Anexa IX Simulare format paginii [311158]

INTRODUCERE

Datorită interesului crescut vis a [anonimizat] a unor sortimente de mezeluri din carne de porc precum și rolul unor terpenoide ca și agenți cu activitate bacteriostatică/bactericidă asupra parametrilor de calitate a acestor produse din carne de porc. Este cunoscut faptul că salvia a făcut și face parte din rutina zilnică a numeroaselor comunități din diferite părți ale globului ([anonimizat], [anonimizat]). Astfel, [anonimizat], medicament sau ca aditiv în scopul ameliorării unor arome. Datele din literatura de specialitate arată o [anonimizat], polifenolilor și acțiunea antimicrobiană a acestora. Prezența acestor compuși chimici rezultați din metabolismul secundar al plantei a determinat ca salvia să prezinte un mare interes pentru industria alimentară și în particular pentru industria cărnii și a preparatelor din carne. Deasemenea, este important de subliniat că proprietatea bacteriostatică/bactericidă a acestor metaboliți secundari poate fi potențată prin acțiunea sinergică a altor substanțe organice și/[anonimizat] o preocupare intensă printre cercetătorii din domeniu o constituie modul sub care poate fi folosită această plantă medicinală în industria alimentară ([anonimizat], extract total standardizat sau planta ca atare după o minimă procesare fizică). [anonimizat], nitriților și nitraților adăugați in preparatele din carne de porc au rolul de prelungire a termenului de valabilitate și prin urmare de menținere a calității produselor prin inhibarea microorganismelor patogene. [anonimizat]. [anonimizat]. Totodată caracterul de antioxidant al compușilor din uleiul esențial de salvie oferă procesatorilor de carne flexibilitatea de a dezvolta produse noi cu o valoare nutritivă sporită și beneficii pentru sănătate și un profil general de calitate atrăgător.

Prezenta teză de disertație este structurată în două părți. Prima parte cuprinde o analiză a stadiului actual și posibilităților de creștere a conservabilității unor produse din carne de porc (cârnați, salam) prin adausul de salvie sub diferite forme ([anonimizat], cenușă, pudre și chiar părți întregi de plante proaspete) în componența rețetelor de fabricație a acestora și stabilirea parametrilor de apreciere a calității produselor în sensul definitoriu pentru securitatea acestor alimente destinate consumului uman direct. Partea a doua cuprinde : stabilirea unui procedeu optim pentru separarea și standardizarea uleiului volatil din salvie; evaluarea metodelor de determinare a caracteristicilor uleiului esențial de salvie respectiv a parametrilor de calitate microbiologică a produselor din carne cu adaos de ulei volatil de salvie; obținerea unor rezultate experimentale în cadrul Laboratorului de Tehnologii Animale din Facultatea TPA pentru evaluarea practică a modelului experimental propus în vederea obținerii unor produse din carne de porc care să satisfacă cerințele de calitate și securitate ale consumatorului european.

PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC

Capitolul 1. Stadiul actual al cunoașterii în domeniul strict al temei abordate

Salvia Officinalis – Considerații teoretice privind descrierea, habitatul și taxonomia

Salvia (Salvia officinalis) (figura 1.1) este un subarbust de cultură, cu baza lignificată, înalt până la 80 cm, cu tulpina dreaptă, cu frunze dispuse opus, ovate până la lanceolate, cu nervuri proeminente mai ales pe partea inferioară opozite, alb-lânoase sclipesc argintiu și emană un parfum ușor amar, aromatic. Florile se prezintă sub formă de spice de dimensiuni mici colorate în nuanțe de albastru-violet (rar albe). Florile de culoare albă sau roz sunt caracteristice salviei cu proprietăți aromatice (figura 1.2). Este considerată ca o plantă medicinală cu caracteristici aromatice și condimentare dar și decorativă. Primele atestări arheologice o situează ca fiind cultivată în regiunea Marii Mediteraneene dar și in regiuni din centrul și sud-estul Europei. Perioada de înflorire durează din mai până în iulie. [28]

Figura 1.1. Varietăți de salvie [5]

Salvia este cunoscută și sub denumirile de jale, jaleș, salbie, șalvir, șalet sau șerlai. Etimologic cuvântul salvie derivă din latinescul "salvare" (vindecare, însănătoșire) [54]. La ora actuală salvia este răspandită pe vaste regiuni din Europa, America și Orientul Mijlociu, fiind cunoscute peste 900 specii ale geniului salvia. Dintre acestea, în România au fost identificate peste 130 răspândite în sudul (zona litoralului și a deltei) și vestul țării (de regulă pe pajiștile din regiunile deluroase) [4]. De fapt astăzi genul Salvia este arhicunoscut atât de comunitatea de cercetători în domeniu dar și de omul obișnuit datorită compușilor prezenți în compoziția plantei utlizați fie în homeoterapie cât și în preparatele culinare.

Figura 1.2. Principalele părți din Salvia officinalis folosite ca sursă de pricipii active pentru industria cărnii

Efectele terapeutice ale salviei sunt de natură stomahic, coleretic, carminativ, astringent, ușor hipoglicemiant, hemostatic, estrogen, emenagog, antisudorific, antinevralgic, antiseptic, spasmolitic, cicatrizant. Deasemenea, ceaiul de slavie ameliorează stările inconfortabile ale femeilor aflate la menopauză. Producătorii de produse cosmetice și dentare folosesc extractele lichide, tincturile sau uleiul esențial de salvie ca ingrediente naturale în pastele de dinți, cremele de față sau de mâini. Totodată alături de proprietățile terapeutice ale salviei cercetările din domeniul chimiei și ingineriei alimentare au relevat faptul că salvia s-a dovedit a fi un antioxidant și agent antimicrobian natural pentru preparatele din carne.

Clasificarea taxonomică a salviei este prezentată în tabelul 1.1.

Tabelul 1.1.

Clasificarea din punct de vedere științific a genului Salvia/specia Salcia Officinalis L.

Sursa bibliografică: https://ro.wikipedia.org/wiki/Salvie

compoziția chimică a uleiului esențial de salvie

Uleiurile esențiale sunt cunoscute pentru proprietățile antioxidante și antimicrobiene, dar dozele mari de aceste uleiuri au fost, uneori, legate de neurotoxicitate și riscul de convulsii. În lumina preocupării, cercetătorii portughezi și spanioli au investigat utilizarea antioxidantă și antimicrobiană a salviei (Salvia officinalis L.), dar cu extracte de salvie pe bază de apă potențial mai sărace decât uleiul de salvie. Folosind frunzele și florile înflorite ale salviei, cercetătorii au produs infuzie de salvie, decoct de salvie și extract de salvie de metanol și apă. Atât activitatea antioxidantă, cât și activitatea antifungică la preparatele obținute prin decocție cât și la cele bazate pe extract de metanol și apă au fost mai eficiente decât la preparatele obținute prin de perfuzare. Creșterea speciilor de Candida, care sunt adesea legate de infecțiile fungice la om, a fost inhibată de salvie într-o manieră dependentă de doză. [6]

Conform articolului 16d alineatul (1), al articolului 16f și al articolului 16h din Directiva 2001/83 Comitetul pentru medicamente pe bază de plante (HMPC) a decretat ca pot fi utilizate pe teritoriul Uniunii Europene următoarelor extracte din frunze de Salvia officinalis:

Extract etanolic lichid (DER 1: 1), folosind ca solvent de extracție soluție70% alcool etilic;

Extract uscat (DER 4-7: 1);

Extract etanolic lichid (DER 1: 3,5-5), folosind ca solvent de extracție soluție 31,5% alcool etilic;

Extract etanolic (DER 1: 4-5) folosind ca solvent de extracție soluție 50% alcool etilic;

Extract etanolic (DER 1: 4-6) în etanol 96% V/V;

Tinctura (raportul de extracție material vegetal/solvent de extracție (etanol70%) 1:10) extract uscat din frunze proaspete (DER 1: 17-18), solvent de extracție etanol 68% V/V; [6].

Componentele biologic active conținute în uleiul esențial de Salviae Officinalis sunt numeroase și în proporții diferite. De regulă frunzele de salvie conțin în medie 1 până la 2,5% ulei volatil în funcție de umiditatea materialului vegetal [13]. Principalele clase de metaboliți secundari identificați în uleiul esențial de salvie precum și cele mai relevanți reprezentanți ai acestora sunt prezentate în continuare:

– hidrocarburile monoterpenice, cu miros puternic aromatizant, în funcție de varietățile de salvie pot atinge până la 35% din compoziția uleiului volatil. Exemple de hidrocarburi terpenice cel mai des întâlnite sunt: α si β –pinen, Δ3 -caren, mircen, γ-terpinen, sabinen, α-terpinen, p-cimen, allo-cimen, α-tuien, limonen, cis si trans-ocimen, terpinolen, camfen, [18];

– din clasa alcoolilor terpenoidici putem aminti: citronelol, linalolul, 1-4-terpinenolul, α-si β-terpineolul, 8-para-cimenolul, sabinol, borneolul, 4- trans –tuianolul, [9];

– ca și esteri terpenoidici și neterpenoidici putem exemplifica: acetatul de bornil, linalil, sabinil, terpenil și de geranil, dar și metil și/sau linalil izovaleriații, [18, 9];

– oxizii monoterpenici eucaliptolul sau 1-8-cineol se pot găsi în uleiul volatil de salvie în proporție de 32-42 %, [5].

– acizi polifenol carboxilici (acizii rosmarinic, clorogenic, nicotinic, cafeic, fumaric, p-cumaric, feluric, glicolic) variază în proporție de 4-5% [12, 19, 20];

– compușii triterpenici cum ar fi acizii crategolic, ursolic, oleanoic, sau germanicolul, izolupeolul, α și β –amirenolul, uvaolul, betulinolul pot atinge 1-2 % din compoziție, [1, 2];

– din clasa hidrocarburilor sesquiterpenice, în uleiul esențial de salvie întâlnim: β-carofilen, aromadendren, allo-aromdendren și δ-cadinen;

– cetonele terpenice (α respectiv β –tuiona, camfora) reprezintă între 20-70% din compoziția uleiului volatil de salvie [3, 4].

Sumarizând cele descriese mai sus putem concluziona că clasele de metaboliți secundari din plante sunt: compușii fenolici, glicozidele, terpenele, alcaloizii așa cum se arată în tabelul 1.2. [31].

Tabelul 1.2.

Principalii compuși activi aparținând diverselor clase de metaboliți secundari

Sursa-(Watson și Preedy, 2010)

Clasele de metaboliți secundari găsite în urma unor cercetări în cadrul plantelor din familia botanică Lamiaceae (cu predilecție rozmarin, salvie, lavandă) sunt: alcaloizi, monoterpe, triterpene, flavonoide, sescviterpene, fenilpropanoide.( Watson și Preedy, 2010) [30]

În funcție de clasa chimică metaboliții secundari descoperiți în plantele din familia Lamiaceae sunt enumerate în tabelul 1.3. [31].

Tabelul 1.3.

Clasificarea metaboliților secundari prezenți în plantele din familia Lamiaceae

Sursa-(Watson și Preedy, 2010) [31]

Industria procesării cărnii de porc folosește în primul rând o substanță esențială ca agent antimicrobian. Totuși, activitatea antimicrobiană a uleiului esențial este o funcție a compoziției uleiului esențial. Componentele individuale purificate ale uleiurilor esențiale sunt de asemenea evaluate pentru activitatea antimicrobiană în mai multe studii. [16] Componenta minoră a uleiului esențial întreg pare să joace un rol critic în activitatea antibacteriană, posibil prin producerea unui efect de sinergie între alte componente. [17]. Deși majoritatea uleiurilor esențiale și a constituenților lor sunt clasificate ca fiind în general considerate sigure (GRAS), utilizarea lor în preparatele de carne ca și conservant este adesea limitată datorită considerentelor de aromă, deoarece dozele antimicrobiene eficiente pot depăși uneori nivelurile acceptabile din punct de vedere organoleptic.

Proprietățile antibacteriene ale uleiurilor comune au fost atribuite prezenței de 1,8-cineol, thujonă și camfor. Cu toate acestea, în 2007, Pinto et al. a declarat că tujonele nu joacă un rol semnificativ împotriva drojdiilor și ciupercilor filamentoase [17].

PROCEDEE TEHNOLOGICE DE CONSEVARE A PREPARATELOR DIN CARNE DE PORC

Conservarea preparatelor din carne de porc se realizează prin procedee fizice, fizico-chimice și chimice.

Procedeele fizice implică de regulă ca agenți frigul și căldura. Tehnica frigului folosește fie temperaturi de refrigerare (0 – 4șC), fie temperaturi de congelare. Tratamentele termice la temperaturi ridicate folosite pentru conservarea preparatelor din carne de porc sunt cele de pasteurizare, sterilizare sau fierbere. În unele cazuri căldura este folosită și sub forma operației de uscare ceea ce conduce defapt la deshidratarea preparatelor din carne.

Procedeele fizico-chimice de conservare au la bază radiațiile electronice (catodice), electromagnetice (infraroșii și ultraviolete) și mecanice (microundele, ultrasunetele). Metodele chimice de conservare a preparatelor din carne de porc utilizează de regulă agenți chimici cu caracter antioxidant, bactericid sau bacteriostatic. Unii specialiști includ în această categorie de metode folosirea gazelor inerte (azot, freon, argon) [23, 27]. Substanțele cu caracter antioxidant au rolul de a preveni sau inhiba autooxidarea lipidelor din compoziția cărnii de porc fie prin interacțiunea directă cu radicalii rezultați in prima etapă de oxidare lipolitică prin donarea unui proton, fie prin reducerea vitezei de oxidare lipidică ca urmare a formării unor complecși cu ionii metalelor tranziționale (Fe2+, Fe3+ și Cu2+). Aceste metale prezente în compozișia preparatelor din carne au rolul de catalizatori ai reacțiilor enzimatice ce au loc sub acțiunea lipazelor, oxigenului sau chiar a radiațiilor luminoase în procesele de oxidare lipolitică.

Pe baza modului lor de acțiune, antioxidanții inhibă sau împiedică oxidarea; ele sunt din nou clasificate în două grupuri [25].

Acțiunea antioxidanților este dependentă de mai mulți factori dintre care mai importanți sunt energia de activare a complexului antioxidant – radicali liberi, viteza de reacție a procelului de oxidare lipolitică, susceptibilitatea la temperaturi ridicate, oxigenul atmosferic, respectiv lumină a compusului cu caracter antixidant, solubilitatea antioxidantului în masa cărnii. De asemenea structura chimică a compusului cu caracter antioxidant joacă un rol determinant în intreruperea reacției în lanț de oxidare a grăsimilor din preparatele de carne de porc. Astfel prezența în structura chimică a unui schelet aromatic sau de tip fenolic, împiedică, prin donarea protonului, propagarea in continuare a reacției de tip radicalic, antioxidantul devenind la rândul său un intermediar radicalic care prin delocalizarea electronilor din structura aromatică se stabilizează prin formarea unor structuri de tip chinonic.

Bioprezervarea utilizând agenți microbieni poate fi practică în produsele alimentare prin două metode de bază:

adăugarea de metaboliți microbieni bruți, semi-purificați sau purificați [15]

prin adăugarea de microorganisme pure și viabile. Utilizarea microorganismelor sau a metaboliților lor ca produse de conservare a alimentelor nu este o metodă primordială de conservare, ci o modalitate de a contribui la abordarea obstacolului în conservarea alimentelor [15].

Salvia este frecvent utilizată în cârnați de porc. Principalii compuși antioxidanți din salvie includ carnosol, acid carnosic, rosmadial, rosmanol, epirosmanol și metil carnosat[15]. Adăugarea de ulei de salvie esențial (3%) a condus la scăderea TBARS atât la carnea de porc brută cât și la carnea de porc gătită cu 75% și respectiv 86% în timp ce în carnea de vită și mânzat brută au scăzut doar cu 57% și cu 62% în comparație cu controlul [15].

Extractul de salvie, singur sau în combinație cu izoascorbat de sodiu, reducerea apei și a activității pH-ului, reducerea numărului de mezofile bacterii și coliformi în carnea de vacă ambalată în vid, dar a avut un gust mai bun în sosurile pentru gătit[15]. La puii procesați prin presiune înaltă, salvia a protejat pieptul de pui de oxidarea lipidelor în timpul depozitării la refrigerare timp de 2 săptămâni [15].

TEHNOLOGIA DE FABRICARE A CÂRNAȚILOR DIN CARNE DE PORC

Procesul tehnologic de fabricare a brânzei telemea este prezentat în schema operațională din figura 1.3. Pentru obținerea cârnaților din carne de porc procesatorii folosesc ca materii prime bradtul și carnea de porc proaspătă în raport de 2:1. Materiile auxiliare sunt reprezentate de piper, boiaua de ardei, usturoi proaspăt sau uscat sub formă de pulbere. Totodată pentru obținerea formelor, compoziția obținută prin amestecarea materiilor prime și auxiliare se introduce în mațe subțiri având diametrul cuprins între  16 – 18 cm. Procesul de obținere a produsului finit necesită parcurgerea următoarelor etape tehnologice ce trebuie respectate cu strictețe:

obținerea pastei de cârnaț;

umplerea mațelor cu pasta de cârnaț;

afumarea la cald;

fierberea bucăților de cârnați;

Figura 1.3. Schema tehnologică de obținere a cârnaților din carne de porc

răcirea;

controlul microbiologic al produsului finit;

depozitarea și ulterior livrarea în consum a cârnaților.

Obținerea pastei de cârnați presupune tocarea la volf a cărnii de porc maturată și răcită anterior prin sita de 3 mm. În continuare carnea măcinată se amestecă cu bradtul maturat fizic la temperatura de 4-6șC/ 24–48h, iar amestecul se prelucrează în continuare cu ajutorul cuterului. De asemenea în această fază se adaugă condimentele măcinate precum și apa răcită sau sub formă de solzi de gheață. Această operație este considerată terminată când compoziția obținută se prezintă sub forma unei paste omogene ce aderă pe mână.

Umplerea mațelor cu pasta de cârnați are ca scop obținerea preparatelor din carne sub formă de batoane și se desfășoară în două etape. Prima etapă vizează pregătirea mațelor pentru umplere care constă în verificarea rezistenței și a elasticității membranelor dar și a calității acestora din punct de vedere al salubrității se apreciaza rezistenta si elasticitatea acestora. A doua etapă constă în umplerea propriuzisă a mațelor cu pasta de cârnați. Executarea acestei faze se poate realiza manual sau mecanic cu ajutorul sprițului acționat hidraulic sau pneumatic. În această etapă operatorul trebuie să verifice dacă plerea mațelor s-a efectuat fără a exista goluri de aer. Operația de umplere cu pastă a mațelor este urmată de obținerea siragurilor de cârnați prin răsucirea matelor din 25 in 25 mm.

Afumarea caldă constă în așezarea siragurilor de cârnați pe rame și introducerea acestora în afumătoare unde inițial se încălzesc mai întâi la 40 – 45 C pentru uscare iar apoi se afumă la 75 – 80 C. Etapa se consideră încheiată în momentul cînd șiragurile de cârnați capătă o culoare brun roscată.

Fierberea cârnaților presupune introducerea barelor cu siragurile de cârnați în cazane cu apă fierbinte (70 – 75șC) și menținerea acestora în apă timp de 10 – 15 minute.

Răcirea cârnaților are loc la temperaturi de 10-15șC în bazine alimentate cu apă glacială. După răcire siragurile de cârnați sunt tăiate astfel încât să se formeze perechi.

PARTEA A II-A: CONTRIBUȚII PROPRII

Capitolul 2. Materiale și metode

2.1. OBȚINEREA EXTRACTELOR STANDARDIZATE DE SALVIE

Materialul vegetal utilizat pentru obținerea extractelor respectiv uleiului esențial de S. officinalis a provenit din două locații diferite și anume:

S.C. Pronatura S.R.L. Zalău (semințe certificate, puritate 90%, capacitate germinativă 65% și MMB 7.5 g);

Facultatea de Agricultură Craiova, câmpurile experimentale ale disciplinei de Fitotehnie. Semințele din această ultimă localitate sunt din recolta a trei ani diferiți(anul 2015, 2016 și 2017).

În vederea realizării cercetărilor, organele aeriene ale plantelor (flori, respectiv frunze) au fost recoltate în zile însorite din lunile iunie-septembrie ale anului 2017. Plantele au fost sortate manual și uscate la temperatura camerei. Ulterior, materialul vegetal uscat a fost măcinat cu ajutorul unei mori până la obținerea unei pulberi fine. Probele măcinate au fost ambalate etanș și depozitate la congelator până la folosirea ulterioară. Pentru extracție din pulberea obținută s-au cântărit la balanța analitică cu precizie de ± 0.0001g câte 10 g frunze, respectiv flori care ulterior s-au introdus într-un balon de 500 ml. Ca solvent de extracție s-a folosit soluția alcoolică de 70% (250 ml). Amestecul de reacție a fost lăsat la macerat la 20°C timp de 5 zile. După expirarea perioadei de extracție amestecul a fost filtrat sub vid moderat și apoi concentrat sub vid într-un rotaevaporator până la o treime din volumul inițial. Reziduul obținut a fost dizolvat în 25 ml apă distilată introdus într-o pâlnie de separare în care în prealabil s-au introdus 100 ml hexan. După separarea straturilor, faza apoasă a fost reextrasă de 2 ori la început cu acetat de etil (50 ml) și apoi cu butanol (50 ml). Extractul apos saturat cu butanol a fost concentrat în vid până aproape de sec obținându-se în final aproximativ 2.85 g respectiv 1.57g reziduu.

În vederea purificării extractelor de frunze respectiv flori de Salvia Officinalis L s-a utilizat tehnica flash cromatografică. Din extractele concentrate s-au luat volume de 30 ml în cazul extractului din frunze, respectiv de 20 ml în cazul extractului din flori filtrate în prealabil prin membrane filtrante PTFE având mărimea porilor 0.45 μm. Filtratele obținut au fost trecute pe coloane ISOLUTE Flash Si II condiționate prin eluare cu amestecul metanol: cloroform în raport de elauare 1:1.

Condițiile de eluare au fost:

– debit de 2 ml/min,

presiune de 200mBarr,

fază mobilă: metanol: cloroform, gradient de concentrație (10:80, 10:60, 10: 40, 10:20,10:10)

S-au colectat un număr de 20 fracțiuni de câte 10,0 ml în cazul extractului din frunze, respectiv 25 fracțiuni a câte 5.0 ml în cazul extractului din flori.

2.1.1. Caracterizarea extractelor alcoolice de salvie

Analiza extractelor obținute a fost efectuată cu ajutorul tehnicii cromatografice (RP-HPLC) folosind un detector de UV/VIS. Protocolul de lucru a fost adaptat după metoda lui Hasler și Stichler folosind un aparat HPLC Shimadzu HPLC Shimadzu SCL-10Avp (figura 2.1). Principalelele componente ale aparatului sunt pompe LC-20AD sp Pump, coloana C1 100-5C18, 250×4,6 mm (E26265), degasor DGU-20As Degasser, CTO- 20AC Column oven, detector SPD-M20A diode array detector, software LCMS solution.

Figura 2.1. HPLC Shimadzu SCL-10Avp

Coloana cromatografică utilizată a fost Nucleosil C18, 5 μm, 4X125 mm, iar faza mobilă utilizată apa bidistilată : H3 PO4 = 98:2 (pH=2,5) (solvent A) și acetonitril (solvent B). Eluarea s-a realizat dupa metoda gradientului liniar în următoarele condiții: la început 50% A, 50% B și după 12 minute -80% B, iar după 15 min, compoziția eluentului a fost schimbată la 50% B până la sfarșitul analizei (20 min). Volumul de injectare a fost 20 μl, temperatura coloanei 35° C, debitul 1,5 ml/min și detectorul UV a fost setat la λ = 366 nm pentru identificarea și cuantificarea flavonoidelor, respectiv la 230 nm pentru compușii diterpernoidici.

Ca standard de referință pentru determinarea flavonoidelor s-a utilizat luteolina (95%) respectiv acid carnosic (98% puritate) pentru determinarea diterpenoidelor.

2.2. OBȚINEREA ULEIULUI ESENȚIAL DE SALVIE

Uleiul esențial a fost separat prin hidrodistilare intr-un aparat Clevenger (figura 2.2.). Florile respectiv frunzele atât proaspete cât și uscate în cantitate 50 g au fost antrenate cu vapori de apă de timp de 4 ore. După distilare, uleiul esențial a fost extras și separat în diclormetan. Faza organică a fost uscată cu sulfat de sodiu anhidru și apoi concentrată prin evaporare sub vid folosind un concentrator BUCHI. Uleiul esențial a fost stocat intr-un vial de culoare brună la congelator pentru analize ulterioare.

Figura 2.2. Aparat de hidrodistilare Neo-Clevenger

Compoziția chimică a probelor de ulei volatil a fost efectuată prin analiză de cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă, (GC/MS). Sistemul utilizat a fost GC/MS QP2010 Plus Shimadzu (figura 2.3). Coloana cromatografică a fost AT 5MS 30m film 0.25 diametru 0.32 mm.

Figura 2.3. : Gaz gromatograf cuplat cu spectrometru de masă

Condițiile cromatografice:

Gaz purtator ca fază mobilă: He, debit 1.5 ml/min.

Temperatura cuptorului a fost setata la 45°C timp de 2 minute, apoi programat pana la temperatura de 250°C cu o viteza de 5°C/min timp de 10 minute. Temperatura injectorului este de 260°C. Modul de injectare: pulsed split,ratia de splitare 1:50. Volum de ulei injectat: 0.2µL.

Parametrii de operare ai detectorului de masă: potential de ionizare 70eV; Temperatura la interfață: 280°C. Identificarea picurilor cromatografice aferente compușilor din probele de ulei volatil analizate s-a efectuat prin compararea spectrelor de masă cu cele existente in baza de spectre NIST. Conținutul fiecărei substanțe chimice din probele de ulei a fost determinat ca procent relativ din aria picurilor aferente TIC-urilor. Indicele de retenție (RI) aferent fiecărui metabolit identificat a fost determinat prin calcul folosind ca standard un amestec de alcani.

2.2.1. Alegerea modelului experimental pentru analiza conservabilității cârnaților din carne de porc

Pentru efectuarea studiului privind influenta metaboliților secundari din diferitele extracte de salvie asupra îmbinătățirii conservabilității cârnaților din carne de porc, s-a aplicat următorul design alimentar (Tabelul 2.1.):

Proba martor – fără adaos de extract de salvie;

Probe cu adaos de extract alcoolic din flori salvie in concentratie 25.0 mg/100g, extract adaugat imediat dupa faza de pregătire compoziție pasta de cârnaț;

Probe cu adaos de extract alcoolic din frunze de salvie in concentratie de 25.0 mg/100g, extract adaugat imediat dupa faza de pregătire compoziție pasta de cârnaț;;

Probe cu adaos de ulei esențial din flori de salvie in concentratie de 25.0 mg/100g, extract adaugat imediat dupa faza de pregătire compoziție pasta de cârnaț;

Probe cu adaos de ulei esențial din frunze de salvie in concentratie de 25.0 mg/100g, extract adaugat imediat dupa faza de pregătire compoziție pasta de cârnaț;

Probele de analizat s-au prelevat la inceputul și sfârșitul perioadei de maturare pentru fiecare din cele patru cazuri.

Tabelul 2.1.

Codificarea probelor de brânză luate în studiu

Principalii indicatori microbiologici ai probelor studiate au fost determinați în conformitate cu cerințelor Reg. (CE) 853/2004 în ceea ce privește numărul total de unități formatoare de colonii sau NTG, Reg. (CE) 2073/2005 modificat cu Reg. (CE) 1441/2007 privind Listeria monocytogenes, Salmonella și Staphylococcus coagulazo-pozitiv. S-au prelevat eșantioane conform SR EN ISO 6887-5/2002 care au fost supuse determinărilor cantitative și calitative, utilizând metodele standardizate (Tabelul 2.2.).

Tabelul 2.2.

Metode de analiză microbiologică a probelor de cârnați luați în studiu

2.2.2. Determinarea activității antioxidante a extractelor alcoolice respectiv uleiurilor esențiale obținute din salvie

Activitatea antioxidantă a extractelor alcoolice respectiv uleiurilor esentiale de salvie a fost evaluată prin măsurarea capacității lor de a inhiba radicalii stabili de 2, 2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH). Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil) este o metodă spectrofotometrică, simplă și puțin costisitoare care se bazează pe proprietatea unor substanțe chimice de a dona un proton atunci când întâlnesc un radical liber. În studiul nostru am folosit protocolul DPPH pus la punct de testare a capacității antioxidante a fost pusă la punct de Mimica-Dukic et al. (2003) la care am operat câteva modificări. Astfel probele de extract alcoolic/ulei esențial în concentratie de 0.5-300.0 µg/ ml in metanol au fost amestecate cu 1 ml de 90 uM soluție DPPH, urmată de adăugarea de 95% metanol până la un volum final de 4ml. După aproximativ 45 de min de repaos la temperatura camerei, s-au citit spectrofotometric absorbanțele blankului și ale solutiilor de probe. Antioxidantul sintetic, BHT a fost folosit ca și probă de control pozitiv. Dispariția DPPH a fost citită la lungimea de undă de 515 nm folosind un spectrofotometru (Jasco UV-VIS-NIR, model 670 – 0032 Hitachi, Tokyo, Japonia, figura 2.4).

Procentul de inhibare a (%) radicalilor liberi de DPPH de catre probele de ulei esențial a fost calculat în felul următor:

Scavenger activity (%) = 100 x (Ablank – Aproba/Ablank) (1)

Unde:

Ablank- absorbanta probei oarbe (care conține toți reactivii cu excepția compusul de testare);

Figura 2.4. Spectrofotometru Jasco UV-VIS-NIR, model 670

Aproba- este absorbanța compusului de testat.

Concentrația de extract/ uleiuri esențiale care asigură un procent de inhibiție de 50% (IC50) a fost calculată din graficul reprezenând procentul de inhibare funcție de concentrația probelor de extract/ ulei.

2.2.3. Metoda de evaluare a procesului de inhibare a reacției de peroxidare a acidului linoleic

Activitatea antioxidantă a extractelor alcoolice respectiv uleiurilor esențiale de salvie a fost determinată in termen de procent de inhibare a reacției de peroxidare a acidului linoleic conform metodei descrisa de Iqbal et al. (2005) cu unele modificări. Extractele de salvie (3 mg) au fost adăugate la un amestec de soluție de acid linoleic (0.13 mL), 95% etanol (10 ml) și 10 ml de 0.2 M fosfat de sodiu tampon (pH 7). Amestecul obținut a fost diluat la 25 ml cu apă distilată. Soluția a fost incubată la 40 ° C timp de 72 h. Gradul de oxidare al acidului linoleic a fost măsurat ca indice de peroxid prin metoda spectrophotometeric așa cum este descris de Yeni et al. (2000). Astfel la 0.2 ml soluția de probă s-au adaugat succesiv, 10 ml de etanol (75%), 0.2 ml de soluție apoasă de tiocianat de amoniu (30%) și 0.2 ml de soluție de clorură feroasa (20 mm la 3,5% HCl). Dupa 3 minute de agitare, absorbanța a fost măsurată la 500 nm folosind spectrofotometrul (Jasco UV-VIS-NIR, model 670 – 0032 Hitachi, Tokyo, Japonia). Un control pozitiv a fost efectuat cu acid linoleic, dar fără adaosl de extracte luate în studiu. Ca și probă oarbă a fost folosită o soluție obținută din aceleași cantități de reactivi mai puțin adaosul de extract de salvie. Activitatea antioxidantă a extractelor etanolice/uleiurilor esențiale a fost determinată conform ecuatiei 2 :

% inhibare oxidare ac. linoleic = 100 – [(Abs.probei la 72 h / Abs.probei oarbe la 72 h) (2

Capitolul 3. rezultate și discuții

3.1. determinarea profilului chimic al extractelor etanolice de salvie

Studiul chimic cantitativ a presupus determinarea cantitativă a polifenolilor totali, flavonoidelor și proantocianidolilor din extractele obținute (EFR1 – extract din frunze de salvie din zona Răzmiresti, EFR2 – extract din flori de salvie din zona Răzmirești, EFC1 – extract din frunze de salvie din zona Craiovei, EFC2 – extract din flori de salvie din zona Craiovei). Concentrațiile soluțiilor stoc ale extractelor vegetale exprimate în functie de cantitatea de material vegetal per mL etanol 70% sunt redate în tabelul 3.1.

Tabelul 3.1

Concentrațiile soluțiilor stoc ale extractelor vegetale exprimate în mg material vegetal într-un mL de solvent (etanol 70%)

Din cele patru extracte analizate (din florile, frunzele de Salvia Officinalis L.), extractul din frunze de salvie recoltată din zona Craiova (EFC1) s-a remarcat prin conținutul cel mai mare de de extractibil, urmat de cel din frunze recoltate din zona Răzmirești. Umiditatea produselor vegetale analizate variază intre 8.3% si 11.4%, fiind maximă in cazul probei de salvie din zona Răzmirești (Tabelul 3.2).

Tabelul 3.2.

Caracteristici fizico-chimice și conținutul în principii active ale extractelor alcoolicede salvie

Referitor la principalele clase de principii active determinate in extractele de S. officinalis, reprezentate de – flavonoide totale (exprimate in rutin), acizi polifenolcarboxilici totali (exprimați in acid cafeic și in acid rozmarinic), proantocianidoli, se constată următoarele (Tabelul 3.2; figura 3.1.):

– continutul in flavone totale variază in ordinea EFC2> EFR2> EFR1> EFC1, rezultatele obținute in urma determinării cantitative a acestora corelându-se cu cele ale analizei calitative;

– cel mai mare conținut in flavone totale il prezinta proba de extract EFC2, de 1.105 %, urmată de EFR2, cu 1.034 %;

– acizii polifenolcarboxilici exprimați in acid cafeic și in acid rozmarinic au ponderea maximă in proba de salvie EFC1, de 2.818% respectiv EFR1 2.245%, și minimă in proba EFR2 de 1.798%;

– continutul in proantocianidoli variază in ordinea EFR2> EFC2> EFC1> EFR1, rezultatele obținute in urma determinării cantitative a acestora corelandu-se cu cele ale ale analizei calitative HPTLC; in probele de salvie EFR1 și EFC1 se inregistrează cea mai mică pondere, de 5.245%, respectiv 5.766%.

a. EFR1 b. EFC1

c. EFR2 d. EFC2

Figura 3.1. Conținutul în polifenoli totali, flavonoide și proantocianidoli în extractele etanolice de salvie

Conținutul de compuși polifenolici și flavonoidici determinați prin RP-HPLC este prezentat în tabelul 3.3.

Tabelul 3.3.

Compoziția în metaboliți cu potențial antimicrobian a extractelor de salvie [mg/100 g material vegetal uscat]

Este cunoscut faptul că salvia conține compuși polifenolici care au caracter antioxidant pronunțat. In această categorie predomină acidul rozmarinic respectiv acidul cafeic [Lu și Foo Yeap, 1999; Velickovic și colab., 2002]. Așa după cum se observă din datele tabelului 3.3, este prezentă în extractele de salvie și luteolina, metabolit având de asemenea caracter antioxidant dar si caracter bactericid și fungicid. Conținutul de luteolină este mult mai mare în frunze decât în flori, în schimb acidul carnosic a avut concentrații relativ egale în cele două tipuri de extracte frunze respectiv flori. Din analiza datelor prezente in tabel se mai constată că substanțele polifenolice se găsesc în concentrație de aproximativ 10 ori mai mare decât ceilalți compuși analizați.

3.2. PROFILUL CHIMIC AL ULEIULUI ESENȚIAL DE SALVIE

Probele de ulei volatil de salvie sunt lichide de culoare alb gălbui, cu miros odorant puternic înțepător. Valorile randamentului de extracție precum și principalele proprietăți fizice sunt prezentate în tabelul 3.4.

Tabelul 3.4.

Randamentul de extracție și parametrii fizici ai uleiurilor esentiale (UE) de salvie

Compoziția chimică a uleiurilor esenȚiale de Salvia officinalis, așa cum a rezultat în urma identificării picurilor din cromatogramele, respectiv spectrelor de masă (figurile 3.2. A, B, C, respectiv D) este prezentată in Tabelul 3.5. Așa după cum arată datele prezentate în tabel în uleiurile esnțiale de salvie indiferent de părțile de material prelevat s-au identificat 20 de compuși reprezentant peste 92.5% din totalul compoziției chimice a uleiurilor. Acesti metaboliți fac parte din clasele monoterpene, diterpene, cetonelor diterpenice, sesquiterpenelor, și esterilor terpenoidici (tabelul 3.5 respectiv figurile 3.2 A, B, C, respectiv D).

Tabelul 3.5.

Compoziția chimică a uleiurilor esențiale de salvie

Figura 3.2.A: Cromatograma ulei volatil obținut din flori de salvie

Figura 3.2.B: Cromatograma ulei volatil obtinut din frunze de salvie

Figura 3.2.C: Spectrul de masă al eugenolului

Figura 3.2.D: Spectrul de masă al α-tuionei

Compoziția uleiului esențial al S. officinalis este puternic influențată de factorii genetici și de mediu, de varsta organelor, de condițiile climatice și de sezonalitate [26]. Datorită unei astfel de variații, compoziția uleiului esențial de salvie obținut în acest studiu nu s-a potrivit cu profilul definit de standardul ISO 9909 [27], descris după cum urmează: α- thujonă (18-43%), β- thujonă (3-8,5%), camfor -24,5%), 1,8-cineol (5,5-13%), humulene (0-12%), α-pinen (1-6,5%), camfen (1,5-7%), limonen linalool (liber și esterificat (maxim 1%)) și acetat de bornil (maxim 2,5%).

Tabelul 3.6.

Clasificarea metaboliților secundari identificați in uleiul esențial de salvie

Uleiul esențial din probele din materialul vegetal provenit din Zona Răsmirești codificate UER1 respectiv UER2 nu prezintă o diferență semnificativă în compoziția lor (tabelul 3.6) și leagă aceste intervale pentru majoritatea compușilor; cu toate acestea, cantitatea relativă pentru α-thujonă este mult mai mică (1,2-3,7%), iar pentru 1,8-cineol (39,5-50,3%) este mult mai mare.

Aceste rezultate sunt în concordanță cu cercetările lui Grausgruber-Gröger et al. 2012 [21], care au relevat că 1,8-cineolul scade constant în timpul perioadei vegetative (aproximativ mai-octombrie), iar conținutul de camfor prezintă un maxim în mijlocul perioadei de înflorire iar α- și β -thujonele cresc treptat în timpul perioadei de vegetatie din luna septembrie. Probele noastre au fost colectate în aprilie și au o cantitate foarte mică de thujone și o cantitate destul de mare de 1,8-cineol. Compoziția chimică a uleiului esențial de salvie provenita din Craiova conține cantități mari de α-tujonă, camfor, β-pinen și α-pinen și este similară cu cele găsite în uleiurile volatile de salvie cultivată în Italia (Veličkovic et al.2003).

Figura 3.3. Structura procentuala a diverselor clase de compuși prezente în compoziția uleiurilor volatile de salvie

3.3. Testarea activității antioxidante a extractelor de salvie

Valorile activității antioxidante ale extractelor etanolice respectiv uleiurilor esențiale de salvie obținute prin metoda DPPH sunt prezentate în tabelul 3.7 respectiv figura 3.3.

Tabelul 3.7.

Valorile capacității antioxidante ale extractelor alcoolice de salvie comparativ cu cele ale antioxidanților uzuali din industria alimentare

Din datele experimentale obținute s-a constatat că activitatea antioxidantă a extractelor alcoolice de salvie este influențată de perioada de vegetație și mai puțin de arealul de cultivare a acestei specii. De asemenea procentul de inhibare a radicalului DPPH a variat între 65.12% pentru extractul obținut din flori de salvie și 90.12% pentru extractul obținut din frunze uscate.

Factorul pozitiv in ceea ce privește capacitatea antioxidantă a uleiului esential obținut din flori uscate de salvie il constituie prezența camforului in concentratii mai mari decât în uleiul volatil obținut din flori proaspete, respectiv prezența mai accentuată a γ- terpinenei in uleiurile obținute din frunzele de salvie. Aceste considerații sunt mai degrabă explicații ușor speculative având in vedere că literatura de specialitate este in acest domeniu pe tărâmul încercărilor preliminare. In ceea ce privește activitatea antioxidantă mai mare a uleiul obținut din plantele cultivate in zona Craiovei, considerăm că acest fapt se datorează prezenței în concentrații mai mari a metaboliților din clasa monoterpenelor oxigenate [Brand-Williams, Cuvelier and Berset, 1995]. De asemenea s-a constatat că spre deosebire de vitamina C și uneori chiar vitamina E care la valori mai mari ale concentratiei adaugate in sistemele bifazice cum sunt cele de tipul emulsiilor din industria cărnii dobândesc un caracter prooxidant, uleiurile esențiale de salvie își păstrează caracterul antioxidant chiar și atunci când se adaugă în produsele din carne în proporții mai mari. Totuși în practică acest avantaj nu poate fi exploatat deoarece adaosul în exces în preparatele din carne de porc le alterează caracteristicile senzoriale de gust și miros.

Determinarea in vitro a activității antimicrobiane a extractelor vegetale de salvie

Pentru a evidenția efectul in vitro al acțiunii bactericide și bacteriostatice a extractelor de salvie s-au folosit tulpini patogene de : Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus cereus ATCC 14579, Listeria monocitogenes ATCC 7644, Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella spp. NCTC 4840. Aprecierea de ordin cantitativ a potențialului biologic activ a celor două tipuri de extracte vegetale (etanolic, respectiv ulei volatil) s-a realizat prin două tehnici difuzimetrice și anume metoda cu discuri și respectiv, cu godeuri . Rezultatele determinărilor microbiologice sunt prezentate în tabelele 3.8 respectiv 3.9.