INTRODUCERE …………………………………………………………………………………………………10 CAPITOLUL 1. CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR ȚINTE ALE ACȚIUNII ANTIBIOTICELOR DIN… [311137]

CUPRINS

Prefață

INTRODUCERE …………………………………………………………………………………………………10

CAPITOLUL 1. CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR ȚINTE ALE ACȚIUNII ANTIBIOTICELOR DIN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

1.1. Peretele celular… …………………………………………………………………………………………………… …….11

1.2. Spațiul periplasmic………………………………………………………………………………………………………..15

1.3. Membrana citoplasmatică……………………………………………………………………………….. ……………15

1.4. Nucleoidul……………………………………………………………………………………………………………………..20

1.5. Ribosomii ……………………………………………………………………………………………………………………..23

1.6. Sporul bacterian………………………………………………………………………………………………………….. .24

1.7. Glicocalixul …………………………………………………………………………………………………………………..26

1.8. Flagelul …………………………………………………………………………………………………………………………28

1.9. Fimbriile ……………………………………………………………………………………………………………………….29

1.10. Pilii ……………………………………………………………………………………………………………………………..30

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 2. ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE

2.1. Substanțe antibacteriene active prin inducerea unor modificări de permeabilitate……………39

2.2. Substanțe care acționează prin denaturarea proteinelor …………………………………. ……………..40

2.3. [anonimizat] ……42

2.4. Coloranți antiseptici ………………………………………………………………………………………………………45

2.5. Agenți sterilizanți în fază de vapori ………………………………………………………………………………..46

2.6. Rezistența microorganismelor la acțiunea antisepticelor si dezinfectantelor……………………..46

2.7. Evaluarea potențialului antibacterian al agenților chimici ………………………………………………47

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 3. AGENȚI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZĂ ………………………………………………….49

3.1. Agenți chimioterapeutici activi prin inhibiție competitivă ……………………………………………….53

3.2. Agenți chimioterapeutici activi prin inhibiția replicării ADN: quinolone………………………….53

3.3. Alți agenți chimioterapeutici de sinteză ………………………………………………………………………….56

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 4. ANTIBIOTICELE- CARACTERIZARE GENERALĂ……………………………………….… 60

4.1. Antibioticele – metaboliți secundari …………………………………………………………………………… …61

4.2. Biosinteza antibioticelor ………………………………………………………………………………………….. …..64

4.3. Clasificarea antibioticelor în funcție de structura chimică ………………………………………………72

4.4. Clasificarea antibioticelor în funcție de mecanismele de acțiune ……………………………………..73

4.5. Determinismul genetic al rezistenței microorganismelor la antibiotice……………………………..85

4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenței microoganismelor la antibiotice………………………….93

4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de forta proton-motrice ………………………………………..95

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 5. CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE ……………………102

5.1. Aminoglicozidele …………………………………………………………………………………102

5.2. Tetraciclinele ……………………………………………………………………………………………………………….110

5.3. Macrolidele, Lincosamidele și Streptograminele (MLS)………………………………………………….118

5.4. Antibioticele β-lactamice ………………………………………………………………………………………………121

5.5. Antibioticele polipeptidice……………………………………………………………………………………………..129

5.6. Antibioticele glicopeptidice și lipoglicopeptidice……………………………………………………………..132

5.7. Antibiotice polichetidice ………………………………………………………………………………………………..136

5.8. Cloramfenicolul …………………………………………………………………………………………………………….139

5.9. Novobiocina ……………………………………………………………………………………… ……………………….141

5.10. Rifamicinele…………………………………………………………………………………………………………………142

5.11. Acidul fusidic ……………………………………………………………………………………………………………….143

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 6. DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMA …………………………………………………………….……………………………….145

6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice ……………..………145

6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I. ………………………………………………..146

6.3. Controlul de calitate în testarea sesibiltății la antibiotice …………………………………………………….147

6.4. Aplicații practice ale citirii interpretative în evidențierea fenotipică a diferitelor mecanisme

de rezistență la principalele specii microbiene de interes clinic …………………………………………………151

6.5. Metode fenotipice calitative și cantitative de evideniere a beta-lactamazelor ……………………….160

6.6. Fenotipuri de rezistență la alte antibiotice la bacterii de importanță clinică…………………………174

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 7. INTERACȚIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR ………………….175

7.1. Sinergismul ……………………………………………………………………………………………………………………….175

7.2. Blocarea secvențială a căilor de sinteză ………………………………………………………………………………176

7.3. Efectele defavorabile ale administrării antibioticelor ………………………………………………………….177

7.4. Pătrunderea a antibioticelor în țesuturi………………………………………………………………………………178

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 8. SUBSTANȚE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSPURESOARE ……………..184

8.1. Ciclosporina …………………………………………………………………………………………………………………….184

8.2. Tacrolimus (FK506) ………………………………………………………………………………………………………….186

8.3. Rapamicina ………………………………………………………………………………………………………………………187

8.4. Micofenolat-mofetil (MMF) ………………………………………………………………………………………………188

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 9. BACTERIOCINELE ……………………………………………………………………………………………191

9.1. Clasificarea bacteriocinelor ………………………………………………………………………192

9.2. Sinteza bacteriocinelor …………………………………………………………………………….193

9.3. Imunitatea bacteriilor față de bacteriocinele endogene …………………………………………194

9.4. Mecanisme de acțiune a bacteriocinelor ……………………..…………………………………..195

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 10. AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR FUNGICE ……………………………………198

10.1. Tipuri de infecții fungice ………………………………………………………………………………………………….198

10.2. Medicamentele antifungice ………………………………………………………………………………………………199

10.3. Rezistența fungilor la medicamente ………………………………………………………………………………….207

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 11. AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR PRODUSE DE PROTOZOARE …..209

11.1. Agenți terapeutici ai giardiozei………………………………………………………………………………………….209

11.2. Agenți terapeutici ai infecțiilor produse de Trichomonas vaginalis ……………………………212

11.3. Agenți terapeutici antimalarici …………………………………………………………………………………………214

Bibliografie selectivă

CAPITOLUL 12. AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR VIRALE ………………………………………219

12.1. Analogii nucleozidelor …………………………………………………………………………………………………. …219

12.2. Amine ciclice…………………………………………………………………………………………………………………….223

12.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: methisazone …………………………………………………………224

12.4. Foscarnet ………………………………………………………………………………………. ………………………………225

12.5. Terapia infecției cu HIV …………………………………………………………………………………………………..225

12.6. Imunizarea pacienților SIDA ……………………………………………………………………………………………228

12.7. Rolul mutațiilor în variabilitatea ribovirusurilor. Fenomenul de rezistență ……………………….229

Bibliografie selectivă……………………………………………………………………………………………………………………….

PREFAȚĂ

Sinteza monografică Antibiotice și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene răspunde unei cerințe de informare și cunoaștere a unor aspecte de ordin teoretic și practic, cu privire la organismele producătoare de antibiotice, mecanismele celulare și moleculare ale actiunii antibioticelor, precum și riscurile imediate sau potențiale pentru sănătatea organismului uman pe care le implică administrarea nejustificată a medicamentelor din clasa antibioticelor și agenților chimioterapeutici. În acest sens, lucrarea propusă spre publicare este prima încercare din literatura științifică biologică din România, de a reuni într-un ansamblu conceptual unitar, prezentarea unui grup de substanțe foarte heterogene care au în comun efectul inhibitor asupra creșterii microorganismelor si multiplicarii virusurilor.

Cartea, bogat ilustrată, reunește problemele multiple ale domeniului, referitoare la structura chimică a diferiților agenți antimicrobieni de biosinteză și de chimiosinteză, a mecanismelor de acțiune asupra microorganismelor patogene, dar și a mecanismelor de rezistență pe care microorganismele o dobândesc consecutiv contactului prelungit cu agentul terapeutic, prin selecția tulpinilor care au devenit rezistente prin evenimente mutaționale unice sau multiple sau consecutiv dobândirii unei gene de rezistență.

Elaborarea acestei monografii este o reflectare a interesului major al unui număr important de specialiști față de fenomenul antibiozei în general, dar și al interesului public, în special față de problemele concrete ale administrării antibioticelor și consecințele, adeseori nefaste, opuse celor așteptate. Cunoașterea principiilor generale ale acțiunii antibioticelor și substanțelor chimioterapeutice antimicrobiene este oportună pentru oricare biolog modern – indiferent de domeniul său de specialitate – ca și pentru biochimist, genetician, medic uman sau veterinar, agronom, cercetător în industria de biosinteză etc.

Monografia Antibiotice și substanțe chimioterapeutice antimicrobiene nu oferă rețete pentru tratamentul infecțiilor produse de microorganisme. Acest fapt nu este posibil, deoarece, în pofida practicii cvasigeneralizate de a lua antibiotice, administrarea lor trebuie să fie precedată în mod obligatoriu de izolarea agentului infecțios și de evaluarea gradului de sensibilitate/rezistență la principalele antibiotice de uz farmaceutic ! Pentru aceasta există acum ghiduri de utilizare a antibioticelor! Numai astfel va fi posibil refluxul mării de antibiotice în care trăim și va fi posibilă reducerea presiunii selective asupra microorganismelor rezistente, a căror proporție a crescut constant și a atins un nivel îngrijorător!

Această lucrare este rodul unei bogate experiențe profesionale acumulată de autori, cadre didactice ale Universității din București, coordonate de prof. dr. Gr. Mihăescu. Apreciem că lucrarea, prin conținutul său științific modern, prin prezentarea științifică accesibilă și atrăgătoare, va stârni interesul nu numai al specialiștilor de profil (biologi și medici), ci și al celor care doresc să înțeleagă secretele acțiunii pastilei magice, al cărei concept elaborat de P. Ehrlich (1904), s-a situat în centrul atenției timp de mai bine de un secol și va rămâne o preocupare de interes major mult timp de acum înainte, dar, în egală măsură, cartea propusă de noi va contribui la înțelegerea cauzelor nereușitei frecvente a tratamentului.

Autorii

INTRODUCERE

Antibioticele (anti + bios = cu efecte nefavorabile) sunt un grup heterogen de substanțe chimice, produse de microorganisme prin procese de biosinteză, care omoară sau inhibă creșterea altor specii de microorganisme. Definiția inițială s-a completat ulterior, în prezent antibioticele fiind definite ca substanțe chimice obținute prin biosinteză, semisinteză sau prin sinteză chimică, care, în concentrație mică inhibă multiplicarea sau omoară microorganismele.

Antibioticele au fost esențiale în lupta cu maladiile infecțioase și au avut o contribuție importantă la creșterea speranței de viață în secolul XX, fiind considerate una dintre marile descoperiri ale lumii moderne, alături de anestezia generală, mașina cu aburi, folosirea energiei atomice și ieșirea omului în spațiul extraterestru. După introducerea penicilinei în clinica generală (1944), infecțiile foarte grave (de exemplu, faringita streptococică) cu indici mari de mortalitate, au devenit vindecabile. In prezent, dependența omului de antibiotice este totală. Din cele peste 500 substanțe cu proprietăți antibiotice identificate, pentru terapia infecțiilor umane și animale se folosește un număr restrâns (circa l00), produse de reprezentanții a 5 genuri de microorganisme din grupurile actinomicete, bacili Gram pozitivi și fungi filamentoși microscopici, ca de exemplu, Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte substanțe cu proprietăți antibiotice sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului, ori sunt lipsite de selectivitate.

Se spune, și nu fără temei, că lumea este o mare de antibiotice. Numai în SUA, în 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dacă se adaugă cele administrate în hrana animalelor și în agricultură, se apreciază că în ultimii 50 de ani s-au produs și s-au utilizat peste un milion de tone de antibiotice. Administrarea lor, adeseori nejustificată, creează o presiune selectivă considerabilă asupra microorganismelor infecțioase, al cărei rezultat este selecția tulpinilor multirezistente. Rezistența multiplă la antibiotice și la agenții de sinteză chimică este o provocare majoră a clinicii infecțioase, ceea ce impune găsirea unor noi antibiotice sau obținerea prin procedee de semisinteză, a unor noi derivați chimici eficienți.

Alcătuirea acestei cărți a izvorât din necesitatea prezentării unitare a stadiului actual al cunoașterii structurii chimice, dar în special a mecanismelor de acțiune și de rezistență a microorganismelor la principalele clase de antibiotice folosite în clinică. Structura chimică a diferitelor antibiotice a fost determinată curând după descoperirea lor, dar mecanismele acțiunii și rezistenței microorganismelor sunt achiziții mai recente.

Prezentarea propriu-zisă a diferitelor substanțe antimicrobiene utilizate în clinică pentru tratamentul infecțiilor produse de microorganisme, este precedată de un capitol de anatomie și fiziologie bacteriană, cu scopul de a înțelege substratul anatomic structural al țintei acțiunii diferitelor substanțe antimicrobiene și de un capitol referitor la acțiunea substanțelor din categoria antisepticelor și dezinfectanților.

Antisepticele sunt substanțe chimice care, aplicate pe țesuturile vii, împiedică creșterea și multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice și pot fi aplicate pe țesuturi umane și animale.Termenul de dezinfectant este restrâns la substanțele cu efect microbicid rapid, exercitat la concentrații mici, care se aplică pe obiecte neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substanțe dezinfectante sunt toxice și nu pot fi administrate la om și la animale. Antisepticele și dezinfectantele cuprind o largă varietate de agenți chimici și poartă denumirea generică de biocide.

Agenții chimioterapeutici sunt substanțe de sinteză chimică, utilizate în tratamentul infecțiilor produse de diferite microorganisme (bacterii, fungi microscopici și protozoare). Conceptul chimioterapiei a fost formulat de P. Ehrlich (l904). Principiul fundamental al chimioterapiei antiinfecțioase constă în utilizarea unor substanțe cu toxicitate selectivă care să inhibe creșterea și multiplicarea agentului patogen infecțios, dar să nu altereze funcționalitatea celulelor organismului uman și animal. Agenții chimioterapeutici interacționează selectiv cu sistemele metabolice active ale microorganismelor, dar nu cu acelea ale celulelor organismului gazdă.

Capitolul 1

CARACTERIZAREA PRINCIPALELOR ȚINTE ALE ACȚIUNII ANTIBIOTICELOR DIN STRUCTURA CELULEI BACTERIENE

Cunoașterea structurii interne a celulei bacteriene este rezultatul utilizării tehnicilor de citochimie și de microscopie electronică. Structura și arhitectura moleculară a componentelor celulare a fost demonstrată cu ajutorul tehnicilor de citochimie, care presupun utilizarea unor metode de colorare selectivă, adică a coloranților cu afinitate pentru o anumită structură celulară. Prin arhitectură moleculară se înțelege modalitatea de aranjare ordonată a subunităților constitutive ale unei structuri. Structura reper a celulei bacteriene este peretele celular. In raport cu peretele se disting structurile intraparietale (care alcătuiesc protoplastul bacterian) și structurile extraparietale (Zarnea, 1983).

Structurile intraparietale sunt reprezentate de: spațiul periplasmic, membrana plasmatică, mezosomul, nucleoidul, citoplasma, ribosomii, incluziile, vacuolele, sporul, aparatul fotosintetic, rhapidosomii (rhapidos = baston) – incluzii ribonucleoproteice în formă de baston, magnetosomii – incluzii intracelulare delimitate de membrană, cu structură cristalină formate din magnetită (Fe3O4). Magnetosomii conferă dipol magnetic permanent celulei, permițându-i să se alinieze pasiv la câmpul geomagnetic. Bacteriile care produc magnetosomi manifestă magnetotaxie, adică procesul de orientare și migrare de-a lungul liniilor câmpului magnetic. Structurile extraparietale sunt reprezentate de: glicocalix cu variantele sale structurale (capsula și glicocalixul comportamental), flageli, fimbrii și pili, spini – structuri pericelulare groase la bază și ascuțite la vârf. Unele structuri (membrana, citoplasma, nucleoidul, ribosomii) sunt esențiale (obligatorii) și se găsesc la toate celulele bacteriene. Altele sunt facultative (spor, aparat fotosintetic, capsulă, flageli), fiind prezente numai la anumite grupe de bacterii.

Peretele celular

Peretele celular este o structură rigidă de înveliș, care delimitează celula bacteriană. La cele mobile, peretele este străbătut de flageli. Structura parietală lipsește la bacteriile din grupul Mycoplasma, precum și la cele halofile extreme (cele care trăiesc în medii saline foarte concentrate, unde structura protectoare față de șocul osmotic nu este necesară). La microscopul optic, peretele celular se evidențiază după colorare selectivă, cu coloranți de mare afinitate față de componentele sale chimice. La microscopul electronic, peretele se evidențiază fie direct, fie după utilizarea unor artificii de tehnică, ce constau în inducerea de leziuni mecanice ale structurii parietale cu ajutorul perlelor de sticlă sau prin ultrasonicare. Conținutul celular se pierde si peretele rămâne ca un sac gol și rigid, care păstrează forma originală a celulei, ceea ce sugerează rolul esențial al peretelui în determinarea formei bacteriene. Grosimea peretelui este cuprinsă între l5 și 30 nm (uneori până la 80 nm).

În ciuda stării incerte a taxonomiei bacteriene, un criteriu empiric care a avut o valoare practică deosebită pentru clasificarea și identificarea procariotelor este comportamentul la colorația Gram (C. Gram, 1884) (Beveridge și Davies, 1983). Caracterul Gram pozitiv sau Gram negativ reflectă deosebiri structurale majore ale peretelui, cu excepția Archaea, cocilor rezistenți la radiațiile ionizante și a micoplasmelor. Relația dintre structura peretelui celular și colorația Gram este următoarea: tehnica implică tratamentul succesiv al celulelor cu cristal – violet (un colorant bazic), urmat de tratamentul cu soluție de iod și ulterior, extracția cu un solvent organic polar (alcool sau acetonă). În interiorul celulei, cristalul violet și iodul formează un complex insolubil. Celulele Gram pozitive, care rezistă etapei de decolorare și rețin complexul insolubil (cristal violet – iod) sunt colorate în albastru închis, iar cele care nu rețin colorantul sunt Gram negative și pot fi diferențiate de cele Gram pozitive prin recolorare cu un colorant de contrast, fiind colorate în roșu. Reacția Gram nu se corelează direct cu compoziția chimică a peretelui, ci depinde de structura sa fizică, de starea fiziologică a celulei și de integritatea ei structurală. Astfel, levurile, care au perete celular gros, dar cu o compoziție chimică diferită de a mureinei, se colorează Gram pozitiv.

În funcție de particularitățile structurale ale peretelui, bacteriile se împart în 4 categorii:

l. Firmacutes (firmus = tare; cutis = înveliș) sunt bacteriile Gram pozitive, cu perete celular gros și rigid, la care mureina reprezintă până la 80% din greutatea uscată a acestei structuri și bacteriile acido-alcoolo-rezistente.

2. Gracilicutes (gracilis = subțire, fin) sunt bacteriile Gram negative cu perete subțire, la care mureina reprezintă circa l0% din greutatea uscată a peretelui.

3. Mollicutes sau Tenericutes (mollis, tener = moale) cuprinde bacteriile din grupul Mycoplasma, lipsite de perete. Periferia celulei este acoperită de o membrană ce conține steroli, cu rol protector față de liza osmotică. Sunt cele mai mici bacterii cunoscute, cu capacitatea de a crește pe medii inerte. Se dezvoltă ca saprobionte în cavitățile organismului uman și animal sau sunt patogene pentru om, animale și plante.

4. Mendosicutes (mendosus =o structură cu defecte). Noțiunea desemnează organismele domeniului Archaea, care au perete celular din care lipsește mureina.

Marea majoritate a bacteriilor cunoscute aparțin grupului Gram pozitive sau Gram negative.

Structura moleculară a peretelui la bacteriile Gram pozitive

La bacteriile Gram pozitive, peretele celular este gros, rezistent și rigid. Componenta esențială este mureina, denumită și peptidoglican, glicopeptid, mucopeptid sau glucozaminopeptid. Mureina formează un strat rigid, adiacent membranei plasmatice și sub aspectul compoziției chimice este unitară la toate eubacteriile (Gram pozitive și Gram negative). Mureina este alcătuită dintr-o componentă peptidică și una glucidică. Componenta glucidică de bază este un dizaharid format din N-acetil-D- glucozamină și acid N-acetilmuramic, legate l-4 (fig. 1). Acidul N-acetilmuramic rezultă prin stabilirea unei legaturi dr tip esteric între N-acetil-D-glucozamină și acidul lactic. Componenta peptidică este un tetrapeptid, a cărui compoziție în aminoacizi este variabilă în funcție de specie, dar conține L-ala, acid D-glutamic, acid diaminopimelic (derivat al lizinei) sau lizina și D-ala și se leagă de acidul N-acetilmuramic. Acidul N-acetil muramic și D-aminoacizii sunt markeri biochimici ai eubacteriilor.

Figura 1. Structura glicanului tetrapeptidic, una dintre unitațile repetitive ale peptidoglicanului structurilor parietale. Aceasta structura chimica se gasește la E. coli, dar bacteriile conțin si alți aminoacizi (dupa Brock, 2005).

Rigiditatea peptidoglicanului este conferită de punți peptidice transversale. Cu cât numărul de legături peptidice este mai mare, cu atât crește rigiditatea peretelui celular. La bacteriile Gram negative, punțile transversale reunesc gruparea NH2 a acidului diaminopimelic, cu gruparea COOH a D-ala terminale a altei grupări peptidice. La bacteriile Gram pozitive, legarea transversală a două peptide învecinate se face printr-o punte peptidică, care, de exemplu, la Staphylococcus aureus este formată din 5 resturi de glicină (fig. 2).

Figura 2. Tetrapeptidele conectate la acidul N-acetilmuramic sunt interconectate prin punți formate din cateva resturi de aminoacizi. La S. aureus tetrapeptidele sunt conectate prin punți de pentaglicină (dupa Brock, 1988).

Se formează astfel o structură covalentă perfect continuă în jurul celulei, o moleculă mureinică gigantă, un adevărat sac mureinic, cu structură tridimensională dinamică (fig. 3) (Ghuysen si Hackenbeck, 1994). La nivelul sacului mureinic sunt localizate enzimele care modelează creșterea sa: murein-hidrolazele care atacă legăturile chimice ale mureinei și murein-sintetazele care inseră noi unități de construcție. Peptidoglicanii diferitelor specii diferă prin aminoacizii 2 și 3 ai tetrapeptidului și prin frecvența punților transversale de pentaglicină. Speciile patogene au o frecvență superioară a punților transversale, ceea ce se corelează cu o rezistență mai mare a mureinei la acțiunea factorilor litici din umorile organismului (lizozimul etc.).

Figura 3. Reprezentarea structurii generale a peptidoglicanului (G = N-acetilglucozamina ; M = acid N-acetilmuramic). La resturile de acid N-acetil-muranic sunt conectate tetrapeptidele, iar aceastea sunt reunite prin legaturi peptidice transversale (dupa Brock, 2000).

Importanța mureinei, ca o componentă structurală esențială a peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive a reieșit din studiul acțiunii a doi agenți antibacterieni, lizozimul și penicilina, asupra peretului celular. Lizozimul clivează legăturile glicozidice l – 4 și hidrolizează mureina celulelor aflate în faza staționară (fig. 4), în timp ce penicilina inhibă cresterea celulelor bacteriene Gram pozitive aflate în faza de creștere, deoarece inhibă treapta finală a sintezei mureinei, reacția de transpeptidare, adică formarea legăturilor peptidice transversale între catenele de glican adiacente.

Figura 4. Imaginea electrono-optică a celulelor de Bacillus subtilis. a. In regiunea centrală s-a initiat formarea septului de diviziune. b. Un stadiu intermediar al degradarii peretelui sub acțiuna lizozimului și retracția protoplastului. c. Protoplastul (original).

La bacteriile Gram pozitive, puntea peptidica transversală reuneste acidul diaminopimelic al unui peptid și D-ala a peptidului adiacent (Ghuysen și Hackenbeck, 1994). Inhibiția reactiei de transpeptidare (de formare a puntilor peptidice transversale) sub acțiunea penicilinei duce la formarea unui peptidoglican subțire. În celulele care cresc, autolizinele continuă să degradeze legaturile chimice ale mureinei, fără a se mai forma alte punți peptidice. Astfel, peretele mureinic se dezagregă progresiv si elibereaza protoplastul, care este o celulă neviabilă, iar în mediul neprotejat osmotic suferă liză. De aceea, penicilina este activă numai asupra celulelor care cresc. In celulele care nu cresc, autolizinele nu sunt active și peptidoglicanul nu este degradat.

Mureina formează o matrice în care se găsesc și alți polimeri: polizaharide, acizi teichoici. Acizii teichoici sunt polimeri de l-3-poliglicerol-fosfat sau de poli-ribitol-fosfat, legați fosfo-diesteric.

Poliglicerol – fosfat

Poliribitol fosfat

Polimerii formează axul central al moleculei. Grupările –OH libere ale glicerolului și gruparea –OH de la C3 a ribitolului sunt ocupate de D-alanină, D-glucoză sau de N-acetilglucozamină. Bacteriile Gram pozitive au două categorii de acizi teichoici: acizi lipoteichoici sau membranari, care traversează peptidoglicanul și cu o extremitate se leagă de glicolipidele din membrană, iar celălalt capăt este liber la suprafața celulei și acizi teichoici parietali, atașați de resturile de acid N-acetilmuramic ale mureinei.

Acizii teichoici sunt molecule lungi și flexibile, filamentoase, care conferă un plus de rigiditate peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive. Pentru bacteriile patogene, acizii teichoici sunt un factor de virulență, deoarece au proprietăți chimiotactic negative față de fagocite. Sunt implicați în transportul ionilor în/și din celulă. Pot avea rolul de receptori de fagi. Uneori bacteriile secretă cantități mari de acizi teichoici solubili.

Peretele celular la bacteriile Gram negative

La bacteriile Gram negative, mureina reprezintă numai 2,5 – l0% din greutatea uscată a peretelui. Peretele lor este mai complex, datorită unei structuri caracteristice denumită membrana externă a peretelui celular, o replică structurală a membranei plasmatice, care poate fi astfel considerată ca membrană internă. La microscopul electronic, peretele celular apare pluristratificat, datorită structurii trilaminare a membranei externe a peretelui (fig. 5).

Figura 5. Pe imaginile electrono-optice, învelișul celulelor bacteriene Gram negative este multilaminar, caracter conferit de cele două membrane: membrana externă și membrana citoplasmatică. Structura mezosomală are conexiune directă cu membrana citoplasmatică și pare asociată cu nucleoidul, iar structura sa este trilaminară (original).

Membrana externă a peretelui conține fosfolipide (35% din greutate), proteine (l5%) și lipopolizaharide (50%). Analiza filogeniei organismelor procariote pe baza secvențierii proteinelor a dus la concluzia existenței unor diferențe filogenetice majore între organismele cu înveliș dublu membranar (didermice) și cele cu membrană simplă (monodermice) (Costerton și colab., 1974).

Mureina este localizată în stratul cel mai intern al peretelui (fig. 6). După un tratament adecvat, membrana externă se poate îndepărta și se obține sacul mureinic pur, extrem de fin care păstrează forma originală a celulei și care sugerează că mureina ar putea fi o rețea bidimensională (un monostrat molecular), în timp ce la bacteriile Gram pozitive cantitatea de peptidoglican corespunde la 20 de straturi moleculare sau mai mult.

Figura 6. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular la bacteriile Gram negative (după Brock, 2005).

Proteinele membranei externe se numesc porine, deoarece reglează permeabilitatea și constituie canalele membranare de transport celular. Inițial s-au descris trei tipuri de porine trimerice: OmpF, OmpC și PhoE. Analiza prin metoda cristalografiei cu raze X relevă că porinele sunt proteine transmembranare a căror configurație secundară este cea de β-pliere. O celulă de Escherichia (E.) coli produce circa 105 molecule porine, cu rolul de bariere selective de permeabilitate. În mediul hiperosmotic, numărul porinelor scade. La E. coli, porinele sunt proteine trimere, subunitățile delimitând un por cu diametrul de 1 nm.

Lipoproteinele leagă ferm membrana externă prin intermediul peptidoglicanului profund. Lipopolizaharidele (LPS) sunt inclavate în membrana externă. Ele sunt de fapt endotoxinele bacteriilor Gram negative (Salmonella, Shigella, Escherichia). Se numesc endotoxine, deoarece se eliberează numai după pierderea integrității celulei. Datorită poziției lor externe, LPS se pot extrage din celule, cu fenol 45 – 60%. Din punct de vedere chimic, LPS sunt molecule complexe, fiind alcătuite dintr-o regiune polizaharidică externă (polizaharidul O), care determină specificitatea antigenică a celulei bacteriene, o regiune oligozaharidică intermediară (regiunea R) și o regiune internă hidrofobă, denumită lipidul A, prin care LPS se ancorează în membrana externă, printre moleculele fosfolipidice (fig. 7). Regiunile intermediară și internă ale moleculei LPS au compoziție chimică relativ constantă la diferite specii de bacterii Gram negative. Polizaharidul regiunii externe are o structură și o compoziție chimică foarte variabile și constituie antigenul somatic O, cu specificitate antigenică foarte înaltă, pe baza căruia numeroasele tulpini ale unei specii aparțin unui mare număr de serotipuri.

Figura 7. Reprezentarea schematică a structurii moleculei de lipopolizaharid (LPS) original).

Lipidul A este legat covalent de oligozaharidul regiunii intermediare. La Salmonella, lipidul A este alcătuit din dizaharide de D-glucozamină, legate l’- 6. Perechile de D-glucozamină sunt interconectate l – 4’, prin punți pirofosfat. Grupările –OH din pozițiile 3, 4 și 6’ ale fiecărui dizaharid sunt substituite de acizi grași (lauric, palmitic, miristoximiristic, hidroximiristic).Grupul –OH din poziția 3 se leagă de componenta polizaharidică (acidul 2-ceto, 3-deoxioctanoic) (KDO). Grupările –NH2 ale glucozaminei sunt substituite de acidul D-3-hidroximiristic (fig. 8). Lipidul A are proprietăți endotoxice, evidențiate la mutantele R (Rough = rugos) care sintetizează LPS incomplet, căruia îi lipsește polizaharidul O și unele componente ale oligozaharidului regiunii intermediare R.

Figura 8. Structura lipidului A al lipopolizaharidului de Salmonella, cu trizaharidul KDO și cu resturile de acizi grași (dupa Rietschel si colab., 1977).

In mediile naturale, cele mai multe bacterii sintetizează polizaharidul O și formează colonii S (Smooth = neted). Cele care nu au polizaharidul O formează colonii R. Polizaharidul O nu este factorul determinant al patogenității, deoarece formele coloniale R ale Bordetella (B.) pertusis, Neisseria (N.) gonorrhoeae sunt patogene (Seifert și colab., 1988; Jawetz și colab., 1989).

Permeabilitatea membranei externe. Membrana externă, ca și celelalte membrane biologice, este alcătuită din stratul lipidic dublu, puțin permeabil pentru moleculele hidrofile. Porinele din membrana externă formează canale de difuzie nespecifică pentru influxul nutrienților și pentru eliminarea produselor de catabolism. Porinele s-au găsit la toate bacteriile Gram negative și chiar la un grup de bacterii Gram pozitive: Corynebacterium – Nocardia – Mycobacterium, care produc un perete celular bogat în lipide, asemănător dublului strat. Porinele clasice OmpF și OmpC transportă preferențial cationi, iar PhoE, transportă anioni. Porinele reglează permeabilitatea membranei externe în funcție de condițiile mediului: în mediile cu osmolaritate mică (cele naturale), porinele sunt mai permeabile, iar la bacteriile patogene, în organismul gazdă, porinele au permeabilitate mai mică.

Moleculele de LPS formează baza structurală a integrității membranei externe. LPS este polianionică datorită sarcinilor negative ale lipidului A și leagă cationi. Moleculele adiacente polianionice de LPS sunt aparent legate electrostatic, una de alta, prin cationi bivalenți (Ca2+, Mg2+) și formează o structură compactă ca un acoperiș de țiglă, pe suprafața membranei externe. Situsurile LPS care leagă cationii sunt esențiale pentru integritatea membranei externe, dar în același timp ele reprezintă călcâiul lui Ahile al acestei structuri. Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexează avid cu LPS și dezorganizează membrana externă, mărind permeabilitatea pentru agenții cu acțiune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toți agenții policationici se leagă de LPS anionice, cu o afinitate variabilă. Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenții anionici și neutri, dar sunt sensibile la detergenții monocationici. Agenții chelatori ai ionilor de Ca2+ și Mg2+ dezorganizează și permeabilizează membrana externă. Cel puțin la enterobacterii, dublul strat fosfolipidic al membranei externe este asimetric, stratul extern conținând aproape exclusiv LPS, în timp ce stratul intern conține aproape exclusiv fosfolipide. Structura porinelor trimere s-a analizat prin difracție cu electroni și cristalografie cu raze X. Monomerii porinei traversează dublul strat și au configurație β-pliată. Aproape invariabil, secvențele porinelor la capătul C-terminal au fenil-alanina. Rareori, restul C-terminal este triptofanul.

Peretele celular la Archaea

La Archaea, peretele celular prezintă diferențe structurale majore, comparativ cu ale eubacteriilor. Diferitele specii de Archaea se colorează Gram pozitiv sau Gram negativ. Peretele lor nu conține acid muramic sau D-aminoacizi, markeri biochimici ai mureinei (Rogers, 1983). Din punct de vedere chimic, peretele la Archaea este heterogen. La Methanobacterium (producătoare de metan), peretele conține o pseudomureină alcătuită din unități repetitive formate din două zaharuri aminate (N-acetilglucozamină și acidul N-acetiltalosaminuronic, markerul biochimic al domeniului Archaea), legate l-3. Resturile acidului N –acetiltalosaminuronic sunt legate prin punți peptidice (ca și la mureină), iar aminoacizii sunt numai izomeri L. Legăturile l-3 ale pseudomureinei sunt rezistente la acțiunea lizozimului.

Peretele celular acido-alcoolo-rezistent al micobacteriilor

Unele genuri ale micobacteriilor (Mycobacterium (M.) tuberculosis, Corynebacterium (C.) diphteriae, Nocardia (N.) asteroides) conțin lipide complexe, care nu se găsesc în structura parietală a altor bacterii. Ele se colorează slab după protocolul colorației Gram, dar se colorează la cald cu fuxină bazică concentrată și sunt rezistente la decolorare succesivă cu acid sulfuric diluat și alcool etilic 96%. Aceste organisme se numesc acido-alcoolo-rezistente (Rogers, 1983). Rezistența la decolorare se datorează compoziției chimice a peretelui celular. Peptidoglicanul micobacteriilor conține acid diaminopimelic ca acid diaminic major, iar acidul muramic este N-glicozilat (și nu N-acetilat). Un alt compus major parietal al micobacteriilor este polizaharidul cu gr. mol. mare – arabinogalactanul – de care se leagă acizi grași cu catenă lungă – acizii micolici – cu 70 – 90 atomi de C. La Corynebacterium și Nocardia, acizii grași au catenă mai scurtă (40 – 60 de atomi de C). O altă categorie de lipide, cele libere, sunt lipooligozaharide ce conțin trehaloză și lipoarabinomanani.

Figura 9. Reprezentarea schematică a componentelor peretelui celular acido-rezistent la grupul Mycobacterium – Nocardia. Regiunea externă a învelișului conține unitați lungi de acid micolic legat de arabinogalactan (dupa Holt, 1998).

Funcțiile peretelui celular

Peretele celular este o structură cu rol esențial în arhitectura celulară, pentru că determină forma celulei și menținerea ei. După pierderea conținutului celular, sacul mureinic păstrează forma inițială a celulei. Mureina conferă celulei elasticitate și plasticitate (capacitatea de a suferi deformări la presiune, fără alterarea structurii celulare), permițând mărirea volumului ei prin creștere.

Peretele celular constituie o barieră suplimentară de permeabilitate, alături de membrana citoplasmatică. La bacteriile Gram pozitive, peretele are o porozitate de 1,1 nm, permițând trecerea moleculelor mai mici de l200 Da (1 Dalton = masa atomului de H, adică l,672649 x l0-24g. l kDa = l 000 Da).

La bacteriile Gram pozitive, peretele participă la formarea septului de diviziune, ce separă cele două celule surori și la procesele de creștere. Creșterea volumului celular este rezultatul creșterii peretelui.

Membrana externă are rolul unei site moleculare și permite difuzia moleculelor mici, dar reține pe cele mari (enzime). Membrana externă este o barieră selectivă, fiind impermeabilă pentru macromolecule, dar permite difuzia limitată a substanțelor hidrofobe, deoarece lama externă nu conține glicerofosfolipide. Suprafața este acoperită cu LPS, care formează o structură quasicristalină. Din această cauză, lama externă nu prezintă o difuzie laterală marcată a moleculelor, tipică membranelor care conțin glicerofosfolipide (Wright și Tipper, 1978).

Membrana externă conține proteine cu funcții de transport molecular. Ele au rolul de receptori de vitamine, glucide, aminoacizi, de transferine (leagă Fe și îl transferă în celulă). În membrana externă a bacteriilor patogene se găsesc proteine de virulență, din categoria adezinelor, cu rol de fixare a bacteriei la suprafața celulelor sensibile. LPS are proprietăți chimiotactic negative față de fagocite, mărind nivelul virulenței bacteriene și conferă individualitate biochimică și serologică diferitelor tulpini. LPS sunt antigene și induc sinteza anticorpilor specifici cu rol protector (Seifert și colab, 1988).

In concluzie, peretele celular este o structură esențială a celulei bacteriene, îndeplinind funcții multiple, cea mai importantă fiind protecția față de liza osmotică în mediile hipotonice.

Singurele procariote care nu au o structură parietală sunt micoplasmele. Ele se pot izola din organismul uman, de la animale, plante, insecte, fungi, sol, ape menajere. Sunt saprobionte, trăind pe materia organică în mediile naturale (ape menajere, sol) sau comensale la om și animale pe mucoasele bucofaringiană și genitourinară, incapabile să se dezvolte în mediul extern ca saprobionte. Unele dintre cele comensale sunt potențial patogene. Faptul că supraviețuiesc, deși nu au perete celular, se explică prin aceea că au o membrană citoplasmatică rigidă (care conține steroli) și pentru că trăiesc în medii protejate osmotic, așa cum este organismul animal și uman.

1.2. Spațiul periplasmic

Spațiul periplasmic este un compartiment celular al bacteriilor Gram negative, delimitat de membrana externă a peretelui celular și de membrana internă (citoplasmatică). Este singurul compartiment al celulei procariote și conține un volum apos semnificativ în care se găsesc proteine și oligozaharide. Proteinele sunt reprezentate de enzime degradative (DN-aza, RN-aza, proteaze, fosfataze, penicilinaza etc.) și proteine de legare specifice pentru diferite molecule, cu rol în transport și chimiotaxie (Costerton și colab., 1974; Wright și Tipper, 1978).

Oligozaharidele se găsesc în concentrații variabile și au rolul de a regla presiunea osmotică a celulei. Când presiunea osmotică a mediului crește, oligozaharidele trec în citoplasmă, iar când scade, oligozaharidele revin în spațiul periplasmic.

Spațiul periplasmic îndeplinește o funcție esențială ce constă în acumularea nutrienților moleculari din mediu, înainte de a pătrunde în celulă. Spațiul periplasmic funcționează ca un compartiment adaptativ, a cărui funcție de depozit este foarte importantă, deoarece bacteriile Gram negative trăiesc, de cele mai multe ori, în mediile oligotrofe (mediile aquatice). În spațiul periplasmic, nutrienții sunt scindați parțial sub acțiunea enzimelor degradative și de aici sunt preluați de proteinele de transport din membrana internă și transferați în celulă. Proteinele periplasmice pot fi eliberate prin conversia celulelor la protoplaști, după tratamentul cu cloroform sau prin șoc osmotic (tratamentul celulelor cu EDTA în mediu hipertonic și transferul lor în mediu hipotonic).

1.3. Membrana citoplasmatică

Membrana plasmatică înconjoară celula bacteriană și este bariera separatoare a citoplasmei de mediul extern. Consecința imediată a lezării membranei este pierderea componentelor citoplasmatice. Grosimea membranei este de 7 – 10 nm. La microscopul electronic are o structură trilaminară, după modelul unitar al membranelor celulare (unit membrane), al lui Robertson. Pe baza structurii fine s-a considerat (eronat) că membrana plasmatică este alcătuită din două straturi de proteine, între care se găsește unul lipidic. In realitate, membrana este un dublu strat fosfolipidic și glicolipidic, la care se asociază proteinele membranare. Ansamblul molecular al membranei este asemănat cu un ocean fosfolipidic, în care sunt incluse ca niște iceberguri, proteinele externe (periferice) și integrate, dar spre deosebire de membrana celulei eucariote nu conține steroli. Singer și Nicolson au propus modelul mozaicului fluid de organizare a membranelor biologice, în acord cu care membranele sunt structuri bidimensionale de proteine globulare și lipide, cu distribuție orientată, stabilizate de moleculele de apă. Acestea sunt legate prin punți intermoleculare de H, formând o structură în rețea. Dizolvarea unei molecule în apă are semnificația stabilirii unei continuități între structurile chimice ale moleculei dizolvate și structura de rețea a apei. Pentru a se integra în structura de rețea a apei, molecula trebuie să formeze o legătură de H cu apa sau să accepte o legătură a acesteia.

Proteinele sunt componentele care conferă membranelor multe dintre proprietățile funcționale specifice (de exemplu, menținerea și utilizarea gradientului transmembranar de H+ pentru sinteza ATP). În raport cu dispunerea lor în structura membranei, proteinele sunt periferice și integrate. Proteinele periferice sunt asociate cu membrana, dar nu au nici o secvență inclusă în structura ei. Structura lor este analogă proteinelor hidrosolubile. Proteinele membranare integrate au cel puțin un domeniu al moleculei situat în regiunea hidrofobă a stratului lipidic. Secvența de aminoacizi a domeniului inclus în stratul lipidic este hidrofobă, are configurația -helix și cuprinde l9 – 23 aminoacizi. Ele pot fi dislocate din structura membranei numai în prezența detergenților ce solubilizează lipidele. Proteinele integrate difuzează liber în planul lateral al matricei lipidice, dar nu trec liber dintr-un strat în altul și de aceea asimetria funcțională a membranei se păstrează pentru perioade lungi. În categoria proteinelor integrate sunt incluse proteinele transmembranare care au o mare parte a masei lor inclusă în dublul strat fosfolipidic, dar expun domenii semnificativ diferite pe ambele fețe ale membranei, ceea ce conferă asimetria funcțională a acesteia și proteinele membranare ancorate care au cel putin un domeniu ce penetrează dublul strat lipidic, dar nu traversează complet membrana. Proteinele membranare anocorate sunt legate covalent de lipidele membranare. Domeniile extralipidice ale proteinelor membranare integrate sunt hidrofile, ceea ce conferă asimetria structurală și funcțională a membranei. Așa se explică permeabilitatea superioară a feței interne în raport cu fața externă.

Figura 10. Modelul mozaicului fluid al structurii membranei. Fosfolipidele formează un strat dublu, cu componentele hidrofobe orientate spre interior, iar capetele hidrofile constituie suprafața internă și externa a membranei. In marea lipidică proteinele plutesc ca niste iceberg-uri. Unele se extind în toata grosimea dublului strat lipidic, iar altele sunt ancorate pe fața internă sau externă. Membrana micoplasmelor și eucariotelor conține colesterol.

Figura 11. Reprezentarea schematică a moleculei fosfolipidice, componenta structurală a membranei. Fosfolipidele sunt molecule polare. „Cozile” de acizi grași sunt foarte hidrofobe (nu formează legături cu apa) și constituie o barieră de permeabilitate față de moleculele hidrosolubile. „Capul” moleculei este format din gruparea fosfat, legată de o grupare care conține N și din glicerol si este foarte hidrofil (formează legături cu moleculele de apă) (dupa Lehninger, 1987).

Asimetria structurală a proteinelor integrate se evidențiază pe imagini eletrono-optice ale membranei criofracturate. Tehnica criofracturării presupune înghețarea rapidă a membranei la temperatura azotului lichid și fracturarea membranei cu un cuțit special. Membrana se clivează de-a lungul regiunii hidrofobe a acizilor grași și rezultă două jumătăți, cu un grad accentuat de asimetrie, conferită de proteinele transmembranare (Rogers, 1983).

Structura membranei plasmatice este stabilizată prin legături de H și interacțiuni moleculare hidrofobe. Ionii de Mg și Ca realizează legături ionice cu sarcinile negative ale fosfolipidelor și stabilizează structura membranei.

Lipidele conțin acizi grași, predominant cu l4 – l6 atomi de C, saturați sau nesaturați. În raport cu capacitatea lor de a interacționa cu structura apei, lipidele membranelor biologice conțin două categorii de structuri chimice (sunt amfipatice): glicerolul intră în structura de rețea a apei, fiind hidrofil, iar restul moleculei (acizii grași) formează componenta hidrofobă a moleculei. Într-o soluție apoasă, lipidele se agregă și formează spontan structuri în dublu strat: acizii grași la interior, în mediul hidrofob, iar moleculele de glicerol rămân expuse în mediul apos.

Funcțiile membranei, dar în special ale lipidelor membranare, s-au studiat folosind ca model, veziculele membranare artificiale sau naturale, ce se formează spontan după spargerea celulelor. S-a demonstrat astfel că procariotele își reglează fluiditatea membranei, prin modificarea proporției acizilor grași saturați/nesaturați. Cultivarea la temperaturi scăzute mărește proporția acizilor grași nesaturați și sporește gradul de fluiditate a membranei. Prin răcire, faza de cristal lichid a lipidelor membranare trece spre o stare solidă de gel, situație în care grosimea dublului strat crește datorită extensiei catenelor de C ale lipidelor.

Dublul strat lipidic este o structură ordonată. Catenele de carbon ale acizilor grași sunt constrânse la o așezare paralelă și datorită caracterului hidrofob, nu se deplasează ușor în afara membranei. Moleculele fosfolipidice sunt foarte mobile și se deplasează în plan lateral (bidimensional), în același strat, cu o frecvență foarte mare, dar mișcările flip-flop, dintr-un strat în celălalt (tridimensionale) sunt foarte rare (una la câteva ore). Stratul lipidic este suportul proteinelor și are rolul unei bariere de permeabilitate. Permeabilitatea diferențiată a celor două fețe ale membranei se explică atât prin asimetria proteinelor, cât și prin compoziția chimică diferită a lipidelor în cele două straturi ale membranei.

Cu excepția micoplasmelor și a Archaea (bacteriile metanotrofe), membrana procariotelor se deosebește de cea a eucariotelor prin absența sterolilor. Sterolii sunt molecule plane, rigide, iar acizii grași sunt flexibili. Sterolii conferă un grad superior de rigiditate membranei plasmatice. Rigiditatea membranei este necesară celulelor lipsite de perete. La eucariote, rigiditatea ar fi necesară pentru a suporta forțele fizice care se exercită asupra membranei. Antibioticele polienice (nistatinul, candicidina) reacționează cu sterolii și destabilizează membrana. De aceea, ele sunt active față de celulele eucariote și nu influențează celulele procariote. Micoplasmele încorporează sterolul în structura membranei, disponibil în mediul de creștere și sunt sensibile la antibioticele polienice.

La unele bacterii, în structura membranei se găsesc molecule asemănătoare structural cu colesterolul și pot avea același rol de creștere a rigidității: hopanoidele. Un compus larg distribuit este diploptenul, cu 30 de atomi de C.

Mecanismele fiziologice ale permeabilității membranei

Creșterea și multiplicarea microorganismelor sunt condiționate de disponibilitatea nutrienților care trebuie să străbată învelișurile celulare și de eliminarea produselor de catabolism. Caracterul hidrofob al membranei îi conferă acesteia proprietatea de barieră de permeabilitate: trec prin difuzie liberă unele molecule hidrofobe mici, molecule lineare și cele solubile în mediul lipidic al membranei (antibioticele cu molecula polară). Apa difuzează liber printre fosfolipidele membranei pentru că molecula este mică și lipsită de sarcină. Membrana exclude moleculele mai mari decât glicerolul, dacă nu sunt transportate de sisteme membranare sau dacă nu se dizolvă în lipide. În același timp, barierele celulare asigură transportul substanțelor nutritive și rețin în interiorul celulei substanțele necesare, funcționând ca adevărate porți moleculare, ce controlează intrarea și ieșirea diferitelor molecule. Datorită structurilor de suprafață, celula bacteriană nu este niciodată în stare de echilibru cu mediul înconjurător, în privința concentrației diferitelor molecule de o parte și de alta a membranei citoplasmatice (Brock, 2005). În funcție de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor, transportul moleculelor (electroliți și neelectroliți) prin membrană se face prin două categorii de procese fiziologice: difuzia pasivă și mecanismele de transfer cu moleculă purtător.

Difuzia pasivă

Difuzia pasivă este cea mai simplă modalitate de pătrundere a moleculelor în celulă și se definește prin trecerea liberă a substanțelor prin membrana plasmatică în ambele sensuri. Procesul difuziei pasive are următoarele particularități: trecerea moleculelor se face fără consum de energie; forța motrice a trecerii este gradientul de concentrație, ceea ce înseamnă că transportul substanțelor se face din zona cu concentrație mai mare, spre zona cu concentrație mai mică a moleculelor; transferul durează până în momentul în care moleculele substanței care se transferă ajung la aceeași concentrație pe ambele fețe ale membranei plasmatice; dacă de o parte a membranei se găsesc mai multe tipuri de substanțe, difuzia pasivă se face individual pentru fiecare tip de moleculă în parte, până la echilibrul osmotic al fiecărei categorii; difuzia pasivă se realizează lent și nespecific. Factorul determinant al difuziei pasive este dimensiunea moleculei.

Prin difuzia pasivă trec moleculele de apă, O2, CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), precum și moleculele liposolubile (care se dizolvă în lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina). Membrana este permeabilă pentru apă și pentru moleculele organice fără sarcină, până la dimensiunile glicerolului. Fluxul molecular în oricare direcție este proporțional cu concentrația moleculei pe fața de intrare, astfel încât rata netă de transfer este proporțională cu diferența de concentrație între cele două compartimente, dar depinde și de alți factori: sarcina moleculei transportate, gradul ei de potrivire conformațională cu discontinuitățile membranare ce formează calea de transport.

Moleculele mai mari decât glicerolul necesită sisteme specifice de transport.

Sisteme de transport cu molecule purtător

Moleculele purtător sunt proteine integrate ale membranei plasmatice, care au proprietatea de a lega substanțele dizolvate de o parte a membranei și de a le transporta pe cealaltă parte, unde le eliberează. Denumirea lor generică este aceea de sisteme de transport, transportori, purtători sau permeaze.

Sunt cel puțin trei clase de sisteme de transport membranar :

– sisteme formate dintr-o componentă ce traversează membrana;

– sisteme formate dintr-o componentă ce traversează membrana și o proteină periplasmică de legare;

– sisteme formate din proteine multiple ce cooperează pentru a media transportul.

Sistemele de transport cu molecule purtător îndeplinesc mai multe funcții: permit intrarea nutrienților în celulă; reglează concentrația metaboliților, catalizând excreția produselor finale ale căilor metabolice; mediază eliminarea activă a antibioticelor și a substanțelor toxice, favorizând supraviețuirea celulei; reglează echilibrul ionic, ce trebuie menținut la concentrații ce diferă mult de concentrația din mediul extern; participă la secreția proteinelor, polizaharidelor și lipidelor; permit transferul acizilor nucleici prin membrană, ușurând schimburile genetice între celule; elimină molecule (antibiotice, toxine) care permit celulei să desfășoare competiția biologică, conferindu-i un avantaj selectiv pentru supraviețuire.

Se cunosc trei modalități de transport prin intermediul moleculelor purtător: difuzia facilitată, translocația de grup și transportul activ.

Sistemele de transfer cu molecule purtător prezintă următoarele caracteristici: prin intermediul lor se realizează o trecere mai rapidă a moleculelor de pe o față pe cealaltă a membranei plasmatice; asigură trecerea simultană a mai multor tipuri de molecule, fără să existe fenomene de interferență; transferă în celule diferite molecule, chiar contra gradientului de concentrație și prin aceasta permit acumularea moleculelor în celulă la concentrații ce pot depăși de l00-l0000 de ori concentrația lor în mediu (cu semnificație deosebită pentru bacteriile care trăiesc în apele oligotrofe, sărace în substanțe nutritive).

Difuzia facilitată

Difuzia facilitată se aseamănă ca mecanism, cu difuzia pasivă, deoarece forța de propulsie a transportului este diferența de concentrație a substanței dizolvate, pe cele două fețe ale membranei plasmatice. Procesul nu este cuplat cu consumul de energie metabolică și nu generează procese concentrative. Transferul moleculelor se face în sensul gradientului de concentrație, din zona cu concentrație mai mare, spre zona cu concentrație mai mică. In final, concentrația substanței în celulă este egală cu concentrația sa în mediu. Nu se produce acumularea (concentrarea) moleculelor pentru că nu se consumă energie. Deosebirea față de difuzia pasivă constă în aceea că intervin molecule membranare care ușurează difuzia moleculelor transportate. Moleculele membranare sunt proteine integrate, cu domenii extramembranare, atât citoplasmatice cât și la suprafața externă.

Există două modalități de transport facilitat: de tip canal (sau por) și de tip purtător (carrier). In difuzia facilitată de tip canal, substanța dizolvată trece de pe o latură pe cealaltă a membranei, printr-un canal sau por. Canalele sau porii sunt proteine oligomerice (în special trimere) de membrană care au rolul de a transfera diferite molecule (fig. 12). Pereții canalului sunt delimitați de secvențe hidrofile, hidrofobe sau amfipatice de aminoacizi, în funcție de proprietățile substratului care difuzează și favorizează trecerea moleculelor, spre deosebire de interiorul hidrofob al stratului lipidic.

Figura 12. Ilustrarea schematică a mecanismului difuziei facilitate de tip canal. Moleculele membranare din categoria porinelor, sunt proteine integrate formate din cateva subunități. Prin modificări conformaționale, porinele realizează transportul moleculelor din mediul extracelular, în mediul citoplasmatic, dar numai în sensul gradientului de concentrație (de la concentrație mare, la concentrație mică). Procesul nu necesită consum de energie (după Black, 1996).

Moleculele purtător pot fi proteine monomerice sau dimerice, au specificitate stereospecifică de substrat și rata de transport este de câteva ori mai mică decât a difuziei de tip canal. Se presupune că molecula purtătoare trece prin membrană împreună cu substratul și isi schimbă conformația spațială, ceea ce îi permite să se prezinte cu suprafața activă, alternativ, spre fața externă sau spre fața internă a membranei. Fiecare tip de proteină purtător are unul sau mai multe situsuri de legare pentru molecula specifică.

Mecanismul de transport al difuziei facilitate funcționează în celulele adaptate la concentrații mari de glucide în mediu (de exemplu, levuri, eritrocite). La bacterii, care trebuie sa preia substanțele nutritive din soluții diluate, nu s-au evidențiat astfel de sisteme de transport.

Translocația de grup

Particularitatea fundamentală a acestei modalități de transport constă în faptul că, pentru a fi transportată prin membrana plasmatică, molecula este modificată chimic. Orice proces de transport în timpul căruia substratul este modificat chimic, se numește translocație de grup. Moleculele din mediu nu vor apărea în celulă în aceeași formă chimică, ci sub forma unui produs modificat (Alberts, 1994). Astfel sunt transportate glucidele (glucoza, fructoza, manoza, lactoza, N-acetilglucozamina), bazele purinice și pirimidinice, acizii grași etc.

Moleculele sunt fosforilate prin sistemul fosfotransferazei, cu un rest de acid fosforic. Sistemul enzimatic al fosfotransferazei este alcătuit dintr-o rețea de proteine citoplasmatice și membranare, care se fosforilează în cascadă. Prima proteină a rețelei (HPr) are localizare citoplasmatică și se fosforilează din fosfoenol-piruvat, rezultând HPr-P, cu eliberarea piruvatului. La nivelul membranei, ultima componentă a catenei de transport, o proteină integrată, fosforilează glucoza prin transferul grupării fosfat. Glucoza este transferată în celulă sub forma esterului glucozo-6-P. La E. coli, sistemul fosfotransferazei este alcătuit din 24 de proteine, iar la transportul unui monozaharid participă cel puțin 4 componente.

Proteinele membranare care se fosforilează în cascadă au rolul de permeaze și formează unul dintre sistemele de transport prin membrana citoplasmatică. Permeazele sunt proteine de transport foarte eficiente. Ele măresc viteza de transport de câteva ori în raport cu difuzia facilitată și sunt factorii determinanți ai ratei excepționale a metabolismului bacterian. Mutantele bacteriene identificate ca fiind lipsite de permeaze, devin dependente de pătrunderea nutrienților prin difuzie și necesită o concentrație externă a moleculelor nutritive de l000 de ori mai mare în raport cu tulpina parentală.

Din categoria permeazelor fac parte:

– sistemele de transport pentru glucide, cu specificitate moderată, deoarece pot fi destinate transportului unei anumite molecule de zahăr sau unui grup de molecule glucidice. S-au identificat sisteme de transport pentru monozaharide, pentru dizaharide și chiar pentru oligozaharide (de exemplu, sistemul de transport al maltozei poate transporta maltodextrine);

– sistemele de transport pentru aminoacizi au afinitate mai înaltă pentru substratul specific (comparativ cu cele ce transportă glucide), fapt care se corelează cu concentrația diferită a celor două categorii de molecule în mediu și cu rata lor diferită de metabolizare;

– sistemele de transport pentru oligopeptide au o specificitate mai mică de legare. La E. coli s-au identificat trei sisteme de transport ale oligopeptidelor: unul care leagă nespecific orice dipeptid, unul pentru tripeptide și altul care leagă orice peptid mai mic de 6 resturi.

Relativa lipsă de specificitate a permeazelor face posibilă pătrunderea unor molecule pentru care membrana nu este permeabilă, prin cuplarea lor cu peptidele. Astfel pătrund agenții chimici antibacterieni, care se leagă de peptide prin legături labile și se eliberează intracelular, după hidroliza peptidelor.

Transportul membranar prin translocație de grup se realizează cu consum de energie. Este o modalitate de a economisi energia, deoarece cea cheltuită prin fosforilare este folosită atât pentru realizarea transportului, cât și pentru prima treaptă a metabolizării glucidului. Translocația de grup realizează acumularea moleculei transportate în celulă, la o concentrație net superioară celei din mediu.

Transportul activ

Transportul activ este modalitatea de transfer intracelular al nutrienților contra gradientului de concentrație, prin care substanțele pot fi concentrate de l000 de ori în interiorul celulei, față de mediul extern. Procesul este totdeauna energizat de o sursă primară de energie și se evidențiază prin incubarea celulelor în prezența unui compus marcat radioactiv. Sursa de energie a transportului activ are trei origini: transportorii cuplați leagă transportul contra gradientului de concentrație al unei molecule cu transportul în sensul gradientului al alteia; pompele dependente de ATP cuplează transportul contra gradientului de concentratie cu hidroliza ATP; pompele dependente de lumină cuplează transportul cu aportul de energie luminoasă (de exemplu, bacteriorodopsina de halofilelor).

Figura 13. Ilustrarea schematică a mecanismului transportului activ. Ca și în cazul difuziei facilitate, moleculele transportoare sunt proteine membranare integrate, dar spre deosebire de difuzia facilitată, procesul de transport activ are loc contra gradientului de concentrație și de cele mai multe ori, consumă energie stocată în ATP (dupa Black, 1996).

Pentru a fi atribuită transportului activ, substanța trebuie să se acumuleze în aceeași formă chimică (și nu sub forma unui derivat al său). Pentru aminoacizi, dovada transportului activ se obține mai ușor, deoarece între momentul pătrunderii lor în celulă, până la încorporarea lor în proteine există un interval de timp suficient pentru evidențierea lor, însă zaharurile sunt metabolizate rapid și de aceea este necesar blocajul metabolic (prin utilizarea mutantelor bacteriene care si-au pierdut capacitatea de a le metaboliza sau prin utilizarea unui analog nemetabolizabil).

Transportul activ se realizează prin intermediul proteinelor membranare de transport (fig. 13). Existența proteinelor membranare de transport a fost dedusă din creșterea peak-ului electroforetic al proteinelor marcate în prezența moleculei transportate și din dispariția lor în celulele mutante pentru sistemul respectiv de transport. Prima proteină purtător, identificată printre proteinele membranare solubilizate este proteina sistemului lac la E. coli. Este o proteină inductibilă, iar în celulele bacteriene crescute pe mediu cu lactoză, ea reprezintă 4% din totalul proteinelor membranare.

Proteinele de transport sunt proteine transmembranare (integrate) și au domenii expuse atât spre citoplasmă cât și spre mediul extern. Structural, moleculele transportoare formează circa 12 helice care se pliază pentru a forma un canal transportor. Transportul implică o schimbare conformațională a proteinei, după legarea substratului specific. Uneori transportul activ este foarte specific, adică pentru fiecare tip de moleculă transportată există o anumită moleculă purtător, care o preia de pe o față a membranei și o transferă pe cealaltă. Acestea sunt sisteme uniport. Alte sisteme transportă simultan, în același sens o substanță, împreună cu o alta necesară pentru transport (sisteme simport). O altă categorie realizează concomitent transportul a două tipuri de molecule, în direcții opuse (sisteme antiport) (Alberts, 1994). Transportul activ al multor glucide și aminoacizi în celula bacteriană este dependent de gradientul electrochimic de H+ prin membrana plasmatică. Substanța care este transportată se leagă specific cu o proteină membranară purtător, după care molecula transportată este eliberată nemodificată chimic, în interiorul celulei. Specificitatea proteinelor membranare de transport s-a demonstrat prin experimente de mutageneză care au arătat că o singură mutație genică anulează capacitatea bacteriei de a transporta glucide specifice prin membrană. Substanțele transportate activ sunt unele glucide, aminoacizii, acizii organici, ionii anorganici (K+, Mg2+, SO42- , PO43-). Glucoza este luată prin procese active la unele bacterii, iar la altele, prin sistemul fosfotransferazei.

Transportul activ necesită consum de energie, deoarece transportorii funcționează pe principiul pompelor concentrative. La bacterii, energia necesară activării pompelor este rezultatul separării ionilor de H+, de electroni, în grosimea membranei, ceea ce constituie forța proton-motrice. Se creează un gradient de concentrație a protonilor între exteriorul și interiorul celulei. Protonii sunt expulzati de pompe specifice dependente de ATP si se concentrează la exteriorul celulei, iar în interior se concentrează OH-. Potențialul electrochimic are rol esențial pentru transportul activ.

La bacteriile Gram negative, transportul moleculelor în celulă este rezultatul acțiunii a două mecanisme, ambele consumatoare de energie. Moleculele sunt transportate în spațiul periplasmic prin intermediul porinelor. În spațiul periplasmic, molecula transportată se leagă specific cu o proteină periplasmică, care facilitează transportul în citoplasmă, pe calea unei proteine purtătoare specifice din membrana celulei, energia necesară transportului fiind furnizată prin hidroliza ATP. Această clasă de transportori s-a denumit sisteme ABC (ATP- Binding Cassette). Un alt mecanism de transport este reprezentat de sistemul fosfotransferazei.

Adeseori, celulele bacteriene posedă două tipuri de sisteme de transport: sisteme constitutive, relativ nespecifice, în condițiile unei relative abundente a nutrienților și sisteme inductibile, cu specificitate înaltă, active în condiții de stress, provocat de deficitul substanțelor nutritive sau indus de substanțe toxice.

Sisteme celulare de transport ionic

Pentru o moleculă fără sarcină, gradientul de concentrație determină transportul pasiv și sensul lui. Dublul strat lipidic este foarte impermeabil pentru moleculele încărcate electric, mici sau mari. Sarcina și gradul de hidratare le împiedică să pătrundă în dublul strat lipidic. Transportul lor este influențat atât de gradientul de concentrație, cât și de diferența de potențial electric a membranei, adică de potențialul membranar. Gradientul de concentrație și gradientul electric, adică gradientul electrochimic, determină forța netă de transport pentru fiecare tip de moleculă. Diferența de potențial a membranei (negativ pe fața internă) favorizează intrarea cationilor, dar se opune accesului anionilor.

Membrana citoplasmatică are rol de barieră osmotică, prin permeabilitatea foarte selectivă, permițând trecerea (ieșirea) unor anioni, dar reține cationii esențiali care au acces în și din celulă, numai pe calea unor unor sisteme specifice de transport. Ionii de K+, Mg2+, SO42-, PO43- sunt transferați activ în celulă, prin intermediul unor molecule purtătoare cu specificitate înaltă, denumite pompe ionice.

Sistemele de transport pentru ionii cu importanță nutritrivă sunt sisteme de influx, iar cele pentru transportul ionilor toxici sunt sisteme de eflux și reprezintă substratul molecular al mecanismelor de rezistență. Aceste pompe au o importanță excepțională pentru sistemele biologice, deoarece realizează și mențin pH, gradientele ionice și potențialul de membrană. Sistemele de transport pentru Na+, Ca2+, H+ și Cl- sunt sisteme de eflux și au rolul de a menține concentrații intracelulare scăzute și de a realiza gradiente ionice transmembranare. Sistemele de eflux pentru cationi consumă energie furnizată prin hidroliza ATP. Unii ioni (Cu2+, Zn2+) au rolul de micronutrienți, fiind utili la concentrații mici și sunt concentrați prin sistemele de influx, dar sunt toxici la concentrații mari, fiind eliminați prin sistemele de eflux. Pentru acești cationi, sistemele de influx și de eflux sunt separate. Sistemele de eflux pentru cationii toxici sunt fie consumatoare de ATP ori sunt cuplate cu un sistem antiport de înglobare a altui cation (H+, Na+, Ca2+).

1.4. Nucleoidul bacterian

Spre deosebire de celulele eucariote care au un nucleu cu structură bine definită, delimitat de o membrană și conținând un număr definit de cromosomi, “nucleul” bacterian reprezintă o formă primitivă de organizare, lipsită de membrană, inclavată direct în citoplasmă. Particularitatea structurii nucleare – lipsa membranei delimitante – este fundamentală pentru organizarea celulară de tip procariot, căruia îi aparțin bacteriile. Datorită caracterelor structurale particulare, “nucleul” bacterian a primit diferite denumiri: nucleoid, material nuclear, nucleoplasmă, echivalent nuclear sau chiar nucleu, prin analogie cu nucleul celulei eucariote, lineom sau genofor.

Aparatul genetic bacterian este reprezentat de două tipuri de structuri: nucleoidul, care din punct de vedere structural și funcțional corespunde cromosomului, iar cea de a doua categorie de structuri o reprezintă plasmidele. Corespunzător celor două tipuri de structuri, determinanții genetici sunt de două categorii: gene esențiale (eucromosomale), localizate în structura cromosomului și genele accesorii, cu localizare plasmidială sau în structura elementelor genetice transpozabile și a unor fagi.

Cromosomul bacterian, ca structură genetică esențială poartă informația genetică ce asigură desfășurarea funcțiilor esențiale pentru existența celulei, adică setul de determinanți minim necesari pentru a codifica arhitectura celulei și pentru a asigura metabolismul energetic și de biosinteză, creșterea, diviziunea și reglarea diferitelor activități celulare. Structurile genetice extracromosomale (plasmidele) poartă informația genetică accesorie, “de confort”, care permite celulei o mai bună adaptare la condiții de mediu, noi sau modificate. Genomul E. coli K12 este alcătuit din circa 4400 de gene. Pentru creșterea în laborator ar fi necesare numai câteva sute. Genomul este rezultatul acțiunii forțelor selective pentru eficiență metabolică și adaptabilitate.

Fiind foarte bogată în ARN, citoplasma celulei bacteriene este intens bazofilă, fapt ce nu a permis diferențierea materialului nuclear, la fel de bazofil, după colorarea cu coloranți bazici de anilină. De aceea, s-a considerat că nucleul bacterian lipsește sau dimpotrivă, că bacteriile ar avea un nucleu imens care ocupă întreaga celulă. Datorită bazofiliei citoplasmei, evidențierea materialului nuclear la microscopul optic este posibilă după utilizarea tehnicilor de colorare selectivă, ce constau în îndepărtarea ARN prin hidroliză acidă (tehnica Robinow și Feulgen) sau enzimatică (cu ribonuclează) și utilizarea coloranților de anilină. După hidroliza ARN, materialul nuclear apare sub diferite forme: sferică, ovalară, de halteră, de bastonaș, reprezentând 5 – l6% din volumul celulei. După tratamentul celulelor cu DN-ază, zona corespunzătoare materialului nuclear apare golită de conținut.

Pe micrografiile electrono-optice, materialul nuclear este localizat, în mod obișnuit, în partea centrală a celulei și se distinge de citoplasma înconjurătoare, prin densitatea sa mai mică la fluxul de electroni, în contrast cu celula eucariotă, la care nucleul este mai electronodens, comparativ cu citoplasma (fig. 14).

Figura 14. Imaginea electrono-optică a nucleoidului bacterian la Bacillus subtilis, x 100 000 (original).

Celula procariotă are un contrast invers al structurilor sale, în raport cu celula eucariotă, care se datorează atât faptului că molecula de ADN nu este asociată cu proteine, cât și densității foarte mari a citoplasmei bacteriene.

Pe secțiuni ultrafine, zona materialului nuclear este ocupată de fibrile fine, cu diametrul de 2,5 nm, uneori aranjate în șiruri ondulate, paralele, asemănătoare cu o jurubiță de ață și sunt sensibile la hidroliza cu DN-ază.

Organizarea fizică a cromosomului

Materialul nuclear poate fi izolat din celulă sub forma unui corpuscul dens și compact. După tratatamentul cu RN-ază, din corpusculul dens se eliberează cromosomul circular, format dintr-o singură moleculă de ADN, circulară, închisă covalent, cu o lungime de l400 µm și diametrul de 2,5 nm, corespunzător diametrului moleculei de ADN dublu catenar. Circularitatea este o condiție a existenței sale. Sub această formă, molecula de ADN este rezistentă la acțiunea exonucleazelor citoplasmatice, active asupra moleculelor lineare de ADN. Cromosomul bacterian este cea mai mare moleculă biologică. Prin lungimea sa (1400 µm), molecula de ADN cromosomal depășește de circa l000 de ori lungimea celulei bacteriene.Corpusculul dens corespunde stării “împachetate” a cromosomului. După tratamentul moderat cu RN-ază și proteaze, din structura compactă se izolează ADN (60%), ARNm, ARNt (30%) și ARN-polimeraza (l0%). Raportată la dimensiunile mici ale unei bacterii, molecula de ADN este supusă constrângerilor topologice de supraspiralizare (suprarăsucire), prin care este “împachetată” pentru a forma un corp compact de l500 de ori mai mic. Pentru a ocupa un volum atât de mic, molecula de ADN se împachetează după norme foarte riguroase, astfel încât, în orice moment, din cele 3000-5000 de gene pe care le conține, oricare să fie accesibilă sistemelor celulare de transcriere și traducere. Moleculele de ARN au un rol esențial în menținerea stării compacte a ADN. S-au propus mai multe modele de împachetare a moleculei de ADN. Cel mai acceptat este acela propus de Pettijohn si Hecht (l974) (citat de Zarnea, 1983), în acord cu care, împachetarea se face printr-un proces de pliere și supraspiralizare (formare de suprahelice) (fig. 15). Se formează astfel o structură condensată, menținută prin acțiunea asociată a proteinelor din nucleoid. Modelul de împachetare prin pliere și supraspiralizare încearcă să explice mecanismul molecular al drumului invers, de la structura circulară relaxată a macromoleculei de ADN, la arhitectura corpusculului dens existent în celulă. Pentru împachetare se consideră că molecula dublu catenară, circulară, inițial se pliază, în 40-60 de domenii egale. Punctele de pliere sunt determinate de molecule de ARN nascente, legate cu una dintre extremități de ARN-polimerază. Moleculele de ARNr și ARNt, împreună cu ARN-polimeraza participă la formarea și menținerea domeniilor de pliere.

Figura 15. Diferite stări fizice (de impachetare) ale cromosomului bacterian. a. Bucle multiple de ADN dintr-o celulă spartă prin șoc hipotonic, răspândite pe suportul reprezentat de o proteină bazică. b. Diagrama ADN supraspiralizat. În stânga sunt reprezentate 7 domenii (numărul real este de circa 50) supraspiralizate, menținute astfel de un set de proteine, care stabilizează capetele unui domeniu. Buclele mici ale fiecărui domeniu pot fi spiralizate în jurul unui set de proteine nucleosomale, reducând tensiunea în dublul helix, creată prin supraspiralizare. În dreapta, două domenii au fost incizate la nivelul unei catene, permițând rotația helixului și relaxarea supraspiralei (dupa Pettijohn și Sinden, 1985).

Prin pliere, diametrul cromosomului scade la circa 30 µm. In interiorul fiecărui domeniu de pliere are loc un proces de supraspiralizare. Supraspiralizarea este o stare fizică în care molecula de ADN se pliază prin răsucire în jurul propriei axe. Intr-o etapă ulterioară, domeniile suprahelicale se pliază din nou unul față de altul, superior și inferior față de un plan orizontal. Astfel, rezultă masa compactă a nucleoidului, așa cum se evidențiază la microscopul optic și se poate izola din celulă.

Rolul topoizomerazelor în menținerea configurației supraspiralizate a moleculei de ADN

Spiralizarea ADN are sens pozitiv și negativ. Spiralizarea primară a dublului helix are sens pozitiv (de dreapta), cu 10,4 pb/tur. Anumite secvențe de ADN, mai ales cele care conțin resturi alternante de G și C, tind să formeze un helix răsucit spre stânga (forma Z) a moleculei de ADN, denumită astfel deoarece axa glucid-fosfat are o structură în zig-zag. Spiralizarea secundară (supraspiralizarea) are sens negativ (de stânga), adică se produce prin răsucirea moleculei de ADN în sens opus spiralizării primare (pozitive) a dublului helix. Molecula de ADN bacterian este, în mod normal, supraspiralizată negativ, cu o spirală negativă la fiecare circa 200 pb. Cromosomul bacterian constă dintr-un număr mare de bucle supraspiralizate, aranjate pe o regiune centrală, rezultând o structură compactă și organizată – nucleoidul. Prin supraspiralizarea negativă, între capetele domeniului pliat, se creează o tensiune de torsiune, direct proporțională cu gradul de spiralizare, care se menține atâta timp cât molecula este închisă covalent. Tensiunea este anulată prin incizia unei catene și formarea buclelor de ADN. Catena incizată se rotește liber în jurul axei moleculei, se relaxează, ia forma circulară deschisă, fără superhelice. Formarea unei bucle elimină un tur al suprahelicei și reduce tensiunea generală a suprahelicei. Formarea suprahelicei și relaxarea ei este condiționată de activitatea unui set de enzime, denumite ADN-topoizomeraze. Topoizomerazele sunt enzime care schimbă configurația spațială a ADN prin ruperea și reunirea catenelor. Unele topoizomeraze sunt helicaze sau giraze (produc spiralizarea moleculei de ADN), iar altele sunt derulaze (produc despiralizarea prin incizia unei catene și bucla se relaxează). O topoizomerază este o nuclează reversibilă, care se leagă covalent la o grupare fosfat a ADN și rupe legătura fosfodiesterică. Deoarece legătura covalentă care unește topoizomeraza la o grupare fosfat a ADN reține energia legăturii fosfodiesterice pe care o rupe, reacția este reversibilă, adică incizia este urmată de legarea celor două capete. Legarea este rapidă și nu necesită un aport suplimentar de energie.

Topoizomerazele de tip 1 acționează prin recunoașterea unui segment de ADN, parțial despiralizat, prin incizia unei catene, ceea ce permite celor două părți ale helicei de ADN, de o parte și de alta a inciziei, să se rotească liber una față de alta, în sensul care reduce tensiunea de supraspiralizare. Aceasta înseamnă că replicarea ADN se face numai cu rotația unei mici părți a helicei, adică a celei situată în aval de bifurcație. Topoizomeraza I, prin clivarea unei catene, elimină tensiunea de torsiune și formează bucle externe distribuite pe toată suprafața nucleoidului. Buclele sunt secvențele de ADN care conțin genele transcrise la un moment dat. Ele sunt invizibile, extinse în citoplasmă și în această topografie sunt mai ușor accesibile ADN-polimerazei și ARN-polimerazei. Pe secțiuni subțiri, anticorpii marcați cu aur, specifici față de ADN monocatenar colorează numai periferia nucleoidului, iar anticorpii specifici față de ADN dublu catenar colorează partea centrală (condensată) a nucleoidului.

Topoizomerazele de tip II se leagă covalent, simultan, de cele două catene ale dublei helice și produc o rupere bicatenară tranzitorie. Aceste enzime se activează la situsurile cromosomale la nivelul cărora se întrepătrund două duble helice. După fixarea topoizomerazei la un astfel de situs, are loc clivarea uneia din cele două helice duble și trecerea celei de a II-a catene, prin breșa creată, urmată de repararea discontinuității înainte de a se disocia de ADN. ADN-polimeraza de tip II poate astfel să separe cele două molecule de ADN catenate.

ADN-giraza (sau topoizomeraza II) modifică configurația spațială a moleculei de ADN, prin catalizarea suprarăsucirii negative ale ADN cromosomal și plasmidial, ușurând împachetarea cromosomului bacterian în spațiul restrâns al celulei. Este o proteină heterotetramerică formată din două subunități A (gyr A) și două subunități B (gyr B) (la E. coli proteinele gyr au 97 kDa). Subunitățile A și B ale topoizomerazei II sunt codificate de genele gyr A și gyr B. După purificarea ADN-girazei de E. coli, structura acestei enzime a fost investigată pentru numeroase alte specii bacteriene, evidențiidu-se un grad înalt de omologie între subunitațile A, pe de o parte, și a subunitaților B, pe de altă parte. Cu toate acestea, secvența situsurilor catalitice din proteinele gyr A și aceea a situsului de hidroliză a ATP în proteinele gyr B sunt foarte conservate. ADN-giraza purificată introduce răsuciri suprahelicale negative ale moleculei de ADN circulară închisă și separă reversibil moleculele circulare catenate. Aceste activități sunt dependente de energia eliberată prin hidroliza ATP și constau în clivarea ambelor catene ale moleculei de ADN, trecerea altui duplex de ADN (sau alt segment al aceluiași duplex) și reunirea catenelor. Activitatea ADN-girazei este inhibată de quinolone Subunitatea A a fost desemnată ca ținta preferențială a acțiunii quinolonelor. Subunitatea B este ținta altor antibiotice: cumermicina și novobiocina.

ADN-giraza este singura enzimă care influențează gradul de spiralizare al ADN, prin catalizarea suprarăsucirilor negative ale ADN cromosomal și plasmidial, fiind esențială pentru menținerea stării suprahelicale a cromosomului bacterian. Inhibiția activității acestei enzime de către fluoroquinolone este asociată cu moartea rapidă a celulei bacteriene. Proteina se leagă de ADN ca un tetramer, în care cele două subunități A și două subunități B împachetează ADN prin supraspiralizare negativă. ADN giraza elimină răsucirile suprahelicale pozitive care se acumulează înaintea bifurcației de replicare. Aceste activități sunt rezultatul secționării coordonate a ambelor catene ale ADN, trecerea celuilalt segment de ADN prin nișă și restabilirea continuității catenei. Mecanismul de acțiune este caracteristic topoizomerazei II. Situsul catalitic al ADN-girazei este situat la tirozina din poziția 122 a subunitații A. Subunitatea B cuprinde situsul de hidroliză a ATP, hidroliză care furnizează energia necesară activității enzimatice. ADN-giraza este esențială pentru mai multe procese vitale: inițierea și progresia bifurcației de replicare, terminarea replicării, transcrierea unor operoni, repararea ADN, recombinarea și transpoziția.

Topoizomeraza IV a fost descrisă recent, iar funcția sa principală este decatenarea, adică separarea copiilor ADN circular dublu catenar după replicarea cromosomului bacterian și a plasmidelor. Topoizomeraza IV este omologă structural cu ADN giraza. Este o enzimă de separare a catenanilor (a moleculelor surori catenate de ADN), rezultați dintr-un rund de replicare bidirecțională și permite segregarea lor în celulele surori. ADN-giraza și topoizomeraza IV acționează asupra dublei catene, dar efectele sunt diferite: giraza împachetează ADN prin inducerea supraspiralizării, iar topoizomeraza IV separă moleculele reunite prin legături intermoleculare. Topoizomeraza IV este formată la fel ca ADN-giraza din două subunități denumite Par C și două subunități Par E, cu aceeași repartiție funcțională ca și a subunităților ADN-girazei. Proteinele Par C și Par E sunt foarte asemănătoare prin structura lor primară cu proteinele Gyr A și Gyr B (40% din secvența aminoacizilor este identică) și sunt codificate de genele parC și parE. Topoizomeraza IV modifică într-o măsură mult mai mică topologia ADN dublu catenar: rolul său este important pentru separarea catenelor de ADN după terminarea replicării. Rolul topoizomerazei IV, ca țintă specifică a quinolonelor a fost recent demonstrat la E. coli, S. aureus și N. gonorrhaeae.

Ryter și Chang (l975) consideră că nucleoidul evidențiat la microscopul electronic ca o structură netă ar reprezenta fracția de ADN condensat, genetic inactivă, care din punct de vedere topologic reprezintă ADN supraspiralizat. Proporția între ADN supraspiralizat și ADN relaxat este menținută prin echilibrul dintre ADN-giraza (topoizomeraza II), enzima care produce supraspiralizarea și topoizomeraza I, enzima care produce relaxarea.

Domeniile cromosomului bacterian sunt topografic independente, ceea ce permite rotația lor liberă și relaxarea individuală a fiecărei supraspirale, care trece reversibil în starea de buclă, configurație în care se replică, este transcrisă sau reparată. ADN bacterian, ca și la eucariote este asociat cu proteine. În celula eucariotă, corpii proteici în jurul cărora se spiralizează dubla catenă de ADN se numesc nucleosomi. La bacterii, organizarea moleculară a nucleosomilor este puțin cunoscută. Se pare că ei conțin două proteine de legare pentru ADN: proteina HU (Helix Unwinding) și proteina I. Ele se găsesc în structura nucleosomului, în proporția de o moleculă la l50-200 perechi de baze.

1.5. Ribosomii

Ribosomii sunt organite ribonucleoproteice, localizate în citoplasmă, care la microscopul electronic au formă sferică, cu diametrul de aproximativ 20 nm. Pe baza constantei de sedimentare (S) se disting următoarele categorii de ribosomi: a) ribosomi 80 S, în citoplasma celulelor eucariote; b) ribosomi mitocondriali și cloroplastici, între 55 S la mamifere și 75 S la plantele superioare; c) ribosomii Archaea, de 70 S, asemănători din punct de vedere funcțional cu ribosomii 80 S ai eucariotelor, datorită absenței sensibilității la streptomicină și cloramfenicol și prin sensiblitatea la toxina difterică; d) ribosomii eubacteriilor, de 70 S.

Numărul ribosomilor în celula bacteriană este corelat cu activitatea ei fiziologică: este mic în celulele în repaus, dar crește foarte mult în celulele fiziologic active (în medie 20000 ribosomi/celulă, cu variații între l5-l00 000).

Ribosomii sunt structuri dinamice, calitate ce se reflectă în capacitatea lor de a se disocia în două subunități, de 30 S și 50 S și de a se reasocia. Disocierea și reasocierea sunt corelate cu variația concentrației ionilor de Mg2+: creșterea concentrației ionilor favorizează asocierea, iar scăderea concentrației lor produce disocierea. Circa l0% din numărul total de ribosomi sunt asamblați, liberi în citoplasmă. Ei sintetizează proteinele structurale. Alți l0% se găsesc sub forma subunităților disociate, iar restul de 80% sunt polisomi.

Ribosomii au două localizări: liberi în citoplasmă sau atașați feței interne a membranei citoplasmatice. La nivelul celor atașați se sintetizează proteinele de export. Studiul ribosomilor a beneficiat de tehnici din domeniul fizicii (metoda dispersiei neutronilor), care, în asociație cu tehnicile de chimie au permis înțelegerea structurii și funcției ribosomilor. La microscopul electronic, s-a demonstrat că ribosomii au formă complexă, cea sferică percepută în mod obișnuit fiind rezultatul examinării cu sisteme optice cu putere redusă de rezoluție. Subunitatea 50S are o formă asemănătoare cu aceea a unui fotoliu, iar subunitatea 30S se aseamănă cu o halteră asimetrică, așezată orizontal pe brațele și spătarul fotoliului. Între cele două subunități rămâne un spațiu prin care trece ARNm.

Din punct de vedere biochimic, ribosomii bacterieni conțin circa 55 de tipuri de molecule proteice și trei tipuri de molecule de ARNr. Studiile privind structura funcțională a ribosomilor s-au făcut cu două metode foarte sensibile: difracția cu neutroni și imunoelectronomicroscopia.

Subunitatea mică 30 S cuprinde 2l tipuri de molecule proteice (S1 – S21), în ordinea descreșterii mărimii, cu greutatea moleculară între 60 000 Da și 8 000 Da și o moleculă de ARNr l6S, alcătuită din circa l6000 nucleotide.

Subunitatea mare, 50S conține 34 tipuri de molecule proteice (Ll – L34, L= Large), cu greutatea moleculară cuprinsă între 9 – 28,5 kDa și două molecule de ARNr, de 23 S și respectiv 5 S. Cele două tipuri de molecule de ARN provin prin clivarea unui precursor comun, de 30 S. Cele 55 de tipuri de proteine ribosomale se găsesc într-un singur exemplar (o singură moleculă din fiecare tip). Unele au rol structural, fiind esențiale pentru asamblarea ribosomului, altele au rol funcțional, permițând legarea ARNm în procesul traducerii și sintezei lanțului proteic. La E. coli, în fiecare subunitate ribosomală, raportul ARN-proteine este 2/l, iar la alte bacterii, raportul este 2/3. Moleculele componente au o distribuție fixă, riguroasă în structura ribosomului. Molecula de ARNr este pliată într-o structură tridimensională ce formează regiunea centrală a ribosomului și determină aspectul său. Proteinele care se leagă de ARNr 16 S sunt mai profunde și sunt cele mai protejate de acțiunea agenților externi. Proteinele sunt localizate în general la suprafața ribosomului, în depresiunile pe care le creează ARN pliat. Unele proteine conțin domenii globulare, localizate la suprafață, ce trimit extensii în regiunea centrală a ribosomului. Interacțiunile fixe ale componentelor condiționează procesele de autoasamblare a ribosomilor.

Asamblarea ribosomilor. In condiții experimentale, componentele ribosomale se dispersează și se autoasamblează după restabilirea condițiilor de mediu, pentru a produce ribosomi activi. S-a reconstituit subunitatea 30 S, dar reasamblarea subunității 50 S este mai complexă deoarece este dependentă de temperatură (60o C) și proteinele se denaturează la această temperatură. În studiile experimentale s-au utilizat ribosomi de Bacillus stearothermophilus, ale căror proteine sunt termostabile, rezistente la 60o C. Ulterior s-a reasamblat subunitatea 50 S de la E. coli. Reasamblarea ribosomilor urmează o cale specifică: anumite proteine se leagă de ARN și complexul este recunoscut succesiv de alte proteine, până ce structura devine completă. Ribosomii reconstituiți sunt funcționali (fac sinteză proteică). Rolul proteinelor pare a fi de stabilizare a ARN, dar ele permit schimbarea configurației ARNr, necesare catalizei sintezei proteinelor.

Ribosomii reprezintă componenta esențială a sistemului de traducere a informației genetice. Ei sunt adevăratele fabrici de proteine ale celulei. Ribosomii au rolul de a menține atât molecula de ARNm, cât și complexul aminoacil-ARNt, într-o orientare corespunzătoare pentru a permite atât citirea mesajului, cât și formarea legăturilor peptidice. Ribosomii se asociază în polisomi (poliribosomi), adică grupări funcționale formate din 4 – 50 unități ribosomale. Dimensiunile polisomilor variază în funcție de lungimea ARNm. Polisomii sintetizează concomitent mai multe molecule proteice pe aceeași moleculă de ARNm.

1.6. Sporul bacterian

Sporul este o forma primitivă de diferențiere celulară, care constă în reorganizarea structurală și funcțională a celulei vegetative și formarea unui nou tip de celulă, cu proprietăți noi. Sporii se formează la bacteriile cilindrice: totdeauna la bacilii anaerobi din genul Clostridium, facultativ la cei aerobi din genul Bacillus, excepțional la coci (Sporosarcina) și la actinomicete. Toate bacteriile sporulate sunt Gram pozitive. Sporularea este condiționată de existența unui perete mureinic gros și de formarea septului de diviziune. Există circa l0 tipuri de spori, ce se deosebesc prin modul de formare, prin structură și prin rezistență la factorii de mediu. Cel mai caracteristic este endosporul, denumit astfel deoarece se formează în interiorul unei celule vegetative. La actinomicete se formează câteva tipuri de spori: artrospori (prin segmentare), oidiospori (prin fragmentare), aleuriospori (se formează apical sau lateral pe sporofori scurți), zoospori (spori mobili), iar aplanosporii se formează prin septarea hifelor și sunt menținuți în interiorul unui înveliș. La Azotobacter se formează chiști.

Endosporul sau sporul endogen a fost considerat ca unic tip sporal bacterian, până la descrierea celorlalte tipuri. Are formă sferică sau ovalară. Cei ovalari au dimensiuni cuprinse între 0,5 – 1 µm, pentru axul scurt și 1,2 – 2 µm pentru axul lung. Endosporul are o refringență deosebită și pe preparatul proaspăt apare strălucitor. Este foarte greu colorabil datorită învelișurilor sporale groase, greu penetrabile pentru coloranți (în special cortexul) și datorită conținutului lor chimic particular. Se colorează prin tehnici speciale.

Poziția sporului în celulă poate fi terminală, subterminală sau centrală. În funcție de dimensiunile față de diametrul celulei vegetative, sporii sunt deformanți (diametrul lor este mai mare decât al celulei) și nedeformanți (diametrul lor este mai mic decât al celulei).

Intr-o celulă bacteriană sporulantă, sporii sunt unici, cu rare excepții: în sol apar bacterii bisporulate, iar în intestinul unor vertebrate acvatice, bacterii polisporulate. Semnificația sporilor multipli nu este clară. Se pare că ei apar ca rezultat al perturbării mecanismului de separare a celulelor după diviziune. Sporii multipli apar în celulele în care materialul nuclear s-a replicat, dar nu s-a format septul de diviziune.

Sporogeneza este declanșată în mod obișnuit de lipsa unui nutrient esențial în mediu, sursa de azot sau de carbon. Procesul este foarte complex din punct de vedere genetic, biochimic, structural și funcțional. Sporularea implică activarea unui număr mare de gene sporale (peste 50) inactive în celula vegetativă, în timp ce sunt represate genele active în celula vegetativă. Sub aspect biochimic, sporularea este însoțită de modificări majore ale componentelor moleculare și structurale. Se sintetizează proteazele care măresc turnover-ul proteic, furnizând aminoacizii necesari sintezei proteinelor noi. Din punct de vedere funcțional, celula sporală dobândește o rezistență deosebită la factorii fizici și chimici. Din punct de vedere structural, la nivel electrono-optic, sporularea la B. subtilis parcurge 7 stadii, în cursul cărora celula sporală se formează și se eliberează. Sporularea este precedată de replicarea materialului nuclear. Ulterior, cei doi cromosomi fuzionează, formând o structură axială alungită unică. Nucleoidul axial diploid segregă în două structuri cromosomale: una migrează spre polul sporal și va deveni nucleoidul sporului, iar cealaltă rămâne în celula vegetativă. Formarea septului sporal este inițiată prin apariția a două mici protuberanțe simetrice ale peretelui, spre interiorul celulei. Membrana citoplasmatică îmbracă aceste excrescențe, se invaginează și formează membrana presporului. Cele două intruzii ale membranei se închid ca o diafragmă, de la exterior spre interior. Membrana presporului este dublă și delimitează componentele celulare ale viitorului spor. Formarea sa este completă la 5 ore după inițiere. În stadiile ulterioare, din materialul care se depune între cele două membrane ale presporului se definitivează morfogeneza cortexului, format din trei lamele: lama internă (profundă), care va deveni peretele sporului, iar după germinare, peretele viitoarei celule; lama intermediară sau cortexul propriu-zis, cu grosime variabila și lama externă. S-au izolat mutante bacteriene care blochează sporogeneza în diferite etape.

Structura internă a endosporului

La diferite grupe de bacterii există variații importante ale structurii sporului, în special în privința învelișurilor, care diferă prin numărul și grosimea lor. Există de asemenea variații cu privire la relația sporului cu celula vegetativă în care s-a format: sporul rămâne inclus în celulă sau se eliberează curând după formare, prin liza acesteia.

Sporul este alcătuit din protoplastul sporal, care conține sporoplasma și materialul nuclear. Protoplastul sporal este acoperit de următoarele structuri:

– un perete intern subțire, originar din membrana internă a presporului. După germinare, acesta va forma peretele celulei vegetative;

– cortexul sporal, cu grosime variabilă, electronodens. Este o structură multilaminară ce se formează pe fețele adiacente ale celor două membrane ale presporului;

– stratul extern al cortexului, derivat din membrana externă a presporului;

– învelișul sporal intern (intina), un strat dens, de natură proteică;

– învelișul sporal extern (exina). Uneori, aceste două învelișuri sunt pluristratificate;

– exosporul, un rest al celulei vegetative, uneori adiacent de celelalte învelișuri sporale, prin intermediul filamentelor “suspensoare” (fig. 16).

Figura 16. Imagine electrono-optică a secțiunii transversale prin sporul în curs de formare la B. megatherium. Componenta structurală electronodensă, delimitantă a protoplastului, este cortexul sporal (x 120000, original).

La unele categorii de spori se găsesc structuri suplimentare denumite apendice sporale. Semnificația lor funcționala nu este certă, dar ar putea fi implicate în dispersarea sporilor în natură sau ar facilita absorbția substanțelor nutritive în perioada premergatoare germinării sporului.

Particularitățile biochimice ale sporului

Schimbarea specificității ARN-polimerazei este foarte importantă pentru controlul sporulării la B. subtilis. Când începe sporularea, multe gene active în celula vegetativă sunt represate și sunt activate genele specifice. Fiecare stadiu al sporulării este marcat de schimbarea expresiei unor gene, mediată de factorul sigma, care schimbă specificitatea legării ARN-polimerazei de promotor. Protoplastul sporal conține toate categoriile de molecule necesare reluării creșterii: materialul nuclear și cantități mici ale fiecărui component al aparatului de sinteză proteică (ribosomi, ARNt, enzime). Lipsesc componentele celulare instabile (ARNm și nucleozid-trifosfații), dar există precursorii lor mai stabili (nucleozid mono- și difosfați). Aminoacizii și enzimele lor de biosinteză sunt virtual absente, dar la germinare, ambele tipuri vor fi generate prin hidroliza proteinelor de depozit, solubile, cu moleculă mică. Puține enzime sporale derivă din enzimele celulei vegetative prin clivare. Majoritatea enzimelor sporale sunt noi. Sinteza lor este codificată de gene activate în timpul sporulării. Toate enzimele sporale sunt termorezistente, fapt explicabil prin dimensiunile lor mici, fiind reprezentate numai de situsul activ al moleculei respective. Lipsesc enzimele fundamentale ale metabolismului celular, ca și sistemele transportoare de electroni.

La cele mai multe bacterii, ionii de Ca2+ lipsesc. In stadiile timpurii ale sporulării apar sistemele de transport activ pentru Ca. Ionii de Ca sunt legați cu o cantitate echivalentă de acid dipicolinic (se formează din acidul diaminopimelic – un precursor al peptidoglicanului) și formează dipicolinatul, care poate constitui circa l5% din greutatea uscată a sporului.

S-a considerat că sporul este rezultatul unui proces de deshidratare profundă. Cercetările ulterioare au evidențiat că deosebirile dintre spor și celula vegetativă nu sunt de ordin cantitativ, ci de ordin calitativ și se datorează stării apei (Gould, 1969). In celula vegetativă, apa liberă reprezintă 70% din cantitatea totală, iar în spor oscilează între 3 – l0%, restul de 90 – 97% fiind apa legată. Din această cauză, sporul este lipsit de metabolism, sau are un metabolism de intensitate foarte mică, nedecelabilă. Celula sporală este vie, dar procesele vieții sunt latente. Fenomenul se numește criptobioză (viață ascunsă).

Consecința particularităților de compoziție chimică, la care se adaugă învelișurile groase multiple și pluristratificate, este rezistența deosebită a sporului la caldură, la acțiunea substanțelor chimice (antiseptice, dezinfectante) și a radiațiilor. Rezistența termică este conferită de dipicolinatul de Ca. Mutațiile care reduc cantitatea de dipicolinat scade rezistența sporului la agentul termic. Rezistența termică a sporului impune o metodologie costisitoare de sterilizare, la temperaturi foarte ridicate. Uneori, sporii rezistă la temperatura de l800 C, de la câteva minute, la câteva ore. De aceea s-a renunțat la metoda sterilizării obiectelor prin fierbere, deoarece tratamentul omoară numai formele vegetative, iar sporii rămân viabili.

Germinarea este procesul de conversie a sporului în celulă vegetativă și decurge în trei stadii:

– activarea sporului prin deshidratare, asociată cu mărirea volumului;

– germinarea, adică modificarea localizată prin gelificare a învelișurilor sporale;

– emergența celulei vegetative din învelișuri, delimitată de un perete derivat din peretele sporal intern.

Intr-un mediu nutritiv optim, germinarea este rapidă: de la inițiere până la diviziunea celulară, procesul durează 90 de minute. In medii favorabile, majoritatea sporilor germinează, dar o proporție mică rămân în stare dormindă. Pentru inițierea germinării, sporii necesită un factor suplimentar: factorul termic, un compus cu grupări –SH, pH acid. După circa o oră de la începutul activării începe sinteza ADN.

1.7. Glicocalixul

Glicocalixul este reprezentat de totalitatea structurilor polizaharidice extraparietale: capsula, cu diferite grade de dezvoltare și glicocalixul comportamental.

Capsula este o structură accesorie, cu o consistență gelatinoasă, vâscoasă, care acoperă complet celula bacteriană. În funcție de gradul de dezvoltare la diferite specii bacteriene se disting următoarele structuri capsulare:

– microcapsula, reprezrentată de o peliculă fină de material polizaharidic, în jurul peretelui celular (până la 0,2 m grosime). La microscopul optic se evidențiază numai prin metoda imunofluorescenței, dar este vizibilă la microscopul electronic;

– macrocapsula, o structură omogenă, aderentă de celulă, mai groasă de 0,2 m, vizibilă la microscopul optic prin tehnici speciale de colorare negativă, dacă este o capsulă suficient de compactă și rigidă, pentru a exclude tușul de India și nigrozina. Dacă are o structură laxă și flexibilă, coloranții o penetrează. Aderența macrocapsulei de celulă este fermă și prin centrifugare se depune concomitent cu celulele;

– stratul mucos este o structură capsulară cu o grosime neuniformă și distribuție dezordonată în jurul celulei. Consistența este mai fluidă, prin centrifugare, celulele se desprind și se depun, iar materialul polizaharidic ramâne în suspensie;

– zoogleea, o masă de material polizaharidic, în care sunt cuprinse un numar mare de celule bacteriene.

Materialul capsular se găsește la bacteriile Gram pozitive și Gram negative (fig. 17) din sol, ape (dulci și sărate), rumen, la bacteriile patogene ce produc infecții ale vezicii urinare și pulmonare.

Figura 17. Macrocapsula la bacili Gram negativi (imagine la microscopul optic, x 1000, original).

Natura chimică a materialului capsular

Materialul capsular este de natură polizaharidică. De cele mai multe ori, în alcătuirea sa se găsesc D-glucoza, D-fructoza, D-galactoza. Mai rare sunt manoza, fucoza, pentozele. Unele polizaharide extracelulare se aseamănă cu acizii teichoici deoarece conțin glicerol-fosfat sau ribitol-fosfat.

Materialul capsular poate fi un homopolizaharid sau un heteropolizaharid. Cele mai cunoscute homopolizaharide sunt dextranii si levanii. Dextranii formează o clasă mare de polizaharide, alcătuiți din unități de D-glucopiranozil, legate l-6, cu punți de ramificare în pozitiile 2, 3 sau 4. Lungimea lanțului este cuprinsă între 40 – 500 resturi de glucoză. Dextranii sunt produși de Peptococcus (Leuconostoc) mesenteroides, din sucroză. Sinteza lor este abundentă în melasa de la fabricile de zahăr, unde o cantitate semnificativă de zahăr este convertită la dextran, aducând prejudicii economice importante. In stare purificată, dextranul se folosește în practica transfuziilor, ca înlocuitor al plasmei, fiind solubil în apă. Sephadexul este un dextran folosit în tehnicile cromatografice bazate pe principiul sitei moleculare și cromatografia de schimb ionic. Levanii sunt poli-D-fructani (fructozizi), sintetizați de unele bacterii patogene pentru plante (Pseudomonas, Xanthomonas), de Streptococcus (Str.) salivarius, de Bacillus. Au greutăți moleculare de l000 kDa sau mai mult (Black, 1996).

Heteropolizaharidele sunt alcătuite dintr-un număr variat de unități diferite: glucoză, fructoză, galactoză, manoză, acid galacturonic, derivați aminați și acetilați ai acestora. Structura biochimică a heteropolizaharidelor este foarte diferită nu numai în funcție de compoziția chimică globală, ci și de secvența diferiților monomeri în catena polizaharidică (de exemplu, pentru xantan, structura repetitivă este un pentazaharid). Diversitatea monomerilor glucidici conferă heteropolizaharidelor o anumită heterogenitate a structurii chimice și în consecință, o anumită specificitate antigenică. De exemplu, la Str. pneumoniae există peste 80 de tipuri chimice diferite de material capsular, care corespund nu numai unor diferențe de compoziție chimică, cât și de secvență a monomerilor. Varianta antigenică a polizaharidului capsular imprimă specificitatea anticorpilor în reacțiile de apărare față de bacteriile patogene.

Capsula este o structură inertă, accesorie ce nu face parte integrantă din celula bacteriană. Cel mai adesea nu îndeplinește o funcție esențială pentru celulă. Bacteriile patogene capsulate sunt virulente, deoarece capsula este un material chimiotactic negativ pentru fagocite. Pe mediul solidificat, ele produc colonii netede (S, Smooth). Mutantele lor necapsulate care produc colonii rugoase (R, Rough) sunt mult mai puțin virulente. Materialul capsular este higroscopic (reține apa) și astfel protejează celula de efectul dăunător al uscăciunii. Materialul capsular ar putea avea rolul de depozit al unor nutrienți din mediu.

Glicocalixul comportamental

La anumite bacterii structurile superficiale sunt acoperite de un glicocalix adevărat, constituit dintr-o rețea de filamente polizaharidice și glicoproteice, legate de lipopolizaharidele membranei externe la bacteriile Gram negative sau de mureina bacteriilor Gram pozitive. Filamentele formează o structură pericelulară dezordonată, ca o pâslă, prin intermediul căreia celula se ancorează fie pe alte celule, fie pe suporturi inerte. Glicocalixul se găseste numai la bacteriile care trăiesc în mediile naturale, având un caracter adaptativ, adică există numai în condițiile în care prezența ei conferă celulei un avantaj selectiv. După cultivare în medii artificiale (bulion, geloza), glicocalixul dispare și din această cauză s-a evidentiat târziu. Deoarece nu persistă la celulele cultivate în mediile artificiale, s-a propus denumirea de glicocalix comportamental.

Glicocalixul a fost studiat la celulele bacteriene din placa dentară. Placa dentară este un depozit de culoare alb-gălbuie, vizibil cu o lupă, ce se formează pe suprafața smalțului dentar, inițiată de Streptococcus mutans. Celulele sale sintetizează un polizaharid glucanic, prin intermediul căruia aderă foarte strâns de suprafața smalțului, formând inițial o microcolonie, iar ulterior, o colonie. Celulele aderă între ele, dar și de smalțul dentar, prin glicocalix. După impregnare cu săruri și glicoproteine salivare se creează un micromediu anaerob, în care bacteriile elimină produsele de catabolism. Micromediul coloniei se acidifică și se creează condițiile favorabile degradării smalțului. Astfel se initiază formarea cariei.

În mediile naturale, celulele bacteriene lipsite de structura capsulară se ancorează de suport prin intermediul glicocalixului. Legarea celulelor de suport este prima etapă a procesului de colonizare. Astfel se inițiază formarea coloniei bacteriene, glicocalixul fiind structura care mediază asocierile bacteriene polispecifice. Astfel s-a demonstrat că în rumen, asocierile coloniale conțin celule ce aparțin unor specii diferite (colonii polibacteriene). Intre ele se stabilesc relații metabolice sinergice, prin care bacteriile realizează activități metabolice, pe care speciile separate nu le pot desfășura. De exemplu, în rumen se produce CH4: unele bacterii produc H2, altele CO2, iar bacteriile metanogene reduc CO2, utilizând H2 ca sursă reducătoare.

Majoritatea microorganismelor din mediile acvatice nu se găsesc ca organisme libere plutitoare, ci trăiesc atașate de suprafețe, inclusiv la suprafața apei, unde formează un biofilm. Asociațiile naturale de bacterii, în matricea unui biofilm funcționează ca un consorțiu cooperant. Biofilmele reprezintă sisteme biologice cu un nivel înalt de organizare, în care comunitățile de bacterii sunt coordonate funcțional. Capacitatea lor de a persista în întreaga biosferă se datorează versatilității lor metabolice și plasticității fenotipice. Un element esențial al adaptabilității este capacitatea lor de a-și alege poziția într-o nișă în care se propagă. Cel mai comun mecanism de poziționare este mobilitatea flagelară și diferitele modalități de translocație pe suprafețe: răsucire, alunecare, înclinare, roire. Unele specii își modifică poziția prin sinteza polizaharidelor, formând o peliculă ce plasează celulele la interfața aer-apă. Un alt mecanism de alegere a poziției este agregarea sau atașarea, prin intermediul căreia se amplifică interacțiunile celulare. Prin atașare, bacteriile nu numai că își fixează poziția pe o suprafață, dar formează comunități și dobândesc avantajul versatilității fenotipice. Biofilmele au rol în epurarea apelor uzate, în epurarea apelor de suprafață contaminate cu produse petroliere. Biofilmele se formează chiar în condiții extreme, ca de exemplu în apele acide (pH = 0) de drenaj al minelor, unde contribuie la circuitul sulfului. Cianobacteriile formează biofilme în izvoarele termale și pe suprafața gheții din Antarctica. Alt tip de comunitate în biofilm este ansamblul bacteriilor asociate cu particulele suspendate, de materie organică sau anorganică. Aceste particule macroscopice formează zăpada marină și sunt bogate în biomasa microbiană și nutrienți, având rol în în circuitul carbonului organic particulat în mediul pelagic (pelagos = mare, zona de larg a apelor marine).

Pentru bacteriile patogene, glicocalixul este structura prin care celulele se ancorează de celulele mucoaselor și inițiază procesul infecțios. De exemplu, Neisseria gonorrhoeae se leagă de celulele uretrale și vaginale prin filamentele glicocalixului. Uneori, legarea mediată de glicocalix are caracter de specificitate pentru un anumit tip de celule (bacteriile care inițiază procese patologice intestinale se leagă uneori exclusiv de epiteliul intestinal). Glicocalixul capsular și cel comportamental sunt structuri foarte variabile din punct de vedere fenotipic, având grade foarte diferite de dezvoltare la aceiași tulpină bacteriană, în diferite condiții de mediu. Deși sinteza reprezintă o cheltuială semnificativă de energie, rolul lor funcțional în mediile naturale justifică existența structurilor polizaharidice. Glicocalixul dispare la celulele cultivate în medii artificiale. Pe medii nutritive bogate, existența acestor structuri nu mai este necesară, dar reapar prin transferul celulelor în medii naturale nefavorabile.

Reunirea tuturor structurilor polizaharidice extraparietale, indiferent de gradul de dezvoltare sub denumirea de glicocalix a fost propusă de Costerton (l974). Capsula este cea mai importantă dintre ele, ca grad de dezvoltare, dar toate structurile polizaharidice îndeplinesc aceiași funcție esențială – aderența celulei de substrat. Gradul diferit de dezvoltare, de la glicocalix la macrocapsulă, implică o diversificare corespunzătoare a funcțiilor acestor structuri. Prin gradul foarte diferit de dezvoltare în raport cu condițiile de mediu, structurile polizaharidice extraparietale sunt expresia autentică a plasticității fenotipice structurale a bacteriilor. Teoria plasticității fenotipice consideră că, bacteriile răspund modificărilor mediului de viață, prin schimbări structurale și funcționale (metabolice) profunde, în contextul activității aceluiași set de gene. Plasticitatea fenotipică a bacteriilor permite adaptarea rapidă la schimbări majore ale mediului. Bacteriile sunt primele organisme care se adaptează la condițiile noi de mediu, în timp ce organismele superioare se adaptează mult mai lent, prin selecția mutantelor. Bacteriile colonizează ecosistemele noi și prin mecanismul genetic al selecției mutantelor. Această dublă capacitate adaptativă – prin plasticitate fenotipică și prin selecția mutantelor – explică uriașul succes al bacteriilor de a popula chiar cele mai ostile medii.

1.8. Flagelul

Flagelul (flagellum = bici) este organitul extracelular al mobilității celulei procariote. Organitul omolog de mobilitate al celulei eucariote este cilul. Flagelii se mai numesc și undulipode (undula = undă mică; pus, podos = picior). Flagelul se prezintă ca un filament extracelular, filiform, ondulat, cu grosimea uniformă pe toată lungimea sa. Lungimea este variabilă, de la 4 – 5 m până la 70 m, iar diametrul este de 20 nm. Flagelii nu se observă prin examinarea directă a celulelor la microscopul optic. Existența lor se deduce indirect, din mobilitatea celulelor bacteriene. Celulele fără flageli se numesc atrihe.

După numărul și modul de așezare a flagelilor, bacteriile sunt:

– monotrihe (cu un singur flagel);

– amfitrihe (cu doi flageli asezați la cei doi poli ai unui bacil);

– lofotrihe (au numeroși flageli grupați într-un smoc);

– peritrihe (celule cu numeroși flageli, distribuiți pe toată circumferința celulei).

Poziția flagelului (sau flagelilor) poate fi polară, subpolară sau ecuatorială.

Comparativ cu cilul celulei eucariote, flagelul are o structură simplă. Flagelul își are originea în structurile de înveliș ale celulei și este alcătuit din următoarele elemente (fig. 18):

– corpusculul bazal, localizat în învelișurile celulare;

– cârligul;

– filamentul extern (flagelul propriu-zis).

Corpusculul bazal formează o structură rotativă unică, atât ca alcătuire cât și ca funcționalitate în sistemele biologice, asemănătoare, în general, cu un buton de cămașă. La bacteriile Gram negative, structura sa este mai complexă, deoarece discurile componente sunt duble, alcătuite din proteine diferite și îndeplinesc funcții diferite. Se disting următoarele discuri:

– discul M (mobil, se rotește cu viteză mare) și este ancorat în structura membranei citoplasmatice;

– discul S (stator) este legat de peptidoglican;

– discul P este localizat în spațiul periplasmic;

– discul L este legat de lipopolizaharidele membranei externe a peretelui.

Aceste discuri sunt așezate pe o structură axială subțire.

Cârligul are rolul de articulație flexibilă între corpusculul bazal și filamentul extern. Prin axul său central, cârligul se leagă de corpusculul bazal.

Mișcarea de rotație a discului M (3000-4000 r/min) este transmisă cârligului și filamentului extern.

Figura 18. Reprezentarea schematică a structurii flagelului (după Todar, 2004).

În alcătuirea flagelului intră cel puțin 11 tipuri de molecule proteice: câte unul în filamentul extern și cârlig și cel puțin 9 tipuri de proteine în corpusculul bazal. Cea mai cunoscută este proteina filamentului extern, denumită flagelină și are gr. mol. de 40 kDa. Moleculele sale sunt așezate după o simetrie helicală, formând o structură tubulară, canaliculară. Moleculele de flagelină au proprietatea de autoasamblare: dacă moleculele de flagelină sunt dispersate, în condiții adecvate, ele se reasamblează spontan. Flagelina se sintetizează sub forma monomerilor, în interiorul celulei. Moleculele străbat axul central al structurii bazale și se așează după o simetrie helicală pentru a forma filamentul extern. Flagelul bacterian crește prin regiunea sa apicală.

Cârligul este format din subunități proteice identice. Funcția sa nu este cunoscută.

Corpusculul bazal are o structură moleculară mult mai complexă. Cele 9 proteine diferite sunt organizate în discurile care înconjură un ax subțire, ce se inseră în membrana citoplasmatică.

1.9. Fimbriile

Fimbriile sunt structuri de tipul unor apendice filamentoase, rigide și neuniforme ca lungime, care se extind de la suprafața celulei bacteriene. Termenul de fimbrii a fost introdus de Duguid (1955) (citat de Zarnea, 1983) (fimbria – latin fibra, franjuri), iar în 1959 Brinton (citat de Zarnea 1983, 1995) a folosit termenul de pil (latin, pilus = păr). Apoi s-a sugerat ca termenul de pil să fie folosit pentru structurile filamentoase codificate de plasmidele conjugative, cu rol în procesul de conjugare ce constă în transferul unui fragment de ADN de la o celulă donor la o celulă receptoare. Adeseori, cei doi termeni se folosesc pentru a descrie aceiași stuctură. Fac excepție structurile fimbriale de la Neisseria, pentru care literatura folosește termenul de pil.

Fimbriile sunt alcătuite din molecule proteice de fimbrilină, cu gr. mol. de 15 – 30 kDa, așezate totdeauna după o simetrie helicală. Numărul lor este de până la l000/celulă. Daca sunt numeroase, au o dispoziție pericelulară. Dacă sunt puține, au localizare polară sau bipolară. Lungimea lor este foarte variabilă (l-20 µm), ceea ce sugerează că au vârste diferite.

Fimbriile se observă la microscopul electronic, după colorația negativă a celulelor întregi sau se evidențiază indirect prin capacitatea lor de a aglutina hematiile diferitelor specii de animale și pot fi împărțite în 3 categorii structurale:

– fimbrii rigide, cu diam. de 5 – 10 nm, cu un lumen de circa 2 nm (la enterobacterii). Regiunea hidrofobă este la capătul COOH al fimbrilinei;

– fimbrii flexibile, cu diam. de de 5 – 6 nm. Se mai numesc fimbrii N-metil-fenilalanină, deoarece la capătul N-terminal al fimbrilinei au un rest de fenilalanină metilată. Se găsesc la Ps. aeruginosa, N. gonorrhoeae, N. meningitidis. Regiunea N-terminală este hidrofobă;

– fimbrii subțiri spiralate, cu diametru de 4 nm sau mai puțin, fără lumen (K88, K99, la E. coli).

Unele fimbrii au atât o regiune rigidă, cât și una flexibilă.

Fimbriile sunt comune la bacteriile Gram negative și mai rare la bacteriile Gram pozitive (Corynebacterium, Actinomyces), dar sunt diferite structural.

O bacterie posedă câteva tipuri de fimbrii, în funcție de grosime, lungime, specificitatea antigenică (determinată de secvența aminoacizilor în molecula de fimbrilină) și de specificitatea receptorilor glicoproteici ai celulelor epiteliale de care aderă.

Fimbriile sunt structuri din categoria adezinelor, adică mediază interacțiunea celulă-suport. În ceea ce privește capacitatea de legare, cele mai multe adezine fac parte din familia lectinelor. Lectinele sunt glicoproteine obținute din plante care se leagă nespecific cu oligozaharide de pe suprafața celulelor și produc aglutinarea acestora. Ele precipită polizaharidele și glicoproteinele sau aglutinează celulele. Activitatea aglutinantă și precipitantă poate fi inhibată de haptene (monozaharide și oligozaharide).

Cea mai importantă funcție care li se atribuie ar fi aceea de punți de aderență intercelulară sau aderență de suportul inert. La bacteriile din mediile acvatice, fimbriile favorizează asocierile dintre celule și astfel se formează pelicule fine (filme) de neuston la suprafața apei, cu rol adaptativ, ce asigură condiții bune de aerare pentru bacteriile aerobe și de luminozitate pentru cele fotosintetizante.

Pentru bacteriile patogene, prezența fimbriilor (tulpinile fim+) le conferă un grad superior de virulență, deoarece fimbriile aderă ferm de receptorii suprafeței celulelor epiteliale ale mucoaselor și ai hematiilor. Receptorii majori pentru fimbriile bacteriene, pe suprafața celule eucariote sunt glicoproteinele cu manoză. Proteina de aderență localizată pe fimbrii se leagă de resturile de manoză ale glicoproteinelor. În funcție de comportamentul în prezența manozei s-au identificat fimbrii manozo-sensibile și manozo-rezistente. La E. coli s-au evidențiat fimbrii manozo-sensibile (manoza inhibă hemaglutinarea prin competiția cu receptorii suprafeței hematiilor). Fimbriile manozo-rezistente aglutinează numai eritrocitele tanate. Celulele bacteriene cu astfel de fimbrii aderă de celulele endoteliale, de celulele epiteliale ale tractului respirator, urogenital, de membrana bazală a tubilor renali, a capsulei Bowmann. O celulă bacteriană exprimă simultan, fimbrii cu specificități diferite de legare de suportul celular. Astfel se explică selectivitatea bacteriilor patogene și comensale pentru anumite gazde și țesuturi. Elaborarea conceptului adezinelor și a specificității lor de legare, explică tropismul tisular selectiv al bacteriilor infecțioase. Caracterul progresiv ascendent al infecției urinare, de la vezică spre rinichi, împotriva fluxului urinar, se explică prin fenomenul de aderență, mediat de fimbrii cu diferite specificități de legare, de celulele epiteliale. Exprimarea fimbriilor pe suprafața celulei este adaptativă. Ele favorizează aderența celulei bacteriene de substraturi celulare diferite.

Fimbrilina este codificată de gene cromosomale, ceea ce denotă că fimbriile au o importanță ecologică deosebită, prezența lor favorizând competiția celulei pentru substrat. După sinteză, fimbrilina este transferată extracelular și depusă la baza fimbriei. Orice linie bacteriană poate să existe alternativ în varianta fim+ sau fim- și să poarte simultan mai multe tipuri de fimbrii. Rata de mutație a genelor care codifică sinteza fimbriilor este foarte mare, astfel încât celulele fim+ trec în varianta fim- și invers, prin retromutație.

Uneori fimbriile suferă fenomenul variației de fază și al variației antigenice. Variația de fază înseamnă că o structură dată este sau nu este produsă. Variația antigenică semnifică faptul că aceiași structură se produce în variante biochimice diferite. Variația antigenică a fimbriilor bacteriene este rezultatul acțiunii mai multor mecanisme. Cel mai simplu este acumularea lentă a mutațiilor punctiforme în gena codificatoare. Fenomenul se numește drift antigenic și are loc atât la bacteriile patogene cât și la cele nepatogene.

1.10. Pilii

Pilii sunt apendice filamentoase neflagelare, a căror sinteză este codificată de gene localizate în structura unor plasmide denumite conjugoni sau plasmide sex. Celulele purtătoare de pili au capacitatea potențială de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numărul pililor pentru o celulă este cuprins între 1 și l0, iar lungimea este de circa 20 µm. Diametrul extern este de 6 – l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm. Pilii sunt alcătuiți din molecule identice de pilină, o fosfoglicoproteină de l2 – l5 kDa. Se sintetizează în celulă, de unde este transferată în lumenul piliar și este asamblată după o simetrie helicală, la extremitatea liberă a acestuia. Pilii pot fi îndepărtați mecanic, prin agitare și se resintetizează. Prin încălzire sau tratament acid, pilii se dezagregă în moleculele componente (pilina). Restabilirea neutralității și a nivelului termic permite autoasamblarea și formarea unei structuri identice cu pilul original (Davis și colab., 1990).

Prezența pililor este asociată totdeauna cu procesul de conjugare bacteriană (fig. 19). Pilii ar putea fi structuri esențiale de transfer al materialului genetic de la celula donor la celula receptor. Molecula de ADN ar trece prin lumenul pilului. După alți autori, pilii ar avea numai rolul de a “agăța” celula receptoare de material genetic, iar prin retracția sa ulterioară, cele două celule s-ar apropia.

Figura 19. Structurile piliare par să medieze conjugarea bacteriană (x 150 000, dupa Todar, 2004).

Rolul pililor în conjugare este argumentat de faptul că depilierea (prin agitare cu perle de sticlă) este însoțită de pierderea capacității de conjugare și de restabilire a ei odată cu resinteza pililor. Capacitatea de sinteză a pilinei se pierde odată cu pierderea plasmidei de sex și este redobândită odată cu recâștigarea plasmidei.

Pilii poartă receptori de fagi. Pe suprafața pililor se găsesc receptori pentru fagii ARN masculi. Se numesc fagi masculi deoarece infectează numai celulele cu potențialitate de donor de material genetic. Marcajul cu fagii ARN mascul este modalitatea de a-i distinge de alte structuri filamentoase. La extremitatea liberă a pililor se găsesc receptori pentru fagii filamentoși. Celulele purtătoare de pili au capacitatea potențială de a dona material genetic (sunt celule mascul). Numărul pililor pentru o celulă este cuprins între 1 și l0, iar lungimea este de circa 20 µm. Diametrul extern este de 6 – l5 nm, iar cel intern de 2,5 nm.

Bibliografie selectivă

Alberts B., Bray D., Lewis J., Molecular biology of the cell, 3rdEdition, Garland Publishing. 1994.

Beveridge T.J., Davies J.A., Cellular responses of Bacillus subtilis and Escherichia coli to the Gram stain – Journal of Bacteriology, 1983, p. 156.

Black J. G., Microbiology – Principles and Applications, 3rd Edition, Prentice Hall, Upper Sadle River, 1996.

Brock, T., Milestones in Microbiology: 1546 to 1940. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1998

Brock T., Biology of microorganisms, 9th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 2000.

Brock T., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 2005.

Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng K.J., Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria- Bacteriology Reviews, 1974, p.38 – 87.

Davis B., Dulbecco R., Eissen H., Microbiology , 4th Edition, New York Lippincott, 1990.

Ghuysen J-M., Hakenbeck R., Bacterial cell wall , Elsevier, 1994.

Gould G.W., Hurst A. (eds) , The Bacterial Spore , Academic Press, San Diego, 1969.

Lehninger A. L. , Biochimie – vol. 1, traducere din limba engleza editia a doua, Editura Tehnica, Bucuresti, 1987.

Jawetz E., Melnick J.L., Adelberg E.A., Medical Microbiology , Appleton & Lange, East Norwalk, CT. 1989.

Pettijohn DE, Hecht R. RNA molecules bound to the folded bacterial genome stabilize DNA folds and segregate domains of supercoiling. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1974; 38:31–41

Pettijohn, D. E., and R. R. Sinden. Structure of the isolated nucleoid, p. 199–227. In N. Nanninga (ed.), Molecular cytology of Escherichia coli. Academic Press, London, England. 1985

Ryter A, Chang A. Localization of transcribing genes in the bacterial cell by means of high resolution autoradiography. J Mol Biol. 1975 Nov 15; 98 (4): 797–810.

Rogers H.J. – Bacterial Cell Structure – American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1983.

Seifert H.S., So M. – Genetic mechanisms of bacterial antigenic variation – Microbiological Reviews, 1988, p. 52.

Todar's Online Textbook of Bacteriology, Kenneth Todar, University of Wisconsin, http://www.textbookofbacteriology.net/

Wright A., Tipper D.J. – The outer membrane of gram-negative bacteria, In Sokatch JR, Ornston LN (eds): The bacteria. Vol. 7. Academic Press, San Diego. 1979, p:427.

Rietschel, E., S. Hase, Ming-Tzan King, John Redmond and Volker Lehman, 1977 – Chemical Structure of Lipid A – Microbiology, 1977, Ed. D. Schlessinger

Zarnea G. – Tratat de Microbiologie generala – volumele I, II, III, V. 1983-1994.

Capitolul 2

ANTISEPTICE SI DEZINFECTANTE

Substanțele chimice din compoziția unui mediu de creștere a microorganismelor pot exercita, în funcție de natura și concentrația lor, trei tipuri de efecte asupra acestora:

– un efect favorizant asupra dezvoltării și multiplicării celulare, prin aportul substanțelor nutritive și realizarea echilibrelor fizico-chimice necesare;

– un efect microbiostatic, prin blocarea potențial reversibilă a proceselor de multiplicare celulară, determinând inhibiția procesului de multiplicare, dar bacteriile rămân viabile și își reiau creșterea și multiplicarea după ce sunt transferate pe medii adecvate;

– un efect microbicid, prin alterarea profundă și ireversibilă a unor procese metabolice esențiale.

Particularitățile fiziologice ale microorganismelor influențează acțiunea substanțelor chimice. De exemplu, CO2 și H2S sunt toxice pentru majoritatea microorganismelor aerobe, al căror metabolism respirator îl inhibă, dar pentru unele specii bacteriene aceste substanțe reprezintă o sursă de energie. Una și aceeași substanță poate acționa în moduri diametral opuse, în funcție de concentrația ei: în concentrație de 1%, zaharoza este o bună sursă de carbon și energie, iar la concentrația de 40% are efect bacteriostatic. Substanțele folosite în metabolismul microorganismelor au rolul de surse de carbon, de azot și de energie sau acționează ca factori de creștere. La concentrații foarte mici ale unei substanțe nutritive în mediu, creșterea bacteriană este foarte slabă, dar se intensifică odată cu creșterea concentrației substanței nutritive, până când aceasta atinge un nivel prag, după care, rata de creștere a populației celulare devine constantă, independentă de concentrația substanței nutritive. Când concentrația substanței atinge limita de toleranță pentru celulă, se produce inhibiția creșterii celulare, iar dincolo de această limită, substanța nutritivă poate avea un efect bactericid. Unele substanțe exercită efecte de chimiotaxie sau chimiotropism pozitiv, fiind atractante pentru microorganisme, în timp ce altele exercită un chimiotactism negativ asupra celulelor, efectul lor fiind repelent.

Efectele dăunătoare ale unor compuși chimici pot fi de tip microbiostatic, alteori, compușii chimici au efect microbicid, adică determină moartea microorganismelor expuse. Împărțirea substanțelor chimice în microbiostatice și microbicide este arbitrară, deoarece o substanță poate fi microbiostatică la concentrație mică sau când acțiunea ei este de scurtă durată, dar poate fi microbicidă la concentrație mare sau după acțiunea prelungită a unei concentrații mici.

Caracterul bacteriostatic sau bactericid este dependent de concentrația la care se manifestă un anumit efect și timpul de acțiune pentru producerea efectului.

O substanță este microbicidă (bactericidă, fungicidă) dacă efectul ei se produce într-un interval scurt de timp și se manifestă la concentrații foarte mici și este microbiostatică, dacă efectul ei rămâne ca atare și la concentrații relativ mari de substanță activă, iar rata efectului microbicid este foarte scăzută, astfel încât cel puțin o parte din celule pot supraviețui timp foarte îndelungat. În practică, în afara celor doi termeni se folosesc denumirile de antiseptice (AS) și dezinfectante (DF) (Redish, 1959).

Antisepticele sunt substanțe chimice care, aplicate pe țesuturile vii impiedică creșterea și multiplicarea microorganismelor existente. Sunt relativ netoxice și pot fi aplicate pe țesuturi umane și animale. Termenul de dezinfectant este restrâns la substanțele cu efect microbicid rapid, la concentrații mici. Ele se aplică pe obiecte neanimate, în scopul distrugerii microorganismelor contaminante. Cele mai multe substanțe dezinfectante sunt toxice și nu pot fi administrate la om și la animale.

Antisepticele și dezinfectantele cuprind o largă varietate de agenți chimici (tabelul 1) și poartă denumirea generică de biocide. Biocidele, în general, au un spectru mai larg de acțiune decât antibioticele și spre deosebire de acestea, care au ținte intracelulare specifice, biocidele au ținte multiple. Majoritatea substanțelor dezinfectante acționează fie prin dizolvarea lipidelor din membrana citoplasmatică (detergenți, solvenți lipidici), fie prin modificări ale proteinelor, acizilor nucleici etc. Unele biocide se folosesc pentru conservarea unor produse biologice (farmaceutice, alimentare). Conservarea semnifică prevenirea multiplicării microorganismelor. Altele se folosesc pentru curățire, care semnifică îndepărtarea unui material străin de pe o suprafață.

Tabelul 1.

Structurile chimice și utilizările biocidelor antiseptice și dezinfectante (după Topley și Wilson’s,

1998).

Metodele de studiu privind mecanismele de acțiune ale AS și DF sunt:

– studiul dinamicii înglobării;

– determinarea efectelor litice sau de pierdere a constituienților celulari;

– studiul efectelor asupra modelului membranar;

– detectarea inhibiției activității enzimelor;

– studiul efectelor asupra proceselor de biosinteză macromoleculară;

– examinarea microscopică a celulelor expuse acțiunii biocidelor.

Efectele nocive ale substanțelor antibacteriene se exercită pe mai multe căi:

– prin modificări de permeabilitate la nivelul peretelui celular și membranei citoplasmatice;

– prin denaturarea unor constituenți celulari esențiali (proteinele);

– prin blocarea grupărilor funcționale active ale enzimelor și interferența cu metabolismul producător de energie;

– inhibiția competitivă prin analogie sterică, a reacțiilor de biosinteză.

Uneori, aceiași substanță își poate exercita acțiunea, pe una sau pe mai multe căi, dar una dintre acestea reprezintă calea principală de acțiune. Oricare ar fi tipul de celulă microbiană, acțiunea substanțelor antimicrobiene se desfășoară după o secvență comună de evenimente. Interacțiunea cu suprafața celulei poate modifica semnificativ viabilitatea (de exemplu, glutaraldehida), dar cei mai mulți agenți antimicrobieni sunt activi după ce pătrund în celulă. Mecanismele acțiunii AS și DF asupra protozoarelor nu au fost investigate, datorită dificultății cultivării unor protozoare în condiții de laborator (de exemplu, Criptosporidium). Diferitele stadii ale ciclului de dezvoltare (de exemplu, trofozoiții și chiștii) ilustrează modul în care schimbările fiziologice și citologice influențează răspunsul la antiseptice și dezinfectanți. AS și DF se folosesc pe scară largă în spitale și în alte locații, pentru aplicații locale și pentru dezinfectarea suprafețelor expuse. Ele constituie o parte esențială a practicilor de control al infecțiilor și contribuie la prevenirea infecțiilor nosocomiale.

2.1. Substanțe antibacteriene active prin modificări de permeabilitate

Substanțele din această categorie (săpunurile, detergenții) produc modificări fizico-chimice, care duc la pierderea permeabilității selective a membranelor celulare, astfel încât membrana citoplasmatică nu mai reține în interiorul celulei, moleculele utile (aminoacizi, nucleotide, coenzime, ioni) și nici nu poate opri pătrunderea din exterior a unor substanțe nocive.

Săpunurile își datoresc efectul antimicrobian, acțiunii acizilor grași nesaturați (oleic, linoleic, linolenic) din compoziția lor. Acțiunea lor se exercită asupra constituienților lipidici ai membranelor celulare, care astfel devin mai permeabile (Jungerman, 1996). Datorită capacității lor emulsionante, săpunurile determină, prin spălare, o reducere masivă a numărului microorganismelor pe suprafața tegumentului.

Detergenții sunt compuși organici tensioactivi, obținuți prin sinteză chimică, din materii prime derivate din petrol. Molecula lor este asemănătoare aceleia a săpunurilor, dar au proprietăți fizice și chimice superioare (Paulson, 1997).

Molecula agenților tensioactivi este asimetrică: conține o regiune hidrofilă și una hidrofobă (lipofilă sau liposolubilă). Molecula detergenților se leagă atât de apă, cât și de moleculele organice nepolare. Molecula amfipatică a detergenților se orientează cu capătul hidrofob, spre materialul organic, iar cu capătul hidrofil, spre apă. Efectul detergenților este udarea, desorbția, emulsionarea, suspensionarea și stabilizarea particulelor dizlocate de pe o suprafață (fig. 20). Rezultatul este detergența (sau curățirea). La contactul cu o suprafață lipidică sau cu interfața ulei-apă, moleculele detergentului se adsorb pe această suprafață, prin grupările lor hidrofobe, iar cele hidrofile rămân în apă.

Figura 20. Molecula de detergent se orientează cu gruparea hidrofobă spre materialul organic (original).

Astfel orientate, moleculele detergentului formează un strat (o soluție) de continuitate între cele două medii insolubile (lipide-apă), ceea ce determină efectul de “udare”, ca rezultat al scăderii tensiunii superficiale.

Pe baza sarcinii sau absenței ionizării grupării hidrofile, detergenții sunt de patru tipuri: cationici, anionici, neionici și amfoterici. Cei neionici nu au calități dezinfectante, iar uneori pot chiar să favorizeze creșterea bacteriilor și fungilor.

Monoglicerida acidului stearic Lauratul de sodiu

(detergent neionic) (detergent anionic)

Detergenții anionici sunt săruri de Na și K ale acizilor grași superiori. Au efect bactericid scăzut, deoarece prin disociere eliberează un anion organic, cu toxicitate redusă, respins de sarcina netă negativă a suprafeței bacteriene. Sunt mai eficienți față de bacteriile Gram negative (Zneiden, 1998).

Detergenții cationici (Cetavlon, Cetazol, Bromocet) sunt săruri quaternare de amoniu, care conțin patru grupări organice legate de un atom de azot.

Structura moleculară a clorurii de cetilpiridinium (detergent cationic)

Prin disociere, detergenții cationici eliberează un cation organic toxic. Compușii amoniului quaternar acționează asupra structurii membranei, pe care o dezorganizează. Bacteriile își pierd sarcina electronegativă, prin adsorbția ionilor pozitivi. Substanțele lipidice din peretele celular și cele din membrană sunt solubilizate. Numeroși constituienți citoplasmatici părăsesc celula, iar substanța activă pătrunde în interior și denaturează proteinele și acizii nucleici.

Sărurile quaternare de amoniu lizează sferoplaștii și protoplaștii aflați în suspensie în soluție de sucroză. Sunt sporostatici (inhibă dezvoltarea celulei vegetative din sporul germinat, dar nu procesul de germinare propriu-zisă). Au efect micobacteriostatic, dar nu micobactericid. Compușii amoniului quaternar se folosesc pentru dezinfecția preoperatorie a tegumentului intact, se aplică pe membranele mucoase.

Detergenții cationici sunt bactericizi față de toate categoriile de bacterii, chiar și față de M. tuberculosis, deoarece dizolvă învelișul lipidic al suprafeței lor. Eficiența lor este diminuată de materialele fibroase, de apă, de ionii de Ca2+ și Mg2+. Oxidează obiectele de metal, dacă nu se adaugă un agent antioxidant (nitritul). Viabilitatea sporilor nu este afectată. Nu sunt toxici pentru organismul uman și nu irită țesuturile. Se folosesc ca antiseptici tegumentari. Acțiunea lor este neutralizată de săpunuri și fosfolipide.

Detergenții neionici (polieteri și esteri poliglicerici) nu au acțiune bactericidă. Adaugați în mediile nutritive sunt chiar metabolizați de unele microorganisme. Unii dintre ei (Tween 80) sunt folosiți ca agenți de dispersare ai celulelor bacteriene, pentru a favoriza creșterea și multiplicarea lor. Concentrațiile mici de polisorbat (Tween) modifică permeabilitatea membranei externe a bacteriilor Gram negative (Zneiden, 1998).

Structura moleculară a Tween 80

Agenții amfoterici cumulează proprietățile de detergent ale compușilor anionici, cu proprietățile antimicrobiene ale compușilor cationici. Activitatea lor rămâne constantă la o variație largă de pH. Din această categorie fac parte compușii din seria Tego.

2.2. Substanțe care acționează prin denaturarea proteinelor

Substanțele din această categorie produc modificări fizico-chimice ale coloizilor citoplasmatici, stopează activitatea enzimelor și precipită sau coagulează proteinele celulare.

Acizii și bazele

Cele mai multe bacterii pot fi cultivate în medii al căror pH este cuprins între 6 și 9, diferența de concentrație a ionilor de H fiind echivalentă cu diferența de la l la 1000. Toleranța la variația largă a pH se datorează faptului că bacteriile sunt puțin permeabile pentru ionii de H+ și OH-, ceea ce le permite menținerea neutralității interne.

Așa se explică faptul că, deseori, tocmai acizii slabi și bazele slabe, care se disociază puțin, au un efect antibacterian evident (McDonell, 1999). Efectul lor nu se datorează ionilor de H+ sau OH-, ci este legat de prezența unui număr mare de molecule nedisociate, acizi sau baze care pot pătrunde în celulă mai ușor decât ionii corespunzători. De aceea, activitatea lor antimicrobiană este dependentă de pH-ul mediului. Așa se explică faptul că într-un mediu ușor acid, acidul acetic este toxic pentru bacterii, pe când HCl are un efect antibacterian slab. La un pH relativ scăzut al mediului, acizii slabi, aflați sub forma nedisociată pot pătrunde în celula bacteriană și îi modifică pH, în timp ce acizii tari, intens disociați rămân în afara ei. In mediul neutru sau ușor alcalin, moleculele de acid acetic sunt aproape complet ionizate (disociate), ceea ce le îngreuiază accesul în celulă și, ca urmare, toxicitatea lor este anulată. Același mod de comportare este caracteristic și bazelor slabe: NH3 este toxic în mediu slab alcalin și inofensiv pentru bacterii, în mediu neutru sau slab acid. Pentru acizii tari, eficiența acțiunii antimicrobiene este proporțională cu concentrația ionilor de H+ în soluție. HCl este sporicid și se folosește pentru dezinfectarea pieilor de animale, infectate cu B. anthracis. Unele bacterii sunt acidotolerante și chiar acidofile. Lactobacillus sp. se dezvoltă la pH 4, iar Thiobacillus thiooxidans, chiar în prezența H2SO4, 0,1 M. Acțiunea antimicrobiană a acizilor este folosită în practică pentru conservarea alimentelor cu acid acetic 5%, cu sărurile acidului propionic (CH3- CH2 – COOH), parahidrobenzoic, benzoic, sorbic sau cu esterii metil, etil, propil, butil, ori prin fermentație lactică naturală. Micobacteriile sunt relativ rezistente la acțiunea acizilor și alcolilor, practica obisnuită fiind lichefierea sputei înainte de cultivare, prin expunere pentru 30 de minute, la NaOH 1N sau H2SO4 1N. Acidul boric este un antiseptic de valoare medie.

Activitatea antimicrobiană a alcalilor tari este dependentă de concentrația ionului OH- în soluție. NaOH are proprietăți alcaline puternice: la concentrația de 5% omoară celulele vegetative, iar la concentrații mai mari omoară sporii de Bacillus anthracis. Ca(OH)2 rezultă din reacția CaO + H2O. Soluția 20% de Ca(OH)2 omoară majoritatea bacteriilor nesporulate.

Alcoolii sunt cei mai utilizați agenți chimici pentru dezinfecție. Ei sunt activi prin efectul denaturant asupra proteinelor și prin solubilizarea lipidelor. Produc ruperea membranelor și inactivarea enzimelor. Omoară bacteriile nesporulate, inclusiv pe cele acidorezistente. Inhibă sporularea și germinarea sporilor, dar efectul este reversibil. Efectul dezinfectant al alcoolilor crește odată cu lungimea catenei (metilic, etilic, izopropanol etc), până la 8 – l0 atomi de C, după care solubilitatea în apă scade progresiv. Cei mai folosiți alcooli sunt CH3OH (metanol), C2H5OH (etanol) și CH3CHOHCH3 (izopropanol). Ultimul este un bactericid mai eficace, la concentrația de 99%. Etanolul se folosește în soluții apoase. Cele mai eficiente sunt cele cu concentrația de 60 – 70%. Prezența apei este esențială pentru activitatea antimicrobiană a etanolului. Concentrațiile mai mari de 90% și mai mici de 5% sunt relativ ineficiente ca agenți dezinfectanți. Acțiunea lor dezinfectantă, ca și efectul denaturant asupra proteinelor implică participarea apei. Eficiența acțiunii lor scade în prezența materiei organice. Expunerea timp de o oră este letală pentru formele vegetative, nu modifică viabilitatea sporilor, dar inhibă sporularea și germinarea lor. Contactul de scurtă durată nu are efect sterilizant, ci numai reducerea populației bacteriene. Alcoolii au activitate antibacteriană rapidă, cu spectru larg față de formele vegetative (inclusiv micobacterii), antifungică, neutralizează infecțiozitatea virusurilor (Zneiden, 1998). Pentru că nu omoară sporii, alcoolii nu se folosesc pentru sterilizare, dar se folosesc pentru dezinfectarea suprafețelor și ca antiseptice tegumentare. Alcoolul izopropilic este mai eficient față de bacterii, iar alcoolul etilic este mai eficient față de virusuri (Mihăescu, 2000).

Fenil-etanolul este activ fața de bacteriile Gram negative și se folosește drept conservant al soluțiilor de uz oftalmic.

Alți solvenți organici (eter, benzen, acetonă) omoară bacteriile dar nu sunt agenți dezinfectanți. Adăugarea câtorva picături de toluen sau cloroform în soluții apoase inhibă dezvoltarea fungilor și bacteriilor. Glicerolul este bacteriostatic la concentrații de peste 50%. Este folosit pentru conservarea vaccinurilor, deoarece nu este iritant pentru țesuturi.

Fenolul (acidul carbolic) este cel mai vechi dezinfectant cunoscut, fiind utilizat de Lister încă din l867. La concentrații mici este bactericid, deoarece produce denaturarea și chiar precipitarea proteinelor celulare. Este iritant și produce coagularea proteinelor tisulare. Aceleași efecte le produc și derivații săi (crezolul, crezil-acetatul). Agenții antimicrobieni de tip fenolic s-au folosit pentru proprietățile antiseptice, dezinfectante sau conservative, în funcție de compus. Adeseori s-au denumit “otrăvuri protoplasmatice generale” (McDonnell, 1999), dar sunt activi și față de membrană.

Fenolul induce pierderea progresivă a constituienților intracelulari, inclusiv eliberarea K+, indiciul major al leziunii membranare. Se consideră că fenolul acționează la punctul de separare a celulelor fiice pereche. Celulele tinere sunt mai sensibile. Fenolii sunt antifungici și antivirali. Acțiunea antifungică se datorează lezării membranei plasmatice și pierderii constituienților citoplasmatici (McDonell, 1999). Fenolul și crezolii au proprietăți analgezice. Se folosesc sub formă de spray ca antiseptice și analgezice pe membranele mucoase (ale urechii, nasului, gâtului). Sunt foarte stabili la încălzire și uscare și își păstrează activitatea în prezența materialului organic. Față de sporii bacterieni au o eficiență moderată. În diluție de 5%o, fenolul este folosit ca prezervant pentru diferite preparate biologice. Prin convenție internațională, activitatea fenolului este considerată ca etalon, în raport cu care se apreciază activitatea antibacteriană a diferitelor substanțe. Fenolii sunt mai activi în amestec cu săpunurile, care măresc solubilitatea lor și favorizează penetrarea în substrat. Adăugarea unui halogen (clor) sau a unui compus organic stimulează activitatea microbicidă a fenolilor.

Difenolii sunt derivații hidroxi-halogenați a două grupări fenolice conectate prin diferite legături. Au spectru larg de eficacitate, sunt sporostatici, dar au activitate scăzută față de Pseudomonas aeruginosa și fungi. Triclosanul și hexaclorofenul sunt cele mai folosite biocide din acest grup: în săpunurile antiseptice și în soluțiile dezinfectante pentru mâini. Ambele au efecte cumulative și persistente asupra tegumentului.

Triclosanul are activitate în special față de bacteriile Gram pozitive. Eficiența față de bacteriile Gram negative și levuri poate să crească prin efectul de formulare: de exemplu, în asociație cu EDTA, determină creșterea permeabilității membranei externe. Efectul primar se produce, probabil, asupra membranei citoplasmatice, deoarece inhibă înglobarea nutrienților, iar concentrațiile mari bactericide produc creșterea amplă a permeabilității și eliberarea rapidă a componentelor celulare.

Hexaclorofenul (difenol-halogenat) este bacteriostatic la diluții foarte mari. In combinație cu un săpun este un dezinfectant eficace al pielii. Dacă este absorbit pe cale tegumentară este toxic. Nu are miros iritant, este un bun deodorant, ceea ce explică utilizarea sa ca deodorant comercial și pentru producerea săpunurilor, înainte de a fi interzis, datorită neurotoxicității la copii. Mecanismul de acțiune constă în inhibiția catenei transportoare de electroni, al cărei sediu structural este membrana citoplasmatică, efectul fiind bactericid.

Clorhexidenul este probabil cel mai folosit biocid în scopul producerii antisepticelor utilizate pentru curățirea mâinilor, dar și ca dezinfectant și conservant. Este un înlocuitor eficient al hexaclorofenului. Are eficiență cu spectru larg. Activitatea antibacteriană este dependentă de pH și este mult diminuată în prezența materiei organice. Clorhexidenul este un agent bactericid, deoarece traversează peretele celular sau membrana externă, prin difuzie pasivă și acționează asupra membranei citoplasmatice, perturbând-i permeabilitatea. Nu este sporicid. Efectul asupra germinării este minim, dar inhibă creșterea. Micobacteriile sunt, în general, foarte rezistente la clorhexiden.

Alexidina diferă chimic de clorhexiden, pentru că are grupări terminale etil-hexil. Are acțiune mai rapid bactericidă, deoarece alterează mai rapid permeabilitatea.

Esterii alchilați ai acidului hidroxibenzoic sunt conservanți ai alimentelor și medicamentelor. Nu sunt toxici, deoarece sunt hidrolizați rapid.

2.3. Substanțe care acționează prin interferență cu grupările active ale proteinelor-enzime

Unele substanțe acționează direct asupra unor grupări reactive (amino, carboxil, sulfhidril, amido, indol) din structura enzimelor, combinându-se cu ele și blocând astfel sau modificând activitatea enzimatică. In funcție de stabilitatea legăturii formate între aceste substanțe și grupările reactive ale enzimelor, efectul este microbiostatic sau microbicid, iar reacția este reversibilă sau ireversibilă.

Formaldehida (HCHO) și glutaraldehida (OCH(CH2)3CHO) omoară celulele prin denaturarea nespecifică a proteinelor și acizilor nucleici și au spectru larg de acțiune antimicrobiană.

Formaldehida (CH2O) este o monoaldehidă, foarte reactivă, care interacționează cu proteinele, cu ADN și cu ARN. Concentrațiile de 25 g/ml pot fi bactericide. Ele înlocuie atomii labili de H din grupările -NH2, -OH, -COOH, -SH ale proteinelor și formează punți metilenice (R-CH2-R), care leagă, în general ireversibil, moleculele proteice și le inactiveză. Reacțiile formaldehidei sunt, parțial, ireversibile. Se folosește în soluție apoasă (34 – 38%) sau 20% în alcool metilic 65 – 70% (pentru a întârzia polimerizarea) sau prin vaporizare la cald, pentru dezinfectarea și sterilizarea suprafețelor uscate. Este bactericidă, fungicidă, sporicidă și inactivează virusurile. In concentrație de 4%o este folosită ca prezervant pentru vaccinuri și preparate de diagnostic. Soluțiile de formaldehidă, apoase sau alcoolice sunt netoxice și neiritante. Ele omoară celulele vegetative în 5 minute, Mycobacterium tuberculosis – în l0 minute, sporii în 3 – l2 ore și inactivează virusurile în l0 minute (McDonell, 1999). O-ftalaldehida are acțiune bactericidă și sporicidă. Este un compus aromatic cu două grupări aldehidice.

Glutaraldehida are spectru larg de activitate față de bacterii, spori, fungi și inactivează virusurile. Se leagă de structurile de suprafață ale celulei, inhibă transportul membranar și enzimele periplasmice, inhibă sinteza macromoleculelor. Glutaraldehida interacționează puternic cu lizina, dar și cu alți aminoacizi. Este mai activă la pH alcalin. Pe măsură ce pH extracelular se modifică la valori alcaline, suprafața celulei expune mai multe situsuri reactive și efectul bactericid este mai rapid. Are efect letal asupra micobacteriilor. La concentrații mici inhibă germinarea sporului, iar la concentrații mari (2%) este sporicidă.

Datorită efectului denaturant asupra proteinelor, glutaraldehida se folosește ca fixator în tehnica de preparare a materialului biologic pentru examinarea la microscopul electronic.

Etilen-oxidul (CH2-O-CH2) este cel mai folosit gaz sterilizant. Molecula de etilen-oxid înlocuie H din proteine, din acizii nucleici și probabil din alte molecule. Legarea etilen-oxidului se numește alchilare și efectul este blocarea grupărilor reactive ale macromoleculelor. Este solubil în apă și foarte exploziv. Este folosit pentru sterilizarea gazoasă a obiectelor termosensibile: echipamente chirurgicale, lenjerie de spital. Are acțiune toxică remanentă (este vezicant).

Ionii unor metale grele (Hg, Ag, Cu, Zn, Fe) sunt toxici pentru microorganisme datorită acțiunii lor oligodinamice, adică sunt activi la concentrații foarte mici. Cu, Zn, Fe intră în componența unor enzime și au rolul fiziologic de microelemente, dar la concentrații supraoptimale, în compoziția substanțelor antimicrobiene, ionii metalelor grele acționează prin precipitarea enzimelor sau a altor proteine esențiale ale celulei. Ionii metalici pot fi așezați în serii cu activitate antimicrobiană descrescătoare: Hg, Ag, Zn, Cu. Sunt activi la concentrații foarte mici (o parte la un milion), datorită afinității lor pentru grupările SH.

Hg este utilizat sub forma sărurilor anorganice (HgCl2, sublimat coroziv, cu CF = 827 și oxicianura de Hg) sau sub formă organică (mertiolat, mercurocrom). Acțiunea sărurilor de Hg se datorează formării de mercaptide cu grupările –SH ale proteinelor. Inițial, reacția este reversibilă și efectul este microbiostatic. Efectul HgCl2 este neutralizat prin adăugarea în exces a compușilor cu grupări –SH (glutation, tioglicolat). Din această cauză, utilizarea ei este considerată a fi perimată. După contactul prelungit sau prin utilizarea unor concentrații mari de HgCl2, reacția devine ireversibilă și efectul este microbicid. HgCl2 este folosită curent în laborator, la concentrații de 1/l000 până la 1/l0 000, care omoară toate microorganismele. La diluții mari (1/20000 sau mai mari), efectul este bacteriostatic. Compușii organici cu Hg se folosesc pentru dezinfectarea rănilor superficiale și pentru conservarea serurilor și vaccinurilor.

Argintul și compușii săi au fost folosiți mult timp ca agenți antimicrobieni. Ionii de Ag au efect microbiostatic, la concentrații foarte mici și microbicid, la concentrații mai mari. Se pare că unele proteine au afinitate mare pentru ionii de Ag și îi fixează chiar la concentrații mici. Bacteriile omorâte sub acțiunea ionilor de Ag conțin în medie l06 ioni/celulă, ceea ce corespunde aproximativ numărului de molecule de proteine-enzime dintr-o celulă. Cel mai important compus este Ag – sulfadiazina (AgSD), dar se folosesc și alți compuși: acetatul și nitratul de Ag. AgNO3, în soluție de 1% (Argyrol) se folosește pentru a inhiba posibilele infecții gonococice ale ochiului la noul născut. Se instilează în ochi imediat după naștere, deoarece infecția nosocomială poate determina orbirea. În locul AgNO3 s-a folosit penicilina, dar odată cu preponderența bacteriilor rezistente la penicilină, AgNO3 a fost reintrodus în uz. Ionii de Ag interacționează cu grupările thiol (-SH), dar probabil și cu alte ținte, iar la nivel membranar produce eliberarea ionilor de K+. Aminoacizii, ca cisteina și alți compuși (tioglicolatul de Na) care conțin grupări tiol, neutralizează activitatea AgNO3 față de Ps. aeruginosa. Aminoacizii care conțin legătura S-S (disulfid), aminoacizii fără S și compușii cu S ca acidul cisteic, L-metionina, taurina, tiosulfatul de Na, nu neutralizează activitatea Ag+. Faptul sugerează că interacțiunea Ag+ cu gruparea tiol a enzimelor și proteinelor. Joacă rol esențial în inactivarea bacteriilor, dar pot fi implicate și alte componente celulare. Sărurile de Ag și ale altor metale grele (Cu) acționează prin legarea de grupările funcționale ale enzimelor fungice. Ag+ produce eliberarea ionilor de K+ din celula microorganismelor. Membrana citoplasmatică, sediul activității multor enzime, este o țintă importantă pentru activitatea Ag. Ag+ este activ nu numai asupra enzimelor: produce inhibiția marcată a creșterii la Cryptococcus neoformans și este depozitat în perete și în vacuolă citoplasmatică. Ag+ inhibă diviziunea celulară și lezează membrana externă la Ps. aeruginosa. Volumul celulei crește semnificativ, iar componentele sale exprimă anomalii structurale. Ag+ interacționează cu acizii nucleici, cel mai probabil cu bazele.

Sulfadiazina este o combinație a doi agenți antibacterieni: Ag+ și sulfadiazina (SD). Efectul antibacterian este rezultatul unui singur compus sau este rezultatul interacțiunii sinergice. AgSD are un spectru larg de activitate, dar spre deosebire de AgNO3 induce formarea protuberanțelor membranare la bacteriile sensibile (dar nu și la cele rezistente). AgSD se leagă de macromoleculele celulare, inclusiv de acizii nucleici.

Zincul se folosește sub forma unui amestec al sării (ZnCl2), cu acizi grași cu lanț lung. Se folosește ca pulbere antifungică sau ca unguent. ZnCl2 este astringentă și se utilizează în tratamentul leziunilor superficiale. Pasta de ZnO se folosește pentru tratamentul infecțiilor fungice și bacteriene.

Acțiunea substanțelor dezinfectante asupra microorganismelor se desfășoară ca un proces treptat, în cursul căruia, numărul bacteriilor viabile scade progresiv: în fiecare unitate de timp va fi distrus un procent constant din numărul celulelor viabile (Todar, 2002). Efectul antimicrobian este dependent de sensibilitatea microorganismului, de faza sa de creștere, de forma de existență (vegetativă sau spor), de natura și concentrația substanței bactericide, de durata acțiunii ei, de compoziția chimică a mediului și de pH. Prezența unor substanțe organice supraadaugate, alcalinitatea și temperaturile scăzute diminuă efectele toxice ale substanțelor chimice.

Halogenii și compușii lor. Halogenii, clorul și iodul, se folosesc ca dezinfectanți sub formă organică și anorganică. Majoritatea compușilor organici ai halogenilor au efect letal asupra celulelor, prin oxidarea proteinelor, ruperea membranelor și inactivarea enzimelor. Iodul este mai puțin reactiv decât clorul, dar are efecte bactericide, fungicide, sporicide, tuberculocide și inactivează virusurile. Tincturile (soluțiile) apoase și alcoolice se folosesc de peste 150 de ani ca antiseptice, sunt iritante și colorante. În soluție se găsesc mai multe variante de iod, în echilibru cantitativ, dar activitatea antimicrobiană principală este produsă de iodul molecular. Iodul se combină ireversibil cu proteinele, prin iodurarea tirozinei și este un agent oxidant (Topley și Wilson, 1998). Tinctura de iod (2 – 7%), adică iodul metalic (I2), dizolvat în soluție alcoolică concentrată de KI, este antiseptic și se aplică pe suprafața pielii, înainte de procedeul chirurgical și pe rănile mici. Soluțiile apoase sunt instabile: în soluție cel puțin 7 specii molecule de iod se găsesc în echilibru cu I2. Cel mai activ este iodul diatomic (I2), având efect microbicid rapid față de bacterii, levuri, microfungi, spori. Folosirea iodului este limitată de toxicitate și de culoare. Este iritant și poate determina chiar reacții alergice. De aceea se utilizează iodofori –complexe alcătuite din iod și un agent de solubilizare, cu rol de purtător al iodului, pe care-l eliberează sub forma sa activă. Iodoforii sunt mai puțin activi față de fungi și spori, comparativ cu tincturile. Iodul pătrunde rapid în celulă și reacționează cu grupările esențiale ale macromoleculelor: cu aminoacizii cu S (cisteina și metionina), cu nucleotidele, cu acizii grași. Efectul este letal. Virusurile nude sunt cele mai sensibile, iar cele învelite sunt mai rezistente. Ca și în cazul bacteriilor, iodul denaturează proteinele capsidei sau ale învelișului. Iodoforii acționează ca rezervor de iod activ, liber. Iodul este solubilizat de agenți tensioactivi: detergenți neionici cu proprietăți dezinfectante și polivinil pirolidona, cu proprietăți antiseptice. Iodul se leagă ușor cu acești compuși organici, de unde este eliberat lent, fapt ce condiționează o dezinfecție eficientă. Iodoforii sunt microbicizi la variații mari de pH și își păstrează activitatea în prezența materiei organice. Iodul se fixează de un grup important de proteine (în special cele care nu conțin aminoacizi cu S), de nucleotide și acizi grași, producând moartea celulei. Clorul liber are culoare caracteristică (verde) și miros pătrunzător. În oricare din variatele sale forme, clorul este deodorant și dezinfectant. Clorul este un agent bactericid foarte puternic (CF = 200). Adăugat în apă, clorul formează acidul hipocloros, produs instabil care degajă O2 în stare născândă, un oxidant foarte puternic, după reacțiile:

În soluție apoasă (apa de clor), clorul este bactericid la concentrația de 0,02%, după maxim 5 minute. Se folosește pentru tratarea apei potabile (clorinare), la concentrația de 1 – 3 mg/l. Clorul și compușii săi sunt inactivați în prezența materiei organice și a catalizatorilor metalici. Soluțiile de hipoclorit sunt folosite pentru dezinfectare și ca deodorante. Sunt inofensive pentru țesuturile umane, ușor de manevrat, incolore, dar decolorante. Se folosesc în spitale pentru dezinfectarea camerelor, a suprafețelor, a instrumentelor nechirurgicale.

Agenții care eliberează clorul sunt cloraminele (derivați clorurați ai aminelor (R-NHCl), din care face parte cloramina-T), hipocloritul de Na, dioxidul de clor. Sunt compuși mult mai stabili decât hipocloriții, cristalini, solubili în apă, cu care dau prin hidroliză, hipoclorit de sodiu și anionul hipocloros. Sunt active la concentrații de 0,5 – l,5%, exprimate în clor activ. Hipocloritul de Na se folosește ca înălbitor al țesăturilor. In apă, ionizează și eliberează Na+ și ionul hipoclorit (OCl-), care stabilește un echilibru cu acidul hipocloros (HOCl). La pH 4-7, clorul există predominant ca HClO, iar la pH peste 9, predomină OCl-. Se folosește pentru dezinfecția obiectelor contaminate cu sânge infectat cu HIV sa cu virusul hepatitei B (VHB). Agenții care eliberează Cl sunt oxidanți foarte activi și denaturează proteinele celulare. La pH scăzut, activitatea compușilor care eliberează Cl este maximă. În concentrații mari, agenții care eliberează Cl sunt sporicizi. Acidul hipocloros perturbă fosforilarea oxidativă. Câțiva compuși organici clorurați se folosesc pentru dezinfectarea apei. Cel mai utilizat este compusul halazon sau acidul parasulfon-dicloraminobenzoic. La concentrația de 4 – 8 mg/l dezinfectează, în 30 de minute, apa ce conține bacili tifici.

Succin-clorimidul, o clorură organică stabilă în formă de tabletă, devine activă în contact cu apa. Este ineficientă față de chiștii de Entamoeba hystolitica.

Alți agenți oxidanți. Permanganatul de potasiu (KMnO4), în concentrație de 1:l0000 este un antiseptic puternic, dar acțiunea sa este neutralizată de prezența substanțelor organice.

Peroxizii. Peroxidul de H, perhidrolul sau apa oxigenată (H2O2) este un antiseptic eficient și netoxic. Se folosește pentru dezinfecție, sterilizare și antisepsie. Este un lichid incolor, disponibil într-o varietate de concentrații, de la 3 la 90%. Molecula este instabilă și se descompune repede în H2O și O2, după reacția:

Deși soluțiile pure sunt în general stabile, cele mai multe conțin stabilizatori care împiedică descompunerea. H2O2 are un spectru larg de eficacitate față de bacterii, spori bacterieni, levuri și inactivează virusurile. Este mai activ față de bacteriile Gram pozitive, dar prezența catalazei sau altor peroxidaze poate să le facă tolerante la concentrațiile mici de H2O2. Pentru efectul sporicid sunt necesare concentrații de 10 – 30% și timp mai îndelungat de contact. H2O2 acționează ca oxidant, producând radicalul OH. liber, reactiv față de grupările cu S și față de dublele legături ale macromoleculelor. În timpul generării O2 se formează O2- (radicalul superoxid), în prezența ionilor de metal din citoplasmă. Radicalul O2- reacționează cu grupările încărcate negativ ale proteinelor și inactivează enzimele. Concentrația de 6-25% H2O2 se folosește pentru sterilizarea unor materiale (implante chirurgicale, lentile de contact). Nu are toxicitate remanentă. Concentrația de 0,1% H2O2 în lapte, la temperatura de 54o, diminuă numărul total de bacterii cu 99,99%. La concentrația de l0%, distruge sporii și inactivează virusurile. Soluția comercială de 3% se folosește pentru dezinfecția rănilor, deoarece bacteriile anaerobe sunt foarte sensibile la prezența O2.

Peroxidul de sodiu (Na2O2), ca pastă, se folosește pentru tratamentul acneii.

Peroxidul de zinc (ZnO2) se folosește în suspensie cu ZnO și Zn(OH)2 pentru tratamentul infecțiilor tegumentare cu bacterii microaerofile și anaerobe.

Benzoil-peroxidul se folosește pentru tratamentul acneii și se adaugă în soluțiile de curățire a pielii.

Acidul peracetic (CH3 –CO–O–OH) este un agent oxidant puternic și se folosește sub formă gazoasă pentru sterilizarea la temperatură scăzută, a camerelor destinate creșterii animalelor germ-free, a aparaturii medicale pentru hemodializă și ca sterilizant al suprafețelor. Este bactericid, fungicid și inactivator al virusurilor la concentrații mai mici de 0,3%. Se descompune la acid acetic și O2, dar nu este sensibil la acțiunea peroxidazei și rămâne activ în prezența materiei organice. Acidul peracetic denaturează proteinele și enzimele, rupând legăturile SH și S-S.

2.4. Coloranții antiseptici

O categorie specială de coloranți manifestă acțiune bacteriostatică: derivații acridinei și coloranții de rozanilină.

Acriflavina este un amestec format din doi derivați ai acridinei. Are toxicitate scăzută și nu sensibilizează tegumentul. Are un spectru larg de acțiune și se folosește pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar. Mecanismul de acțiune pare să conste în capacitatea acridinelor de a se insera între nucleotidele moleculei de ADN.

Cristal-violetul este un derivat metilic al colorantului rosanilină. Este colorantul utilizat în reacția Gram, dar are și efect bacteriostatic asupra bacteriilor Gram pozitive.

Structura moleculară a cristal-violetului (Violet de gențiana)

Cristal-violetul a fost folosit pentru tratamentul vaginitei cauzată de Trichomonas. Agentul etiologic al candidozei vaginale, C. albicans este foarte sensibil la acțiunea colorantului. Mecanismul de acțiune a acestui compus față de bacteriile Gram pozitive este foarte asemănător cu acela al penicilinei, ce constă în blocarea treptei finale a sintezei peretelui celular.

Quinonele sunt coloranți naturali, care conferă culoare multor forme de viață, plante și animale. Unele quinone sunt fungicide de importanță agricolă: cloranil și diclone.

2.5. Agenți sterilizanți în fază de vapori

Multe instrumente medicale termosensibile pot fi sterilizate prin acțiunea sterilizanților lichizi (glutaraldehidă, acidul peracetic, H2O2) sau a agenților sterilizanți în faza de vapori. Cei mai folosiți agenți în aceste sisteme reci sunt oxidul de etilenă, formaldehida, iar mai recent se folosesc H2O2 și acidul peracetic.

Etilen-oxidul și formaldehida sunt agenți alchilanți cu spectru larg. Agenții alchilanți sunt substanțe care adaugă gruparea alchil (ca de exemplu, -CH3), la alte molecule. Adăugând un grup alchil la o bază azotată, îi modifică dimensiunile și determină o eroare de împerechere. Agenții alchilanți acționează asupra ciclurilor purinice azotate, la nivelul O6 al guaninei sau O4 din bazele pirimidinice, producând leziuni mutagene, dar și la nivelul legăturilor fosfodiesterice ale catenei de ADN. Activitatea lor este dependentă de concentrația activă, temperatură, durata expunerii, umiditatea relativă.

Agenții alchilanți se formează prin prepararea multor produse alimentare, în gazele de eșapament prin combustia internă a N2 atmosferic, formâdu-se nitrați și nitriți. Prin arderea tutunului, a produselor petroliere și prin prepararea alimentelor, din resturile de guanină se formează hidrocarburi policiclice aromatice, cu efect alchilant asupra ADN (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Fiind agenți alchilanți, etilen-oxidul și formaldehida reacționează cu proteinele, acizii nucleici, fiind foarte reactivi față de grupările sulfhidril (-SH) ale proteinelor. Etilen-oxidul are dezavantajul că este exploziv și mutagen. H2O2 și acidul peracetic în fază de vapori sunt agenți oxidanți mai activi, la concentrațiile inferioare, decât cele în formă lichidă. Ambele au toxicitate scăzută, acțiune rapidă la temperatură scăzută, dar au penetranță scăzută.

2.6. Rezistența microorganismelor la acțiunea antisepticelor și dezinfectantelor

Rezistența microorganismelor la acțiunea antisepticelor (AS) și dezinfectantelor (DF) poate fi naturală (intrinsecă) sau dobândită.

Rezistența intrinsecă sau naturală este proprie bacteriilor Gram negative, sporilor, micobacteriilor. Este o proprietate controlată de gene cromosomale și permite depășirea acțiunii unui antiseptic sau dezinfectant. Moleculele de antiseptic sau dezinfectant trebuie să străbată straturile externe pentru a atinge ținta celulară. Structura chimică a acestor straturi depinde de grupul de microorganisme și poate constitui o barieră eficientă de permeabilitate, limitând difuzia agentului chimic. Mult mai rar este posibil ca enzimele sintetizate constitutiv să degradeze compusul antiseptic sau dezinfectant.

Sporii de Bacillus spp. și Clostridium spp. sunt cei mai rezistenți la antiseptice și dezinfectante. Sporii de Bacillus spp.(deși, în general, nu sunt patogene), sunt folosiți ca indicatori ai sterilizării eficiente. Sporii de Clostridium sunt patogeni semnificativi: Cl. difficile este cauza comună a diareii de spital.

Multe biocide sunt bactericide sau bacteriostatice la concentrații mici, pentru formele vegetative, dar pentru efectul sporicid sunt necesare concentrații mai mari (de exemplu, glutaraldehida și agenții care eliberează clor). Alcoolii, fenolii, sărurile quaternare de amoniu și clorhexidina nu au efect sporicid, decât la temperaturi superioare (Tortora și colab., 1995). Rezistența superioară a sporilor se datorează structurii complexe a învelișurilor sporale multiple. Invelișurile sporale cuprind o fracție majoră a sporului. Aceste structuri sunt de natură proteică, cu o fracție de polipeptide acide solubile în baze, în învelișul intern și o fracție rezistentă la baze, datorată legăturilor S-S.

Sporularea ete procesul în care celula vegetativă se diferențiază în spor și implică 7 stadii. Celula vegetativă (stadiul 0) suferă schimbări morfo-funcționale, care culminează cu eliberarea sporului matur (stadiul VII). Pentru dezvoltarea rezistenței la biocide, stadiile IV (dezvoltarea cortexului) până la VII, sunt cele mai importante pentru dezvoltarea rezistenței la biocide. Studiul mecanismelor rezistenței sporale se studiază prin tehnica parcurgerii retrograde a treptelor sporulării, care constă în îndepărtarea secvențială a învelișului sporal. In acest scop se folosesc mutante de sporulare, care nu progresează dincolo de stadiile determinate genetic ale sporului, ceea ce permite o sporulare cu un grad înalt de sincronizare. Se adaugă antisepticul sau dezinfectantul la începutul sporulării și se determină gradul de progresie a sporulării (Black, 1996).

Unele microorganisme au un grad intermediar de rezistență la AS și DF, între cele sporulate și nesporulate. La micobacterii, rezistența se datorează peretelui celular complex, care constituie o barieră eficientă față de pătrunderea agenților chimici: peptidoglicanul este legat covalent cu un copolimer polizaharidic (arabinogalactan), alcătuit din arabinoză și galactoză, esterificate cu acizi micolici. Antisepticele și dezinfectantele care au activitate asupra micobacteriilor sunt fenolul, acidul peracetic, H2O2, alcoolul și glutaraldehida. Alți agenți bactericizi – clorhexidina, sărurile amoniului quaternar, sunt bacteriostatice față de Mycobacterium spp., chiar la concentrații mari. Biocidele hidrofile nu penetrează învelișul lipidic consistent hidrofob al celulelor de Mycobacterium, la concentrații suficient de mari, pentru a fi letale. Activitatea lor poate să crească sub efectul diferitelor variantelor de formulare (Mihăescu, 2000).

Peretele Gram pozitiv al bacteriilor din g. Staphylococcus este format din peptidoglican și acizi teichoici. Nici unul dintre componente nu are rolul de barieră eficientă față de AS și DF. Plasticitatea structurii mureinei este bine cunoscută: grosimea și numărul de legături transversale ale peptidoglicanului sunt influențate de condițiile de mediu și de starea fiziologică a celulei, ceea ce modifică gradul lor de sensibilitate la antiseptice și dezinfectante. De exemplu, S. aureus poare să existe în varianta mucoidă, celulele fiind înconjurate de un strat mucos. Tulpinile nemucoide sunt mai sensibile decât cele mucoide, la acțiunea agenților chimici. Bacteriile Gram negative, în general, sunt mai rezistente decât bacteriile Gram pozitive nesporulate: concentrația minimă inhibitorie a dezinfectanților și antisepticelor este mai mare la bacteriile Gram negative, deoarece membrana externă acționează ca barieră limitantă a pătrunderii agenților antibacterieni.

Fenotipul organismelor sesile în biofilme diferă semnificativ de al celulelor planctonice sau de cele crescute pe medii artificiale, în laborator. În diferite zone ale biofilmului, bacteriile au disponibilități diferite ale nutrienților, iar proprietățile fiziologice sunt modificate. In profunzimea biofilmului, limitarea nutrienților reduce rata de creștere a bacteriilor, ceea ce modifică sensibilitatea la acțiunea agenților antimicrobieni. Bacteriile cu o rată mică de creștere sunt deosebit de rezistente. Sensibilitatea redusă a bacteriilor într-un biofilm se datorează mai multor factori:

– accesul redus al dezinfectantului sau antibioticului la celulele din biofilm;

– interacțiunea chimică între DF și biofilm;

– producerea enzimelor degradative și/neutralizante ale substanțelor chimice;

– schimbul genetic dintre celule în biofilm.

Bacteriile din biofilm, recultivate în mediul lichid, redevin sensibile ca și celulele planctonice ale speciei respective.

Rezistența dobândită. Ca și în cazul antibioticelor și al altor agenți chimici, rezistența dobândită la AS și DF poate să se producă prin mutație sau prin dobândirea unei plasmide sau a unui Tn (casetă transmisibilă de ADN cromosomal sau plasmidial, cu proprietăți de integrare). Cu excepția Ag, a compușilor organomercurici, plasmidele induc niveluri semnificative de rezistență la AS și DF (Todar, 2002). Compușii Hg nu se mai folosesc ca dezinfectanți, dar sărurile fenil-mercurice și tiomersalul se folosesc ca agenți conservanți pentru unele produse farmaceutice. Rezistența la Hg este plasmidială, inductibilă și poate fi transferată prin conjugare sau transducție. Izolatele clinice de S. aureus care sintetizează -lactamază sunt rezistente la Hg2+ anorganic și la agenții organomercurici.

2.7. Evaluarea potențialului antibacterian al agenților chimici

Potențialul sau eficiența unui agent chimic antimicrobian este influențată de temperatură, pH, concentrație și timpul de acțiune. Creșterea temperaturii cu l0oC dublează rata reacțiilor chimice și mărește potențialul agentului chimic. La o valoare a pH-ului care mărește gradul de ionizare a unui agent chimic crește și capacitatea sa de a penetra în celulă. Valoarea pH poate altera chiar conținutul celulei.

Concentrația influențează decisiv efectele agentului antibacterian. Concentrațiile mari pot fi bactericide, iar cele mici pot fi bacteriostatice (Zneiden, 1998; McDonell, 1999). Alcoolul etilic și izopropilic sunt excepții notabile de la regula concentrațiilor. Ei sunt mai activi la concentrația de 70% decât la concentrații mai mari. Alcoolii acționează prin coagularea (denaturare permanentă) a proteinelor, iar apa este necesară reacției de coagulare. Amestecul alcool – apă în proporția 70% penetrează mai profund decât alcoolul pur, în materialul supus dezinfectării.

Coeficientul fenolic

Efectul dezinfectant al fenolului este unitatea etalon, cu care se compară alți dezinfectanți, în aceleași condiții de acțiune. Comparația se exprimă în coeficientul fenolic (CF) (Todar, 2002).

Microorganismele test pentru determinarea coeficientului fenolic sunt Salmonella typhi și Staphylococcus aureus. Un dezinfectant care are CF egal cu 1, are aceiași eficiență antibacteriană ca și fenolul, iar un CF mai mic decât 1 semnifică o eficiență mai scăzută.

Coeficientul fenolic se determină astfel:

– se prepară câteva diluții ale agentului chimic și se repartizează volume egale în tuburi test;

– se prepară un set identic de tuburi test cu diluții de fenol;

– ambele seturi de tuburi se aduc la același nivel termic prin încălzire în baie de 20o, timp de 5 minute;

– în fiecare tub din cele două seturi se transferă 0,5 ml din cultura unui microorganism test (S. typhi sau S. aureus);

– după 5, l0, l5 minute se transferă, cu ansa calibrată, un volum din fiecare tub, într-un tub cu bulion nutritiv. Tuburile se incubă;

– după 48 de ore se evaluează turbiditatea tuburilor inoculate și se găsește cea mai mică concentrație (cea mai mare diluție a agentului care a omorât toate organismele în l0 minute, dar nu în 5 minute);

– se stabilește raportul diluției agentului chimic, la diluția fenolului ce are același efect. De exemplu, dacă diluția l/l0 a unui agent chimic are același efect ca și diluția l/l00 a fenolului, CF al agentului chimic este l0.

Determinarea CF este o modalitate adecvată de a aprecia eficiența agenților chimici derivați din fenol, dar este mai puțin adecvată pentru alți agenți dezinfectanți.

Evaluarea potențialului antibacterian a unui agent chimic se poate face mai simplu, prin metoda discurilor de hârtie de filtru:

– fiecare disc de hârtie este îmbibat cu soluția unui agent chimic diferit;

– discurile se așează pe suprafața unei plăci cu mediu agarizat, inoculat cu un microorganism test;

– fiecare organism test se însămânțează pe o placă diferită;

– după incubare, efectul inhibitor al unui agent chimic asupra organismului se identifică printr-o zonă clară de inhibiție a creșterii în jurul discului.

Diametrul zonei de inhibiție a creșterii este proporțional cu potențialul antibacterian al agentului chimic.

Bibliografie selectivă

Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. 1996, pp: 332-352.

Jungerman E., Antimicrobial and Deodorant Soaps: Impact of Regulatory Developments. Cosmetics & Toiletries, Allured Publishing Corporation. 1996.

McDonell G, Russell A.D., Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance, Clinical Microbiology Reviews. 1999, 12: 147-179.

Mihăescu Gr., Microbiologie generala si virologie. Editura Universitatii Bucuresti, 2000.

Paulson D., Developing Effective Topical Antimicrobials, Soap/Cosmetics/Chemical Specialties, 1997.

Reddish G.F., Antiseptics, Disinfectants, Fungicides and Chemical and Physical Sterilization. The Quarterly Review of Biology. 1959, 34(4): 330-331.

Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.

Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998.

Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA. 1995, pp:167-188.

Zneiden A., The War Against Germs. Drug and Cosmetic Industry 162, Advanstar Communications, 1998.

Capitolul 3

AGENȚI CHIMIOTERAPEUTICI DE SINTEZĂ

Utilizarea substanțelor de sinteză chimică sau produse de diferite organisme, în scop terapeutic, este veche. Indienii din Peru mestecau scoarța arborelui de chinină pentru tratamentul malariei. în secolul 15, în Europa se foloseau compușii cu mercur pentru tratamentul sifilisului, iar chinezii utilizau cultura de fungi microscopici crescută pe semințele de soia, pentru tratamentul furunculelor. Conceptul chimioterapiei a fost formulat de Ehrlich (l904) în Germania. El a presupus că este posibilă găsirea unor substanțe chimice cu efecte toxice selective asupra paraziților, dar nu pentru celulele sau tesuturile organismului uman. Ideea a fost denumită “pastila magică”, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Ehrlich a descoperit para-rosanilina, cu efecte antitripanosomiale și a sintetizat compusul arsenic arsfenamina (salvarsan) pentru tratamentul sifilisului.

Structura moleculară a salvarsanului

Gelmo (1908) a sintetizat sulfanilamida pentru tratamentul pacienților infectați cu Treponema pallidum, agentul sifilisului. Eisenberg (1913) a studiat proprietățile bactericide ale azo-coloranților cu grupări sulfonamidice, iar Gratia și Dath (1924), studiind microorganismele din sol, au descoperit actinomicetina, produsă de actinomicete (Todar, 2002). În 1935, Domagk, medic german, a remarcat activitatea antimicrobiană in vitro a compusului prontosil, primul dintr-o serie lungă de substanțe sintetice denumite sulfonamide. Prontosil a fost introdus în clinică în anii ”30 pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar, pneumoniei și altor stări patologice. In vivo, prontosil este convertit la sulfanilamidă activă, analogul acidului paraaminobenzoic (APAB). In 1939, el a demonstrat valoarea terapeutică a sulfonamidelor (gruparea S a compușilor) pentru tratamentul infecțiilor cu Streptococcus și activitatea antimicrobiană cu spectru larg (Todar, 2002). Multe sulfonamide au eficiență inferioară antibioticelor naturale, dar se folosesc pe scară largă.

In 1945, farmacologii aveau la dispoziție, pentru uzul clinic, 5488 derivați ai sulfanilamidei (sulfonamidei).

3.1. Agenți chimioterapeutici activi prin inhibiție competitivă

Sulfonamidele sunt agenți chimioterapeutici foarte importanți din punct de vedere practic. Nu sunt antibiotice, deoarece termenul de antibiotic este rezervat substanțelor sintetizate de organisme, de cele mai multe ori, bacterii sau fungi, care în concentrații foarte mici inhibă sau omoară microorganismele. Descoperirea lor are caracter empiric și pragmatic (tabelul 2). Domagk (cercetător și medic german) a descoperit că prontosilul (un colorant roșu), deși in vitro nu are efecte inhibitorii, in vivo este foarte eficient față de S. aureus. Explicația este următoarea: în organism, molecula de colorant a fost scindată enzimatic și s-a eliberat o moleculă mică – sulfanilamida – foarte activă față de S. aureus, dar inactivă în forma legată de colorant.

Sulfonamidele reprezintă primul grup de substanțe microbiostatice introduse cu succes în clinică, având ca prototip sulfanilamida (para-amino-benzen-sulfonamida).

Mecanismul acțiunii sulfonamidelor a fost clarificat când Woods a demonstrat că acidul para-aminobenzoic (APAB) are o acțiune antagonistă față de aceste substanțe, în sensul că anihilează efectul lor antimicrobian: dublarea concentrației de inhibitor adăugat în mediu necesită dublarea concentrației de APAB, pentru a relua creșterea. Toxicitatea selectivă a sulfonamidelor derivă din faptul că organismul uman preia acidul folic din surse externe, dar multe bacterii își sintetizează propriul acid folic.

Structura moleculară a acidului para-aminobenzoic (APAB).

Tabelul 2.

Agenți chimioterapeutici care acționează prin inhibiție competitivă (adaptare după Topley și

Wilson’s, 1998).

Acțiunea antagonistă a APAB nu este directă, ci se exercită prin intermediul metabolismului bacterian. APAB este un nutrient esențial, fiind precursorul acidului folic, un factor de creștere pentru bacterii. Acidul folic și formele sale reduse – acidul dihidrofolic și tetrahidrofolic – transferă fragmente cu 1C derivate din serină, pentru sinteza metioninei, purinelor, timinei, tiaminei, pantotenatului (Black, 1996).

Datorită marii asemănări a structurii chimice a celor două substanțe(APAB și sulfanilamida), între ele are loc un fenomen de competiție pentru intrarea în calea sintezei acidului folic (fig. 21).

Structura moleculară a acidului folic

Enzima bacteriană implicată în conversia APAB la acid folic (pteridin-sintetaza), adeseori “greșește” și se combină cu sulfanilamida, în loc de APAB. Astfel, sinteza acidului folic și toată calea metabolică dependentă de acidul folic este blocată. Sulfanilamida intră în competiție cu APAB pentru situsul activ al enzimei.

Acest tip de inhibiție este reversibil: dacă sulfanilamida este îndepărtată, enzima funcționează normal. Cu cât raportul moleculelor de sulfanilamidă/APAB este mai mare, cu atât inhibiția metabolismului bacterian este mai amplă.

Figura 21. Ilustrarea schematică a competiției dintre molecula de sulfonamidă și acidul para-aminobenzoic (APAB) pentru substrat, datorită omologiei structurale (adaptare după Wistreich, 1996).

Sulfonamidele au afinitate mai mare decât APAB pentru pteridin-sintetază. Trimetoprimul (un analog al acidului dihidrofolic) are afinitate foarte mare (de 10000-100000 de ori) pentru dihidrofolat-reductaza (DHFR) bacteriană decât pentru cea mamaliană, enzima care catalizează conversia dihidrofolatului la acidul tetrahidrofolic (fig. 22) (Wistreich, 1996). Astfel sunt blocate căile metabolice dependente de acidul folic. Acidul folic acționează ca purtător al grupărilor C1 și este necesar pentru sinteza ADN, ARN, etc. Spre deosebire de mamifere, bacteriile și protozoarele parazite nu au sistem de transport care să preia acidul folic preformat din mediul extern. Majoritatea acestor organisme trebuie să sintetizeze acidul folic, deși unele pot să folosească timidina exogenă, acoperind necesarul metabolic de acid folic.

Fig. 22. Ilustrarea mecanismului acțiunii agenților terapeutici prin inhibiție competitivă: sulfonamidele blochează competitiv conversia pteridinei și APAB în acidul dihidrofolic, pe calea sintezei acidului folic (adaptare după Huang și colab., 2004).

Deoarece, în privința trăsăturilor sale esențiale, metabolismul este același la toate bacteriile, rezultă că toate speciile utilizează acidul folic, chiar dacă nu toate îl pot sintetiza. Sulfamidele sunt toxice pentru bacteriile capabile să sintetizeze acidul folic, pornind de la molecule mai simple. Bacteriile care nu sintetizează acidul folic, ci necesită aportul exogen al moleculelelor preformate, nu sunt sensibile la sulfonamide. Efectul sulfonamidelor este antagonizat necompetitiv de un amestec de intermediari ai căii acidului folic, adică efectul lor antagonic nu poate fi depășit prin creșterea concentrației de sulfonamidă.

Sulfanilamida inhibă sinteza acidului folic prin inhibiție competitivă cu sintetaza acidului dihidropteroic. Enzima catalizează condensarea dihidropteridinei cu acidul para-aminobenzoic, în stadiul timpuriu al sintezei acidului folic. Deoarece acidul folic își păstrează activitatea în celulele bacteriene, efectul inhibitor al sulfonamidelor devine evident după câteva generații de celule, când cantitatea de acid folic s-a diminuat sub un nivel critic, prin distribuție în celulele fiice. Toxicitatea selectivă derivă din faptul că bacteriile sensibile sintetizează acidul folic de novo, iar omul absoarbe cofactorul preformat.

Cele mai cunoscute sulfonamide sunt sulfadiazina și sulfametoxazol (cotrimoxazol), bine absorbite după administrare orală și excretate în urină.

Structura moleculară a sulfametoxazolului (Cotrimoxazol)

Acțiunea derivaților sulfanilamidei este bacteriostatică față de bacteriile Gram pozitive și Gram negative. Se folosesc în tratamentul infecțiilor vezicii urinare, cauzate în marea lor majoritate de E. coli. Circa 5% dintre pacienți suferă efecte secundare, mai ales reacții alergice, cu febră și eritem tegumentar.

Ca și sulfamidele, acidul paraaminosalicilic (APAS) și dapsone, obținuți prin sinteză chimică sunt inhibitori competitivi ai metabolismului APAB și inhibă sinteza acidului folic.

Structura moleculară a Dapsone Structura moleculară a APAS (acid paraaminosalicilic)

Rezistența bacteriană la sulfonamide este mediată de plasmide, dar și de gene cromosomale, prin hiperproducția de acid p-aminobenzoic.

Familia derivaților diaminopirimidinici cuprinde trimetoprimul și tetroxoprimul.

Trimetoprim este un analog al acidului dihidrofolic, component esențial al sintezei aminoacizilor și nucleotidelor. Agentul chimic blochează metabolismul dependent de acidul folic, dar la alt nivel decât sulfonamidele, a căror eficiență o ridică foarte mult (Wistreich, 1996). Agentul inhibă competitiv dihidrofolat-reductaza, enzima care convertește dihidrofolatul la cofactorul activ – acidul tetrahidrofolic. Trimetoprim blochează regenerarea acidului tetrahidrofolic, precursorul acidului folinic și ulterior al purinelor și al sintezei ADN, fiind un inhibitor al creșterii bacteriilor mai eficient decât sulfonamida.

Structura moleculară a acidului tetrahidrofolic

Blocajul secvențial al aceleiași căi de biosinteză, sub acțiunea sulfonamidelor și trimetoprim, determină un grad înalt de activitate sinergică față de un spectru larg de microorganisme.

Omul nu sintetizează acidul folic, dar necesită aportul exogen și sinteza purinelor în celula umană nu este influențată semnificativ de trimetoprim. Are acțiune selectivă deoarece este de 50 000 – 100 000 de ori mai activ față de dihidrofolat-reductaza bacteriană, comparativ cu cea umană.

Trimetoprim are spectru larg de acțiune: coci Gram pozitivi și majoritatea bacililor Gram negativi, cu excepția Ps. aeruginosa și Bacteroides.

Rezistența la trimetoprim poate fi mediată de gene cromosomale ori plasmidiale, mobile prin intermediul Tn7, este consecința dobândirii unei gene a dihidrofolat-reductazei (DHFR), mult mai puțin sensibilă la trimetoprim sau altor mecanisme: supraproducția DHFR, mutații ale genei structurale a DHFR sau dobândirea unei gene care codifică o enzimă rezistentă la DHFR. Genele ce codifică enzimele modificate se găsesc frecvent pe plasmide autotransferabile. Enzimele modificate sunt produse în celule care produc concomitent și o dihidrofolat reductază de tip sălbatic, dar cantitatea enzimei alterate depășește blocajul sintezei acidului folic mediat de efectul trimetoprimului asupra enzimei de tip sălbatic. Rezistența la sulfonamide se produce printr-un mecanism asemănător. Datorită rezistenței la sulfonamide, trimetoprim a fost introdus ca un potențiator al sulfonamidelor, în asociație cu care s-a administrat mult timp, considerându-se că are proprietăți antibacteriene slabe. Acum se administrează pe scară largă, ca agent terapeutic unic.

3.2. Agenți chimioterapeutici activi prin inhibiția replicării ADN: quinolonele

Quinolonele (denumite și 4-quinolone) sunt primele substanțe antimicrobiene obținute pe cale sintetică și formează o familie de compuși care se aseamănă prin existența nucleului quinolinic. Primul compus din acest grup, folosit în terapie este acidul nalidixic.

Quinolonele, alături de β – lactamice și macrolide, reprezintă una dintre cele trei familii principale de agenți antimicrobieni folosiți în terapeutica umană (Wolfson & Hooper, 1989). Importanța lor terapeutică este în continuă creștere începând din 1968, data comercializării primei quinolone reprezentată de acidul nalidixic. Acidul nalidixic este un produs intermediar de sinteză a quinolonelor. Ulterior quinolonele s-au diversificat prin introducerea unui atom de fluor (F) în poziția 6 și a unui heterociclu în poziția 7 (piperazine, pirolidina, etc.) care au generat fluoroquinolonele. Aceste molecule posedă un spectru antibacterian foarte larg și pot fi divizate în molecule metabolizabile și nemetabolizabile (grupele III și IV).

Quinolonele se pot clasifica în două grupe :

– cele de primă generație, ca acidul nalidixic, active asupra bacililor Gram-negativi;

– fluoroquinolonele.

Acid nalidixic Norfloxacin Ciprofloxacin

Ofloxacin Pefloxacin Enoxacin

Amifloxacin Flerofloxacin Lomefloxacin

Temafloxacin Tosufloxacin PD 127, 391

Gama derivaților quinolonici s-a diversificat prin modificarea nucleului de bază, 4-quinolona. La atomul C6 s-a adăugat unul de fluor, ceea ce a crescut semnificativ spectrul și potențialul lor antimicrobian. Avand în vedere spectrul lor de activitate antibacteriană, limitat la bacterii Gram negative și în principal la enterobacterii, acidul nalidixic și derivații săi au fost folosiți pentru tratamentul infecțiilor urinare. Modificările structurii au dat naștere la quinolone, denumite noile quinolone sau fluoroquinolone (norfloxacin, pefloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin etc.), al căror spectru de activitate antibacteriană se extinde la alte specii Gram negative (de ex. Pseudomonas aeruginosa), dar și la anumite specii Gram pozitive (S. aureus) și micobacterii. Totuși, activitatea noilor quinolone față de alte specii, așa cum sunt cele natural-sensibile la acidul nalidixic, rămâne modestă, ceea ce corespunde unui anumit grad de rezistență intrinsecă a acestor specii.

Mecanismul de acțiune a quinolonelor este foarte complex. Aceste molecule pătrund în celula bacteriană prin difuzie pasivă și acționează asupra țintelor specifice reprezentate de topoizomeraze: ADN–giraza (topoizomeaza II) și topoizomeraza IV. Acțiunea celor două enzime este inhibată. Quinolonele se leagă și stabilizează complexele girază-ADN (quinolona singură nu se asociază cu ADN), după clivarea lanțului, împiedicând acțiunea catalitică a ADN-polimerazei la nivelul bifurcației de replicare. Complexul generează o rupere a moleculei de ADN, pe care celula nu o repară eficient. Fluoroquinolonele formează complexe stabile cu topoizomeraza II, efectul fiind moartea celulei. S-a sugerat că quinolonele nu se leagă cu ADN-giraza însăși, ci probabil chiar la situsuri specifice pe ADN, create de ADN-girază.

Studiile comparative ale sensibilității la fluoroquinolone și de dezvoltare a rezistenței, au relevat că ADN-giraza este ținta primară a fluoroquinolonelor la bacteriile Gram negative, iar topoizomeraza IV este ținta primară la bacteriile Gram pozitive. Excepția o constituie Streptococcus pneumoniae, la care fie giraza, fie topoizomeraza pot fi ținte primare, în funcție de fluoroquinolona folosită.

Activitatea antibacteriană este dependentă într-o măsură semnificativă de atomul de fluor din poziția 6 și de nucleul piperazinic din poziția 7. Configurația spațială a quinolonei determină nivelul activității. Astfel, enantiomerii stereochimici (care diferă unul de altul numai prin poziția în spațiu a unei grupări particulare), ce implică grupul metil atașat la inelul al III-lea de ofloxacin, au activități antibacteriene foarte diferite, care diferă în proporție de 1/10.

Quinolonele sunt agenți bactericizi. Ele stopează rapid sinteza replicativă a ADN și întrerup progresia bifurcației de replicare. Inhibiția activității ADN-girazei sub acțiunea fluroquinolonelor induce moartea rapidă a celulei bacteriene. Inhibiția rapidă a sintezei ADN nu explică moartea celulei bacteriene. Pentru efectul letal sunt necesare alte evenimente suplimentare: inhibiția sintezei ARN și a proteinelor. La concentrațiile de quinolone care depășesc un anumit prag, activitatea bactericidă diminuă, probabil pentru că este inhibată numai sinteza ARN și a proteinelor.

Tratamentul cu quinolone, probabil induce efecte pleiotrope, ce pot fi consecințe secundare ale inhibiției sintezei ADN-girazei: leziuni ale ADN bacterian, deoarece quinolonele sunt inductoare ale sistemului reparator SOS, dependent de Rec A.

Noile quinolone au reprezentat un real progres terapeutic având în vedere caracteristicile acțiunii lor antibacteriene (spectru larg, activitate bactericidă și farmacocinetică). Aceasta explică spectaculoasa creștere a utilizării lor în ultimii 10 ani. Dar utilizarea extensivă a noilor quinolone s-a tradus prin emergența îngrijorătoare a tulpinilor rezistente a unor specii bacteriene de mare importanță medicală (enterobacteriile, Ps. aeruginosa, S. aureus, Mycobacterium tuberculosis, N. gonorrhoeae) și a tulpinilor multirezistente la alte antibiotice.

Mecanismele rezistenței bacteriene la fluoroquinolone sunt de trei categorii:

– modificări ale enzimelor țintă ale medicamentelor

– alterări care limitează accesul medicamentelor la țintă

– activitatea pompelor de efux.

Rezistența la quinolone este, predominant, consecința modificărilor enzimei țintă, la situsurile active ale enzimei.

Rezistența speciilor Gram pozitive la quinolone se datorează în special mutațiilor într-o regiune specifică (quinolone resistance determining region – QRDR) a subunității A a ADN-girazei. QRDR este regiunea N-terminală a proteinei, omologă cu regiunile GyrA și ParC de la E. coli. Regiunea cuprinsă între codonii 67 – 106 ai GyrA la E. coli, este determinantă pentru rezistența la quinolone. Mutațiile genei gyrA induc schimbări ale situsului de legare/sau ale sarcinii, care condiționează interacțiunea ADN-girazei cu quinolona. Quinolonele interacționează în primul rând cu subunitatea A, dar s-au identificat mutații ale subunității B care conferă rezistență la quinolone.

ADN giraza și topoizomeraza IV sunt localizate în citoplasma bacteriană. Pentru a-și atinge ținta, antibioticele fluoroquinolonice trebuie să traverseze învelișul celular. Modificările structurale ale membranei externe a bacteriilor Gram negative asociate cu diminuarea înglobării sunt factori importanți ai rezistenței la fluoroquinolone. Variantele Gram negative rezistente la quinolone care se selectează, se datorează modificării porinelor din membrana externă, asociată cu scăderea permeabilității. Rezistența la quinolone nu este transferabilă prin intermediul plasmidelor. La bacteriile Gram pozitive, scăderea ratei înglobării nu s-a demonstrat a fi un mecanism al rezistenței.

Atât bacteriile Gram pozitive, cât și cele Gram negative pot dobandi un nivel scăzut al rezistenței, mediat de activitatea pompelor de eflux, cu rol de transportori multipli, a căror activitate este dependentă de gradientul electrochimic (forța proton motrice).

Nu s-au identificat enzime cu efect inactivator față de quinolone.

Ciprofloxacina are un potențial antibacterian mult mai ridicat decât acidul nalidixic. Efectul bactericid al ciprofloxacinului este rapid, cu o pierdere de 90% a viabilității, într-un interval de l9 minute. Ciprofloxacina se folosește în tratamentul infecțiilor respiratorii, ale tractului urinar, gonoreii, pentru tratamentul infecțiilor diareice cu tulpinile enterotoxigene de E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella. Este activă, de asemenea față de M. tuberculosis. Este parțial metabolizată de ficat și excretată de rinichi. Medicamentele antiacide (Maloox) blochează absorbția ciprofloxacinei și nu vor fi administrate concomitent. Administrată împreună cu teofilina, ciprofloxacina poate duce la acumularea unor nivele sanguine înalte ale teofilinei. Ionii de Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ pot să lege ciprofloxacina și diminuă mult absorbția medicamentului.

Multe antibiotice, inclusiv ciprofloxacina, pot altera microbiota normală a colonului, favorizand dezvoltarea bacteriilor care produc inflamația mucoasei (colita pseudomembranoasă) și determină tulburări diareice (Liebetrau și colab., 2003). Colita pseudomembranoasă se datorează creșterii în exces a bacteriei Clostridium difficile și poate induce stări febrile, durere abdominală, tulburări ale tranzitului intestinal și chiar starea de șoc. Tratamentul cu ciprofloxacină poate să ducă la creșterea în exces a levurii Candida albicans, cu localizare vaginală (vaginită) sau intestinală (disbioza).

Manifestarea efectelor secundare este prevenită prin administrarea probioticelor: Lactobacillus casei, L. acidophilus, Bifidobacterium longum, Saccharomyces cerevisiae.

Derivații quinolonici se folosesc pentru tratamentul infecțiilor căilor urinare, unde, după administrare orală, se acumulează în concentrații inhibitorii. Fluoroquinolonele pătrund în țesutul prostatic la concentrații care echivalează sau depășesc de câteva ori pe cele din plasmă.

Cele mai sensibile la acțiunea quinolonelor sunt enterobacteriile, dar compușii grupului sunt activi față de chlamidii și micobacterii.

Quinolonele au efect antimicrobian prelungit după administrare, ceea ce se reflectă în continuarea supresiei creșterii bacteriene, după eliminarea agentului antimicrobian din organism. Dacă un medicament are un efect persistent după administrare, înseamnă că poate fi eficient chiar în intervalele dintre doze, când nivelul seric și tisular au scăzut sub nivelul concentrației minime inhibitorii.

Quinolonele își păstrează activitatea față de multe bacterii rezistente la antibiotice, inclusiv față de bacilii Gram negativi cu rezistență multiplă, față de S. aureus rezistent la meticilină, față de N. gonorrhoeae rezistent la penicilină, față de Haemophilus influenzae producător de -lactamaze.

Ciprofloxacina, ofloxacina și tosufloxacina sunt active față de Chlamydia trachomatis și Mycoplasma hominis. Quinolonele sunt de asemenea active față de Rickettsia spp.

Acidul nalidixic inhibă numai speciile de bacterii Gram negative aerobe. În molecula de ciprofloxacină, fluorul conferă activitate față de bacteriile Gram pozitive. Grupul piperazinic crește activitatea față de enterobacterii, iar gruparea piperazină și ciclopropil conferă activitate față de speciile de Pseudomonas.

3.3. Alți agenți chimioterapeutici de sinteză

Hidrazida acidului nicotinic (izoniazida, INH), introdusă în clinică înainte de 1950, împreună cu rifampina, formează baza chimioterapiei antituberculoase. Izoniazida este un derivat al nicotinamidei. Mecanismul de acțiune al izoniazidei nu este cunoscut, dar influențează sinteza lipidelor, acizilor nucleici și acidului micolic la M. tuberculosis.

Structura moleculară a izoniazidei Structura moleculară a piridoxinei (vitamina B6)

Se presupune că izoniazida este activă prin competiție cu piridoxina (vitamina B6) necesară creșterii celulelor de M. tuberculosis, sau inhibă sinteza acizilor micolici (acizi grași specifici acestor bacterii). Este bactericidă față de celulele care cresc și se divid și are acțiune bacteriostatică față de celulele care nu se multiplică. Toate cele trei (PASA, dapsone și izoniazida) se folosesc pentru tratamentul infecțiilor cu Mycobacterium.

Etambutolul, pirazinamida și etionamida blochează reacțiile enzimatice în celula bacteriană, deoarece sunt similare dar nu identice cu vitaminele bacteriene.

Etambutolul inhibă arabinozil-transferaza, enzimă implicată în biosinteza arabinogalactanului și lipoarabinomananului. Alte efecte atribuite acțiunii etambutolului sunt inhibiția metabolismului ARN și sintezei fosfolipidelor, inhibiția transferului acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular mureinic, sinteza spermidinei și inhibiția unei trepte timpurii a conversiei glucozei în monozaharidele utilizate pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) și a peptidoglicanului. Este un medicament foarte specific și eficient, utilizat în asociație cu izoniazida, pentru tratamentul tuberculozei. Are efect bacteriostatic. Nu se cunoaște mecanismul care determină rezistența la etambutol (Musser, 1995).

Structura moleculară a etambutolului

Pirazinamida este un derivat sintetic al nicotinamidei. Nu se cunoaște mecanismul de acțiune, nici baza moleculară a rezistenței. Unele tulpini sensibile la pirazinamidă au o enzimă specifică (pirazinamidaza), ce metabolizează pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian. Tulpinile rezistente la pirazinamidă au pierdut activitatea pirazinamidazică. S-au identificat și tulpini foarte rezistente la pirazinamidă, care au și activitate pirazinamidazică. Aceasta sugerează că, în plus față de pierderea capacității de sinteză a pirazinamidazei, există și alte mecanisme de rezistență.

Structura moleculară a pirazinamidei

Etionamida, derivată a acidului izonicotinic, este activă față de M. tuberculosis și alte micobacterii. In vitro, celulele de M. tuberculosis își pierd acidorezistența. Se crede că mecanismul său de acțiune implică inhibiția sintezei acizilor micolici.

Structura moleculară a etionamidei

Nu se cunosc mecanismele rezistenței la etionamidă și la izoniazidă.

Metronidazolul a fost introdus în clinică în 1959 pentru tratamentul infecției cu Trichomonas vaginalis. Ulterior s-a demonstrat eficiența sa față de infecțiile cu bacterii anaerobe și față de alte infecții parazitare. Difuzează bine în țesuturi, inclusiv în sistemul nervos. Are cea mai bună activitate bactericidă, dintre toate medicamentele active față de bacteriile anaerobe.

Acțiunea sa constă în activarea reductivă a grupăriii nitro. Metronidazolul acționează ca acceptor preferențial de electroni(e-), fiind redus de proteinele transportoare de e- cu potențial redox scăzut. Reducerea scade concentrația sa, ceea ce menține un gradient ce favorizează încorporarea medicamentului în celulă și generarea produselor intermediare ale reducerii, cu efecte toxice pentru celulă.

Toxicitatea se datorează compușilor intermediari sau radicalilor liberi ce interacționează cu ADN și probabil cu alte molecule, producând leziuni. Intermediarii citotoxici se descompun în produse finale netoxice și inactive: acetamida și acidul 2-hidroxietil oxamic. Efectul asupra microbiotei intestinale este minim, deoarece medicamentul este redus în condiții anaerobe.

Methenamina este produsul ciclic de condensare a formaldehidei și amoniului. Are activitate antibacteriană slabă, dar la pH acid, fiecare moleculă hidrolizată generează 4 molecule de amoniu și 6 molecule de formaldehidă:

Methenamina este excretată în urina acidă, unde este hidrolizată și formaldehida eliberată este bactericidă. Este disponibilă ca sare a acidului mandelic sau hipuric pentru acidifierea urinii. Nu s-a descris rezistența la formaldehidă, dar tulpinile de Proteus, care produc frecvente infecții urinare sunt rezistente, deoarece ureaza lor clivează ureea la CO2 și NH3 și alcalinizează urina.

Derivații nitrofuranului (furazolidon, nitrofurantoina, nitrofuratel, nitrofurazon) au efect bacteriostatic față de bacteriile Gram pozitive și Gram negative. Cel mai utilizat este nitrofurantoina. Derivații nitrofuranului se folosesc pentru terapia infecțiilor tractului urinar, deoarece realizează concentrații suficient de mari în urină. Nu au acțiune sistemică. Un intermediar redus al nitrofuranilor produce ruperea catenei de ADN, ceea ce explică efectele mutagene ale acestor compuși in vitro. Sunt activate mecanismele de reparare a ADN. Metaboliții reactivi reduși ai nitrofurantoinei interferă nu numai cu ADN, ci par a fi capabili să se lege cu proteinele ribosomale și inhibă sinteza proteinelor. Inhibă respirația bacteriană și metabolismul piruvatului.

Nitroimidazolii au spectru larg de acțiune (bacterii, fungi, protozoare, helminți). Cei cu activitate antibacteriană sunt 5-nitroimidazolii: 2-metronidazolul, furazolidonul și tinidazolul.

Furazolidonul este unul din numărul foarte mare de compuși (de ordinul miilor) de nitrofuran, introduși în clinică după descoperirea acestei clase de compuși în anii ’40. Este activ față de Klebsiella, E. coli, Campylobacter spp., S. aureus, Giardia intestinalis. Efectul lor antibacterian este dependent de reducerea grupării nitro în condiții anaerobe. Compușii captează e- din feredoxina redusă, generată în reacția de decarboxilare a piruvatului. Produsul reducerii are efect letal, probabil prin ruperea catenei de ADN. Unele bacterii microaerofile sunt deosebit de sensibile, dar mecanismul morții lor nu se cunoaște. Aceste substanțe au spectru antibacterian redus, limitat la bacterii anaerobe, cu doar două excepții: Helicobacter pylori și Gardnerella vaginalis, bacterii microaerofile sensibile la nitroimidazol. Condiția esențială pentru ca nitroimidazolii să acționeze, este reducerea parțială a grupării nitrat prin sistemul intracitoplasmatic transportor de electroni. Bacteriile aerobe sunt incapabile să realizeze această reducere, ceea ce explică rezistența lor naturală.

Nitrofuranii sunt agenți antibacterieni a căror structură și mod de acțiune sunt similare cu cele ale nitroimidazolilor. Activitatea lor este legată de reducerea grupării NH2. Întreaga cantitate administrată, pe cale orală sau parenterală rămâne disponibilă acțiunii antimicrobiene. Perioada de înjumătățire permite administrarea a două doze/zi. Datorită mecanismului unic de acțiune, nu există fenomene de rezistență încrucișată. Bacilii Gram negativi posedă rezistență intrinsecă pentru că au pompe de eflux eficiente față de Linezolid.

Oxazolidinonele reprezintă o clasă unică de agenți antimicrobieni sintetici. Utilizarea lor în clinică a fost impusă de necesitatea tratării infecțiilor produse de stafilococii rezistenți la meticilină, de pneumococii rezistenți la penicilină, de enterococii rezistenți la vancomicină. Acești agenți au un mecanism unic de acțiune, ceea ce elimină riscul rezistenței încrucișate cu agenții antimicrobieni disponibili. Deoarece nu sunt molecule naturale, genele de rezistență specifică nu preexistă în genofondul natural. Oxazolidinonele au fost inițial utilizate în terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei, dar ulterior s-a descoperit că au și activitate antimicrobiană. Primul agent al acestei clase a fost produs de compania DuPont de Nemours, la sfârșitul anilor ’70 pentru controlul bolilor foliare bacteriene și fungice la diferite plante, inclusiv la tomate. Modificarea chimică a oxazolidinonei a dus la descoperirea a doi agenți, eperezolid și linezolid, cu activitate in vitro și toxicitate diminuată.

Linezolid are activitate in vitro, față de N. gonorrhoeae și N. meningitidis și are o eficiență bună față de multe bacterii Gram pozitive anaerobe (grupul Bacteroides fragilis). Bacteriile Gram negative sunt probabil intrinsec rezistente, deoarece posedă pompe de eflux, eficiente față de linezolid. In vitro, linezolid are o eficiență relativ bună față de M. tuberculosis și foarte bună față de Nocardia.

Structura moleculară a linezolidului

Concentrațiile subinhibitorii de linezolid diminuă producerea hemolizinei și coagulazei la S. aureus și inhibă sinteza streptolizinei O și DN-azei la streptococi.

Mecanismul de acțiune și rezistență. Oxazolidinonele sunt inhibitorii sintezei proteinelor ribosomale la bacterii, dar spre deosebire de alți agenți antimicrobieni cu acțiune asupra ribosomilor, oxazolidinonele au un mecanism unic de acțiune deoarece blochează prima treaptă a asamblării ribosomilor din subunitățile disociate. Oxazolidinonele se leagă de un situs al subunității 50S, la interfața sa cu subunitatea 30S și previn formarea complexului de inițiere 70S, care cuprinde ARN-fMet, ARNm și cele două subunități ribosomale.

Linezolid se leagă de subunitatea 50S, la sau lângă situsul care leagă cloramfenicolul și lincomicina, deoarece cele 3 molecule intră în competiție pentru situsurile de legare din domeniul V al ARN 23S al subunității 50S. Domeniul V este centrul peptidil-transferazei, care catalizează formarea legăturii peptidice. Spre deosebire de cloramfenicol și lincomicină, linezolid nu inhibă formarea legăturilor peptidice și între ele nu există rezistență încrucișată. Asemănător majorității inhibitorilor sintezei proteinelor ribosomale, activitatea linezolidului față de bacterii in vitro este considerată bacteriostatică, deoarece bacteriile sunt omorâte mai încet decat de agenții bactericizi. Linezolid este metabolizat prin oxidarea inelului morfolino și se formează doi metaboliți: acidul aminoetoxiacetic și hidroxietil glicina. Linezolid este un agent antimicrobian cu spectru larg de activitate, virtual față de toate bacteriile Gram pozitive. Întreaga cantitate administrată, pe cale orală sau parenterală rămâne disponibilă acțiunii antimicrobiene. Perioada de înjumătățire permite administrarea a două doze/zi.

Un parametru esențial al unui agent chimioterapeutic este indicele terapeutic, adică raportul dintre doza toxică minimă și doza cu eficiență maximă. Valoarea mare a acestui raport este caracteristică agenților chimioterapeutici foarte eficienți.

Bibliografie selectivă

Bottom of Form

Black J.G., Microbiology. Principles and Applications. Third Edition. Prentice Hall. Upper Saddle River, New Jersey. 1996, p: 332-352.

Huang H.W., Chen F-Y., Lee M-T., Molecular Mechanism of Peptide-Induced Pores in Membranes, Physical Review Letters. 2004, 92: 198-304.

Liebetrau A., Rodloff A.C., Behra-Miellet J., Dubreuil L., In Vitro Activities of a New Des-Fluoro(6) Quinolone, Garenoxacin, against Clinical Anaerobic Bacteria, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2003, 47(11): 3667-3671.

Mihăescu G., Microbiologie generală si virologie. Editura Universitatii Bucuresti. 2000.

Musser J.M., Antimicrobial agents resistance in mycobacteria: molecular genetic insights, Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8: 496-514.

Todar's Online Textbook of Bacteriology, The control of microbial growth, Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2002.

Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998.

Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L., Microbiology. An Introduction. Fifth Edition. The Benjamin/Cummings Publishing, Co., Inc., Redwood City, CA, 1995, p: 167-188.

Wistreich A.G., Microbiology Laboratory Fundamentals and Applications (Hardcover), 1996.

Wolfson W.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiological Reviews, 1989, 2, (4): 378-424.

Capitolul 4

ANTIBIOTICELE. CARACTERIZAE GENERALĂ

Definiția inițială a antibioticelor ca substanțe chimice cu greutate moleculară mică, produse de microorganisme prin procese de biosinteză, s-a completat ulterior, deoarece antibioticele sunt substanțe chimice obținute prin biosinteză, semisinteză sau prin sinteză chimică, care în concentrație mică inhibă multiplicarea sau omoară microorganismele. Definitorie pentru noțiunea de antibiotic, rămâne capacitatea de a fi produs prin biosinteză de către microorganisme. Producerea antibioticelor a evoluat ca un mecanism ecologic de inhibiție a creșterii altor microorganisme, cu care intră în competiție pentru resursele energetice. Fenomenul se numește antibioză (descris de Pasteur, l877) și are o semnificație funcțională opusă simbiozei. Dar, microorganismele producătoare de antibiotice reprezintă o proporție foarte mică din totalul microorganismelor din sol. Faptul că antibioticele se sintetizează la sfârșitul fazei de creștere, pare să nu le confere un avantaj competitiv real. Gratia și Dath (1924) au studiat microorganismele din sol și în filtratul acelular al culturii de actinomicete au evidențiat efectul inhibitor al unei substanțe pe care au denumit-o actinomicetină. Fleming (l928), în căutarea unor compuși cu potențial antibacterian, a observat inhibiția creșterii coloniilor de Staphylococcus aureus în vecinătatea coloniilor fungice de Penicillium notatum. Apoi a arătat că mediul lichid al culturii de P. notatum, diluat de 800 de ori, a inhibat creșterea culturii de Staphylococcus. A descoperit „medicamentul miracol” – pe care l-a denumit penicilina, dar n-a izolat-o, pentru care a fost distins cu premiul Nobel. Calitățile ei de medicament „miraculos” au fost evidențiate de către Ernst Chain și Howard Florey (1939), care au izolat-o și au folosit-o în tratamentul infecțiilor bacteriene în timpul celui de al II-lea război mondial. Producția industrială a început în l943. Noul medicament a fost introdus în circuitul clinic general în 1944 și a avut un impact uriaș asupra stării de sănătate a populației umane. R. Dubos (1939) a izolat gramicidina și tirocidina din Bacillus brevis, active față de bacteriile Gram pozitive. S. Waksman (1944 – 1945) a izolat streptomicina din Str. griseus, un microorganism izolat din sol, pentru care a primit premiul Nobel. Streptomicina este activă față de unele bacterii Gram pozitive și față de Mycobacterium tuberculosis. El a propus denumirea de antibiotic, cu sensul de compus chimic produs de un microorganism, care la concentrație mică, inhibă sau omoară alte microorganisme.

Antibioticele au fost esențiale în lupta cu maladiile infecțioase și au contribuit esențial la creșterea speranței de viață în secolul XX. După introducerea penicilinei în clinica generală (1944), infecțiile grave (faringita streptococică) până atunci, au devenit vindecabile. Azi, dependența omului de antibiotice este totală. Numai în SUA, în 1998, pentru uzul uman s-au folosit circa 12,5 tone de antibiotice. Dacă se adaugă cele administrate în hrana animalelor și în agricultură, se apreciază că în ultimii 50 de ani s-au produs și s-au utilizat peste un milion de tone.

Antibioticele sunt produse de trei grupe de microorganisme: actinomicete, bacili Gram pozitivi și fungi filamentoși microscopici. Actinomicetele sunt cele mai bune producătoare de antibiotice și alți metaboliți secundari cu activitate biologică. Genul cel mai reprezentativ, Streptomyces, a fost izolat din tubul digestiv al unui pui de găină. Cephalosporium a fost izolat din apa mării, lângă un canal de deversare a apelor menajere, iar Bacillus, dintr-o rană tegumentară a unei fetițe (Tracy) și de aici s-a dat denumirea antibioticului bacitracina.

Estimările numărului de substanțe antibiotice variază: unii au inventariat circa 5.000 antibiotice identificate, iar alții evaluează cifre net superioare de ordinul a 10 000. Actinomicetele produc peste 2/3 din totalul antibioticelor, iar speciile g. Streptomyces produc 70-80% dintre metaboliții secundari. Pentru terapia infecțiilor umane și animale se folosește un număr restrâns (circa l00), produse de reprezentanții a 5 genuri de microorganisme: Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium. Celelalte sunt toxice ori au efecte defavorabile asupra organismului sau sunt lipsite de selectivitate.

Izolarea microorganismelor producătoare de antibiotice este foarte laborioasă, de exemplu din l34.700 tulpini bacteriene izolate din circa 5.000 de probe diferite de sol, o singură tulpină a prezentat interes practic.

În perioada descoperirii celor mai multe antibiotice (anii 1950 – 1960) s-au identificat tetraciclina, eritromicina și kanamicina, agenții antifungici candicidina și nistatinul, precum și substanțe cu efect antineoplazic (adriamicina). Marea majoritate a antibioticelor se obține în procese industriale, pe cale microbiologică. În prezent, numai porțiunea majoră a moleculei de antibiotic este sintetizată de microorganisme, iar restul moleculei este sintetizată pe cale chimică. Se obțin astfel antibiotice de semisinteză sau prin metode de bioconversie. În unele cazuri (de exemplu, cloramfenicolul), întreaga moleculă se sintetizează pe cale chimică, datorită structurii sale moleculare simple.

Convențional, în categoria antibioticelor sunt incluse și substanțele de semisinteză sau cele sintetizate artificial, dar pe care microorganismele le pot sintetiza total sau parțial. Această mențiune (că microorganismele le pot sintetiza total sau parțial) este necesară, pentru ca din categoria antibioticelor să se excludă compușii cu efect antibacterian sintetizați numai pe cale chimică (sulfamidele) sau cei produși în organismele superioare (lizozimul).

Structurile moleculare complexe ale antibioticelor combină derivați a două sau mai multe grupe de metaboliți: aminoacizi, glucide, bazele acizilor nucleici, intermediari ai sintezei lipidelor. Acetil-CoA și propionil-CoA formează catene lungi (ca în sinteza acizilor grași) și rezultă poli- cetone (RCO –CH2–CO– CH2-), care se condensează pentru a forma inelele macrolidelor, polienelor, tetraciclinelor sau porțiuni ale moleculei altor antibiotice.

4.1. Antibioticele – metaboliți secundari

Substanțele biogene preluate de celulă sub o formă simplă, sunt folosite de celulă în următoarele direcții esențiale:

– pentru sinteza metaboliților primari (aminoacizi, baze purinice și pirimidinice, enzime, acizi grași), necesari biosintezei constituienților structurali, rezultatul fiind creșterea celulei. Acești compuși se sintetizează faza de creștere primară, denumită și trofofază;

– pentru producerea energiei, în metabolismul energetic și a produselor metabolismului energetic (produși de fermentație alcoolică, lactică, butirică, propionică, acidă etc.);

– pentru producerea (uneori) a metaboliților secundari (antibiotice, alcaloizi, ergotina, giberelina).

Metaboliții secundari se sintetizează în faza de creștere secundară, idiofază, după epuizarea unui nutrient major (sursa de C sau de N), fiind denumiți și idioliți nu sunt esențiali pentru creșterea celulei și sinteza lor este expresia procesului de diferențiere biochimică. Metaboliții secundari au structuri chimice particulare, nu sunt esențiali pentru creșterea organismului producător, dar probabil au rol în asigurarea supraviețuirii în mediile naturale. Diversitatea chimică și structurile neobișnuite ale metaboliților secundari sunt ilustrate de numărul mare de clase cărora le aparțin: aminozaharuri, quinone, cumarine, epoxizi, alcaloizi ergot, glicozide, derivați indolici, lactone, macrolide, naftalene, nucleozide, peptide, poliacetilene, poliene, piroli, terpenoide, tetracicline etc. Metaboliții secundari conțin legături chimice neobișnuite: inele -lactamice, peptide ciclice alcătuite din aminoacizi normali și modificați, legături nesaturate de poliacetilene și poliene, inelul macrolidelor. Multe produse naturale de importanță medicală (antibiotice), alimentară, industrială sau agricolă sunt metaboliți secundari.

Metaboliții secundari sunt produși numai de unele specii ale unui gen, ca familii de compuși strâns înrudiți: cel puțin 10 peniciline naturale, 10 bacitracine, 25 actinomicine etc. Proporția diferitelor componente în amestec depinde de factori genetici, de factorii de mediu și se datorează relativei lipse de specificitate a enzimelor implicate în metabolismul secundar. În contrast, procesele de biosinteză ale metaboliților primari sunt totdeauna catalizate de enzime cu specificitate înaltă: enzima recunoaște un singur substrat și se formează un singur produs. Specificitatea acțiunii enzimelor care catalizează sinteza metaboliților primari se datorează faptului că erorile de biosinteză a componentelor celulare esențiale sunt, în general, letale, iar erorile care survin în metabolismul secundar nu au consecințe semnificative pentru celula producătoare, deoarece metabolitul secundar modificat își păstrează, de regulă, activitatea biologică. Metaboliții secundari se sintetizează pe o varietate mai mare de căi, decât cei primari. Deși au structuri chimice foarte diversificate și se sintetizează pe căi variate, metaboliții secundari se asamblează dintr-un număr limitat de metaboliți intermediari.

Antibioticele sunt metaboliți secundari a căror sinteză începe târziu în timpul fazei de creștere, la intrarea în faza staționară. Experiențele de autoradiografie cu aminoacizi marcați au evidențiat că în perioada în care miceliul crește cu o rată înaltă, aminoacizii se încorporează în proteinele celulare, dar nu se sintetizează actinomicină. După ce microorganismul a încheiat faza de creștere, rata încorporării aminoacizilor în proteine scade considerabil. Waksman (1961) a intuit că proprietatea anumitor microorganisme de a sintetiza antibiotice nu este corelată cu nici un mecanism esențial al nutriției și creșterii celulei. În general, sinteza metaboliților secundari din categoria antibioticelor este supresată în timp ce celulele se găsesc în faza de multiplicare activă și este cea mai rapidă după ce cultura intră în faza staționară. Comparativ cu metaboliții primari, antibioticele au specificitate redusă de biosinteză, deoarece același organism sintetizează, de multe ori, un grup de molecule înrudite.

Cele două faze, trofofaza și idiofaza, sunt bine separate la o cultură bacteriană producătoare de antibiotic, dar nu sunt clar delimitate pentru microorganismele filamentoase (actinomicete și fungi). Criteriul evaluării creșterii masei celulare este determinarea greutății uscate. În numeroase procese de biosinteză industrială cu microorganisme filamentoase, greutatea uscată continuă să crească semnificativ în idiofază, dar cu o rată mai mică decât în trofofază. Determinarea greutății uscate nu este un criteriu optim pentru evaluarea creșterii. Masa celulară constă din totalitatea structurilor necesare diviziunii celulare (organitele celulare) și din materialele de rezervă (polioli, lipide, polifosfați și glucide nestructurale), care pot să reprezinte 50 – 60% din greutatea uscată a celulei la sfârșitul procesului de biosinteză. Creșterea greutății uscate în idiofază este rezultatul acumulării substanțelor de rezervă, o creștere cu caracter nereplicativ (nu este asociată cu diviziunea celulară),. De aceea, parametrul optim pentru măsurarea creșterii masei replicative a celulei, este determinarea cantitativă a ADN. În acest caz, creșterea celulei poate fi disociată de producerea de antibiotic. Sfârșitul fazei de creștere replicativă este marcat de alți parametrii: scăderea ratei activității respiratorii și scăderea ratei sintezei ARN.

Cele două faze sunt bine delimitate în cazul fermentației antibioticelor (cloramfenicol, colistin, penicilina, bacitracina) în mediile organice complexe, care favorizează creșterea rapidă a culturii discontinue asincrone, dar se suprapun într-un grad semnificativ, în mediile chimic definite (sintetice), care favorizează creșterea lentă.

Factorul care controlează declanșarea biosintezei antibioticelor este deficiența unuia sau mai multor componente nutriționale care limitează creșterea. Epuizarea unui astfel de factor oprește creșterea și inițiază biosinteza idioliților. În mediile definite chimic, favorizante ale creșterii lente, unul sau mai mulți factori nutriționali pot fi limitanți ai creșterii chiar de la începutul cultivării, dar favorabili sintezei antibioticelor. Momentul sintezei produsului nu este un criteriu totdeauna valid pentru a defini metabolitul secundar.

Microorganismele par a fi programate să producă antibiotice numai când rata specifică de creștere scade sub un anumit nivel. Fenomenul s-a stabilizat în evoluție, ca răspuns la presiunile competitive. În mediile bogate în substanțe nutritive, ca de exemplu intestinul mamiferelor, producerea antibioticelor nu este necesară, deoarece resursele satisfac necesitățile metabolice ale întregii asociații. În mediile naturale majore (sol, apă), nutrienții sunt totdeauna limitanți pentru creșterea diferitelor asociații de microorganisme heterotrofe și sinteza antibioticelor devine avantajoasă pentru supraviețuire.

Microorganismele evită efectul letal al antibioticelor pe care le produc (sinuciderea) prin modificarea și detoxificarea antibioticelor de către enzime sintetizate de organismele producătoare; alterarea țintei antibioticului în celula producătoare; scăderea permeabilității pe fața externă a membranei, după ce antibioticul a fost excretat.

Unele antibiotice au rol în dinamica proceselor de sporulare (de exemplu, polimixina, produsă de Bacillus polymyxa). Altele sunt produse secundare, rezultate din degradarea peretelui celular, corelată cu sporularea, deoarece peretele conține D-aminoacizi și glucide care se regăsesc în compoziția chimică a unor antibiotice.

Condițiile de mediu necesare sporulării și secreției metaboliților secundari sunt adeseori asemănătoare și chiar mai stringente decât acelea necesare creșterii vegetative. S-a crezut că sinteza metaboliților este obligatorie pentru sporulare, dar unele tulpini fungice sporulează chiar în absența producerii metaboliților secundari.

Cei mai mulți metaboliți secundari sunt sintetizați de organisme cu creștere filamentoasă și cu morfologie relativ complexă.

Sinteza metaboliților secundari, la microorganisme, este asociată cu procesele de sporulare. Se disting 4 categorii de metaboliți secundari a căror sinteză este declanșată de procesul de sporulare:

– metaboliți care activează sporularea (acidul linoleic, la Asp. nidulans);

– pigmenții structurilor de sporulare (melaninele necesare formării sau integrității sporilor sexuați și asexuați). Melaninele sunt pigmenți de culoare închisă care se formează prin polimerizarea oxidativă a compușilor fenolici, se sintetizează în timpul sporulării și sunt depozitați în peretele celular, având rol protector față de radiațiile UV, dar sunt și factori de virulență;

– metaboliți toxici secretați la timpul sporulării (micotoxinele);

– antibiotice.

Metaboliții secundari sunt substanțe neesențiale pentru organismul producător, cărora li se atribuie următoarele activități biologice:

– inhibiția creșterii sau chiar efectul letal asupra altor organisme din mediu;

– efecte toxice față de organismele multicelulare (nevertebrate, plante);

– stimulează diferențierea microorganismelor;

– au rol în transportul ionilor metalici.

Metaboliții secundari au semnificație adaptativă pentru microorganismele producătoare, deoarece sinteza lor este determinată genetic, iar pe de altă parte, multe clase de compuși prezintă o adaptare remarcabilă de a interacționa cu țintele lor. Unii metaboliți au activitate biologică chiar la concentrațiile mici produse în mediile naturale.

Antibioticele produse de Streptomyces se sintetizează în cantități mici, în faza de tranziție, când creșterea miceliului vegetativ încetinește, ca rezultat al epuizării nutrienților și miceliul aerian este gata să se dezvolte pe seama nutrienților eliberați prin degradarea hifelor vegetative. Astfel de antibiotice ar avea rolul de a proteja organismul producător, de alte microorganisme care tind să consume resursele nutritive din mediu. Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au acțiune sinergică: de exemplu, antibioticele -lactamice și acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus). Acidul clavulanic este un inhibitor natural al -lactamazelor, care conferă rezistență la -lactamice. Antibioticele -lactamice și ale inhibitorilor -lactamazei sunt eficiente față de bacteriile rezistente la -lactami. Efectul sinergic al asociației este reflectat de denumirea dată combinației acidului clavulanic cu meticilina: augmentin. Coproducerea cefamicinei (un antibiotic -lactamic) și acidului clavulanic este constantă: nu există prodcători cunoscuți de acid clavulanic, care să nu producă cefamicine (Challis, Hopwood, 2003). Multe specii de Streptomyces produc două sau mai multe antibiotice, cu acțiune sinergică față de un organism competitiv care domină numeric asociația naturală (Majundar și Kutyner, 1962). Astfel, Str. avermitilis sintetizează doi compuși antifungici cu structuri diferite: oligomicina și un macrolid polienic. Cele două antibiotice au ținte moleculare distincte: oligomicina inhibă o sintază mitocondrială, iar macrolidul polienic se leagă ireversibil de membrana celulelor fungice, alterând permeabilitatea lor. Oligomicina și macrolidele polienice pot acționa sinergic față de fungi. Probabil că un competitor fungic al lui Str. avermitilis, l-a selectat pe ultimul pentru sinteza acestor antibiotice.

Structura moleculară a oligomicinei

Creșterea fungică și sinteza antibioticului sunt rezultatul interacțiunii dintre miceliul fungic, substrat și condițiile de mediu. Sinteza este influențată de condițiile mediului de creștere a fungilor. Multe antibiotice sunt metaboliți secundari, produși în condiții suboptimale de creștere sau în prezența unor cantități limitante de nutrienți. Temperatura, umiditatea, aerația, pH-ul, rata de creștere influențează masa fungică și sinteza antibioticelor.

Sinteza neribosomală a proteinelor

Cele două categorii de proteine celulare și antibiotice polipeptidice se sintetizează după mecanisme diferite. Dovezile experimentale au fost aduse utilizând inhibitori metabolici. De exemplu, cloramfenicolul și puromicina, inhibitori ai sintezei proteinelor celulare, stimulează încorporarea aminoacizilor în actinomicină. În absența sintezei proteinelor celulare, rezerva de aminoacizi poate fi folosită exclusiv pentru sinteza antibioticelor. Nu toate proteinele se sintetizează pe ribosomi. Sinteza neribosomală a peptidelor are loc la procariote și la eucariotele inferioare și se bazează pe principiul matriței cu S (thiotemplate), catalizată de complexe enzimatice mari multifuncționale, denumite peptid-sintetaze, care sunt organizate în module (un modul de inițiere a sintezei și mai multe module de alungire a catenei peptidice) (Lengyel și Soll, 1969). Fiecare modul este alcătuit din mai multe domenii, care determină alungirea catenei polipeptidice prin adăugarea succesivă a aminoacizilor.

Unele polipeptide, cu mai puțin de 50 de aminoacizi, pot fi asamblate de peptid-sintetaze, ca și alți compuși, ca de exemplu acizii grași, a căror sinteză este catalizată de alte sintetaze. Produsele peptidice de sinteză neribosomală includ ciclosporina (cu acțiune imunosupresoare) și antibiotice ca gramicidina S, tirocidina A și surfactinele. Structura modulară a peptid-sintetazelor determină alungirea secvențială a catenei peptidice, prin adausul de aminoacizi specifici.

Modulele au un model comun de organizare care le permite activarea aminoacidului fixat și realizarea unei legături peptidice, ca și modificarea aminoacidului fixat prin reacții de epimerizare sau N-metilare.

S-a demonstrat experimental că un modul de alungire trebuie să posede cel puțin 4 domenii:

– un domeniu de adenilare (A) cu activitate de peptid-sintetază care fixează aminoacidul și îl activează printr-o reacție de adenilare;

– un domeniu de tioesterificare (T sau PCP- peptidyl carrier protein) care menține peptidul nascent asociat cu sintetaza, pe întreaga durată a sintezei prin intermediul unei legături tioesterice;

– un domeniu de condensare (C) prin care sintetaza catalizează formarea legăturilor peptidice;

– un domeniu specific (Te) cu activitate de tioesterază care permite eliberarea peptidului de complexul sintetazei, după terminarea sintezei.

Spre deosebire de calea de sinteză proteică clasică (ribosomală) care utilizează doar 21 de aminoacizi (20 de aminoacizi esențiali și selenocisteina), sinteza non-ribosomală poate utiliza peste 300 de aminoacizi (de exemplu, D-aminoacizi, aminoacizi N-metilați etc.), însă peptidele sintetizate nu pot depăși o secventa de 48 de aminoacizi. Peptid-sintetazele, ca și alte complexe enzimatice (de exemplu, poliketid-sintetazele) sunt interesante datorită posibilității utilizării lor în biosinteza produselor nenaturale (Gotlieb, 1967). Majoritatea peptidelor sintetizate pe cale neribosomală de microorganisme sunt clasificate ca metaboliți secundari, adică rareori au rol în metabolismul primar, în creștere sau în reproducere, dar sinteza lor a evoluat cu un oarecare beneficiu pentru organismul producător.

4.2. Biosinteza antibioticelor

Producerea industrială a antibioticelor presupune, în primul rând, transferul inoculului din laborator în instalația industrială, în condiții de sterilitate. Procesul creșterii microorganismului producător și al biosintezei antibioticului durează între 3 și 10 zile. În etapa a doua, mediul este supus prelucrării pentru îndepărtarea celulelor, iar supernatantul este supus procedeelor specifice pentru purificarea antibioticului și determinarea proprietăților antimicrobiene prin metoda difuziei în mediul nutritiv agarizat, repartizat în plăci Petri. Pe mediul din plăci se însămânțează microorganismul test și se aplică rondelele de hârtie de filtru îmbibate în soluția de antibiotic. În funcție de diametrul zonei de inhibiție, se stabilesc proprietățile antimicrobiene ale antibioticului, în comparație cu aceea a unei soluții standard de antibiotic. Puterea antimicrobiană se exprimă în unități de activitate/mg de produs. Unitatea de activitate este g. Pentru penicilină, o unitate de activitate (UA) este 0,6 g. Antibioticele sunt sintezate într-o serie de reacții, supraadăugate reacțiilor metabolice esențiale. Antibioticele sunt metaboliți secundari și multe dintre ele se sintetizează când fosfatul devine factor limitant al creșterii. Căile sintezei metaboliților primari (aminoacizi, enzime, vitamine) sunt interconectate cu căile sintezei metaboliților secundari. Procesele prin care metaboliții primari sunt transformați în metaboliți secundari sunt căi de biosinteză.

Factori reglatori ai sintezei antibioticelor. Căile de biosinteză a unor antibiotice sunt ramificate. Ele au un trunchi comun, care ulterior se ramifică și duc la sinteza unui metabolit primar și a unui metabolit secundar (Martin și colab., 1980; 2000). În unele cazuri, metabolitul primar inhibă prin feed-back, trunchiul comun al căii și astfel inhibă sinteza antibioticului. Astfel, lizina, un precursor al penicilinei, inhibă sinteza penicilinei și cefalosporinei de către P. chrysogenum. Lizina este factorul reglator major al sintezei antibioticelor -lactamice: calea biosintezei penicilinei se ramifică din calea lizinei în stadiul acidului -aminoadipic. Lizina acționează asupra homocitrat-sintazei, prima enzimă în calea sintezei penicilinei.

Fiecare microorganism producător, ca și fiecare antibiotic, au caracteristici proprii și, în consecință, tehnica producerii industriale este adaptată acestor particularități.

Glucoza, cea mai bună sursă de C pentru creșterea bacteriană, interferă cu biosinteza multor antibiotice. Polizaharidele și oligozaharidele sunt adeseori surse mai bune de C decât glucoza, pentru sinteza antibioticelor. Intr-un mediu care conține glucoză și un alt glucid cu o rată mai mică de metabolizare, curba de creștere a culturii reflectă o creștere diauxică: într-o primă etapă este folosită glucoza, fără producerea antibioticului. După ce glucoza este epuizată, pentru biosinteza antibioticului este metabolizată cea de-a doua sursă de C. Glucoza, datorită ratei crescute cu care este metabolizată, favorizează creșterea rapidă a masei celulare, dar inhibă sinteza multor antibiotice prin efectul supresor asupra unor enime:

– represează biosinteza kanamicinei, datorită represiei N-acetil-kanamicin-aminohidrolazei, probabil ultima enzimă a căii de biosinteză a kanamicinei;

– represează (dar nu inhibă) încorporarea valinei C14 în penicilină;

– interferă cu biosinteza streptomicinei prin represia ultimei enzime a căii de biosinteză.

Amoniul sau orice sursă de N ușor asimilabilă represează enzimele implicate în utilizarea altor surse de N: nitrit-reductaza, nitrat-reductaza asimilatorie, arginaza, ornitin-transaminaza, proteazele extracelulare, enzimele degradative ale purinelor, transportul ureii și enzimele care o încorporează în compușii organici ai celulei.

Fosforul este un factor limitant foarte important al creșterii pentru multe specii de microorganisme care produc antibiotice: Str. griseus (produce candicidina), Str. aureofaciens, înainte de sinteza tetraciclinei. Fosforul reglează sinteza unor antibiotice: peptidice, macrolide, poliene, tetraciclina. Producerea industrială a acestor antibiotice se desfășoară la concentrații mici de P anorganic, limitante ale creșterii. Concentrațiile mari, de până la 300 mM favorizează creșterea masei celulare a microorganismelor producătoare, iar cele sub 10 mM sunt favorabile sintezei antibioticelor. Adăugarea P anorganic nu numai că interferă cu sinteza antibioticelor, dar după câteva ore determină reversia celulelor producătoare de antibiotice, la starea de creștere.

Celulele unui microorganism producător sintetizează antibioticul pe toată durata viabilității. Celulele rămân viabile atâta timp cât sursa energetică este disponibilă. Cauzele încetării biosintezei sunt următoarele:

– declinul ireversibil al uneia sau mai multor enzime ale căii de biosinteză a antibioticului. Activitatea sintetazelor antibioticelor peptidice scade rapid în câteva ore după declanșarea sintezei antibioticului;

– efectul de feedback al antibioticului acumulat. Câteva antibiotice inhibă propria lor biosinteză: cloramfenicolul, cicloheximida, puromicina etc.

– epuizarea precursorilor intermediari ai antibioticului.

Biosinteza penicilinei

Structura de bază a tuturor tipurilor de peniciline este acidul 6-aminopenicilanic, ce constă dintr-un inel tiazolidinic și un inel -lactamic. La acidul 6-aminopenicilanic, în poziția 6, este atașată o catenă variabilă (Arnstein și Margreter, 1958; Fawcett și colab., 1976; Muller și colab., 1991). Microorganismul producător este o tulpină de Penicillium chrysogenum, înalt producătoare, selecționată prin mutageneză.

Faza inițială (“de fermentație”) este cea în care se asigură cultivarea și creșterea în condiții optime a microorganismului producător. Cultivarea se face în tancuri de mare capacitate, prevăzute cu dispozitive de aerare cu aer steril, de agitare și de reglare a temperaturii. Sinteza optimă a antibioticelor -lactamice produse de fungi este în mare măsură dependentă de sursele de C disponibile.

Mediul de cultivare conține lactoză (ca sursă de C), făină de rapiță (sursă de azot), săruri minerale (sulfat de sodiu, sulfat de amoniu, carbonat de calciu, monofosfat de potasiu etc.). La nevoie se adaugă, în condiții de sterilitate, o substanță tensioactivă, care stimulează dezvoltarea miceliului fungic prin dispersarea culturii și mărirea gradului de aerare și un agent antispumant, care oprește formarea spumei datorită agitării, aerării și agentului tensioactiv.

Compușii hidrofili ai cefalosporinelor sunt sintetizați de fungi, bacterii Gram pozitive și Gram negative, iar penicilinele hidrofobe sunt produse numai de fungii filamentoși.

Fazele sintezei au fost identificate prin utilizarea atomilor marcați (C14 și C12, H3 și N15). Primele două trepte ale biosintezei penicilinei și cefalosporinei sunt comune (Trip și colab., 2004). Penicilinele și cefalosporinele naturale sunt formate din aceiași aminoacizi: acidul L–aminoadipic, L-cisteina, L-valina.

Acidul L–aminoadipic este un aminoacid neproteic și este sintetizat pe calea aminoadipatului specifică fungilor, care duce la formarea L-lizinei (Brakhage, 1998; Qeener, 1990).

În prima reacție, cei 3 aminoacizi precursori sunt condensați pe cale neribosomală în tripeptidul (L– aminoadipil)- L- cisteinil- D- valina (ACV). Condensarea neribosomală a tripeptidului limitează calea sintezei. Toate reacțiile necesare formării tripeptidului sunt catalizate de o singură enzimă multifuncțională, denumită ACV-sintetază. Originea acidului -aminoadipic este diferită la fungi și la actinobacterii. La fungi, produsul este un intermediar al căii lizinei, iar la actinobacterii, acidul -aminoadipic este produsul de catabolism al lizinei.

În treapta a doua, închiderea inelului oxidativ al tripeptidului linear duce la formarea unei structuri inelare biciclice – acidul aminopenicilanic, adică inelul -lactamic cu 4 atomi, fuzionat cu inelul tiazolidinic format din 5 atomi. Nucleul comun biciclic este comun pentru toate penicilinele. Reacția este catalizată de izopenicilin-N-sintaza. Rezultă izopenicilina N, a cărei activitate de antibiotic este slabă.

În treapta a treia a biosintezei, lanțul lateral al acidului L–aminoadipic al izopenicilinei N este schimbat cu un grup acil hidrofob. Schimbul este catalizat acil CoA-izopenicilin N-acil-transferază. Tripeptidul ACV se formează pe calea mecanismului sintezei neribosomale a matriței cu S, din aminoacizii precursori. Sistemul multienzimatic al ACV-sintetazei este alcătuit din monomeri cu mase moleculare de circa 420 kDa și manifestă activități catalitice diverse: 1) recunoașterea specifică a celor 3 aminoacizi și activarea lor; 2) formarea punții peptidice; 3) izomerizarea L-valinei la forma D și eliberarea peptidului. Ca și în biosinteza ribosomală a peptidelor, funcția –COOH a aminoacidului este activată prin formarea unei anhidride cu -fosfatul din ATP și eliberarea pirofosfatului (P-Pi). După activarea unui aminoacid, aminoacil-adenilatul este clivat sub acțiunea unei enzime thiol. Se formează o legătură tioesterică între enzima thiol și aminoacid, cu eliberarea AMP. Aminoacizii tioesterificați joacă același rol ca și aminoacizii legați de ARNt în biosinteza peptidelor ribosomale. Ei sunt intermediari cu energie înaltă, care devin țintele atacului nucleofilic al grupării NH2 al unui al doilea aminoacid. Astfel se formează legătura peptidică. Ca și în sinteza ribosomală, peptidul nascent crește de la capătul NH2, spre capătul COOH, iar peptidele intermediare rămîn legate de enzimă, ca tioesteri. Specificitatea de substrat este mai puțin strictă decît în sinteza proteinelor.

Microorganismul producător sintetizează, în mod obișnuit, mai multe tipuri de penicilină, cu aceeași structură de bază, dar care diferă după natura catenei laterale atașată nucleului biciclic prin intermediul unei funcții amidice. Dacă procesul de biosinteză se desfășoară fără adăugarea catenei laterale, sunt produse penicilinele naturale (penicilina G sau benzil-penicilina). Dintre penicilinele naturale, numai penicilina G (benzil-penicilina) este utilizabilă în clinică. Pentru penicilina G, molecula precursoare a catenei laterale este acidul fenil-acetic (C6H5CH2) sau unul din derivații săi (fenilacetatul de Na sau fenilacetamida). Acidul fenil-acetic rezultă și prin transformarea fenil-etilenaminei din extractul de porumb, în acidul fenilacetic.

Biosinteza industrială a penicilinei cu P. chrysogenum s-a realizat utilizând lactoza ca sursă de C, deoarece furnizează cel mai înalt titru al penicilinei. Glucoza în exces determină reducerea amplă a titrului penicilinei.

Deoarece separarea penicilinelor prin purificare este un proces dificil, în mediul de creștere se adaugă molecule precursoare ale catenei laterale, care asigură sinteza unui anumit tip de penicilină, inhibând sinteza celorlalte tipuri. Cea mai utilă penicilină, cea cu activitate față de bacteriile Gram negative, este rezultatul unui proces de biosinteză, combinat cu o cale chimică, prin adăugarea precursorilor specifici în timpul fermentației. Se obțin astfel peniciline de semisinteză (ampicilina, amoxicilina, meticilina). În acest caz, benzil-penicilina produsă în mod natural de miceliul fungic, este clivată chimic sau enzimatic și rezultă acidul 6-aminopenicilenic, supus modificării chimice prin adăugarea unei catene laterale. Penicilinele de semisinteză au avantajele unui spectru mai larg de activitate și ale administrării orale.

Compoziția mediului de cultură este diferită de la un producător la altul. Sursa de carbon a mediului este glucoza și lactoza, iar sursa de aminoacizi și de factori de creștere este hidrolizatul de porumb (corn steep), un ingredient major al mediului. Glucoza poate fi folosită ca unică sursă de carbon, dar are dezavantajul metabolizării rapide și al efectului de represie prin catabolit, de aceea, trebuie să aibă o concentrație mai mică și să se adauge treptat. Sunt mai favorabile metodele de cultivare continuă. În culturile discontinue se folosesc ambele surse de carbon.

Lactoza se metabolizează lent și nu produce fenomenul represiei prin catabolit. Uleiul de floarea soarelui are rol de sursă de carbon, dar este în primul rând agentul antispumant. CaCO3 se adaugă pentru stabilitatea pH. Mediul conține microelemente și obligatoriu, un precursor care să furnizeze precursorii catenei laterale a antibioticului, orientând sinteza spre un anumit tip de penicilină.

Prin adăugarea moleculelor precursoare adecvate, sinteza poate fi orientată în sensul producerii sintezei penicilinei specifice. Acidul fenilacetic (C6H5-CH2COOH) este precursorul sintezei penicilinei G. Pentru sinteza penicilinei V, ca precursor se folosește acidul fenoxiacetic (C6H5-O-CH2-COOH).

Penicilinele sunt sintetizate într-un proces de cultivare submersă, în fermentatoare de 40.000–200.000 litri. Este un proces strict aerob și necesită aerare energică. Penicilina este un metabolit secundar tipic.

Faza “fermentativă” durează circa 120 de ore la 25o și cuprinde trei etape: a) etapa inițială, în care are loc creșterea microorganismului producător, pe seama metabolizării glucozei. Producerea de antibiotic este nesemnificativă; b) etapa de maturație, după epuizarea sursei de carbon, cu sinteza masivă de antibiotic; c) etapa de declin sau de îmbătrânire, în cursul căreia producerea de antibiotic este nulă și survine chiar scăderea cantității sale prin degradare.

Procesul producției de antibiotic, strict aerob este urmărit prin controlul modificărilor biochimice (pH, concentrația lactozei și a NH3), caracteristicile microbiologice (aspectul și gradul de dezvoltare a miceliului) și a concentrației de antibiotic în mediul de cultură. Procesul este submers, necesită o aerare eficientă și este oprit în momentul în care întreaga cantitate de lactoză din mediu a fost metabolizată. În absența sursei de carbon, creșterea miceliului încetează și survine autoliza. NH3 alcalinizează mediul și la pH alcalin, penicilina este instabilă. Penicilina se eliberează în mediu. Sub 1% rămâne asociată cu miceliul fungic. Miceliul se îndepărtează prin filtrare.

Tulpina de Penicillium notatum utilizată inițial pentru biosinteza penicilinei, a produs 6 mg/l. În 1941, în SUA au început studiile pentru ameliorarea randamentului de producție al tulpinii de P. notatum și pentru identificarea unor noi tulpini producătoare de penicilină. S-a identificat astfel o nouă specie, P. chrysogenum, cu un randament de producție mult mai bun, de 60 mg/l.

Studiile de selecție s-au făcut prin mutageneză cu raze X și UV, cu azotiperită. S-au urmărit două aspecte: obținerea unor tulpini lipsite de pigmentul galben – chrisogenina – care îngreunează operațiile de purificare a antibioticului; obținerea tulpinilor înalt producătoare de penicilină, peste 20 g/l. Cele mai multe tulpini obținute în programele de dezvoltare sunt mutante reglatoare. Obținerea lor se bazează pe conceptul că mecanismele de control ale sintezei antibioticelor pot fi depășite prin procese mutaționale. Producția industrială a penicilinelor și cefalosporinelor se realizează cu mutante înalt producătoare de Penicillium și respectiv Cephalosporium acremonium. Cefamicinele sunt produse de specii de Streptomyces.

S-au obținut mutante de Penicillium și Cephalosporium care cresc în profunzime, în condiții de aerare, cu randament de producție de 4500 UI/ml benzil-penicilină, ceea ce echivalează cu 30 g/l, în bioreactoare cu volume de 250-400 m3.

De obicei, mutantele sunt genetic instabile și necesită măsuri de menținere a potențialului de biosinteză și de conservare. Cele mai adecvate metode de conservare sunt păstrarea celulelor vii în azot lichid (minus 196o) sau liofilizarea sporilor.

Reglarea biosintezei penicilinei

Sinteza penicilinei este supusă mecanismului reglării feed-back al sintezei metaboliților primari. Deși penicilina este un metabolit secundar, sinteza sa este influențată de metaboliții primari, deoarece aceștia sunt precursorii metaboliților secundari. Astfel, mecanismele reglatoare ale sintezei metaboliților primari influențează producerea antibioticului.

Unul dintre cei trei aminoacizi care participă la sinteza nucleului comun al penicilinei este L-valina. Biosinteza valinei este reglată printr-un mecanism feed-back: valina exercită o acțiune inhibitorie a activității primei enzime a lanțului de biosinteză. Dacă prima enzimă este inactivată, biosinteza valinei este inhibată și astfel este inhibată biosinteza penicilinei. Dacă în mediu se adaugă lizina, biosinteza penicilinei scade foarte mult. La fungi, lizina se sintetizează pe calea acidului -aminoadipic. Lizina exercită o inhibiție feed-back a activității primei enzime a lanțului de biosinteză, enzimă implicată în sinteza acidului -aminoadipic.

Extracția antibioticului

Lichidul obținut la sfârșitul primei faze este vâscos, cu miros puternic și conține substanțe toxice, compuși piretogeni și numeroase impurități, care depășesc de sute de ori cantitatea de antibiotic. Extracția antibioticului din mediu se face cu solvenți organici (pentru penicilină, cu acetat de amil sau acetat de butil la pH = 2,5). Cele insolubile (tetraciclina) se separă și se solubilizează în solvenți speciali sau separarea unora (streptomicina, neomicina) se face cu ajutorul rășinilor schimbătoare de ioni.

Antibioticul separat din supernatantul de creștere este supus unui proces de purificare, sterilizare, spălare, cristalizare și uscare în vid. Dacă după controalele finale, chimice, microbiologice și toxicologice (pentru absența toxicității și a substanțelor piretogene) îndeplinește condițiile de utilizare, antibioticul este standardizat în raport cu o unitate de activitate stabilită prin convenție internațională și este trecut în faza ultimă, cea de condiționare (repartizare în fiole, flacoane etc.) sub formă de pulberi cristaline (prin sublimarea în vid a soluțiilor) sau încorporat în diferite substanțe. Penicilina se prezintă ca o pulbere albă, microcristalină, hidrosolubilă și netoxică pentru om, chiar în doze mult mai mari decât cele active față de microorganisme.

S-au produs peste l00 de peniciline de biosinteză. Pentru obținerea celor mai utile peniciline se folosește procedeul combinat, fermentativ și chimic, prin care rezultă peniciline semisintetice.

Cefalosporinele (nocardicina, acidul clavulanic și tienamicina) sunt antibiotice -lactamice care conțin inelul dihidrotiazină, în loc de tiazolidină. Au fost descoperite ca fiind produse de Cephalosporium acremonium, dar sunt sintetizate și de alți fungi, ca și de unele procariote. C. acremonium produce 4 tipuri morfologice de celule, care reprezintă stadii ale ciclului de creștere: hife, artrospori, conidii, gemule. Diferențierea morfologică a lui C. acremonium pare a fi legată de sinteza cefalosporinei C. Rata maximă a sintezei cefalosporinei C coincide cu conversia fragmentelor hifale la artrospori.

Sinteza cefalosporinei C este influențată de metionină. Adăugarea metioninei în mediul de fermentație mărește semnificativ producția de antibiotic. Metionina are rol de donor de S pentru sinteza antibioticului și este un inductor al anumitor enzime implicate în sinteză (-(L–aminoadipil-L-cisteinil-D-valin) sintetaza, izopenicilin N sintetaza = ciclaza), dar are și o funcție reglatoare și stimulează formarea artrosporilor.

Sinteza cefalosporinei C de către C. acremonium pare a fi însoțită de creșterea cantității de acid linoleic.

Acidul clavulanic are o importanță clinică deosebită, pentru că deși nu este un antibiotic foarte eficient, se administrează în asociație cu -lactamicele, deoarece este cel mai bun inhibitor al sintezei -lactamazelor.

Semisinteza

Utilizarea penicilinei G (de biosinteză) prezintă câteva dezavantaje importante: este sensibilă la penicilinaze, enzimele care o inactivează prin acțiune asupra ciclului -lactamic; este instabilă în mediul acid al stomacului și de aceea se administrează numai prin injectare; se elimină foarte repede din circulație, prin rinichi. Pentru a menține o concentrație activă, se injectează la intervale scurte; este activă numai asupra bacteriilor Gram pozitive.

Obținerea antibioticelor de semisinteză se bazează principiul utilizării moleculei native, de la care se obțin diferite derivate mai active, prin metode de sinteză. Moleculele rezultate sunt asemănătoare celor naturale, cu valoare terapeutică superioară sau fără valoare. Numai benzil-penicilina, penicilina V și acidul clavulanic sunt molecule naturale. Celelalte peniciline, toate cefalosporinele și cefamicinele sunt derivate ale moleculelor obținute prin biosinteză.

Atomii moleculei de penicilină sunt reactivi și permit un spectru larg de modificări. Practic, fiecare atom din structura penicilinei și cefalosporinei naturale, cu excepția celui de N din ciclul -lactamic, a constituit sediul unei modificări chimice (Diaconu, Nechifor, 1988). Multe antibiotice sunt rezultatul unei singure modificări, iar altele rezultă după două sau chiar mai multe transformări succesive.

Cele mai importante modificări chimice ale moleculei native sunt:

– dezacilarea penicilinelor și cefalosporinelor naturale în scopul obținerii acidului 6-aminopenicilenic (A6AP), respectiv acidului 7 aminocefalosporinic (A7AC);

– acilarea grupării 6(7) NH2 din A6AP, respectiv A7AC și obținerea penicilinelor și cefalosporinelor semisintetice;

– transformarea penicilinei în cefalosporine prin extensia ciclului;

– modificarea poziției 3-acetoxi din cefalosporinei;

– esterificarea grupei 3-carboxil a penicilinei.

Cele mai importante antibiotice de semisinteză sunt ampicilina, oxacilina, meticilina. Jumătate din moleculă se obține prin biosinteză, iar cealaltă jumătate prin sinteză chimică. Penicilinele de semisinteză sunt diferite de cele de biosinteză, prin catenele laterale. Fungii din g. Penicillium nu sintetizează acidul 6-aminopenicilanic. Penicilinele de semisinteză se obțin din penicilina G, supusă acțiunii unei enzime, penicilin-acilaza, extrasă din E. coli. Enzima scindează catena laterală (radicalul benzil) și eliberează acidul 6-aminopenicilanic. Ulterior, pe calea sintezei chimice, gruparea aminică este acilată cu diferiți radicali și rezultă diferite peniciline de semisinteză.

Sinteza chimică

Cercetările privind posibilitatea sintezei chimice a antibioticelor -lactamice au fost stimulate în special de dificultatea metodelor de separare-purificare. Creșterea randamentului de biosinteză, odată cu utilizarea tulpinilor înalt productive (de 100 de ori mai productive decât tulpina de origine izolată de Fleming), a făcut ca metoda sintezei chimice să rămână numai de interes științific.Sinteza chimică are ca scop obținerea unor molecule analoge celor naturale, cu activitate antimicrobiană superioară, mai ieftine, fără efecte secundare asupra macroorganismului. Pe cale sintetică s-au obținut peniciline, cefalosporine peneme, carbapeneme și monobactame.

Biosinteza streptomicinei

Tulpinile înalt producătoare de streptomicină s-au obținut prin selecția tulpinilor mutante sub acțiunea radiațiilor UV și x. Mediile adecvate pentru obținerea streptomicinei de către S. griseus s-au dezvoltat empiric. S-au utilizat medii definite chimic (sintetice) și medii organice complexe. În scop industrial se folosesc mediile complexe (Eshman și colab., 1994). Sursa de C pentru sinteza streptomicinei este D-glucoza, dar pot fi folosite și alte monozaharide sau dizaharide din familia hexozelor (fructoza, galactoza, maltoza, lactoza), cu excepția zaharozei. Xiloza și manitolul sunt eficiente, iar amidonul are un randament inferior al producerii antibioticului.

Sursa de N este complexă: hidrolizatul cu tripsină al caseinei, făina de soia, hidrolizatul de porumb (corn steep), levura uscată, extractul de carne.

Concentrația fosfatului anorganic este esențială pentru sinteza antibioticului. Absența fosfatului interferă cu creșterea și cu sinteza antibioticului. Odată cu creșterea concentrației P anorganic, rata dezvoltării miceliului și a sintezei streptomicinei cresc. Peste un nivel critic al P, sinteza streptomicinei scade accentuat.

Sinteza maximă a streptomicinei de către o tulpină de S. griseus necesită surse adecvate de C și N, oxigenare abundentă și concentrații relativ scăzute de P anorganic (Distler și colab., 1957; Malmberg și colab., 1993). În dinamica procesului se sintetizează cele trei componente fosforilate. Trizaharidul se formează prin condensarea celor componente, formându-se streptomicina și P anorganic. Deoarece D-glucoza este precursorul celor 3 componente, asigurarea condițiilor care duc la creșterea cantității de glucoză și intermediari fosforilați, măresc nivelul sintezei streptomicinei.

Sursa de azot este o sare de NH4+ sau nitratul, pentru limitarea creșterii miceliului. Concentrația de fosfat anorganic este foarte mică, deoarece are efect inhibitor asupra sintezei unei enzime – streptomicin-fosfataza. Unul dintre intermediarii biosintezei streptomicinei este streptomicin-fosfatul. Temperatura de creștere este de 27 – 29o, la pH 7 – 8, cu aerare eficientă.

Procesul de biosinteză parcurge două faze:

– în prima fază, alături de streptomicină, se formează streptomicina B (manozido-streptomicina), care conține un rest de manoză legată de C4 al N-metil-L-glucozaminei, prin legătură -glicozidică. Procesul de biosinteză trebuie dirijat în sensul formării manozido-streptomicinei, mai puțin activă decât streptomicina;

– în faza a II-a, streptomicina B este hidrolizată sub acțiunea manozidazei, la streptomicină, după eliberarea manozei.

Acțiunea manozidazei este influențată de concentrația glucozei din mediu. Enzima se activează numai după ce glucoza a fost epuizată, la 32o, pH 8.

Dihidrostreptomicina este un antibiotic de semisinteză. Se obține pe cale chimică, prin hidrogenarea catalitică a streptomicinei, în cursul căreia gruparea aldehidică a streptozei se transformă în grupare alcoolică.

S-au identificat tulpini de Streptomyces, care sintetizează dihidrostreptomicina.

Hidroxistreptomicina rezultă prin oxidarea grupării metilice a streptozei. Este sintetizată de Str. griseocarnus.

Sinteza antibioticelor polipeptidice

Polimixinele sunt produse de diferite tulpini de B. polymyxa. B. colistinus produce colistina. Fiecare tulpină produce un singur polipeptid. Tulpinile producătoare de antibiotice sunt frecvent mucoide și sporogene. Compoziția mediului de cultivare, în special natura surselor de C și N, influențează profund cantitatea de antibiotic sintetizat. Mediile care favorizează creșterea optimă nu sunt cele mai bune pentru sinteza antibioticului. Polimixina A este sintetizată pe mediu reprezentat de bulionul nutritiv, suplimentat cu glucoză sau sucroză și urme de ioni de Mn. Maltoza, lactoza, rafinoza stimulează sinteza polimixinei, la fel ca și glucoza, dar sucroza este mai puțin eficientă. B. polymyxa produce cantități mari de polizaharid extracelular, o piedică importantă în calea izolării antibioticului. Sinteza polizaharidului este supresată prin adăugarea unor concentrații mai mari de sulfat de amoniu (4,2%) la mediul sintetic, dar randamentul sintezei de polimixină scade cu 50%. Producția optimă de polimixină este optimă în mediul cu 0,5% extract de levuri și sulfatul de amoniu (2%), ca sursă de azot. Sinteza polimixinei începe după ce creșterea miceliului fungic este aproape completă și continuă în faza staționară până când se produce sporularea sau liza culturii. În timpul creșterii, pH-ul mediului scade, dar când creșterea este completă, valoarea pH crește. Sinteza antibioticului începe în momentul începerii creșterii pH. Sinteza polimixinei este strâns dependentă funcțional de capacitatea de sporulare a tulpinii bacteriene. Mutantele care nu sporulează nu sintetizează antibioticul.

Sinteza poliketidelor

Aproximativ 2/3 dintre poliketidele bioactive ca produse naturale sunt sintetizate de actinobacterii. Alte organisme producătoare de poliketide sunt mixobacteriile și fungii filamentoși. Sinteza este catalizată de un aparat enzimatic complex, prin reacții de condensare repetată, ce leagă precursori carbonați cu moleculă mică (grupări acil de 2 – 3 atomi de C derivați din tioesterii CoA) (Pffeifer și Koshla, 2001; Peiru, 2005). Procesul se aseamănă în multe privințe cu sinteza acizilor grași bacterieni și mamalieni. Catena de C este asamblată din unități cu doi atomi de C, care sunt adăugați în moleculă sub forma malonil-CoA sau a analogilor săi. Acizii grași se sintetizează după același mecanism, ceea ce a condus la presupunerea că biosinteza poliketidelor este o variantă a căii de biosinteză a acizilor grași. Concluzia este că aparatul enzimatic catalizator al sintezei poliketidelor a evoluat din sintazele acizilor grași. Poliketid-sintetazele se clasifică în categoria celor de tip I sau de tip II, în funcție de asemănarea cu sintetazele acizilor grași de tip I de la vertebrate sau de tip II, ale bacteriilor și plantelor. Dar, spre deosebire de acizii grași, structurile poliketidelor sunt mult mai diversificate datorită variațiilor structurale ale acizilor grași și modificărilor ulterioare prin glicozilare.

Biosinteza acizilor grași este catalizată de un sistem enzimatic cunoscut sub denumirea de sintaza acizilor grași. Rolul de starter al sintezei îl are unitatea acetil, care este transferată de o acetil-transferază din acetil-CoA, la grupul thiol al unei proteine purtătoare de acil (PPA) și apoi pe grupul thiol al ketoacil-sintazei. Unitatea de alungire a catenei este malonatul, care este transferat de la malonil-CoA, pe gruparea thiol a proteinei purtătoare de acil. Ketoacil-sintaza catalizează condensarea celor două resturi acide, cu eliminarea CO2, pentru a rezulta un rest ketoacil pe gruparea thiol a PPA.

Mecanismul sintezei acizilor grași și al poliketidelor a fost studiat utilizând diferiți precursori marcați cu izotopul C13, la un organism producător de antracicline. Casey (1978) și ulterior Kitamura (1981) au detectat pe cale autoradiografică, încorporarea izotopului C13 în atomii specifici ai agliconului antraciclinelor.

Ketoreductaza reduce gruparea keto la gruparea OH. O dehidratază scoate apa și produce o dublă legătură, redusă ulterior de o enzimă cu NADPH la un lanț de C saturat. După ce grupul acil alungit cu doi atomi de C este transferat pe grupul thiol al ketoacil-sintazei, ciclul se repetă, începând cu reacția de transfer a grupului acil.

Când catena acidului gras a atins lungimea predeterminată, este detașată de complexul keto-acil-sintazei, de o tioesterază. Astfel rezultă acidul gras liber.

Asemănător sistemului enzimatic care catalizează sinteza acizilor grași, biosinteza poliketidelor este catalizată poliketid-sintază.

Poliketidele complexe, de exemplu macrolidele, au poliketid-sintaze specifice pentru fiecare subunitate poliketidică a moleculei. Poliketid-sintazele sunt polipeptide multifuncționale, analoge sintazelor acizilor grași de tip I. Secvența aminoacizilor și a nucleotidelor ADN codificator al diferitelor enzime esențiale sunt bine conservate la diferite specii. Poliketid-sintazele sunt sisteme multienzimatice citosolice, care nu necesită nici un organit pentru menținerea activității in vitro. Ele utilizează un spectru larg de substraturi: acetil-CoA, propionil-CoA, izobutiril-CoA, izovaleril-CoA, malonil-CoA, metilmalonil-CoA, etilmalonil-CoA, propionilmalonil-CoA și hidroximalonil-CoA. Când substraturile sunt chirale (chiralitatea este proprietatea a două corpuri de a se comporta ca un obiect și imaginea sa în oglindă, adică cele două corpuri nu sunt direct superpozabile prin translație în același plan, ci numai după o rotație cu 180o) (ca metilmalonil-CoA), acil-transferazele corespunzătoare au stereospecificitate strictă. Substraturile -carboxilate (de exemplu, malonil-CoA și metilmalonil-CoA) sunt surse de unități de extensie, iar substraturile neutre ca acetil-CoA sunt surse de unități primer pentru sinteza lanțului poliketidic.

Intermediarul a cărui sinteză este rezultatul acțiunii poliketid-sintetazelor, pentru a furniza produsul final natural, necesită activitatea unor enzime care-l modifică: ciclaze, transferaze (N-metil-transferaze, glicozil-transferaze, acil-transferaze), oxidoreductaze dependente de NADP(H) sau FAD(H) și citocromi.

Deși sinteza poliketidelor are loc după un mecanism foarte asemănător cu acela al acizilor grași, primele prezintă o variație structurală accentuată a moleculelor, care survine la diferitele trepte ale sintezei:

a) Unitatea ’’starter’’ a biosintezei catenei poliketidelor este variabilă. În biosinteza acizilor grași, unitatea de start a sintezei este acetil-CoA. În cazul poliketidelor, sinteza poate fi inițiată de propionil-CoA.

b) Variația unității de extindere. În biosinteza acizilor grași, catena de C este totdeauna extinsă cu unități derivate din malonil-CoA, iar la poliketide extinderea catenei se face prin încorporarea unităților propionat din metil malonil-CoA și a unităților butiril din etil malonil-CoA. Ultimele dau naștere catenelor laterale de metil și respectiv etil ale catenei și introduc un centru de chiralitate.

c) Variația numărului unităților de ketide ale catenei. De obicei, lungimea catenei la acizii grași variază între 6 – 12 unități acetil (acizii grași au 12 – 24 atomi de C). La poliketide, numărul obișnuit de unități ketidice este cuprins între 3 și 10, dar poate ajunge la 25.

d) Variațiile reacțiilor care produc alungirea catenei. În biosinteza acizilor grași, fiecare reacție de adăugare a unei unități acetat este urmată de reducerea grupării carbonil la hidroxil, deshidratare în urma căreia se formează o legătură dublă -C=C-, iar în final o a doua reacție de reducere pentru a rezulta unitatea saturată C2. La poliketide, oricare dintre cele trei reacții, dar și cele care urmează, pot fi omise, rezultând o grupare funcțională carbonil, hidroxil sau enoil a catenei de C.

e) Variația reacțiilor care urmează biosintezei catenei de C. Acizii grași sunt cuplați cu derivații glicerolului și sfingozinei pentru a produce diferite lipide. În sinteza poliketidelor, soarta catenei de C este mai variată: poate fi ciclizată și formează compuși aromatici, ca de exemplu antraciclinele și tetraciclina sau poate fi lactonizată pentru a forma macrolide. Lactonele sunt esteri intramoleculari, care au gruparea carbonil (C=O) și se formează prin eliminarea unei molecule de H2O între gruparea –OH și –COOH a hidroxiacizilor. Noile grupări funcționale (carbonil, hidroxil sau enoil) pot fi introduse de enzime specifice (de exemplu gruparea OH 1 și 11 a antraciclinelor). La unele poliketide, grupările OH sunt glicozilate, ceea ce amplifică diversitatea structurală a poliketidelor.

Metodele de ameliorare a producției de antibiotice

Producția de antibiotice se găsește în impas, datorită fenomenelor de rezistență multiplă, întâlnite frecvent la bacterii. Din această cauză se preconizează obținerea unor antibiotice noi prin tehnica fuziunii de protoplaști bacterieni sau fungici. Cele două tulpini celulare (bacteriene, respectiv fungice) supuse procedeului fuziunii, trebuie să facă sinteza a două antibiotice diferite, din aceiași familie. Prin cuplarea artificială a celor două căi de biosinteză poate să rezulte un nou antibiotic (un antibiotic hibrid).

Fuziunea protoplaștilor se poate utiliza în scopul creșterii randamentului producției de antibiotice. Se procedează la fuziunea protoplaștilor unei tulpini bacteriene înalt producătoare, care crește încet sau este pretențioasă la condițiile de creștere, cu o linie bacteriană care face sinteza antibioticelor cu o rată inferioară, dar se dezvoltă repede și nu are exigențe nutritive deosebite. Prin fuziune rezultă organisme care cumulează proprietăți noi, convenabile atât în ceea ce privește producția de antibiotice, cât și exigențele nutritive.

O altă modalitate de creștere a ratei de sinteză a antibioticelor este amplificarea genică. Genele codificatoare ale sintezei antibioticelor sunt cromosomale și extracromosomale (plasmidiale) (Recchia și Hall, 1995). Numărul plasmidelor per celulă este variabil în funcție de tipul de control pe care celula îl exercită: un control riguros are ca efect existența unui număr mic de plasmide în celula (1- 5 copii); un control relaxat permite creșterea numărului de copii plasmidiale per celulă (50-l00). În aceste condiții, dacă genele codificatoare ale sintezei antibioticului sunt plasmidiale, randamentul sintezei crește foarte mult.

Transferul genelor codificatoare ale sintezei unui antibiotic, prin tehnologia ADN recombinant, pare a nu fi realizabil, deoarece genele sunt dispersate. De aceea, s-a recurs la un artificiu: se încearcă mărirea producției de antibiotic prin grefarea unor gene promotor foarte eficiente, care să grăbească intrarea în acțiune a operonului codificator.

O altă cale pentru ameliorarea producerii de antibiotice este biosinteza mutațională sau mutasinteza. Principiul metodologic este următorul: sinteza unui antibiotic se desfășoară pornind de la un produs inițial, prin etape intermediare, până la sinteza produsului final. În această tehnologie se folosesc microorganisme mutante, cu incapacitatea de a face sinteza unui produs, aproape de capătul lanțului de sinteză. Dacă în mediul de creștere se adaugă compusul natural, microorganismul produce antibioticul natural. Dacă în mediul de creștere se adaugă un alt compus, nenatural (de sinteza chimică), celulele încorporează acest produs chimic nou și sinteza este orientată în funcție de natura produsului care a fost furnizat. Această tehnică s-a denumit biosinteza mutațională.

Pentru producerea antibioticelor noi, industria de biosinteză a utilizat două căi majore:

– prin procedee de mutageneză s-a urmărit selecția unor tulpini înalt producătoare. Pe această cale, randamentul biosintezei de antibiotice s-a ameliorat permanent. Procedeul este foarte laborios, deoarece mutageneza este o metoda oarbă, ce presupune testarea a mii și mii de tulpini celulare, după iradiere cu raze UV, X sau după tratamentul cu substanțe chimice mutagene (azotiperita). Această metodă este tipică pentru producerea penicilinei, cu tulpini mutante de P. Chrysogenum (Eishmahan, 1991). Randamentul tulpinilor actuale, obținute prin mutageneză cu radiații gamma (Co6o) este de mii de ori superior față de al tulpinii originale;

– producerea de antibiotice cu un oarecare grad de modificare chimică, prin procedeul semisintezei.

Metoda constă în grefarea unui radical chimic, pe o moleculă de antibiotic, produsă pe o cale naturală.

4.3. Clasificarea antibioticelor în funcție de structura chimică

Din punct de vedere chimic, antibioticele sunt un grup de substanțe foarte heterogene (Bayarski, 2006). Se disting următoarele categorii:

Antibioticele -lactamice constituie unul dintre cele mai mari și importante grupe de antibiotice. Toate cuprind în structura lor, inelul β-lactamic și sunt foarte diverse: penicilinele, cefalosporinele și cefamicinele.

Molecula nativă (benzil-peniclina sau peniclina G) este alcătuită din inelul β-lactamic și inelul tiazolidinic. La C6 este atașat grupul fenil-acetamido (tabelul 3).

La cefalosporine, inelul tiazolidinic are un atom de C suplimentar, cu o legătură nesaturată între C3 și C4 și rezultă o structură denumită cefem.

Cefamicinele sunt similare ca structură chimică, dar inelul β-lactamic conține un grup metoxi, care îi conferă stabilitate la multe enzime β-lactamazice.

Alte variante structurale ale compușilor β-lactamici utilizați în clinică sunt: carbapenem (Imipenem, Meropenem), carbacefem, oxacefem, clavam (acid clavulanic), sulfone, monobactam.

Penicilinele semisintetice se obțin din acidul 6-aminopenicilanic, care se condensează cu orice acid carboxilic. Rezultă astfel un număr mare de peniciline: oxacilina și derivații săi, meticilina, ampicilina, amoxicilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina.

Acidul 6-aminopenicilanic, pentru penicilinele semisintetice, se obține prin tratamentul penicilinei cu o amidază sau prin cultivarea organismului producător, într-un mediu fără donorul grupării acil.

Acidul 6-aminopenicilanic este un dipeptid ciclic, format prin condensarea L-cisteinei și D-valinei și de aceea penicilinele, cefalosporina și cloramfenicolul aparțin grupului antibioticelor oligopeptidice.

Cloramfenicolul este un antibiotic simplu, sintetizat de Streptomyces, dar în cea mai mare parte se obține prin sinteză chimică. Are un spectru larg de acțiune: bacteriile Gram pozitive și Gram negative, dar și bacteriile parazite obligat intracelulare (chlamidii, rickettsii).

Cloramfenicolul conține o grupare nitro și un grup diclor-acetil. El se leagă de subunitatea ribosomală mare și blochează transferul peptidil, la ribosomii care alungesc catena.

Antibiotice polipeptidice: bacitracina (produsă de B. subtilis), gramicidina (sintetizată de B. brevis), cicloserina (produsă de Streptomyces), actinomicina, polimixina (sintetizată de B. polymyxa).

Bacitracina este un peptid ciclic (tabelul 3) ce împiedică defosforilarea purtătorului lipidic ce transferă noul peptidoglican, prin membrana celulei, în timpul sintezei peretelui celular. Bacitracina derivă dintr-o proteină a celulei vegetative, care este degradată parțial în timpul sporulării. Este toxică pentru a fi aplicată sistemic, dar se găsește sub forma unor preparate pentru aplicații locale.

Polimixinele sunt o familie de antibiotice produse de specii de Bacillus. O parte a polipeptidului are o configurație ciclică, cu o “coadă” hidrofobă de acid octanoic (tabelul 4). În clinică se folosesc polimixina B și polimixina E (colistina), precum și derivații lor sulfometilați. Polimixinele sulfometilate au activitate antibacteriană redusă, dar se clivează spontan și rezultă compuși mai activi.

Tyrocidina și gramicidina S sunt polipeptide ciclice (tabelul 4). Ele produc dezorganizarea membranei, rezultatul fiind pierderea moleculelor mici și liza protoplaștilor. Nu se folosesc pentru administrare sistemică, deoarece sunt toxice.

Antibioticele aminoglicozidice a căror denumire se termină cu “mycin” sunt produse de sinteză ale unor specii ale genului Streptomyces, iar cele care se termină cu “micin” sunt sintetizate de tulpini de Micromonospora. Toate aminoglicozidele au un inel format din 6 unități, cu grupări amino și de aici derivă denumirea de aminociclitol. Molecula lor polară, policationică, conține un aminociclitol (tabelul 5), de care se leagă două sau mai multe glucide, dintre care cel puțin unul este aminat. La streptomicină, aminociclitolul este diguanidin-inozitolul (streptidina). Majoritatea aminoglicozidelor au grupul aminociclitol reprezentat de deoxistreptamină. Ele se împart în derivați ai neomicinei, kanamicinei și gentamicinei.

Aminoglicozidele sunt active față de numeroase bacterii patogene Gram pozitive și Gram negative, dar și față de M. tuberculosis. Legarea unei singure molecule este suficientă pentru inactivarea ribosomului bacterian. Aceste antibiotice nu traversează ușor membranele celulare. Se absorb cu dificultate din intestin, dar pentru modificarea microbiotei intestinale, administrarea orală este calea optimă. Sunt ineficiente față de bacteriile cu localizare intracelulară. Anaerobia și prezența cationilor bivalenți diminuează eficiența aminoglicozidelor. Se administrează numai în cazul infecțiilor severe (tuberculoza, bruceloza, tularemie, plaga bubonică). Sunt sinergice cu antibioticele β-lactamice și se folosesc în septicemiile cu bacterii Gram negative. Pentru a-și exercita efectul bactericid, aminoglicozidele necesită sinteza proteică.

Antibioticele poliketide (acetogenine) sunt substanțe naturale derivate din acizi poli-β-cetonici, care la rândul lor se formează din acetil-CoA și mai multe molecule de malonil-CoA, după decarboxilare: griseofulvina (produsă de Penicillium patulum), tetraciclina (sintetizată de Streptomyces).

Tetraciclinele sunt un grup de substanțe naturale sau de semisinteză, a căror formulă cuprinde un nucleu tetraciclic linear fuzionat (tabelul 5), de care se atașează o varietate de grupări funcționale: clor-tetraciclina (produsă de Streptomyces aureofaciens), oxitetraciclina (produsă de S. rimosus).

Sunt cel mai important grup de antibiotice, datorită spectrului antibacterian foarte larg. Sunt active față de bacteriile Gram pozitive și Gram negative, față de protozoarele parazite (Entamoeba), față de chlamidii, micoplasme și ricketsii. Acționează prin inhibiția sintezei proteinelor, deoarece inhibă atașarea aminoacil-ARNt la situsul acceptor ribosomal. Sunt larg utilizate în terapia antiinfecțioasă umană și animală, deoarece nu produc colaterale majore. Se adaugă ca supliment în furaje în doze subterapeutice, pentru stimularea creșterii.

Antibioticele macrolide. Denumirea de “macrolid” desemnează o structură chimică caracterizată prin prezența unui ciclu lactonic cu complexitate variabilă, la care se atașează componenta glucidică (tabelul 5). Ciclul lactonic rezultă prin închiderea unui lanț lung de acizi grași hidroxilați. Antibioticele macrolide sunt foarte diverse, datorită atât variației inelului macrolidic, cât și a complexului glucidic. Cele mai cunoscute sunt eritromicina și oleandomicina.

Antibioticele steroidice au o structură chimică asemănătoare colesterolului. Acidul fusidic (fusidina) este produs de fungii filamentoși din g. Fusarium. Este activ prin legarea de factorul de elongație G (EFG).

Antibioticele polienice se caracterizează prin prezența, în molecula lor, a unui anumit număr de legături duble: nistatina, amfotericina B, candicidina (produse de membri ai g. Streptomyces), iar fumigalina este sintetizată de Aspergillus fumigatus.

Antibiotice glicopeptidice. În clinică se folosesc două glicopeptide: vancomicina și teicoplanina. Vancomicina este o moleculă mare, complexă, produsă de Streptomyces orientalis (tabelul 3). Utilizarea ei este limitată, datorită toxicității asupra rinichiului. Vancomicina este un heptapeptid rezultat din aminoacizi aromatici modificați și condensați într-o structură triciclică, de care se atașează un dizaharid. Activitatea sa antimicrobiană se datorează legării la catenele laterale de D-alanil-D-alanil ale peptidoglicanului, blocând formarea legăturilor încrucișate ale catenei polipeptidice și este limitată, în esență, la bacteriile Gram pozitive, deoarece, la bacteriile Gram negative mureina acoperită de membrana externă, nu este accesibilă antibioticelor glicopeptidice.

4.4. Clasificarea antibioticelor în funcție de mecanismele de acțiune

Antibioticele au acțiune selectivă: ele nu produc leziuni asupra celulelor organismelor superioare, dar inhibă creșterea sau omoară agentul infecțios. Selectivitatea acțiunii este o condiție ideală, pentru că, de exemplu, penicilina produce o stare alergică, independentă de acțiunea antibacteriană și implică o altă parte a moleculei decât cea efectoare a acțiunii antibacteriene. Unele antibiotice produc efecte toxice nete la om și animale și folosirea lor este limitată pentru tratamentul infecțiilor la care riscul administrării este mai mic decât consecințele procesului infecțios. Antibioticele își datorează acțiunea selectivă, reactivității lor chimice mai înalte sau exclusive față de unele componente ale celulei bacteriene sau fungice, în raport cu celulele umane și animale. Sensibilitatea diferitelor organisme la antibiotice, ca și la agenții chimioterapeutici, variază în limite largi. De obicei, bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile, deoarece peretele mureinic este o barieră mai permeabilă pentru moleculele de antibiotic și în plus, sinteza mureinei este o țintă importantă pentru acțiunea unor antibiotice. Bacteriile Gram negative sunt mai puțin sensibile, deoarece membrana externă este hidrofobă, iar moleculele de LPS stabilizate de ionii bivalenți formează o structură densă, greu permeabilă.

Antibioticele se clasifică în funcție de spectrul de activitate, adică de diversitatea microorganismelor asupra cărora acționează:

– antibiotice cu spectru restrâns de activitate, față de bacteriile Gram negative: de exemplu, penicilina G este activă față de cocii Gram pozitivi;

– antibiotice cu spectru intermediar de activitate: sunt active față de bacteriile Gram pozitive, dar și față de unele bacterii Gram negative: streptomicina, neomicina, gentamicina, kanamicina, cefalosporina;

– antibiotice cu spectru larg, active față de bacteriile Gram pozitive și Gram negative: tetraciclina, cloramfenicolul;

– antibiotice antifungice, active față de infecțiile fungice superficiale (de exemplu, griseofulvina) sau față de infecțiile profunde (amfotericina). Nistatinul (stamicin) este activ față de infecțiile tegumentului și ale epiteliilor mucoaselor digestive și vaginale, produse de Candida.

Antibioticele active asupra bacteriilor Gram pozitive și Gram negative sunt de spectru larg. Acestea au o utilitate clinică mai largă decât cele active față de un singur grup de microorganisme, denumite antibiotice cu spectru îngust. Ultimele se folosesc pentru controlul infecțiilor care nu răspund la alte antibiotice. De exemplu, vancomicina (un glicopeptid) este activă față de bacteriile din g. Staphylococcus, Bacillus și Clostridium. În unele cazuri, antibioticele interacționează cu molecule caracteristice microorganismelor și de aceea indexul lor terapeutic este foarte înalt. De exemplu, penicilina este activă față de sinteza mureinei, componenta specifică a peretelui bacterian. Penicilina reacționează și cu moleculele proprii organismului uman și animal, la concentrații de câteva mii de ori mai mari decât cele necesare pentru a omorî bacteriile.

Majoritatea antibioticelor sunt bacteriostatice sau bactericide. Efectul bacteriostatic semnifică inhibiția reversibilă a creșterii, iar cel bactericid are semnificația unei acțiuni letale ireversibile. Excepție fac griseofulvina și antibioticele polienice, care sunt antifungice.

Mecanismele de acțiune a antibioticelor sunt diferite, consecință a diversității structurii lor moleculare (fig. 22). Cele mai multe sunt molecule complexe, cu regiuni hidrofobe, ce ușurează difuzia în celule. Cea mai simplă modalitate de a le clasifica, este în funcție de situsul de acțiune în celula bacteriană:

– antibiotice ce acționează asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular (penicilina, cefalosporina, bacitracina, cicloserina, fosfomicina);

– antibiotice active asupra sintezei proteinelor bacteriene (aminoglicozide, cloramfenicol, tetraciclina, macrolide, streptogramina);

– antibiotice active asupra sintezei acizilor nucleici (rifamicina, novobiocina);

– antibiotice active asupra membranei celulare (polimixina, gramicidina, tirocidina, valinomicina, monensina – ultimele două nefolosite în clinica umană).

În celulă, inhibiția unui proces poate duce la inhibiția sau la stimularea indirectă a altor procese, prin alterarea sistemelor feed-back sau a altor mecanisme de control. De aceea, nu se pot trage concluzii ferme din studiul efectelor unui antibiotic asupra unui singur proces celular.

Figura 22. Ilustrarea schematică a situsurilor majore ale acțiunii antibioticelor (dupa Dale, 1998).

Antibiotice care inhibă sinteza peretelui celular

Peretele acoperă membrana citoplasmatică, conferă forma specifică și rigiditate celulei bacteriene, asigură menținerea integrității structurale. Structura chimică unică a peretelui bacterian condiționează sensibilitatea lui la câteva grupe de antibiotice, care includ -lactamii (peniciline, cefalosporine, carbapenemi și monobactami), acidul clavulanic (un inhibitor al -lactamazelor), antibioticele glicopeptidice (vancomicina, teicoplanina și avoparcina – stimulator al creșterii animalelor). Sunt de asemenea active asupra peretelui, fosfomicina și cicloserina, deși acestea sunt active asupra căii metabolice a sintezei monomerilor peretelui celular.

La bacteriile Gram-negative stratul peptidoglicanic este foarte subțire și este acoperit de membrana externă, care reprezintă o barieră importantă de permeabilitate, în special față de pătrunderea antibioticelor (fig. 23).

Figura 23. Reprezentarea schematică a membranei externe a bacteriilor Gram negative (E. coli) (dupa Davis, 1990).

Sinteza peretelui celular este inhibată de antibioticele -lactamice (peniciline, cefalosporine), inhibitoare ale polimerizării peptidoglicanului și de vancomicină (tabelul 3).

Tabelul 3.

Antibiotice inhibitoare ale sintezei peretelui bacterian (adaptare după Topley si Wilson’s, 1998).

Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde un număr mare de molecule, reprezentantul cel mai vechi fiind penicilina G; ele se pot clasifica în patru grupe:

– peniciline

– cefalosporine

– carbapeneme

– monobactami.

Antibioticele β-lactamice inhibă ultima etapă a sintezei peptidoglicanului, adică formarea punților interpeptidice. Acești compuși prezintă o analogie structurală cu dipeptidul terminal D – ala – D – ala, care face parte din pentapeptidul mureinic.

Problema funcției fiecărei proteine care leagă penicilina (PBP – Penicillin Binding Proteine) a fost studiată în detaliu E. coli. La această specie s-au identificat patru PBP cu greutate moleculară mare (PBP 1a, 1b, 2 și 3), cu rol de enzime bifuncționale: catalizează transpeptidarea și transglicozilarea peptidoglicanilor.

Antibioticele β-lactamice interferă cu reacția finală de transpeptidare, ce formează legăturile transversale între catenele adiacente de peptidoglican, cele care conferă rigiditatea structurii parietale.

Antibioticele β-lactamice sunt bactericide, dar mecanismul acțiunii lor este diferit, asupra bacteriilor Gram pozitive și Gram negative.

Bacteriile produc 4 tipuri de proteine care leagă penicilina (PBP), asemănătoare serin-proteazelor. Unele catalizează reacțiile de transpeptidare (formarea legăturilor încrucișate în peptidoglican) și de carboxipeptidare (modificarea peptidoglicanului) ale asamblării peretelui celular. PBP, după legarea penicilinei, transmit un semnal transmembranar pentru inducerea sintezei β-lactamazelor.

Beta-lactamazele sunt PBP ce catalizează hidroliza inelului β-lactamic și inactivarea antibioticului.

PBP sunt proteine legate de membrană (1% din totalul proteinelor de membrană), esențiale pentru viabilitatea celulei, cu excepția β-lactamazelor care pot fi legate de membrană sau secretate. Antibioticele β-lactamice se leagă covalent cu PBP prin acilarea restului de serină din situsul activ. La bacteriile Gram pozitive, antibioticele β-lactamice difuzează liber spre PBP. La bacteriile Gram negative, porinele membranei externe limitează pătrunderea antibioticelor în celulă, care se acumulează în spațiul periplasmic. Când concentrația devine eficientă, antibioticele sunt legate de PBP de pe suprafața externă a membranei celulare.

Rezistența se manifestă atunci când concentrația antibioticului în periplasmă este mai mică decât cea necesară pentru legarea și inhibiția activității PBP.

În absența sintezei mureinei, celulele lipsite de perete celular suferă fenomenul lizei osmotice. La cocii Gram pozitivi, antibioticele β-lactamice determină pierderea acizilor lipoteichoici parietali. Absența lor elimină controlul procesului autocatalitic, care în mod normal este limitat și dezagregă peptidoglicanul la situsuri strict localizate.

Antibioticele -lactamice sunt active numai asupra celulelor bacteriene tinere, aflate în faza de creștere. Penicilina poate fi administrată în doze mari față de cele terapeutice, singurul risc fiind manifestările alergice. Administrată oral, este degradată în cea mai mare parte, de HCl din stomac. De aceea se injectează intramuscular sau intravenos. Se absoarbe rapid în sânge și este excretată rapid. Din acest motiv se asociază cu procaina, care diminuă excreția și îi prelungește acțiunea.

Penicilina G se folosește pentru tratamentul infecțiilor cu streptococi, meningococi, pneumococi, spirochete, bacili aerobi Gram pozitivi, Clostridium. Iși păstrează activitatea în urină și se folosește pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar.

Carbapenemii reprezintă un grup de antibiotice cu efect bactericid, ce conțin un antibiotic β-lactamic și un compus ce împiedică degradarea medicamentului în rinichi.

Bacitracina (un peptid ciclic) împiedică defosforilarea moleculei lipidice purtătoare, ce transferă molecula de peptidoglican nou sintetizată, prin membrana celulei, în timpul sintezei peretelui celular. Este toxică pentru rinichi și de aceea nu se administrează sistemic, dar se aplică local pentru tratamentul leziunilor tegumentare și ale membranelor mucoase.

Mecanismul acțiunii vancomicinei constă în blocarea creșterii celulei, deoarece formează un complex cu D-ala-D-ala din peptidul mureinic. Este activă numai față de multe bacterii Gram pozitive, pentru că la Gram negative, peptidoglicanul nu este accesibil antibioticului. Nu selecționează mutante rezistente. Cocii Gram pozitivi (Leuconostoc) și Lactobacillus sunt rezistente pentru că lanțul lateral al peptidoglicanului constă din D-alanil-D-lactat, care are afinitate mai mică pentru antibioticele glicopeptidice.

Cicloserina inhibă competitiv formarea D-ala din L-ala și astfel stopează sinteza dipeptidului D-ala-D-ala. Este relativ toxică și se folosește pentru tratamentul infecțiilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte medicamente.

Fosfomicina este un inhibitor al piruvil-transferazei și astfel blochează sinteza acidului N-acetil-muramic.

Cicloserina și fosfomicina se comportă ca analogi ai precursorilor peptidoglicanului. Sunt molecule foarte hidrofile și pătrund în citoplasmă pe calea sistemelor de transport pentru metaboliții înrudiți: fosfomicina este anologă structural cu fosfo-enol-piruvatul, iar cicloserina este analogă D-alaninei:

Structura moleculară a fosfo-enol-piruvatului

Structura moleculară a D-Cicloserinei Structura moleculară a D-Alaninei

Alanina este un compus major al peptidoglicanului și al acizilor teichoici din peretele celulelor bacteriene Gram pozitive. O parte a alaninei parietale se găsește ca izomer D. Prezența D-aminoacizilor (D-ala, acidul D-glutamic) în peretele bacteriilor infecțioase este considerată ca un mecanism protector față de mediul intern al organismului gazdă. Compușii analogi ai D-aminoacizilor au activitate antibacteriană. Antagoniștii D-alaninei (D-cicloserina și O-carbamil-D-serina) inhibă selectiv încorporarea D-alaninei în peptidoglican. D-alanina rezultă din L-alanină sub acțiunea racemazei. Incorporarea D-alaninei este catalizată de D-ala-D-ala ligază. Creșterea E. coli în prezența D-cicloserinei și a sucrozei 0,32 M duce la formarea sferoplaștilor, iar în celulă se acumulează precursorii parietali. Sinteza proteinelor celulare nu este modificată.

Adăugarea D-alaninei în mediul de creștere reversează efectele inhibitorii ale D-cicloserinei.

D-cicloserina are două grupări ionizabile. Este un antibiotic cu spectru larg de activitate, dar este mai eficient față de bacteriile Gram pozitive decât față de cele Gram negative. Este foarte important că D-cicloserina inhibă creșterea M. tuberculosis.

O-carbamil-D-serina izolată dintr-o tulpină de Streptomyces are același mecanism de acțiune: activitatea antibacteriană este reversată de D-alanină.

Antibiotice antiribosomale (inhibitoare ale sintezei proteinelor)

Sinteza proteinelor implică 3 procese de recunoaștere macromoleculară: selecția ARNt inițiator; selecția codonului inițiator pe ARNm; interacția ARNm și ARNt inițiator cu ribosomul neangajat în sinteza proteinelor.

Primul eveniment al inițierii este legarea subunității 30S de codonul inițiator al ARNm și formarea complexului de inițiere. La procariote, inițierea sintzei proteinelor se face prin legarea N-formil-metionil-ARNt. După legarea în polipeptid, N-f-Met este clivată sub acțiunea peptidazelor. f-Met-ARNt inițiator ocupă situsul ribosomal peptidil (P). Al doillea complex aa-ARNt, ca și toate cele care urmează, se leagă la nivelul situsului acceptor (A), unde are loc interacțiunea dintre codonul ce specifică aminoacidul următor și anticodonul din secvența ARNt.

Formarea legăturii peptidice între gruparea COOH a f-Met-ARNt legat la situsul P și gruparea NH2 liberă a aminoacidului din situsul A, este catalizată de enzima peptidil-transferază, componentă a subunității 50S. Se formează un dipeptid legat la situsul A, în timp ce ARNt din situsul P este descărcat de aminoacidul corespunzător (fig. 24). Creșterea polipeptidului cu un aminoacid se face prin clivarea acestuia de la ARNt situat în situsul P și legarea la aminoacidul din situsul A. Reacția de clivare-reunire (adică de formare a legăturii peptidice) consumă energie eliberată prin hidroliza GTP. La sfarșitul reacției, situsul A poartă ARNt al celui de al doilea aminoacid, de care este legat un dipeptid (f-Met și al doilea aminoacid legat – o moleculă de peptidil-ARNt).

Figura 24. Ilustrarea schematica a mecanismului sintezei proteinelor. Amănunte în text. (după Dale, 1998).

Situsul P, foarte apropiat de situsul A, acceptă complexul ARNt-peptidil (ARNt legat cu lanțul polipeptidic în curs de biosinteză). Translocația ARNt la situsul P este însoțită de deplasarea coordonată a ribosomului de-a lungul secvenței de ARNm, cu distanța egală cu un codon. Astfel, un alt codon este plasat în situsul A, care leagă un alt aminoacil-ARNt, pe baza relației specifice codon-anticodon.

Figura 25. Situsurile de acțiune a antibioticelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Quinolonele inhibă replicarea ADN. Rifampicina inhibă transcrierea. Tetraciclinele inhibă traducerea prin blocarea formării complexului de inițiere. Aminoglicozidele ocupă situsul acceptor al ribosomului și induc erori de citire a ARNm. Cloramfenicolul interacționează cu ARNr 23S al subunității ribosomale 50S și inhibă formarea legăturii peptidice. Eritromicina și clindamicina se leagă la subunitatea 50S și interferă cu procesul de translocație a peptidului nascent, de la situsul acceptor (A), la situsul peptidil (P) (după Dale, 1998).

Unele antibiotice acționează selectiv asupra ribosomilor celulei procariote. Altele (de exemplu, cicloheximida) sunt active față de ribosomii celulelor eucariote, iar o altă categorie sunt active față de ambele tipuri de ribosomi. Unele sunt active asupra ribosomilor polisomali (puromicina, cloramfenicolul), iar altele blochează numai ribosomii liberi, de inițiere a catenei polipeptidice, pentru că situsurile lor de legare sunt restrictive și nu se pot asocia cu ribosomii polisomali (de exemplu, eritromicina). Unele antibiotice se leagă de subunitatea ribosomală mică, iar altele se asociază cu subunitatea ribosomală mare (fig. 25).

Antibioticele cu acțiune asupra ribosomilor sunt molecule complexe, adeseori având cicluri și grupări cationice, care favorizează interacțiunile ionice cu ARNr. Spre deosebire de antibioticele care blochează sinteza mureinei la nivelul suprafeței externe a membranei citoplasmatice, cele care acționează la nivelul ribosomilor trebuie să pătrundă în citoplasmă.

Din punct de vedere chimic, majoritatea sunt aminoglicozide policationice, cu molecule polare. Ele au o regiune hidrofobă mare, care ușurează difuzia prin stratul lipidic al membranei.

Aminoglicozidele (streptomicina și kanamicina) au activitate bactericidă dependentă de concentrație. Sunt foarte solubile în apă și insolubile în solvenții organici și de aceea au o capacitate limitată de a traversa membranele lipidice. Aminoglicozidele cationice interacționează chimic cu antibioticele β-lactamice. Rezultatul este deschiderea inelului β-lactamic și acilarea grupului amino al aminoglicozidei, cu pierderea reciprocă a activității antibacteriene. Aminoglicozidele interacționează ionic cu suprafața externă a celulei și sunt transportate în celulă. Sursa energiei este gradientul electrochimic al protonilor generați în procesul respirației. Cele cationice se leagă de resturile încărcate negativ ale LPS și de proteinele anionice ale membranei externe și înlocuiesc competitiv Mg2+ și Ca2+ care consolidează LPS adiacente. Ele modifică conformația subunității 30S a ribosomului polisomal, astfel încât crește rata erorilor de împerechere a codonilor cu anticodonii. Mesajul este tradus greșit și se sintetizează proteine nefuncționale. Aminoglicozidele sunt active și față de ribosomii liberi: asocierea antibioticului cu ribosomul liber blochează interacțiunea acestuia cu ARNm (se blochează astfel formarea complexului de inițiere). Sensibilitatea la Str este dependentă de subunitatea 30 S, pentru că ribosomii hibrizi formați din subunități 30 S de la o tulpină Str rezistentă și subunități 50 S de la o tulpină Str sensibilă, sunt Str rezistenți. Sensibilitatea la streptomicină este determinată de proteina S12. Streptomicina face ca ribosomul să citească greșit ARNm și să insere greșit aminoacidul. Ribosomul normal încorporează fenil-alanina, ca răspuns la mesajul sintetic poli-U, dar streptomicina stimulează intens încorporarea izoleucinei, a serinei și leucinei ca răspuns la mesajul poli-U. Schimbarea mutațională a unui singur aminoacid într-o proteină a subunității ribosomale 30S determină rezistența celulei la streptomicină, dar nu și la antibioticele care conțin deoxistreptamina ca grup lateral atașat heterociclului complex, deoarece ele se asociază cu ambele subunități ribosomale.

Macrolidele (eritromicina, lincomicina și clindamicina) penetrează greu în celula Gram negativă. Se asociază cu ribosomii liberi, dar nu cu ribosomii polisomali. Se leagă cu subunitatea 50 S și interferă cu procesul de translocație a polipeptidului nascent, producând disocierea peptidil-ARNt de ribosom. Deși unele antibiotice care interacționează cu ribosomii liberi blochează complexul de inițiere, eritromicina stopează sinteza proteică numai după ce s-a sintetizat un polipeptid scurt.

Unele antibiotice policiclice mari se leagă cu subunitatea mare a ribosomului și blochează legarea factorilor de elongație EFTu (Elongation Factor Thermo unstable) și EFG (Elongation Factor G, implicat în translocația peptidului nascent).

Acidul fusidic este bacteriostatic, dar la concentrații mari poate fi bactericid. Are o structură moleculară de tip steroidic. Spre deosebire de alți inhibitori ai sintezei proteice, nu se leagă direct de ribosomi, ci formează un complex stabil cu guanozin-trifosfatul și cu factorul de elongație G. Sinteza proteică bacteriană depinde de translocația peptidil-ARNt de la situsul acceptor ribosomal, la situsul peptidil. Translocația necesită factorul G de alungire proteică și hidroliza GTP. Acidul fusidic are capacitatea de a stabiliza complexul ribosom-factorul G de alungire – GTP – fosfat anorganic, inhibând hidroliza GTP și blocând alungirea catenei polipeptidice nascente.

Puromicina a fost izolată din filtratele de Streptomyces alboniger. Antibioticul este un aminoglicozid substituit, alcătuit din 3 componente :

– 6-dimetil-aminopurina

– 3-deoxi-3-amino-D-riboza

– p-metoxi-L-fenilalanina.

Legătura glicozidică, în configurație ca și în nucleozidele naturale, este clivată de acizi tari (HCl 1N, la 100o, timp de 10 min), condiții în care legătura amidică a aminoacizilor este stabilă. Comparativ cu multe alte antibiotice, puromicina are un spectru deosebit de larg al activității, ce constă în inhibiția creșterii. Puromicina este un inhibitor al sintezei proteinelor și inhibă creșterea tuturor organismelor : bacterii, plante, protozoare, animale. Principalul mecanism de acțiune al puromicinei, ca agent inhibitor al sintezei proteinelor a fost definit ca rezultat al investigației mecanismului biosintezei proteinelor.

Datorită analogiei structurale cu aminoacil-ARNt, un intermediar al sintezei proteinelor, puromicina produce terminarea prematură a creșterii catenei polipeptidice. Puromicina eliberează polipeptidul în creștere din complexul ribosom-ARNm, producând o rupere a legăturii ester între gruparea COOH a polipeptidului și gruparea OH a adenozinei din ARNt. Clivarea se datorează faptului că peptidul este transferat de la ARNt la puromicină.

Datorită stopării sintezei proteinelor, efectul puromicinei constă în oprirea creșterii celulei. Efectul este predominant bacteriostatic. Sinteza ADN și ARN continuă pentru un timp la o rată normală sau aproape normală, dar sinteza proteinelor este inhibată imediat. În celulele mamaliene, inhibiția sintezei proteinelor este reversată rapid după îndepărtarea puromicinei.

Deoarece puromicina este un analog al adenozinei, este posibil ca regiunea aminonucleozidică a moleculei să interfere direct cu metabolismul nucleotidelor. Puromicina are toxicitate crescută asupra organismelor superioare: nefrotoxicitate, stare de rău general etc.

Bacteriile Gram pozitive sunt mai sensibile decât cele Gram negative. Diferențele de sensibilitate se pot datora înglobării reduse a puromicinei. Ionii de Mg2+ măresc sensibilitatea la puromicină. Nu se folosește în terapia antiinfecțioasă, dar este utilă în studiul experimental al mecanismului sintezei proteinelor, deoarece interferă cu sinteza proteică, producând eliberarea prematură a polipeptidului nascent din asociația sa cu ribosomul.

Structura moleculară a puromicinei

Cloramfenicolul se leagă reversibil cu subunitatea ribosomală 50 S și blochează alungirea peptidului nascent pe ribosom. Ribosomii 80 S nu sunt afectați, dar probabil ribosomii 70 S mitocondriali sunt sensibili la cloramfenicol.

Antibiotice care modifică permeabilitatea membranei plasmatice

Interacțiunea unor antibiotice (gramicidina, polimixina, nistatina, amfotericina B) cu membrana plasmatică a celulei bacteriene produce creșterea permeabilității și pierderea proprietăților de membrană selectivă. Rezultatul este moartea celulei prin liză osmotică.

Polimixina actionează asupra membranei citoplasmatice ca un detergent cationic, având afinitate pentru grupările sale cationice. Este singurul antibiotic cu acțiune bactericidă asupra celulelor aflate în faza staționară, după ce au depășit faza de creștere. Acționează asupra membranei externe, pe care o fragmentează, ceea ce explică acțiunea sa bactericidă și selectivitatea față de bacteriile Gram negative (tabelul 4).

Sensibilitatea diferitelor specii variază foarte mult, ceea ce denotă specificitatea interacțiunii dintre antibiotic și microorganism.

Antibioticele polienice (nistatin, amfotericina B) formează complexe cu sterolii din structura membranei plasmatice. Nu sunt active față de bacterii, deoarece membrana lor nu conține steroli, dar inhibă creșterea micoplasmelor, deoarece conțin steroli. Rezultatul interacțiunii cu membranele celulelor sensibile este pierderea permeabilității selective, pierderea ionilor de K+ și Mg2+ și diminuarea ratei sintezei proteinelor și a ARN.

Toate tipurile de celule sensibile la acțiunea antibioticelor polienice conțin steroli. Sterolii sunt componente comune multor grupe de organisme: alge, protozoare, levuri, viermi, mamifere etc. Datorită efectului lor asupra permeabilității membranei, antibioticele polienice măresc eficiența altor antibiotice.

Antibioticele polienice se utilizează în tratamentul micozelor. Infecțiile produse de fungi sunt mai rare decât cele bacteriene, rareori pun în pericol viața și adeseori sunt lipsite de importanță clinică. Tratamentul micozelor cu agenți chimici este limitat, datorită absenței specificității acțiunii lor. Cei mai importanți agenți antifungici sunt cei ce acționează asupra membranelor celulare, iar dintre aceștia, nistatinul și amfotericina B.

Tabelul 4.

Antibiotice active asupra membranei bacteriene (adaptare dupa Topley si Wilson’s, 1998)

Amfotericina B este produsă de Streptomyces nodosus. Mecanismul acțiunii sale constă în legarea de ergosterolul din membrana plasmatică a celulei fungice, a unor alge și a unor protozoare, dar și de celulele umane. Efectul este creșterea permeabilității membranei, astfel încât glucoza, K+ și alte molecule esențiale ies din celulă. Amfotericina B se absoarbe puțin din tubul digestiv și de aceea se administrează prin injectare intravenoasă. Rezistența fungică la acest antibiotic nu este cunoscută, dar efectele secundare sunt foarte frecvente și uneori severe.

Nistatinul (Micostatin) este produs de Streptomyces noursei. Mecanismul de acțiune este același ca și al amfotericinei B. Se administrează local pentru tratamentul infecțiilor cu Candida. Nu se absoarbe din intestin și se administrează oral, numai pentru tratamentul suprainfecțiilor intestinale, care adeseori sunt consecutive tratamentului cu antibiotice.

Antibiotice care interferă cu funcțiile acizilor nucleici

Rifamicina B este sintetizată natural, iar rifampicina este derivatul semisintetic cu cea mai largă utilizare clinică (Tabelul 5). Rifampicina este alcătuită dintr-o grupare cromoforă aromatică, inclusă într-o catenă alifatică. Ea se asociază cu subunitatea B a ARN-polimerazei dependentă de ADN și probabil chiar cu ADN în complexul de inițiere, blocând astfel inițierea transcrierii și sinteza ARN. Antibioticul se folosește în terapia combinată a tuberculozei. Mutantele rezistente, cu subunitatea B a ARN-polimerazei modificată se selecționează repede.

Structura moleculară a rifamicinei B

Actinomicina D (Dactinomicina) este formată dintr-o grupare cromoforă aromatică și un ciclu peptidic (Tabelul 5). Ea interacționează cu ADN și inhibă replicarea și transcrierea. Gruparea aromatică se intercalează în dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rămâne la suprafață.

Structura moleculară a actinomicinei D

Novobiocina interferă cu sinteza ARN, deoarece inhibă ARN-polimeraza dependentă de ADN, iar griseofulvina inhibă replicarea ADN, consecutiv interferenței cu polimerizarea nucleotidelor purinice (tabelul 5). Cercetări recente sugerează că novobiocina acționează asupra subunității B a ADN-girazei (topoizomeraza II) care produce și menține starea supraspiralizată a ADN.

Griseofulvina sintetizată de Penicillium griseofulvum a fost izolată ca un factor care produce dezvoltarea anormală (răsucirea) a hifelor fungice. Se folosește pentru tratamentul infecțiilor fungice superficiale. Inhibă creșterea fungilor micelieni, dar nu este activă față de bacterii sau levuri. Nu influențează creșterea fungilor cu pereți celulozici, dar inhibă creșterea fungilor care conțin chitină. Griseofulvina influențează celulele fungice prin contact direct: creșterea hifelor aeriene nu este modificată. Concentrațiile mici produc răsucirea hifelor, ramificarea extensivă, micșorarea distanței dintre pereții transversali, creșterea diametrului. La concentrații mari de antibiotic, modificările de creștere se amplifică și hifele se rup.

Injectarea intravenoasă a griseofulvinei la șobolan determină oprirea mitozei în metafază, produce mitoze multipolare și nuclei anormali. În miceliile tratate cu griseofulvină scade conținutul de proteine, de acizi nucleici. Antibioticul interferă cu creșterea fungică, probabil împiedicând incomplet formarea aparatului mitotic de diviziune (tabelul 5).

Structura moleculară a griseofulvinei

Antibioticele care interacționează cu ADN produc efecte nediscriminatorii asupra ADN bacterian, viral sau al celulei eucariote.

Tabelul 5.

Antibiotice care interferă cu funcțiile acizilor nucleici (dupa Topley si Wilson’s, 1998):

4.5.Determinismul genetic al rezistenței microorganismelor la antibiotice

Utilizarea antibioticelor a reprezentat cea mai importantă modalitate de control a maladiilor infecțioase în secolul 20. Multe maladii infecțioase au fost ținute sub control prin administrarea antibioticelor, dar totuși, infecțiile răman cauza principală a morții în lume. Mai mult, infecții care anterior fuseseră controlate, devin tot mai comune la pacienții cu disfuncții imunitare (SIDA). Microorganismele care produc aceste infecții sunt adeseori rezistente la antibiotice. Rezistența este capacitatea unui organism de a crește în prezența unui nivel ridicat al unui agent antimicrobian. Rezistența bacteriană la antibiotice a fost recunoscută imediat ce antibioticele au fost introduse în clinică. Genele codificatoare ale factorilor de rezistență au preexistat momentului introducerii antibioticelor în clinică deoarece au fost recunoscute în colecțiile bacteriene alcătuite înainte de utilizarea antibioticelor. În anii ’50, Watanabe și colab. au observat că Sh. disenteriae a devenit rezistentă nu numai la sulfonamide, dar și la tetraciclină și cloramfenicol (Watanabe și colab., 1961). Rezistența s-a datorat nu numai mutațiilor unor gene cromosomale, ci prezenței ADN extracromosomal, transmisibil, adică este o rezistență mediată de plasmide.

Capacitatea agenților patogeni de a crește în prezența antibioticelor, prin dezvoltarea rezistenței, a făcut ca victimele să fie la fel de vulnerabile ca în era premergătoare utilizării antibioticelor. Rezistența la toate grupele de antibiotice și la agenții chimioterapeutici a apărut paralel cu folosirea pe scară largă a antibioticelor în clinică și în creșterea animalelor, ceea ce a făcut ca multe dintre ele să fie ineficiente: de exemplu, tuberculoza și alte maladii infecțioase constituie o problemă importantă de sănătate publică, datorită selecției în timp, a tulpinilor rezistente (Rosen și Barkin, 1992). Bacteriile au evidențiat o capacitate remarcabilă de a dezvolta rezistența la fiecare antibiotic introdus în clinică, adeseori prin mecanisme surprinzătoare, care au devenit funcționale foarte repede. Bacteriile rezistente la un antibiotic pot să supraviețuiacă și chiar să se multiplice în prezența concentrațiilor terapeutice de antibiotic. Dezvoltarea rezistenței este inevitabilă după introducerea în clinică a unui antibiotic nou. Rata apariției tulpinilor bacteriene rezistente la medicamentele noi este de ordinul a 1%. Dar după 8-12 ani de utilizare intensivă a antibioticelor (în clinica umană și în zootehnie), tulpinile bacteriene cu rezistență multiplă au devenit foarte frecvente.

Rezistența poate fi naturală (intrinsecă) sau dobândită prin intermediul genelor de rezistență pe cale mutațională sau prin dobândirea genelor exogene.

Rezistența naturală

Rezistența intrinsecă se referă la bacteriile insensibile la un antibiotic, în stare naturală, fără să dobândească factori de rezistență.Ținta acțiunii antibioticului este inaccesibilă. Structurile de înveliș ale celulei bacteriene formează bariere fizice de permeabilitate, care limitează sever difuzia liberă a moleculelor. Absența țintei celulare de acțiune a antibioticului este o cauză a rezistenței naturale. Bacteriile din g. Chlamydia (C. trachomatis produce o uretrită nespecifică, cauză majoră a infertilității umane și produce cele mai multe cazuri de orbire, comparativ cu oricare alt agent infecțios), nu sunt sensibile la acțiunea inhibitorilor sintezei peretelui celular (peniciline), deoarece nu au peptidoglican, deși au enzimele care leagă penicilina (PBP) necesare sintezei peptidoglicanului.

Impermeabilitatea învelișurilor semnifică faptul că antibioticul nu pătrunde în celulă. Multe bacterii posedă mecanisme naturale de excludere a moleculelor mici. La bacteriile Gram pozitive, peretele peptidoglicanic gros și relativ rigid, nu conferă protecție față de antibiotice. Prin peretele mureinic cu o porozitate de 1,1 nm, difuzează liber antibioticele cu moleculă mai mică de 1200 Da. Pentru că cele mai multe antibiotice sunt cel puțin parțial hidrofobe, pot să difuzeze liber prin membrană.

La bacteriile Gram negative, membrana externă este o barieră protectoare eficientă față de moleculele mici, așa cum sunt antibioticele. Prin difuzia pasivă trec moleculele de apă, O2, CO2 (molecule mai mici de 0,8 nm), moleculele liposolubile (care se dizolvă în lipidele membranei celulare, ca de exemplu, tetraciclina), precum și moleculele organice fără sarcină, până la dimensiunile glicerolului.

Penicilina G a fost primul antibiotic introdus în clinică, dar utilizarea sa este limitată deoarece catena laterală nu permite trecerea prin membrana externă a bacteriilor enterice Gram negative (E. coli). Asemănător, antibioticele macrolide (eritromicina) nu penetrează membrana externă, deși în sistemele acelulare de E. coli, eritromicina inhibă la fel de eficient sinteza proteinelor ca și în sistemele acelulare ale bacteriilor Gram pozitive.

Inaccesibilitatea țintei datorită impermeabilității unor structuri, așa cum este membrana externă a bacteriilor Gram negative, este o rezistență pasivă. Dar inaccesibilitatea țintei poate fi un proces activ: de exemplu, activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimină medicamentul contra unui gradient de concentrație.

În vivo, în majoritatea țesuturilor se realizează concentrații mici de antibiotice, care diminuă eficiența antimicrobiană. Astfel, Haemophilus influenzae se deplasează în interstițiile tisulare ale gazdei, unde antibioticele hidrofile mari (gentamicina) nu realizează concentrații mari.

Un alt aspect interesant al rezistenței naturale este reprezentat de rezistența microorganismelor față de antibioticele pe care le sintetizează. De exemplu, streptomicetele manifestă o rezistență intrinsecă față de antibioticele pe care le produc, ca un mecanism de autoprotecție.

Rezistența dobândită

Dobandirea rezistenței la antibiotice este un proces stadial. Rezistența completă nu este conferită totdeauna de o schimbare imediată a genomului bacterian. Primul stadiu este toleranța sau capacitatea bacteriei de a supraviețui în prezența antibioticului, fără să continue creșterea și diviziunea. Rezistența se instalează atunci cand bacteriile nu numai că supraviețuiesc, dar se și multiplică în mediul cu antibiotic. Toleranța favorizează dezvoltarea rezistenței. În condițiile presiunii selective, tulpinile tolerante, adeseori devin rezistente.

Rezistența la antibiotice are totdeauna un substrat genetic. Bacteriile pot dobândi rezistența la un antibiotic, ca rezultat al mutației unei gene cromosomale care modifică ținta sau al expresiei unei gene cromosomale latente. În populațiile bacteriene, patogene și saprobionte, se găsește o rezervă importantă de gene de rezistență. Originea genelor de rezistență la antibiotice, ale bacteriilor patogene nu este clară. Perioada de la începutul tratamentului cu antibiotice (50 – 60 de ani în urmă), până la emergența bacteriilor care exprimă mecanisme eficiente de rezistență, este prea scurtă pentru a explica dezvoltarea factorilor de rezistență din proteine celulare, prin mutație spontană. Dacă un mecanism de rezistență necesită acțiunea cooperantă a câtorva proteine (de exemplu, rezistența la vancomicină), generarea de novo a unui mecanism complex de rezistență a unei bacterii patogene este puțin probabilă.

Majoritatea medicamentelor antimicrobiene sunt derivate din metaboliții organismelor din sol, în special fungi și actinomicete. Toate mecanismele de rezistență cunoscute la bacteriile patogene (ARN-metilaze, transportori de tip ABC = ATP binding cassette, aminoglicozid-fosfotransferaze și -lactamaze), deja există la producătorii de antibiotice. Pentru genele care codifică factorii de rezistență la antibiotice se acceptă două origini:

– prin mutațiile unor gene cu rol în biosinteză, ca de exemplu cele care fosforilează glucidele (kinaze) și acetil-transferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului asupra căruia acționează, modificand și inactivand antibioticele;

– din genele de rezistență existente în mod natural, care probabil au evoluat în mii de milioane de ani în populațiile bacteriene din sol, ca modalități de protecție față de antibioticele produse de ele însele.

Rezistența dobândită prin mutații

Cele mai multe studii referitoare la rezistența bacteriană s-au concentrat asupra evenimentelor mutaționale ale genelor cromosomale. Mutația este un proces genetic important prin care este dobandită rezistența la antibiotice. Modificările genetice microevolutive (mutațiile punctiforme) pot modifica sensibilitatea organismelor la antibiotice prin modificarea structurală a țintei. De exemplu, unele microorganisme își modifică enzima β-lactamază prin mutație punctiformă și astfel spectrul de activitate al enzimei se extinde. Rezistența la sulfonamide este consecința schimbării unui singur aminoacid în secvența enzimei pteridin-sintetază, care face ca sulfonamidele să se lege mai puțin eficient decât APAB. Asemănător, o mutație punctiformă modifică o proteină ribosomală, ce conferă rezistență la streptomicină.

Schimbările genetice macroevolutive implică rearanjarea unor segmente mari de ADN prin transpoziție. Dacă schimbările implică deplasarea genelor de rezistență și trecerea lor sub controlul unui nou promotor, organismul poate deveni rezistent.

În timpul stresului, bacteriile saprobionte și cele patogene își sporesc net rata mutațiilor, adică devin hipermutabile. Ele exprimă și își duplică informația de supraviețuire, printre care și genele de rezistență la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni și integroni. Pe de altă parte, bacteriile au o mare capacitate de a-și păstra materialul genetic care le conferă avantaj selectiv-evolutiv și conservă mutațiile avantajoase chiar în prezența acțiunii mecanismelor de reparare a ADN, care au tendința să le corecteze.

Inițial s-a presupus că rezistența a fost dobândită prin mutație spontană. Rezistența mutațională se numește rezistență primară. Erorile sintetzei replicative a ADN și incapacitatea sistemelor de reparare a ADN, duc la o frecvență a mutației spontane de o pereche de baze/107- 1010 celule, ceea ce înseamnă că pentru fiecare 107- 1010 celule, o singură bază suferă modificare. Dar rata mutației spontane generatoare a rezistenței este mai mică, deoarece pentru apariția rezistenței primare trebuie să se producă mutații multiple. Din această cauză, s-a considerat că apariția tulpinilor rezistente la antibiotice prin procese mutaționale, în timpul terapiei, este improbabilă. Deși mutația este un eveniment rar, rata foarte rapidă de creștere a bacteriilor, favorizează exprimarea rezistenței, relativ repede într-o populație celulară. Odată ce gena de rezistență prin mutație a fost stabilizată, poate fi transferată direct la toate celulele descendente (fluxul genelor pe verticală).

Rezistența plasmidială

Adeseori, izolatele bacteriene au rezistență multiplă la antibiotice și la agenții chimioterapeutici. Genele codificatoare ale rezistenței multiple sunt localizate pe plasmidele de rezistență și pe integroni (tabelul 6).

Plasmidele R (de rezistență transmisibilă, cu caracter infecțios), descrise de Watanabe (l961), sunt elemente genetice extracromosomale care conferă celulei purtătoare, rezistență simultană la mai multe antibiotice, la sulfamide, la cationii metalelor grele. El a demonstrat rezistența simultană a celulelor de Shigella (agentul dizenteriei, bacterie Gram negativă, enterică) la mai multe antibiotice, iar rezistența s-a dovedit a fi transmisibilă la celulele tulpinilor sensibile. Plasmidele de rezistență s-au identificat la toate grupele de bacterii și sunt larg distribuite în natură. Transmiterea rezistenței multiple la antibiotice, de la o celulă la alta, este atribuită plasmidei R. Acestea sunt molecule de ADN circulare, dublu catenare, care se autoreplică fizic independent de cromosom.

Tabelul 6.

Mecanismele moleculare ale rezistenței mediată de gene plasmidiale sau cromosomale, la diferite

antibiotice (după Brock, 2003)

Plasmidele R conțin informația genetică ce conferă rezistență la mai multe antibiotice, la sulfamide (produși de sinteză chimică, derivați ai acidului paraaminobenzoic) și la diferiți agenți chimici. Datorită înrudirii chimice dintre diferite familii de antibiotice, o plasmidă conferă rezistență simltană, la un număr mare de antibiotice. Astfel, celula bacteriană devine suprarezistentă, atât calitativ cat și cantitativ. Datorită rezistenței plasmidiale, bacteriile patogene produc infecții foarte greu de controlat prin mijloacele terapeutice obișnuite. Plasmidele R au fost evidențiate la E. coli, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Erwinia, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium etc, dar sunt foarte importante pentru stafilococi și alte bacterii Gram pozitive, la care determină r

ezistența la medicamente.

Plasmidele R au o structură genetică complexă și sunt alcătuite din următoarele categorii de determinanți genetici:

– genele care conferă rezistență la antibiotice (genele “r ”);

– genele care conferă plasmidei R, funcția de conjugon (transferon). Ele sunt grupate într-un transpozon, formând factorul de transfer al rezistenței (FTR). Se numesc gene tra și codifică sinteza proteinelor necesare transferului plasmidei prin conjugare;

– secvențe de inserție;

– secvența de inițiere a procesului de replicare (“ori”);

– genele ce asigură replicarea fizic autonomă, a plasmidei.

Genele “r ” fac parte din structura unor transpozoni (fiind delimitate de secvențe de inserție) și au o mobilitate foarte accentuată, adică se deplasează dintr-un situs în altul în structura plasmidei sau între plasmidă și cromosom. Numărul genelor de rezistență într-o plasmidă este variabil. Spre deosebire de plasmidele F, plasmidele R nu se integrează în cromosomul bacterian.

Cele două categorii de determinanți genetici, de rezistență și de transfer, pot să existe în stare recombinată sau se găsesc disociați în celula bacteriană, ca unități de sine stătătoare:

– factorul de transfer al rezistenței (FTR) ce poartă gene reglatoare ale replicării, genele de transfer și uneori gena de rezistență la tetraciclina (tet), cu gr.mol. de 11 x l06 Da;

– celălalt component, care conține genele de rezistență la antibiotice și are dimensiuni foarte diferite, între câteva milioane – l00 milioane Da.

Cele două plasmide mici se replică autonom.

În celulele de E. coli, cele două plasmide se recombină și formează o plasmidă mare, care poartă atât genele de rezistență, cat și pe cele de transfer. În această stare, plasmida R se transmite prin conjugare cu o frecvență foarte mare: l00% dintre celulele sensibile ale unei populații celulare ce formează cupluri de conjugare, primesc o copie a plasmidei R și devin rezistente (așa numita rezistență infecțioasă sau transmisibilă). Frecvența transmiterii conjugative scade treptat, datorită sintezei unui represor care blochează activitatea genelor tra și astfel este inhibată sinteza pilinei și implicit asamblarea pililor.

Dacă plasmida R nu conține determinanții genetici tra (FTR), transferul său se face prin transducție mediată de un fag de dimensiuni mari, sau prin conjugare inițiată de alte plasmide conjugative.

O categorie specială de plasmide sunt cele care răspund la feromoni și par a fi limitate la enterococi. Feromonii sunt peptide hidrofobe de 7-8 aminoacizi. Plasmidele sensibile la feromoni codifică rezistența la antibiotice, bacteriocine și hemolizină. În acest sistem de transfer conjugativ, celulele receptoare secretă o familie de feromoni peptidici. Celulele unei populații bacteriene care poartă o plasmidă particulară, reactivă la prezența feromonilor, răspund prin sinteza unei adezine care facilitează formarea agregatelor de împerechere. Celulele donoare, purtătoare ale plasmidei, exprimă molecule de suprafață cu rol de agregare (adezine), iar pe suprafața celulelor receptoare se găsesc substanțe de legare (Gander, 1998). Celulele care se împerechează, realizează contacte prin coliziuni aleatorii. Feromonii măresc de 5 – 6 ori rata de transfer a unei plasmide.

După ce celula receptoare a primit o copie a plasmidei, sinteza feromonului corespunzător este stopată, dar continuă sinteza și secreția feromonilor specifici pentru alte plasmide.

Rezistența mediată de elementele genetice transpozabile

Secvențele de inserție (SI) sunt cele mai simple elemente transpozabile. Ele poartă gena pentru transpozază, flancată la extremități de secvențele repetate invers (SRI).

Deoarece nu poartă nici o genă care să codifice un caracter detectabil, se pot identifica numai prin capacitatea lor de a produce mutații. Lungimea lor este mai mică de 1000 pb.

Integronii sunt secvențe de ADN ce conțin determinanți genetici ai unui sistem de recombinare cu specificitate de situs. Ei recunosc, înglobează și astfel mediază deplasarea unor scurte secvențe mobile de ADN, denumite casete genice (Recchia și Hall, l995). Cele mai multe casete genice cuprind o singură genă de rezistență la antibiotice.

Un integron conține o secvență ce codifică integraza și o secvență adiacentă de recombinare(att), care recunoaște situsul specific de recombinare. Un integron grupează și integrează casete genice multiple.

S-au descris 4 clase de integroni (Livermore, 1995):

– integronii clasei I, cei mai comuni, conțin gena de rezistență la sulfonamidă (sul I) ;

– integronii clasei a II sunt asociați cu Tn7. Celelalte două clase de integroni au o distribuție foarte limitată.

Frecvent, integronii fac parte din structura unor transpozoni.

O casetă genică poate exista în două forme:

ca o secvență lineară într-un integron;

ca o moleculă circulară de ADN, dublu catenară, ce poartă l – 2 gene de rezistență și un situs de recombinare (att) de 59 de nucleotide, cu rolul de a integra caseta genică la situsul specific al unui replicon.

Secvențele 5’ și 3’ care flanchează caseta genică lineară, sunt bine conservate. Regiunea 5’ conține gena int, codificatoare a integrazei, o enzimă de recombinare la situs specific, iar la capătul 3’ se găsește gena de rezistență la un antibiotic.

Integrarea unei casete genice într-un replicon este reversibilă. Caseta excizată se integrează în alt replicon. Prin intermediul casetelor genice, complementul genelor de rezistență poate fi mereu rearanjat și deplasat de pe un replicon pe altul.

Integronii sunt sisteme de diseminare a genelor bacteriene, distincte de plasmide și de EGT.

Integronii se găsesc aproape exclusiv la bacteriile Gram negative și mediază rezistența multiplă la antibiotice (MDR): aminoglicozide, peniciline, cefalosporine, trimetoprim, tetraciclină, eritromicină, cloramfenicol.

Cei mai comuni sunt integronii asociați cu gena de rezistență la sulfonamidă (sul I), care poartă cel puțin 60 de casete genice ce conferă rezistență la antibiotice și cei asociați cu Tn7.

Rezistența multiplă la antibiotice și la agenții chimioterapeutici poate fi datorată diminuării sintezei porinelor, diminuării permeabilității sau expresiei pompelor de eflux, care au specificitate relativ largă de substrat.

Transpozonii sunt segmente de ADN mobile (cu potențial de transpoziție), care includ în alcătuirea lor, o serie de gene structurale, delimitate la extremități de SI, totdeauna repetate în ordine inversată. Mărimea lor variază între 2.l00 – 9.300 pb.

Primii transpozoni, determinanți ai instabilității genetice a culorii semințelor de porumb, au fost descoperiți de către Barbara McClintock, prin experiențe din anii ’40, înainte de elucidarea structurii ADN. În anii ’60 a devenit evident că sistemele genetice bacteriene, ca și cele eucariote, au un grad înalt de instabilitate. Emergența și răspândirea fenomenului de rezistență la antibiotice a amplificat studiul substratului său genetic.

Din punctul de vedere al structurii genetice, Tn simpli sunt asemănători cu SI, dar se deosebesc de acestea prin faptul că în secvența centrală, poartă gene a căror expresie fenotipică este decelabilă și conferă proprietăți noi celulei purtătoare (de exemplu, gene de rezistență la Km, Cm, Tc etc.). Genele structurale sunt flancate de secvențe repetate lungi (l-2 kb), cel mai adesea în ordine inversată. Secvențele inversate conferă o stabilitate superioară structurii Tn.

Transpozonii complecși – grupați în familia Tn1, au până la 20 kbp, dar au fost descriși alții mult mai mari (80 kb). Se disting de transpozonii simpli prin aceea că atât secvențele de transpoziție cat și secvențele specifice sunt flancate de SRI scurte (40 pb), ca și IS.

Majoritatea transpozonilor sunt rezidenți în ADN plasmidial sau în ADN fagic. Mai puțini transpozoni sunt rezidenți în cromosomul bacterian.

Transpozonii sunt secvențe genetice mobile: se deplasează între plasmide și cromosom, trec de pe o plasmidă pe alta sau transpozează între diferite situsuri ale aceleiași plasmide. Interesul pentru studiul transpozonilor s-a amplificat odată cu descoperirea faptului că genele de rezistență la antibiotice pot să treacă de la un replicon la altul. De exemplu, gena pentru β-lactamază este foarte mobilă, trecând cu ușurință de pe o plasmidă pe alta, ceea ce explică răspândirea largă a rezistenței bacteriene la antibioticele β-lactamice.

Relocarea Tn duce la instabilitate genetică, asociată cu modificări fenotipice, dacă transpoziția are ca rezultat inserția unui element Tn într-o genă structurală. Dacă transpoziția are loc într-o genă reglatoare, o genă care în mod normal este represată, poate fi exprimată constitutiv și la un nivel superior celui obișnuit. Unele elemente transpozabile poartă secvențe promotoare mai puternice și pot influența expresia genelor din aval de situsul de inserție, producând mutații polare.

Unele gene de rezistență (TEM-β-lactamaza) s-au găsit atât pe plasmide cât și pe cromosom, la o largă varietate de bacterii. Datorită capacității de transpoziție și inserție, transpozonii sunt factori majori ai reorganizării informației genetice și în consecință, pentru aglomerarea câtorva gene de rezistență într-o singură plasmidă. Structura genetică și mobilitatea fac ca rezistența multiplă la antibiotice să fie foarte probabilă. Transpoziția este o cale ușoară și eficientă pentru transferul concomitent al rezistenței la câteva antibiotice.

Pentru ca un element transpozabil să transpozeze ca o entitate de sine stătătoare, este necesar ca transpozaza (o endonuclează) să recunoască extremitățile sale, caracterizate prin prezența secvențelor repetate invers (SRI).

Astfel, dacă un transpozon are la o extremitate secvența

5’AAAACCCGGT3’

3’TT TTGGGCCA5’,

la celălalt capăt va avea secvența 5’ACCGGGTT TT 3’

3’TGGCCCAAAA5’.

Secvențele repetate invers au rolul de situsuri de recunoaștere pentru transpozază, enzima ce catalizează procesul de transpoziție.

ADN cromosomal și plasmidial bacterian posedă un mare rezervor de gene de rezistență, ce codifică diferite mecanisme de rezistență la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea țintei acțiunii antibioticului.

Rezistența dobândită prin transferul orizontal al genelor

Dezvoltarea largă a rezistenței multiple la multe specii de bacterii, a condus la presupunerea că există și alte mecanisme pentru dobandirea rezistenței (Kruse si colab., 1994). Evaluarea ratei de apariție a mutantelor rezistente la antibiotice trebuie să țină seama de doi factori:

– fluxul genetic la bacterii este mult mai amplu decât la celelalte organisme și rata transferului pe orizontală este net superioară ratei de apariție și selecție a mutantei. Bacteriile fac schimb de informație genetică, depășind barierele de specie, ceea ce permite ca o genă de rezistență existentă în populația bacteriană să se transmită cu o rată înaltă de la o celulă la alta;

– antibioticele se folosesc pe scară largă și expunerea bacteriilor este multiplă (repetată). Lumea vie trăiește într-o adevărată “mare de antibiotice”, ceea ce conferă bacteriilor un avantaj selectiv continuu. În 1991 s-au folosit peste 50 de peniciline, 70 cefalosporine, 12 teracicline, 8 aminoglicozide, 1 monobactam, 3 carbapenemi, 9 macrolide, 2 noi streptogramine și 3 inhibitori ai dihidrofolat-reductazei.

Una dintre căile majore prin care bacteriile devin rezistente este dobândirea ADN exogen pe orizontală. Schimbul genetic pe orizontală semnifică transferul informației genetice între celulele bacteriene, pe alte căi decât prin diviziune. ADN exogen poate fi dobândit prin transferul genelor prin conjugare între speciile bacteriene diferite, pe calea plasmidelor care de obicei poartă gene multiple de rezistență la antibiotice. Unele bacterii sunt în mod natural competente pentru a prelua ADN nud din mediul extern și pot să dobandească gene de rezistență pe calea mecanismului transformării genetice. Alteori, genele de rezistență sunt transferate de fagi prin mecanismul transducției (fig. 26).

Figura 26. Reprezentarea schematică a mecanismelor de transfer al informației genetice între celulele bacteriene (original).

Fluxul genic pe verticală semnifică transmiterea informației genetice în generațiile succesive de celule, odată cu diviziunea. Schimbul pe orizontală semnifică transferul informației genetice între celulele bacteriene, pe alte căi decât prin diviziune. Schimbul genetic orizontal reprezintă mecanismul primar al evoluției rezistenței la antibiotice și se realizează prin conjugare, transformare sau transducție.

Conjugarea este transferul ADN de la o celulă donoare la cea receptoare, prin contact celular direct, mediat de un complex multiproteic specializat, denumit aparat de conjugare. La bacteriile Gram negative, contactul fizic este realizat prin intermediul unor structuri filamentoase extracelulare, denumite pili.

S-au descris două tipuri de structuri genetice conjugative: plasmide conjugative și elemente conjugative cromosomale denumite transpozoni conjugativi.

Transpozonii conjugativi sunt molecule mobile de ADN, care codifică toate funcțiile necesare pentru transpoziția intracelulară, dar și pentru conjugare intercelulară. Se găsesc la o largă varietate de bacterii Gram pozitive (Tn 916, la Enterococcus faecalis) și Gram negative (Tn 455, cu gena de rezistență la tetraciclină, la Bacteroides) și sunt importanți pentru diseminarea genelor de rezistență la antibiotice. Frecvența de transfer a transpozonilor conjugativi este între 10-4 – 10-9.

Transpozonii conjugativi au un situs de origine a transferului conjugativ – ori T, la care ADN este incizat, pentru a iniția transferul unei molecule de ADN monocatenar.

Ca mecanism general al transferului conjugativ mediat de transpozoni sau de plasmide, ADN transferabil (plasmidial sau al unui transpozon cojugativ) al celulei donoare, care poate să conțină gena R, este incizat monocatenar. Catena incizată este transferată sub formă monocatenară în celula receptoare, pe măsură ce este copiată în celula donoare după mecanismul cercului rotativ. În celula receptoare, catena transferată este copiată într-o catenă complementară și se formează o moleculă dublu catenară lineară. Capetele moleculei lineare sunt ligaturate și se formează o moleculă circulară, închisă covalent.

Transferul genelor prin conjugare este supus unor restricții, care au avut rol important în evoluția rezistenței. Prima barieră este constituită de structurile de suprafață ale celor două celule, a doua restricție derivă din faptul că ADN-ul exogen este sensibil la enzimele de restricție, iar a treia din faptul că plasmida transferată poate fi incapabilă să se replice în noua gazdă.

La majoritatea bacteriilor Gram pozitive nu s-au identificat căile de realizare a contactului intercelular și de transfer conjugativ al ADN.

Problema centrală a conjugării bacteriene este înțelegerea modalității în care ADN traversează învelișurile celor două celule. Modelul acceptat presupune existența a două complexe proteice codificate de gene plasmidiale și cromosomale (Grohmann, 2003):

– un complex proteic – relaxosomul, se asociază cu originea de transfer a plasmidei (ori T), incizează una dintre cele două catene, consecința directă și imediată fiind despiralizarea ADN (relaxarea);

– complexul proteic de cuplare condiționează formarea perechilor celulare donor-receptor (complexul mpf = mating pair formation), codificat de plasmidă și implicat în transferul catenei de ADN de la donor la receptor.

Relaxazele ADN sunt enzime esențiale pentru inițierea transferului conjugativ și acționează prin cataliza clivării unei legături fosfodiester la situsul nic (nicking = clivare) localizat la originea de transfer (ori T).

Transferul conjugativ al genelor de rezistență la bacteriile Gram pozitive

Diferențele majore dintre conjugarea bacteriilor Gram negative și Gram pozitive constau în mecanismele prin care se stabilește contactul intercelular, o etapă preliminară obligatorie pentru inițierea transferului conjugativ.

Proteinele esențiale pentru realizarea transferului conjugativ al plasmidelor sunt relaxazele ADN. La toate sistemele cojugative studiate, se acceptă că din celula donor se transferă în celula receptor, o singură catenă de ADN. Generarea unui intermediar plasmidial monocatenar transferabil este consecința acțiunii ADN-relaxazei, care clivează legătura fosfodiesterică a unui dinucleotid specific la situsul nic.

Plasmidele cu spectru larg de gazdă, identificate la streptococi și enterococi, se transferă prin conjugare cu o frecvență variabilă de 1/103 – 106 (un eveniment de conjugare la 103 – 106 celule), în funcție de plasmidă și de genotipul celor două celule ale cuplului. Ele conferă rezistența la macrolide, lincosamide și streptogramina B.

Plasmidele identificate la stafilococi au spectru îngust de gazdă (par a fi limitate numai la stafilococi). Formarea perechilor de conjugare necesită cocultivarea celulelor donor și receptor pe o suprafață solidă. Ambele grupe de plasmide conjugative conferă rezistență la un spectru larg de antibiotice

Din punct de vedere funcțional, aparatul de transfer conjugativ, alături de sistemele de secreție ale câtorva patogeni, de sistemele de transformare naturală și de sistemul de secreție a fagilor filamentoși, alcătuiesc sistemul de secreție de tip IV.

Proteinele de cuplare (mpf = mating pair formation) formează familia proteinelor de transfer (Tra) și probabil au rol de orientare a moleculei prin canalul de transfer.

Conjugarea are un rol major în răspândirea rezistenței bacteriilor la antibiotice. Procesul implică contactul celular direct al celor două celule bacteriene și transferul ulterior al ADN. Conjugarea are un caracter pronunțat de promiscuitate, deoarece poate să se producă între specii neînrudite și chiar între genuri diferite. Din această cauză, rezerva genică disponibilă pentru schimb, este foarte mare.

Rezistența la antibiotice se transmite mai ușor dacă genele sunt transferate la celule sensibile, iar ADN exogen este mai stabil în noua gazdă, dacă conține mai puține situsuri de restricție.

Conjugarea este cea mai comună cale de transmitere a genelor de rezistență.

Transformarea genetică constă în preluarea de către celula bacteriană, a unui fragment de ADN exogen. ADN trebuie să străbată învelișurile celulei și să fie integrat în cromosomul celulei gazdă, prin recombinare omologă. În procesul recombinării omologe, o parte a cromosomului este înlocuită de ADN omolog. Ca și în conjugare, enzimele de restricție-modificare au rol important în transformare. Pentru că ele generează fragmente mai mici, pot să crească șansa recombinării fragmentelor încorporate.

Recombinarea intragenică. Fragmentele mici de ADN încorporate din mediul extern favorizează recombinarea intragenică și astfel rezultă gene mozaic. Genele mozaic conțin ADN din alela originală, dar și ADN din alte gene sau chiar din alte organisme. Majoritatea genelor mozaic se pierd, dar unele pot să exprime un fenotip ce favorizează supraviețuirea organismului, deoarece codifică proteine cu proprietăți noi: de exemplu, gena care codifică o PBP alterată, cu afinitate mică pentru antibioticele β-lactamice. O astfel de genă favorizează toleranța față de antibioticul din mediu și celula purtătoare este favorizată de selecție.

Rezistența încrucișată semnifică fenomenul prin care dobândirea unui singur mecanism de rezistență, conferă rezistență la o clasă întreagă de antibiotice. De exemplu, rezistența S. aureus la meticilină, conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice și cefalosporine. Dar rezistența încrucișată nu este totdeauna o regulă: P. aeruginosa rezistentă la kanamicină rămâne sensibilă la antibiotice asemănătoare (gentamicina). Dacă mecanismul rezistenței este nespecific, așa cum sunt pompele de eflux, poate conferi rezistență încrucișată la o varietate largă de medicamente.

Co-rezistența semnifică activitatea simultană a câtorva mecanisme de rezistență, la același organism (Ballows, 1991). Co-selecția se referă la selecția genelor multiple de rezistență la antibiotice și apare când genele de rezistență sunt componente ale aceluiași operon și deci sub controlul aceluiași promotor. Cunoașterea mecanismelor moleculare de rezistență la antibiotice este necesară pentru a lupta cu succes împotriva bacteriilor rezistente sau multirezistente.

Rezistența naturală are ca suport genetic cromosomul bacterian. Evenimentele genetice implicate în rezistența dobândită pot fi mutațiile, afectând gene prezente pe cromosomul bacterian.

Originea genelor de rezistență

Bacteriile pot dobândi rezistența la un antibiotic, ca rezultat al mutației unei gene cromosomale sau al expresiei unei gene cromosomale latente.

Unele gene de rezistență au apărut prin mutații întâmplătoare care au furnizat un avantaj selectiv celulelor purtătoare (Dixon, 2000). În populațiile bacteriene, patogene și saprobionte, se găsește o rezervă importantă de gene de rezistență, care au două origini:

– prin mutațiile unor gene, ca de exemplu cele care fosforilează glucidele (kinaze) și acetil-transferazele, care au evoluat prin schimbarea substratului acțiunii, modificând și inactivând antibioticele ;

– genele de rezistență existente în mod natural, care probabil au evoluat în mii de milioane de ani în populațiile bacteriene din sol și ape, ca modalități de protecție față de antibioticele produse de ele însele. În aceste medii bacteriile trebuie să intre în competiție cu microorganisme producătoare de antibiotic: fungi, actinomicete (actinobacterii). Ele trebuie să aibă un anumit nivel de rezistență, pentru a supraviețui în mediul natural.

Genele de rezistență la antibioticele β-lactamice s-au descoperit înainte de descoperirea antibioticelor însăși. De exemplu, s-a descoperit că o tulpină de S. aureus izolată înainte de descoperirea antibioticelor și păstrată în colecție, sintetizează β-lactamaza. Se consideră că lizozimul din secreția nazală a exercitat o presiune selectivă care a favorizat selecția celulelor rezistente la antibiotice (Brock și colab., 1998). S-a presupus că bacteriile care formează microbiota normală a tractului digestiv, pot avea rol de rezervor de gene de rezistență, ce pot fi transferate la bacterii ca Enterococcus faecalis, component al microbiotei normale a colonului, dar și la S. aureus și Streptococcus ce colonizează orofaringele. Gena tetO s-a identificat la unele tulpini de Lactobacillus ce colonizează tractul vaginal. Acestea sunt argumentele în favoarea ipotezei transferului orizontal între membrii microbiotei normale și bacteriile patogene, ce poate avea loc în anumite micronișe ale organismului. Bacteriile care sintetizează tetracicline, trebuie să se protejeze de antibioticul pe care-l produc. Genele de rezistență la antibiotice sunt frecvent localizate în același fragment de restricție cu de genele pentru producerea antibioticului.

4.6. Mecanismele moleculare ale rezistenței microoganismelor la antibiotice

Efectul antibioticelor și al agenților chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme, unele mecanisme sunt intrinsece bacteriei; alte mecanisme rezultă din mutațiile genelor ce codifică pentru structurile țintă sau din dobândirea genelor ce modifică sau hidrolizează antibioticele (fig. 27).

Figura 27. Ilustrarea schematică a principalelor mecanisme care determină rezistența la antibiotice. Genele plasmidiale de rezistență codifică sinteza proteinelor de eflux, enzimele care degradează antibioticul sau enzimele care modifică structura antibioticului (după Yim, 2006).

Inactivarea enzimatică a antibioticelor

Inactivarea enzimatică a medicamentului este cel mai comun mecanism prin care se naște rezistența la o varietate largă de tipuri structurale de antibiotice. Genele codificatoare ale enzimelor ce inactivează diferitele antibiotice se găsesc în rezerva naturală de gene de rezistență: bacteriile din sol care trăiesc în proximitatea organismului producător de antibiotic, pot să producă enzime inactivatoare ale antibioticului. Genele ce codifică sinteza enzimelor inactivatoare pot fi transferate prin conjugare mediată de plasmide, ceea ce explică frecvența înaltă la tulpinile bacteriene supuse presiunii selective a antibioticelor. Antibioticele pot fi inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimică, astfel încât ele nu mai sunt transportate în celulă sau nu mai interacționează cu ținta specifică.

Modificarea chimică poate conferi rezistență clinică la aminoglicozide, cloramfenicol, peniciline, cefalosporine. β-lactamazele catalizează hidroliza ciclului β-lactamic (Bachmann și colab., 1998), iar acetil-transferazele transferă un grup acetil de la un donor la un grup funcțional al antibioticului, convertindu-l la forma sa inactivă. Unele bacterii patogene Gram pozitive (stafilococi, enterococi) posedă o enzimă bifuncțională, care inactivează aminoglicozidele: enzima are activitate acetil- și fosfotransferază. Cele două gene au fost dobândite din surse diferite. Ulterior, cele două gene au fuzionat și au generat o genă hibridă, cu distribuție largă la stafilococi și enterococi.

Efluxul activ al antibioticelor

ADN cromosomal și plasmidial bacterian posedă un mare rezervor de gene de rezistență, ce codifică diferite mecanisme de rezistență la medicamente: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, modificarea țintei acțiunii antibioticului.

Celulele bacteriene și eucariote au o varietate de sisteme de transport membranar, care îndeplinesc funcții vitale: înglobarea nutrienților esențiali, eliminarea compușilor toxici, menținerea homeostaziei celulare. Identificarea sistemelor de transport, al căror număr este într-o continuă creștere, se datorează utilizării tehnicilor de clonare genică și secvențiere (Paulsen, 1996). S-au identificat numeroase proteine de transport membranar (de ordinul sutelor), care au funcții fiziologice importante, dar funcționează și pentru eliminarea substanțelor toxice din celulă.

Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al rezistenței. De exemplu, în celulele neoplazice umane, rezistența la agenții chimioterapeutici antitumorali este mediată în mod obișnuit de pompa de eflux reprezentată de glicoproteina P, iar la bacteriile patogene, rezistența la antibiotice și antiseptice se datorează frecvent, eliminării medicamentului. Sistemele de rezistență prin flux sunt dependente de energie și pot fi sisteme de transport activ primare sau secundare. Pompele de eflux pot fi specifice pentru un anumit medicament (de exemplu, transportorul TetB la E. coli, elimină tetraciclina și un spectru îngust de analogi structurali) sau transportă o largă varietate structurală de medicamente și de aceea s-au numit pompe cu funcție transportoare multiplă. Specificitatea de acțiune a transportorilor de eflux este variabilă: majoritatea transportorilor, inclusiv determinanții efluxului de tetraciclină, au un spectru îngust de acțiune, iar pompele de tip MDR (rezistență multiplă = multi drug resistance) exportă compuși chimici cu structură chimică heterogenă.

Sistemele de eflux multiplu au o semnificație clinică majoră: dobndirea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la un spectru larg de agenți chimioterapeutici. Cea mai bine caracterizată pompă de eflux multiplu este glicoproteina P, care conferă rezistența la un spectru larg de medicamente citotoxice prin exportul dependent de ATP. Bacteriile exprimă și își duplică informația de supraviețuire, printre care și genele de rezistență la medicamente, localizate pe plasmide, transpozoni și integroni. Rezistența mediată de pompele membranare de eflux a fost evidențiată inițial, la o tulpină de E. coli, rezistentă la tetraciclină.

Transportorii membranari, cu rol de pompe de eflux, pot fi transportori primari de tipul ABC (ATP-binding cassete) și utilizează energia rezultată din hidroliza ATP, iar transportorii secundari folosesc ca sursă de energie, gradientul chimic transmembranar (forța proton-motrice) (fig. 28).

Figura 28. Reprezentarea schematică a transportorilor primari multipli de tip ABC (A) care utilizează ATP ca sursă de energie și a celor de tip secundar (B) care expulzează antibiotice cu structuri chimice diverse. Efluxul este cuplat cu schimbul de protoni sau ioni de Na (după Putman si colab., 2000).

Toate proteinele de eflux dependente de ATP aparțin suprafamiliei ABC, cunoscute și sub denumirea de ATP-aze de trafic. În general, transportorii de tip ABC au o structură moleculară alcătuită din 4 domenii:

două domenii membranare foarte hidrofobe, care formează 6 helixuri transmembranare

două domenii care leagă nucleotidele (NBD = nucleotid binding domains).

Cei mai mulți transportori de medicamente de tip ABC mediază exportul specific al antibioticelor. Primul transportor bacterian din clasa ABC s-a identificat la Lactococcus lactis: este o proteină membranară de 590 aminoacizi, cu domeniul hidrofob la capătul N-terminal și domeniul hidrofil la capătul C-terminal, care conține caseta ce leagă ATP (fig. 29).

Figura 29. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli de medicamente (multidrug) din suprafamilia ABC

(după Putman si colab., 2000).

Primele proteine identificate ca transportoare ale medicamentelor au fost pompele de eflux pentru tetraciclină, care conferă rezistența bacteriilor Gram pozitive și Gram negative.

Glicoproteina P aparține familiei de transportori de tip ABC (ATP Binding Cassette).

4.7. Sisteme de eflux multiplu dependente de forța proton-motrice

Ulterior s-a identificat un număr mare de proteine de transport, care conferă rezistență multiplă la medicamente (MDR = Multidrug Resistance), implicate în exportul unei mari diversități de compuși chimici antimicrobieni, neînrudiți din punct de vedere structural.

Determinanții MDR pot să contribuie la emergența microorganismelor rezistente prin două mecanisme:

conferă protecție celulei la o concentrație scăzută a agentului antimicrobian, favorizând supraviețuirea acesteia ;

conferă protecție față de concentrații mari ale multor compuși antimicrobieni.

Pompele de tip MDR exportă nu numai substanțe antimicrobiene cu moleculă mică, dar și substanțe bactericide produse de organismul gazdă, ca de exemplu peptidele cationice antimicrobiene.

Pompele membranare de eflux din membrana celulelor bacteriene au un corespondent structural și fiziologic în celula eucariotă, reprezentat de glicoproteina P, care poate conferi rezistență la concentrații mari de agenți chimici antitumorali.

Transportorii multipli conferă rezistență multiplă și utilizează gradientul electrochimic transmembranar al protonilor, sau uneori al ionilor de Na+, pentru a elimina medicamentul. Acestea sunt exprimate la organismele saprobionte și patogene de tip sălbatic, care nu au venit în contact cu antibioticele (înainte ca efluxul semnificativ al agentului antimicrobian să se producă), dar funcționează la un nivel semnificatv mai înalt la organismele rezistente (Westbrock, 1999). Existența sistemelor de eflux, atât la bacteriile patogene cât și la cele saprobionte, sugerează că genele de rezistență sunt colectate cu aceiași rată. Pompele de eflux conferă avantaj celulei, ceea ce explică conservarea genelor și diseminarea largă în populațiile bacteriene (fig. 30).

Transportorii multipli secundari sunt sensibili la agenții care perturbă forța proton-motrice, ceea ce sugerează faptul că ele mediază eliminarea compușilor toxici din celulă, în schimbul protonilor.

Figura 30. Extruzia antibioticelor hidrofobe în spațiul extracelular prin intermediul transportorilor multipli (multidrug)

(după Putman si colab., 2000).

Pe baza dimensiunilor, asemănărilor și structurii primare și secundare, transportorii secundari care conferă rezistență multiplă la medicamente pot fi împărțiți în familii distincte:

– familia moleculelor mari (MF = Major Facilitator)

– familia moleculelor mici (SMR = Small Multidrug Resistance)

– familia moleculelor de Rezistență-Nodulare-Diviziune celulară (RND)

– familia moleculelor de rezistență multiplă și de eliminare a compușilor toxici (MATE).

Moleculele acestor familii au rolul nu numai de a exporta medicamentele, ci sunt implicate și în alte procese fiziologice de transport, dependente de forța proton-motrice.

Familia proteinelor mari de transport (MF) este reprezentată de peste 300 de proteine membranare, fiecare cu specificitate pentru o clasă de compuși: glucide, anioni organici și anorganici. Ele se găsesc atât în membrana bacteriilor, cât și la eucariotele superioare. Sunt molecule alcătuite dintr-un singur polipeptid, care transportă numai molecule mici ca răspuns la gradienții chemoosmotici. Sunt molecule care îndeplinesc funcții fiziologice importante: uniport, simport și antiport pentru monozaharide, oligozaharide, pentru intermediarii ciclului Krebs, esteri ai fosfaților și pentru antibiotice (fig. 31, 32).

Proteinele de eflux care conferă rezistență sunt molecule mari care pot fi divizate în familii distincte: cu 12 și respectiv cu 14 domenii transmembranare (Putman, 2000).

Figura 31. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia MFS- model structural cu 14 domenii segmente transmembranare (TMS) (după Putman si colab., 2000).

Figura 32. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia MSF- model strucutural cu 12 segmente transmembranare (după Putman si colab., 2000).

Cel mai cunoscut transportor MDR cu 14 segmente transmembranare este proteina Qac de la Staphylococcus aureus, funcțională ca sistem uniport, simport sau antiport a unei varietăți mari de substanțe, prin membrană (Fig. 16).

Transportorii MDR cu 12 domenii transmembranare sunt ilustrați de proteina Nor A la St. aureus, descoperită la o tulpină rezistentă la quinolone și la meticilină (Fig. 17). Nor A este o proteină membranară de 388 aminoacizi ce conferă rezistența la compușii hidrofili și rezistență scăzută sau absența rezistenței la medicamentele hidrofobe. Nor A este un transportor multiplu adevărat, deoarece mediază rezistența la o varietate de medicamente diferite structural.

Familia moleculelor mici de rezistență (SMR – Small Molecule Rezistence) multiplă la medicamente cuprinde cele mai mici proteine cunoscute de eflux secundar: au circa 105-107 resturi de aminoacizi (Putman și colab., 2000).Catena polipeptidică formează numai 4 segmente transmembranare. Se crede că aceste pompe mici de eflux multiplu funcționează ca homooligomeri, alcătuiți probabil din 3 monomeri (fig. 33).

Figura 33. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia SMR (după Putman și colab., 2000).

Familia moleculelor mici de eflux constă din două subfamilii filogenetice:

– cele care conferă MDR pe calea unui mecanism antiport medicament : protoni (H+), ca și proteinele de rezistență ale familiei MF;

– cele care nu conțin permeaze cu specificitate de medicament, ci numai pompe de eflux de tip MDR: de exemplu, QacC ce conferă rezistența la compusul quaternar de amoniu la Staphylococcus (Paulsen, 1996).

Moleculele familiei de rezistență-nodulare-diviziune celulară (RND), din punct de vedere funcțional, aparțin la 3 subfamilii specific-bacteriene (fig. 34):

– unele catalizează transportul antiport medicament : H+ , sau pot fi specifice pentru ionii bivalenți ai metalelor grele;

– altele au specificitate pentru lipooligozaharide

– cele din grupul al III-lea catalizează efluxul medicamentelor multiple.

Figura 34. Reprezentarea schematică a transportorilor multipli din familia RND (după Putman si colab., 2000).

Deoarece transportorii de eflux pompează substanțele prin membrana citoplasmatică și prin spațiul periplasmic al bacteriilor Gram negative, o punte proteică reprezentată de o proteină de fuziune membranară, traversează acest spațiu și transferă moleculele porinelor membranei externe, care le elimină în spațiul extracelular. Proteinele de eflux din familia RND au 12 domenii transmembranare.

Sistemele de eflux multiplu din familia RND au o specificitate de substrat mult mai largă decât proteinele de eflux multiplu de tipul sistemului facilitator (MFS) sau al moleculelor mici (SMR).

Familia proteinelor de eliminare a medicamentelor și a compușilor toxici (MATE) s-a descris la Vibrio parahaemolyticus pentru efluxul norfloxacinei (Nor M). Nor M este dependent de energie și mediază rezistența la coloranți, fluoroquinolone hidrofile și aminoglicozide. Toate cele 4 familii de molecule de transport secundar (MFS, SMR, RND și MATE) sunt dependente de gradientul electrochimic transmembranar al protonilor – forța proton motrice – sau posibil, al ionilor de Na.

Transportul e- la O2, aparent produce H2O, dar de fapt, prin disocierea H2O, produce H+ și OH- care se concentrează pe cele două fețe ale membranei.

Diferența de pH și de potențial electrochimic de pe cele două fețe determină o stare energizată a membranei, asemenea unei baterii, care se măsoară în volți și se exprimă ca forță proton motrice.

Forța proton-motrice rezultă dintr-un gradient chimic transmembranar de protoni, acid pe fața externă a membranei, alcalin pe fața internă și un potențial electric, pozitiv pe fața externă și negativ pe fața internă a membranei.

Transportorii primari de rezistență multiplă dependenți de ATP sunt proteine din categoria ATP-azelor de trafic. Cei mai mulți transportori din această categorie mediază exportul specific al antibioticelor.

Atât transportorii primari (cei care leagă ATP), cât și cei secundari elimină din celulă o mare varietate de compuși toxici. Substraturile pe care le leagă sunt heterogene din punct de vedere structural, dar au caracteristici fizice comune: sunt molecule hidrofobe, amfifile și au sarcină pozitivă sau sunt neutre. Aceste caracteristici permit substraturilor transportate să se intercaleze în membrană, ceea ce a dus la ipoteza că transportorii multipli preiau și transportă moleculele din dublul strat lipidic și nu din faza apoasă a citoplasmei.

Pompele de eflux care conferă rezistență multiplă la antibiotice creează dificultăți mari în tratamentul maladiilor infecțioase. Rolul nativ al sistemelor de eflux este apărarea celulei de compușii toxici exogeni. Alteori, sistemele de eflux multiplu par să îndeplinească funcții primare, nelegate de rezistența la medicamente. Ele transportă medicamente multiple numai în situații speciale.

Rezistența prin impermeabilitatea porinelor

Antibioticele policationice din grupul polimixinei se complexează avid cu LPS și dezorganizează membrana externă, mărind permeabilitatea pentru agenții cu acțiune asupra membranei sau componentelor citoplasmatice. Toți agenții policationici se leagă de LPS anionice, cu o afinitate variabilă (Bryan, 1984). Bacteriile Gram negative sunt rezistente la detergenții anionici și neutri, dar sunt sensibile la detergenții monocationici. Agenții chelatori ai ionilor de Ca2+ și Mg2+ dezorganizează și permeabilizează membrana externă. În general, barierele fizice de permeabilitate produc rareori fenomene de rezistență semnificativă, deoarece nici cele mai eficiente bariere nu pot stopa complet difuzia liberă a moleculelor mici. Scăderea ratei influxului, ca mecanism posibil al emergenței rezistenței, a fost argumentat de concentrația intracelulară mică a cloramfenicolului.

Bacteriile Gram negative pot dobândi rezistență înaltă ca rezultat al mutațiilor care modifică porinele și astfel rata difuziei pasive a medicamentului scade foarte mult. Influxul mediat de porine este contracarat de efluxul activ. Structura moleculară, dar în special datele experimentale, sugerează că antibioticele mici (β-lactamice, tetraciclina, cloramfenicolul, fluoroquinolonele) pătrund în celulă în special pe calea porinelor, cel puțin la enterobacterii, care posedă porine cu permeabilitate înaltă. Spre deosebire de acestea, antibioticele cu molecule mari, lipofile (macrolide, rifamicinele, novobiocina, acidul fusidic) difuzează cu dificultate prin porii canalelor. Pentru ele, difuzia lentă prin stratul lipidic este o cale semnificativă de pătrundere în celulă.

Pentru agenții antibacterieni care traversează membrana externă prin canalele formate de porine, scăderea permeabilității porinelor poate să mărească nivelul rezistenței. Pierderea mutațională a porinelor crește rezistența la antibioticele hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari decât nutrienții și trec greu prin canalele de transport ale acestora.

Modificarea mutațională a țintei antibioticului

Multe antibiotice inactivează o enzimă specifică sau ribosomii. Un număr mare de tulpini rezistente apar printr-un proces mutațional: sintetizează o proteină țintă care devine incapabilă să lege antibioticul sau mai rar, ținta își păstrează funcția chiar după legarea antibioticului. Adeseori, diferența dintre proteina de tip sălbatic și cea mutantă constă în substituția unui singur aminoacid în catena proteică. Ribosomii stafilococului pot deveni rezistenți la eritromicină după modificarea ARNr, iar rezistența la rifampină poate să rezulte din schimbarea unui singur aminoacid în subunitatea b a ARN-polimerazei.

Rezistența la unele antibiotice apare prin dobândirea unei gene care codifică o enzimă țintă cu afinitate mult mai mică decât enzima de tip sălbatic: PBP2a (Penicillin Binding Protein)este codificată de o genă care conferă rezistență și care s-a răspândit la speciile de stafilococi (Pinho, 2001).

Utilizarea unei căi metabolice rezistente (de ocolire a căii metabolice inhibate)

Dacă un medicament este activ prin inhibarea unei enzime esențiale a unei căi metabolice, celulele care produc o cantitate mai mare de enzimă pot supraviețui în prezența medicamentului. De exemplu, rezistența la trimetoprim poate fi datorată supraproducției dihidrofolat reductazei (DHFR), mutației genei structurale a DHFR sau dobândirii unei gene care codifică o enzimă rezistentă la DHFR, sau streptomicetele care necesită timidină, dar nu sunt inhibate de trimetoprim și de sulfonamide deoarece produc concentrații adecvate de timidină pe o cale alternativă.

Rareori, mediamentul trebuie să fie convertit de bacterii, la forma sa activă. Mutantele care nu pot metaboliza medicamentul devin rezistente: de exemplu, Bacteroides fragilis nu metabolizează metronidazolul și este rezistentă.

Rezistența multiplă la medicamente poate să apară prin următoarele mecanisme:

– mutațiile genelor codificatoare ale sintezei moleculelor membranare transportoare cu rol fiziologic, urmată de amplificarea lor și schimbarea nivelului de activitate;

– mutațiile genelor reglatoare, care amplifică expresia transportorilor multipli;

– transferul intercelular al genelor de rezistență, prin intermediul transpozonilor sau al plasmidelor.

Localizarea membranară a pompelor de eflux a îngreunat eforturile de a defini mecanismele moleculare care guvernează activitatea acestor proteine. Progresul cunoașterii a fost mult mai rapid în ceea ce privește reglarea activității pompelor de eflux. Supraproducția constitutivă a proteinelor de eflux, în absența agentului chimic, creează un dezavantaj sever în competiția cu cele care exprimă adaptativ proteinele de eflux.

Proteinele transportoare de eflux nu sunt sintetizate în exces, situație reflectată în faptul că aceste proteine sunt foarte greu de produs în cantități adecvate scopului purificării. Sinteza unora dintre ele nu necesită mecanisme reglatoare, datorită nivelului natural scăzut al expresiei, dar sinteza celor mai multe este supusă reglării la nivelul transcrierii și traducerii. Existența celor două trepte de control reflectă măsurile de siguranță ale celulei față de efectele defavorabile ale supraproducției transportorului. Genele codificatoare ale proteinelor inductibile de eflux posedă mecanisme proprii de control al transcrierii și traducerii. Este însă la fel de important ca proteinele de eflux să fie disponibile în condițiile în care sinteza lor este necesară (Moir și colab., 1999). Astfel, expresia celor mai multe proteine de eflux al medicamentelor este inductibilă.

Bibliografie selectivă

Arnstein H.R., Margreiter H., The biosynthesis of penicillin. 7. Further experiments on the utilization of l- and d-valine and the effect of cystine and valine analogues on penicillin synthesis, Biochemestry Journal. 1958, 68(2): 339-348.

Bachmann B.O., Li R., Townsend C.A., .β-Lactam synthetase: A new biosynthetic enzyme, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998, 95(16): 9082-9086.

Balows A., (ed) Manual of Clinical Microbiology, 5th ed., Washington D.C, American Society for Microbiology, 1991.

Bayarski Y., Antibiotics Classification And Side Effects. EzineArticles. 2006.

Brakhage A.A., Molecular Regulation of β-Lactam Biosynthesis În Filamentous Fungi, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998, 62(3): 547-585.

Brock T.D., Medigan M.T., Martinco J.M., Parker J., Biology of Microorganisms Tenth Ed. , New Jersey, Prentice Hall Intern. Inc., 2003, p: 727-804, 846-875, 965-994.

Brock Th. Biology of microorganisms, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988.

Brock Th., Biology of microorganisms, 11th Ed. Madigan M. T., Martinko J. M (eds) Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey. 2005

Bryan L.E., O'Hara K., Wong S., Lipopolysaccharide changes În impermeability-type aminoglycoside resistance În Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, 26(2): 250-255.

Casey M.L., Paulick R.C. and Whitlock H.W. Carbon-13 nuclear magnetic resonance study of the biosynthesis of daunomycin and islandicin. J Org Chem. 1978, 43:1627-1634

Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003, 100(Suppl 2): 14555-14561.

Dale J., Molecular Genetics of Bacteria, 3rd edition, J. Willy & sons Ltd. 1998.

Davis M. J. Fastidious bacteria. Methods in Phytobacteriology. Z. Klement, K. Rudolph and D. Sands. Budapest, Hungary, Akademiai Kiado. 1990, 75-85.

Distler J., Ebert A., Mansouri K., Pissowotzki K., Stockmann M., Piepersberg W., Gene cluster for streptomycin biosynthesis În Streptomyces griseus: nucleotide sequence of three genes and analysis of transcriptional activity, Nucleic Acids Research. 1987, 15(19): 8041-8056.

Dixon B., Changing pictures of patogenicity and virulence. ASM News. 2000, 66:122-127.

Esmahan C., Alvarez E., Montenegro E., Martin J.F., Catabolism of lysine În Penicillium chrysogenum leads to formation of 2-aminoadipic acid, a precursor of penicillin biosynthesis, Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60(6): 1705-1710.

Fawcett P.A., Usher J.J., Huddleston J.A., Bleaney R.C., Nisbet J.J., Abraham E.P., Synthesis of delta-(alpha-aminoadipyl) cysteinylvaline and its role În penicillin biosynthesis, Biochemestry Journal. 1976, 157(3): 651-660.

Gander S., Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents. Journal Antimicrobiology and Chemotherapy. 1996, 37: 1047-1050.

Gottlieb D., Shaw P. D., Antibiotics, vol. I; Structure, vol. II, Biosynthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York. 1967.

Grohmann E., Muth G., Espinosa M., Conjugative Plasmid Transfer În Gram-Positive Bacteria, Microbiol Mol Biol Rev. 2003, 67(2): 277-301.

Kitamura I., Tobe H., Yoshimoto A., Oki T., Naganawa H., Takeuchi T., Umezawa H. Biosynthesis of aklavinone and aclacinomycins. J Antibiot. 1981, 34: 1498-1500

Kruse H., Sorum H., Transfer of Multiple Drug Resistence Plasmids between Bacteria of Diverse Origins În Natural Microenvironments. Appled and Environemental Microbiology. 1994, 60: 4015-4021.

Lengyel P., Söll D., Mechanism of protein biosynthesis, Bacteriology Reviews. 1969, 33(2): 264-

Livermore D.M., beta-Lactamases În laboratory and clinical resistance, Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8(4): 557-584.

Majumdar S.K., Kutzner H.J., Studies on the Biosynthesis of Streptomycin, Applied Microbiology. 1962, 10(2): 157-168.

Malmberg L.H., Hu W.S, Sherman D., Precursor Flux Control through Targeted Chromosomal Insertion of the Lysine ε-Aminotransferase (lat) Gene În Cephamycine C Biosynthesis, Journal of Bacteriology. 1993, 175(21): 6916-6924.

Martin J.F., Demain A.L., Control of Antibiotic Biosynthesis, Microbiological Reviews. 1980, 44(2): 230-251.

Martín J.F., Molecular Control of Expression of Penicillin Biosynthesis Genes În Fungi: Regulatory Proteins Interact with a Bidirectional Promoter Region, Journal of Bacteriology. 2000, 182(9): 2355-2362.

Moir D.T., Shaw K.J., Hare R.S., Vovis G.F., Genomics and Antimicrobial Drug Discovery, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(3): 439-446.

Müller W.H., van der Krift T.P., Krouwer A.J., Wösten H.A., van der Voort L.H., Smaal E.B., Verkleij A.J., Localization of the pathway of the penicillin biosynthesis În Penicillium chrysogenum, The EMBO Journal. 1991, 10(2): 489-495.

Paulsen I.T., Brown M.H., Littlejohn T.G., Mitchell B.A., Skurray R.A., Multidrug resistance proteins QacA and QacB from Staphylococcus aureus: membrane topology and identification of residues involved În substrate specificity, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1996, 93(8): 3630-3635.

Paulsen T. J., Proton-dependent Multidrug efflux Systems, Microbiology Reviews. 1996, 60(4): 575-608.

Peirú S., Menzella H.G., Rodríguez E., Carney J. and Gramajo H., Production of the Potent Antibacterial Polyketide Erythromycin C În Escherichia coli, Applied and Environemental Microbiology. 2005, 71(5): 2539–2547.

Pfeifer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides În heterologous host, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118.

Pinho M. G., de Lencastre H., Tomasz A. An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98: 10886-10891

Putman M., van Veen H.W., Konings W.N., Molecular Properties of Bacterial Multidrug Transporters, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000, 64(4): 672-693.

Queener S.W., Molecular biology of penicillin and cephalosporin biosynthesis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(6): 943-948.

Recchia G.D., Hall R.M., Plasmid evolution by acquisition of mobile gene cassettes: plasmid pIE723 contains the aadB gene cassette precisely inserted at a secondary site În the IncQ plasmid RSF1010, Molecular Microbiology. 1995, 15:179-187.

Recchia G.D., Hall R.M.,. Gene cassettes: a new class of mobile element, Microbiology. 1995, 141: 3015-3027.

Rosen P., Barkin R.M., eds. Emergency Medicine: Concepts and Clinical Practice, Mosby-Year Book. 1992.

Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman. 1998.

Trip H., Evers M.E., Kiel J.A., Driessen A.J., Uptake of the β-Lactam Precursor α-Aminoadipic Acid În Penicillium chrysogenum Is Mediated by the Acidic and the General Amino Acid Permease, Applied and Environemental Microbiology.. 2004, 70(8): 4775-4783.

Waksman S., The role of antibiotics in nature. Perspectives in Biology and Medicine. 1961; 4(3): 271-272.

Waksman S.A. The Actinomycetes. Vol. II. Bailliere, Tindall and Cox, London, 1961

Watanabe T., Fukasawa T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. : transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961, 81(5):669–678

Watanabe T., Fukasawa, T. Episome-mediated transfer of drug resistance in enterobacteriaceae i. : transfer of resistance factors by conjugation. J Bacteriol. 1961 May;81(5):669–678.

Westbrock-Wadman S., Sherman D.R., Hickey M.J., Coulter S.N., Zhu Y.Q., Warrener P., Nguyen L.Y., Shawar R.M., Folger K.R., Stover C.K., Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Efflux Pump Contributing to Aminoglycoside Impermeability, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(12): 2975-2983.

Yim Grace, Attack of the superbugs: antibiotic resistance, The Science Creative Qurterly. 2006

Capitolul 5

CARACTERIZAREA PRICIPALELOR CLASE DE ANTIBIOTICE

5.1. Aminoglicozidele

Aminoglicozidele sunt zaharuri complexe, conectate prin legături glicozidice. Ele diferă atât prin nucleul molecular care poate fi streptidina sau 2-deoxistreptidina, cât și prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko, 2003). Pentru activitatea antimicrobiană, esențiale sunt grupările NH2 și OH libere, prin intermediul cărora aminoglicozidele se leagă de proteinele ribosomale.

Primul antibiotic aminoglicozidic – streptomicina sintetizată de Streptomyces griseus – a fost introdus în clinică de către Schatz și colaboratorii (1944), fiind activă pentru tratamentul tuberculozei, proprietate care s-a păstrat și rămâne medicamentul de elecție pentru chimioterapia combinată a tuberculozei rezistente la medicamente. A fost un instrument util pentru elucidarea sintezei proteinelor, dar este rareori folosită în clinică, cu excepția tratamentului tuberculozei, iar modul său de acțiune diferă într-o oarecare măsură de al altor aminoglicozide utilizate în clinică. Valoarea terapeutică a celorlalte aminoglicozide s-a ameliorat prin cercetări chimiofarmaceutice, care au generat noi variante semisintetice pornind de la moleculele parentale. Ele și-au păstrat rezistența la acțiunea enzimelor degradative ori au un spectru mai larg de activitate.

Streptomicina are structura unui trizaharid, fiind alcătuită din 3 subunități reunite prin legături glicozidice: streptidina, streptoza și N-metil-glucozamina. Streptidina este un inozitol substituit cu două grupări guanido, iar streptoza și N-metil-glucozamina formează dizaharidul streptobiosamină, cu o grupare metilamino. Legăturile glicozidice dintre componente sunt în configurație . Activitatea antibacteriană este anihilată prin clivajul acid al legăturii glicozidice dintre streptidină și streptobiosamină, prin înlocuirea grupărilor guanido cu grupele amino sau prin carbobenziloxilarea aminei secundare. Prin clivajul acid rezultă streptidina și dizaharidul streptobiosamina.

Structura moleculară a streptomicinei

Compușii strâns înrudiți cu streptomicina se formează prin modificări structurale ale streptozei și streptidinei.

Clasificarea aminoglicozidelor

Principalele grupe de antibiotice aminoglicozidice sunt cele din grupa II care conține streptomicina și derivații săi și cele grupa V care este subdivizată în 4 subgrupe.

Structura moleculară a streptograminei A Structura moleculară a streptograminei B

Subgrupa V A conține kanamicina, tobramicina și derivați semisintetici (amikacina, dibekacina, habekacina). Subgrupa V B conține complexul gentamicina și isepamicina, iar subgrupa C cuprinde antibiotice fără semnificație clinică. Subgrupa V D conține sisomicina si netilmicina.

Aminoglicozidele – gentamicina, tobramicina, amikacina și streptomicina sunt folosite în mod curent pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram pozitive și Gram negative.

Structura moleculară a gentamicinei Structura moleculară a streptomicin-sulfatului

Structura moleculară a gentamicin-sulfatului Structura moleculară a clindamicinei

Spectrul de activitate a aminoglicozidelor

Antibioticele aminoglicozidice au un spectru larg de activitate față de bacilii Gram negativi (E. coli, Salmonella spp, Shigella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Acinetobacter spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Morganella spp. și Pseudomonas spp., precum și S. aureus și unii streptococi. În vitro, aminoglicozidele nu sunt active față de Bacteroides spp. și alte bacterii anaerobe, Str. pneumoniae, N. gonorrhoeae, iar activitatea față de enterococi este evidentă numai în asociație sinergică cu antibioticele antiparietale (-laclami și vancomicina).

Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminoglicozidice este diferit. Streptomicina este bactericidă pentru o largă varietate de specii bacteriene Gram pozitive și Gram negative. Celulele animale sunt relativ insensibile la streptomicină, deși apar fenomene de otitoxicitate, nefrotoxicitate și hipersensibilitate. Datorită sarcinii sale electrice, streptomicina interacționează cu multe componente anionice celulare. În vitro, precipită ADN. În general, aminoglicozidele mai noi (gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, isepamicina, dibekacina și arbekacina) au un spectru mai larg decât cele vechi (streptomicina, kanamicina). Deși manifestă nefrotoxicitate și otitoxicitate, iar apariția tulpinilor rezistente este relativ frecventă, aminoglicozidele rămân foarte importante pentru tratamentul unor infecții în situații speciale.

Aminoglicozidele au câteva particularități ale acțiunii antimicrobiene:

activitatea bactericidă este dependentă de concentrație;

– manifestă efectul postantibiotic;

– au o farmacocinetică relativ predictibilă;

– manifestă efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.

Activitatea batericidă a aminoglicozidelor depinde în primul rând de concentrația lor, decât de durata expunerii bacteriilor la concentrațiile inhibitorii ale antibioticului și este mai puțin dependentă de dimensiunile populației bacteriene. Potențialul bactericid, dependent de concentrație, crește odată cu creșterea concentrației antibioticului. Aminoglicozidele manifestă efectul postantibiotic, adică continuă să fie bactericide chiar după stoparea administrării antibioticului. Activitatea bactericidă dependentă de concentrație și efectul postantibiotic, asociat cu riscul atenuat de nefrotoxicitate și ototoxicitate, fac posibilă administrarea unei singure doze/zi, la pacienții cu funcție renală normală.

Sinergismul cu antibioticele antiparietale este probabil, rezultatul înglobării aminoglicozidelor la o concentrație superioară, cauzată de permeabilitatea crescută a celulelor bacteriene, după incubarea cu inhibitorii sintezei peretelui celular. Efectul sinergic al aminoglicozidelor și -lactamilor este foarte evident față de enterococi.

Antibioticele aminoglicozidice sunt folosite pentru tratamentul pacienților neutropenici febrili și a celor cu infecții grave produse de microorganisme Gram negative (enterobacterii, Ps. aeruginosa). Pentru infecțiile tractului urinar, terapia cu aminoglicozide este eficientă, deoarece antibioticele administrate intravenos sunt excretate exclusiv pe cale renală.

Inglobarea aminoglicozidelor

Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu greutate moleculară mică, dar foarte hidrofile. Acumularea lor în celula sensibilă are loc în trei faze. Prima fază constă în interacțiunea ionică cu componentele peretelui celular, urmată de difuzia antibioticului prin pereții bacteriilor Gram pozitive, sau de trecerea prin membrana externă la bacteriile Gram-negative.

Datorită caracterului policationic, aminoglicozidele deplasează ionii de Mg care asigură legătura între grupările fosfat ale lipidelor membranare, auto-amorsându-și în acest fel trecerea prin dezorganizarea membranei externe. Simpla difuzie la nivelul porinelor, al căror diametru este la limita excluderii aminoglicozidelor, nu ar putea realiza concentrații intracelulare crescute de antibiotic (Hancock, 1991). Perturbarea integrității lipopolizaharidelor în sine, a fost considerată ca o componentă a efectului bactericid independent de evenimentele declanșate la nivelul ribosomului.

Aminoglicozidele se acumulează în celulă numai printr-un proces de transport dependent de energie. Acumularea lor în celula bacteriană parcurge două faze: faza I este lentă și depinde de gradientul transmembranar al potențialului electric și deci al fenomenului membranar oxidativ; faza a II-a este rapidă și se traduce printr-o acumulare intracelulară importantă. Concentrațiile intracelulare sunt de circa 100 ori mai ridicate decât cele din mediul extern. Acumularea lentă a antibioticului determină un efect bacteriostatic, iar acumularea rapidă produce efectul bactericid. Rata acumulării este condiționată de mărimea componentei electrice (Δψ), a forței proton-motrice care la rândul ei depinde de funcționarea catenei de respirație și de ATP-aza membranară. Astfel se explică de ce microorganismele cu sisteme transportoare deficiente, cum sunt cele anaerobe, sunt intrinsec rezistente la aminoglicozide. Din același motiv, enterococii și alți anaerobi facultativi sunt rezistenți la concentrațiile mici de aminoglicozide.

Un rol important în acumularea intracelulară a aminoglicozidelor îl au proteinele periplasmatice a căror sinteză este indusă de antibiotic.

Mecanismul de acțiune a aminoglicozidelor

Aminoglicozidele se leagă de ribosomii bacterieni și inhibă sinteza proteinelor. Ribosomul este o structură complexă, în alcătuirea căruia intră 3 molecule de ARN și peste 50 de tipuri de proteine. Subunitatea mare a ribosomului cuprinde două molecule de ARN 5S și 23S și 33 proteine, iar subunitatea mică conține o singură moleculă de ARN 16S și 20 – 21 proteine. Aminoglicozidele se leagă de subunitatea 30S, care are rol esențial în traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic (fig. 35).

Ribosomul are 3 situsuri de legare a ARNt, desemnate A (Aminoacil), P (Peptidil) și E (Exit). În timpul sintezei proteinelor, ribosomii decodifică informația din ARNm și catalizează formarea legăturilor peptidice. Acumularea rapidă a aminoglicozidelor saturează toți ribosomii, producând moartea celulei.

Figura. 35. Ilustrarea schematică a mecanismului de acțiune al aminoglicozidelor: inhibiția formării complexului ribosom 30S – ARNm (Neu și colab., 1988).

Aminoglicozidele induc fenomenul de pleiotropism (modifică expresia unui număr mare de gene) și interacționează cu mecanismul sintezei proteice. Pentru că interacționează cu ribosomii, aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm. Secvența de baze a ARNm este citită greșit și se sintetizează proteine nefuncționale sau sinteza proteinelor este stopată. Streptomicina a devenit un instrument pentru studiul fidelității traducerii informației genetice.

Alte antibiotice aminoglicozidice (bluensomicina, kanamicina, neomicina și paromomicina (toate sunt sintetizate de specii de Streptomyces), induc erori de citire a mesajului În vitro, în sisteme acelulare.

Aminoglicozidele sunt antibiotice cu efect rapid și cu spectru larg de acțiune: sunt sensibile bacteriile strict sau facultativ aerobe Gram pozitive sau negative. Acestea sunt zaharuri sau pseudo-zaharuri aminate, cu caracter policationic, care explică câteva aspecte legate de modul lor de acțiune. Toate aminoglicozidele utilizate în terapeutică, streptomicina și streptinomicina conțin un ciclu deoxistreptomicină bisubstituit în poziția 4 și 6.

Spre deosebire de alte familii de antibiotice, în special β-lactamice și fluoroquinolone, aminoglicozidele folosite în prezent conțin mai puține variante moleculare.

Legându-se la ribosom, aminoglicozidele, pe de o parte perturbă procesul de traducere introducând erori de citire, iar pe de altă parte antrenează stoparea totală a traducerii, interferând cu etapele de inițiere, alungire și terminare. Efectul primar al aminoglicozidelor ar fi ocuparea situsului acceptor (A) al ribosomului.

Streptomicina este un glicozid aminociclitol, larg folosit în terapia tuberculozei. La micobacterii, streptomicina inhibă sinteza proteinelor după 5-15 min., iar sinteza acizilor nucleici continuă pentru o lungă perioadă de timp. Mecanismul acțiunii sale la M. tuberculosis n-a fost studiat, dar la E. coli, streptomicina se leagă inițial la ARNr 16S al subunității ribosomale 30S, la nivelul nucleotidelor 15, 530, 915 și 1400/1500 (Allen, 1989 citat de Pinard, 1991). Regiunea 1400/1500 este considerată ca un component al situsului de fixare dezoxistreptaminelor (Moazed, 1986). Efectele legării aminoglicozidelor la subunitatea ribosomală mică se extind la subunitatea mare, nucleotidul 2660 a ARN 23S. Astfel, interferă cu treapta traducerii, inhibând inițierea și perturbând sinteza proteinelor (Fig. 35). Deoarece inhibă sinteza proteinelor, efectul aminoglicozidelor este bactericid. Streptomicina se leagă de proteina S12 din subunitatea 30S și face ca ribosomul să citească greșit codul genetic. Alte aminoglicozide se leagă nu numai de proteina S12, ci și de proteina L6 a subunității 50S. Acest ultim situs de legare este important pentru rezistența bacteriilor la aminoglicozide. Componenta chimică ce determină citirea greșită este streptamina sau deoxistreptamina, din moleculele de streptomicină, kanamicină, neomicină, paroromicină, gentamicină, bluensomicină etc.

Spectinomicina este un antibiotic aminociclitol, înrudit cu aminoglicozidele și are acțiune bacteriostatică. Acțiunea sa antibacteriană constă în legarea cu o altă proteină ribosomală. Este astfel blocată interacțiunea ARNm-ribosom, fără să produca citirea greșită. Se folosește pentru tratamentul gonoreii (N. gonorrhoeae) rezistentă la penicilină. În scopul tratamentului infecțiilor intracelulare, aminoglicozidele au fost încapsulate în liposomi. Încapsularea în liposomi poate să crească indexul terapeutic al medicamentului prin diminuarea nivelului medicamentului eliberat la situsurile unde este toxic față de nivelul eficienței terapeutice.

Aminoglicozidele sunt eliminate prin filtrare glomerulară și parțial sunt reabsorbite de celulele tubulare proximale printr-un mecanism de pinocitoză în vezicule mici, care fuzionează cu lizosomii, unde se acumulează. Ele induc o fosfolipidoză lizosomală caracterizată prin inhibiția activității sfingomielinazei și fosfolipazei A1 și prin acumularea fosfolipidelor în lizosomi. Fosfolipidoza este însoțită de necroză celulară și regenerare postnecrotică.

Diferiți compuși sau medicamente administrate concomitent cu aminoglicozidele pot să mărească nivelul toxicității (vancomicina, cisplatinum și hidrocortizonul) sau pot să-l diminueze (ticarcilina, carbenicilina, cefalotina, acidul poli-L-aspartic). Toxicitatea aminoglicozidelor nu este influențată de modul de administrare (singure sau în asociație), dar unele medicamente diminuă nivelul renal al acumulării în celulele tubulare.

Rezistența la antibioticele aminoglicozidice este larg răspândită și se produce prin următoarele mecanisme (fig. 36):

– înglobarea scăzută a antibioticului

– modificarea țintei ribosomale

– efluxul antibioticului

– modificarea enzimatică a aminoglicozidelor.

Înglobarea aminoglicozidelor necesită funcționarea catenei de respirație celulară, care generează un potențial electric prin membrana citoplasmatică. Un nivel scăzut al potențialului transmembranar sau absența sa, determină rezistența intrinsecă a bacteriilor anaerobe și scăderea sensibilității bacteriilor facultativ anaerobe (enterococi) la aminoglicozide.

Figura 36. Ilustrarea schematică a mecanismelor de rezistență la antibioticele aminoglicozidice (Neu si colab., 1988).

Modificarea chimică a aminoglicozidelor este principalul mecanism de rezistență bacteriană. Alte mecanisme mai rare de rezistență la aminoglicozide sunt sistemele de eflux și mutațiile situsului ribosomal de legare la ARNr ) (Leclerc și colab., 1991)

Modificarea enzimatică a aminoglicozidelor este mecanismul major de rezistență la aminoglicozide al izolatelor clinice Gram pozitive și Gram negative. Modificarea chimică are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 de enzime care modifică aminoglicozidele. Majoritatea genelor codificatoare ale enzimelor se găsesc la bacteriile Gram negative. În funcție de tipul modificării chimice pe care o catalizează, enzimele care modifică aminoglicozidele se clasifică în trei familii:

– aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC)

– aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT)

– aminoglicozid-fosfotransferaze (APH).

Aminoglicozid O-fosfo-transferaza (APH) și aminoglicozid O-adenil sau nucleotidil-transferaza (AAD sau ANT), catalizează fosforilarea și respectiv nucleotidilarea grupării hidroxil, iar aminoglicozid- N-acetiltransferaza (AAC) catalizează acetilarea grupărilor amino. APH și ANT folosesc ATP și ACA (acetil-coenzima A).

Fiecare dintre cele familii de enzime este împărțită în clase, desemnate prin situsul pe care-l modifică.

Aminoglicozid-fosfotransferazele – APH – (7 clase) sunt kinaze și utilizează ATP ca substrat secundar și fosforilează grupările specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Fosforilarea kanamicinei A catalizată de o aminoglicozid-fosfotransferază (APH), reacție energizată de ATP.

Aminoglicozid-acetiltransferazele – AAC – (4 clase de enzime) utilizează acetil-CoA ca donor al grupării acetil pentru modificarea aminoglicozidelor la gruparea amino din pozițiile 1 și 3 ale inelului deoxistreptaminei și la pozițiile 2’ și 6’ ale inelului 6-aminohexozei. Aminoglicozid 6’-acetiltransferazele au spectru larg și pot modifica majoritatea aminoglicozidelor cu importanță clinică.

Acetilarea kanamicinei A, catalizată de aminoglicozid-N-acetiltransferază (AAC), reacție energizată de coenzima A (AcCoA)

Aminoglicozid-nucleotidiltransferazele – ANT – (5 clase) utilizează ATP ca substrat secundar și modifică antibioticele aminoglicozidice prin transferul AMP la gruparea OH la pozițiile 2’’, 3’’, 4’ și respectiv 9.

Adenilarea kanamicinei A cu AMP, catalizată de aminoglicozid-nucleotidiltransferază, cu consum de ATP.

Aminoglicozidele modificate la grupările amino sau la grupul OH sub acțiunea celor trei categorii de enzime, se leagă slab sau pierd capacitatea de a se lega de ribosomi și nu declanșează faza a II-a a înglobării – dependentă de energie. Efectul inhibitor asupra sintezei proteinelor celulare nu se mai produce și bacteriile supraviețuiesc în prezența medicamentului. Inactivarea enzimatică a aminoglicozidelor este mecanismul principal de rezistență a stafilococilor. Din punct de vedere biochimic, acest mecanism de rezistență este de departe cel mai important, fiind implicat în totalitatea cazurilor de rezistență observate la enterobacterii (> 95%), la Acynetobacter (95%) și la bacteriile Gram pozitive și jumătate din cazurile de rezistență observate la Pseudomonas.

Selecția microorganismelor ce produc enzime sub acțiunea cărora modifică aminoglicozidele, depinde de cantitatea de antibiotice folosită.

Mecanismele neenzimatice de rezistență la antibioticele aminoglicozidice sunt:

– sistemele de eflux

– mutațiile ARNr

Rezistența datorată modificării țintei macromoleculare este o modalitate majoră de dezvoltare a rezistenței. Modificările țintei care determină rezistența la aminoglicozide includ schimbările mutaționale ale proteinelor ribosomale sau ale ARN 16S și metilarea enzimatică a ARNr. Schimbările mutaționale produc rezistența în special la streptomicină. Studiile de RMN (rezonanță magnetică nucleară) asupra nucleotidelor ce cuprind situsul A (acceptor) al ARN 16S, complexat cu paromomicina, precum și asupra subunității 30S complexată cu același antibiotic, relevă că medicamentul se leagă în depresiunea majoră a situsului A. Metilarea N7 a resturilor de guanină ale ARN 16S produce rezistența la concentrațiile mari de aminoglicozide la microorganismele producătoare de aminoglicozide, dar acest tip de rezistență n-a fost raportat la bacteriile cu importanță clinică. Sinteza proteinelor necesită ca anticodonii aminoacil-ARNt și codonii ARNm să se recunoască specific. Evenimentul recunoașterii are loc la nivelul subunității 30S. Fidelitatea recunoașterii este garantată de o secvență ARNr înalt conservată, care constituie situsul interacțiunii dintre codon și anticodon (situsul A). Această secvență este situsul preferat de legare al aminoglicozidelor (kanamicina și streptomicina), care pot să interfere cu sinteza proteinelor prin inducerea citirii greșite a codonilor și terminarea prematură a traducerii.

La enterococi, s-au identificat două tipuri de rezistență la streptomicină:

rezistența la nivele moderate de antibiotic, datorată permeabilității scăzute a membranei, ce poate fi depășită cu administrarea concomitentă a penicilinei, care crește permeabilitatea pentru aminoglicozide;

rezistența la doze mari, mediată ribosomal sau datorată producerii enzimelor inactivatoare ale streptomicinei.

Rezistența la gentamicină se datorează prezenței enzimei inactivatoare 2- fosfotransferază- 6-acetiltransferază. Enzima conferă rezistență la gentamicină, tobramicină, metilmicină, amikacină și kanamicină. Rezistența la gentamicină este un indicator al rezistenței bacteriene la alte aminoglicozide, cu excepția streptomicinei.

La M. tuberculosis nu s-au descris enzime care să modifice aminoglicozidul streptomicină, dar rezistența este determinată de modificarea mutațională a țintei ribosomale.

În principiu, dacă mecanismele de rezistență la antibiotice ar fi inhibate, sensibilitatea bacteriilor la aminoglicozide ar putea fi restabilită. Acest concept este inspirat de asocierea cu succes a primului inhibitor al -lactamazelor – acidul clavulanic – cu amoxicilina (o penicilină). Nu s-au identificat inhibitori ai sintezei enzimelor care modifică aminoglicozidele (Vakulenko, 2003).

Streptomicina produce efecte secundare: este afectat nervul acustic și apar deficiențe de auz, care pot dispărea după întreruperea tratamentului sau pot să persiste.

5.2. Tetraciclinele

Tetraciclinele sunt un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacteriană față de un spectru larg de microorganisme patogene, caracterizate printr-un nivel foarte scăzut de toxicitate pentru gazdele mamaliene ale bacteriilor patogene. Tetraciclinele sunt prototipul antibioticelor cu spectru larg de acțiune, deoarece inhibă creșterea unei varietăți largi de microorganisme. Sunt bine absorbite și sunt active după administrare orală. Din aceste motive, tetraciclinele au cea mai largă utilizare în clinica umană.

Structural, tetraciclinele sunt unice, deoarece nu au nici o înrudire evidentă cu alți metaboliți cunoscuți. Structura de bază a tetraciclinelor constă dintr-un schelet comun de octahidronaftacenic (patru cicluri de carbon hexagonale fuzionate, lineare, A, B, C, D), substituit în pozițiile 5, 6, 7, cu diferiți radicali din care se formează diferite tipuri de tetracicline.

Structura moleculară a tetraciclinei

Structura inelului de bază poate fi substituită la câteva poziții, pentru a forma noi analogi ai tetraciclinei: clortetraciclina (aureomicina) are un atom de Cl, iar oxitetraciclina (kanamicina) are un grup OH în plus, dar nu are clor. Toate cele 3 antibiotice sunt produse pe cale microbiologică, dar sunt și tetracicline de semisinteză, la care diferiți constituienți sunt inserați în inelul de naftacen.

Clasificarea tetraciclinelor

Primul antibiotic al acestei familii, clortetraciclina, a fost descris în 1948, urmată de oxitetraciclină, produse de Streptomyces aureofaciens și respectiv, Streptomyces rimosus.

Tetraciclina propriu-zisă a fost descoperită mai târziu. Este sintetizată de Streptomyces aureofaciens, în anumite condiții de mediu: concentrația ionului de Cl- nu trebuie să depășească 17 părți/milion. Ionul de Cl este îndepărtat cu rășini schimbătoare de ioni sau prin precipitare sub formă de AgCl sau HgCl.

Demetilclortetraciclina este sintetizată de mutante ale Str. aureofaciens, defective pentru metilarea în poziția 6 a ciclului naftacenic. Este un antibiotic important, deoarece acțiunea sa este mai prelungită și este activă față de bacteriile rezistente la celelalte tetracicline. Este molecula de la care se sintetizează tetraciclinele de semisinteză: metaciclina, minociclina.

Sursa de C a organismelor producătoare de tetracicline este reprezentată de glucide, glicerol, iar cea de azot este amoniul. Tetraciclinele clorurate necesită sursa de Cl. Scheletul naftacenic de C al tetraciclinelor este sintetizat din acetat, prin intervenția catalitică a CO2, biotinei, coenzimei A. Atomii de C ai inelelor structurale derivă alternativ din C carboxilic și respectiv C metilic a 9 molecule de acetat.

Compușii clorurați (clortetraciclina) sunt mai activi decât oxitetraciclina și tetraciclina față de stafilococi, streptococi și pneumococi. În clinică se folosesc clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, demetiltetraciclina (clortetraciclina demetilată).

Grupe de tetracicline

Tetraciclinele formează o familie de antibiotice inhibitoare ale sintezei proteinelor prin mecanismul blocării atașării complexului aminoacil-ARNt de situsul acceptor al ribosomului (situsul A). Efectul bacteriostatic al acestor antibiotice are un spectru larg de acțiune, fiind active față de bacterii Gram pozitive și Gram negative, față de chlamidii, micoplasme, ricketsii și protozoare.

Tetraciclinele sunt agenți chelatori puternici (leagă diferiți ioni metalici) și proprietățile lor farmacologice sunt influențate de prezența ionilor metalici. Fiecare dintre inelele nucleului linear tetraciclic trebuie să conțină numai atomi de C, pentru ca antibioticul să-și păstreze activitatea antibacteriană. Excepția este 6-tiotetraciclina, care deși posedă un atom de S la poziția 6 a inelului C, are activitate antibacteriană.

Tetraciclinele atipice (tiotetraciclina și alți analogi ai tetraciclinelor) perturbă structura membranei citoplasmatice și efectul este bactericid, ceea ce contrastează cu efectul bacteriostatic reversibil al tetraciclinelor inhibitoare ale sintezei proteinelor. Efectul tetraciclinelor atipice de dezorganizare a membranei este probabil consecința caracterului lipofil al moleculei, rezultată din planaritatea inelelor B, C și D. Tetraciclinele atipice sunt probabil încorporate în mediul hidrofob al membranei. Din cauza efectelor secundare, derivate din interacțiunea lor nespecifică cu membranele celulelor procariote și eucariote, tetraciclinele atipice nu prezintă interes terapeutic.

În mod obișnuit, se utilizează tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, dar și cele noi, de semisinteză: minociclina și doxiciclina. Toate sunt bacteriostatice, se absorb ușor din tubul digestiv și se distribuie larg în țesuturi și fluide, cu excepția lichidului cefalorahidian.

Tetraciclinele au un spectru foarte larg de acțiune: sunt active față de multe bacterii Gram pozitive și Gram negative, față de rickettsii, chlamidii, micoplasme și față de unii fungi, dar distrug și microbiota normală a intestinului și produc tulburări gastro-intestinale. Tetraciclinele pot produce efecte toxice asupra țesutului hepaticși renal. Administrarea tetraciclinei în timpul sarcinii sau în primii 5 ani de viață are ca rezultat colorarea dinților, atât deciduali cât și permanenți, doarece mugurii ambelor dentiții se formează înainte de naștere. Tetraciclina administrată în timpul sarcinii poate duce la deformarea oaselor cutiei craniene a fătului. Efectele tetraciclinelor asupra dinților și oaselor se datorează capacității lor de a lega ioni de Ca2+.

Mecanismul de acțiune a tetraciclinelor

Tetraciclinele difuzează liber (pasiv) prin porii hidrofili ai membranei externe a bacteriilor Gram negative, dar necesită un sistem de transport dependent de energie pentru a traversa membrana citoplasmatică. La bacteriile Gram pozitive (nu au membrană externă), aceste antibiotice nu difuzează liber în celulă. Tetraciclinele traversează membrana externă a bacteriilor Gram negative enterice prin canalele porinelor din membrana externă (OmpF și OmpC), sub forma complexelor cu ionii bivalenți, în special de Mg2+. Complexul se acumulează în spațiul periplasmic, unde probabil se disociază și moleculele lipofile de antibiotic difuzează prin stratul lipidic al membranei citoplasmatice. În citoplasmă formează complexe cationice cu Mg2+, datorită activității lor chelatoare. Complexul molecular format din tetraciclină și Mg se asociază cu subunitatea ribosomală 30S. Consecința este inhibiția sintezei proteinelor, prin blocarea asocierii aminoacil-ARNt la situsul A al ribosomului bacterian. Tetraciclina inhibă faza de elongare a catenei polipeptidice în timpul traducerii, exercitând un efect bacteriostatic.

O secvență foarte conservată a ARNr 16S pare a fi parte a situsului de legare, ceea ce explică spectrul larg de activitate al tetraciclinei. În alcătuirea situsului de legare pare să intre și proteina ribosomală 7S. Efectul direct al legării tetraciclinei la ribosomi este blocarea accesului aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului. Interferența cu legarea aminoacil-ARNt la situsul A poate să inducă un răspuns stringent și declanșează numeroase efecte secundare, care modifică stabilitatea ARNt, sinteza ARNr, metabolismul aminoacizilor.

Câțiva derivați ai tetraciclinei acționează pe altă cale: chelocardina și tiotetraciclina sunt active față de E. coli și B. subtilis, dar sunt inhibitori ineficienți ai sintezei proteinelor, pentru că nu se leagă stabil de ribosomi. Spre deosebire de alte tetracicline, ele pot inhiba sinteza ADN, ARN și a proteinelor (Speer, 1992). Cele două tetracicline ar putea avea efecte asupra membranei citoplasmatice.

Olivera și Chopra (citați de Speer, 1992), pe baza modului de acțiune, au împărțit tetraciclinele în două categorii :

– cele care inhibă sinteza proteinelor (teraciclina, clortetraciclina, minociclina);

-cele care interacționează cu membrana citoplasmatică (chelocardina, tiotetraciclina, anhidrotetraciclina).

Legarea tetraciclinelor cu proteinele ribosomului este tranzitorie, ceea ce explică efectul bacteriostatic al acestor antibiotice. Sunt inhibitoare față de o varietate largă de bacterii Gram pozitive și Gram negative, chlamidii și micoplasme. Celulele mamiferelor nu concentrează tetraciclina (așa cum fac bacteriile) și de aceea ribosomii lor sunt rezistenți, cu posibila excepție a ribosomilor 70S mitocondriali. Se administrează oral, dar formează complexe neabsorbabile cu ionii bivalenți.Tetraciclina și derivații săi au o utilizare clinică limitată, datorită frecvenței crescute a tulpinilor rezistente. De exemplu, în anii ’80, tetraciclina era folosită pentru tratamentul infecțiilor cu transmitere sexuală, dar după apariția tulpinilor rezistente de N. gonorrhoeae, n-a mai fost utilizată ca antibiotic de primă importanță terapeutică. Oxitetraciclina și tetraciclina sunt încă folosite în tratamentul uretritei nongonococice și a infecțiilor chlamidiale.

Rezistența la tetraciclină este larg răspândită la cocii Gram pozitivi și se manifestă și la Mycoplasma. De aceea, tetraciclina nu se folosește pentru tratamentul primar al infecțiilor tractului respirator inferior. Deși acțiunea sa principală este antibacteriană, tetraciclina este activă față de protozoarele parazite: inhibă Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum. Eficiența derivaților tetraciclinei față de protozoarele parazite este corelată cu gradul de pătrundere în celulă. Cei mai eficienți sunt derivații lipofili, care străbat repede membrana citoplasmatică (tiotetraciclina).

Mecanismele rezistenței la tetracicline

Numeroase specii bacteriene au dobândit rezistență la acțiunea bacteriostatică a tetraciclinelor. S-au identificat cel puțin 24 de gene codificatoare ale rezistenței la tetraciclină și trei determinanți de rezistență la oxitetraciclină, mai întâi la Streptomyces, care produce oxitetraciclina și la Mycobacterium sp.

Rezistența determinată genetic (Taylor, 1996) este mediată de 3 mecanisme diferite:

– activitatea pompelor de eflux, dependente de energie, care elimină tetraciclina din celulă;

– protecția ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile;

– inactivarea enzimatică (degradarea oxidativă)a antibioticelor.

Cele mai multe gene de rezistență codifică pentru unul dintre cele două mecanisme importante ale rezistenței: efluxul sau protecția ribosomilor. Aceste două mecanisme de rezistență la tetracicline sunt cele mai răspândite și nu degradează compusul chimic. Proteinele de eflux schimbă un proton pentru un complex tetraciclină-cation și sunt sisteme antiport.

Rezistența la tetraciclină poate fi consecința sintezei unor proteine ce interacționează cu ribosomul. Proteinele protejează ribosomii de interacțiunea cu antibioticul, astfel încât sinteza proteinelor rămâne neafectată în prezența antibioticului. Protecția ribosomilor celulari este mediată de cel puțin 6 clase de proteine: TetM, TetO, TetP, TetQ, TetS, OtrA, la care s-au adăugat ulterior TetT și TetW. Protecția ribosomilor de acțiunea tetraciclinei, ca mecanism de rezistență, s-a descoperit la Streptococcus. Proteinele protectoare ale ribosomilor conferă rezistență la tetraciclină, doxiciclină și minociclină. Ele se aseamănă cu EF-G, proteina care catalizează reacția de translocație, etapa următoare treptei inhibată de legarea tetraciclinei.

Proteina TetM, descoperită inițial la Streptococcus, unde este codificată de transpozoni conjugativi ca Tn916 și Tn1545, dar și la numeroase bacterii Gram negative (Neisseria, Haemophilus, Bacteroides), dar și la Mycoplasma, Ureaplasma, Streptococcus, Staphylococcus. Proteina TetM s-a purificat (72 kDa) și s-a arătat că În vitro se asciază cu ribosomii. În prezența TetM, legarea teraciclinei la ribosom nu este alterată, dar legarea nu modifică funcționalitatea ribosomului. Are efect protector În vitro, față de acțiunea tetraciclinei. Explicația efectului protector este că proteina se asociază cu ribosomii, făcându-i insensibili la acțiunea tetraciclinei. TetO este o proteină codificată de o plasmidă la Campylobacter coli, Campylobacter jejuni și la bacteriile Gram pozitive, unde pare a fi codificată de o genă cromosomală. TetQ s-a identificat la Bacteroides sp. TetS, la Listeria monocytogenes, este codificată de o genă plasmidială, iar la Enterococcus faecalis, gena codificatoare pare a fi localizată pe cromosom. TetP este codificată de o plasmidă la Clostridium perfringens. OtrA, de la Streptomyces rimosus, producător de oxitetraciclină, este codificată de o genă crmosomală. Toate proteinele care conferă protecția ribosomilor sunt polipeptide de dimensiuni uniforme: TetO are 639 aminoacizi, iar OtrA, 661. Gradul de omologie și de identitate a aminoacizilor diferitelor proteine atinge 75% și respectiv 37 %.

Genele codificatoare ale proteinelor de protecție ribosomală sunt larg distribuite la bacterii, ceea ce a sugerat ideea mobilității determinanților genetici de la organismele producătoare de antibiotic la cele de interes clinic.

Mecanismul de acțiune a proteinelor de protecție ribosomală

Protecția ribosomală este rezultatul sintezei unor proteine codificate de genele de rezistență, care se asociază cu ribosomii și interferă cu legarea tetraciclinei. Tetraciclinele inhibă sinteza proteinelor prin legarea cu afinitate înaltă, de un singur situs localizat pe subunitatea ribosomală 30S, probabil de proteinele S7, S14 și S19. Legarea tetraciclinei în acest situs blochează legarea aminoacil-ARNt sintetazei la situsul ribosomal A (acceptor). Treapta sintezei proteice inhibată de tetraciclină este cea catalizată de EF-Tu (elongation factor thermo-unstable).

Activitatea pompelor de eflux este o modalitate de a limita accesul tetraciclinei la ribosomi și are ca rezultat creșterea capacității celulei de a elimina antibioticul la o rată egală cu rata înglobării. Este cel mai comun mecanism de rezistență, mediat de produsele de sinteză ale genelor de rezistență: acestea sunt proteine ale membranei citoplasmatice care funcționează ca transportori ai tetraciclinei, dependenți de energie. Deși efluxul împiedică acumularea tetraciclinei chiar în celulele rezistente, nivelul intracelular al antibioticului depășește nivelul inhibitor al sintezei proteinelor (Speer, 1992). Explicația se bazează pe capacitatea tetraciclinei de a exista în mai multe forme ionice. Este posibil ca o anumită formă ionică să se lege mai ușor de ribosomi, comparativ cu altele. La tulpinile rezistente, este eliminată forma activă a antibioticului, iar în celulă rămâne o concentrație mare de tetraciclină inactivă sau mai puțin activă, compatibilă cu sinteza proteinelor. Genele tet, codificatoare ale proteinelor de eflux, sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explică distribuția largă a rezistenței. Proteinele de eflux sunt molecule membranare, care funcționează ca pompe de export dependente de energie. Sunt sisteme antiport, care schimbă un proton pentru un complex tetraciclină-cation. Rezultatul activității pompelor de eflux este scăderea concentrației intracelulare a antibioticului și protecția ribosomilor. Majoritatea genelor tet codificatoare ale proteinelor de eflux ale bacteriilor Gram negative (tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG și tetH) au organizare genetică comună, diferită de a genelor bacteriilor Gram pozitive. Ele conferă rezistență la tetraciclină, dar nu la minociclină sau la glicilcicline și cele mai multe sunt localizate în structura unor plasmide mari, conjugative, în care se găsesc gene de rezistență la alte antibiotice, gene de rezistență la metale grele și de sinteză a unor factori de virulență așa cum sunt toxinele. Proteinele de eflux sunt proteine membranare de circa 46 kDa.

Impermeabilitatea structurilor de suprafață ale celulei constituie o cauză importantă a rezistenței la tetracicline. Pentru a inhiba sinteza proteinelor, tetraciclinele trebuie să pătrundă în celula bacteriană și să se lege de ribosomi. Tetraciclina poate exista în două forme: o formă protonată (TH2) și o formă legată de Mg2+ (THMg). Proporția THMg2+ crește la pH mai mare. Tetraciclina este acumulată în celulă ca THMg2+, deoarece pH intern este mai mare decât cel extern. Forma protonată a tetraciclinei difuzează prin membrana citoplasmatică. Difuzia simplă nu explică faptul că bacteriile sensibile acumulează tetraciclină în citoplasmă. În afara difuziei, tetraciclina este înglobată printr-un mecanism dependent de energie, care nu implică o proteină de transport, ci diferența de pH între mediul celular și extracelular. Alterarea porinelor, cu limitarea difuziei tetrciclinelor în spațiul periplasmic este un mecanism posibil de rezistență la bacteriile Gram negative.

Cele 2 mecanisme de rezistență la tetracicline (proteinele protectoare ale ribosomilor și proteinele de eflux) nu inactivează antibioticul. Rareori, antibioticul este inactivat sau modificat pe cale chimică.

Inactivarea enzimatică a tetraciclinelor nu are semnificație ca mecanism de rezistență, dar s-a evidențiat la Bacteroides. Câteva specii de Bacteroides (bacterie anaerobă) degradează oxidativ molecula de antibiotic. Gena care codifică acest tip de rezistență este localizată pe 2 transpozoni înrudiți, ce poartă de asemenea o genă de rezistență la eritromicină. Gena codificatoare a enzimei care degradează tetraciclina s-a identificat inițial, prin capacitatea ei de a conferi rezistență pentru E. coli crescută în condiții aerobe, dar a fost inactivă față de celulele de E. coli crescute în anaerobie sau de Bacteroides.

Gliciltetraciclinele sunt reprezentate de tigeciclină, utilizată pentru tratamentul infecțiilor cutanate și intraabdominale. Caracteristica structurală a tigeciclinei constă în substituția în poziția 9 a tetraciclinei, cu un rest de glicină. Este un antibiotic cu spectru larg de acțiune față de bacterii Gram pozitive, Gram negative, aerobe și anaerobe, dar și față de bacterii patogene rezistente la alte antibiotice: enterococi rezistenți la vancomicină, S. aureus meticilino-rezistent (MRSA), Str. pneumoniae rezistent la penicilină. Este activă față de patogenii Gram negativi: enterobacterii, H. influenzae, N.gonorrhoeae, Legionella pneumophila, micobacterii netuberculoase cu creștere rapidă.

Structura moleculară a tigeciclinei

Dactilociclinele sunt derivați ai tetraciclinei, produși de Dactylosporangium. Ele diferă de alți derivați prin aceea că sunt tetracicline glicozidice. Utilizarea clinică ete limitată, deoarece par să fie active numai față de tulpinile bacteriene care poartă gene de rezistență la tetraciclină, din clasa K. Unele izolate bacteriene sensibile la tetraciclină, nu sunt inhibate de dactilocicline. Incapacitatea lor de a inhiba bacteriile Gram pozitive și negative, se datorează probabil impermeabilității structurilor de suprafață față de dactilocicline (Speer și colab., 1992).

Tetraciclinele se administrează oral, dar unele sunt disponibile ca produse pentru administrare parenterală. După administrare orală, tetraciclinele sunt absorbite în stomac și în intestinul subțire. Absorbția este influențată de conținutul alimentar și de cationii bivalenți. Cu ionii de Ca2+, tetraciclinele formează complexe neabsorbabile. Ele pătrund moderat în fluidele organismului și în țesuturi și sunt excretate prin urină.

Tetraciclinele sunt antibiotice cu spectru larg, fiind utilizate în clinica umană pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram pozitive și Gram negative. Sunt de asemenea active față de agentul malariei și se folosesc pentru profilaxia tulpinilor de Plasmodium falciparum rezistente la agenții chimioterapeutici specifici.

5.3. Macrolidele, Lincosamidele și Streptograminele

Macrolidele, lincosamidele și streptograminele (MLS) au o structură chimică diferită, dar acționează într-o manieră asemănătoare asupra unei game variate de bacterii (Gram pozitive, coci Gram negativi, Chlamydia, micoplasme, Legionella). Absența efectului asupra bacililor Gram negativi se explică prin incapacitatea de a difuza prin membrana externă, datorită caracterului hidrofob al moleculei lor. Macrolidele și lincosamidele au proprietăți antibacteriene, cel mai adesea bacteriostatice.

Mecanismele de acțiune ale antibioticelor grupului MLS

MLS acționează asupra ribosomilor și împiedică ribosomul bacterian să traducă ARN în două moduri diferite. Situsul acțiunii macrolidelor este subunitatea mare a ribosomilor bacterieni.

a) Macrolidele inhibă sinteza proteică dependentă de ARN, la treapta alungirii catenei, producând inhibiția translocării peptidil-ARNt de la situsul acceptor(A), la situsul peptidil donor (P). Ele se leagă de subunitatea ribosomală 50S și interferă cu procesul de translocație a polipeptidului nascent, deoarece stimulează disocierea complexului peptidil-ARNt de ribosomi, în timpul sintezei. Centrul peptidil-transferazei (din subunitatea 50S) este situsul interacțiunii antibioticelor MLS, al cloramfenicolului și puromicinei și pare a fi format în întregime de structura secundară a ARN 23S, ce formează 6 domenii. Aceasta sugerează că legăturile peptidice sunt catalizate de ARNr. Macrolidele și ketolidele interacționează cu nucleotidele ARNr 23S (A2058, A2059 și G2505) din bucla centrală a domeniului V, componente ale centrului peptidil-transferazei și blochează interacțiunea lor cu reactivii fiziologici. Consecința este terminarea prematură a catenei și oprirea reversibilă a sintezei proteinelor. Pentru eritromicină este suficientă legarea unei singure molecule cu subunitatea mare a ribosomului. Eritromicina interacționează cu ARNr, la nivelul unei bucle a unor domenii îndepărtate în structura primară a ARN, dar care prin pliere sunt aduse în juxtapoziție: domeniile II și V ale ARNr 23S. Macrolidele probabil se leagă la situsul peptidil donor (P) al ribosomului și prin competiție interferă cu translocația peptidului de la situsul acceptor la situsul donor. Eritromicina poate să producă disocierea peptidil-ARNt de ribosom. La E. coli, eritromicina inhibă formarea subunității ribosomale 50S.

b) Al doilea mecanism de acțiune constă în inhibarea treptelor inițiale ale asamblării subunității ribosomale 50S. Macrolidele și ketolidele interacționează cu subunitatea 50S parțial asamblată, blocând procesul asamblării. Componentele neasamblate sunt supuse degradării nucleolitice. În celulele tratate cu eritromicină se acumulează un precursor al subunității 50S. Eritromicina se leagă de subunitatea incompletă formată din ARNr 23S, 5S, dar conține numai 18 dintre cele 34 proteine ribosomale ale subunității mari. Situsul de legare la subunitatea ribosomală 50S este comun pentru eritromicină, pentru macrolidele noi, pentru lincosamidă și streptogramina B.

Pentru eritromicină și claritromicină s-a identificat un nou mecanism de acțiune: ele inhibă sinteza ARNm pentru producerea endotelinei-1, la concentrații terapeutice, necitotoxice. Endotelina-1 este un polipeptid cu potențial vasoconstrictor cunoscut și are efecte bronhoconstrictoare. Stimulează secreția de mucus și produce edemul mucoasei, având rol de mediator al inflamației căilor aeriene. Procesul inflamator este multifactorial și macrolidele acționează pe mai multe căi: cele derivate din eritromicină inhibă sinteza citochinelor proinflamatorii (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12 și IFN-).

Macrolidele

Denumirea de macrolide desemnează un grup de antibiotice înrudite structural, produse de specii ale g. Streptomyces.

Grupul macrolidelor cuprinde numai compuși nepolienici (de exemplu, eritromicina). Compușii care conțin un sistem format din mai mult de două legături duble de C conjugate, sunt clasificați ca poliene. Din punct de vedere structural, macrolidele sunt caracterizate printr-un inel lactonic multiunitar, cu puține legături duble, fără atomi de N, la care se atașează, prin legături glicozidice, 1-3 componente glucidice. Macrolidele pot fi glucide aminate sau glucide fără N (neutre). Sunt poliketide naturale, produse ale metabolismului secundar la multe specii ale g. Streptomyces.

Macrolidele prezintă diferențe structurale, dar posedă un schelet de C comun. După numărul de atomi de C ai inelului lactonic (de obicei par), se disting compuși cu 12, 14, 15 sau 16, cu substituienți variați (grupări metil, hidroxil). Prezența grupărilor determină asimetria centrilor inelului lactonic. Componentele glucidice atașate prin legături glicozidice de inelul lactonic sau legate una de alta, sunt totdeauna 6-deoxihexoze. Glucidele poartă grupări N-, O- sau metil. La unele macrolide, glucidele sunt esterificate de un acil: grupul acetil sau izovaleril. Inelul lactonic al antibioticelor macrolide este sintetizat din unități acetat, care sunt adăugate gradat. Inelul lactonic al spiramicinei are duble legături care pot lega aceste macrolide cu macrolidele polienice.

Fiecare compus are caracteristici chimice cât și biologice, proprii:

– majoritatea celor care au cicluri formate din 14 atomi de C sunt substanțe naturale (eritromicina, oleandomicina) sau derivați semisintetici (roxitromicina, diritromicina, claritromicina);

– un singur compus cu 15 atomi (azitromicina);

– compuși naturali cu 16 atomi (josamicina, spiramicina, kitasamicina, midecamicina și tilosina) sau derivați semisintetici(rokitamicina, miocamicina, tilmicosina).

Structura moleculară a eritromicinei A (R=H) și Structura moleculară a ABT-773

claritromicinei (R=CH3)

Structura moleculară a tilosinei

Macrolidele importante din punct de vedere clinic

Eritromicina A, primul antibiotic macrolid utilizat în clinică, posedă un inel cu 14 atomi. Tilosina, un macrolid cu 16 atomi, este utilizată în zootehnie atât ca agent terapeutic cât  și ca stimulator de creștere. Claritromicina este derivatul 16-metoxi al eritromicinei și acum se folosește pentru eradicarea infecției cu H. pylori.

Structura moleculară a claritromicinei

Eritromicina, cel mai important antibiotic macrolid, este produsă de Streptomyces erythreus, izolată dintr-un sol din Filipine. A fost primul antibiotic macrolid introdus în terapie în 1952 și este reprezentativ pentru clasa macrolidelor. Structura sa constă dintr-un inel lactonic macrociclic, de care se atașează două resturi de zahăr.

Structura moleculară a eritromicinei

Este puțin solubilă în apă și este rapid inactivată de sucul gastric. Ca și alte macrolide, eritromicina penetrează greu peretele bacteriilor Gram negative. Eritromicina este un antibiotic cu spectru larg: este activă față de bacteriile Gram pozitive și Gram negative, față de actinomicete, Mycobacterium, T. pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Rickettsia. În funcție de concentrație, de specie, de faza de creștere sau de densitatea inoculului, eritromicina poate fi bacteriostatică sau bactericidă. Eritromicina este un înlocuitor al penicilinei, la persoanele alergice pentru ciclul β-lactamic.

Cele mai multe antibiotice macrolide sunt substanțe bazice, dar unele sunt neutre. Unele sunt solubile în apă, iar altele, insolubile în apă, dar solubile în etanol. Cele folosite în clinică constau dintr-un inel lactonic cu 14, 15 sau 16 atomi de C, substituit cu două sau mai multe glucide neutre sau aminate la C3 și C5.

Macrolidele inhibă creșterea bacteriilor, dar nu sunt active față de fungi, iar lactonele polienice inhibă fungii, dar nu influențează creșterea bacteriilor.

Spectrul de activitate al macrolidelor include bacteriile Gram pozitive (Staphylococcus și Streptococcus) și pe cele anaerobe (Clostridium). Bacteriile Gram negative (H. pylori, Haemophilus spp. Pasteurella spp. și Legionella spp.) sunt de asemenea sensibile. Microorganismele enterice (E. coli și Salmonella) sunt intrinsec rezistente, prin excluderea macrolidelor din citoplasmă datorită arhitecturii membranei externe.

Moleculele noi, ca azitromicina și claritromicina au activitate antibacteriană superioară eritromicinei, deoarece au coeficienți superiori de penetrare intracelulară și tisulară, sunt mai stabile, mai ușor absorbite, iar efectele secundare gastrointestinale au o incidență mai scăzută. Azitromicina este activă față de bacteriile enterice. Mycoplasma spp. și Chlamydia spp. sunt de asemenea sensibile la macrolide. Claritromicina are activitate antibacteriană semnificativă, În vitro, față de micobacteriile netuberculoase.

Macrolidele sunt antibiotice bacteriostatice, utilizate pentru tratamentul unui spectru larg de infecții bacteriene ale tractului respirator cu Legionella, Chlamydia, Haemophilus, unele specii de Mycobacterium (M. intracellulare, M. avium, dar nu M. tuberculosis), ulcerului gastric asociat cu H. pylori și infecții ale țesuturilor moi.

Streptograminele

Streptograminele sunt reprezentate de doi compuși (A și B) cu acțiune sinergică. Ca și macrolidele și lincosamidele și compușii A și B ai streptograminelor se fixează la subunitatea 50S a ribosomilor, la nivelul ARNr 23S.

Lincomicina și clindamicina

Aceste doua antibiotice nu sunt macrolide, dar multe dintre proprietățile lor biologice sunt asemănătoare cu ale eritromicinei. Sunt formate dintr-un aminoacid legat cu un zahăr aminat. Lincomicina este sintetizată de Streptomyces lincolnensis (izolată din solul din Lincoln, Nebraska).

Structura moleculară a lincomicinei

Trăsăturile structurale specifice ale lincomicinei sunt reprezentate de prezența grupărilor –N-CH3 și S-CH3. Originea multor grupări metil, legate de O, N și C este în compușii C1. Grupele metil sunt transferae prin transmetilare din sistemele donoare C1.

Lincomicina este activă față de o largă varietate de bacterii, în primul rând Gram pozitive. Ele au aceleași situsuri de legare la subunitatea 50S, ca și macrolidele și cloramfenicolul și pot intra în competiție pentru legare. Deși sunt foarte diferite ca structură chimică, eritromicina și clindamicina se leagă de subunitatea ribosomală 50S. Inhibă sinteza proteinelor prin interferență cu reacția de transpeptidare, probabil prin blocarea situsului P (peptidil-donor). Astfel este blocată alungirea catenei peptidice. Efectul este bacteriostatic.

Macrolidele și lincomicina sunt bacteriostatice: inhibă numai inițierea noilor catene peptidice.

Utilizarea terapeutică a macrolidelor a fost sever compromisă de emergența tulpinilor rezistente ale multor specii de bacterii patogene. Fenomenul de rezistență a apărut curând după introducerea eritromicinei în terapie în anii ’50. S-a observat că tulpinile rezistente la eritromicină, au devenit rezistente nu numai la toate celelalte macrolide, dar și la lincosamidă și streptogramină B, antibiotice neînrudite chimic cu macrolidele. De aceea, fenomenul s-a denumit ’’rezistența fenotipică la macrolide-lincosamidă-streptogramină B’’(MLSB).

Mecanismele rezistenței la antibioticele MLS

Rezistența la antibioticele MLS (macrolide, lincosamida și streptogramina B) este indusă prin mai multe mecanisme:

– scăderea permeabilității peretelui celular la medicament;

– efluxul activ al medicamentului din celulă. Pompele prin care celula elimină agenții antimicrobieni aparțin suprafamiliei MSF (Major Superfamily Facilitator) sau RND (Resistance, Nodulation and cell Division). Ambele folosesc forța proton-motrice pentru energizarea efluxului. Supraproducția constitutivă a proteinelor de eflux, în absența agentului chimic, creează un dezavantaj sever în competiția cu cele la care proteinele de eflux sunt exprimate adaptativ;

– modificarea mutațională a unei singure proteine a subunității 50S;

– modificarea ARNr 23S al subunității 50S prin metilare. Metilazele sunt codificate de genele erm (erithromycin ribosome methylation);

– inactivarea enzimatică a antibioticelor: enzimele care hidrolizează inelul lactonic al nucleului macrolid și fosfotransferazele care inactivează macrolidele prin fosforilarea grupării 2’-OH a glucidului aminat.

Rezistența la macrolide este cel mai adesea rezultatul modificării țintei antibioticului și constă în modificarea posttranscriere a ARNr 23S sub acțiunea adenin-N6-metiltransferazei. Unele metilaze conferă rezistență numai la unul sau la două antibiotice ale clasei MLSB. Enzimele de metilare adaugă una sau două grupe metil la un rest de adenină situat într-o poziție fixă (A2058 la E. coli) a ARNr 23S. Metilarea are ca rezultat schimbarea conformațională a ribosomilor, ducând la scăderea afinității pentru toate antibioticele MLS. Metilaza ribosomală conferă rezistență încrucișată la antibioticele MLSB, deoarece situsurile de legare ale acestor antibiotice se suprapun.

La diferite tulpini bacteriene patogene s-au evidențiat zeci de gene codificatoare ale metil-transferazei. Genele s-au denumit erm (erythromycin ribosome methylation – A, B, C, D, E, F, G, H, L, N, O, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y) și s-au izolat de la o largă varietate de bacterii Gram pozitive și Gram negative. Multe metil-transferaze sunt exprimate constitutiv. Toate enzimele Erm ale unei clase metilează ținta ribosomală a macrolidelor, adenozina 2058.

Expresia rezistenței la MLSB poate fi constitutivă sau inductibilă. Tipul de rezistență depinde de secvența reglatoare de gena structurală a metilazei. Dacă expresia rezistenței este inductibilă, tulpinile sunt rezistente numai la macrolidele cu 14 și 15 atomi de C, iar macrolidele cu 16 atomi de C, lincosamida și streptogramina rămân active. La tulpinile de S. aureus, rezistența la MLSB poate fi indusă prin expunerea culturii la concentrații mici de eritromicină, care induce expresia enzimei metil-transferază (Erm-C). Metil-transferaza metilează specific ARN 23S la poziția N-6 a adenozinei din poziția 2058 (A2058) la E. coli, un nucleotid esențial pentru legarea antibioticelor MLSB.

Tulpinile bacteriene cu ARNr-metilaze inductibile au predominat în anii ’60-’70. Astăzi, în multe arii geografice se izolează tulpini care sintetizează constitutiv ARNr-metilaze, fără preexpunere la antibiotic. Expresia constitutivă a genei erm se datorează alterărilor structurale ale atenuatorului traducerii erm, datorate delețiilor, duplicațiilor sau mutațiilor punctiforme.

Multe gene erm fac parte din structura unor transpozoni conjugativi sau neconjugativi, localizați pe cromosom, deși unele gene erm s-au găsit în structura genetică a plasmidelor. În general, genele erm sunt asociate cu gene de rezistență la alte antibiotice, în special cu cele de rezistență la tetraciclină. Transpozonii conjugativi pot avea un spectru larg de gazdă. Astfel se explică distribuția largă a genelor erm la un număr mare de specii bacteriene. Genele erm au un conținut G+C scăzut (31-34%). Conținutul G+C cromosomal al bacteriilor Gram negative este mai mare sau egal cu 50%, iar al bacteriilor Gram pozitive este de circa 35%. Alte gene de metilare sunt tlr, car, myr, smr și toate conferă rezistență la macrolidele cu un inel de 16 atomi.

Numeroase cazuri de rezistență a tulpinilor bacteriene patogene la macrolide, pot fi datorate alterării mutaționale a nucleotidelor specifice în secvența ARNr 23S din subunitatea ribosomală mare, 50S. Adenina 2058 sau adenina adiacentă situsului de legare a peptidil-transferazei (A2057 sau A2059)este schimbată cu alt nucleotid prin mutație și conferă cel mai înalt grad de rezistență la anumite macrolide. Mutațiile perturbă, într-o măsură mai mare sau mică, structura situsului de legare, de unde rezultă scăderea capacității antibioticelor macrolide de a interacționa cu ribosomii și de a inhiba activitatea lor.

Toate mutațiile care perturbă structura situsului de legare a antibioticului la ARN 23S, reduc capacitatea medicamentelor de a interacționa și de a inhiba activitatea ribosomilor. Metilarea ARNr la A2058 sub acțiunea metil-transferazei conferă rezistență prin același mecanism. Un nivel mai scăzut al rezistenței este produs prin mutațiile la pozițiile 2057, 2452 și 2611, situate în afara centrului de interacțiune al moleculei ARNr cu macrolidele. Mutațiile ARNr s-au identificat prin tehnicile bazate pe PCR: regiunea genei ARN 23S a H. pylori codificatoare a secvenței adiacente nucleotidei A2058 a fost amplificată și analizată pentru tabloul acțiunii enzimelor de restricție și prin hibridare cu probele de oligonucleotide.

Mutațiile proteinelor ribosomale L4 și L22 ale subunității 50S induc rezistența la macrolide la Str. pneumoniae, datorită alterării conformației situsului care leagă medicamentul. Cele două proteine sunt în contact direct cu A2058 și A752 din regiunea peptidil-transferazei.

Mutații ale ARNr care conferă rezistență la macrolide. Mecanismul rezistenței mutaționale a fost studiat la Helicobacter pylori. Agentul infecțios colonizează stomacul la circa 30% dintre indivizii umani adulți. Majoritatea infecțiilor sunt asimptomatice, dar H. pylori este principalul agent etiologic al celor mai multe ulcere duodenale și multor ulcere gastrice. Este asociat cu dezvoltarea unor tipuri de neoplazie gastrică. Tratamentul preferat pentru infecțiile agresive este o combinație de medicamente care include un derivat al eritromicinei – claritromicina care ameliorează stabilitatea mediului acid și un inhibitor al pompei de protoni. Rezistența la claritromicină apare în timpul terapiei și s-a atribuit mutațiilor la pozițiile A2058 sau A2059 în ARNr 23S. La H. pylori nu s-au identificat gene de metilare a ARNr și nici sisteme de eflux ale macrolidelor. Mecanismele rezistenței par a fi limitate la apariția mutațiilor ARNr 23S.

Dată fiind secvența foarte stabilă a ARNr la diferite specii de bacterii, este de presupus că mutațiile identice vor produce același fenotip la diferite specii bacteriene. Au fost identificate situsurile mutației ARNr care conferă rezistența bacteriilor patogene la macrolide:

– apariția mutațiilor la poziția A2057 este limitată la un grup de propionibacterii rezistente la eritromicină și la o tulpină dublu mutantă de H. pylori, cu o mutație la poziția 2032, suplimentară față de substituția 2057;

– adenozina 2058 este nucleotidul esențial pentru interacțiunea macrolidelor cu ribosomul. Mutația A2058 la G a fost prima mutație identificată a ARNr, care că conferă rezistență la eritromicină;

– mutațiile A2059 la C sau G s-au identificat la Mycobacterium, Propionibacterium, H. pylori și Streptococcus pneumoniae. În experimentele in vitro, mutantele A2059 la H. pylori au niveluri inferioare de rezistență la claritromicină, comparativ cu mutantele A2058.

După expunerea la antibioticele macrolide, tipurile de mutații menționate ale ARNr pot să devină dominante în scurt timp în populațiile de celule care posedă numai 1sau 2 operoni rrn (genele transcrise în ARNr). Cu cât celula posedă mai puțini operoni rrn, cu atât crește probabilitatea apariției rezistenței la macrolide prin mutațiile ARNr. Mutațiile spontane ale ARNr apar constant cu frecvență mică în populațiile bacteriene, iar medicamentele exercită presiune selectivă, favorizând supraviețuirea și proliferarea mutantelor. La bacteriile cu operoni rrn multipli, efectul benefic al mutației într-un operon nu oferă avantaj fenotipic semnificativ. Dar amplificarea genei alele mutante, astfel încât să se extindă la majoritatea operonilor rrn ai celulei, poate conferi un fenotip rezistent. Mutația ARNr 23S are un potențial foarte mare de emergență a mutantelor rezistente la macrolide. În general, la bacteriile cu operoni rrn multipli, rezistența este mediată de o metil-transferază codificată de gena erm, cea care are capacitatea potențială de a modifica toți ribosomii.

Rezistența prin sistemul de eflux. Unele gene de rezistență codifică proteine de transport, cu rol în efluxul proteinelor. Acestea nu modifică antibioticul și nici ținta antibioticului, ci au rol de pompe de eliminare a antibioticului din citoplasmă sau din situsurile membranare de legare, menținând astfel concentrația intracelulară scăzută. Multe dintre proteinele de eflux, codificate mef (macrolide efflux) sunt omologe structural cu celelalte proteine de eflux. La S. aureus funcționează un sistem membranar al pompelor de eflux pentru macrolide.

A fost descrisă existența enzimelor care hidrolizează streptogramina B sau modifică antibioticul prin adăugarea unui grup acetil (acetil-transferaze) la streptogramina A. Degradarea prin hidroliza inelului lactonic al macrolidelor sub acțiunea unei esteraze și modificarea prin fosforilarea macrolidelor și nucleotidilarea lincosamidei sunt mecanisme puțin importante pentru rezistența la MLSB. Un număr mic de tulpini bacteriene poartă gene pentru sinteza enzimelor inactivatoare.

În general, eficiența terapeutică a antibioticelor se evaluează prin inhibiția creșterii bacteriene În vivo, când concentrația antibioticului măsurată de obicei în ser, depășește concentrația minimă inhibitorie (CMI) evaluată in vitro. Macrolidele administrate în scop terapeutic, adeseori ating o concentrație serică mai mică decât valoarea CMI. Concentrațiile serice ale macrolidelor mai mici decât valoarea CMI sunt inhibitorii prin :

– modificarea expresiei unor factori de virulență: adezine, toxine, exoenzime, motilitatea flagelară;

– inducerea unor modificări structurale detectabile la microscopul electronic;

– creșterea sensibilității la factorii serici litici.

Toți acești factori diminuă capacitatea agentului patogen de a produce manifestările patologice specifice.

Eficiența terapeutică a concentrațiilor unor antibiotice, inclusiv ale macrolidelor, mai mici decât CMI se poate datora altor factori: macrolidele se concentrează în leucocite și pot fi astfel transportate la situsul infecției, unde sunt parțial eliberate. Macrolidele interferă cu răspunsul inflamator declanșat de agentul infecțios: leucocitele (neutrofile, monocite, macrofage) concentrează în lizosomi, macrolidele din mediul extracelular neimplicat (țesuturi, vase) și le transportă în situsul infecțios prin răspunsul chimiotactic, eliberând antibioticul în stare activă.

Dozele subinhibitorii ale macrolidelor induc modificări structurale fine ale membranei externe și modifică sensibilitatea la factorii serici antibacterieni (proteinele ce leagă Fe, proteinele de fază acută, complementul, anticorpi naturali).

Emergența tulpinilor rezistente la antibiotice a stimulat căutarea unor noi agenți antimicrobieni. Telitromicina este primul antibiotic cu inel de 14 atomi de C, din grupul ketolidelor, introdus în clinică. Ketolidele sunt derivați semisintetici ai eritromicinei A, cu proprietăți biologice noi.

Ketolidele reprezintă o nouă entitate chimică, caracterizată prin înlocuirea L-cladinozei din inelul A al eritronolidei, cu o funcție 3-ceto și un carbamat la C11- C12. Restul 3-OH rămas după înlăturarea L-cladinozei (un glucid neutru) a fost oxidat la grupul 3-ceto. Denumirea clasei derivă de la gruparea 3-ceto și de la inelul lactonic (Ackermann, 2003). Telitromicina și ABT 773 reprezintă cea mai recentă generație de medicamente, caracterizate prin grupul 3-cetonic ce substituie restul de zahăr 3-cladinoză din eritromicină și claritromicină.

Ambele ketolide au gruparea carbamat C11-C12, care la telitromicină se extinde cu un grup alkil-aril. Această extensie permite telitromicinei să interacționeze cu domeniul al II-lea al ARNr 23S (Vester, 2001).

Structura moleculară a telitromicinei:

Grupul metoxi (a) la C6 favorizează stabilitatea în mediul acid și împiedică hemiacetalizarea internă; funcția ceto (b) elimină inducerea rezistenței încrucișate cu MLS și favorizează legarea de ribosom; lanțul lateral carbamat (c) atașat la C11/C12 mărește afinitatea pentru ribosomi și ameliorează interacțiunea cu ribosomii rezistenți la MLSB

(după Tran, 2004).

S-a considerat că L-cladinoza este esențială pentru activitatea antimicrobiană a macrolidelor cu inel de 14 atomi de C, deoarece scoaterea ei din claritromicină, azitromicină și roxitromicină duce la pierderea activității antimicrobiene. Dar modificarea altor poziții ale inelului, compensează pierderea cladinozei. Această nouă clasă de compuși antimicrobieni a fost produsă pentru a depăși rezistența prin mecanismele obișnuite a cocilor Gram pozitivi, față de eritromicina A.

Telitromicina se leagă de ribosomi cu afinitate de până la 10 ori mai mare decât eritromicina, dar legarea la situsul critic A 2058 este considerabil redusă. Telitromicina are o activitate antimicrobiană În vitro, față de bacteriile aerobe Gram pozitive, mai bună decât a macrolidelor. Este foarte activă față de patogenii respiratori atipici (Bordetella sp, Legionella sp., Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Este activă față de câteva bacterii Gram pozitive și negative: Clostridium sp., Peptostreptococcus sp. și Bacteroides sp. Este inactivă față de enterobacterii, față de Acinetobacter baumanii (bacil Gram negativ). Se acumulează în celulele PMN și în macrofage, unde atinge concentrații de 130 și respectiv de 71 de ori mai mari decât în compartimentul extracelular. Din aceste celule, antibioticul este eliberat lent, ceea ce sugerează că ele acționează ca vehicule de transport spre focarul infecțios. Telitromicina este metabolizată în ficat. Metabolitul major (un alcool) este de 4-16 ori mai puțin activ decât telitromicina și este eliminat în proporție de 80% pe cale digestivă. Excreția telitromicinei este aproape completă din urină, după 24 de ore, iar în fecale, după 72 de ore.

5.4. Antibioticele β-lacamice

Descoperirea antibioticelor -lactamice este una dintre cele mai importante din istoria farmacologiei terapeutice. La sfarșitul anilor ’40, Brotzu a izolat din apa mării (la Cagliari) organismul fungic producător de penicilină, Cephalosporium chrysogenum (Acremonium chrysogenum). În culturile în mediul lichid s-a descoperit alt antibiotic, derivat al compușilor -lactamici, denumit cefalosporină.

Structura moleculară a acidului 6-aminopenicilanic

Antibioticele -lactamice conțin în molecula lor, un inel tetraatomic, în care o grupare carbonil și un atom de N formează o legătură amidică (o -lactamină). Prezența nucleului -lactamic conferă acestor substanțe, proprietăți fizico-chimice și biologice specifice (tabelul 7). La peniciline, cel de-al II-lea nucleu al structurii chimice a penicilinelor este inelul tiazolidinic. Penicilinele sunt derivate ale acidului 6-aminopenicilanic. Cele două nuclee (-lactamic și tiazolidinic) nu sunt coplanare, iar atomul de N iese în afara planului. Atomii de H legați la C5 și C6 au poziție cis. C3 purtător al grupării –COOH este plasat în partea opusă grupării amidice atașată de C6. Prezența celor 3 atomi de C asimetrici (C3, C5, C6), determină activitatea optică a moleculei de penicilină.

Structura penicilinei poate fi fragmentată în componentele din care se sintetizează: resturi de acid acetic monosubstituit, L-cisteină și D-valină.

Clasificarea antibioticelor β-lactamice

Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde un număr mare de variante moleculare, primul reprezentant fiind penicilina, care se pot clasifica în patru grupe:

– peniciline

– cefalosporine

– carbapeneme

– monobactami.

După modul de obținere se disting :

– peniciline de biosinteză: penicilina G, penicilina V, penicilina N;

– peniciline de semisinteză: meticilina, oxacilina, ampicilina, carbenicilina, amoxicilina, azlocilina, piperacilina;

– peniciline de sinteză chimică: peneme, monobactame, carbapeneme.

Componentele moleculare susceptibile de modificare chimică, cu implicații practice majore pentru diversificarea antibioticelor -lactamice sunt: legătura C-N din inelul -lactamic, gruparea amino legată de C6, gruparea –COOH legată de C3, atomul de S și atomul de H atașat de C6. Legătura C-N din ciclul -lactamic este mai reactivă decât cea din amidele obișnuite.

Tabelul 7.

Structura antibioticelor -lactamice și organismele producătoare (după Chopra, 2001)

Succesul antibioticelor -lactamice în tratamentul maladiilor infecțioase se datorează specificității și toxicității scăzute. În ciuda numărului mare de antibiotice și a incidenței crescute a izolatelor rezistente la peniciline, antibioticele -lactamice sunt cele mai utilizate.

Deoarece enzimele de sinteză sunt adeseori instabile și se găsesc în cantități mici, purificarea fiind dificilă, căile biosintezei penicilinei (penam) și a cefalosporinei (cefem) s-au elucidat la sfârșitul anilor ‘70.

Pe baza structurii chimice, -lactamii pot fi clasificați în 5 grupe. Toți au în comun inelul -lactamic cu 4 atomi. Cu excepția monobactamilor care au un singur inel, antibioticele -lactamice constau dintr-un inel biciclic.

Cefalosporinele sunt derivate N-acil ale acidului 7-aminocefalosporanic. Ele conțin ciclul -lactamic, dar diferă structural de peniciline pentru că au un ciclu hexagonal de dihidrotiazină, în locul celui pentagonal de tiazolidină. Prin condensarea celor două inele rezultă nucleul cefem. Cele două inele nu sunt așezate în același plan, iar atomii și grupările atașate lor pot ocupa poziții foarte diferite.

Structura moleculară a acidului 7-aminocefalosporanic

Molecula de cefalosporină poate fi fragmentată în resturile din care este sintetizată: acid D–aminoadipic, L-cisteină, –dehidrovalină și de acid acetic. Nucleul cefem este mai stabil decât nucleul penam, ceea ce explică numărul mare de cefalosporine semisintetice și analogi sintetici. Cele două cicluri sunt asemănătoare structural. În plus, penicilina N și cefalosporina C au aceiași catenă laterală, ceea ce sugerează asemănarea căilor de biosinteză. Cele două antibiotice -lactamice pot fi produse în condiții care favorizează numai o creștere lentă a micliului, în medii organice complexe sau definite chimic, în suspensii bine aerate.

Acțiunea antibacteriană s-a păstrat după modificările importante ale legăturilor atomilor din inelul cefem, deoarece conservă o anumită configurație sterică. Mecanismul lor de acțiune este același cu al penicilinelor: se leagă ireversibil de PBP și împiedică formarea legăturilor transversale ale peptidoglicanului. Cefalosporinele cu importanță clinică majoră sunt semisintetice, cu spectru mai larg de activitate decât penicilinele și sunt, în general, mai rezistente la acțiunea β-lactamazelor.

Nucleul clavam are structura biciclică -lactamică. În poziția C2 are o grupare -hidroxietiliden, iar gruparea carboxil C3 și atomul C5 au aceiași configurație că și în molecula de penicilină. Acidul clavulanic potențează acțiunea antibacteriană a unor antibiotice -lactamice cu spectru larg. Acționează ca inhibitor al lactamazelor, enzime ce inactivează inelul -lactamic. Acidul clavulanic asociat cu un antibiotic -lactamic cu spectru larg, sensibil la efectul hidrolitic al -lactamazelor, interacționează cu enzima și formează un complex inactiv enzimă-acid clavulanic. Antibioticul -lactamic cu spectru larg este protejat și rămâne în forma sa activă.

Acidul clavulanic inhibă TEM -lactamazele, precum și -lactamazele produse de S. aureus. Se cunosc două asociații cu efect terapeutic optim: augmentin (amoxicilină – acid clavulanic) și timentin (ticarcilină – acid clavulanic).

Un număr relativ mare de antibiotice naturale acționează asupra enzimelor implicate în biosinteza peptidoglicanului și stabilizării peretelui celular.

În funcție de spectrul antibacterian, cefalosporinele se clasifică în patru grupe notate I, II, III și IV.

Cefalosporinele din grupa I și II, se disting în funcție de stabilitatea lor la hidroliza cu β-lactamazele cu spectru larg (TEM-1/2 și SHV-1). În grupul II sunt incluse cefalosporinele (grup II B) și cefamicinele (grupul II A). Grupele III și IV conțin antibiotice cu un spectru larg de acțiune. Grupa III e foarte importantă calitativ și cantitativ în practica medicală. Reprezentanții grupei III sunt: cefotaxima, ceftriaxona și ceftazidina. În grupa IV sunt reunite C-3’ produse ca săruri cuaternare de amoniu (cefperoma, cefepima). Aceste molecule posedă aceeași activitate În vitro ca cefotaxima asupra bacililor Gram negativi dar se diferențiază printr-o bună activitate În vitro asupra enterobacteriilor producătoare de cefalosporinaze și asupra tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa multirezistente.

Carbapenemele se deosebesc de peniciline, prin absența atomului de S, dar apare dubla legătură la C2-C3 în inelul tiazolidinic. Prezența dublei legături în inelul carbapenem conferă acestei structuri o reactivitate chimică superioară, comparativ cu inelul penam al penicilinei. Mecanismul de acțiune este comun cu al celorlalte antibiotice -lactamice.

Antibioticele -lactamice monociclice sunt reprezentate de nocardicine și monobactami. Nocardicina A are acțiune antibacteriană moderată față de câteva specii Gram negative (inclusiv Pseudomonas). Celelalte variante moleculare nu au acțiune antibacteriană semnificativă. Nici unul dintre membrii grupului nu se utilizează în clinică. Antibioticele a căror moleculă cuprinde ciclul monobactam, datorită simplității structurale au fost sintetizate pe cale chimică în condiții economice.

Genele pentru sinteza -lactamilor au fost identificate atît la bacterii cît și la fungi. Secvența nucleotidelor genelor celor două grupe de microorganisme are un grad ridicat de omologie (60% dintre nucleotide sunt identice). S-a emis ipoteza unui transfer orizontal al genelor ce codifică biosinteza antibioticelor -lactamice, de la bacterii la fungi. Atît la bacterii cît și la fungi, genele -lactamilor sunt grupate (cluster)într-un singur bloc. Genele pentru biosinteza cefalosporinei la Acremonium chrysogenum sunt organizate în două aglomerări localizate pe cromosomi diferiți. S-a presupus că genele pentru biosinteza -lactamilor, în cursul evoluției, s-au transferat ca o singură grupare, de la un procariot ancestral, la un organism precursor al fungilor care sintetizează antibiotice -lactamice. La organismul eucariot, precursor al fungilor, genele codificatoare ale biosintezei antibioticelor -lactamice s-au distribuit între cei doi cromosomi.

Mecanismul de acțiune a antibioticelor -lactamice

Celula bacteriană trebuie să aibă un perete cu o structură închisă, legată covalent, care să permită adăugarea noilor unități pentru creștere. Noile straturi de mureină sunt adăugate secvențial pe fața externă a membranei citoplasmatice, în proximitatea ei, chiar sub stratul mureinic anterior. Pe măsură ce noile straturi de mureină sunt adăugate, cele vechi sunt deplasate spre exterior și sunt supuse unor forțe de întindere tot mai mari, până la limita elasticității lor. În acest punct, autolizinele sunt extruzate din celulă și hidrolizează stratul cel mai tensionat. Fragmentele mureinice sunt eliberate și uneori chiar reutilizate.

Sinteza mureinei are loc în 3 stadii. În primul stadiu , în citoplasmă, se sintetizează precursorii solubili cu gr.mol. mică – UDP-GlcAc și UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu-mezoDap-D-Ala-D-Ala. Unii agenți antibacterieni interferă cu treptele timpurii ale sintezei peretelui. Inițial, la UDP-MurNAc este adăugat un tripeptid, la care va fi legat dipeptidul D-Ala-D-Ala, sintetizat de o enzimă specifică. D-Ala este produsă din L-Ala sub acțiunea alanin-racemazei.

Stadiul al doilea al sintezei peretelui celular este catalizat de enzime legate de membrană. Regiunea non-nucleotidică a moleculei precursoare sintetizată anterior (intermediarul N-acetil glucozamina și acidul N-acetil muramic-tetrapeptid) este atașată la un purtător lipidic (undecaprenol-pirofosfat, denumit bactoprenol), generând lipidul I. Acesta este integrat în membrană, modificat ulterior prin adăugarea GlcNac și pentaglicinei. Se formează undecaprenol pirofosfat-MurNac(-L-Ala-D-Gln-(NH2-(Gly5)L-Lys-D-Ala-D-Ala)-(1-4)-GlcNac (lipidul II) și este translocat prin membrana plasmatică. Lipidul II are rol de substrat pentru reacția de transglicozilare, polimerizând catenele glican ale peretelui celular bacterian. Rezultă astfel dizaharidul repetitiv (MurNac-GlcNac)n. Purtătorul lipidic are rol de punct de atașare de membrană pentru precursori și permite transportul subunităților prin interiorul hidrofob al membranei citoplasmatice, la suprafața celulei.

În stadiul al treilea al sintezei, subunitățile peptidoglicanice sunt polimerizate prin inserția în peretele celular existent. Polimerizarea se face prin transferul peptidoglicanului nou, de la purtătorul său localizat în membrană, la peptidoglicanul parietal preexistent, printr-o reacție de transpeptidare ce implică lanțurile peptidice ale ambilor polimeri, dintre care una trebuie să posede resturi D-ala-D-ala terminale. Reacția este catalizată de un complex de enzime, astfel încât să elimine riscul spargerii celulei sub acțiunea presiunii de turgor (hidrostatice) din celulă. Enzimele sunt secretate prin membrană. Ele sunt autolizine, transglicozilaze și transpeptidaze, toate cu acțiune degradativă strict controlată asupra peretelui celular, permițând creșterea și diviziunea celulei.

Polimerizarea glucidului și legarea încrucișată a catenelor tetrapeptidice, denumită reacția de transpeptidare, este catalizată de proteine-enzime care leagă penicilina (penicillin binding proteins – PBP), localizate la nivelul membranei citoplasmatice și în spațiul periplasmic.

Dizaharid-pentamuropeptidul extruzat prin membrana citoplasmatică, este inserat în rețeaua mureinică în creștere. Peptidul se leagă de un alt peptid ce aparține altui lanț. Legarea celor două dizaharid-pentamuropeptide prin secvențele terminale se face cu consum de energie furnizată de reacția de transpeptidare și pierderea D-Ala terminală a uneia dintre cele două muropeptide. Rezultă astfel un nonamuropeptid (penta-tetrapeptid) (fig. 37). Restul D-ala al celuilalt muropeptid este adeseori hidrolizat și rezultă un octa- sau chiar un heptamuropeptid.

Figura 37. Componentele moleculare ale mureinei (adaptare după Koch, 2003). Explicații în text.

Antibioticele β-lactamice sunt inhibitoare ale sintezei peretelui celular. Diferitele enzime țintă ale antibioticelor sunt denumite generic PLP (francez – protein liant les penicillines) sau PBP (englez -penicillin binding protein). Funcția enzimatică a fiecărei PBP a fost studiată în detaliu la E. coli. La această specie există patru PBP cu gm mare (PBP 1a, 1b, 2 și 3). Toate sunt enzime bifuncționale: catalizează transpeptidarea și transglicozilarea peptidoglicanilor. Rolul PBP ca enzime implicate în procesul final al formării peretelui mureinic a fost descoperit prin marcare cu penicilină G radioactivă.

PBP sunt enzime care catalizează reacțiile de legare încrucișată între polimerii peptidoglicanului, una dintre treptele finale în procesul asamblării peretelui celular. La Staphylococcus aureus, PBP au funcții fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze și carboxipeptidaze. Unele PBP sunt esențiale pentru supraviețuirea și creșterea celulei. Existența PBP esențiale este argumentată de mutantele care nu sintetizează PBP și sunt condiționat letale. Transpeptidazele (transamidaze) acționează asupra mureinei prin clivarea unor legături peptidice critice și reformarea legăturii cu alt partener peptidic: legătura D-ala-D-ala este clivată și tetramuropeptidul rămâne legat de enzimă, până când alt muropeptid furnizează un grup amino al unui rest de acid diaminopimelic. Autolizinele (hidrolaze) leagă apa în locul grupării amino și în reacția de hidroliză a mureinei eliberează D-ala. Acțiunea lor împiedică formarea legăturilor transversale locale și distruge mureina numai într-o zonă strict limitată a peretelui.

Baza acțiunii antibioticelor β-lactamice constă în aceea că substratul transpeptidării – capătul carboxil al D-alaninei din structura intermediarului dizaharid-tetrapeptid – are omologie structurală strânsă cu inelul β-lactamic. Antibioticele -lactamice inhibă ultima etapă a sintezei peptidoglicanilor, adică formarea punților interpeptidice. Acești compuși prezintă analogie structurală cu dipeptidul terminal D-ala-D-ala, care face parte din pentapeptidul mureinic.

Antibioticele acționează ca pseudosubstraturi și acilează situsurile active ale transpeptidazelor PBP, care devin astfel incapabile să catalizeze reacțiile de polimerizare ale subunităților mureinice. Reacția de acilare a PBP este foarte lent reversibilă. Enzimele PBP deacilate devin incapabile să catalizeze reacțiile de legare încrucișată a peptidelor. Complexul antibiotic-PBP stimulează eliberarea autolizinelor, cu efect degradativ asupra peretelui celular. Presiunea osmotică din celulă, superioară celei din mediul extern, lizează celula.

Transpeptidazele (PBP) sunt diferite la bacteriile Gram pozitive, Gram negative și respectiv anaerobe, ceea ce explică într-o oarecare măsură diferențele activității antibacteriene a antibioticelor -lactamice. Legarea unui antibiotic -lactamic la PBP determină modificări morfologice ale celulei bacteriene: de exemplu, unele antibiotice se leagă de PBP implicată în formarea septului de diviziune. Consecința este că celulele continuă să crească sub forma filamentelor lungi. Legarea de altă PBP duce la liza rapidă a bacteriei, deoarece peretele proemină și celula se sparge. Mecilinam (amidino-penicilina) nu se leagă de PBP ale bacteriilor Gram pozitive și nu influențează creșterea lor, iar aztreonam se leagă numai de PBP ale bacteriilor Gram negative și nu inhibă creșterea celor Gram pozitive sau anaerobe.

Rezistența la antibioticele β-lactamice este conferită pe următoarele căi:

– sinteza β-lactamazelor;

– mutațiile PBP, al căror efect este reducerea afinității de legare cu antibioticele β-lactamice;

– înglobarea diminuată a antibioticelor datorată schimbărilor în structura peretelui sau activității pompelor de eflux.

Cel mai important mecanism de rezistență la antibioticele β-lactamice constă în sinteza enzimelor cu efect hidrolizant asupra antibioticelor. Unul dintre primele rapoarte cu privire la rezistența antibioticelor a fost referitor la o tulpină bacteriană producătoare de –lactamază, o enzimă ce hidrolizează legătura -lactamică a acestei clase de antibiotice. Această legătură este esențială pentru activitatea antibioticelor -lactamice, deoarece are rolul de analog al legăturii peptidice ce leagă D-Ala terminală a peptidului de monomerul peptidoglicanic. -lactamazele sunt enzime foarte eficiente : o singură moleculă poate hidroliza peste 100 000 de molecule -lactamice. β-lactamazele sunt o familie mare de enzime cu structură unitară, toate clivează ciclul -lactamic și inactivează antibioticul, dar diferă prin secvența aminoacizilor. Spectrul lor de activitate este restrâns. -lactamazele s-au diversificat prin mecanismul mutațiilor punctiforme ce se acumulează gradat în genele codificatoare.

Clasificarea -lactamazelor. -lactamazele s-au clasificat în funcție de substratul pe care-l hidrolizează, de sensibilitatea la inhibitori, de modul de producere (constitutiv sau inductibil) și de localizarea cromosomală sau plasmidială a genelor codificatoare.

-lactamazele sunt considerate penicilinaze (cele care acționează asupra penicilinelor), cefalosporinaze (hidrolizează cefalosporinele). Unele au spectru larg de acțiune (cele care hidrolizează penicilinele și cefalosporinele).

-lactamazele produse de S. aureus și S. epidermidis sunt exoenzime, pe care celula le elimină în mediul extracelular, în cantități mari. -lactamazele produse de bacteriile Gram negative sunt endoenzime, pe care celula le sintetizează și le concentrează în spațiul periplasmic. Enzimele hidrolitice sunt polipeptide, al căror punct izoelectric este 8,9.

Clasificarea pe baza secvenței de nucleotide a genelor codificatoare recunoaște 4 clase de -lactamaze: A, B, C, D. Această clasificare este stabilă și reflectă raporturile fundamentale ce nu pot fi modificate de mutații.

Figura 38. Situsurile de acțiune a -lactamazelor (indicate de săgeți).

Enzimele din clasele A, C și D au serină la situsul activ, iar cele din clasa B au 4 atomi de Zn.

β-lactamazele claselor A și B sunt foarte active față de benzil-penicilină și respectiv, peniciline și cefalosporine. Enzimele clasei C sunt în general inductibile, dar mutațiile genelor codificatoare pot duce la supraexpresie. Enzimele clasei D sunt de tip OXA, deoarece hidrolizează oxacilina.

O altă clasificare împarte β-lactamazele în următoarele grupe:

– metalo-β-lactamazele folosesc ionii de Zn la situsul activ, pentru a rupe inelul –lactamic. Acest mecanism de acțiune este specific -lactamazelor clasei B;

– β-lactamazele cu spectru larg de acțiune, sunt active prin mecanismul serin-esteric. Enzima se asociază necovalent cu antibioticul, pentru a forma un complex necovalent. Inelul -lactamic este atacat de hidroxilul liber de pe lanțul lateral al unui rest de serină de la situsul activ al enzimei, rezultând un acil-ester covalent. Hidroliza esterului eliberează enzima activă și antibioticul inactiv, hidrolizat. Acest mecanism este comun –lactamazelor claselor A, C și D.

-lactamazele produse de bacteriile Gram negative (Enterobacter sp., Ps. aeruginosa, Citrobacter sp., Serratia sp., Proteus vulgaris, Klebsiella) au următoarele caracteristici :

– unele hidrolizează preferențial cefalosporinele, cu o rată mult mai înaltă decât penicilinele

– nu sunt inhibate de acidul clavulanic sau de sulbactam

– sinteza lor este indusă

– cele care hidrolizează preferențial penicilinele sunt constitutive

– cele cu spectru larg hidrolizează cu rate comparabile penicilinele și cefalosporinele : TEM-1, TEM-2, SHV-1, HMS. Sunt inhibate de acidul clavulanic.

Mult timp după descoperirea antibioticelor -lactamice, s-a crezut că acestea sunt produse numai de speciile de Penicillium. Ulterior s-au identificat tulpini bacteriene care sintetizează -lactami, dar mecanismele prin care anihilează efectele toxice ale antibioticelor pe care le produc nu sunt clare. O explicație plauzibilă este că -lactamii și -lactamazele au coexistat chiar la organismul ancestral, conform principiului că o celulă producătoare de toxină, trebuie să posede căile prin care să se protejeze de propria-i toxină.

Koch (2003) consideră că -lactamazele au derivat din transpeptidaze, enzimele active în procesul de creștere a sacului mureinic, cu câteva schimbări. Astfel, o PBP funcțională în procesul creșterii, s-a duplicat: o copie s-a transformat dintr-o endotranspeptidază, într-o -lactamază, prin schimbări care permit intrarea apei la situsul activ. Omologia secvenței de aminoacizi este dovada că toate -lactamazele derivă din PBP și nu au avut o apariție independentă. PBP și lactamazele ce hidrolizează penicilina au câteva secvențe de aminoacizi foarte conservate.

Proteinele care leagă penicilina (PBP), de asemenea pot reacționa cu -lactamii, formând serin-esteri, dar spre deosebire de esterii formați de -lactamaze, nu pot hidroliza ușor.

Enzimele -lactamazice sunt detectate prin metode sensibile, la toate bacteriile. Sinteza lor precede era antibioticelor. Lor li se atribuie un posibil rol în asamblarea peptidoglicanului sau au evoluat ca un mecanism protector față de -lactamii produși de bacteriile și de fungii din mediu.

Unele -lactamaze sunt codificate de gene cromosomale și sinteza lor este constitutivă sau inductibilă.

-lactamazele codificate de plasmide transmisibile care se pot disemina cu mare ușurință. Astfel de plasmide s-au identificat la Staphylococcus, H. influenzae, Enterobacter, N. gonorrhoeae. Stafilococii sunt singurii patogeni comuni Gram pozitivi, la care -lactamazele au creat probleme majore de rezistență, deoarece genele s-au răspândit prin transferul pe orizontală al plasmidei de rezistență și s-au selectat tulpinile rezistente, al căror procent a atins 80-90% dintre izolate, atât la S. aureus, cât și la tulpinile coagulazo-negative.

Rezistența naturală prin scăderea afinității între ținta bacteriană și antibiotic

Micoplasmele, bacterii lipsite de perete celular, sunt natural rezistente la actiunea antibioticelor cu ținte de actiune la acest nivel (enzimele PLP). La alte specii bacteriene, PBP manifestă afinitate naturală slabă pentru antibioticele β-lactamice. Este cazul aztreonamului, inactiv asupra bacteriilor Gram pozitive și anaerobe stricte (Georgopapadakou, 1982), cefsulodinului inactiv față de enterobacterii (Barry, 1981) și cefalosporinelor și penicilinei M inactive față de enterococci.

Rezistența bacteriilor Gram pozitive la β-lactamice

Utilizarea în clinică pe scară largă a -lactamilor, constituie factorul major selectiv care influențează sinteza -lactamazelor de către agenții patogeni.

S. aureus este de obicei rezistent la benzil-penicilină, deoarece majoritatea tulpinilor izolate (80-95%) produc penicilinază.

Rezistența tulpinilor de S. aureus la meticilină se datorează legării antibioticului de către PBP, cu rol în sinteza peretelui celular. După legarea antibioticului, PBP se inactivează și sinteza peretelui celular este inhibată. Rezistența la concentrațiile mari de β-lactamice este totdeauna dependentă de sinteza unei noi variante biochimice de PBP (PBP2), codificată de o genă cromosomală. Expresia genei este constitutivă sau inductibilă de către unele antibiotice β-lactamice. Rezistența la concentrațiile mici de meticilină se datorează producerii β-lactamazei, creșterii nivelului PBP sau diminuării afinității de legare a antibioticului de proteinele implicate în sinteza peretelui celular (PBP). Rezistența la concentrațiile mari este totdeauna dependentă de sinteza unei noi variante biochimice a PBP (PBP2), codificată de gena mecA, cu localizare cromosomală. Proteina PBP2 are o afinitate mică pentru cele mai multe antibiotice β-lactamice. Expresia genei mecA este constitutivă sau inductibilă în prezența unor antibiotice β-lactamice. Rezistența la meticilină a tulpinilor de S. aureus (MRSA) este mai mare la 30o C decât la 37o C și se datorează producerii PBP2, care nu este sensibilă la acțiunea meticilinei. În unele cazuri, singurele medicamente eficiente pentru tratamentul infecțiilor cu S. aureus rezistente la meticilină sunt antibioticele glicopeptidice ca vancomicina.

Rezistența tulpinilor de Str. pneumoniae la penicilină se datorează prezenței PBP modificate, în special PBP2, care au o afinitate redusă pentru penicilină. La Str. pneumoniae, β-lactamazele nu au fost niciodată detectate, dar diferitele tulpini codifică 6 variante biochimice de PBP : PBP 1a, 1b, 2a, 2b, 2x și PBP3.

Antibioticele cu structură -lactamică formează un grup larg, utilizate în clinică pentru terapia infecțiilor bacteriene, dar sunt deosebiri foarte mari în ceea ce privește spectrul și intensitatea acțiunii antibacteriene. Diferențele se datorează afinității diferite de legare cu transpeptidazele bacteriene, enzime implicate în sinteza peretelui celular sau cu enzimele care inactivează antibioticul (-lactamaze).

Rezistența naturală la β–lactamice mediata de β-lactamaze la bacilii Gram negativi

La Klebsiella, rezistența este legată de sinteza unei β-lactamaze cromosomale cu spectru larg care antrenează rezistența la peniciline, anulată prin administrarea de inhibitori enzimatici ca acidul clavulanic, sulfbactam sau tazobactam.

La Enterobacter sp., Serratia sp., Morganella sp., Providencia sp., Ps. aeruginosa, rezistența este determinată de producerea unei β-lactamaze cromosomale de tipul cefalosporinazei (Bush, 1995). Terapia infecțiilor cu Ps. aeruginosa se realizează cu aminoglicozide și cu -lactamice. Rezistența celulelor de Ps. aeruginosa se datorează permeabilității scăzute a peretelui, precum și sintezei de -lactamaze.

Serratia marcescens produce în mod natural o enzimă codificată de o gena cromosomală capabilă să inactiveze kanamicina, tobramicina, netilmicina și amikacina, iar Providencia stuartii produce o enzimă capabilă să inactiveze neomicina, gentamicina, tobramicina și netilmicina.

Speciile anaerobe aparținînd genului Bacteroides și care fac parte din microbiota tubului digestiv al omului, sunt natural rezistente la aminopeniciline și la numeroase cefalosporine prin producerea de β-lactamaze codificate de gene cromosomale cu spectru larg, care sunt inhibate de acidul clavulanic.

Rezistența dobândită la antibioticele β-lactamice

Rezistența dobândită la cefalosporinele de generația III, la aztreonam și la penicilinele cu spectru larg este foarte frecventă la 10-30% din tulpinile aparținând speciilor natural producătoare de cefalosporinaze cromosomale inductibile: Enterobacter cloaceae, E. aerogens, Citrobacter freundii, Serratia marcescens si Ps. aeruginosa. Mecanismul de rezistență dobândită constă în sintaza intensă a cefalosporinazelor naturale (Sanders, 1982; Then, 1986).

β-lactamazele codificate de gene plasmidiale care joacă un rol important în patologia infecțioasă pot fi grupate în patru categorii:

– penicilinaze cu efect strict, ce nu inactivează decât penicilinele și care sunt responsabile de rezistența dobandită la penicilina G și A a tulpinilor de S. aureus.

– β-lactamaze cu spectru larg, care inactiveaza penicilinele si În parte cefalosporinele, În afara de cefamicina si cefalosporinele de generatia III. Aceste enzime sunt responsabile, de exemplu, de rezistența dobândită la penicilină, la enterobacterii și Pseudomonas aeruginosa și de aceea denumirea curentă este aceea de penicilinaze. Exemplul tip este TEM-1, identificat acum 30 ani la Escheria coli.

– β-lactamaze cu spectru larg (BLSE), derivate prin mutatiile punctiforme ale enzimelor precedente si care inactiveaza de asemenea În parte cefalosporinazele de generația III și aztreonamul.

– β-lactamaze numite TEM rezistente la inhibitori (TRI sau IRT) derivate prin mutațiile punctiforme ale β-lactamazelor TEM-1 sau 2 care sunt responsabile de rezistența la peniciline.

Aceste enzime, deja numeroase, au fost identificate dupa câțiva ani la tulpinile de E. coli rezistente la asociația amoxicilină-acid clavulanic (Henquell, 1995). La aceste patru categorii de enzime se adaugă câteva enzime plasmidiale mai puțin studiate: cefalosporinazele plasmidiale înrudite cu cefalosporinazele cromosomale naturale ale enterobacteriilor (MIR-1) și identificate la Klebsiella; imipenemaze identificate la E. cloaceae (HMC-1) la Serratia, Ps. aeruginosa sau β-lactamazele cu spectru larg de la Ps. aeruginosa (PER-1)

5.5. Antibioticele polipeptidice

Clasificarea antibioticelor polipeptidice

Polimixinele sunt antibiotice polipeptidice (octapeptide cu gm mare), cu caracteristici chimice și proprietăți biologice identice. Sunt recunoscute 5 polimixine majore, distincte chimic, desemnate polimixina A, B, C, D, E. Cele mai reprezentative sunt polimixina B și polimixina E sau colistina. Toate sunt sintetizate de Bacillus polymyxa și au același spectru antibacterian. Sunt active în concentrații asemănătoare, dar produc efecte secundare semnificative. Polimixinele A și D sunt nefrotoxice și nu au fost niciodată folosite în clinică, iar polimixinele B și E au cel mai scăzut nivel de toxicitate. Aceste antibiotice sunt active față de bacteriile Gram negative, deoarece membrana externă conține lipide cu sarcină negativă (Aerobcter, Brucella, Escherichia, Hemophillus, Klebsiella, Yersinia, Salmonella, Shigella, Vibrio), la concentrații de până la 5,0 g/ml. Nu sunt active față de bacteriile Gram pozitive, cocii Gram negativi și micobacterii. Trichomonas vaginalis este sensibil la concentrația de 125-250 g/ml.

Componentele moleculare ale polimixinei și modalitatea interacției lor

Polimixinele nu sunt absorbite după administrare orală sau tegumentară, nu difuzează semnificativ în țesuturi. De aceea nu sunt eficiente față de infecțiile sistemice difuze sau ale organelor parenhimatoase profunde. Se folosesc în tratamentul infecțiilor localizate : răni, arsuri, mucoase ale tractului intestinal, cavitatea pleurală, spațiul dural, grefe. Se folosesc cu mare eficiență în tratamentul infecțiilor meningeale, pulmonare și ale tractului urinar. Polimixinele se asociază frecvent cu alte antibiotice, pentru a extinde spectrul antimicrobian și se folosesc pentru sterilizarea tractului digestiv.

Situsul celular al acțiunii polimixinelor

Ținta polimixinelor este membrana lipidică, adică membrana externă și citoplasmatică a bacteriilor Gram negative. Fixarea polimixinelor de membrane duce la dezorganizarea acestora și la liza celulei.

Membranele biologice sunt alcătuite dintr-o matrice lipidică, în care sunt distribuite aleatoriu, proteinele globulare ce penetrează stratul lipidic. Membrana citoplasmatică acționează ca barieră de permeabilitate selectivă pentru ioni, nutrienți și este sediul structural al sistemelor de transport. Agenții antimicrobieni pot să dezorganizeze membranele: pot fi cationici, anionici sau neutri. Efectul polimixinelor este asemănător cu al detergenților cationici. Molecula lor conține grupări hidrofile și hidrofobe. La pH neutru sunt încărcate pozitiv și pot fi considerate ca niște compuși cationici, cu activitate față de membrana externă polianionică a bacteriilor Gram negative, sarcină conferită de lipopolizaharide.

Activitatea polimixinelor este antagonizată de compușii anionici, de Mg2+ și de Ca2+, deoarece neutralizează sarcinile negative ale grupărilor fosfat din membrana lipidică. Polimixinele dezorganizează structura membranelor și modifică profund permeabilitatea. Nu se folosesc pentru tratamentul sistemic, deoarece se leagă de diferiți liganzi tisulari și sunt toxice pentru rinichi și pentru sistemul nervos.

Fixarea antibioticelor în structura membranei depinde de concentrația cationilor bivalenți din mediu: carența sau excesul acestora inhibă acțiunea polimixinelor. Compoziția în LPS, fosfolipide și proteine a membranelor bacteriene influențează de asemenea fixarea și gradul de sensibilitate sau de rezistență al diferitelor specii bacteriene la acțiunea polimixinelor. Polimixina și alte molecule policationice se leagă de lipidul A al LPS, într-un raport stoichiometric și se inseră în structura membranei. Un astfel de mozaic molecular dezorganizează straturile lipidice, iar membrana nu mai funcționează normal ca barieră osmotică eficientă. Datorită alterărilor structurale ale membranei externe și interne, echilibrul osmotic este perturbat prin pierderea ionilor de K+. Modificările permeabilității sunt asociate cu pierderea constituienților celulari solubili și a viabilității. Mecanismul este același cu cel propus pentru hemoliză sub acțiunea detergenților ionici. Efectul hemolitic se datorează dezorganizării complexului colesterol-fosfolipide-lipoproteine din membrana eritrocitului.

Concentrațiile minime inhibitorii ale polimixinelor opresc temporar creșterea bacteriilor sensibile, iar concentrațiile de 2-4 ori mai mari au efect bactericid rapid. Sensibilitatea nu depinde de faza de creștere a celulelor bacteriene. Bacteriile sensibile leagă cu afinitate înaltă polimixinele. Specifcitatea înaltă a legării stă la originea unei metode eficiente pentru îndepărtarea endotoxinei din plasma pacienților septici: plasma este perfuzată printr-o coloană la care este legată polimixina.

Rezistența se datorează incapacității antibioticului de a penetra membrana externă.

Bacitracina

Bacitracina s-a izolat în 1945, dintr-o tulpină de Bacillus licheniformis și a fost folosită pentru tratamentul infecțiilor stafilococice severe, până în 1960. Produsul comercial conține un compus principal – bacitracina A și cel puțin 9 polipeptide strâns înrudite. În soluție neutră sau ușor alcalină, activitatea antibacteriană scade foarte mult. Antibioticul este bine tolerat în aplicațiile locale și prin instilare directă în spațiile articulare, în cavitățile pleurale, în rănile chirurgicale, pe membranele mucoase, urechi, ochi, țesutul cerebral. După administrare intramusculară, bacitracina este excretată pe cale urinară și uneori produce hematurie și proteinurie, datorită alterării ireversibile a proprietăților de filtru ale endoteliului glomerulului vascular.

Bacitracina se sintetizează după încheierea fazei de creștere logaritmică și necesită adăugarea nivelelor crescute de Mn2+. În celula producătoare, antibioticul îndeplinește mai multe funcții:

– inhibă dezvoltarea altor microorganisme în mediu. Antibioticele, ca metaboliți secundari au ca funcție primară, inhibiția creșterii altor microorganisme, deoarece alți metaboliți secundari nu au proprietăți antibiotice. Sinteza antibioticelor conferă avantaj selectiv organismelor producătoare, dar pentru bacitracină nu există dovada că în mediile naturale ar avea rol de antibiotic;

– alterează membranele celulelor producătoare, ușurând eliberarea produselor metabolismului secundar: bacitracina produce spargerea protoplaștilor celulelor care o produc;

– represează creșterea vegetativă sau inițiază sporularea;

– are rol de unitate structurală a învelișului sporal. Compoziția în aminoacizi a hidrolizatelor de bacitracină și de înveliș sporal este foarte asemănătoare.

Componentele moleculare ale bacitracinei

Majoritatea compușilor antimicrobieni de origine naturală sau sintetică posedă unul sau mai multe situsuri moleculare la care pot să lege ionii metalici. Bacitracina formează complexe cu ionii metalici. Complexele bacitracinei cu Zn2+, Ni2+, Mn2+ și Co2+, ca și cu ZnO și CdO sunt mai stabile la variațiile de temperatură comparativ cu antibioticul nativ. Pentru sinteza bacitracinei sunt necesari numai ionii de Mn2+. Datorită toxicității sale și disponibilității altor antibiotice, utilizarea sa s-a limitat în special la aplicare locală. Mecanismele de actiune a bacitracinei sunt multiple: dezorganizează membrana externă a bacteriilor Gram negative, inhibă sinteza proteinelor și a peretelui celular. Ultimele două efecte sunt considerate consecințe ale interferenței cu funcțiile de permeabilitate ale membranei.

Rezistența este datorată incapacității antibioticului de a penetra membrana externă.

Gramicidinele și tirocidina sunt sintetizate de tulpini de Bacillus brevis. Structural fac parte din grupul antibioticelor polipeptidice. Aceste antibiotice sunt active asupra membranei și par să acționeze prin producerea porilor membranari. Se folosesc numai cu aplicare locală.

Actinomicina

Actinomicina, produsă de diferite specii de Streptomyces, este primul antibiotic care s-a obținut în stare cristalină, o substanță pigmentată roșu, foarte activă față de bacteriile Gram negative, mai puțin activă față de bacteriile Gram pozitive și lipsită de activitate față de fungi. Antibioticul are un nivel înalt de toxicitate față de animalele de experiență și nu a fost folosită ca agent chimioterapeutic.

Actinomicinele formează o familie de antibiotice cromopeptidice, care diferă numai în regiunea peptidică a moleculei. Gruparea cromoforă, denumită actinocin, este comună pentru toate variantele chimice de actinomicine. Gruparea cromoforă este atașată de două catene pentapeptidice, care pot fi identice sau diferă în compoziția aminoacizilor. Peptidele sunt structuri ciclice, deoarece grupul COOH al aminoacidului terminal – N-metil-L-valina, este esterificat cu gruparea OH a primului aminoacid – treonina, pentru a forma un inel lactonic.

Structura moleculară a actinomicinei D.

Toate variantele de de actinomicină sintetizate de Streptomyces conțin gruparea cromoforă fenoxazinona (1 mol), L-treonina (2 moli), sarcozina (2 moli) și N-metil-L-valina (2 moli)/moleculă de antibiotic. Gruparea cromoforă (fenoxazinona) se sintetizează din triptofan.

Un organism producător al actinomicinei, de obicei sintetizează simultan, mai multe actinomicine, care diferă numai printr-un singur aminoacid al peptidului.

Actinomicina produsă de Str. antibioticus este sintetizată pe o varietate de medii definite chimic și pe medii organice complexe. Randamentul sintezei este mai bun pe medii organice complexe. Sursa de N este acidul glutamic, dar și alți aminoacizi sau compușii azotați anorganici. Cea mai bună sursă de C pentru sinteza antibioticului este galactoza. Glucoza este o sursă optimă pentru creșterea miceliului, dar este metabolizată prea rapid și se sintetizează o cantitate prea mică de actinomicină. Sinteza antibioticului este stimulată în condiții de agitare a culturii.

5.6. Antibioticele glicopeptidice și lipoglicopeptidice

Antibioticele peptidice sunt diferite structural de peptidele clasice pentru ca sunt molecule ciclice, conținând lanțuri esterice și D – aminoacizi, acizi grași saturați sau nesaturați, heterocicluri, glucide aminate sau neaminate. Peptidele sunt clasificate în 6 grupe

Clasificarea antibioticelor peptidice

Vancomicina și teicoplanina

Sunt antibiotice glicopeptidice de interes clinic, componente esențiale ale terapiei antiinfecțioase, fiind active față de agenții infecțioși comuni: Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus. Sunt active exclusiv față de bacteriile Gram pozitive, formând complexe stabile și specifice, necovalente, cu D-Ala-D-Ala terminale ale peptidoglicanului. Astfel este inhibată formarea punților peptidice și creșterea peretelui celular.

Antibioticele glicopeptidice încorporează o structură heptapeptidică centrală, iar diversitatea stru turală suplimentară derivă prin modificări variate sub acțiunea halogenazelor și transferazelor. Pe lângă aminoacidul comun Tir, teicoplanina încorporează aminoacizi neproteici: 4 hidroxifenil-glicina (HPG), 3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) și -hidroxitirozina (-OHTir). Clorinarea Tir, HPG și -OHT la pozițiile 2, 5 și 6, se produce, probabil, după asamblarea peptidului.

Structura moleculară a teicoplaninei

Vancomicina, un antibiotic glicopeptidic, a fost izolată dintr-o tulpină de Streptomyces orientalis, denumită astfel deoarece s-a cultivat din probe de sol din Borneo și India. Antibioticul a fost introdus în clinică în 1958, pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii Gram pozitive.

Structura moleculară a vancomicinei

Vancomicina este o moleculă amfoterică complexă, ce conține azot și glucide, foarte ușor solubilă în apă, rezistentă la acțiunea diferitelor enzime hidrolitice. Spectrul de activitate este îngust, fiind activă față de bacteriile Gram pozitive și față de unele spirochete.

Utilizarea sa a înregistrat o dinamică ascendentă în ultimele două decenii, datorită creșterii ponderii stafilococilor coagulazo-negativi șia tulpinilor de S. aureus rezistente la meticilină. Rezistența la meticilină a unor tulpini de Staphylococcus s-a atribuit unor cantități mai mici de acizi teichoici, ceea ce determină o sarcină mai puțin negativă decât la tulpinile sensibile.

Datele statistice arătau în anul 2000 că circa 75% dintre stafilococii coagulazo-negativi și 47% dintre izolatele de S. aureus din unitățile de tratament intensiv erau rezistente la meticilină. Pentru tratamentul infecțiilor produse de tulpinile stafilococice meticilino-rezistente, vancomicina rămâne antibioticul de elecție, deoarece tulpinile rezistente apar cu o fecvență mai mică decât față de alte antibiotice.

Vancomicina se absoarbe greu din tractul digestiv, iar injecția intramusculară produce durere moderată. Administrarea este limitată la calea intravenoasă.

Mecanismul de acțiune

Vancomicina inhibă sinteza ARN, sinteza peretelui celular și lezează componentele membranei producând moartea celulei. Activitatea sa la situsuri multiple poate să explice absența dezvoltării rezistenței la acest antibiotic.

Vancomicina întrerupe sinteza peretelui celular, formând un complex cu resturile de D-Ala carboxiterminale ale precursorilor peptidoglicanului. Formarea complexului la suprafața externă a membranei citoplasmatice, împiedică transferul precursorilor de la purtătorul lipidic, la peretele peptidoglicanic.

Vancomicina inhibă reacțiile biochimice parietale, catalizate de transpeptidaze.

Antibioticele glicopeptidice au, ca și cele β-lactamice, activitate bactericidă asupra tulpinilor sensibile. În condiții normale ale sintezei peptidoglicanului, la enterococi, două molecule de D-alanină sunt legate de o ligază pentru a forma D-ala-D-ala, adăugată ulterior la UDP-N-acetil-muramil-pentapeptid. UDP-N-acetil-muramil-pentapeptidul, după ce este încorporat în peptidoglicanul nascent prin reacția de transglicozilare permite legarea punților transversale (transpeptidare) și contribuie la rezistența stratului de peptidoglican. Vancomicina acționează asupra ultimei etape a sintezei peptidoglicanului, formând legături de hidrogen, ireversibile, cu extremitatea D-ala-D-ala terminală a tetrapeptidului precursorilor dizaharidici, blocând adăugarea lor la catena polipeptidică în creștere și împiedică formarea legăturilor transversale. Glicopeptidele, mascând extremitatea D-ala-D-ala a tetrapeptidului, împiedică acțiunea transpeptidazelor și formarea legăturilor transversale ale macromoleculei peptidoglicanice.

Activitatea antimicrobiană a antibioticelor glicopeptidice este limitată la bacteriile Gram pozitive. Cele mai multe bacterii Gram pozitive sunt sensibile. Moleculele glicopeptidice sunt mari (vancomicina – 1448 Da, teicoplamina – 1900 Da) și nu pot pătrunde prin membrana externă a bacteriilor Gram negative. Prin localizarea sa în spațiul periplasmic, peptidoglicanul nu este accesibil acțiunii antibioticelor glicopeptidice. Cele mai multe bacterii Gram negative sunt rezistente.

Rezistența la vancomicină

Rezistența poate să fie intrinsecă (naturală). Rezistența streptococilor a fost indusă În vitro, chiar înainte de utilizarea sa în clinică. Molecula de vancomicină nu traversează membrana externă a bacteriilor Gram negative, datorită dimensiunilor mari. Rezistența a apărut după 20 de ani de administrare în clinică, la stafilococi, la Leuconostoc sp., cât și la bacilii Gram pozitivi (Lactobacillus). La Lactobacillus, rezistența se datorează faptului că alanina terminală din gruparea laterală a moleculei de peptidoglican este înlocuită cu lactat (D-alanil-D-lactat), care are o afinitate mai mică pentru antibioticele glicopeptidice. Pentapeptidul modificat înlocuie legătura amidică cu o legătură esterică. Vancomicina se leagă mai puțin stabil cu pentapeptidul modificat decât cu pentapeptidul normal. Pierderea unei legături de H diminuă semnificativ afinitatea vancomicinei pentru peptidul modificat. Deoarece vancomicina se complexează mai puțin frecvent și mai puțin stabil cu componentele peretelui celular, efectul inhibitor este mult diminuat. Pentru ca rezistența celulelor să fie completă, întregul perete trebuie să fie sintetizat cu pentapeptidul modificat.

S. aureus are o sensibilitate uniformă la vancomicină În vitro, dar insuccesele la tratament apar cel mai adesea în cazul endocarditei. Cauza nereușitei ar putea fi toleranța. Toleranța este un fenomen care se manifestă prin faptul că concentrațiile mici de antibiotic sunt inhibitoare ale creșterii (efect bacteriostatic), iar efectul bactericid se produce numai la concentrații relativ mari.

Antibioticele glicopeptidice sunt folosite pentru tratamentul pacienților cu intoleranță la cele uzuale, mai ales la -lactamice. Vancomicina prezintă inconvenientul administrării, deoarece necesită infuzie intravenoasă lentă. Este nefrotoxică și ototoxică, mai ales prin administrarea asociată cu aminoglicozide.

Glicopeptidele sunt antibiotice relativ scumpe. Din aceste cauze, administrarea lor este limitată la situațiile care sugerează rezistența sau alergia față de -lactamice. Utilizarea lor timp de câteva decenii, rareori a indus rezistența stafilococilor și enterococilor.

Viomicina, produsă de Streptomyces floridae, Str. paniceus și Str. vinaceus, este un polipeptid cu caracter intens bazic. Antibioticul diferă de cele mai multe antibiotice prin aceea că este mai activ față de micobacterii, comparativ cu alte bacterii. În vitro nu are activitate față de fungii patogeni pentru om, animale și plante. Produce efecte benefice în infecțiile tuberculoase, dacă este administrată în doze relativ mari. Micobacteriile dezvoltă rezistență la viomicină mult mai lent decât la streptomicină.

Structura moleculară a viomicinei

Dacă este administrată pentru perioade scurte, toxicitatea este relativ mică, dar tratamentul de durată produce efecte colaterale ample.

Mupirocina (acidul pseudomonic A)

Mupirocina este cel mai eficient agent local utilizat pentru eradicarea stării de purtător nazal de S. aureus rezistent la meticilină (MRSA).

Mecanismul de acțiune. Mupirocina este analogul structural al izoleucinei și se leagă competitiv de izoleucil-ARNt sintetază, blocând astfel sinteza proteinelor.

Structura moleculară a mupirocinei

Rezistența la mupirocină se datorează, probabil, mutațiilor genei IRS(izoleucil ARNt-sintetază).

Rezistența la mupirocină cuprinde două grupe fiziologice de microorganisme:

cele rezistente la un nivel scăzut de antibiotic, cu concentrația minimă inhibitorie (CMI) cuprinsă între 4-256 µg/ml; cele rezistente la nivele mari de antibiotic, pentru care concentrația minimă inhibitorie este egală sau mai mare de 512 µg/ml. S-au evidențiat fenomene de rezistență atât la nivelul scăzut, cât și la cel ridicat de antibiotic. Rezistența la nivelul scăzut de mupirocină se poate datora mutațiilor izoleucil-ARNt sintetazei, iar izolatele rezistente la concentrații mari de mupirocină conțin o variantă de izoleucin-ARNt sintetază, distinctă imunochimic de enzima tulpinilor bacteriene sensibile. Cele două variante ale izoleucil-ARNt sintetazei au omologie de numai 30% a aminoacizilor. Varianta mutantă a enzimei este rezistentă la acțiunea mupirocinei. Gena mup A, care codifică varianta rezistentă a izoleucil-ARNt sintetazei este localizată pe plasmide transferabile.

Mupirocina este unul dintre cei mai eficienți agenți cu aplicare locală pentru limitarea stării de purtător a tulpinilor de S. aureus meticilin-rezistente. Tulpinile de S. aureus rezistente la nivele înalte de mupirocină sunt rezistente și la meticilină (tulpini MRSA). Eliminarea tulpinilor rezistente de S. aureus din cavitățile nazale este o strategie importantă în controlul infecției. Cel mai eficient agent cu aplicare locală, pentru limitarea stării de purtător nazal este mupirocina. Aplicarea locală a antibioticului este improbabil că va eradica agentul patogen. De aceea, este importantă detectarea rapidă a tulpinilor de S. aureus rezistente la concentrații mari de mupirocină. În acest scop se folosește metoda amplificării secvenței de 456 bp, a genei mupA.

5.7. Antibiotice poliketidice

Poliketidele formează o familie mare de produse naturale și cuprind printre cele mai complexe molecule de antibiotice din categoria largă a metaboliților secundari (tabelul 8). Donadio (1993) a împărțit poliketidele în două clase: aromatice și complexe.

Structura generală a antraciclinelor

Antraciclinele sunt polichetide aromatice ce formează un grup de substanțe din care fac parte unele dintre cele mai utile citostatice folosite în prezent. Ele au structura 7,8,9,10-tetrahidrotetracen-5,12-quinonă și sunt metaboliți secundari ai actinomicetelor, în primul rând din g. Streptomyces, sau sunt derivații lor semisintetici.

Mai jos sunt redați unii substituienți (R) din antraciclinele naturale de tip aclavinonă. Prin combinațiile posibile ale acestor substituienți rezultă 1344 agliconi diferiți.

R1: H, OH;

R2: H, OH

R4: OH, OCH3

R6: H, OH

R7: H, OH, glicozid

R9: CH3, CH2CH3, COCH3, COCH2OH,

CHOHCH3, CHOHCH2OH, CH2COCH3

R10: H, OH, COOCH3, glicozid

R11: H, OH

Poliketidele sunt produse ca metaboliți secundari, adică se sintetizează după stadiul creșterii vegetative (tabelul 8).

Tabelul 8.

Antibiotice poliketidice și organismele producătoare (după Pfeiffer, 2001).

Cațiva compuși poliketidici au fost utilizați în clinica infecțioasă, în tratamentul neoplaziilor, al maladiilor cardiovasculare și al inflamațiilor (tabelul 9).

Tabelul 9.

Structura și modul de acțiune a antibioticelor poliketidice (după Pfeiffer, 2001).

Primele antracicline au fost descoperite în 1950 (Brokmann și Bauer), iar folosirea lor ca agenți antitumorali a început odată cu descoperirea daunorubicinei. Antraciclinele sunt antibiotice cu activitate antimicrobiană semnificativă. Bacteriile Gram pozitive și fungii au un grad relativ înalt de sensibilitate, iar cele Gram negative sunt, în general, rezistente, dar au un grad prea înalt de toxicitate pentru a fi folosite în acest scop.

Efectele biologice ale antraciclinelor sunt următoarele:

– inhibiția fosforilărilor oxidative în mitocondrii

– inhibiția ADN-polimerazelor

– inhibiția ARN-polimerazelor

– inhibiția enzimelor de reparare a ADN

– inhibiția sintezei metalotioneinei

– inhibiția topoizomerazei I

– inhibiția topoizomerazei II

– inhibiția helicazelor

– producerea radicalilor liberi

– clivajul endonucleolitic.

Doxorubicina (adriamicina) este un antibiotic citotoxic, a cărei parte agliconică este adriamicinona, sintetizată din unități de acetat. Molecula are un ciclu antraciclinic, izolat de la Streptomyces peucetius var. caesius. Din punct de vedere chimic, constă dintr-un nucleu naftacenchinonic, legat printr-o punte glicozidică a atomului 7 al inelului, de un glucid aminat, daunosamina.

Structura moleculară a doxorubicinei Structura moleculară a daunorubicinei

Precursorul doxorubicinei pare a fi o unitate starter propionat, la care sunt adăugate succesiv 9 unități de acetat. Catena de C precursoare a poliketidelor este ciclizată pentru a produce nucleul tetraciclic al antraciclinei. Primul intermediar ciclic cunoscut al celor mai multe antracicline este acidul aclanonic, un intermediar triciclic. Acidul aclanonic este metilat cu un grup metil din 5-adenozilmetionină și rezultă esterul metilic al acidului aclanonic, după care cel de al IV-lea inel este închis și rezultă aclavicetona. Aclavinona este precursorul celor mai multe antracicline, ceea ce înseamnă că organismele producătoare de antracicline conțin enzime ce acționează secvențial și modifică aclavinona pentru a produce alte antracicline.

Structura moleculară a aclavinonei

Cele mai comune modificări ale biosintezei antraciclinelor sunt glicozilările. Agliconul neglicozilat este de obicei inactiv. Glicozidele antraciclinelor naturale sunt de 3 tipuri: rodosamina, daunosamina și glicozide neutre. Glucidele aminate se găsesc aproape exclusiv la poziția 1. Glicozidele neutre sunt produse de organismele mutante defective în sinteza aminoglicozidelor.

Daunorubicina este un antibiotic de fermentație derivat din antraciclină, folosită în clinică pentru tratamentul leucemiilor umane. Se găsește rareori ca produs final al fermentațiilor microbiene, dar este prezentă sub forma derivaților glicozidici, care prin hidroliză acidă furnizează medicamentul. Un produs major al fermentației daunorubicinei este rodomicina, înrudită structural cu antraciclinona.

Mecanismul de acțiune a antraciclinelor

Nu se cunoaște mecanismul primar sau mecanismele prin care antraciclinele produc efectul toxic. Cea mai probabilă țintă pare a fi topoizomeraza II. Pentru inhibarea acestei enzime, o condiție necesară, dar nu și suficientă este interacțiunea antraciclinelor cu molecula de ADN. Topoizomeraza II produce o rupere dublu catenară în ADN, pe care o repară ulterior. Unele antracicline blochează relegarea ADN și astfel produc o rupere dublu catenară și fragmentarea ADN. Alte antracicline, ca de exemplu aclacinomicina A inhibă activitatea topoizomerazei II și astfel este inhibată clivarea dublei catene, urmată de blocarea replicării, transcrierii și reparării ADN.

Doxorubicina se leagă de acizii nucleici, probabil prin intercalarea specifică a nucleului planar al antraciclinei în dublul helix al moleculei de ADN. Molecula antibioticului este amfifilă: inelul antraciclinei este lipofil, iar capătul saturat al ciclului conține grupări OH numeroase, asociate glucidului aminat, rezultând un centru hidrofil. Molecula este amfoterică, deoarece conține funcții acide în grupările fenolice ale ciclului și funcție bazică în grupul amino al glucidului. Doxorubicina se leagă de membrana celulară, dar și de proteinele plasmatice. Cel mai important efect secundar al doxorubicinei și daunorubicinei este cardiotoxicitatea de tip cumulativ. Se presupune că fenomenul cardiotoxicității se datorează producerii radicalilor liberi ai antraciclinei și formării radicalului OH. liber, care reduce Cu2+ și Fe3+, la nivel celular. Producerea și stabilitatea radicalilor este asociată cu numărul grupărilor OH ai moleculei aromatice. Datorită efectului său citotoxic, doxorubicina se administrează pentru tratamentul neoplaziilor. Efectul citotoxic asupra celulelor maligne, precum și efectele sale toxice față de celulele diferitelor organe, se crede că se datorează intercalării antibioticului între bazele ADN și afinității sale de legare cu lipidele membranare. Intercalarea inhibă legarea ADN- și ARN-polimerazei, inhibând procesele de replicare și transcriere a ADN. Doxorubicina pare să interacționeze cu topoizomeraza II, formând complexe care clivează molecula de ADN. Legarea doxorubicinei de membrana celulei, perturbă o varietate de funcții celulare. Reducerea enzimatică a doxorubicinei, prin acceptarea unui electron, sub acțiunea diferitelor oxidaze, reductaze și dehidrogenaze, generează variante moleculare foarte reactive, inclusiv radicalul OH. liber.

Doxorubicina este activă față de un spectru larg de tumori experimentale, este imunosupresivă și are proprietăți carcinogenice la rozătoare. Induce diferite efecte toxice, inclusiv toxicitate cardiacă întârziată și progresivă, mielosupresie (scăderea numărului de leucocite polimorfonucleare circulante) la toate speciile analizate. La șobolan și câine produce atrofia testiculară. Doxorubicina se administrează numai intravenos. Dacă în timpul administrării, medicamentul este extravazat, produce necroză tisulară severă. De aceea, nu se administrează intramuscular sau subcutan.Toxicitatea miocardică manifestată în formă severă prin insuficiență cardiacă congestivă potențial fatală, poate să se producă în timpul terapiei sau după luni ori ani de la terminarea terapiei. Riscul insuficienței cardiace congestive crește odată cu doza totală, prin efect cumulativ, ce depășește 450 mg/m2. Efectele toxice pot să se manifeste chiar la doze cumulative mai mici, la pacienții cu afecțiuni cardiace. Doxorubicina potențează toxicitatea la pacienții supuși altor terapii antineoplazice: iradierea mediastinală, administrarea ciclofosfamidei.

Doxorubicina se metabolizează în ficat și se excretă pe cale hepatobiliară. Din această cauză, toxicitatea este mai mare la pacienții cu insuficiență hepatică.

Administrate ca citostatice, antraciclinele induc selecția unor subpopulații de celule tumorale rezistente, care nu mai răspund la tratament. Cel mai comun mecanism al rezistenței la antracicline este acela care conferă rezistență multiplă la medicamente (MDR). Mecanismul implică o glicoproteină membranară complexă care funcționează ca o pompă de export, ce transportă activ antibioticele antraciclinice din celulă.

5.8. Cloramfenicolul

A fost izolat și cristalizat în același timp, în 3 laboratoare, din culturi de Streptomyces venezuelae și Str. phleochromogenes. Este primul antibiotic cu spectru larg, introdus în clinică. Este primul antibiotic sintetizat complet prin metodele chimiei organice și este singurul antibiotic produs pe cale industrială prin sinteză chimică. Cloramfenicolul produce un efect specific asupra sintezei proteinelor. De aceea, este un instrument important în biologia experimentală, folosit în scopul blocării specifice a sintezei proteinelor, pentru a investiga alte procese celulare, ca de exemplu, controlul sintezei ADN.

Molecula de cloramfenicol conține un inel aril, cu o catenă laterală de 3 atomi de C, care poate fi derivată din fenilalanină sau tirozină. Acidul p-aminobenzoic poate să furnizeze jumătatea nitro-aril și catena laterală. Particularitatea neobișnuită a moleculei de cloramfenicol este N aromatic și halogenul organic. Sunt foarte puțini compuși de origine biologică, cu grupare nitro: acidul -nitropropionic, 2-nitro-imidazolul.

Structura moleculară a cloramfenicolului

Organismul crescut în solul nesteril, nu produce cantități detectabile de cloramfenicol. Numai în solul sterilizat, cloramfenicolul este produs în cantități semnificative. Acest fapt sugerează că cloramfenicolul nu este un antibiotic în sensul convențional – adică o substanță elaborată de un organism ca răspuns la competiția sa cu alte organisme, pentru a supraviețui într-un mediu ecologic complex.

Biosinteza cloramfenicolului progresează rapid în medii organice complexe. În mediile definite chimic, sinteza este mai puțin eficientă. Glucoza este sursa optimă de C pentru creșterea miceliului, dar randamentul sintezei antibioticului este inferior, deoarece este metabolizată cu o rată înaltă. Glicerolul satisface atât cerința creșterii miceliului, cât și a unui bun randament al biosintezei cloramfenicolului. Ionul de amoniu stimulează numai creșterea miceliului, iar nitratul favorizează sinteza cloramfenicolului. Procesul de creștre necesită o sursă de fosfat și de sulf. Magneziul, fierul, zincul sunt necesare pentru creștere, la concentrații mici.

Cloramfenicolul este un antibiotic cu spectru larg, inhibitor pentru creșterea celor mai multe bacterii Gram pozitive și Gram negative, la concentrația de 0,5 g/ml, inclusiv Rickettsia. Clostridium și Pseudomonas sunt de obicei rezistente, ca și celulele mamaliene în cultură. În general are acțiune bacteriostatică, dar este bactericid față de agenții etiologici ai meningitei: Haemophilus influenzae, pneumococi, meningococi. Cloramfenicolul inhibă sinteza proteinelor: molecula se fixează pe subunitatea ribosomală 50 S, interacționează cu ARNr-23S și inhibă formarea legăturii peptidice în catena în curs de sinteză, prin legarea de enzima peptidil-transferază pe subunitatea 50S. Cloramfenicolul este un agent bacteriostatic, inhibitor al creșterii bacteriilor Gram pozitive și Gram negative.

Rezistența la cloramfenicol se datorează, de cele mai multe ori, inactivării antibioticului sub acțiunea enzimelor inactivatoare: cloramfenicol-acetiltransferaza (CAT). Genele cat ale bacteriilor Gram pozitive și Gram negative au un grad redus de omologie și codifică o mare diversitate de enzime. Cel mai adesea, gena se găsește localizată pe plasmide de rezistență.

Uneori, rezistența la cloramfenicol se datorează permeabilității scăzute a membranei externe și implicit reducerii ratei de transport intracelular al antibioticului, precum și acțiunii pompelor de eflux, descrise la bacteriile Gram negative. Rezistența se poate datora capacității bacteriilor rezistente de a degrada antibioticul.

Cloramfenicolul are utilizări clinice restrânse: se folosește în tratamentul infecțiilor severe.

5.9. Novobiocina

Structural, molecula constă din glucidul norioză (inelul A), o componentă cumarinică (inelul B) și un acid benzoic substituit (inelul C), legate printr-o legătură glicozidică și o legătură amidică.

Structura moleculară a novobiocinei

Novobiocina este considerată o cumarină substituită: este prima cumarină izolată ca metabolit microbian și prima identificată ca având N în structura ei. Cumarinele sunt larg distribuite la diferite familii de plante. Câteva cumarine complexe sunt produse ca metaboliți ai bacteriilor și fungilor. Alte cumarine includ aflatoxinele.

Cumarina este o lactonă ce rezultă prin hidroliza enzimatică a unor glicozide, care se găsesc în frunzele și tulpinile mai multor plante: Lavandula (levănțică), Melilotus, Trifolium, Levisticum (leuștean), căpșuni, caise, cireșe, scorțișoară etc. Cel mai cunoscut precursor al cumarinei este melilotozidul din Melilotus altissimus, M. arvensis. Melilotozida conține un eter și cumarina (fig. 39). Cumarina este un fitoestrogen și se găsește în concentrații mici în mulți agenți naturali care se adaugă alimentelor ca amelioratori de gust. Datorită asemănării chimice cu estrogenii, se leagă de receptorul estrogenic uman.

Melilotozid Cumarina

Figura 39. Ilustrarea schematică a hidrolizei melilotozidului la cumarină

Novobiocina are două grupări acide, un fenol ușor acid și un enol mai acid, pe inelul cumarinic. Formează săruri insolubile cu o varietate de cationi bi- și trivalenți: Zn, Al, Mn, Fe. Sarea de sodiu este foarte solubilă în apă. Novobiocina este activă în primul rând față de bacteriile Gram pozitive, dar acționează și asupra unor tulpini de bacterii Gram negative (Klebsiella, Proteus). Este mai puțin activă față de micobacterii și corinebacterii, iar activitatea antifungică este neglijabilă. Novobiocina determină apariția formelor filamentoase ale bacililor Gram negativi, iar activitatea inhibitorie față de bacteriile Gram pozitive este reversată ușor de ionii de Mg2+. Ca și penicilina, novobiocina induce acumularea uridin-nucleotid-mucopeptidelor în celulele de S. aureus. Concluzia este ca efectul său constă în inhibiția sintezei peretelui celular, dar structura parietală nu este ținta primară a acțiunii antibioticului, pentru că creșterea protoplaștilor și a micoplasmelor este puternic inhibată. Novobiocina inhibă creșterea bacteriilor datorită unor efecte multiple: unul dintre ele este efectul chelator față de ionii de Mg. Antibioticul formează complexe specifice cu diferite metale, nu numai cu Mg2+, săruri insolubile, dar Mg2+ este un microelement esențial, având rol structural și funcțional pentru activitatea unei largi varietăți de enzime celulare. Cele mai multe enzime care catalizează reacții ce implică grupările fosfat, necesită ioni de Mg: sintetazele acizilor nucleici (ADN- și ARN-polimeraza), enzimele activatoare ale aminoacizilor, enzimele care catalizează sinteza acizilor teichoici, enzimele glicolitice, fosfolipazele.

Ionii de Mg au rol structural: prin legarea moleculelor fosfolipidice conferă stabilitate membranelor celulare. Au rol în stabilizarea dublei helice ADN și în menținerea subunităților ribosomale 30S și 50S în formă asociată, funcțională de 70S. Deficiența cantitativă a ionilor de Mg are implicații profunde asupra funcționării celulei. Dar nu toate procesele celulare dependente de Mg2+ necesită cantități echivalente de cationi. Deficiența de Mg2+ influențează în grade diferite procesele celulare. Unele organisme au nevoi mai mari de Mg2+ decât altele și de aceea sunt mai sensibile, iar creșterea lor este influențată mai mult. Novobiocina inhibă creșterea bacteriilor, proporțional cu necesarul lor de Mg. Astfel se explică gradul diferit de sensibilitate al bacteriilor: cele Gram pozitive sunt mai sensibile decât cele Gram negative, deși Proteus și Klebsiella au sensibilitate relativ înaltă. Novobiocina este un inhibitor eficient al sintezei acizilor nucleici la E. coli.

Activitatea novobiocinei este amplificată de concentrațiile subinhibitorii de azidă de sodiu. Unele funcții celulare sunt inhibate atât de azidă cât și de novobiocină: respirația, transportul electronilor pe catena respiratorie a bacteriilor aerobe, transportul membranar al aminoacizilor, fosforilarea oxidativă.

5.10. Rifamicinele

Rifamicinele sunt o clasă de antibiotice, inhibitorii ale ARN-polimerazei dependentă de ADN. ARN-polimeraza se atașează de un factor ce conferă specificitate pentru recunoașterea situsurilor promotor ce inițiază transcrierea ADN. Rifamicina se leagă necovalent, dar ferm, de o subunitate a ARN-polimerazei și interferă specific cu procesul de inițiere, dar nu are efect după ce polimerizarea a început.

Rifampicina aparține familiei ansamicilinelor și este un derivat semisintetic al unei molecule naturale, rifamicina B – forma hidrofobă, constituită dintr-un lanț lung alifatic în formă de ansă (de unde și numele familiei), legând două nuclee aromatice. Caracterul hidrofob al moleculei explică dificultățile sale de a traversa membrana externă a bacililor Gram-negativi.

Structura moleculară a rifampicinei

Acțiunea bacteriostatică a rifampicinei se explică printr-o inhibiție a transcrierii ADN în ARN, reacție catalizată de ARN polimeraza dependentă de ADN. Rifampicina acționează, în esență, asupra etapei inițierii transcrierii, dar nu împiedică alungirea lanțului de ARNm. Absența activității rifampicinei asupra ARN polimerazelor celulelor eucariote explică toxicitatea sa selectivă față de bacterii. Rifampicina este un component important al tratamentului pe termen scurt al infecțiilor cu micobacterii cu rezistență multiplă.

Mecanismul acțiunii antibacteriene al rifamicinelor implică inhibiția unei singure ținte enzimatice, adică subunitatea β a ARN-polimerazei dependentă de ADN. La E. coli, această enzimă este un oligomer complex alcătuit din 4 subunități diferite: , , ’ și , codificate de genele corespunzătoare. Enzima poate să existe sub forma regiunii centrale a enzimei alcătuită din 4 subunități (2 ’) sau sub forma holoenzimei (2’ + ). Rifampicina se leagă la subunitatea a ARN-polimerazei de E. coli și produce inhibiția transcrierii. Formarea complexului medicament – enzimă, inhibă inițierea formării lanțului în procesul sintezei ARN.

Nu s-a raportat existența enzimelor inactivatoare ale rifamicinei, iar mecanismul rezistenței la antibiotic se bazează pe mutageneza țintei unice. Din această cauză, tulpinile rezistente au apărut mai repede decât pentru alte familii de antibiotice. Micobacteriile pot dezvolta rezistența la rifampicină, atât În vivo cât și În vitro. Apariția rezistenței este un proces ce constă într-o singură treaptă. Tuberculoza cauzată de tulpini rezistente la rifampicină s-a identificat chiar la pacienții care nu au fost supuși chimioterapiei.

Mutațiile produse de rifamicină sunt inserții și deleții ale ARN-polimerazei bacteriene și apar în cele 3 regiuni scurte înalt conservate ale subunității β, ce formează aria „fierbinte”, cuprinsă între resturile 505-534 (la E. coli), la distanță de situsul activ al enzimei. La micobacterii, peste 90% dintre mutații se datorează schimbării unei singure nucleotide a genei codificatoare a subunității β.

5.11. Acidul fusidic

Este un agent antibacterian de natura sterolică. Molecula este hidrofobă, ceea ce explica efectul redus asupra bacililor Gram negativi, fiind utilizat mai ales ca antibiotic antistafilococic. Mecanismele prin care inhiba sinteza proteinelor nu sunt încă suficient de bine cunoscute.

Structura moleculară a acidului fusidic

Bibliografie selectivă

Ackerman G, Rodloff AC. Drugs of the 21 st century: telithromycin (HMR 3647)—the first ketolide. J Antimicrob Chemother. 2003, 51:497-511.

Ackermann, G., Tang Y. J., Kueper R., Heisig P., Rodloff A. C., Silva J. Jr., and Cohen S. H.,. Resistance to moxifloxacin În toxigenic Clostridium difficile isolates is associated with mutations În gyrA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45:2348-2353.

Barry A.L., Jones R.N., Thornsberry C., Cefsulodin: antibacterial activity and tentative interpretive zone standards for the disk susceptibility test, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1981, 20(4): 525-529.

Brokmann H., Bauer K., Rhodomycin., Ein rotes Antibioticum aus Actinomyceten, Naturwissenschaften. 1950, 37: 492-493

Bush K., Jacoby G. A., Medeiros A. A. A functional classification scheme for -lactamases and its correlation with molecular structure. 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:1211-1233

Chopra I., Roberts M., Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(2): 232-260.

Donadio S., McAlpine J.B., Sheldon P.J., Jackson M., Katz L., An erythromycin analog produced by reprogramming of polyketide synthesis, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993, 90(15): 7119-7123.

Georgopapadakou N.H., Smith S.A., Sykes R.B., .Mode of action of azthreonam, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1982, 21(6): 950-956.

Hancock R.E.W. Bacterial outer membranes: Evolving Concepts. ASM News. 1991, 57:175-182.

Henquell C., Chanal C., Sirot D., Labia R., Sirot J., Molecular characterization of nine different types of mutants among 107 inhibitor-resistant TEM beta-lactamases from clinical isolates of Escherichia coli, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1995, 39(2): 427-430.

Koch A.L., Bacterial Wall as Target for Attack: Past, Present, and Future Research, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(4): 673-687.

Leclerc D., Melançon P., Brakier-Gingras L., Mutations in the 915 region of Escherichia coli 16S ribosomal RNA reduce the binding of streptomycin to the ribosome, Nucleic Acids Research. 1991, 19(14): 3973-3977.

Moazed D, Noller HF., Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell. 1986, 47 (6): 985–994

Neu H.C., Chin N.X., Novelli A., În vitro activity of E-1040, a novel cephalosporin with potent activity against Pseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(11): 1666-1675.

Pfeiffer B.A., Khosla C., Biosynthesis of polyketides in heterologous host, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2001, 65(1): 106-118

Pinard R., Côté M., Payant C., Brakier-Gingras L., Positions 13 and 914 În Escherichia coli 16S ribosomal RNA are involved În the control of translational accuracy, Nucleic Acids Research.. 1994, 22(4): 619-624.

Sanders CC, Sanders WE Jr, Goering RV. In vitro antagonism of beta-lactam antibiotics by cefoxitin. Antimicrob Agents Chemother. 1982, 21 (6): 968–975

Schatz A., Bugie E., Waksman, S. Streptomycin: A Substance Exhibiting Antibiotic Activity Against Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. Proceedings of the Society for Experimental and Biological Medicine.1944, 55 (1944): 66-69.

Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A., Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance, Clinical Microbiology Reviews. 1992, 5(4): 387-399.

Taylor D.E., Courvalin P., .Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter species, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(8): 1107-1112.

Then R.L., Angehrn P., Multiply resistant mutants of Enterobacter cloacae selected by beta-lactam antibiotics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1986, 30(5): 684-688.

Tran M.P., Telithromycin: a novel agent for the treatment of community-acquired upper respiratory infections, Baylor University Medical Center Proceedings. 2004, 17(4): 475-479.

Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A.,Chow J.W., .Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 47(4): 1423-1426.

Vakulenko S.B., Mobashery S., Versatility of Aminoglycosides and Prospects for Their Future, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(3): 430-450.

Vester B., Douthwaite S., Macrolide Resistance Conferred by Base Substitutions in 23S rRNA, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 1-12.

Capitolul 6

DETERMINAREA SPECTRULUI DE SENSIBILITATE LA ANTIBIOTICE A SPECIILOR MICROBIENE. ANTIBIOGRAMĂ

Datorita specificității lor de acțiune, antibioticele manifestă eficiență diferită față de diferite specii microbiene; totalitatea speciilor microbiene sensibile la un anumit antibiotic definește spectrul de activitate al antibioticului respectiv. În funcție de numărul și diversitatea speciilor microbiene afectate, spectrul de activitate al antibioticelor poate fi :

– larg (de exemplu, spectrul de acțiune al tetraciclinei este reprezentat de bacterii Gram-negative, inclusiv chlamidii și rickettsii și specii Gram-pozitive; penicilinele sunt active în special față de specii Gram-pozitive, dar și Gram-negative, inclusiv chlamidii; nitrofuranii, rifampicina, sulfamidele sunt active pe un număr mare de specii bacteriene Gram-pozitive și Gram-negative și pe bacteriile acido-alcoolo-rezistente);

– îngust (novobiocina este activă pe bacteriile Gram-pozitive, mai ales stafilococi, dar și pe coci și bacili Gram-negativi, cum ar fi hemofilii și pasteurelele; glicopeptidele, bacitracina, pe bacterii Gram –pozitive);

– limitat (nitroimidazolii sunt activi doar pe microorganismele anaerobe).

Chiar în cadrul aceleiași specii microbiene, pot exista diferențe mari de sensibilitate a diferitelor tulpini față de un anumit antibiotic, astfel că stabilirea tratamentului cu antibiotice în clinică necesită izolarea tulpinii microbiene care reprezintă agentul etiologic al infecției respective (mai ales dacă acesta aparține unor genuri și specii supuse fenomenului de dobândire a rezistenței clinice) și determinarea spectrului său de sensibilitate la antibiotice.

Evaluarea in vitro a eficienței unui antibiotic se realizează prin măsurarea a trei parametri, care variază în funcție de concentrația antibioticului și de timpul său de acțiune:

concentrația minima activă (= C.M.A.) – este concentrația la care antibioticul poate induce anumite perturbări în activitatea metabolică a microorganismelor, fără a afecta capacitatea de multiplicare și viabilitatea microorganismelor;

concentrație minima inhibitorie (= C.M.I.) – este concentrația la care un antibiotic inhibă multiplicarea microorganismelor (efect bacteriostatic);

concentrație minima bactericida (= C.M.B.) – este concentrația la care un antibiotic are acțiune letală asupra microorganismelor (efect bactericid).

Cunoașterea acestor parametri prezintă o importanță clinică deosebită, deoarece, pentru unele antibiotice, concentrația bactericida este foarte greu de atins in vivo. Din acest motiv, unele antibiotice ca tetraciclina, cloramfenicolul, rifampicina sunt considerate antibiotice bacteriostatice.

Pe lângă valoarea C.M.I. determinată in vitro, în alegerea tratamentului cu un anumit antibiotic, trebuie să se țină cont și de calitățile farmacologice ale antibioticului respectiv (de exemplu, posibilitatea realizarii concentrației active la nivelul focarului de infecție), de eventualele efecte secundare și de starea fiziologică a bolnavului.

Tehnica de evidențiere a sensibilitații la antibiotice a unei tulpini microbiene se numește antibiograma. Antibiograma trebuie practicată în mod obligatoriu în cazul microorganismelor patogene, supuse fenomenului de dobândire a rezistenței, înaintea începerii oricărui tratament cu antibiotice.

După determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice prin tehnici calitative (în care tulpina microbiană de testat este pusă în contact cu diferite antibiotice aflate într-o anumită concentrație), se pot practica teste cantitative pentru determinarea valorii C.M.I. (în care tulpina microbiană este pusă în contact cu concentrații crescătoare ale aceluiași antibiotic).

6.1. Metode calitative de determinare a spectrului de sensibilitate la antibiotice

Metoda difuzimetrică (Kirby-Bauer)

Este o metodă foarte simplă și rapidă, care permite determinarea concomitentă a spectrului de sensibilitate a microorganismului și a valorii C.M.I. în vederea calculării dozelor terapeutice de antibiotice. Metoda are mai multe variante, în practică folosindu-se curent tehnica discurilor impregnate cu antibiotice, standardizată, recomandată de NCCLS / CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standardisation / Clinical Laboratorz Standards Institute).

O serie de factori, ca de exemplu, tulpina microbiană studiată (densitatea inoculului, specia, vârsta culturii), mediul de cultură (compoziția mediului, pH-ul, densitatea și grosimea stratului de mediu), tehnica folosită și criteriile de interpretare a rezultatelor obținute, pot influența rezultatele unei antibiograme. Din acest motiv, tehnica trebuie efectuată în condiții standardizate, reproductibile, conform indicațiilor forurilor internaționale în domeniu.

Pe suprafața unui mediu agarizat însămânțat “în pânză” cu un inocul standardizat, obținut din tulpina de testat, se plasează la distanțe egale discuri impregnate cu soluții de antibiotice de o anumită concentrație care vor difuza în mediu, realizând un gradient de concentrație invers proporțional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distanța față de disc. Dacă tulpina este sensibilă la un anumit antibiotic, creșterea microbiană va fi inhibată pe o anumită suprafață în jurul discului impregnat cu antibioticul respectiv, suprafață denumită zonă de inhibiție a creșterii.

Citirea rezultatelor se realizează prin masurarea diametrelor zonelor de inhibiție a creșterii determinate de diferite antibiotice, cu ajutorul unei rigle gradate. În cazuri de urgență clinică se poate realiza o primă citire la 6-8 h de la incubare. Interpretarea rezultatelor se face în funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție a creșterii, exprimând rezultatul cu termenii de tulpină sensibilă (S), rezistentă (R) sau intermediar sensibilă (I), conform tabelelor cu puncte critice standardizate și corespunzătoare metodei de lucru: tabelele NCCLS pentru metoda difuzimetrică recomandată de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA), in prezent CLSI (Clinical laboratory and Standards Institute).

Termenii S, I, R definesc de fapt și categoriile de antibiotice, în funcție de efectul lor clinic, după cum urmează:

– categoria S, înseamnă că există o mare probabilitate ca antibioticul, administrat în doze obișnuite, să elimine infecția determinată de tulpina testată (C.M.I. are valori net inferioare celor ale concentrațiilor umorale obținute în urma administrării unei doze obișnuite);

– categoria I, semnifica probabilitatea ca antibioticul să fie eficient in vivo prin administrare locală sau prin realizarea în mod fiziologic a concentrațiilor mari in organe sau țesuturi (rinichi, ficat, cai biliare), la nivelul cărora este localizat procesul infecțios;

– categoria R înseamnă că, cel mai probabil, administrarea antibioticului nu va determina eliminarea din organism a agentului infecțios, a cărui sensibilitate a fost testată sau rezultatul tratamentului este imprevizibil.

La citirea și interpretarea rezultatelor se iau în considerare diametrele zonelor de inhibiție, lipsite complet de colonii vizibile cu ochiul liber.

Apariția coloniilor la marginea sau în interiorul zonei de inhibiție se poate datora urmatorilor factori: cultura este mixtă sau suprainfectată; cultura este pură, dar prezintă celule heterorezistente; apariția mutantelor rezistente; dezvoltarea tardivă a unor celule, de fapt sensibile, și apariția coloniilor după ce antibioticul s-a diluat prin difuzie în mediu.

6.2. Metode cantitative de determinare a valorii C.M.I.

Metoda diluțiilor în mediul lichid sau în agar

Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate este însămânțat într-un gradient discontinuu de concentrații ale antibioticului, fie în plăci cu mediu agarizat, fie în tuburi cu bulion nutritiv. După incubarea adecvată, se citeste valoarea C.M.I. prin observarea macroscopică a tuburilor: în primele tuburi, cu concentrații mari de antibiotic, creșterea culturii nu este vizibilă, microorganismele fiind omorâte sau inhibate în prezența antibioticului. Concentrația de antibiotic corespunzătoare tubului cu cea mai mică concentrație, care inhibă creșterea vizibilă a culturii microbiene, reprezintă valorea C.M.I. (mcg/ml) pentru antibioticul respectiv. În tuburile următoare, inclusiv tubul martor de creștere, mediul se tulbură ca urmare a creșterii microbiene. În tubul martor de sterilitate, obligatoriu mediul trebuie să rămână steril (limpede), iar pe placile cu mediu agarizat, coloniile lipsesc. Determinarea C.M.I. se utilizeză pentru stabilirea dozei terapeutice și a căii de administrare în cazul infecțiilor severe, supravegherea evoluției rezistenței bacteriilor la antibiotice, cuantificarea activitații bactericide a substantelor antimicrobiene. Această metodă permite și aflarea valorii C.M.B. (concentrația minimă bactericidă) pentru antibioticul testat. Pentru aceasta, se prelevează 0.01 ml sau 0.1 ml din tuburile utilizate pentru tehnica diluțiilor în mediu lichid (din tubul la care s-a stabilit valoarea C.M.I. și din tuburile anterioare care prezintă concentrații superioare de antibiotic) și se însămânțează pe suprafața unor plăci cu mediu solid nesuplimentat cu antibioticul testat. După incubare, se va observa dezvoltarea microorganismelor la diluția corespunzătoare C.M.I. Valoarea C.M.B. este dată de cea mai mică concentrație de antibiotic care reduce numărul coloniilor pană la 99.9%.

Metoda E-test

La ora actuală, există variante ale metodei difuzimetrice pentru determinarea valorii C.M.I.. O astfel de varianta este E-testul (Epsilometer test), ce utilizează benzi impregnate cu diferite antibiotice ale căror concentrații variază exponențial și sunt înscrise pe banda respectivă. Zona de inhibiție a creșterii microorganismului testat are aspect de elipsă, al cărei diametru variază direct proporțional cu gradientul de concentrație a antibioticului difuzat în mediu, diminuându-se odată cu scăderea concentrației astfel că, la o anumită valoare, zona de inhibiție a creșterii va intersecta banda, concentrația înscrisă pe bandă la acest nivel indicând valorea C.M.I.

6.3. Controlul de calitate în testarea sesibiltății la antibiotice

Controlul de calitate are drept scop să asigure precizia și fiabilitatea tehnicii de testare a sensibilității, performanța reactivilor utilizați și performanța personalului care efectuează testele (Codiță, 2007). Pentru a răspunde acestor deziderate, laboratoarele care realizează antibiograma trebuie să dispună de tulpini de referință pentru realizarea antibiogramei, și anume: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35219, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Haemophilus influenzae ATCC 49766, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

Controlul de calitate trebuie să fie realizat pentru fiecare lot nou de mediu Mueller Hinton și / sau antibiotic, utilizând tulpinile de referință care vor fi testate în aceleași conditii ca și cele bacteriene a caror rezistenta se evaluează. Antibiogramele vor fi efectuate zilnic pentru fiecare dintre tulpinile de referință.

Daca rezultatele nu sunt satisfăcătoare, vor fi controlați următorii parametri:

1. citirea și interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie

– citirea antibiogramei trebuie realizată cu ajutorul unei rigle precise și să se evite la maximum erorile, menținându-se instrumentul de măsură perpendicular pe axa optică;

– trebuie verificat daca interpretările (S, I, R) corespund diametrelor masurate;

– trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire.

2. mediul de cultură

pH-ul trebuie să fie 7,2 – 7,4, deoarece variațiile de pH influentează activitatea aminozidelor, macrolidelor și fenicolilor.

Umiditatea:

– plăcile cu mediu trebuie să fie uscate îinainte de inoculare

Concentrația în timidină sau timină:

– o concentrație prea crescută de timidină determină o reducere a diametrelor zonelor de inhibiție in jurul discurilor de sulfamide și trimetoprim

– pentru aceasta trebuie testat mediul MH cu o tulpină de referință Enterococcus faecalis ATCC 29212; diametrul de inhibiție în jurul discului de cotrimoxazol trebuie să fie > / = 20 mm.

Concentrația în cationi divalenți:

– o concentrație prea crescută în ioni bivalenți (în principal de Ca2+ și Mg2+) determină o reducere a diametrelor zonelor de inhibiție în jurul discurilor de aminozide (testate pentru P. aeruginosa), în timp ce concentrații mai mici favorizează apariția unor zone de inhibiție prea mari

– ionii de Zn influențează activitatea carbapenemelor

– concentrațiile optime trebuie să fie : Ca2+ = 50 – 100 mg și Mg2+ = 20 – 35 m

3. inoculul

– etalonul 0,5 Mc Farland – se poate obtine astfel:

0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) +

95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l);

etalonul astfel preparat trebuie să prezinte o densitate optică (D.O.) de 0,08 – 0,1 la 625 nm.

– se repartizează această soluție în volume de 10 ml, în tuburi identice cu acelea care vor servi la prepararea inoculului

– tuburile se inchid ermetic pentru a evita evaporarea (parafilm, adeziv etc.)

– se marchează nivelul lichidului cu un marker și se controlează periodic măsurându-i densitatea optică

– se conservă tuburile la temperatură ambiantă, ferit de lumină (hârtie de aluminiu)

– tubul etalon se agita înainte de utilizar, iar inoculul și etalonul trebuie să aibă aceeași turbiditate

4. discurile de antibiotice

– înainte de utilizare, cartușul de antibiotic trebuie verificat pentru data valabilității, mai ales pentru -lactamine, și pentru încarcătura discului;

– stocul de cartușe de antibiotice trebuie să fie pastrat la -20 oC; aplicatorul încărcat cu antibiotice trebuie păstrat la + 4 oC;

– discurile umede sau în contact direct cu gheața, sau care au fost conservate la temperatura ambiantă nu trebuie utilizate;

– cartușele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h înainte de utilizare.

5. tulpinile de referință

– de la primirea lor, tulpinile de referință vor fi izolate pe un mediu adecvat; plecând de la această cultură se fac 12 subculturi care se repartizează în 12 tuburi si se conservă prin congelare la – 70 oC. În fiecare lună se va scoate un tub congelat cu tulpina / tulpinile care vor fi testate; se refac 12 tuburi cu culturi pentru congelare, pentru anul viitor, pornind de la al 12-lea tub consevat

Tabelul nr. 10.

Antibiotice de testat pentru cocii Gram-pozitivi, Enterobacteriaceae și bacili Gram negativi nonfermentativi

Antibiograma difuzimetrică poate permite determinarea pattern-urilor de rezistență constitutivă, intrinsecă, nativă, precum și detectarea fenotipică a unor mecanisme de rezistență dobândită.

Plasarea antibioticelor pe placă într-o anumită ordine permite citirea interpretativă a testelor de sensibilitate la antibiotice (concept introdus de Patrick Courvalin (1986) și detectarea fenotipică a unor mecanisme de rezistență la antibiotice (Lambert si colab., 1993).

6.4. Aplicații practice ale citirii interpretative în evidențierea fenotipică a diferitelor mecanisme de rezistență la principalele specii microbiene de interes clinic

Rezistenta S. aureus la β-lactamice

Pentru S. aureus, s-au evidențiat mai multe mecanisme de rezistență la β-lactamice (tabelul 11, 12).

Tabelul 11.

Mecanismele de rezistenta la agenti antimicrobieni la S. aureus (dupa Lowy, 2003).

Tabelul 12.

Mecanismele de rezistenta la ß -lactamice la S. aureus (dupa Lowy, 2003).

BORSA = S. aureus borderline; MODSA = S. aureus modificat.

Rezistenta la meticilină (respectiv oxacilină) (fig. 40) este considerată un marker al polirezistenței incluzând: cefalosporinele, eritromicina și clindamicina, iar izbucnirile intraspitalicesti cu acest tip de tulpini au creat probleme deosebite terapeutice, antiepidemice si de cost al spitalizarii (Codita, 1993). Producerea de beta-lactamază se poate evidenția prin testul treflei, utilizat și pentru detectarea producerii de beta-lactamaze de către tulpinile de N.gonorroeae si Haemophilus sp. Se însămantează o tulpină de S.aureus ATCC 25923 pe o geloză Muller-Hinton (sau M-H cu sange Chocolat pentru N.gonorroeae si Haemophilus sp.); Se aplică un disc de peniciclină G în centrul plăcii (sau de ampicilină în cazul Haemophilus); Se însămânțează în striuri radiale (din centrul plăcii spre periferie) tulpina de testat, o tulpină S. aureus ATCC 25923 (sensibilă la penicilina G), o tulpină de S. aureus ATCC 43300 (rezistentă la penicilina G). Se incubează placa 18 h la 35°C în atmosferă normală (sau 24 h în atmosfera îmbogățită cu CO2 pentru Haemophilus sp. și N. gonorrhoeae). Se suspectează existența β- lactamazei dacă se observă o diferență între diametrul de inhibiție a creșterii produsă de antibioticul de testat între tulpina sensibilă și cea de testat, chiar dacă cele 2 diametre se înscriu în categoria sensibilă a valorilor critice admise pentru tulpina testată.

La ora ctuală există teste rapide, cromogenice, care utilizează un mediu specific (CHROMagar MRSA), care diferențiază cu mare specificitate tulpinile de S. aureus rezistente le meticilină, pe baza culorii coloniilor (Fig. 41).

Figura 40. Mecanismul inducerii sintezei ß-lactamazei stafilococice in prezenta penicilinei. BlaI se leagă de regiunea operator, astfel încât se represează transcrierea ARN atât pentru blaZ, cât și pentru blaR1-blaI; II Legarea penicilinei la BlaR1 stimulează activarea autocatalitică a BlaR1; III-IV BlaR1 clivează BlaI în fragmente inactive permițând transcrierea blaZ și blaR1-BlaI; V-VIII ß-lactamaza, enzimă extracelulară codificată de blaZ (V) hidrolizează ciclul ß-lactamic al penicilinei (VI), în consecință produce inactivarea (VII) (Kernodle si colab., 1990); Schema operonului care codifică rezistența la meticilină a S. aureus. Expunerea MecR1 la un antibiotic ß-lactamic induce sinteza MecR1; MecR1 inactivează MecI, permițând sinteza lui PBP2a (dupa Kernodle si colab., 1997).

Figura 41. Aspectul coloniilor de S. aureus meticilinorezistent pe mediu CHROMagar MRSA (www2.m-techmicro.com/…/chromagar/mrsa/mrsa.jpg)

Rezistența la meticilină în cazul stafilococului auriu este de multe ori asociată cu mecanisme de rezistență care determină inactivarea altor familii de antibiotice. S. aureus rezistent la meticilină prin modificarea PLP este adesea rezistent la aminozide (amikacina și tobramicina și în peste peste 90% din cazuri la gentamicină), la fluoroquinolone, macrolide, lincosamide și ketolide, la fosfomicină și uneori la rifampicină. Ca regulă generală, rămân active pe stafilococ glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele, rifampicina și oxazolidinonele.

Rezistența enterococilor la β-lactamice

La enterococi, rezistența la β-lactamice se realizează prin producerea β-lactamazei și prin modificarea țintei (ce conferă rezistență naturală la cefalosporine, oxaciline si monobactami și sensibilitate diminuată la peniciline).

Rezistența Streptococcus pneumoniae la β-lactamice

Streptococcus pneumoniae prezintă rezistență dobândită la penicilină prin producerea de -lactamaze, evidențiată fenotipic prin testarea sensibilității la oxacilină, utilizând discuri de oxacilina de 5µg. Rezistenta la penicilină este incrucișată pentru toate β-lactamicele, dar prezinta diferite niveluri de expresie in funcție de antibiotic. Activitatea amoxicilinei și cefalosporinelor din generația a treia (cefotaxim, ceftriaxon) este mai puțin modificată decât cea a penicilinei G. In ceea ce priveste piperacilina, cefalosporinele din prima și a doua generație și cele orale, indiferent de generatie, cu excepția cefpodoximului, ele sunt mai puțin active decat penicilina G.

Rezistența la β-lactamice este asociată în proporție de peste 50% cu rezistența la alte antibiotice ca: tetraciclinele, macrolidele, cloramfenicolul sau trimetoprim-sulfametoxazolul (fig. 38). Unele eșecuri terapeutice ar putea fi date de fenomenul de toleranță la penicilină, datorat modificărilor controlului activității autolitice, ducând in vivo la selectarea mutantelor peni-R (raportul CMB/CMI > 32).

Pentru toate tulpinile cu diametrul de inhibitie <26 mm la oxacilină, trebuie testat CMI pentru penicilină, amoxicilină, cefotaxim și toate antibioticele utilizate în tratament.

Figura 42. Tulpini de Streptococcus pneumoniae multi-rezistente la antibiotice (<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>)

Tulpinile de Streptococcus pneumoniae sunt foarte sensibile la optochin, testul la optochin constituind unul dintre testele simple de identificare sau de confirmare a speciei și de diferențiere față de ceilalți streptococi α – hemolitici (testul Lund, 1959). La concentrații de 1 / 500.000 – 1 / 1.000.000, optochinul are acțiune bactericidă pentru pneumococi, în timp ce pentru ceilalți streptococi este nevoie de doze mult mai mari de 1 / 5.000. Se însămânțează tulpina de testat pe o placă cu geloza sânge conținând optochin 0.05% în paralel cu însăamânțarea pe o placă de control fără optochin. În jurul pulberii de optochin apare o zonă de inhibiție a creșterii, cu un diametru de peste 20 mm (fig. 43).

Figura 43. Pneumococ α-hemolitic sensibil la optochin (<gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm>).

În ceea ce privește rezistenta la β-lactamice la alte specii de streptococi, se pare ca doar un număr redus de specii (streptococi orali; S. oralis, S. sanguis, S. mitis) prezintă sensibilitate diminuată la penicilina G (după CLSI).

Evidențierea fenotipică a rezistenței la -lactamice a enterobacteriilor

După sensibilitatea lor naturală la antibioticele β-lactamice, enterobacteriile sunt clasificate în 4 grupe. Clasificarea are la bază comportamentul față de următoarele antibiotice β-lactamice: aminopeniciline, aminopeniciline + inhibitori ai β-lactamazelor (IBL), carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefalosporine din prima generație (CIG), cefalosporine din a II a generație (CIIG), cefalosporine din a III a generație (CIIIG), cefalosporine din a IV a generatie CIVG (cu spectru larg), CIIIG + IBL, carbapeneme, cefamicine.

Grupa I

În această grupă sunt clasate tulpinile de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella ssp. și Shigella spp. (tabelul 13). Această grupă prezintă 4 fenotipuri mai frecvente:

Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate β-lactamicele (60% dintre tulpinile izolate);

Fenotipul 2: tulpini producătoare de cefalosporinaze cromosomale de nivel scăzut (5% dintre tulpinile izolate).

Fenotipul 3: tulpini producătoare de penicilinaze. Această enzimă este în general transferabilă (30% din tulpini).

Fenotipul 4: tulpini producătoare de penicilinaze rezistente la inhibitori.

Grupa II

Această grupă este reprezentată de tulpinile de Klebsiella spp., Citrobacter koseri, C. amalonaticus, E. hermannii (tabelul 14).

Fenotipul 1: tulpini rezistente la concentrații scăzute de amoxicilină și de ticarcilină.

Fenotipul 2: tulpini producătoare de penicilinaze plasmidiale. Nivelul de producere al acestor penicilinaze este variabil, dar în general scăzut.

Fenotipul 3: tulpini producătoare de β-lactamaze de spectru larg (BLSE). Aceste tulpini sunt rezistente la o concentrație relativ scăzută de CIIIG (15% dintre tulpinile de Klebsiella spp. izolate).

Grupa III

Este reprezentată de tulpini de Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. indol (+) și Morganella spp., Providencia spp., Citrobacter freundii (tabelul 15).

Fenotipul 1: tulpini cu rezistență naturală la amoxicilină și la cefalotin, ca urmare a exprimării de cefalosporinaze cromosomale;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la amoxicilina, cefalotina și la ticarcilină, prin producerea unei penicilinaze plasmidiale;

Fenotipul 3: tulpini rezistente la CIIIG;

Fenotipul 4: tulpini de Proteus vulgaris producătoare de cefalosporinaze sensibile la acid clavulanic (cefuroximaze).

Grupa IV

Grupează tulpini de Yersinia spp. rezistente la amoxicilină, ticarcilină, cefalotin și cefoxitin, dar sensibile la pipercilină (tabelul 16).

Tabelele următoare exprimă diferitele fenotipuri de rezistență (ca și fenotipurile sălbatice) stabilind manifestarea fenotipică a producției de β-lactamaze în fiecare grup. Câteva fenotipuri particulare pot fi datorate altor mecanisme. Producerea unei enzime de către o bacterie nu răspunde la legea tot sau nimic, ci există niveluri intermediare de exprimare ce pot fi detectate fenotipic prin citire interpretativă foarte utile în intelegerea dinamicii fenomenului de antibiorezistență.

Tabelul 13.

Fenotipuri de rezistență la antibioticele β-lactamice la enterobacteriile din grupa I . E. coli, P.

mirabilis, Salmonella spp., Shigella spp. (după Jehl și colab., 2004 )

R = rezistent, S = sensibil, I = intermediar, (1) cefalosporine cu spectru larg : cefepim și cefpiromă, 2 E.coli si Shigella, 3-TEM rezistent la inhibitori, 4-β-lactamaza cu spectru extins, 5-cefalosporinază de nivel ridicat

Tabelul 14.

Fenotipuri de rezistență la antibioticele β-lactamice la enterobacteriile din grupa a II a : Klebsiella

spp.,Citrobacter koseri, C. amalonaticus, E. hermannii (după Jehl și colab., 2004 )

(1) penicilinază de nivel scăzut

Tabelul 15.

Fenotipuri de rezistență la antibioticele beta-lactamice la enterobacteriile din grupa a III a :

Enterobacter spp., Serratia spp., Providencia spp., Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, P. penneri,

Morganella spp. (după Jehl și colab., 2004 )

(1) cefalosporinaza inductibilă, (2) cefalosporinaza inductibilă numai pentru P. vulgaris și P. penneri

Sinergismul dintre augmentin și cefotaxim și/sau aztreonam și/sau cefepim și/sau cefpirom, permite detecția anumitor BLSE. Cefepimul sau cefpiromul sunt utile în detecția unei BLSE în prezenta unei CHN.

Tabelul 16.

Fenotipuri de rezistență la antibioticele -lactamice a enterobacteriilor din grupa a IV a: Yersinia

enterocolitica . (după Jehl și colab., 2004 )

Unele tulpini de K.oxytoca, P.vulgaris, P. penneri si Citrobacter koseri sunt hiperproducatoare de <aztreonamaza>, o penicilinaza cromosomală (tabelul 17).

Tabelul 17.

Fenotipuri de rezistenta la -lactamice a tulpinilor producătoare de “aztreonamaza” (după Jehl și colab., 2004)

Rezistența la carbapeneme apare prin urmatoarele mecanisme:

impermeabilitate ( P. mirabilis, E.aerogenes)

impermeabilitate și producere de cefalosporinază de nivel ridicat (E. cloacae, E. aerogenes, P. rettgeri)

carbapenemaze : de tip penicilinază, inactivă asupra CIIIG (E. cloacae); de tip metalo-enzimă, care hidrolizează CIIIG și carbapenemele.

Rezistenta P. aeruginosa la β-lactamice

La P. aeruginosa, rezistența naturală este indusă prin mecanisme de impermeabilitate, eflux, producerea enzimelor inactivatoare și modificarea tintelor.

Fenotipul sălbatic este legat de producerea unei cefalosporinaze inductibile în prezența aminopenicilinelor și cefalosporinelor din prima și a doua generație, cuplată cu o impermeabilitate mai mult sau mai puțin marcată și de un sistem de eflux constitutiv, care determină apariția unui fenotip rezistent la aminopeniciline, ca atare sau asociate cu inhibitori ai β-lactamazelor și la CIG și CIIG, cu conservarea sensibilității la carboxipeniciline, ureidopeniciline, la anumite CIIIG, la monobactami și carbapeneme. Rezistența dobandită apare în urma manifestării mecanismelor enzimatice (penicilinaze, cefalosporinaze, BLSE, metalo-enzime) sau neenzimatice (impermeabilitate, eflux și modificarea țintelor) (tabelul 18).

Rezistența dobândită enzimatică este mediată de:

a) penicilinaze plasmidiale transferabile cum ar fi: PSE, TEM, OXA (nivel scăzut sau ridicat) care se materializează prin rezistența la carboxipeniciline, ureidopeniciline, cefoperazona și sensibilitate la: ceftazidim, cefepim, imipenem și inhibitori de β-lactamaze.

b) BLSE:

– tip penicilinază (TEM, SHV, PER, VEB) care conferă rezistență la toate beta-lactamicele, cu excepția imipenemului, carboxipenicilinelor+ IBL și ureidopenicilinelor+ IBL

– tip oxacilinaza (OXA-2, OXA-10) care conferă rezistență la toate beta-lactamicele, cu excepția imipenemului

c) cefalosporinaze cromosomale derepresate:

– hiperproduse care conferă rezistență la toate β-lactamicele,cu excepția cefepimului și imipenemului

– hiperproduse cu nivel înalt, tulpinile conservandu-și sensibilitatea doar la imipenem

d) carbapenemaze care dau sensibilitate doar la aztreonam

Rezistența dobândită neenzimatică este indusă prin:

a) trei sisteme de eflux: MexA, MexB și OprM, constitutiv, conferă rezistență naturală la carboxipeniciline și aztreonam; MexC, MexD si OprJ, conferă rezistență la cefepim și cefpirom; MexE, MexF și OprN, cuplată adesea cu D2, conferă rezistența la imipenem.

b) deficit de porine – se referă la pierderea porinelor – care dau rezistență variabilă la carbapeneme (uneori asociată cu o cefalosporinază derepresată)

c) modificarea LPS-ului duce la permeabilitate diminuată pentru toate β-lactamicele, cu excepția imipenemului.

d) modificarea PLP-urilor 2 și 4 care confera rezistență la imipenem și 3 care generează rezistență la toate β-lactamicele, cu excepția imipenemului

Tabelul 18.

Evidentierea fenotipurilor de rezistenta la betalactamice pe baza citirii interpretative la

Pseudomonas aeruginosa (după Jehl și colab., 2004)

(1) Ticarcilina +acid clavulanic: S ; Piperacilina+tazobactam : S, (2) Cefalosporinaza de nivel înalt, (3) IBL : inhibitor de beta-lactamază, (4) in funcție de nivelul de producere

Tabelul 19.

Fenotipuri de rezistenta la β-lactamice la Stenotrophomonas maltophilia (după Jehl și colab., 2004)

Activitatea și expresia β-lactamazelor

S = sensibil; R = rezistent; I = intermediar; V = variabil; AC= acid clavulanic; CAZ = ceftazidim

Rezistența la β-lactamice la Acinetobacter spp.

Rezistența naturală se manifestă aproape fără excepție la aminopeniciline, CIG și CIIG.

Rezistența dobândită (tabelul 20) este indusă prin mai multe mecanisme :

producerea de β-lactamaze de tipul penicilinazelor plasmidiale TEM (1 și 2), CARB5

oxacilinaze: OXA21

cefalosporinaze cromosomiale ACE 1 – ACE 4 care hidrolizează toate cefalosporinele

combinarea mecanismelor de tipul: impermeabilitate, modificarea PLP-urilor, producerea de enzime (induc rezistența la imipenem)

Tabelul 20.

Fenotipuri de rezistență la β-lactamice la Acinetobacter spp. (după Jehl și colab., 2004)

Rezistența la β-lactamice la Haemophilus influenzae

Se datorează mai multor mecanisme, cel mai frecvent fiind producerea de β-lactamaze, care a aparut la 30% dintre tulpinile izolate din infecții bronho-pulmonare la adulți. Aceste β-lactamaze sunt plasmidiale de tip TEM, mai rar ROB care inactivează aminopenicilinele, carboxi- și ureidopenicilinele. In general rămân active asociația amoxicilina-acid clavulanic și CIIIG. Producerea β-lactamazelor este ușor de evidențiat prin teste cromogenice (nitrocefin). Un alt mecanism de rezistență destul de frecvent este modificarea țintei. De obicei sunt tulpini necapsulate, rezistența datorându-se alterării uneia sau mai multor PLP-uri și conferă rezistență de nivel scazut la toate antibioticele din această clasă. Rezistența la imipenem se pare că s-ar datora diminuării permeabilității membranei externe printr-un mecanism încă neelucidat. Există în acest sens printre tulpinile sensibile la ampicilină, un număr de tulpini rezistente la imipenem.

6.5. Metode fenotipice calitative și cantitative de evidențiere a beta-lactamazelor

Identificarea definitivă a acesor enzime este posibilă numai prin tehnici de secvențiere a proteinelor și genelor, tehnici care sunt totuși mult prea costisitoare pentru a fi utilizate în clinică și diagnostic. Totuși, metode mai simple de evidențiere și caracterizare a β – lactamazelor sunt disponibile pentru laboratoarele clinice.

A.1.Teste fenotipice bazate pe antibiograma difuzimetrică

Antibiograma difuzimetrică calitativă clasică (metoda Kirby – Bauer)

BLSE pot fi sintetizate în cea mai mare parte de către enterobacterii și sunt reproduse cel mai adesea în antibiogramă prin imaginea uni sinergism (dop de șampanie) între un disc de cefalosporină de generația a III-a și /sau monobactam și un disc de amoxicilină + acid clavulanic.

Dar aceasta imagine poate fi discretă sau atipică. Secreția de BLSE va fi suspectată mai întâi, de micșorarea tuturor diametrelor de inhibiție la toate CIIIG : CTX ≤ 27 mm, CAZ ≤ 22mm, CRO ≤ 25mm, ATM ≤ 27mm (tabelul 21, fig. 44). O tulpină de referință trebuie testată în aceleași condiții în scopul verificării validității discurilor de antibiotice. Prezența unei BLSE indică faptul că tulpina este rezistentă la toate β lactamicele, cu excepția imipenemului și cefamicinei (fig. 44).

Tabelul 21.

Diferențierea ESBL tip TEM de ESBL tip SHV prin metoda difuzimetrică (după Jehl și colab., 2004)

Figura 44. Aspectul antibiogramei la tulpini de E. coli producatoare de ß-lactamaze de spectru larg:

stg. – aspecte de sinergism (<www.microbes-edu.org/…/bla/generalites.html>).

Antibiograma difuzimetrică cantitativă prin metoda E-test.

Principiu: Această metodă se bazazează pe proprietatea ESBL de a fi sensibile la inhibitori de β-lactamaze (acidul clavulanic). Există și excepții de la această regulă – enzimele de tip IRT (Inhibitor Rezistant TEM β–lactamase).

Benzile E-test conțin un gradient de Cefotaxim la un capăt și un gradient de Cefotaxim și acid clavulanic la celălat capăt. Concentrația de Cefotaxim este mai mică în cazul în care acesta este asociat cu acidul clavulanic conform tabelului 22:

Tabelul 22.

Concentrațiile de antibiotic pe striurile E-test

Benzile similare conținând gradiente de ceftazidim / ceftazidim + clavulanat (TZ / TZL) sunt deasemenea disponibile și sunt mai potrivite pentru detectarea tipului enzimatic CTX-M.

Dacă raportul dintre concentrația minimă inhibitorie (CMI) de Cefotaxim și CMI de Cefotaxim + clavulanat este mai mare de 8 rezultă că tulpina respectivă este producătoare de BLSE (Fig. 48-49).

Alternativ, se pot înregistra următoarele aspecte ale plăcii în urma incubării:

Creșterea bacteriană de-a lungul întregii benzi (lipsa elipsei de inhibiție) indică faptul că valoarea respectivă de CMI este mai mare decât cea mai mare valoare din scală (fig. 45).

O elipsă de inhibiție în afara gradientului arată o valoare a CMI mai mică decât cea mai mică valoare din scală. Apariția unei “zone fantomă” plasată sub gradientul CT, deși o zonă de inhibiție clară în jurul capătului CT nu s-a evidențiat, indică producerea de ESBL (fig. 46).

Apariția unei elipse de inhibiție deformate înspre capătul impregnat indică producerea de ESBL, datorită sinergismului dintre cefotaxim (CT) si acidul clavulanic difuzat dinspre regiunea CTL (fig. 47).

Metoda discurilor duble

Aceasta metodă presupune compararea diametrelor zonelor de inhibiție date de un disc impregnate cu o cefalosporină de spectru larg singură cu un alt disc impregnat cu același antibiotic asociat cu un inhibitor de β–lactamaze (acidul clavulanic). Dacă tulpina testată produce o enzimă de tip ESBL, diametrul zonei este mai mare pentru discul ce conține antibiotic + inhibitor. NCCLS recomandă compararea diametrelor zonelor de inhibiție date de către cefotaxim 30 µg/disc cu cele ale cefotaximului + acid clavulanic 30 +10 µg/disc, precum și ceftazidim 30 µg/disc cu cele ale ceftazidimului + acid clavulanic 30 + 10 µg/disc. M’zali și colab., 2000 au evaluat discuri cu antibiotice și inhibitori tip MAST DD, folosind metode conform indicațiilor NCCLS, și au obținut o sensibilitate de 93% a acestei metode pentru tulpini bacteriene control, producătoare de ESBL–uri, în timp ce perechile de ceftazidim și cefotaxim s-au dovedit a avea o sensibilitate mai scăzută: 86% și respectiv 66%.

O variantă a metodei discurilor duble cu antibiotice (produse de OXOID) se bazează pe compararea diametrelor zonelor de inhibiție produse de cefpodoxim 10 µg/disc și cefpodoxim + clavulanat 10 + 1 µg/disc. Producerea de ESBL-uri este confirmată dacă diametrul zonei de inhibiție dată de discul ce conține și clavulanat este cu 5 mm mai mare decât diametrul zonei discului fără inhibitor.

Testul dublei difuzii pentru detectarea ESBL

Pe o placă cu mediu Mueller Hinton inoculată cu tulpina de testat (cultură de 24 h, însămânțare pe placă prin tehnica tamponului) se aplică discuri cu amoxicilină / clavulanat (AMC) și ceftazidim (CAZ) la 25 -30 mm distanță (Jarlier și colab., 1988). De cealaltă parte a discului AMC se plasează un disc conținând o altă cefalosporină, de preferat cefotaxim (CT ). Se incubează peste noapte la 37oC.

Producerea de ESBL este certificată dacă diametrul zonei de inhibiție este extins din cauza clavulanatului ( inhibitorul de β-lactamaze) (fig. 50-51).

Avantajul acestei metode simple este costul scăzut; dezavantajul este acela că separarea optimă a discurilor poate varia cu fiecare tulpina. Izolatele cu ESBL-uri de tip TEM și SHV dau rezultate pozitive, în schimb cele cu enzime de tip CTX-M dau un rezultat pozitiv numai atunci când cefotaximul sau cefpodoximul înlocuiesc ceftazidimul, ca indicator de cefalosporine.

Tulpinile producătoare de AmpC și majoritatea tulpinilor hiperproducătoare de enzime K1, dau rezultate negative, cu toate cele trei cefalosporine.

Figura 50. Detectarea producerii de beta-lactamaze prin testul dublei difuzii.

Discuri cu antibiotice: stânga: IMP, centru: AMC, dreapta: PIP, sus AM, jos: CAZ (după Shah si colab., 2003).

Figura 51. Detectarea ESBL prin testul dublei difuzii: AMC-amoxicilina și acid clavulanic în centru; CAZ-Ceftazidim; ATM-Aztreonam; CTX-Cefotaxim; CRO-Ceftriaxone (după Shah si colab., 2003).

Se recomandă utilizarea discurilor de cloxacilină pentru detectarea penicilinazelor (acest antibiotic inhibă cefalosporinazele);

N.B. – inoculul dens poate masca hiperproducția de beta-lactamaze;

N.B.- când sinergismul nu este vizibil din cauza fuzionării zonelor de inhibiție, se îndepărtează discurile (30 mm) sau se taie discurile de antibiotic în patru.

N.B.- existența unor discrepanțe mari între diametrul zonelor de inhibiție la CAZ și CTX se datorează prezenței unei alte enzime pe lângă ESBL (de exemplu, β-lactamaze AmpC la Enterobacter cloacae).

Teste pentru confirmarea prezenței β-lactamazelor cromosomale inductibile (β-lactamaze tip AmpC)

Cefalosporinele de generația I (ampicilina și amoxicilina) induc exprimarea enzimelor tip AmpC și sunt distruse de către acestea, la majoritatea speciilor de Enterobacteriaceae. Consecutiv, tulpinile bacteriene producătoare de β-lactamaze inductibile tip AmpC devin rezistente constitutiv. Speciile producătoare de β-lactamaze inductibile tip AmpC segregă mutante derepresate care produc enzime AmpC fără inducție (derepresie stabilă). Aceste mutante sunt rezistente la aproape toate penicilinele și cefalosporinele (Livermore și colab, 2001) și sunt de asemeni frecvente în izolatele clnice.

Speciile producătoare de β-lactamaze tip AmpC pot fi recunoscute prin teste de antagonism între cefoxitim și cefotaxim (Sanders și colab. 1986). Pentru efectuarea acestui test se inoculează plăci, conform protocolului din metoda antibiogramei, și se plasează discuri cu ceftazidim și cefoxitim, pe acceași placă, la o distanță de 25 mm. Inducția de β-lactamaze este evidențiată prin aplatizarea zonei de inhibiție a ceftazidimului în dreptul discului de cefoxitim. Astfel, cefoxitimul a determinat producerea de β-lactamaze iductibile care au hidrolizat ceftazidimul (fig. 48).

Acidul clavulanic este un inductor al β-lactamazelor tip AmpC și de aceea apariția unor mici colonii în interiorul zonei de inhibiție a discului AMC (amoxicilină – acid clavulanic) poate fi un indicator util pentru detectarea prezenței enzimelor AmpC.

Figura 52. Detectarea β-lactamazelor inductibile tip AmpC. Discul cu diamterul mare al zonei de inhibiție este ceftazidim (CAZ), iar cel cu diametrul foarte mic este cefoxitim (FOX) (<www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm>).

Au fost concepute numeroase teste directe de detectare a activitații β-lactamazice, dar numai o parte dintre ele se pot folosi ca analize de rutină (James și colab., 1977). Majoritatea folosesc cefalosporine cromogene, sau corelează hidroliza penicilinei cu o schimbare a culorii mediului de reacție, mediată de iod sau detectată cu un indicator de pH.

Cefalosporinele cromogene sunt foarte specifice, în timp ce acidifierea mediului și reducerea iodului se poate datora și altor cauze decât acțiunii β-lactamazelor, generând rezultate fals pozitive. Datorită slabei specificități a testului iodometric ar trebui realizate în paralel controlale pozitive si negative pentru toate testele.

Testul la nitrocefin

Nitrocefinul este o cefalosporină care poate funcționa ca substrat cromogen pentru β-lactmaze și iși schimbă culoarea de la galben la roșu atunci când este hidrolizat. Acesta reprezintă testul cel mai sensibil pentru majoritatea β–lactamazelor, exceptând penicilinazele stafilococice. Avantajul folosirii acestui antibiotic în testele de evidențiere constă în faptul că el este hidrolizat de toate β – lactamazele cunoscute, indiferent de specificitatea acestora.

Nitrocefinul este disponibil sub formă de pudră purificată de la Becton Dickinson (Oxford, UK) sau discuri îmbibate cu antibiotic (OXOID).

Coloniile bacteriene sunt raclate de pe mediul nutritiv solid și resuspendate în tampon fosfat obținându-se o suspensie densă, peste care se adaugă soluție nitrocefin. Activitatea β-lactamazică este evidențiată prin apariția culorii roșii în 1 – 2 minute. În cazul enzimelor cu activitate mai mică răspunsul poate întârzia, însă rezultatele pozitive apărute la mai mult de 10 minute trebuie tratate cu scepticism întrucât ele pot fi cauzate de o activitate β–lactamazică secundară a proteinelor care leagă penicilina (penicillin binding protein – PBP) care formează complexe acil instabile (O’Callaghan și colab., 1972).

Avantajul acestei metode constă în rapiditatea cu care se pot obține rezultate despre prezența β-lactamazelor.

Testul iodometric

Hidroliza penicilinei determină formarea acidului peniciloic, care reduce iodul, decolorând complexul iod–amidon. Această proprietate poate fi exploatată pentru a detecta activitatea β–lactamazică în tuburi sau pe hârtie. Aceste teste sunt sensibile pentru penicilinazele stafilococice, dar sunt mai puțin sensibile decât nitrocefinul pentru majoritatea β–lactamazelor provenite de la bacterii Gram negative.

Metoda în tub: Se poate efectua în cantități mici atât în tuburi, cât și în plăci cu godeuri. Se distribuie benzilpenicilină (penicilină G) în tampon fosfat, în godeurile unei plăci. În această soluție se suspendă cultură bacteriană, solidă (de pe agar) și se păstrază la temperatura camerei pentru aproximativ 30 – 60 minute. Se adaugă amidon solubil în apă distilată și ulterior iod în soluție de iodură de potasiu. Activitatea β – lactamazică este demonstrată prin decolorarea iodului în maxim 5 minute (Catlin și colab., 1975). Sunt necesare teste de control pozitive și negative deoarece alte proteine pot de asemenea reduce iodul, iar un inocul concentrat poate da rezultate fals pozitive.

Metoda pe benzi de hârtie: Se folosește hârtie de filtru Whatman nr.3, îmbibată în soluție de amidon dizolvat în apă distilată la fierbere, la care s-a adăugat benzil – penicilină la răcire. Când benzile de hârtie iodometrică s-au uscat (aproximativ 2 ore), acestea sunt înmuiate în soluție de iod în iodură de potasiu. Pe acestea se aplică colonii dintr-o cultură de 24 de ore. Decolorarea apare în 5 minute și indică activitate β – lactamazică (Jorgensen și colab., 1977).

Testul acidimetric

Hidroliza nucleului β-lactamic generează o grupare carboxil care acidifică un mediu netamponat. Acidifierea rezultată poate fi detectată în tuburi sau pe hârtie de filtru.

Metoda în tub: Se folosește soluție de roșu fenol la care s-a adăugat benzilpenicilină, cu pH 8,5. Soluția de culoare violet este distribuită în godeuri și inoculată cu bacterii din cultură solidă pentru a forma o suspensie densă. Activitatea β-lactamazică este indicată de virajul culorii de la roșu la galben în maxim 5 minute (Duma & Kinz, 1968).

Metoda pe benzi de hârtie: benzile mici, de hârtie de filtru Whatman sunt îmbibate într-o soluție proaspăt preparată de benzilpenicilină, bromo-crezol și NaOH. Benzile se usucă și se păstrează pentru mai multe luni. Înainte de folosire ele trebuiesc rehidratate în apă distilată și apoi se aplică cultură bacteriană de pe agar solid. Apariția culorii galbene în maxim 5 minute indică activitate β-lactamazică (Livermore, 1995).

A.3. Metode de identificare a diferitelor tipuri de β-lactamaze prin cinetică enzimatică

Obținerea extractului proteic:

Tulpinile bacteriene care expimă constitutiv β-lactamaze se cultivă în bulion Mueller-Hinton peste noapte la 37oC, din care se recoltează celulele prin centrifugare. Suspensia celulară obținută din fiecare preparat se supune sonicării urmată de ultracentrifugare. Supernatantul este dializat și concentrat dacă este nevoie.

Purificarea β-lactamazelor:

Într-o primă etapă, β-lactamazele se purifică prin focusare isoelectrică orizontală (IEFO), într-un gradient de pH cuprins între 6.5 și 10.5 obținut prin metoda amfoliților.

După migrare, gelul este împărțit în 30 de segmente egale în care se testează activitatea β–lactamazică cu nitrocefin sau benzilpenicilină (O’Callaghan și colab., 1972). Fracțiile din gel care prezintă activitate β – lactamaizică se încarcă pe o coloană cromatografică de carboxi – metil Sephadex și se eluează cu tampon fosfat conform protocolului descris de Iaconis și colab. (1990). Fracțiile care au prezentat activitate β – lactamazică se concentrează prin ultrafiltrare și au fost trecute în continuare pe o coloană schimbătoare de ioni.

Hidroliza antibioticelor β-lactamice este examinată prin spectrofotometrie UV (Beckman DU-7). Se folosesc cuve de cuartz, de 1cm, la lungimea de undă maximă de absorbție a inelului β-lactam, pentru fiecare antibiotic în parte, iar densitatea optică se măsoara la intervale de 10 secunde, timp de 5 minute.

Maximul de absorbție pentru pricipalele antibiotice folosite sunt:

cefalotin (265 nm)

cefuroxim (274 nm)

cefotaxim (254 nm)

ceftazidim (254 nm)

imipenem (299 nm)

cloxacilin (260 nm)

aztreonam (292 nm)

nitrocefin (489 nm)

Rata de hidroliză a benzilpenicilinei este măsurată la 233 nm. Soluțiile de antibiotic sunt preparate în tampon 0,1M, pH 7.0. Pentru stabilirea profilelor substratelor, toate antibioticele se examinează la o concentrație de 100 uM, mai puțin benzilpenicilina care este testată pentru 500 uM. O unitate de activitate β-lactamazică, este definită ca fiind cantitatea de enzimă care hidrolizează un nmol de substrat / min în etapa liniară a reacției la 37oC în tampon fosfat 0,1M, ph 7.0. Constanta Michaelis (Km) și rata maximă de hidroliză (vm) se determină cu ajutorul transformării Lineweaver-Burk a vitezei inițiale (v) pentru șase concentrații diferite ale substratului. Susceptibilitatea β-lactamazelor de a fi inhibate de clavulanatul de potasiu și cloxacilina este măsurată cantitativ prin preincubarea enzimei cu concentrații diferite de inhibitor pentru 10 minute. Pentru măsurarea activității enzimatice reziduale se adaugă ulterior ca substrat benzilpenicilină (500 uM) sau imipenem (100 uM).

Concentrația de inhibitor necesară pentru a inhiba 50% din activitatea enzimatică se determină prin teste statisitice de certitudine.

Evidențierea fenotipică a rezistenței cocilor Gram-pozitivi la aminozide

La S. aureus rezistența la aceste antibiotice este enzimatică fiind evidențiate mai multe fenotipuri (tabelul 23).

Tabelul 23.

Rezistența S. aureus la aminozide (după Jehl și colab., 2004)

APH = aminozid-fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Rezistența enterococilor la aminoglicozide

Rezistența naturală de nivel scazut (intrinsecă) se datorează unui transport ineficient al acestora prin membrana citoplasmatică, însă activitatea lor este sinergică cu β-lactaminele și glicopeptidele. Specia E. faecium produce în mod natural o acetiltransferază cromosomală AAC(6’) care inactivează aminozidele gentamicina rămâne activă).

Un număr din ce în ce mai mare de tulpini de enterococi manifestă rezistență de nivel înalt la aminoglicozide (HLR) – definită ca CMI ≥2 mg/mg și, concomitent, rezistență la sinergismul cu beta-lactamicele (Tabelul 24). Mecanismul de rezistență preponderent este modificarea enzimatică a aminoglicozidelor, ca urmare a achiziționării uneia sau mai multor gene. Enzimele codificate de aceste gene sunt sintetizate constitutiv și au localizare citoplasmatică. Modificarea enzimatică a antibioticului este asociată cu o diminuare a afinitățtii sale pentru proteinele ribosomale și cu alterarea transportului antibioticului.

Tabelul 24.

Principalele fenotipuri de rezistență ale enterococilor la aminozide (după Jehl și colab., 2004)

APH = aminozid fosfotransferaza; ANT = aminozid nucleotidiltransferaza; AAC = aminozid acetiltransferaza

Enterobacteriile cu exceptia speciei Providencia stuartii, sunt în mod natural sensibile la aminoglicozide. Cele patru aminozide utilizate în terapia infecțiilor cu enterobacterii sunt: gentamicina (GM), tobramicina (TM), netilmicina (NET) și amikacina (AN).

P. stuartii are o rezistență cromosomală la gentamicină, netilmicină și tobramicină. Rezistența dobândită la aceste antibiotice este puțin frecventă (tabelul 25). Anumite fenotipuri de rezistență sunt generate în funcție de prezența anumitor enzime care modifică aminozidele:

Fenotipul 1: tulpini rezistente la gentamicină (GM), asociate cu prezența unei 3-aminoacil-acetiltrensferazei AAC;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la gentamicină (GM) și la netilmicină (NET) asociate cu o 2-nucleotidiltransferază ANT;

Fenotipul 3: tulpini rezistente la tobramicină (TM), netilmicină (NET), și la amikacină (AN) asociate cu o 6-aminoacilacetiltransferază AAC.

Tabelul 25.

Fenotipurile de rezistență dobândită ale enterobacteriilor la aminozide (după Jehl și colab., 2004)

Gm = gentamicina, To = tobramicina, Nt = netilmicina, Ak =amikacina, Is =isepamicina, AAC = aminozid acetiltransferaze, ANT = aminozid nucleotidiltransferaza, APH = aminozid fosfotransferaze In fiecare clasă, enzimele sunt desemnate prin tipul lor de activitate, numărul carbonului purtând gruparea modificată (cifre arabe de la 1 la 6) și ciclul afectat de modificare (primar, secundar sau nemodificat). Cifra romană care urmează indică spectrul de substrat al enzimei (adică ansamblul de molecule hidrolizate).

Evidențierea fenotipurilor de rezistență a pseudomonadaceaelor la aminoglicozide

Fenotipul salbatic este sensibil la toate aminozidele. Fenotipurile de rezistență dobândită se datorează mai multor mecanisme: impermeabilitate, eflux, inactivare enzimatică, mutante respiratorii, combinații ale acestor mecanisme (tabelul 26, 27). La P. aeruginosa cel mai întâlnit mecanism este cel de impermeabilitate (tabelul 26).

Tabelul 26.

Principalele fenotipuri de rezistență ale P. aeruginosa la la aminozide (după Jehl și colab., 2004)

G = gentamicina ; T= tobramicina ; Nt =netilmicina ; A =amikacina ; I = isepamicina; AAC = amioacid-acetiltransferaza ; ANT = aminoacid- nucleotidiltransferaza.

Tabelul 27.

Fenotipuri de rezistență la aminozide la Acinetobacter spp

G = gentamicina; N = netilmicina; T = tobramicina; A = amikacina; I = isepamicina; APH = aminozidfosfotransferaza; ANT = aminozidnucleotidiltransferaza; AAC = aminozidacetiltransferaza.

Evidențierea fenotipurilor de rezistență la quinolone

Stafilococii sunt natural rezistenți la quinolone de prima generație, în schimb sunt sensibili la fluorochinolone.

Sunt descrise 2 mecanisme de rezistență:

afinitate scăzută prin modificarea țintei, ADN giraza. Dobândirea rezistenței este legată de apariția mutațiilor cromosomale în genele gyrA și parC care provoacă o diminuare a legării quinolonelor la țintele lor intracelulare, complexele ADN giraza și ADN topoizomeraza 4.

eflux

Pneumococii prezintă rezistență naturală la quinolonele din prima generație și au sensibilitate redusă la pefloxacin, ofloxacin și ciprofloxacin. Foarte active pe pneumococ sunt levofloxacina și moxifloxacina.

Mecanismele rezistentei dobândite sunt: efluxul activ și mutațiile topoizomerazei IV (gena parC) și girazei (gena gyrA)

Toate enterobacteriile prezintă rezistență incrucișată la toate chinolonele, dar nivelul de exprimare variază pentru fiecare substanță antimicrobiană în funcție de bacterie. Pentru a pune în evidență diferite fenotipuri se testează acidul nalidixic (NAL) și două florochinolone: de exemplu: pefloxacină (PEF) sau ofloxacină (OFX) și ciprofloxacină (CIP) sau norfloxacină (NOR) (tabelul 28).

Au fost identificate următoarele fenotipuri de rezistență la chinolone la enterobacterii:

Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate chinolonele;

Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorchinolone;

Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuată la pefloxacină și la ofloxacină, dar sensibile la ciprofloxacină.

Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate chinolonele.

Tabelul 28.

Fenotipuri de rezistență a enterobacteriilor la chinolone (după Jehl și colab., 2004)

(1) Acid nalidixic și toate chinolonele clasice (prima genetație).

Fenotipurile de rezistență la chinolone la P. aeruginosa

Fenotipul salbatic este sensibil la toate fluorochinolonele deși în terapie cel mai utilizat este ciprofloxacinul (tabelul 29). Rezistența dobândită se datorează următoarelor mecanisme: impermeabilitate (porine și LPS); modificarea afinității țintei (subunitățile A și B ale ADN-girazei și Cșsi D ale topoizomerazei IV; Eflux activ (OprM, OprJ, OprN conferă rezistență de nivel scăzut)

Tabelul 29.

Principalele fenotipuri de rezistență ale P. aeruginosa la chinolone (după Jehl și colab., 2004)

Se consideră că aproape 70% din tulpinile de A. baumanii au dobândit rezistență încrucișată la fluoroquinolone, prin mutații la nivelul țintei.

Evidențierea fenotipurilor de rezistență la glicopeptide. Rezistența stafilococilor

Cazuri de rezistență sporadică la glicopeptide au fost descrise la stafilococii coagulazo-negativi încă din 1981. In primele cazuri rezistența la vancomicină și teicoplanină a fost de nivel scăzut (CMI 8-16 mg/ml). Tulpinile raportate ulterior aveau CMI între 16 și 64 mg/ml la teicoplanină și o sensibilitate menținută la vancomicină. Fenotipul de rezistență a fost asociat cu prezența unei proteine membranare de 35 000-39 000da la S.epidermidis și S.haemolyticus. Câteva tulpini sunt intermediare la vancomicină (tulpini GISA) și au o rezistență crescută la teicoplanină. Acestea au fost izolate de la pacienți care au urmat multiple tratamente cu vancomicină. Aceste tulpini GISA nu au genotipul VanA, VanB, VanC, mecanismul de rezistență fiind încă necunoscut. Articole recente raporteaza tulpini de S.aureus cu sensibilitate redusă la teicoplanină (creșterea CMI de 8 ori) și la vancomicină (CMI dublu), tulpini care sintetizează o noua proteină de 39 000da (fig. 53).

In schimb, tulpini de S.aureus sensibile la vancomicină și cu sensibilitate redusa la teicoplanină posedă o proteină membranară de 35 000da și prezintă o creștere a exprimării PLP 2-1 și PLP 2-2.

Rezistența la glicopeptide este uneori greu de depistat prin antibiograma difuzimetrică. Comitetul de Antibiogramă al Societatii Franceze de Microbiologie (CA-SFM) recomandă determinarea CMI pentru toate tulpinile al căror diametru de inhibiție este mai mic de 17 mm. Detectarea rezistenței pare sa dea rezultate mai bune pe mediu semi-gelozat.

Rezistența enterococilor la vancomicină

Rezistența enterococilor la vancomicină a început să fie semnalată din anul 1988 (Leclercq si al., 1988 & 1989). Supravegherea clinică, biochimică și genetică a rezistenței la glicopeptide în cadrul genului Euterococcus a evidențiat o mare heterogenitate fenotipică și genotipică. Cele trei fenotipuri (VanA. VanB & VanC) sunt definite prin nivelul de rezistență la vancomicină și sensibilitate sau rezistență la teicoplanină (Tabel 30).

Rezistenta intrinsecă (naturală) la glicopeptide numită VanC se caracterizează prin rezistență de nivel scăzut la vancomicină și sensibilitate la teicoplanină întalnită la speciile: E. gallinarum, E. casseliflavus și E. flavescens. Gena VanC codifică o ligază care substituie –D-Ala-D-Ser în locul D-Ala-D-Ala ca precursor al peptidoglicanului.

Mecanismul rezistenței dobândite este legat de producerea unui nou precursor al peptidoglicanului în care dipeptidul terminal ( D-Ala-D-Ala) este înlocuit de D-Ala- D-Lac, a cărui afinitate pentru glicopeptide este redusă. Sunt descrise șase fenotipuri de rezistență dobândită: VanA, VanB, VanD, VanE,VanG, Van E (la E. faecalis și E. faecium).

Tabelul 30.

Distribuția fenotipurilor de rezistență ale enterococilor la chinolone

Transpozonul Tn1546 codifică 9 proteine:

două necesare transpoziției (ORF1 si ORF2)

două implicate în reglarea expresiei inductibile a rezistenței ( VanR siVanS)

cinci implicate în rezistență (VanH-dehidrogenaza, VanA-ligaza, VanX-peptidaza, majore și VanY și VanZ, considerate minore).

A fost descrisă o tulpină de S. bovis rezistentă la vancomicină care posedă gena vanB.

Cea de-a doua formă a rezistenței la vancomicină a rezultat probabil din transferul conjugativ al operonului vanA de la Enterococcus faecalis vancomicin-rezistent (fig. 54). Showsh și colaboratorii au demonstrat că plasmida de la Enterococcus faecalis care conține vanA codifică de asemenea un feromon de sex care este sintetizat și de către S. aureus, sugerând posibilitatea transferului conjugal. Aceste izolate VRSA au rezistența de nivel înalt la vancomicină, cu CMI de 128 µg/ml. Rezistența la aceste izolate este cauzată de alterarea peptidului terminal la D- Ala-D-Lac în loc de D-Ala-D-Ala (fig. 54). Sinteza D-Ala-D-Lac se produce doar prin expunerea la concentrații mici de vancomicină.

Figura 53. Mecanismele de rezistență la vancomicină a tulpinilor VISA. Acestea sintetizează în exces peptidoglican, având ca rezultat creșterea numărului de resturi D-Ala-D-Ala care leagă vancomicina (după Walsh și Howe, 2002).

Figura 54. Mecanismul de rezistență la vancomicină a tulpinilor VRSA (după Hiramatsu și colab., 1997).

Evidențierea rezistenței la macrolide, streptogramine, lincosamide (MLSb)

Rezistența la aceste tipuri de antibiotice este rezultatul activarii a 3 mecanisme:

Modificarea țintei ribosomale (sub-unitatea 50S)

Tulpinile rezistente produc o metilază responsabilă de o dimetilare specifică a adeninei din ARNr 23S. Aceasta provoacă o schimbare de conformație a ARN, care reduce afinitatea MLS pentru ribosomi. Metilarea se produce la toate macrolidele și lincosamidele. Această rezistență depinde de diferiți determinanți genetici. La stafilococ găsim genele ermA, ermB, ermC. Aceste gene sunt purtate de transpozoni (ermA) sau plasmide (erm). Exprimarea fenotipică a rezistenței poate fi inductibilă (rezistență crescută pentru toate macrolidele cu 14 și 15 atomi de carbon și sensibilitate la macrolidele cu 16 atomi de carbon), sau constitutivă (rezistență crescută la toate macrolidele cu 14-16 atomi de carbon, lincozamidele și streptograminele B – rezistență de tip MLSB) (tabelul 31). Rezistența compusului B nu modifică sinergia a doi compuși ai streptograminelor.

Tabelul 31.

Fenotipuri de rezistență la MLS dobândite de către stafilococi (după Jehl și colab., 2004)

(1) 14C: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritromicina

(2) 15C: azitromicina

(3) 16C: spiramicina, josamicina, midecamicina, tilosina

(4): antibiotic a carui activitate bacteriostatica sau bactericida este diminuata

(5) Pri : pristinamicina

Inactivarea antibioticului

StreptograminaA acetiltransferaza conferă rezistență la factorul A astfel încât streptogramin B hidrolaza, codificată de către gena vgb, inactivează factorul B. Cel puțin 2 gene vat și vatB sunt responsabile pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistența izolată la lincosamide, exceptionala la S.aureus dar detectată la stafilococii coagulazo-negativi (S. sciurii, S. cohnii, S. xylosus), este datorată achiziționării unei enzime care modifică prin adenilare lincomicina și clindamicina. Fenotipul LSA poate fi confundat cu fenotipul L, ambele rare la S.aureus. Lincosamidele sunt inactivate de către nucleotid-transferaze codificate de 2 gene plasmidiale foarte apropiate, linA și linA’.

Efluxul activ al moleculelor de antibiotic

Exprimarea acestei rezistențe depinde de gena msrA, care codifică pentru proteina MsrA responsabilă de eliminarea crescută a eritromicinei intrabacteriene. Au fost izolați stafilococi rezistenți doar la streptogramina A. Rezistența dependentă de gena vga este datorată unei diminuări a incorporarii intracelulare a antibioticului.

La enterococi, rezistența naturală se manifestă la lincosamide și la compusul A al streptograminelor (la toate speciile cu excepția E. faecium și E. durans, astfel că acest tip de rezistență poate fi utilizat ca test de orientare pentru identificare).

Rezistența dobândită se manifestă prin două mecanisme: modificarea țintei și inactivarea antibioticului.

Modificarea țintei (subunitatea 50S ribosomală) este mecanismul principal care explică rezistența incrucișată la MLSK. La enterococi gena ermB este responsabilă de această rezistență.

Inactivarea antibioticului se manifestă la E. faecalis prin acțiunea unei lincomicin-nucleotidil-transferaze (codificate de gene linA) care conferă rezistență la streptograminele A.

Rezistența dobandită a Str. pneumoniae la macrolide este MLSB, datorită metilării ARNr 23S, care diminuează afinitatea macrolidelor pentru țintă. Această rezistență este încrucișată pentru toate macrolidele, lincosamidele și streptograminele B și poate fi de tip inductibil sau constitutiv:

– Tulpinile care au gena erm imductibilă sunt sensibile la ketolide la fel ca cele rezistente prin mecanismul de eflux .

– Alte tulpini, care posedă gena mefE, codifică o rezistență prin mecanism de eflux ele fiind rezistente la eritromicină, dar sensibile la clindamiciăa, quinupristină și la ketolide. Genele erm și mefE sunt rareori asociate.

– Al treilea fenotip de rezistență a fost descris la un grup de 10 tulpini care nu au genele erm sau mefE dar sunt ery-R constitutiv și clinda-R.

La S. pyogenes mai puțin de 10% dintre tulpini sunt rezistente la eritromicină, cu o mare heterogenitate

de la o zona la alta (18,3% în Asia, 10,6% în Europa de Est, 9,8% în Europa de Vest).

Doua mecanisme sunt responsabile de aceasta rezistență: modificarea țintei, care dă fenotipul MLSB constitutiv, codificat de gena ermB și un mecanism de efux care dă fenotipul M codificat de gena mefA.

Telitromicina are o activitate intrinsecă superioară celei a macrolidelor.

Evidențierea fenotipurilor de rezistență la tetracicline

Sunt descrise 2 mecanisme de rezistență la tetracicline:

primul este legat de o insuficientă concentrare intracelulară a antibioticului datorită unui eflux excesiv al antibioticului prin membrana citoplasmatică, sub acțiunea unei proteine membranare TET. Acest mecanism conferă o rezistență la tetraciclină, dar nu și la minociclină.

al doilea mecanism este datorat unei modificări a țintei ribosomale a acestor antibiotice. In acest caz, există o rezistență crescută la toate tetraciclinele.

La streptococi și enterococi au fost evidențiate 3 gene de rezistență la tetraciclină, și anume: tetM, tetO (Zilhao și colab., 1988) și tetL (Chopra și colab., 1986).

Rezistența la trimetoprim-sulfometoxazol

Rezistența stafilococului la acesti 2 compuși se realizează prin mai multe mecanisme:

– modificarea enzimelor țintă (DHFR si THFR)

– supraproducerea acestor enzime.

Rezistența la fosfomicină

Rezistența stafilococului la fosfomicină este rezultatul unor mutații foarte frecvente ce țintesc transportul antibioticului. A fost raportata o rezistenta plasmidială la tulpini de stafilococ coagulazo-negativi și la S.aureus (gena fosB la S. aureus). Mecanismul, prin analogie cu cel descris la bacilii Gram negativi, ar putea fi inactivarea antibioticului prin conjugare cu glutation. Specia saprophyticus este natural rezistentă la fosfomicină.

Rezistența la acid fusidic

Rezistenta stafilococului la acidul fusidic este datorata unor mutații care au loc cu frecvență mare, fapt pentru care în clinică acest antibiotic se utilizează numai în asociere cu alte antibiotice.

Rezistența la rifampicină

Se disting două niveluri de rezistență:

– de nivel înalt cu CMI > 32mg/l

– sensibilitate diminuată (CMI 1- 4mg/l), tulpini izolate rareori

Mecanismele de rezistență la S. aureus nu sunt încă cunoscute.

La pneumococ, rezistența la rifampicină, este legată de o mutație a lanțului β al ARN polimerazei care impiedică fixarea antibioticului pe ținta sa.

Rezistența la cloramfenicol

Este predominant plasmidială și se datorează prezenței la enterococi a unor gene cat omologe cu cele de origine stafilococică catpC221, catpC194 și catpSCS7 (Trieu-Cuot et al., 1991; 1993). CatpC221, este o genă, cu expresie inductibilă cu secvență cunoscută (Shaw si colab., 1985), identificată pe plasmida pC221 de la S. aureus. Plasmida conjugativa pIP501 (30,2 kbp), cu spectru larg de gazdă, a fost izolat pentru prima dată din tulpina B96 de S. agalactiae (Horodniceanu și colab., 1976). Prezența sa conferă tulpinii gazdă fenotip Cmr-Emr. Studii bazate pe hibridizări ADN-ADN au evidențiat diseminarea determinantului catpIP501 pe plasmide izolate din enterococi (Pepper și colab., 1986; 1987; 1988).

Spre deosebire de stafilococi și enterococi unde este codificata plasmidial, la pneumococi cloramfenicol acetil transferaza este de natura cromosomală.

Rezistența la oxazolidinone

La stafilococi, până în prezent nu a fost evidențiată rezistență încrucișată între linezolid și alte antibiotice inhibitoare ale sintezei proteice, mai mult oxazolidinonele rămân active asupra tulpinilor de MRSA.

Oxazolidinonele s-au dovedit a fi active asupra tulpinilor de E. faecalis și E. faecium fie că sunt sensibile fie că nu la glicopeptide. In vitro s-au obținut mutante rezistente cu o frecvență de 10-9- 10-11 ( mutații la nivelul subunitatii 23S ribosomale).

La penumococi nu s-a semnalat până în prezent nici o tulpină rezitentă indiferent de sensibilitatea la penicilina G și macrolide.

6.6. Fenotipuri de rezistență la alte antibiotice la microorganisme de interes clinic

B. cepacia este rezistentă, de asemenea, la aminozide, fosfomicina și polimixine, dar sensibilă la fluoroquinolone și cotrimoxazol și, într-un anumit procent, la carbapeneme în special la meropenem. Fenomenul de eflux inactivează asupra cloramfenicolul, trimetoprimul și ciprofloxacinul.

H. influenzae este rezistent la lincosamide și moderat sensibil la macrolide și ketolide. La aminozide sensibilitatea este variabilă iar față de cloramfenicol, tetracicline, rifampicină, quinolone și cotrimoxazol se manifestă o rezistență de nivel scazut.

Biologul sau medicul de laborator care execută antibiograma are obligația de a prezenta clinicianului rezultatul sub forma unui document ușor de citit și de ințeles, care trebuie să urmeze logic rezultatului examenului microscopic direct și al culturii.

Mențiunile obligatorii din buletinul de analiză al antibiogramei sunt: metoda utilizată, lista antibioticelor conform DCI-urilor (denumire comună internațională), răspunsul interpretat ca sensibil, intermediar, rezistent, CMI –uri în anumite cazuri (în special pentru microorganismele izolate din infectii severe), menționarea anumitor fenotipuri de rezistență și consecințele lor terapeutice. În anumite cazuri este mai avantajos ca biologul sau medicul de laborator să prezinte clinicianului doar rezultatele pentru anumite antibiotice, pentru a evita selectarea și emergența unor fenotipuri de rezistență în mediul spitalicesc (tabelul 33).

Antibiograma este inutilă de fiecare dată când tulpina izolată nu poate fi considerată responsabilă de infecția care a determinat prelevarea (ex. -microorganism comensal sau contaminant, cum este cazul streptococilor orali sau Haemophilus parainfluenzae în expectorații, Bacillus într-o singură hemocultură); când numarul de UFC/ml este inferior pragului semnificativ (urina și expectorați); dacă tulpina izolată poate fi considerată ca patogenă, dar face parte dintre speciile sensibile în mod obișnuit la tratamentul de referință și când nu există nici o corelație in vitro-in vivo (ex. Legionella); în infecțiile cutanate pentru care tratamentul este local sau chirurgical.

Antibiograma trebuie practicată în acord cu clinicianul:

– daca o bacterie comensală este izolată de la un pacient imunodeprimat;

– în prelevatele plurimicrobiene care conțin specii aerobe/anaerobe (tabelul 32);

Tabelul 32.

Criterii de decizie pentru realizarea unei antibiograme în funcție de natura prelevatului (după Jehl și colab., 2004)

Tabelul 33.

Agenți antimicrobieni de prima alegere pentru tratamentul infecțiilor cu bacterii patogene antibiorezistente

(după Jehl și colab., 2004)

Bibliografie selectivă

Catlin, B. W., lodometric detection of Haemophilus influenzae beta-lactamase: rapid presumptive test for ampicillin esistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1975, 7:265-270.

Chopra I., Linton A., The antibacterial effects of low concentrations of antibiotics, Advances in Microbial Physiology. 1986, 28:211–259.

Codiță I., The genus Staphylococcus, Bacteriology, Virusology, Parazitology and Epidemiology. 1993, 38(3-4):5-33.

Codiță I., (coordonator), Mazilu M., Mihai., Israil A.M., Ungureanu V., Tatu Chitoiu D., Petrescu A.M., Popa M., Balotescu C., Chersulik E., Lixandru B., Pană M., Ghitță M., 2007, Ghid national pentru aplicarea procedurii de testare a sensibilitatii la antibiotice conform standardului CLSI/NCCLS, Editura Universitara “Carol Davila”, Bucuresti (ISBN:978-973-708-210-7)

Courvalin P., Jarlier C., Transposable multiple antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae, Molecular and General Genetics. 1986, 205(2):291–297.

Duma R. J., Kunz L. J.,. Penicillinase production n the evaluation of disk sensitivity testing of staphylococci to penicillin, American Journal of Clinical Pathology. 1970, 53:865-870.

Lowy F.D., Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, The Journal of Clinical Investigation. 2003, 111:1265-1273.

Hiramatsu K., Aritaka N., Hanaki H., Kawasaki S., Hosoda Y., Hori S., Fukuchi Y., Kobayashi I., Dissemination in Japanese hospitals of strains of Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin. The Lancet Infectious Diseases. 1997, 350:1670-1673.

Horodniceanu T., Bouanchaud D.H.., Bieth G., Chabbert Y.A., R Plasmids in Streptococcus agalactiae (Group B), Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1976, 10(5):795–801.

Iaconis JP, Sanders CC. Purification and characterization of inducible beta-lactamases in Aeromonas spp. Antimicrob Agents Chemother. 1990, 34 (1):44–51

James H., Jorgensen J., Lee C., Gary A. A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of Beta-Lactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1977, 11(6): 1087–1088.

Jarlier V., Nicolas M.H., Fournier G., Philippon A., Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns, Reviews of Infectious Diseases. 1988, 10(4):867–878.

Jehl, F., Chomarat M. Weber M., Alain, G. De l'antibiogramme à la prescription. BIOMÉRIEUX, 2004

Jorgensen J., Lee J.C. Alexander G.A., Rapid Penicillinase Paper Strip Test for Detection of Beta-Lactamase-Producing Haemophilus influenzae and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother. 1977, 11(6): 1087-1088

Kernodle D.S., Zygmunt D.J., McGraw P.A., Chipley J.R., Purification of Staphylococcus aureus beta-lactamases by using sequential cation-exchange and affinity chromatography, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(11):2177–2183.

Kernodle S.J., Improving Health Care with Clinical Practice Guidelines and Critical Pathways: Implications for Pharmacists in Ambulatory Practice, Pharmacy Practice Management Quarterly. 1997; 17(3): 76-89.

Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus aac(6')-Ig gene encoding an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase which modifies amikacin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37(10): 2093-2100.

Lambert T., Gerbaud G., Galimand M., Courvalin P., Characterization of Acinetobacter haemolyticus aac(6~-1g gene encoding an aminoglycoside 6'- N-acetyltransf e rase wich modifies amikacin, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37: 2093-2100.

Leclercq B., Genetic selection of meat-type chickens for high or low abdominal fat content, In : B. Leclercq and C.C. Whitehead (eds), Leanness in domestic birds, 1993, p:25-40. Butterworth, London.

Leclercq B.,. Possibilités d'obtention et des génotypes maigres en aviculture. INRA Productionm Animal. 1989, 2 : 275-286.

Leclercq R., Dutka-Malen S., Duval J., Courvalin P., The vancomycin resistance gene vanC is specific of Enterococcus gallinarum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1992, 36 : 2005-2008.

Livermore D.M., Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clinical Microbiology Reviews. 1995, 8: 557-584.

M'Zali, F. H., Chanawong A., Kerr K. G., Birkenhead D., Hawkey P. M., Detection of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae: comparison of the MAST DD test, the double disc and the Etest ESBL. J. Antimicrob. Chemother. 2000, 45: 881-885

National Committee for Clinical Laboratory Standards Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents. Document M 26-A. NCCLS, Wayne PA. 1998.

National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. Document M7-A5. NCCLS, Wayne, PA, 2000.

National Committee for Clinical Laboratory Standards: Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Document M2-A/. NCCLS, Wayne, PA, 2000.

O' Callaghan C. H., Morris A., Kirby S. M., Shingler A. H., Novel method for detection of P-lactamase by using a chromogenic cephalosporin substrate. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1972, 1:283-288.

Pepper K., de Cespédès G., Horaud T., Heterogeneity of chromosomal genes encoding chloramphenicol resistance in streptococci, Plasmid. 1988, 19(1):71–74.

Pepper K., Horaud T., Le Bouguénec C., de Cespédès G., Location of antibiotic resistance markers in clinical isolates of Enterococcus faecalis with similar antibiotypes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1987, 31(9):1394–1402.

Pepper K., Le Bouguénec C., de Cespédès G., Horaud T., Dispersal of a plasmid-borne chloramphenicol resistance gene in streptococcal and enterococcal plasmids, Plasmid. 1986, 6(3):195–203.

Sanders, C. C., Sanders, W. E. Jr.. Type I beta-lactamases of gram-negative bacteria: interactions with beta-lactam antibiotics. J Infect. Dis. 1986, 154 :792-800

Shah P.M., Isaacs R.D., Ertapenem, the first of a new group of carbapenems. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, 52: 538-542

Strachounski L. S., Andreeva I. V.,. Ratchina S. A, Galkin D. V., Petrotchenkova N. A., Demin A. A., Kuzin V. B., Kusnetsova S. T., Likhatcheva R. Y., Nedogoda S. V., Ortenberg E. A., Belikov A. S., Toropova I. A., The Inventory of Antibiotics in Russian Home Medicine Cabinets, Clinical Infectious Diseases. 2003, 37: 498–505

Trieu-Cuot P., G. de Cespédès, Bentorcha F., Delbos F., Gaspar E., Horaud T., Study of heterogeneity of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) genes in streptococci and enterococci by polymerase chain reaction: characterization of a new CAT determinant, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993, 37(12): 2593–2598.

Trieu-Cout P., Carlier C., Poyart-Salmeron C., Courvalin P., Shuttle vectors containing a multiple cloning site and a lacZ gene for conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to gram-positive bacteria, Gene 1991, 02:99-104.

Walsh T. R., Howe R. A., The prevalence and mechanisms of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Annual Review of Microbiology. 2002, 56:657-675.

Zilhao R., Papadopoulou B., Courvalin P., Occurrence of the Campylobacter resistance gene tetO in Enterococcus and Streptococcus spp., Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(12):1793–1796.

www.gold.aecom.yu.edu/id/micro/pneumococcus.htm

www.microbes-edu.org/…/bla/generalites.html

www.seimc.org/protocolos/microbiologia/cap12.htm

Capitolul 7

INTERACȚIUNILE FARMACOLOGICE ALE ANTIBIOTICELOR

Interacțiunile antibioticelor pot fi împărțite în două categorii:

interacțiuni fizico-chimice care se produc în afara organismului, înainte de de administrare;

interacțiuni care au loc in vivo.

Din prima categorie sunt cunoscute interacțiunile meticilină + kanamicină sau ampicilină + gentamicină. In 2 ore, ampicilina pierde 50% din activitate, în amestecul cu gentamicina.

Utilizarea unor antibiotice asociate este o practică obișnuită în clinică, în special pentru tratamentul infecțiilor grave. Asociația a fost empirică sau s-a bazat pe acțiunea lor complementară. Diseminarea determinanților de rezistență face necesară înțelegerea bazelor moleculare ale administrării asociate a antibioticelor în vederea alegerii optime a asocierilor cu acțiune sinergică și în egală măsură, pentru evitarea antagonismului.

Asociațiile de antibiotice se folosesc frecvent în clinică, pentru următoarele scopuri:

– în majoritatea cazurilor, asociația se administrează pentru a obține un spectru mai larg de activitate sau în scopul întârzierii emergenței subpopulațiilor rezistente la medicament;

– administrarea unor antibiotice cu spectru larg de activitate este obligatorie pentru terapia pacienților în pericol (pacienții neutropenici febrili infectați cu bacili Gram negativi), sau când se suspectează o infecție combinată, polimicrobiană, cu bacterii aerobe sau anaerobe;

– pentru creșterea activității antibacteriene (sinergism);

– pentru utilizarea unor doze mai mici ale unor antibiotice toxice.

Tratamentul combinat se impune, pentru tratamentul infecțiilor al căror agent declanșator nu se cunoaște. Folosirea a două sau mai multe medicamente pentru prevenirea emergenței rezistenței este eficientă pentru tratamentul tuberculozei și pentru terapia unor infecții cronice. Utilizarea asocierilor sinergice este mai complexă. Sinergia se produce atunci când asocierea a două medicamente produce inhibiția sau moartea agentului infecțios, la concentrații de 4 ori mai mici decât în cazul administrării separate a fiecărui medicament.

7.1. Sinergismul

Uneori, antibioticele produse de diferitele specii ale unui grup au acțiune sinergică: de exemplu, streptograminele sunt perechi de antibiotice neînrudite structural, care inhibă sinteza proteinelor ribosomale la treapta transferului peptidil. Streptograminele de tip A se sintetizează pe calea poliketidelor (peptide neribosomale), iar streptograminele de tip B sunt depsipeptide sintetizate neribosomal, care conțin câțiva aminoacizi neproteici. Depsipeptidele sunt compuși naturali sau sintetici cu secvențe de aminoacizi (-NH2) și hidroxicarboxilici (-OH), care de obicei alternează, însă nu în succesiune regulată:

Totdeauna organismele producătoare sintetizează ambele streptogramine. Streptograminele A sau B, singure, sunt bacteriostatice, în timp ce asocierea lor este bactericidă. Creșterea eficienței antibacteriene se datorează legării sinergice a streptograminelor A și B, la situsuri distincte pe ribosom. Legarea streptograminei A la ribosom, mărește afinitatea de legare pe ribosom a streptograminei B, de circa 40 de ori, făcând ca legarea ambelor antibiotice să fie ireversibilă. Legarea antibioticului de tip A, probabil schimbă conformația spațială a ARNr, determinând expunerea unui situs de legare de înaltă afinitate pentru antibioticul de tip B. Efectul sinergic al streptograminelor a fost exploatat clinic, sub forma unei combinații de derivați semisintetici – pristinamicină IA și IIA – cunoscuți sub denumirea de synercid, utilizat pentru tratamentul infecțiilor clinice cu rezistență multiplă la medicamente (Challis, Hopwood, 2003).

Studiile in vitro au arătat că în prezența penicilinei, înglobarea intracelulară a streptomicinei C14 de către Streptococcus faecalis, a crescut semnificativ, față de nivelul înglobării în absența -lactamilor (Korzeniowski și colab., 1978). Alte antibiotice active față de perete (vancomicina, bacitracina, cicloserina), care acționează la diferite trepte asupra sintezei peretelui celular bacterian și care au produs efectul sinergic optim (letal) în asociație cu streptomicina, au ridicat nivelul de încorporare al aminoglicozidului.

Administrarea asociată a antibioticelor prezintă un interes clinic major. Un exemplu tipic în acest sens este administrarea asociată a inhibitorilor -lactamazei, cu alte antibiotice (Bush, 1988). Antibioticul care leagă enzima acționează ca inhibitor al enzimei. Sinteza -lactamazei constituie un mecanism major al rezistenței față de antibioticele -lactamice la bacteriile Gram pozitive și Gram negative. Incercările s-au făcut în sensul dezvoltării de noi antibiotice -lactamice, cu rezistență mai mare la hidroliza mediată de -lactamaze. Sinergismul prin combinația ampicilină-cloxacilină s-a demonstrat și s-a folosit în tratamentul infecțiilor tractului urinar cauzate de organisme producătoare de -lactamaze.

Altă abordare a fost administrarea asociată a unui -lactamic hidrolizabil, activ, un alt -lactamic cu afinitate mai mare pentru enzimă, cel de al doilea având rolul de inhibitor al enzimei. Inhibitori puternici ai diferitelor -lactamaze produse de bacteriile Gram pozitive și Gram negative s-au dovedit a fi două antibiotice naturale: acidul clavulanic (produs de Str. clavuligerus) și sulbactamul. Administrate separat, cele două antibiotice au activitate antimicrobiană limitată. Acești compuși acționează ca inactivatori ai enzimelor bacteriene: atât enzima cât și antibioticul, după ce interacționează, se inactivează reciproc. Asociația clavulanatului de K cu amoxicilina, extinde spectrul acesteia față de microorganismele producătoare de -lactamaze: S. aureus, H. influenzae, Bacteroides fragilis, K. pneumoniae și alte enterobacterii.

Asocierea antibioticelor -lactamice și a inhibitorilor de -lactamază este eficientă față de bacteriile rezistente la -lactami (Siami și colab., 2001). Efectul sinergic al asociației este reflectat de denumirea dată combinației acidului clavulanic cu meticilina: augmentin.

Sulbactamul extinde spectrul ampicilinei, prin același mecanism ca și acidul clavulanic. Ampicilina și sulbactamul au fost legate chimic (sultamicilin) sub forma unui compus absorbit pe cale orală. Asocierea sintezei celor două tipuri de antibiotice caracterizează unele microorganisme în mediile naturale: producerea cefamicinei (un antibiotic -lactamic) și acidului clavulanic este constantă. Nu există producători cunoscuți de acid clavulanic, care să nu producă cefamicine.

Asociația cloramfenicolului la concentrație mică, cu -lactamii, este sinergică față de 20% dintre tulpinile Gram negative rezistente la -lactami prin hidroliza -lactamazei.

7.2. Blocarea secvențială a căilor de sinteză

Asociația trimetoprimului cu sulfametoxazolul exemplifică sinergismul care rezultă din blocarea treptelor secvențiale ale unei căi metabolice esențiale.

Inhibiția dihidropteroat-sintetazei și dihidrofolat-reductazei, trepte în sinteza acidului folic, are ca rezultat sinergismul cu efect bactericid față de multe tulpini bacteriene, a căror creștere este inbibată de cei doi compuși chimici. Asociația trimetoprim-sulfametoxazol poate fi o alternativă la vancomicină.

Trimetoprim-sulfametoxazol, în asociație cu rifampina au fost folosite pentru eradicarea stării de purtător nazal de Staphylococcus, rezistent, în epidemiile nosocomiale. Rifampina singură nu este folosită în acest scop, datorită emergenței tulpinilor rezistente.

Sinergismul cu efect bactericid al asociației -lactamilor (inhibitori ai treptelor tardive ale sintezei peptidoglicanului), cu fosfomicina (inhibitoare a unei trepte timpurii a sintezei peretelui celular) se explică prin blocajul succesiv al treptelor multiple ale unei căi metabolice.

Antibioticele -lactamice au afinități preferențiale pentru ținte specifice, reprezentate de proteinele care leagă penicilina (PBP), localizate în membrana citoplasmatică. Demonstrarea interacțiunii specifice cu PBP a dus la conceptul că asocierea antibioticelor cu afinități complementare înalte poate produce efecte sinergice. Astfel, concentrațiile bacteriostatice ale aztreonamului au devenit litice prin asocierea amidocilinei.

Asociațiile -lactamice pot să producă efecte antagoniste. Antagonismul unor -lactami este frecvent semnalat: de exemplu, antagonismul între azlocilină și cefazolină se manifestă față de 16% dintre bacilii Gram negativi testați (Eliopoulos, 1988).

Frecvența antagonismului variază mult în funcție de metodele folosite in vitro, de combinația de antibiotice și de speciile examinate.

Spre deosebire de asociațiile -lactami-aminoglicozide (streptomicina), al căror antagonism este bine cunoscut și semnalat în clinică, asociația poate avea efect sinergic și bactericid pentru unele tulpini rezistente. Rezistența la aminoglicozide se produce în special, după administrarea aminoglicozidelor ca agenți terapeutici unici, dar poate să apară chiar după administrarea lor în asociație cu -lactamicele.

7.3. Efectele defavorabile ale administrării antibioticelor

Cel mai direct și cel mai evident efect al administrării prelungite pe cale orală a antibioticelor este disbioza intestinală. Microbiota intestinală îndeplinește mai multe funcții, având un rol esențial în stimularea dezvoltării structurilor limfoide asociate tractului digestiv. La fel de importantă pentru organismul uman este sinteza vitaminei K. Vitaminele K există sub două forme naturale: vitamina K1 (filokinona), în țesuturile vegetale și vitamina K2 (menaquinona), sintetizată de bacteriile intestinale. Celor două forme naturale se adaugă menadiona sintetică (vitamina K3).

Structura moleculară a vitaminei K2

Funcția majoră a vitaminei K în organismul uman este menținerea nivelului normal al proteinelor de coagulare sanguină: factorii II, VII, IX, X și proteinele C și S, sintetizate în ficat ca proteine precursoare inactive. Vitamina K se absoarbe la nivel intestinal numai în prezența sărurilor biliare și a altor lipide, prin interacțiunea cu chilomicronii. In consecință, maladiile de malabsorbție a lipidelor pot să aibă ca rezultat deficiența vitaminei K. Forma sintetică K3 este hidrosolubilă și se absoarbe independent de prezența lipidelor intestinale și a bilei. Deficiența K2 este rară, deoarece este sintetizată de bacterii. Tratamentul îndelungat cu antibiotice poate duce la deficiențe ale vitaminei K la adulți. Intestinul nou-născuților este steril, astfel încât este posibilă o deficiență a vitaminei K, dacă lipsește din dietă. Simptomul primar al deficienței vitaminei K la copii este sindromul hemoragic.

Agenții antimicrobieni pot avea efecte toxice directe, pot să interacționeze cu alte medicamente și să-și mărească toxicitatea sau produc tulburări ale echilibrului microbiotei tractului digestiv și favorizează infecțiile cu organisme care în mod normal sunt saprobionte și inofensive. Aproape toate antibioticele produc creșterea numerică a celulelor de Cl. difficile, care secretă o toxină ce determină tulburări diareice și chiar colită pseudomembranară. Alterarea echilibrului intestinal de către antibiotice, poate să ducă la creșterea populației de C. albicans în cavitatea bucală, vagin, tractul gastrointestinal.

Unele antibiotice și agenți chimioterapeutici se metabolizează în ficat și produc leziuni ale acestuia, de exemplu, izoniazida, administrată pentru tratamentul tuberculozei, în timp ce aminoglicozidele pot să lezeze rinichiul. Toxicitatea neurologică este rară, dar aminoglicozidele pot produce tulburări funcționale ale aparatului auditiv sau vestibular, dacă dozajul nu este monitorizat. Reacțiile hematologice au un spectru larg de manifestări clinice.

Agenții farmacologici, administrați în scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o varietate de dezordini imunitare, deoarece acționează ca haptene care se cuplează cu diferite proteine tisulare, conferindu-le imunogenitate. Legarea covalentă a unui medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea lui, de o macromoleculă, creează un conjugat haptenă-macromoleculă, inductoare a unui răaspuns imun specific. Legarea covalentă a celor două molecule se numește haptenare.

Se descriu două tipuri de haptenare:

– haptenarea directă a celulelor (a moleculelor membranare) și a moleculelor extracelulare, sub acțiunea compușilor chimici cu reactivitate nativă (intrinsecă). De exemplu, penicilinele de semisinteză (benzil-penicilina, cefalosporinele), dar și alte medicamente se cuplează cu diferite proteine serice, formând conjugate cu funcție de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilină injectată, se leagă covalent prin gruparea –NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega mii de haptene beta-lactamice, în câteva minute după tratament.

– haptenarea indirectă a moleculelor membranare sau libere, cu derivații rezultați din catabolizarea parțială a unor molecule, care în stare nativă sunt puțin reactive sau areactive.

Metabolizarea are loc în hepatocite, cheratinocite (și în alte celule) și poate crea intermediari reactivi ce formează legături covalente cu molecule carrier.

Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteică. Se produce haptenarea moleculelor în cursul sintezei (haptenare internă) și pot fi expuse ca antigene pe suprafața celulei. Metaboliții reactivi pot fi secretați în spațiul extracelular și se leagă cu proteine extracelulare.

Unii indivizi sunt predispuși la reacțiile alergice față de diverse medicamente, în special antiinfecțioase. Dacă un individ manifestă fenomene alergice față de un compus farmacologic, riscul alergiei față de o altă clasă de compuși farmacologici crește de 9 ori. Circa 10% dintre adulți sunt alergici față de o clasă de compuși și intră în categoria celor cu risc crescut față de alți compuși farmacologici.

Reacțiile de hipersensibilitate imediată de tip 1, induse de medicamente, se manifestă variat: anafilaxie, urticarie, angioedem. Unele substanțe pot produce mai mult de un tip de reacție, la un organism sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacție anafilactică de tip I, o anemie hemolitică datorată reacției citotoxice de tip II, dezordini funcționale de tip III cu complexe imune sau o reacție de hipersensibilitate întârziată. Reacțiile de hipersensibilitate de tip I apar, de cele mai multe ori, în țesuturile bogate în mastocite: tegument, mucoase, mucoasa linguală, plămân, tractul gastrointestinal.

Antibioticele β-lactamice au proprietăți de haptene și, la doze mari, penicilina sau gruparea peniciloil rezultată după ruperea spontană a inelului β-lactamic, formează legături covalente cu proteinele. Gruparea peniciloil are reactivitate chimică crescută. Proteinele tisulare care leagă moleculele β-lactamice se modifică. Conjugatul antibiotic-proteină este inductor al sintezei IgM și IgG și rezultatul este hemoliza.

Alte medicamente care generează reacții imunitare, în absența sintezei Ac sunt sulfonamidele. Metaboliții lor se leagă preferențial cu enzimele care au citocromul P450. Proteina alterată generează un peptid care se asociază cu complexul CMH al celulei, recunoscut de limfocitele T.

Medicamentele se pot complexa cu proteine plasmatice și formează conjugate haptenă-proteine, inductoare ale sintezei Ac specifici. Se formează CI, care se adsorb pe hematii și ulterior se produce liza. Un anumit medicament poate produce o varietate de fenomene patologice, la diferiți pacienți: hemoliza, trombocitopenia, neutropenia sau combinații ale acestor fenomene.

7.4. Pătrunderea antibioticelor în țesuturi

Antibioticele administrate pe cale orală sau parenterală, părăsesc patul vascular și intră în lichidul interstițial pe calea difuziei pasive prin spațiile dintre celulele endoteliului vascular. Din lichidul interstițial, antibioticele pătrund în țesuturi în grade diferite. Gradul de pătrundere tisulară condiționează eficiența clinică și potențialul toxic al agenților antiinfecțioși. Raportul concentrației țesut/ser a aminoglicozidelor și a -lactamilor este subunitar pentru cele mai multe situsuri, cu excepția organelor excretoare.

Bacteriile care cauzează infecții tisulare sunt expuse la concentrații mai mici de antibiotice decât cele care se găsesc în același timp în sânge. Este recunoscut că lichidul cefalorahidian și infecțiile cavitare beneficiază de concentrații mai mici decât cele din sânge. Astfel se explică utilizarea dozelor mai mari de antibiotice pentru tratamentul infecțiilor tisulare. Raportul subunitar al concentrației antibioticului în compartimentele tisular și seric se datorează penetrării extravasculare scăzute ca rezultat al legării medicamentului de proteinele sanguine. Faptul impune obligativitatea ca antibioticele cu afinitate înaltă de legare de proteinele plasmatice să fie folosite în doze superioare pentru a fi la fel de eficiente ca acelea care au un nivel scăzut de legare cu proteinele serice.

Unele antibiotice au capacitatea de a se concentra la anumite situsuri tisulare din organism, ceea ce face ca ele să fie eficiente la doze inferioare. Concentrațiile tisulare mari realizate la situsurile de concentrare pot determina efecte toxice: de exemplu, raportul mare al concentrației prelungite țesut/ser de aminoglicozide produce toxicitate renală. Concentrațiile locale mari de aminoglicozide nu sunt totdeauna toxice, dar crește eficiența terapeutică față de pielonefrită.

Dată fiind corelația în general pozitivă între concentrația tisulară și eficiența terapeutică, în clinică s-a acceptat creșterea dozajului -lactamilor, iar pentru amioglicozide, dozele au fost limitate de toxicitate. Eficiența scăzută a aminoglicozidelor față de infecțiile tisulare are alte explicații: legarea de leucocite și de resturile necrotice la situs, antagonismul prin anaerobioza relativă și antagonismul cationilor metalici din urină.

Cele mai multe infecții bacteriene se produc în spațiul extracelular sau interstițial. Bacteriile aderă la suprafața celulelor gazdă sau de orice suprafață artificială pe care sunt disponibili nutrienții. Infecția produce leziuni ale țesuturilor gazdă prin intermediul metaboliților, toxinelor sau a enzimelor bacteriene sau prin produsele reacției inflamatorii ale gazdei, cum sunt enzimele lizosomale și factorul de necroză tisulară (TNF).

Pentru a fi eficiente în tratamentul infecției, antibioticele trebuie să fie prezente în lichidul interstițial. Concentrația tisulară eficientă este corelată direct cu concentrația sanguină: s-a evidențiat că concentrația minimă eficientă de penicilină, necesară pentru tratamentul infecției cu S. aureus este aceiași cu concentrația minimă bactericidă in vitro. Penicilina rămâne în spațiul extracelular și este eficientă pentru tratamentul infecțiilor bacteriene cu localizare extracelulară.

Antibioticele care pătrund în celule sunt potențial utilizabile pentru tratatamentul infecțiilor produse de microorganisme cu localizare intracelulară: Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, S. aureus. Antibioticul trebuie să pătrundă în celulă (în fagocite) și să-și păstreze activitatea antibacteriană în interiorul celulei (Labro, 2002). Clindamicina, eritromicina, rifampina și fluoroquinolonele pătrund în leucocitele polimorfonucleare. Eficiența lor antibacteriană este diferită, datorită diferențelor de legare a antibioticelor de componentele structurale ale celulei. Antibioticul poate fi legat de membrană, în citoplasmă, de componentele nucleare sau este încorporat în lizosomi. Măsurarea concentrației intracelulare a antibioticului se bazează pe evaluarea cantității de medicament asociat celulei. Asocierea unei cantități mari de antibiotic cu celula nu implică în mod obligatoriu prezența sa la situsul rezidenței agentului infecțios intracelular. Legarea extensivă a antibioticului de componentele celulei, diminuă activitatea sa antiinfecțioasă. Pe de altă parte, condițiile intracelulare nefavorabile (pH acid), pot modifica profilul activității antibioticului în raport cu concentrația: aminoglicozidele, quinolonele și macrolidele sunt mai puțin active la pH acid, iar la pH mic lizosomal sunt cel puțin parțial inactivate (Nix și colab., 1991).

Pentru determinarea gradului în care antibioticele pătrund în țesuturi s-au folosit mai multe metode. Un parametru esențial al evaluării nivelului în care antibioticul pătrunde în țesuturi este specificitatea tisulară, deoarece antibioticele nu se distribuie uniform în organism: de exemplu, un medicament se poate distribui într-o concentrație apropiată de cea serică în țesutul muscular striat, dar concentrația sa în nevrax, plămân sau prostată poate fi mult sub nivelul concentrației serice. Unele țesuturi sau fluide se echilibrează repede cu spațiul vascular, iar altele se echilibrează lent și pot acționa ca situsuri de depozit pentru antibiotice: de exemplu, rinichiul pentru aminoglicozide și țesutul osos pentru tetraciclină.Țesuturile cu echilibrare lentă în raport cu sistemul vascular mențin concentrații mari, mult timp după ce concentrația sanguină a antibioticului scade spre valoarea 0. Alte situsuri cu rol de depozit sunt lichidul ascitic pentru cefalosporine și lichidul interstițial pentru aminoglicozide.

Concentrația de antibiotic determinată într-un țesut depinde de metoda de măsurare. Evaluările sunt influențate de cantitatea de sânge în proba tisulară, de gradul de desicare a probei, de gradul de descompunere chimică a antibioticului în timpul prelucrării etc. Proba trebuie recoltată dintr-un singur tip de țesut și nu prin secționarea transversală a diferitelor straturi tisulare.Țesutul va fi excizat după încheierea fazei de distribuție a medicamentului (la 1-2 ore după administrarea dozei) și după ce a fost atinsă faza de echilibru dintre spațiul vascular și cel tisular. Condițiile tisulare măresc sau scad rata înglobării antibioticului: reacția inflamatorie modifică mediul fizico-chimic. In prostatita cronică, scăderea pH local diminuă penetrarea antibioticului. Modificările permeabilității vasculare influențează penetrarea și capacitatea antibioticului de a atinge situsurile infecției. In cazul meningitei acute, creșterea permeabilității capilare determină creșterea concentrației unor antibiotice (de exemplu, -lactami), în lichidul cefalorahidian (Darouiche și Hamill, 1994).

Metoda veche folosită pentru determinarea penetrării tisulare a unui medicament, presupune omogenizarea probei de țesut și măsurarea concentrației de antibiotic. Recuperarea medicamentului în supernatant este influențată din cauza legării sale de resturile celulare sau de pierderea medicamentului în timpul prelucrării probei. Antibioticele sunt transportate în grade variate în diferite tipuri de celule ale unui țesut și se leagă cu afinități diferite de componentele celulare. Metoda omogenizării probei de țesut sparge membranele celulare și rezultă o suspensie care conține lichidul intracelular, extracelular și compentele particulate ale celulei. Sângele din vasele țesuturilor reprezintă 3-6% din greutatea majorității probelor și este încorporat în omogenatul tisular. De aceea, trebuie estimată concentrația de antibiotic asociată eritrocitelor. Prezența sângelui în proba tisulară nu determină erori importante în estimarea cantitativă a -lactamilor, tetraciclinei sau aminoglicozidelor (Roberts și colab., 1979). Dintre medicamentele folosite în mod curent, sulfonamidele, iar dintre cele noi, ribavirina, se concentrează în eritrocite. Contaminarea cu sânge influențează semnificativ rezultatele analizei medicamentelor care au afinitate mare pentru eritrocite. Pentru medicamentele care se distribuie în mod egal în plasmă, celulele tisulare și eritrocite (tetraciclina, cloramfenicolul, unii -lactami), contaminarea cu sânge nu este o sursă importantă de erori.

Concentrația tisulară a antibioticului se exprimă îm g/gram de țesut.

Aminoglicozidele, -lactamii și quinolonele au fost studiate în ceea ce privește gradul de pătrundere tisulară, prin metoda omogenizării tisulare. Beta-lactamii sunt excluși din cele mai multe tipuri de celule. Ele pătrund în celule numai prin intermediul unui sistem membranar de transport: de exemplu, cefalosporina este transportată în țesutul renal. Concentrația acestor antibiotice se echilibrează în tot lichidul interstițial. După o singură doză, aminoglicozidele se aseamănă cu -lactamii: nu pătrund în celule, iar în lichidul interstițial concentrația este asemănătoare cu cea plasmatică. După doze multiple, aminoglicozidele se acumulează lent în interiorul celulei. Transportul intracelular al acestor antibiotice este un proces lent, datorită permeabilității scăzute a membranei și este unidirecțional, datorită legăturii cu afinitate înaltă care se formează cu mitocondriile și cu lizosomii. Aminoglicozidele translocate în celule sunt legate ferm și devin inactive față de agenții infecțioși. Ele sunt în mică măsură utile pentru tratamentul agenților patogeni cu localizare intracelulară. In țesuturi (mușchi, ficat), raportul concentrației aminoglicozidelor tisulare/serice este 2, dar se concentrează în rinichi, în proporție de 200/1. Mecanismul înglobării în celulele renale probabil este același ca și în celelalte organe, dar rata înglobării în țesutul renal este mult mai înaltă. Concentrațiile intracelulare mari duc la concluzia că antibioticele reacționează cu fosfolipidele, rezultatul fiind nefrotoxicitatea, factorul major al limitării dozelor.

Quinolonele se acumulează în interiorul celulei, în concentrații mai mari decât cele serice și rezultă concentrații relativ înalte în omogenatele tisulare. Cel puțin 60% din doza de quinolone este legată în interiorul celulelor. Legarea intracelulară a quinolonelor are aviditate mai mare și se concentrează la un nivel superior, dar este ușor reversibilă și din această cauză au un timp de înjumătățire de 10 ori mai scurt )Wolfson și Hooper, 1989). Distribuția intracelulară a quinolonelor este avantajoasă pentru tratamentul infecțiilor intracelulare, deoarece aminoglicozidele și -lactamii sunt excluse din situsurile de infecție intracelulară. Quinolonele sechestrate în celule constituie un rezervor prin care se prelungește expunerea bacteriilor în compartimentul extracelular.

Vancomicina și teicoplanina pătrund în cele mai multe tipuri de celule și se concentrează în rinichi. Raportul normal al concentrației tisulare/serică este aproximativ 1. Ambele, dar în special teicoplanina, se leagă de țesuturi și se acumulează prin dozare multiplă, asemănător aminoglicozidelor (Tuazon și Miller, 1984). Vancomicina și teicoplanina sunt molecule mari și se elimină numai prin filtrare glomerulară.

Cloramfenicolul, rifampina și macrolidele, ca eritromicina și azitromicina se comportă asemănător quinolonelor. Ele pătrund reversibil în celule, dar spre deosebire de quinolone, sunt metabolizate într-o proporție importantă.

Colistina, polimixina și amfotericina manifestă o cinetică a legării tisulare și o toxicologie asemănătoare aminoglicozidelor. Ele intră lent în celule, dar afinitatea înaltă de legare intracelulară face ca intervalul de înjumătățire să fie mai mare.

Unele bacterii sunt fagocitate și persistă în macrofage sau în leucocite, dar de cele mai multe ori infecțiile tisulare rezidă în special în spațiul tisular extracelular.

-lactamii și aminoglicozidele sunt excluse din celulele intacte și rămân în sânge și în lichidul interstițial.

In unele situsuri, concentrația antibioticului nu se supune principiului difuziei libere: urina, secreția biliară. Concentrația antibioticelor este determinată de transportul activ. Alte situsuri – umoarea apoasă sau lichidul cefalorahidian, au bariere de permeabilitate. In general, cele 3 clase de antibiotice (-lactami, aminoglicozide, quinolone) se acumulează în urină și toate sunt eliminate prin filtrare glomerulară și/ sau secreție tubulară renală. Unele antibiotice -lactamice sunt concentrate în secreția biliară.

S-au demonstrat corelații directe între concentrațiile serice ale antibioticelor (aminoglicozide, -lactami și quinolone) și eficiența față de infecțiile tisulare. La unele antibiotice, raportul este independent de gradul de legare de proteinele serice. Efectele primare ale legării de proteine sunt încetinirea excreției și reducerea volumului de distribuție tisulară.

Legarea antibioticelor de proteinele serice este un parametru important care condiționează activitatea lor antiinfecțioasă. Concentrația serică a antibioticelor este rezultatul net al legării atât de proteinele serice, cât și de țesuturi. Principalul suport molecular al legării antibioticelor este albumina sanguină și extravasculară.

Deși aminoglicozidele sunt legate în proporție neglijabilă de proteinele serice, legarea poate fi întreruptă de concentrațiile mari de cationi bivalenți. Cationii bivalenți au efect antagonic față de activitatea lor antibacteriană.

Quinolonele se leagă în proporție de până la 40% de proteinele serice, iar pentru antibioticele -lactamice, legarea de proteinele serice este foarte semnificativă.

Biofilmul este o populație de celule care crește pe o suprafață și sunt incluse într-o matrice polizaharidică (Costerton, 1999). Infecțiile organizate în biofilme sunt greu de eradicat și sunt sursa infecțiilor rezistente. Biofilmele se formează in vivo, ca rezultat al aderenței microorganismelor de un substrat anatomic și sunt specifice infecțiilor bacteriene și cu Candida albicans.

Biofilmele sunt cu greu eradicate prin acțiunea bactericidă a substanțelor antimicrobiene. Substanțele antimicrobiene difuzează în biofilm și inhibă creșterea sa. Majoritatea celulelor sunt supuse acțiunii ‘‘cide’’ a agenților antimicrobieni, dar o mică proporție rămân viabile (Donlan și Costerton, 2002).

Cauzele rezistenței biofilmelor. Factorii determinanți ai rezistenței biofilmelor sunt : penetrarea limitată a substanțelor antimicrobiene în biofilm, rata scăzută de creștere a populației bacteriene și posibila expresie a genelor de rezistență.

Penetrarea antibioticelor în biofilm este limitată, deoarece celulele sunt incluse într-o matrice exopolizaharidică, ce poate să limiteze difuzia substanțelor și chiar să le lege. Bariera de difuzie este eficientă față de moleculele proteice mari, așa cum sunt lizozimul și proteinele complementului, sau față de peptidele antimicrobiene din categoria defensinelor. Exopolizaharidele încărcate cu o sarcină electrică negativă sunt foarte eficiente ca barieră protectoare față de antibioticele aminoglicozidice încărcate pozitiv.

Difuzia restrictivă poate limita penetrarea unui agent antimicrobian degradabil sub acțiunea unor enzime hidrolitice de tipul -lactamazelor. Efectul sinergic al difuziei lente și al inactivării enzimatice oferă rezistență eficientă biofilmelor cu Ps. aeruginosa.

Inactivarea sau modificarea antibioticului (acetilarea aminoglicozidelor), asociată cu bariera de difuzie în biofilm creează condiții de protecție a bacteriilor biofilmului: bariera polizaharidică de difuzie protejează celulele biofilmului de acțiunea H2O2. Astfel, celulele planctonice de Ps. aeruginosa sunt mult mai sensibile decât cele din biofilm, deși acestea produc cantități mai mici de catalază, iar rezistența biofilmului la cloramfenicol se datorează atât unei rate de difuzie lentă cât și inactivării enzimatice sub acțiunea cloramfenicol acetil-transferazei (CAT).

Experimental, s-a demonstrat că în cele mai multe cazuri care implică molecule antimicrobiene mici, bariera polizaharidică nu oferă o protecție efectivă, ci doar întârzie moartea celulei. Cele mai eficiente sunt fluoroquinolonele, deoarece difuzează ușor în biofilm și stopează creșterea celulelor (Rediske și colab., 1999).

Bariera biofilmului și inactivarea enzimatică nu creează condițiile creșterii celulelor, ci doar ale supraviețuirii.

Rata scăzută de creștere a celulelor bacteriene este un factor favorizant al supraviețuirii celulelor în biofilm, după tratamentul cu antibiotice. Unele antibiotice își exercită efectul letal numai asupra celulelor care cresc. Penicilina și ampicilina nu sunt active față de celulele care nu cresc. Cefalosporina, aminoglicozidele și fluoroquinolonele pot omorî celulele care nu cresc, dar au un efect letal față de celulele care se divid. Creșterea lentă este un factor major pentru creșterea rezistenței celulelor planctonice staționare.

Majoritatea celulelor dintr-un biofilm nu manifestă o rezistență superioară celulelor planctonice și mor repede sub acțiunea unui antibiotic bactericid. Acțiunea substanțelor antimicrobiene bactericide asupra celulelor planctonice și din biofilm, este bifazică. Intr-o primă etapă se produce moartea majorității celulelor. Populația de celule persistente, restrânsă numeric, este rezistentă la doza inițială, dar este sensibilă la o doză superioară. Biofilmul produce mai multe celule persistente decât o populație planctonică. Antibioticele inhibitoare ale creșterii favorizează supraviețuirea și persistența celulelor planctonice și din biofilm. Scăderea amplă a numărului de celule, planctonice sau din biofilm, are efecte benefice: celulele persistente devin ținta efectorilor imunitari și infecția este eradicată.

Persistența celulelor bacteriene creează probleme clinice ample în cazul în care funcția imunitară nu cooperează cu acțiunea antibioticelor (fig. 55). De exemplu, Str. pneumoniae produce meningita rezistentă datorită inaccesibilității componentelor sistemului imunitar la lichidul cefalorahidian.

Figura 55. Ilustrarea schematică a mecanismului persistenței biofilmelor. Antibioticele sunt active asupra celulelor bacteriene planctonice (cercuri negre și albe) și ale biofilmului. In biofilm, celulele persistente (cercuri albe) sunt inaccesibile efectorilor imunitari și refac populația biofilmului (original).

Compartimentul gastric este de asemenea, lipsit de factori imunitari și infecțiile cu Helicobacter pylori, care produc ulcere peptice (ulcere care nu se datorează mediului acid), sunt foarte rezistente. Mediul gastric necesită sterilizare completă pentru a împiedica recidiva.

Infecțiile cu biofilme sunt, din punctul de vedere al inaccesibilității efectorilor imunitari, asemănătoare cu infecțiile produse de celulele libere, în absența efectorilor imunitari, deoarece exopolimerul biofilmului protejează fizic celulele de accesul factorilor protectori. După prima doză a unui antibiotic bactericid, este eliminată cea mai mare parte a populației celulare. O proporție foarte mică a celulelor infecțioase sunt persistente. Dacă simptomele dispar odată cu eradicarea celulelor libere (planctonice) și terapia este oprită, celulele persistente vor reface populația biofilmului, din care se vor desprinde noi celule planctonice. Această dinamică explică natura recurentă (recidivantă) a infecției sub forma biofilmului și necesitatea unei terapii îndelungate cu antibiotice.

Infecțiile sub forma biofilmelor reprezintă peste 60% din totalul infecțiilor bacteriene, deoarece infecțiile comune ale tractului urinar (cauzate de E. coli și de alți patogeni), infecțiile de cateter (produse de S. aureus și alți patogeni Gram pozitivi), infecțiile urechii medii la copii (produse de H. influenzae), formarea plăcii dentare și gingivita, toate cauzate de biofilme, sunt greu de tratat și adeseori recurente. Alte infecții de biofilm produc morbiditate și mortalitate: endocardita cauzată de S. aureus, infecțiile implantelor permanente (protezele articulare și valvele cardiace, produse de S. aureus) și infecțiile pacienților cu fibroză chistică, produse de Ps. aeruginosa).

Incidența celulelor persistente după acțiunea antibioticelor este de circa 10-6. Bigger (1944) citat de Olson și colab., 2002) a explicat persistența bacteriană prin două ipoteze: a) celulele persistente au o rezistență mai mare la antibiotic; b) celulele persistente au același grad de sensibilitate ca și masa celulară a biofilmului, dar se găsesc într-o stare fiziologică în care efectul bactericid al antibioticului nu se produce. După reluarea creșterii, celulele persistente refac populația, care nu se distinge de cea originală în ceea ce privește sensibilitatea la antibiotic. Factorii care favorizează persistența nu se cunosc, dar sunt celule importante, deoarece au rol esențial în supraviețuirea populației celulare. Celulele persistente nu sunt mutante, ci sunt celule comune ale biofilmului, care, prin mecanisme necunoscute, depășesc faza critică a efectului bactericid.

O explicație nouă a persistenței este derivată din studiile referitoare la moartea programată a celulei eucariote. Celulele bacteriene care suferă efecte grave ale acțiunii factorilor bactericizi, ar activa programul morții celulare. Raționamentul este același cu cel formulat pentru moartea celulelor eucariote. De cele mai multe ori, moartea celulară este rezultatul apoptozei, indusă de leziunile provocate de factori toxici. Antibioticele bactericide nu ar produce moartea celulară, ci numai leziuni declanșatoare ale sinuciderii. Comunitatea biofilmului se aseamănă cu un organism multicelular, deoarece manifestă unele trăsături funcționale care sugerează un grad redus de integrare funcțională. Biofilmul ar beneficia din moartea apoptotică a celulelor lezate, asemenea unui organism pluricelular. Antibioticul difuzează uniform în masa biofilmului și tinde să lezeze toate celulele, riscul fiind dispariția asociației. Celulele persistente ar fi acelea care nu activează programul morții și supraviețuiesc după ce antibioticul atinge întreaga populație celulară.

Pentru eradicarea biofilmelor, asocierea rifampicinei și minociclinei este foarte eficientă și reduce probabilitatea colonizării bacteriene. Încorporarea profilactică a antibioticului în materialul cateterelor va împiedica bacteriile rezistente să colonizeze cateterele impregnate. Metoda se poate aplica pentru cateterele pe termen scurt, dar nu poate fi la fel de eficientă pentru articulațiile artificiale sau pentru valvele cardiace.

Bibliografie selectivă

Bush K., Beta-lactamase inhibitors from laboratory to clinic, Clinical Microbiology Reviews. 1988, 1(1): 109-123.

Challis G.L., Hopwood D.A., Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species, Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100:14555–14561 Suppl 2

Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P., Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections, Science. 1999, 284:318–322.

Darouiche R.O., Hamill R.J., Antibiotic penetration of and bactericidal activity within endothelial cells, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(5): 1059-1064.

Donlan R.M., Costerton J.W., Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.Clinical Microbiology Reviews. 2002, 15(2): 167-193.

Eliopoulos G.M., Eliopoulos C.T., Antibiotic combinations: should they be tested?, Clinical Microbiology Reviews. 1988, 1(2): 139-156.

Eliopoulos G.M., Wennersten C., Zighelboim-Daum S., Reiszner E., Goldmann D., Moellering R.C. Jr., High-level resistance to gentamicin in clinical isolates of Streptococcus (Enterococcus) faecium, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1988, 32(10): 1528-1532.

Korzeniowski O.M., Wennersten C., Moellering R.C. Jr., Sande M.A., Penicillin-netilmicin synergism against Streptococcus faecalis, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1978, 13(3): 430-434.

Labro M.T., Interference of Antibacterial Agents with Phagocyte Functions: Immunomodulation or “Immuno-Fairy Tales”?, Clinical Microbiology Reviews. 2000, 13(4): 615-650.

Nix D., Goodwin D., Peloquin C.A., Rotella D.L., Schentag J.J., Antibiotic tissue penetration and its relevance: model of tissue penetration and their meaning, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991, 35(10): 1947-1952.

Olson M.E., Ceri H., Morck D.W., Buret A.G., Read R.R.., Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics, Canadian Journal of Veterinary Research. 2002, 66(2): 86-92.

Rediske A.M., Roeder B.L., Brown M.K., Nelson J.L., Robison R.L., Draper D.O., Schaalje G.B., Robison R.A., Pitt W.G., Ultrasonic Enhancement of Antibiotic Action on Escherichia coli Biofilms: an In Vivo Model, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(5): 1211-1214.

Roberts T.L. 3rd, Futrell J.W., Sande M.A., Antibiotic penetration into normal and inflamed tissues as reflected by peripheral lymph, Annals of Surgery. 1979, 189(4): 395-403.

Siami G., Christou N., Eiseman I., Tack K.J., the Clinafloxacin Severe Skin And Soft Tissue Infections Study Group, Clinafloxacin versus Piperacillin-Tazobactam in Treatment of Patients with Severe Skin and Soft Tissue Infections, Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2001, 45(2): 525-531.

Tuazon C.U., Miller H., Comparative in vitro activities of teichomycin and vancomycin alone and in combination with rifampin and aminoglycosides against staphylococci and enterococci, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984, 25(4): 411-412.

Wolfson J.S., Hooper D.C., Fluoroquinolone antimicrobial agents, Clinical Microbiology Reviews. 1989, (4): 378-424.

Capitolul 8

SUBSTANȚE NATURALE CU ACTIVITATE IMUNOSUPRESOARE

In perioada timpurie a transplantării, imunosupresia s-a limitat la tratamentul combinat cu azatioprină și corticosteroizi. Eficiența lor este limitată, neselectivă și produc numeroase efecte secundare.

Progresele biologiei celulare cu privire la mecanismele propagării semnalelor intracelulare, precum și studiul chimiei unor compuși naturali a evidențiat faptul că multe produse sintetizate de diferite organisme au afinitate înaltă pentru proteinele celulare care au funcția de transductori ai semnalului. Un grup de compuși naturali care interferă cu semnalizarea intracelulară sunt agenții cu efect imunosupresor: ciclosporina A, FK506 (tacrolimus) și rapamicina (sirolimus). Cei 3 compuși suprimă răspunsul imun, deoarece blochează activarea limfocitelor T și de aceea sunt folosite în clinică pentru a preveni respingerea grefelor de organe.

8.1. Ciclosporina

Ciclosporina A este un antibiotic descoperit în 1971, sintetizată de fungii filamentoși Tolypocladium inflatum, în cultură submersă, de unde se extrage cu solvenți organici. Este bogată în aminoacizi hidrofobi, neutri, insolubilă în n-hexan și apă, dar foarte solubilă în toți ceilalți solvenți organici.Inițial, antibioticul a fost investigat pentru proprietățile antifungice, dar spectrul activității sale este foarte îngust, ceea ce a determinat renunțarea la utilizarea în clinică. Acțiunea sa inhibitorie, in vitro, s-a demonstrat pentru Neurospora crassa, Rhodotorula rubra. Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, rezultat prin condensarea a 11 aminoacizi.

Mecanismul de acțiune

Mecanismul acțiunii antifungice se datorează inhibiției sintezei peretelui celular, în special blocării sintezei chitinei. Un alt antibiotic blocant al sintezei chitinei – polioxina – are un spectru de acțiune la fel de îngust. Ciclosporina inhibă selectiv proliferarea limfocitelor, dar, spre deosebire de alte citostatice, nu modifică rata diviziunii altor celule somatice (Fruman și colab., 1992). In vitro, ciclosporina este de 300 de ori mai activă ca inhibitor al celulelor limfoide splenice, decât al celulelor mastocitoma (nelimfoide). Dozele mari, administrate experimental timp de 13 săptămâni la șobolan, produc toxicitate renală și hepatică. Nefrotoxicitatea este asociată cu depozite mucoide în arteriole, fibroză focală stimulată de vasoconstricție.

Structura moleculară a ciclosporinei

Ciclosporina a fost primul medicament imunosupresor, care a permis imunomodularea selectivă a celulelor T, în condițiile unui grad moderat de toxicitate și a schimbat perspectiva transplantului de organe: a scăzut morbiditatea și a permis transplantul de rutină. În prezent, se folosește pentru prevenirea respingerii grefelor de rinichi, ficat, cord, plămân și a transplantului combinat cord-plămân. Majoritatea pacienților cu transplant necesită tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresor, care cresc sensibilitatea la infecții și malignități, permițând însă supraviețuirea pacienților transplantați, timp de ani de zile. Ciclosporina acționează specific asupra limfocitelor, inhibând transcrierea genică pe o cale dependentă de Ca2+, adică blochează progresia ciclului celular de la G0 la G1, prin legarea cu mare afinitate de o ciclofilină, proteină celulară ubicvitară. Complexul ciclosporină-ciclofilină leagă și blochează funcția enzimatică a calcineurinei, o fosfatază, care are rolul de a defosforila un component citoplasmatic al factorului nuclear al celulelor T activate (NF-ATc) (June și colab., 1987; Marchetti și colab., 2000). Factorul nuclear al limfocitelor B activate este un mesager activator comun al transcrierii în celulele eucariote, denumit NF-kB, fiind descris (în 1986) ca un factor nuclear necesar transcrierii catenei k a imunoglobulinelor în limfocitele B și de aici denumirea de nuclear factor k al celulelor B. In celulele B mature, NF-kB este localizat în nucleu, unde se leagă de o secvență de 10 pb a genei codificatoare a catenei k și activează transcrierea. NF-kB preexistă în citoplasmă într-o formă inactivă, legată de un inhibitor (IkB). După primirea unui semnal, factorul NF-kB este eliberat din asociația cu IkB și transferat spre nucleu, unde activează transcrierea genei specifice. Deoarece se activează numai ca răspuns la un stimul, are statutul funcțional de factor inductibil. Pentru activarea sa, nu necesită sinteză proteică și permite transmiterea rapidă a semnalului. NF-kB realizează comunicarea între citoplasmă și nucleu și transmite mesajul direct la gena țintă. Toate genele care răspund la NF-kB au în comun faptul că amplifică răspunsul imun.Nf-kB este mediatorul care semnalează activarea celulelor limfoide ca răspuns la numeroase citochine produse de celulele imunitare : IL-2, IL-1, IL-6, IL-8, TNF, interferoni etc. Consecința inactivării calcineurinei este menținerea stării fosforilate al NF-ATc. Astfel, transferul în nucleu al componentei citoplasmatice a factorului NF-ATc este blocat și factorul nuclear (NF-ATn) nu se mai formează (fig. 56).

Ciclosporina A și FK506 blochează căile de semnalizare ale altor sisteme celulare, cum ar fi: degranularea dependentă de Ca2+ a mastocitelor; în condiții fiziologice, complexul NF-ATc-NF-ATn se leagă de promotorul genei IL-2 și este factorul stimulator în special al transcrierii ARNm IL-2, necesară activării celulelor T. Complexul NF-ATc-NF-ATn stimulează transcrierea ARNm al altor citochine (IFN ), cu rol esențial în activarea macrofagelor. Sub acțiunea ciclosporinei, celulele T nu mai sintetizează IL-2 sau IFN .

Ciclosporina este un agent imunosupresor selectiv, deoarece acționează asupra celulelor Th1, dar este mai puțin eficientă față de subpopulațiile de limfocite Th2 care produc IL-4, IL-5, IL-7, sau față de limfocitele B, granulocite sau macrofage (Loertscher și colab., 1992; Morikawa și colab., 1994). Imunosupresia cu ciclosporină este o modalitate imunofarmacologică, datorită acțiunii sale selective față de celulele imunocompetente. Deoarece nu inhibă semnificativ limfocitele B, ciclosporina este mai puțin eficientă ca blocant al sintezei anticorpilor. Anticorpii specifici față de antigenele donorului sunt implicați în nefropatia cronică a receptorului de grefă. Ciclosporina stimulează sinteza TGF- (Transforming Growth Factor), inductor al fibrozării rinichiului transplantat (Stepkowski, 2000). Inhibitorii metabolici au acțiune selectivă asupra celulelor T proliferante: inhibă maturarea limfocitelor T din precursori imaturi și omoară celulele T mature proliferante, stimulate de aloantigene.

Figura 56. Ilustrarea schematică a mecanismelor de acțiune a ciclosporinei și FK506 (tacrolimus). Ciclosporina formează un complex stabil cu ciclofilina și o inactivează. In absența ciclofilinei libere, calcineurina nu defosforilează componenta citoplasmatică a factorului activator al limfocitelor T, care rămâne în citoplasmă. Nu se mai asamblează factorul activ nuclear (NF-Atn) al limfocitelor T. FK506 are un mecanism de acțiune asemănător: formează un complex stabil cu o proteină (FKBP) și blochează activitatea de defosforilază a calcineurinei;CsA – ciclosporina; CaN – calcineurina; CpN = ciclofilina; NF-ATc – factorul nuclear de activare a celulelor T (componenta citoplasmatică); NF-ATn factorul nuclear de activare a celulelor T (componenta nucleară); IL-2 – Interleukina 2; FK506 – Tacrolimus; FKBP – proteina de legare a FK506 (după Stepkowski, 2000).

In ultimii ani s-au identificat câțiva compuși chimici naturali, izolați ca și ciclosporina, din culturi de microorganisme: tacrolimus, rapamicina, mizoribina și spergualin (Bierer și colab., 1992). Primii doi sunt înrudiți structural, ambii fiind lactone macrociclice, dar mecanismele de acțiune sunt diferite.

8.2. Tacrolimus (FK506)

Tacrolimus este o lactonă macrociclică lipofilă, produsă de Streptomyces tsukabaensis, cu mecanism de acțiune asemănător cu al ciclosporinei, dar de circa 100 de ori mai puternică. Face parte din clasa macrolidelor și este înrudit cu unele antibiotice. Tacrolimus este un agent imunosupresor tot mai utilizat în clinica de transplantare, ca o alternativă la ciclosoporină, în special în cazurile de respingere refractare la ciclosporină (Banerji și colab., 1991). Absorbția digestivă și farmacocinetica prezintă o mare variabilitate intra- și interindividuală. Efectele secundare sunt asemănătoare celor produse de ciclosporină, dar neurotoxicitatea și diabetogeneza sunt mai frecvente.

Structura moleculară a tacrolimus

Mecanismul de acțiune

Tacrolimus este lipofil și traversează membrana celulelor sistemului imunitar. Deși are o structură chimic diferită, mecanismul de acțiune este asemănător cu acela al ciclosporinei (Pahl și colab., 1992). Ambii aparțin categoriei imunosupresorilor cunoscuți ca inhibitori ai calcineurinei. Ambii compuși se leagă cu proteine citoplasmatice receptoare specifice din categoria imunofilinelor: ciclofilina, respeciv FK-BP (binding protein). Imunofilinele sunt molecule care au rol de receptori pentru o familie de agenți imunosupresori, care includ ciclosporina, tacrolimus (FK506) și rapamicina. Complexul FK-BP leagă calcineurina. Din acest punct, mecanismul său de acțiune este comun cu acela al ciclosporinei. Efectul net este inhibiția propagării semnalului celular declanșat de IL-2 și inhibiția expansiunii clonale a celulelor T citotoxice și a altor celule implicate în respingerea acută a grefei (Dubois și colab., 2003).

Atât ciclosporina cât și tacrolimus sunt metabolizați în ficat și se consideră că interacționează într-un mod asemănător cu alte medicamente care interferă cu calea lor de metabolizare. Deoarece mecanismul acțiunii ciclosporinei A și tacrolimus este același, cei doi compuși nu se pot administra simultan (Sho și colab., 2002). Toxicitatea celor două antibiotice este asemănătoare, dar tacrolimus produce hiperglicemie și neurotoxicitate mai accentuate. Tacrolimus produce mai puțin hirsutism, hipertrofie gingivală și ginecomastie.

Ciclosporina și tacrolimus nu rezolvă problema transplantului. Obstacolul principal în calea grefelor este respingerea cronică, ce se caracterizează prin fibroză, deoarece ambii agenți stimulează sinteza TGF-, care, la rândul său, stimulează dezvoltarea unei fibroze interstițiale (Hultsch și colab., 1992). Consecința este pierderea structurii normale a organului grefat, într-o perioadă de ordinul anilor. Fibroza a rămas cauza majoră a pierderii alogrefei, pe măsură ce controlul respingerii acute s-a ameliorat. Frecvent se produce ocluzia arterială a grefei, ca rezultat al proliferării celulelor musculare netede ale intimei. Este procesul de arterioscleroză a grefei, detectabil în alogrefele cardiace sau renale, în intervalul de 6 – 12 luni după grefare. Majoritatea pacienților cu transplant necesită tratamentul pe termen lung, cu doze mari de imunosupresoare, care măresc sensibilitatea la infecție și malignitate (Todo și colab, 1994; Steinbach și colab., 2004). Ciclosporina permite supraviețuirea pacienților transplantați timp de ani de zile.

8.3. Rapamicina

Rapamicina (cunoscută sub denumirea de sirolimus), un antibiotic macrolid produs de Streptomyces hygroscopicus, a fost introdusă în clinica transplantării în 1999. Din punct de vedere chimic, rapamicina este o lactonă macrociclică. Inițial, a fost descrisă ca un agent antifungic (Calvo și colab., 1992). Sirolimus este un agent imunosupresor, de 10-100 de ori mai activ decât ciclosporina A în prevenirea respingerii alogrefelor vascularizate. Efectul său principal constă în inhibiția proliferării celulelor T, prin blocarea trecerii de la faza G1 la faza S.

Structura moleculară a rapamicinei (Sirolimus)

Sirolimus se leagă, ca și tacrolimus, cu aceiași proteină citoplasmatică (FK-BP) (binding protein), dar efectul său este diferit: inhibă diferite căi de transmitere a semnalelor mediate de legarea antigenului sau de citochine.Ținta sa este o fosfatidilinozitol 3-kinază, al cărei rol este activarea unei kinaze a proteinei ribosomale S6 (S = small). Sirolimus inhibă progresia celulelor T din faza G1 în faza S a ciclului celular (Brown și colab., 2003). Este un inhibitor mult mai eficient al sintezei anticorpilor decât ciclosporina și tacrolimus. Sirolimus are acțiune sinergică în asociație cu ciclosporina și prednisonul și reduce net incidența respingerii acute.

Efectele secundare majore constau în mielosupresie și hipertrigliceridemie, sugerând un posibil rol în inhibiția activității lipoprotein-lipazei și în scăderea numărului de plachete și mai puțin semnificativă, a numărului de leucocite.

8.4. Micofenolat-mofetil (MMF)

Micofenolat-mofetil, esterul 2-morfolinoetil al acidului micofenolic, este cel mai nou și cel mai folosit medicament din această clasă. Este sintetizat de tulpini ale g. Penicillium și a fost introdus în clinica transplantării în 1995.

Structura moleculară a micofenolat-mofetilului (MMF)

In ficat, micofenolat-mofetil este metabolizat prin hidroliză, la metabolitul activ, acidul micofenolic. O parte importantă este conjugat în ficat cu gluconatul și este secretat în bilă și revine în ficat prin circuitul enterohepatic.

Mecanismul de acțiune al MMF este mai selectiv, deoarece inhibă calea sintezei purinelor, dar calea secundară (’’de salvare’’) rămâne funcțională. Este un inhibitor necompetitiv al unei izoforme specifice pentru limfocite, a inozin-monofosfat-dehidrogenazei (IMPDH), necesară sintezei de novo a nucleotidelor cu guanină în faza S a ciclului celular. Limfocitele sintetizează nucleotide de novo, prin conversia 5-fosforibozil-1 fosfatului, la inozin monofosfat (IMP). IMP este convertit la guanozin-monofosfat (GMP), pe calea IMPDH (Sollinger și colab., 1992). Pe calea secundară (calea ‘‘de salvare’’), guanina este convertită la GMP, de către enzima HGPRT (Hipoxantin-Guanozin-Fosfo-Ribozil-Transferază). MMF diminuă concentrația deoxi-guanozin-trifosfatului și inhibă sinteza ADN, inhibă proliferarea limfocitelor, fibroblastelor, celulelor endoteliale și a celulelor musculare netede din peretele arterelor.

Efectele secundare se manifestă, uneori, la nivelul tractului digestiv și sunt dependente de doză: diaree, stare de rău general, vomă. Deși acțiunea sa este relativ specifică asupra limfocitelor, leucopenia, anemia și trombocitopenia pot să însoțească administrarea dozelor mari.

Ciclosporina, tacrolimus și sirolimus fac parte din cea de a doua generație de inhibitori selectivi ai limfocitelor T. Ciclosporina și tacrolimus sunt nefrotoxice, iar sirolimus induce hipertrigliceridemie.

Cea de a III-a generație de agenți imunosupresori au acțiune foarte selectivă, nu sunt toxici și nu produc alte efecte colaterale: sunt imunospresorii anti-sens, oligonucleotide scurte de 16-22 nucleotide antisens, cu secvență complementară ARNm țintă. Legarea oligonucleotidului de ARNm inhibă sinteza proteinei și blochează funcția celulei.

Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranței, în special în transplant, adică va permite sistemului imunitar să adopte ca self, moleculele CMH specifice țesutului grefat.

Bibliografie selectivă

Banerji SS, Parsons JN, Tocci MJ.The immunosuppressant FK-506 specifically inhibits mitogen-induced activation of the interleukin-2 promoter and the isolated enhancer elements NFIL-2A and NF-AT1.Molecular Cell Biology. 1991, 11(8): 4074-4087.

Bierer B.E., Mattila P.S., Standaert R.F., Herzenberg L.A., Burakoff S.J., Crabtree G., Schreiber S.L., Two distinct signal transmission pathways in T lymphocytes are inhibited by complexes formed between an immunophilin and either FK506 or rapamycin, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1990, 87(23): 9231-9235.

Brown V.I., Fang J., Alcorn K., Barr R., Kim J.M., Wasserman R., Grupp S.A., Rapamycin is active against B-precursor leukemia in vitro and in vivo, an effect that is modulated by IL-7-mediated signaling, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America..2003, 100(25): 15113-15118.

Calvo V., Crews C.M., Vik T.A., Bierer B.E.., Interleukin 2 stimulation of p70 S6 kinase activity is inhibited by the immunosuppressant rapamycin, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, 89(16): 7571-7575.

Dubois S., Shou W., Haneline L.S., Fleischer S., Waldmann T.A., Müller J.R., Distinct pathways involving the FK506-binding proteins 12 and 12.6 underlie IL-2-versus IL-15-mediated proliferation of T cells, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003, 100(24): 14169–14174.

Fruman D.A., Klee C.B., Bierer B.E., Burakoff S.J., Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992, 89(9): 3686-3690.

Hultsch T., Martin R., Hohman R.J.,The effect of the immunophilin ligands rapamycin and FK506 on proliferation of mast cells and other hematopoietic cell lines, Molecular Cell Biology. 1992, 3(9): 981-987.

June C.H., Ledbetter J.A., Gillespie M.M., Lindsten .T, Thompson C.B., T-cell proliferation involving the CD28 pathway is associated with cyclosporine-resistant interleukin 2 gene expression, Molecular Cell Biology. 1987, 7(12): 4472-4481.

Loertscher R., Blier L., Steinmetz O., Nohr C., The utility of cyclosporine weaning in renal transplantation, Annals of Surgery. 1992, 215(4): 368-376.

Marchetti O., Entenza J.M., Sanglard D., Bille J., Glauser M.P., Moreillon P., Fluconazole plus Cyclosporine: a Fungicidal Combination Effective against Experimental Endocarditis Due to Candida albicans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2000, 44(11): 2932-2938.

Morikava K., Oseko F., Morikawa S., Iwamoto K., Immunomodulatory effects of three macrolides, midecamycin acetate, josamycin, and clarithromycin, on human T-lymphocyte function in vitro, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994, 38(11): 2643-2647.

Pahl A., Keller U., FK-506-binding proteins from streptomycetes producing immunosuppressive macrolactones of the FK-506 type, Journal of Bacteriology. 1992, 174(18): 5888-5894.

Sho M., Sandner S.E., Najafian N., Salama A.D., Dong V., Yamada A., Kishimoto K., Harada H., Schmitt I., Sayegh M.H., New Insights Into the Interactions Between T-Cell Costimulatory Blockade and Conventional Immunosuppressive Drugs, Annals of Surgery. 2002, 236(5): 667-675.

Sollinger H.W., Belzer F.O., Deierhoi M.H., Diethelm A.G., Gonwa T.A., Kauffman R.S., Klintmalm G.B., McDiarmid S.V., Roberts J., Rosenthal J.T., RS-61443 (mycophenolate mofetil). A multicenter study for refractory kidney transplant rejection, Annals of Surgery. 1992, 216(4): 513-519

Stepkowski, Stanislaw M. Molecular targets for existing and novel immunosuppressive drugs, Expert reviews in molecular medicine. 2000.

Steinbach W.J., Schell W.A., Blankenship J.R., Onyewu C., Heitman J., Perfect J.R., In Vitro Interactions between Antifungals and Immunosuppressants against Aspergillus fumigatus, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48(5): 1664-1669.

Todo S., Fung J.J., Starzl T.E., Tzakis A., Doyle H., Abu-Elmagd K., Jain A., Selby R., Bronsther O., Marsh W., Single-center experience with primary orthotopic liver transplantation with FK 506 immunosuppression, Annals of Surgery. 1994, 220(3): 297-309.

Capitolul 9

BACTERIOCINE

Bacteriocinele sunt proteine antibacteriene cu specificitate înaltă de acțiune, produse de anumite tulpini bacteriene. Activitatea lor este limitată la unele tulpini ale aceleiași specii. Spectrul de activitate restrâns al bacteriocinelor le exclude din categoria antibioticelor clasice. Totuși, sunt agenți antibacterieni foarte eficienți și deși nu au valoare terapeutică, faptul că sunt sintetizate de numeroase specii și produc efecte foarte specifice, a determinat interesul cercetătorilor. Bacteriocinogeneza este un fenomen la fel de frecvent în natură ca și lizogenia. Cele două procese au câteva trăsături comune :

– identificarea tulpinilor bacteriocinogene se face prin cultivarea mixtă a unui număr mic de bacterii presupuse a fi producătoare de bacteriocine (B+), cu un exces de celule ale tulpinilor indicatoare sensibile;

– prin acoperirea coloniilor B+ crescute pe plăci, cu o tulpină indicatoare.

In ambele cazuri, după incubarea pentru 24 de ore, coloniile B+ sunt înconjurate de zone clare de inhibiție. Sinteza bacteriocinelor este codificată de elemente genetice extracromosomale, denumite plasmide "col’’. Denumirea veche a bacteriocinelor este aceea de colicine, atribuită unor substanțe cu proprietăți antibiotice produse de o tulpină virulentă de E. coli, care au efect letal asupra celulelor producătoare, precum și a unor tulpini strâns înrudite cu cea producătoare. Fenomenul de colicinogeneză a fost descoperit de Gratia (l925) (Zarnea, 1990). Producerea colicinelor nu este limitată la E. coli, ci este un fenomen mult mai răspândit în lumea bacteriilor și din acest motiv, Jacob (l953) a dat denumirile de bacteriocine, bacteriocinogeneză și factori bacteriocionogeni, pentru a desemna substanțele, fenomenul și respectiv plasmidele care controlează producerea lor. Denumirile diferitelor bacteriocine provin de la numele genului sau al speciei bacteriei producătoare, la care se adaugă sufixul “cină”: de exemplu, lactocine (produse de Lactobacillus), vibriocine (produse de Vibrio), respectiv pesticine (produse de Yersinia pestis), megacine (produse de B. megatherium), subtilicine (produse de B. subtilis) etc. Plasmidele (factorii “Col”) au aceleași particularități, comune altor plasmide: sunt molecule de ADN, circulare, dublu catenare închise, suprahelicale. La E. coli, în mod obișnuit se găsesc 5-25 de copii/celulă. Unele plasmide “Col” (de exemplu, Col E1) au funcție de conjugon, deoarece poartă în structura lor genetică, determinanții genetici de transfer. Ele se pot transfera la tulpinile col-, prin conjugare. Plasmidele Col tra- se transferă prin transformare genetică, transducție fagică sau prin conjugare inițiată de alte plasmide cu funcție de conjugoni. De cele mai multe ori, bacteriocinele sunt proteine pure. La bacteriile Gram negative, bacteriocinele sunt asociate cu lipopolizaharide de origine parietală, dar activitatea de bacteriocină este asociată totdeauna cu componenta proteică, cu o gr. mol. de l8-90 kDa.

Bacteriocinele produse de bacteriile Gram negative au câteva proprietăți generale:

– au un spectru de acțiune foarte îngust, limitat la tulpina producătoare și la altele strâns înrudite;

– acțiunea lor este bactericidă. O singură moleculă poate fi suficientă pentru a produce liza celulei sensibile;

– se leagă de celulele sensibile prin intermediul unor receptori celulari cu specificitate înaltă, ceea ce explică spectrul lor foarte restrâns de acțiune;

– biosinteza bacteriocinelor nu are efect letal asupra celulei producătoare.

Receptorii parietali sunt analogi receptorilor fagici. Pierderea unui receptor conferă rezistență celulei la bacteriocina corespunzătoare.

Bacteriocinele produse de bacteriile Gram pozitive au un spectru de acțiune foarte larg. Ele sunt active asupra celulelor producătoare, dar și asupra unor specii mai îndepărtate și chiar asupra bacteriilor Gram negative. Din punct de vedere chimic, sunt proteine pure.

O categorie specială de bacteriocine, o constituie cele sintetizate de Ps. aeruginosa (bacilul piocianic), denumite piocine. Ele se evidențiază în lizatele culturilor, după inducția sintezei cu UV, sub forma unor bastonașe perechi, asemănătoare cozilor contractile ale fagilor din seria T-par, infecțioși pentru E. coli, cu lungimea de 90-l25 nm și grosimea de 20 nm. Uneori, perechile de bastonașe apar contractate, mai scurte și groase, iar între cele două structuri electrono-dense se evidențiază zona centrală (“core”), echivalentul structural al cilindrului axial al cozii fagului.

Dacă antibioticele sunt definite ca substanțe produse de unele organisme (pro- sau eucariote) care au efect inhibitor la concentrații scăzute, asupra altor microorganisme (pro- sau eucariote) (Van Damme, 1984, citat de de Vuyst, 1996), definiția bacteriocinelor este mult mai restrictivă. Bacteriocinele sunt substanțe proteice sau complexe proteice (agregate proteice, glicoproteine, glicolipoproteine) cu efect bactericid asupra altor specii, majoritatea strâns înrudite cu specia producătoare (de Vuyst și Van Damme,1996).

9.1. Clasificarea bacteriocinelor

Bacteriocinele formează un grup heterogen de molecule care, în funcție de structura primară, masa moleculară, stabilitate termică, prezența aminoacizilor modificați, sunt grupate în patru clase (Klaenhammer, 1993; Nes și colab., 1996). Aceasta clasificare este frecvent revizuită, pe măsură ce sunt descoperite și caracterizate noi tipuri de bacteriocine și noi asemănări între cele deja existente (tabelul 34).

Cls. I: Lantibiotice: molecule mici (< 5 kDa) subdivizate în două clase:

Clasa Ia – include peptide hidrofobe, cationice (lantionina, nisina, -metillantionona), al căror mod de acțiune constă în formarea porilor în membrana celulei țintă;

Clasa Ib – include molecule proteice cu o structură globulară mult mai rigidă, fără sarcină electrică negativă. Modul lor de acțiune constă în inhibiția sintezei peptidoglicanului în celula țintă (mersacidina, actagardina).

Cls. II: Non-lantibiotice: peptide mici, stabile termic, care acționează asupra peretelui celular și produc creșterea permeabilității membranei plasmatice a celulelor bacteriene sensibile. Sunt subdivizate în:

Clasa IIa – include peptide pediocin-like cu activitate anti-Listeria, care conțin în structura lor o secvență conservată (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val) și două resturi de cisteină care formează o punte disulfurică între jumatățile N-terminale ale moleculei (pediocine PA-I, sakacin A și P, leucocina A, carnobacteriocine) (Dieuleveux, 1998).

Clasa IIb – include o categorie aparte de bacteriocine reprezentate de un sistem format din două componente peptidice diferite, dar care, prin interacțiune, constituie molecula activă (complex de formare a porilor) (lactococcina G și F, lactacina F, plantaricina EF și JK).

Cls. III: bacteriocine termolabile de dimensiuni mari (> 30 kDa), mai puțin cunoscute și studiate (helveticin J și V-1829, acidophillucin A, lactacin A si B);

Cls. IV: amestec nedefinit de proteine, lipide, glucide.

Tabelul 34.

Principalele tipuri de bacteriocine, tulpini producătoare și spectrul inhibitor (adaptare după De Vuyst și Van Damme, 1994).

9.2. Sinteza bacteriocinelor

Genele codificatoare pentru bacteriocinele active sunt dispuse în operoni aglomerați (clusteri). Cei mai studiați operoni sunt cei ai bacteriocinelor aparținând clasei Ia din care fac parte lantionina și nisina. In anul 2000, Altena și colab. au elucidat structura cluster-ului de gene codificatoare pentru clasa Ib de bacteriocine (mersacidina), majoritatea genelor codificând proteine asemănătoare cu cele ale clasei Ia. Localizarea genelor codificatoare poate fi cromosomală (Diep, 1996), plasmidială sau la nivelul unor transposoni (Engelke și colab., 1992; 1994). Majoritatea bacteriilor producătoare de bacteriocine posedă, în același cluster, gene codificatoare ale unor proteine structurale, proteine implicate în transformarea formei inactive în forma activă a bacteriocinelor și proteine implicate în transportul acestora prin membrane, cât și proteine care conferă imunitate celulei producătoare (Cleveland și colab., 2001).

Organizarea genetică a operonilor ce codifică clasa a II-a de bacteriocine (non-lantibiotice) este asemănătoare cu cea a clasei I, genele pentru sistemul plantaricină (plantaricină, pediocină, sakacină) codificând o serie de bacteriocine care utilizează același tip de sistem de transport și sistem reglator. In schimb, fiecare categorie de bacteriocine posedă propriul sistem imunitar care protejează celula bacteriană producâtoare, de acțiunea propriei molecule proteice.

Sinteza tuturor claselor de bacteriocine se realizează prin traducere la nivel ribosomal, singurele care suferă modificări post-translaționale pentru a deveni forme active fiind bacteriocinele aparținând clasei I (Eijsink și colab., 1998). Genele codificatore ale enzimelor implicate în acest proces sunt situate în vecinătatea genelor structurale. Caracteristic pentru sinteza lantibioticelor este prezența la capătul N-terminal al moleculei precursoare a unei secvențe (peptid) leader care are rolul de situs de recunoaștere pentru enzimele implicate în modificările post-transcriere.

Tehnicile moleculare permit manipularea genetică a acestora în vederea studierii din punct de vedere structural și funcțional.

9.3. Imunitatea bacteriilor față de bacteriocinele endogene

Imunitatea celulelor producătoare față de bacteriocinele endogene este un fenomen care, de asemenea, diferențiază bacteriocinele de antibiotice. Genele codificatoare pentru proteinele ce conferă imunitate sunt situate în același operon, în apropierea genelor pentru bacteriocine și a genelor implicate în prelucrarea post-translațională (Nes și colab., 1996). Inițial s-a considerat că, în cazul lantibioticelor, imunitatea este asigurată de o singură genă, gena nisI pentru nisină, respectiv spaI pentru subtilizină, codificatoare ale proteinelor protectoare NisI și respectiv SpaI (Klein și Entian, 1994). Ulterior s-a demonstrat că imunitatea față de aceste bacteriocine este asigurată de un complex de proteine deoarece, prin deleția altor gene, celulele producătoare și-au pierdut imunitatea. Astfel, Duan și colab. (1996) au utilizat o tulpina de Lactococcus lactis, neproducătoare de nisină, dar rezistentă la acțiunea nisinei. Tulpina nu prezintă gena codificatoare a proteinei NisI, dar are secvențe asemănătoare genelor nisF, nisE și nisG, care conferă rezistență la acțiunea nisinei. Deleția genei nisG determină scăderea acestei rezistențe.

Rezistența la bacteriocinele celei de a II-a clase (non-lantibiotice) implică o singura genă codificatoare pentru proteinele imunitare. Structural, aceste proteine au o particularitate unică, având o secvență de 50-150 de aminoacizi atașată membranei celulare, de unde poate fi eliberată. Deși proteina care conferă imunitate față de lactococcină A (LcnI) a fost intens studiată, mecanismul molecular ce stă la baza fenomenului imunitar, nu este cunoscut (Cleveland, 2001).

9.4. Mecanisme de acțiune a bacteriocinelor

Bacteriocinele produse de celulele Gram negative acționează prin mecanisme specifice asupra unor “ținte” situate în membrană sau în citoplasmă. Spectrul foarte limitat de acțiune a bacteriocinelor produse de celulele Gram negative, sugerează existența unor receptori prin care acestea își dobândesc accesul la structurile sensibile. De fapt, moleculele care funcționează ca receptori nu sunt specializate în acest sens, ci îndeplinesc diferite activități, în special de transport celular al unor substanțe nutritive. Mecanismele de acțiune s-au studiat pentru colicine (produse de E. coli). După fixarea ireversibilă la nivelul receptorilor membranei externe, colicinele își exercită efectul bactericid prin unul din următoarele mecanisme:

– inhibarea fosforilării oxidative, stopând astfel procesele energetice celulare. Consecutiv se produce alterarea permeabilității membranei plasmatice, blocarea sintezei macromoleculare (ADN, ARN, proteine), ca și a transportului activ al substanțelor nutritive;

– unele colicine se fixează specific pe molecula de ADN și determină apariția inciziilor monocatenare, ceea ce deschide calea acțiunii nucleazelor celulare și a degradării ADN;

– altele inactivează subunitățile ribosomale 30 S, prin clivarea ARNr l6 S.

In concluzie, bacteriocinele au efect bactericid asupra celulelor sensibile. Ceea ce le deosebește fundamental de alte antibiotice este faptul ca au efect letal asupra celulelor în care s-au sintetizat și din această cauză, proprietatea de bacteriocinogeneză nu se poate perpetua într-o celulă, decât în starea ei potențială. Periodic, sinteza bacteriocinelor este indusă și celula producătoare se lizează, eliberând moleculele cu efect litic în mediu. Efectul litic al bacteriocinelor se manifestă numai asupra celulelor aceleiași specii, care nu o pot codifica, fiind lipsite de factorul Col. Celulele care poartă factorul Col sunt rezistente la acțiunea colicinei omologe, elaborată de celule purtătoare ale aceluiași factor, ca și cum ar fi imune la acțiunea lor.

Lantibioticele conțin în structura lor aminoacizi neproteici, care nu sunt încoporați prin mecanismul genetic clasic(pentru care nu există codoni), ceea ce confirmă modificarea enzimatică posttranslațională a produsului primar. Asfel de aminoacizi prezenți în forma activă a moleculei sunt: lantionina (de la care provine denumirea de lantibiotice), -metillantionona, dehidroalanina, dehidrobutirina. Cel mai important membru al acestei clase de bacteriocine este peptidul nisina, produsă de Lactococcus lactis subsp. lactis. Mecanismul efectului letal asupra bacteriilor Gram pozitive exercitat de aceste molecule și dovedit experimental nu este cunoscut. Se pare că o cauză a morții celulelor sensibile ar fi distrugerea membranei celulare prin proprietatea de detergent-like a peptidului nisină. Mai recent s-a demonstrat că efectul distructiv se datorează formării unor canale în membrana celulară prin încorporarea moleculei de nisină, datorită propietăților sale fizice: nisina este un peptid cationic cu caracter ușor hidrofob. Efectul constă în perturbarea echilibrului ionic prin efluxul de ioni și molecule mici, ceea ce duce la alterarea potențialului membranar. Studiile cu membrane artificiale (liposomi) au demonstrat că formarea canalului transmembranar este un proces dependent de diferența de sarcină a celor două fețe ale membranei, proces în care nisina perturbă atât potențialul membranar cât și pH-ul liposomilor. S-a evidențiat că activitatea nisinei este influențată de compoziția în fosfolipide, ceea ce poate explica diferențele de sensibilitate între diferite specii bacteriene (De Vuyst și Van Damme, 1996). Activitatea bactericidă a lantibioticelor se manifestă cu preponderență față de bacteriile Gram pozitive. Ineficiența față de bacteriile Gram negative se datorează dimensiunilor relativ mari ale moleculelor (aproximativ 1800-4600 Da) care împiedică penetrarea membranei externe a peretelui celular al bacteriilor Gram negative.

In privința modului de acțiune al lantibioticelor, s-a relevat importanța unor molecule de ancorare numite generic lipidul II, din membrana celulelor țintă, molecule care sunt precursori ai peptidoglicanilor și care facilitează activitatea antibacteriană a nisinei și a mersacidinei. Mersacidina (bacteriocină aparținând clasei Ib) inhibă sinteza peptidoglicanului prin blocarea transglicozilării (Brotz și colab., 1998). Pentru nisină și epidermină, lipidul II are rolul de moleculă de ancorare și facilitează din punct de vedere energetic, formarea porilor (Brotz si Sahl, 2000). Același situs de ancorare la membrane este utilizat și de vancomicina dar mecanismul de interacție este specific.

Bacteriocinele sunt adeseori confundate în literatura de specialitate, cu antibioticele, ceea ce limitează din punct de vedere legal, utilizarea lor în industria alimentară (Hansen, 1994). Diferențele între cele două categorii de substanțe cu potențial microbicid, se bazează atât pe modalitatea de sinteză cât și pe modul de acțiune, spectru antimicrobian, toxicitate și mecanisme de rezistență (tabelul 35). Ca o recunoastere a diferențelor nete dintre bacteriocine și antibiotice, a fost propus, pentru bacteriocine, termenul de “prezervanți biologici alimentari”, deoarece nu sunt utilizate în scop medical.

Tabelul 35.

Comparație între bacteriocine și antibiotice (după Cleveland și colab., 2001).

Bibliografie selectivă

Altena K., Guder A., Cramer C., Bierbaum, G., Biosynthesis of the lantibiotic mersacidin: organization of a type B lantibiotic gene cluster. Appl Environ Microbiol., 2000, 66, 2565–2571.

Brotz H., Sahl H.G., New insights into the mechanism of action of lantibiotics-diverse biological effects by binding to the same molecular target, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2000, 46: 1-6.

Cleveland G., Montville J., Nes I.F., Chikindas M.L.,. Bacteriocins: safe, natural antimicrobian for food preservation, International Journal of Food Microbiology.2001,71: 1-20.

De Vuyst L., Van Damme E.J., Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academy & Professional. 1996.

Diep D. B., Havarstein L. S., Nes, I. F., Characterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum C11. J Bacteriol. 1996, 178, 4472–4483.

Dieuleveux V., Van Der Pyl D., Chataud J., Gueguen M., Purification and caracterization of anti-Listeria compounds produced by Geotrichum candidum, Applied and Environemental Microbiology. 1998, 64: 800-803.

Duan K., Harvey M.L., Liu C.Q., Duun N.W., Identification and characterization of mobilizing plasmid, pND300, in Lactococcus lactis M198 and its encoded nisin resistence determinant. Journal of Applied Bacteriology. 1996, 81: 493-500.

Eijsink V.C.H., Skeie M., Middelhoven H.P., Brurberg M.B., Nes I.F., Comparative studies of class IIa bacteriocins of lactic acid bacteria, Applied and Environemental Microbiology. 1998, 64: 3275-3281.

Engelke et al., Biosynthesis of the lantiobiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58(11)3730-3743

Engelke et al., Regulation of nisin biosynthesis and immunity in Lactococcus lactis 6F3. Appl. Environ. Microbiol., 1994.60(3):814-825

Gratia A.,  Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille. C. R. Soc. Biol. 1925, 93:1040-1042

Hansen, N. Nisin as a model food preservative. Crit Rev Food Sci Nutr., 1994. 34(1):69-93.

Jacob F,, Lwoff A,, Siminovitch A,, Wollman E., Définition de quelques termes relatifs a la lysogénie. Ann Inst Pasteur (Paris). 1953, Jan; 84(1):222–224

Klaenhammer T.R., Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria, FEMS Microbiology Reviews. 1993. 12: 39-85.

Klein C., Entian K.D., Genes involved in self-protection against the lantibiotic subtilin produced by Bacillus subtilis ATCC 6633, Applied and Environemental Microbiology. 1994, 60: 2793-2801.

Nes I.F., Diep D.B., Havarstein L.S., Brurberg M.B. Holo H., Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria, Antonie van Leeuwenhoek. 1996, 70: 113-128.

Zarnea G. Tratat de Microbiologie Generala. Editura Academiei Romane, 1990.

Capitolul 10

AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR FUNGICE

Circa 50 de specii de fungi sunt patogene pentru om și animale. Majoritatea fungilor patogeni sunt agenți infecțiosi oportuniști, care invadează țesuturile organismelor cu rezistență scăzută la infecție.Fungii au fost recunoscuți ca agenți patogeni, cu mult înaintea bacteriilor. In 1665 s-a înregistrat o infecție fatală, consecutivă unei infecții orale cu Candida ( Fromtling, 1988). Infecția fungică a țesuturilor umane și animale se produce pe fondul unor condiții locale favorizante (Zarnea, 1970). Din această cauză, transmiterea infecției de la un organism la altul este rară. In general, maladiile fungice nu sunt contagioase.

10.1. Tipuri de infecții fungice

Infecțiile produse de deuteromicete se numesc micoze și pot fi împărțite în două categorii mari:

infecții sistemice sau profunde, în care agentul patogen este larg diseminat în organism și crește în diferite organe și țesuturi, care în mod normal sunt sterile. Pacienții neutropenici au cel mai mare risc pentru micoze profunde;

micoze superficiale, care includ infecții ale pielii, părului, unghiilor. Unii fungi produc numai un tip de infecție, iar altele pe amândouă.

Infecțiile sistemice sunt de origine endogenă și exogenă. Inserția cateterelor predispune pacienții neutropenici la infecții fungice de origine endogenă. Micozele sistemice de origine exogenă au caracter endemic: histoplasmoza, blastomicoza, paracoccidioidomicoza, coccidioidomicoza și penicilioza. La pacienții imunodeficitari se remarcă tendința de transformare a micozelor endemice, în infecții oportuniste.

Pentru majoritatea fungilor patogeni nu se cunosc stadii de înmulțire sexuată și de aceea poziția lor sistematică este incertă. Unele micoze sistemice sunt produse de levuri. Altele sunt cauzate de fungi dimorfici, care cresc ca levuri in vivo (la 37o) și ca miceliu la temperatură mai mică, in vitro pe medii artificiale.Fungii patogeni trăiesc în sol și pătrund în organism pe cale respiratorie, fiind inhalați odată cu aerul. De la poarta de intrare, agentul infecțios se diseminează în organism și se instituie o infecție cronică, cu simptome foarte variate. Infecțiile fungice fatale sunt rare.

Infecțiile fungice apar frecvent, ca o consecință a eliminării microbiotei normale, prin terapie orală cu antibiotice. Câțiva fungi (Cryptococcus neoformans, Coccidioides imitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitides) produc infecții pulmonare foarte asemănătoare prin manifestările clinice, cu tuberculoza. Fungii care produc infecții superficiale se numesc dermatofiți. Dermatofiții sunt un grup de fungi strâns înrudiți, care au capacitatea de a invada țesutul cheratinizat (piele, păr, unghii) la om și la animale. In general, infecția este cutanată și restrânsă la straturile celulare cheratinizate, datorită incapacității fungilor de a penetra țesuturile mai profunde sau organele gazdelor imunocompetente (Wistreich și Lechtman, 1984). Micozele superficiale sunt cauzate, în primul rând, de fungi micelieni (Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton). Ele au afinitate pentru țesuturile care conțin cheratina și produc enzima necesară degradării acestei proteine. Unele cresc pe suprafața firului de păr, iar altele la interior. Vârsta este un factor important care condiționează sensibilitatea la infecție: impetigo al pielii capului este frecventă la copii și rară la adulți, iar infecția interdigitală este frecventă la adulți și rară la copii. Acizii grași nesaturați din screția glandelor sebacee ale adultului, au acțiune antifungică, ceea ce explică rezistența mai mare a adultului la infecțiile fungice superficiale. Una dintre substanțele antifungice, acidul undecilenic, se adaugă în compoziția multor unguente, folosite în controlul infecțiilor fungice ale pielii. Infecția interdigitală este favorizată de umiditatea locală crescută și este produsă de fungi din g. Epidermophyton. Majoritatea infecțiilor cu fungii dermatofitici se pot trata eficient cu griseofulvina, un antibiotic antifungic produs de Penicillium griseofulvum. Griseofulvina se concentrează în celulele epidermice, la valori inhibitoare pentru creșterea dermatofitului.

Micozele intermediare sunt considerate acelea care produc leziuni epidermice, subcutanate, ale mucoaselor, plămânului. Infecția se poate extinde și în alte țesuturi, la diferite profunzimi. Infecția este realizată de inhalarea sporilor, prin contaminarea rănilor sau prin ingestie. Cele mai tipice infecții intermediare sunt candidoza și aspergiloza.

Candidoza este produsă de variate specii de Candida, în special C. albicans, din grupul fungilor imperfecti. In procesul infecțios se prezintă sub formă unei levuri, dar formează și structuri miceliene (Wistreich și Lechtman, 1984). Infecția se localizează, în primul rând, la nivelul membranelor mucoase, dar și în piele sau plămân. Infecțiile mucoasei bucale a noului născut sunt comune, iar la adult produce infecții bucale, tonsilare, vaginale.

Aspergiloza, cauzată de Aspergillus fumigatus este frecventă la puii de găină, în primele zile după ecloziune, la care produce infecții de amploarea unei epidemii. Miceliul se dezvoltă abundent în plămân și respirația devine imposibilă. Produce avortul la vacă, oaie etc. Omul prezintă rezistență naturală la infecția cu A. fumigatus. Cazurile de îmbolnăvire sunt rare.

Structura moleculară a colesterolului Structura moleculară a ergosterolului

10.2. Medicamentele antifungice

Agenții antifungici disponibili pentru tratamentul infecțiilor micotice sistemice sunt limitate ca număr și eficiență, deoarece fungii sunt organisme eucariote și din punct de vedere biochimic se aseamănă cu organismul gazdă. Asemănarea face ca dezvoltarea unui medicament eficient față de agentul invadator, dar sigur pentru gazdă, să necesite un studiu de durată în cercetarea de bază și în clinică. Cercetarea premergătoare introducerii în clinică a unui agent antifungic, necesită studii interdisciplinare de chimie, biochimie, microbiologie, endocrinologie, enzimologie etc. După ce agentul chimic este propus, cercetarea vizează siguranța, biodisponibilitatea, formularea.

Primul agent cu activitate antifungică (griseofulvina) a fost izolat în 1939, iar primul agent polienic antifungic, nistatinul, a fost descoperit în 1949.

Antibioticele polienice (nistatinul și amfotericina B) se sintetizează pe o cale metabolică asemănătoare cu aceea a antibioticelor macrolide (eritromicina). Structural, macrolidele se caracterizează prin inele lactonice multiunitare, care poartă numeroși substituienți: grupări metil, hidroxil, glucide specifice și celpuțin un grup carbonil. Subgrupul polienelor conține o serie de legături duble (între 4 și 7) conjugate. Din punctul de vedere al precursorilor, polienele sunt alcătuite din unități de acetat și propionat. Grupările metil își au originea în unitățile de propionat.

Structura moleculară a nistatinului

Compușii azolici s-au introdus în clinica antifungică în 1944, iar în 1960 s-a folosit amfotericina. Cei mai importanți sunt compuși azolici și amfotericina B din clasa polienelor, medicamentul optim pentru tratamentul micozelor sistemice.

Majoritatea medicamentelor antifungice au ca țintă molecula de ergosterol, sterolul major al membranei plasmatice a fungilor, analogul structural al colesterolului din celula mamiferelor (Hector, 1993). Ergosterolul din membrana fungică contribuie la o varietate de funcții celulare: este sediul chitin-sintetazei, importantă pentru creșterea și diviziunea celulei, este important pentru fluiditatea și integritatea membranei (tabelul 36).

Polienele

Structural, toate antibioticele polienice se caracterizează printr-un inel macrolid lactonic de dimensiuni mari. Se presupune că atât inelul lactonic cât și legăturile duble conjugate multiple (4, 5, 6 sau 7) sunt necesare pentru activitatea biologică. Prezența regiunilor foarte polare și a celor nepolare în moleculele polienice le conferă caracterul amfipatic, ceea ce explică solubilitatea și mecanismul de acțiune. Majoritatea polienelor sunt molecule amfoterice. Aciditatea se datorează grupării carboxil, iar caracterul bazic este conferit de micozamină, un glucid aminat izolat din nistatin și amfotericina B.

Mecanismul de acțiune. Medicamentele din clasa polienelor, în special amfotericina B, au fost considerate cele mai eficiente dintre toți agenții antifungici cu administrare sistemică. Polienele sunt o clasă de medicamente cu acțiune selectivă numai asupra membranelor ce conțin ergosterol: de aceea sunt inhibitorii pentru fungi, dar nu sunt active față de bacterii. Acțiunea diferențiată a permis relevarea unor diferențe biochimice importante între bacterii și fungi.

Aceste medicamente, care includ amfotericina B și nistatinul acționează asemănător altor agenți litici: vitamina A, detergenții ionici, saponine. Vitamina A (un compus polienic) este agent hemolitic (Johnson și colab., 2004). Liza se poate datora oxidării vitaminei A în interiorul membranei celulare. Acțiunea vitaminei A poate fi prevenită de anumiți antioxidanți. Antibioticele polienice și saponina acționează prin mecanisme identice: interacționează cu sterolii membranari, penetrează membrana și produc alterări ale permeabilității organismelor sensibile, ducând la pierderea constituienților citoplasmatici esențiali, rezultatul fiind moartea celulei. Moleculele polienice sunt amfipatice, având grupări hidrofobe și hidrofile. Membrana celulară este situsul acțiunii antibioticelor polienice și ca rezultat al legării polienelor își pierde funcția de barieră selectivă de permeabilitate. Medicamentele se intercalează în membrane și formează un canal, prin care componentele celulare, în special ionii de K, părăsesc citoplasma și alterează gradientul protonic al membranei. Oligomerii se formează prin asocierea monomerilor în conexiune cap-coadă, formându-se complexe suficient de lungi pentru a străpunge membrana și să inducă efectele lezionale.

Deși ergosterolul este sterolul structural predominant al celulei fungice, alți câțiva steroli pot să contracareze efectul inhibitor al polienelor: colesterolul, sitosterolul, stigmasterolul și într-o măsură mai mică, lanosterolul. Sterolii sunt cei mai eficienți în anularea activității polienelor, având cel mai puternic efect asupra spectrului de acțiune al polienelor.

Sensibilitatea la poliene se manifestă și la alte grupe de organisme: alge, protozoare (Leishmania donovani). Antibioticele polienice sunt relativ toxice pentru eritrocitele mamiferelor.

Structura moleculară a amfotericinei B

Amfotericina este mai activă față de celulele fungice, decât față de cele mamaliene, datorită tipului de sterol încorporat în membrană. Amfotericina induce peroxidarea lipidelor din structura membranei, rezultatul fiind modificarea permeabilității. Amfotericina B este insolubilă în apă, iar pentru a deveni activă biologic, trebuie solubilizată în mediul apos. Medicamentul nu interacționează cu colesterolul, ceea ce explică efectele toxice selective ale concentrațiilor mici de amfotericină B, la care medicamentul este monomeric, asupra membranelor cu ergosterol. Amfotericina monomerică s-ar asocia cu ergosterolul în grosimea membranei și ar duce la formarea canalelor transmembranare. Specificitatea medicamentelor pentru membranele cu ergosterol se crede că se datorează interacțiunii canalului format de amfotericina B, cu ergosterolul în membrană. Formarea canalelor oligomerice este condiționată de o concentrație prag a amfotericinei (Fig. 57). Oligomerii se formează prin asocierea cap-coadă a moleculei, ceea ce duce la formarea complexelor suficient de mari pentru a străpunge membrana și a produce efectele toxice.

Figura 57. Reprezentarea schematică a mecanismului de acțiune a amfotericinei B asupra celulei fungice (a) și mamaliene (b) (după Brajtburg și colab., 1996).

Specificitatea amfotericinei B pentru membranele care conțin colesterol poate fi de asemenea asociată cu fosfolipidele și cu raportul sterolului față de fosfolipide. Medicamentul interacționează mai puțin probabil cu membranele care conțin colesterol. S-a sugerat că amfotericina B produce leziuni oxidative ale membranei plasmatice fungice. Se pare însă, că amfotericina B are efect antioxidant in vivo, protejând celulele fungice de atacul oxidativ al gazdei.

Macrofagele pot avea rol de rezervor de amfotericina B, atât pentru acțiunea față de paraziții intracelulari, cât și extracelulari. După ce amfotericina B se asociază cu lipidele membranare, este preluată de macrofage și monocite și inhibă paraziții fungici deja prezenți în interiorul acestor celule sau se disociază de lipidele membranare și acționează asupra paraziților extracelulari. In general, polienele sunt fungicide la concentrațiile care inhibă complet creșterea microorganismului sensibil.

Amfotericina B este fungicidă atât in vivo cât și in vitro. Este activă față de Candida spp., Blastomyces, Histoplasma, Cryptococcus neoformans (C. neoformans este inhalat din mediu, crește în țesutul pulmonar, se diseminează în organism, crește în creier și persistă în prostată. C. neoformans persistă în toate fluidele bogate în fosfolipide, acizi grași și compuși icozanoidici), față de fungii filamentoși Aspergillus, Zygomyces și fungii dimorfici (de exemplu C. albicans), cresc atât sub formă tipică de levură, cât și sub formă de micelii. Candida formează proiecții hifale, lungi și subțiri, asociate cu patogenitatea.

Polienele sunt active față de micoplasme. Micoplasmele nu au perete celular, fiind asemănătoare protoplaștilor. Deosebirea constă în faptul că micoplasmele necesită steroli pentru creștere.

Amfotericina B s-a folosit în terapia infecțiilor fungice mai mult de 40 de ani. Deși s-au descoperit alte medicamente antifungice, amfotericina B rămâne medicamentul de elecție pentru tratamentul infecțiilor fungice sistemice severe și este alternativa pentru tratamentul leishmaniozei viscerale. Amfotericina B și nistatinul s-au folosit pentru tratamentul anumitor infecții cu protozoare. Amfotericina B se administrează intravenos, pentru tratamentul infecțiilor sistemice (Van Etten și colab., 1991). Toxicitatea, în special față de rinichi, dar și riscul producerii anemiei a limitat folosirea acestui medicament. Anemia poate să nu se datoreze acțiunii toxice asupra eritrocitelor, ci supresiei măduvei osoase. Nistatinul este mai puțin eficient și se folosește pentru aplicare locală sau se administrează oral în cazul implicării intestinului. Rezistența apare rareori și constituie un obstacol major în utilizarea terapeutică a polienelor.

Inhibitorii biosintezei ergosterolului

Compușii azolici. Alilaminele, tiocarbamații, compușii azolici și morfolinici se folosesc în tratamentul micozelor ca inhibitori ai căii de biosinteză a ergosterolului. Toate aceste medicamente interacționează cu enzimele implicate în sinteza ergosterolului din squalen, care este produs din acetat prin acetil-CoA, hidroximetilglutaril-CoA și mevalonat.

Squalenul este un compus poliprenil cu 30 atomi de C, care conține 6 unități prenil (C5H8). Prenilul este de asemenea cunoscut sub denumirea de izopren sau izoprenoid. Structura de bază a tuturor steroizilor este formată prin condensarea a 6 grupări prenil.

Structura moleculară a grupului prenil

Ergosterolul este important pentru fungi, deoarece este sterolul dominant în membrana plasmatică a acestor organisme. Cantități foarte mici de ergosterol sunt necesare pentru ca celulele să progreseze în ciclul celular.

In 1969, doi compuși propuși de două laboratoare diferite au fost introduși în clinică pentru tratamentul infecțiilor fungice: clotrimazol și miconazol. A urmat econazolul (1974). Acești 3 compuși azolici rămân cei mai importanți pentru terapia multor dermatofitoze.

Agenții azolici antifungici inhibă sinteza ergosterolului, un compus major al membranei plasmatice a fungilor, prin inhibiția lanosterol-demetilazei, enzimă dependentă de citocromul P450, denumită și 14-sterol-demetilază (P-450DM). Aceiași enzimă are rol important în sinteza colesterolului în celulele mamiferelor. Administrarea compușilor azolici în concentrații terapeutice își datorează eficiența, afinității lor mai mari pentru P-450DM fungică, decât pentru enzima mamiferelor. Expunerea fungilor la un compus azolic produce epuizarea ergosterolului și acumularea sterolilor metilați 14. Ergosterolul, pentru celula fungică, are funcții multiple, una dintre ele fiind asemănătoare celei hormonale, deoarece stimulează creșterea și diviziunea. Efectele medicamentelor se manifestă când pierderea ergosterolului este aproape completă. Este perturbată atât structura membranei celulei fungice, cât și funcțiile sale esențiale: permeabilitatea selectivă și transportul nutrienților, sinteza chitinei (Hector, 1993). Rezultatul net este inhibiția creșterii fungice. Agenții azolici antifungici utilizați în clinică, conțin 2 sau 3 atomi de N în inelul azolic și sunt clasificați ca imidazoli (de exemplu, ketoconazol, miconazol, clotrimazol) sau ca triazoli (de exemplu, itraconazol și fluconazol). Cu excepția ketoconazolului, folosirea imidazolilor și triazolilor este limitată la tratamentul micozelor superficiale.

Clotrimazolul este activ, in vitro, față de dermatofite, levuri patogene, fungi filamentoși și dimorfici, dar și față de unele bacterii Gram pozitive. In clinică se folosește pentru tratamentul infecțiilor dermatofite, infecțiilor fungice superficiale (tinea versicolor, infecții orale și vaginale cu Candida). Activitatea clotrimazolului, in vitro, este comparabilă cu a amfotericinei B. Este mai activ decât griseofulvina și nistatinul. Acționează asupra membranei celulei fungice, a cărei permerabilitate o perturbă.

Structura moleculară a clotrimazolului

Miconazolul este un derivat fenetil-imidazol. Are toxicitate suficient de mică, astfel încât se administrează intravenos, pentru terapia infecțiilor fungice sistemice. Este eficace pentru tratamentul infecțiilor fungice superficiale: dermatofite, candidoză cutanată și vaginală.

Structura moleculară a miconazolului

Econazolul este un derivat antifungic imidazolic, cu o structură identică cu a miconazolului, deosebirea constând în absența unui atom de Cl pe un inel benzenic. Activitatea antifungică in vitro a econazolului este comparabilă cu a miconazolului: are spectru larg de activitate față de dermatofite, Candida spp., alte levuri patogene, fungi filamentoși și unele bacterii Gram pozitive (Georgopapadakou și Walsh, 1996). S-a folosit pentru terapia locală a dermatofitelor, micozelor superficiale (tinea versicolor, candidoză cutanată). Nu este adecvat pentru administrare sistemică, deoarece se leagă stabil de proteinele serice.

Structura moleculară a econazolului

Denumirile generice și comerciale, structurile chimice, formulările și indicațiile privind imidazolii antifungici și a terconazolului, un derivat triazolic, utilizabili în clinică sunt prezentate în tabelul 36.

Tabelul 36.

Principalii agenți terapeutici utilizați in infecțiile fungice (după Topley și Wilson’s, 1998).

Mecanismul de acțiune nu este clar: peretele celular la C. albicans pare a fi evident deformat după tratament, iar membrana plasmatică și cea mitocondrială apar alterate. Mitocondriile par a fi cele mai sensibile.

Compușii azolici, care includ imidazolii (ketoconazol și miconazol) și triazolii (fluconazoli, itraconazol) au acțiune specifică față de lanosterol-demetilază, enzimă a căii de sinteză a ergosterolului. Această enzimă este un citocrom P450 care conține hem la situsul activ. La concentrații mari, compușii azolici pot să interacționeze direct cu lipidele membranare.

Ketoconazolul este un derivat imidazolic antifungic, activ pe cale orală. Este indicat pentru tratamntul blastomicozei, histoplasmozei diseminate. Acțiunea sa este fungistatică și eliminarea infecției necesită o activitate normală a funcției imunitare. Este eficient pentru tratamentul infecțiilor fungice superficiale. Studiile dublu-orb (placebo și medicament) eu evidențiat eficiența medicamentului în tratamentul tinea versicolor. Reacțiile adverse, limitante ale dozei, sunt starea de rău general și voma.

Fluconazolul este activ față de C. albicans in vitro și in vivo și s-a folosit pentru tratamentul candidozei cutanate și orofaringiene. Deoarece administrarea orală este avantajoasă, utilizarea s-a extins pentru tratamentul altor infecții fungice: criptococoza, histoplasmoza, coccidioidomicoza și a infecțiilor cu fungi dimorfici (Van Etten și colab., 1991).

5-fluocitozina este încorporată în celulă de o citozin-permează și dezaminată în 5-fluorouracil, de o citozin-dezaminază. 5-fluocitozina are acțiune specific antifungică, deoarece celulele mamiferelor nu conțin citozin-dezaminază.

Mecanismul primar de acțiune al compușilor azolici constă în inhibiția biosintezei ergosterolului, componentă esențială a membranei citoplasmatice a fungilor, rezultatul fiind acumularea lanosterolului sau a altor intermediari sterolici.

Membrana fungică, spre deosebire de cea bacteriană, conține steroli. Antibioticele polienice, care par să acționeze prin legarea de sterolii membranari, conțin un centru hidrofob rigid și o regiune hidrofilă flexibilă. Structural, polienele sunt molecule lungi, menținute în extensie rigidă de regiunea polienică. Ele interacționează cu celula fungică pentru a produce un complex steroli membranari-polienă, ce alterează permeabilitatea membranei (Van Etten și colab., 1991). Este de fapt un por (canal) membranar, ce alterează profund permeabilitatea membranei: conținutul celulei (ionii de K+ și glucoza) difuzează în mediul extracelular. Celulele procariote nu leagă și nu sunt inhibate de poliene. Deși au fost izolate numeroase antibiotice polienice, numai amfotericina B se folosește pentru administrare sistemică. Nistatinul se folosește pentru administrare locală, iar primaricina, ca preparat cu uz oftalmic.

Unii dintre derivații azolici antifungici sunt activi față de citocromul P450, implicat în demetilarea lanosterolului. Inhibiția biosintezei ergosterolului duce la dezorganizarea structurală a membranei plasmatice fungice și la alterarea permeabilității și funcției de transport. Leziunile membranare duc la dezechilibru metabolic, rezultând inhibiția creșterii celulei fungice sau moartea celulei.

Activitatea antifungică primară de inhibiție a biosintezei ergosterolului membranar tinde să fie o acțiune fungistatică și nu fungicidă. De aceea, derivații azolici antifungici necesită activitatea funcției imunitare pentru a elimina fungii invadatori.

Derivații azolici antifungici pot să afecteze respirația fungică.

Se sugerează existența a cel puțin două mecanisme distincte de acțiune a dervaților antifungici:

– mecanismul fizico-chimic, dependent de faza de creștere a miceliului, necesită concentrații mari de medicament, efectul fiind fungicid; mecanismul nu este comun tuturor derivaților azolici;

– mecanismul metabolic, se produce la concentrații mici de medicament, este un eveniment fungistatic, comun tuturor derivaților azolici.

Clinic, majoritatea derivaților azolici antifungici produc efecte fungistatice. Efectele fungicide au fost raportate de studiile in vitro.

Flucitozina (5-fluorocitozina) este un agent antifungic inhibitor pentru speciile de levuri. Este convertită în celula fungică la 5-fluorouracil, care inhibă timidilat-sintetaza, producând un deficit al timinei și al sintezei ADN

10.3. Rezistența fungilor la medicamente

In anii ’90, rezistența fungică a devenit o problemă importantă la pacienții cu infecții cronice cu HIV, M. tuberculosis și cu alte bacterii. S-a înregistrat o creștere dramatică a incidenței infecțiilor fungice, în special datorită alterării stării imunitare asociată cu SIDA, chimioterapie antineoplazică sau imunosupresia asociată cu transplantul. La pacienții HIV, rezistența infecției orofaringiene cu Candida este o problemă importantă.

Căile prin care fungii previn acțiunea medicamentelor, substanțelor chimice antiseptice sau dezinfectante sunt puțin cunoscute. Rezistența antifungică poate fi împărțită în două categorii: rezistența clinică și rezistența in vitro. Infecția fungică refractară la tratamentul cu un medicament antifungic este definită ca rezistență clinică. Una dintre cauzele comune ale rezistenței este infecția cu o tulpină fungică pentru care concentrația minimă inhibitorie (CMI) este mai mare decât valoarea medie. Rezistența in vitro poate să fie primară și secundară. Rezistența primară poate fi intrinsecă (înăscută) și se datorează rezistenței naturale la agentul antifungic: peretele celular este o barieră mecanică ce diminuă sau chiar exclude pătrunderea agentului antimicrobian. Rezistența secundară sau dobândită semnifică câștigarea rezistenței de către o tulpină la agentul terapeutic antifungic. Această formă de rezistență, rară acum câteva decenii, este cea mai frecventă la pacienții SIDA, care suferă de candidoză orofaringiană sau esofagiană recurentă, rezistentă la compușii azolici (Sheehan și colab., 1999).

Cauzele rezistenței sunt multiple. Tulpinile rezistente pot fi saprobionte la un individ sănătos. Ele devin patogene la persoanele imunocompromise. Tulpinile rezistente de C. albicans pot să apară prin înlocuirea celor sensibile. Analiza RFLP (restriction fragment length polymorfism) a evidențiat modificări genetice, în absența modificărilor fenotipice. O tulpină poate să devină rezistentă prin expunerea la acțiunea medicamentului, pentru perioade lungi. Medicamentul nu produce rezistența, dar selectează tulpinile cu un nivel inițial redus de rezistență. In intervalul acțiunii medicamentului, celula se adaptează la concentrații progresiv crescânde de medicament. Tulpinile de Candida pot deveni tranzitoriu rezistente la medicamente, fenomen denumit rezistență epigenetică. Fenotipul rezistent poate reversa la un fenotip sensibil, odată cu întreruperea administrării medicamentului și eliminarea presiunii selective.

C. albicans poate deveni rezistentă prin mecanisme genetice mutaționale. Mutația genică are o frecvență mică (10-6 – 10-8).

Mecanismele moleculare ale rezistenței fungilor la medicamente sunt diverse (White și colab., 1998). Cele mai frecvente includ:

– diminuarea importului medicamentului în celulă;

– modificarea chimică sau chiar degradarea enzimatică a medicamentului în celulă;

– creșterea ratei efluxului medicamentului;

– modificarea mutațională a țintei celulare a medicamentului.

Metoda standard pentru evaluarea ratei importului medicamentului constă în determinarea cantității de medicament ce se asociază cu celulele, în perioade scurte de timp (mai puțin de 10 secunde). Perioada de incubație scurtă se realizează prin amestecul celulelor și medicamentului pe un suport inert (strat de ulei mineral). După incubări scurte, celulele se recoltează și se determină cantitatea de medicament.

Mecanismele prin care medicamentele sunt transportate în celulă sunt necunoscute. Transportul membranar pare a fi dependent de energie. S-a studiat rata acumulării medicamentelor pentru care CMI este înaltă. Utilizarea medicamentelor marcate radioactiv (fluconazol) a evidențiat că, de regulă, izolatele rezistente acumulează cantități mai mici de medicament, comparativ cu cele rezistente.

Celulele eucariote conțin două tipuri de pompe de eflux, ce contribuie la rezistența la medicamente:

– transportori ABC (ATP-binding cassette);

– proteina transportoare din categoria facilitatorilor majori (MF).

Ambele tipuri de pompe produc rezistența la medicamente.

Transportorii din familia ABC sunt proteine cu domenii membranare multiple, cu 6-7 secvențe incluse în membrană și cu două domenii care leagă nucleotidele (NBD = nucleotide binding domains). NBD leagă ATP, utilizat ca sursă de energie pentru transportorii de tip ABC. Aceștia realizează efluxul activ din celulă, al moleculelor toxice relativ hidrofobe.

Transportorii din categoria MF sunt puțin cunoscuți la fungi, dar sunt asociați cu rezistența la molecule relativ hidrofobe. Nu conțin NBD, sursa de energie fiind forța proton motrice (PMF), adică gradientul de H+ pe cele două fețe ale membranei. Transportorii MF funcționează prin antiport: protonii sunt pompați în celulă, iar molecula substrat este pompată la exterior.

Bibliografie selectivă

Brajtburg J., Bolard J., Carrier effects on biological activity of amphotericin B, Clinical Microbiology Reviews. 1996, 9(4): 512-531.

Fromtling R.A., Overview of medically important antifungal azole derivatives, Clinical Microbiology Reviews.1988, 1(2): 187-217.

Georgopapadakou N. H., Walsh T. J., Antifungal agents: chemotherapeutic targets and immunologic strategies, Antimicrob. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1996, 40: 279-291

Hector R.F., Compounds active against cell walls of medically important fungi, Clinical Microbiology Reviews.1993, 6(1): 1-21.

Johnson MD, MacDougall C, Ostrosky-Zeichner L, Perfect JR, Rex JH., Combination Antifungal Therapy, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004, 48(3): 693-715.

Lortholary O., Dupont B., Antifungal prophylaxis during neutropenia and immunodeficiency, Clinical Microbiology Reviews.1997, 10(3): 477-504.

Sheehan D.J., Hitchcock C.A., Sibley C.M., Current and Emerging Azole Antifungal Agents, Clinical Microbiology Reviews. 1999, 12(1): 40-79.

Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Vol. I , II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998.

Van Etten E.W., van de Rhee N.E., van Kampen K.M., Bakker-Woudenberg I.A., Effects of amphotericin B and fluconazole on the extracellular and intracellular growth of Candida albicans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1991, 35(11): 2275-2281.

White T.C., Marr K.A., Bowden R.A., Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance, Clinical Microbiology Reviews.1998, 11(2): 382-402.

White T.C., Marr K.A., Bowden R.A., Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance, Clinical Microbiology Reviews.1998, 11(2): 382-402.

Wistreich G. A., Lechtman M. D. Microbiology, Macmillan Publishing Comp., 1984.

Zarnea G. Microbiologie generală, Editura Didactica si Pedagogica Bucuresti, 1970

Capitolul 11

AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR PRODUSE DE PROTOZOARE

Un grup mic de protozoare parazite produc modificări majore ale stării funcționale ale mucoasei la om: Giardia duodenalis, Trichomonas vaginalis și Entamoeba histolytica. Ulterior, s-au identificat Blastocystis hominis, Cryptosporidium parvum, Isospora spp. și Cyclospora spp. Metabolismul acestor protozoare pare a fi anaerob și microaerotolerant (Topley și Wilson’s, 1998).

Metabolismul anaerob protejează un complex enzimatic cu potențial redox scăzut: piruvat-feredoxin oxidoreductaza și feredoxina, care activează medicamentul nitroimidazolic – metronidazol, folosit pentru tratamentul infecțiilor cu G. duodenalis, E. histolytica, T. vaginalis (Moulder, 1985). Astfel de căi metabolice ancestrale, funcționează și la bacteriile anaerobe, de asemenea sensibile la metronidazol, dar nu se regăsesc la alte eucariote. Existența lor este un argument în favoarea ipotezei că protozoarele anaerobe s-au diversificat foarte timpuriu în linia de evoluție a eucariotelor.

11.1. Agenți terapeutici ai giardiozei

G. duodenalis (sinonim G. lamblia sau G. intestinalis) este un protozoar flagelat, fiind cel mai comun în tractul intestinal și produce boala diareică datorată consumului de apă contaminată și mai rar de produsele alimentare, în toată lumea. In anumite zone, consumul apei contaminate cu chiști de G. duodenalis este cauza cea mai comună a diareii cronice a călătorilor. G. duodenalis parcurge un ciclu de viață, format din două stadii. Parazitul este ingerat în formă de chist inactiv, cu apa contaminată, mai rar prin alimente sau prin contact direct fecal-oral. Chistul este relativ inert, dar asigură supraviețuirea în condiții improprii de mediu. Chistul evoluează în formă activă de trofozoid, în duoden, după trecerea prin mediul acid al stomacului. Trofozoidul este forma vegetativă, care se hrănește pe mucoasa duodenală sau jejunală și se reproduce prin fisiune binară. In acest stadiu produce simptome diareice și de malabsorbție. După expunerea la sărurile biliare, unii trofozoizi formează chiști în jejun și trec în fecale, completând ciclul de propagare prin infectarea unei noi gazde. Perioada de incubație a infecției cu Giardia este de 1-2 săptămâni. Închistarea poate fi inițiată in vitro, prin cultivarea parazitului în mediu cu o concentrație redusă de săruri biliare și colesterol, urmată de cultivarea într-o concentrație crescută de bilă, la pH alcalin (7,8). Proteinele peretelui chistului sunt transcrise, secretate în vezicule specifice stadiului de închistare și sunt transportate în peretele celular care se formează în 14-16 ore. Inchistarea a fost stopată dacă s-a adăugat colesterolul, ceea ce duce la concluzia că închistarea este asociată cu epuizarea colesterolului. G. duodenalis se găsește în tractul digestiv al unor mamifere: pisică, câine, bovine. Transmiterea la om se face după ingestia apei contaminate, ușurată de relativa rezistență a chistului la clorinare și de capacitatea acestuia de a supraviețui în apă, timp de câteva săptămâni. Transmiterea prin alimente, prin ciclul fecal-oral, în special în comunitățile de copii și prin practici sexuale care includ contactul oral-anal, reprezintă moduri alternative de transmitere a infecției.

Giardia este un organism eucariot tipic, cu nucleu distinct, delimitat de membrana nucleară, citoschelet, sistem de membrane intracelulare, nu are nucleol și mitocondrii, iar reproducerea este asexuată. Cele mai multe organisme eucariote își produc energia pe calea metabolismului aerob (Brock, 1998). Metabolismul energetic al paraziților Giardia, Trichomonas și Entamoeba este de tip fermentativ. Sinteza ATP este dependentă numai de reacțiile de fosforilare la nivelul substratului. In absența mitocondriilor, ciclul acizilor tricarboxilici este absent, deși malat-dehidrogenaza (enzimă a ciclului) este prezentă (fig. 58). In consecință, glucoza nu este oxidată complet până la CO2 și H2O, ca în metabolismul aerob, ci este catabolizată incomplet, la acetat, etanol, alanină și CO2.

Figura 58. Căile intermediare ale sintezei piruvatului (adaptare după Adam, 2001).

Calea metabolismului piruvatului (produsul căii glicolitice) este modificată în funcție de condițiile anaerobe su microaerofile. Proporția produselor finale este influențată de presiunea parțială a O2 și de concentrația glucozei în mediu. In condiții strict anaerobe, produsul major al catabolismului glucidelor este alanina. Alanina se sintetizează ca produs final principal al metabolismului energetic, iar valina este produsul secundar. G. duodenalis nu sintetizează alți aminoacizi (fig. 59).

In vitro, în prezența unor cantități mici de O2 (mai mici de 0,25 M), producerea alaninei este inhibată, dar este stimulată producerea de etanol. La concentrații mai mari de 0,46 M de O2, producerea alaninei este complet inhibată și în metabolismul energetic sunt produse acetatul și CO2.

Figura 59. Sinteza produselor finale din piruvat, la G. duodenalis. Alanina este produsă numai în condiții de anaerobioză. In reacția de decarboxilare oxidativă a piruvatului, acceptorul de electroni este feredoxina, a cărui reducere este catalizată de PFOR (piruvat-feredoxin-oxidoreductaza). In condiții de aerobioză, se formează acetatul, iar în anaerobioză pe lângă acetat, sunt produse și etanolul și alanina (după Adam, 2001).

Aceste valori sunt relevante pentru mediul intestinal, deoarece concentrația O2 variază între 0 și 60 M. O condiție specială pentru creșterea in vitro a trofozoizilor de G. duodenalis este necesarul absolut pentru concentrațiile relativ mari de cisteină, aminoacid care conferă protecție parțială față de toxicitatea O2. Alanina favorizează adaptarea trofozoiților la mediul hipoosmotic. In mediul hipoosmolar, concentrația intracelulară a alaninei scade printr-un mecanism de transport activ. Secreția alaninei se face printr-un transportor de alanină, care transportă și L-serina, glicina, L-treonina, L-glutamina și L-asparagina. Transportorul funcționează ca antiport, prin schimbul alaninei intracelulare cu alți aminoacizi din mediul extracelular.

Calea arginin-dihidrolazei este o sursă potențială de energie. Calea funcționează la unele organisme procariote, iar la eucariote funcționează la G. duodenalis și T. vaginalis. Pe calea arginin-dihidrolazei, arginina este convertită la ornitină și NH4, cu generarea ATP din ADP, prin fosforilare la nivelul substratului. Ornitina este exportată la schimb cu arginina extracelulară, printr-un mecanism de transport. Deși metabolismul este anaerob, trofozoiții produc radicali liberi ai O2, care trebuie detoxificați. La G. duodenalis, prezența SOD (superoxid dismutaza), catalazei sau peroxidazei este incertă. Ca o cale majoră a eliminării radicalilor reducerii parțiale a O2 s-a propus o NADH-oxidază producătoare de H2O. In lipsa mitocondriilor, enzimele căii glicolitice se găsesc în citosol sau pe suprafața citosolică a membranelor. Glucoza, ca sursă energetică majoră, este convertită la piruvat pe calea EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) și HMP (hexozo-monofosfatului).La majoritatea organismelor eucariote și procariote, conversia fructozo-6 fosfatului la fructozo-1,6-difosfat este o reacție ireversibilă catalizată de fosfofructokinaza dependentă de ATP.

La G. duodenalis, T. vaginalis, E. histolytica, această reacție este catalizată de o fosfofructokinază dependentă de PPi și este reversibilă. S-au identificat două enzime care convertesc fosfoenol-piruvatul la piruvat: piruvat-kinaza dependentă de ATP și piruvat-fosfat-dikinaza (PPDK – piruvat phosphate dikinase). Reacția mediată de PPDK convertește fosfoenol-piruvatul + AMP, la piruvat + 2 molecule de ATP, fiind mai avantajoasă energetic. Conversia piruvatului la acetil-CoA este catalizată de piruvat-feredoxin oxidoreductază (PFOR), care utilizează feredoxina ca acceptor de electroni, în locul piruvat-dehidrogenazei cu NAD de la eubacterii și eucariotele aerobe. De la PFOR, electronii sunt transferați la feredoxină. Sistemul enzimatic al piruvat-feredoxin-oxidoreductazei (PFOR) catalizează oxidarea piruvatului pentru a forma acetil-CoA și CO2. Feredoxina este un transportor de e-, care îi poate dona unei hidrogenaze, cu formarea H2. Feredoxinele sunt proteine cu Fe și S, care funcționează și în alte reacții: fixarea N2, fotosinteză. PFOR catalizează o reacție rapidă de schimb între CO2 și gruparea COOH a piruvatului(CH3 –CO – COOH), reacție ce poate fi folosită pentru a diferenția PFOR de alte enzime de clivare a piruvatului. In condiții reducătoare, reacția poate fi reversibilă, permițând sinteza piruvatului din acetat și CO2.PFOR are un rol important în procesele de oxido-reducere ale bacteriilor anaerobe (Clostridium). Enzima permite reutilizarea H2 ca potențial reducător, având rol de hidrogenază de înglobare. Are un potențial redox foarte mic, asemănător cu al H2 (-0,42 V).

ATP este generat prin fosforilare la nivelul substratului. Unele enzime ale căii glicolitice sunt dependente de pirofosfat (PPi), în loc de ATP, ceea ce sugerează un mecanism mai primitiv de utilizare a energiei din legătura PPi. In calea de transport a electronilor, în procesele de oxidare a substratului energetic, lipsesc citocromii. Oxidaza terminală care convertește oxigenul direct la apă, la acest organism microaerotolerant, are rolul de a proteja PFOR și feredoxinele, enzime cu potențial redox scăzut, foarte sensibile la prezența O2.

Sensibilitatea la acțiunea metronidazolului (5-nitroimidazol) constă în aceea că PFOR și feredoxina activează medicamentul in vitro și îl reduc la forma nitroso și la alți radicali (Gardner, 2001). Astfel este întrerupt fluxul electronilor și calea metabolică producătoare de energie. La tulpinile de Giardia rezistente la metronidazol, PFOR are un nivel de 5 ori mai scăzut decât la tulpinile sensibile, nivel corelat cu reducerea ratei de activare a medicamentului la forma nitroso. Efluxul crescut al metronidazolului este de asemenea implicat în protecția parazitului.

Pentru tramentul infecțiilor cu G. duodenalis s-au utilizat benzimidazolii. Efectul lor toxic se exercită, parțial, prin legarea de citoscheletul de -tubulină al parazitului. Legarea produce inhibiția polimerizării citoscheletului și a înglobării glucozei. Benzimidazolii se absorb puțin din tractul gastrointestinal, dar coingestia cu alimentele grase ameliorează absorbția.

Entamoeba histolytica este una dintre cele 6 specii de amoebe parazite ale genului Entamoeba, infecțioase pentru om. Stadiul de trofozoit a fost descris de Loesch (1875), iar forma de chist, de către Quincke și Ross (1893) (citați de Bruckner, 1992). Chiștii supraviețuiesc în apă și reprezintă forma infecțioasă prin ingestia apei. Chiștii sunt singurele forme infecțioase. Cele mai mlte cazuri clinice sunt rezultatul eliminării chiștilor de către purtătorii umani asimptomatici. Ciclul de dezvoltare cuprinde următoarele stadii morfo-funcționale: trofozoidul, prechistul, chistul, metachistul și trofozoidul metachistic. Trăsătura structurală distinctă a chistului este un perete ce se dezvoltă în jurul formei prechistice. Nucleul unic se divide și rezultă 4 nuclei. In stadiul de metachist, amoeba cu 4 nuclei este foarte activă, se separă de peretele chistului și părăsește peretele printr-un por. In trofozoidul metachistic, cei 4 nuclei se divid și formează 8 trofozoizi metachistici uninucleați, de dimensiuni mai mici. Perioada de incubare după ingestia apei contaminate cu chiști, este variabilă: zile, luni sau chiar mai mult. E. histolytica este unică printre amoebele intestinale parazite la om, deoarece poate să depășească peretele intestinal și să invadeze țesuturile. S-au identificat receptorii celulari la care aderă E. histolytica: o lectină cu galactoză. Epiteliul colonic și mucusul conțin glicoproteine cu resturi de galactoză și N-acetilgalactozamină. Metabolismul la Entamoeba este asemănător cu al Giardia și Trichomonas: anaerob, fermentativ, ca și al bacteriilor anaerobe. Entamoeba este microaerotolerantă și poate să crească în atmosferă cu 5% O2, dar metabolismul rămâne anaerob.

Amoebiaza extraintestinală s-a tratat cu metronidazol, dehidroemetină și cloroquină. Cloroquina se folosește pentru tratamentul abcesului hepatic amoebic, deoarece parazitul se concentrează în ficat, dar nu se folosește pentru tratamentul amoebiazei intestinale. Tratamentul este urmat de un amoebicid luminal: iodoquinol sau paromomicină.

Structura moleculară a cloroquinei

Efectele secundare ale metronidazolului sunt starea de rău general, gust metalic, vertij, disbioză intestinală și vaginală cu creșterea levurilor și o reacție asemănătoare cu cea produsă de desulfiram (acelerarea rapidă a circulației sângelui, tahicardie, stare de rău general, vomă, hipotensiune, vedere neclară), când administrarea sa este însoțită de consumul alcoolului.

Antibioticul macrolid azitromicină a evidențiat activitate față de E. histolytica. Are avantajul penetrării tisulare, perioadei lungi de înjumătățire, administrării orale, al toxicității scăzute, ceea ce oferă perspectiva utilizării terapeutice.

11.2. Agenți terapeutici ai infecțiilor produse de Trichomonas vaginalis

Infecția cu Trichomonas vaginalis (Donne, 1836) este transmisă sexual. Cea mai frecventă formă de infecție nevenerică este cea perinatală. Trofozoidul este flagelat și se divide prin fisiune binară. Nu se cunosc forme chistice. T. vaginalis se atașează de mucina epitelială prin intermediul unor adezine lectinice. Secretă proteaze care degradează mucina, iar prin motilitatea flagelară, colonizează celulele epiteliale. T. vaginalis nu are mitocondrii. Lipsesc caracteristicile metabolismului respirator (citocromii și fosforilarea oxidativă). T. vaginalis este anaerob, dar rata sa de creștere este stimulată de nivele scăzute de O2. Nivelul O2 de 0,025% este limita la care E. coli comută de la metabolismul aerob, cu citocrom oxidaza terminală funcțională, la metabolismul anaerob. Totuși, deși rata de creștere a T. vaginalis crește la tensiuni foarte mici parțiale ale O2, abia detectabile prin spectrofotometrie, calea sintezei ATP prin reacții de fosforilare oxidativă nu a fost exploatată. Nutrienții sunt preluați prin mecanisme active ale transportului membranar și prin fagocitoză. Energia este produsă prin glicoliza glucozei, la glicerol și succinat, în citosol, urmată de conversia piruvatului și malatului la H2 și acetat, într-un organit specific, denumit hidrogenosom. Hidrogenosomul conține componente de transport al electronilor, legate de PFOR, hidrogenază și o oxidază. Hidrogenosomii depozitează Ca sub formă legată de malat si acetat. Această structură poate fi o mitocondrie degenerată, un organit derivat din simbioza cu o bacterie înrudită cu cele care au stat la originea diferențierii mitocondriilor sau o relicvă a fuziunii timpurii dintre o celula de Archaea și o bacterie care a generat un eucariot ancestral (Petrin, 1998).

Nitroimidazolii. Clasa nitroimidazolilor utilizați în tratamentul infecțiilor cu protozoarele anaerobe include metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul și secnidazolul.

Metronidazolul (1-(-hidroxietil)-2-metil-5 nitroimidazol, cu denumirea comercială Flagyl) a fost descoperit în 1957, iar rezistența la medicament s-a raportat după 1962.

Structura moleculară a metronidazolului

Este un medicament eficient pentru tratamentul infecției cu Giardia, Entamoeba și Trichomonas. Medicamentul străbate prin difuzie pasivă membrana trofozoidului și după ce ajunge în celulă, feredoxinele (proteine de transport al electronilor), donează electronii grupării nitrice (NO2-) a medicamentului. Prin reducerea grupării NO2-, metronidazolul se activează. Medicamentul redus realizează un gradient care favorizează transportul intracelular al metronidazolului. Forma redusă funcționează ca acceptor final de electroni și se leagă covalent de macromolecula de ADN. Rezultatul legării este pierderea structurii helicale, imposibilitatea de a funcționa ca matriță pentru transcrierea ARN și ruperea catenelor, cu moartea ulterioară a trofozoidului (fig. 60).

Figura 60. Particularitatea fundamentală a metabolismului protozoarelor anaerobe, la care piruvat-feredoxin-oxidoreductaza (PFOR) funcționează în locul piruvat-dehidrogenazei organismelor aerobe. Electronii rezultați din decarboxilarea oxidativă a piruvatului (reacție catalizată de PFOR), sunt transferați la feredoxina oxidată (ox), care donează apoi electronii la NAD(P)+ (reacție catalizată de feredoxin-NAD oxidoreductază), regenerând rezerva intracelulară de NAD(P) și feredoxină oxidată. In procesul reducerii feredoxinei, este generată acetil-CoA din piruvat și CoA redusă (CoASH). Feredoxina are un potențial redox suficient de scăzut pentru a cataliza reducerea și activarea metronidazolului (R-NO2), la radicalul RNO2-, pe calea feredoxinei reduse. NADH-oxidaza are rol de oxidază terminală în transportul electronilor la O2, cu formarea H2O. NADH-oxidaza are de asemenea, capacitatea de a reduce furazolidonul la radicalul nitric, cu efecte toxice. Reacția PFOR se produce în hidrogenosomul de la T. vaginalis (după Adam, 2001).

Un efect suplimentar al metronidazolului este inhibiția transportului electronilor la feredoxină și blocarea căii metabolice a piruvatului. Metronidazolul acționează ca și nitritul de Na, prin distrugerea centrului Fe-S al PFOR, blocând producerea ATP. Activarea metronidazolului prin reacția de reducere, poate duce la formarea radicalilor toxici, care reacționează cu componentele celulare esențiale. Chiștii sunt mai rezistenți la acțiunea nitroimidazolilor, probabil datorită permeabilității reduse a peretelui celular pentru medicament. Dozele orale de metronidazol sunt ușor absorbite și se regăsesc în fluidele organismului, cu puține efecte secundare. Este eficient atât în lumenul intestinului, cât și în țesuturi. Metronidazolul este activ față de bacteriile anaerobe și protozoare, deoarece după ce a fost redus de feredoxină, care la rândul ei a fost redusă de PFOR, generează un radical nitric toxic.

Semnalarea tulpinilor rezistente de T. vaginalis nu a ridicat proporțiile epidemiei. S-a sugerat că manifestarea fenotipică a rezistenței este asociată cu pierderea vitalității parazitului, ceea ce diminuă contactul între partenerii activi sexual. Rezistența G. duodenalis la metronidazol a fost indusă in vitro și se corelează cu scăderea activității piruvat-feredoxin-oxidoreductazei a parazitului, necesară reducerii activatoare a nitroimidazolilor (Snipes și colab., 2000).

Nitroimidazolii cu un grad mai înalt de substituție (miconazol, clotrimazol, itraconazol, ketoconazol), cu activitate antifungică, nu sunt activi față de G. duodenalis.

Efectele secundare ale metronidazolului sunt cefaleea, vertigo, starea de rău general, gustul metalic. Alcoolul trebuie evitat, deoarece metronidazolul inhibă aldehid-dehidrogenaza și implicit calea de metabolizare a alcoolului, cu stare de rău general, tulburări gastrointestinale. Metronidazolul este mutagen pentru bacterii și carcinogen pentru șoarece și șobolan, administrat în doze mari pentru perioade lungi. Mutagenitatea nu s-a demonstrat față de celulele umane, ceea ce sugerează că este un medicament sigur.

Furazolidonul (un compus nitroimidazolic) este activ față de G. duodenalis. Mecanismul acțiunii constă în activarea reductivă în celula trofozoidului, dar spre deosebire de metronidazol, reducerea poate fi mediată nu numai de feredoxină, ci și pe calea NADH oxidazei. Produsele reducerii sunt toxice, lezează molecula de ADN și au efecte letale.

Quinacrina, introdusă ca agent antimalaric în 1930, este tolerată mai bine decât quinina. Quinacrina este un derivat al colorantului acridină. Este un agent de intercalare: se inseră între bazele ADN la G. duodenalis și se crede că această interacțiune produce inhibiția sintezei ADN. Toxicitatea selectivă se explică prin ratele diferite de înglobare ale medicamentului în celula de G. duodenalis și în celulele umane. In vitro, quinacrina reduce viabilitatea chiștilor și rata închistării. Medicamentul induce starea de rezistență in vitro, corelată cu diminuarea ratei de înglobare (Upcroft, 2001). Deși interacționează cu ADN, quinacrina nu este carcinogenă. Se absoarbe rapid din tractul intestinal și se distribuie larg în țesuturi. Are efecte colaterale multiple: febră, starea de rău general, vomă, vertigo, decolorarea galbenă a tegumentului, exacerbarea psoriazis, psihoză.

Paromomicina, un antibiotic din familia aminoglicozidelor, a fost izolată în 1956. Este folosită pentru tratamentul infecțiilor cu E. histolytica și T. vaginalis. Se absoarbe într-o proporție scăzută din intestin. De aceea, chiar dozele mari realizează concentrații scăzute în mediul intern și în urina pacienților cu funcție renală normală. Paromomicina inhibă sinteza proteinelor prin legarea cu subunitățile ribosomale 30 S și 50 S. ARNr de G. duodenalis are dimensiuni neobișnuit de mari.

Structura moleculară a paromomicinei

Bacitracin-zinc. Bacitracina s-a izolat în 1945, dintr-o tulpină de Bacillus și a fost folosită pentru tratamentul infecțiilor stafilococice severe, până în 1960. Datorită toxicității sale și disponibilității unor alte antibiotice, utilizarea sa s-a limitat în special la aplicare locală. Zincul a fost adăugat bacitracinei pentru a-i conferi stabilitate. Bacitracina exercită efectul antibacterian prin interferența cu sinteza componentelor membranare. Eficiența bacitracinei in vitro s-a demonstrat față de E. histolytica și Trichomonas, iar a complexului bacitracină-zinc s-a evidențiat față de G. duodenalis. Inainte de a fi acceptată în tratamentul infecției cu Giardia, sunt necesare investigații suplimentare. Utilizarea complexului bacitracină-zinc are dezavantajul unei nefrotoxicități potențiale prin administrare orală prelungită și al tulburărilor gastrointestinale.

11.3. Agenți terapeutici antimalarici

Plasmodium spp face parte din grupul protozoarelor sporozoare. Sporozoarele nu au organite de locomoție, deși unele formează pseudopode, iar uneori, gameții au mobilitate flagelară. Sporozoarele sunt un grup mare de protozoare, toate parazite obligate, unele pentru o singură gazdă, altele pentru două, în ciclul infecțios în care se succed tipuri morfologice și fiziologice distincte. Modul de nutriție este particular: hrana nu este ingerată, ci este absorbită în formă solubilă, prin învelișul extern, ca la bacterii și fungi. Denumirea de “sporozoare” presupune formarea sporilor în ciclul de viață. Totuși, nu formează spori adevărați de tipul celor fungici, ci numai structuri analoge denumite sporozoizi, implicați în transmiterea la un nou tip de gazdă (Starr și colab., 1981). Cei mai importanți membri ai grupului sunt coccidiile, parazite la păsări și plasmodiile (agenții malariei), infecțioase pentru păsări și mamifere, inclusiv pentru om. Omul este infectat de 4 specii de Plasmodium care produc malaria: P. vivax, P. falciparum, P. malariae, P. ovale. Toate necesită o alternanță de gazde, om-țânțar. Speciile de Plasmodium diferă morfologic, prin unele aspecte ale ciclului de viață și prin severitatea malariei. Cel mai răspândit este P. vivax. Parazitul își desfășoară o parte a ciclului de viață la om și alta la țânțar, vectorul care-l transmite de la om la om. Sunt implicați numai țânțarii din genul Anopheles. Malaria este o boală infecțioasă, foarte frecventă în zonele tropicală și subtropicală. Cea mai caracteristică trăsătură a malariei este reacția febrilă paroxistică, la intervale de 1-3 zile, care alternează cu stări fiziologice normale. Gazdele sporozoarelor sunt specii de nevertebrate, dar mai ales vertebrate. Unele prezintă o alternanță obligatorie a gazdelor, deoarece unele stadii ale ciclului se desfășoară la o gazdă, iar alte stadii au loc în organismul altei specii gazdă. Omul este infectat prin înțepătura femelei de țânțar, care își inseră trompa direct într-un capilar sanguin, unde inoculează sporozoizii. Sporozoizii plasmodiali sunt celule alungite care se formează în organismul țânțarului și se localizează în glanda salivară a insectei. Sporozoizii sunt transportați cu torentul sanguin în tot organismul, dar sunt reținuți de celulele sistemului fagocitar mononuclear din ficat (celulele Kupffer), splină și din ganglionii limfatici. Nu se cunosc mecanismele prin care parazitul străbate epiteliul capilarelor sinusoide pentru a ajunge în spațiul Disse sau trec prin celulele Kupffer din pereții capilarelor sinusoidale pentru a ajunge în hepatocite. Interacțiunea cu hepatocitul, probabil este mediată de receptori: proteina majoră a a membranei sporozoidului interacționează specific cu receptorii membranei hepatocitului (fig. 61).

Figura 61. Ciclul de viață al parazitului malariei (Plasmodium sp.) în organismul țânțarului (gazda definitivă), respectiv și respectiv al gazdei intermediare (mamifere, om) (dupa Phillips, 2001).

In ficat, sporozoidul crește și se transformă în schizont. Schizontul se fragmentează în mii de celule fiice mici, denumite merozoizi, care sunt eliberați din ficat în sânge. Creșterea și diviziunea parazitului malariei în hepatocit durează 6-15 zile, în funcție de specie (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae). La sfârșitul ciclului preeritrocitar, mii de merozoizi sunt eliberați din hepatocite, prin sinusoide, în sânge și în 15-20 de secunde se fixează pe suprafața eritrocitelor și le invadează. Recunoașterea și legarea se fac printr-o interacție foarte specifică între ligandul merozoidului și membrana eritrocitară. In eritrocit, merozoizii se multiplică. La P. vivax și P. orale, unii sporozoizi, după 24 de ore de dezvoltare în hepatocite, reiau ciclul de multiplicare hepatică, sau trec într-un stadiu dormind, de hipnozoid, unde produc o infecție persistentă, de lungă durată (luni sau chiar ani de zile), rezistentă la tratamentul infecției sanguine și se reactivează după întreruperea tratamentului (Phillips, 2001). Stadiul latent se reactivează pentru completarea ciclului hepatic și eliberarea merozoizilor în sânge. Merozoizii infectează hematiile, inițiind stadiul de schizont eritrocitar. La P. vivax, ciclul multiplicării în hematie și liza ei durează 48 de ore. Stadiul multiplicării eritrocitare este însoțit de simptomele alternante de febră și frig. Senzația de frig apare când din eritrocite se eliberează o nouă generație de paraziți. Cele mai multe plasmodii tinere, eliberate din eritrocitul lizat, reiau ciclul infecțios în noi eritrocite. O parte dintre merozoizi, în interiorul eritrocitului, se diferențiază în celule specializate. Acestea sunt celule sexuale (gametocite). Gametociții eliberați din eritrocite nu pot să infecteze alte eritrocite și sunt infecțioase numai pentru țânțar. Gametociții sunt celule sexuate care se deosebesc de celulele vegetative, atât ca aspect cât și în ceea ce privește sensibilitatea la medicamentele antimalarice. Nu se dezvoltă în organismul uman și nu au importanță pentru producerea simptomelor malariei. Gametociții sunt ingerați de gazdă odată cu sângele, prin înțepătură. Infecția țânțarului începe odată cu ingestia celulelor sexuale ale parazitului. Gametocitele se maturează și rezultă gameți masculi și femeli. Doi gameți cu polaritate sexuală opusă fuzionează și formează un zigot. După fertilizare, zigotul se maturează în 24 de ore în ookinet mobil. Ookinetul se deplasează prin mișcare amoeboidală printre celulele epiteliale ale intestinului mijlociu al țânțarului și se închistează pe lamina bazală (stratul matriceal extracelular ce separă hemocelul de regiunea mijlocie a intestinului). Pe lamina bazală, zigotul devine chist de reproducere, care crește progresiv prin diviziuni celulare mitotice succesive. Una dintre diviziuni este meiotică și în oochist se formează un număr mare de celule asexuate, denumite sporozoiți. Ruperea oochistului eliberează sporozoizii, care migrează prin hemocel și ajung în glanda salivară a țânțarului, pentru a completa ciclul în 7-18 zile după ingestia gametocitului, de unde sunt inoculați la o nouă gazdă umană. Toate stadiile ciclului sunt haploide, cu excepția zigotului diploid, care imediat după fertilizare suferă o diviziune meiotică în două stadii, rezultând celula cu un nucleu cu 4 genomuri haploide. Infecția plasmodială a gazdei nu interferă cu funcțiile fiziologice ale insectei, ceea ce denotă că raporturile lor sunt vechi și în evoluție s-a produs o selecție a variantelor de Plasmodium, capabile să conviețuiască cu insecta. La om însă, malaria este o boală gravă, uneori mortală. Datele disponibile sugerează existența a 200-300 milioane de persoane infectate cu agentul malariei, dintre care anual mor circa 2 milioane. Maladia clinică este produsă numai de paraziții asexuați eritrocitari. Paraziții hepatici persistenți și cei din stadiul sexuat (gametocite) nu produc simptome clinice.

Plasmodium nu a fost cultivat pe medii artificiale. Studiile s-au făcut pe stadiul infecțios eritrocitar. Hematiile infectate pot fi separate din sânge și pot fi incubate in vitro, în condiții care permit multiplicarea parazitului. Parazitul are propriul sistem enzimatic generator de energie. Nu sintetizează CoA, pe care o preia din eritrocit. Sintetizează acidul folic, dacă este disponibil precursorul acestuia, acidul para-amino-benzoic. Pentru sinteza proteinelor proprii, parazitul folosește aminoacizii derivați din hemoglobină, cea mai abundentă proteină eritrocitară (circa 90% din totalul proteinelor eritrocitare). Hemoglobina este endocitată prin pinocitoză și este hidrolizată la amnoacizi. Deoarece produsele de degradare ale hemoglobinei – feroporfirinele – sunt toxice pentru membrane, parazitul sechestrează aceste produse. Hematia mamiferelor nu conține ADN, ci numai mici cantități de ARN, ceea ce denotă că, probabil, parazitul sintetizează bazele purinice și pirimidinice, pornind de la aminoacizi. Probabil că permeabilitatea foarte mare a membranei celulare, permite preluarea unor molecule mari din eritrocit. Permeabilitatea crescută, determină pierderea rapidă a macromoleculelor în mediul extracelular, ceea ce explică parazitismul său obligat și imposibilitatea de a crește pe medii artificiale. Probabil există diferențe fiziologice între stadiul infecțios pentru eritrocite și cel infecțios pentru celulele hepatice. Schizontul eritrocitar pare adaptat să utilizeze numai hemoglobina ca sursă de aminoacizi. In zonele calde ale globului, unde țânțarii sunt numeroși, malaria este o infecție endemică. In aceste regiuni, indivizii umani dobândesc rezistență la infecția cu Plasmodium. In Africa de Vest, rezistența la malaria cauzată de P. falciparum este asociată cu prezența în hematii, a hemoglobinei S, care diferă de hemoglobina A, printr-un singur aminoacid în cele două jumătăți simetrice ale moleculei. In hemoglobina S, valina este înlocuită cu acidul glutamic. Hemoglobina S are afinitate scăzută pentru O2, ceea ce creează condiții nefavorabile pentru Plasmodium, care are un metabolism strict aerob și nu se dezvoltă la fel de bine în hematiile S, ca în hematiile cu hemoglobină normală A. Corelat cu afinitatea mai mică a hemoglobinei S față de O2 este faptul ca indivizii suportă greu altitudinile mari, la care presiunea O2 este mai mică, dar în regiunile joase, dezavantajul creat de hemoglobina S nu este evident. In unele regiuni mediteraneene, unde malaria este endemică, rezistența la P. falciparum este asociată cu deficiența în hematii, a enzimei glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza. Pe baza corelațiilor dintre tipul de hemoglobină și gradul de sensibilitate la infecția cu Plasmodium, se consideră că parazitul malariei a fost unul dintre factorii importanți în evoluția sub raport biochimic a speciei umane.

Primul medicament antimalaric a fost quinina, activ față de stadiile eritrocitare asexuate ale tuturor speciilor de Plasmodium. Este gametocid pentru toate speciile, cu excepția P. falciparum. Quinina este un agent de intercalare în molecula de ADN și inhibă sinteza ADN și ARN.

Structura moleculară a quininei

Chinidina, un medicament antiaritmic, izomerul optic D al chininei, este de 2-3 ori mai activă decât quinina.

Agenții antimalarici sunt împărțiți în funcție de stadiile ciclului de viață a parazitului, a cărui dezvoltare o inhibă: sporonticide, gametocide, schizonticide (sanguine și tisulare).

Schizonticidele sanguine (chinina, clorochina, meflochina) se folosesc în tratamentul infecțiilor cu Plasmodium falciparum și P. malariae, iar schizonticidul tisular primaquina este utilizat în tratamentul infecției cu P. vivax și P. orale.

Cloroquina este o bază slabă, folosită ca agent antimalaric din deceniul 5 al secolului trecut, dar capacitatea ei de a crește pH veziculelor acide a fost considerată mult mai târziu. Capacitatea bazelor slabe de a crește pH intravezicular a fost presupusă de de Duve, pentru a explica inhibiția catabolismul proteinelor de către lizosomii celulei mamaliene. Cloroquina poate să inhibe degradarea hemoglobinei ingerată de parazit prin creșterea pH al vacuolei digestive, peste valoarea optimă a activității proteazelor. Mecanismul cel mai probabil, prin care cloroquina determină creșterea pH intravezicular este capacitatea veziculei parazitului de a concentra cloroquina, la valori de peste 100 de ori mai mari decât cele din veziculele celulei mamaliene (Hemingway, 2003). Vezicula de endocitoză a parazitului are un mecanism de concentrare a cloroquinei. Dar enzimele lizosomale ale parazitului sunt active la o variație largă a pH. Creșterea pH vezicular poate omorî parazitul prin inhibiția transferului hemoglobinei spre vacuola digestivă a parazitului. Atât cloroquina cât și quinina acționează, probabil, prin formarea unui complex cu feroprotoporfirina, efectul fiind blocarea transferului pigmenților în vezicula de endocitoză. Se produce liza timpurie a eritrocitului, înainte de desfășurarea stadiului specific al dezvoltării parazitului.

Sulfonamidele și inhibitorii dihidrofolat-reductazei (trimetoprim, tetroxoprim – vezi agenți chimioterapeutici ai infecțiilor bacteriene) sunt activi față de agenții malariei, prin inhibiția sintezei acidului folic, după același mecanism prin care acționează asupra celulelor bacteriene. Acidul p-aminobenzoic și acidul folic reversează efectele sulfonamidelor, ceea ce sugerează că acești agenți sunt activi prin inhibiția căii sintezei acidului folic.

Bibliografie selectivă

Adam R.D., The biology of Giardia spp.Microbiology Reviews, 1991, 55(4): 706-732.

Brock Th., Biology of microorganisms- Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1988.

Bruckner D. A., Amebiasis. Clinical Microbiology Reviews, 1992, 5(4): 356-369.

Gardner T.B., Hill D.R., Treatment of Giardiasis. Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14(1): 114-128.

Hemingway J., Bates I., Malaria: past problems and future prospects – EMBO Reports. 2003, 4(Supp1): S29-S31.

Moulder J.W., Comparative biology of intracellular parasitism – Microbiology Reviews, 1985, 49(3): 298-337.

Petrin D., Delgaty K., Bhatt R., Garber G.- Clinical and Microbiological Aspects of Trichomonas vaginalis – Clinical Microbiology Reviews, 1998, 11(2): 300-317.

Phillips R.S., Current Status of Malaria and Potential for Control- Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14(1): 208-226.

Snipes L.J., Gamard P.M., Narcisi E.M., Beard C.B., Lehmann T., Secor W.E.- Molecular Epidemiology of Metronidazole Resistance in a Population of Trichomonas vaginalis Clinical Isolates. Journal of Clinical Microbiology. 2000, 38(8): 3004-3009.

Starr M. P și colab., The Prokaryotes, Springer Verlag, Berlin, New York, 1981.

Topley and Wilson’s, Microbiology and Microbial Infections, vol. I, II, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998.

Upcroft P., Upcroft J. A., Drug Targets and Mechanisms of Resistance in the Anaerobic Protozoa- Clinical Microbiology Reviews, 2001, Jan, 14(1): 150-164.

Capitolul 12

AGENȚI TERAPEUTICI AI INFECȚIILOR VIRALE

Cei mai simpli agenți infecțioși sunt cel mai greu de controlat. Dificultatea majoră în calea găsirii unor agenți antivirali, se datorează incapacității agenților chimici de a discrimina între mecanismele multiplicării virale și procesele de biosinteză celulară. Discriminarea acestor procese nu este posibilă, deoarece moleculele specific virale sunt sintetizate de aparatul celular: ribosomii și enzimele sintezei proteice. Din această cauză, chimioterapia infecțiilor virale rămâne o problemă majoră a cercetării biomedicale. Insuccesele terapiei infecțiilor virale, comparativ cu succesele terapiei infecțiilor bacteriene, se datorează diferențelor fundamentale între bacterii și virusuri: bacteriile sunt organisme autonome, cu metabolism propriu, iar virusurile sunt entități cu organizare acelulară, care interacționează cu substratul celular viu într-o modalitate specifică, prezentând un parazitism absolut, de nivel genetic, neîntâlnit la bacteriile parazite.In contrast cu infecțiile bacteriene, la care semnele și simptomele maladiei însoțesc multiplicarea bacteriană, în cazul infecțiilor virale, simptomele clinice apar numai după o perioadă de incubație adecvată, timp în care multiplicarea virală atinge o rată maximă (Topley și Wilson’s, 1990). De aceea, terapia instituită la apariția semnelor clinice ale infecției virale va fi tardivă. S-au identificat totuși, molecule specifice multiplicării virale și agenți chimici care interferă cu aceste molecule și inhibă multiplicarea virală. Activitatea antivirală a unui compus, demonstrabilă in vitro, nu este suficientă pentru a-l utiliza în clinică. Introducerea în clinică a unui agent antiviral este rezultatul unor studii preclinice foarte laborioase.

Agenții antivirali trebuie să îndeplinească anumite condiții:

– să prezinte specificitate pentru un țesut sau organ țintă, în care este localizată infecția virală;

– să nu fie toxici pentru celule;

– să fie activi atât intra- cât și extracelular;

– să fie stabili din punct de vedere metabolic.

Foarte puține infecții virale beneficiază de tratamentul chimioterapic: herpesvirusuri (herpes simplex și virusul zona zoster), HIV, gripa. Cele mai bune ținte pentru inhibiția cu agenți antivirali sunt reprezentate de molecule care îndeplinesc o funcție specific virală și care nu au corespondent în celula gazdă. Pentru a identifica moleculele specific virale cu care pot interacționa agenții antivirali, este importantă caracterizarea moleculară a virusului, structura genomului, dar este necesară cunoașterea evenimentelor moleculare ale multiplicării virusului. Toate treptele multiplicării virale sunt ținte potențiale pentru acțiunea agenților antivirali, dar evenimentele timpurii (atașarea, penetrarea, dezvelirea), sinteza acizilor nucleici și a proteinelor specific virale, asamblarea și eliberarea se aseamănă cu procesele celulare normale și sunt catalizate, adeseori, de enzime celulare. Sinteza acizilor nucleici virali este una dintre țintele predilecte ale agenților antivirali, pentru că se deosebește de sinteza acizilor nucleici celulari și este catalizată de enzime specific virale: polimerazele ce catalizează sinteza ADN sau ARN viral și kinazele care fosforilează nucleozidele sunt ținte pentru agenții antivirali. Funcțiile acestor enzime sunt adeseori inhibate selectiv de agenții antivirali, la concentrații semnificativ mai mici decât cele inhibitoare pentru enzimele omologe ale celulei gazdă. Timidin-kinazele catalizează fosforilarea C5’ al pentozei, prima treaptă a sintezei nucleozidelor pirimidinice (timidina, citidina), pentru a fi încorporate în ADN. Nucleozid-kinazele și polimerazele ADN sunt codificate de gene virale și de gene celulare (Lehninger, 1975). Proprietățile lor diferă foarte mult în ceea ce privește specificitatea de substrat, afinitatea de legare și sensibilitatea față de diferiți compuși chimici. Pe aceste diferențe se bazează utilizarea analogilor nucleozidelor chimici în terapia antivirală.

12.1. Analogii nucleozidelor

Analogii nucleozidelor sunt fosforilați de nucleozid-kinazele virale și celulare și sunt încorporați în catene ADN de către ADN- polimeraze, intrând astfel în competiție cu nucleozidele naturale (Bryant, 2001). Analogii vechi ai nucleozidelor (idoxuridina, trifluorotimidina, vidarabina) sunt relativ toxici pentru organismul uman.

Idoxuridina și trifluorotimidina se leagă cu afinitate egală de chinazele virale și celulare, dar sunt inhibitori mai buni ai ADN-polimerazelor virale. Efectul lor este scăderea ratei de sinteză a ADN în celulele infectate și neinfectate. Administrarea sistemică a idoxuridinei pacienților cu encefalită herpetică, nu a scăzut riscul de deces, iar mielosupresia este accentuată la aproape toți indivizii tratați. Insă, compusul este mult mai eficient și are o toxicitate mult mai scăzută atunci când este administrat local (în keratite herpetice).

Vidarabina este analogul adenozinei. S-a sintetizat și s-a studiat ca agent antitumoral.

Structura moleculară a bazele azotate componente ale acizilor nucleici (ciotzina, timina, uracilul, adezina, guanina)

Structura moleculară a vidarabinei Structura moleculară a idoxuridinei

Ulterior s-a evidențiat că vidarabina este activă față HSV, VZV, CMV, virusul vaccinal și unele retravirusuri tumorale. Mecanismul de acțiune implică fosforilarea nucleozidului de către enzimele celulare și încorporarea în catena de ADN viral și celular, în curs de sinteză, rezultatul fiind încetinirea ratei sintezei ADN. Vidarabin-trifosfatul este un inhibitor competitiv al ADN-polimerazei celulare și virale. Este mai activ față de enzimele virale, ceea ce face să aibă efect inhibitor selectiv față de sinteza ADN viral. Vidarabina inhibă și alte trepte ale sintezei acizilor nucleici: poliadenilarea ARN și deoxinucleotidil-transferaza terminală. Inhibă o enzimă de metilare a ARNt și ARNm. Acest efect face ca vidarabina să fie toxică pentru celulele mononucleare. Se folosește ca unguent ocular pentru tratamentul cheratitei herpetice. Pentru tratamentul infecțiilor herpetice prin administrare intravenoasă, vidarabina a fost înlocuită de acyclovir, datorită slabei solubilități în apă și toxicității relativ ridicate.

Ribavirina, un analog sintetic al nucleozidelor purinice(1–D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-carboxiamida), a fost sintetizată la începutul anilor ‘70. Din punct de vedere structural se aseamănă cu guanozina și inozina. In vitro este activă față de o gamă foarte variată de virusuri ADN și ARN: adeno-, herpesvirusuri, influenza A și B, virusul respirator sincițial, buniavirusuri, arenavirusuri, reovirusuri și HIV.

Structura moleculară a ribavirinei

S-au propus trei mecanisme de acțiune, ceea ce explică spectrul său larg de activitate.

a) Medicamentul difuzează ușor în celulele eucariote, unde este convertit de către enzimele celulare, la mono-, di- și trifosfat. Ribavirin-monofosfatul este un inhibitor puternic al IMP (inozin-monofosfat) dehidrogenazei, o enzimă esențială pentru sinteza GTP. Rezultatul este scăderea concentrației celulare a guanozin-nucleotidului, necesar replicării ADN celular și viral.

b) Inhibă procesul de bonetare (capping) al ARNm viral, etapa esențială a traducerii mesajului în proteine virale;

c) Inhibă direct ARN-polimeraza dependentă de ARN a virusurilor influenza și întârzie inițierea și alungirea copiilor de ARNm.

Ribavirina nu este încorporată în structura acizilor nucleici și nici nu determină terminarea transcrierii ARNm. Ribavirina este toxică: produce anemie și este embriotoxică. Anemia apare ca o consecință a difuziei și acumulării acestui compus în eritrocit, unde nu este inactivat prin defosforilare, deoarece eritrocitul nu posedă fosfataze. Astfel, eritrocitele sunt scoase prematur din circulație. La doze mari, ribavirina inhibă eritropoeza în măduva osoasă. Efectele toxice sunt reversibile după oprirea tratamentului, dar timpul de înjumătățire al ribavirinei este de 40 de zile și efectele se prelungesc după oprirea tratamentului. Nu se administrează gravidelor, deoarece puii de șoarece se nasc cu malformații scheletice și probabil efecte asemănătoare s-ar produce asupra fătului uman. Ribavirina se folosește în tratamentul febrei de Lassa. Rata morții pacienților infectați cu arenavirusul febrei de Lassa este de 55-76%, dar scade la 5-9% la cei tratați. Ribavirina se administrează chiar profilactic la cei cu risc mare pentru febra de Lassa. Febra de Lassa este o infecție hemoragică, produsă de un arenavirus (virusul corio-meningitei limfocitare – LCMV), răspândită prin urina rozătoarelor infectate, în ariile endemice (în Africa de vest) și adeseori este fatală. După o săptămână de febră și complicații nespecifice, apare hemoragia, în special în tractul gastrointestinal și chiar moartea prin șoc hipovolemic. Febra hemoragică cu sindrom renal este cauzată de virusul Hantaan (un bunyavirus), transmis prin urina rozătoarelor.

Medicamentul traversează bariera hemato-encefalică și în lichidul cerebrospinal realizează concentrații de 50-100% din cele serice. De aceea se folosește pentru tratamentul encefalitelor. În 1986 a început administrarea sub formă de aerosoli pentru tratamentul infecțiilor cu virusul respirator sincițial.

Analogii nucleozidici utilizați în prezent în chimioterapia antivirală, sunt mai puțin toxici: acyclovirul este activat numai in celulele infectate de virus, iar zidovudina inhibă reverstranscriptaza, enzimă absentă în celulele normale ale organismului.

Acyclovir cunoscut sub denumirea comercială de zovirax (9-(2-hidroxietoximetil) guanina), are cel mai bun index terapeutic dintre toți agenții antivirali în uz și este intens utilizat pentru tratamentul infecțiilor cu virusul herpes simplex (Gold și Corey, 1986) A fost descoperit în anii ‘70 de către Elion și colab., într-un screening pentru compuși cu activitate antivirală. Din punct de vedere chimic este un analog structural al guanozinei, care în locul ribozei, la baza azotată este atașată o catenă laterală neciclică, careia ii lipsesc atomii de C 2’ si 3’. Acyclovir inhibă multiplicarea HSV-1, HSV-2, VZV, cu toxicitate minimă pentru celulă. Este mai puțin eficient față de EBV, CMV sau HH-6 (Acosta și Balfour, 2001).

Structura moleculară a acyclovirului Structura moleculară a guanozinei

Acyclovir difuzează liber în toate celulele, infectate și neinfectate, dar se activează și se acumulează numai în celulele infectate cu herpesvirusuri, deoarece prima treaptă a activării sale, fosforilarea în poziția 5’ a catenei laterale, este catalizată numai de timidin-kinaza (enzimă care catalizează fosforilarea C5’ al pentozei, prima etapă a modificării nucleozidelor pirimidinice pentru încorporarea în ADN) specific virală și în măsură nesemnificativă, de timidin-kinaza celulară.

Afinitatea Tk HSV pentru acyclovir este de circa 3 milioane de ori mai mare decât a Tk celulare. Acyclovir este fosforilat mult mai rapid și de aceea este încorporat preferențial în ADN. Fosforilările ulterioare la formele difosfat și respectiv trifosfat (activ) sunt catalizate de kinazele celulare. In cursul replicării ADN, acyclovir-trifosfatul intră în competiție cu dGTP, care este substratul natural al ADN-polimerazei virale. ADN-polimerazele catalizează încorporarea nucleotid-trifosfaților: cele specific virale sunt de circa 30 de ori mai sensibile la acțiunea inhibitorului, decât ADN-polimeazele umane. Datorită faptului că molecula de acyclovir încorporată nu oferă gruparea 3’OH, următoarea nucleotidă nu mai este legată și replicarea ADN este blocată. Odată cu legarea moleculei de acyclovir la ADN, se formează un complex ternar la care participă acyclovir, ADN-polimeraza și următorul nucleotid, ceea ce duce la scăderea amplă a sintezei ADN viral. Toate aceste proprietăți fac ca acyclovirul să aibă acțiune foarte selectivă asupra multiplicării virale, efectele sale asupra replicării ADN celular fiind nesemnificative. Replicarea ADN al HSV este de 3000 de ori mai sensibilă decât replicarea ADN celular.

Virusurile care codifică sinteza unor enzime ale căror omologe există și în celulă, au avantajul că se pot multiplica în celulele care nu se divid. Herpesvirusurile se deosebesc foarte mult între ele, în privința sensibilității la acyclovir (Bacon și colab., 2003). HSV este un amestec de tulpini Tk+ și Tk-. Tulpinile Tk- au capacități limitate de a stabili infecții latente în neuroni, care să se și activeze. Predomină tulpinile Tk+, deoarece sunt mai neurovirulente și au avantajul selectiv de a stabili infecții latente în ganglionii senzitivi, cu capacitatea de reactivare. Astfel, HSV-1 și HSV-2 sunt extrem de sensibile, necesitând in vitro concentrații de 0,04-0,4 g/ml pentru a obține inhibiția replicării cu 50%. In schimb, Tk VZV nu fosforilează acyclovir la fel de eficient ca enzima omologă de la HSV-1 și HSV-2. Astfel se explică sensibilitatea de 8-10 ori mai mică a VZV la acyclovir. CMV necesită concentrații foarte mari de acyclovir pentru blocarea multiplicării virale, deoarece acest virus nu codifică o Tk proprie. Nu se știe dacă virusul Epstein-Barr codifică o Tk capabilă să activeze acyclovir. Acyclovirul nu poate acționa în faza de latență a nici unuia dintre virusurile herpetice. Un avantaj major al tratamentului cu acyclovir îl reprezintă absența unor efecte grave de toxicitate. Administrarea intravenoasă produce o creștere tranzitorie a nivelului seric de creatinină, datorată probabil unei obstrucții la nivelul tubulilor renali. In literatura de specialitate a mai fost descris un sindrom neurologic tranzitoriu, ale cărui manifestări clinice sunt confuzia, letargia, rareori halucinații și comă. Acest sindrom apare la pacienții imunosupresați, care primesc intravenos doze foarte mari de acyclovir. Acyclovirul previne recurența herpetică. După aplicare zilnică, în doze mici, sunt suprimate aproape complet recurențele frecvente. Nu produce efecte secundare, chiar după administrare prelungită. Dacă este administrat profilactic, la pacienții expuși radiației UV solare sau artificiale, acyclovirul oral scade frecvența leziunilor herpetice, care se declanșează în intervalul 2-7 zile, dar nu influențează leziunile care apar în primele 48 de ore de la expunerea la agenții declanșatori. Leziunile care apar în primele 48 de ore sunt consecința reactivării unor tulpini mai virulente, pe fondul unei reactivități imunitare suboptimale. Acyclovirul reduce la 14% morbiditatea encefalitei herpetice.

Structura moleculară a citozin-arabinozidei

Rezistența la acyclovir se instalează după administrarea pentru perioade lungi de timp, a dozelor care nu suprimă multiplicarea virală, În condițiile presiunii selective, datorată administrării acyclovirului, tulpinile Tk+ nu se pot multiplica și o proporție importantă de virioni suferă conversie de la Tk+ la Tk- sau la forme care au capacitate redusă de a codifica Tk. Astfel de mutante sunt rezistente, deoarece nu fosforilează acyclovir. După oprirea tratamentului, tulpinile Tk- reversează la Tk+- Un alt mecanism de rezistență este expresia unei ADN-polimeraze cu afinitate redusă pentru acyclovir-trifosfat și respectiv expresia unei Tk cu proprietăți alterate de legare a medicamentului. In aceste cazuri, se recomandă administrarea foscarnet, cu un mecanism de acțiune diferit.

Gancyclovir (1,3-dihidroxi-2-propoximetil guanina), este un analog nucleozidic asemănător acyclovirului, cu deosebirea că mai conține o grupare hidroximetil ce se comportă asemănător cu gruparea 3’hidroxil a ribofuranozei. Este activ față de toate virusurile herpetice umane și este de 100 de ori mai eficient în comparație cu acyclovir, față de CMV uman. Toxicitatea este însă mult mai mare decât a acyclovir și din această cauză este folosit doar în cazul pacienților imunocompromiși cu infecții severe provocate de CMV.

Structura moleculară a gancyclovirului

Nu se cunoaște mecanismul care face ca gancyclovirul să fie mult mai eficient decât acyclovir în tratamentul infecțiilor produse de CMV. CMV nu posedă activitate timidin-kinazică (este Tk-). In celulele infectate cu CMV, gancyclovir este activat de timidin-kinaza celulară și se acumulează în concentrație mai mare decât acyclovir. Gancyclovir-trifosfatul (forma activă a gancyclovirului) este încorporat în catenele ADN virale, ceea ce duce la scăderea ratei replicării genomului viral. Datorită prezenței grupării 3’OH, gancyclovir nu funcționează ca un terminator al sintezei catenei DNA. Acest compus are efecte mitogene asupra celulelor mamaliene, este carcinogen și embriotoxic. La om produce efecte toxice asupra măduvei osoase, la circa 25% dintre cazurile tratate. Studii recente au arătat că la 8% dintre pacienții tratați cu gancyclovir pentru o perioadă mai mare de 3 luni, tratamentul a eșuat, ceea ce sugerează posibilitatea selectării unor tulpini virale rezistente la acest compus.

12.2. Amine ciclice

Adamantanii (amantadina și derivatul ei -metil-amantadina sau rimantadina) sunt utilizați pentru tratamentul infecțiilor cu virusul influenza. Din punct de vedere chimic, sunt amine ciclice care derivă formal de la hidrocarbura policiclică adamantan.

Amantadina este o amină triciclică, derivatul 1-amino al adamantanului, un compus complex cu 10 atomi de C, cu o structură de colivie.

Rimantadina este un derivat aproape identic, metilat, al amantadinei. Ambele inhibă multiplicarea virusului influenza A in vitro și in vivo, dar nu inhibă virusul influenza B.

Structura moleculară a amantadinei Structura moleculară a rimantadinei

Mecanismul de acțiune și spectrul activității antivirale sunt identice, însă rimantadina este metabolizată diferit de amantadină și produce efecte secundare (febră, insomnie, dificultăți de concentrare). Amantadina blochează faza timpurie a infecției – dezvelirea- dar influențează și fazele tardive ale multiplicării: asamblarea virionilor și înmugurirea (Brady și colab., 1990). Sensibilitatea virusurilor gripale la amantadină este determinată de prezența proteinei M2 la nivelul membranei plasmatice a celulelor infectate și în cantitate foarte mică în structura virionilor. S-a presupus că această proteină ar forma canale ionice care ar permite trecerea protonilor din endosom spre interiorul virionului ducând la scăderea pH, ceea ce determină eliberarea nucleoproteinei virale în citoplasma celulei infectate. In cursul procesului de asamblare virală, protonii sunt transferați invers, la exteriorul veziculei de exocitoză, proteina M2 menținând nivelul pH peste valoarea la care intregritatea hemaglutininei virale ar fi afectată și nu ar mai putea fi încorporată în peplosul viral. Se pare că amantadina blochează mecanismul de transfer al protonilor mediat de proteina M2, inhibând dezvelirea virionilor, maturarea virionilor sau ambele procese. În absența acidifierii regiunii centrale a virionului în endosom, proteina M1 nu se disociază de complexul ribonucleoproteic și acesta nu este transferat spre nucleu. Amantadina este mai eficace dacă în organism se găsesc anticorpii specifici preformați. In vitro, la concentrații mult mai mari, adamantanii blochează multiplicarea și a altor virusuri ARN: influenza B și paramixovirusuri. Din această cauză, adamantanii se folosesc doar pentru tratamentul infecțiilor cu influenza A. Variantele virale rezistente apar rapid, în 5-7 zile de terapie: 16-45% dintre izolate virale pot fi rezistente.

Ambele medicamente se găsesc în formulări pentru administrare orală. Amantadina atinge nivelul maxim în plasmă la 2-4 ore după administrarea orală și peste 90% reapare nemodificată în urină. Se excretă prin secreție tubulară și filtrare glomerulară. Rimantadina se absoarbe bine după administrare orală (90%) și atinge valori plasmatice inferioare amantadinei. Este metabolizată în proporție mare și este eliminată prin mecanisme renale. Circa 10% se elimină nemodificată. Efectele adverse sunt determinate de tulburări ale activității SNC: nervozitate, vertigo, insomnie.

Administrarea profilactică a celor doi compuși, în cazul unei epidemii, reduce riscul îmbolnăvirii cu 50-90%. Ambii compuși sunt mai eficienți în prevenirea apariției simptomelor clinice tipice infecției cu virusul influenza A, decât în prevenirea apariției infecției propriu-zise. Deși este eficientă și are toxicitate scăzută, amantadina a fost un eșec comercial, deoarece majoritatea indivizilor optează pentru vaccin sau pentru îmbolnăvire, decât să facă profilaxie zilnică. Rimantadina este utilizată profilactic pentru a proteja persoanele care nu au fost vaccinate sau nu pot beneficia de vaccin și care au un risc crescut de a face complicații consecutive infecției cu virusul gripal A.

12.3. Inhibitori ai sintezei proteinelor virale: methisazone (-thiosemicarbazone)

Methisazone (-thiosemicarbazone) este un compus sintetic antiviral, inhibitor al multiplicării poxvirusurilor.

Structura moleculară a methisazonei

Pentru ca efectele inhibitorii să fie demonstrabile, compusul trebuie să fie administrat la inițierea procesului infecțios. Mecanismul de acțiune este ipotetic: pare să inhibe traducerea ARNm viral tardiv. Consecința este o reducere netă a sintezei proteinelor virale tardive, prin dezorganizarea polisomilor. Odată cu eradicarea variolei, medicamentul a ieșit din uz.

12.4. Foscarnet

Foscarnet (fosfono-formiat trisodic) este un analog al pirofosfatului, care nu se aseamănă cu nici un alt medicament antiviral utilizat în clinică. A fost sintetizat la sfârșitul anilor ‘70 ca o alternativă (mai puțin toxic și mai eficient) la acidul fosfonoacetic. Medicamentul este foarte util pentru tratarea infecțiilor cu virusuri herpetice rezistente la acyclovir.

Structura moleculară a foscarnetului

Spre deosebire de compușii antivirali analogi ai bazelor azotate, foscarnet nu necesită o activare prealabilă sub acțiunea kinazelor virale sau celulare. Foscarnet funcționează ca un inhibitor necompetitiv al ARN- și ADN-polimerazelor, legându-se la situsul de legare al pirofosfatului și inhibă necompetitiv legarea de substratul nucleotidic (Piret și colab., 2001). Deși mecanismul inhibiției sintezei ARN și ADN nu este cunoscut cu exactitate, una dintre ipoteze sugerează că forcarnet legat la polimerază, formează un intermediar instabil cu nucleozid-monofosfații, conducând la degradarea acizilor nucleici. Foscarnet inhibă polimerazele celulare cât și cele virale, dar enzimele virale sunt mult mai sensibile decât cele celulare (cele virale sunt inhibate de concentrații de 1/2 – 1/10 din cele necesare pentru inhibarea enzimelor celulare): inhibă polimerazele unor tulpini ale serotipului A de virus gripal, ale virusurilor herpetice umane, virusului hepatitei B și reverstranscriptaza HIV. Foscarnet s-a dovedit a fi extrem de eficient în tratarea pacienților SIDA, infectați cu tulpini de HSV sau VZV rezistente la aciclovir.

Foscarnet are unele dezavantaje majore. Se administrează intravenos și dozele trebuie să se repete la intervale scurte, pentru că timpul de înjumătățire este foarte scurt (Noormohamed și colab., 1998). De aceea se încearcă mărirea timpului de înjumătățire prin conjugare cu alcooli cu catena lungă (derivați de la acizi grași). Un alt dezavantaj, o consecință a structurii sale chimice, este că la pH fiziologic acest compus este ionizat și traversează foarte greu membrana plasmatică celulară. In LCR concentrația de foscarnet este de aproximativ 40% față de cea plasmatică. Aproximativ 30% din cantitatea de foscarnet se depozitează în oase ceea ce determină o creștere a timpului de înjumătățire la câteva luni (Sjovall și colab., 1989). Medicamentul produce efecte adverse: perturbarea funcției renale, induce dezechilibre electrolitice (Ca2+, PO42-, K+, Mg2+). Are acțiune chelatoare intensă pentru ionii bivalenți, în special Ca2+, producând scădere severă, în funcție de doză, ce poate fi fatală.

12.5. Terapia infecției cu HIV

Interesul pentru terapia infecției cu HIV este justificat de numărul în continuă creștere al persoanelor infectate. Astfel, la sfârșitul anului 1999, 34,3 milioane persoane erau infectate sau manifestau semnele clinice ale SIDA. În fiecare zi, se infectează circa 15000 de persoane. 95% din totalul persoanelor infectate se găsesc în țările în curs de dezvoltare. Până în 1999, 18,8 milioane adulți și copii au murit de SIDA, de la recunoașterea epidemiei ca entitate clinică. Găsirea unor modalități eficiente de stopare a multiplicării virale este foarte importantă pentru clinică, deoarece SIDA se corelează cu un titru viral crescut. Medicația anti-HIV încearcă să blocheze multiplicarea virusului în oricare treaptă a ciclului său (Schwartz și Nair, 1999). În interiorul celulei, blocarea ciclului de multiplicare este posibilă prin inhibiția reverstranscriptazei sau a proteazei HIV.

Medicamentele cu o relativă eficiență anti-SIDA intră în 3 categorii majore:

– analogi ai nucleozidelor, ce acționează ca inhibitori ai reverstranscriptazei;

– inhibitori nenucleozidici ai reverstranscriptazei

– inhibitorii activității proteazei.

Reverstranscriptaza este enzima virală care convertește informația genetică virală ARN, într-o moleculă complementară de ADN dublu catenară. Inhibiția reverstranscriptazei este produsă de analogii nucleozidelor: zidovudina (azidotimidina – AZT), dideoxiinozina (DDI) (analogă guanozinei), dideoxicitidina (DD).

Structura moleculară a dideoxiinozinei Structura moleculară a dideoxicitidinei

Analogii nucleozidelor se aseamănă cu substanțele naturale care intră în compoziția ADN al HIV. Incorporarea analogilor bazelor blochează reacția de polimerizare și de sinteză a ADN HIV dincolo de punctul încorporării acestor analogi. Primul compus al grupului este zidovudina (Gotzsche, 1993).

Zidovudina (3’-azido-3’-deoxitimidina), analog al deoxitimidinei, denumită anterior azidotimidina (AZT), este un compus de sinteză din familia analogilor nucleozidici dideoxi, la care grupările OH 2’ și 3’ ale inelului -D-ribofuranozic au fost înlocuite cu atomi de hidrogen și respectiv cu gruparea azidă (N3).

Structura moleculară a zidovudinei

Inițial, compusul a fost studiat pentru proprietățile sale antineoplazice, iar ulterior s-au descoperit cele antivirale (inhibitor al virusului leucemiei felinelor). În 1985 s-a descoperit capacitatea sa de a inhiba HIV. Compusul a devenit disponibil pe piață din 1987, iar în prezent se folosește în schema tratamentului infecției cu HIV (De Cock și colab., 1993; Zhou și colab., 1999). Compusul este fosforilat de către timidin-kinaza celulară, în celulele infectate și neinfectate, la derivații mono-, di- și trifosfat care reprezintă formele active. Zidovudin-trifosfatul, forma activă a AZT, este un inhibitor competitiv al reverstranscriptazei HIV. Zidovudin-trifosfatul are o afinitate de 100 de ori mai mare pentru reverstranscriptază (valoare mica a Km) decât pentru substratul natural deoxitimidin-trifosfatul (dTTP) (valoare mare a Km). Zidovudin-trifosfatul este încorporat în lanțul ADN în curs de sinteză, ca AZT-monofosfat și datorită faptului că în poziția 3’ se află gruparea azido și nu o grupare hidroxil, următorul nucleotid nu se poate lega și sinteza ADN este stopată. Reverstranscriptaza nu excizează AZT încorporată. Zidovudina este activă față de retravirusuri mamaliene și aviare și față de virusul Epstein-Barr. AZT se găsește în formulări pentru administrare orală și parenterală. După administrare orală se absoarbe repede și total, cu valori maxime în sânge la 30-90 min. Penetrează în LCR și de aceea AZT este folosită pentru tratamentul manifestărilor neurologice ale SIDA. Este catabolizată în ficat, în principal prin conjugare cu acidul glucuronic. Din acest motiv metabolizarea zidovudinei este blocată de alți compuși care sunt catabolizați pe aceeași cale la nivel hepatic (agenți antiinflamatori nesteroidici, analgezice narcotice). Un dezavantaj al acestui compus este timpul de înjumătățire foarte scurt la nivel plasmatic fapt pentru care necesită administrare frecventă, dar în celulă stabilitatea sa este net superioară. AZT traversează bariera placentară.

Deși celulele mamaliene nu posedă reverstranscriptaza, totuși AZT are toxicitate moderată. Zidovudin-monofosfatul inhibă competitiv timidilat-kinaza, enzima care catalizează conversia nucleozid-monofosfatului, la nucleozid-difosfat (Chun și colab., 2001). De aceea, în celulele infectate și în cele normale, nivelul intracelular de nucleozid di- și trifosfați scade, ceea ce duce la scăderea ratei sintezei ADN.

Efectele secundare ale administrării acestui compus sunt: anemie severă, neutropenie, dureri de cap, miopatie manifestată clinic prin diminuarea capacității contractile a musculaturii, iar anatomic prin apariția mitocondriilor anormale (cu volum crescut) în fibrele musculare. La pacienții supuși tratamentelor cu zidovudină crește riscul de a dezvolta limfoame non-Hodgkin, probabil ca o consecință a imunosupresiei îndelungate (Hoggard și colab., 2001). La pacienții cu SIDA, supuși unui tratament de lungă durată cu zidovudină, s-a constatat instalarea unei rezistențe a virusului HIV față de acest compus. AZT se folosește pentru tratamentul tuturor stadiilor infecției cu HIV. Dozele mari de 1200-1500 mg/zi prelungesc supraviețuirea, reduc frecvența infecțiilor oportuniste, bolnavul câștigă în greutate, viremia diminuă, iar funcția imunitară se ameliorează (Kakuda și colab., 2001).

In prezent AZT se administrează în doze mici (300-500 mg/zi) și are efecte secundare limitate. Doza optimă este de 600 mg/zi (Cato și colab., 1998). După tratamentul prelungit mai mult de 6 luni, se selectează tulpini de HIV rezistente la AZT, datorită unei mutații a genei care codifică reverstranscriptaza și de aici decurge ineficiența tratamentului. Zidovudina nu elimină și nu neutralizează virusul, ci încetinește evoluția SIDA. Efectele toxice majore ale AZT se produc la nivelul măduvei hematoformatoare, cu monocitopenie și granulocitopenie. AZT poate induce anemie severă și necesită transfuzie sau oprirea terapiei. Dozele mari produc o stare de rău general și dureri de cap.

Didanozina (2’-3’ dideoxiinozina – ddI) este un dideoxinucleozid, analog al deoxiadenozinei. Enzimele celulare o convertesc la ddI-monofosfat, apoi la dideoxiadenozin (ddA)-monofosfat, ddA-difosfat și ddA-trifosfat (ddATP), forma activă. Ca și trifosfații altor dideoxinucleozide, ddATP inhibă competitiv RT HIV și acționează ca terminator al catenei de ADN. ADN-polimeraza umană este relativ rezistentă la ddATP, dar variantele și sunt mai sensibile. In vitro, ddATP intracelulară este la fel de activă față de RT HIV, ca și zidovudina. Este activă față de tulpinile HIV rezistente la zidovudină. La pH acid gastric, ddI este inactivată datorită hidrolizei legăturii glicozidice dintre glucid și bază. De aceea se administrează în asociație cu un tampon al acidității gastrice. Acyclovirul și zidovudina sunt activi numai față de virusurile care se multiplică, iar după oprirea tratamentului, multiplicarea virală este reluată. Acyclovir nu împiedică recurențele ulterioare, iar zidovudina nu oprește progresia SIDA, ceea ce denotă că acești agenți nu elimină virusurile în stare latentă.

O altă clasă de medicamente sunt inhibitorii nenucleozidici ai reverstranscriptazei. Compușii din această categorie (neviparina) sunt inhibitori direcți ai RT HIV, deoarece interacționează cu proteina și alterează conformația situsului catalitic. O singură mutație, chiar punctiformă a genei RT, este adeseori suficientă pentru a diminua eficiența acestor compuși.

Structura moleculară a neviparinei

În tratamentul infecțiilor virale se folosește de asemenea o altă clasă de agenți chimici care sunt inhibitorii proteazei. Proteaza HIV este o aspartic-protează, codificată de virus și are rolul de a genera peptide structurale dintr-un precursor viral. Inhibitorii proteazei sunt reprezentați de molecule peptidice mici, care mimează substratul natural al reacției (Ikuta și colab., 2000). Ele acționează prin blocarea situsului catalitic al proteazei HIV, împiedicând generarea proteinelor virale prin clivarea precursorilor și astfel este stopat procesul maturării virale. O singură mutație a genei ce codifică sinteza proteazei HIV este suficientă pentru a face ca medicamentele să devină ineficiente.

N-butyldeoxynojirimycin (N-butyl-DNJ) elimină complet HIV din celulele infectate cronic (Fischer și colab., 1995). Compusul acționează prin inhibiția glicozilării gp120 a învelișului viral, reducând capacitatea ei de a se lega de receptorii CD4. Glicozilarea glicoproteinelor virale este nespecifică și este catalizată de enzimele celulare, dar activitatea N-butyl-DNJ, in vitro, este foarte specifică față de celulele infectate cu HIV.

O altă țintă a terapiei infecției cu HIV este ARNm. Principiul constă în construcția oligonucleotidelor mici, complementare genelor virale sau secvențelor ARNm (oligonucleotide antisens). Acestea se leagă de acidul nucleic și blochează sinteza proteinelor. Deoarece gena rev are rol reglator esențial, s-a obținut ARN-anti ARNm al acestei gene. Efectul a fost inhibiția sintezei proteinelor în celulele infectate cronic, in vitro.

Interferența cu prima treaptă a ciclului infecțios – legarea HIV de receptorul CD4 al membranei limfocitare – a fost propusă ca o modalitate de tratament. CD4 solubil recombinat este o moleculă incompletă, din care lipsesc secvențele transmembranară și citosolică, care se leagă cu gp120 și împiedică legarea virusului de limfocitele TCD4. Preparatul nu este toxic, dar timpul de înjumătățire este foarte scurt.

Un inhibitor al fuziunii – enfuvirtide – stopeaza intrarea virusului prin blocarea fuziunii invelisului pe calea gp41 cu membrana celulei (H. Chapel si colab. 2006).

Strategia curentă pentru terapia infecției HIV este denumită HAART (Highly Active Anti-Retraviral Therapy) și utilizează combinații ale diferitelor medicamente: un inhibitor al proteazei, asociat cu doi analogi nucleozidici inhibitori ai reverstranscriptazei (Blazevic și colab, 2001). La pacienții supuși terapiei HAART, infecția unor noi celule nu este complet blocată. HIV persistă, cu o rată foarte scăzută a multiplicării în rezervorul celular reprezentat de macrofage, celule T CD4 neangajate și chiar celulele T CD4 de memorie, ceea ce permite eliberarea virionilor progeni și infecția unor noi celule. Dovezile multiplicării HIV la pacienții tratați HAART sunt următoarele:

– mulți pacienți au nivele plasmatice scăzute ale ARN viral, sub limita de detectare prin testele convenționale (200-500 copii/ml), dar detectabile prin metode sensibile care determină cantități de 10-50 de copii ARN/ml;

– pacienții tratați cu HAART devin aviremici, dar prin metoda hibridizării in situ sau RT-PCR se detectează celule infectate productiv, care exprimă ARN HIV-1 (Servais și colab., 2001);

– diferențele cantitative dintre ADN-HIV total și integrat în celulele TCD4 sugerează existența celulelor infectate recent cu HIV-1, în care ADN este neintegrat. Acestea sunt copii lineare complete revers-transcrise, care suferă o reacție aberantă de legare cap la cap, în loc să se integreze în cromosomul gazdei.

Pentru eliminarea rezervorului de virus se impune creșterea dozei terapeutice combinate care să inhibe complet multiplicarea virusului. Dar rezervorul de virus are o persistență îndelungată, iar terapia HAART ete toxică. Pentru eliminarea rezervoarelor de virus se propune stimularea transcrierii și multiplicării virale în celulele infectate latent, sub acțiunea citochinelor. Odată cu multiplicarea virusului, celulele mor datorită efectului citopatic sau expun antigene virale și devin ținta acțiunii litice a limfocitelor TCD4 citolitice. Astfel, o combinație de IL-2, IL-6 și TNF poate induce activarea și multiplicarea virusului în celulele infectate latent, in vitro. IL-2 produce creșterea numerică a celulelor T CD4, dar nivelul viremiei a rămas nemodificat. Celulele infectate latent cu HIV-1 nu exprimă receptori de înaltă afinitate pentru IL-2, citochina poate activa multiplicarea virală prin intermediul receptorilor de mică afinitate sau indirect prin alte citochine ale cascadei. Asocierea HAART cu un agent care să activeze specific numai celulele TCD4 infectate latent, ar fi soluția terapeutică ideală. Terapia multiplă reduce riscul emergenței unei tulpini virale cu rezistență multiplă.

Terapia anti-HIV este ineficientă datorită unor particularități moleculare și biologice ale HIV:

– genomul viral se integrează într-un cromosom celular și infecția rămâne latentă o perioadă nedefinită;

– virusul se poate disemina prin transfer intercelular direct, fără o fază extracelulară;

– virusul infectează celule circulante (limfocite, macrofage) și se diseminează sistemic;

– virusul poate infecta celule ale SNC și agenții terapeutici ar trebui să depășească bariera hemato encefalică;

– virusul scapă acțiunii Ac specifici și rămâne infecțios;

– apariția frecventă a variantelor antigenice.

Imunoglobulinele antivirale sunt disponibile în 3 variante:

– preparatul de globuline imune (IG) pentru injectare intramusculară ;

– preparatul de imunoglobuline pentru injectare intravenoasă (IVIG) ;

– preparate de imunoglobuline injectabile intravenos, cu titru înalt de anticorpi.

Toate variantele se obțin din plasma umană și conțin predominant IgG, dar și alte izotipuri. Se pot obține preparate cu un titru înalt de imunoglobuline față de anumite antigene virale, prin imunizarea animalelor. Preparatul IG nu poate fi administrat intravenos, datorită tendinței IgG de a forma agregate, care, in vivo, fixează complementul. Imunoglobulinele sunt mai eficiente dacă sunt administrate profilactic, decât terapeutic. Preparatele IG se folosesc în primul rând pentru prevenirea hepatitei A și se administrează pacienților, în câteva zile după consumul alimentelor contaminate. Preparatele IG hiperimune obținute prin imunizarea animalelor se administrează postexpunere la VHB și rabie. Preparatul IG specific antirabic se obține din plasma donorilor hiperimunizați.

12.6. Imunizarea pacienților SIDA

Variabilitatea genetică a HIV a împiedicat dezvoltarea unui protocol al imunizării SIDA. S-au obținut anticorpii anti-proteină de înveliș gp120, pentru blocarea interacțiunii gp120 și implicit a infecției (Takeda și colab., 1992). Dar abordarea n-a avut succes, deoarece gena ce codifică gp120 suferă mutații și rezultă variante antigenice ale proteinei care nu sunt recunoscute de anticorpi (Cease și colab., 1987). S-au obținut vaccinuri subunitare, prin inserția câtorva gene ce codifică proteine ale învelișului HIV, în genomul virusului vaccinal sau adeno, ca vectori de expresie clonați în sisteme celulare. S-a încercat vaccinarea cu virus inactivat. Preparatul viral inactivat are utilizare limitată numai la indivizii infectați cu HIV, deoarece metodele de inactivare nu au un grad de certitudine de 100% și pot fi însoțite de păstrarea unei infecțiozități reziduale. Există încercări de a obține virus atenuat infecțios pentru a-l folosi ca agent imunizant, deoarece indivizii infectați cu HIV-2 cauzează o formă mai ușoară de SIDA, cu o perioadă de latență mai lungă și protejează față de infecția cu HIV-1.

12.7. Rolul mutațiilor în variabilitatea ribovirusurilor. Fenomenul de rezistență

Având o structură genetică relativ simplă și fiind metabolic inerte, virusurile au puține mecanisme de a dobândi rezistența la agenții chimioterapeutici.

Virusurile au două proprietăți care le permit să scape de acțiunea inhibitorilor:

– multiplicarea la un titru înalt în celula gazdă sensibilă;

– apariția mutațiilor cu o rată înaltă.

Mutația este forța motrice a evoluției sistemelor vii. Virusurile nu întrunesc criteriile minimale ale celui mai simplu sistem viu, dar evenimentele mutaționale au o frecvență mare.

Cele mai multe virusuri cu genom ADN, au rate de mutație inferioare ribovirusurilor. Mutabilitatea lor este puțin cunoscută, dar este dedusă indirect din diferite observații: de exemplu, virusurile herpetice pot deveni rezistente la medicația antivirală, fapt ce creează dificultăți clinice.

In general, genomul ribovirusurilor are dimensiuni reduse, iar rata de mutație/nucleotid/tur de replicare este maximă, fapt care permite o rată de evoluție de milioane de ori mai rapidă decât a gazdelor lor. Supuse permanent presiunii selective a factorilor de apărare a gazdei, evoluția virusurilor este exclusiv adaptativă. Ratele foarte înalte de mutație, generează așa numitele “mutante de roire” sau populații de quasispecii de virusuri, care conferă o mare adaptabilitate multiplicării virale, menită să compenseze șansa minimă a interacțiunii cu substratul permisiv.

Dar rata mutației nu trebuie să depășească un “prag al erorilor”, care ar genera un virus incapabil de multiplicare. Quasispeciile de virusuri ARN, se adaptează la un prag de erori mutaționale, compatibil cu multiplicarea. Se consideră că virusurile se multiplică la limita superioară a mutabilității și adaptabilității. Datorită ratei înalte a mutației, clonele de ribovirusuri și retravirusuri sunt quasispecii sau “mutante roitoare”, care prezintă variații genetice genomice. Populațiile de quasispecii conferă virusurilor cu genom ARN o adaptabilitate perfectă la mediul gazdei și o capacitate de evoluție foarte rapidă. Anumite secvențe ale genomului sunt mai stabile decât altele, dar și cele mai stabile suferă mutații cu o rată superioară în raport cu dezoxiribovirusurile.

Mutabilitatea accentuată se datorează naturii intrinseci a funcției ARN-polimerazei virale, predispusă la erori (“error prone”), ca o consecință a absenței funcției de corectare (proof reading), în timp ce majoritatea ADN-polimerazelor virale își corectează erorile proprii. Diferite familii de ribovirusuri au rate diferite de mutație. Dintre enzimele de transcriere și replicare a genomului ARN, reverstranscriptazele au o predispoziție mai accentuată la erori, ceea ce se corelează cu o rată înaltă a mutației în ciclul de multiplicare retravirală. Genomul integrat ca ADN proviral este copiat de aparatul enzimatic al celulei, cu o fidelitate relativă și de aceea, retravirusurile endogene evoluează foarte lent, comparativ cu cele exogene (infecțioase).

Modificarea ARN posttranscriere este o cauză majoră a apariției mutațiilor. Modificarea extensivă s-a descris inițial pentru ARNm al proteinei M (matrix) a virusului rujeolic de la pacienții cu PESS.

Spre deosebire de modificarea frecventă A – I la unele virusuri ARN, există câteva cazuri de ARN viral și celular la care conversia A – I, catalizată de ADAR are loc cu selectivitate înaltă, la poziții specifice ale A. De exemplu, la HDV, ARN editing are rol esențial pentru sinteza a două protein cu funcții diferite, de la un ORF: sinteza AgD se face după conversia selectivă a codonului terminal amber UAG, la codonul Trp UIG. Antigenul D este o proteină bazică fosforilată și se acumulează în nucleii celulelor infectate. Este componenta internă a HDV. Mecanismul generării celor două variante este următorul: în timpul replicării genomului, o fracție a copiilor de ARN antigenomic, suferă unul sau mai multe evenimente de “editing” post-transcriere. Unul dintre ele este esențial: A din mijlocul codonului terminal amber UAG al ARN codificator al Ag D de l95 aminoacizi, este dezaminată de o enzimă a celulei. Dezaminarea A are importanță biologică majoră. Conversia A la I (Inozină) modifică mesajul ARN, deoarece I este recunoscută ca G (nu ca A). Molecula de ARN astfel modificată este tradusă într-o proteină a cărei secvență de aminoacizi diferă față de a proteinei native. Codonul terminal amber este înlocuit cu codonul (UIG) pentru sinteza Trp. ARNm modificat, codifică o proteină mai mare – antigenul D de 2l4 aminoacizi, o proteină bazică, fosforilată care se acumulează în nucleul celulei infectate.

Pentru virusurile cu genom ARN de polaritate negativă, hipermutația datorată dezaminării A este asociată cu persistența infecției. Pentru virusurile cu genom ADN dc, modificarea reprezintă un mecanism prin care copiile de ARNm timpuriu sunt inactivate.

Marea diversitate a ribovirusurilor se explică prin mutabilitatea accentuată și adaptabilitatea lor. Cu puține excepții, virusurile capabile să infecteze insecte și animale superioare sau insecte și plante au genom ARN. Adaptabilitatea quasispeciilor le permite deplasarea între diverse medii selective. Foarte adesea, numai una sau câteva schimbări mutaționale permit unui virus să dobândească virulență, să-și schimbe tropismul și să devină rezistent la un medicament antiviral sau la anticorpii specifici. Variațiile secvenței de baze a quasispeciilor pot influența severitatea infecției virale. Faptul este extrem de important pentru cercetători și pentru clinicieni, care tind să considere virusul rujeolic, HIV, virusul hepatitei C sau polio, ca entități infecțioase unice, la care diferiții pacienți răspund diferit. Se ignoră natura fundamentală a ribovirusurilor, adică mutabilitatea lor accentuată, materializată în existența quasispeciilor. Heterogenitatea quasispeciilor, caracterul tranzitoriu, întâmplător, nedeterminat și imprevizibil al apariției lor, creează o genetică aleatorie, contraintuitivă. Baza ubicvității ribovirusurilor este chiar heterogenitatea lor genetică. Existența quasispeciilor ridică probleme insurmontabile controlului majorității infecțiilor cu ribovirusuri, prin intermediul vaccinurilor. Vaccinarea a avut succes pentru unele viroze (produse de virusul polio, rujeola, oreionul, variola), deoarece anumiți epitopi antigenici ai proteinelor virale, au o probabilitate mică de a se modifica, fără să compromită infecțiozitatea lui. Identificarea epitopilor stabili (sau puțin variabili) și imunizanți (stimulatori ai răpunsului imun protector) pentru alte ribovirusuri (FMDV, HIV1, virusul hepatitei C) pune probleme dificile datorită naturii efemere a quasispecilor. Cele mai multe virusuri ARN, suferă o divergență evolutivă, prin substituția bazelor cu o rata de l/l02-l04/nucleotide/an. Rata evoluției virusurilor nu este constantă. Apariția unor noi ribovirusuri în viitor, este o certitudine. Unele apariții se vor datora contactului omului cu virusuri “vechi” de la animalele junglei neexplorate, iar altele vor apărea prin recombinare, reasortare sau prin mutație. Apariția este însă condiționată de evoluția rapidă a quasispeciilor și de capacitatea lor de adaptare rapidă la gazda umană. Adaptarea rapidă va determina transmiterea epidemică sau pandemică la om, așa cum se întâmplă cu influenza A, HIV1, sau va implica omul ca o gazdă sporadică (virusul febrei hemoragice etc.). Este foarte probabil ca majoritatea ribovirusurilor umane, să fi evoluat în ultimele mii sau zeci de mii de ani, dar unele sunt mult mai recente. După Brown (l989), virusurile “noi” au evoluat din interacțiunile genelor cromosomale, cu elemente genetice mobile și cu virusurile “vechi” și din acest punct de vedere, evoluția virusurilor este un proces care nu se temină niciodată. După Botstein (l982), produsul evoluției virale nu este un virus anume, ci o familie de elemente genetice denumite module, fiecare dintre ele purtând o funcție biologică particulară. Fiecare virus este rezultatul unei combinații favorabile de module. Recombinarea genetică furnizează noi variante de module, din care se perpetuează cele mai adaptate.

De cele mai multe ori, rezistența este rezultatul mutației genetice, care produce modificări ale enzimelor sau ale componentelor structurale ale virionului. Eficiența acestui mecanism se observă în culturile celulare, unde virusurile dezvoltă rezistență după numai câteva pasaje, în prezența agentului inhibitor. Rezistența herpesvirusurilor, la pacienții imunocompetenți apare rareori, însă tulpinile rezistente de virus influenza apar cu frecvență mare. În general, virusurile rezistente la acțiunea agenților chimioterapeutici, par să aibă o virulență redusă și produc infecții mai ușoare, în special la herpesvirusuri. Tulpinile rezistente de influenza A sunt a fel de virulente ca și tulpinile naturale. Detectarea și evaluarea genelor de rezistență se face prin diferite metode. Cele tradiționale implică inocularea culturilor celulare cu virusuri, expunerea la agenți inhibitori și determinarea modificărilor ulterioare în celulă sau a cantității de virus progen. Metoda nu este totdeauna relevantă pentru populațiile de virusuri in vivo. Virusurile izolate de la pacienți sunt populații heterogene, cu sensibilitate diferită la agenții inhibitori și chiar cu proprietăți diferite de multiplicare în diferite substraturi celulare. Metodele noi pentru detectarea genelor de rezistență sunt cele moleculare, inclusiv PCR.

Bibliografie selectivă

Acosta E.P., Balfour H.H. Jr., Acyclovir for Treatment of Postherpetic Neuralgia: Efficacy and Pharmacokinetics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(10): 2771-2774.

Bacon T.H., Levin M.J., Leary J.J., Sarisky R.T., Sutton D., Herpes Simplex Virus Resistance to Acyclovir and Penciclovir after Two Decades of Antiviral Therapy, Clinical Microbiology Reviews. 2003, 16(1): 114-128.

Botstein D. and Maurer R., Genetic Approaches to the Analysis of Microbial Development. Ann.Rev.Genetics.1982,16: 61-8383

Blazevic V., Jankelevich S., Steinberg S.M., Jacobsen F., Yarchoan R., Shearer G.M., Highly Active Antiretroviral Therapy in Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Children: Analysis of Cellular Immune Responses, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001, 8(5): 943-948.

Brady M.T., Sears S.D., Pacini D.L., Samorodin R., DePamphilis J., Oakes M., Soo W., Clements M.L., Safety and prophylactic efficacy of low-dose rimantadine in adults during an influenza A epidemic, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1990, 34(9): 1633-1636.

Bryant M.L., Bridges E.G., Placidi L., Faraj A., Loi A.G., and colab., Antiviral l-Nucleosides Specific for Hepatitis B Virus Infection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 229-235.

Cato A. III, Qian J., Hsu A., Levy B., Leonard J., Granneman R., Multidose Pharmacokinetics of Ritonavir and Zidovudine in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998, 42(7): 1788-1793.

Cease K.B., Margalit H., Cornette J.L., Putney S.D., Robey W.G., Ouyang C., Streicher H.Z., Helper T-cell antigenic site identification in the acquired immunodeficiency syndrome virus gp120 envelope protein and induction of immunity in mice to the native protein using a 16-residue synthetic peptide, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1987, 84(12): 4249-4253.

Chun T.W., Justement J.S., Moir S., Hallahan C.W., Ehler L.A., Liu S., McLaughlin M., Dybul M., Mican J.M., Fauci A.S., Suppression of HIV replication in the resting CD4+ T cell reservoir by autologous CD8+ T cells: Implications for the development of therapeutic strategies, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001, 98(1): 253-258.

De Cock K.M., Lucas S.B., Lucas S., Agness J., Kadio A., Gayle H.D., Clinical research, prophylaxis, therapy, and care for HIV disease in Africa, American Journal of Public Health. 1993, 83(10): 1385-1389.

Fischer P.B., Collin M., Karlsson G.B., James W., Butters T.D., Davis S.J., Gordon S., Dwek R.A., Platt F.M., The alpha-glucosidase inhibitor N-butyldeoxynojirimycin inhibits human immunodeficiency virus entry at the level of post-CD4 binding, Journal of Virology. 1995, 69(9): 5791-5797.

Gold D., Corey L., Acyclovir prophylaxis for herpes simplex virus infection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1987, 31(3): 361-367.

Gøtzsche P., Zidovudine dosage. Nordic Medical Research Councils' HIV Therapy Group, British Medical Journal. 1993, 307(6905): 682-683.

H. Chapel, M. Haeney, S. Misbah, N. Snowden – Essential of Clinical Immunology, fifth edition, Blackwell Publishing, 2006.

Hoggard P.G., Sales S.D., Phiboonbanakit D., Lloyd J., Maher B.A., Khoo S.H., Wilkins E., Carey P., Hart C.A., Back D.J., Influence of Prior Exposure to Zidovudine on Stavudine Phosphorylation In Vivo and Ex Vivo, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(2): 577-582.

Ikuta K., Suzuki S., Horikoshi H., Mukai T., Luftig R.B., Positive and Negative Aspects of the Human Immunodeficiency Virus Protease: Development of Inhibitors versus Its Role in AIDS Pathogenesis, Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2000, 64(4): 725-745.

Kakuda T.N., Page L.M., Anderson P.L., Henry K., Schacker T.W., Rhame F.S., Acosta E.P., Brundage R.C., Fletcher C.V., Pharmacological Basis for Concentration-Controlled Therapy with Zidovudine, Lamivudine, and Indinavir, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(1): 236-242.

Lehninger A. L. Biochimie, vol. I, Traducere dupa editia a II-a, Editura Tehnica Bucuresti, 1975.

Noormohamed F.H., Youle M.S., Higgs C.J., Martin-Munley S., Gazzard B.G., Lant A.F., Pharmacokinetics and Absolute Bioavailability of Oral Foscarnet in Human Immunodeficiency Virus-Seropositive Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998, 42(2): 293-297.

Piret J., Lamontagne J., Désormeaux A., Bergeron M.G., Efficacies of Gel Formulations Containing Foscarnet, Alone or Combined with Sodium Lauryl Sulfate, against Establishment and Reactivation of Latent Herpes Simplex Virus Type 1, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2001, 45(4): 1030-1036.

Schwartz S.A., Nair M.P., Current Concepts in Human Immunodeficiency Virus Infection and AIDS, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1999, 6(3): 295-305.

Servais J., Lambert C., Fontaine E., Plesséria J.M., Robert I., Comparison of DNA Sequencing and a Line Probe Assay for Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Drug Resistance Mutations in Patients Failing Highly Active Antiretroviral Therapy, Journal of Clinical Microbiology. 2001, 39(2): 454-459.

Sjovall J., Bergdahl S., Movin G., Ogenstad S., Saarimäki M., Pharmacokinetics of foscarnet and distribution to cerebrospinal fluid after intravenous infusion in patients with human immunodeficiency virus infection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1989, 33(7): 1023-1031.

Takeda A., Robinson J.E., Ho D.D., Debouck C., Haigwood N.L., Ennis F.A., Distinction of human immunodeficiency virus type 1 neutralization and infection enhancement by human monoclonal antibodies to glycoprotein 120, The Journal of Clinical Investigation. 1992, 89(6): 1952-1957.

Topley and Wilson’s. Principles of Bacteriology, Virology and Immunity, 8th Edition, Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990.

Zhou X.J., Sheiner L.B., D’Aquila R.T., Hughes M.D., Hirsch M.S., Fischl M.A., Johnson V.A., Myers M., Sommadossi J.P. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Clinical Trials Group Protocol 241 Investigators, Population Pharmacokinetics of Nevirapine, Zidovudine, and Didanosine in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients, Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999, 43(1): 121-128.