SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE [311339]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL VETERINARE

LUCRARE DE DIPLOMĂ

CARACTERIZAREA MOLECULARĂ A [anonimizat],

Șef lucrări Dr. [anonimizat]: [anonimizat] 2018

REZUMATUL LUCRĂRII

Grâul este printre cele mai vechi și cele mai raspândite culturi de cereal din lume. [anonimizat], redusă în comparațive cu existența umană pe pamant.Este acceptată perioada cuprinsă intre 10.000-8.000 [anonimizat] o cultură alimentară (Wrigley, C. W. 2009).

Pe plan mondial grâul ocupă cea mai mare suprafață cultivată, 222 [anonimizat] o producție de 730 milioane de tone (Razi, 2016).De aceea s-[anonimizat], [anonimizat].Pentru a se putea creea aceste soiuri trebuie cunoscute bolile păgubitoare.

[anonimizat] a ciupercilor, [anonimizat] (Parikh, & Adesemoye 2018).[anonimizat].

[anonimizat] a micotoxinelor…??

Lucrarea de diplomă intitulată “Caracterizarea moleculară a [anonimizat]” este structurată pe două părți și cuprinde patru capitole.

[anonimizat].[anonimizat], structură anatomică și compoziția chimică a boabelor de grâu.[anonimizat]..Sunt menționate micotoxinele produse de speciile din genul Fusarium.

Partea a doua, este formată din capitolele 3, 4, 5 ce cuprind cercetările experimental. [anonimizat].La rezultate s-a ajus prin aplicarea tehnicii de izolare a ADN-ului și metoda de cromatografie în strat subțire (TLC).

Obiectivul lucrării de diplomă a fost izolarea și purificarea culturilor de Fusarium pentru a se realiza determinarea fusarilor toxicogeni prin metoda de cromatografie în strat subțire (TLC) și pentru izolarea de ADN fungic prin tehnica PCR.Experimentele au fost realizate în cadrul Facultății de Biotehnologii a USAMV-București.

INTRODUCERE

Fuzarioza spicelor de grâu este cea mai importantă boală a grâului (Triticum aestivum), găsindu-se în multe regiuni ale lumii.

În urma studiilor cei mai răspândiți agenți patogeni s-a demonstrat a fi Fusarium graminearum și Fusarium culmorum. Importanța speciilor de Fusarium nu este legată numai de bolile produse plantelor infectate ci și de micotoxinele sintetizate și acumularea acestora în materialul vegetal infectat. Micotoxinele tricotecene sunt compuși metabolici produși de speciile de Fusarium. Cele mai semnificative tricotecene sunt: toxina T-2, toxina HT-2, deoxinivalenol (DON), în principal sintetizate de Fusarium graminearum și Fusarium culmorum (Grosu & Cornea, 2014).

CAPITOLUL I

GRÂUL

Scurt istoric

Grâu, termen generic care desemnează mai multe cereal, spontane sau cultivate, ce aparțin genului Triticum, clasa Monocotyledonopsida, ordinal Graminalis, familia Graminae. După porumb grâul reprezintă a doua cultură mondială ca mărime, iar împreună cu derivatii săi face parte din alimentația curentă în Europa Occidentală și Orientil Mijlociu (Dumbravă, 2004).

Grâul a fost cultivat pentru prima oară acum aproximativ 10.000 de ani în perioada revoluției neolitice, perioadă ce a cunoscut trecerea de la vânătoare și adunare de alimente în agricultura stabilă. Cele mai vechi specii cultivate au fost Einkon, specie diploidă (genomul AA) și Emmer, specie tetraploidă (genomul AABB) derivată din hibridizarea spontană a speciei Einkon cu o specie de iarbă sălbatică. Ambele specii se consideră că au originea în partea de sud-est a Turciei.

Spre deosebire de speciile Einkon și Emmer, grâul de pâine a existat numai în cultivare, avand în vedere că a aparut acum aproximativ 9.000 de ani prin hibridizarea speciei Emmer cu „iarba caprei”(Triticum tauschii/ Aegilops tauschii). Prin urmare grâul de paine (Triticum aestivum) este o specie tetraploidă (Shewry, P. R. 2017).

1.2. Genomul grâului

Apariția genomului a fost realizată prin hibridarea spontană dintre o specie ce aparține de Aegilops spp. cu genom BB și specia diploidă Triticum urartu cu genomul AA ce a dus la formarea grâului tetraploid (AABB), iar hibridarea cu Aegilops tauschii, a treia specie ce avea genomul DD, a condus la formarea grâului hexaploid (AABBDD) (Coța L.,2011). Fiecare dintre aceste genomuri este aproape de două ori mai mare decât genomul uman și constă în aproximativ 5.500 de milioane de litere. Grâul este un poliploid cu 3 genomi, fiecare dintre ei fiind repetat în proporție de 80%, ceea ce face cercetările de genomică dificile ( http://www.wheatgenome.info/ ).

1.2.1. Distribuția genelor în grâu

Până în prezent au fost identificate 48 de regiuni bogate în gene („Gene-Rich-Regions”-GRRs), localizate în numar diferit pe brațele cromozomilor: 21 pe brațele scurte, 27 pe brațele lungi; 18 dintre acestea sunt considerate majore conținând 60% din genele grâului, dar acopera numai 11% din genom. Sunt și regiuni sărace în gene („Gene-Poor-Regions”-GPRs), ce conțin intr-un număr mai mare de retrotranspozomi comparativ cu numărul de pseudogene (Gupta P.K., 2008).

1.3. Structura anatomică și compoziția chimică a boabelor de grâu

Structura anatomică este prezentată in Fig.1.1

Fig.1.1. Secțiune prin cariopsa de grâu

În proporție de: 62-75% din masa proaspătă a bobului de grâu se găsesc glucidele, formate din amidon (90%), dextrine și alte glucide mai simple; 10-16% reprezintă procentul pentru proteine, concentrații mari gasindu-se în părțile periferice ale bobului; 1,8-2,6% reprezintă lipidele (acizi grași nesaturați: acidul linoleic, acidul oleic; acizi grași saturați: acidul palmitic); 2,0-3,5% reprezintă procentul de celuloză, aceasta fiind prezentă în cantități mai mari în învelișurile bobului și cu o pondere de 1,5-2,3% sărurile minerale aflate spre părțile periferice ale bobului (Roman, 2011).

CAPITOLUL II

BOLILE GRÂULUI PRODUSE DE CIUPERCI

2.1. Boli produse de ciuperci

Majoritatea bolilor întâlnite la grâu sunt produse de ciuperci, un număr mare fiiind facultative parazite. Bolile produse de fungi prezintă un pericol permanent întrucâ au o rată de multiplicare crescută, se adaptează repede la condițiile de mediu, pot fi dăunătoare și pentru soiurile rezistente, grație apariției continue de noi rase fiziologice virulente. În urma infectării pe plantă apar pete, leziuni, arsuri, putrezirea unor organe prin producerea făinării, ruginii. (Ceapoiu, Grâul, 1984)

Printre cele mai problematice boli produse de ciuperci se numără: făinarea, fuzarioza spicelor de grâu, fuzarioza rădăcinilor, mucegaiul de zăpadă, rugina galbenă, brună și rugina neagră, mălura comună, mălura pitică, arsura spcelore grâu, înnegrirea bazei tulpinii și radacinii de grâu (Ceapoiu, Grâul, 1984).

2.1.1 Fuzarioza spicelor de grâu

Fuzarioza denumită și arsura, înroșirea sau albirea spicelor de grâu este o boală micotică ce se întâlnește în toate zonele de cultură de pe glob, fiind asociată cu mai multe specii de Fusarium spp.anume: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fusarium avenaceum. Aceste ciuperci sunt capabile să producă un numar mare de micotoxine ce reprezintă un real pericol atât pentru om cât și pentru animale, în urma ingerării acestor compuși fungali (Osborne, 2007).

Simptome

Boala se poate stabili în toate fazele de vegetație, dar simptomele sunt diferite în funcție de stadiul de dezvoltare al plantei. Dacă boala apare imediat după germinare, tânăra plantă se îngălbenește, se spiralează și piere înainte de răsărire, așa încât, încă din timpul toamnei apar goluri în culturile de grâu. În faza de înfrățire la rădacini și la baza tulpinii plantei se observă o brunificare. Spicele infectate cresc greu și rămân mai mici in comparație cu cele neinfectate, devin moi, își pierd clorofila, treptat se albesc și se usucă (http://www.scrigroup.com/afaceri/agricultura/Bolile-graului61416.php ).

Faza cea mai periculoasă o reprezintă perioada de după înflorire, când în urma infestării au loc șistăvirea boabelor, pe rahis apar sporodochii de culoare roz-portocaliu, aproximativ 10-20cm din tulpina din imediata apropiere a spicului capătă culoarea violacee, iar interiorul său este plin cu hife miceliene (Ceapoiu, 1984).

Agentul patogen se poate transmite prin semințele infectate, dacă înainte de semănat nu sunt selectate și tratate corespunzător. O altă problemă este reprezentată de depășirea procentul de umiditate (peste 90%), atunci infecțiile sunt mai puternice, iar spicele pot fi cuprinse în întregime de boală. Intensitatea atacului este condiționată și de reacția acidă a solului ce favorizează dezvoltarea fusariilor. Rol important au și condițiile climatice și rezistența soiurilor (Viorel F., 2011).

Boala are ca rezultat pierderi economice semnificative, inclusiv reducerea randamentului și calități boabelor și pierderile indirecte datorate contaminării prin micotoxine care duc la respingerea sau declasarea cerealelor la marketing (Osborne, 2007).

2.2. Agenții patogeni ai fusariozei grâului

Fusarium graminearum

Fusarium culmorum

Fusarium poae

2.2.1. FUSARIUM GRAMINEARUM

Fig.2.2.1.1 Conidii de Fusarium graminearum: A-D Macrocondi

(John F. Leslie & Brett A. Summerel, 2006)

Caracteristici: Sporodochiile sunt mai rar întâlnite, ele putând fi ascunse sub miceliu, dar când sunt prezente au culoare pal portocalie. Macrocondiile sunt relativ subțiri, ușor curbate sau aproape drepte, cu pereți groși, cu 5-6 septe. Celula apicală este conică, iar celula bazală este distinctă, bine dezvoltată. Clamidosporii se formează în macrocondii sau în miceliu, iar forma lor variază. În ceea ce privește aspectul, clamidosporii, se găsesc în lanțuri sau ciorchine.

Prin cultivare pe mediu PDA, coloniile cresc rapid, abundent, sunt de culoari diferite: de la alb la portocaliu pal pâna la galben. Sporodochiile sunt produse după mai mult de 30 de zile de incubare, sunt colorate variat, de la portocaliu la roșu-maro, pigmentul fiind sensibil la pH. (John F. Leslie, 2006).

Fusarium graminearum este principalul agent de cauzalitate al producerii fuzariozei spicelor de grâu. Contaminarea poate fi prezentă încă de la început în cariopsă, sau se poate face indirect prin transportarea sporilor de către vânt sau ploaie la baza spicului de grâu. În prezența umidității și a temperaturilor relativ ridicate sporii germinează în aproximativ 12 ore după inoculare, dând naștere hifelor neramificate ce se vor dezvolta treptat.

Fusarium graminearum produce enzime de degradare a peretelui celular, dar și micotoxine ca: deoxinivalenol (DON) și (zearalenol (ZEA) (Wcisło & Dzwinel, 2016).

Fig.2.2.1.2 Fusarium graminearum pe mediul PDA și macrocondii

2.2.2. FUSARIUM CULMORUM

Fig.2.2.2.1 Conidii de Fusarium Culmorum:A-D Macrocondii

(John F. Leslie & Brett A. Summerel, 2006)

Caracteristici: Macrocondiile se formează din abundență în sporodochii de culoare portocalie. Macrocondiile sunt scurte, groase, cu pereți groși. Celulele bazale sunt slab dezvoltate, ușor curbate, cu partea centrală aproape dreaptă. Celula apicală este rotunjită și tocită, iar celula bazală este crestată și fără o formă distinctă. Prezintă 3 sau 4 septe.Fusarium culmorum nu formează microconidii, iar clamidosporii acestuia se formeaza relativ rapid, după 3-5 săptămâni de încubare.

Caracteristici pe mediu PDA: Fusarium culmorum crește rapid producând multe sporodochii inițial portocalii, apoi maro închis. Cele mai multe tulpini formează pigmenți roșii în agar, unele pot avea miceliul maroniu și pigmentul maroniu in agar (John F. Leslie, 2006).

Fig.2.2.2.2 Fusarium culmorum pe mediul PDA și macrocondii

2.2.3. FUSARIUM POAE

Fig.2.2.3.1 Conidii de Fusarium Culmorum:A-B Marocondi,C-D Microcondi,E-F Microcondi în situs (John F. Leslie & Brett A. Summerel, 2006)

Caracteristici: Macroconidiile sunt rare, cu excepția cazului în care cultura este expusă la lumină apropiată celei UV. Macroconidiile sunt relativ scurte, falcate, cu 3 septe, cu celula apicală curbată și conică. Microcondiile sunt produse abundent pe monofialide în formă de urnă. Conidioforii sunt scurți și ramificați, iar clamidiosporii se formează rar.

Caracteristici pe mediu PDA: Miceliul aerian apare abundent, pâslos și devine pulverulent la momentul formării microconidiilor. Miceliul are inițial o culoare palidă și mai apoi maro roșcat. În mediu sunt eliberați pigmenți de culoare galbenă (John F. Leslie, 2006).

Fig.2.2.3.2 Fusarium Poae pe mediul PDA și micro/macrocondii

2.3. Micotoxinele produse de specile din genul Fusarium

Speciile din genul Fusarium sunt capabile să producă în grâu trei dintre cele mai importante clase de micotoxine: fumonisina (FB1,FB2,FB3); zearalenona (ZAD); trichotecene (toxina HT-2 (HT-2) și toxina T-2 (T-2), diactoxiscripenol (DAS), monoacetoxiscripeno1 (MAS). De asemenea, pot produce micotoxine emergente cum ar fi: fusoproliferina (FUS), beauvericina (BEA), eniatine, moniliformina (MON) sau alte micotoxine ca acid fusaric, fusarina AD, gliotoxina, butenolit sunt recent descoperite și mai puțin studiate (Stanciu, 2017).

Micotoxine de fusarium dacă sunt ingerate au efecte toxice acute și efecte cronice, s-a dovedit că provocă o mare varietate de efecte toxice la animale în urma consumului. Consecințele ingerării acestor compuși fungali variază de la boli acute, cu morbiditate ridicată până la boli cronice în urma careia rezultă decesul. Cu toate acestea, problema majoră în urma consumului de produs contaminat nu sunt episoadele de boală acută, ci mai degrabă ingerarea unor nivele scăzute de toxine care pot provoca o serie de tulburări metabolice, fiziologice și imunologice. Simptomele legate de micotoxicoză pot apărea la concentrații foarte mici, chiar sub limitele de detecție (Escriva & Manyes, 2015).

CAPITOLUL III

MATERIALE ȘI METODE

3.1. Materialul biologic utilizat

Materialul biologic analizat a constat în 9 probe de grâu integral neprelucrat, colectat în timpul campaniei de recoltare 2017 și furnizat de Moara de grâu Oltina din Urlați. Grâul a fost cultivat pe teritoriul județului Ialomița (terenurile din Fierbinți și cele din apropierea comunei Bucu). Primele 6 probe sunt de grâu NON-GMO (Nemodificate genetic), soiuri cultivate în România. Probele 7, 8, 9 sunt de asemenea NON-GMO însă neomologate și în UE.

3.2. Medii de cultură utilizate

Mediul MGA (Malachite Green Agar), mediu de cultură semi-selectiv preparat conform rețetei lui (Leslie & Summerell, 2006). Ingredientele folosite pentru prepararea mediuui MGA (Malachite Green Agar) sunt trecute în tab.3.2-1.

Tab.3.2-1 Ingrediente folosite pentru prepararea mediuui MGA

După sterilizare prin autoclavare (la 121C, 15-20 de minute) mediul a fost răcit la 50-55C și s-a adăugat antibioticele (streptomicină și chloranfenicol), urmând ca mediul să fie distribuit în plăci Petri.

Mediul PDA (Potato Dextrose Agar) a fost preparat conform instrucțiunilor fabricantului, iar pH-ului de 5,4. Compoziția pudrei de PDA este trecută în tab.3.2-2.

Tab.3.2-2 Ingrediente folosite pentru prepararea mediului PDA

Pentru prepararea mediului s-a adăugat 39g de pulbere comercială de PDA la 1L de apă distilată. Amestecul a fost fiert până la dizolvarea pudrei și s-a sterilizat prin autoclavat (15 minute la 121C), după a fost distribuit în plăci Petri.

Mediul lichid PEGB (Potato extract-glucose broth) , a fost preparat potrivit instrucțiunilor de pe ambalaj. Cantitatea necesara a fost de 20 ml pentru fiecare probă, 120 de mililitri cantitatea totală. Pentru cele 6 probe analizate s-au folosit 3,18g de pulbere. Ingredientele raportate la 1L de mediu sunt trecute în tab.3.2-3.

Tab.3.2-3 Ingredientele folosite pentru prepararea mediului PEGB

Mediul PSA (Potato-Sucrose-Agar), a fost folosit pentru stimularea producerii de micotoxine. De asemenea, în raportul lui Vujanovic și Monsour (2011) specia de Fusarium graminearum a produs micotoxina DON și ZEA numai în prezența concentrațiilor mari de zaharoză (20% și peste), (Grosu & Cornea, 2014).

Mediul s-a preparat conform instrucțiunilor de pe ambalaj folosind pulbere comercială. Îngredientele folosite raportate la un litru de mediu sunt trecute în tab.3.2-4.

Tab.3.3-4 Ingrediente folosite pentru prepararea mediului PSA

3.3. Metode de izolare a fungilor din genul Fusarium

Pentru însămânțarea probelor s-a folosit mediul MGA (Malachit Green Agar). După ce a fost preparat conform (Leslie & Summerell, 2006) a fost sterilizat (la 121C, 15 minute) și ulterior suplimentat cu antibioticele streptomicină și chloranfenicol în proporția corespunzătoare.

Pe substratul nutritiv (MGA cu antibiotice) au fost plasate câte 10 cariopse de grâu selectate pe baza simptomatologică. Astfel, din fiecare probă au fost selectate boabe șistave, mate cu simptome similare infecției cu fungi. Boabele au fost puse cu ajutorul unei pense sterile pe mediul de cultură semi-selectiv pentru Fusarium spp. Acest substrat este inhibitor pentru contaminanții din genul Aspergillus și Penicillium spp. Însămânțările au fost realizate la hota cu flux laminar. Probele au fost incubate timp de o săptămână la temperatura de 28C.

Fig.3.3.1 Însămânțarea probelor pe mediu MGA

3.4. Metoda de purificare a culturilor de Fusarium

Pentru purificarea izolatelor de interes, s-a realizat o repicare pe mediul PDA (Potato Dextrose Agar). În condiții aseptice și în prezența becului de gaz cu ajutorul unei anse metalice sterile, au fost prelevate bucăți de mediu pe care s-au dezvoltat fungi filamentoși din familia Fusarium. Probele ce conțin fungii filamentoși au fost cultivate pe mediul PDA.

Plăcile Petri ce conțin probele au fost ținute timp de o săptămână la temperatura de 28C.

3.5. Metoda de cromatografie în strat subtire pentru determinarea fusariilor toxicogeni

Pentru a determina prezența micotoxinelor în probele de analiză, s-au însămânțat fungii filamentoși crescuți pe mediul PDA pe mediul PSA (Potato-Sucrose-Agar). Mediul PSA prin componența sa, stimulează producerea de micotoxine.

Pentru aplicarea metodei de cromatografie în strat subțire au fost necesare realizarea următoarelor etape: folosirea culturile de 12 zile de pe mediul PSA de unde au fost prelevate 4 rondele miceliene de 6 mm în diametru. Cu ajutorul unui ac steril rondelele au fost introduse în tuburi și mojarate energic. Amestecul mojarat s-a omogenizat intr-un 1 ml soluție de extracție 2:1 (v/v) de cloroform:metanol, toate probele au fost vortexate și incubate peste noapte la temperatura de 4C.

Fig.3.5.1 Cele 6 tuburi ce conțin micelii și părți din mediu mojarat

A doua zi probele au fost scoase de la frigider, centrifugate, iar faza lichidă reluată în tuburi de 1,5 ml pentru a se realiza concentrarea prin evaporarea totală a solvenților de extracție. În acest timp a fost pregătită și placa de TLC cu silicagel, prin măsurarea distanțelor dintre cele 6 probe, urmând ca din fiecare probă să se ia 5 µl si să se distribuie în spoturi pe plăci.

Separarea cromatografică a fost realizată în amestec 5:4:1 (v/v/v) de toluen:acetat de etil:acid formic. După aproximativ 30 de minute, perioadă în care a avut loc migrarea, cromatograma a fost uscată și vizualizată în UV la 365nm.

3.6. Metoda de izolare a ADN-ului fungic

Cu scopul de a pregatii materialul genetic folosit în izolarea ADN-ului fungic, din probele obținute pe mediul PDA se pornește o cultură lichidă de fungi în bulion cu extract de cartof si glucoză. S-au prelevat 4 fâșii de mediu, din fiecare probă, fâșii pe suprafața cărora s-au dezvoltat fungii de Fusarium. Probele extrase au fost introduse în mediul lichid din paharele Erlenmeyer. Recoltarea fungiilor de pe mediul PDA s-a realizat în interiorul hotei cu flux laminar, langă becul de gaz, cu ajutorul unei anse sterile.

Fig.3.6.1 Cele 6 probe de fungi în cultura lichidă

În următoarea zi s-a efectuat filtrarea celor 6 probe, solventul fiind îndepărtat, iar biomasa curățată de pe hârtia de filtru, cu ajutorul unei spatule sterile. Biomasa a fost pusă în tuburi și băgată la congelator până la efectuarea izolării și purificării ADN-ului.

Pentru izolarea și purificarea ADN-ului s-au urmărit etapele următorului protocol (Metoda CV.)

Se folosesc probele congelate (cele 6 );

Materialul genetic este pus în mojar și se mojarează cu nisip de cuarț;

După mojarare este reluat cu 1ml tampon de solutie CV(?)și pus în tuburi omogenizându-se ușor;

Se incubează pe baie de apă 15 minute la 68C;

După finalizarea incubării pe baie de apă se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm;

Se reia tot supernatantul și se adaugă un volum egal fenol:cloroform:izoamilic (25:24:1), se agită energic;

Se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm;

Se reia supernatantul și se adaugă 2,5 volume alcool etilic, se omogenizează ușor;

Probele se lasă la congelat până a doua zi.

Pașii urmați a doua zi sunt următorii:

Probele de la congelator se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm și o temperatură de 4C;

Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul de ADN se spală cu etanol de 70%;

Se centrifughează 10 minute la 10.000 rpm și o temperatură de 4C;

Sedimentul de ADN se usucă 10 minute la 37C;

Se reia în 100µl de TE .

CAPITOLUL IV

REZULTATE ȘI DISCUȚII

4.1. Selectarea contaminațiilor

În decurs de o săptămână toate cele 9 probe de grâu analizate au fost ținute în incubator. Condițiile fiind prielnice, s-a realizat contaminarea cu fungi filamentoș în toate plăcile. S-au dezvoltat fuzarii în toate probele, însă din cauza prezenței altor specii (din genul Rhizopus și Aspergilllus) nu a fost posibilă izolarea decât din 6 probe, renunțându-se la probele 1, 2 și 9.

Fig.4.2.1 Proba 1

Fig.4.2.2 Proba 2

Fig.4.2.3 Proba 3 Fig.4.2.4 Proba 4

Fig.4.2.5 Proba 5

Fig.4.2.6 Proba 6

Fig.4.2.7 Proba 7

Fig.4.2.8 Proba 8

4.2. Caracterizarea macroscopică

În urma purificării izolatelor de fungi filamentoși din familia Fusarium prin repicarea pe mediul PDA, după o săptămână în care probele au fost ținute în incubator la temperatura de 28C, fungii de Fusarium s-au dezvoltat așa cum se vede in Fig.4.2.1, căpătând culori diferite: IS3 roșu-brun cu o pată cenușie, IS4 galben-portocaliu, IS5 brun, IS6 galben-pal, IS7 roșu-brun, IS8 galben-portocaliu.

Fig.4.2.1 Fungi de Fusarium pe mediu PDA

Rezultatul însămânțării pe mediul PSA (Potato-Sucrode-Agar), mediu folosit pentru stimularea producerii de micotoxine este vizibil in Fig.4.2.2 și Fig.4.2.3 și poate fi interpretat astfel:

IS3-pigment galben-pal în mediu, miceliul aerian slab dezvoltat, având o culoare pală;

IS4-pigment portocaliu în mediu, cu coloni abundente și albe;

IS5-pigment roșu-brun în mediu, cu miceliu slab colorat;

IS6-pigment galben în mediu, cu miceli aerian abundent și alb;

IS7-pigment brun în mediu, cu micelii maroni,

IS8-pigment roșu-brun în mediu, cu colonii relativ abundente și slab colorate.

Fig.4.2.2 Fungi de Fusarium însămânțați pe mediul PSA (vedere-partea anterioară a placii)

Fig.4.2.3 Fungi de Fusarium pe mediul PSA (vedere-partea superioara a plăcii)

4.3. Determinarea contaminanțiilor cromatogeni

În urma efectuării metodei de cromatografie în strat subtire pentru determinarea fusariilor toxicogeni din probele obținute pe mediul PSA, s-a produs migrarea așa cum se observa in Fig.4.3.1.

Fig.4.3.1. Evidențierea prin TLC a izolatelor de Fusarium spp. producătoare de micotoxine:

1 = IS3, 2 = IS4, 3 = IS5, 4 = IS6, 5 = IS7, 6 = IS8

Prezenta micotoxinelor este marcată cu sageata roșie = DON (deoxinivalenol), micotoxină prezentă în probele IS 6 și IS 8; iar cu săgeată galbenă = ZEA (zearalenol), micotoxină prezentă in probele IS 1 și IS 6.

CONCLUZII

În urma rezultatelor obținute, care au avut drept obiectiv izolarea și purificarea culturilor de Fusarium pentru realizarea determinării fusariilor toxicogeni și izolarea de ADN fungic prin tehnica PCR, concluziile sunt următoarele:

În ceea ce privește evaluarea prezenței specilor de Fusarium în probele de grâu analizat, s-a constatat că acestea au fost infestate cu fuzarii, dar și cu alte speciidin genul Rhizopus și Aspergillus (probele 1, 2 și 9). Probele sigure infestate cu fuzarii au fost 3-8.

În urma însămânțării pe mediul PSA, mediu folosit pentru producerea de micotoxine și aplicarea metodei de cromatografie în strat subțire, s-a constatat prezența micotoxinelor. Micotoxina ZEA (zearalenol) în proba IS3; ZEA și DON (deoxinivalenol) în proba IS6; DON în proba IS8.

Lista de referințe

Bolile graului, http://www.scrigroup.com/afaceri/agricultura/Bolile-graului61416.php (accesat pe 15.05.2018).

Ceapoiu, N. (1984) “Grâul” , Ed. Academiei Republicii Socialiste Române, București, pag.137-150 .

Dumbravă, M. (2004), „Tehnologia culturii plantelor”, Ed. Didactică și pedagogică, București, pag. 21-25 .

Escrivá, L., Font, G., & Manyes, L. (2015). In vivo toxicity studies of fusarium mycotoxins in the last decade: a review. Food and Chemical Toxicology, 78, 185-206.

Grosu, I., Israel-Roming, F., Sicuia, O. A., Constantinescu, F., Popa, G., & Cornea, C. P. (2014). Effect of some bacterial antagonists on growth and mycotoxin production of Fusarium graminearum and F. culmorum isolates. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, 18, 26-31.

Gupta P.K., Mir R.R., Mohan A., Kumar J. (2008) Wheat Genomics: Present Status and Future Prospects. (Review) International Journal of Plant Genomics pag.1-36.

John F. Leslie & Brett A. Summerel (2006), ). “The Fusarium Laboratory Manual”, Blackwell, USA, pag. 158, 176, 220.

Osborne, L. E., & Stein, J. M. (2007). Epidemiology of Fusarium head blight on small-grain cereals. International journal of food microbiology, 119(1-2), 103-108

Parikh, L., Kodati, S., Eskelson, M. J., & Adesemoye, A. O. (2018). Identification and pathogenicity of Fusarium spp. in row crops in Nebraska. Crop Protection, 108, 120-127.

Razi G. (2016), Top 20 cei mai mari producători de grâu http://www.agrofinanciar.ro/Top-20-cei-mai-mari-producatori-de-grau-n343.html (Accesat pe 10.06.2018)

Roman, G. V. (2011), „Fitotehnie Vol.1 Cereale și legume pentru boabe”,Ed. Universală, București, pag. 70-73.

Shewry, P. R. (2017). Do ancient types of wheat have health benefits compared with modern bread wheat?. Journal of Cereal Science.

Stanciu, O., Juan, C., Miere, D., Loghin, F., & Mañes, J. (2017). Occurrence and co-occurrence of Fusarium mycotoxins in wheat grains and wheat flour from Romania. Food Control, 73, 147-155 .

Viorel F. (2011), Fitopatologie specială. Suport de curs, disponibil online pe https://www.scribd.com/doc/79017175/AGRICULTURA-FITOPATOLOGIE-SPECIALA-2012 (accesat pe 15.05.2918).

Wcisło, R., Miller, S. S., & Dzwinel, W. (2016). PAM: Particle automata model in simulation of Fusarium graminearum pathogen expansion. Journal of theoretical biology, 389, 110-122.

Wheat Genome , http://www.wheatgenome.info/ (accesat pe 15.05.2018).

Wrigley, C. W. (2009). Wheat: a unique grain for the world. Wheat: chemistry and technology, (Ed. 4), 1-17.