Refarat 2 Bogdan De Trimis [311584]

RAPORT ȘTIINȚIFIC

(al 2-lea)

29 septembrie 2017

[anonimizat] a unor gene implicate în reprogamarea metabolică a celulei tumorale în prezența unor peptide cu potențial tumoricid

Doctorand: [anonimizat] « Gr.T.Popa » Iași, promoția 2013

Date de contact :

Mobil : [anonimizat] ;

E-mail: [anonimizat]

data admiterii la doctorat : 1-10-2014

Conducător de doctorat: Prof. Dr. Magda Bădescu

Date de contact:

Mobil : [anonimizat];

E-mail : magda.badescu@gmail.[anonimizat] [1-8]. Termenul, specii reactive de oxigen (ROS) cuprinde o varietate mare de molecule. Radicalii liberi sunt o specie chimică care au în structură unul sau mai mulți electroni nepereche. [anonimizat], oxidul nitric și oxigenul care are doi electroni nepereche [3]. Electronii nepereche ai oxigenului reacționează pentru a forma specii foarte reactive parțial reduse care sunt incluse în ROS și cuprind superoxidul (O2-), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil și peroxinitritul. O serie de sisteme enzimatice produc ROS: [anonimizat] P450, lipoxigenaza, cicloxigenaza, [anonimizat] [6]. Metabolismul oxigenului mitocondrial este sursa principală de O2- care rezultă din cuplarea incompletă de electroni și H+ cu oxigenul la nivelul lanțului de transport. [anonimizat], conform așteptărilor acolo unde aceste molecule sunt implicate în semnalizare la nivel celular [8,9]. [anonimizat], [anonimizat], kinaze și prezentarea genică manifestată prin modularea factorilor transcriptori [10-12]. Echilibrul Redox este realizat de diferite sisteme care antagonizează oxidanții toxici de tip ROS. Superoxid dismutaza (SOD) induce conversia superoxidului la H2O2 care este transformată în apă de catalază sau glutation (GSH) peroxidaza asociată cu glutation reductaza. [anonimizat]. GSH are un rol central în menținerea homeostaziei redox iar raportul GSH/glutation oxidat dă o imagine asupra capacității tampon redox al celulei [13]

[anonimizat]-un sistem biologic. [anonimizat] [10, 11]. Stresul oxidativ este cauzat de un dezechilibru între producția de oxigen reactiv și capacitatea sistemului biologic de a detoxifia cu rapiditate reactivii intermediari sau de a repara cu ușurință prejudiciile rezultate. Toate formele de viață păstrează un mediu de reducere în interiorul celulelor. Acest mediu de reducere este conservat de o serie de enzime care au rolul de a menține acest mediu cu ajutorul unei acțiuni constante a energiei metabolice.

Perturbările care ar putea să apară de la această stare normală pot provoca reacții toxice concretizate în producția de peroxizi și radicali liberi, care vor afecta toate componentele celulare, inclusiv lipidele, proteinele și ADN-ul.

Se consideră că stresul oxidativ provoacă apariția mai multor boli. Procesul a fost cuantificat prin măsurarea nivelului de stres oxidativ ca urmare a stării de oxidare a unor molecule de mici dimensiuni numite glutadion. În mod normal, glutationul, care face parte din echipamentul antioxidant non-enzimatic, protejează celulele de stresul oxidativ. Stresul oxidativ este cauzat de compușii reactivi de oxigen, care includ și radicalii liberi de oxigen (RLO). Dacă o celulă este expusă la mai mulți compuși reactivi de oxigen, se poate degrada instantaneu. Consecința este deteriorarea proteinelor, ADN-ului, lipidelor, dar și al altor macromolecule din organism.

Stresul oxidativ este indus de o serie de factori de mediu (surse exogene) printre care metabolizarea unor xenobiotice, medicamente, aditivi alimentary, iradieri cu UV, radiații ionizante, metabolizarea unor poluanți chimici (nitriți, solvenți, barbiturice, gaze iritante, derivași de azot, sulf, etc.), invazia agenților patogeni. Ca surse endogene de stress oxidativ putem menționa: lanțul de transport de electroni din mitocondrii, activitatea enzimatică (oxidaze, cicloxigenaze, lipoxigenaze), activitatea leucocitelor polimorfonucleare, macrofage, oxidarea hemoglobinei, catecolaminelor, tiolilor. Vitaminele E și C sunt foarte importante pentru consolidarea rețelei antioxidante, care luptă împotriva stresului oxidativ. O altă cauză a stresului oxidativ o reprezintă efortul fizic excesiv. Multe dintre medicamente conțin toxine ce pot determina apariția unor procese care stau la baza declanșării stresului oxidativ. Acestea pot, în unele cazuri, să inhibe funcționalitaea ADN-ului sau producția de enzime, ambele cruciale în etapele de glicoliză și oxidare. Limitarea acestor activități poate determina producerea unei cantiățti mari de radicali liberi. În termeni chimici, stresul oxidativ semnifică o creștere accentuată a potențialului de reducere celulară. Efectele stresului oxidativ depinzînd de cat de capabilă este o celulă să depașească modificarile aduse de stresul oxidativ și cât de rapid poate să-și recapete starea inițială.

Unele dintre speciile mai puțin reactive (cum ar fi dismutaza) pot fi convertite prin reacții de oxidoreducere cu metale de tranziție sau alți compuși ciclici de oxidare și reacții de reducere sub forma mai multor specii chimice ale oxigenului mai agresive. Rezultatul ar putea fi afectarea celulară destul de gravă. Printre consecințe se pot număra prejudicile oxidative aduse proteinelor, membranelor și genelor din organismul unei persoane. Efectul pe termen lung, constă în deteriorarea ADN-ului. Cele mai multe dintre speciile chimice de oxigen sunt produse la un nivel scazut de metabolizare aerobică normală și pagubele provocate celulelor sunt reparate în mod constant. Totuși, există și cazul în care celula poate pur și simplu să cedeze sub acțiunea agresivă și constantă a stresului oxidativ. La om, stresul oxidativ este implicat în dezvoltarea mai multor boli printre care si ateroscleroza, boala Parkinson, insuficiența cardiacă, infarctul miocardic, boala Alzheimer, cataracta, cancerul, sindromul X fragil și sindromul de oboseală cronică.

De asemenea, cand este prezent pe termen scurt, stresul oxidativ poate avea un rol important în procesul îmbătrânirii prin intermediul unui proces numit mitohormesis. Speciile de oxigen reactiv pot fi benefice pentru organism dacă sunt utilizate de către sistemul imunitar ca modalitatea de a ataca si a ucide agenții patogeni.

Așa cum s-a menționat, termenul de “specii reactive ale oxigenului” (ROS) este folosit larg pentru a cuprinde atât radicalii liberi ai oxigenului cât și speciile non radical. Una din cele mai populare teorii care explica toxicitatea oxigenului este teoria toxicității radicalului superoxid (O2•¯) – specie reactivă derivată din oxigen a cărui supraproducție determină efecte nocive asupra țesuturilor.

o       Speciile reactive ale oxigenului:

         Radicali liberi::

–          Radical hidroxil: HO*

–          Radical superoxid: O2-

         Non-radicali:

–          Peroxidul de hidrogen: H2O2

–          Oxigenul singlet: 1O2

o       Produși ai peroxidării lipidelor:

–          Radical peroxil: ROO*

–          Radical alkoxil: RO*

o       Produși secundari:

–          Malondialdehida

–          4-hidroxialkenali.

Superoxidul este produs în mod fiziologic, de exemplu în celulele fagocitare. Unele enzime, cum e xantin-oxidaza, au capacitatea de a reduce  O2 la O2•¯, proces catalizat de xantin-dehidrogenaza.  Radicalul superoxid este produs si prin oxidarea unor molecule ca: gliceraldehida, FADH2, hormoni (adrenalina, noradrenalina, dopamina) sau prin oxidarea fierului din hem cu formare de methemoglobina.

Cea mai importantă sursă de superoxid in vivo, în celulele organismelor aerobe, este  lanțul de reacții transportoare de electroni din mitocondrii. In condiții fiziologice 1-3% din O2 este redus la O2•¯. Producția de radicali ai oxigenului prin respirația mitocondrială poate contribui la lezarea  proteinelor, lipidelor și ale ADN-ului mitocondrial, leziuni ce se accentuează cu vârsta. In afara de speciile reactive ale oxigenului, organismele vii produc o gamă largă de radicali liberi (Tabel 1). Exemple de formare a radicalilor liberi sunt numeroase: proteinele ce conțin gruparea thiol (R-SH) oxidează în prezența ionilor metalelor tranziționale, rezultând radicali tiil (RS•).

R-SH  +  Cu2+                                 R-S•   +  RS•  +  Cu+  +  H+

Tabel 1. Exemple de radicali liberi

Peroxidarea lipidelor generează radicali liberi ai carbonului. Unii oxizi ai azotului NO• si  NO2• sunt radicali liberi, ceea ce a condus la introducerea unui nou termen, cel de “specii reactive ale azotului”(RNS).

Ipoteza conform căreia speciile reactive ale oxigenului (ROS) ar juca un important rol în carcinogeneză a câștigat o multitudine de adepți în ultima perioadă, fiind argumentată de numeroase studii. S-a dovedit că acești radicali liberi posedă caracteristicile unor adevărați carcinogeni. În inițierea procesului de carcinogeneză, ROS pot acționa direct prin leziunile produse asupra acizilor nucleici, proteinelor și lipidelor membranare, sau indirect prin produșii finali rezultați din metabolismul oxidativ.

Studii ale țesuturilor non-neurale au cercetat plasma, eritrocitele și țesuturi cum sunt inima, ficatul, rinichiul și pancreasul. Aceste studii s-au concentrat asupra dovezilor de peroxidare mărită a lipidelor, reducerea GSH, și modificarea configurațiilor enzimelor antioxidante. Dovezi ale accentuării oxidative pot fi asociate cu o reducere (accentuare agravantă probabil) sau o creștere (un răspuns compensatoriu probabil) a enzimelor antioxidante [9-13].

Dacă la nivel molecular principala țintă a ROS sunt grupele funcționale tiol (-SH), la nivel celular obiectivul major al ROS sunt membranele celulare. După cum se știe, membrana celulară este formată dintr-un dublu strat fosfolipidic traversat de agregate moleculare proteice care formează zone hidrofile. Membrana celulară favorizează pătrunderea în celulă a substanțelor lipofile, iar apa, ionii și substanțele hidrofile ajung în celule prin canale sau pori membranari cu diametru de aproximativ 5 Å. Acești pori sunt deschiși permanent sau temporar sub acțiunea unor stimuli de tipul mesagerilor biochimici (ex. AMPc) sau al variației potențialului electric [10, 13].

Fig.1: Reglarea metabolismului homocisteinei prin peroxid (H2O2) și alte specii reactive de oxygen [13]

S-a demonstrat experimenal că ROS sunt implicați în creșterea permeabilității vasculare. Acest proces este reversibil până la un anumit moment dat ca urmare a intervenției sistemelor de apărare antioxidante endogene, eliberare de prostaglandine și alți factori care complică mult reacțiile inițiale. Instalarea stresului oxidativ într-un organism viu va perturba homeostazia Ca2+. Aceasta este o consecință inevitabilă până la un anumit punct ca urmare a creșterii influxului celular de Ca2+, activarea proteazelor și a fosfolipazelor [10,13].

În condiții normale există un echilibru între concentrația de Ca2+ intracelulară (0,1 – 0,4 μM) și extracelulară (mM). Menținerea acestui gradient de concentrație a Ca2+ este important pentru menținerea integrității celulare și este realizată prin mecanisme homeostatice foarte eficiente. Acest gradient este reglat prin implicarea mai multor sisteme: ATP-aze, translocaze, canale și transportori proteici de tipul calmodulimei, vit. E, vit. C etc [10,13]. Dacă aceste sisteme homeostatice sunt depășite datorită acțiunilor toxice a ROS și NOS, atunci va fi depășit stadiul reversibil al stresului oxidativ și va crește influxul celular de Ca2+ .

Alterarea homeostaziei Ca2+ va avea drept consecință scăderea concentrației celulare în vitamina E (α-tocoferol) care este un antioxidant foarte important în organismul viu. Sub acțiunea toxică a ROS va fi stimulată peroxidarea acizilor grași polinesaturați (AGPN) din membranele celulare conducând la distrugerea acestora.

Rolul ROS în transformarea și transmiterea semnalului

de transformare malignă a celulei

Leziunea ADN indusă de ROS a fost mult timp creditată a iniția carcinogeneza și transformarea malignă (fig 2) [14]. De exemplu: radicalul hidroxil acționează asupra purinelor, pirimidinelor și a cromatinei, inducând bazele, instabilitate genomică cu alterarea prezentării genice. ADN-ul mitocondrial fiind în imediata apropiere a lanțului de transport al electronilor devine foarte vulnerabil. Mutațiile în ADN-ul mitocondrial induse de ROS, apar ca elemente importante în carcinogeneză [15].

Fig.2 Inițierea carcinogenezei indusă prin expunerea îndelungată la ROS [14]

Producerea patologică de ROS este indusă de infecția cronică sau toxine administrate cronic (fum de țigară, azbestoză) celulele transformate nu au în general zone de control al ciclului celular și prezintă în exces factori oncogeni de creștere și receptorii săi de tirozin kinază care conduc proliferarea celulară care în timp conduce la hipoxie cronică cu apariția tumorii [16-18]. Unii receptori ai tirozin kinazei s-a demonstrat că semnalizează prin mecanisme dependente de ROS [19,20]. Receptorii factorului de creștere derivat-plachetar și al factorului de creștere epidermic transmit cel puțin parțial prin producerea de H2O2 (fig 3).

Fig.3 Mecanisme de transformare și proliferare a celulei tumorale prin inhibiția fosfatazelor proteice indusă de H2O2

Dimerizarea receptorului indusă de substanța legată activează kinaza-3 fosfatidilinozitol cu activarea 1,4,5-trifosfat inozitol a Rac, care la rândul ei activează complexul NADPH oxidaza pentru a genera superoxid și semnalizează în aval prin superoxid și H2O2 . Ultimul, modulează transmiterea semnalului prin oxidarea cisteinei catalitice, din tirozin fosfataza proteică, așa cum PTEN oprind inactivarea tirozin kinazei, semnalizează prin activatorul proteinei-1 și Akt [21-23]. Inhibiția fosfatazelor proteice indusă de H2O2 ajută atât proliferării celulare și oprirea apoptozei cât și creșterii prezenței oncogenilor, care, este un semn marcant în multe cancere, la care semnalizarea este mediată de ROS [24]. Activarea factorilor de creștere oncogeni și transmiterea semnalelor induc proliferarea celulară peste capacitatea de transport vascular. Doar 300 de celule canceroase sunt destule pentru a determina un mediu hipoxic care stimulează angiogeneza [25]. De aici se înțelege că activarea Akt de către ROS poate ajuta supraviețuirea celulelor tumorale în condiții hipoxice prin creșterea translației indusă de hipoxie a factorului 1α (HIF1α) [26].

Rolul stabilizării HIF în hipoxie

Supraviețuirea tumorală în mediul hipoxic necesită un răspuns adaptativ coordonat. Identificarea mecanismelor de detectare a oxigenului și efectele asupra adaptării celulare la hipoxie este o temă foarte importantă pentru cei ce studiază biologia tumorală [27, 28]. Studiile de început sugerau că HIF1α este reglatorul principal al răspunsului la hipoxie [29-32]. Sunt peste 70 de gene a căror transcripție o controlează pentru a facilita supraviețuirea în condițiile unei presiuni reduse a oxigenului [29].

HIF1α apare constitutiv, dar are un timp de înjumătățire foarte scurt din cauza hidroxilării de către dioxigen, oxaloglutarat și a prolil 4-hidroxilazelor dependente de fier (PHD 1,2 și3), localizate respectiv în nucleu, citoplasmă sau în ambele. După hidroxilarea mediată de PHD a Pro564 și a Pro402 în domeniul său de degradare dependent de oxigen, HIF1α se unește în complex cu domeniul-β al proteinei von Hippel-Lindau supresoare tumoral, o componentă a complexului proteină E3 ubiquitină ligaza și suferă ubiquitinarea rapidă NH2-și COOH-terminală dar și degradarea proteolizozomală [30,31].

În condiții de oxigenare normală, timpul de înjumătățire a HIF1α este mai mic de 5 min [31]. Pe baza necesarului de oxigen pentru hidroxilarea mediată de PHD, s-a considerat la început că aceasta este proteina sensor principal [27]. Dar inhibarea PHD nu se produce până când nivelul oxigenului nu scade sub 5%, iar inhibarea maximă nu apare pană când anoxia nu este aproape completă [32].

Studiile recente sugerează că diferite specii de oxigen pot determina stabilizarea HIF1α inhibând activitatea PHD. Acestea sunt de origine mitocondrială incluzând oxidul nitric și ROS [33-35].

Rolul H2O2 mitocondriale în stabilizarea HIF

Pe baza rolului central al oxigenului în fosforilarea oxidativă, este normal că mitocondria poate da un răspuns celular când nivelul oxigenului scade (fig 4) [34,35]. În condiții de hipoxie, mitocondria participă la producerea unei explozii a generării ROS la complexul III al lanțului de transport al electronilor [36].

Dacă presiunea parțială a oxigenului scade, atunci transferul electronilor este întârziat în mitocondrie, de la ubiquinol la citocromul c1 prin proteina fier-sulf Reiske, ceea ce permite legarea lor de oxigenul molecular cu formarea oxigen singlet O2- [36].

Superoxidul este convertit de către SOD în H2O2 (enzima este Mn-SOD în matrixul mitocondrial, Cu, Zn-SOD în spațiul intermembranar mitocondrial și citosol). Ieșirea H2O2 format în citosol, induce un efect inhibitor asupra activității PHD, ceea ce permite acumularea HIF1α și dimerizarea cu HIF1β, trece astfel în nucleu unde modulează prezentarea genelor care ajută supraviețuirea în hipoxie (fig 4) [29].

Fig.4.Transformarea anionului superoxid la nivelul mitocondriei hipoxice în peroxid de hidrogen care va conduce la creșterea concentrației de radical hidroxil care degrada HIF, stabilizțnd HIF1alfa și activeaza calea MAP kinazei conducând la alterarea expresei genice, ihibarea apotozei, proliferarea celulară și angiogeneză.

Sunt studii care arată că HIF1α stabilizat, poate fi blocat în condiția hipoxiei dacă producerea ROS este oprită la nivelul mitocondriei care nu prezintă citocromul c, sau dacă a primit cantități mici de ARN care determină eliminarea proteinei Rieske, arătând astfel rolul ROS mitocondrial la stabilizarea HIF1α [37,38]. Alt studiu susține stabilizarea HIF1α ca fiind independentă de existența ROS mitocondrială [36]. Mecanismul prin care H2O2 inhibă activitatea PHD nu este elucidat, iar eforturile cercetării se îndreaptă asupra oxidării fierului din PHD [39].

Probabilitatea ca ROS să funcționeze ca modulatori cu rol terapeutic

În celula malignă, ROS este crescut pe de o parte datorită semnalizării oncogene a căii complexului NADPH oxidazei, pe de altă parte de la mitocondrie ca rezultat al hipoxiei. Creșterea nivelului oxidant, contribuie la mărirea proliferării celulare și la oprirea apoptozei (fig 3 și 4).

Sunt posibile două metode terapeutice independente pentru abordarea acestor două căi. O cale poate crește epurarea ROS și astfel se reduce semnalizarea prin H2O2 scăzând creșterea tumorală. O metodă opusă va administra substanțe care interferă epurarea ROS ceea ce determină creșterea în exces ROS care declanșează apoptoza (Fig 5) [9, 40-42].

Fig.5 Mecanismele de acțiune ale unor medicamente cu potențial oxidant asupra unor componente de la nivel mitocondrial în celula tumorală

Date de evidență susțin creșterea epurii care aduce creșterea prezenței SOD, glutation peroxidazei, sau catalazei cu reducerea creșterii tumorale in vitro și in vivo în modelul șoarecelui [43,46]. Nu sunt încă substanțe specifice care să inducă aceste siteme enzimatice, dar se fac cercetări în acest sens [47]. Abordarea contrarie, cu reducerea eliminării ROS determină acumularea sa. Nivelul crescut de ROS induce apoptoza determinând deschiderea porului permeabilității tranzitorie mitocondiale și eliberarea factorilor proapoptotici (fig 5) [48, 59].

Controlul apotozei de către mitocondrie

Complexul porului permeabilității tranziționale mitocondrial este un canal multimeric bine reglat fiind constituit de un segment membranar intern, translocaza adenin nucletidic (ANT) care importă ADP și exportă ATP, ciclofilina D, creatinin kinaza intermembranară și un canal extern membranar ionic dependent de voltaj (VDAC, porin).

Agenții chimioterapici modulează deschiderea porului în primul rând declanșând calea răspunsului de lezare a ADN la nivelul zonei de verificare a ciclului celular [18]. Calea de reparare a ADN este cuplată cu efectorii apoptozei pentru a se asigura că leziunea ireparabilă nu trece mai departe la celulele fice.

Apoptoza indusă de medicamente apare când concentrația citosolică a proteinelor deschizătoare ale porului, ca Bax și Bak, cresc peste nivelul bazal și au ca țintă să destabilizeze VDAC prin chaperoni ca Bid și Bim. Destabilizarea VDAC crește generarea de ROS și induce influxul ionic și apoi ruptura membranei mitocondriale, determinând eliberarea grupului proteic proapoptotic, incluzând citocromul c, factorul inductor al apoptozei, Smac/Diablo, procaspazele, și Endo G [49,50].

Pe de altă parte, hexokinazele I și II (crescute de HIF), Bcl-2, Bid și BCL-KL (crescute prin semnalizarea la receptorul tirozin kinazei și de către ROS), induc efecte antiapoptotice prin stabilizarea configurării VDAC [51,52].

Implicarea ROS în reglarea porilor mitocondriali

implicați în permeabilitate și apoptoză

Suplimentar atacului prin proteinele destabilizatoare ale porului, VDAC, care reglează fluxul O2- din mitocondrie în citosol, este sensibil la deschiderea porului tranzițional mitocondrial mediat de superoxide [53-55]. Astfel apoptoza stimulată de producerea ROS poate fi realizată prin acțiunea acestuia asupra VDAC. ANT devine o altă moleculă prin care ROS acționează datorită sensibilității-redox a cisteinei, adăugând un mecanism prin care reducerea GSH indusă medicamentos și pierderea epurării ROS se induce apoptoza (fig 5) [56]. ANT conține trei reziduuri reduse de cisteină în pozițiile 57, 160, și 257. Legăturile disulfidice încrucișate determinate de oxidare ale Cys160 cu Cys257, determină deschiderea complexului por de permeabilitate tranzitorie la mitocondrie [57]. Legarea încrucișată a acestor reziduuri de Cys, modifică conformația ANT inhibându-i capacitatea de fixare a nucleotidelor prin care calciul poate intra. Creșterea calciului, induce formarea complexului ciclofilin D-ANT care deschide porul determinând apoptoza [58].

Glutationul previne legarea, iar glutationul oxidat poate media formarea legăturilor încrucișate între Cys160 cu Cys257 inducând apoptoza (fig. 5) [59,60]. Legăturile disulfidice pot fi reduse de către tioredoxin cuplat la tioredoxin reductaza sau de către GSH cuplat la glutation reductaza, oprind deschiderea porului [61].

Epurarea ROS este de aceea necesară în mitocondrie pentru realizarea echilibrului redox care menține ANT în forma activă, fixând nucleotidele adenina la zonele cu afinitate mică și mare. În acest mod, este oprit calciul să ajungă la ciclofilinul D și prevenind deschiderea porului.

Medicamente sunt disponibile pentru inhibarea epurării ROS

Modalitățile terapeutice care determină acumularea ROS și apoptoza au fost studiate datorită disponibilității medicamentelor care blochează epurarea (fig 5) [42,62,63]. Substanțe catre epuizează GSH, precum buthionine sulfoximine și trioxidul de arsenic, prezintă acțiunea blocantă a epurării ROS in vitro dar și clinic [56,64-67]. Trioxidul de arsenic poate acționa direct pe VDAC pentru a determina deschiderea porului [68]. Disulfiramul și ATN224 inhibă Cu, Zn-SOD prin chelarea Cu, având și ele actvitate blocantă in vitro și in vivo clinic [69-72]. Atât disulfiramul cât și buthionine sulfoximine au fost testate de grupul nostru și s-a arătat că sunt active contra melanomului in vitro [65,69]. Celula melanomului se știe că are nivelul ROS în exces ca urmare a dereglării sintezei melaninei [42,65]. În condiții oxidative, melanina este transformată dintr-o moleculă antioxidantă în una prooxidantă [73].

Inhibiția thioredoxinei care menține ANT în formă redusă, este altă posibilă substanță utilă pentru oprirea epurării ROS [74]. Flavanolii, precum quercetina, pot determina moartea celulei canceroase prin inhibarea thioredoxinei, iar activitatea lor este amplificată de anionii superoxid [75]. Un compus nou, motexafin gadolinium, creat inițial ca radiosensibilizator, este un inhibitor eficient althioredoxinei și este în faza III-a de studiu clinic [76,77]. Motexafin gadolinium este relativ specific tumoral datorită structurii sale asemănătoare porfirinei care este preluată preferențial de către celula canceroasă. Substanța induce stres oxidativ printr-un mecanism de ciclare redox inutil (datorită transferului de electroni de la substratul redus la O2- pentru a produce ROS). Un spectru mare de proteine reductoare importante incluzând GSH și thioredoxinulredus sunt oxidate de către motexafin gadolinium. Această substanță inhibă thioredoxinul și determină conversia acestui epurator într-un generator de ROS care contribuie mai departe inducerea apoptozei [78]. De ținut minte că agenții chimioterapici convenționali pot inhiba thioredoxinul; este vorba de melfalan, carmustin, cisplatin și oxaliplatin [79]. De aceea asocierea acestor agenți în mod sinergic poate fi o abordare mai mult decât utilă. Până în acest moment, toxicitatea acestor agenți care țintesc ROS este tolerabilă.

În concluzie, speciile ROS sunt implicate în carcinogeneză, inițierea creșterii celulelor trzansformate, stabilizarea HIF1α să inducă angiogeneza și reglarea programelor mitocondriale apoptotice. Epurarea H2O2 din celulele transformate poate diminua efectiv creșterea tumorii prin blocarea semnalizării receptorului factorului de creștere și prin prevenirea stabilizării HIF1α mediată de peroxid. Inhibarea semnalizării redox prin epurarea crescută de ROS a fost încercată ca strategie de chemoprevenție precoce în procesul de transformare, doar puține studii au putut prezenta asigurarea succesului acestui principiu pentru pacientul cu boală avansată [80]. Este puțin probabil ca eliminarea semnalizării ROS să poată afecta semnificativ evoluția pacientului, din cauza complexității căilor redundante care asigură creșterea cancerului [18]. Pe de altă parte, creșterea producerii ROS mitocondriale pentru a determina apoptoza, reprezintă o țintă atactivă pentru că acest organit celular controlează decizia celulară de viată sau de moarte. Tratamentele specifice pentru cancer ar putea beneficia în final de creșterea ROS realizată de mitocondria hipoxică. Prin inhibarea epurării ROS, creșterea concentrației sale poate deveni un „călcâi al lui Ahille” pentru metabolismul celulei canceroase. Perioada următoare ar putea pune în lumină adevărul sau consecințele acestei abordări.

Oxidul nitric este un radical liber cunoscut a juca un rol important în menținerea sănătații umane. El este implicat într-un număr de procese fiziologice diverse, incluzând relaxarea musculaturii netede, inhibiția agregării plachetare, neurotransmisia, reglarea imunologică. Căile biochimice ale acestor fenomene au două trăsături comune: sinteza enzimatică de NO din L-arginină și formarea complexului Fe-nitrozil pe o proteină țintă pentru a evoca răspunsul funcțional.

Excesul de NO este un mediator cheie al toxicității în diferite procese fiziopatologice, cum ar fi inflamația și leziunile endoteliale. Ca atare, scavangerii de NO joacă un rol protector important în sistemul biologic. În absența unei activități eficiente a acestora, excesul de NO poate forma peroxinitrit, o moleculă puternic reactivă, capabilă să lezeze molecule biologice din organismul uman.

În condițiile fiziologice ale organismului, diverse specii reactive de oxigen (O2-, H2O2, OH-) sunt formate și descompuse prin reacții enzimatice și nonenzimatice. Nivelele mari de radicali liberi pot iniția peroxidarea lipidică, denaturarea proteinelor și ADN-ului, ducând la dezvoltarea unor injurii tisulare acute sau la dezvoltarea unor boli.

Fe și alte metale tranziționale participă la formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) și la peroxidarea lipidică. Radicalul hidroxil este foarte activ, dar rolul acestuia, ca și al altor ROS în inițierea peroxidării lipidice nu este clarificat. Radicalul hidroxil poate fi format în reacția Fenton (Fe 2+ + H2O2 → Fe3+ + ٠OH + OH-). Ionii de Fe pot iniția peroxidarea lipidică direct sau prin formarea de complexe de oxigen și diferite stări redox ale Fe. Sunt incluși ionii feril (FeO)2+ sau FeOH3+ , periferil (Fe2+O2 sau Fe3+:O2-) sau Fe4+O. Raportul molar între Fe2+ și Fe3+ este important. Fe2+ descompune radicalii hidroperoxil (ROOH) (peroxizi lipidici intermediari) la radicali alkoxil (RO٠) și Fe3+ la radicali peroxil (ROO٠) cu potențial oxidativ mai redus.

Alterarea apoptozei celulelor tumorale

Apoptoza celulară alterată este foarte importantă pentru inițierea oncogenezei și este implicată în rezistența la chimoterapice. Celula canceroasă prezintă de multe ori rezistență la permeabilizarea membranei mitocondriale (MMP), care este o etapă decisivă pentru apoptoză [81]. O legătură între inhibarea apoptozei și reprogramarea metabolică poate fi realizată prin asocierea HK cu canalul anionic dependent de voltaj (VDAC). HK s-a văzut că este strâns legat de proteina mitocondrială exterioară VDAC la celula tumorală decât este la celula normală de control [82,83]. Creșterea interacțiunii HK-VDAC poate fi datorată activării constitutive a Akt-ului. Akt determină translocarea HK spre membrana mitocondrială exterioară unde se fixează de de VDAC, probabil pentru că Akt interferă cu fosforilarea VDAC mediată de kinaza 3 glicogen sintaza (GSK3) [84] sau pentru că Akt fosforilează HK [85]. Dacă se asociază cu VDAC, HK poate lega eficient fosforilarea oxidativă OXPHOS de etapa primară limitată de viteză a glicolizei. În plus, Hk poate inhiba MMP, posibil prin acțiunea asupra porului complex de permeabilitate tranzitorie (PTPC) (care implică și VDAC). Conform acestora, peptidele care lezează competitiv interacțiunea VDAC-HK pot induce MMP cu apoptoză consecutivă [86]. De aceea, teoretic, agenții care disociază legătura VDAC-HK ar avea o acțiune duală și ar modifica în sens invers starea hiperglicolitică în timp ceea ce ar facilita inducerea apoptozei.

Defectele complete sau parțiale ale fosforilării oxidative OXPHOS pot determina de asemenea rezistență la apoptoză. Inhibarea completă a lanțului respirator poate suprima activarea proteinelor proapoptotice Bcl-2, Bax și Bak. Indiferent care dintre ele reprezită un mediator aproape obligatoriu pentru MMP. Defecte severe ale OXPHOS care apar în unele cancere, se cuplează automat la blocarea MMP și astfel inhibă apoptoza (Fig. 6). Defectele OXPHOS reduc capacitatea unor xenobiotice de a induce producerea ROS în mitocondrie, astfel oprind activitatea lor apoptotică. Acest ultim mecanism poate explica faptul că celulele po (celule care nu au ADN mitocondrial și fosforilare oxidativă OXPHOS) sunt rezistente la o serie de compuși care induc apoptoza provocând cicluri redox inutile în mitocondrie [87,88]. Astfel o deficiență de OXPHOS ar putea compromite automat calea intrinsecă a apoptozei printr-o varietate de mecanisme distinct (Fig. 6).

Alte legături între modificările mitocondriale din cancer și blocarea apoptozei sunt mai mult indirecte. O hiperpolarizare a potențialului transmembranar al interiorului mitocondrial așa cum se vede în celula canceroasă (posibil secundar defectelor la ATPaza F1F0) [89], poate scădea probabilitatea deschiderii PTPC [90]. Există o corelare între hiperpolarizarea mitocondrială și o deficiență relativă la canalele membranare K+ plasmatice legate de voltaj (Kv) care cresc K+ citoplasmatic la un nivel la care exercită un efect inhibitor tonic asupra caspazelor și a factorului inductor al apoptozei (AIF) [91]. Inhibarea farmacologică a PDK1, care este ades supra activată în cancer, determină reactivarea PDH și corectează activitatea atât a canalelor Kv cât și hiperpolarizarea mitocondrială, determinând de aici apoptoza celulei canceroase [91]. Astfel, inhibitorii PDK1 pot fi un alt exemplu de agenți cu impact dublu care modifică în sens invers și simultan rezistența la apoptoză și reprogramarea metabolică.

Fig. 6. Rezistenta la apoptoză a celulei tumorale

În concluzie reprogramarea metabolică, implică în cancere activarea oncogenelor Ras (genă care codifică fragmentul mic al GTP-azelor implicate în căile de semnalizare celulară, cu importanță în creșterea și diferențierea celulară), PI3K (fosfatidilinositol 3-kinaza), RTK (receptorii tirozin kinazici), Akt (serin-treonin protein kinazele specifice), Myc (gena care codifică un factor de transcripție), consecutiv inactivării genelor supresoare tumorale NF1 (neurofibromină), PTEN (gena care codifică fosfataza), LKB1(kinaza primară a adenozin monofosfat activat protein kinază), TSC1/2 (complexul pentru scleroză tuberoasă), SDH (succinat dehidrogenază), FH (fumarat hidratază), VHL (von Hippel-Lindau ubiquitin ligază), fiind afectată axa PI3K (fosfatidilinositol 3-kinaza)→ Akt (serin-treonin protein kinazele specifice) → mTOR (ținta pentru rifampicină la mamifere) → HIF (factorul de inhibare al hipoxiei) și/sau inactivând gena supresoare p53 (protein 53).

Unul din principalele mecanisme de glicoliză anaerobă rezidă în activarea factorului inductor al hipoxiei HIF, un factor de transcripție care a fost activat de stresul hipoxic și de asemenea de inflamația oncogenică și de stresul oxidativ. Este un compus constitutiv, heterodimer, fiind format dintr-o subunitatea β stabilă și subunitatea α instabilă. HIF-1 poate contribui la modificările metabolice și oncogenice inducând mai întâi disfuncția mitocondrială. Rolul central în activarea HIF-1, al oncogenelor și al genelor supresoare tumorale, determină reprogramarea metabolică în celula canceroasă stabilind multe legături între biologia celulei tumorale și biochimia acesteia [92].

Odată cu descreșterea concentrației de oxigen, HIF-1 poate induce mutații a două enzime și anume, pentru proteina din matricea mitocondrială: fumarat hidrataza (FH), și a proteinei din membrana internă mitocondrială: succinat DH-aza (SDH) [92].

OBIECTIVELE URMĂRITE:

Determinarea potențialului tumoricid al dermaseptinului în funcție de tipul de linie celulară, măsurând viabilitatea prin metoda de citometrie în flux pentru concetrațiile de peptid la care s-a observant o apoptoză semnificativă prin metoda MTT.

Optimizarea primeri-lor Akt, Hif-1α, XBP, Nrf2, PERK în vederea evaluării metabolismului celulelor tumorale prin determinarea expresiei genice a acestor gene sub acțiunea peptidului citotoxic utilizat.

Evaluarea metabolismului celulelor tumorale prin determinarea expresiei genice pentru Akt, Hif-1alfa XBP, Nrf2, și PERK sub acțiunea peptidelor citotoxice utilizate.

Extracția de material genetic (ADN/ARN) din culturile celulare, revers-transcrierea ARN-ului în ADNc.

Evidențierea toxicității dermaseptinului la diferite concentrații prin expunerea liniilor celulare la 48h prin tehnici de biologie moleculară (RT-PCR) utilizând primeri specifici și gena de referință ABL.

MATERIALE, METODE ȘI TEHNICI

Culturile de celule au fost realizate conform protocoalelor de lucru menționate în primul referat și au fost utilizate următoarele linii celulare aderente:

– Linia celulară HT-29 este o linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal. Celulele HT-29 produc antigen carcinoembrionar și sunt celule umane epiteliale intestinale care produc componentă secretoare de imunoglobulină A. Aceste celule sunt utilizate pentru studii tumorigenice.

– Linia celulară A-549 este o linie celulară aderentă de carcinom alveolar uman.

– Mezoteliomul uman (linia M14K) este o tumoră malignă foarte agresivă, care apare pe suprafețele tapetate cu celule mezoteliale, cel mai des în cavitățile pleurale, dar și în peritoneu, pericard și țesuturile moi paratesticulare. Având potențial de metastazare crescut cu o rezistență crescută la diverse chimioterapice celulele mezoteliale reprezintă o țintă potrivită pentru evaluarea unor noi agenți chimioterapici. Din cele 3 subtipuri histologice de mezoteliom, în experiment se va folosi linia M14K de celule mezoteliale de tip epitelial.

Linia celulară MDA-MB231 (linie celulară aderentă de adenocarcinom mamar) nu a mai fost utilizată deoarece rezultatele experimentale obținute nu au evidențiat o toxicitate semnificativă pentru dermaseptin la concetrațiile de lucru utilizate. La 20uM modificările au fost slab semnificative (p<0,05) și probabil peptidul ar trebui testat la concetrații mult mai mari pentru această liniie celulară (Fig. 7).

Fig. 7. Viabilitatea Celulelor MDA-MB231 (adenocarcinom mamar) fără spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic.

Pentru testarea vibilității prin citometrie în flux au fost selectate următoarele concentrații de peptid (dermaseptin): 4µM (p<0,01) (Fig. 8) și 15-20µM (p<0,001) (Fig. 9) pentru care au fost obținute modificări semnificative statistic sub acțiunea peptidului citotoxic, pentru linia HT29 (adenocarcinom colorectal) la 48 de ore de incubare, evidențiate prin metoda MTT.

Fig. 8. Viabilitatea Celulelor HT29 fără spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic.

Fig. 9. Viabilitatea Celulelor HT29 cu spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic pentru citirea absorbanței cu referință.

Pentru testarea vibilității prin citometrie în flux vor fi selectate următoarele concentrații de peptid (dermaseptin): 4µM (p<0,01) (Fig. 10) și 15-20µM (p<0,001) (Fig. 11) pentru care au fost obținute modificări semnificative statistic sub acțiunea peptidului citotoxic, pentru linia A549 (carcinom alveolar) la 48 de ore de incubare, evidențiate prin metoda MTT.

Fig. 10. Viabilitatea Celulelor A549 fără spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic.

Fig. 11. Viabilitatea Celulelor A549 cu spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic pentru citirea absorbanței cu referință.

Evaluarea apoptozei celulare prin tehnica citometriei în flux

Tehnica se bazează pe capacitatea substanțelor fluorescente de a emite semnale luminoase cu lungimi de undă particulare, în urma excitării lor cu fascicule laser. Determinarea intensității semnalelor optice emise este realizată prin intermediul unui citometru; sistem analizor complex ce combină componente optice, pneumatice și electronice. Citometrele ca analizoare complexe permit caracterizarea moleculară a celulelor intacte, dar sunt totodată create și pentru a realiza o analiză statistică a datelor [93].

Citometria în flux este o tehnică de numărare și examinare a particulelor microscopice, cum ar fi celulele, prin suspendarea acestora într-un flux de fluid și trecerea lor printr-un aparat de detectare electronică. Acesta permite analiza simultană a mai multor parametri fizici și caracteristici chimice de până la mii de particule pe secundă [93].

Principiul esențial al citometriei în flux este acela că celulele antrenate de un flux lichid vor trece în mod individual prin dreptul unui fascicul laser concentrat pe o suprafață extrem de mică. Pe măsură ce, celulele trec prin dreptul fasciculului laser, fiecare particulă dispersează lumina incidentă și emite fluorescență în funcție de compușii organici fluorescenți (fluorofori) folosiți. Lumina dispersată este captată pe două direcții: una paralelă cu fasciculul incident (FSC), iar a doua perpendiculară pe fasciculul incident (SSC). Emisia fluorescentă este captată pe direcția perpendiculară față de fasciculul incident. Lumina dispersată sau emisia fluorescentă (dacă particulele au fost marcate cu fluorofori) oferă informații despre proprietățile particulei. Curentul electric se propagă la amplificator și este convertit la un puls de tensiune [93].

Prin citometrie în flux pot fi analizate particule de aproape orice natură, iar dimensiunea lor poate să fie chiar sub dimensiunea rezoluției luminii vizibile. Numărul de evenimente care pot fi evaluate este uriaș, putându-se ajunge la 100.000 de particule (celule)/secundă, în timp ce până la 20 de parametri distincți pot fi analizați pentru fiecare din aceste particule [94].

Citometrele folosesc laseri pentru a genera sursa de lumină. Pentru a proiecta experimente complexe ale citometriei de flux, este esențial să se cunoască valorile pentru spectrele de excitație și de emisie ale fluoroforilor, precum și cunoștințe despre laseri. Motivul utilizării laserului se datorează capacității de a focaliza lumina într-un fascicul eliptic. Acest lucru este legat de componentele fluidelor adecvate. Laserele emit lumină coerentă, într-un fascicul drept. Sensibilitatea unui citometru în flux depinde în mod esențial de sursa coerentă de lumină, iar criteriul de selecție pentru aceasta este legat de lungimea de undă a laserului care trebuie să fie potrivită cu spectrul de absorbție necesar pentru excitarea fluoroforilor. În plus, sursa de lumină trebuie să fie focalizată la nivelul unei suprafețe foarte înguste precis delimitate. De asemenea, fasciculul trebuie să aibă și o anumită formă, ceea ce se poate realiza cu un sistem optic special. Cea mai utilă formă este cea eliptică, cu dimensiuni de aproximativ 15/60 microni [94]. Principala limitare a laserilor este lungimea de undă disponibilă pentru excitație. Practic toate citometrele sunt livrate standard cu un laser cu argon, ce emite lumină la 488 nm.

Laserele suplimentare pot fi adăugate pentru a crește potențialul de lungimi de undă de excitație. Folosirea unui laser permite fasciculului de lumină să se focalizeze asupra celulelor care trec prin citometru.

Utilizarea de lumină coerentă permite măsurători de perturbare a luminii. Utilizarea focalizării fasciculului eliptic prevede că numai lumina fluorescentă de la o singură celulă va fi măsurată la un moment dat. Doar lungimile de undă individuale ale luminii sunt disponibile pentru excitație (în citometrele noastre, numai între 488 nm și 635 nm).

La intersecția dintre celule și sursa de lumină se găsesc detectori ce înregistrează, pe de o parte lumina refractată de celule (surprinzând caracteristicile fizice ale celulei ca granularitate și volum) și pe de altă parte emisia fluorescentă (caracteristică fluoroforului cu care a fost marcată sonda/anticorpul monoclonal, dar și direct proporțională cu cantitatea de anticorp ce s-a legat de structurile celulare, surprinzând astfel caracteristicile moleculare ale probei (Fig.12) [93, 95].

Fig.12. Principiul de funcționare a unui citometru de flux. (SSC = detector de granularitate celulară, FSC = detector de volum celular, PMT = fotomultiplicator,

FL = detector de radiații [93].

Un detector de radiații absoarbe energia fotonilor recepționați și o transformă într-o cantitate măsurabilă. Dacă o celulă sau particulă trece direct prin lumina laser semnalele fluorescente emise sunt direcționate către tuburi fotomultiplicatoare (PMT) și colectate de o fotodiodă. Toate semnalele sunt dirijate către detectorii lor prin intermediul unui sistem de oglinzi și filtre optice. Fotomultiplicatoarele detectează semnalele de fluorescență care sunt adesea slabe.

Specificitatea detectorului pentru un colorant fluorescent particular este optimizată prin plasarea unui filtru în fața fotomultiplicatorului care permite doar o gamă îngustă de lungimi de undă pentru a ajunge la detector. Aceste filtre sunt numite bandă de trecere. Pulsul pe care îl generează o particulă care este excitată de fasciculul laser va depinde de forma fasciculului, intensitatea luminii, dar și de dimensiune, viteza și încărcarea cu fluorofori a particulei. La o viteză de 10 m/s, o particulă va traversa un fascicul de 10 microni într-o microsecundă. Radiația împrăștiată primită de detector este convertită în semnal electric, care este proporțional cu mărimea celulei.

Lumina emisă de un anumit fluorofor va putea trece de oglinzile dicroice sau va fi reflectată de acestea în funcție de pragul impus de filtre. Într-un citometru de flux, lumina filtrată este detectată folosind o serie de detectori electronici (tuburi fotomultiplicatoare), și convertită la o valoare numerică pentru analiza în calculator. În timp ce fiecare fluorofor va avea un optim, sau lungime de undă de emisie de vârf, spectrele vor fi de fapt distribuite peste un anumit număr de lungimi de undă [95].

Fig.13. Diagrama nivelelor energetice. Când o celulă trece prin dreptul fasciculului laser, excitarea fluoroforilor va conduce la emiterea de lumină cu o lungime de undă superioară celei absorbite, dar la un nivel de energie inferior [93].

Tabel 2. Fluoroforii folosiți, maximul lungimii de undă de excitație și de emisie corespunzătoare fiecărui fluorofor.

Fluorescența este fenomenul de emisie spontană de lumină, la trecerea unui sistem molecular dintr-o stare energetică excitată, tranzitorie, în urma absorbției de energie luminoasă (fotoni) într-o stare cu energie minimă, necesară stabilității energetice a sistemului (Fig.13) [93]. Intervalul în care un compus fluorescent poate fi excitat este denumit spectru de absorbție. Cea mai multă energie este consumată în tranzițiile de absorbție decât în cele de emisie fluorescentă, lungimile de undă de emisie vor fi mai mari decât cele absorbite.

Substanțele fluorescente sau fluoroforii au capacitatea ca, odată stimulate (excitate) cu o lumină caracterizată de o anumită lungime de undă, să emită lumina cu o altă lungime de undă, caracteristică fluoroforului respectiv (Tabel 2).

Substanțele fluorescente pe care le avem astăzi la dispoziție în acest scop acoperă un spectru larg de emisie (Fig.14).

Fig.14. Reprezentarea structurii chimice a ficoeritrinei (PE).

Alegerea unui anumit fluorofor particular ține de o multitudine de considerente, începând cu cele tehnice, legate de chimia cuplării, de disponibilitatea unei surse de lumină de excitație cu lungime de undă potrivită, de posibilitatea înregistrării semnalului, de posibilitatea de a face distincție între spectrele de emisie etc. și terminând cu cele legate de costurile acestor substanțe (Fig. 15) [95].

Fig.15. Reprezentarea spectrelor de excitație și emisie în fluorescență a ficoeritrinei.

Moleculele capabile să absoarbă fotoni sunt numite cromofori, iar cromoforii care emit fotoni, sunt numiți fluorofori (compuși organici fluorescenți). Moleculele fluorescente folosite pentru marcarea anticorpilor sunt caracterizate de maximul lungimii de undă de excitație și maximul lungimii de undă de emisie (Tabel 1). Intensitatea luminoasă depinde de numărul de fotoni emiși, nu de lungimea de undă. Cel mai folosit fluorofor în citometria în flux este ficoeritrina (PE). Aceasta prezintă cea mai mare deplasare Stokes, cea mai mare eficiență cuantică și nu prezintă fenomenul de auto-inhibare.

Ansamblul de informații obținut prin dispersia luminii și a semnalelor înregistrate ca urmare a fluorescenței emise de fluoroforii cuplați, de obicei, cu anticorpi monoclonali, determină identificarea proprietăților fiecărei celule care trece prin dreptul fasciculului laser. Această investigație este denumită imunofenotipare. Lumina înregistrată de către un senzor situat de partea opusă sursei de lumină, senzor denumit detector de volum celular (FSC) oferă informații legate de mărimea particulei. Lumina înregistrată de un alt senzor, situat de obicei la un unghi de 90ș față de fasciculul laser, oferă informații legate de granularitatea sau structura nucleară a celulei respective (Fig.16).

Detecția caracteristicilor fizice ale celulelor (Fig.16) se face prin evaluarea parametrilor Forward scatter (“FSC”) ce reprezintă de fapt lumina transmisă prin împrăștiere la 180° fiind proporțională cu suprafața (dimensiunea) celulei și Side scatter (“SSC”) – lumina refractată și împrăștiată la 90°, proporțională cu complexitatea structurală internă a celulei (granularitatea). Prin combinarea celor doi parametri, mărime și granularitate, fiecare particulă (celulă) va putea fi proiectată sub forma unui punct în cadrul unui grafic denumit uzual „dot plot”. Particule cu dimensiuni și grad de neregularitate al suprafeței diferite vor ocupa zone distincte ale graficului. În acest mod, pe baza acestor două caracteristici, un amestec de celule va putea fi separat în populații distincte, vizibile sub forma unor grupuri compacte de puncte. Acestea vor putea fi ulterior încadrate în așa numite „porți” electronice, ceea ce va permite numărarea lor, dar și selectarea lor pentru analiza ulterioară [96].

Fig.16. Reprezentarea schematică a modului de evaluare a granularității și volumului celular prin citometrie în flux.

Când o particulă conține însă multe substanțe fluorescente multiple, cu spectre de emisie diferite, apare o problemă tehnică legată de posibila suprapunere a acestor spectre. Astfel un PMT destinat unei lungimi de undă de 550 nm (corespunzătoare fluoroforului ficoeritrină-PE) va înregistra și lumina cu lungimea de undă de 525 nm emisă de fluoresceină (FITC), ceea ce ar face imposibil să distingem care detector înregistrează fotonii emiși de către FITC. Această situație impune efectuarea unei operațiuni destul de complexe, denumită „compensație spectrală”, prin care procentul de semnal înregistrat de către un detector pentru o anumită fluorescență este scăzut din procentul de semnal înregistrat de celălalt detector.

În această manieră se poate ajunge la utilizerea unui număr mare de detectori dedicați unor spectre de emisie foarte apropiate. Parametrii celulari pot fi afișati ulterior pe coordonate lineare sau logaritmice, sub formă de grafice mono–parametrice numite histograme (grafic ce înfățișează intensitatea distribuției unui parametru pe axa OX și numărul de evenimente corespunzător pe axa OY) sau bi-parametrice numite dot-ploturi (expuneri biparametrice în care fiecare celulă apare ca un punct pe coordonatele OX și OY corespunzător intensității semnalelor) [97].

În cazul histogramelor semnalul fluorescent este reprezentat sub forma unor vârfuri, care sunt proiectate pe axa X (de obicei logaritmică), cu atât mai departe de origine, cu cât intensitatea semnalului este mai mare. Primul vârf care trebuie să apară în histograme este generat de autofluorescența celulelor, astfel că orice semnal real, înregistrat ca urmare a excitării fluoroforilor, este reprezentat de un vârf situat la dreapta vârfului autofluorescenței.

Analiza bi-parametrică a fluorescențelor compară intensitatea semnalului generat de doi fluorofori. Prin reprezentarea evenimentelor înregistrate sub forma de dot-plot, graficul poate fi împărțit în patru cadrane, care vor fi alocate particulelor dublu-pozitive, dublu-negative, și respectiv simplu pozitive pentru fluoroforii respectivi. Analiza datelor se realizează de către operator, ulterior achiziției. Achiziția datelor pentru un număr foarte mare de celule din aceeași probă permite realizarea unei analize statistice. Stabilitatea setărilor instrumentului permite calibrarea semnalelor fluorescente și astfel și analiza cantitativă a caracteristicilor moleculare ale celulelor [98, 99]. Semnalul care este generat de orice celulă individuală, este în esență trasat de un osciloscop. Integrarea acestui semnal dă o valoare numerică pentru fluorescență. Una dintre primele utilizări ale tehnologiei fluorescente a fost de a caracteriza celulele pentru a urmări experimente celulare [100, 101].

Citometrul FACSCanto II (Becton Dickinson Biosciences) folosit pentru achiziția și prelucrarea datelor în lucrarea de față este prevăzut cu 3 lasere care emit la 405 nm, 488 nm și 633 nm (Fig.17). Citometrul FACSCanto II realizează procesarea datelor cu ajutorul programului BD FACSDiva 6.1.3 (Becton Dickinson) (Fig. 17).

Citometria în flux reprezintă astăzi una dintre cele mai versatile metode utilizate în clinică și în cercetare. Aplicații: cinetica ciclului celular, genetică, biologie moleculară, microbiologie, parazitologie, etc. [97, 102, 103].

Fig.17. Citometru FACSCantoII BD Biosciences.

Tehnica citometriei în flux este folosită de asemenea și pentru detectarea și măsurarea procesului apoptotic [102]. Apoptoza este caracterizată prin modificări ale morfologiei celulare, condensare nucleară, picnoză, dar și printr-o serie de evenimente biochimice care duc la degradarea membranei mitocondriale și a ADN-ului nuclear. Fosfatidilserina prezentă în mod normal la nivelul membranei celulare, dar nedisponibilă, este expusă la suprafața celulelor în diferite stadii ale apoptozei.

Compusul 7-AAD (7-amino-actinomicin D) este un compus chimic fluorescent cu o afinitate mare pentru ADN (Fig.18). Este folosit ca marker fluorescent în citometria de flux și permite evaluarea celulelor intrate în apoptoză târzie sau deja moarte. Se intercalează în ADN-ul dublu-catenar, având o afinitate mare pentru zonele bogate în guanină – citozină (GC) [104].

Fig.18. Structura chimică a 7-AAD [www.wikipedia].

Cu un maxim de absorbție la 546 nm, 7-AAD este excitat eficient folosind un laser de heliu-neon cu lungimea de undă de 543 nm; acesta poate fi excitat cu o eficiență mai mică folosind un laser de argon cu lungimile de undă 488 nm sau 514 nm. Acest fluorofor prezintă un maxim de emisie la 647 nm în roșu aprins (Fig.19) [104].

Compusul 7-AAD nu trece prin membrana celulară intactă, de aceea este utilizat pentru viabilitatea celulară. Celulele cu membrana compromisă se vor colora cu 7-AAD, pe când cele cu membrana celulară intactă vor rămâne necolorate.

Fig.19. Spectrul de absorbție și emisie fluorescentă pentru 7-AAD.

Anexina V (indicator de apoptoză) – În biologia moleculară, analiza afinității Anexinei V este un test de cuantificare a celulelor în curs de apoptoză fiind un indicator timpuriu al acesteia. În acest scop se folosește proteina Anexină V pentru a marca celulele apoptotice și moarte, precum și numărători, folosind fie citometria în flux sau microscopul de fluorescență [105]. Acest compus este o proteină cu masa moleculară de 35-36 kDa, Ca2+ – dependentă, care se leagă la fosfolipidele încărcate negativ, cu o afinitate mare pentru fosfatidilserină (PS).

Apoptoza este caracterizată de o varietate de caracteristici morfologice, cum ar fi pierderea asimetriei membranare și modul de fixare, condensarea citoplasmei și a nucleului, și scindarea internucleozomală a ADN-ului. Unul dintre evenimentele precoce ale apoptozei este translocarea la nivelul membranei celulare a fosfatidilserinei (PS), un fosfolipid membranar, din interiorul celulei și anume de la nivelul stratului intern al bistartului lipidic la exteriorul membranei, adică în stratul extern al bistratului lipidic (Fig.20).

Fig.20. Reprezentarea mecanismului de detectare a celulelor apoptotice cu ajutorul

Anexinei V [102, 105].

Acest eveniment poate fi evaluat în citometria de flux, datorită faptului că PS va putea fi evidențiată prin legare de către Anexina V cuplată la rândul ei, cu o substanță fluorescentă cum ar fi de exemplu ficoeritrina (PE), iar la nivel nuclear se va fixa 7-AAD sau iodura de propidiu (PI) (Fig.24) [102, 105].

Asimetria distribuției componentelor membranare este o caracteristică cu rol esențial în realizarea funcțiilor celulare. Distribuția asimetrică a moleculelor lipidice pe cele două fețe ale bistratului poate fi exemplificată prin structura membranei hematiilor care conține în monostratul lipidic extern predominant fosfatidilcolină și sfingomielină, iar în monostratul intern fosfatidiletanolamină și fosfatidilserină. Consecințele sunt multiple: diferențele gradului de nesaturare ale lanțurilor hidrocarbonate ale lipidelor și natura diferită a grupărilor polare determină diferențe în  fluiditatea celor două monostraturi, apare de asemenea și o distribuție diferită a sarcinilor electrice, fosfatidilserina fiind singurul fosfolipid cu sarcină negativă [102]. Importanța funcțională a asimetriei de distribuție a componentelor membranare poate fi exemplificată astfel: activitatea enzimatică a proteinelor asociate membranei este dependentă de sarcina electrică a fosfolipidelor, proteinkinazele necesitând prezența fosfatidilserinei cu sarcina electrică negativă. În timpul apoptozei, fosfatidilserina este translocată în monostratul exoplasmic al bistratului lipidic și expusă astfel pe suprafața celulară, semnalizând macrofagelor prezența unei celule moarte, acesta fiind semnalul pentru fagocitare [102].

Translocarea fosfatidilserinei în monostratul extern se produce prin inactivarea translocazei care realizează translocări din monostratul extern în cel intern și activarea scramblazei (proteină responsabilă de deplasarea fosfolipidelor între cele două monostraturi ale bistratului lipidic a membranei celulare) care transferă fosfolipide nespecific între monostraturile lipidice [106]. Localizarea glicolipidelor în monostratul extern este implicată funcțional în mecanisme de semnalizare celulară, ele funcționând ca receptori. Se remarcă localizarea proteinelor membranare, mai precis orientarea strictă, specifică pe fața exoplasmică sau citosolică a unor domenii ale moleculelor proteice. De exemplu, glicoproteinele au lanțurile oligozaharidice orientate pe fața externă a membranelor celulare și pe fața citosolică a membranelor reticului endoplasmic și aparatului Golgi [106]. Localizarea asimetrică a lipidelor și proteinelor determină delimitarea specifică a unor domenii structural-funcționale ale membranelor celulare: un exemplu ilustrativ este domeniul apical, respectiv laterobazal al membranei celulelor epiteliului intestinal.

Anexina V se leagă la celulele apoptotice într-un mod dependent de calciu folosind fosfatidilserina ce se află pe suprafața membranei ce sunt, de obicei, prezente numai pe interiorul membranei. Celulele apoptotice individual sănătoase sunt rapid eliminate prin fagocite. Totuși, în procesele patologice eliminarea celulelor apoptotice poate fi amânată sau chiar absentă. Celulele moarte din țesut pot fi detectate cu Anexină V. Marcarea Anexinei V cu molecule fluorescente (PE) sau radioactive, face posibilă detectarea legăturii din etichetarea Anexinei V de la suprafața celulară a celulelor apoptotice. După legarea la suprafața fosfolipidului, Anexina V se asamblează într-un grup trimeric. Acest trimer constă din trei molecule de Anexină V, care sunt legate unele de altele prin interacțiuni necovalente proteină-proteină. Formarea trimerilor de Anexină V rezultă din formarea unei rețele cristaline bidimensionale pe membrana fosfolipidului. Această aglomerare a Anexinei V pe membrană crește foarte mult în intensitate, atunci când Anexina V este marcată cu o sondă fluorescentă sau radioactivă [106].

Incubarea celulelor cu, complexul Anexină V și analiza lor flow-citometrică permit, pe baza analizei fluorescenței, detecția acelor celule intrate în apoptoză, în special a celor aflate în stadii precoce ale procesului. Anexina V poate fi folosită în monitorizarea viabilității celulare, apoptozei timpurii, apoptozei tardive și a morții celulare. Viabilitatea celulară – celulele sunt negative pentru Anexină V și 7-AAD, nu prezintă semne de apoptoză: nu s-au produs translocații ale PS, iar membrana plasmatică este intactă.

Celulele aflate în apoptoză timpurie sunt pozitive pentru Anexină V și negative pentru 7-AAD deoarece, deși s-au produs translocații ale PS membrana plasmatică este intactă, astfel încât fluorocromul 7-AAD nu a putut să pătrundă în celulă. În cazul în care celulele se află în apoptoză tardivă sau sunt moarte, în urma analizei prin citometrie în flux, acestea vor fi pozitive atât pentru Anexină V cât și pentru 7-AAD, deoarece membrana plasmatică și-a pierdut integritatea, iar flurocromul 7-AAD a ajuns la niveul nulear. În numeroase studii, Anexina V a fost folosită pentru a detecta celulele apoptotice in vitro și in vivo [102, 106, 107].

II.4. Prelucrarea și interpretarea statistică a rezultatelor

Pentru prelucrarea statistică a datelor s-a utilizat testul t-Student folosind programul de calcul statistic SPSS 19.0 și programul de calcul Microsoft Excel 1997.

Interpretarea statistică a datelor a considerat diferențele corespunzătoare pentru un prag de semnificație:

p>0,05 statistic nesemnificative;

p<0,05 semnificative statistic;

p<0,01 puternic semnificative statistic;

p<0,001 foarte puternic semnificative statistic.

Având la bază o metodă adecvată cunoașterii proceselor ce se desfășoară aleatoriu, teoria probabilităților, statistica medicală reușește să descifreze cu o eroare cunoscută și acceptabilă – corelația multiplă dintre fenomenele studiate și factorii determinanți, în vederea stabilirii principalelor tendințe ale acestora. În acest scop sunt utilizate programe dedicate pentru prelucrarea statistică a datelor, rezultatele obținute ducând la concluzii clare asupra fenomenelor studiate.

În acest studiu au fost utilizate o serie de metode matematice implementate în soft-ul utilizat pentru prelucrarea datelor (Statistica), metode ce caracterizează valorile medii „normale” ale fenomenelor studiate, sau dispersia și eroarea medie față de aceste valori etc. În aceste studii prelucrarea statistică a datelor s-a efectuat folosind media aritmetică, abaterea standard (DS), coeficientul de variabilitate (%). Alegerea metodelor de cercetare statistică depinde de natura fenomenului studiat, de frecvența, dinamica și structura acestuia.

Indicatorii statistici calculați în cadrul studiului au posibilitatea de generalizare, facilitând interpretarea comparativă, corelativă a diferitelor subgrupe ale lotului cercetat, ridicând deci posibilitatea sintezei de la caracteristicile individuale la cele de grup și de la cele de grup la întregul eșantion.

Prin variantă sau variabilă se înțelege valoarea însușirii concrete, cantitative, numerice, sau calitative ale caracteristicilor de grupare. Cu ajutorul variantelor se poate evidenția „variabilitatea” caracteristicilor, posibilitatea de a se manifesta, ivi în cadrul unor limite prin mai multe valori, sau însușiri concrete. Fiecărui subiect „individ statistic” dintr-o colectivitate cercetată și fiecărei caracteristici de grupare îi corespunde o variantă de grupare, o anumită valoare, nivel de însușire calitativă.

Varianța se poate exprima prin valori absolute, relative, fracții sau însușiri. Grupând datele în clase, se remarcă asimilarea tuturor valorilor unei clase la o valoare unică, aceea a punctului median (în acest mod se face reducerea la cazul unei variabile discontinue).

Efectivul unei valori (sau al unei clase) reprezintă frecvența sa absolută, adică numărul de apariții ale acestei valori (sau al acestei clase) în ansamblul distribuit.

Frecvența relativă se obține raportând frecvența absolută la numărul de indivizi. Suma frecvențelor relative va fi egală cu 1, ceea ce reprezintă mulțimea, adică 100 procente, sau 100 cazuri ale distribuției.

Frecvența cumulată reprezintă numărul de indivizi cumulați până la o anumită valoare a variabilei de studiu; poate fi absolută și relativă.

Plecând de la valoarea cea mai mică (prima din ordinea tabelului) se adună succesiv frecvențele fiecărei valori (sau clase); prin urmare, pentru fiecare valoare se consideră nu numai frecvența sa proprie, ci suma acestei frecvențe cu a tuturor valorilor inferioare. În acest mod se obține o distribuție de frecvențe numite cumulate.

Cu ajutorul indicatorilor statistici se poate efectua analiza cantitativă care să permită evaluări și comparații din punct de vedere a localizării și a împrăștierii datelor. Aceștia exprimă numeric pe baza valorilor de studiu, fie localizarea, fie variația datelor.

Indicatorii de corelație și regresie servesc la exprimarea legăturilor funcționale, cauzale între două sau mai multe caracteristici ale unui fenomen sau colectivități.

Valorile medii sunt indicatori ai însușirii calitative esențiale ale fenomenelor colectivității studiate, măsura tendinței centrale a repartițiilor de frecvențe ale variabilei.

De interes deosebit este cunoașterea comparativă a fenomenelor studiate față de un etalon, valoarea medie. Fără cunoașterea valorii medii, comparația nu este posibilă decât în mod imperfect: comparația dintre două sau mai multe fenomene pentru a constata diferența dintre ele, neputând conclude dacă aceste fenomene sunt sau nu apropiate de o valoare etalon.

Valoarea medie are aceleași dimensiuni concrete cu ale variabilei a cărei repartiție de frecvență o caracterizează (sintetizează). Condițiile pe care trebuie să le îndeplinească o medie ar fi:

să fie definită în mod precis;

să fie expresia, sinteza tuturor observațiilor efectuate;

să posede proprietăți simple, evidente, clare;

să nu fie afectată prea mult de fluctuațiile de selecție.

Valorile medii pot fi exprimate prin cifre absolute sau prin indici. De exemplu, în cazul cunoașterii tensiunii arteriale sistolice sau diastolice la un grup de populație, valorile medii se exprimă prin cifre absolute (mmHg, cm, Kg). În cazul mortalității sau morbidității generale sau specifice pe vârste sau sexe, cauze de boală, valorile medii se exprimă prin cifre relative (la 100 sau 1000 cazuri).

Eroarea standard ajută la determinarea intervalului de variație a mediei pentru o anumită încredere (95%).

Deviația standard arată cât de depărtate sunt datele în jurul valorii medii.

Eroarea mediei aritmetice. Media aritmetică calculată de noi nu reprezintă, de cele mai multe ori, decât o medie empirică și nu una absolută, deoarece noi nu cercetăm totalitatea colectivității, ci doar un eșantion, o parte mai mare sau mai mică din total. Din aceste motive s-ar putea ca eșantionul cercetat să nu corespundă ca structură cu colectivitatea întreagă sau dacă alegerea a fost bine făcută, să existe totuși unele diferențe.

Media calculată diferă mai mult sau mai puțin de media reală, numită și absolută, care ar fi fost obținută în cazul cercetării totalității colectivității. Media practică prezintă, deci o eroare față de această medie absolută.

Compararea mediilor aritmetice se face prin teste specifice pentru serii cu distribuții normale sau cu ajutorul testelor neparametrice în cazul în care distribuția nu este normală.

Testarea statistică stă la baza deducției statistice. Deciziile statistice se bazează pe teoria probabilităților, pe bază de eșantion estimându-se situația pe întreaga populație.

Când avem două sau mai multe eșantioane selectate în mod similar în conformitate cu teoria selecției și dorim să testăm dacă diferențele sunt sau nu semnificative (de exemplu rezultatele a două tipuri de tratamente pe două loturi de bolnavi) în vederea deciziei, aplicăm o serie de teste de semnificație.

Pornim de la ipoteza că diferențele dintre eșantioanele selectate nu sunt diferite semnificativ, diferențele datorându-se fluctuației de selecție ale aceleiași populații.

Această ipoteză o numim ipoteză nulă (H0), ipoteza alternativă ( de acceptare a diferenței semnificative) notându-se cu H1.

Nivel (prag) de semnificație este probabilitatea maximă cu cât putem risca o eroare. În practică, un nivel de semnificație de 0,05 (5%) este suficient de precis, probabilitatea (nivel de încredere) de 95% arătând că decizia este justă. În aceste cazuri afirmăm că ipoteza H0 a fost respinsă la un nivel (prag de semnificație) de 0,05 deci că s-ar putea să greșim cu o probabilitate de 0,05 (5%) și că putem avea o încredere în decizia făcută cu o probabilitate de 95% (nivel de încredere).

Coeficientul de corelație (Pearson) r reprezintă o măsură a puterii legăturii dintre două, sau mai multe variabile. Acesta variază între -1 și +1. O valoare pozitivă indică o variație direct proporțională, iar o valoare negativă indică o dependență invers proporțională. Pentru valori ale lui r apropiate de 0 variabilele pot fi considerate independente, considerându-se nesemnificativ pentru valori r [-0,3 0,3]. Sensul regresiei și al corelației constă în determinarea tipului legăturii cât și formula matematică de dependență între variabilele de interes. Valoarea lui r2 indica procentul cu care variabila independentă afectează variabila dependentă.

Legătura dintre două variabile aleatorii în care una dintre ele variază constant, iar cealaltă variază aleatoriu a fost descrisă de forma liniară a dreptei de regresie. Dacă panta dreptei de regresie este pozitivă atunci dependența între cele două variabile aleatoare este direct proporțională. Astfel o creștere a unei variabile duce la o creștere a celei de a doua variabile. Dacă valoarea pantei dreptei de regresie este negativă atunci dependența între cele două variabile este invers proporțională. Când nu există dependență între cele două variabile panta dreptei este zero.

Tehnici de biologie moleculară

Efectul peptidelor citotoxice va fi evaluat și prin determinarea expresiei unor gene în implicate în metabolismul celulelor tumorale Akt și HIF-1alfa comparativ cu gena de referință GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza). Prin tehnici de biologie moleculară în aceste studii ne-am propus să urmărim modificări ale metabolimului celulelor tumorale sub acțiunea unor peptide citotoxice. Extracția de ADN din culturile celulare tumorale se va realiza automat cu kituri de extracție ARN corespunzătoare pentru extractorul automat Magnesia 16 din cadrul laboratorului. Soluția de ARN este stocată la -20°C până va fi revers-transcrisă în ADNc.

Tehnica PCR se desfășoară în 3 etape:

Denaturarea: la 94șC – ADN-ul țintă este separat în 2 catene;

Hibridizarea primerilor: la 55-70șC, primerii se vor atașa specific și complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene ADN țintă;

Elongatia: la 72șC, ADN-polimeraza în prezența Mg2+/Mn2+ și a excesului de dNTP va extinde primerii la capătul 3’ rezultând un produs specific de amplificare (amplicon).

Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de ampliconi.

Fazele reacției PCR – La rândul său, procesul global de amplificare desfășurat de-a lungul unui număr definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:

Exponențială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon (se admite o eficiență de 100% a reacției);

Lineară: pe măsura ce componentele reacției sunt consumate, se produce o încetinire a reacției, iar produșii PCR încep să se degradeze;

Platou (end-point): reacția este oprită, nu se mai formează alți produși de amplificare, iar dacă faza se prelungește mult produșii PCR vor suferi o degradare importantă.

ADN-ul matrita

puritatea ADN-ului introdus ca matriță reprezintă un parametru important pentru succesul unei reactii PCR (raportul absorbanțelor 260nm/280nm >1.8 înseamnă prezența unor cantități mari de ARN în soluția de ADN și care pot inhiba acțiunea ADN polimerazei). De asemenea o puritate mai mică de 1,8 înseamnă un ADN cu puritate scăzută datorită prezenței de proteine în sistem care pot inhiba reacția de amplificare

Cantitatea de matriță ADN introdusă într-o reacție PCR: cantitățile recomandate pentru o reacție PCR standard sunt de maximum 500 ng pentru ADN. ( ~ 10–15% din volumul mixului de reacție)

Setul de primeri (2 primeri) care este complementar capatului 3’ al fiecarei catene (sens si antisens) din ADN-ul țintă.

Există mai multe programe disponibile on-line pentru proiectarea amorselor.

Lungimea optima este de 18-22bp-

Continutul in grupări GC – reprezintă numărul de C și G reprezentat ca procent din toate nucleotidele primerului – trebuie să fie între 40-60%.

Compozitia în GC a capătului 3’(GC Clamp ) -Sunt necesare cel puțin 3 C sau G printre

să nu formeze structuri secundare – reduc eficiența reacției.

Stuctura în “ac de păr” (hairpins) – se formează prin interacție intramoleculară între nucleotidele aceluiași primer. O valoare negativă mare a lui ΔG (energie liberă Gibbs) ne indică stabilitatea structurii secundare formate. O bucla a capatului 3’ cu un ΔG pȃnăla -2 kcal/mol poate fi tolerată, deși prezența buclei în capătul 3’ poate altera reacția PCR. O buclă în mijlocul primerului cu un ΔG pȃnă la-3 kcal/mol în general poate fi tolerată.

“self dimmer” – un primer are secvențe complementare cu sine însuși. Un self dimer al capătului 3’ cu ΔG pȃnă în -5 kcal/mol poate fi tolerat. Un self dimer al capătului 5’ cu ΔG pȃnă în -6 kcal/mol este de obicei acceptabil.

“cross dimmer”- cei doi primeri au secvențe complementare. Un cross dimer la capătul 3’ cu ΔG pȃnă in -5 kcal/mol poate fi tolerat.

Temperatura de topire (melting) Tm – temperatura la care jumatate din moleculele dublu-catenare de ADN se denaturează și devin monocatenare (este un indicator al stabilitatii dublu-helixului). Temperatura de topire poate fi aproximată după

Primerii cu Tm în intervalul 52-58°C produc în general cele mai bune rezultate.

Primerii cu Tm peste 65°C au tendința de a forma configuratii secundare.

Tm poate varia în funcție de salinitatea mixului de reacție (cationi mono-bivalenti), motiv pentru care este întotdeauna necesară optimizarea condițiilor de reacție.

Tm pentru ambele amorse ar trebui să fie similară pentru cele mai bune rezultate

Temperatura de legare (hibridizare – anealling) Ta este în strȃnsă corelație cu Tm.

Ta cu mult mai mare decȃt Tm va duce la o insuficientă (ineficientă) legare a primerilor la matrița ADN.

Ta cu mult mai mică decȃt Tm poate duce la legarea nespecifică a primerilor

Primerii trebuie să aibă Tm cu aproximativ 5 -10 grade Celsius sub Ta , care este, de obicei, între 55 și 65 de grade Celsius.

Repetițiile de doua nucleotide: un numar mai mare de 4 repetiții dinucleotidice nu trebuie acceptat în secvența unui primer – posibile erori de sinteză.

Repetițiile mononucleotidice (runs) – este acceptabil, dacă numarul maxim de repetiții ale aceleiași nucleotide grupat este de 4bp – posibile erori de sinteza.

Concentrațiile optime primeri: 400 nM concentrație finalǎ (per primer),

EXTRACȚIA DE ARN-ului TOTAL

Se pregătesc, în hotă, materialele necesare prelucrării probei biologice: tuburi de centrifuga de 50 mL, 2 mL si 0.5 Ll, varfuri de la 10 µL pana la 1000 µL, soluție de liza, apa RNase free, RNAzol, recipiente pentru colectarea reziduurilor și materialelor folosite.

Extracția de ARN total cu TRIzol sau TRIreagent

TRIzol® Reagent este o soluție monofazică de fenol, guanidinisotiocianat și alte componente care facilitează izolarea ARN-ului total din produse biolgice cu menținerea integrității ARN-ului obținut datorită eficienței inhibitorilor de RNase.

Extracția:

Se folosesc probe biologice care sunt suspensiile celulare.

Se face liza membranelor celulare cu cu un volum de trei ori mai mare de solutie de liza si se incubează 10 minute la 2-80C.

Dupa incubare proba este centrifugată la 2100 rpm, 10 min, 40C (pentru volume mari) sau 30 sec. la 14000xg, 40C (pentru volume de maxim 2 ml).

Se aruncă supernatantul si se adaugă 1 mL TRIzol peste butonul de celule. Se omogenizează bine prin pipetare.

Se lasă în repaus 10 min la temperatura camerei.

Se adaugă peste omogenatul de mai sus 200 µL de cloroform pentru fiecare 1 mL de Trizol initial.

Se agită energic in mână 15 secunde (sau chiar mai mult, până când culoarea virează la roz lactescent) – etapa esențială; In aceasta etapă se face solubilizarea ARN; cu cât agitarea este mai energică cu atât liza celulara, și solubilizarea ARN vor fi mai bune.

Se lasă 2-3 min in repaus la temperatura camerei.

Se centrifughează la 12000 G, timp de 15 min la 4°C. Lichidul se va separa in 3 faze:

faza inferioară rosie conține cloroform; (si ADN-ul si proteinele din proba)

interfaza conține resturi tisulare sub forma unui inel (a nu se atinge inelul cu varful pipetei!)

faza superioară apoasă conține ARN.

Recuperăm faza superioară, apoasă, într-un eppendorf nou.

Precipitarea ARN-ului

Adăugăm peste supernatantul recuperat 500 µL izopropanol pentru fiecare 1mL de Trizol inițial

Se agită la vortex 5 sec

Se lasă în repaus 10 min la temperatura camerei

Se centrifughează la 12000 G, timp de 10 min la 4°C

Se înlatură supernatantul (sedimentul este foarte mic!)

Dacă se pornește de la foarte putin material este recomandată adăugarea înaintea etapei de precipitare a ARN-ului, a unui suport de precipitare (glycogen 5-20 µg per tub – calitate BioMol 1 µL din sol 10 µg / µl în apa DEPC)

ARN-ul precipitat poate fi păstrat in etanol 70% la -20°C minim un an sau la 4°C o săptămână.

Spălarea

Peste sedimentul recuperat se adaugă câte 1 mL etanol de 70% pentru fiecare 1 mL de Trizol inițial care a fost ținut la -20°C

Se agită la vortex 5 sec

Se centrifughează la 7500 G timp de 5 min la 4°C, după care se elimină supernatantul în totalitate (etanolul inhibă PCR).

Uscarea și rehidratarea

Se usucă în hotă până la evaporarea lichidului rămas (aproximativ 5 min la temperatura camerei) nu se lasă ca ARN-ul să se usuce complet deoarece resolubilizarea lui va fi dificilă.

Se lasă 10 min la 55°C.

REVERSTRANSCRIPȚIA ARN-ului la ADN complementar (ADNc)

Reverstranscripția este un proces de copiere a matriței de ARN in ADNc (ADN complementar) care va fi ulterior supus amplificarii. Acest process a fost realizeazat prin utilizarea reactivului: Thermo Scientific – RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit si a echipamentului SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System.

Kit-ul pune la dispozitie atât primeri random cât și oligo(dT). Primerii random care se hibridizează în zone diferite pe traseul ARN si produc fragmente de dimensiuni reduse din toate tipurile de ARN. Toate componentele kit-ului se păstrează la -200C, se dezgheață pe gheață, se păstrează în timpul manipulării pe gheață și se ating doar cu mănuși. După dezghețare componentele kit-ului sunt vortexate și apoi centrifugate scurt. Se folosesc pentru reverstranscripție 2 µg ARN total (4 µL din soluția de ARN diluat până la 500 ng/uL).

Modul de lucru:

Pregătirea combinațiilor matrice ARN/primer – Pentru fiecare reacție, se amestecă într-un tub steril de 0,2 mL:

Amestecul ARN/Primer se plasează 5 minute la 65șC, apoi imediat pe gheață pentru cel putin 5 minute. Se centrifughează scurt pentru recuperarea condensului, apoi se păstrează pe gheață.

Pregătirea mixului de revers-transcripție – Pentru o singura reactie mix-ul de reverstranscriptie care se adauga in tubul ce contine combinatia matrice ARN/pirmer este:

Dacă se lucrează mai multe probe odată, atunci se pregătește un mix de reverstranscripție pentru acel număr de probe, se omogenizează prin pipetare ușoară, se centrifughează scurt apoi se distribuie, pe gheață, câte 8 µl în fiecare tub cu combinația matrice ARN/primer. Deci volumul total conținut într-un tub de reverstranscriptie de 0,2 mL este de 20 µL.

Amplificarea – Pentru a obține ADN-ul complementar tuburile de 0,2 mL se introduc în termociclor (Agilent Technologies SureCycler 8800) la următorul program:

5 minute la 25șC (hibridizarea primerilor);

60 minute la 60șC (extensia);

15 minute la 70șC (inactivarea enzimei);

4șC (hold).

ADN-ul complementar astfel obținut poate fi utilizat imediat sau păstrat pentru un timp mai scurt la – 20șC sau pe termen lung la -70șC.

ADN-ul complementar obtinut in urma reverstranscriptiei va fi diluat 1:5 cu apa nuclease free.

În tehnicile de amplificare ulterioare se folosesc 5 µL ADNc, care corespund (sunt echivalentul) unei cantități de 100 ng ARN inițial.

Detecția în gel de agaroza cu TBE a produșilor de amplificare PCR:

gelul de agaroza 2%

8 µL din fiecare produs de reactie este amestecat cu 2µL de 6x gel loading buffer, iar 8µL din fiecare amestec este pipetat in fiecare godeu si citit prin separare in gel, detectia facandu-se utilizand bromura de etidiu.

gelul este fotografiat, iar datele sunt interpretate.

Prepararea solutiei TBE 1x din solutie conc 10x

100mL TBE10x……………………….900mL H2O

Se masoara volumul cuvei de migrare a produsului de amplificare, care trebuie sa fie aproximativ 2/3 din inaltimea pieptenelui:

330mL apa……..piepten cu 25 dinti

Se spala cuva cu apa si se lasa la uscat.

Se face gelul de agaroza 2% intr-un Erlenmeyer de 500mL

2g agaroza………………………100mL sol TBE1x

X=6,6g…………………………..330mL volumul cuvei

Se fierbe agaroza cu TBE in cuptorul cu microunde pana la solubilizare(mai mult de 10 minute), apoi se lasa la racit. In timpul fierberii se omogenizeaza bine a.i. solutia sa fie foarte omogena. Dupa racire se add bromura de etidiu

10 µL bromura de etidiu………………..330mL gel

Dupa racirea gelului se scot piaptanul si cele doua margini ale cuvei, dar cu mare atentie pentru a nu rupe gelul.

Se toarna uniform in cuva de migrare, apoi se add sol TBE 1x a.i. gelul sa fie acoperit de o pelicula subtire de solutie. Cu o pompita se aspira lichid din cuva si se pulverizeaza usor lichidul in godeuri pentru a indeparta eventualele resturi de gel aflate in interiorul godeului dupa indepartarea pieptenelui.

* Spre deosebire de PCR-ul clasic Real Time-PCR permite detectarea rapidă a ampliconilor în timp real (încă din timpul reacției – faza exponențială). Măsurarea cineticii reacției încă din fazele incipiente ale acesteia reprezintă unul din avantajele RT-PCR-ului.

Protocol purificare produși PCR din gel

– S-au cântărit tuburile de 1,5mL în care au fost puse fragmentele de gel

– S-a decupat fragmentul de interes din gel cu ajutorul unei pompițe speciale furnizate o dată cu kit-ul

– S-a pus în tuburi și au fost cântărite din nou

– S-a adăugat 10µL Membrane Binding Solution pentru fiecare 10mg de gel. În cazul nostru tuburile goale au avut greutatea de 1 g, iar cu gel 1,2 g astfel că s-a adăugat câte 200µL Membrane Binding Solution.

– S-a vortexat câteva secunde și s-a pus pe termobloc la 65°C până s-a topit gelul (10-15 min)

– S-a transferat conținutul tuburilor pe membrane

– S-a incubat 1 min la temperatura camerei

– S-a centrifugat la 12000g x1 min

– S-a adăugat 700µL de soluție de spălare

– S-a centrifugat la 12000g x1 min

– S-a adăugat 500µL de soluție de spălare

– S-a centrifugat la 12000g x6 min

– S-a mutat membrana într-un tub nou de 1,5mL și s-a pus soluția de eluție

– S-a incubat 5 min la temperatura camerei

– S-a centrifugat la 12000g x1 min

– au fost cuantificați toți produșii obținuți.

Tehnica Real-Time PCR – RT-PCR este numit si quantitative real time PCR (Q-PCR /qPCR/qrt-PCR) sau kinetic PCR (KPCR) este o variantă PCR în care amplificarea (creșterea numărului de ampliconi) poate fi vizualizată în timp real utilizându-se fluorescența.

Există două mari categorii de obținere a fluorescenței proporționale cu creșterea numărului de ampliconi din reacție:

1. Metoda nespecifică: utilizarea unei substanțe fluorocrome, care se intercalează în moleculele dublu-catenare formate și emite fluorescență la denaturarea acestora (SYBR green).

2. Metoda specifică: utilizarea unei probe oligonucleotidice cu două fluorescențe complementare (QUENCHER și REPORTER), care se hibridizează în interiorul ampliconului și care poate emite fluorescență prin fragmentarea sa de către polimerază (probe TaqMan si Molecular Beacons – care include și probele Scorpions).

Avantajele Real Time-PCR:

Se economisește timp deoarece detecția se realizează în faza de creștere exponențială a reacției, nu în faza de platou.

Acuratețe (precizie și exactitate) mai mare a rezultatelor obținute.

Domeniu de liniaritate mult extins (sunt necesare mai puține diluții ale probelor).

Limita inferioară de detecție mult îmbunătățită (se pot detecta cantități mai mici ale ADN-ului țintă).

Real-time PCR este numit și quantitative real time PCR (Q-PCR/qPCR/qrt-PCR), datorită faptului că secvențele amplificate pot fi detectate în timp real dar și cuantificate. Cuantificarea rezultatelor prin metoda curbelor standard constă în compararea probei de interes (prin teste statistice de tip regresie liniară) cu standarde specifice.

Cuantificarea rezultatelor prin metoda comparaței folosind Ct-ul:

Fig.21. Cuantificarea poate fi absolută (Ct sau număr de molecule) sau relativă (rezultatul obținut este raportat la o valoare considerată constantă).

Pentru interpretarea rezultatelor obținute prin această metodă sunt necesari doi parametri:

Threshold–ul (valoare prag) –se stabilește în cursul fazei exponențiale a amplificării și reprezintă linia ce unește punctele în care de la un ciclu la altul eficiența reacției este maximă.

Ct-ul (threshold cycle)- se calculează în funcție de valoarea prag și reprezintă numărul de cicluri necesare ca semnalul fluorescent să depășească o valoare prag prestabilită. Valoarea Ct-ului este invers proporțională cu numărul de copii ADN (Fig.21)

Cuantificarea relativă constă în amplificarea în tandem (standarde și proba de interes) a unei gene de referință (gena house-keeping) care se exprimă egal în toate celulele organismului.

Ulterior se realizează un raport între valorile obținute pentru cele două gene:

gena de referință GAPDH sau ABL

Detecția prin Real-Time PCR utilizând metoda in house cu SYBR green

SYBR GREEN – este un fluorocrom care se leagă nespecific de ADN-ul dublu catenar.

Metoda ieftină dar nespecifică deoarece orice produs (nu doar cel specific) va produce fluorescență prin denaturare (inclusiv dimerii de primeri).

Fig.22. Curbă de topire în cazul detecției unor probele pozitive care au punctul de topire la 83°C. La 75°C, vârfurile apărute reflectă dimerii de primeri.

Această metodă necesită la finalul amplificării efectuarea unei curbe de MELTING (topire) care se traduce prin realizarea unui gradient de temperatură constând în creșterea lentă (câte 1°C la ~ 2-3 secunde) pornind de la temperatura de hibridizare a primerilor până la temperatura de denaturare a întregului amestec de reacție. In fiecare etapă de denaturare va fi citită fluorescența obținută prin topirea produșilor din reacție (Fig.22)

Fiecare produs rezultat în reacția de amplificare va produce astfel un varf de topire.

In functie de temperatura de topire a produsului(silor) și de numărul de vârfuri obținute se poate face interpretarea specificității reacției.

Infrastructura minim necesară pentru realizarea acestei etape a studiului include: hote cu flux laminar, sterile, microscoape (optice de cercetare, electronice de transmisie, cu fluorescență), citometru de flux, sisteme de crioprezervare (cu azot lichid) și cuve pentru stocare, congelatoarea de -20°C, -80°C, frigidere de 4-8°C, pupinele, cetrifugi și microcentrifugi, incubatoare cu CO2 pentru culturi celulare, balanțe simple și balanțe analitice, pH-metru, termomixere și băi termostatate, spectrofotometru, agitator magnetic și orbital, pipete automate monocanal și multicanal, consumabile necesare desfășurării experimentelor (plăci cu 96 de godeuri și fundul plat, flaskuri de cultură, vărfuri sterile și cu filtru pentru micropipete, etc.), extractor automat de ARN/ADN Magnesia 16, nanodrop pentru cuantificarea concetrației și purității de ADN/ARN, termociclor pentru efectuarea reacțiilor PCR (Corbett, Lightcycler480).

REZULTATE OBȚINUTE

Evoluția culturilor de celule tumorale sub acțiunea dermaseptinului în diferite concentrații, cu evaluarea viabilității prin metoda CITOMETRIEI ÎN FLUX

Linia celulară HT-29 – este o linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal.

Pentru evaluarea viabilității celulare prin tehnica citometriei în flux au fost utilizate concentrațiile de peptid citototoxic (dermaseptin) pentru care s-a observat o scădere semnificativă a viabilității prin tehnica MTT. Astfel, linia celulară a fost incubată 48h cu dermaseptin în concentrație de 4µM și 15µM, fiind distribuite în fiecare godeu 1,2×105 celule într-un volum final de 500µL.

Fig.23. Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare HT-29 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie)

S-a observat că numărul de celule a scăzut semnificativ în urma incubării cu dermaseptin în concentrație de 15µM comparativ cu godeul în care celulele au fost incubate cu peptid în concetrație 4 µm și martorul (celule incubate fără peptid), având în vedere că s-a plecat de la o distribuție aproximativ egală de celule/godeu1 (2×105 celule într-un volum final de 500µL) (tabele 3, 4, 5).

Comparativ cu martorul (celulele HT-29 incubate 48h fără peptid) pentru care au putut fi numărate aproximativ 104celule, pentru HT-29 incubate cu dermaseptin 15µM au putut fi evaluate doar 2185 celule (Fig. 26, 28).

Fig.24. Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 8853 de evenimente (din care 8268 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei A-549 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h)

Apoptoza celulară pentru linia HT-29 a fost de aproximativ 21% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 57%) (tabel 3, 4, fig. 23, 25). Pentru martor apoptoza a fost de 20%, cu o viabilitate celulară de 80%.

Tabel 3: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h cu dermaseptin 4µM

*PI= iodură de propidiu (PI)

Fig.25. Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare HT-29 tratată cu 15uM derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie)

Comportamentul celulelor incubate cu dermaseptin 4µM a fost asemănător cu martorul, comparativ cu cel al celulelor incubate cu dermaseptin 15µM pentru care viabilitatea celulară a fost sub 50% (tabel 4, fig. 25)

Tabel 4: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h cu dermaseptin 15µM

Analiza valorilor obținute pentru populațiile de celule tumorale HT-29 incubate 48h cu dermaseptin 15µM, intrate în apoptoză, a evidențiat un număr aproximativ egal de celule aflate în apotoză timpurie (28%) cu cel în apotoză tardivă (28,7%) (tabel 7, Fig. 31).

Fig.26. Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 2525 de evenimente (din care 2158 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei HT-29 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h)

Tabel 5: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h fără dermaseptin (Martorul)

Fig..27…Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare HT-29 netratată cu derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie)

Fig.28 Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 10449 de evenimente (din care 9757 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei HT-29 netratată cu derpaseptin (incubare 48h) – a constituit martorul experimentului.

Linia A549 – este o linie celulară aderentă de carcinom alveolar uman

Pentru evaluarea viabilității celulare prin tehnica citometriei în flux au fost utilizate concentrațiile de peptid citototoxic (dermaseptin) pentru care s-a observat o scădere semnificativă a viabilității prin tehnica MTT. Astfel, linia celulară a fost incubată 48h cu dermaseptin în concentrație de 4µM și 15µM, fiind distribuite în fiecare godeu 1,2×105 celule într-un volum final de 500µL.

S-a observat că numărul de celule a scăzut semnificativ în urma incubării cu dermaseptin în concentrație de 15µM comparativ cu godeul în care celulele au fost incubate cu peptid în concetrație 4 µm și martorul (celule incubate fără peptid), având în vedere că s-a plecat de la o distribuție aproximativ egală de celule/godeu1 (2×105 celule într-un volum final de 500µL) (tabele 6, 7, 8).

Fig.29….Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare A-549 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie)

Comparativ cu martorul (celulele A549 incubate 48h fără peptid) pentru care au putut fi numărate aproximativ 5x103celule, pentru A549 incubate cu dermaseptin 15µM au putut fi evaluate doar 2286 celule (Fig. 32, 34).

Apoptoza celulară a fost de aproximativ 12% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 32%) (tabel 6, 7, fig. 29, 31). Pentru martor apoptoza a fost de 10%, cu o viabilitate celulară de 90%.

Tabel 6: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h cu dermaseptin 4µM

*PI= iodură de propidiu (PI)

Comportamentul celulelor incubate cu dermaseptin 4µM a fost asemănător cu martorul, comparativ cu cel al celulelor incubate cu dermaseptin 15µM pentru care viabilitatea celulară a fost de aproximativ 70% (tabel 7, fig. 31).

Fig..30… Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 3405 de evenimente (din care 3056 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei A-549 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h)

Tabel 7: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h cu dermaseptin 15µM

Fig…31..Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare A549 tratată cu 15uM derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie).

Analiza valorilor obținute pentru populațiile de celule tumorale A549 incubate 48h cu dermaseptin 15µM, intrate în apoptoză, a evidențiat un număr aproximativ egal de celule aflate în apotoză timpurie (10.9%) cu cel în apotoză tardivă (13,7%) (tabel 7, Fig. 31).

Fig.32…. Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 3028 de evenimente (din care 2286 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei A-549 tratată cu 4uM derpaseptin (incubare 48h)

Tabel 8: Viabilitatea celulară a liniei HT-29 incubată 48h fără dermaseptin (Martorul)

Fig..33…Analiza prin tehnica citometriei în flux a viabilității liniei celulare A549 netratată cu derpaseptin (incubare 48h) (Q1= celule necrotice, Q2=celule în apoptoză tardivă, Q3=celule vii, Q4= celule în apoptoză timpurie)

Fig..34… Achiziția prin tehnica citometriei în flux a 5067 de evenimente (din care 4763 celule) în scopul determinării viabilității celulare a liniei A-549 netratată cu derpaseptin (incubare 48h) – a constituit martorul experimentului.

În concluzie, prin tehnica de citometrie în flux, evaluarea viabilității pentru linia de carcinom colorectal (HT-29), apoptoza celulară a fost de aproximativ 21% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 57%) (tabel 3, 4, fig. 23, 25). Pentru martor apoptoza a fost de 20%, cu o viabilitate celulară de 80%.

Pentru linia de carcinom alveolar uman (A549), apoptoza celulară a fost de aproximativ 12% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 32%) (tabel 6, 7, fig. 29, 31). Pentru martor apoptoza a fost de 10%, cu o viabilitate celulară de 90%.

Rezultatele obținute pentru cele 2 linii celulare HT-29 și A549 sunt semnificativ diferite sub acțiunea dermaseptinului la cuncetrații de 15µM, apoptoza celulară fiiind de două ori mai mare pentru linia de adenocarcinom colorectal coparativ cu ce de carcinom alveolar.

În acest studiu, a fost evaluată și linia celulară M14K sub acțiunea dermaseptinului în diferite concetrații. Evaluarea viabilității celulare a fost realizată prin metoda MTT, rezultatele obținute fiind redate în mai jos.

Linia celulară M14K – care este o linie celulară tumorală malignă (mezoteliom uman) foarte agresivă care apare pe suprafețele tapetate cu celule mezonteliale.

Viabilitatea la dezghețarea acestor celule a fost de aproximativ 60% la punerea în cultură cu mediu RPMI (Fig.35).

Fig. 35. Distribuția culturii de celule tumorale M14K la dezghețare (viabilitate aroximativă de 60%).

La aproximativ 14 zile viabilitatea acestor culturi celulare a ajuns la 100%, fiind posibil experimentul propus (Fig. 36).

Fig. 36. Distribuția culturii de celule tumorale M14K la dezghețare (viabilitate aroximativă de 100%).

La 48 de ore de incubare cu dermaseptin a fost determinată viabilitatea celulară prin metoda MTT, fiind citite absorbanțele (cu referință, adică la 595-620nm) pe placa simplă după realizarea unui spin (centrifugarea plăcii 20 secunde la 300g – care înseamnă aproximativ 1699 rpm) (Tabel 9, Fig. 37, 38). Avantajul spinului de placă a fost acela că a concentrat spre centrul plăcii toate celulele, astfel încât măsurătoarea absobanței a fost mai corectă (fig. 37).

Fig. 37 Valorile absorbanțelor obținute prin tehnica MTT pentru linia M14K incubată cu dermaseptin 48h

Tabel 9. Rezultatele obținute pentru M14K (mezolteliom) la 48 h de incubare cu dermaseptin cu citirea absorbanței cu referință (595-620nm)

Viabilitatea Celulelor M14K cu spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic. Au fost obținute rezultate slab semnificative statistic pentru concentrația de 8uM peptid utilizat (Tabel 10, Fig. 33).

Fig. 38. Viabilitatea Celulelor M14K cu spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic pentru citirea absorbanței cu referință.

Tabel 20 Diferențele statistice între viabilitatea celulară sub acțiunea dermaseptinului în diferite concentrații comparativ cu celulele tumorale M14K (mezoteliom) fără peptid citotoxic cu spinul plăcii de cultură.

REZULTATELE EXPERIMENTALE OBȚINUTE PENTRU OPTIMIZAREA PRIMERI-LOR

Rezultatele obținute pentru optimizarea primeri-lor în vederea utilizării lor pentru evaluarea expresiei genice pe ADNc obținut din culturile de celule tumorale – a fost realizat prin două metode:

PCR clasic și migrare în gel de agaroză 2%

qRT-PCR cu SYBR green

Pentru a obține temperatura optimă de alinierea a primerilor la fragmentele țintă de ADNc s-a realizat amplificarea în qRT-PCR folosind SYBR green fiind utilizat următorul program optimizat în cadrul laboratorului:

1 ciclu : 95°C -5min

35 cicluri: 95°C-30 sec

66°C-30 sec

72°C-1min (citire)

1 ciclu (melting)

95°C-1 sec

66°C-1 sec

95°C- citire în continu

Rezultatele obținute au evidențiat faptul că nu toți primerii testați funcționează optim la 66°C sau 72°C (Tabel 21). Primerii care nu au putut fi optimizați la această temepratură, au condus la formarea dimerilor de primeri care se suprapun peste produșii de amplificare, conducțnd la rezultate modificate (semnal intens de amplificare, adică fals crescut datorită dimerilor de primeri).

Tabel 21: Temperaturile optime de aliniere a primerilor utilizați pentru determinarea expresiei genice pentru anumite ținte moleculare

Ca genă de referință s-a optat pentru gena ABL și s-au utilizat următorii primeri [108]:

5’ TGTGATTATAGCCTAAGACCCGGAGCTTTT 3’

5' TTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTT-3

Temperatura optimă de aliniere a acestor primeri (pentru gena ABL) a fost de 55°C. După ce a fost stabilită temperatura optimă de aliniere a tuturor primerilor pentru țintele moleculare stabilite si după stabilirea genei de referință la care se vor raporta numărul copiilor de ampliconi obținuți prin amplificarea qRT-PCR s-a trecut la etapa următoare, și anume, la extracția ARN-ului din culturile celulare tratate sau nu cu peptidul citotoxic (dermaseptin).

Temperatura de aliniere a primer-ului Akt este de 66°C.

Temperatura de aliniere a primer-ului NRF2 este de 66°C.

Temperatura de aliniere a primer-ului CHOP este de 66°C.

Temperatura de aliniere a primer-ului Bcl2 este de 72°C.

Temperatura de melting (topire după amplificare cu Sybr green) pentru gena ABL a fost de 55°C

Programul de optimizarea a primeri-lor a inclus și realizarea unui gradient de temperatură pornind de la

55,3°C; 55,8°C; 57°C

58,3°C; 61,3°C; 61,7°C

63,3°C; 64,5°C; 66,1°C

67,8°C; 69,5°C; 70°C

Produși de amplificare PCR au fost migrați ulterior în gel de agaroză 2% și au fost selectate temperaturile de aliniere pentru care nu s-au obținut produși nespecifici. Aceste temperaturi sunt redate mai jos pentru fiecare primer testat:

AKT

Primer Forward: 60.0°C tctatggcgctgagattgtg

Primer Reverse: 60.0°C cttaatgtgcccgtccttgt

NRF2

Forward: 54.3 °C agtggatctgccaactactc

Reverse: 59.5 °C catctacaaacgggaatgtctg

XBP

Primer Forward: 62.3 °C cctggttgctgaagaggagg

Primer Reverse: 64.0 °C ccatggggagatgttctggag

CHOP

Primer Forward: 61.7 °C ttctctggcttggctgactg

Primer Reverse: 61.5 °C ctgcgtatgtgggattgagg

BCL2

119bp CTGCACCTGACGCCCTTCACC CACATGACCCCACCGAACTCAAAGA

CTGCACCTGACGCCCTTCACCgcgcggggacgctttgccacggtggtgga

ggagctcttcagggacggggtgaactgggggaggattgtggcctTCTTTG

AGTTCGGTGGGGTCATGTG

Primer Forward: 69.6 C ctgcacctgacgcccttcacc

Primer Reverse: 70.2 C cacatgaccccaccgaactcaaaga

După îndepărtarea mediului de cultură din fiecare godeu, peste peletul de celule tratate/netratate cu peptid, pelet care a fost preluat din godeurile plăcilor de experiment, s-a adaugat cate 1 mL trizol s-a omogenizt bine și s-a continuat cu extracția de ARN (cu trizol de la AMBION) urmată de reverstranscripție conform protocolului (Thermo Scientific).

S-au obținut concentrațiile de ARN menționate în tabelul de mai jos (Tabel 22) a cărui puritate a fost calculată raportând absorbanțele la 260 și respectiv 280nm. În tabel este menționată și cantitatea de ARN utilizată în reacția de amplificare RT-PCR.

Tabel 22: concentrațiile de ARN obținute prin extracția acestuia din liniile celulare utilizate în cadrul experimentului:

Unde codurile probă utilizate au fost următoarele:

Realizarea standardelor: S-au amplificat probe de ADNc cu primerii achiziționați pentru a pune in evidență diferite ținte moleculare. S-au făcut optimizări pentru obținerea temperaturilor optime de aliniere (tabel 21). După amplificare (conform programului de mai jos), produșii PCR au fost migrați în gel de agaroză 2% pentru a confirma că ceea ce amplificat este gena de interes.

Programul de amplificare PCR a ADNc:

1 ciclu : 95°C -5min

35 cicluri: 95°C-30 sec

66°C-30 sec/respectiv 72°C (pentru Bcl2 și XBP)

72°C-1min (citire)

1 ciclu (hold) : 4°C

Apoi, au fost taiate fragmentele din gel și purificate de produși de PCR conform protocolului redat la capitolul materiale și metodă, utilizând kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System – Promega.

Gelurile din care au fost purificați ampliconii pentru genele de interes sunt redate mai jos (fiind marcate cu un cerc):

A fost calculată masa moleculară în Da/µL a unui fragment (amplicon PCR) în funcție de numărul de molecule de adenină, guanină, timină și citozină. Apoi aceasta a fost transformată din Daltoni în ng și s-a împărțit cantitatea obținută cu masa moleculară obținând astfel numărul de copii PCR dintr-un µL. Ulterior au fost făcute diluții seriate din 10 în 10 (Tabelul 23). Pentru calculul concentrațiilor produsului de interes au fost utilizate doar primele 4 standarde din cele 6 calculate (STD1-STD4).

Curbele standard pentru gena ABL

Tabel 23: Calculul concentrațiilor de standard pentru țintele moleculare urmărite

Prin amplificarea RT-PCR au fost obținuți ampliconii de interes de diferite concetrații (Tabel 24) și care au fost raportați la concentrația de ABL extrasă din fiecare linie celulară utilizată în experiment, raportul fiind înmulțit cu 100, astfel încât rezultatul final va fi unul procentual (%).

Tabel 24: Numărul de copii amplicon țintă moleculară/µL

Fig. 39 Cuantificarea expresiei genice pentru gena CHOP

raportată la gena de referință ABL

Rezultatele experimentale obținute pentru gena CHOP, a cărei expresie genică a fost evaluată la linia celuleară HT29 (carcinom colorectal) și A549 (carcinom alveolar) în prezența peptidului dermaseptin au fost raportate la un martor constituit din linia celulară fără peptid. De asemenea, s-a luat în considerare și timpul de incubare cu peptid, martorul (linia fără peptid) fiind incubat același timp conform protocolului de lucru.

Analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (80%) pentru gena CHOP pentru linia HT29 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (HT4), comparativ cu martorul (HT0) și o creștere de 2% pentru linia A549 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (A4) comparativ cu martorul (A0). S-a remarcat o creștere de 16% a expresiei genice CHOP la celulele fără peptid la 24 de ore de incubare fără să existe o modificare în cazul celulelor incubate cu peptid 15uM/24h (1).

Tabel 25: Calculul procentual al numărului de ampliconi CHOP/uL raportat la gena de referință ABL

Fig. 40 Cuantificarea expresiei genice pentru gena AKT

raportată la gena de referință ABL

Rezultatele experimentale obținute pentru gena AKT, a cărei expresie genică a fost evaluată la linia celuleară HT29 (carcinom colorectal) și A549 (carcinom alveolar) în prezența peptidului dermaseptin au fost raportate la un martor constituit din linia celulară fără peptid. De asemenea, s-a luat în considerare și timpul de incubare cu peptid, martorul (linia fără peptid) fiind incubat același timp conform protocolului de lucru.

Analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (302,67%) pentru gena AKT pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0) pentru care creșterea a fost de 92,04% față de gena de referință ABL). Prin urmare o creștere de 3 ori a expresiei genice AKT la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o creștere de 76,48% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0) (Fig. 40, Tabel 26).

Tabel 26: Calculul procentual al numărului de ampliconi AKT/uL raportat la gena de referință ABL

Fig. 41 Cuantificarea expresiei genice pentru gena NRF

raportată la gena de referință ABL

Rezultatele experimentale obținute pentru gena NRF, a cărei expresie genică a fost evaluată la linia celuleară HT29 (carcinom colorectal) și A549 (carcinom alveolar) în prezența peptidului dermaseptin au fost raportate la un martor constituit din linia celulară fără peptid. De asemenea, s-a luat în considerare și timpul de incubare cu peptid, martorul (linia fără peptid) fiind incubat același timp conform protocolului de lucru.

Analiza rezultatelor obținute au evidențiat o scădere semnificativă (la 1294,6) pentru gena NRF pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0 pentru care creșterea a fost de 2977,2 față de gena de referință ABL). Prin urmare o scădere de 2 ori a expresiei genice NRF la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o scădere de aproximativ 4 ori pentru linia A549 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (A4) comparativ cu martorul (A0) (Fig. 41, Tabel 27).

Tabel 27: Calculul procentual al numărului de ampliconi NRF/uL raportat la gena de referință ABL

Fig. 42 Cuantificarea expresiei genice pentru gena XBP

raportată la gena de referință ABL

Rezultatele experimentale obținute pentru gena XBP, a cărei expresie genică a fost evaluată la linia celuleară HT29 (carcinom colorectal) și A549 (carcinom alveolar) în prezența peptidului dermaseptin au fost raportate la un martor constituit din linia celulară fără peptid. De asemenea, s-a luat în considerare și timpul de incubare cu peptid, martorul (linia fără peptid) fiind incubat același timp conform protocolului de lucru.

Analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (la 4563) pentru gena XBP pentru linia HT29 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (HT4), comparativ cu martorul (HT0 pentru care creșterea a fost de 106,5 față de gena de referință ABL). Prin urmare o creștere de 45 ori a expresiei genice XBP la linia HT29 tratată cu dermaseptin 4uM și de 15 ori la o concentrație de 15uM dermaseptin față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o creștere de 248,32% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0 pentru care creșterea a fost de 94,2% față de gena de referință ABL). Adică, o creștere de 3 ori a expresiei genice pentru XBP la linia tratată cu peptid 15uM față de martor (Fig. 42, Tabel 28).

Tabel 28: Calculul procentual al numărului de ampliconi XBP/uL raportat la gena de referință ABL

Fig. 43 Cuantificarea expresiei genice pentru gena BCL2

raportată la gena de referință ABL

Rezultatele experimentale obținute pentru gena BCL2, a cărei expresie genică a fost evaluată la linia celuleară HT29 (carcinom colorectal) și A549 (carcinom alveolar) în prezența peptidului dermaseptin au fost raportate la un martor constituit din linia celulară fără peptid. De asemenea, s-a luat în considerare și timpul de incubare cu peptid, martorul (linia fără peptid) fiind incubat același timp conform protocolului de lucru.

Analiza rezultatelor obținute au evidențiat o scădere semnificativă (la 6,6%) pentru gena BCL2 pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0) pentru care creșterea a fost de 18,4% față de gena de referință ABL). Prin urmare o scădere de 3 ori a expresiei genice BCL2 la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM și de 2 ori la o concentrație de 4uM dermaseptin față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o creștere de 33,07% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0 pentru care creșterea a fost de 19,09% față de gena de referință ABL). Adică, o creștere de 2 ori a expresiei genice pentru BCL2 la linia tratată cu peptid 15uM față de martor (Fig. 43, Tabel 29).

Tabel 29: Calculul procentual al numărului de ampliconi BCL2/uL raportat la gena de referință ABL

DISCUȚII:

În aceste studii s-a urmărit determinarea potențialului tumoricid al dermaseptinului în funcție de tipul de linie celulară, măsurând viabilitatea prin metoda de citometrie în flux pentru concetrațiile de peptid la care s-a observant o apoptoză semnificativă prin metoda MTT.

Culturile de celule au fost realizate conform protocoalelor de lucru menționate în primul referat și au fost utilizate următoarele linii celulare aderente: HT-29 – linie celulară aderentă de adenocarcinom colorectal și A-549 – linie celulară aderentă de carcinom alveolar uman.

Pentru testarea vibilității prin citometrie în flux au fost selectate următoarele concentrații de peptid (dermaseptin): 4µM (p<0,01) și 15-20µM (p<0,001) pentru care au fost obținute modificări semnificative statistic sub acțiunea peptidului citotoxic, pentru linia HT29 (adenocarcinom colorectal) la 48 de ore de incubare, evidențiate prin metoda MTT.

Pentru testarea vibilității prin citometrie în flux vor fi selectate următoarele concentrații de peptid (dermaseptin): 4µM (p<0,01) și 15-20µM (p<0,001) pentru care au fost obținute modificări semnificative statistic sub acțiunea peptidului citotoxic, pentru linia A549 (carcinom alveolar) la 48 de ore de incubare, evidențiate prin metoda MTT.

Prin tehnica citometriei în flux, evaluarea viabilității pentru linia de carcinom colorectal (HT-29), apoptoza celulară a fost de aproximativ 21% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 57%). Pentru martor apoptoza a fost de 20%, cu o viabilitate celulară de 80%.

Pentru linia de carcinom alveolar uman (A549), apoptoza celulară a fost de aproximativ 12% pentru concentrația de 4µM dermaseptin, fiind semnificativ crescută la 15µM dermaseptin (aproximativ 32%). Pentru martor apoptoza a fost de 10%, cu o viabilitate celulară de 90%.

Rezultatele obținute pentru cele 2 linii celulare HT-29 și A549 sunt semnificativ diferite sub acțiunea dermaseptinului la cuncetrații de 15µM, apoptoza celulară fiiind de două ori mai mare pentru linia de adenocarcinom colorectal coparativ cu ce de carcinom alveolar.

Viabilitatea Celulelor M14K cu spinul plăcii la 48 de ore de incubare cu dermaseptin comparativ cu celulele tumorale fără peptid citotoxic. Au fost obținute rezultate slab semnificative statistic pentru concentrația de 8uM peptid utilizat.

De asemenea, s-a urmărit optimizarea primeri-lor Akt, Hif-1α, XBP, Nrf2, PERK în vederea evaluării metabolismului celulelor tumorale prin determinarea expresiei genice a acestor gene (Akt, Hif-1alfa XBP, Nrf2, și CHOP) sub acțiunea peptidului citotoxic utilizat. În acest scop a fost extras materialul genetic (ARN) din culturile celulare și revers-transcris în ADNc care ulterior a fost aplificat prin tehnica qRT-PCR. Evaluarea metabolismului celulelor tumorale a fost evaluat prin determinarea expresiei genice pentru Akt, Hif-1alfa XBP, Nrf2, și PERK sub acțiunea peptidelor citotoxice utilizate.

Pentru gena CHOP: analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (80%) a expresiei genice pentru linia HT29 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (HT4), comparativ cu martorul (HT0) și o creștere de 2% pentru linia A549 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (A4) comparativ cu martorul (A0). S-a remarcat o creștere de 16% a expresiei genice CHOP la celulele fără peptid la 24 de ore de incubare fără să existe o modificare în cazul celulelor incubate cu peptid 15uM/24h.

Pentru gena Akt: analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (302,67%) pentru gena AKT pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0) pentru care creșterea a fost de 92,04% față de gena de referință ABL). Prin urmare o creștere de 3 ori a expresiei genice AKT la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o creștere de 76,48% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0).

Pentru gena Nrf2: analiza rezultatelor obținute au evidențiat o scădere semnificativă (la 1294,6) pentru gena NRF pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0 pentru care creșterea a fost de 2977,2 față de gena de referință ABL). Prin urmare o scădere de 2 ori a expresiei genice NRF la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o scădere de aproximativ 4 ori pentru linia A549 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (A4) comparativ cu martorul (A0).

Pentru gena XBP: analiza rezultatelor obținute au evidențiat o creștere semnificativă (la 4563) pentru gena XBP pentru linia HT29 cu 4uM dermaseptin incubată 48h (HT4), comparativ cu martorul (HT0 pentru care creșterea a fost de 106,5 față de gena de referință ABL). Prin urmare o creștere de 45 ori a expresiei genice XBP la linia HT29 tratată cu dermaseptin 4uM și de 15 ori la o concentrație de 15uM dermaseptin față de linia netratată cu peptid. De asemenea, s-a remarcat o creștere de 248,32% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0 pentru care creșterea a fost de 94,2% față de gena de referință ABL). Adică, o creștere de 3 ori a expresiei genice pentru XBP la linia tratată cu peptid 15uM față de martor.

Pentru gena Bcl2: analiza rezultatelor obținute au evidențiat o scădere semnificativă (la 6,6%) pentru gena BCL2 pentru linia HT29 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (HT15), comparativ cu martorul (HT0) pentru care creșterea a fost de 18,4% față de gena de referință ABL). Prin urmare o scădere de 3 ori a expresiei genice BCL2 la linia HT29 tratată cu dermaseptin 15uM și de 2 ori la o concentrație de 4uM dermaseptin față de linia netratată cu peptid. De asemenea s-a remarcat o creștere de 33,07% pentru linia A549 cu 15uM dermaseptin incubată 48h (A15) comparativ cu martorul (A0 pentru care creșterea a fost de 19,09% față de gena de referință ABL). Adică, o creștere de 2 ori a expresiei genice pentru BCL2 la linia tratată cu peptid 15uM față de martor.

Creșterea celulară, proliferarea și supraviețuirea celulelor tumorale, poate fi influențată pe căile de semnalizare metabolică, controlând expresia genică a receptorilor de tirozin kinază (RTK) pentru diferiți factori de creștere celulară. Cele două căi sunt PI3K/Akt (fosfatidil inozitol 3 kinaza/serin/treonin kinază) și MAP kinaza (Ras-BRAF-MEK-ERK).

Se cunosc câteva clase de protein PI3K, cele de clasă I fiind cele mai bine caracterizate și constituind heterodimeri cu subunități regulatorii comune cum ar fi p85 și subunități catalitice (p110) cu rol important în metabolismul celulelor canceroase. Subunitatea p110 are două componente importante și anume una alfa (PI3KCA) și cealaltă beta (PI3KCB) cu expresie diferită în funcție de țesut cu rol important și specific în celula canceroasă umană. Ras joacă un rol important în activarea căii MAP kinaza, dar și în semnalizarea căii PI3K/Akt, stimulând apariția receptorilor membranari pe suprafața celulei tumorale pentru diferiți factori de creștere, incluzând receptori cum ar fi: VEGFR (receptorul factorului de creștere epitelial vascular), EGFR (receptorul factorului de creștere epidermal), PDGFR (receptorul factorului de creșterederivat din plachete), cKIT, cMET [109-111].

Semnalul extracelular care se leagă de RTK, activează subunitatea catalitica alfa a p110 (PI3KCA), activând cascada de fosforilare cu formarea de fosfatidil inozitol 4,5-bifosfat și ulterior de PIP3 (fosfatidil inozitol 3,4,5-trifosfat) semnal secundar pentru legarea Akt la membrana celulară și fosforilarea acesteia dependent de fosfoinozitid-kinază (PDK) izoforma PDK1 fiind predominant implicată. Akt este o serin/treonin kinază, în țesutul uman fiind identificate 3 izoforme notate Akt 1, Akt2. Akt3 [112]. Activarea Akt prin fosforilare va determina scăderea sintezei pentru unele proteine cu rol efector, care constituie semnale de activare pentru mTOR (rapamycin) cu rol bine definit în cancerul uman, astfel încât, Akt devine o țintă molecular importantă în terpia cancerului [113]. Activarea acestor cascade de semnalizare la nivel celular și molecular va avea consecințe semnificative asupra funcționării celulei canceroase, favorizând proliferarea ei și inhibând apoptoza celulară. Un inhibitor (regulator negativ) al căii PI3K/Akt este o proteină PTEN codificată de gena cu același nume (gena pentru deleția de pe cromozomul 10 a fosfatazei și tensinei omologe). PTEN este un important și major supresor tumoral, fiind o fosfatază care defosforilează PIP3 blocând calea PI3K/Akt [114-115]. Dacă PTEN acumulează alterări genetice și iși pierde funcția, celula suferă consecințe grave cu evoluție spre malignizare [115].

RET/PTC sunt proteine recombinante rezultate prin rearanjamentul cromozomial și anume prin remonbinarea genică a regiunii 3’ a genei RET cu regiunea 5’ a genei PTC determinând activarea tirozinkinazică în RET [116,117]. Se cunosc multe tipuri de astfel de proteine recombinante care joacă rol de activatori oncogenici pe calea MAP-kinazei implicată în proliferarea și supraviețuirea celulelor tumorale umane. Există numeroase studii care arată că acești activatori oncogenici influențează și calea de semnalizare celulară și moleculară PI3P/Akt prin activarea subunității p85, jucând rol important în existența celulelor canceroase [118-121]. Poate avea loc activarea constitutivă a RET tirozin kinazei sau fosforilarea direct a PDK și Akt cu RET/PTC [121, 122]. Frecvent mutațiile din PTC asociază mutații ale BRAF [123, 124-126]. Coexistența acestor alterări genetic ear părea că joacă un rol important în agresivitatea tumorală alături de altele care conduc la activarea celor două căi de semnalizare implicate în proliferarea și supraviețuirea celulelor canceroase, cu creșterea supraviețuirii acestora și inhibarea apoptozei celulare [127-129]. Astfel că prin acumularea alterărilor genetice, tumora, pe calea PI3K/Akt activată, va crește invazivitatea și agresivitatea acesteia [130].

În cazul studiilor efectuate, expresia genică pentru Akt a crescut semnificativ la concentrația de 15uM dermaseptin în mediul de cultură pentru celulele liniei tumorale de cancer colorectal (HT29) față de linia cu celule tumorale pulmonare (A549). Ceea ce înseamnă că celulele HT29 sunt mai sensibile la acțiunea dermaseptinului 15uM comparativ cu A549. Rezultatele obținute pentru cele 2 linii celulare HT-29 și A549 sunt semnificativ diferite sub acțiunea dermaseptinului la cuncentrații de 15µM, apoptoza celulară fiiind de două ori mai mare pentru linia de adenocarcinom colorectal coparativ cu ce de carcinom alveolar. Astfel se explică creșterea expresiei genice pentru Akt în cazul celulelor HT29 a căror luptă pentru supraviețuire a fost mult mai intensă.

Reticul endoplasmatic (RE) este un organit important în maturarea și împachetarea proteinelor cu realizarea structurilor secundare, terțiare și cuaternare pentru ca proteinele să fie funcționale. Pe dealtă parte acest organit joacă un rol important în homeostazia celulară și moartea acesteia. Expunerea celulei la diferiți factori de stress a permis studiul RE în condiții de stress atât în celulele normale cât și în cele canceroase. RE este răspunzător de formarea UPR (unfolded protein response – proteine de răspuns, ne-împachetate) și există studii care au pus în evidență legătura dintre stersul RE și cancer în care sunt implicate proteinele UPR atât în carcinogeneză cât și în rezistența la chimioterapie. În condiții normale, expunerea la stress a RE conduce la apoptoză [131]. Dezechilibrul între proteinele pro- și anti-apoptotice Bcl2 în condiții de stres al RE poate determina creșterea transcripției pentru Bcl2-like 1 (BIM), pentru PUMA (p53 ca modulator neregulat de apoptoză care intercaționează cu Bax cu formarea de citorcrom c și activarea apoptozei caspază dependent, prin clivarea p53), pentru NOXA (activator al NADPH) și pentru proteinele BH3.

Stresul RE în celulele tumorale, poate fi produs în anumite condiții cum ar fi hipoxia, privarea de nutrienți, modificarea de pH, vascularizatia săracă, condiții în care este activată formarea de UPR [132-136].

Modificările metabolice și cele inflamatorii sunt importante în procesul de carcinogeneză deoarece cresc activitatea în RE de asamblare și transport al proteinelor, conducțnd astfel la stres în RE [137]. Răspunsul la stres al RE este citoprotector și implicat în creșterea și adaptarea la celulei canceroase la agresivitatea mediului în care există [138,139].

Se cunosc trei căi de semnalizare în cazul stresului RE:

Calea în care este implicată enzima inozitol dependentă 1 alfa (IRE1α) care contribuie în progresia cancerului și scăderea expresiei genei pentru proteina de legare X-bax (XBP1) [140].

Fatorul 6 de activare al transcripției (ATF6).

RE-kinaza pancreatică (PERK) localizată în RE și implicată în carcinogeneză.

XBP1 este crescut în multe cancere umane cum ar fi: cancerul de sân, carcinomul hepatocelular, adenocarcinomul pancreatic [140]. Stresul RE poate constitui o țintă potențială pentru dezvoltarea de noi medicamente în terapia cancerului, care să reducă adaptarea la hipoxie, la inflamație și angiogeneză a celulelor tumorale, astfel încât să poată fi prevenită rezistența la tratamentul citostatic [141, 142].

Sintezele, proliferarea și procesele de glicoliză sunt mult mai intense în celulele tumorale comparativ cu cele normale [143-146].

Factorul 1α indus de hipoxie (HIF1α) joacă un rol important în dezvoltarea tumorală mediind angiogeneza, proliferarea și invazia tumorală, reglând experisa și activitatea enzimelor glicolitice. Blocarea expresiei HIF 1 alfa poate constitui o promisiune ca țintă terapeutică pentru tratamentul tumorilor hipoxice, hipovasculare [147]. De asemnea, pot constitui ținte potențiale în terapia cancerului scăderea sau inihibarea sintezei proteice a unor componente UPR cum ar fi: ATF4, XBP1, PERK [148, 149]. În multe tipuri de cancer cum ar fi cel de sân, hepatocelular, cancerul cerebral, de colon, ovarian, pancreatic, glioblastomul, sunt supra-exprimate componente ale UPR, chaperone RE și receptorul proteic de reglare al abosrbției de glucoză (GRP78) în corelație cu stresul RE, fiind evidențiate pe modele experimentale animale, implicarea acestora ăn dezvoltarea și progresia tumorală [150-152].

Pe de altă parte, stresul RE poate constitui o țintă în terapia cancerului printr-o serie de compuși a căror siteză o detremină [146, 153, 154]. Astfel, domeniul intracitoplasmatic al IRE1 alfa interacționează cu calea apoptotică Bax-Bak determinând activarea căii IRE1 alfa [155], modulând funcționarea Bcl2 în sensul scăderii invazivității în cancerul mamar [156]. Aceste modificări au fost reamarcate și prin studiul pe liniile celulare de cancer mamar (MCF7) sau linii de celule B din leucemia limfatică cronică, care au evoluat spre moarte prin apoptoză atunci cân au fost expuse la stres pentru RE [154, 157]. O altă strategie cu potențial anti-tumoral ar fi activarea axei CHOP-GADD34 [158, 159]. PERK este un important factor în moartea celulară indusă în condiții de stres al RE ca de altfel și în scăderea sintezei de CHOP [160]. Pe de altă parte CHOP s-a dovedit a induce moartea celulei tumorale prin stimularea sintezei unor protein pro-apoptotice și prin stimularea proceselor oxidative în celulele canceroase expuse la stres pentru RE [161].

Celulele canceroase se adaptează la micromediul tumoral prin activarea UPR și a macrofagelor care vor secreta citokone, factori de creștere și de angiogeneză [162]. În condiții de stress al RE, celula canceroasă va crește expresia COX2 pe calea NF-kB care joacă un important rol anti-apoptotic. De asemenea, activarea căii NF-kB joacă un important rol pro-inflamator prin CHOP, fiind stimulată sinteza de IL-8 cum este în cazul celulelor epiteliale umane [163, 164].

Deoarece calea de sinteză UPR este inactivă în celulele normale, expunerea celulelor tumorale la stres al RE pe calea sintezei de UPR, prin hipoxie, privarea de nutrienți, distrugerea ADN, stres metabolic sau stress oxidative, poate constitui o țintă molecular în terapia cancerului [165, 166].

În cazul studiilor efectuate, expresia genică pentru XBP a crescut semnificativ la concentrația de 15uM dermaseptin în mediul de cultură pentru celulele liniei tumorale de cancer colorectal (HT29) față de linia cu celule tumorale pulmonare (A549). Ceea ce înseamnă că celulele HT29 sunt mai sensibile la acțiunea dermaseptinului 15uM comparativ cu A549. Rezultatele obținute pentru cele 2 linii celulare HT-29 și A549 sunt semnificativ diferite sub acțiunea dermaseptinului la cuncentrații de 15µM, apoptoza celulară fiiind de două ori mai mare pentru linia de adenocarcinom colorectal coparativ cu ce de carcinom alveolar. Astfel se explică creșterea expresiei genice pentru XBP în cazul celulelor HT29 a căror luptă pentru supraviețuire a fost mult mai intensă. De remarcat că, deși pentru celulele HT29 expuse la demaseptin 4uM, expresia genică pentru XBP a fost de 3 ori mai mare comparativ cu expunerea celulelor tumorale la 15uM dermaseptin în mediul de cultură (48h), apotoza celulară a fost de două ori mai mare în cel de-al doilea caz (57% pentru 15uM dermaseptin).

NRF2este factorul nuclear eritroid 2 (NF-E2) și constituie una dintre cele mai importante căi de semnalizare implicate în apărarea și supraviețuirea celulei și țesutului la agresiunea exercitată de diferite substanțe toxice sau cu potențial carcinogen. Pe această cale este crescută expresia multor gene cu rol citoprotector. În celula tumorală Nrf2 joacă rol protector fiind implicată în chimiorezitența la citostatice și progresia tumorală. De asemenea, o expresie genică crescută a Nrf2 se asociază cu un prognostic scăzut și chimiorezistență multiplă.

Există studii care au demonstrat stimularea proliferării celulare de către NRF2 pentru linia celulară A549 de carcinom pulmonar [167] prin implicarea unor enzime cum ar fi: glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH), transcetolaza (TKT) și transaldolaza 1 (TALDO1) care sunt implicate în refacerea NADPH (nicotinamid adenine dinucleotid fosfat). Nrf2 este răspunzătoare de activarea direct a G6PDH, TKT, TALDO1, ME1 (enzima malică1), IDH1 (izocitrat dehidrogenaza 1), fiind evidențiate proteine implicate în creșterea influxului intracelular de glucoză și stimularea proceselor metabolice, stimularea sintezei de purine, respectiv blocarea proceselor de distrugere a ADN și ARN, având ca și consecință stimularea proliferării celulelor tumorale. Nrf2 poate stimula proliferarea celulei canceroase și prin reglarea balanței redox, adică prin generarea de antioxidanți cum este stimularea sintezei de glutation care va diminua stresul oxidativ [168, 169]. Pentru celulele A549, [167] a observant că acestea au transformat glutamina din mediul de cultură în glutation sub acțiunea Nrf2 fiind astfel accelerată proliferarea celulară a celulelor A549.

Nrf2 ar putea constitui o țintă moleculară pentru terapia cancerului prin molecule care ar inhibă activitatea Nrf2 la nivelul celulelor tumorale [170, 171, 172].

Dermaseptinul inhibă semnificativ expresia genică pentru pentru Nrf2 pentru linia HT29 la concentrații de 15uM dermaseptin, iar pentru linia A549 prin expunere la 4uM dermaseptin timp de 48h. pentru celulele A549 la 15uM dermaseptin expresia genică Nrf2 este nesemnificativ crescută. Se poate menționa că având în vedere această țintă moleculară, probabil într-un interval de timp mai mare de 48 ore, apoptoza celulelor ar fi mai mare la concetrația de 4uM și ar fi interesant de urmărit care este variația expresiei genice pentru Nrf2 la 72 de ore, comparativ cu viabilitatea celulară prin citometrie în flux.

Acumularea defectelor pe calea apoptotică a celulelor tumorale pot conduce la creșterea supraviețuirii acestora și la rezistența la chimioterapie. Familia proteinelor Bcl2 (B cell lymphoma 2) joacă un rol important în această direcție prin inactivarea domeniului BH3 al proteinelor pro-apoptotice. Familia Bcl2 este constituită din aproximativ 25 de membri cu rol pro- și anti-apoptotic implicați în supraviețuirea și moartea celulară. Creșterea expresiei genice pentru membrii familiei Bcl2 cu rol anti-apoptotic a fost asociat cu rezistența la chimioterapie în diferite cancere [173-175].

Pentru linia HT29, dermaseptinul atât în concentrație de 15uM cât și în concetrație 4uM blochează expresia genei Bcl2, probabil prin scăderea sintezei de proteine anti-apoptotice. În cazul liniei A549, expresia genei Bcl2 este crescută prin expunerea la dermaseptin 15uM, acest lucru fiind explicat probabil prin creșterea sintezei de proteine anti-apoptotice.

În aceste studii s-a observat că dermaseptinul în concentrație de 15uM în mediul de cultură (48h) determină apoptoza liniilor celulare HT29 prin crșterea expresiei genelor Akt, XBP și scăderea expresiei genice pentru Bcl2 și Nrf2, influiențînd expresia genei CHOP în sensul creșterii ei prin expunerea la dermaseptin 4uM timp de 48h. Evoluția liniei A549 este similară cu cea a liniei HT29 cu excepția genelor Bcl2 și Nrf2 pentru care la 15 uM s-a observat o creștere a expresiei acestor gene, iar la concentrații de dermaseptin de 4 uM s-a observat o scădere a expresiei acestora. O posibilă explicație ar fi aceea că la concentrații mari de citotoxic lupta celulelor este mult mai intensă prin creșterea sintezei de proteine anti-apoptotice și și scăderea stresului oxidativ prin sinteză crescută de glutation, creșterea influxului de glucoză, a sintezei de purine și reparațiilor de ADN în celula tumorală. Se pare că aceste mecanisme nu sunt activate la concentrații de 4uM la care și expresia genei CHOP este crescută, adică este stimulată sinteza de proteine pro-apototice în celula canceroasă.

Prin urmare, expunerea celor două linii celulare tumorale la dermaseptin, timp de 48 de ore, s-a dovedit citotoxică, dar s-ar parea că și incubarea timp mai îndelungat de 48 de ore ar avea efect citotoxic la concentrații mult mai mici de peptid (4uM).

CONCLUZII:

Acumularea defectelor pe calea apoptotică a celulelor tumorale pot conduce la creșterea supraviețuirii acestora și la rezistența la chimioterapie. Familia proteinelor Bcl2 (B cell lymphoma 2) joacă un rol important în această direcție prin inactivarea domeniului BH3 al proteinelor pro-apoptotice. Creșterea expresiei genice pentru membrii familiei Bcl2 cu rol anti-apoptotic a fost asociat cu rezistența la chimioterapie în diferite cancere.

De asemenea, s-a urmărit optimizarea primeri-lor Akt, Hif-1α, XBP, Nrf2, PERK în vederea evaluării metabolismului celulelor tumorale prin determinarea expresiei genice a acestor gene (Akt, Hif-1alfa XBP, Nrf2, și CHOP) sub acțiunea peptidului citotoxic utilizat.

Pentru gena CHOP s-a remarcat o creștere a expresiei genice perin expunerea celor două linii celulare la dermaseptin în concentrație 4uM, ceea ce se poate explica prin creșterea sintezei de proteine pro-apoptotice sau a stresului oxidativ la nivelul celulei canceroase.

Dermaseptinul inhibă semnificativ expresia genică pentru Nrf2 atât pentru linia HT29 cât și pentru linia A549. Prin urmare, putem afirma că Bcl2 și Nrf2 pot fi ținte moleculare pentru celulele A549 și HT29, iar pentru linia tumorală de cancer colorectal se poate adăuga și gena CHOP.

BIBLIOGRAFIE:

1. Kamata H, Hirata H. Redox regulation of cellular signalling. Cell Signal 1999;11:1^14.

2. Ueda S, Masutani H, Nakamura H, Tanaka T, UenoM, Yodoi J. Redox control of cell death. Antioxid Redox Signal 2002; 4:405^14.

3. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry, and role inhuman disease. AmJMed 1991;91:14^22S.

4. Kieran MW, Folkman J, Heymach J. Angiogenesis inhibitors and hypoxia. NatMed 2003;9:822^3.

5. Harris AL. HypoxiaFa key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer 2002;2:38^47.

6. Inoue M, Sato EF, Nishikawa M, et al. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life. CurrMed Chem 2003;10:2495^505.

7. Pouyssegur J, Dayan F, Mazure NM. Hypoxia signaling in cancer and approaches to enforce tumour regression. Nature 2006;441:437^43.

8. Linnane AW, Eastwood H. Cellular redox regulation and prooxidant signaling systems: a new perspective on the free radical theory of aging. Ann N YAcad Sci 2006;1067:47^ 55.

9. KinnulaVL, Crapo JD. Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors. Free Radic Biol Med 2004;36:718^44.

10. Thannickal VJ, Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000;279:L1005^ 28.

11. Sen CK. Cellular thiols and redox-regulated signal transduction. CurrTop Cell Regul 2000;36:1^30.

12. Biswas S, Chida AS, Rahman I. Redoxmodifications of protein-thiols: emerging roles in cell signaling. Biochem Pharmacol 2006;71:551^64.

13. Schafer FQ, BuettnerGR.Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic BiolMed 2001;30:1191^212.

14.Valko M, Rhodes CJ, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact 2006;160: 1^40. Epub 2006.

15. Singh KK.Mitochondria damage checkpoint, aging, and cancer. Ann N YAcad Sci 2006;1067:182^90.

16. Sikka SC. Role of oxidative stress response elements and antioxidants in prostate cancer pathobiology and chemopreventionFa mechanistic approach. Curr Med Chem 2003;10:2679^92.

17. Knaapen AM, Borm PJ, Albrecht C, Schins RP. Inhaled particles and lung cancer. Part A: Mechanisms. Int JCancer 2004;109:799^809.

18. Hanahan D,Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000;100:57^70.

19. Sundaresan M,Yu ZX, Ferrans VJ, Irani K, Finkel T. Requirement for generation of H2O2 for plateletderived growth factor signal transduction. Science 1995;270:296 ^ 9.

20. BaeYS, Kang SW, Seo MS, et al. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. JBiol Chem1997;272:217^21.

21. Groen A, Lemeer S, van derWijk T, et al. Differential oxidation of protein-tyrosine phosphatases. J Biol Chem 2005;280:10298^304.

22. Leslie NR, Bennett D, LindsayYE, Stewart H, Gray A, Downes CP. Redox regulation of PI3-kinase signaling via inactivation of PTEN. EMBO J 2003;22: 5501^10.

23.Wang X, McCullough KD, FrankeTF, Holbrook NJ. Epidermal growth factor receptor-dependent Akt activation by oxidative stress enhances cell survival. JBiol Chem 2000;275:14624^31.

24. Benhar M, Engelberg D, Levitzki A. ROS, stressactivated kinases and stress signaling in cancer. EMBORep 2002;3:420^5.

25. Li CY, Shan S, Huang Q, et al. Initial stages of tumor cell-induced angiogenesis: evaluation via skin window chambers in rodent models. J Natl Cancer Inst 2000;92:143^7.

26. Pore N, Jiang Z, Shu HK, Bernhard E, Kao GD, Maity A. Akt1 activation can augment hypoxiainducible factor-1a expression by increasing protein translation through a mammalian target of rapamycin-independent pathway. Mol Cancer Res 2006;4:471^9.

27. Pugh CW. Oxygen sensing in cancer. Ann Med 2003;35:380^90.

28.Verma A. Oxygen-sensing in tumors. Curr Opin Clin NutrMetab Care 2006;9:366^78.

29. Semenza GL, Shimoda LA, Prabhakar NR. Regulation of gene expression by HIF-1. Novartis Found Symp 2006;272:2 ^8.

30. Maxwell PH,Wiesener MS, Chang GW, et al.The tumour suppressor protein VHL targets hypoxiainducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 1999;399:271^5.

31. Huang LE, Gu J, Schau M, Bunn HF. Regulation of hypoxia-inducible factor 1a is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitinproteasome pathway. Proc Natl Acad Sci US A1998; 95:7987^92.

32. Jiang BH, Semenza GL, Bauer C,Marti HH.Hypoxia-inducible factor 1 levels vary exponentially over a physiologically relevant range of O2 tension. Am JPhysiol 1996;271:C1172^80.

33. Metzen E, Zhou J, JelkmannW, FandreyJ, Brune B. Nitric oxide impairs normoxic degradation of HIF-1a by inhibition of prolyl hydroxylases. Mol Biol Cell 2003;14:3470^81.

34. Bell EL, Emerling BM, Chandel NS. Mitochondrial regulation of oxygen sensing. Mitochondrion 2005;5: 322^ 32.

35.Wallace DC. Mitochondria and cancer: Warburg addressed. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2005; 70:363^74.

36. Guzy RD, Schumacker PT. Oxygen sensing bymitochondria at complex III:The paradox of increased ROS during hypoxia. Exp Physiol 2006;91:807 ^19.

37. Mansfield KD, Guzy RD, PanY, et al. Mitochondrial dysfunction resulting from loss of cytochrome c impairs cellular oxygen sensing and hypoxic HIF-a activation. CellMetab 2005;1:393^9.

38. Brunelle JK, Bell EL, Quesada NM, et al. Oxygen sensing requires mitochondrial ROS but not oxidative phosphorylation. Cell Metab 2005;1:409^14.

39. Kietzmann T,Gorlach A. Reactive oxygen species in the control of hypoxia-inducible factor-mediated gene expression.Semin CellDevBiol 2005;16:474^86.

40. Fleury C, Mignotte B,Vayssiere JL. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling.Biochimie 2002;84:131^41.

41. Le BrasM, ClementMV, Pervaiz S, Brenner C. Reactive oxygen species and the mitochondrial signaling pathway of cell death. Histol Histopathol 2005;20: 205^19.

42.Meyskens FL, Jr., Farmer P, FruehaufJP. Redox regulation in human melanocytes and melanoma. Pigment Cell Res 2001;14:148^54.

43. Ough M, Lewis A, Zhang Y, et al. Inhibition of cell growth by overexpression of manganese superoxide dismutase (MnSOD) in human pancreatic carcinoma. Free Radic Res 2004;38:1223^33.

44.Venkataraman S, Jiang X,Weydert C, et al.Manganese superoxide dismutase overexpression inhibits the growth of androgen-independent prostate cancer cells. Oncogene 2005;24:77^89.

45. LiuJ, DuJ, Zhang Y, et al. Suppression of themalignant phenotype in pancreatic cancer by overexpression of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Hum GeneTher 2006;17:105^16.

46. FinchJS,TomeME, Kwei KA, Bowden GT. Catalase reverses tumorigenicity in a malignant cell line by an epidermal growth factor receptor pathway. Free Radic Biol Med 2006;40:863 ^ 75.

47. Nelson SK, Bose SK, Grunwald GK, Myhill P, McCord JM. The induction of human superoxide dismutase and catalase in vivo: a fundamentally new approach to antioxidant therapy. Free Radic Biol Med 2006;40:341^7.

48. Brenner C, Grimm S. The permeability transition pore complex in cancer cell death. Oncogene 2006; 25:4744^56.

49. Faustin B, Rossignol R, Rocher C, Benard G,Malgat M, LetellierT.Mobilization of adenine nucleotide translocators as molecular bases of the biochemical threshold effect observed in mitochondrial diseases. J Biol Chem 2004;279:20411^21.

50. BauerMK, Schubert A, Rocks O, Grimm S. Adenine nucleotide translocase-1, a component of the permeability transition pore, can dominantly induce apoptosis. JCell Biol 1999;147:1493^502.

51. Scorrano L, Korsmeyer SJ. Mechanisms of cytochrome c release by proapoptotic BCL-2 family members. Biochem Biophys Res Commun 2003;304: 437^44.

52. Shoshan-Barmatz V, Israelson A, Brdiczka D, Sheu SS. The voltage-dependent anion channel (VDAC): function in intracellular signalling, cell life and cell death. Curr Pharm Des 2006;12:2249^70.

53.MadeshM, Hajnoczky G.VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. JCell Biol 2001;155:1003^15.

54. Han D, Antunes F, Canali R, Rettori D, Cadenas E. Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol. JBiol Chem 2003;278:5557^63.

55. Garrido C, Galluzzi L, Brunet M, PuigPE,Didelot C, KroemerG.Mechanisms of cytochrome c release from mitochondria.CellDeathDiffer 2006;13:1423^33.

56. Li JJ,Tang Q, Li Y, et al. Role of oxidative stress in the apoptosis of hepatocellular carcinoma induced by combination of arsenic trioxide and ascorbic acid. Acta Pharmacol Sin 2006;27:1078^84.

57. Costantini P, Belzacq AS,Vieira HL, et al. Oxidation of a critical thiol residue of the adenine nucleotide translocator enforces Bcl-2-independent permeability transition pore opening and apoptosis. Oncogene 2000;19:307^14.

58. Halestrap AP, Clarke SJ, Javadov SA. Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusionFa target for cardioprotection. Cardiovasc Res 2004;61:372^85.

59. Armstrong JS, Jones DP. Glutathione depletion enforces the mitochondrial permeability transition and causes cell death in Bcl-2 overexpressing HL60 cells. FASEB J 2002;16:1263^5.

60. Imai H, Koumura T, Nakajima R, Nomura K, Nakagawa Y. Protection from inactivation of the adenine nucleotide translocator during hypoglycaemiainduced apoptosis by mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. Biochem J 2003;371:799^809.

61.Wudarczyk J, Debska G, Lenartowicz E. Relation between the activities reducing disulfides and the protection againstmembrane permeability transition in rat liver mitochondria. Arch Biochem Biophys 1996;327: 215^21.

62. Estrela JM, Ortega A, Obrador E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci 2006;43:143^81.

63. Chen X, Carystinos GD, Batist G. Potential for selective modulation of glutathione in cancer chemotherapy. Chem Biol Interact 1998;111^2:263^75.

64. Friesen C, KiessY, Debatin KM. A critical role of glutathione in determining apoptosis sensitivity and resistance in leukemia cells. Cell Death Differ 2004;11: S73^85.

65. FruehaufJP,ZonisS,al-BassamM,etal.Melanincontent and downregulation of glutathione S-transferase contribute to the action of L-buthionine-S-sulfoximine on humanmelanoma. Chem Biol Interact 1998;111^2: 277^305.

66. Bailey HH, Mulcahy RT, Tutsch KD, et al. Phase I clinical trial of intravenous L-buthionine sulfoximine and melphalan: an attempt at modulation of glutathione. J Clin Oncol 1994;12:194^205.

67. Tchounwou PB,YedjouCG,DorseyWC. Arsenic trioside- induced transcriptional activation of stress genes and expression of related proteins in human liver carcinomacells (HepG2).CellMolBiol2003;49:1071^9.

68. Zheng Y, Shi Y, Tian C, et al. Essential role of the voltage-dependent anion channel (VDAC) in mitochondrial permeability transition pore opening and cytochrome c release induced by arsenic trioxide. Oncogene 2004;23:1239^47.

69. Cen D, Brayton D, Shahandeh B, Meyskens FL, Jr., Farmer PJ. Disulfiramfacilitates intracellular Cu uptake and induces apoptosis in human melanoma cells. JMed Chem 2004;47:6914^20.

70. Brar SS, Grigg C,Wilson KS, et al. Disulfiraminhibits activating transcription factor/cyclic AMP-responsive element binding protein and humanmelanoma growth in a metal-dependent manner in vitro, inmice andin a patient with metastatic disease. Mol Cancer Ther 2004;3:1049^60.

71. Juarez JC, Betancourt O, Jr., Pirie-Shepherd SR,N et al. Copper binding by tetrathiomolybdate attenuates angiogenesis and tumor cell proliferation through the inhibition of superoxide dismutase 1. Clin Cancer Res 2006;12:4974^ 82.

72. Campbell RA, Gordon MS, Betancourt O, et al. ATN-224, an orally available small molecule inhibitor of SOD1, inhibits multiple signaling pathways associated with myeloma progression and has antitumor activity in a murine model of refractory myeloma growth [abstract 4859]. Proc Am Assoc Cancer Res 2006.

73. Meyskens FL, Jr., Farmer PJ, Anton-Culver H. Etiologic pathogenesis of melanoma: a unifying hypothesis for the missing attributable risk. Clin Cancer Res 2004;10:2581^3.

74. BiaglowJE, Miller RA. The thioredoxin reductase/ thioredoxin system: novel redox targets for cancer therapy. Cancer BiolTher 2005;4:6^13.

75. Lu J, Papp LV, Fang J, Rodriguez-Nieto S,NZhivotovsky B, Holmgren A. Inhibition of mammalian thioredoxinreductaseby someflavonoids:implications for myricetin and quercetin anticancer activity. Cancer Res 2006;66:4410^8.

76.Young SW, Qing F, Harriman A, et al. Gadolinium(III) texaphyrin: a tumor selective radiation sensitizer that is detectable by MRI. Proc Natl Acad Sci US A1996; 93:6610 ^ 5. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:2569.

77. Evens AM. Motexafin gadolinium: a redox-active tumor selective agent for the treatment of cancer. Curr Opin Oncol 2004;16:576^80.

78. Hashemy SI, Ungerstedt JS, Avval FZ, Holmgren A. Motexafin gadolinium, a tumor-selective drug targeting thioredoxin reductase and ribonucleotide reductase. JBiol Chem 2006;281:10691^7.

79.WitteAB, Anestal K, Jerremalm E, Ehrsson H, Arner ES. Inhibition of thioredoxin reductase but not of glutathione reductase by the major classes of alkylating and platinum-containing anticancer compounds. Free Radic BiolMed 2005;39:696^703.

80. Meyskens FL, Szabo E. Diet and cancer: the disconnect between epidemiology and randomized clinical trials. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:1366^9.

81. Kroemer, G., Galluzzi, L., and Brenner, C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99–163.

82. Pedersen, P.L. (2007). Warburg, me and Hexokinase 2: Multiple discoveries of key molecular events underlying one of cancers’ most common phenotypes, the ‘‘Warburg Effect’’, i.e., elevated glycolysis in the presence of oxygen. J. Bioenerg. Biomembr. 39, 211–222.

83. Kim, W., Yoon, J.H., Jeong, J.M., Cheon, G.J., Lee, T.S., Yang, J.I., Park, S.C., and Lee, H.S. (2007b). Apoptosis-inducing antitumor efficacy of hexokinase II inhibitor in hepatocellular carcinoma. Mol. Cancer Ther. 6, 2554–2562.

84. Pastorino, J.G., Hoek, J.B., and Shulga, N. (2005). Activation of glycogen synthase kinase 3beta disrupts the binding of hexokinase II to mitochondria bynphosphorylating voltage-dependent anion channel and potentiates chemotherapy-induced cytotoxicity. Cancer Res. 65, 10545–10554.

85. Miyamoto, S., Murphy, A.N., and Brown, J.H. (2008). Akt mediates mitochondrial protection in cardiomyocytes through phosphorylation of mitochondrial hexokinase-II. Cell Death Differ. 15, 521–529. Published online December 7, 2007. 10.1038/sj.cdd.4402285.

86. Robey, R.B., and Hay, N. (2006). Mitochondrial hexokinases, novel mediators of the antiapoptotic effects of growth factors and Akt. Oncogene 25,4683–4696.

87. Kroemer, G., Galluzzi, L., and Brenner, C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99–163.

88. Galluzzi, L., Larochette, N., Zamzami, N., and Kroemer, G. (2006). Mitochondria as therapeutic targets for cancer chemotherapy. Oncogene 25, 4812–4830.

89. Galluzzi, L., Larochette, N., Zamzami, N., and Kroemer, G. (2006). Mitochondria as therapeutic targets for cancer chemotherapy. Oncogene 25, 4812–4830.

90. Zoratti, M., and Szabo, I. (1995). The mitochondrial permeability transition. Biochim. Biophys. Acta 1241, 139–176.

91. Bonnet, S., Archer, S.L., Allalunis-Turner, J., Haromy, A., Beaulieu, C., Thompson, R., Lee, C.T., Lopaschuk, G.D., Puttagunta, L., Bonnet, S., et al. (2007). A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11, 37–51.

92. Cassidy J, Bisset D, Spence AJR, Payene M ( eds), Molecular cancer biology. Oxford Handbok of Oncology , second edition, Oxford University Press 2009: 3- 15.

93. Rahman Misha et al., Flow Cytometry, AbD seroTEC a divizion of morphoSys, 2006.

94. Robinson J. Paul, Flow Cytometry, Purdue University, West Lafayette, Indiana, U.S.A., Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, DOI: 10.1081/E-EBBE 120013923, 2004.

95. Nunez Rafael, Flow Cytometry: Principles and Instrumentation, Curr. Issues Mol. Biol. 3(2): 39-45, 2001.

96. Howard M., Shapiro, Practical Flow Cytometry, 4th edition, Wiley-Liss, 2002.

97. Leonore A. Herzenberg, James Tung, Wayne A Moore, Leonard A Herzenberg, David R Parks, Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed, Nature Immunology, Volume 7, Number, 2006.

98. Brown Michael and Carl Wittwer, Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications in Hematology, Clinical Chemistry 46:8(B) 1221–1229, 2000.

99. Zola Z., Immunological applications of flow cytometry, J. Immunol. Meth., 243:1-2, 2000.

100. Galbraith, D. W., Isolation and flow cytometric characterization of plant protoplasts. In: Methods in Flow Cytometry, (Z. Darzynkiewicz, H.Crissman, eds.), Methods in Cell Biology 33:527-547, 1990.

101. Harkins, K. R. and Galbraith, D. W., Factors governing the flow cytometric analysis and sorting of large biological particles. Cytometry 8:60-71, 1987.

102. Vermes I., Haanen C., Reutelingsperger C., Flow cytometry of apoptotic cell death, J. Immunol. Meth., Vol. 243, 2000.

103. Zilmer N.A., Rodriguez, J.J., Yopp, T.A., Lambert, G.M., and Galbraith, D.W., Flow cytometric analysis using digital signal processing. Cytometry 20:102-117, 1995.

104. Liu X., Chen H., Patel D.J., Solution structure of actinomycin-DNA complexes: drug intercalation at isolated G-C sites, J Biomol NMR 1 (4): 323-47, 1991.

105. Koopman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, Keehnen RM, Pals ST, van Oers MH., Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis, Blood, 84(5):1415-1420, 1994.

106. Raynal P., Pollard H.B., Annexins: the problem of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calcium- and phospholipid-binding proteins, Biochim Biophys Acta, 1197 (1):63-93, 1994.

107. Schmid I., Krall W.J., Uittenbogaart CH, Braun J, Giorgi JV., Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescenc in single laser flow cytometry, Cytometry, 13(2):204-208, 1992.

108. gena ABL….](Hughes TP, Morgan GJ, Martiat P, Goldman JM. Detection of residual leukemia after bone marrow transplant for chronic myeloid leukemia: role of polymerase chain reaction in predicting relapse. Blood. 1991 Feb 15;77(4):874-8. PubMed PMID: 1993225)

109.Fresno Vara JA, Casado E, de Castro J, Cejas P, Belda-Iniesta C, Gonza´lez-Baro´n M 2004 PI3K/Akt signalling pathway and cancer. Cancer Treat Rev 30:193–204.

110. Liu P, Cheng H, Roberts TM, Zhao JJ 2009 Targeting the phosphoinositide 3-kinase pathway in cancer. Nat Rev Drug Discov 8:627–644.

111. Courtney KD, Corcoran RB, Engelman JA 2010 The PI3K pathway as drug target in human cancer. J Clin Oncol 28:1075–1083.

112. Dummler B, Hemmings BA 2007 Physiological roles of PKB/Akt isoforms in development and disease. Biochem Soc Trans 35:231–235.

113. Meric-Bernstam F, Gonzalez-Angulo AM 2009 Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy. J Clin Oncol 27:2278–2287.

114. Cantley LC, Neel BG 1999 New insights into tumor suppression: PTEN suppresses tumor formation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway. Proc Natl Acad Sci USA 96:4240–4245.

115 Sansal I, Sellers WR 2004 The biology and clinical relevance of the PTEN tumor suppressor pathway. J Clin Oncol 22:2954–2963.

116. Ciampi R, Nikiforov YE 2007 RET/PTC rearrangements and BRAF mutations in thyroid tumorigenesis. Endocrinology 148:936–941.

117 Santoro M, Melillo RM, Fusco A 2006 RET/PTC activation in papillary thyroid carcinoma: European Journal of Endocrinology Prize Lecture. Eur J Endocrinol 155:645–653.

118. Miyagi E, Braga-Basaria M, Hardy E, Vasko V, Burman KD, Jhiang S, Saji M, Ringel MD 2004 Chronic expression of RET/PTC 3 enhances basal and insulin-stimulated PI3 kinase/ AKT signaling and increases IRS-2 expression in FRTL-5 thyroid cells. Mol Carcinog 41:98–107.

119. Castellone MD, De Falco V, Rao DM, Bellelli R, Muthu M, Basolo F, Fusco A, Gutkind JS, Santoro M 2009 The betacatenin axis integrates multiple signals downstream from RET/papillary thyroid carcinoma leading to cell proliferation. Cancer Res 69:1867–1876.

120. Hayashi H, Ichihara M, Iwashita T, Murakami H, Shimono Y, Kawai K, Kurokawa K, Murakumo Y, Imai T, Funahashi H,

Nakao A, Takahashi M 2000 Characterization of intracellular signals via tyrosine 1062 in RET activated by glial cell linederived neurotrophic factor. Oncogene 19:4469–4475.

121. Segouffin-Cariou C, Billaud M 2000 Transforming ability of MEN2A-RET requires activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT signaling pathway. J Biol Chem 275:3568– 3576.

122. Jung HS, Kim DW, Jo YS, Chung HK, Song JH, Park JS, Park KC, Park SH, Hwang JH, Jo KW, Shong M 2005 Regulation of protein kinase B tyrosine phosphorylation by thyroidspecific oncogenic RET/PTC kinases. Mol Endocrinol 19:2748–2759.

123. Liu Z, Hou P, Ji M, Guan H, Studeman K, Jensen K, Vasko V, El-Naggar AK, Xing M 2008 Highly prevalent genetic alterations in receptor tyrosine kinases and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase pathways in anaplastic and follicular thyroid cancers. J Clin Endocrinol Metab 93:3106–3116.

124. Xu X, Quiros RM, Gattuso P, Ain KB, Prinz RA 2003 High prevalence of BRAF gene mutation in papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines. Cancer Res 63: 4561–4567.

125. Zhu Z, Ciampi R, Nikiforova MN, Gandhi M, Nikiforov YE 2006 Prevalence of RET/PTC rearrangements in thyroid

papillary carcinomas: effects of the detection methods and genetic heterogeneity. J Clin Endocrinol Metab 91:3603– 3610.

126. Henderson YC, Shellenberger TD, Williams MD, El-Naggar AK, Fredrick MJ, Cieply KM, Clayman GL 2009 High rate of BRAF and RET/PTC dual mutations associated with recurrent papillary thyroid carcinoma. Clin Cancer Res 15:485– 491.

127. Wirtschafter A, Schmidt R, Rosen D, Kundu N, Santoro M, Fusco A, Multhaupt H, Atkins J, Rosen M, Keane W, Rothstein

JL 1997 Expression of the RET/PTC fusion gene as a marker for papillary carcinoma in Hashimoto’s thyroiditis. Laryngoscope 107:95–100.

128. Sheils OM, O’Eary JJ, Uhlmann V, Lattich K, Sweeney EC 2000 RET/PTC-1 activation in Hashimoto thyroiditis. Int J Surg Pathol 8:185–189.

129. Rhoden KJ, Unger K, Salvatore G, Yilmaz Y, Vovk V, Chiappetta G, Qumsiyeh MB, Rothstein JL, Fusco A, Santoro M, Zitzelsberger H, Tallini G 2006 RET/papillary thyroid cancer rearrangement in nonneoplastic thyrocytes: follicular cells of Hashimoto’s thyroiditis share low-level recombination events with a subset of papillary carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 91:2414–2423.

130. Hou P, Liu D, Shan Y, Hu S, Studeman K, Condouris S, Wang Y, Trink A, El-Naggar AK, Tallini G, Vasko V, Xing M 2007 Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res 13:1161–1170.

131. Tabas I, Ron D. Integrating the mechanisms of apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress. Nat Cell Biol 2011;13: 184-90.

132. Martinon F. Targeting endoplasmic reticulum signaling pathways in cancer. Acta Oncol 2012;51:822-30.

133. Travers KJ, Patil CK, Wodicka L, Lockhart DJ, Weissman JS, Walter P. Functional and genomic analyses reveal an essential coordination between the unfolded protein response and ER-associated degradation. Cell 2000;101:249-58.

134. Tsai YC, Weissman AM. The Unfolded Protein Response, Degradation from Endoplasmic Reticulum and Cancer. Genes Cancer 2010;1:764-78.

135. Hirosumi J, Tuncman G, Chang L, Görgün CZ, Uysal KT, Maeda K, et al. A central role for JNK in obesity and insulin resistance. Nature 2002;420:333-6.

136. Ozcan U, Cao Q, Yilmaz E, Lee AH, Iwakoshi NN, Ozdelen E, et al. Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science 2004;306:457-61.

137. Lee AS. GRP78 induction in cancer: therapeutic and prognostic implications. Cancer Res 2007;67:3496-9.

138. Healy SJ, Gorman AM, Mousavi-Shafaei P, Gupta S, Samali A. Targeting the endoplasmic reticulum-stress response as an anticancer strategy. Eur J Pharmacol 2009;625:234-46.

139. Ma Y, Hendershot LM. The role of the unfolded protein response in tumour development: friend or foe? Nat Rev Cancer 2004;4:966-77.

140. Koong AC, Chauhan V, Romero-Ramirez L. Targeting XBP-1 as a novel anti-cancer strategy. Cancer Biol Ther 2006;5:756-9.

141. Kraskiewicz H, FitzGerald U. InterfERing with endoplasmic reticulum stress. Trends Pharmacol Sci 2012;33:53-63.

142. Schleicher SM, Moretti L, Varki V, Lu B. Progress in the unraveling of the endoplasmic reticulum stress/autophagy pathway and cancer: implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Updat 2010;13:79-86.

143. Meienhofer MC, De Medicis E, Cognet M, Kahn A. Regulation of genes for glycolytic enzymes in cultured rat hepatoma cell lines. Eur J Biochem 1987;169:237-43.

144. Dang CV, Lewis BC, Dolde C, Dang G, Shim H. Oncogenes in tumor metabolism, tumorigenesis, and apoptosis. J Bioenerg Biomembr 1997;29:345-54.

145. Osthus RC, Shim H, Kim S, Li Q, Reddy R, Mukherjee M, et al. Deregulation of glucose transporter 1 and glycolytic gene expression by c-Myc. J Biol Chem 2000;275:21797-800.

146. Atsumi T, Chesney J, Metz C, Leng L, Donnelly S, Makita Z, et al. High expression of inducible 6-phosphofructo-2-kinase/fructose- 2,6-bisphosphatase (iPFK-2; PFKFB3) in human cancers. Cancer Res 2002;62:5881-7.

147. Kong D, Park EJ, Stephen AG, Calvani M, Cardellina JH, Monks A, et al. Echinomycin, a small-molecule inhibitor of hypoxia-inducible factor-1 DNA-binding activity. Cancer Res 2005;65:9047-55.

148. Wang Y, Alam GN, Ning Y, Visioli F, Dong Z, Nör JE, et al. The unfolded protein response induces the angiogenic switch in human tumor cells through the PERK/ATF4 pathway. Cancer Res 2012;72:5396-406.

149. Luo B, Lee AS. The critical roles of endoplasmic reticulum chaperones and unfolded protein response in tumorigenesis and anticancer therapies. Oncogene 2013;32:805-18.

150. Nagelkerke A, Bussink J, Mujcic H, Wouters BG, Lehmann S, Sweep FC, et al. Hypoxia stimulates migration of breast cancer cells via the PERK/ATF4/LAMP3-arm of the unfolded protein response. Breast Cancer Res 2013;15:R2.

151. Pike LR, Singleton DC, Buffa F, Abramczyk O, Phadwal K, Li JL, et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J 2013;449:389-400.

152. Clarke HJ, Chambers JE, Liniker E, Marciniak SJ. Endoplasmic Reticulum Stress in Malignancy. Cancer Cell 2014;25:563-73.

153. Moenner M, Pluquet O, Bouchecareilh M, Chevet E. Integrated endoplasmic reticulum stress responses in cancer. Cancer Res 2007;67:10631-4.

154. Rosati E, Sabatini R, Rampino G, De Falco F, Di Ianni M, Falzetti F, et al. Novel targets for endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in B-CLL. Blood 2010;116:2713-23.

155. Hetz C, Bernasconi P, Fisher J, Lee AH, Bassik MC, Antonsson B, et al. Proapoptotic BAX and BAK modulate the unfolded protein response by a direct interaction with IRE1alpha. Science 2006; 312:572-6.

156. Zhao X, Ayer RE, Davis SL, Ames SJ, Florence B, Torchinsky C, et al. Apoptosis factor EI24/PIG8 is a novel endoplasmic reticulum- localized Bcl-2-binding protein which is associated with suppression of breast cancer invasiveness. Cancer Res 2005;65:

2125-9.

157. Puthalakath H, O'Reilly LA, Gunn P, Lee L, Kelly PN, Huntington ND, et al. ER stress triggers apoptosis by activating BH3-only protein Bim. Cell 2007;129:1337-49.

158. Dalton LE, Clarke HJ, Knight J, Lawson MH, Wason J, Lomas DA, et al. The endoplasmic reticulum stress marker CHOP predicts survival in malignant mesothelioma. Br J Cancer 2013;108: 1340-7.

159. Huber AL, Lebeau J, Guillaumot P, Petrilli V, Malek M, Chilloux J, et al. p58(IPK)-mediated attenuation of the proapoptotic PERK-CHOP pathway allows malignant progression upon low glucose. Mol Cell 2013;49:1049-59.

160. Marciniak SJ, Yun CY, Oyadomari S, Novoa I, Zhang Y, Jungreis R, et al. CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum. Genes Dev 2004;18:3066-77.

161. Zinszner H, Kuroda M, Wang X, Batchvarova N, Lightfoot RT, Remotti H, et al. CHOP is implicated in programmed cell death in response to impaired function of the endoplasmic reticulum. Genes Dev 1998;12:982-95.

162. Allavena P, Sica A, Garlanda C, Mantovani A. The Yin-Yang of tumor- associated macrophages in neoplastic progression and immune surveillance. Immunol Rev 2008;222:155-61.

163. Hung JH, Su IJ, Lei HY, Wang HC, Lin WC, Chang WT, et al. Endoplasmic reticulum stress stimulates the expression of cyclooxygenase- 2 through activation of NF-kappaB and pp38 mitogen- activated protein kinase. J Biol Chem 2004;279:46384-92.

164. Park SH, Choi HJ, Yang H, Do KH, Kim J, Lee DW, et al. Endoplasmic reticulum stress-activated C/EBP homologous protein enhances nuclear factor-kappaB signals via repression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Biol Chem 2010;285:35330-9.

165. Scriven P, Coulson S, Haines R, Balasubramanian S, Cross S, Wyld L. Activation and clinical significance of the unfolded protein response in breast cancer. Br J Cancer 2009;101:1692-8.

166. Li X, Zhang K, Li Z. Unfolded protein response in cancer: the physician's perspective. J Hematol Oncol 2011;4:8.

167. Mitsuishi Y, Taguchi K, Kawatani Y, Shibata T, Nukiwa T, Aburatani H, Yamamoto M, Motohashi H. 2012. Nrf2 redirects glucose and glutamine into anabolic pathways in metabolic reprogramming. Cancer Cell 22: 66–79.

168. Reddy NM, Kleeberger SR, Yamamoto M, Kensler TW, Scollick C, Biswal S, Reddy SP. 2007b. Genetic dissection of the Nrf2-dependent redox signaling-regulated transcriptional programs of cell proliferation and cytoprotection. Physiol Genomics 32: 74–81.

169. Ishimoto T, Nagano O, Yae T, Tamada M, Motohara T, Oshima H, Oshima M, Ikeda T, Asaba R, Yagi H, et al. 2011. CD44

variant regulates redox status in cancer cells by stabilizing the xCT subunit of system xc_ and thereby promotes tumor growth. Cancer Cell 19: 387–400.

170. Ren D, Villeneuve NF, Jiang T, Wu T, Lau A, Toppin HA, Zhang DD. 2011. Brusatol enhances the efficacy of chemotherapy by inhibiting the Nrf2-mediated defense mechanism. Proc Natl Acad Sci 108: 1433–1438.

171. Magesh S, Chen Y, Hu L. 2012. Small molecule modulators of Keap1–Nrf2–ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents. Med Res Rev 32: 687–726.

172. Wang H, Liu K, Geng M, Gao P, Wu X, Hai Y, Li Y, Li Y, Luo L, Hayes JD, et al. 2013. RXRa inhibits the NRF2–ARE signaling pathway through a direct interaction with the Neh7 domain of NRF2. Cancer Res 73: 3097–3108.

173. Del Poeta G, Venditti A, Del Principe MI, et al. Amount of spontaneous apoptosis detected by Bax/ Bcl-2 ratio predicts outcome in acute myeloid leukemia (AML). Blood. 2003; 101:2125–31. [PubMed: 12424199]

174. Minn AJ, Rudin CM, Boise LH, Thompson CB. Expression of bcl-xL can confer a multidrug resistance phenotype. Blood. 1995; 86:1903–10. [PubMed: 7655019]

175. Yoshino T, Shiina H, Urakami S, et al. Bcl-2 expression as a predictive marker of hormonerefractory prostate cancer treated with taxane-based chemotherapy. Clin Cancer Res. 2006; 12:6116–24. [PubMed: 17062688]