Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România [311090]
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE
TEZĂ DE DOCTORAT
Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU
Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC
Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU
2016
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE
TEZĂ DE DOCTORAT
Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România
Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU
Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC
Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU
2016
Cuprins
Lista de abrevieri
Partea teoretică
Introducere
Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană
I.1 [anonimizat]
I.2. Factorii de virulență
I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă
I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice
I.4.1. Antibioticele β-lactamice și mecanismele de acțiune
I.4.1.1. Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze
I.4.1.2. Rezistența prin modificarea țintei (proteinele de legare a penicilinei – PBP)
I.4.1.3. Determinismul genetic al rezistenței la β-lactamice
I.4.1.4. Rezistența la meticilină
I.4.1.4.1. [anonimizat]
I.4.2. Rezistența la aminoglicozide
I.4.3. Macrolide, lincosamide, streptogramine B – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
I.4.4. Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. [anonimizat] – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România
2.1. Scopul și obiectivele lucrării
2.2. Materiale și metode
2.2.1. [anonimizat] A (SpA)
– [anonimizat] (PVL)
– Enterotoxine (A, B, C, D)
– Toxina sindromului de șoc toxic (TSST- 1)
2.2.2. [anonimizat]
– [anonimizat] (aacA) și de fosforilare (aphD)
– [anonimizat]
– Evidențierea genelor tetK și tetM
2.2.3. Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin pulse field gel electrophoresis (PFGE)
2.2.4. Tipizarea SCCmec
2.3. Rezultate
2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați
2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate
2.4. Discuții
2.5. Concluzii
2.6. Bibliografie
2.7. Anexe
2.8. Lista lucrărilor publicate/ [anonimizat]
S. aureus – [anonimizat] S. aureus (S. aureus rezistent la meticilina)
UMA – Unitatea Medicala A
UMB – Unitatea Medicala B
UMC – Unitatea Medicala C
UMD – Unitatea Medicala D
PCR – [anonimizat]-α – tumor necrosis factor – α
IL-6 – interleukina-6
IFN-γ – interferon γ
RCT – receptorul T celular
CMH I – complexul major de histocompatibilitate I
TSST-1 – toxina sindromului de șoc toxic 1
Th – limfocite T [anonimizat]-1 – interleukina 1
IL-2 – interleukina 2
MSCRAMMs – Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules
SCVs – ,,small colony variants’’
Partea teoretică
Introducere
Această lucrare își aduce contribuția la îmbogățirea cunoașterii tulpinilor de Staphylococcus (S.) aureus izolate de pe teritoriul României. S. aureus este un patogen oportunist implicat în diverse infecții localizate la nivelul pielii sau în infecții sistemice, invazive, grave ce duc la complicatii la persoanele imunocompromise si cu factori de risc ce predispun la infectii serioase cu S. aureus. Prin acumularea de noi elemente genetice mobile (profagi, plasmide, insule de patogenitate, transpozoni) ce poarta atat gene de virulenta, cat si de rezistenta la antimicrobiene (antibiotice) se arata, inca o data, importanta caracterizarii și cunoasterii acestora. Inainte de era antibioticelor, izolarea tulpinilor sensibile era o dovada în plus ca nu exista o presiune selectiva asupra celulelor bacteriene. Odată cu descoperirea acestora și introducerea lor în practica medicala, bacteriile și-au creat condiții favorabile de lupta și apărare împotriva acestora prin captarea elementelor genetice mobile, dar si prin mutatii la nivelul unor gene tinta. Acest lucru a condus la schimbarea profilului cromosomal si extra cromosomal creand astfel bacterii multirezistente si virulente numite ''superbug''. S. aureus rezistent la meticilina (MRSA) este rezistent la mai multe clase de antibiotice utilizate pentru tratarea lor facand astfel ca infectiile comune să fie dificil de tratat.
Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană
I.1 Staphylococcus aureus – caracterizare generală
Staphylococcus a fost pentru prima data identificat in anul 1880, in Aberdeen, Scotia, de catre chirurgul scotian Sir Alexander Ogston in puroiul recoltat dintr-un abces de la nivelul articulatiei genunchiului (Ogston, 1984). In mod sistematic el a vazut la microscop, in preparatele realizate din puroiul pacientilor cu plagi postoperatorii supurate si abcese, bacterii in clustere sub forma de ciorchine, pe care mai tarziu le-a numit Staphylococcus de la expresia din limba greaca ,,staphyle,, care inseamna ciorchine de strugure (Ogston, 1882). In 1884, Friedrich Julius Rosenbach a fost capabil sa izoleze si sa dezvolte aceste bacterii din abcese si le-a numit Staphylococcus aureus (S. aureus) datorita pigmentului galben-portocaliu sau auriu aparut la nivelul coloniilor, ,,aureus,, insemnand auriu in limba Latina (Rosenbach, 1884).
S. aureus este un coc Gram pozitiv, ubiquitar, comensal. Depinzand de tipul de tulpina, S. aureus poate supravietui de la cateva ore la cateva saptamani sau chiar luni pe suprafete de mediu uscat (Cimolai, 2008). Acest microorganism are capacitatea de a se adapta foarte usor diferitelor conditii de mediu ca urmare a noii structuri, a proprietatiilor metabolice acumulate prin modificari genetice si continua sa fie o sursa inepuizabila de surprize. Aceasta capacitate poate explica de ce S. aureus reprezinta cauza primara a infectiei la om si la animal (Cole si colab., 2001; Fluit, 2012; Hasman si colab., 2010), fiind principala cauza de bacteriemie, de infectie a plagilor chirurgicale, dar si a materialelor protetice.
Se estimeaza ca 20% din populatia umana este purtatoare de S. aureus pe termen lung (Kluytmans si colab., 1997) si poate fi intalnit in microbiota tegumentelor si a mucoaselor, cu precadere in nazofaringele purtatorilor sanatosi (Buiuc si Negut, 2008; Kluytmans si colab., 1997; Cole si colab., 2001). La om, epiteliul scuamos al foselor nazale reprezinta habitatul primar (Peacock si colab., 2001). Se estimeaza ca 60% sunt purtatori tranzitorii, iar 20% nu poarta acest microorganism niciodata (Foster, 2004). Omul si animalul reprezinta rezervorul natural de S. aureus. Există, de asemenea, o prevalență în creștere a purtatorilor gastrointestinali de S. aureus, in special la copii, probabil legata de schimbarea stilului de viață (de transport gastrointestinal al S. aureus, mai ales la sugari) (Lindberg si colab., 2011).
S. aureus este capabil sa produca o gama larga de factori de virulenta necesari pentru supravietuirea si initierea unei infectii, incepand cu cele superficiale ale pielii pana la infectii grave, mai ales la persoanele imunocompromise, ca de exemplu sindromul de soc toxic, sindromul pielii oparite, fasciita necrozanta, abcese, keratite, impetigo, pneumonie necrozanta, osteomielite, endocardite, septicemie, infectii asociate cu implantarea dispozitivelor medicale etc (Kobayashi si DeLeo, 2009; Bose si colab., 2014; Harris si colab., 2002). Este responsabil pentru costuri foarte mari in asistenta medicala, in fiecare an in Statele Unite, in Europa si peste tot in lume (Gould si colab., 2010; Chen si colab., 2013).
Introducerea in practica medicala a antibioticelor pentru tratarea infectiilor produse de S. aureus a condus la selectarea celor mai rezistente clone prin acumularea de elemente genetice mobile purtatoare de gene de rezistenta, cat si prin aparitia unor mutatii punctiforme la nivelul genelor tinta. Tulpinile de S. aureus rezistente la antibioticele beta-lactamice, denumite tulpini de S. aureus rezistente la meticilina (MRSA) au fost recunoscute din 1960 pana in anii 1990 ca patogeni asociati ingrijirilor medicale. Tulpinile MRSA asociate comunitatii au aparut mai tarziu, in anul 1990 (Gordon si Lowy, 2008). In prezent MRSA este considerat cel mai comun patogen bacterian izolat in multe parti ale lumii si este impartit in doua categorii: MRSA asociat spitalelor (HA-MRSA) si MRSA asociat comunitatii (CA-MRSA) (Grundmann si colab., 2010), in acord cu sursa si caile de transmitere. MRSA a devenit o problema importanta de sanatate publica cu numeroase consecinte economice globale (Goetghebeur si colab., 2007). In ultimii ani, MRSA a atins un nivel epidemic (Ma si colab., 2012), atat in comunitate, cat si in mediul spitalicesc.
În prezent, cel puțin 25000 de oameni mor anual în Europa datorită infecțiilor produse de doar cinci tipuri de microorganisme rezistente la antibiotice, printre care: S. aureus rezistent la meticilină (MRSA), S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA) sau S. aureus rezistent la linezolid (ECDC/EMEA 2009, http://ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/Pages/index.aspx). In randul celor mai frecvente cauze de producere a infectiilor nosocomiale (infectii intraspitalicesti) ocupa locul doi. Atunci cand contamineaza produsele alimentare bogate in lipide si proteine, enterotoxinele produse de S. aureus reprezinta cauza importanta de aparitie a toxiinfectiilor alimentare.
Caracteristici de cultivare si identificare
Genul Staphylococcus cuprinde specia S. aureus si face parte din Familia Micrococcaceae. Este un coc Gram-pozitiv, cu diametru de 0,5 – 1,5 micrometri, aerob, facultativ anaerob. Pe frotiu colorat Gram apar de culoare violet si sub forma de ciorchine (Figura 1.).
Figura 1. Frotiu colorat Gram (imagine originala)
Se dezvolta cu usurinta, in 18-24h de la insamantare, pe medii nutritive simple, in mediul aerob. Temperatura optima de crestere este de 37 ± 2ș C, la pH optim de 7,5, dar sunt tolerate variatii mari. Coloniile, dupa 24h de incubare, pe mediu solid au aspect S (smooth), cremoase, rotunde, cu diametrul de 2-3 mm, marginea regulata, suprafata neteda, bombata si lucioasa (Figura 2.).
Figura 2. Colonii de S. aureus pe mediu agar Columbia (Oxoid) cu 7% sange defibrinat de berbec cu hemoliza incompleta de tip α (imagine originala)
Mediile lichide se tulbura omogen, cu depozit granular in partea inferioara a tubului. Pe agar Columbia cu 5-8% sange defibrinat de berbec sau de bou, tulpinile de S. aureus produc o zona circulara de hemoliza in jurul coloniei. Hemoliza totala (beta) cu clarificarea completa a mediului este produsa de hemolizina α a S. aureus (Figura 3.).
Figura 3. Colonii de S. aureus pe mediu agar Columbia (Oxoid) cu 7 % sange defibrinat de berbec cu hemoliza totala de tip β (imagine originala)
Coloniile de S. aureus produc un pigment carotenoid, portocaliu sau galben citrin.
Identificarea fenotipica a tulpinilor de S. aureus se face astfel:
– pentru a diferentia genurile din familia Micrococcaceae de genurile din familia Streptococcaceae se iau in considerare urmatoarele: aspectul microscopic, morfologia coloniilor pe mediul cu agar, testul catalazei (Figura 4.).
Figura 4. Testul catalazei cu ajutorul peroxidului de hidrogen 3% (imagine originala)
– pentru a diferentia genul Staphylococcus de genul Micrococcus: in prezenta eritromicinei se face testul producerii de acid din glucoza in aerobioza, testul sensibilitatii la nitrofurantoin/ furazolidon (diametrul zonei de inhibitie > 15 mm) pe mediul Mueller Hinton agar (Figura 5.), testul modificat pentru oxidaza, testul sensibilitatii la bacitracina;
Figura 5. Testul la furazolidon (F, 100, Oxoid); A – tulpina rezistenta din genul Micrococcus, B – tulpina sensibila din genul Staphylococcus (imagine originala)
– diferentierea S. aureus de celelalte specii de Staphylococcus se face prin: caractere de cultivare, testul coagulazei legate prin reactia de latex-aglutinare pe lama (Figura 6.) si testul coagulazei libere cu ajutorul plasmei de iepure (Figura 7.) (Buiuc si Negut, 2008).
Figura 6. Testul coagulazei legate (test rapid de latex-aglutinare) cu ajutorul reactivului Staphytect (Oxoid). 1 – reactie de aglutinare pozitiva; 2 – reactie de aglutinare negativa (imagine originala)
Figura 7. Testul coagulazei libere cu ajutorul plasmei de iepure (BioRad). Tubul nr. 1 – reactie negativa, tubul nr. 2 – reactie pozitiva (formarea retelei de fibrina) (imagine originala)
I.2. Factorii de virulență
Bacteriile patogene au doua proprietati definitorii: patogenitatea si virulenta. Patogenitatea defineste capacitatea potentiala a unui microorganism de a initia un proces infectios, decelabil din punct de vedere clinic, dar nu o face decat daca este suficient de virulent pentru a depasi barierele de aparare a organismului si a patrunde in tesuturi. Virulenta este capacitatea unei tulpini a unui microorganism patogen aflat intr-o anumita faza de crestere, de a se localiza (a coloniza), de a se multiplica si eventual de a invada celulele si tesuturile gazdei si/sau de a produce toxine, determinand o stare patologica la o gazda receptiva. Pentru a intelege cum reuseste S. aureus sa colonizeze gazda, sa patrunda prin tegument, mucoase si tesuturi lezate, sa disemineze in organism in ciuda mecanismelor de aparare proprii organismului prin sistemul imunitar celular/ umoral si cum se explica diversitatea clinica a afectiunilor determinate de S. aureus, este important de cunoscut structura acestei bacterii si modul de actiune. Patogenitatea determina capacitatea unei bacterii de a genera fenomene inflamatorii, modificari locale si generale, cat si incapacitatea functionala a segmentului colonizat. Este o caracteristica determinata genetic. Virulenta este un atribut care determina gradul diferit de patogenitate al diferitelor tulpini bacteriene. S. aureus isi exercita patogenitatea atat prin structura sa, cat si printr-o multitudine de proteine/ enzime pe care le produce, iar determinantii genetici se afla atat pe cromosomul bacterian, cat si pe elemente genetice mobile (profagi, plasmide, transpozoni, insule de patogenitate etc.). Diferitele combinații ale factorilor de virulenta, interacțiunea cu situsul de infecție și variabilitatea răspunsului imun al gazdei explica o gamă largă de rezultate legate de aceste infecții. Este bine cunoscut faptul că un singur factor de virulenta nu este suficient pentru a provoca o infecție stafilococică (Fournier si Philpott, 2005). Acționând ca un comensal oportunist, bacteria poate avea un impact imperceptibil asupra sănătății sau poate sa produca infecții locale moderate, dar și infecții severe, invazive (Lowy, 1998). Initial, cercetatorii s-au concentrat pe rolul factorilor de virulenta ai suprafetei celulare si mai ales asupra capsulei. Mai tarziu au inceput sa recunoasca importanta globala a exoproteinelor stafilococice si anume a enzimelor citolitice si superantigenelor, in initierea si progresul infectiilor prin distrugerea directa a tegumentelor, mucoaselor si tesuturilor.
Pentru tratarea infectiilor cu S. aureus, antibioticele alese, β-lactamicele pentru S. aureus sensibil la meticilina (MSSA) si vancomicina pentru MRSA, distrug acest microorganism prin liza peretelui celular sau prin inhibarea biosintezei peretelui celular. Aceste antibiotice nu au capacitatea de a inhiba producerea exoproteinelor de catre S. aureus sau sa neutralizeze efectele toxinelor acumulate deja in celulele gazdei. Antibioticele β-lactamice pot activa producerea de enzime citolitice si de alte exoproteine de virulenta atunci cand sunt utilizate necorespunzator pentru tratarea infectiilor produse de S. aureus, respectiv de MRSA (Lin si Peterson, 2010).
Factorii de virulenta pot fi atat structurali, cat si secretati. Au fost descoperiti in jur de 50 de factori de virulenta cu diferite activitati biologice (Cheung si colab., 2002). Unii dintre acestia actioneaza ca superantigene. Sinteza acestora poate fi asociata cu fazele de crestere, astfel ca majoritatea proteinelor asociate peretelui celular sunt sintetizate in faza exponentiala logaritmica, iar exo-enzimele sunt sintetizate in faza post-exponentiala. Enterotoxina A si coagulaza sunt sintetizate in faza de crestere exponentiala (Nienaber si colab., 2011). Acest lucru are importanta clinica.
Principalii factori de virulenta sunt:
Peretele celular la S. aureus este gros fiind alcatuit din 3 straturi: capsula polizaharidica, peptidoglicanul sau mureina (reprezinta 50% din greutatea celulei) si membrana citoplasmatica interna.
Capsula este foarte subtire (microcapsula) si este produsa de aproximativ 90% din izolatele clinice. Se poate vizualiza numai la microscopul electronic. Este alcatuita din acizi hexozoaminouronici. Pana in prezent au fost descrise 11 tipuri serologice. Tipurile 5 si 8 au fost intalnite la aproximativ 75% dintre tulpinile izolate de la om. Tipul 336 a fost intalnit mai rar si nu are o capsula propriu-zisa, prezentand doar polizaharidul 336. Acest tip este implicat in aproximativ 20% din infectii (O’Riordan si Lee, 2004). Tipul 5 este prezent la majoritatea tulpinilor de MRSA (Lowy, 1998; Lee, 1996). Functia de virulenta a capsulei este de a inhiba fagocitoza de catre neutrofile, dar si in mascarea adezinelor de suprafata ducand astfel la cresterea colonizarii bacteriene si a persistentei bacteriilor pe suprafata mucoaselor (O’Riordan si Lee, 2004).
Peptidoglicanul (mureina) (lat. murus = perete) este format prin alternarea subunitatiilor polizaharidice de N-acetilglucozamina si acid N-acetil muramic legate intre ele prin legaturi β-1, 4. Aceste lanturi sunt unite prin punti peptidice. Componenta peptidica este reprezentata de tetrapeptide cu structura L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala. Puntile peptidice ce apartin lanturilor de glican adiacente sunt legate printr-un pentapeptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Peptidoglicanul poate avea activitate endotoxica, stimuleaza descarcarea citokinelor de catre macrofage, activeaza sistemul complement si agregarea plachetelor sangvine. Diferentele din structura peptidoglicanului la diverse tulpini de S. aureus pot contribui la variatii in capacitatea lor de a cauza coagulare intravasculara diseminata (Kessler si colab., 1991). In peptidoglican sunt incorporate proteine si polizaharide. Polizaharidele caracteristice lui S. aureus sunt acizii teichoici (gr. teichos = perete). Pe langa acestia exista si acizi lipoteichoici care au un capat al lantului legat de un glicolipid din membrana plasmatica, iar celalalt expus la exterior (Lowy, 1998; Lazar, 2007; Weidemaier, 2004). Rolul acizilor teichoici este multiplu: confera peretelui celular rigiditate si virulenta ridicata, sunt implicati in transportul ionilor, sunt receptori pentru bacteriofagi, sunt implicati in diviziunea celulara, ajuta la identificarea prin tehnici imunologice, au rol important in atasare si colonizare (Lowy, 1998).
Proteinele de suprafata din structura peptidoglicanului pot fi legate covalent sau prin mecanisme alternative, de exemplu ionic. Acestea sunt foarte importante pentru potentialul patogen al S. aureus. Proteinele sunt legate de stratul mureinic cu ajutorul sortazelor A si B (Mazmanian si colab., 2001). Relevanța proteinelor de suprafata in timpul infecțiilor a fost demonstrată pe mai multe modele animale, comparând tipul sălbatic cu tulpinile fara sortaza A sau B. Absența acestor proteine provoacă o scadere dramatica a virulentei (Weiss si colab., 2004).
Membrana interna sau plasmatica este reprezentata de un strat dublu de fosfolipide, in care sunt inserate proteine. Are rol de bariera pentru majoritatea moleculelor si asigura transportul intra- si extracelular al diferitelor molecule. Proteinele din membrana pot interveni si in transportul unor molecule impotriva gradientului de concentratie (Lazar, 2007).
Coagulaza legata (factorul clumping – Clf) este o proteina de legare la fibrinogen. Mediaza atasarea bacteriei la tesuturile traumatizate si la coagulul sangvin. Este ancorata de peretele celular printr-un motiv LPXTG. Face parte din familia Sdr. Au fost descrise 2 tipuri: ClfA si ClfB, codificate de genele clfA si clfB. Gena clfA codifica un polipeptid de aproximativ 933 aminoacizi (aa), iar gena clfB un polipeptid de aproximativ 913 aa. ClfA se leaga la fibrinogen de lantul γ, iar ClfB de lantul α.
Proteinele de legare la fibronectina (FnBPA si FnBPB) codificate de 2 gene distincte fnbA si fnbB. Gena fnbA codifica o proteina de aproximativ 1018 aa, iar gena fnbB aproximativ 940 aa. Cele doua proteine sunt ancorate in peretele celular printr-un motiv LPXTG. FnBP sunt capabile sa activeze plachetele sangvine, adera la fibrinogen (numai FnBPA) si elastina, faciliteaza invazia in celulele endoteliale si epiteliale, promoveaza evitarea fagocitozei.
Proteina de legare a colagenului (Cna) este codificata de gena cna. Mediaza atasarea de fibrele de colagen de tip I si IV, ce sunt predominant intalnite in tesuturile conjunctive (Campoccia si colab., 2009; Patti si colab., 1993).
Proteina A descoperita in anul 1958 de Jensen (Jensen, 1958) ca prima proteina de suprafata a S. aureus. La inceput a fost privita doar ca proteina de legare la fragmentul Fc al imunoglobulinei G (IgG), iar mai tarziu a fost recunoscut rolul in aderenta si colonizare prin interactia cu factorul von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Face parte din familia Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules (MSCRAMMs), prezentand motivul LPXTG.
Este structurata pe 5 domenii extracelulare (E, D, A, B si C), regiunile Xr si Xc ce strabat peretele celular si un domeniu alcatuit din 18-20 reziduuri hidrofobe care traverseaza membrana plasmatica. Este codificata de gena spa (Harmsen si colab., 2003; Mellmann si colab., 2006). Pana in prezent au fost descoperite 15706 tipuri spa incarcate in baza internationala de date Ridom SpaServer (http://spa.ridom.de/index.shtml).
Proteina de legare a elastinei (EbpS) este codificata de gena ebpS ce produce un polipeptid de 23 kDa. Este o proteina ancorata in membrana plasmatica, nu prezinta secventa semnal si motiv LPXTG. Prezinta doua domenii transmembranare, capetele N si C terminale fiind expuse la suprafata bacteriei.
SraP (serine-rich adhesin for platelets) sau SasA este o glicoproteina de suprafata bogata in serina, de mari dimensiuni, atasata covalent de peretele celular. Se leaga de plachetele sangvine (Siboo si colab., 2005).
Proteinele Sdr – SdrC, SdrD si SdrE fac parte din familia Sdr. Proteinele SdrC si SdrD sunt implicate in colonizarea nazala prin atasarea la celulele epiteliale nazale. Proteina SdrD se leaga de glicoproteina desmoglein-1 (Askarian si colab., 2016), in timp ce proteina SdrC a fost identificata ca legandu-se de β-neurexina (Barbu si colab., 2010). O varianta a SdrD, numita Bsp este capabila sa lege sialoproteina din oase (Tung si colab., 2000).
Emp (extracellular matrix binding protein) codificata de gena emp este o proteina de 38,5 kDa care interactioneaza cu fibrinogenul, fibrina, vitronectina si colagenul. Este implicata in formarea biofilmului (Clarke si Foster, 2006; Johnson si colab., 2008).
Determinantii de suprafata reglati de fier (IsdA, IsdB, IsdC, IsdH). Aceste proteine sunt atasate covalent de peretele celular (prin motivul LPXTG). Se leaga de una sau mai multe proteine care contin fier, cum ar fi transferina, hemul, hemoglobina (Clarke si Foster, 2006; Visai si colab., 2009; Pilpa si colab., 2009). IsdB interactioneaza cu receptorul GPIIb/ IIIa al plachetelor sangvine (Miajlovic si colab., 2010).
Proteina de aderenta extracelulara (Eap – extracellular adherence protein) sau proteina analoga complexului major de histocompatibilitate II (Map – MHC analogous protein), codificata de gena eap, apartine familiei SERAM (Secreted Expanded Repertoir Adhesive Molecule). Legata necovalent de peretele celular, motivul LPXTG lipsind. Mai mult de 98% dintre tulpini produc aceasta proteina. Are rolul de a se atasa de un numar mare de liganzi avand afinitate pentru cel putin 7 proteine plasmatice, printre care fibrinogen, fibronectina, protrombina, factorul Von Willebrand, vitronectina, sialoproteine osoase si trombospondina (Palma si colab., 1999). Este cunoscut faptul că în timpul unei infectii cu S. aureus, proteina Eap poate servi la reducerea inflamației prin inhibarea adeziunii neutrofilelor și extravazare, afectând angiogeneza si vindecarea ranilor. Eap induce secreția de citokine pro-inflamatorii, printre care interleukina-6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală-α (TNF-α) de catre leucocitele CD14+. Este implicată în internalizarea în celulele gazdei, in aderenta celulelor de S. aureus la celulele gazdei si in formarea biofilmului (Palma si colab., 1999; Bjerketorp si colab., 2002; Harraghy si colab., 2003; Haggar si colab., 2003; Haggar si colab., 2004; Athanasopoulos si colab., 2006; Scriba si colab., 2008; Cheng si colab., 2009; Thompson si colab., 2010; Edwards si colab., 2012).
Alte proteine de suprafata sunt: Efb (extracellular fibrinogen binding protein) – o proteina bifunctionala, ce leaga specific fibrinogenul si proteina complement C3, blocheaza activarea plachetelor sangvine (Koch si colab., 2012; Peacock si colab., 2002; Sharp si colab., 2012) si este codificata de gena efb; Ebh (extracellular matrix-binding protein homologue) – proteina ce se leaga de matrixul extracelular al celulelor gazdei si de fibronectina (Clarke si colab., 2002); IsaB (proteina de legare la heparina) se leaga de ADN dublu catenar, ADN monocatenar si ARN (Mackey-Lawrence si colab., 2009); enolaza (proteina de legare la laminina) (Chavakis si colab., 2007); vWfP (proteina de legare la factorul von Willebrand) leaga si activeaza protrombina, leaga fibrinogenul si factorul von Willebrand (McAdow si colab., 2012); pls (plasmin sensitive surface protein) codificata de gena pls, reduce aderenta la fibronectina, fibrinogen, laminina si IgG, reduce invazia in celulele gazdei, se leaga de lipidele celulelor gazdei si este implicata in aderenta la celulele epiteliale nazale (Clarke si Foster, 2006); autolizina (Aaa) codificata de gena aaa, este localizata la suprafata celulei, are multiple functii si adera la fibrinogen, fibronectina, vitronectina (Heilmann si colab., 2005); autolizina majora stafilococica (Atl) codificata de gena atl este implicata in excretia proteinelor citoplasmatice si are rol esential ca proteina de legare a fibronectinei ce mediaza fenotipul cu biofilm al S. aureus. Un nou mecanism de internalizare stafilococica implica autolizina majora Atl si proteina inrudita de soc toxic Hsc70 ca receptor al celulei gazda (Houston si colab., 2011; Pasztor si colab., 2010; Hirschhausen si colab., 2010); proteina de legare a sialoproteinelor din oase (bone sialoprotein binding protein – Bbp codificata de gena bbp) o varianta a lui SdrE, se leaga de sialoproteina (Campoccia si colab., 2009) si fibrinogen (Vazquez si colab., 2011).
Arginine catabolic mobile elements (3 tipuri) (ACMEI/-II/-III) ajuta bacteria in colonizare, dar rolul sau ramane neclar. Acest element mobil cuprinde numeroase enzime si proteine (Thurlow si colab., 2012; Gordon si Lowy, 2008; Urushibara si colab., 2012).
Sbi (Second immunoglobulin-binding protein = S. aureus binding protein of IgG) este o proteina de 436 aa codificata de gena sbi. Poate sa formeze un complex cu fragmentul Fc al imunoglobulinelor G, utilizand doua domenii distincte (Zhang si colab., 1998). Se leaga de factorul H al sistemului complement si in combinatie cu proteinele C3, C3b sau C3d formeaza complexul tripartit Sbi:C3:Factor H (Haupt si colab., 2008; Smith si colab., 2012; Koch si colab., 2012). Factorul H este activ in acest complex inhiband activarea complementului. Aceasta proteina se gaseste extracelular, dar si ancorata de peretele celular prin intermediul acidului lipoteichoic (Smith si colab., 2012).
CHIPS (Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococci) este o proteina mica secretata de aproximativ 62% dintre izolatele de S. aureus. Se leaga specific de receptorii pentru C5a si de peptide formilate aflate pe neutrofile. Astfel recrutarea neutrofilelor la locul infectiei este blocata (DeLeo si colab., 2009; Postma si colab., 2004; Rooijakkers si colab., 2005).
SCIN (Staphylococcal Complement Inhibitor) este cel mai eficient inhibitor al sistemului complement, blocand toate cele 3 cai: clasica, alternativa si lectinica. Blocheaza producerea de C5a (Rooijakkers si colab., 2005).
Proteina Sok, codificata de gena sok, este o proteina de suprafata si are rolul de a permite supravietuirea bacteriei in fagocite (Malachowa si colab., 2011).
Proteina C de suprafata a S. aureus (SasC) codificata de gena sasC este implicata in agregarea celulelor, in acumularea biofilmului si se leaga de matricea extracelulara (Clarke si Foster, 2006; Chavakis si colab., 2007; Schroeder si colab., 2009).
Proteina G de suprafata a S. aureus (SasG) codificata de gena sasG este implicata in formarea biofilmului si se leaga de matricea extracelulara (Clarke si Foster, 2006; Geoghegan si colab., 2010).
Proteina extracelulara de legare a complementului (Ecb) codificata de gena ecb blocheaza proteinele complement C3 si C5, blocheaza chemotaxia si activarea complementului (Sharp si colab., 2012; Hammel si colab., 2007a, 2007b).
Un sistem secretor conservat tip VII, numit Ess, implicat in virulenta a fost descris la S. aureus (EsaA, EsaB, EsaC, EsaD, EssA, EssB, EssC, EssD, EsxA, EsxB) (Kneuper si colab., 2014).
Adezina intercelulara polizaharidica (polysaccharide intercellular adhesion – PIA) codificata de operonul ica (genele icaABDC), iar gena icaR este implicata in reglarea sintezei. Este o adezina pentru agregare, implicata in formarea biofilmului, in rezistenta la antibiotice si in rezistenta la sistemul imunitar (O’Gara, 2007).
S. aureus produce numeroase toxine cu activitate citolitica. Aceste toxine formeaza pori in membrana plasmatica, ducand la distrugerea celulei:
Alfa toxina (alfa hemolizina) este o toxina codificata de gena hla. Ataca plachetele sangvine si monocitele, ceea ce conduce la eliberarea citokinelor pro-inflamatorii si la declansarea cascadei coagularii. Capabila sa formeze pori la nivelul membranei celulei gazda. Determina formarea de canale transportoare de ioni, ce distrug integritatea membranei celulare. Rol important si in realizarea biofilmelor pe dispozitivele protetice (Caiazza si O’Toole, 2003).
Beta-toxina (beta hemolizina) este produsa de 10-20% dintre izolatele de S. aureus umane si de majoritatea izolatelor de origine animala. Gena hlb codifica o proteina de aproximativ 330 aa. Functioneaza ca o sfingomielinaza dependenta de ioni de magneziu, numita si sfingomielinaza C in functie de continutul in sfingomielina al membranelor celulelor tinta. Este cunoscuta sub denumirea de toxina ‘’cald-rece’’.
Gamma toxina (gamma hemolizina) este produsa de 99% dintre tulpinile de S. aureus. Locusul ‘’hlg’’ exprima 3 proteine codificate de trei gene hlgA, hlgB, hlgC. Sunt implicate in liza polimorfonuclearelor prin formarea porilor (Chavakis, 2007; Peacock si colab., 2002; Prevost si colab., 1995). Are rol de spalare a membranelor celulare. Este activa inclusiv impotriva eritrocitelor umane.
Delta toxina (delta hemolizina) este un peptid de 26 aa codificat de gena hld. Este produsa de aproximativ 97% dintre tulpini. Este rezistenta la temperaturi ridicate. Lizeaza eritrocitele prin crearea de pori, se leaga de neutrofile si monocite (Chavakis, 2007; Peacock si colab., 2002; Verdon si colab., 2009).
Leucocidina Panton-Valentine (PVL) este o proteina/ toxina formatoare de pori produsa de anumite tulpini de S. aureus. A fost descrisa pentru prima data de catre Van de Velde in anul 1894 (Van de Velde, 1894) si a fost asociata cu infectii de piele si tesuturi moi in 1932 de catre Panton si colab. (Panton si colab., 1932). PVL tinteste indeosebi leucocitele si macrofagele fiind formata din 2 unitati: componenta S si componenta F, transcrise separat. Are proprietati citolitice crescute, iar tandemul LukS-PV/ LukF-PV se intalneste in infectiile necrozante pulmonare si cutanate, in infectiile profunde si mai rar in bacteriemii (Cribier si colab., 1992; Lina si colab., 1999; Limbago si colab., 2009; Loffler si colab., 2010; Kreienbuehl si colab., 2011). Genele ce codifica aceasta toxina sunt localizate pe un bacteriofag ce se poate transfera de la o tulpina la alta. Este intalnit atat la tulpini MSSA, cat si MRSA din comunitate, ocazional din unitati medicale (Guidance on the diagnosis and management of PVL-associated Staphylococcus aureus infections (PVL-SA) in England. Report prepared by the PVL sub-group of the Steering Group on Healthcare Associated Infection; David si Daum, 2010). Cresterea morbidității și mortalității asociate cu tulpini MRSA, PVL pozitive reprezinta o problemă de sănătate publică la nivel mondial. PVL reprezinta un marker epidemiologic la tulpini de S. aureus comunitare. In Statele Unite ale Americii au fost descrise 2 clone MRSA foarte strans asociate cu focare comunitare de infectii de piele si tesuturi moi: USA400 (MW2, ST1) si USA300, frecvent cuprinzand genele pentru PVL (Maree si colab., 2007; Diep si colab., 2006; Diep si colab., 2008; Tenover si Goering, 2009).
Leucocidinele D, E si M (LukD, E, M codificate de genele lukD, lukE, lukM) sunt leukotoxine formatoare de pori, alcatuite din doua componente si lizeaza leucocitele (Chavakis si colab., 2007; DuMont si colab., 2011). Studiile recente au aratat rolul important al leucocidinei LukED in infectiile sangelui (Powers si Wardenburg, 2014). Leukotoxinele ED, MF-PV, leucocidinele A si B (nume alternative H si G/ lukAB/ lukHG) cauzeaza liza polimorfonuclearelor prin formarea de pori in membrana plasmatica (DuMont si colab., 2011; Gravet si colab., 1998; Herron-Olson si colab., 2007; Choorit si colab., 1995; Ventura si colab., 2010).
Toxine care lizeaza alte componente celulare:
Proteaze – un numar mare ce actioneaza asupra proteinelor celulei degradate cu scopul de a-si asigura nutrientii: serin proteaza A, endoproteaza V8 (SspA) codificata de gena sspA, promoveaza invazia prin degradarea proteinelor de legare a fibronectinei, determina activarea lui SspB si clivarea, dar nu inactivarea catelicidinei LL-37 (Nickerson si colab., 2007; Sieprawska-Lupa si colab., 2004); aureolizina – o metalo-proteaza codificata de gena aur, implicata in activarea SspA; doua cistein-proteaze – staphopaina A (ScpA) codificata de gena scpA determina degradarea colagenului si fibrinogenului si staphopaina B (SspB) codificata de gena sspB (Ohbayashi si colab., 2011; Shaw si colab., 2004; Imamura si colab., 2005); staphostatina B (SspC) codificata de gena sspC este un inhibitor a lui SspB (Rzychon si colab., 2003; Nickerson si colab., 2010); staphostatina A (ScpB) codificata de gena scpB este un inhibitor a lui ScpA, conferind protectie in timpul secretiei (Rzychon si colab., 2003; Nickerson si colab., 2010).
Dezoxiribonucleazele (DN-azele) sunt enzime care degradeaza ADN. S. aureus produce o DN-aza termostabila (termonucleaza) fiind codificata de gena nuc (Brakstad si colab., 1992; Mann si colab., 2009; Berends si colab., 2010). Rar se intalnesc tulpini cu un nou tip de nucleaza termostabila omologa (NucM) (Schaumburg si colab., 2014) sau tulpini defective de gena nuc (van Leeuwen si colab., 2008).
Stafilokinaza (Sak) codificata de gena sak, activeaza plasminogenul, care se transforma in plasmina. Plasmina are activitate fibrinolitica, degradand fibrina aflata in coagulul sangvin. Prin dizolvarea coagulului, infectia nu mai este limitata si astfel S. aureus invadeaza tesuturile sau poate sa patrunda in circulatia sangvina (Bokarewa si colab., 2006). Degradeaza IgG si componentele sistemului complement C3b si C3bi, inhiband fagocitoza. Se leaga de defensine, facandu-le ineficiente (Bokarewa si colab., 2006; Rooijakkers si colab., 2005).
Lipazele (lip) responsabile de hidroliza lipidelor sebacee, cu eliberarea acizilor grasi pe suprafata cutanata. Sunt importante pentru colonizare si persistenta (Kraus & Peschel, 2008). Sunt codificate de gena lip (geh, beh).
Catalaza (KatA) codificata de gena katA transforma peroxidul de hidrogen (H2O2) in apa si oxigen. Testul catalazei ajuta la diferentierea genului Staphylococcus de Streptococcus si Enterococcus (Buiuc si Negut, 2008). Este un factor de virulenta esential pentru supravietuirea, persistenta si colonizarea nazala (Cosgrove si colab., 2007).
Pigmentul carotenoid (stafiloxantina) codificat de gena crtOPQMN da culoarea caracteristica coloniilor de S. aureus, ofera protectie impotriva radicalilor reactivi de oxigen si permite supravietuirea bacteriei in interiorul fagocitelor (Chavakis si colab., 2007; Song si colab., 2009; Pelz si colab., 2005; Liu, 2005).
Coagulaza libera codificata de gena coa se leaga si activeaza protrombina, ceea ce duce la transformarea fibrinogenului solubil in fibrina insolubila. Astfel se formeaza o retea de fibrina ce mascheaza antigenele celulei bacteriene prevenind astfel recunoasterea ei (McAdow si colab., 2012; Peacock si colab., 2002).
Proteina de legare la factorul von Willebrand (vWbp) are activitate asemanatoare coagulazei libere si permite stafilococilor capturati in reteaua de fibrina sa disemineze in leziuni tromboembolice si sa reziste opsonofagocitozei (McAdow si colab., 2012).
Toxine implicate in toxinoze
Enterotoxinele stafilococice (SEs) sunt superantigene pirogenice – PTSAgs (pyrogenic toxin superantigens) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogenice, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic. Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a receptorului T celular (RCT). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor pro-inflamatorii, caracteristice pentru un răspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și interferon-γ (IFN-γ), mediatoare ale patofiziologiei, sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS). Enterotoxinele au activitate proteazică, sunt difuzibile și manifestă tropism față de mucoasa intestinală, fiind cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Până în prezent se cunosc cel puțin 24 tipuri serologice de enterotoxine (A-V) (Bergdoll si colab., 1967; Blaiotta, G. și colab., 2004). Genele sea-sev sunt localizate pe cromosomul bacterian și pe insule de patogenitate egc (enterotoxin gene cluster) sau pe elemente genetice mobile: fagi, transpozoni, plasmide. SEs sunt globuline cu greutate moleculară mică (26900-29600 kDa), prezentând o punte disulfidică esentială pentru exprimarea activitătii enterotoxice. Sunt solubile în apă și solutii cloruro-sodice. Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele complexului major de histocompatibilitate I (CMH I), își induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic; prezintă numeroase variante antigenice și sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, atunci când contaminează produse alimentare bogate în glucide și proteine (White si colab., 1989; Balaban si Rasooly, 2000; Dinges si colab., 2000). Enterotoxinele stafilococice SEA – SEE, SEG – SEI, SER – SET codificate de genele sea-e, seg-i, ser-set au demonstrat activitate emetica/ toxicitate gastroenterica si induc imunomodularea prin activitatea de superantigen (Peacock si colab., 2002; Blaiotta si colab., 2004). Proteinele stafilococice like (SEl) nu au activitate emetica in modelul animal (SElL si SelQ) si sunt codificate de genele selL, selQ sau urmeaza sa fie testate (SElJ, SElK, SElM – SElP, SElU, SElU2 si SelV) si sunt codificate de genele selJ, selK, selM – selP, selU, selU2 si selV (Argudin si colab., 2010).
Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) este un superantigen produs de aproximativ 5-25% dintre tulpinile de S. aureus avand o greutate moleculara de 22kDa (Dinges si colab., 2000). Toxina activează un număr mare de limfocite T helper (Th), se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate II (CMH II), fără a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de interleukina-2 (IL-2) și de interleukina-1 (IL-1) din macrofage. In general, toxina nu este produsa de catre tulpinile din sange si este produsa la locul infectiei trecand apoi in sange. TSST-1 este intalnita la tulpinile de S. aureus din vaginul femeilor aflate in perioada menstruala (100%) si nonmenstruala (50%) (Bergdoll si colab., 1981; McCormick si colab., 2012).
Toxinele exfoliative A, B, C si D (ETA, ETB, ETC, ETD) codificate de genele eta, etb, etc, etd sunt serin proteaze ce lizeaza specific domeniile extracelulare 3+4 ale glicoproteinei desmoglein-1 (DG-1) (codificata la om de gena DSG1) (in special ETB), ducand la formarea unor basici pe piele, fiind exotoxine cu activitate de superantigen (Peacock si colab., 2002; Ladhani, 2003; Kato si colab., 2011).
Peptidele PSM (PSMs) sunt toxine formatoare de pori sau au activitate de detergent (Perret si colab., 2012).
S. aureus produce adenozin sintaza A (AdsA) codificata de gena adsA pentru a scapa de fagocitoza (Thammavongsa si colab., 2009) prin scăderea atributelor citotoxice si a productiei de chemokine în neutrofile.
Multe studii s-au focusat pe enzima secretata numita hialuronidaza (HysA) codificata de gena hysA ce lizeaza acidul hialuronic, un component major al matrixului extracelular al tesuturilor umane. Aceasta enzima faciliteaza invazia bacteriei in tesuturi. Hialuronidaza la S. aureus este un factor de virulenta reglat de CodY (Ibberson si colab., 2014).
Proteinele Stafilococice Superantigen-Like (SSLs) codificate de genele ssl, se leaga la proteina C5 inhiband hemoliza mediata de complement (Langley si colab., 2005; Bestebroer si colab., 2010; Laursen si colab., 2010).
I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă
Infectiozitatea reprezinta capacitatea unui microorganism de a coloniza tesuturile sanatoase, de a se implanta, adica de a stabili o localizare, de a forma un focar primar de infectie si de a depasi mijloacele de aparare ale organismului gazda.
In acord cu doua categorii de mecanisme de patogenitate, S. aureus poate cauza doua tipuri majore de manifestari patologice: una de natura toxica (intoxicatii/ toxinoze), alta de natura invaziva (infectii).
Patogeneza intoxicatiilor stafilococice (toxinozelor) este directa si implica 4 etape:
Colonizarea cu o tulpina toxigena sau ingerarea de produse alimentare contaminate cu toxina stafilococica preformata (enterotoxine stafilococice cu activitate emetica);
Secretia de toxine;
Absorbtia toxinei de catre organismul gazda;
Intoxicatia.
In toxiinfectii alimentare are loc ingerarea de produse alimentare contaminate cu tulpini de S. aureus producatoare de enterotoxine si cu enterotoxine preformate (Washington si colab., 2006; Codita, 1985; 2009), iar aceste superantigene sunt capabile de a stimula mai mult de 10% dintre celulele T ale unei gazde umane. Datorita acestei stimulari intense, raspunsul imun este mult amplificat si neregulat, caracterizat prin eliberarea masiva de citokine, interleukine, factor de necroza tumorala (TNF) si interferon gamma (IFNγ). Enterotoxinele stafilococice stimuleaza in mod direct sistemul nervos vegetativ, iar pacientii cu toxiinfectii alimentare stafilococice prezinta crampe abdominale, greata, varsaturi, urmate uneori de diaree (nu numai diaree). Majoritatea mecanismelor prin care aceste superantigene determina simptomatologia caracteristica toxiinfectiilor alimentare, sunt incomplet elucidate.
Sindromul pielii oparite apare atunci cand tulpina de S. aureus secreta toxine exfoliative (Bukowski si colab., 2010), ce duc la necroliza epidermei.
In caz de sindrom de soc toxic, tulpinile toxigene nu produc toxina in sange si numai la locul infectiei, patrunzand apoi in fluxul sangvin (Bergdoll si colab., 1981). Toxina sindromului de soc toxic (TSST) este cea mai frecvent implicata in sindromul de soc toxic, iar pe locul doi ca frecventa si virulenta se situeaza enterotoxina stafilococica. Perioada menstruala reprezinta cauza comuna pentru aparitia acestui sindrom. Leziunile tegumentare precum arsurile chimice, termice, leziunile produse prin intepatura de insecte sau cele provocate de varicela sau plagile chirurgicale se pot complica, daca acest sindrom se manifesta in afara perioadelor menstruale. Boala se poate manifesta, in anumite cazuri, abia dupa ore sau chiar saptamani, din momentul finalizarii interventiei chirurgicale. Pentru aparitia sindromului de soc toxic nu este obligatorie prezenta bacteriei S. aureus, simpla colonizare anterioara cu tulpini toxigene, poate fi suficienta, iar locul in care a fost produsa toxina sa fie aparent inofensiv. Acest sindrom se asociaza frecvent cu infectii musculo-scheletale, cu infectii respiratorii produse de S. aureus sau chiar cu bacteriemie stafilococica. Boala debuteaza brusc, cu febra accentuata, dureri abdominale, greata, varsaturi, dureri de gat si cefalee (dureri de cap), diaree, dureri musculare. Vertijul apare mai ales cand pacientul se afla in pozitie ortostatica (in picioare). Daca boala se manifesta in timpul perioadei menstruale, mucoasa vaginala va capata un aspect eritematos, iar in unele cazuri pot fi observate scurgeri vaginale purulente (Jarraud si colab., 2002; Cotar si colab., 2010; Kluytmans si colab., 1997; Peacock si colab., 2002). TSST este un superantigen ce stimuleaza activarea limfocitelor policlonale si eliberarea in cantitati mari de interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2) si TNF.
Patogeneza infectiilor cutanate stafilococice este mult mai complexa si implica prezenta unor etape mai discrete. Declansarea unei astfel de infectii presupune urmatoarele etape:
Colonizarea mucoaselor, epiteliilor sau endoteliilor;
Invazia organismului gazda prin depasirea barierelor epiteliale (invazia va fi favorizata atunci cand exista o leziune a epiteliului sau de prezenta orificiului unei glande sebacee, sudoripare sau a foliculului pilos);
Aderarea la nivelul matricei extracelulare dupa ce a depasit bariera epiteliala;
Evitarea si neutralizarea mecanismelor sistemului imunitar de aparare al gazdei prin diverse enzime;
Distrugerea tesuturilor invadate.
La gazda umana, habitatul primar pentru S. aureus este reprezentat de epiteliul foselor nazale anterioare (Peacock si colab., 2001), iar cinci proteine de suprafata ale bacteriei au fost descrise ca fiind implicate in acest proces: ClfB, IsdA, SdrC, SdrD si SasG. ClfB leaga citokeratina-10 de tip I si citokeratina-8, tot prin intermediul regiunii A, jucand un rol important in colonizarea nazala (O’Brien si colab., 2002; Walsh si colab., 2004; Haim si colab., 2010; Vannakambadi si colab., 2011). Persoanele colonizate la nivelul foselor nazale prezinta un risc ridicat de a se infecta cu acelasi tip de tulpina, asa cum persoanele care prezinta status imun deficitar, se colonizeaza frecvent cu S. aureus sugerand ca acesta impreuna cu superantigenele produse conduce la progresul catre diabetul de tip 2 (Vu si colab., 2015).
Stafilococii colonizeaza in mod normal tegumentele intacte (neavand capacitatea de a strabate o bariera epiteliala intacta) si mucoasele gazdei umane si nu numai. Colonizarea gazdei umane se poate realiza in mod intermitent sau persistent, depinzand de gradul de virulenta al tulpinii bacteriene, de factorii ce tin de gazda umana, dar si de competitia naturala cu flora non-stafilococica. Astfel, aproximativ 20-30% din populatia umana este colonizata permanent cu S. aureus (vanBelkum si colab., 2009), 60% este colonizata intermitent (Kluytmans si colab., 1997) si 20% nu este niciodata colonizata cu acest microorganism (Foster, 2004). Gazda umana reprezinta rezervorul natural de S. aureus.
Purtatorii permanenti, cronici provin din randul celor cu leziuni acute sau cronice care pot afecta integritatea tegumentara (solutii de continuitate = plagi) si cei expusi in mod repetat la infectii stafilococice. Cea mai frecventa colonizare se intalneste in randul cadrelor medicale de ingrijire, in randul pacientilor internati cu diferite afectiuni, a celor dializati, a celor diabetici, a celor care utilizeaza droguri injectabile sau in randul persoanelor cu afectiuni dermatologice cronicizate, ce prezinta frecvent leziuni ale tegumentelor si mucoaselor, cei cu onicomicoza cronica la nivelul mainilor si picioarelor, cei care au afectat chemotactismul leucocitar, cei ale caror fagocite au functia oxidativa alterata, cei protezati (prezenta corpurilor straine), cei care prezinta o alterare a functiei imunoglobulinelor sau a sistemului complement (pacientii infectati cu virusul HIV). Toate aceste categorii prezinta un risc deosebit de crescut de a dezvolta infectii cu S. aureus (Washington si colab., 2006; Laupland si colab., 2008).
Colonizarea cu S. aureus reprezinta un factor de risc, fiind un rezervor din care bacteria poate sa patrunda in organism atunci cand apararea gazdei este compromisa. S. aureus poate determina infectii de piele si tesuturi moi, de la forme usoare pana la a pune viata in pericol: pneumonie, endocardita, sindrom de soc toxic, sepsis etc (Kobayashi si DeLeo, 2009; Bose si colab., 2014; Harris si colab., 2002). Infectiile superficiale pot progresa in interiorul gazdei prin continuitate, limfatic, septicemic si bacteriemic ducand la infectii grave. De obicei se descriu infectiile grave fara a mentiona infectia superficiala initiala.
Epiteliul mucoasei nazofaringelui, epiteliul axilei, vaginului, perineului sau a tractului gastrointestinal, dar si tegumentul, de obicei unul lezat (o intepatura sau o plaga nonchirurgicala/ chirurgicala) sau anexele tegumentului: glande sebacee, sudoripare sau foliculul pilos reprezinta porti de intrare a S. aureus in organismul uman. Obiectele straine introduse in organism sunt usor colonizate cu stafilococi facand infectiile dificil de controlat si tratat din cauza heterogenitatii populationale, schimbarii fenotipice, diversitatii, hipermutabilitatii si celui mai important lucru, variantelor de colonii mici (,,small colony variants’’ – SCVs) (Melter si Radojevič, 2010; Proctor si colab., 2014; Johns si colab., 2015).
Prima etapa a colonizarii unui tesut este aderenta celulelor bacteriene la celulele sensibile ale gazdei si reprezinta o etapa cruciala avand un caracter de specificitate, in sensul ca epiteliile situate in diferite localizari anatomice leaga specii bacteriene diferite. Aderenta bacteriana este, de regula, functia adezinelor bacteriene, care se leaga de receptorii glicoproteici sau glicolipidici complementari de pe suprafata celulelor epiteliale sau endoteliale ale gazdei si este un fenomen complex, ce implica atat implantarea, cat si utilizarea substantelor nutritive disponibile in mediul gazdei.
De cele mai multe ori, la S. aureus se intalnesc mai multe adezine pentru acelasi ligand si liganzi care sunt recunoscuti de mai multe adezine. Unele adezine se intalnesc la majoritatea tulpinilor de S. aureus, indiferent de situsul de izolare, iar altele sunt strans legate de anumite afectiuni. Aderenta impiedica indepartarea bacteriilor prin: fluxul secretiilor, tuse, motilitatea cililor, peristaltismul intestinal. Astfel este initiata prima etapa a procesului infectios. Procesul infectios presupune multiplicarea bacteriei la situsul primar al infectiei, invazia si distrugerea tesuturilor gazdei, precum si dezvoltarea unui raspuns inflamator local sau general. Extinderea unei infectii depinde de numarul de celule bacteriene, de virulenta acestora, dar si de rezistenta sistemului imunitar al organismului gazda (Codita, 1993).
Diferitele etape ale unei infectii stafilococice cutanate necesita diferite paneluri de determinanti de virulenta. Astfel in etapa initiala, proteinele de suprafata ale bacteriei, ce leaga moleculele matricei extracelulare favorizeaza colonizarea tesuturilor gazdei, iar sinteza exoproteinelor bacteriene favorizeaza invazia tesuturilor adiacente.
Aderenta asigura colonizarea anumitor situsuri din organism, multiplicarea bacteriilor, sinteza toxinelor necesare invaziei tesuturilor si desfasurarea reactiei inflamatorii de aparare ca urmare a raspunsului imun prin imunitatea innascuta (nespecifica) si imunitatea dobandita (specifica), umorala si celulara din partea organismului gazda.
Bacteriile adera in special la epiteliile mucoaselor, dar si la epiteliile cheratinizate (keratinocite), la endotelii, la tesutul osos, la smaltul dentar etc.
Aderenta la celulele gazdei este directa (prin intermediul adezinelor specifice) sau indirecta (prin intermediul glicocalixului sau al moleculelor de matrice extracelulara de tipul fibronectinei sau al opsoninelor). Adezinele bacteriene confera specificitate tisulara desi exista agenti infectiosi ce pot coloniza diferite tesuturi, in functie de poarta de intrare in organismul gazda producand diferite tipuri de infectii. Structurile bacteriene de aderenta, anatomice sau moleculare sunt de cele mai multe ori adaptative. Ele dispar prin cultivarea succesiva ‘’in vitro’’. Tulpinile bacteriene de laborator sunt mai putin aderente la suport, comparativ cu tulpinile bacteriene izolate recent. Aderenta este conditionata de complementaritatea sarcinilor electrice ale celor doua suprafete. Cele mai multe bacterii au o sarcina neta negativa a suprafetei lor, dar au si zone limitate electropozitive, precum si molecule cu caracter hidrofob.
Au fost detectate numeroase proteine de suprafata ale S. aureus implicate in aderenta. S. aureus adera la colagen, fibrinogen, fibronectina, laminina, trombospondina, elastina, vitronectina, sialoproteina cu ajutorul proteinelor de suprafata precum factorul clumping, proteina de legare a fibronectinei, proteina de legare a colagenului si proteina A stabilindu-se astfel prima etapa a unei infectii. Interactioneaza cu alti liganzi extracelulari ai organismului gazda cum ar fi protrombina, factorul von Willebrand sau cu diversi receptori aflati pe celulele epiteliale/ endoteliale sau pe suprafata plachetelor sangvine ale organismului gazda (McCarthy si Lindsay, 2010).
Colagenul este cea mai abundenta glicoproteina care confera rezistenta si asigura integritatea structurala a tesuturilor. Se afla in piele, tendoane, ligamente, cartilaje, cornee, oase si vase sangvine. Pana in prezent s-au identificat 29 tipuri de colagen (Gordon si Hahn, 2010).
Fibrinogenul este o glicoproteina compusa din 6 lanturi polipeptidice (2 α, 2 β, 2 γ). Participa in procesul de coagulare, mediaza aderenta plachetelor sangvine si agregarea lor in tesutul traumatizat. Apoi este clivat de catre trombina, se formeaza fibrina ca si component major al coagulului sangvin.
Fibronectina este o glicoproteina dimerica. Se gaseste sub forma fibrilara in matricea extracelulara si sub forma solubila in fluidele corporale. Joaca un rol important in aderarea celulara, in crestere, diferentiere, cat si in procesul de vindecare a tesuturilor lezate. Fibronectina din matricea extracelulara se leaga de receptori numiti integrine. Se creaza astfel o punte intre proteinele de suprafata ale bacteriei si integrinele celulei organismului gazda. Majoritatea tulpinilor de S. aureus prezinta la suprafata proteine de legare a fibrinogenului si fibronectinei.
Vitronectina este o glicoproteina abundenta in ser si in matricea extracelulara. Intervine in aderenta si in coagulare.
Elastina este o componenta majora a matricei extracelulare. Joaca un rol important in mentinerea integritatii si functionarii tesuturilor care necesita extindere si deformare (ex. plamanii, pielea sau vasele sangvine). Este un apolimer de tropoelastina.
Protrombina si factorul von Willebrand sunt glicoproteine serice. Intervin in procesul de coagulare. Protrombina (factorul II al coagularii) este o serin proteaza care este clivata pentru a forma trombina. Factorul von Willebrand mediaza adeziunea plachetelor sangvine la tesutul lezat. Este produs constitutiv in endoteliu, megacariocite, tesut conectiv sub-endotelial.
Pe langa proteinele de suprafata implicate in aderenta, S. aureus este capabil de a produce o serie de substante nocive cu ajutorul carora distruge celulele gazdei, alterand mediul intern in beneficiul sau. Produce coagulaza – ce leaga protrombina si transforma fibrinogenul in fibrina, favorizand instalarea patogenului in tesuturi, astfel protejandu-l de sistemul imunitar si de antibiotice. S. aureus este capabil de a secreta lipaze ce-i asigura supravietuirea in regiunile sebacee ale organismului gazda. Tot S. aureus produce hialuronidaza ce actioneaza prin hidrolizarea acidului hialuronic, usurand diseminarea in matricea extracelulara. Sunt enzime care actioneaza asupra acizilor grasi, avand capacitatea de a inactiva lipidele distruse de catre aceste bacterii si se acumuleaza in timpul constituirii abceselor. Alte substante enzimatice extracelulare, cu diverse roluri in patogeneza infectiilor stafilococice sunt: stafilokinaza, termonucleaza, proteaza serica. S. aureus poate sintetiza si elibera numeroase toxine membranar active, ce contribuie la afectarea si distrugerea celulelor gazdei umane: hemolizine (alfa, beta si gamma), dar si toxine sinergohimenotropice. Toxinele sinergohimenotropice au fost descoperite si investigate avand doua componente, fiind sintetizate si secretate separat. Au afinitate crescuta pentru membranele celulare si impreuna (sinergic) sunt activate pentru a actiona asupra acestor membrane. Aceste toxine au capacitatea de a forma pori la nivelul celulelor tinta, fiind activate mai ales impotriva celulelor polimorfonucleare (PMN), monocitelor si macrofagelor. Pot produce necroza dermului fiind asociate in special cu furunculoza umana.
Pentru a produce infectia, S. aureus trebuie sa fie capabil sa contracareze raspunsul imun innascut si dobandit al organismului gazda. Prima linie de aparare a organismului in infectia cu S. aureus o reprezinta mediatorii sistemului imun innascut, nespecific (neutrofile, monocite, macrofage, celule epiteliale, endoteliale si plachete sangvine), anume producerea si secretia unei game largi de citokine si chemokine, activarea celulelor inflamatorii si initierea raspunsului imun adaptativ, dobandit. Fagocitoza si degradarea patogenului se va realiza de catre leucocite, iar moleculele rezultate din degradarea patogenului vor fi prezentate limfocitelor T si B pentru declansarea raspunsului imun adaptativ. Raspunsul sistemului imun adaptativ, specific (limfocite T si B, celule NK, celule LAK, astrocite, celule dendritice, celule Langerhans) apare in cateva zile de la expunerea antigenica prin producerea de anticorpi de catre limfocitele B (Kraus si Peschel, 2008).
Sistemul imun innascut are rolul de a recunoaste un numar mare de patogeni, iar acestia au capacitatea de a suferi mutatii si de a-si modifica expresia fenotipica a factorilor de virulenta. In acest sens, gazda a dezvoltat diferiti receptori care au abilitatea de a detecta diferite motive bacteriene, in general conservate (Aderem si Ulevitch, 2000; Janeway, 1992). Aceste motive bacteriene poarta numele de ‚’motive moleculare asociate patogenului’’ sau PAMPs = Pathogen Associated Molecular Patterns. S. aureus prezinta la suprafata celulei numeroase proteine care mediaza atasarea bacteriei la tesuturile epiteliale si endoteliale ale organismului gazda. Majoritatea fac parte din subfamilia de adezine MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognising Adhesive Matrix Molecules), iar proteinele asociate peretelui celular si cele secretate pot actiona ca PAMPs, de exemplu peptidoglicanul si acidul lipoteichoic (LTA) exercitand astfel un rol inflamator, in timpul infectiei locale sau in sepsis. Proteinele asociate peretelui celular sunt atasate covalent de acesta printr-un motiv LPXTG. Acest motiv structural este tinta sortazei, o transpeptidaza ancorata membranei, codificata de genele srtA sau B (Mazmanian si colab., 2001; Weiss si colab., 2004). Aceasta enzima cliveaza legatura peptidica intre treonina (T) si glicina (G), apoi ancoreaza covalent proteina la peptidoglican (Perry si colab., 2002). Mai multi factori ai gazdei au fost implicati in detectarea innascuta a componentelor stafilococice. In categoria PAMPs intra peptidoglicanul, LTA, acizii teichoici si alanilarea acestora (Fournier si Philpott, 2005) si impreuna cu modulina solubila in fenol (PSM = phenol-soluble modulin) produsa de tulpinile CA-MRSA ce actioneaza asupra leucocitelor sunt recunoscuti fie de catre receptorii Toll-like (TLR) – structuri ce apartin claselor denumite host Pattern Recognition Receptors (PRRs) functionand ca receptor semnal transmembranar – sau de catre receptorii NOD-like (nucleotide-binding oligomerization domain-like). Au fost identificati 10 receptori omologi numiti receptori TLR (TLR2 + TLR1; TLR2 + TLR6; TLR2 + ?; TLR3; TLR4; TLR5; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10) si leaga diverse lipoproteine bacteriene, acid teichoic si lipoteichoic, porine bacteriene, ARNdc, proteine de soc termic, ADNdc bacterian. TLR2 este o proteina transmembranara, cu un domeniu extracelular, un domeniu transmembranar si un domeniu intracelular avand un rol esential in recunoasterea peptidoglicanului, acizilor teichoici si LTA ai S. aureus. TLR2 este exprimat, de asemenea, pe suprafata diferitelor celule implicate in raspunsul inflamator (monocite/ macrofage, neutrofile, celule dendritice, astrocite). Calea de semnalizare TLR2 este implicata in recunoasterea patogenilor extracelulari. LTA reprezinta principala molecula macro-amfifila a S. aureus fiind compusa din aproximativ 25 unitati de poli (1-3) glicerol fosfat legate de un diacidglicerol lipid. LTA provoaca secretia de citokine si chemoatractanti: TNF-α, interleukina-1β (IL-1β), interleukina-8 (IL-8), interleukina-10 (IL-10), interleukina-12 (IL-12), leucotriena B4, proteina C5a, MCP-1 (monocite chemotactic protein), MIP-1α (macrophage inflamatory protein) si CSF-G (factorul stimulant al coloniilor granulocitare) din monocite si macrofage, declansand astfel un raspuns inflamator. Peptidoglicanul este cel mai conservat component al peretelui celular si stimuleaza producerea de citokine pro-inflamatorii si de chemokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) de catre monocite si macrofage (Heumann si colab., 1994; Mattson si colab., 1993). Desi este recunoscut faptul ca poate fi ligand al TLR2, acest aspect ramane in continuare neclar (Fournier, 2013). Acizii teichoici alanilati cresc producerea de TNF-α si MIP-2. Studii recente arata ca acizii teichoici alanilati nu se leaga efectiv de TLR2, ci faciliteaza legarea lipoproteinelor de receptor (Shiratsuchi si colab., 2010). TLR2 coopereaza cu TLR1 si/ sau TLR6 pentru a recunoaste un spectru larg de motive bacteriene si pentru stimularea producerii de citokine. TLR6 este necesar pentru recunoasterea LTA de catre TLR2, insa nu este absolut necesar pentru recunoasterea peptidoglicanului. TLR1 actioneaza sinergic cu TLR2 in recunoasterea LTA (Fournier si Philpott, 2005). TLR2 activeaza factorul nuclear de transcriptie NF-kB. Acesta controleaza expresia a numeroase citokine, chemokine si molecule co-stimulatoare necesare raspunsului imun. TLR2 va interactiona cu diversi adaptori: MyD88 – myeloid differentiation protein, TIRAP/ Mal – TIR-associated protein/ MyD88-associated ligand si Tollip – Toll-interacting protein.
TLR9 este un alt receptor TLR implicat in raspunsul inflamator fata de S. aureus. Se afla in compartimentul intracelular endosomal fiind receptorul cheie pentru ADN bacterian. Activarea TLR9 necesita proteina adaptor MyD88, ducand la activarea factorului NF-kB ceea ce stimuleaza eliberarea de TNF-α, IL-8, IL-12 (Dalpke si colab., 2006).
Receptorii Toll-like activati declanseaza sinteza citokinelor pro-inflamatorii ca de exemplu interleukina-1α (IL-1α), IL-1β, TNFα si IL-6, chemokine (ex. neutrofilele atrag chemokinele) si peptidele antimicrobiene de catre keratinocite si monocite/ macrofage. Proteina A stafilococica este capabila sa interactioneze direct cu receptorul 1 al factorului de necroza tumorala (TNF1), în timp ce proteina L de recunoastere a peptidoglicanului este o amidaza capabila sa inactiveze activitatea pro-inflamatorie a peptidoglicanului (Fournier si Philpott, 2005). Producerea citokinelor, chemokinelor si a altor substante biologic active promoveaza recrutarea neutrofilelor si a altor celule ale sistemului imunitar la locul infectiei. Neutrofilele folosesc numeroase mecanisme de distrugere a celulelor de S. aureus, dependente fie de complement sau de anticorpi in faza adaptativa a imunitatii antibacteriene. Dupa inglobarea si formarea fagosomului, distrugerea bacteriana este stimulata de spargerea oxidativa, generand astfel specii reactive de oxigen si acid hipocloric care poate actiona atat direct sau prin inducerea unei sarcini în membrana fagocitara, stimuland astfel distrugerea enzimatică a bacteriilor. In interiorul fagosomului se gasesc peptide antimicrobiene, precum catelicidina LL-37, lizozim, azurocidin si α-defensine, ce au activitate directa bacteriostatica sau bactericida asupra S. aureus si, de asemenea, numeroase proteinaze, ca de exemplu catepsina G, elastaze, gelatinaze, colagenaze si proteinaza 3 (PR3), precum si hidrolaze acide, ce ajuta la degradarea proteinelor si a componentelor bacteriene de S. aureus. Mai mult decât atât, neutrofilele conțin factori care sechestrează nutrienți esențiali pentru a inhiba dezvoltarea bacteriilor și supraviețuirea lor, cum ar fi lactoferina, care sechestreaza fierul și cupru, transcobalamina II, care se leagă la și sechestreaza vitamina B12 și gelatinaza neutrofilului asociată lipocalinului (NGAL), care se leagă la sideroforii bacterieni și previne ca bacteriile sa extraga fierul. In final, neutrofilele elibereaza peptidele antimicrobiene, proteazele si alte substante implicate in degradarea patogenului.
Dupa recunoasterea PAMPs, PRRs declanseaza producerea mediatorilor pro-inflamatori precum citokine, chemokine si peptide antimicrobiene pentru a initia raspunsuri imune cutanate înnăscute precoce. Aceste raspunsuri includ activarea celulelor endoteliale si promoveaza recrutarea celulelor imune din circulatia sangvina a pielii. In epiderm sunt celule dendritice numite celule Langerhans, iar in derm sunt celule dendritice, macrofage, mastocite, celule T si B, celule plasmatice si celule NK. Fiecare din aceste tipuri de celule poate participa in raspunsurile imune cutanate, inclusiv in apararea gazdei impotriva patogenilor si in diferite boli imune localizate la nivelul pielii, cum ar fi dermatita de contact alergica, dermatita atopică și psoriazisul (Kupper si Fuhlbrigge, 2004; Nestle si colab., 2009). S. aureus secreta o serie de substante care vor atrage leucocitele polimorfonucleare catre locul invaziei bacteriene (chemotactism pozitiv). Alte substante secretate de S. aureus au rolul de a stimula producerea de citokine, care vor recruta celulele fagocitare catre zona invadata.
Pielea reprezinta o bariera fizica si imunologica importanta alcatuita din epiderm cu cele 4 straturi: cornos, granulos, spinos si bazal; derm cu cele 2 straturi: dermul papilar si reticular.
Stratul cornos situat la exterior este alcatuit din keratinocite diferentiate terminal legate intre ele prin fibrile de keratina (Nestle si colab., 2009). Straturile granulos, spinos si bazal se leaga de stratul cornos si impreuna formeaza epidermul. Keratinocitele migreaza din stratul bazal spre stratul cornos de unde sunt indepartate. Acest strat cornos asigura bariera fizica a pielii si este alcatuit din keratinocite moarte ce nu contin organite celulare (Nestle si colab., 2009). Procesul de migrare are loc in mod constant, epidermul fiind astfel reinnoit continuu. Sub epiderm se afla straturile dermului, anume dermul papilar si reticular. Dermul este compus din fibre de colagen si elastina, dar si din anumite structuri ce strabat aceste straturi, precum foliculul pilos, glande sudoripare si sebacee (Krishna si Miller, 2012) (figura X).
Figura X. Arhitectura si raspunsurile imune ale pielii in infectiile cutanate cu S. aureus (imagine modificata dupa Lacey si colab., 2016)
Pielea este colonizata cu microbiomul normal, cu specii diferite dependente de locatie, dar si de alti factori precum temperatura, pH, umiditate, sebum, saruri si acizi grasi. Flora microbiana normala cuprinde diferite specii de stafilococi, propionibacteria, corynebacteria si fungi. Anumite microorganisme ce colonizeaza tegumentul, in particular S. aureus si streptococii β-hemolitici de grup A, dar si bacteriile Gram-negative, virusurile si fungii au potentialul de a produce infectii, mai ales atunci cand bariera pielii a fost distrusa (Moran si colab., 2013).
Infectiile cutanate
Sunt cauzate de invazia microbiana a straturilor pielii si a tesuturilor moi subiacente. Infectiile de piele si tesuturi moi au prezentari clinice, etiologie si severitate diferita. Infectiile apar acolo unde bariera tegumentara a fost distrusa, de catre o plaga nonchirurgicala sau chirurgicala. Totodata, infectiile pot aparea fara o leziune aparenta a barierei tegumentare, precum foliculita la nivelul foliculului pilos sau furuncule si carbuncule formate in pori. Afectarea straturilor profunde precum dermul si tesuturile subcutanate conduce la celulita (Ki si Rotstein, 2008), iar afectarea tesuturilor mai profunde, precum fibrele musculare conduce la fasciita. Infectiile de piele si tesuturi moi sunt cele mai comune si afecteaza toate grupele de varsta, iar anumite conditii precum trauma, imunosupresia, anumite conditii ale pielii, utilizarea drogurilor predispun un individ la acest tip de infectii. S. aureus este capabil de a produce infectii la nivelul tuturor straturilor pielii si in anumite cazuri poate sa produca focare la nivelul tegumentului mai multor indivizi. Acest lucru se intampla atunci cand exista un contact tegumentar strans, in grupuri precum prizonieri, atleti si soldati (Otto, 2010). Tulpinile CA-MRSA USA300 sunt cele mai comune cauze ale infectiilor cutanate, iar 97% din cazurile de infectii de piele si tesuturi moi cu MRSA sunt determinate de aceasta clona (Moran si colab., 2006). Multe infectii cutanate cu S. aureus sunt auto-limitante, dar cu toate acestea, infectiile cutanate complicate pot aparea si acest lucru duce la formarea unui abces de dimensiuni mari (Bae si colab., 2009). Abcesurile se pot forma in epiderm, in derm, in tesuturi subcutanate si contin patogenul, prevenind diseminarea infectiei catre tesuturile sanatoase adiacente (Kobayashi si colab., 2015). Cu toate că formarea de abcese face parte din mecanismul de apărare al organismului, acestea pot provoca patologii semnificative și pot duce la obstructii benigne sau maligne in tesuturi. Ele se pot rupe, eliberand bacterii in tesutul din jur producand inflamatii locale la locul abcesului si la umflarea dureroasa a locului infectiei (Men si colab., 2002). Un abces începe ca un răspuns inflamator acut localizat la nivelul bacteriilor invadatoare. Abcesul devine o colecție cu puroi compus din neutrofile vii și distruse, resturi de țesut distrus și bacterii vii închise într-o capsulă fibroasă (Kobayashi si colab., 2015). Infectiile de piele si tesuturi moi severe pot duce, de asemenea, la necrozarea tesuturilor adiacente.
Raspunsul imun al pielii in cazul infectiilor cutanate
Pielea are un sistem imunitar robust innascut si adaptativ pentru a combate infecția cu S. aureus în cazul în care bariera pielii este distrusa. In straturile pielii există mai multe celule ale sistemului imunitar si anume: in epiderm celule dendritice specializate cunoscute sub numele de celule Langerhans (Nestle si colab., 2009); in derm se afla celule dendritice, macrofage, mastocite, celule T si B, celule plasmatice și celule natural killer (NK), iar contribuția lor la răspunsul imun cutanat a fost prezentat in numeroase studii (Nestle si colab., 2009; Moran si colab., 2013; Ki si Rotstein, 2008; Moran si colab., 2006; Bae si colab., 2009; Kobayashi si colab., 2015; Men si colab., 2002; Kupper si Fuhlbrigge, 2004). Keratinocitele sunt foarte importante în raspunsul imun cutanat. Ele produc cantități mari de IL-1α, TNFα și peptide antimicrobiene, cum ar fi α-defensinele ca răspuns la diferiți stimuli, inclusiv la prezența bacteriilor (Kupper si Fuhlbrigge, 2004). Keratinocitele produc, de asemenea, un număr mare de chemokine și alte citokine imunoreglatoare ca răspuns la stimulare. Aceste produse la rândul lor activează celulele imune înnăscute aflate pe piele, regland astfel expresia altor mediatori inductibili si facilitand recrutarea celulelor imune aditionale din sange (Kupper si Fuhlbrigge, 2004). Keratinocitele recunosc prezența lui S. aureus folosind PRRs. TLR-2 de pe keratinocite recunosc motivele moleculare asociate patogenului (PAMPs), incluzand peptidoglicanul si lipopeptidele (Miller, 2008). Keratinocitele exprimă, de asemenea, receptorul IL-1 (IL-1R), care este activat de către ambele interleukine IL-1α și IL-1β (Miller si Cho, 2011). Cele doua semnale IL-1R si TLR-2 prin proteina 88 (MyD88) activeaza semnalul in aval, ceea ce induce factorul nuclear kB (NF-kB) si caile de semnalizare mitogen-activating protein kinase (MAPK), conducand la transcrierea genelor moleculelor pro-inflamatorii, precum TNFα si IL-6, ce recruteaza neutrofilele in timpul infectiilor de piele cu S. aureus (Von Bernuth si colab., 2008; Picard si colab., 2003). Un model de infecție a pielii folosind soareci cu deficit de MyD88 a demonstrat că acești șoareci au avut o capacitate redusă in recrutarea neutrofilelor și in producerea de citokine, ducând la creșterea susceptibilitatii la infecții. Un studiu suplimentar a identificat axa de semnalizare IL-1R-MyD88 ca fiind, în primul rând, importanta pentru recrutarea neutrofilelor și in protecția împotriva infectiilor de piele si tesuturi moi cu S. aureus (Miller si colab., 2006). Studiile clinice au evidențiat importanța axei IL-1-IL-17 în apărarea gazdei la nivel cutanat impotriva S. aureus (Miller si Cho, 2011). Pacientii cu deficienta a IL-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4), la care semnalul IL-1R si TLR este afectat si pacientii cu sindromul autozomal dominant hiper-IgE (AD-HIES) care au raspunsul IL-17 defectiv s-au dovedit ca sufera de infectii cutanate recurente cu S. aureus (Milner si colab., 2008; Von Bernuth si colab., 2008; Ku si colab., 2007). Functionarea IL-1 promoveaza producerea IL-17 si a catorva citokine de catre celulele Th17, dar si de catre subpopulatii de celule T γδ (Sutton si colab., 2009). Aceste celule producatoare de IL-17, cuprinzand atat celule Th17 si celule T γδ au un rol important in raspunsurile imune epiteliale. Prin producerea IL-17A si IL-17F, acestea induc expresia chemokinelor ce atrag neutrofilele si factorii granulopoietici care promoveaza recrutarea neutrofilului si formarea abcesului (Cua si Tato, 2010; Korn si colab., 2009; Cho si colab., 2010). IL-17 stimuleaza, de asemenea, keratinocitele sa produca peptide antimicrobiene (Liang si colab., 2006). Rolul raspunsului celulelor T in apararea imuna a gazdei in infectiile cutanate cu S. aureus este important, iar celulele T helper (Th) (celulele T CD4+), in special celulele Th1, Th2 si Th17 au fost implicate in patogeneza infectiilor de piele cu S. aureus. Celulele Th1 produc interferon γ (IFN-γ) si promoveaza raspunsurile imune mediate celular. Celulele Th2 produc interleukina 4 (IL-4), interleukina 13 (IL-13) si promoveaza raspunsurile imune mediate de anticorpi. Celulele Th17 produc interleukina 17 (IL-17: IL-17A si IL-17F), interleukina-21 (IL-21), interleukina-22 (IL-22) si interleukina-26 (IL-26), importante in promovarea recrutarii neutrofilelor si in formarea abcesului (Krishna si Miller, 2012; Lacey si colab., 2016). IL-17 intervine in apararea impotriva colonizarii cu S. aureus (Ishigame si colab., 2009).
Mecanismele de aparare antiinfectioasa vor fi activate imediat ce bacteria a depasit bariera epiteliala si mucoasele, prin atragerea si recrutarea leucocitelor polimorfonucleare care au drept rol fagocitarea patogenilor. Pentru a se proteja bacteria va etala un invelis exterior de determinanti antigenici si va interfera cu functia opsoninelor omorand in mod direct fagocitele si elaborand un proces complex de supravietuire in interiorul acestora. Inflamatia reprezinta localizarea raspunsului inflamator al organismului gazda la infectia stafilococica, sub forma de furuncul cu puroi sau abces si se caracterizeaza prin cresterea temperaturii la nivelul situsului primar al infectiei, edem, durere, eritem local, acumularea puroiului si necroza tesuturilor. Se formeaza un cheag de fibrina, in care se afla leucocite si bacterii. Abcesul reprezinta locul de lupta intre bacterii si celulele sistemului imunitar al gazdei. Microorganismul altereaza functiile leucocitelor, prin realizarea unui mediu in care antibioticele au slaba penetranta, iar organismul gazda prin dezvoltarea abcesului, va limita diseminarea celulelor bacteriene. Zonele de necroza se datoreaza mai ales actiunii toxice a leucocidinelor stafilococice, in special a leucocidinei Panton-Valentine. Dupa cateva zile de la declansarea procesului inflamator, celulele fibroblastice, prin sinteza de colagen, vor forma o adevarata capsula in jurul zonei de necroza si abces. Peptidoglicanul de la nivelul peretelui celular activeaza in mod curent factorii sistemului complement, eveniment foarte important in cazul indivizilor care nu au anticorpi specifici, indreptati impotriva antigenelor de la suprafata celulei bacteriene stafilococice. Anticorpii care opsonizeaza bacteria (se ataseaza specific la nivelul capsulei bacteriene) mediaza fagocitoza. Exista cel putin doua tipuri de substante care modereaza opsonizarea: capsula polizaharidica si proteina A. Capsula polizaharidica interactioneaza cu factorii sistemului complement, iar proteina A poate lega specific fragmentul Fc a IgG (Jansson si colab., 1998), dar si fragmentul Fab al Ig (Jansson si colab., 1998; Inganas, 1981; Romagnani si colab., 1982). Astfel se dezvolta imunitatea mediata de anticorpi. Patogenii opsonizati sunt mult mai eficient recunoscuti si ingerati de catre leucocitele polimorfonucleare si macrofage, fiind mai apoi distrusi cu ajutorul reactiilor oxidative din interiorul fagosomului (vezicula cu ajutorul careia a fost internalizata bacteria si in care vor fi deversate enzimele lizozomale). Catalaza stafilococica joaca un rol important deoarece actioneaza pentru asigurarea supravietuirii patogenilor in mediul intracelular, prin transformarea peroxidului de hidrogen in oxigen si apa. Atunci cand S. aureus este captat de fagocitele atipice (fagocitele endoteliale si osteoblastii), cu ajutorul unor mecanisme specifice, poate supravietui in interiorul acestora. Pentru a supravietui in mediul intracelular, S. aureus poate utiliza si alte mecanisme de eludare a proceselor de aparare: generarea unor variante de colonii mici – celule cu crestere incetinita ce altereaza transportul de electroliti, producand in acelasi timp mici cantitati de toxina alfa, iar aceste celule au o rezistenta sporita fata de actiunea antibioticelor, fiind capabile de a supravietui intracelular pe o perioada mai lunga de timp. Reaparitia anumitor tulpini de S. aureus dupa ani de latenta, se pare ca s-ar datora tocmai persistentei acestor celule ce formeaza colonii mici, de exemplu in cazul osteomielitei cronice produsa de infectia cu S. aureus (Melter si Radojevič, 2010).
Calea de semnalizare Nod recunoaste patogenii intracelulari. S. aureus se poate internaliza si expune peptidoglicanul receptorilor Nod. Producerea de citokine printr-un mecanism independent de TLR este reglata de proteinele Nod1 si Nod2 (nucleotide-binding oligomerization domain proteins). Nod2 este exprimata de catre monocite si macrofage si recunoaste peptidoglicanul bacteriilor Gram-pozitive (Ogura si colab., 2001). Peptidoglicanul intact ajuns in spatiul intracelular, vine in contact cu lizozimul degradandu-l, iar produsii digestiei lizozomale vor activa proteinele Nod. Natura liganzilor ramane inca necunoscuta (Janaki si Coggeshall, 2011).
Receptorul TNFR1 – tumor necrosis factor receptor 1 este receptorul pentru TNF-α. Proteina A, interactioneaza cu acest receptor si determina eliberarea de citokine. Se stimuleaza astfel activarea NF-kB, respectiv producerea de IL-8 si recrutarea de neutrofile la locul infectiei. Fiind larg exprimat in epiteliul pulmonar se considera ca proteina A ar fi implicata in patofiziologia pneumoniei cauzate de S. aureus prin activarea TNFR1 si recrutarea de polimorfonucleare producand un fenomen intens inflamator (Gomez si colab., 2004).
Cele mai importante componente ale S. aureus implicate in raspunsul inflamator sunt peptidoglicanul, acizii teichoici si lipoteichoici, dar si proteina A. Alte componente bacteriene implicate in raspunsul inflamator prin producerea de citokine sunt: alfa-toxina, o hemolizina extracelulara ce formeaza pori in membrana eritrocitelor si monocitelor; beta-hemolizina o sfingomielinaza ce lizeaza eritrocitele de oaie, dar nu si eritrocitele umane, monocitele umane, limfocitele sau fibroblastele si este intalnita de obicei la tulpinile de origine animala; peptidele formilate – formil-metionil peptide care sunt chemoatractanti pentru neutrofile si macrofage; modulina solubila in fenol (PSM) intalnita doar la CA-MRSA avand capacitatea de a stimula si atrage neutrofilele, via FPR2/ ALX (Periasamyet si colab., 2012; Rantenberg si colab., 2011). Alfa-toxina poate induce producerea de IL-1β, IL-6, IL-8, cantitati scazute de TNF-α si recrutarea neutrofilelor (Onogawa, 2002; Yarovinsky si colab., 2008), beta-hemolizina nu stimuleaza producerea de citokine, insa lizeaza celulele care contin acesti mediatori. Prin lizarea monocitelor se elibereaza IL-1β (Fournier si Philpott, 2005).
Mediatorii raspunsului imun innascut sunt: citokinele – proteine solubile: IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, TGF-α si chemokine de tip CXC si CC.
Moleculele sistemului complement
Desi, initial, sistemul complement a fost considerat un efector al raspunsului umoral el poate fi activat si in absenta anticorpilor fiind recunoscut ca parte a sistemului imun innascut. Sistemul complement este reprezentat de un numar mare de proteine plasmatice, care reactioneaza in cascada (Janeway si colab., 2001). Patogenii pot activa sistemul complement prin 3 cai distincte: clasica, alternativa si lectinica. Ele difera doar prin modul de activare, de moleculele care initiaza fiecare cale, dar in final se genereaza aceleasi molecule efectoare. S. aureus activeaza toate cele 3 cai ale sistemului complement (Giese, 1994; Hallett si Cooper, 1980; Takahashi si colab., 2005).
Alte molecule cu rol in medierea raspunsului imun innascut sunt proteinele de faza acuta – reactanti sintetizati in timpul raspunsului acut impotriva unor stimuli cum ar fi infectia, inflamatia sau distrugerea tisulara, actionand ca molecule anti-inflamatoare. In serul celor care prezinta infectie cu S. aureus au fost detectate concentratii crescute de amiloid seric A, haptoglobina, orosomucoid (alfa-1 glicoproteina acida), apolipoproteina H (ApoH); eicosanoizii – mediatori lipidici derivati din acidul arahidonic. In infectiile cu S. aureus au fost detectati urmatorii eicosanoizi: prostaglandina D2, E2, F2, leucotriena B4, C4, tromboxanul B2 (Chang si colab., 1992; Perez-Novo si colab., 2008; Sorrell si colab., 1989).
La cateva zile de la contactul cu agentul patogen se declanseaza raspunsul imun adaptativ fiind legat de celulele B (raspuns umoral) si celulele T (raspuns celular). Raspunsul imun mediat de celulele B asupra S. aureus implica producerea de anticorpi (imunoglobuline) directionati impotriva componentelor specific antigenice ale bacteriei S. aureus, ca si anticorpi impotriva toxinelor, ex. α-toxina, β si γ-hemolizinele, leucocidina Panton-Valentine si enterotoxine, impotriva factorilor de virulenta (aureolizina, IsdA si superantigene), impotriva proteinelor peretelui celular (ClfA/B si proteina de legare a fibronectinei), impotriva capsulei polizaharidice, acidului lipoteichoic si peptidoglicanului. Anticorpii contribuie la apararea impotriva patogenilor extracelulari in 3 feluri si anume:
se ataseaza de patogen pentru prevenirea aderarii acestuia de celulele epiteliale sau de matricea extracelulara a gazdei si pot neutraliza toxinele eliberate de catre patogen prin blocarea situsurilor de legare la receptorii gazdei (IgG si IgA au capacitate puternica de neutralizare),
au rolul de a opsoniza componente de pe suprafata patogenului, facilitand astfel fagocitoza, via receptorii pentru portiunea Fc a anticorpilor – IgG1 si IgG3 indeplinesc aceasta functie, insa in cazul S. aureus si IgA este un puternic factor de opsonizare (Gorter si colab., 1987),
atasarea IgM, IgG1 si IgG3 la suprafata patogenului va initia calea clasica de activare a complementului (Holtfreter si colab., 2010).
Mediatorii sistemului imun adaptativ sunt citokinele: IL-2, IL-4, IL-5, factorul de transformare β (TGF-β), IL-10, IL-13 si IFN-γ.
Mecanisme de contracarare a raspunsului imun al gazdei
Pentru a rezista in organism si a produce o boala, S. aureus produce numeroase proteine imunomodulatoare, care actioneaza pentru oprirea sau intarzierea efectelor raspunsului imun al gazdei.
Sistemul imunitar al organismului gazda poate fi evitat prin cateva mecanisme: inhibitia functiei fagocitelor, evitarea sistemului complement, evitarea efectului moleculelor antimicrobiene produse de celulele gazdei, evitarea atacului speciilor reactive de oxigen (Foster, 2005; Kraus si Peschel, 2008).
Factorii de virulenta implicati in atasare au rol important si in evitarea efectorilor sistemului imunitar. Exista factori de virulenta care utilizeaza mai multe mecanisme de contracarare a sistemului imunitar al gazdei, asa cum exista si mai multi factori de virulenta care tintesc acelasi component sau aceeasi activitate a sistemului imunitar (DeLeo si colab., 2009; Fedke si colab., 2004; Rooijakkers si colab., 2005).
Peptidele cationice antimicrobiene si enzimele bacteriolitice sunt molecule antimicrobiene. Defensinele, catelicidina LL-37 si peptidele antimicrobiene produse de plachetele sangvine reprezinta peptide cationice antimicrobiene. Lizozimul, lactoferina, catepsina G, mieloperoxidaza si fosfolipaza A2 (grup IIA), produse de leucocitele polimorfonucleare reprezinta enzimele bacteriolitice (Fedtke si colab., 2004).
Factorii de virulenta ai S. aureus care intervin pentru contracararea moleculelor antimicrobiene sunt:
Stafilokinaza (Sak) inhiba defensinele produse de neutrofile ce lizeaza peretele celular. Aureolizina (metaloproteaza) si proteaza V8 cliveaza catelicidina LL-37 fiind bactericida pentru S. aureus. S. aureus este rezistent la lizozim printr-o modificare chimica la nivelul peptidoglicanului blocand sinteza acestuia. S. aureus altereaza compozitia si incarcatura neta a componentelor peretelui celular, iar defensinele si alte molecule antimicrobiene lizeaza peretele celular.
I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice
I.4.1. Antibioticele beta-lactamice și mecanismele de acțiune
Înainte de anul 1940, infectiile cu S. aureus și în particular, septicemiile, conduceau la 80% din cazuri la decesul pacientului. Descoperirea penicilinei G și utilizarea sa începând cu anul 1940 a condus la modificarea pronosticului acestor infectii. Aceasta descoperire a fost insa de scurta durata, deoarece S. aureus a devenit rezistent la penicilina G prin producerea de penicilinaza. 80% dintre tulpinile de S. aureus erau rezistente la penicilina G. În anul 1960 a fost introdusa meticilina, o beta-lactamina (β-lactamina) rezistenta la acțiunea penicilinazelor. După anul 1961 au apărut primele tulpini rezistente la meticilina (Lowy, 2003).
Antibioticele β-lactamice contin in molecula lor un inel tetraatomic, in care un atom de N si o grupare carbonil formeaza o legatura amidica. Prezenta nucleului β-lactamic confera proprietati fizico-chimice si biologice specifice. Inelul tiazolidinic reprezinta cel de-al II-lea nucleu al structurii chimice a penicilinelor. Penicilinele reprezinta derivati ai acidului 6-aminopenicilanic.
Clasificarea antibioticelor β-lactamice
Familia antibioticelor β-lactamice cuprinde numeroase variante moleculare, penicilina fiind primul reprezentant. Se pot clasifica in 4 grupe:
Peniciline
Cefalosporine
Carbapeneme
Monobactami.
Dupa modul de obtinere se impart in:
Peniciline de biosinteza: penicilina G, V, N;
Peniciline de semisinteza: meticilina, oxacilina, ampicilina, amoxicilina;
Peniciline de sinteza chimica: peneme, carbapeneme.
Mecanisme de acțiune
Antibioticele β-lactamice inhiba ultima etapa a sintezei peptidoglicanilor (formarea puntilor interpeptidice). Diferitele enzime tinta ale antibioticelor sunt denumite PBP (engl. Penicillin Binding Protein). PBP sunt enzime care catalizeaza reactiile de legare incrucisata intre polimerii peptidoglicanului si au functii fiziologice de transpeptidaze, endopeptidaze si carboxipeptidaze. Antibioticele β-lactamice se fixeaza de proteinele de legare a penicilinei (PBP) modificand structura peptidoglicanului fragilizand astfel peretele bacterian. Apoi se poate observa o liza bacteriana. Aceasta activitate bactericida a β-lactaminelor este datorata incapacitatii peptidoglicanului alterat de a menține presiunea osmotica intracitoplasmatica. S. aureus cuprinde 5 PBP (Tabelul ….) (Reynolds, 1988; Komatsuzawa și colab., 1999).
Tabelul …..
PBP la S. aureus
Au fost descrise doua mecanisme:
1. un mecanism fizic de segregare a noului peptidoglican într-un singur și același plan.
2. implica autolizinele codificate de gena lyt.
I.4.1.1. Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze
Rezistența a fost mai puțin frecventă înainte de introducerea antibioticelor în practica clinică pentru tratarea infecțiilor. Datorită presiunii selective a antibioticelor, anumite tulpini au reușit să se dezvolte prin mecanisme de rezistență. Activitatea antibacteriană a fungului Penicillium notatum a fost observată (Fleming 1928) asupra unei culturi de S. aureus, ceea ce coincide cu descoperirea benzilpenicilinei. După introducerea benzilpenicilinei (penicilina G) în practica clinică, în anul 1942 a fost izolată prima tulpină de S. aureus rezistentă, mai intai in spitale si apoi in comunitate (Rammelkamp si Maxon, 1942), mediată de producerea de β-lactamază (penicilinaza). Până în 1950, 40% din totalul izolatelor au devenit rezistente la penicilină G, iar până în 1960, numărul acestora a crescut la mai mult de 80%, atat in mediul spitalicesc, cat si mediul comunitar. În prezent, majoritatea tulpinilor (98%) izolate din mediul spitalicesc și/ sau comunitar sunt rezistente la penicilină G prin producerea de penicilinaza. Kirby a demonstrat pentru prima data ca penicilina a fost inactivata de catre tulpinile de S. aureus rezistente la penicilina (Kirby, 1944). Bondi si Dietz (Bondi si Dietz, 1945) au identificat rolul specific al penicilinazelor. Penicilinazele sunt exoenzime secretate de stafilococ in mediul extracelular (Zygmunt și colab., 1992), in cantitati mari. Gena blaZ este reglata de către un represor constitutiv blaI și un antirepresor blaR1, molecula transmembranara care este activata de prezenta unei β-lactamine. Gena pentru penicilinaza aparține unui transpozon, localizat pe o plasmida mare, ce poarta și alte gene de rezistenta la antibiotice (aminozide, macrolide) (Lowy, 2003), la antiseptice sau la metale grele. Se poate integra și în cromosom. Penicilinaza este un polipeptid de 257 aminoacizi (MM: 28 kDa) care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină G, făcând ineficient antibioticul.
La tulpinile hiperproducatoare de penicilinaza, oxacilina are o activitate diminuata, astfel ca tulpina poate să fie incadrata ca rezistenta. Aceste tulpini se numesc ''borderline'' (BORSA – Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). Acest mecanism conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice, făcând imposibilă utilizarea lor în clinică pentru tratamentul infecțiilor cu MRSA.
β-lactamazele s-au clasificat in functie de: substratul pe care-l hidrolizeaza (penicilinaze – actioneaza asupra penicilinelor, cefalosporinaze – hidrolizeaza cefalosporinele), de sensibilitatea la inhibitori – penicilinazele de la stafilococ sunt sensibile la inhibitorii de β-lactamaze: acid clavulanic, tazobactam, sulbactam (Drugeon, 2006), de modul de producere (constitutiv sau inductibil) si de localizarea cromosomala sau plasmidiala a genelor codificatoare (Mihaescu si colab., 2007).
–
Doua tipuri de rezistenta prin modificarea tintei exista la stafilococi:
1. achiziționarea unei PBP exogene: PBP2a;
2. modificarea sintezei PBP endogene.
I.4.1.4. Rezistența la meticilină
Rezistenta prin producerea proteinei de legare a penicilinei (PBP) numita PBP2a sau PBP2’, a aparut la putin timp dupa introducerea meticilinei, prima penicilina semisintetica, un antibiotic ce era activ asupra tulpinilor de S. aureus producatoare de penicilinaza. PBP2a nu prezinta nicio similaritate cu PBP de la S. aureus. Este foarte apropiata structural de PBP de la S. sciuri. Meticilina, la fel ca diversele β-lactamice, inhiba situsul transpeptidazic al PBP2 conservand activitatea sa transglicolazica. PBP2a prezinta o activitate transpeptidazica de rezistenta la β-lactamice. In prezenta unui antibiotic β-lactamic, peptidoglicanul stafilococului continua sa fie sintetizat datorita activitatii transpeptidazice a proteinei PBP2a si a activitatii transglicolazice a proteinei PBP2 (Pinho si colab., 2001).
Proteina PBP2a este codificata de gena mecA, componenta a operonului mec, ce face parte din cromosomul bacterian prin inserarea unui element genetic mobil numit caseta cromosomala stafilococica mec (SCCmec) (Oliveira și colab., 2006; Milheirico și colab., 2007; Shanshuang și colab., 2011). Expresia sa este esentiala pentru fenotipul de rezistenta la meticilina. Aceasta gena poate sa fie reglata de genele mecI si mecR1. Aceste doua gene sunt similare cu genele blaI si blaR1 ce regleaza producerea de penicilinaza, dar si transcrierea genei mecA (Chambers, 1997).
Recent, omologi ai genei mecA, înrudiți numai la distanță cu gena mecA au fost identificați în genomul de stafilococi și in unele specii bacteriene înrudite (Tabelul …). Până în prezent, patru grupuri de omologi mecA au fost descrise în funcție de gradul lor de omologie cu cea mai timpurie gena mecA identificata.
Tabelul…..
Lista omologilor mecA (dupa Ito si colab., 2012)
atulpinile prototip reprezentative pentru fiecare gena mec: S. aureus N315 pentru mecA, S. sciuri K11 pentru mecA1, S. vitulinus CSBO8 pentru mecA2, M. caseolyticus JCSC5402 pentru mecB si S. aureus LGA251 pentru mecC.
I.4.1.4.1. Casetele SCCmec – substratul genetic al rezistenței la meticilină
Complexul genei mec este situat pe un element genetic mobil ce se poate integra in cromosom la nivelul unui situs unic situat în apropierea originii replicarii și a genei de rezistenta la novobiocina. Se asociaza unui complex de doua gene de recombinaza din familia integrazelor-rezolvazelor denumite ccrA și ccrB (Hiramatsu și colab., 2001; Ito și colab., 2004) ce permit integrarea și excizia complexului mec-ccr, ce se comporta ca o insula de rezistenta la β-lactamice sub denumirea de SCCmec (Staphylococcus Cassette Chromosomal mec).
Pana în prezent au fost descrise 11 tipuri de caseta cromosomala mec (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements – IWG-SCC) prezentate în tabelul……
Tabelul …..
Cele 11 tipuri de SCCmec întâlnite la S. aureus
*O genă ccr sau genele ccr din complexul genei sunt indicate în paranteze.
Complexele genelor ccr frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul….
Tabelul …..
Cele mai frecvente complexe ale genei ccr
**genele ccrA4B4 gasite in tipul SCCmec VIII au fost aproape identice cu cele din elementul SCC-CI de la S. epidermidis și a arătat identități de nucleotide cu cele gasite in tipul SCCmec VI de 89,6% și respectiv 94,5%.
Complexele genei mec frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul ….
Tabelul ….
Cele mai frecvente complexe ale genei mec
Detectarea rezistenței la meticilina se poate face prin:
– disc difuzie utilizand discul de cefoxitin/ moxalactam/ oxacilina;
– metode automate (vitek2, Phoenix, Microscan etc);
– metode imunologice folosind anticorpi anti PBP2a fixati pe particule din latex;
– metode moleculare (PCR, Real-Time PCR). Reacția PCR este considerată ''gold standard'' pentru detectarea rezistentei la meticilina prin amplificarea genei mecA.
Cu ajutorul reacției de amplificare în lanț (PCR) de tip multiplex este posibila determinarea tipului SCCmec util în studii de epidemiologie la S. aureus rezistent la meticilina. Caseta de tip IV a fost descrisa la tulpini comunitare de S. aureus, dar și la cele din spital.
I.4.2. Rezistența la aminoglicozide
Aminoglicozidele sunt molecule cationice cu greutate moleculara mica, hidrosolubile, foarte stabile, de spectru larg și cu o activitate bactericida rapidă. Ele sunt diferite atat prin nucleul molecular (streptidina sau 2-deoxistreptamina = 2-DOS), cat si prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko si colab., 2003). Gruparile NH2 si OH libere, prin intermediul carora aminoglicozidele se leaga de proteinele ribosomale sunt esentiale pentru activitatea antimicrobiana. Patrunderea unui aminozid in celula bacteriana Gram pozitiva se face in 3 etape:
a) trecerea prin peptidoglican este pasiva, rapida si nonspecifica;
b) EDPI (Energy dependent phase) permite translocarea prin membrana citoplasmatica. Acumularea lenta in citoplasma depinde de concentratia extracelulara de antibiotic;
c) EDPII permite fixarea progresiva a aminozidelor la proteinele ribosomale. Aceasta etapa se caracterizeaza prin accelerarea transferului si o saturare a situsurilor ribosomale.
Gentamicina (CN), tobramicina (TOB), amikacina (AK) si streptomicina sunt folosite in mod curent pentru tratamentul infectiilor cu bacterii Gram pozitive si negative.
Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminozidice este diferit. Aminozidele mai noi (CN, TOB, AK) au un spectru mai larg decat cele vechi [streptomicina, kanamicina (K)].
Desi manifesta nefrotoxicitate/ ototoxicitate, iar aparitia tulpinilor rezistente este relativ frecventa, aminoglicozidele raman, in continuare, foarte importante pentru tratamentul unor infectii in situatii speciale.
Au cateva particularitati ale actiunii antimicrobiene:
a) activitatea bactericida este dependenta de concentratie;
b) manifesta efectul postantibiotic;
c) au o farmacocinetica relativ predictibila;
d) manifesta efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.
Aminoglicozidele se leaga de subunitatea 30S a ribosomului bacterian in zona inalt conservata a ARNr, in locul in care se formeaza legatura specifica intre codonul ARNm si anticodonul aminoacil-ARN si inhiba sinteza proteinelor. Subunitatea 30S are rol esential in traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm si astfel se sintetizeaza proteine nefunctionale sau sinteza proteinelor este stopata.
Rezistenta la antibioticele aminoglicozidice este larg raspandita. Se produce prin urmatoarele mecanisme:
1. inglobarea scazuta a antibioticului;
2. modificarea tintei ribosomale;
3. efluxul antibioticului;
4. modificarea enzimatica a aminoglicozidelor.
Modificarea chimica a aminoglicozidelor reprezinta principalul mecanism de rezistenta bacteriana. Mecanismele mai rar intalnite sunt sistemele de eflux si mutatiile situsului ribosomal de legare la ARNr (Leclerc si colab., 1991).
Modificarea enzimatica a aminoglicozidelor reprezinta mecanismul major de rezistenta. Modificarea chimica are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 enzime. Acestea se clasifica in 3 familii:
1. aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC): acetilarea gruparilor amino (NH2);
2. aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT): adauga AMP la gruparea OH la pozitiile 2', 3', 4' si respectiv 9;
3. aminoglicozid-fosfotransferaze (APH): adauga grupari de fosfati la aminoglicozide.
Fiecare dintre cele 3 familii de enzime este impartita in clase, in functie de situsul pe care il modifica.
Fiecare clasa contine numeroase enzime, fiind clasificate in subclase.
AAC cuprinde 4 clase de enzime, care acetileaza grupari amino situate in pozitiile 3, 2', 6', fiind notate AAC(3), AAC(2'), AAC(6'). Subclasele contin de asemenea tipuri de enzime, notate cu cifre romane. In functie de tipul enzimei produse variaza fenotipul de rezistenta fata de diferitele aminoglicozide. AAC(3)-I confera rezistenta fata de CN, AAC(3)-II determina rezistenta fata de CN, netilmicina (NET) si TOB, iar AAC(3)-III induce rezistenta fata de CN, TOB si K. Izoenzimele care au functii identice si astfel confera fenotip de rezistenta identic se noteaza cu litere mici: AAC(6')-Ia si AAC(6')-Ib. Noua enzima bifunctionala ce modifica aminoglicozidele, intalnita la specii de stafilococ si enterococ: AAC(6')+APH(2'') prezinta o importanta speciala. Dispune de o terminatie amino, care catalizeaza acetilarea grupei 6'-amino si de o terminatie carboxil care catalizeaza fosforilarea grupei hidroxil 2''. Aceasta enzima inactiveaza majoritatea aminoglicozidelor (exceptie streptomicina, la tulpinile care nu poseda rezistenta de nivel inalt fata de aceasta), fapt pentru care nici un fel de aminoglicozid nu poate fi utilizat in terapie (Dessen, 2001; Schito, 2006).
ANT cuprinde 5 clase de enzime.
APH cuprinde 7 clase de enzime. Sunt kinaze ce utilizeaza ATP ca substrat secundar si fosforileaza gruparile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.
Aceste enzime ce modifica structura chimica a aminoglicozidelor sunt codificate pe plasmide si transpozoni. Cel mai frecvent intalnite, cu importanta clinica la S. aureus sunt urmatoarele (Dessen, 2001; Fluit, 2001; Ida, 2001):
1. AAC(6')-Ie+APH(2'') codificata de gena aac(6')-Ie+aph(2'') ce confera rezistenta fata de aminoglicozidele folosite in tratamentul infectiilor stafilococice. Gena se afla situata pe transpozonul Tn4001, raspandit la numeroase tulpini de S. aureus si stafilococi coagulazo-negativi. Acest transpozon s-a intalnit pe diferite plasmide, pSK1, pSK23 (plasmid ce poarta si alte gene de rezistenta fata de antibioticele β-lactamice si metale grele) si in variate localizari cromosomale.
2. ANT(4')-I codificata de gena ant(4')-Ia si determina rezistenta fata de K, TOB, neomicina si AK. Gena care se afla pe plasmide mici integrate pe plasmide conjugative mai mari (ex. PSK4'), se insera frecvent la S. aureus pe elementul SCCmec prin intermediul proceselor de recombinare mediate de secventa de insertie IS257.
3. APH(3')-III codificata de gena aph(3')-IIIa localizata pe transpozonul Tn5405, integrat cromosomal sau plasmidic, duce la rezistenta fata de neomicina si K.
Mecanismele neenzimatice de rezistenta la antibioticele aminoglicozidice sunt:
1. sistemele de eflux;
2. mutatiile ARNr.
Rezistenta la CN se datoreaza prezentei enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaza-6-acetiltrasferaza. Enzima confera rezistenta la CN, TOB, NET, AK si K. Rezistenta la CN este un indicator al rezistentei bacteriene la alte aminoglicozide.
Macrolidele, lincosamidele si streptograminele (MLS) sunt antibiotice cu o structura chimica diferita, dar situate in acelasi grup. Macrolidele si lincosamidele au proprietati antibacteriene, cel mai frecvent bacteriostatice. MLS sunt prezentate in tabelul ….
Tabelul …..
Macrolide, lincosamide si streptogramine
Mecanisme de actiune
MLS inhiba sinteza proteinelor prin fixarea de ribosomul bacterian. Ribosomul este alcatuit din subunitatea mica 30S si o subunitate mare 50S. Subunitatea 50S este compusa din ARN 23S si 5S si dintr-un miez de 30 proteine denumite prin litera L (larg) si numerotate. Structura secundara a ARN 23S este pliata datorita imperecherii bazelor complementare si formeaza 6 domenii numerotate de la I la VI. Contactele complexe intre ARN si proteine asigura organizarea tridimensionala a moleculei (structura tertiara). Stabilitatea ansamblului este favorizata de catre interactiunile cu diferite proteine. Structura ribosomului este foarte conservata la toate speciile bacteriene. Eritromicina se leaga de subunitatea 50S a ribosomului bacterian.
Macrolidele sunt nonbactericide pentru S. aureus, iar streptograminele sunt bactericide.
Mecanisme de rezistenta
Trei mari tipuri de mecanisme sunt responsabile de rezistenta dobandita la MLS (Leclercq, 2002):
Modificarea tintei – modificarea tintei ribosomale a macrolidelor antreneaza o rezistenta consecutiva prin diminuarea afinitatii MLS pentru tinta lor. Celulele bacteriene pot modifica ribosomul prin producerea metilazelor codificate de tulpinile clinice prin genele plasmidiale sau prin transpozoni (Tn1545, Tn551, Tn554, Tn917), prin mutatia ARN sau a proteinelor ribosomale.
Metilarea ribosomala – acest fenotip de rezistenta a fost descris in anul 1956 de catre Chabbert. Mecanismul responsabil de rezistenta a fost decodat de catre Weisblum si colab. Aceasta rezistenta este data de metilarea unei singure adenine in pozitia 2058 a ARN ribosomal 23S. Metilarea acestei adenine care joaca un rol clar in fixarea macrolidelor împiedică legarea acestor molecule la tinta lor. Adenina 2058 fiind un punct comun de fixare a macrolidelor, lincosamidelor si streptograminelor B, rezistenta este incrucisata intre aceste trei grupuri de antibiotice sub numele de fenotip de rezistenta MLSB. Aceasta rezistenta este codificata de genele erm (erythromycin ribosome methylase). Genele erm sunt plasate atat pe plasmide cat si pe transpozoni. Distributia genelor erm la Staphylococcus a fost prezentata de Roberts: erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(Q), erm(Y), erm(33). Genele erm(A) si erm(C) sunt responsabile la stafilococ de dimetilare, in timp ce gena erm(B) este responsabila de mono sau de dimetilare in functie de gazda (Douthwaite si colab., 2005). Expresia genelor erm poate fi inductibila sau constitutiva.
Mutatii ribosomale – au fost detectate mutatii ale adeninei in pozitia 2058, 2059 sau 2062 ale ARN ribosomal 23S. Raritatea acestei rezistente la stafilococ poate fi explicata prin prezenta mai multor copii rrn (5 sau 6 la S. aureus). Mutatiile in proteinele ribosomale L4 si L22 sunt responsabile in egala masura de rezistenta.
Modificarea enzimatica – multe enzime sunt capabile de inactivarea MLS. Eritromicina poate fi inactivata de diverse enzime ca de exemplu, esteraze (clasa genelor ere) sau de fosfotransferaze (clasa genelor mph). Aceste gene au fost raportate la stafilococ. Lincosamidele sunt inactivate de catre nucleotidiltransferaze (clasa genelor lnu). Rezistenta la streptogramine se explica frecvent prin asocierea genelor de clasa vat si vgb ce codifica pentru acetilazele streptograminelor A si liazelor factorilor B.
Eflux – la bacteriile Gram pozitive, achizitionarea rezistentei prin eflux activ este data de doua clase de pompe, membrii ai familiei ATP-binding cassette (ABC) transporteurs si Major Facilitator Superfamily (MFS). Un transportor ABC codificat de gena plasmidiala msr(A) este raportata la stafilococ. Transportorii ABC utilizeaza ATP ca sursa de energie si sunt alcatuiti dintr-un canal cu doua domenii asociate membranei citoplasmatice si doua domenii de legare la ATP situate pe suprafata interna a membranei. Gena msr(A) codifica pentru o proteina ce poseda cele doua domenii de legare la ATP caracteristic transportorilor ABC. Cu toate acestea, natura componentei transmembranare a pompei nu este cunoscuta. Este fara indoiala recrutata printre proteinele codificate de genele cromosomale ale stafilococului. Efluxul streptograminelor A este legata de o proteina Vga din aceeasi familie, dar functia de eflux nu este decat ipotetica.
Principalele fenotipuri de rezistenta la MLS sunt prezentate in tabelul…..
Tabelul….
Principalele fenotipuri de rezistenta la MLS
arisc de selectie mutant rezistent;
bactivitate bactericida redusa;
crezistenta la lincomicina si sensibilitate la clindamicina (interpreteaza I);
dposibilitate de rezistenta la lincomicina si la clindamicina in cazul prezentei genelor vga(A) sau vga(Av).
Descoperite acum mai bine de 60 ani, tetraciclinele reprezinta un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacteriana fata de un spectru larg de microorganisme patogene Gram pozitive/ negative, cat si asupra clamidiilor, micoplasmelor, ricketiilor si catorva protozoare. Sunt bine absorbite si active dupa administrare orala. Din aceste motive au cea mai larga utilizare in clinica umana si veterinara. Utilizarea masiva si necontrolata a tetraciclinei, atat in terapia umana, cat si in cea veterinara (ca promotor de crestere) a condus la selectarea si diseminarea clonelor bacteriene rezistente (Poyart, 2006).
Principalele tetracicline sunt prezentate in tabelul…..
Tabelul….
Principalele tetracicline
Structura chimica de baza a tetraciclinelor este prezentata in Fig……
Fig…… Structura chimica de baza a tetraciclinelor (https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline)
Mecanismul de actiune a tetraciclinelor
Penetrarea in bacterii
Intervin doua procese in cursul penetrarii: difuzia pasiva si absorbtia activa la nivelul membranei citoplasmatice. Tetraciclinele nu difuzeaza liber in celula bacteriilor Gram pozitive.
Actiunea la nivelul ribosomului
Tetraciclinele sunt inhibitori ai fazei de elongare a catenei polipeptidice in timpul traducerii (sintezei proteice), exercitand astfel un efect bacteriostatic. Tetraciclina se fixeaza la nivelul subunitatii ribosomale 30S si in particular, de proteinele S7 si de nucleotidele G693, A892, U1052, C1054, G1300 si G1338 ale ARNr 16S, pentru prevenirea atasarii aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului bacterian.
Pe baza modului de actiune, tetraciclinele au fost impartite in doua categorii:
1. cele care inhiba sinteza proteinelor;
2. cele care interactioneaza cu membrana citoplasmatica.
Mecanismele rezistentei la tetracicline
Rezistenta la tetracicline este una dintre cele mai frecvente atat la bacterii Gram negative, cat si la cele pozitive.
Au fost descrise 3 mecanisme diferite determinate genetic:
1. activitatea pompelor de eflux – elimina tetraciclina din celula si este dependenta de energie fiind cel mai comun mecanism de rezistenta. Este mediat de produsele de sinteza ale genelor de rezistenta – proteine ale membranei citoplasmatice care functioneaza ca transportori ai tetraciclinei. Genele tet ce codifica proteinele de eflux sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explica distributia larga a rezistentei. La Staphylococcus genele de eflux sunt localizate, in general, pe plasmide mici de replicare. Prototipul este pT181 purtator al genei tet(K) (Khan si Novick, 1983). Au fost descrise si gene tet(L) (Schmitz si colab., 2001).
2. protectia ribosomilor – intermediul proteinelor solubile. La Staphylococcus au fost descrise genele tet(M), tet(O), tet(W). Cele mai studiate au fost tet(M) si tet(O). Aceste gene sunt de cele mai multe ori localizate pe elemente genetice mobile. Gena tet(M) este localizata pe transpozoni conjugativi in care prototipul este Tn916 si tet(O) pe plasmide conjugative. Proteina TetM a fost purificata (72 kDa) si s-a observat ca ‘’in vitro’’ se asociaza cu ribosomii. ‘’In vitro’’ are un rol protector fata de actiunea tetraciclinei, observandu-se ca legarea tetraciclinei la ribosom nu este alterata, iar aceasta legare nu modifica functionalitatea ribosomului. Proteina se asociaza cu ribosomii, facandu-i insensibili la actiunea tetraciclinei;
3. inactivarea enzimatica – degradarea oxidativa si nu are semnificatie ca mecanism de rezistenta.
Rezistenta dobandita prin mutatii ale genelor cromosomale este rara. Mutatiile sunt localizate in genele codante pentru ARNr 16S sau la nivelul genelor proteinelor de transport membranar.
Izolatele MRSA rezistente la tetraciclină și sensibile la minociclină (până la 50% din izolatele MRSA (Schmitz si colab., 2001) posedă gena tetK, în timp ce izolatele rezistente la minociclină posedă gena tetM sau ambele tetK și tetM (Trzcinski si colab., 2000).
I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus
Linezolidul este un antibiotic sintetic [(S)-N-({3-[3-fluoro-4-(morpholin-4-yl) phenyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)acetamide] (Brickner, 1996), desemnat ca primul membru din clasa de antibiotice numita oxazolidinone. A fost descoperit prin anii 1990 si aprobat de catre U.S. Food and Drug Administration (FDA) pentru uz clinic in anul 2000.
Linezolidul poate inhiba sinteza proteinelor bacteriene prin legarea de subunitatea 50S a ribosomului bacterian, prin intermediul interacțiunii cu domeniul V al 23S ARNr de la bacteriile Gram-pozitive, prevenind astfel formarea initierii complexului tertiar ribosomal N-formil metionil-ARNt-ARNm-70S. Astfel este stopata dezvoltarea bacteriilor prin perturbarea sintezei proteinelor. Efectul este bacteriostatic, nu bactericid. Astfel, linezolidul este diferit fata de alti inhibitori ai sintezei proteice ca si cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele si tetraciclinele. Are avantajul ca pe langa prevenirea sintezei proteinelor stafilococice are si efect inhibitor asupra dezvoltarii celulare bacteriene.
Proprietatiile sale farmacokinetice si farmacodinamice il califica pentru utilizarea in pneumonii nosocomiale si comunitare, in infectii complicate de piele si tesuturi moi (Grau si colab., 2007), in osteomielita (Aneziokoro si colab., 2005), in sepsis (Pistella si colab., 2004) etc.
De la introducerea linezolidului s-a spus ca rezistenta va fi rara si nu va conduce la rezistenta incrucisata (Zhou si colab., 2015).
Prima alerta cu S. aureus rezistent la meticilina si la linezolid a fost raportata in 2001 in America de Nord (Tsiodras si colab., 2001). Dupa acest an, stafilococii si enterococii rezistenti la linezolid au fost raportati (Potoski si colab., 2006; Cai si colab., 2012; Chen si colab., 2013; Gu si colab., 2013).
In Statele Unite ale Americii (U.S.A.), sensibilitatea la linezolid a izolatelor clinice Gram pozitive a fost monitorizata din 2004 printr-un program numit Linezolid Experience and Accurate Determination of Resistance (LEADER). Rezultatele au aratat ca rezistenta a ramas stabila si extrem de scazuta (Jones si colab., 2007; Jones si colab., 2008; Jones si colab., 2009). O retea de supraveghere similara numita "Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum Study" sau ZAAPS a functionat in centrele medicale din Europa (Flamm si colab., 2013; Tian si colab., 2014).
Pana acum au fost descrise 3 mecanisme de rezistenta la linezolid:
a) mutatii variate la nivelul buclei centrale a uneia sau mai multor alele ale regiunii domeniului V al genei 23S ARNr (Hong si colab., 2007; Lincopan si colab., 2009; Bongiorno si colab., 2010; Sorlozano si colab., 2010; De Almeida L.M. si colab., 2013).
b) metilarea ARN-ului de catre doua enzime diferite – RlnM cu imbunatatirea activitatii metiltransferazei urmata de inserarea unui codon in gena metiltransferazei rlmN la S. aureus (Gao si colab., 2010) si metiltransferaza 23S ARNr produsa ca rezultat al achizitionarii genei cfr de rezistenta la cloramfenicol-florfenicol (Mendes si colab., 2008; Quiles-Melero si colab., 2013; Campanile si colab., 2013; Huang si colab., 2014), 23S rRNA metiltransferaza metileaza adenina in pozitia 2503 in 23S ARNr (E. coli 23S rRNA gene numbering).
Gena cfr confera rezistenta la 5 clase de agenti antimicrobieni, ca de ex. fenicoli, lincosamide, oxazolidinone, pleuromutiline si streptogramine A, un fenotip numit PhLOPSA (Kehrenberg si colab., 2005; Long si colab., 2006; Shore si colab., 2010; Toh si colab., 2007). Gena este localizata pe plasmid (Shen si colab., 2013; Cai si colab., 2015) sau cromosom (Toh si colab., 2007; Kehrenberg si colab., 2007). Poate fi transmisa pe orizontala intre specii, este singurul mecanism de rezistenta ce se poate transfera. Acest mod de transmitere este dificil de prevenit si oprit (Kehrenberg si colab., 2007; Nian si colab., 2012). Gena cfr a fost identificata la stafilococii coagulazo-negativi de la animale (Kehrenberg si Schwarz, 2006; Schwarz si colab., 2000). A fost gasita, de asemenea, la un numar limitat de tulpini umane de S. aureus si stafilococi coagulazo negativi (Mendes si colab., 2008; Toh si colab., 2007; Mendes si colab., 2010; Morales si colab., 2010).
c. mutatii sau deletii in genele ce codifica subunitatea ribosomala 50S a proteinelor L3 (De Almeida si colab., 2013), L4 si L22 (codificate de catre genele rplC, rplD si rplV) (Holzel si colab., 2010; Long si Vester, 2012; Shaw si Barbachyn, 2011).
In Romania a fost acordata putina atentie stafilococilor coagulazo-negativi, dar alti autori au raportat capacitatea acestor microorganisme de a fi implicate in infectii severe si in dobandirea rezistentei la linezolid (Bongiorno si colab., 2010; Mendes si colab., 2010; Petinaki si colab., 2009). Stafilococii coagulazo-negativi reprezinta un rezervor neglijat al rezistentei mediata de cfr, frecvent raportata in multe regiuni, incluzand America de Nord (U.S.A., Mexic), America de Sud (Brazilia), Europa (Grecia, Spania, Italia, Franta, Irlanda) si Asia (India) (Gu si colab., 2013; Potoski si colab., 2006; Mendes si colab., 2010; Mutnick si colab., 2003). Cateva tulpini au fost rar raportate in China (Zhou si colab., 2015; Cai si colab., 2012; Chen si colab., 2013; Yang si colab., 2013).
Au fost identificate mai multe tipuri de plasmide ce poarta gena cfr (Shen si colab., 2013; Cai si colab., 2015).
In multe sectii din spital si mai ales la Terapie Intensiva, presiunea antibioticului, datorata fie utilizarii adecvate sau neadecvate si dificultatea detectarii catorva mecanisme fenotipice de rezistenta au condus la cresterea prevalentei tulpinilor rezistente in intreaga lume (Shorr si Lipman, 2007) si favorizeaza astfel dezvoltarea rezistentelor multiple la microorganismele din genul Staphylococcus (Mackenzie si colab., 2007).
Capitolul II – Partea experimentală – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România
2.1. Scopul și obiectivele lucrării
Scopul acestei lucrari a fost de a caracteriza fenotipic si genotipic tulpinile de Staphylococcus aureus izolate din diferite probe biologice de la subiecti umani si suprafete.
Au fost luate în studiu 228 tulpini de S. aureus si 1 tulpina de Staphylococcus hominis (S. hominis) izolate din alimente, de la pacienți cu diferite infecții cutanate, de la purtatori sanatosi, de la copii nou-nascuti sau de cateva luni, de pe suprafete contaminate, astfel: 22 izolate (5681, 5682, 6060, 6061, 6099, 6100, 6219, 6220, 6282, 6283, 6552, 6553, 6554, 6555, 6556, 6557, 6558, 6559, 6560, 6561, 6562, 6563, 6564) provin de la Unitatea Medicală A (UMA) din București, 69 izolate (7486, 7487, 7488, 7489, 7490, 7491, 7492, 7493, 7494, 7495, 7496, 7497, 7498, 7499, 7500, 7501, 7502, 7503, 7504, 7505, 7506, 7507, 7508, 7509, 7510, 7511, 7512, 7513, 7514, 7515, 7516, 7517, 7525, 7526, 7527, 7528, 7529, 7530, 7531, 7532, 7533, 7534, 7535, 7536, 7537, 7538, 7539, 7540, 7541, 7542, 7543, 7544, 7545, 7546, 7547, 7548, 7550, 7551, 7552, 7553, 7554, 7555, 7556, 7557, 7558, 7559, 7560, 7561, 7562) provin de la Unitatea Medicala B (UMB) din Prahova, fiind tulpini implicate in toxiinfectie alimentara (TIA), 6 izolate (7854, 7855, 7856, 7857, 7859, 7860) provin de la Unitatea Medicala C (UMC) din Iasi, fiind tulpini implicate in toxiinfectie alimentara (TIA), 32 izolate (9380, 9381, 9382, 9383, 9384, 9385, 9386, 9387, 9388, 9389, 9390, 9391, 9392, 9393, 9394, 9395, 9396, 9397, 9398, 9399, 9400, 9401, 9403, 9404, 9405, 9406, 9407, 9408, 9409, 9410, 9411, 9412) de la Unitatea Medicala D (UMD) din Vrancea, 28 izolate (1120, 1121, 1122, 1123, 1124-A, 1124-B, 1125, 1126, 1127-A, 1127-B, 1128, 1129, 1130, 1131, 1132, 1133, 1134, 1135, 1136, 1137, 1138, 1139-A, 1139-B, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309) provin de la Unitatea Medicală E (UME) din Suceava, 42 izolate (162957, 157633, 157814, 157832, 158077, 158294, 158342, 158357, 158599, 158848, 159920, 160210, 160472, 163189, 162248, 162467, 162741, 160908, 161005, 163870, 159007, 165197, 165589, 165615, 165854, 165863, 166304, 159277, 164754, 168833, 169015, 164902, 169619, 169570, 170160, 170171, 170075, 170199, 164996, 43, 159339, 159523) provin de la Laboratorul de Analize Medicale din cadrul Institutului Cantacuzino = Unitatea Medicală F (UMF) din București fiind izolate comunitare, 29 izolate (1220127, 1222818, 1223208, 1224086, 1224313, 1226212, 1226855, 1231229, 1229278, 1229023, 1233277, 1232967, 1233839, 1235676, 1235905, 1236049, 1238002, 1170334, 1236841, 1238263, 1238263b, 1238322, 1241615, 1239594, 1243632, 1245118, 1246000, 1246543, 1247067) provin de la Unitatea Medicală G (UMG) din București fiind tot izolate comunitare de la pacienții ce s-au prezentat la camera de gardă a unității medicale, iar 1 tulpina (423/ 22633) de S. hominis provine de la Unitatea Medicala H (UMH) din Bucuresti. Aceste tulpini au fost colectate în anii 2010 (UMA), 2011 (UMB si UMC), 2012 (UMD), 2013/2014 (UME), 2014 (UMF), 2015 (UMG), 2013 (UMH).
Distributia pe sexe a fost: in primul focar F/ M (14/ 6; 70%/ 30%); in al2lea focar F/ M (2/ 1; 40%/ 20%). Mediana varstei pacientilor a fost de 32.5 ani (scala: 4 – 76 ani), iar distributia pe sexe (barbat/ femeie) a fost de 26/ 16 (61.90%/ 38.10%). Mediana varstei pacientilor a fost de 50 ani (scala: 4 luni – 88 ani), iar distributia pe sexe (barbat/ femeie) a fost de 10/19 (34.48%/ 65.52%).
Tulpinile din UMA au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura …)
Figura … Distributia izolatelor de S. aureus din UMA pe probe biologice
Tulpinile din UMB au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura …)
Figura … Distributia izolatelor de S. aureus din UMB pe probe biologice
Tulpinile din UMC au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura …)
Figura … Distributia izolatelor de S. aureus din UMC pe probe biologice
Tulpinile din UMD au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura …)
Figura … Distributia izolatelor de S. aureus din UMD pe probe biologice
In UME au izbucnit 2 focare cu S. aureus, primul in luna Noiembrie 2013, iar al2lea in luna Februarie 2014. Primul focar a cuprins 20 subiecti umani dintre care: 12 nou-nascuti, o lehuza si 7 angajati (personal medical). Al2lea focar a cuprins 3 subiecti dintre care: 2 nou-nascuti, 1 angajat (personal medical) si alte 2 probe din mediul inconjurator (suprafete contaminate). Tulpinile din UME au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura …). De la 2 nou-nascuti s-au izolat cate 2 tulpini de S. aureus din bont ombilical si de pe tegument, iar la un angajat s-au gasit 2 tipuri diferite de colonii de S. aureus in exsudatul faringian. Tulpinile din UME au fost izolate din urmatoarele probe biologice (figura X).
Figura … Distributia izolatelor de S. aureus din UME pe probe biologice
Tulpinile din UMF au fost izolate din secretie purulenta din diferite infectii de piele si tesuturi moi si anume: furunculoza, hidrosadenita, acnee, abces, plaga deschisa, panaritiu, pustule.
Tulpinile din UMG au fost izolate din secretie purulenta din diferite infectii de piele si tesuturi moi si anume: furunculoza, foliculita, abces, celulita, pustule, panaritiu.
Tulpina din UMH a fost izolata din sange.
Insamantarea si identificarea tulpinilor de S. aureus si S. hominis
Tulpinile au fost insamantate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sange defibrinat de berbec. Identificarea s-a realizat prin metoda bacteriologica clasica: frotiu colorat Gram, catalaza, oxidaza. Confirmarea speciei s-a realizat prin testul coagulazei legate – cu ajutorul reactivului Slidex Staph Plus, Slidex Staph (BioMerieux, Franta) si Staphytect (Oxoid ………), testul coagulazei libere – cu plasma de iepure (BioRad, …) si prin metoda moleculara triplex PCR amplificand gena nuc (marker specific pentru S. aureus).
Tulpina de S. hominis a fost identificata cu ajutorul sistemului automat de identificare Vitek2 (BioMerieux, Franta) folosind carduri de identificare GP.
Testarea susceptibilitatii la antibiotice a tulpinilor de S. aureus si S. hominis
Determinarea spectrului de susceptibilitate la antibiotice prin metoda difuzimetrica Kirby Bauer
Testarea susceptibilitatii ’’in vitro’’ la antibiotice a tulpinilor de S. aureus si S. hominis a fost determinata prin metoda disc difuzimetrica Kirby Bauer, pe agar Mueller Hinton.
Materiale necesare:
agar Mueller Hinton Oxoid (Basingstoke, United Kingdom);
discuri de antibiotice Oxoid: benzylpenicilina (P, 1U), cefoxitin (FOX, 30 μg), eritromicina (E, 15 μg), clindamicina (DA, 2 μg), kanamicina (K, 30 μg), tobramicina (TOB, 10 μg), gentamicina (CN, 10 μg), norfloxacin (NOR, 10 µg), ciprofloxacin (CIP, 5 μg), tetraciclina (TE, 30 μg), rifampicina (RD, 5 μg), cloramfenicol (C, 30 μg), sulfamethoxazole-trimethoprim (SXT, 1.25/ 23.75 μg), quinupristin-dalfopristin (QD, 15 μg), linezolid (LZD, 10 μg), mupirocin (MUP, 200 μg), telithromicina (TEL, 15 μg) si acid fusidic (FD, 10 μg);
tampoane;
densimat;
tuburi 12/ 120;
ser fiziologic steril;
tulpina de referinta S. aureus ATCC 29213 (tulpina de control).
Tehnica de lucru
Pentru realizarea antibiogramei s-a folosit o cultura de 18-24h insamantata pe medii de cultura neselective (agar Columbia cu 7% sange defibrinat de berbec).
Din cultura de 18-24h s-a preparat o suspensie cu turbiditatea echivalenta standardului 0.5 McFarland. Aceasta suspensie a fost insamantata pe placile cu Mueller Hinton agar cu tamponul in trei directii diferite. Dupa aplicarea discurilor, placile au fost incubate 18-24h la temperatura de 35ș ± 2șC. Apoi s-au masurat diametrele corespunzatoare fiecarui antibiotic in parte.
Metoda dublului disc (D-test) s-a aplicat in acelasi timp prin plasarea discului de E la o distanta de 20 mm de DA pentru detectarea fenotipului de rezistenta la macrolide, lincosamide, streptogramine B inductibil (MLSBi) (Figura X).
Figura X Detectarea fenotipului de rezistenta inductibila la macrolide, lincosamide si streptogramine B (MLSBi) la tulpinile de S. aureus izolate din UMA, UMD, UME, UMF, UMG, UMH (imagine originala)
Pentru anumite izolate discul de TEL s-a plasat la aceeasi distanta fata de cel de E pentru observarea rezistentei induse la TEL.
Citirea si interpretarea rezultatelor
Se citesc diametrele zonelor de inhibitie a cresterii bacteriene din jurul discurilor si se interpreteaza dupa recomandările și criteriile de interpretare ale standardelor EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) disponibile pe site-ul www.eucast.org pentru anul 2010, 2013, 2014, 2015, in functie de valorile citite, cu:
Sensibil (S);
Intermediar (I);
Rezistent (R).
Cuantificarea Concentratiei Minime Inhibitorii (CMI) prin metoda microdilutiilor in mediu lichid Mueller Hinton si cu ajutorul benzilor E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden).
Materiale necesare:
bulion Mueller Hinton (BMH);
antibiotic pulbere: vancomicina (Sigma Aldrich);
tulpinile de testat cultivate pe agar Columbia (Oxoid) cu 7% sange defibrinat de berbec;
tulpina de referinta S. aureus ATCC 29213.
Tehnica de lucru
Prepararea solutiei de antibiotic:
Antibioticul pulbere folosit a fost diluat in apa distilata sterila (ADsterila) conform standardului utilizat pentru realizarea unei solutii stoc de concentratie 1029 µg/ ml.
Pentru testare, s-au realizat cate sase dilutii alese in asa fel incat sa cuprinda break-point-urile specificate de standardul EUCAST, corespunzatoare testarii bacteriilor genului Staphylococcus.
Calcul volum antibiotic (vi) din concentratia initiala (ci din solutia stoc existenta), pentru obtinerea celei mai mari concentratii de antibiotic dorita (cf – pentru primul godeu – intr-un volum final de 300 µl – vf, din care se vor face urmatoarele dilutii binare).
vi = (cf x vf)/ ci
vi = μl antibiotic din ci 1029 μg/ ml
ci = 1029 μg/ ml
cf = 32 μg/ ml
vf = 300 μl.
Concentratiile utilizate pentru testarea susceptibilitatii tulpinilor luate in studiu sunt prezentate in Tabelul X.
Legenda: VA = vancomicina
S-au obtinut dilutii binare cuprinse intre 32 si 1 μg/ ml.
Din cultura dezvoltata pe mediu se prepara o suspensie bacteriana in solutie salina fiziologica sterila cu turbiditate echivalenta standardului 0.5 McFarland (1-3 x 108 UFC). Inoculul bacterian obtinut se dilueaza 1/ 100 (1 x 106). Se va utiliza in maxim 15 min. de la preparare.
Cate 10 μl din suspensia bacteriana 1/ 100 se vor adauga in fiecare godeu.
S-au folosit un martor de crestere (Mc), reprezentat de mediu inoculat cu suspensia bacteriana in care nu se adauga antibiotic si un martor de mediu (Mm), reprezentat de mediul de crestere bacteriana utilizat pentru testare, in care nu se adauga nici antibiotic, nici inocul bacterian. Placile au fost acoperite cu parafilm pentru evitarea deshidratarii. Au fost incubate la temperatura de 35ș ± 2șC, pentru 18-24h, in atmosfera aeroba.
Citirea si interpretarea rezultatelor
Se apreciaza cresterea sau absenta cresterii bacteriene prin vizualizarea godeurilor, comparativ cu martorii de crestere bacteriana (M+ al reactiei), respectiv cu martorul de mediu (M-).
CMI: cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba complet cresterea microorganismului – detectata cu ochiul liber.
CMB: cea mai mica concentratie de antibiotic care inhiba complet cresterea microorganismului – detectata prin insamantare.
Tabelul X Break-point-urile corespunzatoare agentului antimicrobian vancomicina
Cuantificarea CMI prin E-test la S. hominis
Banda E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden) este un reactiv cu un gradient predefinit de antibiotic pentru cuantificarea valorilor CMI. Placile cu mediu Mueller Hinton au fost insamantate cu o suspensie bacteriana cu turbiditate cunoscuta echivalenta cu 0.5 McFarland. Se lasa la temperatura camerei pentru uscare timp de 10 – 15 minute. Apoi s-a aplicat banda de E-test, dupa care s-a incubat timp de 18 – 24h.
Citirea si interpretarea rezultatelor
Dupa incubare, cresterea bacteriana este vizibila, iar de-a lungul benzii, centrata simetric apare o elipsa. Valoarea concentratiei de antibiotic marcata pe banda, deasupra punctului de intersectare a elipsei zonei de inhibitie cu banda E-test reprezinta valoarea CMI.
Tabelul X
Rezistenta la linezolid a fost definita ca CMI > 4 μg/ mL. Susceptibilitatea la vancomicina a fost definita ca CMI ≤ 4 μg/ mL conform standardului EUCAST Clinical Breakpoint Table v. 3.1.
Extractia de material genetic bacterian (ADN)
Extracția de ADN s-a realizat cu ajutorul kitului ''NucleoSpin Tissue'' (Macherey-Nagel, Germany) conform indicațiilor producătorului sau prin metoda lizei enzimatice si termice (cu lizostafin 1U/ µL, proteinaza K 2 mg/ mL, 5 min./ 100°C).
A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției de amplificare in lant (PCR) simplex țintind gena spa. S-a utilizat protocolul de lucru SeqNet stabilit de cei de la Ridom SpaServer (http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf). Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Ampliconii astfel obținuți au fost purificați utilizând kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen), cu obținerea unor peleți supuși metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Analiza si incadrarea in tipuri spa a secventelor astfel obtinute s-a realizat cu ajutorul softului Ridom StaphType software versiunea 2.2.1 (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany).
Secventele primerilor utilizati in reactia de amplificare in lant si in cea de secventiere a ampliconilor obtinuti sunt prezentate in tabelul …..
Tabelul ……
Secventa primerilor utilizati
A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției PCR in sistem triplex, dupa un protocol optimizat ''in house'' (Dragulescu si colab., 2007), țintind genele lukS/F-PV. S-a utilizat termocycler-ul ''Corbett Research'' (). Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri nucF și nucR (0,2 μM din fiecare), mecA1 și mecA2 (0,2 μM din fiecare), lukS/F1 și lukS/F2 (0,4 μM din fiecare), 1,5 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….
Tabelul ……
Secvența primerilor utilizați în triplex PCR
Programul de amplificare este prezentat în tabelul….
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 2%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
, E
Au fost evidențiate cu ajutorul reacției PCR simplex pentru fiecare genă seA, seB, seC, seD, seE. Mix-ul fiecarei reactii s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri SEA1/ SEA2, respectiv SEB1/ SEB2; SEC1/ SEC2; SED1/ SED2; SEE1/ SEE2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactii este prezentata in tabelul ….
Tabelul ……
Secvența primerilor utilizați în fiecare simplex PCR
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul……
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
S1
A fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru gena tst1. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri TSST1 și TSST2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….
Tabelul ……
Secvența primerilor utilizați în simplex PCR
Programul de amplificare este prezentat în tabelul……..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
– Evidentierea genei blaZ
Rezistenta la penicilina mediata prin producerea de penicilinaza a fost pusa în evidenta prin PCR simplex pentru gena blaZ. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri blaZ1 si blaZ2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….
Tabelul ……
Secventa primerilor utilizati in reactie
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Evidentierea genei mecA prin amplificare genica reprezintă ''gold standard''ul detectarii rezistentei la meticilina (oxacilina, cefoxitin). Detectarea genei s-a realizat prin reactia PCR in sistem triplex descrisa in subcapitolul 2.2.1.
Rezistenta la gentamicina a fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru genele aacA-aphD.
Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri aacA-aphD1 si aacA-aphD2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….
Tabelul ….
Secventa primerilor utilizati in reactie
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
, erm
Genele ermA si ermC au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiilor PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri ermA1 si ermA2, respectiv ermC1 si ermC2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactie sunt prezentate in tabelul ….
Tabelul ….
Secventele primerilor utilizati in reactii
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
Genele tetK si tetM au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiilor PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri tetK1 si tetK2, respectiv tetM1 si tetM2 (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactii sunt prezentate in tabelul ….
Tabelul ….
Secventa primerilor utilizati in reacție
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
Evidentierea genelor cfr si domeniul V 23S ARNr
Genele cfr si domeniul V 23S ARNr au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiilor PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat in volum final de 25 µl si conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri cfr-fw si cfr-rv, respectiv 23S ARNrF si 23S ARNrR (0,4 μM din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactiile de amplificare, cat si in cele de secventiere sunt prezentate in tabelul ….
Tabelul ….
Secventa primerilor utilizati in reacțiile de amplificare si secventiere
Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..
Tabelul…..
Programul de amplificare
Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.
Produsii de amplificare obtinuti au fost purificati cu ajutorul kit-ului Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen), cu obținerea unor peleți supuși metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Secventa genei cfr obtinuta a fost comparata cu secventa cfr din baza de date, iar gena 23S ARNr a domeniului V a fost secventiata pentru identificarea eventualelor mutatii implicate in rezistenta la linezolid. Secventa ADN obtinuta pentru gena domeniului V 23S ARNr a fost aliniata cu secventa de nucleotide corespunzatoare unei tulpini de referinta de S. aureus cu sensibilitate la linezolid (GenBank accession number X68425.1), folosind BioEdit Sequence Alignment Editor.
S-au folosit ca martor pozitiv mai multe tulpini de referință sau din Colectia de Culturi Bacteriene a laboratorului Infectii Nosocomiale si Rezistenta la Antibiotice pentru fiecare metodă si anume: 33/ 2009 pentru genele nuc, lukS/F si mecA; IC13456 pentru gena eta; IC13455 pentru gena etb; IC13454 pentru gena tst1 (Colectia de Culturi Bacteriene); S. aureus National Collection of Type Cultures, U.K. (NCTC) 10652 pentru gena seA; S. aureus NCTC 10654 pentru gena seB; S. aureus NCTC 10655 pentru gena seC; S. aureus NCTC 10656 pentru gena seD; S. aureus Food Research Institute, U.S.A. (FRI) 326 pentru gena seE; 5681/ 2010 pentru genele blaZ, ermC, aacA-aphD, tetK; 39/ 2008 pentru genele ermA, tetM (Colectia de Culturi Bacteriene).
Tipizarea moleculara aelectroforeza in camp pulsator –
Metoda PFGE considerata ''gold standard'' in epidemiologia tulpinilor de S. aureus implicate intr-un focar. Interpretarea rezultatelor s-a facut dupa criteriile stabilite de Tenover si colab. ([]). Pentru determinarea clonalitatii tulpinilor de S. aureus si a detectarii sursei focarului s-a aplicat metoda PFGE tulpinilor implicate in patru focare: in UMA, UMB, UMD si UME.
2.2.4. Tipizarea SCCmec
A fost realizata prin multiplex PCR folosind schema propusa de catre Milheirico si colab. (). Urmatoarele tulpini de referinta au fost utilizate ca si control pozitiv al reactiei: COL (SCCmec tip I), BK2464 (SCCmec tip II), ANS46 (SCCmec tip III), MW2 (SCCmec tip IVa), WIS (SCCmec tip V), HDE288 (SCCmec tip VI).
2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați
Cele 22 izolate din UMA au fost pozitive pentru gena nuc si negative pentru genele ce codifica factorii de virulenta PVL, SEA-SEE, ETA, ETB, TSST1.
Cele 69 izolate din UMB provin dintr-un focar de TIA si au fost pozitive pentru enterotoxinele A, B, C, D astfel: 38/ 69 (55.07%) au fost pozitive pentru ambele gene seA si seD; 7/ 69 (10.14%) pozitive pentru gena seA; 1/ 69 (1.45%) pozitiv pentru gena seB; 2/ 69 (2.90%) pozitive pentru gena seC; 1/ 69 (1.45%) pozitiv pentru gena seD (figura …).
De modificat
Figura X. Distributia genelor de virulenta in tulpinile de S. aureus izolate din UMB
Cele 28 tulpini izolate din UME au fost pozitive pentru gena nuc, iar 13 izolate au fost pozitive pentru genele lukS/F-PV.
Figura …
Distributia pe factori de virulenta a izolatelor de S. aureus din UME
Cele 42 tulpini izolate din UMF au fost pozitive pentru gena nuc, 20 izolate (47.62%) au fost pozitive pentru genele lukS/F-PV, 2 izolate (4.76%) au fost pozitive pentru gena tst1, un izolat (2.38%) a fost pozitiv pentru gena seB, iar 3 izolate (7.14%) au fost pozitive pentru gena seC.
Figura X. Distributia pe factori de virulenta a tulpinilor de S. aureus izolate din UMF
Cele 29 tulpini izolate din UMG au fost pozitive pentru gena nuc, un izolat (3.45%) a fost pozitiv pentru genele lukS/F-PV, 4 izolate (13.79%) au fost pozitive pentru gena tst1, 3 izolate (10.34%) au fost pozitive pentru gena seA, iar 4 izolate (13.79%) au fost pozitive pentru gena seC.
Figura X. Distributia pe factori de virulenta a tulpinilor de S. aureus izolate din UMG
2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMA este prezentata in figura X.
Figura …. Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMA
Prevalenta a fost de 100% (22/ 22) in ceea ce priveste rezistenta la penicilina a tulpinilor izolate din UMA. Prevalenta tulpinilor MRSA a fost de 90.91% (20/ 22), iar la E de 90.91% (20/ 22). La cele 20 izolate MRSA s-a intalnit fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta la K a fost de 90.91% (20/ 22), la CN a fost de 86.36% (19/ 22) ceea ce explica aceeasi prevalenta la TOB fiind intalnit fenotipul de rezistenta KTG (la kanamicina, tobramicina, gentamicina). Prevalenta la TE a fost de 90.91% (20/ 22), iar la QD (20/ 22) prevalenta este de 90.91% fiind raportate rezistente dupa fenotipul MLSBi.
Toate cele 22 de izolate rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 20 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IVE, cele rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, cele rezistente la CN (n = 19) au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar cele rezistente la TE au fost pozitive pentru gena tetK.
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMD este prezentata in figura X.
Figura …
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMD
Prevalenta a fost de 100% (32/ 32) in ceea ce priveste rezistenta la penicilina a tulpinilor izolate din UMD. Prevalenta tulpinilor MRSA a fost de 93.75% (30/ 32), iar la E de 96.88% (31/ 32). La 31 izolate (96.88%) S. aureus s-a intalnit fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta la K a fost de 96.88% (31/ 32), la CN de 96.88% (31/ 32), la TOB de 96.88% (31/ 32) ceea ce explica aceeasi prevalenta la TOB fiind intalnit fenotipul de rezistenta KTG, la CIP de 3.13% (1/ 32), la TE a fost de 96.88% (31/ 32), la C de 3.13% (1/ 32), iar la QD (31/ 32) prevalenta este de 96.88% fiind raportate rezistente dupa fenotipul MLSBi.
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UME este prezentata in figura X.
Figura …
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UME
Prevalenta a fost de 92.85% (26/ 28) in ceea ce priveste rezistenta la penicilina a tulpinilor izolate din UME. Prevalenta tulpinilor MRSA a fost de 67,85% (19/ 28), iar la E de 57,14% (16/ 28). La 4 izolate (14.29%) S. aureus s-a intalnit fenotipul de rezistenta MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta la K a fost de 71.43% (20/ 28), la TE a fost de 7.14% (2/ 28), iar 1 tulpina (3.57%) a fost intermediara la TE, iar la QD (4/ 28) prevalenta este de 14.29% fiind raportate rezistente dupa fenotipul MLSBi.
Toate cele 26 de izolate rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 19 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (16 izolate) si IVE (3 izolate). Trei tulpini cu rezistenta fenotipica la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC, iar un izolat a fost pozitiv pentru gena ermA. O tulpina rezistenta doar la E a fost pozitiva pentru gena ermC. 2 tulpini rezistente la TE si una intermediara la TE au fost pozitive pentru gena tetK.
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMF este prezentata in figura X.
Figura …
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMF
Prevalenta a fost de 95.24% (40/ 42) in ceea ce priveste rezistenta la penicilina a tulpinilor izolate din UMF. Prevalenta tulpinilor MRSA a fost de 59.52% (25/ 42), la E de 50% (21/ 42), iar 1 tulpina (2.38%) a fost intermediara la DA. La un procent de 40.48% (17/ 42) s-a intalnit fenotipul MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta la K a fost de 52.38% (22/ 42), la CIP de 4.76% (2/ 42), la TE a fost de 40.48% (17/ 42), la C a fost de 4.76% (2/ 42), la QD a fost de 40.48% (17/ 42) fiind raportate rezistente dupa fenotipul MLSBi, iar la FD a fost de 7.14% (3/ 42).
Toate cele 40 de izolate rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 25 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IV (9 izolate) si IVE (15 izolate). O tulpina nu a putut fi incadrata in nici un tip SCCmec cu ajutorul schemei utilizate. Toate tulpinile rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC. Tulpinile rezistente fenotipic la TE au fost pozitive pentru gena tetK.
Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMG este prezentata in figura X.
Figura X. Distributia rezistentei la antibiotice a tulpinilor de S. aureus izolate din UMG
Prevalenta a fost de 93.10% (27/ 29) in ceea ce priveste rezistenta la penicilina a tulpinilor izolate din UMG. Prevalenta tulpinilor MRSA a fost de 17.24% (5/ 29), la E de 48.28% (14/ 29), iar 3 tulpini (10.34%) au fost intermediare la DA. La un procent de 44.83% (13/ 29) s-a intalnit fenotipul MLSBi, aceste tulpini fiind raportate rezistente la DA. Prevalenta la K a fost de 48.28% (14/ 29), la CN de 13.79% (4/ 29), la NOR de 6.90% (2/ 29), la CIP de 6.90% (2/ 29), la TE a fost de 44.83% (13/ 29), iar 2 tulpini (6.90%) au fost intermediare la TE. La RD prevalenta a fost de 3.45%, iar 9 tulpini (31.03%) au fost intermediare. La QD a fost de 44.83% (13/ 29) fiind raportate rezistente dupa fenotipul MLSBi, iar 3 tulpini (10.34%) au fost intermediare. La FD a fost de 17.24% (5/ 29).
Toate cele 27 de izolate rezistente fenotipic la P au fost pozitive pentru gena blaZ. Cele 5 izolate rezistente la FOX au fost pozitive pentru gena mecA, situata in caseta cromosomala SCCmec de tip IVE. Toate tulpinile rezistente fenotipic la E si DA (cu MLSBi) au fost pozitive pentru gena ermC. 12 tulpini (41.38%) rezistente la TE au fost pozitive pentru gena tetK, iar o tulpina a fost pozitiva pentru gena tetM. Tulpinile intermediare la TE au fost negative pentru genele tetK si tetM. Doua tulpini (6.90%) rezistente la CN au fost pozitive pentru genele aacA-aphD, iar alte doua tulpini rezistente au fost negative.
Incadrarea tulpinilor din UMA, UMD si UME in profiluri PFGE
Tulpinile MRSA din UMA au fost incadrate in doua profiluri PFGE notate A si B, ……….
Cele 32 tulpini de S. aureus din UMD au fost incadrate in trei profiluri PFGE notate A, B, C. Cele incadrate in profilul PFGE A au prezentat doua subtipuri notate A1 si A2.
Cele 28 tulpini de S. aureus din UME provenite din cele 2 focare au fost incadrate in diferite profiluri (tipuri) PFGE notate cu A, B, C, D, E, F, G, H, I, J. 3 dintre aceste tipuri au fost incadrate si in subtipuri astfel: D cu subtipurile D1 si D2; E cu subtipurile E1 si E2; G cu subtipurile G1 si G2.
Incadrarea in tipuri spa a tulpinilor izolate din UMA, UME, UMF si UMG.
Cele 20 izolate MRSA din UMA au fost incadrate in tipul spa t127, iar izolatele MSSA (2) in tipurile spa t616 si t1556.
Cele 28 tulpini de S. aureus din UME s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa (figura X): t002 (n = 3), t008 (n = 12), t015 (n = 3), t056 (n = 1), t127 (n = 4), t279 (n = 1), t330 (n = 1), t616 (n = 1), t620 (n = 1) si un tip nou t13462, introdus pentru prima data in baza internationala de date Ridom SpaServer.
Figura X. Distributia in tipuri spa a tulpinilor izolate din UME
Cele 42 tulpini de S. aureus din UMF s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa (figura X) astfel: cel mai prevalent tip spa a fost t127 (30.95%, 13/ 42), urmat de t044 (11.90%, 5/ 42), t008 (7.14%, 3/ 42), t284 (7.14%, 3/ 42), t019 (4.76%, 2/ 42), t2881 (4.76%, 2/ 42) si alte 14 tipuri spa cu 2.38% (1 tulpina din fiecare: t005, t091, t174, t223, t280, t355, t435, t437, t948, t1211, t1889, t5841, t14512 si t14513).
Figura X. Distributia in tipuri spa a tulpinilor de S. aureus izolate din UMF
Cele 29 tulpini de S. aureus din UMG s-au incadrat in urmatoarele tipuri spa (figura X) astfel: cel mai prevalent tip spa a fost t127 (44.83%, 13/ 29), urmat de t005 (6.90%, 2/ 29), t021 (6.90%, 2/ 29) si alte 12 tipuri spa cu 3.45% (1 tulpina din fiecare: t002, t012, t015, t053, t084, t559, t582, t620, t701, t728, t7585, t15296).
Figura X. Distributia in tipuri spa a tulpinilor de S. aureus izolate din UMG
Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMA este prezentata in tabelul X.
Tabelul X. Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMA
Principalele pattern-uri de rezistenta la antibiotice intalnite la tulpinile izolate din UMD este prezentata in tabelul X
Tabelul X. Principalele pattern-uri de rezistenta la antibiotice intalnite la tulpinile izolate din UMD
Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UME este prezentata in tabelul X.
Tabelul X. Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UME
(I)* – Intermediar
Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMF este prezentata in tabelul X.
Tabelul X. Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMF
Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMG este prezentata in tabelul X.
Tabelul X. Corelatia dintre patternul de rezistenta la antibiotice, MSSA/ MRSA, tipul spa si PVL la tulpinile din UMG
(I)* – Intermediar
2.3.5. Analiza fenotipica si genotipica a unei tulpini de S. hominis izolata din UMH
Din UMH s-a izolat o tulpina de S. hominis rezistenta la linezolid.
Izolatul a fost sensibil la SXT si vancomicina (valoarea CMI = 3 µg/ mL) (figura X) si rezistent la P, FOX, E, DA, K, CN, TOB, CIP< TE, RD, C, QD, LZD.
Valoarea CMI la linezolid a aratat o rezistenta de nivel inalt (>128 µg/mL) (figura X).
Un amplicon de marimea asteptata a fost obtinut prin PCR pentru gena cfr (figura X). Secventa genei cfr obtinuta a fost comparata cu secventa salvata in baza de date National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Prin secventierea si compararea secventei genei regiunii domeniului V 23S ARNr cu secventa genei 23S ARNr de la S. aureus (GenBank accession no. X68425.1), o singura mutatie punctiforma a fost detectata in pozitia 2603, prin substituirea nucleotidului G cu T (figura X).
Aceasta mutatie a fost detectata ca fiind implicata in rezistenta la linezolid.
Figura 4. Mutatia punctiforma in pozitia 2603 in regiunea domeniului V 23S ARNr (BioEdit Sequence Alignment Editor)
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România [311090] (ID: 311090)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.