Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina [603992]

UNIVERSITATEA „BABEȘ -BOLYAI” CLUJ -NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biologie Medicală

LUCRARE DE DIZ ERTAȚIE

Conducător științific:
Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina

Absolvent: [anonimizat] 2017

1

UNIVERSITATEA ,, BABEȘ -BOLYAI’’ CLUJ -NAPOCA
Facultatea de Biologie și Geologie
Specializarea Biologie Medicală

MODIFICĂRILE POST -SINTETICE ALE
PROTEINELOR, ȚINTĂ ÎN TERAPIA
ANTICANCEROASĂ

Conducător științific:
Șef lucr. dr. SESĂRMAN Viorica Alina
Absolvent: [anonimizat] 2017

2
CUPRINS
LISTĂ ABREVIERI ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 4
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 8
1. PROTEINELE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 9
1.1. Definiție și funcții ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 9
1.2. Asocierea cu cancerul ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……….. 9
2. MODIFICĂRILE POST -SINTETICE ALE PROTEINE LOR ………………………….. …………. 14
2.1. Modificări necovalente în cancer ………………………….. ………………………….. ………………….. 14
2.1.1. Plierea proteinelor ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………….. 14
2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. ………………………. 16
2.2. Modificări covalente în cancer ………………………….. ………………………….. ……………………… 16
2.2.1. Acetilarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 17
2.2.1.1. Proteine acetilate ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 17
2.2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 17
2.2.2. Fosforilarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 21
2.2.2.1. Proteine fosforilate ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 21
2.2.2.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 23
2.2.3. Glicozilarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………….. 25
2.2.3.1. Proteine glicozilate ………………………….. ………………………….. ………………………….. .. 25
2.2.3.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 28
2.2.4. Metilarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………… 30
2.2.4.1. Proteine metilate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 30
2.2.4.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 32
2.2.5. Nitrarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………….. 34
2.2.5.1. Proteine nitrate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 34
2.2.5.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 36
2.2.6. Ubiquitinarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 40
2.2.6.1. Proteine ubiquitinate ………………………….. ………………………….. …………………………. 40
2.2.6.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. …………………… 43
2.2.7. Lipidarea ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………….. 46
2.2.7.1. Proteine lipidate ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 46
2.2.7.2. Țintire în terapia anticanceroasă ………………………….. ………………………….. …………. 47
3. METODE DE ANALIZĂ ȘI IDENTIFICARE A MODI FICĂRILOR POST -SINTE TICE A
PROTEINELOR ÎN CANCE R ………………………….. ………………………….. ………………………….. ….. 50

3
3.1. Spectrometria de masă ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 50
3.1.1. Principiu ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 50
3.1.2. Modificări post -sintetice identificate ………………………….. ………………………….. ………. 51
3.2. Imunohistochimia ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………… 53
3.2.1. Principiu ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 53
3.2.2. Modificări post -sintetice identificate ………………………….. ………………………….. ………. 53
3.3 Tehnologia microarray ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 54
3.3.1. Principiu ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………. 54
3.3.2. Modificări post -sintetice identificate ………………………….. ………………………….. …………… 55
3.4. Analiza SILAC ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 56
3.4.1. Principiu ………………………….. ………………………….. ………………………….. …………………. 56
3.4.2. Modificări post -sintetice identificate ………………………….. ………………………….. ………. 56
CONCLUZII ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. . 58
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 59

4
LISTĂ ABREVIERI

 5-FU- 5- fluorouacil
 ADNMTS -ADN metiltransferaze
 ALK – kinaza limfomului anaplazic
 As-arsen
 ATO – trioxid de arsen
 ATP -adenozin trifosfat
 B100 – apoliproteina B100
 BARD1 – (Breast Cancer 1 associated Ring domain)
 Bcl2 – celula B limfoidă
 BCR -ABL – proteina de fuziune (BCR – breakpoint cluster region; ABL -Abelson)
 BRCA – oncogena pentru cancerul de sân
 CA- (antigen cancer) – antigen în cancer
 Carf- carfilzomib
 CD44 -molecula de adeziune CD44
 CDK – kinaza cic lin dependentă
 c-Myc- oncogena Myc
 CoA -coenzima A
 Co-cobalt
 COX2 – ciclooxigenaza 2
 Domeniu HECT – (Homology to E6AP carboxy terminus) – domeniu proteic din ubiquitin
ligaze
 Domeniu RING -(Really Interesting New Gene) – domeniu proteic ce conține zinc
 Dox- doxo rubicină
 DUB – enzime de dezubiquitinare
 E1- enzime de activare
 E2- enzime de conjugare
 E3- enzime de legare (ligaze)
 ECM – matricea extracelulară
 EGF – factorul de creștere epidermal
 EGFR -receptorul pentru factorul de creștere epidermal
 ELISA – analiză imunoenzimatică
 eNOS – sintetaza oxidului nitric (forma endotelială)

5
 Epi-ML- liganzi epigenetici multipli
 FDA – (Food and Drug Administration )- agenție responsabilă cu reglementarea alimentației
(umană și animală), a suplimentelor dietetice, medicamentelor (umane și animale),
cosmeticelor, dispozitivelor medicale (umane și animale) și a dispozitivelor care
emit radiații (sunt incluse dispozitivele non -medicale), biologice, și a produselor pentru sânge
 FGFR – receptorul pentru f actorul de creștere al fibroblastelor
 GALNACT – glicotransferaze
 GDP – guanozin difosfat
 GrB2 – proteină adaptoare
 GTP – guanozin trifosfat
 HA- acid hialuronic
 HAT -histon acetilaze
 HDAC – histon deacetilaze
 HDACI – inhibitori ai histon deacetilazelor
 Hdm2 – (human double minute 2) – protein ligază
 HER2 – receptorul epidermal 2
 HIF- factorul inductibil al hipoxiei
 HMG -CoA – hidroxi metilglutaril coenzima A
 HPV – virusul papilloma uman
 Hsp- proteine de șoc termic
 IAP- inhibitori ai proteinelor implicate în apoptoză
 ID1- proteină inhibitoare ce se leagă de ADN
 IHC- imunohistochimia
 IL-10- interleukina 10
 iNOS – sintetaza oxidului nitric (forma inductibilă)
 IR- receptorul pentru insulină
 ITK- inhibitori ai tirozin kinazelor
 KAT – lizin acetiltransferaze
 K-lizină
 KMT – lizin metiltransferaze
 Lip- lipozom
 LMC – leucemia mieloidă acută
 MALDI – ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice

6
 MAPK/ERK – protein kinaza activată de mitog en
 Mdm2 – (murine double minute 2) – protein ligază
 MMP -metaloproteine de matrice
 MS- spectrometria de masă
 MUC – mucine
 NADPH – nicotinamid adenin dinucleotid fosfat
 NFkb – factorul nuclear kapa B
 Ni-nichel
 NK- natural killer (celule ucigașe naturale)
 nNOs – sintetaza oxidului nitric (forma neuronală)
 NO- oxid nitric
 NOS – sintetazele oxidului nitric
 NOX -oxizi de azot
 NP- nanoparticule
 NRTK -non-receptori tirozin kinazici
 NSCLC – cancer pulmonar fără celule mici
 p21-proteina 21
 p300 -proteina 300
 p53-proteina 53
 PAT – protein aciltransferaza
 pCAF – factorul coactivator transcripțional asociat cu p53
 PDGF – factorul de creștere derivat plachetar
 PDGFR – receptorul pentru factorul de creștere derivat plachetar
 PEG – poli-etilen glicol
 PI3K – fosfoinozitol 3 kinaza
 PK- protein kinaza
 PKC -protein kinaza C
 PKD – protein kinaza D
 PLGA – acid poli lactic și glicolic
 PMT – protein metiltransferaze
 PPSu – poli- propilen succinat
 PRMT – arginin metiltransferaze
 PTK – protein tirozin kinaze

7
 Rb- proteina pentru retinoblastom
 RNS – specii recative de azot
 ROS – specii reactive de oxigen
 RTK – receptori tirozin kinazici
 SAHA – acidul hidroxamic suberoilanilid
 SAM – S-adenozil metionină
 SDS-PAGE – Electroforeză pe gel de poliacrilamid cu dodecil disulfat
 SILAC – marcarea stabilă a izotopilor cu ami noacizi în culturi de celule
 SOS- (son of seveless)
 Src- proto -oncogena pentru sarcom
 TFC- factorul complex de transcriere
 TGFα și β – factorul de transformare și creștere alfa și beta
 TNFα – factorul de necroză tumorală alfa
 TSA – Trichostatin A
 UB-ubiquitină
 UV- radiații ultraviolete
 VA-acid valproic
 VEGF – factorul de creștere endoteliului vascular
 VEGFR – receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular
 VHL – von Hippel -Lindau

8
INTRODUCERE

Cancerul reprezintă una dintre cele mai necruțătoare boli din întreaga lume. În ultimii ani ,
s-au facut mari eforturi pentru a putea înțelege cancerul, cum se declanșează acesta la nivel
molecular, dar și în dezvoltarea de metode eficiente de țintire anticanceroasă.
Lucrarea are ca scop trecer ea în revistă a principal elor aspecte legate de modificările post –
sintetice la care sunt supuse proteinele precum ș i abordările terapeutice care vizează inhibarea
modificărilor aberante în diferite tipuri de cancere.
Lucrarea de față este organizată în t rei capitole după cum urmează:
Capitolul întâi , intitulat ,, Proteine ” și conține o scurtă prezentare generală a proteinelor,
a funcțiilor acestora, precum și a implicațiilor în apariția cancerului.
Al doilea capitol , intitulat ,,Modificările post-sintetice ale proteinelor ” conține o
clasificare a tipurilor de modificări post -sintetice întâlnite la proteine (necovalente, covalente),
după care se abordează strict modificările post -sintetice covalente ale proteinelor ( fosforilarea,
acetilarea, glicozilarea , metilarea, nitrarea, ubi quitinarea, respectiv lipidarea ) unde este prezentată
natura dinamică a proceselor de semnalizare pe care celulele le manifestă în timpul transformării
lor pentru a deveni celule canceroase (neoplazice). De asemenea, sunt exemplific ate tipurile de
cancer în care apare modificarea respectivă, dar și metodele de țintire în terapia anticanceroasă.
În cel de -al treilea capitol sunt prez entate câteva metode proteomice de detecție a
modificărilor post -sintetice ale proteinelor în cancer.

9
1. PROTEINELE

1.1. Definiție și funcții
Proteinele sunt cele mai instabile macromolecule din sistemele vii și sunt constituite dintr -un set
de 20 de aminoacizi diferiți, legați prin le gături peptidice. Acestea îndeplinesc funcții esențiale în
ceea ce privesc toate pr ocesele biologice: f uncționează ca și catalizatori, sunt implicate în
transportul și stocarea altor molecule precum oxigenul, conferă protecție imună și suport mecanic,
transmit semnale în diferite celule, țesu turi și organe pentru a coordon a procesele biologice. [Berg
și colab., 2002 ]

1.2. Asocierea cu cancerul
Cancerul este o boală asociată cu modificări ale exprimării genelor (supraexprimări,
pierderi ale exprimării) care duc la formarea de proteine anormale, care au capacitatea de a
determina ca celulele s ă se înmulțească necontrolat, să devină canceroase și să formeze tumori .
Dezvoltarea celulelor canceroase este determinată de modificări în genele implicate în
proliferarea celulară, apoptoza etc. Este esențial păstrarea echilibrului în ceea ce privește controlul
diviziunii celulare, pentru o bună funcție a țesutului normal, însă cancerul este asociat cu pierderea
controlului ciclului celular și a instabilității gen etice.
În procesele asociate dezvoltării tumorale, sunt implicate multe gene și molecule, ca genele
supresoare de tumori, diferite proteine, care sunt implicate în procese celulare ( Tabel 1 ) ca
expresia genică, repararea ADN, transducția semnalului, metabolismul celular etc., și funcționează
anormal și datorită unor modificări post -sintetice, care se manifestă fie prin supraexprimare, fie
prin supraactivare (enzime implicate în căile de sem nalizare a unor oncogene).

Evenimente celulare Proteine implicate
expresia genelor p53, BRCA1, c -MYC
transducția semnalului PK, EGFR, RAS, ER, CD44
interacțiuni proteine -proteine c-MYC, RAS, CDK4
metabolismul celular p53, c -MYC, RAS
distribuția și localizarea proteinelor CD44, UBE2N, DUB
repararea ADN p53, BRCA1, PMT,
interacțiuni celulă -celulă MUC, CD44
comunicarea între mediul celular intern și cel
extern MUC, nitrotirozina, CD44

10
translocarea proteinelor BCR -ABL, c -MYC
Tabel 1. Proteine implicate în procesele celulare ce suferă modificări post -sintetice
și sunt asociate cu dezvoltarea cancerului

De exemplu, proteinele p53, BRCA1, c -Myc, prin supraexprimări/activări sunt implicate
în promovarea invaziei celulelor tumorale și metastază. Pr oteinele RAS, prin funcția lor de a regla
interacțiuni proteine -proteine, dacă sunt supraexprimate/activate contribuie la proliferarea
celulară, creșterea tumorală. Receptorii EGFR, ER, TGFR, VEGFR, care sunt implicați în reglarea
semnalizării celulare, pr in supraexprimări contribuie la proliferarea celuleor canceroase, ce duce
la invazia și migrarea celulelor tumorale; VEGFR, iNOS, prin supraexprimări stimulează formarea
de noi vase de sânge (angiogeneza), și contribuie la migrarea celulelor canceroase și metastazare.
De asemenea, nitrotirozina, mucinele, enzimele de conjugare E2, ligaza Mdm2, implicate în
comunicarea între mediul celular intern și cel extern sau în interacțiunile celulă -celulă, prin
supraexprimări/activare sunt asociate în inflamație, și contribuie la migrarea celulelor tumorale
spre alte compartimente celulare. Molecula CD44 este asociată cu reglarea comunicării celulare
prin reglarea semnalului receptorului factorului de creștere epidermal uman (HER), iar ca receptor
de adeziune pentru a cidul hialuronic, contribuie prin degradarea HA, la migrarea celulelor
tumorale, invazie și metastazare.
Unul dintre factorii implicați în dezvoltarea tumorilor este inflamația cronică. Aceasta
apare ca urmare a unor deteriorări la nivelul țesutului prin p roliferarea celulară indusă dar și de
repararea țesutului. Micromediul inflamației este compus din celule tumorale proliferative, vase
de sânge, celule inflamatorii și alte celule asociate cu acestea.
Celulele sistemului imun asociate cu tumorile sunt ac elea implic ate în imunitatea adaptativă, ca
limfocitele T, celulele dendritice, dar și cele implicate în imunitatea înnăscută, cum sunt
macrofagele, leucocitele, celulele NK(natural killer), fiindcă acționează ca promotori ai tumorilor .
Macrofagele au rolul de a inhiba funcțiile limfocitelor prin faptul că acestea eliberează citokine
inhibitoare ca IL -10, prostaglandine, iar împreună cu acestea, generează specii reactive de oxigen
în scopul combaterii infecției/inflamației. [Cooper 2000; Lu și colab., 2 006; Nahoum 2006 ]
Stresul oxidativ reprezintă un dezechilibru în ceea privește producerea de specii reactive
de oxigen și alți metaboliți, care afectează celulele și anumiți compuși din organism, prin
modificări ale structurii și funcțiilor celulare. Ac esta este asociat cu inițierea și dezvoltarea
cancerului prin mutațiile ce afectează ADN , proteine , prin modificări post -sintetice , fosfolipide,
ce duc la transformarea celulelor în celule neoplazice , prin faptul că ROS promovează proliferarea
celulară, an giogeneza, metastaza . Speciile reactive de oxigen sunt generate fie din mediul extern
(radiații UV, substanțe chimice, inflamații etc.) fie din mediul intern, celular, din produșii lanțului

11
respirator ca enzimele NOX ale oxidazei NADPH din membrana plasmatică, mieloperoxidazele
din fagocite.
Speciile reactive de oxigen acționează direct sau indirect asupra ADN prin mutații genetice
la nivelul genelelor supresoare tumorale țintă, de ex. p53 și genele implicate în ciclu l celular, prin
modificări ale exprimării genelelor și a legării ADN de factorii de transcriere ale căilor de
semnalizare celulare . [Sager 1997; Cooper 2000 ; Halliwell 2007; Bedard și Krause 2007; Reuter
și colab., 2010; Sosa și colab., 2012 ]
Pe măsură c e celulele can ceroase se divid necontrolat, tumoa rea necesită formarea de noi
vase de sânge (angiogeneza), datorită nevoii de oxigen și nutrienți, dar și pentru a putea eliminia
compușii care nu mai sunt folositori (,,deșeuri ’’). Procesul de angiogeneză are loc atunci când
țesutul este lezat și este deprivat de oxigen, astfel se declanșează hipoxia, iar celulele trebuie să
activeze răspunsul la stresul generat de hipoxie. Acest răspuns este activat la nivel celular prin
factorul de transcriere HIF, care a re funcția de a reduce efectele cauzate de hipoxie la nivel celular.
Pe urmă, celulele endoteliale sunt activate de factorii angiogenenici ca VEGF ,TGFα și β (factorul
de transformare și creștere alfa și beta ), PDGF (factorul de creștere derivat plachetar), TNFα
(factorul de necroză tumorală alfa ) etc. , prin faptul că aceștia transmit semnale celulelor
endoteliale să migreze , să se dividă ș i să formeze noi vase de sânge. ( Fig. 1 )

Figura 1. Procesul de formare a vaselor noi de sânge (angiogeneza)
mct.aacrjournals.org

12
Prin formarea vaselor noi de sânge, celulele canceroase pot astfel să migreze, să invadeze
țesuturile din apropiere prin pătrunderea în sistemul lor circulator, proces numit metastază, prin
care se pot divide noi celule canceroase, pen tru a forma o nouă tumoră (tumoră secundară). ( Fig.
2). Această migrare a celulelor canceroase se datorează mutațiilor genelor ce controlează
proteinele care leagă în mod normal celulele din țesuturile din apropiere, dar și dereglarea
enzimatică contribuie la acest lucru, prin faptul că, conexiunile dintre celule și țesuturi se
degradează.

Figura 2. Migrarea celulelor tumorale și formarea metastazelor
www.app64bits.com

Migrarea și invazia celulelor canceroase pot fi diferite, în funcție de tipul tumorii și de
modificările la nivel celular în celulele tumorale, și implică reorganizarea structurilor de adeziune ,
care leagă celulele la ECM ( matricea extracelulară). Structurile de adeziune ce influențează
migrația celulelor canceroase sunt cadherinele, impli cate în legarea celulară și sunt dependente de
calciu, selectinele, ce se găsesc în celulele sanguine și în celulele endoteliale și sunt implicate în
adeziunea leucocitară în timpul răspunsului inf lamatoriu în cazul unor leziuni , integrine le, asociate
mai ales în metastază, datorită funcției lor de a media interacțiunile dintre celule și matricea
extracelulară.

13
Celulele stromale au un rol important în dezvoltarea cancerului, deoarece conțin multe proteine,
care acționează asupra celulelor tumorale, favoriz ând astfel creșterea și dezvoltarea tumorilor.
Foarte importante în invazie și migrare s unt metaloproteinele de matrice (MMP), o familie de
endopeptidaze dependente de zinc, care au rolul de a degrada proteine și alte molecule de adeziune
celulară în matricea extracelulară , prin îndepărtarea membranei bazale și a matricei stromale, care
duce implicit la degradarea interacțiunilor dintre celule și matricea extrcelulară. Supraexprimarea
lor este influențată atât de celulele canceroase, prin secreția de interleukine, factori de creștere ca
IGF, EGFR, TGF, cât și de celulele stromale ; acest lucru contribuind la proliferarea celulelor
canceroase ș i implicit în invazia tumorală în diferite tipuri de cancere, ca și cancerul de colon,
carcinom ul gastric, cancerul de plămâni, cancerul esofagian etc.
Astfel, dacă matricea celulară este afectată, structurile de adeziune pot influența răspunsul
migrației. [Nishida și colab., 2006; Prager și Poettler 2012; Pezzella și colab., 2015; Martin și
colab., 2013 ; Duffy și colab., 2000 ; Kessenbrock și colab., 2010 ]

.

14
2. MODIFICĂRILE POST -SINTETICE ALE PROTEINELOR

Proteomul uman este complex și ca urmare acți unii unor stimuli , acesta suferă modifică ri,
iar modificările post-sintetice , ce au loc la unul sau mai mulți aminoacizi dintr -o proteină după ce
proteina a fost tradusă de ribozom, sunt necesare pentru a reglementa activitatea celulară . Aceste
modificări post-sintetice modifică structura și funcția proteinelor prin adiția de grup ări funcționale,
interacțiunea cu alte molecule/proteine, diviziunea celulară și sunt frecvent mediate de activitatea
unor enzime precum kinaze, fosfataze, transferaze, ligaze . [Karve și Cheema 2011; Duan și
Walther 2015 ]
Modificările post -sintetice ce ap ar la protein e se clasifică în modificări necovalente (ce
afectează structura lor prin procesul de pliere, adăugarea de cofact ori ) și modificări covalente care
includ, fosforilarea, acetilarea, glicozilarea , metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, lipidarea.

2.1. Modificări necovalente în cancer

2.1.1. Plierea proteinelor
Un proces la fel de important care trebuie întreprins pen tru menținerea funcției proteinelor,
este plierea acestora într-o conformație tridimensională . Deși plierea și replierea proteinelor au un
rol esențial în ceea ce privește funcția proteinelor, modificarea aminoacizilor contribuie în mod
semnificativ la diversitatea și funcția proteinelor.
În mediul celular, proteinele care sunt nou sintetizate prez intă un risc mare d e pliere și de agregare
greșită , ce pot duce la formarea unor specii cu potențial toxic. În scopul de a preveni sau de a
reduce aceste ,,efecte” negative, celulele prezintă o rețea de șaperoane , care facilitează procesul de
pliere a prot einelor (Fig. 3 ).
Șaperoanele , mai sunt denumite proteine de șoc termic (HSPs) sau proteine de stres ;
concentrația lor crește în condiții de stres , indus de temperaturile ridicate și acționează ca niște
catalizatori prin faptul că asistă la procesul de asamblare a proteinelor, însă nu fac parte din acel
complex asa mblat. Șaperoanele funcționează prin legarea și stabilizarea polipeptidelor nepliate
sau parțial pliate, împiedicând astfel agregarea incorectă, permițând astfel lanțului polipeptidic să
se plieze în conformația sa corectă. Șaperoanele stabilizează de asemenea, lanțurile polipeptidice
nepliate în timpul transportului lor în organitele celulare, de exemplu, în timpul transferului
proteinelor în mitoc ondriile din citosol (Fig. 4 ).

15
Proteinele sunt transportate prin membrana mitocondrială în conformații parțial pliate, care mai
apoi sunt stabilizate de șaperoanele din citosol. Pe urmă, șaperoanele din mitocondrie facilitează
transferul lanțului polipeptidic pe membrană, după care are loc plierea în organit. [Cooper 2000]

Figura 3 . Plierea proteinei cu șaperoane
www.news.berkeley.edu

Figura 4 . Transportul lanțurilor polipeptidice în mitocondrie
www.ncbi.nlm.nih.gov

Dintre proteinele de șoc termic, cele din familia Hsp27, Hsp40, Hsp60 și Hsp90 au fost
identificate ca urmare a implicării lo r în diferite tipuri de cancer ( cancerul de sân, cancerul ovarian
osteosarcomul, cancerul endometrial, leucemia, adenocarcinom pulmonar, cancerul de piele,

16
cancerul de colo n, gliomul, carcinomul hepatocelular, leucemia mieloidă acută, limfom Hodgkin,
carcinoame esofagiene cu celule scuamoase ). Aceste proteine sunt fosforilate de kinaze (MAPK,
PKD, PKC) ca răspuns la stresul oxidativ, la citokinele inflamatorii, dar și la diferiți factori ca și
factorul de necroză tumorală α (TNF – α), factorul de transformare și creștere (TGF – β). Proteinele
de șoc termic sunt implicate în funcțiile celulare esențiale care promovează creșterea celulară,
prolife rarea celulelor tumorale , procese care de asemenea su nt implicate în dezvoltarea cancerului.
[Ciocca și Calderwood 2005 ; Jego și colab., 2013, Zoubeidi și Gleave 2012; Mitra și colab., 2009;
Capello și colab., 2008; Murphy 2013 ]

2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Inhibitorul proteasomului, Velcade (PS -341), utilizat în tratamentul de mielomu multiplu,
induce apoptoza , pentru a inhiba țintit Hsp27.
Compuși precum gelda namicina, radicicol, curcuminul, au arătat faptul că că inhibă invazia
celulelor canceroase și metastaze le prin reglarea expresiei Hsp40.
Prin utilizarea de flavonide, au fost redus e nivelurile ridicate de Hsp60 în celulele tumoral e unor
anumite tipuri de cancer ca și leucemia mieloidă acută, carcinoame esofagiene , carcinomul
colorectal, carcinomul hepatocelular, carcinomul de prostată, carcinoame ovariene. iar prin
folosirea cadmiului, au fost induse exprimări ale genei hsp60 în celulele de hematom. De
asemenea, pentru terapia antitumorală s-au dezvoltat vaccinuri, în care Hsp60 au rol de adjuvanți;
de exemplu vaccinurile care codifică Hsp60 legate la HPV16 E6 și E7 pentru terapia împotriva
cancerului de col uterin asociat cu v irusul papiloma uman.
Pentru inhibarea Hsp70, s-au dezvoltat terapii cu inhibitori ai autofagiei, cum este
hidroxiclorochina, utilizată în diverse tipuri de cancere ca și cancerul de sân, în cancerul pulmonar,
de colon, de prostată, de ficat.
În ceea ce privește țintirea Hsp90 , se folosesc inhibitori HDAC , dar și antibioticul Novobiocin,
care spre deosebire de ceilalți inhibitori , acesta are activitate mai specifică de țintire a Hsp90, prin
faptul că acesta destabilizează diverse proteine clien t ale Hsp90 (Her2, p53 mutantă, Bcr -Abl etc),
și inhibă astfel creșterea celuleor tumorale în cancerul de prostată, leucemie, limfom etc. [Jego și
colab., 2013; Zoubeidi și Gleave 2012; Capello și colab., 2008 ; Murphy 2013 ]

2.2. Modificări covalente în cancer
Modificările covalente ale proteinelor sunt responsabile pentru reglarea expresiei genetice,
repararea ADN, diviziunea celulară, interacțiuni le ce au loc î ntre diferite căi de semnalizare în
procesul de transformare a celulelor pentru a deveni canceroase. Astfel de modif icări includ
fosforilarea, acetilarea, glicozilarea , metilarea, nitrarea, ubiquitinarea, sumoilarea, lipidarea,
hidroxilarea respectiv sulfatarea și sunt catalizate enzimatic de către kinaze , acetilaze etc.

17
Aceste modificări sunt importante nu doar pentru rolul pe care îl au legat de funcțiile
celulare normale, ci și pentru că au un mare potențial în ceea ce privește țintirea unor tratamente
pentru diferite boli , printre care și cancerul, prin utilizarea ca markeri pentru diagnosticarea bolii
sau ca ținte moleculare în dezvoltarea de terapii inovative. [Dwar akanath și colab., 2008; Jin și
Zangar, 2009]

2.2.1. Acetilarea

2.2.1.1. Proteine acetilate
Acetilarea este una dintre modificările post -sintetice covalente ale proteinelor, având o
mare importanță în ceea ce privește structura, funcți a și localizarea intracelulară.
Acest proces are loc la capătul N -terminal a lizinei din histonă, este asociat cu menținerea
stabilității proteinei și este facilitat de difer ite enz ime, histon acetilaze (HAT) sau histon
deacetilaze (HDAC). Enzimele care catalizează acetilarea proteinelor (adăugarea de grupări acetil)
a reziduurilor de lizină sunt denumite lizin (K) acetiltransferaze și sunt notate KAT .. Pentru aceste
tipuri de enzime, este necesar acetil – CoA, ca donor de grupări acetil, fiind implicat în reglarea
metabolică. În cazul unor modificări ale concentrației de ac etil-CoA, au loc schimbări cu privire
la capacitatea enzimelor de a -și îndeplinii funcțiile.
Pe lângă histone, HDAC deacetilează și non -histone, care sunt diferiți factori nucleari de
transcriere (factorul nuclear kB), și proteine (p53, CDK1 , Hsp90, Myc, proteina de fuziune bcr –
Abl etc). , care sunt implicate în proliferarea, di ferențierea și apoptoza celulelor canceroase.
Modificările ce apar în semnalarea procesului de acetilare care rezultă din histon acetilaze
și deacetilaze, pot duce la exprimări aberante ale genelor, ce includ activarea de proto -oncogene ,
suprimarea expresiei genelor supresoar e de tumori , ceea ce duce la dezvoltarea cancerului. Cauza
acestor exprimări aberante poate fi un rezultat al leziunilor genetice care folo sesc mecanisme
epigenetice ce afectează expresia genetică și exprimarea proteinelor . [Dwarakanath și colab., 2008;
Kuo 2011; Narayan și colab., 2016; Singh și colab., 2010; Culf și Culf 20 14]

2.2.1.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Butiratul de sodiu a fost primul inhibitor utilizat în terapia anticanceroasă, datorită rolului
său de a induce acetilarea histon elor. Alți inhibitori ca și, acidul valproic (VA), compusul
Trichostatin A (TSA), care este un antibiotic fungic, și SAHA (acidul hidroxamic suberoilanilid)
au fost identificați ca inhibitori ai histon deacetilazelor (HDACi). Acești inhibitori au activități

18
antican ceroase puternice și specifice prin faptul că reglează nivelul de exprimare a genelor
supresoarelor tumorale (p53, p21) , scade nivelul de exprimare a diferitelor proteine apoptotice ca
și Bcl -2 și bloche ază progresia ciclului celular ( Fig. 5 ). [Singh și colab., 2010 ; Marchion și
Münster 2007 ; Lakshmaiah și colab., 2014 ]

Figura 5 . Mecanismul de acțiune a inhibitorilor HDAC

Trichostatina A (TSA), este un inhibitor HDAC ce blochează proliferarea și declanșează
apoptoza în carcinomul hepatocelular, blochează diferențierea celulelor în cancerul ovarian prin
schimbarea genei supresoare tumorale p21 și prin legarea ADN la proteina ID1 . Acest inhibitor
acționează asupra aceti lării prin faptul că induce acetilarea histonelor, modifică interacțiunea
dintre HDAC și histon acetiltransferazele, interacțiune ce are un rol esențial în ceea ce privește
structura croma tinei și exprimarea genelor. [Dwarakanath și colab., 2008 ; Tóth și c olab., 2004;
Kim și colab., 2010 ]
Eficacitatea inhibitorului SAHA (acidul acidul hidroxamic suberoilanilid) /Vorinostat ca
agent anticancer a fost demonstrată pe mai multe lini i celulare tumorale, astfel încâ t acesta a ajuns
să fie utilizat în tratamentul limfomului cu celule T, o formă de limfom non -Hodgkin. Funcția
acestui inhibitor este aceea de a inhiba metastaza celulelor canceroase.
În ceea ce privește modul de administrare a acestui medicament antitumoral, s -au creat
nanoparticule lipidice (conțin s urfactanți lipidici ca Precirol și Capryol, dar și lecitină) solide

19
încapsulate cu Vorinostat (Fig. 6a), după care au fost administrate intravenos la șoareci ce
prezentau diferite tumori. Rolul acestor nanoparticule lipidice este de a putea fi mai bine absorbite
în celule, pentru a elibera medicamentul în celula canceroasă respectivă, cu scopul de a le distruge,
fără a afecta într -un anumit fel, celulele sănătoase, datorită toxicității reduse. În urma acestui
studiu, prin administr area Vorino statului sub formă încapsulată, s -a constat o reducere eficientă a
tumorilor (Fig. 6b), prin scăderea nivelului de exprimare a histon deacetilazelor HDAC1 și
HDAC3. Prin această form ă încapsulată, eficacitatea Vorino statului este mai mare decât prin
administrarea în formă liberă, datorită faptului că aceste nano particule lipidice sunt mai bine
reținute în organism, și astfel timpul de eliberare în celule este mai mare. [Halsall și Turner 2016;
Ropero și Esteller 2007 ; Sawant și Shegokar 2014 ; Tran și colab., 2014; Kwak și colab., 2015 ]

Figura 6. Nanoparticule lipidice cu Vorinostat
www. media.springernature.com

În terapia anticanceroasă, pe lângă SAHA și TSA, mai sunt folosiți și alți inhibitori ai H DAC , unii
dintre aceștia fiind încă în stadii clinice, care sunt prezentați în Tabelul 2 .

20
Tipul inhibitorului Tipul de cancer Stadiu
Romidepsină Limfon cutanat cu celule T,
Limfom periferic cu celule T Aprobat de FDA
Entinostat Cancerul cu celule multiple Clinic
Nexturastat A Melanom Preclinic
Befexamac Neuroblastom, cancer de
plămân
Reminostat Carcinomul hepatocelular și
colorectal, Limfomul
Hodgkin Aprobat de FDA
Chidamidă Cancerul de sân Clinic
Tabel 2. Inhibitori HDAC
[Li și Seto 2016]

De asemenea, în t ratamentul cancerului , se mai utilizează și inhibitori ai histon acetilazelor
care pot fi naturali sau sintetici, precum curcumina, acidul anacardic din alunele de caju sau diferiți
compuși conjugați cu CoA. Funcția acestor inhibitori natural i ai HAT este aceea de a împiedica
dezvoltarea celulelor cance roase, prin faptul că generează specii reactive de oxigen care inhibă
exprimarea genei p300 în diferite tipuri de cancere (leucemie, limfomul Hodgkin), blochează
procesul de hiperacetilare a his tonelor și induc astfel apoptoza în celulele canceroase. [Zhang și
colab., 2015 ; Folmer și colab ., 2010; Haery și colab., 2015 ]
O altă abordare în ceea ce privește terapia anticanceroasă (ex. cancerul de sân , mielomul
multiplu etc. ) este, pe lângă utilizarea inhibitorilor HAT și HDAC, terapia epigenetică, care
implică utilizarea unor liganzi epigenetici multipl ii (epi -ML) care acționează împotriva mai multor
tipuri de m odificări de natură epigenetică, cum sunt modificări ce afectează ADN, structura
cromatinei, prin modificări ale histonelor, ce implică ac tivarea/ inactivarea unor gene, sau nivelul
de exprimare a acestora, în asociere cu diferite tipuri de cancer.
Funcția acestor liganzi multipli este de a acționa simultan asupra mai multor modificări de natură
epigenetică și de a induc e apoptoza în celulele canceroase . Astfel de compuși epigenetici sunt
compușii chimici naturali care se găsesc în bureții de mare, specia Pseudoceratina purpurea , care
s-au dovedit a fi eficienti î n distrugerea celulelor cancerigene , în special compusul chimic
Psammaplin A (Bisprasin) , ce acționează ca inhibitori ai enzimelor modific ărilor epigenetice (ex.
HDAC 1) în diferite tipuri de cancere (ex. cancerul ovarian, cancerul de plămâni etc.). [Di Cerbo
și Schneider 2013 ; Issa și colab., 2017; Reuter și colab., 2011 ; Kanwal și Gupta 2012 ; Medina
2016; Charkie 2014 ]

21
2.2.2. Fosforilarea

2.2.2.1. Proteine fosforilate
Fosforilarea, ca modificare post -sintetică, reprezintă una dintre cele mai frecvente
modificări reversibile într-o celulă și constă în adăugarea unei grupări fosfat de către o anumită
kinază după care este îndep ărtată de o fosfatază specifică ( Fig. 7 )

Figura 7 . Mecanismul de acțiune a fosforilării
(PK-protein kinaza, PP -protein fosfataza )
www.ncbi.nlm.nih.gov

Protein kinazele (PK) sunt enzime care fosforilează resturi de serină, treonină și tirozină
ale proteinelor specifice din celule. Prin fosforilare, este astfel reglată activitatea enzimatică a
proteinelor , interacțiunea ac estora cu alte proteine sau molecule , modul în care acestea sunt
degradate prin intermediul proteazelor . Modificările ce au loc în căile de semnalizare a protein
kinazelor, prin afectarea funcției kinazei , au ca și efect transformare a malignă a celule lor.
Protein tirozin kinazele (PTK) reprezintă o categorie de oncogene, sunt implicate în
proliferarea celulară, ciclul celular, apoptoză, iar prin dereglări ale exprimării lor, duc la
dezvoltarea mai multor tipuri de cancere umane. Tirozin kinazele sunt împă rțite în două mari clase:
receptori tirozin kinazici (RTK) , de exemplu EGFR (receptorul pentru factorul de creștere
epidermal ), FGFR ( receptorul pentru factorul de creștere fibroblastic ), IR (receptorul pentru
insulină) , VEGFR ( receptorul pentru factorul de creștere endoteliului vascular ), și non-receptori
tirozin kinazici (NRTK ), de exemplu SRC, ABL etc . [Adjei și Hidalgo 2005 ; Vlahovic și Crawford
2002 ]

22
Leucemia cronică mieoloidă este un sindrom al tulburării celuleor stem hematopietice
mielodisplazice, datorată translocării între cromozomul 9 și cromozom ul 22 (Cromozomul
Philadelphia) ( Fig. 8 ) Această translocație are ca rezultat juxtapunrea genei tirozin kinazei ABL1
(Abelson) , care este implicată în reglarea ciclului celular, de pe cromozo mul 9 lângă gena BCR
(Breakpoint Cluster Region), de pe cromozomul 22, ce duce la formarea unei gene noi de fuziune
(BCR -ABL) rezultând o creștere a fosfotirozinei (activitate kinazică mare) , ce transfor mă celulele
stem hematopoietice și este asociată cu gradul de dezvoltare a bolii; ATP se leagă de buzunarul de
legare al Abl și este fosforilat. ( Fig. 9 ) [Baccarani și colab., 2012 ; Shchemelinin și colab., 2006 ]

Figura 8 . Juxtapunerea genei ABL lângă gena BCR,
cu formarea genei de fuziune BCR -ABL
www.synevo.ro

23

Figura 9 . Proteina codificată de g ena de fuziune BCR -ABL – activitatea kinazică
www.docplayer.com

2.2.2.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Tirozin kinazele au un impact în ceea ce privește patogeneza diferitelor tipuri de cancere,
prin faptul că sunt potențiale ținte în medicamentele anticanceroase . Inhibitorii tirozin kinazelor
(ITK ), reprezintă o clasă de medicamente utilizate în chimiote rapie , ce au rolul de a preveni și
bloca căile vitale prin direcționarea moleculelor de semnalizare care sunt necesare pentru
supreviețuirea celualară. Imatinibul (Gleevec) este un inhibitor al tirozin kinazei ce blochează
receptorul kinazei de a se lega de ATP , împiedicând astfel fosforilarea care ar putea aduce beneficii
celulei canceroase și favorizând astfel diviziunea celulară ( Fig. 10 ). Acesta țintește proteina de
fuziune BCR -ABL și este folosit în ter apia leucemiei mieloide cronice, dar și alte tipuri de cancere
(ex. cancerul de sân, glioblastom etc.)

24

Figura 10 . Mecanismul de acțiune a inhibitorului Gleevec
(LMC -Leucemia mieloidă cronică)
www.leukd.blogspot.ro

Pentru creșterea eficienței agenților terapeutici, pentru combaterea cât mai eficientă a
tumorilor canceroase, s -au dezvoltat sisteme biodegradabile mici (de ex. nanoparticule /microsfere )
care înglobează agentul terapeutic . Aceste nanoparticule sunt mai apoi eliberate în organism,
preluate de celulele tumorale care recunosc liganzii țintă specifici, iar în urma eliberării agentului
chimioterapeutic celulele sunt distruse, fără efecte secundare pentru celulele normale. Printre
agenții chimioterapeutici care sunt încapsulați în astfel de siste me, este și agentul terapeutic
Imatinib , ce inhibă proteina de fuziune BCR -ABL din fosforilarea altor proteine în leucemia
mieloidă acută, sau în alte tipuri de cancer (ex. cancerul de sân, glioblastom etc.).
Imatinib , este încapsulat în nanocapsule (Fig. 11 ) formate din acizi poli lactici și glicolici
(PLGA), după care au fost administrate intravenos șoarecilor. S -a constat faptul că, prin
administrarea de nanoparticule cu Imatinib, a fost inhibată proliferarea celule lor canceroase și
angiogeneza (în cazul tumorilor craniene) , dar și o scădere a gradului de toxicitate a agentului
atunci când este administrat liber. [Marslin și colab., 2015 ; Ylmaz și colab., 2012 ]

25

Figura 11. Microsfere cu Imatinib
www.researchgate.net

Vatalanibul este un inhibitor selectiv a l angiogenezei și acționează direct asupra
mielomului multiplu, prin faptul că blochează exprimarea tirozin kinaz elor VEGFR (VEGFR -1 și
VEGFR -2), implicate în creșterea tumorală și metastază. Acesta este utilizat ca agent singur sau
în asociere cu chimioterapia , la pacienții cu cancer colorectal, metastaze hepatice, cancerul de
prostată, cancerul renal avansat.
Există și alți inhibitori ai tirozin kinazei care sunt util izați în terapia anticanceroasă, prezentați în
următorul tabel. [Arora și Scholar 2005; Bari și colab., 2012; Dervisis și Klahn 2016, Focosi 2016 ]

Inhibitori tirozin kinazic i Ținta Tipul de cancer
Erlotinib EGFR Cancerul de plămâni
Canertinib EGFR Cancerul de sân sau a altor
tumori solide
Sutent PDGFR Cancerul renal
Leflunomid PDGFR Cancerul de prostată
Vandetanib EGFR Carcinomul tiroidian medular
Lenvatinib VEGFR Cancerul tiroidian diferențiat
Semaxinib VEGFR Leucemia mieloidă
Tabel 3. Inhibitori tirozin kinazici

2.2.3. Glicozilarea

2.2.3.1. Proteine glicozilate
Glicozilarea reprezintă cel mai complex proces de modif icare a proteinelor și este definit
de procesul de adăugare a lipidelor și carbohidraților la proteine ; astfel se formează lanțurile

26
oligozaharidice, cunoscute sub denumirea de glicani, și se găsesc atât în multe proteine.
Glicozilarea se poate face prin atașări de resturi oligoglucidice prin legături O – sau N -glicozidice.
(Fig. 12 ).

Figura 12 . Legarea lanțurilor laterale de carbohidrați la glicoproteine
The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition

Glicozilare a prin legături N-glicozidice presupune atașarea covalentă a unei oligozaharide
la resturile de asparagină din lanțurile polipeptidice și este implicată în procesele de pliere a
proteinelor, dezvoltare și migrare a tumorilor. Astfel de proteine glicozilate prin legături N –
glicozidice sunt apoliproteina B -100, α -1-antichimiotripsina, ceruloplasmina, iar s upraexprimări
sau modificări ale s tructurii acestora sunt identificate în mai multe tipuri de cancere , de exemplu,
cancerul de sân, cancerul pancreatic, cancerul de plămân, cancerul de colon etc. [Watson și colab.,
2015 ; Vasconcelos dos Santos și colab. 2015; Sheta și Bachvarov 2014 ]
Glicozilarea prin legături O-glicozidice implică atașarea de N -acetilgalactozamină la
oricare dintre resturile de serină sau treonină din proteine. Cea mai abun dentă clasă de O -glicani
o repre zintă mucinele (MUC), niște glicoproteine mari, în care sunt îng lobate multe resturi de
serină și treonină , iar modificări în structura lor sunt asociat e cu diferite tipuri de cancere (gastric,
ovarian, pancreatic, de sân etc.) (Fig. 13 ) [Tucillo și colab., 2014]

27

Figura 13 . Exprimarea mucinelor

Prin dereg lările apărute în exprimare, există câteva tipuri de glicotransferaze (GALNACT), care
sunt exprimate în diferite tumori maligne , prezentate în următorul tabel. [Sheta și Bachvarov 2014 ;
Dall'Olio și Trinchera 2017; Ho și colab. 2016 ]
Tipul de glicotransfer ază Tipul de cancer
GALNT1 Cancer de vezică urinară
GALNT2 Carcinom cu celule scuamoase, carcinomul
hepatocelular (prin modificarea glicozilării
EGFR)
GALNT3 Cancerul pancreatic
GALNT6 Carcinoame gastrice
GALNT7 Cancerul de col uterin, carcinom esofagian
GALNT9 Neuroblastom
GALNT10 Cancerul gastric
GALNT11 Leucemia limfocitară cronică
GALNT12 Cancerul de colon
Tabel 4. Tipuri de glicotransferaze implicate în cancer

28
Dintre glicoproteinele transmembranare, CD44 H aparține unei clase de receptori de
adeziune celulară și este implicată în metastază . CD44 H se leagă de acidul hialuronic (HA), fiind
responsabil de semnalizarea celulară, dar și de declanșarea răspunsului imun inflamator .
La om, familia CD44 este codifi cată de o singură genă și prezintă mai multe izoforme cu diferite
variante (v) (Fig. 14 ) și este glicozilat prin legături O – și N-glicozidice, în funcție de tipul de celulă
canceroasă. Spre exemplu, CD44v6, este exprimat în limfoamele umane non -Hodgkin, cancerul
colorectal, cancerul de sân însă cel mai frecvent, CD44 este exprimat în carcinomul ovarian
epitelial . [Basakran 2015 ; Martin și colab., 2013 ; Misra ș i colab., 2011 ]

Figura 14 . Structura CD44
(s-standard; v -variante)
www.smj.org.sa

2.2.3.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Glicozilarea aberantă a glicoprote inelor din celulele canceroase, este abordată pentru
dezvoltarea unor terapii bazate pe glicani, cum ar fi, i nhibitori ai glicoziltransferazei, crearea de
vaccinuri anticanceroase complet sintetice pe bază de glicani împotriva mai multor tipuri de
cancer, d e exemplu, vaccinurile pe bază de glicopeptide MUC1 cu diferite molecule (peptid T
helper, receptor Toll -like etc.) sunt utilizate în tratarea cancerul ui de sân. [Li și colab., 2010 ; Ho
și colab., 2016 ]
Prin capacitatea sa de biodegrabilitate și prin afinitatea la CD44, acidul h ialuronic, poate fi utilizat
pentru administrarea specifică de agenți terapeu tici (doxorubicină, paclitaxel, mitomicina, 5 –
fluoroacil etc.) celulelor canceroase ce supraexprimă CD44, prin diferite nanoformulări, ce pot fi

29
administrate eficient organelor și celulelor canceroase țintă, cu scopul de a îmbunătăți eliberarea
specifică a medicamentelor antitumorale dar și a proprietăților lor.
În terapia cancerului hepatic , este utilizat doxorubicina, un antibiotic cu toxicita te mare.
De aceea, pentru a reduce gradul de toxicitate a doxorubicinei și pentru a crește eficiența sa, s -au
realizat studii asupra unor șoareci ce prezentau diferite tumori cu supraexprimări a CD44 , prin
încapsularea doxorubicinei în lipozomi cu HA , urmând ca acești lipozomi să fie injectați. Conform
studiilor, concentrația antibioticului a crescut, decât dacă era injectat liber, acest lucru având o
eficiență mai mare prin faptul că, acele tumori au scăzut în volum. (Fig. 15 ) [Watson și colab.,
2015 ; Lu și colab., 2016; Rivankar 2014 , Eliaz și Szoka 2001 ]

Figura 15 . Terapia cu doxorubicină în lipoz om
www.sciencedirect.com
www.researchgate.net

Agentul chimioterapeutic, 5 -fluoroacil a fost încărcat în nanoparticule din chitosan, care
au fost conjugate cu acid hialuronic, ceea ce a dus modificarea dimen siunilor acestor nanoparticule
(nanoparticulele s -au mărit) (Fig. 16 b). Mai apoi, nanoparticulele cu HA au fost injectate în coada
șoarecilor. Prin faptul că, nanoparticulele au fost conjugate cu HA, 5-fluoro acil a fost eliberat în
celulele canceroase în concentrații mai mari, decât administrat liber, datorită gradului mare de
toxicitate , dar și a timpului redus de eliberare , pe care îl are acest agent terapeutic. Totodată, s -a
constat o diminuare considerabilă a tumorilor , prin inducerea apoptozei în celulele canceroase ale
gliobastom ului, ale plămânilor.
Datorită administrării de medicamente antitumorale prin diferite nanoformulări, și datorită
interacțiunii dint re CD44 și HA, face ca această glicoproteină să fie potrivită pentru țintirea
antitumorală a cancerelor care exprimă CD44. [Yadav și colab., 2010; Wang și colab., 2017 ]

30

Figura 16 . Nanoparticule cu acid hialuronic
www.researchgate.net

2.2.4. Metilarea

2.2.4.1. Proteine metilate
Metilarea proteinelor este o modificare post -sintetică covalentă ce implică transferul unei
grupări metil la resturile de lizină și arginină și este catalizată d e o familie de enzime numite
protein metiltransferaze (P MT) care utilizeaz ă S-adenozilmetionina ca donor de resturi metil
(SAM). [Petsko și Ringe 2004 ; Poulard și colab., 2016 ]
Lizina și arginina sunt supuse procesului de metilare în mod diferit, astfel, lizina este
metilată ca monometil -, dimetil – și trimetil -lizină ( Fig. 17 b); fiecare fiind metilată de anumite
protein lizin metiltransferaze (HMT/ KMT) . Arginina este, de asemenea, metilată în trei forme
diferite: monmetil -arginină, dimetil -arginină asimetric ă și dimetil -arginină simetrică ( Fig. 17 a) și
sunt metilate de arginin metiltransferaze (PRMT). Supraexprimării ale arginin metiltransferazelor
au fost identificate în diferite tipuri de cancer. ( Tabel 5 ) [Bedford și Richard 2005; Zhang și colab.,
2012; Poulard și colab., 2016 ; Hamamoto și Nakamura 2016 ]

31

Figura 17 . Formele metilate ale lizinei și argininei

Tipul de arginin
metiltransferază
(PRMT) Tipul de cancer în care gradul de exprimare/activare al PRMT
este modificat
PRMT1 cancer de sân, de vezică, de colon, esofagial, pancreatic, leucemie,
PRMT2 cancer de sân și colon
PRMT4 (Carm1) cancer de colon, hepatic, prostată
PRMT5 cancer de plămâni, ovarian, de sân, gastric
PRMT6 cancer de de sân, de vezică, cervical
PRMT7 cancer de sân
Tabel 5 . Exprimări ale PRMT în cancerul uman

Există și metiltransferaze care catalizează resturi de liz ină în proteinele non -histonice sau
factori de transcripție (p53, ER α, NF kB, pCAF, Rb, VEGFR ), care sunt esențiale pentru
modificările epigenetice ce a u loc în cromatină, și pot fi implicate în cancer. [Zhang și colab.,
2012; Karve și Cheema 2011]

32
ADN genomic este supus metilării, prin intermediul unor enzime, denumite ADN
metiltransferaze (ADNMTS). Mutațiile epigenetice apărute în proces ul de metilare a proteinelor,
ce afectează ADN prin gradul de metilare al proteinelor (hipo/hipermetilări ) dar și exprimări
aberante ale unor proteine , sunt identificate în mai multe tipuri de cancer, de exemplu, cancerul
ovarian, de sân, colon, pancreatic ,gastric etc. (Fig. 18 ) [Lewandowska și Batoszek 2011; ]

Figura 18 . ADN metilat în cancer
www.nccri.ncc.go.jp

2.2.4.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Rolul pe care îl au dereglările epigenetice în dezvoltarea cancerului a dus la crearea de
terapii ce vizează acest tip de modificări. Inhibitori i arginin metiltransferazelor, ca al antodapsonă,
stilbamdină și ai ADN MT ca azacitid ină, decitabin ă și zebularină sunt în prezent cele mai u tilizate
medicamente în terapia cancerelor (ex. leucemie , cancer de sân ) ca urmare a modificărilor
epigenetice, prin faptul că inhibă genele supresoar e tumorale. Pentru ca acești agenți terapeutici să
poată acționa ca și inhibitori ai ADNMT, trebuie să fie integrați în ADN în timpul sintezei. Această
integrare implică faptul că, acești agenți terapeutici suferă modificări chimice, înglobează ADN
metiltransferaza , înlocuiește citozina și creează un complex între ADN metiltransferază și ADN –

33
ul înlocuit de substanța respectiv ă, unde acestea sunt degradate . (Fig. 19) [Kim 2015 ;
Lewandowska și Bartoszek 2011 ; Gnyszka și colab., 2013 ; Morettin și colab., 2015 ]

Figura 19 . Acțiunea azacitadinei în terapia cancerului
www.vidaza.net

Deși marea majoritate a acestor tip de sisteme de înglobare a agenților terapeutici
(lipozomi, nanoparticule, n anocapsule et.) sunt administra ți intravenos, există studii care au
încercat să schimbe modul de administrare a acestora. Un exemplu, sunt nanoparticulele ce
înglobează agentul terapeutic decitabina, un inhibitor al ADNMT, utiliz at în tratamentul leucemiei
cronice și acute, cancerul de sân, cancere declanșate de gene care sunt suprimate de metilarea
aberantă a ADN. Administrarea nanoparticulelor a fost pe cale orală , pe șoareci, cărora le -a fost
indusă leucemia. ( Fig. 20). Aceste nanoparticule sunt formate din acizi poli lactici și glicolici
(PLGA ), pentru a proteja decitabina de degradarea acizilor din stomac, și pentru a putea străbate
mai ușor prin circulația sanguină. Scopul administrării orale a medicamentelor antitumorale pr in
formă încapsulată, este de a îmbunătății calitatea vieții pacientului, dar și o creștere a eficienței
tratamentelor chi mioterapeutice, dat fiind fap tul că decitabina este instabilă administrat oral și
este degradat rapid în ficat . S-a constatat o scăde re a proliferării celulelor canceroase în leucemie,
comparativ cu administrarea medicamentului liber sau în combinație cu alte medicamente
antitumorale. [Jain și colab., 2016 ; Neupane și colab., 2014 ]

34

Figura 20. Nanoparticule încărcate cu decitabină
www.rjpbcs.com

2.2.5. Nitrarea

2.2.5.1. Proteine nitrate
Nitrarea proteinelor face parte din modificările oxidative ale proteinelor , la contactul cu
agenți de nitrare (peroxinitrit) sau în cazul unor nivele crescute de stres oxidativ, și constă în
atașarea de grupări de nitriți ( -NO 2), la resturile de tirozină din proteine de către speciile reactive
de azot. [Karve și Cheema 2011 ; Vannini și colab. 2015 ]
Oxidul nitric (NO), este un compus liber ce străbate membranele celulare și interacționează
cu moleculele țintă, fără a avea nevoie de transportatori sau receptori speciali.
NO se formează din oxidarea aminoacidului l -arginină, sub activitatea catalitică a sintetazelor
(NOS) care necesită NADPH și O 2 ca și cosubstrate, pentru a produce NO și l -citrulină ca și produși
finali (Fig. 21 ). Oxidul nitric este generat de trei tipuri de sintetaze: neuronal ă (nNOs sau NOS1),
inductibil ă (iNOS) și endotelial ă (eNOS sau NOS3). Dintre cele trei enzime NOS, iNOS produce
mai mult NO decât celelalte enzime și este implicat în transformarea mal ignă, angiogeneza și
metastază. [De Sanct is și colab., 2014 ;Vannini și colab., 2015 ]

35

Figura 21 . Formarea oxidului nitric
www.ncbi.nlm.nih.go
Pe lângă implicația sa în diferite procese biologice (traducere, procesarea ARNm etc.) ,
oxidul nitric în asociere cu speciile reactive de oxigen și azot , mai este implicat și în dez voltarea
unor tipuri de cancer, prin modificările ce au loc în genele supresoare tumorale ( deteriorări/
supraexprimări), dar și prin modificarea nivelului de stres oxidativ.
Cancerul pulmonar poate fi inițiat atunci când o celulă normală din plămân suferă mutații genetice,
astfel se formează tumorile, care se pot răspândi în alte zone din plămâni. Fumul de țigară , unul
dintre fact orii declanșatori al acest ui tip de cancer (Fig. 22), conține diferiți compuși cancerigeni
(nitrozamine, hidrocarburi), care, în exces, pot inflam a căile respiratorii prin acumular ea de specii
reactive de oxigen și azot (ROS/RNS), în urma stresului oxidativ. [Wiseman și Halliwell, 1996;
Masri 2010]

36

Figura 22 . Cancerul pulmonar , ca urmare a acumulării
de specii reactive de oxigen și azot din fumul de țigară
www.erj.ersjournals.com

Concentrații mari de oxid nitric au fost identificate și în țesuturile cancerului de sân, dar și
în celulele carcinomului mamar. Exprimările NOS sunt asociate cu tipurile de hormoni secretați
(estrogen, progesteron), dovedind implicarea NO S, ca și compuși liberi, în dezvoltarea cancerului
de sân.
Celulele cervicale produc oxid nitric. Nivele crescute de NO au fost depistate la pacienții
cu cancer de col uterin, indicând astfel implicația sa în progresia cancerului de col uterin. De
asemenea , NO este asociat cu acest tip de cancer și prin infecțiile cu virusul papilloma (HPV), în
condițiile în care au loc supraexprimări ale izoformelor eNOS și iNOS , și astfel, este stimulată
dezvoltarea celulară a celulelor infectate cu ace st tip de virus. [Vahora și colab., 2016 ; Choudhari
și colab., 2013]

2.2.5.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă
Oxidul nitric, prin cele trei tipuri de sintetaze , este implicat în dezvoltarea anumitor tipuri
de cancer. De aceea, pentru a încetini dezvoltarea tumorală, pentru a îmbunătății eficiența terapiilor
convenționale (chimio/radioterapia), se cercetează diferite metode de dezvoltare de inhibitori NOS
(în funcție de tipul de cancer și gradul de evoluție) , dar și de potențiali compuși cu activitate
anticanceroasă care generează și donează NO. [Choudhari și colab., 2013 ; Hickok și Thomas 2010 ]

37
Statinele ( de exemplu simvastatin ă, fluvastatin ă, pravastatin ă, lovastatin ă) sunt agenți de scădere
a concentrației colesterolului , care inhibă HMG -CoA reductaza (3 – hidro xi-3-metilglutaril
coenzima A). Aceasta, la rândul său , catalizează conversia HMG -CoA în mevalonat și astfel este
limitată biosinteza colesterolului ( Fig. 23). Statinele au dove dit a avea activitate antitumorigenă și
apoptotică care este mediată de inducerea iNOS, împotriva multor tipuri de canc er, ca și
carcinomul de sân, cancerul ovarian, cancerul de prostată, melanom.

www.medscape.org
Figura 23 . Acțiunea statinelor
În terapia anticanceroasă cu statine, au fost dezvoltate sisteme de dimensiuni mici
(lipozomi, micelii, nanoparticule etc.) care înglobează acești agenți și o transportă la locul țintă, în
celula canceroasă și astfel este limitată acumularea agenților terapeutici în celulele/țesutul sănătos.
[Pandey și colab., 2016; Romana și colab., 2014 ]
O abordare nouă în terapie, este utilizarea statinelor sub formă de nanocristale, deoarece ,
comparativ cu celelalte tipuri de sisteme, acestea nu au nevoie de alți compuși (substanțe
polimerice etc.), astfel sub această formă, pot avea o eficiență mai mare în terapie, pentru că se pot
dizolva mai rapid în organism, decât administrate oral. ( Fig. 24 )

38

Figura 24 . Cristale de simvastatină
www. innovareacademics.in

Un alt tip de sistem utilizat în terapia cu statine, sunt nanoparticulele, care apar sub formă de
nanocapsule, care prezintă o membrană realizată din polimeri, care limitează eliberarea
medicamentului la locul țintă. De exemplu, agenții terapeutic i fluvastatină și simvastatină , au fost
înglobați într-un astfel de sistem, realizat din PPSu (poli -propilen -succinat). Scopul realizării de
astfel de sisteme, este de a se reduce doza de fluvastatină în cazul administrării orale, dar și a
posibilelor efect e adverse ce pot apărea în cazul unor supradozaje. (Fig. 25)

Figura 25 . Nanoparticule de simvastatină
www.researchgate.net

39
Datorită proprietăților antiinflamatoare a statinelor, s -a cercetat activitatea acestora în celule
canceroase, prin îngloba rea agentul ui terapeutic, pravastatina, în lipozomi. Cercetările in vivo , pe
șoareci, au demonstrat faptul că, în cazul administrării de lipozomi cu pravastatină , eficiența în
tratarea tumorilor a fost mai mare, comparativ cu tratamentul clasic de pravastatină, datorită
capacității de a inhiba proteinele care sunt implicate în declanșarea inflamației.
Statinele administrate sub formă de nanocristale, nanoparticule , lipozomi sunt utilizate în
tratamentul diferitelor forme de cancer, cum este cancerul de sân, cancerul ovarian, cancerul de
prostată, melanom. [Romana și colab., 2014 ; Wu și colab., 2015 ; Kotamraju și colab., 2007 ]
S-a încercat o abordare mai atentă cu privire la identificarea de agenți naturali chimio -preventivi
ai cancer ului (Tabel 6 ). Anumite substanțe de origine alimentară sunt asociate cu mecanisme
antiinflamatorii, în scopul inhibării nivelelor crescute de NO, dar și a genelor implicate în
dezvoltarea de tumori, reducând astfel tumorigeneza. Prin utilizarea de astfel de compuși
alimentari naturali s -ar putea îmbunătăți sau înlocui metodele terap eutice clasice. [Vahora și
colab., 2016 ; Award și Bradford 2005 ]

Agentul chimio -preventiv Sursa
Curcumina Turmeric
Gingerol Ghimbir
Epigalocatechină Ceai verde
Capsaicină Ardei iute
Resveratrol Struguri roșii
Licopen Roșii
Quercitina Capere
Tabel 6 . Agenți chimio -preventivi din alimentație

Cel mai cunoscut agent chimioterapeutic 5 -fluorouracil (5 -FU) a indus iNOS și apoptoza
în celulele canceroase hepatice, datorită compusului l -arginină, care a îmbunătățit sensibilitatea
celulelor la 5 -FU. De asemenea, medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene dononare de NO ,
precum aspirina și ibuprofenul, au demo nstrat a avea funcții anti -proliferative, anti -apoptotice în
celulele canceroase (ale cancerului de sân, de prostată) , prin faptul că au activitate inhibitorie a
ciclooxigenazei 2 (COX -2), care se găsește supraexprimată în diferite tipur i de cancer, dar și
împotriva prostaglandinelor, care se produc în cazul inflamațiilor. [Vannini și colab., 2015 ;
Rayburn și colab., 2009 ; Roxburgh și McMillan 2014 ]

40

2.2.6. Ubiquitinarea

2.2.6.1. Proteine ubiquitinate
Ubiquitinarea este o modificare post -sintetică ce este coordonată și catalizată enzimatic și
vizează proteinel e pent ru degradare și reciclare. Acest tip de modificare are un rol important în
celulă, fiind implicată în ciclul celular, transcriere , diferențiere celulară, răspunsul la deteriorarea
ADN și dezvoltarea cancer ului. [Wei și Lin 2012 ; Shi și Grossman 2010 ]
Proteinele care sunt supuse degradării sunt marcate de o atașare covalentă a unei proteine
reglatoare la resturi de lizină , denu mită ubiquitină (Ub ) și implică activarea acesteia cu ajutorul
unor enzime cu diferite funcții: enzime de activare (E1), de conjugare (E2), ligaze (E3) ce recunosc
substratele țintă, dar și enzime de dezubiquitinare (DUB), ce au rolul de înlătura ubiquitina din
substratele ț intă și o reciclează în citosol . (Fig. 26 )

Figura 26 . Procesul de ubiquitinare a proteinelor
www.ncbi.nlm.nih.gov

Prin faptul că multe proteine implicate în ciclul celular, proliferare celulară, apoptoză sunt
ubiquitinate, de cele mai multe ori, astfel de evenimente celulare sunt modificate în cancer, prin

41
exprimări aberante ale enzimelor ubiquitinări i, acestea fiind asociate ca oncog ene sau supre soaare
tumorale în diverse tipuri de cancer.
Enzimele de conjugare (E2), au funcția de a transfera ubiquitina diferitelor substrate ale
proteinelor țintă , rata transferul ui fiind mai mare atunci când sunt asociate cu o ligază de tipul E3 ,
sunt implicate în reglarea progresiei ciclului celular, a inflamației și sunt supraexprimate în mai
multe tipuri de cancer. De exemplu, enzima de conjugare a ubiquitinei E2N (UBE2N), este
supraexprimată în diverse tumori, precum cea de sân, pancreas, prostată etc. iar cofactorul ei,
UBE2V 1 (varianta 1), se găsește în concentrație ridicat ă în cancerul de sân și cel colorectal, și este
asoci ată cu creșterea migrării celulor canceroase în ambele tipuri de cancer dar și cu creșterea
tumorală. [Gallo și colab., 2017 ; Kar și colab., 2013 ]
Ligazele E3 sunt implicate în reglarea proliferării celulare, opr irea ciclului celuar și
apoptoză . Acestea pot fi supresoare tumorale sau oncogene, în funcție de capacitatea lor de a
degrada fie oncogena, fi e proteina supresoare tumorală. Ubiquitin ligazele de tip 3 sunt de mai
multe tipuri, în funcție de domeniul catalitic conservate: RING – contribuie la transferul direct al
ubiquitinei la substratul pr oteinei țintă , HECT (Homology to E6AP C arboxy Terminus) – se leagă
de ubiquitină înainte să fie transferată ulterior și contribuie la degr adarea proteinei supresoare p53
și familia de proteine omoloage UFD2 (U -box). [Shi și Grossman 2010; Sun 2006 ]
Ligaza Mdm2 (murine double minute 2, HDM2 la om ) este o ligază de tip E3 -RING și este
responsabilă de ubiquitinarea și degradarea proteinei supresoare tumorale p53 , care prin rolurile
sale de a promova invazia celuleor canceroase, metastaza, etc., este implicată în declanșarea
cancerulu i. Această ligază acționează prin faptul că se leagă direct de p53, inhibând astfel din
funcțiile p53( apoptoza, deteriorări ADN etc.) , reglând nivelul acesteia . (Fig. 27 ) [Shi și Grossman,
2010; Huang și Dixit 2016; Micel și colab., 2013]
Mdm2, prin nivele crescute, inactivează funcția p53 și contribuie la progresia metastazelor în
diferite tipuri de cancer precum can cerul de sân, cancerul pulmonar, tumori ( limfomul Hodgkin),
osteosarcoame. [Sane și Rezvani, 2017 ]

42

Figura 27. Interacțiunea Mdm2 -p53
www.researchgate.net

Inhibitorii proteinelor implicate în apoptoză (IAP), fac parte din tipul E3 de ligaze și sunt
active în diferite cancere . Aceștia intervin în degradarea mai multor substrate implicate în
apoptoză, reglează diferiț i factori nucleari (NF -kB) și căi de semnalizare care controlează
exprimarea genelor implicate în inflamație, supraviețuirea celulară. IAP sunt exprimați în
cance rele hepatice, pulmonare, carcinoamele ovariene , tumori limfoide. [Shi și Grossman 2010;
Owens și colab., 2013 ]
Proteina BRCA1 este la rândul său o ligază E3; are activitate supresoare tumorală și este
implicat ă în procesul de reparare a ADN. Această prote ină este exprimată în mod aberant în cele
mai multe cazuri de cancer mamar, dar și în cancerul ovarian. Pentru a avea activitate de tip ligază
E3, BRCA1 formează un complex prin asocierea cu o altă proteină numită BARD1, cu domeniu
RING , și duce astfel la creșterea activității ubiquitin ligaz ei pentru suprimarea tumorii. [Shi și
Grossman 2010; Wu și colab., 2008]
O altă ligază E3 implicată în u biquitinare și degradarea mediată de proteasom, este
complexul VHL (von Hippel -Lindau)- cu o proteină cu un domeniu catalitic de tip RING , care
este exprimată aberant în sindromul cu aceeași von Hippel -Lindau . Boala este caracterizat ă prin
dezvoltarea unor tumori la nivelul celulelor renale, dar și la pancreas ( se formează chisturi) . Unul
dintre substrat ele ligazei VHL este HIF -1α (factorul 1α induc tibil al hipoxiei) (Fig. 28), care
reglează răspunsul celular atunci când nivelul de oxigen este scăzut și reglator al genelor în
angiogeneză . În condiții de hipoxie, se pierde interacțiunea dintre HIF-1α și VHL pentru

43
degradare, și astfel se induc gene ca factorul de creș tere endotelial v ascular (VEGF) sau alte gene
inductibile de hipoxie. [Shi și Grossman 2010 ; Kamura și colab., 2000 ; Robinson și Ardley 2004 ]

Figura 28 . Mecansimul ligazei VHL
www.wikiwand.com

Proteina asociată cu E6 (E6 -AP) face parte din familia de ligaze HECT E3 și are funcția de
a cata liza ubiquitinarea și de a contribui la degradarea genei supresoare p53 de către proteasom în
infecțiile cu papilomavirusuri uman e (HPV) , în funcție de tipul de HPV . Tipurile de HPV de mare
risc, cum sunt cele de tip 16, 18, 31 sunt asociate cu cancerul de col uterin, îm preună cu cancerele
genitale dar și cele de gât și cap. [Kar și colab., 201 3; Micel și colab., 2013 ; Spataro și colab.,
1998 ]
Enzimele de dezubiquitinare (DUB) sunt și ele implicate în degradarea proteasomului, în
procesele reparatorii ale ADN . Supraexprimarea acestor enzime este asociată cu cancerele umane.
De exemplu, USP7 /HAUSP este implicată în reglarea funcției genei supresoare p53 dar și în
înlăturarea ubiquitinei din Mdm2; este superexprimată în carcinomul de plămâni fără celule mici,
cancerul de prostată. O altă enzimă de dezubiquitinare este USP28, care are funcția de a controla
activitatea genei c -Myc, care este implicată în dezvoltarea celulelor canceroase, și este exprimată
în cancerele de colon și sân. [Shi și Grossman 2010 ; Kar și colab., 2013 ]

2.2.6.2. Modalități de țintire în terapia anticanceroasă

Se încearcă dezvoltarea de agenți care vizează inhibarea activit ăților ligazelor E2, E3 și
DUB., prin crearea de inhibitori ai enzimelor de dezubiquitinare , pentru țintirea USP7 ( Fig. 29 ),
sau inhibitori ca Nutlin -3, cu activitate antitumorală puternică în mai multe tipuri de cancere,

44
printre care osteosarcomul și cancerul de prostată, care stabilizează concentrațiile celulare ale
Mdm2 , suprimă activitatea complexului Mdm2 -p53 prin eliminarea ubiquitinei ., astfel s -ar induce
apoptoza în celulele canceroase (Fig. 30 ) [Gallo și colab., 2017 ; Shangary și Wang 2008 ]

Figura 29 . Potențialul terapeutic în țintirea USP7
www.cumc.columbia.edu

Figura 30 . Acțiunea inhibitorilor ( Nutlin -3) în complexul
Mdm2 -p53
www.pnas.org

45
În prezent , se utilizează în terapia antitumorală inhibitori ai proteasomului , care intervin
în căile de semnalizare implicate în procesul de formare a tumorilor, precum delanzomib,
carfilzomib, oprozomib, moarizomib. Primul inbitor proteasomic utilizat în scop clinic este
bortezomib, în tratarea cancerului de prostată, pancreatic, mielom etc.; un compus care mediază
degradarea proteică și are un efect citoto xic asupra celulelor mielomului.
Pentru a reduce toxicitatea în celule, și pentru a avea o eficiență mai bună în tratatarea mielomului,
inhibitori ai proteasomul ui sunt înglobați în lipozomi , în combinaț ie cu alți agenți terapeutici ; în
acest caz au fost înglobați doi agenți terapeutici (carfilzomib și doxorubicina).
Pentru realizarea lipozomilor s-a folosi t ca polimer poli-etilen -glicol (PEG), datorită proprietăților
sale în raport cu mărimea nanoparticulei, compatibilitatea cu agenții terapeutici, ușurința c u care
aceștia pot fi înglobați . (Fig. 31). În acest studiu realizat pe șoareci, s-a constatat prin această
combinație de medicamente, încetinirea dezvoltării tumorii mielomului, decât în cazul în care
agenții terapeutici ar fi fost administrați singular și liber. [Weathington și Mallampalli 2014 ;
Ashley și colab., 2016 ]

mct.aacrjournals.org
Figura 31 . Nanoparticule ce înglobează carfilzomib și doxorubicină
în tratarea mielomului multiplu
a. încărcarea cu doxorubicină; b. încărcarea cu carfilzomib;
c. nanoparticula ce ambii agenți terapeutici

46

2.2.7. Lipidarea

2.2.7. 1. Proteine lipidate

Lipidarea , cazul particular al palmitoilării, este o modificare covalenta post -sintetică ce
implică adăugarea de acizi grași cu 16 atomi de c arbon la resturile de cisteină din membrana
celulară și sunt catalizate de către protein aciltransferaze (PAT). Acest tip de modificare este
reversibilă, proteinele pot fi și depalmitolate, și are un rol important în asocierea ș i interacțiunea
proteinelor membranare. Mutațiile în aceste enzime sunt asociate cu declanșarea cancerului.
Dintre proteinele care suferă modificări lipidice sunt cele din familia RAS. Aceste proto –
oncogene sunt frecvent mutate în cancerele umane și sunt codificate de trei gene : KRAS(cea mai
frecventă în cancer), HRAS și NRAS. RAS aparțin familiei de proteine mici G, și sunt implicate
în creșterea, proliferarea și supraviețuirea celulară . Proteinele RAS sunt lipidate de către anumite
protein aciltransferaze ( DHH9 , DHH11, DHH17), enz ime ce au funcție oncogenică, dereglează
căile de semnalizare din cancer și prin acestă lipidare, este afectată interacțiunea membranară a
izoformelor RAS . Mutații în căile de semnalizare ale genei RAS (RAS -MAPK) blochează
proteina, ceea ce duce la exprimarea aberantă a acesteia și este asociată în multe cancere (Tabel
7). [Guan și Fierke 2011; Azmi 2016 ; Planey 2013; Rajasekharan și Raman 2013 ]
Calea de semnalizare MAPK (protein kin aze activate de mitogen) este inițiată de legarea
factorilor de creștere (TGF -α, EGF, VEGF, PDGF -α) de receptorii proteinei tirozin kinazei, care
activează tirozin kinaza. Prin f osforilarea tirozinei , factorii activatori ai RAS, numiți SOS (son sof
sevenless) din membrana plasmatică, se atașează la fosfotirozină prin intermediul proteinelor
adaptoare Grb2, care facilitează îndep ărtarea GDP de la RAS; RAS se leagă de GTP și fosforilează
RAF, MEK și ERK. ( Fig. 32). [Santarpia și colab., 2012; Roberts și Der 2007; Cristea și Sage
2016 ]
Tipul de cancer TIPUL GENEI RAS IMPLICATĂ
ADENOCARCINOM PANCRE ATIC K
CARCINOM TIROIDIAN H, K, N
CANCER DE COLON K
CANCER DE PLĂMÂNI K
CARCINOM OVARIAN K
MIELOM N, K
LEUCEMIE ACUTĂ/CRONICĂ N,K

47
CANCER DE PIELE H
Tabel 7. Tipuri cancere asociate cu RAS
Midgley și Kerr 2002

Figura 32 . Calea Ras/Mapk
www.journals.prous.com

2.2.7.2. Țintire în terapia anticanceroasă

O strategie alternativă în terapia antitumorală ar fi utilizarea unei combinații de inhib itori
ai căii de semnalizare Ras/Mapk , de exemplu cu inhibitori RAF, pentru tratamentul melanomului ,
și tratamentul cu inhibitori ai receptorului de creștere epidermal (EGFR), pentru cancerul
pulmonar, fără celule mici (NSCLC) ( Fig. 33 ), sau inhibitori ai histon deacetilazelor (HDAC), ca
apicidina; inhibitori ce au funcția de a deregla exprimări ale RAS, dar și a de încetini proliferarea
celulelor canceroase. [Mattingly 2013; Ahronian și Corcoran 2017 ; Rajasekharan și Raman 2013 ]
În scopul țintirii terapeutice a oncogenelor RAS, o metodă este încapsularea agenț ilor
antitumorali în nanovezicule (ex. lipozomi) , pentru a crește eficacitatea lor, dar și pentru a reduce
gradul de toxicitate a acestora împotriva celulelor normale. Prin utilizarea de astfel de
nanoparticule, șansele ca țesuturile tumorale sau celulele canceroase să fie țintite de către agentul
terap eutic este mai mare, față de acțiunea liberă a acestuia.

48
S-a cercetat acțiunea antitumorală a arsenicului, prin trioxidul de arsen, un compus ce induce
apoptoza, inhibă creșterea tumorală și reglează exprimarea K -Ras în diferite tipuri de cancer (
carcin oame pancreatice, cancerul de prostată, leucemie etc.), în care K -Ras este mutant.
Nanoveziculele (lipozomi) au fost realizate din polimeri de tip PEG (poli -etilen -glicol). Trioxidul
de arsen (ATO) este înglobat în lipozomi, care au fost încărcați în prea labil cu săruri metalice cum
sunt acetatul de nichel, cobalt, cupru, zinc etc. cu care trioxidul de arsen fomrează complexe. (Fig.
34). Lipozomii încărcați cu trioxidul de arsen sunt pe urmă injectați, ajung în circulația sangvină
unde sunt preluați de către celule le tumorale, nanoparticulele de arsen fiind astfel elibera te din
lipozomi, în tumori, la un pH scăzut. Trioxidul de arsen poate fi înglobat în lipozomi ca agent
singular, sau mai poate fi asociat și cu alți agenti antitumorali, în funcție de e ficiența lor dar și de
tipul de cancer în care aceștia sunt utilizați.
S-a constatat prin această metodă eficacitatea terapeutică a arsenului, studiu realizat pe șoareci,
prin încetinirea dezvoltării celulelor canceroase, creșterii tumorale în diferite tipuri de cancer
(pancreatic, colorectal, leucemie etc.) , decât în cazul în care agenții terapeutici / trioxidul de arsen
ar fi fost admini strați singular și liber, caz în care gradul de toxicitate ar fi fost prea puternic pentru
celulele normale și eficac itatea lor prea scăzută. [Ahn și colab., 2010; Akhtar și colab., 2017; Printz
2010; Chen și colab., 2006; Antman 2001; Balá z și Sedlák 2010 ]

Figura 33 . Inhibitori RAS
(ALK -kinaza limfomul ui anaplazic; PI3K -fosfoinozitol 3 kinaza)
www.genomemedicine.biomedcentral.com

49

Figura 34 . a. n anoparticule de a rsen; b. lipozomi cu arsen în săruri de nichel
c. lipozomi de arsen în săruri de cobalt
www.spandidos -publications.com
www.researchgate.net

50
3. METODE DE ANALIZĂ ȘI IDENTIFICARE A MODIFICĂRILOR
POST -SINTETICE A PROTEINELOR ÎN CANCER

În diagnosticul și tratamentul cancerului este deosebit de important identificarea
modificărilor post -sintetice a proteinelor în cancer, fiindcă acest lucru îmbunătățește șansele de
supraviețuire. Cu toate acestea, diagnosticarea inadecvată nu permite detectarea anumitor tipuri de
cancer decât în stadii finale.
Proteomica este un domeniu care avansează rapid, datorită evoluțiilor în ceea c e privește
spectrometria de masă și tehnologiile asociate cu aceasta. Scopul acestor tehnologii este detectarea
precoce a proteinelor modificate post -sintetic,dar și a siturilor lor în cancer și, dacă este posibil,
dezvoltarea de terapii. [Lu și colab., 20 07]
În prezent, s-au dezvoltat metode de analiză și identificare a proteinelor modificate
covalent , cum sunt cele bazate pe imunohistochimie (IHC), analiza imunoenzimatică (ELI SA),
spectrometria de masă, SILAC.

3.1. Spectrometria de masă
Spectrometria de masă este utilizată ca instrument de ident ificare a modificărilor post –
sintetice în funcție de abundența, schimbarea masei moleculare a proteinelor modificate. .
Identificarea proteinelor se poate realiza din soluții ce conțin proteine purificate și uneori din
amestecuri complexe. [Van der Merwe și colab., 2007]

3.1.1. Principiu
Pentru a identifica proteina de interes, pentru o anumită modificare post -sintetică, este
necesară digestia enzimatică a acesteia cu anumite enzime (tri psină sau alte proteaze), ca să fie în
fragmente peptidice mici pentru a facilita procesul de analiză , după ce proteinele au fost izolate și
separate prin electroforeză pe gel SDS -PAGE. Spectrometria de masă MALDI (MALDI -MS-
ionizarea prin desorbție laser asistată de o matrice ) presupune generarea de ioni protonați care se
separă la un moment dat, pe baza raportului dintre masa proteomică și încarcarea electrică (m/z)
și compararea maselor peptidice măsurate din spectrele obținute cu masele peptidice existente în
bazele date specifice. [Powers și Palecek 2012 ; Sickmann și colab., 2002; Larsen și colab., 2006;
Cheng și Zhang 2008 ]

51
3.1.2. Modificări post -sintetice identificate
Datorită faptului că, unele fosfopeptide, se găsesc în cantități reduse, pentru a se putea
identifica proteinele fosforilate prin MS s -a încercat îmbogățirea acestora din probele de analiză
prin utilizarea de anticorpi specifici împotriva fosfoserinei, fosfotreoninei,fosfotirozinei , enzime
specifice ca fosfataza, sau asocierea cu alte metode, de exemplu, cromatografia lichidă de înaltă
performanță (HPLC), care implică utilizarea de metale ca zinc, fier etc., pentru care fosfoproteinele
au afinitate. Situsurile proteinelor fosforilate pot fi identificate datorită modificărilor ce au loc în
masa moleculară a ionilor generați prin fragmentarea fosfopeptidelor.
Spectrometria de masă nu poate identifica tot timpul situsuri cu proteine fosforilate doar prin
digestia enzimatică cu o singură protează. Dacă este identificat un anumit situs de interes și se
dorește o analiză mai amănunțită pentru a detecta proteine fosforilate, proba de analiză se mai
poate scinda enzimatic cu o altă enzimă, care poate îmbunătăți detectarea.
Fosforilarea poate fi observată prin pierderea grupării fosfat ( -PO 3H, ce are masa de 80 Da ) din
timpul fragmentării peptidelor ( Fig. 35 ) În funcție de numărul de grupări fosfat pierdute, peptidele
fosforilate la resturile de serină și treonină sunt mai repede detectate față de cele fosforilate la
resturile de tirozină, deoarece gruparea fosfat es te pierdută mai ușor. [Parker și colab., 2010; Seo
și Lee 2004; Sickmann și colab., 2002; Johnson 2012; Witze și colab., 2007 ; Roboz 2002 ]

Figura 35 . Identificarea fosfopeptidelor prin schimbarea de masă indusă de digestia
enzimatică cu fosfatază prin spectrometria de masă
what -when -how.com/proteomics/protein -phosphorylation -analysis

52
Prin spectrometria de masă, pentru detectarea maselor peptidelor ubiquitinate și implicit a
peptidelor cu situsurile de ubiquitinizare la aminoacizii modificați, este necesară digestia
enzimatică cu tripsină, care are produce o peptidă ce conține –GG, ca ș i "etichetă de identificare"
la resturile de lizină ce sunt modificate (Fig. 36 ). Pentru a identifica cu precizie peptidele
modificate, se analizează proteina nemodificată, pentru a stabili cu exactitate peptidele noi
identificate în proteina ubiquitinată. [Parker și colab., 2010; Kirkpatrick și colab., 2005; Xu și
Jaffrey 2013; Xu și Peng 2006 ]

Figura 36 . Identificarea proteinelor ubiquitinate cu eticheta –GG
prin spectrometria de masă
www.ncbi.nlm.nih.gov

Prin spectrometria de masă, tip MALDI sunt astfel detectate și alte tipuri de modificări
post-sintetice, cu proteinele lor țintă . În Tabelul 8 , sunt prezentate câteva tipuri de modificări post –
sintetice și țintele lor, detectate prin spectrometri a de masă, în cancerul de sân. [Kriegsmann și
colab., 2015; Powers și Palecek 2012]

Modificarea post -sintetică Ținte
Fosforilare Receptorul nuclear
Fosforilare Receptorul pentru Estrogen (ER)
Acetilare ER-α
Deacetilare Histon deacetilaza (HDAC)3 H4

53
Glicozilare Proteine serice
Glicozilare Glicani serici
Glicozilare Glicoproteine din seruri
Tabel 8 . Modificări post -sintetice identificate prin MS în cancerul de sân
[Jin și Zangar 2009 ]

3.2. Imunohistochimia
3.2.1. Principiu
Imunohistochimia (IHC) este o metodă ce utilizează anticorpi specifici pentru detectarea și
analiza unor proteine modificate dintr -o probă sau țesut, ce pot fi vizualizați prin colorarea cu
fluorofor (imunoflorescență) sau cu anumite enzime (peroxidază, fosfatază alcalină ).
Prin această metodă se pot determina tipurile de celule canceroase, clasifica tipul de cancer
și posibila origine a celulei canceroase respective. [Duraiyan și colab., 20 12; Idiko 2010; Matos și
colab., 2010 ]

3.2.2. Modificări post -sintetice identificate
Pentru detectarea proteinelor fosforilate țintă este necesară utilizarea unor anticorpi fosfo –
specifici. Astfel, va face posibilă identificarea situsurilor de activare de pe anumiți receptori
fosforilați care sunt implicați în diferite cancere, ca receptorul hormonilor pentru estrogen și
progesteron, markerul Her2 ( Fig. 37 ) la pacienții cu cancer mama r, proteina p16 ca marker de
substituție în infecția cu virusul papilloma (H PV) și cancerul asociat cu acest virus, și proteina p63
asociată cu cancerul de prostată.
Dacă sunt utilizați anticorpi împotriva unui anumit situs de fosforilare dintr -un țesut, este
necesar eliminarea grupărilor fosfat prin digestia cu fosfatază, pentru a nu se detecta colorația în
secțiunea tratată cu fosfatază. În cazul utilizării de anticorpi care sunt specifici pentru un anumit
receptor tirozin kinazic (de ex. Her2), prin aplicarea tehnologiei Western blot, va fi posi bilă
identificarea reacției dintre tirozin kinazele fosfor ilate și anticorpii respectivi. [Duraiyan și colab.,
2012; Mandell 2003 ]

54

Figura 37 . Identificarea prin imunohistochimie a Her2
a. negativ; b. neconcludent; c. pozitiv
www.nature.com/modpathol/journal

3.3 Tehnologia m icroarray
Prin această tehnologie este posibilă detectarea diferitelor modificări post -sintetice, atunci când
detectarea lor este neclară sau imposibilă prin alte tehnici (ex. IHC, MS etc.)

3.3.1. Principiu
Tehnologia m icroarray reprezintă sisteme de analiză care co nțin compuși cu densitate mare
(anticorpi, enzime , proteine, gene etc.) ce permit detecția simultană a mai multor compuși de
interes din cantități destul de mici de probă printr -o singură analiză.
Există mai multe tipuri de microarray: (Fig. 38 )
 ADN microarray în care ADN genomic este tăiat în fragmente mici prin utilizarea
unor endonucleaze de restricție, și marcat cu markeri fluorescenți. Identificarea se face prin
colorația fluorescentă emisă, prin care se poate se poate detecta prezența sau amplificarea genelor
supresoare de tumori, din diferite tipuri de canc er ca melanom, cancer de sân, carcinom gastric
etc.
 Protein microarray în care anticorpii microarray sunt utilizați în scopul detectării
proteinelor modificate post -sintetic ce sunt implicate în cancer, a interacțiunii dintre aceste
proteine, dar și a identificării substratelor protein kinazelor . De asemenea, mai sunt utilizați diferiți
compuși ca lectine pentru detectarea glicoproteinelor modificate, peptide pentru a evalua
activitatea enzimatică a unor enzime implicate în căile de semnalizare ale ace stor modificări post –
sintetice. [Powers și Palecek 2012; Uzoma și Zhu 2013; Jin și Zangar 2009; Govindarajan și colab.,
2012]

55

Figur a 38. Tipuri de tehnologii microarray
www.cell.com

3.3.2. Modificări post -sintetice identificate
Prin metoda ELISA micro array , pentru identificarea proteinelor fosforilate, se utilizează
un anticorp de captare, pentru proteina țintă, după care este adăugat un alt anticorp care are
specificitate pentru situl de fosforilare a proteinei care este supusă analizei. Detectarea proteinei
fosforilate de interes se face prin chemiluminiscența și analiza intensității spoturilor de pe filmele
autoradiografice care exprimă gradul de concentrație al proteinei de interes în probă. Astfel, se pot
detecta modificări la nivelul situsului de fosfor ilare ale proteinelor (ex. Bcr -Abl, EGFR) , care sunt
asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul pancre atic, leucemia cronică mieloidă, cancerul
de prostată etc. [Merbl și Kirschner 2010; Gembitsky și colab., 2004; Atak și colab., 2016]
O altă modificare post -sintetică, în care aceste tehnici de array de proteine sunt aplicate
este glicozilarea. Pentru identificarea proteinelor glicozilate modificate, sunt utilizate compuși ca
autoanticorpi împotriva unor glicopeptide și lectine , cu afinitate pentru glicoproteine, care ar
facilita astfel detecția glicop roteinelor modificate în cancer sau a unor antigene (CA 19 -9, CA 15 –
3, CA -125), care ar putea fi utilizate ca biomarkeri în diagnostic . Astfel, se pot detecta modificări
la nivelul sit usului de glicozilare ale proteinelor (ex. mucine – MUC1, MUC5, MUC16 , alfa
fetoproteina), care sunt asociate cu diferite tipuri de cancer ca și cancerul de piele, cancerul
hepatocelular, cancerul pancreatic, cancerul colorectal etc. [ Atak și colab., 2016; Jacob și colab.,
2011; Patwa și colab., 2010 ; Powers și Palecek 2012]

56
3.4. Analiza SILAC
3.4.1. Principiu
SILAC ( marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili în culturi de celule) este o metodă de
analiză bazată pe marcarea chimică/metabolică a unor aminoacizi cu N15, C13 (care nu sunt
radioactivi) și pe spectrometria de masă ce permite identificarea diferitelor modificări post –
sintetice ale proteinelor, prin compararea maselor moleculare a peptidelor modificate sau
nemodificate detectate, care încorporează aminoacizii ,,grei”, cu masa moleculară standard .
Metoda presu pune marcarea a două tipuri de culturi de celule , una cu aminoacizi mai ușori cu
izotopi 12 C și 14N și cealaltă cu aminoacizi marcați în prealabil cu izotopi grei ca 13C și 15N.
De regulă, aminoacizii utilizați pentru această metodă sunt leucina, lizina și arginina pentru că,
după ce celulele se divid și încoporează toți aminoaicizii cu izotopi, și sunt mai apoi degradate cu
enzime pro teolitice ca tripsina, acești aminoacizi generează peptide cu masă moleculară ridicată
care poate fi detectată și cuantificată prin spectrometria de masă. [Ong și colab., 2002; Mann 2006;
Chaube 2014; Dephoure și colab., 2013 ]

3.4.2. Modificări post -sintetice identificate
O modificare post -sintetică în care metoda SILAC este aplicată, este fosforilarea, pentru a
studia fosfoproteomul pentru identifica situsurile modificate de fosforilare ale proteinelor
implicate în cancer, precum și abundența relativă a acestora. S-au realiza t studii pe receptorii sau
non-receptorii activați de kinază (de ex. Her2, receptorii celulelor T, EGF, PDGF etc.) pentru a
identifica care dintre aceștia prin căile lor de semnaliz are, sunt activați în cancer. Culturile celulare
au fost marcate cu aminoacizi, după care, s -au utilizat anticorpi împotriva fosfotirozinei pentru a
izola fosfo proteomul , iar proteinele astfel precipitate au fost analizate prin spectrometria de masă .
Pract ic, prin SILAC au fost identificate situsurile proteinelor fosforilate, prin modificările apărute
în urma fosforilării. (Fig. 39 ) [Zhang și Neubert 2009; Woods și Darie 2014; Ibarrola și colab.,
2003; Dephoure și colab., 2013 ]

57

Figura 36. Monitorizarea modificărilor în fosforilarea proteinelor prin
Metoda SILAC
www.researchgate.net

a. Cromatografie ionică analizată prin MS. Picurile reprezintă semnalul ionic al peptidelor
individuale
b. Scanări MS al unei peptide nefosforilate și a unei peptide fosforilate. Spectrul din stânga
prezintă mediul normal ( arg 12C) și cel marcat cu arginină 13C pentru peptida
nefosofrilată, cu raportul de 588 (m/z) pentru mediul normal și 591( m/z) pentru med iul
marcat.
Spectrul din dreapta prezintă mediul normal și cel marcat cu arginină 13C pentru
fosofopeptide, cu raportul de 628 (m/z) pentru mediul normal și 632 (m/z) pentru mediul
marcat.
– Mediu normal cu arginină 12C; – mediu marcat cu arginină 13C

58
CONCLUZII

În această lucrare de disertație s -a urmărit prezentarea principalelor aspecte privind
modificările post -sintetice întâlnite la proteine în cancer.
Metodele tehnologice avansate precum spectrometria de masă, imunohistochimia,
tehnologia array și analiza SILAC sunt disponibile din ce în ce mai mult pentru identificarea și
caracterizarea acestor tipuri de modificări post -sintetice.
S-a încercat evidenți erea cât mai precisă a modificărilor post -sintetice (acetilare,
fosforilare, m etilare, glicozilare, nitrare, ubiquitinare și lipidare ) și rolul pe care îl au proteine le
modificate în transcrierea genetică, activitățile enzimatice, procesele de semnalizare celulară pe
care celulele le manifestă în timpul transformării lor pentr u a deveni celule neoplazice, prin
utilizarea de figuri, scheme și tabele.
Datorită rolului pe care îl au proteinele modificate în patologia bolii și prin înțelegerea
mecanismelor de acțiune în progresia cancerului, acestea devin obiective pentru dezvoltarea de
medicamente/terapii antitumorale.

59
BIBLIOGRAFIE

1. Adjei A.A., Hidalgo M., 2005, Intracellular signal transduction pathway proteins
as targets for cancer therapy, J. Clin. Oncol., 23(23), pp. 5386 -5403.
2. Ahn R.W., Chen F., Chen H., Stern S.T., et al., 2010, A novel nanoparticulate
formulation of arsenic tri oxide with enhanced therapeutic efficacy in a murine model breast cancer,
Clin. Cancer Res. , 16(14), pp. 3607 -3617.
3. Ahronian L.G., Corcoran R.B., 2017, Strategies for monitoring and combating
resistance to combination kinase inhibitors for cancer therapy, Genome Medicine , 9(37), pp. 1 -12.
4. Akhtar A., Wang S.X., Ghali L., et al., 2017, Recent advances in arsenic trioxide
encapsulated nanoparticles as drug delivery agents to solid cancers, J. Biomed. Res. , 31(3), pp.
177-188.
5. Antman K.H., 2001, Introduction: The history of arsenic trioxide in cancer therapy,
The Oncol. , 6(2), pp. 1 -2.
6. Arora A., Scholar E.M., 2005, Role of tyrosine kinase inhibitors in cancer therapy,
Perspectives in Pharmacol. , 315(3), pp. 971 -979.
7. Ashley J.D., 2016, Dual Carfilzomib and Doxorubicin loaded liposomal
nanoparticles for synergistic efficacy in multiple myeloma, Mol. Cancer. Ther. , 15(7), pp. 1452 –
1459.
8. Atak A., Mukherjee S., Jain R., Gupta S., et al., 2016, Protein microarray
applications: Autoanti body detection and postranslational modification, Proteomics , 16(19), pp.
2557 -2569.
9. Award A.B., Bradford P.G., 2005, Dietary compounds that protect froma cancer:
Polyphenols, Nutrition and cancer prevention , Editura CRC Press, pp. 140 -141.
10. Azmi A.S., 2016 , Activation of RAS by post -translational modifications,
Conquering RAS: From biology to cancer therapy , 1st edition, Editura Academic Press, Oxford,
pp. 104 -105.
11. Baccarani M., Pileri S., Steegmann J.L., Muller M., Soverini S., Dreyling M., 2012,
Chronic m yeloid leukemia: ESMO Clinical Guidelines for diagnosis, treatment and follow -up,
Ann. Oncol ., 23(7), pp. 72 -77.
12. Baláz P., Sedlák J., 2010, Arsenic in cancer treatment: Challenges for application
of realgar nanoparticles (a minireview), Toxins , 2, pp. 1568 -1581.
13. Bari S.B., Surana S.J., 2012, Tyrosine kinase receptor inhibitors: A new target for
anticancer drug development, J. Phar. SciTech., 1(2), pp. 36 -45.

60
14. Basakran N.S., 2015, CD44 as a potential diagnostic tumor marker, Saudi Med. J.,
36(3), pp. 273-279.
15. Bedard K., Krause K.H., 2007, The NOX familly of ROS -generating NADPH
oxidases: Physiology and pathophysiology, Physiol Rev , 87, pp. 245 -313.
16. Bedford M.T., Richard S., 2006, Arginine methylation: An emerging regulator of
protein function, Molec. C ell, 18, pp. 263 -272.
17. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Protein structure and function,
Biochemistry , 5th edition, Editura W.H. Freeman and Company, New York.
18. Capello F., Conway de Macario E., Marasà L., Zummo G., Macario A.J.L., 2008,
Hsp60 expre ssion, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy,
Cancer Biol. & Ther. , 7(6), pp. 801 -809.
19. Charkie J., 2014, Psammaplin A: A putative adjuvant for DNA damaging therapies,
J. Cancer. Sci.Ther. , 6(2), pp. 505 -509.
20. Chaube R., 2014, Absolute quantitation of post -translational modifications, Front.
Chem. , 2(58), pp. 1 -3.
21. Chen H., MacDonald R.C., Li S., Krett N.L., et al., 2006, Lipid encapsulation of
arsenic trioxide attenuates cytoxicity and allows for controlled anti cancer drug release, J. Am.
Chem. Soc. , 128(41), pp. 13348 -13349.
22. Cheng L., Zhang D.Y., 2008, Introduction to clinical proteomics, Molecular
genetic pathology , Editura Humana Press, pp. 232 -238.
23. Choudhari S.K., Chaudhari M., Bagde S., et al., 2013, Nitric oxide and cancer: a
review, World J. Surgical Oncol., 11(118), pp. 1 -11.
24. Ciocca D.R., Calderwood S.K., 2005, Heat shock proteins in cancer: diagnostic,
prognostic, predictive, and treatment implications, Cell Stress & Chaperones , 10(2), pp. 86 -103.
25. Cooper G.M., 2000, Protein folding and processing, The Cell: A molecular
approach , 2nd edition, Editura Sinauer Associates, Sunderland (MA).
26. Cooper G.M., 2000, The development and causes of cancer, The Cell: A molecular
approach , 2nd edition, Editura Sinauer Asso ciates, Sunderland (MA).
27. Cristea S., Sage J., 2016, Is the canonical RAF/MEK/ERK signaling pathway a
therapeutic target in SCLC?, J. Thorac. Oncol. , 11(8), pp. 1233 -1241.
28. Culf M., Culf A., 2014, Protein acetylation as an integral part of metabolism in
cancer development and progression, Am. J. Cancer Rev. , 2(1), pp. 1 -23.
29. Dall’Olio F., Trinchera M., 2017, Epigenetic bases of aberrant glycosylation in
cancer, Int. J. Mol. Sc i., 18(998), pp. 1 -19.

61
30. De Sanctis F., Sandri S., Ferrarini G., Pagliarello I., et al., 2014, The emerging
immunological role of post -translational modifications by reactive nitrogen species in cancer
microenvironment, Front. Immunol. , 5(69), pp. 1 -12.
31. Deph oure N., Gould K.L., Gygi S.P., Kellogg D.R., 2013, Mapping and analysis of
phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists, Mol. Biol. Cell ., 24(5), pp. 535 -542.
32. Dervisis N., Klahn S., 2016, Therapeutic innovations: Tyrosine kinase inhibitors in
cancer, Vet. Sci. , 3(4), pp. 1 -11.
33. Di Cerbo V., Schneider R., 2013, Cancers with wrong HATs: the impact of
acetylation, Briefings in Functional Genomics , 12(3), pp. 231 -243.
34. Duan G., Walther D., 2015, The roles of post -translational modifications in the
context of protein interaction networks, PloS Comput. Biol. , 11(2), pp. 1 -23.
35. Duraivan J., Govindaraian R., Kalivappan K., Palanisamy M., 2012, Applications
of immunohistochemi stry, J. Pharm. Bioallied. Sci. , 4(2), pp. 307 -309.
36. Dwarakanath B.S., Verma A., Bhatt A.N., Parmar V.S., Raj H.G., 2008, Targeting
protein acetylation for improving cancer therapy, Ind. J. Med. Res., 128, pp. 13 -21.
37. Eliaz R.E., Szoka C.Jr., 2001, Liposome encapsulated Doxorubicin targeted to
CD44: A strategy to kill CD44 overexpressing tumor cells, Cancer Res. , 61, pp. 2592 -2601.
38. Focosi D., 2016, Resistance to tyrosine kinase inhibitors in different types of solid
cancer Resistance to tyrosine kinase inhibitors , Editura Springer, Italia, pp. 45 -47.
39. Folmer F., Orlikova B., Schnekenburger M., Dicato M., Diederich M., 2010,
Naturally occurring regulators of histone acetylation/deacetylation, Current Nutr.& Food Sci. , 6,
pp. 78 -99.
40. Gallo L.H., Ko J., Donog ue D.J., 2017, The importance of regulatory ubiquitination
in cancer and metastasis, Cell Cycle , 16(7), pp. 634 -648.
41. Gembitsky D.S., Lawlor K., Jacovina A., Yaneva M., Tempst P., 2004, A prototype
antibody microarray platform to monitor changes in protein tyrosine phosphorilation, Molec. &
Cell. Proteomics , 3(11), pp. 1102 -1118.
42. Gnyszka A., Jastrz ębski Z., Flis S., 2013, DNA methyltransferase inhibitors and
their emerging role in epigenetic therapy of cancer, Anticancer Res. , 33, pp. 2989 -2996.
43. Govindarajan R., Duraivan J., Kalivappan K., Palanisamy M., 2012, Microarray
and it’s applications, J. Pharm. Bioallied. Sci ., 4(2), pp. 310 -312.
44. Guan X., Fierke C.A., 2011, Understanding protein palmitoylation: Biological
significance and enzymology, Sci. China Chem. , 54(12), pp. 1888 -1897.

62
45. Haery L., Thompson R.C., Gilmore T.D., 2015, Histone acetyltransferases and
histone deacetylases in B – and T -cell development, physiology and malignancy, Genes&Cancer ,
6(5-6), pp. 184 -213.
46. Halliwell B., 2007, Oxidative stress and cancer: Have we moved forward?,
Biochem. J. , 401, pp. 1 -11.
47. Halsall J.A., Turner B.M., 2016, Histone deacetylase inhibitors for cancer therapy:
An evolutionarily ancient resistance response may explain their limited success, Bioessays , 38, pp.
1102-1110.
48. Hamamoto R., Nakamura Y., 2016, Dysregulation of protein methyltransferases in
human cancer: An emerging target class for anticancer therapy, Cancer Sci., 107, pp. 377 -384.
49. Hickok J.R., Thomas D.D., 2010, Nitric oxide and cancer therapy: The emperor has
no clothes, Curr. Pharm. Des. , 16(4), pp. 381 -391.
50. Ho L.W., Hsu W.M., Huang M.C., Kadomatsu K., Nakagawara A., 2016, Protein
glycosylation in cancers and its potential therape utic applications in neuroblastoma, J. Hematol.
Oncol. , 9(1), pp. 1 -15.
51. Huang X., Dixit V.M., 2016, Drugging the undruggables: exploring the ubiquitin
system for drug development, Cell Res. , 26, pp. 484 -498.
52. Ibarrola N., Kalume D.E., Gronborg M., Iwahori A ., Pandei A., 2003, A
proteosomic approach for quantitation of phosphorylations using Stable Isotope Labelling in Cell
Culture, Anal. Chem ., 75(22), pp. 6043 -6049.
53. Idikio H.A., 2009, Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology:
contributions of p rotein life -cycle, use of evidence -based methods and data normalization on
interpretations of immunohistochemical stains, Int. J. Clin. Exp. Pathol., 3(2), pp. 169 -176.
54. Issa M.E., Takhsha F.S., Chirumamilla C.S., Perez -Novo C., et al., 2017,
Epigenetic str ategies to reverse drug resistance in heterogenous multiple myeloma, Clin. Epig. ,
9(17), pp. 1 -13.
55. Jacob F., Goldstein D.R., Bovin N.V., Pochechueva T., et al., 2012, Serum
antiglycan antibody detection of nonmucinous ovarian cancers by usig a printed glyc an array, Int.
J. Cancer , 130, pp. 138 -146.
56. Jain P., Tiwari M., kumar N., Rao J.V., Udupa N., 2016, Orally delivered decitabine
loaded PLGA nanoparticles combined with docetaxel supress solid tumors: an in vitro
investigation, Res. J. Pharm. Biol.&Chem. Sc i., 7(5), 417 -424.
57. Jego G., Hazoumé A., Seigneuric R., Garrido C., 2013, Targeting heat shock
proteins in cancer, Cancer Letters , 332, pp. 275 -285.

63
58. Jin H., Zangar R.C., 2009, Protein modifications as potential biomarkers in breast
cancer, Biomarker Insight s, 4, pp. 191 -200.
59. Johnson M., 2012, Protein modification research methods, Mater Methods , 2(118),
pp. 1 -12.
60. Kamura T., Sato S., Iwai K., Czyzyk -Krzeska M., et al., 2000, Activation of HIF1α
ubiquitination by a reconstituted von Hippel -Landau (VHL) tumor supressor complex, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. , 97(19), pp. 10430 -14035.
61. Kaneal R., Gupta S., 2012, Epigenetic modifications in cancer, Clin Genet. , 81(4),
pp. 303 -311.
62. Kar G., Keskin O., Fraternali F., Gursoy A., 2013, Emerging role of the ubiquitin –
protesome system as drug targets, Current Pharmaceutical Design, 19(00), pp. 1 -15.
63. Karve T.M., Cheema A.K., 2011, Small changes huge Impact: The role of protein
post-translational modifications in cellular homeostasis and disease, J. Amino Acids , 2011 , pp. 1 –
13.
64. Kim S.H., Kang H.J., Na H., Lee M.O., 2010, Trichostatin A enhances acetylation
as well as protein stabililty of Erα through induction of p300 protein, Cancer Res ., 12(2), pp. 1 -8.
65. Kim Y.Z., 2015, Protein methylation and demethylation in cancer, Int. J. Ne urol.
Research, 1(3), 129 -140.
66. Kirkpatrick D.S., Denison C., Gygi S.P., 2005, Weighing in on ubiquitin: The
expanding roles of mass spectrometry based proteomics, Nat. Cell. Biol. , 7(8), pp. 750 -757.
67. Kotamraju S., Willams C.L., Kalyanaraman B., 2007, Stati n induced breast cancer
cell death: Role of inducible nitric oxide and arginase dependent pathways, Cancer Res. , 67(15),
pp. 7386 -7394.
68. Kriegsmann M., Arens N., Endris V., Weichert W., Kriegsmann J., 2015, Detection
of KRAS, NRAS, BRAF by mass spectrometr y- a sensitive, reliable, fast and cost -effective
technique, Diagnostic Pathology , 10(132), pp. 1 -11.
69. Kwak T.W., Kim D.H., Jeong Y.I., Kang D.H., 2015, Antitumor activity of
vorinostat – incorporated nanoparticles against human cholangiocarcinoma cells, J.
Nanobiotechnol. , 13(60), pp. 1 -11.
70. Lakshmaiah K.C., Jacob L.A., Aparna S., Lokanatha D., Saldanha S.C., 2014,
Epigenetic therapy of cancer with histone deacetylase inhibitors, J. Cancer Res.&Ther. , 10(3), pp.
469-478.
71. Larsen M.R., Trelle M.B., Thingholm T. E., Jensen O.N., 2006, Analysis of
posttranslational modifications of proteins by tandem mass spectrometry, Biotechniques , 40(6),
pp. 790 -798.

64
72. Lewandowska J., Bartoszek A., 2011, DNA methylation in cancer development,
diagnosis and therapy – multiple opport unities for genotoxic agents to act as methylome disruptors
or remediators, Mutagenesis , 26(4), pp. 475 -487.
73. Li M., Song L., Qin X., 2010, Glycan changes: cancer metastasis and anti -cancer –
vaccines, J. Biosci., 35, pp. 665 -673.
74. Li Y., seto E., 2016, HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and
therapy, Cold Spring Harb. Prospect Med., 6, pp. 1 -34.
75. Lu B., Huang X., Mo J., Zhao W., 2016, Drug delivery using nanoparticles for
cancer stem -like cell targeting, Front. Pharmacol. , 7(84), pp. 1 -12.
76. Lu H., Ou yang W., Huang C., 2006, Inflammation, a key event in cancer
development, Mol. Cancer Res ., 4(4), pp. 221 -233.
77. Lu M., Faull K., Whitelegge J.P., He J., et al., 2007, Proteomics and mass
spectrometry for cancer biomarker discovery, Biomarker Insights , 2, pp. 347 -360.
78. Mandell J.W., 2003, Phosphorylation state -specific antibodies. Applications in
investigative and diagnostic pathology, Am. J. Path. , 163(5), pp. 1687 -1698.
79. Mann M., 2006, Functional and quantitive proteomics using SILAC, Nat. Rev. Mol.
Cell Biol. , 7(12), pp. 952 -958.
80. Marchion D., Münster P., 2007, Development of histone deacetylase inhibitors for
cancer treatment, Expert Rev. Anticancer Ther., 7(4), pp. 583 -598.
81. Marslin g., Revina A.M., Megraj V.K., Balakumar K.K., Prakash J., et al., 2015,
Delivery as nanoparticles reduces imatinib mesylate -induced cardiotoxicity and improves
anticancer activity, Int. J. Nanomed. , 10, pp. 3163 -3170.
82. Martin T.A., Ye L., Sanders A.J., Lane J., Jiang W.G., 2013, Cancer invasion and
metastasis: Molecular and cel lular perspective, Madame Curie Bioscience Database , Editura
Landes Bioscience, Austin (TX), pp. 1 -54.
83. Masri F., 2010, Role of nitric oxide and its metabolites as potential markers in lung
cancer, Ann. Thoracic Medicine , 5(3), pp. 123 -127.
84. Matos L., Trufel li D.C., Matos M.G., Pinhal A.S., 2010, Immunohistochemistry as
an important tool in biomarkers detection and clinical practice, Biomark Insights , 5, pp. 9 -20.
85. Mattingly R.R., 2013, Activated Ras as a therapeutic target: constraints on directly
targeting R as isoforms and wild -type versus mutated proteins, ISRN Oncology , 2013 , pp. 1 -14.
86. Medina F.J., 2016, The road ahead of the Epi -informatics fiels, Epi-informatics:
Discovery and development of small molecule epigenetic drugs and probes , 1st edition, Editura
Academic Press, Oxford, pp. 411 -413.

65
87. Merbl Y., Kirschner M.W., 2011, Protein microarrays for genome -wide
posttranslational modification analysis, Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. , 3(3), pp. 347 -356.
88. Micel N.L., Tentler J.J., Smith P.G., Eckhardt S.G., 2013, Role of ubiquitin ligases
and the proteasome in oncogenesis: Novel targets for anticancer therapies, J. Clin. Oncol. , 31, pp.
1231 -1238.
89. Midgley R.S., Kerr D.J., 2002, Ras as a target in cancer th erapy, Critical Rev.
Oncol. Hematol ., 44(2), pp. 109 -120.
90. Misra S., Heldin P., Hascall V.C., Karamanos N.K., Skandalis S.S., et al., 2011,
HA/CD44 interactions as potential targets for cancer therapy, FEBS. J., 278(9), pp. 1429 -1443.
91. Mitra A., Shevde L.A., Samant R.S., 2008, Multi -faced role of HSP40 in cancer,
Clin. Exp. Metastasis , 26, pp. 559 -567.
92. Morettin A., Baldwin R.M., Côté J., 2015, Arginine methyltransferases as novel
therapeutic targets for breast cancer, Mutagenesis , 30, pp. 177 -189.
93. Murphy M.E., 2013, The HSP70 family and cancer, Carcinogenesis , 34(6), pp.
1181 -1188.
94. Nahoum S.R., 2006, Why cancer inflammation?, Yale J. Biol. Med. , 79(3-4), pp.
123-130.
95. Narayan S., Bader G.D., Reimand J., 2016, Frequent mutations in acetylat ion and
ubiquitination sites suggest novel driver mechanisms of cancer, Gen. Med. , 8(55), pp. 1 -13.
96. Neupane R.Y., Srivastava M., Gyenwalee S., Ahmad N., et al., 2014, Solid lipid
nanoparticles for oral delivery of decitabine: Formulation optimization, char acterization, stability
and ex -vivo gut permeation studies, Sci. Adv. Mater ., 6, pp. 1 -13.
97. Nishida N., Yano H., Nishida T., Kamura T., Kojiro M., 2006, Angiogenesis in
cancer, Vasc. Health Risk Manag., 2(3), pp. 213 -219.
98. Ong S.E., Blagoevt B., Kratchmarovat I., Kristensen D.B., et al., 2002, Stable
Isotope Labbeling by Aminoacids in Cell Culture, SILAC, as a simple and accurate approach to
expression proteomics, Moll. Cell. Proteomics , 1(5), pp. 376 -386.
99. Owens W.T., Gilmor e P.A., Streuli C.H., Foster F.M., 2013, Inhibitor of apoptosis
proteins: Promising targets for cancer therapy, J. Carcinog. Mutagen , 14, pp. 1 -9.
100. Pandey H., Rani R., Agarwal V., 2016, Liposome and their applications in cancer
therapy, Braz. Arch. Biol. Te chnol. , 59, pp. 1 -10.
101. Parker C.E., Mocanu V., Mocanu M., Dicheva N., Warren M.R., 2010, Mass
spectrometry for post -translational modifications, Neuroproteomics , Editura CRC
Press/Taylor&Francis, Boca Raton (FL).

66
102. Patwa T., Li C., Simeone D.M., Lubman D.M., 2010, Glycoprotein analysis using
protein microarrays and mass spectrometry, Mass Spectrom. Rev., 29(5), pp. 830 -844.
103. Petsko G.A., Ringe D., 2004, Protein Structure and Function , Editura New Science
Press Ltd., London, pp. 126 -127.
104. Pezzella F., Harris A.L ., Tavassoli M., Gatter K.C., 2015, Blood vessels and cancer
much more than angiogenesis, Cell Death Discov., 1, pp. 1 -2.
105. Planey S.L., 2013, Discovery of selective and potent inhibitors of plamitoylation,
Drug discovery , Editura Intech, pp. 251 -276.
106. Poulard C., Corbo L., Le Romancer M., 2016, Protein arginine
methylation/demethylation and cancer, Oncotarget , 7(41), pp. 67532 -67550.
107. Powers A.D., Palecek S.P., 2012, Protein analytical assays for diagnosing,
monitoring, and choosing treatment for cancer patient, J. Healthc. Eng., 3(4), 503 -534.
108. Prager G.W., Poettler M., 2012, Angiogenesis in cancer. Basic mechanisms and
therapeutic advances, Hamostaseologie , 32(2), pp. 105 -114.
109. Printz C., 2010, Arsenic nanoparticle holds promise in blocking agressive bre ast
cancer, Cancer , 116(24), pp. 5567.
110. Rajasekharan S.K., Raman T., 2013, Ras and Ras mutations in cancer, Cen. Eur. J.
Biol., 8(7), pp. 609 -624.
111. Rayburn E.R., Ezell S.J., Zhang R., 2009, Anti -inflamatory agents for cancer
therapy, Mol Cell Pharmacol. , 1(1), pp. 29 -43.
112. Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M., Aggarwal B.B., 2010, Oxidative stress,
inflammation, and cancer: How are they linked?, Free Radic. Biol. Med. , 49(11), pp. 1603 -1616.
113. Reuter S., Gupta S.C., Park B., Aggarwal B.B., 2011, Epigenetic c hanges induced
by curcumin and other natural compounds, Genes Nutrs. , 6(2), pp. 93 -108.
114. Rivankar S., 2014, An overview of doxorubicin formulations in cancer therapy, J.
Cancer Res.& Ther. , 10(4), pp. 853 -858.
115. Roberts P.J., Der C.J., 2007, Targeting the RAF -MEK -ERK mitogen -activated
protein kinase cascade for the treatment of cancer, Oncogene , 26, pp. 3291 -3310.
116. Robinson P.A., Ardley H.C., 2004, Ubiquitin -protein ligases, J. Cell Sci. , 117, pp.
5191 -5194.
117. Roboz J., 2002, Mass spectrometry in cancer research , Editura CRC Press, pp.
387-388.
118. Romana B., Batger M., Prestidge C., Colombo G.,Sonvico F., 2014, Expanding the
therapeutic potential of statins by means of nanotechnology enabled drug delivery systems, Curr.
Topics Med. Chem. , 14, pp. 1182 -1193.

67
119. Ropero S. , Esteller M., 2007, The role of histone deacetylases (HDACs) in human
cancer, Molec. Oncol. , 1, pp. 19 -25.
120. Roxburgh C.S.D., McMillan D.C., 2014, Cancer and systemic inflammation: treat
the tumor and treat the host, Br. J. Cancer. , 110(6), pp. 1409 -1412.
121. Sager R., 1997, Expression genetics in cancer: Shifting the focus from DNA to
RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 94, pp. 952 -955.
122. Sane S., Rezvani K., 2017, Essential Roles of E3 Ubiquitin ligases in p53
regulation, Int. J. Mol. Sci. , 18(2), pp.1 -20.
123. Santarp ia L., Lippman S.L., El -Naggar A., 2012, Targeting the mitogen -activated
protein kinase RAS -RAF signaling pathway in cancer therapy, Expert Opin. Ther. Targets , 16(1),
pp. 103 -119.
124. Sawant S., Shekogar R., 2014, Cancer research and therapy: Where are we tod ay?,
Int. J. Cancer Ther.& Oncol. , 2(4), pp.1 -18.
125. Seo J., Lee K.J., 2004, Post-translational modifications and their biological
functions: Proteomic analysis and systematic approaches, J. Biochem.& Molec. Biol. , 37(1), pp.
35-44.
126. Shangary S., Wang S., 2008 , Targeting the MDM2 –p53 interaction for cancer
therapy, Clin. Cancer Res., 14(17), pp. 5318 -5324.
127. Shchemelinin I., Šefc L., Nečas E., 2006, Protein kinases, their function and
implication in cancer and other diseases, Folia Biologica (Praha) , 52, pp. 81-101.
128. Sheta R., Bachvarov D., 2014, Role of aberrant glycosylation in ovarian cancer
dissemination, Biomed. Reviews , 25, pp. 83 -92.
129. Shi D., Grossman S.R., 2010, Ubiquitin becomes ubiquitinous in cancer. Emerging
roles of ubiquitin ligases and deubiquitin ases in tumorigenesis and as therapeutic targets, Cancer
Biology & Therapy, 10(8), pp. 737 -747.
130. Sickmann A., Mreyen M., Meyer H.E., 2002, Identification of modified proteins
by mass spectrometry, I.U.B.M.B. Life , 54(2), pp. 51 -57.
131. Singh B., Zhang G., Hwa Y .L. Li J., et al., 2010, Nonhistone protein acetylation as
cancer therapy targets, Expert Rev. Anticancer Ther. , 10(6), pp. 935 -954.
132. Sosa V., Moliné T., Somoza R., Paciucci R., et al., 2012, Oxidative stress and
cancer: an overview, Ageing Res. Rev., 12(1), pp. 376 -390.
133. Spataro V., Norbury C., Harris A.L., 1998, The ubiquitin -proteasome pathway in
cancer, Brit. J. Cancer , 77(3), pp. 448 -455.
134. Sun Y., 2006, E3 ubiquitin ligases as cancer targets and biomarkers, Neoplasia ,
8(8), pp. 645 -654.

68
135. Tóth K.F., Knoch T .A., Wachsmuth M., Frank -Stöhr M., et al., 2004, Trichostatin
A-induced histone acetylation causes decondensation of interphase chromatin, J. Cell Sci. ,
117(18), pp. 4277 -4287.
136. Tran T.H., Chu D.T., Truong D.H, Tak J.W., et al., 2016, Development of lipid
nanoparticles for a histone deacetylases inhibitor as a promising anticancer therapeutic, Drug
delivery , 23(4), pp. 1335 -1343.
137. Tucillo F.M., Laurentiis A., Palmieri C., Fiume G. et al., 2014, Aberrant
glycosylation as biomarker for cancer: Focus on CD43, BioMed Research Int., 2014 , pp. 1 -14.
138. Uzoma I., Zhu H., 2013, Interactome Mapping: Using protein microarray
technology to reconstruct diverse protein networks, Genom. Proteom. Bioinf. , 11(1), pp, 18 -28.
139. Vahora H., Khan M.A., Alalami U., Hussain A., 2016, The potential role of nitric
oxide in halting cancer progression through chemoprevention, J. Cancer Prevention , 21(1), pp. 1 –
12.
140. Van der Merwe D.E., Oikonomopoulu K., Marshall J., Diamandis E.P., 2007, Ma ss
spectrometry: uncovering the cancer proteome for diagnostics, Adv. Cancer Res., 96, pp. 23 -50.
141. Vannini F., Kashfi K., Nath N., 2015, The dual role of iNOS in cancer, Redox Biol. ,
6, pp. 334 -343.
142. Vasconcelos -dos Santos A., Oliveira I.A., Lucena M.C., Man tuano N.R, et al.,
2015, Biosynthetic machinery involved in aberrant glycosylation: promising targets for developing
of drugs against cancer, Front. Oncol. , 5(138), pp. 1 -23.
143. Vlahovic G., Crawford J., 2003, Activation of tyrosine kinases in cancer, The
Oncol., 8, pp. 531 -538.
144. Wang T., Hou J., Su C., Zhao L., Shi Y., 2017, Hyaluronic acid -coated chitosan
nanoparticles induce ROS -mediated tumor cell apoptosis and enhance antitumor efficiency by
targeted drug delivery via CD44, J. Nanobiotechnol. , 15(7), pp. 1-12.
145. Watson M.E., Diepeveen L.A., Stubbs K.A., Yeoh G.C., 2015, Glycosylation –
related diagnostic and therapeutic drug target markers in Hepatocellular Carcinoma, J.
Gastrointestin Livers Dis. , 24(3), pp. 349 -357.
146. Weathington N.M., Mallampalli R.K., 2014, Emerging therapies targeting the
ubiquitin proteasom system in cancer, J. Clin. Invest., 124(1), pp. 6 -12.
147. Wei W., Lin H.K., 2012, The key role of ubiquitination and sumoylation in
signaling and cancer: a research topic, Front. Oncol., 2(187), pp. 1 -2.
148. Wiseman H., Halliwell B., 1996, Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen
species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem . J., 313, pp. 17 -29.

69
149. Witze E.S., Old W.M., Resing K.A., Ahn N.G., 2007, Mapping protein post –
translationa l modifications with mass spectrometry, Nat. Methods , 4(10), pp. 798 -806.
150. Woods A.G., Darie CC., 2014, Satbile Isotope Labeling by Amino acids for
quantitive proteomics, Advancements of Mass spectrometry in Biomedical research , Editura
Springer, pp. 96 -97.
151. Wu W., Koike A., Rakeshita T., Ohta T., 2008, The ubiquitin E3 ligase activity of
BRCA1 and its biological functions, Cell Division , 3(1), pp. 1 -10.
152. Wu Y., Wang Z., Liu G., Wang X., et al., 2015, Novel Simvastatin -loaded
nanoparticles based of cholic acid core star shaped PLGA for breast cancer treatment, J. Biomed.
Nanotechnol. , 11(7), pp. 1247 -1260.
153. Xu G., Jaffrey S.R., 2013, Proteomic identification of protein ubiquitinatin events,
Biotechnol. Genet. Eng. Rev. , 29(1), pp. 73 -109.
154. Xu P., Peng J., 2006, Dissecting the ubiquitin pathway by mass spectrometry,
Biochim. Biophys. Acta ., 1764 (12), pp. 1940 -1947.
155. Yadav A.K., Agarwal A., Rai G., Mishra P, Jain S., et al., 2010, Development and
characterization of hyaluronic acid decorated PL GA nanoparticles for delivery of 5 -fluorouracil,
Drug delivery , 17(8), pp. 561 -572.
156. Ylmaz O.K., Ozkan A., Akgun E., Kukut M., et al., 2012, Controlled release of
imatinib mesylate from PLGA microspheres inhibit craniopharyngioma mediated angiogenesis, J.
Mater. Sci.: Mater Med. , 24(1), pp. 147 -153.
157. Zhang C., Zhong J.F., Stucky A., Chen X.L., et al., 2015, Histone acetylation: novel
target for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, Clin. Epigen. , 7, 1-10.
158. Zhang G., Neubert T.A., 2009, Use of Stable Isotope Labeling by Amino acids in
Cell Culture (SILAC), for phosphotyrosine protein identification and quantitation, Methods Mol.
Biol. , 527, pp. 79 -92.
159. Zhang X., Wen H., Shi X., 2012, Lysine methylation: beyond histones, Acta
Biochim. Biophys. Sin., 44(1), pp. 14 -27.
160. Zoubeidi A., Gleave M., 2012, Small heat shock proteins in cancer therapy and
prognosis, Int. J. Biochem. & Cell Biol., 44(2012), pp. 1646 -1656.
161. Duffy MJ., Maguire T.M., Hill A., et al., 2000, Metaloproteinases: R ole in breast
cancer carinogenesis , invasion and metastatsis, Breast Cancer Res., 2(4), pp. 252 -257.
162. Kessenbrock K., Plaks V., Werb Z., 2010, Matric metalloproteinases: Regulators
of the tumor microenvironment, Cell, 141(1), pp. 52 -67.

Linkuri

70
161.https://www.researchgate.net/figure/311502657_fig1_Figure -2-sTeM -images -of-
simvastatin -crystals -A-sVT-lcNs-B-and-sVT-lcN_Mailab -C
162. https://www.researchgate.net/figure/6763171_fig 1_Figure -2
163.https://www.researchgate.net/figure/6869411_fig3_Fig -3-Mdm2 -p53-interaction –
Mdm2 -translocates -from -the-nucleolus -to-the-nucleoplasm -and
164. http://www.nccri.ncc.go.jp/en/divisions/08epigenomics/14carc03_1.html
165. httpmedia.springernature.com/full/springerstatic/image/art%3A10.1186%2Fs12951 –
015-0122 -4/MediaObjects/12951_2015_122_Figa_HTML.gif
166.https://www.researchgate.net/publication/301685835_Hyaluronic_acid
conjugated_liposome_nanoparticles_for_targeted_delivery_to_CD44_overexpressing_glioblasto
ma_cells
167. http://news.berkeley.edu/2014/10/16/new -front -in-war-on-alzheimers -other -protein –
folding -diseases/
168. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1202/?report=objectonly
169. http://www.nature.com/nrc/journal/v1/n3/fig_tab/nrc1201 -194a_F2.html
170. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1074718/figure/F1/
171. https://www.synevo.ro/gena -de-fuziune -bcr-abl1-detectie -cantitativa/
172. http://leukd.blogspot.ro/p/ignorance -is-torture.html
173. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/figure/A1213/?report=objectonly
174. http://www .nature.com/nrm/journal/v8/n4/fig_tab/nrm2143_F1.html
175. http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n1/fig_tab/nrc1251_F4.html
176. https://www.smj.org.sa/index.php/smj/article/view/smj.2015.3.9622/7107
177.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.ht
ml?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4819660_jcp -21-001f1.jpg
178. http://erj.ersjournals.com/content/erj/33/5/1165/F2.large.jpg
179. http://www.medscape.org/viewarticle/416521_13
180.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.ht
ml?title=Click%20on% 20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=3306611_nihms362025f1.jpg
181. http://www.wikiwand.com/en/Von_Hippel%E2%80%93Lindau_disease
182. http://www.pnas.org/content/103/6/1659/F1.expansion.html
183.http://www.nature.com/modpathol/journal/v21/n2s/fig_tab/modpathol200834f3.html
#figure -title
184.https://journals.prous.com/j ournals/servlet/xmlxsl/pk_journals.xml_summary_pr?p_J
ournalId=2&p_RefId=712566&p_IsPs=N
185. https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073 -017-0431-3

71
186. http://www.cumc.columbia.edu/publications/in -vivo/Vol1_no8_apr29_02/
187.https://www.researchgate.net/figure/232230468_fig1_Fig -1-Scanning -electron –
microscopy -micrographs -of-imatinib -mesylate -loaded -PLGA
188. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706115002883
189. http://www.vidaza.net/wp -admin/install.php
190. https://innovareacademics.in/journals/index.php/ijpps/article/view/13086/6727
191. http://www.rjpbc s.com/pdf/2016_7(5)/[52].pdf
192. http://mct.aacrjournals.org/content/molcanther/15/7/1452/F2.large.jpg
193. https://www.spandidos -publications.com/10.3892/etm.2015.2651
194.http://www.sigmaaldrich.com/technical -documents/articles/life -science –
innovations/mission -shrna -library.html
195. http://docplayer.com.br/9870957 -Farmacoterapia -oncologica.html
196.https://www.researchgate.net/figure/43342153_fig1_Fig -1-Schematic -structure -of-
self-organized -nanogels -with-low-molecular -hyaluronic -acid
197.http://w hat-when -how.com/proteomics/protein -phosphorylation -analysis -a-primer –
proteomics/
198. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3937853/figure/F6/
199. http://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167 -7799(00)00006 -8
200. http://mct.aacrjournals.org/content/11/3/538
201.http://www.app64bits.com/scientists -discover -gene -which -could -alter-cancers –
metastasis/
202. https://www.researchgate.net/figure/7595815_fig1_Figure -1-Monitoring -changes -in-
protein -phosphorylation -by-the-SILAC -method -a