Definiția și obiectivele biotehnologiilor [310333]

[anonimizat] o [anonimizat] – [anonimizat], în 1953 și stabilirea tehnicilor de manipulare genetică în 1973, au pus bazele unei biotehnologii moderne cu considerabile efecte economice și sociale .

Noțiunea de biotehnologie nu înseamnă același lucru pentru toată lumea. [anonimizat], [anonimizat], consideră că biotehnologie înseamnă doar tehnici biologice moderne ([anonimizat], anticorpi monoclonali) [anonimizat] „lădița cu scule” a biologilor iar pe Wall Street biotehnologia reprezintă doar o sursă de noi oportunități și de riscuri financiare.

Cuvântul „biotehnologie” este format din doi termeni „bio” provine din grecescul „bios”, care înseamnă „viață” (din care provine și „biologia” = „știința vieții”) și din „tehnologie”, care la rândul său provine tot din limba greacă, „technos” = „meșteșug” + „logos” = „știință”.

O definiție – [anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat] a dezvolta microrganisme cu utilizări specifice. O a [anonimizat] – definește biotehnologia drept utilizarea industrială a ADN recombinat, a fuziunii celulare și a noilor tehnici de bioprelucrare [1].

O definiție încă actuală este cea adoptată în 1978 de către Federația Europeană de Biologie: utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei și ingineriei în scopul obținerii unei aplicații tehnologice (industriale), [anonimizat] a părților componente ale acestora [2].

Biotehnologia constituie aplicarea integrată a științelor biologice și inginerești în vederea utilizării tehnologice a organismelor vii, a [anonimizat] a [anonimizat]. (figura 1.1).

Figura 1.1. Biotehnologia o știință complexă

Dacă la început biologia a fost o știință a naturii, o [anonimizat] (bioproces) este o [anonimizat] – „știința inginerului”.

[anonimizat]. [anonimizat], structuri celulare și subcelulare active (biocatalizatori, anticorpi) la o inginerie sofisticată. (Jurcoane, 2009).

Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic” numit și „bioproces. Punerea la punct a unui bioproces industrial necesită o [anonimizat], enzimologiei, microbiologiei, ingineriei biochimice. Această abordare este evidentă dacă ne uităm la etapele de dezvoltare necesare unui proces industrial de obținere a unui produs pe bază de ADN recombinat: insulină, [anonimizat] (figura 1.2).

Figura 1.2. Etapele de dezvoltare ale unui bioproces pentru producerea și comercializarea unui bioprodus pe bază de ADN recombinat [3]

Aplicațiile biotehnologiilor

Sfera domeniilor de aplicabilitate a biotehnologiilor este foarte largă și este dată de varietatea mare a proceselor biotehnologice. aplicată în diverse domenii, cum ar fi: agricultură, industria alimentară, producție industrială, mediu și medicină.

Federația Europeană de Biotehnologie (EFB) împarte biotehnologiile în:

biotehnologii convenționale (tradiționale) care tratează concepte biotehnologice clasice, aplicate în industrie, agricultură, medicină sau pentru protecția mediului înconjurător;

biotehnologii moderne care abordează concepte biotehnologice moderne, bazate pe studii avansate de biologie moleculară, genetică și inginerie genetică.

În funcție de tipul de celule care se manipulează, deosebim:

biotehnologii microbiene;

biotehnologii vegetale;

biotehnologii animale.

În funcție de domeniul în care își găsesc aplicații produsele obținute pe cale biotehnologică deosebim:

biotehnologii industriale (farmaceutice, alimentare și de depoluare);

biotehnologii agricole (vegetale și în zootehnie);

biotehnologii medical-veterinare.

Rolul biotehnologiilor în diferite domenii

Impactul biotehnologiilor alimentare se reflectă în securitatea alimentara, siguranța alimentară, alimentație și sănătatea, agricultură, bioaditivi și bioingrediente și protecția mediului înconjurător.

Figura 1.3. Impactul biotehnologiilor alimentare în diferite domenii

În industria alimentară biotehnologiile au un rol covârșitor. De fapt, industria alimentară este o biotehnologie deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice și prin urmare conservarea lor până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor și legumelor) sau până la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implică controlul activității enzimatice proprii țesuturilor vegetale și animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare. Enzimele proprii țesuturilor vegetale și animale sunt esențiale în transformările pe care le oferă produsele agroalimentare: maturarea fructelor și legumelor, cerealelor și făinurilor sau diferitelor produse alimentare pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor, maturarea cărnii. (Banu 2000)

Enzimele pot avea însă și rol deteriorativ cu implicații în modificarea caracteristicilor senzoriale și a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare până la prelucrarea termică a acestora.

De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având acțiune dăunătoare, altele având rol esențial în obținerea unor produse alimentare datorită acțiunii lor fermentative: produse lactate acide, brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale și leguminoase.

Microorganismele intervin și în fermentarea unor produse vegetale: varza, murături, măsline, castraveți, cacao, etc.

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului, panificației, etc.) și a culturilor starter (industria berii, laptelui, cărnii, panificației, etc.). La toate acestea trebuie să avem în vedere obținerea de metaboliți secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum și de biomasă alimentară și furajeră, etc. (Banu,2000)

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfecționa procesele de producție, se poate îmbunătăți calitatea produselor alimentare și se poate mări gradul de diversificare a producției alimentare.

Biotehnologii agricole vizează un domeniu larg, care se ocupă cu:

microreproducerea plantelor și animalelor prin tehnici de inginerie genetică, hibridare somatică, selecționare, culturi “in vitro”, culturi celulare vegetale și animale; pot obține replicarea intensivă a semințelor, plantulelor sau liniilor animale selecționate.

ameliorarea plantelor și animalelor, pentru obținerea de linii înalt productive, rezistente la boli dăunători și condiții climaterice extreme. În această direcție se înscrie obținerea de plante cu rate crescute de fotosinteză, plante rezistente la temperaturi scăzute sau ridicate, la secetă sau salinitate crescută a solurilor. Se pot obține de asemenea animale cu producții crescute de carne, lapte, ouă, lână, etc.

Eforturi susținute se depun în direcția obținerii de plante fixatoare de azot, altele decât leguminoasele. Se caută de asemenea specii forestiere apte unor producții rapide de masă lemnoasă de calitate, înalt regenerabile sau capabile de împădurire a zonelor alpine extreme sau deteriorate puternic.

Biotehnologii în medicină umană și sănătate publică. Reprezintă domeniul care a inregistrat cele mai mari progrese datorita marilor descoperiri în biologia moleculară care au generat producerea și sinteza de medicamente, hormoni, de antigene, de enzime, de reactivi necesari diagnosticării si vaccinuri contra a numeroase boli infecțioase, virale și parazitare. Cea mai mare parte a medicamentelor produse și comercializate pe plan mondial sunt produse într-o formă sau alta prin biotehnologie.

Biotehnologiile medical-veterinare au ca scop, în principal, crearea unor sisteme de diagnostic rapid și eficient al maladiilor sau dereglărilor funcționale la om și la animale, producerea unor sisteme biologice de combatere a bolilor (anticorpi monoclonali, vaccinuri și bacterii antagoniste).

Biotehnologii orientate spre producerea de energie. Există biotehnologii utilizate actual pe scară largă pentru producerea de surse auxiliare de energie, precum alcooli, metan, hidrogen, pe baza deșeurilor organice rezultate în agricultură, zootehnie, industria alimentară.

Biotehnologii în controlul poluării. Aceasta ramura a biotehnologiei este orientata in sensul limitarii poluarii mediului inconjurator.

Beneficiile rezultate din aplicarea biotehnologiilor

Biotehnologiilor moderne au impus dezvoltarea lor foarte rapidă la nivel mondial prin:

Creșterea și diversificarea producției vegetale

Primele generații de produse alimentare modificate genetic (OMG sau GMO) au fost bine primite de fermieri în SUA, prin creșterea producției agricole. Spre exemplu, studiile au arătat că, o specie de porumb modificată genetic, rezistent la acțiunea dăunătoare a insectelor, a manifestat o rezistență crescută și la acțiunea altor microorganisme: fungi, mucegaiuri care atacau porumbul nemodificat.

De asemenea, nivelul de micotoxine produse de diferite specii de mucegaiuri sunt mult mai mici la porumbul-GMO.

Beneficii nutritive și igienice

O mare varietate de produse biotehnologice din clasa uleiurilor sau grăsimilor alimentare sunt deja pe piață. Cu ajutorul biotehnologiilor vegetale a fost redus conținutul de acizi grași saturați din câteva sortimente de uleiuri vegetale .

Prin biotehnologie a fost rezolvată o problemă de igienă alimentară, atunci când uleiurile vegetale erau hidrogenate pentru creșterea stabilității la tratament termic sau pentru obținerea margarinei.

Cercetările biotehnologice au vizat de asemenea creșterea conținutului proteic al cartofului. Acești cartofi transgenici conțin un număr important de aminoacizi, care în mod normal nu se găsesc în cartof. Pentru orz au fot create specii bogate în vitamina A sau cu un conținut mai bogat de fier.

A fost creată o roșie modificată genetic care conține de trei ori mai mult antioxidant-licopen. Consumul de licopern este asociat cu scăderea riscului producerii cancerului și scăderea nivelului colesterolului din sânge .

Din punct de vedere al igienei alimentare, biotehnologia încearcă să rezolve și următoarele probleme:

identificarea proteinelor alergenice din lapte, soia, alune și eliminarea lor din producțiile vegetale viitoare;

descreșterea conținutului natural de substanțe toxice, prezente în produsele alimentare.

Creșterea calității produselor

Biotehnologiile sunt de asemenea utilizate pentru modificarea caracteristicilor materiilor prime pentru a fi mai atractive pentru consumator și mai ușor de procesat.

Cercetările efectuate au determinat:

creșterea conservabilității fructelor și vegetalelor proaspete;

ardeii, morcovii și salata sunt mai crocante;

obținerea de soiuri cu sâmburi puțini pentru pepeni și struguri;

creșterea sezonalității soiurilor de tomate, căpșuni;

creșterea aromei roșiilor, ardeilor, perelor;

crearea de specii de ceai și cafea fără cafeină.

Cercetătorii japonezi au identificat enzima care produce substanța care declanșează lăcrimarea atunci când tăiem ceapa. Este numai o problemă de timp până când va fi creată o specie de ceapă fără această enzimă.

Foarte multe cercetări au fost efectuate pentru schimbarea raportului apă-amidon din diferite leguminoase. Astfel, un cartof cu un conținut ridicat de amidon, va fi mai sănătos pentru om, deoarece el va absorbi mai puțin ulei în timpul prăjirii. De asemenea, obținerea amidonului din cartof se va face cu un consum energetic mult mai redus. Cu aceleași scopuri, este în cercetare și o specie de tomate pentru obținerea pastei de tomate. Creșterea cu 1,2% a substanței uscate din cartofi, ar aduce o economie energetică de 35 milioane de $ procesatorilor americani .

De beneficiile biotehnologiilor beneficiază și industria de lactate. Specialiștii din Noua Zeelandă utilizează în prezent biotehnologiile animale pentru creșterea conținutului de cazeină din lapte cu 13%, pentru obținerea unei cantități mărite de brânzeturi.

Biotehnologiile promit să aibă un impact puternic asupra menținerii și îmbunătățirii calității vieții și influențează fiecare etapă a existenței umane, existând deja numeroase aplicații industriale: obținerea de vaccinuri și medicamente pentru uz uman și veterinar, produse alimentare, suplimente nutritive pentru consum uman sau animal, producerea de enzime. Ca urmare a cercetărilor întreprinse, în fiecare zi apar noi descoperiri, în domenii cu implicații majore asupra calității vieții: manipulare genetică (inginerie genetică), imobilizare de enzime, tehnologii fermentative, creare de celule hibrid.

Produși obținuți prin biotehnologie

Viața nu ar fi posibilă fără existența microorganismelor, pentru că acestea stabilesc echilibrul între substanțele organice și cele anorganice, între materia vie și materia nevie. Industria alimentară, în mare parte, este de neconceput fără existența microorganismelor care sunt folosite pentru conservare, obținerea de produse alimentare datorită acțiunii lor fermentative (produse lactate acide, unt, brânzeturi, bere, vin, pâine, alimente fermentate din cereale și leguminoase etc.).

În general, produsele rezultate prin biotehnologii din microorganisme, pot fi clasificate în: celule și biomasă, metaboliți primari, metaboliți secundari și enzime.

Celule și biomasă. Numeroase produse alimentare sunt consumate împreună cu celulele microorganismelor folosite pentru fermentare (produse lactate fermentate, produse de carne și pește fermentate, produse tradiționale fermentate de origine vegetală, pâine) sau se consumă numai mediul fermentat, celulele fiind îndepărtate, cum este cazul băuturilor alcoolice de tipul berii, cidrului, vinului etc. În cazul biomasei, aceasta poate fi utilizată ca aditiv de fermentare (drojdie de panificație) sau aditiv de îmbogățire a produselor alimentare cu proteine, respectiv ca furaje pentru păsări, animale, pești. O serie de microorganisme sunt folosite sub forma de inocul de celule ca bioinsecticide, micoerbicide, vaccinuri.

Metaboliții primari. Sunt molecule mici, vitale pentru celulele vii în vederea producerii de macromolecule sau pentru convertire în coenzime (nucleotide, vitamine). Metaboliții primari de importanță pentru industria alimentară sunt alcoolul etilic, poliolii (manitolul, sorbitolul, xilitolul), conservanți (acidul acetic, acidul lactic, acidul citric, acidul propionic), antioxidanți și sechestranți (acidul ascorbic, acidul citric etc.), potențiatori de aromă (glutamatul monosodic, 5'-IMP, 5'-GMP), acidulanți (acidul acetic, acidul citric, acidul malic, acidul gluconic, acidul lactic, acidul tartric, acidul fumărie etc.), aminoacizi (L-lizina, L-triptofanul, L-fenilalanină etc.), vitamine (riboflavina, ciancobalamine, vitamina C, vitamine D), gaze (CO2).

Metaboliții secundari. Sunt produși de un spectru larg de microorganisme și pot fi folosiți ca aditivi de stimulare (giberelinele) în producția de malț, de conservare (nizina) sau ca: coccidiostate, pesticide, bioinsecticide, inocul pentru semințe, vaccinuri, antihelmintici etc., în producția vegetală sau animală pentru a mări producția de alimente necesare omului. De remarcat că, printre metaboliții secundari se numără și micotoxiele, în special aflatoxinele cu acțiune dăunătoare omului și animalelor.

Producția de metaboliți secundari este afectată de mecanismele determinate genetic ca: derepresia (inducția), reglarea catabolică, reglarea feed-back la care trebuie adăugată reglarea de by-pass.

Reacțiile de producere a celulelor, biomasei și a metaboliților pot fi paralele, perfect consecutive (sau decuplate) sau parțial cuplate în funcție de tipul de reacție se conduce și fermentația respectivă. Fermentațiile pot fi conduse discontinuu sau continuu, impunându-se optimizarea lor. În această direcție, în cazul fermentației discontinue, optimizarea trebuie să rezolve două situații:

când substratul este inhibitor pentru producția de metabolit (sau biomasă);

când produsul este inhibitor (biomasă sau metabolitul).

Prima situație se întâlnește, de exemplu, la obținerea biomasei de drojdie de panificație, unde represiunea catabolică de către glucide antrenează o producție de alcool etilic care trebuie evitată, cele două soluții posibile fiind evitarea excesului de substrat, lucrându-se cu cultura în „pat” și respectiv, plasarea unui detector de alcool în efluentul de gaz (CO2), care permite să se cunoască aportul de substrat ce trebuie furnizat.

A doua situație se întâlnește, de exemplu, la producția de culturi lactice, a căror dezvoltare este însoțită de formarea de acid lactic (bacterii homofermentative) sau alcool etilic/acid lactic (bacterii heterofermentative). Pentru a obține celule de bacterii în cantitate de 60 g/l, este necesară o dializă a culturii, tehnică ce se poate aplica și la fabricarea drojdiei de panificație, în care caz celulele de drojdie se separă prin centrifugare iar „laptele” de drojdie este reciclat. În acest fel se obțin 130 g drojdie/l.

Sistemele de fermentație continuă se pot clasifica după natura biocatalizatorului (imobilizat sau nu, sistem eterogen sau nu, celule incluse, adsorbite, grefate prin covalență), gradul de reciclare al celulelor, gradul de amestecare a fluidelor reacționabile în reactorul continuu.

Producția de enzime. Microorganismele produc o serie de enzime folositoare pentru industria alimentară și alte industrii, constituind deci surse de enzime. Producția de enzime va depinde de tipul de microorganism folosit și de condițiile de dezvoltare: compoziția chimică a mediului de cultură, pH, temperatură, adaosul de substanțe de inducere sau scăderea cantității de substanțe represoare în mediu.

Enzimele produse de microorganisme sunt utilizate în industria alimentară pentru bioconversia unor substanțe în altele, dar și în alte scopuri (îmbunătățirea calității produselor alimentare, creșterea capacității de conservare, creșterea digestibilității prin hidroliza enzimatică, îndepărtarea compușilor nedoriți din materiile prime sau produse alimentare, îmbunătățirea tehnologiilor de prelucrare a produselor alimentare în sensul simplificării, scurtării procesului tehnologic și micșorarea costurilor energetice etc.

Microorganismele intervin însă și în sens negativ: datorită capacității lor patogene manifestată prin însușirea de a pătrunde în organismul viu, se înmulțesc în acest organism, secretă toxine și anihilează sistemele de apărare ale organismului viu. Nu trebuie neglijată nici capacitatea unor microorganisme de a elibera toxine (exotoxine) în mediul în care se dezvoltă, inclusiv în produse alimentare – prin al căror consum se produc toxiinfecții alimentare.

Caracteristicile bioproceselor

Fața de alte procese tehnologice întâlnite în industriile de proces, bioprocesele prezintă o serie de particularități, cum ar fi [2 – 4]:

capacități de producție foarte variate: de la 20 milioane t/an (etanol) până la mai puțin de 20 kg/an (insulină, interferon, anticorpi monoclonali); (tabelul 1.1)

Tabelul 1.1.

Produse majore obținute prin biotehnologii [5]

Datele din tabelul 1.1. nu sunt exhaustive: nu au fost incluse procesele de epurare a apelor uzate, de bioremediere a solurilor poluate, biolixivierea minereurilor sau procesele clasice de fabricare a unor produse alimentare tradiționale: iaurt, pâine, bere, vin, oțet.

produsele de biosinteză se găsesc deseori într-o concentrație foarte scăzută în masa de reacție evacuată din bioreactor (lichidul de fermentație);

separarea produsului se realizează în mai multe etape, acest lucru ducând la creșterea costurilor; costul separării poate atinge în unele cazuri 90 % din costul total al procesului biotehnologic (tabelul 1.2);

Tabelul 1.2.

Costul separării bioproduselor ca fracțiune din costul total de producții

lichidele de fermentație au comportare de fluid nenewtonian; acest lucru necesită o abordare specifică în proiectarea echipamentelor în care se realizează procese de transfer de impuls, căldură și masă;

produsele de biosinteză, în special cele cu masă moleculară mare, sunt labile termic și chimic, sunt sensibile la forțe de forfecare și la tensiuni interfaciale ridicate; acest lucru face ca procedeele clasice de separare (distilarea, de exemplu) să nu poată fi utilizate;

în lichidele rezultate în bioprocese, alături de produsul util există o serie de compuși secundari (impurități) ale căror caracteristici fizice și chimice sunt similare cu ale produsului util; asemănarea proprietăților face foarte dificilă separarea;

produsele de biosinteză, în special cele cu masă moleculară ridicată, prezintă o mobilitate foarte redusă.

Forma de prezentare a bioproduselor

Produsele de biosinteză se prezintă în forme diverse și provin din surse variate. Ele pot fi:

molecule de diferite dimensiuni, de la metaboliți organici cu masă moleculară mică (etanol, acid citric, antibiotice), până la peptide și proteine (insulină, anticorpi, enzime);

molecule bazate pe nucleotide (ARN, plasmide ADN).

Aceste produse pot fi metaboliți ai microorganismelor, celulelor vegetale sau animale; pot reprezenta produsul unei reacții enzimatice sau al unei sinteze peptidice sau pot fi, pur și simplu, componente ale unei surse naturale: sânge, lapte sau țesut vegetal.

Dacă sursa produsului este un microorganism, acesta se poate regăsi excretat în mediul de cultură, se poate acumula în citoplasma sau periplasma celulelor sau poate forma corpi de incluziune – agregate mari de proteine denaturate care se găsesc în interiorul bacteriei.

Concentrația produselor de biosinteză poate varia pe o plajă foarte largă de valori: de la sute de g/L (etanol, acid citric) la mg/L (anticorpi recombinați) sau chiar p,g/L în cazul factorilor de coagulare ai sângelui. Dacă în cazul produselor aflate în concentrație ridicată izolarea/purificarea nu pune probleme deosebite, putându-se realiza prin intermediul operațiilor unitare clasice utilizate în industriile de proces (de ex. separarea și concentrarea etanolului prin distilare), în cazul produselor aflate în concentrații scăzute, alături de cantități considerabile de impurități, cum este cazul factorilor de sânge, anticorpilor monoclonali sau proteinelor recombinate, separarea și purificarea este mult mai dificilă și evident – mai costisitoare. În general, ponderea costului purificării în costurile totale de producție depinde de concentrația produsului în mediul de cultură, reprezentând între 5 și 90 % din costurile totale (tabelul 1.2).

Ca o consecință a acestui fapt, se poate constata că există o relație directă între prețul de vânzare al produselor de biosinteză, preț care reflectă costurile de producție, și concentrația bioprodusului în mediul de cultură (figura 1.4).

Figura 1.4. Relația dintre concentrația produsului în materialul de pornire și prețul de vânzare [6]

Cerințele de puritate ale produselor de biosinteză sunt diferite. În funcție de destinația acestora este stabilit nivelul maxim acceptabil de impurități, precum și natura acestora. Produsele terapeutice de uz uman vor avea cele mai mari exigențe de puritate, în timp ce enzimele industriale se situează la polul opus.

Produsele de biosinteză sunt caracterizate prin randamentul de obținere, puritate, activitate specifică, noțiuni definite astfel:

Pentru industria alimentară importanță prezintă:

bioprocesele anaerobe (fermentațiile propriu-zise);

bioprocesele aerobe (fermentațiile oxidative).

Fermentația este un proces de catabolism care are loc în condiții de anaerobioză și în care energia este obținută prin utilizarea unor compuși organici, atât ca donori cât și ca acceptori de electroni. Capacitatea de a crește în anaerobioză este limitată la procariote (bacterii). Eucariotele sunt facultativ anaerobe. Microorganismele care produc fermentații sunt facultativ sau obligatoriu anaerobe.

Bioprocese anaerobe (fermentații propriu-zise)

Microorganismele facultativ anaerobe au capacitatea de a crește aerob utilizând oxigen sau anaerob utilizând compuși organici (fermentație) ca acceptori finali ai electronilor produși prin catabolism. Au o rată mai mică de degradare a glucidelor în aerobioză decât în anaerobioză.

Figura 2.5. Mecanismul fermentației anaerobe

Microorganismele anaerobe mor în contact cu aerul (O2). Cele facultativ anaerobe sunt heterotrofe (capabile de respirație în prezența O2 și produc fermentații în absența acestuia).

Gama substanțelor fermentescibile este foarte largă (Jurcoane, 2009):

poliglucide (celuloză, amidon, chitină);

diglucide (zaharoză, lactoză, maltoză);

hexoze (glucoză, fructoză, galactoză);

pentoze, polialcooli (glicerol, manitol);

aminoacizi, acizi organici, purine, pirimidine (numai la bacterii).

Produșii rezultați din fermentație sunt și ei foarte diferiți (Jurcoane, 2009):

alcooli (etanol, propanol, butanol, 2,3-butandiol, glicerol);

acizi (lactic, formic, propionic, butiric);

esteri (etilacetat, etilbutiric, poli β-hidroxibutirat);

diferite gaze (H2, CH4, CO2).

Procesele fermentative utilizate în industria alimentară, produse de culturi selecționate, sunt prezentate în următorul tabelul 2.3.

Tabelul 2.3.

Procese fermentative în industria alimentară

Dintre fermentațiile anaerobe cele mai frecvent întâlnite sunt: fermentați alcoolică și fermentația lactică.

Fermentația alcoolică

Fermentația alcoolică este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacții de oxidoreducere sub acțiunea echipamentului enzimatic al drojdiei în produșii principali (alcool etilic și CO2) iar ca produși secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide etc.

Figura 2.6. Biochimismul fermentației alcoolice

Fermentația alcoolică este un proces întâlnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantități mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, Zymomonas, dar ele nu sunt considerate agenți tipici.

Agenții tipici ai fermentației alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot să producă prin fermentarea glucidelor mai mult de 8ș alcool etilic.

Proprietățile biotehnologice ale drojdiilor fermentative

Pentru a putea fi folosite în practică drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate și selecționate în funcție de unele proprietăți care le recomandă pentru utilizare industrială, cum ar fi:

Puterea alcooligenă care se referă la concentrația maximă de alcool ce se poate acumula când în mediu există un exces de zahăr. Drojdiile sunt sensibile la creșterea concentrației în alcool și în timp ce drojdiile cu putere alcooligenă slabă (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentrație în alcool de 4-6ș drojdiile de vin și alcool (Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae) au o putere alcooligenă mare și continuă fermentația alcoolică până se acumulează 16-18ș alcool.

Alcoolorezistența se referă la capacitatea drojdiei de a continua fermentația la creșterea concentrației de alcool.

Sulfitorezistența este capacitatea drojdiilor de vin de a produce fermentația alcoolică în prezența unor concentrații de 200-500 mg SO2/dm3 care pot influența negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scăderii potențialului de oxidoreducere.

Capacitatea de floculare și pulverulența – proprietăți datorate structurii peretelui celular și a modificării de pH și rH din timpul fermentației. Drojdiile floculante pot forma asociații ce se depun mai ușor, în timp ce drojdiile pulverulente se mențin mai mult timp în suspensie și produc o fermentație mai avansată.

Osmotoleranța se referă la capacitatea drojdiilor de a produce fermentația în mediu cu o concentrație crescută de zahăr. Aceste proprietăți sunt recomandate drojdiilor folosite la obținerea alcoolului din melasă cu un randament superior în alcool etilic.

Caracterul killer este întâlnit la unele drojdii capabile de a sintetiza intracelular o toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. În selecționarea drojdiilor de vin culturile care au caracter killer dau randamente superioare, în cursul fermentației are loc o autoselecție naturală.

Factorii care influențează dinamica fermentației alcoolice

Fermentația alcoolică, în condiții industriale folosește substraturi naturale bogate în glucide fermentescibile, iar viteza de fermentare și transformare a glucidelor în produși primari și secundari este dependentă de numeroși factori care pot fi împărțiți în două mari categorii: factori biologici (dependenți de microagenții fermentării) și factori fizico-chimici (dependenți de compoziția mediului supus fermentării și de condițiile de mediu).

Factorii biologici

Fermentația alcoolică este cauzată de enzimele elaborate de celula de drojdie, deci fermentația este un proces de natură enzimatică.

Complexul zimazic acelular obținut prin mojararea celulelor de drojdie este format din 15 enzime care catalizează, în diferite etape, procesele de oxido-reducere ale glucidelor fermentescibile și, în final, formarea de alcool etilic.

Enzimele cele mai importante sunt dehidrogenazele: glicerat-aldehid-dehidrogenaza și alcool dehidrogenaza, care au drept coenzimă NAD, cu rol în transferul de hidrogen în reacțiile de catabolism.

Fermentația decurge rapid dacă celulele sunt în faza de creștere exponențială sau la începutul fazei staționare de creștere. Drojdiile autolizate își pierd proprietățile fermentative ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare (inactivarea enzimelor).

Viteza de fermentație depinde și de numărul de celule/cm3 mediu. Viteza crește cu numărul de celule – prin viteză înțelegând conținutul de alcool format la 100 ml lichid în unitatea de timp. În practică concentrația de microorganisme este stabilită (din rațiuni economice), fiind de 106-107 celule/cm3, pentru declanșarea rapidă a fermentației.

Spectrul de fermentare al glucidelor este un factor important, știind că drojdiile produc fermentarea unui număr limitat de glucide.

Glucidele direct fermentescibile sunt formele dextrogire ale glucozei și fructozei și în mai mică măsură ale galactozei.

Diglucidele sunt hidrolizate de către enzimele drojdiilor în glucide simple:

Pentru obținerea alcoolului etilic de fermentare plecând de la poliglucide, deoarece drojdiile nu produc amilaze/celulaze și nu pot produce hidroliza enzimatică a poliglucidelor, este necesară zaharificarea prealabilă a acestora. Substraturile naturale ce conțin poliglicide (amidon, celuloză) sun hidrolizate în prealabil pe cale chimică sau enzimatică, până la obținerea glucidelor fermentescibile.

Comportarea drojdiilor fermentative în funcție de accesul oxigenului în mediul supus fermentării. În condiții anaerobe, prin imersare în must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor, obținând o cantitate mică de energie (2 moli ATP/mol glucoză fermentată). De aceea ele trebuie să prelucreze o cantitate mare de glucoză pentru a obține energie, dar creșterea numărului de celule se face foarte lent.

Dacă mediul de fermentare este puternic aerat atunci are loc efectul Pasteur, prin care se observă conversia fermentației în respirație. Oxidarea se face până la produșii finali CO2 și H2O, iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru același echivalent energetic consumându-se o cantitate mai mică de zahăr.

În practica vinificării, atunci când fermentația decurge lent, ca rezultat al prezenței în mediu a unui număr mic de celule, se poate stimula creșterea prin aerare.

În industriile fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmărește obținerea de biomasă celulară; de aceea, condițiile sunt anaerobe, pentru ca o cantitate mare de zahăr să fie transformată în alcool etilic.

La fabricarea drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere, pentru obținerea unei cantități mari de biomasă, se procedează la aerarea mediilor nutritive.

Factorii fizici și chimici

Fermentația alcoolică este influențată și de factori fizici și chimici care acționează atât asupra vitezei de fermentare cât și asupra bilanțului masic și a raportului dintre produșii primari și secundari.

Compoziția mediului de fermentare

Componentele mediului nutritiv pot fi metabolizate în mod diferit. Acesta este motivul pentru care la vinuri, de exemplu, în funcție de calitatea mustului (care este influențată de soiul și gradul de coacere a strugurilor), apar diferențe de aromă, buchet. Din punct de vedere al compoziției mediului următorii factori au un rol deosebit:

concentrația în zahăr, influențează direct proporțional viteza de fermentare atunci când se situează între 5-12%.

Cu creșterea concentrației de zahăr unele drojdii mai sensibile sunt inhibate în activitate.

Drojdiile fermentative sunt osmotolerante și produc fermentația în condiții bune a mustului de struguri cu o concentrație de 170-250 g zahăr/dm3.

Substraturi folosite industrial în fermentația alcoolică:

mustul de struguri – la fabricarea vinului;

mustul de malț cu conținut de maltoză (80% din subst. solubilă) – la fabricarea berii;

melasa (cu 45-55% zaharoză necristalizată) – spirt și a drojdie comprimată;

plămezi amidonoase (hidrolizate mai întâi enzimatic, cu obținere de glucoză, maltoză, dextrine) – alcool etilic;

zerul rezultat de la fabricarea brânzeturilor (cu conținut de 4,7% lactoză) – alcool etilic (agenți de fermentare – drojdii din genul Kluyveromyces, producătoare de lactază);

celuloza (după hidroliza chimică/enzimatică din care rezultă celobioză și cellodextrine) – alcool carburant.

concentrația în alcool: în mediile fermentate cu microbiotă naturală, dacă se ajunge la o concentrație alcoolică de 4-6o, se produce o încetinire a fermentației drojdiilor care nu au rezistență la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuată de drojdii alcoolorezistente, până la acumularea a 18-20o alcool (g alcool absolut/100 ml).

pH-ul mediului determină două forme ale fermentării:

fermentarea alcoolică propriu-zisă, ce se desfășoară la pH 3,5-5, când produsul principal este alcoolul etilic și dioxidul de carbon, cu produși secundari în cantități mici;

fermentarea la pH alcalin când în afară de alcool etilic și dioxid de carbon, se formează în cantitate mai mare glicerol (până la 30% din zahărul fermentat).

Mustul de struguri are un pH acid, 3,6, de aceea la fabricarea vinurilor drojdiile sunt avantajate având cele mai bune condiții de dezvoltare și activitate metabolică.

Substanțele chimice existente sau adăugate mediului pot influența procesul fermentativ:

fosfații au o influență pozitivă deoarece participă la formarea acizilor adenilici și la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme sub care acestea sunt transportate în celule și fermentate;

dioxidul de sulf se adaugă în cantități de 200-500 mg x dm3 pentru a favoriza activitatea drojdiilor fermentative, care spre deosebire de alte drojdii sunt sulforezistente.

Temperatura. Enzimele sistemului zimazic prezintă un optim de activitate (determinat genetic).

28-30oC, pentru drojdia de spirt și panificație (S. cerevisiae);

15-20oC, pentru drojdiile de vin (S. cerevisiae var. ellipsoideus și oviformis), care produc o fermentare mai lentă, dar conduc la obținerea unui vin de calitate, deoarece la temperaturi mai scăzute se evită pierderile de substanțe volatile;

6-12oC, pentru drojdia de bere (S. carlsbergensis).

Biochimismul formării în fermentația alcoolică propriu-zisă

Conversia prin fermentare în mediu acid a glucidelor, catalizată de enzime din drojdii, care se desfășoară în cinci etape principale:

transformarea diferitelor tipuri de glucide în esteri ai glucozei și formarea esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa în care se consumă energie prin transformarea ATP-ului în ADP;

formarea triozelor-aldehidă fosfoglicerică și fosfodioxiacetonă;

transformarea triozelor până la formarea de acid piruvic. Energia eliberată prin procesul de oxidoreducere este înmagazinată prin fosforilare de substrat;

decarboxilarea acidului piruvic și formarea de aldehidă acetică;

aldehida acetică se reduce devenind acceptor de hidrogen și se formează alcoolul etilic.

Reacția globală a fermentației alcoolice în mediu acid:

Formarea produșilor secundari

În fermentația alcoolică rezultă o diversitate de produse secundare. În vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substanțe diferite. Majoritatea lor rezultă prin fermentare, iar celelalte sunt dependente de compoziția mediului. Principalii produși secundari sunt:

glicerolul se acumulează în mod normal în cantități de 3,3 g/100 g glucoză fermentată și are un rol benefic asupra calității vinului, conferindu-i „catifelaj”.

aldehidele se acumulează în mediul de fermentare. Cea mai importantă, aldehida acetică, la concentrații ce depășesc 2,5 mg/dm3 influențează indirect gustul, deoarece prin oxidări duce la formarea de acid acetic.

acizii provin atât din must cât și din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatilă vinului (acid acetic, formic, propionic, butiric) precum și o aciditate fixă (acid lactic, succinic) care se regăsește în aciditatea totală a vinului. Acidul lactic se poate acumula în cantități de 20 mg/dm3, iar acidul acetic se acumulează în cantități de 80-120 mg/dm3. Prin formarea esterilor (acetat de etil), gustul vinului este depreciat. Acidul succinic se formează din zahăr sau din aminoacizi și poate reprezenta 0,7% din cantitatea de zahăr fermentată.

alcoolii superiori, care se acumulează mai ales la fabricarea alcoolului, fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot să contribuie la formarea unor substanțe de aromă.

La fabricarea vinului alcoolii superiori sunt precursori de aromă deoarece se pot combina cu diferiți acizi rezultând esteri cu aromă caracteristică. De exemplu, în vinuri, din fenilalanină se formează alcoolul feniletilic care dă aromă de trandafir.

În afară de aspectele pozitive ale fermentației alcoolice la fabricarea alcoolului, vinului, distilatelor, berii, pâinii, poate prezenta și aspecte negative atunci când se produce fermentarea spontană a unor produse bogate în zahăr (siropuri, dulcețuri, compot, miere). În acest caz fermentarea este dată de drojdii osmotolerante care produc prin fermentare alcool etilic, CO2 și o cantitate apreciabilă de acid acetic, ceea ce duce la deprecierea lor.

diacetilul și acetona se formează atunci când numărul de celule de drojdie este prea mare. La concentrații de 0,4 mg/dm3 dă gust de diacetil, iar la concentrații mai mari dă gust neplăcut, mai ales la bere.

mercaptanii, apar când gruparea OH din alcooli este înlocuită cu gruparea SH. Prezența acestor substanțe dă gust neplăcut și se datorează acțiunii unor drojdii cu calități nedorite.

Bilanțul masic al fermentației alcoolice este următorul:

Randamentul practic este de (0,64-0,67) x , deoarece nu toată cantitatea de zahăr este transformată în alcool. O parte din zahăr este transformată în produși secundari, în produși de biosinteză intracelulari (biomasă), iar o altă cantitate este transformată prin respirație în produși finali.

Bilanțul energetic al fermentației alcoolice.

Din punct de vedere energetic, fermentația alcoolică nu este avantajoasă pentru celula de drojdie, deoarece, în anaerobioză, prin fermentarea unui mol de glucoză celula consumă 2 moli de ATP (în etapa de formare a esterilor fosforici), apoi înmagazinează energia eliberată în 4 moli de ATP, astfel încât câștigul este de 2 moli ATP/mol glucoză fermentată.

Energia potențială a glucozei se regăsește în proporție de 92,5% în alcool etilic (alcoolul etilic are o putere mare energetică, de 1363 kJ/mol alcool), 2,5-3% din energie este înmagazinată în ATP, iar restul se regăsește în produse secundare sau se pierde sub formă de căldură.

Fermentații alcoolice neconvenționale

Există bacterii care pot produce cantități apreciabile de alcool: Bacillus macerans, Leuconostoc, Clostridium acetono-etillicus, iar Zymomonas mobilis și Zymomonas anaerobica, produc prin fermentare 10ș-16ș alcool. Cu aceste bacterii pot fi fermentate derivatele celulozice, pentru obținerea de alcool carburant.

Cu ajutorul bacteriilor se obține alcool cu întrebuințări industriale, care nu este folosit în alimentație deoarece bacteriile nu produc și substanțe secundare de aromă, iar randamentul de conversie este mai mic decât al drojdiilor.

Fermentația lactică

Fermentația lactică este un proces anaerob prin care glucide le fermentescibile sunt metabolizate sub acțiunea echipamentului enzimatic al microorganismelor în acid lactic ca produs principal și produse secundare, cum ar fi: diacetil, acetonă, acid acetic, alcool etilic și CO2.

Calea metabolică de producere a acidului lactic este frecvent întâlnită în lumea microbiană. Randamente superioare de convertire a glucidelor în acid lactic sunt întâlnite la bacterii și mucegaiuri.

Bacteriile lactice, considerate agenți tipici ai fermentației, sunt folosite industrial în biotehnologii alimentare, la industrializarea laptelui și a cărnii, în panificație, la conservarea produselor vegetale și la obținerea acidului lactic.

Mucegaiurile selecționate ale genurilor Aspergillus, Penicillium și Mucor pot fi cultivate submers cu aerare dirijat, pentru obținerea industrială a acidului lactic. In condiții naturale, acidul lactic se poate forma și în țesutul muscular prin procesul de glicoliză, prin secvențe biochimice catalizate de enzime similare cu cele ale celulei microbiene.

Microorganisme care produc fermentația lactică

Cea mai recentă clasificare aparține tui Kandler și Weiss (1986), care, în afară de proprietățile fiziologice și tinctoriale ale bacteriilor lactice, are la bază cunoașterea procentuală a conținutului de guanină și citozină din structura acizilor nucleici, criteriu taxonomic stabil, pe baza căruia s-au putut constata similitudini sau diferențieri între speciile cunoscute. Conform acestei clasificări, bacteriile lactice sunt incluse în familia LACTOBACTERIACEAE cu mai multe genuri:

Genul Streptococcus cuprinde:

grupul streptococilor lactici incluși în genul Lactococcus cu speciile: Lactococcus lactis; Lactococcus lactis biovar diacetilactis; Lactococcus lactis biovar acetoinicus și Lactococcus cremoris (sin. Str. cremoris – streptococul smântânii);

grupul viridans, bacterii ce aparțin genului Streptococcus, având ca specii importante pe: Streptococcus salivarius subsp. thermophillus (SST) (sin. Streptococcus thermophillus) cultură folosită la fabricarea iaurtului și Streptococcus bovis;

grupul streptococilor fecali, denumiți și enterococi, cu specia reprezentativă Streptococcus fecalis;

grupul streptococilor patogeni, cu speciile Streptococcus pyogenes (agentul scarlatinei) și Streptococcus agalactiae (agentul mastitei, transmisibil prin laptele colectat de la vaci bolnave).

Genul Lactobacillus (sin. Lactobacterium) include aproximativ 50 de specii clasificate în funcție de temperatura optimă de activitate și de modul de fermentare a glucidelor în homofermentativi – lactobacili care produc numai acid lactic și cantități minore de substanțe de aromă – și heterofermentativi – lactobacili producători de acid lactic, acid acetic, diacetil, CO2.

Lactobacilii homofermentativi se pot clasifica astfel:

termofili (TO = 40.. .50 0C):

Lactobacillus delbrueckii subspecia delbrueckii;

Lactobacillus delbrueckii subspecia lactis;

Lactobacillus delbrueckii subspecia bulgaricum (LDB);

mezofili (TO = 30…35 0C):

Lactobacillus acidophillus;

Lactobacillus helveticus.

Căi de formare a produșilor în fermentația lactică

Biochimismul formării produșilor de fermentație diferă în funcție de echipamentul enzimatic al bacteriilor lactice și de sursele de carbon fermentescibile.

Bacteriile lactice homofermentative produc fermentarea anaerobă a hexozelor pe calea Embden – Mayerhof – Parnas (EMP) până la formarea acidului piruvic, apoi, fiind lipsite de enzima piruvat decarboxilază, reduc acidul piruvic, obținându-se acidul lactic sub acțiunea a două lactatdehidrogenaze care necesită NAD/ NADP în calitate de coenzime:

În fermentația homolactică forma predominantă a acidului lactic este dependentă de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei [lactococii formează L (+)-lactat și lactobacilii D (-) lactat], dar și de prezența lactat racemazei, care, atunci când este activă în celula microbiană rezultă prin fermentație, amestecul racemic (D, L-lactat), conform reacției:

Ecuația globală a fermentației homolactice este următoarea:

Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza și lactoza pot fi transportate ca atare în celulă, printr-un sistem activ de permeaze prezent la Streptococcus salivarius subspecia thermophillus și lactobacilii termofili, sau prin transport activ catalizat de sistemul fosfotransferază – fosfoenolpiruvat (PT-PEP) prezent la bacterii ale genului Lactococcus și Lactobacillus sp., cu formarea esterilor fosforici.

Lactoza sau lactozo-P în celula bacteriană sub acțiunea β-galactozidazei (lactazei) este transformată în glucidele componente:

În timp ce glucoza este metabolizată direct pe calea EMP, galactoza este transformată pe următoarele căi metabolice:

calea D-tagatozei 6P (genul Leuconostoc);

calea Leloir (SST, LDB, Leuconostoc);

calea glicolitică (Embden Mayerhof Parnas) de fermentație a glucozei.

În fermentația homolactică se pot forma, în cantități mici, substanțe de aromă, diacetil și acetonă, fie prin metabolizarea glucidelor, fie a citraților care asigură o sursă suplimentară de acid piruvic.

Bacteriile lactice heterofermentative produc fermentația anaerobă a glucidelor (pentoze, hexoze) pe calea pentozo-fosfatului (6P-gluconatului).

În funcție de specie diferă și natura produselor de fermentație:

Lactobacillus brevis produce acid lactic, acid acetic și CO2;

Leuconostoc mesenteroides produce acid lactic, etanol și CO2;

Lactobacillus bifidus produce fermentare heterolitică pe calea fructozo 6P, fără formare de CO2.

Bifidobacteriile, care reprezintă 95% din microflora intestinală a sugarilor, pot fi folosite pentru obținerea unor produse lactate cu efect terapeutic (produse probiotice).

Aplicații practice ale fermentației lactice

Acidul lactic are multiple întrebuințări:

în industria alimentară pentru acidifierea sucurilor și esențelor de fructe, limonadelor, bomboanelor;

în medicină, sub formă de lactați de Ca și Fe, substanțe ușor asimilabile de către organismul uman;

în industria chimică – mordant la colorarea și imprimarea mătăsii și a diferitelor textile;

în industria pielăriei;

în industria panificației, paralel cu fermentația alcoolică produsă de drojdia de panificație în aluat are loc activitatea fermentativă a bacteriilor lactice din microbiota făinii sau a culturilor selecționate, contribuind la formarea aromei și la creșterea în volum a pâinii;

în industria extractivă, la fabricarea amidonului, în timpul operației de înmuiere a porumbului, prin adăugarea de SO2 este inhibată dezvoltarea bacteriilor butirice și este favorizată dezvoltarea unei fermentații lactice; lichidul obținut de la înmuierea porumbului se folosește în formă concentrată ca adaos la obținerea mediilor de cultură a microorganismelor în industriile fermentative;

în industria laptelui bacteriile lactice, în special cele homofermentative, sub formă de culturi pure selecționate, sunt folosite la obținerea produselor lactate acide: lapte acru, sana, chefir, lapte acidofil, iaurt, smântână fermentată, a untului și la fabricarea brânzeturilor;

prin fermentația lactică spontană determinată de bacteriile lactice din microflora epifită a plantelor, se pot conserva prin murare varza, castraveții, tomatele, măslinele și poate avea loc însilozarea furajelor verzi;

în vinificație bacteriile lactice pot avea un efect pozitiv, reducând aciditatea vinurilor prin transformarea acidului malic în acid lactic;

fermentația lactică spontană nedirijată poate avea și un efect negativ, ducând la alterarea unor produse (acrirea berii, borșirea vinului) sau pierderi de zaharoză la difuziune, în industria zahărului.

Figura 2.7. Calea D-tagatozei 6P

Figura 2.8. Calea Leloir de metabolizare a galactozei

Bioprocese aerobe (fermentații oxidative)

Spre deosebire de fermentațiile propriu-zise anaerobe, fermentațiile acetică, gluconică, citrică ș.a. sunt procese oxidative simple, care se desfășoară în condiții aerobe și se diferențiază de metabolismul oxidativ (respirație) prin aceea că oxidarea este limitată, rezultând în condiții industriale acizi organici cu mare valoare economică.

Fermentatia acetică

Fermentația acetică este un proces aerob prin care substratul (alcoolul etilic) este oxidat în prezența oxigenului din aer, sub acțiunea echipamentului enzimatic al bacteriilor acetice, în acid acetic ca produs principal al fermentației.

Caracterele morfologice și fiziologice ale bacteriilor acetice. Bacteriile acetice sunt bacterii strict aerobe, sub formă de bastonașe, gram-negative, grupate în perechi sau lanțuri, cu dimensiuni variabile (0,5-0,8)x(80,9-4,2) p,m. Pot fi imobile sau mobile, cu cili polari sau peritrichi.

2.2.1.1. Condiții de dezvoltare a bacteriilor acetice

În mediu acid, în timp, pot apărea forme de involuție, ramificate, care își pierd capacitatea de reproducere.

În medii lichide (staționar) se dezvoltă sub forma unui voal fragil care, cu creșterea în dimensiuni, ascensionează pe pereții vasului (Acetobacter ascendens, A. aceti). Alte specii, A.xylinum, A. xilinoides formează, în vin oțețit sau în oțet, un strat gelatinos de natură P-glucanică (coloidal și fibros).

Bacteriile acetice sunt mezofile (temperatura optimă 30 oC) și produc fermentația acetică într-un domeniu larg de temperaturi, 0…35 oC. Au o termorezistență scăzută în mediu lichid cu pH acid, inactivitatea lor având loc la 60 oC într-un minut, în timp ce bacteriile reținute pe suporturi solide (doage de lemn) sunt inactivate la temperaturi mai ridicate (100oC).

Bacteriile acetice sunt tolerante la acid și concentrații de până la 2o acetice activează creșterea celulară. Rezistența la acid acetic se poate explica prin aceea că membrana acestor bacterii are un conținut ridicat de acizi grași saturați, fiind relativ impermeabilă la acid acetic. Valoarea optimă de pH pentru creștere este 5,5 și pH-ul limită 2,5.

Echipamentul enzimatic, deosebit de complex (printre care dehidrogenaze localizate în sisteme membranare cuplate cu lanțul citocromic, enzime ale ciclului Krebs ș.a.), permite oxidarea a aproximativ 80 de compuși (alcooli, glucide, acizi organici).

Dintre sursele de carbon utilizate preferențial, alcoolul etilic este oxidat la acid acetic, iar glucoza la acid gluconic, acid 5-cetogluconic, acid 2,5-cetogluconic.

Bacteriile din genul Acetobacter pot să oxideze și acetații când alcoolul etilic a fost consumat din mediu, deoarece alcoolul etilic inhibă activitatea enzimelor de oxidare a acetatului la CO2 și H2O. Acidul acetic inhibă propria sa oxidare la concentrații mai mari de 8o acetice, la pH = 3.

Ca surse de azot, bacteriile acetice, pot să folosească sărurile de amoniu, aminoacizii și peptidele. De aceea ele se pot dezvolta în medii minerale numai dacă se adaugă extract de drojdie. Bacteriile acetice necesită pentru creștere vitaminele: acid paraaminobenzioc, niacină, tiamină și acid pantotenic.

Bacteriile sunt răspândite în natură pe produse vegetale (fructe, frunze, flori) și transportul lor este favorizat de insecte (Drosophilla melanogaster – musculița de oțet) și nematode (Anqvilula aceti).

2.2.1.2. Clasificarea tehnologică a bacteriilor acetice

W. Hennerberg propune o clasificare a bacteriilor acetice în patru grupe, în funcție de cantitatea de acid acetic produsă, concentrația de alcool din mediu și biotop, este următoarea:

bacterii acetice din plămadă: Gluconobacter suboxidans și Acetobacter industrium;

bacterii acetice din bere: A. aceti – suportă 11 % alcool și poate produce 6,6% acid acetic și A.pasteurianum – suportă 9,5% alcool și produce 6,2% acid acetic. Alte specii: A.kutzingianum, A. rancens;

bacterii acetice din vin: A. orleans – poate produce 9,3% acid acetic; A. xilinum – suportă 7% alcool și produce 4,5o acid acetic și alți produși secundari;

bacterii acetice de fermentație rapidă, izolate din acetatoare: au o mare capacitate de acidifiere, cu speciile A. schutzenbachii (11-14o acetice), A. acetigenum, A. curvum.

Fermentația acetică se desfășoară după reacția globală:

Din punct de vedere energetic, prin oxidarea alcoolului etilic rezultă o energie de 455 kJ/mol (6 moli ATP).

Alcoolul etilic este oxidat în aldehidă acetică în prezența alcooldehidrogenazei. Are loc legarea chimică a unui mol de apă și se formează acetaldehida hidratată, care, în prezența aldehid-dehidrogenazei, cedează 2H+ care este transferat de către enzimele catenei respiratorii celulare pe oxigenul molecular, acumulându-se acid acetic – produsul principal al fermentației.

2.1.1.3. Importanța practică a fermentației acetice

Fermentația acetică este utilizată industrial la fabricarea oțetului, când se pot folosi ca materii prime soluții alcoolice, vin, cidru sau materii prime amidonoase (în prealabil zaharificate și fermentate alcoolic cu drojdii). Fermentația acetică are loc în aparate numite acetatoare. Un acetator simplu este format dintr-un vas tronconic înalt, umplut cu rondele de stejar, prevăzut cu sistem de aerare și recirculare a mediului de cultură, până la atingerea concentrației de 9-10 grade acetice. La pornirea fermentației se face sterilizarea rondelelor și pulverizarea suspensiei de bacterii acetice, care rămân fixate în fibrele lemnoase și, în prezența mediului răspândit uniform și a aerului, produc oțetul. În acest procedeu randamentul de conversie a alcoolului la acid acetic este de 75-80%. Performanțe superioare se obțin cu generatorul de oțet Frings și cu alte sisteme în care randamentul de conversie este de 95%.

După obținere, oțetul își îmbunătățește calitățile senzoriale, ca urmare a reacțiilor de esterificare și de formare a compușilor de aromă.

Fermentația acetică spontană, întâlnită la fermentarea boabelor de cacao, are un rol pozitiv în formarea compușilor de aromă și la obținerea unor boabe de calitate superioară.

Bacteriile acetice A. xylinum pot fi folosite pentru obținerea de β-glucani, utilizați la fabricarea de membrane filtrante din acetat de celuloză.

Gluconobacter suboxidans poate fi folosit pentru oxidarea manitolului în fructoză și a glicerolului în dihidroxilacetonă, utilizată în cosmetică.

Fermentația acetică a vinului și berii păstrate cu „gol de aer” conduce la deprecierea calității acestor băuturi. Deși bacteriile acetice aerobe se dezvoltă la suprafață, acrirea are loc în întregul volum. Acidul acetic format sub voal are o densitate mai mare decât a alcoolului, ceea ce conduce la o circulație a compușilor reactanți care conduce la acrirea totală a produsului.

Fermentația gluconică

Fermentația gluconică este un proces oxidativ simplu prin care glucoza, în prezența oxigenului din aer și a sistemului enzimatic al microorganismelor selecționate, este transformată în acid gluconic ca produs principal.

2.2.2.1. Microorganisme care produc fermentația gluconică

Agenții tipici ai fermentației gluconice sunt bacteriile din genurile Gluconobacter (Acetomonas) și Moraxella și mucegaiurile din genurile Aspergillus (A. niger, A. phoenicis, A.Wentii) și Penicillium (P. chrysogenum, P. luteum).

2.2.2.2. Importanța practică a fermentației gluconice

Acidul gluconic se obține pe cale fermentativă prin culturi de suprafață, folosind ca substrat melasa diluată cu 10-20% zaharoză, repartizată în tăvi cu suprafață mare. Procesul este lent, de aceea a fost înlocuit cu metode submerse cu aerare, în bioreactoare în care procesul este accelerat și randamentul de conversie al glucozei la acid gluconic este de 80-90%, în timp de 18 ore, la 25-30oC și la pH=3. Prin adăugare de carbonat de calciu se formează gluconatul de calciu, din care, prin procedee chimice, se purifică acidul gluconic.

2.2.2.3. Principalele aplicații ale acidului gluconic sunt următoarele:

folosirea gluconaților de Ca, Fe, în terapeutică;

obținerea prafului de copt;

folosirea glucono-lactonei, produs intermediar al fermentației, în industria preparatelor de carne, cărora le conferă un gust acrișor, împiedicând, în același timp, activitatea bacteriilor de putrefacție și menținând culoarea roșie naturală a compoziției salamurilor (tip Tivoli);

folosirea în amestec a acidului gluconic cu soda caustică pentru îndepărtarea rapidă a sărurilor insolubile de magneziu;

folosirea acidului 2 ceto-gluconic la obținerea acidului D-araboascorbic, substanță cu efect antioxidant, care previne râncezirea alimentelor cu conținut ridicat de lipide.

Fermentația citrică

Fermentația citrică este un proces oxidativ complex prin care substratul glucidic (zaharoza) este metabolizat la compuși intermediari de oxidare, cu acumulare în mediu a acidului citric ca produs principal.

2.2.3.1. Microorganisme care produc fermentația citrică

Agenți tipici ai fermentației citrice sunt tulpinile selecționate ale speciei Aspergillus niger care produc activ citrat sintetază. Acidul citric se poate obține cu un bun randament (52 g/dm3) și prin cultivarea tulpinilor de drojdii din specia Candida oleophilla pe medii cu parafine.

2.2.3.2. Producerea industrială a acidului citrică

Producerea acidului citric cu ajutorul mucegaiurilor din genul Aspergillusi este cunoscută din 1913 (patent Zahoski) și aplicarea industrială în 1923 se datorează cercetărilor efectuate de Currie. În 1928 s-a construit o fabrică la Praga. În țara noastră există fabrica de acid citric de la Giurgiu, care, prin procedeul de culturi de suprafață, asigură necesarul de acid citric pentru industria alimentară.

Mediile cu melasă diluată, tratate cu ferocianură de potasiu, după sterilizare și răcire în tavă, se inoculează cu spori de A. niger (3-4 g spori/100 m2 suprafață mediu) și fermentarea are loc la 30-35oC. La suprafață se dezvoltă o dermă cutată prin creșterea aerobă a miceliului vegetativ și reproducător. Fermentația durează 6-8 zile, cu un randament de conversie a zaharozei în acid citric de 70-72% (1 m suprafață miceliu poate să producă 500-800 g acid citric în 24 h). După separare, biomasa poate fi valorificată ca sursă de enzime/proteine, iar din mediul fermentat se separă, prin metode fizico-chimice, acidul citric cristalizat.

Acidul citric se poate obține și prin metode submerse în bioreactoare cu aerare dirijată, prin procedee discontinue sau continue, cu reducerea perioadei de fermentație și creșterea randamentului la valori de 80-85% în acid citric.

2.2.3.3. Importanța fermentației citrice

Acidul citric este principalul acid folosit în industria alimentară pentru fabricarea băuturilor răcoritoare și a produselor zaharoase, în calitate de stabilizant al culorii produselor păstrate în stare congelată și de anticoagulant al sângelui.

În industria farmaceutică intră în componența pulberilor efervescente. Citratul de sodiu este recomandat în compoziția detergenților, ca înlocuitor al fosfaților. Acidul citric sub formă cristalizată, prin încălzire la 170oC, se transformă în acid itaconic utilizat la fabricarea rășinilor schimbătoare de ioni.

Prin fermentații oxidative se mai pot obține și alți acizi de exemplu acidul fumaric – cu culturi din genul Aspergillus și Penicillium, important pentru obținerea aldehidei maleice, materie primă pentru obținerea rășinilor sintetice; acidul kojic – obținut prin cultivarea lui oryzae, folosit ca reactiv în chimia analitică și care intră în compoziția unor insecticide;

cidul ustilagic – obținut cu culturi de micromicete ale genului Ustilago, folosit în industria parfumurilor.

Aceste fermentații, care au loc în mod spontan în condiții naturale, favorizează transformarea compușilor organici din materia nevi în compuși mai simpli, accesibili pentru alte grupe de microorganisme, transformări ce permit un circuit natural al carbonului.

Etapele unui bioproces

Un proces biotehnologic este un proces complex, format din mai multe procese tehnologice componente. Dintre procesele tehnologice componente nu trebuie să lipsească procesul esențial, respectiv procesul biochimic. Așa cum într-un proces tehnologic din industria chimică trebuie să existe cel puțin un proces chimic, proces care implică transformări de substanță la nivel molecular, și în procesul biotehnologic va exista cel puțin un proces biochimic, în care transformările de substanță la nivel molecular decurg la nivelul unui organism viu (microbian, vegetal sau animal) sau al unei porțiuni din acesta (enzimă). Între un proces chimic și un proces biochimic nu există deosebiri fundamentale. În ambele există o transformare fundamentală la nivel molecular (reacția chimică, respectiv reacția biochimică) însoțită de procese de transfer de masă sau de energie (figura 2.9).

Figura 2.9. Asemănări între procesul chimic și procesul biochimic

Acest bioproces presupune parcurgerea mai multor faze: laborator, pilot, industrială.

A. Faza de laborator

1. Izolarea și selecția

izolarea din medii diferite (apă, sol, alte substrate) sau cumpărarea tulpinii producătoare;

cultivarea pe medii adecvate;

obținerea culturilor pure;

omologarea culturilor;

teste de identificare a compusului de interes (calitative și cantitative).

2. Întreținerea tulpinilor producătoare

caracterizarea tulpinilor: criterii morfologice, biochimice, fiziologice, imunologice toxicologice.

tulpina caracterizată se înregistrează într-o colecție de microorganisme sub un număr de identificare.

uneori se aplică procedee de selecție naturală sau artificială (mutageneză) în scopul obținerii de tulpini înalt producătoare.

păstrarea culturilor stoc la frigider.

3. Cultura de inocul

inocul este o cultură microbiană în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător și în anumite condiții specifice de dezvoltare (pH, temperatură, agitare, aerare).

transvazarea culturii inocul în mediul de biosinteză, în condiții aseptice, după o perioadă de dezvoltare bine stabilită pentru fiecare tip de microorganism.

B. Faza de stație pilot

faza de biosinteză propriu-zisă se realizează în bioreactoare.

în prealabil se realizează o sterilizare a instalației, a mediului de cultură, stabilite în laborator ca fiind optime.

în faza de stație pilot, tehnologia elaborată în laborator este verificată și optimizată pe instalații cu capacitate medie (pilot).

pe baza datelor obținute la nivel pilot se elaborează procesul tehnologic pilot, care va fi experimentat industrial și apoi se realizează producția propriu-zisă.

C. Faza industrială

procesul tehnologic are loc în bioreactorul ales conform scopului urmărit;

toți parametri optimizați în fazele de laborator și pilot sunt urmăriți în faza industrială, însă la altă scară.

Un proces biotehnologic industrial, cuprinde, de regulă, următoarele procese componente principale: selecția microorganismelor (celulelor), pregătirea mediului de cultură, procesul biochimic propriu-zis, recuperarea (capturarea) produsului urmată de separarea, purificarea și condiționarea acestuia (figura 2.10).

Figura 2.10. Reprezentarea schematică a unui bioproces

Procesul de bază în biotehnologie „procesul biologic” se desfășoară într-un spațiul numit bioreactor. Descoperirile succesive și dezvoltarea spectaculoasă a biotehnologiei au favorizat atât studiul aprofundat al proceselor implicate, cât și al aparaturii utilizate, în principal, al bioreactoarelor. S-a născut astfel „bioingineria”, care studiază bioprocesele sub toate aspectele (modul de desfășurare, cinetică, transfer de masă și căldură), oferind soluții de optimizare a procesului biotehnologie.

În funcție de poziția acestor procese față de procesul biochimic propriu-zis, care decurge în bioreactor, ele pot fi incluse fie în prelucrarea în amonte de bioreactor (upstream processing), fie în prelucrarea în aval de acesta (downstream processing). Prelucrarea masei de reacție în aval de bioreactor este dictată de numeroși factori, doi dintre aceștia fiind fundamentali: natura produsului de biosinteză obținut și faza în care se găsește acesta în urma procesului de biosinteză.

Figura 2.11. Fazele principale ale unui proces biotehnologic industrial

Bioreactoare

Bioreactorul reprezintă instalația tehnologică în interiorul căreia are loc transformarea materiilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziție de microorganismele vii, celulele animale și vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.

Reușita experimentului de biotehnologie depinde în cea mai mare măsură de condițiile optime de creștere a microorganismelor create în bioreactor. Celulele se luptă continuu cu modificările din mediul înconjurător, astfel încât să obțină și să-și mențină condițiile optime de creștere. Într-un bioreactor, această tendință a celulelor este asistată, este controlată în mod continuu.

Bioreactorul trebuie să asigure aprovizionarea continuă a celulelor cu mijloacele necesare creșterii sau producerii de metaboliți, asigurând pe cât este posibil valorile optime pentru pH, temperatură, concentrația substratului, concentrațiile în săruri minerale, factorii de creștere și pentru concentrația în oxigen.

Fenomenele care au loc în bioreactor au un caracter complex, datorită interdependenței fenomenelor de transfer cu cele biochimice. Analiza procesului trebuie să ia în considerare, pe lângă reacțiile biochimice propriu-zise, și fenomenele fizice cu care acestea interacționează și anume: curgerea, transferul de masă și transferul de căldură, prezente în orice reactor industrial. Descrierea cantitativă a acestor fenomene furnizează ecuațiile cu ajutorul cărora bioreactorul poate fi analizat, optimizat, dimensionat, reglat.

Tipuri de bioreactoare

Bioreactorul discontinuu

Bioreactorul discontinuu este caracterizat prin amestecarea ideală a mediului de cultură și prin operarea în șarje: se încarcă componentele mediului, se inoculează, iar după un interval de timp determinat se descarcă mediul de fermentație conținând produșii de biosinteză.

Bioreactorul continuu

În cazul cultivării continue, prelungirea fazei de creștere exponențială un timp nedefinit se realizează prin adăugarea continuă în reactor a unei soluții de mediu proaspăt cu un debit volumetric și eliminarea continuă a biomasei cu același debit, astfel încât volumul biomasei din fermentator să rămână constant.

Pentru stabilirea ecuației ce generează dezvoltarea microorganismelor, trebuie să se țină seama de faptul că variația concentrației biomasei este datorată existenței a două fenomene antagoniste:

creșterea numărului microorganismelor datorită dezvoltării populației;

scăderea cantității de microorganisme datorită eliminării lor din sistem.

Bioreactorul cu recirculare externă

În unele cazuri, mediul de fermentație de la ieșirea din bioreactor este supus unei operații de separare (prin centrifugare, filtrare, sedimentare), iar concentratul conținând biomasa se recirculă parțial în bioreactor.

Ecuațiile ce guvernează acest proces se bazează pe aplicarea bilanțurilor de materiale pentru biomasă și substrat.

Notăm cu R raportul de recirculare și presupunem aceeași concentrație a substratului și a produsului în debitul de alimentare și în cel de evacuare.

Figura 2.12. Reprezentarea schematică a bioreactorului cu recirculare

Bilanțul de materiale pentru biomasă se scrie astfel:

BI + BE + BG = BR + BIE

unde: BI – biomasă intrată

BE – biomasă existentă

BG – biomasă generată

BR – biomasă rămasă

BIE – biomasă ieșită

Bioreactorul ideal cu deplasare (D) (curgere tip piston)

Reactoarele cu amestecare, operate discontinuu sau continuu sunt tipurile de bioreactoare cel mai frecvent întâlnite în biotehnologie.

Există însă situații în care se utilizează și reactoarele tubulare (cu diametrul mult mai mic decât lungimea), acestea având următoarele avantaje:

construcție simplă, fără zone stagnante; în acest caz ridicarea la scară industrială se realizează mai ușor, fără riscuri;

se poate regla durata de staționare a celulelor în bioreactor, astfel încât conversia substratului să fie mai mare și concentrația produsului finit mai mare;

spumarea este mai mică;

eforturile de forfecare sunt mai mici, deci distrugerea pereților celulelor este mai mică.

Reactorul cu o curgere tip piston este caracterizat prin existența unui profil plan de viteze în secțiune perpendiculară pe direcția de deplasare a fluidului (axa reactorului). Aceasta este o idealizare, deoarece implică o amestecare radială infinită și lipsa amestecării axiale.

Figura 2.13. Reprezentarea schematică a reactorului cu deplasare

2.4.2. Configurația bioreactoarelor

Bioreactorul este „inima” oricărei fermentații sau bioconversii enzimatice. Configurația și construcția unui bioreactor se realizează pe baza unor principii de inginerie bine fundamentate științific.

Alegerea tipului de bioreactor este în strânsă legătură cu tipul bioprocesului ce urmează a se desfășura în el. Acest lucru presupune luarea unor decizii importante referitoare la următoarele aspecte:

configurația bioreactorului: cu agitare mecanică sau un vas cu aerare fără agitare;

mărimea bioreactorului: ce dimensiune a bioreactorului este necesară pentru a asigura producția rentabilă a produsului;

condițiile bioprocesului din interiorul bioreactorului: pH, temperatură, concentrația oxigenului dizolvat;

sistemul de operare respectiv și dacă bioreactorul va funcționa în sistem discontinuu sau în sistem continuu; va fi bioreactorul cuplat în serie cu alte bioteactoare sau va fi singur.

Decizia luată în legătură cu problemele enunțate anterior va avea un impact deosebit asupra performanței ulterioare a bioprocesului.

Înainte de alegerea modului de operare (discontinuu, continuu, semicontinuu), a tipului, a mărimii și a condițiilor de operare, este necesară o alegere preliminară a tipului de reactor în funcție de microorganismul utilizat, mediul de cultură și de caracteristicile procesului biochimic.

2.4.3. Tipuri constructive

Bioreactoarele cilindrice cu sau fără agitare sunt cel mai des utilizate în biotehnologie. Tipuri noi de bioreactoare au fost construite pentru aplicații speciale, cum ar fi:

culturi de țesuturi vegetale sau animale

bioreactoare pentru celule imobilizate.

După natura proceselor biotehnologice, reactoarele pot fi clasificate în:

reactoare biologice: în care se desfășoară un proces de fermentație (cu biomasă);

reactoare biochimice: în care se desfășoară procesele enzimatice.

Reactoarele biologice pot fi pentru fermentații aerobe sau anaerobe. Reactoarele biochimice pot fi: cu enzime libere, cu enzime imobilizate și cu fază solidă.

Formele constructive și modurile de operare ale bioreactoarelor pot fi foarte diferite, în funcție de cerințele și specificațiile proceselor tehnologice.

Reactoare pentru fermentații aerobe. După modul de introducere a energiei necesare amestecării fazei lichide (substrat + microorganisme) și dispersării fazei gazoase (aer), reactoarele aerobe se pot diviza în trei categorii:

cu amestecare mecanică;

cu pompă de recirculare;

cu aer comprimat.

2.4.4. Sisteme de cultivare a microorganismelor

Există două sisteme majore de cultivare a microorganismelor care sau impus cu timpul în domeniul biotehnologiei:

în sistem submers;

în culturi de suprafață.

În cazul cultivării microorganismelor în sistem submers, mediul de cultură este lichid, agitat și aerat; din punct de vedere al continuității procesului, se disting trei moduri de operare: discontinuu, semicontinuu și continuu.

Operarea în sistem discontinuu, adică în șarje (sistem batch). Cultivarea începe la timpul t = 0 și se termină la timpul t = t'. La început, proliferarea celulelor are loc în condiții nelimitative. După ce s-a atins densitatea maximă în celule are loc operarea în condiții limitative de substrat. Substratul se referă la unul dintre nutrienți (sursa de carbon, sursa de azot etc.) sau la oxigen.

În particular, pentru oxigen, care este consumat foarte rapid, o aprovizionare continuă în mediu este posibilă, astfel încât concentrația sa să nu scadă sub o valoare critică specifică microorganismului. Operarea în sistem discontinuu se notează DC, fiind reprezentată grafic în figura 2.12.

Figura 2.14. Reprezentarea grafică a reactoarelor în sistem discontinuu

În cazul acestui tip de operare avem regimul de circulație amestecare perfectă, caracteristică fiind în această situație uniformitatea valorilor concentrației, temperaturii în spațiul bioreactorului și, în general, a tuturor parametrilor care influențează bioprocesul.

Operarea în sistem semicontinuu („extended culture operation”). În acest caz, reactorul este astfel operat încât concentrația substratului limitativ este păstrată constantă prin aprovizionarea sa continuă („feed batch”). Se notează SC și se reprezintă grafic în figura 2.13.

Figura 2.15. Reprezentarea grafică a reactoarelor în sistem semicontinuu

Operarea în sistem continuu („continuous operation”). Aceasta presupune alimentarea continuă cu nutrienți și în același timp evacuarea din reactor a unei cantități echivalente de mediu de cultură.

Cultivarea continuă poate fi realizată în două tipuri de reactoare ideale: R și D. Pentru reactorul R (cu recirculație) se impune amestecare perfectă, deci un grad foarte mare de omogenitate, iar în cazul reactorului D (cu deplasare) se consideră o curgere tip piston.

Figura 2.16. Reprezentarea schematică a reactoarelor R și D

În modelul cu deplasare ideală, D, elementele dintr-o secțiune transversală, o dată intrate în reactor, se deplasează prin translație în direcție axială prin reactor; nu există elemente de fluid care să depășească alte elemente de fluid. Cantitativ, acest model se exprimă prin constanța vitezei fluidului în secțiunea transversală.

În biotehnologie, există însă și sistemul de cultivare a microorganismelor în culturi de suprafață în care mediul de cultură poate fi solid sau semisolid, astfel încât, dacă se ține seama de omogenitatea fazelor se poate face o clasificare a bioreactoarelor în:

omogene: L – L

heterogene: L – S; G – L – S

unde:

L-L: lichid – lichid – monofazice

L-S: lichid-solid – multifazice

G – L- S: gaz – lichid – solid – multifazice

În sistemele omogene, compoziția mediului de fermentație este uniformă pe tot parcursul bioprocesului. În sistemele heterogene, în mediul de fermentație există gradiente de celule sau de substrat. în sistemul omogen, în orice moment, microorganismele din diferite zone ale sistemului au aceeași stare fiziologică (același stadiu de dezvoltare). În sistemul heterogen, microorganismele din diferite zone ale sistemului sunt expuse la diferite condiții de mediu și, în consecință, vor avea diferite stări fiziologice (adică se vor afla în diferite stadii de dezvoltare). Sistemele de operare continuă sunt prezentate în figura 2.17.

Figura 2.17. Sisteme de operare continuă: S – substrat; C – celule

Un alt criteriu care stă la baza clasificării bioreactoarelor este regimul termic

Pentru reactoarele chimice, se pot practica următoarele regimuri:

izoterm: au loc schimburi de căldură cu exteriorul, temperatura rămânând constantă;

adiabat: nu au loc schimburi de căldură cu exteriorul;

neizoterm-neadiabat: au loc schimburi de căldură cu exteriorul, iar temperatura în reactor nu este constantă;

programat: se modifică regimul termic, astfel încât să se atingă un optim dorit;

autoterm: reactorul se susține singur din punct de vedere termic.

Reacțiile chimice pot fi exoterme, cu degajare de căldură (ΔIR < 0) sau endoterme, cu absorbție de căldură din mediul exterior (ΔIr> 0). Reacțiile chimice exoterme pot fi conduse în oricare din regimurile termice specificate, pe când cele endoterme nu pot fi operate autoterm.

Reacțiile biologice sunt exoterme, indiferent de microorganismul utilizat, de condițiile de lucru sau de produșii obținuți.

Deși cantitatea de căldură degajată în urma proceselor biologice este mică în comparație cu cea degajată în procesele chimice, nu trebuie neglijată deoarece materialul biologic (microorganisme, enzime) este foarte sensibil la variațiile de temperatură.

Operarea bioreactoarelor în culturi extinse (cu adaosuri)

În afara modalităților de operare a bioreactoarelor, expuse anterior, în practica biotehnologică se folosește cu succes și tehnica adăugării în bioreactor a unuia sau a mai multor substraturi, în timpul cultivării, fără eliminare de biomasă (fermentație cu adaosuri), numită și cultură extinsă sau operare în sistem semicontinuu.

Acest tip de cultivare se situează între cultivarea „în șarjă" și cea continuă. Caracteristicile celor trei tipuri de operare:

în șarjă: concentrația substratului scade;

continuu: concentrația substratului este constantă;

semicontinuu: concentrația substratului se menține constantă o perioadă, după care scade.

Avantajele sistemului de operare semicontinuu sunt următoarele:

prin alimentarea mediului în timpul cultivării se obțin rezultate superioare în productivitate față de sistemul discontinuu;

în cazul în care se utilizează nutrienți cu proprietăți inhibitoare (metanol, etanol, acid acetic), prin menținerea concentrației acestora între anumite limite se poate obține o scurtare a perioadei de latenta și micșorarea efectului inhibitor al substratului;

este posibilă obținerea unor concentrații mai mari de biomasă (circa 50 g/l) prin adăugarea de substrat.

în cazul în care se dorește obținerea unor concentrații foarte mari de biomasă (circa 100 g/l), sunt necesare concentrații ridicate de nutrienți, ceea ce determină apariția unui efect de inhibiție.

Astfel intervine așa-numita „represie catabolică”, care apare la utilizarea unor surse de carbon și energie ușor metabolizabile (glucoza) și care constă în represia enzimelor implicate în biosinteză datorită acumulării unei cantități mari de ATP în celulă. Pentru a micșora acest efect se adaugă treptat glucoza.

2.4.5. Criterii de alegere a bioreactorului potrivit fiecărui proces tehnologic

Alegerea bioreactorului potrivit pentru un anumit proces biotehnologic se realizează în funcție de o serie de factori predeterminați cum ar fi:

natura microorganismului folosit;

proprietățile mediului de cultură;

parametrii biochimici ai procesului;

amplasamentul bioreactorului.

Caracteristici determinate de natura microorganismului folosit în bioproces. Modul de operare al unui reactor depinde în mod esențial de stabilitatea tulpinii productive. De exemplu, numai tulpinile care sunt suficient de stabile pot fi utilizate în operarea continuă [Aiba, 1973]. Condițiile de operare sunt afectate în mod hotărâtor fiind complet diferite dacă microorganismul este aerob sau anaerob.

În creșterea organismelor aerobe este necesar să existe o cantitate disponibilă de oxigen dizolvat, tot timpul în mediul de cultură.

Deoarece solubilitatea oxigenului în mediul de cultură este mică, este necesară alimentarea continuă cu oxigen.. Aceasta se realizează, de obicei, prin dispersia aerului în mediu. Un grad de dispersie cât mai mare în mediile cu vâscozitate mare conduce la un transfer mai bun al oxigenului și celulele sunt aprovizionate cu oxigen mai bine.

Mărimea și forma celulelor. Acestea au, de asemenea, o influență considerabilă asupra tipului de reactor necesar și a modului de operare. Celulele sferice sunt, de obicei, mai mici și mai puțin sensibile la forfecare decât microorganismele filamentoase.

Formarea celulelor sferice necesită un grad de dispersie mai mare a aerului decât organismele filamentoase. Dimensiunile mici asigură un raport mare între suprafață și volum, un consum mai mare al substratului și, de asemenea, o creștere rapidă. Celulele aerobe cu viteză mare de creștere necesită un consum al oxigenului mai mare.

Organismele filamentoase cresc numai la capătul hifelor. Aceasta conduce la viteze mici de creștere și la cereri mici în oxigen. Deoarece astfel de celule sunt, de cele mai multe ori, sensibile la forfecare, forțe mari de dispersie pot cauza ruperea. De fapt, este de dorit să se disperseze nu numai faza gazoasă ci și microorganismul însuși.

Formarea de micelii și aglomerări are un efect considerabil asupra alegerii reactorului. Aglomerările de celule au un raport mic între suprafață și volum, o viteză mică de consum a substratului și o viteză mică de creștere.

Viteza mică de consum a oxigenului permite folosirea reactoarelor care dispersează aerul într-un grad mic sau moderat.

Celulele care formează aglomerări sunt ușor de separat din mediile de cultură și reintroduse în reactor în scopul ridicării densității celulare. în multe reactoare, densitatea celulară se diminuează considerabil cu creșterea înălțimii (de exemplu, reactoarele turn). Când ieșirea mediului este plasată la capătul reactorului, numai o cantitate mică de celule sunt îndepărtate din turn. în acest fel, timpul de staționare a celulelor în reactor poate fi extins considerabil, fără creșterea timpului de staționare în mediu. Deci, aglomerarea de celule permite operarea în sistem continuu a reactorului de producere a metaboliților, fără o separare specială a celulelor (de exemplu, prin centrifugare sau filtrare).

Aglomerările de celule pot avea diferite morfologii. Acestea depind nu numai de tulpina producătoare, ci și de condițiile unui stres mecanic din reactor. În condițiile unui stres mecanic mic, multe organisme filamentoase (de exemplu, fungii) formează aglomerări voluminoase, interacționând unele cu altele, care conduc la vâscozități mari ale mediului. Aceste aglomerări sunt adesea sensibile la stresul de forfecare, care poate conduce la ruperea filamentelor.

Multe microorganisme au tendința de a crește pe suprafețe. Aceste proprietăți pot fi dorite dacă se dorește operarea continuă, cum ar fi în cazul tratamentului apelor de canal.

Dacă aceste proprietăți sunt foarte pronunțate, pot fi utilizate reactoarele de suprafață. În general, formarea de film nu este dorită. Dacă celulele au tendința să crească la suprafață, formarea regiunilor de stagnare la suprafață poate fi evitată prin utilizarea unui reactor potrivit.

Caracteristici ale reactoarelor determinate de proprietățile mediului de cultură. Caracteristicile mediilor de cultură determină alegerea unui anumit tip de bioreactor.

Proprietățile fizice ale substratului folosit diferă: gazos (de exemplu, metan, dioxid de carbon, la fotosinteză), lichid și solubil în apă (de exemplu, glucoza, lactoză), lichid și insolubil în apă (de exemplu, parafine), solid și insolubil în apă (de exemplu, amidon, celuloză). Fiecare stare fizică exercită o influență considerabilă în alegerea bioreactorului. De aceea, de exemplu, metanul și aerul pot forma un amestec exploziv și reactoarele cu acest amestec nu pot fi folosite.

În cazul substraturilor volatile, se alege un reactor cu debit în contracurent, cu agitare ușoară axială sau un sistem de reactoare cu mai multe stagii pentru a micșora pierderile de gaz. S-a studiat, de asemenea, aerația emulsiilor de ulei în apă. Prezența parafinelor reduce viteza de transfer a oxigenului. În general, reactoarele de suprafață nu sunt potrivite pentru fermentația emulsiilor uleioase.

Dacă se utilizează un substrat solubil în apă, în operarea discontinuă, se obține, de obicei, un mediu mult mai vâscos decât cel inițial. Pentru acest caz se folosesc reactoare speciale cu agitatoare elicoidale. Prezența solidelor grele (de exemplu carbonatul de calciu în mediul de cultură pentru Penicillum chrysogenum) ori a substraturilor fibroase (de exemplu, paie pretratate) limitează alegerea tipului de bioreactor. Fibrele lungi din suspensiile diluate micșorează debitul și particulele mari blochează intrările. în acest caz este necesară introducerea de restricții la prepararea mediilor; se prevăd faze speciale de înlăturare a neajunsurilor.

O altă componentă a mediului care poate influența tipul de bioreactor ce urinează a fi utilizat este concentrația de substrat sau de produs finit.

Efectul biocinetic al substratului sau al produsului pot să afecteze alegerea bioreactorului. în cazul în care substratul prezintă inhibiție sau represie asupra creșterii microorganismului, procesul este condus în sistem semicontinuu, cu alimentare continuă de substrat (fermentație cu adaosuri).

În cazul în care produsul de biosinteză induce inhibiție sau represie când sunt în concentrație mare (de exemplu, glucoza și celobioza la Trichoderma viride, etanolul la Sacharomyces cerevisiae), este de dorit să se folosească aranjamentul în mai multe trepte.

O altă caracteristică, ce influențează alegerea unui anumit tip de bioreactor sau a unui anumit sistem de operare, o constituie prezența în mediul de cultură a unei componente care se degradează în timpul operației de sterilizare (termolabile). în acest caz este necesară sterilizarea separată a acestor materiale.

O altă proprietate a mediului de cultură care influențează procesul de fermentație este tendința de coalescență, adică formarea de bule de gaz care micșorează transferul de oxigen în mediul de cultură. în acest caz se introduc în bioreactor sisteme de disipare a bulelor, cu efect local (mijloace mecanice).

Comportarea reologică a mediului are o mare influență asupra unui bioproces. Mediile cu vâscozitate mică nu creează probleme de agitare și de viteză de transfer a oxigenului. O creștere a vâscozității mediului poate avea diferite cauze:

concentrația mare în substrat (în particular la operarea în sistem „batch”, la începutul cultivării);

secreția de produse vâscoase pe parcursul biosintezei, cum ar fi pullulanul și xantanul;

morfologia microorganismului.

O caracteristică a mediului importantă, care implică alegerea unui anumit tip de bioreactor, este spumarea în timpul cultivării. Formarea de spumă conduce de cele mai multe ori la blocarea ieșirii aerului, inundarea filtrelor de aer, scăderea volumului de mediu în bioreactor, infecția mediului de cultură și, deci, compromiterea procesului de biosinteză.

Există mai multe metode pentru prevenirea fenomenului de spumare:

conducerea procesului astfel încât să nu se formeze spumă; de exemplu o viteză mare de transfer a oxigenului (printr-o agitare corespunzătoare, variabilă în funcție de nivelul concentrației de oxigen dizolvat măsurată continuu) transformă procesul într-unui cu limitare de substrat; în acest caz concentrația oxigenului nu mai este un factor limitativ și nu este necesară mărirea debitului de aer care conduce la spumare excesivă. Această metodă se poate aplica în cazul în care spumarea se datorează proteinelor dizolvate, eliberate din celulele lizate;

adăugarea de antispumanți, care schimbă coalescența mediului. Agentul antispumant se acumulează la interfața gaz-lichid și împiedică formarea spumei.

Antispumanții utilizați în industria de biosinteze sunt:

uleiuri naturale: de soia, de floarea-soarelui;

uleiuri sintetice, care pot fi de natură siliconică sau polimeri organici;

mijloace mecanice: agitatoare cu turație mare, șicane, tuburi interioare.

Spumarea poate fi combătută și prin alegerea tipului de bioreactor potrivit care să permită o circulație rapidă a lichidului fără să formeze spumă (bioreactor cu „draft” interior).

Enzimele definite drept componente de natură proteică, produse de celulele vii care catalizează reacții de sinteză și degradare din organismele animale, vegetale și microorganisme, prezintă numeroase implicații și aplicații în industria alimentară.

Fiind componente ale materiilor prime vegetale și animale utilizate în industria alimentară, a căror activitate nu încetează odată cu recoltarea, depozitarea, conservarea și prelucrarea tehnologică a acestora, enzimele pot manifesta acțiuni favorabile, dorite, care conduc la îmbunătățirea calităților naturale constituționale, gustative etc. sau nefavorabile și nedorite, determinând degradarea și pierderea valorilor nutritive.

Dacă în acest sens se are în vedere activitatea enzimelor proprii materiilor prime vegetale și animale, enzimele ca atare sub formă de preparate enzimatice, obținute din diferite surse bogate în enzime, își găsesc multiple aplicații ca adaosuri, fiind folosite încă din cele mai vechi timpuri ca de exemplu cheagul la prepararea brânzeturilor, „Koji" (kabi-taki = „floare de mucegai", preparat enzimatic obținut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae pe un decoct de orez sau alte cereale), la prepararea unor produse tradiționale-fermentate, larg răspândite în Asia de Sud-Est.

În ultimele decenii, preparatele enzimatice și-au găsit numeroase utilizări în diferite sectoare ale industriei alimentare. Această creștere spectaculoasă a gradului de utilizare a preparatelor enzimatice în industria alimentară (dar și nealimentară) este explicată prin eficiența și precizia, versatilitatea și economicitatea cu care acționează aceste preparate enzimatice.

În industria alimentară, prelucrătoare de materii prime vegetale și animale, practic nu există procese tehnologice în care să nu fie implicate enzimele endogene, proprii materiilor biologice folosite sau ale microorganismelor utilizate în prelucrarea acestora; în plus, în multe cazuri, în prezent, se recurge la suplimentarea acestor activități enzimatice cu enzime exogene, cu preparate enzimatice obținute din diverse surse bogate în enzime, țesuturi vegetale, animale și mai ales în ultimii ani din culturile diverselor microorganisme.

Enzimele sunt utilizate drept catalizatori în condițiile în care există și catalizatori chimici, deoarece prezintă următoarele avantaje:

au capacitatea de a cataliza reacțiile chimice în condiții blânde de temperatură, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie și nu necesită echipamente scumpe rezistente la coroziune.

enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la obținerea de produși de reacție secundari nedoriți. În aceste condiții nu sunt necesare cheltuieli mari privind rafinarea și purificarea produsului ce urmează a fi fabricat.

comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului compuși biodegradabili care nu necesită costuri semnificative de epurare.

anumite enzime nu sunt limitate numai la acțiunea în mediul apos, putând acționa și la interfața dintre două faze, apă : solvent organic sau apă:ulei etc.

Totuși există și o serie de dezavantaje:

au stabilitate limitată;

de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singură dată.

Clasificarea enzimelor

Enzimele se clasifică conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a Uniunii Internaționale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificări există 6 clase principale grupate conform cu reacțiile pe care le catalizează astfel:

Oxidoreductaze care catalizează reacții de oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen sau electroni;

Transferaze care catalizează transferul unei grupări de pe o moleculă pe alta;

Hidrolaze ce catalizează scindarea hidrolitică (implică apa) a legăturilor chimice covalente;

Liaze, care catalizează scindarea legărutilor chimice altfel decât prin hidroliză sau oxidare;

Izomeraze ce catalizează rearanjarea structurală a moleculelor;

Ligaze sau sintetaze care catalizează formarea de noi legături te tip C-N, C-O, C-C, C-S, cu consumare de ATP.

Constituția enzimelor

Determinantă pentru funcția catalitică a enzimelor este configurația lor, respectiv structura și organizarea spațială a moleculei proteice care manifestă activitatea enzimatică.

Din punct de vedere structural, enzimele se împart în două categorii:

enzime de natură exclusiv proteică, constituite în întregime din proteine (de exemplu: pepsina, tripsina, papaina etc.);

enzime de natură heteroproteică formate dintr-o parte proteică (apo-enzimă) și una neproteică denumită cofactor enzimatic. Cele două părți separate sunt inactive catalitic; împreună formează complexul molecular apo-enzimă: cofactor, respectiv holoenzima care manifestă activitate catalitică.

În structura holoenzimei, cofactorul imprimă specificitate de acțiune, respectiv tipul și viteza de reacție catalitică, în timp ce apoenzima imprimă specificitatea de substrat, deci determină substanța asupra căreia acționează enzima.

Apoenzima, fiind de natură proteică, va manifesta proprietățile generale ale proteinelor:

este termolabilă și nedializabilă;

stabilește legătura enzimei cu substratul;

manifestă grade diferite de afinitate pentru cofactor;

este susceptibilă de modificări conformaționale în anumite limite.

Cofactorul enzimatic reprezintă componente neproteice, de natură chimică foarte diferită, care sunt indispensabile pentru manifestările activității catalitice a numeroase enzime.

După natura chimică și modul lor de legare la apoenzimă, cofactorii se clasifică:

coenzimă;

grupări prostetice;

ioni metalici.

Coenzimele sunt compuși organici, derivați din vitamine, care se atașează temporar la apoenzimă și care sunt ușor disociabili de acestea. Ele trec ușor de la o apoenzimă la alta, putând să participe la transformarea altor molecule de substrat după terminarea unei anumite reacții. Din ei fac parte: NAD+, NADP+, FMN, FAD, ATP, CTP, acidul lipoic etc.

Grupările prostetice sunt substanțe organice fixate pe apoenzimă, care disociază greu, deoarece sunt legate prin legături covalente. Aceste grupări sunt: TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetică imprimă mecanismul unor procese enzimatice: transportul de electroni, de grupări –NH2, acetic etc.

Ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funcției catalitice a unor enzime, participând în calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Ele se mai numesc metal-enzime, iar printre ionii care îndeplinesc rol de cofactor se pot menționa: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Mo2+. Unele enzime pot conține chiar doi ioni metalici.

Exercitarea proprietăților catalitice ale enzimelor se realizează prin intermediul situsurilor catalitice — centrilor sau zonelor active — care reprezintă ansamblul grupărilor chimice din structura enzimei ce participă efectiv în manifestarea activității enzimatice (de exemplu, anumite resturi din aminoacizii constituenți ai lanțurilor polipeptidice și cofactorii enzimatici, care vin în contact direct cu substratul).

În funcție de organizarea lor structurală se disting: enzime monomerice, constituite dintr-un lanț polipeptidic care nu poate fi disociat în subunități fără pierderea activității lor catalitice și enzime oligomerice care sunt agregate moleculare constituite din doi sau mai mulți protomeri, respectiv lanțuri polipeptidice similare sau diferite, care prin disociere sau din contră prin asociere devin catalitic-active. Pentru o serie de enzime s-au stabilit existența unor forme moleculare multiple sau izoenzime, care catalizează realizarea aceleiași reacții biochimice, dar care diferă între ele prin configurații spațiale diferite (compoziție în aminoacizi constituenți), prin proprietățile lor fizico-chimice (pH sau temperatură optimă, cinetică de reacție, comportare față de inhibitori sau activatori etc.) și imunologice etc.

Se cunosc, de asemenea, așa-numitele sisteme sau complexe multienzimatice constituite din enzime intim legate prin interacțiuni necovalente, care participă la realizarea unor secvențe de reacții biochimice consecutive și înlănțuite, în care produsul de reacție al primei enzime devine substrat pentru cea de a doua enzimă, al cărui produs de reacție devine substrat pentru a treia enzimă etc., până la realizarea întregului șir de reacții prin care se metabolizează în celule un component biochimic. Astfel de sisteme sau complexe multi-enzimatice sunt, în general, localizate în celule la nivelul diferitelor formațiuni sau organite subcelulare.

Principalele domenii în care enzimele și-au găsit utilizări sunt:

fabricarea unor produse prin transformarea enzimatică a amidonului;

la fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panificație;

în compoziția detergenților;

industria textilă, hârtiei și a furajelor pentru animale;

sinteza catalitică a unor substanțe chimice;

analiza alimentelor, diagnoză chimică și terapie;

inginerie genetică.

Unități de măsură a activității enzimatice

În principiu, determinarea activității enzimelor se efectuează prin: măsurarea gradului de transformare a substratului, măsurarea concentrației produsului de reacție sau măsurarea cineticii de reacție, urmărite într-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprimă cantitativ în unitățile propuse de Comisia de Enzime (CE) și anume:

Unitatea de activitate enzimatică (U) reprezintă cantitatea de enzima care catalizează transformarea a l mol substrat/min în condiții standard (25°C, pH și concentrație de substrat optime). Această unitate de măsură recomandată de CE în 1961 se folosește încă în prezent; CE recomandă renunțarea sau abandonarea progresivă a folosirii unității U și trecerea la Kat.

Katalul (Kat) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează transferarea a l mol substrat/s în condiții standard. (Prin definiție această unitate de măsură se apropie mai mult de dimensiunile constantelor de viteză folosite în cinetica chimică respectiv mol/s.) Se folosește și multiplul kilokatal (K Kat) și respectiv submultiplii milikatul (mKat), microkatul (Kat), nanokatul (nKat) și picokatul (pKat).

Activitatea specifică – reprezintă numărul de unități enzimatice/mg proteină (respectiv Kat/kg proteină și Kat/kg proteină).

Activitatea enzimatică molară (număr de transfer = turnover number) reprezintă numărul de molecule de substrat transformate de către o moleculă de enzimă în timp de l min sau l s (Kat/mol enzimă).

Cu toate aceste recomandări ale Comisiei de Enzime, în lucrări mai vechi sau chiar și în prezent se folosesc și alte moduri, arbitrare, de exprimare a activității enzimelor, care de obicei sânt definite de cei ce le utilizează.

Biotehnologia preparatelor enzimatice

Este un domeniu de bază al biotehnologiei, care are drept scop studierea tehnicilor de obținere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animală, vegetală și microbiană, sub formă liberă sau imobilizată pentru a fi folosite ca agenți biologici în industria alimentară, industria furajelor, industria textilă, detergenților, farmaceutică, cosmetică, chimică, etc.

Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiționale se transformă în biotehnologii, devenind mai eficiente și mai puțin poluante. În figura 3.18. este prezentată ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice în diferite ramuri.

Figura 3.18. Ponderea utilizării preparatelor enzimatice

Așa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea în industria alimentară, urmată de industria detergenților.

3.5. Tipuri de preparate enzimatice

Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme și grade de purificare:

Preparate enzimatice solide:

Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, obținute prin uscarea și măcinarea mediului fermentat;

Preparate sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia analitică și ingineria genetică;

Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanțe crioprotectoare, care sunt urcate în vacuum la temperaturi de -20…..-50C.

Preparate enzimatice lichide

Preparate enzimatice brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare (eliberate de către microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentației).

Preparate parțial purificate, în care se adaugă conservanți pentru a le mări stabilitatea în timp.

În figura 3.19. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Figura 3.19. Principalele tipuri de preparate enzimatice

3.6. Surse de enzime

Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei tipuri de surse: țesuturi animale și vegetale sau microorganisme.

Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria cărnii (ficat, pancreas, inimă, rinichi, creier, mucoasă stomacală și intestinală). Utilizarea aceste surse este pe scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezintă o serie de dezavantaje, cum ar fi: producția limitată, apariția unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la bovine.

Principalele enzime de origine animală care se obțin sub formă de preparate sunt chimozină (renina) care se extrage din stomacul de miel sau viței care se utilizează pentru coagularea laptelui la fabricarea brânzeturilor. O altă enzimă este -amilază pancreatică care are utilizări în industria farmaceutică.

Sursele vegetale sunt reprezentate de semințe (germinate sau negerminate), rădăcini, fructe, sevă, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obținerea preparatelor enzimatice ridică o serie de probleme, cum ar fi: prezența unor substanțe potențial dăunătoare sănătății omului (ex. Compușii fenolici) sau a unor compuși toxici de contaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine vegetală să fie destul de puțin utilizate. Principalele enzime obținute din surse vegetale sunt:

papaina, protează obținută din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizată pentru tenderizarea cărnii sau în industria berii;

ficina, protează obținută din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizată pentru degradarea proteinelor miofibrilare.

bromelina, protează obținută din sucul de ananas (Ananas comosus), folosită pentru hidroliza proteinelor colagenice.

Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din soia și complexul enzimatic din malț (amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub formă de făină de soia sau de malț.

Microorganismele reprezintă principala sursă pentru obținerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizării microorganimelor constau în:

microorganismele se pot obține în cantități mari (biomasă) prin cultivare în instalații speciale pe medii de cultură ieftine (tărâță de grâu, extract de porumb, melasă, șroturi de soia sau floarea soarelui, zer), ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt față de cel al plantelor sau animalelor;

producția de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectarea și utilizarea de tulpini mutante, înalt performante (productive) și prin stabilirea condițiilor optime fizice și chimice pentru producerea de enzime;

proprietățile enzimelor și specificitatea de acțiune diferă cu natura microorganismelor producătoare, astfel industrial se pot obține preparate care corespund întocmai scopului dorit.

preparatele enzimatice obținute pot avea activități diferite cu predominanța unei activități.

Cea mai importantă problemă care trebuie rezolvată la obținerea de preparate enzimatice cu ajutorul microorganismelor este găsirea unui microorganism care să producă în cantitate mare enzima sau sistemul enzimatic dorit. În acest caz un interes practic îl reprezintă microorganismele heterotrofe.

Pentru ca un organism să poată ataca un substrat și să-l metabolizeze, el trebuie să posede enzimele necesare care să catabolizeze reacțiile de metabolism în condițiile de mediu proprii pentru dezvoltare.

Totalitatea enzimelor pe care un organism le posedă în permanență sau pe care poate să le elaboreze la nevoie formează echipamentul enzimatic potențial al microorganismului. Echipamentul enzimatic este determinat la rândul lui de genetica microorganismului. Zestrea ereditară constituită din gene care sintetizează enzimele microorganismelor variază de la o specie la alta.

Majoritatea enzimelor care alcătuiesc echipamentul enzimatic sunt enzime intracelulare. Aceasta înseamnă că enzimele sintetizate de gene, după formare, rămân în celulă, nefiind secretate în mediul înconjurător în care microorganismele se dezvoltă. Activitatea lor se desfășoară în interiorul celulei.

Unele microorganisme cum sunt drojdiile, bacteriile lactice, nu conțin decât enzime intracelulare. La astfel de microorganisme eliberarea enzimelor în mediul înconjurător are loc după moartea celulelor, în urma proceselor de autoliză. Din această cauză, astfel de microorganisme nu metabolizează decât substraturi nutritive solubile și permeabile prin membranele lor celulare.

Alte microorganisme, așa cum sunt bacteriile din genul Baccillus sau fungii din genul Aspergillus, elaborează pe lângă un mare număr de enzime intracelulare și enzime extracelulare, pe care le secretă în mediul înconjurător.

Enzimele extracelulare sunt, în general hidrolaze și sunt secretate de microorganisme cu scopul de a degrada substraturile insolubile și solubile cu molecule mari la compuși solubili ușor asimilabili.

Enzime intracelulare de fermentație

În categoria enzimelor intracelulare sunt incluse toate enzimele care rămân cu biomasa după separarea lichidului de fermentație. Unele enzime se acumulează probabil în periplasmă, astfel încât în mediul de cultură se află cantități mici de enzime rezultate din ruperea pereților unui număr mic de celule. Principalele tipuri de enzime intracelulare sunt prezentate în tabelul 3.4.

Tabelul 3.4.

Tipuri de enzime intracelulare

Majoritatea acestor enzime acționează asupra unor substraturi cu masă moleculară mică. Aceasta se explică prin faptul că substraturile mici pot pătrunde în celule și funcționează astfel ca inductori ai enzimelor care le degradează. Spre deosebire de acestea, enzimele extracelulare acționează asupra substraturilor cu masă moleculară mare.

Enzimele intracelulare se împart în două mari categorii: unele au o poziție centrală în metabolismul organismului în creștere și se produc în cantități mari in biomasă, altele au un rol secundar, minor și se produc în cantități mici. Pentru utilizarea acestora din urmă în scopuri industriale este necesară imobilizarea lor, astfel încât să fie economică și justificată folosirea lor.

În ceea ce privește activitatea enzimatică a acestor preparate, de cele mai multe ori constituie un secret de serviciu, deoarece poate face oricând obiectul unui brevet de invenție. Pentru ca o enzimă să fie economică, ea trebuie să aibă o activitate enzimatică minimă (100 UE/ml). De aceea majoritatea enzimelor intracelulare la care nu se atinge acestă valoare se imobilizează. Alteori, aceste enzime se utilizează pentru atacul unor impurități care incomodează procesul principal, dar fără atacul componentului principal. De exemplu, hidroliza enzimatică completă a amidonului presupune și hidroliza legăturilor α–1,6 glucozidice, aflate în număr mic în structura amilopectinei. Pullulanaza este folosită în acest caz pentru hidroliza legaturilor α–1,6 facilitând în acest fel acțiunea amiloglucozidazei și β-amilazei. Glucozoxidaza este folosită pentru îndepărtarea urmelor de glucoză din praful de ouă folosit la obținerea maionezei și în acest caz nu trebuie să aibă o activitate enzimatică mare.

Producerea enzimelor intracelulare ridică probleme specifice. Bioprocesul trebuie astfel condus încât pe parcursul biosintezei să se evite spargerea celulelor. Un alt aspect se referă la stabilitatea enzimelor; unele enzime sunt stabile în mediul intracelular și devin instabile în afara celulei.

Unul dintre dezavantajele procedeelor de obținere prin biosinteză a enzimelor intracelulare îl constituie necesitatea eliberării acestora din celule, prin distrugerea membranei celulare, extracție și ulterior separarea extractului de resturile celulare. În plus enzimele sunt impurificate cu toate proteinele intracelulare, chiar dacă enzime dorită se află în proporție mare în totalul proteinelor extrase din celule.

Un avantaj tehnologic al enzimelor intracelulare îl constituie faptul că extracția se poate efectua cu un volum mic de soluție tampon, ceea ce conduce la obținerea unui extract brut cu conținut mare de enzimă și nu mai este necesară concentrarea ulterioară a acestuia.

Enzime extracelulare de fermentație

Cele mai importante enzime microbiene extracelulare sunt, în general hidrolazele (proteinaze, amilaze, celulaze) care acționează asupra substraturilor cu masă moleculară mare. Pentru microorganisme, este normal, din punct de vedere fiziologic, să producă nutrienți din polimeri biologici disponibili în mediul înconjurător celular.

Pentru a ataca mai ușor substraturile, microorganismele își produc singure enzimele necesare hidrolizei acestora și uneori această producție de enzimă este optimă chiar la tulpinile sălbatice.

Enzimele hidrolitice produse prin fermentație și utilizate în cantități mari în industrie sunt proteazele, amilazele, celulazele. Acestea sunt comercializate și utilizate în industria alimentară, textilă, detergenților.

Pentru că producția unei enzime extracelulare utilizează în cea mai mare parte resursele disponibile ale celulei, biosinteza și secreția unei astfel de enzime sunt supuse unui complex de factori regulatori. În general, producția acestor enzime este indusă de niveluri reduse ale polimerilor, iar uneori polimerii înșiși funcționează ca inductori. Alteori, compușii care nu sunt substraturi pentru enzime, dar sunt înrudiți ca structură cu acestea, pot funcționa ca inductori. De exemplu, producția de celulaze este indusă atât de lactoză, cât și de celobioză. Producția acestor enzime este de asemenea supusă represiei prin cataboliți. Atâta timp cât nutrienții cu masă moleculară mică sunt disponibili, celulele cresc fără să producă hidrolaze și abia la epuizarea nutrienților începe biosinteza enzimelor hidrolitice extracelulare. Astfel, inducția și represia biosintezei enzimelor sunt fenomene complexe ce au loc în concordanță cu condițiile de mediu în care se găsesc celulele.

Trebuie reținut faptul că factorii care determină înmulțirea și dezvoltarea celulei vor determina și declanșarea biosintezei enzimelor. Un rol important în formarea enzimei îl are existența în mediul de cultură a substratului care induce formarea enzimei specifice degradării respectivului substrat. El constituie inductorul operonului enzimei.

Principalele aplicații ale enzimelor utilizate pe scară largă în ultimele 2 decenii sunt prezentate în tabelul 3.5. (Frost și Moss,1985):

Tabelul 3.5.

Aplicațiile enzimelor în diferite industrii

O analiză a pieței comerciale arată că enzimele obținute prin procese fermentative microbiene reprezintă aproximativ 80% din totalul producției de enzime produse astăzi în lume. Dintre celelelte enzime, obținute prin extracție, necesitătile sunt acoperite de următoarele preparate: cheag de vițel, β-amilază din orz, proteinază pancreatică, etc.

Dintre enzimele de fermentatie cea mai mare cantitate o reprezintă proteinazele alcaline bacteriene utilizate în industria detergenților.

În tabelul 3.6 sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se obțin și aplicațiile în industria alimentară.

Tabelul 3.6.

Aplicațiile enzimelor în industria alimentară

3.7. Tehnologia de obținere a preparatelor enzimatice

Schema tehnologică generală de obținere a preparatelor enzimatice este prezentată în figura în figura 3.20.

Din figura 3.20 rezultă că, preparatele enzimatice se pot obținute sub formă de:

preparate enzimatice brute-uscate;

preparate enzimatice brute – lichide concentrate;

preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv și uscate.

Procesele biotehnologice de obținere a preparatelor microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape:

Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică și fizico chimică a materiilor prime ce intră în compoziția mediului de cultură (fermentativ). Această etapă presupune operații de dozare, mărunțire, solubilizare, sterilizare etc.;

Etapa biologică care constă în obținerea culturilor starter intermediare și a culturii de producție, urmată de etapa fermentativă propriu-zisă;

Etapa de separare, purificare și standardizare a enzimelor.

Figura 3.20. Schema tehnologică generală de obținere a preparatelor enzimatice

Pregătirea mediului de cultură

Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultură.

Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienți microorganismelor în vederea dezvoltării lor în timpul fermentației.

Surse de carbon. Principala sursă de carbon (sursă de energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, sub formă de glucoză, fructoză, galactoză care sunt ușor asimilabile, în timp ce maltoză, zaharoza și lactoza sunt asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le transforme în monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în monoglucide capabili să difuzeze prin membrana celulară.

Ca surse de carbon în rețetele mediilor industriale se folosesc următoarele:

Melasele care provin de la rafinarea zahărului.

Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obținut din industria amidonului după ce suferă o concentrare până la 50% S.U.

Leșiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a transformării masei lemnoase în pulpă celulozică sub acțiunea bisulfitului de calciu.

Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol anabolic, participând la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor și acizilor nucleici.

Principalele surse de azot sunt:

azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul de amoniu, fosfatul acid de diamoniu;

azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia, carne etc.

Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea microorganimelor în timpul procesului de fermentație este necesară prezența ionilor anorganici, aceștia reprezintă circa 8% din substanța urcată a celulelor microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie să fie prezenți în mediul de cultură sunt: macronutrienții (azot, fosfor, sulf, potasiu, și magneziu) și micronutrienții (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel și seleniu).

Surse de factori de creștere. Factorii de creștere sunt compuși organici a căror prezență în mediul de cultură este necesară în cantități mici, având un rol catalitic sau structural pentru microorganisme. Factorii de creștere includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide și nucleozide, aminoacizi, acizi grași, steroli și poliamide.

Principalele vitamine necesare ca factori de creștere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina.

Tratamentul termic al mediilor de cultură. Pentru buna desfășurare a procesului de fermentație este necesară cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultură steril pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de cultură se poate realiza direct în bioreactorul în care se realizează fermentația sau într-un vas sub presiune separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.

Figura 3.21. Schema tehnologică generală de obținere a preparatelor microbiene

Etapa biologică

Obținerea culturilor starter de producție

Pentru producerea enzimelor, fermentațiile industriale se desfășoară în volume de 150 – 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate suficientă de inocul. Cultura folosită drept inocul trebuie să fie în faza exponențială de creștere. La microorganismele care au viteză de creștere redusă, se recomandă să se folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata inițieirii fermentației. Cultura starter de producție trebuie să conțină celule active, adaptate la mediul industrial pentru ca fermentația să se declanșeze rapid. În cazul fermentațiilor desfășurate pe mediul solid, pentru care se utilizează inocul sporifer se recomandă să se asigure prin inoculare concentrații de 105-106 spori pe g mediu, iar în cazul celor submerse cultura starter de producție să fie de circa 10% din mediul de cultură.

Etapa de separare a enzimelor

Extracția. La procedeul discontinuu (nealimentat) și cel alimentat, după terminarea fermentației se separă partea solidă insolubilă (celule și produse insolubile) de partea lichidă care conține enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală sau microfiltrare. Soluția sterilă obținută este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în care enzimele sunt destinate a intra în compoziția unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) și/sau săruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaugă bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).

În cazul în care enzima (enzimele) intră în compoziția unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimentează cu un suport și se usucă prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi realizată o filtrare sterilă.

Pentru a obține și enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separată de partea lichidă, este supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albușul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natură bacteriană care conțin chitinază, mananază, -1,6–glucanază, proteaze, câteodată în combinație cu adaosul de metabisulfit.

În cazul în care enzima este periplasmică, un șoc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se poate realiza și o liză mecanică (folosire de presiuni mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală) Se pot folosi și ultrasunetele cu frecvențe mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor și deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate enzimele intracelulare sunt supuse operațiilor aplicate și enzimelor extracelulare.

Preparatele enzimatice se comercializează de regulă sub formă de pulbere, de microgranule, precum și sub formă lichidă.

Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se controlează granulometria, umiditatea ( 6%). Suportul trebuie să nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloașe. În preparatele comerciale pulbere sau lichide, conținutul de enzimă este redus raportat la suport și de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, în comparație cu nivelul de enzimă conținut.

În ceea ce privește preparatele comerciale microgranulate, acestea se obțin dintr-un ultrafiltrat care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.).

Cantitatea de substrat este astfel calculată încât să se obțină titrul enzimatic dorit în microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1% până la 0,5% față de masa suportului. Picăturile pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer la 70 – 90C.

Preparatele comerciale lichide sunt formulate în general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizează în proporție de 20 – 50% față de preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o substanță bacteriostatică (de exemplu benzoat de sodiu în proporție de 0,1 – 0,2%).

3.8. Enzime imobilizate

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncțional) înseamnă legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

să fie insolubil în apă;

să asigure păstrarea proprietăților catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de acțiune;

să asigure acțiunea enzimei la un pH și temperatură optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele:

creșterea stabilității enzimei, ca proteină și ca activitate catalitică. Această stabilitate este în legătură cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecință asupra variațiilor de conformație a enzimei (se diminuează aceste variații). Imobilizarea conduce și la creștere a concentrației locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar și din punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;

enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în cursul catalizei enzimatice;

se poate modula micromediul în care acționează enzima imobilizată (concentrație substrat, încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile);

refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeași cantitate de enzimă se poate transforma o cantitate mai mare de substrat;

se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, putându-se automatiza procesul, ceea ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;

are loc o creștere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat și al concentrației acestuia;

se poate stopa reacția enzimatică la momentul dorit și se evită trecerea enzimei în produsul transformat;

costurile globale de producție sunt mai mici în comparație cu procedeele în care se folosesc enzime libere;

se pot folosi și enzime care nu sunt trecute în liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Există și dezavantaje, cum ar fi:

costuri privind imobilizarea;

pierderi ale activității enzimatice;

o investiție inițială în utilaje mai mare;

un proces mai complex din punct de vedere tehnic și o supraveghere mai atentă;

utilizarea numai a unor substraturi solubile.

În cazul enzimelor imobilizate se observă un comportament cinetic diferit față de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare a imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor conformaționale ale enzimei după imobilizare. O astfel de modificare apare în primul rând în cazul legării covalente a enzimelor de suport.

Un alt aspect este influența mediului, în cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcționale acide

La imobilizare, în funcție de enzimă și catalizator se poate vorbi de:

randament de fixare care reprezintă cantitatea efectivă de enzimă imobilizată în raport cu cantitatea de enzimă introdusă în procesul de imobilizare:

randament de activitate care reprezintă activitatea reziduală a enzimei imobilizate:

Factorii critici care trebuie luați în considerație la folosirea enzimelor imobilizate

Acești factori se referă la:

eficiența economică a imobilizării determinate de: costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare;

activitatea enzimei imobilizate care este influențată de: tehnica de imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă și a produsului (lor) de transformare;

caracteristicile substratului ce trebuie transformat;

stabilitatea enzimei care trebuie menținută activă un timp cât mai îndelungat.

Figura 3.22. Metode de imobilizare a enzimelor

3.9. Metode de imobilizare a enzimelor

a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul legăturilor slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacțiuni proteină – proteină, legături ionice).

Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi:

prin adsorbție pe suporturi organice: amidon, colagen, Sepharoză modificată, polistiren modificat, rășini schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex, carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.);

prin adsorbție pe suporturi minerale: alumină, argilă (bentonită, montmonirolită etc.), ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punți metalice cu TiCl4).

Adsorbția se realizează prin contactul dintre o soluție apoasă de enzimă cu suportul solid și va fi influențată de: pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei, temperatura și durata de contact a enzimei cu suportul.

Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluția de enzimă și suport într-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluției de enzimă într-o coloană în care suportul este menținut sub forma unui pat.

Adsorbția enzimei de suport poate fi îmbunătățită prin atașarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanțuri cu grupări hidrofile.

Adsorbția este influențată de raportul dintre suprafața și volumul suportului, mărimea particulelor, raportul dintre grupările hidrofile și hidrofobe.

Imobilizarea prin adsorbție prezintă următoarele avantajele și dezavantaje:

Avantaje

simplicitate în execuție (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva minute, enzima care rămâne în soluție fiind eliminată prin spălare);

absența reacțiilor chimice (numai dacă nu se formează punți metalice);

posibilitatea de regenerare a complexului enzimă/suport.

Dezavantaje

stabilizare slabă;

riscul de desorbție a enzimei de către: fluxul de substrat, variație lejeră de pH, forța ionică, temperatură prin includere într-un suport, în care caz se pot include și microorganisme. Includerea poate fi făcută în gel, microincapsulare, includere în fibre.

Avantajele și dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin reticularea suportului după imobilizare.

Avantaje

reacțiile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute;

reacțiile chimice dintre suport și enzimă sunt limitate (enzima este inclusă în geluri naturale);

se poate aplica la toate enzimele (chiar și la amestec de enzime);

se pot folosi suporturi cu forme diferite: filme, fibre, bile.

Proprietățile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfăcătoare.

Dezavantaje

anumite polimerizări necesită agenți denaturanți sau radicalici;

se pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă);

riscul de evadare al enzimei prin micropori.

b) Metode chimice de imobilizare, în care caz imobilizarea se face prin intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacții chimice. Se poate realiza imobilizarea și prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv și legarea încrucișat (Cross-linking) sau reticulară intra și intermoleculară a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncțional.

La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi făcută: prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie să se țină seama de gruparea funcțională care poate reacționa cu protein-enzima și de caracteristicile fizico-chimice ale suportului. Adesea este necesar să se creeze, pe cale chimică, funcții reactive pe suport; prin coreticulare utilizând agenți bi- sau polifuncționali. Cel mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.

Avantajele și dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături covalente

Avantaje

stabilitate mărită datorită faptului că legăturile covalente sunt cele mai puternice dintre toate legăturile menționate anterior;

varietatea mare a suporturilor: sticlă, silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc.

Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezența unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecția situsului activ)

Dezavantaje

trebuie realizate reacții chimice, adesea complexe;

etapa de activare a suportului este lungă;

randamentul de fixare este 100%;

există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate);

este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil;

investiția (costul) este importantă.

3.10 Suporturi de imobilizare comerciale

Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt:

polizaharide: agaroză, celuloză și derivați, alginați, carageenani, dextrani;

poliacrilamide utilizate sub formă de bile;

polistiren (bile și tuburi);

silicea și sticla poroasă.

3.11. Condițiile de inocuitate pe care trebuie să le îndeplinească preparatele enzimatice

număr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;

coliformi, maximum 30/g ;

Escherichia coli – absent/ 25 g ;

Salmonella – absent/ 25 g ;

activitate antibiotică de origine microbiană – absentă;

aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T – 2 (zearalenona) în cazul preparatelor de origine microbiană – absente;

metale grele:

arseniu 3 mg/Kg ;

plumb 10 mg/Kg ;

alte metale grele 40 mg/Kg (exprimată la Pb).

Utilizarea microorganismelor pentru a transforma materialele de origine vegetală sau animală în produse alimentare fermentate este cunoscută încă din antichitate.

De atunci biotehnologiile au evoluat și s-au diversificat, la ora actuală fabricându-se un număr mare și diversificat de produse, de la relativ ieftinii solvenți organici și bio-etanol, până la produse costisitoare ca antibiotice, proteine terapeutice, vaccinuri, hormoni, etc.

Bacterii

Bacteriile utilizate în industria alimentară aparțin următoarelor genuri:

Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub formă de coci sferici sau ovali cu 2, grupate în diplo sau formă de lanțuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate. Importanți pentru industria alimentară sunt:

Streptococii mezofili: Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis);

Streptococii termofili: Str. thermophilus.

Acești streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic și prezintă următoarele activități:

activitate fermentativă: fermentează lactoza și glucoza;

activitate proteolitică;

produc diacetil și acetoină din acid citric (în principal Str. diacetilactis).

Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face prin transformarea inițială a acesteia în glucoză și galactoză – 6P prin intermediul fosfo–galactozidazei.

În continuare, glucoza este apoi fermentată pe calea hexozo – difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată pe calea tagatozei în vederea producerii unei cantități suplimentare de acid lactic (figura 4.23.).

Figura 4. 23. Calea tagatozei de degradare a lactozei de către streptococii lactici

Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi făcută pe cale homofermentativă cu producerea în principal de acid lactic și pe cale heterofermentativă, în condițiile în care glucoza este limitată, calea heterofermentativă fiind calea ribulozei – 6P cu formare de acid acetic, etanol și acid lactic (figura 4.24).

Figura 4.24.Calea homo și heterofermentativă de degradare a glucozei de către bacteriile lactice

Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină și 2,3 butilenglicol este arătată în figura 4.25. Același mecanism îl folosesc și leuconostocii.

Figura 4.25. Transformarea citratului de către Str. lactis subsp. diacetilactis și Leuconostoc

Performanța streptococilor (lactococilor) este influențată de mai mulți factori, după cum urmează:

Prezența inhibitorilor. Ca inhibitori din lapte pot acționa: nizina produsă de unele tulpini de Str. lactis; aportul neadecvat de produși de scindare ai proteinelor necesari creșterii; antibioticele din lapte (penicilina) care provin din antibioticele folosite la tratarea unor boli ale vacilor de lapte (de exemplu mastita).

Incompatibilitatea dintre tulpini. Poate să apară o incompatibilitate în culturi ce conțin tulpini diferite. La o cultivare repetată a acestor culturi cu tulpini diferite de streptococi poate să aibă loc reducerea numărului unor tulpini, astfel încât în cultură rămâne tulpina cea mai agresivă. Factorii care determină selectarea sunt:

diferențele în ceea ce privește durata unei generații;

sensibilitatea la acid lactic;

producerea de substanțe bacteriocine de către unele tulpini care sunt factori de inhibare pentru alte tulpini;

diferențe în ceea ce privește temperatura optimă de dezvoltare;

diferența în ceea ce privește viteza de pierdere a unor plasmide.

Avantajul folosirii unei culturi conținând mai multe tulpini de streptococi constă în rezistența diferită la bacteriofagi a diferitelor tulpini din cultură.

Temperatura. Există o diferență de temperatură optimă între specii, de exemplu între Str. lactis și Str. cremoris, ceea ce poate conduce la predominanța uneia față de cealaltă la o anumită temperatură optimă.

Pentru o cultură cu multe specii sau tulpini de streptococi se recomandă o temperatură de incubare de 27C pentru a se minimaliza efectele de dominare a unei specii asupra alteia. Temperatura optimă pentru streptococii lactici este de aproximativ 30C.

pH-ul. Streptococii lactici produc mai mult de 10% acid lactic/min, raportat la greutatea lor. Se consideră că pH-ul are influență mai redusă asupra diferitelor tulpini de streptococi atâta timp cât plasmidele respective nu au fost afectate.

Mediul de creștere. Sunt streptococi care se dezvoltă mai rapid iar alții mai lent. Cei care se dezvoltă lent sunt cei care nu coagulează laptele degresat la temperatura de coagulare de 21-22C în 18 ore. Cei care se dezvoltă rapid sunt cei care coagulează laptele atunci când sunt inoculați în proporție de 1%. Culturile rapide sunt mai proteolitice decât cele lente. Cele două tipuri de culturi (rapide și lente) pot fi diferențiate prin creștere pe medii de cultură diferite.

Formarea de capsule și polizaharide. Streptococii lactici care se dezvoltă în laptele crud pot conduce la formarea unui coagul gros datorită formării de capsule sau de polizaharide. Așa este cazul lui Str. lactis var. hollandicus.

Depozitarea. Atunci când culturile de streptococi se păstrează în prezența acidului lactic pe care l-au produs, streptococii respectivi pot suferi deteriorări, inclusiv pierdere de plasmide, ceea ce va conduce în final la creșterea proporției de celule lente care nu mai pot fi folosite la fermentația lactică a laptelui.

Culturile mature proaspete trebuie păstrate la 2-5C. Cele congelate la -40C sau uscate prin liofilizare pot fi distruse chiar în proporție de 90-95%; cea mai bună păstrare se realizează într-un antigel subrăcit (glicerol, propilenglicol).

Genul Leuconostoc. Acest gen cuprinde bacterii cu formă sferică, lenticulară, grupate în perechi sau lanțuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.

Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamină, biotină) și zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici și nu reduc azotații. Specii de Leuconostoc formează polimeri (dextran). Se dezvoltă bine la 20-30C.

Genul Leuconostoc cuprinde speciile:

Leuconostoc cremoris (citrovorum);

Leuconostoc lactis;

Leuconostoc dextranicum;

Leuconostoc mezenteroides.

Aceste specii sunt heterofermentative și se dezvoltă greu în laptele fără adaos de stimulatori. În produsele lactate, leuconostocii au două funcții de bază: produc compuși de aromă (diacetil, acetoină); produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în unele tipuri de brânzeturi (Edam, Gouda, Tilsit). Ambele funcții sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 și din lactoză. Leuconostocii intervin deci în metabolismul glucidelor și al citratului.

Metabolismul glucidelor. Fermentarea glucidelor de către leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele care codifică etapele inițiale ale fermentării lactozei (ca de altfel și ale metabolizării citratului, producerii de proteaze) sunt localizate în plasmide.

Metabolismul citratului. Metabolismul citratului de către leuconostoci este același ca și la streptococi cu mențiunea că leuconostocii produc diacetil și acetoină la pH scăzut. Acetoina se poate forma pe două căi:

prin decarboxilarea acetolactatului;

din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o reacție care necesită NADH sau NADPH.

În metabolismul glucidelor de către leuconostoci piruvatul este un produs intermediar (ca și la streptococi).

Leuconostocii (ca de altfel și lactobacilii) pot produce la unele brânzeturi unele defecte și anume:

crăparea pastei la brânza Cheddar (defect numit „Blit opennes”);

apariția timpurie de gaze la brânza Gouda.

Aceste defecte se datorează formării de CO2.

În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează și pentru:

fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveți, măsline) intervenind în cadrul microflorei spontane sau sub formă de culturi concentrate;

fermentarea malolactică a vinurilor;

producția de dextran.

Genul Pediococcus – aparține familiei Streptococaceae. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză. Sorbitolul și amidonul nu sunt fermentați. Pediococi nu lichefiază gelatina și nu reduc NaNO3 la NaNO2. Sunt anaerobi – microaerofili și au necesități nutritive complexe. Multe specii sunt catalază-negative.

Principalii reprezentanti importanti pentru industria alimentara sunt P.acidilacti și P. Pentosaceus.

Având în vedere că pediococii produc acid lactic și bacteriocine, ei exercită o acțiune inhibitoare față de microorganismele patogene și cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii).

În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele să fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza și deci uscarea produsului.

Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit.

Genul Lactobacillus – aparține familiei Lactobacillaceae. Aceste bacterii sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. În general sunt catalază – negative citocrom-oxidază – negative, nu reduc azotații, nu lichefiază gelatina. Au activitate proteolitică și lipolitică redusă. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

În funcție de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii pot fi:

termofili: Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, temperatura optimă fiind 37-45C;

mezofili: Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis etc.; temperatura optimă de dezvoltare fiind 26-30C.

Metabolismul lactozei. Pentru a se dezvolta în lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza cu ajutorul -galactozidazei și/sau -D–fosfogalactozid – galactohidrolazei, așa cum este prezentată în figura .

Figura 4.26. Transformarea lactozei în glucoză și galactoză

Metabolismul hexozelor. După hidroliza lactozei în celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea Embden – Meyerhof.

Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată trebuie mai întâi să fie transformată într-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă transformări pe calea Embden – Meyerhof. Rezultatul net al fermentației glucozei pe calea Embden – Meyerhof este formarea a 2 moli ATP/mol glucoză care asigură energia dezvoltării lactobacililor.

Activitatea proteolitică. Deși taxonomic, lactobacilii sunt considerați ca având slaba activitate proteolitică, totuși ei își pot obține azotul necesar dezvoltării din proteine existente în mediul fermentativ. Activitatea proteolitică a lactobacililor contribuie atât la textura cât și la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.) dar și la eliberarea unor aminoacizi care stimulează creșterea și activitatea altor bacterii lactice folosite în culturile starter în amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea endoproteinazică a lactobacililor este asociată cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este localizată intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc hidroliza parțială a macromoleculelor proteice, din care se formează peptide suficient de mici pentru a fi transportate în interiorul celulelor unde se continuă degradarea lor până la aminoacizi, necesari creșterii.

Producerea de compuși de aromă și H2O2. Principala contribuție a lactobacililor este producția de acid lactic. În cazul produselor lactate acide, deși speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative, acestea însă produc și alți metaboliți printre care produși volatili ca acetaldehida, diacetil și alcool în cantitate mai mare fiind produsă acetaldehida. În plus, Lactobacillus casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L. casei nu este însă un producător major de diacetil). Anumiți lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul și jenează dezvoltarea altor microorganisme.

Lactobacilii se utilizează în industria laptelui, a cărnii și în alte scopuri.

În industria laptelui se utilizează Lactobacillus lactis și Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este și el implicat în unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat și a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizează pentru obținerea produsului yakult.

În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus și în special Lactobacillus plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat.

Alte utilizări. Lactobacilii interesează și în fermentarea măslinelor, verzii, castraveților, gogonelelor, în producerea spirtului și drojdiei presate în vederea acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus și genul Staphylococcus

Pentru industria cărnii interesează anumite specii de micrococi și stafilococi care sunt folosite pentru:

capacitatea lor de a reduce azotații la azotiți (contribuie la formarea culorii cărnii sărate în prezență de azotați);

activitatea lor catalazică;

activitatea de acidificare, proteolitică și lipolitică.

Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus aurantiacus și Micrococcus varians.

Pentru industria laptelui, micrococii formează partea principală a populației nelactice din laptele crud și respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de cultură pură în scopul accelerării formării aromei brânzei fabricate din lapte pasteurizat datorită activității proteolitice și lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic și anume Rulactina ce conține o metal-protează cu activitate strict endoproteinazică obținută din Micrococcus caseolyticus.

Din genul Staphylococcus interesează speciile de stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans.

Combinațiile de micrococi și stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazică și catalazică. În aceste combinații, Staphylococcus carnosus acționează mai bine decât micrococii în formarea culorii, reducând azotații la azotiți și respectiv azotiții la oxid de azot, chiar în condiții de aciditate ridicată a substratului. Aroma produselor la care este utilizată cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioară.

Genul Streptomyces – Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producând mirosuri și gusturi dezagreabile, altele (puține la număr) sunt patogene.

Genul Propionibacterium – Bacteriile propionice fermentează carbohidrații, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice „tip lapte” sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum și shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici și jensenii.

4.2. Drojdii

Drojdiile, ciuperci unicelulare care se înmulțesc prin înmugurire, mai rar prin sciziparitate și care formează ascospori (sunt și drojdii care nu fac spori, acestea denumindu-se drojdii false-torule și micoderme) sunt agenți tipici ai fermentației alcoolice.

Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces ellipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lămâi (Saccharomyces apculatus), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de cilindru (Pichia).

La unele specii, ca rezultat al procesului de înmugurire, celulele de înmugurire rămân atașate de celula mamă și, înmugurind la rândul lor, formează un pseudomiceliu, asemănător în structură cu cea a amilopectinei, componentă a amidonului. Desigur, forma drojdiilor este în funcție de vârsta și condițiile de cultură. Pe medii solide, drojdiile formează colonii caracteristice speciei.

Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparținând familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii, vinului și pâinii, genul Kluyveromyces care fermentează lactoza (levuri ale laptelui), genul Debaryomices care se utilizează în industria cărnii. Mai interesează drojdiile aparținând familiei Criptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca agenți de fermentație și ca producători de biomasă.

Cea mai largă utilizare a drojdiilor este cea de a produce fermentație alcoolică. Acestea sunt de fapt drojdiile „adevărate” care aparțin genului Saccharomyces (Meyen) Rees și care se caracterizează prin aceea că nu formează miceliu tipic, produc l-4 spori, iar puterea de fermentare depășește puterea de respirație.

Sunt adaptate la condiții de anaerobioză și, prin urmare, nu formează voaluri la suprafața lichidelor. Acestea sunt de fapt drojdii cultivate, izolate și selecționate prin culturi în scopuri utile-industriale și se deosebesc de cele care și-au păstrat caracterele primitive, fiind cunoscute sub denumirea de drojdii sălbatice.

Drojdiile, după modul lor de comportare în timpul fermentației, pot fi grupate în drojdii de fermentație superioară și drojdii de fermentație inferioară. Cele de fermentație superioară se ridică în cantitate mare la suprafață în spuma care acoperă lichidul de fermentare, au optimul de temperatură la 28 … 30°C și fermentează numai la 1/3 din rafinoză. Drojdiile de fermentație inferioară nu se ridică la suprafață decât în cantitate mică, au optimul de temperatură la 8 … 12°C și fermentează complet rafinoză.

Zaharurile fermentate de drojdii sunt triozele (aldehida glicerică și dioxiacetona), aldohexozele (D-glucoza, D-manoza și D-galactoza), cetohexozele (D-fructoza). Di- și trizaharidele sunt fermentate în măsura în care drojdiile respective conțin enzimele necesare transformării acestora în zaharuri simple. Poliglucidele nu sunt transformate de drojdii. Excepție fac Saccharomyces fragilis care fermentează inulina și Endomycopsis fbuligerea care fermentează amidonul.

Fermentația alcoolică produsă de drojdii este influențată de concentrația zaharului fermentescibil în must sau plămadă, temperatură, conținutul în alcool și felul drojdiei. Concentrația favorabilă de zahăr fermentescibil în must sau plămadă este de 10-15%. Fermentația alcoolică se desfășoară bine la pH = 4-4,5, în mediu alcalin sensul fermentației fiind schimbat. Viteza maximă a fermentației este la 30°C, dar în practică aceasta se realizează la temperaturi cuprinse între 4 și 28°C.

Alcoolul, pe măsura acumulării în mediu, devine toxic pentru drojdii. Există specii de drojdii care se dezvoltă la 16-18% alcool, însă în cele mai multe cazuri fermentația se oprește la 12-14% alcool. O dată cu creșterea temperaturii de fermentare se mărește toxicitatea alcoolului. Fermentația alcoolică este un proces anaerob. Dacă drojdiile se cultivă în aerobioză pe substraturi adecvate, ele se înmulțesc foarte mult și deci produc biomasă.

Fermentația alcoolică nu este o fermentație absolut pură. Chiar în cazul unei fermentații alcoolice normale, în afară de alcoolul etilic iau naștere glicerina (produs secundar predominant care se formează din ~ 8% din totalul zaharurilor existente in mediu), acid lactic, acid acetic, substanțe acetoinice (acetil metil carbinol = acetoină și diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizi rezultați la degradarea substanțelor proteice din plămezi și musturi. Acești alcooli superiori se formează prin reacții de dezaminare și decarboxilare ale aminoacizilor leucină, izoleucină și valină.

De remarcat că în funcție de modul de dirijare al fermentației alcoolice, (pH, substanțe adăugate), fermentația alcoolică poate fi deviată substanțial de la cursul „normal”. De exemplu, în prezență de acid sulfuros sau bisulfit se produce multă glicerina. Același lucru se întâmplă dacă pH-ul este alcalin. Fermentația alcoolică se aplică în mod deosebit la fabricarea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secară), produse care conțin zaharoză (sfeclă, melasă), lactoza (zer), glucoza (hidrolizate celulozice, leșii sulfitice). Fermentația alcoolică stă la baza fabricării vinului și berii.

Drojdiile sunt folosite pentru obținerea de biomasă (inclusiv drojdia de panificație), pentru producere de glicerina, grăsimi, băuturi fermentate lactate și pe bază de cereale și leguminoase, cât și pentru producția unor enzime (lactază, invertază).

Dintre drojdii, în industria cărnii se folosește Debaromyces hansenii care este tolerantă la clorură de sodiu, nu reduce azotatul și necesită oxigen atmosferic pentru multiplicare. Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamului neafumat sau puțin afumat. Are capacitatea de a consuma oxigenul din pastă și de a distruge peroxizii formați de unele bacterii lactice.

În cazul brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă rapid la suprafața brânzeturilor și în interiorul brânzeturilor cu pastă moale sau cu mucegai în pastă, în timpul presării, zvântării și maturării, având următoarele acțiuni pozitive:

consumă lactatul și în acest fel contribuie la neutralizarea pastei, îmbunătățind prin aceasta consistența și favorizând implantarea bacteriilor;

produc factori de creștere pentru dezvoltarea bacteriilor;

produc o „acoperire” la anumite tipuri de brânzeturi (Roquefort);

produc proteoliză și lipoliză și prin urmare contribuie la consistența și aroma brânzei;

produc compuși volatili de aromă.

Dintre drojdii, Candida kansei a fost cultivată în asociație cu lactobacili și Str. thermophilus, favorizând prin oxidarea lactatului scăderea potențialului de oxidoreducere și producerea de factori de creștere, dezvoltarea culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida lipolitică este uneori folosită la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele conținute realizează o hidroliză a grăsimilor din brânză, fapt ce favorizează utilizarea acestora de către Penicillium.

4.3. Mucegaiurile

Mucegaiurile sunt cuprinse în patru clase mari din care, pentru industria alimentară, interesează Phycomycetes. Din clasa Phycomycetes, interesează (în sens pozitiv), genurile Mucor și Rhizopus, aparținând familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se întâlnesc pe diferite produse vegetale și alimentare, sub formă de colonii pufoase, au o acțiune fermentativă netă. În afară de faptul că unele specii de Mucor și Rhizopus se folosesc la obținerea unor produse alimentare fermentate, mucegaiurile aparținând acestor genuri sunt surse importante de enzime, în principal, amilolitice și proteolitice.

Din clasa Ascomycetes genurile Aspergillus și Penicillium. Dacă mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează mai puțin la fabricarea unor produse alimentare (de exemplu șuncă S.U.A. și Spania), obținerea de produse fermentate tradiționale din Orientul îndepărtat, aceste mucegaiuri au o largă utilizare în obținerea de preparate enzimate amilazice, proteazice, pectolitice. Mucegaiurile din genul Penicillium sunt mult utilizate în industria laptelui (brînzeturilor), cărnii (salamurilor crude), dar și ca surse de enzime amilolitice, proteolitice și pectolitice.

Genul Mucor cuprinde specii cu aparatul vegetativ dintr-o singură celulă puternic ramificată, cu numeroase nuclee. Majoritatea speciilor sunt saprofite, preferând însă medii ușor acide, bogate în zahăr. Se înmulțesc pe două căi: asexuat și sexuat. În primul caz sporii se formează în sporangi rotunzi sau piriformi lipsiți de apofize, aflați la extremitatea unor prelungiri simple sau ramificate numite sporangiofori.

Genul Rhizopus se deosebește de Mucor prin faptul că sporangioforii simpli – neramificați, pornesc mai mulți din același loc iar sporangii au apofize.

Genul Aspergillus cuprinde specii pluricelulare care produc pe suprafața substraturilor pâsle colorate. Speciile acestui gen au conidiofori unicelulari cu extremitatea aproape sferică, pe suprafața cărora se află prelungiri – sterigme ce produc șiraguri de conidii.

Genul Penicillium se deosebește de Aspergillus prin conidiofori pluricelulari ramificați în formă de penson.

În industria cărnii, culturile starter de spori de mucegai se utilizează la maturarea unor tipuri de șuncă și a unor tipuri de salamuri crude fabricate în România, Italia, Ungaria, Elveția, Spania, Franța, Bulgaria, Austria, Belgia, R.F.G. (și mai puțin în S.U.A., Israel, Iugoslavia, Polonia). În cazul salamurilor crude afumate sau neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la reglarea eliminării apei din produs și a schimbului de gaze, la formarea aromei și la aspectul comercial al produsului. Aroma este, în general, mai evidentă la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau după „periere”. Culoarea miceliului rămas este dependentă de varietatea mucegaiului folosit, în Italia se preferă o culoare alb-ivoar, în Ungaria o culoare gri, în România o culoare alb-mat. Prin utilizarea culturilor starter de spori de mucegai, se suprimă apariția pe salamuri a mucegaiurilor toxicogene , precum și a mucegaiurilor de „pătare” (care produc spoturi de culoare verde sau neagră), în special a mucegaiului Penicillium stoloniferum .

Penicillium nalgiovensis

Tulpina selecționată de Penicillium nalgiovensis este cea mai frecvent utilizată pentru însămânțarea de suprafață a salamurilor crude, deoarece acoperă în mod uniform si rapid produsul cu miceliu de culoare albă din care se dezvoltă conidiofori purtători de conidii (spori). Acoperirea cu miceliu a produsului are loc după 3-4 zile de la însămânțare cu spori, iar corpii de fructificație cu conidii apar după 5-6 zile de la însămânțare. Temperatura optimă de dezvoltare a acestui mucegai este de 22 … 23°C.

Penicillium expansum

Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22°C, umiditatea relativă pentru sporulare fiind de 82%, pentru germinare 88%, iar pentru dezvoltare 92-95%. După însămânțarea batoanelor cu spori, produsul depozitat în încăperi cu ~ 90% umiditate se acoperă cu un strat compact și pufos de miceliu, după aproximativ 8 zile; maturizarea deplină a mucegaiului (produs gata pentru periere) are loc după 30 zile de la însămânțare. Penicillium expansum nu produce micotoxine, dacă substratul conține proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).

În industria laptelui culturile fungice sunt necesare atât în fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă cât și cu mucegai la suprafață. Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (brânza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost etc.) se utilizează tulpini de Penicillium roqueforti. Pentru brânza de tip Camembert, cu mucegai la suprafață, se folosesc două specii de Penicillium: P. camemberti și P. caseicolum. Aceste mucegaiuri au un rol fundamental în formarea aromei, consistenței și aspectului brânzeturilor respective, prin procesele de proteoliză și lipoliză pe care le realizează.

Penicillium Roqueforti Thom

Acest mucegai crește în colonii cu aspect pufos, catifelat, azonate, în general subțiri, cu conidiofori scurți și abundenți, cu marginea cu aspect arhnoid, stelat sau ca o rețea. Conidiile sunt lungi, de culoare galben-verzui închis, adesea verzui, până aproape de negru pe spatele coloniei. Tolerează cantități mari de NaCl (5-8%) în mediu acid și se poate dezvolta într-o atmosferă conținând doar 5% oxigen. Se dezvoltă bine la temperaturi de 20 … 25°C (dar nu și la temperaturi > 35°C), pe medii cu umiditate ridicată. Dezvoltarea abundentă a miceliului are loc la pH = 4,5-7,5.

Mucegaiul poate folosi sulfatul de amoniu ca singura sursă de azot. Nu utilizează aminoacizii leucină, cisteină și metionină. Produce enzime proteolitice și lipolitice, substratul având o deosebită influență asupra activității enzimatice. Prin cultivarea pe medii îmbogățite în grăsime se obține o cultură cu puternică activitate proteolitică și lipolitică, acizii grași eliberați fiind transformați în compuși carbonilici și în special metilcetonele rezultate prin β-oxidarea acizilor grași. Datorită echipamentului enzimatic proteolitic, conținutul în aminoacizi liberi din brânzeturi crește simțitor.

P. roqueforti se dezvoltă în canalele și golurile practicate în pasta brânzeturilor moi, producând spori de culoare verde-închis și astfel conferă brânzei respective aspect marmorat.

Cercetările efectuate la Universitatea din Wisconsin, asupra toxinogenezei lui Penicillium roqueforti, au pus în evidență faptul că acest mucegai produce PR-toxina, nocivă pentru șobolani la care induce modificări histologice la nivelul ficatului, rinichiului precum și hemoragii, fenomene tremorgene, avorturi și retenția placentei la mamifere.

Pe lingă PR-toxină, în miceliul de Penicilliiim roqueforti, s-au pus în evidență și doi alcaloizi asemănători cu cei produși de către ergot: roquefortina și izofumigaclavina. Acești doi alcaloizi au fost puși în evidență și în brînzeturile fabricate cu Penicillium roqueforti, în proporție de 0,66-6,8 mg/kg produs. Ambele substanțe posedă acțiune neurotoxică. Roquefortina are DL50 = 15—20 mg/kilocorp la șoareci (administrare prin injectare intraperitoneală).

Penicillium Camemberti și Penicillium caseicolum

Aceste două specii de mucegai sunt strâns înrudite și sunt utilizate în producția brânzeturilor de tip Camembert, incluzând Camembert, Brie, Neufchâtel, Coulommier, Garre de l'Est, Olivet.

Tulpinile au fost izolate de pe brânzeturi sau din camerele (pivnițele) de maturare a brânzeturilor.

Deși strâns înrudite, cele două specii P. camemberti Thom și P. caseicolum Bainer se deosebesc între ele prin caracteristicile fiziologice și biochimice.

Penicillium camemberti Thom denumit și Penicillium album se utilizează pentru obținerea de brânză tip Camembert cu textură mai untoasă, mai parfumată, dar de culoare gri-alburie.

Penicillium caseicolum Bainer, denumit și Penicillium candidum, se utilizează pentru obținerea de brânză tip Camembert cu o textură mai compactă, aromă mai delicată și o culoare alb-imaculată.

Definiție, rol și importanță pentru industria alimentară

Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obțin plecând de la o cultură pură stoc și care prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producția unor alimente fermentate.

Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme.

Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în vederea: dirijării unor procese biochimice prin care se asigură produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv capacitatea de conservare); asigurării unor însușiri senzoriale; asigurării, în unele cazuri, și a unor însușiri nutritive.

asigurarea inocuitate produsului alimentar, datorită:

acizilor organici (și în special acidului lactic) acumulați în mediu;

substanțelor antibiotice și bacteriocine;

competiției bacteriilor lactice cu microorganismele patogene și cele de alterare în ceea ce privește consumul de substanțe nutritive;

inhibării producției de amine biogene;

inhibării producției de nitrozamine.

Deosebit de importantă este asigurarea inocuității microbiologice a produselor alimentare la care s-au folosit culturi starter de bacterii lactice. Alături de materiile prime și auxiliare de calitate ireproșabilă sau igiena producției și personalului, prin folosirea de culturi starter de bacterii lactice se asigură o dominare numerică a acestora față de microflora naturală (spontană), inclusiv cea patogenă (salmonele, stafilococi, clostridii), care este împiedicată în dezvoltarea ei datorită unui sistem antagonic complex.

Sistemul antagonic include acizi organici (în special lactic și acetic), antibiotice, peroxizi și metaboliți, nefiind exclusă nici competitivitatea dintre bacteriile lactice pe de o parte și cele de alterare și patogene, pe de altă parte, pentru substanțele nutritive esențiale din mediul în care se dezvoltă (produsul alimentar).

Acidificarea mediului este intensă și rapidă mai ales în cazul în care substratul conține un glucid ușor fermentescibil (lactoza în cazul bacteriilor lactice tipice), datorită acumulării de acid lactic. În funcție de tipul microflorei lactice, se pot acumula și alți acizi organici, în special acid acetic. Prin acumularea de acizi organici, pH-ul mediului (produsului alimentar) scade sub valoarea optimă de dezvoltare a bacteriilor de alterare și a celor patogene.

acțiunea față de stafilococi si salmonele. În preparatele de carne care au suferit un tratament termic necorespunzător (substerilizare), în cîrnații și salamurile crude semiuscate (aw > 0,92) sau în salamurile uscate (aw < 0,92), se poate dezvolta Staphylococcus aureus care elaborează enterotoxină, stabilă la căldură. In general, stafilococii proliferează și produc enterotoxină în primele stadii ale fermentației salamurilor și cârnaților cruzi, mai ales în stratul periferic.

Inhibarea dezvoltării stafilococilor este mărită dacă raportul bacterii lactice/stafilococi este mare și dacă temperatura de fermentare-maturare este mai scăzută. S-a demonstrat experimental că, în prezență de cultură starter de bacterii lactice, numărul de stafilococi coagulazo-pozitivi din salamurile fermentate la 22…24°C este mai redus iar producerea de enterotoxină este inhibată și aceasta din cauză că, inoculum de bacterii lactice (pediococi și lactobacili) va controla fermentația, va accelera formarea de acid lactic și astfel, indirect, va întârzia dezvoltarea stafilococilor.

Prezența salmonelelor în cârnații și salamurile crude este mai rară. Bacteriile lactice componente ale culturilor starter au acțiune inhibitoare față de salmonele, efectul inhibitor fiind dependent de specie, sușă, raportul bacterii lactice/salmonele, temperatura de fermentare, intensitatea și viteza acumulării acidului lactic.

Stafilococii și salmonelele pot fi prezente și în diverse produse lactate (produse lactate acide, smântână, brânză proaspătă de vaci, unt, brânzeturi fermentate cu pastă opărită sau neopărită, brânză telemea, înghețată, lapte praf). La produsele lactate la care se folosesc culturi starter de bacterii lactice, s-a dovedit că există un antagonism evident între acestea, pe de o parte, și stafilococi-salmonele, pe de altă parte în cazul culturilor starter de streptococi s-a dovedit că acțiunea de inhibare nu este direct corelată cu viteza de acumulare a acidului lactic .

În ceea ce privește formarea de toxine botulinice de către CI. botulinum tip A, B, E, F (toxine care sunt labile la căldură și care se deosebesc între ele prin faptul că sunt neutralizate specific de către anticorpii omologi), aceasta este dependentă de condițiile în care se dezvoltă microorganismul: potențial redox, pH, activitatea apei; concentrația NaCl și azotit, temperatură. Experimental, s-a dovedit că prin folosirea culturilor starter de bacterii lactice, în prezența unui glucid fermentescibil adecvat (glucoza, zaharoza) se inhibă în mare măsură formarea de toxină botulinică. Dacă este prezent și azotitul în concentrație de 50-150 mg/kg, acțiunea de inhibare a formării toxinei este totală în cârnații cruzi fermentați-maturați la 27°C.

În cazul produselor vegetale murate (fermentate lactic), incidența formării toxinei botulinice este extrem de rară, din cauza rapidei dezvoltări a bacteriilor producătoare de acid lactic, bacterii care au o bună toleranță la concentrații mai mari de NaCl (2-8%) și acid lactic. Ca rezultat al respirației țesuturilor vegetale supuse murării și a dezvoltării bacteriilor se creează un mediu anaerob și prin urmare competiția între bacteriile producătoare de toxine și cele producătoare de acizi este câștigată de acestea din urmă, care sunt tolerante la pH scăzut și concentrație mare de NaCl. În produsele vegetale murate, dezvoltarea lui CI. botulinum și producerea de toxină este inhibată la un pH < 4,6 și la concentrațiile de NaCl existente în produs. La conservarea prin murare a produselor vegetale trebuie să se aibă însă în vedere că anumiți compuși pot acționa favorabil sau defavorabil asupra bacteriilor lactice. De exemplu, în varză există substanțe care inhibă dezvoltarea bacteriilor gram-negative dăunătoare, dar nu și pe cele lactice. Măslinele verzi tratate necorespunzător cu alcalii sau prin șoc termic, înainte de a fi saramurate, pot avea substanțe inhibitoare față de bacteriile lactice.

Având în vedere că produsele vegetale conțin azotați, aceștia sunt transformați în azotiți, în timpul fermentației lactice, care inhibă dezvoltarea microorganismelor formatoare de spori în produsele vegetale fermentate lactic. O contribuție însemnată la capacitatea de conservare a produselor alimentare la care s-au folosit culturi starter o are și peroxidul de hidrogen (H2O2) care este bacteriostatic și bactericid, eficace în special față de microorganismele ce nu secretă catalază.

În acest context sunt mai sensibile la H2O2 bacteriile gram-negative (salmonele, bacteriile coliforme) în comparație cu cele gram-pozitive (stafilococi, clostridii). Peroxidul de hidrogen poate fi eficace prin el însăși sau datorită formării unor compuși inhibitori cu unele componente din produsul alimentar. De exemplu, în laptele crud, peroxidul de hidrogen reacționează cu tiocianatul și peroxidaza și formează o serie de compuși care au acțiune inhibitoare față de microorganismele de alterare

Având în vedere că anumite culturi starter pot forma H2O2 în condiții de refrigerare fără a se dezvolta numeric și fără a produce acid lactic, s-a ajuns la concluzia că aceste culturi starter pot fi utilizate pentru inhibarea microorganismelor psihrotrope în produsele alimentare depozitate în condiții de refrigerare.

Astfel, se cunoaște că aproape 90% din bacteriile psihrotrope care alterează carnea sunt gram-negative, grupul cel mai important constituindu-l Pseudomonas – Achromobacter, atât pentru carnea proaspătă cât și pentru cea refrigerată. S-a constatat că prin utilizarea unei culturi starter de Streptococus lactic și Leuconostoc citrovorum în proporție de 10% față de masa cărnii de vită tocată se împiedică dezvoltarea microorganismelor aerobe, fără a se ajunge la modificări de pH. De asemenea, prin folosirea de culturi starter de L. bulgaricus, L. lactis și Pediococcus cerevisiae în carnea mărunțită la nivel de 5 x 108 celule/g carne tocată și păstrată în condiții de refrigerare, s-a ajuns la o inhibare a bacteriilor psihrotrope, inhibare pusă pe seama H2O2.

Cercetările au demonstrat că culturile starter lactice pot fi folosite și ca microfloră de suplimentare în alimentația animalelor tinere (viței, purcei) și aceasta pe motivul că la viței și purcei lactobacilii și streptococii joacă un rol important în digestia glucidelor, în special a lactozei, care este transformată în acid lactic ce joacă un dublu rol:

aciditatea lactică favorizează acțiunea pepsinei ce provoacă coagularea cazeinei laptelui, care în continuare este atacată de tripsină ce eliberează aminoacizii;

aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microorganismelor cu putere patogenă, cum ar fi E. coli care se dezvoltă în mediu alcalin sau ușor acid.

Prin schimbarea habitatului și datorită tratamentelor fizice, psihice, transportului sau înlocuirii laptelui matern cu lapte simulat, se modifică flora lactică la viței și purcei. Acest lucru se realizează și prin tratament cu antibiotice. Datorită pierderii florei lactice, vițeii și purceii pot căpăta diferite afecțiuni digestive care pot produce mortalitate de 3-10%. În condițiile în care vițeii și purceii nu sunt alăptați normal, alimentele de alăptare pot fi suplimentate cu culturi starter care trebuie să aibă o concentrație mare de germeni viabili în condiții normale de depozitare ale alimentelor de alăptare. Se utilizează culturi starter de Str. lactis, Str. thermophilus, L. helveticus. L. acidophilus, îmbogățite cu aminoacizi și vitamine din grupul B.

Producerea de antibiotice și bacteriocine

Anumiți streptococi lactici și lactobacili produc antibiotice în mediul în care se dezvoltă. De exemplu, Str. cremoris produce diplococcină strâns asociată de celulele respective, antibiotic care este inhibitor față de Staphylococcus aureus dar nu și față de Eschcrichia coli.

Streptococcus lactis produce nizină, stabilă la căldură și la pH acid, care are acțiune inhibitoare față de bacteriile gram-pozitive. Nizina nu stopează germinarea sporilor, dar inhibă dezvoltarea sporilor germinați. Lactobacillus plantarum produce lactolină, iar Lactobacillus brevis produce lactobrevină. Specii de Lactobacillus acidophilus produc lactocidină, acidofilină și acidolină. Acidofilina produsă în timpul dezvoltării lactobacililor în lapte este stabilă la căldură și pH acid. Acidolină produsă în aceleași condiții are acțiune față de bacteriile gram-pozitive și negative.

Anumite specii de microorganisme produc bacteriocine care nu sunt clasificate ca antibiotice dar care au acțiune antibiotică. De exemplu, L. cremoris produce diacetil prin fermentarea citratului, care exercită acțiune inhibitoare față de bacteriile patogene și cele de alterare. Având în vedere concentrația relativ redusă a diacetilului în produsele alimentare, nu se poate vorbi de o acțiune inhibitoare a acestuia față de grupele de microorganisme menționate. Efectul inhibitor al diacetilului este evident numai la o concentrație a acestuia de 170 mg/kg, ceea ce ar însemna folosirea diacetilului ca aditiv de conservare, fapt ce nu este permis de legislația sanitară în vigoare, el fiind socotit un aditiv de aromatizare.

Producerea de amine biogene

Dintre aminele biogene din produsele fermentate interesează în mod deosebit histamina și tiramina, care se formează în cantități mai mari datorită acțiunii histidin și tirozin-decarboxilazelor produse de microorganisme (bacterii și drojdii). S-a dovedit că în metabolismul normal al omului, tiramina este oxidată rapid de monoamina-acid-oxidaza (MAO), dar la persoanele tratate cu inhibitori MAO, tiramina se acumulează și exercită un efect vasotonic puternic. Printr-un mecanism diferit și histidina acționează ca un vasopresor, în prezența inhibitorilor MAO.

În produsele de carne fermentate au fost găsite cantități relativ mari de tiramina și histamina și cantități mai mici de feniletilamină, triptamină, cadaverină, putresceină, în funcție de durata fermentării. Produsele fermentate natural au un conținut între 184 și 534 mg tiramină/kg produs. Activitatea tirozin-decarboxilazică a microflorei naturale crește paralel cu creșterea acidității produsului, fiind un mecanism de protecție al bacteriilor față de acidificarea mediului. Microflora spontană are activitate decarboxilazică mai mare, fiind adaptată la temperaturi mai ridicate, la o activitate a apei aw mai redusă și la o concentrație de NaCl mai mare. Tirozindecarboxilaza din produsele de carne fermentate s-a dovedit a fi indusă în prezența tirozinei disponibile. Prin folosirea de culturi starter de Lactobacillus și Pediococcus, se împiedică dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică (punerea în libertate de tirozină) și decarboxilazică și deci se împiedică formarea unor cantități mari de tiramina. (același lucru se poate spune și despre acumularea celorlalte amine biogene.) Și în cazul altor produse alimentare se înregistrează nivele mai scăzute de amine biogene dacă s-au folosit culturi starter.

În literatură sunt indicate următoarele nivele de tiramina:

0-2,17 g/g în brânza fermentată;

6-11 g/ml în bere;

0,2-12 g /ml în vin;

95-304 g/g în extract de drojdie;

0,9-13 mg/100 g în varză tocată și murată.

Inhibarea producerii de nitrozamine

În cazul cărnii, azotitul se adaugă pentru formarea culorii cărnii sărate destinată preparatelor din carne, semiconservelor și salamurilor crude și pentru proprietățile sale antimicrobiene. Azotitul rezidual poate însă reacționa cu aminele secundare, conducând la formarea de nitrozamine care au acțiune cancerigenă. Prin reducerea cantității de azotit rezidual se diminuează producția de nitrozamine în produsele din carne dar, în același timp, se reduce și capacitatea acestuia de a inhiba dezvoltarea lui CI. botulinum și de formare a toxinei botulinice. Bacteriile lactice, având la dispoziție un substrat fermentescibil, sunt agenți eficace antibotulinici, deoarece produc acid lactic și deci scad pH-ul sub valoarea optimă de dezvoltare a lui CI. botulinum, deci asigură stabilitatea produselor chiar în prezența unei cantități mai mici de azotit rezidual. Realizarea unui pH scăzut și existența unui nivel de azotit rezidual de asemenea scăzut fac să scadă producția de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun frigerii și coacerii (tabelul 4.8).

Tabelul 4.8.

Conținutul de nitrozamine în bacon după 25 zile de păstrare la 4°C

Produsele vegetale conțin azotați și azotiți și anumite bacterii lactice, incluzând sușe de L.plantarum care pot reduce azotații la azotiți. În această direcție, s-a găsit că azotitul din varza murată crește de la un nivel inițial foarte redus până la 108 mg/kg, după 5 zile de fermentare, după care se reduce aproape de nivelul inițial. Din această cauză, în produsele vegetale fermentate lactic nu s-au pus în evidență nitrozamine, chiar dacă unul din partenerii de reacție este prezent (aminele). La produsele vegetale fermentate, datorită pH-ului scăzut, azotitul rezidual este adus la nivele nepericuloase din punct de vedere al formării nitrozaminelor.

Condiții de utilizare a culturilor starter în industria alimentară

La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se aibă în vedere următoarele:

să conțină un anumit număr de microorganisme viabile (g/ml) și un număr cât mai redus de germeni nedoriți;

produșii metabolici, primari și secundari, să nu prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor;

să nu conțină și să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la oameni;

să aibă o anumită (anumite) activități specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc;

microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele științific întreg;

speciile (sușele) noi care se introduc în producție, trebuie să fie înregistrate la MS și să fie depozitate în colecții cu nomenclator; înainte de utilizare în producție să fie testate din punct de vedere al inocuității în conformitate cu legislația în vigoare;

sușele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de către institute specializate, în ceea ce privește puritatea lor;

speciile, care pe baza noilor cunoștințe științifice au fost recunoscute ca având potențial patogen sau toxicogen, trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare sușă, realizându-se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate și mutagenitate.

Toate cele menționate trebuie să se constituie ca o obligativitate absolută deoarece:

culturile starter se pot consuma în stare vie, odată cu produsul alimentar, așa cum este cazul produselor lactate acide, brânzeturilor, salamurilor și cârnaților cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varză murată, castraveți murați, gogonele murate, măsline verzi;

culturile starter se pot consuma după distrugerea lor, rămânând în produsul alimentar atât ele cât și produșii lor de metabolism, așa cum este cazul brânzei proaspete de vaci și a iaurtului care au fost pasteurizate, brânzeturilor topite, produselor de panificație etc.;

produșii de metabolism ai culturilor starter se consumă odată cu produsele alimentare, însă microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, așa cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oțetului, acidului citric, acidului lactic etc.

Culturi starter de bacterii lactice

Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite domenii: industria laptelui, cărnii, produselor vegetale murate, industria vinului, industria panificației, industria sucurilor de fructe și legume fermentate etc.

Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură produselor alimentare în care se introduc un anumit grad de inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece bacteriile lactice produc:

acizi organici, în principal acid lactic, dar și acid acetic, alcool, CO2;

substanțe bacteriocine eliberate în mediul de cultură;

peroxizi organici (H2O2).

În plus, bacteriile lactice intră în competiție cu microorganismele patogene și cele de alterare în ceea ce privește consumul de substanțe nutritive, iar datorită și acidifierii mediului, consecință a acumulării acizilor organici, bacteriile patogene și de alterare sunt inhibate în dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.

Datorită acidității se inhibă și dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică și decarboxilazică, deci se formează cantități mai reduse de amine biogene, iar în cazul cărnurilor sărate în prezență de azotiți, datorită acidității se favorizează descompunerea mai completă a azotiților, deci scade producția de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii și prăjirii.

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub formă de produse lactate dietetice acide sunt benefice pentru sănătatea oamenilor deoarece:

aciditatea lactică favorizează acțiunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea cazeinei laptelui care este în continuare degradată de tripsina pancreatică;

aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei cu activitate patogenă și favorizează implantarea bifidobacteriilor cu consecințe pozitive pentru organismul uman.

În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac următoarele precizări:

bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative;

bacteriocinele sunt proteine și activitatea lor dispare prin hidroliza lor de către proteaze;

bacteriocinele au acțiune bactericidă, dar nizina este și bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;

bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai mare parte; o mică parte rămân în celulele bacteriene;

bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura speciilor și sușelor producătoare, modalitățile de producere și natura lor chimică;

bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecție au un spectru de acțiune relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe sușe ale aceleiași specii.

bacteriocinele sunt sensibile la acțiunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă că ingerarea de produse ce conțin bacteriocine nu modifică microbiota tractului intestinal și nu va conduce la riscuri în ceea ce privește folosirea de antibiotice comune;

bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă în laptele pasteurizat la 63C/30s minimum sau la 72C/15s;

rezistența lor termică se datorează structurii moleculare simple;

bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce înseamnă că sunt adaptate la condițiile de mediu ale bacteriilor producătoare;

eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate este limitată de condițiile de conducere a fermentației (temperatură, pH, aw)

Laptele – mediu de cultură pentru dezvoltarea microorganismelor

În ceea ce privește mediul de cultură „laptele”, se menționează faptul că, acesta nu este un mediu ideal pentru dezvoltarea bacteriilor lactice din două motive:

laptele crud nu are un conținut optim de substanțe nutritive azotate, vitamine și alți factori de creștere, indispensabili bacteriilor lactice .

există diferențe genetice între specii și sușe în ceea ce privește utilizarea lactozei și galactozei. Astfel, culturile starter de iaurt (Lactobacillus bulgaricus și Str.thermophilus) produc mai rapid acid lactic, dacă lactoza a fost în prealabil hidrolizată cu β-galactozidază. Din lapte, Lb.bulgaricus folosește numai glucoza.

de asemenea, azotul neproteic din lapte nu este satisfăcător cantitativ pentru bacteriile lactice care trebuie să posede activitate proteolitică pentru a hidroliza proteinele în scopul eliberării aminoacizilor necesari pentru nutriția azotată. În această direcție există diferențe între specii și tulpini. Tulpinile lente utilizează azotul neproteic, dar se dezvoltă greu. Tulpinile rapide, utilizează peptidele hidrolizate de ele, deoarece posedă echipament proteolitic puternic. În fapt, diferențele dintre tulpinile lente și rapide, constau în absența și, respective prezența unor plasmide care conțin gene ce codifică sinteza de peptihidroloze (proteinaze și peptidase). Tulpinile lente au pierdut aceste plasmide când celulele s-au divizat în cursul dezvoltării, iar cele rapide le-au păstrat. Această situație poate apărea și în cazul utilizării lactozei.

tipul de proteină din lapte, are influență, de asemenea, asupra dezvoltării bacteriilor lactice. Astfel, Lb. bulgaricus utilizează preferențial β-cazeina ca sursă de azot, în timp ce leuconostocii prefera azotul dintru-un extract de drojdie.

tipul de aminoacizi folosiți este diferit în funcție de specie. Streptococii folosesc valina, glicina, histidina, izoleucina, în timp ce leuconostocii preferă valina și glutamatul. În general, laptele conține 20% din totalul aminoacizilor și peptidelor necesare dezvoltării optime a leuconostocilor și streptococilor.

adaosul de substanțe stimulatoare sub formă de extract de drojdie, extract din pancreas, sirop de porumb, suc de tomate, are drept scop îmbogățirea mediului de cultură, laptele, cu factori stimulatori: aminoacizi, vitamine, substanțe minerale sau enzime proteolitice necesare hidrolizei inițiale a proteinelor din lapte.

în cazul bacteriilor lactice de aromatizare este necesară prezența în mediul de cultură a citratului și a ionilor de Mg2+ și Mn2+.

laptele crud conține o serie de inhibitori naturali, cum ar fi lactotransferina, care exercită actiune bacteriostatică asupra tulpinilor care necesită prezența fierului în mediul de reacție, lactoperoxidaza care manifestă actiune bacteriostatică fața de strptococi, lizozimul care are acțiune bactericidă fața de toate bateriile lactice.

Tipuri de culturi starter utilizate în industria laptelui

La obținerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în mod deosebit următoarele:

mediul de cultură (laptele);

tratamentul termic aplicat laptelui;

condițiile de incubare;

interacțiunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;

eventualele infectări cu bacteriofagi;

instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.

De la început, facem precizarea că prin cultură starter înțelegem culturile obținute din cultura pură stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smântână, unt, brânzeturi.

Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria laptelui pot fi clasificate în mezofile și termofile.

Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi clasificate în:

Culturi starter singulare (single strain starter) care conțin numai Str. lactis subsp. lactis și respectiv Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis și Lactococcus cremoris) ambii homofermentativi care produc acid lactic (L+) în proporție de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a apărut ca o necesitate de a se evita formarea “ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” formate în urma producerii de CO2 de către bacteriile aromatizante.

Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele avantaje:

se poate utiliza continuu aceeași cultură cu activitate relativ constantă și previzibilă;

nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-se riscul deprecierii acestora de către fagi;

se folosesc cantități mai mici de inoculum pentru obținerea de cultură primară și secundară;

influențele compoziționale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;

se creează condiții de realizare a unei producții standardizate de produse lactate de calitate superioară;

cultura poate fi controlată și supravegheată din punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea și eventual lisogenia).

Culturile starter singulare mezofile prezintă însă următoarele dezavantaje:

pot fi depreciate de tulpinile producătoare de bacteriocine;

pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liză fagică;

pot suferi pierderi de plasmide și deci pot pierde una sau mai multe din funcțiile lor.

Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini selecționate, neînrudite pe plan fagic și cultivate separat până la stadiul de cultură primară sau chiar până la stadiul de cultură starter de producție când se amestecă între ele.

În aceste condiții, tulpinile nu se dezvoltă împreună decât cel mult timp de 10 generații, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină dominantă. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni în șir fără a-și pierde capacitatea de acidifiere.

Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regulă, din două tipuri de bacterii lactice:

bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;

bacterii lactice producătoare de aromă: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau specii de leuconostoci.

După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate în următoarele grupe:

culturi starter mixte tip L care conțin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris (citrovorum), Leuconostoc dextranicum și/sau Leuconostoc lactis care sunt toți heterofermentativi și produc acid lactic D(-);

culturi starter mixte de tip D care conțin Str. lactis biov. diacetilactis ca singură specie producătoare de aromă;

culturi starter mixte tip LD care conțin atât specii de leuconostoci cât și Str. lactis subsp. diacetilactis ca producători de aromă.

La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în vedere că:

streptococii acidifianți mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoză;

leuconostocii, cei heterofermentativi, și Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc diacetil și acetoină din citrat, dar produc și acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei și glucozei;

Culturi starter termofile. Culturile starter termofile pot fi:

acidifiante: Lactobacillus acidophilus;

acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili și dintr-o specie de streptococi. În această direcție amintim:

cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus și Str. thermophilus;

cultura starter termofilă pentru brânzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis + Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această cultură starter se folosește la fabricarea brânzeturilor cu pastă tare și semitare, deci la care se practică încălzirea a doua a bobului de coagul.

Utilizarea culturilor starter termofile este benefică deoarece:

produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui și determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din coagul;

au activitate proteolitică și prin urmare contribuie la ameliorarea proprietăților reologice și la aroma produselor fermentate; ca urmare a activității proteolitice rezultă și aminoacizi din proteine care stimulează dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;

produc și compuși de aromă, dar în principal aldehidă acetică, acetonă, precum și urme de acetoină;

produc și substanțe cu caracter filant care influențează vâscozitatea produsului (Str. thermophilus în cultura pentru iaurt);

produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei etc.);

produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).

Având în vedere cantitățile mari de iaurt ce se fabrică pe plan mondial, este necesar să cunoaștem factorii care influențează performanța optimă a culturilor pentru iaurt. Acești factori se referă la:

temperatura de incubare care este de 41-42C (apropiată de temperatura optimă de dezvoltare a lui Lactobacillus bulgaricus). După 3 ore de incubare se ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus și Str. thermophilus fiind 1/1;

tratamentul laptelui – pasteurizarea influențează pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:

modificarea structurii proteinelor;

eliminarea parțială a oxigenului și realizarea unei microaerofilii propice;

distrugerea inhibitorilor din lapte;

formarea de acid formic care favorizează dezvoltarea culturii;

disponibilitatea substratului. Laptele este un bun substrat dar trebuie arătat că Lactobacillus bulgaricus are preferință față de glucoză și deci ar trebui ca lactoza să fie prehidrolizată la -galactozidaza;

metaboliți produși în mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură și deci adausul de catalază va stimula producția de acid lactic de către Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2 decât Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu trebuie să fie agitat prea mult ca să nu includă aer (oxigen) care ar strica condițiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus și ar deveni toxic pentru Str. thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apără de acțiunea oxigenului prin intermediul manganului intracelular care înlocuiește acțiunea superoxiddismutazei;

interacțiunile dintre bacterii din cultura pură (inoculum) sau cultura starter. Între cele două microorganisme există un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazeină care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la rândul său, favorizează dezvoltarea lui L. bulgaricus prin producerea de acid formic și CO2;

calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie să conțină antibiotice, substanțe conservante, dezinfectante și să provină de la animale sănătoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lactice

Controlul culturilor starter implică următoarele determinări:

examenul microscopic care trebuie să arate raportul dintre coci și bacili, raport care trebuie să se situeze în limitele 1/1-1,5/1;

activitatea acidifiantă care se urmărește prin determinarea acidității titrabile atunci când cultura se află în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidență culturile “rapide” și “lente” (fast and slow);

rezistența la aciditate, ținându-se seama că Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~1,7% aciditate iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistența la aciditate se urmărește prin determinarea supraviețuitorilor după ce în mediul de cultură se atinge o aciditate critică;

rezistența la răcire care este importantă pentru produsele lactate ce se congelează (iaurt, înghețata de iaurt). Rezistența la răcire se urmărește la –6-9C și apoi la -18C sau -25C;

producerea de substanțe filante care constă în măsurarea vâscozității pe o probă inoculată de lapte cu 12% S.U., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37C până ce se atinge un pH de 4,2-4,3. Se pot depista în acest fel culturile filante;

activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură păstrată la 4C la care se determină tirozina sau aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetrică;

activitatea lipolitică se poate determina prin măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea culturii (lapte);

proprietățile senzoriale se determină la culturile de 24-48 ore la 20C (se pot determina și substanțele de aromă respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina)

Culturi starter concentrate de microorganisme

Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate în condiții controlate, concentrate într-un volum mic și conservate prin congelare sau uscare în vederea depozitării și transportului.

Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. În ceea ce privește culturile starter concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Pe lângă acestea se folosesc și alte culturi de bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptococi, bacterii propionice etc.

Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:

obținerea culturilor starter de producție (maiele de producție);

obținerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, compoziții carnate etc.

Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obținute prin două procedee:

procedeul de cultivare periodică;

procedeul de cultivare continuă.

5.7.1 Tehnologia de obținere a culturilor starter concentrate

Tehnologia de obținere include următoarele operații de bază:

inocularea mediului de cultură cu microorganismul din cultura stoc;

incubare pentru multiplicare la nivel maxim;

concentrarea mediului împreună cu celulele sau separarea celulelor, de regulă prin centrifugare și resuspendare într-un lichid adecvat,

conservare prin congelare și uscare;

depozitare în stare congelată și uscată.

În tehnologia de obținere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultură care să asigure toate substanțele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii, realizându-se un control riguros al temperaturii și menținerii pH-ului la valori optime.

Pentru eventuala neutralizare a acidității se utilizează hidroxid de amoniu și/sau hidroxid de calciu.

Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face în două moduri:

sub formă lichidă, în care caz, concentratul de bacterii se suspendă într-un antigel solubil în apă (alcooli polihidrici) care se utilizează în proporție de 40-50% față de concentrat. Congelarea se face la -40C (de fapt se realizează o subrăcire).

Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:

se împiedică acțiunea dăunătoare a gheții asupra celulelor de bacterii;

manipularea concentratului este mai ușoară;

concentratul se poate încălzi până la temperatura de utilizare chiar în timpul manipulării fără ca celulele să-și piardă viabilitatea și activitatea;

congelarea în azot lichid (-196C) în care caz concentratul se amestecă cu un agent crioprotector: 10% glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.

Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat să se adauge agenți de stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract de malț, metalglicerofosfați alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistină și/sau dextran. Amestecul respectiv se introduce în pungi de plastic care se congelează în azot lichid.

Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:

la temperaturi de –20…-40C;

la temperatura de -196C (în azot lichid);

conservarea prin reducerea conținutului de apă se face prin liofilizare, în care caz concentratul de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză) după care se liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară) temperatura produsului nu trebuie să depășească 40-45C. După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în atmosferă de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-18C).

Culturile starter concentrate trebuie să conțină între 2,5·1010 – 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.

5.7.2. Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice în industria laptelui

Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc în industria laptelui sunt acelea destinate:

pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian și elvețian;

pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.

Avantajele și dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate în tabelul de mai jos.

Avantaje:

activitatea culturilor poate fi controlată și supravegheată înainte de expediere;

se elimină operațiile de întreținere și de preparare a maielelor intermediare (primară, secundară, terțiară);

se face economie la forța de muncă;

se pot stabili ușor sistemele de rotație în vederea evitării infecției cu bacteriofagi;

se obțin produse de calitate mai constantă

Se scurtează procesele tehnologice ale fabricării produselor prin accelerarea acidifierii, deoarece se suprimă faza de dezvoltare logaritmică în laptele de fabricație

Dezavantaje:

necesită spații de depozitare la temperaturi scăzute atât la producător cât și la cumpărător pentru păstrare până la folosire;

concentrarea nu este posibilă la toate culturile starter;

depozitarea în stare congelată sau uscată, în funcție de timp, poate conduce la micșorarea drastică a numărului de celule viabile

Culturile pot să fie influențate negativ în ceea ce privește unele plasmide ce codifică anumite funcțiuni

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria laptelui

Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de vitamine și factori suplimentari de creștere 1% lactat de sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultură se ajustează la pH = 7,0 și se sterilizează.

Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32C/3 zile

Dacă mediul de cultură conținând bacterii propionice dezvoltate după incubare se utilizează ca o cultură (maia) de producție, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se oprește înainte de coagularea laptelui, deoarece în stare de coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele destinat fabricării brânzeturilor.

Celelalte operații de obținere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleași ca cele descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate.

Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5C în care caz celulele își păstrează viabilitatea și activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25C poate fi făcută pentru cel mult 2 săptămâni.

Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai folosesc obținerea de culturi intermediare).

5.10. Culturi starter concentrate de spori de mucegai

Tehnologia de obținere include următoarele operații:

prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia și repartizarea în eprubete (agar înclinat);

însămânțarea mediului în eprubete cu spori de mucegai ce se dorește a se cultiva;

termostatare pentru germinare spori cu organe purtătoare de spori și sporulare;

preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% și însămânțare medii de cultură Czapek cu 2% agar aflate în vase Roux;

recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic 0,8% astfel ca să se asigure în suspensie 108-1010 spori/ml;

păstrare suspensie la 0-4C.

Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată și sub formă de emulsie liofilizată, emulgatorul fiind polietilsorbitanul .

Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate în industria laptelui și cărnii, utilizarea lor fiind în funcție de produsul alimentar în care se folosește cultura respectivă de spori de mucegai.

Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrată se diluează cu apă fiartă și răcită în raport de 1/3.

Cinetica reprezintă studiul schimbărilor fizice și chimice apărute în timp, într-un proces, în cazul nostru, procesul de creștere al microorganismelor. Schimbările fizice pot avea loc din cauza schimbărilor de temperatură, presiune și concentrație. Prin fermentație are loc procesul de creștere al microorganismelor, pe medii de cultură, cu scopul de a biosintetiza diverse substanțe chimice cu rol în structura și aroma produsului alimentar.

Procesul de fermentație alcoolică, întâlnit în pâine, de exemplu, are 3 scopuri: de a produce bioxid de carbon necesar în crearea structurii pâinii; de a produce aroma pâinii și de a schimba structura proteinelor astfel încât pâinea să fie masticabilă.

Figura 6.27.Celule de drojdii în aluatul de pâine

Fazele de creștere a microorganismelor

Curba de creștere a microorganismelor cuprinde mai multe faze:

faza de inoculare;

faza creșterii logaritmice a numărului de microorganisme;

faza de retardare;

faza de descreștere a numărului de microorganisme.

Prin inoculare de celule aparținând unei culturi pure (drojdia în panificație, bacterii lactice în industria laptelui, mucegaiuri și bacterii în bioreactoare în procesele de biosinteză, etc.), într-un mediu nutritiv se poate stabili dinamica de creștere a numărului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.

După Monod, curba de creștere cuprinde următoarele faze: faza de lag sau faza staționară, faza de creștere accelerată, faza de creștere logaritmică sau exponențială, faza de retardare, faza staționară, faza morții accelerate și faza morții logaritmice.

Figura 6.28.Curba de creștere a microorganimelor

Faza de lag corespunde perioadei de timp în care microorganismele se aclimatizează la condițiile de mediu care li se oferă. Nu se constată o creștere a numărului de celule. Această perioadă depinde de mai mulți factori: compoziția mediului, tipul microorganismului, vârsta microorganismului și temperatură. În această fază are loc biosinteza de ADN/ARN și o activare a sistemelor enzimatice precum și elaborarea de enzime induse. În cazul drojdiilor, această fază poate dura 1-2 ore.

Urmează faza de creștere accelerată în care au loc reacții metabolice cu viteză mare și constantă. În această fază se produce o mărire a dimensiunii celulelor prin creșterea mai rapidă a volumului în raport cu suprafața celulară, ceea ce favorizează declanșarea procesului de reproducere.

În timpul fazei creșterii logaritmice are loc cu intensitate, diviziunea celulară care se face cu consum mare de substanțe nutritive din mediu. Creșterea masei celulare poate fi determinată cantitativ prin dublarea numărului de celule pe unitatea de timp (pentru drojdii și bacterii) sau ca o dublare a biomasei pe unitatea de timp pentru fungi filamentoși, streptomicete. Prin exprimarea acestor valori pe o scară semilogaritmică rezultă o dreaptă. Deși celulele schimbă compoziția mediului de cultura prin consumarea de nutrienți și eliberarea de metaboliți, în faza de log rata de creștere rămâne constantă.

Rata de creștere este dependentă de concentrația în nutrienți. Rata de creștere în biomasă, X (mg/l), crește ca o funcție a timpului datorită conversiei nutrienților în biomasă:

unde: μ – este rata de creștere specifică (d-1). Aceasta reprezintă masa de celule produsă/ masa de celule pe unitatea de timp.

Rata de creștere μ, conform ecuației stabilită de Jaques Monod, este dependentă de trei parametri:

concentrația substratului, S;

μ m (mg/l), rata maximă de creștere;

Ks este o constantă specifică de substrat.

Constanta Ks este concentrația substratului la care se obțin ½ din rata specifică maximă de creștere (μ = μ m/2) și este echivalentă cu constanta Michaelis în cinetica enzimatică.

Figura 6.29. Efectul concentrației substratului asupra constantei ratei de creștere

Cinetica Monod

Dacă există un exces al tuturor nutrienților, atunci μ = μ m și cultura se află în faza de log, la rata maximă de creștere. Rata specifică de creștere maximă, μ m, are o importanță considerabilă în procesele industriale în care se urmărește obținerea de biomasă celulară și este dependentă de natura microorganismului și de condițiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri aceasta poate varia între 0,090-0,61 h-1.

La cultivarea lui Aspergillus niger pe mediu cu glucoză la 30șC s-a obținut μ m = 0,2 și un timp de dublare al biomasei de 3,46 h.

Pe măsură ce mediul sărăcește în substanțe nutritive, viteza de creștere începe să scadă și are loc faza de retardare în care se acumulează metaboliți celulari și în care viabilitatea microorganismelor scade.

Urmează apoi o fază scurtă de staționare a procesului de creștere, când se stabilește un echilibru între numărul de celule care se formează prin reproducere și a celulelor care se autolizează. Cantitatea de biomasă poate să rămână constantă deși se schimbă compoziția celulelor. Datorită lizei unor celule se eliberează noi substraturi care vor servi drept nutrienți pentru celulele viabile. Faza staționară poate fi atinsă la o concentrație de celule bacteriene de aproximativ 109 celule pe ml. Dimensiunea populației va depinde de dimensiunea celulelor, nutrienții disponibili și natura microorganismelor.

În faza staționară celulele pot să rămână active din punct de vedere metabolic fără să aibă condiții de înmulțire. Intrarea în faza staționară a culturilor aerobe, este determinată de limitarea conținutului de oxigen, care este consumat rapid din mediu. Bacteriile anaerobe sunt limitate în creștere din cauza acumulării de compuși de catabolism, toxici pentru celulele care i-au produs. De exemplu, sreptococii lactici sunt inhibați la creșterea concentrației de acid lactic.

Faza de declin sau curba de distrugere și inactivare metabolică a celulelor sau fazele morții accelerate sau a morții logaritmice a microorganismelor apare ca urmare a lipsei de surse de nutriție și energie, de denaturare a componenților celulari în prezența substanțelor acumulate (alcooli, acizi, bacteriocine, etc.) de autoliză, încât se poate produce în final sterilizarea mediului (moartea tuturor celulelor) și pierderea culturii. Această fază este de obicei logaritmică adică, o proporție constantă de celule moare în fiecare unitate de timp (o oră).

Cinetica procesului de fermentație în sistem închis (discontinuu) și deschis (continuu)

Durata fazelor curbei de creștere a microorganismelor depinde de temperatură, pH, aerarea (intensitatea agitării și cantitatea de oxigen).

Rata de creștere a culturilor este importantă pentru studiul proprietăților fiziologice a tulpinilor selecționate, pentru stabilirea condițiilor de reproducere când acestea sunt utilizate drept culturi starter sau pentru obținerea în condiții avantajoase a unor compuși celulari.

În timpul fazei logaritmice de creștere, fiecare celulă se divide la un interval constant de timp. Timpul mediu de generație (tg) este timpul necesar unei populații microbiene de a se dubla (ca număr de celule sau masă celulara).

Numărul de generații la timpul t este:

n = (log Nf- log No)/0,301

unde: Nf reprezintă numărul de celule la timpul t;

No reprezintă numărul inițial de celule (al inoculului).

Constanta ratei medii de creștere, k, este dată de numărul de generații pe unitatea de timp (număr de generații/ora).

De exemplu, pentru o populație bacteriană care a crescut de la 103 (N0) la 109 (Nf) într-un timp de 10 ore se obțin următoarele valori:

K = (log 109 – log 103)0,301 x 10h = 2 generații pe ora

tg = 1/k = 1/2generații/h =0,5h/generație, sau 30 minute /generație

Timpul de generație variază cu specia și cu condițiile de mediu. În tabelul de mai jos se dau valori ale tg pentru unele microorganisme cultivate în condiții optime.

Tabelul 6.9.

Timp de generație pentru microorganisme

După L.M. Prescott, 1990

Randamentul de creștere exprimă cantitatea de biomasă rezultată prin consumul unui nutrient.

Y = masa celulară rezultată prin creștere/masa substratului consumat, g/g.

Randamentul y crește cu concentrația nutrientului, până când, aceasta atinge o valoare, în care are loc o saturare a sistemelor de transport și rata de creștere rămâne constantă sau scade.

În sistem închis, fermentațiile se fac într-un mediu nutritiv aflat în volum limitat, care se consumă repede, astfel că după câteva generații se instalează repede faza staționară de creștere.

În scopul menținerii populației microbiene în faza exponențială de creștere se folosesc sisteme de fermentare deschise, care sunt alimentate continuu cu nutrienți și din care sunt îndepărtați produșii de catabolism.

Celula microbiană, având masa redusă, este puternic influențată de condițiile mediului ambiant și reacționează foarte rapid la diferiți factori fizico-chimici și biologici.

Creșterea microorganismelor este afectată și controlată prin anumiți factori ecologici care pot fi divizați în grupul factorilor intrinseci uneori greu de controlat: pH și capacitatea tampon, potențialul de oxido-reducere, structura biologica și prezența unor constituenți antimicrobieni. Factorii extrinseci mai ușor controlabili, includ temperatura și durata de păstrare, efectele unor procese asupra aw prin sărare, afumare sau uscare, variația de pH, tratarea cu radiații, adăugarea de CO2 (de exemplu ambalarea în atmosferă controlată), sau adaos de conservanți.

Culturile continui se pot produce prin două metode. Utilizând chemostatul, cultura este alimentată cu mediu steril la aceeași rată la care mediul care conține microorganisme este înlăturat. Un element cheie al chemostatului este ca rata de creștere și producția totală pot fi controlate independent. Chemostatul este un rezervor de mediu steril care este adăugat culturii la o rată constantă. Nutrienți proaspeți intră constant în cultură, iar produșii de catabolism sunt continuu înlăturați.

Al doilea tip de cultură continuă este un turbidostat. Această metodă utilizează aceeași ipoteză ca și la chemostat cu excepția unei fotocelule care monitorizează densitatea optică a culturii. Fluxul de mediu ce intră în cultură este ajustat automat menținând o turbiditate predeteminată.

Chemostatele sunt folositoare în studierea fiziologiei microorganismelor deoarece se poate modifica un nutrient și se pot observa modificările apărute asupra microorganismului. Astfel este posibil să se studieze cât de eficient utilizează microorganismele nutrienții. Turbidostatele se utilizează când este dorită obținerea constantă de celule identic metabolic.

În industria laptelui se utilizează:

preparate enzimatice pentru coagularea laptelui la fabricarea branzeturilor sau pentru delactozarea laptelui;

culturi starter de (bacterii, drojdii și mucegaiuri) utilizate la fabricarea produslor lactate acide: iaurturi, smântână, brânzeturi.

Compoziția și proprietățile laptelui

Laptele este un lichid de culoare alb gălbui secretat de glanda mamară a mamiferelor. Din punct de vedere fizic, este un sistem complex putând fi considerat o emulsie de tipul U/A, în care faza grasă U este prezentă sub formă de globule, iar faza apoasă A conține proteine sub formă coloidală (micelii) și substanțele solubile (lactoză, săruri minerale, vitaminele hidrosolubile etc.). În tabelul de mai jos este prezentată compoziția chimică a laptelui de vacă.

Tabelul 7.10.

Compoziția chimică a laptelui de vacă

Principalele proprietăți fizico-chimice ale laptelui materie primă sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Tabelul 7.11.

Proprietățile fizico-chimice ale laptelui de vacă

Compoziția biochimică a laptelui

Enzimele proprii laptelui sunt acelea care își au originea în structurile celulare ale glandei mamare și cele de origine sanguină.

Enzimele laptelui sunt implicate în :

aroma și stabilitatea laptelui și a produselor lactate (lipaza, xantinoxidaza, proteaza, fosfataza);

diagnosticarea bolilor glandei mamare (catalaza, superoxid dismutaza);

maturarea brânzeturilor fabricate din laptele nepasteurizat (proteaza alcalină, proteaza acidă, esterazele), respectiv cele care rezistă pasteurizării (plasmina sau proteaza alcalină).

Enzimele laptelui pot fi localizate în fracțiunea solubilă, fracțiunea micelară (cazeina), membrana globulelor de grăsime, materialul celular. Localizarea enzimelor indică originea lor în organismul animal (de exemplu, celulele secretoare ale glandei mamare, sânge).

Tabelul 7.12

Enzime prezente în lapte

Preparate enzimatice folosite în industria laptelui

În industria laptelui s-au propus spre utilizare următoarele preparate enzimatice:

Lizozimul din albușul de ou. Lizozimul se utilizează în industria brânzeturilor, pentru împiedicarea dezvoltării bacteriilor sporulate aparținând genului Clostridium și în special Clostridium tirobutiricum care pot metaboliza acidul lactic pe care-l transformă în acid butiric și cantități importante de CO2 și H2. În afară de gustul neplăcut produce și o balonare a acestora, cu formare de găuri mari neregulate, care pot conduce chiar la „ruperea” brânzei.

Prin adaos de lizozim se realizează liza celulei vegetative și deci se împiedică dezvoltarea bacteriilor butirice în lapte. Dacă în lapte ajung spori de Cl. tirobutiricum aceștia rezistă la pasteurizare și vor rămâne în coagul, deci vor produce balonarea târzie a brânzeturilor.

Lizozimul împiedică însă dezvoltarea lactobacililor și în special dezvoltarea lui Lb. helveticus folosit la fabricarea brânzei Șvaițer, deci se împiedică acidifierea normală a laptelui (maturarea). Bacteriile propionice nu sunt inhibate de lizozim.

β-Galactozidaaza (lactaza) este enzima capabilă să hidrolizeze lactoza cu formare de glucoză și galactoză. Industrial se utilizează pentru:

delactozarea produselor lactate destinate persoanelor cu insuficiență (intoleranță) la lactoză;

delactozarea laptelui concentrat sau a laptelui praf;

obținerea de siropului de glucoză și galactoză din lactoză din zer.

Glucozoxidaza care catalizează transformarea glucozei în acid gluconic s-a propus a fi utilizată ca antioxidant enzimatic în produsele bogate în grăsimi (unt, lapte parf cu grăsime). Practic însă la aceste produse se utilizează antioxidanți chimici sau ambalare sub atmosferă de gaz inert (azot). Acțiunea glucozoxidazei s-ar manifesta prin aceea că activează lactatperoxidaza (LPS) care utilizează oxigenul în vederea producerii de H2O2.

Catalaza se utilizează în combinație cu glucozoxidaza pentru a elimina excesul de H2O2 care rezultă la acțiunea glucozoxidazei sau singură pentru a elimina excesul de H2O2 adăugată direct în lapte în scop de conservare. Apa oxigenată reziduală (rămasă neconsumată) în condițiile în care nu s-ar folosi și catalaza ar modifica caracteristicile senzoriale ale laptelui precum și valoarea nutrițională a proteinelor prin oxidarea metioninei.

Tratamentul laptelui cu H2O2 și catalază se impune față de tratamentul termic (în unele țări) în două cazuri:

când fermele nu dispun de echipament de răcire iar tratamentul termic (pasteurizarea) nu este fezabil din punct de vedere tehnic (se folosește ~ 2 ml H2O2 33% la 1 l lapte). Laptele ajuns în fabrică trebuie încălzit la 50C/30 min apoi răcit la 35C și se adaugă catalaza( 20 mg/l).

când laptele este destinat fabricării brânzeturilor și se dorește să se păstreze enzimele proprii laptelui precum și bacteriile lactice de contaminare, dar se dorește să se distrugă cele de alterare, în special coliformi care sunt puțin rezistente la acțiunea H2O2. De remarcat că H2O2 nu contribuie la distrugerea totală a bacteriilor patogene (Microbacteriunm tuberculosis, Brucella abortus și unele specii de Staphylococcus, precum și bacteriile sporogene).

Superoxid dismutaza (SOD), împreună cu catalaza a fost propusă pentru inhibarea oxidării lipidelor prin faptul că realizează catalizarea dismutării anionului superoxidic (O2) cu formare de apă oxigenată și oxigen:

Apa oxigenată formată poate fi degradată de catalază în O2 și H2O cu reducerea simultană a unei a doua molecule de H2O2 sau poate fi degradată de peroxidază la H2O în prezența unui donator de H2.

Preparate enzimatice folosite la coagularea laptelui

Coagularea enzimatică a laptelui s-a realizat la început exclusiv cu cheag, însă creșterea producției de brânzeturi pe plan mondial a pus problema unui înlocuitor pentru cheag. Întrucât coagularea laptelui este inițiată prin scindarea legăturii peptidice dintre fenilanina 105 și metionina 106 din k-cazeină, oricare endo-peptidază care este capabilă să producă această hidroliză este un înlocuitor potențial pentru cheag (chimozina). Această proprietate hidrolitică-coagulantă nu este suficientă, fiind necesar ca preparatul enzimatic respectiv să aibă și o activitate proteolitică nespecifică corespunzătoare, în sensul că trebuie evitată degradarea intensă a proteinelor la pH-ul natural al laptelui pentru a nu se distruge zonele de interacțiune pentru agregarea miceliilor. Principalele preparate enzimatice de origine animală sunt cheagul și pepsina.

Cheagul – preparat enzimatic din stomacul glandular de vițel, miel, ied sacrificați în perioada de alăptare. Se mai numește pressure, rennet. Preparatul cheag are ca principiu activ chimozina, însă conține și ceva pepsină, raportul masă chimozină activă/masă pepsină activă > 1,38. Cheagul industrial se obține sub formă lichidă sau pulbere.

La folosirea cheagului în soluție apoasă trebuie să avem în vedere că acesta își pierde din activitate dacă:

concentrația enzimei în soluție este mică;

este prezentă lumina solară sau chiar lumina din încăperi;

soluția este puternic agitată cu formare de spumă;

temperatura depășește 60C;

soluția are pH 6,6÷7,4.

Stabilitatea enzimei este bună între pH 5,0 și 6,0.

Pepsina este un preparat enzimatic care se obține din mucoasa roșie a stomacelor de vită și mai ales porc, unde se găsește sub formă inactivă de pepsinogen. Trecerea sub formă activă are loc sub influența HCl folosit la extracția enzimei din mucoasa stomacală roșie. Preparatul mai conține și chimozină, raportul masă chimozină activă/masă pepsină activă > 0,154.

Pepsina coagulează bine numai laptele acidifiat la pH 6,6. În comparație cu cheagul are o activitate proteolitică mai mare putând conduce la defecte de gust (gust amar). Se obține sub formă de pepsină praf tip L (putere de coagulare 1:50000 sau 1:120.000). Pepsina praf are 3% apă, maximum 40% (pt. 1:120000) – 58%(1:50000) NaCl și maximum 3,5% lipide.

Preparatele enzimatice fungice se prezintă sub formă de pulberi fine, omogene, alb-gălbui, solubile în apă, însă ca acțiune sunt inferioare enzimelor coagulante de origine animală, în principal cheag.

La folosirea preparatelor enzimatice fungice trebuie să avem în vedere următoarele:

creșterea temperaturii de coagulare peste 30C influențează pozitiv coagularea (deci trebuie să se țină seama de sortimentele de brânză cu temperatura de coagulare a laptelui 30C);

aciditatea laptelui 20 T influențează negativ acțiunea enzimelor;

coagulul obținut are o durată mai lungă de întărire, consistenți mai moale, ceea ce favorizează pierderi de substanță uscată în zer. Se impune prelungirea duratei de coagulare și prelucrare a coagulului cu 10 – 15 min, respectiv creșterea acidității laptelui supus închegării și creșterea temperaturii acestuia;

activitatea proteolitică a enzimelor fungice este mai mare decât a cheagului, în special asupra proteinelor serice, ceea ce înseamnă pierderi de proteine în zer.

Preparatele enzimatice de origine bacteriană au o utilizare mai limitată din următoarele motive:

au activitate proteolitică mai mare și din această cauză produc defecte la brânzeturi;

coagulul obținut este moale, iar pierderile de cazeină și grăsime în zer sunt mai mari.

Biotehnologia fabricării brânzeturilor

Cuprinde următoarele operații: controlul laptelui materie primă; curățirea laptelui; normalizarea laptelui; pasteurizarea laptelui; însămânțarea laptelui cu culturi lactice, adaos de CaCl2 și maturarea acestuia; închegarea laptelui (coagularea); prelucrarea coagulului; formarea și presarea brânzeturilor; sărarea brânzeturilor; maturarea brânzeturilor, depozitarea și condiționarea brânzeturilor.

Dintre operațiile menționate cele cu caracter foarte pronunțat biotehnologic sunt următoarele:

Însămânțarea laptelui cu culturi lactice, adausul de CaCl2 și maturarea acestuia

Prin pasteurizarea laptelui, microflora naturală a acestuia este distrusă, fiind necesară o însămânțare a laptelui cu culturi de producție specifice sortimentului de brânză ce se fabrică. Culturile starter de producție sunt obținute din cultura selecționată sub formă lichidă sau liofilizată, prin pasaje succesive:

cultură selecționată cultură primară cultură secundară cultură de producție

Microorganismele utilizate în culturile starter de producție, la fabricarea brânzeturilor sunt mezofile sau termofile. Dintre cele mezofile (optimum de temperatură de dezvoltare 15-40C) se folosesc cele homofermentative: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris (produc acid lactic L+); heterofermentative: Lactococcus lactis subsp. lactis biov. diacetilactis (produce acid lactic L+) și Leuconostoc cremoris (produce acid lactic L+).

Speciile termofile frecvent utilizate (temperatura optimă 30-50C) sunt următoarele : Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (produce acid lactic L+), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (produce acid lactic L-) și Lactobacillus helveticus (produce acid lactic DL).

Aceste culturi sunt utilizate în industria brânzeturilor pentru realizarea următoarelor deziderat :

producția de acid lactic din lactoză în vederea scăderii pH-ului. Aciditatea finală atinsă va depinde de specia folosită, cantitatea de cultură adăugată și condițiile de termostatare (temperatură, timp). Cu cât pH-ul brânzei este mai scăzut cu atât mai mult acid lactic rămâne nedisociat și acționează ca un conservant. Bacteriile lactice cresc bine în condiții de microaerofilie și în timpul dezvoltării lor scad potențialul redox și deci, împiedică dezvoltarea bacteriilor aerobe de alterare;

reglarea sinerezei coagulului prin aciditatea produsă de culturile starter în funcție de parametrii închegării laptelui;

producerea de aromă (diacetil și acetoină) precum și CO2 din citrat care contribuie la realizarea unei structuri “deschise” și formarea de ochiuri mici de fermentare pentru anumite brânzeturi. Acest deziderat este realizat în principal de bacteriile lactice heterofermentative. Acidul lactic intervine și el în gustul brânzei și, în plus, prin efectul asupra pH-ului intervine în determinarea texturii, consistenței, elasticității și capacității de feliere a brânzei respective;

producerea de proteinaze și peptidaze cu rol în maturarea brânzeturilor. Pentru anumite brânzeturi (Emmental) se utilizează și Propionibacterium shermanii, care fermentează acidul lactic cu producere de acid propionic, acid acetic și CO2 care provoacă “desenul” brânzei (ochiuri mari). Pentru brânzeturile de tip Limburger se utilizează Brevibacterium linens care contribuie la maturarea de suprafață a brânzei și formează colonii roșii-orange.

Sporii mucegaiului Penicillium roqueforti se utilizează la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă (Roquefort, Stilton) iar sporii de Penicillium camemberti se utilizează pentru maturarea de suprafață a brânzeturilor de tip Camembert, Brie etc.

Microflora variază numeric în timp. Astfel, dacă în brânza inițială se găsesc între 106–107 celule formatoare de colonii/g, pe măsură ce maturarea progresează numărul bacteriilor lactice se reduce, în funcție de brânză și, în principal, în dependență de gradul de eliminare al lactozei, de nivelul de NaCl din brânză și/sau gradul de autoliză al bacteriilor lactice. Activitatea bacteriilor lactice este inhibată când nivelul de NaCl în apa conținută de brânză este mai mare de 5%.

Cultura starter de bacterii lactice se folosește după o prealabilă păstrare la frig (10C) de cel puțin 5–6 ore în intervalul maxim de 48 de ore de la preparare.

Proporția de cultură starter de producție adăugată laptelui destinat fabricării brânzeturilor depinde de: calitatea laptelui, felul brânzei, activitatea bacteriilor lactice, anotimp.

Cultura starter de producție se folosește atâta timp cât nu prezintă semne de degradare: întârziere în coagulare, aciditate scăzută, lipsă de aromă specifică, impurificare cu alte microorganisme.

Adaosul de CaCl2 în laptele supus maturării este necesară din următoarele motive:

restabilirea echilibrului în săruri de calciu pentru a îmbunătăți coagulabilitatea laptelui pasteurizat;

îmbunătățirea consumului specific, ca rezultat al obținerii unui coagul mai ferm și reducerea tendinței de prăfuire a acestuia în timpul prelucrării coagulului în cazan;

evitarea defectelor de structură a bobului și a cașului, legate de prelucrarea unui coagul moale, cu slabă putere de contractare și cu o slabă sinereză.

Cantitatea de CaCl2 adăugată este de 10-30 g CaCl2/100 l, în funcție de tipul de pasteurizare aplicată și de anotimp. Clorura de calciu se adaugă sub formă de soluție 40% (50 ml/100 l lapte). Trebuie avut în vedere că la adaos de CaCl2 crește aciditaea laptelui cu circa 1T la un adaos de 50 ml CaCl2/100 l lapte.

În ceea ce privește maturarea laptelui înainte de coagulare, aceasta este necesară din următoarele motive:

mărirea capacității de hidratare a proteinelor, afectate de pasteurizare;

întărirea globulelor de grăsime;

creșterea ușoară a acidității laptelui prin fermentarea parțială a lactozei în acid lactic, aciditate care împiedică dezvoltarea bacteriilor gazogene;

modificarea stării sărurilor minerale;

eliminarea gazelor din lapte.

Poate fi maturat laptele crud sau laptel pasteurizat. Laptele crud poate fi maturat natural (12 ore la 15C) în zona de munte unde încărcătura microbiologică a laptelui este redusă. Laptele crud poate fi maturat și prin adaous de cultură de producție în proporție de 0,01% cu păstrare la 14÷16C, timp de 12 ore.

Coagularea laptelui

Închegarea laptelui (coagularea) este operația de bază la fabricarea brânzeturilor, deoarece se separă cazeina.

Coagularea laptelui poate fi realizată:

cu ajutorul acizilor, în care caz se modifică starea coloidală a cazeinei, în sensul că, odată cu scăderea pH-ului și trecerea unei părți din calciul legat de cazeină sub formă de sare de calciu în zer, are loc destabilizarea miceliilor de cazeină care precipită sub formă de acid cazeinic:

Coagulul obținut este moale, cu conținut redus de calciu și aciditate ridicată. Coagularea acidă este aplicată la fabricarea brânzei de vaci, în care caz închegarea (coagularea) are loc sub acțiunea acidului lactic rezultat prin fermentarea lactozei de către bacteriile lactice.

coagularea cu ajutorul enzimelor coagulante, în care caz procesul este reprezentat schematic astfel:

Pentru înțelegerea procesului de închegare (coagulare) este necesar să se cunoască proprietățile miceliilor de cazeină și mecanismul intim al coagulării laptelui.

Proprietățile miceliilor de cazeină. Miceliile de cazeină au diametrul cuprins între 30 – 300 nm (media 150 nm) și concentrația lor în lapte este de 1012 micelii/ml lapte. Miceliile în ansamblul lor sunt puternic hidratate (3,5 – 3,7 g H2O/g proteină). Miceliile de cazeină sunt formate din subunități de cazeină, agregate în submicelii.

Fiecare submicelă este formată din S1-, S2-, – și k-cazeină în raport 4:1:4:1.

k-Cazeina se găsește la suprafața submiceliilor care sunt legate între ele prin intermediul fosfaților de calciu coloidal. k-Cazeina are caracter amfipatic având o parte hidrofobică care reprezintă 2/3 din k-cazeină. Această parte hidrofobică este legată prin intermediul H2N-terminal de S1 -, S2 – și – cazeină precum și cu fosfatul de calciu. Cealaltă parte a k-cazeinei (1/3 din k-cazeină) are o grupare C-terminală și este hidrofilică-anionică. Această parte a k-cazeinei, orientată la exteriorul submiceliului, prezintă numeroase grupări hidrofilice datorită glucidului din structura acestei părți a k-cazeinei. Cele două părți componente ale k-cazeinei sunt unite prin legătura peptidică fenilalanina 105 – metionina 106. Datorită structurii menționate, miceliile de cazeină nu se pot asocia între ele deoarece:

protuberanțele hidrofilice – anionice dau miceliilor în ansamblul lor o încărcare electrică negativă cu un potențial de -10…-20 mV. Datorită repulsiei electrostatice dintre două micelii încărcate negativ este anulată atracția, ele rămânând dispersate în plasma laptelui;

protuberanțele hidrofilice ale miceliilor nu pot să se interpenetreze și deci și din acest motiv agregarea micelară nu este posibilă.

Structura unui miceliu de cazeină este arătată în figura

Figura 7.30. Structura miceliilor de cazeină

a – vedere spațială; b – structură schematizată

Mecanismul intim al coagulării laptelui. În procesul de coagulare a laptelui s-au pus în evidență două faze:

reacția primară, specifică, respectiv faza enzimatică în care se eliberează 1,5÷2% azot solubil în TCA 12%. Coeficientul de temperatură Q10 = 3, reacția producându-se cu o viteză apreciabilă chiar la 0C. Această fază este independentă de ionii de Ca2+. În această fază, legătura peptidică Phe 105 – Met 106 este scindată de enzima coagulantă punându-se în libertate partea hidrofilică anionică-glicomacropeptid cu masa moleculară 6754 și care conține 64 resturi aminoacidice. Acest glicomacropeptid trece în plasma laptelui. Ceea ce rămâne atașat la S1-, S2- și -cazeină este partea hidrofobică a k-cazeinei insolubile și care este denumită para-k-cazeină;

faza de coagulare propriu-zisă este neenzimatică și care constă în asocierea miceliilor de cazeină destabilizate prin scindarea glicomacropeptidei din k-cazeină. De fapt, agregarea miceliilor de cazeină începe atunci când aproape 80% din k-cazeină este hidrolizată. Prin îndepărtarea glicomacropeptidei, potențialul electric al miceliilor de cazeină scade de la -10…-20 mV la -5…-7 mV, respingerea electrostatică este anulată, iar miceliile formează inițial structuri de lanțuri care apoi se agregă într-o rețea tridimensională (de gel) care înglobează globulele de grăsime (dacă acestea sunt prezente) și faza apoasă a laptelui.

Agregarea implică interacțiuni Van der Waals, hidrofobice și electrostatice. Adaosul de CaCl2 favorizează fuzionarea miceliilor prin formarea de legături dintre grupările fosforil ale -cazeinei și Ca2+. Tăria gelului este determinată de numărul acestor legături și este corelată cu randamentul în brânză și calitatea acesteia. Coagularea propriu-zisă este dependentă de temperatură, coeficientul de temperatură Q10 = 1,3-1,6C. Coagularea propriu-zisă nu are loc la 15C, chiar dacă k-cazeina a fost scindată complet. Reprezentarea schematică‚ a coagulării laptelui este arătată în figura de mai jos:

Figura 7.31. Reprezentarea schematică a coagulării laptelui – faza enzimatică

Factorii care influențează coagularea laptelui. Coagularea enzimatică a laptelui cu cheag (chimozina) este influențată de mai mulți factori, care sunt prezentați în cele ce urmează:

temperatura la care are loc acțiunea cheagului, optimul de temperatură fiind 40÷41C. În practică, temperatura de coagulare variază între 25÷42C, în funcție de sortiment. În funcție de temperatura de coagulare se stabilește și durata coagulării (tabelul 7.13). De regulă, temperatura de închegare în cazul brânzeturilor moi este mai scăzută, pentru a avea un grad mai redus de deshidratare a coagulului. Coagularea laptelui pentru brânzeturile tari se face la o temperatură mai ridicată și având în vedere și încălzirea a II-a, se realizează o deshidratare mai avansată a coagulului, brânzeturile finite având un conținut mai mic de umiditate.

Tabelul 7.13.

Temperaturile de închegare pentru diferite tipuri de brânzeturi

Temperatura de coagulare poate fi mai ridicată pentru un anumit sortiment de brânză dacă laptele a fost insuficient maturat, aciditatea este mai redusă și conținutul de grăsime mai mare;

cantitatea de săruri de calciu influențează durata coagulării dar și calitatea coagulului. La un nivel scăzut de săruri de calciu se mărește durata coagulării, iar coagulul are consistența moale. Durata coagulării scade și mai mult iar tăria coagulului se mărește și mai mult dacă se adaugă și fosfat monosodic (50-70 g/100 l lapte);

gradul de aciditate al laptelui, influențează coagularea în sensul că viteza de coagulare crește odată cu creșterea redusă a acidității. Activitatea optimă a cheagului este la pH 6,0-6,4 (media 6,2);

cantitatea de enzimă coagulantă determină viteza coagulării, atunci când concentrația de enzimă este în anumite limite;

compoziția chimică a laptelui, respectiv un conținut mai mare de substanță uscată, determină o cantitate mai mare de enzimă coagulantă pentru a obține coagularea în timpul dorit și o consistență normală a coagulului;

tratamentul termic preliminar al laptelui conduce la prelungirea duratei de coagulare datorită:

reducerii concentrației de calciu, fosfor și citrați solubili (precipitarea în principal a sărurilor de calciu);

dezagregării miceliilor de cazeină;

formarea complexului k-cazeină/-lactoglobulină mai puțin sensibil la cheag;

depunerea proteinelor serice denaturate pe miceliile de cazeină;

eliminarea CO2 care conduce la scăderea pH-ului.

Păstrarea la rece a laptelui pasteurizat modifică echilibrul dintre cazeina micelară și solubilă, în sensul micșorării dimensiunilor miceliilor de cazeină, ceea ce prelungește durata coagulării, coagulul obținut fiind moale;

omogenizare laptelui scurtează durata de coagulare a laptelui, deoarece la omogenizare are loc o creștere a gradului de agregare a particulelor de cazeină. Omogenizarea mai are și următoarele efecte pozitive: se reduce conținutul de grăsime în zer și se îmbunătățește consumul specific; se împiedică transudarea grăsimii din brânză în timpul maturării, mai ales la brânzeturile care se maturează la temperaturi mai ridicate (Emmental, Trapist, Olanda, Cașcaval).

Puterea de coagulare, necesarul de cheag, pregătirea soluției de enzimă coagulantă.

Puterea de coagulare se exprimă prin cantitatea de lapte (în volume) ce poate fi coagulată de o cantitate de enzimă în soluție (volume) la temperatura de 35C în 40 min (2400s):

în care : P – este puterea de coagulare;

E – volumul de enzimă (în soluție), în l;

V – volumul de lapte coagulat, în l;

T – timpul de coagulare, în secunde.

Puterea de coagulare este înscrisă pe eticheta produsului (lichid sau pulbere).

Practic, norma de consum de enzimă coagulantă este mai mare deoarece durata de coagulare este uneori mai mică de 40 min iar temperatura sub 35C.

Cantitatea de cheag necesară coagulării se stabilește cu relația:

în care : C – este cantitatea necesară de enzimă lichidă sau soluție de enzimă praf, în l;

L – cantitatea de lapte ce trebuie coagulată, în l;

S – timpul necesar pentru coagularea probei, în s;

T – timpul de coagulare al laptelui, în min.

Exemplu : L = 1000 l; S = 22 s; T = 35 min.

În acest caz, C = (1000. 22)/(600.35) = 1,04 l cheag

Întrucât, în formula anterioară, timpul în care a avut loc coagularea probei se consideră în momentul introducerii soluției de cheag în paharul cu probă și până în momentul formării coagulului (coagul gata pentru prelucrare) s-a modificat relația, considerându-se ca timpul de coagulare să fie din momentul introducerii enzimei coagulante și până în momentul apariției primelor flocoane de coagul (timp de floculare):

în care : C – este cantitatea de enzimă, în ml ;

L – cantitatea de lapte, în l ;

t1 – timpul de floculare, în minute sau secunde ;

t2 – timpul de coagulare dorit, în minute sau secunde.

Pregătirea soluției de enzimă trebuie să se facă cu 1/2 ore înainte de folosire. În cazul folosirii cheagului praf, pentru solubilizare se folosește fie apă fiartă și răcită la 30 – 35C, adăugându-se la 1l apă și o lingură de sare, fie zer dezalbuminizat cu aciditate 80 – 120T și temperatura de 30 – 35C.

În apa respectivă sau zer se solubilizează 1g cheag/l. Soluția de cheag astfel pregătită poate fi păstrată la 10C, timp de 2-3 ore, în cazul soluției apoase de cheag și maxim 24 ore în cazul soluției de enzimă preparată cu zer dezalbuminizat.

Cheagul soluție se adaugă după ce s-au introdus în laptele prelucrat:

clorura de calciu, dacă laptele a fost pasteurizat;

cultura de producție de bacterii lactice, spori de mucegai, bacterii propionice, în funcție de sortiment;

coloranții naturali, la unele sortimente;

alte substanțe corective (azotat de potasiu, acid lactic etc.).

Soluția de cheag se adaugă în jet subțire pe toată suprafața laptelui, care se amestecă bine timp de 4 min pentru repartizarea uniformă a enzimei coagulante.

Maturarea brânzeturilor

După sărare, „brânza crudă” trece la maturare, care este un proces complex corespunzând transformărilor enzimatice ale componenților coagulului. Reacțiile biochimice care au loc la maturare conferă brânzei caracteristici cu totul noi, pasta devenind mai moale, mai onctuoasă, cu gust și miros plăcut. Sub raport tehnologic, procesul de maturare cuprinde trei faze:

prematurarea (impropriu denumită prefermentare) când are loc acidifierea pastei prin transformarea lactozei în acid lactic, o slabă degradare a cazeinei și formarea găurilor specifice la anumite brânzeturi, prin acțiunea bacteriilor propionice;

maturarea propriu-zisă (impropriu denumită fermentarea principală), în care au loc transformările biochimice cele mai importante, substraturile cele mai implicate fiind proteinele și lipidele;

maturarea finală (impropriu denumită fermentarea finală), cunoscută sub denumirea de „affinage”, în care se continuă transformările biochimice dar cu o viteză mai redusă și în care se definitivează aroma (gust și miros) specifică brânzei respective.

Activitatea enzimelor implicate în maturare este influențată de:

compoziția brânzei crude;

structura miceliilor de cazeină și a grăsimii;

umiditatea brânzei;

pH-ul brânzei; temperatura de maturare;

potențialul redox al brânzei;

conținutul de NaCl din brânză.

Enzimele implicate în maturare sunt cele proteolitice și lipolitice, cu specificația că, imediat după adăugarea culturilor lactice are loc transformarea lactozei în acid lactic. Consecința acumulării de acid lactic este scăderea pH-ului care trebuie să fie la 24 ore diferit în funcție de felul brânzei:

brânzeturi cu pH 5 și peste 5 (brânzeturi cu încălzirea a doua la temperaturi ridicate);

pH 5 și sub 5 (în această grupă intră brânzeturile moi, Cheddar și brânzeturile la fermentarea cărora participă mucegaiurile.

pH-ul nu trebuie să depășească valoarea de 5,3, deoarece maturarea ar decurge prea repede (proteoliza accelerată).

În orice caz, acumularea de acid lactic este mai rapidă la brânzeturile tari și semitari în comparație cu cele moi, dar nivelul final de acid lactic este mai scăzut decât la brânzeturile moi pentru că o parte din lactoză se îndepărtează la încălzirea a doua și la presarea coagulului trecând în zer. Având în vedere că acidul lactic format se combină cu calciul din paracazeinat, rezultă că la brânzeturile tari se păstrează în brânză o cantitate mai mare de calciu sub formă de paracazeinat de Ca decât la brânzeturile moi.

Consecințele acumulării de acid lactic sunt următoarele:

inhibarea dezvoltării microorganismelor de alterare și producătoare de gaze;

favorizează dezvoltarea microorganismelor consumatoare de acizi;

influențează consistența și structura pastei, la pH optim rezultând o pastă fină, moale, gălbuie, iar la pH ridicat o pastă tare, cauciucoasă, albă și chiar sfărâmicioasă;

acidul lactic este el însăși un component de aromă (gust) sau precursor de aromă, putând fi substrat pentru bacteriile propionice care-l transformă în acid propionic, acid acetic și acid carbonic (CO2 + H2O).

În timpul maturării pH-ul crește ajungând:

5,5 – 5,7 la brânzeturile cu pastă tare;

5,8 – 6,6 la brânzeturile cu mucegai;

5,2 – 5,5 la brânzeturile cu pastă moale.

Degradarea proteinelor în timpul maturării. Enzimele care acționează asupra proteinelor, deci implicate în maturare (care au rămas în coagul) sunt:

proteaza alcalină care aparține grupului serin-proteazelor și care prezintă activitate de tip tripsinic. Are o activitate optimă la 37C și pH 7,5…8,0. Degradează preferențial -cazeina în 1, 2, 3-cazeina, dar și proteazo-peptonele. Degradează și S2 – cazeina. k-Cazeina este rezistentă la proteoliză. Proteinele serice nu sunt afectate. Proteaza alcalină este selectiv termorezistentă (este inactivată la 142C/16s). Activitatea sa este influențată de pH, concentrația de NaCl, temperatura de maturare și umiditatea brânzei. Importanța proteazei alcaline este mare la brânzeturile cu mucegai de suprafață (Camembert) și la brânzeturile cu pastă presată și maturare lentă;

proteaza acidă are activitate optimă la pH 3,5-4,0 și temperatura de 50C. Acționează preferențial asupra S1-cazeinei, activitatea fiind comparabilă cu cea a chimozinei;

proteazele și peptidazele extra- și intracelulare elaborate de microorganismele utilizate în culturile de producție (maiele).

Enzimele implicate în degradarea lipidelor în timpul maturării brânzeturilor pot fi:

lipoprotein-lipaza proprie laptelui. Enzima are temperatura de acțiune optimă la 30-37C și pH optim la 8–9.

preparate enzimatice intenționat adăugate, cum ar fi:

lipaze secretate de mucegaiurile folosite la fabricarea unor brânzeturi care pot produce prin -oxidare și metil-cetone (P. roqueforti, P. camemberti);

lipazele elaborate de unele specii de lactobacili din culturile adăugate în laptele destinat fabricării brânzeturilor;

lipazele produse de drojdiile care se dezvoltă la suprafața unor brânzeturi;

lipazele și esterazele bacteriilor psihotrope în măsura în care acestea sunt prezente în brânză.

Consecința lipolizei trigliceridelor (în principal) este acumularea de acizi grași liberi care intervin în principal ca atare la creșterea acidității brânzei dar și la aroma acesteia, mai ales la brânzeturile moi unde maturarea are loc și sub influența mucegaiurilor pentru care acizii grași liberi reprezintă substrat în -oxidare în care se formează metil-cetone, iar prin reducerea metil-cetonelor se formează și alcooli secundari. Dacă luăm în considerare o pasteurizare eficientă a laptelui, la maturarea brânzeturilor (sub aspect proteolitic și lipolitic) participă:

enzimele elaborate de culturile starter de bacterii lactice folosite la maturarea laptelui;

enzima (enzimele) coagulantă(e) rămasă(e) în coagul;

enzimele secretate de microflora care infectează laptele postpasteurizare, respectiv coagulul în diferite etape de prelucrare a acestuia.

În plus, pentru anumite tipuri de brânzeturi trebuie să avem în vedere:

activitatea proteolitică și lipolitică a unor mucegaiuri utilizate în pastă și la suprafață;

activitatea proteolitică și lipolitică a Bacterium lineus;

activitatea proteolitică și lipolitică a Propionibacterium shermanii;

activitatea proteolitică și lipolitică a unor drojdii de suprafață.

În mod voit pentru accelerarea maturării unor brânzeturi se utilizează preparate enzimatice lipazice și esterazice.

Produse lactate acide

Produsele lactate acide sunt acele produse lactate care se obțin prin fermentarea lactozei din lapte cu ajutorul culturilor starter de bacterii lactice.

În realizarea unor produse lactate acide-dietetice de calitate se impun următoarele:

folosirea unor materii prime (lapte de vacă, de oaie, de bivoliță) de înaltă calitate sub aspectul compoziției, caracteristicilor senzoriale și al gradului de contaminare;

respectarea tehnologiei de obținere atât a culturilor starter de producție cât și a produselor lactate acide.

Produsele lactate acide cuprind diferite sortimente de iaurt, lapte bătut, lapte acidofil și chefirul. La obținerea produselor lactate acide de o egală importanță este atât prepararea culturilor starter de producție, cât și fabricarea propriu-zisă a produselor.

Prepararea culturilor starter de producție

Prepararea culturilor starter de producție (impropriu denumite maiele) implică transplantări repetate pe lapte, începând cu o cultură pură stoc (inoculum) care este preparată de un laborator specializat și care este livrată fabricilor sub formă lichidă sau uscată.

Culturile pure stoc (inoculum) pot fi culturi singulare (formate din una sau mai multe tulpini ale aceleiași specii) și mixte (formate din specii diferite).

Din cultura pură selecționată (inoculum) lichidă sau din cea liofilizată, după reactivare, prin pasaje succesive pot fi obținute:

cultura primară (maiaua primară sau maiaua mamă);

cultura secundară (maiaua secundară);

cultura terțiară (maiaua terțiară), care poate fi utilizată drept cultură starter de producție (maiaua de producție)

Cultura primară. Se obține prin inocularea laptelui pasteurizat și răcit cu cultura pură (inoculum) primită de la laboratorul de specialitate. Felul culturii, proporția de inoculare, temperatura și durata de termostatare diferă în funcție de felul produsului pentru fabricarea căruia se folosește cultura respectivă. Imediat după termostatare, cultura se răcește rapid și se depozitează la 1…2°C până a doua zi.

Cultura secundară se obține din cultura primară (a doua zi), dar având în vedere că această cultură secundară reprezintă a doua transplantare (pasaj) ea se constituie ca un stadiu mai avansat de reactivare a culturii pure (inoculum) și de aceea din cultura primară se inoculează în laptele destinat culturii secundare o cantitate mai mică din cultura primară, iar durata de termostatare este ceva mai redusă. Și această cultură se păstrează la 1…2°C, timp de 1-2 ore.

Cultura terțiară sau de producție. Se prepară din cultura secundară (a treia zi), după aceeași tehnică ca și în cazul culturii primare, însă din punct de vedere cantitativ această cultură trebuie să satisfacă necesarul producției, iar din punct de vedere calitativ trebuie să prezinte caracteristicile produsului respectiv de bună calitate (aspect, consistență, gust, miros, ș.a.).

Cultura starter terțiară sau de producție se inoculează zilnic și tot zilnic se controlează chimic, senzorial și microbiologic. La folosirea culturii starter de producție trebuie să avem în vedere următoarele:

cultura să fie pură (să nu conțină decât microorganismele specifice);

cultura să fie activă (să producă fermentația specifică în timp normal și să asigure o anumită aciditate);

cultura să-și mențină în timp însușirile inițiale;

cultura să fie menținută 5-6 ore înainte de folosire, la 1…2°C, pentru a se favoriza acumularea substanțelor aromatizante;

să nu fie cultură starter de producție mai veche de 48 ore.

În legătură cu obținerea culturilor starter de producție facem următoarele precizări:

în unele cazuri, impuse de producție sau de calitatea necorespunzătoare a culturii, este necesar să se mărească necesarul de pasaje (culturi) intermediare, în aceleași condiții ca la cultura secundară, în vederea corectării unor defecte. Acest lucru se impune în principal la cultura pentru iaurt, în vederea refacerii raporturilor simbiotice dintre microorganisme;

dacă cultura primară prezintă caracteristici foarte bune ea poate fi folosită direct la prepararea culturii starter de producție (cazul folosirii culturilor pure stoc lichide).

Condiții pe care trebuie să le îndeplinească laptele destinat fabricării produselor lactate acide-dietetice

Calitatea laptelui folosit la prepararea produselor lactate acide-dietetice determină în mare măsură calitatea produselor finite. Rezultă că trebuie recepționat numai laptele de primă prospețime, deci cu un grad de contaminare cât mai redus și compoziție normală (se exclude laptele care conține și colostru, lapte falsificat, lapte provenit de la animale tratate cu antibiotice, lapte mamitic, ș.a).

În cazul laptelui de vacă, acesta trebuie să corespundă următoarelor cerințe:

densitate, minimum 1,029;

aciditate, maximum 17-19°T;

titru proteic, minimum 3,2;

proba reductazei (durata de decolorare a albastrului de metilen) minimum 3 ore.

Obtinerea iaurtului

Iaurtul este un produs lactat acid care se fabrică în numeroase țări, în principal din lapte de vacă, cultura starter de producție având în compoziție două bacterii lactice: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus și Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, între care se creează relații simbiotice, ceea ce conduce la accelerarea procesului de fermentație și de formare a substanțelor de aromă specifice produsului.

Schema tehnologică de fabricare a iaurtului din lapte de vacă este prezentată în figura 7.31. Operațiile principale sunt descrise în continuare.

Normalizare. Pentru iaurtul obișnuit laptele se normalizează la 2,8 % grăsime; pentru iaurtul slab se folosește laptele degresat; pentru iaurtul extra, laptele se normalizează la un conținut de grăsime care să asigure în produsul finit 4% grăsime.

Omogenizarea laptelui este foarte importantă din următoarele motive:

se mărește numărul de globule de grăsime cu diametrul 2,0 µm (se formează noi globule cu noi membrane la care participă o cantitate mai mare de cazeină) ceea ce favorizează digestia în tractusul intestinal;

se fragmentează miceliile de cazeină obținându-se un coagul mai fin, mai stabil, cu o eliminare mai redusă a zerului;

se împiedică separarea grăsimii la suprafața produsului finit. Omogenizarea va conduce la obținerea unui coagul (gel) care va avea globulele mici de grăsime, fin dispersate în matricea proteică, eliminându-se în acest fel efectul de „vacuolizare” în matricea proteică, efect care poate avea loc dacă laptele nu este omogenizat și globulele de grăsime au dimensiuni mari;

se îmbunătățește gustul produsului și conservabilitatea acestuia deoarece o parte din fosfolipidele membranei globulelor de grăsime inițiale trec în plasmă și contribuie mai bine la gust, la emulsionarea globulelor de grăsime nou formate și la conservabilitatea produsului;

produsul finit produce o senzație de sațietate la un consum mai mare (300-400 g). Omogenizarea se face la presiunea de 150-200 at.

Figura 7.31. Schema tehnologică de obținere a iaurtului

Pasteurizarea laptelui la temperaturi ridicate (>85°C), cu menținerea laptelui la această temperatură timp de 20-30°C minute, are drept scop:

îmbunătățirea calității igienice a laptelui prin distrugerea sigură a microorganismelor – forme vegetative;

îmbunătățirea mediului pentru dezvoltarea bacteriilor lactice (laptele) prin distrugerea sistemului lactoperoxidazic (inactivarea lactat-peroxidazei), eliminarea oxigenului și formarea unor compuși cu acțiune reducătoare (eliberarea de grupări -SH);

îmbunătățirea consistenței iaurtului deoarece prin încălzirea laptelui la temperatura >85°C și menținerea acestuia la 85-95°C are loc o denaturare a proteinelor serice și asocierea lor cu K-cazeina miceliilor de cazeină ceea ce favorizează obținerea unui coagul mai fin care reține mai bine zerul (hidratarea proteinelor este mai bună).

Consistența coagulului se îmbunătățește și prin creșterea gradului de hidratare a cazeinei prin trecerea parțială a fosfaților coloidali în săruri insolubile. Pasteurizarea și menținerea în vane se face sub agitare continuă.

Concentrarea laptelui este practicată numai în cazul fabricării iaurtului extra. Concentrarea se face până la 15% substanță uscată (în produsul finit). La concentrare volumul inițial al laptelui se reduce cu 10-20%. Prin concentrarea laptelui se asigură stabilizarea structurii proteinelor, mărirea conținutului de grăsime raportat la substanța uscată ceea ce asigură un produs finit cu o consistență mai fermă, dar mai cremoasă fără separare de zer.

În unele cazuri creșterea conținutului de substanță uscată se face prin adaus de cazeinat/coprecipitat, lapte praf degresat sau lapte concentrat.

Răcirea laptelui. Răcirea laptelui se practică imediat după pasteurizare sau concentrare, urmărindu-se ca temperatura laptelui să fie cu puțin deasupra temperaturii de dezvoltare a culturii starter adăugate. Răcirea se execută în aceeași vană în care s-a făcut pasteurizarea sau menținerea laptelui și durează 15…30 minute până se atinge temperatura de 45…48°C.

Însămânțarea (inocularea) laptelui se face cu cultura starter de producție menționată anterior. În acest scop, cultura se omogenizează, se diluează cu lapte în raport 1:0,5 și se introduce în laptele destinat producției de iaurt, care trebuie să fie agitat puternic, în vederea repartizării cât mai uniforme a culturii; în caz contrar particulele (grunjii) de cultură starter vor constitui centri de fermentație puternică determinând apariția în coagul a golurilor de fermentare (spații umplute cu zer). Se adaugă 0,5-2% cultură starter de producție (cu un exces de 0,1-0,2% față de necesarul stabilit teoretic).

Repartizarea în recipientele de desfacere. Ambalajele folosite (sticlă, plastic, carton parafinat) trebuie să fie bine igienizate. Repartizarea în ambalajele de desfacere se face în instalații automate, în tot timpul turnării iaurtul din vana din care se preia laptele trebuie să fie sub agitare.

Termostatarea produselor ambalate și introduse în navete se face în camera termostat, la temperatura de 42…45C, pentru o durată de 2,5…3 ore. Respectarea strictă a temperaturii de termostatare este obligatorie deoarece:

temperatură mai mare favorizează dezvoltarea lactobacililor, consecința fiind obținerea unui iaurt cu aciditate ridicată, gust acru și aromă slabă;

o temperatură mai scăzută favorizează dezvoltarea streptococilor obținându-se un iaurt cu aromă bună, dar cu aciditate redusă și deci fără gust specific.

Momentul final al întreruperii fermentării se poate stabili: senzorial, prin aprecierea coagulului care nu trebuie să aibă zer eliminat, iar la înclinarea recipientului coagulul nu trebuie să se desprindă de pereții ambalajului și să nu elimine zer; chimic prin determinarea acidității titrabile care la iaurtul de vacă trebuie să fie 80-90°T. Mai precis punctul final al termostatării poate fi determinat potențiometric prin măsurarea pH-ului (pH final 4,65-4,7).

Răcirea și depozitarea produsului. Răcirea se realizează în două etape:

prerăcire la temperatura de 20°C în timp de 2,5-3 ore, cu scopul de a se realiza întărirea coagulului și prevenirea separării zerului (se realizează mai bine stabilitatea gelului proteic);

răcirea propriu-zisă la temperatura de 2…8°C, în care caz coagulul devine mai compact, gustul și mirosul mai bine evidențiate. Răcirea propriu-zisă are loc 10-12 ore.

Depozitarea iaurtului la producător trebuie să se facă la temperatura de 2…4 °C și pe o durată cât mai mică, pentru a evita apariția unor defecte.

Operațiile de termostatare, prerăcire, răcire și transport trebuie să se facă fără manipulări brutale care ar putea produce spargerea coagulului și eliminarea zerului.

Defectele ce pot să apară la fabricarea iaurtului sunt menționate în tabelul 7.14.

Tabelul 7.14.

Defecte ce se pot constata la iaurt

Caracteristicile produsului finit. Produsul finit trebuie să corespundă următoarelor caracteristici:

Senzoriale:

aspect și consistență : coagul compact, omogen, fără bule de gaze și fără zer eliminat, cu aspect de porțelan la rupere (se admite max. 2% zer eliminat la iaurtul foarte gras și max. 5 % la cel gras și slab);

culoare: albă, cu nuanță gălbuie mai ales când iaurtul este fabricat din lapte de vacă;

gust și miros: plăcut, acrișor, aromat.

Fizico-chimice

Microbiologice:

bacterii patogene – lipsă;

bacterii coliforme – 5 pentru iaurtul în ambalaje de desfacere și 50 pentru iaurtul în bidoane.

Enzimele țesutului muscular și importanța lor în procesul de rigiditate și maturare a cărnii

În transformarea țesutului muscular în carne, cu proprietăți senzoriale care o fac aptă de consum (frăgezime, suculență, savoare), aceasta parcurge trei stadii:

Stadiul de prerigiditate – începe imediat după sacrificarea animalului, prin întreruperea circulației sanguine (sângerare), structurile vii ale mușchiului continuând sa funcționeze pentru un anumit timp în vederea obținerii homeostaziei [mecanismele fiziologice necesare organismului pentru a-și menține stabilitatea structurii și funcțiile sale precum și constanța compoziției mediului intern, indiferent de variațiile mediului exterior. Reglările hormonale ale temperaturii corporale, prizei alimentare precum și cele care contribuie la menținerea diverselor concentrații plasmatice (glicemie, calcemie, etc.) fac parte din homeostazie].

Acest stadiu se caracterizează prin contracții persistente ale țesutului muscular, datorita excitațiilor nervoase.

Durata acestui stadiu coincide, în fapt cu durata în care sistemul nervos încă mai acționează (20-30 minute în cazul țesutului muscular de bovine).

Stadiul de rigiditate – se instalează complet după 19-24 ore de la sacrificare, dacă temperatura de păstrare este de aproximativ 15°C.

activitatea țesutului muscular în acest stadiu depinde de rezervele sale energetice capabile să regenereze ATP (fosfocreatină, glicogen);

prin hidroliza ATP (adenozin trifosfat) se eliberează fosfat anorganic și pH-ul scade până la valori de 5,4-6,0 în funcție de tipul de mușchi. Mușchii roșii se vor contracta mai lent și acidifierea lor va fi mai puțin importantă, ATP-aza (enzima care hidrolizează ATP-ul) lor fiind inhibată la pH< 6;

temperatura de păstrare a cărnii postsacrificare influențează de asemenea, vieza de scăere a pH-ului. La temperaturi până la 10-12șC, viteza de sădere a ph-ului este mai redusă, deoarece se încetinește viteza de hidroliză a ATP-ului, în timp ce sub 10șC are loc o accelerare a hidrolizei ATP-ului și deci a scăderii pH-ului.

În concluzie, amplitudinea scăderii pH-ului este diferențiată în funcție de tipul de mușchi care se caracterizează printr-un conținut diferit de ATP (adenozin trifosfat), PC (fosfocreatina) și glicogen (poliglucidă întâlnită în regnul animal. Se găsește în cantități mari în ficatul omului și a animalelor).

De aici rezultă rigiditatea musculară care se caracterizează prin:

degradarea compuși lor macroergici (ATP și PC) și a glicogenului (poliglucidă de rezervă întâlnită în regnul animal se găsește în ficat)

evoluția pH-ului ca o consecință, în principal, a glicolizei anaerobe și corelat cu aceasta, modificarea activității ATP-azice și a nivelului de Ca2+ din reticulul sarcoplasmatic;

formarea complexului actomiozinic;

modificarea capacității de reținere a apei, care devine minimă;

formarea de amoniac.

Toate aceste modificări vor conduce la o carne cu o duritate excesivă, lipsită de frăgezime și fadă (fără gust și miros specific), neacceptată de consumatorul avizat.

Stadiul de maturare are loc la păstrarea cărnii în stare refrigerată și va conduce la îmbunătățirea principalelor caracteristici senzoriale ale cărnii: frăgezime, consistență, suculență, aromă (gust și miros), culoare.

Maturarea începe odată cu rezoluția (terminarea) rigidității și este o consecință a două mecanisme dependente de temperatură. Cele două mecanisme care intervin în maturarea cărnii sunt: enzimatice și fizico-chimice.

Mecanismul enzimatic este realizat de enzimele proteolitice intracelulare menționat în tabelul 8.15.

Tabelul 8.15.

Sisteme proteolitice prezente în țesutul muscular

Din tabelul de mai sus se poate observa că principalele enzime proteolitice ce intervin în maturarea cărnii sunt cele descrise în continuare.

Proteinazele neutre activate de Ca2+ (calpainele). Sistemul proteinazic dependent de Ca2+ și de grupările tiolice libere, este activ la pH neutru (gr. tiolitice sinonim cu mercaptani R-SH-substanțe organice derivate de la acidul sulfhidric (H2S), prin înlocuirea unui atom de hidrogen cu un radical organic, sunt de obicei lichide, cu miros neplăcut și foarte persistent (ex: CH3 SH- metan tiol sau metilmercaptan sau C2H5-SH- etil-mercaptan sau etan-tiol).

Proteazele lizozomiale: sunt localizate în lizozomi și au activitate maximă la pH=4-6, fiind reprezentate de catepsinele B, D, H, L, cea mai activă fiind catepsina D atât față de miozină, proteină de tipul globulinelor care se găsesc în țesutul muscular cât și față de actină. Catepsinele B, L, H slăbesc țesutul conjunctiv atunci când ajung în spațiul extracelular (în afara fibrei musculare).

Sistemul multifuncțional (proteozom, macropam, prosom). Este caracterizat prin protein-enzime cu masă moleculară mare având o structură cuaternară complexă formată din subunități cu masă moleculară mică, neidentice.

Mecanismul fizico-chimic al maturării. Acest mecanism este controlat de presiunea osmotică a țesutului muscular care crește de la 270-300 mosmoli cât reprezintă valoarea fiziologică până la 500-600 mOsmoli, valoare atinsă în plină rigiditate și care se mențineți și la maturarea cărnii [osmoza- trecerea solventului printr-o membrană semipermeabilă (permeabilă numai pentru solvent) care separă două soluții cu concentrații diferite].

Această creștere a presiunii osmotice este consecința acumulării în sarcoplasmă [gr. SARKOS- carne și PLASMĂ- formație, parte din CITOPLASMA celulei sau a fibrei musculare, nediferențiată în miofibrile (filamente fine și contracțiile care se diferențiază) în celula sau fibră musculară și care prin contractare determină contracția mușchilor] a substanțelor cu masă moleculară mică (ioni, peptide, aminoacizi, acid lactic).

În funcție de mușchi, presiunea osmotică finală corespunde unei creșteri a pulberii ionice și a concentrației (0,2-0,3 M), concentrație care aduce modificări importante la nivelul structurii fibrei musculare.

În concluzie sub acțiunea enzimelor proteolitice și a presiunii osmotice se slăbește structura fibrei musculare, rezultatul fiind o îmbunătățire a frăgezimi cărnii.

Corelația dintre acțiunea enzimelor proteolitice și frăgezimea cărnii

Frăgezimea cărnii (rezistența opusă la masticație) este determinată de specie, rasă, vârstă, stare, îngrășare, tipul de mușchi și gradul de maturare al cărnii (acțiunea enzimelor proteolitice).

Momentul în care s-a făcut refrigerarea sau congelarea, modul în care s-a executat răcirea (în carcasă sau pe porțiuni anatomice) influențează frăgezimea cărnii.

Specia

În funcție de specia de la care provine, carnea prezintă viteze diferite de maturare, mergând de la 1 la 10 pe o scară a vitezei. Carnea de pasăre se maturează cel mai rapid, urmată de carnea de porc și de vițel, apoi de oaie și de vită. Explicația acestei diferențe este pusă pe seama:

echipamentul enzimatic (concentrația de enzime proteolitice este mai mare la carnea de pasăre);

conținutul în inhibitori ai proteazelor (concentrația de calpastină este mai mare în carnea de vită și de porc);

sensibilității proteinelor contractile la enzimele proteolitice (miofibrilele cărnii de pasăre sunt mai ușor deteriorate de catepsine și calpaine decât miofibrilele cărnii de vită).

Aceste diferențe depind în fapt de caracteristicile metabolice și contractile ale mușchiului. Prin trecerea de la mușchi cu contracție lentă și metabolism oxidativ (mușchi de vită) la mușchi de culoare albă, cu contracție rapidă și metabolism glicolitic (mușchi de pui), viteza relativă de maturare.

Vârsta

Înaintarea în vârstă atrage după sine modificări în cele două structuri determină frăgezimea: COLAGENUL și MIOFIBRILELE.

Referitor la colagen, conținutul acestuia va fi în funcție de specie, rasă, sex, vârstă, mușchi și tip de mușchi. Dacă conținutul de colagen nu se modifică semnificativ cu vârsta, se modifică în schimb calitatea acestuia, în sensul că fibrele de colagen devin mai termostabile ca urmare a creșterii numărului de legături intermoleculare cu rezistență mare la căldură și cu rezistență mecanică ridicată.

Sexul

Influențează conținutul de colagen și gradul de reticulare al acestuia. Astfel femelele au un conținut de colagen mai mic și un grad de reticulare mai redus în comparație cu masculii castrați sau necastrați. Sexul influențează în principal, tipul de mușchi. Carnea femelelor și a masculilor castrați prezintă un procent mai mare de fibre albe, cu metabolism glicolitic, decât masculii necastrați.

Influența sexului opus asupra tipului de fibre este asemănătoare cu cea a agenții lor anabolici care fac să crească nivelul de miozină izoformă lentă în detrimentul izoformei rapide, ceea ce va conduce la micșorarea frăgezimii.

Rasa

În general, frăgezimea cărnii este mai bună când provine de la rasele perfecționate pentru producția de carne (cu masă musculară mare). În acest caz, diferențele de frăgezime sunt puse pe seama tipului de fibre care sunt în procentaj mai mare de tip CONTRACTIL/GLICOLITIC, la animalele hipermusculare (animale pentru producția de carne). Pentru animalele din aceeași rasă, vârstă, sex, există diferențe de frăgezime a cărnii de la animal la animal.

Tipul de mușchi

Pentru același animal, evoluția maturării este dependentă de tipul de mușchi care se caracterizează prin conținutul în proteine sarcoplasmatice, miofibrilare, enzime proteolitice, inhibitorii ai enzimelor proteolitice, viteza contracției, felul metabolismului, conținutul în fier (conținutul în mioglobină). Mușchii pot fi clasificați în:

mușchi de tip I (contracție lentă, foarte roșii, metabolism de tip oxidativ)

mușchi de tip II B (contracție foarte rapidă) culoare aproape albă, metabolism glicolitic)

mușchi de tip II A (contracție rapidă, culoare roșie, metabolism mixt și anume oxidativ-glicolitic)

mușchi de tip intermediar care sunt puțin definiți fiind considerați intermediari din punct de vedere al contracției și metabolismului, culoarea lor fiind roșie ca la mușchii de bovină.

Mușchi de tip II A și II B sunt cei mai fragezi după 8 zile de conservare în stare refrigerată, urmați fiind în ordine de mușchii de tip I. Mușchii cei mai duri sunt cei intermediari. De regulă, mușchii care se contractă rapid se maturizează rapid, urmați în ordine de cel care se contractă lent și de mușchii intermediari. Mușchii cu viteza mare de contracție prezintă un nivel mai scăzut de inhibitori ai calpainelor (proteinaze neutre activate de Ca2+).

Corelația dintre evoluția biochimică, consistența și suculența cărnii

Consistența cărnii. Este determinată de vârsta animalului și de gradul de îngrășare. Astfel, carnea animalelor tinere este mai puțin consistență decât a animalelor adulte, după cum carnea grasă are o consistență mai fină decât cea slabă, în care există mai mult țesut conjunctiv între fasciculele de fibre musculare sau între diferiți mușchi. Carnea perselată (grăsimea este distribuită intramuscular), este mai consistentă decât cea marmorată (grăsimea este distribuită între mușchi)

Consecința cărnii este determinată și de starea biochimică a țesutului muscular postsacrificare. Imediat după sacrificare, consistența cărnii este moale dar elastică. Carnea intrată în rigiditate are consistență fermă iar cea maturată are o consistență mai moale.

Suculența cărnii. Este determinată de capacitatea de reținere a apei (suc intracelular și interfascilar) precum și de grăsimea intramusculară.

Suculența cărnii depinde de specie, rasă, vârstă și de starea de îngrășare a animalului de la care provine carnea.

Animalele tinere dau o carne mai suculentă decât cele adulte datorită funcții fibrelor musculare și cantității mai mari de apă.

Carnea de porcine este mai suculentă decât cea de bovină și de oaie.

Suculența cărnii de bovină și de oaie este cu atât mai mare cu cât gradul de marmorare și perselare este mai avansat.

Suculența depinde și de tipul de mușchi, acesta crescând odată cu intensitatea metabolismului oxidativ. Suculența crește și o dată cu creșterea gradului de maturare.

La masticație, prima impresie a suculenței este determinată de cantitatea de suc eliberat în timpul masticației. La o masticație prelungită are loc o stimulare a salivației de către grăsime, impresia de suculență în acest caz fiind mai durabilă.

Corelația dintre aroma cărnii (gust și miros) și evoluția biochimică a acestuia

Aroma cărnii este influențată de următorii factori:

specia, în care caz intervine mai mult grăsimea decât carnea, compoziția chimică a grăsimii fiind controlată genetic;

rasa, în sensul că animalele de carne dau carne cu gust și miros mai pronunțat decât cele de lapte. În funcție de rasă s-au determinat diferențe în ceea ce privește compoziția în acizi grași ai trigliceridelor;

sexul, al cărui efect se corelează cu controlul genetic asupra metabolismului și producția de hormoni steroizi și influența asupra compoziției lipidelor și metabolismul lor. Chiar și produșii de metabolism ai hormonilor sunt responsabili de gustul și mirosul cărnii, mai ales prin lipidele pe care le conțin;

tipul de mușchi, în sensul că mușchii diferă între ei prin compoziția chimică, precursorii de aromă (aminoacizi liberi, nucleozide, baze purinice, precursorii de aromă (aminoacizi liberi, nucleozide, baze purinice și pirimidinice, acizi organici, zaharuri etc.) Grăsimea intramusculară și mai ales fracțiunea fosfolipidică are o influență primordială asupra aromei. La porcine nivelul de fosfolipide crește o dată cu intensitatea metabolismului oxidativ, fapt ce explică intensitatea aromei cu creșterea activității acestui metabolism.

gradul de maturare al cărnii, care mărește atât cantitatea de precursori de gust și miros cât și cantitatea de substanțe de aromă (gust și miros) ca atare.

La maturare sunt afectate proteinele din care sub acțiunea enzimelor proteolitice se formează peptide și aminoacizi liberi:

nucleotidele din care se formează inozinmonofosfatul care este o substanță tipică și indispensabilă pentru gustul cărnii (transformarea inozinmonofosfatului în hipoxantină, modifică în rău gustul cărnii);

trigliceridele și fosfolipidele, prin a căror hidroliză se formează precursori și substanțe de gust și miros.

Acizii grași cu masă moleculară mică intervin direct în gustul și mirosul cărnii, glucide le sunt la originea formării a numeroși acizi organici volatili (acid lactic, piruvic, acetic).

Frăgezirea artificială a cărnii

Frăgezirea artificială a cărnii prezintă interes numai pentru carnea de vită deoarece cărnurile de porc, de oaie, de pasăre sunt suficient de fragede, întrucât provin de la anumale și păsări foarte tinere.

Metode de frăgezire (tenderizare) a cărnii

Pentru frăgezirea cărnii (tenderizare) se pot utiliza următoarele metode:

mecanice: mașini cu ace sau lame care dezorganizează țesutul conjunctiv și muscular;

fizico-chimice: injectare de NaCI sau CaCh, care activează calpainele dependente de calciu (calpaineproteinaze neutre activate de ionul de Ca2+);

termice: tratament termic moderat la 55…57șC, care activează acțiune a unor enzime endogene;

enzimatice: acțiunea unor enzime proteolitice exogene.

Utilizarea enzimelor proteolitice exogene

Ameliorarea frăgezimii cărnii cu ajutorul enzimelor proteolitice este promițătoare, însă legislația actuală limitează folosirea enzimelor proteolitice de origine bacteriană și utilizarea sărurilor de frăgezire care conțin papaină, ficină, bromelină.

Experimental s-au folosit și enzime proteolitice din mucegaiuri (aspergilus) și diverse bacterii precum și tripsina pancreatică.

Enzimele proteolitice exogene pot fi folosite sub formă de săruri de frăgezire. Sub formă de soluții lichide injectabile animalului antesacrificare sau în carne postsacrificare.

Sărurile de frăgezire. Sărurile autorizate conțin papaină la nivel de 30 g/kg care de bucătărie și sunt utilizate în gospodăria individuală. Prezenta suportului de NaCl permite o mai bună difuzie a enzimei în carne și o slăbire parțială a structurii proteice a acestuia. Activitatea catalitică a sărurilor de frăgezire este slabă, dacă este păstrată la rece carnea tratată, dar devine maximă la începutul tratamentului termic, fiind optimă la 40-50șC în cazul papainei. Papaina este inactivată la 75-80șC.

Injectarea antesacrificare a preparatelor enzimatice. Primul procedeu aplicat a fost denumit PRO-TEN și a constat în injectarea în vena jugulară a bovinelor, cu 10-30 min. înainte de sacrificare, a unei soluții de papaină de concentrație 5% (papaină inactivată solubilizată în ser fiziologic). Cantitatea injectată este de 1-3 mg/kilocorp viu, în funcție de puritatea preparatului enzimatic inactivarea prealabilă a enzimei prin oxidarea grupării tiol a restului de cisteină, este indispensabilă deoarece enzima activă poate cauza animalului un stres sever la nivel respirator.

Enzima este activată în organismul animal sub acțiunea substanțelor reducătoare și a căldurii animalelor.

După sacrificare, carcasele sunt prelucrate normal însă durata maturării se reduce cu 2-5 zile în loc de 10-12 zile pentru carnea de bovine.

Injectarea cărnii postsacrificare. Această metodă este mai eficace sub aspect tehnologic, dar difuzia enzimei în țesutul muscular necesită și o frăgezire mecanică.

Injectarea se face cu soluții enzimatice cu concentrația de 0,1-0,001 % în funcție de mărimea mușchiului, durata de contact și eficacitatea enzimei.

Alte utilizări ale enzimelor în industria cărnii

Preparatele enzimatice se mai folosesc în industria cărnii pentru decolorarea enzimatică a sângelui, degresarea oaselor destinate fabricării gelatinei, recuperarea cărnii de pe oase, prelucrarea pieilor, îndepărtarea părului la porcine.

Degresarea oaselor destinate fabricării gelatinei. În procesul de fabricare a gelatinei, degresarea oaselor este o operație obligatorie. În mod obișnuit, degresarea se face prin extracția oaselor cu solvenți organici sau prin spălare cu apă caldă în contracurent. Degresarea se poate realiza și pe cale enzimatică folosind lipaze microbiene. Lipaza utilizată pentru degresare a fost obținută prin fermentarea unui mediu de cultură cu Aspergillus Arrhisus.

Procesul tehnologic cuprinde următoarele operații: oasele proaspete sunt sfărâmate, după care sunt spălate cu apă caldă în contracurent pentru a se îndepărta cea mai mare parte din grăsime. Oasele degresate cu apă caldă sunt apoi menținute în tancuri cu apă la 37°C și un pH=7,2 în care se adaugă Lipază și CaCl2, pH-ul se menține la 7,2 prin adaosul de NaOH.

Tratamentul cu lipază poate fi efectuat în mai multe reprize, după fiecare tratament enzimatic, oasele fiind spălate cu apă la 80șC și cu pH=8,5.

Pornind de la oase cu un conținut de lipide de 19-35% prin spălare cu apă caldă în contracurent. Se îndepărtează 24-43% din lipide, iar după trei tratamente cu lipază se îndepărtează 92-97% din lipidele inițiale.

Calciul adăugat sub formă de CaCl2 are un triplu rol: activator, agent de protecție și constituent al lipazei.

Recuperarea cărnii de pe oase. Pentru recuperarea cărnii de pe oasele proaspete se utilizează enzime proteolitice care acționează asupra proteinelor țesutului conjunctiv din periost (membrană conjunctiv-fibroasă care învelește osul) astfel încât se favorizează desprinderea țesutului muscular aderent la os. În acest scop, oasele rezultate la tranșare se introduc într-un cazan cu agitator împreună cu apa și enzima proteolitică. Prin agitare se favorizează desprinderea țesutului muscular.

În final apa se aduce la fierbere pentru a se inactiva enzima. Prin sedimentare, oasele se separă de partea lichidă conținând fragmente de țesut muscular, care se separă prin centrifugare sub formă de omogenat grosier ce poate fi utilizat în preparatele din carne.

Prelucrarea pieilor

I. Înmuierea este prima etapă de prelucrare a pielii conservate prin sărare după recoltare în abator. Prin înmuiere se îndepărtează murdăriile (inclusiv sângele rămas în piele) și se realizează hidratarea pielii.

Prin folosirea enzimelor proteolitice în etapa de înmuiere se favorizează hidratarea (umflarea). Prin schimbarea apei de înmuiere cu una proaspătă la care se adaugă 5% NaCl acțiunea enzimelor proteolitice folosite în etapa de înmuiere este diminuată prin rehidratarea pielii și umflarea acestuia;

II. Etapa a doua o constituie cenușărirea, care constă în îndepărtarea părului sau a lânii de pe piele cu ajutorul hidroxidului de calciu în prezeță de sulfiți. Prin folosirea Proteazelor alcaline în operația de cenușărire se poate diminua cantitatea de hidroxid de calciu și de sulfiți, reducându-se astfel gradul de poluare al apelor de tăbăcărie. Procesul se desfășoară la 35-40șC și la pH=8-9 timp de 6 ore;

III. Etapa a treia în prelucrarea pieilor este șămăluirea, prin care pielea devine suplă, mai moale, mai mătăsoasă la pipăit. Această operație se făcea înainte cu extracte apoase fermentate din excremente de găină, porumbel, câine (șamale fermentative) în prezent se folosesc preparate enzimatice de proteaze alcaline la pH=7-9,5 și la temperatura de 25-35°C. Capacitatea de colorare a pielii (fixarea și omogenitate a culorii) va depinde direct de suplețea atinsă de piele în etapa de sămăluire.

IV. Etapa următoare este tratarea lor în zemuri tanante vegetale în care au loc diferite fermentații (alcoolică, acetică, lactică, propionică, butirică) sau în zemuri cu crom care sunt foarte bazice și în care nu se dezvoltă microorganismele. În concluzie : folosirea enzimelor la prelucrarea pieilor, în primele etape reprezintă un câștig de timp, de energie și o diminuare a poluării mediului.

Îndepărtarea părului de la porcinele prelucrate prin opărire.

Pentru ușurarea depilării porcinelor și a capului de porc se pot folosi enzime proteolitice care hidrolizează parțial proteinele ce mențin bulbul părului în dermă (pătura profundă a pielii la animale vertebrate așezate sub epidermă) în dermă să găsesc vase de sânge, terminații nervoase, corpusculi tactili, fibre musculare, grăsimi).

Preparatul enzimatic se introduce în apa de opărire care se menține la 60șC timp de 3-5 min, după care se face depilarea manuală sau mecanică.

Rolul diferitelor microorganisme la maturarea preparatelor din carne crudă

În această direcție se are în vedere acțiunea bacteriilor lactice, a micrococilor, a drojdiilor și a mucegaiurilor.

Bacteriile lactice acționează pozitiv asupra următorilor indicatori:

culoare: prin scăderea pH-ului care favorizează degradarea NaNO2;

aromă: prin formarea de acizi organici și compuși de tipul acetoinei și diacetilului;

rezistență la tăiere (consistență):

prin scăderea ph-ului conservare;

prin suprimarea microorganismelor nedorite datorită formării de acid lactic (antiseptic), scăderii pH-ului (disocierea acizilor organici), producerii de antibiotice și bacteriocine.

Micrococii și stafilococii nepatogeni, care acționează pozitiv asupra următorilor indicatori:

reducerea azotului prin elaborarea de nitrat-reductaze;

culoare: prin consum de O2 în interiorul salamului și scăderea pH-ului, fapt ce conduce la protejarea pigmenților de sărare, prin distrugerea apei oxigenate (H2O2) produsă de lactobacili, cu ajutorul catalazei;

aromă: prin degradarea proteinelor și lipidelor, prin distrugerea peroxidului de hidrogen cu ajutorul catalazei, peroxid care ar putea conduce la râncezirea grăsimilor;

conservarea: prin reducerea azotului la azotit, ultimul având acțiune de inhibare asupra microorganismelor nedorite.

Drojdiile acționează pozitiv asupra următorilor indicatori:

culoare: protejarea culorii prin consum de oxigen, ceea ce împiedică formarea de H2O2, distrugerea H2O2 care modifică culoarea;

aromă: degradarea proteinelor și lipidelor, împiedicarea râncezirii prin distrugerea H2O2 și protejarea suprafeței față de O2 și lumină;

conservare: crearea unui microclimat, la suprafața produsului nefavorabil dezvoltării unor microorganisme de alterare;

starea suprafeței membranei: prin acoperirea suprafeței acesteia cu colonii de drojdie.

Mucegaiurile mobile acționează pozitiv asupra următorilor indicatori:

culoare: prin protejarea culorii și împiedicarea formării de H2O2 prin consum de O2, distrugerea H2O2care modifică culoarea;

aromă: prin degradarea proteinelor, lipidelor, împiedicarea râncezirii prin distrugerea H2O2 și protecția suprafeței față de O2 și lumină;

conservare: prin realizarea unui microclimat la suprafața produsului nefavorabil dezvoltării microorganismelor de alterare;

starea stratului marginal: protecția față de uscarea excesivă, respectiv împiedicarea formării inelului de culoare brună;

starea suprafeței membranei prin acoperirea acesteia cu un strat de miceliu alb;

alte acțiuni: prin împiedicarea formării de micotoxine de către mucegaiurile toxicogene.

Utilizarea culturilor starter de bacterii în industria cărnii

Culturile starter concentrate de bacterii folosite în industria cărnii pot fi singulare sau în amestec. Ele pot fi formate din bacterii lactice (L. plantarum, L. sake, L. pentosus, L. alimentarius), pediococi (P. acidilacti, P. pentosaceus), stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M. varians), streptomicii (Streptomyces griseus).

În literatura de specialitate sunt menționate următoarele culturi starter concentrate de bacterii singulare sau în amestec:

S. carnosus

S. carnosus + P. pentosaceus;

S. xylosus + P. pentosaceus;

M. varians;

M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti;

M. varians + P. pentosaceus;

S. carnosus + Streptomyces griseus.

Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea lentă a salamurilor crude unde se realizează o scădere lentă a pH-ului și deci consistența produsului se realizează în timp. Gustul acestor produse este puțin acrișor (pH 5,6-6,1).

Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se utilizează la maturarea rapidă a salamurilor crude în care caz realizarea consistenței merge paralel cu acidifierea.

Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii pot fi livrate în stare lichidă subrăcită sau uscată. Adaosul în compoziție trebuie să asigure o concentrație de cel puțin 106-107/g pastă. Modul de folosire al culturilor starter concentrate este în funcție de modul lor de conservare. Cele congelate în antigel se utilizează ca atare; cele liofilizate se suspend în apă pentru o distribuție mai uniformă în compoziție.

Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria cărnii nu se amestecă cu sare, condimente, acid ascorbic, acizi alimentari și nici nu se păstrează în amestec cu substanțele menționate deoarece se inactivează rapid. De asemenea, trebuie să se aibă în vedere două situații particulare:

folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu adaos de GDL (glucono delta lactona). În condițiile folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt aduse la pH izolelectric și pierd apa de hidratare, azotitul de reduce bine la NO, se favorizează dezvoltarea bacteriilor lactice care produc și H2O2. Acidifierea rapidă împiedică însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se lucrează cu NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat să se folosească culturi starter concentrate de stafilococi care produc catalază, reduc azotatul la azotit și se pot dezvolta la pH 4,7 fiind și un bun producător de aromă;

folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice au acțiune bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este și alcoolul etilic și, deci, inhibă culturile starter. În acest caz se recomandă să se folosească o cantitate mult mai mare de cultură starter, pe de altă parte uleiurile eterice să fie încapsulate.

Condiții de calitate pentru culturile starter

Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii trebuie să îndeplinească următoarele condiții:

să fie tolerante la NaCl (concentrație 2,5-3%);

să se dezvolte bine în saramura de concentrație 6%;

să se dezvolte bine în prezență de 80-100 mg NaNO2/kg compoziție dar să acționeze și la temperatură mai scăzută (14-24C);

să producă numai acid lactic (culturile starter concentrate de bacterii lactice să cuprindă numai specii homofermentative);

să fie puțin lipolitice și proteolitice;

să nu producă mirosuri și gusturi nedorite din cauza produșilor secundari de metabolism;

să fie nepatogene (să nu producă infecții și să nu producă toxine);

să se adapteze compoziției de carne utilizată și condițiilor de fermentare a produselor, respectiv la creșterea concentrației de NaCl, la temperatura de afumare rece și de uscare, de activitate a apei care scade progresiv pe măsura uscării produsului;

să producă catalază și nitratreductază (cele cu micrococi, streptomicii, stafilococi);

să fie inactivate la 57-60C.

Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în special lactice și pediococi) prezintă următoarele avantaje

se micșorează durata de maturare a produselor carnate;

se îmbunătățesc proprietățile senzoriale (gust, miros, consistență);

se asigură un grad înalt de inocuitate produsului carnat (salamurile și cârnați cruzi) prin controlul dezvoltării microorganismelor patogene și de alterare și prin limitarea folosirii unor substanțe cu caracter toxic (amine și nitrozamine)

Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în compoziția salamurilor crude următoarele efecte:

acidifierea pastei cu următoarele consecințe:

scăderea pH-ului și deci aducerea proteinelor la punctul izoelectric deci și la starea de hidratare minimă, favorizându-se în acest fel uscarea;

reducerea mai rapidă și mai completă a NaNO2;

inhibarea microorganismelor patogene: Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl. botulinum;

producerea de substanțe de aromă;

controlul producției de amine biogene prin inhibarea bacteriilor cu activitate decarboxilazică (inhibare prin competiție față de nutrienți și, respectiv, prin acidifiere);

controlul producției de nitrozamine (aciditate formată, respectiv pH-ul scăzut favorizează transformarea NaNO2 în NO și deci rămâne în produs o cantitate mai mică de NaNO2 care ar putea intra în combinație cu aminele secundare pentru a forma nitrozaminele;

controlul microflorei de alterare și patogene prin producția de H2O2, bacteriocine.

Pediococii din culturile starter concentrate produc în compoziția salamurilor crude următoarele efecte:

acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai ridicate fără formarea de produși care să afecteze negativ gustul și mirosul;

producerea de H2O2, bacteriocine cu acțiune inhibitoare față de microorganismele patogene.

Factorii care influențează acțiunea fermentativă a bacteriilor din culturile starter

Capacitatea bacteriilor lactice din culturile starter de a fermenta zaharurile adăugate va depinde de: temperatura de fermentare, conținutul de NaCl din compoziție, nivelul de inoculare cu culturi starter a compoziției, nivelul florei de contaminare inițială a compoziției, starea fizică a culturilor starter, tipul de zahăr adăugat, cantitatea de zahăr adăugată.

Temperatura de fermentare. La alegerea temperaturii de fermentare trebuie să se țină seama ca fiecare tip de microorganism are un optim de creștere, exprimat prin numărul de diviziune (generații) pe oră. La această temperatură optimă, microorganismul respectiv are și activitatea cea mai mare. Cu cât temperatura de fermentare a unui salam este mai apropiată de temperatura optimă, cu atât bacterii le din cultura starter încep să producă acid cu o viteză mai mare.

Adaosul de NaCl. Așa cum s-a mai menționat NaCl are un rol de conservare, concentrații man de NaCl inhibând dezvoltarea microorganismelor, prin dezhidratarea acestora. Factorul de inhibare nu este reprezentat de conținutul total de NaCl ci de nivelul de NaCl dizolvat în apa liberă a compoziției. Din acest punct de vedere, microorganismele din cultura starter se comportă diferit, în funcție de concentrația de NaCl în mediul de fermentare. Cu cât nivelul de NaCl din apa liberă a salamurilor este mai mare, cu atât durata procesului va fi mai lungă.

Numărul de bacterii la etice din cultura starter. Acest număr determină de asemenea, viteza de fermentare. Astfel dacă numărul de bacterii lactice din cultura starter adăugată este mărit de 10 ori, durata fazei de LAG este redusă la jumătate, pH-ul final nu este modificat esențial.

Flora de contaminare. Este influențată din punct de vedere cantitativ/calitativ de condițiile de depozitare ale cărnii utilizate la fabricarea salamurilor crude. Carnea care a fost menținută pentru o durată mai mare în sălile de sacrificare sau în depozitele de refrigerare va conține un număr mai mare de bacterii de alterare care au capacitatea de a degrada proteinele și lipidele cu producerea de mirosuri nedorite.

Condiția fizică culturi starter. Se referă la forma de utilizare a acesteia congelată sau uscată prin liofilizare. În general, culturile starter congelate încep fermentarea mai repede decât cele liofilizate pentru același nivel de inocul.

Tipul de zahăr adăugat. Viteza de fermentare și cantitatea de acid format va depinde de tipul de zahăr adăugat. Fermentarea cea mai rapidă și respectiv acumularea cea mai mare de acid lactic are loc în cazul glucozei, urmând zaharoza, maltoza, maltodrexina, galactoza și rafinoza.

Modificările fizice care au loc la fabricarea preparatelor din carne crudă

Principala modificare fizică ce are la fabricarea salamurilor și cârnaților cruzi este legarea pastei, care constă în transformarea pastei crude într-o structură legată fermă, consistentă, elastică, caracteristică produsului finit.

La „legarea” pastei contribuie: acidifierea, NaCl, eliminarea apei, în special în faza de uscare.

Acidifierea propriu-zisă, așa cum deja s-a menționat, are loc în faza de afumare și în prima parte a fazei de uscare la produsele fără etuvare .

Acidifierea este provocată de microorganismele prezente în mod
spontan în pastă care fermentează zaharurile adăugate și fac ca pH-ul să scadă sub 5,4 care este pH-ul punctului izolitric al principalelor proteine din carne.

Clorura de sodiu dizolvată în apa conținută de carne extrage proteinele sarcoplasmatice (sarcoplasmă- gr. Sarcos, carne și plasma- formație- parte din citoplasma celulei sau a fibrei musculare) care au ramas în carne, după scurgerea acesteia (acolo unde operația de scurgere există) și o anumită cantitate de proteine miofibrilare care vin în contact cu particule de carne și de slănină în procesul de toc are.

O dată cu acidifierea pastei, proteinele extrase sunt denaturate și trec din starea de soluție în stare de gel care leagă într-un tot unitar particulele individuale de carne și slănină.

NaCl contribuie și la umflarea particulelor de carne care se leagă mai bine între ele. Legarea optimă a pastei are loc la 6% NaCl și la pH<5,5 adică în faza de uscare, când prin eliminarea apei se ajunge la creșterea concentrației de NaCl în faza apoasă.

Concentrația de NaCl este diferențiată pe straturi mai ales în produsele aflate în faza finală de uscare-maturare. Astfel în stratul periferic, concentrația de NaCl este ~6% în cel de mijloc 5% și în stratul interior ~4%.

În finalul uscării- maturării există tendința de migrare a NaCl din zonele cu concentrație crescută în zonele cu concentrația mai redusă, [apt explicabil, având în vedere afinitatea NaCl pentru apă, care este în procent mai ridicat în zonele centrale.

Eliminarea apei în procesul de uscare conduce treptat la întărirea salamului care devine compact.

Eliminarea umidității trebuie să se facă la o viteză optimă. Dacă apa este eliminată cu o viteză prea mică, se pot petrece fenomene nedorite și anume:

restabilire a ph-ului la valoarea inițială, datorită activității proteolitice a microflorei, consecință fiind înmuierea produsului, deși proteinele deja denaturate nu mai pot să se rehidrateze (acest lucru se petrece în sezonul cald când salamurile crude sunt scoase prematur de la uscare la maturare;

apariția unui gust exagerat de picant, hidroliza grăsimilor antrenând apariția proceselor de oxidare de tip acroleina (acroleina- aldehidă nesaturată CH2=CH-CHO, care se prezintă sub forma unui lichid cu miros înecăcios p.f 52oC. Se obține din glicerină prin pierderea a două molecule de apă);

o dezvoltare abundentă a micro florei de suprafață și în special a mucegaiurilor care fructifică și produsul se învârtește (în cazul produselor fără mucegai uri nobile pe membrană);

întârzierea uscării produsului.

Dacă apa este eliminată cu o viteză prea mare, acidifierea produsului este exagerată acesta căpătând gust acid.

Formarea aromei preparatelor din carne crudă

La formarea aromei salamurilor și cârnaților cruzi contribuie:

componentele cărnii și ale slăninii, ale condimentelor (preexistente în materiile prime și auxiliare);

substanțele de aromă din fum (în cazul produselor afumate la rece);

substanțele de aromă care se formează în decursul fermentației

(maturării) din glucide, proteine, lipide.

Materia primă (carnea) contribuie cu substanțe de gust și de miros ca atare și cu precursori de gust și miros, care formează așa numita fracțiune nevolatilă, solubilă în apă: aminoacizi liberi, dipeptidele carnozină și anserină, tripeptidul glutation, creatină, creatinină, glucide simple și fosforilate, săruri anorganice, nucleotide și nucleozide, baze purinice și pirimidinice, acid lactic și alți acizi organici, uree, compuși cu sulf etc.

Din slănină intervin în gust și miros acizii grași liberi și fosfolipidele. Substanțele de gust și de miros din condimente și din fum au o contribuție însemnată la formarea aromei salamurilor și cârnaților cruzi, mai ales că pe parcursul uscării are loc o concentrare a acestor substanțe.

Cea mai importantă contribuție o au produsele de aromă (gust și miros) formate în cursul fermentației (maturării din zaharurile adăugate, din aminoacizii existenți sau din cei formați prin hidroliza proteinelor, precum și cele formate prin degradarea lipidelor (lipoliză și oxidare).

La gustul produselor fermentate participă și NaCl adăugată.

De remarcat că aroma salamurilor crude este în strânsă dependență de gradul de acidifiere a compoziției. La salamurile crude etuvate, cu maturare scurtă, gustul predominant este cel acrișor (dat de acidul lactic) care se suprapune peste gustul dat de alte componente.

La salamurile crude cu maturare lungă, aroma este mal pronunțată, gustul acrișor nefiind perceptibil.

Procese microbiologice la prelucrarea și conservarea cărnii

Carnea este un aliment valoros din punct de vedere nutritiv, datorată prezenței surselor de carbon și de energie (glicogen, acid lactic rezultat prin glicoliză), surselor de azot (proteine asimilabile), sărurilor minerale, vitaminelor, unui conținut de apă liberă de 67 (carnea de vită) – 71 % (carnea de pui), încât asigură condiții favorabile pentru creșterea microorganismelor, în special a bacteriilor de putrefacție.

După sacrificarea animalului, carnea poate să sufere procese aseptice datorate enzimelor din țesutul muscular, care pot să producă prin maturare îmbunătățirea valorii cărnii, sau procese microbiologice, care pot să ducă la alterarea cărnii și la risc în consum.

Surse de contaminare microbiană a cărnii

Animalul viu sănătos conține în mușchi un număr foarte redus de microorganisme (absente sau o celulă la 100g). Dacă animalul este obosit înainte de sacrificare sau este bolnav, microorganism ele, care sunt vehiculate prin circuitul sanguin, nu mai sunt distruse de către fagocite și se pot concentra și localiza în anumite organe: rinichi, ficat, splină. Când animalul este bolnav, microorganismele patogene răspândite în organism pot fi transmise după sacrificare prin intermediul cărnii contaminate dintre patogene, care se pot transmite pe cale digestivă prin consum de carne contaminată, fac parte:

Mycobacterium tuberculosis (tip bovis), agent al tuberculozei, care este inactivat prin tratamentul termic al cărnii la 80 … 85șC, timp de 10 minute, astfel, animalele bolnave sunt sacrificate separat și carnea este pasteurizată la 85°C timp de 30 minute;

Bacillus anthracis, agent al anthraxului, care se poate transmite prin carne de ovine;

alte specii, care pot aparține genurilor: Francisella, leptospira, Brucella, Coxiella ș.a. care produc infecția pe cale cutanată.

Contaminarea cărnii se poate produce și în momentul sacrificării; prin contactul cuțitului cu plaga jugulară pot fi antrenate microorganisme de pe suprafața pielii și părului, care sunt transmise în organismul în starea de agonie, prin circulația sângelui. Dacă, după sacrificare, nu se face rapid răcirea și eviscerarea, ca urmare a creșterii permeabilității pereților celulari și ca urmare a stresului suferit de animal, la sacrificare se poate produce un transfer al microorganismelor din viscere și are loc contaminarea cu microorganisme de origine intestinală, enterobacterii, din care sunt facultativ patogene/patogene: Salmonella typhi, Klebsiella, Listeria monocitogenes, Yersinia enterocolitica, proteus, Escherichia coli.

Contaminarea internă a țesutului muscular, care se produce postmortem, este redusă. În funcție de condițiile mediului ambiant și de păstrarea condițiilor igienice la procesarea cărnii (jupuire, eviscerare, despicare, toaletare), are loc contaminarea externă. Dacă în urma contaminării interne în carne poate exista 1 celulă la 10g sau 1 celulă la l00g, prin contaminare externă numărul de celule poate ajunge la 102 – 103 cm-2 suprafață carne/carcasă.

În cazul bovinelor, contaminarea externă se poate produce la jupuire, atunci când, accidental, părul care are o încărcătură microbiană de 107-108. g-l vine în contact cu carnea, din surse umane, prin mâini murdare și mai ales când eviscerarea este defectuoasă.

În cazul porcinelor, contaminarea microbiană poate avea loc mal intens dacă opărirea se face pe orizontală, prin imersarea în bazine cu apă la 64 … 65șC. Prin repetarea opăririi, apa se încarcă cu microorganisme și există pericolul ca pulmonii să se încarce cu un număr mare de microorganisme, mărind riscul de contaminare, la prelucrare.

Din punct de vedere microbiologie, prin contaminarea externă pot ajunge pe carne bacterii din genurile: Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinetobacter, Bacillus, Clostridium, Micrococcus ș.a., bacterii de putrefacție, care se pot dezvolta pe carne în condiții de refrigerare.

Factorii care condiționează dezvoltarea microorganismelor în carne

Transformările pe care le pot produce microorganismele contaminate ale cărnii sunt dependente de factori intrinseci (compoziție, aw, pH, rH) și extrinseci (temperatura de păstrare a cărnii).

Accesul microorganismelor, situate la suprafața cărnii, la nutrienți este dificil, ca urmare a izolării acestora de către pereții celulelor din țesut.

Carnea în carcasă este mal greu alterabilă decât carnea tocată, tocmai datorită acestor bariere naturale.

Carnea are un aw, de 0,98 – 0,99 optim pentru dezvoltarea tuturor microorganismelor, inclusiv a bacteriilor care necesită cele mai ridicate valori. Prin zvântarea cărnii în carcase, aceste valori optime se reduc și sunt create condiții favorizante pentru microorganisme xerofile (mucegaiuri).

În țesutul viu și, imediat după sacrificare, valoarea potențialului de oxidoreducere este în domeniul pozitiv, deci este favorizată dezvoltarea microbiotei aerobe. După 4-6 ore de la sacrificare, deoarece oxigenul nu mai este furnizat prin circulația sângelui, potențialul redox devine negativ (- 50 m V) și este posibilă dezvoltarea bacteriilor anaerobe de putrefacție.

Valoarea pH-ului cărnii joacă un rol important în demararea proceselor de alterare a cărnii. Carnea are un pH = 6,5 – 7, favorabil dezvoltării bacteriilor de putrefacție. După sacrificare, la animalul sănătos, se instalează rigiditatea, deoarece în urma procesului de glicoliză catalizat de enzime ale țesutului se formează acid lactic, iar din acizii adeninici se eliberează grupări fosfat. Prin acest complex se formează complexe rigide asociate cu o scădere a pH-ului la 5,5 – 5,7, cu efect inhibitor asupra înmulțirii bacteriilor. Faza de rigiditate, care poate dura câteva ore, este continuată cu o maturare biochimică datorată activității enzimelor proteolitice tisulare, cu formare de proteine mai solubile ușor asimilabile și, ca rezultat al reacțiilor de dezaminare, crește pH-ul la valori 6 – 6,5, favorabile bacteriilor de putrefacție.

Dintre factorii extrinseci, temperatura are un rol major la conservarea calității cărnii. Prin răcirea cărnii, imediat după sacrificare și păstrarea în condiții de refrigerare, este încetinită atât înmulțirea microorganismelor cât și producerea de toxine bacteriene. Astfel, dacă păstrarea se face la + 10°C, producerea de toxine de către specii ale genului Clostridium este oprită, iar, la păstrarea la temperaturi sub +3°C, producerea de toxine este inhibată pentru toate bacterii le toxicogene. Pentru păstrarea cărnii și oprirea înmulțirii bacteriilor de putrefacție se recomandă temperatura de 0șC (în condiții de vacuum), iar la temperatura de -18°C este oprită total înmulțirea microorganismelor în carne. Se consideră că Listeria monocytogenes, agent al listeriozei, poate suferi modificări neletale sau subletale în carnea de vită tocată, congelată la -18°C.

Alterările microbiene ale cărnii sunt dependente de natura și de concentrația de microorganisme, de tipul de carne, de umezeala relativă din depozit și de temperatura de păstrare. Astfel, alterarea cărnii este specifică și, în funcție de factorii enumerați, aceasta poate fi provocată de 1-4 specii, deși pe carne există o microbiotă mult mai complexă. Se pot întâlni următoarele tipuri de alterări:

alterarea superficială prin păstrarea cărnii la temperaturi de 0…10șC, care se produce lent, deoarece temperaturile scăzute scad viteza de metabolism a microorganismelor, iar modul de alterare este dependent de umezeala relativă a aerului din depozit. Dacă acesta este mai mare de 80-90% și suprafața cărnii este umedă, este favorizată înmulțirea bacteriilor psihrofile și psihrotrofe ale genului Pseudomonas.

În carnea alterată, la creșterea numărului de bacterii la valori de aproximativ 107. cm-2 este sesizat mirosul de putrefacție, iar la creșterea peste 108. cm-2, acesta este asociat cu formarea de mucus. Mucusul rezultă în urma juxtapunerii sau coalescenței între coloniile de bacterii și a modificării structurii proteinelor din zona superficială. Dintre bacteriile producătoare de mucus fac parte cele ce aparțin genului Pseudomonas, bacterii gram-negative, aerobe, cu activitate lipolitică și proteolitică, cu specii Ps. fluorescens, Ps. ambigua, Ps. fragi, Ps. putida, și genuri: Aeromonas, Micrococcus.

La păstrarea cărnii în depozit cu umezeală relativă a aerului mai mică de 75%, când suprafața cărnii este zvântată, alterarea poate fi produsă de către drojdii și mucegaiuri.

Mucegăirea, care apare vizibilă după 1-2 săptămâni de păstrare, atunci când aw-ul este suficient de scăzut pentru a nu permite creșterea bacteriană. Dacă în prima fază de dezvoltare mucegai urile se pot îndepărta prin spălare, o dată cu sporularea se constată o pătrundere a hifelor în carne, pe distanțe de 1-2 cm, și prin spălare rămân pete inestetice, având loc deprecierea cărnii. Dintre mucegaiurile care se pot dezvolta pe carne în condiții de refrigerare fac parte: Cladosporium herbarum, Sporotrichum carnis (care se poate dezvolta pe carne la temperatura minimă de creștere de -5,7°C), Thamnidium elegans, specii ale genului Penicillium. Mucegăirea este uneori asociată cu creșterea drojdiilor psihrotrofe din genurile: Candida (produce lipaze ce catalizează râncezirea), Rhodotorula, Debaryomyces;

Alterarea superficială și de profunzime, care poate avea loc prin menținerea cărnii la temperaturi de 10 … 25oC (casnic, pe rețeaua de livrare etc.). Această alterare are loc și atunci când răcirea se face lent după sacrificare și păstrarea se face la temperatura mediului ambiant. Poate să fie evidențiată după 2-1 zile de la sacrificare și este datorată dezvoltării bacteriilor aerobe de putrefacție psichrotrofe și mezofile aparținând genurilor: Pseudomonas, Lactobacillus (Lb. viridiscens, Lb. fermenti), Brochothrix thermosphacta, formatoare de mucus.

Pe lângă alterarea de suprafață în etapa finală se poate produce o alterare de profunzime, mai frecvent în partea posterioară a carcaselor, unde răcirea are loc lent și este produsă de bacterii ale genului Bacillus și Clostridium (Clostridium perfringens). Carnea alterată prezintă o culoare cenușiu-verzui, ca urmare a formării de către microorganisme a apei oxigenate care reacționează cu pigmenții cărnii, formând choleglobina, sau prin eliberare de H2S prin putrefacție, care transformă oxihemoglobina în sulfomioglobină (thiomthemoglobină) de culoare verzuie.

În cazul în care concentrația de bacterii ale genului Bacillus cu speciile: Bacillus megatherium, Bacillus subtilis-mesentericus este mai mare de 103. g-l, în urma formării de acid propionic prin fermentație ca și prin eliberarea de acizi grași prin hidroliza grăsimilor din țesutul adipos, carnea capătă un miros acru, de „încins”.

Alterarea profundă, care poate avea loc în carne cu contaminare internă, la temperaturi de 20 …45șC. Această alterare se produce când nu se face răcirea după sacrificare și climatizarea spațiilor de depozitare a cărnii este necorespunzătoare. Alterarea poate să fie sesizată după 4-8 ore, mai ales dacă eviscerarea nu este făcută imediat după moartea animalului și este datorată bacteriilor anaerobe ale genului Clostridium.

În prima etapă sunt active clostridii glucidolitice care pot folosi în nutriție glicogenul cu specia predominantă Clostridium perfringens; în această fază nu este sesizat mirosul neplăcut dar, datorită formării prin fermentație a gazelor CO2 și H2 mușchiul devine buretos. În etapa a II-a, activitatea predominantă aparține bacteriilor anaerobe de putrefacție: Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens ș.a. care formează, prin degradarea protidelor din carne, amine toxice și alți produși finali care imprimă un miros dezagreabil, specific.

Particularități ale microbiotei cărnii de pasăre

Carnea de pasăre are valoare nutritivă ridicată și umidități de până la 70%, încât este un produs ușor alterabil. Carnea păsărilor vii poate suferi o contaminare internă, în special cu bacterii ale genurilor: Salmonella, Corynebacterium, Flavobacterium și Moraxella. În timp ce contaminarea internă este ocazională și limitată, contaminarea externă este frecventă și are loc în cursul diferitelor operații tehnologice. Astfel, la opărire și deplumare se poate produce o contaminare masivă cu microorganisme (provenite din sol, apă, materii de dejecție), aflate pe suprafața penelor. Eviscerarea în abatorul de păsări se face prin vacuumare și dacă au loc, accidental, rupturi ale intestinelor, se produce contaminarea cu bacterii din microbiota intestinală, respectiv enterococi și enterobacterii: Escherichia, Salmonella, Campylobacter ș.a. O reducere a numărului de microorganisme are loc la clătirea carcaselor cu apă potabilă sau cu apă clorinată.

Alterarea cărnii de pui se face mai rapid decât cea a cărnii de vită și este datorată bacteriilor din genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella. În carnea de pasăre ambalată prin vacuumare se poate produce acrirea cărnii datorată activității bacteriilor facultativ anaerobe din genurile Lactobacillus și Brohothrix. În cazul în care prin activitatea bacteriilor de putrefacție au rezultat amine toxice, consumul cărnii este riscant, deoarece aminele sunt termostabile și rezistă la tratamente termice lejere.

Particularități ale microbiotei cărnii de pește

Peștele viu prezintă o microbiotă similară în componență cu cea a apei în care trăiește. Microorganismele sunt reținute, prin procesul de filtrare al apei, pe suprafața branhiilor sau sunt adsorbite de mucus. Mucusul natural situat la suprafața peștelui are însușiri bactericide în raport cu unele specii, dar acestea se pierd după ce peștele este recoltat.

Alterarea peștelui se produce rapid, datorită migrării microorganismelor din intestine ca urmare a permeabilizării post-mortem a acestora, motiv pentru care este obligatorie eviscerarea rapidă a peștelui. În timp ce peștii de apă dulce au în cantitate mare bacterii de putrefacție ale genului Alcaligenes, la peștii din ape sărate predomină genul Flavobacterium. Din microbiota intestinală prin migrare în carne se pot întâlnii specii ale genurilor: Pesudomonas, Clostridium, Bacillus, Escherichia, Vibrio, Campylobacter.

Alterarea peștelui la păstrare în condiții de refrigerare se produce mai lent și este dată de bacterii ale genurilor: Achromobacter, Flavobacterium ș.a. și mai rapid la temperatura camerei, când se produce putrefacția dată de bacterii din genurile: Proteus, Escherichia. Peștele păstrat neeviscerat suferă alterarea asociată cu umflarea, datorată formării de gaze: CO2, H2, H2S, de către bacterii din genul Clostridium.

Prin consum de pește alterat se pot produce intoxicații grave, ca urmare a prezenței de toxine produse de bacterii toxicogene sau a aminelor biogene toxice.

Alterarea sesizabilă a cărnii de pește are loc la creșterea numărului total de bacterii peste 105 . g-l, iar dacă numărul depășește valoarea de 106 celule. g-l, peștele nu se admite în consum.

Microorganisme transmisibile prin carne și factori de risc

Prin consum de carne contaminată, există riscul de transmitere a următoarelor grupe de microorganisme:

microorganisme patogene provenite prin contaminare internă în timpul vieții și vehiculate prin carne, microorganisme care produc stări de infecție după ingerare și învingerea forțelor de apărare a organismului, dând boli ca, de exemplu: bruceloza, rujetul, tuberculoza, leptospiroza ș.a;

microorganisme patogene și facultativ patogene ce provin din contaminare externă prin contact direct la manipularea cărnii, din diferite surse: sol, apă, insecte, sursă umană. Din acest grup fac parte specii ale genurilor: Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Clostridium, Escherichia ș.a.

Defectele și alterările microbiene

Se pot întâlni tipurile de defecte și de alterări prezentate în continuare.

Formarea de mucus la suprafața batoanelor, datorată dezvoltării bacteriilor sau drojdiilor, este favorizată de umiditatea ridicată sau de apariția apei de condens. Se poate forma frecvent la suprafață sau sub membrană; formarea este datorată bacteriilor aerobe și facultativ anaerobe din genurile/speciile: Pseudomonas, Aeromonas, Lactobacil/us viridiscens, Microbacterium thermosphactum. În anumite condiții, formarea de mucus și apariția petelor albe pot fi datorate dezvoltării de drojdii halotolerante cu specia Debaryomyces hansenii.

Mucegăirea este un defect de suprafață și poate fi datorată mucegaiurilor ce se pot dezvolta în domeniul de refrigerare și care pot proveni din contaminare externă (aer, mâini, utilaje). Dintre mucegaiurile ce dau pete inestetice și colorate fac parte genurile: Penicillinum, Cladosporium, Thamnidium, Aspergillus.

Colorarea cu apariția de pete albastre, rar întâlnită este determinată de unele bacterii din genul Chromobacterium cianogenum ce pot proveni din sare sau aer.

Acrirea și înverzirea pastei este un defect întâlnit la prospături (parizer, polonez) și se datorează dezvoltării bacteriilor lactice heterofermentative, care se pot înmulți În anumite condiții, dând acrirea ca rezultat al formării de acid lactic. Deoarece aceste bacterii produc apă oxigenată, în absența catalizei inactivate prin pasteurizare, aceasta poate produce oxidarea pigmenților roșii ai cărnii cu formare de porfirine de culoare verde.

Înverzirea poate fi: superficială, sub formă de inel situat la o anumită distanță de suprafață; sau în zona centrală a umpluturii, în funcție de viabilitatea bacteriilor heterolactice, activitatea lor fermentativă și activarea catalazică.

Acest defect se caracterizează și prin modificarea gustului și este dat de bacterii lactice din genul Leuconostoc și Lactobacillus cu speciile: Lb. viridiscens, Lb. plantarum, Lb. leichmani, apare frecvent la preparatele din carne cu adaos de ficat, splină.

Umflarea apare la prospături și este un defect rar întâlnit, atunci când în pastă sunt prezente bacterii ale speciei Clostridium perfringens. În cazul în care concentrația în celule este mare, are loc o fermentație cu producere de gaze (CO2 și H2), care determină umflarea, pasta este buretoasă și, prin consum, există riscul de toxiinfecție alimentară.

Amidonul este un polizaharid de rezervă specific vegetalelor, care constă dintr-un număr mare de molecule de glucoză unite prin legături α-glucozidice. Se găsește în:

țesuturile fotosintetice;

țesuturile de rezervă: semințele plantelor, tuberculi și rădăcini.

Amidonul se extrage din:

semințele cerealelor: amidonurile cerealiere: grâu, porumb, orez, orz, manioc;

semințele leguminoaselor. amidonurile leguminoase: linte, mazăre, fasole;

rădăcini și tuberculi: amidon de cartofi; amidon de tapioca;

tulpini: amidon de sago;

fructe: amidon de banane.

Plantele utilizează amidonul ca o cale de depozitare a excesului de glucoză, sub formă de granule și, de asemenea, utilizează amidonul ca aliment în timpul fosforilării oxidative în mitocondrii. Amidonul este polizaharidul cel mai utilizat în dieta omului (cerealele, rădăcinile și tuberculi sunt sursele principale de amidon din dieta zilnică).

Structura amidonului

Granula de amidon prezintă trei niveluri de structură:

nivel molecular sau structura chimică;

microstructură;

nivel cristalin.

Structura chimică – Amidonul are următoarea formulă chimică (C6H10O5)n. El este un homopolimer al D-glucozei, la care unitățile de D-glucoză sunt legate, între ele, în principal, prin legături α-(1,4) glicozidice (95-96%) și legături α-(1,6) glicozidice (5-4%). Legătura α-(1,4) glicozidică este o legătură axială ecuatorială, cu un unghi ascuțit, ceea ce permite lanțului liniar de α-glucan să se plieze și să se răsucească. În stare solidă, lanțurile liniare au forma unui resort comprimat, helix cu 6 unități de glucoză la o spiră. Fiecare lanț de α-glucan prezintă la extremitatea sa în poziția C1 o funcție pseudoaldehidică reducătoare.

Amidon este un amestec de doi polimeri cu structuri primare diferite:

amiloza cu structură liniară, în proporție de 20-25%;

amilopectina cu structură ramificată, în proporție de 75-80%.

În funcție de raportul dintre cei doi polimeri se deosebesc următoarele tipuri de amidon:

amidon comun: amiloză 25-26%; amilopectină 75-74%;

amidon ceros: amilopectină în proporție de 97-99%;

amidon amilozic, cu conținut de amiloză de până la 50-80%.

Granula de amidon purificată conține și o serie de componente minore: proteine, lipide, substanțe minerale (<1%, în funcție de tipul de amidon) care influențează comportamentul amidonului în timpul proceselor de transformare și calitatea produselor finite.

Atât amiloza, cât și amilopectina conțin polimeri ai unităților de D-glucoză în conformația 4C1. La amiloză acestea sunt legate α-(1,4) cu toți atomii de oxigen din ciclu de aceeași parte, pe când la amilopectină apar și legături α–(1,6) care se formează la punctele de ramificație.

În figura 9.32. este indicată structura chimică atat a amilozei cat si a amilopectinei.

Figura 9.32. Structura amilozei și amilopectinei

Amiloza conține în principal un singur lanț neramificat cu 500-20000 unități de D-glucoză legate α- (1,4), în funcție de sursă (doar câteva ramificații α – (1,6) și grupări fosfat legate au putut fi găsite, dar acestea au o mică influență asupra comportamentului moleculei). Amiloza poate căpăta o formă extinsă (raza hidrodinamică 7-22 nm) dar, în general, tinde să se înfășoare într-un singur helix puternic răsucit la stânga. Helixul simplu al amilozei are hidrogenul care leagă atomii O2 și O6 pe suprafața exterioară a helixului și numai oxigenul ciclului care se leagă la interior. Hidrogenul care leagă lanțurile aliniate determină retrogradarea și unele eliberări ale apei legate (sinereza). Aceste lanțuri aliniate pot apoi forma cristalite cu benzi duble care sunt rezistente la actiunea amilazelor. Acestea posedă legături de hidrogen extinse inter și intra-benzi, care conduc la o structură hidrofobă cu solubilitate redusă. Conținutul de amiloză al amidonului este cauza principală a formării amidonului rezistent. Helixul singular al amilozei se comportă similar cu cilodextrinele. Amiloza formează complexe cu moleculele hidrofobe: iod, catene de hidrocarburi și acizi grași. Reacția de complexare cu iodul stă la baza caracterizării analitice a amidonurilor și la stabilirea gradului de hidroliză a acestuia, culoarea complexului format între lanțurile liniare și I2 fiind influențată de lungimea lanțului. Lanțurile cu grade de polimerizare (GP) diferite dau culori, de asemenea, diferite:

GP = 9-12 formează complexe de culoare galben-brun până la brun;

GP = 12-15 formează complexe de culoare brun până la roșu;

GP> 15 formează complexe de culoare violet până la albastru.

Amilopectina este componentul ramificat al amidonului format din resturi de α-D-glucopiranoză cuplate, în principal, prin legături α-(1,4) și legături de ramificate α-(1,6) în proporție mică. În figura 9.32. este indicată structura chimică a amilopectinei. Fiecare moleculă de amilopectină conține un milion de resturi de glucoză, aproximativ 5% formează puncte de ramificare. Amilopectina are structura formată dintr-un ansamblu de ciorchine (cluster, figura 9.33), care cuprinde:

lanțuri scurte exterioare neramificate (lanțurile A), cu GP 15-16;

lanțuri ramificate interne (lanțurile B), cu GP 40-45;

lanț care conține gruparea reducătoare (lanțul C).

Figura 9.33. Modelul structural al amilopectinei

Microstructura – Amiloza și amilopectina se asociază între ele prin legături de hidrogen și se aranjează radiar în straturi pentru a forma granula de amidon. Granula de amidon se prezinta ca o matrice amorfa în care se găsesc presărate zone cristaline. Granulele native de amidon prezinta susceptibilitate redusa la acțiunea enzimelor hidrolitice datorită prezenței zonelor rezistente (cristaline). Zonele amorfe prezintă susceptibilitate ridicată la acțiunea enzimelor hidrolitice

Granulele de amidon au mărimi diferite, care variază de la 3 la 100µ. Amidonul de grâu are o distribuție mai largă atât a granulelor mici, cât și a celor mari. Forma granulelor, de asemenea, poate fi diferită și să includă: sfere simetrice și asimetrice, discuri simetrice și asimetrice, poliedre.

Nivelul cristalin – Zonele cristaline sunt constituite din lanțuri liniare scurte (tip A) ale amilopectinei, cu GP cuprins între 15-20, periodicitatea cristalitelor (50–60Å) datorându-se legăturilor ramificate α-(1,6) glicozidice (Figura 9.34).

Figura 9.34. Structura cristalină a amilopectinei

Din punct de vedere al tipului de cristalinitate, amidonurile se clasifică în:

amidon tip A, caracteristic amidonurilor cerealiere;

amidon de tip B, care cuprind: amidonurile din tuberculi; amidonurile bogate în amiloză, >40%; amidonurile retrogradabile;

amidonul tip C, caracteristic amidonurilor leguminoase, care corespund unui amestec de structuri tip A și B.

Solubilitatea amidonului

La temperatura camerei și la un pH cuprins între 3-10, granulele de amidon sunt insolubile, datorită organizării interne a granulelor de amidon nativ, în ciuda faptului că amidonul este o moleculă puternic hidroxilată și, deci, hidrofilă. Granulele native de amidon sunt insolubile în apă, dar se umflă ușor și devin parțial hidratate. Sistemul apă-amidon este multifazic, datorită prezenței amilopectinei și amilozei, două structuri cu comportamente diferite față de apă.

Pentru solubilizarea amidonului se aplica un tratament hidrotermic (peste 60oC), când are loc distrugerea ireversibilă a granulei de amidon. Acest fenomen poartă denumirea de gelatinizare.

Gelatinizarea amidonului. Gelatinizarea amidonului este una din cele mai importante proprietăți fizice ale amidonului. Gelatinizarea amidonului este un proces relativ complex care implică distrugerea structurii ordonate a granulelor de amidon și decurge diferențiat după specia botanică și cristalinitatea amidonului nativ.

În cazul aplicarii tratamentelor hidrotermice granulele de amidon trec succesiv prin stadiile:

granula umflata – inițial (20 – 60oC), granulele de amidon se umflă ca rezultat al absorbției a 30-40% apă.

granula gelatinizata – la atingerea temperaturii de gelatinizare 60 la 85oC granulele de amidon se umfla tangential si simultan si isi pierd birefringenta si cristalinitatea datorita ruperii legaturilor de H. În intervalul de temperatura mentionat este absorbită mai multă apă de amiloplaste, acestea se rup și amiloza este prima componentă eliberată, urmată apoi de producerea simultană a două fracțiuni de amidon.

granula solubilizata – la creșterea ulterioară a temperaturii rezultă dezintegrarea granulelor în fragmente mai mici și în distrugerea amilopectinei. Creste solubilitatea si transparenta pastei, precum si vascozitatea solutiei de amidon. Gelatinizarea totală se asigură atunci când amidonul pierde structura cristalină.

Factorii care influențează gelatinizarea amidonului sunt:

conținutul de apă;

concentrația amidonului;

natura amidonului;

enzimele de degradare;

alți factori de mediu: conținutul de grăsime; conținutul de proteine; temperatura care determină: absorbția apei de amiloplaste, ruperea amiloplastelor, formarea rețelei de amidon, hidratarea rețelei ruperea rețelei în diferite puncte, gelatinizarea; legăturile de hidrogen. Gelatinizarea amidonului este fundamentală pentru diferite tipuri de produse alimentare: pâine și produse de patiserie; paste făinoase; snack-uri pe bază de amidon; cereale pentru micul dejun; făinuri pregelificate; produse pentru copii (baby foods). Gradul de gelatinizare a amidonului poate fi determinat calitativ și cantitativ prin: metode fizice; chimice și biochimice; prin pierderea birefringenței; creșterea vâscozității și susceptibilității la enzime; descreșterea entalpiei, prin rezonanță magnetică de protoni; prin calorimetrie de scanare diferențială; prin pierderea patern-ului de difracție în raza X și cu ajutorul biosenzorilor pentru maltoză. Proprietățile reologice ale dispersiilor de amidon evidențiază comportamentul nenewtonian, tixotrop și vâscoelastic, condiționate de: originea amidonului, temperatură, concentrație, cinetica încălzirii și agitare.

Prin racirea pastelor de amidon au loc reorganizari ale amilozei si amilopectinei, fenomen care poarta denumirea de retrogradarea amidonului.

Retrogradarea amidonului este fenomenul de trecere ireversibilă a macromoleculelor din stare solubilizată sau puternic umflată, în forme insolubile sau microcristalite.

Obținerea amidonului din porumb

Schema tehnologica de obținere a amidonului din porumb este prezentată în figura 9.35.

Prelucrarea biotehnologică a amidonului

Prelucrarea biotehnologică a amidonului presupune trei tipuri de transformări:

hidroliza amidonului cu obținere de maltooligozaharide, maltodextrine, sirop de maltoză, sirop de glucoză și dextroza;;

izomerizarea glucozei cu obținere se izosirop;

reacții de sinteză cu obținere de ciclodextrine și zaharuri de sinteză. În figura 9.36. sunt prezentate procesele enzimatice folosite în industria amidonului.

Figura 9.35. Schema tehnologică de obținere a amidonului din porumb

Figura 9.36. Principalele transformări enzimatice din industria amidonului

9.4.1. Hidroliza amidonului

Hidroliza industrială a amidonului cuprinde două etape de transformare:

lichefierea – dextrinizarea amidonului prin care se urmărește solubilizarea macromoleculei de amidon și creșterea stabilității soluțiilor obținute la temperaturi <60o, în vederea zaharificării. Lichefierea este procesul de scădere bruscă a vâscozității dispersiilor de amidon. Dextrinizarea este procesul de depolimerizare hidrolitică a amidonului, cu formare de dextrine cu mase moleculare diferite în funcție de condițiile tratamentului. Pentru lichefiere – dextrinizare se folosesc acizi (HCl, H2SO4 sau, acid oxalic) sau α-amilaze termostabile. Reacția care are loc este următoarea:

În această etapă se obțin, în afară de prehidrolizate, ce se supun zaharificării și maltodextrine, care sunt oligozaharuri liniare sau ramificate cu 5-10 unități de glucoză și care sunt caracterizate printr-un echivalent de dextroză (DE) <20;

zaharificarea prehidrolizatelor pentru obținerea de siropuri de glucoză sau dextroză, siropuri de maltoză sau de maltooligozaharide. Pentru zaharificare se folosesc enzimele: α-amilaza fungică, β-amilaza, amiloglucozidaza, exomaltohidrolaze, enzime de deramificare, cum este pullulanaza. Gradul de conversie a amidonului la hidroliză se caracterizează prin echivalentul de dextroză sau DE. DE reprezintă puterea reducătoare a unui hidrolizat, exprimat în raport de dextroză (α-D-glucoză pură, cristalină) în procente față de substanța uscată.

A. Lichefierea – dextrinizarea amidonului se realizează în următoarele scopuri:

– obținerea unor hidrolizate cu vâscozitate redusă, în cazul unor concentrații ale suspensiei de amidon >30%, pentru o, prelucrare eficientă a acestora în etapa de zaharificare;

– solubilizarea totală a macromoleculelor de amidon, astfel încât, substratul să se găsească într-o stare moleculară care să permită o interacțiune ,maximă enzimă-substrat.;

– crearea unor condiții pentru o separare cât mai ușoară a constituenților neamidonoși;

– dextrinizarea până la un grad de hidroliză exprimat ca DE al prehidrolizatelor, care să nu permită retrogradarea acestora decât în limite foarte mici. În această etapă se realizează valori ale lui DE, cuprinse între 20-20, valorile optime fiind de 14-18, atunci când etapa de dextrinizare precede etapa de zaharificare.

Pentru realizarea lichefierii – dextrinizării se utilizează metodele:

– metoda hidrolizei acide cu HCl, H2SO4 sau mai rar acid oxalic, în sistem discontinuu sau continuu. În sistem discontinuu hidroliza amidonului decurge conform schemei prezentate în figura 9.37. Hidroliza acidă în sistem continuu presupune trecerea suspensiei acidulate printr-un schimbător de căldură la temperatura de 140-160oC, timp de 5-6 minute;

Figura 9.37. Hidroliza acidă a amidonului în sistem discontinuu

metoda mixtă, acidă și enzimatică constă în hidroliza acidă sub presiune, urmată de tratarea cu α-amilază bacteriană, mai rar cu α-amilază fungică;

metoda enzimatică este aplicată pentru obținerea dextrozei (DE 100) și a siropului de glucoză cu DE>80. Enzimele folosite sunt: α-amilaza moderat termostabilă și α-amilaza termostabilă. α-amilazele sunt endoenzime specifice legăturilor α-(1,4). Ele depolimerizează amidonul până la glucoză și oligozaharide (α-dextrine care au legături α-(1,4) și un număr limitat de ramificații α-(1,6), maltotrioză, maltoză). Cele mai multe α-amilaze au activitate optimă la pH 4,8-6,9 și la 40-50oC. α-Amilazele hidrolizează catenele α-glucozidice începând din capătul nereducător cu eliberare exclusivă de maltoză. Au fost izolate și exoenzime care eliberează maltotrioză, maltotetroză sau maltohexoză. Pentru lichefierea – dextrinizarea enzimatică a amidonului se utilizează 2 tehnici:

a) cu o singură doză de enzimă: α-amilază. În acest caz se folosesc α-amilaze stabile la temperaturi ridicate (α-amilaze termodurice, temperaturi < 90oC), sintetizate de bacteriile:

Bacillus licheniformis: se folosesc preparatele enzimatice comerciale Termamyl, Optitherm; Rohalase AT;

Bacillus stearothermophius: se foloseste preparatelul enzimatic comercial Nervanase sau amestecuri de 2 amilaze: Termamyl KLLS și Nervanase.

În prezent se utilizează α-amilaze acidofile (Termamyl LS, pH 5,4), care prezintă avantajul că formează cantități mai mici de maltuloză și compuși de culoare la valori de pH < 5,5. În figura 9.38. este prezentată schema de dextrinizare – lichefiere enzimatică într-o singură treaptă.

Figura 9.38. Schema de lichefiere – dextrinizare enzimatică a amidonului într-o singură treaptă

b) cu adaos de enzimă în două trepte (figura 9.39).

Figura 9.39. Schema tehnologică de lichefiere – dextrinizare enzimatică a amidonului cu α-amilază moderat termostabilă în două trepte

Producerea maltodextrinelor

În etapa de lichefiere – dextrinizare se obțin:

prehidrolizate, care se valorifică în etapa de zaharificare;

maltodextrine, produse de hidroliză a amidonului cu DE <20%.

Prin variația concentrației substratului, concentrației enzimei, regimului de temperatură și a duratei de hidroliză se obține o gamă largă de maltodextrine, cu caracteristici diferite. Dintre maltodextrinele tipice, cele mai cunoscute sunt maltodextrinele Maltrin, cu DE și conținuturi de glucoză, maltoză și maltotrioză diferite. Un tip special de maltodextrine sunt maltodextrinele formatoare de geluri termoreversibile obținute prin hidroliza amidonului de cartofi, conform schemei din figura 9.40.

Figura 9.40. Schema tehnologică de obținerea a maltodextrinelor formatoare de geluri termoreversibile

B. Zaharificarea prehidrolizatelor

Metoda de zaharificare a prehidrolizatelor depinde de următorii parametri tehnologici:

gradul de hidroliză al prehidrolizatelor, obținute după lichefiere – dextrinizare;

concentrația substratului și a enzimei;

tipul de enzimă sau sistemul enzimatic utilizat;

durata procesului.

Enzimele frecvent folosite pentru zaharificare sunt:

amiloglucozidaza;

α-amilaza fungică;

β-amilaza;

exomaltohidrolaze specifice.

Prin zaharificarea prehidrolizatelor de amidon se obțin o gamă largă de îndulcitori ai amidonului, diferențiați prin compoziție și proprietăți funcționale.

Producerea siropurilor de maltooligozaharide

Siropurile de maltooligozaharide se pot obtine din hidrolizate de amidon, amidon solubil, amilopectina sau amiloza prin actiunea hidrolitica a exomaltohidrolaze specifice sau in combinatie cu o enzima de deramificare.

Tipuri de exomaltohidrolaze si produsii re reactie rezultati in urma hidrolizei hidrolizatelor de amidon:

Importanta siropurilor de maltooligozaharide decurge din o serie de proprietati ale acestora si anume: nu sunt cariogene, sunt nefermentescibile si au efect pozitiv asupra microflorei intestinale.

Producerea siropurilor de maltoza si a siropurilor de conversie inalta

Siropurile de maltoza se obtin cu ajutorul enzimelor cu activitate maltogenica: α-amilaze fungice, β-amilaza din malt, β-amilaza bacteriana – singure sau in amestec cu enzime de deramificare (pullulanaza).

Siropurile de conversie inalta se obtin cu ajutorul enzimelor cu activitate maltogenica cat si glucogenica (preparate enzimatice comerciale Fungamyl 800L si AMG 200L).

Producerea siropurilor de glucoză

Siropurile de glucoză sunt îndulcitori importanți, obținuți prin hidroliza amidonului prin:

metoda acidă;

metode acid-enzimă;

metode enzimă-enzimă.

În funcție de tehnica folosită siropurile cu același DE prezintă o structură compozițională diferită, precum și proprietăți funcționale diferite. Ele se clasică, în funcție de DE, astfel:

tip I, siropuri cu grad de conversie scăzut: DE = 20-38;

tip II, siropuri cu grad de conversie normal: DE = 38-55;

tip III, siropuri cu grad de conversie mediu: DE = 55-73;

tip IV, siropuri cu grad de conversie ridicat: DE >73.

Hidroliza acidă a amidonului se folosește pentru obținerea siropurilor de glucoză de tip I și II, iar metoda acid-enzimatică presupune o etapă de prehidroliză acidă a amidonului, urmată de o zaharificare cu amiloglucozidază pentru obținerea siropurilor tip III și IV. În figura 9.41. este prezentată schema tehnologică de obținere a siropurilor de glucoză propusă de Corn Refiners Association.

Figura 9.41. Schema tehnologică de obținere a siropului de glucoză propusă de Corn Refiners Association

Producerea dextrozei

Dextroza se obține numai prin folosirea metodei enzimă-enzimă în vederea hidrolizei totale a amidonului. Procedeul enzimă-enzimă permite obținerea dextrozei monohidrat, dextrozei anhidre, zahărului total și a siropului de dextroză folosit la obținerea izosiropului (figura 9.42). Procedeul constă în:

lichefierea – dextrinizarea amidonului cu o α-amilază bacteriană termodurică;

zaharificarea cu glucoamilază fungică și/sau enzimă de deramificare se realizează discontinuu sau semicontinuu în instalații prevăzute cu agitatoare.

Figura 9.42. Schema tehnologică de obținere a diferitelor tipuri de dextroză

9.4.2. Izomerizarea siropului de dextroză. Obținerea izosiropului

Glucoza din siropuri poate fi izomerizată cu glucoizomeraze la fructoză pentru creșterea puterii de îndulcire (173 la fructoză, față de 74 la glucoză).

Glucoizomeraza este o enzimă intracelulară, de origine microbiană, care din punct de vedere al modului de acțiune este o oxidoreductază intramoleculară ce catalizează intertransformarea aldozelor în cetoze. Substraturile naturale ale enzimei sunt D-xiloza, D-glucoza, D-sorbitolul și D-riboza, care sunt transformate în formele lor cetonice D-xiluloza și D-fructoza. Glucozizomeraza este o metaloenzimă care în forma cristalină conține elementele cobalt și magneziu. Glucoizomeraza activă este un polimer constituit din patru subunități inactive identice și are masa moleculară cuprinsă între 157-175 kDa. Cobaltul mărește în mare măsură termostabilitatea și activitatea enzimei, iar ionii de magnezii acționează ca activatori ai enzimei. În centru catalitic al glucoizomerazei se găsește lizina, care acționează prin cele 2 grupări amino amfionice, izomerizarea decurgând printr-un mecanism endiolic. Temperatura optimă a glucoizomerazelor este cuprinsă între 60-90oC, iar pH-ul optim între 6,5-9.

Izomerizarea glucozei se poate realiza pin mai multe metode:

cu ciclohexilamină;

izomerizare alcalină;

izomerizare cu schimbători de ioni;

izomerizare enzimatică.

Primele trei metode prezintă dezavantajul formării unor cantități mai mari de produse secundare: psicoză, manoză și substanțe colorante.

Procedeul enzimatic utilizează glucozizomeraza pentru conversia glucozei la fructoză și se realizează în sistem discontinuu (figura 9.43) sau continuu, cu enzime solubile neimobilizate sau cu enzime imobilizate. Cele mai utilizate preparate comerciale de glucozizomerază se obțin din tulpinile de bacterii Bacillus coagulans, Streptomyces albus, Streptomyces murinus, (Sweetzyme) Actinoplanes missouriensis. 1 kg de Sweetzyme poate produce 18000 kg s.u. sirop de fructoză.

Figura 9.43. Schema tehnologică de obținere a izosiropului prin izomerizare discontinuu

Folosirea enzimelor imobilizate prezintă următoarele avantaje:

oferă posibilitatea reutilizării enzimei;

permite eliminarea impurificării produsului finit cu enzimă;

formarea produsului finit poate fi controlată mai riguros;

proprietățile enzimei pot fi modificate favorabil prin imobilizare.

Dezavantajele folosirii enzimelor imobilizate sunt:

activitatea specifică a enzimei imobilizate este mai mică, în comparație cu aceea a enzimei solubile;

există riscul alterării centrului catalitic activ al enzimei;

apariția unor fenomene de împiedicare sterică datorită suportului utilizat sau diferențelor de porozitate.

Din punct de vedere al utilizării industriale a preparatelor de glucozizomerază trebuie să îndeplinească câteva criterii de bază:

enzima trebuie să suporte temperaturi de min. 60oC, pentru a preveni contaminarea bacteriană a produsului;

enzima trebuie să manifeste maximum de activitate enzimatică la valori ale pH-ului <6,5, pentru a exclude transformarea fructozei rezultate prin reacție alcalină, în D – psicoză, zahăr al cărui metabolism este mai puțin cunoscut;

preparatul enzimatic să poată izomeriza glucoza în soluție cu concentrație ridicată de s.u. de circa 30-50%;

preparatul enzimatic de glucozizomerază să acționeze specific, încât sa nu fie izomerizate alte zaharuri existente în hidrolizatul de amidon, astfel ca fructoza să rămână singurul produs de transformare;

este de dorit ca enzima să lucreze fără adaos de cobalt, deoarece acesta naște îndoieli îndreptățite de natură alimentară, deși el poate fi complet îndepărtat prin demineralizare cu schimbători de ioni;

enzima să fie insensibilă la impuritățile rezultate prin prelucrarea hidrolizatului de amidon inițial;

enzima acre răspunde cerințelor enunțate trebuie să poată fi imobilizată pe un suport insolubil pentru a fi utilizată continuu fără a impurifica produsul finit.

Procedeul cel mai larg utilizat este procedeul de izomerizare continuă în reactoare tip coloană cu pat fix (coloane scurte și largi) și în pat fluidizat (coloane lungi și subțiri). În coloană cantitatea de enzimă este fixă, dar activitatea scade logaritmic cu timpul de utilizare. Debitul siropului de glucoză prin coloană trebuie scăzut odată cu scăderea activității enzimei, pentru a obține un produs cu conținut constant de fructoză. Se recomandă utilizarea mai multor coloane legate în serie (figura 9.44), când variațiile debitului de produs și timpul de staționare total scad. Prezența oxigenului în substrat implică:

colorarea mai intensă a siropului în comparație cu izomerizarea în prezență de gaz inert sau de sulfit (0,02-0,07%, față de s.u. a lichidului izomerizat;

formarea acizilor;

consum mai mare de alcalii pentru controlul pH-ului;

proveniența enzimei: glucozizomeraza. Glucozizomeraza sintetizată de Streptomyces phaeochromogenes este insensibilă la oxigenul atmosferic.

Figura 9.44. Schița instalației de izomerizare a glucozei pentru obținere a siropului de fructoză

(100 t/zi, Crueger and Crueger, 1989)

În procesul continuu, oxigenul atmosferic are o acțiune pronunțată de inactivare a enzimei. Glucozizomeraza utilizată în procedeul continuu este Sweetzyme imobilizată produsă de Novo Industries A/S, cu următoarele caracteristici: temperatura de 65oC, pentru productivitatea maximă a enzimei; pH-ul <5 determină denaturarea ireversibilă a enzimei; în cazul izomerizării la pH>8,0 nu este esențial adaosul de ioni de Co2+ și Mg2+, la pH<8,0 prezența Mg2+este necesară la concentrații de 8.10-3 M, în cazul în care siropul de glucoză nu conține Ca2+, enzima este sensibilă la prezența oxigenului atmosferic, în special, la temperaturi ridicate, puritatea siropului este o condiție foarte importantă pentru stabilitatea enzimei, mărimea particulelor de enzimă influențează activitatea enzimei, dar nu și stabilitatea ei.

pH-ul alcalin favorizează formarea psicozei, manozei, sorbozei, compușilor acizi și a substanțelor colorate. Pentru caracterizarea izomerizării tehnice a glucozei la fructoză se utilizează ca indicatori mai importanți:

timpul de înjumătățire – timpul în care enzima pierde 50% din activitatea de izomerizare în condiții de lucru continui;

timpul de contact – timpul în care enzima este în contact cu substratul;

gradul de izomerizare exprimat prin cota parte din glucoză acre a fost izomerizată la fructoză;

productivitatea exprimată prin raportul dintre substanța uscată izomerizată , cu grad de izomerizare diferit și cantitatea de enzimă utilizată.

Procedeul continuu de izomerizare este de preferat celui discontinuu deoarece:

doza de enzimă este mai mică;

costul aditivilor este mai redus;

costurile de purificare sunt mai mici;

volumul reactorului mai mic. Izomerizarea discontinuă a glucozei cu Sweezyme se face în tancuri de 25-120m3. Enzima imobilizată nu se degradează fizic după 20 ore de utilizare, dar activitatea ei scade lent după 5-6 reutilizări. Pentru a menține constant conținutul de fructoză, timpul de reacție trebuie prelungit sau cantitatea de enzimă se suplimentează.

Metode de separare a fructozei din izosiropurile tipice

În scopul suplimentarii izosiropurilor cu noi cantitati de fructoza, aceasta se poate separa din amestecul format in urma izomerizarii in urmatoarele moduri:

cristalizarea glucozei;

precipitarea glucozei sub formă de sare dublă glucoză-NaCl;

separarea fructozei sub formă de fructozat de calciu;

scoaterea continuă a fructozei din reacția de izomerizare prin complexare cu borat;

oxidarea selectivă a glucozei cu glucozoxidaza imobilizată urmată de îndepărtarea acidului gluconic sub formă de gluconat de calciu insolubil;

separarea fructozei prin fermentația alcoolică specifică a glucozei;

separarea cromatografică a izosiropului tipic.

Făina de grâu. Compoziție chimică și biochimică.

Indicii de calitate prin care se caracterizează făina de grâu sunt:

Extracția sau gradul de extracție al făinii reprezintă cantitatea de făină obținută din 100 kg grâu. Datorită faptului că substanțele minerale, celuloza și hemiceluloza sunt localizate în special la periferia bobului, odată cu creșterea gradului de extracție al făinii crește și conținutul ei mineral (cenușa) și conținutul de înveliș motiv pentru care se observă închiderea la culoare a făinii. Această variație a conținutului mineral cu extracția se datorează faptului că substanțele minerale ale bobului sunt localizate în special în stratul aleuronic (7%) și în înveliș (3,5%).

Tipul făinii este reprezentat de conținutul mineral (cenușa) al făinii, exprimat în miligrame/100 g făină substanța uscată (tabel 10.16).

Tabelul 10.16.

Tipurile de făinuri de grâu fabricate în România

Compoziția chimică a făinii de grâu

Făina de grâu are o compoziție complexă (tabel 10.17). Ea conține componente chimice și biochimice în proporții ce depind de extracție, soiul grâului, gradului de maturizare biologică, condițiile agro-climatice de cultură și de depozitare după recoltare. Repartizarea neuniformă a acestor componente în bobul de grâu determină variația compoziției chimice și biochimice a făinurilor cu gradul lor de extracție.

Făina are un conținutul de umiditate de 14-14,5%, iar substanța uscată este formată din proteine, glucide, lipide, săruri minerale, vitamine, pigmenți:

Tabelul 10.17.

Compoziția chimică a făinii de grâu (în % S.U.)

Proteinele (10-12%) sunt din punct de vedere tehnologic componentul principal al făinii de grâu. Se împart în două mari categorii:

proteinele aglutenice;

proteinele glutenice (cele mai importante)

Proteinele glutenice sunt proteine de rezervă ce reprezintă circa 85% din totalul proteinelor făinii și sunt reprezentate de două tipuri: gliadina și glutenina.

Gliadina. Aceasta are caracter acid pentru că în compoziția ei predomină acidul glutamic și prolina. Reprezintă 30-35% din totalul proteinelor. Este constituită din patru fracțiuni: -, -, – și -gliadina. Gliadina este extensibilă și puțin elastică.

Glutenina reprezintă 40-50% din totalul proteinelor din făină. Are caracter acid datorită acidului glutamic care predomină în compoziția sa. Este elastică și puțin extensibilă.

Proteinele glutenice se găsesc în bobul de grâu numai în endosperm, în proporție mai mică în centru și mai mare la periferia bobului.Datorită prezenței lor numai în endosperm, conținutul de proteine glutenice în făinuri scade cu creșterea extracției peste 70 %, și determină deosebiri însemnate în conținutul acestora pentru făinuri de același tip obținute prin extracții simple și extracții intermediare sau extracții totale.

Aceste două proteine din grâu, gliadina și glutenina, au proprietatea de a absorbi apă și de a se umfla, stare în care se unesc și formează glutenul. Capacitatea acestor proteine de a forma gluten conferă grâului proprietăți unice de panificație.

Glutenul reprezintă în aluat o fază proteică continuă sub formă de pelicule subțiri care acoperă granulele de amidon și celelalte componente insolubile în aluat. Aceste pelicule sunt capabile să se extindă în prezența gazelor de fermentare dând naștere unei structuri poroase, miezul pâinii.

Proprietățile elastico – vâscozice ale proteinelor glutenice în aluat sunt considerate determinante pentru proprietățile de panificație ale grâului.

Amidonul este din punct de vedere cantitativ componentul principal. Amidonul de grâu prezintă ca specificitate o distribuție dimensională bimodală și anume două tipuri de granule din punct de vedere dimensional, și anume: granule mici (cu dimensiuni 10) m și granule mari (cu dimensiuni 10m). În timpul procesului de măciniș granulele, în principal cele mari, pot suferi deteriorări mecanice ale suprafeței. Îndepărtarea unei părți din suprafața rezistentă la acțiunea enzimelor amilolitice permite pătrunderea amilazelor în interiorul granulelor pe care le pot astfel hidroliza cu formare de zaharuri fermentescibile, în special maltoză.

Cantitatea normală de amidon deteriorat la măcinare este de 6-9% și ea este importantă pentru hidroliza enzimatică a acestuia în procesul tehnologic de preparare a pâinii, amidonul fiind sursa principală de zaharuri fermentescibile din aluat.

Poliglucide neamidonoase: cuprind celuloza, hemiceluloza și pentozanii. Dintre acestea cei mai importanți sunt pentozanii. Pentozanii au fost identificați în aproape toate părțile anatomice ale bobului de grâu, dar cu pondere mai importantă în părțile periferice.

Făina de grâu conține 1,2-4% pentozani. Circa 40% dintre ei sunt solubili în apă (PS), iar restul sunt insolubili (PI). Cea mai mare parte a pentozanilor (aprox. ¾) sunt arabinoxilani, ei fiind constituenții principali ai pereților celulari.

Arabinoxilanii solubili și cei insolubili sunt asemănători ca structură chimică. Ei sunt formați dintr-un lanț liniar de -D-xilopiranoză legată (1,4) cu grad de polimerizare de aprox. 200, pe care sunt fixate ramificații formate din arabinofuranoză. Fixarea ramificațiilor are loc la nivelul carbonului din poziția 3 a xilozei (cazul cel mai frecvent de monosubstituție) sau la atomii de carbon 2 și 3 al acesteia (caz de bisubstituție), existând zone foarte bogate în ramificații și zone mai puțin bogate. Aceste ramificații influențează conformația pentozanilor și în consecință, proprietățile lor fizico-chimice și tehnologice. Funcția de alcool primar a arabinozei poate fi esterificată prin acid ferulic sau acid fenolic.

Pentozanii se caracterizează prin capacitate mare de legare a apei: pentozanii solubili leagă o cantitate de apă de trei ori mai mare față de masa lor (raportată la substanța uscată), iar pentozanii insolubili de zece ori, pentozanii fiind responsabili de circa ¼ din apa absorbită de făină la frământare.

Experimental s-a constatat că, pentozanii solubili în apă au efect pozitiv asupra calității pâinii, iar cei insolubili efect negativ, reducând volumul pâinii și înrăutățind însușirile fizice ale miezului.

Lipidele sunt prezente în cantități mici în făinuri, 0,6-0,7% în cele de extracții mici și 2% în cele de extracții mari. Cu toate acestea ele joacă un rol tehnologic important deoarece în aluat formează complecși cu proteinele și amidonul influențând calitatea pâinii și prospețimea ei.

Pigmenți. Pigmenții făinii sunt reprezentați de pigmenți carotenoidici, xantofile și flavone. Carotenii și xantofilele sunt prezenți în endospermul bobului și se vor găsi în făinurile albe, iar flavonele sunt prezente în părțile periferice se vor găsi în făinurile negre.

Prin oxidare, se adiționează oxigen la nivelul dublelor legăturilor conjugate, și pigmenții trec într-o formă peroxidică incoloră determinând albirea făinii. Acest proces se realizează la maturizarea făinii, precum și prin acțiunea conjugată a unor oxidoreductaze.

Făinurile de grâu mai conțin vitamine în special din grupul B, B1, B2, B6, PP, dar și unele cantități de acid folic, acid pantotenic, vitamina E. Sunt prezente în cantități mai mari în făinurile de extracții mari în comparație cu cele de extracții mici.

Compoziția biochimică a făinii de grâu

Se referă la conținutul în enzime al făinii. Acesta depinde de extracția făinii, de soiul grâului, de condițiile climatice din perioada de maturizare, de gradul de maturizare biologică a bobului, de eventuale degradări pe care le suferă grâul înainte sau după recoltare (încolțire, atacul ploșniței grâului, ș.a.).

Sunt mai bogate în enzime făinurile de extracții mari față de cele de extracții mici, făinurile provenite din boabe recoltate în condiții climaterice umede, din boabe nematurizate, încolțite sau atacate de ploșnița grâului. Sunt mai sărace, cele provenite din grâne sticloase, din recoltele anilor secetoși, din grâu uscat după recoltare la temperaturi ridicate.

Enzimele cele mai importante din făina de grâu sunt: amilazele și proteazele, dar și celelalte enzime au o importantă influență tehnologică.

A. Amilazele făinii sunt reprezentate de și -amilaza.

Făinurile normale de grâu conțin -amilaza doar în cantități foarte mici (urme), iar în unele cazuri, cum sunt făinurile provenite din grâne sticloase sau grâne cultivate și recoltate în condiții climatice secetoase, pot fi complet lipsite de -amilaza. Conținutul în această enzimă crește mult în urma germinării bobului. -Amilaza este prezenta in cantitate suficientă pentru a forma maltoză.

Acțiunea -amilazei asupra amidonului este de corodare a granulei și de dextrinizare. -Amilaza este singura amilază care poate ataca granula intactă de amidon, deși cu viteză foarte mică. În urma acțiunii ei asupra granulelor de amidon, ele devin accesibile la acțiunea -amilazei. -Amilaza acționează atât la fermentare, cât și în primele 2-3 minute ale coacerii, până când enzima este inactivată termic.

-Amilaza este termorezistentă și acidosensibilă. Activează optim la temperatura de 60-66C, dar este distrusă termic la 83C, are un pH optim cuprins între 5-5,5.

-Amilaza exercită o acțiune de zaharificare asupra amidonului. Ea acționează în cazul amidonului numai asupra granulelor de amidon deteriorate mecanic la măcinare și asupra acelora la care în prealabil a acționat -amilaza, acțiunea ei limitându-se la zona de granulă deteriorată, restul de granulă nefiind atacată.-Amilaza este mai sensibilă la temperatură și mai rezistența la aciditate decât -amilaza. Activează optim la temperaturi de 48-51C, este distrusă în proporție de 50% la 60C și inactivată la 70-75C. iar pH optim este între 4-5.

Enzimele amilolitice sunt tehnologic cele mai importante enzime. Prin hidroliza amidonului din aluat ele asigură necesarul de zaharuri fermentescibile (maltoză) necesare desfășurării procesului de fermentație și obținerii unei pâinii de calitate.

În făinurile cu un conținut redus de -amilază sau lipsite de aceasta factorul care limitează hidroliza este cantitatea de amidon deteriorat, asupra căruia poate acționa -amilaza. Atunci când, atât conținutul în amidon deteriorat este mic precum și conținutul în -amilază atunci se va obține o pâine cu un volum redus, crustă deschisă la culoare, datorită neformării în cantitate suficientă de zaharuri fermentescibile. Făinurile hipoamilazice pot fi corectate prin adaos de -amilază exogenă

B. Pentozanazele (xilanaze) și hemicelulazele sunt enzime capabile să hidrolizeze arabinoxilanii prezenți în făina de grâu, având rolul de a scinda hidrolitic lanțul principal de xiloză în fragmente cu dimensiuni mai mici. Alături de aceste enzime un rol important în au arabinozidaza și acid ferulic esteraza care au ca acțiune ruperea ramificațiilor de arabinoză și respectiv acid ferulic. Făina de grâu prezintă numeroase xilanaze, dar activitatea lor este redusă. Pentru a corecta acest deficit, în panificație pot fi utilizate hemicelulazele fungice (din Aspergillus niger). Sub acțiunea hemicelulazelor are loc solubilizarea unei fracțiuni de pentozani ceea ce conduce la eliberarea de apă, care devine disponibilă pentru formarea rețelei glutenice. Pe de altă parte, sub acțiunea hemicelulazelor s-ar diminua efectul defavorabil al hemicelulozelor insolubile asupra continuității filmului glutenic.

În procesul tehnologic de preparare a pâinii, 15-20% din pentozanii din aluat sunt hidrolizați în prezența pentozanazelor proprii ale făinii. Creșterea proporției de pentozani hidrolizați și a efectului asupra calității pâinii este posibil prin adaos de pentozanaze exogene..

C. Proteazele endogene (ale făinii) sunt numeroase fiecare având proprietăți și specificități proprii. Ele hidrolizează legăturile peptidice, de preferință la nivelul aminoacizilor încărcați cu sarcini pozitive, ceea ce explică acțiunea lor redusă față de proteinele făinii de grâu la care aminoacizii bazici sunt în proporții reduse. În făină sunt prezente și proteaze acide și proteaze serinice.

În făinurile normale enzimele proteolitice sunt prezente în cantități mici, iar conținutul lor crește considerabil în făinurile provenite din grâne încolțite și mai ales în cele obținute din grâne atacate de ploșnița grâului.

Alături de enzimele proteolitice din făină, în aluat există și alte enzime proteolitice care provin fie de la drojdie (enzimele proteolitice endocelulare pot fi eliberate prin citoliza celulei) sau enzime proteolitice din malț, precum și o activitate proteolitică reziduală a unor preparate amilolitice fungice sau bacteriene care pot fi utilizate pentru corectarea activității amilazice a fâinii. Ținând cont de activitatea proteolitică diversă este greu de precizat în ce mod și ce rol are fiecare enzimă proteolitică asupra caracteristicilor aluatului.

Cele mai importante și prezente în cantități mai mari în făinuri sunt endopeptidazele. Prin efectul lor hidrolitic ele exercită o acțiune de înmuiere a glutenului, înrăutățind proprietățile reologice ale aluatului. Exopeptidazele hidrolizează proteinele eliberând aminoacizi, acțiunea lor asupra însușirilor aluatului fiind nesemnificativă.

Proteoliza conduce la diminuarea rezistenței aluatului, crește viteza de adsorbție a apei și, în consecință, este necesară o durată redusă de frământare pentru a nu se ajunge la o diminuare drastică a vâscozității aluatului. Modificări proteolitice limitate sunt necesare atunci când se panifică făinuri foarte puternice.

Totuși, o acțiune limitată a enzimelor proteolitice proprii făinii și a celor elaborate de drojdii este benefică pentru calitatea finală a produsului finit din următoarele motive:

aminoacizii liberi și peptidele formate prin proteoliză intervin ca precursori de aromă (gust și miros) fie direct, fie după metabolizarea lor de către drojdii;

aminoacizii liberi se constituie ca parteneri în reacțiile Maillard care sunt foarte importante în formarea aromei pâinii;

aminoacizii liberi și dipeptidele sunt sursă de azot pentru drojdia de panificație utillizată pentru fermentare.

D. Ester-hidrolazele. În panificație interesează, în mod deosebit, fitazele și lipazele.

Fitazele catalizează hidroliza fitaților prezenți în făină, eliberând fosfați acizi de calciu și magneziu și acidul fosforic. Fiitaza este termorezistentă, rămânând activă până la 70C iar pH-ul optim este de ~5,0. Acțiunea fitazei depinde deci de condițiile de fermentare: pH, temperatură, durata de acțiune.

Panificația cu maia semisolidă este favorabilă hidrolizei fitaților ca de altfel și acidifierea artificială a aluatului. Acțiunea fitazelor este benefică în plan nutrițional deoarece ele au capacitate demineralizantă, în sensul că formarea de fitați (complexe între acidul fitic și ionii bivalenți) este diminuată.

Lipazele au proprietatea specifică de a hidroliza triacilglicerolii la interfața apă/lipide, fiecare lipază având o specificitate de poziție. În cazul făinii de grâu lipaza eliberează acizii grași din poziția 1 și 3. La conservarea făinii activitatea lipazelor nu este de neglijat datorită faptului că nu sunt inhibate în absența apei de solvatare. Rezultatul acțiunii lor este creșterea conținutului de acizi grași liberi, în principal acid linoleic care este acidul gras nesaturat preponderent în făina de grâu. Oxidarea „spontană” sau cea catalizată de lipoxigenază contribuie la maturarea făinii, dar în final și la râncezirea acesteia.

În cursul frământării și fermentării acțiunea lipazelor este aproape nulă.

E. Oxidoreductazele mai importante din făina de grâu sunt lipoxigenaza, precum și oxidoreductazele care acționează prin intermediul oxigenului (polifenoloxidaza, glucozoxidaza, sulfhidriloxidaza), precum și cele care funcționează cu H2O2 (catalaza și peroxidaza).

Lipoxigenaza catalizează oxidarea, cu ajutorul oxigenului molecular a acizilor grași liberi care posedă sistemul de duble legături, neconjugate, cis/cis 1 : 4, pentadienice (R-CH=CH-CH2-CH=CH-R’-COOH), dintre aceștia fiind acizii linoleic și linolenic. Reacția catalizată de lipoxigenază, conduce la hidroperoxizi reactivi, capabili de a se cooxida cu alte substanțe. Activitatea lipoxigenazei în făina de grâu este considerabil mai mare decât în cazul făinurilor din leguminoase.

Tabelul 10.18.

Efectul lipoxigenazei în panificație

În aluat lipoxigenaza acționează alături de alte sisteme oxido-reducătoare, între care sunt posibile interacțiuni, deși în procesele de peroxidare a lipidelor este implicată în principal lipoxigenaza.

Polifenoloxidaza oxidează compușii fenolici la chinone, acestea din urmă polimerizându-se sub formă de la polimeri colorați în brun. Ele pot oxida acidul ferulic legat de pentozani sau tirozina (tirozinază) proteinelor glutenice, modificând în acest fel vâscozitatea aluatului prin crearea de punți covalente pentozani-pentozani, pentozani–proteine, proteine– proteine. În ce privește polifenoloxidaza, în oxidarea polifenolilor această enzimă concurează cu lipoxigenaza pentru oxigen.

Oxidoreductaze care funcționează cu H2O2. În această categorie menționăm:

Catalaza care descompune H2O2 în apă și oxigen, făcând să crească în acest fel efectul lipoxigenazei. Catalaza intră în competiție cu peroxidaza în ceea ce privește utilizarea oxigenului.

Peroxidaza catalizează oxidarea, cu ajutorul H2O2 a grupărilor fenolice sau aminice. Enzima poate deci conduce la reticulări covalente ale proteinelor și pentozanilor, similar cu cele induse de polifenoloxidaza. Peroxidaza va avea deci un efect de ameliorare asupra consistenței aluatului și volumului pâinii. Catalaza și peroxidaza fiind enzime hematinice, ele vor cataliza și oxidarea lipidelor, dar cu o specificitate mai redusă decât lipoxigenaza.

Catalaza și peroxidaza, mai puțin puternice decât lipoxigenaza, sunt capabile să catalizeze același tip de reacții ale lipidelor nesaturate. Pe de altă parte, catalaza descompune apa oxigenată, care este un inhibitor puternic al lipoxigenazei, potențând astfel activitatea acesteia din urmă.

Donatorul de hidrogen al reacției catalizată de peroxidază este foarte adesea un compus polifenolic, cunoscut pentru proprietățile sale antioxidante, fiind un potențial inhibitor al lipoxigenazei.

F. Ascorbatoxidaza care catalizează oxidarea cu ajutorul oxigenului molecular a acidului ascorbic (care se adaugă curent în panificație). Acidul ascorbic este transformat în acid L-dehidroascorbic, care la rândul său oxidează glutationul, în prezența de glutation reductază. Glutationul prin oxidare devine indisponibil pentru a participa la reacții de rupere a punților disulfidice dintre proteine, consecința fiind o „întărire” a aluatului (glutenului).

Acidul ascorbic inhibă activitatea de albire a aluatului dar nu și formarea peroxizilor. Inhibarea de către acidul ascorbic a albirii luteinei l-a determinat pe Mc. Donald (1979) să considere că radicalul reactiv format intermediar în reacția lipoxigenazei oxidează acidul ascorbic preferențial pigmentului luteină. Acest mecanism este posibil să acționeze și în cazul carotenilor, ceea ce ar explica efectul acidului ascorbic de inhibare a albirii aluatului în prezența lipoxigenazei.

Este posibil, de asemenea, ca în reacția de oxidare a acidului ascorbic cu formare de acid dehidroascorbic, acesta să intre în concurență pentru oxigen cu lipoxigenaza.

10.2. Utilizarea preparatelor enzimatice în panificație

Utilizarea preparatelor amilolitice

Adaosul de -amilază în panificație se face în două scopuri:

mărirea cantității de glucide fermentescibile în aluat;

prelungirea prospețimii pâinii.

În primul caz, adaosul se face atunci când se panifică făinuri cu grad mic de deteriorare a amidonului, rezistente la atacul -amilazelor și lipsite de -amilază activă sau al cărui conținut este insuficient pentru a produce o amiloliză normală. Sunt făinuri cu capacitate mică de a forma glucide fermentescibile și în consecință de a forma gaze.

Este cazul frecvent de folosire a -amilazei exogene. În principiu, -amilaza se adaugă în făinurile sănătoase.

Surse de -amilază. În panificație se folosesc:

-amilaza de malț (cereale);

-amilaza fungică (Aspergillus oryzae și Aspergillus awamori);

-amilaza bacteriană (Bacillus subtilis).

Aceste amilaze diferă între ele prin acțiunea de corodare a granulei de amidon, de dextrinizare și de zaharificare. Cu excepția acțiunii de zaharificare pentru care cea mai activă este -amilaza de malț, pentru celelalte activități ordinea descrescătoare este -amilaza bacteriană, -amilaza de malț, -amilaza fungică.

Din punct de vedere al stabilității termice, cea mai stabilă este -amilaza bacteriană urmată de cea de malț, iar cea mai puțin stabilă este cea fungică. -Amilaza fungică este inactivată rapid la temperaturi peste 70C, -amilaza de cereale rezistă până la 80C, în timp ce -amilaza bacteriană supraviețuiește procesului de coacere, la 90C, ea mai păstrând 10% din activitatea sa.

Termostabilitatea diferită a -amilazelor explică diferențele în activitatea lor de lichefiere și prezintă importanță pentru însușirile fizice ale miezului.

Efectul -amilazei exogene în panificație

Suplimentarea făinii cu -amilaza conduce la intensificarea amilolizei și creșterea cantității de glucide fermentescibile în aluat, capabile să asigure formarea gazelor pe toată durata procesului tehnologic, inclusiv în fazele lui finale, la un nivel care să asigure pâine de calitate.

Datorită creșterii cantității de glucide fermentescibile în aluat, este stimulată activitatea drojdiei și bacteriilor. Crește numărul celulelor de drojdie și se intensifică activitatea lor fermentativă și în consecință crește volumul pâinii. Stimularea activității microbiotei aluatului determină maturizarea mai rapidă a acestuia, creându-se posibilitatea reducerii duratei de fermentare.

Pâinea preparată cu adaos de -amilază se menține mai mult timp proaspătă. Acest lucru s-ar datora dextrinelor (cu 3…9 unități de glucoză) care se acumulează în miez, precum și unei gelatinizări mai bune a amidonului rămas nehidrolizat, care se află în cantitate mai mică decât în lipsa -amilazei, în urma hidrolizei lui și în prezența apei eliberată de proteinele care coagulează. În această stare amidonul retrogradează mai lent și, în consecință, învechirea este mai lentă.

Mărimea efectelor asupra calității pâinii depinde de proveniența enzimei și de cantitatea adăugată. Doze mici de -amilază de toate proveniențele măresc volumul pâinii și îmbunătățesc elasticitatea miezului și structura porozității. În doze mari, însă, creșterea volumului este însoțită de reducerea elasticității miezului și de creșterea lipiciozității lui. -Amilaza bacteriană utilizată în doze mari conduce la miez lipicios decât -amilaza din malț și fungică, datorită unor cantități mai mari de dextrine acumulate în miez.

Conținutul mărit de dextrine din miez în cazul -amilazei bacteriene se datorează termostabilității ei mari și ca urmare a duratei lungi de acțiune la coacere. A doua explicație a lipiciozității miezului pâinii preparate cu -amilaza bacteriană, (în exces), este gradul de polimerizare al dextrinelor formate, de 25…35.

Amilazele au și efecte secundare, uneori nedorite în aluat. Adaosul lor reduce consistența aluatului și modifică proprietățile reologice ale acestuia. Crește extensibilitatea și scade rezistența aluatului cu atât mai mult cu cât adaosul de -amilază este mai mare.

Aceste efecte apar când preparatele de -amilază sunt însoțite de oarecare activitate proteolitică, în general mică, precum și datorită faptului că maltoza formată prin hidroliza amidonului exercită asupra glutenului din aluat o acțiune de deshidratare.

Având în vedere că, în urma amilolizei glucidul fermentescibil format este maltoza, pentru fermentarea căreia drojdia de panificație are nevoie de timp pentru a-și sintetiza enzimele maltaza și permeaza maltozei, folosirea adaosului de -amilază în scopul asigurării procesului de fermentare va fi eficient, mai ales în procedeele de preparare a aluatului relativ lungi.

Condiții de folosire a -amilazei

Suplimentarea făinii de grâu cu -amilază se face în doze ce depind de capacitatea făinii de a forma gaze, activitatea preparatului și metoda de preparare a aluatului. Pe baza experiențelor practice s-au stabilit următoarele doze:

15-20 unități S.K.B./100 g făină pentru -amilaza fungică;

8-15 unități S.K.B./100 g făină pentru -amilaza de malț;

Max. 1 unitate S.K.B./100 g făină pentru -amilaza bacteriană;

9-90 unități maltogenice/100 g făină pentru -amilaza bacteriană maltogenică.

Preparatele de -amilază se pot adăuga în mori sau în fabrica de pâine. Mai răspândită este metoda de adăugare în fabrica de pâine.

Utilizarea de amiloglucozidază

Amiloglucozidaza este o enzimă amilolitică care nu este prezentă în grâu și făina de grâu. Spre deosebire de și -amilază, amiloglucozidaza hidrolizează nu numai legăturile glucozidice (1,4), cât și legăturile (1,6).

Ea hidrolizează amidonul până la glucoză ca produs final. Cantitatea de glucoză formată depinde de proveniența enzimei și doza folosită. Hidroliza amidonului până la glucoză este importantă pentru drojdie, deoarece ea este deficitară în enzima maltaza, enzimă care hidrolizează maltoza cu formare de glucoză, care ulterior este fermentată.

În panificație se folosește amiloglucozidază fungică obținută din Aspergillus niger și Aspergillus delemar, fiind preferată cea din Asp. niger care are stabilitate termică mai bună. Rămâne activă până la 70C, ceea ce face ca efectul ei asupra volumului pâinii să fie mai mare față de cea obținută din Aspergillus delemar.

Efectul amiloglucozidazei asupra creșterii volumului pâinii este mai mare decât al -amilazei. Asocierea ei cu -amilaza mărește cantitatea de glucide fermentescibile în aluat și volumul pâinii. Când se utilizează în combinație cu -amilaza bacteriană se previne formarea miezului lipicios și se elimină efectele supradozării accidentale cu -amilază.

Experimental s-a constatat că amiloglucozidaza are proprietăți de antiînvechire.

Utilizarea pentozanazelor și hemicelulazelor

Pentozanaze exogene folosite în panificație sunt: xilanaza și hemicelulaza.

Xilanazele exogene adăugate în aluat hidrolizează pentozanii solubili și insolubili într-o măsură mai mare sau mai mică în funcție de originea lor și acționează în mod diferit asupra proprietăților aluatului și calității pâinii, unele având efecte bune, altele efecte slabe sau nule.

Xilanazele se clasifică după mecanismul lor de acțiune în endo- și exo-xilanaze în care endoxilanazele hidrolizează legăturile (1,4) din interiorul lanțului principal al xilanilor formând oligomeri cu masă moleculară mare, în timp ce exoxilanazele acționează la capetele lanțului punând în libertate produse mult mai simple. Alături de enzimele ce hidrolizează lanțul principal al xilanilor mai există și enzime care hidrolizează ramificațiile: -arabino-furanozidaze, esteraze, și care permit accesul endoxilanazelor la lanț.

Se consideră că endoxilanaza este cea mai eficientă pentozanază pentru panificație.

Acțiunea xilanazelor în aluat nu se rezumă numai asupra xilanilor și/sau arabinoxilanilor ci și asupra complexelor acestora cu alți componenți ai făinii, în particular cu proteinele glutenice. Acțiunea pozitivă a xilanazei în aluat poate fi atribuită diminuării conținutului de pentozani insolubili și a faptului că apa pusă în libertate de către pentozanii solubilizați prin hidroliză devine disponibilă pentru formarea glutenului.

Hemicelulazele sunt un amestec de mai multe enzime, care reduc conținutul de hemiceluloză din aluat, reducând astfel efectul negativ al acestora asupra rețelei glutenice.

Surse de pentozanaze

Xilanaze active se găsesc în culturile unor mucegaiuri, Aspergillus oryzae și Aspergillus niger, precum și în culturile de Trichoderma reesei. Hemicelulazele se obțin din culturile unor mucegaiuri.

Efectul adaosului de xilanază în panificație

Utilizarea în panificație a xilanazei are următoarele efecte:

îmbunătățește stabilitatea aluatului și toleranța lui la fermentare;

mărește volumul pâinii prin creșterea capacității aluatului de a reține gazele;

îmbunătățește textura miezului și uniformitatea structurii lui;

prelungește prospețimea pâinii.

Ambele enzime, xilanaza și hemicelulaza dau efecte superioare atunci când sunt asociate cu -amilaza.

În mod similar, adaosul de pentozanaze influențează comportarea aluatului și calitatea pâinii îmbogățită în fibre: se îmbunătățesc prelucrabilitatea aluatului, volumul pâinii, menținerea prospețimii și culorii cojii.

Folosirea pentozanazelor se recomandă mai ales la prepararea pâinii integrale și a celei îmbogățite în fibre, precum și la obținerea pâinii de secară.

Condiții de folosire a pentozanazelor

Dozarea pentozanazelor se face în funcție de tipul și calitatea făinii utilizate și de compoziția aluatului. Doza de xilanază variază între 50 și 400 FXU/kg făină. Doza optimă pentru făinurile normale europene este de 150-200 FXU/kg făină. Ea asigură creșterea volumului pâinii cu aproximativ 20% Supradozarea xilanazei conduce la aluaturi moi și, deși volumul pâinii crește, structura miezului se înrăutățește .

Asocierea xilanazei cu -amilază în proporție de 4-10 FAU/kg făină mărește volumul pâinii cu peste 30% față de martor.

Hemicelulaza se folosește în proporții de 60-200 SHU/kg făină, efectele ei fiind superioare când se asociază cu -amilaza fungică.

Utilizarea proteazelor

Problema adaosului de proteaze în aluat se pune în cazul făinurilor puternice care formează gluten caracterizat prin rezistență și elasticitate mari și extensibilitate mică și sărace în enzime sau prelucrate prin tehnologii scurte cu timpi scurți de fermentare. În acest caz, aluatul nu se poate extinde sub presiunea gazelor de fermentare, are în consecință capacitate mică de reținere a gazelor, iar pâinea se obține densă, nedezvoltată. Aceste făinuri solicită și consum mărit de energie la frământare.

Acțiune: degradarea structurii glutenice prin hidroliza legăturilor peptidice ale proteinelor glutenice.

Rol pozitiv:

slăbirea structurii glutenice;

măresc extensibilitatea glutenului;

reduc timpul de frămăntare.

Adaosul de protează se face în două scopuri:

reducerea timpului de frământare;

slăbirea aluatului.

Pentru reducerea timpului de frământare, numărul de legături peptidice ce urmează a fi hidrolizate trebuie să fie limitat, motiv pentru care cantitatea de protează adăugată este mică. Adaosul în acest scop se face în maia. În timpul fermentării maielei proteaza are timp să acționeze asupra glutenului, iar în aluat, amestecul de proteine nemodificate din făina nou introdusă și glutenul parțial hidrolizat din maia conduce la o bună înmuiere a aluatului la frământare permițând reducerea duratei de frământare. În condițiile folosirii maielei fluide/semifluide cu 50% făină, reducerea timpului de frământare poate fi de 20%. La adăugarea proteazei la frământarea aluatului timpul de frământare rămâne neschimbat datorită timpului scurt de acțiune.

Atunci când se urmărește slăbirea aluatului, adaosul de proteaze se face în faza de aluat. În acest caz, cantitatea adăugată este de 2-3 ori mai mare decât cea adăugată în faza de maia. Acțiunea proteazei adăugate continuă în timpul fermentării, a operațiilor de prelucrare și prima parte a coacerii, având ca rezultat creșterea extensibilității și a proprietăților de fluaj ale aluatului.

Adaosul de proteaze exogene permite, astfel reglarea proprietăților reologice ale aluatului potrivit nevoilor tehnologice.

Surse de proteaze

Cea mai ieftină sursă de proteaze o constituie produsele de malț. Ele au însă și cantități importante de -amilază, care nu este întotdeauna necesară.

În ultimul timp, o largă utilizare a căpătat-o proteaza fungică obținută din Aspergillus oryzae. Ea are pH-ul optim la 5,5, ceea ce corespunde cu pH-ul din aluat și prezintă în același timp toleranța cea mai bună. Se mai folosește proteaza bacteriană obținută din Bacillus subtilis al cărui pH optim de activitate este 7.

Preparatele fungice conțin endo- și exopeptidaze. Endopeptidazele modifică proprietățile reologice ale aluatului, iar exopeptidazele măresc conținutul de aminoacizi în aluat.

Dozarea greșită a proteazelor conduce la produse de slabă calitate. La utilizarea în exces, aluaturile devin lipicioase, dificil de modelat, cu capacitate mică de menținere a formei și reținere a gazelor, rezultând produse aplatizate, cu volum mic și colorație intensă a cojii. La utilizarea unei cantități prea mici, aluatul este dificil de prelucrat, rezultând produse cu volum mic, simetrie slabă, cu miez sfărâmicios.

Utilizarea lipazelor

Câteva lipaze 1,3 specifice, exogene au fost găsite ca având efecte pozitive în panificație. Mecanismul după care lipaza acționează în aluat determinând îmbunătățirea calității pâinii nu este elucidat. S-au formulat două ipoteze:

primă ipoteză consideră că lipaza introdusă în aluat hidrolizează lipidele din făină împiedicându-le să complexeze cu proteinele glutenice, care astfel devin disponibile pentru formarea glutenului.

a doua ipoteză constă în faptul că prin hidroliza lipidelor făinii în prezența lipazei 1,3 hidrolitice se formează monogliceride și acizi grași liberi. Monogliceridele acționează ca emulgatori, iar acizii grași polinesaturați liberi în prezența lipoxigenazei endogene și a oxigenului inclus la frământare se oxidează la hidroperoxizi, proces cuplat cu reacțiile de oxidare din aluat, oxidarea grupărilor –SH cu influență pozitivă pentru însușirile reologice ale aluatului și calitatea pâinii și oxidarea pigmenților carotenoidici cu efect de albire a miezului pâinii.

De asemenea, faptul că atunci când se adaugă lipază aluatul se albește, demonstrează că au loc procese de oxidare.

Rol: hidroliza trigliceridelor la mono și digliceride. Efectul adaosului de lipaze în aluat:

stabilitate crescută a aluatului;

volum mărit al pâinii;

structură îmbunătățită a porozității și elasticitate mărită a miezului;

miez de culoare mai deschisă;

prospețime prelungită.

Cercetările experimentale asupra proprietăților reologice ale glutenului în urma tratamentului cu lipaze au arătat că acesta este semnificativ mai puternic și mult mai elastic decât în absența adaosului acestora.

Preparate ce conțin lipaze. Se utilizează pentru panificație o lipază 1,3 specifică obținută din culturi submerse de Aspergillus oryzae modificate genetic. Enzima hidrolizează legăturile esterice din pozițiile 1,3 din molecula lipidelor. Activează optim la pH 6-9 și temperatura de 30-40C.

Condiții de folosire a lipazelor

Doza utilizată de lipaze exogene variază cu calitatea făinii între 500 și 2000 LU/kg făină. Se obține o creștere a volumului pâinii de 20-30%.

Supradozarea lipazelor conduce la aluaturi foarte puternice și creșteri mici ale volumului pâinii.

Asupra prospețimii pâinii s-a constatat că adaosul a 250 LU/kg făină la pâinea fără grăsimi are același efect ca adaosul a 6% grăsimi.

Lipazele pot fi utilizate singure sau asociate cu pentozanaze (hemicelulaze sau xilanaze) sau cu -amilaza fungică sau cu ambele, când se obțin rezultate superioare.

În făina de grâu există și fosfolipază D care hidrolizează legătura dintre acidul fosforic și glicerină modificând, în acest fel, proprietățile tensioactive ale fosfolipidelor din făină și împiedică interacțiunea acestora cu glutenul, amidonul și faza gazoasă a alveolelor (porilor) din aluat. Rolul fosfolipazelor in panificatie:

Prin acțiunea asupra fosfolipidelor formează emulgatori în aluat ceea ce permite:

înlocuirea emulgatorilor DATEM/SSL;

îmbunătățesc caracteristicile aluatului, prelucrabilitatea lui;

îmbunătățesc stabilitatea la fermentare;

îmbunătățesc caracteristicile produsului finit

Utilizarea preparatelor ce conțin lipoxigenază

Surse de lipoxigenază exogenă. Cea mai bogată și mai bine cunoscută sursă de lipoxigenază o constituie boabele de soia. Ele conțin de 40 de ori mai multă lipoxigenază decât grâul, enzima fiind identificată pentru prima dată în aceste boabe.

În aluat lipoxigenaza de soia este activă asupra acizilor linoleic și linolenic.

Acțiunea lipoxigenazei în aluat. În panificație lipoxigenaza acționează în două direcții:

îmbunătățirea însușirilor reologice ale aluatului;

deschiderea culorii (albirea) aluatului și a pâinii.

Acțiunea lipoxigenazei asupra însușirilor reologice ale aluatului constă în creșterea toleranței la frământare și a stabilității lui.

Toleranța aluatului la frământare se referă la capacitatea lui de rezista la frământare excesivă, de a rezista la cădere, după ce s-a atins timpul de formare, adică de a-și menține stabilitatea.

S-a observat că în prezența lipoxigenazei scade numărul de grupări –SH în aluat și crește cel al punților disulfidice.

Explicarea mecanismului prin care lipoxigenaza îmbunătățește însușirile reologice ale aluatului are la bază procesul de oxidare a grupărilor sulfhidril din proteinele glutenice.

Capacitatea lipoxigenazei de a albi făina și în general de a decolora o serie de pigmenți este una din cele mai importante proprietăți ale acesteia. Experimentele cu enzime din surse diferite au arătat că substratul pentru activitatea de albire variază și include carotenul, xantofilele etc.

Oxidarea pigmenților făinii în procesul de preparare a pâinii este influențată de durata și viteza de frământare precum și de modul de preparare a aluatului.

Efectul adaosului de lipoxigenază în aluat

Lipoxigenaza este un ameliorator al făinurilor de calitate slabă. Ea este activă în aluat mai ales la frământare, dar continuă la fermentarea în vrac a aluatului, la dospirea finală și păstrează o oarecare activitate și în prima parte a coacerii.

Efectul ei în panificație constă în:

mărirea toleranței la frământare și a timpului de relaxare a aluatului;

creșterea volumului pâinii și îmbunătățirea texturii miezului;

deschiderea culorii miezului;

intensificarea aromei pâinii prin acțiunea asupra lipidelor din aluat.

Preparate de lipoxigenază. Cea mai utilizată sursă de lipoxigenază este făina de soia. Preparatele de făină de soia nu au activitate standardizată. Ele pot fi formate numai din făină de soia sau pot conține și alte ingrediente active, cum sunt: peroxidul de calciu, sulfatul de calciu, uleiul vegetal, mono- și digliceridele, fosfatul dicalcic, fosfatul diamonium, făina de porumb.

Condiții de folosire a lipoxigenazei. Făina de soia se folosește în panificație în proporție de 0,5-1% față de făina prelucrată.

Utilizarea glucozoxidazei

Glucozoxidaza catalizează oxidarea glucozei în D-gluconolactonă și H2O2. Această enzimă nu se găsește în făină, dar poate fi utilizată ca preparat enzimatic exogen. Glucozoxidaza catalizează oxidarea -D-glucozei în prezența oxigenului cu formarea acidului D-gluconic și a apei oxigenate, după reacția:

Acțiune:

oxidarea gruparilor SH ale glutenului;

oxidarea gruparilor acidului ferulic ale henicelulozelor

Efecte pozitive:

mărește rezistența glutenului și implicit a aluatului;

crește volumul pâinii și îmbunătățește textura miezului;

deshidrateaza aluatul la suprafață;

conferă cojii pâinii o textură crocantă

Apa oxigenată rezultată activează catalaza/peroxidaza făinii, activitatea lor fiind legată de prezența apei oxigenate. Oxigenul eliberat din această reacție participă în procesele de oxidare din aluat.

Îmbunătățirea proprietăților reologice ale aluatului este atribuită oxidării grupărilor –SH libere din aluat și formarea de punți disulfidice între proteinele glutenice.

În reacția de descompunere a apei oxigenate participă catalaza endogenă a făinii sau catalaza care însoțește, de regulă, glucozoxidaza în preparatele comerciale.

Îmbunătățirea proprietăților reologice ale aluatului de către glucozoxidază este pusă în legătură și cu activarea peroxidazei făinii, enzimă care catalizează oxidarea cu ajutorul H2O2 a grupărilor fenolice sau aminice determinând reticulări covalente ale proteinelor și/sau pentozanilor.

Enzima realizează și un efect de uscare a aluatului. Cauza care determină acest efect este atribuită formării gelurilor oxidate de către pentozanii solubili.

Cel mai bun sistem oxidant pentru gelificarea oxidativă a pentozanilor este sistemul H2O2-peroxidaza. În aluaturile din făină de grâu gelificarea oxidativă este realizată de peroxidaza endogenă a făinii. Tirozinaza, sistemul acid linoleic/lipoxigenază și alte enzime oxido-reducătoare din aluat au în aceeași măsură efect asupra gelificării pentozanilor.

Pentru formarea gelurilor oxidate ale pentozanilor au fost propuse două mecanisme. Primul se bazează pe formarea de acid difeluric în urma legării a două resturi de acid feluric adiacente, care determină legarea a două lanțuri de arabinoxilani, iar al doilea consideră că are loc adiția radicalilor proteici la dubla legătură activată a acidului feluric esterificat din arabinoxilani, având ca urmare formarea de legături între proteine și pentozani.

Asupra gelificării oxidative a pentozanilor influențează: concentrația de pentozani, originea lor ( varietatea de grâu, părțile anatomice ale grâului din care provin), caracteristicile structurale ale arabinoxilanilor (flexibilitatea lanțului poliglucidic, localizarea acidului feluric, lungimea lanțului, conformația sterică ), pH-ul și temperatura, concentrația și tipul de oxidant. Un pH al aluatului în jurul valorii 5 și o temperatură de 20-25C favorizează reacțiile de reticulare ale pentozanilor.

Surse de glucozoxidaze O serie de mucegaiuri reprezintă surse bogate în glucozoxidază, fiind folosite pentru obținerea preparatelor enzimatice de acest tip.

Preparate de glucozoxidază. Se obțin și se comercializează preparate de glucozoxidază din Aspergillus niger. Aceste preparate au pe lângă glucozoxidază și o anumită cantitate de catalază.

Condiții de folosire a glucozoxidazei Glucozoxidaza se folosește în doze care depind de calitatea făinii, compoziția și metoda de preparare a aluatului și variază de la 2,5 – 50 GU/100 g făină GU – unități de glucozoxidază.

Adaosul de glucozoxidază în aluat este însoțit de un adaos de glucoză. De obicei pentru doza optimă de enzimă se adaugă 0,5 g glucoză/100 g făină.

10.3. Aspecte tehnologice privind fabricația pâinii

Fazele tehnologice mai importante care intervin în fabricarea pâinii sunt următoarele:

frământarea în prezența aerului care conduce la obținerea unui aluat de o anumită consistență;

fermentarea principală (primară) urmată de divizare și modelare în bucăți;

fermentarea secundară (dospire). Temperatura aluatului în cele trei faze nu depășește 35C;

coacerea care se realizează la t = 250C, în care caz temperatura miezului nu depășește 100C.

Există variante în ceea ce privește tehnologia de fabricare a pâinii (figura 10.45), care se referă la:

intensitatea și durata frământării în prezența sau absența făinii de soia;

durata fermentației primare și secundare;

utilizarea unui mediu de fermentare semilichid (maia lichidă ) sau semisolid (baș).

Figura 10.45. Diagramele diferitelor tipuri de panificare

frământare; B- fermentare primară; C- divizare modelare; D – fermentare secundară (dospire); E-coacere

În toate cazurile se urmărește obținerea unui aluat suficient de dezvoltat prin fermentare, care să conducă, după coacere, la un volum optim al pâinii, cu miez poros (alveolar), o coajă cu colorație agreabilă ochiului și cu un ansamblu de caracteristici senzoriale acceptate de consumator.

Consistența aluatului se poate aprecia după curba farinografică obținută cu farinograful Brabender (figura 10.46), curbă care oferă informații privind durata de frământare și asupra stabilității aluatului în caz de frământare prelungită.

Figura 10.46. Reprezentare grafică a unei farinograme

(Unitățile Brebender reprezintă o măsură a consisteței aluatului)

10.3.1. Prepararea aluatului

Are drept scop obținerea aluatului cu însușiri reologice optime și respectarea compoziției produsului care se fabrică.

Pentru 100 kg făină, în funcție de extracția și calitatea făinii și produsul care se fabrică, se folosesc următoarele cantități de materii prime:

apă 40-70 l;

drojdie 0,4-3 kg;

sare 0- 1,8 kg, doza obișnuită fiind de 1,3-1,5 kg.

Metode de preparare a aluatului

Pentru prepararea aluatului se folosesc două metode:

metoda directă sau monofazică;

metoda indirectă sau polifazică.

Metoda directă

Metoda are o singură fază – aluatul și constă în faptul că toate componentele din rețetă se introduc la prepararea acestuia. Este cea mai simplă și mai rapidă metodă de preparare a aluatului. Se caracterizează prin consum mare de drojdie.

Se cunosc două procedee ușor diferite de preparare a aluatului prin metoda directă: procedeul clasic, în care aluatul este frământat cu malaxoare clasice, lente un timp de 10-15 minute, după care este fermentat 2-3 ore la 30-32C utilizând 1,5-3% drojdie și procedeul rapid, în care aluatul este frământat cu malaxoare cu turație mare a brațului de frământare (rapide, intensive sau ultrarapide) urmată de o fermentare scurtă, de 10-20 minute a aluatului. Acest tip de frământare impune folosirea la prepararea aluatului a substanțelor oxidante, cea mai utilizată dintre acestea fiind acidul ascorbic (50-75 ppm) și mărirea dozei de drojdie la 3-5%.

Procedeul rapid are ca avantaje:

reducerea pronunțată a fermentării înainte de divizare face ca aluaturile preparate prin procedeul rapid să se prelucreze mecanic ceva mai bine decât aluaturile obținute prin procedeul clasic.

scurtarea procesului tehnologic si calitatea superioară a pâinii reprezintă avantajele acestui procedeu.

Dezavantajul procedeului rapid constă în faptul că reducerea timpului de fermentare a aluatului are ca influență negativă asupra aromei și duratei de menținere a prospețimii pâinii. Cu toate acestea, în ultimul timp, procedeul a căpătat o largă utilizare.

Aluaturile preparate prin această metodă au la sfârșitul frământării temperaturi de 25-31C . Metoda directă de preparare a aluatului se aplică pentru produsele preparate din făinuri de extracții mici.

Metoda indirectă

Metoda prezintă două variante:

metoda bifazică;

metoda trifazică.

Metoda indirectă de preparare a aluatului urmărește:

înmulțirea, activarea și adaptarea drojdiei la mediul – aluat;

mărirea timpului de acțiune a enzimelor în vederea acumulării de substanțe ce determină maturizarea aluatului, acizi și substanțe de aromă;

maturizarea mai completă din punct de vedere reologic a aluatului.

Metoda bifazică cuprinde: maiaua și aluatul.

Maiaua se prepară din făină, apă și drojdie. În scopul creșterii acidității inițiale a maielei și aluatului, la maia se adaugă o porțiune de maia fermentată numită baș. Proporția acestuia variază cu calitatea și extracția făinii între 5 și 20% în raport cu făina prelucrată, valorile inferioare folosindu-se pentru făinurile de extracție mică și de calitate bună, iar valorile superioare pentru făinurile de extracție mare și calitate slabă. Modul de conducere a maielelor, adică mărimea, consistența, temperatura și durata de fermentare a acestora influențează întreg procesul tehnologic și calitatea pâinii. Toți acești parametrii se adoptă în funcție de calitatea făinii.

După consistență maiaua poate fi : consistentă și fluidă.

Maiaua consistentă are umiditatea de 41-44% și se prepară dintr-o cantitate de făină ce reprezintă 30-60% din cantitatea de făină prelucrată, în funcție de calitatea făinii.

Consistența maielei va fi mai mare pentru făinurile de calitate slabă și mai mică pentru făinurile foarte bune și puternice.Temperatura maielei variază între 25 și 29C, iar durata de fermentare între 90 și 180 minute. Limitele inferioare sunt folosite la prelucrarea făinurilor de calitate slabă, iar cele superioare la prelucrarea celor de calitate foarte bună sau puternice.

Pentru făinurile de calitate medie temperatura optimă este de 28C.

Reducerea cantității de făină, a temperaturii și duratei de fermentare a maielei și creșterea consistenței în cazul făinurilor slabe, limitează proteoliza și umflarea nelimitată a proteinelor glutenice, protejându-se astfel proprietățile ei reologice, iar creșterea cantității de făină, a temperaturii și duratei de fermentare a maielei și reducerea consistenței ei în cazul prelucrării făinurilor puternice accelerează proteoliza și umflarea nelimitată a proteinelor glutenice, ceea ce reduce elasticitatea și mărește extensibilitatea conducând în consecință la creșterea capacității de reținere a gazelor în aluat.

Maiaua fluidă (poliș) are umiditatea 63-75% și conține 30-40% din făina prelucrată. Se obține din făină, apă drojdie și baș,.care se folosește pentru mărirea acidității inițiale a maielei.

Maiaua fluidă se prepară cu temperatura de 27-29C și se fermentează 3-4 ore în funcție de calitatea și extracția făinii. Organoleptic, sfârșitul fermentării se identifică prin formarea la suprafața maielei a unei spume dense.

Aluatul se prepară din maiaua fermentată, restul de făină, apă, sare și materiile auxiliare.

Parametrii tehnologici ai aluatului, consistența, temperatura, durata de frământare și fermentare se aleg în funcție de calitatea făinii după aceleași principii ca la prepararea maielei, utilizându-se consistențe mai mari, temperaturi, durate de frământare și fermentare mai mici la prelucrarea făinurilor slabe, consistențe mai mici, temperaturi, durate de frământare și fermentare mai mari la prelucrarea făinurilor puternice.

Durata de frământare a aluatului este 8-15 minute, temperatura de 25-32C, iar durata de fermentare de 0-60 minute.

Metoda trifazică

Procedeul trifazic cuprinde: prospătura, maiaua și aluatul. Se recomandă în special la prelucrarea făinurilor de extracție mare, a celor de calitate slabă și degradate.

Prospătura se prepară din 5-20% din totalul de făină prelucrată, în funcție de calitatea făinii, apă și drojdie. Pentru mărirea acidității inițiale a acesteia se poate adăuga 1% baș, acesta din urmă reprezentând maia fermentată.

Prospătura reprezintă o cultură de drojdii și bacterii și se folosește pentru mărirea acidității inițiale a maielei și aluatului, necesare pentru întărirea glutenului și limitarea astfel a degradării lui enzimatice, precum și pentru obținerea de produse cu gust și aromă plăcute.

Prospătura se frământă 6-8 minute și se fermentează 4-6 ore la o temperatură de 27-28C, în funcție de calitatea și extracția făinii.

Maiaua se prepară din prospătura fermentată, făină, apă și drojdie, care după fermentare se folosește la prepararea aluatului.

Avantajele metodei indirecte:

pâinea obținută este de calitate superioară, cu gust și aromă mai plăcute și miez cu proprietăți fizice superioare față de pâinea obținută prin procedeul direct;

procedeul indirect prezintă flexibilitate tehnologică mai mare, aluatul se maturizează mai repede și mai complet, utilizează cantități mai mici de drojdie față de procedeul direct.

Dezavantajele procedeului indirect constau în durate lungi ale procesului tehnologic și pierderi de substanță uscată la fermentare mai mari.

10.3.2. Frământarea aluatului

Operația de frământare are drept scop obținerea unui amestec omogen din materiile prime și auxiliare și în același timp a unui aluat cu structură și proprietăți fizico-reologice specifice, care să-i permită o comportare optimă în cursul operațiilor ulterioare din procesul tehnologic.

Procesul de frământare constă dintr-un proces de amestecare și unul de frământare propriu-zisă.

În faza de amestecare se realizează amestecarea intimă a componentelor aluatului și hidratarea lor.

În faza de frământare propriu-zisă, aglomerările umede de făină apărute încă din faza anterioară, sub influența acțiunii mecanice de frământare se lipesc între ele și formează o masă compactă, omogenă, care cu timpul capătă însușiri elastice. Are loc formarea structurii glutenului și a aluatului. În procesul de formare a aluatului se disting mai multe faze, care pot fi urmărite cu ajutorul farinografului. Ele sunt: dezvoltarea, stabilitatea, înmuierea aluatului. Durata dezvoltării și stabilității aluatului și valoarea înmuierii lui sunt în funcție de calitatea făinii. Dezvoltarea și stabilitatea sunt mai mari și înmuierea mai mică pentru făinuri bune și foarte bune, și mai mici, respectiv, mai mare pentru făinuri slabe (vezi Controlul calității făinii de grâu).Timpul necesar pentru dezvoltarea optimă a aluatului este de 2-25 minute, în funcție de calitatea făinii, cantitatea de apă și turația brațului frământător. Frământarea aluatului trebuie să se oprească înainte ca aluatul să înceapă să se înmoaie. Continuarea frământării peste acest moment duce la înrăutățirea însușirilor reologice ale aluatului.

Durata fazei de frământare propriu zisă este mai mare decât durata fazei de amestecare. Ea este de 8-12 minute, necesită un consum mai mare de energie și se execută pentru malaxoarele prevăzute cu trepte de viteză la treapta a doua de viteză.

Formarea glutenului aluatului

Pentru formarea aluatului de grâu, cu însușirile lui specifice, elasticitate și extensibilitate, hotărâtoare este formarea glutenului. Aceasta este condiționată de hidratarea proteinelor glutenice și de acțiunea mecanică de frământare.

Cea mai mare parte din apa legată de proteinele glutenice (apă ¾) este reținută pe cale osmotică, iar restul prin adsorbție, spre deosebire de amidon care leagă cea mai mare parte din apă prin adsorbție și pe cale mecanică în microcapilare, și numai o mică parte prin osmoză (absorbție).

Pentru formarea glutenului se admite mecanismul potrivit căruia în urma hidratării și acțiunii mecanice de frământare proteinele glutenice cu structura lor nativă, globulară, suferă un proces de depliere a structurii lor în urma ruperii legăturilor ce condiționează această formă (legături de hidrogen, hidrofobe, disulfidice), însoțită de modificări de conformație a moleculei. Prin aceasta la suprafața moleculei apar grupări reactive capabile să reacționeze cu cele ale moleculei vecine. Acest lucru are loc atunci când moleculele ajung destul de aproape unele de altele. Apare astfel posibilitatea formării de legături între moleculele de gliadină și glutenină. Natura aminoacizilor existenți în structura lor face posibilă formarea unui număr mare de tipuri de legături: disulfidice, de hidrogen, hidrofobe, ionice.

La formarea glutenului cu însușirile lui specifice, un rol important se atribuie legăturilor disulfidice. Pentru formarea acestora se admite mecanismul interschimbului sulfhidril-disulfdic, formulat de Goldstein, potrivit căruia legătura disulfidică moleculară se formează între o moleculă proteică conținând o legătură disulfidică intramoleculară și o moleculă conținând o grupare sulfhidril, în locul legăturii intramoleculare formându.se o grupare sulfhidril capabilă la rândul ei să intre mai departe în același tip de reacție. În felul acesta prin reacții de schimb disulfid-sulfhidril, legăturile disulfidice dispar într-un punct și apar în alt punct al aluatului. Pe baza acestui mecanism se pot explica însușirile elasto-vâscozice ale aluatului, existența unui număr fix, permanent de punți disulfidice fiind proprie corpurilor elastice. Alături de punțile disulfidice, toate celelalte tipuri de legături de hidrogen, hidrofobe, ionice, contribuie la formarea glutenului cu structura sa tridimensională.

Numărul și viteza de formare a legăturilor transversale din structura glutenului, depind de intensitatea acțiunii mecanice de frământare, respectiv cantitatea de energie transmisă aluatului și de viteza cu care aceasta este transmisă.

De numărul și rezistența legăturilor formate între moleculele de gliadină și glutenină depind însușirile reologice ale aluatului. Legăturile disulfidice și ionice măresc elasticitatea și coeziunea, iar cele de hidrogen și hidrofobe măresc extensibilitatea și plasticitatea.

Legăturile disulfidice și cele de hidrogen se formează la începutul frământării, în timp ce celelalte tipuri de legături, hidrofobe și ionice se formează pe durata frământării.

Pentru însușirile reologice ale aluatului un rol important se atribuie legăturilor de hidrogen, al cărui număr este preponderent, ele reprezentând cca. 70% din totalul legăturilor din aluat, precum și datorită faptului că fiind legături mai puțin rezistente pot fi modificate sub diferite influențe, modificându-se astfel starea fizică a aluatului.

Glutenul formează în aluat o matrice proteică sub formă de pelicule subțiri care înglobează granule de amidon și celelalte componente insolubile ale făinii. Pentru a rezulta o structură consistentă, coezivă a aluatului, glutenul trebuie să acopere întreaga suprafață a acestora. Pentru aceasta, făina trebuie să conțină minim 7,0% proteine. La un conținut mai mic de proteine glutenul nu poate îngloba întreaga masă a granulelor de amidon și nu formează un aluat legat.

În afară de interacțiunea dintre cele două proteine glutenice în urma căreia se formează glutenul, proteinele glutenice mai interacționează în timpul formării aluatului și cu alți componenți ai făinii, cum sunt glucidele și lipidele, cu care formează complecși cu rol important pentru însușirile aluatului.

Peptizarea proteinelor

În timpul frământării crește cantitatea de proteine solubile. Această creștere este cu atât mai mare, cu cât durata și intensitatea frământării sunt mai mari și calitatea făină mai slabă. Proteinele solubilizate sunt formate din glutenină și ele rezultă în urma depolimerizării acesteia, în principal prin ruperea legăturilor disulfidice din structura ei. Creșterea cantității de proteine solubile are loc și datorită umflării nelimitate a acestora, a peptizării lor, favorizată de o structură puțin rezistentă a glutenului. La aceasta contribuie și acțiunea enzimelor proteolitice.

Absorbția aerului

Foarte importantă la frământare este includerea aerului în aluat, deoarece oxigenul conținut de acesta participă la reacții de oxidare a proteinelor și a pigmenților făinii. Din acest punct de vedere interesează nu numai cantitatea de aer inclus ci și gradul de dispersare al acestuia în aluat Aerul inclus în aluat la frământare este important și pentru porozitatea produsului, bulele de aer formate stau la originea porilor.

Sfârșitul frământării se determină organoleptic. Aluatul bine frământat este omogen, elastic și la proba de întindere între degetul mare și arătător formează o peliculă fină și transparentă. Aluatul insuficient frământat este omogen, dar este lipicios, iar aluatul suprafrământat la proba de întindere se rupe.

La frământare, prin adaos de apă la făină, se declanșează rapid activitatea enzimelor care conduce la formarea zaharuri fermentescibile, precursorilor de aromă:

glucide simple și dizaharide prin acțiunea amilazelor asupra amidonului;

aminoacizi sub acțiunea exopeptidazelor asupra proteinelor;

hidroperoxizi prin acțiunea lipoxigenazei asupra acizilor polinesaturați, în particular acidul linoleic.

Aceste reacții se continuă până în primele stadii ale coacerii și încetează odată cu inactivarea termică a enzimelor care catalizează reacțiile menționate.

Având în vedere efectele multiple, reacțiile catalizate de lipoxigenază sunt considerate reacții “cheie”, pentru că ele induc modificări conformaționale ale miceliilor lipoproteice asigurând agregarea proteinelor glutenice cu formare de gluten. Diminuarea concentrației de acizi grași polinesaturați în cursul frământării este o dovadă a acțiunii lipoxigenazei și această diminuare este cu atât mai importantă cu cât nivelul de lipoxigenază din aluat este mai ridicat și cu cât energia mecanică acumulată de aluat este mai mare. Un conținut mai mare de lipoxigenază se poate realiza prin adaos de făină de soia. Frământarea intensivă mărește acțiunea lipoxigenazei, oxidarea acidului oleic putând fi cvasitotală la o încorporare suficientă de aer. Sinteza concomitentă de radicali peroxidici și hidroperoxidici cu mare putere oxidantă, conduce la reacții cuplate de oxido-reducere.

Reducerea hidroperoxizilor poate avea loc la nivelul locurilor hidrofobice ale miceliilor lipoproteice ale făinii concomitent cu oxidarea cuplată a grupărilor tiolice. În consecință se produc modificări ale distribuției sarcinilor electrice la suprafața proteinelor și de localizare a punților disulfurice, ceea ce conduce la o inversie a miceliilor cu eliberarea lipidelor legate. Acest proces antrenează după sine o ameliorare a calității reologice a aluatului, în sensul că se mărește toleranța la frământare și crește volumul pâinii.

În plus hidroperoxizii sunt implicați în oxidarea cuplată a substraturilor lipofile cum ar fi pigmenții carotenoidici, prin a căror distrugere, aluatul se albește la frământare. Prezența agenților inhibitori ai lipoxigenazei cum ar fi acidul ascorbic sau NaCl, conduce la frânarea albirii. Rezultă că momentul adăugării de NaCl influențează atât albirea aluatului cât și reologia aluatului. Tocoferolii prezenți în aluat joacă un rol antioxidant și captează radicali liberi din mediu, pierzând însă funcția vitaminică. La coacere, produșii de scindare ai hidroperoxizilor conduc la formare de hexanal, care modifică aroma miezului.

În fapt, frământarea conduce la realizarea caracteristicilor aluatului, caracteristici care sunt strâns corelate cu modificările proteinelor glutenice.

Gluteninele, care constau din subunități cu masă moleculară 60140 kDa, la frământare suferă un proces de depolimerizare și de extensie prin reducerea grupărilor –SS- intermoleculare. În structura polimerilor de glutenină ar intra numai subunități de glutenine cu masă moleculară cuprinsă între 90 și 140 kDa care prezintă zone -helix spre extremități și zone centrale -pliate acestea intervenind în elasticitatea glutenului. Gliadinele reacționând ca plastifianți, dar intervenind și în procesele dinamice prin intermediul legăturilor hidrofilice și hidrofobice.

Figura 10.47. Reprezentarea schematică a structurii polimerului de glutenină (a) și a interacțiunii dintre glutenine și gliadine

De remarcat că la frământare sunt afectate un număr relativ redus de grupări –SS- care trec în grupări –SH, o parte dintre acestea refăcându-se în etapele următoare pe care le suferă aluatul, în special la fermentare.

Tabelul 10.19.

Conținutul în glucide simple și aminoacizi al făinii de grâu (în stare uscată)

10.3.3. Fermentarea

Operația are loc după frământare și reprezintă o fermentare în vrac. Pentru prospătură și maia fermentarea se realizează în timpul cuprins între sfârșitul frământării și frământarea fazei următoare la care sunt utilizate maia, respectiv aluat, iar pentru aluat, în intervalul de timp de la sfârșitul acesteia până la trecerea lui la operația de divizare.

Scopul operației de fermentare este maturizarea aluatului. Un aluat matur trebuie să aibă la sfârșitul fermentării capacitate bună de formare a gazelor, capacitate bună de reținere a gazelor și să conțină cantități suficiente de substanțe de gust și de aromă.

Capacitatea de reținere a gazelor se modifică continuu pe durata fermentării datorită modificării proprietăților reologice ale aluatului, în urma proceselor coloidale și a proteolizei din aluat. Aluatul elastic și rezistent imediat după frământare devine la sfârșitul fermentării mai puțin rezistent și mai puțin elastic ,dar cu extensibilitate mărită, ceea ce îi permite să rețină mai bine gazele de fermentare. Creșterea capacității aluatului de reținere a gazelor este scopul principal al procesului de fermentare, alături de acumularea de substanțe de gust și de aromă.

Maturizarea aluatului este rezultatul unui complex de procese biochimice, microbiologice și coloidale, care au loc concomitent la fermentare.

Procesele biochimice, amiloliza și proteoliza, furnizează sursa de carbon, respectiv de azot, pentru microflora aluatului formată din drojdii, care produc fermentația alcoolică și bacterii care produc fermentația lactică. În aluat amiloliza are rolul să asigure necesarul de zaharuri fermentescibile care să întrețină procesul de fermentare pe toată durata procesului tehnologic, zaharurile proprii ale făinii fiind insuficiente pentru aceasta. De aceea formarea maltozei prin hidroliza amidonului este deosebit de importantă în aluat. Ea are loc prin acțiunea comună a – și -amilazei.

Intensitatea amilolizei depinde de conținutul de enzime amilolitice active al făinii, în principal -amilaza, și de conținutul de amidon deteriorat mecanic. Explicația constă în faptul că dintre enzimele amilolitice, singura -amilaza, care este prezentă în făină numai sub formă de urme sau lipsește complet, poate exercita o acțiune de corodare a granulei intacte de amidon, deși cu viteză mică, fiind posibilă pătrunderea ulterioară a enzimei în interiorul granulei, urmată de hidroliza ei.-Amilaza, enzimă prezentă în cantități suficiente în făină poate hidroliza numai granulele de amidon deteriorate mecanic în procesul de măcinare, hidroliza ei rezumându-se numai la porțiunea de granulă deteriorată, restul granulei comportându-se ca o granulă intactă. De aceea cantitatea de maltoză formată depinde de conținutul de -amilază și mai ales de conținutul de amidon deteriorat al făinii. Conținutul optim al acestuia din urmă în făină este de 6-9%.

Proteoliza în aluat este importantă pentru că ea influențează însușirile reologice ale aluatului, de care depind capacitatea lui de a reține gazele și a-și menține forma, însușiri care influențează direct calitatea pâinii.

Datorită proteolizei și peptizării unei părți a proteinelor, în timpul fermentării aluatul își reduce consistența, se înmoaie, cu atât mai pronunțat cu cât făina este de calitate mai slabă și-și mărește extensibilitatea. Acest lucru este dorit în cazul prelucrării făinurilor puternice, dar nu este dorit în cazul făinurilor slabe, motiv pentru care în acest ultim caz durata de fermentare și temperatura se reduc.

Proteoliza este activată de prezența drojdiei în aluat, datorită conținutului său în glutation și modificării potențialului de oxido-reducere, care are loc în sensul intensificării însușirilor reducătoare.

Rolul principal în proteoliză îl are structura , gradul de agregare al glutenului, care determină atacabilitatea lui enzimatică. În făinurile normale rolul proteazelor proprii este minor. Ele se găsesc în cantitate mică în stare activă, au pH-ul optim și temperatura optimă de activitate în afara valorilor existente în aluat.

Procesele microbiologice constau în fermentația alcoolică produsă de drojdii și fermentația acidă produsă de bacterii.

În fermentația alcoolică drojdia fermentează mai întâi zaharurile proprii ale făinii și numai după epuizarea lor începe să fermenteze maltoza cu viteză apreciabilă. După epuizarea zaharurilor proprii până la începerea fermentării maltozei are loc o diminuare a degajărilor de dioxid de carbon, cunoscută sub numele de “pauză de maltoză”. Trecerea la fermentarea maltozei are loc după un timp de adaptare, de inducție, în care drojdia își sintetizează enzimele implicate în acest proces, respectiv permeaza maltozei și maltaza. Aceste enzime se sintetizează, se induc în celula de drojdie în prezența maltozei. Adaptarea la fermentarea maltozei are loc la activarea prealabilă a drojdiei, iar în absența acesteia în fazele de prospătură și maia pentru metoda indirectă de preparare a aluatului, și în faza de aluat pentru metoda directă. Intensitatea fermentației alcoolice crește cu temperatura, până la 35C, și în aluaturi de consistență mică. Dioxidul de carbon, format în timpul procesului de fermentație alcoolică, exercită o acțiune mecanică de întindere a rețelei proteice din aluat, contribuind la desăvârșirea formării structurii glutenului și prin aceasta la îmbunătățirea însușirilor reologice ale aluatului și a capacității lui de reținere a gazelor.

Fermentația lactică este produsă de bacteriile lactice, homo- și heterofermentative, aduse de făină și de drojdie în aluat. Ele fermentează hexozele și pentozele formând ca produs principal acidul lactic. Alături de acesta care reprezintă aproximativ 2/3 din aciditatea totală, se mai formează și alți acizi, mai importanți fiind acidul acetic și formic (aprox. 1/3 din aciditatea totală).

La temperatura de preparare a maielei și aluatului, rolul principal în formarea acidității aluatului îl au bacteriile mezofile cu optimul de activitate de 30-35C, cele termofile cu optimul de activitate la 48-52C, având un rol minor.

Acizii formați în fermentația lactică măresc aciditatea aluatului și deplasează pH-ul spre valori mai acide. Aceasta influențează proprietățile reologice ale aluatului, activitatea enzimelor, gustul și aroma produsului. De aceea aciditatea finală a prospăturii, maielei și aluatului este luată drept indice a produsului de maturizare a semifabricatelor. Un rol deosebit îl joacă acidul lactic. El îmbunătățește însușirile fizice ale glutenului slab, activează celula de drojdie, are acțiune favorabilă asupra gustului produsului. Coborârea pH-ului este favorabilă și pentru combaterea îmbolnăvirii pâinii de boala mezentericus și pentru prelucrarea făinurilor provenite din grâu încolțit, bogate în -amilază.

Sfârșitul fermentării se stabilește organoleptic prin determinarea acidității.

Pentru prospătură și maia, organoleptic se apreciază volumul care, în timpul fermentării crește de 2-3 ori și aspectul suprafeței, care la început este bombată și la sfârșitul fermentării devine plană și apoi concavă, datorită pierderii unei părți din dioxidul de carbon, după aspectul în ruptură, care trebuie să fie poros, fără apă liberă vizibilă, după gust și miros, de alcool și dioxid de carbon. În momentul în care suprafața a devenit plană, puțin căzută în cuvă, fermentația se consideră terminată. Pentru aluat se apreciază structura în ruptură și elasticitatea. Aciditatea la sfârșitul fermentării trebuie să corespundă valorii optime.

La fermentare, drojdia de panificație va consuma rapid stocul de zaharuri fermentescibile și, în consecință, cantitatea de glucoză generată prin acțiunea combinată a – și -amilazei asupra amidonului, precum și prin acțiunea maltazei secretată de drojdie asupra maltozei, va fi principala sursă de zaharuri susceptibile de a interveni în reacția Maillard, dar va fi și o sursă de formare a substanțelor de aromă în fermentația primară și secundară alături de procesul de catabolism al drojdiilor când se formează substanțe de aromă pe seama metabolismului proteic. Rezultă că inițial, drojdia consumă zaharurile fermentescibile din făină, care nu sunt însă suficiente pentru asigurarea nevoilor energetice ale drojdiei pe toată durata fermentației. Pe măsură ce amilazele aluatului formează maltoză din amidon, pe care drojdia o poate metaboliza numai după o anumită perioadă de inducție în care este reconstituit echipamentul enzimatic al drojdiei și anume se activează permeaza și maltaza, astfel încât se formează glucoza ce poate fi ușor fermentată.

Zaharoza, în schimb este rapid transformată în glucoză și fructoză de către invertaza drojdiei, chiar în timpul frământării.

Când făinurile sunt hipodiastazice, folosirea malțului sau amilazelor de origine microbiană este binevenită în vederea asigurării nivelului optim de zaharuri fermentescibile, care să asigure volumul optim al pâinii, culoarea cojii și aroma pâinii. Făinurile superdiastazice, la care atât amiloliza cât și proteoliza sunt intensificate nu pot fi panificate ca atare ci trebuie ameliorate prin cupajare cu făinuri hipodiastazice.

La fermentare (primară și secundară), circa 95% din zaharurile fermentescibile sunt fermentate pe calea care conduce la alcool etilic și CO2, restul de 5% fiind fermentate prin așa zisele fermentații secundare mai puțin cunoscute care conduc la formarea de alcooli superiori, compuși carbonilici, acizi organici, esteri. În aceste fermentații secundare pot fi antrenați și aminoacizi precum și acizi grași. Din figura 10.48. se observă că placa turnantă în metabolismul zaharurilor fermentescibile de către drojdie este acidul piruvic, precursor al numeroaselor substanțe volatile ce se formează pe cale enzimatică și anume:

decarboxilarea acidului piruvic conduce la acetaldehidă și CO2;

acetaldehida este redusă la alcool etilic de către alcooldehidrogenaza;

acidul piruvic conduce și la formare de acid acetic și CO2 prin intermediul acetil-CoA;

acidul piruvic este redus la acid lactic de către bacteriile care posedă lactatdehidrogenază și aceeastă transformare este foarte importantă în cazul procedeului cu fermentare îndelungată.

Figura 10.48. Reprezentarea schematică a amilolizei și a metabolismului drojdiei în fermentația aluatului de pâine

Prin condensarea a două molecule active de acetat se formează acetoină care, la rândul său, prin oxidare conduce la diacetil și alți compuși de importanță mare pentru aroma pâinii. O schemă mai completă a produșilor ce se formează plecând de la acidul piruvic este arătată în figura 10.49. Aminoacizi liberi din aluat sunt metabolizați de drojdie după mecanismul lui Ehrlich, mecanism care se derulează paralel cu fermentația alcoolică. Se formează alcooli superiori în miezul pâinii cum ar fi izobutilic, izoamilic și 2-fenil-etilic din valină, izoleucină și respectiv fenilalanină.

Figura 10.49. Căile de formare a unor constituienți volatili pornind de la acidul piruvic

Prin reducerea duratei de fermentare, se reduce aroma pâinii, iar prin folosirea de prefermenți în stare semilichidă sau semisolidă, aroma pâinii se îmbunătățește simțitor. În cazul prefermentului semilichid (maia fluidă) în care drojdia fermentează un mediu îmbogățit timp de 2-3 ore și chiar mai mult se obțin rezultatele cele mai bune din punct de vedere al aromei pâinii finite.

10.3.4. Refrământarea aluatului

Este o frământare de scurtă durată care se execută în timpul fermentării aluatului. Se face în scopul îmbunătățirii structurii aluatului. Durata și intensitatea operației depind de calitatea și extracția făinii și durata de fermentare a aluatului.

În cazul făinurilor albe și de calitate foarte bună se pot face două refrământări, fiecare cu durata de 0,5-1 minut, iar în cazul făinurilor de calitate medie se face o refrământare de 0,5-1 minut. Aluaturile preparate din făinuri slabe nu se refrământă deoarece se accentuează degradarea însușirilor reologice ale aluatului.

10.3.5. Coacerea

Viteza reacțiilor biochimice crește la începutul coacerii și, în plus, evoluția structurii substratului datorită fragilizării legăturilor de hidrogen, provocată de creșterea temperaturii, va accelera aceste reacții enzimatice. Între gelatinizarea termică a amidonului și denaturarea termică a amilazelor există un interval de timp de câteva secunde pentru -amilaza (zona C) și de câteva minute (zona D și E). În aceste pauze scurte producția de maltoză și dextrine este maximă. Amiloliza se desfășoară la temperatura ordinară a aluatului crud până la începutul coacerii când amidonul este gelatinizat. În prima etapă activitatea amilolitică este importantă pentru că drojdia produce CO2 care determină volumul pâinii și porozitatea acesteia.

În același timp, amiloliza este importantă pentru a realiza o coajă cu culoare frumoasă la coacere. În cazul amilolizei excesive, la începutul coacerii crește proprietatea colantă a miezului, se accentuează producția de CO2 dar se diminuează și retenția de gaze, precum și volumul pâinii, în schimb se accentuează colorația cojii prin reacția Maillard.

Aromele formate la coacere sunt dependente de natura și cantitatea substanțelor volatile/nevolatile formate în etapele precedente.

Astfel, o parte din alcooli și acizii volatili proveniți prin fermentare, sunt angajați în reacții de esterificare și vor îmbunătăți aroma miezului.

Aminoacizii cu sulf ai drojdiei și făinii conduc la formarea unor cantități mici de mercaptani și H2S. Hidroperoxidul acidului linoleic conduce la n-hexanal și se pot forma în plus pentanal în cantitate mică și un rest acid cu lanț lung în cantitate mare. Se mai formează: produși rezultați din ruperea hidroperoxidului cu 10; produși rezultați din oxidarea cuplată a carotenilor și anume acizi și -iononă .

Zaharurile și aminoacizii formați în perioada fermentării și care nu au fost utilizați de drojdie intră în reacții Maillard obținându-se produși care dau aroma și culoarea cojii.

Circa 95% din aminoacizii liberi rămași în aluat intră în reacția Maillard, cei mai utilizați fiind aminoacizii aminați. Compușii majori care se formează la coacerea pâinii sunt:

2-acetil 1-pirolină (aromă de floricele de porumb sau de prăjit);

2 –acetil tetrahidropiridină (aromă de prăjit);

nonenal (din oxidarea lipidelor).

Utilizarea preparatelor enzimatice în panificației

Preparatele enzimatice se folosesc în industria panificației pentru:

accelerarea maturizării făinurilor proaspăt măcinate;

standardizarea conținutului de ce-arnilază din făină;

condiționarea aluatului.

Accelerarea maturizării făinii de grâu

În cazul făinii normale, accelerarea maturizării făinii pe cale enzirnatică, prin folosirea unor preparate enzimatice exogene, favorizează:

eliberarea de acizi grași nesaturațidin lipidele făinii (lipaze, esteraze);

oxidarea acizi lor grași nesaturați eliberați cu formare dehidroperoxizi, care au efect dublu: de întărire a proteinelor glute.nice și de albire a făinii (lipoxigenaza);

oxidarea cuplată a acidului ascorbic și a glutationului redus (ascorbatoxidaza, glutation dehidrogenaza);

punerea în libertate a H2O2, a oxigen ului activ sau rnolecular cu acțiune asupra acizi lor grași nesaturați și, deci, cu formare de peroxizi (glucozoxidaza, catalaza);

schimburi -SH/-SS- în vederea dezvoltării aluatului la fabricarea pâinii (sulfhidriloxidaza).

Pentru standarizarea conținutului de α-amilază din făină se utilizează, în mod curent, α-amilaza de natură fungică, pentru că, spre deosebire de α -amilaza bacteriană și din malț, este inactivată la – 60°C, deci înainte de gelatinizarea amidonului. De asemenea, are un optim de activitate la pH-ul aluatului de 4,5 – 5,5.

Adaosul de α-amilază fungică în făină se stabilește pe baza determinării activității α-amilazice a făinii ce urmează a fi suplimentată (metoda SKB -Sandsted, Kneen și Blish, indicele de cădere a lui Hagberg sau metoda Ferrand).

Condiționarea aluatului prin folosirea de preparate enzimatice exogene

Preparatele enzimatice folosite pentru condiționarea aluatului sunt preparate enzimatice hidrolitice (proteaze, pentozanaze, lipaze, este raze) și oxidoreductaze.

Utilizarea de proteaze. Suplimentarea cu proteaze a făinii de grâu se face pentru a scurta durata de frământare și a modifica consistența aluatului, a controla textura pâinii și a îmbogăți aroma. Folosirea proteazelor este indicată la obținerea aluatului din făină „tare”, cu conținut ridicat de proteine precum și la folosirea făinii cu gluten deteriorat provenită din grâne cu coacere la temperaturi ridicate (ani foarte călduroși).

Se utilizează, de regulă, proteaze fungice cu activitate endo- și exopeptidazică. Endopeptidazele modifică proprietățile vâscozo-elastice ale aluatului și îmbunătățesc proprietățile de lucrabilitate ale aluatului împreună cu elasticitatea și textura acestuia. Aluaturile cu extensibilitate ridicată se prelucrează mai ușor (durata de malaxare se scurtează cu 10 – 30% și, deci, se reduce consumul de energie). Exopeptidazele, punând în libertate aminoacizi liberi care intră în reacții Maillard, contribuie la îmbunătățirea aromei pâinii.

Proteazele de origine bacteriană sunt recomandate a fi folosite în aluaturile pentru biscuiți, fursecuri, produse tip crakers.

Utilizarea pentozanazelor. Pentozanazele fungice se utilizează pentru hidroliza pentozanilor solubili și insolubili din aluat, cu efecte asupra proprietăților reologice ale aluatului, volumului pâinii și structurii miezului, fără a genera aluat lipicios. Pentozanazele fungice se utilizează și la obținerea pâinii de secară pentru reglarea vâscozității aluatului, deoarece făina de secară are un conținut ridicat de pentozani ce se hidratează lent și deci, în lipsa enzimelor pentozanazice, ar conduce la aluaturi foarte vâscoase care generează pâine cu volum scăzut și miez uscat, sfărâmicios.

Utilizarea lipazelor. La utilizarea lipazelor din diferite surse, se mărește conținutul de lipide libere sub formă de mono- și digliceride care joacă rol de emulgator, dar, în același timp, se complexează și cu amiloza/amilopectina, întârziind retrogradarea amidonului. Pe de altă parte, acizii grași liberi se constituie ca substrat pentru enzimele de oxidoreducere, în principal pentrulipooxigenază. Efectele finale ale lipolizei restrânse constau în îmbunătățirea proprietăților reologice ale aluatului, creșterea volumului pâinii și asigurarea unui miez cu porozitate uniformă

Utilizarea enzimelor de oxidoreducere. Aceste enzime (lipooxigenaza, glucozoxidaza și sulfhidriloxidaza) accelerează procesul de reformare a legăturilor disulfurice dintre lanțurile polipeptidice, obținându-se un aluat elastic. Acțiunea enzimelor menționate, precum și a altor oxidoreductaze, a fost deja menționată.

Utilizarea culturilor starter în panificație

Maturarea aluatului este mai completă atunci când în practica de panificație se folosește „bașul”, care aduce în aluat atât aciditate cât și bacterii lactice adaptate deja la mediul din aluat. Bașul este un gen de cultură starter de bacterii lactice.

O cultură starter adevărată trebuie, însă, să conțină bacterii lactice selecționate. La fabricarea pâinii prin procedeul „San Francisco” s-a utilizat pentru acidifierea mediului Lactobacillus sanfrancisco. Mediul de cultură denumit și bulion de aluat acru bacterian (SDB) conține maltoză, cazeină hidrolizată, extract de drojdie, suspensie de drojdie proaspătă (Saccharmoyces cerevisiae), sorbitan polioxietilen monooleat. Mediul inoculat s-a termostatat la 30°C/1-2 zile, într-o atmosferă cu concentrație mare de CO2, atmosferă obținută prin suflare de CO2 deasupra culturii. După multiplicare, celulele au fost colectate prin centrifugare, spălate cu soluție 0,5% NaCl și resuspendate într-un lichid stabilizator format din 6 părți glicerol și 6 părți soluție apoasă, 8% lapte praf degresat, 2% glutamat monosodic și 0,5% sorbitan polioxietilen monooleat, raportul dintre biomasa bacte- riană și lichidul de stabilizare fiind 1 la 4. Amestecul se conservă prin congelare în azot lichid sau prin liofilizare.

Pentru fabricarea unei pâini din făină de grâu pe bază de aluat acru (baș), în procedeul „San Francisco” s-a utilizat pentru fermentare și o cultură care este formată din Lactobacillus sanfrancisco și drojdia Saccharmyces exiguus (Torulopsis holmii = Candida milleri), raportul drojdii/bacterii fiind 1:100. Drojdia menționată nu poate utiliza maltoza, dar aceasta este metabolizată de Lactobacillus sanfrancisco, pe cale fosforolitică, eliberând în mediu o moleculă de glucoză pentru o moleculă de maltoză utilizată. Drojdia, în schimb, utilizează glucoza disponibilizată și produce substanțe stimulatoare esențiale pentru Lactobacillus.

Avem de-a face, în cazul acestei culturi, cu o simbioză perfectă. Starterul este refăcut la fiecare 8 ore cu 100 de părți făină de grâu cu conținut ridicat de gluten și cu 46-52 părți de apă. Amestecul este apoi fermentat și pH-ul scade de la 4,4-4,5 până la 3,8-3,9. Pentru a obține aluatul de pâine se amestecă 20 de părți din starterul fermentat cu 100 de părți făină, 60 de părți apă și 2 părți de NaCl. De la pH-ul inițial de 5,2-5,3, după 7 ore de fermentare, pH-ul ajunge la 3,9, amestecul fiind gata de a fi prelucrat.

Pot fi folosite și culturi starter concentrate prin cultivarea bacteriilor lactice prin metoda continuă (ca în cazul culturilor concentrate folosite în industria laptelui). Astfel, sunt comercializate următoarele culturi starter de bacterii lactice:

Florapan L-22, care este formată din Lactobacillus delbrueckii (homofermentativ);

Florapan L-73, care este formată din Lactobacillus plantarum (homofermentativ);

Florapan L-62, care este formată din Lactobacillus brevis (heterofermentativ).

În industria berii intervin două tehnologii distincte și anume tehnologia malțului și tehnologia berii.

11.1. Tehnologia malțului

Tehnologia malțului implică următoarele operații (figura 11.50) din care, din punct de vedere biotehnologic, interesează operația de germinare a orzului, respectiv orzoaicei, materii prime de start.

Figura 11.50. Tehnologia de fabricare a malțului

Germinarea orzului/orzoaicei are drept scop următoarele:

sinteza de enzime în cantitate mai mare;

micșorarea complexității substanțelor de rezervă și a celor ce intră în structura bobului de orz/orzoaică, proces denumit și “solubilizarea orzului”.

La germinarea orzului/orzoaicei au loc următoarele procese:

creșterea țesutului embrionar cu dezvoltarea plumulei și a radicelelor;

activarea enzimelor preexistente în orz și sintetizarea „de novo” a enzimelor, în principal a hidrolazelor, orzul/orzoaica matur(ă) conținând în cantități mici toate enzimele hidrolitice cu excepția -amilazei.

La germinare se formează deci amilază și cantități noi din celelalte hidrolaze în următoarea succesiune: -glucanaze, -amilază, enzime proteolitice (peptidaze și proteinaze), fosfataze, -amilază;

respirația, care va fi dependentă de aerarea orzului în procesul de germinare.

La germinare sunt degradate principalele substanțe din orz și anume:

degradarea amidonului. Conținutul de amidon scade de la 63% la ~58% prin formare de zaharuri simple sub acțiunea amilazelor. Din zaharurile simple formate ~50% sunt consumate prin respirație. Activitatea amilazică a malțului finit se măsoară prin „puterea diastazică”.

degradarea hemicelulozelor. Pereții celulari ai bobului de orz sunt formați din hemiceluloze, respectiv din -glucani (80-90%) și pentozani (20%). -Glucanii sunt polimeri liniari cu masă moleculară mare (conțin ~ 200000 resturi de D-glucopiranoză) formați din D-glucoză legate între ele -1,4 (70%) și 1,3 (30%). La nivelul pereților celulari -glucanii sunt legați de proteine prin legături covalente, formând complexe care realizează o matrice relativ rigidă. Pentozanii sunt polimeri ramificați cu masă moleculară mare formați din molecule de D-xiloză legate -1,4. Lanțurile laterale sunt formate din arabinoză.

Prima enzimă implicată în degradarea -glucanilor este -glucan solubilaza care realizează scindarea -glucanului de proteină (enzima joacă rolul unei carboxipeptidaze), -glucanii eliberați din complex devenind solubili. -Glucan solubilaza este prezentă în orz dar este și sintetizată în cursul germinării. Enzima este termostabilă, fiind stabilă la brasaj, timp de o oră și la 65C. -Glucanii sunt degradați în continuare de -glucanaze diferite. Două endo–glucanaze și anume -1,3 glucanaza și 1,3-1,4 glucanaza sunt în principal sintetizate la germinare și vor interveni în degradarea pereților celulari ai orzului. Aceste -glucanaze fragmentează lanțul -glucanic conducând la -oligozaharide.

Exo -glucanazele desprind o moleculă de celobioză de la capătul nereducător al lanțului -glucanic iar celobioza la rândul ei este transformată în două molecule de glucoză de către celobiază (-glucozidază). Circa 50-90% din activitatea -glucanazelor este pierdută la uscarea malțului, iar la brasaj hidroliza -glucanilor are loc la 45-55C deoarece la temperaturi ceva mai ridicate aceste -glucanaze sunt inactivate rămânând doar -glucan solubilaza care va elibera -glucani din complexul cu proteinele, ceea ce va conduce la creșterea vâscozității mustului și deci mărirea timpului de filtrare a plămezii. Un exces de -glucani în bere poate cauza dificultăți de filtrare sau tulburări în produsul finit.

Enzimele care degradează pentozanii sunt: endoxilanaza (hidrolizează legăturile – 1,4 din interiorul lanțului pentozanic); exoxilanaza (hidrolizează legăturile -1,4 de la capătul lanțului pentozanic); arabinoxilanaza care acționează asupra lanțurilor laterale de pentozani formate din arabinoză cu eliberare de arabinoză; xilobiaza care degradează xilobioza la două molecule de xiloză.

În prima etapă de degradare a -glucanilor și a pentozanilor se formează dextrine liniare -glucanice și respectiv “dextrine” ramificate -pentozanice. În etapa a doua dextrinele menționate sunt degradate la celobioză și respectiv xilobioză (dizaharide) și glucoză, respectiv arabinoza, xiloză (monozaharide).

Hidroliza hemicelulozelor (-glucani) și pentozani are loc în proporție de 70% în timpul malțificării orzului (figura 11.51).

Figura 11.51. Hidroliza pentozanilor și -glucanilor

Gradul de degradare a hemicelulozelor se apreciază prin diferența de randament între măcinișul fin și măcinișul grosier (dur) care trebuie să fie maximum 2,2% și prin măsurarea vâscozității mustului de laborator (maximum 1,85 mPa·s) respectiv a conținutului de -glucani (~ 200 mg/l).

Degradarea proteinelor. Sub influența peptid hidrolazelor (endo- și exopeptidaze și proteinaze) are loc o hidroliză a substanțelor cu azot fapt ce este apreciat prin gradul de solubilizare proteică (cifra Kolbach) și conținutul malțului în azot aminoacidic.

Nivelul de solubilizare este în funcție de tipul de bere ce se produce din malțul respectiv:

malțul tip Pils va conține ~ 600 mg/100 g S.U. azot solubil total și 126 mg/100 g S.U. azot -aminic;

malțul pentru berea blondă va conține 700 mg/100 g S.U. azot solubil total și 147 mg/100 g S.U. azot -aminic;

malțul pentru berea brună va conține 900 mg/100 g S.U. azot solubil total și 190 g/100 g S.U. azot -aminic.

Din diferite cauze, malțul finit poate prezenta următoarele deficiențe:

conținut ridicat de boabe negerminate, care se constată prin măsurarea plumulei (acrospirei) care, în mod normal, la orzul bine germinat este:

2/3 până la 3/4 din lungimea bobului la malțul blond;

3/4 până la 1/1 din lungimea bobului la malțul brun.

Dacă plumula este zero, orzul se consideră negerminat și atunci se determină procentul de boabe negerminate. Un malț cu 8% boabe negerminate este de fapt un amestec de malț și orz și ca atare la plămădire se intervine cu enzime din afară pentru a suplimenta nivelul de enzime al boabelor negerminate la nivelul celor germinate. În acest scop se recomandă să se folosească Cereflo 200 L (endo–glucanază dar care are și activitate nestandardizată de -amilază) + Cereflo 2XL (conține -amilază, -glucanază și protează), Ceremix 2XL + Ultraflo L (conține -glucanaza) sau Ceremix 6XMG (conține proteaza neutră, -amilază, -glucanază, pentozanază și celulază). Se poate folosi și Alphalase AP-3 care conține -amilază, protează și glucanază.

Malț deficitar în -amilază, deficiență care se poate constata analitic prin una din următoarele metode:

determinarea duratei de zaharificare (normal 15 min);

determinarea filtrabilității palierului 80C de la brasaj (analiza Hartong-Piratski);

determinarea gradului de fermentare a mustului de laborator (minimum 80%);

determinarea conținutului de -amilază după metoda EBC.

Prelucrarea malțului cu deficiență în -amilază va avea următoarele consecințe: obținerea de plămezi nezaharificate; filtrabilitate redusă a mustului și berii; flocularea prematură a drojdiei la fermentare; obținerea de bere cu grad de fermentare redus; apariția de urme de nezaharificate în must și bere.

Deficiențele menționate se pot corecta folosind enzime exogene în diferite etape tehnologice: plămădire, în mustul cu hamei înainte de fierbere; în linul de fermentare.

Deficitul de -amilază în malț poate fi corectat după cum urmează:

adaos de Fungamyl 800L în proporție de 1-2kg/t măciniș la plămădire;

adaos de Termamyl 120 L în proporție de 2g/hl must;

adaos de Fungamyl 800 L în proporție de 0,5-3 g/hl must în linul de fermentare (doza de 0,5 g/hl se utilizează atunci când temperatura de fermentare este de 4-7C, doza de 3g/hl se folosește când se dorește un grad de fermentare mai ridicat);

adaos de Nervanase BT-2 în proporție de 1,5l/tonă malț pentru Nervanase BT-2 (180)

Malț incomplet citolizat. Această deficiență a malțului se poate constata prin următoarele determinări: diferența între măcinișul fin și grosier (dur), care în mod normal trebuie să fie 1,8%; vâscozitatea mustului de laborator care în mod normal trebuie să fie 1,5-1,65 mPa·sec.

Folosirea malțului incomplet citolizat ar conduce la randament în extract mai scăzut, o filtrabilitate mai scăzută a mustului și berii.

Se recomandă în acest caz folosirea următoarelor preparate enzimatice exogene: Cereflo 200L în proporție de 0,5-1 kg/tonă malț sau Ultraflo L în proporție de 0,2 kg/tonă malț. Deoarece Ultraflo L are numai activitate -glucanazică, în principal, și celulazică, pentozanazică, arabinazică, în secundar, și nu are activitate -amilazică, cele două enzime se utilizează împreună la plămădire, în următoarele proporții: Cereflo 200L 0,4-0,8 kg/tonă malț iar Ultraflo L 0,1-0,2 kg/tonă malț.

Se mai recomandă și adaosul de Fynizym în proporție de 1g/hl must; la fermentarea primară se pot folosi și combinațiile Ceremix 2XL+Cereflo 200 L; Ceremix 2XL + Ultraflo L sau Ceremix 6XMG, al cărui dozaj se face în funcție de diferența între randamentul în măciniș fin și grosier (dur) așa cum se arată în tabelul 11.21.

Tabelul 11.21.

Corelația dintre diferența de măciniș (%) și adaosul de Ceremix 6XMG

Se poate utiliza și -Glucanase 200 L în proporție de 250-500 ml/tonă malț.

Malț insuficient solubilizat proteolitic. În general un malț bine solubilizat este caracterizat prin următoarele:

azot solubil total pentru o bere blondă 550-750 mg/100 g S.U.;

azot aminic liber, minimum 150 mg/100 g S.U.

Determinările se fac pe mustul de laborator. Dacă valorile menționate nu sunt realizate, malțul este insuficient solubilizat și va avea următoarele consecințe: încetinirea procesului de fermentație și respectiv oprirea procesului de fermentare la diferite grade de fermentare (aceste deficiențe sunt datorate în principal conținutului mai scăzut de aminoacizi liberi).

La un conținut de aminoacizi liberi prea mare (malț suprasolubilizat) se va influența negativ culoarea mustului la fierbere și implicit a berii și de asemenea se vor înrăutăți proprietățile senzoriale și stabilitatea berii (coloidală și biologică).

Pentru a remedia această deficiență a malțului (de slabă solubilizare) se recomandă folosirea la brasaj a preparatului Neutrază 0,5L în proporție de 0,3-0,7 kg/tonă malț. Se mai poate folosi Proteinase 200 L în proporție de 0,25 kg/tonă malț.

11.2. Tehnologia berii

Tehnologia berii implică operațiile menționate în figura 11.52, din care, din punct de vedere biotehnologic, interesează operațiile de brasaj (plămădire și zaharificare), fermentație/primară și secundară) și maturizare a berii.

Figura 11.52. Schema tehnologică de obținere a berii

Plămădirea și zaharificarea plămezii (brasaj) este operația care se execută în scopul obținerii mustului. Substanțele care trec din malț în must formează extractul mustului, extract ce este format prin solubilizarea substanțelor solubile preexistente în malț, respectiv cele care devin solubile în operația de brasaj sub influența enzimelor din malț și a celor adăugate.

Principalele enzime care acționează la brasaj și sunt proprii plămezii sunt arătate în tabelul 11.22.

Tabelul 11.22.

Principalele enzime de plămadă și caracteristicile lor

Substraturile atacate în timpul brasajului sunt substanțele cu azot, hemicelulozele, compușii cu fosfor, polifenolii, lipidele și amidonul.

Degradarea substanțelor cu azot. Substanțele cu azot din orz sunt solubilizate în proporție de ~ 70% la malțificare de către peptid hidrolazele existente în orz și cele sintetizate la malțificare. În malțul uscat vor rămâne active în principal proteinazele (endopeptid hidrolazele) și carboxipeptidaza. În timpul malțificării se vor forma din proteinele insolubile de depozit, proteine solubile, peptide și aminoacizi.

La brasaj vor exista în plămadă proteine insolubile, globuline și albumine solubile, peptide și aminoacizi. Primul palier de temperatură la brasaj este cel denumit proteolitic și este cuprins între 40 și 50C iar durata variază între 15 și 60 minute. În timpul acestui palier se vor hidroliza în continuare proteinele cu formare de peptide și aminoacizi. Sub acțiunea enzimelor proteolitice menționate în tabelul 6,2, acțiunea acestor enzime fiind dependentă de temperatură, pH și durată. La temperaturi de 40-45C se formează produși cu masă moleculară mai mare (acționează mai bine endoproteinazele și carboxipeptidazele). Dacă pauza de proteoliză la 45-50C este mai mare se micșorează cantitatea de substanțe cu masă moleculară mai mare și deci se va influența negativ capacitatea de spumare a berii și stabilitatea spumei acesteia.

Produșii rezultați în urma activității endo- și exopeptid hidrolazelor sunt următorii:

Compuși macromoleculari cu masa moleculară 60000 care constituie azotul coagulabil și care reprezintă ~ 20% din substanțele cu azot ale mustului nefiert. Acești compuși sunt coagulabili la plămădire și mai ales la fierberea mustului. Sunt precursori activi de trub din bere;

Compuși cu masă moleculară medie (10000-60000) care reprezintă ~ 20% din substanțele cu azot din must. Au acțiune favorabilă în formarea spumei berii, fiind relativ termostabili;

Compuși cu masă moleculară mică, reprezentând ~ 60% din substanțele cu azot din must, din care circa 22% sunt -aminoacizi liberi, sursă de azot pentru drojdii. Conținutul în -aminoacizi din must trebuie să fie 200 mg N/l pentru a se asigura multiplicarea drojdiei și o aromă corectă a berii.

Controlul degradării substanțelor cu azot la brasaj se face prin determinarea azotului solubil, azotului coagulabil, azotului -aminic. Un indice important este cifra intensității plămădirii după Kolbach cu valori între 80-120 (normal 105) care se calculează cu relația:

Substanțele cu azot formate la brasaj și care ajung în must sunt implicate în:

nutriția drojdiei pentru fermentare deci și formarea unor substanțe de aromă;

însușirile senzoriale ale berii finite (plinătate și rotunjire, gust, culoare);

capacitatea de spumare a berii și însușirile spumei (densitate, persistență, volum);

formarea trubului în berea finită, deci stabilitatea coloidală a berii.

Degradarea hemicelulozelor. În timpul palierului de proteoliză are loc și o degradare a -glucanilor din pereții celulari ai endospermului sub influența -1,3-1,4 glucanazei și endo -1,4 glucanazei care acționează bine la 40-45C și sunt inactivate la 55-60C. La temperaturi mai mari se eliberează -glucani din complexele cu proteinele sub influența -glucan-solubilazei și respectiv este eficientă endo 1,3- glucanaza care acționează bine la 60-62C.

Rezultă că în must pot exista -oligozaharide, glucoza, arabinoza, xiloză, precum și -glucani și pentozani în măsura în care aceștia nu au fost solubilizați.

Rezultă cu nivelul de -glucani și -xilani din must va fi cu atât mai mare cu cât malțul inițial a fost mai slab solubilizat. Pe de altă parte nivelul substanțelor menționate în must va fi mai mare dacă nu se respectă la brasaj parametrii optimi de acțiune ai -glucanazelor și xilanazelor.

Degradarea compușilor cu fosfor. Degradarea fosfaților are loc sub influența fosfatazelor din malț care hidrolizează compușii cu fosfor organici eliberând acid fosforic. Acidul fosforic eliberat reacționează cu sărurile din apă și formează în plămadă și must sisteme tampon. Are loc și o scădere a pH-ului plămezii. Condițiile optime pentru fosfataze sunt: temperatura 50-53C (sunt inactivate la temperaturi mai mari de 60C și pH = 5). Temperatura de plămădire de 58-62C restrânge activitatea fosfatazelor. Degradarea compușilor cu fosfor este influențată de gradul de solubilizare a malțului, de activitatea fosfatazică a malțului și condițiile de brasaj.

Degradarea polifenolilor. Polifenolii reprezintă 0,3-0,4% din substanța uscată a orzului, fiind localizați în coajă și strat aleuronic (mai puțin) precum și în endosperm. La brasaj, polifenolii care trec în plămadă și respectiv în must vor forma cu proteinele complecși insolubili (mai ales la fierberea mustului cu hamei), ceea ce va face ca berea finită să fie mai stabilă coloidal. În prezența aerului însă, polifenolii pot fi oxidați enzimatic la brasaj, cu formare de compuși incolori care apoi se vor polimeriza în compuși colorați. Brasajul, la temperaturi mai mici (~ 50C) și cu pauze mari va conduce la o cantitate mai mare de polifenoli în must, iar un brasaj la temperatură mai mare și durata mai mică va conduce la un must cu un conținut mai redus de polifenoli.

La plămădire este necesar să se ia următoarele măsuri:

să se evite contactul cu aerul pentru a nu se ajunge la formarea de substanțe colorante;

să se corecteze pH-ul (pH-ul deplasat spre acid conduce la micșorarea oxidării polifenolilor);

să se inactiveze enzimele care catalizează oxidarea enzimatică a polifenolilor prin adaos de formaldehidă (250 mg/kg malț folosit la plămădire).

Degradarea lipidelor. Degradarea lipidelor aduse de malț (trigliceride mono- și digliceride, fosfatide) are loc și la brasaj, sub influența lipazelor din malț, care au temperatură optimă la 35-40C și sunt inactivate la 65C/30 min. La plămădire la 62-64C în must se găsește o cantitate mai mică de lipide decât la plămădire la 68C. La fierberea mustului și la răcirea acestuia, odată cu trubul format se elimină o parte din lipidele mustului. Cu cât în must se găsește o cantitate mai mare de lipide nehidrolizate cu atât se influențează mai mult negativ gustul berii și însușirile de spumare ale berii.

Degradarea amidonului. Degradarea amidonului decurge în trei faze: absorbția apei și umflarea granulei; gelatinizarea amidonului; degradarea enzimatică a componentelor granulei de amidon (lichefiere și zaharificare).

În prima fază granula de amidon absoarbe apa și își mărește volumul, cu atât mai mult cu cât temperatura apei de plămădire este mai mare (volumul maxim se obține la 50C).

În faza a doua granula de amidon se fisurează iar când granula ajunge la temperatura de gelatinizare, se distruge și amidonul se transformă într-o soluție vâscoasă, care la răcire se gelifică. Soluția vâscoasă de amidon este formată din molecule de amilopectină dispersate în faza continuă formată din amiloză. Temperatura de gelificare a amidonului este în funcție de proveniența acestuia (tabelul 11.23).

Tabelul 11.23.

Temperatura de gelatinizare a amidonului din diferite surse

În faza a treia sub acțiunea enzimelor sintetizate în principal la malțificare au loc două procese și anume:

lichefierea amidonului, care se manifestă prin micșorarea vâscozității amidonului gelatinizat sub acțiunea dextrinizantă a -amilazei (optim la 70C);

zaharificarea, care constă în scindarea legăturilor -1,4 din amiloză și amilopectină de către -amilaza cu formare de dextrine liniare și ramificate și cu masă moleculară mai mică, precum și cantități mici de maltoză și glucoză; concomitent acționează și -amilaza (optim 63C) cu formare de amilopectină. Atât acțiunea -amilazei cât și a -amilazei asupra amilopectinei se oprește la 2-3 resturi de glucoză în fața legăturilor -1,6 din amilopectină.

Dextrinaza limită (optim 55-60C) are o acțiune slabă deoarece este inactivată la temperaturi scăzute (65C).

În figura 11.53. se arată schema de degradare a amidonului la brasaj.

Figura 11.53. Schema de degradare a amidonului la malțificare și brasaj

Pentru a obține musturi cu fermentescibilitate mai mare (conținut mai mare de lactoză) se fac pauze mai mari la temperatura de 62-63C, adică la temperatura optimă de acțiune a -amilazei și se corectează pH-ul plămezii la 5,4-5,6. Dacă se fac pauze mari la 72-75C, adică la temperatura optimă de acțiune a -amilazelor, musturile sunt mai bogate în dextrine, deci au fermentescibilitate mai redusă.

Acțiunea de zaharificare a enzimelor din plămadă va putea fi deci influențată prin temperatură, durată, pH, concentrația plămezii.

O zaharificare bună a amidonului trebuie să conducă la musturi cu grad final aparent de fermentație de cel puțin 80% (must numai din malț).

11.3. Folosirea nemalțificatelor la fabricarea berii

Ca cereale nemalțificate pot fi utilizate porumbul, orezul, orzul. La folosirea porumbului și orezului la fabricarea berii se obțin următoarele avantaje: costurile de fabricație sunt mai mici; berea finită are o culoare mai deschisă; berea finită are o stabilitate mai mare; proprietățile de spumare ale berii sunt mai bune.

Deoarece temperaturile de gelatinizare a amidonului de porumb și orez sunt mai mari decât a amidonului din malț, plămădirea acestor materii prime se face într-un cazan separat pentru nemalțificate, deci se impune o fază tehnologică separată.

Pot fi utilizate două variante tehnologice în cazul utilizării acestor două nemalțificate și anume:

utilizarea de malț, care aduce atât -amilază cât și -amilază;

utilizarea unor enzime exogene de lichefiere și anume o -amilază industrială.

În primul rând se utilizează 10% malț față de cantitatea de porumb sau orez folosită ca nemalțificate, concentrația plămezii de porumb sau orez trebuind să fie 20% (raport apă/cereale = 5:1).

În cel de-al doilea caz se utilizează un preparat enzimatic pentru lichefiere. Firma Novo recomandă preparatul enzimatic Termamyl 60 L sau 20 L în proporrție de 0,5 kg/tonă nemalțificate (porumb sau orez) precum și folosirea a 50-70 ppm Ca2+ prin adaos de Ca(OH)2 în apa de plămădire , deoarece ionii de Ca2+ au efect de stabilizare termică a Termamyl-ului. Prin folosirea Termamyl-ului este posibil să se ridice concentrația plămezii până la 30% (raport apă/nemalțificate = 3,3:1).

La folosirea orzului ca cereală nemalțificată, malțul poate fi înlocuit în proporție de 50% cu orz, cu condiția folosirii unor preparate enzimatice adecvate. Folosirea orzului ca cereală nemalțificată prezintă următoarele avantaje:

amidonul din orz și malț au aceeași temperatură de gelatinizare și deci nu este nevoie de un cazan pentru nemalțificate;

orzul conține și -amilază ca și malțul și deci poate fi ridicat procentul de nemalțificat peste 50%;

degradarea proteinelor dun orz conduce la obținerea de aminoacizi la fel ca și din malț.

Având în vedere că prin fermentarea mustului se obține un grad de fermentare mai scăzut decât atunci când la brasaj s-a folosit numai malț, se utilizează la plămădire următoarele combinații de enzime:

Cereflo 200 L 1 kg/t orz;

Neutraza 0,5 0,5 kg/t orz sau

Ceremix 2XL 2 kg/t orz sau

Ceremix 6XMG 1 kg/t orz.

Dacă procentul de orz depășește 40% este bine să se folosească și Fungamyl 800 L în proporție de 0,3-0,5 g/h care se adaugă în linul de fermentare în vederea creșterii gradului de fermentare.

Se mai pot folosi și următoarele preparate enzimatice: Nervanase BT-2 (vezi fișa produsului) împreună cu -Glucanase (vezi fișa produsului) și Proteinase 200 L (vezi fișa produsului). Alphalase AP-3 se poate folosi și singură (vezi fișa produsului).

Fermentarea primară a mustului de bere

Înainte de a fi supus fermentării, mustul de bere fiert cu hamei, răcit și limpezit trebuie aerat pentru a se asigura condiții normale pentru multiplicarea drojdiilor. Aerarea se face prin dispersia aerului steril în mustul de bere. Conținutul optim de oxigen în must corespunde la 75% din saturarea maximă la 5C care este de 10 mg O2/l, ceea ce înseamnă 8-9 mg O2/l. În practică se utilizează 3-20 l aer/hl cultură de producție (obținută în generatorul mare) pentru realizarea fermentației primare. La fermentarea primară au loc următoarele procese:

fermentarea zaharurilor fermentescibile pe calea Embden-Meyerhoff-Parnas conform ecuației:

Viteza de fermentare a zaharurilor depinde de caracteristicile tulpinei de drojdie, starea fiziologică a culturii, cantitatea de inocul, temperatura de fermentare, compoziția și concentrația în extract a mustului, geometria vasului, convecția în must, presiunea din vasul de fermentare.

Cantitatea de inoculum este de 0,5-0,7l cremă densă de drojdie/hl must, ceea ce corespunde la 15-30 mil. celule /hl must. Fermentația la rece are loc la temperatura de însămânțare de 5-6C și o temperatură maximală de 8-9C, iar fermentarea la cald are loc la temperatura de însămânțare de 7-8C și o temperatură maximală de 10-12C.

Durata fermentației primare este de 6-10 zile și se desfășoară în patru faze, conform datelor din tabelul 11.24.

Tabelul 11.24.

Fazele fermentării primare

Prin transformarea zaharurilor în alcool etilic, densitatea mustului scade. Profunzimea fermentației se exprimă prin “gradul de fermentare” (sau atenuarea mustului). Gradul de fermentare (GF) exprimă procentul de extract total al unui must care a fost fermentat și se calculează cu relația:

[%]

în care: ep este extractul mustului primitiv, în %;

et extractul în produsul fermentat în momentul determinării gradului de fermentare, în %.

Se deosebesc:

grad de fermentare aparent când et se măsoară ca extract aparent în mustul fermentat conținând alcoolul etilic;

grad de fermentare real, când et se măsoară ca extract real în produsul dezalcoolizat prin distilare și reconstituit.

Pentru conducerea procesului de fermentare este necesar să se cunoască:

gradul final de fermentare (determinat în laborator) care exprimă fermentescibilitatea maximă a unui anumit must;

grad de fermentare în berea tânără, deci după fermentarea primară;

grad de fermentare în bere după fermentarea secundară și maturare și care se numește și grad de fermentare al berii de vânzare.

Gradul de fermentare aparent în berea blondă tânără este de 70-73% iar în cea brună 58-60%. Gradul de fermentare aparent final este de 80-83% în berea blondă și 70-72% în cea brună. Gradul de fermentare în berea de vânzare este cu 3-4% mai mic decât gradul de fermentare final în cazul berilor blonde și cu 5-6% mai mic în cazul berilor brune.

Formarea produșilor secundari de fermentație este rezultatul activității vitale a drojdiilor. Substanțele incluse în categoria produșilor secundari sunt alcooli superiori, aldehidele, esterii, dicetonele vicinale, compușii volatili cu sulf, glicerina și acizii organici (fig. 6.5). Concentrația lor în bere nu trebuie să atingă pragul de sensibilitate deoarece se ajunge la defecte de gust precum și la înrăutățirea aromei, stabilității spumei, plinătății berii.

Alte transformări. La fermentația primară mai pot avea loc următoarele transformări:

consumarea azotului -aminic de către drojdie, excreția de substanțe cu azot de către drojdie, precipitarea peptidelor cu masă moleculară mare;

scăderea pH-ului de la 5,3-5,6 în mustul primitiv la 4,3-4,6 în bere cauzată de formarea acizilor organici și consumarea de către drojdie a ionilor fosfat și -aminoacizilor;

creșterea capacității reducătoare deci scăderea rH-ului berii datorită consumării O2 din must de către drojdie, conținutul de O2 în bere ajungând la 0,01 mg/l;

deschiderea culorii berii cu trei unități EBC de culoare datorită scăderii pH-ului și a adsorbției substanțelor colorate la suprafața drojdiei;

precipitarea și adsorbția de către drojdie a unor substanțe amare și polifenolice (se elimină 25-30% din substanțele amare la fermentația la rece și până la 50% la fermentația la cald);

dizolvarea de CO2 în bere, solubilizarea fiind dependentă de temperatura berii și de presiunea exercitată asupra berii. Berile de bună calitate au 4,5-5,0 g CO2/l. La tragerea berii în ambalaje se pierde 0,3 g CO2/l deci berea la sfârșitul fermentației trebuie să aibă 4,7-5,2 g CO2/l.

11.4. Folosirea preparatelor enzimatice exogene la fermentația primară

Preparatele enzimatice folosite la fermentația primară se utilizează pentru unul din următoarele scopuri:

hidroliza urmelor de amidon din must;

creșterea gradului de fermentare;

îmbunătățirea filtrabilității berii.

În primul caz, se știe că mustul diluat, rezultat din amestecarea primului must cu apele de spălare a borhotului (denumit și mustul de cazan plin) se fierbe împreună cu hameiul, după care se separă trubul la cald, se răcește până la temperatura de însămânțare și se limpezește la rece. Acest must mai poate conține urme de amidon nehidrolizat (valori de iod mai mari de 0,2 determinate fotometric după metoda EBC), care ar afecta stabillitatea coloidală și microbiologică a berii finite.

Pentru a înlătura acest inconvenient se recomandă un adaos de Fungamyl 800 L, în proporție de 0,3-0,5 ml/hl must, în linul de fermentare, preparat enzimatic care este o -amilază fungică ce hidrolizează legăturile 1,4 din amiloză și amilopectină.

Prin adaos de Fungamyl 800 L, crește și gradul de fermentare cu 2.5%.

În cel de-al doilea caz, pentru creșterea gradului de fermentare, este necesar să se modifice spectrul în hidrați de carbon al mustului, ceea ce se poate realiza prin următoarele metode: modificarea diagramei de brasaj, prin mărirea pauzei la 63C, pentru creșterea cantității de zaharuri fermentescibile; adaos de extract de malț cu putere diastazică ridicată în timpul fermentației, însă există pericolul infectării mustului inițial; prin utilizarea unor preparate enzimatice pentru zaharificare, fie la brasaj, fie la fermentare.

Ca preparate enzimatice se pot folosi:

Fungamyl 800L în proporție de 0,3-1 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 80-85%;

Fungamyl 800 L în proporție de 1-5 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 85-90%.

Preparatul enzimatic se adaugă în linul de fermentare.

AMG-300 L (amiloglucozidaza), în proporție de 5 ml/hl must, în care caz se obține un grad de fermentare foarte mare ( 100%), berile respective având un conținut redus de hidrați de carbon. Explicația faptului că prin folosirea AMG se obține un grad de fermentare așa de mare, constă în aceea că AMG scindează atât legăturile -1,4 cât și pe cele -1,6 glucozidice de la capătul nereducător al substratului care poate fi amidonul, dextrinele sau oligozaharidele din must, cu eliberare de glucoză.

Promozym 200L, în proporție de 32 ml/hl must pentru a obține un grad de fermentare de până la 90%, enzima producând deramificarea dextrinelor și amilopectinei, prin scindarea legăturilor -1,6.

Ambazyme 200 L (amiloglucozidaza), care se folosește în proporție de 3-9 g/hl must;

Amylozyme 200 L, care se folosește în proporție de 1-2 g/hl must.

Preparatele ezimatice utilizate, după ce au acționat, trebuie să fie inactivate, ceea ce impune pasteurizarea berii finite. Acest lucru se impune cu atât mai mult cu cât atât AMG cât și Fungamyl au și o activitate proteolitică nestandardizată care ar putea conduce la deprecierea berii. Pentru inactivarea enzimelor respective trebuie realizate următoarele valori de pasteurizare: AMG 1200 UP (echivalent a 5 min. de încălzire la 76C); Promozym 80 UP; Fungamyl 10UP (echivalent a 60 min. la 60C).

În general, preparatele enzimatice amilolitice de origine fungică sunt caracterizate prin temperaturi de inactivare mai scăzute decât cele de origine bacteriană și de aceea sunt preferate sub aspectul inactivării lor într-un regim blând de pasteurizare a berii.

Având în vedere totuși rezistența termică destul de ridicată a AMG și în mare măsură și a Promozym-ului, se recomandă ca aceste enzime să fie folosite la plămădire și mai puțin la fermentarea primară. În cazul în care berea nu se pasteurizează este necesar ca și Fungamyl-ul să fie utilizat tot la plămădire.

În cel de-al treilea caz, pentru îmbunătățirea filtrabilității berii se utilizează Finizym 200 L în proporție de 0,4 ml/hl bere. Se mai poate mări filtrabilitatea mustului și respectiv a berii prin folosire la plămădire a următoarelor preparate enzimatice: Cereflo 200L; Ultraflo L; Viscozym 120L. De asemenea se recomandă folosirea preparatului enzimatic -Glucanase 200L în proporție de 250-500 ml/tonă malț (când se utilizează malț + orez). Preparatul poate fi adăugat și la fermentarea primară/secundară în proporție de 0,5-1 ml/tonă must sau bere.

11.5. Folosirea preparatelor enzimatice exogene la fermentația secundară și maturarea berii

Berea de fermentație primară este o bere din care s-a recuperat biomasa de drojdie (2-2,5 l cremă de drojdie/hl must însămânțat) și care conține 0,4-0,5 kg CO2/hl dizolvat.

Această bere este trecută la fermentația secundară și maturare unde vine cu 1,2-1,4% extract fermentescibil din care 80% maltoză și 20% maltotrioză. La fermentația secundară au loc următoarele procese:

se continuă fermentarea zaharurilor până la atingerea gradului de fermentare a berii de vânzare;

saturarea berii cu CO2;

limpezirea naturală a berii (formarea trubului la rece).

La maturarea berii au loc următoarele procese:

depunerea drojdiilor rămase după îndepărtarea biomasei și a precipitatelor din bere;

antrenarea unor compuși volatili cu CO2 care se degajă;

sinteza unor noi cantități de produși secundari de fermentație (crește cu 20% cantitatea de alcooli superiori și cu 30-200% cea de esteri);

transformarea unor compuși cu prag de sensibilitate mai ridicat (diacetil, aldehide), berea considerându-se matură când conținutul de diacetil scade sub 0,1 mg/l.

Consecința maturării berii îl reprezintă înnobilarea gustului și aromei berii.

La fermentația secundară și maturarea berii trebuie să avem în vedere următoarele aspecte:

îndepărtarea componentelor care ar produce în berea finită trubul coloidal (amidon, dextrine, -glucani, proteine, polifenoli);

îndepărtarea sau împiedicarea formării produșilor secundari cu prag de sensibilitate ridicat (dicetone vicinale cum ar fi diacetilul și acetoina);

îndepărtarea oxigenului.

Pentru îndepărtarea amidonului nehidrolizat și a dextrinelor și -glucanilor se utilizează, în ordine, următoarele enzime:

Fungamyl 800L, care se dozează în berea cu temperatura de 4C, în proporție de 1ml/hl pentru un timp de acționare de 5 zile;

Fungamyl 800 L, care se dozează în berea cu temperatura de 4C, în proporție de 3 ml/hl, pentru un timp de acțiune de 3 zile.

Fungamyl-ul se adaugă atunci când în berea rezultată de la fermentația primară au rămas urme de amidon și când concentrația de CO2 din bere, înainte de filtrare, este prea mică. Enzima este introdusă într-un tanc gol peste care se transvazează berea cu deficiențele menționate.

Finizym 200 L care se adaugă în proporție de 1ml/hl bere, în condițiile în care berea nu s-a limpezit bine ca o consecința a unui conținut mare de -glucani. Enzima se introduce într-un tanc gol peste care se transvazează berea cu deficiențe. La folosirea Finizym-ului în scopul îmbunătățirii filtrabilității berii timpul de maturare se prelungește cu 2-5 zile.

Amylozyme 200 L în proporție de 0,1-0,5 g/hl bere.

Îndepărtarea proteinelor. Pentru îndepărtarea substanțelor proteice, pe plan mondial s-au utilizat următoarele enzime:

Papaina care se adaugă în tancul de fermentare secundară, în timpul maturării berii, când pH-ul este mic și deci există condiții de activare a enzimei de către substanțele reducătoare din bere. Papaina se poate doza în bere și după o prefiltrare prealabilă a berii, în filtre cu Kieselgur, în acest fel crescând eficiența papainei. Când se utilizează sub formă de preparat purificat papaina se poate doza, în berea filtrată, înainte de îmbuteliere.

În afara acțiunii hidrolizante, papaina are și capacitatea de a precipita proteinele din bere încărcate negativ, deoarece papaina are sarcină electrică negativă. Prin adaos de papaină în berea tânără (bere după fermentația primară) se formează trub, din această cauză adaosul de papaină trebuie făcut cu 10-14 zile înainte de flitrare, în caz contrar trubul se formează în berea finită.

Doza de preparat comercial utilizată variază între 2-10 g/hl bere. În timpul pregătirii soluției de papaină trebuie evitat contactul cu aerul sau în apa de solubilizare trebuie să se adauge 0,1% metabisulfit. În acest fel se evită inactivarea papainei. Firma Enzymes et Derivates recomandă folosirea preparatului Papaină – Chilko –P în proporția menționată în fișa tehnică.

Preparatele enzimatice de origine microbiană sunt reprezentate de endopeptid hidrolaze din fungi și bacterii care trebuie să hidrolizeze numai compușii macromoleculari din bere ce sunt precursorii trubului coloidal. Nu trebuie să fie afectați compușii cu azot responsabili de o bună spumare a berii, pentru plinătatea și catifelarea gustului ei.

Îndepărtarea compușilor fenolici pentru îndepărtarea compușilor fenolici s-au propus următoarele procedee:

oxidarea lor cu o polifenoloxidază în cursul brasajului, oxidare care antrenează polimerizarea și deci precipitarea lor, precipitatele fiind îndepărtate la filtrarea plămezii. Acest procedeu nu este încă practicat industrial;

prin utilizarea PVPP care este un procedeu fiabil, dar costisitor. Îndepărtarea polifenolilor, care sunt antioxidanți, poate avea un efect negativ asupra stabilității senzoriale a berii.

Îndepărtarea oxigenului. Oxigenul dizolvat în bere poate modifica caracteristicile senzoriale ale acesteia prin reacții de oxidare. În berea nepasteurizată, oxigenul favorizează dezvoltarea bacteriilor aerobe, inclusiv a drojdiilor care n-au fost eliminate în totalitate, și deci favorizează apariția trubului biologic. Pentru îndepărtarea oxigenului se utilizează preparatul enzimatic glucozoxidază – catalază care acționează după următorul mecanism: glucozoxidaza elimină oxigenul pe care îl consumă pentru oxidarea glucozei pe care o transformă în acid gluconic; catalaza transformă apa oxigenată generată în cursul acțiunii glucozoxidazei în apă și oxigen. Preparatele enzimatice de glucozoxidază-catalază extrase din Asp. niger și P. notatum au pH optim la 4,8 și 6,0 la 20C.

Având în vedere că eliminarea oxigenului este posibilă atât timp cât există glucoza în bere este necesar ca preparatul de glucozoxidază să conțină și urme de carbohidraze care să regenereze glucoza din carbohidrații existenți în bere sau să se adauge glucoza la nivel de 0,1g/l bere. Berea tratată cu glucozoxidază-catalază capătă un gust ușor de oxidat, datorită faptului că enzima catalaza nu poate transforma H2O2 în prezența alcoolului și în acest caz acționează ca o peroxidază care oxidează compuși din bere. Acest inconvenient poate fi surclasat prin folosirea superoxiddismutazei care reacționează cu ionii superoxidici și deci conduce la ameliorarea proprietăților senzoriale ale berii.

Reacțiile implicate în folosirea enzimelor menționate sunt următoarele:

Glucoza + H2O + O2 glucozoxidază -gluconolactona + H2O2

+ H2O

Acid gluconic

H2O2 catalaza H2O + 1/2O2

4 O2- + 4H+ superoxid dismutaza H2O2 + 2 O2

Firma Enzymes et Derivates recomandă utilizarea preparatului enzimatic Glucox RF (conține glucozoxidază + catalază) în proporție de 0,4-1,5 g/hl bere.

Accelerarea maturizării berii. Reducerea diacetilului și acetoinei este etapa limitantă a maturării berii, defectele de gust datorită diacetilului și acetoinei fiind o problemă majoră a berarilor. Diacetilul și acetoina conferă berii un gust de unt inacceptabil pentru consumatori. Pragul de percepție pentru diacetil este de 0,02-0,08 mg/l în funcție de bere și sensibilitatea consumatorului. Concentrația de diacetil în bere la sfârșitul maturării trebuie să fie 0,1 mg/l, la concentrații superioare există riscul ca berea să prezinte un gust de unt.

Precursorul diacetilului este -acetolactatul produs de drojdie în timpul fermentației. -Acetolactatul eliberat în must este transformat neenzimatic în diacetil. Această reacție chimică este etapa limitantă și este accelerată la temperaturi mai ridicate. În final, diacetilul este asimilat de drojdie și redus enzimatic în acetoină care are un prag de percepție la 50 mg/l. Cantitatea de diacetil formată va depinde de compoziția mustului, starea fiziologică a drojdiei și procedeul de fermentație.

Pentru reducerea rapidă a diacetilului în cursul maturării berii s-au propus următoarele procedee:

maturarea la cald a berii (14-16C/2-3 zile), în care caz -acetolactatul este transformat în diacetil, care, la rândul său este redus de drojdii în acetoină. Datorită temperaturii ridicate se favorizează autoliza drojdiei și deci apariția gustului “de drojdie”, de “autoliză” la bere. În plus, din drojdia autolizată se eliberează enzime proteolitice care afectează spumarea berii prin degradarea proteinelor cu capacitate de spumare.

folosirea de -acetolactat decarboxilază sub denumirea de Maturex L care se adaugă în mustul de bere răcit, în linul de angajare în proporție de 1-2 ml/hl must. Prin folosirea Maturex-ului concentrația de diacetil se menține la nivele scăzute și timpul de fabricare al berii se scurtează cu 5-6 zile.

Firma recomandă ca Maturex-ul să se utilizeze concomitent cu Finizym-ul și Fungamyl-ul, pentru a realiza și o mai bună saturare cu CO2 a berii și pentru o mai bună limpezire. Proporțiile din fiecare enzimă sunt următoarele: Maturex L 0,25 ml/hl; Finizym 200 L 0,25 ml/hl; Fungamyl 800 L 0,25 ml/hl;

degradarea dicetonelor vicinale (diacetil și acetoină) cu ajutorul unui preparat enzimatic de diacetilreductază elaborată de Acetobacter aerogenes sau obținută dintr-un extract de drojdie. Activitatea diacetilreductazei este inhibată de alcool, la o concentrație de 3,3% alcool, enzima fiind inactivată în proporție de 42%. Această acțiune inhibitoare a alcoolului limitează utilizarea enzimei sub aspect economic. Diacetil reductaza ar acționa în transformarea diacetilului în acetoină și a acetoinei în 2,3 butilenglicol (figura 11.54).

Figura 11.54. Degradarea diacetilului la acetoină și a acetoinei la 2,3 butilenglicol

12.1. Caracteristicile oțetului alimentar ca produs finit

Generalități

Oțetul este o soluție de acid acetic diluat în apă, cunoscut și ca oțet de fermentație, care se obține din lichide cu conținut de alcool, prin supunerea acestora fermentației acetice.

Oțetul de fermentație se obține după natura materiei prime folosite: din vinul natural alterat; din malț; plamada de malț supusă fermentației alcoolice; din fructe, când este preparat din mustul de fructe; din alcool etilic obținut din industria vinului.

În prezent, în lume se fabrică o gamă variată de sortimente de oțet. Cea mai mare cantitate rezultă prin transformarea alcoolului în fermentație alcoolică. Se obține oțet din vinuri albe și roșii, din bere și malț, din cidru, din fructe (mere și pere, banane, mango, citrice, nuci de cocos), iar în Asia din alcoolul de orez. Producția mondială de oțet, exprimat în acid acetic pur, este de peste 200 mii tone, ceea ce înseamnă circa 2 miliarde litri oțet de 10°.

După calitățile gustative, primul loc îl ocupă oțetul din vin și cel din malț. Aceste două sortimente au apărut la sfârșitul secolului al XVIII-lea. Cerintele crescânde de oțet, cantitățile limitate de materie primă pentru prepararea oțetului de vin si fabricarea relativ complicată a oțetului din malț, au dus la fabricarea oțetului din alcool etilic din vin. Din acel moment, industria oțetului a cunoscut posibilitatea unei extinderi largi funcție de existenta industriei de alcool. Fabricarea relativ simplă a oțetului din alcool a întărit și mai mult poziția predominantă a acestuia.

L. Pasteur a fost primul care a demonstrat că acidul acetic provine prin oxidarea etanolului, în evidență fiind rolul microorganismelor Acetobacter în această transformare.

Pentru savant, problema esențială era de a găsi mijlocul de împiedicare a dezvoltării vegetațiilor parazite care erau pricina bolilor vinurilor. Savantul a observat, după o serie de experimentări, că nu era nevoie decât să se ridice câteva secunde temperatura vinului la 50 sau 60°C.

Oțetul obținut în urma acestei fermentații se prezintă sub forma unui lichid incolor sau colorat, cu gust acru; poate fi obținut prin fermentație acetică a lichidelor alcoolice diluate (vin, bere, alcool rectificat-rafinat diluat), distilarea uscată a lemnului ori diluarea acidului acetic pur.

Compoziția oțetului de vin

Este caracterizată printr-un gust și o aromă plăcută, specială, conținând pe langă acid acetic (3-9%), o cantitate apreciabilă de extract (1,5-3 g%) și săruri, printre care bitartratul de potasiu a cărui prezență permite diferențierea acestuia de oțetul de bere, fructe etc.

Bacteriile acetice reprezintă un univers specific. Pentru prima oară ele au fost izolate în culturi pure de către savantul danez Jensen. În 1879 el a reușit să obțină din pelicula acetică două specii de bacterii pe care, urmând terminologia timpului, le-a denumit: Micoderma aceti și Micoderma pasteurianum. Mai târziu același savant le-a schimbat denumirea în Bacterium aceti și Bacterium pasteurianum, la care a mai adăugat specia Bacterium kutzingianum.

În țările văduvite de vița de vie, oțeturile se fermentează pe malț, cereale și bere. Acestea se deosebesc de cele de vin și alcool printr-un gust fad, neplăcut și prin absența aproape completă a aromei. Pentru ameliorare se adaugă lichidului puțin vin. Metodele cele mai răspândite pentru obținerea oțetului sunt: metoda Orleans sau metoda franceză; metoda rapida sau germană, existând bineînțeles o serie de variante intermediare.

Deși durata procesuui de preparare a oțetului mărește costul produsului, această perioadă prezintă avantaje. În acest timp, considerat „îndelungat”, se formează substanțe aromatice („buchetul”) care imprimă oțetului calități superioare, tot astfel cum calitățile vinului se îmbunătățesc prin păstrarea în pivniță, după epuizarea fermentației.

Diferite specii de bacterii acetice se comportă diferit față de prezența acidului acetic în mediul respectiv. Introducerea în proces a bacteriilor care sunt adaptate la concentrații mari de acid acetic va permite obținerea unor condiții selective capabile de a proteja fabricația atât față de flora străină cât și de cea formată din bacterii nedorite.

Un proces tipic de fermentație continuă îl reprezintă „metoda rapidă" de fabricare a oțetului. Această tehnologie se poate aplica deoarece, odată însămânțat și intrat într-o judicioasă conducere a parametrilor de cultivare, se poate produce oțet într-o perioadă foarte îndelungată.

Una dintre problemele fundamentale ale fabricării oțetului ar fi închiderea ermetică a vaselor și, legat de aceasta, instalarea unui dispozitiv care să stimuleze curentul de aer condiționat la o temperatură și compoziție strict determinată, precum și un dispozitiv pentru reglarea vitezei aerului, depășindu-se, astfel, pierderile de până la 30 % din producție, în special din cauza volatilizării alcoolului și acidului acetic.

De altfel, temperatura are o influență decisivă asupra formării acidului acetic(oțetului). În perioada de vară temperatura trebuie să fie în jurul valorii de 35°C. O dată cu sosirea anotimpului de vară, diferența de temperatuă dintre încăpere și vas se micșorează pâna când devine zero. Dar o dată cu reducerea diferenței de temperatură, se reduce și diferența de aerație și deci și acțiunea oxidantă a bacteriilor. Aceasta, la rândul ei duce la o scădere a temperaturii în interiorul vasului și, ca urmare, la o diminuare a aerisirii. În cele din urmă, curentul poate fi total întrerupt și funcționarea vasului să înceteze din cauza insuficienței de oxigen.

Desigur există și alte metode pentru fabricarea oțetului care în principiu rezultă din combinarea celor două metode enunțate. Astfel, există metoda veche, de prin 1732, în care vasul umplut cu material convenabil (ciorchini de struguri fără boabe, talaj etc), se completează cu un lichid de fermentat și se lasă în repaus o jumătate de zi, după care se introduce din nou în primul vas. Prin această metodă pelicula bacteriană se dezvoltă pe toată suprafața poroasă a materialului și fermentația se produce mai repede decât la metoda Orleans.

Oțetul din alcool poate fi considerat ca un produs finit, însă nu este comercializabil deoarece are un miros dezagreabil și un gust înțepător și îmbătător datorită prezenței de aldehide; acesta dispare fie prin oxidare, fie prin evaporare.

Prin decantare oțetul se clarifică fără altă operație. După această fază, se pritocește. Când butoaiele nu sunt bine închise, fermentația este foarte activă la suprafața lichidului și când a oxidat puținul alcool pe care-l conține, atacă oțetul care devine apos. Dacă el conține substanțe azotate sau acizii malic și tartric este expus pericolului de a fi atacat de Bacterium xilinum care descompune acidul acetic, făcându-l apos. După preparare, indiferent de metodă, produsul este clarificat prin decantare și păstrat la 10 – 15°C în butoaie pline, unde suferă o oxidare lentă care-i ameliorează calitatea.

Oțetul alimentar este un produs de fermentație acetică obținut prin oxidarea enzimatică a alcoolului etilic din unele lichide cu un conținut moderat de alcool.

Oțetul este o soluție apoasă de acid acetic, care în funcție de materia primă din care se obține mai conține: glucide, alcool etilic, substanțe tanante, coloranți, compuși cu azot, vitamine, săruri minerale etc. Calitatea oțetului de vin este reprezentată prin: 15-18 g/l extract; 5-8 g/l zaharuri; 12 g/l acid tartric; 2-4 g/1 săruri minerale; 0,8-1,2 g/l alcool etilic și 50-80 g/l acid acetic; aciditatea totală a oțetului alimentar este 9-0,3 g acid acetic la 100 grame produs (9° aciditate ); culoare de la alb-galbui la brun-roșcat.

Concentrația totală reprezintă concentrația maximă de acid acetic care s-ar putea obține prin transformarea totală a alcoolului din mediu de reacție, calcul utilizat în practica industrială, are la bază următoarea corespondență (pentru 100 ml):

4,6 g etanol → 5,8 ml etanol → 5,9 ml acid acetic

La concentrațiile uzuale ale oțetului, eroarea introdusă prin acest calcul este nesemnificativă.

Bacteriile acetice se caracterizează printr-o remarcabilă capacitate de oxidare a etanolului la acid acetic la diverse valori de pH. Acestea aparțin genurilor Acetobacter și Gluconobacter: A. Aceti, A. Hansenii, A. orleanense, A. suboxidans, A. xilinus etc.

Conversia etanolului în acid acetic, în procesul de fermentație acetică aerobă propune, mai întâi, transformarea acestuia în acetaldehidă, transformare catalizată de alcooldehidrogenaza (1). Acetaldehida este hidratată sub acțiunea unei hidrolaze (2), iar aldehid-dehidrogenaza (3) conduce la acid acetic.

Activitatea optimă a acetobacteriilor este la pH de 3 – 3,2 la concentrația acidului acetic de 8 – 10% și a alcoolului etilic de 6 – 7%.

Cultura bacteriilor acetice se menține în mediu agarizat, care conține fosfați de amoniu, magneziu și potasiu. Maiaua de bacterii selecționate se realizează în mediu nutritiv lichid cu aerare intensă (1,84 m3 aer pentru un litru alcool etilic absolut). Mediul nutritiv conține pentru un litru alcool etilic absolut: 0.25 g superfosfat; 0.25 g sulfat de amoniu; 9 g carbonat de potasiu; 5 g glucoză.

Fermentația acetică este un proces aerob exoterm, cu degajare de 455 – 490 kJ/mol.

Caracteristicile organoleptice și fizico-chimice ale oțetului

Caracteristicile organoleptice ale oțetului de fermentație și de distilare sunt prezentate în tabelul 12.25.

Tabelul 12.25.

Caracteristicile organoleptice ale oțetului de fermentație și de distilare

Caracteristicile fizico-chimice ale oțetului sunt redate în tabelul 12.26.

Tabelul 12.26.

Caracteristicile fizico-chimice ale oțetuluide fermentație și cel de distilare

12.2. Tipuri de oțet de fermentație și caracteristici compoziționale

Influența procesului tehnologic asupra calității oțetului de fermentație nu este neglijabilă și în anumite cazuri (oțetul balsamic) este extrem de importantă. Cu toate acestea, cel mai important factor este materia primă. În funcție de natura materiei prime, există câteva tipuri distincte de oțet, prezentate pe scurt în continuare.

Oțetul de vin. Se fabrică în mod normal din vin. Totuși, există sortimente comerciale care sunt prezentate ca „oțet din vin", deși numai o parte din substratul inițial este formată din vin, restul fiind un alt lichid hidroalcoolic, de obicei un amestec de spirt și apă. Se folosesc în general vinuri de calitate inferioară sub aspectul acidității volatile, cu un conținut redus de dioxid de sulf sau alte substanțe care ar putea inhiba bacteriile acetice. Culoarea oțetului din vin variază de la galben pal la roșu, în funcție de sortimentul de vin folosit ca materie primă. Conform normelor Comunității Europene, aciditatea totală a oțetului din vin trebuie să fie de minim 6 g/100 ml, iar conținutul de etanol să fie sub 1,5% (vlv).

Oțetul de fructe. Oțeturile de fructe sunt obținute prin fermentația acetică a unor soluții alcoolice obținute din fructe. Cel mai popular produs de acest tip este oțetul de mere, care are o culoare galben deschisă și o aromă specifică.

Oțetul de orez. Se fabrică în Asia, din lichide hidroalcoolice obținute prin fermentarea alcoolică a unor plămezi de orez, uneori chiar din rachiu de orez. Metodele tradiționale folosesc fermentația acetică lentă, dar au fost dezvoltate și procedee submerse.

Oțetul din spirt. Este denumit uneori și oțet alb. Se obține prin fermentația acetică a unor substraturi obținute prin diluarea spirtului și adăugarea unor nutrienți. În mod normal, acest tip de oțet este incolor și nu are aromă.

Oțetul balsamic. Este un produs special, fabricat printr-o tehnologie particulară care pornește de la mustul de struguri. Imediat după începerea fermentației alcoolice a mustului (la aproximativ o zi de la presare), acesta este concentrat prin evaporare până când volumul se reduce la o treime din cel inițial. În continuare acest substrat este supus unor fermentații alcoolice și acetice concomitente și foarte lente. În acest timp, soluția este trecută succesiv prin butoaie din lemn de diferite esențe.

Procesul durează între 5 și 12 ani, uneori mai mult. Produsul are un conținut ridicat de substanță uscată, o aromă specială și o tărie acetică de 6-15 grade. Indicii compoziționali ai oțetului variază foarte mult în funcție de materiile prime folosite și tehnologia adoptată. Caracteristicile unor tipuri comerciale de oțet de fermentație sunt prezentate în tabelul 7.3, împreună cu caracteristicile „oțetului” sintetic.

Tabelul 12.27.

Caracteristicile unor tipuri comerciale de oțet

Fermentația acetică

Fermentația acetică este un proces aerob exoterm, cu degajare de 455-490 kJ/mol.

Factorii dominanți în procesul de fermentare

Viteza de conversie a alcoolului etilic la acid acetic depinde de natura microorganismelor și a substratului, de gradul de aerare, de temperatură și scade cu creșterea concentrației acidului acetic prezent în mediu.

Bacteriile acetice din vin

Această grupă curpinde următoarele bacterii: Bacterium orleanense, care formează un voal subțire, adeseori roz și care are tendința de a se înălța pe pereții vasului. Are l,3 – 2 μ în lungime și 0,3 – 0,4 μ în lățime. Poate produce 9,3% acid acetic; oțetul care ia naștere este parfumat și limpede. Acetobacterium plicatum (Fuhrmann) este o bacterie care suportă 10 – 11% alcool și produce 7,5% acid acetic, Bacterium xylinoides (Heneberg), care produce 8% acid acetic, Acetobacter ascendens (Henneberg), izolat din oțetul de vin tulbure dă naștere unui voal care se rupe ușor. Bacterium vini acetati (Henneberg) este izolat dintr-o fabrică de oțet de vin din Berlin, Bacterium xylinum (Brown), izolat din oțetul de vin, se prezintă sub formă de bastonașe curbate, prezintă polimorfism, suportă numai până la 7% alcool, produce 4,5% acid acetic precum și alți produși secundari; oțetul format este de calitate inferioară.

Numărul microorganismelor prezintă importanță la începutul alterării, când viteza de dezvoltare a bacteriilor depinde de numărul celulelor care ramân la suprafață, reținute de forțele capilare în contact cu pereții și cu lichidul. După constituirea voalului, cantitățile de acid acetic formate devin foarte apropiate, oricare ar fi fost populația de pornire.

Temperatura este un factor determinant; oțetirea progresează cu atât mai repede cu cât temperatura este mai ridicată; aciditatea volatilă formată la începutul alterării este de 2 ori mai mare la 28°C decât la 23°C și de 2 ori mai rapidă la 23°C decât la 18°C.

Oxigenul este în general indispensabil pentru multiplicarea bacteriilor acetice. Pentru a se multiplica și a realiza fermentația acetică, bacteriile acetice au nevoie de mult aer. Doza de oxigen din doi litri de aer este necesară pentru formarea unui gram de acid acetic, deci pentru a spori aciditatea volatilă a unui litru de vin cu 0,8g H2SO4.

pH-ul limită pentru dezvoltarea bacteriilor acetice a putut fi determinat pe vinuri slab alcoolice (8% vol.). Dacă la un pH mai coborât de 3,0 astfel de vinuri formează totuși voal la suprafață, acesta este construit din levurile micodermice de „floare”.

Gradul alcoolic este un factor însemnat pentru dezvoltarea bacteriilor acetice. Deși e cunoscut în practică faptul că vinurile cu grad alcoolic ridicat se îmbolnăvesc mai rar de oțetire, nu este totuși posibil de stabilit o concentrație alcoolică peste care vinul devine inapt pentru înmulțirea bacteriilor acetice; aceasta se datorează faptului că toxicitatea alcoolică este strânsă de cea a ionilor de H, pH-ul care va frâna dezvoltarea acetobacteriilor, variză cu gradul alcoolic: pH-ul variză de la 3,0 pentru 8,5 vol. % alcool, la 3,4 pentru 12,5 vol. %. Orientativ, oțetirea este un proces rar la vinurile de peste 12 grade alcoolice din regiunile viticole nordice și la cele de peste 15 vol. % în cele sudice.

Taninul vinului nu formează dezvoltarea bacteriilor acetice, dar o întârzie mult când se află într-o concentrație sporită; vinurile roze se oțetesc mai ușor decât cele roși corespunzătoare. Consistența voalului crește cu sporirea conținutului în tanin, probabil ca urmare a insolubilității acestor polifenoli.

Alți factori intervin, deasemenea, în activitatea și multiplicarea bacteriilor acetice. Acetobacteriile nu sunt influențate de variațiile în limitele naturale a conținutului în diferiți cationi a vinurilor; sărurile minerale sunt întotdeauna suficiente pentru a permite dezvoltarea lor. Proporția mare de citocromi în celulele bacteriilor acetice ar îndreptăți presupunerea unei nevoi mai mari de fier a acestora. Reducerea sub un miligram la litru a cantității de fier prezentă în vin, prin tratarea cu ferocianură de potasiu sau fitat de calciu, nu sistează multiplicarea lor.

Acetifierea industrială folosește uneori preparate pe bază de fosfați ce activează fermentația acetică; de asemenea, fierul, manganul, sărurile de uraniu, oxidul de fier coloidal și cărbunenele animal catalizează dezvoltarea bacteriilor.

Înmulțirea bacteriilor acetice solicită prezența următorilor aminoacizi: valina, izoleucina, alanina, cisteina, histidina, prolina; similarea azotului amoniacal face posibilă diferențierea unor specii.

Cele mai multe specii au nevoie de vitamine exogene ca: acidul pantotenic, nicotinamida și acidul para-aminobenzoic.

Fermentarea spontană în absența anhidridei sulfuroase a mustului din struguri alterați, mai ales la temperaturi ridicate, duce de multe ori la dezvoltarea bacteriilor acetice în asociație de „simbioză” cu unele levuri și la formarea unor proporții mai mari de acizi volatili.

Soluțiile de acid acetic pot fi produse folosind două categorii de procedee: chimice (oxidarea acetaldehidei, distilarea uscată a lemnului) și biotehnologice (fermentație acetică).

Obținere acidului acetic prin metode chimice

Oxidarea acetaldehidei la acid acetic se realizează industrial în prezența unor catalizatori de tipul sărurilor de Fe, Ni, Mn, Co.

Prin distilarea uscată a lemnului rezultă, pe lângă acid acetic și alți compuși secundari. Acidul acetic rezultă în acest caz sub forma unei soluții care conține aproximativ 10% acid acetic, 2,5% alcool metilic, 0,5% acetonă, gudroane și alți compuși. Acidul acetic este transformat în sare de calciu și separat. Sarea se tratează cu acid sulfuric rezultând din nou acid acetic.

Acidul acetic obținut prin ambele metode descrise mai sus se purifică în continuare prin distilare și alte procedee chimice. Se obține în acest fel acid acetic glacial sau soluții foarte concentrate de acid acetic. Pe baza acestora, se pot prepara soluții de acid acetic cu concentrația cuprinsă între 60 – 80%, denumite de multe ori „esență de oțet” și care se folosesc, prin diluare, aromatizare și colorare (de cele mai multe ori cu caramel) la obținerea „oțetului” sintetic. Fabricarea în scop alimentar a acestui tip de „oțet” este interzisă în multe țări, iar acolo unde este permis, proveniența produsului trebuie să fie marcată explicit.

12.5. Utilizarea proceselor biotehnologice la fabricarea oțetului și a acidului acetic glacial

Oțetul este un produs cu gust acru, înțepător, datorită conținutului în acid acetic. Se folosește în alimentație drept condiment la acrirea unor mâncăruri, la marinarea legumelor, peștelui, etc.

Se obține prin două metode: prin fermentația acetică a unor materii prime și prin diluarea cu apă a acidului acetic pur (esența de oțet). După materia primă folosită la fabricare se clasifică în: oțet de fermentație și oțet de distilare.

Oțetul de fermentație

Materiile prime folosite la fabricarea oțetului de fermentație sunt: vinul, borhotul de fructe, tescovina, diferite soluții alcoolice, etc. Alcoolul din aceste materii prime este oxidat în acid acetic în prezența aerului. Pentru ca fermentarea acetică să decurgă normal, se asigură în lichidul supus fermentării o concentrație alcoolică până la maximum 12°, temperatura între 25 și 32°C, precum și diferite săruri pentru nutriția bacteriilor acetice. În asemenea condiții, activitatea bacteriilor acetice este optimă. Vinurile destinate oțetului sunt de obicei bolnave (oțetite, etc), cu defecte sau sunt slab alcoolice. În vederea obținerii unui produs fără defecte, vinurile sunt supuse unor operații de condiționare (limpezire, cupajare, etc), iar alcoolul se diluează până la tăria indicată, după care i se adaugă substanțe nutritive.

Principiul de fabricație al oțetului constă în crearea unei suprafețe cât mai mari de contact între materia primă, bacteriile lactice și aer, în vederea asigurării unei oxidări complete a alcoolului etilic conținut de materia primă. Diferitele procedee industriale folosite pentru fabricația oțetului se deosebesc prin aparatura folosită.

Orice lichid cu conținut de alcool poate fi utilizat la obținerea oțetului; este cunoscut oțetul de vin, fiind cel mai vechi și cel mai apreciat. Pentru obținerea unui oțet de bună calitate se cere ca materia primă să fie din punct de vedere calitativ la nivelul cerințelor tehnologice.

Pentru fabricarea oțetului din vin se pot întrebuința atât vinurile albe, cât și vinurile roșii.

Din cauza prețului de vânzare redus, la fabricarea oțetului din vin nu se întrebuințează în general vinurile de calitate superioară. Se valorifică vinurile alterate calitativ, dar nu toate vinurile alterate se pretează la fabricarea oțetului, sunt admise vinurile care au un inceput de oțetire sau care au început să se întindă.

Conținutul în alcool nu trebuie să fie prea ridicat. Cel mai bun oțet este cel obținut din vinurile care au o concentrație de 8 – 9% alcool. Vinurile mai slabe produc un oțet slab, greu de conservat; când gradul alcoolic este mai mare acidifierea este incompletă și neuniformă, dar se poate corecta prin utilizarea vinurilor care pot respecta această cerință tehnologică.

Vinurile care conțin dioxid de sulf se acidifiază greu sau chiar deloc întrucât dioxidul de sulf este un antiseptic puternic cu acțiune inhibantă.

Conținutul în alcool al vinurilor trebuie să fie cuprins între 8 – 9 volume % alcool. La un grad alcoolic mai ridicat al vinului, bacteriile acetice nu se dezvoltă bine. Din vinurile cu un conținut mai mic în alcool, rezultă un oțet slab, greu de conservat, cunoscându-se că dintr-un grad de alcool rezultă un grad de acid acetic.

Transformarea vinului în oțet se face cu ajutorul bacteriilor acetice. Ele trăiesc la suprafața vinului și formează o peliculă subțire, mai mult sau mai puțin transparentă, mată sau gelatinoasă. Temperatura optimă pentru activitatea bacteriilor acetice este între 22 și 26°C.

Cu ajutorul enzimei alcoolaza, bacteriile acetice oxidează alcoolul etilic, transformându-l la început în aldehidă acetică apoi în acid acetic.

Dintre bacteriile acetice care se folosesc la fabricarea oțetului, cele mai importante sunt: Bacterium orleanse, Bacterium xylinum, Bacterium Schűtzenbachii, etc.

În funcție de materia primă folosită există oțet de fermentație obținut prin fermentarea acetică a lichidelor alcoolice și oțet de distilare, obținut prin distilarea acidului acetic pur.

Oțetul de fermentație, după felul materiei prime folosite în fabricarea lui, poate fi din vin când este pregătit din vin natural, din malț când plămada de malț se supune fermentației acetice, din fructe când este pregătit din mustul de fructe fermentat acetic, din vin cu adaos de alcool și chiar numai din alcool atunci când la pregătirea mediului se folosesc și săruri minerale ca surse de azot, fosfor, magneziu, potasiu, etc.

În procesul de fermentare, oxidarea alcoolului până la acid acetic se efectuează cu ajutorul bacteriilor acetice cultivate. Oxidarea are loc în căzi în care se găsesc suporturi de oxidare. În ultimul timp fermentarea acetică se desfășoară în vase special construite și în condiții submerse. La aceste instalații productivitatea este foarte mare. Ele însă nu s-au răspândit până în prezent prea mult, deoarece sunt destul de scumpe pentru a le înlocui pe cele actuale.

Ca materii prime în fermentația acetică sunt utilizate vinuri alterate și slab alcoolizate, alcooluri obținute din cereale, sfeclă ori cartofi, rafinate sau diluate, sucuri de fructe, siropuri de zahăr, materiale amidonase, etc.

Acidul acetic este din punct de vedere chimic un acid alifatic, monocarboxilic. Sunt utilizate în acest scop vinurile care au început a se oțeti, ori au început să se „întindă”. Vinurile amare nu pot fi utilizate în acest scop deoarece mirosul se accentuează.

Tabelul 12.28.

Modificări ale compoziției chimice a vinului intervenit prin transformare în oțet, datorită activităților bacteriilor acetice

* după introducerea în aparatul de acetificare;** pentru valori medii a 20 probe de vinuri transformate în oțet.

12.5.1. Schema tehnologică generală

Indiferent de tehnologia aplicată, procedeele biotehnologice se bazează pe fermentația acetică a unor lichide alcoolice. Schema tehnologică generală de fabricare a oțetului este prezentată în figura 12.55.

Operațiile care implică aspecte biotehnologice sunt: prepararea substratului hidroalcoolic, fermentația acetică și, într-o mai mică măsură, maturarea. Aceasta din urmă se aplică selectiv, mai ales în cazul oțetului obținut prin fermentație submersă.

Figura 12.55. Schema tehnologică generală de fabricație a oțetului de fermentație

12.5.2. Prepararea substratului hidroalcoolic

Materiile prime care pot fi folosite la fabricarea oțetului sunt foarte diverse: vin, spirt (alcool etilic), cidru și diverse soluții alcoolice obținute prin fermentația alcoolică a unor sucuri de fructe, a mierii, a mustului de malț și a unor materii prime amidonoase. Condiția esențială este să conțină alcool etilic. Aceste materii prime se pot folosi individual sau în amestec, cu sau fără adaos de apă.

Concentrația de alcool etilic din soluția hidroalcoolică se reglează la valori cuprinse între 3,5 % (v/v) și 17 % (v/v), în funcție de tăria acetică, care urmează să fie obținută și randamentul de conversie corespunzător tehnologiei folosite. Randamentul teoretic de conversie este prezentat odată cu tratarea mecanismului fermentației, iar randamentele practice sunt prezentate individual, în funcție de tehnologia de fabricație.

Pe lângă prezența alcoolului etilic, pentru desfășurarea fermentației acetice în condiții bune, este necesară și o serie de nutrienți secundari și factori de creștere. Dacă se utilizează ca materie primă vinul sau lichide alcoolice provenite din fermentarea sucurilor de fructe și a mustului de malț, adăugarea de nutrienți secundari nu este strict necesară. De asemenea, până la o anumită limită, fermentația acetică poate fi condusă în condiții relativ acceptabile, chiar dacă se folosesc amestecuri între materiile prime descrise mai sus, apă și alcool etilic. Totuși, dacă fracțiunea reprezentată de vin, must de malț fermentat sau de sucurile fermentate de fructe este sub 50 – 60%, este necesară adăugarea unor elemente nutritive suplimentare. Anumite substanțe nutritive au un efect pozitiv, chiar și asupra substraturilor formate exclusiv din vin.

Cantitatea de nutrienți utilizată și proporția dintre aceștia depinde de natura substratului. De obicei se folosesc săruri de amoniu (sulfat de amoniu, fosfat de amoniu), de potasiu și de fosfor (sulfat de potasiu, fosfat de potasiu) și extracte de malț condiționate sub diverse forme.

Maturarea – limpezirea

Oțetul din șarjele normale se păstrează minimum o lună în vase pentru maturare-limpezirea, după care se face eventual o corecție de compoziție, urmată de filtrare, îmbuteliere, depozitare temporară și livrare. În unele cazuri este necesară și stabilizarea.

Filtrarea oțetului

Oțetul din șarjele normale conține în suspensie impurități, au aspect tulbure sau este slab colorat. Se procedează la filtrarea lui, iar uneori este cleit cu gelatină. Pentru intensificarea culorii oțetului se adaugă anumiți coloranți alimentari. Nu este permisă adăugarea în oțet a substanțelor conservante, artificiale, aromatizante, a substanțelor cu gust iritant și sintetice îndulcitoare. Oțetul din vin nu este pus în consum decât după maturare, când s-a format aroma și buchetul sau datorită resturilor rezultate în urma reacțiilor dintre acizii din oțet și alcool etilic rămas nefermentat.

12.5.3. Aspecte microbiologice și biochimice în timpul fermentației acetice

Microorganismele care produc cantități semnificative de acid acetic fac parte din genul Acetobacter (Acetobacter aceti, Acetobacter acetigenus, Acetobacter ascendes, Acetobacter hansenii, Acetobacter kűtzingianus, Acetobacter liquefaciens, Acetobacter orleanense, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter schűtzenbachii, Acetobacter suboxidans, Acetobacter xylinus). În tabelul 12.29. sunt prezentate unele caracteristici importante din punct de vedere tehnologic ale bacteriilor acetice.

Tabelul 12.29.

Caracteristici importante din punct de vedere tehnologic ale unor bacterii acetice

Datele din tabelul 12.29. trebuie considerate ca având valoare strict informativă deoarece în practică, în acetatoarele industriale, se pot selecta varietăți care produc peste 15% (m/v) acid acetic.

Mecanismul biologic de conversie a etanolului în acid acetic începe cu reacția de formare a acetaldehidei, catalizată de o alcooldehidrogenază, conform reacției:

I

În continuare, aldehida acetică, sub acțiunea unei hidrataze, prin adiția unei molecule de apă se transformă în aldehida hidratată, conform reacției:

II

Sub acțiunea unei aldehiddehidrogenaze, aldehida hidratată este convertită apoi în acid acetic conform reacției:

III

Există și o cale colaterală de transformare a acetaldehidei, printr-o reacție de disproporționare:

IV

Etanolul format în acest caz se poate oxida din nou conform reacției (I), iar ciclul poate fi reluat conform reacției (IV). Proporția de acid acetic care se formează în cursul fermentației pe această cale în raport cu cantitatea de acid acetic format pe calea principală nu este cunoscută până în prezent.

Formarea acetaldehidei ca intermediar în fermentația acetică a fost dovedită experimental prin adăugarea de sulfit sau bisulfit de calciu în fermentatorul acetic. Disulfitul de calciu reacționează cu aldehida acetică conform reacției:

V

În acest fel se blochează mecanismul principal al fermentației acetice. Produsul format nu este oxidat de bacteriile acetice și se acumulează în mediu.

Randamentul teoretic de conversie a alcoolului etilic în acid acetic este de 130,4 kg de acid acetic la 100 kg de alcool. Dacă se exprimă alcoolul în grade Salleron, randamentul teoretic devine 0,0103 kg de acid acetic/grad alcoolic Salleron.

Viteza de conversie depinde de natura microorganismelor și a substratului, de nivelul de aprovizionare cu oxigen, de temperatură și scade cu creșterea concentrației acidului acetic prezent în mediu.

Fermentația acetică este un proces exoterm. Conversia fiecărui mol de alcool etilic este însoțită de eliberarea unei cantități de căldură de 117 kcal.

12.5.4. Procedee de realizare a fermentației acetice

O dată asigurat conținutul corespunzător de alcool etilic și substanțe nutritive, pentru desfășurarea fermentației acetice rămâne esențială atingerea și menținerea unei anumite concentrații a oxigenului dizolvat. De modul în care se realizează aprovizionarea cu oxigen a bacteriilor acetice depind viteza procesului de fermentație și, într-o oarecare măsură, calitățile senzoriale ale produsului finit.

În funcție de viteza de formare a acidului acetic (și implicit de modul de aerare) procedeele de fermentație acetică pot fi împărțite în două categorii: procedee lente și procedee rapide. Procedeele rapide se împart, principial, în procedee la care contactul soluției alcoolice cu aerul se face prin distribuirea acesteia pe o coloană de umplutură inertă și procedee submerse.

Procedeele lente (tip Orleans)

Sunt cele mai vechi tehnici comerciale de fabricare a oțetului, principiul fiind cunoscut din antichitate. Soluția alcoolică este plasată la început într-un vas cu raport diametru/înălțime mare, care conține talaș, tulpini de viță de vie sau alte materiale de origine vegetală (de exemplu coceni de porumb) care pot asigura o suprafață specifică mare. După aproximativ 7 zile, perioadă în care se declanșează fermentația acetică, lichidul este trecut într-un alt vas. Acesta este de obicei un butoi din lemn de esență tare dar poate fi și o cadă închisă construită din același material. Umplerea se face în așa fel încât lichidul să ocupe de la 50% până la 70% din volumul total al vasului.

În aceste condiții, fermentația acetică se desfășoară lent, numai la suprafața lichidului, unde concentrația de oxigen dizolvat este suficientă pentru a asigura metabolizarea alcoolului etilic de către bacteriile acetice. Se formează astfel un „voal de fermentație” în care numărul de bacterii acetice active este mare. Fermentația durează între 8 și 14 săptămâni, în funcție de compoziția inițială a soluției alcoolice, temperatură, natura microorganismelor, suprafața de contact lichid/aer etc. După ce fermentația acetică se consideră încheiată, se extrage din vas o cantitate de oțet reprezentând 60 – 70% din volumul inițial și se înlocuiește cu materia primă. În acest fel în vasul de fermentație rămâne o cantitate de oțet care conține un număr suficient de bacterii acetice pentru reluarea fermentației. Din acest moment nu mai este necesară etapa inițială, respectiv trecerea prin vasul cu umplutură.

La unele variante ale acestui procedeu, pentru realizarea unei aerări suplimentare, soluția alcoolică aflată în fermentație acetică este trecută succesiv dintr-un vas în altul.

Procedeele lente se folosesc, în general, pentru obținerea unui oțet cu tăria de 4 – 7 grade acetice. Viteza scăzută implică ocuparea unui spațiu de fermentație mare, ceea ce se traduce în ultimă instanță printr-o suprafață construită mare și costuri investiționale ridicate în comparație cu celelalte procedee. Avantajul esențial al procedeelor lente este aroma foarte fină a produsului finit.

Atunci când se folosesc materii prime corespunzătoare, calitățile senzoriale ale oțetului fabricat prin fermentație lentă nu pot fi obținute sub nici o formă prin utilizarea metodelor rapide. Din acest motiv, procedeele lente sunt folosite pentru fabricarea oțeturilor din fructe și a unor produse speciale, cum este, de exemplu, oțetul balsamic.

Procedee rapide care folosesc coloane cu umplutură

În acest caz, pentru atingerea unui nivel ridicat de oxigen dizolvat, plămada este distribuită printr-un procedeu oarecare pe o coloană cu umplutură care asigură o suprafață mare de transfer gaz-lichid. Distribuirea plămezii se poate face continuu (cazul procedeului care folosește stropirea uniformă a părții superioare a coloanei cu substrat) sau discontinuu (prin „înecarea” periodică cu substrat a coloanei, urmată de scurgerea substratului).

Prima variantă este utilizată mai frecvent deoarece regimul de aerare fluctuează mai puțin și, în consecință, fermentația acetică decurge în condiții mai bune, atât sub aspectul randamentului cât și al vitezei. Umplutura este formată, de obicei, din talaș de fag roșu, dar se poate folosi și talașul de stejar, spuma de mare, cocsul sau mangalul tratat în prealabil cu HCl diluat. Densitatea și capacitatea de îmbibare a unor materiale de umplutură sunt prezentate în tabelul 12.30.

Tabelul 12.30.

Caracteristicile unor materiale de umplutură folosite la fabricarea oțetului

Cel mai răspândit acetator cu umplutură este aparatul Frings, prezentat în figura 12.56.

Proiectat în secolul al XlX-lea și perfecționat pe parcurs, aparatul Frings a constituit principalul tip de acetator utilizat până la dezvoltarea industrială a fermentației acetice submerse. Acetatorul Frings este format dintr-un vas tronconic cu înclinație mică (1) în interiorul căruia este fixată, între două grătare (3,5), o coloană de umplutură (2). Volumul acetatoarelor uzuale este de 10 – 25 m3. Soluția alcoolică parțial acetificată, colectată la partea inferioară a aparatului, este recirculată continuu cu ajutorul unei pompe (15) și împrăștiată cvasiuniform de un distribuitor (11) pe suprafața superioară a umpluturii. Distribuitorul trebuie să asigure o împrăștiere uniformă a soluției, pentru realizarea unei suprafețe de transfer gaz/lichid cât mai mare, în cursul curgerii gravitaționale.

În contracurent cu lichidul prin coloană circulă curenți de aer proaspăt. Aerul intră prin orificii (2) distribuite în serală pe toată înălțimea aparatului și iese printr-un racord montat la partea superioară a acetatorului. Pentru recuperarea parțială a vaporilor de acid acetic care părăsesc incinta de fermentație odată cu aerul se folosește uneori un condensator (10).

Cantitatea de căldură care se formează în cursul fermentației acetice industriale este de aproximativ 10 600 kJ/kg de alcool etilic metabolizat. Cea mai mare parte din această căldură este transferată fluxului de aer, care circulă prin acetator, și mediului exterior. Totuși, în anumite condiții, dacă viteza de conversie a etanolului în acid acetic crește peste o anumită limită sau temperatura mediului exterior este ridicată, este necesară preluarea excesului de căldură prin intermediul unui schimbător de căldură (14).

Figura 12.56. Acetatorul cu coloană de umplutură Frings:

1 – corpul acetatorului; 2 – orificii de admisie a aerului; 3 – grătar inferior; 4 – termometru; 5 – grătar superior; 6 – racord de evacuare a aerului din acetator; 7 – racord de ieșire a agentului de răcire; 8 – racord de evacuare a aerului din condensator; 9 – racord de intrare a agentului de răcire; 10 – condensator; 11 – dispozitiv de stropire; 12 – coloană de umplutură; 13 – racorduri pentru agentul de răcire; 14 – schimbător de căldură; 15 – pompă; 16 – racord de evacuare

Se consideră că regimul termic normal de funcționare corespunde următoarelor plaje de temperatură, distribuite pe înălțimea coloanei: 22 – 26°C în partea superioară; 26 – 28°C în zona centrală și 30 – 34°C în partea inferioară. Măsurarea temperaturii se face cu o serie de termometre (4) dispuse pe înălțimea coloanei.

Menținerea sub control a procesului de fermentație se poate face acționând asupra a trei parametri: debitul de aer proaspăt (se modifică prin obturarea sau deschiderea orificiilor de aerisire 2); temperatura lichidului distribuit pe secțiunea superioară a coloanei (prin modificarea debitului/temperaturii agentului de răcire folosit la schimbătorul de căldură) și gradul de recirculare (se modifică debitul de lichid pompat).

La prima pornire a aparatului se folosește un amestec de materie primă și soluție alcoolică aflată în stare de fermentație acetică (cuib de oțet), preluată dintr-un alt acetator, aflat în regim normal de funcționare. Deoarece prima pornire este un proces delicat, este recomandabil să se urmărească cu atenție temperaturile în cele trei zone ale umpluturii și să se intervină dacă este necesar prin modificarea debitului de aer sau a regimului de pompare.

Dacă, cantitatea de cuib aflată la dispoziție este redusă se adoptă, de obicei, un regim inițial intermitent de pompare. Fermentația acetică se conduce până la un conținut remanent de alcool etilic de circa 0,2%. În acest moment se extrage rapid 50 – 70% din oțetul aflat în aparat, se începe imediat alimentarea treptată cu materie primă, urmărind regimul de temperatură, și se reia ciclul de funcționare.

În regim normal de funcționare un ciclu de producție a aparatului durează 8-12 zile pentru un oțet cu tăria de 9 grade acetice. Acetatorul Frings poate produce, în condițiile unor costuri rezonabile, oțet cu tăria de până la 12 grade acetice. Desigur că în acest caz durata unui ciclu crește.

Pentru un anumit volum dat al aparatului și al coloanei de umplutură, productivitatea depinde de durata ciclului de funcționare care, la rândul lui, este dependent de productivitatea unității de volum a umpluturii. În general, aceasta are în 24 de ore o medie de 2,0 – 4,5 kg acid acetic/m3 umplutură. Productivitatea este influențată de natura bacteriilor acetice și modul de conducere a fermentației. Mai mult, productivitatea părții superioare a coloanei este semnificativ mai mare decât cea a părții inferioare. Astfel, în timp ce în primele straturi de umplutură se convertește în acid acetic aproximativ 40% din alcoolul etilic prezent inițial, în straturile inferioare conversia scade până la 4%.

Randamentul practic al acetatoarelor Frings este cuprins între 75% din randamentul teoretic (dacă nu sunt prevăzute cu condensator și condițiile generale de funcționare sunt defectuoase) și 90% din randamentul teoretic (dacă sunt prevăzute cu condensator și regimul de funcționare este corespunzător). Fracțiunea cea mai mare a pierderilor (până la 90% din pierderile totale) este formată din acidul acetic pierdut prin evaporare.

Procedeele care se bazează pe înecarea periodică a umpluturii folosesc baterii de 2-10 vase, care funcționează împreună. Înecarea umpluturii se face numai de jos în sus. Fiecare acetator este inundat succesiv și periodic cu aceeași cantitate de soluție alcoolică aflată în fermentație acetică. În general, inundarea se face prin pompare dar, în cazul bateriilor de două acetatoare, se poate face și prin dezlocuirea soluției cu aer comprimat. Durata unui ciclu complet este mai mare decât la acetatorul Frings (10 – 30 de zile), iar randamentul de transformare este asemănător (până la 85% din randamentul teoretic).

Procedee care folosesc fermentația submersă

Dezvoltarea industrială a fermentației acetice submerse a avut loc treptat, după 1950, pe baza experienței acumulate în producția submersă de antibiotice. În cazul fermentației acetice submerse, suprafața de transfer gaz/lichid creată cu ajutorul umpluturii în cazul acetatoarelor clasice este înlocuită cu suprafața unor bule de aer cu dimensiuni mici, distribuite în număr foarte mare în toată masa lichidului aflat în fermentație. În plus, „cuibul de oțet” folosit la acetatoarele cu umplutură este înlocuit adeseori cu culturi selecționate de bacterii acetice.

La unele dintre primele acetatoare care foloseau fermentația submersă, pentru distribuirea bulelor de aer a fost folosită o placă groasă de sticlă sinterizată. În prezent, instalațiile industriale de obținere a oțetului prin fermentație submersă utilizează bioreactoare de diverse tipuri (Vogelbusch, B.M.A., Chemap etc.) adaptate corespunzător, la care generarea unei suprafețe de contact cât mai mare între aer și lichid se face prin mijloace mecanice. Un acetator tipic din această clasă este format dintr-un vas de oțel inoxidabil, acido-rezistent sau polipropilenă armată cu fibre de sticlă, un sistem mecanic de distribuire a aerului sub formă de bule cu diametru mic (turbină cu sau fără autoaspirație, fie un injector special combinat cu un sistem de palete pentru realizarea unui regim puternic turbionar), suprafețe de transfer termic montate în interior sau un schimbător de căldură extern, spărgător de spumă (de obicei de tip mecanic, cu elemente active), condensator pentru recuperarea vaporilor de acid acetic, aparatură de automatizare și control specifică.

Printre altele, aceasta trebuie să cuprindă elemente pentru măsurarea temperaturii, a conținutului de oxigen dizolvat (pO2), a conținutului de alcool și a nivelelor de lichid și spumă din aparat. Conducerea procesului se realizează în general automat, uneori cu calculator de proces, prin reglarea continuă a temperaturii și a conținutului de oxigen dizolvat.

În momentul în care conținutul rezidual de alcool etilic atinge 0,2%, se extrage automat 30 – 50 % din volumul de lichid din acetator și se înlocuiește treptat (pentru menținerea temperaturii în plaja optimă pentru bacteriile acetice) cu materie primă. Productivitatea unui astfel de aparat depinde de nivelul de aerare (5-15 m3 aer/m3 de soluție x oră) și de eficacitatea cu care acesta este distribuit sub formă de bule fine.

Un acetator submers tipic poate produce 25 – 30 kg de acid acetic/m3 de volum util în 24 de ore. Volumul util este, de obicei, 60 – 70% din volumul total. De exemplu, în cazul unui acetator cu un volum util de 21 m3, la care se extrage pe ciclu o treime din soluția acetică, durata fermentației pentru o tărie finală de 12 grade acetice este de aproximativ 30 de ore. Randamentele obținute sunt net superioare în raport cu acetatoarele cu umplutură, putând atinge 98% din randamentul teoretic.

Prin fermentație submersă se pot obține soluții cu o tărie acetică de până la 15 grade. Dacă se urmărește obținerea unei concentrații mari de acid acetic, se separă fermentația în două trepte, care se desfășoară în bioreactoare diferite, cu culturi diferite și parametri specifici. Din punctul de vedere al operării, acetatoarele submerse sunt mai sensibile decât cele cu coloană de umplutură, deoarece absența aerării pe durate chiar foarte scurte (sub 1 min) provoacă o reducere majoră a numărului de bacterii acetice active, cu repercusiunile corespunzătoare asupra duratei ciclului și a randamentului. Astfel de evenimente sunt evitate prin utilizarea unor surse de rezervă pentru alimentarea cu energie și a unor sisteme de automatizare cu siguranță mare în exploatare.

Oțetul produs prin fermentație submersă este mult mai tulbure și ceva mai puțin aromat decât cel produs în acetatoare cu umplutură. Din aceste motive este supus unei operații de limpezire/filtrare și se lasă uneori la maturare/învechire în butoaie de lemn. Se obține astfel un oțet bogat în principii biologice, rezultate în urma autolizei celulelor bacteriene.

Privită global, dintre tehnicile prezentate, fermentația submersă este cea mai avantajoasă din punct de vedere economic, mai ales dacă prețul unității de suprafață construită este mare. Acest tip de fermentație acetică a permis construirea unor linii de producție pentru acid acetic glacial de origine biologică. În acest scop, acidul acetic de fermentație se extrage cu acetat de etil, se separă și se concentrează prin distilare.

Materiile prime

Materiile prime folosite pentru fabricarea alcoolului prin fermentație se clasifica astfel:

Materii prime amidonoase:

cereale: porumb, grâu, secară, orz etc.

radacini si tuberculi: cartofi, rădăcini de manioc, tuberculi de batate

Materii prime zaharoase:

sfecla si trestie de zahăr;

melasa din sfecla si trestie;

Materii prime celulozice:

deșeuri din lemn;

leșii bisulfitice rezultate la fabricarea celulozei.

Materii prime care conțin inulina și lichenină.

Cele mai utilizate materii prime sunt cerealele, cartofii și melasa. În continuare este prezentata compozitia chimica a principalele materii prime.

Tabelul 13.31.

Compoziția chimică a unor cereale folosite la fabricarea alcoolului

Tabelul 13.32.

Compoziția chimică a cartofilor (valori medii)

Figura 13.57. Schema bloc a fabricării alcoolului din cereale și cartofi

(procedeu fără fierbere sub presiune DSA)

Materiile auxiliare

Materiile auxiliare sunt formate din: malț verde, preparate enzimatice, săruri nutritive și factori de creștere pentru drojdii, acid sulfuric pentru acidifiere, antispumanți și antiseptici, dezinfectanți.

13.2.1. Malțul

Din punct de vedere al biotehnologiei interesează malțul verde care se obține asemănător cu malțul pentru bere, dar durata de germinare este mai mare. Malțul se folosește pentru conținutul său în – și -amilază, enzime de lichefiere și zaharificare a plămezilor. Din punct de vedere al calității, malțul verde se apreciază după:

aspectul exterior;

activitate -amilazică (unități SKB care reprezintă grame de amidon solubil, dextrinizat de către 1g malț verde timp de 60 minute, la 20C în prezența unui exces de -amilază);

activitate -amilazică (unități Windish-Kobach-WK) care reprezintă grame de maltoză rezultată prin acțiunea extractului provenit din 100 g malț verde asupra unei soluții de amidon solubil 2% în timp de 30 min la 20C și pH 7,4.

Aprecierea malțului în funcție de activitatea – și -amilazică este arătată în tabelul 13.32.

Tabelul 13.32.

Aprecierea calității malțului în funcție de activitatea și -amilazică*

* – raportare la substanță uscată

Necesarul de malț verde se poate calcula cu relația:

în care:

Mv este cantitatea de malț verde necesară pentru 100 kg cartofi sau cereale, kg

Ca – cifra de amiloză, constantă specifică pentru fiecare tip de materie primă

(Ca = 1054 pentru porumb și Ca = 1,001 pentru grâu);

A -conținutul în amidon al materiei prime, %;

– activitatea -amilazică a malțului verde, SKB.

Malțul verde se utilizează sub formă de lapte de slad, în care caz malțul verde se macină umed (în mori cu disc sau ciocane, cantitatea de apă folosită fiind 250-300 l/100 kg malț verde). Laptele de slad se dezinfectează cu formalină 40% adăugată în proporție de 150-200 ml/1000 l plămadă.

13.2.2. Preparatele enzimatice de origine microbiană

Preparatele enzimatice de origine microbiană care trebuie să conțină enzimele de degradare a amidonului la zaharuri fermentescibile, se pot utiliza în următoarele scopuri:

pentru moderarea parametrilor tehnologici de prelucrare hidrotermică a materiilor prime în vederea zaharificării;

pentru înlocuirea parțială a malțului;

pentru înlocuirea totală a malțului.

În primul caz, preparatele enzimatice termostabile se folosesc pentru o lichefiere prealabilă tratării termice la parametrii maximi, respectiv se gelatinizează și se fluidifică amidonul din materia primă la temperatură și durată de fierbere mai mici decât atunci când nu se utilizează adaos de enzime. Preparatul enzimatic folosit este de tipul Termamyl-ului care acționează la 90-92C pentru lichefiere, după care fierberea se face la temperaturi mai scăzute în care caz avem următoarele avantaje: economie de abur; randament mai mare în alcool.

În cel de-al doilea caz, prin folosirea preparatelor enzimatice alături de malț se poate înlocui parțial malțul verde, mai ales atunci când acesta are o activitate enzimatică mai redusă. Cantitatea de malț verde poate fi scăzută cu până la 80% din cea necesară (în general 80-100 kg/tonă de amidon).

În cel de-al treilea caz malțul verde se înlocuiește total cu preparate enzimatice ceea ce prezintă următoarele avantaje:

comoditate în utilizarea și păstrarea preparatelor enzimatice în comparație cu malțul verde;

necesită doze mai mici care sunt mai ieftine în comparație cu malțul verde, la dozele utilizate în practica industrială;

preparatele enzimatice nu introduc în circuit microorganisme de infecție a plămezilor;

au acțiune mai eficientă în fluidificare (dextrinizare), fluidificare-zaharificare, în funcție de felul preparatului enzimatic și etapa în care se utilizează.

Preparatele enzimatice utilizate în industria spirtului pot aparține la una din următoarele grupe (tabelul 13.33):

Tabelul 13.33.

Preparatele enzimatice folosite în industria spirtului ale firmei

NOVO-NORDISK și AMB

13.3. Tehnologia de fabricare a alcoolului din materiale amidonoase

Din punct de vedere biotehnologic, la fabricarea spirtului din cereale și cartofi, interesează operațiile de fierbere, zaharificare și fermentare.

13.3.1 Fierberea

Fierberea se poate realiza prin două grupe de procedee: procedee cu fierbere sub presiune a materiei prime (HDV) și procedee fără fierbere sub presiune (DSA).

Din punct de vedere al desfășurării procesului, atât fierberea sub presiune cât și cea fără presiune poate fi continuă sau discontinuă.

Fierberea sub presiune are următoarele dezavantaje:

consum de energie termică mai ridicat (~ 660-800 MJ/hl alcool absolut);

se formează substanțe melanoidinice și caramel datorită temperaturii ridicate de fierbere ( 130C) ceea ce antrenează pierderi de zaharuri fermentescibile;

plămezile obținute nu sunt omogene iar borhotul furajer are o valoare nutrițională mai redusă.

La fierberea fără presiune, este necesar să se realizeze o mărunțire optimă a materiilor prime pentru a se obține randament maxim în alcool, cu consum minim de energie. Energia de mărunțire este de 20-40 MJ (5-10 kWh/hl alcool, respectiv 20-25 kWh/tonă cereale). Măcinarea poate fi uscată, umedă, uscată-umedă.

În funcție de modul în care se realizează mărunțirea, procedeele de fierbere fără presiune (DSA) pot fi:

procedee DSA cu măcinare uscată (procedeul Grosse –Lohmann-Spradau arătat în figura 13.58);

Figura 13.58. Procedeul Grosee-Lohmann-Spradau

1-transportor; 2-moară; 3,5-pompe; 4-fierbător Henze; 6-zaharificator

procedee DSA cu măcinare umedă (procedeul Westphal arătat în figura 13.59);

Figura 13.59. Procedeul Westphal

1-alimentare cu materie primă; 2-moară; 3-evacuare corpuri străine; 4, 10, 13 – pompe; 5- schimbător de căldură; 6-spre fermentare; 7-apă de răcire; 8-fierbător Henze; 9-zaharificator; 11-alimentare cu abur când nu se recuperează căldură din borhot; 12-alimentare cu abur cu recuperare de căldură din borhot (SRV); 14- tanc de borhot; 15- vas de destindere; 16- ejector; 17-introducere enzime; 18-alimentare cu apă pentru măcinare

procedee DSA cu măcinare uscată-umedă (procedeul Dinglinger și Klisch și procedeul Klisch arătat în figura 13.60);

Figura 13.60. Schema procedeului DSA cu funcționare continuă (după Klisch, 1993)

1-alimentare cu abur; 2-apă, borhot; 3–amilază; 4-materia primă; 5-moară cu ciocane; 6-schimbător de căldură în spirală; 7-apă de răcire; 8-schimbător de căldură cu plăci; 9-apă caldă; 10-omogenizator; 11-spre fermentare; 12-plămadă de drojdie ; 13-fierbător Henze; 14-vas de leșie; 15-vas de fludificare finală; 16-amiloglucozidază; 17-ejector; 18-dispozitiv pentru măsurarea și reglarea temperaturii

procedee fără presiune dar cu dispersia materialului cu ajutorul unui dispergator de tip Ultra-turax montat în zaharificator (figura 13.61).

Figura 13.61. Procedeul prin dispersie DMV cu recircularea borhotului (după Piper și Senn, 1985)

1-cereale (boabe); 2-enzime; 3-apă; 4-aparat de plămădire și dispersie; 5-alimentare cu abur a mantalei; 6-agitator; 7-apă de răcire, 8-evacuare condens; 9-plămadă dulce; 10-dispergator; 11-lin de fermentare; 12-plămadă fermentată; 13-abur; 14-aparat de distilare; 15-borhot; 16-alcool; 17-vas de sedimentare borhot; 18-drojdie; 19-borhot concentrat (furajare); 20-borhot lichid; M-motor, P-pompe

Procedeul prin dispersie (DMV) prezintă următoarele avantaje:

pot fi prelucrate toate tipurile de materii prime amidonoase cu randamente ridicate în alcool (~ 66 l alcool absolut /100 kg amidon);

se poate obține un grad de mărunțire optim al materiei prime prin controlul granulației;

se poate realiza o economie de energie de 80% față de procedeul de fierbere cu presiune și de 30% față de celelalte procedee de fierbere fără presiune;

borhotul este recirculat, iar în final borhotul obținut are o calitate superioară;

se disponibilizează fierbătorul Henze care poate fi folosit în alte scopuri (rezervor de apă caldă sau pentru fermentare);

se micșorează consumul de apă de răcire, mai ales dacă se folosesc schimbătoare de căldură cu plăci pentru plămada zaharificată;

într-un singur utilaj se realizează mărunțirea, lichefierea și zaharificarea amidonului din cereale și cartofi.

Având în vedere folosirea enzimelor NOVO și ABM, în figurile 13.62.-13.65. se prezintă schițele simplificate de fierbere discontinuă și continuă sub presiune și fără presiune cu etapele de utilizare a enzimelor în vederea realizării scopurilor urmărite.

Figura 13.62. Locul de adaos a enzimelor la fierberea discontinuă sub presiune a cartofilor și cerealelor

1-fierbător Henze; 2-separator de abur; 3-zaharificator; 4-cuva de fermentare

Figura 13.63. Locul de adaos al enzimelor la fierberea discontinuă fără presiune a materiilor prime amidonoase mărunțite

1-amestecător; 2-pompă de recirculare; 3-vas pentru diluare; 4-zaharificator

În legătură cu folosirea preparatelor enzimatice trebuie să se facă următoarele precizări:

pentru Termamyl și BAN se recomandă să se urmărească ca valoarea pH-ului să fie în intervalul 5,6-6,5. Aceasta se obține prin adăugare de var, ionii de calciu contribuind la stabilizarea preparatelor enzimatice. Concentrația ionilor de calciu nu trebuie să fie mai mică de 50 mg/l pentru Termamyl și Fungamyl și 100 mg/l pentru BAN. Duritatea apei de 1 mech/l corespunde la 20 mg Ca/l iar dacă la prelucrarea cerealelor se folosește apa cu duritate mai mică de 2,5 respectiv 5 mech/l, este necesar să se folosească fie adăugarea ionilor de Ca2+ sub formă de var la prelucrarea cerealelor, fie sub formă de Ca(OH)2 la prelucrarea cartofilor.

Figura 13.64. Locul de adaos al enzimelor la fierberea continuă sub presiune a materiilor prime amidonoase mărunțite

1-amestecător; 2-cap de contact cu vapori de apă; 3-fierbător tubular sau coloane de fierbere; 4-separator de abur cu recircularea acestuia; 5-sisteme de răcire; 6-zaharificator

Figura 13.65. Locul de adaos al enzimelor la fierberea continuă fără presiune a materiilor prime amidonoase mărunțite

1-amestecător; 2-injector; 3-aparate (utilaje) de fermentație la cald; 4-sistem de răcire; 5-zaharificator; 6-răcitor

Temperaturile optime pentru activitatea preparatelor enzimatice de lichefiere (fluidificare) a amidonului (-amilaze) depind de pH și de conținutul de ioni de calciu din plămadă.

Enzimele de fluidificare –zaharificare (Fungamyl) sau cele de zaharificare Spirizym și San Super acționează mai bine la valori pH mai mici, iar dacă pH-ul amestecului măcinătură/apă este mai mare de 6,0, acesta va scădea până la pH 5,5 cu acid sulfuric.

Culoarea pe care o dă plămada zaharificată cu iodul trebuie să fie galbenă. Dacă culoarea este brună sau chiar violetă, zaharificarea nu este completă, de aceea ea trebuie continuată la fermentare prin adaos de enzimă de zaharificare. În acest sens, după răcirea plămezii la 60C se recomandă să se adauge 100 ml San Super sau 100 ml Spirizym sau 20 ml Fungamyl la 100 l plămadă. După menținere timp de 60 minute la temperatura de 55-60C, pH-ul se corectează la 3,2-3,8, se răcește la 30C și se introduce cultura de drojdie.

13.3.2. Fermentarea plămezilor de cereale și cartofi

Pentru fermentarea plămezilor dulci se pot folosi:

drojdii lichide pregătite (cultivate în fabrică);

drojdii speciale pentru alcool uscate sau sub formă comprimată;

drojdii de panificație

Criteriile de caracterizare și selecționare a drojdiilor pentru fabricarea spirtului sunt următoarele: capacitatea și viteza de fermentare, toleranța la alcool, osmotoleranța, capacitatea de formare a produselor secundare, rezistența față de antiseptice.

Drojdia lichidă pregătită în fabrică implică următoarele etape de obținere:

cultura de laborator care se obține din cultura pură (inoculum) de drojdii selecționate pentru spirt, care se multiplică pe un mediu de must de malț steril, în câteva trepte până se ajunge la o cantitate de cultură în baloane de 5 l must, cu care se pot însămânța 50 l plămadă specială în vasul pentru cultura de producție. Mediul de cultură (must de malț cu concentrație 12-15% extract) se acidifică până la 0,8D și după însămânțare cu inoculum se termostatează la 30C timp de 20-24 ore;

cultura de producție se obține pe plămezi speciale pentru drojdie preparate din materia primă amidonoasă de bună calitate, prelucrată hidrotermic și zaharificată. Plămada specială pentru cultura de producție se acidifică fie prin adaos de H2SO4 fie pe cale fermentativă (producere de acid lactic de către bacterii lactice) .

Pentru pregătirea culturii de producție cu acidulare cu H2SO4 se procedează astfel: plămada specială zaharificată se aduce la 50-52C și se acidifică până la o aciditate de 0,7-0,8D pentru plămada din cereale și 0,8-0,9D pentru plămada din cartofi corespunzătoare unui pH de minimum 3,6.

În această plămadă specială răcită la 30C se introduce cultura de laborator reprezentând 10% față de plămadă. Fermentarea se conduce la maximum 30C până la scăderea extractului plămezii de la 16-18% la 5,5-6%. Cultura de producție astfel obținută se folosește la fermentarea plămezii necesară obținerii spirtului. Din cultura de producție se oprește o cantitate ce reprezintă inoculul pentru o nouă șarjă de cultură de producție.

Pentru pregătirea culturii de producție prin acidifiere biologică se procedează în felul următor: plămada specială zaharificată, cu temperatura de 52…55C: se însămânțează cu o cultură de Lactobacillus delbrüeckii care în timp de 24 ore formează acid lactic până la o aciditate de 2,0-2,2D la plămezile de cartofi și 1,7-2,0D la plămezile de cereale. Însămânțarea plămezii se face cu circa 100 ml cultură de laborator de L. delbrüeckii 250-300 l plămadă. Pentru următoarele plămezi însămânțarea se face cu o porțiune din plămada fermentată lactic prelevată înainte de pasteurizare. Plămada specială fermentată lactic se pasteurizează la 75…80C/30 min, se răcește la 29…30C și se însămânțează cu cultura de drojdie de laborator pregătită ca mai înainte și se temostatează la 30C până ce concentrația în extract a plămezii ajunge la 1/3 față de inițial.

Cultura de producție lichidă se însămânțează în plămada destinată fermentării pentru producerea de alcool (plămada principală) în proporție de 1-3l/hl plămada.

Drojdia uscată se utilizează direct la fermentarea plămezii principale, după o prealabilă hidratare. Adăugarea se face prin distribuție uniformă pentru ca fermentația să pornească în întreaga masă de plămadă. O mică parte din drojdia uscată – hidratată se împrăștie la suprafața plămezii pentru a se intensifica producția de CO2 care să formeze un strat protector la suprafața plămezii, în vederea împiedicării și infectării cu microorganisme dăunătoare. Doza de drojdie folosită este de 10-20 g/hl plămadă, mai rar 50 g/hl, un gram de drojdie uscată conținând 20-25×109 celule.

Avantajele folosirii preparatelor uscate de drojdie constă în:

pornire rapidă a fermentației;

randament optim de transformare a zaharurilor în alcool;

desfășurarea în condiții reproductibile a fermentației;

calitate constantă a produsului finit.

Puterea alcooligenă și toleranța la alcool a unor preparate de drojdie uscată, în comparație cu drojdia lichidă sau cea comprimată sunt arătate în tabelul 13.34.

Tabelul 13.34.

Puterea alcooligenă și toleranța la alcool a unor preparate de drojdie uscată

Drojdia de panificație este utilizată în fabricile de spirt cu capacitate redusă. Cantitatea de drojdie necesară este de 100-200 g/hl plămadă zaharificată. Pentru creșterea siguranței în conducerea fermentării drojdia trebuie să fie de bună calitate, cu număr mare de celule vii, cu număr redus de microorganisme străine. Drojdia, sub formă de suspensie într-o cantitate mică de plămadă zaharificată, se tratează cu H2SO4 până la 1,8-2D cu menținere timp de 1 oră. În aceste condiții, microorganismele de infecție și celulele de drojdie slabe sunt distruse.

Fermentația plămezii principale durează 72 ore la 20-30C și cuprinde trei faze:

faza inițială ~ 22 ore;

faza principală ~ 18 ore;

faza finală ~ 32 ore.

Pentru scurtarea duratei de fermentație până la 48 ore se folosesc următoarele metode:

pornirea fermentației la temperaturi mai ridicate de 24-25C, în care caz faza inițială se reduce la 4-6 ore;

folosirea la obținerea plămezii a borhotului lichid recirculat (maximum 60%) prin care se declanșează mai rapid fermentația, scurtându-se faza inițială de 2-3 ore;

utilizarea unei cantități mai mari de lapte de slad pentru a asigura cantitatea suficientă de amilaze pentru zaharificare secundară;

folosirea unei cantități mai mari de cultură de producție de drojdie (10-15%);

conducerea fermentației la 35-36C;

folosirea preparatelor enzimatice microbiene pentru hidroliza avansată a amidonului până la glucoza, fără dextrine limită, în scopul scurtării fazei finale.

Plămezile fermentate trebuie să aibă un extract aparent de 0,3-1,5% la cele de cartofi; 0 la cele de porumb; 1,0-1,3% la cele de orez; 1,1-1,4% la cele de secară; 0,9-1,1% la cele de ovăz.

Extractul real al plămezii fermentate se stabilește cu relația:

er = 0,3·A + eA + 0,4

în care:

er – este extractul real al plămezii fermentate, %;

A-concentrația în alcool a plămezii fermentate, % vol;

eA – extractul aparent al plămezii fermentate, %

La folosirea procedeului de fierbere cu recircularea borhotului extractul aparent al plămezii dulci cât și al plămezii fermentate crește în funcție de numărul de recirculări.

Atât la cultura de drojdie lichidă, cât și la plămada principală este obligatoriu controlul microbiologic pentru a constata: numărul de drojdii; numărul de bacterii de infecție.

Culturile de drojdie lichide trebuie să conțină 50-300·106 celule/ml, sub 50· 106 celule/ml denotând o multiplicare slabă. Numărul de celule moarte nu trebuie să depășească 5%.

Gradul de infectare al plămezilor trebuie să fie cât mai scăzut, o plămadă de calitate având < 2· 106 bacterii/ml. Plămada se consideră ușor infectată când numărul de bacterii este de (4-15 )·106/ml; infectată la (15-50)·106 /ml și puternic infectată (50-120)·106/ml. Cultura de drojdie nu trebuie să conțină mai mult de (1-2)· 106 germeni/ml. Pentru a avea un număr redus de bacterii trebuie realizată acidifierea corectă a plămezii. Acest lucru este necesar și pentru a împiedica formarea de acroleină în plămadă de către bacterii (alcoolul brut trebuie să conțină < 0,2 mg/100 ml acroleină).

13.4. Tehnologia de fabricare a spirtului din melasă

Biotehnologia fabricării spirtului din plămezile de melasă, operațiile tehnologice sunt menționate în figura 13.66. La obținerea plămezii trebuie ținut cont de compoziția chimică a melasei (tabelul 13.35).

Figura 13.66. Schema bloc a fabricării alcoolului din cereale și cartofi

(procedeu fără fierbere sub presiune DSA)

Tabelul 13.35.

Compoziția chimică a melasei

O problemă care se pune la fabricarea spirtului de melasă, este cea a realizării culturii de producție de drojdie, care trebuie utilizată în proporție mai mare în raport cu plămada principală de melasă, deoarece melasa, chiar cu corectarea compoziției se constituie ca un mediu mai puțin convenabil pentru drojdii.

Pentru a avea un volum mare de cultură de producție, obținerea acesteia se face în trei trepte:

cultura în generatorul mic de drojdie;

cultură în generatorul mare de drojdie;

prefermentarea.

Mediul de cultură utilizat este o plămadă de melasă cu 16-17Blg. cu adaosuri de săruri nutritive și aciditate 1,1-1,3D și care a fost sterilizat. Acest mediu se însămânțează fie cu o cultură de producție precedentă. Cultura din generatorul mic servește ca inoculum pentru plămada de melasă din generatorul mare care are concentrația de 15-17Blg. corectată și sterilizată la fel ca în treapta precedentă. Durata de fermentare pentru fiecare treaptă este de 8 ore, în decursul cărora extractul trebuie să scadă la 6-7 Blg.

Se poate merge și pe următoarea variantă: se pulverizează 9-10% plămada principală fermentată care se trece în generatorul mare unde este acidificată la 0,75-0,8S și menținută 6 ore la 26…28C pentru terminarea fermentației, extractul ajungând la 5-5,8%. Această plămadă fermentată, considerată cultura de producție se introduce în plămada principală.

La fermentarea plămezilor de melasă (în prealabil pregătite) se folosesc procedee de fermentare discontinuă și continuă, cele continui fiind:

procedee fără refolosirea drojdiei;

procedee cu separarea și refolosirea drojdiei

Pregătirea plămezii de melasă constă în: diluare cu apă, neutralizare, acidulare, adăugare săruri nutritive, limpezire, sterilizare (pasteurizare), răcire.

Plămada principală de melasă se diluează la 30-34% extract iar cultura de producție de drojdie (plămada de drojdie) la 12-16% extract. Cele două plămezi pot avea și aceeași concentrație în extract de 23%.

Cultura de drojdie de producție se însămânțează în proporție de 40% față de plămada principală de producție.

În cazul fermentării în sistem continuu (se folosește o baterie de linuri de fermentare), colectarea drojdiei făcându-se din ultimul lin de fermentare prin separarea centrifugală, în care caz “laptele de drojdie” concentrat reprezintă 7-10% din plămada fermentată. Acest lapte de drojdie este refolosit la fermentare, după tratare cu H2SO4 timp de 1 oră, la pH 2,2-2,4.

Fermentarea continuă prezintă următoarele avantaje:

randament în alcool până la 64-65 l alcool absolut/100 kg zaharoză din melasă;

creșterea productivității;

spațiu necesar mai redus, investiție mai redusă;

consumul de utilități este mai redus și uniform.

Dezavantajul fermentării continui constă în instabilitatea biologică a plămezii ce se fermentează dezavantaj ce poate fi depășit prin utilizarea instalației firmei Starcosa/BMA ce folosește o combinație bioreactor-unitate de microfiltrare.

14.1. Principalele enzime din musturi și vinuri

Enzimele din musturi și vinuri provin din materia primă – strugurii, dar la echipamentul lor enzimatic mai intervin cu enzime:

drojdiile care participă la fermentația mustului (drojdii de contaminare și selecționate);

mucegaiurile de infecție a culturilor avariate, în special Botryotinia;

bacteriile, în principal cele care produc fermentația malo-lactică.

Enzimele proprii strugurilor din drojdii și bacterii sunt descrise în continuare.

Oxidoreductazele sunt mai concentrate în părțile solide ale boabelor de struguri (pielița și pulpa), ceea ce explică diferențele de calitate între vinurile provenind de la aceiași struguri, dar la care mustul s-a obținut prin presare la presiuni diferite. Oxidoreductazele din struguri (cele care au grupare heminică – citocromozidaza, peroxidaza, catalaza; cele care conțin cupru sau mangan-tirozinaza, catecholoxidaza, p-difenoloxidaza, lacaza; ascorbatoxidaza) sunt inactivate la temperaturi mai mari de 70°C, iar SO2 inhibă oxidoreductazele la nivel de 50 – 100 mg/l.

Acțiunea SO2 se corelează cu cantitatea de chinone din must, care se formează sub acțiunea polifenol-oxidazelor asupra fenolilor în prezență de O2, în momentul zdrobirii strugurilor. Aceste chinone sunt reduse de SO2 aproape instantaneu și În acest fel se protejează oxidoreductazele.

O serie de oxidoreductaze sunt proprii drojdiilor și bacteriilor, fiind implicate în procese fermentative (triozofosfatdehidrogenaza, alcooldehidrogenaza, lactatdehidrogenaza, malicdehidrogenaza, acetaldehiddehidrogenaza etc.).

Prin urmare, la stabilirea dozelor de SO2 trebuie să se cunoască concentrația chinonelor în must. Efectul oxidoreductazelor este minimalizat dacă:

SO2 este adăugat în momentul obținerii mustuielii și este distribuit omogen în mustuială;

se face bentonizarea musturilor cu – 2g/l bentonită, mai ales în cazul mustuielii din struguri avariați de mucegaiuri, care provoacă o îmbogățire cu oxidoreductaze a strugurilor;

are loc o sulfitare corectă a mustuielii (inactivarea cu SO2 se consideră că este parțial reversibilă).

Conservarea mustului prin pasteurizare conduce la inactivarea completă a oxidoreductazelor, iar conservarea la frig și sub atmosferă de CO2 menține oxidoreductazele într-o stare de latență.

Transferazele proprii mustului și vinurilor (fosfotransferazele, fosfomutazele și transaminazele) sunt în cantități foarte reduse, cea mai mare parte aparțin drojdiilor care intervin în fermentația alcoolică, cu primele două clase, și în biosinteza a numeroși acizi cu cea de-a treia clasă. Alte transferaze din drojdii intervin în formarea alcoolilor superiori, alcooli care sunt eliminați în mediu.

Enzimele pectolitice din must provin din struguri și concentrația lor este crescută în cazul strugurilor avariați de mucegaiuri, în special din genul Botryotinia.

Se găsesc pectin esteraze (PE) în concentrație variabilă, dar întotdeauna relativ ridicată, poligalacturonaze (PG), cele de tip endo fiind capabile să reducă vâs- cozitatea mustului. Enzimele pectolitice din must sunt importante în limpezirea spontană a mustului și vinului.

Enzimele proteolitice din struguri și, respectiv, din must su.nt active la pH-ul mustului și relativ termolabile, ceea ce explică conținutul de azot solubil mai redus al vinurilor obținute prin macerare la cald.

Enzimele proteolitice din must favorizează dezvoltarea drojdiilor prin formare de azot asimilabil (drojdiile, deși posedă enzime proteolitice, nu pot acționa decât intracelular).

Glucozidazele. Strugurii au un potențial invertazic destul de mare, care, însă, trece în must în proporție de 30 – 35%, restul rămânând în boștină și, respectiv, în burbă. La pH-ul mustului de 3,2 – 3,5, activitatea invertazică reprezintă numai 70 – 75% din cea maximă (la pH = 1,8).

Invertaza este inhibată de alcool și este puțin inhibată de SO2. Drojdiile au și ele o invertază localizată în membrană. În vinul tânăr, rămâne numai 15 – 30% din activitatea invertazică a mustului, restul fiind eliminată la deburbare, separare drojdii, tratamentul cu bentonită.

Maturarea și tnvechirea vinurilor conduc la diminuarea în continuare a activității invertazice.

Liazele din must și din vin provin din struguri, dar în principal intră în echipamentul enzimatic al drojdiilor din must și vin. Drojdiile posedă: piruvat decarboxilaza implicată în metabolismul glucidelor și în fermentația alcoolică; oxalacetat de boxilaza, care decarboxilează acidul oxalacetic în acid piruvic, enzima fiind im licată în fermentația malo-lactică, degradarea acidului tartric și citric; malat-decarboxilaza, care catalizează decarboxilarea acidului malic în fermentația malo-lactică; aldolaza, care intervine nî scindarea fructozo 1,6P în două trioze (glicerinaldehid difosfat și hidroxiacetonofosfat).

Izomerazele intră, în principal, în echipamentul enzimatic al drojdiilor și bacteriilor lactice și intervin în procesul de glicoliză. Mai importante sunt glucozofosfatizomeraza și triozofosfatizomeraza.

Ligazele intră în echipamentul enzimatic al drojdiilor și sunt reprezentate de ATP-sulfurilaza care catalizează sinteza adenozin-5-fosfosulfatului (APS), compus care apare ca intermediar în procesul de reducere a sulfaților în SO2. Așa se explică prezența în vin a unei cantități mai mari de SO2 decât cel utilizat la sulfitare.

14.2. Folosirea enzimelor exogene în vinificație

Preparatele enzimatice exogene pentru vinificație nu au găsit încă o utilizare largă din următoarele motive:

compoziția chimică a strugurilor este foarte variată de la soi la soi, în funcție de podgorie și de condițiile de climat, ceea ce determină o mare variabilitate a echipamentului enzimatic propriu și a drojdiilor de contaminare;

vinificatorul are la îndemână mijloace fizice și chimice cu care asigură o evoluție biologică normală a vinului.

Într-o oenologie modernă, utilizarea preparatelor exogene, în mod sigur, se va impune pentru a asigura realizarea unor produse finite de calitate superioară, pentru a crește profitabilitatea sectorului prin creșterea randamentului în must, prin accelerarea și facilitarea unor operații tehnologice.

Direcțiile principale de folosire a preparate lor enzimatice exogene se referă la:

tratamentul strugurilor zdrobiți (mustuielii) în vederea îmbunătățirii randamentului în must, respectiv pentru extracția cât mai avansată a substanțelor de aromă și culoare din struguri (în principal pielița și pulpa);

facilitarea clarificării (limpezirii) și, respectiv, a fiitrării în diferite faze de fabricație a vinului;

facilitarea eliberării unor substanțe volatile în vinul tânăr (terpineoli volatili), care contribuie la „buchetul” unor vinuri de marcă (Muscat, Traminer etc.).

14.2.1. Folosirea preparatelor enzimatice la macerare

Preparatele enzimatice cu activitate, în principal, pectolitică și, în unele cazuri, și hemicelulazică și celulazică, se adaugă la strugurii zdrobiți (mustuială), substratul atacat fiind reprezentat de formele insolubile de pectine continute în pereții celulari ce sunt asociate cu substanțe nepectice, în principal hemiceluloze, substanțe pectice care trec în forme solubile. Prin degradarea pereților celulari se facilitează eliberarea sucului vacuolar, obținându-se mustul. Se realizează în acest fel o creștere de randament care poate depăși 10%, depinzând de natura mustuielii. Această creștere poate fi și mai mare în cazul strugurilor pulpoși (anumiți hibrizi) și a celor bogați în zahăr (muscat). Creșterea de randament se referă la mustul ravac și la cel provenit de la pres ea întâi.

La obținerea vinurilor roșii, preparatele enzimatice pectolitice se folosesc atât în cazul viniflcării clasice cât și în cazul termovinificării.

La vinificarea clasică – macerare – fermentare pe boștină, adaosul de preparate enzimatice pectolitice prezintă următoarele avantaje: se realizează o fermentare mai rapidă și mai puțin turbulentă; se formează mai puțină spumă; se reduce durata macerării – fermentării și se îmbunătățește gradul de extracție al substanțelor colorate/colorante; crește randamentul în must ravac, așa cum deja s-a menționat; se ușurează operația de presare a boștinei; se realizează o limțezire mai bună a mustului și ulterior a vinului; se ușurează filtrarea mustului și vinului; se obțin vinuri cu un buchet mai bogat, cu o corpolență mai mare și cu un conținut mai scăzut în tanin; maturarea vinurilor se face mai rapid.

Așa cum s-a menționat, macerarea – fermentarea este mai scurtă, netumultoasă și nu se formează multă spumă. Creșterea temperaturii la macerare – fermentare este mică și, deci, nu există riscul întreruperii fermentației din această cauză. Deoarece fermentația tumultoasă este în mare parte eliminată, se mărește puțin conținutul de alcool și se reduce conținutul de acizi volatili. Durata fermentației se reduce cu circa 30 – 50%, ceea ce înseamnă un important avantaj economic, deoarece se poate dubla capacitatea de producție, mai ales dacă unitatea vinificatoare dispune de rototancuri sau fermentatoare continue.

Îmbunătățirea culorii mustului este evidentă, chiar dacă durata macerării- fermentării este mai scurtă. Extracția culorii în cazul tratamentului strugurilor zdrobiți cu preparate enzimatice pectolitice este inițial destul de lentă, fiind accelerată după 6 – 8 ore de macerare – fermentare (acest lucru este important la vinificarea în alb a strugurilor, unde nu se cere să se extragă mult material colorat/colorant).

În cazul strugurilor roșii, remontajul (recircularea) în tancul de macerare- fermentare se poate reduce la două reciclări pe zi, fiind necesar ca boștina să fie cufundată permanent în mustul care fermentează. Remontajul mustuielii trebuie să se facă după fiecare 12 ore. Scurgerea mustului ravac trebuie să se facă imediat ce s-a atins intensitatea dorită a culorii, ceea ce nu corespunde cu o anumită densitate a mustului (fig. 9.1).

La macerarea – fermentarea clasică se recomandă să se folosească:

Pectinex 1 XL, 5 – 10 g/100 kg struguri;

Pectinex 3XL, 1,6 – 3 g/100 kg struguri;

Ultrazim – 100G, 1 – 2 g/1 00 kg struguri;

Vinozym G, 3 g/100 kg struguri (27g/t);

SIHA – Pectinaze W, 2 – 4ml/100 kg struguri;

SIHA – Pectinaze NK, 10 – 20 ml/1 00 kg struguri.

Figura 14.67. Influența macerației cu și fără adaos de enzime de macerare asupra culorii și densității mustului

La termovinificație, care se impune atunci când strugurii sunt avariați de mucegaiuri, tratamentul termic produce o plasmoliză a bobului de strugure, membranele celulare fiind denaturate, ceea ce conduce la creșterea permeabilității lor și, în consecință, la o extracție mai bună a zahărului, acizilor și substanțelor de aromă si culoare.

Avantajele termovinificării în prezență de preparate enzimatice pectolitice sunt următoarele: reducerea timpului de menținere la 50°C și prin urmare creșterea capacității separatoarelor de must; un volum mai mare de must ravac (cu 20%); o creștere a randamentului total (must ravac + must presa 1); o ușoară presare a boștinei; o limpezire (clarificare) mai rapidă și mai ușoară; formarea unei cantități mai mici de spumă la fermentare; facilitarea filtrării mustului și vinului.

Tratamentul enzimatic durează 4 ore.

Dozele de preparate enzimatice recomandate sunt următoarele:

Pectinex 1XL, 10 – 15 g/100 kg struguri;

Pectinex 3XL, 3,5 – 5 g/100 kg struguri;

Ultrazim 100G, 0,25 – 1 g/hl în mustuială înaintea încălzirii, 0,5 – 1 g/hl după încălzire, înaintea presării.

La vinificarea în alb, tratamentul cu enzime pectolitice al strugurilor zdrobiți (mustuiala) prezintă următoarele avantaje: presarea este mai ușoară și mai rapidă; se previne împroșcarea; se obține mai mult must ravac de primă calitate și mai puțin must de presare; randamentul total în must crește; mustul este mai bogat în zahăr, compuși de aromă, substanțe de culoare; vinul obținut are o calitate mai bună.

Rezultă că prin tratament enzimatic se ajunge la o folosire mai bună a utilajelor, a căror încărcare devine mai mică, durata de prelucrare inițială se scurtează, iar capacitatea de producție devine mai mare.

Creșterea în must ravac poate ajunge la 20%. Având în vedere că presarea devine mai lejeră, mustul de presă conține mai puțin material de tulbureală. Deoarece se extrage aproape toată cantitatea de zahăr din struguri, vinul obținut va conține un procent mai mare de alcool.

Tratamentul cu enzime pectolitice se poate face în mustuiala care iese din zdrobitor sau direct în tancul de macerare, chiar de la început și apoi, când acesta s-a umplut, conținutul trebuie agitat. Se impune, deci, introducerea între zdrobitor și presă a unui tanc de macerare în care mustuiala se ține 2 – 4 ore la – 15°C.

La macerarea mustuielii se folosesc următoarele doze de preparate enzimatice:

Pectinex 1XL, 5-10 g/100 kg struguri;

Pectinex 3XL, 1,6-3,3 g/100 kg struguri;

Ultrazym 100 G, 0,5-1,5 g/hl mustuială;

Vinozym FCE G, 2g/100 kg struguri;

SIHA – Pectinase W, 2 – 6 ml/100 kg struguri;

SIHA – Pectinase NK, 10- 30 ml/100 kg struguri.

14.2.2. Folosirea preparatelor enzimatice la clarificarea musturilor și vinurilor

În cazul vinificației în alb, se recomandă ca mustul după obținere (must ravac+must presa I) să fie tratat cu enzime pectolitice în vederea: îndepărtării mai rapide a substanțelor mucilaginoase, inclusiv a pectinelor; limpezirii mai bune și oxidării mai reduse; îmbunătățirii fermentației, fără exces de spumă; degradării biologice mai rapide a acizilor organ ici (malic); ușurării filtrării, intensificării și „rafinării” aromei, obținerii unui „buchet” mai „curat” mai autentic.

Datorită faptului că substanțele mucilaginoase se îndepărtează mai rapid, se asigură și o precipitare a substanțelor care formează tulbureala, înainte de a începe fermentația. Având în vedere că o dată cu precipitatul se îndepărtează și o mare parte din polifenoloxidaze, rezultă că limpezirea mustului înainte de fermentare va reduce gradul de oxidare al vinului. În acest caz și fermentarea este mai puțin tumultoasă, fără ca să se prelungească ci, din contră, începe mai repede și este mai scurtă. Spuma ce se formează este fină și se dezintegrează repede.

Aceasta înseamnă că tancul de fermentare poate fi folosit la un volum de 30 – 40% mai mult. Dintr-un must care s-a limpezit ușor va rezulta un vin care, de asemenea, se va limpezi ușor.

Preparatele enzimatice și dozele utilizate sunt următoarele:

Novoclaire TM-FCE-G: 1 g/hl must alb sau roșu;

Ultrazym 100G: 0,2 – 1 g/hl must alb (pentru deburbare);

Ultrazyrn 100G: 1 – 5 g/hl pentru mustul alb de presă;

Ultrazym 100G: 1 – 3 g/hl must roșu (după adaosul de gelatină 10 – 20 g/hl);

Pectinex 1XL: 2,5 g/100 hl must alb sau roșu;

Pectinex 3XL: 0,8 – 1,6 g/100 hl must alb sau roșu;

Ultrazym 100G: 0,25 – 1 g/hl În must, după presare la termovinificație;

SIHA – Pektinase W: 2 – 5 ml/hl must alb;

SIHA – Pektinase NK: 10 – 30 ml/hl must alb.

14.2.3. Folosirea enzimelor pectolitice pentru facilitarea filtrării și limpezirea vinurilor

Enzimele pectolitice sunt denumite și enzime de filtrare, datorită aptitudinilor de a ameliora viteza de filtrare a musturilor și vinurilor.

În măsura în care degradarea pectinelor conduce la micșorarea vâscozității mediului, este logic că viteza de filtrare va crește, deoarece acțiunea colmatantă a pectinelor insuficient degradate este considerabilă, la care se adaugă acțiunea colmatantă a celulozelor și, în principal, a hemicelulozelor. Având în vedere prezența celor trei polizaharide, în componența enzirnelor de filtrare ar trebui să existe enzime pectolitiee, hemicelulaze și celulaze. Foarte frecvent, tratamentul cu enzime de filtrare este completat cu cleirea cu gelatină, proprie eliminării acțiunii colmatante și a factorului de instabilitate care îl constituie polifenolii condensați. Sinergismul tratamentului enzimatic și al cleirii cu gelatină conduce la o ameliorare notabilă a filtrabilității.

Având în vedere că o mare putere colmatantă o are dextranul, polizaharid de fermentație microbiană (recolte avariate și infectate cu Leuconostoc dextranicum), sau așa numitul β-glucan Botritis produs de Botritis cinerea care infectează strugurii, este necesar ca preparatele enzimatice să conțină și dextranaze, respectiv β-glucanază Botritis.

Se pot utiliza următoarele preparate enzimatice:

Novoclair FCEG: 1 g/hl must pentru depectinizare;

Novoferm 12L: 5 – 10 ml/hl și maximum 20 ml/hl în mustul deja fer-mentat;

Novoferm 12G: 3 – 5 g/hl și maximum 10 g/hl în mustul deja fermentat;

Vinoflow G: 3 – 5 g/hl vin tânăr;

Glucanex: 1 g/hl vin în cazul în care provine din struguri infectați cu Botritis cinerea;

SIHA-Pektinase W: 5-7 ml/hl;

SIHA-Pektinase NK: 30 ml/hl.

14.3. Microflora implicată în productia vinicolă

Pe suprafața strugurilor, în special în faza de coacere, se găsesc bacterii, drojdii și mucegaiuri, care la zdrobirea strugurilor ajung în must, unde suferă o selecție datorită conținutului în acizi organici, substanțelor tanante și conținutului de zahăr. Mai sensibile sunt bacterii le care nu suportă acidități mari.

14.3.1. Bacteriile

Bacteriile, care se găsesc în număr mare pe struguri, se diminuează ca număr în must și în vin, datorită acidității și formării alcoolului.

Bacteriile care rămân în vin sunt numai sub formă de coci sau bastonașe, aerobe și anaerobe, nesporulate și aparțin genurilor Acetobacter, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus și Pseudomonas.

Speciile aparținând genului Acetobacter (Acetobacter aceti, subspeciile aceti, subspeciile orleanensis, subspeciile xilinum, subspeciile liquefaciens și Acetobacter pasteurianus cu subspeciile pasteurianus, lovaniensis, estunensis, ascendens, paradoxus), produc, în condiții favorabile, oxidarea alcoolului la acid acetic.

Ele produc oțețirea vinurilor slabe, mai ales vara (la temperaturi de 23 … 28°C și când vasele nu sunt pline), formând la suprafață o peliculă, fină, cenușie, la început transparentă, care se înqroașă, căpătând culoare roz și formează cute pe lângă pereții vasului. Mai târziu, această peliculă se rupe, cade la fundul vasului, formând o masă densă mucilaginoasă sau gelatinoasă.

Dezvoltarea bacteriilor este favorizată de o fermentare lentă a rnustulut, când drojdiile nu mai acționează normal și, de asemenea, când fermentarea vinurilor roșii se face cu boștină la suprafață (căciulă la suprafață în vase deschise), când pH-ul vinului este mare (aciditate fixă mică).

Formarea acid ului acetic de către bacteriile acetice este întotdeauna însoțită de o esterificare (se formează acetatul de etil).

Vinurile albe cu aciditate mai mare de 1,4 g/l și cele roșii cu aciditate mai mare de 1,7 g/l sunt considerate oțețite.

Bacteriile aparținând genurilor Streptococcus (Str. malolactis) Leuconostoc (Leuconostoc gracile oenos A, X, P), Pediococcus (P. cerevisiae și P. casei), Lactobacillus heterofermentativ (L. fructivorans, L. disidiasus, L. hilgardii, L. brevis) pot avea un rol pozitiv, în fermentația malo-lactică necesară dezacidificării vinurilor cu un conținut ridicat în acid malic, dar această fermentație malo-lactică trebuie împiedicată la vinurile îmbuteliate și, în special, la cele cu aciditate mică, la care se pot provoca defecte (gust de acid lactic, aciditate volatilă ridicată).

Vinurile cu aciditate mică fermentate malo-Iactic devin fade, se tulbură, capătă miros de varză murată și gust acru-dulce (neplăcut), puțin înțepător, iar în fază înaintată primesc și un gust și miros de ulei rânced.

Fermentația malo-lactică în acest caz este însoțită și de alte boli (băloșire, întinderea vinului). Cunoscându-se faptul că fermentația malo-lactică este favorizată de o temperatură de 20…25°C, de o aerare moderată a vinului, de un pH = 4,2 – 4,5, precum și de faptul că dezvoltarea bacteriilor rnalo-lactice este asigurată când există substanțe azotoase (vinurile tinere menținute mai mult timp pe drojdie oferă aceste substanțe azotoase), atunci se pot lua măsurile de îm- piedicare a acestei fermentări în cazul vinurilor cu conținut scăzut în alcool și aciditate mai mică.

Bacteriile anaerobe cuprinzând speciile Bacterium manitopoeum, Bacterium intermedium și Micrococcus acidovorans pot produce fermentația manitică a vinurilor. Manitarea sau borșirea vinurilor se produce la vinificarea în toamnele călduroase și se manifestă prin tulbureală, modificarea culorii, apariția de miros de fructe în descompunere și, în stadiu avansat, miros de zeamă de varză.

Gustul vinului este acru-dulceag, care zgârie pe gât. Văzut prin transparența, vinul dă reflexe mătăsoase. Boala se ivește, în general, la vinurile roșii, deoarece bacteriile manitice se dezvoltă în boștină la temperatura de 25 … 30°C.

Boala nu apare la vinurile cu ~14% volume alcool sau la cele care au un conținut mare de zahăr.

Bacteriile manitice descompun o parte din glucoză în acid lactic, alcool etilic și CO2, iar altă parte în aldehidă acetică și acid formic, ultimul dând prin descompunere CO2 și H2. Levuloza este descompusă la manită (50 – 72%), acid acetic (13-16%), acid lactic (10-15%), acid succinic (0,6%), CO2 (7-12%) și glicerină (1 – 1,5%). Pentru transformare în manită, levuloza funcționează ca acceptor de hidrogen:

Bacteriile anaerobe de tipul Bacterium tartarophtorum, Lactobacillus plantarum, Bacillus sporogenes, Bacterium gracile, Micrococcus variococcus (reprezentative sunt primele două specii) produc fermentația propionică, boala presiunii (pousse) și întoarcerii vinului (tourne). Sunt supuse îmbolnăvirii rnusturile spre sfârșitul fermentației alcoolice, vinurile tinere dar și cele finite, în special cele slab alcoolice și cu aciditate mică și care mai conțin zaharuri reziduale.

Sunt foarte susceptibile vinurile provenite din strugurii atacați de mană, mucegai, grindină, vinurile care sunt bogate în substanțe azotoase. Boala apare mai ales în toamnele calde și în iernile blânde sau primăvara și se manifestă prin tulbureală, degajare de CO2 care atunci când se acumulează în vase închise poate conduce la deformare (la vasele metalice) sau la spargere (la vasele de lemn). În această fază, boala este denumită „pousse”. Când nu se mai degajă CO2, însă caracteristicile sunt specifice fermentației propionice, boala se numește „tourne”.

Vinul afectat prezintă miros de acid acetic și acetat de etil, gustul devine fad, iar în ceea ce privește culoarea, vinurile albe lmbuteliate devin roșii-brune iar cele roșii-brune devin negre. Privit în lumina soarelui, și rotit în pahar, vinul prezintă unde (valuri) mătăsoase ce se mișcă în toate sensurile, care nu sunt altceva decât asociații de filamente de bacterii. Pe fundul vaselor se depune un sediment negru, dens, mucilaginos, care se rupe la întindere în fire lungi. Bacteriile amintite atacă, cu predilecție, sărurile acidului tartric:

Bacteriile respective atacă și glicerolul pe care-l transformă în acizi propionic, lactic, acetic. Zahărul este transformat în acid acetic și CO2, dar și în manită. Boala este favorizată de temperatura ridicată la fermentare și la depozitarea vinului. Sunt afectate cu predilecție vinurile roșii, slab acide (pH > 3,5), netaninoase. Zahărul și substanțele azotoase favorizează dezvoltarea bacteriilor, în timp ce taninul o inhibă.

Bacillus viscosusvini, Bacterium gracile, Streptococcus mucilaginosus, varietatea vini, împreună cu mucegaiul Oematium pullulans și drojdiile Pichia și Torula pot provoca boala întinderii sau băloșirea vinului. Sunt afecta te în special vinurile albe noi, slab alcoolice și netaninoase.

Boala începe prin tulbureala vinului care devine vâscos, la turnare curgând într-o șuviță continuă, ca uleiul. Gustul este fad, plat, cleios. Dacă vinul se agită, se degaja CO2 și iși pierde consistența cleioasă. Substanța cleioasă se depune în final la fundul vasului.

Bacteriile Bacillus amaracrylus și Bacillus tartarophtorum pot produce amăreala vinurilor vechi, mai ales a celor îmbuteliate. În faza inițială a bolii, vinul prezintă un miros particular, culoarea devine strălucitoare, iar gustul mai fad dulceag. Când boala avansează, gustul devine amar, înțepător, culoarea devina brună și în sticlă se formează un depozit brun, lipicios, mucilaginos, neaderent la sticlă.

Bacteriile respective descompun glicerina cu formare de acid acetic, formic, acrilic, lactic, crescând, deci, atât aciditatea volatilă cât și cea fixă. În aceste vinuri apare acroleina, care se combină cu polifenolii (în special taninurile epicatehinice) și rezultă substanțe ce caracterizează vinurile amare.

14.3.2. Drojdiile

Drojdiile implicate în vinificație aparțin următoarelor genuri:

Saccharomyces Rees, cu speciile: Sacharomyces cerevisiae, varietatea ellipsoideus, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bailii, Saccharomyces Chevalieri, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bisporus;

Kluyveromyces, cu specia Kluyveromyces veronae;

Kloeckera, cu specia Kloeckera magna;

Saccharomyces Hansen, cu speciile: Saccharomyces ludwigii Hansen, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces mestris;

Candida Berkhont, cu specia Candida vini (Mycoderma vint);

Pichia Hansen, cu speciile: Pichia membranaefaciens Hansen, Pichia fermentans Loddler;

Hansenuela Sydow, cu specia Hansenuela anomala;

Debaryomyces, cu specia Oebaryomyces hansenii;

Schizossacharomyces, cu speciile: Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans;

Torula, cu speciile: Torulopsis bacillaris, Torulopsis stellate;

Brettanomyces, cu specia: Brettanomyces intermedius.

Pentru producția vinicolă din țara noastră interesează, în mod special, speciile descrise în continuare.

Saccharomyces cerevisiae, varietatea elipsoideus reprezintă – 80% din totalul drojdiilor din mustul aflat într-o fază avansată de fermentare (> 5° alcool).

Cunoscute și sub denumirea de levuri eliptice, aceste drojdii fermentează cea mai mare parte din zahărul mustului, producând în condiții naturale ~ 7,5° alcoo/.

Drojdii selecționate pot forma până la 18 – 18,5° alcool, fiind capabile să fermenteze normal și la < l0°C. Au o mare rezistență la SO2 (-300 mg/l), putându-se dezvolta la un potențial de oxidoreducere scăzut.

Sunt alcoolo-rezistente, fiind capabile să refermenteze vinunle cu 10-12° alcool, cărora li s-a adăugat zahăr sau must concentrat. Sunt capabile să fermenteze și sub presiune de CO2, în care caz formează un sediment nisipos.

Unele rase peliculare, la sfârșitul fermentației, în prezența aerului formează buchet și aromă, caracteristice vinului sherry. Din această specie se selecționează sușe care servesc drept culturi starter (inocul) necesare obținerii culturii de producție pentru producția vinicolă.

Saccharomyces oviformis Ostervalder se găsește pe struguri, în must prezentându-se sub formă de celule eliptice și mai rar rotunde. Au o putere alcooligenă mai mare decât Saccharomyces ellipsoideus, devenind dominantă la sfârșitul fermentației și după fermentație. Rezistă la un nivel de – 300 mg SO2 total/l, respectiv 100 mg SO2 liber/l. Dă rezultate bune la prepararea vinurilor seci din musturi bogate în zahăr.

Poate provoca refermentarea vinuri lor demiseci, demidulci și dulci și, de aceea, la aceste vinuri drojdia respectivă trebuie îndepărtată. La unele vinuri obținute din podgona Xeres-Spania și Jura-Franța, la suprafața vinului se formează un voal, sub influența căruia vinul capătă caracteristici deosebite. La vinurile spumante, la tirajul vinului, se utilizează cultura de producție obținută din cultura starter (inoculum) de Saccharomyces oviformis.

Saccharomyces bayanus Saccharodo se aseamănă cu Saccharomyces oviformis în ceea ce privește asimilarea și fermentarea zaharurilor, dar se deosebește prin forma celulelor care este mai alungită. Au o putere alcooligenă și o rezistență la alcool mai redusă. Necesită pentru dezvoltare mezoinozitol.

Saccharomyces chevafieri Guillermond se aseamănă cu Saccharomyces ellipsoideus sub raportul activității fermentative. Se întâlnește mai mult pe strugurii roșii.

Saccharomyces bailli Linder este rezistentă la SO2 și poate produce, împreună cu Saccharomyces oviformis și Saccharomyces ludwigii, fermentarea vinurilor dulci moderat sulfitate. Deși produce – 10% alcool (volume), este considerată ca o drojdie dăunătoare.

Kloeckera apiculata, Kloeckera africana, Kloeckera jensenii și Kloeckera magna pot reprezenta până la 99% din totalul drojdiilor strugurilor în faza de coacere. Au o capacitate de dezvoltare foarte mare, în mustul proaspăt sau intrat în fermentație, reprezentând 90 – 95% din totalul drojdiilor. Produc, însă, cantități mici de alcool, maximum 5 – 6°. Produc o cantitate mare de acizi volatili șiesteri volatili.

Acționează bine la potențial redox ridicat, deci sunt sensibile la acțiunea SO2. Sunt rezistente la aciditatea vinurilor, dar sensibile la acțiunea taninului. Având în vedere că produc esteri care comunică vinului aromă de fruct, sunt utilizate la obținerea vinurilor destinate fabricării coniacului

Saccharomycodes ludwigii este o drojdie asemănătoare unei lămâi, având o putere de fermentare redusă, dar o mare rezistență față de SO2 și acidul acetic.

Rezistența față de SO2 este legată de proprietatea de a declanșa fermentarea la un potențial de oxidoreducere scăzut. Înaintea fermentării propriu-zise, drojdiile ridică pH-ul, ceea ce determină reducerea cantității de SO2 liber, după care începe fermentarea.

Drojdia se poate folosi pentru desulfitarea musturilor sau vinurilor sau pentru creșterea pH-ului. Refermentarea vinurilor dulci puternic sulfitate se poate datora activității acestei drojdii. În practica curentă, dezvoltarea acestei drojdii comunică vinurilor un buchet dezagreabil, oțețit, datorită conținutului ridicat de esteri volatili. Drojdiile aparținând genului Saccharomycodes sunt considerate dăunătoare mai ales pentru vinurile dulci conservatecu SO2, până la 1000 mg/l SO2 total și 100 mg SO2 liber/l.

Candida vini (Mycoderma vini), Candida mycoderma (Rees) Loddler și Van Rij, împreună cu alte drojdii ale genului Candida sunt denumite „drojdii de floare”, deoarece produc „floarea vinului”, caracterizată prin formarea unei pelicule la suprafața vinului. Drojdii peliculare mai sunt și cele din genul Pichia. Dezvoltarea drojdiilor Candida depinde de: concentrația vinului în alcool <12% volume alcool); aciditatea redusă a vinului; temperatură (24 … 26°C).

Într-un vin cu 5-6° alcool, după 24 ore, în vase deschise (prezența aerului) se formează o peliculă de culoare alb-albăstruie, care se îngroașă în fiecare zi, devenind de culoare galben-murdar. Drojdia asimilează alcoolul ce este oxidat la acetaldehidă și acid acetic, care apoi sunt descompuse la CO2 și H2O.

Sunt degradați parțial și acizii volatili. După consumarea alcoolului, drojdiile distrug și acizii vinului, mai întâi cel malic și pe urmă cel tartric. Floarea vinului, în general, precede boala oțețirii vinului, iar fermentația manitică poate să se declanșeze înainte de apariția florii.

Pichia vini, Pichia membranafaciens, Pichia fermentans au capacitatea de a forma voal la suprafața mustului și vinului, de culoare cenușie-alburie, cu zbârcituri. Aceste drojdii conduc la scăderea concentrației în alcool a vinului și la creșterea acidității volatile a acestuia, putând imprima un miros neplăcut datorită acetatului de arnil. Sunt considerate drojdii dăunătoare.

Brettanomyces intermedius (Brettanomyces vini, schanderlil) se întâlnește în must și în vin. Deși poate produce 8° alcool, drojdia este considerată ca dăunătoare, deoarece produce și mult acid acetic (- 2,4 g/l).

Se întâlnește în vinurile bolnave de floare, conferind vinurilor și iz de urină de șoareci, datorită producerii de acetamidă. De regulă, boala apare la vinurile albe de masă, albe sau roșii de desert sau șampanizate. Defectul poate fi prevenit prin realizarea la timp a pritocurilor, prin cupajare cu vinuri mai acide sau prin adaos de acid tartric sau citric. Vinul bolnav nu-și mai găsește utilizare.

Drojdiile care intervin în fermentarea mustului pot produce în vinurile respective, în special la cele tinere, defectele prezentate în cele ce urmează.

Miros și gust de hidrogen sulfurat și de mercaptan. Defectul apare la vinurile tinere, rezultate din musturi care în timpul fermentației au venit în contact cu sulf, sulfați, sulfuri. Aceste substanțe sunt atacate de drojdii, iar sulful pătrunde în celule în care este redus enzimatic la H2S. Din celule, H2S este eliminat în vin.

Vinul care prezintă acest defect are gust și miros de ouă clocite (H2S) sau de usturoi (mercaptani) sau un miros amestecat datorită celor două substanțe.

Gust de drojdie stătută. Acest defect se întâlnește la vinurile care au stat mult timp pe drojdia care a fermentat alcoolic mustul și este evident când drojdiile au suferit procesul de autoliză. Are loc și o tulbureală proteică a vinului. Drojdiile autolizate favorizează în continuare dezvoltarea bacteriilor din vin, care pot produce îmbolnăviri sau defecte la vinuri.

14.3.3. Mucegaiurile

Mucegaiurile care prezintă interes în industria vinului, mai ales, prin defectele ce le produc, sunt descrise în continuare.

Mucor racemosus Fresenius infectează strugurii în caz de ploaie și în felul acesta cantități mari de spori ajung în must. Dacă, din diferite motive, mustul nu a intrat în fermentație, fn mustse formează așa-numitele „drojdii Mucor”, care se înmulțesc prin înmugurire ca și drojdiile. În acest caz se produce o slabă fermentație alcoolică·(4 – 5% volume alcool). La fermentarea mustului se produc și acizi organici (oxalic, succinic) și glicerină.

Mucor mucedo, dezvoltat pe struguri sau în vasele de lemn folosite pentru transportul sau depozitarea vinuri lor și care nu au fost bine curățite și dezinfectate, poate să imprime vinului miros de mucegai. Vinurile cu tărie alcoolică mai mare vor evidenția mai pregnant mirosul de mucegai (uleiul eșențial responsabil de miros de mucegai este mai solubil în alcool). Taninul, de asemenea, evidențiază mirosul de mucegai.

Rhizopus nigricans se dezvoltă în special pe strugurii vătămați. Sporii ajunși în must pot produce până la 2% alcool și diverși acizi organici (succinic, fumaric, acetic, gluconic, oxalic). Fiind mai sensibil la alcool, mucegaiul dispare rapid din mustul care fermentează.

Aspergillus glaucus și Aspergillus niger sunt, în general, mucegaiuri de pivniță, dar pot determina și fermentarea oxidativă a zaharurilor, conducând la formarea de acizi organ ici. Cele două mucegaiuri pot produce și fermentația alcoolică a zaharurilor.

Penicillium glaucum este tot un mucegai de pivniță, dar se poate dezvolta pe strugurii copți al căror must capătă un gust amar. Mucegaiul dezvoltat pe vasele vinicole (impregnează doagele), în timpul formării de conidii, secretă esteri cu gust și miros de mucegai care pot fi transmiși vinului.

Oidium lactis – fung imperfect – poate infecta mustul de struguri, dezvoltându-se la suprafață sub forma unui strat de floare. Fiind sensibil la concentrații de alcool mai mari de 1%, dispare rapid din mustul în fermentație.

Dematium pullulans formează în must celule izolate, înmugurite, care se aseamănă cu drojdiile adevărate (drojdii Oematium). Acestea nu sunt altceva decât oidii care pot realiza o fermentare alcoolică a mustului, în timpul căreia se formează aldehidă acetică, acid lactic, succinic,gluconic, oxalic, acetic etc. împreună cu unele bacterii produce boala băloșirii vinului.

Botryotinia fuckeliana (De By) Wetzel, cunoscut și sub denumirea de Botritis cinerea, poate fi considerat ca un mucegai util și neutil. Mucegaiul este util, pentru că poate produce stafidirea strugurilor, concentrația în zahăr putând ajunge la 500 g/l, vinul obținut din asemenea struguri fiind un vin licoros, uleios, parfumat, cu gust caracteristic. Mucegaiul este neutil (dăunător) deoarece consumă acizii organici tartric și malic, fermentează zaharurile cu formare de glicerină și dextran (β-glucanul Botritis) care mărește vâscozitatea mustului. Mucegaiul consumă substanțele cu azot solubile, determinând, deci, o reducere a vitezei de fermentație a mustului de către drojdii.

Sunt atacate și substanțele de aromă din struguri, astfel că vinul rezultat nu mai are „buchetul” soiului ci un „buchet” particular. Mucegaiul secretă numeroase enzime, mai importante fiind:

oxidoreductazele (polifenoloxidazele), care fac ca vinurile obținute din strugurii atacați să fie predispuse la casa oxidazică (casa brună sau casa oxidazică), la vinurile care vin în contact cu aerul. Sunt afectate atât vinurile albe cât și cele roșii, vinurile albe căpătând culoare galbenă, care trece la brun-negru, iar cele roșii se brunifică și se tulbură. La suprafața vinuri lor albe, în contact cu aerul se formează o pată irizantă, iar în masă vinul se tulbură, după un timp limpezindu-se ca urmare a depunerii precipitatului. La vinurile roșii, după depunerea sedimentului (în cantitate mai mare decât la vinurile albe), culoarea brună se diminuează, vinul căpătând o culoare spălăcită, spre roz.

Gustul și mirosul vinurilor sunt modificate, apărând „buchetul” de „maderizat”, de „fiert”, caracteristic vinurilor de tip oxidativ (Madera, Marsala, Heres). Acest „buchet” fiind consecința unei oxidări rapide, nu este bine armonizat ca în, cazul unei învechiri normale, de durată;

hidrolazele (enzimele pectolitice, celulazele, enzimele proteolitice), care nu ar avea rol negativ în must, ci mai degrabă un rol pozitiv, dar acțiunea lor pozitivă este surclasată de acțiunile negative ale mucegaiului.

14.4. Folosirea culturilor de drojdii indigene

Fermentația spontană a musturilor are loc sub influența drojdiilor care provin de pe struguri, deci nu are loc datorită unei singure specii, ci datorită unui ansamblu de specii a căror evoluție este dependentă de concentrația în alcool.

Fermentația spontană este declanșată de drojdiile apiculate (în special Kloeckera apiculata) care produc – 4 % volume alcool și al căror număr reprezintă în această etapă circa 70 – 80% din totalul drojdiilor din mustul în fermentare.

După declanșarea fermentației încep să predomine drojdiile eliptice (Saccharomyces ellipsoideus), ce pot produce – 16% alcool în volume, și care în plină fermentație alcoolică reprezintă – 90% din totalul drojdiilor, dar încep să scadă numeric când concentrația în alcool ajunge la 10- 11 % volume alcool.

În finalul fermentației acționează și drojdiile Saccharomyces ovitormis care formează – 18% volume alcool și chiar mai mult (-20%), când se adaugă și zahăr în mod treptat. Celelalte specii de drojdii, care au fost amintite anterior, au o participare minoră la fermentația mustului, acțiunea lor fiind evidentă, în sens negativ, când strugurii nu sunt sănătoși.

Această fermentație spontană, din punct de vedere al originii drojdiilor și al succesiunii speciilor în cursul desfășurării ei, poate să fie controlată și dirijată în două moduri:

prin folosirea de culturi de producție de drojdii indigene;

prin utilizarea de culturi starter de drojdii (inocul) sub formă de culturi starter de producție sau culturi starter concentrate.

Avantajele folosirii celor două tipuri de culturi .sunt următoarele:

se înlătură întârzierea fermentației ca urmare a unei sulfitări cu doze mari de SO2 impusă de starea recoltei;

se modifică numeric și calitativ microflora levurică din must, ceea ce face ca fermentarea să fie mai rapidă și mai completă.

14.4.1. Culturi de producție de drojdii indigene

În scopul obținerii culturilor de producție de drojdii indigene, cu câteva zile înainte de începerea campaniei de vinificație, se culege o cantitate de – 1500 kg struguri ·sănătoși curați, copți, din care se obțin – 1200l must. Circa 100 l must se sulfitează la nivel de 5 – 10 g SO2/hl și se lasă în repaus 10 – 12 ore, într-un loc răcoros, pentru depunerea suspensiilor. Mustul limpede este trecut într-un vas care se plasează într-o lncăpere la o temperatură care favorizează fermentarea alcoolică. Datorită acțiunii de selecție exercitată de SO2, fermentația este realizată în special de drojdiile eliptice. În momentul în care fermentația s-a declanșat, se adaugă treptat restul de must (1100 l), care la obținere a fost sulfitat cu 30 – 40 g SO2/hl. După 2 – 3 zile de fermentare se obține cultura primară (-12 hl), care este folosită în proporție de 3% pentru însămânțarea unor șarje mai mari de must sulfitat, din care, în continuare, după 2 – 3 zile de fermentare (cultura secundară) se folosesc cantități corespunzătoare pentru însămânțarea unei șarje mai mari de must în prealabil sulfitat și lăsat un oarecare timp pentru ca SO2 să acționeze (cultura de producție). Această ultimă cultură este considerată ca o cultură de producție și este folosită pentru însămânțarea.partidelor de must pentru fermentare în vederea obținerii de vinuri.

În cazul vinificației în roșu, după 3 – 4 ore de la umplerea cu mustuială, se efectuează un remontaj de 15 – 20 min, în cursul căruia se adaugă 2 – 3% cultură de producție ce se va răspândi în masa mustuielii.

14.4.2. Culturi starter (inocul) de drojdii pentru vinificație

Culturile starter de drojdii se obțin prin selecționarea celor mai va drojdii din punct de vedere al însușirilor de fermentație.

Obținerea culturilor starter (inocul) implică izolarea drojdiilor din habitatul lor natural și multiplicarea lor pe medii nutritive adecvate (must de struguri, must agarizat etc.).

Formele sub care sunt comercializate aceste culturi starter (inocul) de drojdii sunt:

culturi starter în mediu lichid;

culturi starter pe mediu.solid de gelatină sau geloză;

culturi starter liofilizate (drojdiile se liofilizează împreună cu mediul lor de protecție).

Principalele culturi starter (inocul) de drojdii sunt:

cultura starter de Saccharomyces ellipsoideus;

cultura starter de Saccharomyces oviformis;

cultura starter de Saccharomyces pombe.

Prima cultură este utilă la folosirea strugurilor avariati; a celor proveniți din podgorii noi la care nu s-au stabilizat specii de drojdii valoroase, la obținerea vinurilor spumante și ori de câte ori se aplică sulfitarea (cele două operații sulfitarea și însămânțarea completându-se reciproc).

A doua cultură este necesară pentru completarea fermentării. În această direcție, amintim faptul că la obținerea vinurilor roșii cu 13 – 14% volume alcool, în faza tumultoasă acționează Saccharomyces ellipsoideus și durează 7 – 8 zile, în acest timp zaharurile fiind transformate în cea mai mare parte în alcool.

Fermentarea lentă (faza a treia) este continuată de Saccharoyces oviformis, care transformă restul de zaharuri în alcool. Această fază începe de obicei, după tragerea vinului de pe boștină și accelerarea ei poate fi realizată prin adaos de cultură starter de producție de Saccharomyces oviformis, astfel încât practic, faza a treia de fermentare urmează (sau se confundă) fermentației tumultoase.

Cultura de producție se poate adăuga chiar de la începutul fermentării, cu condiția ca raportul dintre Saccharomyces oviformis și Saccharomyces ellipsoideus să fie 10:1, sau se poate adăuga în momentul în care vinul a ajuns la 10% alcool (în volume).

A treia cultură (inocul) este necesară pentru că are capacitatea de a utiliza dezacidificarea biologică, fără ca zahărul să fie fermentat. Această cultură este recomandat a fi folosită pentru dezacidificarea musturilor care urmează a fi concentrate.

Pentru a fi utilizate în producție, culturile starter de producție se pregătesc din inocul, prin metoda pasajelor multiple, ca și în cazul culturilor din industria laptelui. Se pot folosi și culturi starter concentrate, care se conservă prin congelare sau, cel mai bine, prin uscare. Cultura starter concentrată conține ~3×1010 drojdii/g și este păstrată sub atmosfera de CO2 sau N2. Înainte de folosire, aceste culturi concentrate se rehidratează în amestec apă/must sau într-o soluție 10% zahăr, rehidratarea făcându-se în raport 1/10. Culturile concentrate se folosesc direct în producție (fără executare de pasaje).

Dintre culturile starter concentrate se amintesc cele comercializate de Begerow prin firma Biami Internatinal Avrig – Sibiu și anume:

Siha Aktiv 3, care conține Saccharomyces cerevisiae WET – 3, recomandată pentru toate utilizările;

Siha Aktiv 4, care conține Saccharomyces bayanus CH-158, recomandată pentru vinurile spumante și anume pentru fermentarea a doua la tanc sau sticle;

Siha Aktiv 5 – Agglocompact, care conține Saccharomyces bayanus sub formă granulată și care este recomandată pentru vinurile spumante, cu fermentarea secundară la sticle;

Siha Aktiv 7, care conține Saccharomyces cerevisiae 0-176, recomandată la fabricarea vinului Rieskling (alb);

Siha Aktiv 8, care conține Saccharomyces cerevisiae WF-748, recomandată pentru fabricarea vinurilor roșii tip Burgundia;

Siha Varioferm, care este un amestec de sușe de Saccharomyces cerevisiae și care se recomandă a fi utilizată la obținerea vinurilor albe și roșii, precum și pentru finalizarea fermentării incomplet fermentate;

Siha Aktivferm – Primo, care se recomandă a fi utilizată pentru fermentarea musturilor în condiții dificile, precum și pentru fermentarea vinurilor incomplet fermentate;

Siha Aktiv Cryarome, care se recomandă la fermentarea la rece a mustului, în vederea obținerii de vinuri fine, vinuri aromate.

14.5. Fermentații care au loc la producerea vinului

Ferment atia alcoolică

Fermentarea mustului cuprinde trei etape: prefermentativă, de fermentare tumultoasă și postfermentativă.

Prima etapă durează până la degajarea CO2 din toată masa mustului. În această etapă, mustul se tulbură, temperatura crește cu 1 … 3°C, conținutul de glucide scade. CO2 format se dizolvă parțial în must, iar apoi se degajă, la suprafața lichidului, acumulându-se spumă. În această etapă, drojdiile se dezvoltă foarte mult, ajungând la 7 – 8 milioanelml. Etapa durează – 3 zile, fiind influențată de: temperatura inițială a mustului, temperatura ambiantă, doza de SO2 aplicată, concentrația de zaharuri din must, respectiv sușa de drojdie utilizată și felul fermentației (spontană sau dirijată).

Etapa tumultoasă se desfășoară de la terminarea etapei prefermentative până la scăderea degajării de CO2. Drojdiile se înmulțesc foarte mult, având activitate intensă. Temperatura lichidului ajunge la – 30°C. Prin fermentarea zaharurilor se formează alcool și CO2, care ridică tulbureala de la fundul vasului de fermentare la suprafața lichidului.

Pe parcursul etapei tumultoase, au loc ridicări și coborâri repetate ale tulburelii, ceea ce face ca fermentarea să fie accelerată. După circa 4 zile de fermentare, datorită hidrolizei enzimatice a pectinelor, tulbureala începe să se depună. Durata fermentării tumultoase este de 8 – 14 zile. Cu cât fermentarea este mai lungă, cu atât vinul este mai aromat; în general, musturile cu conținut ridicat de zahăr fermentează mai lent.

Etapa postfermentativă este o etapă de 'terrnentare liniștită, deoarece, datorită acumulării de alcool etilic,· activitatea fermentativă a drojdiilor este mult stânjenită. În această etapă, degajarea de CO2 este mult mai redusă, substanțele de tulbureală depunându-se fără reveniri în masa lichidului.

O dată cu substantele de tulbureală încep să se depună și drojdiile. Temperatura vinului scade, iar în condiții de frig se depun și sărurile tartrice. Etapa se caracterizează prin începerea limpezirii vinuri lor, care capătă însușirile lor specifice. În condiții adecvate de temperatură, la sulfitări reduse, vinurile cu un conținut ridicat de acid malic suferă fermentația malo-lactică. La anumite tipuri de vinuri, etapa postfermentativă se întrerupe, astfel încât să se asigure o anumită concentrație de zahăr în vin (vinuri demiseci, demidulci și dulci). Pentru a se obține vinuri cu mult CO2 reținut în masa acestuia, se face fermentarea la ≤16°C, în care caz vinul reține până la 1,3 g CO2/l față de un vin normal care are – 0,5 g CO2/l.

Mecanismul fermentației alcoolice. Transformarea zahărului în alcool etilic și CO2 implică o serie de reacții intermediare complexe, legate între ele, care alcătuiesc calea Embden-Meyerhof-Parnas, până la formarea acidului piruvic, acesta fiind apoi transformat în alcool etilic și CO2 printr-o altă serie de reacții catalizate tot enzimatic (figura 14.68).

Figura 14.68. Mecanismul biochimic al fermentației alcoolice

Fermentarea alcoolică este asigurată de drojdii a căror dezvoltare în must este dependentă de diferiți factori, care sunt prezentati în continuare.

Temperatura. Intensitatea procesului de fermentație crește până la temperatura de 35°C, după care scade. Chiar și sub 35°C, fermentația este limitată, în vin rămânând zahăr nefermentat. Numărul de drojdii formate este cu atât mai mare cu cât temperatura este mai redusă.

Presiunea osmotică. Presiunea osmotică a mustului de struguri nu este jenantă pentru drojdiile de fermentare. Rezistența osmotică a drojdiilor prezintă importanță în special la prepararea vinurilor de desert bogate în alcool sau la prepararea vinurilor din struguri stafidiți, la fabricarea vinurilor licoroase.

Potențialul de oxidoreducere. Potențialul mustului proaspăt este +325,6 mV. Datorită prezenței substanțelor oxidabile, el crește în prezența aerului și se stabilizează la valoarea +473,3mV. În timpul fermentației alcoolice, potențialul de oxidoreducere scade după 30 de zile de la începerea fermentației la +60mV. La un potențial de oxidoreducere scăzut, înmulțirea drojdiilor și fermentarea decurg lent Acțiunea inhibitoare a SO2 este în strânsă legătură cu potențialul redox. În fapt, esența tehnicii sulfitării constă în efectuarea fermentării musturilor în prezența unui conținut redus de oxigen (oxigenul din must oxidează acidul sulfuros), adică la un potențial de oxidoreducere scăzut în acest fel se elimină microorganismele care se dezvoltă în prezența aerului (bacterii lactice, droidii sălbatice, mucegaiuri), în timp ce drojdiile adevărate sunt împiedicate să consume zahărul prin respirație și, folosind respirația intramoleculară, produc fermentația alcoolică.

Nivelul de azot din must. Drojdiile care fermentează mustul de struguri au la dispoziție azot asimilabil (50 – 70% din azotul mustului este azot asirnilabil) format din azot amoniacal, aminoacizi, amide, peptide, peptone.

Conținutul de azot asimilabil prezintă importanță la dezvoltarea bacteriilor, în special la vinurile cu aciditate scăzută. Astfel, bacteriile malo-lactice folosesc ca sursă de energie și azotul ușor asimilabil.

Concentratia de CO2 și O2. CO2 inhibă dezvoltarea drojdiilor de la concentrația de 0,2'S g CO2/l. În prezența O2 are loc o inhibare a fermentației și o creștere a respirației (Efectul Pasteur).

Acizii volatili. Acizii volatili (formic, acetic, propionic, butiric, lactic) au acțiune inhibitoare asupra drojdiilor care, atunci când este cuplată cu temperatura scăzută, contribuie la întreruperea fermentației. Așa se explică de ce musturile care au suferit fermentații bacteriene nu mai pot fermenta alcoolic.

pH-ul. Mustul de struguri are pH = 2,8 – 3,8; deși drojdiile se dezvoltă bine la pH = 4 – 6, chiar la pH-ul mustului ele se dezvoltă bine. La un pH < 2,8, fermentația alcoolică este mult încetinită, dezvoltarea drojdiilor fiind inhibată. Variații în aciditatea mustului conduc la variații în formarea de produși secundari, în special glicerol..

Substanțele tanante. În cantitate mare, aceste substanțe pot opri fermentația alcoolică prin împiedicarea înmulțirii drojdiilor. Așa se explică de ce vinurile puternic taninate nu fermentează niciodată complet. Atâta -tirnp cât drojdiile sunt tinere ele pot acționa, dar pe măsură ce îmbătrânesc fixează taninul pe membrană, împiedicându-se astfel schimbul osmotic.

Alcoolul etilic. Inhibă drojdiile în funcție de concentrație, dar și în funcție de specia de drojdie și de vârsta acesteia. Saccharomyces ellipsoideus suportă concentrații mari de alcool (17-18%), în timp ce Saccharomyces epicuietis suportă numai concentrații de – 5%. Dacă se adaugă alcool în mustul aflat în plină fermentație, cu Saccharomyces ellipsoideus, are loc o întrerupere a acesteia, apoi aceasta pornește lent și continuă până la atingerea concentrației de la 16 – 17% alcool și chiar la 18%.

Sărurile minerale. Mustul conține cantități adecvate de săruri minerale pentru desfășurarea normală a fermentației alcoolice. Prin îmbogățirea excesivă a mustului cu fier și cupru se ajunge la scăderea vitezei de fermentare și a puterii alcooligene, iar vinurile obținute sunt incomplet fermentate, fiind instabile din punct de vedere microbioioqic și fizico-chimic. Aceste vinuri sunt predispuse oxidărilor excesive în timpul conservării, ceea ce conduce la degradarea lor din punct de vedere senzorial.

În prezența oxigenului, potențialul redox al acestor vinuri crește brusc și determină apariția caselor ferice.

Prezența fierului și a cuprului peste limitele normale în vinurile care urmează a fi șampanizate jenează drojdia, în procesul de fermentare sub presiune crescândă în recipiente, prin valoarea ridicată a potențialului redox.

Existența sistemului redox cu valoare ridicată împiedică formarea „buchetului” specific șampaniei, precum și formarea „buchetului” de învechire la sticlă al vinurilor.

În tehnologia de fabricare a vinurilor este, deci, necesară evitarea unui conținut ridicat de fier și cupru, atât în mustul ce urmează a fi fermentat cât și în vinul ce urmează a se conserva și învechi sau în cazul vinuri lor ce urmează a fi șampanizate.

Influența negativă și, uneori, pozitivă a acestor metale trebuie înțeleasă prin modificarea potențialului redox în timpul fermentării, care influențează metabolismul drojdiei și, ulterior, în celelalte faze de dezvoltare a vinuri lor, când influențează stabilitatea, maturitatea, învechirea și calitățile senzoriale ale vinurilor.

Produși secundari ai fermentației alcoolice. În timpul fermentației alcoolice se formează și produși secundari cum ar fi: diverși acizi organ ici (acetic, lactic, formic, malic, succinic, propionic, citromalic, dimetilgliceric); glicerol; acetoină și diacetil. Se consideră că formarea produselor secundare se încadrează în schema fermentației glicero-piruvice, a treia formă a fermentației alcoolice.

Literatura de specialitate arată că unele drojdii de vin pot asimila acizii organici caracteristici musturilor și vinurilor. Drojdiile de fermentație alcoolică pot să transforme acidul malic în acid piruvic, care intră în mecanismul fermentatiei alcoolice, acest lucru fiind posibil datorită enzimei malatdehidrogenază carboxilantă, ce intră în echipamentul enzimatic al drojdiilor de vin. Degradarea poate afecta 10 – 25% din conținutul inițial de acid malic, iar în cazul lui Saccharomyces pombei până la 90% din conținutul inițial de acid malic din must.

14.5.2. Aspecte fizico-chimice, biochimice și microbiologice ale vinificării strugurilor roșii

Fermentația pe boștină

În tehnologia de fabricare a vinurilor roșii, macerația (proces de dezvoltare și difuzie a substanțelor colorante, a taninului, a celor care constituie extractul vinului și a substanțelor de aromă) are loc o dată cu fermentația alcoolică (în limbaj oenologic, procesul se numește „fermentare pe boștină”),

La fermentarea pe boștină, trebuie să se aibă în vedere că poate avea loc o adsorbție a substanțelor colorate pe pielițe, ciorchini, semințe și chiar drojdii. La macerație are loc modificarea pH-lui și a potențialului redox care antrenează după sine o transformare parțială a antocianilor în leucoantociani. La vinificația în roșu (pe boștină), circa 60 – 80% din substanțele colorate trec în vin.

Fermentația pe boștină trebuie condusă diferențiat ca timp, în funcție de diferiți factori. Când strugurii sunt supramaturați, când au aciditate redusă, când sunt bogați în tanin, când sulfitarea nu se face sau se execută cu doze mici, când temperatura de fermentare este ridicată iar vinurile sunt de consum curent, a căror ameliorare calitativă este redusă la maturare (învechire), fermentarea pe boștină este scurtă.

Când strugurii sunt mai puțin maturați, când au aciditate ridicată, sunt mai puțin colorați și taninoși, când sulfitarea a fost normală și temperatura de fermentare este mai scăzută, iar vinurile se ameliorează în mare măsură la învechire, fermentarea pe boștină este de mai lungă durată.

Termamacerația

Acest procedeu de macerație constă în încălzirea fie a strugurilor, fie a mustului, în vederea extragerii mai accentuate (până aproape de 100%) a materiilor colorate din pieliță. Cea mai adecvată metodă de macerație este cea a mustuielii obținute prin desciorchinarea și zdrobirea boabelor de struguri, la o temperatură care începe la 50°C și care este maximă la 75 … 80°C, având o perioadă de macerație la cald de 30 min, în comparație cu 4 – 5 zile la maceratia clasică, când se extrag numai – 60% din materiile colorate.

La termomacerație, comparativ cu macerația clasică, crește conținutul de azot amoniacal și aminoacidic în vin și se micșorează azotul proteic, crește conținutul de substanțe minerale și conținutul de acid tartric.

Comportamentul echipamentului enzimatic al strugurilor este diferit la termomacerație:

enzimele pectolitice sunt inactivate și din această cauză vinurile sunt tulburi și se limpezesc greu, deci trebuie utilizate preparate enzimatice exogene, sau se amestecă 60% mustuiala termomacerată cu 40% mustuială clasică;

enzimele oxidazice sunt împiedicate în activitatea lor atât prin sulfitarea moderată (40 g SO2/hl) cât și datorită temperaturii de macerare de – 70 … 80°C.

Inactivarea enzimelor oxidazice, mai ales a celor din strugurii avariați de mucegaiuri (se distrug lacaza și tirozinaza fungică la 70°C/30 min), este benefică pentru păstrarea vinurilor (nu se mai casează oxidazic). Dacă se aplică combinația sulfitare/temperatură, atunci termomacerația se poate face la temperaturi mai reduse.

Microorganismele din mustuiala termomacerată sunt, în general, distrusă, dar mustul se reînsămânțează spontan cu drojdii (se pot adăuqa și sub formă de culturi starter), astfel că fermentația aicoolică decurge bine, și chiar mai repede, datorită potențialului mai ridicat al mvstului în substanțe nutritive.

Și bacteriile malo-lactice acționează mai bine din două motive: potențialul nutritiv mai ridicat al mustului; pH-ul mai ridicat.

Dacă fermentația malo-lactică întârzie, este necesar să se adauge vin aflat în plină fermentație malo-lactică. Macerația la cald este consumatoare de energie și, deci, influențează costurile de producție.

Macerația carbonică

Aceasta constă în menținerea strugurilor nezdrobiți într-o primă fază, în recipiente ermetice, sub presiune de CO2. Se impune ca strugurii să fie introduși la macerare cât mai întregi posibil și să fie sulfitați la un nivel de 4 – 8 g SO2/100 kg struguri.

Datorită prezenței CO2 în incinta ermetică, acesta difuzează în boabele de struguri care trec într-o fază anaerobă. În interiorul boabelor, la nivel celular, are loc o fermentație alcoolică slabă (1,5 – 2% alcool) însoțită și de formarea de produse secundare (glicerol, acetaldehidă, acid acetic, succinic). Această etapă durează 6 – 10 zile și se desfășoară la 30 … 35°C. Fermentația alcoolică intracelulară este însoțită și de o degradare enzimatică a acidului malic printr-un mecanism care implică enzimele malic-dehidrogenaza și oxalacetat decarboxilaza, când se formează acid piruvic, al doilea mecanism fiind cel la care participă enzimele malic-decarboxilaza, piruvat decarboxilaza și alcooldehidrogenaza, produsul final fiind acidul acetic (se degradează până la 40% din cantitatea inițială de acid malic).

Datorită acțiunii enzimelor pectolitice din pieliță (PME) are loc permeabilizarea mai accentuată a acesteia, astfel că se favorizează schimbul de substanțe cu exteriorul, dar și trecerea unor substanțe din pieliță și pulpă (in special substanțe colorate/colorante).

De remarcat că din cantitatea totală de struguri introduși la macerația carbonică, numai circa 20% rămân intacți și suferă fermentație alcoolică intracelulară, circa 20% din struguri sunt striviți și, deci, mustul eliberat suferă o fermentație alcoolică sub influența drojdiilor care alcătuiesc o parte din microflora spontană, iar circa 60% din struguri suferă ambele tipuri de fermentații. În mustuiala produsă sub influența bacteriilor lactice specifice, ambele fermentații pot fi realizate și cu ajutorul culturilor de drojdii și bacterii.

Fermentațiile vinului ravac au loc la 15 … 20°C, timp de circa 48 de ore; în final vinul se trage de pe drojdii și se tratează corespunzător pentru maturare. La macerația carbonică au loc următoarele procese mai importante:

creștere a concentrației de acid succinic;

scădere a concentrației de acid malic și o menținere la nivel constant a acidului tartric;

scădere a azotului total și amoniacal și o creștere a azotului aminic;

creștere a nivelului de polifenoli în pulpă, ca urmare a difuziei din pieliță.

Culoarea și cantitatea de substanțe polifenolice dintr-un vin de macerație carbonică sunt dependente de temperatura și de durata fazei de fermentare intracelulară. Vinurile de macerație carbonică au o aciditate mai scăzută (totală și volatilă) și nu mai păstrează aroma caracteristică soiului.

Se recomandă ca macerația carbonică să se aplice În zonele calde,
precum și În cazul strugurilor avariați de mucegaiuri.

Fermentatia malo-lactică a vinurilor

În vinificație, anumite bacterii lactice, cum ar fi Leuconostoc oenes, Lectobacillus plantarum, Pediococcus parvulus, Pediococcus vini, Streptococus malolactis, Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc gracile, sunt capabile să fermenteze acidul malic cu transformarea acestuia în acid lactic și CO2. În cazul lui Leuconostoc oenes, gradul de transformare este foarte ridicat și anume între 75 și 96%.

Se consideră că bacteriile malo-lactice necesită pentru dezvoltare un factor de creștere care este 4'-0 (β-D-glucopiranozil)-D-(R)-acidul pantotenic (factorul TJ).

Acest factor se găsește în mod natural în struguri, dar și în alte produse cum ar fi portocalele, lămâile, pepenii.

Activitatea factorului crește dacă se întârzie recoltarea strugurilor și dacă fermentarea alcoolică începe imediat după obținerea mustului. Dezvoltarea bacteriilor malo-lactice în vin și metabolismul lor depind de aciditatea vinului. La pH < 3,5, Leuconostoc oenes, bacteria lactică cea mai frecvent întâlnită și cea mai importantă în vinificație, este singura care rezistă și, în afară de fermentatie malo-lactică, degradează și acidul citric și fumaric cu formare de acid acetic. În același timp utilizează arginina, histidina și acetaldehida. În schimb, specii de Lactobacili și Pediococi au fost izolate din vin cu pH = 3,5 sau mai mare și pot metaboliza acidul malic, dar nu pot utiliza acidul citric și fumaric și nu produc acetat.

Având în vedere că aciditatea totală a vinurilor (aciditatea titrabilă) este dată în principal de acizii tartric, malic, citric, citromalic, lactic, succinic, oxalic, glioxalic, glicolic, oxiglutaric, sub formă liberă, dar mai ales sub forma sărurilor acide, și că această aciditate variază între 3,0 și 6 g H2SO4/l (exprimare ca H2SO4), respectiv 60 – 120 mVal/l, în cazul vinurilor cu aciditate mică <3 g/l), fermentația malo-lactică nu este de dorit, deoarece se influențează negativ calitatea vinurilor.

Vinurile mai bogate în alcool sunt mai puțin acide, deoarece alcoolul determină o precipitare a bitartratului de potasiu, care constituie o parte importantă a acidității vinurilor.

Aciditatea totală a vinurilor scade în perioada păstrării lor datorită:

fermentării malo-lactice;

precipitării bitartratului, accentuată de păstrarea la rece a vinurilor;

esterificării acizi lor.

Fermentația malo-lactică trebuie luată, deci, în considerație în special la vinurile roșii, mai ales dacă acestea provin din strugurii care nu au fost bine copți și au aciditate mare. În acest caz, fermentația malo-lactică trebuie să aibă loc concomitent cu macerarea și fermentația alcoolică. Dacă tragerea vinului de pe boștină are loc prea devreme (circa 6 zile de macerare) și se execută și sulfitarea, se împiedică declanșarea și desfășurarea fermentației malo-lactice până în primăvara următoare, ceea ce este un lucru negativ pentru stabilitatea biologică a vinului.

Se poate executa scurqerea-mai rapidă a vinului de pe boștină fără a se împiedica fermentația malo-lactică, dacă se evită scăderea temperaturii și dacă se realizează amestecarea acestuia cu unvin rezultat din mustul de la presare.

La vinurile albe, cu aciditate moderată, datorită sulfitării mai puternice, fermentația malo-lactică este mai puțin frecventă, dar și mai puțin căutată, deoarece, determinând micșorarea acidității, vinurile își pierd din prospețime și fructuozitate, devenind plate, gustul normal al vinului fiind acoperit de acidullactic.

La vinurile albe cu aciditate mare (pH < 3,0), dacă este necesară dezacidifierea, aceasta se realizează inițial pe cale chimică, iar dacă se face și dezacidifiere prin fermentație malolactică, aceasta se poate executa chiar și în faza de must. La vinurile aibe, se recomandă și fermentarea cu drojdii din genul Schizosaccharomyces, care au capacitatea de a degrada și acidul malic, cu condiția ca aceste drojdii să fie inactivate și eliminate după terminarea fermentației, deoarece în caz contrar imprimă vinului gust de H2S și mercaptani.

Mecanismul fermentării malo-lactice

Acidul malic este metabolizat la acid lactic de către bacteriile lactice care posedă enzima malo-lactică. Această enzimă este o malat-decarboxilază care necesită NAD+ (fără a fi redus) și Mn2+ Enzima este specifică lui Leuconostoc oenes și transformă acidul malic în acid lactic.

În afară de această enzimă, Lactobacillus plantarum și alți lactobacili, în prezența malatului se induce o altă enzimă numită enzima malică, care degradează acidul malic, aceasta fiind o malat-decarboxilază care produce piruvat și CO2 și care necesită NAD+ ce este redus:

În primul caz, Leuconostoc oenes necesită un glucid (glucoză) ca sursă de energie, iar în al doilea caz (Lactobacillus plantarum) sursa de energie este chiar acidul malic.

Factorii care influențează fermentația malo-lactică

Fermentația malo-lactică poate fi influențată prin următorii factori, care pot fi utilizați de producătorii de vin separat sau în combinații diverse: pH scăzut, conținut ridicat în alcool, temperatură de depozitare scăzută, conținut ridicat de SO2, îndepărtarea rapidă a vinului de pe boștină (la vinurile roșii), clarificare timpurie, pasteurizare, filtrare sterilă, folosire de agenți bacterieni alături de SO2, folosire de tulpini de drojdie care produc fermentație alcoolică cât mai pură.

În continuare, se vor prezenta cei mai importanți factori de influență asupra fermentației malo-lactice.

Concentrația în alcool. Efectul concentrației în alcool asupra dezvoltării bacteriilor malo-lactice este în funcție de specie, conținutul în azot al vinului și de pH. Prin creșterea conținutului în alcool se inhibă dezvoltarea bacteriilor malo-lactice, deci se inhibă activitatea de metabolizare a acidului malic (peste 11 % alcool).

Durata de fermentare pe baștină. Bacteriile malo-lactice se dezvoltă mai bine în boștină decât în lichid, ceea ce înseamnă ca la „tragerea” timpurie a vinului de pe boștină se lntărzie fermentația malo-lactică.

Durată mai mare de fermentare pe boștină este recomandată la musturile provenite din strugurii insuficient copți, care au un conținut mare de acizi, respectiv de acid malic.

Dioxidul de sulf. SO2 acționează și ca antiseptic, acțiune care crește pe măsură ce pH-ul scade. Acțiunea antiseptică este în funcție de doza de SO2. Rezultă că, în practica de obținere a vinurilor roșii, sulfitarea trebuie astfel făcută încât la sfârșitul fermentației alcoolice să poată avea loc și fermentația malo-lactică. Vinul roșu nu trebuie tras de pe boștină atâta timp cât acesta conține acid malic, iar sulfitarea vinului trebuie să se facă după terminarea fermentației malo-lactice. Până la terminarea fermentației malo-lactice, vasele se păstrează complet pline pentru a se preveni degradarea vinurilor de către bacterii le acetice sau prin oxidări.

Temperatura de fermentare malo-lactică. Fermentația malo-lactică decurge normal (4 – 5 zile) la 20 … 25°C. La 30°C, fermentația malo-lactică este foarte rapidă și există pericolul formării de manitol din fructoză. La 15°C, fermentația malo-lactică durează 14 – 30 de zile, iar la 10 … 12°C durează câteva luni. Sub 10°C, practic, fermentația malo-lactică nu se declanșează, fiind deci necesară o ridicare a temperaturii vinului până la cea optimă fermentației malo-lactice.

pH-ul. pH-ul constituie unul din principalii factori de influență (de limitare) a fermentației malo-lactice, bacteriile malo-lactice având pH optim cuprins între 4 și 4,5, iar vinurile roșii un pH = 2,8 – 3,8. Vinurile roșii tinere (după fermentația alcoolică) au pH ≥ 3,3, deci sunt încă susceptibile de a fi fermentate malo-lactic, deci există posibilitatea ca aceste vinuri să-și piardă din calitatea senzorială și să devină „plate” și puțin rezistente la acțiunea bacteriilor dăunătoare. Vinurile cu aciditate mare (pH < 3,0), între care pot intra și vinurile albe, se recomandă a fi fermentate malo-lactic pentru a deveni mai catifelate. În acest scop, ele se dezacidifică inițial pe cale chimică (cu CaCO3 în cantitate de 50 – 100 g/hl) pentru a aduce pH-ul la pragul minim în care se poate declanșa fermentația malo-lactică (pH ≥ 3,3).

Acidul fumaric. Este considerat agent antibacterian, deci inhibitor al fermentației lactice (prin scăderea pH-ului și datorită acțiunii bactericide). La nivel de 0,8 9 acid fumaric/l, fermentația malo-lactică este întărziată atât la vinurile roșii cât și la cele albe. La nivel de 1 – 1,5 g/l, fermentația malo-lactică este împiedicată timp de un an.

Acidul fumaric nu inhibă competitiv sau necompetitiv enzima malo-lactică și nici permeaza, ci acționează asupra dezvoltării bacteriilor malo-lactice cu cât mai eficace cu cât pHul vinului este mai scăzut (efect bactericid). Atunci când fermentația malo-lactică are loc în prezența de acid fumaric, acesta este degradat până la acid lactic.

Acidul fumaric se recomandă să fie adăugat la vinurile tinere și nu în must, deoarece ar fi consumat de drojdii în proporție de 90%.

Legumele și fructele sunt produse alimentare de origine vegetală. Datorită valorii nutritive, calităților gustative și a gradului ridicat de asimilare de către organismul uman, ele sunt recomandate și utilizate pe scară largă în alimentație, în stare proaspătă sau conservată.

Caracterizarea nutritivă a legumelor și fructelor proaspete

Locul important ocupat de aceste alimente în hrana omului este determinat de faptul că ele constituie importante surse de glucide, vitamine, săruri minerale și alte substanțe formate în procesul de fotosinteză și care au un rol benefic pentru organism.

Legumele și fructele proaspete au un conținut ridicat de apă (75-95%) care le conferă starea de frăgezime și prospețime pe tot circuitul tehnico-economic.

Glucidele existente în proporție de 75% din substanța uscată sunt reprezentate în mare parte de zaharuri simple, ușor asimilabile (glucoză, galactoză, fructoză), de amidon (cartofi), celuloză și hemiceluloză (în coajă). Poliglucidele existente favorizează digestia și asimilarea și contribuie la reglarea tranzitului intestinal.

Prezența glucidelor simple în legume și fructe contribuie la scurtarea perioadei de păstrare a acestora în rețeua comercială, deoarece zaharurile simple sunt substanțe organice ușor descompuse de enzimele proprii sau de cele ale microorganismelor care se găsesc pe coajă, rezultînd modificări biochimice nedorite.

Aproape toate legumele și fructele conțin cantități importante de vitamine: vitamina A, vitamina C (pentru care legumele și fructele sunt sursele naturale de bază), B1, B2, vitamina P și acid pantotenic; de asemenea, unele conțin și vitaminele liposolubile E și K, provitamina D, vitamina B6 etc. Cele mai bogate surse de vitamina C sunt: fructele citrice, cătina, măceșele, coacăzele negre, ardeiul, guliile, salata verde, legumele vărzoase, căpșunile și altele.

Conținutul de vitamine din legume și fructe este influențat în timpul păstrării de acțiunea oxigenului și de temperatură, înregistrîndu-se pierderi în cantități variabile.

Legumele și fructele sunt surse importante și pentru unele substanțele minerale (Ca, Mg, Na, K, Fe) care contribuie la menținerea echilibrului acido-bazic în organismul uman. Legumele de la care se consumă frunzele (salată, ceapă verde, pătrunjel, spanac, leuștean etc.) au un conținut mai ridicat de calciu și fier.

Acizii organici sunt alți componenți importanți ai legumelor și fructelor: acidul citric (predomină cantitativ), benzoic, succinic etc. Prezența lor influențează proprietățile gustative ale fructelor și legumelor cât și procesul de păstrare, deoarece mulți acizi organici au acțiune antiseptică, reducînd activitatea enzimatică; unii acizi (oxalic, malic) influențează negativ utilizarea calciului din hrană (îl blochează în oxalați și malați).

Proteinele se găsesc în cantități reduse, dar în forme ușor asimilabile de către organism (albumine, globuline, flavoproteide etc.).

Legumele și fructele mai conțin în cantități variabile și uleiuri eterice, fitoncide, substanțe tanante și pigmenți.

Uleiurile eterice imprimă legumelor și fructelor un miros specific, chiar la concentrații foarte mici.

Fitoncidele sunt substanțe cu efect bacteriostatic și bactericid care anihilează eventuala microfloră dăunătoare de pe traiectul gastro-intestinal.

Cele mai răspîndite fitoncide sunt: alicina (din ceapă, usturoi), sinalbina (din muștarul alb), sinigrina (în muștarul negru), tomatina (în tomate) etc.

Substanțele tanante contribuie la formarea gustului, culorii, exercitînd și o acțiune conservantă.

Pigmenții determină culorile specifice diferitelor legume și fructe. Principalii pigmenți sunt carotenul (din morcov), licopenul (pigmentul roșu din tomate, ardei etc.), clorofila (pigmentul din legumele și fructele de culoare verde), pigmenții antocianici (de culoare roșie, violetă sau albastră din struguri, sfeclă, varză roșie, mure).

Tabelul 15.36.

Principalele componente chimice din legumele și fructele consumate

În conținutul unor legume și fructe se mai găsesc și glicozide (substanțe formate dintr- un component glucidic legat de un rest neglucidic) cum sunt: solanina (cartofi, tomate verzi, vinete), amigdalina (în sîmburi de caise, vișine, prune), sinigrina (în hrean) etc. Ingerate în cantități mari, acestea pot provoca intoxicații grave.

Partea comestibilă a legumelor și fructelor diferă de la o specie la alta și poate fi reprezentată prin: rădăcină, tulpină, bulbi, tuberculi, frunze, fructe, muguri etc.

Clasificarea legumelor și fructelor proaspete

Clasificarea legumelor și fructelor se face după anumite caracteristici comune ale acestora (caracteristici botanice, compoziție, mod de utilizare etc.) (tabelul 15.37 și tabelul 15.38).

Tabelul 15.37.

Clasificarea legumelor

Legumele bulboase sunt reprezentate de ceapă, usturoi și praz. Acestea se consumă pentru bulbul bogat în substanțe nutritive cît și pentru frunze, cînd sunt tinere. Bulbul este o tulpină falsă, mult dezvoltat la ceapă și usturoi și bogat în uleiuri eterice, în fitoncide precum și în vitaminele C, E și din grupa B.

Legumele bostănoase includ castraveții, dovleceii, pepenii verzi și galbeni. Sunt bogate în glucide și vitamine (B1, B2, C, provitamina A etc.). Fructul lor se folosește cînd a ajuns la maturitatea de consum sau la cea fiziologică (pepenii).

Legume solano-fructoase: tomatele, ardeii și vinetele fac parte din aceeași familie botanică, având fructul reprezentat de bace cărnoase cu caracteristici comune. Sunt legume valoroase din punct de vedere alimentar, foarte plăcute la gust fiind consumate pe scară largă în stare proaspătă.

Legumele frunzoase se consumă pentru conținutul mare de vitamine (B1, B2, C, caroten), săruri minerale (spanacul se distinge prin frunzele sale bogate în fier) și hidrați de carbon. Din această grupă fac parte: spanacul, salatele, loboda și andivele.

Legumele păstăioase (fasole, mazăre, bame) se consumă sub formă de păstăi verzi sau boabe proaspete, uscate sau conservate. Ele au cel mai mare conținut de substanțe proteice, amidon, vitaminele B1, B2, C, provitamina A precum și săruri minerale bogate în calciu, fosfor și fier.

Legumele rădăcinoase includ morcovul, pătrunjelul, păstârnacul, țelina, sfecla și ridichile. Partea comestibilă o formează rădăcina. Pătrunjelul și țelina se cultivă și pentru frunzele puternic aromate datorită uleiurilor eterice conținute. Morcovul este considerat cea mai nutritivă rădăcinoasă datorită conținutului ridicat de caroten și vitamine.

Tabelul 15.38.

Clasificarea fructelor

Legumele tuberculifere sunt reprezentate în principal de cartofi. Cartoful reprezintă partea îngroșată a extremităților tulpinilor subterane în care se acumulează substanța de rezervă, care este în mare parte amidonul; la acesta se adaugă și unele substanțe proteice și vitamine (în special vitamina C). Cartoful constituie materia primă de bază în industria alcoolului și a glucozei. Conservat prin deshidratare, sub formă de făină de cartof, este folosit ca adaos la fabricarea pîinii, pentru gustul plăcut și prelungirea prospețimii acesteia.

Legumele vărzoase sunt valoroase din punct de vedere alimentar și se consumă pentru căpățîna lor, în stare proaspătă (ca salată), conservată prin murare sau inclusă în diferite rețete de preparate culinare. La gulii se consumă tulpina îngroșată, relativ sferică.

Legumele condimentare aparțin diferitelor familii botanice și se disting prin conținutul bogat în uleiuri eterice, fiind utilizate pentru îmbunătățirea gustului și formarea aromelor în industria culinară și cea a conservelor.

Ciupercile se deosebesc de celelalte legume prin faptul că sunt lipsite de clorofilă; corpul lor este alcătuit din miceliu, picior și pălărie și se înmulțesc prin spori. Sunt apreciate pentru valoarea lor nutritivă, respectiv conținutul în proteine, substanțe minerale (K, Fe, Ca, Mg, Na), vitamine (A, B, C, D).

15.3. Evoluția principalelor componente din fructe și legume in cursul maturării

Maturarea reprezintă un proces dinamic fiziologic-biochimic, care se materializează prin formă, mărime, greutate, pigmentație, compoziție chimică, gust și miros. Maturarea exprimă, deci, însumarea materială a modificărilor suferite de fructe și de legume în ciclul de creștere și dezvoltare și se exprimă cantitativ prin gradul de maturare.

Din punct de vedere al folosirii și acceptabilității pentru consum sau pentru prelucrare industrială, maturitatea fructelor și legumelor poate fi:

maturitate comercială (tehnică, industrială), care se referă la perioada până la încetarea creșterii și dezvoltării (de exemplu fructe verzi pentru dulceață, dovlecei în floare, mazăre verde, fasolea verde păstăi pentru conserve, fructe în pârg pentru împulpare);

maturitate de recolta re (de livadă, de câmp, sau de grădină), care se definește prin formă, mărime (volum și greutate), pigmentație.

Aceste două tipuri de maturări au loc înainte ca fructele și legumele să fie desprinse de plantele-mamă. După desprindere are loc așa-numita maturare (maturitate) de consum în stare proaspătă.

Maturarea (maturitatea) de consum se caracterizează și se definește prin fermitatea (textura) și raportul dintre componentele substanței uscate. La maturarea de consum se desfășoară procese catabolice și în această perioadă datorită, în principal, enzimelor hidrolizante, substanțele cu masă moleculară mare (amidon, pectină, proteine, tanoidele și chiar celuloza) suferă transformări care le fac mai fragede, mai suculente, mai aromate, textura pierzând treptat din fermitate. Durata maturării de consum este foarte scurtă la fructele timpurii (căpșune, cireșe, zmeură, vișine, caise, piersici, pere, prune). Maturitatea de consum pentru diverse legume se apreciază după raportul dintre diferitele componente ale substanței uscate.

După recoltare, fructele și legumele continuă să respire aerob. La fructe și legume respirația este diferită ținând cont de faptul că pot fi climacterice sau neclimacterice. La cele climacterice (avocado, banane, caise, mango, pere, mere, papaya, piersici, prune, roșii), în funcție de temperatură, absorbția de O2 scade până la minimum climacteric, apoi crește din nou până la un maximum climacteric urmat de o descreștere.

La fructele și legumele neclimacterice (ananas, castraveți, căpșune, lămâi, grapefruturi, portocale, cireșe, smokine, struguri) absorbția de O2 scade continuu după recoltarea fructelor.

Deosebirile dintre produsele vegetale climacterice și neclimacterice constă în producție de etilenă, care este mai mare la cele climacterice.

În ceea ce privește evoluția diferitelor componente din fructe și legume se fac unele precizări care sunt expuse în continuare.

Proteinele. Acestea se acumulează în perioada de creștere și dezvoltare și se diminuează la maturarea de consum sau la depozitare, datorită activității enzimelor proteolitice.

Lipidele. Se acumulează în faza de dezvoltare, după care se diminuează la maturarea de consum și depozitare, datorită activități lipazelor proprii sau sub influența microorganismelor (în special mucegaiuri), dacă păstrarea se face în condiții neadecvate de temperatură și umiditate relativă. Prin formare de acizi grași liberi crește aciditatea produselor respective, pe de o parte, și, pe de altă parte, aceștia constituie substraturi oxidabile în funcție de gradul de nesaturare, iar în final, sub influența oxigenului atmosferic, produsele devin râncede.

Cerurile. Se sintetizează pe măsura dezvoltării fructelor ca și în procesul de maturare-păstrare.

Glucidele. Zaharurile simple (glucoza, fructoza, zaharoza) se acumulează în cursul creșterii și dezvoltării fructelor și legumelor. În timpul depozitării, conținutul de zaharuri simple scade, cu excepția fructelor și legumelor care conțin amidon, din care, prin hidroliză, se formează glucide simple.

Polizaharidele din peretele vegetal al fructelor și legumelor. La fructe și legume, peretele vegetal reprezintă o organizare supramoleculară de polizaharide și alte substanțe, care evoluează în funcție de diferențierea celulelor și de îmbătrânirea țesuturilor. Organizarea structurală a peretelui vegetal se referă la:

lamela medie, care este formată din substanțe pectice. Se formează în timpul diviziunii celulare și asigură coeziunea dintre celulele vecine. Această structură este stabilizată sub formă de gel, prin asocierea lanțuri lor pectice la nivelul zonelor homogalacturonice neesterificate, interacțiune realizată prin intermediul ionilor de Ca2+;

peretele primar, care este caracteristic celulelor nediferențiate în faza de creștere. Acest perete este fin și suplu și este constituit din polizaharide în proporție de 90% și din proteine, în proporție de 10%. Acest perete posedă o tramă de miofibrile de celuloză înglobate într-o matrice amorfă, puternic hidratată, formată din pectine, xiloglucani și/sau heteroxilani;

peretele secundar, care se formează după diferențierea celulelor. În peretele secundar, celuloza formează microfibrile dispuse în straturi orientate, care conferă peretelui vegetal o mare rezistență mecanică. Acest perete secundar se poate impregna cu lignină, mai ales în cazul țesuturilor de susținere și al vaselor conductoare de sevă. Acest perete secundar este inextensibil și puțin hidrofil.

La fructe și legume, compoziția peretelui vegetal este apropiată de cea a pereților primari, ceea ce reflectă predominanța parenchimului de rezervă. Peretele vegetal de la fructe și legume are și o proporție oarecare de perete secundar, care provine din vasele conductoare (tabelul 15.39).

Tabelul 15.39.

Compoziția (% față de S.U.) peretelui vegetal al fructelor și al legumelor

Polizaharidele reprezintă fracțiunea cea mai importantă a peretelui vegetal, așa cum este evidențiat în ceea ce urmează:

Celuloza. Este un homopolimer de glucoză. Unitățile succesive de D-glucopiranoză sunt legate prin legături glucozidice β-1 ,4 Dispunerea moleculelor de glucoză în lanțurile polimerului permite formarea de legături de hidrogen intralanțuri, care stabilizează macromolecula sub formă de ruban și de legături de hidrogen interlanțuri, permițând astfel asocierea macromoleculalor în microfibrile elementare. Microfibrilele, la rândul lor, formează fibre care prezintă parțial o structură cristalină. Această cristalinitate, care afectează un număr redus de fibre, conferă celulozei o mare rezistență fizică și chimică. În pereții primari, diametrul microfibrilelor este de ~ 3,5 nm, iar în peretele secundar fibrilele au diametrul de 15-20 nm. Celuloza este hidrolizată de celulazele unor microorganisme patogene ale vegetalelor și de bacterii le din rumenul erbivorelor.

Xiloglucanii. Pereții fructelor și legumelor sunt bogați în xiloglucani care pot reprezenta 20% din substanța uscată a pereților primari. Scheletul de bază este format din resturi de D-glucoză legate β-1,4. Macromoleculele pot forma asociații cu microfibrilele de glucoză prin intermediul legăturilor de hidrogen.

Heteroxilanii. Se găsesc în cantitate mai mică în pereții primari ai fructelor și legumelor (~5%). Structural ei sunt formați din xiloză, forma piran legală β-1,4. Grupările 0-3 și/sau 0-2 ale xilozei pot fi substituite cu lanțuri laterale, variate în natură. Substituentul cel mai frecvent este arabinoza, urmat de acidul galacturonic și eterul 4-0 metilic. Xilozele din lanțul principal pot fi acetilate, iar resturile de arabinoză pot fi esterificate în 0-5 cu acizi fenolici (ferulic sau p-cumaric).

Substanțele pectice. Sunt polizaharide care conțin acid galacturonic. Scheletul principal al pectinelor este format din acid galacturonic și cantități mici de ramnoză. Lanțurile laterale sunt formate din arabinoză și galactoză. Scheletul principal reprezintă zone „lise” (formate din homogalacturonani) și zone ramificate cu catene laterale (formate din ramnogalacturonani).

Zonele homogalactonice sunt formate numai din acizi D-galacturonici legați α-1,4. Funcțiile carboxilice ale lanțuri lor poligalacturonice pot fi esterificate cu alcool metilic, iar funcțiile alcool (0-3 și/sau 0-4) cu acid acetic.

Zonele ramnogalacturonice au ramnoză care se inserează între resturile de acid galacturonic, după o secvență repetitivă. Circa 30 – 50% din ramnoză este substituită în 0-4 cu lanțuri laterale de oze neutre.

Lanțurile laterale ale pectinelor sunt compuse numai din oze neutre (arabinoza și galactoza). Se mai pot găsi xiloză, glucoză, manoză și acid glucuronic și mai rar metilfucoză, metilxiloză. Arabinoza și galactoza formează polimeri (arabani, galactani, arabinogalactani) legați de scheletul principal la nivelul resturilor de ramnoză, cu formare de zone ramificate. Xiloza formează mai ales lanturi laterale monomerice fixa te de acidul galacturonic în 0-3.

Proteinele și glicoproteinele parietale. În peretele primar se găsește extensina, o glicoproteină bazică, bogată în hidroxiprolină și serină, lizină și tirozină. Conținutul său în glucide este de – 50%, din care 96% arabinoză și 4% galactoză. Moleculele de extensină se pot lega între ele prin punți de isotirozină, cuprinzând două resturi tirozină din două lanțuri polipeptidice apropiate. Complexele arabinogalactani-proteine sunt glicoproteine care conțin 90 – 98% glucide. Fracțiunea proteică conține – 50% hidroxiprolină, prolină, glicină, alanină, acid glutamic. Partea glucidică este formată din arabinoză și galactoză cu structură ramificată de arabino-galactani de. tip II. În peretele vegetal se găsesc următoarele enzirne: peroxidaze, fosfataze, diverse glucozidaze.

Constituenți minori. În peretele vegetal se găsesc acizi fenolici (ferulic și cumaric), lignină (polimer tridimensional complex) asociată cu polizaharidele parietale, cutină compusă din esteri ai acizi lor grași cu lanț lung cu alcooli cu lanț lung, de asemenea cu alcani și ceruri. Se mai pot găsi și suberină, un compus similar cu cutina.

În ceea ce privește evoluția celulozei, hemicelulozelor și substanțelor pectice sunt de făcut următoarele constatări:

celuloza și hemicelulozele se acumulează pe parcursul creșterii și dezvoltării fructelor și legumelor, în timpul depozitării constatându-se numai o diminuare a conținutului de hemiceluloză;

substanțele pectice al căror nivel depinde de felul fructelor și legumelor, de stadiul de dezvoltare al fructelor și legumelor precum și de durata de depozitare, care influențează în primul rând raportul' dintre substanțele pectice insolubile și solubile, determină textura produselor vegetale.

În cazul merelor, perelor, piersicilor, prunelor, conținutul în substanțe pectice se menține constant în raport cu greutatea fructului proaspăt (0,5-1%). Pe măsură ce fructele respective se maturează, substanțele pectice sub formă de protopectină insolubilă trec și în formă solubilă (pectină, acid pectinic și pectic), astfel încât, la maturitatea de recoltare, circa 1/3-2/3 din cantitatea totală de substanțe pectice sunt sub formă solubilă. O situație deosebită o prezintă piersicile, la maturarea cărora conținutul de acid pectinic crește de la 24 la 75% din totalul materialului insolubil în alcool. Acidul pectic nu se modifică semnificativ, reprezentând 5-10% din totalul materialului insolubil în alcool. Masa moleculară a tuturor fracțiunilor de substanțe pectice scade o dată cu maturarea, gradul de esterificare al acizilor pectinici rămânând 75 – 80%.

La depozitarea merelor, perelor, piersicilor, prunelor are loc o creștere a substanțelor pectice solubile, rata de conversie a substanțelor pectice insolubile în substanțe pectice solubile fiind dependentă de temperatura de păstrare și anume este relativ mai scăzută la 0°C și mai mare la 15°C. Sucul obținut prin presarea fructelor menționate conține pectine solubile, dar și insolubile atașate de pulpa din suc. Acest suc conține – 1,126 mg pectină/ml, cu un grad de esterificare de 87 – 90%.

Căpșunele, zmeura, merele au un conținut variabil de substanțe pectice (căpșune 0,5 – 1,4%; mure 0,7- 1,2%, zmeură 0,6 – 1 %), 50 – 95% din acestea fiind sub formă solubilă, chiar și atunci când aceste fructe nu sunt complet maturate. În fructele complet maturate (maturitatea de consum), aproape toate substanțele pectice sunt sub formă solubilă. Zmeura este cea mai sensibilă la depozitare, după 1 – 6 zile constatându-se scăderi semnificative în substanțe pectice totale și solubile. De remarcat că vâscozitatea extracte lor de căpșune scade evident după formarea pigmentului roșu, ceea ce înseamnă că are loc scindarea substanțelor pectice (scăderea masei moleculare).

Strugurii conțin în medie 0,02 – 0,6% substanțe pectice, sub formă de protopectină, în cazul celor necopți și sub formă solubilă în cazul celor copți. Gradul de esterificare al pectinelor din struguri este redus (în medie 30%), ceea ce înseamnă că activitatea pectinesterazică este semnificativ scăzută.

Fructele citrice au substanțe pectice localizate în coajă, flavedo și albedo (20 – 30% față de substanță uscată), în vezicule și în suc (3 – 6% față de substanță uscată). Pectinele din citrice au un grad de esterificare de – 68%. Pe măsura maturării crește conținutul de substanțe pectice solubile din coajă, flavedo și albedo, însă cele din suc nu se modifică semnificativ o dată cu maturarea.

Enzimele care degradează polizaharidele parietale pot fi glucanaze, enzime care degradează heteroxilanii (xilanaze și altele), enzime pectolitice. Glucanazele sunt enzime care hidrolizează legătura dintre două molecule de glucoză, așa cum se găsesc în celuloză și alți glucani.

Degradarea celulozei. Sensibilitatea celulozei la hidroliză enzimatică va depinde de: gradul de polimerizare, cristalinitate și suprafața specifică accesibilă enzimelor. În cazul pereților vegetali, suprafața specifică' este afectată de incrustațiile de polimeri necelulozici.

Tratamentele fizice sau chimice pot modifica structura pereților vegetali, deci a celulozei, ameliorând în acest fel sensibilitatea celulozei la hidroliză enzimatică. Enzimele celulolitice pot fi secretate de bacterii aerobe și anaerobe precum și de mucegaiuri, sub forma unui complex care prezintă trei tipuri de activitate enzimatică, În funcție de modul de acțiune și substratul preferențiat:

enzime endohidrolizante a legăturilor glucozidice din interiorul lanțului poliglucidic. Sunt endoglucanaze β-1,4, care sunt mai active în zone amorfe decât în cele cristaline. Reactivitatea celulozei la endoglucanaze variază invers cu indicele său de cristalinitate;

enzime exoglucanazice, care acționează plecând de la extremitatea nereducătoare a lanțului și care, la rândul lor, pot fi clasificate în:

1 ,4-β-glucan-4 glucohidrolaza, care eliberează glucoza;

1,4-β-glucan-4-celobiohidrolaza, care eliberează celobioza (dimer al glucozei).

Degradarea altor glucani. Hidroliza celulozei este limitată de prezența altor constituenți ai țesuturilor vegetale. De exemplu, xiloglucanii fructelor și legumelor, care au un rol important în coeziunea edificiului parietal, pot fi hidrolizați numai dacă celuloza este în prealabil hidrolizată. Având în vedere că scheletul lor principal este asemănător cu al celulozei, acesta va fi degradat de enzime de tip endoglucanaze, degradare care va fi modulată de specificitatea enzimei și de dispoziția resturilor de xiloză, galactoză, fructoză. Eliminarea resturilor laterale de xiloză și galactoză este realizată de enzime care scindează atât legături β-1 ,3 cât și β-1,4.

Enzimele care degradează heteroxilanii. Aceste polizaharide sunt degradate de anumite tipuri de enzime, care sunt prezentate în continuare.

Xilanazele sunt enzime ce hidrolizează polizaharide de tipul arabinoxilanilor. Xilanazele pot fi:

endoxilanaze, care scindează legăturile β-1,4 din interiorul lanțului principal de xilan, eliberând oligomeri liniari sau substituenți cu grad mare de polimerizare, respectiv cu grad mic de polimerizare. Natura, frecvența și repartiția lanțuri lor laterale substituite pe lanțul liniar. de xilan va condiționa capacitatea endoxilanazelor de a hidroliza substratul;

xilozidaze, care hidrolizează oligomerii mici eliberați de endoxilanaze, până la monomer de xiloză.

Enzimele auxiliare sunt implicate în hidroliza catenelor substituite și pot fi:

α-L-arabinofuranozidaze, care eliberează resturi de arabinofuranoză nereducătoare sub formă de monomeri, de pe lanțul principal format de xiloză; glucuronidaze, care eliberează acidul glucuronic sau derivatul său metilat (acidul 4-0-glucuronic) fixat pe lanțul de xilan prin legătură α-1,2;

xilanacetilesteraze, care eliberează acid acetic dintr-un xilan la care resturile de xiloză au grupări acetil la C2 sau C3;

ferulatesteraze, care acționează asupra catenelor laterale ce conțin acid ferulic, pe care-l eliberează.

Enzimele pectolitice sunt enzime care degradează zonele „lise” și zonele cu catene laterale (zonele ramificate).

pectinesteraze (enzime de saponificare), care catalizează dezesterificarea grupărilor metilice ale pectinelor cu formare de acizi pectinici și alcool metilic. Pectinmetilesterazele de origine vegetală hidrolizează gruparea metil adiacentă la o grupare carboxil liberă, în timp ce pectinmetilesterazele mucegaiurilor atacă la întâmplare și nu sunt sensibile la ion ii de Ca2+, așa cum sunt cele de origine vegetală;

poligalacturonaze, care sunt enzime ce hidrolizează legăturile intre două resturi de acid galacturonic. După modul lor de acțiune acestea pot fi:

endopoligalacturoriaze, care eliberează un monomer, un dimer și un trimer de acid galacturonic;

exopoligalacturonaze, care acționează la extremitatea nereducătoare a unui lanț la care acidul carboxilic nu este esterificat. Acțiunea lor în lungul lanțului este blocată de prezența grupării metil, de un rest de ramnoză sau de un lanț lateral. Ele pot fi: poligalacturonhidroliaze care eliberează acid galacturonic și poligalacturonidaze care eliberează acid digalacturonic;

liaze, care catalizează depolimerizarea unui substrat prin reacția de β-eliminare (în absența apei). Sunt de origine bacteriană și, mai rar, fungică, dar nu au fost detectate în produsele vegetale. Se numesc și pectinliaze, care acționează endo- și exo-, afinitatea scăzând cu creșterea gradului de metilare. Există și pectatliaze care acționează asupra acidului poligalacturonic sau al unei pectine slab metoxilate. Ele acționează endo- și exo-, cele exo- acționând de la capătul reducător al acidului poligalacturonic cu eliberare de dimeri nesaturați.

Degradarea zonelor ramificate. Zonele ramificate ale pectinelor sunt constituite dintr-un schelet ramnogalacturonic care are grupări acetilate și lanțuri laterale de oze neutre (arabinoze și/sau galactoză). Degradarea lor implică deci prezența următoarelor enzime:

ramnogalacturonaze, care hidrolizează legătura dintre acidul galacturonic și ramnoză, eliberând oligomeri a căror structură de bază este un tetramer format din ramnoză și acid galacturonic care alternează, extremitatea nereducătoare fiind ramnoza și cea reducătoare acidul galacturonic;

esteraze, care eliberează grupările acetilate esterificate ale ramnogalacturonanilor pectinelor. Ferulatesterazele eliberează acidul ferulic care esterifică arabinoza sau galactoza;

arabinaze (endo), care scindează legăturile α-1,5 între două resturi de arabinoză prin atac la întâmplare în interiorul lanțurilor liniare ale arabanilor, cu eliberare de monomer, dimer sau trimer de arabinoză;

arabinofuranozidaze (exo), care hidrolizează legăturile α-1,3 sau α-1,5, cu eliberare de arabinofuranoză terminală nereducătoare;

galactanaze, care pot fi endo -, exo- și ozidaze și toate hidrolizează legături care implică resturi de galactoză din galactanii liniari sau arabinogalactani de tip I sau II.

Endogalactanazele hidrolizează legăturile β-1,4 între două resturi de galactoză, cu eliberare de monomer sau oligomeri cu DP≤4. Exogalactonazele acționează asupra legăturilor β-1,4 sau β-1,3.

Acizii organici. Creșterea, maturarea și depozitarea fructelor și legumelor este însoțită de modificări în conținutul diferiților acizi organici, savoarea fructelor maturate și depozitate datorându-se, cel puțin în parte, unei dezacidificări progresive care are loc în special la maturare și depozitare. În timpul maturării și depozitării, dezacidificarea se face pe calea ciclului Krebs cuplat cu respirația, însă dezacidificarea cea mai importantă are loc datorită enzimei malice (malat-dehidrogenaza decarboxilantă). În cazul merelor, degajarea de CO2 este mai mare în prezența malatului, în perioada climacterică decât în cea preclimacterică.

Această producție de CO2 poate explica parțial criza climacterică (prin creșterea concentratiei de CO2 procesul de respiratie este încetinit), care este însoțită de o creștere a sintezei de proteine.

Fenolii. Nivelul de compuși fenolici crește pe parcursul dezvoltării fructelor și legumelor și scade în cursul maturării și depozitării, consecința fiind diminuarea astringenței.

Anumite boli de depozitare conduc la îmbrunări ale țesuturilor superficiale sau interne. Substraturile de îmbrunare la mere și la pere sunt acidul clorogenic, l-epicatehina, d-catehina, acidul hidrocafeic, care sunt oxidați de polifenoloxidaze, enzime ce pot oxida și pigmenții antocianici și flavonici. Pot acționa însă și catalazele și peroxidazele, Anumiți reducători împiedică îmbrunarea. De exemplu, îmbrunarea merelor este împiedicată de acidul ascorbic. Merele bogate în acid ascorbic se îmbrunează mai greu decât cere care conțin puțin acid ascorbic. În celulele vegetale care respiră activ, acumularea de fenoli oxidați este împiedicată de potențialul redox scăzut. În țesuturile vegetale deteriorate, fenolii se oxidează mai rapid. În celulele vii sănătoase, fenolii nu pot fi oxidați din cauză că ei sunt localizați în vacuole iar oxidazele în protoplasmă.

Pigmenții. La fructe și legume, modificarea conținutului de pigmenți se corelează cu modificarea culorii, o anumită culoare fiind caracteristică maturitătii de recoltare. Pigmenții verzi (clorofilele a și b) dispar în fructele maturate, etilena stimulând dispariția prin activarea clorofilazei, în cazul merelor. Clorofilaza nu degradează însă profund clorofila, dar activitatea enzimei crește pe măsură ce conținutul de clorofilă scade. În cazul perelor, dispariția clorofilei este exponențială (variația conținutului pe unitatea de suprafață în unitatea de timp).

Descompunerea clorofilei este influențată de temperatură, lumină, conținutul mediului ambiant în CO2 și O2.

Pigmenții carotenoidici se acumulează în fructe și în legume până la realizarea maturității fiziologice, după care are loc degradarea lor.

Pigmenții antocianici se acumulează pe măsură ce fructele se maturează, la depozitare putând avea loc o biodegradare a pigmenților, mai ales în cazul unor boli fiziologice.

Pigmentii flavonici se acumulează în special în perioada de creștere, această acumulare fiind mai puțin evidentă la maturarea fructelor și legumelor. În general, păstrarea necorespunzătoare conduce la degradarea pigmenților, ceea ce reprezintă o pierdere de calitate senzorială și, în unele cazuri, o pierdere de calitate nutritivă.

Vitaminele. Conținutul în vitamine crește în perioada de creștere și maturare a fructelor și legumelor, dependent de condițiile pedoclimatice și tehnologice de cultură aplicate. La depozitarea fructelor și legumelor recoltate la maturitate, conținutul în vitamine (în special vitamina C) scade, în măsură mai mică sau mai mare, în funcție de temperatura și de natura atmosferei de depozitare.

Produșii organici volatili. Aceștia se formează în perioada maturării fructelor și legumelor. Sunt reprezentați de aldehide, cetone, esteri, alcooli etc. De remarcat că în fructe predomină esterii, în timp ce în sucuri predomină alcoolii, fapt ce se explică prin intervenția hidrolazelor, ceea ce înseamnă că tehnica de extracție a sucului are o mare influența asupra aromei acestuia. Prin păstrarea fructelor și legumelor la temperaturi scăzu te și. sub atmosferă controlată se încetinește formarea de produși organici volatili, deci se întârzie formarea aromei caracteristice.

Hormonii. Hormonii vegetali (auxinele: acidul 3-indolilacetic, indolilacetonitrilul, aldehida 3-indolacetică; giberelinele:

acidul giberilinic, giberilinele GA1, GA2 etc.;

citokininele: kinetina, zeatina, difenilureea, zeatinribozidul, acidul abscisic, etilena) suferă modificări în timpul creșterii și maturizării fructelor și legumelor.

Auxinele influențează creșterea, textura pulpei, accelerarea maturării și producția de etilenă. Influențează, de asemenea, nivelul de proteine și de acizi nucleici, frânând procesul de trnbătrănire. Giberelinele intervin în transformarea triptofanului în auxine, influențează scăderea nivelului de amidon, azot total și creșterea conținutului de acizi nucleici, celuloză și hemiceluloză. Citokininele stimulează creșterea și întârzie degradarea clorofilei și procesul de maturare. O poziție specială o are etilena (considerată ca hormon), care stimulează maturarea fructelor și legumelor. Producerea de etilenă precede maximum climacteric la banane, coincide cu acesta la mere și pere, sau are loc după acesta la tomate.

Enzimele. Sinteza enzimelor este corelată cu tipul produselor horticole. Astfel, la cele neclimacterice, sinteza enzimelor este mai intensă în faza de creștere și se diminuează în faza de maturare. La cele climacterice, se constată o intensificare a sintezei enzimelor în prima parte a fazei de creștere și în perioada de climacteric, corespunzătoare maximumului în respirație.

Evoluția activității diferitelor enzime la creșterea și maturarea fructelor și legumelor este următoarea:

hidrolazele (amilaza, celulaza, invertaza) își intensifică activitatea în faza de maturare;

transaminazele au o activitate mai intensă în faza de maturare, determinând scăderea conținutului de aminoacizi;

piruvatdecarboxilaza are o activitate sporită în faza de maturare, fapt ce determină transformarea piruvatului în aldehidă acetică și CO2;

clorofilazele au o activitate mai mare în faza de maturare, ceea ce se corelează cu degradarea clorofilelor;

polifenoloxidazele și citocromoxidazele sunt active pe toată perioada maturării;

catalaza și peroxidaza sunt deosebit de active în timpul activității de respirație maximă;

lipazele și lipoxidaza sunt mai active în perioada de preclimacteric, conducând la hidroliza lipidelor și, respectiv, la oxidarea lor;

enzimele pectice au activitate mare în prima fază de creștere, după care activitatea lor se reduce până la maturare. În faza de maturare, înmuierea țesuturilor vegetale (fructe și legume), consecință a evoluției substanțelor pectice, are loc sub influența enzimelor pectice saponificante (pectindemetoxilaze) prezente în căpșune, struguri, banane, cireșe, mere, pere, portocale, piersici, tomate și sub acțiunea enzimelor depolimerizante (pectindepolimeraze) și este hotărâtoare pentru determinarea texturii, însă nu trebuie neglijați și alți factori, cum ar fi turgescența celulară, dimensiunile celulelor parenchimatice și grosimea membrane celulelor respective. În ceea ce privește membranele celulelor parenchimale, este posibil ca acestea să fie cu atât mai tari cu cât gradul de esterificare al pectine este mai redus și cu cât conținutul de calciu este mai ridicat. În cazul perelor pectindemetoxilazele (PME și PE) au o activitate mare în fructele tinere (iulie) și apoi se constată o scădere a activității PME până la recoltare (septembrie, octombrie). După recoltare nu mai are loc scăderea activității PME. În cazul perelor ce se maturează în pom s-a constatat o scădere a activității PME.

Perele care se recoltează când sunt tari se mențin la rece pentru maturare, în acest interval fiind intensificate activitatea enzimelor pectindemetoxilazelor (în special PE). Când perele sunt aduse la temperatura camerei, se înmoaie, ceea ce înseamnă că devin active pectindepolimerazele (poligalacturonaza). Activitatea PME în cazul merelor crește pe măsură ce fructele se maturează, maximumul de activitate fiind întâlnit la fructele supramaturate. La depozitarea merelor, care se recoltează când sunt tari, are loc o înmuiere lentă a țesuturilor, depinzând de temperatura de păstrare și de varietatea merelor. Micșorarea lanțului poligalacturonic și micșorarea gradului de esterificare arată că la depozitarea merelor acționează ambele categorii de enzime pectice.

La maturarea piersicilor la temperatura de 8°C, activitatea pectinesterazei este maximă în primele două săptămâni, după care scade și începe a fi evidentă activitatea poligalacturonazei, fructele devenind moi. Prin păstrarea piersicilor la 0°C se inhibă activitatea pectinesterazei pe o durată de circa 2 săptămâni, după care activitatea crește brusc, coincizând în timp cu formarea unui lanț poligalacturonic mai lung și mai slab metoxilat, pulpa fructelor devenind fibroasă.

La cireșe, maximul de activitate al PME s-a observat în timpul maturării, în timp ce la grapefruturi activitatea PME se diminuează în timpul maturării. Poligalacturonaza a fost pusă în evidență și în cireșe, fiind responsabilă de înmuierea cireșelor conservate în prezența de SO2.

În timpul maturării bananelor timp de 11 zile, la temperatura camerei, are loc o scădere a conținutului de protopectină și o creștere a celui de pectină solubilă, ceea ce presupune o activitate a pectinmetilesterazei, dar și a poligalacturonazei. În orice caz, activitatea polimetilesterazei din coajă se intensifică prin trecerea fructelor de la culoarea verde la culoarea galbenă.

La maturarea tomate lor, când pigmentația trece de la verde la roșu, evidențiază o creștere a polimetilesterazei cu până la 40%, iar atunci când tomatele au o suprafață roșie, activitatea enzimelor depolimerizante (poliqalacturonaza) crește.

În concluzie, gradul de esterificare al pectinelor fructelor și legume scade datorită intervenției pectindemetoxilazelor. Această acțiune de saponificare a pectinelor nu conduce la insolubilizare, deoarece acțiunea enzimelor respective asupra pectinelor demetoxilate conduce la creșterea solubilității pectinelor. Se consideră că, în timpul maturării, fructele și legumele pot sintetiza încă oligouronide, dar acestea nu se pot condensa în acizi pectici, în faza finală a matură sinteza oligouronidelor încetează, dar conținutul acestora crește pe seama degradării acizilor pectici.

15.4. Folosirea enzimelor implicate în hidroliza polizaharidelor pereților parietali

În industria sucurilor de fructe și legume, preparatele enzimatice exogene pot interveni, în etapele menționate în fig. 15.69, în vederea:

ameliorării randamentului în suc la presare;

preparării sucurilor pulpoase de tip nectaruri (macerarea și stabilizarea sucurilor pulpoase);

obținerii de sucuri limpezi (clarificare).

Figura 15.69. Folosirea enzimelor pectolitice în industria sucurilor:

A- pectinaze pentru ușurarea presării; B- pectinaze pentru macerare;

C-pectinaze și celulaze pentru lichefiere; D- pectinaze pentru clarificare.

15.4.1. Folosirea enzimelor înainte de operația de presare

Tehnologia generală de obținere a sucurilor de fructe și legume implică următoarele operații succesive:

sortarea: se îndepărtează fructele vătămate, cele imature și trecute de maturitatea de consum. Fructele mature dau un randament scăzut de suc care este și greu de presat, iar sucurile obținute sunt foarte tulburi;

spălarea: se face, în mod obișnuit, în scopul îndepărtării impurităților aderente și al înlăturării parțiale a microflorei epifite;

sfărâmarea (zdrobirea, mărunțirea): se face prin răzuire la fructele sănătoase. Strugurii, vișinele, cireșele, bacele nu se mărunțesc. Masa de fructe sfărâmate se numește pulpă, care din punct de vedere fizic este un sistem eterogen format din două faze:

faza lichidă (suc) eliberată din structura celulelor în timpul zdrobirii – mărunțirii. Această fază lichidă este foarte vâscoasă;

faza solidă, care se prezintă ca o masă semigelificată cu o capacitate de reținere a apei foarte mare, ceea ce limitează scurgerea sucului la presare. Această fază solidă este alcătuită din protopectină hidratată cu suc precum și din materiale puțin hidratabile (celuloze și hemiceluloze) care rețin și componente de aromă și culoare.

Prin adaos de enzime pectolitice la pulpă se realizează următoarele: crește randamentul în suc la presare; se favorizează extracția pigmenților și aromelor.

Acțiunea enzimelor pectolitice asupra celor două componente ale pulpei este diferită: acțiunea asupra sucului se manifestă prin reducerea vâscozității prin solubilizarea pectinelor din suc; acțiunea asupra fazei solide se traduce prin scăderea cantității de pectină insolubilă, prin distrugerea structurii de gel, astfel că se ajunge la creșterea permeabilității acestui strat, care eliberează suc. Tot din partea solidă nehidratabilă se eliberează componentele de aromă și culoare.

Adaosul de preparate enzimatice pectolitice se poate face în următoarele moduri: în masa de pulpă înainte de încălzire și termostatarea acesteia pentru acțiunea enzimelor, în care caz doza de enzime trebuie mărită cu 20 – 30%, deoarece contactul pulpei cu pereții schimbătorului de căldură poate conduce la micșorarea activității enzimatice; după încălzirea masei de fructe zdrobite – mărunțite (pulpă), înainte ca aceasta să fie introdusă la termostatare; direct în masa de pulpă adusă la temperatura de termostatare.

Preparatele enzimatice folosite ca adaos în pulpa de fructe sunt cele care favorizerază hidroliza scheletului principal al pectinelor: poligalacturonazele (endo), pectinmetilesterazele, pectinliazele, arabinazele, ramnogalactouronazele, galactonazele.

Nivelul activităților enzimatice trebuie dozat cu precizie, deoarece endopoligalacturonazele și pectinmetilesterazele acționează sinergetic, un exces de pectinmetilesteraze având acțiune de inhibare a pectinliazelor.

Eficacitatea enzimelor pectolitice la creșterea randamentului în suc la presare va fi influențată de:

compoziția în polizaharide a pereților parietali;

condițiile de stocare a fructelor și legumelor, care pot contribui la modificarea compoziției pereților parietali (de exemplu prin oxidarea pulpei se limitează degradarea polizaharidelor de către enzimele pectolitice);

conținutul de calciu parietal;

stadiul fiziologic al fructelor și legumelor, care influențează starea pectinei (acționează enzimele pectolitice proprii țesuturilor vegetale).

Preparatele enzimatice pectolitice comerciale, de regulă, au și activitate arabinazică și galactonazică, ceea ce este important în scindarea lanțuri lor laterale de arabinoză și galactoză din zonele ramificate ale pectinelor, fapt ce conduce la creșterea randamentului în suc la presare. Doza de preparat enzimatic folosită se stabilește în funcție de: felul fructelor și legumelor; condițiile tehnologice de lucru: temperatura, durata de acțiune, tipul de presă folosit.

În general, doza folosită este de 100 – 150 g/t pulpă. Prin adaos de enzime pectolitice în pulpă înainte de presare, sucul obținut va avea o vâscozitate mai mică și, deci, o filtrabilitate mai bună.

Randamentul în suc (cu sau fără adaos de enzime) este influențat de gradul de prospețime al fructelor (tabelul 15.40).

Tabelul 15.40.

Randamentul în suc în funcție de prospețimea fructelor

Conform recomandărilor firmei NOVO, preparatele enzimatice pectolitice se folosesc în soluții cu următoarele concentrații:

Pectinex 1 XL, soluție 10%;

Pectinex 2XL, soluție 5% (comercializat și ca Ultrazym 40 L);

Pectinex 3XL, soluție 3,3%;

Ultrazym 100, soluție 2%.

Soluțiile se prepară prin solubilizarea preparatului enzimatic în suc clar, proaspăt și trebuie folosite în intervalul a 4 ore. Controlul acțiunii enzimelor se face prin măsurarea cantității de suc eliberat (se centrifughează o probă) și prin măsurarea vâscozității fructului obținut după centrifugarea masei de fructe tratate enzimatic.

Creșterea randamentului în suc la presare se poate face și prin lichefierea pulpei de fructe sau legume.

Lichefierea implică degradarea completă a peretelui vegetal, ceea ce înseamnă că protoplastele se sparg sub influența presiunii osmotice, sucul celular fiind eliberat. Lichefierea se aplică la fructele care ridică probleme de presare (fructe tropicale). Lichefierea conduce și la ameliorarea extracției constituenților celulari puternic adsorbiți de pulpă (carotenul din morcovi, antocianii din struguri etc.).

Folosirea enzimelor pentru clarificare (limpezire)

Presarea cu sau fără adaos de preparate enzimatice pectolitice conduce de regulă la un suc brut cu viscozitate și turbiditate ridicată. Clarificarea sucului constă tocmai în îndepărtarea tulburelii, iar dacă se face prin filtrare operația este greoaie din cauza vâscozității sucului, iar filtrul se colmatează repede datorită particulelor în suspensie. Eliminarea substanțelor pectice pe cale enzimatică se poate face pe două căi:

prin precipitate, în care caz pectinele sucului brut sunt demetilate pectinmetilesteraza pură și se adaugă ioni de Ca2+ favorizindu-se astfel formarea gelului de pectat de calciu care angrenează particulele în suspensie. Gelul respectiv se poate concentra deshidratându-se și se sedimentează sau poate să floteze la suprafață dacă sucul suferă o fermentație alcoolică cu producere de CO2 (aceasta este operația de defecație în cadrul cidrului, defecația nu se aplică în cazul sucurilor de fructe deoarece procedeul este de durată).

prin hidroliză enzimatică care este realizată prin acțiunea conjugată a pectinliazelor, poligalacturonazelor și arabinozelor.

Limpezirea enzimatică a sucurilor se face la cald (45…55°C, timp de 1 oră) sau la rece (15…25°C, timp de 8 ore). Proporția de preparate enzimatice pectolitice furnizate de firma NOVO este arătată în tabelul 15.41.

Tabelul 15.41.

Doze de preparate enzimatice folosite la limpezirea sucurilor

Uneori, limpezirea enzimatică este cuplată cu c1eirea cu gelatină (5-8 g/hl), bentonită și kieselsol, singure sau în adaos succesiv: gelatină – bentonită. Pentru sucurile bogate în polifenoli se recomandă combinația succesivă gelatină – kieselsol – bentonită. Se ajunge astfel la flocularea particulelor în suspensie sub influența taninului prezent sau adăugat. După limpezirea enzimatică urmează următoarele operații tehnologice:

filtrarea: se face în filtre-presă cu azbest, folosind kieselgur sau bentonită ca material auxiliar de filtrare;

detartrizarea: se aplică la sucul de struguri și are drept scop îndepărtarea bitartratului de potasiu aflat în soluție. Se realizează prin adaos de lactat de calciu (1%) sau de carbonat de calciu (1%). Se poate realiza și prin depozitare frigorifică la – 7°C, timp de câteva luni, sau 3 – 7 zile la -3°C;

pasteurizarea: se face la 80°C, timp de 10-60 s, fiind urmată de răcire;

conservarea, care se poate realiza: sub presiune de CO2 (1,5% CO2 la presiunea de 7 bar);

prin congelarea la -30°C după dezaerare, în cutii de carton parafinate;

prin concentrare prin evaporare sub vid (sub 100 mm Hg presiune reziduală) până la atingerea concentrației de 65 – 70% zahăr total, cu recuperarea arome lor care se adaugă în sucul concentrat;

prin concentrare prin crioconcentrare.

O poziție specială în ceea ce privește clarificarea o constituie sucul de mere, care se caracterizează prin prezenta pectinelor cu un grad mare de esterificare (în general, gradul de esterificare variază în funcție de fruct și de conținutul în pectilmetilesterază, fiind 22 – 98% la mere, 47 – 60% la portocale și 44 – 70% la struguri).

După destinație, sucul de mere poate fi:

natural, nelimpezit și filtrat;

natural, conținând un anumit nivel de pulpă;

tulbure, centrifugat pentru eliminarea particulelor grosiere, dar nefiltrat;

clar-ambru, limpezit prin tratament enzimatic și fitrat;

limpede, dar concentrat până la 70% Brix.

Efectul de limpezire poate fi obținut prin acțiunea conjugată a PE și PG. în acest caz, PE diminuează gradul de esterificare al pectinei la un nivel suficient (55 – 60%) pentru a permite acțiunea depolimerizantă a PG. Efectul de limpezire poate fi atins și cu pectinliază (PL), care acționează asupra pectinelor cu grad de esterificare superior la 55 – 60%. Deci, un bun preparat enzimatic pectolitic pentru limpezire trebuie să conțină cele trei enzime specifice și, în particular, o foarte bună activitate pectinmetilesterazică sau pectinesterazică (PME sau PE) și pectinliazică (PL), activitatea poligalacturonazică fiind mai puțin importantă (PG).

Recent s-a dovedit că endopectintranseliminaza (PTE) este capabilă singură să producă limpezirea sucului de mere.

Limpezirea sucului de mere decurge în mai multe etape:

de regulă, preparatul enzimatic pectolitic este dizolvat în apă sau într-o cantitate mică de suc,astfel încât să poată fi bine amestecat în masa sucului la agitare mecanică;

după adaosul enzimei are loc solubilizarea pectinei insolubile legate la particulele în suspensie, ceea ce corespunde la o fază de lag. În continuare se realizează diminuarea vâscozității pectinei solubile, rata scăderii vâscozității fiind dependentă de temperatură, cantitatea de enzimă adăugată și natura sucului;

particulele fine din suc se aglomerează și formează flocoane care sedimentează, sucul devenind limpede (clar) sau cu puține impurități. În continuare, sucul este filtrat sau centrifugat. La floculare se pot adsorbi și substanțele colorate, inclusiv cele rezultate din acțiunea polifenoloxidazelor care acționează până la limpezire.

Eficacitatea diferitelor preparate comerciale pectolitice se poate observa după:

timpul necesar formării flocoanelor;

viteza de filtrare a sucului după aplicarea tratamentului enzimatic pentru o anumită perioadă de timp;

măsurarea transmitanței sucului limpezit.

Se cunoaște că pectinele solubile acționează ca niște coloizi protectori și că hidroliza parțială a acestora permite ca particulele insolubile fine să se aglomereze și să floculeze.

Pentru floculare este necesar să se hidrolizeze 30% din totalul grupărilor carboxilice esterificate și circa 5% din totalul legăturilor glucozidice. Faza scurtă de lag în scăderea vâscozității arată că trecerea protopectinei insolubile în pectină solubilă este prima etapă în procesul de limpezire a sucului de mere. Acest lucru s-a demonstrat experimental pe un suc de mere din care s-a îndepărtat, în prealabil, protopectina insolubilă și care la adaos de preparatenzimatic pectolitic nu a mai prezentat fază de lag în scăderea vâscozității.

Limpezirea completă cu pectinliază pură (PTE sau PL) are loc când 50% din pectina solubilă este precipita bilă cu alcool etilic, iar vâscozitatea s-a redus cu -25%. La tratamentul cu endo-PTE sau exo-PL nu se eliberează metanol.

Particulele fine din sucul de mere sunt formate din proteine și poliglucide, complexul conținând -36% proteine, încărcarea electrică netă fiind negativă la pH = 3,5 (pH-ul sucului).

Miezul particulelor este format din proteină, iar la exterior se găsește poliglucidul-pectina, încărcată electric negativ. Prin hidroliza parțială a fracțiunii pectinice se expune porțiunea proteică încărcată negativ, care poate fi neutralizată de alte particule, ceea ce conduce la floculare. În această direcție, adaosul de coloid pozitiv la pH = 3,5 (gelatină) îmbunătățește limpezirea, în timp ce adaosul de coloid negativ la pH = 3,5 (alginat de sodiu) inhibă limpezirea. După cercetări mai recente, materialul depectinizat este neutru din punct de vedere electric la pH = 3,5.

Procesul de limpezire este influențat de pH, temperatură, durata și concentrația de enzime adăugate. Gelatina influențează pozitiv limpezirea, deoarece formează complecși cu taninul existent sau adăugat la suc. Unele preparate comerciale de enzime pectolitice conțin și gelatină, astfel încât concentrația acesteia în suc să fie de 0,005 – 0,1 %, pentru a ajuta limpezirea. Gelatina, prin complexarea taninului, face ca enzimele pectolitice să nu mai fie inhibate. pH-ul sucului de mere, având valoarea 3,2 – 4, se încadrează în pH-ul optim de activitate al: preparate lor comerciale de enzime pectolitice (3,5 – 5,0), respectiv al fracțiunilor de endo- și exo-poligalacturonaze (pH = 4-4,5); pectinmetilesterazelor (4,5 – 5,0) și endo- și exo-pectin transeliminazelor (5-5,5). pH-ul sucului de mere este influențat de varietatea și de gradul de maturitate al fructelor (merelor). Faza neenzimatică de limpezire este mult influențată de pH. Astfel, un suc de mere cu pH mai scăzut va prezenta o floculare mai rapidă, din cauză că încărcarea electrică negativă a particulelor fine este mai mare.

Creșterea temperaturii influențează pozitiv faza enzimatică de limpezire, deoarece face să crească viteza degradării pectinelor de către enzimele pectolitice și, prin urmare, se scurtează durata limpezirii. Sucul de mere cu pH = 3,5, tratat cu enzime pectolitice, la o concentrație de 0,025% și cu adaos de 0,005% gelatină, la temperaturi cuprinse între 10 și 50°C, va necesita durate de floculare diferite și anume: 200 min la 10°C; 93 min la 20°C; 50 min la 30°C (fără gelatină durata va fi de 105 min); 34 min la 40°C și 24 min la 50°C. Se observă că, între 10 și 30°C, durata limpezirii scade de două ori cu creșterea temperaturii cu 10°C, iar la temperaturi peste 30°C, durata limpezirii scade de 1,5 ori. Durata necesară limpezirii este invers proporțională cu concentrația enzimei folosite, în domeniul de temperatură 5 … 50°C. Tratamentul enzimatic durează 2 – 16 ore, însă, prin adaos de gelatină 0,005%, durata limpezirii se reduce la jumătate.

Merele conțin amidon care trece în suc, fapt ce mărește vâscozitatea acestuia, ceea ce reduce viteza de filtrare și, în plus, constituie o sursă posibilă pentru apariția tulburelii, în special în sucul concentrat, tulbureală ce nu mai poate fi practic eliminată. Tulbureala apare și în sucul concentrat la reconstituire. Având în vedere că în suc rămâne – 5% din amidonul conținut de mere, se impune ca acesta să fie degradat concomitent cu pectina insolubilă. În acest scop, sucul se încălzește la 70°C, pentru gelatinizarea amidonului, apoi se răcește la 50 … 55°C și se tratează concomitent cu enzime pectolitice și cu amiloglucozidază (AG-150L) care este activă la pH-ul acid al sucului (2 – 5 g amiioglucozidază/hl).

Sucul de mere limpezit și filtrat la temperaturi mai mari decât temperatura de depozitare poate să se tulbure și să se închidă la culoare în timpul depozitării, defect care poate fi evitat prin prelucrarea la rece a fructelor și prin folosirea unei cantități mai mari de gelatină. Defectul este consecința polimerizării catehinelor (polifenoli) și proantocianidinelor oxidate de polifenoloxidazele existente în mere, în stadiile inițiale ale prelucrării acestora. Cantități importante din compușii oxidați și polimerizați sunt îndepărtate la presare, compușii respectivi fiind insolubili și, suplimentar, la limpezirea enzimatică și la filtrare. Eventualii precursori care trec în suc pot fi împiedicați de a se oxida prin introducerea în suc a acidului ascorbic.

15.4.3. Folosirea enzimelor pectolitice în tehnologia nectarurilor de fructe

Nectarurile sunt sucuri pulpoase care se pot obține din fructe semințoase (mere, pere), din fructe cu sâmburi (caise, piersici, prune, vișine) sau din fructe bace (căpșune, agrișe, coacăze, zmeură). Procesul tehnologic include următoarele operații:

pregătirea fructelor care diferă în funcție de felul lor: fructele semințoase se spală, se sortează, se dezintegrează în mori coloidale, se opărește piureul obținut cu abur direct și masa obținută se trece printr-o pasatrice cu ochiuri de 2 mm și apoi printr-un extractor; fructele cu sâmburi se spală, se îndepărtează cod ițele, se aburesc, iar masa caldă se trece printr-o pasatrice cu ochiuri de 4 mm;

fructele bace se spală, se sortează, se zdrobesc, se preîncălzesc și apoi se trec printr-un extractor. Pentru evitarea îmbrunării în piureul obținut se adaugă 0,05% acid ascorbic. Tratamentul termic aplicat masei de pulpă are drept scop inactivarea enzimelor pectolitice proprii, în principal pectinmetilesteraze; centrifugarea: se face în scopul eliminării unei părți din celuloză;

corectarea: se corectează conținutul de zahăr prin adaos de zahăr în proporție de 8 – 10% sub formă de sirop de zahăr; se corectează aciditatea prin adaos de acid citric sau tartric;

dezaerarea: se face sub vid la 40°C, pentru împiedicarea reactiilor de oxidare și reducerea pierderilor de vitamină C;

omogenizarea: se realizează într-un omogenizator la 250/50 bar pentru reducerea dimensiunilor particulelor din suspensie sub 100 μ;

pasteuriza rea și ambalarea aseptică în recipiente.

Nectarul ca produs finit este alcătuit din două faze: una lichidă (suc) și una solidă (în suspensie) formată din celule izolate sau agregate de celule. Această stare bifazică a nectarurilor poate fi mai mult sau mai puțin stabilă din punct de vedere al tulburelii (aceasta trebuie menținută în timp fără depunerea fazei aflate în suspensie).

În privința instabilității sunt create două ipoteze:

ipoteza în care pectinele solubile dezesterificate reacționează cu calciul din suc cu formare de pectat de calciu insolubil, care precipită o dată cu particulele tulburelii aflate în suspensie. Deci, în acest caz, instabilitatea este datorată prezenței pectinmetilesterazelor. Din acest motiv, preparatele enzimatice exogene nu trebuie să conțină pectinmetilesteraze, ci numai endopoligalac- turonaze care hidrolizează pectinele solubilizate în oligomeri ce nu mai formează geluri cu calciu și, deci, se asigură în acest fel stabilitatea tulburelii nectarului;

ipoteza lui Struebi ș.a. (1978) prin care stabilitatea tulburelii neclarului este asigurată de vâscozitatea fazei lichide (suc); vâscozitate care este cu atât mai mare cu cât pectinele solubilizate au masă moleculară mai mare. O fază lichidă vâscoasă limitează sedimentarea particulelor din suspensie. Deci, pentru a evita formarea gelului de pectat, pectinele solubilizate nu trebuie să fie demetoxilate (trebuie să rămână puternic metoxilate), ceea ce înseamnă că la macerare nu trebuie să se folosească preparate enzimatice care conțin pectimetilesteraze, ci numai endopoligalacturonaze și alte enzime care degradează pectinele fără a le dezesterifica (pectinliaze).

În concluzie, pentru a obține nectaruri stabile din punct de vedere al tulburelii, în pulpa rezultată la pregătirea fructelor se adaugă enzime pectolitice depolimerizante (PG și PL) care asigură desprinderea celulelor din structura lor pectinică, prin hidroliza limitată a scheletului pectinic care formează trama celulelor ce conțin suc. Acest gen de hidroliză limitată a pectinelor din lamela medie este cunoscută sub denumirea de macerare.

15.4.4. Implicatiile enzimelor pectolitice în tehnologia sucului de tomate

Sucul de tomate, ca de altfel și alte sucuri naturale din legume, este un produs valoros din punct de vedere nutrițional (conține vitamine, zaharuri, săruri minerale, substanțe pectice), cu calități senzoriale superioare (gust, miros, culoare).

Obținerea sucului de tomate se face prin procedeul „la cald” și „la rece”.

Procedeul la cald implică următoarele operații:

prespălarea și spălarea, care se execută în apă rece sau încălzită la 50°C, cu agitare prin intermediul aerului, urmată de dușare cu apă sub presiune;

zdrobirea și preîncălzirea la 60°C și chiar la 82,5°C (în instalații moderne preîncălzirea se poate realiza sub vid);

extracția , care se face în extractoare speciale ce realizează și trecerea în suc a pulpei în proporție de maximum 80%;

dezaerarea sub vid înaintat (temperatura de fierbere 35…40°C);

omogenizarea pentru dezintegrarea particulelor din pulpă, fapt ce împiedică stratificarea produsului;

pasteurizarea fulger la 130 … 135°C, timp de 8 – 12 s și răcire până la umplerea cutiilor, închiderea și menținerea acestora în stare răsturnată 5 min, după care cutiile se răcesc rapid (în cazul sticlelor, dacă acestea și capsulele nu sunt sterilizate, dacă umplerea și încapsularea nu sunt realizate aseptic, se face o nouă pasteurizare).

În procedeul la cald, încă de la început, tomatele zdrobite sunt supuse tratamentului termic care inactivează enzimele pectice. În acest caz, vâscozitatea sucului este proporțională cu cantitatea de substanțe dispersate coloidal în suc.

Aceste substanțe pectice nu numai că influențează vâscozitatea, dar contribuie și la reținerea sedimentului în suspensie. Transformările pe care le suferă substanțele pectice sunt datorate numai tratamentului termic. În acest sens, protopectinele insolubile sunt hidrolizate la substanțe pectice solubile, capabile să formeze dispersii coloidale în apă. În același 'timp, tratamentul termic provoacă ruperi, contractări, separări de celule, modifică matricea celulozică, astfel încât urmează și extracția substanțelor pectice deja aflate în formă solubilă (datorită maturării).

La obținerea sucului de tomate prin procedeul la rece, există un interval de timp între operația de dezintegrare a tomatelor și pasteurizarea sucului, fapt ce permite ca pectinesteraza (PE) să demetileze acizii pectinici puternic esterificați în acizi pectinici mai slab metoxilați și în acizi pectici, în continuare putând să acționeze poligalacturonaza (PG) ce degradează acizii pectinici slab metoxilați la produși cu masă moleculară mică, care nu mai contribuie la mentinerea vâscozității sucului. Un asemenea suc are un aspect apos și nu are capacitatea de a menține sedimentul în suspensie, dar poate fi concentrat până la consistenta de sos.

În cazul în care se dorește să se obțină sucuri de tomate relativ mai clare, se recurge la tratament cu poligalacturonaze exogene.

15.4.5. Alte utilizări ale enzimelor pectolitice la prelucrarea fructelor

Enzimele pectice se mai utilizează pentru:

stabilizarea tulburelii sucului de citrice;

recuperarea sucului din pulpa de fructe rămasă după extracția primară;

recuperarea uleiului esențial din coaja citricelor și obținerea agentului de tulbureală;

dezamărârea sucurilor (în care caz preparatele pectolitice conțin și naringinază);

obținerea de pectine slab metoxilate din cojile de citrice.

Stabilizarea tulburelii sucului de citrice. Sucul proaspăt de citrice (în special portocale) conține particule fin divizate în suspensie care-i dau aspect tulbure, aceasta constituind un indice de calitate, produsele clare (limpezi) având valoare comercială scăzută. În cazul suspensiilor din sucul de citrice, materialul insolubil conține și o fracțiune cu dimensiuni ale particulelor sub 2 um, fracțiune formată din pectine, proteine, lipide, iar la sucul obținut din portocale șhamuti materialul insolubil conține și cristale de hisperidină. De gradul de tulbureală al sucului de citrice sunt legate și aroma și culoarea produsului. Atunci când sistemul coloidal al sucului colapsează, acesta se clarifică și apar două faze: o fază sediment-floconoasă și o fază de ser. Stabilitatea tulburelii sucului de citrice este datorată În mare măsură pectinelor solubile provenite din coajă, dar mai ales din membranele veziculelor ce conțin sucul. Totodată, sucul de citrice are un conținut ridicat și de pectinesterază care, la fructul respectiv, se găsește în sucul veziculelor. Stabilitatea tulburelii se realizează printr-un tratament termic aplicat sucului (- 90°C), care conduce la inactivarea pectinesterazei. Dacă nu se inactivează pectinesteraza, aceasta demetilează pectinele solubile (DE = 65%), transformându-le În pectine slab metoxilate, care reacționează cu ion ii de calciu din suc, formând pectați insolubili prin a căror precipitare se antrenează și particulele tulburelii, sucul exprimând un suc clar, fără culoare. Acest suc nu este dorit din punct de vedere comercial.

Pentru a stabiliza tulbureala sucurilor de citrice (portocale), în afară de tratamentul termic, se poate aplica și un tratament enzimatic. În acest scop se adaugă o poligalacturonază care degradează pectinele dezesterificate de către pectinesteraza proprie sucului, înainte ca aceste pectine să reacționeze cu ionii de calciu sub forma de pectați insolubili. Preparatele enzimatice cu activitate poligalacturonazică mare, dar cu activitate redusă metilesterazică sau polimerazică, conduc la formarea de acizi oligogalacturonici ce dau pectați solubili care asigură stabilitatea tulburelii sucurilor de citrice netratate termic.

În cazul în care se pune problema obținerii unor sucuri concentrate de lămâie (70% Brix), pentru a evita fenomenul de gelificare favorizat de pH-ul scăzut, de un conținut ridicat de pectine sau de reacțiile de îmbrunare, este necesar să se utilizeze un preparat enzimatic poligalacturonazic care să ajute la micșorarea vâscozității și la clarificare.

Având în vedere că în sucurile de citrice (portocale) există două pectinesteraze, una dintre ele fiind mai ușor inhibată decât cealaltă în prezența oligomerilor cu grad de polimerizare scăzut (DP=8-10), s-a propus stabilizarea tulburelii prin inhibarea pectinesterazei cu ajutorul hidrolizatelor pectice ce conțin resturi de acid poligalacturonic cu un grad de polimerizare 8 – 15. Se consideră că masa moleculară a hidrolizatelor este suficient de mare pentru a inhiba pectinesteraza, dar nu suficient de mică pentru a cauza clarificarea sucului prin precipitarea Ca2+ sub formă de pectați insolubili. Practic, este foarte ușor să se prepare hidrolizate de acid pectic cu lungime de lanț dorită, după care să se adauge hidrolizatul în sucul ce trebuie să fie stabilizat din punct de vedere al tulburelii, eliminându-se astfel tratamentul enzimatic și cel termic.

Folosirea enzimelor pectolitice pentru recuperarea sucului din pulpa de fructe după extracția primară. Extracția sucului de citrice, în special de portocale, implică tăierea în jumătăți a fructelor și presarea acestora, sucul brut obținut fiind trecut într-un finisor, după care este supus tratamentului termic pentru stabilizare și apoi este răcit. Materialul ce rămâne la presare, precum și cel obținut din finisarea sucului brut, conține pulpă care constă din vezicule cu pereții rupți (saci). Pulpa poate fi prelucrată în continuare pentru recuperarea de substanță uscată solubilă, cunoscută sub denumirea de „apă de pulpă” sau, mai corect, suc secundar.

Recuperarea acestui suc secundar se face prin „spălarea” pulpei cu apă în contracurent, obținându-se un suc cu concentrația 5-7% Brix, ce poate fi concentrat, de regulă, până la 25 – 35% Brix (maximum 50% Brix), deoarece la o concentrare mai avansată vâscozitatea crește foarte mult (până la 20000 cP),· având consistență de gel.

Dacă pulpa se tratează cu enzime pectolitice, se mărește cantitatea de substanțe recuperate cu 15 – 18% față de metoda extracției cu apă în contracurent, sucul obținut putând fi concentrat până la 70% Brix, fără pericolul gelificării, vâscozitatea acestui suc fiind – 2000 cP.

Pentru ca și sucul secundar obținut prin extracție cu apă în contracurent să poată fi concentrat până la 70% Brix, este necesar să fie tratat cu enzime pectolitice pentru scăderea vâscozității. Se utilizează preparate pectolitice cu activitate poligalacturonazică mare, dar și cu activitate pectinesterazică redusă, deoarece este de dorit reducerea vâscozității lichidului fără pierderea stabilității tulburelii. Preparatul pectolitic se adaugă în proporție de 50 – 500 mg/kg, durata acțiunii fiind de 30 – 60 min. Sucul secundar concentrat poate fi utilizat ca agent de tulbureală, ca aromatizant sau la fabrica rea băuturilor răcoritoare.

Recuperarea uleiului esențial din coaja citricelor. Prin presarea cojilor de citrice în prezența apei se obține o emulsie de tipul U/A (ulei/apă) diluată, care trebuie concentrată prin centrifugare, în final obținându-se uleiul esențial. Dacă se folosesc enzime pectolitice, se recuperează o cantitate mai mare de ulei esențial. În practică se folosește o enzimă pectolitică în proporție de 200 – 2000 mg/kg emulsie concentrată la 35 – 50% ulei esențial ce provine de la prima centrifugare.

Tratamentul se face la temperatura de 27 … 38°C, pentru o durată de 4 – 6 ore. Trebuie avut în vedere că pH-ul trebuie să fie-3,2, deoarece în cazul emulsiei de portocale diluate aceasta fermentează ușor în 1-2 ore și se acrește, uleiul esențial căpătând miros nedorit. Emulsia diluată de lămâie, având un pH mai scăzut decât cea de portocale, fermentează mai greu, deci are o stabilitate mai bună. Prin tratament cu enzime pectolitice se recuperează o cantitate mai mare de ulei din emulsia U/A, deoarece emulsia este spartă prin degradarea substanțelor pectice solubile până la compuși care nu mai pot acționa ca emulgatori și stabilizatori.

Obținerea agentului de tulbureală din coaja citricelor. Materia primă o constituie cojile de citrice care se mărunțesc în prezența unei cantități mici de apă. Prin tratarea amestecului respectiv cu enzime pectolitice depolimerizante se eliberează agentul de tulbureală (pectine solubile). Amestecul se tratează apoi termic pentru inactivarea enzimelor pectolitice, după care agentul de tulbureală se recuperează prin centrifugare și se concentrează. Produsul finit se stabilizează prin pasteuriza re sau cu ajutorul unui agent chimic. Agentul de tulbureală are gust mai mult sau mai puțin amar, în funcție de proveniența cojilor (portocale, lămâi, grepfruturi) și are tendința de a se brunifica în timpul depozitării. Prin păstrarea produsului în stare refrigerată, îmbrunarea este mult mai redusă. Concentratul se folosește ca agent de tulbureală în stare diluată. Având în vedere variațiile compoziționale ale cojilor de la șarjă la șarjă, nu există posibilitatea standardizării agentului de tulbureală concentrat.

Hidroliza flavonoidelor (dezamărârea sucurilor). În citrice se găsește o gamă destul de largă de flavonoide sub formă de glucozide ce se pot separa ca cristale în sucurile de grapefrut și de portocale. În grapefrut, în portocalele acre și amare (Citrus auranticus, Natsudaidat) predomină naringina (amară), iar în portocalele dulci, în lămâi și în unele specii de mandarine predomină hisperidina.

Naringina este 7-(2-ramnozid-β-glucozid) 4', 5, 7' trihidroxiflavonă iar hesperidina este 7-(6-ramnozid β-glucozid) 4' – metoxi – 3',5,7 trihidroxiflavonă.

În procesul maturării grapefrutului are loc o scădere a concentrației de naringină, deci o diminuare a gradului de amăreală. Diminuarea amărelii ar fi consecința transformării naringinei în roifolin, care este ramnoglucosidul naringinei (4', 5,7 trihidroxiflavona), dar și consecința diluării flavonoidelor o dată cu creșterea masei fructelor. La prelucrarea fructelor, naringina trece din albedo și din membrane în suc, mai ales, atunci când se folosesc presiuni mari în vederea obținerii unui randament superior în suc și a unei extracții mai mari a culorii. Prin folosirea unor preparate enzimatice pectolitice din Aspergillus niger, care conțin naringinază, se poate reduce gradul de amăreală al sucului de grapefrut, la pH=4 și la temperatura de 50°C. Domeniul de pH pentru activitatea naringinazei este între 3,5 și 5, iar cel de temperatură între 20 și 60°C. Preparatul conțin o ramnozidază care hidrolizează naringina la ramnoză + prunină și o β-glucozidază care hidrolizează prunina la naringenină și glucoză.

Prin adaos de glucoză sau glucono-δ-lactonă se inhibă activitatea β-glucozidazei și se acumulează prunină. Sucul de grapefrut, ce conține glucoză, tratat cu naringinază este mai puțin amar decât cel fără glucoză.

Ramnozidaza este inhibată de ramnoză. Se pot obține preparate de naringinază la care activitatea pectinazică este foarte redusă, prin distrugere selectivă a activității pectinazice în urma unui tratament cu uree și incubare la 37°C, timp de 2 ore, la pH = 8. Sursele de naringinază sunt: Coniella diplodiella, Sclerotina libertiana, Aspergillus usamii, Shirousami, Aspergillus Saitoi varietatea Kagoshimaensis, Cochiobolus myabeanus, Rhizoctonia solanii, Phopsis citri.

S-a realizat o bună dezamărâre a sucului de grapefrut prin adaos de 0,01 – 0,05% preparat naringinazic și incubare 1 – 4 ore la + 5°C sau 44 ore la 5șC la pH-ul natural al sucului. Pectinesteraza proprie sucului trebuie inactivată termic înainte de adaosul preparatului naringinazic, pentru a se menține stabilitatea tulburelii.

Hidroliza flavonoidelor este practicată, în special, în Japonia pentru dezamărârea conservelor de portocale amare (Natsudaidat), în care caz dezamărârea enzimatică a produselor se realizează prin termostarea acestora la 30°C, timp de 2 săptămâni la temperatura camerei. În cazul sucului de portocale amare ambalat în cutii, este suficientă o termostatare la 30°C, timp de 2 ore. Preparatul naringinazic nu este eficace dacă drept îndulcitor se utilizează ciclamatul care inhibă naringinaza. Zaharina și dulcina nu au efect de inhibare semnificativ asupra naringinazei.

Obținerea de pectine slab metoxilate. Se cunoaște că pectinele slab metoxilate (LMP) au proprietatea de a forma geluri stabile în prezența cationilor bivalenți (Ca2+) și la concentrații mult mai mici de zahăr decât cele necesare la obținerea gelurilor din pectine normale, din cauza numărului mare de grupările carboxil capabile să reacționeze cu ionii bivalenți într-un domeniu larg de pH.

Pectinele slab metoxilate pot fi obținute prin hidroliza parțială acidă sau alcalină a esterilor metilici prezenți în pectină. Se utilizează și demetilarea cu amoniac în alcool. Demetilarea poate fi realizată și enzimatic cu pectinesteraza fungică. Preparatul enzimatic trebuie să fie liber de poligalacturonază, ceea ce poate fi realizat prin tratamentul preparatului brut (care conține și poligalacturonaza) cu uree. Pectinmetilesteraza fungică are un pH optim în domeniul acid (pH-ul sucului de fructe citrice). Dacă se dorește să se obțină pectine slab metoxilate care să producă geluri la pH neutru, se utilizează o prctin metilesterază din tomate. Materia primă în cazul fructelor citrice o constituie cojile care se amestecă cu apă, iar amestecul bine omogenizat se supune acțiunii pectinmetilesterazei timp de câteva ore.

Produsele finite sub formă de pulbere se utilizează ca stabilizatori în produsele de carne cu structură omogenă și ca agenți de îngroșare și gelificare în produsele pe bază de fructe precum și în pudding-uri

Folosirea microorganismelor la conservarea produselor vegetale

Conservarea prin acidificare naturală, denumită și conservare biochimică sau murare, se aplică în special produselor vegetale (legume și mai rar fructe cereale) și prezintă următoarele avantaje:

obținerea unui produs stabilizat la un cost de transformare redus;

conduce la obținerea unor produse cu calități senzoriale dorite, datorită în principal aromei deosebite obținute prin fermentare;

ameliorarea calității nutritive prin producerea de vitamine din grupul B și de aminoacizi;

reprezintă un mijloc de a prelungi sezonul de prelucrare a produselor vegetale și de a oferi consumatorului produse vegetale și în timpul sezonului de iarnă;

consumurile energetice sunt foarte reduse, în comparație cu alte metode de conservare.

Principiul fermentării produselor vegetale se bazează pe selecția bacteriilor utile (bacterii lactice), realizată de saramură, care au capacitatea de a transforma zaharurile existente în materiile prime vegetale în acid lactic, care scade pH-ul și deci stabilizează produsul. Acțiunea bacteriilor se poate derula concomitent cu a drojdiilor, iar însămănțarea mediului poate fi spontană (microflora lactică provine de la materii prime și auxiliare) sau controlată (se utilizează culturi starter singulare sau mixte).

Pentru conservare prin acidificare naturală sunt necesare: materii prime, NaCl, apă, aditivi de conservare, amelioratori de aromă.

Materiile prime. Acestea pot fi: varză aibă, castraveți, măsline (se murează ca produse singulare), pătlăgele roșii imature (gogonele), ardei grași kapia, pepeni verzi, morcovi, andive, ceapă, fasole verde, porumb, sfeclă roșie, inclusiv sucuri obținute din unele produse vegetale. În tabelul 15.42. este prezentată compoziția chimică a celor mai importante produse vegetale ce se murează.

Tabelul 15.42.

Compoziția chimică a unor produse vegetale ce se supun conservării prin acidificare naturală

La produsele vegetale menționate, în afară de valoarea nutritivă – energetică, interesează calitatea sanitară (gradul de prospețime, curățenia, încărcătura microbiologică) și calitatea senzorială comercială (consistența, aspectul general, aroma). De exemplu, se preferă castraveți mici (cornison), cu lungime < 10 cm, de formă cilindrică sau ovoidală, de culoare verde închis, nepătați de boli criptogamice, recoltați în stadiul de maturitate comestibilă (cu conținut de zaharuri fermentescibile de minimum 1 %).

Varza pentru murat trebuie să fie sănătoasă, ajunsă la maturitate, îndesată, cu un conținut de zahăr fermentescibil de minimum 2%.

Tehnologia de obținere a produselor vegetale conservate prin acidificare naturală constă în următoarele operații: clasare pe mărimi, pregătirea materiilor prime, așezare în recipiente, saramurare, fermentare, depozitare.

Clasarea pe mărimi este necesară pentru a obține produse uniform fermentate. Operația de pregătire a materiilor prime este în funcție de felul acestora. În general, toate produsele menționate (cu excepția verzei albe) se supun operației de spălare în scopul îndepărtării impurităților și în mare parte a microflorei epifite, inclusiv a microorganismelor de alterare. La castraveți se recomandă și înțeparea lor pentru a ușura pătrunderea saramurii.

Varza este inițial lăsată 1-3 zile în stive pentru o autoîncălzire ce înlesnește fermentarea ulterioară, datorită înmuierii țesutului, după care este curățată de foile exterioare, putând fi murată întreagă, în jumătăți sau mărunțită. Dacă se murează întreagă se perforează coceanul cu un sfredel. Dacă se murează ca varză tocată, se supune mărunțirii și coceanul care reprezintă ~ 10% și care este bogat în zaharuri și vitamină C. Măslinele verzi sunt tratate cu alcalii pentru a îndepărta substanțele amare și anume glucozidele fenolice și oleuropeina.

După tratamentul cu alcalii, măslinele se spală intens pentru îndepărtarea alcaliilor. Măslinele: verzi pot fi tratate termic (șoc) la 74°C, timp de 3 min, fapt ce conduce la îmbunătățirea proprietăților de fermentare.

NaCl. Rolul principal al NaCl este de a realiza o plasmoliză a țesuturilor pentru eliberarea de susbtante nutritive în saramura de acoperire, necesare dezvoltării bacteriilor lactice. NaCl din saramură conduce și la inactivarea enzimelor pectinolitice și celulolitice proprii țesuturilor vegetale și realizează o selecție a bacteriilor lactice pentru inițierea fermentării. Dintre oligoelemente, este necesară prezența manganului care stimulează dezvoltarea bacteriilor lactice.

Concentrația de NaCl în saramură variază în limite largi (0,5-11%), în funcție de produs, dar, de regulă, este de 1,5 – 3%.

Apa. Apa potabilă clorinată trebuie fiartă împreună cu NaCl pentru a face saramura. Proporția de saramură adăugată, în raport cu greutatea produselor ce se murează, variază între 10 și 50%. În orice caz, produsele ce se murează trebuie să fie complet acoperite de saramură.

Aditivi de conservare. În unele cazuri, se adaugă acid acetic pentru a modifica rapid pH-ul, precum și acetat de calciu sau de sodiu pentru a se evita fenomenul de ramolisment. Pentru a prelungi durata de conservare, se poate adăuga sorbat de Na sau K, respectiv benzoat și hrean.

Amelioratori de aromă. Pentru a îmbunătăți aroma produsului murat inclusiv a zemii respective, se adaugă diferite plante condimentare (mărar uscat, hrean, țelină frunze, frunze de vișin etc.).

15.5.1. Procesele fermentative

Specii implicate. La fermentarea spontană a produselor de origine vegetală sunt prezente în funcție de etapa fermentării diverse bacterii neutil și utile, în funcție de gradul inițial de contaminare care poate ajunge la 107 germeni/g din care 5×103/g sunt germeni producători de acid lactic. Gradul inițial de contaminare va depinde de calitatea spălării vegetalelor și, eventual, de tratamentul termic aplicat. Saramura realizează o inhibare a bacteriilor Gram-negative sau Gram-pozitive. Printre bacterii le lactice utile mai importante sunt: specii de Lactobacillus (Lactobacllus plantarum, Lactobacillus brevis), Leuconostoc (Leuconostoc mezenteroides), Pediococcus (Pediococcus pentosaceus, Pediococcus cerevisiae).

Fazele fermentației. Fazele fermentației cu influență pozitivă asupra calității produselor finite sunt următoarele:

faza de inițiere sau preliminară, în care predomină la început bacteriile Gram (+) și Gram (-) care dispar cu timpul, lăsând loc bacteriilor lactice, în special bacteriilor lactice heterofermentative (Leuconostoc mezenteroides). Bacteriile Gram-negative aparțin genurilor Aerobacter, Escherichia, Aeromonas, Achromobacter, în cazul fermentării măslinelor, și genurilor Achromobacter, Alcaligenes și Pseudomonas, în cazul morcovi lor și sfeclei roșii. Unele bacterii Gram (-) pot conduce la diminuarea conținutului de azotat din produsele ce se murează, iar altele pot excreta în mediu enzime pectolitice. Anumite bacterii Gram (-), cum ar fi cele din genul Clostridium, sunt responsabila de fermentația butirică, în timp ce bacteriile din genul Baccillus pot provoca ramolismentul produselor murate. Spre sfârșitul fazei de inițiere (preliminară) , bacteriile lactice heterofermentative (Leuconostoc mezenteroides) fermentează deja glucidele, cu formare de acid lactic, acetic, alcool etilic, manitol, CO2. Se creează un mediu anaerob propice dezvoltării bacteriilor lactice homofermentative. La începutul fazei de inițiere (preliminară) pot să acționeze într-o mică măsură și drojdiile și bacteriile acetice, dar activitatea lor este rapid stopată prin crearea mediului anaerob. Faza de inițiere, care durează 2-3 zile, este caracterizată prin degajare mare de CO2, iar activitatea mediului (saramurii) ajunge la 0,7- 1 %, raportul acid acetic/acid lactic fiind 0,4;

faza de fermentație primară (principală), care este caracterizată prin predominanța bacteriilor lactice homofermentative (Lactobacillis plantarum, Pediococcus pentosaceus) față de cele heterofermentative (Lactobacillus brevis și Leuconostoc mezenteroides). În această fază se transformă în acid lactic glucidele fermentescibile rămase de la prima fază, inclusiv manitolul format în faza preliminară. Degajarea de CO2 în faza primară este foarte redusă.

Această fază durează 21-30 de zile, în funcție de diverși factori (concentrația saramurii, temperatura de fermentare, gradul de anaerobioză realizat etc.). Fermentația primară este considerată terminată când pH-ul mediului a ajuns la 3,8 – 4,1 (aciditate totală = 2%). Se consideră că la sfârșitul fazei primare acționează în principal, Leuconostoc pentosaceus (heterofermentativ), producând din nou acid acetic, acid lactic, manitol și CO2.

Influența negativă asupra calității produselor finite are următoarele două faze:

faza de fermentație secundară, care constă în fermentarea glucidelor reziduale de către drojdiile fermentative, în condițiile în care bacteriile lactice sunt inhibate de către pH-ul scăzut (aciditate ridicată). Principalele specii de drojdii fermentative întâlnite într-un mediu privat de aer sunt: Sacch. rosei, Sacch. bailli, Sacch. delbrueckii, Torula etchellsii și Hansenula anomalia. Principalele drojdii oxidative sunt: Debariomyces, Pichia; Sacch. rouxi și Candida. Alte specii de drojdii fermentative – oxidative pot existat în număr mic (Rhodotorula). Zeama, în faza de fermentare secundară, prezintă o ușoară tulbureală;

faza de postfermentare. Dacă produsele vegetale sunt bine fermentate (faza primară reușită) și recipientele sunt ermetic închise, ferite deci de aer și de lumină difuză, acestea se pot păstra foarte bine, mai ales la temperaturi de 4…10șC. Atunci când recipientele sunt deschise, se pot infecta la suprafața saramurii cu drojdii oxidative, mucegaiuri și bacterii aerobe. Drojdiile și mucegaiurile consumă acidul lactic, creând condiții pentru dezvoltarea bacteriilor de alterare. Mucegaiurile sunt deosebit de periculoase, deoarece secretă enzime pectolitice care afectează consistența produselor conservate prin acidificare. În ordinea descrescândă a importanței, mucegaiurile de infecție sunt: P. oxalicum, Aseoehyta cueumis, Fusarium roseum, Cladosporium cladosporoides, Altemaria tenuis, Fusarium oxysporium, Fusarium solani.

Factorii care influențează acidificarea naturală a produselor vegetale.

Acești factori sunt următorii:

concentrația saramurii;

temperatura de fermentare;

disponibilitatea substanțelor nutritive;

prezența inhibitorilor care se găsesc în substrat;

aditivii de natură chimică întrebuințați;

prezența aerului și a luminii;

aciditatea, pH-ul și capacitatea tampon a mediului.

Adaosul de sare. La acidificarea naturală a produselor vegetale, adaosul de sare este necesar în scopul:

influențării directe a tipului de bacterii ce se dezvoltă (rol selectiv față de microorganisme, cele homofermentative fiind halotolerante);

influențării gradului de acidificare;

prevenirii înmuierii produselor;

extragerii parțiale prin difuzie a sucului celular ce conține substanțe solubile, în special glucide fermentescibile, extracția fiind evidentă în cazul produselor mărunțite (varza tocată).

Varza aibă tocată se sărează cu 2-3% NaCl, castraveții se introduc în saramura de 5-8%, iar măslinele verzi în saramura de 4-7%. Varza albă în căpățâni se murează în saramură de 5-6%. Concentrația de NaCl va influența, la rândul său, dezvoltarea unei specii sau a alteia de bacterii lactice.

Astfel, la acidificarea naturală a verzei tocate, în faza primară, se dezvoltă L. mezenteroides care suportă concentrații mai mici de NaCl. Acest microorganism nu se dezvoltă la acidificarea naturală a castraveților sau a măsline lor verzi, probabil din cauza concentrației mari de NaCl. Pentru a se realiza o acidificare a castraveților la concentrații mai reduse de sare (1 – 4%), fără a se ajunge la înmuierea acestora, se recomandă să se folosească o apă cu duritate de ~ 20° germane, deoarece în caz contrar consistența va fi redusă. La folosirea apei cu duritate ~ 10° germane, se recomandă să se adauge clorură de calciu (CaCl2, 0,3-0,5% față de saramură), alaun de potasiu (~0,5% față de saramură) sau acetat de calciu. Se formează în aceste condiții cantități mai mari de pectat de calciu insolubil, care conferă consistența optimă castraveților. În aceste condiții, în faza primară de fermentație a castraveți lor, acționează L. mezenteroides.

Temperatura de fermentare. La acidificarea naturală a vegetalelor se utilizează bacterii lactice mezofile cu temperatura optimă de dezvoltare de 28…30°C, care nu se pot multiplica la temperaturi mai mari de 40°C.

Dezvoltarea lui L. mezenteroides este favorizată de temperaturi mai scăzute în comparație cu temperaturile mai ridicate care favorizează dezvoltarea lui L. plantarum. L. mezenteroides predomină atât în faza preliminară cât și în cea primară de fermentație a verzei tocate, dacă temperatura de fermentare este cuprinsă între 7,5 și 18°C. Dacă fermentarea este condusă la 32 și 31șC, predominanța lui L. mezenteroides se manifestă în faza preliminară, după care în faza primară începe să predomine L. plantarum.

Varza tocată fermentată la 13…18°C are o calitate superioară față de cea fermentată la 24°C, deoarece bacterii le lactice heterofermentative au o acțiune mai mare la temperaturi mai scăzute. Pentru castraveți se recomandă o temperatură de fermentare de 25…30°C, când L. plantarum și P. pentosaceus fermentează rapid. La noi în țară se recomandă ca acidificarea naturală să se facă la temperaturi de 20 … 25°C. La sfârșitul fermentației lactice se recomandă ca temperatura să fie scăzută cât mai mult posibil (0…5°C pentru castraveți și < 14°C pentru varză), pentru a împiedica celelalte tipuri de fermentații, în special cea butirică și alterarea putrefactivă.

Disponibilitatea substanțelor nutritive. Pentru bacterii le lactice, aceasta va depinde în mare măsură de tratamentele preliminare pe care le suferă produsele vegetale înainte de saramurare și de fermentare. Substanțele nutritive sunt imediat disponibile în cazul verzei tocate, în timp ce în cazul castraveți lor și al măslinelor, acestea trebuie să difuzeze în saramură înainte de a începe fermentația. Se consideră că bacteriile lactice se dezvoltă atât în saramură cât și în interiorul castraveți lor. În cazul măslinelor care conțin între 2 și 3% zahăr fermentescibil, prin tratament cu alcalii se reduce cantitatea de substanțe nutritive disponibile (inclusiv glucidele) și, deci, se influențează negativ fermentația lactică.

De exemplu, producătorii californieni folosesc metode prin care se penetrează total măslinele verzi cu alcalii și din această cauză se îndepărtează foarte multe glucide, pentru fermentare adecvată fiind necesar un adaos de glucoză. Producătorii spanioli folosesc metode prin care penetrează numai din pulpa fructului și din această cauză se păstrează o cantitate satisfăcătoare de glucide pentru fermentația lactică, produsul finit având însă și un anumit grad de amăreală, ceea ce este preferat de unii consumatori.

Inhibitorii care se găsesc în mod natural în produsele vegetale. În varză .se găsesc anumiți inhibitori ai bacteriilor Gram (-), dar care nu inhibă și bacteriile lactice. Măslinele verzi conțin inhibitori ai bacteriilor lactice, aceștia fiind compuși de hidroliză ai oleuropeinei (agliconul și acidul elenolic). Oleuropeina din măslinele verzi este hidrolizată de către β-glucozidază. Prin tratamentul măslinelor cu alcalii sau cu șoc termic, înainte de saramurare-fermentare, se distruge β-glucozidaza și, deci, oleuropeina rămâne intactă, neavând proprietatea de inhibare a bacteriilor lactice.

Având în vedere că pentru condimentarea produselor vegetale murate se adaugă mărar uscat, frunze de vișin, de stejar, muștar, hrean, usturoi, trebuie să se țină cont și de influența fitoncidelor, respectiva unor substanțe tanante asupra bacteriilor lactice și asupra microflorei de însoțire.

Aditivi de natură chimică. La acidificarea naturală se folosesc acidul benzoic, acidul sorbic, bisulfitul de potasiu. De regulă, acești conservanți se adaugă după terminarea fermentației lactice pentru împiedicarea dezvoltării drojdiilor și mucegaiurilor la suprafața saramurii, o dată ce recipientele au fost deschise. Asemenea conservanți sunt folositori în cazul depozitării produselor murate în recipiente mari.

Prezența aerului și luminii. Pentru a avea o fermentație lactică normală, este necesar să se creeze un mediu anaerob care este, în același timp, defavorabil dezvoltării bacteriilor acetice, mucegaiurilor și drojdiilor. Mediul anaerob este, însă, favorabil dezvoltării bacteriilor propionice care nu influențează negativ calitatea produselor, dar și dezvoltării bacteriilor butirice împotriva cărora se luptă prin vânturarea (pritocirea) zemii, mai ales la finele fazei primare de fermentație lactică.

Anaerobioza favorizează și dezvoltarea unor bacterii de alterare, dar împotriva acestora se luptă prin creșterea acidității (creșterea conținutului de acid lactic), astfel ca pH-ul să fie 3,8 – 4,1.

La murarea verzei tocate sau în bucăți, tasarea, pe lângă faptul că înlesnește difuzia sucului celular și mărește gradul de folosire a capacității recipientelor, ajută și la crearea mediului anaerob. Lumina solară împiedică dezvoltarea microorganismelor la suprafața salamurilor în cazul recipientelor deschise, însă cea difuză favorizează această dezvoltare, Lumina solară directă conduce la decolorarea produselor verzi, în cazul în care acestea au fost ambalate în recipiente de sticlă necolorată.

Fermentația propriu-zisă. Substratul fermentativ îl formează glucoza, fructoza și zaharoza, pentozele libere prezente în produsele vegetale neavând semnificație cantitativă în fermentație. În anumite cazuri, manitolul poate fi luat în considerare ca substrat în homofermentația verzei tocate, el formându-se în heterofermentația verzei tocate. De menționat că manitolul se găsește în cantități mai mari în unele produse vegetale, cum ar fi ciupercile.

Bacteriile lactice implicate în acidificarea produselor vegetale fermentează pe două căi și anume:

lactobacilii fermentativi (L plantarum și pediococii) metabolizează hexozele pe calea glicolizei, producând, în principal, acid lactic (85-95%). Pe această cale se formează 2 moli de ATP/mol hexoză. Balanța electronică este asigurată prin reducerea NAD+ la NADH în reacția de transformare a triozofosfatului în piruvat, respectiv prin oxidarea NADH în NAD+, în reacția de transformare a piruvatului în lactat. De fapt, L plantarum este considerată ca bacterie lactică facultativ homofermentativă, deoarece este capabilă să producă glucozo 6-P-dehidrogenază, 6-P-gluconat – dehidrogenază și fosfocetolază, cu ajutorul căreia este implicat în fermentarea pentozelor;

bacteriile lactice heterofermentative (L. mezenteroides, L. brevis) transformă un moi de glucoză în acid lactic, acid acetic și CO2. Se formează în acest caz numai 1 mol ATP/mol hexoză, respectiv 3 moli NADH/mol hexoză (1 mol NADH este oxidat prin reducerea piruvatului la acid lactic). Fructoza poate fi fermentată ca și glucoza de către bacterii le lactice heterofermentative, dar și acest glucid poate funcționa și ca un acceptor de electroni în oxidarea NADH la NAD+ rezultatul fiind acela că o mare parte din fructoză se transformă în manitol.

În heterofermentație, pe lângă acid lactic se produce CO2, acid acetic, alcool etilic, manitol, în funcție de zahărul de la care s-a plecat.

În homofermentație, producția de acid lactic este mare:

Din cele menționate rezultă că nivelul de acid lactic produs în sub fermentat va depinde de raportul bacterii homofermentative/bacterii heterofermentative. Producția de acid acetic în mediu va fi determinată de dezvoltarea bacteriilor lactice heterofermentative și de potențialul reducător al substratului, care determină, la rândul său, raportul acetat/etanol.

În timp ce acidul lactic are o valoare pK scăzută, rezultând o valoare scăzută a pH-ului, deci o contribuție în controlul microflorei nelactice (de alterare și patogenă), acidul acetic este mai eficace în prevenirea dezvoltării mucegaiurilor asociate cu înmuierea vegetalelor (castraveților). De remarcat că L. mezenteroides produce numai acid lactic D(-), iar L. brevis, L. plantarum și P pentosaceus produc ambii izomeri lactici: D(-) și L (+). Ambii izomeri sunt metabolizați de mamifere, izomerul D(-) fiind metabolizat însă mai lent. Conform recomandărilor FAO/WHO în produsele alimentare destinate copiilor (< 3 ani) nu trebuie să existe izomerul D(-) sau racemicul DL. În cazul adulților, consumul de izomer D(-) nu trebuie să depășească 100 mg/kilocorp și zi. În recomandările FAO/WHO din 1974, nu mai există limită pentru nivelul de acid lactic D(-) ingerat de omul adult.

Reacții produse de bacterii lactice în prezența oxigenului. Se cunoaște că bacteriile lactice sunt anaerobe sau facultativ anaerobe, incapabile să sintetizeze hem, deci sunt lipsite de citocromi și catalaze cu hem în structură (excepție făcând cazul în care hemul este suplimentat în mediu). Față de acțiunea nocivă a H2O2, L. plantarum, L. pentosaceus și L. mezenteroides folosesc ionii de mangan. Se crede că L. plantarum ar poseda și o pseudocatalază care conține mangan. Bacteriile lactice pot realiza o serie de reacții oxidative catalizate de enzimele flavonice. De exemplu, L. plantarum și L. delbrueckii au o flavin-piruvat-oxidază care catalizează transformarea piruvatului în acetil fosfat, CO2 și H2O2. Acetil fosfatul este folosit în continuare pentru producerea de ATP. L. curvatus, L. sake, L. acidophilus, L. lactis, L. bulgaricus au o lactatoxidază care reduce O2 la H2O2. Excesul de electroni poate fi îndepărtat (fără producere de ATP) prin intermediul NADH-oxidazei, care catalizează formarea de H2O2 la H2O.

Folosirea culturilor starter la fermentarea produselor vegetale. Culturile starter pot fi utilizate cel puțin pentru demararea fermentației lactice, astfel ca bacteriile lactice de contaminare să nu aibă timp de multiplicare pentru a produce substanțe nedorite.

La folosirea culturilor starter pentru demararea fermentației lactice se pot obține produse finite de o calitate mai omogenă și ameliorată. Criteriile de selecție pentru bacterii le lactice din culturile starter sunt următoarele:

dezvoltarea la temperatura ambiantă în zonele geografice de producție;

dezvoltarea rapidă și predominantă;

producerea rapidă de acid lactic;

conversia totală a zaharurilor în acid lactic;

producția redusă de CO2;

rezistența la bacteriofagi;

capacitatea de a crește valoarea nutrițională a produselor finite (producerea de vitamine din grupul B și aminoacizi);

utilizarea sub formă deshidratată, concentrată sau liofilizată.

Limitarea folosirii culturilor starter la nivel industrial s-ar datora următoarelor cauze:

nu s-a realizat o cultură starter de bacterii lactice care să satisfacă din toate punctele de vedere (capacitate de acidificare, formare de aromă etc.);

nu s-au putut obține tulpini de bacterii lactice în cantități suficiente pentru utilizare industrială;

recipientele de fermentare folosite în prezent nu sunt adecvate unui proces anaerob;

manipulările materiilor prime conduc la contaminarea acestora și nu pot fi folosite mijloace adecvate de distrugere a microflorei spontane de pe produsele vegetale ce urmează a fi fermentate cu cultură starter (tratamentul termic de distrugere a microflorei spontane este greu de aplicat la nivel industrial și dacă este aplicat poate conduce la modificarea caracteristicilor senzoriale ale materiilor prime vegetale);

produsele vegetale au o microfloră naturală, care, dacă este bine dirijată prin concentrația de NaCl în saramură și prin temperatura de fermentare, realizează o lactofermentație bună;

saramura folosită la fermentație poate fi utilizată ca inocul pentru o nouă șarjă.

Culturile starter folosite la fermentarea produselor vegetale sunt prezentate în tabelul 15.43.

Tabelul 15.43.

Culturile starter folosite la fermentarea produselor vegetale

Aroma, textura și aspectul produselor vegetale fermentate. În cazul măslinelor verzi fermentate, contribuția bacteriilor lactice la aromă ar consta în producerea unui nivel dorit de aciditate prin folosirea zaharurilor fermentescibile (contribuția la gust). Acetaldehida și alcoolul etilic rezultați în fermentație contribuie la miros.

Aroma murăturilor (gogonelelor) s-ar datora unui complex de substanțe volatile. Substanțele volatile detectate au fost formaldehida, acetaldehida, aldehida propionică, acetona, aldehida butirică, alcoolul etilic, butiratul de etil și aldehida izovalerianică. Cea mai mare influență a bacteriilor lactice asupra aromei s-a constatat în cazul verzei albe tocate. În acest caz, o aromă plăcută este asociată cu un anumit raport de acizi volatili/acizi nevolatili.

La varza tocată se preferă dezvoltarea lui L. mezenteroides în faza preliminară a fermentației, pentru că acesta formează cantități mari de acid acetic. Din acest motiv, în faza preliminară a fermentației se recomandă o temperatură de 18°C, deoarece o temperatură superioară favorizează dezvoltarea lui L. plantarum care, prin fermentarea glucidelor, conduce la un raport mai scăzut de acizi volatili/acizi nevolatili. Din cauza acestui raport, pH-ul va fi mai scăzut, aciditatea mai mare, produsul având o aromă puternic acidă, în comparație cu produsul fermentat la temperaturi mai scăzute care are o aromă mai fină, mai puțin acidă.

În ceea ce privește textura, există indicații că, o dată cu creșterea concentrației de acid acetic, produsul devine mai moale (mai puțin consistent). La aceeași concentrație, acidul lactic are un efect de înmuiere mai pronunțat decât acidul acetic, și aceasta din cauză că acidul lactic are capacitatea de a îndepărta mai mult Ca2+ din substanțele pectice în comparație cu acidul acetic.

Măslinele verzi fermentate cu L. mezenteroides au o consistență mai mare decât cele fermentate cu L. plantarum. În general, consistența variază invers proporțional cu procentul de aciditate titrabilă (exprimată ca acid lactic).

Rezultă că tipul de fermentație lactică dictează cantitate a de acid lactic format și, prin urmare, influențează consistența produsului.

Desigur că o influență deosebită asupra consistenței o are și concentrația saramurii care controlează tipul și gradul de dezvoltare al microorganismelor, respectiv activitatea enzimelor pectolitice de origine microbiană sau cele care se găsesc în vegetalele supuse acidificării natura le. De asemenea, trebuie să se aibă în vedere concentrația de Ca2+ din saramură și temperatura de depozitare a produsului În timpul fermentației și postfermentației.

În anumite condiții, aspectul produselor fermentate este modificat prin apariția de pustule la suprafața castraveți lor și măslinelor verzi, precum și prin apariția de cavități în interiorul castraveților.

Valoarea nutritivă a produselor vegetale fermentate. La judecarea valorii nutritive a produselor vegetale trebuie să se aibă în vedere, în primul rând, conținutul în vitamine, în special în β-caroten, acid ascorbic, acid folic și mai puțin în vitamine din grupul B. Produsele vegetale au și un conținut ridicat de fibră (celuloză) precum și cantități importante de Na, K, Ca, Mg. Importanța legumelor și fructelor rezidă din acțiunile pe care le pot îndeplini acestea: alcalinizantă, mineralizantă, laxativă, constipantă, diuretică și de stimulare a funcțiilor hepatice (ureopoieza și glicogeneza), vitaminizantă.

Prin acidificarea naturală, în saramura folosită trec o serie de substanțe nutritive (săruri minerale, vitamine, aminoacizi liberi, glucide simple), ceea ce face ca valoarea nutritivă a acestor produse să scadă. În plus de aceasta, trebuie să se aibă în vedere că bacteriile lactice folosite pentru fermentație au nevoie de substanțe nutritive pe care le consumă tot din substratul supus fermentației. S-a dovedit că, la fermentarea sucului de castraveți cu L. plantarum, s-ar pierde între 10 și 30% din conținutul inițial de acid pantotenic, leucină, izoleucină, valină, triptofan și cisteină.

Dacă produsele fermentate au și un conținut ridicat de NaCl (8-16%), la desărarea acestora până la 2 – 4% NaCl se accentuează pierderile și anume se pierde circa 86% din vitamina C, 82% din tiamină și 28% din caroten. Se consideră că în timpul acidificării naturale pot avea loc și transformări ale carotenului din forma trans în forma cis, care are o acțiune mai redusă ca provitamina A. Zeama de varză se îmbogățește însă în vitamina C în timpul fermentației lactice a verzei albe.

Disponibilitatea fierului din morcov crește la lactofermentația acestuia. Lactofermentația produselor vegetale conduce la micșorarea conținutului de azotat (provenit din soi), acțiune denitrifiantă având bacteriile care se dezvoltă în faza de inițiere.

În produsele fermentate se găsesc și amine biogene. De exemplu, în varza murată au fost puse în evidență: cadaverina, 28 mg/kg; histamina, 29 mg/kg; putresceina, 17 mg/kg și tiramina, 43 mg/kg. La morcovii și sfecla lactofermentate s-au pus în evidență 1 – 15 mg/kg amine biogene (în principal cadaverina). Microorganismele producătoare de amine biogene sunt: P.cerevisiae, L. mezenteroides și L. buchneri, care este un mare producător de histamină.

În schimb, Lactobacillus plantarum contribuie la reducerea conținutului de amine biogene. Se consideră că histamina și tiramina se formează în stadiul final al fermentării. Oprirea fermentației la un nivel de acid lactic de 0,8-1% conduce la evitarea formării aminelor menționate. Putresceina, cadaverina se formează în faza inițială de fermentare datorită Enterobacteriaceae-lor și enterococilor.

Defectele produselor vegetale lactofermentate. Principalele defecte ce se întâlnesc la produsele vegetale lactofermentate sunt prezentate în continuare.

Ramolismentul. Este un defect de consistență ce se datorează activității enzimatice pectolitice și celulolitice exercitate de mucegaiuri și de drojdiile oxidative, inclusiv de unele bacterii, la care se adaugă o activitate pectolitică proprie țesuturilor vegetale. Pentru a evita defectul se impune:

spălarea intensă a produselor vegetale înainte de saramurare;

respectarea concentrației saramurii de acoperire;

menținerea stării de anaerobioză în produs prin buna etanșare a recipientelor (se preferă recipiente cu capacitate redusă, pentru ca, după deschidere, produsele fermentate să fie consumate rapid);

menținerea produselor lactofermentate la temperaturi <10°C (4..10°C);

adaos de CaCl2.

Aspectul vâscos al zemii. Defectul este datorat prezenței în zeamă a unor polizaharide, de exemplu dextranul, care sunt produse din glucidele reziduale, în anumite condiții, de către unele bacterii lactice, cum ar fi Leuconostoc mezenteroides, Leuconostoc dextranicum, Lactobacillus collinoides și Pediococcus cerevisiae. Chiar produsul vegetal capătă aspect vâscos și moale asemănător albușului de ou crud (defectul se întâlnește la varza murată, morcovii murați, sfecla roșie murată).

Gust și miros dezagreabil. Acest defect este consecința dezvoltării microorganismelor de alterare, care infectează produsele în timpul fermentării și depozitării. Defectul este întâlnit la măslinele fermentate (boala Zapatera) și este cauzat de bacterii le genurilor Propionibacterium și Clostridium care formează acid propionic, butiric, valeric, caproic, caprilic. Defectul poate fi întâlnit și la alte produse vegetale lactofermentate la care, dacă predomină Lactobacillus brevis, apare gust și miros de acid acetic. În primul caz se impune: spălarea riguroasă a materiilor prime; folosirea unei concentrații adecvate a saramurii, demararea rapidă a fermentației lactice.

Modificarea culorii. La varza aibă murată, poate apărea culoarea roșie datorită drojdiei Rodotorula. La castraveți poate apărea o colorație galbenă, în unele cazuri, sau verde-oliv, în alte cazuri, în funcție de tratamentele efectuate.

Umflarea. Acest defect poate apărea la măsline și se datorează lui Clostridium tyrobutiricum, care produce fermentare butirică cu apariția de gaze în măsline. La măslinele verzi defectul se poate datora și bacteriilor coliforme, care se pot dezvolta în faza de inițiere, în condițiile în care concentrația saramurii nu este satisfăcătoare. La castraveți defectul se datorează acumulării de CO2 în țesut, cu producerea de cavități lenticulare mari.

Dioxidul de carbon se formează în heterofermentația lactică, dar este produs și de bacterii le lactice homofermentative prin decarboxilarea acizilor organici și a aminoacizilor, precum și de bacterii coliforme și drojdii.

Corelația dintre producția de CO2 și formarea cavităților în castraveții murați. La murarea castraveți lor, în anumite condiții în interiorul acestora apar cavități lenticulare, pe toată lungimea produsului, care constituie un defect· de fermentație. În general, s-a constatat că defectul este cu atât mai pronunțat cu cât concentrația de CO2 în saramură, respectiv în castraveți, este mai mare și cu cât temperatura de fermentare este mai mare. Defectul este mai pronunțat la castraveții mai mari și la cei cu densitate mai mică. Prezența cavităților în castraveți s-a constatat atât la niveluri de CO2 în saramură de suprasaturație cât și de saturație. Apariția defectului este dependentă și de raportul castraveți/saramură.

Mecanismul formării cavităților în castraveți. Se cunoaște că mezocarpul castraveților conține spații de aer intracelulare. Cantitatea de gaze din aceste spații reprezintă 5 – 9% în volume (75% N2 + 20% O2 + 5% CO2). Aceste gaze pot difuza în afară din castraveții proaspeți prin așa-numitele stomate și prin coaja acestora, astfel încât presiunea internă egalizează presiunea exterioară a mediului.

La murarea castraveților, saramura pătrunde prin coaja acestora și formează, încă din prima zi, un strat de lichid în mezocarp, imediat sub coajă, care constituie o barieră permeabilă selectivă la difuzia de N2 și CO2, în funcție de solubilitatea acestora, în stratul de lichid format în mezocarp. În consecință, o dată cu formarea acestui strat de lichid în castraveți sunt blocate gazele țesutului, în special N2. Având în vedere formarea de CO2 și în saramură, există un gradient de difuzie pentru CO2 din saramură în castraveți (interior).

Pătrunderea CO2 din saramură în castraveți este favorizată de faptul că acesta penetrează bariera de lichid din stratul exterior al mezocarpului datorită solubilității mari a acestuia. Deoarece solubilitatea N2 în stratul de lichid este mult mai redusă (de circa 80 ori), rezultă că în interiorul castraveților va lua naștere o presiune egală cu suma presiunilor parțiale, pCO2 + pN2, care va fi mai mare decât presiunea exterioară și, prin urmare, țesuturile din partea centrală vor fi rupte și se formează cavități.

De remarcat că la creșterea presiunii din interior contribuie și CO2-ul format chiar în castraveți, ca rezultat al acțiunii bacteriilor lactice homofermentative asupra aminoacizilor.

Pentru a împiedica apariția defectului, s-a propus ca CO2-ul din saramură să fie purjat cu ajutorul azotului sau aerului. Prin folosirea azotului ca gaz de purjare nu se ridică probleme de modificări de gust și de culoare și nici nu se favorizează dezvoltarea microorganismelor aerobe, multe dintre ele fiind înzestrate cu echipament enzimatic pectolitic. Purjarea CO2-ului cu ajutorul aerului este economică, dar prezintă dezavantajul că favorizează dezvoltarea bacteriilor aerobe.

Apariția defectului mai poate fi evitată și prin tratarea castraveților proaspeți cu O2 care difuzează în interiorul acestora și datorită activității respiratorii este transformat în CO2 ce înlocuiește N2 din țesutul castraveților. Dioxidul de carbon, fiind solubil în lichidul interstițial, va micșora presiunea interioară și, deci, defectul va fi înlăturat atunci când castraveții vor fi murați.

Defectul poate fi împiedicat și dacă se realizează carbonatarea produsului concomitent cu saramurarea, adică înainte de a se forma stratul de lichid în mezocarpul exterior al castraveți lor. Dacă carbonatarea se face după 1 – 2 zile de la saramurare, incidența apariției defectului este mai mare. Se consideră că nivelul de CO2 nepericulos este de 30-60 mg/100ml. Defectul poate fi prevenit dacă:

se prelungește faza de fermentație primară;

se evită dezvoltarea drojdiilor în faza de fermentație secundară;

se utilizează culturi pure de bacterii mutante de Lactobacillus plantarum, care nu mai transformă malatul în acid lactic + CO2.