Studierea abundenței, diversității și dinamicii unor grupe de bacterii implicate în circuitele biogeochimice este deosebit de importantă în contextul… [310875]

[anonimizat] a necesității încadrării proprietăților biologice ale solurilor în studiile de evaluare a impactului asupra mediului precum și în programele de monitorizare a calității solurilor. Astfel, comunitățile microbiene și numărul total al microorganismelor din sol pot servit ca instrument de evaluare a modificării calității solului.

În cele 12 variante de sol au fost studiate 6 grupe ecofiziologice de microorganisme care pot reprezenta indicatori biologici ai calității solurilor studiate. Acestea sunt reprezentate de: [anonimizat], amonificatoare, nitrificatoare reprezentate de nitratbacterii și nitritbacterii și denitrificatoare.

Material și metodă:

Cu ajutorul pensetei s-au îndepărtat materialele străine ([anonimizat]) [anonimizat] s-a cernut printr-o sită cu diametrul < 2 mm. Din solul sfărâmat și cernut s-a extras proba analitică (10 g) prin metoda sferturilor (această metodă de prelucrare a solului s-a [anonimizat] 10 g sol).

S-au realizat 6 diluții zecimale succesive (10-1-10-6) ale probelor de sol (10 g) aparținând celor 12 variante (diluțiile s-au realizat cu apă distilată). Prima diluție a probelor de sol (10-1) (imag.1) s-a omogenizat cu ajutorul agitatorului magnetic (110 rpm) pentru desorbția celulelor (imag.2).

Au fost preparate medii de cultură solide și lichide specifice pentru fiecare grupă microbiană studiată (imaginea 3).

Numărul total de bacterii heterotrofe aerobe s-a determinat prin metoda culturii în plăci (Atlas 2004) utilizându-se un mediu nutritiv solid cu extract de carne ce prezintă următarea compoziție: extract de carne 0,3 g, agar 2 g, peptonă 1 g, NaCl 0,5 g, 100 ml H2O dist.; pH-7,5; sterilizare 1 h la 1200C în autoclav.

Ultimele 3 diluții succesive ale probelor de sol au fost însămânțate pe mediul de cultură solid turnat în plăci Petri. Pentru fiecare diluție zecimală s-au utilizat câte 3 plăci Petri iar în fiecare placă s-a inoculat câte 1 ml din diluția respectivă (imag. 4). Plăcile Petri însămânțate s-au incubat în termostat 7 zile la 300C) (imag.5).

Drojdiile și mucegaiurile s-au cultivat pe mediul de cultură Agar Sabouraud (pH 5,4-5,6; condiții de incubare 4-5 zile la 250C). Mediul prezintă următoarea compoziție: peptonă 1 g, glucoză 3-4 g, agar 1,5-2 g, apă distilată 100 ml.

Metoda utilizată pentru determinarea drojdiilor și mucegaiurilor a [anonimizat] (Atlas, 2004). Această metodă se aplică atunci când se cultivă microorganisme pe medii de cultură solide turnate în plăci Petri. Consistența mediilor solide este conferită de fapt de prezența agarului, o [anonimizat].

După perioada de incubare a plăcilor, numărarea coloniilor de germeni heterotrofi aerobi și drojdii și mucegaiuri s-a realizat cu ajutorul numărătorului de colonii.

Aprecierea microflorei totale de microorganisme/1 g sol s-a realizat după următoarea formulă (Atlas, 2004):

N= A·10n

unde : N- [anonimizat] g sol ;

numărul mediu al coloniilor dezvoltate pe trei plăci Petri ;

10- coeficientul de diluție;

n- numărul de ordine al diluției cu care s-a realizat însămânțarea.

Imaginea 6. Determinarea numărului total Imaginea 7. Determinarea numărului total

de bacterii heterotrofe aerobe de drojdii și muceagiuri

Imaginea 8. Culturi de fungi pe mediul Sabouraud

a b

Imaginea 9. Colonii de fungi (imagini în detaliu)

Pentru determinarea numărului de microorganisme amonificatoare, nitrificatoare (nitritbacterii și nitratbacterii) și denitrificatoare s-a utilizat metoda “most probable number” (MPN) sau NCP (numărul cel mai probabil) de microorganisme după Alexander (1965). În cazul acestei metode microorganismele se cultivă pe medii de cultură lichide turnate în eprubete.

Bacteriile amonificatoare s-au determinat pe mediul de cultură cu apă peptonată ce prezintă următoarea compoziție: peptonă 2 g, NaCl 0,5 g; 100 ml H2O dist. Înainte de sterilizare s-a ajustat pH-ul la valoarea 7,9. Mediul s-a turnat în eprubete și s-a sterilizat 1 h la 1200C.

Mediul de cultură utilizat pentru determinarea nitritbacteriilor a prezentat următoarea compoziție: soluție salină a lui Winogradski, diluată 1:20, 100 ml, (NH4)2SO4 0,05 g, CaCO3 0,1 g (Drăgan-Bularda, 2000). Sterilizarea s-a realizat în autoclav timp de 20 de minute la 1100C.

Nitratbacteriile s-au determinat pe mediul lichid ce conține: soluție salină a lui Winogradski, diluată 1:20, 100 ml, NaNO2 0,1 g, CaCO3 1 g (Drăgan-Bularda, 2000). Sterilizarea s-a realizat în autoclav timp de 20 de minute la 1100C.

Bacteriile denitrificatoare au fost determinate pe mediul de cultură lichid “De Barjac”, după Pochon, 1954. Acesta este compus din: KNO3 0,2 g, glucoză 1 g, CaCO3 0,5 g, soluție Winogradski 5 ml, H2O dist. 95 ml. Ph-ul s-a ajustat la valoarea 7,2 iar sterilizarea s-a realizat 20 minute la 1120C (3 zile succesiv).

Pentru fiecare diluție zecimală a probelor de sol s-au utilizat 5 eprubete. Fiecare eprubetă s-a inoculat cu câte 1 ml din diluția respectivă. După perioada de incubare de 3 săptămâni la 280C, s-a analizat în fiecare eprubetă produsul tipic de reacție după cum urmează:

culturile bacteriilor amonificatoare au fost analizate utilizând reactivul Nessler pentru evidențierea amoniacului produs de aceste bacterii. La 1 ml mediu de cultură s-a adăugat 1 ml reactiv Nessler. Apariția unei colorații galben-portocalii în mediile inoculate a indicat formarea amoniacului și deci prezența amonificatoarelor;

în cazul nitritbacteriilor s-a testat prezența nitriților cu reactiv difenilamină sulfurică, iar în cazul nitratbacteriilor s-au detectat nitrații în prezența ureei în mediul sulfuric (s-a urmărit apariția unei colorații albastre);

culturile bacteriilor denitrificatoare au fost analizate pentru evidențierea nitriților produși de aceste bacterii în urma reducerii nitraților, utilizând reactiv difenilamină sulfurică.

Numărul probabil de bacterii amonificatoare, nitritbacterii, nitratbacterii și denitrificatoare s-a determinat utilizând tabelul statistic al lui Alexander (1965) și luând în calcul eprubetele pozitive în care s-a identificat produsul tipic de reacție.

Pe baza numărului total de microorganisme ce aparține fiecărei grupe ecofiziologice studiate s-a apreciat potențialul bacterian al calității solurilor studiate, calculând indicele bacterian al calității solului (IBCS) (Muntean, 1995-1996) după formula:

IBCS= 1/n X ∑log10 N,

unde:

IBCS = indicatorul bacterian al calității solului;

n = numărul grupelor fiziologice de microorganisme luate în calcul;

N = numărul bacteriilor ce aparține fiecărei grupe ecofiziologice.

Imaginea 10 Culturi de bacterii amonificatoare pe mediu lichid (apariția tulburării în eprubetele pozitive)

Imaginea 11 Imaginea 12

Imaginea 13 Imaginea 14

Imaginea15

Imaginile 11,12, 13, 14, 15 Testarea prezenței amoniacului cu reactiv Nessler (apariția colorației galbene-portocalie indică prezența amonificatoarelor)

Imaginea 16 Imaginea 17

Imaginile 16 și 17 indică testarea prezenței nitraților și nitriților cu reactiv difenilamină sulfurică pentru confirmarea prezenței nitrificatoarelor și denitrificatoarelor

Rezultate obținute:

Probele de sol s-au recoltat de pe 12 suprafețe experimentale reprezentate de:

1 – salcâm N0P0;

2 – salcâm N60P60;

3 – salcâm N120P120;

4 – versant fără cleionaje 10% N0P0;

5 – versant fără cleionaje 10% N60P60;

6 – versant fără cleionaje 10% N120P120;

7 – versant 40% N0P0;

8 – versant 40% N60P60;

9 – versant 40% N120P120;

10 – platou nivelat zonă înaltă;

11 – platou nivelat zonă joasă;

12- pădure de fag zonă limitrofă.

Tabel 1

Numărul microorganismelor ce aparține fiecărei grupe microbiene studiate (celule/g sol uscat)

BHA- bacterii heterotrofe aerobe

BAM – bacterii amonificatoare

NIB- nitritbacterii

NAB – nitratbacterii

BDN – bacterii denitrificatoare

Tabel 2

Exprimarea logaritmică a numărului de microorganisme ce aparține fiecărei grupe microbiene studiate (log celule/g-1 sol uscat)

Tabel 3

Valorile indicatorilor bacterieni ai calității solurilor studiate

Tabel 4

Ierarhia calității solurilor studiate în funcție de valorile IBCS

Valorile IBCS prezentate în tabelele 3 și 4 indică o densitate ridicată a microorganismelor cu excepția probelor de sol recoltate de pe suprafețele experimentale: versant fără cleionaje 10% N120P120, versant 40% N0P0, versant fără cleionaje 10% N0P0, unde valorile IBCS indică o densitate moderată a grupelor microbiene.