“ Modificări de laborator la pacienții cu enterocolită Clostridium difficile” AUTOR: Macaveiu (Scorțea) Camelia COORDONATOR: Șef lucr. univ. dr…. [311568]

LUCRARE DE LICENȚĂ

“ Modificări de laborator la pacienții cu enterocolită Clostridium difficile”

AUTOR:

Macaveiu (Scorțea) Camelia

COORDONATOR:

Șef lucr. univ. dr. COCUZ Maria Elena

Brașov, 2016

LUCRARE DE LICENȚĂ

“ Modificări de laborator la pacienții cu enterocolită Clostridium difficile”

Brașov, 2016

CUPRINS

I.PARTEA GENERALĂ

1. Introducere………………………………………………………………3

2. Rolul microbiotei indigene………………………………………………4

3. Structura bacteriilor……………………………………………………..4

4. Patogenitatea bacteriilor………………………………………………..5

5. Apărarea antiinfecțioasă………………………………………………..6

6. Infecția cu Clostridium difficile…………………………………………8

6.1 Încadrarea toxonomică a speciei……………………………………………………8

6.1.1.Principalele specii ale genului Clostridium……………………………………8

6.2 Definiția enterocolitei cu Clostridium difficile…………………………………….9

6.3 Etiologie……………………………………………………………………………9

6.3.1 Agentul etiologic……………………………………………………………..9

6.3.2.Habitatul……………………………………………………………………10

6.4 Epidemiologie……………………………………………………………………..10

6.4.1 Frecvența…………………………………………………………………..10

6.4.2 Sursa de infecție…………………………………………………………….11

6.4.3 Modul de transmitere……………………………………………………….11

6.4.4 Receptivitate……………………………………………………………….12

6.4.5 Clasificare epidemiologică…………………………………………………12

6.5 Patogenie și factori de risc…………………………………………..12

6.6 Tablou clinic și forme clinice……………………………………….13

6.7 Complicații…………………………………………………………..14

6.8 Profilaxia…………………………………………………………….14

6.9 Diagnosticul de laborator în enterocolita Clostridium difficile……..15

6.9.1 Teste de laborator nespecifice……………………………………………..15

6.9.2 Teste de laborator specifice………………………………………………..18

6.9.2.1 Examenul macroscopic………………………………………………18

6.9.2.2 Examenul microscopic……………………………………………….19

6.9.2.3 Examenul bacteriologic………………………………………………19

6.9.2.4 Modalitățile de identificare ale toxinelor………………………….. 22

II.PARTEA SPECIALĂ

1. Introducere………………………………………………………………25

2. Scopul și obiectivele……………………………………………………25

3.Material si metodă………………………………………………………26

3.1 Metoda determinării toxinelor A/B……………………………………………….27

3.2 Coprocultura ( izolare și identificare bacteriologică)………………………………30

3.3 Metoda colorației Gram……………………………………………………………35

4. Rezultate si discuții…………………………………………………….37

5. Concluzii………………………………………………………………..63

BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………64

ABREVIERI…………………………………………………………………………………….67

I.PARTEA GENERALĂ

1. [anonimizat]. [anonimizat], în acest caz debutând un proces lung ce va continua pe tot parcursul vieții și anume contaminarea.

Contaminarea reprezintă simpla prezență a [anonimizat]. Colonizarea presupune înmulțirea microorganismelor fără a determina nici un fel de reacții. Colonizarea este condiționată de anumite condiții favorabile de înmulțire: nutrienți, PH, eficiența apărării antiinfecțioase locale sau prezența unor factori nocivi: antibioticele.[6]

Microorganismele care în mod obișnuit sunt prezente în organismul uman sănătos alcătuiesc „flora normală” sau „microbiota indigenă”. Legăturile care se formează între microbii din flora normală și organismul gazdă sunt: fie de mutualism (ambii au beneficii) fie de comensalism (doar unul are beneficii de asociere, fără a-i provoca daune celuilalt). [6]

Datorită cantității mari de materie organică rezultată din degradarea alimentelor, colonul reprezintă în mod normal cea mai importantă zonă colonizată a organismului. Numărul de microbi care compun flora normală a colonului este de ordinul germeni / gram de materie fecală.

Flora normală a colonului este formata din:

95-99 % germeni anaerobi: Bifidobacterium bifidum, Bacteroides fragilis;

germeni facultativ anaerobi: Escherichia Coli, Enterococcus faecalis;

germeni tranzienți Klebsiella spp, Protus spp, Enterobacter spp. [1]

2. Rolul microbiotei indigene

Microbii noștri au un rol nutritiv, stimulează imunitatea și ne protejează de alți microbi. Rolul nutritiv al microbilor reiese din producerea de substanțe considerate vitamine (biotina, riboforina sau vitamina K) și din producerea de substanțe care cresc capacitatea de digestie a gazdei. Rolul imunostimulator prin producerea de anticorpi.[6]

Bacteriile din flora normală pătrund în medii sterile, ocazional, sistemul imun este stimulat și produce anticorpi care reacționează cu germenii patogeni împiedicând colonizarea și invazia acestora.

Rolul de apărare reiese din competiția pentru hrană a bacteriilor bune cu alte bacterii sosite ulterior. Deși bacteriile nou sosite ar putea trai în colon, nu ar avea destula sursa de hrană. [5]

Eubioza reprezintă starea de echilibru între microbii florei normale și organismul gazdă [6]. Atunci când starea aceasta de echilibru se rupe se instalează disbioza, urmată de colonizări anormale. Disbioza odată instalată poate fi datorată: modificărilor condițiilor locale (PH, nutrienți), modificărilor condițiilor generale ale gazdei sau a unor factori din mediul extern, întrebuințarea antibioticelor (în special a celor cu spectru larg poate conduce la inhibarea florei normale și selectarea unor tulpini rezistente). [6]

3. Structura bacteriilor

Componentele obligatorii sunt reprezentate de:

materialul nuclear: format dintr-o molecula de ADN, situat central

citoplasma: este formată din apă 80% în care sunt dizolvate proteine, lipide, acizi nucleici, ioni anorganici. Conține materialul nuclear și diverse structuri esențiale: mezozomi (invaginări ale membranei citoplasmice), ribozomi (determină aspectul granular și bazofilia citoplasmei) și incluziunile (rezervele nutritive ale bateriilor)

membrana citoplasmatică: este o membrana biologică groasă din compoziția ei făcând parte două lanțuri fosfolipidice și proteine

peretele celular: învelește membrana citoplasmatică, conține o componentă ce se numește peptidoglican care este asociată altor structuri diferite la bateriile gram pozitive față de cele gram negative. Peretele celular al bacteriilor gram pozitive este mai gros decât al celor gram negative. Acesta asigură forma bacteriilor. [8]

Structurile facultative sunt reprezentate de:

glicocalixul: rețea de fibre polizaharidice pe suprafața bacteriei

capsula: caracter de virulentă pentru că împiedică fagocitoza

cilii: prezenți pe suprafețele unor specii bacteriene cu rolul de a asigura locomoția, mobilitatea

pilii: sunt prezenți la numeroase specii de baterii gram negative, sunt apendici filamentați

sporii: sferici sau ovali se dezvoltă în interiorul sau la extremitatea corpului unor bacterii: Bacillus și Clostridium. Ei pot fi deformanți sau nedeformanți și au rol în conservarea fondului genetic și supraviețuirea speciei. [8]

4. Patogenitatea bacteriilor

Patogenitatea se referă la capacitatea unui microorganism de a induce o stare de boală într-un organism receptiv. [8]

Patogenitatea este rezultatul interacțiunii a doi factori: gradul de dotare al microorganismului cu factori de agresiune și eficienta mecanismelor de apărare antiinfecțioasă a gazdei. Patogenitatea unui microorganism este determinată de virulența și/sau toxigenitatea acesteia.

Virulența este capacitatea unor germeni de a pătrunde în gazdă, de a persista prin neutralizarea mecanismelor de apărare de a se înmulți, de a invada direct sau prin produsele elaborate organismul și produce leziuni în țesuturi.

Daca microbul întâlnește condiții prielnice de mediu se vorbește despre amplificarea virulenței (exacerbare) și anume: trecerea de la o gazdă la alta, transferul de material genetic și sinergism microbian. [8]

Daca microbul nu întâlnește condiții prielnice de mediu (provine din cultura veche, cultura este expusă la factori fizici) vorbim despre atenuarea virulenței. Se discută despre sinergism bacterian atunci când bacteriile cu echipament de patogenitate scăzut se asociază cu alte bacterii astfel putând produce infecții.

Echipamentul enzimatic divers al bacteriilor patogene fac posibilă invadarea țesuturilor. În cazul Clostridium aceste enzime (lecitinază) au efecte citotoxice. Producerea de leziuni tisulare se datorează efectului citotoxic dar într-o mică măsură, în mare măsură este rezultatul acțiunii diverselor toxine bacteriene, a fenomenelor de inflamație și a hipersensibilității. [8]

Toxigenitatea reprezintă capacitatea bacteriei de a elabora toxine [8]

Toxinele sunt componente sau produși de excreție ai bacteriilor cu o compoziție chimică diferită și anumite proprietăți biologice care permit excitarea unor efecte nocive asupra organismului uman. [8]

In funcție de modul în care au intrat în contact cu țesuturile umane toxinele pot fi:

Exotoxinele sunt produse de excreție a celulei bacteriene care sunt elaborate după o perioadă necesară sintetizării lor. Acestea sunt de natura proteică, fiind localizate la nivel citoplasmic, în special la bacteriile gram pozitive. Exotoxinele sunt termolabile și puternic imunogene; au toxicitatea crescută fiind cele mai puternice otrăvuri. Exotoxinele pot fi transformate în anatoxine prin tratare la cald cu formol. Anatoxinele sunt toxine microbiene atenuate, lipsite de toxicitate. De obicei germenii toxigeni rămân cantonați la poarta de intrare în timp ce exotoxinele difuzabile se răspândesc în tot organismul. [8]

Endotoxinele sunt componente ale celulei bacteriene localizate în peretele celular al bacteriilor gram negative, sunt termostabile și slab imunogene. Nu pot fi transformate în anatoxine. Pot fi eliberate prin bacterioliză fără a fi nevoie de o perioadă de latență. Sunt de natură lipopolizaharidică. Endotoxinele sunt implicate etiologic în șocul toxico-septic în peste 70% din cazuri. [8]

5. Apărarea antiinfecțioasă

Organismul uman posedă în mod fiziologic apărare antiinfecțioasă. Aceasta apărare se realizează prin barierele externe (tegumentul și mucoasele), factori interni umorali și răspuns imun. Tegumentul oferă protecție eficientă organismului în calea germenilor exogeni.

Mucoasele prezintă mecanisme generale de protecție anti-microbiană dar și mecanisme particulare. Mecanismele particulare specifice mucoasei digestive sunt datorate secrețiilor de la acest nivel: saliva, sucul pancreatic și gastric și bila. Aceste sucuri au și acțiune anti-microbiană și antitoxică.

De asemenea un rol important îl au procesele de masticație, deglutiție și peristaltismul intestinal aceste procese ajutând la eliminarea din organism a bacteriilor patogene. [8]

Factorii interni celulari sunt implicați în procesele de fagocitoză și pinocitoză.

Fagocitoza se realizează prin intermediul unor celule de origine mezenchimală numite fagocite care au capacitatea de a recunoaște, capta, încorpora și digera particulele sau macromoleculele care pătrund în organism. Principalele fagocite ce intervin în acest proces sunt: granulocite polimorfonucleare (neutrofile) și mononucleare (monocite sau macrofage).

Pinocitoza este un proces ce se desfășoară similar cu fagocitoza doar că se declanșează în cazul substanțelor macromoleculare solubile, procesul este discontinuu datorită necesității refacerii membranei celulare consumate [8].

Factori interni umorali sunt reprezentați de componente ale complementului și de unii mediatori ai inflamației.

Complementul este unitatea fundamentală alcătuită din 11 componente proteice cu origini diferite în epiteliul intestinal (, ), macrofag (, ), hepatocite () și celule spenice ( Complementul își exercită acțiunea doar după activare. Efectorii sunt anafilatoxinele, complexul de atac C566-9 (bactericid pe gram negativ) și factori chemotactici pentru fagocite. Calea de activare poate fi clasică prin complexe imune sau alternă inițiată de contactul cu componente bacteriene. [8]

Mediatorii inflamației sunt acei factori umorali care se concentrează în țesutul lezat după o agresiune exogenă (agent fizic, chimic sau biologic). Acești factori sunt efectorii complementului, sistemul kininelor plasmatice, prostaglandine și factori chemotactici microbieni. Din acțiunea acestor factori rezultă un sindrom inflamator caracterizat clinic prin:

rubor (roșeața) datorată vasodilatației

tumor (tumefiere) prin acumularea de plasmă și celule sanguine

calor (creșterea temperaturii locale) prin inițierea metabolismului celulelor sanguine

dolor (durere locală) determinată de inițierea terminațiilor nervoase. [8]

Răspunsul imun este caracterizat de o serie fenomene ce se succed după pătrunderea unui antigen în organism, finalizat prin eliberarea de anticorpi specifici și limfocite T specializate. Antigenele pătrund pe diferite căi: digestivă, respiratorie, cutanată, prin inoculare sau transplante se activează prima linie de apărare nespecifică (neutrofile și macrofage ce pot elimina, degrada antigenul sau îl pot prezenta limfocitelor. [8]

6. Infecția cu Clostridium difficile

6.1. Încadrarea toxonomică a speciei

Aceasta se face în ordinea descrescătoare mărimii unităților toxonomice și anume:

Ordinul: CLOSTRIDIALES;

Familia: CLOSTRIDIACEAE;

Genul: CLOSTRIDIUM;

Specia: DIFFICILE [6].

Denumirea speciei CLOSTRIDIUM difficile este formată din două cuvinte: primul scris cu majuscule este genul din care face parte bacteria și al doilea cuvânt scris cu litere mici denumește un caracter reprezentativ (difficile – dificil, greu de tratat). [6]

6.1.1 Principalele specii ale genului Clostridium

Principalele specii ale genului Clostridium produc următoarele boli:

Clostridium botulinum: produce prin toxina boala numită botulism care este o afecțiune neuromusculară (paralitică) [26]

Clostridium tetani: produce prin exotoxina elaborată boala numită tetanos și se manifestă prin afectare neurologică: tonus muscular crescut și spasme musculare generalizate. Se face prevenție prin vaccinare. [26]

Clostridium perfringens: produce gangrena gazoasă, enterita necrozantă, abcese pelvine, septicemii [28]

Clostridium difficile produce enterocolita pseudomembranoasă sau enterocolita postantibioterapie. [16]

6.2 Definiția enterocolitei cu Clostridium difficile

Definiție: ”Enterocolita determinată de Clostridium difficile este o boală infecțioasă acută, contagioasă, care este rezultatul modificării florei bacteriene a colonului, a colonizării cu Clostridium difficile și a eliberării toxinelor care generează inflamația și distrugerea mucoasei intestinale. [18]

6.3 Etiologie

6.3.1 Agentul Etiologic

În anul 1935 HALL și O”TOOLE au izolat din scaunul nou-născuților sănătoși o bacterie Gram pozitivă, anaerobă, producătoare de citotoxină pe care au numit-o BACILLUS difficilis deoarece cultivarea și izolarea ei s-a efectuat cu dificultate. [8]

În momentul de față se produce fenomenul invers, societatea având dificultăți în limitarea dezvoltării și răspândirii acestei bacterii.

Primul caz de colită pseudomembranoasă a fost descris și raportat de către J.M Finney și William Osler în anul 1893. Era vorba de o femeie de 22 de ani care a suferit o rezecție de tumoră gastrică și a prezentat în urma operației diaree. Pacienta a decedat a 15-a zi postoperatoriu, la autopsie intestinul prezenta membrane cu aspect difteric [20].

La începuturile erei antibioticelor (1950-1970) colita pseudomembranoasă a devenit o complicație frecventă a utilizării antibioticelor. Pe atunci Staphylococcus aureus a fost considerat principalul agent cauzator al acestei boli, datorită identificării prin colorația Gram. Drept urmare a fost folosit ca și tratament standard Vancomicina. Tratamentul funcționa, drept urmare agentul etiologic nu s-a pus sub semnul întrebării până la sfârșitul anului 1970. [20]

În anul 1978 ca agent etiologic al enterocolitei pseudomembranoase a fost incriminat Clostridium difficile. [14]

Clostridium difficile este un bacil Gram pozitiv, anaerob, mobil, care formează spori rezistenți la căldură și care rezistă în mediul înconjurător luni și chiar ani de zile. [18]

6.3.2 Habitatul

Bacteriile anaerobe din genul Clostridium sunt larg răspândite în natură fiind prezente în intestinul animalelor, al omului și prin intermediul materiilor fecale eliminate care ajung pe sol.

Toate speciile formează endospori, datorită acestor spori bacteriile supraviețuiesc timp îndelungat în sol (dimpotrivă, unele specii chiar se înmulțesc). Sporii dețin o rezistență nativă la acțiunea agenților fizici și chimici. [9,14]

Exemplu:

Timpul de supraviețuire la fierbere: 5 minute;

105 grade Celsius căldură umedă: 30 minute;

Glutaraldehidă: 2-3 ore;

Formaldehidă: 4-5 zile;

Mediul extern, feriți de razele solare și umezeală (luni, ani). [9,14]

6.4 Epidemiologie

6.4.1 Frecvența

În SUA incidența infecțiilor Clostridium difficile era în anii 1990 la 39-40 de cazuri la 100.000 de persoane, în 2001 a crescut la 50, în 2005 84 de cazuri la 100.000 de persoane cunoscând o evoluție crescândă. În prezent în SUA sunt înregistrate 3.000.000 de cazuri de diaree și colită Clostridium difficile, producând decesul a peste 14.000 de americani anual. [18]

În Romania primele cazuri de infecție Clostridium difficile au fost înregistrate și raportate în Ianuarie 2011 simultan cu apariția testelor de determinare a toxinelor A,B.

În anul 2011 se raportau 2 cazuri pe lună, în 2013 s-a ajuns la 60-70 de cazuri pe lună și în 2014 s-a ajuns la 100 de cazuri pe lună. În anul 2013 au fost înregistrate 1237 de cazuri.

Studii recente atestă faptul că ribotipul 027 este preponderent implicat în infecțiile Clostridium difficile din Romania cu 63,7 %.

Cazuri determinate de ribotipul 027 au fost înregistrate începând cu anul 2000 (în Canada și SUA) extinzându-se an de an, în prezent fiind semnalată în 18 țări europene. [21]

Elementele de alarmă sunt creșterea gravității și fatalității infecției și exacerbarea virulenței tulpinilor de Clostridium difficile simultan cu creșterea vulnerabilității gazdei. [18]

6.4.2 Sursa de infecție

Rezervorul de infecție:

mamifere: bovine, cabaline, porci, rozătoare, câini, pisici și oameni;

Până în 50% din nou născuți au Clostridium difficile în scaun la câteva zile după naștere, apoi procentul scade progresiv;

Copii sub trei ani nu fac infecție Clostridium difficile;

5-7% din adulții sănătoși prezintă bacteria intestinal;

La pacienții spitalizați perioade lungi partajul trece de 50%.

Sursa de infecție o reprezintă omul bolnav cu Clostridium difficile care elimină cantități mari de clostridii prin scaunul diareic, care în contact cu aerul se transformă în spori. [21]

Tulpinile din ribotipul 027 sunt mai sporogene, iar eliminarea sporilor durează mai mult timp, de aici și tendința de recidive. Sporii se găsesc în mediul înconjurător al bolnavului (pat, lenjerie de corp și pat, saltele, paturi, paviment, obiecte sanitare, etc.) și pot fi antrenați de aer la distanță . Purtătorii de Clostridium dififile au un rol fără importanță (cantitate foarte mică de spori eliminați) ca și sursa de infecție. [21]

6.4.3 Modul de transmitere

Calea de transmitere a infecției este fecal-orală.

Există mai multe căi de transmitere ale infecției:

transmiterea prin contact

transmiterea prin contact direct este cea mai frecventă, prin contact interuman cu bolnavul în special din cauza mâinilor murdare. Mâna poate fi contaminată direct prin autocontaminare

transmiterea prin contact indirect are loc atunci când între bolnavi și persoane receptive se interpun diferite obiecte îmbrăcăminte, instrumente, termometre etc)

transmiterea aerogenă se realizează prin sporii antrenați de masele de aer.

transmiterea prin intermediul apei și alimentelor are un rol presupus neclar.

Se consideră, în general, că infecțiile generate de Clostridium difficile sunt infecții nosocomiale sau iatrogene. Ultimele studii arată că aproximativ în 41% din cazuri este infecția este dobândită în comunitate fără expunere anterioară la antibiotic. [7,18,21]

6.4.4 Receptivitate

Receptivitatea este generală. Sunt afectate în special :

persoanele în vârstă de peste 65 de ani, frecvent peste 80 ani.

receptivitate crescută au persoanele cu factori de risc asociați (ex: spitalizare prelungită, antibioticoterapie, neoplazii, sarcină, tratamente cu inhibator de pompă de protoni, diete drastice, sau monotone).

personalul sanitar, aparținătorii bolnavului și alți bolnavi. [21]

6.4.5 Clasificare epidemiologică

Infecția Clostridium difficile se poate considera de origine:

nosocomială, debutul simptomelor încep la 48 de ore de la internare, pe parcursul internării și până la 28 de zile după externare .

comunitară, debutul simptomelor se produce la mai mult de 8 săptămâni de la externare.

Nedeterminabilă, debutul simptomelor la un interval de 4-8 săptămâni de la externare. [17]

6.5 Patogenie si factori de risc

Flora normală intestinală modelează proliferarea celulelor epiteliale și sistemul imun al tubului digestiv, astfel prevenind colonizarea și infectarea cu bacterii patogene. Distrugerea florei normale cauzată de terapia cu antibiotice produce dezechilibre și astfel pot duce la înmulțirea necontrolată a bacteriilor patogene. Antibioticele produc alterarea și suprimarea florei normale.

Tulpinile patogene de Clostridium difficile produc toxina A, toxina B și toxina binară. Ele sunt proteine cu greutate moleculară mare atașându-se de receptori specifici de pe celulele mucoasei intestinale. Intracelular toxinele modifică proteinele Rho, arhitectura citoscheletă și mișcarea celulară. Sugarii și copii mici sub 2 ani nu prezintă receptori pentru toxinele Clostridium difficile și drept urmare nu dezvoltă boala. [18]

Factori favorizanți ai infecției:

Persoane în vârstă, spitalizate îndelungat, cu operații chirurgicale laborioase în zona digestiva sau care provin din serviciile de terapie intensivă;

Pacienți cu boală inflamatore intestinală;

Utilizarea antibioticelor în ultimele trei luni (clindamicina, cefalosporine, fluorochinolone, amoxicilină, ampicilina, etc.) ;

Chimioterapia, imunodeficiențe;

Mediul spitalicesc, spitalizări prelungite;

Administrarea de inhibatori de pompă de protoni. [14] [18]

6.6 Tablou clinic si forme clinice

Pacientul prezintă:

scaune diareice apoase , uneori cu mucozități sau sânge

crampe abdominale

astenie

anorexie

grețuri

febră [16,18]

In formele severe scaunele sunt în număr mare, peste 10-20 pe zi, apar semne de deshidratare, insuficiență renală.

O serie de factori dictează severitatea formei clinice și pot fi grupați sub forma de scoruri de severitate:

Vârsta pacientului (mai mare de 65 de ani) ;

Temperatura (febra, frison) ;

Valoarea albuminei: sub 3.5 g/dl;

Valoarea hemoglobinei: sub 9 g/l;

Valoarea lactatului: peste 5 nmol/l;

Valoarea creatininei serice: peste 1.5 mg/dl;

Antibiotic sistemic administrat în paralel cu terapia infecție Clostridium;

Durata spitalizării;

Leucocitoză importantă;

Semne de soc;

Creșterea nivelului de procalcitonină, hemoculturi pozitive;

Megacolon (îngroșarea peretelui colonic, ascită) ;

Colita pseudomembranoasă (endoscopic) ;

Ileus [17] [18].

Infecția poate îmbrăca următoarele forme:

Colonizare de scurtă durată, la pacientul spitalizat;

diaree acută, formă medie sau severă, scaune apoase;

diaree severă asociată cu colita pseudomembranoasă, insuficiență renală, leucocitoză;

infecția recurentă, apare în interval de 60 de zile după tratamentul inițial. [18]

6.7 Complicații

Megacolonul toxic determinat de inflamarea și dilatarea periculoasă a colonului [19]

Colita fulminantă afectează întreg colonul provocând durere severa, diaree cantitativă, uneori cu deshidratare și șoc. Pune viața pacientului în pericol.

Perforația colonului dilatarea periculoasă a colonului (megacolonul toxic) poate avea ca rezultat perforarea colonului cu potențial letal. [19]

6.8 Profilaxia

Pentru ca focarul sa nu ia amplitudine, se declanșează luarea următoarelor măsuri:

Măsuri față de suspecți (evaluarea bolnavului, recoltarea de scaun pentru efectuarea toxinelor A,B și izolarea suspectului până la aflarea rezultatului);

Măsuri față de bolnavii contaminați (evaluarea bolnavului, izolarea lui într-un salon cu grup sanitar propriu. Izolarea se realizează încă 72 de ore după normalizarea scaunului, monitorizare zilnică, tratament etiologic); [17 ,21]

măsuri față de calea de transmitere (igiena strictă a mâinilor cu apă și săpun, folosirea mănușilor de unică folosință, se curăță suprafețele cu detergent apoi se dezinfectează cu soluție de hipoclorit de sodiu 10%, fișele bolnavilor nu se introduc în salon);

măsuri față de populația receptivă:

personalul medical își va declara starea de sănătate zilnic. Spitalul va asigura echipament de lucru de unică folosință, săpun, prosop de hârtie.

rudele bolnavului: se va limita contactul cu bolnavul, este interzis așezatul pe patul bolnavului, informarea asupra măsurilor de prevenire ale infecției. [17,21]

6.9 Diagnosticul de laborator în enterocolita Clostridium difficile

Diagnosticul pozitiv se stabilește prin însumarea de: criterii epidemiologice (pacient cu tratament antibiotic, spitalizat etc), elemente clinice (diaree apoasă, febra, etc.) și teste paraclinice (laborator și imagistică).

Investigațiile paraclinice de imagistică efectuate în scopul susținerii diagnosticului sunt:

CT de abdomen care evidențiază semne de colită pseudomembranoasă, megacolonul și edemul mucoasei intestinale

Endoscopia digestivă inferioară descrie zone denivelate, alb-gălbui, aderente, răspândite pe mucoasa colo-rectală inflamată.

6.9.1 Teste de laborator nespecifice

Testele de laborator nespecifice efectuate în vederea evaluării gradului de severitate al bolii sunt următoarele:

Hemoleucograma completă;

Uree și creatinină serică;

Electroliții;

Proteinele totale, serice;

Electroforeza: albumina serică;

VSH, fibrinogen și proteina C reactivă;

Valoarea lactatului. [16]

Proteinele serice acest test determină suma proteinelor serice circulante putând fi influențat atât de condiții fiziologice (alimentație, sarcină) cât și de condiții patologice (deshidratare, hemoconcentrație datorită pierderii de lichide, infecții și/sau inflamații).

Serul și plasma diferă în ceea ce privește tipul și concentrația de proteine. Serul nu conține fibrinogen și majoritatea factorilor coagulării. [10,35,38]

VSH reprezintă rata la care sedimentează hematiile dintr-o probă de sânge anticoagulat într-un interval de o oră. Cu cât hematiile sedimentează mai repede cu atât VSH_ul este mai mare.

Viteza de sedimentare a hematiilor este un test screening utilizat în suspiciunea de: infecții, reacții inflamatorii, boli autoimune etc. [10,35]

Fibrinogenul este o glicoproteină dimerică prezentă în plasmă, reprezentând factorul numărul 1 din cascada coagulării. Este sintetizat în ficat și aparține grupului proteinelor de fază acută.

Creșterea fibrinogenului în cadrul răspunsului de fază acută se întâlnește în următoarele afecțiuni: infecții, inflamații, arsuri, traumatisme, etc. [10,36]

Proteina C reactivă (PCR) este o proteină neglicolizată, fiind un reactant de fază acută nespecific care crește ca răspuns al inflamației și al lezării tisulare. Este un indicator mai sensibil decât VSH. [10,37]

Hemoleucograma este o analiză folosită uzual în laborator fiind un test screening de bază ce permite diagnosticul diverselor boli hematologice și nehematologice (infecții, inflamații, etc.).

Hemoleucograma este o analiză complexă ce ne oferă informații legate de numărul de leucocite și formula leucocitară, numărul de enterocite, hemoglobină, hematocritul și indicii eritrocitari, numărul de trombocite și indicii trombocitari.

Numărul de leucocite și formula leucocitară sunt în special urmărite în hemoleucogramă în cazul suspicionării unei infecții. Într-o infecție acută tipică vom avea leucocitoză sau neutrofilie.

Neutrofilia reprezintă creșterea numărului de neutrofile peste valoarea normală. Neutrofilele sunt cel mai numeros tip de leucocite jucând un rol major în apărarea antiinfecțioasă primară a organismului prin fagocitarea și digestia microorganismelor [10,13]

Ureea serică reprezintă principalul produs azotat final al metabolismului aminoacizilor, proveniți din scindarea în stomac și intestin a proteinelor sub acțiunea fermenților proteolitici și absorbția acestora prin peretele intestinal. Nivelul persistent crescut al ureei serice indică o alterare a ratei de filtrare glomerurale. [10,33]

Creatinină serică este antihidridă creatinei fiind forma sa de eliminare, formându-se în țesutul muscular. Creatina este cel mai fix constituent azotat din sânge. O perturbare a funcției renale reduce excreția de creatinină având ca rezultat creșterea creatininei serice.

Evaluarea funcției renale prin determinarea creatininei este mai specifică și sensibilă decât determinarea ureei. [10,34]

Potasiul lichidul intracelular are ca și cation principal potasiul, acesta fiind constituent al sistemului tampon. Ca și repartiție potasiul este concentrat în proporție de 90% în interiorul celulei; celulele lezate eliberează în sânge potasiul.

Potasiul are următoarele roluri: este indispensabil în desfășurarea fenomenelor electrice de la nivel membranar, conducerea nervoasă, echilibrul acido-bazic, contracție musculară, anabolism proteic [10,40]

Lactatul este un produs al metabolismului anaerobic al glucozei. Acest test se efectuează pentru: evaluarea unei acidoze și stabilirea gradului de oxigenare tisulară. Atunci când nivelul de acid lactic crește în sânge rezultă acidoză lactică.

Pacienții care prezintă acidoză lactică metabolică și PH sub 7,35 sunt cu un risc semnificativ de a dezvolta insuficiență multiplă de organ.

Acidoza lactică poate fi consecința următoarelor boli: diabet zaharat, infecții, neoplasme, insuficiență renală, etc. [39]

Sodiul este prezent în toate umorile organismului fiind cationul principal în sectorul extracelular. Rolul principal al sodiului în organism este de a determina deplasările de apă. Volumul lichidului din sectorul extracelular, este dependent de cantitatea totală de sodiu din organism.

Sodiul seric este recomandat a se efectua pentru evaluarea echilibrului hidro-electrolitic și acido-bazic în următoarele situații: sindroame diareice severe, deshidratare, insuficiență renală, etc.[10,40]

Albumina serică este o proteină non-glicozilată și reprezintă cel mai important component proteic din plasmă. Este considerată ca fiind reactant de fază acută (procesele infecțioase și inflamatorii acute au ca răspuns scăderea albuminei).

Albumina este un indicator al stării de nutriție al organismului. Se recomandă a se efectua în evaluarea nutrițională, afecțiuni renale, infecții, enteropatii cu pierdere de proteine, etc. [10]

6.9.2 Teste de laborator specifice

Teste specifice de laborator pentru diagnosticare:

EIA teste imunoenzimale din materii fecale pentru detectarea toxinei A și B (rapide). Acestea au sensibilitate de 70-80% și specificitate de 98%;

Determinare prin PCR (biologie moleculară) este o metodă care implică costuri ridicate. Se efectuează pentru determinarea genei toxinelor A și B având o specificate de 97% și o sensibilitate de 86%;

Cultivarea pe medii de cultură a materiilor fecale – are o sensibilitate de 90-100% și o specificitate de 85-100%. Izolarea bacteriologică necesită timp, personal cu experiență și nu precizează dacă toxina produce sau nu toxinele A,B;

Teste de citotoxicitate (efectul citopatic este neutralizat de administrarea antiserului specific). Sunt considerate testele ‚gold-standard’ de diagnostic având sensibilitate de 70-100% și o specificitate de 90-100%;

Detectarea glutamat dehidrogenazei (pune în evidență enzima produsă de Clostridium difficile). Are sensibilitate de 85-100% și specificitate 87-98%. [16,18,22,23,24]

Testul de citotoxicitate este considerat mai sensibil decât cel enzimatic; identificarea prin cultura de Clostridium difficile poate dura aproape o săptămână fiind o întârziere pentru diagnostic, de aceea testele EIA rapide de screening sunt foarte eficiente. [25]

6.9.2.1 Examenul macroscopic

Suspiciunea de infecție cu bacterie anaerobă este sugerată de:

Aspectul și consistența scaunului (materii fecale lichide, apoase) ;

Mirosul putrid (determinat de anaerobi) datorat produșilor finali de metabolism;

Prezența de puroi, mucus și sânge în scaun. [2]

6.9.2.2 Examenul microscopic al materiilor fecale

Tehnicile de laborator folosite pentru obținerea unui diagnostic prezumtiv în diareea infecțioasă sunt: frotiul direct colorat Gram și coprocitograma.

Coprocitograma presupune efectuarea unui frotiu din materiile fecale proaspete colorat cu albastru din metilen. Aceasta tehnică indică prezența calitativă și cantitativă a eritrocitelor și leucocitelor vizualizate la microscopul optic. [2,10]

Frotiul colorat Gram din produse patologice (frotiu direct) este frecvent folosit în bacteriologie.

În cazul bolilor diareice se efectuează frotiu din materii fecale proaspăt emise care se colorează Gram; la microscopul optic se pot observa următoarele caractere morfologice: [2]

Dimensiune: 0,5-0,9 µm / 3-16,9 µm;

Forma: bacili groși, de lungimi variate, cu capete rotunjite sau tăiate drept;

Modul de grupare: izolați;

Sporii: prezintă spori ovulari sub-terminali, deformanți. Sporii apar în colorația Gram incolori, refringenți în interiorul corpului bacterian;

Capsula: necapsulați;

Tinctorialitate: gram pozitivi (violet) ;

Localizare: extracelulari;

Mobilitate: mobile cu flageli peritrichi;

Bacterii anaerobe, folosesc procesul de fermentație pentru obținerea energiei necesare [2,10]

6.9.2.3 Examenul bacteriologic

Diagnosticul de laborator al colitei Clostridium difficile se poate obține prin cultivarea materiilor fecale pe medii de cultură (diagnostic bacteriologic) și prin determinarea a toxinelor A, B (diagnostic imunologic).

În următoarea schemă se prezintă metodologia de izolare a clostridiilor în cadrul compartimentului de microbiologie ce presupune după prelevarea materiilor fecale pentru coprocultură însămânțarea pe medii acelulare specifice, izolare si identificare prin tehnici ce au fost dezvoltate în partea specială.

Figura 1 – Metodologia de izolare a clostridiilor din materii fecale [2]

În tabelul următor sunt prezentate mediile de cultură folosite pentru izolarea clostridiilor, componentele specifice conținute de acestea (nutritive/selective) și aspectul caracteristic al coloniilor ce au crescut pe medii după însămânțare și incubare la termostat :

Tabelul 1. Medii de cultură și creștere specifică a clostridiilor [2]

6.9.2.4 Modalitățile de identificare ale toxinelor

Clostridium difficile produce doua toxine:

Toxina A, cu proprietăți de enterotoxină, determină creșterea secreției de fluide și inflamația de la nivelul mucoasei intestinale;

Toxina B, citotoxică pe celule embrionare umane. Această toxină prezintă în vitro o acțiune citotoxică de aproximativ 1000 de ori mai puternică decât a toxinei A, acționând împreună sinergic.

Aproape toate tulpinile de Clostridium difficile produc toxina dar s-a demonstrat că unele tulpini pot secreta doar toxina B. [10]

Identificarea toxinelor se poate efectua prin următoarele tehnici: pe culturi de celule, teste imunoenzimatice și biologie moleculară (real-time-PCR).

Identificarea pe culturi de celulă

Materiile fecale lichide se centrifughează 30 de minute la 3000 de rotații pe minut, se decantează supernatantul care se reține. Sedimentul se omogenizează cu un volum egal de tampon fosfat salin, peste noapte se lasă la frigider iar a doua zi se centrifughează din nou 30 de minute la 3000 de rotații pe minut. Se decantează supernatantul care se reține;

In condiții de sterilitate supernatantul se filtrează prin membrane cu pori de 0,45 µm;

Culturile de celule WI-38, vero se incubează cu supernatantul filtrat; se folosește de preferință WI-38 (fibroblaste de plămân uman) ;

Efectul citopatic apare la 18-24 de ore de la incubare;

Un tub martor de celule pe care se inoculează amestec de filtrat și ser antitoxic – Clostridium difficile. Se urmărește apoi efectul toxic;

Rezultatul pozitiv: în tubul cu filtrat de materii fecale efectul citopatic, iar în tubul neutralizat cu ser antitoxic efect citopatic inhibat. [2]

Tabelul 2. Caracterele specifice toxinelor A/B [2]

Identificarea toxinelor prin teste imunoenzimatice

Testele imunoenzimatice au apărut recent în laboratoare, dar datorită simplității de aplicare și sensibilității lor mari prezintă o dezvoltare rapidă. Tehnicile sandwich sunt folosite preferențial pentru evidențierea antigenelor din diverse probe și se realizează prin căptușirea godeurilor cu imunoglobulina cunoscută.[41]

Sistemul biotina-avidina (streptavidina) se utilizează frecvent pentru amplificarea interacției antigen-anticorp ,datorită puternicei afinități existente între cele 2 componente. Reacția finală este de culoare și se datorează acțiunii specifice a enzimei asupra unui substrat.[41]

Identificarea prin PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) sau amplificarea moleculară este larg folosită în stabilirea diagnosticului bolilor infecțioase. Aceasta tehnică realizează amplificarea acizilor nucleici țintă într-un timp scurt. La început PCR-ul s-a folosit pentru agenții patogeni ce nu puteau fi cultivați în vitro sau pentru cei cu creștere lentă. Un avantaj important este acela că pentru amplificarea moleculară sunt necesare cantități mici de probă. Enzima folosită DNA-polimerază este termostabilă (rezistă la temperaturi de până la 95 grade C).

Tehnica PCR necesită 3 etape de desfășurare: denaturare, hibridare si renaturare. Cele 3 etape reprezintă un ciclu, în urma căruia rezultă produșii de reacție ce vor fi folosiți ca și matrița pentru următorul ciclu (se pot efectua 25-30 de cicluri ).

Denaturarea termică a dublului helix DNA din probă de analizat se face prin încălzirea la 95 grade C a soluțiilor apoase în prezența a 2 oligonucleotide si a 4 deoxiribonucleotide.    Răcirea amestecului de reacție la temperaturi de 37 – 60 grade C, permite realizarea cu mai multă ușurință a interacțiilor dintre cele 2 oligonucleotide  și monocatenele DNA (rezultate în urma denaturării).

Creșterea temperaturii mediului de reacție la 72 grade C și adăugarea de DNA-polymerase ce catalizează extinderea primerilor în prezența celor 4 tipuri de deoxiribonucleotide.

După cele 25-30 de cicluri matrița inițială este amplificată de ori. [41]

I.PARTEA SPECIALĂ

1. Introducere

În urmă cu 4 ani (anul 2012) la Spitalul de Boli Infecțioase Brașov un nou test era inclus în lista analizelor efectuate curent. Era vorba despre un test diagnostic ce putea detecta prezența toxinelor A și B produse de Clostridium difficile. De la început am realizat importanța testului și ceea ce declanșează din punct de vedere medical un rezultat pozitiv.

Enterocolita Clostridium difficile este o problemă de actualitate cu care sistemul medical se confruntă, o problemă de sănătate publică. Este o infecție frecvent întâlnită în ultima perioadă fiind considerată uneori infecție nosocomială.

Un test pozitiv determină:

Declararea cazului la Direcția de Sănătate Publică;

Internare și tratament în spital;

Analize de laborator;

Măsuri epidemiologice (izolarea bolnavului în saloane speciale, folosirea echipamentelor de unică folosință, igienizare strictă).

2. Scopul și obiectivele

Scopul lucrării este de a stabili tipul analizelor de laborator ce se modifică în cadrul ECD, al modului și intensității în care aceste analize se modifică (creșteri/scăderi ale valorilor) în funcție de starea de reactivitate/imunitate a pacientului în contextul bolii aflate în evoluție.

Obiectivele acestei lucrări au fost reprezentate de:

Studierea și prezentarea documentată a tehnicilor de laborator: coprocultura și determinarea toxinelor A și B utilizate în diagnosticul etiologic (enterocolita cu Clostridium difficile) al unei boli diareice acute.

Evaluarea modificărilor unor parametrii de laborator în cazul evoluției enterocolitei cu Clostridium difficile (ECD).

3.Material si metodă

Lucrarea ‚Modificări de Laborator la Pacienții cu Enterocolită Clostridium Difficile’ este un studiu efectuat retrospectiv de tip observațional pe un număr de 145 de pacienți internați în spitalul clinic de boli infecțioase Brașov în perioada Ianuarie 2014 – Decembrie 2015.

Criteriul de selecție al pacienților în studiu a fost rezultatul pozitiv al testului diagnostic: Rida Quick Clostridium difficile, Toxina A/B, metoda imuno-cromatografică. Perioada în care am analizat lotul de pacienți a fost de doua luni (Aprilie – Mai 2016) iar ca și unelte de cercetare am folosit arhiva medicală a spitalului clinic de boli infecțioase Brașov.

Au fost analizate modificările următorilor parametrii de laborator:

Numărul de leucocite și formula leucocitară

Viteza de sedimentare a hematiilor

Proteina C Reactivă

Fibrinogenul

Ureea și creatinina serică

Proteinele serice

Electroliții serici: sodiu, potasiu, calciu ionic.

Am analizat și unele aspecte epidemiologice ale cazurilor de ECD:

Vârsta pacienților

Genul pacienților

Mediul de proveniență al pacienților

Durata de spitalizare

Pentru obținerea unui diagnostic etiologic prompt se vor folosi următoarele metode: metoda determinării toxinelor A/B, coprocultura (identificare și izolare), metoda colorației Gram.

3.1 Metoda determinării toxinelor A/B

Testul diagnostic folosit în cadrul laboratorului se numeste RIDA Quick CLOSTRIDIUM difficile, toxina A/B. Este un test rapid care detecteaza toxinele A/B produse de Clostridium difficile printr-o tehnica imunocromatografica oferindu-ne un rezultat de tip calitativ (pozitiv sau negativ).

Principiu

Caseta conține streptavidina imobilizată în banda testului și anticorpi anti-imunoglobulina de capra în banda controlului. Anticorpii specifici se vor lega de antigenul din probă și vor forma complex de antigen-anticorp de tip ‚sandwich’. Complexele migrează prin capilaritate, ajung în zona care conține banda testului, se leagă de streptavidina prezenta la nivelul fazei solide și pot fi vizualizate sub forma unei benzi colorate în roșu în fereastra rezultatelor (rezultat pozitiv).

Recoltarea probei

Se recoltează într-un coprorecoltor materii fecale proaspăt emise și se transportă într-un timp cât mai scurt la laborator.

Stabilitatea probei

Proba se lucrează în maxim 3 ore de la recoltare; dac acest lucru nu este posibil proba poate fi păstrată, păstrându-si stabilitatea timp de 3 zile la frigider (2-8 grade Celsius).

Materiale necesare

Pipete și vârfuri specifice, tuburi Eppendorf, stativ, ceas de laborator, reactivi, caseta test, mănuși și recipient pentru deșeurile medicale.

Figura 2. Reactivii A și B

Figura 3. Materialele necesare efectuării testului

Metoda de lucru

Se aduc reactivii la temperatura camerei (20-25 de grade Celsius);

Într-un tub Eppendorf se pun 12-14 picături de reactiv A;

Se pun apoi 12-14 picături reactiv B;

Cu ajutorul unei pipete se adăugă 50 µl de probă;

Se mixează și se lasă tubul intr-un stativ timp de 5 minute sa sedimenteze;

După 5 minute cu ajutorul pipetei se pipetează 150 µl din supernatant în caseta test;

Rezultatul se citește după 15 minute.

Figura 4. Modul de lucru

Interpretare

Interpretarea rezultatelor se face după cum urmează:

Testul este considerat valid (negativ) daca întotdeauna se obține o bandă colorată în roșu în fereastra controlului.

Figura 5. Casetă cu test negativ

Testul este considerat invalid daca nu apare liniuță roșie în fereastra controlului. în acest caz se repeta efectuarea testului.

Figura 6. Casetă cu test invalid

Testul este considerat pozitiv dacă în fereastra testului avem o liniuță în dreptul controlului și o liniuță în dreptul probei testate. În funcție de pragul de sensibilitate al testului, un rezultat negativ nu exclude o afecțiune asociată Clostridium difficile.

Figura 7. Casetă cu test pozitiv

Surse de eroare

Recoltare, etichetare, transport sau păstrare improprie a probei;

Nivel scăzut de toxina A/B, sub limita de detecție a testului;

Degradarea toxinelor;

Erori legate de personalul medical care efectuează testul.

3.2 Coprocultura ( izolare si identificare bacteriologica )

O etapă esențială pentru clarificarea diagnosticului etiologic al unei infecții este reprezentată de cultivarea produsului patologic (materiile fecale) prin însămânțare pe medii de cultură acelulare.

Recoltarea probei

Trebuie făcută la debutul bolii, înaintea începerii tratamentului antibiotic. Se folosește un coprorecoltor prevăzut cu lopățică, cu ajutorul acesteia prelevăm scaun vizând porțiunile lichide, sangvinolente sau mucoase. Se recoltează aproximativ 5 ml de scaun lichid.

Pentru coprocultura, coprorecoltorul conține mediul de transport: CARY-BLAIR ce asigură viabilitatea bacteriilor.

Transportul și stabilitatea probei

Transportul și prelucrarea probei se face cât mai rapid posibil, în aproximativ 1 ora dacă proba este recoltată în recipient fără mediu mergând spre 24 de ore la temperatura camerei dacă proba este recoltată în recipient cu mediu de transport.

Materiale necesare

Proba de testat, bec Bunsen, ansă, medii de cultură acelulare specifice, termostat, exicator pentru anaerobioza, marker, mănuși de unică folosință.

Izolarea bacteriei din produs patologic

Intr-un coprorecoltor se recoltează materii fecale proaspăt emise, recoltate cu lopățica specială, aduse în laborator într-un timp cât mai scurt. Aceasta etapă de izolare constă în însămânțarea materiilor fecale pe medii de cultura specifice și obținerea de cultură pură pentru etapa următoare de identificare. Izolarea bateriilor anaerobe se poate efectua cu sau fără îmbogățire [2]

Izolarea anaerobilor cu îmbogățire

Îmbogățirea anaerobilor sporulați se bazează pe un proces de ‚selecție a sporilor’ din materii fecale și anume de cultivare a prelevatului după debarasarea sa de formele vegetative aerobe și anaerobe.

Pentru ‚selecția sporilor’ se folosesc și sunt descrise doua tehnici:

Tehnica tratamentului termic

Bulionul CTGA (bulion carne tocată glucoză-amidon) fiind mediu de îmbogățire este preîncălzit la temperatura de 80 de grade Celsius în baie de apă timp de 5 minute. Se adaugă un mililitru suspensie de materii fecale și se continuă încălzirea încă 10 minute. Se răcește brusc și din acel tub se re-inoculează în proporție de 1/10 un lat tub de bulion CTGA; se fac dispersii pe cele doua medii de izolare. Se incubează anaerob proba 24 de ore la 37 de grade Celsius și apoi se procedează la studiul caracteristicilor de cultivare a Clostridium difficile și Clostridium perfringens. [2]

Tehnica tratării cu alcool

Din suspensia de fecale 1/10 în soluție salină izotonă se pipetează 1 ml care se amestecă cu 1 ml alcool etilic absolut, apoi amestecul se supune unei agitări continue la temperatura camerei timp de o ora.

Din proba prelucrată se fac însămânțări:

Un tub cu bulion CTGA se incubează 24 de ore la 37 de grade Celsius, din acesta se fac apoi dispersii pe agar-sânge și mediu cu gălbenuș de ou în vederea izolării după o incubare anaerobă 24-48 ore la 37 de grade Celsius.

O placă de mediu Nagler care de asemenea se incubează 24-48 de ore la 37 de grade Celsius, anaerob. [2]

Izolarea anaerobilor fără îmbogățire

Din suspensia 1/10 în soluție salină izotonă se efectuează dispersii pe 2 medii selective:

Agar feniletilalcool (PEA) îmbogățit de preferință cu 5% sânge defibrinat de berbec, acest mediu permițând creșterea clostridiilor și a altor bacterii gram pozitive anaerobe. [2]

Figura 8. Clostridium difficile – Creștere PEA îmbogățit cu sânge

Agar cu galbenus de ou, fructoză și antibiotice (cefoxitină și D ciclosterină), acest mediu prezintă selectivitate înaltă, inhibă creșterea tuturor clostridiilor și cocilor gram pozitivi, Clostridium difficile fiind singurul care nu este inhibat.

Ambele medii se incubează în condiții de anaerobioza 48 de ore la 37 de grade Celsius.

Atunci când informațiile clinice suspicionează Clostridium difficile este obligatoriu ca mediul cu ou sa conțină antibiotic (cefoxitină și D ciclosterină).

Figura 9. Evidențiere Clostridium difficile pe mediu agar utilizând metoda iradierii cu ultraviolete

Deoarece Clostridium difficile a fost izolat și la persoane sănătoase implicarea etiologică a acestuia necesită probarea calităților toxigene: enterotoxina și citotoxina.

Caractere de identificare biochimică

Izolarea Clostridium difficile poate fi făcută pe agar – bază selectiv (D-cicloserină și cefoxitina).

Cultura pura obținută pentru identificare se verifică în felul următor: se repică colonii (prin decuparea gelozei din jurul coloniei) în bulion VF-regenerat, se incubează 24 de ore la 37 de grade Celsius. Se controlează tuburile cu creștere evidenta prin efectuarea unui frotiu colorat Gram din cultura. Izolatele care au fost corect purificate au morfologie uniformă pe frotiul colorat Gram, sunt considerate strict anaerobe și pot fi testate biochimic.[2]

Teste preliminare

Determinarea prezentei sporilor

Microscopie, dacă pe frotiul gram din primocultură nu observăm spori se repică pe mediul Nagler și se incubează 48 de ore la 37 de grade Celsius și apoi la temperatura camerei se urmărește sporularea prin efectuarea de frotiuri Gram la 3-4 zile, se notează forma și poziția sporilor.

Testul termic, prezintă sensibilitate mai mare decât microscopia. Sporii supraviețuiesc după încălzire la 80 de grade Celsius timp de 10 minute în baie de apa. Daca după efectuarea frotiului Gram nu se observă spori vom inocula cultura într-un tub cu bulion peptona și extract de levura adiționat cu 1% glucoză și 1% amidon. Încălzim din nou la 80 de grade Celsius timp de 10 minute tubul și îl incubăm apoi la 37 de grade Celsius, dacă avem creștere de cultură atunci testul este pozitiv (sporii sunt prezenți).

Sensibilitatea la vancomicină vs colistin

Toate clostridiile sunt sensibile la vancomicină și rezistente la colistin.[2]

Producerea de lecitinază și lipaza

Cu ajutorul unei anse se repică din cultura pură în striu longitudinal pe mediu Nagler, se incubează anaerobi la 37 de grade Celsius timp de 48 de ore. Dacă apare precipitat opac în mediul din jurul coloniei aceasta produce lecitinaza, apoi se urmărește până la o săptămână pentru producerea de lipază (film perlat, iridescent pe creșterea bacteriană).[2]

Creșterea în lapte turmensolat

Prin intermediul testului urmărim: acidifierea, apariția și caracterele cheagului și bineînțeles digestia cheagului.[2]

Teste definitive

Bateria de teste minimale folosite pentru identificarea clostridiilor lecitinazo – negative este formată din: mobilitate, fermentarea zaharurilor, producerea de lipază, producerea de indol, hidroliza gelatinei și a esculinei, digestia cărnii. [2]

Tabelul 3. Bateria cu teste de identificare

3.3 Metoda colorației Gram

Materiale necesare: proba de testat, lamă de sticlă pe care se întinde frotiul, pipete sterile, flacoane cu soluție de violet de gențiana 1%, lugol, amestec de colorant alcool-acetona, fuxină bazică 1%, apa distilata, sursă de apă curentă, tăviță de colorare, suport de lame și mănuși de unica folosință.

Tehnica de colorare

Lama cu frotiul uscat se așează pe suportul metalic;

Cu ajutorul unei pipete sterile este acoperită cu soluție violet de gențiană (1-2 minute) ;

se varsă colorantul de pe lama în tăviță;

Frotiul se acoperă apoi cu soluție lugol (2-4 minute) ;

Se varsă mordantul de pe lama în tăviță;

Timp de câteva secunde se toarnă peste frotiu amestecul decolorant alcool –acetonă ținând lama ușor înclinată pana când lichidul ce se scurge devine incolor;

Se spală ușor cu apă de la robinet frotiul;

Se acoperă frotiul cu soluție fuxină bazică 1% timp de 1-2 minute;

Se spală cu apă de la robinet;

Se usucă în aer pe un suport de lame;

Se examinează la microscopul optic.[12]

Interpretare

In funcție de afinitatea pentru coloranții folosiți bacteriile se vor colora în violet (Gram pozitive) sau în roșu (Gram negative).

Figura 10. Clostridium difficile – Colorație Gram

4. Rezultate si discuții

Am analizat câteva aspecte epidemiologice ale cazurilor de ECD internate în spitalul clinic de boli infecțioase Brașov în perioada Ianuarie 2014 – Decembrie 2015.

Am constatat ca frecvența internărilor a crescut o dată cu vârsta pacienților.

Tabel 4. Distribuția numerică a internărilor pentru ECD în raport cu vârsta pacienților

Figura 11. Frecvența internărilor pentru ECD în funcție de vârsta pacienților

Pacienții internați cu ECD au avut vârste variate de la 40 de ani la peste 80 de ani.

Am analizat genul pacienților internați:

Tabelul 5. Distribuția numerică a internărilor pentru ECD în raport cu genul pacienților

Figura 12. Frecvența internărilor pentru ECD în raport cu genul pacienților

Internări pentru ECD am constatat atât la genul feminin cât și la cel masculin în proporții apropiate (53,10%și46,90 %).

Am analizat mediul de proveniență al pacienților internați pentru ECD.

Tabelul 6. Distribuția numerică a internărilor pentru ECD în raport cu mediul de proveniență al pacienților

Figura 13. Frecvența internărilor pentru ECD în funcție de mediul de proveniență al pacienților

Am constatat ca 71 % dintre pacienții internați pentru ECD au provenit în cea mai mare parte din mediul urban, doar 29 % provenind din mediul rural.

Durata de spitalizare la pacienții internați pentru ECD a variat de la câteva zile până le cel mult o lună de zile.

Tabelul 7. Distribuția internărilor pentru ECD în raport cu numărul de zile de spitalizare

Figura 14. Durata spitalizării pentru ECD

Am constat că mai mult de jumătate dintre pacienți (56,55 %) au necesitat internare pe o perioadă de 2-3 săptămâni. O proporție importantă de cazuri – 14,48 % au necesitat îngrijiri medicale peste 3 săptămâni.

Am analizat evoluția bolii la pacienții cu ECD.

Tabelul 8. Distribuția internărilor pentru ECD în raport cu evoluția și starea la externare

Figura 15. Starea la externare a pacienților internați pentru ECD

Evoluția pacienților internați pentru ECD a fost favorabilă în 86,90 % din cazuri; o proporție de 8,28 % dintre pacienți au avut recidivă a bolii, iar la 4,83 % dintre cazuri evoluția a fost nefavorabilă.

Am analizat modificările numărului de leucocite la pacienții cu ECD.

Tabelul 9. Modificările numărului de leucocite la pacienții cu ECD

Figura 16. Numărul de leucocite la pacienții cu ECD

Am constat ca aproape două treimi dintre pacienți au prezentat leucocitoză (63,45 % din cazuri), restul au avut număr normal de leucocite (36,55 % din cazuri).

Am analizat gradul de modificare al leucocitozei la pacienții cu ECD

Tabelul 10. Leucocitoza la pacienții cu ECD

Figura 17. Intensitatea leucocitozei la pacienții cu ECD

În ceea ce privește intensitatea leucocitozei, aceasta a variat de la ușoară (11000-15000 / mm3) la 41,30 % din bolnavi, la medie (15000-20000 / mm3) la 28,26 % din cazuri și marcante (peste 20000 pe mm3) la 30,44 % din cazuri.

În cadrul formulei leucocitare am analizat modificările numărului de neutrofile:

Tabelul 11. Modificările numărului de neutrofile la pacienții cu ECD

Figura 18. Numărul de neutrofile la pacienții cu ECD

Se observă că 70,55 % din pacienții cu ECG au prezentat neutrofilie, 27,40 număr mare de leucocite și o proporție foarte redusă, 2,05 % din cazuri, neutropenie.

Am analizat gradul de modificare al VSH la pacienții cu ECD

Tabelul 12. Modificările VSH la pacienții cu ECD

Figura 19. Valorile VSH la pacienții cu ECD

In cele mai multe cazuri 80,90% VSH-ul a prezentat valori crescute.

Am analizat intensitatea modificărilor VSH în cadrul ECD

Figura 13. Intensitatea creșterii valorilor VSH la pacienții cu ECD

Figura 20. Intervalele de creștere a valorilor VSH la pacienții cu ECD

Creșterile au fost ușoare (11-30 mm pe ora) la 36,58 % dintre pacienți, medii (între 30și50 mm la ora) în 30,08 % din cazuri și marcate (peste 50 mm pe o ora) la 33,33 % dintre bolnavi.

În cadrul sindromului biologic inflamator am analizat variațiile valorilor proteinei C reactive׃

Tabelul 14. Modificările valorilor proteinei C Reactive la pacienții cu ECD

Figura 21. Proteina C Reactiva la pacienții cu ECD

Proteina C reactivă a fost crescută la 80,96 % dintre pacienții cu ECD.

Am analizat intensitatea modificărilor CRP în cadrul ECD

Tabelul 15. Intensitatea creșterii valorilor proteinei C Reactive la pacienții cu ECD

Figura 22. Intervale de creștere a valorilor proteinei C Reactive în ECD

Creșterile au fost ușoare (11-50 mg pe litru) la 29,9 % dintre pacienți, medii (între 50 și150 mg per litru) în 42,75 % din cazuri și marcate (peste 150 mg pe litru) la 27,35 % dintre bolnavi.

Modificările valorilor fibrinogenului sunt prezentate în următorul tabel׃

Tabelul 16. Modificările fibrinogenului la pacienții cu ECD

Figura 23. Fibrinogenul seric la pacienții cu ECD

Am constatat valori crescute la aproape 80 % dintre pacienți.

Am analizat intensitatea modificării valorilor fibrinogenului:

Tabelul 17. Intensitatea creșterii valorii fibrinogenului în ECD

Figura 24. Intervale de creștere a valorii fibrinogenului la pacienții cu ECD

Creșterea valorilor fibrinogenului a fost variată de la ușoară (între 451 și 610 mg %) în 58,26 % din cazuri, la medie (între 601și800 mg %) la 33,92 % pacienți și marcate ( peste 800 mg %) în doar 7,83 % din cazuri.

Am evaluat funcția renala la pacienții cu ECD prin analiza valorilor ureei și creatininei serice.

Tabelul 18. Ureea serica la pacienții cu ECD

Figura 25. Modificările valorilor ureei serice la pacienții cu ECD

Ureea serică a prezentat valori normale în 28,30 % cazuri și crescute la aproape trei sferturi dintre bolnavi.

Am analizat intensitatea modificării ureei in cadrul ECD:

Tabelul 19. Intensitatea creșterii valorii ureei serice la pacienții cu ECD

Figura 26. Intervale de creștere a valorii ureei serice la pacienții cu ECD

Creșterile valorilor ureei serice au fost ușoare (între 45și80 mg %) la 58% dintre bolnavi, medii (între 80si 120 mg %) în 22,37 % cazuri și marcate (peste 120 mg %) la aproape 20 % din pacienți.

Am analizat valorile creatininei serice:

Tabelul 20. Creatinina serica la pacienții cu ECD

Figura 27. Modificările creatininei serice la pacienții cu ECD

Creatinina serica a avut valori normale în 37,74 % din cazuri și crescute la aproape două treimi dintre pacienți.

Am analizat intensitatea modificării creatininei serice:

Tabelul 21. Intensitatea creșterii valorii creatininei serice la pacienții cu ECD

Figura 28. Intervale de creștere a valorii creatininei serice la pacienții cu ECD

Creșterile creatininei serice au fost ușoare (între 1,4 și 3 mg %) la 63,64 % bolnavi și medii (între 3și5 mg %) la un sfert dintre bolnavi. Retenție azotată marcata am constat la 12,13 % cazuri (peste 5 mg %).

Am evaluat proteinele serice la pacienții cu ECD.

Tabelul 22. Proteinele serice la pacienții cu ECD

Figura 29. Modificările proteinelor serice la pacienții cu ECD

Am constatat hipoproteinemie la 64,84 % din bolnavi.

Am analizat gradul de intensitate hipoproteinemiei serice:

Tabelul 23. Intensitatea hipoproteinemiei la pacienții cu ECD

Figura 30. Hipoproteinemia la pacienții cu ECD

Valorile proteinelor serice au fost ușor scăzute (până la 5,5 g pe dl) la 55,93 % dintre bolnavi, mediu scăzute (pana la 4,5 g pe dl) în 35,59 5 din cazuri și marcat scăzute (sub 4,5 g pe dl) în doar 8,47 % cazuri.

Am analizat în cadrul modificărilor electrolitice determinate de deshidratarea acută, valorile sodiului, potasiului și calciului ionic.

Tabelul 24. Modificările valorilor sodiului seric la pacienții cu ECD

Figura 31. Sodiul seric în cursul evoluției ECD

Sodiul seric a fost scăzut la 71,43 % dintre pacienții cu ECD.

Am urmărit intensitatea modificării sodiului seric:

Tabelul 25. Hiponatremia la pacienții cu ECD

Figura 32. Intensitatea hiponatremiei la pacienții cu ECD

Hiposodemia a fost preponderent ușoara – 80% cazuri dar și marcată (sub 130 mmol per litru) în 20% din cazuri.

Am evaluat modificările calciului ionic in ECD:

Tabelul 26. Modificările valorii calciului ionic la pacienții cu ECD

Figura 33. Calciul ionic în ECD

Calciul ionic a fost normal la 48,57 % dintre bolnavii cu ECD și scăzut în 51,43 % din cazuri.

:Am evaluat modificările potasiului in ECD:

Tabelul 27. Modificările valorilor potasiului seric la pacienții cu ECD

Figura 34. Potasiul seric la pacienții cu ECD

Potasiul seric a prezentat valori normale în 53,57 % din cazurile de ECD și valori scăzute la 27,14 % bolnavi. Am constatat și creșteri ale potasemiei la 14,29 % dintre pacienți.

Am evaluat buletinul de analize al unui pacient bolnav cu ECD in vârstă de 77 ani internat la Spitalul clinic de boli infecțioase Brașov:

Figura 35.a. Buletin de analize al unui pacient bolnav cu ECD

Figura 35.b. Buletin de analize al unui pacient bolnav cu ECD

Am constatat :

Testul rapid pentru toxinele A/B produse de Clostridium difficile este pozitiv;

Modificări ale hemoleucogramei : ușoară leucocitoză (14.100 / mm3) cu neutrofilie (12.570/mm3 neutrofile din leucocite), ușoară anemie (hemoglobina=11,2g/dl ,hematocrit =31.7% );

Modificări ale parametrilor biochimici: creșterea marcată a CRP (192 mg/l), retenția azotată exprimată prin creșterea marcată a ureei serice (239mg/dl) și creșterea moderată a creatininei serice (4,47 mg/dl), hipoproteinemie serică medie (proteine serice =4,9g/dl);

Modificări medii ale VSH (30 mm/1h) si fibrinogenului (660 mg/dl);

Modificări ale ionilor: hiponatremie marcată (Na = 108 mmol/l) și hipocalcemie (calciu ionic =0,95 mmol/l);

Modificări electroforetice marcate: hipoalbuminemie ( albumină = 29% din cantitatea de proteine serice).

Concluzii

Analiza unor date epidemiologice și a modificărilor unor parametrii de laborator la cazurile de enterocolită Clostridium difficile internate în spitalul clinic de boli infecțioase din Brașov în perioada Ianuarie 2014 – Decembrie 2015 a dus la stabilirea următoarelor concluzii:

Internări pentru ECD s-au constatat la toate vârstele, cel mai frecvent la persoane cu vârsta peste 60 de ani, provenind în special din mediul urban în proporții apropiate la ambele genuri

Durata de spitalizare a pacienților a variat, cele mai multe cazuri necesitând 2-3 săptămâni de internare.

Evoluția a fost favorabilă în marea majoritate a cazurilor, decesele au fost rare.

In cazul modificărilor unor parametrii de laborator sindromul biologic inflamator de tip bacterian a fost bine exprimat, majoritatea pacienților prezentând: leucocitoză, neutrofilie, valori crescute ale VSH, CRP și fibrinogenului, de intensitate cel mai frecvent ușoară și medie.

Retenția azotată exprimată prin creșterea valorii ureei și creatininei serice a fost constatată la trei sferturi dintre bolnavi, fapt ce impune monitorizarea riguroasă a funcției renale în cursul evoluției bolii.

O altă modificare constatată a fost hipoproteinemia, la două treimi dintre bolnavi de intensitate variată de la ușoară în majoritatea cazurilor la severă în pana la 10% din cazuri.

Dezechilibre electrolitice au fost constatate intr-o proporție importantă de cazuri reprezentate de: hiposodemie, hipopotasemie, și hipocalcemie, aceste modificări impun necesitatea monitorizării în dinamică a acestor parametrii.