Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România [310318]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU

2016

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

ȘCOALA DOCTORALĂ DE BIOLOGIE

TEZĂ DE DOCTORAT

Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

Conducător științific: PROF. DR. GRIGORE MIHĂESCU

Îndrumător științific: PROF. DR. CARMEN MARIANA CHIFIRIUC

Doctorand: [anonimizat]-CARMINA DRĂGULESCU

2016

Cuprins

Lista de abrevieri

Partea teoretică

Introducere

Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană

I.1 [anonimizat]

I.2. Factorii de virulență

I.3 Interacțiunea agentului infecțios cu organismul gazdă

I.4. Determinismul genetic și mecanismele biochimice de rezistență la antibiotice

I.4.1. Antibioticele β-lactamice și mecanisme de acțiune

I.4.1.1. Rezistența enzimatică a S. aureus mediată de β-lactamaze

I.4.1.2. Rezistența prin modificarea țintei (proteinele de legare a penicilinei – PBP)

I.4.1.3. Determinismul genetic al rezistenței la β-lactamice

I.4.1.4. Rezistența la meticilină

I.4.1.4.1. [anonimizat]

I.4.2. Rezistența la aminoglicozide

I.4.3. Macrolide, lincosamide, streptogramine B – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.4. Tetracicline – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. aureus

I.4.5. Linezolid – mecanisme de acțiune și rezistența tulpinilor de S. [anonimizat] – Profiluri genice de virulență și rezistență la tulpini de Staphylococcus aureus izolate în România

2.1. Scopul și obiectivele lucrării

2.2. Materiale și metode

2.2.1. [anonimizat]-Valentine (PVL)

– Proteina A (SpA)

– Enterotoxine (A, B, C, D, E)

– Toxina sindromului de șoc toxic (TSST- 1)

2.2.2. [anonimizat]

– [anonimizat] (aacA) și de fosforilare (aphD)

– [anonimizat]

– Evidențierea genelor tetK și tetM

2.2.3. Tipizarea moleculară a tulpinilor de S. aureus prin pulse field gel electrophoresis (PFGE)

2.3. Rezultate

2.3.1. Profilurile genelor de virulență și semnificație clinică a factorilor codificați

2.3.2. Profilurile genelor de rezistență ale tulpinilor de S. aureus izolate

2.4. Discuții

2.5. Concluzii

2.6. Bibliografie

2.7. Anexe

2.8. Lista lucrărilor publicate/ [anonimizat]

S. aureus – [anonimizat] S. aureus (S. aureus rezistent la meticilina)

UMA – Unitatea Medicala A

UMB – Unitatea Medicala B

UMC – Unitatea Medicala C

UMD – Unitatea Medicala D

PCR – [anonimizat]-α – tumor necrosis factor – α

IL-6 – interleukina 6

IFN-γ – interferon γ

RCT – receptorul T celular

CMH I – complexul major de histocompatibilitate I

TST-1 – toxina sindromului de șoc toxic 1

Th – limfocite T [anonimizat]-1 – interleukina 1

IL-2 – interleukina 2

Partea teoretică

Introducere

Această lucrare își aduce contribuția la îmbogățirea cunoașterii tulpinilor de Staphylococcus (S.) aureus izolate de pe teritoriul României. S. aureus este un patogen oportunist implicat în diverse infecții localizate la nivelul pielii sau în infecții sistemice, invazive, grave ce duc la complicatii la persoanele imunocompromise si cu factori de risc ce predispun la infectii serioase cu S. aureus. Prin acumularea de noi elemente genetice mobile (profagi, plasmide, insule de patogenitate, transpozoni) ce poarta atat gene de virulenta, cat si de rezistenta la antimicrobiene (antibiotice) se arata, inca o data, importanta caracterizarii și cunoasterii acestora. Inainte de era antibioticelor, izolarea tulpinilor sensibile era o dovada în plus ca nu exista o presiune selectiva asupra celulelor bacteriene. Odată cu descoperirea acestora și introducerea lor în practica medicala, bacteriile și-au creat condiții favorabile de lupta și apărare împotriva acestora prin captarea elementelor genetice mobile, dar si prin mutatii la nivelul unor tinte. Acest lucru a condus la schimbarea profilului cromosomal si extra cromosomal creand astfel bacterii multirezistente si virulente numite ''superbug''. S. aureus rezistent la meticilina (MRSA) este rezistent la mai multe clase de antibiotice utilizate pentru tratarea lor facand astfel ca infectiile comune să fie dificil de tratat.

Capitolul I. Implicațiile speciei Staphylococcus aureus în patologia umană

I.1 Staphylococcus aureus – caracterizare generală

Staphylococcus a fost pentru prima data identificat in anul 1880, in Aberdeen, Scotia, de catre chirurgul scotian Sir Alexander Ogston in puroiul recoltat dintr-un abces de la nivelul articulatiei genunchiului (Ogston, 1984). Etimologia cuvantului ce defineste aspectul sau morfologic provine din limba greaca, unde staphylos înseamnă ciorchine. Acest nume a fost schimbat ulterior in Staphylococcus aureus (S. aureus) de catre Friedrich Julius Rosenbach care a fost creditat, la momentul respectiv, de catre sistemul oficial al nomenclaturii. Se estimeaza ca 20% din populatia umana este purtatoare de S. aureus pe termen lung (Kluytmans si colab., 1997) si poate fi frecvent intalnit in microbiota tegumentelor si a mucoaselor, cu precadere in nazofaringele purtatorilor sanatosi (Buiuc si Negut, 2008; Kluytmans si colab., 1997; Cole si colab., 2001).

S. aureus este un coc Gram pozitiv, ubiquitar, comensal. Depinzand de tipul de tulpina, S. aureus poate supravietui de la cateva ore la cateva saptamani sau chiar luni pe suprafete de mediu uscat (Cimolai, 2008). Acest microorganism are capacitatea de a se adapta foarte usor diferitelor conditii de mediu ca urmare a noii structuri, a proprietatiilor metabolice acumulate prin modificari genetice si continua sa fie o sursa inepuizabila de surprize. Aceasta capacitate poate explica de ce S. aureus reprezinta cauza primara a infectiei la om si la animal (Cole si colab., 2001; Fluit, 2012; Hasman si colab., 2010).

S. aureus este capabil sa produca o gama larga de factori de virulenta necesari pentru supravietuirea si initierea unei infectii, incepand cu infectii superficiale ale pielii pana la infectii grave, mai ales la persoanele imunocompromise, ca de exemplu sindromul de soc toxic, sindromul pielii oparite, pneumonie necrozanta, fasciita necrozanta, abcese, keratite, impetigo, osteomielite, endocardite, septicemie, infectii asociate cu implantarea dispozitivelor medicale etc (Kobayashi si DeLeo, 2009. 9:545–551; Bose si colab., 2014; Harris si colab., 2002). Este responsabil pentru costuri foarte mari in asistenta medicala, in fiecare an in Statele Unite, Europa si peste tot in lume (Chen si colab., 2013; Gould si colab., 2010). Introducerea in practica medicala a antibioticelor pentru tratarea infectiilor produse de S. aureus a condus la selectarea celor mai rezistente clone prin acumularea de elemente genetice mobile, cat si prin aparitia unor mutatii punctiforme. In ultimii ani, tulpinile de S. aureus rezistente la meticilina au atins un nivel epidemic (Ma si colab., 2012). La om, epiteliul scuamos al foselor nazale reprezinta habitatul primar (Peacock si colab., 2001). Aproximativ 20% din populatia umana este intotdeauna colonizata cu S. aureus, 60% sunt purtatori tranzitorii si 20% nu poarta acest microorganism niciodata (Foster, 2004). Omul si animalul reprezinta rezervorul natural de S. aureus.

În prezent, cel puțin 25000 de oameni mor anual în Europa datorită infecțiilor produse de doar cinci tipuri de organisme rezistente la antibiotice, printre care: S. aureus rezistent la meticilină (MRSA), S. aureus rezistent la vancomicină (VRSA) (ECDC/EMEA 2009, http://ecdc.europa.eu/en/publications/surveillance_reports/Pages/index.aspx).

Caracteristici de cultivare si identificare

Genul Staphylococcus cuprinde specia S. aureus si face parte din Familia Micrococcaceae. Este un coc Gram-pozitiv, cu diametru de 0,5 – 1,5 micrometri, aerob, facultativ anaerob. Pe frotiu colorat Gram apar de culoare violet si sub forma de ciorchine (Fig. 1.).

Fig. 1. Frotiu colorat Gram (imagine originala)

Se dezvolta cu usurinta, in 18-24h de la insamantare, pe medii nutritive simple, in mediul aerob. Temperatura optima de crestere este de 37 ±2ș C, la pH optim de 7,5, dar sunt tolerate variatii mari. Coloniile, dupa 24h de incubare, pe mediu solid au aspect S (smooth), cremoase, rotunde, cu diametrul de 2-3 mm, marginea regulata, suprafata neteda, bombata si lucioasa (Fig. 2.).

Fig. 2. Colonii de S. aureus pe mediu agar Columbia (Oxoid) cu 7% sange defibrinat de berbec cu hemoliza incompleta de tip α (imagine originala)

Mediile lichide se tulbura omogen, cu depozit granular in partea inferioara a tubului. Pe agar Columbia cu 5-8% sange defibrinat de berbec sau de bou, tulpinile de S. aureus produc o zona circulara de hemoliza in jurul coloniei. Hemoliza totala (beta) cu clarificarea completa a mediului este produsa de hemolizina α a S. aureus (Fig. 3.).

Fig. 3. Colonii de S. aureus pe mediu agar Columbia (Oxoid) cu 7 % sange defibrinat de berbec cu hemoliza totala de tip β (imagine originala)

Coloniile de S. aureus produc un pigment carotenoid, portocaliu sau galben citrin.

Identificarea fenotipica a tulpinilor de S. aureus se face astfel:

– pentru a diferentia genurile din familia Micrococcaceae de genurile din familia Streptococcaceae se iau in considerare urmatoarele: aspectul microscopic, morfologia coloniilor pe mediul cu agar, testul catalazei (Fig. 4.)

Fig. 4. Testul catalazei cu ajutorul peroxidului de hidrogen 3% (imagine originala)

– pentru a diferentia genul Staphylococcus de genul Micrococcus: in prezenta eritromicinei se face testul producerii de acid din glucoza in aerobioza, testul sensibilitatii la nitrofurantoin/ furazolidon (diametrul zonei de inhibitie > 15 mm) pe mediul Mueller Hinton agar (Fig. 5.), testul modificat pentru oxidaza, testul sensibilitatii la bacitracina;

Fig. 5. Testul la furazolidon (F, 300) (imagine originala)

– diferentierea S. aureus de celelalte specii de Staphylococcus se face prin: caractere de cultivare, testul coagulazei legate cu ajutorul reactiei de aglutinare pe lama (Fig. 6.) si libere cu ajutorul plasmei de iepure (Fig. 7.), testul termonucleazei (Buiuc si Negut, 2008).

Fig. 6. Testul coagulazei legate cu ajutorul reactivului Slidex Staph Plus (BioMerieux, Franta). 1 – reactie de aglutinare pozitiva; 4 – reactie de aglutinare negativa (imagine originala)

Fig. 7. Testul coagulazei libere cu ajutorul plasmei de iepure (BioRad). Tubul nr. 1 – reactie negativa, tubul nr. 2 – reactie pozitiva (formarea retelei de fibrina) (imagine originala)

I.2. Factorii de virulență

Pentru a intelege cum reuseste S. aureus sa se ataseze, sa patrunda, sa infecteze si sa se raspandeasca in organism in ciuda mecanismelor de aparare proprii organismului prin sistemul imunitar celular/ umoral si cum se explica diversitatea clinica a afectiunilor determinate de S. aureus, este important de cunoscut structura acestei bacterii si modul de actiune. S. aureus isi exercita patogenitatea atat prin structura sa, cat si printr-o multitudine de proteine/ enzime pe care le produce. Diferitele combinații ale acestora, interacțiunea cu situsul de infecție și variabilitatea răspunsului imun al gazdei explica o gamă largă de rezultate legate de aceste infecții. Este bine cunoscut faptul că un singur factor de virulenta nu este suficient pentru a provoca o infecție stafilococică (Fournier si Philpott, 2005). Acționând ca un comensal, bacteria poate avea un impact imperceptibil asupra sănătății sau poate sa produca infecții locale moderate, dar și infecții severe, invazive (Lowy, 1998). Initial, cercetatorii s-au concentrat pe rolul factorilor de virulenta ai suprafetei celulare si mai ales asupra capsulei. Mai tarziu au inceput sa recunoasca importanta globala a exoproteinelor stafilococice, ca si citolizinele si superantigenele, in initierea si progresul infectiilor prin distrugerea directa a tegumentelor, mucoaselor si tesuturilor.

Pentru tratarea infectiilor cu S. aureus, antibioticele alese, β-lactamicele pentru S. aureus sensibil la meticilina (MSSA) si vancomicina pentru MRSA, distrug acest microorganism prin liza peretelui celular sau prin inhibarea biosintezei peretelui celular. Aceste antibiotice nu au capacitatea de a inhiba producerea exoproteinelor de catre S. aureus sau sa neutralizeze efectele toxinelor existente deja in celulele gazdei. Antibioticele β-lactamice pot activa producerea de enzime citolitice si de alte exoproteine de virulenta atunci cand sunt necorespunzator utilizate pentru tratarea infectiilor produse de S. aureus, respectiv de MRSA (Lin si Peterson, 2010).

Sunt mai multe categorii de factori de virulenta in functie de rolul lor si modul de actiune:

a) Factori de virulenta ai S. aureus implicati in aderenta de celulele gazdei si de proteine

Peretele celular la S. aureus este gros fiind alcatuit din 3 straturi: capsula polizaharidica, peptidoglicanul sau mureina (reprezinta 50% din greutatea celulei) si membrana citoplasmatica interna.

Capsula este foarte subtire (microcapsula) si este produsa de aproximativ 90% din izolatele clinice. Se poate vizualiza numai la microscopul electronic. Este alcatuita din acizi hexozoaminouronici. Pana in prezent au fost descrise 11 tipuri serologice. Tipurile 5 si 8 au fost intalnite la aproximativ 75% dintre tulpinile izolate de la om. Tipul 336 a fost intalnit mai rar si nu are o capsula propriu-zisa, prezentand doar polizaharidul 336. Acest tip este implicat in aproximativ 20% din infectii (O’Riordan si Lee, 2004). Tipul 5 este prezent la majoritatea tulpinilor de MRSA (Lowy, 1998; Lee, 1996). Functia de virulenta a capsulei este de a inhiba fagocitoza de catre neutrofile, dar si in mascarea adezinelor ducand astfel la cresterea colonizarii bacteriene si persistentei bacteriilor pe suprafata mucoaselor (O’Riordan si Lee, 2004).

Peptidoglicanul (mureina) (lat. murus = perete) este format prin alternarea subunitatiilor polizaharidice de N-acetilglucozamina si acid N-acetil muramic legate intre ele prin legaturi β-1, 4. Aceste lanturi sunt unite prin punti peptidice. Componenta peptidica este reprezentata de tetrapeptide cu structura L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala. Puntile peptidice ce apartin lanturilor de glican adiacente sunt legate printr-un pentapeptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Peptidoglicanul poate avea activitate endotoxica, stimuleaza descarcarea citokinelor de catre macrofage, activeaza sistemul complement si agregarea trombocitelor. Diferentele din structura peptidoglicanului la diverse tulpini de S. aureus pot contribui la variatii in capacitatea lor de a cauza coagulare intravasculara diseminata (Kessler si colab., 1991). In peptidoglican sunt incorporate proteine si polizaharide. Polizaharidele caracteristice lui S. aureus sunt acizii teichoici (gr. teichos = perete). Pe langa acestia exista si acizi lipoteichoici care au un capat al lantului legat de un glicolipid din membrana plasmatica, iar celalalt expus la exterior (Lowy, 1998; Lazar, 2007; Weidemaier, 2004). Rolul acizilor teichoici este multiplu: confera peretelui celular rigiditate si virulenta ridicata, sunt implicati in transportul ionilor, sunt receptori pentru bacteriofagi, sunt implicati in diviziunea celulara, ajuta la identificarea prin tehnici imunologice.

Proteinele de suprafata din structura peptidoglicanului pot fi legate covalent sau prin mecanisme alternative, de exemplu ionic. Acestea sunt foarte importante pentru potentialul patogen al S. aureus. Proteinele sunt legate de stratul mureinic cu ajutorul sortazelor A si B (Mazmanian si colab., 2001). Relevanța proteinelor de suprafata in timpul infecțiilor a fost demonstrată in mai multe modele animale, comparând tipul sălbatic și tulpinile fara sortaza A sau B. Absența acestor proteine provoacă o scadere dramatica a virulentei (Weiss si colab., 2004). Cele mai studiate proteine sunt: proteina A codificata de gena spa (leaga IgG), factorul clumping (leaga fibrinogenul) si este codificat de genele clfA/B, proteina de legare a fibronectinei A si B (fibronectin binding protein – FnBPA/B, codificate de genele fnbA/B), proteina de legare a colagenului (collagen binding protein – Cna codificata de gena cna), proteina de legare a sialoproteinelor din oase (bone binding protein – Bbp codificata de gena bbp), adezina pentru elastina (elastin binding protein – EbpS codificata de gena ebpS) si proteina de aderenta extracelulara Eap (extracellular adherence protein, codificata de gena eap) care are rolul de a se atasa de un numar mare de liganzi, cunoscuta si sub denumirea de Map (MHC analogous protein), fiind o proteina analoga complexului major de histocompatibilitate II.

S. aureus cell wall-associated virulence factors include: capsular polysaccharides (CPSs), staphyloxanthin (carotenoid pigment) and a group of proteins known as microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs).

Microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMMs), such as clumping factors A and B (ClfA and ClfB/ clfA and clfB genes), fibronectin-binding proteins A and B (FnBPA and FnBPB/ fnbA and fnbB genes), collagen adhesion and protein A (spA/ spa gene), play important roles in microbial adhesion to host cells and proteins (i.e. fibronectin, fibrinogen and collagen) and establish the first step of an infection. The ability of S. aureus to adhere to the epithelial cells of the anterior nares and to the desquamated nasal epithelial cells determines nasal colonization. Five surface proteins were described to be involved in this process, namely clumping factor B (ClfB), the iron regulated surface determinant protein A (IsdA/ isdA gene), two proteins of the serine-aspartic acid repeat protein family (Sdr), SdrC (sdrC gene) and SdrD (sdrD gene), the S. aureus surface protein G (SasG/ sasG gene). The ligands of SdrD are not known so far, whereas SdrC was currently identified

to bind to β–neurexin [63]. SasG is involved in biofilm formation and bind to the extracellular matrix [64, 65]. ClfB was described to bind to fibrinogen [66] and acts as a phagocytosis inhibitor. Additionally, ClfB provides high binding affinity to cytokeratin-10, a major surface protein of the desquamated nasal epithelial cells [67]. For this reason,

cytokeratin-10 is likely to serve as a receptor for S. aureus during nasal colonization. Since the anterior nares are an iron-restricted environment, Furregulated proteins like the iron-regulated surface determinant protein Isd-family are probably induced during nasal colonisation [68]. IsdA not only provides adhesion to cytokeratin-10 and other surface

proteins of the corneocytes [69], but also binds to a broad spectrum of interacting human plasma proteins, e.g. fibronectin, fibrinogen, fetuin [68], holo and apo-transferrin, haemoglobin, haemin, asialofetuin (expressed in iron-restricted environments), involucrin,

loricrin, lactoferrin inhibitor. IsdA is also involved in resistance to human skin fatty acid, peptides and heme transfer. It was shown that triclosan promotes S. aureus nasal colonization [70]. Other protein called S. aureus autolysin/ adhesion (Aaa/ aaa gene) located at the cell surface has a multiple function and adheres to fibrinogen, fibronectin

and vitronectin [71]. Another cell-surface protein called elastin-binding protein (EbpS/ ebpS gene) mediates binding to elastin and soluble tropoelastin [72]. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA biofilm/ icaABDC) is an adhesin for aggregation, involved

in biofilm formation, resistance to antibiotics and resistance to immune system [73].

Immunodominant surface antigen B (IsaB/ isaB gene) binds to the dsDNA, ssDNA, RNA [74]. Iron-regulated surface determinant protein B (IsdB/ isdB gene) binds to haemoglobin, haemin and interacts with GPIIb/ IIIa on platelets [75]. Iron-regulated surface determinant protein C (IsdC/ isdC gene) binds to haemin [64]. Iron-regulated surface determinant protein H (IsdH/ isdH gene) is a receptor for haemoglobin, haptoglobulin, haemoglobin-haptoglobulin complex, causes haem detachment, degradation of C3b, evasion of phagocytosis [76, 77]. S. aureus surface protein C (SasC/ sasC gene) is implicated in cell aggregation, biofilm accumulation, binds to the extracellular matrix [64, 78, 79]. Serine-rich adhesin for platelets (SraP/ sraP gene) binds to platelets [64]. Extracellular matrix (ECM) binding protein (Emp/ emp gene) binds to extracellular matrix of host cells and is involved in biofilm formation [64, 80]. ECM binding protein homologue (Ebh/ ebh

gene) binds to extracellular matrix of host cells and fibronectin. Plasmin-sensitive surface protein (Pls/ pls gene) reduces adhesion to fibronectin, fibrinogen, laminin and IgG, reduces invasion to host cells, binds to lipids of host cells and is involved in adhesion to

nasal epithelial cells [64]. Second immunoglobulin-binding protein (S. aureus binding protein of IgG) (Sbi/ sbi gene) may form a complex with Fc domain of IgG, binds to human complement regulators Factor H and Factor H related protein 1 (FHR-1) from human serum in combination with C3b or C3d and forms tripartite Sbi:C3:Factor H complexes [81, 82]. Von Willebrand factor binding protein (vWfbp) binds to and activates prothrombin, binds to fibrinogen and vW factor [83]. During orthopedic infections, like osteomyelitis or orthopedic implant infections two staphylococcal proteins, Bbp and Cna, were identified. Both proteins possess high binding affinities to proteins present in

the dense connective tissues, facilitating attachment of S. aureus to these sites of infection. Bone sialoprotein binding protein (Bbp/ bbp gene), a variant of SdrE, is an MSCRAMM that binds to bone sialoprotein [84] and fibrinogen [85]. It is well known that SdrE is involved in platelet aggregation [64]. Collagen adhesion protein (Cna/ cna gene) mediates attachment to collagen fibers (type I and IV), which are predominantly found in connective tissues [84, 86]. The recognition by the host immune system of these microorganisms is prevented by MSCRAMMs proteins [87]. For example, Clf and FnBP are able to cause platelet activation, which results in clotting. FnBP adhere to fibrinogen (FnBPA only) and elastin, facilitates invasion of endothelial and epithelial cells and promotes avoidance of phagocytosis. Protein A binds to both the Fcγ region of immunoglobulins (Ig) [88] leading to inhibition of phagocytosis and to the Fab portion of Ig [88-90]. Many studies have shown that the binding of protein A to Ig contributes to its mitogenic activity [90], enhances natural killing activity against lymphoid tumour cell lines [91], and induces Ig secretion by human B cells [92]. It was shown that protein A activates complement (binds to complement protein C3 and promotes C3-C3b conversion) via the classical pathway [93]. When administered to laboratory animals or tested in vitro, protein A produces a variety of biological effects including hypersensitivity reactions, complement activation,

derepression of the opsonizing activity of serum and histamine release from basophils [94].

Nguyen et al. describes the specific interaction of staphylococcal protein A with human platelets via gC1qR. This interaction suggest a potential role for gC1qR in S. aureus pathogenesis. This represent a novel mechanism for S. aureus localization to sites of vascular injury and thrombosis. In the pathogenesis of endocarditis the adhesion of S. aureus to platelets is a major determinant of virulence. A critical event in the induction of infective endocarditis is represented by the interaction between S. aureus and platelets at the cardiac valve surface [95]. The molecular mechanisms of interactions between platelets and S. aureus are incompletely understood [96]. These adhesins interact specifically with various proteins present in host plasma and with the extracellular matrix of host tissues [97]. It is known that during a S. aureus infection, extracellular adherence protein (Eap/Map/ eap/map gene) may serve to reduce inflammation by inhibiting neutrophil adhesion and extravasation, impairing angiogenesis and wound healing. Eap induces the secretion of the proinflammatory cytokines interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) by CD14+ leukocytes, binds to fibrinogen, fibronectin, prothrombin, vWF, binds to pseudocapsule in abscesses. It is involved in internalization in host cells, being a MHC-II analogue protein, in adhesion of S. aureus cells to host cells and in biofilm formation [98-107]. In the bloodstream the virulence factors cause inflammation, impair immune cell function, alter coagulation and compromise vascular integrity. Two of the best-studied proteins are Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococci (CHIPS) and Staphylococcal Complement Inhibitor (SCIN). CHIPS blocks C5a receptor impeding migration of neutrophils to the site of infection [78] and formyl peptide receptors

FPR-1 on neutrophils, impeding chemotaxis and activation [108].

b) Toxins, enzymes and biologically active proteins

b1. Virulence factors enabling S. aureus to evade innate immune defences related to leukocyte migration and phagocytic activity

b1.1. Factors promoting neutrophils lysis

α-hemolysin (Hla/ hla gene) is a cytolytic poreforming toxin, causing dose dependent induction of apoptosis or necrosis and phagosomal escape from macrophages.

β-hemolysin (Hlb/ hlb gene) is a Mg2+ dependent sfingomyelinase with cytolytic activity which hydrolyzes membrane sfingomyeline to the second messenger ceramide.

γ-hemolysin (HlgA, HlgB, HlgC/ hlgA, B, C genes) is a bicomponent leukocidin involved in lysis of PMNs by plasma membrane pore formation [78, 109, 110].

δ-hemolysin (Hld/ hld gene) is a cytolitic toxin

causing lysis of erythrocytes, other mammalian cells

and membrane-bound organelles by pore formation

at low concentrations, causing detergent-like membrane

solubilization at high concentrations; binds to

neutrophils and monocytes [78, 109, 111]. PVL encoded by lukS-PV, lukF-PV genes is a

bicomponent leukocidin, pore-forming toxin that kills leukocytes by induction of PMN apoptosis

[109, 112, 113]. The clear differences in virulence

between isogenic pairs of PVL-positive/ negative

strains could not be established by Voyich et al.

[114]. Labandeira-Rey et al., in an acute pneumonia

mouse model, clearly demonstrated the role of PVL

as a major determinant of virulence using other sets

of isogenic strains for PVL [113]. The experiments

results confirmed that PVL is a virulence factor

[115]. This discrepancy basically comes from the

choice of the experimental models and the strains.

The capacity of S. aureus strains to release PVL in

the presence of antibiotics (oxacillin, clindamycin,

linezolid, vancomycin, fusidic acid) were examined

by Dumitrescu et al. When S. aureus was incubated

at inhibitory concentrations, no PVL was detected,

while subinhibitory concentrations of oxacillin enhanced

the PVL level. Clindamycin, linezolid and

fusidic acid were inhibitory and vancomycin had

roughly no effect [116]. Leukocidins D, E and M (LukD, E, M/ lukD,

lukE, lukM genes) are bi-component pore-forming

leukotoxins that kill leukocytes [78, 117]. Recent

studies show the important role of LukED in bloodstream

infection [118]. Two-component leukotoxin

ED (lukE, lukD genes), MF-PV, leukocidins A and

B (alt. names H and G/ lukAB/ -HG genes) cause

lysis of PMNs by plasma membrane pore formation

[117, 119-122].

PSM peptides (PSMs) are pore-forming toxins

or have detergent activity [123]. b1.2. Factors impeding neutrophils migration

Staphylococcal Superantigen-Like proteins 2, 3,

4, 6 (SSL2, 3, 4, 6/ ssl2, 3, 4, 6 genes) potentially

bind to glycoproteins [124]. Staphylococcal Superantigen-

Like 5 (SSL5/ ssl5 gene) binds to P-Selectin

Glycoprotein Ligand-1 (PSGL-1) and cell surface

receptors for human IgA in a sialic acid dependent

manner, inhibits P-selectin-mediated neutrophils

rolling and extravasion, binds to and inhibits Matrix

Metalloproteinase-9 (MMP-9), activates and aggregates

platelet glycoprotein Ibα (GPIbα), binds to all

G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) via their glycosylation

sites [87, 124-128]. Staphylococcal Superantigen-

Like Protein 9 (SSL9/ ssl9 gene) is

binding to monocyte derived dendritic cells [129].

Staphylococcal Superantigen-Like 11 (SSL11/ ssl11

gene) binds to neutrophils and monocytes in a sialyl

Lewis X factor dependent manner [126, 130].

Staphylococcal Superantigen-Like 10 (SSL10/ ssl10

gene) binds C-X-C Chemokine Receptor type 4 (CXCR4), an α-chemokine receptor with chemotactic

activity for lymphocytes, blocks Ca2+ dependent

mobilization and migration, binds IgG, inhibits complement

activation via classical pathway by inhibiting

C1q binding to IgG, binds to fibrinogen and

fibronectin, binds to chemokine receptors [131-133].

Staphylococcal Superantigen-Like 7 (SSL7/ ssl7

gene) binds to C5, inhibits C5 cleavage by convertases,

inhibits C5a generation and C5a induced phagocytosis,

binds to IgA, inhibits binding of IgA to FcαI

granulocyte Receptor (FcαRI), inhibits bactericidal

serum activation and oxidative burst. Thus, C5-IgASSL7

tripartite complex binds to the Fc region of IgA

and blocks recognition by neutrophils [134-136].

Formyl Peptide Receptor-Like 1 (FPRL1/ flr, fll

gene) inhibitor protein (FLIPr) blocks Formyl Peptide

Receptor-2 (FPR-2) on neutrophils, monocytes,

B-cells, NK-cells and inhibits binding of chemoattractants

[78, 137]. b1.3. Factors conferring resistance to oxidative

burst

S. aureus golden pigment, staphyloxanthin

(crtO-N/ crtOPQMN), also functions to resist destruction

by neutrophils (reactive oxidant-based

phagocytosis). In a mouse model with intraperitoneal

bacteria challenge, inhibition of staphyloxanthin

biosynthesis allows S. aureus to become more

vulnerable to innate immune clearance resulting in

a significant reduction of S. aureus bacterial load in

the kidney [78, 138, 139].

Catalase (KatA/ katA gene) and alkyl hydroxide

reductase (AhpC/ ahpC gene) inactivate hydrogen

peroxide; these enzymes are pivotal for nasal colonization

[140].

Thioredoxin and thioredoxin reductase also inactivates

ROS [78]. b2. Virulence factors enabling S. aureus to

evade innate immune defenses related to complementb

2.1. Factors causing complement inactivation

and the inhibition of phagocytosis

It is proven that capsular polysaccharides (CPSs/

cap genes) involved in inhibiting bacterial cells adherence

and phagocytosis by masking surface antigens

are additionally involved in altering C3 (CPS5

and 8) or C3b (CPS1) deposition [61, 78, 141].

Staphylococcal complement inhibitor (SCIN/

scn, scb, scc genes) can blocks convertase function,

a crucial phase of the complement cascade – C3 convertases

C4bC2b and C3bBb, C5 convertase and facilitates evasion from phagocytosis and killing by

PMNs [78, 142].

Extracellular complement-binding protein (Ecb/

ecb gene) blocks the C3 convertase C3bBb, the C5

convertases C4b2aC3b and C3b2Bb, blocks chemotaxis

and complement activation [142-144].

Clf A causes platelets adhesion (fibrin-mediated);

binds to complement regulator factor I and fibrinogen

[64, 78, 83, 109].

Clf B determines platelets adhesion (fibrinmediated);

binds to cytokeratin-10 and fibrinogen

[64, 83, 109]. Extracellular fibrinogen-binding protein (Efb)

is a bi-functional protein which can specifically bind

to fibrinogen and complement protein C3, blocks the

platelet activation, blocks the C3 convertase C3bBb

and the C5 convertases C4b2aC3b and C3b2Bb [82,

109, 142].

Coagulase (Coa/ coa gene) binds and activates

prothrombin, promotes conversion of fibrinogen to

fibrin, resulting in clotting [83, 109]. The resulting

fibrin layer is masking bacterial cell antigens thus

preventing their recognition.

Staphylokinase (Sak/ sak gene) activates plasminogen

to plasmin, promotes fibrin clot resolution,

degradation of bactericidal defensins, decreases

severity of infection [78]. Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococci

(CHIPS), Staphylococcal Complement Inhibitor

(SCIN) and formyl peptides (fMLPs), which are

ligands for formyl peptide receptor [78] are involved

in inhibiting phagocytosis (see chapter a).

S. aureus produce adenosine synthase A (AdsA/

adsA gene) to escape from phagocytosis [145] by

decreasing cytotoxic attributes and chemokines production

in neutrophils.

c) Virulence factors enabling S. aureus to

evade innate immune defenses related to antimicrobial

peptides

c1. Evading antimicrobial peptides action by alteration

of bacterial cell wall components

Antimicrobial peptide sensor (ApsS/R/X) binds

and impairs antimicrobial peptides [146] by activating

different regulatory systems. Gra regulatory system (graRS) impairs phagocytosis

and action of antimicrobial peptide LL-37 [147].

Multiple peptide resistance factor F (MprF) inserts

lysine into teichoic acids, making them unrecognoscible

by antimicrobial peptides [148].

Dlt operon (DltA/B/C/D) inserts D-alanine into

teichoic acids [78]. S. aureus becomes resistant to lysozyme by O

acetylating its peptidoglycan (PG) by O-acetyltransferase

(OatA) [78, 149].

Staphylococcal serine protease A, V8 endoprotease

(SspA/ sspA gene) is a serine protease which

promotes invasion by degrading fibronectin-binding

MSCRAMMs, causes activation of SspB and cleavage

but not inactivation of Cathelicidin LL-37 [150,

151]. Serine protease – like proteins (SplA-F/ splAF

genes) are trypsin-like serine proteases with narrow

substrate specificity, secreted as zymogen [152]. c2. Cathelicidin resistance

Staphylokinase (Sak) is an exoprotein produced

by S. aureus, which activates host plasminogen, inactivates

α-defensin antimicrobial activity. A direct

binding between α-defensins and staphylokinase was

shown to result in a complex formation with a significant

reduction of fibrinolytic activity. This finding

may have clinical implications. The fibrinolytic

effects of staphylokinase may be downregulated at

the site of vascular occlusion [153].

Aureolysin (Aur) produced by S. aureus is a

neutral, calcium-stabilized, zinc-dependant metalloprotease,

belongs to the superfamily of M4 and it is

involved in activation of SspA, conversion of plasminogen

to angiostatin and mini-plasminogen,

degradation of plasminogen activator inhibitor 1, inactivation

of α2-antiplasmin, degradation of Cathelicidin

LL-37 [154].

Methicillin resistance (mecA gene) correlates

with cathelicidin resistance, but this mechanism has

to be identified [155]. d) Other biologically active proteins

Many studies have focused on the secreted enzyme

hyaluronidase (HysA/ hysA gene), which

cleaves the hyaluronic acid polymer, a major component

of the extracellular matrix of human tissues,

at the -1,4 glycosidic bond. This enzyme facilitates

the invasion of tissues by bacteria. S. aureus hyalu ro –

nidase is a CodY-regulated virulence factor [156].

Staphylococcal cysteine protease staphopain B

(SspB/ sspB gene) is a cysteine protease, mimicking

plasma serine proteases and causing conversion of

kininogen, hydrolysation of the Bz-Pro-Phe-Arg

substrate of kallikrein, cleavage of fibrinogen at the

same site as plasmin, cleavage of fibronectin, degradation

of collagen, cleavage of CD11b on monocytes

and neutrophils, cleavage of CD31 on neutrophils,

apoptosis-like cell death of neutrophils and monocytes,

release of leucyl-methionyl-lysyl-BK (kinin, leads to leakage from vessels and hypotension) together

with ScpA [150, 157-161].

Staphostatin B (SspC/ sspC gene) is an inhibitor

of SspB [162, 163].

Staphopain A (ScpA/ scpA gene) is a cysteine

protease, causing degradation of collagen and fibrinogen,

release of leucyl-methionyl-lysyl-BK

(kinin, leads to leakage from vessels and hypotension)

together with SspB [158, 161].

Staphostatin A (ScpB/ scpB gene) is an inhibitor

of ScpA, conferring protection during secretion

[162, 163].

Lipase, glycerol ester hydrolase (lip, geh, beh/

lip, geh, beh genes) are causing hydrolysis of lipids,

hydrolysis of skin sebum for nutrient acquisition, interference

with granulocytes triacylglycerols degradation

[78, 164].

Fatty acid-modifying enzyme (FAME) modifies

fatty acids [165]. PtdIns-phospholipase C (Plc) degrades membrane

associated inositol phospholipids, interferes

with cellular signalling phosphotidylinositol-specific

lipase activity [78, 166].

Enolase (Eno) catalyzes phosphory-glycerate to

phosphoenol-pyruvate, binds to laminin [78].

Arginine catabolic mobile elements (3 types)

(ACMEI/-II/-III) seem to aid colonization, but their

role is still unclear. They contain several enzymes

and proteins (arginine deaminase system, oligopeptide

permease, zinc-containing alcohol dehydrogenase,

spermine/spermidine acetyltransferase and

others) [112, 141, 167].

Thermonuclease (Nuc/ nuc gene) is an extracellular

nuclease, involved in degradation of DNA,

biofilm release, escape from neutrophil extracellular

traps [168, 169]. Staphylococcal major autolysin (Atl/ atl gene)

is involved in excretion of cytoplasmic proteins, has

an essential role in the fibronectin-binding proteinmediated

S. aureus biofilm phenotype. A novel

staphylococcal internalization mechanism involves

the major autolysin Atl and heat shock cognate protein

Hsc70 as host cell receptor [170-172].

A conserved Type VII secretion system, termed

Ess, which is dispensable for laboratory growth, but

required for virulence was described in S. aureus

(EsaA, EsaB, EsaC, EsaD, EssA, EssB, EssC, EssD,

EsxA, EsxB) [173].

e) Staphylococcal toxins involved in toxinoses

Exfoliative toxins A, B, C and D (ETA, ETB,

ETC, ETD/ eta, etb, etc, etd genes) are glutamatespecific serine proteases, which specifically cleaves

the extracellular domains 3+4 from desmoglein 1

(ETB), causing epidermal blister formation and are

exotoxins with superantigen activity [109, 174].

Staphylococcal enterotoxins (SEs: SEA to SEE,

SEG to SEI, SER to SET/ sea-e, seg-i, ser-set genes)

have demonstrated emetic activity/gastroenteric toxicity

and induce immunomodulation via superantigen

activity [109, 175]. Staphylococcal-like (SEl)

proteins, are not emetic in a primate model (SElL

and SElQ/ selL, selQ genes) or have yet to be tested

(SElJ, SElK, SElM to SElP, SElU, SElU2 and SElV/

selJ, selK, selM to selP, selU, selU2 and selV genes)

[176]. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST1/ tstH

gene), which is coded by a gene sited on the mobile

genetic element staphylococcal pathogenicity island

1, possess endothelial toxicity (direct and cytokinemediated)

and superantigen activity [109]. Nafcillin

increases exotoxin (α-toxin and TSS toxin-1 [TSST-

1]) production at sub growth inhibitory concentrations,

while linezolid and clindamycin inhibit

exotoxin production [177].

Principalii factori de virulenta sunt:

Leucocidina Panton-Valentine (PVL) este o proteina/ toxina produsa de S. aureus care tinteste indeosebi leucocitele si macrofagele fiind formata din 2 unitati: componenta S si componenta F, transcrise separat. Are proprietati citolitice crescute, iar tandemul LukS-PV/ LukF-PV se intalneste in infectiile necrozante, profunde si mai rar in bacteriemii (Loffler si colab., 2010).

Proteina A descoperita in anul 1958 de Jensen (Jensen, 1958) ca prima proteina de suprafata a S. aureus. La inceput a fost privita doar ca proteina de legare la imunoglobulina G (IgG), iar mai tarziu a fost recunoscut rolul in aderenta si colonizare prin interactia cu factorul von Willebrand (Hartleib et al., 2000). Face parte din familia MSCRAMM, prezentand motivul LPXTG (fig. ). Este structurata pe 5 domenii extracelulare (E, D, A, B si C), regiunile Xr si Xc ce strabat peretele celular si un domeniu alcatuit din 18-20 reziduuri hidrofobe care traverseaza membrana plasmatica.

Enterotoxinele stafilococice (SEs) sunt superantigene pirogenice – PTSAgs (pyrogenic toxin superantigens) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogene, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic. Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a receptorului T celular (RCT). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor proinflamatorii, caracteristice pentru un răspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și IFN-γ, mediatoare ale patofiziologiei, sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS). Enterotoxinele au activitate proteazică, sunt difuzibile și manifestă tropism față de mucoasa intestinală, fiind cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Până în prezent se cunosc cel puțin 24 tipuri serologice de enterotoxine (A-V) (Blaiotta, G. și colab., 2004). Genele sea-sev sunt localizate pe cromosomul bacterian și pe insule de patogenitate egc (enterotoxin gene cluster) sau pe elemente genetice mobile: fagi, transpozomi, plasmide. Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele complexului major de histocompatibilitate I (CMH I), își induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic; prezintă numeroase variante antigenice și sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, atunci când contaminează produse alimentare bogate în glucide și proteine.

Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) este un superantigen produs de anumite tulpini de S. aureus. Toxina activează un număr mare de limfocite T helper (Th), se leagă direct de moleculele complexului major de histocompatibilitate II (CMH II), fără a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de IL-2 și de IL-1 din macrofage.

Înainte de anul 1940, infectiile cu S. aureus și în particular, septicemiile, conduceau la 80% din cazuri la decesul pacientului. Descoperirea penicilinei G și utilizarea sa începând cu anul 1940 a condus la modificarea pronosticului acestor infectii. Aceasta descoperire a fost de scurta durata deoarece S. aureus a devenit rezistent la penicilina G prin producerea de penicilinaza. În anul 1960 a fost introdusa meticilina, o β-lactamina rezistenta la acțiunea penicilinazelor. 80% dintre tulpinile de S. aureus erau rezistente la penicilina G. După anul 1961 au apărut primele tulpini rezistente la meticilina (Lowy, 2003).

Mecanisme de acțiune

Beta-lactamicele actioneaza asupra sintezei peptidoglicanului. Se fixeaza de proteinele de legare a penicilinei (PBP) modificand structura peptidoglicanului fragilizand peretele bacterian. Apoi se poate observa o liza bacteriana. Aceasta activitate bactericida a beta-lactamicelor este datorata incapacitatii peptidoglicanului alterat de a menține presiunea osmotica intracitoplasmatica. S. aureus cuprinde 5 PBP (Tabelul ….) (Komatsuzawa și colab., 1999; Reynolds, 1988).

Tabelul …..

PBP la S. aureus

Au fost descrise doua mecanisme:

1. un mecanism fizic de segregare a noului peptidoglican într-un singur și același plan.

2. implica autolizinele codificate de gena lyt.

Rezistența a fost mai puțin frecventă înainte de introducerea antibioticelor în practica clinică pentru tratarea infecțiilor. Datorită presiunii selective a antibioticelor anumite tulpini au reușit să se dezvolte prin mecanisme de rezistență. Activitatea antibacteriană a fungului Penicillium notatum a fost observată (Fleming 1929) asupra unei culturi de S. aureus, ceea ce coincide cu descoperirea benzilpenicilinei. După introducerea benzilpenicilinei (penicilina G) în practica clinică, în anul 1942 a fost izolată prima tulpină rezistentă, mediată de producerea de β-lactamază (penicilinaza). Până în 1950, 40% din totalul izolatelor au devenit rezistente la penicilină G, iar până în 1960, numărul acestora a crescut la 80%. În prezent, majoritatea tulpinilor (98%) izolate din mediul spitalicesc și/ sau comunitar sunt rezistente la penicilină G prin producerea de penicilinaza. Penicilinazele sunt exoenzime secretate de stafilococ (Zygmunt și colab., 1992). Gena blaZ este reglata de către un represor constitutiv blaI și un antirepresor blaR1, molecula transmembranara care este activata de prezenta unei beta-lactamine. Gena pentru penicilinaza aparține unui transpozon, localizat pe o plasmida mare, ce poarta și alte gene de rezistenta la antibiotice (aminozide, macrolide), la antiseptice sau la metale grele. Se poate integra și în cromosom. Penicilinaza este un polipeptid de 257 aminoacizi (MM: 28 kDa) care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină G, făcând ineficient antibioticul.

La tulpinile hiperproducatoare de penicilinaza, oxacilina are o activitate diminuata, astfel ca tulpina poate să fie incadrata ca rezistenta. Aceste tulpini se numesc ''borderline'' (BORSA – Borderline Oxacillin Resistant Staphylococcus aureus). Acest mecanism conferă rezistență la toate antibioticele β-lactamice, făcând imposibilă utilizarea lor în clinică pentru tratamentul infecțiilor cu MRSA.

Penicilinazele de la stafilococ sunt sensibile la inhibitorii de beta-lactamaze: acid clavulanic, tazobactam, sulbactam (Drugeon, 2006).

–

Doua tipuri de rezistenta prin modificarea tintei exista la stafilococi:

1. achiziționarea unei PBP exogene: PBP2a;

2. modificarea sintezei PBP endogene.

Rezistenta prin producerea proteinei PBP2a a aparut la putin timp dupa introducerea meticilinei, prima penicilina semisintetica, un antibiotic ce era activ asupra tulpinilor de S. aureus producatoare de penicilinaza. Rezistenta este rezultatul producerii, atat la S. aureus, cat si la stafilococii coagulazo-negativi a unei proteine PBP numita straina (PBP2a) care nu prezinta nicio similaritate cu PBP de la S. aureus. Este foarte apropiata structural de PBP de la S. sciuri. Meticilina, la fel ca diversele beta-lactamice, inhiba situsul transpeptidazic al PBP2 conservand activitatea sa transglicolazica. PBP2a prezinta o activitate transpeptidazica de rezistenta la beta-lactamice. In prezenta unui antibiotic beta-lactamic, peptidoglicanul stafilococului continua sa fie sintetizat datorita activitatii transpeptidazice a proteinei PBP2a si a activitatii transglicolazice a proteinei PBP2 (Pinho si colab., 2001).

Proteina PBP2a este codificata de gena mecA, componenta a operonului mec, o parte din caseta cromosomală mec (SCCmec) (Oliveira și colab., 2006; Milheirico și colab., 2007; Shanshuang și colab., 2011). Aceasta gena poate sa fie reglata de genele mecI si mecR1. Aceste doua gene sunt similare cu genele blaI si blaR1 ce regleaza producerea de penicilinaza, dar si transcrierea genei mecA (Chambers, 1997).

Complexul genelor mec este situat pe un element genetic mobil ce se poate integra in cromosom la nivelul unui situs unic situat în apropierea originii replicarii și a genei de rezistenta la novobiocina. Se asociaza unui complex de doua gene de recombinaza din familia integrazelor-rezol denumite ccrA și ccrB (Hiramatsu și colab., 2001; Ito și colab., 2004) ce permit integrarea și excizia complexului mec-ccr, ce se comporta ca o insula de rezistenta la beta-lactamice sub denumirea de SCCmec (Staphylococcus cassette chromosomal).

Pana în prezent au fost descrise 11 tipuri de caseta cromosomala mec (International Working Group on the Staphylococcal Cassette Chromosome elements – IWG-SCC) prezentate în tabelul……

Tabelul …..

Cele 11 tipuri de SCCmec întâlnite la S. aureus

*O genă ccr sau genele ccr din complexul genei sunt indicate în paranteze.

Complexele genei ccr frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul….

Tabelul …..

Cele mai frecvente complexe ale genei ccr

**genele ccrA4B4 gasite in tipul SCCmec VIII au fost aproape identice cu cele din elementul SCC-CI de la S. epidermidis și a arătat identități de nucleotide cu cele gasite in tipul SCCmec VI de 89,6% și respectiv 94,5%.

Complexele genei mec frecvent întâlnite la stafilococi sunt prezentate în tabelul ….

Tabelul ….

Cele mai frecvente complexe ale genei mec

Detectarea rezistenței la meticilina se poate face prin:

– disc difuzie utilizand discul de cefoxitin/ moxalactam/ oxacilina;

– metode automate (vitek2, Phoenix, Microscan etc);

– metode imunologice folosind anticorpi anti PBP2a fixati pe particule din latex.

– metode moleculare (PCR). Reacția PCR este considerată ''gold standard'' pentru detectarea genei mecA.

Cu ajutorul reacției de amplificare în lanț (PCR) de tip multiplex este posibila determinarea tipului SCCmec util în studii de epidemiologie la S. aureus rezistent la meticilina. Caseta de tip IV a fost descrisa la tulpini comunitare de S. aureus, dar și la cele din spital.

Aminozidele sunt molecule cationice cu greutate moleculara mica, hidrosolubile, foarte stabile, de spectru larg și cu o activitate bactericida rapidă. Ele sunt diferite atat prin nucleul molecular (streptidina sau 2-deoxistreptamina = 2-DOS), cat si prin aminohexozele legate de nucleu (Vakulenko si colab., 2003). Gruparile NH2 si OH libere, prin intermediul carora aminozidele se leaga de proteinele ribosomale sunt esentiale pentru activitatea antimicrobiana. Patrunderea unui aminozid in celula bacteriana Gram pozitiva se face in 3 etape:

a) trecerea prin peptidoglican este pasiva, rapida si nonspecifica;

b) EDPI (Energy dependent phase) permite translocarea prin membrana citoplasmatica. Acumularea lenta in citoplasma depinde de concentratia extracelulara de antibiotic;

c) EDPII permite fixarea progresiva a aminozidelor la proteinele ribosomale. Aceasta etapa se caracterizeaza prin accelerarea transferului si o saturare a situsurilor ribosomale.

Gentamicina (CN), tobramicina (TOB), amikacina (AK) si streptomicina sunt folosite in mod curent pentru tratamentul infectiilor cu bacterii Gram pozitive si negative.

Spectrul de activitate al diferitelor antibiotice aminozidice este diferit. Aminozidele mai noi (CN, TOB, AK) au un spectru mai larg decat cele vechi [streptomicina, kanamicina (K)].

Desi manifesta nefrotoxicitate/ ototoxicitate, iar aparitia tulpinilor rezistente este relativ frecventa, aminoglicozidele raman, in continuare, foarte importante pentru tratamentul unor infectii in situatii speciale.

Au cateva particularitati ale actiunii antimicrobiene:

a) activitatea bactericida este dependenta de concentratie;

b) manifesta efectul postantibiotic;

c) au o farmacocinetica relativ predictibila;

d) manifesta efectul sinergic cu antibioticele antiparietale.

Aminoglicozidele se leaga de subunitatea 30S a ribosomului bacterian in zona inalt conservata a ARNr, in locul in care se formeaza legatura specifica intre codonul ARNm si anticodonul aminoacil-ARN si inhiba sinteza proteinelor. Subunitatea 30S are rol esential in traducerea cu mare fidelitate a mesajului genetic. Aminoglicozidele induc erori de citire a ARNm si astfel se sintetizeaza proteine nefunctionale sau sinteza proteinelor este stopata.

Rezistenta la antibioticele aminoglicozidice este larg raspandita. Se produce prin urmatoarele mecanisme:

1. inglobarea scazuta a antibioticului;

2. modificarea tintei ribosomale;

3. efluxul antibioticului;

4. modificarea enzimatica a aminoglicozidelor.

Modificarea chimica a aminoglicozidelor reprezinta principalul mecanism de rezistenta bacteriana. Mecanismele mai rar intalnite sunt sistemele de eflux si mutatiile situsului ribosomal de legare la ARNr (Leclerc si colab., 1991).

Modificarea enzimatica a aminozidelor reprezinta mecanismul major de rezistenta. Modificarea chimica are loc la nivelul grupelor amino sau hidroxil. S-au identificat peste 50 enzime. Acestea se clasifica in 3 familii:

1. aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC): acetilarea gruparilor amino (NH2);

2. aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT): adauga AMP la gruparea OH la pozitiile 2', 3', 4' si respectiv 9;

3. aminoglicozid-fosfotransferaze (APH): adauga grupari de fosfati la aminoglicozide.

Fiecare dintre cele 3 familii de enzime este impartita in clase, in functie de situsul pe care il modifica.

Fiecare clasa contine numeroase enzime, fiind clasificate in subclase.

AAC cuprinde 4 clase de enzime, care acetileaza grupari amino situate in pozitiile 3, 2', 6', fiind notate AAC(3), AAC(2'), AAC(6'). Subclasele contin de asemenea tipuri de enzime, notate cu cifre romane. In functie de tipul enzimei produse variaza fenotipul de rezistenta fata de diferitele aminoglicozide. AAC(3)-I confera rezistenta fata de CN, AAC(3)-II determina rezistenta fata de CN, netilmicina (NET) si TOB, iar AAC(3)-III induce rezistenta fata de CN, TOB si kanamicina (K). Izoenzimele care au functii identice si astfel confera fenotip de rezistenta identic se noteaza cu litere mici: AAC(6')-Ia si AAC(6')-Ib. Noua enzima bifunctionala ce modifica aminoglicozidele, intalnita la specii de stafilococ si enterococ: AAC(6')+APH(2'') prezinta o importanta speciala. Dispune de o terminatie amino, care catalizeaza acetilarea grupei 6'-amino si de o terminatie carboxil care catalizeaza fosforilarea grupei hidroxil 2''. Aceasta enzima inactiveaza majoritatea aminoglicozidelor (exceptie streptomicina, la tulpinile care nu poseda rezistenta de nivel inalt fata de aceasta), fapt pentru care nici un fel de aminoglicozid nu poate fi utilizat in terapie (Dessen, 2001; Schito, 2006).

ANT cuprinde 5 clase de enzime.

APH cuprinde 7 clase de enzime. Sunt kinaze ce utilizeaza ATP ca substrat secundar si fosforileaza gruparile specifice OH, la toate clasele de antibiotice aminoglicozidice.

Aceste enzime ce modifica structura chimica a aminoglicozidelor sunt codificate pe plasmide si transpozoni. Cel mai frecvent intalnite, cu importanta clinica la S. aureus sunt urmatoarele (Dessen, 2001; Fluit, 2001; Ida, 2001):

1. AAC(6')-Ie+APH(2'') codificata de gena aac(6')-Ie+aph(2'') ce confera rezistenta fata de aminoglicozidele folosite in tratamentul infectiilor stafilococice. Gena se afla situata pe transpozonul Tn4001, raspandit la numeroase tulpini de S. aureus si stafilococi coagulazo-negativi. Acest transpozon s-a intalnit pe diferite plasmide, pSK1, pSK23 (plasmid ce poarta si alte gene de rezistenta fata de antibioticele β-lactamice si metale grele) si in variate localizari cromosomale.

2. ANT(4')-I codificata de gena ant(4')-Ia si determina rezistenta fata de K, TOB, neomicina si amikacina (AK). Gena care se afla pe plasmide mici integrate pe plasmide conjugative mai mari (ex. PSK4'), se insereaza frecvent la S. aureus pe elementul SCCmec prin intermediul proceselor de recombinare mediate de secventa de insertie IS257.

3. APH(3')-III codificata de gena aph(3')-IIIa localizata pe transpozonul Tn5405, integrat cromosomal sau plasmidic, duce la rezistenta fata de neomicina si K.

Mecanismele neenzimatice de rezistenta la antibioticele aminoglicozidice sunt:

1. sistemele de eflux;

2. mutatiile ARNr.

Rezistenta la CN se datoreaza prezentei enzimei inactivatoare 2-fosfotransferaza-6-acetiltrasferaza. Enzima confera rezistenta la CN, TOB, NET, AK si K. Rezistenta la CN este un indicator al rezistentei bacteriene la alte aminoglicozide.

Descoperite acum mai bine de 60 ani, tetraciclinele reprezinta un grup de antibiotice naturale cu activitate antibacteriana fata de un spectru larg de microorganisme patogene Gram pozitive/ negative, cat si asupra clamidiilor, micoplasmelor, ricketiilor si catorva protozoare. Sunt bine absorbite si active dupa administrare orala. Din aceste motive au cea mai larga utilizare in clinica umana si veterinara. Utilizarea masiva si necontrolata a tetraciclinei, atat in terapia umana, cat si in cea veterinara (ca promotor de crestere) a condus la selectarea si diseminarea clonelor bacteriene rezistente (Poyart, 2006).

Principalele tetracicline sunt prezentate in tabelul…..

Tabelul….

Principalele tetracicline

Structura chimica de baza a tetraciclinelor este prezentata in Fig……

Fig…… Structura chimica de baza a tetraciclinelor (https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline)

Mecanismul de actiune a tetraciclinelor

Penetrarea in bacterii

Intervin doua procese in cursul penetrarii: difuzia pasiva si absorbtia activa la nivelul membranei citoplasmatice. Tetraciclinele nu difuzeaza liber in celula bacteriilor Gram pozitive.

Actiunea la nivelul ribosomului

Tetraciclinele sunt inhibitori ai fazei de elongare a catenei polipeptidice in timpul traducerii (sintezei proteice), exercitand astfel un efect bacteriostatic. Tetraciclina se fixeaza la nivelul subunitatii ribosomale 30S si in particular, de proteinele S7 si de nucleotidele G693, A892, U1052, C1054, G1300 si G1338 ale ARNr 16S, pentru prevenirea atasarii aminoacil-ARNt la situsul A (acceptor) al ribosomului bacterian.

Pe baza modului de actiune, tetraciclinele au fost impartite in doua categorii:

1. cele care inhiba sinteza proteinelor;

2. cele care interactioneaza cu membrana citoplasmatica.

Mecanismele rezistentei la tetracicline

Rezistenta la tetracicline este una dintre cele mai frecvente atat la bacterii Gram negative, cat si la cele pozitive.

Au fost descrise 3 mecanisme diferite determinate genetic:

1. activitatea pompelor de eflux – elimina tetraciclina din celula si este dependenta de energie fiind cel mai comun mecanism de rezistenta. Este mediat de produsele de sinteza ale genelor de rezistenta – proteine ale membranei citoplasmatice care functioneaza ca transportori ai tetraciclinei. Genele tet ce codifica proteinele de eflux sunt asociate cu plasmide conjugative, ceea ce explica distributia larga a rezistentei. La Staphylococcus genele de eflux sunt localizate, in general, pe plasmide mici de replicare. Prototipul este pT181 purtator al genei tet(K) (Khan si Novick, 1983). Au fost descrise si gene tet(L) ();

2. protectia ribosomilor – intermediul proteinelor solubile. La Staphylococcus au fost descrise genele tet(M), tet(O), tet(W). Cele mai studiate au fost tet(M) si tet(O). Aceste gene sunt de cele mai multe ori localizate pe elemente genetice mobile. Gena tet(M) este localizata pe transpozoni conjugativi in care prototipul este Tn916 si tet(O) pe plasmide conjugative. Proteina TetM a fost purificata (72 kDa) si s-a observat ca in vitro se asociaza cu ribosomii. In vitro are un rol protector fata de actiunea tetraciclinei, observandu-se ca legarea tetraciclinei la ribosom nu este alterata, iar aceasta legare nu modifica functionalitatea ribosomului. Proteina se asociaza cu ribosomii, facandu-i insensibili la actiunea tetraciclinei;

3. inactivarea enzimatica – degradarea oxidativa si nu are semnificatie ca mecanism de rezistenta.

Rezistenta dobandita prin mutatii ale genelor cromosomale este rara. Mutatiile sunt localizate in genele codante pentru ARNr 16S sau la nivelul genelor proteinelor de transport membranar.

Izolatele MRSA rezistente la tetraciclină și sensibile la minociclină (până la 50% din izolatele MRSA (Schmitz si colab., 2001) posedă gena tetK, în timp ce izolatele rezistente la minociclină posedă gena tetM sau ambele tetK și tetM (Trzcinski si colab., 2000).

Linezolidul este un antibiotic sintetic [(S)-N-({3-[3-fluoro-4-(morpholin-4-yl) phenyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl)acetamide] (Brickner, 1996), desemnat ca primul membru din clasa de antibiotice numita oxazolidinone. A fost descoperit prin anii 1990 si apobat de catre U.S. Food and Drug Administration (FDA) pentru uz clinic in 2000.

Linezolidul poate inhiba sinteza proteinelor bacteriene prin legarea de subunitatea 50S a ribosomului bacterian, prin intermediul interacțiunii cu domeniul V al 23S ARNr de la bacteriile Gram-pozitive, prevenind astfel formarea initierii complexului tertiar ribosomal N-formil metionil-ARNt-ARNm-70S. Astfel este stopata cresterea bacteriilor prin perturbarea sintezei proteinelor. Efectul este bacteriostatic, nu bactericid. Astfel, linezolidul este diferit fata de alti inhibitori ai sintezei proteice ca si cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele si tetraciclinele. Are avantajul ca pe langa prevenirea sintezei proteinelor stafilococice are si efect inhibitor asupra cresterii celulare bacteriene.

Proprietatiile sale farmacokinetice si farmacodinamice il califica pentru utilizarea lui in pneumonii nosocomiale si comunitare, infectii complicate de piele si tesuturi moi (Grau si colab., 2007), osteomielita (Aneziokoro si colab., 2005), sepsis (Pistella si colab., 2004) etc.

De la introducerea linezolidului s-a spus ca rezistenta va fi rara si nu va conduce la rezistenta incrucisata (Zhou si colab., 2015).

Prima alerta cu S. aureus rezistent la meticilina si la linezolid a fost raportata in 2001 in America de Nord (Tsiodras si colab., 2001). Dupa acest an, stafilococii si enterococii rezistenti la linezolid au fost raportati (Potoski si colab., 2006), (Cai si colab., 2012), (Chen si colab., 2013), (Gu si colab., 2013).

In Statele Unite ale Americii (U.S.A.), sensibilitatea la linezolid a izolatelor clinice Gram pozitive a fost monitorizata din 2004 printr-un program numit Linezolid Experience and Accurate Determination of Resistance (LEADER). Rezultatele au aratat ca rezistenta a ramas stabila si extrem de scazuta (Jones si colab., 2007), (Jones si colab., 2008), (Jones si colab., 2009). O retea de supraveghere similara numita "Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum Study" sau ZAAPS a functionat in centrele medicale din Europa (Flamm si colab., 2013), (Tian si colab., 2014).

Pana acum au fost descrise 3 mecanisme de rezistenta la linezolid:

a) mutatii variate la nivelul buclei centrale a uneia sau mai multor alele ale regiunii domeniului V al genei 23S ARNr (Hong si colab., 2007), (Lincopan si colab., 2009), (Bongiorno si colab., 2010), (Sorlozano si colab., 2010), (De Almeida L.M. si colab., 2013).

b) metilarea ARN-ului de catre doua enzime diferite – RlnM cu imbunatatirea activitatii metiltransferazei urmata de inserarea unui codon in gena metiltransferazei rlmN la S. aureus (Gao si colab., 2010) si metiltransferaza 23S ARNr produsa ca rezultat al achizitionarii genei cfr de rezistenta la cloramfenicol-florfenicol methylation of RNA by two different enzymes – RlnM, with enhanced methyltransferase activity following a codon insertion in the methyltransferase gene rlmN in S. aureus and 23S rRNA methyltransferase produced as a result of chloramphenicol-florfenicol resistance (cfr) gene acquisition (Mendes si colab., 2008), (Quiles-Melero si colab., 2013), (Campanile si colab., 2013), (Huang si colab., 2014), 23S rRNA metiltransferaza metileaza adenozina in pozitia 2503 in 23S ARNr (E. coli 23S rRNA gene numbering).

Gena cfr confera rezistenta la 5 clase de agenti antimicrobieni, ca de ex fenicoli, lincosamide, oxazolidinone, pleuromutiline si streptogramine A, un fenotip numit PhLOPSA (Kehrenberg si colab., 2005), (Long si colab., 2006), (Shore si colab., 2010), (Toh si colab., 2007). Gena este localizata pe plasmid sau cromosom (Toh si colab., 2007), (Kehrenberg si colab., 2007). Poate fi transmisa pe orizontala intre specii si acest mod de transmitere este dificil de prevenit si oprit (Kehrenberg si colab., 2007), (Nian si colab., 2012). Gena cfr a fost identificata la stafilococii coagulazo-negativi de la animale (Kehrenberg si Schwarz, 2006), (Schwarz si colab., 2000). A fost gasita de asemenea la un numar limitat de tulpini umane de S. aureus si stafilococi coagulazo negativi (Mendes si colab., 2008), (Toh si colab., 2007), (Mendes si colab., 2010), (Morales si colab., 2010).

c. mutatii sau deletii in genele ce codifica subunitatea ribosomala 50S a proteinelor L3 (De Almeida si colab., 2013), L4 si L22 (codificate de catre genele rplC, rplD si rplV) (Holzel si colab., 2010), (Long si Vester, 2012), (Shaw si Barbachyn, 2011).

In Romania a fost acordata putina atentie stafilococilor coagulazo-negativi, dar alti autori au raportat capacitatea acestor microorganisme de a fi implicate in infectii severe si in dobandirea rezistentei la linezolid (Bongiorno si colab., 2010), (Mendes si colab., 2010), (Petinaki si colab., 2009). Reprezinta un rezervor neglijat al rezistentei mediata de cfr, frecvent raportata in multe regiuni, incluzand America de Nord (U.S.A., Mexic), America de Sud (Brazilia), Europa (Grecia, Spania, Italia, Franta, Irlanda) si Asia (India) (Gu si colab., 2013), (Potoski si colab., 2006), (Mendes si colab., 2010), (Mutnick si colab., 2003). Cateva tulpini au fost rar raportate in China (Zhou si colab., 2015), (Cai si colab., 2012), (Chen si colab., 2013), (Yang si colab., 2013).

In multe sectii din spital si mai ales la Terapie Intensiva, presiunea antibioticului, datorata fie utilizarii adecvate sau neadecvate si dificultatea detectarii catorva mecanisme fenotipice de rezistenta au condua la cresterea prevalentei tulpinilor rezistente in intreaga lume (Shorr si Lipman, 2007) si favorizeaza dezvoltarea rezistentelor multiple la microorganismele din genul Staphylococcus spp. (Mackenzie si colab., 2007).

Scopul acestei lucrari a fost de a caracteriza fenotipic si genotipic tulpinile de Staphylococcus aureus

Au fost luate în studiu ….. tulpini de S. aureus, izolate de la pacienți cu infecții cutanate, …. 22 tulpini provin de la Unitatea Medicală A (UMA) din București, 28 tulpini provin de la Unitatea Medicală B (UMB) din Suceava, 42 tulpini provin de la Laboratorul de Analize Medicale din cadrul Institutului Cantacuzino = Unitatea Medicală C (UMC) din București fiind izolate comunitare, 29 tulpini de la Unitatea Medicală D (UMD) din București fiind tot izolate comunitare de la pacienții ce s-au prezentat la camera de gardă a unității medicale. Aceste tulpini au fost colectate în anii 2010 (UMA), 2013/2014 (UMB), 2014 (UMC) și 2015 (UMD). În paralel, au fost folosite ca referință mai multe tulpini pentru fiecare metodă.

Extracția de material genetic bacterian. Extracția de ADN s-a realizat cu ajutorul kitului ''NucleoSpin Tissue'' (Macherey-Nagel, Germany) conform indicațiilor producătorului.

A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției de amplificare în lanț (PCR) in sistem triplex, dupa un protocol optimizat ''in house'' (Dragulescu si colab., 2007), țintind gena lukS/F. S-a utilizat termocycler-ul ''Corbett Research'' (). Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri nucF și nucR (5 pmoli/R din fiecare), mecA1 și mecA2 (5 pmoli/R din fiecare), lukS/F1 și lukS/F2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,5 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în triplex PCR

Programul de amplificare este prezentat în tabelul….

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 2%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

A fost pusă în evidență cu ajutorul reacției PCR simplex țintind gena spa. Protocolul de lucru a fost stabilit de cei de la Ridom spaserver (http://www.ridom.de/doc/Ridom_spa_sequencing.pdf). Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV. Ampliconii astfel obținuți au fost purificați utilizând kit-ul Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Ampliconii purificați au fost introduși în reacția de secvențiere utilizând kitul BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems), apoi purificați cu ajutorul kit-ului DyeEx 2.0 Spin (Qiagen), cu obținerea unor peleți supuși metodei Sanger de secvențiere cu echipamentul ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Analiza si incadrarea in tipuri spa a secventelor obtinute s-a realizat cu ajutorul softului Ridom StaphType software (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany).

Secventele primerilor utilizati in reactia de amplificare in lant si secventierea ampliconilor obtinuti sunt prezentate in tabelul …..

Tabelul ……

Secventa primerilor utilizati

Au fost evidențiate cu ajutorul reacției PCR simplex pentru fiecare genă sea, seb, sec, sed, see. Mix-ul fiecarei reactii s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri SEA1/ SEA2, respectiv SEB1/SEB2; SEC1/SEC2; SED1/SED2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactii este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în fiecare simplex PCR

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul……

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

S

A fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru gena tsst-1. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri TSST1 și TSST2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secvența primerilor utilizați în simplex PCR

Programul de amplificare este prezentat în tabelul……..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

– Evidentierea genei blaZ

Rezistenta la penicilina mediata prin producerea de penicilinaza a fost pusa în evidenta prin PCR simplex pentru gena blaZ. Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri blaZ 1 si blaZ 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ……

Secventa primerilor utilizati in reactie

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Evidentierea genei mecA prin amplificare genica reprezintă ''gold standard''ul detectarii rezistentei la meticilina (oxacilina, cefoxitin). Detectarea genei s-a realizat prin reactia PCR in sistem triplex descrisa in subcapitolul 2.2.1.

Rezistenta la gentamicina a fost pusa in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex pentru gena aacA-aphD.

Mix-ul reactiei s-a realizat în volum final de 25 μl și conține 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri aacA-aphD 1 si aacA-aphD 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventa primerilor utilizati in reactie este prezentata in tabelul ….

Tabelul ….

Secventa primerilor utilizati in reactie

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

, erm

Genele ermA-C au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri ermA 1 si ermA 2, respectiv ermC 1 si ermC 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactie sunt prezentate in tabelul ….

Tabelul ….

Secventele primerilor utilizati in reactii

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

Genele tetK si tetM au fost puse in evidenta cu ajutorul reactiei PCR simplex. Mix-urile reactiilor s-au realizat în volum final de 25 μl și conțin 5x tamponul enzimei Taq DNA polimeraza Promega (Promega Corporation, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, primeri tetK 1 si tetK 2, respectiv tetM 1 si tetM 2 (10 pmoli/R din fiecare), 1,25 U enzimă Taq DNA polimeraza Promega, apă distilată sterilă liberă de DN-aze, RN-aze până la volum final de 25 μl. Secventele primerilor utilizati in reactii sunt prezentate in tabelul ….

Tabelul ….

Secventa primerilor utilizati in reacție

Programul de amplificare este prezentat in tabelul…..

Tabelul…..

Programul de amplificare

Produșii de amplificare au fost migrați prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, 100V, timp de 48 minute, colorat cu bromura de etidium și vizualizat pe transiluminator cu UV.

Tipizarea moleculara a

Metoda PFGE considerata ''gold standard'' in epidemiologia tulpinilor de S. aureus. Determinarea clonalitatii tulpinilor

Ogston A., 1984, "On Abscesses". Classics in Infectious Diseases", Rev. Infect. Dis., 6, 122–28.doi:10.1093/clinids/6.1.122.

Kluytmans J., van Belkum A., Verbrugh H., 1997, "Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks", Clin. Microbiol. Rev., 10, 505–20.

Codiță I., 2008, Identificarea stafilococilor, Tratat de microbiologie clinica, Buiuc D., Negut M., Editura Medicala Bucuresti, 562-583.

Cole A.M., Tahk S., Oren A., Yoshioka D., Kim Y.H., Park A., Ganz T., 2001, "Determinants of Staphylococcus aureus nasal carriage", Clin Diagn Lab Immunol., 8, 1064–9. doi:10.1128/CDLI.8.6.1064-1069.2001.

Cimolai N., 2008, "MRSA and the environment: implications for comprehensive control measures", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 27, 481–93. doi:10.1007/s10096-008-0471-0.

Fluit AC., 2012, Livestock-associated Staphylococcus aureus, Clin. Microbiol. Infect., 18, 735–44.

Hasman H., Moodley A., Guardabassi L., Stegger M., Skov R.L., Aarestrup F.M., 2010, Spa type distribution in Staphylococcus aureus originating from pigs, cattle and poultry, Vet. Microbiol., 141, 326–31.

Kobayashi S.D., DeLeo F.R., 2009, An update on community-associated MRSA virulence, Curr. Opin. Pharmacol., 9, 545–551.

Bose J.L., Daly S.M., Hall P.R. and Bayles K.W., 2014, Identification of the Staphylococcus aureus vfrAB Operon, a Novel Virulence Factor Regulatory Locus, Infect. Immun., 82, 1813. DOI: 10.1128/IAI.01655-13.

Harris L.G., Foster S.J., and Richards R.G., 2002, An introduction to Staphylococcus aureus, and techniques for identifying and quantifying S. aureus adhesins in relation to adhesion to biomaterials: review, European Cells and Materials, 4, 39-60.

Chen M., Yu Q., and Sun H., 2013, Novel Strategies for the Prevention and Treatment of Biofilm Related Infections, Int. J. Mol. Sci., 14, 18488-18501; doi:10.3390/ijms140918488.

Gould I.M., Reilly J., Bunyan D., and Walker A., 2010, Costs of healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus and its control, Clin. Microbiol. Infect., 16, 1721–1728.

Ma Y., Xu Y., Yestrepsky B.D., Sorenson R.J., Chen M., Larsen S.D., Sun H., 2012, Novel Inhibitors of Staphylococcus aureus Virulence Gene Expression and Biofilm Formation, PLoS ONE, 7, e47255. doi:10.1371/journal.pone.0047255.

Peacock S.J., de Silva I., and Lowy F.D., 2001, What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus?, Trends Microbiol., 9, 605–610.

Foster TJ., 2004, The Staphylococcus aureus ''superbug''. J Clin Invest., 114, 1693–1696. doi:10.1172/JCI200423825.

Fournier B., Philpott D.J., 2005, Recognition of Staphylococcus aureus by the Innate Immune System, Clin. Microbiol. Rev., 18, 521–540.

Lowy F.D., 1998, Medical progress – Staphylococcus aureus infections, N. Engl. J. Med., 339, 520–32.

Lin Y.-C. and Peterson M.L., 2010, New insights into the prevention of staphylococcal infections and toxic shock syndrome, Expert Rev. Clin. Pharmacol., 3, 753–767.

O’Riordan K., Lee J.C., 2004, Staphylococcus aureus capsular polysaccharides, Clin. Microbiol. Rev., 17, 218–234.

Lee J.C., 1996, The prospects for developing a vaccine against Staphylococcus aureus, Trends Microbiol., 4, 162-6.

Kessler C.M., Nussbaum E., Tuazon C.U., 1991, Disseminated intravascular coagulation associated with Staphylococcus aureus septicemia is mediated by peptidoglycan-induced platelet aggregation, J. Infect. Dis., 164, 101-7.

Lazar V., 2007, Microbiologie medicala, Editura Universitatii Bucuresti.

Weidemaier C., 2004, Role of teichoic acids in nasal colonisation, a major risk factor in nosocomial infections, Nature Medicine, 10, 243-245.

Mazmanian S.K., Ton-That H. & Schneewind O., 2001, Sortase-catalysed anchoring of surface proteins to the cell wall of Staphylococcus aureus, Mol. Microbiol., 40, 1049-1057.

Weiss W.J., Lenoy E., Murphy T., Tardio L., Burgio P., Projan S.J., Schneewind O. & Alksne L., 2004, Effect of srtA and srtB gene expression on the virulence of Staphylococcus aureus in animal models of infection, J. Antimicrob. Chemother., 53, 480-486.

Lowy F.D., 2003, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, J. Clin. Invest., 111, 1265-1273.

Komatsuzawa H., Choi G.H., Ohta K., Sugai M., Tran M.T., Suginaka H., 1999, Cloning and characterization of a gene, pbpF, encoding a new penicillin-binding protein PBP2B, in Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 43, 1578-1583.

Reynolds P.E., 1988, The essential nature of staphylococcal penicillin-binding proteins, pp. 343-351. În Actor P., Daneo-Moore L., Higgins M.L., Salton M.R., Shockman G.D. (ed.), Antibiotics inhibition of bacterial cell surface assembly and function. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Zygmunt D.J., Stratton C.W., Kernodle D.S., 1992, Characterization of four β-lactamases produced by Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 36, 440-445.

Drugeon H.B., 2006, β-lactamines et Staphylocoques, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 117-124.

Pinho M.G., Filipe S.R., de Lencastre H., Tomasz A., 2001, Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2a in Staphylococcus aureus, J. Bacteriol., 183, 6525-6531.

Chambers H.F., 1997, Methicillin resistance in staphylococci: molecular and biochemical basis and clinical implications, Clin. Microbiol. Rev., 10, 781-791.

Poyart C., 2006, Tetracyclines, Antibiogramme, 2-eme Edition, ESKA, 325-333.

Drăgulescu E.C., Oprea M., Străuț M., Codiță I., 2007, Detectarea rapidă a tulpinilor de Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent folosind tehnica PCR multiplex, A XI-a Reuniune Anuală de Microbiologie, 24-26 mai, Mamaia, România – poster.

Strommenger B., Kettlitz Ch., Werner G., and Witte W., 2003, Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Nine Clinically Relevant Antibiotic Resistance Genes in Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiol., 41, 4089–4094.

Lina G., Piemont Y., Godail-Gamot F., Bes M., Peter M-O., Gauduchon V., Vandenesch F., and Etienne J., 1999, Involvement of Panton-Valentine Leukocidin–Producing Staphylococcus aureus in Primary Skin Infections and Pneumonia, Clin. Infect. Dis., 29, 1128–1132.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother., 51, 3374–3377.

Brakstad O.G., Aasbakk K. and Maeland J.A., 1992, Detection of Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene, J. Clin. Microbiol., 30, 1654-1660.

Harmsen D., Claus H., Witte W., Rothgänger J., Claus H., Turnwald D., Vogel U., 2003, Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting using a novel software for spa-repeat determination and database management, J. Clin. Microbiol., 41, 5442–5448.

Mellmann A., Friedrich A.W., Rosenkötter N., Rothgänger J., Karch H., Reintjes R., Harmsen D., 2006, Automated DNA sequence-based early warning system for the detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreaks, PLoS Med., 3, e33.

Blaiotta G., Ercolini D., Pennacchia C., Fusco V., Casaburi A., Pepe O., Villani F., 2004, PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus spp. Strains isolated from meat and dairy products. Evidence for new variants of seG and seI in S. aureus AB – 8802. J. Applied Microbiol., 97, 719–730.

Johnson W., Tyler M.S., Ewan S.D., Ashton E.P., Polland F.E. and Rozee K.R., 1991, Detection of genes for enterotoxins, exofoliative toxins and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 29, 426–430.

Murchan S., Kaufmann M.E., Deplano A., de Ryck R., Struelens M., Elsberg Zinn Ch., Fussing V., Salmenlinna S., Vuopio Varkila J., El Solh N., Cuny Ch., Witte W., Tassios P.T., Legakis N., van Leeuwen W., van Belkum A., Vindel A., Laconcha I., Garaizar J., Haeggman S., Olsson-Liljequist B., Ransjo U., Coombes G., and Cookson B., 2002, Harmonization of Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocols for Epidemiological Typing of Strains of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: a Single Approach Developed by Consensus in 10 European Laboratories and Its Application for Tracing the Spread of Related Strains. J. Clin. Microbiol., 41, 1574–1585.

Vakulenko S.B., Donabedian S.M., Voskresenskiy A.M., Zervos M.J., Lerner S.A., Chow J.W., 2003, Multiplex PCR for Detection of Aminoglycoside Resistance Genes in Enterococci, Antimicrob. Agents Chemother., 47, 1423-1426.

Leclerc D., Melancon P., Brakier – Gingras L., 1991, Mutations in the 915 region of Escherichia coli 16S ribosomal RNA reduce the binding of streptomycin to the ribosome, Nuc. Acids Res., 19, 3973-3977.

Khan S.A., Novick R.P., 1983, Complete nucleotide sequence of pT181, a tetracycline-resistance plasmid from Staphylococcus aureus. Plasmid, 10, 251-259.

Schmitz F.J., Krey A., Sadurski R., Verhoef J., Milatovic D., and Fluit A.C., 2001, Resistance to tetracycline and distribution of tetracycline resistance genes in European Staphylococcus aureus isolates, J. Antimicrob. Chemother., 47, 239–240.

Trzcinski K., Cooper B.S., Hryniewicz W., and Dowson C.G., 2000, Expression of resistance to tetracyclines in strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. Antimicrob. Chemother., 45, 763–770.

Oliveira D.C., Milheirico C., de Lencastre H., 2006, Redefining a Structural Variant of Staphylococcal Cassette Chromosome mec, SCCmec Type VI, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 3457-3459.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus, Antimicrob. Agents Chemother., 51, 3374–3377.

Milheirico C., Oliveira D.C., and de Lencastre H., 2007, Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: „SCCmec IV multiplex”, J. Antimicrob. Chemother., doi:10.1093/jac/dkm112.

Shanshuang Li., Skov R.L., Han X., Larsen A.R., Larsen J., Sorum M., Wulf M., Voss A., Hiramatsu K. and Ito T., 2011, Novel Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Elements Identified in Clonal Complex 398 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Strains, Antimicrob. Agents Chemother., 55, 3046-3050.

International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome Elements (IWG-SCC), 2009, Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements, Antimicrob. Agents Chemother., 53, 4961-4967.

Hiramatsu K., Cui L., Kuroda M., Ito T., 2001, The emergence and evolution of methicillin resistant Staphylococcus aureus, Trends Microbiol., 9, 493-496.

Ito T., Ma X.X., Takeuchi F., Okuma K., Yuzawa H., Hiramatsu K., 2004, Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase ccrC, Antimicrob. Agents Chemother., 48, 2637-2651.

Martineau F., Picard F.J., Lansac N., Menard C., Roy P.H., Ouellette M., and Bergeron M.G., 2000, Correlation between the resistance genotype determined by multiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, Antimicrob. Agents Chemother., 44, 231–238.

Brickner S.J., 1996, "Oxazolidinone antibacterial agents". Curr. Pharmaceut. Design, 2, 175–194.

Grau S., Aguado J.M., Mateu-De Antonio J., Gonzales P., Del Castillo A., 2007, Economic evaluation of linezolid versus teicoplanin for the treatment of infections caused by gram-positive microorganisms in Spain, J. Chemother., 19, 398–409.

Aneziokoro C.O., Cannon J.P., Pachucki C.T., Lentino J.R., 2005, "The effectiveness and safety of oral linezolid for the primary and secondary treatment of osteomyelitis". J. Chemother., 17, 643–650.

Pistella E., Campanile F., Bongiorno D., Stefani S., Di Nucci GD, Serra P. & Venditti M., 2004, Successful Treatment of Disseminated Cerebritis Complicating Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Endocarditis Unresponsive to Vancomycin Therapy with Linezolid, Scandinavian J. Infect. Dis., 36, 222-225.

Zhou W., Niu D., Cao X., Ning M., Zhang Z., Shen H., Zheng K., 2015, Clonal dissemination of linezolid-resistant Staphylococcus capitis with G2603T mutation in domain V of the 23S rRNA and the cfr gene at a tertiary care hospital in China, BMC Infectious Diseases, 15, 97. DOI10.1186/s12879-015-0841-z.

Tsiodras S., Gold H.S., Sakoulas G., Eliopoulos G.M., Wennersten Ch., Venkataraman L., Moellering Jr R.C., Ferraro M.J., 2001, Linezolid resistance in a clinical isolate of Staphylococcus aureus, Lancet, 358, 207–208.

Cai J.C., Hu Y.Y., Zhang R., Zhou H.W., Chen G.X., 2012, Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci and Enterococcus faecium from China, J. Med. Microbiol., 61, 1568-1573.

Potoski B.A., Adams J., Clarke L., Shutt K., Linden P.K., Baxter C., Pasculle A.W., Capitano B., Peleg A.Y., Szabo D., Paterson D.L., 2006, Epidemiological profile of linezolid-resistant coagulase-negative staphylococci, Clin. Infect. Dis., 43, 165–171.

Chen H., Wu W., Ni M., Liu Y., Zhang J., Xia F., He W., Wang Q., Wang Z., Cao B., Wang H., 2013, Linezolid-resistant clinical isolates of enterococci and Staphylococcus cohnii from a multicentre study in China: molecular epidemiology and resistance mechanisms, Int. J. Antimicrob. Agents, 42, 317-321.

Gu B., Kelesidis T., Tsiodras S., Hindler J. & Humphries R.M., 2013, The emerging problem of linezolid-resistant Staphylococcus, J. Antimicrob. Chemother., 68, 4–11.

Jones R.N., Fritsche T.R., Sader H.S., Ross J.E., 2007, LEADER surveillance program results for 2006: an activity and spectrum analysis of linezolid using clinical isolates from the United States (50 medical centers), Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 59, 309-317.

Jones R.N., Ross J.E., Castanheira M., Mendes R.E., 2008, "United States resistance surveillance results for linezolid (LEADER Program for 2007)", Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 62, 416–426.

Jones R.N., Kohno S., Ono Y., Ross J.E., Yanagihara K., 2009, ZAAPS International Surveillance Program (2007) for linezolid resistance: Results from 5591 Gram-positive clinical isolates in 23 countries, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 64, 191-201.

Flamm R.K., Mendes R.E., Ross J.E., Sader H.S., Jones R.N., 2013, An international activity and spectrum analysis of linezolid: ZAAPS Program results for 2011, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 76, 206-213.

Tian Y., Li T., Zhu Y., Wang B., Zou X. and Li M., 2014, Mechanisms of linezolid resistance in staphylococci and enterococci isolated from two teaching hospitals in Shanghai, China, BMC Microbiol., 14, 292.

De Almeida L.M., De Araújo M.R.E., Sacramento A.G., Pavez M., De Souza A.G., Rodrigues F., Gales A.C., Lincopan N., Sampaio J.L.M., Mamizuka E.M., 2013, Linezolid Resistance in Brazilian Staphylococcus hominis Strains Is Associated with L3 and 23S rRNA Ribosomal Mutations, Antimicrob. Agents Chemother., 57, 4082–4083.

Bongiorno D., Campanile F., Mongelli G., Baldi M.T., Provenzani R., Reali S., Lo Russo C., Santagati M., Stefani S., 2010, DNA methylase modifications and other linezolid resistance mutations in coagulase-negative staphylococci in Italy, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2336-2340.

Hong T., Li X., Wang J., Sloan C., Cicogna C., 2007, Sequential linezolid-resistant Staphylococcus epidermidis isolates with G2576T mutation, J. Clin. Microbiol., 45, 3277–3280.

Lincopan N., De Almeida L.M., Elmor De Araújo M.R., Mamizuka E.M., 2009, Linezolid resistance in Staphylococcus epidermidis associated with a G2603T mutation in the 23S rRNA gene, Int. J. Antimicrob. Agents., 34, 281–282.

Sorlozano A., Gutierrez J., Martinez T., Yuste M.E., Perez-Lopez J.A., Vindel A., Guillen J., Boquete T., 2010, Detection of new mutations conferring resistance to linezolid in glycopeptide-intermediate susceptibility Staphylococcus hominis subspecies hominis circulating in an intensive care unit, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 29, 73–80.

Gao W., Chua K., Davies J.K., Newton H.J., Seemann T., Harrison P.F., Holmes N.E., Rhee H.W., Hong J.In., Hartland E.L., Stinear T.P., Howden B.P., 2010, Two novel point mutations in clinical Staphylococcus aureus reduce linezolid susceptibility and switch on the stringent response to promote persistent infection, PLoS Pathog., 6: e1000944.

Campanile F., Mongelli G., Bongiorno D., Adembri C., Ballardini M., Falcone M., Menichetti F., Repetto A., Sabia C., Sartor A., Scarparo C., Tascini C., Venditti M., Zoppi F., Stefani S., 2013, Worrisome Trend of New Multiple Mechanisms of Linezolid Resistance in Staphylococcal Clones Diffused in Italy, J. Clin. Microbiol., 51, 1256–1259.

Huang Y., Xu Y., Liu G., Mei Y., Xia W., Xu T., Gu B., Pan S., 2014, Emergence of linezolid resistance in a clinical Staphylococcus capitis isolate from Jiangsu Province of China in 2012, J. Thorac. Dis., 6, E48-E53.

Mendes R.E., Deshpande L.M., Castanheira M., Dipersio J., Saubolle M.A. and Jones R.N., 2008, First Report of cfr-Mediated Resistance to Linezolid in Human Staphylococcal Clinical Isolates Recovered in the United States. Antimicrob. Agents Chemother., 52, 2244–2246.

Quiles-Melero I., Gómez-Gil R., Romero-Gómez M.P., Sánchez-Diaz A.M., De Pablos M., Garcia-Rodriguez J., Gutiérrez A., Mingorancea J., 2013, Mechanisms of Linezolid Resistance among Staphylococci in a Tertiary Hospital. J. Clin. Microbiol., 51, 998–1001.

Kehrenberg C., Schwarz S., Jacobsen L., Hansen L.H., Vester B., 2005, A new mechanism for chloramphenicol, florfenicol and clindamycin resistance: methylation of 23S ribosomal RNA at A2503, Mol. Microbiol., 57, 1064-1073.

Long K.S., Poehlsgaard J., Kehrenberg C., Schwarz S. and Vester B., 2006, The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to phenicols, lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilins, and streptogramin A antibiotics, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 2500–2505.

Shore A.C., Brennan O.M., Ehricht R., Monecke St., Schwarz St., Slickers P. and Coleman D.C., 2010, Identification and Characterization of the Multidrug Resistance Gene cfr in a Panton-Valentine Leukocidin-Positive Sequence Type 8 Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus IVa (USA300) Isolate, Antimicrob. Agents Chemother., 54, 4978–4984.

Toh S.M., Xiong L., Arias C.A., Villegas M.V., Lolans K., Quinn J., Mankin A.S., 2007, Acquisition of a natural resistance gene renders a clinical strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus resistant to the synthetic antibiotic linezolid, Mol. Microbiol., 64, 1506-1514.

Kehrenberg C., Aarestrup F.M., Schwarz S., 2007, IS21-558 insertion sequences are involved in the mobility of the multiresistance gene cfr, Antimicrob. Agents Chemother., 51, 483-487.

Nian H., Chu Y., Tian S., Sun G., Ding L., Guo L. and Shang H., 2012, First report of clinical linezolid-resistant Staphylococcus cohnii mediated by the cfr gene, African J. of Microb. Research., 6, 5043-5047.

Kehrenberg C., Schwarz S., 2006, Distribution of florfenicol resistance genes fexA and cfr among chloramphenicol-resistant Staphylococcus isolates, Antimicrob. Agents Chemother., 50, 1156-1163.

Schwarz S., Werckenthin C. and Kehrenberg C., 2000, Identification of a plasmid-borne chloramphenicol-florfenicol resistance gene in Staphylococcus sciuri, Antimicrob. Agents Chemother., 44, 2530–2533.

Mendes R.E., Deshpande L., Rodriguez-Noriega E., Ross J.E., Jones R.N. and Morfin-Otero R., 2010, First report of linezolid-resistant Staphylococcal clinical isolates in Mexico caused by cfr: evidence of in vivo cfr mobilization, J. Clin. Microbiol., 48, 3041–3043.

Morales G., Picazo J.J., Baos E., Candel F.J., Arribi A., Pelaez B., Andrade R., De La Torre M.A., Fereres J. and Sanchez-Garcia M., 2010, Resistance to linezolid is mediated by the cfr gene in the first report of an outbreak of linezolid-resistant Staphylococcus aureus, Clin. Infect. Dis., 50, 821–825.

Holzel C.S., Harms K.S., Schwaiger K., Bauer J., 2010, Resistance to linezolid in a porcine Clostridium perfringens strain carrying a mutation in the rplD gene encoding the ribosomal protein L4, Antimicrob. Agents Chemother., 54, 1351-1353.

Long K.S. si Vester B., 2012, Resistance to linezolid caused by modifications at its binding site on the ribosome, Antimicrob. Agents Chemother., 56, 603–612.

Shaw K.J. si Barbachyn M.R., 2011, The oxazolidinones: past, present, and future, Ann. New York Acad. Sci., 1241, 48–70.

Mendes R.E., Deshpande L.M., Farrell D.J., Spanu T., Fadda G., Jones R.N., 2010, Assessment of linezolid resistance mechanisms among Staphylococcus epidermidis causing bacteraemia in Rome, Italy, J. Antimicrob. Chemother., 65, 2329-2335.

Petinaki E., Kanellopoulou M., Damani A., Foka A., Spiliopoulou I., Skalmoutsou N., Raitsiou B., Valakis K., Papafragas E., 2009, Linezolid-resistant Staphylococcus cohnii, Greece, Emerg. Infect. Dis., 15, 116-118.

Mutnick A.H., Enne V., R.N. Jones R.N., 2003, Linezolid resistance since 2001: SENTRY antimicrobial surveillance program. Ann. Pharmacother., 37, 769-774.

Yang X.J., Chen Y., Yang Q., Qu T.T., Liu L.L., Wang H.P., Yu Y.S., 2013, Emergence of cfr-harbouring coagulase-negative staphylococci among patients receiving linezolid therapy in two hospitals in China, J. Med. Microbiol., 62, 845-850.

Shorr A.F., Lipman J., 2007, Resistance in the intensive care unit: whose problem is it and how can intensivists help?, Crit. Care Med., 35, 299–301.

Mackenzie F.M., Bruce J., Struelens M.J., Goossens H., Mollison J., Gould I.M. and on behalf of the Arpac Steering Group, 2007, Antimicrobial drug use and infection control practices associated with the prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in European hospitals, Clin. Microbiol. Infect., 13, 269–276.

https://it.wikipedia.org/wiki/Tetracicline