CORELAȚII IMUNO-HEMATOLOGICE ÎN STĂRI DE IMUNODEFICIENȚĂ ȘI HIPERSENSIBILITATE [311116]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

SPECIALIZAREA de BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Îndrumător Științific:

Conf. dr. Gabriel GÂJÂILĂ

Absolvent: [anonimizat]-Cristina DOBRE

BUCUREȘTI

– 2017 –

[anonimizat]:

Conf. dr. Gabriel GÂJÂILĂ

Semnătura……………….

Absolvent: [anonimizat]-Cristina DOBRE

BUCUREȘTI

– 2017 –

CUPRINS

Pag.

[anonimizat] a avut ca scop evaluarea corelațiilor analizelor hematologice de sânge cu analizele imunologice la pacienții cu diferite vârste care pot prezenta stări de imunodeficiență și hipersensibilitate în vederea determinării unui diagnostic.

Diagnosticul de laborator are o importanță foarte mare deoarece analizele de laborator reprezintă modul eficient de monitorizare nu numai a stării de sănătate ci și a [anonimizat], boli care au la bază origine endocrinologică și nu în ultimul rând detectarea alergiilor. Cu ajutorul analizelor de laborator se poate pune un diagnostic corect pentru care poate fi prescris sau nu un tratament în funcție de rezultatele obținute.

În această lucrare au fost folosite aparate specializate având la bază o tehnologie avansată astfel încât rezultatele obținute sunt foarte precise însă pentru ca aceste rezultate să fie corecte este nevoie de o atenție mare a persoanei în grija căreia este aparatul respectiv deoarece acesta se poate decalibra și rezultatele emise nu vor arăta adevărul iar pacientul poate fi diagnosticat greșit.

Un alt lucru foarte important îl reprezintă cunoașterea teoretică a fenomenelor cu substrat imunologic pentru ca diagnosticul și tratamentul să fie corecte. Și nu în ultimul rând este necesar a se cunoaște riscul ce poate surveni în urma existenței unei stări de imunodeficiență deoarece o imunitate scăzută poate duce la apariția din ce în ce mai frecventă a unor semne și simptome confundate de obicei cu boli ușoare care de fapt sunt mult mai grave iar organismul este vulnerabil în fața diverșilor patogeni nemaiputând sa lupte contra lor.

Pentru prezenta lucrare vreau să îi mulțumesc domnului Conf. Dr. Gabriel Gâjâilă pentru sprijinul acordat și domnului Sandu Mărculescu (asistent generalist la Gral Medical) pentru ca a avut amabilitatea și răbdarea de a [anonimizat].

MORFOLOGIA ȘI FIZIOLOGIA SISTEMULUI IMUN

Apǎrarea nespecificǎ

Apǎrarea nespecificǎ reprezitǎ prima barierǎ de apărare a organismului, modul de reacție fațǎ de un agent strǎin dependent de structura conformaționalǎ (determinate genetic) [anonimizat]ǎrare, dar nici cu natura agentului strǎin și nici cu numărul de contacte precedente ale organismului cu același agent. (Radu și Voiculescu, 1985)

Apǎrarea nespecificǎ la poarta de intrare

Cele mai importante bariere atât nespecificǎ cât și specificǎ împotriva multiplilor agenți stǎini sunt mucoasele și pielea. Ele pot fi împǎrțite în:

– [anonimizat]ǎini la nivelul porții de intrare putem aminti: integritatea epiteliului, pielii sau mucoaselor, mucusul (deoarece reține o serie de particule și unii germeni patogeni); dar nu în ultimul rând mișcarea în sens contrar a cililor vibratili la nivelul epiteliului căilor respiratorii. Factorii nespecifici care au o intervenție majorǎ asupra agenților infecțiosi (cum ar fi bacteriile, paraziții dar și unele virusuri) la nivelul barierelor chimice sunt după cum urmeazǎ:

– PH-ul scǎzut la suprafața pielii determinǎ micromediu deranjant pentru bacteriile

patogene sau condiționat-patogene datoritǎ unei concentrații mari de H fiind impropie pentru dezvoltarea microorganismelor.

– La realizarea unei bariere chimice eficiente contribuie și acizii grași cu molecula

lungǎ datoritǎ efectelor bactericide dar și accentuării pH-ului scǎzut al pielii.Acești acizi grași se întâlnesc mai mult în secreția sebacee.

– Lizozimul este o enzimǎ bacteriolitică ce are capacitatea de a distruge peretele

celular al bacteriilor având astfel o acțiune bactericidǎ. Se gǎsește în cantitǎți mari în secrețiile externe, de exemplu: saliva; secreția lacrimalǎ; mucus.

– Acidul abscisic reprezintǎ cea mai eficientǎ armă de apǎrare a organismului

împotriva agenților infecțioși introduși odatǎ cu alimentele. HCl asigurǎ un pH foarte acid de 2,2 rezultând acțiunea puternicǎ antiseptică a HCl din stomac.

– Secreția biliarǎ alături de secreția pancreaticǎ și secreția intestinalǎ reprezintă factori

foarte puternici care asigurǎ sterilitatea conținutului din duoden dar și din prima jumatate a jejun-ileonului. ( Radu și Voiculescu, 1985)

Sistemul lifoid

Sistemul limfoid este reprezentat de organele limfoide cum ar fi: timusul, splina, ganglionii limfatici și formațiunile asociate mucoaselor. Sistemul limfoid este implicat în apărarea organismului iar organele limfoide au capacitatea de a recunoaște structurile proprii organismului (self) și de a le diferenția de cele străine organismului (nonself).

1.3.1 Timusul

Timusul este un organ limfoid voluminos situat în partea superioară a mediastinului anterior, de origine epitelială. Acesta este primul organ limfoid care se dezvoltă atât la păsări cât și la mamifere. Timusul prezintă la exterior o capsulă subțire ce transmite septuri conjunctive ce delimitează doi lobi care la rândul lor sunt împărțiți incomplet in lobuli.

Lobulii conțin o rețea de celule epiteliale printre care se întâlnesc celule limfoide denumite timocite. Epiteliul timic este format din următoarele zone:

– zona corticală

– zona medulară

Zona corticală este alcătuită din celule epiteliale stelate ce prezintă numeroase

prelungiri fine ce se întrepătrund.

Zona medulară este formata din celule epiteliale mari, de formă ovală cu prelungiri scurte și este diferențiată în 2 tipuri de aglomerări ale celulelor epiteliale:

– corpusculii Hassal sunt alcătuiți din celule dispuse concentric formând uneori cavități chistice căptușite de celule columnare ce prezintă microvili;

– limfocite de talie medie denumite și limfocite nule sau novice care au dobândit imunocompetență datorită contactului cu antigenul nonself.

La unirea joncțiunii zonei corticale cu zona medulară se întâlnesc macrofagele ce intervin în prelucrarea limfocitelor distruse la nivel intracortical. (Valeria Dănacu, 2015)

1.3.2 Ganglionii limfatici

Sunt organe limfoide secundare situate pe traiectul vaselor limfatice. La exterior prezintă o capsulă conjunctivă din care pornesc numeroase trabecule. Stroma ganglionilor limfatici este formată din fibre și celule reticulare, iar în ochiurile acesteia se găsesc celule limfoide, macrofage, vase limfatice și sanguine.

Vascularizația ganglionilor limfatici este atât sanguină cât și limfatică astfel că limfa este adusă la nivelul ganglionului limfatic prin 5-8 vase limfatice aferente care se varsă în sinusul subcapilar, de unde pornesc radiar sinusuri corticale printre trabeculele conjunctive care se transformă în sinusuri medulare ce se continuă cu vasele limfatice eferente.

Zona corticală este divizată în 2 subzone:

– corticala externă foarte bogată in limfocite B

– paracorticala (corticala profundă) unde se găsesc limfocite T

În corticala externă sunt întâlnite aglomerări de limfocite denumite foliculi limfoizi primari; ei conțin în special limfocite mici. După stimularea antigenică se transformă în foliculi limfoiyi secundari cu o zonă de mare densitate denumită centru germinativ.

Zona medulară este dispusă sub forma unor cordoane și conține țesut limfoid dens. Aici predomină limfocitele B asociate cu macrofage și celule T. Spre deosebire de limfă sângele circulă în direcția opusă acesteia. La nivelul hilului din ganglion pătrunde artera aferentă apoi se continuă cu arteriolele ce formează un plex capilar. Din plexul capilar la nivel profund rezultă venulele postcapilare cu endoteliu înalt.

Tot aici limfocitele părăsesc circulația sanguină astfel celulele B ajung în cortexul extern, iar celulele T în paracortex apoi trec în zona medulară unde se colectează sinusurile limfatice medulare și limfocitele părăsesc ganglionul prin vasele limfatice eferente.

Ganglionii limfatici au următoarele funcții:

– filtrează limfa și rețin corpurile străine (nonself) cu ajutorul fagocitelor ganglionare

– sunt utilizați ca suport material în proliferarea limfocitelor după stimularea antigenică deoarece limfa eferentă este filtrată și îmbogățită în anticorpi și limfocite. ( Grigore Mihăescu, 2001)

1.3.3 Splina

Splina reprezintă cel mai mare organ limfoid fiind un filtru sanguin cu un rol important în sistemul imunitar. Capsula conjuntivă ce acoperă splina trimite o rețea de trabecule conjunctive ce împarte splina în compartimente ce comunică între ele. Fiecare compartiment este alcătuit din pulpa albă și pulpa roșie.

Pulpa albă este formată din totalitatea tecilor periarteriolare. Acestea au o zona internă bogată în limfocite T și o zonă externă bogată în limfocite B și plasmocite ce alcătuiesc aglomerări denumite foliculi.

Pulpa roșie este alcătuită din cordoane Bilroth (cordoane de țesut splenic) și sinusuri venoase (capilarele arteriolelor "în perie"). Cordoanele Bilroth sunt formate dintr-o rețea de celule și fibre reticulare prin care se deplasează celule libere cu funcție fagocitară. Aceste cordoane comunică cu sistemul venos al splinei. Granița dintre pulpa albă și pulpa roșie denumită și zona de schimb dintre cele două compartimente este reprezentată de capilarele zonei marginale.

În splină se întâlnesc foliculii limfoizi primari dispuși la periferia tecii limfoide periarteriolare sau în apropierea acesteia. Splina nu prezintă circulație limfatică. Limfocitele ies din sânge prin peretele capilarelor din zona marginală fiind foarte permeabil și ajung în pulpa albă, apoi trec iar în pulpa roșie la nivelul sinusurilor venoase ce comunică atât cu capilarele zonei marginale dar și cu sistemul venos al splinei. Limfocitele părăsesc splina prin vena splenică. ( Grigore Mihăescu, 1995)

1.3.4 Formațiuni limfoide asociate mucoaselor

Mucoasele reprezintă cele mai vulnerabile structuri ale organismului la contactul cu antigenele. Condițiile pătrunderii antigenelor în interiorul organismului sunt create de contactul permanent cu microorganismele.

La nivelul mucoaselor sistemul imunitar prezintă o formațiune menită să excludă antigenele exogene înaintea pătrunderii lor în mediul intern dar și să diminueze expunerea aparatului imunitar la antigene.

Sistemul imunitar al mucoaselor are rol de reglator asupra funcției aparatului imunitar sistemic datorită calității "zonei de control" a organismului față de antigene. În mucoasa intestinală celulele care reacționează la antugene sunt organizate în structuri distincte cum ar fi: foliculii limfoizi, plăcile Peyer și amigdalele. În intestin structurile limfoide sunt lipsite de înveliș capsular și vase limfatice aferente astfel că epiteliul intestinal reprezintă barieră pentru antigenele mari, dar care permite să pătrundă antigene solubile și mici datorită permeabilității mari. Structurile limfoide întâlnite în tubul digestiv includ amigdalele, plăcile Peyer, apendicele, plăcile limfoide ale colonului.

Amigdalele sunt singurele structuri ale tubului digestiv acoperite de o capsulă, situate în unghiurile mandibulare. Acestea prezintă pe fața internă cripte tonsilare ce pătrund adânc în masa fonsilei determinând un contact mai rapid cu antigenele pătrunse pe cale digestivă.

Foliculii limfoizi sunt caracteristici intestinului fiind întâlniți ca foliculi solitari la nivelul ileonului în partea terminală sau ca foliculi agregați denumiți plăci Peyer. O placă Peyer este formată dintr-un număr de 20-30 foliculi agregați situați in ileonul terminal pe marginea liberă a intestinului.

Cea de-a doua categorie de formațiuni limfoide sunt cele cu distribuție difuză întâlnite în lamina propria și stratul epitelial al mucoasei. La nivelul laminei proprii se găsesc limfocite T în proporții egale și plasmocite în număr mare, iar în stratul epitelial sunt întâlnite mai ales limfocite T citotoxice și limfocite cu marker IgA+.

1.4 Celulele sistemului imun

Cel mai complex sistem al organismului uman este reprezentat de sistemul imunitar. Sistemul imunitar este alcătuit din țesuturi derivate din mezoderm, iar limfocitul reprezintă componenta celulară principală datorită căruia țesutul este denumit țesut limfoid.

1.4.1 Limfocite

Totalitatea organelor limfoide atât primare cât și secundare împreună cu celulele corespunzătoare componente poartă denumirea de limfon. Limfonul are funcția de a recunoaște și a păstra memoria la nivel celular dar și molecular. Sistemul limfoid este format din celule ce poartă numele de imunocite care au capacitatea de a recționa specific cu antigenul în timpul formării răspunsului imun.

Toate celulele sistemului limfoid prezintă pe suprafața lor molecule cu rol de receptor ce au capacitatea de a recunoaște specific determinanții antigenici străini. Sistemul imunitar funcționează pe principiul interacțiunii specifice dintre antigen (semnal) si receptorul limfocitar. În concepția actuală, limfocitul reprezintă celula cheie a sistemului imunitar care prezintă o capacitate de reactivitate și diferențiere extraordinară.

Limfocitele reprezintă 25-33% din totalul leucocitelor, iar numărul lor variază în funcție de vârstă astfel că cel mai mare număr de limfocite este prezent la copii. În trecut, înainte de anii '50 limfocitele erau deosebite doar în funcție de dimensiuni: mari, mijlocii sau mici. Însă, Roit și colab.(1966) au împărțit limfocitele în 2 categorii diferite în funcție de raportul cu organul primar limfoid:

– limfocite T sunt defirențiate și maturate în timus; ele reprezintă 55-80% din limfocitele circulante

– limfocite B sunt diferențiate și maturate în bursa lui Fabricius la păsări și în echivalenții ei la mamifere; ele au rol în imunitatea umorală.

Clasificarea limfocitelor:

Limfocitele sunt clasificate în funcție de mai multe criterii. Primul criteriu este reprezentat de capacitatea lor de a interacționa cu antigenul specific:

– incompetente- limfocitele nu reacționează cu antigenul

– competente- acestea recunosc și apoi interacționează cu antigenul

Al doilea, în funcție de durata vieții limfocitele se împart în:

– limfocite cu viață scurtă (efectoare ale răspunsului imun)

– limfocite cu viață lungă (limfocite de memorie). Acestea circulă în organismul uman perioade foarte mari (chiar și toată viața).

Cel de-al treilea criteriu se bazează pe raportul cu funcția pe care o îndeplinesc limfocitele:

– efectoare sunt acele limfocite care neutralizează antigenul direct sau indirect prin molecule efectoare

– reglatoare – prin acțiunea lor păstrează echilibrul optim al răspunsului imun. (Grigore Mihăescu, 2001)

1.4.2 Sistemul fagocitar mononuclear (SFM)

Sistemul fagocitar mononuclear este alcătuit din celule mononucleare care sunt capabile să fagociteze dar și din celule de origine ale fagocitelor mononucleare denumite celule stem.

Celula stem reprezintă celula "cap de serie" fiind localizată în măduva osoasă, nediferențiată având o activitate mitotică înaltă. Ea va genera atât precursorii macrofagelor cât și pe aceia ai eritrocitelor, polimorfonuclearelor megacariocitelor.

Monoblastul este prima celulă identificată pe linia de diferențiere a fagocitelor mononucleare ce este capabil să fagociteze dar și să adere la suportul de sticlă prezentănd pe suprafața sa receptori pentru Fc. Este localizat în măduva osoasă.

Promonocitul se întâlnește în măduva osoasă, are o dimensiune de 15 μm, prezintă un nucleu dantelar, citoplasmă acidofilă cu poliribozomi.

Din maturarea promonocitului rezultă monocitul ce este eliberat în sânge iar după 60 h unde devine o celulă circulantă pentru aproximativ 24 h migrând apoi spre un focar de inflamație. În cazul în care nu există un focar de inflamație, monocitul migrează în țesut unde se transformă în macrofag rezident și își îmbogățește echipamentul enzimatic.

Din punct de vedere al localizării se disting:

– fagocite mononucleare tisulare reprezentate de histocitele din țesutul

conjunctiv, țesutul limfoid (macrofage libere și fixe), din măduva osoasă, plămâni (macrofage alveolare), din cavități seroase (macrofage din articulații, din pleură și peritoneu)

– fagocite mononucleare intravasculare: cele care au contact cu sângele (celule Kupffer, histocitele din cordoanele pulpei rosii splenice) sau contactul cu limfa (macrofage intra- și extrasinusoidale din ganglionii limfatici.

Macrofagele sunt celule mobile întâlnite în sânge(monocite) dar pot fi și celule fixe alcătuind sistemul reticulo-histocitar. Ele înglobeazǎ fragmente de germeni sau particule macromoleculare, iar ca exemple putem menționa : macrofagele din splina și ganglionii limfatici ; celulele Kupper din ficat ; histocitele din țesutul conjunctiv.

Macrofagele prezente în sau lângă fluxul sanguin si limfatic supraveghează aceste fluide pentru a îndepărta materialele străine dar și pentru a le prelucra ca antigene ce vor fi prezentate limfocitelor. Macrofagele splenice și cele din măduva osoasă sunt situate extrasinusoidal, iar pentru a încorpora materialul străin (nonself) în celule trebuie să străbată endoteliul. Fagocitele sanguine au proprietăți de a migra din patul vascular în țesuturi, iar cele cu rezidență tisulară sunt mobile în interiorul țesutului respectiv.

Deplasarea fagocitelor poate să fie întâmplătoare, nedirecționată sau orientată către stimulii chimici eliberați de microorganismele invadatoare. Chimiotaxia este deplasarea orientată a macrofagelor fiind ușurată de enzimele active la pH-ul tisular secretate de acestea. (Grigore Mihăescu, 1995)

1.4.3 Granulocite

Granulocitele denumite și polimorfonucleare (PMN) sunt reprezentate de neutrofile, bazofile si eozinofile. Acestea au o durată de viață scurtă doar câteva zeci de ore, dar deși au durată de viață scurtă numărul lor în sânge este constant datorită faptului ca producerea granulocitelor este reglată în funcție de nevoile organismului. Iar aceste fapt face ca în timpul unei infecții când numărul granulocitelor este în scădere să se considere că organismul prezintă o incapacitate de apărare.

Granulocitele neutrofile, denumite și ,,celule kamikaze’’ deoarece ele ajung primele la locul infecției, sunt celule care fagocitează edificii mari (corpi bacterieni integri). (Grigore Mihăescu, 1995)

Neutrofilele reprezintă aproximativ 60-70% din leucocitele circulante având diametrul de 9-12 μm și prezentând granulații numeroase care pot fi:

– granulații specifice (primare) ce apar în stadiul de promielocit și înmuguresc pe fața concavă a cisternelor aparatului Golgi. Acestea mai conțin lactoferin, hidrolaze acide degradative, substanțe cu acțiune bactericidă.

– granulații azurofile (secundare) sunt întâlnite doar în primele etape a dezvoltării neutrofilului fiind implicate în procesele inflamatorii. Ele conțin fosfatază alcalină și lizozim. Sunt formate când promielocitul se transformă în mielocit. (Valeria Dănacu, 2015)

Polimorfonuclearele eozinofile sunt alcătuite din enzime ce metabolizează histamina și leucotrienele dar conține și proteine toxice care provoacǎ distrugerea celulelor epiteliale din tractul respirator.

Eozinofilele sunt în procent de 3-5% din totalul leucocitelor sanguine având un diametru de 12-15 μm. Au o durată de viață cuprinsă între 7-10 h fiind distruse la nivelul splinei dar și în țesuturi. În citoplasmă prezintă colorații mari sferice. O granulă este formată din : – internum format din molecule de proteină bazică

– matricea dispusă la exterior are un aspect mai puțin dens ce înconjoară centrul

granulei și este denumită externum.

Ca și roluri ale eozinofilelor putem aminti : intervenția în reacțiile de apărare acționând asupra complexelor antigen-anticorp, hiperimune, alergice, anafilactice având capacitatea de a distruge microorganismele si paraziți, dar participă și la fluidifierea sângelui prin secretarea fibrolizinei. (Valeria Dănacu, 2015)

Polimorfonuclearele bazofile sunt formate din mulți mediatori chimici și precursori cum sunt : leucotrienele ; prostaglandinele ; factorii activatori ai trombocitelor.

Bazofilele au o pondere redusă în sângele circulant fiind în procent de mai puțin de 1% din leucocitele sanguine. Ele au formă sferică dar citoplasma este bazofilă, cu un nucleu neregulat uneori având formă de trifoi, treflă sau literei "S" însă prezintă si granulații numeroase răspândite neuniform.

Locul de formare al bazofilelor este măduva roșie hematogenă formându-se dintr-o celulă stem pluripotentă. Durata de viață este de 8-10 zile și sunt capabile să intervină în stări inflamatorii, de șoc sau stres. (Valeria Dănacu, 2015)

Moleculele sistemului imun

Moleculele sistemului imun sunt reprezentate de sistemul complementului,

imunoglobulinele (anticorpi) si citokinele.

1.5.1 Sistemul complementului

Sistemul complementului (alexinei) reprezintǎ componenta complexă a serului normal fiind format din 25 de proteine serice plasmatice care se activeazǎ una pe alta în lanț (,,activare în cascadǎ’’) având un rol esențial în apărarea organismului. Complementul intervine în etapele finale de realizare a proceselor imune cum ar fi liza celulară.

Există douǎ cǎi de activare a complementului care conduc la aceiași produși finali : calea comunǎ (clasică) și calea alternativǎ (fig 1.1). Aceste cǎi de activare a complementului sunt formate din : factori declanșatori și secvențele procesului.

În calea clasică, complexul proteic C1 se leagă de complexele antigen-anticorp formându-se proteaza activă care clivează si activează C4 și C2. Apoi are loc formarea C3-convertazei care este o enzimă complexă și scindeză C3 specific.

Calea alternativă este activată în absența complexelor imune cum ar fi: cristale de urați, polizaharidul pneumococic, proteina C reactivă. Fixarea complementului pe cale alternativă reprezintă prima barieră de apărare în fața infecțiilor, înainte de activarea sistemului imun. În calea alternativă, factorul B se leagă de C3b formându-se complexul C3bB care este clivat de factorul D și rezultă un fragment mic (Ba) dar și convertaza C3 (C3bBb) analoagă cu convertaza C3 a căii clasice (C4b2b). Acest complex se disociază ușor dar devine relativ stabil prin legarea proteinei serice P care clivează C3 și eliberează C3a și C3b. Prin clivarea C5 de către C3b rezultă C5a și C5b. Și în ultimă fază C5b sub acțiunea C6, C7, C8 și C9 formează complexul molecular denumit complex de atac de membrană de formă cilindrică. Complexul prezintă o suprafață externă hidrofobă și un miez hidrofil. (Grigore Mihăescu, 1995)

Figura 1.1 Sistemul complement

https://www.boundless.com/microbiology/the-complement-pathway

1.5.2 Structura imunoglobulinelor

Imunoglobulinele (denumite și anticorpi) sunt glicoproteine sintetizate în organism în prezența unor substanțe străine, cu funcție de anticorpi și au rol important în reacțiile de imunitate umoralǎ.

O imunoglobulinǎ este alcătuitǎ din douǎ categorii de lanțuri polipeptidice (fig 1.2):

– Lanțuri grele sau H care conține 450-600 de AA ; regiunea CH este formatǎ din 3-4 domenii cu 100-110 AA care au subzone: CH1; CH2; CH3; CH4.

– Lanțuri ușoare sau L care conțin 214 AA formate dintr-un domeniu variabil (VL) și unul constant (CL) fiecare cu câte 107 AA.

Două lanțuri H alcătuiesc miezul central al structurii imunoglobulinei protejate fiecare de către un lanț L astfel între lanțurile alăturate dar și cele vecine se formeazǎ punți disulfurice. Părțile constante ale lanțurilor H formeazǎ fragmentul Fc; acestea sunt unite prin punți disulfurice, iar între porțiunile VL si VH vecine se realizează o porțiune Fab (fragment de legare a antigenului).

Regiunea ,,balama’’ este întalnitǎ în vecinatatea punților disulfurice ale lanțurilor H ducând la bifurcarea moleculei în Y. Această regiune are un rol important în flexibilitatea și funcționalitatea moleculei prin intermediul căreia se transmit efectele complexării moleculei de la nivelul fragmentului Fab la Fragmentul Fc. ( Radu și Voiculescu, 1985)

Figura 1.2 Structura unei imunoglobuline https://www.google.ro/search?q=imunoglobulina+structura&source

1.5.2.1 Clasificarea imunoglobulinelor

Imunoglobulinele sunt clasificate în 5 clase ce pot fi observate în fig. 1.3 dintre care 3 sunt principale (IgG; IgM; IgA) și doua secundare (IgD; IgE).

Figura 1.3 Clasificarea imunoglobulinelor

http://www.bio.unibuc.ro/pdf/licenta_2013/Imunobiologie.pdf

Clasa IgG:

Dintre toate cele 5 clase această imunoglobulină IgG are ca structurǎ modelul reprezentativ de imunoglobuline. În cadrul acestei clase există 4 subclase: IgG1; IgG2; IgG3; IgG4.

Proprietăți care nu au legatură cu activitatea imunǎ:

-Sunt ușor de obținut în stare purǎ ; au greutatea moleculară de 150kDa; constanta de sedimentare =7S; proporția de glucide per moleculă este de 3%; concentrația sericǎ este de 800-2000mg%; iar moleculele sunt termorezistente.

Proprietăți ce au legaturǎ cu activitatea imunǎ (specifica) :

– Moleculele sunt bivalente deoarece conțin 2 fragmente Fab.

– Legătura dintre anticorpi IgG și antigenul corespondent este puternicǎ.

– Anticorpii IgG au rol prioritar, mare în imunitatea umoralǎ.

Funcțiile imunoglobulinelor G: activarea SC pe cale clasică; fagocitoza osponica; mediatori și citotoxicitații celulare anticorpodependente (ADCC) și neutralizarea toxinelor prin intermediul reacției de seroneutralizare (dupa Miller si colab.,1991).

Clasa IgA:

Acest tip de imunoglobuline se întâlnesc atât în umori sau ser (sub forma de monomeri sau dimeri), cât și în secrețiile externe (sub formă dimerizată sau agregate mari). În cadrul acestei clase există douǎ subclase de IgA:

– subclasa IgA1: în proportie de 90% în ser dintre care 80% este monomerǎ

– subclasa IgA2: predomină în secreții sub formǎ dimerizatǎ cu o structură originalǎ datorită faptului că lanțurile L sunt unite prin legături covalente, iar lanțurile H unite prin interacțiuni necovalente.

IgA sericǎ are o concentrație relativ mare de 90-450mg%; reprezintǎ aproximativ 15-20% din totalul imunoglobulinelor din circulație având o constantă de sedimentare egalǎ cu 7S sau 9S. Se considerǎ că la vârsta de 14 ani este atins nivelul seric normal.

IgA secretorie (sIgA) reprezintǎ forma întâlnitǎ în secreții unde predomină ca dimer dar mai există polimeri și monomeri însǎ în cantitate redusǎ. Are o greutate molecularǎ de 400kDa și constanta de sedimentare egalǎ cu 11S. Aceasta este secretatǎ de plasmocitele din foliculii limfoizi întâlniți în chorionul mucoaselor.

În privința structurii IgA secretorie ea mai conține pe lângă lanțul J o glicoproteină suplimentarǎ denumită piesa secretorie (piesa S sau CS), aceasta fiind sintetizată însǎ de celulele epiteliale nu de plasmocite.

Funcțiile IgA:

– moleculele IgA serice nu activeazǎ complementul pe cale clasicǎ; nu favorizeazǎ fagocitoza opsonicǎ, nu aglutineazǎ și nu precipită aglutininile.

– moleculele IgA secretorii se întalnesc în toate tipurile de secreții dar în concentrații diferite. S-a observat că nou-născuții au un nivel redus de IgA sinteza acesteia în corp începe la 30 de zile după naștere. Au un rol important în apărarea locală fiind o barieră împotriva antigenelor virale, bacteriene sau parazitare deoarece imobilizează și reunește agenții infecțiosi. ( Radu și Voiculescu, 1985)

Clasa IgM: Proprietăți care nu au legatură cu activitatea imunǎ:

– Molecula IgM are o structurǎ pentameră alcătuitǎ din 5 unități identice care prezintǎ 10 situsuri de legare specificǎ cu Ag însǎ doar 5-6 sunt active dintre acestea; reprezentând prima barierǎ ele fiind cele care apar timpuriu în imunitatea umoralǎ ; au capacitatea mare de activare a sistemului complement pe cale clasicǎ; iar legătura dintre anticorpul IgM și antigenul corespondent este mai slabǎ spre deosebire de legătura din cazul IgG.

Clasa IgD:

Moleculele acestei clase au greutate molecularǎ de 185Da; constanta de sedimentare egală cu 7S reprezentând aproximativ 0,2-1% din cantitatea totalǎ de Ig. Moleculele de IgD prezintǎ un catabolism foarte rapid. Se întâlnesc în organism sub două forme : molecule solubile; circulante în plasmă sau receptorii pentru aglutinine la nivelul membranei limfocitelor B.

Funcția IgD: nu fixeazǎ și activeazǎ C; nu traverseazǎ placentǎ; nu provoacǎ degranularea bazofilelor și a mastocitelor și nu se fixeazǎ citofil pe monocite sau limfocite. Au rol important la nivel celular fiind receptor pentru Ag pe membrana limfocitelor B dar intervine și în diferențierea lor. Concentrația sericǎ la om crește de la naștere pânǎ la vârsta de 15 ani iar patologic crește în infecțiile cronice la copii; boala reumatoidă; leucemia limfaticǎ cronicǎ și boala Hodgkin.

Clasa IgE:

Moleculele din aceastǎ clasǎ sunt termosensibile ; au greutate moleculara de 90kDa; constanta de sedimentare de 8S; concetrația sericǎ este redusǎ, iar nivelul normal seric fiind atins la vârsta de 14 ani. Acestea sunt secretate de către plasmocite aflate sub controlul Th și Ts. ( Radu și Voiculescu, 1985)

1.5.3 Citokine

Citokinele sunt proteine mici secretate de orice celulă a organismului având efect specific asupra interacțiunilor și comunicărilor dintre celule. Citokinele sunt molecule cu activitate biologică prezentând receptori de mare afinitate pentru diferite citokine. Activitatea acestora se poate realiza atât in vivo cât și in vitro fiind denumite datorită acestui fapt și imunohormoni sau hormoni reglatori ai răspunsului imun. Citokinele actionează la nivel local în comparație cu hormonii care acționează la distanță.

Clasificarea citokinelor:

Citokinele sunt împărțite în:

– Interleukine (IL) sunt peptide hidrosolubile fiind sintetizate de limfocite în special

dar și de alte celule având efect nu doar asupra celulelor limfoide ci și asupra altor celule. Rolul lor este esențial datorită faptului că mediază cooperarea celulelor sistemului imunitar.

– Interferonul (IFN) reprezintă un tip special de citokine și este o substanță proteică

sintetizată în unele celule ale organismului, sinteza lor fiind indusă de diverși agenți chimici sau biologici.

Cea mai importantă funcție a interferonului este inducerea stării antivirale, dar mai prezintă și alte funcții cum ar fi: inhibiția multiplicării celulelor normale și tumorale, reglarea proceselor de diferențiere celulară și nu în ultimul rând reglarea funcției imunitare.

– Factor de necroză tumorală (TNF) este o proteină proinflamatorie cu funcție de

citokină capabilă să distrugă celulele tumorale, să regleze sistemul imunitar dar și să inducă necroza și apoptoza celulelor umorale cât și inducerea inflamației.

Există două tipuri de TNF: TNF-α (casectina) și TNF-β (limfotoxina).

S-a descoperit ca cele două tipuri de TNF prezintă omologie la 34% din secvențele de aminoacizi. Limfotoxina este produsă la nivelul limfocitelor, celulelor NK și a macrofagelor stimulate. Ea poate fi întâlnită fie ca proteină solubilă, fie ca proteină asociată membranei citoplasmatice a unor celule.

Casectina este o citokina proinflamatorie care este produsă în macrofage și monocite dar și de limfocite, neutrofile, mastocite. Ea se prezintă sub forma de trimer și poate exista fie sub formă solubilă, fie sub formă legată de membrană. Casectina acționeză direct prin intermediul a doi receptori de suprafață (TNFP I și TNFR II). Este implicat in distrugerea celulelor B insulare.

Chemochinele sunt proteine cu greutate moleculară mică fiind caracterizate printr-o

omologie bună a structurii. Funcția lor principală este de a activa și a recruta leucocitele la locul de inflamație însă unele sunt produse și în lipsa unei infecții sau a unei inflamații pentru a regla traficul leucocitelor în organism.

Cooperări celulare și moleculare în răspunsul imun

Răspunsul imun reprezintă ansamblul tuturor fenomenelor complexe declanșate de interacțiunea antigenului cu sistemul imunitar în cadrul căruia sunt activate celulele imune care se multiplică și apoi se transformă în celule efectoare și celule cu memorie.

1.6.1 Particularități generale ale răspunsului imun

Trăsăturile generale ale răspunsului imun față de o substanță străină (nonself) sunt:

– caracterul adaptativ al funcției sistemului imunitar ce implică mobilizarea celulelor pre-programate activate de un anumit antigen ce corespunde specificității lor

– caracterul economic al activității sistemului imunitar care constă în activarea numai a subpopulațiilor celulare ce recunosc substanțele străine, celelalte clone nefiind implicate pentru a rămâne disponibile altor interacțiuni

– eficiența sistemului imunitar reiese din caracterul economic al mijloacelor celulare dar și moleculare și din amplificarea pe 2 căi a efectorilor:

a)proliferarea masivă a celulelor alese la nivelul cărora se produc modificări funcționale calitative rezultând celule efectoare și celule de memorie

b)celulele efectoare produc un număr mare de molecule de recunoaștere luând formă de receptori specifici

– cooperarea celulelor sistemului imunitar cu alte celule care sunt capabile să furnizeze rezistență organismului. Cooperarea se poate face și cu factori nespecifici imunității naturale cum sunt: fagocitele, sistemul complement,etc.

– pentru ca sistemul imunitar adaptativ să intre în acțiune este nevoie de o perioadă de timp în care sunt activate și multiplicate limfocitele care recunosc antigenul în comparație cu reacțiile neadaptative care sunt imediate

– protecția organismului și a urmașilor săi este asigurată prin transferul de anticorpi cu ajutorul secreției lactate dar și a placentei

– reacțiile adaptative prezintă o proprietate unică fundamentală- memoria imună este netransmisibilă la descendenți. ( Radu și Voiculescu,1985)

1.6.2 Tipuri de rǎspuns imun

Rǎspunsul imun se clasificǎ în funcție de mecanismele acestuia în:

– Rǎspuns imun umoral (R.I.U) prezintă ca verigă efectoare anticorpi sau imunoglobuline care sunt proteine specifice

– Rǎspuns imun celular (R.I.C) prezintă ca verigă efectoare o subpopulatie de celule numite limfocite T efectoare (imune).

În evoluția celor 2 tipuri de răspuns imun etapele de evoluție ale imunității sunt grupate în 2 stadii (faze):

– Rǎspuns primar

– Rǎspuns secundar

Răspunsul primar începe în momentul contactului organismului cu antigenul complet necunoscut, iar evoluția lui presupune o serie de faze:

– Faza de latențǎ (4-7 zile) nu se produce nicio modificare aparentǎ

– Faza exponențială (2-3 zile) se observă o creștere lentǎ a intensitǎții reacției imune

– Faza staționarǎ (3-5 zile) intensitatea răspunsului rǎmane aceeași, constantă

– Faza de declin (după 10-14 zile de la stimulare) intensitatea rǎspunsului scade lent pana aproape de 0.

Rǎspunsul secundar reprezintă modul de reacționare specificǎ a organismului în momentul contactului cu un antigen cunoscut. Fazele acestui tip de răspuns sunt:

– Faza de latențǎ mai scurtă decat cea a rǎspunsului primar

– Faza exponențialǎ are loc creșterea foarte rapidǎ a intensitǎții răspunsului ajungând la nivelul ridicat

– Faza stațioanarǎ se observǎ persistarea nivelului ridicat un timp îndelungat

– Faza de declin se remarcǎ scăderea lentă dar se păstreazǎ un fond imunitar residual mult mai mare decat rǎspunsul primar.

1.6.3 Proprietǎțile răspunsului imun

Proprietățile fundamentale ale rǎspunsului imun sunt: recunoașterea; specificitatea și memoria imunǎ.

Recunoașterea reprezintǎ proprietatea sistemului imunitar de a găsi diferite antigene și de a fi capabil să producǎ un rǎspuns specific fatǎ de acele antigene.

Specificitatea este capcacitatea sistemului imunitar sǎ recunoascǎ un anumit tip de antigen din multitudinea de antigene cu care organismul a avut contact.

Memoria imună reprezintǎ proprietatea sistemului imun care fiind expus repetat la același antigen să determine producerea rapidǎ, intensă a unui răspuns imun.

1.6.4 Tehnici de evaluare a răspunsului imun

În evaluarea structurilor și proceselor biologice implicate în sistemul imun ce protejează organismul sunt folosite tehnici specifice imunologiei clinice astfel că pentru răspunsul imun umoral este studiată interacțiunea dintre antigen și anticorpi, iar în privința răspunsului imun celular este folosită determinarea numărului de limfocite, citokine, etc.

Clasificarea tehnicilor de evaluare a răspunsului imun este organizată în funcție de tipul răspunsului imun. Cele mai întâlnite metode de evaluare ale răspunsului imun umoral:

– determinarea calitativă a imunoglobulinelor serice

Pentru această metoda este folosită tehnica de imunofluorescență simplă deoarece sunt

obținute date legate de prezența imunoglobulinelor la nivelul serului sau a altor lichide biologie. Pe lângă această tehnică se mai pot folosi și tehnici serologice ce au la bază fenomenul de aglutinare însoțit de precipitare imună.

– determinarea cantitativă a imunoglobulinelor serice

Există metode variate folosite pentru determinarea cantitativă însă acestea se împart în

funcție de aprecieri: semicantitative unde sunt folosite reacția de aglutinare lentă și imunodifuzia radială dublă sau cantitative determinate cu ajutorul imunodifuziei radiale simple, ELISA sau nefelometriei. Utilizarea acestor tehnici permite obținerea de rezultate ce pot fi comparate cu valori ale etaloanelor proteice.

– titrarea complementului sau a componentelor sale

Analizarea atât calitativă cât și cantitativă a componentelor complementului se poate realiza prin tehnici de imunodifuzie radială doar dacă există seruri corespunzătoare, standardizate. Reducerea cantitativă a unui component nu produce o schimbare în eficiența sistemului comparativ cu absența unui singur component care determină deficiență totală din punct de vedere funcțional.

Metodele de evaluare ale răspunsului imun celular sunt următoarele:

– determinarea activității fagocitare

În activitatea fagocitară sunt implicate 2 tipuri de celule: neutrofilele respectiv, celule din seria monocite-macrofage. Astfel că pentru analizarea fagocitozei la nivelul neutrofilelor sunt utilizate teste care au la bază tehnici de migrare în stratul filtrant și sub stratul de agaroză, dar și tehnici de înglobare și evaluare a metanolismului oxidativ cu ajutorul chemiluminescenței.

La nivelul seriei monocite-macrofage este urmărită capacitatea de deplasare sau migrare prin tubul capilar și stratul filtrant dar și capacitatea de endocitoză sau înglobare a particulelor de C sau a hematiilor heterologe.

– determinarea activității limfocitare

Cele mai importante teste folosite în determinarea activității limfocitare au la bază

tehnici de separare celulară care stabilește raportul între limfocitele T și B. Prin intermediul

testului bazat pe citometria de flux este permisă determinarea subpopulațiilor limfocitare. Iar testele de transformare blastică unde celulele limfocitare sunt în contact cu substanțele mitogene furnizează informații despre funcționalitatea limfocitelor.

– determinarea activității citotoxice

Cu ajutorul testelor de citotoxicitate se pot analiza limfocitele T citotoxice, celulele K ,celulele NK și macrofagele. Însă aceste teste sunt foarte costisitoare deoarece necesită aparatură specifică și de asemenea reactivi specifici.

1.7 Caracterizarea stărilor de imunodeficiență și hipersensibilitate

1.7.1 Stǎri de imunodeficiență

Imunodeficiența este starea de diminuare a rectivității imune umorale; celulare sau umoral-celulare apărutǎ în urma unor carențe naturale ale mecanismelor declanșării dezvoltării și a realizării finale a imunității.

1.7.1.1 Clasificarea imunodeficiențelor

Imunodeficiențele sunt clasificate în imunodeficiențe primare (înnăscute) sau secundare (dobândite). La rândul lor imunodeficiențele primare sunt împărțite în funcție de tipul imunității:

– Pe linia imunității umorale: conține hipo și agamaglobulinemiile care sunt afecțiuni congenitale provocate de un deficit funcțional al sistemului limfocitar bursodependent.

Cele mai importante afecțiuni din aceastǎ categorie sunt:

– Gamaglobulinemia legată de cromozomul X: aceastǎ afecțiune se manifestǎ doar la indivizii de sex masculin și este datoratǎ unor gene purtate de genomul heterozigot al mamei care se activeazǎ la fătul mascul. Afecțiunea poate fi însoțitǎ de diferite modificări cum sunt cele articulare, dermatomiozita sau pareze ale neuronului motor periferic.

– Deficiența de imunoglobuline IgA secretoare: indivizii care suferǎ de această afecțiune prezintǎ o apărare deficitarǎ la nivelul mucoaselor și a pielii.

– Deficiența de imunoglobuline IgG și IgA sistemice asociatǎ cu creșterea titrului plasmatic de IgM.

– Deficiența imunoglobulinice Kappa

– Pe linia imunități celulare: ca și afecțiune ce caracterizeazǎ această categorie este Sindromul Di George denumit și aplazie timică congenitală. Copii se nasc fără timus și nu vor prezenta bagajul celular al sistemului timodependent: această boală fiind caracterizată prin imunitate celulară abolită și în același timp este diminuat mai mult sau mai puțin răspunsul umoral.

– Pe linie mixtă (atât umorală cât și celulară) cele mai cunoscute afecțiuni care fac parte din această categorie sunt:

– Sindromul Wiskott-Aldrich reprezintă o boalǎ congenitalǎ cu manifestări ca exeme și trombocitopenie; bolnavii contractând frecvent infecții intercurente.

– Imunodeficiența de tip Swiss este transmisǎ prin intermediul unei gene recesive autosomale manifestatǎ prin diminuarea imunității umorale și celulare însǎ prezintǎ și semne cum este diareea cronicǎ sau leucopenia. Bolnavii sunt sensibili la infecții.

– Disgenezia reticularǎ

– Deficienta enzimaticǎ

– Ataxia-teleangiectazia congenitalǎ: indivizii ce suferǎ de aceastǎ afecțiune se nasc cu hiploplazie sau displazie timicǎ dar și cu o deficiență în sintezǎ de imunoglobuline IgA secretoare.

Imunodeficiențele secundare reprezintǎ stări de diminuare a imunitǎții care apar pe parcursul unei afecțiuni ce produce scăderea rezistenței organismului. Ele pot fi de duratǎ și pot avea intensități diferite. Ca și boli care determinǎ imunodeficiența secundarǎ putem aminti: tumori ,, solide‘‘; leucozele; Boala Hodgkin; infecțiile cronice; scleroza în plăci etc. (Radu și Voiculescu, 1985).

1.7.2 Stǎri de hipersensibilitate

Hipersensibilitatea, cunoscutǎ și sub numele de alergie, reprezintǎ reacția exageratǎ de apărare atât ca intensitate cât și ca duratǎ a organismului împotriva unui antigen recunoscut de anticorpi. Antigenul capabil să declanșeze reacția de hipersensibilitate este denumit alergen.

1.7.2.1 Clasificarea stǎrilor de hipersensibilitate

Stările de hipersensibilitate au fost clasificate în 4 categorii:

– Hipersensibilitate imediatǎ de tipul I (atopică sau anafilactică) survine la câteva minute după contactul cu antigenul sub forma unor urticarii, astm sau șoc anafilactic.

– Hipersensibilitate imediată de tipul II (citotoxică, dependentă de complement) corespunde distrugerii celulelor organismului prin intermediul mecanismelor autoimune sau tratamente.

– Hipersensibilitatea imediată de tipul III (prin complexe imune circulante) caracterizatǎ de depunerea anticorpilor pe pereții vaselor unde produc leziuni.

– Hipersensibilitatea întarziată de tipul IV produce reacții inflamatorii importante.

1.7.2.1.1 Hipersensibilitate imediatǎ de tipul I

Aspectele clinice ale acestei afecțiuni sunt următoarele:

– Fenomene cutanate dupǎ ințepături de insectă

– Reacții de intoleranță la antibiotice putând ajunge pânǎ la șocul anafilactic

– Alergiile cutanate sau dermatitele alergice datorate hipersensibilizarii pielii

– Alergiile respiratorii pot fi provocate de diferiți factori cum sunt polenul , fân, pǎr de animale, particule de praf

– Alergiile digestive au ca alergene diferite tipuri de fructe și alimente, se manifestă prin urticarie sau uneori edem Quincke

Testarea hipersensibilității imediate de tip I se realizează prin:

-Testul Prausnitz-Kustner reprezintǎ un test imunologic folosit anterior de cǎtre medici pentru a determina dacă un pacient este alergic la un antigen specific.

-Testul de anafilaxie pasivǎ

-Dozarea imunoglobulinelor IgE serice prin imunodifuzie în prezența unui ser imun standard anti-IgE

1.7.2.1.2 Hipersensibilitatea imediatǎ de tip II

Aspectele clinice ale hipersensibilițǎtii imediate de tip II cuprinde:

– Incompatibilitatea de grupǎ sanguinǎ caracterizată de reacțiile de incompatibilitate ce apar între eritrocitele donatorului și anticorpii receptorului

– Reacțiile de respingere a heterogrefelor

– Bolile autoimune care prezintǎ specificitate dintre organe

– Anemii hemolitice toxice cu componentă autoimunǎ

– Agranulocitoze toxice autoimune după medicamente

– Trombocitopenii toxice după tranchilizante

Testarea hipersensibilității imediate de tip II se realizează prin:

-Dozarea concentrației de complement seric

1.7.2.1.3 Hipersensibilitate imediatǎ de tipul III

Aspectele clinice ale acestei categorii sunt polimorfe :

– Boala serului este un sindrom care apare în urma administrǎrii de ser antitoxic având manifestări variate ca febră; eritem localizat sau generalizat; inflamația articulațiilor etc.

– Sindromul ,,plamânului de fermier‘‘ este întâlnit la muncitorii agricoli care devin sensibili la fânul putrezit provocând alergii respiratorii cu rinita dar și insuficiență respiratorie

– Boala columbofililor reprezintă un tip de alergie întalnită la persoanele care au păsări în colivie și inhalează astfel particule de materii fecale uscate

– Periartrita nodoasă este inflamația peretelui arterelor datorită irigării proaste a țesuturilor

– Poliartrita reumatoidă, în special poliartrita cronică evolutivă (PCE) prezintă ca manifestări clinice pusee acute apărute în circulație și fixarea pe sinoviala articularǎ a complexelor imune circulante(CIC)

– Glomerulonefritele acute difuze reprezintă consecința fixării CIC la nivelul epiteliului glomerulilor.

Testarea hipersensibilității imediate de tip III se realizează prin determinarea consumului de complement și a complexelor imune circulante.

Determinarea consumului de complement

Pentru a scădea concentrația complementului seric sunt folosite mai multe metode cum sunt :

– Imunodifuzia radialǎ

– Testul CH50

– Testul legării subfracțiunii de complement CIq

Determinarea prezenței complexelor imune (CIC) se face prin:

– Precipitarea cu polietilen-glicol a CIC din serul testat

– Teste care folosesc celule indicatoare purtătoare de receptorii

– Determinarea criglobulinelor serice

1.7.2.1.4 Hipersensibilitate întârziatǎ de tipul IV

Aspecte clinice: hipersensibilitatea întarziatǎ poate fi întâlnitǎ ca fenomen predominant sau asociat . Putem menționa:

– Infecții bacteriene sau parazitare cronice

– Fenomene de respingere a grefelor

– Cancer dar și unele boli autoimune: lupusul diseminat; boala Hodgkin.

Testarea hipersensibilității întârziate se poate realiza atât prin tehnici in vivo cât și in vitro. (Radu și Voiculescu, 1985)

CAPITOLUL II

Material și metodă

2.1 Obiective

Plecând de la potențialul de analiză existent în laboratorul de investigare clinică ne-am propus sǎ facem o evaluare a statusului imun luând în calcul atât mecanismele de rǎspuns imun celular cât și cele de răspuns imun molecular. Parametrii evaluați au permis în bună măsură aprecierea corectă a potențialului de răspuns imun și amplificarea unor posibile abateri cu sau farǎ semne clinice.

Dacă la o scurtă analizǎ a parametrilor imunologici testați nu se pot desprinde elemente suficiente pentru stabilirea unui diagnostic atunci când se face corelarea datelor obtinuțe la testările biochimice, hematologice și imunologice se pot contura clar stări ce pot fi încadrate în stări de hipersensibilitate sau de imunosupresie.

Existența unor valori ridicate la titlul imunoglobulinelor implicate în stările alergice (IgE, IgG, IgM) face posibilǎ evidențierea unor cazuri clinice la care starea alergicǎ este deja instalatǎ sau este în curs de instalare. Valorile efectorilor celulari și moleculari analizați exprimă de multe ori abateri ale răspunsului imun ce nu au fost încă exprimate clinic.

În acest sens obiectivul de bază al cercetării realizate a fost identificarea acelor elemente care pot construi semnale de alarmǎ privitoare la eminenta instalare și evoluție a unor stǎri alergice. Fărǎ sǎ intrǎm în mecanismele imunologice care preced și ulterior declanșeazǎ o stare de hipersensibilitate și farǎ a analiza natura alergenilor declanșatori putem evalua aceste mecanisme numai pe baza unor valori cantitative legate de celulele implicate în declanșarea stării alergice și a moleculelor cu rol similar.

2.2 Material

Materialul biologic utilizat în experiment a fost reprezentat de persoane venite la laboratorul Gral Medical pentru evaluări hematologice și biochimice. La majoritatea cazurilor s-a efectuat și investigații privitoare la unii factori ai imunității celulare și umorale. O parte din pacienți aveau diagnostic prezumtiv și o alta parte erau veniți pentru investigații de rutinǎ.

Din considerente de dontologie profesionalǎ nu se vor menționa date privitoare la acești pacienți. Metodele utilizate pentru investigare s-au bazat pe aparatura existentă în laborator. Majoritatea datelor au fost obtinuțe utilizând aparatele de Tip : Sysmex și Cobas.

Aparatura este de ultimǎ generație omologatǎ și acreditatǎ pentru efectuarea acestor teste, iar personalul care deservește aceste aparate este specializat în acest sens și datele obținute pot fi luate în calcul pentru stabilirea mai multor tipuri de diagnostic. Studiul a fost efectuat asupra unui grup de persoane în număr de 25 a căror vârstă a fost cuprinsă între 0 și 80 de ani.

Pacienți au fost organizați în grupuri în funcție de vârstă. Astfel s-au format următoarele grupe:

– grupa 1: cuprinde pacienți cu vârsta între 0-10 ani

– grupa 2: formată din pacienți care au o vârstă între 10 și 20 de ani

– grupa 3 : cuprinde pacienți cu vârsta între 20-30 de ani

– grupa 4: cuprinde pacienți cu vârsta între 30-60 de ani

– grupa 5: este formată din pacienți a căror vârstă este de peste 60 de ani.

Pentru extragerea rezultatelor și a concluziilor am selectat 10 persoane alese aleatoriu.

2.3 Sistemele automate de analiză hemato-imunologică

Aparatele utilizate pentru a obține rezultatele ce stau la baza acestui studiu au fost: aparatul Cobas 6000 și aparatul Sysmex XT 2000.

2.3.1 Recoltarea probelor de sânge

Pentru a fi probat diagnosticul este necesar să se facă următoarele analize și investigații:

Pregătirea pacientului: Este foarte important ca pacientul să fie informat despre procedura la care va fi supus în felul acesta fiind obținut acordul lui.

Pentru a se putea recolta probele este necesar ca pacientul să fie în condiții bazale adică recoltarea să se facă între orele 7 și 9 dimineața și acesta să fie în condiții "a jeun". Dacă probele sunt recoltate atunci când condițiile bazale nu sunt întrunite se va ține cont de efectele adiționale produse de efortul fizic (determinarea creșterii glucozei, acidului lactic, proteinelor serice, CK) dar și de starea emoțională sau ritmul circadian care afecteză anumiți parametri.

Există 2 tipuri de recoltare a probelor de sânge astfel recoltarea se poate face fie sub forma unei singure probe, fie sub forma probelor multiple.

Flebotomia:

În cazul recoltării sângelui venos sunt utilizate 2 tehnici diferite de recoltare:

sistem serigă: prin intermediul căruia se ține sub control viteza de recoltare și astfel riscul de colabare a venei nu există.

sistem vacuum: în cadrul acestei metode tuburile folosite sunt vidate în momentul imediat anterior recoltării fiind eliminat riscul pierderii de vid, iar proporția de sânge recoltat-aditiv este constantă și rezultatele obținute sunt corecte.

Sistemul seringă (instrucțiuni):

– Înaintea puncționării venei acul trebuie introdus în tubul de recoltare și fixat prin

rotire ușoară în sensul acelor de ceasornic.

– Se puncționează vena, după care se slăbește garoul și se trage ușor pistonul până se

oprește fluxul sanguin.

– Se scoate tubul din ac prin rotirea în sensul acelor de ceasornic în timp ce acul

rămâne în venă.

– În cazul în care trebuiesc recoltate mai multe probe se fixează tubul următor în ac

și se procedează conform instrucțiunilor de mai sus.

– După ce s-a terminat recoltarea probei de sânge se scoate întâi tubul din ac și apoi

acul din venă niciodată invers!!!!!

Sistemul vacuum (instrucțiuni):

Este necesar fixarea pistonului la baza tubului după care trebuie îndepărtat.

Pentru a recolta sânge este important introducerea acului în venă.

Se slăbește garoul și se fixează tubul în acul care este aflat deja în venă prin rotirea

în sensul acelor de ceasornic.

Se așteaptă oprirea fluxului sanguin, apoi se scoate tubul din ac prin rotirea în sens

invers acelor de ceasornic.

Dacă este necesară recoltarea mai multor probe se fixează următorul tub în ac și se

urmărește instrucțiunile de mai sus.

Când s-a terminat recoltarea probelor de sânge se scoate acul din venă însă

ATENȚIE trebuie scos întâi tubul din ac și apoi acul din venă!!!

Foarte important de știut sunt când se recoltează probe de sânge indiferent de tehnica de recoltare sunt următoarele manevre:

folosirea mănușilor sterile pentru fiecare pacient căruia i se recoltează probe

trebuie evitată puncționarea unor zone unde sunt vizibile leziuni cutanate

dezinfectarea zonei unde va avea loc puncționarea prin intermediul unui tampon

steril imbibat în soluție de izopropanol 70% folosit pentru a îndepărta contaminanții

după tamponare este necesar să se usuce zona înainte de puncționare deoarece

poate fi indusă hemoliza probei dacă zona este umedă

după ce a fost recoltată proba de sânge trebuie aplicat un tampon compresiv pentru

asigurarea hemostazei și evitarea formării unui hematom, apoi se acoperă cu un pansament steril

acul de puncție trebuie depus într-un recipient în care sunt depozitate reziduurile

înțepătoare sau tăietoare

Aditivi

Pentru împiedicarea procesului de coagulare a sângelui integral sunt folosite vacutainere ce conțin substanțe anticoagulante deoarece anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA, citrat) sau prin inhibarea trombinei (hirudina, heparinat de litiu sau sodiu).

Capacele vacutainerelor au culori diferite în funcție de aditivul folosit pentru a nu fi nicio confuzie în identificarea tubului de recoltare.

Tuburile de recoltare folosite în laboratoarele Gral Medical sunt tuburi Beckton-Dickinson cu următoarele coduri de culoare (fig.2.1):

capac mov- folosește ca anticoagulant EDTA și este utilizat pentru analize

hematologice iar cele cu capac mov ce conțin citrat 4+1 sunt folosite la determinarea VSH-ului.

capac albastru- conține citrat 9+1 și este utilizat pentru analiza coagulării.

capac verde- conține Heparinat fiind utilizată plasma pentru analize chimice cum

ar fi troponina T.

capac galben- utilizat pentru analizele de biochimie

capac roșu- tubul nu prezintă anticoagulant, iar serul este folosit pentru testele de chimie, imunologie și serologie.

Figura 2.1 Tipuri de vacutainere – Original

Volumul optim de probă:

În laborator au loc erori uneori dar cea mai întâlnită eroare la nivelul unui laborator o reprezintă cantitatea de probă insuficientă primită. Și pentru asigurarea volumului adecvat de probă este necesară recoltarea unei cantități de 2 ori și jumătate față de volumul folosit pentru efectuarea unui test. Dar în același timp este foarte important să se evite recoltarea de sânge în exces, mai ales la copii mici, vârstnici sau la pacienți internați la terapie intensivă.

Volumele de sânge recomandate în cazul analizoarelor automate actuale sunt de:

4-5 ml sânge utilizat în investigațiile biochimice uzuale

1 ml de sânge folosit pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Prelucrarea probelor de sânge după recoltare:

Componentele sângelui:

Un adult de 70 kg are aproximativ 4,75-5,5 L de sânge din care plasma reprezintă

aproximativ 60 % și restul de 40 % sunt celulele sanguine. Plasma este formată din apă și constituenți dizolvați cum sunt hormonii, anticorpii și enzimele; aceștia sunt transportați către țesuturi. Celulele sanguine reprezentate de hematii, leucocite și trombocite sunt suspendate în plasmă.

Plasma se poate separa de ser prin centrifugare. Iar diferența dintre cele două este faptul că plasma reține fibrinogenul fiind înlăturat din ser. Sângele care este recoltat fără anticoagulant, cu sau fără gel separator, trebuie lăsat să sedimenteze sau să coaguleze. Apoi va fi centrifugat și se separă serul care conține albumină și globuline. În schimb plasma este obținută din sânge recoltat într-un tub cu anticoagulant după care se centrifughează. Plasma conține albumină, globuline și fibrinogen.

În funcție de anumiți analiți există diferențe semnificative între rezultatele obținute din ser și cele din plasmă: K, Mg, P, proteine totale, lactat etc.

Factorii care determină aceste diferențe dintre rezultatele obținute din ser și cele din plasmă sunt:

consumarea analitului în timpul procesului de coagulare: glucoza, fibrinogen;

în timpul procesului de coagulare poate fi eliberat din celule analitul: K, LDH,

fosfor, lactat;

metoda de determinare a GGT, Li poate interfera cu anticoagulantul.

Plasma Vs Ser

Ca și avantaje ale plasmei față de ser putem aminti:

-procesarea accelerata unde are loc eliminarea etapei de formare a coagulului, iar

creșterea vitezei de rotație poate scurta timpul de centrifugare.

-Obținerea unei cantități mai mari cu 15-20 % de plasmă decât de ser dintr-o probă.

-Nu se mai produc interferențe legate de coagularea post-centrifugare deoarece în

ser se pot forma coaguli după o centrifugare precoce spre deosebire de plasmă unde acest lucru nu se întâmplă.

-Rezultatele din plasmă exprimă mai fidel statusul pacientului in vivo decât cele din

ser. Și tot la nivelul plasmei există un risc mai mic de apariție a hemolizei și trombocitolizei decât în ser.

Dezavantajele sunt următoarele: în plasmă prezența fibrinogenului alterează electroforeza proteinelor; anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare, iar folosirea plasmei heparinizate duce la interferarea litiului sau amoniului din anticoagulant cu metodele de determinare a acestora.

Faza precentrifugare

Atât serul cât și plasma trebuie separate fizic de celulele sanguine repede deoarece există riscul obținerii unor rezultate eronate și din această cauză limita maximă este de 2 ore din momentul recoltării. Pentru potasiu, ACTH , cortizol, catecolamine, acid lactic și homocisteină este recomandat un contact redus (< 2 ore) cu celulele sanguine.

Metabolismul celuleor sanguine este inhibat de refrigerarea probelor care stabilizează anumiți constituenți termolabili. Din aceasta cauză pentru probele folosite la determinarea K nu este indicată refrigerarea probei deoarece este inhibată glicoliza și favorizată eliberarea K din celule de către temperatura scăzută ducând astfel la obținerea unor rezultate false. În schimb probele din care se fac testele de ACTH, PTH, acid lactic, catecolamine și gastrina trebuie răcite prin plasarea într-un recipient cu apă și gheață.

Centrifugarea

Centrifugarea probei pentru a putea fi obținut serul (fig 2.2) este necesară doar după ce se constată coagularea completă a sângelui. În mod normal timpul de coagulare este de cca 30 de minute dar există și cazuri în care pacienții primesc tratament anticoagulant sau pot fi și pacienți care prezintă defecte de coagulare (coagularea se produce cu întârziere).

Centrifugarea probelor trebuie efectuată în general la 3000 g timp de 5 minute atât pentru obținerea serului cât și pentru obținerea plasmei. Iar ca să se poată obține o plasmă deplachetată proba trebuie centrifugată la 2000-3000 g pentru un timp de 15-30 de minute.

Ca și contraindicații putem menționa faptul ca odată separate serul sau plama nu se mai pot recentrifuga probele, la fel și în cazul probelor recoltate în vacutainere cu gel separator. Programul de întreținere al centrifugilor este format din verificarea periodică efectuată cu ajutorul unui tahometru dar și verificarea vitezei de centrifugare obținute în urma unei setări specifice.

Figura 2.2 Probă centrifugată – Original

Transportul probelor

În funcție de natura produsului și de stabilitatea analiților care trebuie testați se întâlnesc 3 tipuri de transport al probelor:

– transport în condiții ambientale

– transport la rece (probe refrigerate)

– transport în gheață carbonică (probe congelate)

Timpul de transfer al probelor către laborator poate fi:

– scurt, atunci când locul de recoltare sau clinica sunt în același loc unde este și

laboratorul

– mediu, atunci când locul de recoltare sau clinica se găsesc în aceeași localitate cu

laboratorul

– lung, atunci când locul de recoltare sau clinica este în altă localitate decât laboratorul

iar probele sunt trimise prin poștă sau curier.

Regulile generale pentru transportul probelor:

Când pobele se sânge au un timp de transfer scurt sau mediu acestea trebuie

transportate ambiental în containere sau în pungi speciale. Tot probele transportate ambiental trebuiesc protejate de temperaturi extreme și acest lucru este realizat prin ambalarea în materiale izolante.

Probele care sunt refrigerate sunt plasate în apropierea pungilor cu gheață nu direct

pe pungile cu gheață.

În cazul probelor congelate este necesară verificarea dimensiunii containerului

deoarece trebuie introdusă o anumită cantitate de gheață carbonică care să reziste duratei transportului. Pe tot parcursul transportului se monitorizează temperatura cu ajutorul unor dispozitive de monitorizare.

S-a constat că unii parametrii biochimici cum sunt electroliții și enzimele nu au fost afectați de transportul prin poștă sau curier. Acest lucru este valabil și pentru concentrația hemoglobinei sau pentru numărul de eritrocite. În schimb au fost observate diferențe majore în cazul hematocritului, volumului eritrocitar mediu (VEM) dar și în cazul bilirubinei. Dacă este nevoie să se prepare un frotiu din sânge venos acesta trebuie făcut în maxim 3 ore de la recoltarea sângelui.

Referitor la transportul plasmei la distanță pentru a se efectua teste de coagulare se va face doar în gheață carbonică și decongelarea probelor în timpul transportului va genera rezultate eronate.

Stocarea probelor în laborator

După terminarea procesului analitic doar o parte din probe vor fi păstrate o anumită perioadă de timp, în condiții bine stabilite pentru a se putea fi permisă confirmarea rezultatelor, verificarea identității probelor sau pentru efectuarea unor probe suplimentare.

Timpul de arhivare al probelor în funcție de tipul de probă este următorul:

Probele pentru hematologie sunt păstrate la 2-4ș C timp de 24 h

Probele pentru biochimie și imunochimie sunt păstrate de asemenea la 2-4ș C dar

timp de o săptămână.

Probele pentru determinarea PSA sunt păstrate la -20ș C timp de 2 săptămâni, în

aceste condiții sunt păstrate și probele pentru boli autoimune sau alergologice.

2.3.2 Aparatul Cobas 6000

Aparatul Cobas 6000 reprezintă o combinație personalizată între modulul de chimie

clinică Cobas c 501 (fig 2.4) și modulul de imunologie Cobas e 601 (fig 2.3). Meniul aparatului pune la dispoziție peste 190 de teste de chimie clinică și imunologie, iar viteza de lucru a aparatului poate varia de la 170 până la 2170 de teste pe oră. Acest aparat poate prelua un volum de peste 95% din volumul de lucru unui laborator deoarece pe lângă cele 190 de teste de chimie clinică și imunologie mai conține și 3 parametri ISE.

Aparatul Cobas 6000 poate fi încărcat simultan la nivelul analizorului cu 150 de probe. Cobas 6000 utilizează reactivi lichizi cu o compoziție chimică standardizată. Folosirea celor două pachete de reactivi cobas c-pack și cobas e-pack asigură o logistică simplă și o manevrarea mai ușoară a reactivilor. Totodată calibrarea reactivilor se poate face doar o singură dată pentru fiecare lot și schimbarea lor nu întrerupe operațiunile de rutină.

Pentru siguranța rezultatului aparatul Cobas 6000 prezintă protecție împotriva contaminării probei datorită folosirii vârfurilor de unică folosință pentru probe utilizate la modulul de imunologie dar și datorită mixării ultrasonice a amestecului de reacție. Acest aparat mai este capabil să detecteze automat prezența cheagurilor, să verifice efectul prozon ( excesul antigenului) dar mai este capabil și să evalueze gradul de hemoliză, icter și lipemie pentru fiecare probă (serum index).

Cobas 6000 este alcătuit din:

Unitatea de control ce prezintă interfața cu utilizatorul și rulează în Windows XP,

ecran tactil TFT de 17 inch incluzând și opțiune de mouse, funcție de backup pe USB.

Unitatea centrală reprezintă locul unde sunt încărcate probele în aparat. Pot fi

încărcate până la 150 de probe simultan în stative de câte 5 poziții. Ea este capabilă să gestioneze 3 module de analiză având o capacitate maximă de 600 de probe pe oră. Tot aici are loc încărcarea și descărcarea continuă a stativelor de probă.

Modulul de chimie clinică Cobas c 501 reprezintă locul unde sunt efectuate testele

de chimie clinică, ISE dar și peste 100 de aplicații de Imunologie în Faza Omogenă (HIA). Acest modul prezintă o viteză de lucru de până la 1000 de teste pe oră cu posibilitate de schimbare în timpul lucrului a rectivilor. La nivelul acestui modul este asigurată nu doar integritatea probei prin tehnologii inovatoare cum sunt: serum index, mixarea amestecului de reacție cu ajutorul ultrasunetelor ci și detectarea automată a nivelului de lichid sau a prezenței cheagurilor în probă.

– Modulul de imunologie Cobas e 601 are la bază 93 de aplicații de imunologie în fază

heterogenă (HetIA) printre care teste pentru anemie, markeri osoși, markeri cardiaci, hormoni, markeri tumorali și boli infecțioase. Viteza de lucru al acestui modul este de 170 de teste pe oră; putând efectua 25 de teste simultan ce sunt direct accesibile.

Pentru siguranța rezultatelor sunt utilizate vârfuri de unică folosință necesare la pipetarea probei și este folosită detectarea automată a nivelului de lichid dar și a cheagului de fibrină din probă.

Figura 2.3 Aparatul Cobas e 601- Original

Figura 2.4 Aparatul Cobas c 501- Original

2.3.3 Analizorul hematologic XT-4000i

Analizorul XT-4000i (fig 2.5) utilizează o tehnologie modernă unică ce are la bază citometria fluxului de fluorescență (FCP) dar și tehnologia de focalizare hidrodinamică care permite analiza conținutului de ADN/ARN, dimensiunea celulei și complexitatea internă a celulei.

Cele două tehnologii diferite permit ca aparatul să clasifice populațiile normale de leucocite,eritrocite și trombocite de populațiile anormale scăzând numărul intervențiilor manuale. El folosește o diodă laser cu tehnologie avansată care împreună cu citometria fluxului fluorescent prezintă sensibilitate pentru măsurarea și diferențierea tipurilor de celule din probele de sânge dar și din fluidele corpului. Ca și analize efectuate asupra fluidelor corpului cum este lichidul cefalorahidian, lichidul seros și lichidul sinovial sunt determinările numărului de leucocite și eritrocite. Datorită acestui fapt rezultatele obținute sunt foarte precise. Acest aparat prezintă o rată de evaluare și un timp de reacție foarte reduse. Capacitatea de lucru a acestui analizor este de 80 de probe pe oră.

Modelul XT-4000i este capabil să combine măsurători cantitative cu măsurători calitative ale reticulocitelor oferind o imagine completă pe baza căreia se poate constata prezența anemiei și starea sistemului hematopoietic.

Analizele care se pot efectua cu ajutorul analizorului XT-4000i sunt următoarele:

conținutul de granulocite imature (IG%) – constă în obținerea numărului de

metamielocite, mielocite și promielocite

numărul de trombocite se poate determina cu ajutorul metodei optice fluorescente

și a impedanței clasică

raportul leucocitelor și a eritrocitelor din probele de fluide ale corpului (lichidul

cefalorahidian, lichidul seros și lichidul sinovial)

numărul de reticulocite fluorescente necesare pentru reducerea metodelor de

confirmare manuale și erorile lor inerente

analiza hemoglobinei de înaltă calitate ( RET-He) realizată printr-o metodă directă

ce presupune încorporarea fierului la nivelul hematiilor ce se află în curs de dezvoltare și este necesară pentru evaluarea și gestionarea anemiei.

-măsurarea directă a hematocritului (HCT)

Hematocritul este determinat prin numărarea și detectarea volumului fiecărui eritrocit.

Tehnologiile folosite de aparatul XT-4000i :

Celulele roșii (eritrocite) și trombocite: Pentru determinarea numărului de eritrocite

și trombocite este folosită ca metodă de detecție impedanța sau curentul direct împreună cu tehnologia de focalizare hidrodinamică. Datorită acestor metode folosite sunt evitate suprapunerile și repunerile în circulație a celulelor. Discriminatoarele automate separă cele două populații de celule pe baza unui algoritm complex. Indiferent de ce concentrație (extrem de scăzută sau mare) au probele analizorul Sysmex XT-4000i analizează cu mare precizie și acuratețe eritrocitele și trombocitele.

Analiza hemoglobinei

Metoda de analiză a hemoglobinei folosită de către aparatul Sysmex XT-4000i este utilizarea reactivului fără cianură cum este sulfatul de laur de sodiu (SLS). SLS reprezintă metoda ideală pentru analizele de înaltă performanță datorită timpului de reacție foarte scurt.

Citrometria fluxului

Citrometria fluxului tradițional reprezintă metoda cea mai bună în diferențierea populațiilor de celule, dar aceasta necesită folosirea unor reactivi foarte scumpi pe lângă faptul că este procedura este destul de greoaie și consumă timp. Citometria cu flux este capabilă să măsoare caracteristicile optice și fluorescente ale unei singure celule sau a oricărei alte particule cum sunt nucleii, microorganismele, preparate cromozomiale etc. Culorile fluorescente se pot intercala cu diverse componente celulare cum ar fi ADN-ul sau ARN-ul.

Anticorpii conjugați cu coloranți fluorescenți leagă proteine specifice pe membranele celulare sau în interiorul celulei și în momentul trecerii celulei marcate printr-o sursă de lumină moleculele fluorescente sunt excitate. Când revin la starea de repaus fluorochromii emit energii luminoase cu lungimi de undă mari. Utilizarea mai multor fluorochromi ce prezintă lungimi de undă de excitare similare și lungimi de undă de emisie diferite permit analizarea mai multor proprietăți ale unei celule în același timp. Coloranții folosiți în mod obișnuit de citometria de flux conțin iodură de propidium, fitoceritină și fluoresceină.

Coloranții tandem ce prezintă un transfer de energie prin rezonanță internă de fluorescență crează foarte multe lungimi de undă și foarte multe culori. Un citometru de flux funcționează astfel: celulele din suspensie sunt trase într-un flux laminar ce permite separarea individuală a celulelor care trec prin punctul de interogare intersectându-se cu un fascicul de lumină monocromatică. Lumina emisă în toate direcțiile este adunată prin intermediul unor filtre și oglinzi ce izolează lungimile de undă care sunt detectate de tuburile fotomultiplicatoare și digitalizate pentru analiza computerului.

La aparatul Sysmex XT-4000i s-a lucrat la tehnicile de bază astfel că acum aparatul folosește aplicații de flux pentru care sunt utilizați coloranți fluorescenți simpli dar sofisticați capabile să determine diferențe de rutină mai precise dintre populațiile normale și anormale.

Reticulocite și trombocite

Pentru determinarea analizelor eficiente și reproductibile ale numărului de reticulocite și a stadiilor de maturitate este utilizată tehnologia fluorescentă. Astfel această tehnologie avansată da un număr exact de reticulocite și trombocite fluorescente în situații diferite cum ar fi concentrații foarte scăzute sau când există în probă trombocite gigant ori fragmente de eritrocite. Separarea celulelor nucleate de reticulocite are loc datorită intensității fluorescenței mari. Într-o populație de reticulocite imature (IRF) are loc analizarea și apoi raportarea informațiilor privind rata producției de reticulocite .

Figura 2.5 Aparatul Sysmex XT-4000i – Original

CAPITOLUL III REZULTATE OBȚINUTE

3.1 Rezultate

Asocierea hipergamaglobulinemiei (concentrații foarte crescute de imunoglobuline totale în care predominant a fost titlul IgG) cu limfopenie și monocitoză la persoanele cu vârste cuprinse între 20-50 de ani denotă un răspuns imun de tip umoral accentuat care este cauzat de posibile infecții cronice nedectabile încă din punct de vedere microbiologic. Testele efectuate în cazul acestor persoane fie nu au cuprins analiza microbiologică, fie testarea microbiologică efectuată pentru un număr limită de germeni a fost negativ.

În unele situații rezultatele investigațiilor hematologice indică o neutropenie relativ redusă ce poate fi explicată prin existența unei infecții produsă de germeni cu status intracelular care nu activează mecanismele de fagocitoză realizate de neutrofile. Este posibil ca în acest caz răspunsul imun să se deruleze prin mecanisme de citotoxicitate independente de prezența anticorpilor. În majoritatea cazurilor neutropenia nu este asociată cu modificări ale titlului de anticopi.

Aceste situații au fost întâlnite în special la persoanele adulte sau în vârstă.

Creșterea concentrației de proteină C reactivă a fost semnalată în special la persoanele adulte. Corelarea rezultatelor obținute indică faptul că proteina C reactivă este mai mult decât un marker specific proceselor inflamatorii fiind asociat cu o multitudine de alte procese fiziopatologice. Testele biochimice efectuate la aceleași persoane cât și o serie de manifestări clinice indică nivelul crescut de proteină C reactivă ce poate fi corelată în special cu obezitatea și rezistența la insulină.

Proteina C reactivă amplifică răspunsul imun inflamator prin activarea sistemului complement ceea ce duce la apariția unor leziuni tisulare, la instalarea unor tulburări circulatorii și implicit la afectarea oragnelor limfoide secundare. Un substrat de natură alergică poate fi mai greu demonstrat în cazul acestor pacienți.

Testele hepatice indică mai mult existența unor hepatopatii, iar rezultatele obținute la testele de biochimie se pot asocia ușor cu creșteri ale nivelului de proteină C reactivă și implicit cu o stimulare a mecanismelor de fagocitoză și de activare a proteinelor sistemului complement.

În unele cazuri cu referire în special la copii testele au evidențiat un ASLO crescut. Reacția face referire la infecțiile cu streptococi și constituie premiza unor stări alergice care sunt încadrate în tipul III, deși persoanele în cauză au o vârstă redusă rezultatele analizelor efectuate de acești pacienți indică infecții vechi cu streptococi beta-hemolitici și persistența acestora în organismul lor. Examenele hematologice în această situație arată o creștere a nivelului neutrofilelor fapt ce certifică existența unor tulpini de streptococi la nivelul unor mucoase.

La persoanele trecute de 30 ani se constată și existența unei monocitoze exagerate ceea ce demonstrează că rata de schimb a macrofagelor tisulare este destul de ridicată și că există o reactivare antigenică permanentă. Fără a avea date oficiale putem presupune că la aceste persoane este posibil să existe tulburări renale asociate cu insuficiență cardiacă și respiratorie. Din păcate de cele mai multe ori parametrii imunologici nu au fost analizați în aceste cazuri și nu se poate afirma că există un substrat de tip alergic.

La copiii cu o vârstă de până în 10 ani rezultatele buletinelor de analiză în majoritatea cazurilor a fost constat un nivel crescut de IgE. Dacă sunt imunoglobuline cu structură normală produse de clone celulare diferite rezultatele pot fi corelate cu afecțiuni hepatice. Dacă sunt clone unice excesul imunoglobulinic poate fi rezultatul unei stimulări alergice. În cazul probelor analizate se poate vorbi de stări alergice de tipul I (hipersensibilitate imediată). Fenomenul se produce la persoane cu teren constituțional particular de tip atipic care răspunde la contactele inițiale cu alergenul prin secreție de IgE. Acesta se cuplează cu receptorii Fc situați pe mastocitele tisulare și bazofilele circulante pe care le activează. La un nou contact realizat între anticorpii fixați pe celula sensibilizată cu alergenul specific are loc activarea celulei și degranularea rapidă producând eliberarea la nivelul substratului tisular a mediatorilor activi ce prezintă un efect toxic și care generează fenomene locale și generale exprimate clinic.

Din nefericire aceste stări la copii cu vârsta până la 7-8 ani prezintă manifestări foarte șterse ale reacțiilor care nu sunt sesizate de părinți. Astfel cu cât numărul contactelor cu structura antigenică este mai mare cu atât reacția devine mai evidentă.

La copii trecuți de vârsta de 10 ani hipergamaglobulinemia de tip IgG presupune existența unui răspuns imun secundar ceea ce înseamnă că pacientul a venit de mai multe ori în contact cu antigenul inductor. Buletinele de analiză arată la aproape jumătate din cazuri o creștere a nivelului de proteină C reactivă și limfocitoză. Este greu să afirmăm dacă această stare este indusă de infecții subclinice sau se datorează unui portaj prelungit de microbi. În cazul hipergamaglobulinemiei de tip A este necesar să se stabilească corelații cu titlul obținut prin reacția ASLO.

IgA este asociată cu infecții la nivelul mucoaselor și acest proces patologic este specific copiilor. De prea puține ori buletinele de analize au fost însoțite de examene microbiologice.

La persoanele în vârstă majoritatea buletinelor de analiză indică parametrii hematologici aproape normali în schimb se constată modificări la nivelul titlului IgA și IgG. Acest fapt poate fi explicat prin existența unor infecții cronice nemanifestate clinic sau mascate de alte boli. Obligatoriu la aceste persoane se recomandă efectuarea testelor ASLO, PCR, VSH. Valori crescute la aceste teste pot confirma suspiciunile anterioare. Foarte rar la această categorie se semnalează titlul crescut de IgE și deci o manifestare scăzută a unor eventuale alergii.

3.2 Selecție analize

Rezultate grupa 1:

Rezultate grupa 2:

Rezultate obținute la grupa 3:

Rezultatele obținute la grupa 4:

Rezultate obținute la grupa 5:

CONCLUZII

Asocierea datelor obținute la examenele hematologice cu testarea statusului imunitar ajută la evidențierea unor stări de boală datorate unor infecții vechi persistente pe fond de imunodeficiență sau a unor stări de hipersensibilitate.

Într-o sinteză a interpretării rezultatelor din buletinele de analiză se pot desprinde următoarele aspecte:

la copii cu vârsta de până la 10 ani pe fondul creșterii titlului de IgE s-a costatat

existența unor stări alergice de tip imediat cu asocieri neconcludente privitoare la formula leucocitară. Pacienții respectivi erau la debutul unor stări anafilactice și atipice.

la aceeași categorie de vârstă titlul crescut de IgG și IgM se poate asocia cu alergii

de tip II în care manifestarea alergică îmbracă de regulă reacție de tip alimentar. Din păcate nu avem date concludente legate de efectorii celulari în acest caz.

La copii cu vârsta de peste 10 ani se evidențiază o hipergamaglobulinemie a

imunoglobulinei din clasa IgA. O parte dintre acești copii prezintă și valori crescute la testul ASLO. În cele mai multe cazuri se poate trage concluzia ca este vorba de o infecție cronicizată cu streptococi și că trebuie căutată localizarea acestora. Soluția eficientă de tratament este administrarea de antibiotice și stoparea unei alergii grave generate de complexele imune circulante (toxină streptococică-anticorp-antitoxină).

la persoanele tinere cu vârste cuprinse între 20 și 30 de ani se evidențiază mai

frecvent doar modificări hematologice în majoritatea cazurilor manifestate prin neutrofilie. Asocierea cu un nivel înalt de proteină C reactivă poate duce la suspiciunea unor posibile tulburări renale care pot evolua nefavorabil ajungându-se după câțiva ani la leziuni de glomerulonefrită de tip alergic. În această situație se recomandă efectuarea testului ASLO.

La adulții cu vârste cuprinse între 30-60 de ani modificările hematologice indică

preponderent limfocitoză și neutropenie. Titlul imunoglobulinic este însă aproape normal. Posibil ca aceste persoane să fi făcut investigații pentru teste de rutină privind starea de sănătate. Există două excepții în cadrul căruia se constată monocitoză cu valori exagerate. De multe ori în cazul monocitozei ar putea exista hipergamaglobulinemie de tip IgG și în acest caz suspiciunile indică cauze care ar putea fi de natură oncologică.

la persoane în vârstă de peste 60 de ani majoritatea buletinelor prezintă parametrii

hematologici aproape normali. Uneori însă testele imunologice și determinarea VSH-ului arată valori crescute în acest caz fiind posibil să evolueze o infecție cronică diagnosticată sau nediagnosticată. La această categorie titlul IgE se menține la valori normale deci suspiciunea de alergii nu există.

Analiza datelor furnizate de laborator și a surselor bibliografice demonstrează că în

majoritatea cazurilor testele efectuate nu au permis investigarea tuturor factorilor de risc ce permit declanșarea unor stări alergice. Totodată cazurile analizate nu permite evaluări corecte privind eventuale stări de imunodeficiență care generează infecții cronice. În acest sens este recomandată asocierea examenului hematologic, biochimic și imunologic pentru a stabili un diagnostic cât mai corect.

Bibliografie

• Nicolae R. și C. Voiculescu, 1985. Probleme de imunopatologie chirurgicală. Editura Academiei, București

• Revista Practica Veterinară.ro, 2016. Nr. 24

• Grigore Mihăescu, 1995. Imunologie. Editura Universitatea din București

• Grigore Mihăescu, 2001. Imunologie și Imunochimie. Editura Universitatea din București

• Valeria Dănacu, 2015. Histologie și Embriologie animală. Editura Ars Docendi Universitatea din București

•https://www.google.ro/search?q=imunoglobulina+structura&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjtlMapkfLTAhXDQpoKHW9XBggQ_AUIBigB&biw=1440&bih=745#imgdii=_spjnyIvPYmD8M:&imgrc=i0OZ5xaeTb1IhM

•https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/immunology-applications-12/diagnostic-immunology-148/complement-fixation-746-6674/images/the-complement-pathway/

•http://www.bio.unibuc.ro/pdf/licenta_2013/Imunobiologie.pdf

•https://www.sysmex.com/la/es/Products/Hematology/XTSeries/Pages/XT-4000-Hematology-Analyzer.aspx

•https://www.sysmex.com/us/en/Brochures/Brochure_XT-4000i_MKT-10-1138.pdf

•http://www.roche.ro/home/roche-romania/divizia-de-diagnostic/domenii-de-expertiza/diagnostic-clinic/chimie-clinica/cobas_6000.html

•http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/modul-de-recoltare-prelucrare-transport-si-stocare-a-probelor-de-sange-66

•http://www.spitalmures.ro/_files/Documente/LAMC-PT-07-A4-Manualul_recoltarii-Ed4.pdf

•http://anatomie.romedic.ro/sistemul-imunitar

•http://rmj.com.ro/articles/2012.1/RMR_Nr-1_2012_Art-2.pdf

•http://anatomie.romedic.ro/sistemul-complement

•https://en.wikipedia.org/wiki/Cytokine

•https://it.wikipedia.org/wiki/Chemochine

•https://www.synevo.ro/factor-de-necroza-tumorala-tnf-alfa/