ANKARA TEKES İ SPERMASININ DONDURULMASINDA BAZI KRİ YOPROTEKTANLARIN ETK İSİ Mustafa Numan BUCAK DÖLERME VE SUN’ İ TOHUMLAMA ANABİ LİM DALI DOKTORA… [602676]

TÜRKİYE CUMHUR İYETİ
ANKARA ÜN İVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİ TÜSÜ

ANKARA TEKES İ SPERMASININ DONDURULMASINDA BAZI
KRİ YOPROTEKTANLARIN ETK İSİ

Mustafa Numan BUCAK

DÖLERME VE SUN’ İ TOHUMLAMA ANABİ LİM DALI

DOKTORA TEZ İ

DANIȘMAN
Prof. Dr. Necmettin TEKİ N

2007-ANKARA

ii

Ankara Üniversitesi Sa ğlık Bilimleri Enstitüsü
Dölerme ve Sun’i Tohumlama Doktora Program ı
Çerçevesinde yürütülmü ș olan bu çal ıșma, așağıdaki jüri taraf ından
Doktora tezi olarak kabul edilmi știr

Tez Savunma Tarihi: 23/02/2007

iii
ÖNSÖZ
Gen kaynaklar ının etkili șekilde kullan ılabilmesi gen kayna ğını olușturan
gamet hücrelerinin ba șarılı bir șekilde dondurarak saklanması nı gerektirmektedir. Bu
saklama çe șidi spermalar ın istenilen yerlere kolayca gönderilmesini, yap ılacak
hayvan ıslah ında birörneklilik ve h ız kazand ırmas ı, entansif yeti știricilikte
hastal ıkların kontrol alt ına al ınması nda büyük önem ta șımaktad ır.

Dondurulmu ș sperma ile baz ı türlerde yap ılan suni tohumlamada ba șarı
sağlan ırken, diğer baz ı türlerde (keçi, koyun) fertilite ba șarısı sınırlı kalmaktad ır.
Bundaki temel neden, spermatozoan ın dondurma i șlemine olan duyarl ılığıdır. Koç-
Teke sperması nın dondurulmas ı/çözdürülmesi sonras ı istenilen oranda motilite
eldesine ra ğmen, fertilite oran ının s ınırlı olmas ı, çal ıșmalar ı spermatozoon
biyodinamiği ve tohumlama metodlar ı üzerine yönlendirmi știr. Șu an keçi
yetiștiriciliğinde dondurulmu ș sperma laparoskopik tohumlama yönetiminde kabul
edilir sonuçlar vermesine kar șılık, tekniğin pratik olmamas ı, ișçilik masraflar ı dahil
bir tak ım masraflara neden olmas ı kullan ımını sınırlı bırakmaktad ır.

Bu anlamda, çalı șmalar sperman ın farkl ı katk ı maddeleri içeren
sulandı rıcılarla ve farkl ı tekniklerde dondurulmas ına eğilim göstermektedir.
Dondurulmu ș teke sperması nın servikal tohumlamalarda kullan ılmas ında fertilitenin
düșük oranda seyretmesi, spermatozoon membran ında geli șen ultrastrüktürel
yıkımlanmalar ve spermatozoan ın dondurma/çözdürme sı ras ında ve genital kanalda
ilerlerken ya șlanması erkek aç ısından bașta gelen faktörlerdir.

Yapı lan bu tez çalı șmas ının amac ı, teke sperması sulandı rıcısına kat ılan
kriyoprotektanlar ın çözüm sonrası spermatolojik parametrelere etkisinin
araștırılmas ına yönelik olmu ștur.

Doktora program ına bașlama ve ara ștırma görevlili ği süreciyle devam eden
zaman dilimi içerisinde her anlamda beni destekleyen, bana yeni ufuklar açan,
akademik ara ștırmalarda bilimsel ve sistematik bir bak ıș aç ısı kazanmamda sonsuz
yard ımlar ı olan k ıymetli hocam ve tez dan ıșman ım Say ın Prof.Dr.Necmettin Tekin’e,
yak ın ilgileri nedeniyle Anabilim Dal ının diğer akademik ve idari personeline, beni
hep sabı rla ve ilgiyle kar șılayan sevgili e șim Sibel Eren Bucak’a șükranlar ımı
sunar ım.

iv

İÇİNDEKİLER

KABUL VE ONAY İİ
ÖNSÖZ İİİ
İÇİNDEKİLER İV
SİMGELER VE KISALTMALAR V İ
ÇİZELGE VE RESİ MLER V İİ
1. GİRİȘ 1
1.1. Ankara keçisinin ırk özellikleri 2
1.1.1. Morfolojik özellikleri 2
1.1.2. Ya șam koșulları ve tiftik özellikleri 2
1.2. Ankara keçisinin dölerme ö zellikleri 3
1.2.1. Ankara keçilerde k ızgınlık ve suni tohumlama 3
1.2.2. Ankara tekesi spermas ının özellikleri 4
1.2.3. Tekelerde dölerme fizyolojisi 4 1.2.3.1. Spermatozoon üretimi 4 1.2.3.2. Testis fonksiyonlar ının hormonal kontrolü 5
1.2.3.3. Çiftle șme ve ejakülasyon 5
1.3. Teke spermas ının dondurularak uzun süreli saklanmas ı 6
1.3.1. Teke spermas ında dondurma i șlemlerini etkileyen 6
faktörler 1.3.2. Teke spermas ının dondurulmas ında kullan ılan sulandı rıcılar 7
1.3.3. Teke spermas ının sulandı rmas ı ve suland ırma oran ı 7
1.3.4. Teke spermas ının dondurulmas ı-çözdürülmesi 9
1.4. Teke spermas ının dondurulmas ında kullan ılan kriyoprotektanlar 10
1.4.1. Sakkaritler 12 1.4.2. Antioksidanlar 14 1.4.2.1. Spermanı n kısa ve uzun süreli saklanmas ında 15
antioksidanlar ın etkisi
1.4.2.2. Glutatyonun gamet ve embriyo üzerine etkisi 16

v
1.4.3. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 17

2. GEREÇ VE YÖNTEM 19
2.1. Hayvan materyali ve hayvanlar ın bakı m-beslemesi 19
2.2. Sperman ın al ınmas ı 19
2.3. Sperman ın sulandı rılmas ı ve dondurulmas ı 19
2.4. Sperman ın in vitro de ğerlendirilmesi 23
2.4.1. Nativ spermada de ğerlendirme 23
2.4.2. Dondurulmuș -çözdürülmü ș spermada de ğerlendirme 23
2.4.3. Sperma de ğerlendirme parametreleri 23
2.4.3.1. Toplam miktar 23
2.4.3.2. Spermatozoa motilitesi 23 2.4.3.3. Anormal spermatozoa oran ı 23
2.4.3.4. Ölü spermatozoa oran ı 24
2.4.3.5. Spermatozoa yoğunlu ğu 24
2.4.3.6. Hipoozmotik ș ișme testi (HOST) 25
2.5. İ statistiksel analiz 25

3. BULGULAR 26
3.1. Nativ spermada bulgular 26
3.2. Dondurulmuș -çözdürülmü ș spermada bulgular 26

4. TARTI ȘMA 28
5. SONUÇ VE ÖNER İLER 34
ÖZET 36
SUMMARY 37
KAYNAKLAR 38
ÖZGEÇM İȘ 47

vi

SİMGELER VE KISALTMALAR
BHT Butilat hidroksitoluen
CAT Katalaz
DMSO Dimetilsülfoksit
EDTA Etilendiamintetraasetik asit
GP Glutatyon Peroksidaz GSSG Okside Glutatyon
GSH Redükte glutatyon
NADPH Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat
ROS Serbest Oksijen Radikalleri SOD Süperoksit Dismutaz

vii

ÇİZELGE VE RESİ MLER

Çizelgeler
Çizelge 1. Miks edilen ejakülat larda spermatolojik özellikler
Çizelge 2. Fakl ı kriyoprotektan içeren suland ırılarla dondurulan Ankara tekesi
spermas ından çözüm sonrası elde edilen spermatolojik özellikler

Resimler
Resim 1. Çal ıșmada kullan ılan Ankara tekeleri
Resim 2. Spermanı n al ınmas ı ve suland ırılmas ında kullan ılan ekipmanlar
Resim 3. Sun’i vajen ile tekeden sperman ın al ınmas ı
Resim 4. Tekelerden al ınan ejakülatlar ın bir tüpte miks yap ılmas ı.
Resim 5. Spermanı n sulandı rılmas ı kullan ılan sulandı rıcı gruplar ı
Resim 6. Spermanı n sulandı rma iș lemi

1. Giriș

Ankara Keçisi (Capra prisca) tiftik verimiyle özelle șmiș ‘tiftik keçisi’ olarak ta
anılmaktad ır. Ankara Keçisinin, 13. yüzy ılda Türklerin Hazer Denizinin doğusundan
Anadoluya beraberlerinde getirdiğ i bir keçi ırkı olduğu bilinmektedir. Bu ırkın,
Anadolu’nun iklim ve co ğrafi koș ullar ına uyum sa ğlayarak, bugünkü Ankara
keçisinin özelliklerini kazand ığı belirtilmektedir (Batu, 1951). Ankara keçisi, Orta
Anadolu’nun özgün ve özellikle yapa ğı (tiftik) verimi için yeti știrilen bir hayvan
türüdür. Birçok ülkede mohair diye adland ırılan tiftik, bilindi ği gibi bütün dünyaya
yurdumuzdan yayı lan Ankara keçisinin ürünüdür. Bu nedenle, dünya literatüründe
Ankara Keçisi (The Angora Goat) olarak tan ınmaktad ır. Ankara keçisi özellikle
tekstil endüstrisinde ham madde ihtiyac ını karșılamak amac ıyla tiftik üretimi ve
yavru verimi için yeti știrilmektedir. Dünyada Ankara keçisi yeti știriciliği yap ılan
bașlıca ülkeler: Türkiye, Güney Afrika, ABD, Kanada, Yeni Zelanda, La Sota,
Rusya, Arjantin ve Brezilya’d ır. Ancak bunlardan ilk üç ülke tiftik amaçl ı
yetiștiricilikte öne ç ıkmaktad ır (Yalç ın, 1982; Öztürk, 1989; Güne ș ve ark., 2002).
Türkiye Cumhuriyetin kurulu ș yıllar ında art ıș gösteren tiftik keçisi varl ığı
1960’l ı yıllara kadar bu art ıșını sürdürmüș , 1980’li ve 1990’lı yıllarda h ızlı bir
șekilde dü șüș göstermi știr. 1930’lu y ıllarda Ankara keçisi say ısı 2,5-3 milyon
civar ındayken, bu rakamlar Türkiye İstatistik Kurumu son ve rilerinde (2005) Türkiye
genelinde 232966, Ankara’da is e 88427 Ankara keçisi oldu ğu kaydedilmi știr. Bu
azalmada tiftik fiyatlar ındaki yetersizlik ve pazar sorunu, meralar ın bilinçsiz
kullan ımı ve ziraat alanlar ına dönüș türülmesi, meralar ın orman alan ı olarak
kullan ılmas ı, yetiștiricilere gerekli bilginin verilerek yo ğun yeti știricilik
yöntemlerine yöneltilmemesi, et fiyatlar ının tiftik fiyatlar ına göre daha fazla artmas ı
gibi nedenler rol oynamaktad ır. Günümüzde Anadolu’da Ankara keçisi
yetiștirilmesinin ba șlıca nedeni, yeti știricilerin geleneksel de ğerlere bağ lılığındandı r
(Dașkıran, 2006; Namdar, 2006).

2
1.1. Ankara keçisinin ırk özellikleri
1.1.1. Morfolojik özellikleri
Ankara keçisi, ufak yap ılı, ince ve zarif vücut yap ısına sahip bir ırktır. Yüz ve
bacaklar d ıșında bütün beden, tarsal ve karpal mafsallara kadar ince, yumu șak, parlak
ve lüleli tiftikle örtülüdür. Aln ında kakülü bulunan ve kar ın alt ı tamamen tiftikle
örtülü olanlarda tiftik verimi yüksektir. Sa ğrı omuzdan yüksektir, arka bacaklar
önlerden biraz daha uzundur.
Çoğunlukla beyazd ır. Ankara yöresinde yetiș tirilen Ankara keçilerinde ba ș ve
ayaklar dahil tüm vücut beyazd ır. Konya ve yöresi keçileri krem ve sar ı renkli, Do ğu
ve Güneydoğu illerinde yeti știrilenler gümü și gri, kahverengi ve siyah renktedir.
Baș profili düzgündür. Küçük, zarif, al ın geniș, gözler parlak ve bak ıșlar
canl ı, dudaklar ince, di șler muntazamdı r. Bașın yandan görünü șü dișilerde hafif iç
bükey ya da düz, tekelerde ise d ıș bükeydir. Erkeklerde, boynuzlar iyi geli șmiș kendi
ekseni etraf ında k ıvrılm ıș, geriye do ğru yat ıktır. Dișilerde ise, boynuzlar k ısa ve
arkaya k ıvrıktır. Ancak, alçak, batakl ık, nemli iklimlerde yeti știrilen Ankara keçisi
sürülerinde ırk özellikleri bozulmaktad ır (T.C. Resmi Gazete, 2004; Namdar, 2006).

1.1.2. Yașam koșullar ı ve tiftik özellikleri
Ankara keçisinin bir step hayvan ı olușu, 800 metreden daha yüksek rak ımlarda, kuru
ve az yağı șlı bir bölge olan Orta Anadolunun uygun ya șam alan ı olmas ına yol
açm ıștır. Ayr ıca Siirt ve Mardin illerimizde de yayg ındır. Ülkemizde tipik ırk
özelliklerini üzerinde toplayan en saf örnekler Anka ra yöresinde yeti știrilmektedir
Yașam süreleri ortalama 8-15 y ıl aras ındad ır (Öztürk, 1989; Namdar, 2006). Ankara
keçileri, di ğer ırk keçilerden daha az olup, sürü yönetimleri kolayl ıkla
yap ılabilmektedir. Ancak, diğer evcil hayvanlara nazaran daha fazla sa ğlık
problemlerine ve parazit enfeksiyonlar ına aç ıktır. Bu olumsuzluklar, iyi bak ım ve
beslemeyle kontrol alt ına al ınabilmektedir (Sell, 1993).
Ankara keçisi tifti ği, parlak elastik, zararl ı güneș ıșınlarını geçirmeyen, nem
çeken, ısıya dayan ıklı, kolayca boyanabilen ve kolay kir tutmayan bir elyaf
özelliğindedir. Bir tekstil elyaf ı olmakla birlikte, geneld e dokuma sanayiinde saf
olarak kullan ılmaz. Pamuk, yün ve akrilik gibi elyaflarla de ğișik oranlarda

3
kar ıștırılarak kullan ılır. En büyük tüketimi tekstil sanayisinde olup, kuma șlarda, lüks
battaniyelerde, hal ıcılıkta, trikotaj endüstrisinde, peruk, oyuncak sanayi ve para șüt ipi
yap ımında kullan ılmaktad ır (Namdar, 2006).
Bugün dünyanı n birçok ülkesinde yeti știrilen Ankara keçisinin tiftiğ i, incelik
ve yumuș akl ık gibi önemli özellikleri bak ımından yurdumuzda üretilen tiftikler
seviyesine ula ștırılamam ıștır. Diğer ülkelerde tiftik verimi ortalama 4 kg’a kadar
çıkart ılm ıștır. Yurdumuzda ise tiftik verimi ortalama 2,75 kg (1,37-6,50 kg)
civar ındad ır (Mohair Council of America, 2006; Namdar, 2006).

1.2. Ankara keçisinin dölerme özellikleri
1.2.1. Ankara keçilerde k ızgınlık ve suni tohumlama
Keçilerde ergenlik ya șı, ırk, ısı, ıșık ve besleme gibi çevrese l etkilere göre 3-12 ay
aras ında değișim göstermektedir. Genel olarak keçiler, mevsimsel poliöstrik
hayvanlard ır. Çiftleșme mevsimi sonbahar ve erken k ıș dönemidir. Gün ıșığının
azalmaya ba șlamas ı, çiftleșme mevsimine giri și uyar ır. Ayrı ca sürüde tekenin varl ığı
östrusün ba șlamas ına katk ıda bulunur. Di și keçi, ilk östrusta iz leyen östruslara göre
daha düș ük doğurma oran ına sahiptir. Ankara keçisinde doğumu izleyen s ıfat
sezonunda, yani yaklaș ık olarak 7 ayl ıkken, ilk k ızgınlık görülür. Do ğum oran ı
ortalama %85,05, döl verimi 1,03, do ğumdan sütten kesime kadar ki ya șama gücü
oran ı ortalama %92,67’dir (T ekin ve Muyan, 1985).
Ankara keçilerinde k ızgınlık süresi 22-48 saat, k ızgınlık siklusu süresi 19-21
gün aras ında değișmekte ve ovulasyon ise k ızgınlığın sonuna doğru olmaktad ır.
Gebelik süreleri ise yakla șık 148 gündür. Ankara keçilerinde k ızgınlık bașlang ıcında
ve k ızgınlık bașlang ıcından 12 saat sonra taze spermayla yap ılan tohumlamalardan
her ikisinde de %94 oran ında gebelik oran ı elde edildi ği bildirilmektedir (Tekin ve
Muyan, 1985). K ızgınlık ortası ndan itibaren yap ılan taze spermayla tohumlamalarda
ise gebelik oran ı düșmektedir. Yap ılan çal ıșmalarda taze spermayla yap ılan servikal
tohumlamalardan %33-89 oran ında gebelik al ındığı bildirilmektedir. Bu oranlar
üzerinde tohumlama dozu, sperman ın bırak ıldığı yer ve tohumlama zaman ı etkili
olmaktad ır. Dondurulmu ș spermayla yap ılan servikal tohumlamalardan ise %38,5-
73,0 arası ndaki oranlarda gebelik, yakla șık %40 oran ında da kuzulama oran ı elde

4
edilmektedir (Ritar ve Salamon, 1983; Teki n ve Muyan, 1985; Sevinç ve ark., 1989;
Sungur ve ark., 1993; Tekin ve ark., 1996).

1.2.2. Ankara tekesi spermas ının özellikleri
Ankara tekelerinden sperma genelikle suni vajen ve elektroejakül atör yöntemleriyle
alınmaktad ır. Suni vajenle daha ç ok sezon içinde sperma alı nabilmesi, sezon d ıșında
elektroejalülatörle sperma alma aray ıșlar ını doğurmu ștur. İki yöntemle al ınan
spermaları n kaliteleri üzerinde farkl ı görüșlerin oldu ğu belirtilmektedir (Tekin ve
ark., 1996; Leboeuf ve ark., 2000).
Ankara tekesinin spermatolojik özellikleri ise șöyle s ıralanabilir; Ejakülat
miktar ı: 1,44-1,07 ml, spermatozoa motilitesi: %81,1-83,2 spermatozoa yo ğunluğu:
2,1- 3,1X109/ml, anormal spermatozoa oran ı: %2,1- 4,2, ereksiyon de ğeri 2,2,
yetiștirme mevsiminde günlük spermatozoa üretimi 4,0-6,4 X 109, pH: 6,7 (Tekin ve
Muyan, 1985; Tekin ve ark., 1996; Leboeuf ve ark., 2000).

1.2.3. Tekelerde dölerme fizyolojisi
1.2.3.1. Spermatozoon üretimi (Spermatogenezis)
Spermatogenezis iș lemi, fötal hayatta geli șmektedir. Erken fötal hayatta seminifer
tubül duvarlar ında yer alan primordial hücrele rden spermatogonia denilen kök
hücreler șekillenmektedir. Geli șen spermatogonialar canl ının pubertaya eri șim
zaman ına kadar inaktif kal ır, daha sonra ise spermato zoon üretimi için bölünmeye
bașlarlar. Kök hücre spermatogoniumları diploid say ıda kromozom (2n=60) içerir ve
pubertasta daha fazla say ıda diploid spermatozoa üretmek içi mitotik bölünmelere
uğrar. Bölünmeler sonras ı olușan yeni spermatogoniumlar kök hücrelerden farkl ı
olup, son a șamada primer spermatositlere farkl ılașır. Primer spermatositlerin miyotik
bölünmeleriyle de spermatidler olu șur. Spermatidler spermiozis iș lemiyle bir tak ım
morfolojik de ğișime uğrayarak spermatozoa halini al ırlar. Bu süreç yakla șık olarak
22 gün sürer.

5
1.2.3.2. Testis fonksiyonlar ının hormonal kontrolü
Testis fonksiyonlar ı, spermatozoa ve androjenle rin üretimi, hipofizden salg ılanan
gonadotropinler taraf ından sağlanmakta ve düzenlenmektedir. Gonadotropinlerin
üretimi ve sal ınımı, çevresel uyar ımlarla ili șkide olan beynin di ğer merkezleriyle
kontrol edilmektedir. Gonadot ropinlerden LH (lüteinle știrici hormon), leydig
hücreleri üzerine etkiyere k androjen üretimini uyar ır. Androjenler ise
spermatogenezisi baș latmalar ı için seminifer tubüller üzerine etkimektedir. FSH
(folikül stimüle edici hormon)’un rolü tam aç ık olmasa da pubertasta ve yeti știrme
mevsiminde spermatozoa üretiminin ba șlamas ı için gereklidir. Fakat,
spermatogenezisin devam ı için gerekli olmad ığı görülmektedir. Gonadotropinlerin
salg ılanması nı etkileyen ana d ıș kaynakl ı uyar ım gün uzunlu ğudur (Evans ve
Maxwell, 1987).
Fotoperiyodik etkiyle gün uzunlu ğunun kı salmas ı, gonadotropin salg ılanmas ını
art ırarak testis fonksiyonlar ının uyar ılmas ına neden olur. Uyar ımda bulunan di ğer
faktörler, sı cakl ık, besleme, hastal ıklar, stres ve sosyal uyarı md ır. Bu uyar ımlar
sonrası spermatozoon kalitesinde (yo ğunluk, motilite ve dondurulabilirlik) artma
gözlenmektedir (Evans ve Maxwell, 1987; Karagiannidis ve ark., 2000; Gacitua ve
Arav, 2005). Yeti știrme mevsimi d ıșında gün uzunlu ğuna bağlı gonadotropin
sal ınımında bir azalma olmas ına rağmen, spermatozoa ve androjen üretimi için
yeterli düzeyde gonadotropin üretimi gerçekle șmektedir. Yine de bu dönemde testis
büyüklüğünde, spermotozoa üretiminde ve fertilitede dü șmeler olmaktad ır (Evans ve
Maxwell, 1987).

1.2.3.3. Çiftle șme ve ejakülasyon
Tekeler normalde östrus gösteren di șilere ilgi gösterme ș eklinde tepki verirler. Bu
durum, temel seksüel uyar ımın olfaktorik oldu ğunu göstermektedir. Olfaktorik
uyar ımda, feromon denilen kimyasal mesajlar ın karșı cinsiyet taraf ından alg ılan ıp
fiziksel ve davran ıșsal değișimlerin șekillenmesine yol aç ılmaktadı r. Bu değișimler
sonrası nda erkekte di șiyle çiftle șme isteği ve davran ıșlar ı meydana gelerek, koitus ile
kısa süren ejakülasyon oluș makta ve çiftle șme esnası nda sperma anterior vajinaya
bırak ılmaktad ır (Evans ve Maxwell, 1987).

6
1.3. Teke spermas ının dondurularak uzun süreli saklanmas ı
Sperma ba șarıyla dondurulan ilk canl ı hücrelerden olmas ı bak ımından önem
tașımaktad ır. Memeli spermatozoonlar ının dondurulmas ı ile kabul edilebilir fertilite
sonuçlar ın elde edilmesi baz ı önemli faktörlerin etki sindedir. Bunlar aras ında
dondurma teknikleri, uygun suland ırıcı, spermatozoa suland ırma oran ı, dondurma ve
çözdürme h ızı, türlere özgü spermatozoon fizyolojisi ve özellikleri say ılabilir (Purdy,
2006). Ayr ıca, farkl ı türlere ait sperma hücrelerinin dondurulmas ı, hücrelerin farkl ı
büyüklük, șekil ve lipit bile șenine sahip olmas ından dolay ı ayr ıcal ık göstermektedir.
Keçi yeti știriciliğinde, dondurulmu ș sperman ın servikal tohumlamada kullan ımı
henüz tatmin edici sonuçlar vermemektedir. Sperman ın dondurulmas ı
spermatozoonda yap ısal, biyokimysal ve fonksiyone l hasara neden olarak, di și
genital kanaldaki fizyolojik uyar ımlara karș ı spermatozoonda prematür aktivasyona
ve spermatozoon motilitesi, canl ılığı ve fertilitesinde dü șüșlere neden olabilmektedir
(Maxwell ve Watson, 1996; Purdy, 2006). Söz konusu parametreler üzerinde
yetiștirme mevsimin etkinli ği önemli görülmekte ve yayg ın görüș ün dondurulacak
sperman ın normal yeti știrme mevsiminde al ınması yönünde olmaktad ır (Leboeuf ve
ark., 2000). Bu bak ımdan, sun’i tohumlaman ın entansif keçi üretim ve
yetiștiriciliğinde önemli yere sahip olmas ının yanı nda, elde edilecek sonuçlarda
sperman ın dondurulmas ındaki bașarı da önemli rol oynamaktad ır (Purdy, 2006).
Teke sperması nın dondurma-çözdürme sonras ı motilite, canl ılık ve
fertilitesinde saklama süresinin etkisi tart ıșmal ıdır. Kimi ara ștırıcılar (Waide ve
ark.,1977; Shamsuddin ve ark., 2000), saklama süresi uzunlu ğunun bu
parametrelerde dü șüșlere neden oldu ğunu bildirmesine ra ğmen, baz ı çal ıșmalarda
saklama süresinin etkili olmad ığı belirtilmi știr (Ritar ve Salamon, 1983; Leboeuf ve
ark., 2000).

1.3.1. Teke spermas ında dondurma i șlemlerini etkileyen faktörler
Teke sperması nın dondurulmasnda birçok fa ktör etkili olmaktad ır. Bunlar șöyle
sıralanabilir (Leboeuf ve ark., 2000):
1- Sperman ın dondurulmas ında infertil ya da dam ızlık değeri olmayan erkeklerin
kullan ılmas ı

7
2- Seminal plazmal ı ya da plazmas ız ejakülatlar ın kullan ılmas ı, yıkama metotları ,
yıkama sı vısının bileșenleri, y ıkama oran ı ve santrifüj i șlemi.
3- Suland ırıcının bileșenleri ve suland ırıcıda yumurta sar ısının bulunup
bulunmamas ı.
4- Sulandı rma metotlar ı, kat ılan gliserol oran ı.
5- Ekilibrasyon zaman ı.
6- Sperman ın payet ya da pelet biçiminde dondurulmas ı

1.3.2. Teke spermas ının dondurulmas ında kullan ılan suland ırıcılar
İzotonik suland ırıcılarla yap ılan dondurma ve çözdürme i șlemleri, hücre membran ı
lipit katmanlar ında gelișen değișikliklere ba ğlı olarak ba ș, akrozom ve kuyruk
kısımlar ında membran hasar ına yol açmaktad ır (Holt and North, 1991). Ortam ın
hipertonik olması nda ise, plazma ve akrozomal membran bütünlü ğü yanı nda,
mitokondriyi de içeren spermatozoon yap ısı korunmaktad ır. Buna disakkritlerle
(trehaloz) olu șturulan hipertonik ortam ın donma sı ras ındaki kristal formasyonunu
azaltmas ı ve olu șan intraselüler dehi drasyon kontrolünün rol oynad ığı
belirtilmektedir (Aisen ve ark., 2000; Aisen ve ark., 2005).
Teke sperması nın dondurulmas ında en yayg ın olarak kullan ılan suland ırıcılar
aras ında, yağsız inek sütü-0,5 M glukoz, Tris-s itrik asit-glikoz-yumurta sarı sı ve
sitrat-glikoz-yumurta sar ısı sulandı rılar ı say ılabilir. İlk iki suland ırıcı Ankara tekesi
spermas ının dondurulmas ında yoğun olarak kullan ılmaktad ır. Suland ırma oranlar ının
artmas ı suland ırıcı bileșenlerinin yo ğunluklar ını azaltmay ı gerektirmekte, daha dü șük
ozmolariteye sahip suland ırıcı olușturulmas ını sağlamaktad ır (Corteel, 1975; Evans
ve Maxwell, 1987; Ritar ve ark., 1990a; Purdy, 2006).

1.3.3. Teke spermas ının suland ırmas ı ve suland ırma oran ı
Teke sperması nın suland ırılmas ı bir ya da iki etapta yap ılabilmektedir. İki etapl ı
sulandı rmada, sperman ın tekeden al ınımından sonra kriyoprotektan içermeyen
sulandı rıcıyla final suland ırma oran ının yar ısıyla suland ırılmakta ve daha sonra
5oC’ta üzerine kriyoprotektan içeren suland ırıcı ilk suland ırıcı miktar ı kadar
eklenerek final suland ırma iș lemi gerçekle știrilmektedir. İki etapl ı sulandı rman ın
diğerine göre bir üstünlü ğünün olmad ığı görülmü ștür. Tek etaplı sulandı rma,

8
sulandı rıcı haz ırlama ve sperman ın sulandı rılma iș lemini kolayla ștırmas ı bak ımından
tercih edilmektedir (Evans ve Maxwell, 1987).
Sperman ın sulandı rılmas ında suland ırıcıya kat ılan yumurta sar ısı ve sütün
sperma hücrelerine zararl ı etkileri oldu ğu belirtilmektedir. Söz konusu etkinin,
yumurta sarı sında bulunan lesitinlerin semi nal plazmada bulunan fosfolipaz A
enzimiyle ve süt suland ırıcısında bulunan bir komponent ile de bulbouretral bez
kökenli SPU 3 olarak adland ırılan protein fraksiyonunun reaksiyona girerek,
spermatozoan ın soğutma ve dondurulması nda yașam ını bask ılad ığı, akrozom
reaksiyonunu uyard ığı ve hücre kromatinlerinde ayr ıșmalara neden oldu ğu
bildirilmektedir (Iritani ve Nishikawa, 1961; Pellicer-Rubio ve Combarnous, 1998;
Leboeuf ve ark., 2000). Beli rtilen olumsuz etkilerin giderilmesi için, sperman ın
yıkanarak seminal plazmas ından ayr ılmas ı gerektiği belirtilmektedir (Leboeuf ve ark,
2000). Spermay ı y ıkayarak seminal plazmas ından ay ırma iș lemi, önce 1:5-1:10
oran ında suland ırmay ı ve 10-15 dakika 600- 1000 g’de santrifüj i șlemini
gerektirmektedir. Yap ılacak çift y ıkama ișlemi tek y ıkama ișlemine göre daha etkili
sonuçlar vermektedir (Ritar ve ark., 1990a; Salamon ve Ritar, 1982). Fakat baz ı
yazarlar, y ıkama ișleminin zaman kaybettirici bir i șlem olduğunu, yı kamayla seminal
plazmadaki baz ı yararl ı etkenlerin kaybedildi ği ve y ıkama ișlemi olmaks ızın
yap ılacak dondurma i șleminde di ğer iș leme göre çözüm sonu spermatozoon kalitesi
üzerine bir fakl ılığın olmad ığını belirtmektedir (Ritar, 1993; Villemure ve ark., 2003;
Purdy, 2006). Iritani (1961) ve Roy ( 1957) fosfolipaz A aktivitesinin 2-3 dakikada
60oC’ta bozuldu ğunu göstermi știr. Ritar ve Salamon (1983), y ıkanmaksı zın
dondurulacak spermaya %1,5 oran ında yumurta sar ısının kat ılabileceğini tavsiye
etmiș lerdir. Da șkın ve Tekin (1996) ise, yumurta sar ısının teke sperması nın
sulandı rılıp dondurulmas ı üzerine olumlu etkilerinin oldu ğunu gözlemlemi știr.
Sperman ın sulandı rma oran ı, optimum tohumlama dozunun eldesinde önemli
olmaktad ır. Sulandı rma iș leminin 1:1-1:23 (sperma: suland ırıcı) oranlar ı aras ında
yap ılmas ı tohumlamada optimum ba șarıyı sağlamaktad ır (Purdy, 2006). Bazı
araștırıcılar da (Ritar ve Salamon, 1983; Ritar ve ark., 1990b) ba șarılı dondurma ve
fertilite oran ının ml’de 80-500 X 106 oran ında spermatozoaya sahip numunelerden
elde edildi ğini bildirmektedirler. Servikal tohumlamada kullan ılacak dondurulmu ș-
çözdürülmü ș sperman ın bir tohumlama dozunda yakla șık 200 milyon, serviks

9
arac ılığıyla yap ılacak intrauterin tohumlamada 60 milyon, laparoskopik
tohumlamada ise 20 milyon motil spermatozoa olmas ı gerektiği belirtilmektedir
(Evans ve Maxwell, 1987).

1.3.4. Teke spermas ının dondurulmas ı-çözdürülmesi
Yıkama ișlemi yap ılarak/yap ılmaks ızın yaklașık olarak 1,5-4 saatte 4-6oC’a
soğutulan suland ırılm ıș sperma, kuru buz üzerindeki yuvac ıklarda pelet formunda ya
da sı vı azot buhar ında payetlerde dondurulmaktad ır (Evans ve Maxwell, 1987;
Purdy, 2006). Pelet șeklinde dondurma i șlemi, 0,1-0,3 ml’lik sperma hacimleri
halinde –79oC’taki kuru buz kal ıplar ı üzerinde 2-4 dakikada gerçekle șmekte, donan
peletler s ıvı azotta (-196oC) saklanmaktad ır. Sperman ın pelet șeklinde dondurulmas ı
maliyetini dü șürmekte, tohumlamada kullan ılmas ını daha kolay hale getirmekte ve
sperman ın soğutulmas ı esnası nda gelișebilecek seeding olay ına katk ı sağlayarak
çözüm sonras ı spermatozoa motilitesi ve fertilitesinde payet șeklinde dondurmaya
göre daha iyi sonuç vermektedir (Evans ve Maxwell, 1987; Ritar ve ark., 1990b;
Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006). An cak dondurulan peletlerin saklanmas ı
esnası nda kontaminasyon riski, sperman ın dozlanması nda ve depolanmas ı
sıras ındaki markalama i șlemlerinde güçlükler gözlenmektedir (Purdy, 2006;
Lebeouf, 2000). Sperman ın payette dondurulma i șlemi, 0,25-0,5 ml’lik payetlerde
sıvı azot buhar ının 3-4 cm üzerinde 7-8 dakikada yapı lmaktad ır. Programlanabilir
dondurma cihaz ı, büyük miktarlarda payette sperman ın dondurulmas ı ve
soğutma/dondurma h ızının kontrollü yap ılmas ında kullanı lmaktad ır. Kontrollü
dondurma i șleminde genellikle 4-5oC’tan -80oC’a 7-15 dakikada so ğutma ve s ıvı
azota nakil; 4oC’tan −5oC’a 4oC/dakika h ızda, −110oC’a 25oC/hızda, −140oC’a
35oC/hızda soğutma ve s ıvı azota nakil protokolleri kullan ılmaktad ır. Payette
dondurma i șlemi, pelet șeklinde dondurma iș leme göre daha pahal ı ve daha fazla iș
gücünü doğurmaktad ır (Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006).
Teke sperması nın dondurulmas ında h ızlı dondurma metodu, kriyoprotektif
etkileri nedeniyle yava ș dondurmaya tercih edilmektedir. Çözüm sonu spermatozoon
motilitesi, canlı lığı ve fertilitesindeki farkl ılıklar soğutma h ızına bağlanabilmekle
beraber dondurma tekni ği, sperman ın dondurulmas ına kadar olan i șlemler,

10
tohumlama teknikleri gibi faktörler de teke spermas ının fertilitesinde önem
tașımaktad ır (Purdy, 2006).
Sperman ın çözdürülmesi ise pelet ya da payet formunda dondurulmas ına göre
değișmektedir. Pelet formunun çözdürülmesi 37oC’l ık çözdürme s ıvılar ında
yap ılmaktad ır. Payet formunun çözdürülmesinde ise birçok çözdürme ısı ve süreleri
kullan ılmaktad ır. Bu ısı ve süreleri; 37oC’ta 15-30 saniye, 40oC’a 20 saniye, 70oC’ta
7 saniyedir. Fakat ilk iki çözdürme protokolü ba șarıyla kullan ılmaktad ır. 70oC’ta 7
saniyede çözüm i șlemi, en iyi sonuçlar ı vermesinin yan ında saha koș ullar ında
uygulanabilirli ğini s ınırlı tutmaktad ır (Evans ve Maxwell, 1987; Purdy, 2006).

1.4. Teke spermas ının dondurulmas ında kullan ılan kriyoprotektanlar
Sperman ın dondurulmas ında kullan ılacak suland ırıcıda kryoprotektif özellikli
maddelerin bulunmas ı gereklidir. Kriyoprotektanlar (so ğuk șokuna kar șı koruyucu
maddeler) hücrenin so ğutulmas ı, dondurulmas ı ve çözdürülmesi esnası nda gelișen
fiziksel, kimyasal ve oksid atif stresi ve bunlardan do ğan ısı șoku, ozmotik deği șim,
intraselüler kristal oluș umu ve olu șan serbest oksijen radikallerinin olu șturduğu
hasarlar ı azaltmak amac ıyla kullan ılmakta, direk olarak çözüm sonu spermatolojik
parametreleri ve fertiliteyi etkilemektedir. İnternal özellikli kriyoprotektanlar ın
(gliserol, dimetilsülfoksit, etilen glikol) hücre içinde olu șan donma ve çözünme
esnası nda gelișen hasara kar șı, baz ı eksternal kriyoprotektanlar ın ise (dissakkartiler,
trehaloz, sükroz, raffinoz, la ktoz, dekstran; yumurta sar ısı; antioksidanlar, redükte
glutatyon, okside glutatyon, vitamin C; yüzey geni șletici maddeler, SDS; EDTA)
hücre d ıșında benzer etkisi son zamanlarda anla șılm ıș, sperma sulandı rıcılar ında
kullan ılmaya ba șlanm ıștır (Chen ve ark., 1993; Ball ve ark., 2001; Aisen ve ark.,
2005; Funahashi a ve Sano, 2005).
Hücre dondurulmadan önce kri yoprotektanlarla inkubas yona tabi tutularak,
intraselüler bak ımdan dengeye gelmesi sa ğlanmaktad ır. Kriyoprotektanlar ın bu
noktada en önemli özellikleri; dü șük moleküler ağı rlığa sahip olmaları ve belirli
oranlarda katı ldığında toksik etki göstermemeleri olmaktad ır (Palas ız ve Mapletopt,
1996; Isachenko ve ark., 2000). Hücre dondurma s ıvılar ındaki kryoprotektanlar ın
toksitesini azaltmak için, hücrelerin kr yoprotektanlara maruz kalma süresinin
kısalt ılmas ı ve geçirgen özelli ği olmayan kriyoprotektanlar ın kullan ımı gibi

11
uygulamalar önerilmektaedir (Palas ız ve Mapletopt, 1996; Massip, 2001).
Kriyoprotektanlar biyoenerjik denge üzerine doğrudan etki yaparl ar. Bu proseste
membranlardaki iyon de ğișimleri ve fosforilasyon/defosforilasyon geniș ölçüde ATP
tüketimini artı rmaktad ır. Kriyoprotektanlar ın kimyasal yap ısındaki C/OH oran ının
yüksek olması , koruyucu etkinliğ ini azaltmaktad ır (Arav ve ark., 1993; Storey ve
ark., 1998). Suland ırıcıda kullanı lacak oranlar ı ve koruyucu etkileri hayvan türüne,
hücredeki geçirgenlik farkl ılıklar ına, sperman ın dondurma metotlar ına, sulandı rıcının
bileșenlerine ve tonisitesine ba ğlıdır (Evans ve Maxwell, 1987; Jarkson ve ark.,
1997).
İnternal kryoprotektanlar ( hücreye penetrasyon özelli ğine sahip olanlar),
ozmotik olarak spermatozoan ın dehidrasyonuna neden olan eriyiklerdir. Dehidrasyon
ișleminin ba șlamas ından kı sa bir süre sonra, ortamdaki kriyoprotektan ve su dengeye
gelerek, benzer intra- ve ekstrasellüler yo ğunluğa ulașırlar. Spermatozoan ın düș ük
oranda intrasellüler suya sahip olmas ı, hücrelerinin donma noktas ını düșürmesi ve
daha az oranda intrasellüler buz kristallerinin olu șumuna yol açmas ı, hücrenin hasar
görmesini ve fertilite oran ındaki düșüșleri azaltmaktadı r. İnternal kriyoprotektanlar,
hücre membran ı lipit ve proteinlerinde yeni düzen lemelere neden olur. Bu düzenleme
membran esnekliğ inde art ıșı, düș ük ısılarda daha fazla dehidrasyonu, sonuçta ta
dondurma i șlemi sonras ı hücrenin ya șama gücünü art ırmay ı beraberinde
getirmektedir (Mazur, 1996; Palas ız ve Mapleyopt, 1996; Gao ve Crister, 2000;
Purdy, 2006). Teke spermas ının dondurulmas ında bir çok internal özellikli
kriyoprotektan (gliserol, DMSO, etile n glikol, propilen glikol ve bunlar ın
kombinasyonlar ı) denenmi ș, fakat en fazla kullan ılan ı çözüm sonu en iyi koruma ve
iyileș meyi sağlamas ından dolay ı gliserol olmu ștur. Suland ırıcıya kat ım oranlar ı ise
%4-7 aras ında değișim göstermektedir. Gliserolün suland ırıcıya tek ad ımda ve
37oC’ta kat ılmas ı diğer kat ım prosedürlerine göre optimum sonucu sa ğlamaktad ır
(Leboeuf ve ark, 2000; Purdy, 2006).
Eksternal kriyopr otektanlar (hücreye penetrasyon özelli ğine sahip olmayanlar)
spermatozoon plazma membran ını geçemedikleri için ek strasellüler olarak
etkilerinden dolay ı, plazma membran ında değișimlere; s ıvı ve katyonlara karș ı
permeabilite art ıșına yol açmakta ve ekst rasellüler ortamda geli șen kristalizasyonu
azaltmaktad ır. Ayr ıca lipit peroksidasyonunu ve hücre membran ındaki esnekli ğinin

12
kaybı nı önledikleri, ayr ıca da membran proteinlerinde stabilizasyon sa ğlad ıklar ı
bilinmektedir Suland ırıcıya kat ılmalarnda internal kriyopro tektanlara sinerjik etki
yapmakta ve geli șecek olas ı toksik etkileri azaltmaktad ır (McWilliams ve ark., 1995;
Cabria ve ark., 2001; Purdy, 2006).

1.4.1. Sakkaritler
Eksternal kriyoprotektan olarak gör ev yapan sakkaritler ozmotik bas ıncı art ırarak
hücresel dehidrasyonu uyar ırlar. Bu amaçla intrasellüler kristal olu șum s ıklılığını
daha da azaltm ıș olurlar. Șekerler spermatozoon plazma membran ındaki
fosfolipitlerle etkileș ime girerek, donma i șleminde daha uygun yaș am ortam ı
sağlama amacı yla, membranlarda yeni düzenlemelere yol açarlar.
Trehaloz, iki D-glikoz molekülünün ba ğlanmas ıyla olușmuș bir disakkarit
bileșiğidir (Richards ve ark., 2002). Tam olarak etki mekanizmas ı bilinmemekle
birlikte, spermatozoa plazma membran ına penetre oldu ğu, donma ve çözüm
esnası nda membran fosfolipitlerinin polar ba ș gruplar ıyla hidrojen ba ğlar ı kurarak
yüzey art ığı sağlad ığı, fosfolipitlerde meydana gelen ısı değișimlerini, fosfolipit açil
zincirleri aras ındaki van der waals etkile șimlerini, reaktif oksijen radikallerinin
sal ınımını ve bu sal ınımla beraber spermatozoon ve sperma plazması ndaki redükte
glutatyon (GSH) tükenimini azaltt ığı ileri sürülmektedir. Ayr ıca hücreyle ortam
aras ında ozmotik tamponlay ıcı olarak görev yaparak so ğuk șokuna kar șı koruma
sağlamaktad ır (Mcwilliams ve ark., 1995; Gao ve Cr ister, 2000; Aboagla ve Terada,
2003; Aisen ve ark., 2005; Purdy, 2006).
Son yı llarda trehaloz teke spermas ının dondurulmas ında sulandı rıcıya
kat ılmaya ba șlam ıș, sulandı rıcıya 50-100 mM oranlar ında ilavesi, çözüm sonras ı
%66,0±2,9-78,0±1,8 oranlar ı aras ında motilite eldesi önemli bulunmu ștur. Sağlam
akrozom yönüyle en yüksek oran (%60 üzer i) ise yine trehaloz içeren suland ırıcıdan
elde edilmi știr. Trehaloz dondurma öncesi ortamda teke spermatozoas ında membran
bütünlük ve esnekli ğini de art ırm ıștır (Aboagla ve Terada, 2003; Purdy, 2006).
Yapı lan bir çalı șmada, koç spermas ının dondurulmas ında, sulandı rıcıya 100
mM trehaloz eklenmesi, çözüm sonu motiliteyi (%65), akrozom bütünlü ğünü (%75)
ve HOS test oran ını (%50) kontrole göre önemli oranda koruyarak iyile știrmiș,

13
fertilitede ortalama %45,85 oranda gebelik elde edilmi știr (Aisen ve ark., 2000;
Aisen ve ark., 2002).
Koçlarda trehalozun (50 mM) çözüm sonras ı sperma ve oksidatif stres
üzerine etkilerini ara ștıran bir grup ara ștırmac ı da (Bucak ve ark., 2007), trehalozun
çözüm sonras ı spermatozoon motilitesi ve canl ılığında önemli oranda (%59,0±2,9 ve
%66,0±4,4) art ıșlara neden oldu ğunu göstermiș tir. Aynı çal ıșmada trehaloz kontrol
grubuna göre daha dü șük lipid peroksidasyon olu șumunu (8,6±0,2 ve 9,2±0,5
nmol/ml) vermi ș ve GSH ve vit E sevi yelerini de önemli oranda (2,3±0,8 nmol/ml ve
3,3±0,2 mg/dl) yükseltmi știr
Kas hücresinin dondurulmas ında trehalozun membran yap ısını ve
fonksiyonunu koruduğu, hücre katmanlar ını stabilize etti ği ve intramembranöz
partiküllerin agregasyonunu önledi ği gösterilmi știr (Rudolph ve Crowe, 1985;
Anchordoguy ve ark., 1987).
Bir grup ara ștırıcı (Storey ve ark., 1998b), farelerde yapt ıkları bir çal ıșmada,
sulandı rıcıya kat ılan trehalozun di ğer baz ı poliol grubu kriyoprotektanlara ve
raffinoza karș ı dondurma öncesi ve sonras ı plazma membran bütünlüğünde (%94±3
ve %48±6) önemli oranda koruma sa ğlam ıștır
Koçlarda ise gliserolün yoklu ğunda yapı lan dondurma i șleminde trehaloz ve
sükrozun glikoza göre daha yüksek çözüm sonu motilitesi verdi ği görülmü ștür
(Molina ve ark., 1994). Fakat baz ı araștırıcılar da (Chen ve ark. 1993; Foote ve ark.,
1993) boğalarda yaptı kları çal ıșmalarda, trehalozun (0,05-0,10 M) kontrole göre
çözüm sonras ı motilite (%60 ve %65) ve fertilite üzerinde (%73,1 ve %71,3) önemli
etki yapmad ığını göstermi șledir Bu durumun ise trehalozun dü șük dozda (0,05-0,1
M) kullanı mından ileri geldi ğini bildirilmi știr (Aboagla ve Terada, 2003).
Teke sperması nın dondurulmas ında sulandı rıcıya ilave edilen trehaloz,
kontrol grubuna göre çözüm sonu motilite oranı nda koruma sa ğlamazken
(%54,0±2,9 ve %53,0±3,0), ölü oran ı (%25,0±1,3 ve %27,6±1,5) ve anormal
spermatozoa oran ı (%5,3±0,7 ve %10,4±1,0) bak ımından en iyi korumay ı sağlam ıștır
(Bucak ve Uysal, 2007).
Sakkaritlerin koruyucu etkilerini mo lar ya da kitle konsantrasyonlar ına göre
gösterdikleri tart ıșmal ıdır. Molar etkinin ortamdaki elektrolit yo ğunluğunu bast ırarak
ya da ortamdaki donmam ıș kanallar ın büyümesini sa ğlayarak gösterildi ği

14
belirtilmektedir. Șekerlerin kitlesel etkileri ise ekst ernal ortamdaki ‘metastable kristal
formasyonu’na katk ı sağlayarak gösterdikleri san ılmaktad ır. Son aylarda yap ılan bir
çalıșmada șekerlerin kitlesel yo ğunluğunun molar miktarlar ına göre daha da etkinlik
gösterdiği saptanm ıștır (Koshimoto ve Mazur, 2002).

1.4.2. Antioksidanlar
Sperman ın dondurulmas ı-çözdürülmesi esnas ında olușan membran lipit faz
değișime, ozmotik-mekanik strese ve ortamdaki serbest oksijene ba ğlı olarak geli șen
lipit peroksidasyonu ve bunun sonucu olarak olu șan serbest oksijen radikalleri (ROS;
bașlıcalar ı: süperoksit anyon radikali, hidroks i radikali, hidrojen peroksit),
ekstraselüler kristal olu șumu, bunlar ın sonucu olarak geli șen membran
proteinlerindeki denaturas yon, hücre organellerinde yap ısal deformasyon, DNA’da
kırılmalar ve hücresel lizis antioksidanlar ın ilavesiyle azalt ılabilmekte, çözüm sonu
spermatozoon fonksiyonlar ını iyileș tirmektedir (Aitken, 1995; Maxwell ve Watson,
1996; Oehninger ve ark., 2000; Bilodeau ve ark., 2002). Antioksidanlar bu etkilerini
ortamdaki oksijen yo ğunluğunu azaltarak, geli șecek ya da baș lam ıș olan zinzir
reaksiyonunu önleyerek/k ırarak, ortamda olu șmuș peroksitleri parçalayarak etki
gösterirler (Cheeseman ve Slater, 1993; Marxwell, 1995; Sardesai, 1995; Thomas,
1995).
Sperman ın dondurulmas ı-çözdürülmesi, olu șan ROS ürünlerinin yaratt ığı
oksidatif stresle ve spermatozoon membran ındaki sülfidril gruplar ının yeniden
düzenlenmesiyle yak ın ilișkilidir. Bununla birlikte, sülfidril gruplar ında aç ılmalar;
miktar ve da ğılımında değișimler, spermatozoada prematür kapasitasyon, spermadaki
bazı antioksidan seviyelerinde dü șme ve taze spermaya göre lipit peroksidazyonuna
daha duyarl ı hal meydana gelmektedir (O’flabe rty ve ark.,1997; Bilodeau ve ark.,
2000; Mazur ve ark., 2000; Chatterjee ve ark., 2001). Bu s ırada geli șen ısı
değișimleri de membran sol-jel dengesini bozan stresin bir di ğer kayna ğıdır (Quinn,
1989).
Serbest oksijen radikallerini n toksik etkilerine karș ı koymak için,
spermatozoa ve seminal plazma lipit peroksidasyonuna kar șı bir tak ım
antioksidanları içermektedir (Alvarez ve Stor ey, 1983; Nissen ve Kreysel, 1983;
Jeulin ve ark., 1989). Bu antioksidanlar ın bir k ısm ı ortamda olu șan ROS ürünleri

15
temizleyicisi (albumin, taurin, hipotaurin, vitamin E), di ğer bir k ısm ı enzimsel
[katalaz (CAT), superoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GP)], bir grup ise
zincir reaksiyonlar ını kırıcısı (ürat, askorbik asit, vit E, thiol bile șikleri) olarak
etkimektedir (Halliwell ve Gutteridge, 1989; Sikka, 1996). Fakat bu antioksidan
sistemi, ROS ürünlerinin olas ı toksik etkilerine ve oksidatif hasara kar șı koymada
yeterli gelmemektedir (Taylor, 2001). Bu amaçla sperma suland ırıcılara kat ılan bazı
antioksidanları n k ısa ve uzun süreli saklamada ortamda olu șan lipit peroksidasyonun
yaratt ığı oksidatif hasar ı minimize etti ği ve canlı lığı koruduğu saptanm ıștır.

1.4.2.1. Sperman ın kısa ve uzun süreli saklanmas ında antioksidanlar ın etkisi
Koç spermas ının 7-14 günlük k ısa süreli saklanmas ında süperoksit dismutaz (SOD,
800 U/ml) ve CAT (200 U/ml) spermatozoan ın yașama süresini, motilitesini,
akrozom bütünlü ğünü ve fertilitesini iyile știrdiği rapor edilmi știr (Stojanov ve ark.,
1994; Maxwell ve Stojanov, 1996). Ayr ıca dondurulmas ı üzerinde de, suland ırıcıya
kat ılan SOD, katalaz ve taurinin çözüm sonu motiliteyi ve fertiliteyi iyile știrdiği
belirtilmiș tir (Maxwell ve Watson, 1996; Sanch ez-Partida ve ark., 1997; Uysal ve
ark., 2000).
Teke sperması nda da sulandı rıcıya ilave edilen SOD, katalaz ve sitokrom C
altı, GP ise on iki günlük k ısa süreli saklamada spermatozoon canl ılığında art ıșlar
sağlam ıș, (Stojanov ve ark., 1994) teke spermas ının dondurulmas ında da,
sulandı rıcıya kat ılan katalaz (200 U/ml), s odyum pruvat (0,11 mg/ml)’ ın çözüm
öncesi ve sonras ı progressif motiliteyi art ırdığı gözlenmi știr (Khalifa ve El-Saidy,
2006).
Ayg ırlarda yap ılan bir çalı șmada suland ırıcıya ilave edilen antioksidanlar ın
(katalaz, BHT, vitamin E, vitamin C, tempo) 72. saate kadar saklanan spermatozoa
motilitesinde önemli oranda bir iyile șme yapmad ığı gösterilmiș tir (Ball ve ark.,
2001). Fakat bu antioksidanla rdan (BHT, 0,02-1,25 mM; vitamin E, 1-80 µg/ml;
tempo, 0,039-1,25 µg/ml) vitamin C (1-400µg/ml)’nin d ıșındakiler hindi spermas ının
kısa süreli saklanmas ında (48 saat) spermatozoa ya șam ını, membran bütünlüğünü ve
motilitesini iyile știrmiștir. Araș tırma sonuçlar ı itibariyle vitamin C’nin dü șük
dozlarda kat ılmas ıyla antioksidan görevi gördü ğünü, yüksek dozlarda katı lmas ı ise
protektif özellikte oldu ğunu düșündürmektedir (Donoghue ve Donoghue, 1997).

16
1.4.2.2. Glutatyonun gamet ve embriyo üzerine etkisi
Glutatyon, lipit per oksidasyonu sonucu oluș an ROS ürünlerine kar șı koruyucu etkisi
non-enzimatik özelli ğinde olan, memeli sperma ve genital kanal ında da bulunan ve
protein yap ısında olmayan bir thiol, L-g-glut amyl-L-cysteinylglycine, bile șidir. Bu
thiol bileșiği, hücre içi redoks i șleminin sürdürülmesi yan ında hücredeki ekzojen ve
endojen bile șimlerin antioksidayonunda ve deto ksifikasyonunda önemli rol oynar.
Antioksidan sistemdeki rölü, suda çözünen antioksidanlar ı rejenere etme yateneğine
sahip olması dır. Memeli spermas ındaki glutatyon seviyesi türe özgü farkl ılıklar
gösterir (Irvine, 1996; Baumbe r ve ark., 2000; Luberda, 2005).
Glutatyon, redükte glutatyon (GSH) ve oks ide glutatyon (GSSG) olmak üzere
iki formda bulunmaktad ır. ROS ürünlerine kar șı glutatyonun koruyucu etkisi,
glutatyon peroksidaz, glutatyon re düktaz gibi enzimlerle etkile șime girmesiyle
kolaylaștırılır. Canl ı dokularda, yap ısında selenyum içeren enzim olan glutatyon
peroksidaz, GSH varl ığında peroksidasyon sonucu olu șmuș hidrojen peroksit ve lipit
peroksitlerinin indirgenmesini katalize ederek, GSSG’ye dönü șür. Bu dönüș üm
sıras ında GSH, glutatyon peroksidazı n substrat ı görevi görmesiyle peroksidayonu
yavașlatarak motilite kayb ını, intrasellüler enzim sal ınımını ve kromatin hasar ını
azalt ır. Tersine i șlemde ise, pentoz fosfat yol uyla GSSG, glutatyon redüktaz
enzimiyle nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) varlı ğında GSH’a
indirgenmektedir (Aitken, 1989; Sinha ve ark., 1996; Luberda, 2001).
Spermatozoan ın aerobik ortamda inkübasyonunda intraselüler GSH’ı n azalması ,
GSSG yo ğunluğunun art ıșıyla ilișkili değildir. Bu i șlemde GSH’ ın diğer moleküllerle
verdiği reaksiyonlar önemli olabilmektedir. GSH’daki azalmaya, membran
proteinlerinin GSH ile disülfit ba ğlar ıyla bağlanmas ı (protein-S-S-glutatyon) ve hem
GSH’ ın hemde GSSG’nin aerobik ortamda hücre membranı ndan d ıș ortama geçi și
neden olmaktad ır. Olușan disülfit yap ı, oksidatif atağa kaș ı membran proteinlerini
korumaktad ır (Van Klaveren ve ark., 1997; Bilodeau ve ark., 2000).
Glutatyonun suland ırıcılara kat ılmas ı, ortamda bulunan ROS ürünleriyle
reaksiyona girerek ve donma esnas ında membran proteinler indeki sülfür gruplar ında
gelișen bozulma ve da ğılmay ı kısmen önleyerek oksidatif hasara karș ı koruyucu
etkinlik olu șturur. (Shan ve ark., 1990; Chatterjee ve ark., 2001). Bo ğa ve
domuzlarda yap ılan çal ıșmalarda dondurma ve çözdürme i șlemlerinin, spermada

17
bulunan doğ al glutatyon seviyesini dü șürdüğü saptanm ıștır (Bilodeau ve ark., 2000;
Gadea ve ark., 2004). Bunun yanı nda domuzlarda yap ılan çalıșmalarda suland ırıcıya
ilave edilen glutatyonun kontrole göre çözüm sonras ı fertiliteye (%84,6±3,8 ve
%81,2±4,4) önemli katk ılar yapmad ığı belirtilmi știr (Gadea ve ark., 2005).
Tekelerde yap ılan bir çal ıșmada da glutatyon (5 mM) çözüm sonras ı
motiliteyi (%53,6±0,4), akrozom anoma lilerini (%6,2±0,5) önemli oranda
korumuș tur. Fertilite üzerindeki etkisi ise önemli say ılmam ıștır (Sinha ve ark., 1996).
Glutatyonun k ısa süreli saklanan koç spermas ı üzerine etkisi ise 6. saatte
spermatozoon motilitesini (%77,9±1,8) ve 30. saatte canl ı oran ını (%51,7±4,4)
önemli oranda korumas ıyla ortaya ç ıkm ıștır (Bucak ve Tekin, 2007).
Glutatyonun fertilizasyon medyumuna ilavesi blastosist oran ını art ırmaktad ır.
Oositte ise sitoplazmik mutarasyonda ve kromatin dekondensasyonu sonras ı
fertilizasyonu takiben erkek pronükleus olu șumunda önemli rol oynamakta, ayr ıca
miyotik a ğ morfolojisinin korunmas ında gelișen oksidatif ata ğa karșı durmaktad ır
(Gardiner ve Reed, 1994; Eppi g, 1996; Sutovsky ve Scha tten, 1997; Boquest ve ark.,
1999; Kim ve ark., 1999).

1.4.3. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)
EDTA permeabl olmayan bir șelat özelli ğinde oldu ğundan, spermatozoon
motilitesinde zararl ı bir etkisi olmad ığı bildirilmektedir. İnsanlarda yap ılan bir
çalıșmada suland ırıcıya 0,5 mM ve 1 mM oran ında kat ılmas ı, spermatozoan ın
inkübasyonunda motil kalma süresine katk ı sağlamaktad ır (Kuo ve ark., 1998;
Sørensen ve ark., 1999). EDTA’in buradak i etkisi, seminal plazmada bulunan ve
yüksek miktarlar ıyla spermatozoon üzerinde toksik etki gösteren baz ı metallerle
(kalsiyum, çinko) șelat olușturarak ortamdaki metal yo ğunluğunu düș ürmesi, bu
nedenle de motiliteyi iyile știrmesi yönüyledir (Riffo ve ark., 1992). Tekelerde
sulandı rıcıya 1mg/ml dozunda EDTA’i n ilavesinin çözüm sonrası spermatozoon
motilitesini art ırdığı (%65,4) gösterilmiș tir (Khalifa ve El-Saidy, 2006). Bunun
yan ında EDTA’in yüksek oranda kullan ımı, seminal plazmada bulunan ço ğu metali
bağlayabilece ğinden spermatozoon motilitesini kötüle știrmekte ve spermisidal etki
olușturmaktad ır (Sørensen ve ark., 1999; Lee ve ark., 2002; Zairi ve ark., 2005).

18
Koçlarda yap ılan bir çalı șmada dondurma/çözdürme sonras ı, trehaloz ve
EDTA (1,5 gram/litre) kombinasyonunun en yüksek plazma membran bütünlü ğü
oran ını (%60) verdi ği gösterilmi știr. Trehalozun membran fosfolipitlerindeki
antioksidan olarak koruyucu etkisi, EDTA ile hücreden ve membrandan kalsiyumun
uzaklaștırmas ıyla azalmaktad ır. Bu durum Ca2+ ile trehaloz aras ındaki sinerjik etkiyi
göstermektedir (Aisen ve ark., 2005).
Koçlardaki bir ba șka çalıșmada da, suland ırıcıda EDTA’in trehalozla
kombine kullan ımıyla olușan sinerjik etki, çözüm sonras ı termoresistans ( 0. ve
4.saatte) üzerinde aç ıkça görülmü ș, sıras ıyla motilite oranlar ı %72,3, %57,6 olarak
belirlenmiș , çözüm sonrası akrozom bütünlü ğünde de önemli oranda (%62,4) koruma
sağlanm ıștır. EDTA’n ın yaln ız kullan ımı çözüm sonras ı 0. saatte kontrole göre
motilite üzerinde koruma sa ğlarken (%67,7, %63,4), 4. sa atte ise önemli farkl ılık
görülmemi știr (%27,9, %32,1 (Aisen ve ark., 2000).
EDTA’in etkisinin geçirgen olmaya n ve suda eriyen moleküllerinin
antioksidatif etki göstermesiyle șekillendiği ve hidrojen peroksi tin toksik etkisini
fenton tipi reaksiyonla nöt ralize ederek gösterdi ği ortaya at ılm ıștır (Bilodeau ve ark.,
2002). Sulandı rıcılara ilave dilen EDTA’in Ca2+ ile H bağıyla birleșip kalsiyumun
spermatozoon canl ılığı ve akrozom bütünlü ğü üzerindeki bask ılay ıcı etkisini elimine
etmektedir (Bakas ve Disalvo, 1991; Hamm ertstedt, 1993; Bailey ve Buhr, 1995). Bir
bașka çal ıșmada da, EDTA (5 mM) ile kullan ılan diğer baz ı antioksidanlar ın (SOD,
Katalaz, pruvat) sinerjik etkisi vard ır. H 2O2 ile inkübe edilmi ș spermaya EDTA’in
ilavesi dondurulmu ș/çözdürülmü ș spermatozoon motilitesini iyile știrmiș ve
intrasellüler ATP kayb ını engellemiș tir (Bilodeau ve ark., 2002).
Yapı lan bu tez çalı șmas ının amac ı, teke sperması sulandı rıcısına kat ılan
kriyoprotektanlarla çözüm sonras ı spermatolojik parametrelerin iyile știrilmesi
neticesinde sahada yap ılacak tohumlama uygulamalar ıyla fertilite sonuçlar ının
art ırılmas ına yönelik olarak, literatürdeki söz ko nusu kriyoprotektanlarla ilgili bilgi
eksikliğinin giderilmesi ve Ankara keçisi spermas ının dondurulmas ındaki etkilerinin
araștırılmas ı olmuș tur.

19
2. Gereç ve Yöntem
2.1. Hayvan materyali ve hayvanlar ın bak ım-beslemesi
Çal ıșmada, yeti știrme mevsimi içinde Lalahan Hayvanc ılık Merkez Araș tırma
Enstitüsü bünyesindeki Ankara tekesi sürüsünden seçilen, fertil ve 3-4 yaș lı üç baș
Ankara tekesi kullan ılm ıștır. Hayvanlarda düzenli ve rutin sa ğlık kontrolleri ve a șım
sezonuna girerken flushing uygulamas ı yap ılm ıștır.

2.2. Sperman ın al ınmas ı
Sperma, yeti știrme mevsimi içinde haftada ik i ve her tekeden en az alt ı kez olmak
üzere sun’i vajen yard ımıyla Ankara tekelerinin di șiye atlatı lmas ıyla alı nm ıștır.

2.3. Sperman ın suland ırılmas ı ve dondurulmas ı
Ankara tekelerinden al ınan ejalülat örneklerinde n makroskopik ve mikroskopik
özellikleri yönüyle normospermi gösterenler kar ıștırılm ıștır (miks ejakülat). Miks
sperman ın yoğunlu ğu hemositometrik yöntemle tesp it edilerek, her payette (0,25
mm3) yaklașık 200 milyon motil spermatozoa olacak șekilde suland ırma ișlemine
alınm ıștır. Miks spermadan dört e șit miktarda numuneler al ınarak 37oC’taki su
banyosundaki cam tüplerde al ıkonulmuș tur. Sperman ın sulandı rılmas ında temel
sulandı rıcı olarak, Tris-sitrik as it-glikoz-yumurta sar ısı-gliserol suland ırıcısı
kullan ılm ıștır.
Spermaları n suland ırılmas ında kullanı lan temel suland ırıcı:
Tris (Hidroksimetilaminometan) 375 mM
Sitrik asit 124 mM
Glikoz 41,625 mM
Distile suyla 100 ml’ye tamamlanm ıș ve %9 oran ında yumurta sar ısı ve % 6
oran ında gliserol eklenmiș tir. Temel suland ırıcının pH’s ı 6,8-7,0 olarak
ayarlanm ıștır.
Sulandı rma gruplar ı, kontrol (temel suland ırıcı) ve bu suland ırıcıya farkl ı oranlarda
üç ayr ı kriyoprotektan kat ılm ıș 10 ml’lik suland ırıcılardan olu șmuștur.

20
Kontrol ve kriyoprotektan içeren suland ırıcı gruplar ı:
1- Temel suland ırıcı + Trehaloz (100 mM) + EDTA (0,015 gr/10 ml)
2- Temel suland ırıcı + Okside glutatyon (GSSG, 5 mM)
3- Temel suland ırıcı + Trehaloz + EDTA + GSSG (Kombine)
4- Temel suland ırıcı (Kontrol)
Miks ejakülattan her bir deney tüpüne 0,5 ml sperma konulduktan sonra belirtilen
sulandı rıcılarla suland ırma iș lemini takiben payetlere çekilerek 2,5 saat +5oC’ta
ekilibrasyona b ırak ılm ıștır. Ekilibrasyonu izleyen süreçte s ıvı azot buhar ında
dondurulan (~-100oC) sperma numuneleri -194oC’taki sı vı azotta de ğelendirilmek
üzere saklanm ıștır.

21

Resim 1. Çal ıșmada kullan ılan Ankara tekeleri Resim 2. Spermanı n al ınmas ı ve suland ırılmas ında kullan ılan
ekipmanlar

Resim 3. Suni vagen ile tekeden sperman ın al ınmas ı Resim 4. Tekelerden al ınan ejakülatlar ın bir tüpte miks yap ılmas ı

Resim 5. Spermanı n sulandı rılmas ında kullan ılan suland ırıcı gruplar ı Resim 6. Spermanı n sulandı rma iș lemi 22

23
2.4. Sperman ın in vitro de ğerlendirilmesi
2.4.1. Nativ spermada de ğerlendirme
Miks edilmiș ejakülatlarda spermatolojik özellikler [toplam miktar, motilite,
yoğunluk, anormal spermatozoa oran ı, ölü spermatozoa oran ı, hipoozmotik șișme
testi (HOST)] belirlenmi știr.

2.4.2. Dondurulmu ș-çözdürülmü ș spermada de ğerlendirme
Dondurulan sperma örnekleri, su banyosunda 37oC’ta 20 saniyede çözdürülmü ștür.
Çözdürülmü ș her bir sperma numunesinde spermatozoa motilitesi, anormal
spermtozoa oran ı, ölü spermatozoa oran ı ve HOST yönüyle spermatolojik özellikler
belirlenmiș ve karșılaștırılm ıștır.

2.4.3. Sperma de ğerlendirme parametreleri
2.4.3.1. Toplam miktar
Ankara tekelerinden al ınan ejakülat örnekleri dereceli bir tüpte miks edildikten sonra
ml olarak miktar ı kaydedilmi știr.

2.4.3.2. Spermatozoa motilitesi Motilitesi tayin edilecek miks spermadan ısıtma tablal ı mikroskopta lam ın üzerine
bir damla al ınarak üzeri lamel ile kapat ılm ıștır. Mikroskop sahası nda X200
büyütmeli objektifte ileri yönde aktif düzgün hareket eden spermatozoan ın oran ı (%)
motilite değ eri olarak kaydedilmi știr.

2.4.3.3. Anormal spermatozoa oran ı
Sperma numunelerinde anormal spermatozoa oran ı sıvı fikzasyon yöntemi ile
belirlenmiș tir. Fikzasyon amaçlı 0,5 ml Hancock s ıvısı içine 1-2 damla sperma
numunesi damlat ılm ıștır. İyice kar ıșımlar ı sağlandı ktan sonra karı șımdan bir damla
sperma lam üzerine al ınarak üzerine lamel kapat ılm ıștır. İmmersiyon objektifinde
(1000X) 400 spermatozoa say ılarak anormal spermatozoa oran ı % olarak

24
belirlenmiș tir. Normal spermatozoa yap ısı dıșındaki yap ılar anormalite olarak kabul
edilmiștir.

Hancock sı vısının haz ırlan ıșı:
1. kar ıșım: NaCl (9 gram) 2. kar ıșım: A- Na 2HPO 4.2H 2O (21,682 gram)
Bidistile su (500 ml) Bidistile su (500 ml)
B- KH 2PO 4 (22,254 gram)
Bidistile su (500 ml)
200 ml A ile 80 ml B kar ıștırılarak 2. kar ıșım hazı rlan ır ve Hankok s ıvısı;
Formalin (62,5 ml) 1. kar ıșım (150 ml)
2. kar ıșım (150 ml), bidistile suyla 500 ml’ye tamamlanarak haz ırlanm ıștır.

2.4.3.4. Ölü spermatozoa oran ı
Spermalarda ölü spermatozoa oran ının belirlenmesinde eozin-nigrozin boyama s ıvısı
kullan ılm ıștır. Is ıtma tablas ındaki lam üzerine bir k ısım sperma numunesi 4 k ısım
boyama sı vısı konarak kar ıștırılm ıș ve frotileri çekilerek kurutulmu ștur. Bu çekilde
hazırlanan frotilerde mikroskopta (400 X büyütme) 400 spermatozoa say ılarak ölü
spermatozoa oran ı % olarak belirlenmi știr. Spermatozoon ba ș kısm ının tamam ının ya
da bir bölümünün boya almas ı ölü spermatozoa oran ını göstermiștir.
Eozin-nigrozin boyama s ıvısının haz ırlan ıșı
:
Eozin (1,67 gram)
Nigrozin (10 gram) Sodyum sitrat (2,9 gram), 100 ml distile suya tamamlanarak haz ırlanm ıștır. Boyama
sıvısı kullan ımdan önce filtre edilmi știr.

2.4.3.5. Spermatozoa yo ğunluğu
Sperma yoğ unluğunun belirlenmesinde hemositometrik yöntem kullan ılm ıștır. Nativ
spermadan alı nan numunelerin suland ırılmas ı ve tespiti için Hayem sı vısı
kullan ılm ıștır. Bu s ıvının 5 ml’sine otomatik pipetle 0,01 ml sperma numunesinden
alınarak, 1/500 oran ında suland ırılm ıștır. Thoma lam ında 10 büyük karede say ılan
spermatozoa yo ğunluğu șu formüle göre yap ılm ıștır:

25
Sayı lan spermatozoon say ısı
Yoğunluk (109 /ml) = _________________________________________________ X 1000
Sayı lan büyük kare X Büyük kare hacmi X Suland ırma oran ı

Hayem s ıvısının haz ırlan ıșı:
Sodyum sülfat (5 gram) Sodyum sitrat (1 gram) Civa klorür (0,5 gram) Bidistile su (200 ml)
2.4.3.6. Hipoozmotik șișme testi (HOST)
Numunelerdeki spermatozoon membran ının fonksiyonel bütünlü ğünün belirlenmesi
amac ıyla HOST uygulanm ıștır. Su banyosunda +37
oC’taki 100 mOsm’luk HOST
sıvısından 300 µl alı nm ıș, üzerine sperma numunesinden 30 µl eklenmi știr. Bu
kar ıșımın +37oC’ta 30 dakika inkübasyonu sonrası , lam üzerine bu karı șımdan bir
damla al ınıp froti çekilerek, 400x büyütmeli objektifte 400 șișmiș ve k ıvrılm ıș
kuyruğa sahip spermatozoan ın oran ı % olarak belirlenmiș tir.
HOST s ıvısının haz ırlan ıșı:
0,9 gram früktoz
0,49 gram trisodyum sitrat, 100 ml’ye tamamlanarak (100 mOsm/ kg) haz ırlanm ıștır.

2.5. İ statistiksel analiz
İstatistiksel analizde 6 farkl ı uygulamadan elde edilen verilerin ortalamalar ı
kullan ılm ıștır. Farkl ı gruplar ın karșılaștırılmas ında Kruskal-Wallis test, aralar ında
önemli farkl ılık bulunan ikiden fazla grubu kar șılaștırmak için de Mann-Whitney
Testi uygulanm ıștır. Farkl ılığın P< 0,05 düzeyde olmas ı önemli kabul edilmi știr.

26
3. Bulgular
3.1. Nativ spermada bulgular
Çal ıșma süresince Ankara tekelerinden al ınan ejakülatlar miks yap ılarak
spermatolojik özellikler (motilite, yo ğunluk, anormal ve ölü spermatozoa oranlar ı,
HOST) de ğerlendirilmi știr. Her bir ba ğıms ız uygulamadan elde edilen bulgular
çizelgede belirtilmi știr (Çizelge 1). Buna göre, miks ejakülatlarda toplam miktar,
spermatozoa yo ğunluğu, motilitesi, anormal ve ölü spermatozoa oranlar ı, HOST
değerleri (%) s ıras ıyla, 2,7±0,3; 3,5±0,4; 84,9±1,1; 6,7±0,8; 8,6±0,8; 67,2±1,6 olarak
belirlenmiș tir.

3.2. Dondurulmu ș-çözdürülmü ș spermada bulgular
Bu çalı șmada Ankara tekesi spermas ı sulandı rıcılar ına kat ılan farkl ı
kriyoprotektanlar ın çözüm sonrası spermatozoonlar üzerindeki etkileri çizelgede
gösterilmi știr (Çizelge 2). Çözüm sonras ı spermatozoa motilitesi (%) GSSG,
kombine ve konrol gruplar ında, s ıras ıyla, 53,7±3,7; 46,2±1,2; 42,5±3,2 olarak
saptanm ıștır. Trehaloz+EDTA içeren grupta ise bu oran 30,0±2,0 olmu ștur. Anormal
spermatozoada, kriyoprotektan içern gr uplar birbirlerine göre (trehaloz+EDTA,
GSSG, kombine; % 10,5±0,9, %13,2±0,9, % 8,0±0,9) istatistiksel olarak önemli farkl ılığa
neden olmazken, kontrol grubuna göre en dü șük oran ı vermișlerdir ( P<0,05). GSSG içeren
grupta ölü spermatozoa bak ımından en dü șük oran (30,0±2,0) elde edilmi știr.
Hipoozmotik șișme testinde ise GSSG ve kombine gruplar ının (%40,5±2,7;
%27,0±1,4) diğer gruplara (Trehaloz+EDTA, kontrol; %11,7±1,8, %16,2±2,0) göre
daha yüksek sonuçlar verdi ği gözlenmiș tir (P<0.05).

27
Çizelge 1. Miks ejakülatlarda sp ermatolojik özellikler
Uygulamalar Toplam
miktar (ml) Yoğunluk
(X109/ml) Motilite
(%) Anormal
Oran (%) Ölü oran ı
(%) HOST (%)
1. Uygulama 2,3 3,0 80,3 5,7 10,2 66,8
2. Uygulama 2,8 3,3 85,0 8,2 9,3 67,3
3. Uygulama 2,0 3,0 85,0 5,7 7,6 68,0
4. Uygulama 3,3 4,2 84,2 7,6 8,2 67,5
5. Uygulama 2,5 3,6 88,3 7,8 8,3 65,8
6. Uygulama 3,4 4,2 86,6 5,5 8,0 67,7
Ortalama X±Sx 2,7±0,3 3,5±0,4 84,9±1,1 6,7±0,8 8,6±0,8 67,2±1,6

Çizelge 2. Dondurulmu ș çözdürülmü ș Ankara tekesi sperması ndan çözüm sonras ı elde edilen spermatolojik özellikler (n:6)

Gruplar Motilite (%)
X±Sx Anormal Oran (%) X±Sx Ölü oran ı (%)
X±Sx HOS test
(%)
X±Sx
Trehaloz+EDTA 30,0±2,0a 10,5±0,9a 59,0±1,9a 11,7±1,8a
GSSG
53,7±3,7b 13,2±0,9a 30,0±2,0b 40,5±2,7b
Trehaloz+EDTA+GSSG
46,2±1,2b 8,0±0,9a 38,0±0,9c 27,0±1,4c
(Kombine)

Kontrol 42,5±3,2b 21,5±1,3b 40,7±3,1c 16,2±2,0a
ÖD * * * *
a,b,c: Ayn ı sütunda farkl ı harfler taș ıyan ortalamalar aras ı farkl ılıklar önemlidir (* P<0,05)

28
4. Tart ıșma
Dünya tiftik üretiminde Ankara keçisi önemli yere sahiptir. Bu nedenle spermas ının
bașarılı bir șekilde dondurularak tohumlamada ve türün ıslah ında kullanı lmas ı keçi
yetiștiriciliğini doğrudan etkileyebilmektedir. Te ke sperma hücrelerinin dondurma
ișlemi s ıras ında soğuk șokuna kar șı duyarl ılık göstermeleri, hücreler üzerindeki
hasar ı art ırarak çözüm sonras ı spermatolojik özellikleri ve fertiliteyi olumsuz yönde
etkilemektedir. Bu nedenle sperma suland ırıcılar ına kat ılacak koruyucu ve
antioksidan özellikli kimi katk ı maddeleriyle dondurma i șlemi ve ortamda geli șecek
soğuk șoku hasar ı minimize edilebilmektedir. Literatür taramalar ında bu tarz
araștırmaları n fazla olmad ığı görülmü ș, sunulan çal ıșmada bu konu üzerine
eğilinmiștir.
Bilimsel ve modern anlamda canl ı hücre dondurma çal ıșmalar ı, 1949 yı lında
Polge ve arkada șlar ının gliserolün kriyoprotektan (so ğuk șokuna kar șı koruma
sağlay ıcı) özelliğini bulmas ından sonra baș lam ıș, ilk dondurulan hücre spermatozoon
olmuștur. Bu anlamda, kriyobiyoloj i hücre, doku, organ ve organizmalar ın
dondurulması nı inceleyen bilim dal ı olarak önemini artı rm ıș ve dondurulan-
çözdürülen hücrenin fizyolojik-fonksi yonel özelliklerinin daha iyi anla șılmas ı,
kriyobiyolojiyi yönlendirmi știr (Polge ve ark, 1949; Leibo and Brandley, 1999).
Spermatozoondaki membransel yap ılar (plazma membran ı, dıș akrozomal membran
ve mitokondri membran ı) ile oosit-embriyo membran ı, donma/çözünme i șlemine
karșı son derece duyarl ıdır. Membran yapı lar ı ak ıcı mozaik tarz ında düzenlenmiș
protein, glikoprotein ve glikolipitlerle bezeli iki s ıralı fosfolipit katman ından
olușmuștur. Bu yap ılar ın termodinamik özellikte ve %65-70 oran ında doymam ıș
fosfolipitlerden olu șmas ı, membranlar ın soğutulmas ı sıras ında geri dönü șümsüz faz
değișimine, s ıvı fazdan jel faz ına geçmesine neden olmaktad ır (Watson, 1995;
Watson, 2000). Geliș en faz de ğișimi sonras ı bozulan membran stabilizasyonu ile
hücrede so ğuk șoku hasar ı gelișmektedir. Ayr ıca membranlar ın doymam ıș
fosfolipitlerce zengin olmas ı, hücrelerin dondurulması sıras ında gelișen oksidatif
stresle iliș kili olarak hücreleri lipit peroksidasyonuna kar șı duyarl ı k ılmakad ır
(Watson, 1995; Holt, 2000). Bu geli șen olaylar spermatozoon yap ısında ve
menbranları nda değișiklikler geli șerek, hücre motilitesinde, canl ılığında ve
fertilitesinde dü șüșlerle kendini göstermektedir (Maxwell and Watson, 1996).

29
Sperma hücreleri lipit peroksidasyonunun zararl ı etkilerini kar șılamak için
bazı antioksidanlar ı içermektedir. Fakat bu endojen antioksidanlar sperman ın
dondurulması nda yeterli gelmemekte, ekzojen antioksidanlara gerek duyulmaktad ır.
Son yı llarda kriyoprotektif amaçl ı olarak sperma suland ırıcılar ına ilave edilen
antioksidan özellikli kimi maddelerin çözüm sonu parametreler üzer inde etkinlikleri
saptanm ıștır (Kantola ve ark., 1988; Jeulin ve ark., 1989; Griveau ve ark., 1995;
Aurich ve ark., 1997).
Aisen ve arkada șlar ın koçlarda yaptı klar ı çal ıșmalarda suland ırıcıya kat ılan
trehaloz ve EDTA kombinasyonun bunlar ın tek kullan ılmalar ına ve kontrol grubuna
göre çözüm sonu motilite ve akrozom bütünlü ğü oranlar ında (%72,3±0,9 ve %75,0)
önemli koruyucu etki sa ğlad ığı gösterilm știr. Bu etkiler, treh alozun belirli oranlar ının
membran-solüsyon arabiriminde suyla yer de ğiștirerek dondurma öncesi ortamda
hücresel dehidrasyona yol açmas ı, membran fosfolipitleriyl e direkt olarak etkile șime
girerek so ğuk șokuna kar șı koruyuculuk sağ lamas ı, EDTA’in ise trehalozun donma
derecesini dü șürerek sinerjik bir etki yaratmas ıyla olușmuștur (Aisen ve ark, 2000;
Aisen ve ark, 2005). Ayn ı zamanda Trehalozun tam olarak etki mekanizmas ı
açıklanamamas ına rağmen, donma esnas ında geliș en ekstraselüler ortama su ç ıkıșının
yaratt ığı hızlı fiziksel ve morfolojik de ğișikliklere kar șı hücre membranlar ını dirençli
hale getirdi ği, ortamda geliș en kristalizasyon ve donmam ıș kanalları n șekil-yap ısını
ve tuz yo ğunluğunu etkiledi ği ve donma s ıras ında gelișen intraselüler kristal
olușumunu azalttı ğı bildirilmektedir (Anchordoguy ve ark., 1987; Foote ve ark.,
1993; Nicollajsen ve Hvidt, 1994; Orsi ve Leese, 2001; Aboagla ve Terada, 2003).
Bunun yanı sıra trehalozun tekelerde (Aboagla ve Terada, 2003) ve koçlarda
(Bucak ve ark., 2007) çözüm sonu spermato zoa motilitesi üzerinde (%78 ve %56)
kontrol gruplar ına göre (%62,0 ve %47,5) önemli oranda iyile șmeler sağlad ığı
belirtilmiș tir. Ancak boğalarda yap ılan bir çal ıșma, trehalozun kontrol grubuna göre
motilite (%60 ve %65) ve fertilite oranlar ı (%73,1 ve %71,3) üzerinde etkinli ğinin
olmad ığını göstermiștir (Chen ve ark., 1993; Foote ve ark., 1993).
Sunulan çal ıșmada ise kullan ılan 100 mM trehalozun a șırı bir hiperozmotik
ortam olu șturarak sperma hücrelerinde büzü șmelere neden oldu ğu ve EDTA’n ın bu
değișimlerde yeterli ölçüde koruyucu etki sa ğlamayarak, çizelge 2’de görüldü ğü gibi

30
çözüm sonras ı spermatozoa motilitesini ve ölü oran ını (%30,0±2,0 ve %59,0±1,9),
kontrol grubuna (%42,5±3,2 ve %40,7±3,1) göre koruyamad ıklar ı görülmüș tür.
Daha önce yaptı ğımız çal ıșmalarda da suland ırıcıya ayn ı oranda kat ılan
trehalozun çözüm sonras ı motilitede ve k ısa süreli saklanan numunelerde
spermatozoon yaș am ı üzerine önemli katk ılar yaptığı gösterilmi știr (Bucak ve Tekin,
2007; Bucak ve Uysal, 2007). Suland ırıcıya kat ılan yüksek yoğunluktaki trehalozun
yaratt ığı spermatozoonlar üzerindeki hasar, yeterli hücresel bütünlükle geçimli
olmayan hücre d ıșına s ıvı çıkıșına bağlanabilmektedir (Curry ve Watson, 1994).
Fakat baz ı yazarlar, sperma suland ırıcısına kat ılan yüksek orandaki trehalozun, dü șük
oranlar ına göre so ğuk șoku hasar ına karșı daha iyi koruma sa ğlad ığını belirtmektedir
(Woelders ve ark., 1997; An ve ark., 2000; Aboagla ve Terada, 2003). Yap ılan
çalıșmalardaki farkl ı sonuçlar ın ortaya çı kması , sulandı rıcıya kat ılan değișik Tris
konsantrasyonlar ına, türe özgü spermatozoon membran yap ılar ının farkl ı özellik
göstermesine ve dondurma/çözdürme h ızına bağlanabilmektedir. Bu anlamda
yapt ığımız baz ı ön deneme çalı șmalar ında da sulandı rıcıda Tris miktar ının 250 mM
civar ında olması , ortama 50 mM’dan daha fazla trehalozun kat ılmamas ı gerektiğ ini
göstermiștir.
Ön denemelerde yüksek yo ğunluklu trehalozun olu șturduğu hipertonik
ortam ın spermatozoa motilitesini bask ıladığı, ortam ın izotonik hale
dönüș türülmesiyle de bu bask ının kalkt ığı görülmüș , fakat eski motil durum elde
edilememi știr. Ancak ș u söylenebilir: Suland ırıcılardaki Tris ve kat ılacak trehaloz
yoğunluklar ı ayarlanarak olu șturulacak hipertonik ortam ın kı sa süreli saklama
sıras ında spermatozoa motilitesini bask ılamas ıyla enerji kayb ının azalt ılmas ı, bu
sayede de suland ırılm ıș sperman ın daha uzun sürelerde, fakat dondurulmadan
saklanabilece ği protokollerin olu șturulabilmesi olana ğını sağlam ıș olmaktad ır.
Bunun yanı sıra, son y ıllarda koçlarda yap ılan çal ıșmalarda trehaloz ve
EDTA’in direkt ortamda geli șen lipit peroksidasyonuna kar șı koruyuculuk
sağlayarak, serbest radikal temizleyicili ği yapt ığını göstermi știr (Aisen ve ark., 2005;
Bucak ve ark, 2007). Tekelerde yap ılan bir ara ștırmada ortama ilave edilen EDTA
(1mg/ml)’in çözüm sonras ı spermada H 2O2 formasyonunu bask ılad ığı ve çözüm
sonrası spermatozoa motilitesini art ırdığı (%65,4) gösterilmi știr (Khalifa ve El-
Saidy, 2006). EDTA’in buradaki etkisi, seminal plazmada bulunan ve yüksek

31
miktarlar ıyla spermatozoon üzerinde toksik etki gösteren bazı metallerle (kalsiyum,
çinko) șelat olușturarak ortamdaki metal yo ğunluğunu düșürmesi, bu nedenle de
motiliteyi iyile știrmesi yönüyle olmu ștur (Riffo ve ark., 1992). Bunun yanı nda
EDTA’in yüksek oranda kullan ımı, seminal plazmada bulunan ço ğu metali
bağlayabilece ğinden spermatozoon motilitesini kötüle știrmekte ve spermisidal etki
olușturmaktad ır (Sørensen ve ark., 1999; Lee ve ark., 2002; Zairi ve ark., 2005). Bir
bașka çal ıșmada da EDTA (5 mM) ile kullan ılan diğer baz ı antioksidanları n (SOD,
Katalaz, pruvat) sinerjik etkisi vard ır. H 2O2 ile inkübe edilmi ș spermaya EDTA’in
ilavesi dondurulmu ș/çözdürülmü ș spermatozoon motilitesini iyile știrmiș ve
intraselüler ATP kayb ını azaltm ıștır (Bilodeau ve ark., 2002).
Tüm bu sonuçlardan bu iki maddenin (Trehaloz ve EDTA) ortamda eneji
kaynağından ziyade, dondurma-çözdürme i șlemi s ıras ında ekstrasellüler
kryiopotektif-antioksidatif ve ozmotik bas ıncı düzenleyici özellik gösterdi ğini ortaya
koymaktad ır. Çal ıșmam ızda kriyoprotektan içeren gruplardan çözüm sonras ı elde
edilen anormal spermatozoa oran ının (trehaloz+EDTA, GSSG, kombine; % 10,5±0,9,
%13,2±0,9, % 8,0±0,9) kontrole göre dü șük ç ıkmas ı (%21,5±1,3) ve trehalozun etkili
bir membran koruyucu özelli ğinin oldu ğunu gösterilmesine ra ğmen, aynı durumun
HOST sonuçlar ından elde edilememesi, trehalozoun etkinli ğini düșündürücü
kılmakad ır. Aynı durum Saanen teke spermas ının trehalozla dondurulmas ından da
elde edilmi ș, kontrolle karș ılaștırılmas ında motilite (%54,0±2,9 ve %53,0±3,0) ve
HOST (% 44,5±6,7 ve 53,4±1,2) oranlar ında korunma sa ğlanmazken, ölü oran ı
(%25,0±1,3 ve %27,6±1,5) ve anormal spermatozoa oran ı (%5,3±0,7 ve %10,4±1,0)
bak ımından en iyi korunmanı n sağland ığı gösterilmi știr (Bucak ve Uysal, 2007).
Çal ıșmada okside glutatyonun (GSSG) en yüksek HOST (%40,5±2,7)
değerini vermesi, spermatozoa plazma membran bütünlü ğünü üzerinde kryoproktif
özelliğini göstermi știr. Aynı șekilde trehaloz ortam ına kat ılan GSSG, trehalozun
neden oldu ğu düș ük motilite (%30,0±2,0) ve HOST (11,7±1,8) oranlar ı ile yüksek
ölü spermatozoa (%59,0±1,9) oran ına olumlu katk ısıyla etkinlik göstermi ș, fakat bu
etki önemli say ılmam ıștır.
GSH (0,5 mM ve 5 mM) ve GSSG (0,5 mM)’ un suland ırıcıda varl ığı, donma
esnası nda spermatozoondan salı nan enzim oran ını/miktar ını azaltarak çözüm sonu
motiliteyi ve fertiliteyi art ırmakta, akrozomal anomalileri azaltmaktad ır. Bu durum

32
boğa ve tekelerde yap ılan çal ıșmalarda gösterilmi știr (Sinha ve ark., 1996; Slaweta
ve Laskowska, 1987; Bilodeau ve ar k., 2001; Chatterjee ve ark., 2001). Yap ılan bu
çalıșma, sonuçlar ı itibariyle glutatyonun olumlu et kilerini desteklemekte ve çözüm
sonrası en düșük ölü spermatozoa (%30,0±2,0) ve en yüksek HOST (%40,5±2,7)
oranlar ıyla glutatyonun etkisi ni göstermekedir. Glutatyonun suland ırıcılara kat ılmas ı,
ortamda bulunan ROS ürünleriyle reaksiyona girerek ve donma esnas ında membran
proteinlerindeki sülfür gruplar ında gelișen bozulma ve da ğılmay ı kısmen önleyerek
oksidatif hasara karș ı koruyucu etkinlik olu șturmaktad ır. (Shan ve ark., 1990;
Chatterjee ve ark., 2001). Bo ğa ve domuzlarda yap ılan çal ıșmalarda dondurma ve
çözdürme i șlemlerinin, spermada bulunan do ğal glutatyon seviyesini dü șürdüğü
saptanm ıștır (Bilodeau ve ark., 2000; Gadea ve ark., 2004). Teke sperması na ilave
edilen redükte glutatyon (5 mM) çözüm sonras ı motiliteyi (%53,6±0,4) ve akrozom
anomalilerini (%6,2±0,5) önemli oranda korumu ștur. Fertilite üzerindeki etkisi ise
önemli say ılmam ıștır (Sinha ve ark., 1996). Benzer șekilde, glutatyonun k ısa süreli
saklanan koç spermas ı üzerine etkisi ise 6. saatte spermatozoon motilitesini
(%77,9±1,8) ve 30. saatte canlı oran ını (%51,7±4,4) önemli oranda korumas ıyla
ortaya ç ıkm ıștır (Bucak ve Tekin, 2007). Bu sonuçlar da, yap ılan çal ıșmada elde
edilen glutatyonun etkisini desteklemektedir.
Fakat domuzlarda yap ılan çalıșmalarda suland ırıcıya ilave edilen glutatyonun
kontrole göre çözüm sonras ı fertiliteye (%84,6±3,8 ve %81,2±4,4) önemli katk ılar
yapmad ığı belirtilmiș tir (Gadea ve ark., 2004). Ayn ı șekilde Foote ve ark. (2002)
boğalarda yapt ıklar ı bir çal ıșmada glutatyonun (0,5 mM) sperman ın kısa ve uzun
süreli saklanmas ındaki etkileri ara ștırm ıșlard ır. Buna göre, çözüm sonras ında
kontrole göre (%58 ve %56) motilitede önemli farkl ılık gözlenmezken, +5oC’ta 24
saat saklanan numunelerde önemli farklı lık (%20 ve %15) olu șmuștur. Çözüm
sonrası numunelerin 12 saat inkübasyonu sonrası ise glutatyon içeren suland ırıcı,
kontrole göre motilitede önemli oranda koruma sa ğlam ıștır (%23 ve %15).
Glutatyonun farklı etkilerle kendini göstermesinin, kullan ılan suland ırıcı
bileșenlerinin fark ından ileri geldiği söylenilebilir. Ayr ıca, kat ılan antioksidan
oranlar ın fazla olmas ı, spermatozoa metabolizmas ı için gerekli olan serbest radikal
varl ığını düșürdüğünden spermatolojik parametreleri de olumsuz etkilemektedir.

33
Çal ıșmada kullan ılan GSSG kombine gruplar ında çözüm sonu morfolojisi
sağlam spermatozoa ve HOST oranlar ının kontrole göre yüksek ç ıkması , hipertonik
ortam ın spermatozoon morfolojisi üzerinde olu șturduğu olumsuz etkinin GSSG ile
giderilmeye çal ıșıldığını ve antioksidanları n spermatozoon morfolojisinde önemli
yeri olduğunu göstermektedir. Hipoozmoik șișme testi olarak HOST, spermatozoon
plazma membran ının fonksiyonel bütünlü ğünü değerlendirmekte ve sonuçlar ının
yüksek olması (%50≤ ), motilite ve in vivo/vitro fertilite parametreleriyle yak ından
ilișkilendirilmektedir (Neild ve ark., 1999; P ẻrez-Llano ve ark., 2001). Sunulan
çalıșmada GSSG ve kombine gruplar ı en yüksek HOST (%40,5±2,7 ve %27,0±1,4)
sonuçlar ını vermiș tir. Ayr ıca, suland ırıcıya ilave edilen trehaloz ortam ı hipertonik
hale getirerek, çözüm sonras ı parametreleri iyile știrmemiș, EDTA’n ın ise bu noktada
olumlu etkileri görülmemi știr. Yap ılan baz ı çal ıșmalarda trehalozun plazma
membran bütünlü ğünü (%44,8±5,7 ve %44,5±6,7) kontrol gruplar ına (%44,0±1,2 ve
%53,4±1,2) göre koruyamamas ı, bu araștırma sonuçlar ını destelemektedir (Bucak ve
Uysal, 2007; Bucak ve ark., 2007). Bu durumdan, trehalozun suland ırıcılardaki Tris
yoğunluğuna bağlı olarak hareket edebilece ği ve ancak kendi etkisiyle ortamda
olușabilecek ozmolaritelerde etkinlik gösterebilece ği sonuçlar ı çıkar ılabilir.

34

5. Sonuç ve Öneriler

Dünya keçi yeti știriciğ inde sperman ın saklanması , ıslah çal ıșmalar ında, amaca
yönelik yeti știricilikte, erkek dam ızlık masraflar ının düș ürülmesinde önemli bir yere
sahiptir. Fakat, dondurulmu ș/çözdürülmü ș spermayla yap ılan servikal
tohumlamalarda ba șarı oran ının düș ük olması , spermanı n ancak k ısa süreli
saklamayla kullan ılabileceği imkan ını vermektedir. İntrauterin laparoskopik
tohumlama yöntemi, dondurulmu ș/çözdürülmü ș sperman ın kullan ımına imkan
sağlarken, yöntemin pratik kullan ımının zorluğu ve fazla i ș gücü maliyeti tekni ğin
yaygı nlașmas ına olanak vermemi știr. Fakat son y ıllarda teke sperması nın farkl ı
teknik ve yöntemlerle dondurulmas ı ile kabul edilebilir fertilite oranlar ı al ınmaya
bașlam ıștır.
Tekelerde sperman ın dondurma ve fertilite ba șarısını art ırmak için,
sulandı rıcılara kriyoprotektif amaçl ı bazı maddeler (kriyoprotektanlar,
antioksidanlar, surfektanlar) kat ılmaktad ır. Genel olarak olum lu etkileri olmakla
birlikte, kriyoprotektif etki ler hayvan türüne, sulandı rıcı bileșenlerine ve dondurma
hızına göre de ğișmektedir. Kriyoprotektif etki veren șekerler, kat ım oranlar ında
ortamda farklı ozmolariteler olu șturmas ı bak ımından, sperma hücrelerini direk olarak
etkilemekte ve yüksek oranda kat ılmalar ında oluș an hiperozmotik ortam, türler
arası nda farklı etkilere neden olmaktad ır. Yap ılan çal ıșmalar suland ırıcılardaki Tris
ve șeker oranlar ının dengelenmesi gerekti ğini belirtmektedir. Fa kat bu konuda türlere
özgü bir protokol olu șturulamam ıștır.
Yapı lan çal ıșmada, sulandı rıcıya ilave edilen trehaloz ortam ı hipertonik hale
getirerek, çözüm sonras ı spermatozoa motilitesi (%30,0±2,0), ölü spermatozoa
(%59,0±1,9) ve HOST (%11,7±1,8) oranlar ını kontrol gruplar ına (%42,5±3,2,
%21,5±1,3, % 16,2±2,0 ) göre iyile știrmemiș, EDTA’in ise bu noktada etkileri
görülmemi știr. Çal ıșmada suland ırıcı gruplar ından GSSG’un çözüm sonras ı anormal
(%10,5±0,9), ölü (%30,0±2,0) spermatozoa ve HOST (%40,5±2,7) oranlar ında
önemli iyile știrmeler sa ğlad ığı gözlenmi știr. Sonuçlar ı itibariyle en dü șük anormal
spermatozoa oranlar ı kryoprotektan içeren grupla rdan (trehaloz+EDTA, GSSG,
kombine; % 10,5±0,9, %13,2±0,9, % 8,0±0,9) elde edilmi știr.

35
Literatürlerde HOST de ğerinin %50’nin alt ında olmas ının fertiliteyi
düșüreceği bulgular ının bildirilmesi, fertilite ile HOST de ğeri aras ında bir
korelasyonun oldu ğunu göstermektedir. Yap ılan çal ıșmada, çözüm sonu HOST
oranları nın düșük olması , fertilite oranlar ını s ınırlı b ırakabilece ğini
düșündürmektedir.
Yapı lacak çal ıșmalarla, spermatozoon membran parametreleri üzerindeki
bulgular ın geliș tirilmesiyle dondurma i șlemlerindeki ‘deneme yöntemler’ini,
biyomühendislik boyutuna ta șımas ı ve spermatozoon biyodinamiğine aç ıklık
kazand ırmas ı beklenmektedir. Bu sayede; gelecekteki teke spermas ı dondurma
ișlemlerinde önemli ba șarılar ın sağlanacağı ve bu durumun direk olarak sun’i
tohumlama uygulamalar ına yans ıyacağı aç ıktır.

36
ÖZET

Ankara Tekesi Spermas ının Dondurulmas ında Baz ı Kriyoprotektanları n Etkisi

Bu çalıșman ın amacı Ankara tekesi spermas ı sulandı rıcısına ilave edilen baz ı
kriyoprotektanlar ın spermanı n dondurulup çözdürülmesi sonras ı spermatolojik
parametrelere etkisinin ara ștırılmas ı olmuș tur.

Çal ıșmada, 3 baș ergin Ankara tekesinden al ınan ejakülatlar kullan ılm ıștır.
Ejakülatlar yetiș tirme mevsiminde sun’i vajen kullan ılarak haftada iki kez
toplanm ıștır. Al ınan ejakülatlar birle știrildikten sonra 4 e șit hacme bölünmü ș ve
37oC’l ık su banyosundaki kriyoprotektan içeren (100 mM Trehaloz + 0,015 gr/10 ml
EDTA, 5 mM GSSG ve Trehaloz+ EDTA +GSSG) ve içermeyen temel suland ırıcıyla
0,25 mm3’lük payette yakla șık 200 milyon motil spermatozoa olacak șekilde
sulandı rılm ıștır.

Suland ırılan spermalar payetlere (0,25 mm3) çekilerek, 5oC’ta ekilibrasyona
bırak ılm ıștır. Ekilibrasyonu izleyen süreçte payetler s ıvı azot buhar ında dondurulmuș
ve -196 oC’taki sı vı azotta de ğerlendirilmek üzere saklanm ıștır.

Çözüm sonu spermatozoa motilitesinde, kriyoprotektan içeren gruplarda
(GSSG, kombine; %53,7±3,7, %46,2±1,2) kontrol grubuna (%42,5±3,2) göre önemli
farkl ılık ç ıkmam ıștır. Anormal spermatozoada, kriyoprotektan içeren gruplar
(trehaloz+ EDTA, GSSG, kombine; % 10,5±0,9, %13,2±0,9, % 8,0±0,9) aras ında
istatistiksel olarak önemli farkl ılık oluș mazken, kontrol grubuna (%21,5±1,3) göre en
düșük oranlar ı vermișlerdir (P<0,05). GSSG içeren grupta ölü spermatozoa bak ımından
en düș ük oran (30,0±2,0) elde edilmi știr (P<0,05). Hipoozmotik șișme testinde
GSSG ve kombine gruplar ı istatiksel aç ıdan en yüksek oran ı vermiștir (%40,5±2,7 ve
%27,0±1,4, P<0,05).

Sonuç olarak, Ankara tekesi sperması suland ırıcılar ına kat ılan
kriyoprotektanlar ın (GSSG ve kombine gruplar ı) çözüm sonras ı baz ı spermatolojik
parametreler üzerine önemli katk ılar sağlad ığı görülmüștür.

Anahtar Kelimeler: Kryoprotektan, kryoprotektif etki, sperman ın dondurulmas ı,
spermatolojik parametreler, teke spermas ı.

37
SUMMARY

Effect of Some Cryoprotectants in cryopreservation of Angora Goat Semen

The aim of this study was to be investig ated the effects of some cryoprotectants
added to extender of Angora goay semen on spermatologic parameters after frozen-
thawed semen.

Ejaculate samples obtained from three ma ture Angora goats were used in this
study. Ejaculates were collected using an ar tificial vagina twice a week during the
reproductive season. After pooling, each pooled ejaculate was split into four equal
aliquots and dilute d with based extender contai ning cryoprotectants (100 mM
Trehalose + 0,015 gr/10 ml EDTA, 5 mM GS SG and Trehalose+ EDTA+GSSG), or
no cryoprotectants at 37oC to a final concentra tion of approximately 2×108 motil
spermatozoa per straw.
Diluted samples were aspirated into 0,25 ml straws, equilibrated at 5
oC.
Following equilibration, the straws were frozen in liquid nitrogen vapour and stored at -196
oC so as to be evaluated.
Post-thawed spermatozoa motility did not exist significant difference at the
groups with cryoprotectants (GSSG, co mbined; 53,7±3,7%, 46,2±1,2%), compared
to the control (42,5±3,2%). At abnornal spermatozoa rates, while there was not
statistically difference among th e groups including cryoprotectants
(trehalose+EDTA, GSSG, comb ined; 10,5±0,9%, 13,2±0,9%, 8,0±0,9%),
they gave
the lowest rates, in comparision to control (21,5±1,3%, P<0,05). Dead spermatoza with
the lowest rate was attained at group with GSSG. At HOST, GSSG and combined
groups gave the highest rates (40,5±2 ,7% and 27,0±1,4%, P<0,05), statistically.

In conlusion, it was seen that cryop rotectants (GSSG and combined groups)
added to extender of Angora goat semen pr ovided the significant contributions on
post-thawing some spermatological parameters.

Key words: Cryoprotectant, cryoprotective e ffect, semen cryopreservation,
spermatologic parameters, goat semen.

38

KAYNAKLAR

ABOAGLA, E.M.E., TERADA, T. (2003). Trehalose-enhanced fluidity of the goat sperm
membrane and its protection during freezing. Biol. Reprod., 69: 1245-1250.

AISEN, E.G., ALVAREZ, H.I., VENTURINO, A., GADRE, J.J. (2000). Effect of trehalose
and EDTA on cryoprotective action of ram semen diluents. Theriogenology, 53: 1053-
1061.

AISEN, E.G., MEDINA, V.H., VENTURINO, A. (2002). Cryopreservation and post-
thawed fertility of ram semen frozen in different trehalose concentrations.
Theriogenology, 57: 1801-1808.
AISEN, E.G., QUINTANA, M., MEDINA, V., MORELLO, H., VENTURINO, A. (2005).
Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders. Cryobiol., 50: 239-249.
AITKEN, R.J. (1989). The role of free oxygen radicals and sperm function. İnt. J. Androl.,
12: 95-97.
AITKEN, R.J. (1995). Free radicals, lipid pe roxidation and sperm function. Reprod. Fertil.
Dev., 7: 659-668.
ALVAREZ, J.G., STOREY, B.T. (1983). Taurine, hypotaurine, epinephrine and albumin
inhibit lipid peroxidation in rabbit spermatozoa and protect against loss of motility. Biol. Reprod., 29: 548-555.
AN, T.Z., IWAKIRI, M., EDASHIGE, K., SAKURAI, T., KASAI, M. (2000). Factors
affecting the survival of frozen-thawed mouse spermatozoa. Cryobiol., 40: 237-249.
ANCHORDOGUY, T.J., RUDOLPH, A.S., CARPENTER, J.F., CROWE, J.H. (1987).
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing.
Cryobiol., 24: 324.
ARAV, A., SHEHU, D., MATT İOLİ, M. (1993). Osmotic and cytotoxic study of
vitrification of ımmature bovine oocytes. J. Reprod. Fertil., 99: 353-358.

AURICH, J.E., SCHÖNHERR, U., HOPPE, H., AURICH, C. (1997). Effect of antioxidants
on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen. Theriogenology,
48: 185-192.
BAILEY, J.L., BUHR, M.M. (1995). Regulation of internal Ca
2+ by chilled bull and boar
spermatozoa. Cryobiol., 32: 259-269.
BAKAS, L.S., DISALVO, E.A. (1991). Effect of Ca
2+ on the cryoprotective action of
trehalose. Cryobiol., 28: 347-353.
BALL, B.A., MED İNA, V., GRAVANCE, C.G., BAUMBE R, J. (2001). Effect of
antioxidants on preservation of motility, viab ility and acrosomal in tegrity of equine
spermatozoa during storage at 5
oC. Theriogenology, 56: 577-589.

39
BATU, S. (1951). Türkiye Keçi Irklar ı ve Keçi Yetistirme Bilgisi. Ankara Üniversitesi
Veteriner Fakültesi Yay ınlar ı, No. 4, Ankara.

BAUMBER, J., BALL, B.A., GRAVANCE, C.G., MEDINA, V., DAVIES-MOREL,
M.C.G. (2000). The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial me mbrane potential and membrane lipid
peroxidation. J. Androl., 21: 895-902.

BILODEAU, J.F ., CHATTERJEE, S ., SIRARD, M.A ., GAGNON, C . (2000). Levels of
antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and
thawing. Mol. Reprod. Dev. , 55: 282-288.
BILODEAU, J.F., BLANCHETTE, L.S., GAGNON, I.C., SIRARD, M.A. (2001). Thiols
prevent H
202-med ıated loss of sperm motility in cryopreserved bull semen.
Theriogenology, 56: 275-286.
BILODEAU, J.F., BLANCHETTE, S., CORMIER, N., SIRARD, M.A. (2002). Reactive
oxygen species-mediated loss of bovine sp erm motility in egg yolk Tris extender:
protection by pyruvate, metal chelators a nd bovine liver or oviductal fluid catalase.
Theriogenology, 57: 1105-1122.
BOQUEST, A.C., ABEYDEERA, L.R., WANG, W.H., DAY, B.N. (1999). Effect of adding
reduced glutathione during insemination on the development of porcine embryos in vitro. Theriogenology, 51: 1311-1319.

BUCAK, M.N., ATE ȘȘAHİN, A., VARI ȘLI, Ö., YÜCE, A., TEK İN, N., AKÇAY. A.
(2007).The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen. Microscopic and oxidative stress parameters after freeze-thawing process.
Theriogenology, 67: 1060-1067.
BUCAK, M.N., TEK İN, N. (2007). Protective effect of taurine, glutathione and trehalose on
the liquid storage of ram semen. Small Rum. Res. (bask ıda).
BUCAK, M.N., UYSAL, O. (2007). The role of antioxidants in freezing of saanen goat
semen. Indian Vet. J. (bask ıda).

CABRIA, E., ANEL, L., HERRAEZ, M.P. (2001). Effect of external cryoprotectants as
membrane stabilizers on cryopreserved ra ınbow trout sperm. Theriogenology, 52: 623-
635.
CHATTERJEE, S., DE LAMIRANDE, E., GAGNON, C. (2001). Cryopreservation alters
membrane sulfhydryl status of bull spermatozoa: protection by oxidized glutathione. Mol. Reprod. Dev., 60: 498-506.

CHEESEMAN, K.H., SLATER, T.F. (1993). An introduction to free radicals biochemistry.
Br. Med. Bull, 49: 481.

CHEN, Y., FOOTE, R.H., BROCKETT, C.C. (1993). Effect of sucrose, trehalose,
hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm. Cryobiol., 30:
423-431.
CORTEEL, J.M. (1975). Effet du ‘lavage’ sur la conservation des spermatozoides de bouc a
basse temperature. Ann. Biol. Anim., Biochim. Biophys., 15: 525-528.

40

CURRY, M.R., WATSON, P.F. (1994). Os motic effects on ram and human sperm
membranes in relation to thawing injury. Cryobiol., 31: 39-46.

DAȘ KIN, A., TEK İN, N. (1996). The effect of Egg-yolk on the quality of frozen angora goat
semen. Tr. J. Vet. Anim. Sci., 20: 395-398.
DAȘ KIRAN, İ. (2006). Ankara keçisi. Eri șim: [http:// irfandaskiran.8m.com/ angora. html].
Erișim tarihi: 10.11.2006.
DONOGHUE, A.M., DONOGHUE, D.J. (1997). Effects of water- and lipid-soluble
antioxidants on turkey sperm viability, membrane integrity, and motility during liquid
storage. Poult. Sci., 76: 1440-1445.

EPPIG, J.J. (1996). Coordination of nuclear a nd cytoplasmic oocyte maturation in eutherian
mammals. Reprod. Fertil. Dev., 8: 485-489.

EVANS, G., MAXWELL, W.M.C. (1987). Salamon’s Artificial Insemination of Sheep and
Goats. Sidney: Butterworths, pp. 8-21; 107-141.

FOOTE, R.H., BROCKETT, C.C., KAPROTH, M.T. (2002). Motility and fertility of bull
sperm in whole milk extender containing antioxidants. Anim. Reprod. Sci., 71: 13–23.
FOOTE, R.H., CHEN, Y., BROCKET, C.C. (1993). Fertility of bull spermatozoa frozen in
whole milk extender with trehalose, taurine, or blood serum. J. Dairy Science, 76: 1908-
1913.
FUNAHASHI A, H., SANO, T. (2005). Select antioxidants improve the function of extended
boar semen stored at 10
oC. Theriogenology, 63: 1605-1616.
GACITUA, H., ARAV, A. (2005). Successful pregnancies w ith directional freezing of large
volume buck semen. Theriogenology, 63: 931-938.

GADEA, J., SELLES, E., MARCO, MA., COY, P., MATA´S C., ROMAR, R., RU İZ S.
(2004). Decrease in glutathione content in boar sperm after cryopreservation. Effect of
the addition of reduced glutathione to the freezing and thawing extenders.
Theriogenology, 62: 690-701.

GADEA, J., GARCIA-VAZQUEZ, F., MATAS, C., GARDON, J.C., CANOVAS, S.,
GUMBAO, D. (2005). Cooling and freezing of boar spermatozoa: Supplementation of
the freezing media with reduced glutathione preserves sperm function. J. Androl., 26:
396-404.
GAO, D.Y., CR İSTER, J.K. (2000). Mechanisms of cryoin jury in living cells. Ilar Journal
(Online), 41: 4.
GARDINER, C.S., REED, D.J. ( 1994). Status of glutathione during oxidant-induced
oxidative stress in the pre-implantation mouse embryo. Biol. Reprod., 51: 1307-1314.

GRIVEAU, J.F., DUMONT, E., RENARD, P., CALLEGARI, J.P., LE LANNOU, D.
(1995). Reactive oxygen species, lipit peroxida tion and enzymatic defence systems in
human spermatozoa. J. Reprod. Fertil., 103: 17-26.

41
GÜNEȘ, H., HORST, P., EVR İM, M., VALLE-ZORATE, A. (2002). Studies on
improvement of the productivity of Turkish Angora Goats by crossing with South
Africian Angora Goats. Small Rum. Res., 45: 115-122.
HALLIWELL, B., GUTTERIDGE, J.M.C. (1989). Free Radicals İn Biology And Medicine
(2nd Ed). Clarendon Press, Oxford.
HAMMERSTEDT, R.H. (1993). Maintenance of bioenergetic balance in sperm and
prevention of lipid peroxidation: A review of the effect on design of storage preservation
systems. Reprod. Fertil. Dev., 5: 675-690.

HOLT, W.V., NORTH, R.D. (1991). Cryopreservation, actin localization and thermotropic
phase transitions in ram spermatozoa. J. Reprod. Fert., 91: 451-461.

HOLT, W.T. (2000). Basic aspects of frozen storage of semen. Anim. Reprod. Sci., 62: 3-22.
IRITANI, A., NISHIKAWA, Y. (1961). Studies on the egg-yolk coagulating factors in goat
semen: Properties of the coagulating factor a nd influential conditions for coagulation. In:
Proc. Silver Jubilee Lab. Anim. Husbandry, Kyoto University, pp. 97–104.
IRVINE, D.S. (1996). Glutathione as a treatment for male infertility. Rev. Reprod., 1: 6-12.

ISACHENKO, E.F., NAYUDU, P.L., MICHELMANN, H.W. (2000). Progress, problems,
and perspective in cryopreservation of human oocytes, embryos and ovarian tissue.
www.ferti.net .

JACKSON, T.H., UNGAN, A., CRISTER, J. K., GAO, D. (1997). Novel microwave
technology for cryopreservation of biomat erials by suppression of apperant ice
formation. Cryobiol., 34: 363-372.
JEULIN, C., SOUFIR, J.C., LAVAL-MARTIM , D., CALVAYRAC, R. (1989). Catalase
activity in human spermatozoa and seminal plasma. Gamete Res., 24; 185-196.

KANTOLA, M., SAARANEN, M., VANHA-PERTTULA, T. (1988). Selenium and
glutathione peroxidase in seminal plasma of men and bulls. J. Reprod. Fertil., 83: 785-
794.

KARAGIANNIDIS A, VARSAKELI, KARATZAS G. (2000). Characteristics and seasonal
variations in the semen of Alpine, Saanen and Damascus goat buck born and raised in
Greece. Theriogenology, 53: 1285-1293.
KHALIFA, T.A.A., EL-SAIDY, B.E. (2006). Pellet-freezing of Damascus goat semen in a
chemically defined extender. Anim. Reprod. Sci., 93: 303-315.

KİM, I.H., VAN-LANGENDONCKT, A., VAN SOOM, A., VANROOSE, G., CAS İ, A.L.,
HENDRİKSEN, P.J.M., BEVERS, M.M. ( 1999). Effect of exogenous glutathione on
the in vitro fertilization of bovine oocytes. Theriogenology, 52: 537-547.

KOSHIMOTO, C., MAZUR, P. (2002). The effect of the osmolality of sugar-containing
media, the type of sugar, and the mass and molar concentration of sugar on the survival of frozen-thawed mouse sperm. Cryobiol., 45: 80-90.

42
KUO, Y.L ., TZENG, W.L ., CHIANG, H.K ., NI, R.F., LEE, T.C ., YOUNG, S.T . (1998).
New system for long-term monitoring of sperm motility: EDTA effect on semen. Arch.
Androl. , 41: 127-133.

LEBOEUF, B., RESTALL, B., SALAMON, S. (2000). Production and storage of goat
semen for artificial insemination. Anim. Reprod. Sci., 62: 113-141.
LEE, C.H., WANG Y ., SHİN, S.C ., CHIEN, Y.W . (2002). Effects of chelating agents on the
rheological property of cervical mucus. Contraception, 65: 435-440.
LEIBO, S.P., BRANDLEY, L. (1999). Comparative cryobiology of mammalian
spermatozoa. In: The Male Gamet. Ed.: C. Gagnon , St Louis: Cache River Press, p.:
502-515.
LUBERDA, Z. (2001). Present conception rega rding the effect on reactive oxygen species
on functions of mammalian spermatozoa. Post ępy Biologii Komórki, 28: 309-316.

LUBERDA, Z. (2005). The role of glutathione in mammalian gametes. Reprod. Biol., 5: 1-
13.

MARXWELL, R.J. (1995). Prospects fort he use of antioxidants therapies. Drugs, 49: 345-
361.

MASSIP, A. (2001). Cryopreservation of embryos of farm animal. Reprod. Dom. Anim., 36:
49-55.
MAXWELL, W.M.C., STOJANOV, T. (1996). Liquid storage of ram semen in the absence
of some antioxidants. Reprod. Fertil. Dev., 8: 1013-1020.
MAXWELL, W.M.C., WATSON, P.F. (1996). Recent progress in the preservation of ram
semen. Anim. Reprod. Sci., 42: 55-65.
MAZUR, P. (1996). Principles of medical cryobiology. In: The freezing of living cells,
tissues, and organs. Cell chemistry and phyology, JAI Press Inc, pp.: 355-384.
MAZUR P, KATKOV II, KATKOVA N, CRITSER JK. (2000). The enhancement of the
ability of mouse sperm to survive freezing and thawing by the use of high concentrations
of glycerol and the presence of an Escherichia coli membrane preparation (Oxyrase) to
lower the oxygen concentration. Cryobiol, 40: 187-209.

MCWILLIAMS, R.B., GIBBONS, W.E., LEIBO, S. P. (1995). Osmotic and physiological
responses zygotes and human oocytes to mono-and disaccharides. Hum. Reprod., 10:
1163-1171.

MOHAIR COUNCIL OF AMER İCA. (2006). Fiber goats. Eri șim: [http://
www.goatweb.com/ discover/fiber/angora.shtml]. Eri șim tarihi: 10.11.2006.

MOLINIA, F.C., EVANS, G,. MAXWELL, W.M.C. (1994). Effects of monosaccharides
and disaccharides in Tris-based diluents on mo tility, acrosome integr ity and fertility of
pellet frozen ram spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., 36: 113-122.
NAMDAR, O. (2006). Ankara keçisi. Eri șim: [http:// www.ankara-tarim.gov.tr /diger/ keci/
akecisi.htm]. Eriș im tarihi: 22. 11. 2006.

43

NEILD, D., CHAVEZ, M., PLORES, N,, MORA , M,, BECONI, M,, AGUERO, A. (1999).
Hypoosmotic test in equine spermatozoa. Theriogenology, 51: 721-727.

NICOLLAJSEN, H., HVIDT, A. (1994). Phase behaviour of the system trehalose- NaCl-
water. Cryobiol., 31: 199-205.
NISSEN, H.P., KREYSEL, H.W. (1983). Superoxi de dismutase in human semen. Klinische
Wochenschrift, 61: 63-65.
OEHNINGER, S, DURU, N.K., SRISOMBUT, C., MORSHEDI, M. (2000). Assessment of
sperm cryodamage and strategies to ımprove outcome. Mol. Cell Endocrinol., 169: 3-10.
O’FLABERTY, C., BECONI, M, BEORLEGUI, N. (1997). Effect of natural antioxidants,
superoxide dismutase and hydrogen peroxi de on capacitation of frozen-thawed bull
spermatozoa. Andrologia, 29: 269-275.

ORSI, N.M., LEESE, H.J. (2001). Protection against reactive oxygen species during mouse
preimplantation embryo development: role of EDTA, oxygen tension, catalase,
superoxide dismutase and py ruvate. Mol. Reprod. Dev., 59: 44-53.

QUINN, PJ. (1989). Prenciples of membrane st ability and phase behavior under extreme
conditions. J. Bioenerg. Biomembran., 21: 3-19.
ÖZTÜRK, A. (1989). Ankara keçisi yeti știriciliği. T.C. Tarı m Orman ve Köy İșleri
Bakanl ığı. Lalahan Hayvanc ılık Araștırma Enstitüsü Müdürlü ğü Yay ını, Ankara.
PALASIZ, A.T., MAPLETOPT, R.J. (1996). Cryopreservation of mammalian embryos and
oocytes: Recent advances. Biotechn. Advances, 14: 127-149.

PELLICER-RUBIO, M.T., COMBARNOUS, Y. (1998). Deterioration of goat spermatozoa
in skimmed milk-based extenders as a result of oleic acid released by the bulbourethral
lipase busgp60. J. Reprod. Fertil., 112: 95-105.
PEREZ-LLANO, B., LORENZO, J.L., YENES, P., TREJO, A., GARCIA-CASADO, P.A.
(2001). Short hypoosmotic swelling test for the prediction of boar sperm fertility. Theriogenology, 56: 387-398.

POLGE, C., SMITH, A., PARKES, A. (1949). Revival of spermatozoa after vitrification and
dehydration at low temperatures. Nature, 164: 166.

PURDY, P.H. (2006). A review on goat sperm cryopreservation. Small Rum. Res., 63: 215-
225.

RICHARDS, A.B., KRAKOWKA, S., DEXTER, L.B., SCHMID, H., WOLTERBEEK,
A.P.M., WAALKENS-BERENDSEN, D.H., SHIGOYUKI, A., KUR İMOTO, M.
(2002). Trehalose: a review of prpoperties, history of use and human tolerance, and
results of multiple safety studies. Food and Chemical Toxicology, 40: 871-898.

RIFFO, M., LE İVA, S., ASTUD İLLO, J. (1992). Effect of zinc on human sperm motility
and the acrosome reaction. Int. J. Androl., 15: 229-237.

44
RITAR, A.J. (1993). Control of ovulation, storage of semen and artificial insemination of
fibre-producing goats in Australia: a review. Aust. J. Exp. Agric., 33: 807-820.

RITAR, A.J., BALL, P.D., O’MAY, P.J. (1990a). Examination of methods for the deep
freezing of goat semen. Reprod. Fert. Dev., 2: 27-34.

RITAR, A.J., BALL, P.D., O’MAY, P.J. (1990b) . Artificial insemination of Cashmere goats:
effect on fertility and fecundity of intravaginal treatment, method and time of
insemination, semen freezing process, number of motile spermatozoa and age of female. Reprod. Fert. Dev., 2: 377-84.

RITAR, A.J., SALAMON, S. (1983). Fertility of fresh and frozen-thawed semen of the
angora goat. Aust. J. Biol. Sci., 36: 49-59.

ROY, A. (1957). Egg-yolk coagulating enzyme in the semen and Cowper’s gland of the
goat. Nature, 179: 318-319.

RUDOLPH, A.S., CROWE, J.H. (1985). Membrane stabilization during freezing-thawing
process: The role of two natural cryoprot ectants, trehalose and proline. Cryobiol., 22:
367-377.

SALAMON, S., RITAR, A.J. (1982). Deep freezi ng of Angora goat semen: effects of diluent
composition and method and rate of dilution on survival of spermatozoa. Aust. J. Biol.
Sci., 35: 295-303.
SANCHEZ-PARTIDA, L.G., SETCHELL, B.P., MAXWELL, W.M.C. (1997). Epididymal
compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoa.
Reprod. Fertil. Dev., 9: 689-699.
SARDESAI, V.M. (1995). Role of antioxidants in health maintenance. Nutr. Clin. Pract., 10:
19.
SELL, R. (1993). Angora goat. Alternative Agriculture Series, Number 7. Eri șim:[http://
www.ag . ndsu.edu/ pubs/ alt-ag/angora.htm].

SEVİNÇ, A., TEK İN N, YURDAYDIN, YAVA Ș Y, DAȘ KIN A, TÜRKER F. (1989).
Çifteler tar ım ișletmesinde yetiș tirilen Ankara keçisi tekelerinin dölverimi üzerinde
araștırmalar. Do ğa, 13: 191-199.

SHAMSUDDIN, M., AMIRI, Y., BHUIYANAN, M.(2000). Characteristics of Buck Semen
with Regard to Ejaculate Numbers, Collection Intervals, Diluents and Preservation Periods. Reprod. Dom. Anim., 35: 53-57.

SHAN, X., AW, T., JONES, D. (1990). Glutathione-dependent protection against oxidative
injury. Pharmac. Ther., 47: 61-71.
SIKKA, S.C. (1996). Oxidative stres and role of antioxidants in normal and abnormal sperm
function. Bioscience, 1: 78-86.
SINHA, M.P., SINHA, A.K., SINGH, B.K., PRASAD, R.L. (1996). The effect of
glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen. Anim.
Reprod. Sci., 41: 237-243.

45
SLAWETA, R., LASKOWSKA, T. (1987). The e ffect of glutathione on the motility and
fertility of frozen bull semen. Anim. Reprod. Sci., 13: 249-253.

SØRENSEN, M.B., STOLTENBERG, M., DANSCHER, G. AND ERNST, E. (1999).
Chelation of intracellular zinc ions affects human sperm cell motility. Mol. Hum. Reprod., 5: 338-341.
STOJANOV, T., POMARES, C.C., MAXWELL, W.M.C., EPPLESTON, J. (1994). Effect
of cytochrome c on the survival of ram and goat spermatozoa during liquid storage. In:
Proc. 7 as Jornadas Internacionales de Reproduccion Animal, Murcia, p. 333 (Abstract).

STOREY, B.T., NOILES, E.E., KATHLEEN, A.T. (1998). Comparison of glycerol, other
polyols, trehalose, and raffinose to provide a defined cryoprotectant medium for mouse
sperm cryopreservation. Cryobiol., 37: 46-58.
SUNGUR, H., GONCAGÜL T, ÖZSAR S. (1993). Ankara keçilerinde sı fat döneminde
dondurulmuș ve taze sperma ile sun’i tohumlma çal ıșmalar ı ve fertilite kontrolü. Lalahan
Hay. Arș. Ens. Der., 33: 59-64.
SUTOVSKY, P., SCHATTEN, G. (1997). Depletion of glutathione during bovine oocyte
maturation reversibly blocks the decondensa tion of the male pronuc leus and pronucleus
apposition during fertilization. Biol. Reprod., 56: 1503-1512.
TAYLOR, C.T. (2001). Antioksidants and r eactive oxygen species in human infertility.
Environ. Toxicol. Pharmacol., 10: 189-198.
T.C. RESMİ GAZETE. (2004). Yerli Hayvan Irk ve Hatlar ının Tescili Hakk ında Tebliğ (No:
2004/39). Yay ın tarihi: 12.11.2004.
TEKİN, N, MUYAN, M. (1985). Keçilerde ba șlıca dölerme özellikleri. Do ğa, 9: 208-218.
TEKİN, N., YURDAYDIN, N., DA ȘKIN, A. (1996). Ankara keçilerinden de ğișik
yöntemlerle sperma al ınmas ı ve değerlendirilmesi. Ankara Üniv. Vet. Derg., 43: 397-
403.
THOMAS, M.J. (1995). The role of free radicals and antioxidants: how the we know that
they are working. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr., 35: 21.

UYSAL, O., K İNET, H., ÇEV İK, M., ÇETİNKAYA, S. (2000). Değ ișik antioksidan içeren
farklı sulandı rıcılarla dondurulmu ș koç spermalar ından elde edilen dölverimi. Ankara
Üniv. Vet. Derg., 47: 177-189.

VAN KLAVEREN, R.J., DEMEDTS, M., NEMERY, B. (1997). Cellular glutathione
turnover in vitro, with emphasis on type II pneumocytes. Eur. Res. J., 10: 1392- 1400.

VILLEMURE, M., LAZURE, C., MANJUNATH, P. (2003). Isolation and characterization
of gelatine-binding proteins from seminal plasma. Reprod. Biol. Endocrinol., 1: 39.
WAIDE, Y., NIWA, T., ASANUMA, R. (1977). Studies on preservation of liquid and frozen
semen of domestic animals. III. Viability and fe rtility of frozen goat spermatozoa. Jpn. J.
Anim. Reprod., 23: 129-137.

46
WATSON, P.F. (1995). Recent developments and concepts in the cryopreservation of
spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod. Fertil. Dev., 7:
871-891.

WATSON, P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen.
Anim. Reprod. Sci., 60: 481-492.

WOELDERS, H., MATTHIJ, A., ENGEL, B. (1997). Effects of trehalose and sucrose,
osmolality of the freezing medium, and cooling rate on viability and intactness of bull
sperm after freezing and thawing. Cryobiol., 35: 93-105.

YALÇIN, B.C. (1982). Angora goat breeding. In: Proceedings of the Third International
Conference on Goats, January 10-15, Tucson, AZ, pp. 269-278.

ZAIRI, A., BELAÏD, A., GAHBICHE, A., HA NI, K. (2005). Spermicidal activity of
dermaseptins. Contraception, 72: 447- 453.

47
ÖZGEÇM İȘ

I- Bireysel Bilgiler

Ad ı Mustafa Numan
Soyadı Bucak
Doğum Yeri-tarihi Düzce- 23.06.1976
Uyruğu Türkiye Cumhuriyeti
Medeni durumu Evli Askerlik Durumu Tecilli İletișim adresi ve telefou Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Dölerme ve Sun’i Tohumlama Anabilim Dal ı, Ankara
0 505 620 86 20
II- Eğitimi

2001- :Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun’i Tohumlama
Anabilim Dalı doktora program ı
1996-2001 :Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yüksek lisans program ı
1995-1996 :Ankara Üniversitesi TÖMER Yabanc ı Dil program ı
Yabanc ı Dil : İngilizce
III- Ünvanlar ı

2002- … :Ankara Üniver sitesi Veteriner Fakültesi Dölerme ve Sun’i Tohumlama
Anabilim Dalı Araștırma Görevlisi

IV-Mesleki Deyenimi

1997 : Bolu Köy-tür A.Ș . Tavukçuluk Entegre Tesisleri Yaz Staj ı (3 ay)
1998 : Tar ım Bakanl ığı Bala Tar ım İșletmesi Yaz Stajı (2 ay)
1999 : Ankara Atatürk Orman Çiftli ği S ığırcılık Șübesi Yaz Stajı (2 ay)

V- Üye oldu ğu Bilimsel Kurulu șlar

Reprodüksiyon ve Sun’i Tohumlama Bilim Derne ği

VI-Akademik İlgi Alanlar ı

Gamet hücreleri üzerine antioksidan etki
Gamet hücrelerinin dondurulmas ı

48
Yay ınlar ı

1- Makaleler
Bucak, M.N., Ate șșahin, A., Var ıșlı, Ö., Yüce A., Tekin. N., Akçay A. (2007). The
influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen:
Microscopic and oxidative stress para meters after freeze-thawing process.
Theriogenology, 67: 1060-1067.

Bucak, M.N., Tekin, N. (2007). Protective eff ect of taurine, glutathione and
trehalose on the liquid storage of ram semen. Small Ruminant Research (Bas ımda).
Bucak, M.N. , Tekin, N. (2007).Kryoprotektanl ar ve gamet-embryo dondurulmas ında
kryoprotektif etki. Ankara Ün iversitesi Vet. Fak. Derg, 54: 67-72.
Akçay, E., Var ıșlı Ö., Bucak, M.N., Yava ș İ., Tekin, N. (2007). Hindi spermas ının
dondurulmsı nda farkl ı sulan ırıcılar ın spermatozoa motilitesi üzerine etkisi. Ankara
Üniversitesi Vet. Fak. Derg, 54: 35-38.
Bucak, M.N., Uysal, O. (2007). The role of antioxidants in freezing of saanen goat
semen. Indian veterinary Journal (Bas ımda).

Uysal, O, Korkmaz, T, Bucak, M.N. , Yavaș, İ (2006). Evaluat ıon by hypoosmot ıc
swelling test of cryopreserved bovine sper matozoa. Indian veterinary Journal, 83:
555-559.

Uysal, O, Bucak M.N. , Yavaș İ, Var ıșlı Ö, Gurcan IS (20 05). Evaluation of ram
Sperm frozen with various taurine c oncentrations. Indian Veterinary Jo ıurnal, 82:
1059-1061.

2- Bildiriler
O. Uysal, Bucak , M.N., İ. Yavaș, Ö. Var ıșlı. Değișik s ıcaklı k ve sürelerde
çözdürülen dondurulmu ș boğa spermas ının in vitro bulgularla değerlendirilmesi. III.
Ulusal Reprodüksiyon ve Suni Tohumlama Kongresi. 30 Eylül-2 Ekim 2004,
Manavgat/Antalya-Türkiye. Bucak, M.N. , Ateșșahin, A., Tekin, N. Effects of various additives on ram semen
viability parameters, lipit peroxidation and antioxidant activities following freezing and thawing. The 35
th international scientific communications Session of the faculty
of animal science, 15-17 November, Bucharest, Romania.

3- Posterler

1- Bucak, M.N. , Tekin, N. Effect of taurine, gl utathione and trehalose on chios ram
semen during liquid storage at 5oC. The 35 th international scientific communications
Session of the faculty of animal scien ce, 15-17 November, Bucharest, Romania.

49

VII- Bilimsel Etkinlikleri 1-Projeler
Ankara tekesi spermas ının farkl ı antioksidanlarla dondurulmas ı ve thermoresistenz
test ile de ğerlendirilmesi. Ankara Üniversitesi Bilimsel Ara ștırmalar Projeleri
Müdürlüğü Araștırma Fonu, 2005, Türkiye.

2- Seminerler

Erkek çiftlik hayvanlar ında sperma plazmas ı ve erkek eklenti bezleri. Ankara
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Döle rme ve Sun’i Tohumlama Anabilim Dal ı, 2002.

Kryoprotektanlar ve gamet-embriyo dondurulmas ında kryoprotektif etki. Ankara
Üniversitesi Veteriner Fakültesi Döle rme ve Sun’i Tohumlama Anabilim Dal ı, 2004.