Bolile neurodegenerative sunt afecțiuni neurologice cronice produse prin [602465]

1
Introducer e

Bolile neurodegenerative sunt afecțiuni neurologice cronice produse prin
pierderea progresivă a neuronilor. În funcție de regiunea SNC afectată și de
prezența unor markeri celulari și moleculari, se deosebesc mai multe tipuri, care
au o etiologie multifactorială și/sau monogenică. Cele mai frecvente afecțiuni sunt
boala Alzheimer și boala Parkinson; alte forme mai rare sunt boala Huntington,
ataxiile spinocerebeloase, scleroza laterală amiotrofică precum și atrofia
musc ulară spinală (Mircea Covic, 2017).
După mai bine de 100 de ani de cercetări, cauzele exacte ale bolii
Alzheimer sunt încă, în mare parte, necunoscute, cu excepția a 1 -5 % dintre situații
în care au fost relevate componentele genetice pregnante , respectiv mutații ale
genelor implicate în metabolismul amiloidului sau în formarea citoscheletului
neuronului și caracteristice demenței Alzheimer de tip familial . (Wilson et al. ,
2011).
Boala Alzheimer, maladie întâlnită la 5% dintre persoanele cu vârsta peste
70 de ani este cea mai frecventă cauză de demență. Aceasta se caracterizează prin
pierderi neuronale , în special în zona cortexului, atrofie cerebrală corticală dar și
în hipocam p, ce produce o deteriorare intelectuală lentă, dar progresivă, cu
pierd erea memoriei, afazie, agnozie, dezorientare temporo -spațial ă, până la
demență. Aceste fenomene se asociază cu o insuficiență sinaptică primară,
disfuncția neurotransmițătorilor, în special o deficiență marcantă în acetilcolină,
depleția neurotrofinei și d isfuncție mitocondrială. Modificările
anatomopatologice specifice bolii Alzheimer sunt plăcile senile de β -amiloid
extraneuronale și agregatele neurofibrilare intraneuronale, formate prin
hiperfosforilarea proteinei Tau. (Mircea Covic, 2017). Boala Alzheim er este o
afecțiune neurodegenerativă, progresivă și ireversibilă fiind considerată cea mai
frecventă formă de demență . (Hrițcu et al., 2015).

2
Ultimele date din domeniul medical preconizează că populația mondială
este în curs de îmbătrânire. Conform unor statistici s -a observat că segmentul de
populație care se află în cel mai rapid proces de extindere, este reprezentat de
grupul persoanelor cu vârsta de peste 65 de ani, dar în special persoanele peste 85
de ani.
Principalele caracteristici neuropatologice ale bolii Alzheimer sunt
prezența benzilor neurofibrilare și a β -amiloidului depozitat sub formă de plăci
senile la nivelul creierului. Boala Alzheimer se caracterizează și prin o serie de
manifestări clinice: tulburări de memorie, tulburări de gândire, t ulburări de limbaj,
tulburări de comportament și tulburări de personalitate (Sisodia și colab., 2007).
Demența este în genere o pierdere a abilităților cognitive de funcționare, gândire,
amintire și raționament , comportament, într -o asemenea măsură încât interferează
cu viața și activitățile cotidiene ale unei persoane. Aceste funcții includ memoria,
abilitățile lingvistice, percepția vizuală, rezolvarea problemelor, auto -gestionarea
și abilitatea de a se concentr a și de a acorda atenție. Unii oameni cu demență nu
își pot controla emoțiile, iar personalitățile lor se pot schimba.
Demența variază în funcție de severitate, de la stadiul cel mai blând, când
începe să afecteze funcționarea unei persoane, până la cea m ai severă etapă, atunci
când persoana trebuie să se bazeze complet pe alții pentru activitățile de bază ale
vieții. Toate aceste procese de alterare neuronală sunt acompaniate de importante
degradări ale str ucturilor genice, concomitent cu alterări imunolo gice. (Lucian
Hrițcu, Neurofiziologie, Iași, 2011). Descifrarea patogeniei moleculare a bolii
Alzheimer continuă și sunt speranțe de identificare a unor molecule terapeutice
care ar putea încetini evoluția bolii. Un exemplu îl constituie inhibitorii de
secretază, care scad producția și depozitele de amiloid , dar mai există și alte
substanțe ale căror efecte sunt încă în decurs de cercetare.

3
Scopul cercetărilor

Boala Alzheimer este, probabil, una dintre cele mai dramatice patologii ale
cogniției la vârste înaintate, aceasta determinând cercetătorii să -și pună întrebări
privind atât etilogia cât și factorii de risc și evoluția, manifestările sale clinice.
Lucrarea de licență își propune să realizeze o sinteză a uneia dintre cele mai
cunos cute cercetări în domeniu, configurând astfel imaginea stadiilor și a
expresiei clinice a bolii. Scopul acestei lucrări de licență este acela de a investiga
efectele etilcafeatului asupra statusului oxidativ din hipocampul unui model
animal de demență.
Cunoscând efectele nocive ale radicalilor liberi, am ales să utilizăm
proprietatea antioxidantă a etilcafeatului pentru a urmări și determina dacă
folosind această metodă alternativă am provocat o reacție antioxidantă în creierul
modelului animal prin determi narea markerilor specifici enzimatici și non –
enzimatici.
Datorită incidenței crescute a acestei maladii la momentul actual în lume, am
considerat că o abordare a efectelor antioxidante din diversi compusi ar putea
constitui un studiu de interes larg, și m ai mult de atât ar atrage atenția asupra
proprietăților antioxidante ale etilcafeatului asupra căruia nu s -au efectuat încă
destule cercetări.

4
CAPITOLUL 1.
DATE GENERALE PRIVIND MECANISMELE IMPLICATE
ÎN PATOGENEZA MALADIEI ALZHEIMER

1.1 Generalități
În 190 6, Alois Alzheimer descria în articolul “O boală neobișnuită a cortexului
cerebral ”, cazul unei paciente de 51 de ani care prezenta pierderi de memorie,
dezorientare, halucinații și tulburări cognitive.
Denumirea bolii Alzheimer vine de la numele psihiatrului și histopatologului
german, Alois Alzheimer, care a descris pentru prima dată în anul 1906 anomaliile
țesutului cerebral la o pacientă care a murit de o boală mentală neobișnuită.
După moartea pacientei, doctorul Alzheimer a examina t creierul acesteia și a
descoperit numeroase acumulări anormale de substanțe în creier ,, în prezent
numite plăci amiloide, dar și aglomerări de fibre în neuroni , cunoscute în zilele
noastre sub numele de benzi neurofibrilare (Wagmob, 2013).
Examinarea pos t-mortem a relevat un creier atrofic cu schimbări semnificative
ale neurofibrilelor și cu zone în care apăreau depuneri neobișnuite ale unei
substanțe speciale din cortex. Un secol mai târziu, această afecțiune fără
precedent, numită boală Alzheimer a de venit cea mai răspândită maladie
neurodegenerativă, a cărei etiologie rămâne încă necunoscută (M.Goedert et al,
2006).
În conformitate cu Raportul Mondial privind Alzheimerul, 46 .8 milioane de
perso ane sufereau de demență în anul 2015, și este de așteptat ca numărul
cazurilor să se dubleze la fiecare 20 de ani. Aproximativ 5 -8% dintre persoanele
cu vârste peste 65 de ani, 15 -20% dintre persoanele peste 75 de ani, 25 -50% dintre
persoanele peste 85 de ani sunt afectate de demență.

5
Prevalența majoră este în Asia (22,9 milioane de cazuri), urmată apoi de Europa
(10,5 milioane de cazuri) și America (9,4 milioane de cazuri). AD este cea mai
comună formă de demență, reprezentând 50 -75 % din totalul de demențe la nivel
global (B.Duthey, 2004).
Maladiile ne urodegenerative ce se caracterizează prin deteriorarea sistemului
neurotransmițătorilor, s -ar putea constitui într -o mare familie, deși la prima vedere
sunt destul de diferite. (Lucian Hrițcu, 2011) , în aceste condiții AD se
caracterizează printr -o deterio rare progresivă a funcțiilor cognitive, determinând
o reducere semnificativă a volumului creierului la pacienții cu demență de tip
Alzheimer comparativ cu cei sănătoși.(M.P.Mattson, 2004).
Atrofia rezultă în urma degenerării sinaptice și a morții neuronale , preponderant
din hipocamp, regiunea creierului care joacă un rol important în memorie și
orientare spațială. Vârsta înaintată reprezintă un factor de risc pentru, riscul
dezvoltării acestei boli ajungând până la 50% pentru persoanele cu vârsta de peste
85 de ani.( L.O. Soto -Rojas et al., 2015).
Femeile sunt mult mai susceptibile să dezvolte această boală comparativ cu
bărbații, acest lucru fiind corelat cu speranța de viață mai ridicată și cu scăderea
nivelului de estrogeni la menopauză, care ar putea con stitui un factor de risc
pentru AD (S.C.Janicki et al., 2010).
Bolile neurodegenerative sunt afecțiuni neurologice cronice produse prin
pierderea progresivă a neuronilor. În funcție de regiunea SNC afectată și de
prezența unor markeri celulari și molecular i, se deosebesc mai multe tipuri, care
au o etiologie multifactorială sau monogenică. Cele mai frecvente sunt boala
Parkinson și boala Alzheimer.(Mircea Covic, 2017 ).
Boala Alzheimer este caracterizată de o pierdere progresivă a memoriei și a altor
funcții cognitive. (vezi figura 1). De obicei durează peste un deceniu pentru ca
boala să își urmeze cursul și pacienții să moară complet neajutorați .

6
Durata lungă a acestei maladii și atacul său asupra structurilor fragile care
adăpostesc ceea ce reprezentăm noi per ansamblu constituie o povară emoțională,
dar mai ales financiară pentru pacienți, familiile acestora și societate. Costurile
pentru tratame ntele bolii Alzheimer s -au estimat în 2010 la 604 bilioane de dolari
la nivel global.(Wimo et al, 2010).
AD produce o scădere în volum și greutate a creierului, afectând unele regiuni
ale creierului precum și neuronii din zonele respective mult mai marcan t
comparativ cu alte boli.( Teresa Gomez -Isla, 1996). Mai mult decât atât , p e lângă
reducerea în volum a creierului, un alt semn al AD este prezența plăcilor
amiloidice în creier, cauzate de ,, depunerea unei substanțe speciale în cortex,, ,
așa cum a fos t descrisă inițial de Alois Alzheimer.
Aceste plăci numite și plăci senile au fost găsite în domeniile extracelulare ale
creierelor AD și în mod special în regiunea hipocampului. Ele sunt alcătuite dintr –
o peptidă numită β -Amiloid, care prin agregare forme ază plăcile amiloidice. Alt
semn al bolii ar fi prezența agregărilor neurofibrilare intracelulare din creier
observate de asemenea și în boala Parkinson, fiind compuse din proteine Tau
hiperfosforilate.(I. Grundke -Iqbal et al, 1986) . Aceste proteine asocia te
microtubulilor reacționează în mod normal cu tubulina pentru a stabiliza
microtubulii. (E. Giraldo et al., 2014).
Având în vedere tendințele evolutive ale bolii Alzheimer care sunt corelate cu
îmbătranirea populației și care sunt de creștere progresivă a numărului de
îmbolnăviri se apreciază că în primele decenii ale acestui mileniu, demența
Alzheimer va deveni problema numărul 1 a sănătății publice devans ând bolile
cardiovasculare, cancerul și accidentele de circulație , devenind principala c auză
de morbiditate, invaliditate, mortalitate. ( Gautier, Tudose, 2000).
Mai mult decât atât, AD produce pierderi neuronale în zone specifice ale
creierului. O mare parte din pierderea în volum este cauzată de atrofia acestuia și
de stoparea proceselor n euronale.

7
Boala Alzheimer , prezentă la 5% dintre persoanele peste 70 de ani este cea mai
frecventă cauză de demență.Se caracterizează prin pierderea neuronilor, în special
în cortex, atrofia cerebrală corticală și în hipocamp, ce produce o deteriorare
intelectuală lentă, dar progresivă manifestată prin pierderea memoriei, afazie,
agnozie, dezorientare temporo -spațială, pană la demență. Aceste fenomene se
asociază cu o insuficiență sinaptică primară ce este reprezentată de disfuncția
neurotransmițătorilor, î n special o deficiență marcată de acetilcolină, depleția
neurotrofinei și disfuncție mitocondrială.
Modificările anatomo -patologice specifice bolii Alzheimer sunt plăcile senile de
β-amiloid extraneuronale și agregatele neurofibrilare intraneuronale format e prin
hiperfosforilarea proteinei Tau. Această maladie este o afecțiune cu importantă
eterogenitate genetică.
Circa 25% din cazurile de boală Alzheimer sunt familiale și se subîmpart în două
grupe: boala Alzheimer cu debut precoce (sub 60 -65 de ani) și bo ala Alzheimer
cu debut tardiv ( peste 65 de ani).
Boala Alzheimer cu debut precoce (60 % din cazurile familiale, 13% fiind
transmise autozomal dominant) se prezintă sub trei tipuri principale: tip 1 ( 10-15
%)- produs de mutațiile genei APP (21q21) – ce co difică proteina precursoare a
β-amiloidului; tip 3 (20 -70 %) produs de mutațiile genei PSEN1 (14q24.3), ce
codifică presenelina 1; tip 4 (sub 5 %) produs de mutațiile genei PSEN2 (1q31 –
q42) ce codifică presenelina 2; presenelinele acționează ca secretaze,
transformând APP-ul în amiloid.
Există și cazuri familiale rare care nu sunt determinate de mutații între cele 3
gene, ci în alte gene, încă neidentificate.
Boala Alzheimer cu debut tardiv sau tipul 2 este asociată cu alela epsilon 4 a genei
APOE (19q13. 2) ce codifică o moleculă chaperone, care promovează depozitarea
β amiloidului și fosforilarea proteinei T au. Majoritatea pacienților cu boala

8
Alzheimer sunt încă cazuri sporadice, cu determinism multifactorial și rezultă din
combinația a trei categorii de factori etiologici.Vârsta este principalul factor de
risc în boala Alzheimer.
Predispoziția genetică este determinată de variante alelice ale mai multor gene de
risc, precum APOJ (care codifică apolipoproteina J), TOMM40 care codifică un
transportor al m embranei mitocondriale, SORT1 codifică un receptor implicat în
clivarea APP, MAPT care codifică proteina T au.
De o importanță incontestabilă sunt și factorii exteriori care pot duce la
dezvoltarea acestei maladii. Expunerea la unul sau mai mulți factori de mediu:
traumatisme craniene, virusuri, toxine, concentrații mari de colesterol la vârsta
medie, anestezice generale, activarea cronică a axei glucocorticoizilor, deficit
estrogenic la femeile ce se află în perioada de postmenopauză.( Mircea Covic,
Genet ică medicală).
Maladia Alzheimer se caracterizează prin liză neuronală, distrugerea prelungirilor
nervoase și acumularea plăcii senile în creier. ( amiloidoza). Denumirea de
amiloidoza este improprie deoarece inițial s -a considerat că fibrele au o natură
asemănătoare amidonului . Amiloidoza constă în acumularea extracelulară a
proteinelor insolubile în spațiul intracelular al țesuturilor parenchimatoase (ficat,
splină, rinichi, suprarenale), în vasele sanguine, în țesutul nervos și în mușchiul
cardiac, înt r-o masură în care perturbă funcția țesutului.
Proteina principală a plăcii senile este β-amiloidul , un material hialin eozinofil.
Microscopia electronică a relevat structura fină fibrilară a proteinelor din
depozitele amiloidice. Fibrele sunt fragmente proteolitice ale diferitelor proteine
plasmatice și au structură β-pliată.
În placa de amiloid s -au găsit circa 15 proteine diferite. Cele mai comune proteine
precursoare ale amiloidului sunt amiloidul -β, catenele L ale gamaglobulinelor

9
asociate cu mielomu l multiplu, dar și alte proteine plasmatice cum ar fi
transtiretina care este prealbumina care leagă tiroxina.
Proteinele plasmatice precursoare sunt fie în mare exces cantitativ , catenele L la
pacienții cu mielom multiplu sau β2 microglobulina la pacienții cu dializă cronică
, sau sunt forme mutante (transtiretina) la pacienții cu neuropatii amiloide
familiale. Proteina amiloid a plăcii senile este un polipeptid de 4,3 Kda, rezultat
din clivajul proteolitic al unei proteini mai m ari cunoscută ca precursor al
amiloidului β.
Proteina precursoare are funcții complexe: este esențială pentru supraviețuirea și
pentru creșterea neuronilor. Funcțiile sale multiple și complexe se corelează cu
starea fizic ă a peptidului în formă monomeră, alfa helicală, solubilă, amiloidul
stimulează creșterea prelungirilor neuronale. La pacienții cu Alzheimer,
amiloidul își modifică conformația cre scând frecvența secvențelor β-pliate cu
tendința de autoagregare.
Agregatul are conformație fibrilară și es te factorul neurotoxicității, implicat în
patogeneza maladiei, datorită capacității sale de a activa calea clasică a
complementului prin legarea specifică a C1q la domeniul colegenic. În placa
fibrilară de amiloid -β, în cortexul și hipocampul pacienților Alzheimer se găsesc
proteine ale cascadei complementului. S-a considerat că apo E ar putea fi
implicată ca potențial mediator al transformării conformaționale a precursorului
amiloidului β. (Cartea de Imunobiologie).

10

Fig.1.Dezvoltarea progresivă a bolii Alzheimer
(Igor O. Korolev, 2014).

1.2 Mecanisme neurochimice
Încă nu s -au descoperit tratamente eficiente pentru a preveni, a opri sau a eradica
boala Alzheimer, dar cercetările avansate din ultimele trei decenii ar putea
schimba această imagine sumbră. Studiile genetice demonstrează că boala are
cauze multiple. Ab ordările interdisciplinare care combină biochimia, biologia
moleculară și celulară precum și modelarea transgenică au evidențiat unele dintre
mecanismele sale moleculare.
Progresele din domeniul chimiei, radiologiei și biologiei încep să ofere
biomarkeri extrem de folositori în diagnosticarea și prevenirea acestei boli și astfel
să conducă la apariția unor medicamente personalizate gata să revoluționeze
industria farmaceutică și studiile clinice. ( Yadong Huang et al., 2012).
AD provoacă o pierdere mare în greutatea și volumul creierului și afectează unele
regiuni ale acestuia și populațiile neuronale. (Gomez -Isla et al., 1996).

11
Deși AD provoacă în mod clar pierderea neuronilor în regiuni specifice ale
creierului cum ar fi de exemplu, celulele piramidale d in lamina II a cortexului
entorhinal și în regiunea CA1 din hipocamp, o mare parte din pierderea în volum
a creierului este cauzată de scorojirea acestuia și de pierderea proceselor
neuronale ( Yadong Huang și Lennart Mucke, 2012) iar scăderea în volum a
anumitor regiuni ale creierului poate fi detectată cu ajutorul RMN -ului,
observându -se astfel cauza declinului cognitiv specific bolii Alzheimer. (Frisoni
et al, 2010).

Simptomele clinice sunt determinate de deteriorarea domeniilor cognitive
selective, în special a acelora legate de memorie. Declinul memoriei se manifestă
inițial ca o pierdere de memorie episodică, care este considerată o subcategorie a
memoriei declar ative. Disfuncția în cazul acesta este reprezentată de
imposibilitatea rememorării evenimentelor recente, inclusiv activitățile
autobiografice. Elucidarea determinanților moleculari care stau la baza
întreruperii episodice a memoriei recente și declin ul celorlalte domenii cognitive
rămâne încă un mister în ceea ce privește mecanismele de acțiune ale acestei boli
necruțătoare. (Frank M. LaFerla et colab., 2007).

1.2.1 β-amiloidul

Alzheimer a descoperit în urma cercetărilor sale că există o substanță specială ce
apare sub formă de pelicule în anumite regiuni ale creierului, denumite mai târziu
plăci amiloidice. În anul 1980 s -a descoperit că aceste plăci sunt formate din
agregate de peptide mici numite B amiloide. A doua leziune descrisă de
Alzheimer era localizată intraneuronal, aparând sub forma unor agregate
neurofibrilare, demonstrându -se mai târziu că sunt agregate ale proteinei Tau
anormal fosforilată.( Frank M. LaFerla et colab, 2007).

12
β amiloidul este produs prin endoproteoliza protein ei precursor amiloidice (APP),
sub acțiunea unui grup de enzime sau complexul enzimatic format din alfa, beta
și gama secretaze. Clivarea și transformarea APP -ului pot fi împărțite într -o cale
amiloidogenă și una neamiloidogenă. Peptida β-amiloidică a fost identificată ca o
component ă a plăcilor amiloidice extracelulare la mijlocul anilor 80. Nu a durat
însă mult până au apărut date în literatură ce confirmau existența plăcilor β-
amiloidice și la nivel intraneuronal.
Studiile recente au arătat că existența acestor plăci β-amiloidice la nivel
intraneuronal poate fi considerat un simptom precoce în patologia bolii
Alzheimer. (Frank M. LaFerla et al, 2007 ).
Deși există un număr mare de dovezi care demonstrează că plăcile amiloidice se
acumulează intracelular, o eventuală posibilitate ar fi aceea că acesta se
acumulează din cauză ca o porțiune de β-amiloid nu e este secretată și rămâne
astfel blocată intracelular, sau β- amiloidul secretat este absorbit înapoi de celulă
pentru menținerea rezervelor ei interne. Peptidele Aβ, constituent principal al
plăcilor de amiloid și diferiți alți metaboliți sunt obținute în urma clivajului
electrolitic al APP. (Citron, 2010 , De Stropper et al, 2010.)
Evidențele susțin ipoteza că APP și Aβ contribuie esențial la cauzalitatea
patogenezei AD. (Yadong Huang, Lennart Mucke, 2012).
Supraexpresia APP la om rezultată prin duplicarea genei ce este responsabilă de
sinteză acesteia sau trisomia 21 pot provoca apariția precoce a AD în timp ce
trisomia parțială 21, fără excl uderea genei APP nu are același efect. (Prasher et al,
1998).

Subunitatea catalitică a ϓ -secretazei, complex care eliberează peptide Aβ din
precursorul său format de PS1 sau PS2. Mutațiile autozomale ale APP, PS1 care
modifică procesarea APP și producerea sau autoagregarea din Aβ, producând
agregarea și acumularea de Aβ în creier reprezintă începutul AD.( Lars Bertram

13
et al, 2010) precum și e xpresia neuronală a APP -ului uman mutant (hAPP) singură
sau în combinație cu PS1 mutant în cazul rozătoarelor trans genice produc mai
multe modificări atribuite AD.(Ashe et al, 2010.)

Îmbătrânirea este cel mai important factor de risc nongenetic cunoscut. Potențiali
factori de risc pentru debutul târziu al AD mai pot considerați : vătămarea capului,
nivelurile scăzute ale educației, hiperlipidemia, hipertensiunea arterială,
homocisteinemia, diabetul zaharat și obezitatea.( Deborah E. Barnes și Yaffe,
2011). Evidențele arată că Aβ reglează activitatea neuronală în creier provocând
o combinație intrigantă a activității abe rante a rețelei neuronale și oboselii
sinaptice.(Palop, Mucke, 2010 ).

Deteriorările interneuronilor inhibitori și stimularea aberantă a receptorilor pentru
glutamat pot determina excitotoxicitatea și pot să joace roluri definitorii
ascendente în această cascadă patogenică. (Meilandt et al, 2008.) Activitatea
neuronală aberantă ar putea declanșa un cerc vicios prin mărirea producției de Aβ
care este reglată cel puțin parțial de către activitatea neuronală.(Bero et al, 2011).
AD este în mod clar o p roteinopatie în care mai multe proteine capătă conformații
potențial patogene și se acumulează separat sau împreună în creier. Prin referire
la definiția patologică a bolii, AD nu este asociat numai cu o acumulare anormală
de plăci amiloide ci și aglomerăr ile neurofibrilare. (NFTs) Aglomerările
neurofibrilare se formează intracelular și sunt compuse în principal din agregate
TAU care suferă modicări posttranslaționale anormale, cum ar fi fosforilări și
acetilări exagerate.(Cohen et al, 2011).

Constatările recente au schimbat percepția asupra parerii tradiționale care susținea
că Tau funcționează în primul rând prin stabilizarea microtubulilor și agregarea
lor în AD cauzând în AD deficite prin mecanismele de pierdere a funcției . În
culturile de celule și în cazul modelelor animale modificate genetic se sugerează

14
că Tau poate facilita în mod normal sau poate spori neurotransmisia excitatorie
prin reglarea distribuției moleculelor de semnalizare legate de activitatea
sinaptică. (Mor ris et al, 2011).

Cu toate acestea, când acesta suferă modificări anormale, ia conformații patogene,
este îmbogățit cu terminații dendritice care pot interfera cu neurotransmisia.
(Hoover et al.,2010) iar oligomerii Aβ contribuie la îmbogățirea postsinapt ică a
Tau printr -un proces ce implică membri ai familiei kinazelor cu rol în reglarea
afinității microtubulilor.(Yu et al., 2012).
Într-un mod inedit, reducerea TAU împiedică Aβ să cauzeze deficite neuronale în
culturile de celule și de șoareci transgenici .

Astfel, în timp ce plăcile amiloidice au o acțiune constructivă comparativ cu
proteinele Tau, efectele adverse depind în mare parte de acesta din urmă. Aceste
concluzii sunt în concordanță cu studiile genetice privind mutațiile APP sau
preseniline care cauzează acumularea de Aβ în creier provocând AD cu plăci
amiloidice și ghemuri neurofibrilare, în timp ce mutațiile Tau produc doar
ghemuri neurofibrilare fără plăci amiloidice sau AD.(Bertram et al., 2010).
O mare parte din cazurile de AD prezintă de asemenea acumulări anormale ale
proteinei presinaptice, α-sinucleina și a proteinei de legare a ARN -ului TDP -43
din creier. (Higashi et al.,2007). La fel și cu Tau, formele mutante ale acestor
proteine nu provoacă AD, ci alte tulburări neurodegenerative.
Aβ stimulează împachetarea greșită și acumularea de α-sinucleină in vitro și in
vivo, iar studiile pe șoareci dublu transgenici au arătat că aceste molecule duc la
disfuncții mitocondriale și neurotoxicitate.( Chang et al, 2005 ). Disfuncția
mitocondtrială este mai evidentă în apo E4 decât în cărăușii apo E3 așa cum afirmă
Gibson et al ., în 2000).

15
Apo E4 este de asemenea asociată cu scăderea metabolismului glucozei cerebrale
atât la pacienții cu AD cât și la subiecții fără semne de demență, care probabil
reflectă disfuncțiile mitocondriale Apo E4 dependente.(Small et al ., 2000).

Ca și Aβ, Tau și α-sinucleina pot exista în diverse moduri de împachetare și
evidențele au arătat că agregatele mai mici, cum ar fi spre exemplu oligomerii
solubili, (vezi figura 2) au o patogenitate mai pronunțată spre deosebire de
agregatele fibrilare mari, in solubile, foarte ordonate.( Winner et al., 2011).

O întrebare interesa ntă rămâne însă fără răspuns deocamdată; dacă patogenitatea
in vivo a acestora și a altor prot eine asociate tulburărilor neurodegenerative depind
de conformațiile specifice, spre exemplu structurile de tip β -foaie pliată, și dacă
proteinele necesită autoagregarea sau legarea de alte proteine pentru a -și realiza
stările conformaționale.

În acest ca z cel puțin pentru Tau și α-sinucleină, ambele fiind proteine considerate
intrinsec dezordonate, se poate presupune că monomerii și -ar putea lua
conformații patogene în circumstanțele care favorizează neplierea proteinelor.
(Miller et al.,2011).

16

Fig.2. Moduri de împachetare ale β -amiloidului.
(Frank.M.LaFerla et al., 2007)

1.2.2 Proteina Tau
Creierul pacienților cu Alzheimer conține două tipuri diferite de depozite de
protein e, plăcile amiloidice și aglomerările neurofibrilare. Multe dintre cercetările
actuale vizează determinarea naturii acestor depozite și a factorilor care produc
apariția acestora. O componentă importantă a aglomerărilor sunt filamentele
helicoidale asociate (PHFs) care sunt în mare parte alcătuite din proteina Tau
asociat ă microtubulilor. Aceste aspect e ridică două întrebări: Prin ce se deosebește
proteina Tau din filamente de proteina Tau normal ă? Și: Ce factor cauzează
această diferență?
Principalele diferențe între cele două tipuri de Tau sunt: Tau PHFs este foarte
insolubil și asamblat în filamente helicoidale, poate fi deosebit și prin folosirea de

17
anticorpi a căror reacție este adesea dependentă de fosforilare, de aici putem afima
ca Tau PHFs este anormal fosforilată.( G.Drewes et al., 1992).
Leziunile neurofibrilare tau -pozitive abundente constituie o caracteristică
neuropatologică definitorie în boala Alzheimer.

Tau este o proteină asociată microtubulilor care este implicată în asamb larea și
stabilizarea acestora. În creierul uman adult sunt exprimate 6 izoforme Tau care
sunt produse prin splicingul alternativ al ARN -ului mesager de la o singură genă
situată pe brațul lung al cromozomului 17.

Regiunile repetitive ale Tau și secvențe le care flanchează repetările co nstituie
domenii de legare la microtubuli iar funcțiile regiunilor amino -terminale rămân
încă necunoscute.
Proteina Tau este exprimată mai ales în neuroni, date recente arată prezența
acesteia și în oligodendrocite. În inte riorul celulelor nervoase, Tau este prezentă
în principal în axoni. Tau nu pare a fi o proteina esențială deoarece inactivarea
acesteia nu produce decât o reducere a numărului de microtubuli în unii axoni de
calibru mic.

Proteina Tau este reglată în dezvo ltare, în sensul că numai izoforma sa cu trei
repetări și fără inserții terminale este prezentă în creierul fetal. Toate cele 6
izoforme Tau sunt exprimate în creierul uman adult, unde izoformele Tau cu 3
repet ări par a fi mult mai abundente decât izoforme le Tau cu 4 repetări.
Tau este o fosfoproteina iar mobilitatea ei electroforetică este încetinită prin
fosforilare. Se știu foarte puține lucruri despre protein kinazele care se presupune
că ar produce fosforilarea Tau. Izoformele Tau cu trei repetări se asamblează sub
forma elicoidală iar cele cu patru repetări iau conformații de filamente drepte.

18
Încă de la descoperirea sa, proteina Tau a fost considerată un promotor puternic
al polimerizării tubulinei in vitro. Legarea Tau la microtubuli reduce inst abilitatea
dinamică a acestora. Analiza dinamicii creșterii microtubulilor individuali indică
faptul că Tau crește rata de ascoiere și scade rata de disociere a moleculelor de
tubulină la capetele de creștere și inhibă tranziția către faza de scurtare.
Injectată în fibroblaști produce o creștere a masei microtubulilor și rezistența
acestora la agenții de depolimerizare.( Michel Gordet et al., 1993).

Fig.3. Patologia Tau în AD, vizualizată cu anticorpi anti -Tau dependenți de
fosforilare (AT -8).
(Maria Grazia Spillantini, 1998).

În urma realizării unor studii s -au constatat următoarele aspecte: benzile
neurofibrilare apar, în mod normal, în hipocamp o dată c u îmbătrânirea, iar
benzile neurofibrilare prezente în neocortex indică boala Alzheimer. (Goate et al,
1995).

19
1.2.3 Aglomerările neurofibrilare
Boala Alzheimer este o tulburare neurodegenerativă a cărei cauze rămîn încă
necunoscute și este caracterizată de afectarea treptată a funcției cognitive.
Corelația histopatologică a bolii este reprezentată de formare plăcilor senile
neuritice (SP) și a ghemurilor neurofibrilare specifice Alzheimerului (ANT) în
cortexul cerebral.
Cu toate acestea, în limita topografi că a unor situsuri de preferință, un număr mai
mic de leziuni similare sunt prezente și în creierul majorității subiecților vârstnici
normali din punct de vedere neurologic.
Există opinii diferite cu privire la prima leziune caracteristică acestei boli, d ar
pare plauzibil că acumularea de mase mari de fibre intracitoplasmatice anormale
descri se pentru prima dată de Alois Alzheimer în 1907, conduc către degenerarea
celulelor nervoase afectate.
Însuși, Alzheimer a adus în 1911 ideea că ANT nu trebuie conside rate leziuni
statice, folosind tehnici de impregnare cu argint a reușit să distingă formele târzii
de neurodegenrare de cele inițiale. Etapele timpurii sunt caracterizate de
incluziuni fibrilare anormale delicate prezente în țesuturile nervoase afectate.

Aceste fibre argintofile agregă în mănunchiuri mari care inundă întreaga
citoplasmă neuronală, în cele din urmă, precum clasiele aglomerări neurofibrilare
specifice acestei maladii.(C.Bancher et al, 1988).

20

Fig.4.Ghemuri neurofibrilare în diverse stadi i ale evoluției, așa cum au fost ele
descrise în 1911 de către Alzheimer: a.incluziuni fibrilare argintofile delicate;
b.ghemuri neurofibrilare clasice Alzheimer; c.Ghemurile fantomă (libere în
neuropil). (C.Bancher et al, 1988).

1.3 Stresul oxidativ
Stresul oxidativ este definit ca dezechilibrul biochimic care apare între
producerea speciilor reactive de oxigen (ROS) și eliminarea acestora din
organism care conduce la apariția unor leziuni permanente și ireversibile alea
celulelor . (Harman D., 1991). De asemenea, este cunoscut faptul că multe căi
apoptotice sunt semnalizate de molecule prooxidante și chiar radicali liberi ai
oxigenului.
În cele mai multe cazuri însă, pierderea echilibrului homeostatic conduce la
slăbirea barierei antioxidante reprezentată de enzime și molecule cu un important

21
rol în reducerea radicalilor liberi ai oxigenului sau inhibiția activității sau sintezei
factorilor prooxidanți. (Cojocaru et al., 2007).
Stresul oxidativ joacă un rol cunoscut în patogeneza unui număr de boli. El este
corelat, în special cu etiologia bolii Alzheimer, maladie neurodegenerativ ă
asociată vârstei înaintate și cea mai frecventă cauză de demență la bătrâni.(C.
Cheignon et al., 2017). În bolile neurodegenerative precum Al zheimer și
Parkinson, creierul prezintă deteriorări oxidative, stresul oxidativ fiind considerat
factorul declanșator.
Creierul ar putea fi în mod particular sensibil la stresul oxidativ deoarece la nivelul
acestuia se consumă o cantitate foarte mare de ox igen molecular. (28% din
consumul total al corpului). (B.Halliwell et al., 1989). Radicalii liberi sunt produși
în mod constant în celulele eucariote și acest lucru trebuie contrabalansat prin
apărarea antioxidantă necesară menținerii homeostaziei redox.
Semnele histopatologice ale AD sunt ghemurile neurofibrilare intracelulare și
formarea plăcilor senile extracelulare compuse din peptide β -amiloidice în formă
agregată cu metale precum cuprul, zincul, fierul. Ionii metalici activi cu poten țial
redox, precu m cuprul, pot cataliza producerea speciilor reactive de oxigen când
se leaga de β -amiloid. (C.Cheignon et al., 2017).
Datorită importanței conversiei energiei, majoritatea ROS din organism provin
din lanțul respirator și prin urmare sunt potențial periculo ase. Astfel, există o serie
de enzime și compuși mici care există pentru a controla nivelurile ROS. În
general, ROS sunt menținuți la un nivel scăzut dar niciodată eliminați complet.
Acumularea unor cantități mari de ROS este periculoasă și este definită c um am
spus și mai devreme ca stres oxidativ. Acumulările ROS pot fi cauzate fie de
supraproducție, fie de eliminarea deficitară a acestora. Eliminarea se poate face
prin mai multe mecanisme și este realizată de compuși antioxidanți.

22
Prin definiție, un com pus antioxidant este o moleculă endogenă care atunci când
este prezentă în concentrații scăzute în comparație cu concentrația substratului
oxidativ, întârzie semnificativ sau inhibă oxidarea substratului.( B.Halliwell et al.,
1989).
Conversia energiei este unul dintre procesele fundamentale care stau la baza vieții.
Aceasta există de la apariția primelor forme de viață și a mecanismelor de bază,
cum ar fi pasajul ionilor prin membrana semipermeabilă, printr -un mecanism
denumit chemiosmoza, prezent la toate organismele vii. Designul general al
enzimei care transformă gradientul de ioni în energie chimică sub formă de ATP
este același în toate organismele vii. (F.L.Sousa et al., 2013).
Așa cum am prezentat anterior, dezechilibrul apărut între speciile reactive de
oxigen cu acțiune nocivă și mecanismele de apărare antioxidantă cauzează
apariția stresului oxidativ. În creier când balanța redox este dezechilibrată stresul
oxidativ produce deteriorări alarmante care conduc la pierderi neuronale în
congruență cu ma ladiile neurodegenerative.
Speciile reactive de oxigen pot determina clivarea acizilor nucleici, inactivarea
enzimatică, depolimerizarea polizaharidelor, peroxidarea lipidelor și multe alte
procese distructive. În general deteriorările cauzate de ROS condu c la moarte
celulară dacă acumulările de specii reactive sunt considerabile. (Michael H.Yan et
al., 2013).
Reacțiile cu transfer de electroni sunt folosite pentru formarea gradientului
transmembranar al ionilor.Cu alte cuvinte, acestea sunt reacțiile redox , în care
electronii sunt transmiși printr -un lanț de la un prim donor prin mai mulți
intermediari către un acceptor final. Pentru oameni, animale și multe alte ființe,
acceptorul final de electroni este oxigenul molecular.
Un avantaj al acestui acceptor final de electroni este potențialul său redox ridicat
și prin urmare energia ridicată a reacțiilor în care este implicat. Primim donatori

23
de electroni odată cu mâncarea ingerată. Astfel, energia de care avem nevoie
pentru a trăi provine dintr -o reacție red ox între produșii asimilabili din alimente
și oxigenul molecular.

Oxigenul accept ă 4 electroni și 4 protoni pentru a produce două molecule de apă.
Reducerea oxigenului molecular conduce la apariția radicalului superoxid, a
peroxidului de hidrogen și a rad icalului hidroxil.

Acești intermediari pot reprezenta un pericol deoarece sunt fie foarte reactivi și
prin urmare dificil de controlat (radicalii hidroxil), fie sunt precursori în formarea
incontrolabilă a speciilor reactive: O 2 +NO= peroxinitrit .
Dintr e organitele și enzimele care pot genera ROS în celulă, mitocondria este
responsabilă de producerea a mai mult de 90% dintre speciile reactive.
Aceste produceri de ROS pot apărea atunci când electronii se desprind din lanțul
transportor de electroni reacț ionând cu dioxigenul. În jur de 1 -5% din oxigenul
total folosit de complexele I și III ale lanțului transportor de electroni este eliminat
sub formă de superoxid. ( Liochev et al., 1994).
Viața în mediul aerob, cu oxigenul molecular ca acceptor final de ele ctroni are ca
rezultat producția constantă a speciilor reactive de oxigen în organismul nostru.
ROS sunt produși pe cale enzimatică sau non -enzimatică ( De ex: în macrofage
pentru a distruge antigenele) sau non -enzimatic ca o reacție secundară.(B.Halliwel
et al., 1989).
Ca răspuns, SOD (superoxiddismutaza) din mitocondrie și cea din citosol
catalizează reacția ce convertește superoxidul în O 2 și H2O2. Glutation peroxidaza
și catalaza acționează ca antioxidanți convertind H2O2, care de altfel e foarte toxic
pentru celulă în apă. Peroxidul de hidrogen nu este un radical de aceea el poate
traversa membrana și se poate propaga rapid de -a-lungul celulei. Cu toate acestea

24
poate reacționa cu Fe2+ și alți ioni ai metalelor tranziționale pentru a forma
radicalul hidroxil care este extrem de periculos, fiind cea mai reactiv ă specie
oxidativă , capabilă să inițieze reacții autocatalitice în lanț ale radicalilor. (Vezi
figura 5).
Ca sursă majoră a producerii de energie și de ROS endogeni, mitocondria joacă
un rol -cheie în funcționarea și supraviețuirea neuronilor din creier, organul cu cel
mai intens metabolism energetic din întregul organism uman. Neuronii au o
glizoliză limitată iar ca celule postmitotice ce conțin acizi grași polinesaturați în
membranele lor, neuronii sunt sensibili la creșterea ROS. (Parihar et al., 2007).
Prin urmare, disfuncțiile mitocondriale par să favorizeze stresul oxidativ,
îmbătrânirea și tulburările neurodegenerative. De fapt, disfuncția mitocondrială și
stresul oxidativ constituie cele mai importante caracteristici ale maladiei
Alzheimer. (Michael H.Yan et al., 2013).

Fig.5. Stresul oxidativ indus în celul ă în locuri cu un nivel ridicat de β -amiloid,
unde metalele Aβ sunt una dintre sursele principale de producție ale ROS.
Spațiile portocalii sunt zonele afectate de stresul oxidativ.
(C.Cheignon et al., 2017).

25
1.3.1 Deterior ări ale ADN -ului în AD
Studii realizate pe ADN -ul mitocondrial din neuronii corticali ai pacienților cu
AD cu vârste până în 75 de ani au de 15 ori mai multe deleții spre deosebire de
grupul de control asociat aceleași vârste. Studiile ultrastructurale mor fometrice
din ultima vreme realizate pe biopsii din creier au demonstrat prezența
distrugerilor structurale ale mitocondriei printr -o deteriorare a neuronilor
piramidali, care probabil contribuie la disfuncția mitocondrială și crește stresul
oxidativ în c reierul unui bolnav cu AD.
Creșterea în mărime a mitocondriilor și scăderea în număr a acestora în neuronii
AD implică o dinamică mitocondrială defectuoasă în creierul AD. Odată cu
creșterea speranței de viață se așteaptă ca și incidența bolilor neurodegen erative
să crească. Stresul oxidativ devenind o caracteristică imporantă în rândul bolilor
de acest gen.
În analiza rolului stresului oxidativ în aceste afecțiuni, majoritatea studiilor au
arătat că mitocondria este o sursă important de ROS, locuri de int eracțiune cu
ROS, țintă pentru stresul oxidativ.
În concordanță cu acestea, alterările ADN -ului mitocondrial și dinamica
mitocondrială sunt induse de stresul oxidativ și amplifică de asemenea generarea
de ROS, contribuind astfel la creșterea stresului oxi dativ din AD și din alte boli
neurodegenerative.(Michael H. Yan et al, 2013).
1.3.2. Dezvoltare de noi tratamente
Stresul oxidativ se află în prim -planul cercetări lor privind boala Alzheimer. În
timp ce implicațiile sale în neurodegenerarea caracteristică a AD sunt ample,
aspectul cel mai important este că stresul oxidativ pare din ce în ce mai mult un
progenitor al bolii și nu doar un epifenomen. Mai mult, dovezile arată că o
perioadă îndelungată de acumulări de distrugeri oxidative conduce de fapt la

26
apariția bruscă a simptomelor specifice AD, incluzând depozitele de amyloid -β,
ghemurile neurofibrilare, disfuncțiile metabolice și declinul cognitiv.
Aceste constatări oferă perspective importante în dezvoltarea potențialelor
tratamente și chiar posibilitatea descoperirii unor soluții preventive. Strategiile
terap eutice curente vizează doar ameliorarea simptomelor , stopând progresul
bolii și prin urmare amânând deteriorarea inevitabilă a funcțiilor cognitive.
Așa cum numărul de cazuri de AD este într-o continua creștere, cererea unei
metode adecvate de tratament crește și ea direct proportional. (Ballenger, 2006;
Jellinger, 2006) .
Așa cum afirma Nunomura et al. în 2001, î n special în stresul oxidativ, protecția
neuronală față de distrugerile oxid ative poate constitui o modalitate de prevenție
a bolii dacă este realizată corespunzător.
În aceste sens, eforturile s -au concentrat pe captarea speciilor reactive de oxigen
care provoacă stresul oxidativ în celulă, acest lucru dând rezultate semnificati ve
și având un real succes printre studiile clinice de eficacitate. De aceea,
îmbunătățirea ulterioară necesită elucidarea mecanismelor moleculare implicate
în stresul oxidativ al AD. În cadrul unei celule funcționale aerobe în respirație se
generează inev itabil ROS . Reacțiile de oxidoreducere necesare pentru sinteza
ATP produc intermediari de radicali liberi în timpul transferului de electroni de la
o celulă la alta. În ciuda mecanismelor de excludere a radicalilor liberi din
interiorul celulei, prevenind dispersia potential dăunătoare a radicalilor liberi
intermediari, o cantitate substanțială de ROS este eliberată zilnic exercitându -și
acțiunea nocivă asupra celulelor.
Într-o celulă specializată cu activitate metabolică intensă, cum ar fi un neuron,
număr ul de astfel de radicali liberi produși este estimat la 1011 ROS/cel/zi. Aceste
efecte nuizibile sunt mult mai accentuate în AD. (Peters en et al.,2007).

27
1.3.3. Deteriorările oxidative și markerii stresului oxidativ
Deteriorarea oxidativă marcată de peroxidarea lipidelor, nitrare, carbonilii reactivi
și oxidarea acizilor nucleici este crescută în cazul neuronilor vulnerabili din AD,
în comparație cu pacienții neafectați indiferent dacă aceștia suferă sau nu de alte
patologii asemănătoare. (ex: ghemuri le neurofibrilare ). Mai mult decât atât,
reducerea activității metabolice ca rezultat al distrugerilor oxidative asupra
componentelor vitale mitocondriale a fost demonstrat ă în AD. Citocrom -oxidaza,
complexul piruvat dehidrogenazei și complexul α-cetogluta rat dehidrogenazei au
arătat o reducere a activității pricinuită de distrugerile oxidative. (Aliev et al,
2003). Markerii stresului oxidativ apar cu multe decenii înaintea depunerilor
efective de plăci de β -amiloid. (David J.Bonda et al, 2010).
În mod sim ilar, nivelurile crescute de izoprostane, produșii oxidării acizilor grași
polinesaturați se găsesc la pacienții diagnosticați cu stadiul predormal al AD,
insuficiență cognitivă ușoară (MCI ).
Alt marker al stresului oxidativ este prezența hemeoxigenazei -1, care este crescută
în țesutul cerebral post -mortem al persoanelor cu AD și în insuficiența cognitivă
ușoară. Dovezile sugerează că secreția și depunerea de β -amiloid în neuronii
vulnerabili din AD sunt măsuri compensatorii luate de celulă într -un efort de a se
proteja de daunele cauzate de stresul oxidativ.( Hayashi et al., 2007). De exemplu,
nu s-a demonstrat numai că β -amiloidul urmează apariției factorilor de stres
oxidativ în AD.( Peters en et al., 2007), dar s -a dovedit a avea capacități
antioxidante î n lichidul cefalorahidian și plasmă, protejând lipoproteinele de
oxidaze .(David J. Bonda et al, 2010).
Se presupune că ciclul de distrugeri neuronale autopropagate ca multe alte dintre
semnele distinctive secundare studiate sunt ele însele considerate sur se de stres
oxidativ. Efectul general este cel de feedback pozitiv. Spre exemplu, Fe în exces
și depozitele de Cu raportate în cazurile de AD catalizează formarea radicalilor
HO din H 2O2 și a produșilor finali ai glicării.

28
În mod similar, activarea microgliei în special a celor care înconjoară plăcile
senine (Gras et al, 1990), produce oxid nitric și superoxide in vivo , care
reacționează formând peroxinitrat. Activarea NADPH oxidazei microgliale în
creier generează, de asem enea, ROS și provoacă moarte neuronală însemnată.(
Park et al., 2008).
β-amiloidul a fost direct implicat în formarea ROS prin intermediul radicalilor
peptidil sau a asocierilor de metale, stimulând indirect formarea de ROS prin
activarea microgliilor . Produșii finali ai glicării avansate pot fi supuși ciclului
redox în prezența metalelor de tranziție pentru a produce ROS. Într-un mod inedit,
produșii finali ai glicării pot activa receptorii pentru a crește producția de ROS.
Sunt implicați receptorii pentr u produșii finali ai glicării avansate și receptorii
scavenger din clasa A . Anomaliile funcțiilor proteozomale și ale sistemelor de
degradare a proteinelor încurajează de asemenea producția de ROS. (Zhu et al.,
2001).
În ultima vreme anomaliile mitocondria le, cauzate ini țial de tulburările oxidative
au rol definitoriu în acumulările de ROS din celulă. (Bonda et al, 2010b.) Pe scurt,
deoarece mitocondriile sunt centrele metabolice și sursele inițiale de stres
oxidativ, perturbarea oxidativă în operațiunile l or duce la o deteriorare a
capacității metabolice.(Wang et al., 2009).
Daunele oxidative de la nivelul unui lanț transportor de electroni ar împiedica
transferul efectiv al acestora în timpul fosforilării oxidative, generând ROS în
exces. Efectul general este ciclul vicios al feedbackului pozitiv în care ROS
produce stres oxidativ care duce în cele din urmă la multiplicarea speciilor
reactive de oxigen cauzând prejudicii celulare, pentru că AD este ultima
manifestare a acestui ciclu și pentru că v ârsta este un factor de risc primar în
patologia AD.( Katzman, 1986).

29
1.3.4. Modelul cascadei oxidative neurodegenerative
S-a propus modelul cascadei oxidative a neurodegenerării induse de vârstă care
este vinovată de etiologia bolii Alzheimer. Oarecum simplificată, cascada este în
esență după cum urmează:
– ROS produce în mod inevitabil într -o celulă aerobă daune în rândul
macromolecule lor vitale (ADN, ADN mitocondrial, fosfolipide, proteine) în
ciuda eforturilor depuse de mecanismele antioxidan te. ( Petersen et al, 2007).
Aceste distrucții se acumulează în celulă pe parcursul mai multor ani ;
– daunele oxidative provocate de radicalii liberi cauzează generarea continuă de
radicali liberi, celula atingând un prag de unde nu mai poate controla prop agarea
ciclică.
Celula începe să își inițieze o stare de echilibru compensatoriu, astfel încât să își
poată controla mediul și să continue să existe. ( Zhu et al, 2001 ).

Fig.6.Mecanismul ipotetic al morții neuronale.Radicalii liberi și peroxidarea
lipide lor membranare.Formarea aldehidelor care afectează ATP -aza membranară
ce produce o creștere a Ca intracelular ce conduce într -un final către moartea
neuronală. (William.R.Markesbery, 1996).

30
Cu toate acestea starea de echilibru oxidativ destinată să prelun gească viața
celulară face celula vulnerabilă următoarelor afronturi. (Vezi figura 6)
Mai exact, secreția de β -amiloid pentru a captura ROS conduce în cele din urmă
la distrugerea integrității celulare, peptida însăși devine supusă unor leziuni
oxidative c are-i provoacă oligomerizarea și agregarea, care la rândul său produce
neuroinflamare, leziuni mitocondriale și prin urmare alte generații ROS. Alte
consecințe ale leziunilor celulare oxidative includ aberații ale ciclului celular și
hipefosforilarea Tau, conducând la formarea NFT. ( Mark et al, 1997).
Prin urmare aceste celule cedează sau continuă să existe sub forma unor celule
disfuncționale, a căror ultime manifestări sunt declinul cognitiv și demența
specifice AD.(Zhu et al, 2001 ).
1.4 Demența
Demența degenerativă primară (PDD) cunoscută și sub numele de demență de tip
Alzheimer (DAT) este o tulburare progresivă care se manifesta astfel: pierder ea
capacității intelectuale într -atât încât să afecteze viața social ă, memoria fiind grav
afectată, ap ar probleme cu gândirea abstractă, judecata, funcțiile corticale
superioare sau chiar schimbări de personalitate.
Cei afectați sunt dezorientați, neștiind adesea unde se află și de cele mai multe ori
nu sunt conștienți de propriul lor comportament.
În caz ul acestei perturbări cognitive, problemele comportamentale sunt, de
asemenea, evidente. Asemenea probleme pot include dificultate în realizarea
sarcinilor de zi cu zi precum și manifestarea comportamentelor supărătoare (cum
ar fi rătăcirea, iritabilitate a, agresivitatea, frica și anxietatea).
Există surprinzător de puține date empirice privind natura și prevalența
problemelor comportamentale la pacienții cu DAT (Linda Teri et al., 1988).

31
Demența văzută ca sindromul clinic global al declinului cognitiv al conștiinței
neatinse, nu este nici etiologic, nici patologic specifică, putând fi în schimb
provocată de o varietate de entități clinicopatologice irelevante.(McHugh, 1982).
Aproximativ 50 % din cazuri nu au o cauză cu specificitate demonstrabi lă, sunt
progresive, prezentând modificări specifice neuropatologiei Alzheimer (Katzman,
1976).
Cel mai frecvent tip de demență este demența senilă, prezentată ca entitate clinică
AD fără referință către un anumit grup de vărstă.

Deși această afecțiune este definită atât de implicațiile clinice cât și de cele
patologice, cercetările clinice și cele de laborator pot prezenta cu strictețe
caracteristicile neuropatologice după cum afirma Constantinides et al în 1978 .
Diagnosticul neuropatologic a l bolii este el însuși nespecific, indicând diferitele
evoluții ale bolii.
Fiecare dintre modificările histopatologice din patologia AD , se găsesc și în alte
tulburări, astfel că niciuna dintre aceste schimbări nu este specifică unei singure
entități a bol ii (Terry, 1980).

De asemenea, sunt recunoscute mai multe variante în complexul AD, cazurile
fiind distinse de prezența sau absența așa numitelor simptome corticale sau
instrumentale, precum și de diferite grupuri de organisme neuronale (corinergice
sau noradrenergice) care se deteriorează în diferite locații ale creierului bazal
(John C.S Breitner, Marshal F. Folstein, 1984).

Cel puțin un studiu a arătat că schimbări specifice apărute pe computerul
tomograf, pot releva un subgrup de ca zuri cu o tulburare preogresivă rapidă.
(Naguib și Levy, 1982).
În cele din urmă a fost cunoscut de decenii c a o variantă AD să poată fi influențată
de eredita te urmând modelul transmiterii autozomale dominant e, în timp ce alte

32
cazuri nu au raportat predispoziție familială. Lipsa de specificitate în diagnostic
și în corelațiile clinicopatologice a împiedicat progresul considerabil în
terapeutica și cercetarea AD.( John.C.S Breitner, Marshal.F.Folstein).

Demența Alzheimer afazică

În 1837, un subgrup al AD a fost caracterizat prin prezența afaziei, apraxiei sau
agnoziei. În anul acela James Cowles Prichard a descris un grup de pacienți cu
demență care progresa urmărind 4 stadii:
1.pierderea funcțiilor memoriei
2.pierderea competențelor rationale
3.pierderea abilităților de înțelegere lingvistică
4.deteriorări ale personalității, cu perturbări ale voinței și instinctelor, ducând în
final către o stare vegetativă.

Disfuncția limbajului specifică AD a fost analizată de Sjoren et al, în 1952 care
au descris boala cuprinzând trei stadii, și anume: afazia, apraxia și agnosia:
1.pierderea memoriei. (1 -3 ani)
2.apariția semnelor instrumentale (afazia, apraxia, agnosia). (4 -6 ani)
3.starea vegetativă care conduce la convulsii și în final la moarte.(peste 7 ani).
(Breitner și Folstein, 1984).

Demența Alzheimer familială

Agregarea familială în AD a fost demonstrată cel mai convingător prin analiza a
peste 50 de familii cu o presupusă tulburare dominant autozomală raportată.
Alte așa numite st udii pe populație au analizat rudele și au descoperit că acestea
au un risc crescut de a dezvolta demență mai târziu în viață.

33

Fig.7.Scrisul de mână a 4 subiecți AD agrafici și 2 non -agrafici. a) pacientă de
92 de ani, bolnavă de 2 ani care a încercat să scrie: ,, I like the country,,. b)
femeie de 83 de ani, bolnavă de 3 ani, a încercat să scrie: ,,looking forward to a
very good lunch,,. c) femeie de 79 de ani, bolnavă de 4 ani, nu a putut să explice
ceea ce a vrut să comunice. d)femeie de 86 de ani, bolnavă de 6 ani și -a scris
numele . e) femeie de 83 de ani a scris: ,, I like crabmeat,, (caz non -agrafic). f)
femeie de 76 de ani, bolnavă de 6 ani a scris: ,, this is a beautiful day,,.(caz non –
agrafic).
(Breitner și Folstein, 1984).

Printre ace ste studii se numără cel al lui Larsson care este notabil prin
dimensiunile și descoperirile sale, rapoarte de segregare sugestive ale unei stări
dominante autozomale.

34
În timp ce 4 % dintre rudele de gradul I ale lui Larsson au avut demență
(contrastând cu așteptările de peste 50 % dintr -o boală clasică dominantă), aceasta
a fost explicată partial de incidența demenței dependente de vârstă. Larsson a
estimat o morbiditate de 95 % în rândul rudelor cu AD trecute de vârsta de 95 de
ani.
Această ipoteză ar putea fi reconsiderată cu o ipoteză dominantă mendeliană, dacă
probanzii lui Larsson ar fi de fapt un mix de forme genetice și non -genetice ale
demenței.

Mai recent, cercetătorii au extins lucrarea lui Larsson utilizând autopsia dovedită
AD cercetată excl usiv. Aceștia au confirmat descoperirile lui Larsson, expresia
dependentă de vârstă a bolii printre cei expuși riscului, și a demonstrat de
asemenea că unele afecțiuni precoce sau severe sunt moștenite, sau pot fi altele
care elimină din start aceast ă ipoteză a zestrei genetice.
Prin urmare, aceste serii neuropatologice de probanzi definite reprezintă încă un
mix între cazurile familiale și cele non -familiale, fără mijloace de identificare a
cazurilor familiale a priori (Breitner și Folstein, 1984).

35
CAPITOLUL 2.
ETILCAFEATUL ȘI EFECTELE ACESTUIA ASUPRA
SISTEMULUI NERVOS CENTRAL AL UNUI MODEL
ANIMAL DE DEMENȚĂ

2.1 Cafeina și rolul acesteia în maladia Alzheimer

Fig.8. Structura chimică a cafeinei
Sursă: https://pubchem.ncbi.nlm.n ih.gov/compound/2519#section=2D –
Structure
Cafeina este o metilxantină, care se găsește într -o cantitate mare în cafea și este
considerată cea mai consumata substanță psihoactivă la nivel global. (Fisone G.
et al, 2004).
Fiind o substanță activă la nivel cerebral, acționând prin stimularea sistemului
nervos, prin creșterea pulsului și a tensiunii arteriale, stimularea diurezei și a
peristaltismului intestinal, întrebarea ,,Oferă cafeina protecție împotriva
demenței?,, a fost pusă pentru prima dată în 2002.(Maia și Mendonca, 2002).
Cafeina este metabolizată la nivelul ficatului până la teofilină și paraxantină
ambele fiind la fel de active fiziologic . Nu există diferențe considerabile în ceea

36
ce privește metabolismul și răspunsul fiziologic la cafeină la persoanele în vârstă
comparativ cu tinerii, în plus farmacocinetica cafeinei este similară după
administrarea orală sau intravenoasă a animale și oameni.(Fredholm B. et al
1999).
Studiile epidemiologice recente au relevat că un consum de c afeină mai rid icat
de-a lungul timpului ar reduce riscul apariției bolii Alzheimer. (G.W. Arendash et
al, 2006).Pacienții cu AD au consumat semnfic ativ mai puțină cafeină în timpul
celor 20 de ani anteriori diagnosticării comparativ cu persoanele în vârstă fără
AD. (Mai a și de Mendonca, 2002).
Cafeaua/cafeina s -a dovedit a avea un rol definitoriu în îmbunătățirea procesării
informațiilor la persoanele în vârstă, dar și în cazul tinerilor adulți.(Lorist.M et al,
1995).
Deși rezultatele cercetătorilor sugerează că aportul cronic de cafeină în perioada
vieții poate întârzia sau chiar proteja împotriva AD, măsura în care se poate
petrece acest lucru rămâne dificil de evaluat la om, deoarece:
1) studiile retrospective sunt bazate pe ,,recall,, și nu pot sa diferențieze fără
echivoc aportul de cafeină de ceilalți factori care pot afecta cogniția pe durata
vieții.
2) studiile controlate care implică administrarea cafeinei pe parcursul a decenii
sunt impracticabile.
Cafeina, consumată la scară lar gă, în special din cafea și ceai este un antagonist
al receptorului pentru adenozină A 1 și A 2A neselectiv. Acționează ca un stimulent
pentru creier cel mai probabil prin creșterea metabolismului energetic cerebral,
activitatea corticală, nivelurile de ace tilcolină extracelulară, promovând vigilența
și excitarea.

37
Administrarea cafeinei pe termen lung sau a antagonistului receptorului A 1 (până
la 2 săpt ămâni), la rozătoarele normale nu s -a observat niciun beneficiu cognitiv.(
G.W. Arendash et al, 2006).
Mecanismul de acțiune al cafeinei la nivel molecular cerebral include receptorii
pentru adenozină, rianodină și GABA, precum și izoenzimele fosfodiesterazelor
nucleotidelor ciclice, sistemul de transmitere al impulsului nervos de tip
dopaminergic, în sensul stimulării sistemului nervos central (Preedy, 2014).
Cercetările pe modele animale nu prezintă date elocvente cu privire la o legătură
directă între demența de tip Alzheimer și cafeină. Cu toate acestea , acțiunea
benefică asupra memoriei și cogniției a fost intens studiată și
argumentată.(Angelucci et al., 1999)

Fig.8.Efectul protector al administrării cafeinei în corelație cu producerea
plăcilor amiloidice în cazul șoarecilor transgenici AD, încă din tinerețe sau după
instalarea acestei pa tologii.(G.W.Arendash și Chuanhai Cao, 2010).

38
Cafeina și alți receptori antagoniști A 2A, sunt neuroprotectori împotriva pierderii
neuronale dopaminergice în modelul șoarecelui MPTP al PD, și pot atenua
efectele neurotoxicității in vitro. (Dall Igna et al., 2003 ).
Efectele benefice ale cafeinei nu implică modificări ale nivelelor receptorilor
pentru adenozină a le creierului, ci mai degrabă o suprimare a producției de Beta
Amiloid indusă de cafeină , datorată reducerii expresiei Presenilinei 1 și a Beta –
secretazei.(BACE). Aportul unei cantități moderate de cafeină zilnic este corelat
cu protecția surprinzătoare împ otriva AD sau chiar întârzierea apariției acestei
maladii.

2.2 Etilcafeatul, structură chimică și proprietăți

Fig.9. Structur a chimică a etilcafeatului
Sursă: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Etilcafeatul este un compus chimic cu formula moleculară C11H12O4 cu o
greutate moleculară de 208.213 g/mol.
Acidul cafeic (3,4 dihidroxicinaminic sau CA) este un tip de acid fenolic format
din grupări fenolice și acrilice, fiind larg răspândit în lumea vegetală. Acidul
cafeic prezintă proprietăți biologice remarcabile, cum ar fi: inhibarea formării
melaninei, rol antioxidant, antimitotic și anticancerigen, ceea ce relevă lar ga

39
utilizare a acestuia în medicină în diverse suplimente, în cosmetic și chiar în
industria aditivilor alimentari.
Cu toate acestea, punctul de topire foarte ridicat, solubilizarea anevoioasă și
stabilitatea limitată îl fac greu de utilizat în multe domenii. Pentru a preîntâmpina
problemele amintite anterior, au fost dezvoltate strategii ce presupun modificarea
acestor acizi pentru o mai bună manipulare și exploatare a proprietăților lor.
(Shangde Sun et al, 2018).
În ultimele decenii, consumul de vin roșu a crescut în urma descoperirii unor
efecte benefice ale compușilor antioxidanți conținuți de acesta, cum ar fi
rezveratrolul, o fitoalexină fenolică care este acum supliment nutritional datorită
proprietăților sale antiinflamatorii, scade conce ntrația zahărului din sânge și are
efecte anticancerigene.
Pe de altă parte vinurile albe conțin cantități considerabile de antioxidanți, în mod
particular acizi fenolici, benzoici sau hidroxicinaminici.
Acizii fenolici reprezintă o tremie din cantitatea totală de fenoli din dietă și sunt
cea mai predominantă clasă de antioxidanți fenolici descoperiți în vinurile albe.
Conținutul de acid cafeic și caftaric din vinurile albe îl poate depăși pe cel al
vinurilor roșii în funcție de practicile enologice utiliz ate.
Biodisponibilitatea acidului caffeic în vinul roșu a fost stabilită: cel mai mare
nivel al acidului caffeic este atins la 60 de minute dupa consumul vinului roșu,
concentrația plasmatică a acidului caffeic fiind corelată cu potențialul antioxidant
al plasmei.
Hidroxicinamații sunt larg răspândiți în lumea vegetală, formând de obicei
asocieri care sunt responsabile de gustul amar al multor alimente, cum ar fi:
cafeaua, merele, spanacul, salata verde, citricele, anghinarele sau tărâțele
cerealelor. (Ema nuele Boselli et al, 2009).

40
2.3 Surse de etilcafeat
Etilcafeatul, compus fenolic natural, a fost izolat din Bidens pilosa , o plantă
medicinală utilizată pentru tratarea unor anumite sindroame inflamatorii. Bidens
pilosa este o plantă larg răspândită în zonele tropicale și subtropicale și a fost
raportat că posedă proprietăți antihiperglicemice, antihipertensive,
antiulcerogene, imunosupresive și antiinflamatorii, antileucemice, antimalarice și
antimicrobiene.
Cu toate acestea, mecanismele celulare și moleculare care stau la baza
proprietăților antiinflamatorii ale extractului de B. pilosa și ale compușilor să i
activi derivați nu sunt în prezent bine definite.
Studiile au arătat că etilcafeatul joacă un rol important în suprimarea producție i
de oxid nitric.
O altă sursă de etilcafeat este planta numită, Ligularia fisheri , întâlnită în estul
Asiei, în Coreea, China și Japonia. Această plantă este comestibilă, utilizată
frecvent în medicina tradițională pentru proprietățile sale curative în artrita
reumatoida, icter, scarlatină.
A fost demonstrat că extractele și compușii farmacologici activi din L.fisheri
exercită activitate antioxidantă, antiinflamatorie, antihepatotoxică și antitumorală.
Etilcafeatul și derivații acestuia, c ompuși fenolici naturali izolați dintr -o varietate
mare de plante, inclusiv Bidens pilosa și Salvia guaran itica posedă proprietăți
antiinflamatorii și antitumorale. Deși s -au făcut numeroase cercetări, mecanismul
de acțiune al etilcafeatului nu este încă p e deplin cunoscut. (Ha Neul Lee et al.,
2014).
Elephantopus scaber i este o plantă de dimensiuni mici aparținând familiei
Compositae, fiind răspândită în zonele cu climat blând și cald. În practicile
medicale tradiționale, este adesea utilizată pentru tratamentul unui număr de boli.
Spre exemplu, în medicina tradițională chinezească, E. scaberi este utilizată ca

41
diuretic antife bril, antiviral și antibacterian, tratemntul hepatitelor, artritei
reumatice. Bronșitei, tusea asociată pneumoniei și atralgiei. În urma utilizării
extractelor etanolice din această plantă, a fost remarcată acti vitatea
imunosupresoare importantă a unui compus de interes, etilcafeatul. Mai mult
decât atât, etilcafeatul a suprimat în mod marcant producția de oxid nitric (NO),
(production and downregulated mRNA transcription of
iNOS,) scăderea transcripției ARNm a i NOS, lucru ce a condus la emiterea
ipotezei ce sugerează că aceste compus ar avea proprietăți antiinflamatorii utile
pentru tratarea diferitelor boli autoimune, cum este și maladia Alzheimer. (Shikui
Xu et al., 2017).
Etilcafeatul sau etil 3,4 dihidroxicin amatul a fost izolat și din petalele de Prunus
yedoensis, familia Rosaceae. Petalele uscate de P.yedoensis, cultivate în regiunea
Aomori din Japonia au fost supuse extracției cu n -hexan, cloroform și metanol
succesiv pentru a se obține compușii de interes.
Alți derivați ai acidului cafeic au fost izolați din specii înrudite cu cea prezentată
anterior. Dintre aceștia, amintim: 6 -O-cafeoil -D-glucopiranoz a izolată din Prunus
grayana, 1.6-di-O-dicafeoil -β-D-glucopiranozida izolată din florile de Prunus
serrula ta.
Existența etilcafeatului în extractul din petalele de Prunus serrulata a fost raportată
în studii anterioare, mai mult decât atât, acesta a fost considerat un artefact rezultat
în urma extracției cu etanolul drept solvent. În urma unor experimente simp le s-a
concluzionat că aceste compus este autentic și nu un artefact derivat din acidul
cafeic în amestec cu etanolul, cum s -a considerat inițial.(Toshiro Noshita et al.,
2006).

42
CAPITOLUL 3 .
MATERIAL E ȘI METODE DE CERCETARE
3.1. Materialul de cercetat
Experimentele din prezentul studiu s -au realizat pe 20 de șobolani albi, masculi,
rasa Wistar, care cântăreau 350 ± 10g la începutul experimentului.
Animalele au fost menținute la o temperatură de 22șC, umiditate de 50% și au avut
acces liber la a pă ad libitum și la hrană. Șobolanii au fost tratați în concordanță cu
normele instituționale privind efectuarea studiilor experimentale pe animale de
laborator și toate procedurile experimentale sunt în conformitate cu Directiva
Consiliului European din 2 4 noiembrie 1986 (86/609/EEC).
În vederea realizării studiului propus privind investigarea efectelor etilcafeatului
asupra statusului oxidativ din hipocampul unui model animal de demență au fost
utilizate metode standardizate pentru animalele de laborator .
3.2. Metode de cercetare
3.2.1. Administrarea substanțelor chimice
Animalele din prezentul studiu au fost împărțite în 4 loturi (5 animale/lot):
(1) Control – care a inhalat soluție salină 0,9% NaCl cu 1% Tween 80;
(2) Aβ1 -42 – care a inhalat soluție s alină 0,9% NaCL cu 1% Tween 80;
(3) Aβ1 -42 – la care s -a administrat etilcafeat (1 mg/kg)
(4) Aβ1 -42 – la care s -a administrat donepezil (5 mg/kg)
Modelul amiloidic de demență a fost indus prin injectarea stereotaxică
intracerebroventriculară (i.c.v.) a A β1-42 (Sigma -Aldrich, Germania). Pentru
obținerea suspensiei de Aβ1 -42, peptida Aβ1 -42 a fost dizolvată în ser fiziologic
steril (1 mM) într -un tub Eppendorf ce a fost ulterior sigilat și incubat la 37°C

43
timp de 4 zile. Utilizând seringa Hamilton, 4 µl de suspensie de Aβ1 -42 s-au
administrat în 4 minute (1µl/1 minut), seringa fiind menținută pentru încă 5
minute înainte de a fi îndepărtată lent. La animalele de control, în locul suspensiei
de Aβ1 -42 s-a administrat i.c.v. același volum de ser fiziologic ste ril. După
îndepărtarea seringii, a fost aplicat antibiotic pentru a fi evitate infecțiile, iar
incizia a fost închisă. Postoperator, animalele au fost cazate individual în cuști
până la vindecarea inciziilor, având acces liber la apă și mâncare. Animalele din
lotul de control și cu Aβ1 -42 au fost supuse acelorași condiții dar în absența
expunerii la carveol.

3.2.2. Recoltarea probelor
Animalele au fost sacrificate și s -a colectat hipocampul de la fiecare animal.
Fiecare probă de țesut nervos a fost cântărită și omogenizată (1:10) cu gheață, 0,1
M tampon fosfat de potasiu (pH 7,4) și 1,15% KCl. Omogenatele obținute au fost
centrifugate ( 15 minute la 960 x g) iar din supernatantul obținut s -au determinat
activitățile specifice ale acetilcolinesterazei (AChE), superoxid -dismutazei
(SOD), glutation -peroxidazei (GPX), precum și nivelul glutationului redus
(GSH), al proteinelor carbonilate și al malondialdehidei (MDA).

3.2.3. Determinarea activității AChE
Determinarea activității acetilcolinesterazei (AChE) s -a realizat în conformitate
cu metoda elaborată de Ellman et al. (1961) utilizându -se acetiltiocolina (ATC)
ca substrat artificial. Amestecul de reacție (volumul final de 600 µl) a fost format
din soluția de tampon fosfat 0,26 M cu pH 7,4, 1 mM acid 5,5' -ditio-bis-2-
nitrobenzoic (DTNB) și 5 mM ATC. Evaluarea s -a realizat cu a jutorul
spectofotometrului la 412 nm. Activitatea enzimei este exprimată în nmoli
ACT/min per/mg proteină.

44

3.2.4. Determinarea activității SOD
Determinarea activității superoxid dismutazei (SOD, EC 1.15.1.1) s -a realizat în
conformitate cu protocolul ela borat de Winterbourn et al., 1975. S -a monitorizat
capacitatea enzimei de a inhiba reducerea fotochimică a Nitro Blue Tetrazoliului
(NBT) în prezența radicalilor superoxid rezultați în mediul de reacție din procesul
de fotoreducere a riboflavinei. Fiecare reacție de amestec de 1,5 ml, conține Tris
100 mM / HCl (pH 7.8), NBT 75 mM, riboflavină 2μM , EDTA 6 mM și 200 μl
de supernatant. Monitorizarea creșterii absorbției la 560 nm, este urmată de
producerea albastrului formazan. O unitate de SOD este definită ca fiind cantitatea
necesară pentru a inhiba rata de NBT prin reducere de 50% (Winterbourn et al.,
1975 ). Activitatea enzimei este exprimată în unități/mg proteină.
3.2.5. Determinarea activității GPX
Activitatea glutation -peroxidazei (GPX, E.C. 1.11.1.9), a fost analizată printr -un
test de spectrofotometrie. Reacția de amestec constă dintr -un 1 ml de tampon
fosfat 0,4 M (pH 7,0) care conține EDTA 0,4 mM, 1 ml de NaN 3 5 mM, 1 ml de
GSH 4 mM și 200 μl de supernatant care a fost incubat la 37°C, timp de 5 minute.
Apoi, se adaugă 1 ml de 4 mM H 2O2 și se incubează la 37°C timp de 5 minute.
Excesul de GSH a fost cuantificat prin metoda DTNB descrisă de către Sharma
and Gupta (2002) . O unitate de GPX este definită ca fiind cantitatea de enzimă
necesară pentru a oxida 1nmol GSH / min. Activitatea enzimei este exprimată în
unități/mg proteină.
3.2.6. Determinarea conținutului total de GSH redus
Glutationul (GSH) s -a determinat pe baza metodei descrisă de Fukuzawa and
Tokumura (1976) . Astfel, s -au amestecat 200 μl supernatant cu 1,1 ml tampon
fosfat de sodiu 0,25 M (pH 7,4) și 130 μl DNTB 0,04%. În final, amestecul a fost
adus la un volum de 1,5 ml cu apă distilată iar absorbanța s -a citit la

45
spectofotometru la 412 nm. Conținutul total de GSH redus a fost exprimat în μg
GSH/μg proteină.
3.2.7. Determinarea nivelului proteinelor carbonilate
Gradul de oxidare al proteinelor din hipocamp a fost evaluat prin determinarea
nivelului de grupări carbonil pe baza metodelor descrise de Oliver et al. (1987) și
Luo and Wehr (2009) . Supernatantul a fost împărțit în două probe care conțin
fiecare aproximativ 2 mg de proteină. În ambele probe s-a produs precipitarea
proteinelor prin adăugare de acid tricloracetic 10% (w/v, concentrația finală). Una
din probe a fost tratată cu HCl 2N iar cealaltă probă cu DNPH 0,2% (w/v) în HCl
2N. ambele probe au fost incubate la 25șC și agitate la intervale d e 5 minute.
Probele au fost precipitate din nou cu acid tricloracetic 10% (w/v, concentrația
finală) și extrase cu etanol -acetat de etil (1:1, v/v) și apoi precipitate cu acid
tricloracetic 10%. Ulterior au fost dizolvate în uree 8M cu tampon fosfat de sod iu
20 mM, pH 6,5. Resturile celulare insolubile au fost îndepărtate prin centrifugare
la 13000 x g la 4șC. Absorbanța s -a citit la spectofotometru la 370 nm comparând
problele tratate cu DNPH cu cele cu HCl (control). Rezultatele sunt exprimate în
nmoli DN PH/mg proteină.
3.2.8. Determinarea nivelului MDA
Malondialdehida (MDA) este un indicator al peroxidării lipidelor și a fost
măsurată spectrofotometric cu ajutorul testului de acid tiobarbituric Ohkawa et al.
(1979) . Se adaugă 200 μl de supernatant care se amestecă cu 1 ml de acid
tricloracetic 50% în HCl 0,1M și 1ml de acid tiobarbituric 26 mM. După
vortexare, probele au fost menținute la 95°C timp de 20 de minute.
Ulterior, probele au fost centrifugate la 960 x g, timp de 10 minute iar
supernatanții au fost citiți la 532 nm. S -a construit apoi curba de etalonare și
rezultatele au fost exprimate în nmol/mg proteină.

46
3.2.9. Determinarea concent rației proteinelor
S-a utilizat metoda BCA (acid bicinconinic) descrisă de Smith et al. (1985) .
3.2.10. Calculul statistic al datelor experimentale
Aplicând metodele statisticii matematice se poate calcula o valoare cât mai
apropiată de cea reală și se poate estima și gradul de certitudine al respectivelor
rezultate, deoarece este greu ca în practică să se facă un număr foarte mare de
determinări .
Utilizarea statisticii matematice în investigațiile experimentale este
indispensabilă, deoarece compararea gradului de corelare și es timare a
fenomenelor necesită etaloane precise.
Pentru prelucrarea statistică a datelor am aplicat testul „t” al lui Student . Au fost
calculate:
-media aritmetică (M)
-eroarea standard a mediei (E.S.M.)
Media aritmetică
Reprezintă raportul dintre suma tuturor valorilor individuale și numărul total al
valorilor individuale (n) ale probelor.

unde:
xi – valorile individuale,
n – numărul total al valorilor individuale.
Eroarea standard
nxi
Mn
i
==1

47
Deoarece media aritmetică nu scoate în evidență dispersia valorilor individuale în
jurul valorii medii, precum și granițele de variație a șirului statistic, se impune
calcularea acestui indice de dispersie, care este eroarea standard (Es).

unde σ reprezintă abaterea standard și se calculează după formula standard:

unde:
d21 reprezintă pătratul diferențelor dintre media aritmetică și valorile individuale;
n = numărul de determinări
nEs=
12
1
−=
nd

48
CAPITOLUL 4

REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1. REZULTATE

4.1.1. Evidențierea efectelor administrării etilcafeatului asupra activităților
specifice ale SOD și GPX

Analizele biochimice din omogenatele de hipocamp au evidențiat că
administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) a determinat creșterea semnificativă a
activi tăților specifice ale SOD (p<0,001) (Fig. 1) și GPX (p<0,01) (Fig. 2) în loturile
tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu loturile de control negativ tratate doar cu Aβ1 -42.
În contrast, Aβ1 -42 a manifestat efecte prooxidante puternice, caracterizate prin
diminuar ea activităților specifice ale SOD și GPX din omogenatele de hipocamp ale
șobolanilor Wistar. Donepezilul a fost utilizat ca martor pozitiv manifestând efecte
asemănătoare lotului de control.

49

Fig. 1. Variațiile activității specifice a SOD în urma admi nistrării etilcafeatului
(1 mg/kg) la loturile tratate Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42. Valorile
sunt medii ± ESM, n=5 animale/lot, ##p<0,001 vs. Aβ1 -42.

Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil0.00.51.01.5SODU/mg proteină##

50

Fig. 2. Variațiile activității specifice a GPX în administrării etilcafeatului (1
mg/kg) la loturile tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42.
Valorile sunt medii ± ESM, n=5 animale/lot, #p<0,01 vs. Aβ1 -42.

4.1.2. Efectul administrării etilcafeatului asupra conținutului total de GSH redus
și a nivelului proteinelor carbonilate și MDA

Rezultatele experimentale obținute prin analiza biochimică a omogenatelor de
hipocamp au evidențiat că administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) a determinat
creșterea semnificativă a conținutului total de GSH redus (p<0,001) (Fig. 3),
concomitent cu scăderea semnificativă a nivelului de proteine carbonilate (p<0,0001)
(Fig. 4) și a nivelului MDA (p<0,0001) (Fig. 5) în loturile tratate cu Aβ1 -42
Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil051015GPXU/mg proteină#

51
comparativ cu loturile de control negativ tratate doar cu Aβ1 -42. În contrast, efectul
prooxidant al Aβ1 -42 s-a mani festat prin diminuarea semnificativă a conținutului
total de GSH redus și prin creșterea semnificativă a nivelului proteinelor carbonilate
și a MDA în omogenatele hipocampilor șobolanilor de laborator. Donepezilul a fost
utilizat ca martor pozitiv manifest ând efecte asemănătoare lotului de control.

Fig. 3. Variațiile conținutului total de GSH redus în administrării etilcafeatului
(1 mg/kg) la loturile tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42.
Valorile sunt medii ± ESM, n=5 animale/lot, ## p<0,001 vs. Aβ1 -42.

Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil05101520GSHGSH/g proteină##

52

Fig. 4. Variațiile nivelului de proteine carbonilate în administrării etilcafeatului
(1 mg/kg) la loturile tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42.
Valorile sunt medii ± ESM, n=5 animale/lot, ###p<0,0001 vs. Aβ1 -42.

Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil051015Proteine carbonilatenmol/mg proteină###

53

Fig. 5. Variații le nivelului de MDA în urma administrării etilcafeatului (1 mg/kg)
la loturile tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42. Valorile sunt
medii ± ESM, n=5 animale/lot, ###p<0,0001 vs. Aβ1 -42.

4.1.3. Efectul administrării etilcafeatului asupra activității specifice a
acetilcolinesterazei

Analizele biochimice efectuate pe omogenatele de hipocamp ale șobolanilor
tratați cu Aβ1-42 l-a care s -a administrat etilcafeat (1 mg/kg) au evidențiat existența
unei scăderi semnificative a activității AChE ( p<0,01) la loturile tratate cu etilcafeat
comparativ cu loturile de control negativ tratate doar cu Aβ1-42 (Fig. 6). De
asemenea, administrarea Aβ1-42 a determinat o creștere semnificativă a activității
Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil05101520MDAnmol/mg proteină###

54
specifice a AChE co mparativ cu lotul de control, sugerându -se efecte prooxidante.
Donepezilul a fost utilizat ca martor pozitiv manifestând efecte asemănătoare lotului
de control.

Fig. 6. Variațiile activității specifice a AChE în urma administrării etilcafeatului
(1 mg/kg) la loturile tratate cu Aβ1 -42 comparativ cu lotul tratat cu Aβ1-42.
Valorile sunt medii ± ESM, n=5 animale/lot, #p<0,01 vs. Aβ1 -42.

4.2. Discuții
Numeroase date experimentale sugerează faptul că stresul oxidativ și stresul
nitrosativ joacă un rol important în patologia bolii Alzheimer (AD) (Butterfield et
al., 2010 ). Stresul oxidativ se declanșează în stadiile inițiale ale bolii AD, sugerându –
se astfel rolul său în patogeneza bolii AD (Wang et al., 2014 ), în strânsă corelație cu
Control
A1-42
A1-42+etilcafeat (1mg/kg)
A1-42+Donepezil020406080AChEnmol/min/mg proteină#

55
prezența Aβ. Într -adevăr, au fost raportate nivele crescute de Aβ1 -40 și Aβ1 -42 care
sunt asociate cu nivele crescute ale produșilor de oxidare ai lipidelor, proteinelor și
acizilor nucleici la nivelul hipocampului și cortexului pacienților cu AD (Butterfield
and Lauderback, 2002 ). În contrast, regiuni ale creierului cu nivele scăzute de Aβ (de
exemplu, cerebelul), nu prezintă concentrații ridicate ale markerilor stresului
oxidativ (Sultana et al., 2006 ). Recent s -a confirmat că oxidări ale proteinelor și
lipidelor au fost observate în acele regiuni din creier bogate în Aβ, unde pe baza
proteomicii redox s -au putut identifica proteinele oxidate în stadiile inițiale ale bolii
AD (Butterfield, 2014 ). În creierul pacienților cu AD, biomarkerii stresului oxidativ
sunt următorii: proteinele carbonilate și produ șii de peroxidarea ai lipidelor, în
special în hipocamp și cortexul parietal, precum și produșii de oxidare ai ADN
mitocondrial în lobii frontal, temporal și parietal (Cheignon et al., 2018 ).
Jiao-Ning et al . (2015) au demonstrat faptul că etilcafeatul exercită efecte
neuroprotective împotriva degradărilor induse de peroxidul de hidrogen și
lipopolizaharide prin intermediul modulării căii acidului arahidonic și a kinazei p38 –
MAPK, fiind considerat un agent terapeutic ce poate fi utilizat pentru prevenția și
tratarea bolilor neurodegenerative ce implică stresul oxidativ și inflamația. Lira et al.
(2018) au demonstrat că izopropilcafeatul manifestă potențial antioxidant, fiind
capabil să prevină prod ucerea radicalilor liberi și a stresului oxidativ.
În concordanță cu studiile anterior, datele obținute în prezentul studiu au
demonstrat clar potențialul antioxidant al etilcafeatului evidențiat prin intensificarea
activității enzimelor antioxidante prec um SOD și GPX. De asemenea, profilul
antioxidant al etilcafeatului a fost confirmat și prin creșterea conținutului total de
GSH redus precum și scăderea nivelurilor de proteine carbonilate și MDA la
animalele tratate cu Aβ.

56
CONCLUZII

Având în vedere rezultatele acestui studiu în concluzie afirmăm că:

1. Administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) la animalele tratate cu Aβ1 -42 a
determinat creșterea semnificativă a activităților specifice a SOD, și GPX
în omogenatele de hipocamp.
2. Administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) la animalele tratate cu Aβ1 -42 a
determinat creșterea semnificativă a conținutului total de GSH redus din
omogenatele de hipocamp.
3. Administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) la animalele tratate cu Aβ1 -42 a
determinat scăd erea semnificativă a nivelului proteinelor carbonilate și
MDA din omogenatele de hipocamp.
4. Administrarea etilcafeatului (1 mg/kg) la animalele tratate cu Aβ1 -42
poate reface statusul antioxidant al creierului și poate induce efecte
neuroprotective prin dim inuarea stresului oxidativ indus de Aβ1 -42. De
aceea, etilcafeatul poate fi utilizat pentru ameliorarea stresului oxidativ
asociat cu boala Alzheimer.