Refarat 1 Bogdan De Trimis Partea 1 [311605]
RAPORT ȘTIINȚIFIC
28 iulie 2017
Selectarea unor markeri tumorali implicați
în metabolismul celulei canceroase
și stabilirea metodelor de evaluare a potențialului tumoricid
al unor peptide citotoxice
Doctorand: [anonimizat] « Gr.T.Popa » Iași, promoția 2013
Date de contact :
Mobil : [anonimizat] ;
E-mail: [anonimizat]
data admiterii la doctorat : 1-10-2014
Conducător de doctorat: Prof. Dr. Magda Bădescu
Date de contact:
Mobil : [anonimizat];
E-mail : magda.badescu@gmail.[anonimizat]-un organism. Cancerul este o tulburare a diviziunii celulare care se declanșează atunci când o celulă normală suferă anumite modificări care îi permit să crească și să se dezvolte necontrolat și neinvaziv. Celula stem este celula care nu a suferit încă procesul de diferențiere și dobândire a [anonimizat]. O celulă stem normală trece prin trei procese esențiale de-a [anonimizat] (prin apoptoza). Carcinogeneza pornește în cele mai multe cazuri prin modificarea ireversibilă a ADN-ului unei celule stem [1].
Procesele pe care le suferă aceasta pentru a deveni o [anonimizat] (Fig.1.).
INIȚIEREA – reprezintă fenomenul genetic care presupune modificarea ireversibilă a ADN-ului nuclear al celulei stem respective în urma expunerii la un agent carcinogen inițiator (fizic, chimic sau viral). În urma expunerii se pot produce mutații care determină intrarea celulelor într-o stare premalignă (când apar diferite efecte epigenetice), cu transmiterea acestor modificări celulelor fiice. Se crede că prin excizia și îndepărtarea nucleotidelor alterate s-[anonimizat], însă această modalitate numită terapie genică este încă în faza experimentală [2,3].
PROMOVAREA – apare ca urmare a acțiunii unui agent promotor asupra celulei deja inițiate. [anonimizat], [anonimizat] o diviziune aberantă formând o [anonimizat]. Aceasta este teoria monoclonală a dezvoltării cancerului dintr-o singură celulă care suferă o mutație. [anonimizat], câte o clonă din fiecare celulă [2,3].
PROGRESIA – este etapa în care numărul de celule aberante crește foarte mult (105 celule), datorită diviziunii anarhice a [anonimizat] 105 celule, se intră în etapa de carcinom in situ. Acest carcinom in situ este o [anonimizat], care nu depășește membrana bazală și nu dă semne și simptome de boală. [anonimizat] 105 celule sunt suficiente pentru punerea diagnosticului microscopic histopatologic de cancer. [anonimizat]; [anonimizat] a tumorii este și ea foarte ridicată. În momentul în care tumora ajunge la 109 celule, [anonimizat]. Între faza de carcinom in situ și cancer clinic manifest există faza de microcancer [2,3].
Progresia cuprinde două procese extrem de importante [1-4]:
Invazia locală – care depinde de timpul de dublare al tumorii, de agresivitatea ei și de capacitatea de apărare a gazdei. Orice tumoră este formată din celule aflate în faze diferite ale ciclului celular și anume celule aflate în repaus (faza G0), celule în diviziune (fazele G1, G2, S, M) și celule care mor (în apoptoză). Această heterogenitate apare datorită faptului că vascularizația tumorală este inconstantă și neuniformă, astfel din tumoare se vor selecta clone celulare agresive și rezistente la tratament, clone celulare mai puțin agresive și sensibile la tratament și clone celulare care vor muri. Factorul angiogenetic tumoral (TAF) Volkmann este responsabil de neoangiogeneza tumorală sau de dezvoltarea vascularizației proprii tumorale. Prin invazie este depășită capsula organului în care se dezvoltă tumoarea, cu infiltrarea acesteia în organele vecine.
Metastazarea – este procesul prin care celulele maligne diseminează la distanță, în alte sisteme ale organismului cu care organul în care s-a dezvoltat tumoarea primară nu este în raport anatomic. Celule maligne migrează la distanță de la situsul primar în alte organe, unde se fixează și generează o nouă tumoare. Cel mai frecvent metastazarea se face pe cale sanguină și pe cale limfatică, dar și pe alte căi cum ar fi: calea bronhogenă, prin infiltrarea sistemului nervos (pe traiectul tecilor nervoase), prin lichidul cefalo-rahidian și peritoneal.
Fig.1. Mecanismul de carcinogeneză care include trei etape: inițierea, promovarea și progresia tumorală
Celula canceroasă este o celulă heterogenă, cu un genom extrem de instabil supus mutațiilor și anomaliilor cromozomiale, având capacitatea de a invada țeuturile învecinate și de a metastaza la distanță. Dintre caracteristicile principale ale celulelor tumorale, menționăm excesul de heterocromatină nucleară numit și hipercromazie, modificările de formă și de volum ale organitelor celulare și ale citoplasmei, mitoze atipice în număr foarte mare, independența față de factorii de creștere, cu creștere și multiplicare anarhică, total diferită de celula normală și un grad foarte scăzut de diferențiere, uneori chiar lipsa diferențierii, numită și anaplazie.
Modificările pe care le suferă celula stem normală pentru a deveni malignă sunt [1-4]:
Transformarea – constă în modificare fenotipică celulară care este obligatorie pentru ca celula să devină neoplazică. Ea este transmisă descendenților celulari și este reprezentată de modificările morfologice ale genomului celular, care au fost induse în procesul de inițiere, modificări ce constau în capacitatea de a produce tumori prin diviziune celulară aberantă.
Alterarea inhibiției de contact – în condiții obișnite, celulele normale se opresc din diviziune în momentul în care se atinge un punct critic semnalizat prin acțiunea factorilor supresori ai creșterii celulare și intră în apoptoză. Celula canceroasă prezintă însă, atât alterarea inhibiției de contact a mișcării, dată de faptul că ele nu se opresc din diviziune la contactul cu alte celule, nu au o orientare specifică în cadrul țesutului și se suprapun, precum și alterarea inhibiției de contact a diviziunii, reprezentată de faptul că se divid nelimitat, atât în mediu lichid cât și în mediu solid, nerespectând punctul critic de stopare al multiplicării.
Modificări ale membranei celulare – se produc alterări ale transportului transmembranar și joncțiunilor intercelulare, modificări ale sarcinilor electrice de o parte și de alta a membranei (comparativ cu celulele normale, celulele tumorale devin mai electronegative pe suprafața externă a membranelor celulare prin expunerea grupelor polare de fosfatidil serină din stratul intern al bistratului lipidic al memebranei celulare în stratul extern al acesteia), alterări ale permeabilității membranare, ale enzimelor și ale compoziției membranelor (Fig.2.).
Aceste modificări funcționale ale mebranelor celulare sunt foarte importante, motiv pentru care unii autori considera cancerul chiar o boala a membranelor celulare. S-au constatat alterări ale comunicării intercelulare care s-ar datora în primul rând, unor modificări ale receptorilor de pe suprafață ale membranei a caror capacitate de recepționare a informației este mult mai scazută pentru celulele neoplazice.
Aceste informații nu mai pot fi ajustate la un anumit nivel "prag" și nici transmise. Modificarile glicoproteinelor dar și ale glicolipidelor, pot determina schimbări în configurația receptorilor de pe suprafață ale celulei canceroase, având ca rezultat imposibilitatea de a răspunde la stimulii altor celule sau la semnele chimice din alte zone ale organismului. Aceste modificări pot fi importante și pentru apararea imună impotriva cancerului deoarece aceste glicoproteine și glicolipide reprezintă un mijloc prin care celulele fiice ar putea fi recunoscute de către sistemul de supraveghere imunologică.
Fig.2. Modificări funcționale ale membrelor celulare în celula normal și tumorală
Nivelul AMPc se modifică în funcție de starea activității celulare astfel că, au fost înregistrate nivele înalte ale AMPc pentru celulele normale în repaus și nivele scăzute în celulele normale aflate în diviziune precum și în cele canceroase. Se știe că adenil-kinaza este o enzimă situată pe suprafața internă a membranei celulare și are ca funcție conversia ATP-ului (adenozintrifosfat) în AMPc (adenozin monofosfat ciclic) ca mesager secundar implicat în reglarea unor evenimente intra-celulare [5,6]. In plus, guanozin monofosfatul ciclic (GMPc), de asemenea important reglator în activitatea celulară, are un comportament opus față de AMPc în sensul că celulele aflate in diviziune si cele canceroase au nivele scăzute de AMPc și crescute de GMPc, iar pe de altă parte stimulează sinteza de ARN în anumite celule. Promotorii tumorali acționând asupra celulelor inițiate modifică nivelul de AMPc favorizând astfel transformarea malignă a celulelor respective. Scăderea nivelului de AMPc observat în celulele transformate reprezintă un prim stimul major pentru dezvoltarea autonomă. Se pare că, în cascada evenimentelor celulare ce conduc la exprimarea completă a maligniățtii, o modificare importantă o are supresia adenil-kinazei și scăderea consecutivă a AMPc. În condițiile în care s-ar reuși normalizarea nivelelor de AMPc din celulele transformate acestea ar putea fi revărsate către celulele normale. Alterări ale permeabilității si transportului transmembranar, precum și transportul substanțelor transmembranar se realizează cu o rată mai înaltă în celulele transformate malign.
Modificări antigenice – celulele tumorale au antigene de suprafață care sunt capabile să declanșeze un răspuns imun din partea organismului gazdă. Determinarea antigenelor tumorale este importantă la diagnostic pentru monitorizarea terapeutică a bolii.
Modificări genice – anumite gene normale, numite proto-oncogene în urma unor mutații genetice, se pot transforma în oncogene sau gene ale cancerului, care vor declanșa transformarea celulelor stem normale în celule maligne (Fig.3.). Genele care sunt implicate într-o susceptibilitate crescută a individului pentru cancer sunt împărțite în trei categorii: gene de reparare a ADN-ului, gene propriu-zise ale cancerului (oncogene) și gene de metabolizare ale agenților carcinogeni externi.
Fig. 3. Gene implicate în formarea unei clone tumorale.
Modificări cromozomiale – celulele somatice normale conțin un număr diploid de 46 cromozomi (2N) dispuși în 23 de perechi. Euploidia caracterizează celulele normale, ea fiind prezența unui număr multiplu de N cromozomi într-o celulă. Celulele maligne sunt caracterizate de aneuploidie, și anume un număr de cromozomi care nu este multiplu de N. Astfel că, în celulele maligne apar anomalii cromozomiale de număr. Anomaliile cromozomiale de structură sunt și ele specifice celulelor maligne, fiind reprezentate de inversii, translocații, deleții, prezența cromozomilor inelari și prezența cromozomilor dicentrici (Fig.4.).
Fig.4. Modificări cromozomiale în celulele tumorale.
Modificări biochimice – apar mai ales alterări ale metabolismului proteic și glucidic, precum și ale metabolismului acizilor nucleici. Celula malignă are o rată crescută de sinteză a proteinelor, ADN-ului și ARN-ului. Metabolismul celulelor maligne este glicolitic anaerob, creșterea ratei diviziunii celulare fiind corelată cu creșterea glicolizei. Creșterea transportului trans-membranar în celulele tumorale se corelează cu o activitate metabolică mult crescută în celula canceroasă, factor determinant pentru multiplicarea necontrolată a acestora. Se produc la nivelul membranei celulare modificări de permeabilitate ce permit trecerea în celulă în special al unor zaharuri și aminoacizi. Creșterea transportului zaharurilor și al aminoacizilor nu este responsabilă de status-ul malign al celulei, ci reprezinta mai degraba consecința transformării maligne. O altă dimensiune a transportului este exportul (alterarea secreției). Alterarea exportului este rezultatul fie al producerii în exces a unei secreții normale, fie al producerii unei secreții anormale determinată de activarea inadecvată a unor gene ("turned-off genes"). Un exemplu de secreție anormală ar fi cea a hormonilor ectopici (ACTH, gonadrofine, ADH etc). De asemenea, o relevanță directă a tulburărilor de secreție este reprezentată de exportul anormal de proteaze, cu rol în procesele de degradare apărute în cursul metastazării si a extensiei locale;
SISTEMELE GENICE – Procesul malign este consecința alterării mutaționale a unei gene normale, numită proto-oncogenă, care devine anormală sau oncogenă, precursoare a cancerului. Oncogena poate determina transformarea celulelor stem în celule maligne, de aici rezultând clona celulară malignă. Prin mutații genetice se pot produce fenotipuri celulare tumorale dominante (gena se manifestă la heterozigoți, având fenotip manifest) sau recesive (gena se manifestă la homozigoți, având fenotip manifest). În prezent se cunosc aproximativ 100 de oncogene, iar pentru declanșarea procesului malign uneori sunt necesare implicarea mai multor oncogene, alteori însă este necesară doar o singură oncogenă pentru a declanșa procesul de promoție a celulei normale [5-7].
Menționăm sistemele genice implicate în oncogeneză ca fiind următoarele: oncogenele, rezultate din proto-oncogene, anti-oncogenele (genele supresoare tumorale), sistemul de reparare al leziunilor ADN și sistemul genic de metabolizare a carcinogenilor exogeni (Fig.5.) [7].
Oncogenele – au în general caracter dominant fiind forme aberante structural și funcțional ale proto-oncogenelor care favorizează proliferarea malignă a clonei celulare formate. Au rol în evoluția locală a tumorii și metastazarea la distanță, precum și în selecția clonelor agresive rezistente la tratament [7].
Proto-oncogenele – sunt genele normale responsabile de creșterea diferențierea și proliferarea celulelor stem normale, iar prin mutația lor apar oncogenele. Pentru devoltarea fenotipului canceros sunt necesare aproximativ 6-7 mutații, dar uneori în cancerele agresive o singură mutație este suficientă. După transformarea proto-oncogenei în oncogenă, aceasta va determina creșterea și proliferarea aberantă a celulelor precum și lipsa lor de diferențiere. Mecanismele prin care proto-oncogenele se transformă în oncogene cuprind: mutația punctiformă, translocația, amplificarea genică, rearanjarea genică și inserția virală. Exemple de oncogene care sunt responsabile de dezvoltarea unor cancere: c-abl determină leucemia mieloidă cronică, c-gip – cancer ovarian, C-erbB2- adenocarcinom mamar, ovarian și de stomac, c-myc – cancer pulmonar, de sân și de col uterin, c-ret – cancer tiroidian [7].
Fig.5. Sistemele genice implicate în oncogeneză: oncogenele, rezultate din proto-oncogene, anti-oncogenele (genele supresoare tumorale), sistemul de reparare al leziunilor ADN și sistemul genic de metabolizare a carcinogenilor exogeni [7].
Anti-oncogenele – au ca principală funcție inhibarea multiplicării celulare. Sunt în general gene recesive, iar când ambele alele din cuplu sunt inactivate, ele pot contribui la dezvoltarea cancerului deoarece este inactivat controlul multiplicării celulare, astfel celulele se pot multiplica aberant și necontrolat. Anti-oncogenele se mai numesc și gene supresoare tumorale, deoarece inactivează procesul de creștere și multiplicare celulară atunci când acesta a atins pragul critic. Inactivarea genelor supresoare este responsabilă de dezvoltarea fenotipului canceros, câteva din anti-oncogenele implicate în cancer fiind următoarele: gena p53 – cancer pulmonar cu celule mici, sindrom Li Fraumeni și cancer mamar, gena NF2 este implicată în producerea neurofibromatozei de tip 2 care este o stare precanceroasă, gena WT-este implicată în nefroblastom ereditar, genele MCC și OCC – cancer colorectal, gena RB – retinoblastom [7].
Gena RB1 – implicată în retinoblastom se află pe cromozomul 13q14, supresia acestei gene fiind întâlnită și în osteosarcom și unele cancere pulmonare cu celule mici.
Gena p53 – este localizată pe cromozomul 17p13 și este responsabilă de codificarea unei proteine care oprește celulele să intre în faza S a ciclului celular, când se sintetizează ADN. Ea controlează de asemenea și apoptoza. Fumul de țigară, unele virusuri și razele UV pot modifica gena p53 conducând la mutații cu apariția de cancer pulmonar, colorectal, hepatic sau de col uterin (Fig.6.) [7].
Fig. 6. Gene implicate în cancerul colorectal
Sistemele de reparare a leziunilor ADN – atunci când sunt deficitare induc instabilitatea cromozomială care reprezintă stări pre-canceroase, fiind asociate cu un risc oncogen crescut. Dacă aceste sisteme nu funcționează eficient și corespunzător, anomaliile se acumulează foarte rapid, astfel încît o proto-oncogenă poate deveni oncogenă, iar o genă supresoare tumorală (anti-oncogenă) poate fi inactivată (Fig.7.) [6,7]. Principalele sisteme de reparare a leziunilor ADN sunt:
Sistemul de excizie și reparare a leziunilor determinate de agenți alchilați;
Sistemul de reparare a leziunilor determinate de razele X;
Repararea conformațională a ADN-ului prin topoizomeraze.
Genele metabolismului carcinogenilor exogeni sunt responsabile de metabolizarea toxinelor care afectează organismul. Carcinogenii externi suferă în organism un proces de oxidare prin citocromul p450, urmat de conjugare sub controlul transferazelor, astfel fiind descompuși în metaboliți care vor fi eliminați din organism. Dacă acest sistem de metabolizare este deficitar, metaboliții rezultați din fazele intermediare ale procesului de distrugere al carcinogenului pot ataca materialul genetic al celulei, prin urmare pot apărea cancere [7].
Se estimează că aproximativ 5-10% din cancere au determinism genetic, însă pe măsură ce citogenetica se dezvoltă, acest procent tinde să crească peste 30% [1,2,7]. Cancerele determinate genetic pot fi împărțite în două categorii: cancere ereditare și cancere cu predispoziție familială. Cancerele ereditare reprezintă doar 2% din totalitatea cancerelor [1,2,7]. Formele de cancer ereditar sunt moștenite direct de la părinți la urmași și au o frecvență crescută în cadrul aceleași familii, în prezent cunoscându-se aproximativ 50 de forme de cancer ereditar. Dintre caracteristicile importante ale cancerelor ereditare menționăm două, și anume: apariția de cancere în cadrul unor neoplazii endocrine multiple și transmiterea autozomal dominantă a predispoziției către neoplasm. Caracteristicile generale ale cancerelor cu determinism genetic sunt:
Au frecvență crescută în cadrul aceleași familii;
Apar la vârste mici;
Au caracter multifocal (apar mai multe tumori primare în cadrul aceluiași organ);
Au caracter bilateral (în cazul organelor simetrice se dezvoltă bilateral, simetric).
Cancerele ereditare – au mod diferit de transmitere și manifestare în funcție de mecanismul mutațional implicat în dezvoltarea neoplaziei. Astfel întâlnim [1,2]:
Transmiterea directă a procesului malign – prin ADN-ul malign modificat al celulei stem a organului în care se dezvoltă cancerul, cum este cazul retinoblastomului, nefroblastomului și neuroblastomului.
Transmiterea unei gene mutante – BRCA1 și BRCA2 implicate în cancere mamare, ovariene și pancreatice
Transmiterea ereditară a unei afecțiuni cu potențial crescut de malignizare – stare pre-neoplazică. Cele mai cunoscute stări pre-neoplazice și cancerele pe care le generează sunt polipoza adenomatoasă familială (cancer colorectal, gastric și duodenal), neurofibromatoza (neurofibrosarcoame, tumori cerebrale, leucemie acută mieloblastică), sindroame de imunodeficiență (predispoziție către limfoame).
Fig.7. Influența carcinogenilor alimentari aspura frecvenței de apariție a tumorilor.
La om se cunosc aproximativ 200 de mutații care predispun la cancer, pentru apariția fenotipului canceros fiind necesare în jur de 6-7 mutații. Sindroamele de instabilitate cromozomială au ca trăsătură principală incapacitatea de reparare a leziunilor ADN-ului provocate de factori de mediu cum ar fi de exemplu agenții alchilanți. Cancerele care se transmit autozomal dominant de la părinți la urmași sunt retinoblastomul, nefroblastomul, melanomul multiplu atipic familial, sindroamele de tumori endocrine multiple (MEN1 și MEN2) și sindroamele de cancere familiale (mamar, ovarian, gastric, colorectal etc.). Stări de predispoziție către neoplazii transmise autozomal dominant: polipoza colică multiplă familială, neurofibromatoza, sindromul Peutz-Jeghers, scleroza tuberoasă.
Cancerele familiale ereditare -Sunt caracterizate prin incidența anormal de crescută a cancerului cu același tip histologic și aceeași caracterizare în cadrul aceleași familii, cu dezvoltarea neoplasmului la vârste mici și prezența unei stări pre-neoplazice în cele mai multe cazuri. Cele mai importante și mai frecvente cancere familiale ereditare sunt cancerele de colon familiale, melanomul multiplu atipic familial, cancerul mamar ereditar, sindroamele familiale de neoplazii endocrine multiple, cancerele familiale pediatrice (retinoblastom, nefroblastom), neurofibromatoza și sdr Li-Fraumeni.
Există anomalii constituționale (mutații genice), citogenetice (alterări cromosomiale) și metabolice (alterări ale funcționalității enzimelor de reparare al ADN-ului dar și al enzimelor implicate în metabolismul și supraviețuirea celulară) asociate cu risc crescut de cancere, atât în copilărie cât și la vârsta adultă. Ele predispun individul către anumite tipuri de cancere, și nu către cancer în general. Transmiterea lor se face autozomal recesiv. Exemple de stări de predispoziție către cancer și cancerele care le determină: aniridia determină nefroblastom; sdr Beckwith – nefroblastom, corticosuprarenalian; criptorhidia – cancer testicular; malformații genito-urinare – nefroblastom, nevi bazocelulari cutanați – carcinom bazocelular, rabdomiosarcom; mongolism – leucemii, meduloblastom; anemie Fanconi – leucemii, cancere epidermoide, hepatoame; sindromul de ataxie – telangiectazie – leucemii, limfoame.
Anomaliile cromozomiale predispun indivizii către cancere, de exemplu sindromul Down sau trisomia 21 este asociat cu risc crescut de leucemii și limfoame, sindromul Turner este asociat cu cancere genitale, iar sindromul Klinefelter asociază risc crescut de cancer mamar. Sindroamele de instabilitate cromozomială precum anemia Fanconi, sindromul Bloom, Xeroderma Pigmentosum și sindromul Ataxie-Telangiectazie au o transmitere autozomal recesivă și asociază un risc crescut de cancer. Datorită expunerii la carcinogeni exogeni, numărul de anomalii genetice crește în timp favorizând apariția celulei maligne [1-4]. Cele mai multe cauze ale carcinogenezei sunt determinate de leziuni în macromolecula de ADN, anomalii de număr sau de structură a cromozomilor: translocații, deleții, duplicații, inversii și rearanjamente cromozomiale care se transmit ereditar în unele cazuri. De exemplu: leucemia limfatică cronică este asociată cu deleția brațului lung al cromozomului 22 și translocația sa reciprocă cu un segment din crs 9. Limfomul Burkitt prezintă translocație între crs 8 și crs 14 producându-se transformarea malignă a limfocitelor producătoare de imunoglobuline. Cancerul de sân este asociat cu numeroase linii celulare ce prezintă translocații și schimburi între crs 1 și oricare dintre ceilalți cromozomi umani. Sarcomul Ewing este asociat cu translocație între crs 11 și 12. Neuroblastomul este dat de deleția brațului scurt al cromozomilor 1, 2 și 3 iar retinoblastomul este cauzat de o deleție pe brațul scurt al crs 12 [7].
Factorii ambientali
Agenții carcinogeni externi au un rol covârșitor în carcinogeneză, ei fiind reprezentați de:
Substanțe chimice: unele uleiuri minerale care pot induce cancerul de piele, fumul de țigară care poate fi responsabil de cancerul de plămân, benzenul care poate induce leucemia, etc.
Radiațiile ionizante și neionizante care pot induce apariția cancerului de piele,
Unele virusuri, cum ar fi în cazul retorvirusurilor, precum sarcomul Rous determinat de virusul sincițial respirator și virusul HIV care determină SIDA și sarcomul Kaposi. Un cancer foarte frecvent de origine virală este cancerul de col uterin determinat de HPV (Human papiloma virus), al cărui ADN integrat în ADN-ul celulei gazdă dă naștere la numeroase modificări mutaționale. Prevenția acestui cancer se poate realiza prin informarea riguroasă asupra bolilor cu transmitere sexuală, prin reducerea numărului de parteneri sexuali și depistarea leziunilor precanceroase pe colul uterin care se face prin testul Babeș-Papanicolau, un test de citologie exfoliativă cervico-vaginală, asociat cu examenul histologic al leziunilor detectate.
Cancerul este mai frecvent la vârste de peste 40 ani, acest fapt fiind datorat acumulării de mutații de-a lungul timpului, atât la nivelul membranei celulare cât și la nivelul nucleului.
Terapia genică – există numeroase studii care demonstrează importanța terapiei genice aceasta fiind o tehnică de tratament care presupune inserarea unei gene funcționale în genomul unui pacient oncologic și modificarea genomului celulelor tumorale cu scopul corectării unei erori genetice implicate în carcinogeneză.
Există mai multe posibilități prin care se poate realiza terapia genică și anume:
Inserarea în celulele tumorale a unor ”gene suicidare” sensibile la tratamentul chimioterapeutic.
Transferul în genomul individului afectat a unor gene supresoare tumorale care să inhibe acțiunea oncogenelor și să oprească diviziunea anarhică a celulelor tumorale.
Inactivarea oncogenelor prin mecanisme antisens.
Transferul unor gene responsabile de producerea unor citokine, care să stimuleze producția de celule efectoare ale sistemului imunitar și apărarea împotriva celulelor maligne.
Anularea expresiei unor oncogene prin intermediul ribozomilor [7].
II. TIPURI DE ADN ȘI REPARAREA ACESTUIA
Consecințele fenotipice ale diferențelor ce pot apărea în secvența ADN la diferiți indivizi au un spectru larg: unele nu au efect fenotipic sau acesta este minim, altele pot produce direct o stare de boală; între aceste două extreme se plasează variațile fenotipice normale determinate genetic ale morfologiei și fiziologiei organismului, ale comportamentului și personalității individului, ale răspunsului său la factorii externi (de la alimente, la diferiți agenți patogeni sau medicamente). Prin urmare, bolile genetice sunt numai partea cea mai evidentă, extremă, a variabilității genetice.
Sursele de variabilitate
Variabilitatea genetică este produsă prin trei tipuri de fenomene interconectate: mutații, recombinări și migrații. Mutațiile determină modificări în structura materialului genetic al unui individ și creează fondul genetic caracteristic unei populații; migrațiile unor persoane dintr-o populație în altă populație aduc un potențial genic nou, iar recombinările din gametogeneză și fecundare produc un „amestec” al zestrei genetice parentale într-o combinație nouă, specifică descendentului. Cea ce înseamnă că genomul uman nu este o entitate statică, fixă [8].
MUTAȚIILE – Termen folosit pentru prima oară în genetică de către Hugo de Vries, în 1901, prin care se înțelege orice modificare în secvența sau aranjarea nucleotidelor din ADN. Mutațiile pot fi accidentale, permanente și ereditare. Dacă interesează ADN-ul genic, mutațiile pot produce o schimbare detectabilă a fenotipului dar acest lucru nu este întotdeuna obligatoriu. Mutațiile se pot clasifica în trei mari categorii în funcție de mărimea materialului genetic interesat (genă, cromosom, genom):
Mutații genice, care afectează secvența nucleotidelor unei gene; ele pot interesa întreaga genă sau o parte a ei (rearanjări intragenice) sau numai o pereche sau câteva perechi de nucleotide (mutații punctiforme), formând o variantă alelică a genei normale („de tip sălbatic”). Se apreciază o frecvența mutațiilor genice de 10-5 – 10-6 /locus/generație.
Mutații cromosomice, care produc schimbări în structura cromosomilor și deci în ordinea liniară a genelor în cromosomi (remanieri cromosomice: pierderea, câștigul sau rearanjarea unor segmente). Se cunoaște că mutațiile cromosomice se produc cu o frecvență de 10-4 /diviziune celulară.
Mutații genomice („de ploidie”), care afectează cantitatea de material genetic și se traduc printr-o modificare a numărului diploid de cromosomi întregi. Acest tip de mutații afectează fie 1-2 perechi de cromosomi (aneuploidie), fie toți cromosomii, prin adăugarea a 1-2 seturi haploide (poliploidie). Mutațiile genomice sunt cele mai frecvente mutații la om, aproximativ 10-2 /diviziune celulară [8].
Ultimele două tipuri de mutații sunt reunite într-un singur grup numit anomalii cromosomice. O altă clasificare a mutațiilor se bazează pe tipul de celule afectate: germinale (ce vor forma, în gonade, celule sexuale) sau somatice. În cazul, mutațiilor germinale, se pot produce gameți anormali care (în cazul în care individul este fertil), după fecundare, transmit mutația la generația următoare, rezultând un individ ale cărui celule vor fi toate mutante; mutațiile germinale sunt deci ereditare. În al doilea caz, cel al mutațiilor somatice, descendenții unei celule mutante vor forma o clonă celulară anormală, prezentă în anumite țesuturi, rezultând un mozaicism somatic. Se cunoaște că mutațiile somatice nu pot fi transmise generațiilor viitoare [8].
Mutațiile pot fi clasificate în spontane și induse în funcție de cauza care le-a produs. Mutațiile spontane sunt cele mai numeroase și se produc prin erori de copiere în cursul replicării ADN. Deși funcția de autocorecție a ADN polimerazelor reduce semnificativ numărul de erori, mărimea enormă a genomului uman face ca la orice replicare a celor 3 miliarde de nucleotide să apară erori (10-10). Mutațiile induse sunt determinate de agresiunea unor substanțe chimice exogene, a radiațiilor ionizante sau a metaboliților reactivi. Urmările acestor atacuri genotoxice sunt reduse prin intervenția unor sisteme eficace de supraveghere, alarmă și reparare; dovada nedorită a eficacității lor este adusă de mutațiile genelor implicate în aceste procese ce cresc semnificativ rata mutațiilor, producând – cel mai – adesea cancere (Fig.8.) [8].
Fig.8. Modificări fenotipice ale celulei normale cu evoluția către celula neoplazică cu modificarea morfologiei și a genotipului celular.
Consecințele fenotipice ale mutațiilor formează un spectru foarte larg.
Cele mai multe mutații germinale (produse în regiunile necodante ale ADN) nu au un efect fenotipic, sunt mutații neutre. Ele generează variantele alelice ce alcătuiesc polimorfismul ADN, dacă un locus are mai mult de o variantă (alelă) ce se întâlnește în populație cu o frecvență mai mare de 1% (ce face ca producerea ei întâmplătoare să fie improbabilă). Heterozigoția medie a ADN genomic la om a fost apreciată la 0,001 – 0,004 (adică 1:250 – 1:1000 pb diferă prin secvențele alelice). De notat că unele gene, și în special genele HLA, au un polimorfism înalt.
Uneori mutațiile noi pot avea efecte benefice, producând o mai bună adaptare la mediu și/sau o rezistență mai mare la agresiunile ecologice sau o creștere a „aptitudinilor reproductive” („fitness”). Avantajul selectiv al heterozigoților (Na), purtători ai unei gene mutante, se poate înscrie în această categorie. Cert este că mutațiile reprezintă „combustibilul brut care conduce evoluția”.
Deseori mutatiile pot fi patogene, producând o modificare fenotipică evidentă (letală, subletală, morbidă) sau crescând susceptibilitatea la boală.
Până acum ne-am referit la mutațiile germinale, care sunt ereditare. Deși mutațiile somatice nu se transmit la descendenți, nu înseamnă că medical nu sunt importante. Evoluția de la zigot la adult necesită circa 1015 diviziuni celulare; la o frecvență medie de 10-10 erori de replicare per diviziune se produc în genomul fiecărei celule somatice mii de mutații. Efectul lor va depinde de natura mutației, localizarea și țesutul implicat; ele vor produce clonele anormale implicate în cancer, afectări degenerative sau „îmbătrânire” precoce.
Consecințele patogene ale mutatiilor, germinale și somatice, ne permit să afirmăm că mutațiile sunt cauza principală de boală la om [8].
MUTAȚII SPONTANE
Pot fi descries două mecanisme de generare a mutațiilor spontane:
Cea mai importantă sursă de leziuni ADN o reprezintă însuși procesul de replicare. În cursul replicării semiconservative, fiecare catenă a ADN „parental” servește ca matriță pentru sinteza unei noi catene; acest proces, efectuat de polimeraze, implică recunoașterea unei baze din catena matriță și adăugarea complementară a unui nucleotid la capătul 3’ al catenei ce se sintetizează. ADN polimeraza δ catalizează împerecherea corectă a A cu T șu G cu C, făcând rareori erori. Și totuși, datorită unui fenomen de tautomerie (ce implică deplasarea unui atom de hidrogen din nucleotid), acestea pot forma structuri alternative care fac ca bazele să se împerecheze greșit (“mismatch”). ADN polimerazele corectează în mare măsură aceste erori. Acestea sunt mai rare în cazul ADN polimerazei delta, principala polimeraza implicată în replicarea ADN, dar relativ frecvente în cazul altor polimeraze. Pe ansamblu, erorile care rezultă în urma procesului de replicare au o frecvență de aproximativ 50.000/genom/zi. Dar organismul uman posedă alte sisteme de reparare care determină ca rata erorilor de împerechere apărute în cursul unei runde de replicare să fie extrem de redusă, de circa o încorporare greșită la 109 – 1010 nucleotide [8].
Există leziuni care pot să apară spontan, în condiții fiziologice, în absența replicării. De exemplu, hidroliza reziduurilor nucleotidice poate să conducă la situsuri abazice; apariția lor poate fi favorizată de temperaturi crescute și acidifierea mediului celular. Dezaminarea spontană a citozinei, adeninei, guaninei sau 5-metilcitozinei poate conduce la formarea uracilului, hipoxantinei, xantinei și, respectiv, timinei [8].
MUTAȚIILE INDUSE
Mutațiile induse sunt determinate de agenți mutageni externi sau interni, fizici sau chimici. Factorii de mediu extern precum radiațiile ultraviolete (UV) – componentă a radiației solare, radiațiile ionizante și numeroși agenți chimici genotoxici pot cauza diverse alterări în structura ADN (tabelul 1) care, lăsate nereparate, pot conduce la apariția mutațiilor. Pe primul loc ca frecvență în această categorie se află radiațiile ultraviolete, ce produc dimeri pirimidinici. Din punctul de vedere al consecințelor, fumul de țigară este însă cel mai important agent mutagen exogen, acesta fiind responsabil de producerea mai multor decese prin cancer decât orice alt agent exogen cunoscut. Hidrocarburi policiclice se găsesc însă și în produșii de combustie; lor li se adaugă agenți alchilanți/metilanți ce poluează atmosfera, gudroanele de ulei, medicamente antitumorale, diverse minerale sau metale. Radiațiile ionizante (X, gama) induc în special rupturi mono- sau bicatenare ale ADN. La om, radiațiile ionizante – din surse naturale, profesionale, medicale sau accidentale – au probabil consecințe genetice mici (datorită eficacității mecanismelor de reparare a leziunilor) reprezentate cel mai adesea sub formă de mutații recesive, care se vor manifesta numai dacă se întâlnesc doi heterozigoți cu o mutație identică [8].
Tabelul 1 Tipuri de leziuni ADN și agenții etiologici ai acestora
MECANISMELE REPARĂRII LEZIUNILOR ADN
Genomul uman suferă numeroase și variate leziuni – spontane sau induse de agenți externi sau interni. Totuși rata mutațiilor este menținută la un nivel scăzut prin intervenția unor sisteme de recunoaștere a leziunilor ADN și reparare enzimatică, care realizează fie o restituție fidelă a structurii inițiale fie o reparare parțială, cu defect. Acțiunea acestor sisteme este corelată cu mecanismele care coordonează progresia prin ciclul celular, tolerarea unor leziuni sau apoptoza. Nici unul dintre mecanismele de reparare ale ADN nu are o eficiență absolută dar, în general, performanța lor este ridicată. Existența unor boli umane asociate cu defecte în repararea ADN, multe din ele având o creștere a susceptibilității la cancer, demonstrează importanța acestui proces de “control al calității ADN” [8].
MECANISMELE DE REPARARE ALE ADN NUCLEAR
Repararea erorilor de împerechere din cursul replicării ADN.
În momentul în care cele două catene ADN sunt separate, nucleotidele activate se aranjează "spontan" și pe bază de complementaritate pe întreaga porțiune a matriței de ADN astfel expusă. Stoichiometria reacției de poziționare pe bază de complementaritate permite împerecheri greșite (în special G-T) cu o probabilitate de 1 la 10.000. În plus, replicarea secvențelor repetitive ale ADN se însoțește relativ frecvent de fenomenul de “alunecare (glisare)” (slippage) a ADN-polimerazei, ceea ce conduce la formarea unor bucle de către una din catene cu alungirea (inserție) sau scurtarea (deleția) secvenței repetitive (Fig.9.). Rata mutațiilor este, însă, mult mai mică datorită intervenției unor mecanisme care asigură fidelitatea replicării și păstrarea informației ereditare.
Un prim mecanism implică ADN polimerazele care nu catalizează încorporarea pasivă a oricărui nucleotid care este deja legat prin punți de hidrogen la catena matriță, ci discriminează activ împotriva unor împerecheri greșite, acestea producând distorsiuni a dublului-helix ADN. Distorsiunile acționează ca semnal pentru îndepărtare bazei inserate greșit. Mecansimul crește acuratețea replicării de aproximativ 100 de ori, reducând rata așteptată a erorilor de la 10-4 la aproximativ 10-6 [8].
Fig.9. Repararea ADN prin excizia de nucleotide
Un alt mecanism major răspunzător pentru acuratețea replicării ADN este activitatea de autocorecție (sau editare de la proofreading) a ADN polimerazelor. Ca un veritabil "editor", ADN polimerazele verifică dacă ultimul nucleotid plasat la capătul 3'OH al catenei de ADN este "scris corect", deci dacă nu există o greșeală de împerechere. In cazul unei astfel de erori ele pot să-l excizeze (datorită capacității exonucleazice 3' – 5' pe care o posedă) și să-l înlocuiască cu nucleotidul corespunzător. O astfel de activitate, demonstrată pentru ADN polimerazele delta si epsilon, permite creșterea acurateței replicării ADN de circa 100-1000 ori (Fig. 10.).
Fig.10. Mecanisme de reparare ADN.
În sfârșit, puținele erori de împerechere care apar totuși în ciuda intervenției mecanismelor mai sus amintite vor fi ținta unor mecanisme de reparare a erorilor de împerechere (MMR de la mismatch repair) ce intervin după replicare.
Sistemul MMR a fost descris inițial la E.coli cu fenotipul mutator (mut), ce determină o creștere a ratei mutațiilor spontane pentru toți locii din genomul bacteriei. Sistemul implică intervenția unor proteine speciale (proteine mutator): Mut S, Mut L și Mut H – ce formează așa numitul sistem de reparare “direcționat metil”. Denumirea derivă de la mecanismul de identificarea a catenei care conține nucleotidul împerecheat greșit. Această funcție pare a fi asigurată de diferența în statusul de metilare care există între catena nou sintetizată (nemetilată) și catena matriță (metilată). În esență, împerecherea greșită produce o distorsiune a catenei nou sintetizate, nemetilată, recunoscută de proteina Mut S care se fixează la catenă și „recrutează” proteinele Mut L (care stabilizează complexul), Mut H (cu acțiune endonucleazică) și o helicază (Mut U, care desface duplexul ADN). Mut H va cliva catena de ADN și fragmentul de circa 100 pb va fi îndepărtat de o exonuclează. Golul rezultat va fi reparat de către ADN polimeraza, folosind secvența de baze a matriței. Pasul final este realizarea legăturii fosfodiester de către ADN ligază.
La om au fost identificate genele care codifică proteinele MSH 2, MSH3 și GTBP (sau MSH6) – omologe cu Mut S – precum și proteinele MLH1, PMS1 și PMS2 – omologe cu Mut L. Nucleotidele împerecheate greșit sunt identificate prin intermediul a două complexe: MSH2/MSH6 (GTBP) care recunosc în special erorile de împerechere și MSH2/MSH3 care recunosc preferențial micile inserții/deleții. După recunoașterea erorii de împerechere, intervin complexele heterodimerice MLH1/PMS2 și MLH1/PMS1 ce interacționează cu complexele legate anterior (Fig.11). În continuare, procesul de reparare presupune secționarea și degradarea exonucleazică a unui fragment ADN cu o lungime de peste 1-2 kb (ce conține erorile de replicare), urmată de refacerea secvenței normale. Pentru aceste acțiuni, mecanismul de reparare utilizează o serie de factori comuni altor sisteme de reparare (ADN-polimeraza δ, RPA, PCNA, factorul de replicare C (RFC), exonucleaza 1, FEN1 și exonucleazele asociate ADN-polimerazelor δ și ε). Mutațiile genelor implicate în calea MMR au drept consecință o boală genetică, relativ frecventă, numită cancerul colorectal nonpolipozic ereditar (HNPCC), responsabilă de apariția a circa 5% din toate cazurile de cancer colorectal; boala se asociază un risc relativ crescut pentru dezvoltarea unor neoplazii maligne cu alte localizări.
Fig. 11. Identificarea nucleotidelor împerecheate greșit și repararea prin excizie, resinteză și ligare a ADN-ului.
Există câteva caracteristici ale neoplasmelor colorectale care apar în cadrul HNPCC: 70% sunt localizate proximal de flexura splenică, există un exces de cancere mucinoase sau cu infiltrație limfocitară iar evoluția pare a fi mai bună. Markerul principal al celulelor cu HNPCC este instabilitatea microsateliților (secvențe di-, tri- sau tetranucleotidice înalt repetitive, dispersate în genom). Circa 60-70% din cazurile de HNPCC sunt determinate de mutații ale genelor MLH1 și MSH2; un număr redus de cazuri sunt asociate cu mutații ale genelor PMS1, PMS2 și MSH6.
Repararea bazelor modificate sau alterate după replicare
În afara erorilor ce se produc în timpul replicării, o altă sursă de mutații este modificarea chimică sau alterarea bazelor azotate după replicare. Leziunile ADN produse de agenți endogeni sunt îndepărtate de obicei prin mecanismul de excizie a bazelor (BER) modificate și mai rar prin reparare directă monoenzimatică (MGMT). Agenții mutageni exogeni care produc distorsiunea dublului helix prin legături încrucișate intra- sau intercatenare; aceste alterări sunt îndepărtate prin excizia nucleotidelor (NER).
Mecanismele BER, NER și chiar a MMR sunt variante ale unui mecanism general de reparare prin excizie-resinteză, ce diferă prin ținta lor, modul de recunoaștere a leziunii și moleculele efectoare. Acest mecanism se realizează în mai multe etape:
recunoașterea situsului lezat (bază sau nucleotid), prin acțiunea unor enzime specifice;
desfacerea dublului helix, de către o helicază;
excizia fragmentului de ADN alterat și a unui segment învecinat leziunii, prin intervenția unor endonucleaze;
îndepărtarea și degradarea fragmnetului, de către exonucleaze;
resinteza componentelor breșei/lacunei (folosind ca matriță catena de ADN complementară) prin acțiunea unor ADN polimeraze;
realizarea, de către o ADN ligază, a legăturii fosfodiester între fragmentul de ADN neosintetizat și capetele libere ale catenei de ADN.
Repararea prin excizia bazei (Base Excision Repair- BER). O bază modificată chimic (frecvent prin dezaminare spontană) este îndepărtată prin intermediul unor ADN-glicozilaze care clivează legătura glicozil dintre baza azotată și deoxiriboză. Se creează astfel un situs abazic care este recunoscut de către endonucleaza APE1 (apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1), enzimă cu rol cheie în calea de reparare BER la om; această enzimă clivează catena ADN pe flancul 5’ al situsului abazic.
Apoi intervine polimeraza β care îndepărtează reziduul 5’-deoxiribozo-fosfat (dRp), inseră nucleotidul corespunzător catenei matriță și recrutează complexul ligază 3 – XRCC1, care va reface continuitatea catenei. În unele cazuri reziduul 5’-deoxiribozofosfat rezistă la acțiunea polimerazei β, fiind necesară o cale alternativă, cu intervenția polimerazei δ și îndepărtarea a 2 – 13 nucleotide (“long-patch BER”). În această cale alternativă, minoră la om, intervine și PCNA (antigenul nuclear al celulelor proliferante) și nucleaza FEN1 care împiedică formarea unor structuri secundare de către porțiunile ADN monocatenare apărute intermediar. Continuitatea catenei va fi restabilită de această dată de către ligaza 1 (Fig. 12).
Repararea directă mono-enzimatică (MGMT). Prin intervenția unor cataboliți celulari reactivi se formează O6-metilguanina. În acest caz se produce o reparare directă, prin intervenția enzimei metilguanin metil transferaza (MGMT); aceasta transferă gruparea metil de la nivelul O6-metilguaninei pe un reziduu propriu de cisteină (Fig. 13) formând 5-metilcisteina, o moleculă foarte stabilă, care inactivează enzima.
Repararea sacrifică în întregime o moleculă proteică pentru fiecare leziune corectată. De aceea, acest mecanism de reparare este foarte rapid saturat atunci când organismul este supus unor agenți alchilanți exogeni.
Fig.12. Mecanismul BER de reparare ADN prin excizia bazei modificată chimic
Fig.13. Metilarea nucleotidelor.
Repararea prin excizia nucleotidelor (Nucleotid Excision Repair – NER). Calea de reparare NER este utilizată pentru corectarea a diferite tipuri de leziuni ADN asociate cu distorsiunea structurii dublu-helicoidale, precum dimerii de pirimidină produși de radiațiile UV sau modificările chimice determinate de benzpiren, aflatoxină și cisplatin. Acest sistem de reparare este complex și implică un număr mare de proteine și gene.
Aceste gene au fost identificate la pacienți cu diferite mutații ce produc trei afecțiuni rare: xeroderma pigmentosum (XP), sindromul Cockayne (CS) și o formă cu fotosensibilitate a trichotiodistrofiei (TTD). Trăsătura comună este sensibilitatea foarte accentuată la expunerea solară ca urmare a reparării deficitare a leziunilor ADN induse de radiațiile UV; în schimb, celelalte manifestări clinice sunt extrem de diferite. Pacienții cu XP prezintă o creștere foarte accentuată, de peste 2000 de ori, a riscului pentru apariția unui cancer cutanat și, în multe cazuri, o neurodegenerare accelerată. Pacienții cu CS prezintă anomalii neurologice degenerative progresive foarte severe și manifestări de îmbătrânire precoce. TTD este caracterizată prin aspectul fragil al părului și unghiilor, precum și unele trăsături prezente și în CS. Heterogenitatea clinică este consecință heterogenității genetice. Pentru XP sunt identificate 7 gene (XPA – XPG). În cazul CS sunt implicate 5 gene: CSA, CSB și alele specifice ale XPB, XPD și XPG. TTD varianta cu fotosensibilitate este determinată de mutația a 3 gene: din nou XPB și XPD, precum și TTDA. Mecanismul prin care este recunoscută leziunea ADN este o problemă încă mult discutată. În prima etapă intervine un complex specific (XPC-hHR23B) care recunoaște distorsiunea ADN produsă de agenții mutageni și localizează catena lezată. A doua etapă implică întreruperea activității helicazelor (XPB și XPD din structura TFIIH) și, în cazul particular al leziunilor induse de radiațiile UV, fixarea la acest nivel a unui factor specific (UV-DDB, alcătuit din subunitățile p125 și p48). Următoarea etapă în calea NER este formarea la nivelul leziunii a unui macroagregat proteic necesar pentru incizia duală a catenei care conține leziunea. După îndepărtarea unui fragment de 24-32 de nucleotide care conține leziunea, are loc resinteza ADN, prin intermediul ADN polimerazei δ sau ε, și legarea capetelor, prin intermediul ligazei 1 (Fig.14.).
Fig. 14. Repararea prin excizia nucleotidelor (Nucleotid Excision Repair – NER)
Modelul descris mai sus este utilizat pentru repararea ADN-ului netranscris, majoritar în genom. În cazul special al genelor transcrise, leziunile care impiedica activitatea de elongare realizată de ARN polimeraza II în cursul transcriptiei sunt reparate printr-un sistem cuplat cu transcriptia (transcription-coupled repair – TCR). Corectarea este realizată de 5-10 ori mai rapid, cu participarea acelorași factori utilizați pentru ADN-ul netranscris (cu excepția XPC). Semnalul de recunoaștere a leziunii este blocarea progresiei ARN polimerazei II. În plus, intervin și proteinele CSA și CSB (implicate în sindromul Cockayne), care au rolul de a cupla activitatea ARN polimerazei II cu mecanismul de reparare.
Repararea rupturilor ADN
Rupturile monocatenare ale ADN sunt produse de speciile reactive de oxigen și reparate prin intermediul enzimelor responsabile de ultimele etape ale mecanismului BER.
Rupturile bicatenare ale ADN, mai rare decât cele monocatenare, pot apărea fie spontan (în cursul replicării, recombinării meiotice sau recombinării somatice VDJ, ce are loc în sinteza imunoglobulinelor), fie ca urmare a expunerii la radiațiile ionizante. Repararea rupturilor bicatenare este un proces complex care se realizează în mai multe etape. Prima etapă constă în sesizarea prezenței unei rupturi ADN bicatenare, prin intervenția probabilă a unui complex multiproteic numit BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex). Următoarea etapă este una de semnalizare, care implică activitatea a două kinaze înrudite: ATM și ATR. Acestea produc activarea unor proteine importante pentru repararea propriu-zisă (NBS1 sau BRCA1) sau blocarea ciclului celular, la nivelul punctului de control G2/M (prin intermediul proteinelor MDM2 și P53). După aceste etape comune, celula alege unul din mecanismele alternative de reparare: recombinare omologă sau unirea neomologă a capetelor.
Recombinarea omologă (homologous recombination – HR) este mecanismul cel mai frecvent utilizat la om și este un mecanism de reparare precis, care utilizează pentru reparare o catenă de ADN intactă de pe cromatida soră sau de pe cromosomul omolog; Recombinarea omologă debutează prin procesarea inițială a capetelor rupte de către complexul NBS1-MRE11-RAD50 (activat de către proteina ATM) care va conduce la formarea unor capete 3’ monocatenare. RAD52 se atașează la capetele monocatenare astfel formate și le protejează. Apoi, ADN-ul intact de la nivelul cromatidei soră sau a cromosomului omolog este utilizat ca matriță pentru a înlocui informația genetică în cursul procesului nucleolitic. În final intervine o etapă de ligare care completează acest mecanism de reparare a ADN.
Unirea neomologă a capetelor (non-homologous end-joining – NHEJ) un mecanism predispus la erori (mici inserții sau deleții), în care capetele rupte ale ADN sunt unite fără nici o omologie, ori cu ajutorul unor secvențe omologe scurte (< 10 pb).
Unirea neomologă a capetelor rupte debutează prin legarea heterodimerului KU70/KU80 la nivelul capetelor ADN care activează apoi o protein kinază ADN-dependentă. Intervine, de asemenea, complexul NBS1-MRE11-RAD50 care are atât activitate enzimatică cât și structurală. Una dintre activitățile importante ale proteinei NBS pe această cale este activarea recombinazelor RAG1 și RAG2 (care intervin în procesul de recombinare VDJ din cursul sintezei imunoglobulinelor). Complexul XRCC4/ligază 4 este necesar pentru unirea capetelor rupte. Repararea poate fi în acest caz fie precisă, fie cu pierderea sau adiția unor nucleotide ceea ce conduce la o mutație.
Mutațiile genelor care codifică proteine ce intervin în repararea rupturilor ADN pot determina numeroase boli: ataxia telangiectazia, sindromul Nijmegen, sindromul Bloom, anemia Fanconi, cancerul de sân ereditar. Majoritatea lor implică mutații ale proteinelor ce intervin în calea HR și au transmitere recesivă, deși există și exemple de boli cu transmitere dominantă.
Ataxia telangiectazia (AT) este o afecțiune rară (circa 1 la 100.000 locuitori), care se manifestă clinic prin ataxie (datorită unei degenerări neuronale progresive), prezența telangiectaziilor vizibile în special la nivelul conjunctivei bulbare, radiosensibilitate, imunodeficiență și un risc crescut pentru apariția cancerelor, mai ales a limfoamelor. Heterozigoții (circa 1% din populație) au un risc crescut pentru cancerul de sân. Boala este determinată de mutația genei ATM (cromosomul 11q22) care codifică o protein kinază ce activează numeroase proteine implicate în căile de reparare ale rupturilor ADN sau în punctul de control G2/M a ciclului celular.
Cancerul de sân ereditar este una dintre cele mai frecvente boli genetice (circa 1 la 800 de indivizi) caracterizată printr-un risc crescut de apariție a unui neoplasm mamar (36-85%), precum și pentru cancerul de ovar (16-60%). Debutul bolii este adeseori precoce și uneori bilateral. Au fost identificate două gene: BRCA1 (17q21) și BRCA2 (13q12) ce codifică proteine care interacționează cu RAD51 în calea de reparare HR a rupturilor ADN bicatenare.
REPARAREA LEZIUNILOR LA NIVELUL ADN MITOCONDRIAL.
Absența histonelor cu rol protector și mediul foarte bogat în specii reactive de oxigen rezultate în cursul sintezei ATP fac ca ADN-ul mitocondrial să fie mult mai susceptibil la anumite tipuri de leziuni comparativ cu ADN-ul nuclear. În prezent se cunoaște că la nivelul acestor organite funcționează unele mecanisme de reparare prezente și la nivel nuclear, în timp ce altele sunt absente [8].
Fig.15. Repararea leziunilor ADN mitocondrial.
Astfel, mitocondriile prezintă capacitatea de reparare a O6 metilguaninei prin intermediul enzimei MGMT. De asemenea, au fost identificate numeroase componente care intervin în mecanismul BER, precum unele ADN glicozilaze, endonucleaza APE1 etc. În schimb, mecanismul NER este absent. Rata mutațiilor care persistă în urma intervenției acestor mecanisme de reparare este considerată a fi de 10 ori mai mare decât în cazul genomului nuclear și aceasta contribuie la procesul de îmbătrânire și la apariția unor boli degenerative (Fig.15) [8].
TOLERAREA LEZIUNILOR ADN
În punctele de control ale ciclului celular sunt declanșate mecanismele care blochează progresia celulelor cu leziuni ale ADN pentru a permite repararea lor înaintea replicării. Dar aceasta viziune este o suprasimplificare deoarece în prezent devine tot mai clar faptul că, în anumite condiții (de exemplu, „saturarea” mecanismelor de replicare datorită leziunilor prea numeroase) celulele pot tolera unele dintre leziunile ADN, fără a le corecta. Când ajung în dreptul leziunii catenei matriță, ADN polimerazele sunt confruntate cu următoarea alternativă:
inseră la întâmplare un nucleotid și depășesc astfel „punctul critic”, replicând restul ADN din replicon; celula supraviețuiește dar leziunea ADN persistă; efectul va depinde de localizarea leziunii în genom;
lasă o breșă în catena nou sintetizată și reiau replicarea în aval de locul leziunii; lacuna produsă poate fi uneori rezolvată ulterior (prin intervenția unui sistem enzimatic de recombinare postreplicativă).
Prin ambele alternative se poate corecta leziunea sau se produce o reparare infidelă, cu defect.
III. AVANTAJELE REPROGRAMĂRII METABOLICE ÎN CELULELE TUMORALE
Prima modificare specifică tumorii, la nivel celular este modificarea metabolismului acesteia, descoperită în 1920 de Otto Warburg laureate al premiului Nobel. Această modificare la nivelul celulei tumorale a fost numită și fenomenul „Warburg” și constă în creșterea glicolizei menținută în condiția unei presiuni variabile a oxigenului (glicoliza anerobă) determinând o producție mare de lactat [9,10]. Suplimentar, sau alternativ, celula canceroasă utilizează cantități mari de glucoză ca sursă de carbon pentru reacții anabolice. Fenomenul Warburg nu este valabil pentru toate tipurile de cancer [11], dar creșterea preluării de glucoză este destul de importantă încât este utilizată în clinică pentru imagistica sa prin utilizarea analogului glucozei marcat cu izotopi de fluor: 2-(18F)-fluoro-2-deoxi-D-glucoză (FDG) pentru tomografia cu emisie de pozitroni (PET). Tehnica FDG-PET asociată tomografiei computerizate (PET/CT) asigură o sensibilitate >90% și specificitate pentu detectarea metastazelor în cele mai multe cancere epiteliale [12].
Există mai multe motive pentru care reacțiile anabolice adică creșterea preluării glucozei este necesară în producerea ATP-ului glicolitic reprezentând un avantaj în creșterea tumorală (Fig. 16):
Primul motiv ar fi că, utilizând glicoliza anaerobă, celula poate trăi în situația unei presiuni a oxigenului care variază (din cauza variației hemodinamicii la periferia vaselor sangvine) care ar deveni letală celulelor care depind de fosforilarea oxidativă (OXPHOS) pentru producerea de ATP-ului [13].
Al doilea, celula canceroasă produce metabolic acid bicarbonic și lactic, iar lactatul este principalul produs final al glicolizei anaerobe. Acești acizi condiționează microclimatul [14], favorizând invazia tumorală [15] și reducând efectorii imuni anticanceroși [16]. Lactatul produs de celulele tumorale este preluat de celule stomale (prin transportorii monocarboxilat MCT1 și MCT2) producând piruvatul care realimentează celula canceroasă sau poate fi utlizt pentru fosforilarea oxidativă [14]. Acest circuit realizează un micromediu în care părțile anaerobe (celulele canceroase) și cele aerobe (celulele stromale netransformate) sunt intricate în căi metabolice complementare, asigurând tamponul și recircularea produșilor metabolismului anaerob pentru a susține supraviațuirea celulei canceroase dar și creșterea ei.
Al treilea, celula tumorală poate metaboliza glucoza pentru a produce nicotinamida adenin dinucleotid fosfat (NADPH) utilizând calea pentoz-fosfaților (PPP), care reprezintă apărarea sa antioxidativă contra microclimatului ostil și contra agenților chimioterapeutici [17]. NADPH poate și mai mult, contribuind la sinteza acizilor grași. Partea neoxidativă a căii pentoz-fosfaților PPP (în care riboza 5-fosfatul un intermediar al PPP, este ars în glicoliză) este contolată prin reacții catalizate de două transferaze: transcetolaze și isoforma transcetolaza-1(TKL1) și este mult crescută în canerele multiple [18,19]. Transcetolaza este enzima cheie a etapei neoxidative a căii pentozofosforice, care catalizează transformarea glucozei în ribozo-5-fosfat. Ribozo-5-fosfat este substratul sintezei acizilor nucleice. Prin inhibarea transcetolazei nu mai are loc sinteza ARNm, și nici replicarea ADN-lui. Prin acest mecanism citostaticele inhibă indirect sinteza ADN-lui, iar unele medicamente cu acțiune similar citostaticelor, pot transformă glucoza neutilizată prin calea PPP în acizi grași și aminoacizi. Astfel încât, prin acest proces celulele tumorale vor avea un mecanism asemănător celulelor normale.
Fig.16. Reprogramarea metabolică în celulele tumorale
Al patrulea și cel mai important, celula canceroasă utilizează intermediari ai căii glicolitice în reacții anabolice (de exemplu glucoza 6-fosfat pentru sinteza glicogenului și a ribozei 5-fosfat, dihidroxiaceton fosfatul pentru sinteza triacilgliceridei și a fosfolipidului, iar piruvatul pentru sinteza alaninei și maltului) [17]. Izoforma embrionară a piruvat kinazei (PK), care defosforilează fosfoenolpiruvatul (PEP) la piruvat, este prezentă în cantitate mare în celula tumorală dar absentă în țesuturile adulte cu excepția celui adipos [20]. De remarcat că această izoformă a piruvat kinazei PKM2 are o activitate variabilă de la activitate mare (forma tetramerică) la cea mică (forma dimerică) [20,21]. Forma dimerică a PKM2 cu activitate redusă, asigură un avantaj metabolic pentru că fosfo-metaboliții din amonte ai piruvatului se acumulează și devin disponibili ca precursori ai sintezei aminoacizilor, acizilor nucleici și ai lipidelor [21] iar producția de lactat este evitată. Acest principiu de ”deviere„ (cel puțin o parte a sa) a intermediarilor din calea glicolitică spre reacții anabolice se aplică și metabolismului piruvatului derivat din glicoliză. În celula canceroasă proliferantă, piruvatul poate intra în ciclul trunchiat al acidului tricarboxilic (TCA sau ciclul Krebs). Produsul acestui ciclu trunchiat TCA este acetil-CoA care iese din matrixul mitocondrial (Fig. 16) devenind disponibilă pentru sinteza acizilor grași, colesterolului și izoprenoizilor. Sintaza acizilor grași (FASN) sintetizează acizi grași cu lanț lung din acetil-CoA, malonil-CoA și NADPH, această enzimă fiind activată sau crescută în multe cancere [22]. Colinkinaza (ChoK) care formează fosforilcolina, apare asemănor mult crescută în cancer [23].
Întregul metabolism este astfel reorganizat (în special glicoliza dar și ciclul TCA) pentru amplificarea reacțiilor anabolice legate de creșterea celulei și a proliferării. Apare greu de a împăca creșterea producției de lactat (ce determină o pierdere clară de carbon care ar fi putut fi utilizată pentru anabolism) cu scăderea activității PK (ce ar fi redus mai repede nivelul piruvatului și astfel producerea de lactat) și a ciclului trunchiat TCA (care ar fi utilizat piruvatul) decât dacă consumul net de glucoză n-ar fi fost mai mare în celula canceroasă decât în cea normală.
Mecanismele reprogramării metabolice
Reprogramarea metabolică în celula canceroasă are în spate mecanisme moleculare complexe (Fig.17). Au fost suspicionate defecte primare ale fosforilării oxidative OXPHOS pentru a explica fenomenul Warburg, întrucât mitocondria celulei tumorale este destul de mică și este deficitară în subunitatea β-F1 a ATP-(sint)azei [24]. Mutații ale ADN-ului mitocondrial (ADNm) pot apare ca rezultat al progresiei tumorale [25], dar unele mutații ale ADNm pot contribui activ la progresia tumorală. Prezența unui ADNm mutant pentru a doua subunitate a NADH dehidrogenazei (în cazul carcinomului scuamos de cap și gât) stimulează glicoliza anaerobă, concomitent cu producerea de specii reactive de oxygen ROS și cu creșterea tumorală [26].
Fig.2: Mecanisme moleculare ale cancerului – reprogramarea metabolică specifică. Prin activarea oncogenelor se produc diferite transformări și are loc reprogramarea metabolică. GLUT = transportor glucoză, HK = hexokinază, VDAC = canal anionic voltaj dependent, PFK = fosfofructokinază, PGM = fosfoglicerat mutază, PKM2 = izoforma M2 a piruvat Kinazei, LDHA = izoforma A a lactat DH-azei, MCT = transportor monocarboxilat, CA9, 12 = anhidarza carbonică 9 și 12, NHE1 = gena care codifică proteina cu importanță în funcționarea pompei Na+/H+, PDK = piruvat DH-aza kinază, SCO2 = sinteza de citocromoxidaza c, ACL = ATP-citrat-liază, FASN = realizarea sintezei acizilor grași, ChoK = colinkinază, CPT = carnitin palmitoil-transferaza.
Unul dintre pricipalele mecanisme ale glicolizei anaerobe este activarea factorului inductor al hipoxiei (HIF), un factor de transcripție care este activat de stresul hipoxic dar și de cel oncogen, inflamator, metabolic și oxidativ [27-29]. HIF-1 este un heterodimer compus din subunități stabile β constitutive și subunități α instabile, care sunt sintetizate sau degradate în condiții de oxigenare normală datorită acțiunii secvențiale a prolil hidroxilazei dependente de oxygen (PHDs) și a ubiquitin VHL ligazei. HIF-1 stimulează conversia glucozei la piruvat și lactat prin creșterea izoformei 1 a transporterului de glucoză (GLUT1), a hexokinazei (HK1 șiHK2, care catalizează prima treaptă a glicolizei) și lactat dehidrogenazei A (LDHA) ca și a transportorului 4 monocarboxilat (MCT4) care este enzima extractoare de lactat [13,28].
Fig. 17. Markeri tumorali și legăturile lor cu metabolismul celulei canceroase. PI3K = fosfatidilinositol 3-kinasă, mTOR = ținta pentru rifampicină la mamifere, HK = hexokinază, VDAC = canal anionic voltaj dependent, VEGF = factorul de creștere a endoteliului vascular, HIF = factorul de inhibare al hipoxiei, Ang-2 = angiopoietin-2, F1F2 ATPase = F1F2 ATPază, SCO2 = sinteza de citocromoxidaza c, p53 = proteina 53, PGM = fosfoglicerat mutază.
HIF-1 scade transformarea piruvatului în acetil-CoA prin piruvat dehidrogenaza (PDH). În acest scop, HIF-1 activează gena care codează PDH kinaza1 (PDK1) care inhibă PDH [29-30]. Acetil CoA intră în condiții fiziologice în ciclul TCA (Krebs), generând donatori de electroni NADH și FADH2 care dau electroni în lanțul respirator – complexul I și respectiv II. Astfel, inhibând PDH si HIF-1 reduce fosforilarea oxidativă OXPHOS. Mai mult, HIF-1 ajută la adaptarea mitocondriei la hipoxie prin activarea subunității COX4-2 citocrom c oxidazei (COX) și LON proteazei care degradează COX4-1 [32]. HIF-1 contrabalansează acțiunea stimulantă a Myc asupra biogenezei mitocondriale reducând astfel masa mitocondrială. Pe de altă parte, HIF-1 acționează împreună cu c-Myc pentru glicoliza aerobă prin inducerea HK2 și PDK1 [33].
Pe langă scăderea presiunii oxigenului, activarea HIF-1 poate fi indusă de tumoră în urma mutațiilor liniei germinale pentru cele două enzime ale ciclului TCA: fumarat hidroxilaza (FH) din matricea mitocondrială și succinat dehidrogenaza (SDH) din membrana internă a mitocondriei. SDH este membru funcțional al complexului II din lanțul respirator. Mutațiile care conduc la pierderea funcției FH sau ale subunităților SDHB, SDHC și SDHD ale SDH determină acumularea intermediarilor din ciclul TCA, fumarat sau succinat, care inhibă competitiv prolil hidroxilaza HIF-1α-cetoglutarat dependentă, enzimă care are ca țintă să distrugă HIF-1α in condiții dependente de oxygen [34]. Aceste exemple ilustrează că inducerea HIF-1 poate contribui la modificările metabolice și oncogenice induse de disfuncții mitocondriale primare.
Mai mult decât acțiunea principală de activare a HIF-1, oncogenii și genele supresoare tumorale induc reprogramarea metabolică a celulelor canceroase la mai multe niveluri, stabilind multiple legături între biologia celulei tumorale și biochimia sa. Poate cel mai clar exemplu al schimbării de la metabolism aerob la glicoliza anaerobă este reprezentată de inactivarea supresorului tumoral p53.
Date importante asupra legăturii cancerului cu modificările metabolice – Celula canceroasă este diferită de cea normală prin multe modificări molecular [35,36]. O serie dintre acestea sunt date de reprogramarea metabolică (Fig. 17).
Importanța și eficiența semnalelor de creștere în celula tumorală
Factorii de creștere activează de obicei receptorul tirozin kinazelor (RTKs), care apoi stimulează două căi importante de semnalizarea kinazelor transmițătoare: calea Ras la Raf la kinaza MAP(ERK) și calea fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K). ERK și PI3K converg să activeze mTOR pentru stimularea creșterii celulare. Majoritatea cancerelor arată mutații activatoare ale reglatorilor de conducere (K-Ras, H-Ras, N-Ras, B-Raf, subunitățile p110a PI3K și RTKs) sau efectorii lor din aval (kinaza Akt și pdk1), sau mutațiile inactivatoare in reglatori negativi ai acestor protein [37]. Există multiple mecanisme prin care activarea constitutivă a semnalelor factorilor de creștere pot determina reprogramarea metabolică asociată cancerului.
Activarea tirozin kinazei inclusiv familiile kinazelor RTK și Scr determină fosforilarea enzimelor pe reziduul tirozinei. Aceasta poate modifica activitatea izoformei piruvat kinazei care apare specific în cancer, PKM2, enzimă ce se leagă de peptidele conținând fosfotirozina [38]. Prin interacțiunea dintre PKM2 și peptidele ce conțin fosfotirozina, PKM2 eliberează activatorul său alosteric, FBP. Se realizează inhibarea activității PKM2 odată ce aceasta trece din forma sa teramerică activă în forma dimerică inactivă [38]. Acest mecanism poate contribui la stimularea reacției anabolice prin tirozin kinaza oncogenă. Inhibarea parțială a PKM2 (care catalizează ultima etapă a glicolizei, piruvatul din amonte) permite intermediarilor glicolizei să „devieze” spre reacții anabolice și tot odată să evite producerea excesivă a piruvatului. Dar, inhibarea doar a PKM2 nu este suficient pentru obținerea reprogramării specifice cancerului, care se bazează pe aspecte suplimentare, incluzând o creștere generalizată a fluxului glicolitic.
Supraactivarea celulară a sistemului PI3K/Akt, în aval de RTKs, mediază o creștere a fluxului glucozei și aminoacizilor prin membrana plasmatică care poate fi atribuită parțial cel puțin activării HIF-1α [13].
Serin-treonin protein kinazele specifice (Akt fosforilat) – Familia de proteine AKT, ai căror membri se numesc și protein kinazele B (PKB): Akt1, Akt2, Akt3, joacă un rol important în semnalizarea celulară. Această familie include 3 gene care codifică cele 3 enzime, membre ale familiei de proteine specifice serin – treonin kinazice.
Akt stimulează prezența unui transportor de glucoză (GLUT1) și determină translocarea altuia (GLUT4) către membrana plasmatică. Akt stimulează glicoliza prin activarea fosforilării 6-fosfofructo-2-kinazei (PFK2) și sinteza acizilor grași prin fosforilarea ATP citratliazei [39]. Prin mecanisme care nu sunt încă complet clare, Akt stimulează asocierea HK1 și HK2 cu mitocondria [40], legând sinteza ATP-ul rezidual din mitocondrie de prima etapă limitantă de viteză a glicolizei. Mai mult, PI3K determină reducerea transcripțională a carnitin palmitoiltransferazei 1A (CPT1A) [50], o enzimă localizată la nivelul membranei externe mitocondriale care catalizează esterificarea acizilor grași cu lanț lung de carnitină, inițiind importul mitocondrial de acizi grași și orientându-I spre β-oxidare. Unul dintre efectele clare ale activării PI3K este inhibarea β-oxidării care contribuie la „dependența de glucoză” a celulei canceroase [41]. PI3K activată, induce FASN, iar activarea fosforilării de către Akt și FASN se corelează pentru tumorile slolide cum ar fi de exemplu cancerul ovarian [22].
mTOR este o kinază serin/treonină, activată în avalul sistemului constitutiv activat PI3K/Akt. mTOR crește translarea proteică dependentă de fragmentul ribozomal cap dar și creșterea celulară, în timp ce inhibă reacțiile catabolice mediate de autofagie. Există studii clinice care au urmărit eficacitatea terapeutică a inhibitorilor mTOR. Creșterea activității căii PI3K/Akt/mTOR induce fosforilarea 4E-BP1, care este inhibitorul factorului de inițiere a translației eukarioticelor elF4E, din care rezultă mărirea activității elF4E și translația dependentă de fragmentul ribosomal cap în cancere. Creșterea elF4E poate fi stimulator tumoral, iar inhibarea sa poate reduce creșterea cancerului xenogrefat uman [42]. mTOT este inhibat de hipoxie și în cancerul de sân crește frecvent prezentarea 4E-BP1 și elF-4G pentru a crește translația factorilor proangiogenic, hipoxia și ARNm independent de fragmentul ribosomal cap și de supraviețuire [43]. Rămâne de investigat contribuția translației dependente de fragmentul ribosomal cap în opoziție cu cea independentă pentru creșterea cancerului.
Alterarea apoptozei celulelor tumorale
Apoptoza celulară alterată este foarte importantă pentru inițierea oncogenezei și este implicată în rezistența la chimoterapice. Celula canceroasă prezintă de multe ori rezistență la permeabilizarea membranei mitocondriale (MMP), care este o etapă decisivă pentru apoptoză [44]. O legătură între inhibarea apoptozei și reprogramarea metabolică poate fi realizată prin asocierea HK cu canalul anionic dependent de voltaj (VDAC). HK s-a văzut că este strâns legat de proteina mitocondrială exterioară VDAC la celula tumorală decât este la celula normală de control [45,46]. Creșterea interacțiunii HK-VDAC poate fi datorată activării constitutive a Akt-ului. Akt determină translocarea HK spre membrana mitocondrială exterioară unde se fixează de de VDAC, probabil pentru că Akt interferă cu fosforilarea VDAC mediată de kinaza 3 glicogen sintaza (GSK3) [40] sau pentru că Akt fosforilează HK [47]. Dacă se asociază cu VDAC, HK poate lega eficient fosforilarea oxidativă OXPHOS de etapa primară limitată de viteză a glicolizei. În plus, Hk poate inhiba MMP, posibil prin acțiunea asupra porului complex de permeabilitate tranzitorie (PTPC) (care implică și VDAC). Conform acestora, peptidele care lezează competitiv interacțiunea VDAC-HK pot induce MMP cu apoptoză consecutivă [48]. De aceea, teoretic, agenții care disociază legătura VDAC-HK ar avea o acțiune duală și ar modifica în sens invers starea hiperglicolitică în timp ceea ce ar facilita inducerea apoptozei.
Defectele complete sau parțiale ale fosforilării oxidative OXPHOS pot determina de asemenea rezistență la apoptoză. Inhibarea completă a lanțului respirator poate suprima activarea proteinelor proapoptotice Bcl-2, Bax și Bak. Indiferent care dintre ele reprezită un mediator aproape obligatoriu pentru MMP. Defecte severe ale OXPHOS care apar în unele cancere, se cuplează automat la blocarea MMP și astfel inhibă apoptoza (Fig. 18). Defectele OXPHOS reduc capacitatea unor xenobiotice de a induce producerea ROS în mitocondrie, astfel oprind activitatea lor apoptotică. Acest ultim mecanism poate explica faptul că celulele po (celule care nu au ADN mitocondrial și fosforilare oxidativă OXPHOS) sunt rezistente la o serie de compuși care induc apoptoza provocând cicluri redox inutile în mitocondrie [44,49]. Astfel o deficiență de OXPHOS ar putea compromite automat calea intrinsecă a apoptozei printr-o varietate de mecanisme distinct (Fig. 18).
Fig. 18. Rezistenta la apoptoză a celulei tumorale.
Alte legături între modificările mitocondriale din cancer și blocarea apoptozei sunt mai mult indirecte. O hiperpolarizare a potențialului transmembranar al interiorului mitocondrial așa cum se vede în celula canceroasă (posibil secundar defectelor la ATPaza F1F0) [49], poate scădea probabilitatea deschiderii PTPC [50]. Există o corelare între hiperpolarizarea mitocondrială și o deficiență relativă la canalele membranare K+ plasmatice legate de voltaj (Kv) care cresc K+ citoplasmatic la un nivel la care exercită un efect inhibitor tonic asupra caspazelor și a factorului inductor al apoptozei (AIF) [51]. Inhibarea farmacologică a PDK1, care este ades supra activată în cancer, determină reactivarea PDH și corectează activitatea atât a canalelor Kv cât și hiperpolarizarea mitocondrială, determinând de aici apoptoza celulei canceroase [51]. Astfel, inhibitorii PDK1 pot fi un alt exemplu de agenți cu impact dublu care modifică în sens invers și simultan rezistența la apoptoză și reprogramarea metabolică.
În concluzie reprogramarea metabolică, implică în cancere activarea oncogenelor Ras (genă care codifică fragmentul mic al GTP-azelor implicate în căile de semnalizare celulară, cu importanță în creșterea și diferențierea celulară), PI3K (fosfatidilinositol 3-kinaza), RTK (receptorii tirozin kinazici), Akt (serin-treonin protein kinazele specifice), Myc (gena care codifică un factor de transcripție), consecutiv inactivării genelor supresoare tumorale NF1 (neurofibromină), PTEN (gena care codifică fosfataza), LKB1(kinaza primară a adenozin monofosfat activat protein kinază), TSC1/2 (complexul pentru scleroză tuberoasă), SDH (succinat dehidrogenază), FH (fumarat hidratază), VHL (von Hippel-Lindau ubiquitin ligază), fiind afectată axa PI3K (fosfatidilinositol 3-kinaza)→ Akt (serin-treonin protein kinazele specifice) → mTOR (ținta pentru rifampicină la mamifere) → HIF (factorul de inhibare al hipoxiei) și/sau inactivând gena supresoare p53 (protein 53).
Unul din principalele mecanisme de glicoliză anaerobă rezidă în activarea factorului inductor al hipoxiei HIF, un factor de transcripție care a fost activat de stresul hipoxic și de asemenea de inflamația oncogenică și de stresul oxidativ. Este un compus constitutiv, heterodimer, fiind format dintr-o subunitatea β stabilă și subunitatea α instabilă. HIF-1 poate contribui la modificările metabolice și oncogenice inducând mai întâi disfuncția mitocondrială. Rolul central în activarea HIF-1, al oncogenelor și al genelor supresoare tumorale, determină reprogramarea metabolică în celula canceroasă stabilind multe legături între biologia celulei tumorale și biochimia acesteia (Fig. 16) [7].
Odată cu descreșterea concentrației de oxigen, HIF-1 poate induce mutații a două enzime și anume, pentru proteina din matricea mitocondrială: fumarat hidrataza (FH), și a proteinei din membrana internă mitocondrială: succinat DH-aza (SDH) [7].
IV. PEPTIDE CITOTOXICE CU POTENTIAL TUMORICID
Peptidele sunt structuri proteice naturale sau obținute prin sinteză care are loc prin condensarea intermoleculara a aminoacizilor la nivelul gruparilor – COOH si – NH2 , cu apariția legăturilor peptidice( – CO – NH -) .
In orice peptidă aminoacizii terminali posedă o grupare – NH2 liberă (aminoacid N – terminal) și o grupare – COOH liberă (aminoacid C – terminal), un număr de aproximativ 50 de resturi de aminocizi, numărătoarea aminoacizilor din lanțul peptidic începând la la capătul amino-terminal. Prin urmare, în mod convențional la reprezentarea grafică a unui lanț polipeptidic, primul aminoacid este purtătorul grupării – NH2 libere, iar ultimul aminoacid este purtătorul gruparii – COOH libere.
Nomenclatura chimică a peptidelor constă în indicarea succesivă a denumirii fiecărui aminoacid cu adaugarea sufixului “il”, cu excepția ultimului aminoacid (C – terminal) care are o denumire neschimbată. Spre exemplu o tetrapeptidă cu structura:
H2N – Ala – Glu – His – Lis – COOH
Se va denumi: alanil – glutamil – histidil – lizina.
Clasificarea peptidelor se poate face în diferite moduri și anume:
a) în funcție de numărul aminoacizilor participanți:
– oligopeptide (continand intre 2-9 resturi de aminoacizi);
– polipeptide (continand intre 10-100 resturi de aminoacizi).
b) in functie de felul aminoacizilor:
– homopeptide (formate din acelasi aminoacid);
– heteropeptide (formate din aminoacizi diferiti).
c) in functie de modul de aranjare a aminoacizilor in catena:
– peptide liniare;
– peptide ramificate;
– peptide semiciclice;
– peptide ciclice.
Peptide si polipeptide naturale
Peptidele naturale sunt sintetizate de catre plante, animale si microorganisme si ele indeplinesc in organismele vii si celule cele mai variate roluri:
– componente structurale ale tesuturilor;
– hormoni;
– factori de eliberare ai hormonilor;
– antibiotice;
– toxine;
– inhibitori de enzime.
Numeroase studii au evidențiat proprietățile tumoricide ale unor peptide naturale cunoscute ca fiind antimicrobiene [52-54]. De asemenea, rezistența tot mai frecventă la antibioticele convenționale este o problemă globală de sănătate publică și nevoia de noi antibiotice a stimulat interesul în găsirea și sinteza de noi peptide antimicrobiene care pot fi utilizate ca terapeutice [55,56].
Peptidele naturale antimicrobiene au în general o masă moleculară mică adică un număr relativ redus de aminoacizi, fiind cele mai simple arme de apărare celulară, aparținând sistemului imun nespecific [57]. In ciuda cercetărilor intense, mecanismele biochimice care stau la baza procesului de inserție membranară a peptidelor citotoxice sunt incomplet cunoscute, existând însă un interes ridicat de a găsi noi agenți terapeutici având în vedere rezistența frecventă la multe dintre antibiotice utilizate în mod curent în terapia antiinfecțioasă (Fig.19) [57].
Fig. 19. Mecanisme de acțiune a peptidlor cationice asupra membranelor celulare.
In plus, față de activitatea antibacteriană și de modulare a răspunsului imun pe care o au aceste peptide, studii recente au arătat că o parte din aceste peptide cationice au o activitate citotoxică importantă asupra celulelor canceroase și nu acționeză asupra celulelor normale de mamifer [53,57].
Cea mai mare parte a medicamentelor anticanceroase disponibile permit un control al creșterii tumorale doar la concentrații care influențează și celulele sănătoase, rezultând efecte secundare indezirabile. Astfel, este imperativă găsirea unor noi produse cu mecanisme noi de acțiune, iar una din direcțiile actuale de cercetare este reprezentată de utilizarea peptidelor antimicrobiene citototoxice [57].
Dermaseptin – este un peptid cationic datorită numeroaselor resturi de lizină, cu o structură amfifilică de tip α-helix, țintește direct anumite membrane celulare la nivelul cărora formează canale ionice permeabile care conduc la depolarizare și citoliză ireversibilă și în cele din urmă la moartea celulei [58]. Include în structura sa 27-34 de resturi de aminoacizi și s-a demonstrat că are efect citotoxic în infecțiile severe cu fungi la vertebratele cu sindroame imunodeficitare sau cu terapie cu medicamente imunosupresive. Dermaseptinul a fost propus ca medicament nou, mecanismul de acțiune având la bază afinitatea peptidului pentru membrana eritrocitelor umane fără ca acesta să fie toxic pentru hematie. Rolul eritrocitului este acela de a transporta peptidul în sistemul circulator. În mommentul în care ajunge în vecinătatea micro-organismului (fungi), datorită afintății mai mari pentru acesta, peptidul este transferat spontan pe suprafața țintei microbiene asupra căreia va avea o acțiune litică la nivel de membrană.
Prin urmare, acest peptid este solubil în apă și nehemolitic la concentațiile sale antimicrobiene efective și amfifilice. La concentrații mici inhibă creșterea de numeroase specii de bacterii, fungi și induce liza osmotică la protozoare [59]. Prin urmare, compoziția în aminoacizi, amfifaticitatea, sarcina cationică și dimensiunea, permit peptidelor citotoxice să se atașeze și să se insere în bistratul fosfolipidic al membranei celulare, cu formarea de pori transmambranari, care vor modifica permeabilitatea membranei celulare și vor determina evoluția celulei respective către apoptoză [60,61].
Deoarece, conform literaturii de specialitate, un număr foarte mare de peptide antimicrobiene izolate din natură (specii diferite de insecte, amfibieni, păsări, pești și mamifere) și foarte multe peptide citotoxice obținute prin sinteză, au dovedit a avea un spectru larg de activități antimicrobiene și anticancerigene [62-65]. Ȋn aceast referat ne-am propus să analizăm efectul biologic al dermaseptimului asupra liniilor celulare tumorale: MDA-MB231 (adenocarcinom mamar), M14K (mezoteliom uman), HT-29 (adenocarcinom colorectal) și linia celulară A-549 (carcinom alveolar uman).
Pentru a analiza efectele produse de dermaseptin asupra viabilității, citotoxicității și proliferării celulare (celule provenite din diferite linii celulare tumorale în studiul de față) au fost folosite următoarele tehnici: tehnici de cultivare a celulelor și testul de viabilitate MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu].
Numeroase studii au încercat să explice mecanismul de acțiune al peptidelor citotoxice prin modele de tipul porilor transmembranari clasici, a porilor toroidali sau de inserție membranară și distrugere a membranelor [66], dar încă mai există neclarități cu privire la modalitatea exactă de acțiune al acestora asupra microorganismelor in vivo, dar și asupra celulelor in vitro (Fig.19) [67-72]. Având în vedere toate aceste aspecte, în studiile experimentale desfășurate în cadrul acestui referat am dorit să verificăm ipoteza conform căreia peptidele citotoxice, cum ar fi dermaseptinul are potențial tumoricid și dacă magnitudinea efectului depinde de natura peptidului utilizat și de concentrația acestuia în mediul de viață al celulelor, dar și de tipul de linie celulară utilizată experimental, in vitro.
OBIECTIVELE URMĂRITE:
Stabilirea unor peptide cunoscute cu acțiune antimicrobiană (dermaseptin), care va fi utilizată în anumite concentrații, la anumite intervale de timp în mediul de cultură al unor linii celulare tumorale diferite (HT-29, MDA-MB-231, A-549, M14K) aderente și în suspensie.
Determinarea potențialului tumoricid al dermaseptinului în funcție de tipul de linie celulară, măsurând viabilitatea prin metoda MTT.
Optimizarea primeri-lor Akt, Hif-1α, XBP, Mrf2, PERK în vedrea evaluării metabolismului celulelor tumorale prin determinarea expresiei genice a acestor gene sub acțiunea peptidelor citotoxice utilizate.
MATERIALE, METODE ȘI TEHNICI
Culturile de celule sunt procese prin care celulele sunt cultivate în condiții controlate. Liniile celulare pot crește în culturi aderente sau în suspensie.
În acest referat am utilizat patru linii celulare aderente: linia celulară HT-29 (adenocarcinom colorectal), linia celulară MDA-MB231 (adenocarcinom mamar), linia celulară A-549 (carcinom alveolar uman), linia celulară M14K (mezoteliom uman).
– Linia celulară HT-29 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal. Celulele HT-29 produc antigen carcinoembrionar și sunt celule umane epiteliale intestinale care produc componentă secretoare de imunoglobulină A. Aceste celule sunt utilizate pentru studii tumorigenice.
– Linia celulară MDA-MB231 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom mamar. Celulele MDA-MB231 sunt celule umane epiteliale.
– Linia celulară A-549 este o linie celulară aderentă de carcinom alveolar uman.
– Mezoteliomul uman (linia M14K) este o tumoră malignă foarte agresivă, care apare pe suprafețele tapetate cu celule mezoteliale, cel mai des în cavitățile pleurale, dar și în peritoneu, pericard și țesuturile moi paratesticulare. Având potențial de metastazare la 75% dintre pacienți [66] și răspuns sub 20% la diverse chimioterapice [67] celulele mezoteliale reprezintă o țintă potrivită pentru evaluarea unor noi agenți chimioterapici. Din cele 3 subtipuri histologice de mezoteliom, în experiment se va folosi linia M14K de celule mezoteliale de tip epitelial.
Toate liniile celulare tumorale vor fi cultivate în mediu RPMI-1640 (Sigma Aldrich) cu 10% SFV (Faetal Bovine Serum, GIBCO) [68]. Expansionarea celulelor se va face în flaskuri de 250 mL pentru a obține un număr suficient de celule (104 celule tumorale/godeu –[69]. Celulele tumorale aderente vor fi desprinse prin tripsinizare (incubare timp de 3 minute la 37șC cu tripsina Eurobio). Se vor folosi celule cu viabilitate mai mare de 97%. Testarea propriu-zisă se va realiza în plăci de 96 de godeuri cu fundul plat, folosindu-se un volum final de lucru de 200µL per godeu (Fig. 20). Pentru evitarea efectului de margine și menținerea umidității în placă, în coloanele și rândurile marginale se va pipeta doar mediu de cultură. Studiul viabilității se va efectua după 24 de ore de incubare la 37șC, 5% CO2, folosind colorantul vital MTT .
Prepararea mediului de cultură, a soluțiilor de lucru, manipularea probei ce urmează a fi cultivată, consumabilele (pipete, varfuri pipete, flacoane) se vor realiza într-o hotă cu flux laminar clasa II, conform intrucțiunilor de utilizare a acesteia.
In timpul sesiunii de lucru la hota cu flux laminar se vor respecta strict condițiile de asepsie: se va lucra cu manusi si halat, se vor evita mișcările bruște și ieșirea din zona de lucru a hotei. În cazul în care se intrerupe pentru câteva minute lucrul la hota, mănușile se vor decontamina (Fig. 20).
Fig. 20 Prepararea culturilor celulare tumorale.
Prepararea mediului de cultura cu RPMI1640
Se prepară cu următoarele componente: RPMI 1640 cu L-Glutamina, ser fetal de vitel, heparina, L-Glutamina, antibiotic penicilina-steptomicina.
Mediul se pregătește
într-o tranșă de 51 ml (sau multiplu de 51) iar diferite componente (glutamina, SVF, antibioticele) se păstrează la congelator în flacoane cu o cantitate corespunzătoare unei tranșe sau multiplul ei.
proaspăt, cu soluțiile componente alicotate în recipiente mici stocate la frigider.
Prepararea mediului de lucru s-a făcut într-un flacon steril utilizând doar consumabile sterile în incinta hotei cu flux laminar.
S-au pus toți reactivii și materialele de lucru în hotă, după ce au fost în prealabil șterse cu soluție dezinfectantă, apoi iradiat cu UV timp de 30 de minute-decontaminarea fizică se face doar pentru soluții stocate în recipiente de sticlă, pentru cele din plastic nu se recomandă sa stea sub acțiunea UV.
Rețeta preparare mediu de cultură
* Ser Fetal de Vițel: Concentrația mai mare asigură un indice mitotic ridicat.
* L-Glutamina este instabilă și trebuie adaugată la mediu, înainte de folosire.
* Observații: în funcție de reactivii existenti în laborator se pot utiliza suplimente specifice culturilor celulare în general.
Componentele mediului au fost introduse în flaconul pentru cultură, în ordine, după formula agreată, flaconul a fost agitta ușor în plan orizontal după adaugarea fiecarui component (pentru a preveni contaminarea soluțiilor de lucru, acestea au fost ținute lângă flacără pentru a putea fi ușor flambate înainte și după prelevarea din ele).
S-a luat o cantitate de 1-2 ml mediu preparat pentru care s-a determinat pH-ul, apoi s-a corectat pH-ul cu bicarbonat de sodiu sau acid clorhidric la 7,2-7,4.
S-a vortexat proba și s-a luat inoculul de probă calculat și notat pe fișa de tehnică pentru fiecare cultură celulară.
S-a agitat cultura prin mișcări circulare ușoare pentru a se amesteca bine mediul cu probă, evitându-se umectarea filtrului de la flascul de cultură.
S-au pus culturile în termostat și s-a notat pe fișă ora și data de debut a culturilor.
Controlul calității mediului
Noile flacoane ale oricarui component a mediului de cultură (ex. ser, glutamina, etc.) trebuie să fie testate inainte de introducere în uz, printr-o cultură paralelă.
După ce s-a preparat mediul, pentru a se verifica sterilitatea se incubează 1-2 ml din fiecare flacon cu mediu de lucru timp de 3 zile la 37ș C pentru a verifica o posibilă contaminare a acestuia.
Dacă în laborator apare o contaminare microbiană se va stabili sursa (mediu, om).
Toate datele privind componentele mediului (seria, durata de valabilitate etc. se notează în caietul de tehnică, pentru a putea fi evaluate atunci când se produc eșecuri (în serie).
INCUBAREA ȘI MONITORIZAREA CULTURILOR CELULARE
Incubarea s-a făcut la 37 șC într-un incubator cu 5% CO2.
Tuburile de cultură au fost plasate în poziție orizontală (suprafața mare mediu -fază gazoasă și dispunerea pe o suprafață mare a celulelor sunt o conditie pentru o crestere optimă a celulelor).
Urmărirea culturii se face zilnic:
– conținutul flacoanelor se agită ușor de 1-2 ori /zi.
– s-au notat modificările apărute (culoare, pH, tș).
Pe parcursul incubării se mai pot schimba timpii de cultură și concentrația celulară (prin suplimentarea culturii cu mediu proaspat/proba refrigerată).
PRELUCRAREA CULTURILOR CELULARE
PREPARARE SOLUȚIEI PRE-TRIPSINIZARE (INCUBARE) IN SOLUȚIE 2XSSC
Prepararea soluției
Se cântărește la o balanță electronică:
-8,76g NaCl și se dizolvă în 250 ml apă distilată și
-4,41g Citrat de sodiu și se dizolvă în 250 ml apă distilată
-se amestecă cele două soluții obținându-se în final o soluție cu concentrație 2xSSC în de cantitate de 500 ml care se va depozita într-un recipient de 500 ml.
Se umplu cuvele termorezistente emailate cu locașuri pentru lame, cu soluție 2xSSC și se introduc în baia termostatată programată la 600 C. Când temperatura în soluția SSC din cuvă a atins 600C se imersează lamele destinate marcajului pentru 20 minute.
-după expirarea timpului, se clătesc în trei pahare cu apă distilată rece de la frigider (4-60C)
-uscarea lamelor.
PREPARAREA SOLUȚIEI de TRIPSINIZARE
Solutia tripsina
a)Soluția Stock (concentrată):
Se cântărește la o balanță electronică:
-0,50 g tripsină pulbere 1:250
-se adaugă 20 ml AD în recipientul cu tripsină și
-se așează pe platanul agitatorului magnetic pentru 20 minute
-după agitare, se filtrează într-un alt recipient
-se ajustează la pH de 7,4 (soluțiile pentru ajustarea pH-ului: NaOH 1M-bază, HCl 1N-acid )
b)Soluția lucru:
Intr-un pahar Berzelius de 50 ml, se amestecă:
-1 ml sol stock tripsină
-45 ml sol Hank’s 1xN (5 ml Hank’s 10xN+ 45 ml AD)
-se ajustează la pH de 7,1 (NaOH 1M)
-se utilizează pentru marcaj la o temperatură de aprox 100C
Activitatea tripsinică este dependentă de pH și de temperatură. Este recomandat ca pH-ul soluției de lucru a tripsinei să fie cunoscut – pH-ul optim pentru activitate este intre 7-9. Temperatura băii se recomandă a fi controlată. (Medical citogenetics and cell culture G-Banding by Trypsin –Giemsa Technique pg.165)
Se tratează lamele cu soluție tripsină de lucru. Durata expunerii la tripsină este variabilă; este necesară determinarea timpului pentru fiecare caz sau uneori ori pentru fiecare lamă de la același caz în parte .
– soluția de tripsină
-pH-ul optim 7,1
-temperatura soluției de 10-150C sau mai scăzută (temperatura mai crescută accelerează timpul de acțiune a tripsinei).
Testul de viabilitate folosind MTT (test colorimetric) este un test care analizează metabolismul celular, care se bazează pe capacitatea succinat dehidrogenazelor mitocondriale din celulele vii de a reduce sărurile solubile de tetrazolium din MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu] – (galben) și de a forma cristale insolubile de formazan (albastru închis) (Fig.21). Aceste cristale insolubile sunt impermeabile pentru membrana celulară și astfel se vor acumula în interiorul celulelor sănătoase. Deoarece reducerea MTT-ului poate apare doar în celulele active metabolic nivelul de activitate este o metodă de măsurare a viabilității celulelor. Formazanul insolubil în apă poate fi solubilizat cu izopropanol, dimetil sulfoxid (DMSO) sau alt solvent organic.
Tratarea celulelor cu MTT permite evaluarea metabolismului oxidativ și a răspunsului unei populații celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vieții celulelor în cultură. Din acest motiv testul MTT este folosit ca test pentru studii de viabilitate, citotoxicitate și proliferare celulară (Fig. 20) [73].
Solubilizarea celulelor prin adiția unui detergent determină eliberarea cristalelor care apoi sunt la rândul lor solubilizate într-o soluție colorată. Absorbanța acestei soluții colorate poate fi cuantificată prin măsurare la o anumită lungime de undă (de obicei între 500 nm și 600 nm) cu un spectrofotometru.
Fig.21. Ecuația reacției de reducere a sării solubile de tetrazolium (MTT) sub acțiunea succinat dehidrogenazei mitocondriale la cristalele insolubile de formazan (albastru), care se va acumula în celula vie
Această reducere are loc numai atunci când enzimele reductaze mitocondriale sunt active, și prin urmare conversia poate fi direct legată de numărul de celule viabile (vii). În cazul în care cantitatea de formazan violet produsă de celulele tratate cu un agent este comparată cu cantitatea de formazan produsă de celulele control, eficiența agentului cauzat de moartea celulelor poate fi dedusă prin producerea unei curbe doză-răspuns.
Reactivi necesari:
MTT – soluție – 4 mg/mL preparată din MTT pudră. Se va stoca la 4°C. Cantitatea de MTT se va calcula în funcție de numărul de godeuri utilizate. După solubilizarea completă a MTT-ului în PBS soluția de MTT va fi sterilizată printr-un filtru mic de porozitate mică (0,22 μm).
DMSO (Dimetilsulfoxid) pentru dizolvarea cristalelor de formazan formate prin reducerea MTT.
Modul de lucru:
S-au folosit plăci de cultură de 96 godeuri. În godeul B2, C2 s-a pus soluție simplă de RPMI, iar în godeurile B3, C3 s-au adăugat 200µL soluție RPMI cu celule tumorale care au constituit controlul negativ pentru experiment. În godeurile B4, C4 până la B11, C11 și respectiv F2, G2 până la F5, G5 s-a adăugat peste celulele tumorale peptid citotoxic în concentrație crescătoare cu câte 1µM, de la 1-10µM/volum final de 200µL/godeu pentru godeurile B4, C4 – B11,C11, respectiv F2, G2, F3, G3. În godeurile F4, G4 concentrașia de peptid a fost de 15µM, iar în F5, G5. Pentru toate concentrațiile de peptid s-a lucrat în duplicat pentru determinarea viabilității celulare prin metoda MTT (Fig. 22).
1. Din flask-ul cu celulele de testat se introduc în fiecare godeu câte 100µl suspensie conținând numărul optim de celule stabilit prin optimizare.
2. Se adaugă concentrația de peptid citotoxic stabilită în modelul experimental, în fiecare godeu și se va incuba la 37°C timp de 24, 48, 72 h.
3. S-a va centrifuga placa la 200g timp de 5 min și se va adăuga 200µL mediu proaspăt.
4. Apoi se adaugă MTT câte 50µL/godeu.
5. Și se va incuba placa cu MTT la întuneric și 37°C, timp de 4h.
6. După acest interval de timp se va separa prin centrifugare mediul (supernatantul), iar cristalele de formazan formate vor fi dizolvate adăugând 100μL DMSO/godeu după îndepărtarea supernatantului.
7. Extincția va fi citită la spectrofotometru, la lungimea de undă de 595/620 nm.
Fig.21. Schema de lucru utilizată pentru evaluarea citotoxicității peptidei (PC) în funcție de concentrațiile de peptid utilizate.
Având în vedere literatura de specialitate conform căreia peptidele citotoxice determină formarea de pori transmembranari care realizează permeabilizarea celulei conducând la moartea acesteia, pentru studiul nostru dorim să verificăm ipoteza de lucru conform căreia peptidele citotoxice evaluate au potențial tumoricid a căruri intensitate depinde atât de natura peptidului utilizat sau/și de concentrația acestuia în mediul de viață al celulelor cât și de tipul de linie celulară utilizată în experimentul in vitro.
În scopul analizării viabilității, citotoxicității și proliferării celulare s-a folosit testul MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazoliu] care a permis evaluarea metabolismului oxidativ și a răspunsului unei populații celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vieții celulelor în cultură (Fig. 22).
Fig. 22. Placa de lucru cu soluție MTT în godeurile cu celule tumorale cu sau fără peptid citotoxic (dermaseptin).
Concentrațiile de peptid citotoxic (dermaseptin) au fost stabilite respectând următorul model experimental:
pentru dermaseptin: de la 1-10µM / 200µL volum final / godeu, 15µM și respectiv 20 μM / 200µL volum final / godeu, în fiecare godeu existând 104 celule tumorale.
S-a adăugat soluția de peptid citotoxic din fiecare concentrație stabilită în fiecare godeu și s-a incubat la 37°C cu 5% CO2. Expunerea la peptid citotoxic a fost realizată timp de 24h, 48h, 72h.
Se va lucra în triplicat pentru fiecare linie celulară
Controlul negativ a fost constituit din celulele aflate în godeurile în care nu a fost adăugat peptid citotoxic, astfel încât a putut fi făcută comparația între evoluția celulelor tratate cu peptid și cele netratate.
Tehnici de biologie moleculară
Efectul peptidelor citotoxice va fi evaluat și prin determinarea expresiei unor gene în implicate în metabolismul celulelor tumorale Akt și HIF-1alfa comparativ cu gena de referință GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza). Prin tehnici de biologie moleculară în aceste studii ne-am propus să urmărim modificări ale metabolimului celulelor tumorale sub acțiunea unor peptide citotoxice. Extracția de ADN din culturile celulare tumorale se va realiza automat cu kituri de extracție ARN corespunzătoare pentru extractorul automat Magnesia 16 din cadrul laboratorului. Soluția de ARN este stocată la -20°C până va fi revers-transcrisă în ADNc.
Tehnica PCR se desfășoară în 3 etape:
Denaturarea: la 94șC – ADN-ul țintă este separat în 2 catene;
Hibridizarea primerilor: la 55-70șC, primerii se vor atașa specific și complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene ADN țintă;
Elongatia: la 72șC, ADN-polimeraza în prezența Mg2+/Mn2+ și a excesului de dNTP va extinde primerii la capătul 3’ rezultând un produs specific de amplificare (amplicon).
Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de ampliconi.
Fazele reacției PCR – La rândul său, procesul global de amplificare desfășurat de-a lungul unui număr definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:
Exponențială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon (se admite o eficiență de 100% a reacției);
Lineară: pe măsura ce componentele reacției sunt consumate, se produce o încetinire a reacției, iar produșii PCR încep să se degradeze;
Platou (end-point): reacția este oprită, nu se mai formează alți produși de amplificare, iar dacă faza se prelungește mult produșii PCR vor suferi o degradare importantă.
ADN-ul matrita
puritatea ADN-ului introdus ca matriță reprezintă un parametru important pentru succesul unei reactii PCR (raportul absorbanțelor 260nm/280nm >1.8 înseamnă prezența unor cantități mari de ARN în soluția de ADN și care pot inhiba acțiunea ADN polimerazei). De asemenea o puritate mai mică de 1,8 înseamnă un ADN cu puritate scăzută datorită prezenței de proteine în sistem care pot inhiba reacția de amplificare
Cantitatea de matriță ADN introdusă într-o reacție PCR: cantitățile recomandate pentru o reacție PCR standard sunt de maximum 500 ng pentru ADN. ( ~ 10–15% din volumul mixului de reacție)
Setul de primeri (2 primeri) care este complementar capatului 3’ al fiecarei catene (sens si antisens) din ADN-ul țintă.
Există mai multe programe disponibile on-line pentru proiectarea amorselor.
Lungimea optima este de 18-22bp-
Continutul in grupări GC – reprezintă numărul de C și G reprezentat ca procent din toate nucleotidele primerului – trebuie să fie între 40-60%.
Compozitia în GC a capătului 3’(GC Clamp ) -Sunt necesare cel puțin 3 C sau G printre
să nu formeze structuri secundare – reduc eficiența reacției.
Stuctura în “ac de păr” (hairpins) – se formează prin interacție intramoleculară între nucleotidele aceluiași primer. O valoare negativă mare a lui ΔG (energie liberă Gibbs) ne indică stabilitatea structurii secundare formate. O bucla a capatului 3’ cu un ΔG pȃnăla -2 kcal/mol poate fi tolerată, deși prezența buclei în capătul 3’ poate altera reacția PCR. O buclă în mijlocul primerului cu un ΔG pȃnă la-3 kcal/mol în general poate fi tolerată.
“self dimmer” – un primer are secvențe complementare cu sine însuși. Un self dimer al capătului 3’ cu ΔG pȃnă în -5 kcal/mol poate fi tolerat. Un self dimer al capătului 5’ cu ΔG pȃnă în -6 kcal/mol este de obicei acceptabil.
“cross dimmer”- cei doi primeri au secvențe complementare. Un cross dimer la capătul 3’ cu ΔG pȃnă in -5 kcal/mol poate fi tolerat.
Temperatura de topire (melting) Tm – temperatura la care jumatate din moleculele dublu-catenare de ADN se denaturează și devin monocatenare (este un indicator al stabilitatii dublu-helixului). Temperatura de topire poate fi aproximată după
Primerii cu Tm în intervalul 52-58°C produc în general cele mai bune rezultate.
Primerii cu Tm peste 65°C au tendința de a forma configuratii secundare.
Tm poate varia în funcție de salinitatea mixului de reacție (cationi mono-bivalenti), motiv pentru care este întotdeauna necesară optimizarea condițiilor de reacție.
Tm pentru ambele amorse ar trebui să fie similară pentru cele mai bune rezultate
Temperatura de legare (hibridizare – anealling) Ta este în strȃnsă corelație cu Tm.
Ta cu mult mai mare decȃt Tm va duce la o insuficientă (ineficientă) legare a primerilor la matrița ADN.
Ta cu mult mai mică decȃt Tm poate duce la legarea nespecifică a primerilor
Primerii trebuie să aibă Tm cu aproximativ 5 -10 grade Celsius sub Ta , care este, de obicei, între 55 și 65 de grade Celsius.
Repetițiile de doua nucleotide: un numar mai mare de 4 repetiții dinucleotidice nu trebuie acceptat în secvența unui primer – posibile erori de sinteză.
Repetițiile mononucleotidice (runs) – este acceptabil, dacă numarul maxim de repetiții ale aceleiași nucleotide grupat este de 4bp – posibile erori de sinteza.
Concentrațiile optime primeri: 400 nM concentrație finalǎ (per primer),
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Refarat 1 Bogdan De Trimis Partea 1 [311605] (ID: 311605)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.