac.

Figura 2.6 Imagini micro scopice ale unor microsfere din chitosan preparate prin evaporarea
solventului dintr -o emulsie cu ulei de semințe de bumbac.103- Shahidi F., Arachchi J.K.V

Alți autori au formulat microsfere prin aceeași tehnică, iar după formarea acestora au
adăugat un reticulant, soluție de TPP, pentru a întări chitosanul prezent pe suprafață externă a
microsferelor. Randamentul de incapsulare a scăzut odată cu creșterea concentrației de TPP.
Acest fenomen indică faptul că TPP -ul nu se leagă numai de chitosan ci și de medicament.124
Tehnica de emulsificare/reticulare chimică a fost descrisă de mai mulți autori. Pe scurt,
această tehnică constă î n formarea unei faze apoase de chitosan dizolvat într -o soluție slab acidă
în care medicamentul se poate dizolva sau dispersa cu ajutorul ultrasunetelor. Apoi, această faza
este adăugată într -o faza uleioasă (parafină lichidă) cu un agent de disperie adecv at cum ar fi
sesquioleat de sorbitan sau Span 80 iar emulsia a/u este formată prin agitarea cu o paleta sau prin
agitare magnetică. Odată ce s -a format emulsia, se adaugă o soluție de toluen saturat de
glutaraldehida pentru a întări microsferele.125 După obț inerea acestor microsfere, acestea vor fi
spălate de mai multe ori cu eter de petrol distilat, apă și izopropanol. De asemenea, este
important ca acestea să se spele o dată cu o soluție de metabisulfit 5% pentru eliminarea restului
de glutarladehida care e ste dăunătoare organismului.126
În Figura 2.7 este prezentată morfologia particulelor preparate din chitosan/gelatină
coagulată cu ulei de floarea -soarelui la 4oC reticulat cu TPP.

31

Figura 2.7 Imagine cu o microparticulă din chitosan reticulat cu TPP (A). D etalii de suprafață a
microparticulei (B).103- Shahidi F., Arachchi J.K.V

Microsferele din chitosan reticulat cu glutaraldehida s -au dovedit a fi purtători
biodegradabili cu o durata lungă de acțiune în eliber area controlată de medicamente.127 În
studiile î n vivo pe șoareci și șobolani s -au folosit astfel de microsfere ce au eliberat hormoni
(progesteron) sau alte medicamente (izoflavone) pe o perioada mai lungă de timp. Microsferele
administrate intramuscular au avantajul de a depăși primele bariere metabol ice și reduc cantitatea
de administrare. Este o bună alternativă ce soluționează biodisponibilitatea medicamentelor
administrate oral. Ge și colab. au studiat efectul biodisponibilitatii daidzeinei, o izoflavonă
naturală, încapsulată în microsfere și admin istrată unor șobolani Wistar. Pentru a se observa
prezența medicamentului în plasmă s -a utilizat o tehnică de fluorescență sensibilă, rezultând o
prezența a medicamentului de 35 de zile în plasmă ce a fost exprimată ca valoare a
biodisponibilitatii de 39%. Aceste studii au evidențiat faptul că biodisponibilitatea
medicamentelor poate fi îmbunătățită utilizandu -se microsfere din chitosan administrate
intramuscular comparativ cu medicamentele administrate pe cale orală. 111 Ge Y., Chen D . Această
eliberare p relungită este datorată în consecință biodegrabilitatii chitosanului reticulat cu
glutaraldehida. Deși chitosanul este degradat de lizozim, acea stă degradare este foarte lentă. În
timpul degradării în vivo a microsferelor, eliberarea medicamentului este gu vernată atât de
difuzie, cât și de biodegradarea matricii medicamentului.114-Jameela tastatura

32
Recent, a fost descrisă prepararea miscrosferelor de chitosan/heparină, formate pentru
eliberarea controlată de proteine prin tehnica emulsiei a/u. Prin această metodă s -au obținut
microparticule cu dimensiuni între 120 -500 μm, mărimea acestora depinzând de viteza de rotație
folosită pentru omogenizarea emulsiei.128
Tehnica de evaporare a solventului din emulsie poate fi combinată cu tehnica uscării
prin pulverizare . Tehnica uscării prin pulverizare sau spray drying este un proces ce constă în
pulverizarea unei soluții de polimer, în care medicamentul este solubilizat, într -o camer ă la
temperaturi ridicate. Când soluția este introdusă în duza printr -o pompă peristalt ică, atomizarea
are loc datorită forței aerului comprimat care disloca lichidul în picături mici și îl împinge într -o
camera cu aer fierbinte iar solventul este evaporat. Microparticulele formate în acest fel sunt
separate într -un ciclon și colectate într -o sticlă de colectare. Acestea prezintă o formă măruntă și
stafidită datorită evaporării rapide a solventului și o crustă exterioară în timpul primei etape de
uscare. După ce se formează această crustă, solventul aflat în interior se va evapora ceea ce va
duce la contracția parțială a particulelor.129 În figura 2.8 sunt ilustrate microparticule de chitosan
obținute prin tehnica uscării prin pulverizare.

Figura 2.8 Morfologia microparticulelor de chitosan obținute prin uscare prin pulverizare
reticulate cu TPP 0,1% (A) și 0,2% (B).103 Shahidi F., Arachchi J.K.

He și colab. au descris prepararea microparticulelor din chitosan cu ajutorul uscării prin
pulverizare. Aceștia au raportat formarea unor microsfere cu ajutorul unei duble emulsii a/u/a
încărcate cu medicamente hidrosolubile. Medicamentul a fost dizolvat într -o soluție de gelatină
și a fost emulsionat într -o soluție de etilceluloză în clorură de metilen. Această emulsie primară
a/u a fost apoi picurată într -o soluție de chitosan iar emulsia dublă rezu ltată a fost uscată prin
pulverizare pentru a îndepărta solventul. Acești cercetători au raportat o eliberare lentă a
cimeditinei și famoditinei, medicamente încapsulate în microsferele realizate, eliberare datorată
abilităților umede a microsferelor. Avan tajul acestei metode modificate constă în adăugarea unui

33
alt polimer care poate controla eliberarea medicamentului într -o măsură mai mare decât
chitosanul singur.130

2.7 Nanocapsule . Sinteza nanocapsulelor polimerice.

Nanotehnologia a fost considerată una dintre principalele tehnologii ale secolului XXI și
promite o revoluție în domeniul farmaceutic, medical și alimentar. Această tehnologie implică
proiectarea, sinteza, caracterizarea și aplicarea particulelor sau sisteme cu dimensiuni mai mici
de 1 mm.131 Nanotehnologia este aplicată în prezent în numeroase produse comerciale (produse
cosmetice și de protecție solară, medicamente, stomatologice umpluturi, produse alimentare),
precum și în sistemele de filtrare a apei și sisteme catalitice.132
Nanocapsulele au f ost sintetizate din polimeri ce formează o structura globulară cu un
perete pentru a proteja substanțele bioactive de factorii externi (lumină, căldură, oxigen)
crescând stabilitatea și îmbunătățind biodisponibilitatea compușilor nanoencapsulați. Procesul de
încapsulare și tipul de polimer (naturali, sintetici) au un impact direct asupra sintezei
nanocapsulelor, impact ce se reflectă în parametri precum: dimensiunea, potențialul zeta,
eficiența încapsulării, solubilitatea în apă, stabilitatea apoasă, permea bilitatea la suprafață,
rezistența pereților, caracteristici ce ar putea limita domeniile de utilizare. Pentru sinteza
nanocapsulelor se pot utiliza diferiți polimeri, cu toate acestea, studiile realizate până în prezent
au arătat că nanocapsulele polimeri ce biodegradabile pot fi una dintre metodele stabile în ceea ce
privește depozitarea și eficiența eliberării compusilor activi încapsulați.133
În sistemele de distribuire a medicamentelor, utilizarea polimerului îmbunătățește
stabilitatea, absorbția, terapia și concentrația de medicamente în țesutul țintă.134 Compușii
bioactivi pot fi nanoencapsulați prin diferite tipuri de vehicule de dimensiuni nanometrice, cum
ar fi nanoemulsii, lipozomi sau nanocapsule.135
Nanocapsulele sunt sisteme veziculare în care compuș ii specifici sunt solubilizati într –
un miez apos sau uleios, fiind acoperite de o singură membrană polimerica (perete). După
sinteză, evaluarea stabilității nanocapsulelor este crucială, urmărindu -se parametrii importanți,
cum ar fi dimensiunea, indicele d e polidispersie, potențialul zeta, morfologia, pH -ul și profilul de
eliberare.136
Dimensiunea nanoparticulelor și diametrul mediu al acestora (media z), pot fi
determinate prin mai multe metode cum ar fi DL- difractia cu laser însă cea mai utilizată metodă

34
este DLS -difractia dinamică a luminii care permite descrierea dimensiunii particulelor și
fenomenele de distribuție și destabilizare.137
Potențialul Zeta este o proprietate fizică exprimată de particule în suspensii,
macromolecule sau suprafața materialului. Acesta corespunde potențialului electric al
nanoparticulelor influențat de compoziția nanocapsulelor și mediul în care sunt dispersate.138
Morfologia este, de asemenea, un alt parametru important pentru caracterizarea
nanocapsulelor iar pentru acesta se folo sesc multe tipuri de microscopie electronică. Ca exemplu,
în prezent, microscopia electronică de transmisie (TEM) este cea mai utilizată tehnică, aceasta se
efectuează după înghețarea nanocapsulelor și permite obținerea de informații despre structura,
porozitatea polimerului și estimarea grosimii peretelui.139
Toți parametrii menționați mai sus sunt evaluați după prepararea nanocapsulelor și
monitorizați în timpul stocării, însă stabilitatea acestor sisteme depinde de compoziția și tehnica
aleasă pentru sinte ză iar tehnica aleasă este influențată la rândul ei de caracteristicile fizico –
chimice ale polimerului utilizat și de compusul activ ce urmează a fi încapsulat.140
După modul de formulare a l nanocapsulelor, acestea se pot sintetiza prin două metode
diferite: polimerizarea interfaciala a monomeri lor și cu polimer preformat.
2.7.1 Sinteza nanocapsulelor prin polimerizarea monomerilor

Prin această metodă, monomerii cianoacrilatului sunt polimeriza ți și formează
nanocapsule într -o soluție apoasă. Polimerizarea m onomerilor se poate realiza prin emulsii,
tehnică ce permite formarea mai rapidă a nanocapsulelor și polimerizare interfaciala, metodă ce
s-a demonstrat a fi eficientă în ceea ce privește încapsularea medicamentelor. 141
Pe scurt, monomerul este adăugat într -o soluție apoasă care conține surfactant (mediu de
polimerizare), iar sub agitare puternică la temperatur a camerei, acesta polimerizeaza. 142
În timpul sintezei, se adaugă stabilizatori și surfactanti a căror tip și concentrație
influențează în mod direct d imensiunea și masa moleculară a nanocapsulelor formate. Solvenții
sunt utilizați pentru a dispersa uleiul din faza apoasă și pentru a transporta monomerii. Compusul
ce urmează a fi încapsulat este fie solubilizat în mediul de polimerizare fie absorbit după
polimerizarea completă. După concentrarea la presiune scăzută și temperatura camerei, suspensia
trebuie purificată pentru a îndepărta surfactantii și stabilizatorii prin centrifugare iar particulele
formate sunt suspendate în mediu fără surfactant. Princ ipiul de încapsulare prin această metodă
are avantajul că structurile se formează în emulsie, adică polimerul se formează în situ, totuși în
timpul polimerizarii pot apărea reacții între monomer și compușii de interes iar produșii rezultați

35
pot fi toxici ș i pot limita utilizarea acestor tipuri de nanocapsule. Astfel, principalele aplicații ale
nanocapsulelor formate prin polimerizarea monomerului sunt asociate doar cu proteine și
peptide, nu și cu compușii bioactivi. În figura 2.9 este reprezentată tehnica obținerii
nanocapsulelor prin polimerizarea monomerilor.

Figura 2.9 Reprezentare schematică a sintezei nanocapsulelor prin polimerizarea monomerului .
Priscilla Pereira dos Santos
2.7.2 Sinteza nanocapsulelor cu polimer preformat.

Din cauza compușilor toxici ce apar în momentul formării nanocapsulelor prin tehnica
descrisă mai sus, s -a dezvoltat o alternativă: formarea nanocapsulelor cu ajutorul unui polimer
preformat. Această alternativă oferă posibilitatea de a c ontrola PDL -ul și masa moleculară a
polimerului. Indicele de polidispersie (PDL ) reprezintă raportul greutății moleculare medii (M w)
la distribuția greutății moleculare (M n). PDL =M w/Mn
Acest indice trebuie să fie cunoscut deoarece în amestecul global de polimer există
câteva lanțuri de polime r cu greutate mai mare care influențează M w. PDL se poate afla prin
diferite metode: reologice, vâscozitate, osmoză cu membra nă, distribuția luminii. Un PDL = 1
indică faptul că lanțul de polimeri este monodispers, însă în mod normal, este dificilă sintet izarea
lanțurilor de polimeri cu M w sau M n identice, prin urm are, toți polimerii vor avea PDL > 1. De
obicei, sistemele polimerice radicale au o gre utate moleculară foarte mică PDL ~ 1,2 până la
1,5.143

36
Prin polimer preformat înțelegem dispersarea polimerului insolubil în apă într -o faza
apoasă în prezență de stabilizatori, surfactanți și ulei. Câteva ex emple de astfel de tehnici sunt:
emulsifierea/ metoda evapor ării solventului, metoda depunerii interfacial e, emulsifierea /metoda
difuziei solventului si metoda precipiării cu electroliți . 119 Priscilla Pereira dos Santos
În figura 2.10 sunt reprezentate schematic metodele de formulare a nanoc apsulelor cu
polimer preformat .

Figura 2.10 Reprezentarea schematică a formării nanocapsulelor cu polimer prefor mat: A)
metoda evaporării solventului B) emulsifierea, metoda difuziei solventului C) metoda precipiării
cu electroliți D) metoda depunerii interfaciale. 119 Priscilla Pereira dos Santos Commented [A5]: Spatii de ajustat

37
Tehnica cea mai avantajoasă și care a dus la formarea unor nanocapsul e mai stabile și
mai rezistente la sedimentare este evaporarea solventului (figura 2.10.A). În procedeul evaporării
solventului, polimerul este dizolvat într -un solvent organic, cum ar fi cloroform, diclormetan sau
acetat de etil, iar sinteza nanocapsulelo r implică două etape: emulsionarea soluției de polimer
(faza organică) într -o fază apoasă și evaporarea solventului, inducerea precipitării polimerului și
formarea de nanoparticule. Un alt avantaj pe care îl aduce metoda evaporării solventului este
utiliza rea fazei apoase sub formă de suspensie, ceea ce îmbunătățește procesul de sinteză a
nanocapsulelor însă aceasta poate fi aplicată doar compușilor solubili în grăsimi.144
Metoda difuziei solventului (figura 2.10.B) presupune dizolvarea polimerului într -un
solvent parțial solubil și saturat în apă, fapt ce va duce la polimerizarea și difuzia polimerului și
ulterior formarea nanoparticulelor. In final, solventul este eliminat prin evaporare sau filtrare iar
nanoparticulele obținute sunt utilizate în transportul de medicamente. Principalele avantaje ale
acestei metode sunt: eficiența mare de încapsulare, dimensiuni scăzute ale nanoparticulelor și
eficiența încapsulării medicamentelor lipofile și hidrofile.145
Precipitarea cu electroliți este o metodă bazată pe sepa rarea solventului apos din soluția
apoasă prin efectul de sărare . Acesta constă în utilizarea electroliților pentru desolvarea
polimerului (figura 2.10.C). În această tehnică, atât polimerul cât și compusul de interes sunt
dizolvate într -un solvent emulsio nat într -un gel apos care conține un agent de sărare (electroliți
cum ar fi: clorură de magneziu, clorură de calciu și acetat de magneziu). Ulterior, în această
emulsie se adaugă un stabilizator coloidal care va induce formarea de nanocapsule.146
Tehnica cea mai utilizată pentru a prepara nanocapsule cu compuși bioactivi este
depunerea interfacială (figura 2.10.D), denumită și nanoprecipitare și care se bazează pe
depunerea interfacială a unui polimer după deplasarea unui solvent semi -polar (miscibil în apă)
dintr -o soluție lipofilă. Tehnica utilizează polimeri și stabilizatori biodegradabili, asigurând o
eficientă ridicată de incapsulare a medicamentelor și lărgind gama de utilizare a nanoparticulelor
formate datorită eliminării totale a solvenților în suspen sie. În faza organică se va afla polimerul,
o parte alicotă alcătuită dintr -un solvent ușor de îndepărtat (acetonă sau etanol), ulei și
trigliceride. Compusul de interes este injectat într -o faza apoasă care conține apă și un agent
tensioactiv. Apoi, depun erea polimerului are loc imediat pe interfața dintre apă și solventul
organic, indusă de difuzia rapidă a solventului, conducând la formarea instantanee a
nanocapsulelor. După formarea nanocapsulei, solventul organic este îndepărtat prin evaporare la
presi une redusă.147

38
2.8 Nanoparticule cu proprietăți superparamagnetice

Obținerea unor particule superparamagnetice funcționalizate cu aplicații în tehnici de
detoxifiere sangvină constituie obiectul de studiu a numeroase colective de cercetare din întreaga
lume. Studiile au fost orientate pe de o parte în direcția preparării acestor tipuri de particule
magnetice și pe de altă parte conceperii de sisteme de separare magnetică care să permită
îndepărtarea eficientă și rapidă a acestor particule magnetice din sâng e. Interesul pentru această
direcție de studiu derivă din limitările tehnicilor actuale de detoxifiere sangvină dar și din
potențialul particulelor magnetice de a fi utilizate cu succes în scopuri ce implică contactul
direct cu sângele. Particulele magnet ice prezintă numeroase a plicații biomedicale precum
transportul și eliberarea țintită de medicamente, separarea celulară și repararea țesuturilor,
imagistica prin rezonanță magnetică și tehnici de hipertermie. 148
Nanopartiucule cu dimensiuni foarte reduse (<300 nm) se pot folosi de țintirea pasivă a
tumorilor printr -un efect de permeabilitate și retenție la nivelul acestora. Aceste nanoparticule se
pot transporta relativ ușor prin organism utilizând un câmp magnetic din exterior. Cu toate
acestea, limitarea majoră a ghidarii pasive este dată de incapacitatea de a se acumula o
concentrație suficient de mare de medicament la nivelul tumorilor, pentru a putea atinge nivelul
dorit de eficacitate terapeutică.
Cel mai frecvent utilizat material în crearea de siste me de eliberare controlată și țintită
de medicamente sunt oxizii de fier, dar mai ales magnetita (Fe 3O4) și versiunea oxidată a
acestuia, γ -Fe2O3 (magemită) care este folosită ca un miez acoperit de o matrice a unui polimer.
Acești oxizi posedă proprietăț i superparamagnetice și pot fi încorporate în sisteme de țintire
activă a țesuturilor canceroase, fiind astfel un mijloc relativ ușor prin care se poate elibera țintit
un anumit principiu activ. Aceste particule magnetice dețin caracteristici unice : sunt u șor de
preparat, au dimensiuni foarte mici, iar prin înglobarea lor în matricea polimerică a
nanocapsulelor, circulă rapid prin organism prin intermediul fluxului sangvin. Magnetita este
utilizată datorită stabilității sale foarte bune și proprietăților ma gnetice excelente. De asemenea,
o altă caracteristică importantă a particulelor este biodegradarea după ce își îndeplinesc funcția,
cu ajutorul ionilor reziduali pe calea metabolismului normal al fierului din organism. 149

2.9 Eliberarea medicamentului

Un sistem de eliberare a medicamentelor este definit ca un sistem sau dispozitiv care
permite introducerea unei substanțe terapeutice în organism și își îmbunătățește eficiența și

39
siguranța prin controlul, timpul și locul eliberării de medicamente în organism . Acest proces
include înglobarea agentului terapeutic, eliberarea produsului incapsulat și transportul ulterior al
agenților activi la locul de acțiune. Sistemele de eliberare controlată a medicamentelor se pot
defini în mare și ca tehnici de terapie gene tică. În scopul realizării eliberării programate a
medicamentelor, se pot utiliza diferite sisteme ce conțîn un polimer ce acoperă și protejează
medicamentele până in momentul eliberării, la trecerea acestora prin barierele impuse de către
organism. Aceste sisteme pot folosi mecanisme fizice: umflarea și spargerea, sau mecanisme
chimice: degradarea enzimatică. În general, nanocapsulele sunt concepute pentru a se sparge
după expunerea predeterminată la un mediu apoi, eliberând ulterior medicamentul. Factorii fizici
ce pot fi controlați sunt: rază nanocapsulelor, presiunea osmotică a conținutului, grosimea și
elasticitatea peretelui.150
Câteva dintre avantajele pe care le aduce utilizarea sistemelor de eliberare controlată a
medicamentelor sunt:
-posibilitatea livrării și eliberării principiului activ într -un loc țintă
-utilizarea optimă a medicamentului, așa cum este el incapsulat
-menține rea unui nivel terapeutic optim
În Figura 2.11 este reprezentat schematic un model de eliberare de medicament la un
anumit pH.

Figura 2.11 Realizarea eliberării medicamentului dintr -o particular la un anumir pH Aceeasi referinta
ca mai sus
Biodegradarea poate fi controlată prin utilizarea proprietăților polimerului (masă
moleculară, grad de acetilare, legături formate cu medicamentul) cu scopul expunerii selective a
acestuia la factori degradativi cum ar fi temperatura sau pH -ul. 151Eliberarea medicamentului din
structura pariculei este realizată odată cu degradarea polimerului de la suprafață acesteia și
depinde mult de mecanismul de degradare. Ceea ce trebuie controlat în această etapă este
eliberarea medicamentului după ce particula a ajuns la țesutul țintă, drept urmare, polimerul

40
trebuie ales cu foarte mare atenție. Degradarea polimerului ce învelește particul a trebuie să fie
optimă sau controlată prin diverse metode.152
În cazul nanoparticulelor polimerice, eliberarea poate avea loc fie prin procesul de
degradare a polimerului ca urmare a interacțiunii cu o enzimă, sau prin ruperea legaturilor
covalente dintre m edicament si polimer. N anoparticulele ce folosesc o matrice polimerică sunt
solide, iar medicamentul ce stă la suprafața sau la interiorul acestora, se va detașa prin desorbtie
sau prin fuzionarea lui din inte rior spre exterior.153
Pe de altă parte, în struc turile de tip nanocapsulă mecanismul de eliberare este diferit
față de cel al nanoparticulelor deoarece acestea folosesc polimerul ca și înveliș de suprafață.
Eliberarea se poate realiza prin intermediul abilității învelișului polimeric de a răspunde
la anumiți factori externi de natură biologică: schimbare de pH, de temperatura, tăria ionică.
Medicamentul va fi eliberat treptat ca urmare a modificării mediului extern .154 Un alt procedeu
de eliberare este cel chimic, care degradează suprafața nanocapsulei (p olimerul), în urma intrării
în contact a acestuia cu o enzima sau altă substanță de natură să rupă legăturile acestuia.155
Sistemele de tip nanocapsula sunt ușor de controlat osmotic. Învelișul poate acționa ca o
membrană semipermeabila ce favorizează pătrun derea apei în nanocapsula și totodată ieșirea
medicamentului la exterior datorită presiunii osmotice create.156
Un alt procedeu întâlnit în cazul acestor structuri este difuzia controlată ce se folosește
de învelișul permeabil al nanocapsulelor. În acest caz , doza de medicament eliberată nu depinde
numai de proprietățile substanței active (gradientul de concentrație) ci și de proprietățile
polimerului (capacitatea de umflare, grosimea peretelui și porozitatea).
Difuzia reprezinda procesul de amestecare confo rm mișcărilor browniene a particulelor
a două substanțe până la omogenizarea completă și ireversibilă a sistemului. Difuzia moleculară
este pătrunderea moleculelor unui corp printre moleculele altui corp, fără a există curgere.
Rezultatul acestui fenomen e ste o amestecare completă a celor două substanțe. Când temperatura
este uniformă și nu se acționează cu nicio forță externă asupra particulelor se ajunge la o
amestecare completă a particulelor. Când temperatura este mai ridicată, difuzia este mai rapidă
datorită agitației termice. De asemenea, difuzia este facilitată de relaxarea și umflarea structurilor
în mediul biologic. Structura nanocapsulelor este degradată treptat iar medicamentul este
externalizat. Difuzia prin intermediul unei membrane este descri să de legea lui Fick:

41
Unde Φ reprezintă fluxul moleculelor transportate pasiv (moli/s) în sensul gradientului
de concentrație dc/dx, printr -o suprafață S a membranei. Semnul minus sugerează că difuzia are
loc întotdeauna de la zonele de concentrație mare spre zonele de concentrație mică.
Coeficientul de difuzie depinde de natura substanței, de temperatură și de forma și
dimensiunea particulelor ce difuzează. Pentru particule sferice de mici dimensiuni, coeficientul
de difuzie se scrie sub forma:

Unde T este temperatura absolută exprimată în Kelvin, k este constanta lui Boltzmann, η este
vâscozitatea, ia r r este raza particulelor. În F igura 2.12 este reprezentat schematic mecanismul de
difuzie.

Figura 2.12 Difuzie printr -o membrane semipermeabilă în ti mp

2.10 Concluzii

Nanotehnologia s -a dovedit a fi o strategie viabilă și promițătoare în protejarea și
eficientizarea compusilor bioactivi în industria farmaceutică și alimentară. Se pot utiliza diferiți
compuși și materiale pentru încapsularea compusilo r activi, însă nanocapsulele polimerice sunt
structurile cele mai stabile în timpul depozitării și au demonstrat o eficientă ridicată în
controlarea eliberării principiilor active. Acest capitol cuprinde descrierea unor tehnici de
obținere a nanocapsulelor polimerice, avantajele și limitările acestora. În concluzie, cea mai
utilizată tehnică atunci când se preferă obținerea de nanostructuri pentru sisteme de eliberare
controlată este cea cu polimer preformat datorită eliminării ușoare a substanțelor rezidua le, cum
ar fi solvenții organici. Pe lângă tehnica utilizată, trebuie acordată o atenție sporită și polimerului
utilizat ca material de perete a nanocapsulelor.

42
Emulsiile sunt sisteme lichide multifazice ce conțin apă, ulei și surfactanți. Surfactanții
sunt utilizați pentru a crea o interfață mai stabilă între apă și ulei. Obținere nanostructurilor prin
tehnica emulsiilor s -a demonstrat a fi foarte eficientă datorită faptului că apare posibilitatea
încapsularii de molecule uniforme incompatibile foarte dif erite într -un purtător unic.
Există o serie de parametri foarte importanți ce pot influența stabilitatea emulsiilor cum
ar fi: concentrația și presiunea osmotică, temperatura, agenții tensioactivi utilizați, concentrația
agenților tensioactivi, raportul ap ă/ulei.
Cel mai mare avantaj pe care îl aduc amulsiile este posibilitatea pe care o oferă pentru
încapsularea mai multor tipuri de molecule simultan. Când medicamentul incapsulat este
hidrofob, metoda de preparare a emulsiilor trebuie schimbată deoarece es te necesară o faza
internă organică.
Există diferite metode prin care medicamentele încapsulate în structuri pot fi eliberate,
iar aceste metode se aleg în funcție de tipul de medicament folosit, de tipul de polimer folosit și
de zona de interes unde urme ază a fi eliberat medicamentul. Una dintre cele mai importante
metode de eliberare a medicamentelor este difuzia controlată. În sistemele de tip nanocapsulă și
nanoparticulă, eliberarea medicamentului este unul dintre aspectele cele mai importante care se
urmăresc. În cazul sistemelor matrice, viteza de eliberare este controlată de viteza de difuzie a
principiului activ prin matricea polimerică. Fenomenul de difuzie stă la baza a numeroase
schimburi de substanță care au loc în natură între organisme sau în interiorul unui organism. În
toate aceste cazuri însă, substanțele care difuzează nu sunt în contact direct, ci sunt despărțite
printr -o membrane.

43
CAPITOLUL 3
SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA NANO CAPSULELOR BIOTINILATE
MAGNETICE PE BAZĂ DE CHITOSAN CU POTENȚIALE APLICAȚII
DE TIP TERANOSTIC

Obiectivul lucrării

Chitosanul este un polimer natural, obținut prin procesul de deacetilare al chitinei. Acest
biopolimer prezintă proprietăți remarcabile, cum ar fi biocompatibilitate, biodegradabilitate,
activit ate antibacteriană și cicatrizantă. Grupările hidroxil și amino care se găsesc în structura
chitosanului permit modificarea chimică și controlul proprietăților fizice. În prima parte a
studiului a fost realizată modificarea chitosanului cu clorura de palmi toil și biotină cu scopul de a
obține compuși hidrofobi capabili să încorporeze medicamente hidrofobe. Lanțul de palmitoil a
fost atașat la grupările amino ale chitosanului printr -o reacție de acilare, obținându -se chitosan
modificat cu grupări palmitoil.
În etapa următoare, materialul obținut a fost formulat în nanocapsule prin procesul
emulsificarii. Prepararea nanocapsulelor este un proces complex ce necesită o derulare
progresivă a unor etape bine stabilite, pentru a îndeplini obiectivul propus. Polimer ul utilizat în
sintezei acestor nanostructuri este un derivat amfifilic al chitosanului, N -palmitoil chitosan ul
biotinilat , obținut prin reacția de acilare a copolimerului cu clorură de palmitoil și biotină .
Această modificare oferă lanțului polimeric capa citatea de a îngloba compuși activi hidrofobi
precum paclitaxelul, datorită afinității reduse a lanțului de palmitoil față de soluțiile cu caracter
polar. Biotina a fost utilizată pentru a facilita procesul de internalizare a nanostructurilor în
celulele t umorale.
În cadrul acestei lucrări este prezentată sinteză unor structuri de tip nanocapsula, pe
baza de N -palmitoil chitosan biotinilat , obținute prin două tehnici diferite și evaluează
capacitatea de încapsulare a medicamentelor chimioterapeutice (Paclitaxel) în scopul utilizării
acestora că o strategie alternativă în terapia cancerului.
Nanocapsulele magnetice pe baza de chitosan biotinilat au fost preparate prin două
tehnici: emulsia simplă, în care s-a folosit N -palmitoil chitosan biotinilat și magnetită hidrofobă
(magnetită acoperită cu oleat de sodiu, Mg_NaOl) (I) și emulsia dublă în care s -a utilizat același
polimer și magnetită hidrofilă ( magnetită acoperită cu cu Pluronic F127, Mg_F127) (II).

44
Nanocapsulele obținute astfel au fost caracterizate pentru a obține informatii cu privire
la structura, compoziție chimică, dimensiune, distribuție dimensională, potențial Zeta și
capacitatea lor de înglobare a substanțelor active hidrofobe și eliberarea ace stora in vitro odată
cu degradarea învelișului polimeric în mediile biologice simulate

3.1 Materiale și metode experimentale
3.1.1 Materiale și reactivi utiliza ți

Materialele și reactivii utilizați pentru prepararea nanoparticulelor magnetice biotinila te
sunt reprezentate în Tabelul 1 iar î n figurile 3.1 și 3.2 sunt reprezentate structurile celor mai
importante materiale utilizate.

Tabelul 3 .1 Materiale și reactivi utilizați pentru obținerea particulelor magnetice
biotinilate
Polimer: Chitosan (Cs) LMW M=50 -190kDa
și grad de deacetilare 75 -85% (Sigma Aldrich) C12H22O8N2
Clorură de palmitoil (Cp)/clorură de
hexadecanoil (Sigma Aldrich) C16H31ClO
Paclitaxel izolat din fungi (PTX) C47H51NO 14
Agent de reticulare: Tripolifosfat de sodiu
(TPP) puritate >98 % Na5O10P3
Polioxietilen sorbitan monooleat (Tween80) C32H60O10
Biotin ă (Sigma Aldrich) C10H16N2O3S
N-hidroxisuccimid ă (NHS) (Sigma Aldrich) C4H5NO 3
Dimetil sulfoxid (DMSO) (Sigma Aldrich) (CH 3)2SO
Activator al reacției de biotinilare: 1 -etil-3-(3-
dimetil aminopropil) carbodiimidă
hidroclorurată ( EDAC) (Sigma Aldrich) C8H17N3·HCl
Solvent: Etanol (Sigma Aldrich) C2H6O
Solvent: Acid acetic (Sigma Aldrich) C2H4O2
Solvent: Metanol (Sigma Aldrich) CH 4O

45
Hidroxid de sodiu (Sigma Aldrich) NaOH
Solvent: Di etil eter (Sigma Aldrich) (CH 3CH 2)2O
Solvent: Acetonă (Sigma Aldrich) C2H5OH

Chitosan

Biotină

PTX

NHS

TPP

Tween 80

46

EDAC

Figura 3.1 Structuri moleculare și supramoleculare ale materia lelor utilizate în
prepararea particulelelor magnetice biotinilate

Acid acetic

Metanol

DMSO

Acetonă

Dietil eter

Figura 3.2 Structuri moleculare și supramoleculare ale solv enților utiliza ți în
prepararea particul elelor magnetice biotinilate

3.1.2 Aparatura utilizată în sinteze

Pentru a sintetiza și pentru a testa și observa toate modificările ce apar în timpul și după
sintetiza, am utilizat următoarele tipuri de aparate:
 Spectrofotometr u UV -1700 PharmaSpec, Shim adzu
 Aparat de centrifugă Hettich Zentrifugen Universal 320R
 Plită de agitare, modelul AREX
 Aparatul Zetasizer Malvern NanoS
 Etuvă Nahita 636
 Liofilizator

47
 Spectroscop FT -IR Bruker Vertex 70
 Aparatul Zetasizer Malvern NanoS
 Baie de ultrasonicare Bandelin
 Omogenizator cu ultrasunete Sonopuls HD 2200
 Spectrometru 1H -RMN Bruker Avance
 Centrifug ă UNIVERSAL 320R
 Aparatul ULTRA TURRAX modelul IKA T25

Plită de agitare modelul AREX

Baie de ultrasonicare Bandelin

Centrifugă modelul UNIVERSAL 320R

Omogeniz ator cu ultrasunete Bandelin

Figura 3.3 Imagini ale plitei de agitare, baia de ultrasonicare, centrifuga și omogenizatorul
utilizate în sinteza nanocapsulelor de tip teranostic

48
3.2 Sinteza nanocapsulelor magnetice biotinilate
3.2.1 Metoda generală de o bținere a N -palmitoil -chitosanului

Pentru a obține structurile dorite, am plecat de la un polimer purificat, N-palmitoil –
chitosan (PCs), pe care l -am sinstetizat prin reacția de acilare a chitosanului cu clorură de
palmitoil (CP) (Figura 3.4) la un raport molar Cs:CP 1:1, conform unui raport precedent 157,cu
diferite modificări. S-au solubilizat inițial 1g de chitosan în 100ml de soluție de acid acetic 1%
(v/v) adăugat în ploaie pentru a evita formarea de aglomerări. Cu ajutorul unei so luții de NaOH
1M, am modificat pH -ul acid al soluției până la valoarea de 6.5 în picătură, pentru a nu precipita.
Reacția s -a realizat s ub agitare magnetică timp de 24 de ore la temperature camerei pentru a
eficientiza procesul și pentru a asigura solubili zarea totală a chitosanului. Ulterior, s -au adăugat
tot în picătură 1.5ml clorură de palmitoil. În următoarea etapă, pH -ul a fost ridicat la valoarea de
7-7.5 cu o soluție de NaOH 5M tot în picătură sub agitare magnetică iar precipitarea s -a realizat
cu aj utorul unui amestec de metanol -amoniac. Precipitatul a fost apoi separate prin centrifugare
și purificat prin spălări repetate cu apă distilată, metanol cald la 50oC si dietil eter aproximativ
10ml pentru a înlătura acizii grași liberi (acidul palmitic). P entru uscare , s-a utilizat etuva timp
de 24 de ore la 40oC +/-2oC.
În Figura 3.4 este prezentată reacția de acilare a chitosanului .

Figura 3.4 Sintez a palmitoil chitosanului (PC s) (A), mecanismul de substituție acil nucleofil
(B)158

49
3.2.2 Obținerea pol imerului N-palmitoil chtitosan biotinilat (BPCs)

Biotina (Vitamina B7) este o vitamină cu rol în creșterea celulară și poate fi propusă
drept compus activ cu rol de moleculă de țintire a formulărilor chimio -terapeutice datorită
supraexprimării receptorilo r pentru biotină de la suprafata celulelor canceroase, ceea ce ajută la
internalizarea structurilor formate în celulele.
Pentru procesul de internalizare a structurilor pe care le vom formula, în celulele
tumorale, am ales să biotinilam compusul astfel: p este 100ml acid acetic 0.1M, am adăugat în
ploaie 1g de produs solid PCs sub agitare magnetică. Separat, am pregătit 5ml DMSO în care am
solubilizat 0.25g de biotină și 0.1g NHS. În următoarea etapă, separat, am solubilizat 0.25g
EDAC în 0.5ml apă distilat ă, pe care l -am adăugat ulterior în picătură. După acest proces, reacția
a fost lăsată în repaos 20 de minute iar apoi a fost adăugată tot în picătură peste PCs -ul
solubilizat în acid acetic. Tot acest proces s -a desfășurat la temperatura camerei, sub agit are
lentă. În Figura 3.5 este prezentată reacția de biotinil are a N -palmitoil chitosanului.

Figura 3.5 Parcursul Sintez a N-palmitoil chitosanului biotinilat

3.2.3 Metoda generală de preparare a nanoparticulelor magnetice

În scopul sintetizării nanocap sulelor pe bază de emulsii, am utilizat două tipuri de
magnetită: una hidrofobă (Mg_NaOl) și una hidrofilă (Mg_ PF127).

Magnetita hidrofobă (MgNaOl)

Aceste structuri coloidale monodisperse superparamagnetice au fost obținute prin
dizolvarea clor urilor de fier FeCl 3 și FeCl 3, NaOH și a oleatului de sodiu (NaOl) în toluen,
etanol, amestecate mecanic pe baie de apă termostatată timp de 4h. Concentrația de NaOH și
NaOl influențează în mod direct proprietățile de suprafață, dimensiunea, dispersia amestecului și

50
proprietățile magnetice. S -a demonstrat că NaOl este un agent tensioactiv decisiv în ceea ce
privește dimensiunea și magnetismul particulelor.159 Acest agent a fost ales deoarece
reacționează ca substanță tampon a pH -ului și pentru că menține nanoparticulel e stabile în medii
cu solvenți nepolari. Acidul oleic sau oleatul de sodoiu, este un surfactant amfifilic ce are o
influență mult mai mare asupra suprafețelor nanoparticulelor față de alți agenți tenzioactivi
deoarece particulele obținute capătă un înveliș rezistent la apă ce le face să fie ușor de dispersat
în solvenți organici nepolari (hexan, toluen, cloroform).160,161
Coprecipitarea chimică se realizează astfel: se introduce un exces bazic de NaOH care
ajută la formarea precipitatelor de magnetită în soluți i apoase de Fe2+ și Fe3+ peste care se adaugă
oleatul de sodiu (NaOl) la o temperatura relativ scăzută pentru a se modifică proprietățile de
suprafață ale particulelor.162,163

Magnetita hidrofilă (MgPF127)

Materialul magnetic selectat pentru acest studiu a f ost reprezentat de oxidul de fier
trivalent, Fe 3O4. Motivele care au stat la baza selecției acestui tip de material magnetic au fost
reprezentate, în primul rând de proprietațile sale magnetice excelente care -i permit manipularea
în câmp magnetic și în al doilea rând de faptul că este un material biocompatibil. Magnetita a
fost obținută prin metoda Massart care constă în co -precipitarea în mediu bazic a soluțiilor
apoase de săruri de Fe 2+ și Fe 3+.
Particulele de magnetită (Fe3O4) au fost preparate prin c o-precipitare în prezență de
surfactant (Pluronic F127 ) .164 Pluronic F127 a fost selectat deoarece este un surfactant hidrofil,
biocompatibil ce prezintă un potențial ridicat de a controla dimensiunea și stabilitatea
particulelor de magnetită.
S-au prepara t două soluții: una constituită din clorură de fier (II) tetrahidrat, și una de
clorură de fier (III) hexahidrat, dizolvate în 84ml apă distilată cu 36ml soluție apoasă de Pluronic
F127 de concentrație 2%. Soluțiile au fost amestecate într -un balon cu trei gâturi. Procesul s -a
desfășurat sub agitare mecanică pe baie de apă termostatată la 65oC. Ulterior, peste sinteză, s -a
adăugat o soluție de hidroxid de sodiu 10% cu ajutorul unei pompe cu debit de 10ml/min, iar
reacția a continuat încă 30 de minute.

51
3.2.4 Metoda de preparare a nanocapsulelor

În această lucrare, nanocapsulele magnetice au fost obținute prin două metode diferite:
emulsie simplă (I) și emulsie dublă (II), cu două tipuri de magnetită diferită.
Metoda I: Emulsia 1 (NP_MgNaOl): S e amestecă 1m l magnetită hidrofobă umedă cu
4ml cloroform după care se dispersează cu ajutorul ultrasunetelor timp de 1min. Soluția se
adaugă peste 5ml BPCs 0.5% și se dispersează din nou la ultrasunete timp de 2min.
Emulsia 2 (NP_MgNaOl_Surf. ): Se amestecă 1ml magneti tă hidrofobă umedă cu 4ml
cloroform și 0.1ml Span80 după care se dispersează la ultrasunete timp de 1min. Separat, se
pregătește o soluție de 10ml BPCs 0.5% cu 0.1ml Tween80 care se omogenizează timp de 2 min
la ultrasunete. Peste soluția de BPCs se adaugă solutia de magnetită și se amestecă timp de 5 min
la ultraturax, de 2 ori cu pauză de 5 min la 15000 rpm.
Emulsia 3 ( NP_MgNaOl_PTX ): Se amestecă 1 ml magnetită hidrofobă umedă cu 4ml
cloroform și 5mg PTX dizolvat în 0.1 ml etanol, după care se dispersează c u ajutorul
ultrasunetelor timp de 1min și se adaugă 0.1 ml Sp an80 și s e lasă în repaus 5min. Separat, se
pregătește o s oluție de 10ml BPCs 0.5% cu 0.1 ml Tween 80 care se omogenizează 2 min cu
ultrasunete, peste care se adaugă magnetită și se amestecă timp de 5 min la ultraturax, de 2 ori cu
pauză de 5 min la 15000 rpm.
Metoda II: Emulsia 1 (NP_MgF127_0.5): Se amestecă cloroform 9ml cu etanol 1ml și
0.1ml Span80 sub agitare la 500 rpm la ultraturax pentru 5 min. Se adaugă peste amestec 5 ml
Mg_PF127 (5 min la baia cu ultrasunete; 2min la omogenizatorul cu ultrasunete) și se amestecă
la 15000 rpm la ultraturax 5 min. Se lasă în repaus 5 min, apoi se adaugă 30 ml BPCs 0.5% (0.1
ml Tween 80) și se amestecă la 15000 rpm 5 min de doua ori cu 5 min pauză între agi tări.
Emulsia 2 (NP_MgF127_1): Se amestecă cloroform 4.5 ml cu 0.5ml etanol
și 0.05ml Span80 sub agitare la 500 rpm la ultraturax pentru 5 min. Se adaugă peste amestec 2.5
ml Mg_PF127 (5 min la baia cu ultrasunete; 2min la omogenizatorul cu ultrasunete ) și se
amestecă la 15000 rpm la ultraturax 5 min. Se lasă în repaus 5 min, apoi se adaugă 15 ml BPCs
1% (0.05 ml Tween 80) și se amestecă la 15000 rpm 5 min de doua ori cu 5 min pauză între
agitări.
Emulsia 3 (NP_MgF127_TPP): Se amestecă cloroform 9ml cu et anol 1ml și 0.1ml
Span80 sub agitare la 500 rpm la ultraturax pentru 5 min. Se adaugă peste amestec 5 ml
Mg_PF127 (5 min la baia cu ultrasunete; 2min omogenizatorul cu ultrasunete ) apoi se amestecă
la 15000 rpm la ultraturax 5 min. Se lasă în repaus 5 min , apoi se adaugă 30 ml BPCs 0.5% (0.1

52
ml Tween 80) și TPP în picătură într -un raport de BPCs:TPP de 5:1 și se amestecă la 15000 rpm
5 min de două ori cu 5 min pauză între agitări.
Emulsia 4 (NP_MgF127_PTX): Se solubilizează 5mg P TX în 0.5ml etanol și se adaugă
peste 4.5ml cloroform cu etanol 0.5ml și 0.05ml Span80 sub agitare la 500 rpm la ultraturax
pentru 5 min. Se adaugă peste amestec 2.5 ml Mg_PF127 (5 min la baia cu ultrasunete; 2min la
omogenizatorul cu ultrasunete ) și se am estecă la 15000 rpm la ultraturax 5 min. Se lasă în repaus
5 min, apoi se adaugă 15 ml BPCs 1% (0.05 ml Tween 80) și se amestecă la 15000 rpm 5 min de
două or i cu 5 min pauză între agitări.

3.3 Metode de caracterizare a polimerului
3.3.1 Evaluarea gradulu i de substituție prin metoda acidului trinitrobenzen
sulfonic (TNBS)

Cuantificarea grupărilor amino este importantă în numeroase domenii biologice. Multe
dintre metodele existente pentru acest scop se bazează pe caracterul nucleofil al azotului aminic.
Metodele ce utilizează derivați nitrobenzenici cum ar fi 1 -fluor -2, 4- dinitrobenzen (1 -3) și 2,4,6 –
trinitrobenzen -1-acid sulfonic (TNBSA) sunt foarte populare. Ultimul reactiv, TNBSA este
specific pentru grupările amino primare (4 -8). Procedura este simp lu de efectuat: proteina
permite reacția cu TNBSA într -un mediu tamponat, obținându -se N -derivați de proteină
trinitrofenil (proteină TNP), concentrația acestora putând fi determinată prin spectroscopie de
absorbție moleculară.
Cu o zi înaintea efectuării testului, 10mg de compus derivate de chitosan (NPCs) au fost
pusși la umflat în 2.5 ml apă deionizată timp de 24 de ore sub agitare magnetică. S -au preparat și
50ml NaNCO 3 (4%) și 50ml de HCl (2M ). Următoarea etapă presupune amestecarea celor 2.5ml
de prob a cu 2.5ml de NaHCO 3 (4%) și cu 2.5ml reactiv TNBS 0.1% (care se prepară pe loc din
soluția stoc din frigider) la temperatura de 37oC sub agitare lentă. După 2 ore, se adaugă 2.5ml
de soluție de HCl (2M) pentru a întrerupe reacția și se citește absorbanța soluției cu ajutorul unui
Spectrofotometru UV -1700 PharmaSpec, Shimadzu la o lungime de undă de 344nm. Grupările
amino rămase libere, sunt cuantificate pe baza unei curbe de calibrare standard obținută prin
determinarea grupărilor amino ale unor soluții de chitosan de diferite concentrații.
Metoda TNBS este una eficientă, rapidă, ce poate indentifica grupările aminice rămase
libere după acilarea chitosanului, deoarece în urmă reacției cu reactivul TNBS formează un
compus ce poate fi cuantificat la spectrof otmetru la lungimea de undă de 344nm.

53
În figur a 3.6 este reprezentat principiul testului TNBS.

Figura 3.6 Principiul cuantificării grupărilor amino din soluția de PCs

3.3.2 Evaluarea gradului si biotinilare prin tehnica HABA -Avidină

Biotina este o mole culă mică, solubilă în apă, cu o greutate moleculară de 244Da.
Această moleculă este un micronutrient esențial în creșterea celulelor și implicit în transferul de
material genetic.
Gradul de biotinilare se poate cuantifica cu ajutorul tehnicii HABA -Avid ină. HABA
(acid caboxilic 2,4 – hidroxiazobenzen) este un omolog al biotinei care realizează legături mult
mai slabe cu avidina. Astfel, în prezența biotinei, acesta este dezlocuit stoechiometric din
complexul HABA -Avidină, schimb care este însoțit de o scă dere a absorbanței de la 500nm
cuantificată spectrofotometric cu ajutorul unui spectrofotometru UV -1700 PharmaSpec,
Shimadzu.
Tehnica a fost realizată astfel: complexul Haba/Avidină a fost solubilizat în 10ml apă
bidistilată. Pentru trasarea curbei de etal onare a biotinei în raport cu HABA, s -au preparat soluții
de biotină în apă bidistilată cu concentrații în domeniul 0,01 -0,05 nmoli/ml. 0,9ml soluție HABA
au fost amesteca ți în 0,6 ml soluție de biotină și lăsate in repaus timp de 30min, după care pentru
fiecare concentrație s -a măsurat extincția la 500nm.
Pentru realizarea testului, am procedat astfel: 2mg din trei probe de BPCs solubilizate în
2ml acid acetic 0.1M. Din această soluție s -au luat 0.6ml peste care s -au adăugat 0.99ml soluție
de HABA -Avidina și am citit absorbantă la spectrofotometru la o lungime de undă de 500nm.
Diferențele de absorbante au fost date de concentrația de biotină din fiecare compus. Gradul de
biotinilare a fost calculat folosind ecuația:
Gradul de biotinilare = (ΔA 500nmPB – b) / (a × m)

54
Unde ΔA 500nmPB reprezintă diferența dintre extincția reactivului pur HABA/Avidină la
500nm și extincția înregistrată după incubarea polimerului cu HABA/Avidină, b este intercepția
dreptei cu ordonata curbei de etalonare a bioti nei, a este panta dreptei iar m este masa probei
exprimată in mg.
3.3.3 Testul de solubilitate

Pentru a se observa solubilitatea polimerului, am realizat următorul test de solubilitate :
din produsul BPCs uscat rezultat, s -au luat trei probe de câte 10mg care s -au solubilizat în 5ml
acid acetic 0.1M, 5ml DMSO respectiv 5mL apă și au fost lăsate la temperatura camerei 24h. În
tabelul 3.1 sunt prezentate rezultatele testului solubilitătii, gradul de biotinilare și gradul de
substituție al polimerului.

3.4 Metode de caracterizare a nanocapsulelor magnetice
3.4.1 Determinarea dimensiunilor nanocapsulelor

Tehnica DLS (Dynamic light scattering) adesea numită și spectroscopie de corelare
fotonică (PCS), este o tehnică comună pentru determinarea dimensiunii parti culelor în suspensii
coloidale. Această poate caracteriza structuri de dimensiuni foarte mici și poate achiziționa date
cu privire la diametrul hidrodinamic (dimensiunea medie) și distrubuția dimensională a
nanostructurilor. Structurile suspendate în solve ntul lichid suferă o mișcare aleatorie Browniană
iar lumina este împrăștiată din particule în suspensie, datorită variației de intensitate produse de
schimbările de localizare ale structurilor din suspensie.
În cadrul acestei lucrări, nanocapsulele magneti ce au fost caracterizate folosind un
aparat de tip Malvern NanoS Zetasizer (Figura 3.7). Probele analizate sunt suspedate într -un
mediu lichid, iar cu ajutorul aparatului, se analizează variațiile de intesitate luminoasă create de
mișcarea aleatorie astfe l încât, dacă o nanocapsulă este mai mică, deplasarea sa prin mediu va fi
mai rapidă. Ecuația Stokes -Einstein corelează dimensiunea nanocapsulelor cu viteză rezultată în
urmă mișcării Browniene.

55
Unde D reprezintă coeficientul de difuzie , kB reprezintă c onstanta lui Boltzmann, T este
temperatura iar η este vâscozitatea solventului (a mediuliu) iar rh este raza particulei
hidrodinamice.165

Figura 3.7 Aparatul Zetasizer Malvern NanoS

3.4.2 Determinarea potențialului Zeta

Potențialul Zeta al particulelor p recum și dimensiunile acestora, influențează dramatic
stabilitatea, circulația acestora în fluxul sangvin și absorbția acestora în organism. Acest
potential a fost măsurat folosind tehnica Laser Doppler Veocimetry (LDV), cu un aparat de
tip Zetasi zer Malve rn NanoS (Figura 3.7 ) care determină mobilitatea eletroforetică a
nanocapsulelor analizate, prin măsurarea vitezei acestora atunci când sunt sub influența unui
curent electroforetic. Potențialul Zeta este calculat pe baza ecuației lui Smoluchowski.

Unde η este vâscozitatea și ε este constanta dielectrică, k reprezintă parametrul Debye -Huckel
iar r este raza particulei.
Potențialul Zeta, este un termen științific pentru potențialul electrocinetic al sistemelor
coloidale care apare la suprafața de separar e dintre stratul dublu electric al particulelor aflate sub
influență unui curent electroforetic și fluidul dispersat. Stratul dublu electric apare în urma
dispersării particulelor încărcate deja cu o anumită sarcina, adică prezența unei sarcini electrice
pe suprafața particulei afectează distribuția ionilor în regiunea interfacială înconjurătoare,
conducând la o creștere a concentrației ionilor de semn contrar particulei la suprafață acesteia.
Stratul dublu electric din jurul fiecărei particule este alcăt uit din două zone: o zonă interioară,

56
numită strat Stern (unde ionii sunt puternic legați) și o zonă exterioară, difuză, în care ionii sunt
mai puțin bine atasați. Prezentarea distribuției celor două straturi poate fi urmărită in Figura 3.8 .

Figura 3 .8 Reprezentarea schematică a distribuției ionilor la contactul cu o particulă încărcată
electric

În stratul difuz observăm o limită imaginară în jurul particulei până când această capătă
o formă stabilă. Când particulele se mișcă, ionii din interiorul ac estei limite se mișcă odată cu ea.
Ionii care se află în afară limitei imaginera nu se deplasează odată cu particula. Limita aceasta
poartă denumirea de suprafață de forfecare hidrodinamică (Plan de forfecare). Potențialul Zeta
este potențialul care apare la această limita și se măsoară în milivolti. O proba poate fi
caracterizată ca fiind stabilă sau instabilă, în general, fie la +30mV, fie la +30mV. Particulele
care depășesc acest domeniu, sunt considerate, în mod obișnuit, stabile în suspensii apoase.
Valoarea potențialului Zeta al unei probe indică dacă particulele aflate într -un lichid tind să se
asocieze sau nu.

Commented [A6]: Spatii

57
3.4.3 Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (FT -IR)

Radiațiile infraro șii sunt acele radiații din spectru l electromagnetic, ca re au lungimea de
undă superioară radiațiilor ce să află în domeniul vizibil și inferioară microundelor, cuprinse
între 780nm și 1mm. La întâlnirea unui fascicul de radiație infraroșie de o anumită frecvența cu o
moleculă, pot avea loc două fenomene:
– dacă moleculă vibrează cu o frecvența diferită de cea a undelor incidente, radiațiile
trec fără a interacționa cu moleculă.
– dacă moleculă vibrează cu aceeași frecvența cu cea a undelor incidente, aceasta va
absorbi o parte din energia radiantă și va trece pe un nivel energetic superior sau într -o stare
excitată. Această tranziție este cuantificată și se manifestă prin mărirea amplitudinii oscilațiilor
moleculei.
Spectroscopia în infraroșu cu transformată Fouriere este o tehnică ce furnizează
informaț ii esen țiale despre structura moleculară a componentelor organice și anorganice și este
una dintre cele mai versatile analize tehnice pentru caracterizarea chimică nedistructivă .166
Această metodă analitică, analizează structura moleculară și natura grupărilor func ționale din
molecule prin determinarea transmitanței sau absorbanței comparativ cu o probă de referință.
Proba analizată este străbătută de radiație IR, o parte din aceasta este absorbită de material, iar
cealaltă trece prin el și este înregistrată de apar at care mai apoi procesează datele achiziționate cu
ajutorul transformatei Fourier și le convertește în unități de măsură din spectrul electromagnetic.
Domeniul infraroșu este cuprins intre lungimi de undă de 0.8 și 200 μm și este divizat în trei
subdomeni i: IR apropiat, IR mijlociu și IR îndepărtat. Regiunea utilizată în spectroscopia FT -IR
este cea de mijloc (2,5 – 25μm), cu lungimi de undă cuprinse între 400 și 4000 cm-1. În figura 3.9
este reprezentat spectrul electromagnetic

Figura 3.9 Spectrul elec tromagnetic167

58
În analiza FT -IR, absorbția radiației IR apare atunci când foton ii, care dețin energii
similar cu cele ale legăturilor din molecule, trec printr -o moleculă și realizează o excitație a
acesteia din care rezu ltă o stare energetică mai mare. Vibr ația legăturilor se realizează dacă
acestea absorb un foton cu o energie egală cu cea pe care o are legătura specifică. Vibrațiile
legaturlor sunt vizibile în domeniul IR. Valorile de vârf a fiecărei absorbanțe IR este determinată
de proprietățile intrinse ci ale fiecărei molecule și astfel, fiecărei grupări din moleculă ii va
corespunde o valoare a absorbanț ei.168
Pentru a caracteriza nanostructurile prezentate în această lucrare, am utilizat un
Spectroscop FT-IR Bruker Vertex (Figura 3.10 ), pe un domeniu înt re 4000 și 400 cm -1, cu o
rezoluție de 4 cm -1, în mod de transmitanță. Probele analizate au fost mojarate cu KBr, iar
amestecul a fost prelucrat cu ajutorul unei preșe hidraulice de 2 tone sub formă unor discuri
subțiri.

Figur a 3.10 Spectroscop FT -IR Bruker Vertex 70

3.4.4 Determinarea capacității de eliberare a medicamentului in vitro

Pentru a analiza eliberarea in vitro a medicamentului din nanocapsulele obținute, am
folosit două soluții ce pot simula mediile biologice. Sol uție PBS cu pH=7,4 și ABS cu pH=5.5.
S-au pregătit soluții din toate probele de nanocapsule obținute astfel: o cantitate de nanocapsule a
fost redispersata într -o membrană de dializă fiartă în prealabil, care a fost introdusă în soluții
tampon fosfat ajung ându -se la un volum total de 25ml. Probele au fost introduse în etuvă
modelul ESAC ( Figura 3.11 ) la o temperatura de 37oC. La anumite intervale de timp, s -au
prelevat 1,5ml din soluția aflată în afara membranei de dializă pentru citirea spectrofotometrică a
absorbanței la o lungime de undă de 227nm cu ajutorul unui Spectrofotometru UV -1700

59
PharmaSpec, Shimadzu (Figura 3.12 ). Cantitatea de substanță prelevată de soluție tampon a fost
înlocuită iar cantitatea de medicament eliberată a fost calculată cu ajutor ul unei curbe etalon.

Figura 3.11 Etuvă modelul ESAC

Figura 3.12 Spectrofotometru UV -1700 P harmaSpec, Shimadzu

3.5 Rezultate și discuții
3.5.1 Evaluarea gradului de sustituție, de biotinilare și solubilitatea polimerului
Gradul de substituție
După obținerea N -palmitoil chitosanului, gradul de substituție a fost determinat prin
metoda TNBS. Metoda TNBS este o metodă simplă și rapidă prin care se pot identifica compușii
rămași liberi în reacție, în cazul nostru grupările amini ce rămase libere după acilare, deoarece în
urma reacției cu TNBS se formează un compus cromogen, ce poate fi cuantificat
spectrofotometric la 344 nm .

60
În vederea cuantificării grupări lor amino rămase libere din polimerul NPCs sintetizat , s-
a efectuat testul cu reactiv TNBS după o metodă descrisă anterior169 cu diferite modificări.
Gradul de substituție al polimerului a fost calculat folosind o curbă standard obținută prin
determinarea conținut ului liber de grupări –NH 2 a mai multor soluții ce conțin cantități
crescătoare de N -palitoil chitosan. Evaluarea gradului de substituție al polimerului este important
de determinat deoarece dimensiunile structurilor obținute ulterior depind și de lungimea catenei
polimerului și de natura grupărilor atașate acestuia.
Gradu l de biotinilare
În această lucrare, gradul de biotinilare al polimerului bioti nilat B PCs a fost determinat
cu cantitativ cu ajutorul testului HABA/Avidină folosind un protocol descris anterior.170 Pe scurt,
compușii BPCs care au fost analizați au fost dizol vați în 2ml acid acetic 0.05M. Compusul
HABA/Avidină a fost dizolvat în 10ml apă deionizata. S -au amestecat 0.6ml BPCs cu 0.9ml
HABA/Avidina și s -au citit absorbanțele la 550nm. Pentru trasarea curbei de calibrare, biotina a
fost dizolvată în apă deionizat ă (la concentrații în gama 0,01 -0,05 nmol / ml). Rezultatele acestor
teste sunt redate în Tabelul

Tabelul 3.2 Rezultatele gradului de biotinilare, a solubilității și a gradului de substituție

După cum se observă, proba supusă testelor de solubilitate a prezentat o solubilitate
ridicată în acid acetic și DMSO, iar în apă un nivel accentuat de umflare. Gradul de biotinilare
arată o cantitate de biotină de 0.598 nm/mg.
3.5.2 Caracterizarea fizico -chimică a polimerului utilizat în formularea emulsiilor

Polimerul obținut a fost caracterizat prin spectrosco pie în infraroșu. În Figura 3.13 sunt
reprezentate spectrele chitosanului după reacția de acilare și biotinilare. Spectrul FT -IR al
polimerului este reprezentat de absorbțiile caracteristice următoarelor gr upări: 3387 cm-1
corespunzătoare atât vibrațiilor de întindere a grupărilor amino (NH) cât și a grupărilor hidroxil
(HO); benzile de la 2916 cm-1 respectiv 2847 cm-1 pot fi atribuite vibrațiilor de deformare ale
grupărilor metilen (CH 2) din lanțul palmitoi lului; semnalele de la 1651 cm-1 și 1558 cm-1 sunt

61
reprezentate de amida primară și secundară. Banda de la 1420 cm-1 definește vibrația de întindere
a grupării C -N iar cea de la 1018 cm-1 este atribuită vibrațiilor grupării C -O-C. În tabelul 3.3 sunt
repre zentate benzile caracteristice de absorbanță în IR a BPCs -ului, unde putem corela
absorbanta cu fiecare grupare în parte. S -au înregistrat benzi caracteristice atât chitosanului cât și
palmitoilului si biotinei.

Figura 3.13 Spectrel e FT -IR al polimerului N -palmitoil chitosan biotinilar din care s -au obținut
emulsiile

Tabelul 3.3 Valorile benzilor caracteristice compoziției polimerului
Compus Bandă reprezentativă (cm-1) Grupare

Chitosan 3387 OH/NH
1651 C=O
1420 C-N/N-H
1018 C-O-C

Palmitoil 1651 C=O
2816/2846 CH 2

3387 OH/NH
1651 C=O

62
Biotină 1149 C-O
1420 C-N

3.5.3 Prepararea structurilor de tip nanocapsule prin metoda emulsiei simple si
emulsiei duble.

În cadrul acestei lucrări s -au sintetizat structuri de tipul nanocapsulelor magnetice pe
bază de N -palmitoil chitosan biotinilate, prin două tehnici diferite: tehnica dublei emulsii și
tehnica simplei emulsii. În Figura 3.14 este reprezentată schematic obținerea acestor structuri.

Figura 3.14 Reprezentare schemat ică a procesului de sinteză a nanocapsulelor

Prima emulsie dublă formulată datează de 80 de ani171, însă există încă multe alte
provocări în ceea ce privește obținerea dublelor emulsii stabile. Emulsiile reprezintă acele

63
sisteme lichide alcătuite din mai m ulte faze: apă, ulei și surfactanți. Acestea se constituie în
lichide unice, relativ izotropice și stabile din punct de vedere termodinamic și prezintă în general
stabilitate limitată. În general, emulsiile pot fi simple sau multiple. Pentru a se formula e mulsii
cu aplicație în eliberare de medicamente, se urmărește încetinirea destabilizării cinetice cu
ajutorul unor agenți tensioactivi de suprafață.
În cazul emulsiilor simple , acestea sunt dispersate și constituite din sisteme multfazice
din cel puțin dou ă lichide insolubile unul în celălalt. Faza dispersată apare sub formă de picături
în faza continuă. În funcție de procesul de emulsificare, diametrul picăturilor variază între 0,1um
și 0,1mm. Aceste tipuri de emulsii sunt instabile din punct de vedere ter modinamic, ceea ce
înseamnă că picăturile au tendința de a se aglomera datorită tensiunilor de suprafață ale acestora.
Emulsii le duble sunt constituite dintr -o emulsie care la rândul ei formează o altă
emulsie, astfel se pot distinge două tipuri de emulsii duble: emulsia a/u/a – apă-în ulei -în apă, în
care o emulsie simplă a/u este dispersată în picătură într -o faza apoasă și emulsia u/a/u – ulei-în
apă-în ulei, în care o emulsie simplă u/a este dispersată într -o faza uleioasă.
De obicei, emulsiile duble su nt construite printr -un procedeu de emulsif icare în două
etape (Figura 3.11 ). În cazul acetor sisteme, se utilizează doi surfactanti, unul hidrofob cu rolul
stabilizării interfeței interne în emulsia inițială a/u, și unul hidrofil care stabilizează interfa ță
externă a picăturilor de ulei. Emulsia inițială a/u se prepară în condiții de forfecare ridicată
pentru a se formă picături cât mai mici, iar în cea de -a II-a etapă, când se produce emulsificarea
emulsiei, forțele de forfecare sunt mai mici pentru a evi ta ruperea picăturilor interne.172 În acest
proces, forțele de forfecare ridicată, care au fost induse cu ajutorul unui aparat ULTRA
TUR RAX modelul IKA T25 (Figura 3.15 ), au rolul de a produce picături cât mai mici în emulsie
și de a distribui picăturile dim ensional în faza continuă.

Figura 3.15 Aparatul ULTRA TURRAX modelul IKA T25

64
Florența și Whitehill descriu patru posibile mecanisme prin care emulsiile a/u/a devin
instabile:173
– coalescenta picăturilor de apă interne
– coalesc enta picăturilor de ulei
– ruptura peliculei de ulei care separă fazele interne și externe
-trecere apei și a materialului solubil în apă (medicamentul) în interiorul picăturile prin
pelicula de ulei.
Ultimul mecanism se poate realiza prin două fenomene: p rin transportul micelar invers
care duce la pătrunderea direct a apei prin pelicula de ulei și prin difuzie, acolo unde pelicula de
ulei este foarte subțire.174-N.Garti Toate aceste fenomene sunt responsabile de distribuția mărimilor
picăturilor interne și externe, aspect crucial în stabilizarea emulsiilor și pot apărea atât în
momentul formulării emulsiei, cât și în momentul depozitării acesteia. În plus, aceste aspecte
sunt importante deoarece emulsiile duble sunt caracterizate în general în funcție de ra ndamentul
de captare al unui anumit compus în faza de picătură internă și stabilitatea în timp.174
Caracteristicile nanocapsulelor obținute prin emulsii se pot realiza prin ajustarea
parametrilor de sinteză, având modificări în ceea ce privește dimensiunea, valoarea potențialului
Zeta, indicele de polidispersie. Pentru aceste aspecte s -au dezvoltat de -a lungul timpului multiple
modificări ale tehnicii de emulsificare cu scopul obținerii diferitelor tipuri de nanostructuri.
În literatura de specialitate se găs esc multiple formulări ale emulsiilor duble cu diferite
tipuri de uleiuri, diferte tipuri de surfactanti și fracții de faza (Tabelul 3.2). Combinațiile
surfactantilor influențează în mod deosebit stabilitatea fazei apoase exterioare iar agenții
tensioactiv i ce se adaugă în polimer sunt buni emulgatori și stabilizatori deoarece pot proteja
suprafețele picăturilor și reduc fenomenul de coalescență prin intermediul unei forț e de rezistență
la forfecare.174-N.Garti Se poate spune că alegerea metodei de preparar e a emulsiilor este cel mai
important aspect și are în vedere dimensiunea picăturilor formate și stabilitatea în timpul
depozitării acestora.
Cele mai importante aparate utilizate în emulsificare sunt aparatele de agitare, sistemele
rotor -stator și omogeni zatoarele de înaltă presiune. Agitatoarele sunt cele mai vechi tipuri de
apare utilizate în formularea emulsiilor, acestea împărțind faza dispersată prin tensiunile de
forfecare ale turbulenței aparatului.175 Consumul de energie este de obicei unul mare. În cazul
aparatului Ultra -TURAXX utilizat in această lucrare pentru sinteza emulsiilor, procesul de
emulsificare are loc datorită turbulenței crescute a rotorului și existența unei cavității dințate pe
stator. Dimensiunea picăturilor și distribuția uniformă a acestora în sistemul coloidal nu sunt

65
ușor de controlat. Pentru sintetizarea dublelor emulsii este necesară o utilizare a forțelor de
forfecare foarte mare, în cazul nostru, aparatul a fost utilizat la 15000 rpm pentru a obține
picături foarte mici și pen tru a preveni coalescenta acestora în faza exterioară.

Tabelul 3.4 Câteva exemple de formulări de succes utilizate pentru producerea de emulsii
duble (W1 / O / W2)
Faza apoasă internă (W 1) ConcentrațiaW 1% Faza uleioasă (O) Faza apoasă internă (W 2)
Fără a ditivi 30vol.% Ulei de soia; 0.5% PC; 0.5% PGCR 1% LPC; 5% glucoză 176
Fără aditivi 10vol.% Acid oleic; TGPR 3% Tween 20 3% 177
Fără aditivi 5 și 10% Ulei de rapiță; PGPR 10% Tween 80 1 -3% 178
Tris–HCl tampon 10vol.% Oleat de etil decan, MCT; 5%Cr -310 Tris–HCl tampon (1% PGML) 179
D(+) glucoză 5% 10–30vol.% Ulei de soia; PGPR 5% Tween 80 0.5%; D(+) glucoză alginate de sodiu
5%180

În prezent, există o serie de aplicații promițătoare orientate către domeniul
nanotehnologiei se bazează pe un nou concept care imp lică o procedură de abordare simultană a
diagnosticului cu terapia în medicina personalizată, numite și nanosisteme teranostice. Un astfel
de sistem este capabil să elibere un medicament citostatic cu eliberare declanșată sau controlată,
și poate ținti spe cific tumorile și în același timp permite realizarea diagnosticului prin metode
imagistic e cu o precizie destul de mare.
În această lucrare s -au sintetizat nanosisteme magnetice compuse din:
-un miez magnetic, folosind magnetita pentr u direcționarea particulelor spre tumori și
pentru diagnosticul prin tehnica RMN
-o capsulă biocompatibilă alcătuită din N -palmitoil chitosan biotinilat care asigură
stabilizarea structurilor în mediul fiziologic și internalizarea acestora în celulele canc eroase
datorită biotinei
-o substanță activă chimioterapeutică (Paclitaxel)
Luând în considerare facatorii menționați anterior, în scopul optimizării emulsiilor și
nanocapsulelor finale obținute, s -au realizat modificări ale valorilor parametrilor implicaț i în
reacție. Inițial s -au efectuat studii pe probe cu cantități mici de faze, pentru a se observă efectele
dorite și pentru a obține o serie de concluzii în ceea ce privește modul de formulare al sintezei
finale. Aceste emulsii sunt reprezentate în Tabelu l 3.3.
Compoziția chimică, distribuția dimensională a mărimii și sarcina de suprafață a
nanosistemelor magnetice au fost caracterizate prin analize FT -IR și DLS. Nanostructurile
obținute au prezentat dimensiuni submicronice si valori ale potențialului Zet a pozitive, corelate

66
cu modificările parametrilor de sinteză. Pentru evaluarea potențialului acestora de a fi utilizate ca
sisteme de administrare a medicamentelor, s -au efectuat teste de eliberare in vitro . Aceste
structuri au prezentat capacitate de îngl obare a medicamentului hidrofob utilizat precum și
capacitate de eliberare controlată in mediile biologice simulate de PBS 7.4 și ABS 5.5 .

3.5.4 Caracterizarea fizico -chimică a nanostructurilor
3.5.4.1 Analiza DLS a nanocapsulelor

În cadrul acestei lucră ri s-au sintetizat mai multe nanosisteme cu rol în eliberarea de
medicamente , prin două metode diferite. Aceste emulsii diferă între ele nu numai datorită
metodei utilizate în prepararea lor ci și datorită concentrației de polimer, tipului de magnetită
utilizat precum și tipul agentului tensioactiv. Nanostructurile obținute în urma sintezei au fost
caracterizate prin tehnica DLS, pentru a observa dimeniunea medie și distribuția dimensionala a
acestora. Din rezultatele obținute în tabelul 3.5 putem observa u rmătoarele aspecte:
Dimensiuni:
Se poate observa din tabelul 3.5 că nu doar caracteristicile polimerului și concentrația
acestuia acestuia influențează dimensiunea nanocapsulelor, ci și metoda utilizată în sinteză.
Nanocapsulele obținute în sinteze au dim ensiuni foarte apropiate. În cazul dublelor emulsii se
observă obținerea unor nanocapsule cu dimensiuni relativ mai mari decât în cazul nanocapsulelor
obținute prin emulsiile simple. În sistemul NP_MgPF127_ 0.5, nanocapsulele obținute au o
dimensiune mai ma re decât a NP_MgPF127_1 datorită diferenței concentrației de polimer
utilizată în reacție. Se observă că în momentul înglobarii Paclitaxelului acestea tind să își
micșoreze dimensiunile.
Pe de altă parte, se constată că dimensiunile nanocapsulelor din sist emele NP_MgNaOl
și NP_MgNaOl_Surf variază de la 371 -215.7 , datorită utilizării surfactantilor în cea de a două
sinteză. De asemenea, înglobarea medicamentului în nanocapsulele obținute prin emulsii simple
duce la diminuarea dimensiunilor acestora.
Potenția lul Zeta :
Pentru toate nanosistemele analizate s -au înregistrat valori negative ale potențialului
Zeta, fapt care confirmă prezența biotinei pe suprafața acestora. Pentru structurile din emulsia
dublă NP_MgPF127_TPP formulată cu TPP, se observă o modulare a potențialului Zeta de la –
6.27 mV la -13.5mV datorită cantității de TPP adăugate Indicele de polidispersitate:

67
Vitaza de amestecare este strâns legată de indicele de polidispersitate, de aceea nu se observă
variații mari ale acestuia deoarece sintezele s-au realizat la aceeași viteză de rotație (15000rpm),
însă în cazul sistemului în care se află și TPP apare o creștere semnificativă a indicelui de
polidispersitate ca urmare a reacției de gelifiere a sistemului. De asemenea se observă o valoare
generală mai mică al indicelui în cazul nanocapsulelor obținute prin emulsie simplă deoarece
acestea sunt mai ușor de dispersat în momentul în care se sintetizează.

Tabelul 3.5 Rezultatele obtinute in urma analizei DLS
Cod nanosisteme Componente Diametru mediu
(nm) Intensitate
(%) Indicele
de
polidispe
rsitate Poten
tialul
Zeta
(mV) Conductivitate
(ms/cm)
NP_Mg PF127_0.5 BPCs 0.5%/Mg_F127 241.6 386.5
(94.6) 0.465 -6.27 0.196
NP_Mg PF127_1 BPCs 1%/Mg_F127 317.1 373.2
(90.3) 0.422 -14.9 0.03
NP_Mg PF127_TP
P BPCs 1%/Mg _F127/TPP
5/1 229.6 129.9
(51.3) 0.744 -13.5 0.04
NP_Mg PF127_PT
X BPCs 1%/Mg_F127/PTX 221.5 230.4
(98.5) 0.335 -16.4 0.015
NP_MgNaOl BPCS 0.5%/Mg_NaOl 371 423.1
(96.9) 0.279 -18.6 0.053
NP_MgNaOl_Surf
. BPCS
0.5%/Mg_NaOl/Surf. 215.7 262.8
(86.8) 0.370 -19.4 0.024
NP_MgNaOl_PT
X BPCS
0.5%/Mg_NaOl/PTX 205.3 283.2 (100) 0.288 -18.7 0.01

3.5.4.2 Spectrul FT -IR al nanocapsulelor

Nanostructuri le încărcate cu medicamentau fost caracterizate cu ajutorul spectroscopiei
în infraroșu. În Figura 3.16 putem observa spectrele acestor nanostructuri încărcate cu Paclitaxel
și obținute prin emulsie simplă (NP6_MgNaOl_PTX ) respectiv dublă emulsie
(NP4_MgPF127_PTX ). În Spectrul FT -IR observăm benzile absorbanței caracteristice
următoarelor grupări:
-NP6_MgNaOl_PTX: vibrați ile de la 2925 cm-1 și 2856 cm-1 sunt corespunzătoare
grupărilor metilen (CH 2) din lanțul de palmitoil, cele de la 1737 cm-1 specifice grupărilor C=O
iar semnalele de la 1633 cm-1 și 1529 cm-1 sunt reprezentative pentru amida primară și cea

68
secundară. În c azul vibrațiilor de la 1462 cm-1 și 1365 cm-1 avem grupările C -N și N -H.
Urmărind în continuare spectrul, vom observa semnale la 1174 cm-1 și 1099 cm-1
corespunzătoare grupării C -O și semnalul de la 588 cm-1 responsabil vibrațiilor din legăturile Fe –
O-Fe ce se găsesc în magnetită. -NP4_MgPF127_PTX: 2924 cm-1 și 2854 grupările metil (CH 2)
din lanțul de palmitoil, 1737 cm-1 gruparea C=O, 1643 cm-1 și 1535 cm-1 sunt amidele, 1462 cm-1
și 1354 cm-1 grupările C -N și N-H, 1247 cm-1 gruparea C -N, vibrația de la 11 03 cm-1 este
caracteristică grupării C -O iar la 586 cm-1 întâlnim vibrațiile legăturilor Fe -O-Fe din magnetită.
Conform literaturii de specialitate, benzile principale ce corespun Paclitaxelului sunt
următoarele: vibrațiile de întindere ale grupărilor C -N la 1200 -1250 cm-1, benzile amidelor sunt
la 1650 cm-1, reprezentate de grupările NH, vibrațiile de întindere a grupărilor C=O la 1735 cm-1
iar CH 2 are vibrații de întindere simetrice și asimetrice 2970 -2885 cm-1.

Figura 3.16 Spectrele FT -IR ale nanostruc turilor create prin dublă si simplă emulsie pe bază de
N-palmitoil chitosan biotinilat incărcate cu Paclitaxel și magnetită hidrofobă
(NP_MgNaOl_PTX) si magnetită hidrofilă (NP_MgPF127_PTX)

69
Pentru aceste două tipuri de nanostructuri, benzile caracteristic e de absorbanță în
infraroșu sunt reprezentate în T abelul 3.6, unde le putem corela cu fiecare grupare funcțională în
parte. Din tabel putem observa că s -au înregistrat benzi caracteristice chitosanului, lanțurilor de
palmitoil, biotinei și Paclitaxel. În plus, se pot observa benzile de la 588 cm -1 si 596 cm -1
corespunzătoare vibrațiilor legăturilor dintre fier si oxigen (Fe -O-Fe). În general, benzile
Paclitaxelului se suprapun peste cele ale structurii polimerului. Din această cauză, medicamentul
are benz i comune atât cu chitosanul , în zonele 1737 cm -1 și 1245 cm -1 corespunzătoare
grupărilor C=O și C -N, cât și cu lanțul de palmitoil la vibrațiile 2925 cm -1 și 2856 cm -1 datoriă
întinderii grupărilor CH2.

Tabelul 3.6 Valorile benzilor caracteristice compoz iției nanostructurilor formulate
Compus Bandă reprezentativă (cm-1)

NP_MgNaOl_PTX NP_MgFP127_PTX Grupare
Chitosan 1737 1737 C=O
1462 1462 C-N/N-H
1365 1354
1099 1103 C-O
Palmitoil 1737 1737 C=O
2925 2924 CH 2
2856 2854
Biotină 1737 1737 C=O
1099 1103 C-O
1462 1462 C-N
Paclitaxel 2925 2924 CH 2
2856 2854
1737 1737 C=O
Magnetită 588 586 Fe-O-Fe

70
3.5.4.3 Studii in vitro de eliberare a medicamentului în medii biologice simulate

Pentru ca structurile formulate să fie utiliza te în scopul de a ținti și distruge celulele
tumorale, acestea trebuie să treacă de barierele impuse de celulele tumorale și să penetreze
membrana acestora. În cazul medicamentulu i ales (Paclitaxel) , a cărui primă localizare de
acțiune se află la nivel mic rotubular, concentrația este esențială pentru ca efectul său să fie cât
mai satisfăcător. De aceea, eliberarea lui intracelulară eficientă este esențială pentru a distruge
celulele tumorale.
Paclitaxelul este un medicament chimioterapic ce se folosește în scopul distrugerii
celulelor tumorale ce apar la nivel mamar, pulmonar, pancreatic sau ovarian. În tratamentul
obișnuit, acesta este administrat intravenos, efectul său terapeutic bazându -se pe interferența
toxinei cu procesul de diviziune celulară, care declanșează apoptoza sau oprirea proliferării.
Studiile asupra cineticii de eliberare a Paclitaxelului pe care le -am efectuat au fost
realizate în două medii biologice simulate (soluții tampon fosfat cu pH de 7.4 respectiv 5.5), la o
temperatura de 37oC timp de 24h (Figura 3.17 ). Se observă că nanocapsulele prezintă un model
de eliberare bifazic, o prima faza în care medicamentul s -a eliberat rapid, în primele 4h, după
care într -o faza secundă eliberare s -a produs constant până la 24h. De asemenea, se poat e
observă că în cazul ambelor tipuri de nanocapsule, eliberarea mai accentuată de medicament a
avut loc la un pH mai acid. Acest fenomen trebuie luat în considerare deoarece celulele tumorale
prezintă un pH acid.

Figura 3.17 Cinetica de eliberare a medic amentului în soluții tampon cu pH=7.5 și pH=5.5

71
Există numeroase studii care confirmă că pH -ul și temperatura sunt investigate în
amănunt pentru a trata tumorile solide, întrucât țesuturile inflamate sau neoplazice prezintă un
pH acid sau o temperatura mai ridicată decatu țesuturile sănătoase.181 Pentru a se obține efectul
de țintire al tumorilor solide de către medicamente se proiectează transportori de medicamente
sensibili la anumiți stimuli care se pot dezintegra și pot elibera medicamentul încapsulat atu nci
când întâlnesc un pH mai scăzut sau o temperatura ridicată la fel ca în cazul tumori lor.
Gradul de substituție în derivații de chitosan acilați a fost determinată prin cuantificarea
grupărilor amino libere rămase prin analiză TNBS, conform unei metode descrise anterior, cu
unele modificări.182 . TNBS -ul a fost introdus de Okuyama și Satake ca un reactiv specific pentru
grupările amino primare. Acest reactiv este solubil în apă, relativ stabil și reacționează cu
grupările amino în condiții relativ blânde.
Dintre toate substanțele, Biotina (Vitamina B7) este cunoscută ca fiind implicată în
diverse funcții ale celulelor cum ar fi: creșterea celulară și transferul de material genetic între
acestea.183 Există numeroase studii care arată o supraexprimare a recepto rilor pentru biotină pe
suprafață celulelor tumorale, în sepcial asupra celulelor cancerului de san.184 Mecanismul de
internalizare sau absorbție în celule are loc prin intermediul endocitozei mediate de receptorii de
pe suprafață celulelor.185
În 2007, Reidl ing și colab. au raportat că receptorii de biotină sunt supraexprimati pe
celulele tumorale. Multe alte studii îndreaptă atenția asupra dezvoltării compusilor biotinilați ca
o țintire activă a tumorilor. Pentru acest lucru, am ales să biotinilăm polimerul utilizat (PCs)
pentru a dezvolta ulterior sisteme ce au ca scop eliberarea de medicament locală.186 Pe scurt,
biotina, cunoscută și sub numele de vitamina B7 este necesară în creșterea și dezvoltarea
celulelor tumorale. Nanocapsulele biotinilate vor avea ava ntajul că vor fi direcționate in tumori,
trecând de barierele acestora și facilitând eliberarea de medicament la locul dorit.
W. Jiang, T. Wen și colab. au demonstrat că proprietățile nanoparticulelor magnetice
depind în cea mai mare parte de condițiile de reacție: valoarea pH -ului, solventul ales, natura
agentului de stabilizare. Așadar, nanoparticulele magnetice au fost sintetizate astfel: clorurile de
fier (FeCl 3 și FeCl 3) împreună cu o cantitate de NaOH au fost dizolvate în 9ml apă cu 12ml
etanol și 21m l toluen prin agitare mecanică pe baie de apă termostatata la 74oC timp de 4h.
Amestecul a fost răcit până la temperatura camerei prin îndepărtarea sursei de căldură iar
precipitatul a fost izolat din solvent prin decantare magnetică .187,188
Oxizii de fier su nt compușii cei mai importanți ai metalelor de tranziție din punct de
vedere tehnologic. Nano oxizii de fier au fost sintetizați în numeroase studii aproape prin toate
metodele chimice cunoscute care includ precipitarea la temperatura ambientală/ridicată, mediere Commented [A7]: Nu aici!
Commented [A8]: Nu aici!

72
a surfactantului, emulsie/microemulsie, electrodepunere. Oxizii de fier la scala nano prezintă un
interes major datorită aplicațiilor acestora ca materiale catalitice, absorbanti pentru tratarea
apelor reziduale, pigmenți, agenți floculanti și schi mbători de ioni. De aceea, nano -magnetita
(Fe3O4) și magnetita γ-Fe2O3 sunt materiale utilizate des în aplicațiile biomedicale.
Caractereisticile cele mai importante ale acestor compuși includ în cea mai mare parte starea
trivalentă a fierului, solubilitat ea scăzută și culorile strălucitoare .189

3.6 Concluzii

S-a obținut N -palmitoil chitosan prin acilarea chitosanului cu palmitoil după care acest
compus a fost biofuncționalizat cu biotină . Nanocapsulele magnetice au fost formulate prin
metodele emulsiei si mple și emulsiei duble, folosind două tipuri de magnetită, una hidrofobă
(MgNaOl) și una hidrofilă (MgPF127). În continuare, nanocapsulele au fost încărcate cu
Paclitaxel în mometul în care acestea s -au sintetizat.
S-a analizat gradul de substituție, gradu l de biotinilare și solubilitatea polimerului
obținut BPCs. Evaluarea gradului de substituție a fost realizată cu ajutorului reactivului
TNBS pentru a cuantifica grupările amino rămase libere din polimer. Acest lucru este important
deoarece dimensiunile na nocapsulelor formulate depind și de lungimea catenei polimerului.
Conform testului HABA/Avidină s -a evidențiat că în polimer există o cantitate de biotină
care va ajuta la internalizarea nanocapsulelor în celulele tumorale. Testul de solubilita te a arătat
că polimerul este solubil în acid acetic și DMSO și se umflă în apă.
Compoziția chimică și structura moleculară a polimerului a fost analizată cu ajutorul
unor spectre FT -IR unde s -au observat benzi specifice chitosanului, palmitoilului și biot inei. Tot
prin analiză FT -IR a fost analizată compoziția chimică a nanocapsulelor încărcate cu
medicament care au prezentat și benzi specifice Paclitaxelului care se suprapun peste cele ale
chitosanului și lanțului de palmitoil.
Analiza DLS a nanocapsulelo r sintetizate a înregistrat dimensiuni cuprinse între 205.3 –
371 nm și valori negative ale potențialului Zeta ce variază între -6.27 și -19.5 mV datorită
modificării unor parametri de sinteză. Tehnicile de obținere diferite evide nțiază faptul ca
dimensiunil e structurilor variază și în funcție de acest aspect.
Studiile in vitro de eliberare au arătat că nanocapsulele pot fi utilizate cu scopul țintirii
tumorilor, având sensibilitate la temperatura și la un pH mai acid, caracteristici întâlnite în cazul
tumori lor. Commented [A9]: Nu aici!

73
CONCLUZII GENERALE

Chitosanul este un copolimer liniar semisintetic de interes major în aplicațiile
biomedicale datorită proprietăților sale imunologice, de biocompatibilitate, biodegrabilitate,
hemocompatibilitate și nontoxicitate. Acest biopolimer deschide orizonturi noi în ceea ce
privește evoluția diagnosticarilor și videcarilor multor boli precum cancerul.
Derivații amfifili ai chitosanului prezintă un interes deosebit în generarea sistemelor de
eliberare controlată a medicamentelor ce pot înglob a o cantitate de medicament hidrofob precum
paclitaxelul. Un alt avantaj major adus de acest polimer este faptul că se pot obține diferite tipuri
de sisteme de eliberare controlată a medicamentelor, putând fi procesat în diferite forme cum ar
fi: nanoparti cule, nanocapsule, hidrogeluri, filme, bureți, nanotuburi, membrane, pansamente etc.
Nanotehnologia s -a dovedit a fi o strategie viabilă și promițătoare în protejarea și
eficientizarea compusilor bioactivi în industria farmaceutică și alimentară. Se pot ut iliza diferiți
compuși și materiale pentru încapsularea compusilor activi, însă nanocapsulele polimerice sunt
structurile cele mai stabile în timpul depozitării și au demonstrat o eficientă ridicată în
controlarea eliberării principiilor active .
În preze nt, există o serie de aplicații promițătoare orientate către domeniul
nanotehnologiei care se bazează pe un nou concept care implică o procedură de abordare
simultană a diagnosticului cu te rapia în medicina personalizată. Aceste aplicații poartă
denumirea de nanosisteme teranostice. Un astfel de sistem este capabil să elibere ze un
medicament citostatic cu eliberare declanșată sau controlată, și poate ținti specific tumorile și în
același timp permite realizarea diagnosticului prin metode imagistice cu o pre cizie destul de
mare.
Emulsiile sunt sisteme lichide multifazice ce conțin apă, ulei și surfactanți. Surfactanții
sunt utilizați pentru a crea o interfață mai stabilă între apă și ulei. Obținere nanostructurilor prin
tehnica emulsiilor s -a demonstrat a fi foarte eficientă datorită faptului că apare posibilitatea
încapsularii unor molecule uniforme incompatibile foarte diferite într -un purtător unic. Există o
serie de parametri foarte importanți ce pot influența stabilitatea emulsiilor cum ar fi: concentraț ia
și presiunea osmotică, temperatura, agenții tensioactivi utilizați, concentrația agenților
tensioactivi, raportul apă/ulei.
Cel mai mare avantaj pe care îl aduc amulsiile este posibilitatea pe care o oferă pentru
încapsularea mai multor tipuri de molecu le simultan. Când medicamentul incapsulat este Commented [A10]: Introduci paragraf cu teranostic

74
hidrofob, metoda de preparare a emulsiilor trebuie schimbată deoarece este nec esară o faza
internă organică.
Paclitaxelul este un medicament citostatic și citotoxic, utilizat în tratarea diferitelor
tipuri de cancer. Acesta se poate atașa chimic pe gruparea funcțională a chitosanului și se poate
elibera într -un loc specific de acțiune.
În cadrul acestei lucrări, inițial a fost sintetizat N -palmitoil chitosan funcționalizat cu
biotină. Acest compus a fost anal izat, obtinându -se rezultate cu privire la gradul de substituție,
gradul de biotinilare, solubilitate și caracterizare fizico -chimică. Gradul de substituție a fost
evaluat cu ajutorul reactivului TNBS pentru cuantificarea grupărilor amino rămase libere.
Rezultatul gradului de substituție a fost de 56,83%. Gradul de biotinilare s -a evaluat cu ajutorul
testului cu HABA/Avidină care a confirmat că in interiorul polimerului există o cantitate de
biotină de 0.598 nm/mg. Testele de solubilitate efectuate asupra p olimerului BPCs au arătat că
acesta este solubil în acid acetic și în DMSO iar în apă acesta se umflă. Analiza FT -IR a
confirmat prezența chitosanului, a palmitoilului și a biotinei în proba analizată.
Structuri le de tipul nanocapsulelor magnetice obținute din N -palmitoi l chitosan
biotinilat utilizând tehnica emulsiilor sim ple și tehnica emulsiilor duble au fost caracterizate prin
tehnica DLS care a oferit informații cu privire la : dimensiunile nanocapsulelor cuprinse între
205,3 și 371 nm și potențialul Ze ta ce variază între -6,27 și -19,5 mV. Compoziți a chimică a
nanostructurilor a fost confirmată cu ajutorul spectroscopiei FT -IR care arată că în interiorul
acestora există magnetită și Paclitaxel. Cu ajutorul unor studii de eliberare am putut observa
cinet ica eliberării P aclitaxelului în medii simulate și am putut observa o eliberare mai eficientă în
prezența unui pH mai acid (PBS pH=5,5) specific tumorilor solide.
În concluzie, acest studiu a demonstrat faptul că nanostructurile obținute se pot utiliza
ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor, structura polimerului fiind degradată în
medii acide specifice la nivelul tumorilor. Nanostructurile pot ținti tumorile cu ajutorul unor
câmpuri magnetice exterioare datorită utilizării magnetitei în sintez a acestora. Dimensiunile
obținute variază între 200 și 400 nm.

Mulțumiri : Această lucrare a fost susținută financiar de către Universitatea de
Medicină și Farmacie Grigore T.Popa din Iași, contract nr. 27499/2018.

Commented [A11]: Extinde m aceste paragrafe

75
BIBLIOGRAFIE

1 R.A.A. Muzzarelli, Chitin and Chitosan edited by G. Skjak -Braek, T. Anthonsen, P.
Sandford, Elsiever Applied Science, Londres, 1989, p. 87 –99.
2 Liu CG, Desai KGH, Chen XG, Park HJ. Linolenic acid -modified chitosan for
formation of se lf-assembled nanoparticles. J Agric Food Chem. 2005; 53:437 -41.
3 A. Ali, S. Ahmed, A review on chitosan and its nanocomposites in drug delivery, Int. J.
Biol. Macromol. 109 (2018) 273 –286.
4 S. Ahmed Shakeel, Ikram, chitosan and gelatin based biodegradabl e packaging films
with UV -light protection, J. Photochem. Photobiol. B Biol. 163 (2016) 115 –124
5 K. Kurita, Applications of chitin and chitosan, edited by Goosen MFA, Lancaster, PA:
Technomic Publishing, 1997, p.103
6 Gades, M.D., Stern, J.S., 2005. Chitosan supplementation and fat absorption in men and
women. J. Am. Diet Assoc . 105, 72 –77.
7 Iftekhar Shams, M., Nogi, M., Berglund, L. A., & Yano, H. (2012). The transparent
crab: preparation and nanostructural implications for bioinspired optically transparent
nanocomposites. Soft Matter, 8(5), 1369 –1373.
8 Julie Nilsen – Nygaard, Sabina P. Strand, Kjell M. Vårum, Kurt I. Draget and Catherine
T. Nordgård – Chitosan: Gels and Inter facial Properties – Review – Polymers .2015.
9 Varum, K.M.; Smidsrod, O. Structure –property relationship in chitosans. In
Polysaccharides: Structural Diversity and Functional Versatility ; Dimitriu, S., Ed.; Marcel
Decker: New York, NY, USA, 2005; pp. 625 –642.
10Dautremepuits C., Paris -Palacios S., Betoulle S., Vernet G., Modulation in hepatic and
head kidney parameters of carp induced by copper and chitosan, Comparative Biochemistry and
Physiology C, Vol.137, 325 -333, 2004.
11 K.M. Varum, M.H. Ottoy, O. Smidsro d, Water -solubility of partially N -acetylated
chitosans as a function of pH: effect of chemical composition and depolymerisation, Carbohydr.
Polym. 25 (1994) 65 –70.
12 A.C. Jayasuriya, K.J. Mauch, In vitro degradation behavior ofchitosan based hybrid
micropa rticles, J. Biomed. Sci. Eng. 4 (5) (2011) 383 –390.
13 D. Ren, H. Yi, W. Wang, X. Ma, The enzymatic degradation and swelling properties of
chitosan matrices with different degrees of N -acetylation, Carbohydr. Res. 340 (15) (2005)
2403 –241.

76

14 M.G. Peters, App lications and environmental aspects of chitin and chitosan, J. Mat.
Sci.–Pure Appl. Chem. A32 (1995) 629 –640.
15 M.D. Lootsik , M.M. Lutsyk , Rostyslav Bilyy , R.S. Stoika , Preparation of chitosan with
high blood clotting activity and its hemostatic potential assessment (2015), 33.
16 Dash M. et al., Chitosan -A versatile semi -synthetic polymer in biomedical applications.
Progress in Polymer Science, Vol.36, 981 –1014, 2011.
17C. Sc hatz, C. Viton, T. Delair, C. Pichot, A. Domard, Typical physicochemical
behaviors of chitosan in aqueous solution, Biomacromolecules 4 (2003) 641 –648.
18 Hosam I Salaheldin, Chitosan Molecular Weight Effect on The Synthesis of Gold
Nanoparticles and Catalytic Degradation of Environmental Pollutants, ResearchGate, 2018
19 Panith, N., Wichaphon, J., Lertsiri, S., Niamsiri, N., 2016 . Effect of physical and
physicochemical characteristics of chitosan on fat -binding capacities under in vitro
gastrointes tinal conditions . LWT -Food Sci. Technol. 71, 28.
20 Ríos-Donato, N., Navarro -Mendoza, R., Ávila -Rodríguez, M., Mendizábal -Mijares, E.,
2006. Obtención de sulfato de quitosano y su aplicación en el proceso de coagulación –
floculación de suspensiones coloidale s aniónicas de caolinita . Rev. Iberoam. Polim. 7, 145 –161.
21 Clark L., Smith A.F., X-ray diffraction studies of chitin, chitosan and derivatives , The
Journal of Physical Chemistry, Vol.40, 863 –879, 1937.
22 Cho Y.W., Jang J., Park C.R., Ko S.W., Preparation and solubility in acid and water of
partially deacetylated chitins , Biomacromolecules, Vol.1, 609 – 614, 2000.
23 Saito Y., Putaux J.L., Okano T., Gaill F., Chanzy H., Structural aspects of the swelling
of hchitin in HCl and its conversion into a -chitin , Macromolecules, Vol.30, 3867 – 3873, 1997.
24 Yui T., Imada K., Okuyama K., Suzuki K., Ogawa K ., Molecular and crystal structure
of the anhydrous form of chitosan , Macromolecules, Vol.27, 7601 – 7605, 1994
25 Ngo, D.N., Kim, S.K., 2014. Antioxidant effects of chitin, chitosan, and their
derivatives. In: Kim, S.K.(Ed.), Advances in Food and Nutrition Research . Elsevier Science,
United States, pp. 15 –31. vol. 73.
26 Mireles, M., Martino, J., Bouzas, J. A. Torres, In Advances in Chitin and chitosan
edited by CJ Brine, PA Sandford, JP Zikakis, Elsevier Applied Science, London, 1992, p. 506 –
515.
27 Y. Yuan, B. M. Chestnutt, W. O. Haggard, J. D. Bumgardner, R. A. A. Muzzarelli, In
Chitin and chitosan in biomaterial science, edited by R. Jayakumar & A. Prabaharan,
Trivandrum, India: Research Signpost, 2008.

77

28 Wedmore I., McManus J.G., Pusateri A.E., Holcomb J.B., A special report on the
chitosanbased hemostatic dressing : experience in current combat operations, Journal of Trauma,
Vol.60, 655 –658, 2006
29 Tharanathan R.N., Kittur F.S ., Chitin -the undisputed biomolecule of great potential ,
Critical Review in Food Sci ence and Nutrition, Vol.43, 61 –87, 2003
30 Felt O., Buri P., Gurny R., Chitosan: a unique polysaccharide for drug delivery, Drug
Development and Industry Pharmacy, Vol. 24, 979 –993, 1998
31 Jumaa M., Furkert F.H., Mulle B.W., A new lipid emulsion formulation with high
antimicrobial efficacy using chitosan , European journal of biopharmaceutical sciences, Vol.53,
115–123, 2002.
32 Guo Z., Chen R., Xing R., Liu S., Yu H., Wang P., Li C., Li P., Novel derivatives of
chitosan and their antifungal activities in vitr o, Carbohydrate Research, Vol.341, 351 –354,
2006.
33 Pujals G., Sune -Negre J.M., Perez P., Garcia E., Portus M., Tico J.R., Minarro M.,
Carrio J ., In vitro evaluation of the effectiveness and cytotoxicity of meglumine antimoniate
microspheres produced by sp ray drying agains t Leishmania infantum, Parasitology Research,
Vol.102, 1243 – 1247, 2008.
34 Soppimath K., Aminabhavi T., Kulkarni A., Rudzinski W. J., Controlled Release,
Vol.70, 1, 2001
35 VandeVord, P. J., Matthew, H. W. T., DeSilva, S. P., Mayton, L., Wu , B., & Wooley,
P. H. (2001). Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. Journal of
Biomedical Materials Research, 59(3), 585 –590.
36 Chatelet, C. (2001). Influence of the degree of acetylation on some biological
properties of chitos an films. Biomaterial s, 22(3), 261 –268. doi:10.1016/s0142 -9612(00)00183 -6
37 Chen L, Han D, Jiang L. On improving blood compatibility: from bioinspired to
synthetic design and fabrication of biointerfacial topography at micro/nano scales. Colloids Surf,
B 2011;85:2 –7.
38 Labarre D. Improving blood compatibility of polymeric surfaces. Trends Biomater
Artif Organs 2001; 15:1 –3.
39 Ostuni E, Chapman RG, Holmlin E, Takayama S, Whitesides GM. A survey of
structure –property relationships of surfaces that resist the adsorption of protein. Langmuir 2001;
17:5605 –20
40 Balan, V., & Verestiuc, L. (2014). Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A
review. European Polymer Journal, 53, 171 –188. doi: 10.1016/j.eurpolymj.2014.01.033

78

41 Soppimath K., Aminabhavi T., Ku lkarni A., Rudzinski W. J., Controlled Release,
Vol.70, 1, 2001
42 Hirano S., Iwata M., Yamanaka K., Tanaka H., Toda T., Inui H., Enhancement of
serum lysozyme activity by injecting a mixture of chitosan oligosaccharides intravenously in
rabbits, Agricultur al and Biological Chemistry, Vol. 55, 2623 –2625, 1991.
43 Rao S.B., Sharma C.P., Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and
hemostatic potential, Journal of Biomedical Materials Research, Vol.34, 21 –28, 1997.
44 Rodríguez -Nuñez, J.R., López -Cervantes, J., Sánchez -Machado, D.I., Ramírez -Wong,
B., Torres -Chavez, P., Cortez -Rocha, M.O., 2012 . Antimicrobial activity of chitosan -based films
against Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus . Int. J. Food Sci. Tech. 47, 2127 –
2133.
45 Tahng H., Zhang P., Kieft, T.L., Ryan, S.J., Baker S.M., Wiesmann, W.P., Rogelj, S.,
2010. Antibacterial action of novel functionalized chitosan arginine against gram -negative
bacteria . Acta Biomater. 6, 2562 -2571.
46 Rodríguez -Núñez, Tomás J. Madera -Santana, T.J. , Sanchez -Machado, D.I., Lopez
Cervantes J, Soto Valdez, H.2015. Chitosan/hydrophilic plasticizer based films: preparation
pshysicochemical and antimicrobial properties . J. Polym.Environ.22, 41 -45.
47 Dutta, P.K., Tripathi, S., Mehrotra, G .K., Dutta, J., 2009. Perspectives for chitosan –
based antimicrobial films in food applications . Food Chem. 114, 1173 –1182.
48 Guzman -Villanueva, D., El -Sherbiny, I.M., Vlassov, A.V., Herrera -Ruiz, D., Smyth,
H.D.C., 2014. Enhanced cellular uptake and gene s ilencing activity of siRNA molecules
mediated by chitosan -derivative nanocomplexes . Int. J. Pharm. 473, 579 –590.
49 Park, J.H., Hong, E.K., Ahn, J., Kwak, H. -S., 2010. Properties of nanopowdered
chitosan and its cholesterol lowering effect in rats. Food Sci . Biotechnol. 19, 1457 –1462.
50 Panith, N., Wichaphon, J., Lertsiri, S., Niamsiri, N., 2016 . Effect of physical and
physicochemical characteristics of chitosan on fat -binding capacities under in vitro
gastrointestinal conditions . LWT -Food Sci. Technol. 71, 25–32.
51 A.R. El Zein, F. Dabbarh, C. Chaput, In Chitosan in pharmacy and chemistry, edited by
R.A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli, ATEC, Grottammare, Italy (2002), p. 365 –370.
52 M. Rinaudo, Chitin and chitosan: properties and applications, Prog. Polym. Sci. 31 (7)
(2006) 603 –632.
53 Calvo P., Vila -Jato J.L., Alonso M.J. – Comparative in vitro evaluation of several
coloidal systems, nanoparticles, nanocapsules, and nanoemulsions, as ocular drug carriers. – J.
Pharm. Sci., 85, 530 -536, 1996.

79

54 Müller R.H., Maass en S., Weyhers H., Mehner T. – Phagocityc uptake and cytotoxicity
of solid lipid nanoparticles (SLN) sterically stabilized with poloxamine 908 and poloxamer 407.
– J. Drug. Target., 4 (3), 161 -170, 1996.
55Elbaz E., Zeevi A., Klang S., Benita S. – Positivel y charged submicron emulsions – a
new type of colloidal drug carrier. – Int. J. Pharm., 96, R1 -R6, 1993.
56F.A. Oyarzun -Ampuero, M. Garcia -Fuentes, D. Torres, M.J. Alonso. Chitosan -coated
lipid nanocarriers for therapeutic applications. J. DRUG DEL. SCI. TEC H., 20 (4) 259 -265
2010.
57 M. Padaki, A.M. Isloor, J. Fernandes, K.N. Prabhu, New polypropylene supported
chitosan NF -membrane for desalination application, Desalination 280 (1) (2011) 419 –423.
58 Lubben I.M., Verhoef J.C., Aelst A.C., Borchard G., Junginge r H.E., Chitosan
microparticles for oral vaccination: preparation, characterization and preliminary in vivo uptake
studies in murine Peyer's patches, Biomaterials, Vol.22, 687 -694, 2001.
59 Trudi J. A., Julian D. T., Chitosan as a Nasal Delivery System: The Effect of Chitosan
Solutions on in Vitro and in Vivo Mucociliary Transport Rates in Human Turbinates and
Volunteer, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.86, Nr.4, 509 -513, 1997.
60 Grenha A., Remunan -Lopez C., Carvalho E.L.S., Seijo B., Microspheres con taining
lipid/chitosan nanoparticles complexes for pulmonary delivery of therapeutic proteins, European
Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol.69, 83 –93, 2008.
61 Zhang Y., Zhang M., Cell growth and function on calcium phosphate reinforced
chito san scaffolds, Journal of Material Science: Materials in Medicine, Vol.15, 255 -260, 2004.
62 Kumari, A., Yadav, S. K., & Yadav, S. C. (2010). Biodegradable polymeric
nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 75(1), 1 –18.
63 Nguyen Anh Dzung, 2011, Chitosan and Chitosan Derivatives as Potential Adjuvants
for Influenza Vaccine, World Academy of Science, Engeneering and Technology,1839 -1846.
64 Ezhilarasi, P. N.; Karthik, P.; Chhanwal, N.; Anandharamakrishnan, C. (2012).
"Nanoencapsulation Techniques for Food Bioactive Components: A Review". Food and
Bioprocess Technology. 6 (3): 628 –47.
65G. Suffredini, J.E. East, L.M. Levy. New Applications of Nanotechnology for
Neuroimaging. American Journal of Neuroradiology July 2014, 3 5 (7) 1246 -1253;
66 Cruz, L., Soares, L.U., Dalla -Costa, T., Mezzalira, G., da Silveira, N.P., Guterres, S.S.
and Pohlmann, A.R. 2006b. Int. J. Pharm., 313:198 –205.

80

67 Chen R.H., Hwab H.D., Effect of molecular weight of chitosan with thesame degree of
deacet ylation on the thermal, mechanical, and permeability properties of theprepared membrane,
Carbohydrate Polymers, Vol.29, 353 -358, 1996.
68 Khan, M., & Lo, I. M. C. (2016). A holistic review of hydrogel applications in the
adsorptive removal of aqueous pollut ants: Recent progress, challenges, and perspectives. Water
Research, 106, 259 –271.
69 Cheng Cao, Chunhong Yan, Zhiqiang Hu, Shao Zhou, Potential application of
injectable chitosan hydrogel treated with siRNA in chronic rhinosinusitis therapy, Molecular
Medi cine Reports, 12: 6688 -6694, 2015.
70 Ravi -Kumar M.N.V., Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Sashiwa H., Domb A.J.,
Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives, Chemical Review, Vol.104, 6017 -6084,
2004.
71 Anitha, A., Sowmya, S., Kumar, P. T. S., Deep thi, S., Chennazhi, K. P., Ehrlich,
H.Jayakumar, R. (2014). Chitin and chitosan in selected biomedical applications. Progress in
Polymer Science, 39(9), 1644 –1667.
72 T. Banerjee, S. Mitra, A.K. Singh, R.K. Sharma, A. Maitra, Preparation,
characterization and biodistribution of ultrafine chitosan nanoparticles, Int. J. Pharm. 243 (2002)
93–105.
73 S. Alam, Z.I. Khan, G. Mustafa, M. Kumar, F. Islam, A. Bhatnagar, F.J. Ahmad,
Development and evaluation of thymoquinone encapsulated chitosan nanoparticles for no se-to-
brain targeting: a pharmaco scintigraphic study, Int. J. Nanomed. 7 (2012) (2012) 5705 –5718.
74 L.T.K. Ngan, S.L. Wang, Ð.M. Hiep, P.M. Luong, N.T. Vui, T.M. Ðinh, N.A. Dzung,
Preparation of chitosan nanoparticles by spray drying, and their antibacter ial activity, Res.
Chem. Intermed. 40 (2014) 2165 –2175.
75 A. Grenha, Chitosan nanoparticles: a survey of preparation methods, J. Drug Target.
20 (2012) 291 –300.
76 Y.D. Reddy, D. Dhachinamoorthi, K.B. Chandra Sekhar, Formulation and in vitro
evaluation of antineoplastic drug loaded nanoparticles as drug delivery system, Asian J. Pediatr.
Pract. 7 (2013) 1592 –1604.
77 Shukai Ding, Christophe A. Serra, Thierry F. Vandamme, Wei Yu, Nicolas Anton,
Double emulsions prepared by two –step emulsification: History, St ate-of-the-art and
Perspective, Corel,2018.

81

78 S. Sengupta, D. Eavarone, I. Capila, G. Zhao, N. Watson, T. Kiziltepe, R. Sasisekharan,
Temporal targeting of tumour cells and neovasculature with a nanoscale delivery system, Nature,
436 (2005) 568 -572.
79 M. L u, C. Zhao, Q. Wang, G. You, Y. Wang, H. Deng, G. Chen, S. Xia, B. Wang, X.
Li, L. Shao, Y. Wu, L. Zhao, H. Zhou, Preparation, characterization and in vivo investigation of
blood -compatible hemoglobin -loaded nanoparticles as oxygen carriers, Colloids and S urfaces B:
Biointerfaces, 139 (2016) 171 -179.
80R. Verma, T.N. Jaiswal, Protection, humoral and cell -mediated immune responses in
calves immunized with multiple emulsion haemorrhagic septicaemia vaccine, Vaccine, 15
(1997) 1254 – 1260.
81 B. Li, Y. Jiang, F. Liu, Z. Chai, Y. Li, Y. Li, X. Leng, Synergistic effects of whey
proteinpolysaccharide complexes on the controlled release of lipid -soluble and water -soluble
vitamins in W1/O/W2 double emulsion systems, International Journal of Food Science and
Technology, 47 (2012) 248 -254.
82 X. Huang, R. Fang, D. Wang, J. Wang, H. Xu, Y. Wang, X. Zhang, Tuning polymeric
amphiphilicity via Se -N interactions: towards one -step double emulsion for highly selective
enzyme mimics, Small, 11 (2015) 1537 -1541.
83 N. Garti, A. Aser in, Double emulsions stabilized by macromolecular surfactants,
Advances in Colloid and Interface Science, 65 (1996) 37 -69.
84 N. Garti, Progress in Stabilization and Transport Phenomena of Double Emulsions in
Food Applications, Food Science & Technology, 30 (1997) 222 -235.
85 M. Iqbal, N. Zafar, H. Fessi, A. Elaissari, Double emulsion solvent evaporation
techniques used for drug encapsulation, International journal of pharmaceutics, 496 (2015) 173 –
190.
86 D.T. Chong, X.S. Liu, H.J. Ma, G.Y. Huang, Y.L. Han, X .Y. Cui, J.J. Yan, F. Xu,
Advances in fabricating double -emulsion droplets and their biomedical applications,
Microfluidics and Nanofluidics, 19 (2015) 1071 -1090.
87 W. Seifriz, Studies in emulsions, The Journal of Physical Chemistry, (1925) 587 -600.
88 A.T. Florence, D. Whitehill, Stability and stabilization of Water -in-Oil-in-Water
multiple emulsions, in: ACS Symposium Series, American Chemical Society 1985, pp. 359 –380.
89 A. Aserin, Multiple emulsions, Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company,
2007.
90 M. Frenkel, R. Shwartz, N. Garti, Multiple emulsions. I. stability: inversion, apparent
and weighted HLB, Journal of colloid and interface science, 94 (1983) 174 -178.

82

91 P.S. Clegg, J.W. Tavacoli, P.J. Wilde, One -step production of multiple emulsions:
microfluidic, polymer -stabilized and particle -stabilized approaches, Soft Matter, 12 (2016) 998 –
1008.
92 N. Garti, M. Frenkel, R. Shwartz, Multiple emulsions. part II: proposed technique to
overcome unpleasant taste of drugs, Journal of Dispersion Science and Technology, 4 (1983)
237-252.
93 R. Goubran, N. Garti, Stability of water in oil emulsions using high molecular weight
emulsifiers, Journal of Dispersion Science and Technology, (1988) 131 -148.
94 S. Matsumoto, Y. Kita, D. Yonezawa, An attempt at prepar ing water -in-oil-in-water
multiple -phase emulsions, Journal of colloid and interface science, 57 (1976) 353 -361.
95 M. Ficheux, L. Bonakdar, F. Leal -Calderon, J. Bibette, Some stability criteria for
double emulsions, Langmuir: the ACS journal of surfaces an d colloids, 14 (1998) 2702 -2706.
96 S. Magdassi, M. Frenkel, N. Garti, R. Kasan, Multiple emulsions II: HLB shift caused
by emulsifier migration to external interface, Journal of colloid and interface science, 97 (1984)
374-379.
97 Y. Sela, S. Magdassi, N. G arti, Polymeric surfactants based on polysiloxanes -graft -poly
(oxyethylene) for stabilization of multiple emulsions, Colloids and Surfaces A: Physicochemical
and Engineering Aspects, 83 (1994) 143 -150.
98 A.T. Florence, D. Whitehill, Some features of breakd own in water -in-oil-in-water
multiple emulsions, Journal of colloid and interface science, 79 (1981) 243 -256.
99 A.T. Florence, D. Whitehill, Multiple W/O/W emulsions stabilized with poloxamer and
acrylamide gels, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 32 (1 980) 64P.
100 A.T. Florence, D. Whitehill, Stabilization of water / oil / water multiple emulsions
polymerization of the aqueous phases, J. Pharm. Pharmacol, (1982) 687 -691.
101 T.K. Law, T.L. Whateley, A.T. Florence, Stabilisation of w/o/w multiple emulsions by
interfacial complexation of macromolecules and nonionic surfactants, Journal of Controlled
Release, 3 (1986) 279 -290. (SUNT CAM VECHI DAR… SUNT RELEVANTE….))
102 J.A. Omotosho, T.K. Law, T.L. Whateley, A.T. Florence, The stabilization of w/o/ w
emulsions by interfacial interaction between albumin and non -ionic surfactants, Colloids and
Surfaces, 20 (1986) 133 -144.
103 N. Gaiti, a. Aserin, Y. Cohen, Mechanistic considerations on the release of electrolytes
from multiple emulsions stabilized by BSA and nonionic surfactants, Journal of Controlled
Release, 29 (1994) 41 -51.

83

104 K. Oza, S. Frank, Multiple emulsions stabilized by colloidal microgrystalline
cellulose, Journal of Dispersion Science and Technology, 10 (1989) 163 -185.
105 H.J. Yang, I.S. Park, K . Na, Biocompatible microspheres based on acetylated
polysaccharide prepared from water -in-oil-in-water (W1/O/W2) double -emulsion method for
delivery of type II diabetic drug (exenatide), Colloids and Surfaces A: Physicochemical and
Engineering Aspects, 34 0 (2009) 115 -120.
106 R. Lutz, A. Aserin, L. Wicker, N. Garti, Release of electrolytes from W/O/W double
emulsions stabilized by a soluble complex of modified pectin and whey protein isolate, Colloids
and Surfaces B: Biointerfaces, 74 (2009) 178 -185.
107 D. Ch ognot, M. Leonard, J. -L. Six, E. Dellacherie, Surfactive water -soluble
copolymers for the preparation of controlled surface nanoparticles by double emulsion/solvent
evaporation, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 51 (2006) 86 -92.
108 T.K. Law, T.L. What eley, A.T. Florence, Multiple emulsions stabilized by protein:
nonionic surfactant interfacial complexation, Woodhead Publishing Limited, 2005.
109 A. Benichou, A. Aserin, N. Garti, Double emulsions stabilized by new molecular
recognition hybrids of natural polymers, Polymers for Advanced Technologies, 13 (2002) 1019 –
1031.
110 S.C. Yu, A. Bochot, G. Le Bas, M. Chéron, J. Mahuteau, J.L. Grossiord, M. Seiller, D.
Duchêne, Effect of camphor/cyclodextrin complexation on the stability of O/W/O multiple
emulsions, I nternational journal of pharmaceutics, 261 (2003) 1 -8.
111 R. Goubran, N. Garti, Stability of water in oil emulsions using high molecular weight
emulsifiers, Journal of Dispersion Science and Technology, (1988) 131 -148.
112 M.J. Alonso, S. Cohen, T.G. Park, R. K. Gupta, G.R. Siber, R. Langer, Determinants of
release rate of tetanus vaccine from polyester microspheres, Pharmaceutical Research, 10 (1993)
945-953.
113 Y. Ogawa, M. Yamamoto, H. Okada, T. Yashiki, S. Tsugio, A new technique to
effciently entrap leuprol ide acetate into microcapsules of polylactic acid or
copoly(lactic/glycolic) acid, Chemical & pharmaceutical bulletin, 36 (1987) 1095 -1104.
114 Y. Ogawa, M. Yamamoto, S. Takada, H. Okada, T. Shimamoto, Controlled -release of
leuprolide acetate from polylactic acid or copoly(lactic/glycolic) acid microcapsules: Influence
of molecular weight and copolymer ratio of polymer, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 36
(1988) 1502 -1507
115 I.D. Rosca, F. Watari, M. Uo, Microparticle formation and its mechanism in single a nd
double emulsion solvent evaporation, Journal of Controlled Release, 99 (2004) 271 -280.

84

116 Panos, Ines; Acosta, Niuris; Heras, Angeles, Current Drug Discovery Technologies,
Bentham Science Publishers, Volume 5, Number 4, 2008, pp. 333 -341
117 Shahidi F., Ar achchi J.K.V., Jeon Y.: Food applications of chitin and chitosans. Trends
in Food Science & Technology 10, 37, (1999).
118 Knapczyk J., Krówczynski L.: Pharmaceutical Dosage Forms with Chitosan, G. Skjak –
Braek, T. Anthonsen, and P. Sandford Ed.; Elsevier Ap plied Science: London, pp. 665 -670,
(1989).
119 Koide S.S.: Chitin -chitosan: properties, benefits and risks. Nutrition Research 18,
1091, (1998).
120 Lim S.T., Martin G.P., Berry D.J., Brown M.B.: Preparation and evaluation of the in
vitro drug release propert ies and mucoadhesion of novel microspheres of hyaluronic acid and
chitosan. Journal of Controlled Release 66, 281, (2000).
121 El-Hameed M.D.A., Kellaway I.W.: Preparation and in vitro characterisation of
mucoadhesive polymeric microspheres as intra -nasal de livery systems. European Journal of
Pharmaceutics and Biopharmaceutics 44, 53, (1997).
122 Genta I., Perugini P., Conti B., Pavanetto F.: A multiple emulsion method to entrap a
lipophilic compound into chitosan microspheres. International Journal of Pharmace utics 152,
237, (1997).
123 Higuera -Ciapara I., Felix -Valenzuela L., Goycoolea F.M., Argüelles -Monal W.:
Microencapsulation of astaxanthin in a chitosan matrix. Carbohydrate Polymers 56, 41, (2004).
124 Anal A.K., Stevens W.F., Remuñán -López C.: Ionotropic cro ss-linked chitosan
microspheres for controlled release of ampicillin. International Journal of Pharmaceutics 312,
166, (2006).
125 Ge Y., Chen D., Xie L., Zhang R.: Optimized preparation of daidzein -loaded chitosan
microspheres and in vivo evaluation after i ntramuscular injection in rats. International Journal of
Pharmaceutics 338, 142, (2007).
126 Jameela S.R., Kumary T.V., Lal A.V., Jayakrishnan A.: Progesterone -loaded chitosan
microspheres: a long acting biodegradable controlled delivery system. Journal of C ontrolled
Release 52, 17, (1998).
127 Jameela S.R., Jayakrishnan A.: Glutaraldehyse cross -linked chitosan microspheres as a
long acting biodegradable drug delivery vehicle: studies on the in vitro release of mitoxiantrone
and in vivo degradation of microsphe res in rat muscle. Biomaterials 16, 769, (1995).

85

128 He Q., Ao Q., Wang A., Gong Y., Zhao N., Zhang X.: In vitro cytotoxicity and protein
drug release properties of chitosan/heparin microspheres. Tsinghua Science & Technology 12,
361, (2007).
129Martinac A., F ilipovi -Gri J., Voinovich D., Perissutti B., Franceschinis E.:
Development and bioadhesive properties of chitosan -ethylcellulose microspheres for nasal
delivery. International Journal of Pharmaceutics 291, 69, (2005).
130 Kim J., Lee H.Y., Kim M.H., Lee H., Kang H., Kim S.M.: Preparation and
characterization of chitosan/gelatin microcapsules containing triclosan. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces 52, 52, (2006).
131 Hoyt, V. W., & Mason, E. (2008). Nanotechnology: emerging health issues. Journal of
Chemic al Health and Safety, 15, 10 -15.
132 Brayner, R. (2008). The toxicological impact of nanoparticles. Nano Today, 3, 48 -55.
133 Priscilla Pereira dos Santos, Simone Hickmann Flores, Alessandro de Oliveira Rios,
Renan Campos Chiste, Trends in Food Science & Techn ology: a review. Biodegradable
polymers as wall materials to the synthesis of bioactive compound nanocapsules,2016, 23 -33.-
TOATE REFERINTELE CU ROSU DE SUS SI JOS SUNT LUATE DIN ACEST ARTICOL!!!
134 Kayser, O., Lemke, A., & Hernandez -Trejo, N. (2005). The i mpact of
nanobiotechnology on the development of new drug delivery systems. Current Pharmaceutical
Biotechnology, 6, 3 -5.
135 Huang, Q., Yu, H., & Ru, Q. (2010). Bioavailability and delivery of nutraceuticals
using nanotechnology. Journal of Food Science, 75 , R50 -R57.
136 Couvreur, P., Barratt, G., Fattal, E., & Vauthier, C. (2002). Nanocapsule technology: a
review. Therapeutical Drug Carrier Systems, 19, 99 -134.
137 Venturini, C. G., J€ ager, E., Oliveira, C. P., Bernardi, A., Battastini, A. M. O.,
Guterres, S. S., et al. (2011). Formulation of lipid core nanocapsules. Colloids and Surfaces A:
Physicochemical and Engineering Aspects, 375, 200 -208.
138 Lobato, K. B. d. S., Paese, K., Forgearini, J. C., Guterres, S. S., Jablonski, A., & Rios,
A. d. O. (2013). Charact erisation and stability evaluation of bixin nanocapsules. Food Chemistry,
141, 3906 -3912
139 Couvreur, P., Barratt, G., Fattal, E., & Vauthier, C. (2002). Nanocapsule technology: a
review. Therapeutical Drug Carrier Systems, 19, 99 -134.
140 Reis, C. P., Neufel d, R. J., Ribeiro, A. J., & Veiga, F. (2006). Nanoencapsulation I.
Methods for preparation of drug -loaded polymeric nanoparticles. Nanomedicine:
Nanotechnology, Biology and Medicine, 2, 8 -21.

86

141 Reis, C. P., Neufeld, R. J., Ribeiro, A. J., & Veiga, F. (2006 ). Nanoencapsulation I.
Methods for preparation of drug -loaded polymeric nanoparticles. Nanomedicine:
Nanotechnology, Biology and Medicine, 2, 8 -21.
142 Rollot, J. M., Couvreur, P., Roblot -Treupel, L., & Puisieux, F. (1986).
Physicochemical and morphological characterization of polyisobutyl cyanoacrylate
nanocapsules. Journal of Pharmaceutical Sciences, 75, 361 -364
143 Vrignaud, S., Benoit, J. -P., & Saulnier, P. (2011). Strategies for the nanoencapsulation
of hydrophilic molecules in polymer -based nanoparticles. Biomaterials, 32 , 8593 -8604 .
144 Soppimath, K. S., Aminabhavi, T. M., Kulkarni, A. R., & Rudzinski, W. E. (2001).
Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. Journal of Controlled Release,
70, 1 -20.
145 Mora -Huertas, C. E., Garrigues, O., Fessi, H., & Elaissari, A. (2012). Nanocapsules
prepared via nanoprecipitation and emulsificationediffusion methods: comparative study.
European Journal of Pharmaceuti cs and Biopharmaceutics, 80, 235 -239.
146 Rao, J. P., & Geckeler, K. E. (2011). Polymer nanoparticles: preparation techniques
and size -control parameters. Progress in Polymer Science, 36, 887 -913.
147 Quintanar -Guerrero, D., Allemann, E., Fessi, H., & Doelker, E. (1998). Preparation
techniques and mechanisms of formation of biodegradable nanoparticles from preformed
polymers. Drug Development and Industrial Pharmacy, 24, 1113 -1128.
148 Doina Hritcu, Marcel I.Popa, Niculina Popa, Vasile Badescu, Vera Balan, Prepar ation
and characterization of magnetic chitosan nanospheres, Turk.J.Chem. 33(2009), 785 -796.
149 EK. Schlachter, et al. Metabolic pathway and distribution of superparamagnetic iron
oxide nanoparticles: în vivo study. Internațional journal of nanomedicine, 20 11, 6, 1793.
150 Jain K.K., Drug Delivery Systems An Overview, Humana Press, 2008.
151 Nazila Kamaly, Basit Yameen, Jun Wu, and Omid C. Farokhzad. Degradable
Controlled -Release Polymers and Polymeric Nanoparticles: Mechanisms of Controlling Drug
Release.Chem Rev. 2016 February 24; 116(4): 2602 –2663.
152 K.W. Leong, R. Langer. Polymeric controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery
Reviews Volume 1, Issue 3, September 1988, Pages 199 -233.
153 Fu Y, Kao WJ. Drug release kinetics and transport mechanisms of non -degradable and
degradable polymeric delivery systems. Expert Opin Drug Delivery. 2010; 7:429 –444.
154 Abouelmagd SA, Hyun H, Yeo Y. Extracellularly activatable nanocarriers for drug
delivery to tumors. Expert Opinion on Drug Delivery. 0:1 –18.

87

155Cauchetier E, D eniau M, Fessi H, Astier A, Paul M. Atovaquone -loaded nanocapsules:
influence of the nature of the polymer on their in vitro characteristics. International Journal of
Pharmaceutics. 2003; 250:273 –281
156 Keraliya RA, Patel C, Patel P, Keraliya V, Soni TG, Pa tel RC, Patel MM. Osmotic
drug delivery system as a part of modified release dosage form. ISRN Pharm. 2012;
2012:528079.

158Balan, V., Dodi, G., Tudorachi, N., Ponta, O., Simon, V., Butnaru, M., & Verestiuc, L.
(2015). Doxorubicin -loaded magnetic nanocapsul es based on N -palmitoyl chitosan and
magnetite: Synthesis and characterization. Chemical Engineering Journal, 279, 188 –197.
159 Jiang, W., Wu, Y., He, B., Zeng, X., Lai, K., & Gu, Z. (2010). Effect of sodium oleate
as a buffer on the synthesis of superparam agnetic magnetite colloids. Journal of Colloid and
Interface Science, 347(1), 1 –7.
160 X.Q. Liu, M.D. Kaminski, Y.P. Guan, H.T. Chen, H.Z. Liu, A.J. Rosengart, J. Magn.
Magn. Mater. 306 (2006) 248.
161 V.V. Korolev, A.G. Ramazanova, A.V. Blinov, Russ. Chem. Bu ll. 51 (2002) 2044.
162 D.K. Kim, Y. Zhang, W. Voit, K.V. Rao, M. Muhammed, J. Magn. Magn. Mater. 225
(2001) 30.
163 T. Fried, G. Shemer, G. Markovich, Adv. Mater. 13 (2001) 1158.
164 Calvo P., Remunan Lopez C., VilaJato J.L., Alonso M.J. Novel hydrophilic chito san-
polyethylene oxide nanoparticles as protein carriers. J Appl Polym Sci. 1997;63:125 -32.
165 Cao A (2003) Light scattering. Recent applications. Anal Lett 36:3185 –3225
166 Von Aulock, F.W.; Kennedy, B.M.; Schipper, C.I.; Castro, J.M.; Martin, D.E.;
Watkins, J.M.; Wallace, P.J.; Puskar, L.; Bégué, F.; Nochols, A.R.L.; et al. Advances in Fourier
transform infrared spectroscopy of natural glasses: From sample prepration to data analysis.
Lithos 2014, 206 –207, 52 –64.
167 Jorstad, S. G., Marscher, A. P., Larionov, V. M., Agudo, I., Smith, P. S., Gurwell,
M.,Wiesemeyer, H. (2010). FLARING BEHAVIOR OF THE QUASAR 3C 454.3 ACROSS
THE ELECTROMAGNETIC SPECTRUM. The Astrophysical Journal, 715(1), 362 –384.
168 Parikh, S.J.; Chorover, J. FTIR spectroscopic study of biogenic Mn -oxide formation
by Pseudomonas putida GB -1. Geomicrobiol. J. 2005, 22, 207 –218
169 Balan, V., Dodi, G., Tudorachi, N., Ponta, O., Simon, V., Butnaru, M., & Verestiuc, L.
(2015). Doxorubicin -loaded magnetic nanocapsules based on N -palmitoyl chitosan and

88

magn etite: Synthesis and characterization. Chemical Engineering Journal, 279, 188 –197.
doi:10.1016/j.cej.2015.04.152
170 Balan, V., Petrache, I. A., Popa, M. I., Butnaru, M., Barbu, E., Tsibouklis, J., &
Verestiuc, L. (2012). Biotinylated chitosan -based SPIONs with potential in blood -contacting
applications. Journal of Nanoparticle Research, 14(2).
171 W. Seifriz, Studies in emulsions. III. Double reversal of oil emulsions occasioned by
the same electrolyte, J. Phys. Chem. 29 (1925) 738.
172 N. Garti, C. Bisperink, Double emulsions: progress and applications, Curr. Opin.
Colloid Interface Sci. 3 (1998) 657.
173 A.T. Florence, D. Whitehill, Some features of breakdown in waterin -oil-in-water
multiple emulsions, J. Colloid Interface Sci. 79 (1) (1981) 243.
174 VANDERGRAAF, S., SCHROEN, C., & BOOM, R. (2005). Preparation of double
emulsions by membrane emulsification, a review. Journal of Membrane Science, 251(1 -2), 7–15.
175 H. Schubert, H. Armbruster, Principles of formation and stability of emulsions, Int.
Chem. Eng. 32 (199 2) 14.
176 Y. Mine, M. Shimizu, T. Nakashima, Preparation and stabilization of simple and
multiple emulsions using a microporous glass membrane, Colloid Surf. B: Biointerfaces 6 (1996)
261.
177 T. Kawakatsu, G. Trag¨ ardh, C. Tr ˚ ag¨ ardh, Production of W/O/W ˚ emulsions and
S/O/W pectin microcapsules by microchannel emulsification, Colloid Surf. A: Physicochem.
Eng. Aspects 189 (2001) 257.
178 U. Lambrich, S. van der Graaf, K.S. Dekkers, R.M. Boom, H. Schubert, Production of
double emulsions using microchannel emulsification, in: Proceedings of the ICEF, vol. 9,
Montpellier, 2004.
179 S. Sugiura, M. Nakajima, K. Yamamoto, S. Iwamoto, T. Oda, M. Satake, M. Seki,
Preparation characteristics of water -in-oil-in-water multiple emulsions using microchannel
emulsificatio n, J. Colloid Interface Sci. 270 (2004) 221.
180 G.T. Vladisavljevic, M. Shimizu, T. Nakashima, Preparation of monodisperse multiple
emulsions at high production rates by multistage premix membrane emulsification, J. Membr.
Sci. 244 (1 –2) (2004) 97.
181 Yahara T., Koga T., Yoshida S., Nakagawa S., Deguchi H., Shirouzu K., Relationship
between microvessel density and thermographic hot areas in breast cancer, Surgery Today,
Vol.33, 243 –248, 2003.

89

182 Cayot, P., & Tainturier, G. (1997). The Quantification of Protein Amino Groups by the
Trinitrobenzenesulfonic Acid Method: A Reexamination. Analytical Biochemistry, 249(2), 184 –
200.
183 Vadlapudi, A. D., Vadlapatla, R. K., Pal, D., & Mitra, A. K. (2013). Biotin uptake by
T47D breast cancer cells: Functional and molecular evidence of sodium -dependent multivitamin
transporter (SMVT). International Journal of Pharmaceutics, 441(1 -2), 535 –543.
184 Yang, W., Cheng, Y., Xu, T., Wang, X., & Wen, L. (2009). Targeting cancer cells
with biotin –dendrimer conjugates. European Journal of Medicinal Chemistry, 44(2), 862 –868.
185 Heo, D. N., Yang, D. H., Moon, H. -J., Lee, J. B., Bae, M. S., Lee, S. C., … Kwon, I.
K. (2012). Gold nanoparticles surface -functionalized with paclitaxel drug and biotin receptor as
theranostic agents for cancer ther apy. Biomaterials, 33(3), 856 –866.
doi:10.1016/j.biomaterials.2011.09.064
186 Reidling, J. C., Nabokina, S. M., & Said, H. M. (2007). Molecular mechanisms
involved in the adaptive regulation of human intestinal biotin uptake: A study of the hSMVTC
Carbohydr ate Polymers 216 (2019) 129 –139
187 X.T. Wen, J.X. Yang, B. He, Z.W. Gu, Curr. Appl. Phys. 8 (2008) 535.
188 W. Jiang, X.T. Wen, W. Wang, Y. Wu, Z.W. Gu, J. Inorg. Mater. 24 (2009) 727.
189 Cornell R. M., and Schwertmann U., 1996. The Iron Oxides Structure, Prop erties,
Reactions, Occurrence and Uses. VCH Verlagsgesellschaft Weinheim.