Donisă Andreea -Mădălina [602176]

3

UNIVERSITATEA “ ALEXANDRU IOAN CUZA ” IAȘI
FACULTATEA DE CHIMIE
SPECIALIZAREA CHIMIA ȘI BIOCHIMIA
HETEROCICLURILOR

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator Științific:
Lector dr. Robert -Vasile Grădinaru

Masterand: [anonimizat]
2015

4
UNIVERSITATEA “ ALEXANDRU IOAN CUZA” IAȘI
FACULTATEA DE CHIMIE
SPECIALIZAREA CHIMIA ȘI BIOCHIMIA
HETEROCICLURILOR

LUCRARE DE DISERTAȚIE

SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA
OCTAPEPTIDELOR DE TIP AMILOIDIC

Coordonator Științific :
Lector dr. Robert -Vasile Grădinaru

Masterand: [anonimizat]
2015

5
CUPRINS

INTRODUCERE ……………………………………………………………………………………………………….3
CAP.I. PARTEA TEORETICĂ ………………………………………………………………………………5
I. Generalități…… …………………………………………………………………………………………………………….. 5
I.1. Definiție și structură …………………………………………………………………………………………5
I.1.1. Caracteristicile legăturii peptidice …………………………………………………………6
I.2. Clasificarea peptidelor ………… ……………………………………………………………………………6
I.3. Structura primară a peptidelor ……………………………………………………………………………7
I.4. Structura secundară a peptidelor ………………………………………………………………………..7
I.4.1. Modelul α -helicoidal …………………………………………………………………………..7
I.4.2. Modelul straturilor β -pliate ……………………. …………………………………………….8
I.5. Structura terțiară și cuaternară ……………………………………………………………………………9
I.6. Metode de sintez ă a peptidelor …………………………………………………………………………10
I.6.1. Sinteza peptidelor în fază solidă ( Merrifield )………………………………………..12
I.6.2. Sinteza peptidelor în fază lichidă………………….. …………………………………….12
I.7. Strategii utilizate în sinteza de peptide în fază solidă …………………………………………..12
I.7.1. Strategia Fmoc ……………………………………………………………….. ………………..12
I.7.2. Strategia Boc …………………………………………………………………………………….14
I.8. Suporturi macromoleculare utilizate în sinteza de peptide în fază solidă ……………….15
I.9. Purifica rea proteinelor …………………………………………………………………………………….16
I.9.1. Cromatografia de lichid e de înaltă performanță…………………………………….16
I.10. Metode utilizate în caracterizarea peptidelor …………………………………………………….17
I.10.1. Spectrometria de masă de tip electrospray (ESI) ………………………………….17
I.10.2. Spectrofotometria UV -VIZ………………………………………….. …………………..18
I.10.3. Spectroscopia de fluorescen ță…………………………………………………………..19
CAP.II. PARTEA EXPERIMENTALĂ ……………………………………………………………….21
II.1. Materiale de cercetare ……………………………………………………………………………………21
II.1.1. Reactivi chimici și materiale ……………………………………………………………..21
II.2. Sinteza manuală a peptidei Aβ(9 -16)……………………………………………………………….22
II.3. Sinteza manual ă a peptidei Aβ (9-16-Phe)………………………………………………………..24

6

CAP.III. REZULTATE ȘI DISCUȚII ………………………………………………………………….26
III.1. Caracterizarea peptidei native Aβ (9 -16) prin spectrometrie de masă ………………….26
III.2. Separarea, purificarea și caracterizarea peptidei native Aβ (9 -16) prin cromatografie
de înaltă performanță (HPLC) ………………………………………………………………………………………….26
III.3. Separarea, purificarea și caracterizarea peptidei mutante prin HPLC. …………………31
III.4. Determinarea teoretică a caracterului hidrofil -hidrofob al peptidelor investigate ….34
III.4.1. Determinarea caracterului hidrofil -hidrofob cu ajutorul aplicației Peptide
2.0…………………………………………………………………………………………………………….. …………………. 34
III.4.2. Determinarea caracterului hidrofil -hidrofob cu ajutorul programului
GPMAW…………………. ……………………………………………………………………………………………………35
III.5. Investigarea peptidelor prin spectroscopie UV -VIZ………………………………………….35
III.6. Studiul fluorescenței peptidei native Aβ (9 -16)………………………………………………..36
CONCLUZII …………………………………………………………………………………………………………….. 38
BIBLIOGRAFIE ………………………………………………………………………………………………………40

7
INTRODUCERE
Cercetările privind compoziția chimică și structura moleculelor proteice, precum și
impor tanța legă turilor peptidice ce unesc aminoacizii din aceste macromolecule complexe cu
importanță biologică s -au dezvoltat foarte mult în seco lul al XX -lea. În ultimele decenii de o
atenție deosebită s -au bucurat studiile privind proprietățile peptidelor de sinteză și ale peptidelor
naturale.
Peptidele sunt subst anțe chimice cu structură macromoleculară care se găsesc în toate
celulele vii, unde îndeplinesc funcții biologice fundamentale: enzimatice, hormonale sau
imunologice.
De exemplu, principala caracteristică neuropatologică a bolii Alzheimer (AD), o
reprezintă depozitele extracelulare de fibrile de peptid ă β-amiloidică. Aβ este o peptid ă format ă
din 40 -42 aminoacizi derivați din clivajul proteolitic al proteinei precursoare amiloidului (APP).
Peptida Aβ este generată prin acțiunea succesi vă a β și γ secretazelor.
Se disting două metode principale de sinteză a peptidelor, și anume: sinteza în fază
lichidă și sinteza peptidelor în fază solidă cu metoda elaborată de Merrifield . Ultima stra tegie
este mai frecvent folosită în ultimele decenii datorită obținerii unor cantități mai mari de peptidă
a cărei puritate este net superioară .
Sinteza peptidelor este importantă pe de o parte p entru verificarea structurii acestora ce
poate fi determinată prin analiza secvențială, și pe de altă part e, permite obținerea unor peptide
sau proteine care au roluri important e în organism . Sinteza peptidelor se poate realiza pornind de
la aminoacizi naturali, caracterizarea peptidelor putând fi realizată cu ajutorul tehnicilor
spectrometrice de masă, spectroscopice FT -IR, HPLC sau RMN.
Merrif ield a fost primul care a aplicat conceptul de sinteză în fază solidă asupra unor
peptide, obținând pentru ace asta premiul Nobel în 1984. Metoda și aparatul imaginate de
Merrifield au fost utilizate pentru sinteza în fază solidă a bradikininei (peptidă ce provoacă
dilatarea vaselor de sânge) , a catenelor A și B ale insulinei (hormon ce participă la metabolismul
glucidelor) , având avantajul unor randamente de peste 80 % ș i scurtarea timpului de reacție .
În 1963, Merrifield a folosit pentru prima datã termenul de sinteză de peptide în fazã
solid ă, când a descris prepararea unei tetrapeptide ( Leu-Ala-Gly-Val) pe un polimer insolubil pe
toată durata sintezei. În acea perioadă , rășinile nu aveau spațiatori pentru legarea aminoacizilor
și, în consec ință, nu se puteau sintetiza peptide cu mai mult de 4 resturi de aminoacizi.

8
Sinteza peptidelor în faz ă solidă poate fi defini tă ca fiind un proces în care peptida este
construită prin adă ugarea succesivă a aminoacizilor cu gr upări protejate care vor constitui
secvența dorită, în timp ce capătul său C -terminal este legat pe un polimer insolubil.
De altfel, p rima dipeptidă a fost obținută de Emil Fischer la începutul secolului XX, în
fază lichidă, prin blocarea grupării carboxil a unuia dintre aminoacizi și a grupării amino a
celuilalt aminoacid, etapă urmată de activarea carboxilului liber și formarea legături i peptidice.
În final, cele două grupări protectoare au fost îndepărtate pentru a se obține dipeptida liberă.
În anul 1969, Hirschman a folosit metoda sintezei în fază solidă utilizând un aparat
automat, reu șind să sintetizeze ribonucleaza , o enzimă din pancreasul bovin, care posedă în
structura primară o secvență de 124 de resturi de aminoacizi .
În prezent, din punct de vedere practic , se preferă numai sinteza în fază solidă, când se
aplică una dintre variantele sale moderne, care presupune utilizarea unor rășini cu capacitate de
legare ridicată, a unor agenți de activare și clivare mai eficienți. Sinteza peptidelor poate avea loc
atât manual, cât și automat, pentru economisirea timpului în producerea peptidelor cu catena mai
lungă.
Pentru a evita formarea unor peptide nedorite, cu unul sau mai mulț i aminoacizi lipsă ,
care reprezintă impurități greu de îndepă rtat la purificare a peptidei, se recurge de obicei la dubla
cuplare a fiecă rui aminoaci d în parte (“double coupling”). Sinteza unor peptide mic i, de înaltă
puritate, poate fi realizată și manual, cu mijl oace tehnice relativ modeste și într-un interval de
timp acceptabil.
Studiul de față prezintă sinteza, purificarea ș i caracterizarea prin diferite metode
spectrometrice și spectoscopice a două octapeptide derivate d e la polipeptida beta amiloidică 1 –
42, care a fost asociată cu unele manifestări patologice î n cadrul bolii Alz heimer .

9
CAPITOLUL I
PARTEA TEORETICĂ

I. Generalități
I.1. Defi niție și structură
Peptidele sunt combinații de tip amidic rezultate prin condensarea a două sau mai multor
molecule de aminoacizi. Din punct de vedere teoretic , legătura peptidică este rezultatul eliminării
apei între o grupare aminică și o grupare carboxilică a unor aminoa cizi diferiți.
Practic, această cuplare presupune activarea grupă rii car boxilice a unui aminoacid , acesta
din urmă având capacitatea de a „polimeriza” pentru a forma lanțuri peptidice. Simplificat, a cest
proces poate fi reprezentat ca o reacție de condensare (Schema 1).

Schema 1. Formarea legăturii peptidice între doi aminoacizi

Peptidele naturale sunt sintetizate de microorganisme, plante și animale și îndeplinesc
diferite roluri în celulele și organismele vii:

10
• Componente structurale ale țesuturilor;
• Transportori de electroni;
• Antibiotice sau inhibitori naturali ai enzimelor.

I.1.1. Caracteristicile legăturii peptidice
Legătura peptidică -CO–NH- are în componență un atom de carbon hibridizat sp2 și un
atom de azot hibridizat sp3.
Datorită conjugării interne dintre perechea de electroni neparticipanți ai azo tului și
perechea de electroni π ai legăturii duble C = O, rotația liberă în jurul legăturii -CO – NH- este
restricționată , legătura amidică fiind plană (atomii de oxigen, carbon, azot și hidrogen sunt într –
un plan, conformația cea mai stabilă este cea în care atomul de oxigen (din legă tura C=O) și
atomul de hidrogen (din le gătura N -H) sunt în poziție opusă față de legătura C – N (conformație
-trans) (Figura 1 ).

Figura 1 . Conformația trans a peptidelor
https://www3.nd.edu/~aseriann/ctpep.html

I.2. Clasificarea peptidelor
Peptidele pot rezulta din două, trei sau "n" molecule de aminoacizi. Pentru sistematizarea
acestor compuși, conve nțional, ei se clasifică în patru clase:
 peptide (oligopeptide) – compuși formați dintr -un nu măr relativ mic de α -aminoacizi (2 –
10 resturi de aminoacizi;
 polipeptide – compuși formați dintr -un număr mai mare de α -aminoacizi (11-50 resturi de
aminoacizi) , dar cu masa moleculară mai mică de 10000 Da;

11
 proteine – compuși cu masa moleculară mai mare de 10000 Da (peste 50 de resturi de
aminoacizi) ;
 heteroproteide – compuși care pe lângă un lanț proteic, mai conțin și o grupare neproteică
numită grupare prostetică.
Glutationul, hormonii peptidici, carnozina sunt exemple de peptide sintetizate în mediul
viu. Câteva dintre aceste peptide simple (di -, tri-oligopeptide) s unt prezentate mai jos (Schema
2).

Schema 2 . Exemple de oligopeptide prezente în organismele vii

I.3. Structura primară a peptidelor
Structura primară a unei peptide este determinată de natura și succesiunea aminoacizilor
în catena polipeptidică.
Aminoacizii pot fi legați prin legături peptidice care împreună cu atomii de carbon din
poziț ia α formează catena principală a peptidei.
Atunci când un grup de aminoacizi este legat prin legături peptidice într -o matrice liniară,
ea este menționată ca o polipeptidă. Această secvență liniară de aminoacizi este numită structura
primară conformațională a moleculelor de polipeptide.

I.4. Structura secundară
Structura secundară se referă la forma și la lungimea lanțurilor polipeptidice, proprietăți
induse de legăturile de hidrogen care apar între aceste lanțuri . Cele mai întâlnite tipuri de
structură secundară sunt α – helixul și lanțurile β .

I.4.1. Modelul α -helicoidal
Structura α -helix este un aranjament rigid al catenei polipeptidice, care prezintă simultan
unghiuri conformaționale permisive și numărul maxim de legături de hidrogen înt re unitățile
peptidice (Figura 2 ). A fost descoperită de Pauling în 1951.

12

Figura 2 . Reprezentarea schematică a modelului α-helicoidal
http://ro.wikipedia.org/wiki/Fi%C8%99ier:Alfa_helix.PNG

Catenele laterale R ale aminoacizilor sunt orientate spre exteriorul cilindrului delimitat de
α-helix, pentru a evita împiedicările sterice rezultate în urma interacției cu scheletul catenei
polipeptidice.
Aminoacizii care preferă să adopte conformația he lixului proteic fac parte din așa numita
serie MALEK (codurile formate din o literă a aminoacizilor: metionină, alanină, leucină, acid
glutamic și lizina ). În contrast, aminoaciz ii aromatici (triptofanul, tiroz ina și fenilalanina, dar și
alți aminoacizi (izoleucina, valina și treonina ), adoptă configurația β.
Resturile de pro lină, hidroxiprolină și glicină prezente în structura primară a proteinelor
tind să confere catenei polipeptidice o altă conformație decât cea de α -helix, denumită β
“întoarsă ” sau modelul straturilor pliate.

I.4.2. Modelul straturilor pliate
Acest element de structură secundară (numit β pentru că a fost descoperit după α -helix)
este stabilizat prin legături de hidrogen ce se formează între lanțuri polipeptidic e învecinate. În
conformația β, legăturile de hi drogen se pot forma intra – sau intercatenar . Structura β pliată poate
exista în două variante:

 antiparalelă , în care lanțurile polipeptidice învecinate au polaritate opusă, iar legăturile
de hidrogen formate sunt paralele;

13
 paralelă , în care c atenele sunt orientate în aceea și direcție, iar punțile de hidrogen sunt
mai slabe (Schema 3).

Schema 3 . Reprezentarea schematică a modelului straturilor β -pliate

Structura β pliată antiparalelă apare în proteine fibrilare de tipul fibroinei, care este o β
keratină, produsă de viermele de mătase.

I.5. Structura terțiară și cuaternară
Structura terțiară este nivelul de organizare structurală ce indică rezultatul interacțiunilor
dintr e resturile aminoacizilor din cate nele polipeptidice (R) (Figura 3), iar ca urmare a acestor
interacțiuni apar: legături de hidrogen, l egături ionice , forțe van der Waals .

14

Figura 3 . Structura terțiară a unei subunități aparținând adenozintrifosfatazei din
Escherichia coli
http://ro.wikipedia.org/wiki/Protein%C4%83

În ceea ce privește structura cuaternară, aceasta reprezin tă nivelul cel mai înalt de
organizare a proteinelor și este rezultatul interacțiunii dintre catenele polipeptidice independente
care au structuri primare, secundare și terțiare bine definite (Figura 4).

Figura 4 . Structura cuaternară a hemoglobinei
http://ro.wikipedia.org/wiki/Protein%C4%83

I.6. Metode de sinteză a peptidelor
Emil Fisher a sintetizat peptide prin acilarea grupei -NH 2 a unui aminoacid, cu grupa –
COOH a altui aminoacid .
La dipeptida rezultată a atașat, un al treilea aminoacid și așa mai departe, construind pas
cu pas peptide cu numărul dorit de resturi de aminoacizi.

15
Etapele sintezei de peptide au fost următoarele:
• Blocarea grupării amino cu ajutorul unei grupări protectoare;
• Activarea aminoacidului;
• Formarea legăturii peptidice;
• Îndepărtarea grupării protectoare.

În literatură, este descris un număr considerabil de combinații de grup e protectoare ale
aminoacizilor, în prezent, folosindu -se cel mai des doar două astfel de combinații. Prima
combinație este t-butiloxicarbonil/benzil (Boc/Bzl ) (Schema 4 ), fiind introdusă de Merrifield în
anul 1963.

Schema 4 . Combinația de grupe protectoare Boc /Bzl folosită în sinteza peptidelor în fază
solidă

Cea de -a doua, sistemul fluorenilmetiloxicarbonil/ t-butil (Fmoc/ t-Bu) (Schema 5 ), a fost
dezvoltat de Sheppard și colaboratorii săi.

Schema 5 . Combinația de grupe protectoare Fmoc/ tBu

16
I.6.1. Sinteza peptidelor în fază solidă ( Merrifield )
Sinteza în fază solidă a fost elaborată de Merrifield și se bazează pe efectuarea reacțiilor
de condensare și deprotejare repetată într -un sistem bifazic, solid – lichid, în care substratul (un
aminoacid N -protejat sau o peptidă N -protejată) este în fază solidă și reactanții s unt în fază
lichidă (soluție).

Etapele sintezei de peptide în fază solidă sunt:
 Atașarea covalentă a primului aminoacid amino -protejat la suportul poli meric solid;
 Deprotecția grupei aminice a primului aminoacid atașat;
 Cuplarea următorului aminoacid amino -protejat;
 Scindarea peptidei de pe suportul solid, precum și deprotecția tuturor grupelor protectoare
ale catenelor laterale ale resturilor de aminoacizi, la sfârșitul procesului de sinteză.

Desprinderea polipepti dei de pe polimer se poate realiza prin tratare cu TFA (acid
trifluoroacetic) care nu scindează legăturile peptidice.
Prin această metodă s -au sintetizat, cu rezultate bune, insulina și unii hormoni hipofizari
(hormonu l adenocorti cotrop, hormonu l de cre ștere, prolactina).

I.6.2. Sinteza peptidelor în fază lichidă
Sinteza de peptide în fază lichidă presupune următoarele etape: protejarea, activarea,
cuplarea și deprotejarea selectivă, fiind folosită pe ntru sinteza unor secvențe mici.
Dezavantajul sintezei peptidelor în fază lichidă constă în probleme legate de solubilitate
(peptidele mai lungi nu sunt foarte solubile în solvenți organici), dar și referit oare la sinteză și
purificare care sunt laborioa se și de lungă durată .

I.7. Strategii utilizate în sinteza de peptide în fază solidă
I.7.1. Strategia Fmoc
Primul aminoacid care este legat de rășină este deprotejat cu piperidină de gruparea
Fmoc , iar al doilea aminoacid este activat cu PyBOP (hexafluorofosfat de benzotrizol -1-il-N-oxi-
tris(pirolidino) -fosfoniu sau alt agent de cuplare cum ar fi 2-(1H-benzotriazol -1-il)-1,1,3,3 –
tetrametiluroniu hexaf luorofosfa t (HBTU) (Schema 6) .
PyBOP conține pirolidină în locul dimetilaminei astfel încât nu formează produși
secundari toxici.

17

Schema 6. (1) – Structura reactivului PyBOP ; (2) – Structura activatorului HBTU

Ciclul de deprotejare și cuplare se repetă până se obține secvența dorită, apoi se
realizează deprotecția finală și clivarea de pe rășină cu aci d trif luoroacetic -TFA (Schema 7 ).
Protecția Fmoc este frecvent utilizat ă, dar are dezavantajul unor costuri relativ mari
comparativ cu reactivul Boc .

18

Schema 7. Mecanismul de sinteză în fază solidă prin metoda Fmoc

I.7.2. Strategia Boc
Metoda Boc a fost aproape abandonată în ultimii ani, deoarece HF este extrem de toxic și
necesită echipament de laborator foarte scump, iar tratamentele repetate cu HF pe parcursul
deprotecției pot conduce la alterarea legăturilor peptidice, care sunt foarte sensibile.

19
Dezavantajul acestei metode constă în faptul că ciclul de sint eză durează mult timp, iar
cantitatea de solvent este mai mare.

I.8. Suporturi macromoleculare utilizate în sinteza de peptide în fază solidă
Suportul solid este de obicei un polimer cu o grupare reactivă de care se poate lega
primul aminoacid din secvența peptidei care urmează să fie sintetizată. De cele mai multe ori
polimerul solid reacționează în fază solidă în special prin intermediul grup ărilor funcționale
localizate în interiorul particulelor acestuia.

Caracteristicile unui suport solid eficient sunt următoarele:
 Trebuie să se prezinte sub formă de granule, care să permită manipularea ușoară și
filtrarea rapidă din lichide;
 Trebuie să fie inert față de toți reactivii și solvenții folosiți în timpul sintezei;
 Trebuie să aibă o capacitate mare de umflare în solvenții utilizați în sinteze, permițând
astfel accesul rapid al tuturor reactivilor în particula de polimer.

În vederea obținerii pe ptidelor în formă amidică, este necesară introducerea funcțiunii
aminice de care se va lega capătul C -terminal și care prezintă o structură electronic ă ce
favorizează clivarea peptide i ca amidă, prin tratare la finalul sintezei cu acid.
Astfel, în această categorie intră r ășina amidică Rink (rășină aminometilică
funcționalizată cu Fmoc -2,4-dimetoxi -4’-(carboxi-metiloxi) -benzhidrilamină(Schema 8 ).

Schema 8. Rășina Rink Amide

Sinteza în faza solidă poate fi automatizată, folosind sisteme automate de sinteză, î n felul
acesta se pot obține peptide care pot conține până la 50 de aminoacizi. Avantajele sintezei în fază
solidă sunt:

20
 Toate reacțiile se realizează într -un singur vas, ceea ce simplifică și accelerează sinteza;
 Se evită pierderile mari de produși de reacție, care în mod normal, se înregistrează pe
parcursul izolării și purificării intermediarilor la sinteza în fază lichidă;
 Se pot folosi reactivii în exces pentru obținer ea unor randamente mari în produsul finit;
 Favorizează dizolvarea și împiedică agregarea intermediarilor;
 În funcție de grupele protectoare există două strategii de lucru: Boc și Fmoc.

I.9. Purificarea peptidelor
Hidrofilicitatea și hidrofobicitatea devin factori esențiali în sepa rarea peptide lor. Astfel,
cromatografia de lichide de înaltă performanță în fază inversă este cea mai utilizată metodă
pentru separa rea și purificarea peptidelor.

I.9.1. Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)
Această tehnică presupune utilizarea unui gradient liniar, apă: TFA (0,1%) / TFA:
acetonitril la pH 2,0 și temperatura camerei. Semnalul peptidei poate fi optimizat prin
modificarea gradientului concentrației acetonitrilului, 0,5 -2,0% ACN/min, iar utilizar ea TFA
(volatil) în amestecul de solvenți elimină necesitatea de îndepărtare ulterioară a eventualelor
săruri.
Acidul trifluoroacetic este eficient în separarea amestecurilor complexe de peptide,
datorită proprietăților sale de a forma asociații ionice. Peptidele sunt încărc ate electric pe un
domeniu larg de pH, iar prezența diferiților contraioni vor influența co mportamentul lor
cromatografic. Astfel, contraionii anionici, trifluoroacetat, fosfat vor interacționa cu resturile
peptidice protonate (încărca te pozitiv).
Suporturile HPLC cele mai eficiente în separarea peptidelor sunt cele pe bază de silice,
conținând grupări funcționale de tipul octil C 8 sau octadecil C 18, legate covalent. Peptidele sunt
eluate de pe faza staționară hidrofobă de silice (supo rt) în ordinea creșterii hidrofobicității.
Pentru purificarea, id entificarea și stabilirea purit ății peptidei sintetizate s -a utilizat un
cromatograf de lichid de înaltă performanțã, HPLC, având o coloan ă cromatografică tip
Spherisorb (ODS) C 18 (Schema 9).

21

Schema 9. Diagrama simplificată a unui cromatograf de lichide

1. S1, S2- rezervoare cu solvent organic / soluție tampon diluată;
2. P1, P2- pompe ce permit stabilirea unui gradient de concentra ție;
3. M- manometru pentru m ăsurarea presiunii ;
4. V- valvă prin intermediul căreia se face injectarea probei ;
5. C- coloana cromatografic ă;
6. D- detector (m ăsoară absorbanța la una sau mai multe lungimi de undă) ;
7. A- sistem de achizi ție a datelor.

I.10. Metode utilizate în caracterizarea peptidelor

I.10.1. Spectrometria de masă de tip electrospray (ESI)
Spectometria de masă este o metodă de investigare cu aplicații largi în domeniul chimiei
analitice, cum ar fi:

 Determinarea maselor atomice și moleculare ;
 Identificarea compu șilor organici ;
 Compozi ția izotopică a elementelor.

Ionizarea de tip electrospray are la baz ă următoarele etape :

 Un flux de lichid conținând moleculele analitului de interes este amestecat cu azot și
forțat să treacă printr -un tub capilar din oțel inoxidabil menținut la un pot ențial de 3 -4
kV. Se formează astfel un con de detenție (cunoscut sub denumirea de con Taylor)
conținând picături de lichid suspendate în fază gazoasă.

22
 În contra curent se va aplica un flux de azot încălzit, care determină micșorarea continuă
a volumului picăturilor. Acest proces are ca rezultat o creștere substanțială a densității
câmpului electric pe suprafața picăturii până în momentul în care se atin ge limita
Reyleigh.
 Ionii rezultați sunt extrași din picături și orientați prin intermediul unui tub capilar către
analizorul de masă.
 Principiul de funcționare a unei surse de ionizare de tip ESI este ilustrat în Schema 1 0.

Schema 1 0. Schema de funcționare a unei surse de ionizare de tip ESI

Peptidele pot fi caracterizate prin spectrometrie de masă, când li se determină nu numai
masa ci și puritatea. Pentru măsurarea masei unei peptide cu ajutorul acestei tehnici, moleculele
peptidelor trebuie a duse în fază gazoasă.
De asemenea, dacă proba are grupări funcț ionale care acceptă mai uș or un proton (ex.:
grupări amino ), atunci se va alege detecția î n modul pozitiv. Dacă peptida este pură, în spectrul
de masă apar numai semnalele acesteia.

I.10.2. Spectrof otometrie UV -VIZ
Avantaju l spectro fotometriei constă în faptul că permite determinarea concentrațiilor atât
a substanței anorganice cât și a substanț elor organice.

23
Un spectrofotometru (Schema 1 1) este format:
 dintr -o surs ă de lumină ;
 un sistem optic pentru p roducerea luminii momocromatice;
 lentile ;
 un sistem de fante ;
 un sistem mon ocromator cu reț ea de difrac ție sau cu prismă;
 spațiu pentru cuve cu solu ție de referință;
 cuve pentru solu ția de analizat ;
 un detector de radia ție luminoasă ;
 un amplificator și un sistem de afișare .

Schema 1 1. Schema unui spectofotometru
http://www.scritub.com/stiinta/chimie/SPECTROSCOPIE -UVViz25557.php

În cazul proteinel or, absorbția în domeniul UV -VIZ, poate fi remarcată pe baza unor
grupe funcționale:
 legătura peptidică (tranziții π-π∗, absorbție intensă la 190 nm, tranziții n -π∗, absorbție
ce apare la 210 -220 nm) ;
 aminoacizi aromatic i (tranziții π-π∗, fenilalanina apare la 260 nm, tirozina la 275 nm) ;
 cofactori enzimatici (NAD -ul, FAD -ul, nuclee porfirinice, ioni metalici).

I.10.3. Spectroscopia de f luorescen ță
În urma interacți unii fotonilor cu electronii de valență ai moleculelor, aceștia trec de pe
orbitalii din starea fundamentală, pe orbitalii cu nivele de energie mai ridicate. O parte din
molecule nu rămân pentru o perioadă lungă în această stare excitată și revin la starea ini țială

24
printr -un proces de relaxare. Acest proces de relaxare în care se emite lumina , poartă nume le de
fluorescență .

Schema 1 2. Schema de principiu a spectroscopiei de fluorescență
http://www.niqro.3x.ro/neon/neon.htm

Atomii sau moleculele pot fi excitați fie prin absorbție de un de electromagnetice de o
anumită lungime de undă , fie prin c iocniri cu alte particule ( ex.: electroni).
De obicei lungimea de undă a fotonului emis este mai mare, av ând astfel energie mai
mică față de energia absorbită.
Se cunosc o serie de biomolecule ce prezintă fluorescență (aminoacizi, proteine, lipide).
De exemplu, aminoacizii cu grupări aromatice (fenilalanina, tirozina) sunt fluorescenți, și drept
urmare, peptidele ce conțin în structură acești aminoacizi sunt fluorescente.

25
CAPITOLUL II
PARTEA EXPERIMENTALĂ

II.1. Materiale de cercetare
II.1.1. Reactivi chimici și materiale
Sinteza octapeptide lor s-a realizat pe o r ășina Fmoc -Rink -Amide care a fost procurată de
la firma Novabiochem și are capacitatea de legare de 0,48 mmol aminoacid/g rășină. Aminoacizii
protejați la gruparea α -aminică cu gruparea Fmoc (9 -fluorenilmetiloxicarbonil) au provenit de la
GL Biochem (Shang hai) Ltd , dimetilformamida (DMF), piperidina, 4 -metilmorfolina au f ost
procurate de la Sigma , iar albastrul de bromfenol și acidul trifluoracetic de la Merck .
Astfel, s inteza peptidelor a fost realizatã într -o seringă din material plastic cu frită,
utilizând o trompă de apă pentru îndepărtarea soluțiilor în exces și a solvenților de spălare și
bineînțeles, sticlăria u zuală de laborator (Figura 5).

Figura 5. Instalaț ie utilizată la sinteza peptidelor
(1-Sering ă ce conține rășina ; 2-robinet ; 3- balon de colectare conectat la vid )

26
II.2. Sinteza manuală a peptidei native Aβ (9 -16) (NH 2-GYEVHHQK -CONH 2)
Peptida a fost sintetizată manual, pe o rășină Fmoc -Rink -Amide (104 mg rășină, cantitate
teoretic ă necesară pentru sinteza a 50 µmol de peptidă) (Schema 1 3) folosind metoda Fmoc.
În scopul obți nerii un ui randament maxim , au fost folosite cantități stoechiometrice mai
mari atât în cazul reactivilor de cuplare (raport molar 1:5) cât și în acela al aminoacizilor ( raport
molar 1:2) .
Excesul de reactivi și aminoacizi a fost îndepărtat ulterior prin spălare cu
dimetil formamidă (DMF) , iar în final, produsul a fost clivat de pe suportul solid cu ajutorul unui
amestec format din acid trifluoroacetic, triisopropilsilan și apă .

Schema 1 3. Structura primar ă a peptidei native Aβ(9 -16)
H2N-GYEVHHQK -CONH 2

Etapele principale care intervin î n decursul sintezei au fost următ oarele :

 s-a cântărit rășina, aminoacizii și activatorul, HBTU;
 la fiecare aminoaci d folosit î n decursul sintezei s -a adăugat activator ul;
 în seringa ce conținea rășina s -a adăugat dimetilformamidă ( DMF ) și s-a incubat timp de
50 minute în scopul umflă rii acesteia ;

27
 după înlăturarea dimetilformamidei , a fost îndepărtată gruparea protectoare -Fmoc a
lisinei cu o soluție de 20% piperidină în DMF, la interval de timp de 2, 2, 5 respectiv 10
minute;
 ulterior, a fost necesar ă spălarea rășinii cu DMF de 7 -8 ori, cu îndepărtarea solventului de
fiecare dată ;
 cuplarea a durat 50 minute pentru fiecare aminoacid, etapă urmat ă de verificarea gradului
de obținere a cuplării cu albastru de bromfenol ( soluția de testat care conținea răși na și
aminoacizii cuplaț i pe aceasta a determinat un vir aj de culoare de la albastru la galben,
fapt ce a confirmat că reacția de cuplare a funcț ionat );
 ciclul de sp ălare, deprotecție și cuplare a fost reluat pentru fiecare aminoacid în parte,
până la introducerea ultimului aminoacid din secvenț a peptidei țintă ;
 în ceea ce privește ultimul rest de aminoacid adăugat, acesta a fost de asemenea
deprotejat . Gruparea amino -protectoare a fost îndepărtată cu soluția de piperidină, urmată
de spălarea repetată (de 7-8 ori) a rășinii cu DMF, de două ori cu diclormetan și de trei
ori cu etanol absolut ;
 pentru îndepărtarea peptidei de pe rășină, aceasta din urmă a fost incubat ă timp de trei ore
cu un amestec de clivare (4,77 mL TFA (acid trifluoroacetic) , 238,5 µL T IS
(triisopropil silan) , 238,5 µL apă) ;
 după clivare, peptida brută a fost precipitată cu 34 mL t-butilmetil -eter și incubată timp
de 12 ore la -20 0C;
 amestecul eterogen a fost filtrat , iar peptida a rămas pe filt ru împreună cu rășina ;
 ulterior, peptida a fost spălată cu dietil -eter și eluată cu acid acetic 100% (6 -8 fracțiuni a
câte 1 mL în care s -a regă sit ca ntitatea cea mai mare de peptidă) și mai apoi cu acid
acetic 5% (12 fracțiuni a câte 1 mL). Toate fracț iunile au fost colecta te în tuburi
Eppendorf, înainte de liofilizare (uscare prin înghețare) (Figura 6), în scopul stabilizării ș i
caracterizării produsului obținut prin metode spectrale ș i spectometri ce.
 Cantitatea de peptid ă brută rezultată în urma sintezei a fost de 190,8 mg.

28

Figura 6. Liofilizator (Dispozitiv de uscare a probelor)

II.3. Sinteza manual ă a peptidei Aβ (9 -16-Phe) ( NH 2-GFEVHHQK -CONH 2)
Sinteza peptidei Aβ (9-16-Phe), a fost realizată manual, după același protocol utilizat la
sinteza peptidei native Aβ (9 -16) și pe aceeași r ășină Fmoc -Rink-Amide (Schema 1 4).
Diferența care apare în structura primară a celor două peptide constă î n înlocuirea restului
de tirozin ă din poz iția a doua cu fenilalanină. În acest caz, cantitatea de peptidă brută obținută a
fost de 143 mg.

29

Schema 14. Structura primară a peptidei mutante Aβ (9 -16-Phe)
H2N-GFEVHHQK -CONH 2

30
CAPITOLUL III
REZULTATE ȘI DISCUȚII

III.1 . Caracterizarea peptidei native Aβ (9-16) prin spectrometrie de masă
Pentru caracterizarea peptidei nou sintetizate, s -a apelat la spectrometria de masă, în
scopul determinării masei moleculare și purității acesteia.
În urma măsurătorilor, s pectrele de masă au confirmat prezenț a peptidei sintetizate și,
alături de semnalele acesteia s-au regăsit și fragmente care au fost atribuite unor forme trunchi ate
ale peptidei de interes .
Semnalul caracteristic ionului molecular [M+H ]+ s-a regă sit la m/z = 996,59 , și
corespunde peptidei native Aβ (9 -16), alături de semnalele de la m/z = 997,59, respectiv 998,59
care indică prezența speciilor monoprotonate (Figura 7).

Figura 7. Spectrul de mas ă (ESI -MS) al peptidei native Aβ (9 -16)

III.2. Separarea, purificarea și caracterizarea peptidei native Aβ (9 -16) prin cromatografie
de înaltă performanță (HPLC)
Verificarea purității peptidei native Aβ (9 -16) a fost realizată cu ajutorul cromatograf iei
de lichide de înaltă performanță (Figura 8). Pentru separarea peptidei s -a folosit o coloană Vydac

31
C18. Faza mobilă utilizat ă a fost alcătuită dintr -un amestec de solvenți : solvent A (500 mL apă
bidistilată cu 0,5 mL acid trifluoroacetic) și solvent B (400 mL acetonitril, 100 mL apă bidistilată
și 0,5 mL acid triflu oroacetic).

Figura 8. Cromatograf de înaltă performanță

Solvenții folosiți au fost degazaț i timp de 15 minute . Peptida a fost dizolvată în solventul
A și in jectată î n sistemul cr omatografic.
Separarea cromatografică a presupus următorii pași:
 În primul pas, s-a echilibra t coloan a (faza staționară) cu un amestec de solve nți (5% B și
95% A) ast fel încâ t să se atingă condițiile inițiale ale fazei mobile: pH, polaritate, forțe
ionice. Polaritatea a fost controlată prin realizarea unui gradient de acetonitril. Aciditatea,
respectiv g radul de solubilizare al compușilor separați a fost asigurată prin prezența unei
concentraț ii mici de acid trifluoroacetic (TFA 0,1% );
 În al doilea pas, proba a fost preluată de că tre faza mob ilă și introdusă în colo ană;
 Coloana a fost spălată cu acelaș i solvent (5 % B), în scopul îndep ărtarii compuș ilor
nelega ți și a eventualelor impurități;
 În următorul pas s -au eluat treptat substanțele adsorbite pe coloană. Acest lucru s -a putut
realiza prin modificarea compoziției fazei mobile prin creșterea graduală a
hidrofobicității;
 Al 5 -lea pas a urmă rit îndepărtarea compușilor foarte hidrofobi de pe coloana
cromatografic ă numai cu ajutorul solvent ului B (80% acetonitr il, 20% apă și 0,1% TF A);

32
 Ultimul pas a constat în reechilibrarea coloanei cu 5% solvent B.
În Tabelul 1 sunt prezenta ți parametri i de separare (timp, concentrați ile fazei mobile)
folosiți î n decursul separă rii cromatografice .
Profilul separă rii cromatografice a l peptidei native este ilustrat în Figura 9. Pe baza
profilului obținut, am constatat faptul că peptida a eluat după aproximativ 13 min ute.

Tabel 1 . Etapele separă rii cromatografice

Durata (min) B(%) A(%) Etapa de separare
0-3 5 95 Echilibrare
3-40 5-100 0-95 Aplic area unui gradient de concentraț ie
40-45 100 0 Spălarea coloanei
45-50 5 95 Re-echilibrare

Figura 9 . Profilul cromatografic de separare al peptidei Aβ (9-16)
pe o coloană Vydac C18

În cazul separă rii peptidei native pe coloana de tip Vydac C18 s-au înregistrat două
cromatogram e. Semnalul înregistrat la 216 nm , caracteristic legă turilor peptidice, a indicat

33
prezența unei concentrații mici de impurităț i care au apărut î n decursul procesului de sinteză.
Astfel, cromatograma din Figura 9 a confirmat faptul că peptida sintetizată s-a dovedit a fi
relativ pură.
De asemenea, semnalul corespunzător peptidei a fost unul de intensitate mare, îngust și
fără “umeri”.
Pe de altă parte, apariț ia semnalului de la 276 nm a indicat prezența tirozinei în secvența
peptidei. Fracțiunile care conțin peptida de int eres au fost eluante/colectate în funcți e de creșterea
absorbanței la 216 nm, respectiv 276 nm.
După etapa de eluți e, fracțiunile obținute au fost liofilizate , fiind supuse ulterior la
analize spectrofot ometrice și spectrometrice. Măsurătorile spectrometrice de masă efectuate au
fost realizate folosind soluții ale peptidelor de concentrație 1 μg/μL .
După purificarea peptidei Aβ (9 -16) pe o coloană cromatografică C 18, s-a obținut un
produs cu o purit ate mult îmbunătățită. În vederea efectuării fragmentărilor teoretice (Figura 10)
s-a folosit programul GPMAW (Tabel 2). Astfel, au fost atribuite semnalele din spectrul de masă
ale peptidei studi ate. Spectrul obținut în urma purificării a indicat apariția semnalelor
caracteristice ionului molecular (m/z = 996,1), alături de prezența unor specii dublu pro tonate
(m/z = 498,6) .

Tabel 2. Determinarea fragmentelor teoretice ale peptidei native Aβ (9-16) cu ajutorul
programului GPMAW

b b-18 Simbol
aminoacid y y-17 y-18
58,029 40,019 1 G 8
221,093 203,082 2 Y 7 939,480 922,454 921,470
350,135 332,125 3 E 6 776,417 759,390 758,406
449,204 431,193 4 V 5 647,374 630,348 629,364
586,263 568,252 5 H 4 548,306 531,279 530,295
723,321 705,311 6 H 3 411,247 394,220 393,236
851,380 833,369 7 Q 2 274,188 257,188 256,177
8 K 1 146,129 129,103 128,119

34

Figura 10. Schema de fragmentare a peptidei native Aβ (9 -16) cu formarea ionilor
A, B, X și Y

Din Figura 10 se pot observa unele dintre fragmente le anticipate care sunt notate cu a, b,
x și y.

35

Figura 11 . Spectrul de mas ă (ESI -MS) al peptidei native Aβ (9 -16) după purificare
pe o coloană cromatografică C 18

III.3 . Separarea, purificarea și caracterizarea peptidei mutante Aβ (9-16-Phe) prin
cromatografie de înaltă performanță (HPLC)
Verificarea purității peptidei Aβ (9 -16-Phe) a fost realizată folosind același protocol
utilizat la separarea peptidei native. Profilul separ ării cromatografice a l peptide i mutante este
redat în Figura 1 2.

Figura 1 2. Profilul separ ării cromatografice al peptidei Aβ (9 -16-Phe)

Cromatograma octapeptidei mutante a indicat existența unui compone nt major itar, la
circa 15 minute, alături de o serie de impurități. Detecț ia la 216 nm este specifică peptidelor, iar

36
cea de -a doua lungime de undă (260 nm ) vizează prezența compuș ilor aromatici (în cazul
mutantului, a restului de fenilalanin ă). Fracțiunile care conțin peptida mutant ă au fost colectate în
funcție de creșterea absorbanței la 216 nm, respectiv 260 nm.
După etapa de colectare , fracțiunile obținute au fost liofilizate , fiind supuse ulterior la
analize spectrometrice . Ca și în cazul peptidei native, identificarea fragmentelor teoretice ale
peptidei mutante (Figura 13) s-a realizat cu ajutorul programului GPMAW (Tabel 3). În urma
măsurătorilor MS/MS, s-au obținut semnale caracteristice ionului molecular, precum și aducților
de K (Figura 14).

Tabel 3 . Determinarea fragmentel or teoretice ale peptidei mutante Aβ (9 -16-Phe) cu
ajutorul programului GPMAW
b b-18 Simbol
aminoacid y y-17 y-18
58,029 40,019 1 G 7
205 187,087 2 F 6 786 769 768
334 316,130 3 E 5 639 622 621
433 415,198 4 V 4 510 493 492
570 552,25 5 H 3 411 394 393
698 680,316 6 Q 2 274 257 256
7 K 1 146 129 128

37

Figura 13. Schema de fragmentare a peptidei mutante Aβ (9-16-Phe) cu formarea ionilor
A, B, X și Y

Figura 13 prezintă modul de fragmentar e al lanțului peptidic în vederea caracterizării
teoretice a peptidei mutante, precum și verificarea obținerii fragmentelor corespunzătoare
secvenței nou sintetizate în spec trul de masă.

Figura 14 . Spectrul de mas ă (ESI -MS) al peptidei mutante (9-16-Phe) după purificare pe o
coloană cromatografică C 18

38
Astfel, peptida a prezentat semnale caracteristic e la m/z = 843,1, semnal atribuit ionului
molecular [M+H ]+ ce corespunde peptidei mutante Aβ (9 -16-Phe) în secvența căreia lipsește un
rest de histidină (Tabel 4 ) și un semnal la m/z = 422,1 caracteristic ionilor dublu încărcați electric
([M+2H]2+). De asemenea, a fost observa t un semnal pentru aductul de potasiu al peptidei
trunchiate Aβ (9 -16-Phe) la m/z = 881,1.

Tabel 4 . Estimarea maselor moleculare a peptidei Aβ (9 -16-Phe) cu ajutorul programului
Peptide mass calculator (http://www.peptidesynthetics.co.uk/tools/ )

Secvență peptidă Masă moleculară (Da)
GFEVHHQK 980
FEVHHQK 923
GEVHHQK 832
GFVHHQK 850
GFEHHQK 880
GFEVHQK 843
GFEVHHK 852
GFEVHHQ 852

Deși cuplarea aminoacizilor s -a efectuat de două ori, reacția nu a decurs pe măsura
așteptărilor , întrucât în spectrul de masă, ionul molecular indică lipsa unei histidine din secvența
peptidei.
Principala cauză datorită căreia secvența a prezentat dificultăți, a fost deprotecția
incompletă, alături de reacțiile secundare care contribuie la formarea unor compuși nedoriți, și
care posedă caracteristici asemănătoare moleculei de peptidă.

III.4. Determinarea teoretică a caracterului hidrofil -hidrofob al peptidelor invest igate
III.4.1. Determinarea caracterului hidrofil -hidrofob cu ajutorul aplicației Peptide 2.0
Peptidele hidrofile care conțin un procent de reziduuri > 25% și < 25% reziduuri
hidrofob e se dizolvă în medii ap oase, cu condiția ca totalitatea r eziduuri lor constituente să fie
distribuit e aproape în întreaga secvență (Tabel 5).

39
Tabel 5. Determinarea caracterului hidrofil -hidrofob al peptidelor studiate cu ajutorul aplicației
Peptide 2.0

Parametri GYEVHHQK GFEVHQK
Hidrofobicitate 12,5 % 28,6 %
Aciditate 12,5 % 14,2 %
Bazicitate 37,5 % 28,6 %
Caracter neutru 37,5 % 28,6 %

III.4.2. Determinarea caracterului hidrofil -hidrofob al peptidelor cu ajutorul programului
GPMAW

Figura 1 5. Evaluarea caracterului hidrofil -hidrofob al peptidelor sintetizate cu ajutorul
programului GPMAW

Din Figura 15 , se poate observa faptul că peptida nativă Aβ (9 -16) prezintă un caracter
hidrofil mai ridicat comparativ cu peptida mutantă . Explicația ar consta în faptul că peptida
nativă prezintă tirozin ă, aminoacid a cărei grupare –OH mărește caracterul hidrofil al peptidei.

III.5 . Investigarea peptidelor prin spectroscopie UV -VIZ
În vederea confirmării prezenț ei compușilor aromatici în structura primară a peptidelor
sintetizate s -au efectuat mă suratori spectroscopice UV-VIZ.

40
În acest scop s -a folosit un volum de 70 μL peptidă nativă, respectiv 90 µL în cazul
peptidei mutante , în apă bidistilată . Înainte de a înregistra spectru l, s-a trasat spectrul de
absorbț ie cu ajutorul apei bidistilate , aceasta fiind soluția de referi nță. Spectrele de absorb ție ale
peptide lor sunt redat e în Figura 16 .

Figura 16 . Spect rele electronice de absorbție a le peptidelor sintetizate

Spectrele UV al e peptidelor au indicat prezenț a unei benzi de absorbți e, atât în cazul
peptidei native cât și în cazul celei mutante la 210 nm (tranziții n -π∗) caracteristică legăturilor
peptidice .
În plus, nucleul fenolic grefat pe lanțul polipept idic a determinat apariț ia unui semna l în
acelaș i domeniu spectral la 275 nm în cazul tirozinei (aminoacid ce apare în secvența peptidei
native) și implicit la 260 nm în cazul fenilalaninei .
Din Figura 16 se poate observa clar apariția celor două maxime , fapt care confirmă
prezenț a compușilor aromatic i în structura peptidelor sintetizate, prin urmare, reacția de cuplare a
avut loc cu succes.

III.6. Studiul fluorescenței peptidei native Aβ (9 -16)
În scopul confirm ării existen ței tirozin ei în secvența peptidei Aβ (9 -16) s -a utilizat
spectroscopia de fluorescență.

41
Pentru ale gerea lungimii optime de excitare au fost necesare teste preliminare î ntr-un
domeniu spectral mai la rg. Inițial, s-a înregistrat un spectru de emisie folosind lungimea de undă
de excitare de 275 nm. Maximul de emisie al acestui spectru de fluorescență s-a situat la 296-297
nm. Mai târziu, s -a fixat lungimea de undă de emisie la valoarea de 295 nm și s -a înregi strat
spectrul de excitare al că rui maxim a avut valoarea de 282 nm. La final , s-a ales maximul de
excitare anter ior. Spectrul obț inut s -a distins printr -un maxim de emisie la 301 -303 nm.
Analizând spectrul din Figura 17, se poate trage concluzia că lungimea de undă de
excitare la care se î nregi streaz ă semnalul de fluorescență cel mai intens ș i stabil este de 282 nm,
semnal ce indic ă prezența tirozinei în secvența peptidei nou sintetizate.

Figura 17 . Spectrele de excitar e și emisie ale peptidei native Aβ (9 -16)

42
CONCLUZII

În urma cercetărilor efe ctuate în domeniul proteomicii , s-au desprins următoarele
concluzii:

 În studiul de față s -a urmărit sinteza, purificarea și caracterizarea prin diferite metode
spectrometrice și spectoscopice a două octapeptide derivate de la polipeptida beta
amiloidică 1 -42 ce prezintă o importanță fiziologică deosebit ă.

 Pentru sinteză s -a optat pentru tehnica în fază solidă deoarece aceasta prezintă avantajul
că reacția de cuplare s -a realizat într-un singur vas, ceea ce a simplificat și accelerat
sinteza;

 De asemenea, cuplarea aminoacizilor s -a realizat de două ori, fapt care a condus la
obținerea unei purități și a unui randament superior .

 Pe de altă parte, s -a optat pentru strategia Fmoc/t -Bu pentru protejarea grupărilor
funcționale din catenele laterale ale aminoacizilor, deoarece în aceste condiții s -a putut
evita apariția eventualelor reacții care pot conduce la deprotecția aminoacizilor terminali
asemeni reacți ilor frecvent întalnite în strategia Boc.

 Pentru a reduce fenomenul de racemizare ce apare pe parcursul sintezei, peptidele au fost
sintetizate de la capătul C -terminal către capătul N -terminal. Scopul protejării grupei a
fost acela de a evita participarea acesteia la reacții chimice, datorită naturii sale bazice.

 Prin spectometria de masă a fost confirmată masa moleculară a peptidelor sintetizate și,
odată cu aceasta și puritatea acestor peptide.

 Verificarea purității peptide lor s -a realizat cu ajutorul unui cromatograf de înaltă
performanță echipat cu o coloană Vydac C 18. Datorită faptului că s -a lucrat cu cantități

43
mari de aminoacizi, peptidele obținute au prezentat în cromatogramă și omologi inferiori
cu mai multe resturi d e aminoacizi lipsă, ce au constituit impurități greu de separat.

 Spectrele de masă ale peptidelor studi ate au confirmat masa molecular ă a acestora, alături
de fragmente le specifice fiecă reia. Rez ultatele experimentale au fost în concordanță cu
cele teoretice obț inute cu ajutorul programului GPMAW .

 Investi garea proprietăților aminoacizilor aromatici prezenți î n componența peptidelor s-a
realizat c u ajutorul spectroscopiei UV -VIZ și a fluoscenței. În urma măsurătorilor,
spectrele au confirmat reacția de cuplare. De menț ionat este faptul că aceșt i aminoacizi au
fost cuplați î n dec ursul ultimelor etape de sinteză și din acest motiv aceștia indică
prezenț a unor hepta sau octapeptide .

 Studiile experimentale de sinteză precum și cele de caracterizare au confirmat obținerea
celor două octapeptide cu succes, cu randamente ridicate.

44
BIBLIOGRAFIE

1. E.V. Suprun, N. V. Zaryanov, S.P. Radko – Tyrosine Based Elec trochemical Analysis of β –
Amyloid Fragment (1 -16) Binding to Metal(II) Ions , Institute of Biomedical Chemistry,
Pogodinskaya Street, Rusia, 201 5;
2. S. Kobayashi, Y. Tanaka – Dependence pH and proposed mechanism for aggregation of
Alzheimer’s disease -related β -amyloid (1–42) protein , Institute of Medical Science and
Department of Cardiovascular, St. Marianna University, School of Medicine , Kawasaki City,
2015 ;
3. V. Muresan, Z. L. Muresan – β-Amyloid precursor protein:Multiple fragments, numerous
transport routes and mechanisms , Department of Pharmacology and Physiology, New Jersey
Medical School , 2015 ;
4. Rosa F. B. – Dual role of Cu2+ ions on the aggregation and degradation of soluble Aβ
oligomers and protofibrils investigated by fl uorescence spectroscopy and AFM , University of
Barcelona, Spania, 2012;
5. M. Murariu., G. Drochioiu . – Sinteza de peptide și interacțiunea acestora cu metalele grele ,
Editura Tehnopress, Ia și, 2011;
6. Mary S. L. – Mass Spectr ometry of Proteins and Peptides , Richland, 2009;
7. M. Pleniceanu, Isvoranu , Rev. Chim. (Bucure ști), 2005, p. 846;
8. L.Vlădescu , M. Serdaru, L. Pascu, Rev. Chim. (Bucure ști), 2005, p. 593;
9. M. John – Peptide Synthesis and Applications , Humana Press, Totowa, 2005;
10. M. William – Antibacterial Peptide Protoc ols, Humana Press, Totowa, 1997;
11. M.D. Taylor , ed., Amidon G. L., –Peptide -based drug desing. Contr olling transport and
metabolism , American Chemical Society, Washington, 1995;
12. J. Briand , Muller S. – Synthetic polip eptides as antigens , Strasbourg, 1990;
13. G. Allen – Sequ encing of Proteins and Peptides , Elsevier Science Publishers, Amsterdam,
1986;
14. M. Bodanszky – Principles of peptide synthesis , Case Western Reserve University, Berlin,
1984;
15. M. Goodman – Peptides. Proceedings of the fiftamerican peptide sym posium , Halsted Press,
New York, 1977;
16. D. H. Hey– Amino Acids, Peptides and Related Compounds , London, Butterworth, 1973;

45
17. R. Pettit George – Synthetic peptides , New York, Van Nostrand Reinhold, 1970 -1971;
18. S.J. Morrow Young J.D. – Solid phase peptide synthesis , San Francisco, W. H. Freeman and
Company, 1969;
19. E. Schroder, K. Lubke – The peptides , Academic Press, New York, 1966;
20. E. Schroder , K. Lubke – The peptides , vol.1., Methods of peptide synthesis , National
Institutes of health, Bethesda, Maryland, 1965;