Compuşii biologic activi din Aloe vera (Aloe barbadensis) şi Mușețel (Camomila oficinalis) cu aplicaţii în dermatologie [310913]

UNIVERSITATEA „DUNĂREA DE JOS” GALAȚI

FACULTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

SPECIALIZAREA: FARMACIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific:

Prof.dr.habil. Rodica Mihaela DINICĂ

Absolventă

Alina COSTACHE

GALAȚI

2019

CAPITOLUL 3 (4)- PARTEA EXPERIMENTALĂ

DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ANTIOXIDANTE ȘI ANTIMICROBIENE A UNOR COMPUȘI BIOACTIVI DIN ALOE BARBADENSIS ȘI MATRICARIA CHAMOMILLA

(4)3. 1. Scopul lucrării

În cadrul acestei lucrări de licență am ales să studiem principiile active din Aloe vera (Aloe barbadensis) și Mușețel (Matricaria chamomilla).

[anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat], enzime, saponine.

Principalele componente ale mușețelului sunt: apigenina, terpinen-4-ol, 1,8-cineol, gamma-terpinen, p-cimen și alte terpene. Uleiul de mușețel este unul dintre cei mai buni dezinfectanți.

[anonimizat], soluții, săpunuri, în scopul ameliorării simptomelor bolii.

Evaluarea eficienței principiilor active din Aloe vera și Mușețel în combaterea afecțiunilor dermatologice.

[anonimizat].

(4)3.2 Obiectivele lucrării

Plantele care fac obiectul studiului au fost colectate și supuse la doua tratamente și anume de uscare și liofilizare în cadrul laboratorului de chimie organică.

Au fost supuse analizei cele două plante sub două forme:

– Aloe vera uscată și liofilizată,

– Mușețel uscat și liofilizat;

[anonimizat] a extractelor,

Identificarea cromatografica a [anonimizat] a extractelor obținute din cele două plante

Obținerea unui preparat farmaceutic cu extract din cele două plante.

(4) 3. 3 MATERIALE ȘI METODE

3.3.1. Metode de separare: extracția cu solvenți

Compușii bioactivi au fost separați din materialul vegetal prin extracție.

Extracția este una din operațiile de bază ale practicii chimiei organice fiind una din principalele metode de separare și purificare a substanțelor organice.

Extracția este operația prin care una sau mai multe componente ale unei faze (lichide sau solide) sunt transferate într-o altă fază (lichidă), [anonimizat].

Alegerea solventului este esențială pentru eficiența procesului de extracție și ține cont de:

– selectivitatea pentru componenta de extras;

– [anonimizat]-ul și starea ionică;

– solventul trebuie să fie cât mai pur pentru a nu modifica valoarea coeficientului de repartiție a lui Nernst;

– [anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat] a [anonimizat]:

A. [anonimizat] o [anonimizat];

B. [anonimizat], fiecăruia corespunzându-i o nouă repartiție la echilibru.

Obținerea extractelor hidroalcoolice

Mod de lucru: Cu ajutorul balanței analitice s-au cântărit câte 10g din fiecare probă de Aloe vera și câte 10 g din fiecare probă de mușețel. După cântărire plantele s-au tranzvazat într-câte un pahar Erlenmeyer. Pentru a se obține extractul, s-au adăugat peste planta triturată 100 g de etanol de 70°. Paharul a fost supus ultrasonării timp de două ore la o temperatura de aproximativ 400C, iar în final extractul obținut s-a filtrat.

Figura 3.1 Baie de ultrasunete model Bandelin Sonorex Digitec și unul din extractele obținute

3.3.2. Identificarea compușilor prin metoda cromatografică pe strat subțire

Cromatografia a fost descoperită de botanistul rus Tswet care în 1906 a separat o serie de pigmenți vegetali cum sunt clorofilele și xantofilele, din extracte în eter de petrol, pe o coloană de carbonat de calciu fin pulverizat.

Introducând un solvent în partea superioară a coloanei, el a constatat că zona intens colorată din capul coloanei se deplasează de sus în jos, iar componenții se separă în funcție de viteza lor de migrare și afinitatea lor față de faza staționară (CaCO3), în zone colorate distincte, sub formă de inele, care corespund diverșilor pigmenți separați.

Tswet a denumit acest proces de separare "cromatografie", termen care provine de la grecescul "chroma" (culoare) și "graphein" (a scrie).

Un rol important în dezvoltarea cromatografiei l-a avut Martin și Synge (premiul Nobel în 1962) care au descoperit în 1941 cromatografia de repartiție, care a stimulat cercetările în acest domeniu, ceea ce a dus la descoperirea proceselor intime de separare, la stabilirea parametrilor cromatografici și la dezvoltarea continuă a performanțelor de separare, detecție și de dozare ale metodelor cromatografice.(33)

Cromatografia reunește un grup important de metode de separare, care permit separarea, izolarea, identificarea și dozarea simultană a componenților din amestecuri complexe, pe bază de repartiții diferite a componentelor într-o fază staționară și una mobilă. Separarea compușilor prin cromatografie se datorează vitezei de migrare diferită a acestora de-a lungul fazei staționare, care este determinată de modul de distribuție a substanțelor, de separarea dintre cele două faze precum și de viteza de deplasare a fazei mobile.

Faza staționară poate fi un solid absorbant, un lichid depus pe suport solid, un schimbător de ioni sau un gel. Faza mobila poate fi un gaz sau un lichid. La intrarea în coloana cromatografică, faza mobilă poartă numele de eluent sau developant, iar la ieșire se numește efluent sau eluat.

Cea mai utilizată clasificare a metodelor cromatografice este cea care are la bază natura sau starea de agregare atât a fazei mobile cât și a celei staționare. Din punct de vedere al mecanismelor de separare, metodele cromatografice se grupează după principalele interacții fizico-chimice care apar între faza staționară și componentele amestecului, în timpul procesului de sorbție- desorbție.

Sediul procesului de separare cromatografică este coloana cromatografică, faza în care se depune faza staționară. În funcție de forma coloanei în care este depusă faza staționară se disting:

– cromatografia pe coloană închisă;

– cromatografia pe tub deschis;

– cromatografia plană;

– cromatografia pe filament.

Metodele cromatografice pot fi utilizate în scop analitic sau preparativ.

Pentru efectuarea separărilor și analizelor cromatografice se parcurg următoarele etape:

– pregătirea probelor;

– aducerea în contact a amestecului de separat cu faza staționară;

– separarea cantitativă (developarea);

– detecția componentelor prin metode fizico-chimice adecvate.

O analiză cromatografică se rezumă în general la următoarele concepte fundamentale:

– proba este dizolvată în faza mobilă;

– faza staționară este cel mai frecvent un lichid adsornit la suprafața unor particule de solid utilizate pentru a împacheta coloane;

– faza mobilă este trecută peste faza staționară nemiscibilă – aceasta se numește eluție;

– solutul care are o mare afinitate față de faza mobilă se va mișca prin coloană foarte încet;

– componenții probei se vor separa în benzi discrete vizibile la detector și rezultă cromatograma.

Cromatografia este utilizată pentru:

– analiză – examinarea amestecului, a componentelor sale și relațiile dintre acestea;

– identificare – determinarea unui amestec sau componente pe baza unor componente deja cunoscute;

– purificare – separarea componentelor pentru a izola unul dintre ele ce prezintă interes pentru studii ulterioare;

– cuantificare – determinarea cantității amestecului și/sau a componentelor prezente în probă.

Cromatografia în fază lichidă – separă probe de lichid cu un solvent lichid ( faza mobilă) și cu o coloană compusă din microsfere solide (faza fixă).

Cromatografia în fază gazoasă – separă probe de vapori cu un gaz transportor (faza mobilă) și o coloană de microsfere lichide sau solide (faza fixă).

Cromatografia pe hârtie – separă probe de lichide uscate cu un solvent lichid (faza mobilă) și o bandă de hârtie (faza fixă).

Cromatografia în strat subțire – separă probe de lichide uscate cu un solvent lichid (faza mobilă) și o farfurie de sticlă acoperită cu un strat subțire de alumină sau silicagel.

Cromatografia pe strat subțire

Tehnica de cromatografie pe strat subțire are o serie de avantaje foarte importante față de alte tehnici cromatografice dintre care se pot menționa următoarele: sunt simple, rapide, sunt economicoase și accesibile oricărui laborator de analiză și control, se utilizează cantități foarte mici de substanță (probe) și au o mare putere de rezoluție.

Cele mai importante aplicații ale cromatografiei planare, mai ales pe strat subțire sunt utilizate în scop analitic calitativ (separare și detecție) și cantitativ (dozare) pentru analiza unor produse vegetale, a unor medicamente și a numeroase substanțe de interes biologic.

Dar pentru obținerea unor rezultate de înaltă încredere anlitică este necesară utilizarea unor substanțe etalon de foarte bună calitate, certificate de firme de prestigiu.

Un alt aspect important este detecția compușilor separați care adesea sunt incolori, de aceea pentru vizualizarea lor trebuie să se folosească reacții de culoare sprecifice sau selective, prin pulverizarea cromatogramelor cu soluții de reactivi, când se obțin spoturi (pete) colorate caracteristic.

Se poate face și detecția prin expunerea la radiații UV, procedeu care poate fi aplicat și pentru deerminări cantitative cu ajutorul unui fotodensitometru.

Cromatgrafia pe strat subțire este foarte asemănătoare cu cromatografia de lichide, din punctul de vedere al teoriei, naturii fazelor staționare și mobile ca și din puunctul de vedere al aplicațiilor.

De aceea, cromatografia pe strat subțire fiind mult mai puțin costisitoare și mai rapidă se poate utiliza la stabilirea condițiilor optime pentru separarea prin cromatografie de lichide pe coloană.

Prin cromatografie pe strat subțire se pot separa ioni anorganici, complecși organo-metalici precum și compuși organici din probe variind de la micrograme la grame.

Ca fază staționară se utilizează un strat subțire de 0,1-0,25 mm de suport depus pe o suprafață solidă rigidă la care aderă, de exemplu: placă de sticlă, sau pe o suprafață solidă suplă cum este folia de aluminiu sau de material plastic, de pe care se pot decupa spoturile care înglobează analiții, pentru analiza lor separată.

Suporturile de fază staționară trebuie să aibă o anumită granulație exprimată în µm și în meshi, așa cum se poate observa în următorul tabel.

Tabelul 3.1 Exprimarea mărimii particulelor în mm și în mesh

Cele mai utilizate faze staționare sunt cele de silicagel, alumină, pulbere de celuloză. Silicagelul se poate utiliza ca atare sau se pot grefa pe suprafața particulelor sale grupări RP18, RP8, RP2 sau grupări –CN, -NH2, C6H5-, etc.

Plăcile cu straturi subțiri pot avea diverse dimensiuni, mai utilizate fiind cele de 5×5 cm, 5×20 cm, 10×20 cm și 20×20 cm. Pentru cromatografia preparativă grosimea stratului subțire este de 1-2 mm, iar pentru cromatografia analitică de cca 10 ori mai mică, deci de 0,1-0,25 mm.

În cromatografia pe strat subțire, un spot de probă este aplicat peste o bucată de hârtie sau de sticlă având faza staționară impregnată. Capătul suprafeței de hârtie sau sticlă este apoi scufundată într-o cantitate de solvent, care servește ca fază mobilă. Solventul migrează de-a lungul fazei staționare, separând componenții probei în lungul drumului său. Când solventul ajunge în vecinătatea părții superioare, este înlăturată cantitatea suplimentară de solvent și este lăsat să se usuce.

Cromatografia în strat subțire, rapidă și foarte flexibilă, este utilizată pentru o gamă largă de substanțe. Fiind un pionier în cromatografia pe strat subțire, Merck a introdus pe piață primele plăci pre-acoperite. Astăzi, se găsesc o gamă largă de plăci fiabile și se aduc pe piață produse noi în mod regulat.

Metodele cromatografiei în strat subțire, indiferent dacă sunt manuale sau automate, oferă o serie de avantaje. Reduc costurile, elimină instrumentele complicate și etapa de pregătire a probelor, sunt ușor de reprodus și permit utilizarea de probe multiple în condiții identice. Mai mult, metodele cromatografiei pe strat subțire pot fi transpuse ușor la scală preparativă (cromatografie preparativă în strat subțire).

Mod de lucru: Placa cromatografică utilizată a fost de silicagel. Aceasta se decupează la dimensiunile cerute de bacul cromatografic și de numărul de spoturi care urmează a fi depuse. Plăcile pentru strat subțire sunt pregătite în prealabil și activate. Ele au dimensiuni standard, iar adsorbantul se alege după natura componenților și amestecul de solvent pentru eluție.

Amestecul de solvent se introduce în camera de cromatografie și se atașează capacul pentru a ajunge la saturație de vapori. Amestecul a fost obținut din acetat de etil, metanol și apă în proporție de 10:3:1.

Proba de analizat, dizolvată în general într-un solvent se aplică la baza plăcii cromatografice la 10-20 mm de margine.

S-au utilizat 4 extracte alcoolice din Aloe vera uscata și liofilizată și respectiv extracte din Mușețel uscat și liofilizat și un martor apigenina.

Probele au fost aplicate pe plăci în concentrație minim 0,01% din componentele de separație, însă nu trebuie să fie foarte concentrate, deoarece la concentrații mari separarea va deveni difuză.

Figura 3.2. Identificarea cromatografică a extractelor

După aplicarea probelor, locurile de depunere trebuie să fie uscate foarte bine. După evaporarea solventului de extracție, placa cromatografică se introduce în camera de developare care conține faze mobile.

După ce developantul a atins distanța de deplasare prevăzută, placa sau hârtia cromatografică se scoate și se usucă, trecându-se la detecția componenților.

3.3.3 Analiza spectrofotometrică UV-Vis

Spectrometria în UV-VIS se aplică în domeniul spectral 180-110 nm, deci între ultravioletul apropiat, domeniu în care se obțin mai puține informații structurale (mai ales pentru compușii nesaturați), dar se obțin date importante pentru analiza cantitativă a compușilor organici medicamentoși a unor complecși metalici ai acestora.

Domeniul spectral UV-VIS este alcătuit de fapt din trei zone spectrale și anume:

– ultravioletul apropiat, cuprins între 185-400 nm;

– vizibilul, cuprins între 400-700 nm;

– infraroșul foarte apropiat, cuprins între 700 și 1100nm.

În practica analitică, domeniul spectral UV-util este domeniul UV apropiat, cuprins între 200 și 380 nm, iar domeniul spectral VIS-util este cuprins între 380 nm și 780 nm.

Spectrometria UV-VIS este utilizată mai ales pentru determinări cantitative, bazate pe absorbția radiațiilor din domeniile menționate mai sus, absorbție care este proporțională cu concentrația analitului, într-un domeniu de concentrații dat, în care există o relație liniară între absorbanță și concentrație.

Spectrele de absorbție din domeniul vizibil și ultraviolet implică tranzițiile electronilor. Aceste tranziții au loc între starea fundamentală și o stare electronică excitată a moleculelor, fiind permise și tranzițiile ce au loc între orbitalii moleculari de același tip și care au loc cu conservarea spinului electronic. Intensitatea benzilor de absorbție depinde de probabilitatea producerii tranzițiilor electronice implicate în absorbția energiei.

Pe lângă conservarea spinului, există anumite reguli de selecție, tranzițiile permise de aceste reguli conducând la absorbții caracterizate prin coeficienți molari de extincție (E), cu valori cuprinse între 104-105, tranzițiile "interzise" având coeficienți molari de extincție cuprinși între 1-103. De aceea aceste reguli trebuiesc luate în sensul probabilității de tranziție între două stări.

Conform regulilor de selecție sunt interzise tranzițiile între stări care au aceeși simetrie a distribuției electronice. O măsură a variației distribuției sarcinii electronice la trecerea de la starea fundamentală la cea excitată este momentul de tranziție, astfel regula de selecție prevede obligativitatea existenței unui moment de tranziție diferit de zero pentru ca tranziția să fie admisă. Probabilitatea tranziției, deci și intensitatea benzii de absorbție este proporțională cu pătratul momentului de tranziție.

Majoritatea benzilor de absorbție se datoarează unor tranziții în care sunt implicate modificări ale momentului electric de dipol. Momentul de tranziție este caracterizat nu numai prim mărimea dar și prin direcția sa în moleculă, direcție ce trebuie să coincidă cu direcția vectorului electric al radiației excitatoare.

Tranziții σ→σ* au loc la absorbția radiațiiilor luminoase din domeniul ultravioletului de vid (λ~180 nm), domeniu greu accesibil din punct de vedere experimental.

Tranzițiile π→ π* sunt caracteristice legăturilor delocalizate, benzile corespunzătoare acestor tranziții sunt relativ intense și sunt puternic influențate de mărimea porțiunii conjugate a moleculei.

Tranzițiile n→σ* și cele n→ π* sunt situate la lungimi de undă mai mari decât benzile σ→σ* , respectiv π→ π* și sunt de intensitate mai mică deoarece corespund unor tranziții electronice teoretic interzise.

Ele sunt mai puțin influențate de dimensiunea moleculei, orbitalele n, corespunzătoare electronilor neparticipanți, fiind localizate pe heteroatomi. Numai compușii care au legături π vor prezenta benzi de absorbție în UV-VIS.

Din punct de vedere praactic, al informațiilor ce se pot obține cu privire la structura moleculară, semnificativ este domeniul 180-800 nm, pentru care sunt construite majoritatea spectrofotometrelor. Regiunea ultravioletă este divizată, din motive experimentale, în două porțiuni distincte:

– ultravioletul de vid;

– ultravioletul de cuarț.

Ultravioletul de vid, sau ultravioletul îndepărtat, reprezintă domeniul sub 200 nm, limită sub care oxigenul din aer absoarbe puternic și face imposibile măsurătorile. Din această cauză măsurătorile au loc în atmosferă de gaz inert (azot sau argon).

Ultravioletul de cuarț, sau mai simplu ultravioletul, reprezintă domeniul peste 200 nm. În acest domeniu se lucrează cu sticlă de cuarț, care este transparentă pentru radiațiile UV. Spectrele electronice sunt cele mai complexe spectre, tranzițiile electronice implicând și tranziții între nivele de rotație și vibrație, acestea având un caracter de bandă.

În spectrometria de absorbție în UV-VIS se măsoară de regulă absorbanța, care este proporțională cu concentrația analitului, conform legii Lambert-Beer, utilizând relațiile

A=log=log=a•b•c; a=

sau:

A=ɛ•b•c

de unde:

c= și ɛ=

în care:

A – absorbanța și a – absorbtivitatea;

b – grosimea stratului de soluție, deci a cuvei, în cm;

c – concentrația analitului determinat;

ɛ – absorbanța molară (în L/cm•mol) și ea este egală cu ɛ= a•M și este independentă de concentrație.

Poziționarea benzilor de absorbție și intensitatea acestora este influențată atât de natura substituienților (grupărilor funcționale) prezenți în moleculă cât și de solventul în care este dizolvat compusul. Efectele întâlnite sunt:

-efect batocrom – deplasarea maximelor de absorbție spre lungimi de undă mai mari;

-efect hipsocrom – deplasarea maximelor de absorbție spre lungimi de undă mai mici;

-efect hipercrom – creșterea intensității de absorbție;

-efect hipocrom – scăderea intensității de absorbție.

Substituienții care fac ca absorbția să aibă loc în UV-VIS sunt grupări cromofore și sunt în general grupările cu electroni π care pot interacționa cu sistemul de electroni π din restul moleculei, extinzând în felul acesta delocalizarea: -NO2, -NO, -CHO, -COOH.

Substituienții care alături de cromofori produc atât modificarea poziției cât și intensitatea absorbanței sunt grupări auxocrome. Acestea sunt grupări saturate de atomi de tipul: –OH, -NH2, -Cl.

Dintre încercările de sistematizare și clasificare a benzilor de absorbție, deși nu unanim recunoscută trebuie menționată cea care face următoarele diferențieri:

-benzi R (radicalice) – sunt benzi „interzise” datorită tranzițiilor n→ π* a unor grupări nesaturate simple ca: >C=O și –NO2;

-benzi K (conjugate) – datorate tranzițiilor π→ π* în moleculele nesaturate cu legături conjugate;

-benzi B (benzenoidice) – caracteristice moleculelor aromatice și heteroaromatice; se prezintă ca niște benzi largi cu coeficienți de extincție relativ mici (ex. benzenul prezintă o bandă largă, cu tendința vizibilă de structură fină de vibrație în regiunea 230-270 nm);

-benzi E (etilenice) – ca și cele B sunt caracteristice tot moleculelor aromatice, fiind atribuite tranzițiilor electronice ale sistemului de trei legături duble etilenice într-o conjugare ciclică.

O altă clasificare folosește următoarea nomenclatură a benzilor: N→V pentru tranzițiile de tip π→ π*, N→A sau N→Q pentru cele n→ π* și N→B pentru cele n→σ*. Spectrele UV ale compușilor aromatici se diferențiază net de cele ale polienelor, datorită conjugării specifice stării aromatice.

Benzile de absorbție din spectrele electronice sunt influențate în poziție, intensitate și semilățime de solventul utilizat. Efectul de solvent este direct legat de gradul de interacțiune dintre solvent si solvit.

Modificările din spectre pot fi puse pe seama interacțiilor dipol-dipol, a formării compușilor cu transfer de sarcină. Deplasările benzilor electronice datorită efectelor de solvent se explică prin solvatarea diferită a stării fundamentale și a celei excitate, ca rezultat al diferenței in distribuția de sarcină dintre cele două stări.

O deplasare batocromă este cauzată de o mai mare solvatare a stării excitate în comparație cu cea fundamentală, pe când o deplasare hipsocromă este urmarea unei solvatări mai mari a stării fundamentale.

Efectul de solvent poate fi folosit la determinarea tipului de tranziție electronică întrucât benzile π→ π* se deplasează batocrom cu creșterea polarității solventului în timp ce benzile n→ π* se deplasează hipsocrom la trecerea de la un solvent nepolar la unul polar. Solvatarea puternică a nivelelor n se datorează interacției puternice dintre dipolii solventului și electronii neparticipanți localizați pe heteroatomi.

Cu ajutorul spectrelor electronice se pot obține informații cu privire la natura cromoforilor și la poziția lor relativă față de alte elemente structurale, se pot trage concluzii cu privire la stereochimia moleculelor, la existența legăturilor de hidrogen, a efectelor de conjugare, la influența solvenților. Pe baza comparării a numeroase spectre a unor serii de structuri similare s-a dezvoltat o spectrometrie UV-VIS empirică, ce oferă o serie de informații cu caracter general privind natura compușilor.

Marele avantaj și aport al spectroscopiei UV-VIS este acela că oferă o metodă comodă, dar în același timp modernă și performantă, ce se dovedește a fi de o mare utilitate în studiile analitice, în studiul vitezelor de reacție și a echilibrelor chimice, în elucidarea mecanismelor de reacție și al interacțiilor intermoleculare.

3.3.4 Determinarea activității antioxidante – metoda DPPH

Antioxidanții sunt substanțe chimice care au proprietatea de a neutraliza substanțele periculoase pentru organism, numite radicali liberi. Aceștia atacă membranele celulare și produc dereglări ale funcționării normale, ajungând chiar la distrugerea lor.

Antioxidanții se pot clasifica după funcția și natura lor:

După funcția principală pe care o îndeplinesc:

– propriu-ziși (antioxidanți primari);

– substanțe care prezintă acțiune antioxidantă, dar în egală măsură și alte funcții.

După natura lor, aceștia pot fi:

– naturali (tocoferoli);

– de sinteză.

Alături de antioxidanții propriu-ziși se utilizează și substanțe ce pot întări acțiunea antioxidanților primari. Aceste substanțe poartă denumirea de substanțe sinergetice sau substanțe de complexare a metalelor.

Radicalii liberi există în organismul uman ca intermediari în procese de oxido-reducere, având roluri multiple, demonstrate deja: funcționale, de comunicare intercelulară, distructive, citolitice.

Se încearcă obținerea unei imagini cât mai clare în ceea ce privește rolul exercitat de RL în organism, atât în condiții normale, homeostazice, cât și în condiții patologice. Există o serie de date interesante privitoare la implicarea lor în deteriorarea membranelor celulare, creșterea permeabilității celulare, procese de îmbătrânire, etc.

Radicalii liberi reprezintă molecule sau fragmente moleculare ce conțin un electron impar. Moleculele organice prezintă un număr par de electroni, fiecare orbital al moleculei fiind ocupat de doi electroni ce prezintă moment magnetic cu spini opuși. Astfel, RL prezintă următoarele proprietăți:

-conțin unul sau mai mulți electroni impari;

-pot fi neutri sau încărcați cu sarcini pozitive sau negative;

-posedă o reactivitate chimică mare, dependentă de temperatură și concentrație. (46)

Radicalii liberi din organismul uman provin în primul rând din procesele de oxidare, derulate de organism pe fond de stres, stări emoționale negative și nu în ultimul rând de la toxicele provenite exogen și ajunse în organismul uman pe diferite căi (alcool, tutun , medicamente, poluare, etc.).

Din punct de vedere al naturii elementului care conține electroni neîmperecheați, radicalii liberi pot fi clasificați în:

A. RL ai oxigenului;

B. RL ai azotului;

C. Compuși aromatici;

D. Compuși de tip chinonic și semichinonic;

E. Acizi nucleici;

F. Radicalul thiil.

Activitatea antioxidantă utilizând radicalul 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) s-a determinat conform metodei descrise de Bozin, Mimica-Dukic, Samojlik, Goran și Igic (2008).

Pentru determinarea activității antioxidante s-au utilizat următoarele probe de analizat:

Extract alcoolic de Aloe vera uscată, Au,

Extract alcoolic de Aloe vera liofilizată, Al,

Extract alcoolic de Mușețel uscat, Mu,

Extract alcoolic de Mușețel liofilizat, Ml,

Modul de lucru: Proba de analizat s-a obținut prin adăugarea într-o eprubetă a unui volum de 0,5 mL de extract alcoolic, 1 mL de soluție DPPH de concentrație 3.5 miligrame/100 mL (în soluție de metanol 95%) și s-a adus la un volum final de 4 mL cu soluție de metanol de concentrație 95%.

Proba martor s-a obținut prin amestecarea a 1 mL DPPH cu 3 mL metanol.

Absorbanța soluțiilor rezultate și a probei martor s-a înregistrat după o oră repaus la temperatura camerei. S-au realizat câte două determinări pentru fiecare probă în parte. Dispariția radicalului DPPH s-a măsurat spectofotometric la o lungime de undă de 515 nm. Capacitatea de a anihila radicalii (RSC – radical scavenging capacity), exprimată ca procent, s-a calculat utilizând următoarea ecuație:

3.3.5 Determinarea activității antimicrobiene

În prezent, numeroase ramuri industriale din domeniul alimentar, farmaceutic sau cosmetic caută surse alternative, naturale, fără impact negativ asupra consumatorilor și implicit asupra mediului înconjurător, pentru acele componentele care prezintă acțiune antioxidantă și antimicrobiană.

Scopul studiului a constat în determinarea activității antimicrobiene a speciilor de A.barbandensis și M.chamomilla asupra unor tulpini bacteriene.

Studiul s-a desfășurat în luna iunie 2019 în cadrul laboratorului de Bacteriologie al Spitalului Clinic de Urgență pentru Copii “ Sfântul Ioan ” din Galați.

Determinarea activității antimicrobiene a extractelor hidroalcoolice din celor două specii asupra unor tulpini de referință utilizând metoda difuzimetrică Kirby-Bauer.

Astfel, pentru a demonstra activitatea antimicrobienă, am folosit antibiograma difuzimetrică (Kirby-Bauer). Prin depunerea etractelor pe suprafața unui mediu solid, însămânțat cu suspensia bacteriană/fungică de testat, substanța antimicrobiană activa difuzează în mediu și realizează în jurul discului o zonă de inhibiție a culturii, în funcție de sensibilitatea culturii bacteriene/fungice. Germenele însămânțat nu crește în aria în care concentrația de extract depășește concentrația minimă inhibitorie.

Mediu folosit a fost:

– Mueller Hinton (bacterii Gram negative și Gram pozitive);

Citirea și interpretarea rezultatelor

– Dacă în jurul discului a existat o zonă de inhibiție a creșterii, atunci este sensibil (S);

– Dacă zona de inhibiție a avut un diametru de 0 mm, atunci este rezistent (R);

– Pentru antibioticele (Eritromicină și Streptomicina = 10 μg/disc) și antimicoticul (nistatin = 100 U.I./disc) folosite, interpretarea s-a făcut în funcție de standardul de referință CLSI 2012:

– Dacă diametrul zonei de inhibiție este la Streptomicină ≥ 15 mm, la Eritromicină > 20 mm și la nistatin ≥ 18 mm, atunci tulpina bacteriană este sensibilă;

– Dacă tulpina este sensibilă semnifică faptul că antibioticul/antimicoticul respectiv poate fi utilizat în terapia infecției cu germenul respectiv;

– Dacă diametrul zonei de inhibiție este la Streptomicină ≤ 12 mm, la Eritromicină < 19 mm și la nistatin ≤ 17 mm, atunci tulpina bacteriană este rezistentă;

Substanța antimicrobiană impregnată în disc, difuzează în mediu și realizează în jurul discului, o zonă de inhibiție a culturii, în funcție de sensibilitatea acesteia. După incubare, am citit numai plăcile care au prezentat o creștere a culturii corespunzătoare din punct de vedere al purității și al densității (cultură densă aproape confluentă). Am efectuat citirea cu ochiul liber, măsurând diametrul zonei de inhibiție în mm, de 2-3 ori în direcții diferite, cu ajutorul unei rigle.

Pentru mediul transparent, am făcut citirea direct pe fundul plăcii, iar pe plăcile cu geloză sânge măsurarea diametrelor zonei de inhibiție am realizat-o la suprafața mediului. Am luat în considerare:

– diametrele zonelor de inhibiție: zona lipsită de colonii microbiene vizibile cu ochiul liber, inclusiv diametrul discului cu antibiotic.

Tehnica de lucru pentru antibiograma difuzimetrică Kirby-Bauer

Tehica de lucru este reprezentată de metoda difuzimetrică standardizată Kirby-Bauer, conform următoarelor etape:

prepararea inoculului

însămânțarea acestuia

îmbibarea blank discurilor

depunerea extractelor și a discurilor

incubarea

citirea

Pentru fiecare tulpină bacteriană izolată în cultură pură, am realizat un inocul cu turbiditatea de 0,5 Mc Farland (1.5 x 10 8 CFU/ml), controlată nefelometric cu ajutorul echipamentului Densimat, conform IL-LAM-31.

Am folosit 4 colonii identice, pe care le-am suspendat în aproximativ 3 mililitri soluție salină pentru bacterii. Însămânțarea am realizat-o cu ajutorul unui tampon de vată steril, înmuiat în suspensia microbiană și stors bine prin rotirea lui apăsată pe peretele interior al tubului cu suspensie, pentru a îndepărta excesul de lichid și apoi am însămânțat, prin descărcarea tamponului în mod uniform pe suprafața mediului Am lăsat inoculul să se absoarbă în mediu timp de 5-10 minute apoi am depus discurile (microcomprimate cu antibiotice și rondele cu extract) cu ajutorul unei pense presând ușor pe suprafața mediului însămânțat, și am pipetat extractele uscate și liofilizate și alcoolul 70° pe discuri.

Se va respecta o distanță de ~ 15 mm de la marginea plăcii și ~ 30 mm între microcomprimate.

După aplicarea microcomprimatelor și a discurilor impregnate cu extract, se lasă acestea să adere la mediu 10-15 min, după care se termostatează la 37˚C.

Plăcile se plasează în poziție răsturnată, nu mai mult de trei plăci una deasupra celeilalte, în condiții de aerobioză. Durata incubării este de 16-18 ore.

Figura 3.3 Aranjarea plăcilor în termostat

(4)3.3.6. Realizarea unui unguent și a unui gel cu posibile proprietăți antiacneice

(4)3.3.6.1 Noțiuni generale despre unguente. Prepararea unguentelor

Pentru obținerea unguentelor se parcurg următoarele faze de lucru:

– pregătirea bazei de unguent;

– dispersarea substanțelor active în baza de unguent;

– ambalarea, etichetarea și expedierea unguentelor preparate.

1. Pregătirea bazei de unguent

Pentru prepararea unguentelor bazele sunt selectate în funcție de scopul terapeutic urmărit. La bazele de unguent oficinale în F.R.X, avem indicat modul de preparare în cadrul monografiei respective. La bazele neoficinale în F.R.X, prepararea se face în funcție de excipienții din compoziția bazelor cât și a substanțelor active care vor fi încorporate. [2]

– Prepararea bazelor de unguent conținând excipienți grași. Excipienții grași de consistență solidă, semisolidă sau lichidă se amestecă prin metoda fuziunii la cald pe baia de apă sau utilizând radiații infraroșii. Pentru a scurta timpul de omogenizare a bazei, bazele solide pot fi răzuite înainte de amestecare. După topirea amestecului de excipienți grași baza se filtrează pentru eliminarea eventualelor impurități, iar pentru filtrare se utilizează țesături din bumbac. După filtrare baza topită este amestecată într-un vas corespunzător până la răcire, operația fiind necesară pentru a evita formarea grunjilor (grunjii se formează datorită punctului de solidificare diferit al excipienților din compoziția bazei).

– Baze de unguent emulsii de tip A/U. Aceste baze se prepară prin topirea simultană a excipienților grași cu emulgatorii A/U pe baia de apă sau utilizând alte metode prin care cele două componente pot fuziona. După topire se adaugă soluția apoasă conținând substanțele active dizolvate (încălzită la aproximativ 70-80șC), adăugarea făcându-se treptat și amestecându-se continuu. Amestecarea poate avea loc manual, utilizând patentulă și pistil sau utilizând diferite aparate acționate electric, mecanic etc.

– Prepararea bazelor de unguent-emulsii U/A. Acest tip de baze se prepară în următorul mod: excipienții lipofili se topesc la 70-80șC, apoi se adaugă faza apoasă care conține substanța activă și emulgatorul, care în funcție de structura chimică se poate încorpora astfel:

– dacă emulgatorul este neionogen (Tween, Mirj etc.) acesta se topește simultan cu faza grasă pe baia de apă;

– dacă emulgatorul este ionogen (cationic sau anionic) acesta se va dizolva parțial sau total în faza apoasă, după care se emulsionează în baza grasă prescrisă;

– dacă emulgatorul utilizat este format din amestec de emulgatori cu proprietăți diferite se va proceda în felul următor: emulgatorul U/A se va dizolva în apă după care se va încorpora în faza hidrofilă, iar emulgatorul A/U se va dizolva odată cu fuziunea la cald a componentelor grase;

– dacă emulgatorul utilizat este format din ceruri emulgatoare prepararea are loc în următorul mod:

– în prima fază se obține cerura emulgatoare;

– în continuare cerura emulgatoare este încorporată într-o bază anhidră;

– apoi baza anhidră va fi hidratată.

După amestecarea fazei lipofile cu emulgatorii, respectiv soluția apoasă ca și la prepararea bazelor precedente, unguentul se va amesteca până la răcire. În soluția apoasă se vor adăuga conservanți potriviți.

– Gelurile cu polietilenglicol. Acest tip de geluri se prepară prin topirea componentelor lichide și a celor solide pe baia de apă, iar dacă este cazul se asociază cu excipienți grași utilizând emulgatori adecvați, omogenizarea continuându-se până la răcirea bazei. [2]

– Hidrogelurile. Se prepară prin hidratarea la rece sau alternând hidratarea la temperatură ridicată cu temperatură scăzută și aceasta în funcție de natura macromoleculei respective. Pentru prepararea unui gel corespunzător se vor utiliza auxiliari potriviți (umectanți, conservanți etc.).

– Unguente mixte. Acest tip de baze au în compoziția lor atât baze hidrofile (hidrogeluri, polietilenglicol, baze emulsii U/A) cât și baze grase. Cele două tipuri de baze se vor topi separat urmând ca amestecarea lor în stare topită să se realizeze la o temperatură corespunzătoare.

– Bazele de unguente oftalmice și nazale. Acest tip de baze datorită utilizării terapeutice (pe mucoasa nazală respectiv oftalmică) trebuie să îndeplinească anumite condiții și anume: să fie sterile, să aibă în compoziție baze emulsive. Pentru a corespunde calitativ, prepararea lor trebuie să aibă loc în condiții speciale care să asigure sterilitatea bazei și trebuie să conțină emulgatori adecvați, astfel încât baza rezultată să aibă proprietăți emulsive.

2. Dispersarea substanțelor active și auxiliare

Substanțele active și auxiliare pot fi introduse în baza de unguent în mai multe moduri:

– prin dizolvare, obținându-se unguente soluții;

– prin emulsionare, obținându-se unguente emulsii;

– prin suspendare, obținându-se unguente suspensii,

– sau mixt: prin suspendare și dizolvare, prin emulsionare și suspendare, prin emulsionare, dizolvare și suspendare etc. obținându-se unguente polifazice.

– Încorporarea substanțelor active prin dizolvare. Metoda constă în dizolvarea substanțelor solubile în faza lipofilă prin dizolvare la rece sau la cald (de exemplu: camfor se dizolvă în baze grase) sau a substanței hidrofile în baza hidrofilă (de asemenea la rece sau la cald) în funcție de solubilitatea substanțelor respective (de exemplu: ichtiol, salicilat de sodiu în baze hidrofile) urmată de amestecarea componentelor până la răcire.

Dezavantajul acestei metode este că din unguentul tip soluție unele substanțe pot recristaliza la răcire (sau în timp) mai ales în situația în care este depășită limita de solubilitate a substanței în baza respectivă.

– Încorporarea substanțelor active prin emulsionare. Substanțele active se dizolvă în faza în care sunt solubile și anume: cele lipofile în baza grasă iar cele hidrofile în apă, tipul de emulsie fiind dat de natura emulgatorului. Când se adaugă apă pentru dizolvarea substanțelor hidrosolubile, cantitatea de solvent adăugată se scade din cantitatea totală de bază prescrisă.

– Încorporarea substanțelor prin suspendare. Această metodă se aplică pentru substanțele care nu sunt solubile în baza de unguent. Pentru obținerea unguentelor suspensii substanțele active insolubile se pulverizează până la gradul de finețe corespunzător sitelor VIII sau IX iar pentru unguentele oftalmice astfel încât diametrul particulelor să nu fie mai mare de 50 µm (F.R.X). După pulverizarea substanței active se procedează în felul următor:

– când substanța activă insolubilă este prescrisă în concentrații sub 5% prepararea unguentului se realizează prin amestecarea substanței fin pulverizate cu ulei de parafină până la omogenizare (cantitatea de ulei de parafină utilizată se scade din cantitatea totală a bazei de unguent) după care se adaugă restul bazei de unguent prescrisă;

– dacă substanța activă insolubilă este prescrisă în concentrații mai mari de 5% prepararea unguentului suspensie se realizează în următorul mod: substanța activă insolubilă fiind pulverizată se amestecă cu o mică parte din baza de unguent topită până la omogenizare adăugându-se apoi treptat, treptat restul bazei de unguent topite și amestecând până la răcire.

La prepararea unguentelor suspensii omogenizarea se realizează până când nu mai sunt vizibile aglomerări de particule cu ochiul liber sau cu lupa (4.5x).

F.R.X prevede ca unguentele care se aplică pe plăgi, pe arsuri sau pe pielea sugarilor, să fie preparate cu baze având proprietăți emulsive și de asemenea să fie preparate astfel încât să fie asigurată sterilitatea și să fie ferite de contaminarea ulterioară cu microorganisme.

Prepararea unguentelor cu antibiotice are loc în mod similar.

Pentru a asigura sterilitatea unguentelor se vor steriliza la temperaturi de 1600C timp de 2 ore sau la 1400C timp de 3 ore componente grase ca: lanolină, vaselină, cetaceul, uleiuri vegetale cât și pulberi termostabile.

Ustensilele utilizate la preparare și obiectele de porțelan se încălzesc timp de 60 de minute la 1800C. Obiectele din cauciuc, materiale plastice termorezistente, tifonul, vata se sterilizează prin autoclavare menținându-se timp de 15-20 minute la 1200C sau 25-30 minute la 1150C în aparat.

Pentru unguentele care conțin baze de unguent și substanțe active termolabile prepararea va fi realizată în boxe sterile ferindu-se de contaminarea cu microorganisme (utilizând lucrul aseptic).

3.3.6.2 Pielea – considerații generale

Din cele mai vechi timpuri, aspectul și culoarea trenului au contribuit la diagnosticarea și previzionarea evoluției bolilor. În general fiecare afecțiune iși pune amprenta aspectul pielii, în special aspectul tenului. Asupra înfățișării noastre se reflectă stilul de viață, temperamentul, precum și starea de funcționare a organismului. Sănătatea și integritatea pielii este strâns legată de sănătatea întregului organism.

Pielea reprezinta cel mai mare organ al corpului uman, ea îndeplinește numeroase funcții, printre care :

rol de înveliș protector, în condițiile în care este intactă

rol în termoreglarea temperaturii corpului

rol antitoxic prin eliminarea substanțelor toxice cu ajutorul glandelor sudoripare

funcția de organ de simț prin receptorii tactili, termici și receptorii pentru durere

previne pierderea excesivă a fluidelor lichidelor

combate pătrunderea substanțelor nocive din mediul extern

Din punct de vedere histologic, pielea este constituită de la interior spre exterior din trei zone: hipoderm, derm, epiderm. Toate cele trei zone sunt distincte și suprapuse.

Figura 3.4 Structura pielii

Tratamentul/îngrijirea pielii seboreice cu tendință acneică

Tema aleasă și posibilitățile de cercetare în problematica tenului seboreic cu tendințe acneice sau chiar tratarea unor leziuni post acneice trimit către opțiunea unui tratament local/topic în care am urmărit obiective precum:

Ameliorarea simptomelor

Diminuarea și evitarea apariției acneei

Normalizarea keratinizării (combaterea efectelor comedolitice și inflamatorii)

Utilizarea de agenți care acționează în scopul modificării florei microbiene

Utilizarea în preparatul farmaceutic a unor componente cu rol cicatrizant având ca scop evitarea impactului negativ asupra calității vieții ;

Formularea produselor cu utilizare cosmetică/dermatologică implică alegerea cu grijă a ingredientelor și trebuie ținut cont de elemente importante precum: proprietățile de hidrofilie, lipofilie și miscibilitate ale componentelor, de acțiunea dorită (emolientă, lubrifiantă, calmantă), pH-ul pielii, mai ales în cazul pielii cu tendințe acneice acesta trebuie sa tindă către un pH acid, și nu în ultimul rând este foarte importantă alegerea formei farmaceutice coroborată cu procesul de absorbție percutanată.

Aplicarea directă a medicamentului/ preparatului pe zona și în concentrația dorită, precum și efectele secundare reduse față de tratamentul sistemic, sunt două dintre avantajele tratamentului topic.

Tratamentul local se afla în strânsă legătură cu fenomenul de penetrabilitate și absorbție de la nivel cutanat.

Absorbție/ penetrare la nivel cutanat coroborate cu informații din tehnică farmaceutică

O serie de factori influențează în mod direct procesul de absorbție la nivel cutanat, printre cei mai importanți se numără:

caracteristicile formei farmaceutice

proprietățile fizico-chimice ale substanței active ale compușilor biologic activi din structura chimică a Aloe barbandensis și a M.chamomilla, în cazul de față

concentrația substanțelor

vascularizația de la locul absorbției

suprafața de absorbție

Deși funcția stratului cornos este aceea de a forma o barieră de protecție impotriva substanțelor din mediul exterior, substanțele cu proprietăți înalt liposolubile la aplicarea pe piele pot pătrunde lent, contrar celor hidrosolubile care sunt oprite de straturile externe ale pielii.

Transferul medicamentului din vehicul în stratul cornos depinde de coeficientul de partiție, solubilitatea substanței în cele două componente: vehicul și strat cornos. Practic difuziunea în stratul cornos este influențată atât de factori care țin de medicament/preparat cât și de factori care țin de suprafața, integritatea, tipul, temperatura pielii și de eventualele leziuni de pe suprafața acesteia care conduc la absorbție mărită.

În cazul substanțelor, bazelor liposolubile absorbția se realizează transepidermic și transfolicular, absorbția fiind favorizată de vehiculul uleios cât și de fricționarea locală.

Unguentele prezintă ca excipienți vaselina și lanolina cu proprietăți ocluzive și emoliente care permit medicamentului o acțiune în profunzime, iar cremele definite ca fiind amestecuri de substanțe lipo și hidrosolubile conduc către limitarea deshidratării cutanate și emoliente.

În facilitarea penetrației și resorbției percutanate o importanță majoră are utilizarea amestecurilor de emulgatori care conferă bazelor de unguent valoarea HLB adecvată fiecarei substanțe incluse în preparat. Baza de unguent cu proprietăți adecvate permit aplicarea în strat continuu pe suprafața pielii la care se adaugă importanța masării pielii care mărește absorbția.

În urma cercetărilor s-a stabilit următoarea relație în funcție de proprietățile termodinamice ale substanței active în procesul de eliberare și penetrație din vehicul:

dq/ dt = (P*C) (Concentrația medicamentului) D*A / L , unde:

P*C – coeficientul de distribuție a substanței active între vehicul și bariera pielii

Concentrația medicamentului – concentrația medicamentului în vehicul

D – difuziunea substanței active în faza de barieră

A – suprafața secțiunii transversale

L – grosimea fazei de barieră

Gradul de pătrundere în piele este determinat de distribuția efectivă și difuziunea în faza de barieră cutanată. Constanta de permeabilitate este dată de produsul celor doi factori. Coeficientul de distribuție depinde foarte mult de forța de interacțiune moleculară dintre molecula penetrantă și membrană. Când coeficientul de distribuție are valoare mică, are loc penetrarea mai usoară a substanței prin membrană.

Odată absorbite, ingredientele sunt preluate de vasele limfatice sau de vasele de sânge și circulă prin organism. Aproape orice produs aplicat local poate fi detectate în sânge; de obicei nivelurile sunt scăzute.

Liposolubilitatea substanțelor reprezinta un factor special în absorbție cu atât mai mult cu cât este asociată cu proprietatea de hidrofilie. Activitatea termodinamică constantă a agentului penetrant în vehicul conduce la un grad de absorbție percutanat constant.

Datele din literatura de specialitate confirmă rolul deosebit pe care îl are conținutul de apă din stratul cornos în relație cu resorbția substanței active, practic umiditatea crescută facilitează absorbția transfoliculară. Excipienții anhidri grași prezintă rolul de acceleratori ai hidratării stratului cornos, contrar excipienților hidrofili care produc modificari neînsemnate.

Natura substanțelor tensioactive constituie un alt factor de care depinde capacitatea de penetrație a unguentului, agenții tensioactivi anionici și cationici prezentând o acțiune de înmuiere importantă și favorizând trecerea barierei lipidice. Din cercetările biofarmaceutice s-a constat că laurilsulfatul de sodiu – tensioactiv anionic prezintă remarcabile efecte asupra penetrației și resorbției la nivel percutanat a preparatelor în care este introdus.

3. Caractere și control. Conservare

Condiții de calitate a unguentelor

La unguente F.R.X prevede controlul următorilor parametrii:

Aspect. Unguentele trebuie să aibă un aspect omogen, prezentând culoarea și mirosul caracteristic componentelor.

Omogenitatea. Unguentele întinse în strat subțire pe o lamă de microscop și examinate cu lupa (de 4,5x), nu trebuie să prezinte aglomerări de particule sau picături de lichide.

Mărimea particulelor. Particulele insolubile din unguentele suspensii se examinează pe o cantitate de unguent având aproximativ 10 mg substanță activă. Unguentul se etalează în strat foarte subțire pe o lamă microscopică. În urma examinării pentru unguentele dermice 90% din particule trebuie să aibă un diametru de cel mult 50 µm iar pentru 10% din particulele examinate se admite un diametru de cel mult 100 µm. La unguentele oftalmice dimensiunile particulelor insolubile examinate trebuie să se încadreze în următoarele limite:

– 90% să aibă un diametru de cel mult 25 µm

– iar pentru 10% se admite un diametru de cel mult 50 µm.

Masa totală pe recipient. Se determină prin cântărirea individuală a conținutului din 10 recipiente.

Sterilitatea. Pentru unguentele sterile acest parametru se determină conform prevederilor din F.R. X de la monografia „Controlul sterilității”.

pH-ul. Trebuie să fie cuprins între 4,5-8,5, iar determinarea se realizează potențiometric.

Dozarea. Se efectuează conform prevederilor monografiei respective.

Ambalarea unguentelor. Unguentele se ambalează în următoarele tipuri de recipiente:

– borcane din sticlă, de metal, de material plastic;

– în cutii, flacoane de material plastic;

– tuburi metalice sau din material plastic.

Pentru ambalarea unguentelor în industrie se utilizează aparate care funcționează automat realizând o umplere corespunzătoare.

Conservarea unguentelor

Această formă se ambalează și se conservă în recipiente bine închise, depozitate în încăperi la temperaturi de cel mult 250C. Pentru a asigura stabilitatea unguentelor se pot adăuga auxiliari corespunzători (conservanți, antioxidanți etc.).

(??)3.3.6.3 Rețeta de preparare a unguentului și a gelului

Tema aleasă și posibilitățile de cercetare în problematica tenului seboreic cu tendințe acneice sau chiar tratarea unor leziuni post acneice trimit către opțiunea unui tratament local/topic în care am urmărit obiective precum:

Ameliorarea simptomelor

Diminuarea și evitarea apariției acneei

Normalizarea keratinizării ( combaterea efectelor comedolitice și inflamatorii)

Utilizarea de agenți care acționează în scopul modificării florei microbiene

Utilizarea în preparatul farmaceutic a unor componente cu rol cicatrizant având ca scop evitarea impactului negativ asupra calității vieții;

Formularea produselor cu utilizare cosmetică/dermatologică implică alegerea cu grijă a ingredientelor și trebuie ținut cont de elemente importante precum: proprietățile de hidrofilie, lipofilie și miscibilitate ale componentelor, de acțiunea dorită (emolientă, lubrifiantă, calmantă), pH-ul pielii, mai ales în cazul pielii cu tendințe acneice acesta trebuie sa tindă către un pH acid, și nu în ultimul rând este foarte importantă alegerea formei farmaceutice coroborată cu procesul de absorbție percutanată.

Aplicarea directă a preparatului pe zona și în concentrația dorită, precum și efectele secundare reduse față de tratamentul sistemic, sunt două dintre avantajele tratamentului topic.

Obiectivul a constat în realizarea unui unguent și a unui gel în a căror compoziție să fie încorporate ingrediente cu puternice acțiuni antiacneice și cicatrizante asupra leziunilor cutanate.

Unguentul cuprinde în formula de preparare extract liofilizat din Aloe barbandensis și Matricaria chamomilla, aflate sub formă de extracte alcoolice, precum și alte substanțe menite să completeze acțiunea compușilor biologic activi prezenți în cele două plante.

Gelul conține extract liofilizat din M.chamomilla aflat sub formă de extract alcoolic și gel preluat direct din frunza proaspăt recoltată a plantei A.barbandensis și introdus în stare pură în formula de gel studiată în cadrul laboratorului de Tehnică farmaceutică.

Cele două formule de preparare, a unguentului și a gelului conțin alături de compușii biologic activi studiați ai celor două plante și substanțe cunoscute, cercetate și utilizate de specialisti în afecțiuni dermatologice precum acneea.

Metoda de preparare: Conform metodei descrise în cursul de Tehnică farmaceutică și conformă cu îndrumările efectuate de profesorul coordonator în cadrul lucrărilor practice efectuate în cadrul laboratorului de tehnică.

Spațiul de preparare: Laboratorul de Tehnică farmaceutică din cadrul Facultății de Medicină și Farmacie, Specializarea Farmacie;

Materiale utilizate:

pahar Berzelius, baghete de sticlă, flacon Erlenmeyer

sticle de ceas pe care au fost cântărite substanțele în cantități mici

mojare cu pistil din porțelan

balanțe de cântărit

cartelă de celuloid

lingurițe din plastic

substanțe

recipiente de condiționare

Gelul reprezintă o bază de unguent hidrofilă, hidrosolubilă, care manifestă un efect protector de suprafață, cu viteză și grad de absorbție scazută, dar care conferă un efect accentuat de răcorire prin formarea unui film la locul de aplicare. Funcțiile cele mai importante ale unui gel sunt hidratarea pielii prin aportul crescut de apă și prin stimularea circulației la nivelul pielii, astfel se dovedește eficient pentru pielea grasă la care pot apărea probleme legate de acnee.

Formularea Gelului cu Aloe barbandensis sub formă de gel

Rp: Carbopol 940……………………………………1g

Glicerina………………………………………..12g

Soluție Na OH 10%…………………………..3g

Soluție Fenosept 0,2%……………………….1g

Gel A.barbandensis…………………………10 g

M.chamomilla extract alcoolic……………1g

Bisabolol ………………………………………..4 picături

Apă distilată……………………………..q.s.ad 100g

Procedeul de preparare:

Se cântărește mai întâi paharul Berzelius cu o baghetă în el și se notează tara acestuia,

Se cantăresc toate componentele din formulă astfel încât sa aibe cantitatea prescrisă,

Se adaugă glicerina, soluția de Fenosept 0,2% și aproximativ 60 g de apă distilată, în paharul Berzelius,

Peste glicerină, soluția de Fenosept si apă s-a adăugat Carbopolul în porțiuni mici agitând continuu

Soluția alcoolică de M.chamomilla s-a adaugat peste preparatul descris anterior, după care s-a efectuat omogenizarea preparatului; se adaugă și cele 4 picături de bisabolol pentru intensificarea efectului antiinflamator, cicatrizant urmărit

Următoarea etapă a fost aceea de introducere a gelului de aloe extras din frunza proaspăt recoltată în cantitatea de preparat formulat anterior (care după perioada de repaus a căpătat o structură clară de gel)

S-a lăsat în repaus produsul rezultat astfel încat să aibe loc procesul de îmbibare și toate ingredientele adăugate să fie absorbite în structura de gel

Soluția proaspăt preparată de NaOH 10% cu rol în neutralizarea grăsimilor acide ale Carbopolului concomitent cu dizolvarea acestuia, s-a diluat cu aproximativ 10 g de apă distilată după care s-a adus în porțiuni mici și sub continuă agitare peste preparatul anterior;

Se completează cu apă distilată, astfel încât preparatul final să cântărească 100g.

Descriere preparat:

Gelul format trebuie să fie incolor, translucid. Datorită gelului de aloe extras manual din frunza proaspătă a plantei și datorită adăugării soluției alcoolice de mușețel, preparatul a căpătat o culoare ușor gălbuie și cu miros caracteristic uleiului volatil provenit de la planta utilizată.

Observații:

Carbopolii sunt polimeri de carboxivinil care au în compoziția lor grupe carboxil repartizate de-alungul catenei, acestea ajută la imprimarea proprietăților tensioactive moleculelor prin dubla neutralizare. Pentru neutralizare se utilizează o amină cu catena lungă și o bază obișnuită cum ar fi hidroxilul de sodiu.

Carbopolul utilizat, respectiv Carbopol 940 se utilizează pentru o consistență mai vâscoasă a preparatului. Fiind un emulgator anionactiv favorizează formarea emulsiilor U/A și poate acționa ca emulgator propriu-zis sau poate avea rol de stabilizator al emulsiei deja formate.

Carbopolul este solubil în soluția de hidroxid alcalin. Este parțial solubil în apă, cu tendință de aglomerare, fapt pentru care este indicat să adăugăm apa distilată în porțiuni mici și sub agitare ușoară.

Bucățile de gel de aloe extrase cu ajutorul linguriței se supun triturării înainte de a fi introduse în preparat. Conținutul gelului de aloe este bogat în enzime și fitohormoni cu rol important în metabolismul celular, precum și minerale și microelemente necesare organismului: calciu, fosfor, fier, potasiu, cupru, clor, zinc, magneziu. Studiile au arătat că este singura plantă în care s-a identificat vitamina B₁₂. În preparate de uz topic A.barbandensis prezintă proprietăți hidratante, emoliente, protectoare, capabile să mențină sau să restabilească elasticitatea pielii datorită proprietăți de penetrabilitate caracteristic acestei plante prin cantitatea de apă conținută.

Pentru calculul cantității de aloe utilizat în formulă se ia în calcul o cantitate de minim 10g, care se va scade din cantitatea de apă.

Prin utilizarea gelului pur din Aloe barbandensis am urmarit implicarea compușilor biologic activi pentru acțiunea antiinfecțioasă, antibacteriană și pentru acțiunea de stimulare a regenerării celulare, caracteristici pe care produsul farmaceutic final trebuie sa le dețină.

Extractul alcoolic de musețel imprimă preparatului prin conținutul în apigenină și azulenă acțiune antiiradiantă și antiinflamatoare. Acțiunea cicatrizantă a preparatelor de mușețel se explică prin influențarea favorabilă asupra metabolismului pielii, prin stimularea proceselor de fosforilare oxidative, activarea epitelizării și apariția țesutului de granulație după arsuri.

Cu ajutorul NaOH 10% se neutralizează grăsimile acide ale Carbopolului în același timp are loc dizolvarea acestuia si gelificarea dispersiei. Utilizarea unei cantități mai mari de NaOH 10% ar conduce la un preparat mai puțin vâscos. Se utilizează 0,3 g NaOH substanță solidă pentru un gram de Carbopol.

Glicerina este un alcool trihidroxic obținut prin saponificarea grăsimilor, este un solvent polar și hidrofil, miscibil cu apa și alcoolul. Îndeplinește numeroase roluri în ceea ce privește prepararea tehnică:

conservant antimicrobian, în soluții apoase combate dezvoltarea microorganismelor pe care le deshidratează

umectant, emolient, datorită vâscozității conduce la aderare bună a preparatului pe suprafața pielii și mucoaselor, menține umiditatea la suprafață

protectant, antiflogistic în preparate cu utilizare topică

Soluția de Fenosept 2% (Phenylhydrargyri boras) prezintă acțiune antiseptică fiind activă în combaterea bacteriilor, ciupercilor, protozoarelor.

Conservare: conform specificațiilor din FRX, în recipiente bine închise. Temperatura de conservare trebuie sa fie de cel mult 25șC.

Produsul a fost ambalat în cutie cosmetică cu folie protectoare și capac.

Mod de utilizare/administrare:

Gelul preparat este hidrofil, neiritant, se poate întinde cu ușurință și se menține pe locul aplicat.

Se aplică local pe zona afectată pentru un efect de răcorire, hidratare și prezintă rol emolient fiind capabil să restabilescă elasticitatea pielii datorită conținutului mare în apă provenită și din compoziția gelului de Aloe barbandensis.

Figura 3.5 Ingrediente și prepararea gelului

Unguentul este un preparat semisolid, destinat aplicării pe piele în scop terapeutic în care au fost înglobate mai multe substanțe cu rol în afecțiuni dermatologice.

Obținerea unui produs farmaceutic eficient și stabil constă în selectarea emulgatorilor potriviți, metoda și ordinea de amestecare a componentelor, precum și temperatura la care are loc emulsionarea celor două faze.

Formularea unguentului cu extract alcoolic de A.barbandensis și M.chamomilla

Rp: Laurilsulfat de sodiu…………………………4 g

Apa distilată…………………………………………….1,5 g

Alcool cetilstearilic…………………………………..36 g

Parafina lichidă………………………………………..20 g

Vaselină………………………………………………….40 g

Extract alcoolic A.barbandensis…………………1,5 g

Extract alcoolic M.chamomilla…………………..1,5 g

Sulf precipitat………………………………………….0,5 g

Oxid de Zinc……………………………………………0,3 g

Glicerina…………………………………………………10 g

Alantoină………………………………………………..0,1 g

Niacinamida……………………………………………….1g

Vitamina A palmitat……………………………………IV gtte

Vitamina E palmitat…………………………………….IV gtte

Vitamina F…………………………………………………II gtte

Tween 80………………………………………………..0,5-1 g

Procedeul de preparare:

Cu ajutorul balanței se cântăresc ingredientele conform prescripției,

Pe baia de apă, la o temperatură de 60șC se topesc alcoolul cetilstearilic, vaselina și parafina lichidă într-o patenă în ordinea temperaturii de topire specifică fiecărui ingredient

Laurilsulfatul de sodiu cântărit în prealabil se dizolvă într-un pahar Berzelius în care se află apă încălzită la fierbere,

Apa împreună cu laurilsulfatul de sodiu trebuie sa fie la o temperatură destul de ridicată pentru a se aduce în fir subțire și sub agitare energică peste baza de unguent formată anterior pe baia de apă la 60șC. Acest amestec urmează a fi triturat până la răcire, luând în timp aspect omogen;

În momentul în care temperatura amestecului bază-soluție laurilsulfat de sodiu ( Baza III) a mai scăzut, cu o parte din acest preparat aflat în stare semifluidificat se încorporează Alantoina și Niacinamida

Oxidul de zinc și sulful precipitat sunt insolubile în baza de unguent și pentru că prezintă tendință de aglomerare se pulverizează fin și se trec prin sita VII sau VIII

Într-un mojar de dimensiuni mai mici aducem sulful și oxidul de zinc, împreună cu glicerina și cu Tween 80 în cantitățile specificate în formula de preparare. În acest amestec încorporăm și extractele alcoolice de A.barbandensis și M.chamomilla,

Amestecul semifluidizat care conține Alantoina și Niacinamida se adaugă peste preparatul compus din restul de substanțe, glicerină, Tween 80 și extractele alcoolice din plante și se continuă triturarea

În final se aduc împreună într-un mojar de dimensiuni mai mari și ușor încălzit restul de baza III și amestecul semifluidificat preparat în etapa anterioară care are în compoziția sa substanțele redate în Rp;

Vitaminele A, E, F sunt miscibile cu baza de unguent, se adaugă la final după ce preparatul a ajuns la temperatura camerei. Se continuă omogenizează întregul preparat.

Pentru producerea efectului terapeutic dorit este foarte importantă repartizarea uniformă a substanțelor medicamentoase. Aceasta se realizează printr-o mișcare generală de triturare a întregului amestec de la dreapta la stânga cu mișcări uniforme, ordonate, cu energie, iar perioadele de triturare trebuie să alterneze cu cele de repaus.

Descriere preparat:

Aspectul preparatului este omogen, de culoare albă, în conținutul preparatului se pot observa substanțele active într-un grad de dispersie avansat.

Observații:

Unguentul format cu ajutorul Bazei III este de tip unguent emulsie A/U, un unguent polifazazic (emulsie-suspensie) datorită substanțelor încorporate.

Tipul unguentului este dat de emulgatorul folosit și anume laurilsulfatul de sodiu care este un emulgator hidrofil anionic care formează bază de unguent U/A, însă pentru a conferi stabilitate sistemului a fost necesară asocierea unui emulgator cu caracter lipofil și anume alcoolul cetilstearilic care stabilizează filmul interfacial și crește vâscozitatea fazei interne. Cantitatea mai mare de emulgator lipofil transformă preparatul într-un unguent de tip A/U.

Tween-ul 80 emulgator neionic care formează baze de unguent emulsie U/A a fost introdus in formulă cu scopul de a putea asocia în preparat și substanțe anionactive și cationactive. Împreună cu glicerina asigură umectarea sulfului și previne fenomenul de flotare. Pentru emulsionarea unor cantități mai mari de soluție uleioasă se adaugă 1g de tween 80, în cantitate de 2,5% din masa unguentului.

Glicerina – asigură o bună aderență a pulberilor la aplicarea pe piele, reduce evaporarea apei după aplicarea pe piele și în timpul depozitării produsului cănd recipientul este închis.

Oxid de zinc este o substanță foarte des întâlnită în rețetele pentru creme antiacneice datorită proprietăților antiinflamatoare, sicative și ușor astringente. Dizolvarea parțială a particulelor de oxid de zinc (ZnO) eliberează ioni de Zn2 + în suspensie apoasă care contribuie la activitatea antimicrobiană a ZnO. Mecanismele activității antimicrobiene a ZnO în formulările topice se bazează pe generarea de specii reactive de oxigen și prin contact direct cu pereții celulelor. Pulberea de ZnO încorporată în formularea topică la concentrația mai mare de 1% a inhibat creșterea bacteriilor, dar nu a ciupercilor, chiar și atunci când a fost utilizată în concentrații mai mari (8%)

Sulful precitat prezintă rol antiseboreic, keratoplastic;

Alantoina conferă proprietăți antiinflamatorii slabe, epitelizante și cicatrizante și deține efect antiiritant, efect urmărit atunci când acneea este însoțită de aspectul roșu al suprafetei cutanate. Dozajul uzual utilizat în preparare este cuprins între 0,1-2%.

Niacinamida este o forma a vitaminei B₃, ce deține ca proprietăți cosmetice: reducerea roșetei, atenuarea acneei și a petelor, are influență asupra reglării sebumului. Dozajul uzual în formulare este cuprins în intervalul 1-4%;

Pielea pe lângă funcția senzitivă îndeplinește și rol de absorbție al unor vitamine precum vitamina A, E și a unor medicamente liposolubile.

Vitamina A este miscibilă cu baza de unguent. Produce efectul epitelizant vizibil, mai pronunțat în preparate precum lipogelurile și unguentele hidrofile. Această vitamină are un rol important în metabolismul bazal și al proteinelor, lipidelor și glucidelor astfel că atunci când nu se găsește în cantitate corespunzătoare poate provoca pe piele hiperkeratoză. Sub formă de tretinoina (vitamina A acidă) are acțiune cheratolitică, acționând direct asupra lizozimului celular producând eliberarea enzimelor protectolitice și hidrolitice, care prin liza conținutului celular al comedoanelor previne staza seboreică și evită obturarea orificiului folicular și producerea acneei.

Vitamina E palmitat este utilizată cu scopul de a opri procesul oxidativ din faza lipofilă sau hidrofilă folosit într-o concentrație de 0,001-0,1 % și pentru rolul în metabolismul țesutului colagen- acțiune antisclerogenică.

Vitamina F administrată sub formă de unguent și aplicată la nivelul pielii stimulează țesuturile colagene și regenerarea epitelială.

Preparatul conține extracte alcoolice din plantele studiate care au în compoziția lor compuși biologic activi cu numeroase acțiuni farmacologice benefice tratării afecțiunii luate în discuție, precum și rol de agent conservant antimicrobian. Extractele de plante, uleiurile esențiale și constituenții activi împreună cu alcoolul au acțiune antimicrobiană ce constă în denaturarea proteinelor membranare când se produce întreruperea membranei exterioare, inactivarea enzimelor implicate în sinteza componentelor structurale ale bacteriei.

Conservare: se realizează în recipiente închise, la o temperatură de cel mult 25șC.

Unguentul preparat este conservat în cutie cosmetică de plastic cu un gramaj de 30-50 g prevăzută cu subcapac și capac.

Mod de utilizare/administrare:

Creat pentru afecțiuni provocate de acnee, acest unguent are utlizare externă, se aplică local de două ori pe zi, dimineața și seara, după o prealabilă demachiere a tenului.

și poza în care apare preparatul în patena +mojar!!!

Figura 3.6 Ingredientele pentru prepararea unguentului

(4)3.4 REZULTATE ȘI DISCUȚII

(4 )3.4.1 Identificarea cromatografică a principalilor compuși din speciile studiate

Conform metodei descrise la subcapitolul anterior s-a realizat o placuta cromatografică de dimensiuni 10/5cm, având ca suport Silicagel g cu F254.

Interpretarea cromatogramei:

Cu creionul se marchează centrul petelor;

Se stabilește valorea Rf a petelor, care reprezintă raportul dintre distanța parcursă de substanță de la punctul de aplicare a soluției până la centrul petei (în cm) raportat la distanța parcursă de developant de la punctul de aplicare a soluției până la frontul developantului (în cazul nostru 8 cm), trecând prin centrul petei;

Pentru identificarea substanțelor, se compară pe aceeași cromatogramă, valoarea Rf și culoarea petei obținute cu soluția-probă cu valoarea Rf și culoarea petei soluției-etalon, cele două pete trebuia să fie asemănătoare.

Au fost spotate 4 probe: Mu,ML,AL, AU și 1 martor: apigenina.

În urma evaluării petelor obținute au fost identificați și esteri terpenoidici și acidul cinamic și a calculului valorilor Rf datele sunt redate în tabelul de mai jos:

Rezultatele obținute sunt redate în tabelul 3.2.

Tabel 3.2 Valorile Rf a compușilor obținuți prin cromatografia TLC a extractelor studiate

Figura 3.7 Cromatograma obținută la identificarea principalilor compuși din extractele studiate, după tratarea cu reactivul vanilic

3.4.2 Identificarea compușilor cu ajutorul metodei spectrofotometrice UV-Vis

Identificarea principalilor compușilor prin realizarea spectrelor UV Vis s-a făcut cu Spectrofotometrul UV Vis Specord 210 Plus, producător Analytic Jena.

Figura 3.8 Spectrofotometru UV-Vis Specord 210 plus, Analytik Jena

Figura 3.9 Spectrul UV Vis al Apigeninei

Figura 3.10 Spectrul UV Vis al extractului de Mușețel uscat

Figura 3.11 Spectrul UV Vis al extractului de Mușețel liofilizat

Figura 3.12 Spectrul UV Vis reunit al apigeninei cu extractul de mușețel liofilizat

Figura 3.13 Spectrul UV Vis reunit al aloinei

Figura 3.14 Spectrul UV Vis al extractului de Aloe vera uscată la aer

Figura 3.15 Spectrul UV Vis al extractului de Aloe vera liofilizată

3 4.3 Determinarea activității antioxidante – metoda cu Radicalul DPPH

Capacitatea de a anihila radicalii liberi (RSC – radical scavenging capacity) s-a evaluat prin măsurarea activității extractelor asupra radicalilor 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH).

Radicalul DPPH este una din cele mai comun utilizate substanțe pentru evaluarea rapidă a activității antioxidante datorită stabilității aceestuia (în formă radicalică) și a simplicității metodei.

Figura 3.16 Pregătirea probelor pentru studierea activității antioxidante

Extractele analizate au redus radicalul stabil DPPH, de culoare violet, la compusul DPPH-H roz pal – gălbui.

Rezultatele obținute sun redate în tabelul de mai jos:

Tabelul 3.3 Rezultate obținute la determinarea activității antioxidante

Figura 3.17 Graficul activității antioxidante al probelor studiate

Din reprezentarea grafică a activității antioxidante a extractelor se observă că cea mai mare activitate antioxidantă a avuto amestecul ăn proporție de 2:1 ML+AL.

Aceste rezultate sugerează faptul că extractele alcoolice de Aloe vera și Mușețel au un potențial remarcabil de a dona electroni radicalilor liberi reactivi, transformându-i pe aceștia din urmă în specii mai stabile, non-reactive și terminând reacția radicalică în lanț.

3.4.4 Determinarea activității antimicrobiene

Substanța antimicrobiană impregnată în disc, difuzează în mediu și realizează în jurul discului, o zonă de inhibiție a culturii, în funcție de sensibilitatea acesteia.

Au fost citite numai plăcile care au prezentat o creștere a culturii corespunzătoare din punct de vedere al purității și al densității (cultură densă aproape confluentă).

Citirea s-a efectuat cu ochiul liber, măsurând diametrul zonei de inhibiție în mm, de 2-3 ori în direcții diferite, cu ajutorul unei rigle. Pentru mediul transparent, citirea s-a făcut direct pe fundul plăcii, iar pe plăcile cu geloză sânge măsurarea diametrelor zonei de inhibiție s-a realizat la suprafața mediului.

Au fost luate în considerare:

– diametrele zonelor de inhibiție: zona lipsită de colonii microbiene vizibile cu ochiul liber, inclusiv diametrul discului cu antibiotic.

– coloniile bine dezvoltate apărute în interiorul zonei de inhibiție .

Germenele însămânțat nu crește în aria în care concentrația de principiu activ al A barbandensis sau M.chamomilla depășește concentrația minimă inhibitorie.

Incubarea s-a făcut cu ajutorul unui termostat de laborator.

Au fost luate în considerare diametrele zonelor de inhibiție: zona lipsită de colonii microbiene vizibile cu ochiul liber, inclusiv diametrul discului cu antibiotic, figura și coloniile bine dezvoltate apărute în interiorul zonei de inhibiție.

Figura 3.18 Termostat de laborator TC100

Figura 3.19 Sensibilitatea Staphilococcus aureus(STG) și Sensibilitatea Streptococus pyogenes (dreapta)

Figura 3.20 Evidențierea zonelor de inhibiție

Tabelul 3.4 evidențiază activitatea antimicrobiană a extractelor asupra unor bacterii Gram pozitive.

Tabelul 3.4 Activitatea antimicrobiană asupra unor bacterii Gram pozitive

Figura 3.21 Graficul activității antimicrobiene a principiilor active din extractele de A.barbandensis si M.chamomilla asupra unor bacterii Gram positive

3.4.5 Analiza și controlul stabilității unguentului și gelului realizate

Figura 3.22 Prezentarea unguentului și gelului

3.4.5.1 Efectuare teste de stabilitate

Conform F.R.X. unguentele trebuie testate atât din punct de vedere organoleptic cât și cu ajutorul analizelor fizico chimice a unor parametri: pH, vâscozitate etc.

a. Controlul organoleptic: omogenitate, culoare și miros caracteristic componentelor. Omogenitatea se controlează prin întinderea unguentului pe o placă și observarea cu lupa. Se determină mărimea particulelor pentru unguentele suspensii (obișnuite și oftalmice).

b. Solubilitea extractelor în soluție alcoolică

Tabel 3.3 Solubilitatea în alcool

c. Capacitate de întindere

Probe pentru determinarea capacității de întindere au fost supuse unor forțe asemănătoare celor aplicate în momentul întinderii unguentului pe piele. Poze cu hârtia milimetrică !!!

Tabel 3.4 Capacitatea de întindere

c. Determinarea plasticității care uneori se confundă cu capacitatea de întindere. Se folosește dispozitivul Ofeda și Arbussa, alcătuit din 2 plăci de sticlă de anumite dimensiuni, aplicând pe placa inferioară o anumită cantitate de unguent, peste care se suprapune placa superioară, și se măsoară suprafața de întindere. Se pun apoi diverse greutăți și se fac citirile după fiecare greutate, determinându-se suprafețele de întindere. Se obțin date numerice, care permit aprecierea valorilor orientative ale plasticității unguentelor.

d. Influența temperaturii asupra unguentului și a gelulul

Unguentele pot suferi modificări de culoare, gust, miros, reologice datorită influenței luminii, variațiilor de temperatură, a contaminării cu bacterii, fungi. Soluția care se află la indemâna preparatorului este aceea de a utiliza conservanți.

Variațiile de temperatură favorizează separarea fazelor unei emulsii. Temperatura ridicată influențează emulgatorii naturali prin dizolvarea parțială în soluții sau accentuarea hidrolizei acestora (lecitina). În ambele cazuri se va reduce vâscozitatea și se va produce desfacerea emulsiei. Temperaturile scăzute vor avea același efect prin ruperea filmului elastic de emulgator.

Tabel 3.5 Observarea modificărilor sub inflența temperaturii timp de 4 săptămâni !!!

Discuție

În urma studiului efectuat s-a ajuns la concluzia că atât unguentul cât și gelul pe parcursul celor 4 săptămâni de studiu nu au suferit modificări de structura, miros, aspect, la temperaturi cuprinse între: 2-8 șC, respectiv 15-25șC .

În cea de-a patra săptămână au fost înregistrate modificări ("+") la preparatele condiționate la temperaturi de peste 30șC.

Produsele farmaceutice menținute la temperaturi crescute au suferit schimbări legate de miros și de textura. În unguent a intervenit fenomenul de separare a fazelor, iar gelul și-a modificat vâscozitatea, aceasta scăzând odată cu creșterea temperaturii. S-a sesizat posibila apariție a microorganismelor datorată expunerii îndelungate a preparatului la o temperatură neconformă cu specificațiile din FRX privind conservarea.

Controlul stabilității unguentului s-a facut și prin determinarea potețiometrică a pH-ului unguentului preparat.

Figura 3.23 Pregătirea probelor pentru citirea pH-ului

pH-ul unguentui/ gelului este important pentru conservarea și evitarea incompatibilităților. pH-ul se măsoară direct sau după diluarea cu apă distilată, cu pH-metrul. Uneori, stabilitatea unui unguent poate fi ameliorată prin adaos de soluții tampon.

pH-ul reprezintă cologaritmul zecimal al concentrației ionilor de H+ dintr-o soluție apoasă și este exprimat matematic printr-un număr ce caracterizează aciditatea sau alcalinitatea acelei soluții.

Conform F.R.X pH-ul trebuie să fie cuprins între 4,5-8,5, iar determinarea se realizează potențiometric.

Determinarea pH – lui s-a făcut cu pH-metrul, Model InoLab_IDS Multi 9310, producător WTW, care efectuează măsurarea diferenței de potențial dintre doi electrozi, electrodul indicator și electrodul de referință introduși în soluție.

Figura 3.24 pH-metru Multi 9310

În mod obișnuit se folosesc ca electrod-indicator, electrodul de sticlă, care permite efectuarea unor determinări în serie și nu este influențat de prezența unor agenți oxidanți sau reducători și care poate fi folosit în intervalul de pH = 2-10. În intervalul dintre determinări, electrodul se păstrează în apă. Ca electrod de referință se folosește electrodul de calomel saturat, care în intervalul dintre determinări se păstrează în soluție saturată de clorură de potasiu. Se mai poate folosi și electrod de argint păstrat în soluție saturată de clorură de argint.

pH-metrele trebuie etalonate cu soluții tampon cu pH diferit, pentru a verifica pe de o parte integritatea electrodului de sticlă și pe de alta parte, dacă reacția electrodului corespunde unei funcții liniare. Etalonarea se face cu cel puțin două soluții tampon, care trebuie astfel alese încât să prezinte o diferență de pH care să nu depășească 4 unități, iar pH-ul soluției de analizat să fie situat între ele.

Substanțele folosite la prepararea soluțiilor tampon pentru etalonare (tetraborat de sodiu, carbonat de sodiu, citrat monopotasic, fosfat disodic, acid citric) trebuie să prezinte un grad înalt de puritate, iar soluțiile tampon se prepară cu apă distilată proaspat fiartă și răcită și pot fi folosite cel mult 3 luni de la preparare. La apariția de flocoane, soluțiile trebuie reînnoite.

Determinarea pH-ului gelului preparat. S-a facut conform cu F.R.X., astfel:

– 5,0 g unguent/gel se agită puternic cu 30 mL apă distilată, timp de 1 minut;

– soluția se filtrează și se determină pH-ul prin metoda potențiometrică.

pH-ul s-a determinat imediat după prepararea unguentelor (pH1), după 24 ore (pH2), pentru testarea stabilității, după 7 zile (pH3), după 15 zile (pH4) și 30 zile (pH5). În tabelul 3.4 sunt prezentate rezultatele determinării de pH a unguentului.

Tabelul 3.4 Rezultatele determinării pH-ului unguentului

Figura 3.25 Stabilitatea unguentului și agelului prin determinarea pH-ului

Rezultatele relevă faptul că atât unguentul cât și gelul se încadrează în limite conforme cu datele din F.R.X adică are pH-ul cuprins între 4,5-8,5. Spre sfârșitul perioadei de studiu a stabilității se observă o ușoară acidifiere a probelor de analizat evidențiată printr-o scădere a pH-ului.

CONCLUZII

Prin analiza cromatografică TLC s-au pus în evidență, pe baza valorilor Rf, compuși organici din clasa flavonoidelor. De semeni s-a comparat Rf martorului apigenină cu Rf –urile probelor Mu și ML și s-a constat că sunt similare;

Pe baza maximelor de absorbție a spectrelor UV Vis înregistrate s-au identificat compuși organici din clasa flavonoidelor dar și alți compuși precum apigenina, aloina;

Rezultatele activității antioxidante sugerează faptul că extractele alcoolice de Mușețel și Aloe barbandensis au un potențial remarcabil de a dona electroni radicalilor liberi reactivi, transformându-i pe aceștia din urmă în specii mai stabile, iar cea mai mare activitate antioxidantă s-a înregistrat la amestecul în proporție de 2:1 ML+AL;

Activitatea antimicrobiană prin metoda aplicată a evidențiat faptul că probele analizate au o sensibiliate crescută la bacterii gram pozitive. Rezultate foarte bune înregistrandu-se la Stafilococcus aureus;

S-a efectuat testul de solubilitate al extractului pulbere înainte de includere în ungent și rezultate bune s-au obținut la 0,1g extract/mL;

Au fost efectuate teste de stabilitate ale unguentului și ale gelului, rezulatatele fiind conforme cu prevederile FRX, din punct de vedere organoleptic neânregistând modificări;

Capacitatea de întindere a unguentului și gelului au înregistrat dimensiuni conforme cu FR.X.;

Controlul modificărilor sub înfluența temperaturii în decurs de patru sătămâni a relevat faptul că atât unguentul cât și gelul nu au suferit modificări la temperaturile de condiționare specificate de FRX;

Rezultatele determinărilor de pH relevă faptul că atât unguentul cât și gelul se încadrează în limite conforme cu datele din F.R.X adică au pH-ul cuprins între 4,5-8,5. Spre sfârșitul perioadei de studiu a stabilității se observă o ușoară acidifiere a probelor de analizat evidențiată printr-o scădere a pH-ului.