Tehnici imagistice de clasificare a celulelor aflate în diferite [604258]

Universitatea “Politehnica” din București
Facultatea de Electronică, Telecomunicații și Tehnologia Informației

Tehnici imagistice de clasificare a celulelor aflate în diferite
stadii de malignitate

Lucrare de disertație
prezentată ca cerință parțială pentru obținerea titlului de
Master în domeniul Electronică Aplicată și Tehnologia Informației
programul de studii de masterat Electronică și Informatică Medicală

Conducători științifici Absolvent: [anonimizat]. Valentina Alexandra BĂLUȚĂ
Prof. Dr. Ing. Sever PAȘCA

2018

2

3

4

5

6

7

Cuprins

Abstract
I. Introducere
I.1. Generalități culturi celulare
I.2. Aplicarea unor pulsuri re gulate de tensiune în culturile celulare
I.3. Microscopia holografică
I.3.1. Configurații holografice digitale
I.3.2. Investigarea culturilor celulare prin microscopie holografică
II. Proceduri experimentale
II.1. Proiectarea unei incinte 3D
II.2. Componentele montajului experimental
II.3. Electroporarea celulelor B16F10
II.4. Înregistrarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor
III. Prelucrarea imaginilor reconstruite din hologramele înregistrate
III.1. Segmentarea manuală a imaginilor înregistrate
III. 2. Obținerea coeficienților de caracterizare a celulelor
III.2.1. Comparație celule aflate în diferite stadii de malignitate
III.2.2. Comparație celule maligne porate și neporate
IV. Concluzii
V. Tendințe viitoare
Bibliografie
Anexe

8

9

Abstract

Procedura de electroporare reprezintă o platformă tehnologică utilă pentru aplicații biologice și
industriale multiple. Se bazează pe aplicarea unor impulsuri electrice c e induc permeabilizarea
membranelor celulare. În funcție de caracteristicile pulsului ( durata – microsecunde sau nanosecunde ,
valoarea amplitud inii), memb rana celular ă sau organitele celulare devin permeabile , permițând astfel
diverselor substanțe să int re sau să iasă din celula. În ultima decadă , s-au dezvoltat multe aplicații cum
ar fi electrochemote rapia, electrotransferul genei ș i vaccin area împotriva cancerul ui, electrofuziunea
celulară și electroablația . În industria alimentară și a biomasei, electroporarea a fost implementată cu
succes pentru conservarea alimentelor, creșterea calității și economisirea de energie în procesarea
biomasei.
În paralel cu dezvolta rea rapidă a aplicațiilor existe nte, s-a manifestat un interes cons tant în
cercetarea fundamentală deoarece mecanismele intrinseci ale electropor ării sunt încă în studiu .
Modificările celulare și moleculare care apar în timpul procesului de electr oporare și de recuperare a
celulelor , nu sunt încă bine cunoscute și descrise în detaliu datorită dinamicii lor rapide . Din acest
motiv, este dificil ă analiza cu o sensibilitate ridicată prin tehnici optice și electrice. Îmbunătățirea
eficienței aplicațiil or medicale necesită totuși o mai bună înțelegere a evenimentelor fizice apărute în
celulele electroporate atât în timpul porării câ t și după aplicarea pulsului.
Metodele optice pot oferi informații semnificative cu privire la modificările morfologice ale
celulelor care însoțesc electroporarea. În cadrul acestor metode, se propune utilizarea m icroscopiei
holografice digitale (DHM) ca tehnică inovativă pentru studiu l modificărilor celulare ulterioare
electroporării. DHM a fost deja validată pe eșantioane biologice și este utilizată , în prezent, pentru a
studia diferite domenii de interes precum medicina , știința material elor, caracterizarea micro sistemel or,
etc. Prof itând de rezoluția spațio -temporală înaltă a imaginilor cantitative de fază (QPIs) oferite de
DHM, această metodă a fost utilizată pentru a evalua dinamica producerii și repară rii daunelor după
microchirurgia cu laser și microman ipulare a optică a celulelor . Totodată , DHM permite obținerea ,
pentru o singură celulă , a unei hărți cu valori ale indiciilor de refracție . Microscopul de fază a fost
dezvoltat pentru a efectua măsurător i, a obține valori ale indicilor de refracție , corespunzători celulelor
atașate d e substrat sau a organisme lor multicelulare și a observa modificările dependente de timp ale
indicilor din celulă .
DHM poate fi utilizat ă pentru reconstrucția imaginilor din eșantioane transparente după o
singură achiziț ie a unei imagini, în fracțiuni de secunde, fără a folosi nici un fel de marker sau substanțe
chimice de contrast. Principiul fizic al metodei se bazează pe schimbările de f ază introduse în frontul
fascico lului difuzat de specimen datorită diferitelor lungimi ale căii optice , în fiecare punct al
eșantio nului. Atunci când acest fascico l interferă cu fascico lul de referință, suprapunerea lor produce
imaginea holo grafică, care conține valorile diferenței de fază, corespunzătoare specimenului , în fiecare
punct. Mai mult, reconstrucția folosi nd teoria scala ră a difracției, analiza Fourier și tehnicile specifice
de procesare a imaginii recuperează informații despre forma și proprietățile optice ale eșantionului .

10
Celulele vii, aflate î n mediul lor natural lichid pot fi astfel caracterizate prin conservarea viabilității
celulare. În consecință, DHM reprezintă o tehnică non -distructivă, neinvazivă, ce nu implică utilizarea
markerilor cromatografici, cu rezoluție nanometrică de -a lungul axei de propagare a fascicolul ui laser.
Pentru caracteriza rea potențialul metastatic celular , am propus biomarkeri optici noi, pornind de
la DHM : analiza bimodală QPI, combinată cu calculul indicelui de refracție (RI) și al densității maselor
uscate (DM). Rezultatele obținute arată că sublinia celulară cu potențial metastatic mai mare prezintă o
histogramă unimodală, un indice de refracție mai mare și o densitate mai mică de masă uscată.
În domeniul patologiei canceru lui, s -a raportat că RI , măsurat pe celule individuale , este mai
mare la celulele malign e decât la cele normale. A ceastă caracteristică a fost atribuită conținutului mai
mare de proteine din celulele canceroase , proteine care susțin procesul de diviziun e. S-a demonstrat că
"celulele neimplicate" (celule histopatologic e normale , identificate în tumorile colectate de la pacienții
cu cancer) au RI crescut . Măsurarea RI a fost efectuată fie pe celule ade rente, fie pe celule atașate de
substrat. Întreaga analiză a ținut cont de faptul că măsurarea RI este puternic dependentă de starea
experimentală (celule vii sau fixe, o singură celulă față sau un țesut , temperatură , osmolaritate) și de
rezoluția metodei (harta efectivă RI sau 3D RI ).
Lucrarea a pornit de la utilizarea metodei DHM, în configurație off-axis, pentru a descoperi
diferențele dintre două sublinii (F1 și F10) ale celulelor B16 de melanom murin, caracterizate prin
potențial metastatic diferit. S-au calculat RI -urile celulelor aderente în zone specifice , densitatea de
masă uscată a ambelor sublinii și s-au caracteriza t distribuțiile cu diferență a fazei ale imaginilor
cantitative reconstruite folosind coeficientul de bimodalitate. Corelațiile observate ale profilurilor
bimodalității RI, densității maselor uscate și bimodalității QPI cu potențialul me tastatic celular au fost
validate prin alte două standarde care cuantifică rata de proliferare a celulelor: teste clonogenice și
înregistrăr i ale indexului de celule bazat pe impedanță .

11

Listă figuri

Fig. 1.1….……………………………………………………………………………………………… .15
Fig. 1.2….……………………………………………………………………………………………… .15
Fig. 1.3…..……………………………………………………………………………………………… 15
Fig. 1.4…..……………………………………………………………………………………………… 17
Fig. 1.5…..……………………………………………………………………………………………… 20
Fig. 1.6…..……………………………………………………………………………………………… 20
Fig. 1.7…..……………………………………………………………………………………………… 21
Fig. 1.8…..……………………………………………………………………………………………… 22
Fig. 2.1…..……………………………………………………………………………………………… 26
Fig. 2.2…….…………………………………………………………………………………………… ..26
Fig. 2.3…….………………… …………………………………………………………………………..27
Fig. 2.4…….………………… …………………………………………………………………………..27
Fig. 2.5…….……………………………………………………………………………………………..28
Fig. 2.6…….……………………………………………………………………………………………..29
Fig. 2.7…….………………… …………………………………………………………………………..31
Fig. 2.8..……..………………………………………………………………………………………. …..31
Fig. 2.9..……..……………… …………………………………………………………………………..33
Fig. 2.10…………………… ………………………………………………………………………….. …34
Fig. 2.11…..………………… …………………………………………………………………………..35
Fig. 2.12…… …..…………… …………………………………………………………………………..36
Fig. 2.13………..………………………………………………………………………………………..36
Fig. 3.1…..……………………………………………………………………………………………39 -41
Fig. 3.2…….……………………………………………………………………………………….…42 -44
Fig. 3.3…….…………………………………………………… ………………………………………..45
Fig. 3.4…….……………………………………………………………………………………………..46
Fig. 3.5…….……………………………………………………………………………………………..47
Fig. 3.6…….……………………………………………………………………………………………..47
Fig. 3.7…….……………………………………………………………………………………………..48
Fig. 3.8..……..……………………… ……………………………………………………………………48
Fig. 3.9..……..……………… …………………………………………………………………………..50
Fig. 3.10…………………………… ……………………………………………………………………..52
Fig. 3.11…………………………… ……………………………………………………………………..53
Fig. 3.12…………………………… ……………………………………………………………………..58
Fig. 3.13…………………………… ……………………………………………………………………..58
Fig. 3.14…………………………… ……………………………………………………………………..59
Fig. 3.15…………………………………………………………… …………………………………….. 60

12

13

Listă tabele

Tabel 1….………………………………………………………………………………………………. .54
Tabel 2….……………………………………………………………………………………………… ..54
Tabel 3….………………………………………………………………………………………………. .57
Tabel 4….………………………………………………………………………………………………. .57
Tabel 5….………………………………………………………… ……………………………………..58
Tabel 6….…………………… …………………………………………………………………………..58
Tabel 7….…………………… …………………………………………………………………………..59
Tabel 8….…………………… …………………………………………………………………………..60

14

15

Listă acronime

DHM = Digital Holographic Microscopy
AFM = Atomic -Force Microscopy
SEM = Scanning Electron Microscopy
PI = Propidium Iodide
HI = Holographic Interferometry
CGH = Computer Generated Holography
CCDs = Charged Coupled Devices
DMD = Digital Micromirror Device
BS = Beamsplitter
DM = D ry Mass
OPD = Optical Phase Differences
OPS = Optical Phase Synchronization
QPIs = Quantitative Phase Images

16

17

I. Introducere

I.1. Generalități culturi celulare

Celula reprezintă blocul de construcție pentru viața umană. De exemplu, m aterialul genetic al
fiecărei celule din corpul uman, ce se compune din 100 trilioane de celule, deține secretul unor boli
ereditare, cum ar fi Tay Sachs, fibroza chistică, boala Alzheimer și alte boli complexe precum cele de
inimă . Cultura de țesut a fost dezvoltată prima oară la începutul anilor 1900 pentru studiul
comportamentului celular – fără variații ce ar putea apărea în întregul organism – prin expunerea la
stres normal sau indus. Inițial, oamenii de știință au folosit fragmente de țesuturi însă, tehnicile
dezvoltate treptat pentru studiul comportamentul celulelor au schimbat numele în culturi de celule.
În forma sa cea mai simplă, cultur a celulară implică dispersarea celulelor într -un mediu
artificial compus din soluții de nutrienți, pe o suprafață adecvată pentru a susține creșterea celulelor,
precum și condiții ideale de temperatură, umiditate și atmosferă gazoasă. Într -un astfel de sis tem, un
cercetător poate măsura cu precizie răspunsul alterărilor celulare din cultură, prezența sau absența altor
tipuri de celule, agenți cancerigeni și virusuri.
Celulele pentru culturi , ADN -ul sau fragmente mici de țesut (biopsii) pot fi extrase din
organism . Limfocitele pot fi imortalizate cu ajutorul virusul Epstein -Barr și apoi reprodus e pe termen
nelimitat î n mediul de cultură. Fibroblastele (celule de la o b iopsie a pielii) pot fi folosite pentru a
stabili o linie de celule, deși creșterea lor în m ediul de cultură este limitată în timp.
Cultura celulară se referă la preluarea celulelor de la un organism animal sau de la o plantă și
creșterea ulterioară a acestora într -un mediu artificial favorabil. Celulele pot fi eliminate din țesutul
direct și de zagregate cu ajutor enzimatic sau mecanic înainte de cultivare, sau pot fi derivate dintr -o
linie celulara [1].
În prezent, există trei clase generale de culturi celulare:
a) Cultura celulară primară
Cultura celulară primară permite menținerea creșterii celul elor disociate din țesutul parental
(cum ar fi rinichi sau ficat) , folosind metode mecanice sau enzimatice, în mediul de cultură, cu
recipiente de sticlă sau plastic adecvate. Cultura primară de celule se poate realiza în două moduri, în
funcție de tipul de celule din cultură și de scopul analizei.
Culturi pentru c elule aderente – celule ce necesită atașament pentru creștere; se spune că sunt
celule dependente de ancorare. Celulele aderente sunt , de obicei , derivate din țesuturi de organe, cum ar
fi rinich i în cazul în care acestea sunt imobile și încorpo rate în țesutul conjunctiv.
Culturi pentru c elule în suspensie – celulele care nu necesită atașament pentru creștere, nu se
atașează de suprafața vaselor de cultură. Toate culturile în suspensie sunt deriva te din celule ale
sistemului sanguin deoarece aceste celule sunt, de asemenea, suspendate în plasma in vitro, așa cum
sunt, de exemplu, limfocitele.

18

b) Culturile celulare secundare
Atunci când o cultură primară este subcultivată devine ceea ce se numește cu ltură secundară sau
linie celulară. Subcultura se referă la transferul de celule dintr -un vas de cultură într -un alt vas. Acest
lucru este necesar în mod periodic pentru a furniza substanțe nutritive proaspete și spațiu de creștere
pentru linii de celule î n continuă dezvoltare. Procesul conduce la eliminarea mediul de creștere și
disocierea celulelor aderente (de obicei, pe cale enzimatică). Astfel de culturi pot fi numite culturi
secundare.
c) Linii celulare
O linie de celule sau tulpina celulei poate fi fini tă sau continuă . În funcție de durata de viață a
culturii, liniile de celule sunt clasificate în două categorii:
Liniile celulare finite – Linii celulare care au o durată de viață limitată, trec printr -un număr
limitat de generații de celule (de obicei , 20-80 dublări de populație) și sunt cunoscute ca fiind linii
celulare finite. Aceste linii de celule prezintă proprietatea inhibării de contact, limitarea densității și a
dependenței de ancorare. Rata de creștere este lentă și timpul de dublare este de aprox imativ 24 -96 de
ore.
Liniile celulare continue – Linii celulare transformate în condiții de laborator sau în condiții de
cultură in vitro ce dau naștere unor linii celulare continue. Aceste linii celulare prezintă proprietatea
ploidiei (aneuploidie sau het eroploidie), lipsa inhibiției de contact și dependența de ancorare. Ele cresc
fie într -un monostrat , fie în suspensie. Rata de creștere este rapidă și timpul de du blare poate fi de 12 –
24 ore.
Pe scurt, liniile celulare finite cuprind celule normale ce se divid de un număr limitat de ori
înainte de a -si pierde capacitatea de proliferare, eveniment determinat genetic, cunoscut sub numele de
senescență. Cu toate acestea, unele linii celulare devin nemuritoare printr -un proces de transformare
care poate să apa ră spon tan sau poate fi indus chimic și viral. Atunci când o linie celulară finită suferă
transformări și dobândește capacitatea de a se diviza la nesfârșit devine o linie continuă de celule.
Printre modalități le de realizare a culturilor de linii se pot aminti:
Culturi le monostrat – De obicei, baza vasului de cultură este acoperită cu un strat continu de
celule, denumite generic culturi monostrat.
Culturile în suspensie – Majoritatea liniilor celulare continuă să crească ca mon ostraturi. Une le
dintre celule sunt antiadezive ( de exemplu , celule de leucemie) și pot fi păstrate mecanic în suspensie
sau pot fi propagate în suspensie [1].
Condițiile de cultură variază foarte mult de la un tip de celulă la altul. Mediul artificial în care
celulele sunt cultivate în mod invariabil constă dintr -un vas adecvat ce conține un substrat sau un mediu
care furnizează substanțele nutritive esențiale (aminoacizi, carbohidrați, vitamine, minerale), factori de
creștere, hormoni și gaze (O 2, CO 2). Cele mai multe celule tr ebuie să fie cultivate atunci câ nd sunt
atașate de un substrat solid sau semisolid, în timp ce altele pot fi cultivate plutind în mediul de cultura
(cultură în suspensie).
Pe baza formei și aspectului, culturile celulare pot fi împărțite în trei c ategorii de bază:
 fibroblastice: celulele sunt bipolare sau multipolare, au forme alungite și cresc atașate la un
substrat.

19

Fig. 1.1: Celule fibroblaste [url-1.1]

 epiteliale: celulele au formă poligonală cu mai multe dimensiuni, cresc atașate la un substrat în
patch -uri discrete.

Fig. 1.2: Celule epiteliale vezicale [url-1.2]

 celulele limfoblaste: sunt piese de formă sferică și, de obicei, cultivate în suspensie, fără a fi
atașate la o suprafață.

Fig. 1.3: Limfoame maligne [url-1.3]

Prin urmare , metoda culturilor celulare este una dintre cele mai importante instrumente utilizate
în biologia celulară și moleculară oferind sisteme model excelente pentru studierea fiziologiei normale
și a biochimiei celulare (de exemplu studii metabolice, îmbătrânirea), efectele medicamentelo r și a

20
compușilor toxici asupra celulelor, mutageneza și carcinogeneza. De asemenea, sunt utilizate în
screening -ul de droguri și de fabricație pe scară largă a compușilor biologici (de exemplu vaccinuri,
proteine terapeutice). Avantajul major al utilizări i culturilor celulare pentru oricare dintre aceste
aplicații este consistența și reproductibilitatea rezultatelor care pot fi obținute de la utilizarea unui lot de
celule clonale.

I.2. Aplicarea unor pulsuri regulate de tensiune în culturile celulare

Conceputul d e electroporare poate fi ilustrat cu ajutorul mai multor definiții:
Electroporarea constă în aplicarea unor impulsuri de tensiune mare și durată mică la nivelul
celulelor și țesuturilor. Aceste impulsuri electrice speciale acționează la nivelul me mbranelor celulare,
în special , în spațiile intercelulare lipidice, determinând modificări moleculare ce produc f ormarea unor
ultramicropori ce cresc permeabilitatea. Fenomenul formării acestor ultramicropori este complet
reversibil deoarece moleculele lipidice revin la structur a lor inițială atunci când descă rcarea electrică
încetează. Această formare și dispariție continuă a porilor produce o c reștere semnificativă a
permeabilității nespecifice în favoarea gradienților de concentrație. Cercetătorii susț in că formarea
ultramicrocanalelor de origine electrică survine în structura lipidică a stratului cornos care cimentează
keratinocitele . În funcț ie de zona cutanată de interes, această structură lipidică reprezintă aproximativ
5-30%, fiind principala barieră a pielii pentru penetrarea substanțelor.
Electroporarea este o metodă de transfecție fizică care utilizează un impuls elect ric pentru a crea
temporar pori în membranele celulare, prin care substanțele, cum ar fi acizii nucleici, pot trece în
celule. Este o strategie extrem de eficientă pentru introducerea acizilor nucleici străini în multe tipuri de
celule, inclusiv bacterii și celule ale unor m amifere.
Electroporarea poate fi folosită și ca metodă fizică de livrare a genei. Din acest motiv, se aplică
pe scară largă pentru o varietate de tipuri de celule, inc lusiv animale, plante și microb i [2]. În timpul
electropor ării, celulele sunt expuse la u n puls de înaltă tensiune în prezența acidului nucleic exogen.
Tensiune a mare face ca membrana celulară să fie tranzitoriu permeabilă, permițând acizilor nucleici
străini să intre în celule [3 – 5]. Este de notat faptul că f iecare tip de celulă necesită co ndiții de
electroporare ușor di ferite, ce trebuie determinate experimental.
Cei mai importanți parametri pentru electroporarea efectivă sunt intensitatea câmpului electric
[kV/cm] și intervalul de timp în care se aplică câmpul electric (lungimea pulsului [p s]). Printre
numeroasele utilizări ale electroporări i se num ără și tratarea tumorilor [6 – 7], aceasta fiind considerată
una dintre tehnicile cele mai utile în terapia genică [8].
Acțiunea unui impuls electric de amplitudine joasă este capabilă să producă o permeabiliza re
reversibilă a membranei [9 – 10]. În tot acest timp, molecule exogene, pentru care în mod normal
membr ana nu este permeabilă, pot depă și bariera membranei prin difuzie. În terapia cancerului, această
tehnică a fost folosită cu succes pentru a îmbunătăți eficiența citostaticelor [7] [11]. O metodă derivată
este electroporarea transdermică. Pulsurile electrice se aplică peste stratul dermal, fapt ce conduce la
creșterea difuzivități medicamentelor prin ea.
Florin Ciobanu et all. au arătat faptul că electroporarea în prezența bromurii de etidiu s -a
dovedit a fi utilă pentru crearea celor mai bune conditii de electroporar e a celulelor maligne B16F10.

21
Aplicarea repetată a unui puls scurt (100 ps, 1 kV/ cm) a permis cre șterea procentului de celule viabile
porate (peste 70%). Condițiile electrice descrise în cadrul acestui articol poate fi utilizate și pentru
încapsularea altor molecule mici în cel ulele B16F10, cu observația că optimizare a trebuie făcută pentru
fiecare ti p de moleculă în parte [12].
Având în vedere toate cele de mai sus, principalul avantaj al electroporării este aplicabilitatea sa
pentru transfecția tranzitorie și stabilă a tuturor tipurilor de celule . Mai mult decât atât, pentru ca
electroporarea să fie ușoară și rapidă, este nevoie de a transfecta un număr mare de celule într -un timp
scurt, odată ce sunt determinate condițiile optime de electroporare. Dezavantajul major al electroporării
este moartea substanțială a celulelor , provocată de impulsuri le electrice de înaltă tensiune și doar
repararea parțială a membranei deoarece electroporarea necesită utilizarea unor cantități mai mari de
celule în comparație cu metodele chimice de transfecție.
Preparerea culturilor celulare Aplicarea pulsului electric Întoarcerea la condițiile de crestere Testarea celulelor
Fig. 1.4: Fluxul de lucru al electroporării

În Fig. 1.4. este prezentată o schemă a principalelor etape ale procesului de electroporare,
începând cu prepararea culturilor celulare și terminând cu analiza acestora după ce au fost aplicate
pulsuri de electroporare.

I.3. Micr oscopia holografică

La început, observarea culturilor celulare cu ajutorul microscoapelor optice a adus multe
informații noi și folositoare în studiul culturilor celulare și nu numai. Micr oscopia în câmp luminos
necesită probe colorate, de amplitudine, lucru care conduce la moartea celulelor. Microscopia de
fluorescență necesita, de asemenea, markeri specifici pentru observarea stării celulelor.
Cu timpul, două aspecte au fos t mai dificil de rezolvat în cazul tehnicilor microscopice . Primul
dintre acestea este limita o ptică de difracție care este aproximativ jumătate din lungimea de undă a
luminii folosite la microscop. Acest lucru face aproape imposibilă distingerea structuri lor intracelulare
care sunt mai mici decât limita de difracție. O altă problemă este diferența scăzută a indicelui de
refracție între o celulă și m ediul înconjurător, diferență care în mod normal este mai mică de 0,1. Deci,
o singură celulă arată ca fiind aproape transparentă, lucru ce face ca obținerea de imagini cu contrast
ridicat să fie dificilă atunci când sunt utilizate microscoape optice clasice. În ac este condiții, în care o
singur ă celulă se prezintă ca aproape transparentă, utilizarea de microscoa pe optice clasice face
anevoioasă obținerea de imagini cu contrast ridicat. Pas 1 Pas 2 Pas 3 Pas4

22
În acest scop, diferite tehnici au fost dezvoltate pentru a depăși problema indicelui de refracție.
Una dintre metodele bine dezvoltate este posibi litatea de a utiliza markeri pe p ost de agenți de contrast,
cum ar fi coloranți de fluorescență și puncte cuantice, ce sunt capabile să fie atașate pe unele părți ale
celulei. A ceste metode au probleme cauzate de agentul de contrast, cum ar fi foto -oxidarea sau
toxicitatea pentru probele biologice, probleme întalnite și la tipurile anterioare de microscoape.
Cealaltă metodă bine cunoscută pentru a îmbunătăți contrastul imaginii este de a profita de
diferența de fază a trecerii luminii prin proba transparentă. Descoperirea microscopului h olografic a
permis “investigarea” celulelor biologice în scopul observării morfologiei celulei sau a grosimii
acesteia în timp real, schimbarea volumului și asa mai departe [13].
Istoria holografiei a început în 1948, când Dennis Gabor a introdus o metodă de evitare a
aberației de sferice și de îmbunătățire a calitații imaginii în microscopia electronică, metodă cu ajutorul
căreia se economisesc lentile în instalația experimentală [Gabor, 1948]. În arhitectura de bază, Gabor
definește o configura ție în lin ie în cazul în care două fascico le ajung în planul de înregistrare: fascico lul
de obiect datorat difracți ei pe probă și fascico lul de referință datorat nondifracției de lumină ce trece
prin e șantion. Deoarece ambele fascico le de lumină , care inte rferă , se propagă în aceeași direcție,
reconstrucția obiectului complex a frontului de undă se suprapune cu imaginea obiectului ce
corespunde frontului de undă conjugat și cu ordinu l zero (inte nsitatea undei de referință). Prin urmare,
holografia Gabor suf eră de zgomotul datorat suprapunerii între termeni , în procesul de reconstrucție.
Cea mai importanta limitare vine de la faptul că abordarea Gabor prezintă aplicabilitate doar atunci
când se analizează probe de difracție slabe, sau cu alte cuvinte, procesu l trebuie explicat prin holografie
si nu prin difracție [ 14].
Pentru a el imina aceste deficiențe, fascico lul de referință poate fi introdus din exterior l a planul
de înregistrare, permiț ând astfel ca holografia să domine procesul de înregistrare, indiferen t dacă proba
trebuie sau nu să fie considerată ca și o difracție slabă. Suprapunerea la planul de înregistrare atât a
unui fascico l de referință filtr at spațial, cât și a unui fascico l de imagistică ce transportă informația
despre probă, produce figura de interferență. Se pot distinge diferite moduri de introducere a
fascico lului de referință, dar, în esență, există două opțiuni: off -axis [ 15] și configurația on -axis [ 16].
Anteriorul evită distorsiunile cauzate de suprap unere, în direcția de observare, din cei trei termeni
holografici primiți de la configurația în linie de la imagini reale și virtuale propagate la diferite
unghiuri. Și aceasta din urmă are nevoie de înr egistrarea mai multor holograme, obținute prin varierea
fazei fascico lului de referin ță, cu scopul de a evita denaturarea.
Actualmente, microscopia holografică digitală se dezvoltă rapid și are drept scop depășirea
multor obstacole pentru obținerea unor imagini de înalta calitate. Văzută ca o tehnologie modernă ce
permite studii imagistice 3D, cantitative, de fază, în timp real, care nu distruge proba și nu folosește
markeri și colorații, DHM capătă un rol important în ceea ce privește aplicațiile biomedicale.
Conceptul de bază în holografia digitală este înregistrarea figurii de interferență care se obține
din suprapunerea undei de referință cu cea de obiect. Această înregistrare se realizează pe o cameră
video și nu pe placă holografică, așa cum se realiza în mod clasic. Aceasta este transmisă apoi către
computer și, de aceea, re construcția se realizează digital, prin simularea propagării undei prin
hologramă.
Prin prelucrarea cu ajutorul unui calculator, este posibil să se recupereze informațiile complete
ale formelor de undă complexe , difractate de către obiect, adică amplitud inea și faza. Metoda de

23
obținere a acestei informații include un proces de filtrare , în spațiul Fourier , în scopul de a diferenția
imaginea reală de cea virtuală , care se obține în ordinele +1 și -1 de difracție. După filtrare, holograma
digitală rezultat ă este multiplicată cu o undă de referință numerică care se potrivește cu referința fizică
utilizată pentru înregistrarea hologramei digitale (simulând astfel procesul de propagare). Apoi, se
poate face o reconstrucție numerică bazată pe integrala Fresnel – Kirchhoff, permițând astfel să se
calculeze amplitudinea și faza corespunzătoare obiectului (probei). Ecuațiile folosite oferă posibilitatea
ca reconstrucția să se realizeze în planuri diferite și, în special, în vecinătatea planului focar unde se
obține imaginea focalizată a obiectului. Din acest motiv, se consideră că există posibilitatea focalizării
digitale și a scanării axiale cu precizie nanometrică a imaginii reconstruite.
Ca orice tehnică holografică și microscopia holografică digitală respectă do uă etape :
1. Înregistrarea hologramei;
2. Reconstrucția imaginii obiectului.
Prima etapă este experimentală și constă în realizarea unui montaj în care este introdus obiectul
real și care permite înregistrarea hologramei obținută prin suprapunerea dintre o undă de obiect
(reflectată sau transmisă de obiect) și una de referință. Această figură de interferență se înregistrează pe
senzorul unei camere video sau foto.
A doua etapă este numerică și pornește de la holograma înregistrată experimental sub forma
unei imagini digitale, care, transmisă la computer, devine o matrice de numere ce poate fi prelucra tă
folosind operații specifice. În această etapă , se realizează reconstrucția imaginii 3D a obiectului , prin
simularea propagării , pornind de la hologramă și utilizând un soft specializat , bazat pe teoria scalară a
difracției, în aproximația Fresnel în câmp apropiat.

I.3.1. Configurații hologr afice digitale

O privire de ansamblu asupra principalelor tipuri de configurații interferometrice utilizate în
holografia digitală este importantă întrucât, înainte de începerea u nui experiment practic trebuie puse în
ordine toate aspectele legate de instalația experimentală , în vederea obținerii ulterioare a celor mai b une
rezultate. În primul rând, holografia Fre snel se referă la o configurație în care obiectul se află la o
distanță fi nită față de planul hologramei, iar referința este , de obicei , o undă plană. Ima ginile se
formeaza atunci când poziția obiectului și poziția sa în oglindă , relativ la hologramă, resp ectă mărirea
unitate, fapt ilustrat și în fig. 1.5. Pentru a evita suprapunerea dintre imaginea reală și cea virtuală după
reconstrucție, undele de referință si cele ale obiectului sunt deplasate cu un ung hi, lucru încercat inițial
de că tre Leith și Upatni eks. Poziția imaginii și mărirea pot fi manipulate prin utilizarea unei alte
referințe. Plasarea la o distanță suficient de mare și utilizarea transformatei Fresnel , în etapa de
reconstrucție , permit imagistica unui obiect mai mare decât dimensiunea matricei CCD, lucru favorabil
mai ales î n aplicații metrologice macroscopice [ 17].

24

Fig. 1.5 – Holografia Fresnel off -axis [url-1.4]. Cu al bastru sunt reprezentate fascico lele de
referință iar cu roșu modul de propa gare al unui punct pe un obiect :
( a ) de înregistrare și ( b ) de reconstrucție

Holografia off -axis este necesară pentru a evita suprapunerea dintre ordinul zero și imaginile
holografice. Acest lucru reduce însă co nținutul de informații al hologramei la un sfert din numărul de
pixeli.
Cu un alt tip de configurație holografică, mai exact prin intermediul configurației in -line,
câmpul obiectului este aliniat perfect cu fascico lul de referință , iar întregul număr de pixeli al
hologramei este utilizat, fapt ce conduce la distanțe minime mai scurte pentru reconstrucția Fresnel și o
rezoluție mai mare a imaginii rezultate. Au fost propuse și demonstrate mai multe metode pentru a
reduce sau elimina efectul ordinului zero ș i al imaginilor duble. Termenul de ordinul zero (sau DC)
poate fi parțial suprimat prin simpla scădere a intensității medii a întregii holograme sau alternativ, prin
aplicarea unui filtru trece -sus transformatei Fourier a hologramei în apropierea frecvenței de zero.
Eficacitatea filtrului trece -sus depinde de conținutul spectral al obiectului. Expunerile separate ale
referinței, obiectului și scăderea lor din hologramă , înainte de filtrarea de ordin zero, îmbunătăț esc
rezultatul. Eliminarea așa -numitor imagini duble este mai dificilă și necesită tehnici speciale. Totusi,
metoda de aplicare a unui filtru trece -sus po ate fi eficientă atunci când natura dinamică a obiectului se
opune metodei de defazare [ 17].

Fig. 1.6 – Holografia on-axis [url-1.5]: ( a ) suprapunerea dintre unda de obiect și cea de referință :
( b ) reconstrucția imaginii obiectului (ordinul +1) cu dezavantajul că există atât ordinul
zero cât și imaginea dublă/geamănă (ordinul -1)

25
Pe de altă parte, microscopia holografică digitală in -line sau on -axis constituie un inst rument
potrivit pentru aplicații biologice , fiind un model superior microscopiei convenționale cu lumină
compusă. Avantajele holografiei digitale in -line constau în :
 Simplitatea microscopului: holografia in -line este un tip de microscopie fără obiective.
Hardware -ul necesar constă dintr -un laser, un orificiu ș i o cameră (CCD).
 Simplitatea de pregătire a probelor: secționarea sau colorarea nu sunt necesare. A stfel, pot fi
vizualizate celulele în starea lor naturală.
 Viteza: modificările în specimen pot fi urmărite cu o viteză egală cu număru l de frame -uri ale
camerei CCD.
 Multitudinea de informații: o singură hologramă conține toate informațiile cu privire la structur a
tridimensională a obiectului.
 Rezoluția maximă: rez oluția optimă, de ordin ul lungimii de undă a laserului; poate fi obținută
cu ușurință [ 18].

Fig. 1.7 – (A) Aranjamentul de bază al holografiei in -line; (B) Schema aranjamentului
experimental folosit pentru a înregistra o imagine optică și o hologramă a aceluiași obiect [url-1.6]

Montajul experime ntal al configurației in -line ( fig. 1.7 ) cuprinde:
(A) Un laser (L) iluminează un orificiu (P ), care acț ionează ca o sursă punctiformă . Undele sferice
care pornesc din orificiu ilumineaza obiectul (O), iar interferența la ecran (C ) a undelor
împrăștiate ( – – – ) cu unda de referință ( – ) constituie holograma.
(B) Ocularul (f), camera (g ), oglinda (h) și obiectivul (b ) fac parte dintr -un microscop inversat.
Pentru a înreg istra hol ograma, lumina de la un laser (a ) este reflectată pe o oglindă și , mai apo i,
concen trată de obiectiv pe orificiu (c ). Lumina care iese din orificiu trece prin obie ct, prin
substratul de sticlă (d ) și formea ză o hologramă pe cipul CCD ( e). Pentru a înregistra o imagine
optică conventională a obiectului, oglinda este transformată pentru a permite ca lumina albă de
la o lampă ( nu ap are reprezentată în fig. 1.7), ce luminează obiectul, să ajungă la un al doilea
cip CCD atașat la ocular.

26
Având în vedere cele de mai sus, cât și urmarea principiului interferometric de bază, diferite
structuri clasice pot fi utilizate pentru a asambla o configurație DHM.
În acest sens, Mach -Zehnder [19], Michelson [20], Twyman -Green [21] au fost propuse ca și
arhitecturi i nterferometrice de bază. Dintre acestea, configurația Mach -Zehnder este de departe cea mai
utilizată în practica DHM [22].

I.3.2. Investigarea culturilor celular e prin microscopie holografică

Căutarea unei metode destinate studiului celular cu exactitate, fără utilizarea de markeri sau
colorare, a condus la apariția mai multor tehnici microscopice cantitative interferometrice folosind
proprietățile de fază ale luminii coerente pe imaginea unui eșantion. Una dintre ele este holografia
digitala. Așa cum a fost specificat și în subcapitolul anterior, în anul 1948, Dennis Gabor a inventat o
modalitate de a codifica faza luminii, atât ca informație , cât și ca o înregistrare ce conține toate
informați ile într -o singură înregistrare, adică holograma [23].
Hologramele sunt frecvent utilizate ca piese de ar tă și sunt afișate ca imagini 3 D iluminate.
Descoperirile lui Denis Gabor au stat la baza dezvoltării hologra fie digitale în anii 1990 [24 – 25], în
care, informațiile referitoare la un obiect, se co lectează pe un senzor digital iar mai apoi sunt introduse
într-un computer.
Cu ajutorul microscopiei holografice este posibilă ob servarea formei celulei, înregistrarea
diferenței de fază introdusă , din care se poate calcula apoi volumul și masa uscată fără nici un fel de
alte substanțe chimice utilizate și cu o sursă de lumină de intens itate foarte scăzută [26 -28], caz în care
intensitatea este mult sub ceea ce este considerat a fi fototoxic pentru culturile celulare sau alte
preparate biologice . În fig. 1. 9, o cultură de celule, fibroblaste de șoarece L929, este prezentată după ce
a fost înregistrată folosind atât microscopia cu contrast de fază cât și DHM . Se poate observa faptul că
imaginile DHM arată similar cu imaginile de contrast de fază, dar, în plus, oferă informații cantitative
în a treia dimensiune (de -a lungul axei), ceea ce microscopia clasică nu oferă, în niciuna dintre
variantele sale. Din aceas tă informație cantitativă, se pot calcula apoi alți parametri folositori care oferă
informații utile la nivel de celulă singulară [29].

Fig. 1.8 – O cultură celulară capturată cu ajutorul microscopiei holografice digitale (A) și cu
microscopia cu contrast de fază (B) . Celulele sunt fibroblaste de ș oarece
BN7005 -H1D2 și au aproximativ 20 µm în diametru [url-1.7]

27
Un alt avantaj al DHM este faptul că permite înregistra rea obiecte lor aflate în mișcare, viteza de
achiziție a hologramelor fiind cea dată de viteza senzorului CCD. Din acest motiv, ea este foarte
potrivită pentru studiul proceselor rapide. Acest avantaj se datorează faptul că , în montajul
experimental , nu se folosește procedura de scanare, ca în cazul AFM, SEM, microscopie confocală. În
DHM, toată imaginea se înregistrează dintr -o dată.
Celul ele se deplasează în mod contin u, atât in vivo , cât și in vitro. Atunci când celulele sunt în
cultură, mișcarea este adesea aleatoare, în tim p ce mișcarea celulară normală d ntr-un organism este mai
organizată. Studiile despre cancer metastatic implică, de cele mai multe ori, studii de migrare sau de
motilitate. Cu toate acestea, studiile de migrare celulara sunt dificile at unci când se utilizează metode
standard de filtrare, de exemplu camera Boyden [30], Zigmond [31 ] sau Dunn [32]. Studiile ce
presupun intervale de timp între analize sunt foarte utile însă necesită setup -uri costisitoare cu lumină
albă sau microscopie de fluorescență. Alte două t este utilizate în mod obișnuit pentru studiul motilității
sunt: te stul ce constă în scrijelirea ră nii și testul de migrare trans -endoteliala [33 – 34]. Este imp ortant
de precizat faptul că numai un număr limitat de linii celulare po ate fi studiat prin aceste metode.
DHM poate furniza informații în timp real despre mișc area celulei folosind un spectru mult mai
larg de celule și linii celulare. Primele studii în ac est sens au ilustrat migrația fib roblastică [35 ]. Un alt
studiu a utilizat abilitatea 3 D a tehnicii DHM pentru dezvoltarea unei metode de migrare a celulelor în
prezența cancerului, cum ar fi condițiile in vivo [36 ]. Astfel, mediul 3D in vivo a fost creat utilizând o
matrice de geluri. Cea de -a treia dimensiune a fost utilizată în continuare de către Garc ia-Sucerquia și
colaboratorii să i în studiile lor de miscare prin lichide [37 ]. Au urmat algele și protozoarele cărora le -au
fost determinate mișcarea prin lichid.
Celulele în suspensie sunt dificil de urmărit folosind microscopia traditionala. Tehnica DHM a
fost folosit ă pentru a analiza populația de celule endotel iale umane în traiectoria lor 3 D printr-o soluție
[38]. Celule le au fost urmărite pe o distanță de 189 µm de -a lungul axei Z. Sun si colegii săi au urmărit
linia de celule leucemice umane HL -60 dintr -o suspensie. Langehanenberg et all. au prezentat un studiu
în care celulele fibrosarcom au crescut într -un model de țe sut pe bază de colagen [39 ]. Cu ajutorul
DHM, s -a urmărit cu succes mișcarea celulele prin modele de tesut. Recent, s -a utilizat DHM -ul pentru
a urmări mișcarea celulară și pentru a arăta corelația mișcării celulei cu morfologia acesteia [40]. Cel
mai rece nt studiu din acest domeniu indic ă faptul că atât celulele mici , cât și cele mari dintr -o
populație , de multe ori , se deplasează într -un mod diferit , în comparație cu celulele mijlocii , iar
traiectoria mișcării celulei este dependent ă de linia celulară [41 ].
Analizând studiil e amintite mai sus , se poate afirma faptul că DHM este potrivit ă pentru studiile
ce presupun intervale de timp în care se studiază mișcarea ș i evoluția unei linii celulare, analiza putând
fi realizată până la nivel de unică celulă.

28

29

II. Proceduri experimentale

Partea experimentală a lucrării implică parcurgerea urmă toarelor etape:
 realizarea montaju lui experimental necesar achiziționă rii hologramelor digitale;
 proiectarea unei incinte 3D în care să poată fi fixat specimenul celular;
 proiecta rea circuitului de microfluidică util pentru electroporarea celulelor B16F10;
 înregistrarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor;
 segmentarea manuală a imaginilor celulelor de c ontrol B16F1 și, respectiv, elec troporate
B16F10 ;
 obținerea unor coeficienț i de caracterizare a celulelor .

II.1. Componentele m ontajul ui experimental

Montajul experimental ( fig. 1.9), utilizat pentru achiziț ia hologramelor, este compus din
următoarele elemente principale:
 Sursa este un laser cu He -Ne, cu lungimea de undă λ= 632.8nm, dublu stabilizat în amplitudine
și frecvență pentru obținerea unor imagini la parametrii constanți, timp îndelungat;
 De la laser prima dată avem un be am splitter care împarte fascicolul în alte două fascicole:
fascico lul de r eferință și fascico lul obiect. Cu alte cuvinte, beam splitter -ul are rolul de a
transmite o parte a radiației laser, iar cealaltă parte o reflectă;
 Două oglinzi așezate la 45ᵒ față de fascicolul inc ident. Fiecare dintre acestea reflectă câte unul
dintre fascico lele obținute mai sus;
 Un fascico l este denumit ” de obiect ” deoarece trece prin proba care se analizează;
 Un obiectiv este plasat după probă pentru a-i mări detaliile micrometrice ale acesteia . Distanța
dintre probă și obiectiv se poate modifica realizând astfel focalizarea pentru obținere a unor
imagini cu detalii clare ;
 Cel de -al doilea fascico l este denumit ” de referință ” deoarece ajunge direct la mediul de
înregistrare. Acesta trece doar printr -un obi ectiv , identic cu cel din fascico lul de obiect, cu
scopul de a asigura aceeași curbură a frontului de undă pe senzorul camerei video CCD unde se
suprapun cele două fascicole ;
 Compensatorul Soleil -Babinet, plasat în fascicolul de refe rință este format din două prisme care
alunecă una față de ce alaltă, permitând astfel introducerea unei diferențe de fază controlată în
drumul optic;
 Un ultim beam splitter este plasat astfel încât să recombin e cele două fascico le;
 Ca și mediu de înregistrare , se folosește o c ameră video CCD care înregistrează holograma,
adică figura de interferență obținută prin suprapunerea celor două fascico le: de obiect și de
referință.

30

Fig. 2.1 – Schema bloc a instalației experimentale

Rezoluția minimă în planul transversal este puțin mai mică de 1μm în timp ce rezoluția axială
este de ordinul nanometrilor prin softul de reconstrucție a imaginii obiectului din holograma
înregistrată experimental .
Exista două locuri în care se poate vedea imaginea. De aceea, într -unul dintre acestea se
montează camera CCD.

Observații: 1) Obiectivele sunt identice pentru a putea exista interferență.
2) În afară de obiectiv, camera oferă o mărire a imaginii, prin poziționarea ei la o
distanță mai mare față de al doilea beam splitter.
În con figurația off -axis (cea folosită în cadrul prezentei lucrări), între cele două fascico le care
interferă exista un mic unghi.

Fig. 2.2 – Reprezentarea instalației propriu -zise
O1BS
M2SBCLaserpA
M
BS2 2O11
CCDsample

31
II.2. Proiectarea unei incinte 3D

Necesitatea unei astfel de incinte a apărut ca urmare a faptului că probele ce se dores c a fi
analizate sunt lichide. Simpla plasare a celulelor pe un coverslip (fig. 2. 3.) conduce la feno menul de
„uscare a celulei” ș i, implici t, la imposibilitatea de achiziț ionare a imaginilor.

Fig. 2.3 – Modele de coverslip -uri utilizate pe ntru analiza celulară [url-1.8]

În vederea soluționării problemei mai sus menț ionate , am recurs la re alizarea unui „rezervor”
care să fixeze coverslip -ul. Pentru realizarea propriu -zisă a acestuia, a fost necesară proiectarea î n
AutoCAD 3D a unei incinte (fig. 2.4).

Fig. 2.4 – Proiectarea î n AutoCAD 3D a incintei

Ulterior, realizarea fizică a incintei a fost posibila cu ajutorul unei imprimante 3D.
Observație: A fost necesară proiectarea incintei într-un program specializat de grafică
inginerească 3D deoarece i mprimanta utilizează doar fișiere le produse cu ajutorul uno r pachete
software de grafică 3D sau CAD. Obiectele conținute în aceste fișiere sunt discretizate (feliate) în
suprafețe bidimensionale, suprafețe care atunci când sunt suprapuse, formează obiectul inițial. Fiecare
suprafață corespunde unei depuneri de pulbere de 0,1 mm.
Cu alte cu vinte, imprimare a 3D are la bază un princi piu asemănă tor unui Computer Tomog raf:
discretizarea obiectului în felii 2D ș i suprapunerea acestora.

32
II.3. Electroporarea celulelor B16F10

În cadrul aceastei lucră ri de cercetare, s -au electroporat celule epiteliale de șoarece , cunoscute
sub numele de celule B16F10.
Celulele de melanom murin B16F10 au fost cultivate în tr-un mediu Eagle , modificat de
Dulbecco cu concentrație ridicată de glucoză (Mediul Eagle modificat de Dulbecco = varianta lichidă a
formei Dulbecco origi nale, cu o singură modifica re adusă : piridoxal, care este o aldehidă, a fost înlocuit
cu piridoxină. Această modificare a demonstrat că îmbu nătățește stabilitatea mediului ). Mediul astfel
rezultat, format din 1 mM L -glutamină, peste care s -a adaugat 10% ser fetal b ovin, a fost introdus în
incubator la 37 °C și 5% concentraț ie de C02 (Heracell 150i, Thermo Scientific, USA). Toate produsele
de cultură au fost achiziționate de la Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germania . Cu 24 de ore înainte de
realizarea exper imente lor, celulele au fost recoltate prin tripsinizare (0,5% porcină tripsinica , în
vacutainere cu EDTA, Gibco, UE) și însămânțate l a 5-10 x 104 celule / ml în camer a opti că cu bază din
sticlă ( 2 micro -godeuri, Ibidi, Germania). În momentul experimentelor holografic e, celulele acopereau
numai 20 -30% din cameră (fig. 2.5.c). Această densitate celulară scăzută evită suprapunerea celulelor
și asigură un câmp elec tric om ogen în zona celulei ce se doreș te a fi observat ă. Astfel, este permisă
prelucrarea digital ă a imaginii unei singure celule.

Fig. 2.5 – Lamele din oțel inoxidabil în formă de L; (B) profilul pulsului de electroporare: a fost
aplicat un tren de patru impulsuri cu o frecvență de 1 kHz; (C) celule atașate la cameră , acoperind
doar 20-30% din suprafața acesteia , permițând analiza separată a unei singure celule;
(C) electropermeabilizarea membranelor verificată cu ajutorul ioduri de propidiu;
(D) acumularea probelor fluorescente pentru permeabilizarea membranei celulare

33
În timpul experimentelor, au fost utilizate două soluții de cufundare a celulelor:
 soluția M: 300mM soluție manitol (Aldrich Chemistry, Franta) cu o co nductivitate de până la
0,001 S /m și 305 ± 10 mOsmoli, preparată cu apă ultrapură (18,2 MΩ × cm la 25 °C , Sistem
inteligent de apă ultrapură Smart2Pure, TKA , Germania). pH -ul soluției a fost ajustat la 7,2 prin
adăugarea a 20 µl de NaOH 1 M peste 500 ml de soluție M (concentrație finală de sodiu 40
µM).
 soluția D: mediu Eagle modificat de Dulbecco fără fenol roșu, cu 1 g/ l D-glucoză și piruvat
(Gibco Invitrogen, USA). Prin mă surare , s-a constatat că osmolaritatea (Osmomat 030,
Gonotec, Germania) acestei soluții este de 298 ± 2 mOsmol i.
Indicii de refracție ai acestor soluții au fost măsurați cu un refractomet ru Abbe (Novex,
Holland): nM = 1,3412 ± 0,0003 și nD = 1,3356 ± 0,0002.
Pentru testele care pun în evidență realizarea procesului de electroporare s -a utilizat soluție de
iodură de propidiu (PI) (Fluka Biochemica, USA) (concentrație finală de 0,15 µM). S oluția stoc PI (75
mM) a fost păstrată la î ntuneric, la o tem peratură de 4 °C ș i preparată ulterior în apă ultrapură.
Electroporarea celulelor atașate a fost efectuată în soluție M, în camera celulară Ibidi, utilizând
un generator de impulsuri (ELECTRO cell B10, Betatech, Franța). S -a aplicat o secvență de patru
impulsuri bipolare rectangulare (intensi tatea câmpului electric de 1 kV/ cm pentru ambele impulsuri
pozitive și negative, cu caracterist icile de timp descrise în fig. 2.5 (b)). S -au folosit electrozi p lați din
oțel inoxidabil în formă de L, ce atingeau baza camerei; distanța dintre electrozii a fost de 0,5 cm (fig.
2.5 (a)). Electroporarea celulară a fost verificată prin pătrun derea colorantului fluorescent iodură de
propidiu [42] (fig. 2.5 (c) și 2.5 (d)).

Fig. 2.6 – Schema de ansamblu a montajului experimental

34
II.4. Înregis trarea digitală și reconstrucția numerică a hologramelor

O hologramă reprezintă o figură de interferență înregistrat ă pe un mediu sensibil sau, altfel spus,
suprapunerea dintre un front de undă difractat de către obiect și un front de undă de referință, ambele în
lumină coerent ă. O hologramă este , de obicei, înregistrată pe o suprafaț ă plană. Cu toate acestea,
holograma conține informații despre întregul front de undă trid imensional.
Această informație este codifica tă sub formă de microinterfer ențe cu maxime și minime , care nu
pot fi vă zute cu ochiul liber din cauza frecvențelor spațiale ridicate (distanțe mici) . Unda obiect poate fi
reconstruit ă prin iluminarea hologra mei cu unda de referință . Ace astă undă reconstruit ă nu poate fi
distins ă de unda obiectului original. Un observator vede o imagine tridimensională care prezintă toate
efectele perspectivei și profunzimii focalizării.
În configurația inițială a lui Gabor, fasci colul de referință și fascicolul de obiect sunt situate de -a
lungul axei normale fa ță de placa fotografică. Această configuratie con duce la o ima gine reconstituită
suprapusă peste unda strălucito are de reconstrucție și o a doua imagine , așa -numita "imagine
geamănă ". Îmbunătățiri le semnificative ale acestei holograme “in-line” au fost fă cute de Leith și
Upatnieks [ 43] [15] care au introdus o undă de referință în afara axei. Prin confi gurația propusă , cele
două imagini și unda de reconstrucție sunt separate spațial. O aplicație majoră a holografiei este
interferometria holografică (HI), dezvoltată la sfârșitul anilor 1960 de către Stetson, Powell [ 44 – 45] și
alții. Cu HI a fost posibilă maparea suprafeț elor cu o precizie micro metrică .
Dezvoltarea tehnologiei informatice a permis transferul procesului de înregistrare sau a
procesului de reconstrucție în computer. Prima abordare a condus la holografia generată de calculator
(CGH), care ne permite să generăm h olograme artificiale prin metode numerice. Aceste holograme
generate de calculator sunt apoi reconstruite optic. Reconstrucția holografică numerică a fost inițiată de
Yaroslavskii et al [ 46-48]. Ei au extras, în mod optic , părți extinse ale hologramelor “in-line” și Fourier
înregistrate pe o placă holografică . Mai apoi, holograme le digitizate , "convenționale" au fost
reconstruite numeric. Onural și Scott [ 49 – 51] au îmbunătățit algoritmul de reconstrucție și au aplicat
această metodă la măsurare a particulelor. Haddad et a l. [52] au descris un microscop holografic bazat
pe reconstrucția numerică a hologramelor Fourier.
Un mare pas a fost dezvoltarea înregistrării directe a hologramelor Fresnel cu dispozitive
cuplate (CCD) de către Schnars și Juptner [ 53] [24]. Această metodă permite înregistrarea digitală
completă și prelucrarea hologramelor, fără înregistrarea fotografică ca pas intermediar . Schnars și
Juptner au aplicat metoda de interf erență și au demonstrat că reconstrucția holografică digitală oferă
mult mai multe posibil ități decât procesarea convențională (optică).
Fazele fascico lelor înregistrate și diferențele de fază dintre ele pot fi calculate direct de la
hologramele digitale, fără a genera interferograme deplasate în fază [ 54].
Pe la mijlocul anilor 1990 , holograf ia digitală a fost modificată, îmbunătățită și aplicată în multe
tehnici de măsurare , dintre care, cele mai importante sunt urmă toarele :
– îmbunătățirea tehnicilor experimentale și a algoritmului de reconstructie;
– aplicații în analiza de formațiilor și măsura rea formei;
– dezvoltarea holografiei digitale cu schimbarea fazelor;
– aplicații în imagistică, urmărirea particulelor și microscopie;
– măsurarea distribuțiilor indicelui de ref racție în medii transparente;

35
– aplicații în criptarea informațiilor ;
– dezvoltarea hol ografiei di gitale comparative.
Recent, s -a demonstrat cum se pot reconstrui optic hologramele digitale folosind un dispozitiv
cu cristale lichide (LCD) [ 55] sau un dispozitiv digital cu micro -oglin zi (DMD) [ 56].

Fig. 2.7 – Înregistrarea hologramelor

Aranjamentul general pentru înregistrarea hologramel or, în configurație off-axis, este prezentat
în fig. 2.6 [57 – 58]. Fascicolul laser, cu o lungime de coerență suficientă , este împărțit în două părți de
către un beam -splitter (BS). O undă ce luminează obiectul este împrăștiat ă și reflectată , de exemplu pe
o placă fotografică. A doua undă , numit a undă de referință, iluminează direct mediul de înregistrare .
Mai apoi, fascico le se suprapun și interferează .
Unda originală a obiectului este reconstruită pri n iluminarea hologramei cu unda de referință,
fig. 2.7. Un observat or vede o imagine virtuală ce nu poate fi diferențiată de imaginea originala a
obiectului . Imaginea reconstruită prezintă toate efec tele perspectivei și profunzimea focalizării.

Fig. 2.8 – Reconstr ucția hologramelor

36
Procesul hologr afic este descris matematic după cum urmează:

O (x, y) = o (x, y) exp (iφ o (x, y)) (2.1)
este amplitudinea complexă a undei obiectului de amplitudine o și faza φ o iar

R (x, y) = r (x, y) exp (iφ R (x, y)) (2.2)
este amplitudinea complexă a undei de referință de amplitudine r si faza φ R.

Ambele unde interferă la suprafa ța mediului de înregistrare . Intensitatea obținută după
suprapunere este calculată astfel:

I (x, y) = |O(x, y) + R (x, y) |2
= (O(x, y) + R (x, y)) (O(x, y) + R(x , y))*
= R(x, y) R*(x, y) + O(x, y) O*(x, y)
+ O ( x, y) R * (x, y) + R (x, y) O * (x, y) (2.3)

unde * reprezin tă complexul conjugat.

Amplitudinea funcției de transmisie h(x, y) a plă cii fotografice dezvoltate (sau o rice alt suport
de înregi strare) este proporțională c u I(x, y):

h (x, y) = h 0 + βτ I (x, y) (2.4)
unde β este o constan tă, τ este timpul de expunere iar h 0 este amplitudinea de transmisie
a plăcii ne-expuse. h (x, y) se mai numeste și funcție hologramă.

Pentru a descrie matematic reconstrucția hologr amei, amplitudinea funcției de transmisie
trebuie înmulțită cu amplitudinea complexă a undei de reconstru cție (aceasta descrie procesul de
iluminare a hologramei cu unda de referință) :

R (x, y) h (x, y) = [h 0 + βτ (r2 + o2)] R (x, y)
+ Βτr2O (x, y) + βτ R2(x, y) O*(x, y) (2.5)

Primul termen din partea dreaptă este unda de referința , înmulțită cu un factor. Acesta reprezintă
undă nedi fuzată care trece prin hologramă (ordinul zero al difracț iei). Al doilea termen este unda
obiectului reconstruit, care formează imagine a virtuală. F actorul βτr2 influențează numai luminozitatea
imaginii. Al treilea termen produc e o imagine reală , distorsionată a obiectului. Pentru holografia în
configurație off-axis, imaginea virtuală, i maginea reală și und a nedifuzată sunt separate spațial.
Instalaț ia experimentală folosita pentru holografia digitală se bazează pe schema
interferometrul ui Mach -Zehn der în configurație "off -axis", care func ționează în transmisie, fiind
adecvat pentr u probe transparente [59]. În configurația experimentală utilizată , ungh iul dintre razele de
referință și obiect a fost setat pentru a îmbunătăți rezoluția l aterală , prin obținerea interfranjei la o
valoare optimă de 8 -12 pixeli.

37
Am folosit un laser He -Ne dublu stabilizat în amplitudine, cu o lungime de undă egală cu 632,8
nm (Spectra Physics) și o cameră CCD pentru achiziția imaginilor (Pike, F421C echipat ă cu senzor
Kodak de 2048 × 2048, 6. 7 pixeli). Un obiectiv de microscop de 40x (N = 0,85) (Nikon) a asigurat o
rezoluție laterală de 0,9 μm, permițând un câmp optic de aproxi mativ 200 μm.
Un set de 14 holograme a fost înregistrat pe ntru fiecare celulă singulară aleasă – neporată sau
electroporată . O probă a unei astfel de holog rame, corespunzătoare unei celule electroporate, este
prezentată în fig. 2.9 (a).
În ceea ce privește celulele electroporate, p rimele două holograme ale aceleiași celule au fost
înregistrate în soluțiile D și , respectiv , M. Soluțiile utilizate s -au obținut folosind un sistem manual de
perfuzie , fără a se înd epărta camera Ibidi cu celule din montaj ul experimental DHM, evitând astfel
orice deplasare a celulei. Apoi, s -a aplicat trenul de impulsuri de electroporare descris în fig. 2.9 (b). A
treia hologramă a fost înregistrată la 2 secunde după l ivrarea pulsului, în soluția M. Hologramele
ulterioare ale celulei au fost înregistrate la fiecare minut , în decurs ul a 10 minute de la livrarea pulsului.
Electroporare a și achizitia imaginilor au fost realizate la temperatura camerei.
Hologramele c elulelor neporate au fost înregistrate în fiecare minut , în decursul a 13 minute ,
pentru a păstra același procedeu ca și în cazul celulelor porate . Scopul înregistrarii î n timp a fost de
observare a variaț iilor coeficienților de caracterizare a celulelor în timp. Pe scurt, seturile de celule
neporate au jucat r olul unor referințe în comparație cu care s -au analizat celulele supuse unor pulsuri de
tensiune continuă.

Fig. 2.9 – Etapele exper imentale și numerice ale achiziției și prelucrării imagi nilor holografice
corespunzătoare celulelor electroporate: (a) hologramă , (b) și (c) imagini cantitative reconstruite,
(d) secțiunea transversală prin imaginea cantitativă reconstituită

Reconstrucția imaginii a fost realizată utilizând software -ul comercial dedicat KOALAR [60].
Procedura constă în urmărirea rutinelo r standard ale software -ului [61]:
– Transformarea hologramei înregistrate în imagine cu nivele de gri;
– Importare a în soft -ul de reconstrucție;
– Aplicare a transformatei Fourier (în scopul de a izola informațiile obiectului complex de
amplitudine codificat în holograma digitală );
– Selectare a ordin ului +1 (-1 obiect virtual, +1 obiect real);
– Simularea propagării utilizând operatorul asociat difracției Fresnel , în câmp apropiat;

38
– Obținerea matrice i de numere complexe și descompunerea lor pentru a determina
ampl itudinea și faza ;
– Aplicare a unor filtre de corecție , în spațiul Fourier , pentru corectarea aberațiilor de
sfericitate, de înclinare, pentru îndepărtarea anumitor zgomote;
– Obținere a imaginii de fază și reprezentare a 3D a acesteia .
În final, rezultă o imagine cantitativă de fază a celulei (o imagine care atribuie o valoare de
diferență d e fază fiecarui pixel) (fig. 2.9 (b) și 2.9 (c)). Profilul de diferenței optice de fază (fig. 2.9 (d)
a fost trasat de -a lungul unei direcții para lele cu câmpul electric aplicat, prin punctul în care diferență
de fază este maximă.
Procedura de achizitie a hologramelor și , mai apoi , de reconstrucție a imaginilor 3D de fază , s-a
realizat atât pentru celulele de control, B16F1, cât și pentru cele electroporate, B16F10. Două tipuri de
experimente au fost realizate:
a) Experimente de el ectroporare , unde au fost folosite doar celule B16F10. Două tipuri de probe:
a.1. culturi de celule B16F10 electroporate ;
a.2. culturi de celule B16F10 ne -electroporate, considerate de control .
b) Experimente de stabili re a unor parametri cu valori diferite , pentru celule aflate în diverse stadii
de malignitate. Două tipuri de probe:
b.1. culturi de celule B16F1 ne -electroporate ;
b.2. culturi de celule B16F10 ne -electroporate .
Fig. 2.9 prezintă câte un exemplu pentru fiecare specimen celular utilizat în cadrul acestei
lucrări.

Fig. 2.10 – Holograme celulare: celulă B16F1 (stânga) și celulă B16F10 (dreapta );
imagini cantitative de fază 3D ale acele iași celule B16F1 (stânga) și
B16F10 (dreap ta) reconstruite folosind software -ul dedicat KOALAR

39
Fig. 2.10 prezintă un set de imagini holografice consecutive ale unei celule B16F10,
achiziționate în soluții D și M înainte de electroporare și la momente diferite de timp după aplicarea
pulsului. Schimbările optice de fază sunt codificate în culori (albastru repr ezintă cea ma i mică diferență
de fază, roșu cea mai înalt ă). Modificările valorilor optice de deplasare a fazelor, care reflectă variațiile
în forma celulară și indicele de refracti e, sunt observate după livrarea pulsului.

Fig. 2.11 – Imagini holografi ce consecutive ale unei celule B16F10 atașate în două soluții (D și M ) la
diferite momente de timp. În partea de sus: (a) holograma înregistrată în soluția D înainte de eliberarea
pulsului electric; (b) holograma achiziționată în soluția M înainte de livra rea pulsului electric; (c)
holograma achiziționată în soluția M la 2 secun de după livrarea pulsului; (d) î n soluția M la 10 minute
după livrarea pulsului. Partea inferioară: profilele de fază de-a lungul secțiunilor transversale , prin
punctul de deplasare maximă a fazei corespunzătoare fiecărei holograme

Diferență de fază depinde atât de înălțimea cât și de indicele de refracție al celulei în fiecare
pixel (x, y) al imaginii. Pentru a determina individual aceste valori, a fost pr opusă o aș a-numită metodă
de decuplare [28 ], bazată pe înregistrarea a două holograme din aceeași regiune în două lichide, cu
indici de refracție ușor diferiți. Am folosit în cadrul experimentul soluțiile D și M, obținând două
imagini caracterizate în fiec are punct de coordonate le (x, y) pr in valori ale diferenței de fază Δ D(x, y)
și Δ M(x, y), respectiv:

Δ D(x, y) =
[n(x,y) – nD]*h(x,y) (2.6)

40

Δ M(x, y) =
[n(x,y) – nM]*h(x,y) (2.7)

unde λ = 632,8 nm este lungimea de undă a laserului, h este înălțimea iar n este indicele
de refracție al celule i în punctul de coordonate (x, y).

Ecuațiile (2. 6) și (2 .7) au fost folosite pentru a obține valorile n(x, y) și h(x, y) în fiecare punct
investigat (x, y) , cunoscând valorile diferențelor de fază introduse de celulă în fiecare punct :
h(x,y) =
( ) ( )

( ) (2.8)

n(x,y) = ( ) ( )
( ) ( ) (2.9)

Aceste ecuații au fost aplicate pentru prima pereche de holograme achiziționate în soluții D și M
înainte de livrarea pulsului electric (în acest caz, parametrii n și h sunt denumiți n BP și h BP). Apoi, ele
au fost rezolvate folosind următoarele perechi d e holograme: aceeași hologramă obținu tă în soluția
inițială D, asociată cu cele obținute în soluția M la 2 secunde, 1, 2, 3 … 7 min după livrarea secvenței de
impulsuri (aici, N și h sunt denumiți n AP și h AP).
Pentru extragerea datelor celulare , au fost elaborate coduri MATLAB (adaptate pentru această
serie de procesare a holograme lor). În etapa de decuplare, aceste coduri au vizat o regiune cu
dimensiune a 3 x 3 pixeli , în regiune a unde diferență de fază este maximă . Valorile medii n(x, y) și
h(x, y) , corespunzătoare acestei regiuni , au fost calculate folosind ecuatiile (2.8) și (2. 9).
Parametrii n și h au fost calculați din perechi de holograme achiziționate înainte și după livrarea
pulsului, reducâ nd astfel riscul unor erori suplimentare, dar cu beneficii majore asupra monitorizării
evoluției aceleiași celule mai mult timp după electro porare.
Pentru decuplarea calculelor , s-au utilizat numai hologramele înregistrate până la minutul 7.
Pentru perioade mai lungi de timp , procedura de decuplare , bazată pe holograma inițială , nu mai este
sigură, în principal datorită unei posibile deplasări a celulei.

Fig. 2.12 – Prima hologramă în mediul de cultură D, n1 = 1,3360

41

Fig. 2.13 – A doua hologramă în mediul M izo -omolar 300mM,
n2 = 1,3416, conductivitate = 10μS/ cm

Observatii:
 celula investigată este imersată succesiv în două lichide diferite , cu valori adecvate pentru
indici de refracție n1 și n2 , în ipoteza că indicele de refracție RI și înălțimea H rămân
neschimbate;
 sunt înregistrate două holograme și reconstituite imaginile corespunzătoare fiecăreia ;
 două hărți de fază sunt folosite ca punct de pornire pentru a rezolva în MATLAB un sistem cu
două ecuații și două necunoscutele n și h ( n – indicele de refracție al celulei și h – înălțimea
celulei în zona corespunzătoare maximului de fază) .

În concluzie, o rice tehnică holografică constă din două etape:
a) Înregistrarea hologramelor , etapă în care sunt folosite obiecte reale;
b) Reconstrucția imaginii obiectului se realizează printr -o procedură digitală, folosindu -se un
soft specializat care se bazează pe teoria scalară a difracției , cât și pe teoria Fresnel. Softul
permite obțin erea de imagini tridimensionale în care ne sunt oferite informații despre
dimensiunil e obiectului, cea de -a treia dimensiune fiind diferența de fază Δρ dintre o rază
care trece prin celulă și una care trece pe lângă ea . Valoarea diferenței de fază este
proporțională atât cu înălțimea celulei cât și cu indicele ei de refracț ie.

42

43

III. Prelucrarea imaginilor reconstruite din hologramele înregistrate

Imaginile medicale conțin o multitudine de obiecte și modele, care pot transmite informații
despre mecanismele care stau la baza biologiei.
În cadrul laboratorului de Microscopie Holografică Digitală, cu ajutorul unui microscop care
funcționează pe principiile tehnicii DHM, construit din componente separate, pe masă holografică,
conform schemei prezenta te în capitolul anterior, bazat pe interferometrul Mach -Zehnder, s-a reuș it
achiziționarea de imagini a unor celule neporate si, re spectiv electroporate de melanom de soarece.
Această metodă de achiziție a imaginilor celulelor B16F10, aflată la nivel de cercetare, folosește celule
atașate de substrat, extrase din culturi celulare și oferă informații suplimentare de -a lungul axei de
propagare a fascico lului lumi nos, comparativ cu microscopia optică clasică, unde sunt disponibile
informații doar în plan perpendicular pe axa de propagare.
Setul de date, de imagini hol ografice , utilizat în cadrul acestei lucră ri, este format din 7 celule
electroporate ș i 6 neporate, de control. Pentru fiecare celulă î n parte au fost achiziț ionate 1 3 holograme,
dintre care: prima (di) este utilizat ă pentru a se calcula prin comparaț ie cu cele vecine (mi ș i md1 , 2,
3…7) indicii de refracție și înă lțimea, într -o zonă de 9 pixeli pătraț i (3 x 3 pixeli ).
Observatie: Hologramele din mijloc sunt cele etichetate cu mi ș i sunt înregistrate î nainte de
electroporare, î n timp ce hologramele md0 – md10 sunt î nregistrate la diferite momente după
electroporare.
Din aceste holograme au fost reconstruite imaginile de fază ale obiectului .

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la di
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la mi

Fig. 3.1 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă B16F10

44

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md0
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md1

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md2
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md3

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md4
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md5

Fig. 3.1 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă B16F10 (continuare)

45

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md6
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md7

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md8
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md9

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md10
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la dd
Fig. 3.1 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă B16F10 (continuare)

46

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la di
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la mi

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md0
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md1

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md2
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md3

Fig. 3.2 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă neporată

47

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md4
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md5

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md6
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md7

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md8
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md9

Fig. 3.2 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă neporată (cotinuare)

48

Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la md10
Imagine reconstruită
după holograma înregistrată la dd

Fig. 3.2 – Holograme consecutive achiziționate pentru o singură celulă neporată (continuare)

III.2. Segmentarea manuală a imaginilor înregistrate

Procesarea și analiza imaginilor oferă un mijloc de a extrage, de a cuantific a obiecte și modele
în valori ale imaginii și de a obține răspunsuri la întrebări le cu semnificație biologică . Aceste etape
oferă două avantaje importante, comparativ cu metodele traditionale de analiză:
a) Viziunea umană poate fi ușor influența tă de ideile preconcepute vis -à-vis de unele obiecte sau
concepte. Analiza automată a imaginii oferă o abordare imparțială pentru extragerea
informațiilor de interes dintr-o serie de imag ini.
b) Odată ce o rutină de analiză a imaginii es te concepută, ea poate fi aplicată unui număr mare de
imagini microscopice, facilitând colectarea unor cantități mari de date pentru analiza statistică
ulterioară .

Cu toate acestea, în unele cazuri mai dificile, cand avem de -a face cu imagini ce nu prezintă
contururi cla re, procesele amintite mai sus ș i anume pr ocesarea ș i analiza, pot conduce la rezultate
eronate. Pentru rezolvar ea acestor probleme, se apelează la rutine manual e sau semi -manuale î n care
utilizatorul decide vizual sau în urma unor analize, delimitarea celulei de restul imaginii. În prezenta
lucrare, avâ nd de -a face cu astfel de imagini , se recurge la segmentarea manuală a acestora .
Segmentarea reprezintă procesul pri n care o imagine este împărțită în regiuni le sau obiecte le
constituente. Aceste obiecte pot fi prelucrate sau analizate în continuare pentru extragerea in formațiilor
cantitative.
Analiza imaginilor implică conversia caracteristicilor și a obiectelor , din date ale imaginii în
informații cantitative despre aceste caracteristici și atribute măsurate. Imaginile microscopice din
biologie sunt adesea complexe, zgomotoase, încărcate de artefacte și, prin urmare, necesită pași
intermediari de procesare a imaginii pentru extragerea informațiilor cantitative semnificative. Uneori,
combinăm segmentarea cu diferite tehnici de procesare morfologică și filtrare pentru a obține o

49
segmentare precisă și robustă a unei imagini. O sinteză a unei strategii generale pentru analiza imaginii
este prezentată mai jos:
a) Punctu l de pornire al analizei imaginil or implică, pentru î nceput, achizitia unei imagini digitale
utilizând o cameră CCD. I maginile microscopice obținute d e camere le digitale CCD sunt
supuse unor imperfecțiuni ale setării achiziției imaginilor, cum ar fi zgomotul datorat ilumină rii
neuniforme , pixeli lor defecți, etc. Adesea , trebuie să procesăm mai întâi imaginea pentru a
corecta a ceste defecte și, de asemenea, p entru a mări contrastul în scopul evidenț ierii
caracteristicile de inte res din imagine.
b) Având corectate artefactele și contrastul îmbunătățit, se pot aplica di verse tehnici de calcul
pentru a extrage caracteristicile și modelele din imagini.
c) După ce caracteristicile biologice importante din imagine au fost segmentate , se po t obț ine
informații cantitative din acestea . MATLAB oferă un set de instrumente ce poate fi utilizat
pentru a m ăsura proprietățile regiunilor.

În cadrul prezentei lucră ri au fost parcurți toți pașii enumerați mai sus. Achiziția imaginilor,
descrisă î n capitolul anterior, a fost urmată de aplicarea unor operații de filtrare , în scopul elimină rii
artefactelor.

(a1) (a2) (b1) (b2)

Fig. 3.3 – Filtrarea celulelor cu ajutorul software -ului KOALA:
(a1 și a2) celule B16F10 neporate; (b 1 și b2 ) celule B16F10 porate nefiltrate;
(a1 și b1) filtrate în spațiul Fourier (b1 și b2)

După parcurgerea acestor eta pe, am recurs la implementarea în MATLAB a unu i algoritm de
segmentare manuală a celulelor porate și neporate. Iniț ial, am pornit cu un algoritm de segmentare
automată însă, din cauza aplică rii trenu rilor de impulsuri, algoritmul înlătura o bună parte din urma
lăsată de celula. De aceea, în urma unor discuții cu o întregă echipă de profesori d e la Universitatea de
Medicină și Farmacie din București, am considerat că este mai bine să ne reorient ăm că tre un program
interactiv de segmentare manuală, întrucât acea urmă , lăsată de celulele de interes, face practic parte

50
din aceasta . În consecință , pentru a cal cula suprafața proiectată de celule , am elaborat coduri MATLAB
pentru detecț ia marginilor și a contururilor celulare (anexa 1).
Secțiunea de cod din anexa 1 conține un cod scris de mine, care perm ite segmentarea manuală a
structurilor anatomice , necesare ulterior în cadrul programelor de analiză statistică. Prin modificări
minore, acesta poate trasa atât contururi simple, necesare pentru a delimita nucleul celular, cât și
contururi multiple pentru a putea extrage, spre exemplu, structuri asemeni citoplasmei, organitelor
celulare. Cu ajutorul mouse -ului, utilizatorul poate trasa cu precizie contururile, iar odată obținute,
programul retunează automat, pentru regiunea delimitată de conturul trasat, o serie de coeficienți
precum aria, numărul de pixeli, media, abaterea standard, perimetrul și alții, coeficienți prezentați la
finalul rulării într -o fereastră separată. Aceștia sunt stocați în variabile și pot fi bineînțeles utilizați
ulterior în cadrul an alizei statistice.
Importanța existenței unui program de segmentare manuală se poate identifica și în alt tip de
situații. Ne putem imagina cazul în care am beneficia de ajutorul unor cadre medicale (exact cum s -a
întamplat și î n cazul meu) , iar acestea a r putea utiliza acest program de segmentare manuală pentru a
trasa o serie de contururi de referință, care ulterior ar constitui o bază de date de importanță majoră.
Astfel de baze de date sunt utilizate în mai toate aplicațiile de natură medicală, iar pri ntre posibilele
utilizări ale acesteia, amintim cel puțin exemplul în care baza de date ar putea fi integrată într -o
aplicație de verificare a performanțelor unui algoritm de segmentare automată.
În urma rulării programului MALTLAB , prezentat în anexa 1, se obțin ca și rezultate finale
următoarele (fig. 3. 5 pentru o celulă porată si fig. 3.7 pentru o celulă neporată) :

Fig. 3.4 – Eliberare cursor pentru trasare contur

51

Fig. 3.5 – Segmentarea manuală a unei celule B16F10, la momentul t = 4s de la aplicarea pulsului
electric

După cum se poate observa în fig. 3.6 , toate celulele B16F10 prezintă atât nucleu, evidențiat cu
roșu, cât și organite celulare, colorate cu galben. Ceea ce apare colorat cu bleu, extremitățile celulare,
reprezintă urma lăsată de celulă. Așa cum am menționat și mai sus, la determinarea coeficienților
celulari a fost luată în calcul și această urmă.

a) b)

Fig. 3.6 – Imaginea rezultată în urma segmentării: (a) tonuri de gri ; (b) color

52

Fig. 3.7 – Segmentarea manuală a unei celule neporate , la momentul t = 2 min.

Folosind profilul cantitativ de fază al celulei, fără procedura de decuplare, pot fi calculați diferiți
parametri . Aceș tia oferă informații cu privire la structura și forma celulelor [6 1], modificările
volumului celular și dinamic a masei uscate a celulei [62 ].
Aria, valoarea medie, deviaț ia standar d, perimetrul și alț i parametri au fost returnati la sfârș itul
segmentării manuale, într -o fereastră separată . Acest lucru a fost posibil prin utilizarea instrucț iunii
regionprops.

Fig. 3.8 – Parametrii returnați în urma segmentă rii

53
III.2. Obținerea coeficienților de caracterizare a celulelor

Pe baza imaginilor reconstituite din hologramele înregistrate experimental, am determinat
suprafața ariei proiectate (A) și profilul mediu al diferenței optice de fază (OPS). Pentru a calcula aria
proiectată a celulelor, am elaborat coduri MATLAB pentru de tecția marginilor celulare. Suprafața
celulei a fost calculată ca suma tuturor pixelilor din interiorul acestui contur. Dimensiunea unui pixel a
fost stabilită anterior printr -o procedură de calibrare independentă, utilizând un obiectiv micrometric.
Profil ul mediu al diferenței optice de fază s-a obținut prin însumarea valorilor de fază din interiorul
conturului celulei și, mai apoi, împărțind valorea obținută la numărul de pixeli din cadrul acestui
contur. Masa uscată (DM) a fost calculată în conformitate cu o metodă descrisă de Popescu et al. [62]
ca un element de suprafață integrat al deplasării de fază pe întreaga zonă celulară.

III.2.1. Comparație celule aflate în diferite stadii de malignitate

a) Indicele de refracție

Determinarea indicilor de refracție (RI) și a dimensiunii celulelor aderente vii aflate în cultură, a
fost posibilă folosind microscopia holografică digitală în configurație off -axis, fără a utiliza agenți de
contrast exogeni. Indicele de refracție celular ă și densitatea maselor uscate au fost comparate pentru
două sublinii ale celulelor melanomului murin B16 cu diferite potențiale metastatice. Mai mult,
folosind analiza bimodală, am identificat diferite caracteristici ale distribuției diferențelor de fază în
imaginile cantitative reconstituite, corespunzătoare celor două sublinii.
În studiul actual, am folosit subliniile celulare B16F1 și B16F10, din seria selectată de Isaac
Fidler în 1973 [63]. Existența subliniilor melanomului murin B16, diferențiate pe b aza
comportamentului metastatic, oferă un bun model in vitro pentru studierea caracteristicilor biofizice ale
celulelor maligne și a modificărilor din cursul transformării celulare. Selecția variantelor B16 s -a bazat
pe potențialul lor crescător de a forma colonii pulmonare după injecția intravenoasă la șoareci. În acest
scop, Fidler a efectuat administrarea intravenoasă a celulelor B16 urmată de subcultura tumorilor
pulmonare induse în cicluri repetitive [63]. În acest fel, comportamentul metastatic a fost diferențiat:
B16F1 are cel mai mic potențial de a forma tumori pulmonare în timp ce B16F10 este la polul opus.
În ceea ce privește proprietățile optice, am constatat că, în zona de deplasare maximă a fazei,
F10 are un RI mai mare decât F1. Zona cu difere nță de fază maximă a fost asociată, în multe lucrări, cu
zona nucleului, care este, de asemenea, regiunea de înălțime maximă a celulei. Este cunoscut faptul că
indicele de refracție este influențat de concentrația proteinelor, crescând cu 0,002 unități pen tru fiecare
procent din conținutul de proteine [64]. S -a constatat că RI este heterogen în interiorul celulei și se
presupune că regiunile cu RI înalte corespund componentelor celulare, dar RI -urile fiecărui organ sunt
încă sub studiu [65].
Există o lite ratură abundentă care investighează diferențele de RI între celulele canceroase și
cele normale. Choi și colab. (2010) au apreciat că RI este mai mare în celulele maligne, propunând RI
ca biomarker pentru diagnosticarea cancerului [66]. Utilizând microscop ia optică de coerență, ei au
reconstru it hărțile RI ale celulelor aderente vii pentru mai multe linii celulare normale și canceroase.

54
Valorile medii ale RI s -au dovedit a fi de 1,353 ± 0,008 pentru cazurile normale și 1,371 ± 0,014 pentru
celulele canceroa se. Prin utilizarea diferitelor tipuri de celule, s -a observat că această concluzie este
valabilă pentru orice tip de linie celulară deoarece RI este mai mare în celulele maligne [67 – 68].
Diferența de RI a fost atribuită acumulării mari de proteine în organele celulare (în principal în nucleu)
ca urmare a diviziunii rapide a celulelor canceroase și a ratei mai mari de proliferare. Mai mult, Bista și
colab. a u propus ca RI -ul nuclear să fie o măsură a densității nucleare de masă; au raportat valori ale R I
nucleare de peste 1,5496 care variază în timpul ciclului celular datorită variațiile conținutului de ADN
[69].
În prezent, cartografia RI cu rezoluție înaltă poate fi efectuată contribuind la evaluarea riscului
de cancer [70].

Fig. 3.9 – Indicele de refracție al celulelor B16 calculat pe o suprafață de 3 × 3 pixeli, selectată în
zona cu diferență de fază maximă

Valorile pentru RI găsite în studiul meu (1,3610 ± 0,0039 pentru B16F1 și 1,3989 ± 0,0112
pentru B16F10) [72] și evidențite pe graficul din fig. 3.9 sunt în acord cu rezultatele studiilor
menționate mai sus. Valorile mai mari ale F10 ar putea fi un potențial instrument de a discrimina nu
numai între celule normale și maligne, ci și între celule maligne cu potențial metastatic diferit.

55
b) Densitatea de masă uscată (DM)

Nr. celula DM 1 DM 2 DM 3 DM 4 DM 5
di 3.85e+12 8.45e+11 1.93e+12 4.46e+12 4.78e+12
mi 3.29e+12 8.65e+11 2.01e+12 4.26e+12 4.74e+12
md0 3.04e+12 8.54e+11 1.99e+12 3.94e+12 4.79e+12
md1 2.99e+12 8.00e+11 3.32e+12 3.67e+12 4.16e+12
md2 3.07e+12 6.99e+11 2.92e+12 3.02e+12 3.54e+12
md3 2.86e+12 6.59e+11 2.71e+12 3.14e+12 3.67e+12
md4 2.99e+12 6.74e+11 2.73e+12 3.13e+12 3.49e+12
md5 2.72e+12 6.8e+11 2.80e+12 2.87e+12 3.12e+12
md6 2.41e+12 6.44e+11 2.75e+12 2.87e+12 3.09e+12
md7 2.52e+12 6.08e+11 2.72e+12 2.94e+12 2.79e+12
md8 2.41e+12 5.76e+11 2.68e+12 2.89e+12 2.94e+12
md9 2.29e+12 6.05e+11 2.61e+12 2.72e+12 2.90e+12
md10 2.19e+12 5.95e+11 2.78e+12 2.65e+13 2.94e+12
dd 1.53e+12 5.23e+11 2.47e+12 2.56e+12 2.92e+12

Tabel 1: Tabel centralizator pentru coeficientul DM corespunzător subliniei celulare B16F10

Nr. celula DM 1 DM 2 DM 3 DM 4 DM 5 DM 6
di 7.69e+11 5.84e+11 1.30e+12 1.53e+12 5.99e+12 2.99e+13
mi 7.61e+11 6.08e+11 1.22e+12 1.05e+12 6.27e+12 2.85e+13
md0 7.15e+11 5.98e+11 1.20e+12 1.02e+12 6.57e+12 3.02e+13
md1 7.01e+11 6.06e+11 1.22e+12 1.06e+12 6.12e+12 3.27e+13
md2 7.34e+11 6.28e+11 1.15e+12 1.13e+12 6.08e+12 3.12e+13
md3 6.85e+11 5.87e+11 1.13e+12 1.11e+12 6.11e+12 2.88e+13
md4 7.15e+11 6.33e+11 1.15e+12 1.21e+12 5.22e+12 2.97e+13
md5 7.16e+11 5.99e+11 1.13e+12 1.25e+12 5.14e+12 2.66e+13
md6 7.43e+11 5.75e+11 1.01e+12 1.25e+12 4.90e+12 2.42e+13
md7 7.27e+11 6.97e+11 9.80e+11 1.19e+12 4.71e+12 2.65e+13
md8 7.21e+11 6.02e+11 8.78e+11 1.31e+12 4.31e+12 2.39e+13
md9 7.03e+11 5.56e+11 9.33e+11 1.21e+12 4.53e+12 2.50e+13
md10 6.92e+11 5.91e+11 9.23e+11 1.17e+12 4.57e+12 2.58e+13
dd 6.78e+11 5.66e+11 8.23e+11 1.12e+12 4.69e+12 2.63e+13

Tabel 2: Tabel centralizator pentru coeficientul DM corespunzător subliniei celulare B16F1

Pe baza valorilor obținute pentru DM (anexa 2), centralizate în tabelele 1 si 2, am reprezentat
grafic (fig. 3.10 ) media densitatii de masă uscată, exprimată în pg/ µm2, în functie de tipul celulei B16.

56

Fig. 3.10 – Densitatea de masă uscată a celulelor B16 folosind valoarea diferenței de fază a fiecărui
pixel înmulțită cu factorul constant
(λ = 635 nm – lungimea de undă a laserului,
α = 0,2 ml/g – creșterile refractive ale proteinelor [71]). Valoarea medie ± STDEV
a fost calculată pe cinci celule (mi) pentru fiecare subliniere

Am constatat că densitatea de masă uscată, care caracterizează conținutul de proteine al întregii
celule, este mai mare pentru F1 decât pentru celulele F10 , lucru ilustrat și în fig. 3.10 . Valorile medii
(1,4261 ± 0,0844 pg/μm2 pentru F1 și 0,8003 ± 0,1771 pg/μm2 pentru F10) sunt în concordanță cu cele
raportate în studiile în care acest parametru a fost urmărit în timpul ciclului celular [61, 73]).
Densitatea de masă uscată este corelată cu conținutul neapos al celulei, destul de similar cu
densitatea clasică. Utilizând tehnica de separare a densității în gradient, Baniyash și colab. au arătat că
în celulele tumorale B16 există populații de celule cu densități diferite [74]. Populația cu densitate mai
mică s -a dovedit a fi mai reușită în colonizarea pulmonară și a fost selectată ca F10, în timp ce
populația cu densitate mare a avut o capacitate de colonizare a plămânului mai scăzută și a fost
selectată ca F1. R ezultatul meu confirmă observația conform căreia o capacitate metastatică mai mare
este asociată cu o densitate mai mică; densitatea de masă uscată ar putea juca astfel rolul biomarkerului
timpuriu pentru potențialul metastatic celular.

57
c) Coeficientul de bimodalitate

Am căutat un alt biomarker optic pentru potența metastatică utilizând metoda coeficienților de
bimodalitate pentru a analiza parametrii QPIs.

Sublinia celulară B16F1 B16F10
Coeficientul
multimodal b min – max 0,5444 – 0,6303 0,4227 – 0,5020
medie ± STDEV 0,68522 ± 0,03134 0,46692 ± 0,03176

Fig. 3.11 – Exemple de hărți cantitative ale diferențe i de fază și histogramele asociate, corespunzătoare
pentru celulele B16F1 (A) și B16F10 (B). Sunt prezentate valorile skewness (e), kurtosis (k) și coeficientul
multimodal (b). Histogramele s -au calculat pe baza QPI -urilor reconstituite (pentru claritatea
histogramelor, sunt inserate pe abscisă un număr mai mic de puncte, însă calculele au fost efectuate
utilizând rezoluția unitară). (C) Sunt prezentate statistici ale coeficienților multimodali pentru B16F1 și
B16F10 (pentru calcule au fost utilizate cinci c elule (momentul mi) din fiecare sublinie).

Din analiza fig.3.11 putem deduce că histogramele celulelor F1 prezintă distribuții bimodale ale
deplasărilor de fază din celule, în timp ce histogramele celulelor F10 prezintă tendința de distribuție cu
un singu r vârf [72]. Deși am lucrat numai pe cinci celule aparținând fiecărei sublinii, parametrii
kurtosis și skewness (anexa 3) au fost calculați pentru toți pixelii fiecărei imagini de fază, furnizând o
cantitate fiabilă de date, potrivită pentru analiza de ord in înalt. Gradul de bimodalitate este o
caracteristică importantă a distribuției de frecvență, deoarece sugerează neregulile existente, cum ar fi
polarizarea sau două distribuții subiadiacente combinate într -una. Celulele normale prezintă distribuții
multi modale cu grupuri distincte de vârfuri dominante (vârfuri pentru nucleu și citoplasmă), în timp ce
tendința de distribuție cu vârf uni c poate fi un semn de anomalie.

58
d) Aria celulară

Nr. celula Arie 1 Arie 2 Arie 3 Arie 4 Arie 5
di 40895.75 19094.38 28808.00 43978.38 45297.50
mi 36904.50 19420.38 29381.38 42418.88 45114.25
md0 36129.75 19203.63 29060.00 40774.50 45322.63
md1 35475.00 18493.13 38065.63 40025.25 42071.13
md2 35729.25 17369.75 35655.13 36284.75 38608.88
md3 34961.13 16861.13 34382.38 36694.25 39341.50
md4 35447.50 16933.84 34185.00 36941.75 38593.38
md5 33821.31 17018.63 34935.63 35125.50 36869.00
md6 32129.25 16755.42 34334.25 35138.25 36173.75
md7 33019.88 16197.25 34264.13 35687.38 34882.00
md8 31156.63 15689.88 33949.00 35289.50 35598.50
md9 30695.50 16083.38 33656.25 34445.38 35484.25
md10 30262.00 15791.63 34827.00 32876.89 35602.00
dd 25845.50 15032.50 32771.00 33396.63 35702.35

Tabel 3: Tabel centralizator pentru aria celulară corespunzătoare subliniei celulare B16F10

Nr. celula Arie 1 Arie 2 Arie 3 Arie 4 Arie 5 Arie 6
di 18300.88 16009.25 23711.00 25849.75 50971.25 113976.88
mi 18031.38 15980.13 22868.38 21358.00 51641.00 11425.73
md0 17566.38 15983.63 22736.38 20872.88 51202.50 114201.13
md1 17396.25 16121.25 22964.13 21412.88 50870.13 119048.25
md2 17660.63 16300.00 22201.75 21918.50 51140.13 116698.13
md3 17198.13 15775.00 22274.26 21983.88 50823.13 111206.50
md4 17524.75 16463.50 22317.88 22790.25 47181.00 112593.63
md5 17430.75 16165.88 22198.50 23091.00 46856.25 107372.38
md6 17903.13 15684.38 20909.13 23290.00 45968.00 101635.63
md7 17642.38 16187.63 20481.88 22755.38 44920.63 106904.25
md8 17549.13 16052.25 19390.50 23807.88 43245.88 101672.38
md9 17506.50 15495.75 19997.38 22827.13 44081.38 103608.50
md10 17360.63 15825.00 19990.38 22531.88 44009.38 105230.81
dd 17102.88 15622.38 18774.63 21814.13 44690.24 107048.63

Tabel 4: Tabel centralizator pentru aria celulară corespunzătoare subliniei celulare B16F1

Analizând valorile ariilor proiectate, obținute pentru celulele B16F10 (tabelul 3 ) se poate
desprinde următoarea afirmație: la aplicarea primului impuls de curent continu, valoarea ariei scade cu
aproximativ 10%. Ulterior acestui puls, aria continua să -și urmeze trendul descendent într -un ritm

59
neregulat. De cealaltă parte, ariile corespunzătoare subliniei celulare B16F1 (tabelul 4) tind să -și
conserve în timp valorea.
Comparând cele două tabele, se poate concluziona asupra faptului că malignitatea are inf luență
directă asupra ariei celulare.

e) Volumul celular

Nr. celula Volum 1 Volum 2 Volum 3 Volum 4 Volum 5
di 6,09E+06 3,63E+06 5,87E+06 1,07E+07 9,14E+06
mi 6,30E+06 3,64E+06 6,04E+06 1,02E+07 8,94E+06
md0 5,68E+06 3,66E+06 6,04E+06 1,03E+07 9,03E+06
md1 5,56E+06 3,49E+06 7,05E+06 9,46E+06 8,78E+06
md2 5,73E+06 3,30E+06 6,55E+06 9,27E+06 7,97E+06
md3 5,41E+06 3,33E+06 6,65E+06 9,15E+06 8,41E+06
md4 5,76E+06 3,38E+06 6,52E+06 8,81E+06 8,14E+06
md5 5,53E+06 3,40E+06 6,58E+06 7,97E+06 7,53E+06
md6 5,37E+06 3,32E+06 6,46E+06 7,83E+06 7,45E+06
md7 5,30E+06 3,20E+06 6,56E+06 7,85E+06 6,97E+06
md8 5,55E+06 3,20E+06 6,34E+06 7,74E+06 7,21E+06
md9 5,43E+06 3,19E+06 6,34E+06 7,72E+06 7,13E+06
md10 5,24E+06 3,14E+06 6,29E+06 7,24E+06 6,97E+06
dd 4,48E+06 2,89E+06 5,66E+06 7,06E+06 7,03E+06

Tabel 5: Tabel centralizator pentru volumul celular corespunzător subliniei celulare B16F10

Nr. celula Volum 1 Volum 2 Volum 3 Volum 4 Volum 5 Volum 6
di 3,41E+06 3,21E+06 4,34E+06 5,05E+06 9,65E+06 2,26E+07
mi 3,46E+06 3,16E+06 4,34E+06 4,04E+06 9,77E+06 2,28E+07
md0 3,27E+06 3,09E+06 4,31E+06 4,06E+06 9,43E+06 2,29E+07
md1 3235089 2986860 4,30E+06 3,89E+06 9,99E+06 2,22E+07
md2 3259135 3157338 4,20E+06 4,15E+06 9,53E+06 21809503
md3 3,24E+06 2,94E+06 4,21E+06 4,34E+06 9,01E+07 2,26E+07
md4 3,32E+06 3,07E+06 4,19E+06 4,49E+06 9,32E+06 2,33E+07
md5 3,23E+06 3,05E+06 4,23E+06 4,49E+06 9,22E+06 2,16E+07
md6 3,24E+06 2,96E+06 4,05E+06 4,40E+06 9,13E+06 2,04E+07
md7 3,28E+06 3,02E+06 4,08E+06 4,29E+06 9,18E+06 2,13E+07
md8 3,20E+06 2,95E+06 3,64E+06 4,50E+06 8,74E+06 1,86E+07
md9 3,15E+06 2,73E+06 3,95E+06 4,39E+06 9,10E+06 2,05E+07
md10 3,17E+06 2,93E+06 3,79E+06 4,29E+06 9,24E+06 2,04E+06
dd 3,25E+06 3,04E+06 3,72E+06 4,31E+06 9,29E+06 2,05E+07

Tabel 6: Tabel centralizator pentru volumul celular corespunzător subliniei celulare B16F1

60
Din valorile volumului celular (anexa 4) obținute pentru sublinia celulară B16F10 (tabelul 5)
putem concluziona asupra faptului că procesul de electroporare conduce la o descreștere în timp a
volumului într -o manieră asemănătoare cu cea a ariei.
Pentru subsetul B16F1 (tabelul 6), se remarcă acealași ritm de descreștere în timp a volumului.
Deși aceste celule nu suferă modificări în timp si sunt considerate drept refe rință în raport cu subsetul
B16F10, se înregistreaz ă o modificare a valorilor în râ ndul volumului, ce -i drept nu la fel de mare ca și
în cazul celulelor electroporate.
Conform celor de mai sus, valorile obținute pentru volum nu permit desprinderea unei con cluzii
universal valabile care să permită , mai departe , diferențierea celulelor maligne.

f) Diferența de cale optică

Nr. celula OPD 1 OPD 2 OPD 3 OPD 4 OPD 5
di 99,074 154,095 143,385 160,089 152,362
mi 105,411 154,116 155,921 153,685 151,299
md0 102,563 159,29 161,449 168,257 154,141
md1 102,359 159,317 160,663 170,757 158,129
md2 102,114 161,807 164,074 183,168 158,442
md3 103,458 166,159 158,509 181,63 166,624
md4 102,285 166,202 160,227 181,514 163,065
md5 106,425 166,319 163,892 180,579 168,086
md6 110,011 167,984 167,651 175,073 157,188
md7 107,312 168,721 156,473 169,425 164,515
md8 112,85 175,516 158,398 171,601 162,493
md9 115,728 168,657 176,817 175,643 161,726
md10 112,19 166,075 175,676 175,864 157,356
dd 131,849 162,799 174,233 176,786 163,595

Tabel 7: Tabel centralizator pentru diferența de cale optică corespunzătoare subliniei celulare B16F10

Pe baza imaginilor reconstituite din hologramele înregistrate experimental, am determinat
diferența de cale optică (OPD).
Valorile OPD au fost calculate în felul următor:
– pas 1: am determinat suma tuturor valorilor de fază din interiorul conturului delimitat cu
ajutorul segmentării manuale;
– pas 2: am împărțit suma obținută la pasul 1 la numărul de pixeli din interiorul acel uiași contur .
Valorile obținute pentru subliniile celulare B16F10 și B16F1 (tabelele 7 și 8) demonstrează că
OPD crește doar pe măsura aplicării pulsurilor de tensiune continuă.

61
Nr. celula OPD 1 OPD 2 OPD 3 OPD 4 OPD 5 OPD 6
di 168,388 179,721 158,169 172,185 131,679 119,905
mi 171,561 172,618 163,642 165,167 127,771 121,428
md0 165,913 166,573 164,902 171,373 126,925 125,321
md1 167,183 159,312 164,037 158,862 130,857 115,534
md2 162,999 166,531 163,627 164,646 128,457 115,604
md3 169,983 160,874 163,772 175,009 131,661 122,761
md4 169,982 162,652 163,827 172,074 133,349 123,348
md5 163,349 165,836 166,333 168,181 132,713 122,123
md6 161,264 163,755 172,009 164,063 135,506 125,274
md7 163,368 164,919 174,936 165,785 138,586 127,165
md8 161,658 159,242 164,478 166,012 139,065 111,183
md9 161,101 152,418 175,791 168,771 137,008 119,796
md10 163,771 159,862 168,778 165,653 137,459 122,213
dd 170,412 170,441 175,835 170,758 132,716 124,099

Tabel 8: Tabel centralizator pentru diferența de cale optică corespunzătoare subliniei celulare B16F1

Astfel, OPD poate fi propus ca si biomarker util în diferențierea celulelor maligne. Alături de
acest parametrul, indicele de refracție, înalțimea celulei, aria proiectată și coeficientul de bimodalitate
reprezinta buni indicatori în aprecierea gradului de diferențiere între subliniile celulare B16F10 și,
respectiv, B16F1.

III.2.2 . Comparație celule maligne porate și neporate

Programul s oftware Origin Lab v.8.0 a fost utilizat pentru compila rea datele și evalua rea
semnificației statistice a diferențelor dintre celulele electroporate și cele de control (test non -parametric
de tip Mann -Whitney) . Reprezentările grafice din figurile 3.12 și 3.13 sunt cutii de tip "box and
whiskers", în car e cutiile includ percentile 25 -75, whiskers sunt outliers, linia orizontală mijlocie este
mediană, iar pătratul mic din cutie este media.

a) Înălțimea celulară și variația indexului de refracție

Utilizând procedura de decuplare, atât înălțimea cât și indice le de refracție al fiecărei celule au
fost calculate într -o zonă pătrată, de 3 x 3 pixeli, în regiunea de deplasare maximă a fazei, identificată
cu ajutorul codurilor MATLAB descrise în anexe. Ambii parametri au fost prezentați folosind variațiile
lor rela tive între 2 secunde, 1, 2 … 7 min după livrarea pulsului (variații denumite hAP și n AP) și
momentul premergător livrării pulsului (h BP și n BP). Înainte de eliberarea pulsului, înălțimea celulelor
variază de la 2,87 μm până la 14,61 μm, în funcție de forma celulei. Indicele mediu de refracție a fost
identificat ca fiind n BP = 1,3929 ± 0,0263. La 2 secunde după administrarea pulsului, s -a observat o

62
modificare statistică semnificativă a înălțimii celulei (înălțimea medie a celulelor electroporate a
crescut cu 33%, p = 0,014). În același interval de timp, înălțimea medie a celulelor de con trol a scăzut
cu 6,7% (fig. 3. 12 (b)) [75] .

Fig. 3.12 – Variația înălțimii celulare observată la 2 s după eliberarea pulsului (h BP – înălțimea
celulei înainte de electroporare, h AP – înălțimea celulei după electroporare). Pentru procedura de
decuplare, am folosit holograma achiziționat ă în soluția D înainte de aplicarea impulsului:
(a) exemplu de variație tipică a înălțimii celulei, calculată pe o singură celulă;
(b) variația relativă a înălțimii celulare calculată în toate experimentele

Totodată, (la 2 secunde după aplicarea pulsului), indicele de refracție a arătat o scădere
statistică semnificativă (valoarea medie a scăzut cu 1,2% în celulele electroporate (p = 0,026), iar în
cazul celulelor de control s -a înregistrat o crește re mică de doar 0,1%) (fig. 3.1 2 (b)).

Fig. 3.13 – Variația indicelui de refracție celulară la 2 secunde după livrarea pulsului (n BP –indicele de
refracție al celulei înainte de electroporare, n AP – indicele de refracție al celulei după electroporare)

63
Datorită neomogenității intrinseci a celulelor în cultură, grosimea absolută și indicii de refracție
au fost dispersați. În figurile 3. 12 (a) și 3.1 3 (a) sunt date exemple de rezultate tipice pe o singură
celulă. Pentru a evidenția efectul impulsurilor câmpului electric a plicat asupra grosimii celulare și a
indicilor de refracție, variația relativă a acestor parametri a fost com pusă (ilust rată în figurile 3. 12 (b) și
3.13 (b)). În următoarele 7 minute d upă picătură inițială (fig. 3.1 4), indicele de refracție arată o tendință
constantă de recuperare, ajungând la valoarea de control după aproximativ 4 minute. În celulele de
control, indicele de refracție a rămas aproximativ constant; creșterea ușoară care s -a observat poate fi
atribuită condițiilor în care celulele au fost ținu te în timpul experimentului [75].

Fig. 3.1 4 – Variația relativă a indicelui de refracție celulară în decurs a 7 minute de la aplicarea
impulsului. Inserția prezintă evoluția indicelui relativ de refracție în 2 secunde după porare (n BP – indicele
de refracție al celulei înainte de electroporare, n AP – indicele de refracție al celulei după electroporare)

b) Aria proiectată a celulei, profilul diferenței optice de fază și evoluția masei uscate

Prin prelucrarea imaginilor cantitative de fază, am calculat trei parametri care au legătură cu
morfologia întregii celule: suprafața ariei proiectate (A), profilul mediu al diferenței de fază (OPS) și
masa uscată (DM). Evoluția tuturor parametrilor este r eprezentată ca o variație relativă a valorilor
acestora la 2 secunde, 1, 2 … 10 min după livrarea pulsului (denumiti AAP, OPS AP și DM AP) și în
momentul aplicării pulsului (A BP, OPS BP și DM BP) ( fig. 3.1 5).

64

Fig. 3.15 – Variația relativă a proiecției celulare (a), deplasarea medie a fazei optice (c) și masa uscată (e)
după livrarea pulsului. Graficele (b), (d) și (f) prezintă acești parametri după scăderea punct elor de
control și a variației lor în timp (A BP – zona proiectată a celulei înainte de electroporare, A AP – zona
proiectată a celulei după electroporare, OPS BP – profilul mediu al diferenței optice de fază corespunzător
celulei înainte de electroporare, OPS AP – profilul mediu al diferenței optice de fază corespunzător celulei
după electroporare, DM BP – masa uscată medie a celulei înainte de electroporare,
DM AP – masa uscată medie a celulei după electroporare)

65
O scădere dependentă de timp a ariei proiectate a fost observată ca efect al aplicării impulsului
(fig. 3.1 5 (a)). La sfârșitul celor 10 minute, suprafața proiectată a celulelor porate a scăzut cu 19,5 ±
1,6%, în timp ce suprafața proiectată a controalelor a scăzut cu numai 8,4 ± 6,7%. În același interval de
timp, OPS a crescut cu 6 ± 1%, co mparativ cu o creștere a contr oalelor de 0,5 ± 0,3% (fig. 3.1 5 (c)). În
ceea ce privește masa uscată, nu s -au observat modificări evidente atunci când celulele electroporate au
fost comparate cu martorii (fig. 3.1 5 (e)). După c um se poate observa în fig. 3.15 (f), modificarea
relativă a masei uscate a fost în limitele a mai puțin de ± 4%, aflându -se asfel în limitele de sensibilit ate
ale experimentelor mele [75].
De asemenea, putem spune că celulele de control au suferit schimbări progr esive ale suprafeței
proiectate și ale profilul ui difere nței optice de fază , fiind expuse la aceleași condiții în timpul
experimentului: imersie în soluția de manitol, fără control al temperaturii si al concentrației de CO 2. Cu
toate acestea, modificările înregistrate în celu lele porate au fost mai semnificative decât cele observate
în cazul martorilor.
Prin scăderea zonei celulelor porate din cea a controalelor, în fiecare moment de timp, se poate
observa răspunsul net al celulelor la aplicarea pulsului, în ceea ce privește suprafața proiectată (fig.
3.15 (b)). Un calcul similar al OPS arată evoluția profilul ui mediu al diferenței optice de fază, cauzat de
livrarea pulsului (fig. 3.1 5 (d)).
După cum se observa în fig. 3.1 5 (b) și 3.1 5 (d), de la 3 până la 4 minute după eliberarea
pulsului, variația relativă a zonei celulare proeminente și a profilul ui mediu diferenței optice de fază a
devenit acelaș i în celulele portate și de control (apariția platourilor). Se poate concluziona că impactul
maxi m al aplicării trenului de impulsuri este prezent în primele 3 minute după aplicarea pulsului. În
intervalul 4 – 10 minute, suprafața celulelor porate și profilul mediu diferenței optice de fază se
comportă sim ilar cu cel al controalelor .

66

67

IV. Concluzii

Electroporarea celulară reprezintă una dintre cele mai promițătoare platforme biotehnologice ale
momentului, deschizând mari perspective în domeniul tratării cancerului, imunoterapiei și terapiei
genetice. Impulsurile electrice controlate sunt livrate celulelor și țesuturilor, mărind permeabilitatea
membranei celulare la diferite molecule mici, medicamente, prote ine și acizi nucleici, care, î n mod
normal, nu sunt permeabile . Modificările celulare și mole culare datorate permeabilizării membranei și
recuperării consecutive necesită totuși o mai bună înțelegere. În cadrul acestei lucrari de disertatie mi –
am propus să monitorizez proprietățile optice și geometrice a le celulelor expuse la trenurile succesive
de impulsuri electrice utilizate în electrochemoterapie.
Celulele electroporate au prezentat un comportament bifazic atât din punct de vedere al
parametrilor optici , cât și în ceea ce privește forma. Indicele de refracție (RI) s -a dovedit a fi un
parametru cu semnificație biologică ridicată, fiind legat de conținutul celular, rata divizării celulare și
permeabilitatea membranei. Metoda bazată pe DHM deschide o perspectivă mai largă în înțelegerea
modificărilor celulare și moleculare induse prin electroporar e.
Microscopia holografică digitală (DHM) este o tehnică interferometrică modernă care oferă,
după o singură expunere, fără substanțe chimice aplicate, informații despre caracteristicile optice și
geometrice ale probelor biologice transparente, fiind adecv ată pentru monitorizarea dinamicii celulelor
vii. Am folosit o configurație DHM off-axis (laser He -Ne care funcționează la o lungime de undă egală
cu 632,8 nm). Procedura de decuplare (baie de celule fie în manitol, fie în mediul de cultură celulară) a
permis calcularea RI și a înălțimii celulare, în timp ce informațiile legate de forma celulei au fost
obținute din imagini cantitative de fază, reconstituite 3D. Celulele B16F10 au fost expuse unor trenuri
de impulsuri rectangulare bipolare (1 kV/cm, 100 microsecunde, 1 kHz, electroporare c elule B16F10,
Betatech).
RI și înălțimea celulei au fost calculate într -o zonă bine definită utilizând procedura de
decuplare și parametrii globali ai celulelor ( aria suprafeței proiecției celulei (A ), profilul diferenței de
fază (OPS) și masa uscată (DM) ). Monitorizarea acestora s -a facut pe o perioada de timp egală cu 10
min.
La 2 secunde după livrarea pulsului, înălțimea celulei a crescut cu 33%, RI a scăzut cu 1,2%,
revenind la valoarea de control după aproximativ 4 min. Evoluția bifazică a proiecției celulare,
stationaritatea DM, au fost abordate prin dinamica soluțiilor pentr u membrana celulară
electropermeabilizată.
Această lucrare propune biomarkeri optici noi pentru a caracteriza potențialul metastatic celular:
analiza bimodală QPI, combinată cu calculul indicelui de refracție și a densității maselor de materie
uscat ă. Pe langă aceștia, au fost luate î n considerare și supuse spre analiză și rezultatele obținute pentru
aria proiectată, volum ul celular , coeficientul de bimodalitate ș i diferența de cale optică . Rezultatele
obținute subliniază faptul că celulele cu potențial me tastatic prezintă o histogramă unimodală, un indice
de refracție mai mare și o den sitate mai mică de masă uscată. Totodată, pe baza rezultatelor se mai

68
poate evidenția faptul ca aria proietată crește iar coeficientul OPD descrește în timp, în cazul celulel or
electroporate, comparativ cu sublinia de control.

69

70

V. Tendințe viitoare

În cadrul acestei lucră ri de cercetare , au fost testate si prezentate date pentru a ilustra principiul
abordării . Evoluțiile viitoare, precum utilizarea celule lor sincronizate și implementarea unor algoritmi
de detecție automată sunt în desfășurare. De asemenea, pe viitor t rebuie luată în considerare
posibilitatea extinderii metodei de la analiza unei singure celule la un număr mai mare de celule atașate
și chia r la țesuturi. Măsurarea schimbă rii de fază prin utilizarea unui dispozitiv portabil miniaturizat ,
bazat pe tehnica interferometrică și prelucrarea ulterioară a datelor ar putea avea potențial clinic,
contribu ind la optimizarea medicației pentru cancer.

71

72

Bibliografie

[1] A. Doyle and J. B. Griffiths (Eds), John Wiley & Sons Ltd, Cell and Tissue Culture: Laboratory
Procedures in Biotechnology , Cell Biochemistry and Function , 332, 1999
[2] Shigekawa K, Dower W .J., Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: A general approach to
the introduction of macromolecules into cells , Biotechniques , 6:742–751, 1988
[3] Tsong T .Y., Electroporation of cell membranes , Biophys J., 60:297 –306, 1991
[4] Rols M -P, Golzio M, Delteil C, Teissie J. , In vitro delivery of drugs and other molecules to cells ,
Jaroszeski MJ, Heller R, Gilbert R, editors. Methods in Molecular Medicine. Vol. 37. Totowa, NJ:
Humana Press, 83–97, 2000
[5] Rols M.P., Electropermeabilization: A physical method for the delivery of t herapeutic molecules
into cells , Biochim Biophys Acta, 1758:423 –428, 206
[6] A llegretti , J.P., W.R. P anje, Electroporation therapy for head and neck cancer including carotid
artery involvement , Laryngoscope , 111, 52 –56, 2001
[7] Okino, M., H. Mohri , Effects of a high -voltage electrical impulse and an anticancer drug on in vivo
growing tumors , Jpn. J. Cancer. Res., 78, 1319 –1321 , 1987
[8] Dzau, V.J., M.J. Mann , A. E hsan, D.P. G iese, Gene therapy and genomic strategies for
cardiovascular surgery: the emerging field of surgiomics , J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 121, 206 –216,
2001
[9] D imitrov , D.S., A.E. Sowers , Membrane electroporation – fast molecular exchange by
electroosmosis , B. B. A., 1022, 381 –392, 1990
[10] M .A., L.W., S. Bagdonas, J. Moan , The photosensitizing effect of the photoproduct of
protoporphyrin IX , J. Photochem. Photobiol. B, 60, 108 –113, 2001
[11] Rabussay , D.P., G.S. Nanda , P.M. Goldfarb , Enhancing the effective ness of drugbased cancer
therapy by electroporation (electropermeabilization) , Technol. Cancer Res. Treat., 1, 71 –82, 2002
[12] Florin Ciobanu, Mihai Radu, Mihaela Moisescu, Marius Surleac, LauraBajenaru, Eugenia Kovacs,
Eletroporation of malignant cells for enhanced uptake of therapeutic drugs , Romanian J. Biophys, Vol.
17, No. 3, 211 –217, 2007
[13] Yoonsung Bae, Quantitative Phase -Contrast Imaging using Digital Holographic Microscope ,
Department of Information and Communications, Gwangju Institute of Sci ence and Technology, 261
Cheomdan -gwagiro, Buk -gu, Gwangju 500 -712, Republic of Korea , 2009
[14] V. Micó, C. Ferreira, Z. Zalevsky and J. García, Basic principles and applications of digital
holographic microscopy , Formatex, 2010
[15] Leith EN, Upatnieks J ., Wavefront reconstruction with diffuse illumination and three -dimensional
objects , J. Opt. Soc. Am., 54: 1295 -1301 , 1964
[16] Gabor D, Goss WP., Interference microscope with total wavefront reconstruction , J. Opt. Soc.
Am., 56: 849 -856, 1966

73
[17] Kim Myung K. Kim , Principles and techniques of digital holopraphic microscopy , SPIE Reviews,
May 14, 2010
[18] Wenbo Xu, M. H. Jericho, I. A. Meinertzha gen, and H. J. Kreuzer, Digital in -line holography for
biological applications , Dalhousie University, Halifax, NS, Canada B3H 4J1, July 16, 2001
[19] Zhang T., Yamaguchi I., Three -dimensional microscopy with phase -shifting digital holography ,
Opt. Lett., 23: 1221 -1223 , 1998
[20] Iwai H, Fang -Yen C, Popescu G, Wax A, Badizadegan K, Dasari RR, Feld MS., Quantitative
phase imaging using actively stabilized phase -shifting low -coherence interferometry , Opt. Lett., 29:
2399 -2401 , 2004
[21] Reichelt S., Zappe H. , Combined Twyman -Green and Mach -Zehnder interferometer for microlens
testing , Appl . Opt., 44:5786 -5792 , 2005
[22] Wahba HH., Kreis T., Characterization of graded index optical fibers by digital holographic
interferometry , Appl. Opt., 48: 1573 -1582 , 2009
[23] Gabor, D. , A new microscopic principle , Nature, 1948, 161:777 -778
[24] Schnars, U. & Juptner, W. , Direct recording of holograms by a CCD targ et and numerical
reconstruction , Applied Optics, 33:179 -181, 1994
[25] Cuche, E.; Marqu et, P. & Depeursinge, C., Simultaneous amplitude -contrast and quantitative
phase -contrast microscopy by numerical reconstructi on of Fresnel offaxis holograms , Applied Optics,
38, 6994 –7001 , 1999
[26] Rappaz, B.; Marquet, P.; Cuche, E.; Emery, Y.; Depeursi nge, C. & Magistretti, PJ., Measurement
of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic
microscopy , Optics Express, 13: 9361 -9373 , 2005
[27] Mölder, A.; Sebesta, M.; Gustafsson, M.; Gisselsson, L.; Gjörlo ff-Wingren, A. & Al m, K. , Non-
invasive, label -free cell counting and quantitative analysis of adherent cells using digital holography ,
Journal of Microscopy, 232(2):240 -247, 2008
[28] Rappaz, B.; Barbul, A.; Emery, Y.; Korenstein, R.; Depeursinge, C.; Magistr etti, P.J. & Mar quet,
P., Comparative study of human erythrocytes by digital holographic microscopy, confocal microscop y
and impedance volume analyzer , Cytometry Part A, 73A:895 -903, 2008
[29] Mona Mihailescu, Irina A. Paun, Eugenia Vasile, Roxana C. Popescu, Alexandra V. Baluta, Diana G.
Rotaru, Digital Off -Axis Holographic Microscopy: from Cells Vizualization, to Phase Shift Values, Ending with
Physiological Parameters Evolution, Romanian Jou rnal of Physics – Volume 61, Numbers 5 -6, November 24,
2015
[30] Boyden, S. , The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear
leucocytes , The Journal of Experimental Medicine, 115:453 -466, 1962
[31] Zigm ond, S.H. & Hirsch, J. G., Leukocyte locomotion and chemotaxis: New methods for
evaluation, and demonstration, of a cell-derived chemotactic factor , The Journal of Experimental
Medicine, 137:387 -410, 1972
[32] Zicha, D.;Dunn, G. A. & Brown, A.F. , A new direct -viewing chemotaxis chamber , Journal of Cell
Science, 99(4):769 -775, 1991
[33] Gabbiani, G.; Gabbiani, F.; Heimar k, R.F. & Schwartz, S.M. , Organization of actin cytoskeleton
during early endothelial regeneration in vitro , Journal of Cell Science, 66:39 -50, 1984

74
[34] De Beck er, A.;Van Hummelen, P.; Bakkus, M.; Vande Broek, I.; De Wever, J.; De Waele, M. &
Van Riet, I. , Migration of culture -expanded human mesenchymal stem cells through bone marrow
endothelium is regulated by matrix metalloproteinase -2 and tissue i nhibitor of m etalloproteinase -3,
Heamatologica, 92:440 -449, 2007
[35] Mann, C.J.; Yu, L. & Kim, M.K. , Movies of cellular and sub -cellular motion by digital
holographic microscopy , Biomedical Engineering Online, 5:21 , 2006
[36] Dubois, F.; Yourassowsky, C.; Monnom, O.; Legros, J. -C.; Debeir, O.; Van Ham, P.; Kis s, R. &
Decaestecker, C. , Digital holographic microscopy for the three -dimensional dynamic analysis of in
vitro cancer cell migration , Journal of Biomedical Optics, 11:054032 , 2006
[37] Garcia -Sucerquia, J.; Xu, W .; Jericho, S.K.; Klages, P.; Jeri cho, M.H. & Kreuzer, H.J. , Digital in –
line holographic microscopy. Applied Optics , 45 (5):836 -850, 2006
[38] Sun, H.; Song, B.; Dong, H.; Reid, B.; Player, M.A.; Watson , J. & Zhao, M. , Visualization of fast –
moving cells in vivo using digital holographic video microscopy , Journal of Biomedical Optics,
13(1):014007 , 2008
[39] Langehanenberg, P.; Lyubomira, I.; Bernhardt, I.; Ketelhut, S.; Vollmer, A.; Georgiev, G.; von
Bally, G. & Kemper, B. , Automated three -dimensional track ing of living cells by digital holographic
microscopy , Journal of Biomedical Optics,14: 014018 , 2009
[40] Persson, J.; Mölder, A.; Petters son, S. -G. & Alm, K., Cell motility studies using d igital
holographic microscop, Microscopy, Science, Technology, Applications and Education, Mén dez-Vilas,
A. & Díaz, J., 2006
[41] Kersti Alm, Helena Cirenajwis2, Lennart Gisselsson, Anette Gjörloff Wingren, Birgit Janicke,
Anna Mölder, Stina Oredsson and Johan Persson, Digital Holography and Cell Studies, Research and
Technologies , Sweden, p. 245, 2015 , 2003
[42] G. Pucihar, T. Kotnik, D. Miklavčič, and J. Teissié, Kinetics of transmembrane transport of small
molecules into electropermeabilized cells , Biophys. J. 95(6), 2837 –2848, 2008
[43] Leith E N and Upatnieks , Reconstructed wavefronts and communication theory , J. Opt. Soc. Am.
52 1123 –30, 1962
[44] Powell R L and Stetson K A, Interferometric vibration analysis by wavefront reconstructions , J.
Opt. Soc. Am. 55 1593 –8, 1965
[45] Stetson K A and Powell R L, Interf erometric hologram evaluation and real -time vibration
analysis of diffuse objects , J. Opt. Soc. Am. 55 1694 –5, 1965
[46] Kronrod M A, Yaroslavski L P and Merzlyakov N S, Computer synthesis of transparency
holograms , Sov. Phys. –Tech. Phys. 17 329 –32, 1972
[47] Kronrod M A, Merzlyakov N S and Yaroslavski L P, Reconstruction of holograms with a
computer , Sov. Phys. –Tech. Phys. 17 333 –4, 1972
[48] Yaroslavskii L P and Merzlyakov N S, Methods of Digital Holography (New York: Consultants
Bureau), 1980
[49] Onur al L and Scott P D, Digital decoding of in -line holograms , Opt. Eng. 26 1124 –32, 1987
[50] Liu G and Scott P D, Phase retrieval and twin -image elimination for in -line Fresnel holograms , J.
Opt. Soc. Am. A 4 159 –65, 1987
[51] Onural L and Oz gen M T, Extraction of three -dimensional object -location information directly
from in -line holograms using Wigner analysis , J. Opt. Soc. Am. A 9 252 –60, 1992

75
[52] Haddad W, Cullen D, Solem J C, Longworth J M, McPherson A, Boyer K and Rhodes C K ,
Fourier -transform holographic microscope , Appl. Opt. 31 4973 –8, 1992
[53] Schnars U and Juptner W, Principles of direct holography for interferometry , FRINGE 93: Proc.
2nd Int. Workshop on Automatic Processing of Fringe Patterns ed W Juptner and W Osten (Berlin:
Akademie) pp 115 –20, 1993
[54] Schnars U, Direct phase determination in hologram interferometry with use of digitally recorded
holograms , J. Opt. Soc. Am. A 11 2011 –5, 1994 (Reprinted in: Hinsch K and Sirohi R ( ed),
Holographic Interferometry – Principles and Techni ques (SPIE Milestone Series vol 144), pp 661 –5,
1997
[55] Osten W, Baumbach T, Seebacher S and Juptner W, Remote shape control by comparative digital
holography , Proc. 4th Int. Workshop on Automatic Processing of Fringe Patterns ed W Juptner and W
Osten (Berlin: ¨ Akademie), 373 –82, 2001
[56] Kreis T, Aswendt P and Hofling R, Hologram reconstruction using a digital micromirror device ,
Opt. Eng. 40 926 –33, 2001
[57] Harriharan P, Optical Holography (Cambridge: Cambridge University Press), 1984
[58] Kreis T, Holographic Interferometry (Berlin: Akademie), 1996
[59] M. Mihailescu, M. Scarlat, A. Gheorghiu, J. Costescu, M. Kusko, I. A. Paun, and E. Scarlat,
Automated imaging, identification, and counting of similar cells from digital hologram reconstructions ,
Appl. Opt. 50(20), 3589 –3597, 2011
[60] http://www.lynceetec.com/?s=koala
[61] P. Girshovitz and N. T. Shaked, Generalized cell morphological parameters based on
interferometric phase microscopy and their a pplication to cell life cycle characterization , Biomed. Opt.
Express 3(8), 1757 –1773, 2012
[62] G. Popescu, Quantitative phase imaging of nanoscale cell structure and dynamics , Methods Cell
Biol. 90, 87 –115, 2008
[63] Fidler, I.J., Selection of successive tumour lines for metastasis , Nature: New biology, 242 (118),
148-149, 1973
[64] Barer, R., Refractometry and Interferometry of Living Cells , J. Opt. Soc. Am., 47 (6), 545 -556,
1957
[65] Liu, P.Y., Chin, L.K., Ser, W., Chen, H.F., Hsieh, C.M., Lee, C.H., Su ng, K.B., Ayi, T.C., Yap,
P.H., Liedberg, B., Wang, K., Bourouina, T., Leprince -Wang, Y., Cell refractive index for cell biology
and disease diagnosis: past, present and future , Lab Chip 16 (4), 634 -644, 2016
[66] Choi, W.J., Jeon, D.I., Ahn, S. -G., Yoon, J.-H., Kim, S., Lee, B.H., Full-field optical coherence
microscopy for identifying live cancer cells by quantitative measurement of refractive index
distribution , Optics Express 18 (22), 23285 -23295, 2010
[67] Liang, X.J., Liu, A.Q., Lim, C.S., Ayi, T.C., Yap, P.H., Determining refractive index of single
living cell using an integrated microchip , Sensors and Actuators a -Physical 133(2), 349 -354, 2007
[68] Backman, V., Wallace, M.B., Perelman, L.T., Arendt, J.T., Gurjar, R., Muller, M.G., Zhang, Q.,
Zonios, G., Kline, E., McGillican, T., Shapshay, S., Valdez, T., Badizadegan, K., Crawford, J.M.,
Fitzmaurice, M., Kabani, S., Levin, H.S., Seiler, M., Dasari, R.R., Itzkan, I., Van Dam, J., Feld, M.S.,
Detection of preinvasive cancer cells , Nature 406(6791), 35 -36 , 2000
[69] Bista, R.K., Uttam, S., Wang, P., Staton, K., Choi, S., Bakkenist, C.J., Hartman, D.J., Brand, R.E.,

76
Liu, Y., Quantification of nanoscale nuclear refractive index changes during the cell cycl e, J. Biomed.
Opt. 16 (7), 070503 -070503 -070503, 2011
[70] Sun, L.X., Zhang, Y.Q., Wang, Y.J., Zhang, C.L., Min, C.J., Yang, Y., Zhu, S.W., Yuan, X.C.,
Refractive index mapping of single cells with a graphene -based optical sensor , Sens. Actuator B –
Chem. 242, 41 -46, 2017
[71] Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best -Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R.R., Feld, M.S.,
Badizadegan, K., Optical imaging of cell mass and growth dynamics , American journal of Physiology,
Cell physiology 295(2), C538 -544, 2008
[72] Violeta L. Călin, Mona Mihăilescu, Eugen I. Scarlat, Alexandra V. Băluță , Daniel Călin, Eugenia
Kovacs, Tudor Savopol, Mihaela G. Moisescu, Evaluation of the metastatic potential of malignant cells
by image processing of digital holographic microscopy data , FEBS Open Bio, 2017
[73] Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Prasanth, S.G., Popescu, G.:
Optical measurement of cycle -dependent cell growth , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108 (32), 13124 –
13129, 2011
[74] Baniyash, M ., Netanel, T., Witz, I.P., Differences in Cell Density Associated with Differences in
Lung -colonizing Ability of B16 Melanoma Cells , Cancer research 41 (2), 433 -437, 1981
[75] Violeta L. Călin, Mona Mihăilescu, Nicolae Mihale, Alexandra V. Băluță , Eugenia Kovacs,
Tudor Savopol, Mihaela G. Moisescu, Changes in optical properties of electroporated cells as revealed
by digital holographic microscopy, Biomedical Optics Express, Vol. 8, No. 4, 2017

[url-1.1] Fibroblaști
http://www.wikiwand.com/gl/Fibroblasto ( accesat la data de 30.12.2016 )
[url-1.2] Analiza urinii
http://www.qreferat.com/referate/medicina/Analiza -urinii -examenul -de-uri458.php ( accesat la data de
30.12.2016 )
[url-1.3] Limfoame maligne
http://www.esanatos .com/boli/boli -si-tratamente/canceru l/36/limfoamele -maligne -aspecte
gen85466.php ( accesat la data de 30.12.2016 )
[url-1.4] Principiile și tehnicile microscopiei holografice digitale
http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=1305556 ( accesat la data de
04.01.2017 )
[url-1.5] Principiile și tehnicile microscopiei holografice digitale
http://photonicsforenergy.spiedigitallibrary.org/article.aspx?articleid=130 5556 ( accesat la data de
04.01.2017 )
[url-1.6] Holografia digitală in -line pentru aplicații biologice
http://www.pnas.org/content/98/20/11301.full.pdf ( accesat la data de 05.01.2017 )
[url-1.7] Biologie computatională
http://www.annaleida.com/files/Digital_Hol.pdf ( accesat la data de 08.01.2017 )
[url-1.8] Coverslip
https://www.tedpella.com/histo_html/coverslp.htm#260375 -1 (accesat la data de 20.04.2018)

77

Anexe

Anexa 1 – Segmentare

% Pregatire scriere program nou – anexa 1
clc; % Golire fereastra de comanda
clear; % Sterger e variabile
close all; % Inchidere ferestre, cu exceptia celor create cu imtool
imtool close all; % Inchidere ferestre create cu imtool
workspace; % Afisare panou corespunzator spatiului de lucru
fontSize = 16;

% Citire imagine din folder
folder = fullfile(matlabroot, 'E:\Articol\coeficienti' );
baseFileName = 'Phase_p5di.tif' ;
% Numele fisierului com plet, cu calea prefixata
fullFileName = fullfile(folder, baseFileName);
% Verificare existenta fisier
if ~exist(fullFileName, 'file')
% Fisierul nu a fost gasit -> verificare cale fisier
fullFileName = baseFileName;
if ~exist(fullFileName, 'file')
% Nu exista fisier -> atentionare utilizator
errorMessage = sprintf( 'Eroare: %s fisierul nu exista in directorul caii de
cautare.' , fullFileName);
uiwait(warndlg(errorMessage));
return;
end
end
grayImage = imread(fullFileName);
imshow(grayImage, []);
axis on;
title('Imaginea de intrare in tonuri de gri' , 'FontSize' , fontSize);
set(gcf, 'Position' , get(0, 'Screensize' ));
message = sprintf( 'Click stanga pentru a putea incepe trasarea conturului. \n
Ridicati but onul mouse -ului pentru a finaliza conturul' );
uiwait(msgbox(message));
hFH = imfreehand();
% Crearea unei imagini binare ("mask") a obiectului
binaryImage = hFH.createMask();
xy = hFH.getPosition;
% Dimensionare imagini -> utilizare subplot
subplot(2, 3, 1 );
imshow(grayImage, []);
axis on;
drawnow;
title('Imaginea de intrare in tonuri de gri' , 'FontSize' , fontSize);
% Afisare imagini binare
subplot(2, 3, 2);
imshow(binaryImage);
axis on;
title('Masca binara a regiunii' , 'FontSize' , fontSize);

78
% Etichetare imagine binara si construire centroid si centru de masa
labeledImage = bwlabel(binaryImage);
measurements = regionprops(binaryImage, grayImage, …
'area', 'Centroid' , 'WeightedCentroid' , 'Perimeter' ,'Eccentricity' );
area = measurements.Area
centroid = measurements.Centroid
centerOfMass = measurements.WeightedCentroid
perimeter = measurements.Perimeter
eccentricity=measurements.Eccentricity
% Calculare arie (in pixeli) regiune delimitate
numberOfPixels1 = sum(binaryImage(:))
% Alta metoda de calcul: con siderare pixeli fractionali
numberOfPixels2 = bwarea(binaryImage)
% Obtinere coordonate regiune delimitata
structBoundaries = bwboundaries(binaryImage);
xy=structBoundaries{1}; % Construire matrice n x 2 (formata din coordonatele x,y)
x = xy(:, 2); % Coloane
y = xy(:, 1); % Randuri
subplot(2, 3, 1); % Afisare peste imaginea de intrare -> suprapunere
hold on;
plot(x, y, 'LineWidth' , 2);
drawnow;
% Masca = true -> setare linie la 255
burnedImage = grayImage;
burnedImage(binaryImage) = 255;
% Afisare i magine cu masca "burned in."
subplot(2, 3, 3);
imshow(burnedImage);
axis on;
caption = sprintf( 'Imagine cu masca interioara' );
title(caption, 'FontSize' , fontSize);
% Mascare imagine si afisare
% Pastrare imagine din interiorul mastii -> zero in afara mastii
blackMaskedImage = grayImage;
blackMaskedImage(~binaryImage) = 0;
subplot(2, 3, 4);
imshow(blackMaskedImage);
axis on;
title('Masca exterioara regiunii' , 'FontSize' , fontSize);

% Calcul valoare medie (mean)
meanGL = mean(blackMaskedImage(binaryImage));

% Calcul deviatie standard (std2)
stdGL = std2(blackMaskedImage(binaryImage));

% Marcare centroid si centru de masa('r+')
hold on;
plot(centroid(1), centroid(2), 'r+', 'MarkerSize' , 30, 'LineWidth' , 2);
plot(centerO fMass(1), centerOfMass(2), 'g+', 'MarkerSize' , 20, 'LineWidth' , 2);
% Innegrire interior regiune
insideMasked = grayImage;
insideMasked(binaryImage) = 0;
subplot(2, 3, 5);
imshow(insideMasked);
axis on;
title('Masca din interiorul regiunii' , 'FontSize' , fontSize);

79
% Decupare imagine
leftColumn = min(x);
rightColumn = max(x);
topLine = min(y);
bottomLine = max(y);
width = rightColumn – leftColumn + 1;
height = bottomLine – topLine + 1;
croppedImage = imcrop(blackMaskedImage, [leftColumn, topLine, width, height]);
% Afisare imagine decupata
subplot(2, 3, 6);
imshow(croppedImage);
axis on;
title('Imagine decupata' , 'FontSize' , fontSize);

% Afisare centroid si centru de masa('r+')
hold on;
plot(centroid(1) -leftColumn, centroid(2) -topLine, 'r+', 'MarkerSize ', 30,
'LineWidth' , 2);
plot(centerOfMass(1) -leftColumn, centerOfMass(2) -topLine, 'g+', 'MarkerSize' , 20,
'LineWidth' , 2);

% Centralizare rezultate
message = sprintf( 'Mean value within drawn area = %.3f \nStandard deviation =
%.3f\nNumber of pixels = %d \nArea in pixels = %.2f \nPerimeter = %.2f \n Eccentricity
= %.2f\nCentroid at (x,y) = (%.1f, %.1f) \nCenter of Mass at (x,y) = (%.1f, %.1f) \n
Red crosshairs at centroid. \nGreen crosshairs at center of mass.' , …
meanGL, stdGL, numberOfPixels1, numberOfPixels2 , perimeter,eccentricity,
centroid(1), centroid(2), centerOfMass(1), centerOfMass(2));
msgbox(message);

80

81
Anexa 2 – Histograma și densitatea de masă uscată

% Histograma_1
a=imread( '1_1.tif' );
a=a(:,:,1);
N=imhist(a); % obtinere histograma (cu tot cu nivelul de negru)
Val=N(2:256,1); % srocarea valoriloe din imagine, exceptand negrul
% stem(1:1:255,Val) %refacerea histogramei fara nivelul de negru

% Densitatea de masa uscata
medie=150.217;
lambda=663;
alpha=0.0018;
arie=54156.00;
intermediar= (10*lambda)/(2*pi*alpha);
dry_mass=intermediar*medie*arie

% Histograma_2
a=rgb2gray(a);
a=imread( '1_1.tif' );
a=a(:,:,1);
[l,c]=size(a);
b=zeros(size(a));
b=uint8(b);
for i=1:1:l
for j=1:1:c
if (a(i,j)==0)
t=0;
else
t=a(i,j);
end
b(t)=b(t)+1;
end
end

% Rolul for -ului de mai sus este de a extrage celula din imagine, de a nu lua in
% considerare si fundalul negru ce are ca si index idx=0
figure
subplot(1,2,1);
imshow(uint8(a));
title('Imaginea originala' );
subplot(1,2,2);
h1=bar(a);
title('Histograma asociata imaginii' );
dlmwrite( 'phase_p1di.txt' ,a, ' ');
figure
h2=bar(b,10);
title('Histograma celula normala' );

%Extragere imagini si copiere in .txt
a=imread( '1_1.tif' );
a=a(:,:,1);
dlmwrite( 'valori_18mart1_2_di.txt' ,a, ' ');

82

83
Anexa 3 – Skewness si kurtosis

% Pregatire scriere program nou – anexa 2
clc; % Golire fereastra de comanda
clear all; % Inchidere ferestre

%Citire imagine
im_aux=imread( '1_1','tif'); % % 1_1.tif=croppedImage (imaginea decupata rezultata
in urma rularii codului existent in anexa 1)
[L,C]=size(im_aux(:,:,1));

% Inalturarea liniei de 255 corespunzatoare fazei maxime
C=C-1;
PhaseIM=im_aux(:,1:C,1);
figure, imshow(PhaseIM),colormap(jet)

%*****************************************************
% Se introduce valoare din tabel pentru O PD corespunzatoare fiecarei celule in
parte
OPDc=150.217;
%*****************************************************

%Calcul valoare sigma
sig=0;
inc1=0;
for i=1:1:L
for j=1:1:C
if (PhaseIM(i,j)~=0) % Se tine cont de faptul ca in afara celulei a vem
valoarea 0
sig=sig+(double(PhaseIM(i,j)) -OPDc)^2;
inc1=inc1+1;
end
end
end
sig_phi=sig/inc1

% Calcul valoare skewness
skew=0;
for i=1:1:L
for j=1:1:C
if (PhaseIM(i,j)~=0)
skew=skew+(((double(PhaseIM(i,j)) -OPDc)^3)/(sig_phi^3));
end
end
end

skew_phi=skew

% Calcul valoare kurtosis
kurt=0;
for i=1:1:L
for j=1:1:C
if (PhaseIM(i,j)~=0)
kurt=kurt+(((double(PhaseIM(i,j)) -OPDc)^4)/(s ig_phi^4));
end
end

84
end

kurt_phi=kurt

85
Anexa 4 – Volum

% Citire imagine
a=imread( '1_1.tif' ); % 1_1.tif=croppedImage (imaginea decupata rezultata in urma
rularii codului existent in anexa 1)
a(:,:,1)=[];
% Convertire spatiu de culoare RGB -> Gray
a=rgb2gray(a);
% Linia corespunzatoare fazei maxime
b=a(54,:);

figure
subplot(221),image(a), colormap(gray(256));
subplot(222),plot(b);xlabel( 'Distanta[micrometrii]' ); ylabel( 'Diferenta de faza
[grade]');
b=double(b);

% Calcul kurtosis
m4=kurtosis(b)
% Calcul skewness
m3=skewness(b)
% Calcul volum
volum=trapz(trapz(double(a)))