Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de [311094]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU

2016

TEZĂ DE DOCTORAT

Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de
Staphylococcus aureus izolate în România

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU

2016

Cuprins

Lista de abrevieri

Introducere

Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană

I.1. Caracteristici de cultivare si identificare

I.2. [anonimizat]-[anonimizat]

I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă

I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice

I.4.1. Antibioticele β-lactamice și mecanismele de acțiune

Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze

Rezistența prin modificarea țintei (proteinele de legare a penicilinei – PBP)

Determinismul genetic al rezistenței la β-[anonimizat]

I.4.2. Rezistența la aminoglicozide

I.4.3. Macrolide, lincosamide, streptogramine B – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.4. Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. [anonimizat] – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

2.1. Scopul și obiectivele lucrării

2.2. Materiale și metode

2.2.1. Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență

Proteina A (SpA)

[anonimizat] (PVL)

Enterotoxine (A, B, C, D)

Toxina sindromului de șoc toxic (TSST- 1)

2.2.2. Evidențierea genelor de rezistență

Evidentierea genei blaZ

Evidențierea genei mecA

Evidențierea genei de acetilare (aacA) și de fosforilare (aphD)

[anonimizat]

2.2.3. Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE)

2.2.4. Tipizarea SCCmec

2.3. Rezultate

2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați

2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate

2.4. Discuții

2.5. Concluzii

2.6. Bibliografie

2.7. Anexe

2.8. Lista lucrărilor publicate/ [anonimizat]

S. aureus – Staphylococcus aureus

SARMS. aureus rezistent la meticilina)

UMA – Unitatea Medicala A

UMB – Unitatea Medicala B

UMC – Unitatea Medicala C

UMD – Unitatea Medicala D

PCR – [anonimizat]-α – tumor necrosis factor – α

IL-6 – interleukina-6

IFN-γ – interferon-γ

RCT – receptorul T celular

CMH I – complexul major de histocompatibilitate I

TSST-1 – toxina sindromului de șoc toxic 1

Th – limfocite T helper

CMH II – complexul major de histocompatibilitate II

IL-1 – interleukina-1

IL-2 – interleukina-2

MSCRAMMs – Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules

SCVs – ,,small colony variants’’

Introducere

S. aureus este un patogen oportunist implicat în diverse infecții tegumentare sau în infecții sistemice, invazive, ce duc la complicatii la persoanele imunocompromise si cu factori de risc ce predispun la infectii grave. Prin acumularea de noi elemente genetice mobile (profagi, plasmide, insule de patogenitate, transpozoni) ce poarta atat gene de virulenta, cat si de rezistenta la antibiotice, tulpinile de S. aureus devin progresiv tot mai rezistente, atât calitativ cât și cantitativ. Captarea elementelor genetice mobile, dar si mutatiile la nivelul unor gene tinta a schimbat profilul cromosomal si extracromosomal, rezultând astfel bacterii multirezistente si virulente (''superbug''). S. aureus rezistent la meticilina (SARM) este rezistent la mai multe clase de antibiotice, facand astfel ca infectiile comune să fie greu de tratat si controlat. Existenta unor variante de colonii mici (Small Colony Variants – SCVs), cu mutatii ale unor gene implicate in metabolism îngreunează si mai mult tratamentul infectiilor cu S. aureus, mai ales cele cu implicare osoasă (osteomielita).

Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană

Staphylococcus a fost identificat in puroiul recoltat dintr-un abces al articulatiei genunchiului (Ogston, 1984). Aglomerările bacteriene sub forma de ciorchine, le-a denumit Staphylococcus (lb. greacă – staphyle = ciorchine de strugure). Ulterior agentul infecțios a fost cultivat și datorita pigmentului galben-portocaliu al coloniilor, Rosenbach (1884) l-a denumit S. aureus.

S. aureus este ubicuitar, comensal. În funcție de tulpină, S. aureus poate supravietui de la cateva ore, până la cateva saptamani sau chiar luni pe suprafete uscate (Cimolai, 2008). Se adaptează foarte usor diferitelor conditii de mediu ca urmare a unui potențial înalt de variabilitate genetică, care explică importanța S. aureus ca agent infecțios pentru om si animale (Cole si colab., 2001; Fluit, 2012; Hasman si colab., 2010), fiind principala cauza de bacteriemie, de infectie a plagilor chirurgicale, dar si de colonizare a materialelor protetice.

Se estimeaza ca 20% din populatia umana este purtatoare de S. aureus pe termen lung (Kluytmans si colab., 1997) in microbiota tegumentară si a mucoaselor, cu precadere in nazofaringele purtatorilor sanatosi (Buiuc si Negut, 2008; Kluytmans si colab., 1997; Cole si colab., 2001). La om, epiteliul scuamos al foselor nazale este habitatul primar (Peacock si colab., 2001). Se estimeaza ca 60% sunt purtatori tranzitorii, iar alți 20% nu poarta acest microorganism (Foster, 2004). Omul si animalele reprezinta rezervorul natural de S. aureus. Există, de asemenea, o prevalență în creștere a purtatorilor gastrointestinali de S. aureus, in special la copii, probabil legat de schimbarea modului de hrănire, mai ales la sugari (Lindberg si colab., 2011).

S. aureus produce o gama larga de factori de virulenta prin care initiază procesele infecțioase, de la cele superficiale (tegumentare) pana la cele grave: sindromul pielii oparite, fasciita necrozanta, abcese, keratite, impetigo, pneumonie necrozanta, osteomielite, endocardite, sindromul de soc toxic, septicemie, infectii asociate cu implantarea dispozitivelor medicale etc. (Kobayashi si DeLeo, 2009; Bose si colab., 2014; Harris si colab., 2002).

Tulpinile de S. aureus rezistente la meticilina (SARM) au fost recunoscute din anii ’60 pana in ‘90 ca patogeni asociati practicii medicale. Tulpinile SARM asociate comunitatii au aparut in anul 1990 (Gordon si Lowy, 2008). În acord cu sursa si caile de transmitere (fig. X ), tulpinile SARM sunt impartite in trei categorii:

tulpini SARM din spital (HA-MRSA);

tulpini SARM circulante în comunitate (CA-MRSA) (Grundmann si colab., 2010);

tulpini SARM circulante la animale (LA-MRSA) (Smith, 2015).

Tulpinile SARM au devenit o problema importanta de sanatate publica cu numeroase consecinte economice globale (Goetghebeur si colab., 2007). In ultimii ani au atins un nivel epidemic (Ma si colab., 2012), atat in comunitate, cat si in mediul spitalicesc, iar unele clone au devenit endemice in mediul de spital sau in comunitate, fiind raspandite in anumite zone geografice (Vandenesch si colab., 2003; Rolo si colab., 2012).

În prezent, cel puțin 37000 de oameni mor anual în Europa datorită infecțiilor produse de cinci tipuri de microorganisme rezistente la antibiotice, printre care: tulpinile SARM, S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA) sau S. aureus rezistent la linezolid (ECDC/EMEA,2009,http://ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/Pages/index.aspx). Printre cele mai frecvente cauze de producere a infectiilor asociate asistenței medicale, tulpinile de S. aureus ocupa locul doi. Atunci cand contamineaza produsele alimentare bogate in lipide si proteine, enterotoxinele produse de S. aureus reprezinta cauza importanta de aparitie a toxiinfectiilor alimentare.

I.1. Caracteristici de cultivare și identificare

Genul Staphylococcus face parte din Familia Micrococcaceae si cuprinde peste 40 de specii, dintre care peste 20 izolate de la om, specia S. aureus fiind cea mai frecvent implicată in patologia infectioasa. Recent au fost descoperite alte 2 specii, S. argenteus sp. nov. si S. schweitzeri sp. nov. (Tong si colab., 2015). Este un coc Gram pozitiv, cu diametru de 0,5 – 1,5 μm, aerob, facultativ anaerob. Pe frotiul colorat Gram apar de culoare violet, grupate sub forma de ciorchine, vezi Figura 2.

S. aureus crește in 18-24 h pe medii nutritive simple, in mediul aerob la temperatura optima de 37 ± 2ș C, pH optim de 7,5, dar tolerează variatii mari. Coloniile, dupa 24 h de incubare, pe mediu solid, au aspect S (smooth), cremoase, rotunde, cu diametrul de 2-3 mm, marginea regulata, suprafata neteda, bombata si lucioasa, vezi Figura 3.

S. aureus tulbură omogen mediul lichid, cu depozit granular in partea inferioara a tubului. Pe agar Columbia cu 5-8% sange defibrinat (de berbec sau de bou), tulpinile de S. aureus produc o zona circulara de hemoliza completă (beta), datorată sintezei hemolizinei α , vezi Figura 4.

Coloniile de S. aureus produc un pigment carotenoid, portocaliu sau galben citrin, dar acest caracter nu este constant si ca atare nu constituie un criteriu stabil de diferentiere.

Identificarea fenotipică

Genurile familiei Micrococcaceae se diferențiază de genurile familiei Streptococcaceae pe baza urmatoarelor criterii: morfologia celulelor, morfologia coloniilor pe mediul cu agar, caractere metabolice, rezistența la antibiotice, testul catalazei, vezi Figura 5.

În prezenta eritromicinei se testeaza producerea de acid din glucoza in aerobioza, sensibilitatea la nitrofurantoin/ furazolidon 100 μg/ disc (diametrul zonei de inhibitie, mai mare de 15 mm) pe mediul agar Mueller Hinton, testul modificat pentru oxidaza, testul sensibilitatii la bacitracina, vezi Figura 6.

Staphylococcus aureus se diferențiază de celelalte specii de Staphylococcus prin caractere de creștere și prin prezența următorilor factori:

proteina A;

factorul clumping (antigenul capsular – coagulaza legată) evidențiat prin testul rapid de latex-aglutinare pe lama, vezi Figura 7, cu reactivi de identificare rapida de generatia I si a II-a, cu și fara anticorpi monoclonali (AMC) anticapsulari;

coagulaza liberă evidențiată cu testul plasmei de iepure, vezi Figura 8,
(Buiuc si Negut, 2008).

Diferentierea S. aureus de S. argenteus se face prin tipizarea genei rpoB si PCR pentru gena crtM ce codifica stafiloxantina (Mellman si colab., 2006).

I.2. Factorii de virulență

Bacteriile patogene au doua proprietati definitorii: patogenitatea si virulenta. Patogenitatea defineste capacitatea potentiala a unui microorganism de a initia un proces infectios, decelabil din punct de vedere clinic, numai dacă este suficient de virulent pentru a depasi barierele de aparare a organismului si a patrunde in tesuturi. Virulenta este capacitatea unei tulpini a unui microorganism patogen aflat intr-o anumita faza de crestere, de a se localiza (a coloniza), de a se multiplica si eventual de a invada celulele si tesuturile gazdei si/sau de a produce toxine, determinand o stare patologica la o gazda receptiva.

Patogenitatea este o caracteristica determinata genetic. Virulenta este un atribut cantitativ al patogenității diferitelor tulpini bacteriene. S. aureus isi exprimă patogenitatea atat prin caracterele structurale, cat si printr-o multitudine de proteine/ enzime pe care le produce. Genele codificatoare ale enzimelor degradative sunt localizate atat pe cromosomul bacterian, cat si pe elemente genetice mobile (profagi, plasmide, transpozoni, insule de patogenitate etc.). Diferitele combinații ale factorilor de virulenta, interacțiunea cu factorii locali ai situsului de infecție și variabilitatea răspunsului imun al gazdei explica diversitatea rezultatelor cu privire la aceste infecții. Pentru inițierea unui proces infecțios stafilococic este necesară cooperarea mai multor factori de virulență (Fournier si Philpott, 2005). Fiind un comensal oportunist, infecția cu S. aureus poate să rămână subclinică, poate sa fie o infecție locală moderată sau o infecție severă, invazivă (Lowy, 1998). Este recunoscut rolul enzimelor citolitice si al superantigenelor, in initierea si progresul infectiilor prin liza celulelor epiteliului tegumentar, al mucoaselor si al celulelor tisulare.

Factorii de virulenta pot fi atat structurali, cat si solubili. Au fost identificați circa 50 de factori de virulenta cu diferite activitati biologice (Cheung si colab., 2002). Unii dintre acestia sunt recepționați de sistemul imunitar ca superantigene. Sinteza lor poate fi asociata cu fazele de crestere, astfel ca majoritatea proteinelor asociate peretelui celular sunt sintetizate in faza exponentiala logaritmica, iar exo-enzimele sunt sintetizate in faza staționară. Enterotoxina A si coagulaza sunt sintetizate in faza de crestere exponentiala (Nienaber si colab., 2011).

Proteine ale suprafeței celulare cu rol de adezine

Structurile suprafeței celulare la S. aureus sunt capsula polizaharidica, peptidoglicanul (reprezinta 50% din greutatea celulei) si membrana citoplasmatica.

Peptidoglicanul (mureina) este format din catene polizaharidice formate prin alternarea resturilor de N-acetilglucozamină si acid N-acetil muramic legate intre ele prin legaturi β-1, 4. Aceste lanturi sunt unite prin punti peptidice. Componenta peptidica este reprezentata de tetrapeptide cu structura L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala. Puntile peptidice ce apartin lanturilor de glican adiacente sunt legate printr-un pentapeptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Peptidoglicanul poate avea activitate endotoxica, stimuleaza sinteza citokinelor de catre macrofage, activeaza sistemul complement si induce agregarea plachetelor sangvine. Diferentele din structura peptidoglicanului la diverse tulpini de S. aureus pot contribui la variatii ale capacitații de a produce coagularea intravasculara diseminata (Kessler si colab., 1991).

In peptidoglican sunt incorporate proteine si polizaharide. Polizaharidele caracteristice lui S. aureus sunt acizii teichoici (lb. gr., teichos = perete), lipoteichoici (polimeri de glicerol-fosfat sau de ribitol-fosfat), cu un capat al lantului legat de un glicolipid din membrana plasmatica, iar celalalt expus la exterior. Rolul acizilor teichoici este multiplu: confera peretelui celular rigiditate si virulenta ridicata, sunt implicati in transportul ionilor, sunt receptori pentru bacteriofagi, au rol important in atasare si colonizare (Lowy, 1998).

Proteinele de suprafata din structura peptidoglicanului legate covalent sau prin legături ionice sau interacțiuni hidrofobe sunt foarte importante pentru potentialul patogen al S. aureus. Relevanța lor pentru procesul infecțios a fost demonstrată experimental, comparând tipul sălbatic cu tulpinile fara sortaza A sau B. Sortazele sunt enzime (cistein- transpeptidaze) cu rolul de a ancora proteinele de suprafata de peretele celular (Mazmanian si colab., 1999). Absența acestor proteine provoacă o scadere dramatica a virulentei (Weiss si colab., 2004). Sortazele cliveaza legatura peptidica intre treonina (T) si glicina (G), și ancoreaza covalent proteina la peptidoglican (Perry si colab., 2002).

Factorul clumping – Clf (coagulaza legata) este o proteina asociată peptidoglicanului, care leagă fibrinogenul, mediind atasarea bacteriei la tesuturile traumatizate si la coagulul sangvin. Factorul clumping este ancorat de peretele celular printr-o secvență Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG). Au fost descrise 2 variante moleculare: ClfA si ClfB, codificate de genele clfA si clfB. Gena clfA codifica un polipeptid de aproximativ 933 aminoacizi (aa), iar gena clfB un polipeptid de aproximativ 913 aa. ClfA se leaga de lanțul γ al fibrinogenului, iar ClfB de lantul α. Varianta ClfB ar avea rol in aderenta S. aureus la celulele epiteliului nazal.

Proteinele care leagă fibronectina (FnBPA si FnBPB) sunt codificate de 2 gene distincte fnbA si fnbB. Gena fnbA codifica o proteina de aproximativ 1018 aa, iar gena fnbB aproximativ 940 aa. Cele doua proteine sunt ancorate de peptidoglican printr-o secvență LPXTG. Cele două proteine se leagă de glicoproteinele membranei plachetare (complexul IIa/IIIb), le activează, adera la fibrinogen (numai FnBPA) si la elastina, faciliteaza invazia in celulele endoteliale si epiteliale, sunt repelente pentru fagocite.

Proteina de legare a colagenului (Cna) mediaza atasarea de fibrele de colagen de tip I si IV, predominante cantitativ in tesuturile conjunctive (Campoccia si colab., 2009; Patti si colab., 1993).

Proteina A (Jensen, 1958) face parte din familia moleculelor care au afinitate de legare pentru moleculele matricei de aderență intercelulară a țesuturilor (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules – MSCRAMMs). Proteina A prezintă secvența LPXTG, se leagă cu mare afinitate la regiunea Fc a IgG (subclasele 1, 2, 4) inhibând astfel acțiunea fagocitelor profesioniste, are rol in aderenta si colonizare prin interactia cu factorul von Willebrand (Hartleib si colab., 2000).

Molecula de proteină A are 5 domenii extracelulare (E, D, A, B, C), regiunile Xr si Xc ce strabat peretele celular si un domeniu alcatuit din 18-20 reziduuri hidrofobe care traverseaza membrana plasmatica. Este codificata de gena spa (Harmsen si colab., 2003; Mellmann si colab., 2006). Au fost identificate 16127 variante ale genei spa incarcate in baza internationala de date Ridom SpaServer (http://spa.ridom.de/index.shtml) si este in plina expansiune. Principalele 20 variante (tipuri) genice spa ale tulpinilor SASM, PVL pozitive, in Europa sunt: t318, t435, t645, t002, t008, t284, t127, t159, t021, t590, t314, t005, t078, t189, t044, t105, t012, t355, t019, t131, iar la tulpinile SARM, PVL pozitive sunt: t044, t008, t019, t437, t002, t355, t024, t657, t131, t852, t318, t012, t595, t021, t311, t690, t692, t068, t121, t304 (http://www.seqnet.org/).

Rareori se izolează tulpini de S. aureus netipabile prin tipizarea spa, respectiv detectarea polimorfismului in regiunea X a proteinei stafilococice A (Baum si colab., 2009).

Proteinele de suprafata a căror expresie este reglată de prezența fierului (IsdA, IsdB, IsdC, IsdH) sunt legate covalent de peretele celular (prin secvența LPXTG). Se leaga de una sau mai multe proteine care contin fier: transferina, hemoglobina (Clarke si Foster, 2006; Visai si colab., 2009; Pilpa si colab., 2009). Proteina IsdB interactioneaza cu complexul glicoproteinelor IIb/ IIIa al membranei plachetelor sangvine (Miajlovic si colab., 2010).

Proteinele SdrC si SdrD au rol în aderența S. aureus la celulele epiteliale nazale. Proteina SdrC a fost identificata ca legandu-se de β-neurexina (Barbu si colab., 2010), iar proteina SdrD se leaga de glicoproteina desmoglein-1 (Askarian si colab., 2016). O varianta a SdrD, numita Bsp leagă sialoproteina din oase (Tung si colab., 2000).

Proteina G de suprafata a S. aureus (SasG) codificata de gena sasG este implicata in formarea biofilmului, se leaga de matricea extracelulara (Clarke si Foster, 2006; Geoghegan si colab., 2010) si a fost descrisa ca fiind implicata in atasarea la celulele epiteliului nazal.

Autolizina (Aaa) codificata de gena aaa, este localizata la suprafata celulei, are multiple functii si adera la fibrinogen, fibronectina, vitronectina (Heilmann si colab., 2005).

Proteina de legare a elastinei (EbpS), un polipeptid de 23 kDa, este codificata de gena ebpS, leaga elastina solubila si tropoelastina. Este o proteina ancorata in membrana plasmatica, nu are secventa semnal si nici secvența LPXTG.

Adezina intercelulara polizaharidica (polysaccharide intercellular adhesion – PIA) codificata de operonul ica (genele icaABDC), are rol în agregarea celulelor bacteriene, in formarea biofilmului, in rezistenta la antibiotice si in rezistenta la efectorii imunitari (O’Gara, 2007).

Proteina de legare la heparina (IsaB), se leaga de ADN dublu catenar, monocatenar si de ARN (Mackey-Lawrence si colab., 2009).

Proteina C de suprafata a S. aureus (SasC) codificata de gena sasC este implicata in agregarea celulelor, in formarea biofilmului si se leaga de matricea extracelulara (Clarke si Foster, 2006; Chavakis si colab., 2007; Schroeder si colab., 2009).

SraP (serine-rich adhesin for platelets) sau SasA este o glicoproteina de suprafata bogata in serina, de mari dimensiuni, atasata covalent de peretele celular. Se leaga de glicoproteinele membranei plachetare și determină agregarea (Siboo si colab., 2005).

Proteina Emp (extracellular matrix binding protein, 38,5 kDa) codificata de gena emp interactioneaza cu fibrinogenul, fibrina, vitronectina si cu colagenul. Este o adezină cu rol în formarea biofilmului (Clarke si Foster, 2006; Johnson si colab., 2008).

Proteina Ebh (extracellular matrix-binding protein homologue) se leaga de fibronectina matricei extracelulare a celulelor tisulare (Clarke si colab., 2002).

Proteina Pls (plasmin sensitive surface protein, codificata de gena pls), reduce aderenta la fibronectina, fibrinogen, laminina si IgG, reduce invazia in celulele gazdei, se leaga de lipidele celulelor gazdei si este implicata in aderenta la celulele epiteliului nazal (Clarke si Foster, 2006).

Proteina Sbi (Second immunoglobulin-binding protein = S. aureus binding protein of IgG, codificata de gena sbi) are o secvență de 436 aa. Poate sa formeze un complex cu fragmentul Fc al imunoglobulinelor G, prin doua domenii distincte (Zhang si colab., 1998). Se leaga de factorul H al sistemului complement si in asociație cu proteinele C3, C3b sau C3d formeaza complexul tripartit Sbi:C3:Factor H (Haupt si colab., 2008; Smith si colab., 2012; Koch si colab., 2012). Factorul H este activ in acest complex inhiband activarea complementului. Proteina Sbi este extracelulară, dar si ancorata de peretele celular prin intermediul acidului lipoteichoic (Smith si colab., 2012).

Proteina de legare la factorul von Willebrand (FvW) leaga si activeaza protrombina, leaga fibrinogenul si factorul von Willebrand, are activitate asemanatoare coagulazei libere si permite stafilococilor capturati in reteaua de fibrina sa disemineze in leziuni tromboembolice si sa reziste opsonofagocitozei (McAdow si colab., 2012).

Proteina de legare a sialoproteinelor din oase (bone sialoprotein binding protein – Bbp, codificata de gena bbp) o varianta a lui SdrE, se leaga de sialoproteina (Campoccia si colab., 2009) si fibrinogen (Vazquez si colab., 2011).

Proteina de aderenta extracelulara (Eap- extracellular adherence protein) sau proteina analoga complexului major de histocompatibilitate II (Map – MHC analogous protein), codificata de gena eap, apartine familiei SERAM (Secreted Expanded Repertoir Adhesive Molecule). Este legata necovalent de peretele celular, fără secvența LPXTG. Mai mult de 98% dintre tulpini produc aceasta proteina. Are rolul de a se atasa de un numar mare de liganzi avand afinitate pentru cel putin 7 proteine plasmatice, printre care fibrinogenul, fibronectina, protrombina, factorul Von Willebrand, vitronectina, sialoproteine din țesutul osos si trombospondina (Palma si colab., 1999). În procesul infecțios cu S. aureus, proteina Eap inhibă aderența neutrofilelor și extravazarea, cu diminuarea angiogenezei si întârzierea cicatrizării. Eap induce sinteza citokinelor pro-inflamatorii: interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroza tumorala-α -TNF-α în macrofage (CD14+). Este implicată in aderenta celulelor de S. aureus la celulele gazdei, în internalizarea lor în celulele tisulare si in formarea biofilmului (Palma si colab., 1999; Bjerketorp si colab., 2002; Harraghy si colab., 2003; Haggar si colab., 2003; Haggar si colab., 2004; Athanasopoulos si colab., 2006; Scriba si colab., 2008; Cheng si colab., 2009; Thompson si colab., 2010; Edwards si colab., 2012).

Proteina CHIPS (Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococci) este secretata de aproximativ 62% dintre izolatele de S. aureus. Se leaga specific de receptorii pentru C5a si de peptide formilate ale membranei neutrofilelor, blocând astfel recrutarea neutrofilelor la locul infectiei (DeLeo si colab., 2009; Postma si colab., 2004; Rooijakkers si colab., 2005).

Proteina SCIN (Staphylococcal Complement Inhibitor) este cel mai eficient inhibitor al sistemului complement, blocand toate cele 3 cai: clasica, alternativa si lectinica. Blocheaza producerea de C5a (Rooijakkers si colab., 2005).

Enzime, alte proteine biologic active si toxine

Toate proteinele grupului sunt factori de virulenta care permit S. aureus să evite acțiunea efectorilor sistemului imunitar innascut

Factori care lizează neutrofilele

Alfa toxina (alfa-hemolizina), codificata de gena hla, se leagă pe membrana plachetelor sangvine si a monocitelor, ceea ce conduce la eliberarea citokinelor pro-inflamatorii si la declansarea cascadei coagularii. Toxina formează pori în membrana și perturbă astfel echlibrul ionic. Are rol important in formarea biofilmelor pe dispozitivele protetice (Caiazza si O’Toole, 2003).

Beta-toxina (beta-hemolizina) este produsa de 10-20% dintre izolatele de S. aureus umane si de majoritatea izolatelor de origine animala. Gena hlb codifica o proteina de aproximativ 330 aa cu funcție de sfingomielinaza dependenta de ioni de magneziu, numita sfingomielinaza C, in functie de continutul in sfingomielina al membranelor celulelor tinta. Este cunoscuta sub denumirea de toxina ”cald-rece’’.

Gamma toxina (gamma hemolizina) este produsa de 99% dintre tulpinile de S. aureus. Locusul ‘’hlg’’ exprima 3 proteine codificate de trei gene hlgA, hlgB, hlgC, litice pentru polimorfonucleare prin mecanismul formării porilor membranari (Chavakis, 2007; Peacock si colab., 2002; Prevost si colab., 1995).

Delta toxina (delta hemolizina), un peptid de 26 aa codificat de gena hld, este sintetizată de aproximativ 97% dintre tulpini. Este rezistenta la temperaturi ridicate. Lizeaza eritrocitele prin formarea porilor, se leaga de neutrofile si monocite (Chavakis, 2007; Peacock si colab., 2002; Verdon si colab., 2009).

Leucocidina Panton-Valentine (PVL) este o proteina/ toxina formatoare de pori produsa de anumite tulpini de S. aureus. A fost descrisa de Van de Velde (1894) si a fost asociata cu infectii ale tegumentului si ale altor tesuturi (Panton si colab., 1932). PVL este formata din 2 unitati: componenta S si componenta F, transcrise separat. Este litică pentru leucocite, iar tandemul celor două subunități LukS-PV/ LukF-PV este sintetizat de tulpinile de S. aureus care produc infectii necrozante pulmonare si cutanate, infectii profunde si mai rar de cele care produc bacteriemii (Cribier si colab., 1992; Lina si colab., 1999; Limbago si colab., 2009; Loffler si colab., 2010; Kreienbuehl si colab., 2011). Genele codificatoare ale toxinei PVL sunt localizate în genomul unui fag lizogenic ce se poate transfera de la o tulpina la alta. Fagul lizogenizează atat tulpini SASM, cat si SARM din comunitate, ocazional din unitati medicale (Guidance on the diagnosis and management of PVL-associated Staphylococcus aureus infections (PVL-SA) in England. Report prepared by the PVL sub-group of the Steering Group on Healthcare Associated Infection; David si Daum, 2010). Cresterea morbidității și mortalității asociate cu tulpini SARM, PVL pozitive, reprezinta o problemă de sănătate publică la nivel mondial. PVL reprezinta un marker epidemiologic la tulpini de S. aureus comunitare. In Statele Unite ale Americii au fost descrise 2 clone SARM asociate cu focare comunitare de infectii tegumentare și ale tesuturilor moi: USA400 (MW2, ST1) si USA300, frecvent pozitive pentru genele PVL (Maree si colab., 2007; Diep si colab., 2006; Diep si colab., 2008; Tenover si Goering, 2009).

Leucocidinele D, E si M (LukD, E, M codificate de genele lukD, lukE, lukM) sunt leucotoxine formatoare de pori, alcatuite din doua subunități (Chavakis si colab., 2007; DuMont si colab., 2011). Leucocidina LukED are rol important in infectiile sangelui (Powers si Wardenburg, 2014). Leucotoxinele ED, MF-PV, leucocidinele A si B (nume alternative H si G/ lukAB/ lukHG) lizează polimorfonuclearele prin formarea porilor membranari (DuMont si colab., 2011; Gravet si colab., 1998; Herron-Olson si colab., 2007; Choorit si colab., 1995; Ventura si colab., 2010).

Peptidele denumite generic modulina solubila in fenol (PSM = phenol-soluble modulin) sunt toxine formatoare de pori sau cu activitate de detergent (Perret si colab., 2012; Tsompanidou si colab., 2013).

Factori ce confera rezistenta la antioxidanți

Pigmentul carotenoid (stafiloxantina) codificat de gena crtOPQMN da culoarea caracteristica coloniilor de S. aureus, ofera protectie față de radicalii reactivi ai oxigenului si permite supravietuirea bacteriei in interiorul fagocitelor (Chavakis si colab., 2007; Song si colab., 2009; Pelz si colab., 2005; Liu, 2005).

Catalaza (KatA) codificata de gena katA transforma peroxidul de hidrogen (H2O2) in apa si oxigen. Testul catalazei diferențiază genul Staphylococcus de Streptococcus si Enterococcus (Buiuc si Negut, 2008). Este un factor de virulenta esential pentru supravietuirea, persistenta si colonizarea nazala (Cosgrove si colab., 2007).

Alchil hidroperoxid reductaza (AhpC) codificata de gena ahpC, inactiveaza peroxidul de hidrogen și are rol important in colonizarea nazala (Cosgrove si colab., 2007).

Thioredoxin si thioredoxin reductaza inactiveaza, de asemenea, radicalii reactivi ai oxigenului (ROS) (Chavakis si colab., 2007).

Factori antifagocitari și inactivatori ai complementului

La S. aureus, capsula (CPS) este foarte fină (microcapsula), vizibilă numai la microscopul electronic si este produsa de aproximativ 90% din izolatele clinice. Este alcatuita din acizi hexozoaminouronici. Au fost descrise 11 tipuri serologice ale polizaharidului capsular. Tipurile 5 si 8 sunt cele mai frecvente, la aproximativ 75% dintre tulpinile izolate de la om.

Tipul 336, implicat in aproximativ 20% din infectii, nu are o capsula propriu-zisa, deoarece sintetizează numai polizaharidul 336 (O’Riordan si Lee, 2004).

Tipul 5 include majoritatea tulpinilor SARM (Lowy, 1998; Lee, 1996). Virulența capsulei constă în efectul repelent față de neutrofile, dar si in mascarea adezinelor de suprafata, favorizând astfel colonizarea si persistența bacteriilor pe suprafata mucoaselor (O’Riordan si Lee, 2004). CPS este codificata de genele cap.

Proteina extracelulara de legare a complementului (Ecb), codificata de gena ecb, blocheaza proteinele complement C3 si C5, blocheaza chemotaxia si activarea complementului (Sharp si colab., 2012; Hammel si colab., 2007a, 2007b).

Proteina Efb (extracellular fibrinogen binding protein, codificata de gena efb) este o proteina bifunctionala, ce leaga specific fibrinogenul si proteina complementului C3, blocheaza activarea plachetelor sangvine (Koch si colab., 2012; Peacock si colab., 2002; Sharp si colab., 2012).

Coagulaza libera (Coa) codificata de gena coa se leaga si activeaza protrombina, care clivează fibrinogenul solubil și-l convertește in fibrina insolubila. Reteaua de fibrina mascheaza antigenele celulei bacteriene, prevenind astfel recunoasterea ei (McAdow si colab., 2012; Peacock si colab., 2002).

Stafilokinaza (Sak), codificata de gena sak, activeaza plasminogenul, care se transforma in plasmina. Plasmina are activitate fibrinolitica, degradand fibrina din coagulul sangvin, favorizând dizolvarea coagulului și diseminarea S. aureus în tesuturi sau în sânge (Bokarewa si colab., 2006). Stafilokinaza degradeaza IgG si componentele sistemului complement C3b si C3bi, inhiband fagocitoza. Leagă defensinele și le neutralizează funcția protectoare (Bokarewa si colab., 2006; Rooijakkers si colab., 2005).

Adenozin-sintaza A (AdsA) codificata de gena adsA, este o proteină prin care S. aureus evită acțiunea fagocitelor (Thammavongsa si colab., 2009) prin scăderea atributelor citotoxice si a productiei de chemokine în neutrofile.

Inhibitori ai activității peptidelor antimicrobiene

S. aureus devine rezistent la lizozim prin O-acetilarea peptidoglicanului sub actiunea O-acetiltransferazei (OatA) (Chavakis si colab., 2007; Bera si colab., 2005).

Numeroase proteaze bacteriene degradează proteinele celulei și eliberează nutrientii: serin proteaza A, endoproteaza V8 (SspA) codificata de gena sspA, promoveaza invazia celulelor prin degradarea proteinelor de legare a fibronectinei, determina activarea lui SspB si clivarea, dar nu inactivează catelicidina LL-37 (Nickerson si colab., 2007; Sieprawska-Lupa si colab., 2004).

Proteinele asemănătoare serin-proteazelor (SplA-F) codificate de genele splA-F sunt serin-proteaze de tipul tripsinei, cu specificitate de substrat, secretate ca zimogen (Popowicz si colab., 2006).

Alte proteine biologic active

Hialuronidaza (HysA) codificata de gena hysA hidrolizeaza acidul hialuronic, un component major al matricei extracelulare a tesuturilor și ușureaza invazia bacteriei in tesuturi. Hialuronidaza la S. aureus este un factor de virulenta (Ibberson si colab., 2014).

Staphopaina A (ScpA) codificata de gena scpA si staphopaina B (SspB) codificata de gena sspB (Ohbayashi si colab., 2011; Shaw si colab., 2004; Imamura si colab., 2005) sunt cistein-proteaze care hidrolizează colagenul si fibrinogenul.

Staphostatina B (SspC) codificata de gena sspC este un inhibitor a lui SspB (Rzychon si colab., 2003; Nickerson si colab., 2010).

Staphostatina A (ScpB) codificata de gena scpB este un inhibitor a lui ScpA, conferind protectie in timpul secretiei (Rzychon si colab., 2003; Nickerson si colab., 2010).

Lipazele (lip), codificate de gena lip (geh, beh), hidrolizează lipidele sebacee, cu eliberarea acizilor grasi pe suprafata cutanata. Sunt importante pentru colonizare si persistenta (Kraus & Peschel, 2008).

Lipazele (Fatty acid-modifying enzyme – FAME) hidrolizează acizii grasi (Chamberlain si Imanoel, 1996).

Enolaza (proteina de legare la laminina) (Chavakis si colab., 2007).

Dezoxiribonucleazele (DN-azele) degradeaza ADN. S. aureus produce o DN-aza termostabila (termonucleaza) codificata de gena nuc (Brakstad si colab., 1992; Mann si colab., 2009; Berends si colab., 2010). Rar se intalnesc tulpini cu un nou tip de nucleaza termostabila omologa (NucM) (Schaumburg si colab., 2014) sau tulpini defective de gena nuc (van Leeuwen si colab., 2008).

Autolizina majora stafilococica (Atl) codificata de gena atl are rol esential ca proteina de legare a fibronectinei ce mediaza fenotipul cu biofilm al S. aureus. Un nou mecanism de internalizare stafilococica implica autolizina majora Atl si proteina inrudita de soc toxic Hsc70 ca receptor al celulei gazda (Houston si colab., 2011; Pasztor si colab., 2010; Hirschhausen si colab., 2010).

Un sistem secretor conservat tip VII, numit Ess, implicat in virulenta a fost descris la S. aureus (EsaA, EsaB, EsaC, EsaD, EssA, EssB, EssC, EssD, EsxA, EsxB) (Kneuper si colab., 2014), iar proteinele stafilococice EsxA si B mediaza eliberarea celulelor de S. aureus internalizate in celulele gazdei (Korea si colab., 2014).

Proteina Bap (biofilm associated protein), 2276 aa, codificata de gena bap este asociata peretelui celular, are rol in aderența intercelulară si este implicata in formarea biofilmului (Cucarella si colab., 2001).

Proteina Sok, codificata de gena sok, asociată peretelui celular, favorizează supravietuirea bacteriei in fagocite (Malachowa si colab., 2011).

Toxine

Enterotoxinele stafilococice (SEs) sunt superantigene pirogenice (pyrogenic toxin superantigens – PTSAgs) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogenice, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic. Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a receptorului T celular (RCT). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor pro-inflamatorii, caracteristice pentru un răspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și IFN-γ, mediatoare ale patofiziologiei sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS). Toxinele sintetizate de S. aureus sunt, în primul rând, enterotoxine: au activitate proteazică, sunt difuzibile și au tropism bine exprimat față de mucoasa intestinală, fiind cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Se cunosc cel puțin 24 tipuri serologice de enterotoxine (A-V) (Bergdoll si colab., 1967; Blaiotta. și colab., 2004). Genele sea-sev sunt localizate pe cromosomul bacterian și pe insule de patogenitate egc (enterotoxin gene cluster) sau pe elemente genetice mobile: fagi, transpozoni, plasmide. Enterotoxinele stafilococice sunt globuline cu gr. mol. mică (26900-29600 Da). Exprimarea activitătii enterotoxice este strict corelată cu o punte disulfidică. Sunt solubile în apă și în solutii cloruro-sodice. Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa II (CMH II) și de catena β a RCT (receptorul de Ag al limfocitelor T), induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic. Sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, care cresc pe produse alimentare bogate în glucide și proteine (White si colab., 1989; Balaban si Rasooly, 2000; Dinges si colab., 2000). Enterotoxinele stafilococice SEA – SEE, SEG – SEI, SER – SET codificate de genele sea-e, seg-i, ser-set au demonstrat activitate emetica/ toxicitate gastroenterica si induc imunomodularea prin activitatea de superantigen (Peacock si colab., 2002; Blaiotta si colab., 2004). Proteinele stafilococice like (SEl) nu au activitate emetica in modelul animal (SElL si SelQ) si sunt codificate de genele selL, selQ sau urmeaza sa fie testate (SElJ, SElK, SElM – SElP, SElU, SElU2 si SelV) si sunt codificate de genele selJ, selK, selM – selP, selU, selU2 si selV (Argudin si colab., 2010).

Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) este un superantigen produs de aproximativ 5-25% dintre tulpinile de S. aureus, cu o gr. mol. de 22 kDa (Dinges si colab., 2000). Toxina activează un număr mare de limfocite T helper (Th), se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate II (CMH II), fără a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de interleukina-2 (IL-2) și interleukina-1 (IL-1) din macrofage. In general, toxina nu este produsa de tulpinile implicate în septicemii, ci este produsa la locul infectiei trecand apoi in sange. TSST-1 este sintetizată de tulpinile de S. aureus din vaginul femeilor aflate in perioada menstruala (100%) si nonmenstruala (50%) (Bergdoll si colab., 1981; McCormick si colab., 2012).

Toxinele exfoliative A, B, C si D (ETA, ETB, ETC, ETD) codificate de genele eta, etb, etc, etd sunt serin proteaze ce lizeaza specific domeniile extracelulare 3+4 ale glicoproteinei desmoglein-1 (DG-1) (codificata la om de gena DSG1) (in special ETB), ducand la formarea unor vezicule tegumentare, fiind exotoxine cu activitate de superantigen (Peacock si colab., 2002; Ladhani, 2003; Kato si colab., 2011).

I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă

Infectiozitatea definește capacitatea unui microorganism de a depasi mijloacele de aparare ale organismului gazda, de a coloniza tesuturile gazdei, adica de a stabili o localizare și de a forma un focar primar de infectie.

S. aureus poate cauza doua tipuri majore de manifestari patologice:

– de natura toxica (intoxicatii/ toxinoze);

– de natura invaziva (infectii).

Patogeneza intoxicatiilor stafilococice (toxinozelor) este directa si implica 4 etape:

Colonizarea cu o tulpina toxigena sau ingerarea produselor alimentare contaminate cu toxina stafilococica preformata (enterotoxine stafilococice cu activitate emetica).

Secretia de toxine.

Absorbtia toxinei în organismul gazda.

Intoxicatia.

Toxiinfectiile alimentare survin ingerării produselor alimentare contaminate cu tulpini de S. aureus producatoare de enterotoxine si cu enterotoxine preformate (Washington si colab., 2006; Codita, 1985; 2009). Enterotoxinele de S. aureus sunt superantigene, adică stimulează mai mult de 10% dintre clonele de celule T ale unei gazde umane. Ca urmare, raspunsul imun este mult amplificat și caracterizat prin eliberarea masiva de citokine, interleukine, TNF si IFN-γ. Enterotoxinele stafilococice stimuleaza in mod direct sistemul nervos vegetativ, asociate cu manifestări patologice ale tractului gastrointestinal (crampe abdominale, stare de rău general, vomă, urmate uneori de diaree).

Sindromul pielii oparite este determinat de toxine exfoliative (Bukowski si colab., 2010), ce duc la necroliza celulelor epiteliale.

In majoritatea cazurilor de sindrom de soc toxic, tulpinile eliberează toxina în focarul infectiei, apoi trece in fluxul sangvin (Bergdoll si colab., 1981). Sindromul de șoc toxic este indus de TSST, dar și de enterotoxina stafilococica. Cel mai frecvent, sindromul de soc toxic stafilococic se manifestă la femei de varsta fertila, in perioada menstruala. Leziunile tegumentare precum arsurile chimice, termice, leziunile produse prin intepatura de insecte, cele provocate de varicela sau plagile chirurgicale se pot complica, conducând la manifestarea acestui sindrom. Sindromul se asociaza frecvent cu infectii musculo-scheletice, cu infectii respiratorii produse de S. aureus sau chiar cu bacteriemie stafilococica.

Patogeneza infectiilor cutanate stafilococice este mult mai complexa si implica prezenta unor etape mai discrete. Declansarea unei astfel de infectii presupune urmatoarele etape:

Colonizarea epiteliilor, mucoaselor si endoteliilor

Invazia țesuturilor prin depasirea barierei epiteliale

Distrugerea tesuturilor invadate

I.3.1. Colonizarea epiteliilor, mucoaselor si endoteliilor

S. aureus aderă la tesuturile epiteliale si endoteliale ale organismului gazda prin numeroase proteine de suprafață. Majoritatea fac parte din subfamilia de adezine MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognising Adhesive Matrix Molecules).

La gazda umana, habitatul primar pentru S. aureus este reprezentat de epiteliul foselor nazale anterioare (Peacock si colab., 2001). În acest proces sunt implicate cinci proteine de suprafata ale bacteriei: ClfB, IsdA, SdrC, SdrD si SasG. ClfB leaga citokeratina-10 de tip I si citokeratina-8, tot prin intermediul regiunii A, având un rol important in colonizarea nazala (O’Brien si colab., 2002; Walsh si colab., 2004; Haim si colab., 2010; Vannakambadi si colab., 2011). Persoanele colonizate la nivelul foselor nazale au un risc ridicat de a se infecta cu acelasi tip de tulpina, asa cum persoanele cu deficit al funcției imunitare, se colonizeaza frecvent cu S. aureus (Vu si colab., 2015).

Pielea reprezinta o bariera fizica si imunologica importanta alcatuita din epiderm cu cele 4 straturi (cornos, granulos, spinos si bazal) și dermul cu cele 2 straturi (dermul papilar si reticular).

Stratul cornos situat la exterior este alcatuit din keratinocite diferentiate terminal legate intre ele prin fibrile de keratina (Nestle si colab., 2009). Straturile granulos, spinos si bazal se leaga de stratul cornos si impreuna formeaza epidermul. Keratinocitele, sub presiunea celulelor care rezultă prin diviziunea celor din stratul bazal, ajung în stratul cornos de unde sunt indepartate. Stratul cornos asigura bariera fizica a pielii si este alcatuit din keratinocite moarte ce nu contin organite celulare (Nestle si colab., 2009). Procesul de reînnoire are loc in mod constant, epidermul având o rată înaltă a diviziunii celulelor. Sub epiderm se afla straturile dermului: dermul papilar si reticular. Dermul este format din fibre de colagen si elastina, dar si din structurile ce strabat aceste straturi: foliculul pilos, glande sudoripare si sebacee (Krishna si Miller, 2012), vezi Figura 9.

Pielea este colonizata cu microorganisme care fac parte din microbiota normala, cu specii diferite dependente de locatie si de alti factori (temperatura, pH, umiditate, sebum, saruri si acizi grasi). Microbiota normala cuprinde diferite specii de stafilococi, propionibacterii, corinebacterii si fungi. Anumite microorganisme ce colonizeaza tegumentul, in particular S. aureus si streptococii β-hemolitici de grup A, dar si bacteriile Gram negative, virusurile si fungii au potentialul de a produce infectii, mai ales atunci cand bariera epiteliala a fost distrusa (Moran si colab., 2013).

Stafilococii nu colonizeaza tegumentele intacte si nici mucoasele gazdei umane. Colonizarea gazdei umane depinde de gradul de virulenta al tulpinii bacteriene, de factorii de apărare ai gazdei, dar si de competitia microbiotei. Astfel, aproximativ 20-30% din populatia umana este colonizata permanent cu S. aureus (vanBelkum si colab., 2009), 60% este colonizata intermitent (Kluytmans si colab., 1997) si 20% nu este colonizata cu acest microorganism (Foster, 2004). Gazda umana reprezinta rezervorul natural de S. aureus.

Purtatorii permanenti, cronici sunt cei cu leziuni acute sau cronice si cei expusi in mod repetat la infectii stafilococice. Colonizarea are frecvență mare la personalul de ingrijire medicală, la cei dializati, la diabetici, la cei care-și injectează droguri, cei cu disfuncții ale neutrofilelor (de aderență sau de metabolism oxidativ) (Washington si colab., 2006; Laupland si colab., 2008).

S. aureus poate determina infectii de la forme usoare pana la cele care periclitează viața: infectii tegumentare, ale tesuturilor moi, infectii musculo-scheletice, infectii ale tractului respirator (pneumonie), infectii ale sistemului nervos central, ale tractului urinar, infectii endovasculare, endocardita, sepsis etc. (Kobayashi si DeLeo, 2009; Bose si colab., 2014; Harris si colab., 2002). Infectiile superficiale pot progresa in profunzime prin continuitate, pe cale limfatică sau sanguină, cu evoluție septicemică. De obicei se descriu infectiile grave fara a mentiona infectia superficiala initiala.

Epiteliul mucoasei nazofaringelui, epiteliul axilei, vaginului, perineului sau al tractului gastrointestinal, dar si tegumentul lezat sau anexele tegumentului (glande sebacee, sudoripare sau foliculul pilos) sunt porti de intrare a S. aureus in organismul uman.

Implanturile sunt usor colonizate cu stafilococi, facand infectiile dificil de controlat, din cauza heterogenitatii populationale ca urmare a hipermutabilitatii. Variantele cu colonii mici (small colony variants – SCVs) rezulta prin mutatiile unor gene implicate in metabolism, nu au virulenta foarte inalta, dar persistă pentru că invadează celulele tisulare (Melter si Radojevič, 2010; Proctor si colab., 2014; Johns si colab., 2015).

Colonizarea epiteliilor

Infectiile cutanate sunt cauzate de invazia microbiana în straturile epiteliului pielii si în derm după distrugerea mecanică a barierei epiteliale. Infectiile se pot iniția la nivelul foliculului pilos, fara o leziune aparenta a barierei epiteliale: foliculita sau furuncul. Infecția dermului și hipodermului determină celulita (Ki si Rotstein, 2008), iar a țesutului muscular, fasciita.

Infectiile tegumentului și ale tesuturilor moi sunt cele mai comune, la toate grupele de varsta. Majoritatea infectiilor cutanate cu S. aureus sunt auto-limitante.

Diferitele etape ale unei infectii stafilococice cutanate necesita seturi diferite de factori de virulenta.

Astfel, in etapa initiala, proteinele de suprafata ale bacteriei, ce leaga moleculele matricei extracelulare favorizeaza colonizarea tesuturilor gazdei, iar sinteza exoproteinelor bacteriene favorizeaza invazia tesuturilor adiacente.

Prima etapa a colonizarii unui tesut este aderenta celulelor bacteriene la celulele sensibile ale gazdei si reprezinta o etapa cruciala avand un caracter de specificitate, in sensul ca epiteliile situate in diferite localizari anatomice leaga specii bacteriene diferite.

Aderenta bacteriana este, de regula, functia adezinelor bacteriene, care se leaga de receptorii glicoproteici sau glicolipidici complementari de pe suprafata celulelor epiteliale. Aderenta asigura colonizarea anumitor situsuri din organism urmată de multiplicarea bacteriilor.

Bacteriile adera in special la epiteliile mucoaselor, dar si la epiteliile cheratinizate (keratinocite), la endotelii, la tesutul osos, la smaltul dentar etc.

Aderenta la celulele gazdei este directa (prin intermediul adezinelor specifice) sau indirecta (prin intermediul glicocalixului sau al moleculelor matricei extracelulare, în special fibronectina). Adezinele bacteriene confera specificitate tisulara, desi exista agenti infectiosi ce pot coloniza diferite tesuturi, in functie de poarta de intrare in organismul gazda producand diferite tipuri de infectii. Structurile bacteriene de aderenta, anatomice sau moleculare sunt de cele mai multe ori adaptative. Ele dispar prin cultivarea succesiva in vitro. Tulpinile bacteriene de laborator sunt mai putin aderente la suport, comparativ cu tulpinile bacteriene izolate recent. Aderenta este conditionata de complementaritatea sarcinilor electrice ale celor doua suprafete. Cele mai multe bacterii au o sarcina neta negativa a suprafetei lor, dar au si zone limitate electropozitive, precum si molecule cu caracter hidrofob.

Au fost detectate numeroase proteine de suprafata ale S. aureus implicate in aderenta. S. aureus adera la colagen, fibrinogen, fibronectina, laminina, trombospondina, elastina, vitronectina, sialoproteina prin intermediul adezinelor: factorul clumping, proteina de legare a fibronectinei, proteina de legare a colagenului si proteina A (McCarthy si Lindsay, 2010).

Colagenul este cea mai abundenta glicoproteina care confera rezistenta si asigura integritatea structurala a tesuturilor. S-au identificat 29 tipuri de colagen (Gordon si Hahn, 2010).

Fibronectina este o glicoproteina dimerica. Se gaseste sub forma fibrilara in matricea extracelulara si sub forma solubila in fluide. Are un rol important in aderența celulara, cat si in procesul de cicatrizare a tesuturilor lezate. Majoritatea tulpinilor de S. aureus prezinta la suprafata proteine de legare a fibrinogenului si fibronectinei.

De cele mai multe ori, S. aureus codifică mai multe adezine pentru acelasi ligand. Unele adezine sunt sintetizate de majoritatea tulpinilor de S. aureus, indiferent de situsul de izolare, iar prezența altora se corelează strict cu situsul infecției.

Invazia țesuturilor

S. aureus eliberează un set de proteine-enzime cu acțiune litică asupra celulelor gazdei, alterand mediul intern:

– coagulaza leaga protrombina si transforma fibrinogenul in fibrina, favorizand instalarea patogenului in tesuturi, astfel protejandu-l de sistemul imunitar;

– lipazele îi asigura supravietuirea in glandele sebacee: actioneaza asupra acizilor grasi;

– hialuronidaza hidrolizează acidul hialuronic, usurand astfel diseminarea in matricea extracelulara. Alte enzime extracelulare, cu diverse roluri in patogeneza infectiilor stafilococice sunt stafilokinaza, termonucleaza, proteaza serica etc.;

– sintetizează numeroase toxine cu acțiune asupra membranelor: hemolizine (alfa, beta si gamma), formatoare de pori în membrana celulelor sensibile: polimorfonucleare (PMN), monocite si macrofage.

Focarul infecțios

Dupa depasirea barierei epiteliale, S. aureus adera la matricea extracelulara, prin intermediul proteinelor de suprafata.

Dupa cateva zile de la declansarea procesului inflamator acut al organismului gazda la infectia stafilococica, se formeaza un abces (Bae si colab., 2009). Inflamatia se caracterizeaza prin cresterea temperaturii la nivelul situsului primar al infectiei, edem, durere, eritem local, acumularea puroiului si necroza tesuturilor adiacente în infectiile severe tegumentare si ale tesuturilor moi. Zonele de necroza se datoreaza mai ales actiunii toxice a leucocidinelor stafilococice, in special a leucocidinei Panton-Valentine. Abcesul reprezinta o colecție purulenta formată din neutrofile vii și lizate, resturi de țesut, bacterii vii si lizate, delimitate de o capsulă fibroasă de colagen (Kobayashi si colab., 2015) sintetizat de fibroblaste. Abcesele se pot forma in epiderm, in derm si in tesuturi subcutanate (Kobayashi si colab., 2015). Celulele bacteriene sunt astfel protejate de actiunea leucocitelor. Formarea abcesului este un mecanism de apărare al organismului, dar provoacă patologii semnificative ce pot duce la obstructii vasculare. Capsula fibroasă se poate rupe, eliberand bacterii care se diseminează in tesutul adiacent, amplificând procesul inflamator.

Cele mai importante componente ale S. aureus implicate in raspunsul inflamator sunt peptidoglicanul, acizii teichoici, acizii lipoteichoici (LTA), alfa-toxina, o hemolizina extracelulara ce formeaza pori in membrana eritrocitelor si monocitelor.

alfa-toxina poate induce sinteza interleukina-1β (IL-1β), IL-6, interleukina-8 (IL-8) si recrutarea neutrofilelor (Onogawa, 2002; Yarovinsky si colab., 2008).

beta-hemolizina este o sfingomielinaza ce lizeaza eritrocitele de oaie, dar nu si pe cele umane, fiind produsă de tulpinile izolate de la animale;

peptidele formilate – formil-metionil peptide, chemoatractante pentru neutrofile si macrofage;

peptidoglicanul activeaza sistemul complement;

polizaharidul capsular si proteina A inhibă opsonizarea celulelor bacteriene, conferindu-le protecție față de fagocite;

catalaza stafilococica asigură supravietuirea S. aureus in mediul intracelular, prin conversia peroxidului de hidrogen in O2 și H2O.

Pentru a supravietui in mediul intracelular, S. aureus poate utiliza si alte mecanisme de eludare a proceselor de aparare: generarea unor variante care, in vitro generează colonii mici (celule cu crestere lentă) și intracelular supravietuiesc o perioada mai lunga de timp. Astfel se explica reaparitia anumitor tulpini de S. aureus dupa ani de latenta, de exemplu in osteomielita cronică produsa de infectia cu S. aureus (Melter si Radojevič, 2010).

Raspunsul imun innascut si dobândit

Proteinele asociate peretelui celular si cele secretate pot actiona ca factori de virulență, ce poarta numele generic de "tabloul molecular asociat patogenului" sau PAMPs ( Pathogen Associated Molecular Patterns ).

Tegumentul este protejat de celule care mediază răspunsul imun înnăscut și dobândit (adaptativ):

în epiderm, celule dendritice specializate Langerhans (Nestle si colab., 2009);

in derm, celule dendritice, macrofage, mastocite, limfocite B si T, celule NK (Nestle si colab., 2009; Moran si colab., 2013; Ki si Rotstein, 2008; Moran si colab., 2006; Bae si colab., 2009; Kobayashi si colab., 2015; Men si colab., 2002; Kupper si Fuhlbrigge, 2004).

Sistemul imunitar innascut are rolul de a recunoaste un numar mare de patogeni, care expun un tablou bine conservat al antigenelor bacteriene (Aderem si Ulevitch, 2000; Janeway, 1992): peptidoglicanul, acizii lipoteichoici, acizii teichoici si forma alanilata a acestora (Fournier si Philpott, 2005).

Peptidoglicanul este cel mai conservat component al peretelui celular si stimuleaza sinteza citokinelor pro-inflamatorii si a chemokinelor (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) în monocite si macrofage (Heumann si colab., 1994; Mattson si colab., 1993).

Antigenele PAMPs sunt recunoscute de receptorii familiei Toll-like (TLR) – structuri ce apartin claselor denumite Pattern Recognition Receptors (PRRs) functionand ca receptor semnal transmembranar, sau de receptorii NOD-like (nucleotide-binding oligomerization domain-like). Au fost identificati 10 receptori omologi ai familiei TLR (TLR2 + TLR1; TLR2 + TLR6; TLR2 + ?; TLR3; TLR4; TLR5; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10).

Prima linie de aparare a organismului in infectia cu S. aureus o reprezinta astfel mediatorii sistemului imunitar innascut (neutrofile, monocite, macrofage, celule epiteliale, endoteliale si plachete sangvine), producerea si secretia unei game largi de citokine si chemokine, activarea celulelor inflamatorii si initierea raspunsului imun adaptativ, dobandit. Dupa recunoasterea PAMPs, PRRs declanseaza mecanismele de aparare antiinfectioasa prin recrutarea leucocitelor PMN care fagocitează patogenii.

Keratinocitele sunt foarte importante în raspunsul imun cutanat producand mari cantități de interleukina-1α (IL-1α), TNFα și peptide antimicrobiene: α-defensinele ca răspuns la diferiți stimuli, inclusiv la prezența bacteriilor (Kupper si Fuhlbrigge, 2004). Keratinocitele produc, de asemenea, un număr mare de chemokine și alte citokine imunoreglatoare ca răspuns la stimulare. Keratinocitele recunosc prezența S. aureus folosind receptorii PRRs. TLR-2 de pe membrana keratinocitelor recunosc PAMPs – peptidoglicanul si lipopeptidele (Miller, 2008). Keratinocitele exprimă, de asemenea, receptorul IL-1 (IL-1R), care este activat de IL-1α și IL-1β (Miller si Cho, 2011).

Apararea față de infectiile cutanate cu S. aureus este mediată de limfocitele T CD4+. Celulele Th1 produc IFN-γ si stimulează raspunsul imun mediat celular. Celulele Th2 produc interleukina-4 (IL-4), interleukina-13 (IL-13) si stimulează raspunsul imun mediat umoral. Celulele Th17 produc pe langa interleukina-17 (IL-17: IL-17A si IL-17F) si interleukina-21 (IL-21), interleukina-22 (IL-22), interleukina-26 (IL-26), ce stimuleaza recrutarea neutrofilelor în focarul infecțios (Krishna si Miller, 2012; Lacey si colab., 2016).

Acizii lipoteichoici stimulează secretia citokinelor si a chemokinelor: TNF-α, IL-1β, IL-8, interleukina-10 (IL-10), interleukina-12 (IL-12), leucotriena B4, proteina C5a, MCP-1 (monocite chemotactic protein-1), MIP-1α (macrophage inflamatory protein-1α) si CSF-G (factorul stimulator al creșterii coloniilor granulocitare) din monocite si macrofage, declansand astfel un raspuns inflamator.

Calea de semnalizare Nod recunoaste patogenii intracelulari. S. aureus se poate internaliza si expune peptidoglicanul receptorilor Nod. Sinteza citokinelor printr-un mecanism independent de TLR este reglata de proteinele Nod1 si Nod2 (nucleotide-binding oligomerization domain proteins). Nod2 este exprimata de monocite si macrofage si recunoaste peptidoglicanul bacteriilor Gram pozitive (Ogura si colab., 2001). Peptidoglicanul intact ajuns in spatiul intracelular, vine in contact cu lizozimul degradandu-l, iar produsii digestiei lizozomale vor activa proteinele Nod. Natura liganzilor ramane inca necunoscuta (Janaki si Coggeshall, 2011).

Stimularea raspunsului imun adaptativ

La cateva zile după contactul cu agentul patogen, raspunsul imun adaptativ, mediat de limfocitele B (raspuns umoral) si de limfocitele T (raspuns celular) devine protector. Anticorpii sunt specifici față de componentele antigenice ale S. aureus: anticorpi anti-toxine (α-toxina, β si γ-hemolizinele, leucocidina Panton-Valentine si enterotoxine), anti-factori de virulenta (aureolizina, IsdA si superantigene), anti-proteine ale peretelui celular (ClfA/ B si proteina de legare a fibronectinei), anti-polizaharidul capsular, anti-acid lipoteichoic si anti-peptidoglican.

Anticorpii neutralizează toxinele, opsonizează celulele bacteriene, facilitand astfel fagocitoza, via receptorii pentru portiunea Fc a anticorpilor – IgG1 si IgG3. IgA este un factor opsonizant esențial (Gorter si colab., 1987).

Evitarea raspunsului imun

Pentru a rezista in organism si a produce o infectie, S. aureus trebuie sa contracareze raspunsul imun al gazdei prin sinteza a numeroase proteine imunomodulatoare, care inhibă acțiunea efectorilor imunitari:

inhibitia functiei fagocitelor, blocarea cascadei sistemului complement, evitarea efectului moleculelor antimicrobiene produse de celulele gazdei, evitarea atacului intermediarilor reactivi ai O2 (Foster, 2005; Kraus si Peschel, 2008).

Unii factori de virulenta contracarează efectorii sistemului imunitar pe mai multe căi, asa cum exista mai multi factori de virulenta care tintesc acelasi component sau aceeasi activitate a sistemului imunitar (DeLeo si colab., 2009; Fedke si colab., 2004; Rooijakkers si colab., 2005).

I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice

I.4.1. Antibioticele beta-lactamice și mecanismele de acțiune

Antibioticele β-lactamice contin in molecula lor un inel tetraatomic, in care un atom de N si o grupare carbonil formeaza o legatura amidica. Prezenta nucleului β-lactamic confera proprietati fizico-chimice si biologice specifice. Inelul tiazolidinic este cel de-al II-lea nucleu al structurii chimice. Penicilinele sunt derivati ai acidului 6-aminopenicilanic.

Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde numeroase variante moleculare, clasificate in 4 grupe:

Peniciline

Cefalosporine

Carbapeneme

Monobactami.

Dupa modul de sinteză se impart in:

peniciline de biosinteza: penicilina G, V, N;

peniciline de semisinteza: meticilina, oxacilina, ampicilina, amoxicilina;

peniciline de sinteza chimica: peneme, carbapeneme.

Mecanisme de acțiune

Antibioticele β-lactamice inhiba ultima etapa a sintezei peptidoglicanilor (formarea puntilor interpeptidice). Ținta antibioticelor sunt enzimele PBP (engl. Penicillin Binding Protein), care catalizeaza reactiile de legare incrucisata intre polimerii peptidoglicanului si au functii fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze si carboxipeptidaze. Antibioticele β-lactamice se fixeaza de proteinele-enzime (PBP) cu rol în sinteza peptidoglicanului. Rezultă astfel un peptidoglican fragil la liza osmotică.

Tabelul 1 PBP la S. aureus

Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze

Până în 1950, 40% din totalul izolatelor de S. aureus au devenit rezistente la penicilină G, iar până în 1960, numărul acestora a crescut la mai mult de 80%, atat in mediul spitalicesc, cat si mediul comunitar. În prezent, majoritatea tulpinilor (98%) izolate din mediul spitalicesc și/ sau comunitar sunt rezistente la penicilină G prin producerea de penicilinaza. Kirby (1944) a demonstrat ca penicilina a fost inactivata de tulpinile de S. aureus rezistente la penicilina. Bondi si Dietz (1945) au identificat rolul specific al penicilinazelor. Penicilinazele sunt exoenzime secretate de stafilococ in mediul extracelular (Zygmunt și colab., 1992), in cantitati mari. Gena pentru penicilinaza aparține unui transpozon, localizat pe o plasmida mare, ce poarta și alte gene de rezistenta la antibiotice (aminozide, macrolide) (Lowy, 2003), la antiseptice sau la metale grele. Se poate integra și în cromosom.

Penicilinaza este un polipeptid de 257 aminoacizi (MM: 28 kDa) care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină G, făcând ineficient antibioticul.

La tulpinile hiperproducatoare de penicilinaza, oxacilina are o activitate diminuata, astfel ca tulpina poate să fie incadrata ca rezistenta. Aceste tulpini se numesc ''borderline'' (BORSA – Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). Mecanismul enzimatic conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice, făcând imposibilă utilizarea lor în clinică pentru tratamentul infecțiilor cu SARM.

β-lactamazele s-au clasificat in functie de substratul pe care-l hidrolizeaza:

– penicilinaze – actioneaza asupra penicilinelor;

– cefalosporinaze – hidrolizeaza cefalosporinele.

În funcție de sensibilitatea la inhibitori, penicilinazele de la stafilococ sunt sensibile la inhibitori: acid clavulanic, tazobactam, sulbactam (Drugeon, 2006).

În funcție de modul de producere, penicilinazele sunt constitutive sau inductibile. În raport cu localizarea genelor codificatoare sunt cromosomale sau plasmidiale.

Al II-lea mecanism de rezistența constă în sinteza unei noi variante de PBP (PBP2a).

Determinismul genetic al rezistenței la β-lactamice

Rezistența la meticilină prin sinteza unei noi variante a proteinei de legare a penicilinei (PBP), PBP2a sau PBP2’, a aparut la putin timp dupa introducerea meticilinei în terapia antiinfecțioasă, prima penicilina semisintetica, inițial activă față de tulpinile de S. aureus producatoare de penicilinaza. PBP2a nu are nici-o asemănare cu PBP de la S. aureus. Este foarte apropiata structural de PBP de la S. sciuri. Meticilina, la fel ca diversele β-lactamice, inhibă situsul transpeptidazic al PBP2 conservand activitatea sa transglicozilazica. PBP2a are activitate transpeptidazica, ce-i conferă rezistență la β-lactamice. In prezenta unui antibiotic β-lactamic, activitatea transpeptidazică și transglicozilazică a proteinei PBP2a asigură sinteza unui peptidoglican funcțional, protector față de liza osmotică (Pinho si colab., 2001). Proteina PBP2a este codificata de gena mecA, componenta a operonului mec, localizată pe cromosom, prin inserarea unui element genetic mobil – caseta cromosomala stafilococica mec (SCCmec) (Oliveira și colab., 2006; Milheirico și colab., 2007; Shanshuang și colab., 2011). Expresia sa este esentiala pentru fenotipul de rezistenta la meticilina.

Recent, omologi ai genei mecA au fost identificați în genomul de stafilococi și in unele specii bacteriene înrudite (vezi Tabelul 2). Până în prezent, au fost descrise patru grupuri de omologi mecA în funcție de gradul lor de omologie cu cea mai timpurie gena mecA identificata.

Tabelul 2: Lista omologilor mecA (dupa Ito si colab., 2012)

a Tulpinile prototip reprezentative pentru fiecare gena mec: S. aureus N315 pentru mecA, S. sciuri K11 pentru mecA1, S. vitulinus CSBO8 pentru mecA2, M. caseolyticus JCSC5402 pentru mecB si S. aureus LGA251 pentru mecC.

Casetele SCCmec – substratul genetic al rezistenței la meticilină

Complexul genei mec este localizat pe un element genetic mobil ce se poate integra in cromosom la nivelul unui situs unic situat în apropierea originii replicarii și a genei de rezistenta la novobiocina, ce se comporta ca o insula de rezistenta la β-lactamice sub denumirea de SCCmec (Staphylococcal Cassette Chromosome mec). Gena mec se asociaza unui complex de doua gene ce codifica recombinaze din familia integrazelor-rezolvazelor denumite ccrA și ccrB (Hiramatsu și colab., 2001; Ito și colab., 2004), ce permit integrarea și excizia complexului mec-ccr.

Pana în prezent au fost descrise 11 tipuri si mai multe subtipuri de caseta cromosomala mec (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements – IWG-SCC) prezentate în tabelul……

Tabelul …..

Cele 11 tipuri de SCCmec întâlnite la S. aureus

*O genă ccr sau genele ccr din complexul genei sunt indicate în paranteze.

Complexele genelor ccr frecvent identificate la stafilococi sunt prezentate în tabelul….

Tabelul …..

Cele mai frecvente complexe ale genei ccr

**Genele ccrA4B4 gasite in tipul SCCmec VIII au fost aproape identice cu cele din elementul SCC-CI de la S. epidermidis și a arătat identități de nucleotide cu cele gasite in tipul SCCmec VI de 89,6% și respectiv 94,5%.

Complexele genei mec frecvent identificate la stafilococi sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul ….

Cele mai frecvente complexe ale genei mec

Detectarea rezistenței la meticilina se poate face prin:

– metoda disc difuzimetrică, cu discul de cefoxitin/ moxalactam/ oxacilina;

– metode automate (vitek2, Phoenix, Microscan etc);

– metode imunologice cu anticorpi monoclonali anti PBP2a fixati pe particule din latex;

– metode moleculare (PCR, Real-Time PCR). Reacția PCR este de referință ("gold standard") pentru detectarea rezistentei la meticilina prin amplificarea genei mecA.

Reacția de amplificare în lanț (PCR) de tip multiplex determină tipul SCCmec util în studiile de epidemiologie ale S. aureus rezistent la meticilina.

Rezistența la aminoglicozide

Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu gr. mol. mica, hidrosolubile, foarte stabile, de spectru larg și cu activitate bactericida rapidă. Ele diferă atat prin nucleul molecular (streptidina sau 2-deoxistreptamina = 2-DOS), cat si prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko si colab., 2003). Gruparile NH2 si OH libere, prin intermediul carora aminoglicozidele se leaga de proteinele ribosomale sunt esentiale pentru activitatea antimicrobiana. Patrunderea unui aminozid in celula bacteriana Gram pozitiva se face in 3 etape:

a) trecerea prin peptidoglican este pasiva, rapida si nonspecifica;

b) EDPI (Energy dependent phase) permite translocarea prin membrana citoplasmatica. Acumularea lenta in citoplasma depinde de concentratia extracelulara de antibiotic;

c) EDPII permite fixarea progresiva a aminoglicozidelor la proteinele ribosomale. Aceasta etapa se caracterizeaza prin accelerarea transferului si o saturare a situsurilor ribosomale.

Gentamicina (CN), tobramicina (TOB), amikacina (AK) si streptomicina sunt folosite in mod curent pentru tratamentul infectiilor cu bacterii Gram pozitive si negative.

Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminoglicozidice este diferit. Cele noi (CN, TOB, AK) au un spectru mai larg decat cele din generația veche [streptomicina, kanamicina (K)].

Desi manifesta nefrotoxicitate/ ototoxicitate, iar aparitia tulpinilor rezistente este relativ frecventa, aminoglicozidele raman, in continuare, foarte importante pentru tratamentul unor infectii in situatii speciale.

Particularitati ale actiunii antimicrobiene ale aminoglicozidelor:

a) activitatea bactericida este dependenta de concentratie;

b) manifesta efectul postantibiotic;

c) au o farmacocinetica relativ predictibila;

d) manifesta efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.

Aminoglicozidele se leaga de subunitatea 30S a ribosomului bacterian in zona inalt conservata a ARNr, la situsul în care se formeaza legatura specifica intre codonul ARNm si anticodonul aminoacil-ARNt si inhiba sinteza proteinelor. Subunitatea 30S are rol esential in traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm si astfel se sintetizeaza proteine nefunctionale sau sinteza proteinelor este stopata.

Tulpinile de S. aureus rezistente la aminoglicozide apar frecvent, prin urmatoarele mecanisme:

1. diminuarea ratei înglobării antibioticului;

2. modificarea tintei ribosomale;

3. efluxul antibioticului;

4. modificarea enzimatica a aminoglicozidelor.

Mecanismul major de rezistenta este modificarea enzimatica a aminoglicozidelor, prin adăugarea unor grupări chimice la grupele amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 enzime catalizatoare, clasificate in 3 familii:

1. aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC): acetilarea gruparilor amino (NH2);

2. aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT): adauga AMP la gruparea OH la pozitiile 2', 3', 4' si respectiv 9;

3. aminoglicozid-fosfotransferaze (APH): adauga grupari de fosfati la aminoglicozide.

Fiecare dintre cele 3 familii de enzime este impartita in clase, in functie de situsul pe care il modifica.

Fiecare clasa contine numeroase izoenzime, grupate in subclase.

AAC cuprinde 4 clase de enzime, care acetileaza grupari amino situate in pozitiile 3, 2', 6', fiind notate AAC(3), AAC(2'), AAC(6') (Dessen, 2001; Schito, 2006).

ANT cuprinde 5 clase de enzime.

APH cuprinde 7 clase de enzime. Sunt kinaze ce utilizeaza ATP ca substrat secundar si fosforileaza gruparile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Genele codificatoare ale enzimelor ce modifica structura chimica a aminoglicozidelor sunt localizate pe plasmide si transpozoni.

Mecanismele neenzimatice de rezistenta la antibioticele aminoglicozidice sunt:

1. sistemele de eflux;

2. mutatiile ARNr.

Rezistenta la CN se datoreaza enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaza-6-acetiltransferaza, ce confera rezistenta la CN, TOB, NET, AK si K. Rezistenta la CN este un indicator al rezistentei bacteriene la alte aminoglicozide.

Mecanisme de acțiune și rezistența ale tulpinilor de S. aureus la macrolide, lincosamide, streptogramine B

Macrolidele, lincosamidele si streptograminele (MLS) sunt antibiotice cu o structura chimica diferita, dar situate in acelasi grup (tabelul..). Macrolidele si lincosamidele au proprietati antibacteriene, cel mai frecvent bacteriostatice.

Tabelul …..

Macrolide, lincosamide si streptogramine

Mecanisme de actiune

MLS inhiba sinteza proteinelor prin fixarea pe ribosomul bacterian. Structura secundara a ARN 23S formeaza 6 domenii (I – VI). Contactele complexe intre ARNr si proteine asigura organizarea tridimensionala a moleculei (structura tertiara). Stabilitatea ansamblului este favorizata de interactiunile cu diferite proteine. Structura ribosomului este foarte conservata la toate speciile bacteriene.

Eritromicina se leaga de subunitatea 50S a ribosomului bacterian.

Macrolidele sunt bacteriostatice, iar streptograminele sunt bactericide pentru S. aureus.

Mecanisme de rezistenta

Rezistenta la MLS este dobândită prin 3 mecanisme (Leclercq, 2002):

Prin mutația proteinelor ribosomale;

Celulele bacteriene își modifica ARN ribosomal prin metilare, reacție catalizată de metilazele codificate de genele plasmidiale sau localizate pe transpozoni (Tn1545, Tn551, Tn554, Tn917). Metilarea ARN ribosomal (Chabbert, 1956) constă în metilarea adeninei in pozitia 2058 a ARN ribosomal 23S. Metilarea A 2058, împiedică legarea antibioticelor MLS cu tinta lor. Adenina 2058, fiind un punct comun de fixare a macrolidelor, lincosamidelor si streptograminelor B, rezistenta la aceste trei grupuri de antibiotice este incrucisata, cunoscută sub numele de fenotip de rezistenta MLSB. Rezistenta este codificata de genele erm (erythromycin ribosome methylase). La Staphylococcus genele erm [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(Q), erm(Y), erm(33)] sunt plasate atat pe plasmide cat si pe transpozoni. Expresia genelor erm poate fi inductibila sau constitutiva;

Mutatii ribosomale – au fost detectate mutatii ale adeninei in pozitia 2058, 2059 sau 2062 ale ARN ribosomal 23S. Raritatea acestei rezistente la stafilococ poate fi explicata prin prezenta mai multor copii rrn (5 sau 6 la S. aureus). Mutatiile in proteinele ribosomale L4 si L22 sunt responsabile in egala masura de rezistenta;

Modificarea enzimatica – multe enzime sunt capabile de inactivarea MLS. Eritromicina poate fi inactivata de diverse enzime ca de exemplu, esteraze (clasa genelor ere) sau de fosfotransferaze (clasa genelor mph). Aceste gene au fost raportate la stafilococ. Lincosamidele sunt inactivate de catre nucleotidiltransferaze (clasa genelor lnu). Rezistenta la streptogramine se explica frecvent prin asocierea genelor de clasa vat si vgb ce codifica pentru acetilazele streptograminelor A si liazelor factorilor B;

Efluxul activ prin dobândirea genei, la bacteriile Gram pozitive, prin doua clase de pompe din familia ABC (ATP-binding cassette) și MFS (Major Facilitator Superfamily). Un transportor ABC codificat de gena plasmidiala msr(A) este raportat la stafilococ. Transportorii ABC utilizeaza ATP ca sursa de energie si sunt alcatuiti dintr-un canal cu doua domenii asociate membranei citoplasmatice si doua domenii de legare la ATP situate pe suprafata interna a membranei. Gena msr(A) codifica o proteina ce poseda cele doua domenii de legare la ATP caracteristice transportorilor ABC. Componenta transmembranară a pompei nu este cunoscuta, dar este o proteină codificată de o genă cromosomală a stafilococului. Efluxul streptograminelor A pare a fi mediat de o proteina Vga din aceeasi familie.

Principalele fenotipuri de rezistenta la MLS sunt prezentate in tabelul…..

Tabelul….

Principalele fenotipuri de rezistenta la MLS

aRisc de selectie mutant rezistent;

bactivitate bactericida redusa;

crezistenta la lincomicina si sensibilitate la clindamicina (interpreteaza I);

dposibilitate de rezistenta la lincomicina si la clindamicina in cazul prezentei genelor vga(A) sau vga(Av).

Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

Tetraciclinele reprezinta un grup de antibiotice naturale cu activitate fata de un spectru larg de bacterii patogene Gram pozitive/ negative, chlamidii, micoplasme, ricketsii si cateva protozoare. Sunt bine absorbite si active dupa administrare orala. Din aceste motive au cea mai larga utilizare in clinica umana si veterinara. Utilizarea masiva si necontrolata a tetraciclinei, atat in terapia umana, cat si in cea veterinara (ca promotor de crestere) a condus la selectarea si diseminarea clonelor bacteriene rezistente (Poyart, 2006).

Tabelul….

Principalele tetracicline

Structura chimica de baza a tetraciclinelor (https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline)

Mecanismul de actiune a tetraciclinelor

Pătrunderea in celula bacteriană

Tetraciclinele pătrund în celula bacteriană Gram negativă prin difuzie pasiva si prin transport activ mediat de transportori membranari. Tetraciclinele nu difuzeaza liber in celula bacteriilor Gram pozitive.

Tetraciclinele sunt inhibitoare ale fazei de alungire a catenei polipeptidice in timpul traducerii mesajului, exercitand astfel un efect bacteriostatic. Tetraciclina se fixeaza la nivelul subunitatii ribosomale 30S si in particular, de proteinele S7 si de nucleotidele G693, A892, U1052, C1054, G1300 si G1338 ale ARNr 16S, blocând astfel atasarea aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului bacterian.

Pe baza modului de actiune, tetraciclinele au fost impartite in doua categorii:

1. inhibitoare ale sintezei proteinelor;

2. cele care interactioneaza cu membrana citoplasmatica.

Mecanismele rezistentei la tetracicline

Rezistenta la tetracicline este una dintre cele mai frecvente atat la bacterii Gram negative, cat si la cele Gram pozitive.

Au fost descrise 3 mecanisme determinate genetic:

1. rezistența datorată pompelor de eflux este cel mai comun mecanism de rezistenta: pompele, dependente de energie elimina tetraciclina din celula. Genele de rezistență codifică sinteza proteinelor membranare care functioneaza ca transportori ai tetraciclinei. Genele tet ce codifica proteinele de eflux sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explica distributia larga a rezistentei. La Staphylococcus genele de eflux sunt localizate, in general, pe plasmide mici. Prototipul este pT181 purtatoare a genei tet(K) (Khan si Novick, 1983). Au fost descrise si gene tet(L) (Schmitz si colab., 2001);

2. rezistența datorată protecției ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile. La Staphylococcus au fost descrise genele tet(M), tet(O), tet(W). Cele mai studiate au fost tet(M) si tet(O), localizate, de cele mai multe ori, pe elemente genetice mobile. Gena tet(M) este localizata pe transpozoni conjugativi, pentru care prototipul este Tn916 si tet(O), pe plasmide conjugative. Proteina TetM a fost purificata (72 kDa). In vitro se asociaza cu ribosomii, avand un rol protector fata de actiunea tetraciclinei. Legarea tetraciclinei la ribosom nu modifica functionalitatea ribosomului. Proteina TetM se asociaza cu ribosomii, facandu-i insensibili la actiunea tetraciclinei;

3. inactivarea enzimatica a antibioticului este o degradare oxidativa si nu un mecanism de rezistenta propriu-zis.

Rezistenta dobandita prin mutatii ale genelor cromosomale este rara. Mutatiile sunt localizate in genele codificatoare pentru ARNr 16S sau la nivelul genelor proteinelor de transport membranar.

Izolatele SARM rezistente la tetraciclină și sensibile la minociclină – până la 50% din izolatele SARM (Schmitz si colab., 2001), posedă gena tetK, iar izolatele rezistente la minociclină posedă gena tetM sau ambele gene, tetK și tetM (Trzcinski si colab., 2000).

Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența a tulpinilor de S. aureus

Linezolidul este un antibiotic sintetic [(S)-N-({3-[3-fluoro-4-(morpholin-4-yl) phenyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)acetamide] (Brickner, 1996), desemnat ca primul membru din clasa de antibiotice numita oxazolidinone.

Linezolidul poate inhiba sinteza proteinelor bacteriene prin legarea de subunitatea 50S a ribosomului bacterian, prin intermediul interacțiunii cu domeniul V al 23S ARNr de la bacteriile Gram pozitive, prevenind astfel formarea initierii complexului tertiar ribosomal N-formil metionil-ARNt-ARNm-70S. Astfel este stopata dezvoltarea bacteriilor prin perturbarea sintezei proteinelor. Efectul este bacteriostatic, nu bactericid. Astfel, linezolidul este diferit fata de alti inhibitori ai sintezei proteice ca si cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele si tetraciclinele.

Proprietatile sale farmacokinetice si farmacodinamice il recomandă pentru terapia pneumoniei nosocomiale si comunitare, a infectiilor tegumentare complicate si a infecțiilor tesuturilor moi (Grau si colab., 2007), a osteomielitei (Aneziokoro si colab., 2005), a septicemiei (Pistella si colab., 2004) etc.

Prima alerta cu S. aureus rezistent la meticilina si la linezolid a fost raportata in 2001 in America de Nord (Tsiodras si colab., 2001). Ulterior, au fost raportate si alte tulpini de stafilococi si enterococi rezistenti la linezolid (Potoski si colab., 2006; Cai si colab., 2012; Chen si colab., 2013; Gu si colab., 2013).

In Statele Unite ale Americii sensibilitatea la linezolid a izolatelor clinice Gram pozitive a fost monitorizata din anul 2004 prin programul Linezolid Experience and Accurate Determination of Resistance (LEADER). Rezultatele au aratat ca rezistenta a ramas stabila si extrem de scazuta (Jones si colab., 2007; Jones si colab., 2008; Jones si colab., 2009). O retea de supraveghere asemănătoare – "Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum Study" sau ZAAPS a functionat in centrele medicale din Europa (Flamm si colab., 2013; Tian si colab., 2014).

Au fost descrise 3 mecanisme de rezistenta la linezolid:

a) mutatii variate la nivelul buclei centrale a uneia sau mai multor alele ale regiunii domeniului V al genei 23S ARNr (Hong si colab., 2007; Lincopan si colab., 2009; Bongiorno si colab., 2010; Sorlozano si colab., 2010; De Almeida L. M. si colab., 2013);

b) metilarea ARN, catalizată de două metil-transferaze. Metiltransferaza 23S ARNr este codificată de gena cfr (de rezistenta la cloramfenicol-florfenicol) (Mendes si colab., 2008; Quiles-Melero si colab., 2013; Campanile si colab., 2013; Huang si colab., 2014), 23S rRNA metiltransferaza metileaza adenina in pozitia 2503 in 23S ARNr (E. coli 23S rRNA gene numbering).

Gena cfr confera rezistenta la 5 clase de agenti antimicrobieni: fenicoli, lincosamide, oxazolidinone, pleuromutiline si streptogramine A (Kehrenberg si colab., 2005; Long si colab., 2006; Shore si colab., 2010; Toh si colab., 2007). Gena este localizata pe o plasmidă (Shen si colab., 2013; Cai si colab., 2015) sau pe cromosom (Toh si colab., 2007; Kehrenberg si colab., 2007) și este transferabilă interspecific.

Gena cfr a fost identificata la stafilococii coagulazo-negativi izolați de la animale (Kehrenberg si Schwarz, 2006; Schwarz si colab., 2000), dar și la un numar limitat de tulpini umane de S. aureus si stafilococi coagulazo negativi (Mendes si colab., 2008; Toh si colab., 2007; Mendes si colab., 2010; Morales si colab., 2010);

c) mutatii sau deletii ale genelor care codifica proteinele L3 (De Almeida si colab., 2013), L4 si L22 (codificate de genele rplC, rplD si rplV) (Holzel si colab., 2010; Long si Vester, 2012; Shaw si Barbachyn, 2011).

Stafilococii coagulazo-negativi reprezinta un rezervor neglijat al rezistentei mediata de cfr, frecvent raportata in America de Nord (U.S.A., Mexic), America de Sud (Brazilia), Europa (Grecia, Spania, Italia, Franta, Irlanda) si Asia (India) (Gu si colab., 2013; Potoski si colab., 2006; Mendes si colab., 2010; Mutnick si colab., 2003).

Au fost identificate mai multe tipuri de plasmide ce poarta gena cfr (Shen si colab., 2013; Cai si colab., 2015) transferabilă, fiind singurul mecanism de transmitere a rezistenței la linezolid.

In multe sectii din spital si mai ales in unitatile de terapie intensiva, presiunea antibioticului, datorata utilizarii adecvate sau neadecvate, precum si dificultatea detectarii mecanismelor de rezistenta prin metode fenotipice au condus la cresterea prevalentei tulpinilor rezistente in intreaga lume (Shorr si Lipman, 2007), ceea ce favorizeaza astfel dezvoltarea rezistenței multiple la microorganismele din genul Staphylococcus (Mackenzie si colab., 2007).

Capitolul II. Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

Scopul și obiectivele lucrării

Scopul: Caracterizarea fenotipică și genotipică a tulpinilor de Staphylococcus aureus izolate din diferite probe biologice de la subiecți umani și de pe suprafețe neanimate.

Obiectivele:

Materiale și metode

Am analizat 228 tulpini de S. aureus și 1 tulpină de Staphylococcus hominis izolate din alimente, de la pacienți cu diferite infecții cutanate, de la purtători sănătoși, de la copii nou-născuți sau de câteva luni, de pe suprafețe contaminate, astfel:

22 tulpini, au fost izolate de la Unitatea Medicală A (UMA) din București;

69 tulpini, au fost trimise de Direcția de Sănătate Publică Prahova, fiind implicate în toxiinfecții alimentare (TIA);

6 tulpini, au fost trimise de Direcția de Sănătate Publică Iași, fiind implicate în TIA;

32 tulpini, izolate de la Unitatea Medicală B (UMB) din Vrancea;

28 tulpini, izolate de la Unitatea Medicală C (UMC) din Suceava;

42 tulpini, izolate de la Laboratorul de Analize Medicale din Institutul Cantacuzino = Unitatea Medicală D (UMD);

29 tulpini comunitare, izolate de la Unitatea Medicală E (UME) din București fiind izolate de la pacienții ce s-au prezentat la camera de gardă a unității medicale;

1 tulpina (423/ 22633) de S. hominis a fost izolată de la Unitatea Medicală F (UMF) din București.

Tulpinile au fost colectate în anii 2010 (UMA), 2011 (DSP Prahova și DSP Iași), 2012 (UMB), 2013/2014 (UMC), 2014 (UMD), 2015 (UME), 2013 (UMF).

Tulpinile de S. aureus din mediul de spital (de la UMA, UMB, UMC) au fost izolate din următoarele probe biologice: exsudat nazal (10), exsudat faringian (5), bont ombilical (14), secreție oculară (1), secreție pustulă (2), secretie plaga (1), lochia (1), tegument axilă (31), tegument (7), secreție purulentă (1), abces (3), masă radiantă sala nasteri (1), masă ginecologica sala nasteri (1), alte surse (3).

Tulpinile de la DSP Prahova si DSP Iasi au fost izolate din exsudat nazal (16), exsudat faringian (5), alimente (37), lichid de vomă (1), materii fecale (16).

Tulpinile de S. aureus din comunitate (de la UMD si UME) au fost izolate din secreție purulentă din diferite infecții de piele și țesuturi moi: furunculoză, foliculita, hidrosadenită, acnee, abces, celulită, plagă deschisă, panarițiu, pustule.

Tulpina de la UMF a fost izolată din sânge.

Identificarea tulpinilor de S. aureus și S. hominis

Tulpinile au fost însămânțate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sânge defibrinat de berbec. Identificarea s-a realizat prin metoda bacteriologică clasică: frotiu colorat Gram, testul catalazei și al oxidazei. Confirmarea speciei s-a realizat aplicând următoarele metode:

testul rapid de latex aglutinare [coagulaza legată – cu reactivul Slidex Staph Plus, Slidex Staph (BioMerieux, Franța) și Staphytect (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom)];

testul coagulazei libere – cu plasma de iepure (BioMerieux, Franța; BioRad Laboratories);

metoda moleculară triplex PCR pentru amplificarea genei nuc, ce codifica termonucleaza (marker specific pentru S. aureus).

Tulpina de S. hominis a fost identificată cu sistemul automat de identificare Vitek2 (BioMerieux, Franța), folosind carduri de identificare GP.

Sensibilitatea tulpinilor de S. aureus și S. hominis la antibiotice

Sensibilitatea tulpinilor de S. aureus și S. hominis la antibiotice a fost determinată prin metoda disc difuzimetrică Kirby Bauer, pe agar Mueller Hinton.

Materiale:

agar Mueller Hinton Oxoid (Basingstoke, United Kingdom);

discuri impregnate cu antibiotice (Oxoid): benzylpenicilină (P, 1U), cefoxitin (FOX, 30 μg), eritromicină (E, 15 μg), clindamicină (DA, 2 μg), kanamicină (K, 30 μg), tobramicină (TOB, 10 μg), gentamicină (CN, 10 μg), norfloxacin (NOR, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, 5 μg), tetraciclină (TE, 30 μg), rifampicină (RD, 5 μg), cloramfenicol (C, 30 μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (SXT, 1.25/ 23.75 μg), quinupristin-dalfopristin (QD, 15 μg), linezolid (LZD, 10 μg), mupirocin (MUP, 200 μg), telithromicină (TEL, 15 μg) și acid fusidic (FD, 10 μg);

tampoane cu bumbac și tijă din lemn;

densimat;

tuburi 12/ 120;

ser fiziologic steril;

tulpina de referință S. aureus ATCC 29213 (tulpina de control).

Tehnica de lucru

Pentru realizarea antibiogramei s-a folosit o cultură de 18-24 h însămânțată pe medii de cultură neselective (agar Columbia cu 7% sânge defibrinat de berbec).

Din cultura de 18-24h s-a preparat o suspensie cu turbiditatea echivalentă standardului 0.5 McFarland. Suspensia a fost însămânțată pe plăcile cu agar Mueller Hinton și după o incubare de 18-24 h la temperatura de 35ș ± 2șC s-au măsurat diametrele zonei de inhibiție a creșterii corespunzătoare fiecărui antibiotic.

Metoda dublului disc (D-test) s-a aplicat prin plasarea discului de E la o distanță de 20 mm de DA pentru detectarea fenotipului de rezistență la macrolide, lincosamide, streptogramine B inductibil (MLSBi) (fig. X).

Figura X. Detectarea fenotipului de rezistență inductibilă la macrolide, lincosamide și streptogramine B (MLSBi) al tulpinilor de S. aureus izolate din UMA, UMB, UMC, UMD, UME.

Pentru anumite izolate discul de TEL s-a plasat la o distanță de 20 mm față de cel de E pentru observarea rezistenței induse la TEL.

Citirea și interpretarea rezultatelor

Se citesc diametrele zonelor de inhibiție a creșterii bacteriene din jurul discurilor și se interpretează după recomandările și criteriile de interpretare ale standardelor EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) disponibile pe site-ul www.eucast.org pentru anul 2010, 2013, 2014, 2015, în funcție de valorile citite, cu:

Sensibil (S);

Intermediar (I);

Rezistent (R).

Cuantificarea Concentrației Minime Inhibitorii (CMI) prin metoda microdiluțiilor în mediu lichid Mueller Hinton și cu benzile E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden).

Materiale:

bulion Mueller Hinton (BMH);

antibiotic pulbere: vancomicină (Sigma Aldrich);

tulpinile de testat cultivate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sânge defibrinat de berbec;

tulpina de referință S. aureus ATCC 29213.

Tehnica de lucru

Antibioticul pulbere a fost diluat în apă distilată sterilă conform standardului utilizat pentru realizarea unei soluții stoc de concentrație 1029 µg/ ml.

Pentru testare, s-au realizat câte șase diluții alese în așa fel încât să cuprindă break-point specificate în standardul EUCAST, corespunzătoare testării bacteriilor genului Staphylococcus.

S-a calculat volumul initial de antibiotic (vi), astfel:

vi = (cf x vf)/ ci

vi = μl antibiotic din ci 1029 μg/ ml

ci = 1029 μg/ ml

cf = 32 μg/ ml

vf = 300 μl.

pentru obținerea celei mai mari concentrații de antibiotic dorită [concentrația finală (cf) – pentru primul godeu – într-un volum final de 300 µl – volum final (vf), din concentrația inițială (ci) din soluția stoc existenta, din care se vor face următoarele diluții binare].

Concentrațiile pentru testarea sensibilității tulpinilor sunt prezentate în tabelul X.

Tabelul X. Concentrațiile pentru testarea sensibilității tulpinilor de S. aureus

S-au obținut diluții binare cuprinse între 32 și 1 μg/ ml.

Din cultura crescută pe mediu se prepară o suspensie bacteriană în soluție salină fiziologică sterilă cu turbiditate echivalentă standardului 0.5 McFarland (1-3 x 108 UFC). Inoculul bacterian se diluează 1/ 100 (1 x 106). 10 μl din suspensia bacteriană 1/ 100 se vor adăuga în fiecare godeu.

Citirea și interpretarea rezultatelor

Se apreciază creșterea sau absența creșterii bacteriene prin vizualizarea godeurilor, comparativ cu martorii de creștere bacteriană (M+ al reacției), respectiv cu martorul de mediu (M-).

CMI: cea mai mică concentrație de antibiotic care inhibă complet creșterea microorganismului (creștere nedetectabilă cu ochiul liber).

CMB: cea mai mică concentrație de antibiotic care inhibă complet creșterea microorganismului – detectată prin însămânțare.

Tabelul X. Valorile limită inhibitorii ale vancomicinei

Cuantificarea CMI la vancomicină și linezolid prin E-test la S. hominis

Banda E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden) este un reactiv cu un gradient predefinit de antibiotic pentru cuantificarea valorilor CMI. Plăcile cu mediu agar Mueller Hinton au fost însămânțate cu o suspensie bacteriană cu turbiditate cunoscută echivalentă cu 0.5 McFarland. Se lasă la temperatura camerei pentru uscare timp de 10 – 15 minute. Apoi s-a aplicat banda E-test, după care s-a incubat timp de 18 – 24h.

Citirea și interpretarea rezultatelor

Dupa incubare, creșterea bacteriană este vizibilă, iar de-a lungul benzii, centrată simetric apare o elipsă. Valoarea concentrației de antibiotic marcată pe bandă, deasupra punctului de intersectare a elipsei zonei de inhibiție cu banda E-test reprezintă valoarea CMI.

Tabelul X

Rezistența la linezolid a fost definită ca CMI > 4 μg/ mL. Sensibilitatea la vancomicină a fost definită ca CMI ≤ 4 μg/ mL conform standardului EUCAST Clinical Breakpoint Table v. 3.1.

Extracția ADN

Extracția ADN s-a realizat utilizând kitul ''NucleoSpin Tissue'' (Macherey-Nagel, Germany) conform indicațiilor producătorului sau prin metoda lizei enzimatice și termice (cu lizostafin 1U/ µL, proteinază K 2 mg/ mL, 5 min./ 100°C).

Evidențierea genelor codificatoare ale factorilor de virulență

Gena pentru proteina A s-a evidențiat prin metoda PCR simplex, țintind gena spa. S-a utilizat protocolul de lucru SeqNet stabilit de cei de la Ridom SpaServer (http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf) (fig. X).

Secvente ale genei spa analizate cu programul Ridom StaphType software v. 2.2.1 pentru izolatul din UMD

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Ampliconii astfel obținuți au fost purificați utilizând kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați utilizând kit-ul DyeEx 2.0 Spin (Qiagen). Fracțiunea depusă a fost denaturată și supusă metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Analiza și încadrarea în tipuri spa a secvențelor astfel obținute s-a realizat utilizând softul Ridom StaphType software versiunea 2.2.1 (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany).

Secvențele primerilor utilizați în reacția PCR și în cea de secvențiere sunt prezentate în tabelul …..

Tabelul. Secvența primerilor pentru gena spa

Gena pentru leucocidina Panton-Valentine (PVL) a fost pusă în evidență prin tehnica reacției PCR în sistem triplex, după un protocol optimizat ''in house'' (Drăgulescu și colab., 2007), țintind genele lukS/F-PV. S-a utilizat termocycler-ul ''Corbett Research''. Amestecul de reacție s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5 x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri nucF și nucR (0,2 μM din fiecare), mecA1 și mecA2 (0,2 μM din fiecare), lukS/F1 și lukS/F2 (0,4 μM din fiecare), 1,5 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.

Tabelul. Secvența primerilor pentru gena leucocidinei Panton-Valentine utilizați în triplex PCR

Programul de amplificare este prezentat în tabelul….

Tabelul. Programul de amplificare pentru triplex PCR

– Enterotoxine stafilococice (A, B, C, D, E)

Genele codificatoare au fost evidențiate în reacția PCR simplex pentru fiecare genă: seA, seB, seC, seD, seE. Amestecul fiecărei reacții s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri SEA1/ SEA2, respectiv SEB1/ SEB2; SEC1/ SEC2; SED1/ SED2; SEE1/ SEE2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvența primerilor utilizați în reacții este prezentată în tabelul ….

Tabelul. Secvența primerilor pentru genele ce codifica enterotoxinele A-E utilizați în fiecare reactie PCR simplex

Programul de amplificare este prezentat în tabelul…..

Tabelul. Programul de amplificare pentru reactiile simplex PCR seA-seE

Gena pentru toxina sindromului de șoc toxic-1 (TSST1) a fost evidențiată în reacția PCR simplex pentru gena tst1. Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri TSST1 și TSST2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvența primerilor utilizați în reacție este prezentată în tabelul ….

Tabelul. Secvența primerilor pentru gena tst1 utilizați în reacția PCR simplex

Tabelul. Programul de amplificare pentru gena tst1

Evidențierea genelor de rezistență la antibiotice

Gena blaZ

Rezistența la penicilină mediată prin producerea de penicilinază a fost pusă în evidență prin PCR simplex pentru gena blaZ. Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri blaZ1 și blaZ2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl.

Tabelul. Secvența primerilor utilizați în reacție pentru amplificarea genei blaZ

Tabelul. Programul de amplificare pentru gena blaZ

Evidențierea genei mecA prin amplificare genică reprezintă standardul detectării și confirmării rezistenței la meticilină (oxacilină, cefoxitin). Detectarea genei s-a realizat prin reacția PCR în sistem triplex.

Evidențierea genei de acetilare (aacA) și de fosforilare (aphD)

Rezistența la gentamicină a fost evidențiată prin tehnica reacției PCR simplex pentru genele aacA-aphD.

Amestecul reacției s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri aacA-aphD1 și aacA-aphD2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvența primerilor utilizați în reacție este prezentată în tabelul ….

Tabelul. Secvența primerilor pentru gena de acetilare și fosforilare utilizați în reacție

Tabelul. Programul de amplificare pentru gena aacA-aphD

Evidențierea genelor ermA, ermC

Genele ermA și ermC au fost puse în evidență prin reacția PCR simplex. Amestecurile reacțiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri ermA1 și ermA2, respectiv ermC1 și ermC2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvențele primerilor utilizați în reacție sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul. Secvențele primerilor pentru genele ermA si ermC utilizați în reacțiile PCR

Tabelul. Programul de amplificare pentru genele ermA si ermC

Genele tetK și tetM au fost evidențiate prin reacțiile PCR simplex. Amestecurile de reacție s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri tetK1 și tetK2, respectiv tetM1 și tetM2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvențele primerilor utilizați în reacții sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul. Secvența primerilor pentru genele tetK si tetM utilizați în reacțiile PCR

Tabelul. Programul de amplificare pentru genele tetK si tetM

Genele cfr și domeniul V 23S ARNr au fost evidențiate prin tehnica reacțiilor PCR simplex. Amestecurile reacțiilor s-au realizat în volum final de 25 µl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimerază Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri cfr-fw și cfr-rv, respectiv 23S ARNrF și 23S ARNrR (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimerază Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secvențele primerilor utilizați în reacțiile de amplificare, cât și în cele de secvențiere sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul. Secvența primerilor pentru genele cfr si 23S ARNr utilizați în reacțiile de amplificare și secvențiere

Programul de amplificare este prezentat în tabelul…..

Tabelul. Programul de amplificare pentru genele cfr si 23S ARNr

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

Produșii de amplificare au fost purificați cu kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen). Fracțiunea depusă a fost denaturată și apoi supusă metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Secvența rezultată a genei cfr a fost comparată cu secvența cfr din baza de date, iar gena 23S ARNr a domeniului V a fost secvențiată pentru identificarea eventualelor mutații implicate în rezistența la linezolid. Ampliconul secvenței ADN pentru gena 23S ARNr a domeniului V a fost aliniată cu secvența de nucleotide corespunzătoare unei tulpini de referință de S. aureus cu sensibilitate la linezolid (GenBank accession number X68425.1), folosind BioEdit Sequence Alignment Editor.

Pentru reacțiile de amplificare prezentate anterior s-au folosit ca martor pozitiv mai multe tulpini de referință sau din Colecția de Culturi Bacteriene a laboratorului Infecții Nosocomiale și Rezistența la Antibiotice: 33/ 2009 pentru genele nuc, lukS/F și mecA; IC13456 pentru gena eta; IC13455 pentru gena etb; IC13454 pentru gena tst1 (Colecția de Culturi Bacteriene); S. aureus National Collection of Type Cultures, U.K. (NCTC) 10652 pentru gena seA; S. aureus NCTC 10654 pentru gena seB; S. aureus NCTC 10655 pentru gena seC; S. aureus NCTC 10656 pentru gena seD; S. aureus Food Research Institute, U.S.A. (FRI) 326 pentru gena seE; 5681/ 2010 pentru genele blaZ, ermC, aacA-aphD, tetK; 39/ 2008 pentru genele ermA, tetM (Colecția de Culturi Bacteriene).

Electroforeza în gel de agaroză

Produșii de amplificare obținuți după fiecare reacție PCR au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1.5% sau 2%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromură de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Documentarea gelului s-a realizat cu echipamentul cu UV Vilber Lourmat.

Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin electroforeză în câmp pulsator – pulse field gel electrophoresis (PFGE)

Metoda PFGE este considerată standardul de referință în epidemiologia tulpinilor de S. aureus.

Principiul metodei constă în înglobarea celulelor bacteriene într-un bloc de agaroză 2%, lizarea peretelui celular, eliberarea ADN cromosomal, digestia ADN cu o enzimă de restricție SmaI 10U/ μL (Promega Corporation, Madison, WI, USA) ce recunoaște situsul CCC^GGG și migrarea fragmentelor de diferite dimensiuni într-un gel de agaroză 1.2% în câmp electric alternativ ce își schimbă periodic sensul.

Câmpul electric pulsatoriu alternează cu 120° la fiecare 90 de secunde, pentru 18-24 ore la 14°C.

Metoda PFGE a fost realizată după o variantă optimizată a protocolului standardizat Harmony (Murchan și colab., 2003) în sistem CHEF Mapper (BioRad).

Interpretarea rezultatelor s-a făcut după criteriile stabilite de Tenover și colab. (1995), iar clonalitatea tulpinilor a fost evaluată utilizând programul BioNumerics software versiunea 6.6 (Applied Maths), cu coeficientul Dice și metoda de analiză UPGMA (toleranță 1.5% și optimizare 1.5%). Pentru stabilirea pulsotipurilor s-a ales arbitrar un prag de asemănare de 80% între profilurile de benzi obținute la analiză.

Pentru determinarea clonalității și a detectării sursei focarului s-a aplicat metoda PFGE tulpinilor de S. aureus izolate din cinci focare: în UMA, DSP Prahova și Iasi, UMB și UMC.

Tipizarea SCCmec

A fost realizată prin reacția multiplex PCR după schema propusă de Milheirico și colab. (2007). Tulpinile de referință au fost utilizate pentru controlul pozitiv al reacției: COL (SCCmec tip I), BK2464 (SCCmec tip II), ANS46 (SCCmec tip III), MW2 (SCCmec tip IVa), WIS (SCCmec tip V), HDE288 (SCCmec tip VI).

Rezultate

Profilurile genelor de virulenta ale tulpinilor de S. aureus

Tulpinile izolate din mediul de spital de la UMA si UMC au prezentat urmatorii factori de virulenta (fig. X): toate tulpinile (n = 50) au fost pozitive pentru gena nuc (fig. X), iar prevalenta tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/ F a fost de 26% (13/ 50).

Figura X. Distributia genelor de virulenta a tulpinilor de S. aureus izolate din mediul de spital

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 2% a ampliconilor nuc (279 pb.), lukS/F (433 pb.), mecA (532 pb.) obținuți prin triplex PCR. Legendă: 1 – 5 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 33/ 2009 (martor pozitiv); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Tulpinile izolate din comunitate de la UMD si UME au prezentat urmatorii factori de virulenta (fig.X): toate tulpinile izolate au fost pozitive pentru gena nuc, prevalenta tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/F a fost de 29.58% (21/ 71), pentru gena tst1 a fost de 8.45% (6/ 71) (fig. x), pentru gena seA a fost de 4.23% (3/ 71) (fig. x), pentru gena seB a fost de 1.41% (1/ 71), pentru gena seC a fost de 9.86% (7/ 71).

Figura X. Distributia genelor de virulenta a tulpinilor de S. aureus izolate din comunitate

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor tst1 (350 pb.). Legendă: 1 – 18 tulpini de S. aureus izolate din UME; MP – tulpina IC13454 (martor pozitiv); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor seA (120 pb.). Legendă: 1 – 11 tulpini de S. aureus izolate din UMD; MP – tulpina S. aureus National Collection of Type Cultures, U.K. (NCTC) 10652 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Cele 69 tulpini izolate de DSP Prahova provin dintr-un focar de TIA si au fost pozitive pentru enterotoxinele A, B, C, D astfel: prevalenta tulpinilor de S. aureus pozitive pentru ambele gene seA si seD a fost de 55.07% (38/ 69); pentru gena seA, de 10.14% (7/ 69); pentru gena seB, de 1.45% (1/ 69); pentru gena seC, de 2.90% (2/ 69); pentru gena seD, de 1.45% (1/ 69).

Cele 6 tulpini izolate de DSP Iasi provin dintr-un focar de TIA si au fost pozitive pentru enterotoxinele A, B, C, D astfel: 2 izolate (33.33%) au fost pozitive pentru ambele gene seA si seD (fig. x).

Figura X. Distributia genelor de virulenta in tulpinile de S. aureus izolate de catre DSP Prahova si DSP Iasi

Profilurile rezistenței la antibiotice ale tulpinilor de S. aureus

Tulpinile izolate din mediul de spital (UMA, UMB, UMC) au prezentat urmatoarea distributie a rezistentei la antibiotice (fig. X).

Figura X. Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din mediul de spital

Suplimentar pentru un numar de 28 tulpini izolate de la UMC s-a realizat testarea sensibilitatii la MUP. Toate tulpinile au fost sensibile.

Prevalenta rezistentei la penicilina a tulpinilor izolate din mediul de spital a fost de 97.56% (80/ 82). Prevalenta tulpinilor SARM a fost de 84.15% (69/ 82), iar la E de 81.71% (67/ 82). La 55 izolate (67.07%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 86.59% (71/ 82), la CN, de 60.98% (50/ 82), la TOB, de 60.98% (50/ 82), la CIP, de 1.22% (1/ 82), la TE, de 64.63% (53/ 82), iar 1 tulpina (1.22%) a fost intermediara la TE. Prevalenta rezistentei la C a fost de 1.22% (1/ 82), la QD, de 67.07% (55/ 82), fiind raportate rezistente in corelatie cu fenotipul MLSBi. Toate tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital au fost sensibile la RD, SXT, VA, LZD.

Tulpinile izolate din comunitate (UMD si UME) au prezentat urmatoarea distributie a rezistentei la antibiotice (fig. X).

Figura X. Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din comunitate

Suplimentar pentru un numar de 42 tulpini izolate de la UMD am evaluat sensibilitatea la C, iar pentru 29 tulpini izolate de la UME am evaluat sensibilitatea la NOR. Prevalenta rezistentei la C a fost de 4.76% (2/ 42), iar la NOR de 6.90% (2/ 29).

Prevalenta rezistentei la penicilina a tulpinilor izolate din comunitate a fost de 94.37% (67/ 71). Prevalenta tulpinilor SARM a fost de 42.25% (30/ 71), iar la E de 49.30% (35/ 71). 4 tulpini au fost intermediare la DA, iar la 30 izolate (42.25%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 50.70% (36/ 71), la CN, de 5.63% (4/ 71), la TOB, de 7.04% (5/ 71), la CIP, de 5.63% (4/ 71), la TE, de 42.25% (30/ 71), iar 2 tulpini (2.82%) au fost intermediare la TE. Prevalenta rezistentei la RD a fost de 1.41% (1/ 71), 9 tulpini fiind intermediare. Prevalenta rezistentei la QD a fost de 42.25% (30/ 71), 3 tulpini fiind intermediare, iar la FD a fost de 11.27% (8/ 71). Toate tulpinile de S. aureus izolate din comunitate au fost sensibile la SXT, VA, LZD, MUP.

Profilul genelor de rezistență al tulpinilor de S. aureus izolate din diferite surse

Cele 48 de tulpini izolate din mediul de spital (de la UMA si UMC) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ (fig. X).

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor blaZ (173 pb.). Legendă: 1 – 22 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Cele 39 de tulpini rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (16 tulpini) si IVE (23 tulpini) (fig. X), cele rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, un izolat a fost pozitiv pentru gena ermA, iar o tulpina rezistenta numai la E a fost pozitiva pentru gena ermC. Cele rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD (fig. X), iar cele rezistente si intermediare la TE au fost pozitive pentru gena tetK (fig. X).

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză a ampliconilor SCCmec. Legendă: 1 – 11 tulpini de S. aureus izolate din UMA; M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega; I – VI tipurile SCCmec; MN1 si MN2 – martor negativ (cu H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor aacA-aphD (227 pb.). Legendă: 1 – 9 tulpini de S. aureus izolate din UMA; MP – 5681/ 2010; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor tetK (360 pb.). Legendă: 1 – 3 tulpini de S. aureus izolate din UMC; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Cele 67 de tulpini izolate din comunitate (de la UMD si UME) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 30 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (9 tulpini) si IVE (20 tulpini). O tulpina nu a putut fi incadrata in nici un tip SCCmec. Toate tulpinile rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC (fig. X). Tulpinile rezistente fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK, iar o tulpina a fost pozitiva pentru gena tetM. Tulpinile intermediare la TE au fost negative pentru genele tetK si tetM. Doua tulpini rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar alte doua tulpini rezistente au fost negative.

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor ermC (299 pb.). Legendă: 1 – 16 tulpini de S. aureus; MP – tulpina 5681/ 2010 (martor pozitiv); MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Incadrarea tulpinilor de la UMA, DSP Prahova, DSP Iasi, UMB si UMC in pulsotipuri PFGE

Tulpinile SARM de la UMA s-au incadrat in doua pulsotipuri PFGE notate A si B cu un indice de asemănare > 90%. Tulpinile incadrate in pulsotipul PFGE A, cat si cele incadrate in pulsotipul PFGE B au un indice de asemănare de 100% (0 benzi diferenta) ceea ce demonstreaza clonalitatea acestora.

Analiza profilurilor de macrorestricție in cadrul tulpinilor trimise de DSP Prahova si DSP Iasi, la un indice de asemanare de 80% a evidențiat existența mai multor pulsotipuri distincte notate A, B, C, D, E, F, G, dintre care unul comun unor tulpini producătoare de enterotoxine A și D izolate din exsudat faringian, din exsudat nazal, din coproculturi și din alimente, dar și unor tulpini producătoare de enterotoxină A, izolate din coproculturi și din alimente (fig. X).

Figura X. Dendrograma tulpinilor de S. aureus trimise de DSP Prahova si DSP Iasi. Legenda: chenar albastru – tulpini de la DSP Prahova; chenar rosu – tulpini de la DSP Iasi

Cele 32 tulpini de S. aureus de la UMB au fost incadrate in trei pulsotipuri PFGE notate A, B, C si 2 subtipuri (notate A1 si A2) cu un indice de similaritate de ….. Cele incadrate in pulsotipul PFGE A au prezentat doua subtipuri notate A1 si A2 cu un indice de similaritate de …………..

Genotipizarea izolatelor de S. aureus s-a realizat prin metoda “Electroforeza in camp pulsator” a ADN genomic digerat cu enzima SmaI, denumita pe scurt metoda PFGE.

Toate izolatele analizate au fost tipabile, generand un profil PFGE. Au fost identificate 4 profiluri distincte, notate A1, A2, B si C. Dupa analiza computerizata (programul BioNumerics, Applied Maths) aceste profiluri au servit la obtinerea unei dendrograme utilizata pentru a evalua gradul de inrudire genetica a tulpinilor. Un procent de asemănare ≥ 80% intre profilurile PFGE (diferenta de pana la 5 fragmente ADN) indica ca tulpinile sunt inrudite genetic.

Din punct de vedere epidemiologic, asemănarea poate sugera o sursa comuna a tulpinilor.

27 de tulpini au prezentat profilul A1 (asemănare 100%), 3 tulpini profilul A2 (asemănare 80%), 1 tulpina profilul B (asemănare < 80%) si 1 tulpina profilul C (asemănare < 80%).  Tulpinile cu profilul A1 reprezinta o clona. Tulpinile cu profil A2 pot fi inrudite genetic cu cele cu profil A1.

Cele 28 tulpini de S. aureus de la UMC izolate din cele 2 focare, la un indice de asemanare de 80% intre profilurile de benzi obtinute la analiza, s-au distins 10 pulsotipuri (tipuri) notate cu A, B, C, D, E, F, G, H, I, J si 6 subtipuri (notate D1, D2, E1, E2, G1, G2). Intre tipurile identificate exista un grad mic de asemanare (44.87%).

Tulpinile incadrate in pulsotipul A prezinta un indice de asemanare de 100% (0 benzi diferenta) ceea ce demonstreaza clonalitatea acestora;

Tulpinile incadrate in pulsotipul D cu un indice de asemanare de 87.45% (3 benzi diferenta) sunt strans inrudite intre ele;

Tulpinile incadrate in pulsotipul E cu un indice de asemanare de 90.91% (2 benzi diferenta) sunt strans inrudite intre ele;

Tulpinile incadrate in pulsotipul G cu un indice de asemanare de 85.72% (3 benzi diferenta) sunt strans inrudite intre ele (fig. X).

Rezultatele sugereaza posibilitatea unei circulatii endemice a unor tulpini provenind din multiple surse.

Figura X. Dendrograma tulpinilor de S. aureus izolate de la UMC

Distributia tipurilor spa a tulpinilor de S. aureus izolate din UMA, UMC, UMD si UME

Cele 50 tulpini de S. aureus izolate de la UMA si UMC au fost incadrate in urmatoarele tipuri spa (fig. X): t127 (48%, 24/ 50), t008 (24%, 12/ 50), t002 (6%, 3/ 50), t015 (6%, 3/ 50), t616 (4%, 2/ 50) si alte 6 tipuri spa cu 2% (1 tulpina din fiecare): t056, t279, t330, t620, t1556 si un tip spa nou t13462, introdus pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer (fig. X).

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor spa (diferite dimensiuni). Legendă: 1 – 14 tulpini de S. aureus izolate din UMC; M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Figura X. Distributia tipurilor spa a tulpinilor de S. aureus izolate de la UMA si UMC

Cele 71 tulpini de S. aureus izolate de la UMD si UME s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa: a prevalat t127 (36.62%, 26/ 71), urmat de t044 (7.04%, 5/ 71), t005 (4.23%, 3/ 71), t008 (4.23%, 3/ 71), t284 (4.23%, 3/ 71), t019 (2.82%, 2/ 71), t021 (2.82%, 2/ 71), t2881 (2.82%, 2/ 71) si alte 25 tipuri spa cu 1.41% (1 tulpina din fiecare): t002, t012, t015, t053, t084, t091, t174, t223, t280, t355, t435, t437, t559, t582, t620, t701, t728, t948, t1211, t1889, t5841, t7585 si trei tipuri spa noi t14512, t14513, t15296 introduse pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer (fig. X).

Figura X. Distributia tipurilor spa a tulpinilor de S. aureus izolate de la UMD si UME

O tulpina izolata de la UME a prezentat o mutatie punctiforma la nivelul semnaturii 3’ schimband astfel structura initiala 3’TAYATGTCGT in 3’TAYATATCGT.

Relatiile evolutive ale tipurilor spa in tulpinile din mediul de spital de la UMA si UMC sunt prezentate in fig. X. Tulpinile s-au grupat intr-un singur cluster notat cluster 1 [4 (8% din totalul tulpinilor); 2 (18% din toate tipurile spa: t015 si t620)].

Relatiile evolutive ale tipurilor spa in tulpinile comunitare de la UMD si UME sunt prezentate in fig. X. Tulpinile s-au grupat in 7 clustere ce cuprind urmatoarele tipuri spa: cluster 1 [spaCC582/ 021 – 7 (10% din totalul tulpinilor); 5 (15% din toate tipurile spa: t012, t019, t021, t582, t1889)]; cluster 2 [spaCC14512 – 5 (7% din totalul tulpinilor); 3 (9% din toate tipurile spa: t008, t701, t14512)]; cluster 3 [spaCC620 – 3 (4% din totalul tulpinilor); 3 (9% din toate tipurile spa: t015, t620, t7585)]; cluster 4 [spaCC127 – 28 (39% din toate tulpinile); 3 (9% din toate tipurile spa: t127, t174, t948)]; cluster 5 – 4 (6% din totalul tulpinilor); 2 (6% din toate tipurile spa: t005, t223)]; cluster 6 – 2 (3% din totalul tulpinilor); 2 (6% din toate tipurile spa: t002, t053)]; cluster 7 – 4 (6% din totalul tulpinilor); 2 (6% din totalul tipurilor spa: t284, t435)].

Tabelul X. Principalele pattern-uri de rezistenta ale tulpinilor de S. aureus izolate de la UMB

Tabelul X. Corelatia între profilul de rezistenta la antibiotice, SASM/ SARM, tipul spa si PVL la tulpinile de S. aureus de la UMA si UMC

(I)* – Intermediar

Tabelul X. Corelatia dintre profilul de rezistenta SASM/ SARM, tipul spa si PVL la tulpinile de S. aureus de la UMD si UME

(I)* – Intermediar

Analiza fenotipica si genotipica a unei tulpini de S. hominis izolata din UMF

Din UMF s-a izolat o tulpina de S. hominis rezistenta la linezolid.

Izolatul a fost sensibil la SXT si VA (valoarea CMI = 3 µg/ mL) (fig. X) si rezistent la P, FOX, E, DA, K, CN, TOB, CIP, TE, RD, C, QD, LZD.

Valoarea CMI la linezolid a aratat o rezistenta de nivel inalt (>128 µg/mL) (fig. X).

Figura X. Testarea sensibilitatii la vancomicina a tulpinii de S. hominis prin metoda E-test

Figura X. Testarea sensibilitatii la linezolid a tulpinii S. hominis prin metoda E-test

PCR pentru gena cfr

Un amplicon de marimea asteptata a fost obtinut prin PCR pentru gena cfr (fig. X). Secventa ampliconului genei cfr a fost comparata cu secventa salvata in baza de date National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor cfr (746 pb.). Legendă: 1 – tulpină izolată din UMF; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Prin secventierea si compararea secventei genei regiunii domeniului V 23S ARNr (fig. x) cu secventa genei 23S ARNr de la S. aureus (GenBank accession no. X68425.1), o singura mutatie punctiforma a fost detectata in pozitia 2603, prin substituirea nucleotidului G cu T (fig. X).

Aceasta mutatie a fost deja detectata ca fiind implicata in rezistenta la linezolid.

Figura X. Electroforeza în gel de agaroză 1.5% a ampliconilor 23S ARNr (420 pb.). Legendă: 1 – tulpină izolată din UMF; MN – martor negativ (H2O); M – marker de greutate moleculară 100 pb. Promega

Figura 4. Mutatia punctiforma in pozitia 2603 in regiunea domeniului V 23S ARNr (BioEdit Sequence Alignment Editor)

2.4. Discuții

Studiile de epidemiologie au aratat o crestere a incidentei nu doar in randul infectiilor asociate ingrijirilor medicale, dar si in randul infectiilor asociate mediului comunitar (Dryden, 2009).

Infectiile de piele si tesuturi moi cauzate de S. aureus reprezinta un grup divers de infectii ce pot fi clasificate in necomplicate si complicate. Factorii gazdei precum co-morbiditatea si factorii bacterieni, in particular rezistenta la antibiotice, complica managementul acestor infectii.

La nivel European, SARM este considerat cel mai important patogen implicat in infectiile de piele si tesuturi moi complicate. Terapia trebuie initiata empiric inainte de primirea rezultatului de la laborator (Lee si colab., [51]).

In anul 2008, Europa aparea cu un procent semnificativ de tulpini SARM, fiind de aproximativ 44% in infectiile de spital (Kock si colab., [52]). Alte studii Europene au aratat o prevalenta a rezistentei la oxacilina la tulpini de S. aureus de 26.7%. Au fost raportate prevalente diferite in randul SARM intre anumite tari, nivelul rezistentei variind de la 40% in Marea Britanie, Belgia, Grecia, Irlanda si Islanda la numai 0.6% in Suedia (Sader si colab., [53]). Procente de 25% sau mai mari au fost raportate in Bulgaria, Croatia, Cipru, Grecia, Israel, Italia, Malta, Portugalia, Irlanda, Romania, Spania, Turcia si Marea Britanie (Kock si colab., [52]). In acord cu raportul sistemului de supraveghere a rezistentei la antibiotice ECDC (EARS-Net), in Romania, procentele de SARM in randul infectiilor invazive a fost de 49.5% in 2011, 53.3% in 2012, 64.5% in 2013 si 56% in 2014 ([54]). Aceste date au fost obtinute datorita sistemelor de supraveghere si a criteriilor de control al focarelor (Humphreys, [55]). Prevalenta tulpinilor SARM in spital (HA-MRSA) a fost la un nivel inalt in Australia (Humphreys [55]), Africa de Nord, Orientul Mijlociu și Asia de Est (Ippolito & al. [56]).

Tipul spa t030 a fost descris ca MRSA prevalent in Turcia (Alp si colab., [57]) si Romania (Grundmann si colab., [3]), cel mai raspandit SARM in spitalele din Romania, fiind raportat in numeroase studii (Oprea & al. [58], Ionescu & al. [59]), si a devenit endemic (Szekely si colab., [60]). ST239/ t030 puternic asociat cu tipul SCCmec III este acum, diseminat in multe tari din Asia si, particular, in China, deși ar putea fi provenit din țări Europene (Chen si colab., [61]). In spitalele din Romania clona ST239 a fost raportata de catre sistemul de supraveghere structurat Seqnet.org (Grundmann si colab., [62]) si de catre alti autori (Cîrlan si colab., [63]). Tipul spa t127 raportat frecvent in spitalele din Romania (Oprea si colab., [58], Szekely si colab., [60], Codiță si colab., [64]), a fost descris de catre Franco si colab., ([65]) ca fiind asociat cu animalele (ex. porci).

In Europa, CA-MRSA a fost descris pentru prima data la inceputul acestui deceniu. In America de Nord si de Sud, Asia si Malta au fost raportate cele mai inalte prevalente in randul purtatorilor de CA-MRSA (>50%). Prevalente intermediare (25 – 50%) au fost raportate in China, Australia, Africa si in cateva tari din Europa, precum Portugalia (49%), Grecia (40%), Italia (37%) si Romania (34%). Alte tari Europene, incluzand Olanda si tarile Scandinave au raportat, in general, prevalente scazute (Alaklobi si colab., [66]). Tulpinile CA-MRSA prezinta o prevalenta inalta in Statele Unite ale Americii, Canada (Carroll [67]) si Australia (Kock si colab., [52]). Atat in Europa, cat si in Statele Unite ale Americii există o creștere dramatică a numărului de rapoarte care arată creșterea prevalenței SARM în infecții asociate comunitatii. Inainte de anul 2000, in Statele Unite ale Americii procentul tulpinilor SARM izolate din infectii de piele si tesuturi moi a fost foarte scazut (3%) si s-a ridicat in cateva regiuni la 30% si apoi la 64% intre anii 2001-2004, cu 97% dintre tulpini apartinand clonei USA300 (Moran si colab., [6]).

Alte clone USA includ USA400 (ST1), USA1000 (ST59) si USA1100 (ST30) (Pan si colab., [68]).

In China, cea mai comuna clona printre tulpinile CA-MRSA raportata in infectiile de piele si tesuturi moi la copii a fost ST59-MRSAIV/V-t437 (Wu si colab., [69], Li si colab., [70]). In Beijing, un studiu recent a raportat clona ST398 in fermele de animale avand o prevalenta ridicata in infectiile de piele si tesuturi moi, dintre care 64.3% sunt purtatoare de gene lukS/F-PV (Zhao si colab., [71]). In Japonia, cea mai comuna clona printre tulpinile SARM asociate infectiilor de piele si tesuturi moi a fost MLST-CC8/spa-CC008-SCCmec-IV (Maeda si colab., [72]). In New York, US CC8 este cea mai comuna clona in infectiile de piele si tesuturi moi cu S. aureus, mai ales dintre S. aureus PVL pozitiv (Kaltsas si colab., [73]).

Inainte de anul 2003, Vandenesch si colab., ([21]) au aratat un numar limitat de clone cu distributie geografica preferentiala. Dupa acest an, o diversitate genetica inalta a fost raportata in Europa printre tulpinile CA-MSSA (Rolo si colab., [74]) si CA-MRSA. Este clar ca anumite tulpini se gasesc in anumite zone geografice, in timp ce altele se gasesc peste tot, dar nu este clar de ce anumite tulpini SARM predomina in spitale si altele in mediul comunitar (Diep si colab., [75]). Anumite tulpini au prezentat variatii in ceea ce priveste declansarea de focare.

Cea mai prevalenta clona Europeana detectata a fost ST80, in timp ce in Statele Unite ale Americii cele mai prevalente clone au fost ST8 (USA300) si ST1 (USA400), iar in Oceania ST30. Studiul propus de catre Tristan si colab., ([20]) sugereaza schimbul intercontinental a numeroase clone continent-specifice: clona ST8 din Statele Unite ale Americii catre Europa, clona ST1 din Statele Unite ale Americii catre Europa si Asia, clona ST59 (USA1000) din Statele Unite ale Americii catre Asia, clona ST80 din Europa catre Asia (Hsu si colab., [76]) si clona ST30 din Oceania catre Europa. Caracterul epidemic al tulpinilor CA-MRSA, in special al clonei USA300 raspandita geografic pe scara larga este prost inteles. Tulpinile USA300 poarta tipul SCCmec IV conferind rezistenta la clasa de antibiotice β-lactamice si o insula de patogenitate, arginine catabolic mobile element (ACME), ce inhiba producerea celulelor polimorfonucleare. Legătura fizică dintre caseta SCCmec și ACME sugerează că selecția pentru rezistența la antibiotice și pentru patogenitate pot fi interconectate (Diep si colab., [77]).

Principala clona Europeana, t044/ ST80 a fost detectata in Austria, Belgia, Bulgaria, Chile, Croatia, Cipru, Republica Ceha, Finlanda, Franta, Germania, Grecia, Ungaria, Islanda, Iran, Irlanda, Italia, Iordania, Liban, Olanda, Norvegia, Romania, Spania, Suedia, Elvetia, Emiratele Arabe Unite, Regatul Unit al Marii Britanii (baza de date EU Ridom SpaServer), de asemenea in Europa de Nord (ex. Danemarca), unde tulpinile SARM sunt rare in spitale (Faria si colab., [78]). ST30 este, de asemenea, clona majora in Asia si Oceania (Ho si colab., [79], Vlack si colab., [80]) si este denumita clona Pacific Sud-Vest (Vlack si colab., [80]).

Clonele ST1 si ST30, PVL pozitive, pot fi considerate pandemice. Au fost detectate in America, Europa si Asia. Cateva clone specific continentale descrise in 2003, precum clona ST8, s-au răspândit peste tot în lume. Tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive s-au raspandit in mai multe tari de pe diferite continente (Tristan si colab., [20], Vandenesch si colab., [21]). In 2002, PVL a fost asociata cu 1.6% dintre tulpinile de S. aureus in Anglia si Tara Galilor (Holmes si colab., [81]). In prezent, prevalenta tulpinilor CA-MRSA, PVL pozitive variaza considerabil de la un continent la altul. Spre deosebire de Statele Unite, în cazul în care tulpinile CA-MRSA sunt implicate, in prezent, in majoritatea infectiilor cu S. aureus în comunitate, în Europa de Nord, prevalența tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive este mai mic, aprox. 1-3% (Del Giudice si colab., [82]), in timp ce in tarile Europei de Sud, precum Grecia si țările situate la granițele sudice ale Europei, cum ar fi Algeria, au o prevalență mai mare.

Tulpinile SASM/ SARM, PVL-pozitive au fost ocazional descrise in Romania (Ionescu si colab., [59], Năstase si colab., [83], Codiță si colab., [84]). Monecke si colab., ([85]) au raportat prevalente inalte ale tulpinilor PVL pozitive in tara noastra (31% SARM, 14% SASM). Un studiu arata rate relativ inalte ale tulpinilor PVL-pozitive (23.93%), mai ales ale tulpinilor CA-MRSA (51.11%) in regiunea de Nord-Est a Romaniei (Vremera si colab., [86]).

Initial tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive au fost sensibile la majoritatea agentilor antimicrobieni antistafilococici, apoi au achizitionat noi determinanti de rezistenta antimicrobiana. In Asia (Singapore, Republica Populară Chineză) sau Africa (Algeria) majoritatea tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive au prezentat determinanti de rezistenta antimicrobiana multipli (Tristan si colab., [20]). In Romania, majoritatea tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive au fost rezistente la eritromicina (91.30%) si sensibile la clindamicina, fluoroquinolone, rifampicina, cloramfenicol sau acid fusidic (Vremera si colab., [86]).

In tarile cu prevalenta inalta, tulpinile CA-MRSA, PVL-pozitive sunt responsabile pentru cresterea numarului de infectii asociate ingrijirilor medicale. Printre diferitele clone, s-au observat variații de secvență a genei pentru PVL. Clona cea mai frecvent observata în Europa, ST80 adăpostește haplotipul H2, care este descris ca alela ancestrala ce a dat naștere la celelalte variante. Aceste tendințe, deși în mare parte regionalizate, trebuie să fie luate în considerare atunci când se vorbeste despre infecțiile de piele, precum si despre alte infecții, incluzand pneumonia asociata comunitatii. Aceste tendințe conduc spre o incidență crescută a tulpinilor CA-MRSA și o sensibilitate scăzută la agenții antimicrobieni. Acestea trebuie să fie luate în considerare atunci când se aleg optiunile de tratament empiric (Vandenesch [87]).

Tulpinile CA-MRSA de multe ori provoaca boli mai severe, cum ar fi infecțiile profunde ale pielii. O asociere epidemiologica clara intre tulpinile de S. aureus, PVL-pozitive si pneumonia necrozanta a fost demonstrata (Lina si colab., [23]). In Statele Unite ale Americii, prevalenta inalta a tulpinilor CA-MRSA, PVL-pozitive este în principal responsabila pentru infecțiile necrozante, în timp ce în Europa majoritatea cazurilor de pneumonie necrozanta sunt cauzate de tulpinile SASM, PVL-pozitive ce sunt mai virulente decat clonele CA-MRSA, PVL-pozitive (Sicot si colab., [88]).

In Romania, un studiu si o comunicare au prezentat rapoarte de caz cu sepsis fatal datorat clonei CA-MRSA, PVL-pozitive, tip spa t044 (Szekely si colab., [89], Alexandrescu si colab., [90]).

Cu toate acestea, se cunosc puține lucruri despre situația din Romania. In studiile recente din Romania procentele de SARM în spitale sunt foarte mari, variind de la aproximativ 30% până la 85%, în timp ce, de asemenea, tulpinile CA-MRSA au fost identificate (Coman si colab., [91], Grigore si colab., [92], Dorneanu si colab., [93], Szekely si colab., [94], Dorobăț si colab., [95], Ionescu si colab., [59], Kock si colab., [52], Năstase si colab., [83], Nica si colab., [96], Vremera si colab., [86], Ionescu si colab., [97]).

Studiul prezentat a aratat o prevalenta a tulpinilor SARM, in mediul de spital, de ……, iar in comunitate de ……. Tipul spa prevalent in mediul de spital a fost …., iar in comunitate ……..

The previous administration of linezolid is known to be associated with the development of resistance in CoNS. There are also reports of infection or colonization by linezolid-resistant CoNS in patients with no previous exposure to the antibiotic (B.A. POTOSKI & al. [16]) and of environmental contamination with methicillin-resistant staphylococci with reduced susceptibility to glycopeptides (F. PERDELLI & al. [55]). Many studies show that tigecycline, as compared to vancomycin and linezolid, is safer and more effective in hospitalized patients with serious infections caused by MRSA (I. FLORESCU & al. [56]), (C.A. KREIS & al. [57]). Moreover, tigecycline resistance was rare in isolates causing clinically significant infections (A.N. DABUL & I.L. CAMARGO [58]), (R. HOPE & al. [59]).

In Romania, reports on antimicrobials consumption indicated that some of antimicrobials reserved for hospital use, linezolid included can be purchased from community pharmacies [60]. This could represent a premise of eroding linezolid efficiency on Gram-positive cocci (enterococci, staphylococci), which is even more unwanted as linezolid is considered the ultimate solution for vancomycin resistant enterococci. In 2013, the incidence of Enterococcus faecalis strains with reduced susceptibility to linezolid was as high as 8.2%, which is the highest in Europe [POPESCU G. – UNPUBLISHED DATA].

Additionally, linezolid was recently officialy included in the WHO 5th category of drugs recommended for the therapy of XDR Mycobacterium tuberculosis, which could have a significant impact in a country with high prevalence of tuberculosis (TB) like Romania (CH. LANGE & al. [61]).

On the other hand, transmission of resistance genes and/or resistant strains have to be taken into consideration. Sorlozano et al. (A. SORLOZANO & al. [26]) firstly reported G2603T mutation in the domain V region of 23S rRNA gene of S. hominis strains isolated in 2010 from infections evolving in an ICU in Granada, Spain, but on our knowledge, no other reporting in Europe of this mutation in S. hominis was registered until now. However, many groups of researchers, from Brasil (N. LINCOPAN & al. [25]), (R.C. CHAMON & al. [54]), (T.A. CIDRAL & al. [62]) and the other from China (W. ZHOU & al. [10]) reported this mutation in S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis and S. capitis, respectively.

In our case, the source remained unknown, despite of the isolation of this linezolid-resistant CoNS, because the hospital did not implement screening but for Staphylococcus aureus. Moreover, irrespective of the fact that we have no data to support the S. hominis strain involvement in sepsis, as it was isolated from a single bloodculture, previously mentioned propensity towards genetic transfer of resistance makes public health impact significant.

Nowadays, linezolid-resistant Staphylococcus is still sporadic. The prolonged hospital stay, especially in ICUs, frequent interventions, the adequate or inadequate use of antibiotics and the difficulty in detecting certain resistance phenotypes/ genotypes may accelerate the dissemination of linezolid resistant Staphylococcus. To preserve the therapeutic efficacy of this reserve antimicrobial for a longer period of time, rational use of linezolid and surveillance of resistance in staphylococci using the most rapid and sensitive methods are recommended.

2.5. Concluzii

Tulpinile izolate din mediul de spital de la UMA si UMC (n = 50) au fost pozitive pentru gena nuc.

Prevalenta tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/ F a fost de 26% (13/ 50).

Prevalenta tulpinilor de S. aureus izolate de DSP Prahova (focar TIA) pozitive pentru ambele gene seA si seD a fost de 55.07% (38/ 69); pentru gena seA, de 10.14% (7/ 69); pentru gena seB, de 1.45% (1/ 69); pentru gena seC, de 2.90% (2/ 69); pentru gena seD, de 1.45% (1/ 69).

Prevalenta tulpinilor de S. aureus izolate de DSP Iasi (focar TIA) pozitive pentru ambele gene seA si seD a fost de 33.33%.

Tulpinile izolate din comunitate de la UMD si UME au fost pozitive pentru gena nuc.

Prevalenta tulpinilor de S. aureus pozitive pentru genele lukS/F a fost de 29.58% (21/ 71); pentru gena tst1 a fost de 8.45% (6/ 71); pentru gena seA a fost de 4.23% (3/ 71); pentru gena seB a fost de 1.41% (1/ 71); pentru gena seC a fost de 9.86% (7/ 71).

Prevalenta rezistentei la penicilina a tulpinilor izolate din mediul de spital a fost de 97.56% (80/ 82).

Prevalenta tulpinilor SARM a fost de 84.15% (69/ 82).

Prevalenta rezistentei la E a fost de 81.71% (67/ 82). La 55 izolate (67.07%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 86.59% (71/ 82), la CN, de 60.98% (50/ 82), la TOB, de 60.98% (50/ 82), la CIP, de 1.22% (1/ 82), la TE, de 64.63% (53/ 82), iar 1 tulpina (1.22%) a fost intermediara la TE. Prevalenta rezistentei la C a fost de 1.22% (1/ 82), la QD, de 67.07% (55/ 82), fiind raportate rezistente in corelatie cu fenotipul MLSBi. Toate tulpinile de S. aureus izolate din mediul de spital au fost sensibile la RD, SXT, VA, LZD.

Prevalenta rezistentei la penicilina a tulpinilor izolate din comunitate a fost de 94.37% (67/ 71).

Prevalenta tulpinilor SARM a fost de 42.25% (30/ 71).

Prevalenta rezistentei la E a fost de 49.30% (35/ 71). 4 tulpini au fost intermediare la DA, iar la 30 izolate (42.25%) de S. aureus am identificat fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta rezistenței la K a fost de 50.70% (36/ 71), la CN, de 5.63% (4/ 71), la TOB, de 7.04% (5/ 71), la CIP, de 5.63% (4/ 71), la TE, de 42.25% (30/ 71), iar 2 tulpini (2.82%) au fost intermediare la TE. Prevalenta rezistentei la RD a fost de 1.41% (1/ 71), 9 tulpini fiind intermediare. Prevalenta rezistentei la QD a fost de 42.25% (30/ 71), 3 tulpini fiind intermediare, iar la FD a fost de 11.27% (8/ 71). Prevalenta rezistentei la C a fost de 4.76% (2/ 42), iar la NOR de 6.90% (2/ 29). Toate tulpinile de S. aureus izolate din comunitate au fost sensibile la SXT, VA, LZD, MUP.

48 de tulpini izolate din mediul de spital (de la UMA si UMC) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ.

39 de tulpini rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (16 tulpini) si IVE (23 tulpini).

Tulpinile rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, un izolat a fost pozitiv pentru gena ermA, iar o tulpina rezistenta numai la E a fost pozitiva pentru gena ermC.

Tulpinile rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar cele rezistente si intermediare la TE au fost pozitive pentru gena tetK.

67 de tulpini izolate din comunitate (de la UMD si UME) rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ.

30 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (9 tulpini) si IVE (20 tulpini). O tulpina nu a putut fi incadrata in nici un tip SCCmec. Toate tulpinile rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC. Tulpinile rezistente fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK, iar o tulpina a fost pozitiva pentru gena tetM. Tulpinile intermediare la TE au fost negative pentru genele tetK si tetM. Doua tulpini rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar alte doua tulpini rezistente au fost negative.

50 tulpini de S. aureus izolate de la UMA si UMC au fost incadrate in urmatoarele tipuri spa: a prevalat t127 (48%, 24/ 50), urmat de t008 (24%, 12/ 50), t002 (6%, 3/ 50), t015 (6%, 3/ 50), t616 (4%, 2/ 50) si alte 6 tipuri spa cu 2% (1 tulpina din fiecare): t056, t279, t330, t620, t1556 si un tip spa nou t13462, introdus pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer.

71 tulpini de S. aureus izolate de la UMD si UME s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa: a prevalat t127 (36.62%, 26/ 71), urmat de t044 (7.04%, 5/ 71), t005 (4.23%, 3/ 71), t008 (4.23%, 3/ 71), t284 (4.23%, 3/ 71), t019 (2.82%, 2/ 71), t021 (2.82%, 2/ 71), t2881 (2.82%, 2/ 71) si alte 25 tipuri spa cu 1.41% (1 tulpina din fiecare): t002, t012, t015, t053, t084, t091, t174, t223, t280, t355, t435, t437, t559, t582, t620, t701, t728, t948, t1211, t1889, t5841, t7585 si trei tipuri spa noi t14512, t14513, t15296 introduse pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer.

O tulpina izolata de la UME a prezentat o mutatie punctiforma la nivelul semnaturii 3’ schimband astfel structura initiala 3’TAYATGTCGT in 3’TAYATATCGT.

Cea mai prevalenta clona de S. aureus izolata din mediul de spital a fost t127, iar din comunitate t127. Studiile anterioare au aratat o posibila legatura intre tulpinile t127 izolate de la om si animal, iar acest lucru sprijina dezvoltarea, in viitor, a numeroase studii prin utilizarea unei abordari integrate, anume ‘’o singura sanatate’’. Studiul nostru a aratat ca S. aureus t127 din comunitate a fost implicat in numeroase focare intraspitalicesti, in ultimii ani.

Genele responsabile pentru producerea PVL au fost detectate la tulpinile cu tipurile spa t008 si t044, dar si la urmatoarele tipuri spa: t019, t127, t284, t355, t435, t437, t1211, t1889, t5841, t14513.

Detectarea genelor pentru PVL, TSST si SEs ale tulpinilor S. aureus prin utilizarea metodelor moleculare si testarea sensibilitatii la antibiotice a aratat diferente intre tulpinile izolate din mediul de spital si din comunitate.

Detectarea genelor de virulenta si rezistenta la antibiotice poate sprijini o supraveghere sporită și intervenții în domeniul sănătății publice, cu scopul de a preveni diseminarea clonelor implicate în pneumonie necrozanta, in infecții supurative, complicate de piele, in soc toxico-septic si in toxiinfectii alimentare atat in comunitate, cat si in mediul de spital.

Supravegherea sistematica a tulpinilor de S. aureus izolate din mediu de spital si din comunitate este necesară și ar trebui să se facă în mod regulat pentru un tratament adecvat, împreună cu măsurile concepute pentru a limita diseminarea lor, incluzand o abordare integrată, anume ’’o singura sănătate’’.

Rezultatele studiului nostru au confirmat faptul că izolarea tulpinilor de S. aureus/ SARM ramane o constrângere de sanatate publica de prima urgenta.

4. Conclusions

This is the first case of linezolid-resistant bacteria received and confirmed by the Reference Laboratory for Nosocomial Infections and Antimicrobial Resistance in Romania.

The rapid identification, the prevention of dissemination along with rational use of antibiotics are important bundles contributing together in preventing the selection of drug-resistant pathogens.

As far as we know, this is the first report of a linezolid-resistant strain of staphylococci in Romania and the second report of G2603T mutation in the domain V region of 23S rRNA gene of S. hominis in Europe.

2.6. Bibliografie

2.7. Anexe

Anexa 1

Prevalenta S. aureus la pacienti cu infectii ale pielii si tesuturilor moi: un studiu pilot European multi-centric

Criterii de includere

Toti pacientii (adulti si copii) care se prezinta in urgenta cu leziuni purulente ale pielii si tesuturilor moi (furuncul, abces, celulita, celulita necrotizanta, panaritiu, limfagita etc) cu durata de mai putin de o saptamana.

Definitii (del Giudice et al. Dermatology 2011; 222:167-170; Tomas et al. Acta Radiol Short Rep. Feb 2014; 3(2): 2047981614523172)

Furuncul: Foliculita cu aspect de inflamatie papulonodulara, cu diametrul mai mic de 2 cm

Abces: Masa inflamatorie de peste 2 cm in diametru care necesita interventie chirurgicala cu drenaj al colectiei purulente

Celulita: Placa inflamatorie tratata cu success, exclusive cu antibiotic

Celulita necrotizanta: Placa inflamatorie care necesita atat terapie cu antibiotic, cat si interventie chirurgicala

Panaritiu: Reactie inflamatorie implicand structurile cutanate din jurul unghiei

Limfagita: Inflamatie a vaselor limfatice prin infectia tesuturilor

Identificarea pacientului

Factori de risc

Parametri clinici

Terapia cu antibiotice

Sensibilitatea la antibiotic (laborator)

Anexa 2

2.8. Lista lucrărilor publicate/ prezentate la conferințe, publicate din teza de doctorat

Articole științifice

Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Codiță I., Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from a familial foodborne outbreak. Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2013, 72(3): 210 – 217.

Drăgulescu E.-C., Coldea I.L., Lixandru B.-E., Codiță I., Compararea sensibilității a două metode utilizate pentru detectarea directă în lapte a S. aureus posibil producător de enterotoxină B. Bacteriologia Parazitologia Imunologia Epidemiologia, 2013, 58(1-2): 7-12.

Drăgulescu E.C., Codiță I., HOST – PATHOGEN INTERACTION IN INFECTIONS DUE TO STAPHYLOCOCCUS AUREUS. STAPHYLOCOCCUS AUREUS VIRULENCE FACTORS, Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2015, 74(1-2): 46-64.

Coldea I.L., Zota L., Dragomirescu C.C., Lixandru E.B., Drăgulescu E.C., Sorokin M., Codiță I., Staphylococcus aureus harbouring egc cluster coding for non-classical enterotoxins, involved in a food poisoning outbreak, Romania, 2012/ Staphylococcus aureus purtător de gene codante pentru enterotoxine non-clasice (cluster egc), implicat într-un focar de toxiinfecție alimentară, România, 2012, Revista Română de Medicină de Laborator, 2015, 23(3): 285-294 (FI 0,171).

Cotar A.I., Zaharia A., Drăgulescu E.C., Pistol A., Popovici F., Codiță I., The Role of Molecular Typing Methods in the Outbreak Investigation of a Possible Staphylococcal Food Poisoning, Romanian Biotechnological Letters, 2016, 21(2): 11404-11412 (FI 0.404).

Comunicări și postere

Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Irimia M., Trifan A., Dobrescu A., Duca E., Codiță I., Pulsotipuri și toxinotipuri de Staphylococcus aureus izolate din toxiinfecție alimentară în anul 2011, lucrare prezentată la Congresul Național de Microbiologie, Conferința Națională de Epidemiologie, 10 – 12 noiembrie 2011, Iași, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 56, supliment 2011, pag. 70 – poster.

Codiță I., Drăgulescu E-C., Dinu S., Lixandru B-E., Șerban R.I. t127 spa type MDR MRSA strains isolated in 2010/2011 from pediatric and new born units in Bucharest, lucrare prezentată la 7th Conference of the Romanian Association of Medical Laboratories with international participation, 10 – 12th May 2012, Brașov, România, iar rezumatul este publicat în Revista Română de Medicină de Laborator (Romanian Review of Laboratory Medicine), vol. 21, no. 2/4, May 2011 – comunicare orală.

Codiță I., Drăgulescu E.-C. Tipizarea Casetei Cromozomale mec stafilococice – evoluții recente și necesități de armonizare, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 28 – referat.

Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Coldea I.L., Dinu S., Codiță I. Identificarea unei clone bacteriene endemice de S. aureus circulante într-o secție de nou născuți utilizând metode de tipizare moleculară, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 33 – comunicare orală.

Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Mihăescu G., Codiță I., Inducerea rezistenței la telitromicină de către eritromicină la izolate de Staphylococcus spp. rezistente la macrolide, lucrare prezentată la Conferința Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 8-10 noiembrie 2012, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 57, Nr. 3-4, iulie-decembrie 2012, pag. 52 – comunicare orală.

Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Negut M., Codiță I. „Reacții multiplex PCR pentru detectarea enterotoxinelor stafilococice și a proteinelor enterotoxin-like”, 2nd Congress of the Romanian Association of Medical Laboratories with international participation, 5-8 Iunie 2013, Brașov, România – poster.

Coldea I.L., Lixandru B.-E., Drăgulescu E.-C., Niculita D., Codita I. Focare de toxiinfecții alimentare stafilococice analizate prin metode de tipizare moleculară și determinarea profilului toxic, lucrare prezentată la A VI-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 14-16 noiembrie 2013, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 58, iulie-decembrie (3-4)/ 2013, pag. 71 – poster.

Drăgulescu E.-C., Coldea I.L., Lixandru B.-E., Zorescu C., Șerban R., Codiță I., Contaminare încrucișată cu tulpini de Staphylococcus aureus t008 PVL pozitive, t127 și t015, într-o secție de nou-născuți din România, 2013, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 43 – comunicare orală.

Coldea I.L., Drăgulescu E.-C., Lixandru B.-E., Dragomirescu C.C., Neguț M., Codiță I., Rezistența la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus asociate focarelor de toxiinfecții alimentare izolate în perioada 2009-2013 în România, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 51 – comunicare orală.

Cotar A.I., Zaharia A., Pistol A., Popovici F., Drăgulescu E.-C., Codiță I., Un posibil focar de toxiinfecție alimentară într-un restaurant din București, 26 iulie 2014, lucrare prezentată la A VII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 13-15 noiembrie 2014, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 59, iulie-decembrie (3-4)/ 2014, pag. 51 – comunicare orală.

Codiță I., Drăgulescu C.-E., Usein C.-R., Coldea I.-L., Lixandru B.-E., Dinu S., Buzea M., Zorescu C., Șerban R.I. HOSPITAL ACQUIRED INFECTIONS OUTBREAKS CAUSED BY HAND HYGIENE NEGLECTED PITFALLS. the 9th Balkan Congress of Microbiology (Microbiologia Balkanica 2015), 22-24 October 2015, Thessaloniki, Greece – poster.

Cotar A.I., Zaharia A., Drăgulescu E.C., Pistol A., Popovici F., Codiță I. Investigation of a possible outbreak of staphylococcal food poisoning, Bucharest 2014. Lucrare acceptată la European Scientific Conference on Applied Infectious Disease Epidemiology (ESCAIDE), 11-13 November 2015, Stockholm, Sweden – Abstract ID: 2997 – poster.

Drăgulescu E.C., Buzea M., Lixandru B.E., Ionescu G., Codiță I. Sensibilitatea la antibiotice a unor tulpini de Staphylococcus aureus izolate din infecții comunitare cutanate și ale părților moi, lucrare prezentată la A VIII-a Conferință Națională de Microbiologie și Epidemiologie, 12-14 noiembrie 2015, București, România, iar rezumatul este publicat în Revista Bacteriologia, Virusologia, Parazitologia, Epidemiologia, vol. 60, iulie-decembrie (3-4)/ 2015, pag. 68 – poster.

Drăgulescu E.C., Lixandru B.E., Codiță I., Markeri de patogenitate la tulpini de Staphylococcus aureus izolate din infecții de piele și țesuturi moi, lucrare prezentata la Prima Conferință Națională a Asociației de Medicină de Laborator din România cu participare internațională, 18-21 mai 2016, Cluj-Napoca, România, iar rezumatul este publicat în Revista Română de Medicină de Laborator (indexată ISI Thompson Reuters, cu factor de impact 0.143/ 2015), supliment la vol. 24(1), martie 2016, pag. S146 – S147 – poster.