Lucrare de licență [310391]

Lucrare de licență

„Ponderea grupelor sanguine și fenotipării în sistemul Rhesus și Kell în vederea asigurării transfuzionale”

AUTOR:

FLOREA (MOCĂNIȚA) VASILICA-ALINA

COORDONATOR:

conf. univ. dr. Idomir Mihaela Elena

dr. [anonimizat], 2016

CUPRINS

PARTEA GENERALĂ …………………………………………………….

CAPITOLUL 1 – NOȚIUNI INTRODUCTIVE …………………………..

INTRODUCERE ……………………………………………………

ANTIGENELE ………………………………………………………

ANTICORPII ………………………………………………………..

CAPITOLUL 2 – SISTEME DE ANTIGENE DE GRUP SANGUIN ……..

2.1 SISTEMUL AB0 ………………………………………………………..

2.2 SISTEMUL RHESUS …………………………………………………..

2.3 SISTEMUL KELL ……………………………………………………..

PARTEA SPECIALĂ ………………………………………………………

CAPITOLUL 1 – SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI ……………….

ARGUMENTAREA ALEGERII TEMEI…………………………………….

SCOPUL STUDIULUI ……………………………………………………………….

OBIECTIVELE STUDIULUI …………………………………………

CAPITOLUL 2 – MATERIAL ȘI METODĂ …………………………….

2.1 TIPUL DE STUDIU ……………………………………………………………………

2.2 LOTUL DE STUDIU ………………………………………………………………….

2.3 METODE MANUALE…………………………………………………………………………………

2.3.1 METODE DE DETERMINAREA A GRUPELOR SANGUINE AB0…….

2.3.2 METODA DE DETERMINARE A RH-ULUI…………………………………

2.4 METODE AUTOMATE……………………………………………………………

2.4.1 APARATUL QWALYS………………………………………………………………..

2.4.2 [anonimizat]………………………………………………………………..

CAPITOLUL 3 – REZULTATE ȘI DISCUȚII …………………………..

3.1 REZULTATE …………………………………………………………………………….

3.2 DISCUȚII …………………………………………………………………………………

CAPITOLUL 4 – CONCLUZII ………………………………………………………….

BIBLIOGRAFIE ………………………………………………………………………………

ANEXA 1…………………………………………………………………………………………..

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL 1 – NOȚIUNI INTRODUCTIVE

1.1 INTRODUCERE

“Sângele are puteri miraculoase și vehiculează viața”, [anonimizat] a face baie în sângele victimelor (la vechii egipteni) sau de a bea uneori sângele gladiatorilor uciși în arenă (romani). Ideea de înlocuire a sângelui a început să prindă contur odată cu descrierea circulației sanguine în 1628, de către Harvey. Primele încercări în domeniul transfuziei au fost urmate de eșec, s-a transfuzat sânge de la animale la om. [anonimizat] 1828, a transfuzat sânge uman unei femei care suferise o hemoragie în urma unui avort.[1] 1901, anul în care Karl Landsteiner a descoperit grupele sangiune 0AB, a constituit fundamentul dezvoltării imunoserologiei sanguine, o [anonimizat], antropologie și genetică. Imunoserologia sanguină are ca factori determinanți antigenul și anticorpul.[2]

Imunohematologia a apărut ca urmare a studiului afecțiunilor de izoimunizare (allo-imunizare) sau autoimunizare realizându-se legătura dintre imunoserologie și hematologie.[3] Reacția antigen – anticorp are loc în două etape: prima etapă este specifică, rapidă și invizibilă având loc prin aderarea anticorpului la suprafața hematiei ce conține antigenul respectiv fiind o etapă de sensibilizare; a doua etapă este nespecifică, variabilă în timp, rezultatul fiind o reacție vizibilă, de aglutinare care presupune acțiunea sarcinilor electrice ale mediului intern asupra hematiilor sensibilizate. Această etapă este urmată în „vivo” de hemoliza hematiilor, astfel explicându-se o parte din „transfuziile ineficiente”. Se poate urmări și in vitro.[2]

Mecanismele imunizării care sunt apanajul imunohematologiei sunt: izoimunizarea sau alloimunizarea și autoimunizarea. Alloimunizarea reprezintă imunizarea între indivizii aceleași specii, face referire la expunerea organismului la un antigen pe care nu îl posedă, non-self, când sistemul imunitar va produce anticorpi împotriva acelui antigen. Autoimunizarea are loc când anticorpii interacționează cu propriile antigene. [2],[3]

1.2 ANTIGENELE

Antigenele reprezintă corpuri străine (necunoscute) organismului numite non-self care, pătrunse în organism, au capacitatea de a declanșa un răspuns imun specific.[4] Condițiile de antigenitate sunt: calitatea de a fi corp străin, greutatea moleculară mai mare de 10.000 Daltoni, structura chimică mai complexă, conformația spațială stabilă. În organismele vii, pot fi considerate condiții de antigenitate și alți factori ca existența de receptori specifici în organism, reactivitatea și starea organismului (anumite stări fiziologice), concentrația antigenului, timpul de contact cu antigenul, numărul de contacte cu antigenul și pauzele dintre contacte.[4]

Din punct de vedere chimic, antigenele pot să fie: proteine, glicoproteine, lipoproteine, polizaharide, acizi nucleici. Cu cât structura lor este mai complexă cu atât antigenitatea este mai puternică. Antigenul are pe suprafața lui determinanți antigenici (epitopi). Limfocitele T și imunoglobulinele au receptori care pot recunoaște antigenele de pe molecula intrusă (situsuri antigenice). Legătura dintre antigene și anticorpi se face prin epitopi și situsuri antigenice.[5]

Din punct de vedere structural, antigenul are două componente: o componentă purtător sau carrier, reprezentând cea mai mare parte a moleculei și o componentă formată din epitopi acesta având rolul de a stimula reacțiile antigenice.[3] Epitopii pot fi de trei tipuri: unii dominanți, aflați pe suprafața moleculei și la care organismul are acces rapid, alții subdominanți la care organismul are acces doar după desfacerea enzimatică a proteinei (antigenul pătrunde în organism, macrofagul îl incorporează, desface legăturile disulfurice enzimatic și îl prezintă antigenelor limfocitare) și alții critici care sunt inaccesibili sistemului imunitar.[6]

După originea lor, antigenele pot fi: naturale, artificiale și sintetice. Antigenele artificiale sunt naturale dar modificate prin legarea unor molecule mici iar antigenele sintetice sunt de sinteză, obținute in vitro. Antigenele naturale pot să fie: solubile (foarte mici, moleculare) sau insolubile (corpusculare). Antigenele solubile sunt cele mai numeroase, dintre ele făcând parte toate macromoleculele, proteinele, polizaharidele, acizii nucleici, lipidele. Antigene insolubile pot fi: virusuri sau ale celulelor procariote și eucariote. Antigenele corpusculare sunt împărțite în 4 categorii: antigene virale (prezente în coada bacteriofagului sau în capside), antigenele parazitare (antigene somatice – fac parte din corpul parazitului; antigene solubile – sunt secretate de parazit), antigenele bacteriene (antigene somatice – fac parte din peretele celular, flageli sau capsula bacteriană; antigene solubile – enzime și toxine;) și antigene umane din care fac parte și antigenele eritrocitare.[7]

Cele mai numeroase antigene moleculare solubile sunt proteinele complexe: glico-proteine, glicolipide, lipoproteine, nucleoproteine. Proteinele sunt cele mai puternice antigene, glucidele devin antigene doar dacă se leagă de proteine și au o înaltă specificitate după legare, lipidele nu sunt antigenice dar pot deveni în cazul în care se leagă de proteine cum ar fi de exemplu fosfolipidele. Polizaharidele au complexitate mai mare decât proteinele și sunt mai imunogene, dar cu cât greutatea moleculară este mai mică cu atât sunt mai slab imunogene. Lipidele moleculare sunt neimunogene în stare nativă dar când se conjugă cu proteine devin imunogene, haptene. Haptenele sunt substanțe cu greutate moleculară mică care după legarea de macromolecule mai mari pot deveni antigene. Haptenele sunt antigene incomplete.[6]

Deoarece celulele sanguine circulante provin dintr-o celulă progenitoare comună, nu este surprinzător faptul că există un număr de antigene de grupă de sânge comun. Diversele linii celulare au atât antigene unice cât și antigene diferite. Primele studii asupra antigenelor eritrocitare au fost realizate în urmă cu aproximativ 100 de ani în timp ce studiile care au analizat trombocitele și antigenele celulelor albe sunt mult mai recente. Pentru majoritatea antigenelor, există dovezi ce sugerează că pot participa la apărarea gazdei, dar mecanismele nu sunt încă cunoscute. Antigenele celulelor roșii, trombocitelor și celulelor albe pot să fie constituite din proteine, carbohidrați atașați la proteine sau lipide. În cadrul fiecărei categorii, antigenul poate fi produs în mod intrinsec în timpul formării acelei celule sau poate fi absorbit din plasmă. Antigenele pot fi legate la suprafața celulei, pot fi încorporate parțial în interiorul membranei sau pot fi transmembranare. Cercetătorii au grupat antigenele în funcție de activitățile funcționale ale asocierii carbohidraților, lipidelor sau proteinelor. Acestea includ funcții precum: stabilitatea membranei, transportul prin membrană, activitatea enzimatică, etc. Deși este important modul în care o proteină sau carbohidrații asociați cu un antigen de grup sanguin contribuie la integritatea unei celule, acesta nu poate constitui singura explicație pentru prezența antigenului. La om s-au identificat 33 sisteme de grup sanguin cu 298 de antigene. Pe lângă aceste antigene, s-au mai descoperit și alte antigene care nu au putut fi clasificate în sisteme definite. Majoritatea antigenelor eritrocitare sunt sintetizate de hematii, dar există și antigene care se absorb din plasmă pe suprafața membranei eritrocitare. Studiul antigenelor eritrocitare și a structurilor membranare asociate permite o mai bună înțelegere a fiziologiei eritrocitelor, de exemplu anomalii ale unor sisteme de grup sanguin cum ar fi Rh și Kell pot fi asociate cu modificări în fiziologia și morfologia hematiei. Studierea transmiterii informațiilor antigenice la descendenți a oferit o mai bună înțelegere a mecanismelor de exprimare genetică.[7] Situsurile antigenice pot varia, astfel pe un eritrocit pot fi aproximativ 1.000.000 de situsuri AB0 și 25.000 de situsuri RhD. Antigenele eritrocitare mai pot fi întâlnite și pe leucocite, trombocite, plasmă, salivă, lapte și majoritatea țesuturilor organismului. Aceste antigene eritrocitare, glico-proteine de grup sanguin, cam la 75% din populație se întâlnesc și pe suprafața celulelor tisulare dar și în secreții exocrine cum ar fi saliva sau sucul gastric (acești indivizi se numesc secretori). Restul de 25% din populație sunt nesecretori. Aceste glicoproteine sunt hidrosolubile și pot fi studiate ușor.[8]

Antigenele de histocompatibilitate (HLA) constituie molecule de suprafață ale majorității țesuturilor și sunt strict specifice fiecărui individ (idioantigene). Antigenele de transplantare după grefarea unui țesut sau organ, moleculele HLA ale donatorului, se comportă ca niște antigene, sunt percepute de organismul primitor ca non-self astfel declanșându-se un răspuns imun care în final duce la respingerea grefei.[1] Referitor la sistemul major de histocompatibilitate, se disting 3 grupe importante: idioantigenele (sunt specifice fiecărui individ), izoantigenele (se găsesc la grupuri de indivizi din aceeași specie; de exemplu grupele AB0, sistemul Rh și alloantigenele.

În pofida încercării implementării unei singure nomenclaturi ale sistemelor antigenice, numele tradiționale sunt încă frecvent utilizate de către numeroase laboratoare, acest lucru generând confuzie. Ca exemplu, poate fi amintită terminologia Fisher-Race ce continuă să fie utilizată pentru sistemul Rh. În 1980, Societatea Internațională de Transfuzie (ISBT) a stabilit ca important folosirea unei nomenclaturi internaționale. Antigenele sanguine au fost clasificate în sisteme, colecții și serii. În 2004 grupele sanguine au fost clasificate în 29 de sisteme, 6 colecții și 2 serii.

Un sistem de grup sanguin este genetic distinct de celelalte și este structurat din unul sau mai multe antigene codificate fie de un singur locus genetic, fie de un complex format din două sau mai multe gene învecinate, fără posibilitatea unei recombinări între gene. În plus acest sistem de grup sanguin trebuie definit de către un alloanticorp uman a cărei genă codificată este identificată și secvențiată.

Termenul de colecție a fost introdus de către ISBT în anul 1988, pentru a reuni seturi înrudite de antigene care nu au putut fi corect clasificate ca sisteme, deoarece nu s-a putut demonstra determinismul gentic distinct față de celălalte sisteme existente. Momentan există 7 colecții recunoscute.

Din punct de vedere al seriilor, un antigen poate să fie numit un antigen cu frecvență scăzută (700 serii) sau un antigen cu frecvență crescută (900 serii). Un antigen cu frecvență scăzută este antigenul care are incidență sub 1% din majoritatea populației testate, similar cu sistemul trombocitar numit "privat". Antigenele cu frecvență mare sunt antigene cu frecvență de peste 90% în majoritatea populațiilor, similar cu sistemul trombocitar denumit „public”. Antigenele cu frecvență crescută au fost încadrate în cele 900 de serii.[9]

Fiecărui grup antigenic i s-a atribuit o identificare numerologică, aceasta fiind formată din 6 cifre. Primele 3 cifre reprezintă sistemul antigenic din care face parte respectivul antigen iar următoarele 3 cifre definesc antigenul. Fiecare sistem are alocat un sistem alfabetic, de exemplu sistemului AB0 îi corespunde numărul 001 iar antigenul A este primul antigen al sistemului AB0. Astfel, acest sistem are alocat conform ISBT numărul 001001 sau AB0001. Prin convenție, 0 poate fi omis și numărul poate fi separat prin punct.[9]

1.3 ANTICORPII

Anticorpii sau imunoglobulinele sunt factori umorali de natură proteică, produși de către limfocitele B specializate, transformate în plasmocite în urma unui stimul antigenic. Anticorpii reprezintă cam 20% din proteinele plasmatice. Anticorpii pot fi clasificați, în funcție de natura antigenului corespunzător, în alloanticorpi (de la aceeași specie), heteroanticorpi (altă specie) și autoanticorpi (de la același individ).[10]

Sunt cunoscute 5 clase de imunoglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), această clasificare făcându-se în funcție de structurile chimice. Acestea se află în plasmă, umori, salivă, lacrimi, lapte, țesuturi. Alloanticorpii apar în urma intrării antigenului în organism, prin transfuzii sau incompatibilitate feto-maternă în sarcină. În general, acești anticorpi sunt incompleți, imuni, de tip IgG. Mai sunt și anticorpi care apar fără o stimulare antigenică cunoscută doar ca răspuns la substanțe genetice, anticorpi compleți, naturali de tip IgM sau IgA. IgG reprezintă singurul tip de anticorpi ce pot traversa bariera placentară, activează calea clasică a sistemului complement (30 de proteine) și pot produce hemoliza extravasculară prin opsonizare și înlăturarea celulelor transfuzate. IgM fac parte din anticorpii naturali ai sistemului AB0, sunt anticorpi anti-A și anti-B, produc hemoliza imediată intravasculară a eritrocitelor incompatibile și pot activa complementul. IgA nu poate activa complementul și poate să reprezinte aproximativ un 1/4 din anticorpii anti-A și anti-B. În urma transfuziilor cu plasmă, pot apărea anticorpi anti-IgA ce pot produce șocul anafilactic la indivizi cu deficit genetic de IgA. Aceste 3 categorii de anticorpi sunt cei mai importanți în imunohematologie și pentru transfuziile sanguine.[11]

Aglutinarea constituie o reacție antigen-anticorp. În cazul eritrocitelor, se poate dicuta despre reacții de aglutinare și de hemolizare. Are loc o “aglomerare de particule antigenice” la contactul cu anticorpul, cu specificitate față de antigen[4], creându-se o rețea tridimensională, vizibilă cu ochiul liber. Anticorpii conduc la formarea unor punți moleculare de legătură între antigene creeându-se agregate mari.[4] Aglutinarea poate fi directă sau artificială. Aglutinarea directă are loc în mediu salin iar anticorpii sunt în general IgM, denumiți și aglutinanți (sunt mai eficienți datorită formei pentamerice). Aglutinarea artificială se asociază cu sensibilizarea anticorpului pe situsul antigenic (lipire specifică), aceasta nefiind urmată de aglutinare. Pentru ca totuși aglutinarea să aibă loc, se modifică parametrii mediului (de exemplu se realizează tratarea eritrocitelor).[5] Hemoliza constă în activarea cascadei complementului până la liza membranei hematiilor implicând prezența componentelor acestui sistem în mediul de reacție.

In vivo, se asociază cu declanșarea anemiilor hemolitice autoimune în condiții patologice, in vitro este indicator pentru reacțiile serologice în determinarea grupelor de sânge și Rh.[5]

Anticorpii imuni anti-A și anti-B sunt importanți pentru implicarea în determinismul unor accidente de transfuzie și în boala hemolitică a nou-născutului. Pot apărea prin hetero-imunizare și aloimunizare.[11]

Heteroimunizarea apare ca urmare a introducerii în corpul uman a unor substanțe având origine animală sau bacteriană, formându-se heteroanticorpi în special pentru substanța A, nu e valabil și pentru substanța B.[11]. Imunizarea anti A la persoanele de grup 0 poate apărea ca urmare a unor stimuli ca vaccinarea cu anatoxină difterică sau tetanică (în mediul de cultură există extracte de stomac de porc bogate în substanța A). Serul implicat în digestia enzimatică este foarte bogat în substanța A și este capabil să imunizeze persoanele de grup A și B. Imunizarea se poate realiza prin ingestia de preparate farmaceutice de origine animală ce conțin substanța A extrasă din stomacul de porc (medicamente pentru tratarea ulcerelor, a anemiilor pernicioase și a infecțiilor cu Toxocara canis și vaccinul antigripal).[12]

Aloimunizarea se poate realiza prin sarcină sau prin transfuzii. În sarcină, imunizarea apare în urma incompatibilității dintre grupa de sânge a mamei și a fătului.[11] La marea majoritate a cazurilor, acesta lucru se întămplă în momentul nașterii și foarte rar prin trecerea celulelor incompatibile în circulația sanguină a mamei. În cazul transfuziei de sânge incompatibil AB0 care declanșează sinteza de anticorpi imuni AB0, imunizarea a fost demonstrată în cazul transferului de fracțiuni plasmatice (crioprecipitate) sau de plasmă proaspătă congelată. Originea anticorpilor imuni AB0 poate fi stroma reziduală a eritrocitelor incompatibile sau a substanței A sau B plasmatice[1] Antigenele eritrocitare sunt evidențiate cu ajutorul reacțiilor de aglutinare, de aceea ele se mai numesc și aglutinogene. Pentru că provoacă reacții de aglutinare, anticorpii se numesc aglutinine. Importanța antigenelor eritrocitare este multiplă, încă din anii 1900 s-a observat că o bună cunoaștere și înțelegere a grupelor sanguine este esențială pentru terapia transfuzională. Este obligatoriu să fie determinată compatibilitatea deoarece indivizii care nu au antigenele respective pe eritrocite pot sintetiza alloanticorpi sau pot fi alloimunizați dacă sunt expuși unei transfuzii de sânge cu o anumită expresie antigenică. Anticorpii ce reacționează cu antigenele eritrocitare pot induce probleme de tipul reacțiilor posttransfuzionale hemolitice imediate sau întârziate sau boala hemolitică a nou-născutului.[15]

CAPITOLUL 2 – SISTEME DE ANTIGENE DE GRUP SANGUIN

2.1 SISTEMUL AB0

Karl Landsteiner a descoperit sistemul 0AB în urma unui experiment. A recoltat sânge de la colaboratorii săi, a separat serul de hematii punând în contact probele între ele, a observat că unele au aglutinat iar altele nu. În urma experimentului, Landsteiner a descris 3 grupe sanguine 0, A, și B. Ultimul grup AB a fost descoperit în 1902 de către Decastello și Sturli, discipolii lui Karl Landsteiner.[13] În anul 1907, Yansky descrie cele patru grupe de sânge și le notează cu cifre romane de la I la IV (0I, AII, BIII, ABIV). Atât pe plan național cât și internațional este în prezent în vigore notarea de tipul 0 (α,β), A(β), B(α) și AB(0). În funcție de prezența sau absența antigenelor eritrocitare A și B se definesc grupele sanguine din sistemul 0AB. Grupa sanguină 0 nu are niciun antigen. Grupa sanguină A are antigenul A. Grupa sanguină B are antigenul B. Grupa sanguină AB are antigenul A cât și antigenul B. Dacă punem în contact diferite grupe de sânge se pot produce anticorpi specifici anti-A, anti-B sau ambii. Fiziologic, corpul omenesc nu conține anticorpi împotriva antigenelor proprii, sângele de grupă 0 are în ser aglutinine anti-A (α) și anti-B (β); sângele de grupă A are în ser aglutinine anti-B (β); sângele de grupă B are în ser aglutinine anti-A (α); sângele de grupă AB nu are în ser aglutinine.[15]

În urma acestor informații, Karl Landsteiner a formulat cele două legi fundamentale ale sistemului 0AB:

1. „În sângele aceluiași individ, nu pot coexista aglutinogenul și aglutinina omoloagă.” Când antigenul AB0 nu este exprimat pe suprafața eritrocitului, indivizii au întotdeauna în plasmă anticorpi anti-AB0 cu stimularea producerii acestor anticorpi sub acțiunea agenților externi.

2. „Absența unuia dintre cele 2 aglutinogene implică prezența aglutininei corespunzătoare”.[15]

Anticorpii AB0 sunt formați în general dintr-un mixt de imunoglobuline IgM și IgG, ambele având reactivitate tehnică la 370C și capacitate de activare a complementului.

Antigenele sistemului 0AB sunt caractere permanente apărute încă din faza embrionară. Antigenele de grup sunt întâlnite în mai multe organe (stomac, intestin, plămân, creier, inimă) și în diferite celule sanguine (incluzând eritrocitele) și umori. Antigenele de grup de pe hematii sunt alcoolosolubile iar substanțele specifice de grup din umori sunt hidrosolubile și rezistente la fierbere.

Anticorpii anti-A și anti-B sunt de două feluri, naturali (regulari, datorită constanței de aproape 100% a apariției anticorpilor la indivizii al căror aglutinogen omolog este absent) și imuni. Anticorpii naturali pot apărea fără o influență exterioară sau ca rezultat al unei heteroimunizări în primele luni de viață. La copilul nou-născut, în primele săptămâni de viață, sunt prezenți în ser doar anticorpii trecuți de la mamă pe cale transplacentară. Datorită acestui fapt la nou-născut grupa este determinată numai pe eritrocite prin metoda Beth-Vincent. Capacitatea antigenului crește până la vârsta de adult, numărul de situsuri pe un eritrocit normal de persoană adultă poate ajunge la 800.000.[10] S-a demonstrat că anticorpii trecuți transplacentar de la mamă, anti-A sau anti-B, sunt IgG iar cei ai copilului sunt IgM.[15]

Grupele sanguine se transmit ereditar conform legilor lui Mendel și anume dominant, recesiv sau codominant. Gena A determină apariția antigenului A, gena B antigenul B și gena H antigenul H. Pentru grupele 0 și AB fenotipul este identic cu genotipul.[15] Sistemul 0AB nu este pe deplin cunoscut, are cel puțin 3 locusuri independente 0AB,H,Se. Se mai preuspune existența unui al patrulea locus pentru exprimarea antigenelor.[10] Ambele gene, A și B, sunt alele codominante în timp ce 0 este o alelă recisivă, deci rezultă patru fenotipuri diferite: A, B, AB, 0. În mod normal genele alelelor ocupă aceiași poziție pe cromozomul pereche. Rareori unii indivizi pot exprima un fenotip CIS AB în care genele alele A și B sunt situate pe același cromozom. Acest fenomen se datorează unei colecții de alele mutante AB0 care codifică o glicozil-transferază capabilă să sintetizeze ambele antigene A și B. Alele A și B sunt formate din șapte nucleotide diferite care codifică informația pentru enzime diferite.[16]

Genele A și B codifică glicotransferaze. Gena 0 determină producerea unei enzime inactive. În trecut se credea că nu produce nicio enzimă, de aici și denumirea de alelă mută.

S-a dovedit în ultimele decenii că antigenele A și B nu sunt rezultatul direct al genelor. La o substanță de bază H, precursoare, genele determină adăugarea glucidului specific fiecărei grupe prin producerea unor enzime specifice. Gena H este prima care acționează, eritrocitele de grup 0 au doar antigenul H. Pe acest substrat de antigen H, enzima N-acetilgalactozamin transferaza codificată de gena A adaugă o N-acetilgalactozamină pentru grupul A iar în cazul grupului B este transportat pe substratul H o moleculă de D-galactoză produsă de enzima D-galactozamin transferaza codificată de gena B. Anumite stări de boală pot duce la alterarea antigenelor eritrocitare ori slăbirea lor apariția unui nou antigen denumit „antigen câștigat” sau „pseudoantigen”.[14]

O boală importantă este boala hemolitică a nou-născutului, mama are anticorpi anti-A și anti-B de tip IgG iar copilul are grup A sau B. Anticorpii materni pătrund în circulația fetală traversând placenta și sensibilizează eritrocitele.[10]

Fenotipul A este datorat unei mutații a cadrului de citire a genei (cadrul de citire a genei se află în regiunea centrală a genei fiind alcătuit din exoni și introni), mutație legată de un codon stop, rareori o mutație care produce o enzimă multifuncțională.

În cadrul sistemelor AB0 au fost găsite numeroase mutații dar cele mai comune se regăsesc în fenotipul A2 unde alelele A ale genelor AB0 au două nucleotide diferite ca formă față de fenotipul A1 ceea ce duce la diminuarea activității enzimatice și implicit a scăderii expresiei antigenice. Fenotipul A1 poartă peste 800.000 de antigene A față de eritrocitele de fenotip A2 care au doar 250.000 de antigene A. La fel se petrece și în cazul subgrupelor grupei B datorat unei mutații a unei alele B a sistemului AB0.[10]

Antigenele din sistemul AB0 sunt reprezentate de lanțuri carbohidrate oligozaharidice. Există 4 tipuri de lanțuri oligozaharidice, predominante fiind lanțurile de tip 2 și 4 care se află pe membranele eritrocitare. Lanțurile de tip 1 se găsesc în plasmă, salivă și fluidele organismului. Lanțurile de tip 3 se găsesc în mucusul secretat de mucoasa gastrică sau chiștii ovarieni. Genele AB0 nu codifică direct antigenii dar codifică enzimele ce adaugă zaharide specifice structurii membranare eritrocitare. Aceste zaharide sunt antigene eritrocitare.[17]

La indivizii cu fenotipul AB, transferazele A și B coexistă și competiționează pentru același substrat. Alelele de tip 0 codifică o transferază nonfuncțională, deci niciun zaharid specific nu e adăugat structurii membranare eritrocitare. Mutațiile alelelor A și B exprimate prin substituția aminoacizilor din structura transferazelor se traduce printr-o slăbire a expresiei antigenelor A și B frecvent clasificate ca subgrupe. Cele mai comune subgrupe asociate alelei A sunt: A1 (prezent la circa 80% din populație) și A2 (prezent la circa 20% din populație). Celelalte subgrupe A sunt mai puțin frecvente decât acestea (Aint, A3, Am, Ax, Aend, Ael, Afinn). Relevanța clinică a subgrupelor A și B este mult mai importantă la donator decât la primitor. Pot fi clasați ca fenotip de tip 0 indivizii care au o expresie slabă a antigenelor eritrocitare din punct de vedere serologic datorate unei expresii slabe a subgrupelor alelelor. Este posibil ca indivizii să fie greșit clasificați ca având grup 0. Clasificarea greșită ca fenotip de grup 0 a unui individ cu subgrup de tip A sau B nu este o problemă din punct de vedere al primitorului, însă clasificarea greșită a donatorului ca fiind de grup 0, el fiind A sau B, poate duce la apariția hemolizei intravasculare.[15]

Pe membranele celulare, atât transferazele de tip A cât și cele de tip B adaugă un fragment zaharidic substratului, codificat de gena H. Gena H e localizată pe cromozomul 19, gena moștenită pe acest locus fiind transmisă mendelian. Pentru acest locus s-au identificat două gene: H și h. Uneori se moștenesc alelele slabe în locusul specific H și acestea sunt notate cu h. Aceste alele codifică transferazele funcționale. Dacă alelele sunt moștenite în sistem homozigot (hh) substanța H nu este prezentă pe membrana eritrocitară. Fără prezența substanței H pe eritocite, transferazele A și B chiar dacă sunt prezente nu au capacitatea de a adăuga zaharidele specifice antigenelor A și B. Acest genotip hh este cunoscut ca și fenotip Bombay, din punct de vedere serologic eritrocitele sunt de grup 0, însă nu asemănător cu fenotipul obișnuit 0 care are mari cantități de antigen H pe membrana eritrocitară. Copilul unui părinte cu fenotipul Bombay (hh) poate avea o expresie antigenică normală A, B sau ambele dacă moștenește alela dominantă de la celălalt părinte. Indivizii cu fenotipul Bombay pot sintetiza anticorpi anti-A, anti-B și anti-H, prezența acestor anticorpi făcând dificilă găsirea sângelui compatibil în cererea de transfuzie pentru că este un fenotip extrem de rar (poate primi sânge doar de la alt fenotip Bombay).

Yamakami descoperă în 1926 prezența antigenelor de grup sanguin HAB în salivă și în alte lichide umorale (lacrimi, sucul gastric, transpirație, lichidul chistului hidatic). Mai sunt cunoscute și sub denumirea de substanțe de grup sanguin, sunt hidrosolubile și glicoproteine ca și structură chimică. Locusul sistemului secretor se găsește pe perechea de cromozomi 19, alelele pot fi Se ca genă dominantă și se ca genă recisivă pentru același locus. Cei care au gena Se dominantă simplă sau dublă sunt considerați secretori de substanță de grup sanguin HAB, iar cei cu genotipul sese sunt considerați nesecretori. Frecvența la populația albă este de 80% față de 20% în favoarea persoanelor secretoare. Toți secretorii, independent de grupul sanguin din care fac parte, secretă substanța H variat din punct de vedere cantitativ. Cea mai mare cantitate de substanță H este secretată de cei cu grupa 0, indivizii de grup A secretă H și A, cei de grup B secretă H și B iar cea mai mică cantitate de substanță H este secretată de cei de grup AB pentru că secretă atât H cât și A și B.[15] Persoanele cu grup 0 au un substrat de antigen H netransformat pe eritrocite.[11] Antigenul H participă la formarea substanței precursoare pentru antigenele A și B, fiind determinat de gena H. La forma homozigotă hh, cunoscută ca fenotipul Bombay, eritrocitul nu conține antigenele H, A, B astfel nereacționând cu serurile ce conțin anticorpi anti-A, anti-B, anti-H. Serul celor cu fenotipul Bombay are anticorpi anti-H, anti-A și anti-B. În cazul necesității unei transfuzii, aceasta se va efectua tot de la persoane cu fenotip Bombay.[10] Antigenul H este prezent pe toate hematiile, indiferent de grupul sanguin. Grupa 0 are antigenul H, grupa A are antigenul A și H, grupa B are antigenul B și H iar grupa AB are antigenul A, B și H. Excepție de la această regulă este fenotipul Bombay, antigenul H fiind absent.[15] Determinarea sistemului 0AB face în mod obligatoriu atât pentru antigene cât și pentru anticorpi, acest lucru conferind securitate sistemului.[18]

2.2 SISTEMUL RHESUS

În urma cercetărilor asupra imunizărilor, efectuate pe iepuri care au fost injectați cu hematii provenind de la maimuța Macacus Rhesus, Landsteiner și Weiner au obținut un ser de tip uman ce aglutina hematiile tuturor maimuțelor Macacus 85% dintre cele umane (rasa albă). În concluzie, 85 din 100 de persoane albe aveau un antigen comun cu maimuțele Macacus. Acest antigen a primit numele de Rhesus iar anticorpul anti-Rhesus sau anti-Rh.[18]

Descoperirea factorului Rh a dus la rezolvarea cauzelor bolii hemolitice a nou-născutului și a accidentelor posttransfuzionale în cazul compatibilității în sistemul 0AB. Cu anticorpii omologi s-au găsit peste 30 antigene ale sistemului Rh care au denumiri diferite în funcție de autorii care le-au descris: Rosenfield (Rh), Fisher-Race (CDE), Wiener (Rh-hr).[19]

Wiener afirma că pe una dintre perechile de cromozoni autosomali se află un singur locus care poate fi ocupat de o singură genă. Fiecare genă produce un singur aglutinogen, care este format din 2 sau maxim 3 factori sanguini.[20] Wiener care folosește nomenclatura Rh-hr fiind primul care a descris conceptul genetic considera că există un singur locus pe cromozom, cromozomul 1 și multiplele gene alele concurând la acesta. Aglutinogenul eritrocitar conține 2- 3 factori care sunt puși în evidență cu ajutorul anticorpilor omologi.[21]

Fisher a constatat, în urma cercetărilor făcute cu ajutorul celor 4 seruri cunoscute până în anul 1943 (anti-D, anti-C, anti-c, anti-E) ca antigenul C este antitetic cu c, lipsa factorului C implică prezența factorului c și invers. Genele C și c sunt alele ale aceluiași locus, acest lucru înseamnând că acest locus nu poate fi ocupat decât de gena C sau c. Totuși prezența unui factor pe eritrocit nu exclude prezența celuilalt factor pe același eritrocit. Același lucru este valabil și pentru factorul e. După Fisher, referitor la sistemul Rh, pe un cromozom există 3 locusuri ocupate de 3 gene legate între ele. Din cele 6 gene luate câte 3 au rezultat 8 grupe cromozomiale. Fisher considera că Cde, cde și cDE sunt formele primitive ale rasei albe. Din aceste 3 forme au apărut în decursul anilor restul grupelor cromozomiale în urma fenomenului de crossing-over. Astfel au apărut Cde și cDe din formele Cde și cde. Cea mai rară formă este CdE, rezultată prin dublu crossing-over dintre cromozomii Cde și cdE sau cdE și Cde. Cercetările ulterioare au demonstrat că ordinea genelor pe cromozomi este DCE, gena C fiind plasată între D și E.[18]

Pe de altă parte, Fisher folosește altă nomenclatură: D, C, E, d, c, e. A descoperit că antigenul C este antitetic cu c și E este antitetic cu e prin intermediul a 4 seruri: anti-C, anti-c, anti-E, anti-e, ceea ce înseamnă că absența unui factor implică prezența celuilalt. Primul locus poate fi ocupat de genele D sau d, al doilea de C sau c iar ultimul de E sau e. Au mai fost descoperite și alte alele Dw, Dcor, Cw, Cx, Ew, es.[20]. Genele se transmit conform legilor lui Mendel, factorii pentru care există anti-seruri CcDEe sunt factori codominați, factorul d este recesiv față de factorul D.[20] Acest sistem are mai multe dificultăți, chiar și după 40 de ani de studii, legate de nomenclatură, antigene și aspecte biochimice.[21]

Există 3 sisteme de notare: unul care folosește literele DCE creat de Fisher și Race care este și cel folosit în practică; unul care folosește literele Rh și R utilizate de către Weiner; unul ce folosește cifre, este considerat cel mai potrivit și că va fi acceptat la nivel mondial.[21]

Sistemul Rh este cel mai polimorf dintre sistemele eritrocitare. A fost demonstrat că antigenele Rh sunt de natură proteică, cu foarte puține excepții, nu există anticorpi naturali. Antigenul D este cel mai imunogen.[21]

Levine descoperea în anul 1939, în serul unei mame care născuse un copil cu anemie hemolitică, un anticorp care aglutina eritrocitele copilului și tatălui și nu aglutina eritrocitele mamei. Prin heteroimunizarea cobailor și a iepurilor cu eritrocitele maimuței Maccacus a fost obținut un alt anticorp. Inițial acesta părea că recunoaște același antigen identificat de Levine pe eritrocitele mamei dar s-a aflat în final că cele două antigene sunt diferite.[19]

Antigenul D a fost identificat în serul femeii ce născuse copilul cu anemie hemolitică. Este foarte important și în aloimunizare feto-maternă și transfuzională.[21]

Antigenul LW este prezent pe toate eritrocitele umane, cu mici excepții, fiind definit printr-un heteroanticorp față de eritrocitele maimuței Maccacus.[21]

Anticorpii anti-D stabilesc fenotipurile RhD pozitiv și RhD negativ. Persoanele ale căror eritrocite sunt aglutinate de anticorpii prezenți la gravide (anti-D) au antigen D, produs al genei D fiind Rh pozitivi. Indivizii Rh pozitivi reprezintă aproximativ 85% din caucazieni. Indivizii Rh negativi (circa 15% dintre caucazieni), ale căror eritrocite nu aglutinează cu antigenul D se consideră că nu au gena D ci au o alelă silențioasă d, doză dublă dd.[21]

Transfuzia cu sânge Rh pozitiv la o persoană Rh negativ coduce la o imunizare, la producerea de anticorpi anti Rh. Antigenul D fiind cel mai imunogen există o posibilitate foarte mare ca să se producă anticorpii anti Rh.[20]

Antigenele C și E apar mai frecvent la persoanele cu Rh pozitiv decât la cei cu Rh negativ. Frecvența antigenelor C și E este mai ridicată pe eritrocitele pe care se situează și antigenul D. La persoanele Rh pozitive nu se depistează antigenele C și E ca și determinări de rutină, doar în cazul în care se determină și antigenele c și e. Un eritrocit C negativ este cu siguranță c pozitiv ca și un eritrocit c negativ care este sigur C pozitiv, la fel este și în cazul eritrocitelor E negativ sau pozitiv, cu foarte puține excepții.[20]

S-a descoperit un ser care aglutinează toate eritrocitele care nu au antigene C atât Rh negativ cât și Rh pozitiv. Acest fapt a condus la identificarea unui nou antigen c prezent pe eritrocitele indivizilor care nu posedă antigenul C. Nu se poate obține o reacție negativă la ambele seruri, sunt antitetice, aspect valabil și pentru anti-E și anti-e.[20]

Fenotipurile Rh pot fi definite în funcție de reacțiile cu anticorpii anti-D, anti-C, anti-E, anti-c, anti-e. De exemplu, pentru următoarele reacții D+, C+, E-, c+, e+, mai ușor este să fie utilizată varianta propusă de Rosenfield. Mai grea este varianta cu cifre în loc de litere, pentru D s-a atribuit cifra 1, pentru C cifra 2, pentru E cifra 3, pentru c cifra 4 iar pentru e cifra 5. Atunci când are o loc o reacție pozitivă se notează doar cifra iar în cazul reacției negative se adaugă semnul minus în fața cifrei. Pentru exemplul anterior, notarea va fi 1, 2, -3, 4, 5. Din părinți Rh pozitiv poate rezulta un copil Rh negativ dacă ambii părinți sunt heterozigoți Dd, viceversa nu e valabilă.[20]

Rosenfield a numerotat antigenele sistemului Rh începând cu Rh 1 până la Rh 47 (sunt alele la cele 3 locusuri corespunzătoare unor antiseruri specifice).

Race și Sanger au observat, în 1951, că unele eritrocite nu aglutinau cu serurile anti-C, anti-c, anti-E, anti-e ceea ce indică lipsa alelelor Cc și Ee și o expresie crescută a factorului D. Creșterea expresivității factorului D are loc prin absența competiției în sistemul Rh. În general, indivizii care au deleție parțială de Rh au în cantitate mare anticorpi față de antigenele lipsă ale sistemului Rh. Numărul acestor persoane este destul de mare în prezent. Acești indivizi aparțin tuturor raselor, o frecvență mărită întâlnindu-se la rasa neagră. Există și cazuri de deleție totală, fără nici un antigen din sistemul Rh.[22]

Dintre antigenele Rh cel mai bine evidențiat este factorul D, acesta este și cel mai imunogen. Din punct de vedere al imunogenității, în ordine descrescătoare alți factori sunt: c, E, C și e în ordine descrescătoare.[20]

Foarte rar se întâlnesc anticorpi ai sistemului Rh de tip natural, marea majoritatea sunt de tip imun. În general cei de tip natural se întâlnesc în cazul deleției totale sau parțială sau la cei normali foarte rar cu specificitate anti-C și anti-E. Anticorpii sistemului rezistă toată viața însă pot scădea cantitativ.[20]

Inițial s-a crezut că cele cinci tipuri de antiseruri: anti-D, anti-C,anti-c, anti-E și anti-e sunt suficiente pentru a determina antigenele sistemului Rh, dar în 1946 Callender și Race au remarcat un anticorp care aglutina eritrocitele donatorului de același tip cu ale bolnavului CDe/Cde, ceea ce a condus la imunizarea primitorului. S-au mai descoperit alele pentru locusul C/c (Cw, Cu, Cx,cv) pentru locusul D (Du, Dw) și pentru locusul E (e, Eu, ex, ev, ET, es, el). Nu se cunosc încă cauzele acestor mutații.[18]

Căile de imunizare sunt transfuziile cu sânge și sarcinile incompatibile. Transfuzia cu sânge incompatibil reprezintă un pericol doar de la a doua transfuzie incompatibilă, în urma primei transfuzii are loc producerea de anticorpi la primitor. Reacția antigen-anticorp are loc după a doua transfuzie și se poate manifesta prin: stare de șoc și hemoliză intravasculară sau alte reacții mai ușoare depinzând de titrul anticorpului. În cazul sarcinilor incompatibile situația este oarecum asemănătoare cu cea din transfuzii în privința apariției anticorpilor, apar mai rar în timpul primei sarcini. În mod obișnuit apar post-partum și vor influența sarcinile viitoare.[18]

Deși această numerotație e una mai simplu de folosit și pronunțat este utilizată nomenclatura lui Fisher și Race. Aceștia sunt de părere că sistemul Rh genetic este format din trei locusuri legate, la nivelul lor se află trei pseudoalele sau serii de alele: D sau d, C sau c-, E sau e, acestea constitue un haplotip care induce construirea unei combinații specifice de antigene pe suprafața eritrocitului. Fiecare individ primește genetic două haplotipuri, unul de la fiecare părinte care vor constitui genotipul individului.[23] Este vorba de un individ homozigot când cele două haplotipuri sunt la fel și de unul heterozigot când sunt diferite. La caucazieni sunt haplotipuri des întâlnite (Dce, dce, DcE), mai rar întâlnite (Dc-e, dc-E, dCe, DCE) și foarte rar întâlnite (dCE). La populația neagră cel mai întâlnit haplotip este Dc-e. Fisher și Race consideră că apariția unor haplotipuri rare se datorează unor crossing-over a două haplotipuri des întălnite. Prin combinarea celor 5 anticorpi de bază se pot obține 18 fenotipuri Rh.

În mod uzual fenotipurile Rh se exprimă pornind de la rezultatele obținute cu cei cinci reactivi: anti-D, anti-C, anti-E, anti-c- și anti-e.[24] Când este vorba despre antigenele D, C, E se scrie în nomenclatura obișnuită, în ordinea menționată mai sus, cu majuscule, când sunt prezente antigenele C și c- se va scrie Cc-, în cazul în care este prezent doar c- se va scrie c-c-, la fel și pentru E și e rezultând: Ee, EE, ee. Pentru D, deoarece nu a fost găsit un anticorp anti-d, nu se poate știi cu siguranță dacă e Dd sau DD, atunci este fie D pentru pozitivi, fie dd pentru negativi. În prezent se cunoaște existența mai multor variații fenotipice decât ale celor 3 perechi de alele în sistemul Rh, acestea pot fi considerate expresii la nivelul celor trei locusuri D, C, E.

Variantele antigenului D slabe poartă numele de Rh slab sau Du. Nu pot fi identificate cu testele obișnuite, pentru depistarea lor se folosesc teste mai sensibile cum sunt testul Coombs indirect, prin utilizarea eritrocitelor tratate cu protează iar cel mai bun este cel de fixare-eluție. Antigenele D slabe sunt considerate Rh pozitiv și nu sunt imunogene. Este important să fie identificate la donatorii de sânge, la femeile ce au născut copil cu Rh pozitiv și la nou-născut (ar putea să-și imunizeze mama). La cei Rh negativ nu e obligatorie identificarea, ei primesc în caz de transfuzie tot sânge Rh negativ. Antigenul D parțial este prezent la cei cu Rh pozitiv și lipsește la cei cu Rh negativ[21]

2.3 SISTEMUL KELL

Antigenul Kell a fost evidențiat cu ajutorul testului antiglobulinic indirect, în 1946, la o femeie care născuse un copil cu boală hemolitică gravă. Acesta aparține unui nou sistem Kell-Cellano în care s-au mai descoperit până în prezent aproximativ 21 de antigene. Factorul Kell are o importanță deosebită datorită imunogenității puternice și deși are o frecvență mică (9%) este considerat al doilea ca importanță în cazul transfuziilor. Antigenul Kpa și Jsa au frecvență mică iar k, Kpb și Jsb au frecență mare.[25] Circa 90% din populație este homozigotă kk în cazul transfuziei de sânge, restul de 10% fiind KK poate primi antigene străine k de aceea este necesară determinarea antigenelor K și k.[26]

Sistemul Kell este al doilea cel mai imunogen sistem după sistemul Rh. Antigenul Kell este codificat de alela K. Există un antigen antitetic k Cellano care este cel mai răspândit.[27]

Fenotipul Ko apare în urma prezenței la acești indivizi a genei de formă homozigotă ko/ko. Cei cu genotipul ko/ko nu au nici un antigen în sistemul Kell, această genă e considerată ca supresoare. Aceste persoane în cazul transfuziilor sau transplacentar dezvoltă anticorpi față de antigenele din sistemul Kell, pentru siguranța lor vor fi transfuzați cu sânge având același fenotip Ko.[28]

Antigenul Kx este considerat de către unii autori substanța fundamentală pentru toate antigenele sistemului Kell, în momentul în care apare cel puțin o genă din alelele K, Kp sau Js antigenul Kx este transformat în antigenul determinat genetic. Acest antigen se găsește în cantitate mare la cei cu fenotipul Ko și sub forme de urme la cei care au un sistem Kell normal.[29]

În 1961 Allen și Rosenfield realizează o clasificare numerică în ordinea descoperirii a antigenelor sistemului Kell (de exemplu K1 pentru K, K2 pentru k, K3 pentru Kpa, K6 pentru Jsa, K12 pentru Bc, K17 pentru antigenul Wk).

Antigenele sunt prezente din timpul vieții intrauterine astfel explicându-se gravitatea bolii hemolitice a nou-născutului. Acestea sunt necesare pentru o structură normală și o bună funcționare a eritrocitului. Lipsa antigenului, prezent în mod normal pe celule seriei albe, duce la imposibilitatea distrugerii microorganismelor de către leucocite. Apariția bolii granulomatoase cronice se explică prin lipsa antigenului Kx de pe suprafața monocitelor și neutrofilelor.

Fenotipul McLeod apare la sexul masculin, la bărbații la care substanța fundamentală Kx lipsește, acest lucru ducând la neproducerea antigenelor din sistemul Kell sau la producerea lor în cantități foarte scăzute.[30]

Cei mai mulți anticorpi sunt de tip imun, incompleți la cald, de tip IgG fiind depistați prin testul antiglobulinic (testul Coombs indirect). Anticorpii de tip natural anti-Kell sunt de tip IgM și pot apărea în urma infecțiilor cu E. coli 0125.[26] Anti-K poate apărea în urma transfuziilor de sânge și sarcinilor incompatibile, anti-k este puțin frecvent. [31]

Siguranța transfuzională începe cu eligibilitatea donatorului, efectuarea probelor de pretestare cu respectarea normelor cadrului legal pe parcursul recoltării și obținerii produselor sanguine, a condițiilor de păstrare, asigurarea corespunzătoare a transportului și efectuarea transfuziei. sigurarea unui număr suficient de personal medical calificat care să cunoască și să respecte normele printr-o pregătire continuă. Spațiul trebuie delimitat corespunzător, trebuie să existe: o zonă a donatorilor, zonă de recoltare, zonele de testare și prelucrare a sângelui, zonă de depozitare, zonă pentru eliberarea deșeurilor.[32]

PARTEA SPECIALĂ

CAPITOLUL 1 – SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

1.1 ARGUMENTAREA ALEGERII TEMEI

În urma campaniilor în media inițiate de centrele de transfuzie din țară și Institutul de Hematologie Transfuzională din București, am hotărât să particip și eu ca donator la Centrul de Transfuzie Sanguină Brașov. În 14 februarie 1949 a fost înființată rețeaua de transfuzie sanguină din țară prin constituirea primelor 30 de centre de transfuzie, incluzând Centrul de Transfuzie Sanguină Brașov.

Încă de la început am realizat că donarea de sânge este un procedeu foarte riguros ceea ce impune un sistem foarte bine organizat, toți pașii fiind atent aleși și monitorizați. Seriozitatea cu care este tratat acest procedeu medical m-a determinat să aprofundez acest domeniu și de asemenea să aleg subiectul acestui studiu.

Se respectă următorii pași:

– înregistrarea și verificarea donatorilor în baza de date;

– completarea chestionarului pe propria răspundere;

– efectuarea analizelor predonare care constau în măsurarea tensiunii arteriale, puls, greutate temperatură, glicemie și hemoglobină;

– prezentarea la triere donatori și verificarea de către medicul a documentelor (fișa, chestionarul completat pe propria răspundere și analizele predonare hotărând donatorii eligibili);

– efectuarea prelevării de către asistentul medical în sala de recoltare;

– supravegherea medicală a donatorului, după donare, cel puțin 10 minute.

Donarea de sânge reprezintă actul medical prin care este prelevată o cantitate de sânge corespunzătoare unei doze terapeutice (450 ml) ce se folosește pentru transfuzii la alte persoane sau pentru producția de preparate derivate de sânge. Donarea este un act voluntar, persoanele cu vârsta în intervalul 18-65 ani, apte din punct de vedere medical, pot deveni donatori eligibili.[33]

Recoltarea sângelui se efectuează într-un sistem de pungi de plastic, legate între ele într-un circuit închis și steril. Sistemul închis permite obținerea în urma unei singure donări a mai multor produse sanguine. Produsele sanguine sunt: sânge total (se recoltează într-un sistem de pungă simplă ce conține o soluție anticoagulant și de conservare respectând proporțiile optime); concentratul eritrocitar și plasma (recoltarea se face într-un sistem de pungi duble iar în urma centrifugării și separării se obțin cele două produse: concentratul eritrocitar – 200 ml și plasma – 250 ml); concentratul eritrocitar, concentratul trombocitar și plasma (recoltarea se face într-un sistem de pungi triple iar în urma centrifugării și separării se obțin 3 produse: concentratul eritrocitar – 200 ml, plasma – 200 ml și concentratul trombocitar – 50 ml).[34]

1.2 SCOPUL STUDIULUI

Scopul studiului a constat în analizarea frecvenței grupelor de sânge AB0, stabilirea Rh(D), fenotipului Rh și antigenului Kell la donatorii de la Centrul de Transfuzie Sanguină Brașov precum și evidențierea importanței și a complexității sistemelor eritrocitare în vederea asigurării transfuzionale.

1.3 OBIECTIVELE STUDIULUI

Obiectivele lucrării au constat în:

– Analizarea inițială a profilului donatorului pentru fiecare an al studiului în parte;

– Analizarea distribuției grupelor sanguine în perioada studiată și pentru fiecare an de studiu în parte în vederea observării eventualelor variații semnificative;

– Analizarea distribuției fiecărei grupe sanguine atât în funcție de sexul donatorului cât și al mediului de proveniență pentru fiecare an al studiului și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției Rh-lui pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției Rh-lui pozitiv în funcție de sexul donatorului pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției Rh-lui negativ în funcție de sexul donatorului pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției antigenului Kell pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției antigenului Kell pozitiv în funcție de sexul donatorului pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției antigenului Kell negativ în funcție de sexul donatorului pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

– Analizarea distribuției fenotipurilor Rh pentru fiecare an al studiului în parte și pentru tot lotul studiat;

CAPITOLUL 2 – MATERIAL ȘI METODĂ

2.1 TIPUL DE STUDIU

Studiul efectuat a fost retrospectiv de tip descriptiv.

Datele au fost obținute din baza de date a Centrului de Transfuzie Sanguină Brașov.

2.2 LOTUL DE STUDIU

Lotul de studiu a inclus 2862 donatori fiind compus din persoane aparținând ambelor sexe (1906 bărbați și 956 femei), provenind din mediul urban (2333) și rural (529) și cu vârsta cuprinsă în intervalul 19-25 de ani. Au fost incluși în lotul de studiu donatorii având anul nașterii în perioada 1991-1997.

Perioada studiată a fost de 3 luni: iunie-august 2015.

2.3 METODE MANUALE

2.3.1 METODE DE DETERMINARE A GRUPELOR SANGUINE AB0

Determinarea grupei AB0 prin macrometodă trebuie să fie efectuată prin două probe care se completează și se controlează una pe alta: metoda Beth-Vincent (care identifică antigenul eritrocitar) și metoda Simonin sau serică (care identifică anticorpul seric). Cea mai bună garanție a unei deterrninări sigure a grupajului OAB este dată de concordanța rezultatului între cele două probe. Nu trebuie să se dea niciodată rezultatul atât timp cât cauza dezacordului dintre cele două probe nu este elucidată. Sângele este recoltat cu sau fără anticoagulant, proba se va centrifuga pentru a separa eritocitele de ser iar probele care nu pot fi testate imediat vor fi stocate la 4 – 8° C și testate în max. 48 ore, acestea nu trebuie sa prezinte hemoliză.

Principiul metodei: se bazează pe principiul aglutinării.

Reactivi si materiale: suspensie eritrocitară 10% în ser (sau plasma) autolog sau în ser fiziologic, a eritrocitelor de testat; ser sau plasmă centrifugată; placa de opalin; eprubete (vacuete); pipete Pasteur; baghetă de sticlă cu vârf rodat pentru a amesteca reactivii; stativ; centrifugă; seruri test anti-A, anti-B , anti-A+B; eritocite test AI, A2, B și 0 în suspensie salină 10%.

Metoda Beth-Vincent: se depune pe placă de opalin câte o picatură din fiecare ser test: anti-A, anti-B, anti-AB, cu diametrul de 5 -6 mm; se adaugă câte o picatură de eritrocite de testat în suspensie 10% în ser fiziologic, plasmă sau ser; se amestecă cu ajutorul baghetei de sticlă sau cu fundul unei eprubete, până la omogenizare; se amestecă câteva secunde, dând mișcare de rotație placii (basculare); reacția se citește după 3-5 min.

Metoda Simonin (serică): cu o pipeta curată se depun pe o placă, de 4 ori câte 2 picături de ser sau de plasmă de testat; se adaugă câte o picatură de eritocite test A1, A2, B și 0 în suspensie salină 10%; se amestecă cu ajutorul baghetei de sticlă sau cu fundul unei eprubete, până la omogenizare; se amestecă câteva secunde, dând o mișcare de rotație plăcii (basculare); reacția se citește după 5 – 8 min. Bagheta cu care se amestecă trebuie să fie clatită în ser fiziologic și să fie bine ștearsă când se trece de la o picatură la alta.

Fig.2.1 Seruri test

Fig.2.2: Placă de sticlă încărcată cu seruri test

Rezultate și interpretare: Concordanța rezultatelor între cele 2 probe este imperativă; nu trebuie concluzionat niciodată în caz de discordanță. Cele 4 posibilități sunt indicate în tabelul următor:

Tabelul 2.1 Concordanță rezultate grupe sanguine

Fig.2.3: Citirea și interpretarea rezultatelor

Determinarea grupei sanguine se face întotdeauna prin ambele metode, a căror rezultate trebuie să concorde; trebuie respectat raportuI între eritrocite si ser; trebuie verificate serurile test (neexpirate, aspect limpede), sau hematiile test (nehemolizate); serurile și hematiile test trebuie păstrate Ia 4 – 8 °C; rezultatele se citesc în câteva minute; placa de opalin (sticla), eprubetele, pipetele trebuie să fie curate și uscate; să nu se amestece serurile test sau hematiile test.

2.3.2 METODA DE DETERMINARE A RH-ULUI

Sângele este recoltat cu sau fără anticoagulant, proba se va centrifuga pentru a separa eritocitele de ser iar probele care nu pot fi testate imediat vor fi stocate la 4 – 8° C și testate în max. 48 ore, acestea nu trebuie sa prezinte hemoliză.

Principiu:

Metodele de testare se bazează pe principiul aglutinării. Hematiile umane normale care prezintă antigenul D vor aglutina în prezența serului test anti-D și deci vor fi clasificate ca Rh pozitive, D+, în timp ce hematiile cărora le lipsește acest antigen vor fi clasificate ca Rh negative, D- . Se recoltează sângele cu sau fără anticoagulant; probele care nu pot fi testate imediat vor fi stocate la 4 – 80 C și testate în max. 48 ore; probele nu trebuie sa prezinte hemoliză.

Materiale necesare: hematii de testat, suspensie în plasma proprie sau ser; lame de sticlă, placă de opalin sau eprubete de hemoliză; pipete Pasteur; stativ; bagheta de sticla cu vârf rodat; centrifugă; ser test anti-D; ser Rh Control; eritrocite martor 0 Rh + și 0 Rh-

Tehnica pe plăci la temperatura camerei: „se depune pe pIaca cu godeuri câte o picătură de ser test anti-D, respectiv o picatură din seruI Rh Control; se adaugă câte o picatură de eritrocite de testat în ser autolog; se amestecă cu ajutorul unei baghete de sticlă sau dând o mișcare de rotație (basculare) plăcii; se șterge bagheta pentru fiecare reacție în parte și este necesar să se asigure o curățenie perfectă a plăcii și a pipetelor foIosite; se citește reacția de aglutinare după 3-5 min. Nu se interpretează marginile uscate sau fibrele de fibrină ca aglutinare”. [3]

Rezultate si interpretare:

Prezența aglutinării indică că celulele care au fost testate posedă antigen D și sunt clasificate ca D+. Absența aglutinării indică că celulele care au fost testate sunt lipsite de antigenul D și sunt clasificate ca D-. Rezultatele pot fi validate doar dacă martorii pozitiv și negativ dau reactiile așteptate pentru a controla activitatea reactivului.

2.4 METODE AUTOMATE

Sistemele automate permit determinarea grupelor AB0, Rh, fenotipul Rh și antigenul Kell. În laboratorul Centrului de Transfuzie Brașov se utilizează două sisteme automate: Qwalys și ID Dia Med.

2.4.1 APARATUL QWALYS

Aparatul Qwalys 3 este fabricat de către Diagast Parc Eurasanté, având sediul în Loos Cedex, Franța.[35]

Materiale necesare funcționării aparatului QWALYS 3:

Echipamente: aparatul, PC, imprimantă.

Consumabile: hârtie pentru scoatere la imprimantă, plăci, eprubete pentru probă, apă distilată, soluție de curățarea CleanLys, alcool.

Reactivi: MagneLys, Bromeline.[35]

Placa ABDLys conține: prima coloană (ser anti-A), a doua coloană (ser anti-B), aceste utilizează principiul metodei Beth-Vincent, iar a treia coloană (ser anti-D) a patra coloană este coloana de control iar coloana 5 și 6 sunt neîncărcate se folosesc pentru proba serică, apoi se repetă acest șablon. Pe placa ABDLys se pot lucra 16 probe iar, termenul de valabilitate este de cinci zile de la data deschiderii.

Placa DUOLys poate fi folosită pentru grup, Rh și fenotip. Aceasta conține: prima coloană (ser anti-A), a doua coloană (ser anti-B), a treia coloană (ser anti-AB), a patra (ser anti-D), următoarele cinci coloane pentru fenotip, a zecea coloană pentru control, următoarele două sunt pentru proba serică (metoda Simonin). Pe DUOLys se pot lucra 8 probe , termenul de valabilitate este tot 5 zile de la deschidere la temperatura de 4oC.

Fig.2.6: Microplacă DUOLys

Alte plăci: PhénoLys, Phéno 1,2 Lys se folosesc doar pentru determinarea fenotipurilor; Groupa DVI Lys pentru determinarea grupelor și a mai multor tipuri de D și placa de diluție care este mai înalta decât celălalte.

Reactivii folosiți pentru determinarea grupelor, Rh-ului și a fenotipurilor sunt: Bromeline și MagneLys. Bromeline are proprietatea de a desface polizaharidele de pe suprafața hematiilor ajutând la formarea reacției antigen-anticorp, producându-se aglutinarea, valabilitatea de 5 zile de la deschiderea flaconului la temperatura de 4oC. MagneLys conține particule magnetice și are valabilitatea de 20 zile, la temperatura de 4oC.

Fig.2.7: Reactivii

Fig.2.8: Eritrocite test

Pentru curățirea seringilor se folosește CleanLys și alcool care se adaugă în stația de spălare de lângă reactivi, se verifică de fiecare dată să fie o cantitate suficientă și să se afle în termenul de valabilitate (CleanLys 10 zile în sticlă după deschidere și 48 h în stația de spălare a aparatului). Aparatul este conectat la două recipiente: unul pentru deșeuri și unul cu apă distilată; înainte de pornirea aparatului se verifică ca recipientul pentru deșeuri să nu fie plin, iar cel pentru apă distilată să nu fie gol.

Poziționarea microplăcilor în raft se realizează în funcție de configurația care trebuie respectată.

Fig.2.9. Racii încărcați cu probe

Principiul de funcționare al aparatului:

Tehnologia magnetizării eritrocitelor este o tehnologie nouă, care se bazează pe magnetizarea eritrocitelor astfel forța magnetică atragând celule roșii înlocuind centrifugarea, particulele magnetice sunt legate de eritrocite. Principiul de bază al aglutinării este formarea legăturii anticorp-antigen, anticorpul din ser se leagă cu antigenul de pe hematie. În cazul aglutinării sângelui, hematiile încărcate cu particule magnetice (MagneLys) împreună cu Bromeline sunt adăugate pe o placă căptușită cu anticorpi din serul test. Placa este așezată pe un dispozitiv magnetic. Reacția este pozitivă dacă are loc reacția antigen–anticorp (aglutinare) și negativă când reacția nu are loc.[35]

Metoda de lucru a aparatului:

Probele folosite de aparatul QWALYS 3 sunt probe recoltate pe anticoagulant și centrifugate în prealabil. Înainte de introducerea în raci, li se scot capacul și se așează cu codul de bare către cititorul aparatului. Aparatul o dată cu scanarea reactivilor, plăciilor verifică automat și termenul de valabilitate (cam 5 zile de la prima folosire a produsului respectiv, softul reține data și verifică valabilitatea). Se pot folosi mai multe tipuri de plăci de lucru, de exemplu cele pentru determinarea grupelor și Rh-ului conțin încorporat ser test: anti-A, anti-B, anti-AB și anti-D.

Înainte de pornirea aparatului se verifică dacă brațul robotizat de manevrare este așezat la mijloc pentru a nu sparge geamul de protecție. După pornire aparatul verifică să nu fie aer pe tubulatură (dacă este aer prezent se repetă evacuare apei distilate); mișcă agitatorul; verifică brațul de lucru și să fie liber suportul microplăci, verifică incubatorul.

E recomandat un control zilnic al funcționării aparatului cu ajutorul probelor test, rezultatele trebuie să fie cât mai apropiate de cele etalon. Se încarcă raftul pentru microplăci cu plăcile cu care vom lucra în ziua respectivă, în funcție de operație și numărul de probe. Se introduc reactivii în suport, se apasă foarte bine pentru a nu se deplasa în momentul în care se agită. La fel se procedează și cu hematiile test.

După ce se introduc racii cu probe, se scanează probele și se alege tipul de operație. În funcție de operația necesară aparatul scoate de pe raft pe suport plăciile de care are nevoie apoi totul este scanat și automat verificată data de valabilitate.

După fiecare folosire a seringilor (4 la număr) aparatul le curăță, introducându-le în stația de spălare, în care se află CleanLys și alcool. Apoi introduce seringele în MagneLys, după care în probele de analizat pe rând încărcându-le cu hematii și le depune pe placa de diluție. Placa de diluție cu plasma si MagneLysul se țin câteva minute la incubat, peste se adaugă Bromeline. Din această soluție se pipetează în godeurile rândurile 1,2 și 3 în care se utilizează principiul Beth-Vincent și determinarea Rh-ului.

Aparatul agită hematiile test, pune placa de diluție pe raft unde o lasă până când agită hematiile, o repune pe suportul de microplăci, după care pipetează hematiile test peste godeurile în care a pus anterior plasma din probe, rândurile 5,6. Placa ABDLys este pusă pe agitator câteva minute, apoi pusă pe magnetizator la fel câteva minute și repusă pe agitator. Apoi brațul robotizat pune placa în cititor unde este și fotografiată. Imaginea cu interpretarea rezultatelor va putea fi vizualizată pe ecran și tipărită.

În timpul programului de lucru după ce aparatul nu mai pipetează din probe, pe ecran va apărea un mesaj că racul cu proba poate fi retras pentru adăugarea altor probe de analizat, care vor fi scanate si lucrate, prelungindu-se timpul de lucru.

Tehnica folosită de QWALYS 3 este o micrometodă ca și avantaje ale acestei metode comparativ cu macrometodele (Beth-Vincent, Simonin și determinarea Rh-ului) putem evidenția :

Cantitatea mică de probă necesară pentru efectuarea determinării;

Precizia metodei;

Siguranță datorată operării cu coduri de bara;

Posibilitatea controlului intern;

Timpul scurt necesar efectuării;

Înlăturarea erorii umane (interpretarea, spălarea plăciilor, temperatura camerei unde se efectuează, curățirea pipetei).

Iar ca și dezavantaje:

Termenul de valabilitate al produselor folosite (reactivi, plăci, hematii test);

Costul ridicat;

Faptul că se consumă aceiași cantitate de consumabile indiferent de numărul de probe;

Atenția la detalii (pe fiecare produs se scrie data deschiderii, se pun produsele ca să pot fi citite cu cititorul de bare).

Aparatul este conceput astfel incât să „împiedice” apariția erorilor. Posibilele surse de erori pot fi: neefectuarea controlului intern si necalibrarea aparatului; poziționarea greșită a microplăcilor pe raft (există o anumită regulă de așezare); fixarea incorectă a reactivilor, hematiilor test în suportul lor; aerul ce se află pe tubulatura seringilor să nu fie evacuat în totalitate; probele să fie introduse cu capacul pus; proba să fie hemolizată; proba să nu fie centrifugată; proba să prezinte cheaguri; cantitatea de soluție pentru curățarea seringilor să fie insuficientă.

Aparatul are aplicabilitate pentru screeningul anticorpilor iregulari, determinarea grupelor de sânge, determinarea Rh-ului, determinarea fenotipului și a fenotipurilor de specialitate și a D mai slabe (s-au depistate mai multe tipuri de D ca și mai multe A, B). Se poate folosii în centre de transfuzie sanguină, cercetare în domeniu hematologiei.

Rezultate:

Fig.2.10 Rezultat aparat format hârtie

Fig.2.11 Rezultat aparat format digital

Concluzii:

Aparatul QWALYS 3 are o largă întrebuințare în hematologie, se pot determina mai multe tipuri de fenotipuri, tipuri de antigen D de pe hematie (se cunosc mai multe tipuri de antigene A, B, D din această cauză s-a renunțat la notarea grupelor de sânge cu cifre romane). Deși principiul pentru determinarea grupelor și al Rh-ului este asemănător cu cel folosit în macrometode, diferența constă în faptul că aparatul are nevoie de o cantitate mult mai mică de probe, siguranța și calitatea determinărilor sunt net superioare față de macrometode, de asemenea contribuția analistului este redusă în comparație cu macrometodele

2.4.2 APARATUL ID-DIA MED

O altă metodă utilizată este cea a cartelelor ID-Dia med, este o metodă originală ce permite efectuarea de grup sanguin AB0 probă globulară și serică, grup sanguin Rhesus (D), fenotip Rhesus complet (C, c, E, e) și Kell, fenotip eritrocitar extins (determinarea altor antigene eritrocitare), depistare (screening) și identificare a anticorpilor iregulari, test Coombs direct și indirect, probă de compatibilitate (prin test enzimatic la 370C, test Coombs indirect la 370C și test salin la 40C și 220C). Cartela este confecționată dintr-un material plastic, transparent având șase microtuburi cu configurație profilată după cum urmează: conține o cameră de aer în partea superioară a microtubului ce favorizează procesul de incubare între hematii și ser în cazul testelor ce necesită această etapă, mai conține o coloană îngustă ce permite în cursul etapei de centrifugare standardizată un bun contact între hematii și ser favorizând reacția antigen-anticorp, iar în partea inferioară se găsește un vârf conic ce permite sedimentarea hematiilor neaglutinate.

Suspensia de gel conținut de microtuburi poate fi trei tipuri: un tip de suspensii de gel neutru folosit pentru testul enzimatic, testul salin și proba serică Simonin a grupajului AB0 alt tip de suspensii conține antiseruri eritrocitar de tip monoclonal sau policlonal pentru grupajul AB0/D, fenotipul Rhesus/Kell sau fenotipul extins la alte sisteme antigenice eritrocitare, al treilea tip de suspensii este suspensia de gel antiglobulinic polispecific sau monospecific pentru testul Coombs direct și indirect. Cartele ID-Dia Med au configurații variate (combinații de teste sau teste repetitive pe aceiași cartelă), foarte flexibile și adaptabile oricărui tip de laborator.

Metoda ID-Dia Med presupune utilizarea: incubatorului ID 37 SII, centrifuga ID 12 SII și a pipetei automate ID EP 3

Fig.2.12 Incubatorul Dia Med vedere frontală

Fig.2.13 Incubatorul Dia Med vedere de sus

Fig.2.14 Centrifuga Dia Med

Fig.2.15 Pipetă Dia Med

Fig.2.16 Cartele Dia Med sigilate pentru determinarea sistemului AB0

Fig.2.17 Cartele Dia Med sigilate pentru determinarea fenotipului Rhesus și antigenului Kell

Principiul metodei este realizarea unui mediu de reacție care în timpul centrifugării standardizate să oprească aglutinatele formate (reacție pozitivă) sau să lase să treacă hematiile libere neaglutinate. După o eventuală etapă de incubare specifică fiecărui test, cartele ID sunt supuse unei centrifugării standardizate pe parcursul căreia hematiile difuzează în coloana de gel. Dacă reacția antigen-anticorp are loc, aglutinatele formate sunt reținute în porii gelului, în funcție de intensitatea reacției, aglutinatele se opresc la diferite nivele ale coloanei de gel, rezultând o scară standardizată de lectură a rezulatatelor. În cazul unei reacții negative, hematiile libere trec prin coloana de gel și sedimentează în vârful conic al microtubului.[36]

Interpretarea rezultatelor este ușor de realizat, în cazul unei reacții pozitive apare o linie roșie formată din hematiile aglutinate la suprafața gelului sau pot apărea la diferite niveluri ale coloanei de gel. Pentru a exista o siguranță, precizie în citirea diferitelor niveluri de aparție în gel s-a realizat o scală standardizată după cum urmează:

4+ linia roșie, hematiile aglutinate sunt vizibile la suprafața gelului;

3+ sunt prezente hematii aglutinate atât la suprafața gelului cât și în treimea superioară a coloanei de gel;

2+ eritrocitele aglutinate se găsesc în treimea superioară și medie a coloanei de gel;

1+ eritrocitele aglutinate se găsesc în treimea inferioară a coloanei de gel, de asemenea se pot găsii câteva hemtii libere în vârful microtubului;

Fig.2.18 Rezultate cartele donator pentru sistemul AB0, fenotip Rhesus și antigenul Kell

Avantajele metodei sunt rezultate stabile care pot fi citite și interpretate în timp de 48 de ore (în condițiile conservării la 40C), interpretare directă și simplă, fotocopierea cartelei pentru arhivare și de asemenea este o metodă specifică și foarte sensibilă.

Dezavantajele metodei pot fi considerate pretul mare al cartelelor, dotarea laboratorului cu centrifugă ID-Dia MEd cu program standardizat și automat, incubator ID-Dia Med

Cartele ID- DiaMed pot avea diferite configurații:

Există posibilitatea de a efectua mai multe teste pe aceiași cartelă, acest lucru este realizabil datorită faptului că fiecare microtub conține alt tip de reactiv și cartelele sunt acoperite cu o folie de aluminiu care permite utilizarea, în funcție de necesitate, a unui anumit număr de microtuburi de pe cartelă, exemplu de cartele: grupaj sanguin AB0/D, fenotip Rh și Kell;

Alt tip de cartelă se întălnește același tip de reactiv în toate microtuburile astfel se poate testa șase eșantioane diferite, exempl: grupaj Rh, Kell, teste Coombs;

Există diferite seturi de hematii test care pot fi utilizate în anumite probe, pentru testul „clasic” proba serică Simonin hematiile de grup A1, A2, B, 0 și pentru depistarea anticorpilor iregulari alte paneluri de hematii.

Ca și reactivi suplimentari se folosesc: ID- Diluent-1, ID- Diluent-2 și ID- Papaină.

Enzimele proteolitice modifică antigenele celulelor roșii și în consecință influențează reactivitatea anumitor sisteme antigen-anticorp. Cele mai folosite enzime în imuno-hematologie sunt papaina și bromelina. Papaina este utlizată în general pentru tratarea hematiilor înaintea utilizării lor în timp ce bromelina este cea mai utlizată enzimă pentru reactivi suplimentari.

ID- Diluent-1 este o soluție modificată de Bromelină cu o activitate enzimatică standardizată și stabilizată cu ajutorul conservanților: antibiotic și sulfametoxazol, special preparată pentru tehnica în gel. Este utilizată pentru prepararea suspensiilor eritrocitare de 5%. Pentru prepararea suspensiilor eritrocitare se poate folosi sânge proaspăt recoltat pe anticoagulant (citrat, EDTA, CPD-A) sau se mai poate folosi sânge proaspăt recoltat fără anticoagulant.

ID-Diluent-2 este o soluție cu forță ionică scăzută denumită și LISS preparată pentru tehnica în gel. Se folosește atât cu suspensii eritrocitare de 5% cât și suspensii de 0,8%.

ID-Papaină este o soluție de papaină cu o activitate enzimatică standardizată și stabilizată cu ajutorul conservanților pregătită pentru tehnica în gel.

Din această gamă largă de cartele ID-DiaMed am folosit două tipuri: A-B-AB-D-CDE-ctl și C-c-E-e-K-ctl.

Primul tip se utilzează pentru depistarea grupajului sanguin AB0 (proba globulară Beth-Vincent) și Rhesus(D) atât pentru reactivi monoclonali cât și pentru cei policlonali diferența dintre cele două metode constă în utilizarea reactivilor și anume pentru reactivi monoclonali se folosește reactivul LISS ID-Diluent-2 iar în celălalt caz se utilizează reactivul Bromelină ID-Diluent1.

Echipamentul este necesar în cazul efectuării tuturor determinărilor avem nevoie de: centrifugă, distribuitor, pipetă, stativ de lucru, conuri pentru pipetă, eprubete procurate de la aceiași firmă.[34]

Prepararea soluției din hematiile de testat: într-o eprubetă curată se adaugă 0,5 ml soluție reactiv (ID-Diluent-1 sau ID-Diluent-2) peste care se poate adăuga in funcție de sângele utilizat, dacă este sânge total se pun 50 microlitri și dacă se folosește sediment eritrocitar 25 microlitri. Această soluție se omogenizează putând fiind imediat utilizată. Reactivul trebuie păstrat în condiții optime la o temperatură între 2-80C și după deschidere are termenul de valabilitate de șase luni, înainte de utilizare se aduce la temperatura camerei.

Se alege cartela ID care se va folosi, se trec datele de identificare a persoanei pe cartelă. După care se îndepărtează folia de aluminiu atât cât avem nevoie pentru analiză. Preparăm soluția conform celor spuse mai sus, din care adăugăm 10 microlitri în fiecare microtub întrebuințat. Cartele ID se centrifughează timp de 10 minute, aranjarea în centrifugă se face conform standardelor, în acest caz pentru ecchilibrare se folosesc cartele sigilate, centrifugharea se face la 900C pentru a facilita obținerea reacției antigen-anticorp. După cele 10 minute se efectuează citirea și interpretarea rezultatelor. În cazul donatorilor pentru o bună evidență aceste cartele sunt xeroxate și atașate fișei de donator, în care mai sunt notate datele personale de identificare, grupa sanguină, Rh, Kelul și numărul donărilor.

Rolul microtubului ctl este de martor, acesta pentru a putea fi validată proba trebuie să iasă intotdeauna negativ. În cazul în care ctl este pozitiv proba nu este validată și se repetă.

Pentru efectuarea grupajului AB0 proba Simonin se folosește o cartelă ce conține șase microtuburi cu gel neutru NaCl/ Enzimă, dacă se utilizează trei tipuri de hematii test: A1, B și 0 se pot efectua două teste pe o cartelă.

Hematiile test sunt testate pentru depistarea anumitor boli transmisibile pe cale sanguină (HIV, HCV și HBs) sunt preparate dintr-o singură unitate sanguină, se conservă la 2-80C și au ca termen de valabilitate șapte săptămăni de la data preparării. Peste microtuburile cu gel neutru identificate se distribuie 50 microlitri din hematiile test, iar peste se adaugă 50 microlitri de plasmă sau ser. Cartelele se incubează 10 minute, la temperatura camerei și se centrifughează tot 10 minute. În cazul în care utilizăm ser în loc de plasmă acesta trebuie să fie limpede și fără reziduri de fibrină care pot interfera cu reacția probei și astfel pot apărea erori.

Cea de-a doua cartelă utilizată este care include fentipul Rhesus C, c, E, e și Kell, în cazul acestei probe se folosește reactivul LISS. Această cartelă se folosește pentru o singur test. Iar procedeul este asemănător cu cel pentru grupajul AB0 proba Beth-Vincent, de asemenea microtubul ctl trebuie să fie negativ pentru ca proba să fie validă.

Sângele recoltat pe anticoagulant se centrifughează pentru separarea părții roșii de plasmă, este recolatat în eprubete sterile, de unică folosință pe care sunt notate datele personale de identificare, fiecare donator primește un număr unic de identificare, fiecare donare la rândul ei primește un număr de identificare efectuată în ordinarea donării, de asemenea produsele obținute. La prima donare donatorului i se identifică grupa de sânge și Rh-ul, urmând ca la a doua donare să se identifice fenotipul Rh extins și Kell.

Se identifică cartela pe care o vom utiliza, se trec datele de identificare ale donatorului, între timp am pregătit materialele necesare efectuării probelor, recativii aduși la temperatura camerei.

CAPITOLUL 3 – REZULTATE ȘI DISCUȚII

S-a analizat inițial profilul donatorilor pentru fiecare an al studiului în parte. S-au analizat cei 126 de donatori născuți în anul 1991, așa cum rezultă din tabelele 3.1- 3.8

Tabelul 3.1 Grupa 0 Rh (D) pozitiv

Tabelul 3.2 Grupa 0 Rh negativ

Tabelul 3.3 Grupa A Rh (D) pozitiv

Tabelul 3.4 Grupa A Rh negative

Tabelul 3.5 Grupa B Rh (D) pozitiv

Tabelul 3.6 Grupa B Rh negative

Tabelul 3.7 Grupa AB Rh (D) pozitiv

Tabelul 3.8 Grupa AB Rh (D) negative

Fig.3.1 Diagrama anul 1991 repartizată pe sexe

Fig,3.2 Diagrama anul 1991 repartizată pe medii

În continuare am studiat distribuția grupelor sanguine a donatorilor în anul 1991:

Tabelul 3.11 Grupe sanguine anul 1991

Fig.3.3 Diagrama grupelor sanguine

Am analizat distribuția grupelor de sânge în funcție de sexe și mediu

Fig.3.4 Diagrama grupa 0 pe sexe

Fig.3.5 Diagrama grupa 0 pe medii

Fig.3.6 Diagrama grupa A pe sexe

Fig.3.7 Diagrama grupa A pe medii

Fig.3.8 Diagrama grupa B pe sexe

Fig.3.9 Diagrama grupa B pe medii

Fig.3.10 Diagrama grupa AB pe sexe

Fig.3.11 Diagrama grupa AB pe medii

Am analizat distribuția Rh-ului

Prezența antigenului D :

Fig.3.12 Diagrama Rh

Distribuția Rh-lui pozitiv în funcție de sexul donatorilor

Fig. 3.13 Diagrama Rh pozitiv

Distribuția Rh-ului negativ în funcție de sexul donatorilor

Fig. 3.14 Diagrama Rh negativ

Distribuția antigenului Kell

Fig. 3.15 Antigenul Kell

Distribuția antigenului Kell pozitiv și negativ în funcție de sexe

Fig. 3.16 Diagrama Kell negativ

Fig. 3.17 Diagrama Kell pozitiv

Distribuția fenotipurilor

Fig. 3.18 Diagrama Fenotip

În anul 1992 s-au analizat 781 de donatori așa cum rezultă din tabele 3.19-3.

Tabelul 3.19 Grupa 0 pozitiv

Tabelul 3.20 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.21 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.22 Grupa A negativ

Tabelul 3.23 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.24 Grupa B negativ

Tabelul 3.25 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.26 Grupa AB negativ

Fig.3.19 Diagrama anul 1992 repartizată pe sexe

Fig.3.20 Diagrama anul 1992 repartizată pe medii

Fig. 3. 21 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.22 Diagrama grupa 0 repartizată pe sexe

Fig.3.23 Diagrama grupa 0 repartizată pe medii

Fig.3.24 Diagrama grupa A repartizată pe sexe

Fig.3.25 Diagrama grupa A repartizată pe medii

Fig.3.26 Diagrama grupa B repartizată pe sexe

Fig.3.27 Diagrama grupa B repartizată pe medii

Fig.3.28 Diagrama grupa AB repartizată pe sexe

Fig.3.29 Diagrama grupa AB repartizată pe medii

Fig.3.30 Diagrama Rh

Fig. 3.31 Diagrama Rh pozitiv

Fig. 3.32 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig. 3.33 Diagrama antigenul Kell

Kell negativ împărțit pe genuri

Fig. 3.34 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv împărțit pe sexe

Fig. 3.35 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.36 Diagrama fenotip

În anul 1993 s-au analizat 684 de donatori

Tabelul 3.45 Grupa 0 pozitiv

Tabelul 3.46 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.47 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.48 Grupa A negative

Tabelul 3.49 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.50 Grupa B negative

Tabelul 3.51 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.52 Grupa AB negativ

Fig.3.37 Diagrama anul 1993 repartizați pe sexe

Fig. 3. 38 Diagrama mediu

Grupele sanguine

Fig. 3. 39 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.40 Diagrama grupa 0 repartizată pe sexe

Fig.3.41 Diagrama grupa 0 repartizată pe medii

Fig.3.42 Diagrama grupa A repartizată pe sexe

Fig.3.43 Diagrama grupa A repartizată pe medii

Fig.3.44 Diagrama grupa B repartizată pe sexe

Fig.3.45 Diagrama grupa B repartizată pe medii

Fig.3.46 Diagrama grupa AB repartizată pe sexe

Fig.3.47 Diagrama grupa AB repartizată pe medii

Prezența antigenului D

Fig. 3. 48 Diagrama Rh

Rh-ul pozitiv împărțit pe sexe

Fig. 3.49 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul negativ împărțit pe genuri

Fig. 3.50 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig. 3.51 Diagrama Kell

Kell negativ repartizat pe sexe

Fig. 3.52 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv împărțit pe genuri

Fig. 3.53 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.54 Diagrama fenotip

În anul 1994 s-au analizat 626 de donatori

Tabelul 3.79 Grupa 0 pozitiv

Tabelul 3.80 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.81 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.82 Grupa A negative

Tabelul 3.83 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.84 Grupa B negative

Tabelul 3.85 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.86 Grupa AB negative

Fig.3.55 Diagrama Anul 1994 repartizați pe sexe

Fig.3.56 Diagrama anul 1994 repartizați pe medii

Grupele sanguine

Fig. 3. 57 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.58 Diagrama grupa 0 repartizati pe sexe

Fig.3.59 Diagrama grupa 0 repartizați pe medii

Fig.3.60 Diagrama grupa A repartizați pe sexe

Fig.3.61 Diagrama grupa A repartizați pe mediu

Fig.3.63 Diagrama grupa B repartizați pe sexe

Fig.3.64 Diagrama grupa B repartizați pe mediu

Fig.3.65 Diagrama repartizată pe sexe

Fig.3.66 Diagrama repartizată pe mediu

Prezența antigenului D

Fig. 3. 67 Diagrama Rh

Rh-ul pozitiv pe sexe

Fig. 3.68 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul negativ pe sexe

Fig. 3.69 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig. 3. 70 Diagrama Kell

Kell negativ repartizat pe sexe

Fig. 3.71 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv repartizat pe sexe

Fig. 3.72 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.73 Diagrama fenotip

În anul 1995 s-au analizat 431 de donatori

Tabelul 3.105 Grupa 0 pozitv

Tabelul 3.106 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.107 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.108 Grupa A negativ

Tabelul 3.109 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.110 Grupa B negative

Tabelul 3.111 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.112 Grupa AB negative

Fig.3.74 Diagrama anul 1995

Fig.3.75 Diagrama anul 1995

Grupele sanguine

Fig. 3.76 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.77 Diagrama grupa 0

Fig.3.78 Diagrama grupa 0

Fig.3.79 Diagrama grupa A

Fig.3.80 Diagrama grupa A

Fig.3.81 Diagrama grupa B

Fig.3.82 Diagrama grupa B

Fig.3.83 Diagrama grupa AB

Fig.3.84 Diagrama grupa AB

Prezența antigenului D

Fig. 3.85 Diagrama Rh

Rh-ul pozitiv repartizat pe sexe

Fig. 3.86 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul negativ repartizat pe sexe

Fig. 3.87 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig.3.88 Diagrama Kell

Kell negativ repartizat pe sexe

Fig. 3.89 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv repartizat pe sexe

Fig. 3.90 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.91 Diagrama fenotip

În anul 1996 s-au analizat 190 de donatori

Tabelul 3.130 Grupa 0 pozitiv

Tabelul 3.131 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.132 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.133 Grupa A negativ

Tabelul 3.134 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.135 Grupa B negative

Tabelul 3.136 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.137 Grupa AB negativ

Fig.3.92. Diagrama anul 1996

Fig.3.93 Diagrama anul 1996

Grupele sanguine

Fig. 3.94 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.95 Diagrama grupa 0

Fig.3.96 Diagrama grupa 0

Fig.3.97 Diagrama grupa A

Fig.3.98 Diagrama grupa A

Fig.3.99 Diagrama grupa B

Fig.3.100 Diagrama grupa B

Fig.3.101 Diagrama grupa AB

Fig.3.102 Diagrama grupa AB

Prezența antigenului D

Fig. 3.103 Diagrama Rh

Rh-ul pozitiv repartizat pe genuri

Fig.3.104 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul negativ împărțit pe sexe

Fig. 3. 105 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig. 3.106 Diagrama Kell

Kell negativ repartizat pe sexe

Fig. 3.107 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv împărțit pe genuri

Fig. 3.108 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.109 Diagrama fenotip

În anul 1997 s-au analizat 24 de donatori

Tabelul 3.155 Grupa 0 pozitiv

Tabelul 3.156 Grupa 0 negativ

Tabelul 3.157 Grupa A pozitiv

Tabelul 3.158 Grupa A negative

Tabelul 3.159 Grupa B pozitiv

Tabelul 3.160 Grupa B negative

Tabelul 3.161 Grupa AB pozitiv

Tabelul 3.162 Grupa AB negative

Fig.3.110 Diagrama anul 1997

Fig.3.111 Diagrama anul 1997

Grupele sanguine

Fig. 3.112 Diagrama grupe sanguine

Fig.3.113 Diagrama grupa 0

Fig.3.114 Diagrama grupa 0

Fig.3.115 Diagrama grupa A

Fig.3.116 Diagrama grupa A

Fig.3.117 Diagrama grupa B

Fig.3.118 Diagrama grupa B

Fig.3.119 Diagrama grupa AB

Fig.3.120 Diagrama grupa AB

Prezența antigenului D

Fig. 3.121 Diagrama Rh

Rh-ul pozitiv repartizat pe sexe

Fig. 3.122 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul negativ repartizat pe genuri

Fig. 3.123 Diagrama Rh negativ

Antigenul Kell

Fig. 3.124 Diagrama Kell

Kell negativ împărțit pe genuri

Fig. 3.125 Diagrama Kell negativ

Kell pozitiv repartizat pe sexe

Fig. 3.126 Diagrama Kell pozitiv

Total fenotipuri

Fig. 3.127 Diagrama fenotip

Fig.3.128 Diagrama anii 1991-1997

Fig.3.129 Diagrama anii 1991-1997

Grupele sanguine pe tot parcursul perioadei

Fig.3.130 Diagrama grupe

Analizând diagrama de mai sus rezultă: grupa sanguină A este cea mai frecventă cu 41%, pe locul doi se clasează grupa 0 cu 34%, urmând grupa B având 18% iar cel mai puțin frecventă este grupa AB cu 7%. În general frecvența este: grupa 0 40-50%, grupa A 35-45%, grupa B 8-11% și grupa AB 3-15%.[37] În cazul României frecvența este astfel: grupa 0 34%, grupa A 41%, grupa B 19% iar grupa AB 6% sunt similare studiului efectuat.[38]

În Australia grupa 0 deține 49% fiind cea mai frecventă, grupa A 38%, grupa B 10% iar grupa AB 3%. Față de studiu analizat în această lucrare diferența constă în ordinea primelor două grupe și anume în Australia pe primul loc avem grupa 0 cu 49% urmată de grupa A cu 38% și a procentajelor fiecărei grupe.[39]

China are următoarea frecvență, grupa 0 48%, grupa A 28%, grupa B 19% iar grupa AB 5%. Ordinea este asemănătoare cu cea din Australia, diferența fiind procentele.

Ordinea grupelor de sânge în Japonia este următoare: grupa 0 cu 28%, grupa A 48%, grupa B 23% iar grupa AB 9%. Ordinea este asemănătoare cu cea a studiului analizat diferența o fac procentele.[40]

În cazul Statelor Unite ale Americii avem o împărțire pe rasele dominante, astfel în cazul caucazienilor avem grupa 0 cu 45%, grupa A 40%, grupa B 11% iar grupa AB 4%. Frecvența este asemănătoare cu cea din Australia și China, procentajul dintre grupa 0 și A este apropiat, iar grupa AB are un procentaj scăzut doar 4%. Populația de origine africană din SUA are următoare frecvență: grupa 0 51%, grupa A 26%, grupa B 19% iar grupa AB 4%, ordinea este similară cu cea a caucazienilor se observă o diferență notabilă pentru grupa A( la africani 26% iar la caucazieni 40%). Hispanicii din SUA au frecvența grupa 0 57%, grupa A 31%, grupa B 10% iar grupa AB 2%, ordinea este similară cu cea a caucazienilor și a africanilor diferența constă în procentajul și valoarea scăzută a grupei AB doar 2%.

În Canada frecvența este următoarea: grupa 0 46%, grupa A 42%, grupa B 9% și grupa AB 3% similară cu frecvența celorlalte etnii din SUA diferența constă în procentaj.[40] . Frecvența cea mai mare pentru grupa 0 este 57% la populația hispanică din SUA, pentru grupa A este de 48% la japonezi, pentru grupa B 23% și grupa AB 9% la japonezi.

Fig.3.131 Diagrama grupa 0

Fig.3.132 Diagrama grupa 0

Fig.3.133 Diagrama grupa A

Fig.3.134 Diagrama grupa A

Fig.3.135 Diagrama grupa B

Fig.3.136 Diagrama grupa B

Fig.3.137 Diagrama grupa AB

Fig.3.138 Diagrama grupa AB

Fig. 3.139 Diagrama Rh

Reiese din diagrama de mai sus că Rh-ul pozitiv predomină cu 88% față de 12% Rh-ul negativ. În România Rh-ul(D) pozitiv este de 86% iar cel negativ de 14% asemănător studiului.[41]

În Anglia procentul este de 83% Rh-ul (D) pozitiv față de 17% Rh-ul negativ ; SUA Rh-ul pozitiv reprezintă 85% iar Rh-ul negativ 15% ; Nigeria Rh-ul pozitiv este de 95,2% iar Rh-ul negativ 4,8% ; New Guinea Rh-ul pozitiv este 95,9% iar cel negativ 4,1% ; Arabia Saudită și Pakistan Rh-ul pozitiv este de 93% iar cel negativ 7%.[42] În cazul populației kurde Rh-ul pozitiv este de 91,1% iar cel negativ de 8,9%.[43] În cazul studiului studenților nigerieni cu origini africane Rh-ul pozitiv este de 94% iar Rh-ul negativ de 6%.[44] În cazul majorității grupurilor etnice sudaneze Rh-ul pozitiv este 98% iar Rh-ul negativ este 2%.[45] În cazul localității Lagos din Sud-Vestul Nigeriei Rh-ul pozitiv este de 97% iar cel negativ de 3%.[46] În cazul localității Minna din Nord-Centru Nigerie Rh-ul pozitiv 96,7% iar Rh-ul negativ este 3,3%.[47] Rh-ul pozitiv este predominant diferența constă în procente. Rh-ul pozitiv are cel mai mare procentaj în cazul grupurilor etnice sudaneze 98%,urmată de New Guinea 95,9%, Nigeria cu 95,2% apoi Arabia Saudită și Pakistanul cu 93%, studiul analizat 88%, România 86%, SUA 85% și Anglia 83%. În cazul Rh-ului negativ cel mai mare procent se întălnește în cazul Angliei 17%, urmată de SUA 15%, studiul analizat 14% iar cel mai mic procent se întălnește în cazul grupurilor etnice din Sudan 2%.

Fig. 3.140 Diagrama Rh pozitiv

Rh-ul pozitiv repartizat pe sexe, raportul este de 67% masculin față de 33% feminin.

Fig. 3.141 Diagrama Rh negativ

Raportul este 62% masculin față de 38% feminin.

Fig. 3.142 Diagrama Kell

Din lotul analizat reiese că 92% dintre donatorii sunt Kell negativ și 8% sunt Kell pozitivi.

Fig. 3.143 Diagrama Kell negativ

Din cei 92% donatori Kell negativ bărbați sunt 67% iar, femei 33%

Fig. 3.144 Diagrama Kell pozitiv

Raportul donatorilor Kell pozitiv este de 68% masculin față de 32% feminin.

Fig. 3.145 Diagrama fenotip

Ordinea frecvenței fenotipurilor lotului analizat este: DCcee 35%, DCCee 26%, DCcEe 14%, ccee 11%, DccEe 10%, DccEE 2%, Dccee 1%, Ccee 1%, DCEee 0%, DCCEe 0%, DCEEe 0%, ccEe 0%, CCee 0%.

În Franța frecvența fenotipurilor este următoarea: DCcee 34,39%, DCCee 19,94%, ccee 15,40%, DCcEe 12,87%, DccEe 12,24%, Dccee 2,32%, DccEE 0,95%, Ccee 0,95% DCCEe 0,42%, ccEe 0,42%, CcEe 0,10%.[48]

În cazul rasei negre frecvența fenotipurilor este: Dccee 42%, DCcee 26%, DccEe 16%, ccee 7%, DCcEe 4%, DCCee 3%, DccEE 1%, Ccee 1%, ccEe 0%.[49]

Frecvența fenotipurilor exprimate procentual în cazul populației est africane este: Dccee 81,9%, DccEe 8%, DCcee 2,9%, ccee 2,9%, DccEE 2,2%, DCcEe 0,7%, DCCee 0%, Ccee 0%, ccEe 0%.

Ordinea frecvenței fenotipurilor la populația thailandeză este: DCCee 55,6%, DCcEe 26,7%, DCcee 8,7%, DccEE 3,6%, DccEe 1,5%, Dccee 0,6%, ccee 0%, Ccee 0%, ccEe 0%.

În cazul populației mexicane frecvența fenotipurilor este: DCCee 27%, DCcEe 26%, DCcee 18%, DccEe 8%, DccEE 7%, ccee 3%, Dccee 2%, Ccee 0,2%, ccEe 0,2%.

Populația din Arabia Saudită prezintă următoarele frecvențe ale fenotipurilor: DCcee 28,1%, DCCee 20,7%, DCcEe 14,8%, Dccee 10,8%, ccee 10,3%, DccEe 10,3%, DccEE 4,4%, Ccee 0,5%, ccEe 0%.[49]

Fenotipul DCcee este cel mai întălnit în cazul studiului analizat cu 35% iar cel mai puțin frecvent la populația est africane 2,9%, DCCee este cel mai frecvent la populația thailandeză 55,6% la capătul opus se află populația est africană unde nu se întălnește și populația neagră 3%, al treilea fenotip DCcEe este cel mai răspândit la populația thailandeză 26,7% și cel mai puțin răspândit este la est africani cu 0,7%, al patrulea fenotip ccee se întălnește frecvent în cazul Franței 15,4% și cel mai puțin frecvent în cazul populației thailandeze 0% și 2,9% populația est africană, al cincelea DccEe este cel mai întălnit rasei negre 16% și cel mai puțin frecvent în cazul populație thailandeze cu 1,5%, al șaselea fenotip DccEE este cel mai frecvent întălnit la populația mexicană 7% iar cel mai puțin frecvent este în Franța cu 0,95% și al șaptelea Dccee este cel mai întălnit la populația est africane 81,9% și cel mai puțin frecvent în cazul populației thailandeze cu 0,6%, al optelea Ccee este cel mai frecvent în cazul studiului analizat 1% și în cazul rasei negre 1% iar cel mai puțin frecvent în cazul populației est africane și thailandeze 0%, al noulea DCEee se întălnește doar în cazul studiului analizat, al zecelea DCCEe este mai frecvent la francezi cu 0,42% și cel mai puțin frecvent în cazul studiului studiului analizat 0%, al unsprezecelea DCEEe se întălnește în cazul studiului analizat, al doisprezecelea ccEe este cel întălnit la populația mexicane 0,2% și cel mai puțin frecvent la populația arabia saudită, thailandeze, est africane, rasei negre și a studiului analizat cu 0%,al treisprezecelea CCee se întălnește doar în cazul studiului analizat, fenotipul CcEe nu are corespondent în studiul analizat, se întălnește doar la francezi.Un fenotip rar întălnit la caucazieni este CCDEe cu o frecvență de 0,2%, acesta nu se întălnește în studiul analizat.[50]