Șef lucr. dr. Adriana Petruș [311282]

UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE ȘTIINȚE

DOMENIUL: BIOLOGIE

SPECIALIZAREA: BIOLOGIE

DURATA STUDIILOR: 3 ANI

FORMA DE ÎNVĂȚĂMÂNT: ZI

CERCETĂRI PRIVIND EFECTUL RAZELOR UV ASUPRA

ORGANOGENEZEI IN VITRO

LA SEQUOIA SP. ȘI DROSERA ROTUNDIFOLIA L.

Conducător științific:

Șef lucr. dr. Adriana Petruș

Absolvent: [anonimizat]

2014

Cuprins

INTRODUCERE

Radiațiile ultraviolete (UV) sunt radiații electromagnetice cu o lungime de undă mai mică decât radiațiile luminii percepute de ochiul uman. Spectrul UV este cuprins între lungimile de undă 1 – 380 nm. Denumirea de „ultraviolet” [anonimizat] o [anonimizat] (Rab și Saltveit, 1996).

[anonimizat]. Semnalele comune ale răspunsului la factorii de stres abiotici includ: ofilirea, [anonimizat], [anonimizat]. La plante toate aceste efecte dăunătoare cauzează o reducere a creșterii și o scădere a bioproductivității lor.

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat]. Stresul oxidativ este unul dintre pericolele majore pentru plantele expuse factorilor poluați din mediu. Mecanismul de acțiune al radicalilor liberi este încă neclar. [anonimizat], organe și în organisme. Cloroplastele, [anonimizat], ceea ce va duce la o diminuare a creșterii plantelor (Kwon și colab., 2002).

Radiațiile UV sunt capabile să inducă acumularea acidului salicilic în plante. Totodată, ele stimuleazǎ [anonimizat]. [anonimizat], pot crește rezistența lor la boli. Citocrom P450 monooxigenază este o hemoproteină, [anonimizat], fiind implicată în biosinteza protectorilor împotriva radiațiilor UV (Narusaka și colab., 2004).

[anonimizat], [anonimizat], radiațiile cu lungime mare de undă (cuprinsă între 400 și 700 nm) sunt indispensabile în procesele de fotosinteză și în creștere ([anonimizat], 1998).

[anonimizat]. [anonimizat] a căror lumină este foarte apropiată de cea a luminii solare și care nu încălzește atmosfera din imediata apropiere a plantulelor. [anonimizat]. Radiațiile UV sunt utilizate în micropropagare în procesul de asepsizare a aerului din încăperi. [anonimizat] a [anonimizat] a acestora, fără afectarea fenotipă a vitroplantulelor (Cachiță și colab., 2004).

[anonimizat]: razele UV aplicate într-un anumit regim, previn apariția infecțiilor în camera de creștere fără afectarea fitoinoculilor, precum și faptul că acestea inhibă calusogeneza, favorizând rizogeneza la baza fitoinoculilor de Sequoia sp.

Mulțumesc Universității din Oradea, Facultății de Științe, Departamentului de Biologie pentru că mi-au pus la dispoziție biobaza de cercetare a laboratorului de biotehnologie vegetală, reactivii și mediile de cultură necesare realizării experimentelor care fac obiectul prezentei lucrări de licență, precum și d-nei sef lucr. dr. Adriana Petruș.

ORGANOGENEZA IN VITRO

Culturile in vitro – Caracteristici generale

Prin cultură in vitro se înțelege în general creșterea într-un ambient controlat, pe medii artificiale, în condiții de asepsie totală, a unor organe, țesuturi, părți de organe sau celule vegetale. Pentru ca o cultură sa fie reușită sunt necesari mai mulți factori și această reușită este detectabilă când inoculul crește vizibil.

Explantul (inoculul), este acea porțiune de plantă care poate fi un organ,țesut sau o celulă care se detașează de planta mamă (donor) și este inoculat pe un mediu artificial de cultură in mediu steril (Cachiță, 1987). Evoluția explantului este dirijată, în funcție de scopul urmărit, de un operator. Explantului poate să îi fie stimulată dezvoltarea organelor aeriene (tulpina și frunzele) și rădăcina pentru a evolua formând una sau mai multe plante noi numite neoplantule, sau stimulând inmulțirea nediferențiată a celulelor, poate forma calus.

Explantul reprezintă o unitate vie care conține în celulele ei informația genetică a plantei mamă și este capabil să regenereze una sau mai multe plante identice cu planta donor datorită totipotenței.

Capacitatea celulelor vegetale de a se divide, reproduce și a forma o plantă identică cu planta mamă se numeste totipotență. Fiecare celulă vie este totipotentă teoretic, totuși s-a observat în practică că nu toate celulele iși pot utiliza această abilitate, fie datorită îmbătrânirii și diferențierii celulare, fie din specializării mai mare a acestor celule.

S-a demonstrat practic că la o plantă matură, celulele specializate din care sunt alcătuite țesuturile și la care le lipsește citoplasma și nucleul nu sunt totipotente, cum ar fi: traheidele, sclereidele, fibrele libero-lemnoase, etc. Explicația acestui aspect constă in faptul că celulele totipotente au întreaga informație genetică în cromozomii din nucleu (Timir și Biswajit, 2005).

Odată cu înaintarea în vârstă, la plantele cormofite, anumite celule își pierd capacitatea de totipotență sau aceasta este foarte mult redusă. În anumite zone rămân totuși celule cu activitate intensă, formându-se celule noi și având loc diviziune aproape continuu. Aceste celule sunt poligonale, mici in dimensiuni, bogate în citoplasmă, cu vacuolă mică și nucleu mare dispus central. Prezintă si o membrană celulozică, formând țesutul numit meristem (Stănică, 2004).

Față de multiplicarea tradițională, unde se folosesc semințe sau porțiuni mari de plantă cum ar fi: butași, altoi sau marcote, la multiplicarea in vitro se folosesc inoculi mici, de dimensiuni milimetrice, sau chiar microscopice (protoplaști, celule), inoculi care supuse la condiții normale de cultură nu ar supraviețui, nefiind capabile sa opună rezistență factorilor patogeni și să-și sintetizeze singure substanțele nutritive necesare supraviețuirii.

Din acest motiv, pentru reușita culturii de celule și țesuturi este nevoie respectarea următoarelor condiții (Timir și Biswajit, 2005):

pregătirea unui mediu de creștere care să asigure o bună nutriție a inoculului, asigurând o sursă de carbon organic ușor accesibil explantelor;

factorii de mediu (temperatura, umiditate, lumină) trebuie controlați pentru a fi in limite optime pentru fiecare specie, soi și fază de creștere, în funcție de cerințele acesteia și scopul multiplicării;

creșterea și diferențierea sau dediferențierea organelor trebuie stimulată utilizând substanțele stimulatoare de creștere corespunzătoare;

sterilizarea mediului și a vaselor de cultură, dezinfecția materialului vegetal, efectuarea tuturor operațiilor în hota cu flux de aer laminat steril și folosirea instrumentarului sterilizat prin flambare, pentru a asigura o asepsie deplină pe tot parcursul producerii plantelor in vitro.

Diferențierea

Diferențierea este un proces ce constă într-o serie de transformări pe care le pot suferi celulele nediferențiate sau meristemele, acestea trec printr-o specializare morfologică și structurală, dobândind caracteristici noi care le posedă celulele adulte (Timir și Biswajit, 2005).

In vitro, diferențierea celulară nu e așa variată, ca aceea din cazul ontogenezei și a histogenezei normale (Gautheret, 1966).La diferențierea in vitro unele funcții sunt mai reduse sau simplificate iar altele sunt amplificate. Pentru studiul citodiferențierii (diferențierea celulelor specializate) se urmărețte formarea elementelor lemnoase, a xilemului. Acest tip de celule sunt ușor de identificat la culturile in vitro și pot fi studiați factorii care concură la inițierea și susținerea xilogenezei. În ceea ce privește histodiferențierea (diferențierea celulelor), acest fenomen se petrece pe măsura constituirii organelor.

Dediferențierea

Dediferențierea este procesul opus al diferențierii. Celulele inoculate pe medii aseptice trebuie sa sufere un proces de conversie pentru a își reorganiza un mod de viață, din celule definitivate structural și funcțional trebuie să treacă la starea de celule meristematice, apte de multiplicare, acest proces este numit dediferențiere (Timir și Biswajit, 2005).

Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenția este foarte inegal răspândită la celule, țesuturi și organe variate, în cadrul aceleiași specii și la specii și genuri diferite. O condiție de bază este aceea ca celulele sa fie vii și să nu se găsească într-un proces avansat de senescență.

Fazele de dediferențiere celulară pot fi subdivizate astfel:

I. Prima fază de dediferențiere:

a – amorsarea proceselor de dediferențiere;

b – producerea dediferențierii celulelor, până la dobândirea caracte risticilor citologice specifice unui țesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate, asemănătoare, ca aspect și structură, cu cambiul;

II. A doua fază de dediferențiere:

a – dediferențierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem primar; generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau de meristemoizi (centre organogene), ori de embrioni somatici, iar din aceștia, regenerarea de plante;

b – generarea – prin proliferarea celulelor dediferențiate – a unui calus neorganizat, omogen structurat. La nivelul acestui țesut calusal se pot, apoi, forma meristemoizi sau centri embriogeni.

Rizogeneza

Un anumit fragment explantat, în linii mari, se comportă ca un minibutaș. El diferă de un butaș normal, întrucât butașul clasic, fiind mai mare, deține bogate rezerve endogene, în plus acesta deține muguri și, eventual, frunze. Mugurii și frunzele pot, și după detașarea fragmentului de pe planta–mamă, să sintetizeze anumiți fitohormoni (Khachatourians și colab., 2002).

Explantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse și a detașării lui de organul căruia îi aparține, nu mai beneficiază de “mesaje” și de “susțineri“ pe care să le primească de la mugurii sau de la frunzele individului sau structurilor căruia i-au aparținut celulele sale, și – odată explantat – el rămâne, în totalitate, dependent de mediul de cultură; explantul, detașat fiind de sistemul în care se afla integrat, este lipsit de întreg “complexul rizocalinic” endogen, particular fiecărei plante integre, precum și de o serie de alți factori endogeni corelativi, de care existența sa este puternic legată. În acest caz, factorul genetic, mărimea explantului, vârsta plantei–mamă, starea fiziologică a celulelor pe care le deține explantul etc. sunt tot atâția factori care concură în evoluția ulterioară a cormofitoinoculului.

Uneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacității rizogene, mai ales ca urmare a practicării unor repicări (subculturi) succesive.Se pune problema păstrării sau a redobândirii – în caz de pierdere – a capacității rizogene. Factorii care condiționeaz menținerea capacității rizogene și, mai ales, cei ce cauzează pierderea aptitudinii rizogene, sunt încă în mică măsură cunoscuți (Khachatourians și colab., 2002).

Caulogeneza

In vitro, formarea de mugurași, respectiv generarea de centri vegetativi, este esențială atunci când se urmărește multiplicarea sau regenerarea unei plante ori a unui genotip, indiferent de calea prin care acesta a luat naștere. Inducerea caulogenezei la nivelul inoculilor cultivați in vitro, este stimulată de prezența în mediul de cultură a citochininelor, adeseori, în condițiile asocierii acestora, cu auxinele. Neoformarea de mugurași la nivelul calusului se află sub controlul interacțiunii celor două categorii de fitohormoni. Reușita neoformării de mugurași presupune nu numai prezența celor două tipuri de regulatori de creștere, ci și a realizării unui anumit raport între auxine și citochinine – în dependență de proporția componenților – al cărui eficiență este valabilă funcție de specie, de proveniența și natura inoculului, dar – uneori – și funcție de numărul de repicări suportate de cultura respectivă, în antecedență (Khachatourians și colab., 2002).

În general, se acceptă posibilitatea echilibrării conținutului endogen de fitohormoni, cu adaosul din afară de fitoregulatori de creștere, în substratul de cultură. Uneori, se poate declanșa caulogeneza reducând concentrația de auxină în mediul de cultură. Alteori, de exemplu, experiențe făcute pe explante prelevate din măduvă de tutun (Lee și Skoog, 1965) au dovedit că este posibilă favorizarea formării de mugurași, prin adăugarea în substratul de cultură a unor compuși fenolici, care par să acționeze prin intermediul AIA oxidazei, indirect, asupra nivelului endogen de auxină. Dar, se cunosc și exemple de reacție inversă a cormofitoinoculilor. Sastri (1963) menționa faptul că la cultura de Armoracia rusticana că aportul de auxină a favorizat neoformarea de mugurași, în timp ce sporirea conținutului de chinetină a inhibat caulogeneza.

Factorii fizici: lumina și temperatura din camerele de creștere, umiditatea și concentrația de oxigen din interiorul vaselor de cultură, precum și calitățile fizice ale mediului de cultură sunt controversați în ceea ce privește efectele lor asupra caulogenezei, acțiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor și de etapele de cultură parcurse anterior (Cachiță, 1987; Roșu, 1999).

Calusogeneza

Plantele își dezvoltă mase de celule neorganizate numite calus ca răspuns la stimuli biotici și abiotici. De la descoperirea faptului că o combinație de hormoni de creștere, auxine și citochinine induce creșterea de calus in vitro, acest sistem experimental a fost folosit în studii diverse și în aplicații horticole. O perioadă lungă de timp formarea moleculară a calusului a fost obscură, dar recent s-a înțeles cum proliferarea celulară neprogramată e suprimată în timpul creșterii normale a plantei și cum factorii genetici și de mediu pot opri această suprimare pentru a induce formarea calusului.

Skoog și Miller (1957) au arătat că un raport normal de auxine si citochinine induce formarea calusului, iar un raport mare de auxine la citochinine sau citochinine la auxine induce dezvoltarea rădăcinilor și accelerarea regenerării. De când s-a descoperit acest sistem, a fost folosit deseori în multiplicare in vitro.

Calusul indus prin rănire a fost observat și folosit pentru o perioadă lungă de timp în contexte variate de la scoarța copacilor până la folosirea în horticultură (Cline și Neely, 1983). Acest fel de calus deseori acumulează proteine și sunt deseori folosite pentru a preveni infecția și pierderea de apă. Calusul indus prin rănire derivă din celule variate incluzând celule vasculare, corticale, etc. În unele cazuri calusul indus prin rănire regenerează organe noi sau țesuturi noi, sugerând o totipotență ridicată (Stobbe, 2002).

Domenii de aplicare a culturilor in vitro

Din cauza numărului mare de probleme unde culturile in vitro sunt de mare folos, sunt utilizate în prezent multe domenii incluzând: farmacie, industria alimentară, agricultură, silvicultură, industria ușoară, etc. În general în agricultură și în special în horticultură, culturile in vitro sunt folosite pentru multiplicarea anumitor specii, soiuri sau clone, pentru a conserva germoplastul horticol, ameliorarea speciilor cultivate, sau pentru obținerea de metaboliți secundari.

Avantajele culturii in vitro sunt multiple, printre care amintim (Petruș, 2013):

este asigurată o multiplicare clonală cu viteză mare a multor soiuri, hibrizi sau clone rare sau valoroase, pornind doar cu cantități mici de material vegetal. Teoretic, este asigurată o replicare exponențială, prin care se pot obține în aprox. 6 luni peste 1 milion de plante;

există capabilitatea de a produce material săditor lipsit de factori patogeni, material mai viguros, precoce și productiv;

nu are nevoie de spații mari de cultură, valorifică bine spațiul mic din laboratoare prin cultura pe verticală pe nivele suprapuse;

se pot obține plante haploide, prin cultura de antere, polen sau alte explante de țesuturi generative (cu n cromozomi);

face posibilă obținerea hibrizilor interspecifici datorită fecundării in vitro, care în condiții normale nu se pot obține;

se pot selecționa plante rezistente la boli, stres și dăunători;

nu există efectul sezonier de pepinieră;

posibilitatea de a obține semințe artificiale;

obținerea de plante pe rădăcini proprii fără a se cheltui în plus pe altoire;

se asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care în condiții normale de cultură nu înrădăcinează;

păstrează materialul în faza de plantulă până la comenzi noi ferme de multiplicare.

Chiar si cu aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultivarea in vitro și care trebuie sa fie înmulțite tradițional.

De asemenea există și unele impedimente în utilizarea acestei metode pentru replicarea în masă a plantelor, cum ar fi (Petruș, 2013):

este necesar un laborator cu dotări minime, instalații și aparate costisitoare dar indispensabile activităților de micropropagare;

este necesară prezența unui personal specializat în manipularea in vitro și multiplicarea clonală;

necesitatea și utilizarea fitohormonilor, care sunt puțin accesibili tuturor unităților de producție și sunt scumpi;

unele specii sau soiuri nu au posibilitatea de a fi controlate din cauza caracterului recalcitrant, acestea nu răspund la metodele cunoscute de multiplicare;

este posibilă apariția și multiplicarea mutațiilor excesive, un risc care poate afecta autenticitatea soiurilor.

EFECTUL CALITĂȚII LUMINII ASUPRA PLANTELOR

Toate plantele au nevoie de lumină pentru a crește și a se dezvolta, dar nu toate felurile de lumină influențează plantele in același fel. În primul rând, lumina este de mai multe feluri. Lumina are mai multe lungimi de undă exprimate în micrometri, nanometri sau angstromi. Un metru este format dintr-un milion de micrometri , un micrometru este format din o mie de nanometri iar un nanometru este format din zece mii de angstromi. Lungimile de undă cu importanță principală in fotobiologie sunt ultravioletele (UV), lumina vizibilă si infraroșiile (IR) (Hopkins, 1999). În concordanță cu Devlin (1975), lungimile de undă între 300 nm până la 900 nm au capacitatea de a afecta creșterea plantelor. Totuși, nu este numai calitatea luminii care afectează creșterea plantelor. Alte proprietăți ale luminii includ intensitatea luminii si durata luminii cât și alți factori climatici implicati.

Lumina solară constă din aproximativ 4% radiație ultravioletă, 52% radiație infraroșie si 44% lumină vizibilă. Lumina poate fi reflectată, transmisă sau absorbită. Doar lumina care este absorbită are un efect, lumina vizibilă care e reflectată e cea care e percepută de ochi. Dar majoritatea luminii care ajunge in straturile superioare ale atmosferei e filtrată sau reflectată înapoi in spațiu, doar o portiune mică ajunge pe planetă (Whiting, 2010).

Calitatea luminii care ajunge la plante și organele care o absorb variază in concordanță cu mulți factori. Acești factori pot include perioada zilei, anotimpul, localizarea geografică, gazele si umiditatea din atmosferă, norii, fumul, praful si alți poluanți ai aerului, topografia, prezența barierelor incluzând alte plante, arhitectura plantei și localizarea organelor care absorb lumina pe plantă (Cerdan, 2003).

Lungimea de unda vizibilă se află între aproximativ 390 nm si 760 nm care reprezintă o secțiune mică din întreg spectrul electromagnetic al radiației solare. Lumina vizibilă corespunde cu aproximație de radiația activă fotosintetic de la 400 nm la 700 nm. Aceste lungimi de undă conțin cantitatea potrivită de energie pentru procesele biochimice necesare plantei și din această cauză proporția acestei lungimi de undă la cantitatea de lumină disponibilă este de o primă importanță in determinarea calității luminii.

Aranjate de la cea mai scurtă la cea mai lungă lungime de undă, lumina vizibilă corespunde culorilor violet, albastru, verde, galben, portocaliu si roșu. Aceste culori sunt folosite ca standarde in descrierea calității luminii. Partea extremă a regiunii roșii in exces de 700 nm e deseori referită ca infraroșu iar partea extremă a regiunii violet este numită ultraviolet. Lumina albă e aceea in care toate lungimile de undă vizibilă sunt prezente iar negrul nu are nici o lungime de undă vizibilă.

Radiația ultravioletă este încărcată cu cantități excesive de energie și poate rupe legături moleculare. Aceasta este absorbită de oxigenul atmosferic (O2), de ozon (O3) și de sticlă (Hopkins, 1999). În contrast cu aceasta, radiația infraroșie conține energie minimă și doar participă indirect in fotosinteză și alte reacții ale plantelor. Totuși, este responsabilă pentru temperatura ridicată. Aceasta face pământul locuibil pentru majoritatea organismelor.

Lumina infraroșie este absorbită de celule dar energia conținută este prea puțină pentru a excita electronii. Majoritatea din această energie este convertită in căldură. Cantități semnificative de radiație infraroșie sunt absorbite de vaporii de apă, dioxid de carbon si alte gaze din atmosferă, dar poate trece prin sticlă.

Lumina din timpul zilei e bogată cu lungimi de undă albastre, din cauza aceasta cerul este albastru. La amurg, timpul când soarele răsare si apune, când soarele este cu 10 grade sau mai puțin mai jos de linia orizontului, lumina e bogată cu raze mai lungi roșii, motiv pentru care in acele momente cerul este roșu. Hopkins (1999) explică faptul ca la amurg distanta de la soare la un observator pe pământ este de câteva ori mai lungă decât atunci când soarele este la mijlocul cerului. Ca rezultat, majoritatea luminii violete si albastre e răspândită, făcând lumina mai lungă portocalie si roșie vizibilă observatorului.

Efectul luminii asupra plantelor cultivate în condiții naturale de viață

Lungimile de undă au efecte diferite asupra plantelor si fotosintezei. Lumina violet-albastră este cea mai efectivă in fotosinteză. Pigmentul absorbant este clorofila colorată în verde. Lumina verde este cea cu eficiența cea mai scăzută, este mai mult reflectată de plantă ceea ce dă frunzelor plantelor culoarea verde. Lumina albastră și roșie sunt active in fotomorfogeneză, reglarea creșterii plantei prin lumină. Pigmenții implicați in absorbția acestei lumini sunt responsabili pentru fototropism, răspunsul direcțional al plantelor la lumină (Moore, 2003).

Alte procese afectate de fitocrom sunt mișcarea frunzelor, sensibilitatea fototropică, alungirea frunzelor si tulpinii, sinteza clorofilei,activarea enzimelor, sinteza proteinelor, dezvoltarea rădăcinilor, formarea rizomilor si bulbilor.

Calitatea luminii e de asemenea importantă in grădinăritul din interior. Descoperirea despre rolul luminii in fotosinteză a fost larg aplicată in iluminarea artificială.

Efectul luminii asupra fitoinoculilor

Formarea rădăcinilor a fost stimulată de lumina roșie (cu lungimea de undă de 660 nm) (Murashige, 1974).

După Maene și Debergh (1985) natura luminii (respectiv lungimea de undă a acesteia) s-a dovedit a fi mai puțin importantă în faza de creștere în lungime a tulpinițelor, intensitatea luminoasă (100 mol m-2 s-1) condiționând, calitatea răsadurilor materialului de plantat și înrădăcinarea. O intensitate scăzută a luminii, de 30 mols-1m-2 a fost necesară pentru a induce o elongație uniformă a tulpinițelor, în primele 3 săptămâni.

Fuernkranz și colaboratorii (1990) au constatat că, lumina galbenă (475 – 750 nm) a determinat creșterea numărului de rădăcinițe/lăstar, în schimb, lumina albastră (400 – 524 nm) a stopat complet rizogeneza.

La concentrații mici, fiziologic stimulatoare, auxinele exercită o acțiune benefică asupra creșterii vitroplantulelor,dar, auxina nativă sau AIA de sinteză, administrate exogen, sunt fotooxidabile și sunt degradate de către radiațiile ionizante, de razele UV, de peroxizi etc. (Bellamine, 1998).

La calus friabil și compact de Caustis blakei (Webber și colab., 2003) a fost descris efectul produs de patru tipuri de iradieri luminoase, asupra organogenezei. Autorii au menționat faptul că, cea mai eficientă organogeneză a fost identificată la calusul friabil, iradiat puternic, cu 300 µmol m-2 s-1. Utilizându-se pentru iluminarea vitroculturilor lumina roșie, s-a constatat că, aceasta a indus stimularea rizogenezei la trandafir (cv. Sonia și cv. Sabrina) și la gerbera (cv. Rebecca) (Podwyszyńska și Gabryszewska, 2003).

S-au efectuat studii referitoare la urmărirea acțiunii luminii de natură diferită, asupra evoluției vitroculturilor de Coleus și au observat faptul că, lumina albastră și cea verde, în comparație cu cea roșie și portocalie, a stimulat creșterea vitroplantulelor (Radoveț-Salinschi și Cachiță, 2004). Un aspect particular o are și iluminarea vitroplantulelor, după transferarea lor în mediul normal de viață (Petruș – Vancea și Cachiță, 2004, 2008; Petruș – Vancea, 2009).

Caracteristicile lămpii UV

Lămpile bactericide de tip LBA-e (Fig. 1) – precum aceea utilizată de noi în experimentele care fac obiectul prezentei lucrări de licență – acționează distructiv prin intermediul radiației ultraviolete de lungime de undă bine determinată asupra microorganismelor aflate în aer sau pe suprafețele supuse acestor radiații.

Lungimea de undă a acestor radiații (253,7 nm) reprezintă un maxim pentru efectul bactericid și este garantată de firma constructoare a tubului UV folosit. Tubul folosit a fost de 30W (Manual utilizare lampă UV, 2011).

După montarea la locul de utilizare, lampa se pune sub tensiune (după caz) prin acționarea întrerupătorului de rețea sau introducerea ștecherului în priză. În timpul funcționării normale, tubul cu ultraviolete emite o lumina continuă de culoare bleu-albăstruie și o radiație electromagnetică (253,7 nm) care are o acțiune bactericidă asupra aerului și suprafețelor iradiate.

Lămpile bactericide au următoarele părți funcționale (Fig. 1):

Lampă bactericidă

Dispozitiv de orientare

Piesă de legătură cu stativul (stut)

Stativ mobil

Întrerupător

Ștecher cu împământare

Programator (opțional)

Fig. 1. Lampă UV mobilă, utilizată în experimentele care fac obiectul lucrării de licență (Manual utilizare lampă UV, 2011).

Lampa cu ultraviolete are timpuri diferite de folosire pentru obținerea unui nivel optim de dezinfecție a aerului dintr-un spațiu cu o încărcătură microbiană determinată (Fig. 2).

Fig. 2. Nivelele de dezinfecție ale lămpii UV mobile utilizată în experimente (Manual utilizare lampă UV, 2011).

4. DESCRIEREA SPECIILOR STUDIATE

4.1. Sequoia sp.

Denumirea științifică Sequoia (Fig. 3) a fost dată plantelor în amintirea conducătorului indian numit ,‚Sequoyah’’. Cea mai importantă rezervație naturală cu Sequoia este Parcul Național Sequoia, din regiunea centrală a statului California, înființat în anul 1890.

Regn: Plantae

Încrengătură: Gymnosperme

Ordin: Pinales

Familie: Cupressaceae

Gen: Sequoiadendron

Specie: Sequoia sp.

Fig. 3. Specii ale genului Sequoia, încadrare sistemică (http://en.wikipedia.org/wiki/Sequoiadendron_giganteum).

Speciile genului Sequoia sunt specii de conifere gigant care cresc mai ales pe versantul apusean al Sierrei Nevada, în Californa. Au frunze aciculare, ca niște solzi, lipite de rămurele. Conurile cu semințe sunt brun roșcate, ovoide, nu mai lungi de 5-8 cm.

La maturitate arborii genului Sequoia sunt dintre cei mai înalți copaci din lume, specimene cu înălțimea de 94 m și 17 m în diametru au fost găsiți. Specimenele ce ajung la maturitate pot trăi mii de ani, cel mai bătrân găsit fiind vechi de aproximativ 3000 de ani cu o

creștere inregistrată de aproximativ 40 metri cubi pe an, ceea ce ar putea fi copacul cu cea mai rapidă creștere (Aune, 1994)

Lemnul de Sequoia este mult utilizat în industria de prelucrare a lemnului, fiind folosit îndeosebi la confecționarea articolelor de mobilier, a elementelor de construcție (uși, ferestre, etc.) și a structurilor caselor din lemn; în trecutul nu prea îndepărtat, arborii de Sequoia au fost utilizați la confecționarea traverselor de cale ferată, datorită durității și a rezistenței lor în timp. Produsele fabricate din acest material sunt deosebit de apreciate, atât datorită aspectului plăcut, cât și grație durabilității lor, lemnul de Sequoia fiind rezistent la atacul dăunătorilor de natură fungică, bacteriană, precum și la cel al insectelor.

Culturile in vitro la Sequoia sp. au fost inițiate încă din anul 1950, când au fost vitrocultivate explante prelevate din țesut cambial. Ulterior, au fost utilizate explante prelevate de la diferite organe ale plantelor de Sequoia (Ball, 1950).

Timp de mulți ani a fost crezut că arborii sunt fără insecte si boli și capabil sa reziste la fenomenele naturale ale incendiilor și inundațiilor. Cercetările însă au arătat că semințele sunt susceptibile la foc, de asemenea arborii cei mai înalți pot avea probleme cu propria greutate. Incendiile repetate pot slăbi structura copacului si pot permite intrarea fungilor în interiorul acestuia (Ball, 1950).

Mortalitatea in exemplarele bătrâne este de obicei cauzată prin căderea acestora din cauza slăbirii structurii, descompunerea rădăcinilor sau cantități excesive de zăpadă. Sequoia cei mai înalți au fost dovediți având abilitatea de a sta ferm în fața vântului puternic, în ciuda înălțimii si a coronamentului mare si expus.

4.2. Drosera rotundifolia L.

Drosera rotundifolia L. (roua cerului) (Fig. 4) este o planta insectivoră care se găsește în unele mlaștini și bălți, care ulterior sunt declarate arii protejate. Această specie a fost categorizată ca fiind pe cale de dispariție în unele zone din S.U.A. și în zonele unde era găsită frecvent. Detaliile mecanismului de hrănire ale acestei plante au fost prima dată descrise în secolul nouăsprezece (Darwin, 1975), descriind natura complicată a atacului pe neașteptate asupra insectelor. Drosera rotundifolia este una din cele mai răspândite specii ale genului său. Nu doar că este găsită in majoritatea Siberiei,Europei de nord și Americii de nord, dar apare și in părți ale Japoniei și ajunge până în Korea de sud și Noua Guinee, unde condițiile de sol și umiditate sunt favorabile (Legasy, 1995).

Regn: Plantae

Încrengătură: Angiosperme

Ordin: Caryophyllales

Familie: Droseraceae

Gen: Drosera

Specie: Drosera rotundifolia L.

Fig. 4. Aspecte ale speciei Drosera rotundifolia, încadrare sistemică (http://en.wikipedia.org/wiki/Drosera_rotundifolia).

În Europa de Vest specia a fost intens studiată în Anglia și Scoția. Localizarea din Europa include mare parte din Franța,Germania,Benelux,nordul Portugaliei și Spania. În Scandinavia și insulele nordice ale Europei, D. rotundifolia se găsește în Suedia, Finlanda,Danemarca și de asemenea în sudul Norvegiei si Islanda.

America de nord regiunile Canadei manifestă oportunități majore pentru specie, în afară de tundră și preerii (Legasy, 1995).

Înălțimea unei plante individuale este variabilă și poate ajunge până la 25 cm, deși de obicei este mult mai mică in statură. Diametrul caracteristic al unei plante adulte este de 2 cm pana la 5 cm. Structura frunzei se manifestă într-o rozetă, de la centrul căreia apare o tulpină subțire cu flori albe sau roz. Florile sunt suportate asimetric pe o parte a tulpinii. Fiecare floare are 5 petale. Semințele de culoare maro deschis ale speciei sunt de 1 mm până la 1.6 mm lungime cu o forma conică. Frunzele plantei sunt atașate cu un pețiol subțire cu lungime de 1 cm până la 5 cm (Legasy, 1995).

Mecanismul carnivor. Goodale (1885) explică faptul că o trăsătură răsunătoare a speciei D. rotundifolia este aranjamentul gros de peri glandulari pe frunze, de la vârful fiecăreia se secretă o picătură de lichid vâscos transparent. Perii de la margine au o statură mai alungită și sunt terminate in glande de culoare purpurie. Perii de la mijloc sunt mai scurți in lungime si manifestă tulpini verzi cu glande ovoide.

Când un animal atinge glandele interioare ale speciei D. rotundifolia perii marginali încep să facă o mișcare de închidere. După aceea frunza plantei se închide rapid asupra prăzii.

Darwin (1975) a fost primul care a observat că un obiect cu masă și de 0.0008 mg poate iniția mișcarea perilor glandulari in modul de capturare. De asemenea Darwin a observat că excitația crește dacă prada are chimicale azotate extractibile. În acest caz se emană o secreție acidă care accelerează dezintegrarea si digestia prăzii. Dacă o pradă încearcă sa scape, ea excită glandele mai mult ceea ce accentuează activitatea glandulară.

5. CERCETĂRI PROPRII PRIVIND EFECTUL RAZELOR UV ASUPRA ORGANOGENEZEI LA NIVELUL FITOINOCULILOR

5.1. Scopul cercetărilor

Scopul cercetării a constat în identificarea efectelor razelor ultraviolete asupra organogenezei in vitro la Sequoia sp. și Drosera rotundifolia L.

Ipoteza de la care am plecat în cercetările noastre a fost aceea că, razele UV, aplicate în intervale de timp scurte pot asepsiza aerul din camera de creștere, fără afectarea fitoinoculilor.

Motivația alegerii temei

Tratamentul cu raze UV se aplică în camerele de creștere a vitroculturilor, în unele situații de suspiciune a unei infecții fungice sau bacteriene, fiind o soluție în asepsizarea aerului din încăpere. Pe de altă parte, razele UV pot avea o acțiune nociva fenotipică sau chiar genotipică asupra plantelor, motiv pentru care, mi-am propus ca în urma studierii efectului razelor UV asupra unor specii vegetale aflate în stadiul de incubare și creștere in vitro, să identific a posibila durată de acțiune lampei UV de 30 W, care să nu afecteze organogeneza fitoinoculilor.

Am ales doua specii variate de plante, și anume: arborele vieții (gimnosperm) și roua cerului (angiosperm – dicotiledonat), deoarece au cerințe eco-fiziologice diferite.

5.2. Material și metodă

Protocolul experimental este prezentat în tabelul 1.

Tabelul 1 Protocol experimental.

Materialul vegetal a constat din minibutași binodali de Sequoia, respectiv propaguli uniformi de Drosera rotundifolia L. (Fig. 5), cultivați în fitobaza laboratorului de biotehnologie al Departamentului de Biologie, a Facultății de Științe, pe medii de bază Murashige-Skoog (1962), lipsite de regulatori de creștere, solide.

După repicare, recipientele cu fitoinoculii, amplasați pe un mediu de cultură similar cu cel descris anterior, au fost menținute timp de 90 de zile în condiții de iluminare cu o intensitate de 1700 lx, emisă de tuburi fluorescente albe, dispuse la 80 cm deasupra recipientelor, la o temperatură de 23 ± 2 șC, cu o fotoperioadă de 8 h întuneric/24 h.

Vitroplantulele au fost împărțite în trei loturi (V0, V1 și V2). Toate cele trei loturi au fost menținute în condiții de creștere mai sus descrise, dar două loturi de vitroplantule au fost izolate zilnic cu folie de aluminiu, timp de 5 minute, respectiv 15 minute și tratate cu lumină UV emisă de o lampă mobilă de UV de 30 W, utilizată în asepsizarea aerului camerei de inoculare, menținută la o distanță de 80 cm de recipiente (Fig. 6).

A B

Fig. 5. Aspecte minibutașilor de Sequoia sp (A) și ale propagulilor de roua cerului (Drosera rotundifolia L.) (B), în prima zi de la inoculare (bara reprezintă 1 cm).

A

B

Fig. 6. Aspecte ale camerei de incubare și creștere a vitroculturilor sub lumină UV (stg) și sub lumină fluorescentă (dr.) (A) și lampa UV în acțiune (B).

5.3. Rezultate și discuții

5.3.1. Rezultate privind studiul efectului razelor UV asupra fitoinoculilor de Sequoia sp.

A. La 30 de zile de la inoculare indicii de creștere ai vitroplantulelor de Sequoia sp. au suferit inhibiții, la loturile menținute 5 minute sau 15 minute sub UV, comparativ cu lotul martor, unele semnificative din punct de vedere statistic (Tabelul 2).

Un aspect deosebit de important semnalat este însă, pe lângă faptul că nu au apărut infecții la loturile testate acela că procesul de calusogeneză, atât de frecvent întâlnit la această specie, chiar și în absența regulatorilor de creștere din mediul de cultură, a fost stopat. Calusul apărut la baza fitoinocului este – în general – cauza principală a absenței, în totalitate, a rizogenezei la această specie, în condițiile cultivării ei in vitro.

Tabelul 2 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Sequoia sp., la 30 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V1- UV – 5 minute

V2- UV – 15 minute

Notă: – media (cm), S – abaterea standard, ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

B. La 60 de zile de la inoculare s-a păstrat tendința semnalată la o lună de la inoculare. A fost remarcată inhibiția calusogenezei (Tabelul 3, Fig. 8).

Tabelul 3 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Sequoia sp., la 60 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V1- UV – 5 minute

V2- UV – 15 minute

C. La 90 de zile de la inoculare vitroplantulele lotului menținut sub iluminare timp de 5 minute (V1) au fost scoase din experiment, din motive tehnice. Indicii de creștere au fost mici la lotul tratat 15 minute cu UV (Tabelul 4, Fig. 7).

Deosebit de important în acest stadiu al experimentelor a fost neogeneza rădăcinițelor la baza fitoinoculilor (Fig. 7).

Tabelul 4 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Sequoia sp., la 90 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V2- UV – 15 minute

Notă: – media (cm), S – abaterea standard, ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

A B

Fig. 7. Aspecte ale vitroplantulelor de Sequoia sp., la 90 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă (A); V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h (B); V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h (B) (bara reprezintă 1 cm).

5.3.2. Aspecte morfo-anatomice ale vitroplantulelor de Sequoia sp.

Din punct de vedere morfologic, plantulele menținute câte 15 minute/24 h sub lumină UV erau normal conformate, cu o pigmentație intensă, fără modificări fenotipice (Fig. 8 și Fig. 9).

A B

C D

Fig. 8. Aspecte ale vitroplantulelor de Sequoia sp. la 90 de zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă (A); V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h (B); detaliu de calus format la baza fitoinoculilor lotului martor (C – 0,6X); detaliu de tulpiniță iradiată timp de 90 de zile cu UV, timp de 15 min/24 h (D – 0,4 X) (săgeata indică formațiunea calusală; bara indică 1 cm).

A B

Fig. 9. Aspecte ale vitroplantulelor de Sequoia sp. la 90 de zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă (A); V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h (B), scoase din recipientele de cultură (bara reprezintă 1cm).

Din punct de vedere anatomic, nu am identificat modificări în structura tulpiniței vitroplantulelor iradiate cu UV, timp de 15 minute zilnic (Fig. 10 A).

La exteriorul tulpiniței se află epiderma, urmată de un țesut parenchimatic bine reprezentat, în cadrul căruia, dispuse pe un singur cerc erau fasciculele conducătoare libero-lemnoase cu liberul spre exterior și lemnul spre interior. Celulele parenchimatice erau bine structurate, fără spații celulare largi, cu pereții normali, fără urme de hiperhidrie sau alte modificări (Fig. 10 B). Vasele lemnoase au fost dispuse radiar (Fig. 10 C).

A B

C

Fig. 10. Aspect ale structurii tulpiniței de Sequoia sp. la 90 de zile de creștere sub iradiere cu UV,câte 15 minute/24 h (A – 100X), detaliu de țesut parenchimatic (B – 400X) și detaliu de țesut conducător (f.c. –fascicul conducător libero-lemnos; p.f. – parenchim fundamental; mdv – măduvă; x – xilem) (C – 200X).

5.3.3. Rezultate privind studiul efectului razelor UV asupra fitoinoculilor de Drosera rotundifolia L.

A. La 30 de zile de la inoculare rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos. Indicii de creștere sunt inhibați de prezența razelor UV. Din perspectiva prelucrării statistice inhibițiile au fost distinct semnificativă sau chiar foarte semnificative (Tabelul 5).

Tabelul 5 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 30 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V1- UV – 5 minute

V2- UV – 15 minute

Notă: – media (cm), S – abaterea standard, ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

B. La 60 de zile de la inoculare s-a păstrat tendința din prima lună de creștere, înregistrându-se temporizări ale creșterii fitoinoculilor (Tabelul 6).

C. La 90 de zile de la inoculare indicii de creștere privind rizogeneza, respectiv numărul de rădăcinițe și lungimea rădăcinițelor au marcat inhibiții semnificative statistic în cazul lotului menținut timp de 5 minute sub acțiunea UV (Tabelul 7). O imagine de ansamblu a monitorizării creșterii vitroplantulelor de roua cerului pe parcursul celor 90 de zile de vitrocultură este prezentată în figura 11.

Numărul propagulilor nu a fost semnificativ superior variantelor tratate cu UV, comparativ cu lotul martor, în schimb, dimensiunea medie a rozetelor a fost distinct semnificativ inhibată la plantulele menținute fie 5 minute, fie 15 minute sub lumină UV (Fig. 12).

De asemenea, radiația UV a inhibat semnificativ formarea de tije florale (Tabelul 7).

Tabelul 6 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 60 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V1- UV – 5 minute

V2- UV – 15 minute

Notă: Notă: – media (cm), S – abaterea standard, ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Tabelul 7 Prelucrarea statistică a datelor biometrizate la nivelul vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L., la 90 zile de creștere sub diferite tipuri de iluminări: V0 – lumină albă fluorescentă; V1 – lumină UV de 30 W, timp de 5 min./24h; V2 – lumină UV de 30 W, timp de 15 min./24h.

V0-martor

V1- UV – 5 minute

V2- UV – 15 minute

Notă: ± S (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor – în cm), s2 – varianța, p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): ns – diferența nesemnificativă, * – diferența semnificativă, ** – diferența distinct semnificativă, *** – diferența foarte semnificativă.

Fig. 12. Valori procentuale ale indicilor de creștere la vitroplantulele de Drosera rotundifolia L., la 30, 60 și 90 de zile de creștere în condiții de iradiere, timp de 5 min./24 h (V1) și de 15 min./24h, sub lampă UV de 30W (V2), comparativ cu lotul martor, neiradiat (V0), considerate ca fiind 100%.

În ansamblu, pe parcursul experimentului, la roua cerului am identificat o temporizare a creșterii la variantele menținute un anumit timp sub lampa de UV (Fig. 12).

A B C

Fig. 12. Aspecte ale vitrotufelor de Drosera rotundifolia L., la 90 de zile de creștere în condiții de iluminare cu lumină albă – martor (A), cu tratament de 5 min./24 h cu lampă UV de 30W (B) și cu menținere de 15 min./24h sub lampă UV de 30W (C) (bara reprezintă 1 cm).

5.3.4. Prevenirea infecțiilor în camera de creștere

Chiar dacă uneori a fost demonstrată existența unei conviețuiri între un fung și vitroplantule de roua cerului (Cachiță și colab., 2008), apariția de infecții în recipientele de cultură nu este una dorită, dimpotrivă, conduce la pierderea culturilor și pagube uriașe producătorilor industriali.

După cum se poate observa în figura 13, procentul de infecții, cu specii de mucegai (Fig. 14) a fost nul la loturile menținute sub iradiere UV tip de 5 minute, respectiv 15 minute.

Fig. 13. Exprimarea procentuală a infecțiilor apărute la nivelul fitoinoculilor de Drosera rotundifolia L., la 90 de zile de creștere în condiții de iluminare cu lumină albă – martor (V0), cu tratament de 5 min./24 h cu lampă UV de 30W (V1) și cu menținere de 15 min./24h sub lampă UV de 30W (V2).

Pentru producătorii industriali, apariția unor infecții poate conduce la pierderi mari. Problema infecțiilor este una majoră. În general, ele se iau în calcul de către producători, iar în primele zile de la se procedează la înlăturarea lor din camera de creștere, pentru a nu se extinde. Aceste infecții pot fi de natură bacteriană (Gram pozitive: Actinomyces, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus sau Gram negative: Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Achromobacter, Agrobacterium etc.) sau de tip fungic (Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Alternaria, Trichoneme, Candida, Botrytis, Fusarium, Mucor, Rhizopus etc.). Recipientele infectate se îndepărtează și se sterilizează prin autoclavare, prealabil deschiderii lor, pentru a împiedica contaminarea atmosferei din laborator cu germeni sau cu spori.

A B

Fig. 14. Tipuri de infecții apărute la 30 de zile de la inoculare, la nivelul recipientelor care nu au beneficiat de tratamente cu raze UV (martor) (bara reprezintă 1cm).

Posibile cauze ale apariției infecției ar putea fi: incorecta sterilizare a mediilor de cultură, a recipientelor, a instrumentarului necesar inoculării, a unor erori de inoculare, dar în toate aceste cazuri, apariția infecției trebuia să fie în primele 5-7 zile de la inoculare. O altă ipoteză ar fi existența unui material vegetal bolnav, în vitrocultură anterioară, dar aceasta nu este susținuta de faptul că, dintr-o tufa aflată în vitrocultura s-au subcultivat propaguli în aproximativ 10 recipiente noi, iar infecția noastă a fost un caz singular. Probabil că, sporii fungului sunt în camera de creștere și pătrund prin folia de polietilena în zonele sensibile ale acesteia.

La sparanghel, a fost studiat chiar un așa numit fenomen de cocultură spontană de către Cachiță și colaboratorii (2008 a și b), iar Petruș și colaboratorii (2011) au studiat fenomenul de cocultură indusă. Autorii au concluzionat că în urma cultivării controlate în regim de cocultură indusă, creșterea unui fung, cu fitoinoculii de Asparagus officinalis L. nu afectează cele două specii, nici pozitiv nici negativ. Fitoinoculul nu este infectat de către fung, în cocultură.

În cercetările noastre care fac obiectul prezentei lucrări de licență a apărut aceeași specie de fung, Cladosporium sp. (Fig. 14 B), cu o manifestare similară celor descris anterior, fapt ce semnalează existent lui în camera de creștere a vitroculturilor, dar și un mucegai alb (Fig. 14 A), încă nestudiat de noi.

5.4. Concluzii

Radiațiile UV de 30 W, aplicate timp de 5 minute și 15 minute fitoinoculilor de Drosera rotundifolia L. au condus la eliminarea infecțiilor apărute pe parcursul a 90 de zile, dar și la temporizare creșterii în vitrocultură, motiv pentru care, dacă se dorește și menținerea în cultură pentru o perioadă mai îndelungată și rărirea intervalului de repicare, recomandăm acest tratament.

Iradierea timp de 15 minute pe zi, a vitroplantulelor de Sequoia sp. a condus la inhibarea procesului de calusogeneză și startarea rizogenezei, aspect deosebit de important la această specie recalcitrantă la aclimatizarea ex vitro tocmai din cauza apariției calusului la baza fitoinoculului și a absenței sistemului radicular.

La ambele specii, iradierea a determinat temporizarea creșterii și prevenirea în totalitate a infecțiilor.

6. BIBLIOGRAFIE

Aune, P.S., 1994, Proceedings of the Symposium on Giant Sequoias: Their Place in the Ecosystem and Society, June 23-25, 1992. USDA Forest Service Gen. Tech. Rep.PSW-151, Visalia, California.

Ball E.A., 1950, Differentiation in a callus of Sequoia sempervirens, Growth 14(4), pp. 295-325.

Bellamine, J., Penel, C., Greppin, H., Gaspar, Th., 1998, Confirmation of the role of auxin and calcium in the late phases of adventitios root formation. Plant Growth Regulation, 26, pp. 191-194.

Cachiță, C.D., Deliu, C., Rakosy – Tican, L., Ardelean, A., 2004, Tratat de biotehnologie vegetală. Vol. 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca.

Cachiță, C.D., Turcuș, V., Petruș – Vancea, A., Barbu – Tudoran, L., Crăciun, C., 2008 a, Drosera rotundifolia L. vitrocultures associated with a saprophyte fungus. Studia Univ. Vasile Goldiș, Seria Șt. Vieții, 18, pp. 103 – 106.

Cachiță, C.D., Turcuș, V., Hurgoiu, F., Petruș – Vancea, A., 2008 b, Coculturi de durată produse spontan, între fitoinoculi și un fung saprofit. În: Lucrările celui de al XVI – lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale, București, intitulat ”Biotehnologii vegetale pentru sec. XXI”, Cachiță, C.D., Brezeanu, A., Ardelean, A. (eds.), Editura Risoprint, Cluj – Napoca, pp. 185-193.

Cerdan, P.D., Chory, J., 2003, Regulation of flowering time by light quality. Letters to Nature 423, pp. 881-885.

Cline, M.N., Neely, D., 1983, The histology and histochemistry of wound-healing process in geranium cuttings. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 108, pp. 496–502.

Darwin, Ch., 1875, Insectivorus plants. Editura John Murray, London, p. 462.

Devlin, R., 1975, Plant Physiology, 3rd ed. New York.

Fuernkranz, H.A., Nowak, C.A., Maynard, C.A., 1990, Light effects on „in vitro” adventitious root formation in axillary shoots of mature Prunus serotina. Physiol. Plant., 80, pp. 337 – 341.

Gautheret, R.J., 1966, Factors affecting differentiation of plant tissues grown in vitro. Ed. W. Beermann, North Holland Publ.Co. Amsterdam.

Goodale, G.L., 1885, Physiological botany: Outlines of the histology of phaenogamous plants. Vegetable physiology, Volumul 2. Ivison, Blakeman.

Hopkins, W.G., 1999, Introduction to Plant Physiology. ed. 2 ,Wiley.

Khachatourians, G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W., Hui, Y.H., 2002, Transgenic Plants and crops. Marcel Dekker, Inc.

Kwon, S.V., Jeong, Y.J., Lee, H.S., Kim, J.S., Cho, K.Y., Allen, R.D., Kwak, S.S., 2002, Enhanced tolerances of transgenic tobacco plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against methyl viologen mediated oxidative stress. Plant, Cell and Environment, 25, pp.873–882.

Lee, T.T., Skoog, F., 1965, Effects of hydroxybenzoic acids on indoleacetic acid inactivation by tobacco callus extracts. Physiol. Plant 18, pp. 577-585.

Legasy, K., LaBelle-Beadman, S., Chambers, B., 1995, Forest Plants of Northeastern Ontario. Lone Pine Publishing, Ontario.

Maene, L.J., Debergh, P.C., 1985, Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rooting in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 5, pp. 23 – 33.

Moore, R., Clark, W.D., Vodopich, D.S., 2003, Botany. 2nd ed. New York, NY: Mcgraw-Hill companies.

Murashige, T., 1974, Plant propagation though tissue culture. Ann. Rev. Plant. Physiol. 25, pp. 135 – 166.

Murashige, T., Skoog, F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues cultures. Physiologia Plantarum, 15, pp. 155-159.

Narusaka, Y., Narusaka, M., Seki, M., Umezawa, T., Ishida, J., Nakajima, M., Enju, A., Shinozaki, K., 2004, Crosstalk in the responses to abiotic and biotic stresses in Arabidopsis: Analysis of gene expression in cytochrome P450, gene superfamily by cadmiuNA microarray. Plant Mol. Biol., 55., pp. 327-342.

Petruș – Vancea, A., 2009, Biochemical analyses of Cymbidium hybridum exvitroplantlets lighted up with different light types, during their acclimatization on the septic medium. Scientific Bulletin Serie F, Vol. XIII, Biotechnology, pp. 10 – 17.

Petruș – Vancea, A., 2013, Biotehnologie vegetală – Curs litografiat. Universitatea din Oradea.

Petruș – Vancea A., Cachiță, C.D., 2004, Studierea influenței exercitate de natura luminii în aclimatizarea exvitroplantulelor. pp. 138 – 151. În: Cachiță, C.D., Ardelean, A. (eds) Lucrările celui de al XIII -lea Simpozion Național de Culturi de Țesuturi și Celule Vegetale „Vitroculturile la cormofite, modele experimentale în cercetările de biologie”. Editura Bion.

Petruș – Vancea, A., Cachiță, C.D., 2008, Biochemical determinations made on African violets (Saintpaulia ionantha) exvitroplantlets, being illuminated during their acclimatization to a septic medium, with different types of light. Studia Univ. Vasile Goldiș, Seria Șt. Vieții, 18, pp. 87 – 92.

Petrus-Vancea, A., Cachiță, C.D., Turcuș, V., Ipate, I., Purcărea, C., 2011, Induced in vitro co-culture between Asparagus officinalis L. phytoinocula and a saprophytic fungus, Studia Univ. Vasile Goldiș, Seria Șt. Vieții, vol 21 (3), pp. 619- 624.

Podwyszyńska, M., Gabryszewska, A., 2003, Effect of red light on ex vitro rooting of rose and gerbera microcuting in rockwool. pp. 237 – 243. In: Economou, A.S., Read, P.E. (eds.) Proceedings of the first international symposium on acclimatization and establishment of micropropagated plants. Acta Horticulturae, 616.

Popovski, K., Popovska – Vasilevska, S., 1998, Energetical factors of the greenhouse climate. pp. 133 – 145. In: Popovski, K., Rodrigues, A.C. (eds.) Heating greenhouses with geothermal energy. Published by Institute for Innovative Technologies of Azores Inova, Ponta Delgada (Azores, Portugal).

Rab, A., Saltveit, M.E., 1996, Differencial chilling sensitivity in cucumber (Cucumis sativus) seedlings. Physiol. Plant. 96., pp. 375-382.

Radoveț-Salinschi, D., Cachiță, C.D., 2004, Conținutul în pigmenți asimilatori în frunzulițele vitroplantulelor de Coleus blumei Benth., culturi iluminate cu lumină de culori variate. Analale Societății Naționale de Biologie Celulară. IX/1, pp. 387 – 391.

Roșu, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicații în ameliorare. Editura Ametist-92, București.

Sastri, R.L.N., 1963, Morphogenesis in plant tissue cultures.Int.Soc.,Plant morphologists. Delhi.

Skoog, F., Miller, C.O., 1957, Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11, pp. 118–130.

Stănică, F., 2004, Microînmulțirea plantelor horticole, Editura INVEL-Multimedia București.

Stobbe, H., Schmitt, U., Eckstein, D., Dujesiefken, D., 2002, Developmental stages and fine structure of surface callus formed after debarking of living lime trees (Tilia sp.). Ann. Bot. (Lond.) 89, pp. 773–782.

Timir, B.J., Biswajit, G., 2005, Plant Tissue Culture. Universities Press India.

Webber, J., Johnston, M.E., Wearing, A.H., 2003, High irradiance increases organogenesis in friable callus of Caustis blakei. (Cyperaceae). In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant, 39, pp. 139–141.

Whiting, D., Roll, M., Vickerman, L., 2010, Plant growth factors: light. Colorado State University: http://www.ext.colostate.edu/mg/Gardennotes/142.html, disponibil în data de 24.06.2014.

***, 2011, Biocomp – Manual de utilizare lampă bactericidă.

Pagini web:

http://en.wikipedia.org/wiki/Drosera_rotundifolia, disponibil in iunie 2014.

http://en.wikipedia.org/wiki/Sequoiadendron_giganteum, disponibil în iunie 2014.

7. ANEXĂ – Articol publicat din lucrare