Colectiv de autori [310316]
Colectiv de autori
1). ASIMINEI STELIAN
2). ANDERCO ȘTEFANIA
3). DOBRE GHEORGHE
4). IȘAN ELENA
5). MITROIU MIRCEA DAN
6). PUCHIANU GHEORGHE
7). SECAȘIU VASILE
8). SOLCAN GHEORGHE
Colectiv de autori
PATOLOGIA ALBINEI MELIFERE
1) ASIMINEI Stelian
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Cercetător științific (CS); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● Coordonator PATOLOGIA ALBINEI MELIFERE;
● Autor al cap. I.3.; I.4.; I.5. și al subcap. II.3.1.2.; II.3.1.3.;II.3.1.4.2.; II.6.2.1.
2) SOLCAN Gheorghe
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● Profesor univ., Disciplina: [anonimizat] – USAMV Iași;
● Premiul ,,T. Săvulescu,, al Academiei României;
● Premiul ,,I. Adameșteanu ˮ al ASAS;
● Autor al cap. II.5.
3) SECAȘIU Vasile
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD); Cercetător științific principal gradul I (CP1);
● Laureat al Academiei Române;
● Autor al cap. II.2.
4) [anonimizat]
● Biolog (B); Doctor în biologie (PhD);
● Conf. Univ. Disciplina: [anonimizat], [anonimizat] – UAIC Iași;
● Coordonator de grup Fauna Europaea pentru ,,Hymenoptyera Apocrita excluding Ichneumonoidea";
● Autor al cap. I.1.; I.2.
5) PUCHIANU Gheorghe
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● [anonimizat];
● [anonimizat] – U. Brașov;
● Coautor al cap. II.3.
6) IȘAN Elena
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● [anonimizat];
● Autor al cap. II.4.;
7) ANDERCO Ștefania
●Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● [anonimizat];
● Autor al cap. II.1.
8) DOBRE Gheorghe
● Doctor medic veterinar (DVM); Medic primar veterinar (MPV); Doctor în medicină veterinară (PhD);
● Coautor al cap. II.6.
CUPRINS
Cuvânt înainte
Îmi face o deosebită plăcere și sunt onorat să adresez cititorilor cuvinte de apreciere despre o lucrare cum este cea intitulată „Patologia albinei melifere”, [anonimizat], situație creată în special de intervențiile necontrolate în arealele în care sunt crescute albinele.
[anonimizat]: Albina meliferă: [anonimizat]; Familia de albine: organizare și funcționare; Apărarea antiinfecțioasă la albina meliferă; Diagnosticul bolilor la albine: conduită generală; profilaxia bolilor albinelor; Bolile virale la albine; Bolile bacteriene la albine; Bolile parazitare la albine; Bolile micotice la albine; Intoxicațiile albinelor; [anonimizat], tehnopatiile și dăunătorii albinelor.
[anonimizat] ([anonimizat], [anonimizat], studenți sau doctoranzi) va înțelege valoarea deosebită științifică și practică a acestei lucrări. [anonimizat]-și aducă la zi cunoștințele privind patologia albinei melifere.
Felicit, pe această cale, pe autori pentru deosebita valoare științifică a lucrării, pentru faptul că au realizat prin această lucrare o actualizare a cunoștințelor privind biologia și patologia albinei melifere.
Martie 2016 Prof. Univ. Dr. (CS I) Dumitru MILITARU
Președinte
Secția de Medicină Veterinară
Academia de Științe Agricole și Silvice
„Gheorghe Ionescu – Șișești”
Prefață
Uniți de același țel creator, autorii volumului „Patologia albinei melifere” oferă cititorilor o valoroasă realizare editorială. Nominalizarea acestora se referă la personalități de elită ale profesiei – universitari, cercetători, doctori în științe – care, și în creații anterioare, și-au dovedit performanțele. Invitația din partea coordonatorului, dr. S. Asiminei, de a prefața această frumoasă carte, mă onorează. Demersul complex despre Apis mellifera mi se pare benefic, oportun și lăudabil, de a oferi informații și noutăți „de ultimă oră” despre proverbiala insectă dăruitoare de bunuri apicole.
Despre actualitatea și șiragul informațiilor cuprinse în volum voi face câteva remarci.
„Ab initio” autorii oferă date de taxonomie, morfo-fiziologie și biologie a albinei. Cu imagistica variată se oferă totul despre morfologia, ontogenia și organizarea acestei insecte.
Remarcabilă este prezentarea sistemelor de apărare; imunitatea în toate compartimentele: tisulară, celulară, umorală, cu sublinieri referitoare la agenții patogeni – virusuri, bacterii, paraziți, toxicoze ș.a. Aspectele de patologie se referă la demersurile și modalitățile de diagnostic, de la prelevarea probelor, la metodologii de diagnostic în laborator pe grupe de proveniență: puiet, albine adulte, produse apicole. Și finalizează cu recomandări terapeutice și profilactice.
O dimensiune aparte este reprezentată de folosirea plantelor medicinale în scop profilactic, dar și riscurile unor intoxicații produse de acestea. Datorită importanței și diversității agenților patogeni și a metodelor de diagnostic și profilaxie specifice, în secțiunea a doua sunt prezentate pe categorii bolile, cu expunere clasică: virale, bacteriene, parazitare, micotice și intoxicațiile de natură diferită – plante, insecticide, pesticide etc.
De remarcat și includerea metodelor de diagnostic imunoenzimatice – ELISA, PCR ș.a. – care oferă o mai mare precizie și siguranță în diagnostic. În sfera noutăților, de subliniat: includerea unei categorii de afecțiuni mai puțin cunoscute anterior, precum: tehnopatiile, efectul iradiațiilor și tulburările de comportament ale albinelor.
Abordarea problemelor de genetică, cu anomalii și malformații, aprofundează aspectele de patologie și oferă noi orientări atât apicultorilor cât și specialiștilor.
Încheierea lucrării se referă la importanța și vasta problemă a dăunătorilor, în care sunt incluși: de la insecte și acarieni, la mamifere – printre care și omul.
Sursele bibliografice, indigene și străine, oferă un vast orizont informațional, de la opere clasice, la cele mai recente apariții editoriale din 2015, completate prin sistemele internet. Diversitatea imagisticii, cu originalitatea multora dintre figuri, cu scheme și schițe originale, sporesc valoarea acestei reușite opere, de înaltă exigență științifică, informativă și practică.
Pentru reușita editorială, bogăția informațiilor și nivelul tehnic superior, adresez cuvinte de laudă și admirație distinșilor autori. Cu certitudine, și prin această exemplară creație editorială se confirmă dictonul: „Vita brevis, scriptio longa!”.
Prof. Dr. DHC Eronim Șuteu
Membru de onoare al ASAS
USAMV Cluj – Napoca
Faultatea de Medicină Veterinară
Cuvânt înainte
Îi revine unui profan datoria de a face, prin acest cuvânt înainte, o incursiune într-o lume încă înconjurată de mister, în pofida evidenței unei organizări sociale complexe și facinante: lumea albinelor. Pasionații de istorie nu pot decât să remarce faptul că albina este cea care a inspirat, prin organizare și solida imagine de hărnicie, cea mai mare cucerire a heraldicii epocii moderne: ea a fost aleasă ca simbol al casei imperiale a lui Napoleon I, deci ca prim simbol al Europei unite! Și nu sunt puțini cei care, admirând la Luvru magistrala pictură a încoronării lui Napoleon ieșită din penelul lui Jacques-Louis David, își opresc ochii asupra abundenței de albine de pe mantiile personajelor și de pe obiectele drapate. Este un elogiu permanent adus acestor harnice insecte care continuă să ne uimească. Ca simbol al altruismului și devoțiunii, albina, despre care vechii greci spuneau că ,,este apreciată nu fiindcă muncește pentru ea, ci fiindcă muncește pentru toți”, a intrat în cultura colectivă și pigmentează existența umană.
Interferențele geologului cu un pasionat de viața albinelor, precum autorul acestei cărți, sunt rare; cu toate acestea geologul din mine nu poate decât să dedice un gând pios personajului care a făcut din apicultura românească un reper mondial: profesorul Veceslav Harnaj. Puțini apicultori și încă și mai puțini geologi știu că profesorul Harnaj, pe care personal l-am cunoscut ca profesor de hidraulică la Facultatea de Geologie a Universității din București, iubit de studenții anului meu pentru excelenta fluență a cursului și pentru micile glume integrate în momentele oportune, era același cu Veceslav Harnaj, președintele pe cinci mandate al Apimondiei și președinte de onoare pe viață al celui mai înalt forum al apiculturii mondiale. El ne-a deschis ochii asupra lumii extraordinare a acestor insecte, într-atât încât, în urma unei noi interferențe, să îmi atragă atenția publicarea în anul 2006, în prestigioasa revistă Science, a descoperirii unei albine perfect conservate într-o picătură de chihlimbar. Acest strămoș al lui Apis mellifera, albina comună de astăzi, s-a fosilizat în urmă cu peste 35 de milioane de ani!
Cartea domnului Stelian Asiminei este un exemplu concludent al îmbinării rigurozității științifice cu o mare pasiune pentru subiectul de studiu: umila dar atât de complexa albină, care este confruntată cu amenințări, care, necontracarate la timp, pot duce la dispariția speciei. Ecosistemul tererstru ar fi, fără îndoială, dezolant de sărac dacă aceste amenințări s-ar concretiza. Structurată pe capitole respectând logica științifică și abordând progresiv aspecte privind taxonomia (o altă interferență cu studiul organismelor fosile abordat în cadrul geologiei), anatomia, fiziologia și organizarea socială a coloniilor de albine, lucrarea domnului doctor Asiminei este una complexă, facilitând înțelegerea acțiunii infecțiilor virale, bacteriene, parazitare și fungice care decimează coloniile de albine și, nu în ultimul rând, înțelegerea profilaxiei bolilor. Este remarcabilă intenția autorului de a trage un clopot de alarmă în privința afecțiunilor induse coloniilor de albine de activitatea antropică și de consecințele sale: poluarea, otrăvirea cu pesticide sau insecticide, încălzirea globală. Sindromul colapsului coloniilor de albine, descris cu acuratețe și reală forță, este mai ușor de înțeles dacă îl raportăm la modificările induse în ecosistem de activitatea umană.
Cartea se constituie în întregul său într-o lectură captivantă atât pentru specialiști cât și pentru profani. Citind-o, mi-au venit în minte cuvintele lui Albert Eistein, spirit profund analitic, care spunea, referindu-se la importanța albinelor ca polenizator al culturilor entomofile: „dacă albinele ar dispare de pe Terra, omenirea ar avea aceeași soartă în patru ani; cu cât există mai multă polenizare, cu atât iarba este mai multă, sunt mai multe animale, mai mulți oameni”. Personal, nu pot să îmi imaginez cum ar arăta lumea fără aceste harnice și omniprezente viețuitoare, care se încăpățânează să reziste de mai bine de 35 de milioane de ani! Este meritul cărții că oferă o trecere în revistă a pericolelor care pândesc această minunată specie.
Încheind acest cuvânt înainte, nu pot decât să îi adresez calde felicitări autorului.
Prof. univ. Dr. (CS1) Ștefan Marincea
Institutul Geologic al României
Facultatea de Ingineria Geologiei și Geofizică
București
Universitatea Liège, Belgia,
Faculty of Science
Introducere
Insectele sunt prezente aproape oriunde și sunt reprezentatele unui număr impresionant de animale din biomasa terestră. Dintre insecte, unele trăiesc în colonii, așa numitele insecte sociale, iar altele trăiesc izolat sau în colectivități mici.
Insectele sociale fac parte din ordinul Hymenoptera și sunt organizate în caste, fiecare castă având anumite atribuții în cadrul coloniei. Și albinele europene (Apis mellifera) sunt parte a acestui ordin și sunt implicate în perpetuarea vieții prin polenizarea plantelor entomofile și prin asigurarea unor produse alimentare sau terapeutice. Însă aceste ființe extraordinare au mulți dușmani în natură, și vorbim aici de virusuri, bacterii, miceți sau paraziți. Omul are și el partea sa de contribuție la decimarea, uneori, a coloniilor de albine, prin generarea unor noi afecțiuni, cum sunt intoxicațiile cu pesticide sau dezvoltarea unor boli exotice, în arealul climei temperat – continentale.
La aceste agresiuni, albinele răspund prin amorsarea mecanismelor de apărare socială și individuală, înnăscute sau dobândite.
Apărarea socială și cea individuală, înnăscute, beneficiază de mijloace imune apărute și moștenite pe parcursul dezvoltării filogenetice a speciei.
Imunitatea dobândită, este apanajul dezvoltării sistemului imun pe baza informației antigenice dobândită de la matcă (regină) sau prin activarea memoriei imunologice. Ceea ce până acum era pus la îndoială, a fost demonstrat de Salmela Heli, Gro V. Amdam și Freitak Dalial în anul 2015, după 15 ani de cercetări.
Albina meliferă, este sortită dispariției dacă oamenii de știință, specialiștii din apicultură și apicultorii nu beneficiază de cunoștințe suficiente pentru stăvilirea bolilor infecțioase și a celor datorate intervenției omului în ecosistem. Acest fapt este posibil prin diagnosticarea corectă a bolilor și aplicarea măsurilor de profilaxie generale și specifice în fiecare stupină.
Având în vedere aceste aspecte, în această carte abordăm unele subiecte care țin de taxonomie, anatomia, fiziologia și organizarea socială a coloniilor de albine, utile în înțelegerea problemelor abordate ulterior.
În capitolele următoare facem o sinteză a cunoștințelor actuale în domeniul imunității înnăscute și dobândite, diagnosticul de laborator (conduita generală) în bolile albinelor, precum și măsurile generale de profilaxie în afecțiunile întâlnite la aceste insecte.
În secțiunea a II-a, sunt prezentate afecțiunile virale, bacteriene, parazitare și micotice, alături de intoxicațiile naturale sau provocate. În ultimul capitol al secțiunii a II-a sunt descrise unele afecțiuni necontagioase, tulburările de comportament, tehnopatiile și dăunătorii albinelor. În subcapitolul tulburărilor de comportament descriem sindromul colapsului coloniilor de albine (CCD), afecțiune tot mai întâlnită datorită poluării ecosistemelor și migrării în zonele temperate a unor agenți etiologici exotici. În cadrul capitolului bolilor parazitare, nosemoza este tratată ca o entitate duală, respectiv infecția cu Nosema apis, endemică în țările cu climă temperat – continentală și infecția cu Nosema ceranae, insinuată în această caracteristică climatică, datorită fenomenului de încălzire globală, iar în capitolul bolilor bacteriene includem hafnioza, determinată de Hafnia apis, în locul salmonelozei, cum era denumită până acum, pe nedrept, această afecțiune.
Avem convingerea că tematica abordată și nivelul științific la care sunt prezentate subiectele antamate, vor face această lucrare interesantă și atractivă pentru toate categoriile de specialiști în domeniu, precum și pentru apicultori.
Ținem să mulțumim Domnului Profesor univ. Dr. D.H.C. Ioan Paul pentru sprijinul acordat și încurajările făcute în elaborarea capitolului ,,Apărarea antiinfecțioasă la albina meliferă", precum și Domnului Profesor univ. Dr. D.H.C. Constantin Milică, pentru aprecierile făcute la elaborarea capitolului ,,Profilaxia în bolile albinelor".
Nu în ultimul rând, mulțumim sponsorilor noștri, Tiberiu Nichiteanu și familia sa, precum și tuturor celor care au crezut în acest proiect.
Autorii
SC Nicvitib SRL loc Miorcani, J07/335/1996, RO 8181794, Botoșani. Nichiteanu Tiberiu XT 408328
Mircea – Dan MITROIU
I.1. Albina meliferă: noțiuni de taxonomie, anatomie și fiziologie
I.1.1. Taxonomie
Albinele melifere fac parte din încrengatura Arthropoda, clasa Insecta, ordinul Hymenoptera, suprafamilia Apoidea, familia Apidae, genul Apis. Din genul Apis fac parte șapte specii (8): Apis andreniformis Smith, 1858, Apis florea Fabricius, 1787, Apis dorsata Fabricius, 1793, Apis cerana Fabricius, 1793, Apis koschevnikovi Enderlein, 1906, Apis mellifera Linnaeus, 1758 și Apis nigrocincta Smith, 1861. Apis andreniformis și Apis florea sunt specii foarte asemănătoare, de talie mică (albine pitice), răspândite în Asia tropicală și subtropicală (China de sud-est, India, Birmania, Laos, Vietnam, Malaezia, Indonezia, Filipine. Sunt cele mai primitive specii de albine, având colonii mici, cuiburi simple, și productivitate scăzută de miere (31). Niciuna dintre cele două specii nu are subspecii cunoscute (8).
Apis dorsata, albina tropicală, indiană sau gigantică, populează Asia de Sud-Est (India, Vietnam, Malaezia, Indonezia, Filipine). Traiește în sălbăticie, în regiuni împădurite, până la 2.000 m altitudine, este de talie mare și foarte agresivă. Este o bună producatoare de miere și ceară, dar nu a putut fi domesticită întrucât nu folosește cavități pentru cuiburi; cu toate acestea, localnicii colectează mierea acestei specii. Apis dorsata are patru subspecii cunoscute (8).
Apis cerana, albina asiatică, trăiește în cea mai mare parte a Asiei (China, Pakistan, India, Coreea, Japonia, Malaezia, Nepal, Bangladesh, Papua Noua Guinee, Insulele Solomon) și este asemănătoare cu albina europeană, fiind ceva mai mică și având colonii alcătuite dintr-un număr mai mic de indivizi. Este o specie care a fost domesticită, putând trăi în stupi artificiali. Apis cerana are opt subspecii cunoscute (8).
Apis koschevnikovi, albina lui Koschevnikov, trăiește pe insula Borneo. Nu are nicio subspecie cunoscută (8).
Apis mellifiera, albina europeană, populează toate continentele cu excepția Antarcticii, fiind introdusă de către om în multe zone care nu fac parte din arealul său natural, cum ar fi sud-estul Asiei. Apis mellifera este deci specia cea mai răspândită și cuprinde aproape 30 desubspecii, cu numeroase rase, forme, sau varietați (8). Subspeciile mai cunoscute sunt:
Apis mellifera mellifera Linnaeus, albina vestică, europeană sau neagră, comună, popula în mod natural Europa Occidentală și septentrională, dar a fost introdusă în multe zone;
Apis mellifera ligustica Spinola sau albina italiană popula în mod natural peninsula italiană, dar a fost introdusă în multe alte zone;
Apis mellifera caucasia Pollmann, albina caucaziană sau gri, este originară din Caucaz, dar răspândită în multe țări;
Apis mellifera carnica Pollmann sau albina carnioliană populează centrul și sud-estul Europei, inclusiv România; după Engel (1999), Apis mellifera carpatica și A. mellifica var. banatica sunt sinonime ale albinei carnioliene. După Coroian et al. (2014), în România se întâlnesc două subspecii: A. mellifera carnica și A. mellifera macedonica; prima preferă un climat mai rece, iar a doua unul mai cald.
Apis nigrocincta este răspândită în Indonezia și Filipine. Este apropiată morphologic de A. cerana și își construiește cuiburile în diverse cavități. Nu are nicio subspecie cunoscută (8).
I.1.2. Morfologia externă și anatomia albinei adulte
In cadrul familiei de albine se disting trei caste: matca (femelă fertilă), trântorul (mascul, Fig. I.1.1.) și albina lucrătoare (femelă sterilă, Fig. I.1.2). Morfologia acestora prezintă particularități pentru fiecare castă, însă organizarea de bază este aceeași, fiind prezentată succinct mai jos (19, 15). Ca orice insectă, fiecare individ este alcătuit din trei părți: cap, torace și abdomen (Fig. I.1.3).
I.1.2.1. Capul (Fig. I.1.4.A, I.1.4.B) este rezultatul unirii mai multor segmente într-o capsulă cefalică puternic sclerificată, triunghiulară la matcă și albina lucrătoare și rotundă la trântor, la nivelul căreiase află antenele, ochii și aparatul bucal. Acestea vor fi descrise ulterior, în cadrul aparatelor și sistemelor de care apartin. In interiorul capsulei cefalice se găsesc porțiunile anterioare ale tubului digestiv și ale sistemului nervos.
I.1.2.2. Toracele este format din trei segmente sudate: pro- mezo- și metatorace și poartă organele de locomoție: două perechi de aripi (prima pereche pe mezotorace, a doua pe metatorace) și trei perechi de picioare (câte o pereche pe fiecare segment toracic). La albine ca și la multe alte himenoptere, primul segment abdominal (numit propodeu) este fuzionat cu partea posterioară a toracelui, ansamblul purtând numele de mezosomă. La nivelul mezosomei se găsesc și o parte dintre orificiile externe ale aparatului respirator: trei perechi de stigme.
Fig. I.1.1. Trântor, habitus în vedere laterală
I.1.2.3. Abdomenul este format din mai multe segmente (șapte la albina lucrătoare și matcă, opt la trântor, incluzând segmentul fuzionat la torace), mobile unele față de altele. Legătura dintre segmentul fuzionat la torace și cel de-al doilea segment se face prin intermediul unui peduncul. Partea din abdomen posterioară pedunculului, foarte mobilă datorită acestuia, se numește gaster. Fiecare segment este compus dintr-un tergit (dorsal) și un sternit (ventral), al doilea fiind de dimensiuni mai mici. Peretele gasterului este bogat în țesut muscular și adăpostește cea mai mare parte a aparatului digestiv și anexele sale, aparatul excretor, aparatul vulnerant, glandele ceriere, aparatul reproducator și importante părți componente ale sistemului circulator și ale celui respirator.
I.1.2.4. Tegumentul acoperă corpul și este structurat, de la interior spre exterior, din membrana bazală, hipoderma formată dintr-un singur strat de celule, și cuticula acelulară, pluristratificata (epicuticula la exterior și procuticula la interior). Cuticula reprezintă exoscheletul, iar expansiunile sale spre interiorul corpului formează endoscheletul pe care se inseră musculatura.
Interesantă este structura hipodermei, în care celulele au structuri și funcții variate: rol secretor (secretă chitina, ceara, saliva, veninul și firul de păr) sau senzitiv (17).
Fig. I.1.2. Albină lucrătoare, habitus în vedere laterală
Fig. I.1.3. Albină lucrătoare, structura corpului în vedere laterală
I.1.2.5. Organele de locomoție ale albinei sunt picioarele (Fig. I.1.5, I.1.6) și aripile (Fig. I.1.7), prinse de torace.
Fiecare picior este format din cinci articule: coxa, trocanterul, femurul, tibia și tarsul. Tarsul se termină cu două gheare și o ventuză, formațiuni anatomice necesare în special agățării de substrat.
Prima pereche de picioare este adaptată și pentru curățarea antenelor (Fig. I.1.6), iar ultima pereche de picioare are o particularitate structurală numită corbiculă sau paneraș, utilizată în depozitarea și transportul polenului și propolisului în stup (Fig. 1.5). Polenul și propolisul sunt descărcate în celulele stupului cu ajutorul unui pinten prezent pe tibia celei de a doua perechi de picioare.
Fig. I.1. 4. Capul în vedere frontală: A. Trântor; B. Albină lucrătoare
Zborul albinelor este realizat cu ajutorul aripilor. Albina dispune de două perechi de aripi membranoase prevazute cu nervuri fine. Prima pereche de aripi este mai mare decat cea de a doua. Aripile sunt atașate toracelui printr-un sistem de articulații care permit mișcările de zbor și de repliere dorsală, în repaus. În timpul zborului, cele două perechi de aripi sunt cuplate cu ajutorul croșetelor (hamuli). Croșetele, în număr de circa 20, sunt plasate pe marginea anterioară a celei de a doua perechi de aripi, iar în timpul zborului se fixează într-un șanț situat la marginea posterioară a primei perechi de aripi (Fig. I.1.7).
Nervurile aripii conferă rigiditate, dispunerea lor delimitând un anumit număr de celule. Fiecare celulă poartă un nume și, eventual, un număr de ordine. Se disting celule radiale, cubitale, anale etc. Dispunerea și forma celulelor, delimitate de nervuri, este determinată genetic și reprezintă criterii pentru identificarea subspeciilor, raselor sau populațiilor de albine.
Mușchii, care acționează aripile, ocupă cea mai mare parte a toracelui și sunt reprezentați de două mase voluminoase, inserate pe piesele chitinoase ce alcătuiesc scheletul (Fig. 1.8). În zbor, numărul de bătăi ale aripilor, este de 400-450 pe secundă. În condiții normale, albina atinge o viteză de 25-30 km pe oră. Viteza de zbor, raza de acțiune, consumul de energie, altitudinea, sunt dependente de condițiile meteorologice, relief și cantitatea de polen și/sau nectar transportată.
Fig. I.1.5. Picioarele albinei lucrătoare, fața externă
I.1.3. Organizarea internă: aparate și sisteme
Organizarea internă a albinei va fi prezentată pentru insecta adultă. Organele, aparatele și sistemele sunt comune cu ale majorității insectelor, fiind asemănătoare cu cele ale altor reprezentanți ai ordinului Hymenoptera (23, 15).
I.1.3.1. Aparatul digestiv
Aparatul digestiv începe cu armătura bucală și se continuă cu orificiul bucal, care este dechiderea anterioară a tubului digestiv. Acesta din urmă străbate corpul și se deschide posterior prin orificiul anal (anus). Tubul digestiv este acompaniat de glandele digestive.
Armătura bucală, reprezentată printr-un aparat bucal pentru rupt, lins și supt (Fig. I.1.4.B) formată din labru (buză superioară), două mandibule și trompă, realizează funcția de prehensiune și conducere a hranei spre faringe.
Mandibulele sunt bine dezvoltate și au rol în malaxarea polenului, construirea fagurilor, prin manipularea cerii, curățarea fagurilor și stupului sau apărare.
Fig.I.1. 6. Picioarele albinei lucrătoare, fața internă
Trompa este formată din două maxile și o buza inferioară sau labiu. Fiecare maxilă este alcătuită dintr-o piesă bazală, cardo, urmată de stipes, lacinia (redusă) și galea. Pe fiecare maxilă se inseră câte un palp maxilar redus. Labiul este format din submentum, mentum, glose (fuzionate și foarte lungi) și paraglose (reduse). Glosele formează limba, ce se termină cu lingurița (labelum). Palpii labiali se inseră pe labiu și sunt foarte lungi.
Trompa este necesară recoltării nectarului din flori. Piesele trompei acționează independent, la nevoie reunindu-se într-un canal continuu. Nectarul este aspirat prin spațiul capilar dintre trompă și teaca pe care o formează palpii labiali și galeele, la forța de succțiune contribuind și faringele musculos. Saliva ajunge în canalul trompei, de unde este condusă spre vârful limbii, amestecându-se cu hrana. Trompa poate fi extinsă sau retractată, precum și mișcată în diverse direcții cu ajutorul unor mușchi (23). De la nivelul trompei, hrana ajunge în gura propriu-zisă (cibarium), care este o pungă musculoasă puternic contractilă. Aici alimentele staționează puțin, după care sunt conduse în faringe și apoi în gușă. Trompa are dimensiuni diferite în funcție de subspecie, albina cu trompa cea mai lungă fiind cea caucaziană (7,2 mm).
Fig. 1.7. Albina lucrătoare, aripile
Tubul digestiv (Fig. I.1.9) este alcătuit din trei regiuni: intestinul anterior, mijlociu și posterior, fiecare având o alcătuire complex, detaliată mai jos (23, 27).
Din intestinul anterior fac parte faringele, esofagul, gușa și proventriculul (stomac filtrator sau mestecător). Acestea sunt acoperite de chitină care le protejează de acțiunea iritantă a alimentelor. Gușa este o pungă foarte subțire și extensibilă, cu rol în depozitarea temporară a alimentelor. Derivă, ca și proventriculul, din esofag, prin dilatare. Proventriculul face legatura între gușă și ventricul. Spre gusă are o deschidere compusă din patru buze prevăzute cu spini. Această deschidere, valvula cardiacă, separă intestinul anterior de cel mijlociu și are rol de a opri revenirea alimentelor din ventricul în gușă.
Intestinul mijlociu (mezenteronul) este alcătuit din ventricul (stomac propriu-zis), acesta fiind locul în care intervin enzimele digestive. Intestinul mijlociu nu are în componență chitină, însă este protejat prin intermediul membranei peritrofice secretate de intestin. Ventriculul este curbat, musculos și are foarte multe pliuri. În ventricul începe digestia alimentelor sub acțiunea sucurilor digestive. Membrana peritrofică, ce-l captușește, permite fluxul sucurilor digestive spre lumenul intestinal și a produșilor de digestie spre intima peretelui ventricular.
Fig. 1.8. Mușchii aripilor
Intestinul posterior (proctodeum) este ultimul segment al tubului digestiv și este prevăzut cu o pungă rectală (rect). El se deschide la exterior prin anus, situat între ultimul tergit și ac. Ca și intestinul anterior, el are în componență chitină. Intestinul posterior este separat de ventricul, prin pilor. La nivelul valvulei pilorice se deschid tuburile lui Malpighi, cu rol excretor. Intestinul posterior este subțire, tubuliform, scurt și se deschide în punga rectală. Aceasta este voluminoasă, are pereții foarte elastici, iar în grosimea lor se găsesc șase papile rectale cu rol de absorbție a apei și de secreție a catalazei. Catalaza împiedică fermentația fecalelor acumulate în punga rectală, în special în timpul iernii.
Glandele anexe ale tubului digestiv sunt complexe, și se disting:
glandele salivare, situate în cap, produc saliva cu rol solvent;
glandele hipofaringiene, situate de asemenea în cap, funcționează ca
producătoare de lăptișor de matcă la albinele tinere, la adulte secretând invertaza și amilaza ce intervine în digestia glucidelor;
glandele mandibulare sunt producătoarele unei alte fracțiuni a lăptișorului de matcă și intervin în prelucrarea cerii; la matcă aceste glande secretă „substanța de matcă”, un feromon care are rol în menținerea coeziunii roiului, în împerechere, precum și în inhibarea devoltării ovarelor la albinele lucrătoare; glandele labiale sunt de două tipuri: glandele postcerebrale, situate în cap, dezvoltate la albina lucrătoare și matcă, dar atrofiate la trântor, produc salivă cu pH neutru, fiind utilizate de albină la producerea cerii; glandele toracice dispuse în torace, secretă un produs cu pH de 6,3-7 și au rolul diluării mierii destinate larvelor și lubrefierii granulelor de polen
Fig. I.1.9. Sistemul digestiv și excretor
La albine, digestia este extracelulară și are loc în tubul digestiv, sub acțiunea enzimelor digestive. Albina lucratoare adultă secretă enzime care îi permit digerarea unui mare număr de zaharuri complexe ca zaharoza, maltoza, melezitoza, trehaloza etc. Ea nu poate însă digera lactoza și dextrinele complexe sau amidonul cu granulație mare. Digestia grăuncioarelor de polen se realizează după trecerea enzimelor prin membrana acestora, exina fiind indigestă. Corpul adipos servește drep depozit pentru elementele nutritive în exces. Albinele născute la sfârșitul verii consumă multă hrană, în special polen, acest lucru permițându-le să-și facă rezerve de glicogen, grăsimi și proteine, care vor fi utilizate primăvara viitoare la creșterea puietului (25).
Eliminarea resturilor alimentare și a produșilor de excreție colectați de tuburile Malpighi se face prin golirea pungii rectale, în timpul zborului.
Nevoile alimentare ale albinelor depind de perioada de dezvoltare, castă sau de activitatea adultului. În vederea definitivării dezvoltării sistemului glandular și implicit a capacității de secreție a lăptișorului de matcă, albina adultă nou-nascută are nevoie ca timp de 6-9 zile să consume cantități mari de polen. La maturitate, albina adultă are nevoi alimentare mult mai reduse în azot, prin urmare renunțând la polen și consumând cu precădere miere și nectar. Toate larvele, în primele trei zile postembrionare, sunt hrănite cu lăptișor de matcă de către albinele doici. Peste vârsta de trei zile, hrana larvelor ce vor deveni lucrătoare sau trântori se compune din secreția glandelor salivare ale doicilor, putină miere și polen. Viitoarea matcă are nevoie de cantități mari de proteine, glucide și lipide, astfel încât ea va fi hranită pe tot parcursul dezvoltării cu lăptișor de matcă. Greutatea celor 1.000-1.500 de ouă depuse zilnic de către matcă, depășește greutatea mătcii, astfel încât ea este hrănită aproape continuu de către lucrătoare (18).
I.1.3.2. Aparatul respirator
Aparatul respirator (Fig. I.1.10) este constituit dintr-un sistem ramificat de trahei și traheole, care reprezintă niște invaginații ale ectodermului, fiind acoperite cu chitină. Chitina se pierde o dată cu procesul de năpârlire.
Ramificațiile traheale se deschid la exterior prin orificii numite stigme sau spiracule. În funcție de numărul, poziția și funcționalitatea stigmelor, se cunosc mai multe tipuri de sisteme respiratorii. Albinele posedă sistemul holopneustic, la care toate perechile de stigme sunt funcționale. Stigmele au dispozitive complexe de deschidere și închidere. La lucrătoarele adulte stigmele sunt repartizate simetric, pe ambele laturi ale corpului, câte o pereche pe fiecare segment: trei perechi pe mezosomă și șase perechi pe abdomen (1).
În interiorul corpului, traheile se divid în traheole, ajungând la dimensiuni foarte mici (sub 1 µm) când intră în plasma celulelor. Așadar, transportul oxigenului la celule se realizează fără participarea sistemului circulator. Traheile și traheolele au o structură, de la exterior spre interior, formată dintr-un strat de celule epiteliale, aplatizate și intima, pe care se găsesc inserate nervuri îngroșate și spiralate numite tenidii. Din loc în loc traheile se lărgesc în saci de aer lipsiți de tenidii, care au rol în reducerea greutății insectei, reprezintă o rezervă de aer sau permit dilatarea unor organe interne. Circulația aerului în sistemul traheal este obținută prin mișcările de pompare ale abdomenului (23).
I.1.3.3. Aparatul circulator
Aparatul circulator al albinelor (Fig. I.1.11) este alcătuit dintr-un sistem vascular deschis (lacunar), cu poziție dorsală, caracteristic insectelor. El este alcătuit dintr-un vas dorsal și mai multe sinusuri (lacune) care deservesc organele interne.
Porțiunea anterioară a vasului dorsal se numește aortă, iar cea posterioară, situată în abdomen, inima propriu-zisă. Inima are cinci cavități numite ventriculi (ventriculite). Fiecare ventricul are o pereche de orificii numite ostiole (ostii), situate lateral. Ostiolele sunt prevăzute cu valvule care nu permit refularea hemolimfei. Prin contracția unor mușchi, diafragma dorsală se aplatizează, inima se dilată pasiv și hemolimfa din sinusul perivisceral intră prin ostiole în inimă. Ventriculele se contractă și hemolimfa este împinsă în aortăDin aortă hemolimfa ajunge la creier, apoi se întoarce în sinusurile perineural și pervisceral de unde își reia circuitul (23).
Fig. 1.10. Aparatul respirator
Hemolimfa este formată din plasmă și hemocite. Reprezintă 25-30% din greutatea larvei sau până la 40% la albina adultă, fiind de culoare galbenă. Plasma este compusă din apă (85-90%), săruri minerale, zaharuri, aminoacizi, acizi grași, proteine, enzime și produși de excreție, care sunt eliminați la trecerea prin tuburile Malpighi. Hemocitele sunt reprezentate de prohemocite, plasmatocite, oenocite, sferocite, hemocite granulare de tip I, II, II și IV, și celule adipoase (4).
Rolul hemolimfei este de transport al substanțelor nutritive, hormonilor sau a metaboliților, fagocitarea țesuturilor proprii în timpul metamorfozei, apărare etc. Hemolimfa nu conține pigment respirator, acesta fiind de altfel inutil, deoarece celulele sunt cuplate la aparatul respirator prin intermediul traheolelor, însă are în componență diferite tipuri de celule, cu rol important în imunitate.
Celulele hemolimfei insectelor au fost descrise pentru prima dată de Schwammerdam în anul 1758, numindu-le globule de transport. Ulterior, cercetările au fost extinse, dar multe aspecte funcționale au rămas neelucidate.
Fig. I.1.11. Aparatul circulator
I.1.3.4.Țesutul hematopoetic și hematopoeza
Hematopoeza reprezintă formarea celulelor sanguine (hemocite) în țesuturile hematopoetice (THP). Hemocitele sunt componente foarte importante ale sistemului imunitar înnăscut la nevertebrate, sensibile la semnalele biochimice și implicate în fagocitoză, formarea de noduli și încapsularea agenților patogeni. Participă, de asemenea, la sinteza și transportul substanțelor nutritive și a hormonilor de creștere, precum și la vindecarea leziunilor prin sinteza de țesut conjunctiv (21).
THP au fost descrise la două specii de insecte (Drosophila melanogaster – musculița de oțet și Manduca sexta – viermele tutunului). La acestea, hemocitele au origine embrionară, din celulele mezodermale și post-embrionară, din THP (13). Este de presupus că THP ale albinei melifere sunt organizate și funcționează într-un mod asemănător.
În prezent, literatura de specialitate recunoaște următoarele tipuri principale de celule (12, 20):
– prohemocitele sau celulele stem, sunt celule mici, rotunde, cu un nucleu mare, citoplasmă puțină și fără organite citoplasmatice specializate; aceste celule sunt progenitorii hemocitelor imature. Toate tipurile de celule din hemolimfă sunt derivate din prohemocite.
– plasmatocitele sunt mai bogate în citoplasmă, sunt delimitate de o membrană ondulată și pot emite pseudopode. Plasmatocitele sunt celule fagocitare active; lizează resturile celulare în timpul dezvoltării normale și agenții patogeni în timpul răspunsului imun. Plasmatocitele se pot diferenția în celule mari, aplatizate (numite și lamelocite la Drosophila și alte insecte), capabile să formeze o capsulă în jurul invadatorilor patogeni.
– granulocitele sunt celule ce conțin în citoplasmă granule acidofile, cu densitate electrono-optică mare și acționează ca fagocite. La unele insecte, inclusiv Drosophila, granulocitele lipsesc, funcțiile acestora fiind îndeplinite de plasmatocite.
– oenocitele sunt celule mari, ovale, a căror citoplasmă conține aglomerate de material cristalin și/sau microtubule. La Drosophila oenocitele sunt denumite celule cristaline. Oenocitele sunt rezervorul de profenoloxidază, enzimă cu rol major în imunitatea înnăscută.
– sferulocite sau adipohemocite, sunt celule bazofile ce conțin granule variabile ca mărime și formă. Aceste celule pot reprezenta o fază avansată a diferențierii plasmatocitelor în fagocite (13).
Tabel I.1.1. Hemocitele implicate în imunitatea înnăscută ale unor insecte (după Gliński Z. and Jarosz J., 2001; Nakamara și colab., 2010)
Centrele hematogene sunt situate, la embrion, în celulele mezodermale ale capului și în celulele din mezodermul cardiogen. Primul centru este populat cu prohemocite din care vor lua naștere hemocitele cu rol imun și fagocitar, iar al doi-lea centru stă la originea ganglionilor limfonodurilor din regiunea toracelui. Ambele centre hematogene produc plasmatocite și celule cristaline, însă diferențierea lamelocitelor și a altor forme de hemocite are loc numai în mezodermul cardiogen. Transformarea plasmatocitelor în lamelocite, are loc sub influența mai multor factori specifici și determinanți genetici. Un astfel de factor este Collier, în lipsacăruia lamelocitele lipsesc în infecțiile parazitare, astfel că nu se mai produce încapsularea paraziților.
La insecte THP sunt diferențiate în:
a) structuri primare, reprezentate de limfonoduri și corpul gras;
b) structuri secundare organizate în insule compacte de hemocite, hemocitele libere și hemocitele fixe.
Aceste structuri au localizare variabilă, dependentă de specie (fig. I.1.12).
I.1.3.4.1. Structurile primare
La Drosophila și Manduca, limfonodurile apar târziu la embrioni și sunt amplasate de o parte și de alta a vasului dorsal (Fig. I.1.12). Fiecare lob este format din aproximativ 20 de prohemocite. Pe măsura dezvoltării larvelor, se produce o acumulare masivă de prohemocite și apariția unor noi limfonoduri, cel mai dezvoltat fiind limfonodul anterior.
Un limfonod este format din trei zone (Fig. I.1.13):
– zona medulară, densă, conține prohemocite nediferențiate (celule stem pluripotente) care sunt înconjurate de lamele bazale extracelulare (13). La unele specii de insecte, în această zonă sunt întâlnite și alte tipuri de celule mezenchimale, numite fibroblaste sau celule reticulare;
– zona corticală, alcătuită din hemocite pe cale de transformare și maturare, exprimă doi markeri de diferențiere rapidă, unul pentru diferențierea plasmatocitelor, iar celălalt pentru diferențierea oenocitelor (celulele cristaline);
– zona a treia, exterioară, formată dintr-un grup de prohemocite situate la baza posterioară a limfonodului anterior, denumit centrul posterior de semnalizare (CPS). Acest grup de prohemocite exprimă markeri moleculari specifici, care reglează rata diferențierii prohemocitelor din zona medulară adiacentă.
Diferențierea prohemocitelor în limfonoduri și eliberarea lor în hemolimfă are loc începând cu cel de-al treilea stadiu de dezvoltare larvar și ia sfârșit la câteva ore după începerea metamorfozei.
Limfonodurile de tip compact dispar la începutul metamorfozei la unele insecte (Manduca sexta, Bombyx mori etc.) sau persistă și la indivizii adulți (Gryllus bimaculatus, Locusta migratoria etc.) (13 ).
Corpul gras este prezent la toate insectele, fiind un organ similar ficatului și țesutului gras de la vertebrate. Este implicat în metabolismul lipidelor și carbohidraților, detoxifiere și imunitate, precum și în sinteza și secreția proteinelor care sunt stocate în cantități mari în hemolimfă. (5, 33, 14).Mărimea acestui organ este condiționată de specie, stadiul de dezvoltare al insectelor, forma de organizare socială și climă (33, 14).
Fig. I.1.12. Manduca sextata, secțiune transversală schematizată, cu localizarea limfonodul asociat vasului dorsal (după Grigorian și Hartenstein, 2013)
Corpul gras este localizat în abdomenul insectelor, sub tegument (corpul gras parietal) și în jurul organelor interne (corpul gras visceral). Este populat de trofocite, adipocite, oenocite la toate insectele, precum și de urocite și micetocite la mare parte dintre acestea (24). Corpul gras este delimitat de hemocel printr-o capsulă bazală (14, 24).
I.1.3.4.2. Țesutul limfoid secundar
Țesutul limfoid secundar este organizat în insule compacte de hemocite, atașate la trahee și la discurile imaginale ale aripilor. Aceste insule sunt populate cu prohemocite, plasmatocite, precum și celule reticulare care au sub control proliferarea și diferențierea hemocitelor; apar în fazele incipiente ale dezvoltării larvare și sunt înconjurate de hemocite libere diferențiate, formate în cel de-al cincilea stadiu larvar. Toate tipurile de insule sunt înconjurate de câte o membrană bazală. Membrana bazală a insulei de hemocite libere are o structură laxă, ce permite migrarea hemocitelor diferențiate în hemolimfă (13).
Fig. I.1.13. Drosophila, alcătuirea limfonodului asociat vasului dorsal (după Grigorian și Hartenstein, 2013)
I.1.3.4.3. Hemocitele pluripotente și formarea de linii de hemocite distincte
Prohemocitele, care populează domenii specializate în THP, sunt pluripotente și prin diviziune rapidă și diferențiere, iau naștere cele mai multe, dacă nu toate, tipurile de hemocite din hemolimfa insectelor.
Într-o fază mai avansată a hematopoezei din zona medulară, anumite semnale inhibă proliferarea și diferențierea prohemocitelor; la sfârșitul perioadei larvare, toate prohemocitele par să se diferențieze. În schimb, prohemocitele din zona corticală, care nu primesc semnale inhibitorii, continuă proliferarea, precum și exprimarea și diferențierea markerilor. Un fapt interesant, observat la artropode, este interconvertibilitatea hemocitelor. Astfel, lamelocitele și granulocitele se pot transforma în plasmatocite, plasmatocitele în oenocitoide sau celulele sferice în plasmatocite și granulocite. Localizarea și diferențierea în timp a hemocitelor este stabilită încă din faza embrionară de determinanți genetici.
Se știe că la vertebrate, o celulă stem pluripotentă dă naștere unei linii celulare capabile să răspundă specific unui anumit tip de antigen. La nevertebrate, nu se cunoaște cu precizie dacă există această posibilitate, prin care o celulă stem pluripotentă (prohemocit) poate devini progenitoarea unui singur tip de hemocit diferențiat (clonă). La unele insecte (Gryllus spp., Locusta migratoria, Bombyx mori), se întâlnesc insule izogenice de hemocite în THP, cărora li se poate spune clone.
Fig. I.1.14. Formarea liniilor de hemocite diferențiate la Drosophila (după Grigorian și Hartenstein, 2013)
I.1.3.4.4. Mobilizarea liniilor de hemocite
Hematopoeza la nevertebrate este reglabilă și răspunde la cerere. Apariția unei leziuni tegumentare sau a unei intruziuni bacteriene, duce la o multiplicare accelerată a hemocitelor. Un rol important în această situație o au, probabil, citokinele. La Drosophila melanogaster nu se cunoaște clar ce tip de molecule duce la proliferarea clonelor de hemocite (13). Însă, modele experimentale la nevertebrate, efectuate cu citokinele vertebratelor, au relevant faptul că acestea modulează funcțiile hemocitelor (10). La insecte, acești mesageri sunt denumiți chemokine sau hemokine (12).
Mutațiile genelor care codifică componentele acestei căi de semnalizare pot modifica proliferarea și diferențierea hemocitelor.
I.1.4. Aparatul excretor
La insecte, aparatul excretor este reprezentat de tuburile Malpighi, nefrocite (printre care și celulele pericardiace) și corpul adipos. Tuburile Malpighi (Fig. I.1.9) sunt lungi, filamentoase, prevăzute cu un lumen central, închise la un capăt și deschise la nivelul valvulei pilorice (23). La albina adultă tuburile Malpighi sunt în număr de 100, iar la larvă există doar patru (2). Ca la majoritatea insectelor, principalul produs de excreție este acidul uric care, în intestinul terminal, se amestecă cu resturile alimentare și este eliminat la exteriorul cuibului în timpul zborului.
I.1.5. Sistemul nervos
Sistemul nervos al albinei (Fig. I.1.15) are o componentă centrală (creierul și lanțul ganglionar ventral) , o componentă periferică și alta simpatică sau somatogastrică.
Creierul este situat în capsula cefalică și rezultă din asocierea ganglionilor cefalici. El cuprinde trei părti principale (23):
protocerebrum este situat în partea din față sus a capsulei cefalice, fiind centrul vederii.Este în legatura cu ochii compuși prin intermediul nervului optic și cu ochii simpli (oceli) prin nervii ocelari. Protocerebrum formează partea cea mai dezvoltată a creierului și are două formațiuni pedunculate, centri nervoși foarte importanți care coordoneaza diferitele activități cerebrale;
deutocerebrum este centrul nervos al antenelor, de aici plecând doi nervi antenari groși, unul senzitiv și altul motor;
tritocerebrum dă naștere nervului labrului și nervului pericardial, asigurând controlul glandelor endocrine.
Lanțul nervos ventral cuprinde ganglionul subesofagian, situat în cap, două perechi de ganglioni toracici și cinci perechi de ganglioniabdominali. Ganglionul subesofagian dă naștere unor nervi motori și senzitivi asociați cu pieselor bucale. Ganglionii toracici trimit nervi motori și senzitivi către picioare, aripi și stigme. Ganglionii abdominali inervează musculatura și stigmele abdominale.
Componenta periferică (sistemul nervos periferic) este alcatuită din nervii care părăsesc sistemul nervos central.
Sistemul nervos simpatic iși are originea în sistemul nervos central. Este format din sistemul somatogastric care este în legătură cu creierul și sistemul simpatic ventral. El se asociază mai ales tubului digestiv și organelor de reproducere.
I.1.6. Organele de simț
Organele de simț ale insectelor recepționează stimuli exogeni și endogeni și îi transmit la sistemul nervos central. Componentele de bază sunt celulele senzitive. Organele de simț sunt reprezentate de chemo-, higro-, termo-, mecano- și fotoreceptori. Ele pot fi relativ simple (de exemplu sensile, scolopodii) sau mai complexe (de exemplu ochii compuși).
Dintre toate simțurile albinei, cel tactil este cel mai bine dezvoltat, perceperea fiind realizată prin sensile care sunt dispuse pe tot corpul. Lumina este percepută cu ajutorul celor doi ochi compuși și a celor trei oceli. Mirosul este detectat mai ales cu antenele, iar simțul gustativ este perceput la nivelul pieselor bucale. Organele auzului pare să lipsească, zgomotele fiind percepute de către simțul tactil sub formă de vibrații.
Fig. I.1.15. Sistemul nervos central
Pe baza structurii ochilor, văzul albinelor nu diferă probabil mult de cel al altor insecte, acuitatea vizuală fiind mediocră în special din cauza dimensiunii mici a cristalinelor care compun ochiul și a fenomenului de difracție asociat (16).
Albina are doi ochi mari, compuși (Fig. 1.16), situați de o parte și de alta a capului și conectați la creier prin intermediul nervilor optici. Fiecare ochi compus al unei albine lucrătoare este format din 4.000-5.000 de ochi simpli numiți omatidii. La trântor, la care are ochii compuși sunt mult mai mari, numărul de omatidii pentru fiecare ochi este de 7.000-8.000, iar la matcă de 3.000-4.000 (28). Ca și la alte insecte fiecare omatidie este un sistem optic complet și cuprinde o cornee, un cristalin și o retină alcătuită din șapte sau opt celule receptoare. (23, 29).Pe lângă ochii compuși albina are și trei oceli (Fig. 1.16). Aceștia sunt ochi simpli, mici, dispuși în triunghi pe partea dorsală a capului. Rolul lor este de măsurare a intensității luminii, permițându-i albinei să distingă zorii zilei de amurg, precum și înseninarea sau înnorarea cerului. Această structură a organelor vizuale permite albinei să aibă un câmp vizual de aproape 360 grade, vederea fiind binoculară și panoramică. Vederea albinei este diurnă deoarece formează imagini prin apoziție; fiecare omatidie recepționează razele luminoase orientate paralel cu axa ei lungă, astfel căeste redată imaginea unei parți minuscule a câmpului vizual, în ansamblu obținându-se o imagine detaliată, asemănătoare unui mozaic (26, 18, 15).
Simțul olfactiv al albinei este foarte dezvoltat, receptorii fiind situați la nivelul celor două antene. Antena (Fig. I.1.17), de tip geniculat, este formată din trei părți: scapus, pedicel și flagelul cu 10 articule. La nivelul acestora se găsesc diverse structuri cu funcții variate, numite sensile. Plăcile poroase sunt sensibile la mirosuri, numărul acestora fiind mai mare la albina lucrătoare (3.600-6.000) față de matcă (3.000) și mai mic decât la trântor (30.000); acest lucru le permite trântorilor să găsească matca în timpul zborului nupțial. Sensilele trihoide (de mai multe tipuri) par sensibile la vibrații, pe o antenă găsindu-se în jur de 8.500 de astfel de structuri. Sensilele baziconice, cu rol în perceperea mirosului, sunt în număr de circa 150 și se găsesc pe al treilea și al zecelea segment antenal. Prin intermediul antenelor albinele comunică între ele, recunosc dușmanii sau albinele străine, percep parfumul florilor și mirosul mierii și se orientează în interiorul stupului (25).
Fig. I.1.16. Albina lucrătoare, ochiul compus și ocelul lateral stâng
Simtul gustului la albine este de asemenea foarte dezvoltat, distingându-se gustul oral legat de cavitatea bucală, gustul tarsal dat de organele sensitive ale tarsului anterior și gustul antenal, la nivelul segmentelor terminale ale antenei. Albina deosebeste gustul dulce, sărat și acru. Nu s-au înregistrat reacții ale celulelor receptoare la substanțele amare, dar ele au efecte inhibitoare asupra receptorilor pentru sucroză (3).
I.1.7. Aparatul reproducator
Fiecare castă de femele prezintă particularități anatomice și fiziologice diferite ale aparatului reproducător: la albina lucrătoare acesta este subdezvoltat, lipsit de spermatecă și, în general, nefuncțional; la matcă, după împerechere, acesta se dezvoltă foarte mult, în special ovarele și spermateca. Trântorii au întotdeauna aparatul reproducător funcțional.
Matca este singura femelă fecundă a familiei de albine. În lipsa mătcii, albina lucrătoare poate depune doar ouă nefecundate, din care iau naștere trântori.
Organele de reproducere ale mătcii (Fig. I.1.18) sunt formate dintr-o pereche de ovare compuse din ovariole. Ovariolele, în număr de 160-180 pentru fiecare ovar, se deschid în oviducte, care, la rândul lor, prin unire, formează oviductul median (comun). Acesta se continuă cu vaginul și apoi cu vestibulul vaginal sau bursa copulatrix. După împerechere, sperma este depozitată în spermatecă, un mic diverticul care comunică cu vaginul printr-un canal (11, 19, 15).
Fig. I.1.17. Albina lucrătoare, antena
Ouăle se formează în ovariole, de unde ajung în oviduct și vagin. Matca are posibilitatea de a fecunda sau nu un ou, atunci când acesta ajunge în dreptul canalului spermatecii. Din ouăle fecundate se vor dezvolta viitoare mătci sau albine lucrătoare, iar din cele nefecundate trântori. Oul depus de matcă are forma unui bastonaș alb-sidefiu de 1,5 mm lungime si 0,5 mm în diametru, mai gros la unul dintre capete.
La mascul (trântor), organele de reproducere sunt reprezentate de două testicule situate dorsal, în abdomen, canalele deferente, veziculele seminale, glandele mucoase, canalul ejaculator, și penis. Fiecare testicul este compus din aproximativ 200 de tuburi seminifere sau testiole, care se deschid într-o cavitate comună unde se acumulează spermatozoizii. Legătura dintre testicule și organul copulator se realizează prin intermediul canalului ejaculator. La formarea spermei contribuie, pe langă testicule, veziculele seminale și glandele mucoase. În veziculele seminale, care sunt reprezentate de o dilatatie a canalului deferent, este depozitată sperma la trântorul matur sexual. Glandele mucoase, în număr de două, foarte voluminoase, plasate în abdomenul trântorului, secretă un mucus abundent în momentul copulației, cu rol de a proteja sperma împotriva uscării. (19, 15).
Reproducerea albinelor se face sexuat și partenogenetic. Masculii (trântorii) iau naștere prin partenogeneză (fără fecundare), iar femelele din ouă fecundate. Ca la majoritatea insectelor, ciclul biologic la albine este organizat în trei perioade: embrionară, postembrionară și postmetabolă. Lungimea acestor perioade este determinată atât genetic, cât și de factorii de mediu, ea fiind ușor diferită la cele trei caste (a se vedea capitolul al doilea).
Fig. I.1.18. Aparatul reproducător femel (matcă)
Perioada embrionară începe odată cu formarea embrionului și se încheie cu eclozarea larvei din ou. Dezvoltarea postembrionară durează de la eclozarea larvelor până la apariția adultului din pupă. Ansamblul transformarilor morfologice și fiziologice care au loc în perioada postembrionară constituie metamorfoza, care la albine este completă (dezvoltare holometabolă).
I.1.8. Aparatul vulnerant
Aparatul vulnerant (Fig. I.1.19), cu rol în apărare, este caracteristic tuturor himenopterelor aculeate, la albine el găsindu-se la lucrătoare și mătci deoarece acul este rezultatul transformăriiovipozitorului (structură cu rol inițial în depunerea pontei) într-o structură cu rol în apărare.
Fig. I.1.19. Aparatul vulnerant
Componentele aparatului vulnerant sunt (23, 11, 15):
două lanțete simetrice (valvele 1), foarte fine și ascutite ce poartă barbe sub forma unor cârlige și care sunt ghidate și protejate de două teci chitinoase (valvele 2). Lanțetele formează acul propriu-zis, prin care este injectat veninul;
glanda acidă, producatoare de venin
glanda alcalină (glanda lui Dufour) care, probabil, ajutăla lubrefierea acului, dar determină și mirosul caracteristic al ouălor depuse de matcă, diferit față de cel al ouălor nefertile depuse ocazional de lucrătoare;
vezica (sacul) cu venin, care servește ca rezervor pentru depozitarea veninului produs;
un ansamblu de piese chitinoase și muschi care asigură ieșirea acului din abdomen și apoi injectarea veninului.
În momentul când albina înteapă, cele două lanțete sunt introduce alternativ în tegumentul victimei, veninul fiind dirijat în leziune prin canale foarte fine care ajung la extremitatea lanțetelor. După atac, acul poate reveni în poziția inițială numai când sunt înțepate nevertebratele. La vertebrate, din cauza cârligelor, acul ramane agățat în piele, se rupe împreună cu glandele atașate, vezica cu venin și ultimul ganglion nervos al lanțului ganglionar, iar albina moare după o zi din cauza leziunii (15).
I.1.9. Glandele cerifere
Glandele cerifere sunt organele specializate pentru secreția cerii ale albinei lucrătoare. Ele sunt situate ventral, pe ultimile patru sternite abdominale, sub oglinzile cerifere, fiind acoperite de un strat protector de chitină. Oglinzile cerifere au formă ovală și aspectneted, strălucitor, fiind poroase pentru a permite ieșirea cerii.. Pe fiecare sternit din cele patru se găsesc câte două formațiuni glandulare, fiecare fiind alcătuită din 10.000-20.000 de celule secretorii.În zona oglinzilor cerifere, care sunt în numar de opt, cuticula este strabatuta de un numar mare de formațiuni tubulare, cu rol de transport al secreției glandulare. Rolul glandelor cerifere este de secreție a chitinei în stadiul pupal și de ceară începand cu vârsta de 3 zile, în perioada postmetabolă (30).
Ceara reprezintă secreția naturală a glandelor cerifere și este folosită de albinele lucrătoare pentru construcția fagurilor și căpăcirea celulelor în care este depozitată hrana sau în care se dezvoltă puietul. Ceara este o substanță grasă, de culoare albă și punct de topire în jur de 33-36 grade Celsius, ceea ce o face să fie lichidă în momentul secreției și să poată ieși prin porii oglinzilor cerifere. Secreția de ceară nu este continuă în decursul vieții albinei lucrătoare, ci răspunde necesităților de construcție a celulelor pentru creșterea puietului și de depozitare a mierii și păsturii. După secreție, ceara este transportată prin rețeaua de canale din glandă spre exterior, unde, la nivelul oglinzii cerifere, prin intarire, iau naștere niște solzișori, care sunt preluați apoi de periuțele celei de a treia perechi de picioare. La producerea cerii contribuie și enzimele secretate de glandele labiale, cervicale si toracice. Întărirea cerii se realizează sub acțiunea concomitentă a temperaturii scăzute și a secrețiilor glandelor mandibulare. Albina secretă concomitent opt solzișori de ceară, fiecare în greutate de 0,25-0,8 mg. Pentru producerea unui kilogram de ceară sunt necesari 1.250.000 până la 4.000.000 de solzișori (30).
I.1.10. Glanda lui Nasonov (glanda olfactivă)
Glanda olfactivă a albinelor se găsește în zona dorsală și posterioară a abdomenului și se deschide între ultimele două tergite ale acestuia. Secreția acestei glande are multiple roluri: marcarea florilor bogate în nectar, a stupului, precum și recunoașterea albinelor din același stup și diferențierea celor străine. Difuzarea la distanță a secreției se face prin ridicarea abdomenului și bătaia aripilor (18, 25).
I.1.11. Sistemul hormonal
Ca și la alte insecte, sistemul hormonal al abinelor este format în principal din corpora allata – glandă accesorie creierului, aflată în capul albinei – și glandele protoracice. Ambele tipuri de glande sunt activate de un produs al unor celule neurosecretorii de la nivelul creierului (22).
Corpora allata secretă hormonul juvenil. Acesta are rol în metamorfoză, secreția sa cauzând menținerea caracterelor juvenile și împiedicând apartția caracterelor următorului stadiu de dezvoltare. Diminuarea secreției de hormon juvenil face ca insecta, la următoarea năpârlire, să treacă la următorul stadiu de dezvoltare (pupă sau adult). Hormonul juvenil are rol însă și în viața albinei adulte. După cum se va vedea în capitolul următor, de-a lungul vieții sale, albina lucrătoare îndeplinește o secvență de sarcini. După circa trei săptămâni în care albina a îndeplinit preponderant sarcini în interiorul stupului, ea va face incursiuni din ce în ce mai lungi în exterior, începându-și viața de albină culegătoare. Această schimbare drastică de comportament este însoțită și probabil inițiată de o creștere semnificativă a producției de hormon juvenil. Dacă lucrătoarele în vârstă lipsesc, se constată o accelerare a transformării albinelor tinere în albine culegătoare, observându-se o creștere precoce a nivelului de hormon juvenil în corpul acestora (9).
Glandele protoracice secretă hormonul de năpârlire (numit și ecdison sau hormon de creștere), care acționează asupra epidermei și cuticulei larvelor, determinând năpârlirea acestora (22).
I.1.12. Bibliografie
Bailey, L., (1954): The Respiratory Currents in the Tracheal System of the Adult Honey-bee. Journal of Experimental Biology 31: 589-593;
Barbosa-Costa, K., Kerr, W. E., Carvalho-Zilse, G. A., (2012): Number of Malpighian Tubules in Larvae and Adults of Stingless Bees (Hymenoptera: Apidae) from Amazonia. Neotropical Entomology 41: 42-45;
de Brito Sanchez, M. G., (2011): Taste Perception in Honey Bees. Chemical Senses 36 (8): 675-692 ;
Caloianu-Iordăchel Maria, Zărnescu Otilia (1999) : Caracterizarea structurală și ultrastructurală a celulelor sanguine la nevertebrate și vertebrate inferioare. În : Tratat de hematologie animală. Coordonator : Manolescu N., Ed. Fundația “România de Mâineˮ, București, pag. 115- ;
Chan WT Queenie, Mutti S. N., Foster J. L., Kocker D. Sarah, Amdam V. Gro, Wollschin F. (2011): The Worker Honeybee Fat Body Proteome Is Extensively Remodeled Preceding a Major Life – History Transition. În: Journal. Pone, 2011;
Chirilă, A., Petruică, S., (2005) : Tehnologii apicole moderne. Stupăritul pastoral. Editura Fundația Națională „Satul Românescˮ ;
Coroian, C. O., Muñoz, I., Schlüns, E. A., Paniti-Teleky, O. R., Erler, S., Furdui, E. M., Mărghitaș, L. A., Dezmirean, D. S., Schlüns, H., de la Rúa, P., Moritz, R. F. A., (2014) : Climate rather than geography separates two European honeybee subspecies. Molecular Ecology 23 (9): 2353-2361;
Engels, M. S., (1999): The Taxonomy of Recent and Fossil Honey Bees (Hymenoptera: Apidae; Apis). Journal of Hymenoptera Research 8 (2): 165-196;
9. Fahrbach S. E., Robinson, G. E., (1996): Juvenile hormone, behavioral maturation, and brain structure in the honey bee. Development Neuroscience, 18(1-2): 102-114;
10. Garcia-Garcia E.,Galindo-Villegas J., Mulero V. (2015): Mucosal immunity in the gut: The non-vertebrate perspective. În: Academia.edu. Spania;
11. Gauld, I., Bolton, B., (1988): The Hymenoptera. Oxford University Press, Oxford, 332 pp;
12. Gliński Z. and Jarosz J. (2001): Infection and immunity in the honey bee Apis mellifera. Apiacta, 36(1), 12-24;
13. Grigorian Melina, Hartenstein V. (2013): Hematopoiesis and Hematopoietic Organs in Arthropods. Dev Genes Evol. 223(0);
14. Ivanova Evgenya, Staikova Teodora, (2007): Stage specificity in the expression of proteins of honey bee fat body (Apis mellifera L.) in the course of ontogenesis. Journal of Cell and Molecular Biology, 6(2), 129-135;
15. Lampeitl, F., (2005) : Albinăritul pentru începători. Editura M.A.S.T., București ;
16. Land, M. F., (1997): Visual Acuity in Insects. Annual Review of Entomology 42: 147-177;
17. Lazăr Șt., Vornicu O.C. (2007): Apicultura. Editura ALFA, Iași;
18. Lebrun, D., (1991) : La vie des insectes sociaux. Abeilles, fourmis, termites. Éditions Ouest-France, Rennes, 158 pp. ;
19. Mărghitaș, L. A., (1995): Creșterea albinelor. Editura Ceres, București;
20. Nakahara Y., Kanamori Y., Kiuchi M., Kamimura M.(2010): Two Hemocyte Lineages Exist in Silkworm Larval Hematopoietic Organ. PLOS One. 2010; 5(7);
21. Pankey J.P. and Tiwari R.K. (2012): An Overview of Insect Hemocyte Science and its Future Application in Applied and Biomedical Fields. Am. J. Biochem. Mol. Biol., 2(3):82-105;
22. Pedigo, L. P., (1989): Entomology and pest management. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jeresey, 646 pp.;
23. Radu, V., Gh., (1967): Zoologia nevertebratelor, vol. II. Editura didactică și pedagogică, București;
24. Ramos Martins Juliana, Gentile Bitondi Marcia (2012): Nuclear Immunolocalization of Hexamerins in the Fat Body of Metamorphosing Honey Bees. Insects, 3, 1039-1055;
25. Ritter, W., (2000): Bolile albinelor. Editura M.A.S.T., București;
26. Seidl, R., Kaiser, W., (1981): Visual Field Size, Binocular Domain and the Ommatidial Array of the Compound Eyes in the Worker Honey Bees. Journal of Comparative Physiology 143: 17-26;
27. Serrão, J. E., (2007): Proventricular structure in the bee tribe Augochlorini (Hymenoptera: Halictidae). Organisms, Diversity & Evolution 7: 175-180;
28. Snodgrass R E (1956): Anatomy of the honey bee (Ithaca, New York: Comstock PublishW. E., ing Associates);
29. Varela, F. G., Wiitanen, W., (1970): The Optics of the Compound Eye of the Honeybee (Apis mellifera). The Journal of General Physiology 55 (3): 336-358;
30. Volcinschi, T., (1988): Ceara. Centrul de material didactic și propagandă agricolă, București;
31. Wongsiri, S., Limbipichai, K., Tangkanasing, P., Mardan, M., Rinderer, T., Sylvester, H. A., Koeniger, G., Otis, G., (1990): Evidence of reproductive isolation confirms that Apis andreniformis (Smith, 1858) is a separate species from sympatric Apis orea (Fabricius, 1787). Apidologie 21 (1): 47-52 ;
32. Zahradnik, J., (1991) : Guide des abeilles, guêpes et fourmis. Les hyménoptères d’Europe. Éditions Hatier, Paris, 191 pp.;
33. ***Honey Bee Suite (2010). În: Honey beesuite. www. com/the-role-of-fat bodies;
Mircea – Dan MITROIU
I.II. Familia de albine: organizare și funcționare
I.2.1 Organizarea coloniei și dezvoltarea puietului
Familia (colonia) de albine este formată dintr-un grup de indivizi din aceeași specie care trăiesc împreună și depind unii de alții. Indivizii coloniei prezintă un nivel ridicat de organizare socială, membrii ei fiind specializați din punct de vedere structural și fiziologic pentru îndeplinirea unor funcții diferite, fiind grupați în mai multe caste. La albine se disting trei caste: mătci sau regine (femele fertile), albine lucrătoare (femele sterile) și trântori (masculi fertili). Ceea ce deosebeste colonia de albine de coloniile altor himenoptere sociale este perenitatea: matca este înconjurată pe tot parcursul unui an de un grup mai mare sau mai mic de albine lucrătoare și supraviețuiește mai multor cicluri anuale ale coloniei sale.
Albinele sălbatice își construiec cuibul în cavități naturale, ca de exemplu scorburi sau crăpături, în care fagurii sunt paraleli și prinși de tavan. Odată cu semidomesticirea lor, omul le-a creat albinelor cuiburi artificiale (stupi), din diverse materiale și cu forme variate (Fig. I.2.1).
Fig. I.2.1. Stupi
Astăzi, se folosesc trei tipuri principale de stupi (stupi sistematici): orizontal, vertical și multietajat (1). Un stup vertical obișnuit (Fig. I.2.2) ocupă un volum de 40 de litri și conține 9-10 faguri verticali, fiecare situat în interiorul unei rame mobile, ceea ce permite observarea fagurilor și, dacă este cazul, rearanjarea acestora. Ramele sunt dispuse fie perpedicular cu deschiderea stupului (urdinișul), caz în care așezarea se numește „pat receˮ, fie paralel cu acesta („pat caldˮ, Fig. I.2.3).
Fig. I.2.2. Rame verticale mobile în interiorul stupului
La nivelul fiecărui fagure, există circa 9.000 de celule dispuse în două straturi (Fig. 2.4). Construcția unui figure se realizează în câteva săptămâni sau luni și este opera a zeci de mii de albine lucrătoare. Ele se organizează în formațiuni conice cu baza în sus, în care albinele se prind de picioare. În jurul acestora se grupează celelalte albine, în 2-3 straturi, ceea ce asigură o temperatură suficient de ridicată și uniformă (circa 33-34 de grade Celsius), necesară producerii și manipulării solzișorilor de ceară. Regularitatea construcției fagurilor este uimitoare, dacă avem în vedere numărul mare de albine care participă, fiecare cu secreția ei de câteva miligrame de ceară. Construcția unui figure începe din partea superioara a ramei prin depunerea, inițial, unor aglomerări de ceară minuscule, care ulterior cresc în dimensiune. Treptat, prin acumularea cerii și prelucrarea ei, celulele cresc și iau formă alungită, fiind hexagonale în secțiune pentru a maximiza numărul de celule dintr-un spațiu dat și oblice, pentru a împiedica curgerea mierii (4, 6).
Matca poate depune ouăle în trei tipuri diferite de celule, câte un tip pentru fiecare casta: celule de albine lucrătoare, celule de trântori și celule de matcă sau botci, fiecare de dimensiuni diferite (2, 4, 6).
Celulele de albine lucrătoare sunt cele mai numeroase, fiind folosite la creșterea puietului de albine lucrătoare și la depozitarea rezervelor de hrană (miere și păstură). O celulă tipică are diametrul de 5,3-5,5 mm, o adâncime de 10-12 mm și poate conține circa 0,4 grame de miere sau 0,2 grame de polen.
Fig. I.2.3. Urdinișul
Celulele de trântori folosesc la creșterea puietului de trântori și depozitarea mierii. Au un diametru de 6,25-7 mm și o adâncime de 13-16 mm.
Celulele de matcă (botcile) au formă de ghindă, cu diametrul de 10-12 mm și adâncimea de 20-25 mm. Ele sunt construite fie la marginea de jos a fagurilor, fie în spațiile libere ale acestora. Spre deosebire de celelalte tipuri de celule, acestea au pèreții îngroșați, la exterior apărând modele aproximativ hexagonale. Alungirea botcilor continuă după depunerea oului de către matcă și eclozarea larvei. După rolul lor, botcile sunt de mai multe feluri. Botcile de schimbare liniștită a mătcii sunt în număr de 2-3 pe un fagure și sunt construite atunci când colonia înlocuiește o matcă bătrână și ineficientă. Botcile de roire sunt în număr de 20-30 pe un fagure, de obicei pe marginile laterale sau inferioară și sunt construite înainte de roirea coloniei. În fine, botcile de salvare sunt construite atunci când matca a murit, prin modificarea celulelor din mijlocul fagurelui, în care se găsesc ouă sau larve tinere. După apariția mătcilor, botcile sunt distruse de către albinele lucrătoare.
În funcție de necesitățile coloniei, celulele pot suferi modificări, astfel că o celulă de lucrătoare poate fi transformată în una de trântor sau botcă. De asemenea, mai există așa-numitele celule de legătură care sunt construite în special în locurile de fixare a fagurilor de rame, având rol de consolidare (6).
Fig. I.2 4. Fagure în interiorul ramei
Ouăle sunt depuse de matcă în poziție verticală, lipite cu extremitatea mai subțire de fundul celulelor (Fig. 2.5). De regulă matca depune circa 1.500-2.000 de ouă în 24 de ore. Fiecare ou este depus într-o celulă diferită. În cazul tuturor castelor, după trei zile, din ou se dezvoltă o larvă mică care apoi se curbează pe fundul celulei (Fig. 2.5). După 8-10 zile de la depunerea oului, albinele lucrătoare căpăcesc celulele. Capacelele celulelor sunt construite din ceară, sunt poroase, permițând circulația aerului. Peste câteva zile larva se întinde, iar trecerea dintre intestinul mediu și cel posterior se deschide, astfel încât excrementele pot fi eliminate pe fundul celulei. Înainte de transformarea în prepupă, larva își țese un cocon din mătase, secretată de glandele sericigene. Urmează apoi stadiul de pupă și, în final, de insectă adultă, care iese din cocon și celulă cu ajutorul mandibulelor (Fig. I.2.5). Transformarea dintr-un stadiu în altul este lentă, insesizabilă. Începând cu stadiul de prepupă, apar schițate cele trei părți ale corpului: capul, toracele și abdomenul. Apoi, sub tegument încep să se dezvolte mugurii aripilor, picioarelor și pieselor bucale. Practic, se constată o retopire a corpului insectei și reconstituirea lui pe baza discurilor imaginale. Dezvoltarea fiziologică se desăvârșește în următoarele zile, când tegumentul este pigmentat în totalitate, glandele hipofaringiene sunt total dezvoltate, aparatul vulnerant devine funcțional etc (4, 5).
Durata dezvoltării variază în funcție de castă, iar în interiorul aceleiași caste depinde de temperatura din cuib și de cea exterioară, dar și de subspecia, rasa sau sușa de albine. În cazul albinelor lucrătoare, dezvoltarea de la ou la insectă adultă durează, în medie, 20 de zile, în cea de-a 21-a apărând insecta adultă. Stadiul de larvă durează 7 zile, iar stadiile de prepupă și pupă 10 zile. În cazul mătcii, dezvoltarea este mai scurtă, ea durând, în medie 15 zile. În a 16-a apare insecta adultă (imago), iar maturitatea ei sexuală se desăvârșește în următoarele 5-6 zile. În acest caz, stadiul de larvă durează 6 zile, iar stadiile de prepupă și pupă tot 6 zile. Dezvoltarea trântorilor se face, în medie, în 24 de zile, aceștia având dezvoltarea cea mai lentă dintre toate castele. Stadiul de larvă durează 11 zile, stadiile de prepupă și pupă 9 zile. Perioada postmetabolăa începe cu apariția adultului din pupă și se încheie la moartea individului. Are o durată diferită la cele trei caste: 3-6 ani la matcă, 1-9 luni la albina lucrătoare (mai scurtă la albinele de vară, mai lungă la cele de iarnă) și 1-3 luni la trântor (1, 5).
Fig. I.2.5. Stadiile de dezvoltare preimaginale: a. Ou; b. Larvă curbată; c. Larvă întinsă; d. Prepupă; e. Pupă. După 8-10 zile de la depunerea oului, celulele sunt căpăcite
Într-un stup ordinea stabilită de albine este imuabilă. În timpul sezonului activ, ramele din centru sunt ocupate de ouă, larve și pupe, astfel că întreg ansamblul celulelor are formă aproximativ sferică sau elipsoidală, respectiv pătrată sau dreptunghiulară, în funcție de formatul ramei. În partea superioară și la colțurile de sus ale ramei se găsesc rezervele de miere. Polenul, sub forma de păstură, este stocat la marginea puietului, iar când rezervele sunt mari, poate ocupa și o ramă întreagă.
Matca depune ponta în mod organizat. La examinarea unei rame cu puiet se pot vedea inele concentrice de ouă proaspăt depuse, de larve tinere, de larve în vârstă și apoi de pupe. Stadiile de aceeași vârstă sunt foarte bine grupate, ceea ce înlesnește reglarea temperaturii, a umidității și a hrănirii larvelor. Reglarea populației unui stup, în perioada activă, se face în funcție de condițiile atmosferice și abundența sau micșorarea cantităților de polen și nectar. Timpul frumos și culesul de nectar și polen bogat stimulează ponta mătcii. Din contră, timpul nefavorabil și lipsa hranei reduc sau suprimă ponta mătcii. Alături de acest fenomen, îndepărtarea ouălor, larvelor și trântorilor sunt alte mijloace de reglare a numărului de indivizi din colonie.
Până în ziua a treia de dezvoltare, larvele de lucrătoare pot fi transformate în larve de matcă printr-o altă compoziție a lăptișorului (hranei). Factorii care determină evoluția unei larve femele către matcă sau albină lucrătoare sunt insuficient cunoscuți. Tipul și mai ales cantitatea hranei, precum și feromonii secretați de matcă sunt determinanți (5).
I.2.2. Ciclul anual al coloniei
Ciclul anual al familiei de albine este legat de latitudine. În condițiile țării noastre, colonia de albine are o perioadă activă și una de repaus sau de hibernare. Perioada activă începe, în general, la sfârșitul lunii ianuarie, prin apariția puietului. Dezvoltarea cuibului urmează apoi o curbă ascendentă până la sfârșitul lunii iunie, după care populația stupului începe să scadă treptat, până când depunerea ouălor de către matcă încetează. În funcție de potențialul reproductiv al mătcii, condițiile de mediu și vegetația existentă în zonă, în general, în luna noiembrie colonia de albine intră în repaus cu o populatie de 10.000-20.000 de indivizi. Pe timpul iernii, colonia se restrânge într-un spațiu mic și trăiește din rezervele de miere.
În cursul unui ciclu anual din zona temperat-continentală, albinele au o durata de viață variabilă. Fiziologia albinelor lucrătoare este diferită de la un sezon la altul. Odată cu începerea activitații de creștere a puietului, apariția de noi albine adulte este din ce în ce mai frecventă. Albinele care au trecut peste iarnă mor unele după altele, iar procesul de înlocuire este din ce în ce mai accentuat. În general, în luna mai dispar ultimile albine bătrâne. Rata înmulțirii este superioară pierderilor prin mortalitate. Populația stupului crește necontenit. În perioada de activitate maximă (iunie), numărul indivizilor dintr-o
colonie ajunge la aproximativ 60.000 de indivizi, ocazional chiar mai mult. Deoarece spațiul din stup este limitat, nemaiexistând posibilitatea construirii de noi faguri, apare o stare de dezechilibru la nivelul coloniei, ceea ce declanșează așa numitul roit, care apare de obicei între lunile mai și iulie (3).
În faza premergătoare roitului, albinele lucrătoare încep să construiască botcile de roire. Cu câteva zile înainte de apariția noilor mătci, activitatea albinelor devine frenetică, temperatura și umiditatea din interiorul stupului crescând semnificativ. Acest lucru determină ca aproximativ jumătate din populația de albine să părăsească stupul împreună cu vechea regină. Roiul se localizează de obicei pe o creangă sau un alt suport, de unde poate fi mutat de către apicultor într-un stup gol. Dacă acest lucru nu se întâmplă, albinele cercetașe vor zbura în căutarea unui loc propice pentru instalarea coloniei.
În vechiul stup, încep să apară noile regine virgine. De regulă, prima regină apărută, ajutată de albinele lucrătoare, le omoară pe celelalte, distrugând botcile care le conțin. Ocazional, un stup poate roi acum a doua oară, o parte din lucrătoare urmând o regină nou apărută. Odată cu apariția reginelor, apar și numeroși trântori. Aceștia zboară din stup și așteaptă regina în vederea acuplării, care are loc în aer, la circa 10 metri înălțime. Regina se poate împerechea în zbor cu 8-10 trântori, după care se întoarce în stup. După împerechere trântorii mor (2, 3).
Predispoziția pentru roit se pare că are și o componentă genetică, ea fiind diferită pentru diverse subspecii și rase de albine. De asemenea, vârsta mătcii joacă și ea un rol: coloniile cu mătci mai în vârstă au o predispoziție mai mare spre roit decât cele cu mătci tinere. Supraîncălzirea stupului din cauza expunerii la radiațiile solare contribuie și ea la declanșarea roitului (2).
Albinele apărute în perioada de activitate maximă a coloniei, așa numitele albine de vară, au viată scurtă (4-5 săptămâni). Ele desfasoară o activitate intensă ca doici și de aceea secretă o cantitate mare de lăptișor care este distribuit larvelor. Pentru această secreție se dezvoltă și funcționează foarte mult glandele hipofaringiene și mandibulare în detrimentul corpului gras. Astfel, albina de vară nu-și face rezerve de lipide și, în consecință, longevitatea ei scade la aproximativ șase săptămâni. Albinele cu longevitate mare (6-9 luni), numite de iarnă, apar în intervalul august-noiembrie. În această perioadă activitatea de creștere a puietului este redusă, așa că activitatea glandelor hipofaringiene și mandibulare este și ea redusă. Se dezvoltă în schimb corpul gras, prin înmagazinarea unei cantități importante de lipide, ce le asigură o longevitate crescută (5).
Mecanismele fiziologice nu sunt cunoscute încă suficient pentru a explica detaliat aspectele longevității scăzute sau crescute. Și intervenția unei componente genetice este de presupus, deoarece albinele provenite din rasele adaptate climatului tropical supraviețuiesc greu în zonele temperate.
I.2.3. Activitățile coloniei
Activitățile unei colonii de albine se centrează pe depunerea pontei, îngrijirea și hrănirea puietului și asigurarea unor rezerve suficiente de hrană pentru sezonul rece. Toate aceste activități necesită o comunicare adecvată între membrii coloniei. Comunicarea între albine se realizează prin intermediul antenelor, feromonilor sau al schimbului de hrană (trofilaxiei) și, deloc de neglijat, al „dansului” caracteristic. Un rol mare în comunicare îl au și feromonii (ectohormonii), care sunt substanțe chimice (acizi organici sau alcooli, foarte volatili), eliberați de organism în mediu. Feromonii sunt folosiți pentru atragerea partenerului sexual, marcarea traseelor și florilor, pentru declanșarea apărării coloniei sau pentru realizarea coeziunii și coordonarii sociale (substanța reginei).
Colonia de albine, în totalitatea ei, este o entitate de sine stătătoare și independentă. Albinele lucrătoare, de la ieșirea lor din pupă și până la moarte, îndeplinesc succesiv mai multe roluri în colonie, în funcție de vârstă (3, 5). Astfel, în primele 10 zile de viață, albina nu părăsește stupul. Una dintre primele sale sarcini este curățarea celulelor fagurelui; ea inspectează celulele din care ies noi albine, îndepărtează resturile de ceară și exuviile larvare. Tot acum se ocupă și de toaletarea altor albine, putând curăța pâna la 80 pe oră. Apoi, odată cu dezvoltarea glandelor hipofaringiene și mandibulare, ea devine o albină doică și va avea ca sarcină hrănirea puietului. În primele 3 zile, toate larvele, indiferent de castă, sunt hrănite cu lăptișor de matcă, o substanță bogată în proteine produsă de aceste glande. Larvele sortite să devină mătci sunt hrănite în continuare exclusiv cu lăptișor de matcă, iar cele ce se vor dezvolta în albine lucrătoare sau trântori, vor primi doar un amestec de polen și miere. Pentru dezvoltarea completă a unei albine, aceasta trebuie să primească 2000-3000 de vizite de hrănire.
Între a 10-a și a 20-a zi de viață, albina efectuează primele zboruri de orientare în jurul stupului. Ea zboară în cercuri concentrice din ce în ce mai largi, memorând în tot acest timp peisajul din jurul stupului, cât și forma și culoarea acestuia, repere ce o vor ajuta să nu se rătăcească mai târziu, când se va îndepărta mai mult de stup pentru activitățile de cules. Dezvoltarea în această perioadă a glandelor cerifere permite albinei să contribuie și la construirea sau repararea fagurilor, precum și la căpăcirea celulelor ce conțin puiet sau rezerve alimentare. De asemenea, ea poate să îndepărteze gunoiul și cadavrele albinelor moarte din stup și să stea de pază. Albinele paznic stau la urdiniș și nu lasă să pătrundă în stup decât albinele proprii coloniei respective. Există o oarecare toleranță pentru albinele străine rătăcite și încărcate cu polen. Însă, uneori, mai ales spre sfârșitul sezonului de cules, se poate declanșa așa numitul furtișag: coloniile de albine slăbite sunt luate drept țintă de alte colonii și hrana stocată este sustrasă. Astfel, un stup atacat, poate și complet golit de rezervele de hrană de către albinele atacatoare.
Ultima perioadă din viața unei albine, începând aproximativ cu a 20-a zi și până la moartea sa, este dedicată culegerii de polen, nectar, apă și propolis, care sunt aduse în stup în gușă și pe picioarele posterioare. Recoltarea polenului și nectarului nu se face la inițiativa individuală a albinelor culegătoare ci în funcție de informațiile furnizate de albinele cercetașe care efectuează mișcări caracteristice la întoarcerea în stup. Descifrarea acestui „dans” a fost facută de către Karl von Frisch, care împreună cu Nikolas Tinbergen și Konrad Lorenz, a obținut, în anul 1973, premiul Nobel. În funcție de caracterul dansului, se disting două tipuri (2,3): dansul circular și cel elipsoidal.
Dansul circular este executat de lucrătoarele care au găsit o sursă de polen sau nectar în apropierea stupului (până la 100 m depărtare de acesta). Albinele se învârt în cercuri de câțiva centimetri în diametru, schimbând frecvent sensul de rotație. Albinele neocupate cu alte munci palpează albina care dansează, se impregnează cu mirosul acesteia și al hranei descoperite și apoi zboară în afara stupului în căutarea sursei de hrană anunțate. Dacă hrana este abundentă, aceste albine vor dansa la rândul lor la revenirea în stup, antrenând astfel și alte albine în această activitate;
Dansul elipsoidal, balansat sau în 8 (Fig. 2.6) este executat de albinele cercetașe atunci când sursa de hrană este plasată la o distanță mai mare de 100 de metri față de stup. Mai întâi albina parcurge o distanță dreaptă, apoi face un semicerc revenind în punctul din care a plecat, parcurge din nou porțiunea dreaptă și în final efectuează un semicerc în direcție opusă celui parcurs prima dată. Toate aceste mișcări se repetă timp de câteva minute. În timp ce parcurge porțiunea dreaptă a traseului, albina bate din aripi, își balansează abdomenul și produce niște vibrații care sunt percepute de receptorii de pe picioarele albinelor. La nivelul porțiunii rectilinii a traseului, frecvența balansărilor indică bogăția sursei de nectar (cu cât balansările sunt mai frecvente, sursa de hrană este mai bogată), iar viteza de deplasare indică distanța până la sursa de hrană. Astfel, în 15 secunde, pentru o distanță de 100 m, albina parcurge porțiunea dreaptă de 10 ori, pentru 500 m de 6 ori, iar pentru 8 km o dată și jumătate. Amplasarea sursei de hrană față poziția soarelui este semnalizată prin orientarea porțiunii rectilinii a dansului. Dansul fiind efectuat pe suportul fagurelui, în plan vertical, deschiderea unghiului și direcția de mișcare (către soare sau opusă acestuia) indică locul sursei de hrană față de poziția soarelui. Astfel, o traiectorie executată vertical de jos în sus indică faptul că hrana se află în direcția soarelui, sub un unghi de 0 grade față de acesta. Același traseu, dar efectuat de sus în jos, indică o direcție opusă soarelui. O traiectorie de jos în sus sub un unghi de 60 de grade spre stânga în raport cu verticala indică o sursă de hrană aflată cu 60 de grade la stânga soarelui. O traiectorie de sus în jos sub un unghi de 120 de grade spre dreapta în raport cu verticala indică o sursă de hrană aflată cu 120 de grade la dreapta soarelui. Orientarea dansului se schimbă în cursul unei zile în funcție de pozitia soarelui dimineața, la prânz sau seara. În zilele înnorate poziția soarelui este percepută prin captarea radiației ultraviolete.
Uneori, albinele culegătoare se pot rătăci în masă, atunci cand stupii sunt aranjați simetric, au aceeași formă și culoare, iar peisajul este monoton. Acest fapt duce la golirea unor stupi, de obicei cei asezați central în stupină, în favoarea celor de pe extremități. Deriva se poate reduce prin individualizarea stupilor cu ajutorul reperelor și prin evitarea aliniamentului prea strict.
Rolul albinelor culegătoare este de a aduce la stup nectar, polen, propolis și apă. Nectarul este aspirat cu ajutorul trompei și depozitat în gușă. Pentru a o umple, o albină trebuie să viziteze peste o mie de flori, cantitatea adunată fiind de circa 75 mg (3). Lungimea trompei obligă albina să aleagă doar florile cu o anumită adâncime a corolei, pentru a ajunge la sursa de nectar. O mică parte din nectarul acumulat trece mai departe pentru a fi digerat. La întoarcerea în stup, nectarul este transferat altor albine sau regurgitat în celulele destinate depozitării acestuia, albina reluându-și apoi activitatea de culegătoare. Transformarea nectarului în miere este atât un proces fizic, cât și unul biochimic. Cel fizic constă în evaporarea parțială a apei, datorită ventilării celulelor și a regurgitărilor repetate. Procesul biochimic constă în transformarea zaharozei în glucoză și fructoză, sub influența invertazei secretate de glandele faringiene ale albinelor cu vârstă mai mare de 21 de zile (4).
Fig. I.2.6. Dansul elipsoidal (a se vedea explicațiile în text)
Când albina vizitează o floare, polenul de pe staminele florii se lipește de perii de pe corpul său. Dacă polenul este greu accesibil, albina își folosește mandibulele și picioarele anterioare pentru a-l culege. Cu ajutorul unei mici picături de nectar regurgitat, albina transferă polenul pe picioarele mijlocii. Apoi, cu ajutorul periuței situate pe fiecare dintre picioarele posterioare, albina culege polenul de la nivelul picioarelor mijlocii și de pe corp. În următoarea etapă, albina își încucișează sub abdomen picioarele posterioare, frecându-se rapid unul de altul. Astfel, polenul de la nivelul periuței unui picior se acumulează la nivelul pieptenului piciorului opus. Prin mișcările piciorului, polenul este apoi împins în sus, către corbiculă, unde va forma mici aglomerări de 2-3 mm în diametru, totalizând, pe ambele picioare, circa 40-50 mg, adică aproximativ jumătate din greutatea propriului corp. Mărimea, greutatea și culoarea aglomerărilor de polen diferă în funcție de specia de plantă dominantă vizitată. O albină trebuie să viziteze circa 400 de flori pentru o încărcătură completă de polen. La întoarcerea la stup, albina depozitează polenul în celule, ajutându-se de ghearele și pintenii picioarelor mijlocii. Apoi albinele din stup bătătoresc cu capul polenul acumulat și în final îl acoperă cu miere pentru a nu se altera (2, 3).
O altă sursă de zaharuri folosită de albine în afară de nectar o reprezintă secrețiile dulci ale afidelor (păduchilor de plante), care sunt eliminate după ce aceștia se hrănesc cu seva plantelor. Acestea sunt colectate de pe plante, transportate de albine în gușă, regurgitate și înghițite de mai multe ori și apoi depozitate în celule, unde se transformă în așa numitul „mielatˮ sau „miere de manăˮ. Aceasta poate avea efecte nedorite la nivelul coloniei în timpul iernii, cauzând toxicoze, diaree sau chiar mortalitate în masă (3, 4).
Propolisul este o secreție cu aspect de rășină, produsă la nivelul mugurilor unor specii de arbori, cum ar fi plopul, salcia sau castanul. Albinele îl colectează și apoi îl transportă în corbicule la stup, unde amestecat cu ceară, folosește la cimentarea fagurilor și a crăpăturilor stupului. Având în componență numeroase substanțe cu efect antibiotic, propolisul este folosit de asemenea la învelirea cadavrelor de rozătare sau de alte mici animale care au pătruns în stup și au fost omorâte de albine, pentru a împiedica intrarea lor în putrefacție și a menține cuibul aseptic (3).
Apa este absolut necesară pentru supraviețuirea albinelor, un stup putând consuma până la un litru pe zi în perioadele foarte călduroase. Apa este recoltată de albinele culegătoare, depozitată la nivelul gușei și apoi regurgitată în faguri. O parte este consumată de puiet, o alta este folosită pentru fluidizarea mierii, iar o alta se evaporă contribuind la răcorirea stupului (2, 3).
Fiind un spațiu relativ închis, reglarea temperaturii din interiorul stupului este de importanță vitală. Menținerea unei temperaturi mai mari de 30 de grade Celsius, chiar și iarna, este vitală pentru supraviețuirea coloniei. Albina, luată ca individ separat, este poikilotermă, însă, reunite într-un grup de cel puțin 50 de albine, ele reușesc să realizeze climatizarea cuibului, prin creșterea temperaturii corpului lor, realizată prin vibrarea mușchilor aripilor. În interiorul stupului temperatura nu este uniformă. În centrul coloniei, acolo unde crește puietul, temperatura, chiar și iarna, se menține în jurul a 34-35 de grade Celsius. Spre marginea cuibului, temperatura are abateri mai mari față de optim. În timpul iernii, cand colonia este lipsită total sau aproape total de puiet, albinele formează ghemul de iernare pentru a-și asigura căldura necesară în centrul cuibului. Albinele aflate la exteriorul ghemului formează un strat protector, fiind așezate ca țiglele pe acoperișul unei case. Periodic, albinele aflate la exteriorul ghemului, pătrund în interiorul acestuia pentru a se încălzi, iar altele le iau locul. Amintim faptul că temperatura minimă pe care o poate suporta o albină izolată este de 8 grade Celsius. Sub această temperatură aceasta moare. Vara, când temperatura exterioară este superioară temperaturii optime a cuibului, adică când depășește 36,5 grade Celsius, ventilarea stupului este realizată prin evaporarea apei și mișcările continue ale aripilor albinelor postate la urdiniș. Ventilarea are de asemenea funcția de împrospătare a aeurlui din stup, unde se pot acumula cantități toxice de dioxid de carbon provenit din respirația albinelor (3, 5).
I.2.4. Bibliografie
Chirilă, A., Petruică, S., (2005) : Tehnologii apicole moderne. Stupăritul pastoral. Editura Fundația Națională „Satul Românescˮ;
Lampeitl, F., (2005): Albinăritul pentru începători. Editura M.A.S.T., București ;
Lebrun, D., (1991) : La vie des insectes sociaux. Abeilles, fourmis, termites. Éditions Ouest-France, Rennes ;
Mărghitaș, L. A., (1995): Creșterea albinelor. Editura Ceres, București.
Ritter, W., (2000): Bolile albinelor. Editura M.A.S.T., București;
Volcinschi, T., (1988) : Ceara. Centrul de material didactic și propagandă agricolă, București ;
Stelian ASIMINEI
I.III. Apărarea antiinfecțioasă la albina meliferă
Starea de sănătate este condiționată de integritatea anatomică și funcțională a organismului. În cazul în care apar factori perturbători, este modificat echilibrul morfo – fiziologic normal și se instalează starea de boală. Factorii care pot interveni în tulburarea homeostaziei organismului animal sunt de natură endogenă sau exogenă. Factorii exogeni pot fi infecțioși și neinfecțioși. Agenții infecțioși, responsabili de apariția stării de boală, sunt virusurile, bacteriile, miceții și paraziții. Starea de boală determinată de agenții patogeni vii care se răspândesc între vietăți, prin contaminare, se numește proces infecțios sau infecție. Așadar, ,,procesul infecțios reprezintă totalitatea reacțiilor biologice și morfologice, locale și generale, consecutive pătrunderii și multiplicării agenților patogeni vii în organismul animal” (33).
Printre modificările biologice și morfologice, inflamația și reacția imună sunt procese prin care organismul identifică, se adaptează și elimină tot ceea ce îi este străin (non-self), printr-o gamă variată de mecanisme, umorale, celulare și tisulare. Capacitatea de a face deosebire între self și non-self este condiția esențială pentru desfășurarea acestor procese. Această “sarcină” este îndeplinită de gene care codifică sinteza de proteine cu rol în recunoașterea imunologică și în cooperarea celulară.
Unele procese imune sunt moștenite, înnăscute, altele sunt câștigate prin adaptare morfo-fiziologică la praticularitățile fizico-chimice ale fiecărui agent infecțios.
Mecanismul de apărare imună bivalentă, este întâlnit la toate vertebratele și mai puțin la nevertebrate, la care predomină răspunsul imun înnăscut.
Pornind de la aceste considerente, în lucrarea de față, vom trece în revistă cunoștintele actuale în domeniul inflamației și imunității, structurate după importanța practică și funcțională la Apis melifera, dar și la alte insecte (Drosophila melanogaster, Anopheles spp. și Rhodnius prolixus), care au fost folosite ca modele experimentale în studiile axate pe aceste procese.
I.3.1. Inflamația
Inflamația este răspunsul organismului animal la acțiunea distructivă a diverșilor
agenți patogeni. Aceasta se manifestă printr-o mare diversitate de reacții locale și generale exteriorizate prin modificări alterative, circulatorii și productive.
Modificările troficității tisulare, ale circulației sanguine, limfatice și lacunare și înmulțirea celulelor sunt interdependente. Nici una dintre aceste componente ale procesului inflamator, luate separat, nu au semnificație inflamatorie (27).
Aceast proces patologic, prezent la vertebrate, nu a fost abordat și la artropode, cu toate că modificările alterative, exsudative și proliferative (productive sau hiperplazice) sunt prezente, fiind asemănătoare cu cele întâlnite la vertebrate, dar la scară mai mică.
Sistemul circulator al artropodelor este de tip deschis, lacunar. De regulă, inima este tubulară, situată dorsal. De la ea pleacă vase spre toate organele și țesuturile. Apoi, vasele se deschid în lacunele dintre organe, cavitatea corpului fiind numită și hemocel. Hemocelul este divizat în camere, numite sinusuri. După ce are loc schimbul de substanțe între organe și hemolimfă, aceasta ajunge din sinusuri înapoi la inimă, prin orificii speciale numite osteole. Circulația hemolimfei din inimă la organe și apoi la inimă este realizată de contracțiile inimii și ale organelor accesorii de pulsație. Sistemul de valve prezent la nivelul inimii nu permite refularea acesteia în pauzele dintre contracții (45).
Acest tip de sistem circulator permite contactul intim între hemolimfă și organe sau țesuturi, astfel că celulele și moleculele hemolimfei, implicate în inflamație, reacționează prin constituirea exsudatului inflamator.
Agenții etiologici ai inflamațiilor sunt bacteriile, virusurile, miceții, paraziții, agenții chimici sau fizici, macromoleculele proteice, complexele imune și traumatismele (27).
Procesul inflamator are caracter secvențial și decurge în trei faze:
● alterativă;
● exudativă;
● proliferativă (27, 41).
I.3.1.1. Faza alterativă se caracterizează, pe deoparte, prin modificările distrofice și necrotice ale celulelor parenchimatoase, ale substanței fundamentale, ale celulelor și fibrelor conjunctive, iar pe de altă parte, prin exacerbarea activității metabolice în alte celule. Consecutiv acestor modificări, în focarul inflamator sunt eliberate substanțe biologic active de tipul aminelor biogene, F3 a complementului, derivații acidului arahidonic (fig. I.3.1), citokine etc. Acestea, împreună cu acțiunea agenților patogeni, dezintegrează substanța fundamentală intercelulară și permite hemolimfei (celule, electroliți și molecule) să pătrundă în focarul inflamator. Astfel, este deschisă calea spre faza exsudativă.
I.3.1.2. Faza exsudativă se află sub influența mediatorilor chimici ai inflamației.
Aceștia acționează asupra dinamicii hemolimfei în proximitatea focarului inflamator, prin încetinirea fluxului și marginalizarea hemocitelor. Substanțele chemotactice din focarul inflamator favorizează penetrarea spațiilor intercelulare de către hemocite, prin diapedeză. Hemocitele cele mai active, în această fază, sunt granulocitele și/sau plasmatocitele (sferulocite), care au capacități fagocitare crescute. Atașarea agenților patogeni la membrana citoplasmatică a fagocitelor este facilitată de opsonine (polipeptide antimicrobiene, F3 a complementului, unele pectine), care sunt constituienți normali ai hemolimfei și ai lichidului interstițial.
Fig.I.3.1. Rolul fosfolipidelor în dezvoltarea procesului
inflamator și a imunității celulare la insecte (după,Garcia și colab. 2009)
Legendă: Eicosanoizii sunt metaboliții oxigenați ai acidului arahidonic. Acidul arahidonic și Lyso-PAF iau naștere din fosfolipide prin acțiunea hidrolitică a fosfolipazei A2 (PLA2). Din acid arahidonic rezultă prostaglandinele, leucotrienele, tromboxani, prostacicline și endoperoxizi intermediari, catalizarea fiind realizată de ciclooxigenază și lipooxigenază, iar Lyso-PAF este acetilat de PAF-acetiltransferaza cu eliberarea factorului de agregare a plachetelor sanguine (PAF). PAF poate fi degradat de PAF-acetil-hidrolaza cu regenerarea Lyso-PAF. In prezența dexametazonei, răspunsul imun este inhibit datorită suprimării activității PLA2 și a lipooxigenazei (LOX), proces observat și în cazul scăderii producției de acid arahidonic sau a infectării insectei Galeria mellonela cu bacteria entomopatogenă Xenorbabdus nematophila (27).
Eicosanoizii au rol central în procesele imune prin medierea imunității celulare în infecțiile bacteriene (reglează clearance-ul bacterian în hemolimfă) și în formarea de granuloame (25).
Fagocitoza este fenomenul cheie al procesului inflamator (41).
Fagocitoza poate fi completă sau incompletă. Fagocitoza incompletă este inductorul imunității dobândite, prin prezentarea epitopilor, de către celulele prezentatoare de antigen, genelor
responsabile cu sinteza proteinelor antimicrobiene, sau mijlocul prin
care virusurile se răspândesc în organismul albinelor.
I.3.1.3. Faza proliferativă, apare tardiv, și se manifestă prin multiplicarea elementelor celulare în focarul inflamator și dezvoltarea unui țesut conjunctiv fibrilar, generat de fibroblaste, dar numai după ce toxinele au fost inactivate și resorbite, teritoriul a fost curățat prin fagocitoză, iar agenții patogeni au fost anihilați (27, 41), pentru ca în final să se producă melanizarea țesutului conjunctiv de neoformație
Evoluția procesului inflamator a fost demonstrat de Krantz și colab. (2014) la larvele insectei Drosophila melanogaster după lezarea cuticulei de către paraziți. Acesta se desfășoară etapizat, după următorul model:
În prima etapă se formează o structură compusă din celule și hemolimfă care obliterează leziunea produsă de parazit. Mobilizarea hemocitelor sesile și din hemocel , în special plasmatocite, se face sub impulsul substananțelor chemotactice, eliberate din epiteliul cuticulei larvare lezate.
În multe cazuri, leziunile cuticulei servesc ca poartă de intrare pentru agenții patogeni. Acest fapt duce la activarea receptorilor PRRS de către persefone (semnal chimic transmis de la țesutul mort); PRRS sunt receptori pentru PAMPs care sunt asociați agenților patogeni sau componentelor eliberate după moartea celulelor. Receptorii persefonelor (Psh) includ familii de peptide legate de receptorii de membrană Toll – like și NODca citoplasmatici. PRRS endocitare declanșează capacitatea fagocitelor de a se atașa de microorganismele patogene.
În etapa a II-a, plasmatocitele din leziune sunt degranulate și inițiază formarea unui coagul imatur, cu sprijinul factorilor umorali (lipoforin, hexamerine etc.) din hemolimfă, în această etapă fiind încorporate și celulele cristaline.
În următoarea etapă are loc formarea coagulului dur și melanizarea acestuia. Procesul se desfășoară sub impulsul profenoloxidazei (PPO) (1). Sistemul este activat de recunoașterea non-selfului de către PRRs, precum și de o serie de factori endogeni eliberați de țesuturile lezate. Cascada serin – proteazei duce la scindarea proPO (datorită intervenției enzimei pro-PPAE) din care rezultă PO activă. În continuare, PO catalizează oxidarea fenolilor la chinone, care ulterior, prin polimerizarea chinonelor ia naștere melanina (fig. I.3.2) (29). Toate celulele și resturile celulare sunt înglobate în matricea chiagului. Apoi, are loc reepitelizarea țesutului de neoformație, cu apariția unui sincițiu care schimbă arhitectura citoscheletului (fig. I.3.3) (1)
Inflamația și imunitatea înnăscută sunt procese de apărare antiinfectioasă nespecifice, fiind primele reacții de apărare față de agresiune. Inflamația are caracter local și urmărește anihilarea agresorului la nivelul țesutului afectat. În momentul când agentul patogen depășește apărarea locală și pătrunde în hemolimfă, intră în “scenă” mijloacele apărării imune înnăscute. Astfel, în funcție de natura agentului patogen, sunt activate căile de comunicare ale informației antigenice la genele care controlează producția de peptide antimicrobiene și transformarea prohemocitelor în fagocite (fig. I.3.4).
Fig. I.3.2. Privire de ansamblu asupra cascadei melanizării la artropode
(după Reumer O., Van Loy T., Schoofs L., 2010).
Fig. nr. I.3.3. Încapsularea și melanizarea unui agent patogen în larva insectei D. melanogaster (după Dushay M., Illinois Institute of Technology).
Având în vedere aceste considerente, în continuare, vom prezenta datele cunoscute în prezent despre antigene, receptorii de antigen, căile de comunicare între receptori și genele implicate în activarea răspunsului imun înnăscut al insectelor, față de acțiunea agenților patogeni animați.
I.3.2. Antigenele
Compușii chimici care induc reacții imune celulare și umorale se numesc antigene (Ag). Acestea sunt substanțe străine (non-self) față de organismul gazdă deoarece au o structură chimică diferită față de cele ale primitorului de antigene.
Antigenele sunt de origine animală, vegetală, bacterienă, virală, parazitară, micotică sau sunt heteroantigene, exogene sau endogene, iar după felul cum reacționează cu anticorpii, antigenele pot fi precipitinogeni sau aglutinogeni (22).
Antigenele microbiene sunt modele moleculare asociate microorganismelor patogene (PAMPs). Acestea sunt componente ale peretelui celulei bacteriene [lipopolizaharidele (LPS) la bacteriile Gram – negative, acidul lipoteicoic și peptidoglicanii pentru bacteriile Gram – pozitive], β-1,3 glucani din fungi sau glicosilphosphatidilinositol (GPI) din protozoarele parazite (27).
Trebuie să amintim că nu toate structurile menționate anterior sunt antigenice, ci numai anumite părți din antigen sunt imunogene, acele părți din structura unui antigen care interacționează specific cu situsuri combinative de pe moleculele implicate în răspunsul imun, respectiv anticorpii sau receptorii TRC. Aceste fragmente antigenice se numesc epitopi
Fig. nr. 3.4. Procesul infecțios și răspunsul imun celular și umoral, la Apis mellifera (aspect general, original).
I.3.3. Receptorii de antigen
Pentru ca sistemul imun să fie eficient, microorganismele patogene trebuie să fie recunoscute. Recunoașterea acestora este realizată prin receptorii specifici, prezenți în hemolimfă sau pe membrana și în citoplasma hemocitelor sau al altor celule (tabel. I.3.1).
Tabel nr. I.3.1. Familiile de gene implicate în recunoașterea Ag la unele insecte (după Cristophides și colab., 2002, 2004, citați de Evans D.J. și colab.,2006)
Receptorii din hemolimfă sunt: receptorul lipopolizaharide-proteine (LPS-proteine), receptorul pentru recunoașterea peptidoglicanului (PGRPs), receptorii pentru bacteriile gram-negative (GNBPs), receptorii pentru recunoașterea β-1,3 glucani (βGRP), iar receptorii de pe membrana și din citoplasma hemocitelor sunt croquemort = molecula de recunoaștere a celulelor moarte (omologul receptorilor macrofagici CD36 de la mamifere), molecula DSCAM (molecula celulei de aderență în sindromului Down), proteina de recunoaștere a peptidoglicanului (PGRP-LC), EATER (proteina transmembranară) și receptorii membrilor familiei Toll.
Legătura dintre antigene și receptorii de antigene este realizată de către căile (pathway) de comunicare, specifice pentru anumite răspunsuri imune (5).
I.3.4. Căile de comunicare cu organitele celulare responsabile de sinteza polipeptidelor antimicrobiene sau a citokinelor
Albinele au patru căi asociate receptorilor imunologici: Toll, IMD, JAK/STAT, JNK (5) și o cale funcțională, dar încă nedesemnată (46).
Dintre toate proteinele implicate în căile de semnalizare la Drosophila melanogaster și Anophpeles gambiae, un singur efector lipsește cu desăvârșire la Apis mellifera: ligandul nepereche de la calea JAK/STAT. Prezența receptorului de citokine domeless și a tuturor celorlalți membri ai căii de semnalizare JAK/STAT sugerează că această cale este funcțională la albina meliferă.
Tabel nr. I.3.2. Familiile de gene implicate în căile de comunicare imune la unele insecte (după Cristophides și colab., 2002, 2004, citați de Evans D.J. și colab.,2006)
I.3.4.1. Calea de semnalizare Toll
Activarea căii Toll (fig. I.3.5) are ca rezultat declanșarea unor cascade de reacții care duc la stimularea factorului nuclear NF-kB.
Heterodimerul NF-kB se găsește în stare inactivă în citoplasma celulelor, complexat cu proteina inhibitoare IkBa. Prin intermediul receptorilor de membrană, o varietate de semnale extracelulare activează enzima Kinaza IkB (IKK) care, la rândul ei, fosforilează proteina IkBa, ceea ce duce la disocierea IkBa de NF-kB și eventuala degradare a IkBa de către proteaze. NF-kB activat este apoi translocat în nucleu unde se leagă de secvențe specifice de ADN, numite elemente de răspuns (RE).
Complexul ADN/NF-kB recrutează apoi alte proteine, cum ar fi coactivatori și ARN- polimerază, care transcrie ADN în ARNm, care la rândul său, este translatat în proteină, ceea ce duce la o schimbare a funcției celulare; începe sinteza PPA și a altor proteine efectoare (44).
Așadar, receptorii căii Toll duc la degradarea inhibitorilor (Cactus și Caudal) și translocarea factorilor DIF și Dorsal în nucleu. KappaB nuclear (NF°B) transcriu apoi, în nucleu, peptidele antimicrobiene (9).
Componentele intracelulare Tollip, Pellino, Cactin și receptorul TNF asociat factorului 2 (TRAF-2) ajută la exprimarea principalilor factori cu rol în activarea căii de semnalizare Toll, fiind prezenți la Apis mellifera, Drosophila melanogaster și Anophaeles gambiae. Toți efectorii legați de calea de semnalizare Toll, prezenți la Apis mellifera participă la sinteza peptidelor antimicrobiene, fenoloxidazei și a lizozimului (trei molecule din trei gene diferite).
Fig. I.3.5: Calea Toll la A. melifera. Numele membrilor acestei căi au fost date după componentele căii Toll de la D. melanogaster, împreună cu omologii lor de la vertebrate (în paranteză). GB 18323 ș.a.m.d. = numele oficial al genelor implicate în imunitate la Apis mellifera (după Evans D.J, și colab., 2006 ) (vezi anexa 1).
I.3.4.2. Calea de semnalizare IMD
Calea de semnalizare IMD (fig. I.3.6), activată de peptidoglicani (PGRP – LC), este specifică în aparărea antimicrobiană.
Activarea căii IMD duce la clivarea inhibitorului factorului nuclear (Cactus, Caudal and Relish) și translocarea factorilor nucleari KappaB (dorsal – releated immunity factor – DIF -, Dorsal and relish) la nucleu. În nucleu, factorii nucleari KappaB activați, transcriu peptidele antimicrobiene (AMP). Calea IMD este prezentă în cea mai mare parte din celulele epiteliale ale insectelor, fiind bine conservată la albina meliferă și care are efectori pentru toate componentele imunității.
Calea de semnalizare IMD este specifică bacteriilor Gram- negative, dar și altor tipuri de peptidoglicani prezente la bacteriile Gram – pozitive [peptidoglicani de tipul acidului diaminopimelic (DAP)], și chiar la fungi. Această specificitate largă este cauzată de cele trei forme de îmbinare alternative a PGRP-LC la Drosophila melanogaster , care transportă diverse domenii de recunoaștere a peptidoglicanilor.
Pe langă activarea Relish, calea IMD mai activează și componentele căii de semnalizare JNK, iar dovezi recente arată faptul că această cale poate ține sub control sinteza peptidelor antimicrobiene prin feedback pozitiv și negativ (Wojda și col., 2004, citați de 4).
I.3.4.3. Calea JAK/STAT
Calea de semnalizare JAK/STAT (fig. I.3.7) induce sinteza complementului, proliferarea hemocitelor și stimulează acțiunea fagocitelor, fiind activată de citokine, în special ligandul UPD (proteina glicozilată extracelulară).
Efectorii imuni ai căii JAK/STAT de la albine cuprind receptorii de citokine Dom (cytokine receptor domeless), JAK tirozin kinaza (Hopscotch), factorul de transcripție STAT92E, doi factori de reglementare negativă SOCS (suppressor of cytokine signalling), PIAS (protein inhibitor of activated STAT) și două componente recent identificate, respectiv tirozin fosfataza Ptp61F (XP392429) și
WD40 – bromo- protein care conține domeniul BRWD3 (XP395263). Deși ligandul cheie (UPD) pentru calea JAK/STAT, nu a fost identificat în genomul albinei melifere, prezența receptorului omolog citokine gp130 Domeless și toți ceilalți membri ai caii de semnalizare, indică faptul că acest mecanism ar putea fi comun pentru diptere și albina meliferă (5).
I.3.4.4. Calea de semnalizare JNK
Calea de semnalizare JNK (Jun-amino-terminale kinazele) (fig. I.3.6), activată de o varietate de factori stresanți, citokine inflamatorii, factori de creștere și agoniști GPCR, este implicată în controlul expresiei unor gene AMPS, precum și în reglarea cicatrizării leziunilor și în melanizare (29).
I.3.4.5. Calea funcțională, nedesemnată are sub control sinteza de serin – proteaze, fibrinogen și citokine de semnalizare pentru receptoriii secundari B și C , prin intermediul a 40 de gene.
I.3.5. Sistemul imun înnăscut la albina meliferă
Efectorii imunității naturale sunt constituiți din structuri și funcții normale ale organismului, acțiunea lor fiind nespecifică și nediferențiată. Acești factori țin de barierele naturale externe sau interne, secrețiile glandelor, antagonismul microbian, factorii umorali și celulari sau factorii constituționali și genetici cu caracter de rasă sau linie (39).
La insecte, sistemul imunitar înnăscut este format dintr-o mare varietate de mecanisme de apărare, care acționează individual sau în combinație, pentru a preveni accesul bacteriilor, virusurilor, miceților sau paraziților în organismul lor sau pentru a anihila creșterea și multiplicarea agenților patogeni, odată patrunși în corpul gazdelor (2); pe o treaptă superioară se află insectele sociale, care sunt capabile să răspundă acțiunii patogene a agresorilor fizici și biologici atât la nivel de grup, cât și individual.
I.3.5.1. Imunitatea de grup social
Comportamentul social al albinei melifere este determinat genetic. Această constatare a fost posibilă după raportarea secvenței complete a genomului albinei melifere europene de către Michel Solignac și echipa sa de la Gif – sur – Yvette, care au fost responsabili cu maparea genetică, în cadrul proiectului coordonat de George M. Weinstock și Gene E. Robinson (47).
Analiza secvenței genomului albinei melifere a scos în evidență faptul că albinele au un număr deosebit de mare de gene olfactive (în legătură directă cu recunoașterea tipurilor de flori, a feromonilor cu rol în comunicarea între albine și a apartenenței lor la colonia care le-au dat naștere) și pentru a produce lăptișorul de matcă; acest lucru reflectă comportamentul social al insectei, hrănirea și dezvoltarea larvelor și, desigur, asigurarea supraviețuirii castelor (regină și lucrătoare).
Surprinde, însă, numărul redus de gene implicate în mecanismul imunității înnăscute; viața socială a albinelor, reprezintă, într-o primă analiză, o vulnerabilitate majoră, în lupta cu agenții patogeni (48), iar prin densitatea indivizilor, microclimat și rezervele de hrană stocate, ar reprezinta un mediu atractiv pentru diverși agenți patogeni (5). Însă, colonia de albine se apără de agresori prin mijloace imune și de cooperare între grupe de indivizi. Acestea sunt reprezentate de:
peptide antimicrobiene (PPA), respectiv defensina 1, secretată de celulele epiteliale din glandele salivare (17);
bacteriile endosimbiontice obligatorii și comensale (4). Insectele sociale schimbă bacteriile simbiontice între ele, fiind benefice în lupta împotriva agenților patogeni, inclusiv în apărarea față de Paenibacillus larvae (4);
diversitatea genetică a indivizilor unei colonii (15), datorită poliandriei (24);
abundența de indivizi în colonie îmbunătățește capacitatea concurențială în utilizarea resurselor de hrană;
curățirea celulelor și încălzirea cuibului;
creșterea puietului în mediu steril;
febra socială ca răspuns la boală;
transfer de trăsături ale sistemului imun;
utilizarea compușilor antimicrobieni din natură (propolis);
diviziunea muncii în colonie pe grupe de indivizi, care are ca scop:
hrănirea puietului și a mătcii;
construirea fagurilor din materiale antimicrobiene;
asigurarea pazei și a ventilației;
culegerea polenului, nectarului și a apei.
Această diversitate de mijloace defensive, codificate genetic, fac ca virusurile, bacteriile și paraziții, să aibă suficiente obstacole de învins, până la declanșarea unei afecțiuni în familia de albine. Activitatea anti-patogenă a coloniei este cu atât mai eficientă cu cât numărul albinelor este mai mare.
I.3.5.2. Imunitatea individuală
Imunitatea înnăscută individuală a insectelor este formată din structuri și funcții normale ale organismului fiind reprezentată de:
țesuturi: exoschelet (tegument), epiteliul intestinal, excretor și traheal, corpul gras, limfonoduri;
celule: hemocitele circulante (prohemocite, plasmatocite, granulocite, cistocite, oenocitoide și adipohemocite sau sferulocite), hemocitele fixe și celulele epiteliale;
molecule: enzime și peptide, citokine, radicali de oxigen și azot;
functii: fagocitoza, multiplicarea celulară, capsulogeneza, granulogeneza, melanogeneza, sincițializarea.
I.3.5.2.1. Barierele naturale cu rol protector
Barierele naturale cu rol protector sunt formate din tegument și epiteliile
aparatelor digestiv, excretor, respirator, precum și de flora microbiană normală cantonată la nivelul acestor epitelii.
Tegumentul protejează albinele prin duritate și impermeabilitate. La multe insecte, dar și la albine, tegumentul elaborează secreții cu rol antiinfecțios (4, 23).
Epiteliul intestinal, excretor și traheal fac parte din sistemul de apărare imună în țesuturile epiteliale.
Contactul cel mai strâns dintre insecte și agenții patogeni se realizează la nivelul epiteliilor de acoperire ale tractului intestinal, ale aparatului excretor și ale căilor respiratorii, cel mai vulnerabil fiind însă epiteliul tractului digestiv (9).
Stomacul reprezintă o barieră importantă împotriva agenților patogeni prin protecție mecanică (epiteliul ciliat, membrana peritrofică și peretele intestinal), fiziologică (aciditatea sucului și peristaltismul intestinal) și imună ( lizozimul, PPA și ROS). Funcția imună este potențată prin cooperarea cu flora comensală, iar activarea anumitor reacții ale sistemului imun depind de microorganismele patogene sau comensale prezente sau nu în intestin.
Investigațiile efectuate prin microscopia fluorescentă cu bacterii Gram- negative (Erwinia carotovora) pe larvele și pe adulții insectei Drosophila melanogaster, au relevat faptul că răspunsul imun în intestin este reglementat de căile de semnalizare IMD, JAK/STAT și mai puțin calea Toll (29). Aceste căi induc sinteza PAM (dipericin, cecropin și metchnikowin) la nivelul epiteliului intestinal, iar în tubii Malpighi, este sintetizat în plus oxidul nitric (NO) (29). În epiteliul tubilor Malpighi, sub impulsul fragmentului dizaharid-tetrapeptida din PGN al TCT (citotoxina traheală), este indusă expresia genelor PGRPs și PGRP-LE (30), care inițiază apărarea imună locală.
Rolul corpului gras și al limfonodurilor în apărarea imună este prezentat în cap. I.1. , sucapitolul “Țesutul hematopoetic și hematopoeza”.
I.3.5.2.2. Flora intestinală normală și patogenă la insecte
Raporturile dintre insecte și bacterii, la nivelul tubului digestiv, sunt de natură simbiontică primară , comensală și patogenă (9, 3); se stabilesc relații de conviețuire mutuale, de acceptare reciprocă, în beneficiul ambilor parteneri, sau antagonice, prin afectarea diferitelor funcții biologice ale gazdei (2).
Bacteriile simbiontice trăiesc sub presiunea unui sistem imun activ, și prin urmare, elaborează mecanisme de apărare față de efectorii imunității organismelor gazdă. Pe de altă parte, efectul expunerii permanente, în toate fazele dezvoltării insectei, la acțiunea antigenică a bacteriilor simbionte, întărește sistemul imunitar al insectelor în lupta cu agenții patogeni (3).
Relația dintre insecte și bacterii este co-dependentă. Asociațiile bacteriene din insecte sunt implicate în degradarea materialelor vegetale și alte alimente, reglarea pH-lui, sinteza vitaminelor, și în cazuri relativ rare, inducerea bolii, iar insectele sociale oferă resurse unice pentru simbionții microbieni datorită densității mari de indivizi din cadrul coloniilor, schimbului de alimente și alte resurse, precum și coexistența mai multe generații de membri ai coloniei (4).
Trebuie să menționăm că bacteriile endosimbiontice ale insectelor nu sunt recunoscute oficial ca taxoni distincți în cadrul Enterobacteriaceaelor. Din această categorie de bacterii fac parte genurile Sodalis, Buchnera, Wigglesworthia, Baumannia și Blochmannia (43).
I.3.5.2.2.1. Endosimbionții primari (ereditari) sunt transmiși vertical de la mamă la pui și le oferă gazdelor compuși nutriționali specifici, care sunt esențiali pentru supraviețuirea și dezvoltarea lor. Aceste bacterii au fost descrise la multe specii de insecte.
Gillianella apicola și Snodgrassella alvi sunt bacterii endosimbiontice ale Apis mellifera și ai bondarilor (Bombus spp.). Prima este o bacterie de fermentație zaharolitică, iar a doua un oxidant al acizilor carboxilici. Aceste bacterii au nișe metabolice diferite, formând o rețea sintrofică pentru împărțirea resurselor metabolice. Ambele specii posedă numeroase gene care mediază interacțiunile celulă – celulă și colonizarea intestinului. Specificitatea de gazdă este determinată de mai mulți factori, inclusiv interacțiunea dintre gazdă – microbi, microb – microb și transmisie socială (3).
Bacteria Buchnera aphidicola, endosimbiont al păduchelui de mazăre (Acyrthosiphon pisum), sintetizează aminoacizii esențiali necesari afidelor și care nu se găsesc în seva plantelor, iar bacteria Wigglesworthia glossinidia, endosimbiont al muștei țețe (Glossina morsitans), îi sintetizează acesteia vitaminele esențiale care nu sunt prezente în sângele vertebratelor. În aceste cazuri, relația simbiontică, este obligatorie (2).
I.3.5.2.2.2. Endosimbionții secundari sau comensali pot fi transmiși orizontal, vertical sau prin intermediul vectorilor și trăiesc în hemocelul insectelor. Relațiile comensale au fost stabilite mai târziu, în cadrul evoluției lor filogenetice. Primul endosimbiont comensal descoperit a fost bacteria Sodalis glossinidius din musca țețe, transmisă vertical, și trăiește intra- și extracelular, în diferite țesuturi ale gazdei.
Bacteriile comensale activează sinteza minimă de peptide antimicrobiene (AMP), specii reactive de oxigen (ROS) și specii reactive de nitrogen (RNS), asigurând protecția intestinului împotriva agenților patogeni. În cazul unor agenți patogeni cu virulență mare, echilibrul între flora comensală și microorganismele patogene (virusuri, bacterii, fungi sau paraziți) se menține prin activarea puternică a sintezei de AMP, ROS și RNS (9).Acești radicali de oxigen și de azot au proprietăți antibacteriene și antiparazitare puternice (fig. I.3.7).
Albinele sunt colonizate de o mare diversitate de bacterii, însă foarte puține sunt patogene. Izolatele recente de la albinele adulte indică prezența a zeci de taxoni bacterieni, care variază de la bacterii Gram – pozitive la alfa-, beta- și gama – proteobacterii (tabel nr. I.3.3). În timp ce câteva specii bacteriene sunt în mod clar patogene, cele mai multe nu au fost asociate cu vreo boală a albinelor, iar impactul lor reciproc sau asupra gazdelor este necunoscut (4).
Cele mai întâlnite bacterii comensale, la albine, sunt Wolbachia și Spiroplasma; Wolbachia spp. este foarte răspândită la albinele rasei Apis mellifera carnica din Bremen, Germania, fiind endemică la albina lucrătoare (13). Aceste bacterii interferează capacitatea reproductivă a gazdei prin inducerea partenogenezei, uciderea masculilor, feminizarea și crearea de incompatibilități citoplasmatice între celulele sexuale masculine și feminine (2). Efectele supresoare ale bacteriilor sunt contracarate prin diverse mijloace individuale sau de grup, cum sunt efectul de ecranare a simbionților bacterieni sau modularea expresiei unor gene care influențează în mod activ fiziologia intestinului insectei (9).
Experiențele efectuate cu bacteriile simbiotice au relevant și efecte antagonice cu bacteriile patogene și miceți (4, 30). Astfel, din intestinul albinelor au fost izolate 43 de specii de bacterii simbiontice, care au fost cultivate împreună cu Paenibacillus larvae și s-a observat că unele bacterii au acțiune bacteriostatică. Aceste bacterii sunt:
• Acinetobacter;
• Bacillus cereus;
• Lysinbacillus fusiformis;
• Brevibacillus formosus;
• Stenotrophomonas maltophilia (4).
Fig. I.3.7. Rolul florei bacteriene comensale și patogene în homeostazia intestinului la insecte (după Garcia și colab., 2010).
Legendă:
A). bacteriile comensale activează producția minimală de ROS și RNS;
B). bacteriile patogene și paraziții determină sinteza unor cantități mai mari de ROS și RNS
În altă experiență, Omar M. O. Mohamed și colab. (2014), au izolat de la albinele aparținând rasei Apis mellifera carnica, șase tulpini bacteriene (Bacillus subtilis, patru tulpini și Pseudomonas fluorescens, două tulpini) și șase tulpini ale micetului Ascosphaera apis. Bacteriile au fost identificate pe baza caracterelor morfologice, tinctoriale și ARNr, secvența 165, iar tulpinile fungice pe baza morfologiei și a ARN-ului ribosomal, secvența 5.85. Testele in vivo și in vitro au evidențiat inhibarea creșterii fungilor, în mod diferențiat, în funcție de tulpină, însă ambele specii de bacterii au activitate antifungică.
Rezultatele obținute în cele două experiențe oferă un mecanism nou de apărare împotriva agenților patogeni, pentru insectele sociale, precum și punctual de plecare pentru o strategie de control în loca americană și ascosferoză (4).
Tabel nr. I.3.3. Tipurile bacteriene din intestinul albinei melifere (după Ronberg, A. și colab, 2012).
I.3.6. Imunitatea celulară, umorală și tisulară
I.3.6.1. Imunitatea celulară
Imunitatea celulară înnăscută a insectelor, este realizată de hemocitele circulante și include fagocitoza, agregarea hemocitelor, încapsularea agentului patogen (granulogeneza) și sincițializarea, iar mediatorii acestor procese sunt profenoloxidaza (PPO), metaboliții oxigenați ai acidului arahidonic (eicosanoizii) și factorul de activare al plachetelor sanguine (PAF), imunitatea celulară fiind specifică fiecărui agent patogen și asemănătoare la diferite specii de insecte.
Fig. 3.8. Morfogeneza granulomului infecțios (după Jimenez și Bande, 2013, modificat de noi).
I.3.6.1.1. Fagocitoza este un proces prin care hemocitele recunosc, înglobează și lizează agentul patogen, fiind mediată de două proteine transmembranare, respectiv Eater și Nimrod (34, 25).
I.3.6.1.2. Agregarea hemocitelor este un mijloc de izolare și inactivare a agenților patogeni, fiind realizată sub impulsul citokinelor eliberate în hemolimfă de celule specializate, sensibilizate de factorii căilor de semnalizare Toll și IMD.
I.3.6.1.3. Hipertrofia celulară se întâlnește în infecțiile cu protozoare intracelulare (nosemoză, gregarinoză) când pătrunderea și dezvoltarea formelor invazionale în enterocite, produce creșterea în volum a celulelor parazitate (34).
I.3.6.1.4. Granulogeneza este următorul pas în acțiunea de anihilare a agenților patogeni de către organismul gazdă, prin inițierea și constituirea unui înveliș, în jurul virusurilor, bacteriilor, miceților, paraziților sau corpurilor străine, format din celule și fibre conjunctive (34). Granulomul, în mărime de >10 µm, este format din hemocite, în special granulocite și plasmatocite, plasate în jurul agenților patogeni. La exterior, granulomul matur este înconjurat de o capsulă fibroasă.
Din punct de vedere morfologic granuloamele poat fi diferențiate în granulom compact infecțios (fig. I.3.8), parazitar (fig. I.3.3) sau de corp străin.
I.3.6.1.5. Sincițializarea este un proces de unire a unui grup de celule animale în care citoplasma își menține continuitatea. Prin sincițializare iau naștere celulele gigante. Acestea sunt de două tipuri: celule gigante de tip Langhans și celule gigante de corp străin. Primele sunt întâlnite în bolile infecțioase, iar secundele în bolile parazitare și în procesele de necroză și resorbție (27).
Rolul mediatorilor proceselor imune celulare va fi tratat, pe larg, mai jos.
I.3.6.2. Imunitatea umorală
Imunitatea umorală înnăscută la albine este legată de receptorii de antigen. Aceștia sunt prezenți pe membranele și în citoplasma celulelor epiteliale și a hemocitelor. Receptorii de antigen sunt asociați unor căi (pathway) de comunicare cu genele responsabile de sinteza efectorilor umorali ai imunității. Fiecare cale asociată receptorilor de antigen este specializată pentru un anumit tip de molecule purtătoare de specificitate antigenică.
Activarea sintezei de peptide antimicrobiene în celulele imunologic active din epitelii, organe și corpul gras are loc prin intermediul căilor Toll, IMD și JAK/STAT (Janus kinaza/semnal traductor și activator al transcriptazei). Căile de activare Toll și IMD răspund la semnalele antigenice venite de la bacteriile Gram-pozitive și Gram-negative, precum și de la fungi, iar calea JAK/STAT, specifică și mamiferelor, activează producția de peptide antimicrobiene în corpul gras (echivalentul ficatului de la mamifere). Leulier și Rozet, (2009) (citați de 9), descriu o rețea de gene de reglementare care controlează activarea unor reacții imune implicate în sinteza peptidelor antimicrobiene (AMP), specii reactive de oxigen (ROS), specii reactive ale azotului (RNS) sau intermediarii acestora (tabel nr. I.3.4).
I.3.6.2.1.Efectorii imunității umorale
Efectorii imunității umorale sunt peptidele antimicrobiene (PPA), fenoloxidaza (PO), speciile reactive de oxigen (ROS), speciile reactive de azot (RNS), lizozimul și proteinele ce conțin tiolester (CET).
I.3.6.2.1.1. Peptidele antimicrobiene
La albine sunt șase peptide antimicrobiene (tabel nr. I.3.5), în timp ce la Drosophila melanogaster, au fost identificate 20, iar la Anophpeles gambiae nouă. Două dintre PPA, respectiv abaecina și apidaecina, fac parte din clasa de peptide antimicrobiene bogate în prolină, două sunt defensine convenționale și două (apisimin și hymenoptaecin) sunt distincte față de toate celelalte PPA recunoscute.
Analiza genomică arată că gena care codifică polipeptida apidaecin constă dintr-un conservant N-terminal, urmat de mai mulți exoni, fiecare codificând o peptidă completă 28-amino acid.
Tabel nr. I.3.4. Familiile de gene efectoare implicate în imunitatea unor insecte (după Cristophides și colab., 2002, 2004, citați de Evans D.J. și colab.,2006)
Această genă și ADN-complementar (ADNc) au fost utilizați pentru descrierea mecanismului de sinteză a PPA ca răspuns la atacul bacterian. Structura genomică a apidaecinei oferă posibilitatea descoperirii unui mecanism ce ar putea genera răspuns specific la agenți patogeni variați. Deoarece fiecare exon este o peptidă antimicrobiană funcțională și distinctă, nu este exclus ca variația de îmbinare din acest loc să determine transformarea acestei gene în efectori imun. Exonii apidaecin diferă foarte mult de la o albină la alta, atât ca număr cât și ca secvență a aminoacizilor codificați.
Cu excepția defensinei-2, toate PPA de la albine, au fost caracterizate prin secvențierea proteinei. Cinci, din cele șase PPA, sunt sub controlul diverselor provocări imune.
Metodele de secvențiere a genomului la Drosophila a permis descrierea genelor implicate în apărarea imună și caracterizarea peptidelor antimicrobiene (PPA). Acestea sunt mici, au sarcină cationică și structuri diferite. Sunt eliberate în hemolimfă în timpul infecției. Principala sursă de PPA este glanda hipofaringiană, dar și celulele epiteliilor, precum și unele organe interne. Cele mai multe PPA sunt defensinele care acționează în principal asupra bacteriilor Gram- pozitive. Cecropinele au un spectru larg de acțiune, dar sunt mai eficiente asupra bacteriilor Gram- negative. Sunt și alte tipuri de PPA, cum ar fi atacinele, diptericinele, drosocinele și drosomicinele. Aceste peptide antimicrobiene acționează asupra membranelor celulare ale bacteriilor prin modificarea permeabilității acestora sau prin distrugeri la nivelul organitelor citoplasmatice, după penetrarea membranei celulei bacteriene.
Tabel nr. I.3.5. Polipeptidele antimicrobiene la Apis mellifera (original)
I.3.6.2.1.2.. Fenoloxidaza
Fenoloxidaza (fig. I.3.2) se găsește în organismul animal ca precursor de profenoloxidază (PPO), fiind un actor important al apărării umorale la insecte. Însă, pentru a acționa în procesul imun, PPO trebuie să fie transformată în PO pe cale enzimatică (clivajul proteolitic).
Cascada de activare a PPO este reglementată de inhibitori ai serin-proteazei din plasmă (inclusiv de membrii Superfamiliei Serpinelor) și fenoloxidaza (PO) activă, acest proces fiind inhibat direct de factorii proteici din hemolimfă. Inhibitorii activării PPO sunt esențiali pentru că PO are potențial toxic ridicat pentru gazdă (10).
Acești compuși sunt precursori ai polimerului melanină, care este depus pe suprafața paraziților încapsulați, în granuloamele formate de hemocite și la nivelul leziunilor tisulare.
Melanizarea granuloamelor, dependentă de metabolismul tirozinei (fig. I.3.10), deși în unele cazuri, nu este relevantă pentru anihilarea unei infecții, este importantă pentru izolarea agenților patogeni.
Albinele posedă o singură genă profenoloxidază (proPO), comparativ cu trei și nouă la Drosophila și, respectiv Anopheles. Ca la majoritatea genelor proPO, și genei proPO de la albine îi lipsește o peptidă de semnalizare și are secvența consens a NRFG în jurul locului de activare. Codarea genei proPO este exprimată mai puternic la puietul de albine (larve și pupe).
I.3.6.2.1.3. Lizozimul
În genomul albinelor există doar trei lizozime, din care două de tipul C- (chicken) și unul de tipul i-(invertebrate).
Lizozimul și peptidele hemolimfei, cele mai active în infecțiile bacteriene, sunt inactive în invazia fungică.
I.3.6.2.1.4. Tiolester de complement
Proteinele ce conțin tiolester (CET), din genomul albinelor sunt în număr de patru, mult mai puține față de cele de la muște (15 la Anopheles și șase la Drosophila).
Proteinele CET sunt induse de infecții; la țânțari inițiază fagocitoza, iar la vertebrate joacă un rol central în imunitatea înnăscută ca factori ai complementului. La insecte, membrii acestui grup au rol în recunoașterea non-selfului și ca efectori (opsonine) (47).
I.3.6.2.1.5. Speciile reactive de oxigen și de azot
Țânțarul Anopheles stephensi , vector natural al protozoarului Plasmodium spp., limitează dezvoltarea parazitului în organismul său prin sinteza de oxid nitric (NO).
Sinteza NO are loc în intestinul mediu, imediat după invazia protozoarului, odată cu prânzul infectant, și se află sub controlul genei NOS. Este bine să menționăm că raportul nitrit/nitrați din hemolimfă cât și produsele de sinteză NO sunt mai mari la țânțarii infectați cu Plasmodium, iar tratamentul cu N-NITRO-l-arginină metilester asupra genei NOS, crește semnificativ numărul de paraziți în țânțarii infectați.
Genele ce codifică sinteza DOUX țin sub control producția de ROS, sub impulsul PAMPs – ului bacteriilor comensale și a microorganismmelor patogene.
Producția de ROS și RNS este dependentă de potențialul patogen al florei bacteriene intestinale sau din hemolimfă (fig. I.3.11.; I.3.12).
Aceste mecanisme de control coordonează distrugerea eficientă a microorganismelor patogene și protejează bacteriile comensale de acțiunea litică a radicalilor de oxigen și de azot.
Fig. I.3.10. Sinteza melaninei si a citotoxinelor,
granulogeneza (după Garcia, S.E. și col., 2009)
Fig. nr. I.3.11. Ipoteza homeostaziei intestinale la Triatominae (după Garcia și colab., 2010).
Legendă: Agenții patogeni, prin PAMPs (GPI, LPS, PGN, LTA , βGLU), sunt recunoscuți de receptorii căilor Toll și IMD din membranele celulelor epiteliale ale intestinului. De aici, sunt transmise semnale chimice către genele responsabile cu sinteza și eliberarea PAM în intestin și în hemocel. Concomitent, are loc activarea NAPDH, NOX și DUOX care declanșează sinteza ROS și RNS. NO din hemocel poate acționa ca molecule de semnalizare care induc răspunsul imun în hemocite și corpul gras. Cascada proPO poate, de asemenea, activa celulele epiteliale din lumenul intestinal și poate iniția melanizarea micoorganismelor patogene. Catepsinele și lizozimul, prin activare, pot fi implicate în liza microorganismelor (9).
Activarea phenoloxidazei este realizată de mai multe proteine (serin-proteaza, PPO, zimogenul și inhibitori de protează) fiind inițiată de recunoașterea PAMPs care duce la declanșarea cascadei serin-proteazei. Aceasta catalizează apoi oxidarea tirozinei la dihidroxifenilalanina (DOPA), care este ulterior oxidată în dopaquinonă , dopamină, chinonă și 5,6-dihidroxiindol și care au activitate antibacteriană foarte puternică.
I.3.6.3. Imunitatea tisulară
Procese reactive tisulare, în apărarea imună înnăscută, se întâlnesc și la insecte, fiind reprezentate de metaplazie, atrofie și hiperplazie (34).
I.3.6.3.1. Metaplazia este un proces de adaptare al țesuturilor la acțiunea patogenă a unor protozoare și constă în transformarea unui țesut de bază în altul diferit (34). Se întâlnește în parazitismul cu Malpighamoeba mellificae și cu Nosema spp., în care epiteliul cilindric se transform în epiteliu pavimentos.
I.3.6.3.2. Atrofia este un proces de reducere a volumului unui țesut (34). Se întâlnește în glandele hipofaringiene și în corpul gras în infecțiile cu Nosema ceranae.
I.3.6.3.3. Hiperplazia se caracterizează prin multiplicarea elementelor tisulare, pe fondul acțiunii iritative și toxice (34) în parazitismul cu Acarapis woodi.
I.3.6.4. Apărarea imună înnăscută în infecțiile virale, micotice, bacteriene și parazitare
I.3.6.4.1. Infecția virală induce răspuns de apărare celulară reprezentat de fagocitoză (fig. I.3.14) și uneori de granulogeneză (13); în viroze, apare și răspunsul imun inductibil (vezi imunitate dobândită). Fagocitarea virionilor de către hemocite apare în faza precoce și tardivă a bolii, atunci când sunt eliberate în hemolimfă celulele infectate cu virusuri.
I.3.6.4.2. În infecțiile micotice sau bacteriane, reacțiile imune celulare sunt însoțite de schimbări în numărul și procentul diverselor tipuri de hemocite. Are loc o diferențiere prematură a hemocitelor și concomitent, migrația chemotactică a acestora spre focarul inflamator pentru fagocitarea agenților patogeni și inițierea granulogenezei. Granulocitele sunt primele celule care ajung în preajma miceților sau bacteriilor. Ele eliberează factori chemotactici care incită multiplicarea plasmatocitelor și le atrag spre focarul inflamator.
Activarea locală a PO duce la încapsularea și melanizarea agenților patogeni (fig. I.3.9 și I.3.10), precum și la inițierea reacției de apărare celulară prin fagocitoză (în special granulocitele). PO joacă rolul complementului de la vertebrate.
I.3.6.4.3. În infecțiile cu Saccharomyces cervisiae la Rhodnius prolixus, eicosanoizii și PAF mediază răspunsul imun celular (agregarea hemocitelor în monostraturi și fagocitoza). Dintre hemocite, plasmatocitele sunt cele mai implicate. Tratarea hemocitelor cu WEB 2086, un antagonist specific al receptorilor PAF, duce la scăderea fagocitozei și a formării monostratului celular.
La D. melanogaster fagocitoza este realizată, în principal de plasmatocite, în timp ce agregarea și încapsularea este realizată de lamelocite. Lamelocitele se atașează, sechestrează și apoi inactivează microorganismele patogene prin asfixie sau liză și prin implicarea radicalilor liberi.
I.3.6.4.4. În infecțiile parazitare, microagregarea hemocitelor și fagocitoza sunt mediate de eicosanoizi și PAF. Experimențele efectuate de Garcia și col., 2004 (citat de 9) relevă că inhibarea biosintezei eicosanoizilor cu dexametazonă, afectează puternic microagregarea hemocitelor și activarea sistemului PPO, în paralel cu creșterea numărului de paraziți în hemolimfă și a letalității insectelor infectate cu epimastigoți. Însă, inocularea acidului arahidonic în hemocel duc la atenuarea efectului patogen al paraziților, fapt ce sugerează că eicosanoizii și PAF mediază reacțiile imune celulare. Pentru evidențierea răspunsului imun al insectelor la acțiunea patogenă a protozoarelor vom prezenta rezultatele unor experiențe efectuate pe flagelatul Trypanosoma rangeli, care prezintă forme infecțioase numai la insectele genului Rhodnius. Rhodnius prolixus aparține subfamiliei Triatominae, familia Reduviidae.
T. rangeli trebuie să supraviețuiască în intestin și să traverseze peretele intestinal pentru a ajunge în glandele salivare ale insectei Rhodnius prolixus. Depășirea barierei intestinale este facilitată de factorii proprii hemolitici și de lectine. Odata ajunse în hemocel tripanosomele trebuie să treacă de sistemul imun al insectei Rhodnius prolixus, format din lizozimul cu acțiune tripanolitică, factorii de activare ai PPO, fagocitoza, microagregarea hemocitară, producția de superoxid și oxid nitric (fig. I.3.9) și o proteină tripanolitică specifică: Whitten și colab., 2001 (citat de 10) arată că liza epimastigoților de Trypanosoma rangeli poate fi realizată de radicalii de nitrat (oxid nitric și superoxid) prin transmiterea semnalului antigenic la gena responsabilă cu sinteza acestora, respectiv NOS. Efectul litic al radicalilor de nitrat asupra epimastigoților la insectele Rhodnius prolixus se manifestă puternic în hemolimfă și în corpul gras sub impulsul LPS parazitare, în timp ce la nivelul intestinului acțiunea NO este nesemnificativă (10), iar Mello și colab., 1995 (citat de 10) au observat că după inocularea în hemocelul insectei Rhodnius prolixus de epimastigoți de T. rangeli, aceștia se multiplică accelerat, de mai multe ori, în timpul stagiului extracelular și interferează activarea sistemului prophenoloxidazei (PPO).
Trypanosoma rangeli nu induce sinteza de peptide antimicrobiene cu acțiune tripanolitică. Crește însă cantitatea de lizozim și activitatea unei lectine legată de galactoză, cu rol în anihilarea tripanosomelor prin formarea de monostraturi de hemocite din hemolimfă, în jurul grupurilor de paraziți.
Rezumând, infecția cu T. rangeli inhibă acțiunea PLA2 , astfel că sinteza de PAF și eicosanoizi se reduce, încât imunitatea celulară este aproape abolită. Același proces are loc și cu efectorii imunității umorale: scad PO, producția de superoxid și oxizi nitrici (nitrați și nitrit), iar datele despre sinteza PPA sunt incomplete (10).
Fig. nr. I.3.12. Producția principalelor specii reactive de oxigen (ROS) și a speciilor reactive de nitrogen (RNS) (după Garcia și colab., 2010).
Legendă:
NOX (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase) și DUOX (dual oxidaza) clivează molecula de oxigen (O2) în anion superoxid (O2‾), care reacționează cu H și formează peroxidul de hidrogen (H2O2) sub acțiunea SOD (superoxid dismutaza). Apoi, H2O2 este hidrolizat rezultând radicalul de hidroxil (OH). Genele care codifică sinteza DOUX țin sub control producția de ROS, sub impulsul PAMPs – ului bacteriilor comensale și a microorganismmelor patogene. Aceste mecanisme de control coordonează distrugerea eficientă a microorganismelor patogene și protejează bacteriile comensale de acțiunea litică a radicalilor de oxigen și azot.
RNS sunt produși prin activarea NOS (nitric oxide sinthase), care clivează RNH2 (guanidine nitrogen of L-arginine) cu obținerea oxidului nitric (·NO) care reacționează cu formarea de nitrat (NO2) și de azotat (NO2+); O2‾ și (·NO) pot reacționa între ei cu producerea OONO‾ (peroxynitrite) și acid peroxynitrous (OONOH). După Folez și O'Farrell, 2003 (citat de 8), RNS au rol important în inducția sintezei de AMPS în corpul gras al insectei; bacteriile intestinale activează NOS, care eliberează NO în hemocel. La rândul său, NO acționează ca o moleculă de semnalizare pentru hemocite și de aici în organele hematopoietice pentru sinteza peptidelor antimicrobiene (9).
I.3.7.Imunitatea dobândită
Imunitatea dobandită este starea de rezistență a organismului față de factorii “non-self” antigenici, realizată prin structuri de neoformație, cu un înalt grad de specificitate pentru antigen. Imunitatea dobândită are caracter individual, filogenetic apare la vertebrate, momentul apariției este independent de dezvoltarea ontogenetică, nu este ereditară, efectorii sunt imunoglobuline și celule (limfocite reactive sau specific sensibilizate și alte tipuri de celule) cu activitate specifică și diferențiată în funcție de antigen, iar în determinismul acestui tip de imunitate sunt implicate mecanisme de memorie (39).
Imunitatea dobândită apare după transferul de efectori imuni (imunitate dobândită pasiv) sau de antigene (imunitate dobândită activ).
Efectorii imuni iau naștere sub impulsul antigenelor (epitopi) moleculare prezente în structura microorganismelor patogene (LPS, peptidoglicani etc.), în cazul imunității dobândite activ sau pot fi transferați de la un animal imun la altul sensibil, în cazul imunității pasive.
Imunitatea dobândită, activ sau pasiv, este cunoscută foarte bine la vertebrate. În schimb, la insecte, nu a fost acceptată posibilitatea existenței imunității dobândite, până cînd nu au început să apară dovezi în acest sens. Datele existente la ora actuală, probează că și la insecte se poate vorbi de un răspuns imun dobândit pasiv și/sau activ ( 32, 18).
Acest proces este posibil prin amorsarea imună trans-generație (TGIP = Trans-generational immune priming) și prin răspuns imun anamnestic, în cazurile unor infecții repetate (32).
Mecanismele implicate în transferul și/sau sinteza proteinelor antimicrobiene și transformarea celulelor progenitoare în efectori ai imunității sunt legate de factorii epigenetici (14).
Fenomenele biochimice care permit acidului dezoxiribonucleic (ADN) să se exprime într-o manieră diferită, grație activării și reprimării anumitor gene, dar fără a provoca la nivelul secvenței genice modificări ireversibile, sunt definite ca mecanisme epigenetice (16, 49). Aceste modificări sunt produse la nivelul histonelor prin adăugarea grupărilor metil, fosfat, acetil sau ubicuitina. Procesele de metilare ale histonelor activează sau inactivează genele, în funcție de locul din moleculă unde este adăugat grupul metil, iar prin acetilare are loc, preponderant, activarea genelor (50).
I.3.7.1. Imunitatea dobândită pasiv este caracteristică nou-născuților, care primesc anticorpi (Ig) de la mamă, prenatal sau/și postnatal și la animalele cărora li se tranferă efectorii imuni pe căi naturale sau parenterale.
I.3.7.2. Imunitatea dobândită activ se întâlnește la animalele mature din punct de vedere imunologic, după un contact întâmplător sau voit cu un antigen.
Fig. I.3.13. Mecanismul transferului de epitopi din intestine în corpul gras și din corpul gras în ovocit, la Apis mellifera (prelucrare după Salamela Heli, Amdam V. Gro și Freitak Dalial, 2015).
Legendă: a) bacterii; b) proteină de transport sau CPA; c) epitop (Ag I); d) complex Ag-proteină de transport din intestin în corpul gras; e) vitelus (VTS); f) complex VTS-Ag; g) migrarea transmembranară a complexului VTS-Ag în ovocite; Ag II = infecție; PPA = polipeptide antimicrobiene.
Amorsarea imună trans-generație (TGIP) atribuită inițial vertebratelor, este acum dovedită științific și la nevertebrate. Experiențele care au precedat această descoperire au relevat că atât microorganismele patogene, cât și cele nepatogene, prin epitopii lor, declanșează răspuns imun anamnestic al larvelor care provin din femele care au fost expuse, înainte de pontă, la infecția cu aceleași antigene. De exemplu, creșterea titrului de PPA, la generația următoare, se produce după inocularea femelelor adulte ale insectei Tenebrio molitor cu lipopolizaharide bacteriene (LPS), iar inocularea larvelor gândacului roșu de făină (Tribolium castaneum) cu Bacillus thurngiensis a dus la activarea răspunsului imun specific TGIP (32). Freitak și colab., 2009 (citați de 32) au demonstrat că la contactul femelelor lupului verzei (Trichoplusia ni) cu bacterii nepatogene se obține un răspuns imun crescut la generația următoare. La Manduca sexta, sistemul imunitar embrionar este activat după inocularea unor antigene în ouă, iar creșterea rezistenței larvelor față de Paenibacillus larvae a fost obținută după inocularea mătcilor albinei melifere (Apis mellifera) cu Paenibacillus larvae inactivat (32).
TGIP a fost demonstrat și la Galleria mellonella prin hrănirea larvelor acestei molii cu unele bacterii nepatogene sau patogene, respectiv Pseudomonas entomophila și Seratia entomophila. Această proces a dus la creșterea activității lizozimului și a fenoloxidazei în hemolimfa larvelor provenite din ouăle femelelor adulte provenite din larvele hrănite cu bacterii, precum și la exprimarea genelor care codifică sinteza de proteine antimicrobiene în ouăle depuse de moliile de sex femel, rezultate din aceleași larve. Pentru a putea fi urmărit traseul epitopilor în organismul larvelor, bacteriile au fost tratate cu substanșe fluorescente; acestea au traversat epiteliul intestinal, au ajuns în hemolimfă, după care s-au acumulat în ovocitele ovarelor ( 6).
Mai multe studii au aratat ca amorsarea imună poate persista chiar și în generația următoare. Există tot mai multe dovezi că răspunsurile imune ale insectelor au specificitate în raport cu agentul patogen cu care se confruntă, iar factorii adjuvanți, cum sunt alimentele, bacteriile comensale și interacțiunile sociale pot afecta imunitatea insectelor. Astfel, efectele TGIP asupra imunității puilor, sunt modelate de o serie de factori și, prin urmare, descendenții insectelor imunizate în perioada dezvoltării ontogenetice, sunt capabile să-și ajusteze răspunsurul imun la acțiunea parazitoizilor și ale agenților patogeni în funcție de vârsta lor, riscurile și condițiile de mediu în care trăiesc (35).
De asemeni, datorită costurilor energetice, numărul de ouă protejate de TGIP este limitat, fiind invers proporțional cu numărul de ouă produse, în vederea protejării eficiente a urmașilor. Mamele, în loc să furnizeze, în mod egal, fiecărui ou, protecție imună, insuficientă în apărarea infecțioasă, limitează transferul de efectori imuni la mai puține ouă, asigurând astfel perpetuarea speciei. Acest aspect a fost observat de Zanchi C. și colab. (2012), pe femelele gândacului Tenebrio molitor.
La Apis mellifera, TGIP este asigurată de epitopii microorganismelor patogene, care sunt transferați din lumenul intestinal în hemocel și, de aici, în corpul gras. În cele din urmă, epitopii sunt detectați în ovocitele mătcii (32). În acest fel, mama (regina) își ‘’vaccinează puii’’, aceștia fiind pregătiți să declanșeze apărarea imună celulară și umorală (PPA și hemocite cu memorie imunologică), la un eventual nou contact al larvelor cu agenții infecțioși (fig. I.3.13) (32).
Aceste observații au ridicat semne de întrebare: prin ce mijloace este realizată amorsarea imună la generația următoare în lipsa anticorpilor (32) ?
Aceast aspect a fost rezolvat de Salamela Heli, Amdam V. Gro și Freitak Dalial (2015) prin descoperirea rolului vitelusului (VTS) în transferul antigenelor, din corpul gras în ovocite, la mătci, prin marcarea Ag (Paenibacillus larvae și E. coli) cu iodură de propidiu, iar a VTS cu un anticorp monoclonal conjugat cu Fluor 488. Vitelusul se comportă ca un mijloc de transport care are atașat la remorcă epitopii agenților patogeni. Aceștia au fost urmăriți, etapizat, până la nivelul ovocitului. În ovocit, probabil că receptorii de antigen activează calea Toll sau IMD, după care, în stadiul larvar, este declanșată sinteza de PPA și diferențierea prohemocitelor în fagocite, la un nou contact cu antigenele transportate de vitelus.
În infecțiile virale, Deddouche și col., 2008 și Dostert și col., 2005 (citați de 29), susțin că răspunsul imun inductibil este tributar domeniului Dicer2, component al ARNi, iar receptorii implicați în recunoașterea antigenelor virale fac parte din căile de semnalizare Tol și JAK/STAT (fig. I.3.14).
Fig. I.3.14. Imunitatea în infecțiile virale.
Stânga: Evoluția infecțiilor virale realizate prin endocitoză sau prin replicarea virusului în celulele infectate depinde de factorii celulari endogeni ai gazdei lor (reprezentat în verde). Multe virusuri depind de producția de ARNds pentru replicare. Mijloacele inhibitorii ale gazdei, reprezentate de ARNi, compus din Dicer-2 (Dcr-2) și cofactorul său R2D2, duc la scindarea ARNds viral în siARNs. Acesta este ulterior încorporat în AGO2, component al complexului RISC, care are rolul distrugerii secvențelor identice cu ARN-ul viral (în albastru). Răspunsul de apărare imediată antivirală este realizat prin codarea componentelor inhibitorii ale ARNi (în roșu). Unele infecții virale, duc, de asemenea, la activarea căii de semnalizare Toll, însă nu se cunosc reacțiile în cascadă care duc la activarea NF-kB și apoi a genei antivirale DIF (în albastru). O ipoteză recentă, presupune că gruparea amino-terminală din DexD/H a domeniului Dicer2 este implicată în răspunsul antiviral inductibil, acest proces sugerând o legătură între acestea și ARNi (Deddouche și col., 2008).
Dreapta: celule neinfectate. Celulele pot produce și elibera factori antivirali, însă mijloacele prin care este realizat acest proces este necunoscut. Se presupune că sunt implicate mecanisme de recunoaștere a produselor virale, resturi celulare sau alți factori antivirali. Căile de semnalizare JAK/STAT și Toll au rol important în sinteza proteinelor, iar unele dintre acestea (Vago și vir-1) au proprietăți antivirale (după Deddouche și col. 2008; Dostert și col., 2005, modificat de noi).
I.3.7.3. Răspunsul imun anamnestic, în cazurile unor infecții secundare, este frecvent întâlnit la insectele sociale, în mediul lor natural. Reamorsarea activitații imune este realizată cu același tip de efectori (31), pe două căi:
persistența îndelungată a efectorilor imunității umorale și celulare specifice unui anumit tip de antigen în hemolimfă, și
sinteza de molecule antimicrobiene specifice antigenului și diferențierea din prohemocite a unor celule cu activitate de memorie fagocitară și de sechestrare celulară.
Urmând acest raționament, un grup de cercetători (21) au efectuat infectări și reinfectări pe larve de lepidoptere (Parasemia plantaginis), cu specii bacteriene de control (E. coli) și specii bacteriene patogene ( Serratia marcescens). Grupul larvelor infectate cu E. coli a înregistrat o mortalitate de 13,8% la prima inoculare și de 9,1% la inocularea a II-a, în timp ce grupul de larve inoculate cu Serratia marcescens a avut o mortalitate de 90,4% la inocularea I-a și de doar 37,4% la reinfectare. Rezultatele arată că expunerea anterioară la infecția orală cu Serratia marcescens, protejează larvele supraviețuitoare de o infecție letală la al II-lea contact cu același agent patogen.
Aceste rezultate, peste care s-au suprapus și datele oferite de investigațiile asupra efectorilor imunității, au dus la concluzia că larvele acestor lepidoptere, cu toate că au o durată de viață scurtă, rămân protejate împotriva unui agent patogen întâlnit anterior, probabil, răspunsurile imune persistente implicând radicalii liberi de oxigen.
Recent, s-a constatat că în infecția primară cu doze subletale de Streptococcus pneumoniae sau în infecția naturală cu micetul Beauveria bassiana, Drosophila melanogaster este rezistentă la o infecție ulterioară cu aceeași agenți patogeni, acest fapt persistând toată viața insectei. În acest proces de memorie imunologică intervin fagocitele, aflate sub controlul receptorilor căii Toll (29).
Studii in vitro, efectuate pe intestinul mediu al insectei Rhodnius prolixus, pentru determinarea activității antibacteriene împotriva E. coli și S. aureus, la 1 și 7 zile p.i., au arătat că în conținutul intestinal anterior, activitatea litică este mai mare ca în conținutul intestinului posterior, iar ARNm a indus sinteză crescută, la 7 zile p.i., pentru lizozim A,B,C, defensină și prolixicin, în timp ce în porțiunea posterioară a intestinului mediu a crescut sinteza de lizozim B și prolixicin. Acest fapt sugerează că Rhodnius prolixus modulează distinct expresia genelor AMP la infecția cu agenții infecțioși și depend de speciile de bacterii care produc infecțiile. Deci, expresia genelor care codifică sinteza AMP, este specifică agentului patogen (38).
Astfel de dinamică temporală față de invaziile microbiene a fost constatată și la Bombus terrestris (10). Bondarii au fost stimulați cu un elicitor imun, înregistrându-se creșterea activității PO corelată cu numărul de hemocite. Activitatea antibacteriană, pe de altă parte, nu a fost detectată imediat după infecție, dar a crescut între 2 și 24 ore de la stimulare.
Susceptibilitatea larvelor insectei Manduca sexta la infecția cu mai multe tulpini bacteriene, patogene și nepatogene, Gram negative (E. coli și Pseudomonas aeruginosa), a fost investigată de către Dunn și Drake (1983) ( citat de 11), constatând că multiplicarea unor tulpini bacteriene s-a redus semnificativ în prima oră, urmată de o a doua fază în care aceste tulpini au fost eliminate complet. Tulpinile rămase viabile și-au accelerat multiplicarea încât au dus la moartea gazdelor. În acest caz, imunitatea celulară, respectiv fagocitoza și granulogeneza, sunt responsabile de reducerea rapidă a numărului de bacterii în prima fază, pentru ca în faza a doua, să intervină imunitatea umorală, care nu este letală pentru tulpinile bacteriilor patogene.
Inocularea unor bacterii nepatogene în hemocelul larvelor de stadiul 5 (L5) ale insectei M. sexta a dus la răspuns imun mai puternic în același stadiu de dezvoltare și o mai bună supraviețuire la o infecție ulterioară cu bacterii patogene (35).
Alți cercetători, explorând capacitatea gândacului Tenebrio molitor de a inactiva o doză mare de bacterii Staphylocuccus aureus, inoculate în haemocel, au observat un clearance foarte rapid a S. aureus în prima oră. Activitatea antimicrobiană indusă, a început să crească în hemolimfa gândacilor până când cele mai multe bacterii au fost eliminate și a rămas ridicată până la 28 de zile de la infecția inițială. Aceste experiențe au arătat că funcția imună indusă târziu în infecția bacteriană este de a proteja gazda împotriva bacteriilor care au supravietuit răspunsului imun celular (11).
Explicațiile pentru răspunsul specific la reinfectare nu sunt suficiente, chiar dacă este implicată fagocitoza, controlată de receptorii căii Toll și sinteza de AMP care este posibilă prin activarea receptorilor căii Toll și ai căii IMD (fig. nr. I.3.5 și I.3.6 ).
Rămân necunoscute mecanismele prin care este activată memoria imunologică la reinfectare sau la generațiile următoare.
I.3.8. Bibliografie
1. Chmielewski M., Buczek K., Pliszczynski M. (2007): Immunity of the honey bee (Apis mellifera L.) in parasitic invasions. În: Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska Lublin – Polonia, vol. LXII(1), Sectio DD;
2. Eleftherianos I., Atri J., Accetta Julia and Castillo C. J. (2013): Endosymbiotic bacteria in insects: guardians of the immune system?. În: Front. Physiol. 10.3389/fphys. 00046;
3. Engel P., Stepanauskas R., Moran N. A. (2014): Hidden diversity in honey bee gut symbionts detected by single-cell genomics. PLOS Genet, 10 (9);
4. Evans D.J., Armstrong N. T. (2006): Antagonistic interactionsbetween honey bee bacterial symbionts and implications for disease. În: BMC Ecology, 6:4;
5. Evans D.J., Aronstein K., Chen P.Y., Hetru C., Imler L.J., Jiang H., Kanost M., Thompson J.G., Zou Z., and Hultmark D. (2006): Immune pathways and defence mechanisms in honey bees Apis mellifera. În: Insecte Mol. Biol. 15(5), 645-656;
6. Fors Lisa, Markus R., Theopold U., Hambäck P.A. (2014): Differences in cellular immune competence exolain parasitoid resistence for two coleopteran species. În: PLOS One, 9(9): e108975;
7. Freitak D., Schmidtberg H., Dickel Franziska, Lochnit G., Vogel Heiko, și Vilcinskas A. , (2014): The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Journal List Virulence, 5(4), 547-554;
8. Garcia-Garcia E., Galindo-Villegas J., Mulero V. (2015): Mucosal immunity in the gut: The non-vertebrate perspective. În: academia.edu;
9. Garcia S. E., Castro P. Daniele, Figueiredo B. Marcela, Azambja Patricia (2010): Immune homeostasis to microorganisms in the guts of triatomines (Reduviidae) – A Review. În: Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 105(5), pag. 605-610;
10. Garcia S. E., Castro P. Daniele, Figueiredo B. Marcela, Gonzales S. M., Azambja Patricia (2009): Trypanosoma rangeli: a now perspective for studyind the modulation of immune reactions of Rhodnius prolixus. În: Parasites& vectors, 2(1):33;
11. Gätschenberger H. Azzami Klara, Tautz J., Beier H. (2013): Antibacterial Immune Competence of Honey Bees (Apis mellifera) Is Adapted to Different Life Stages and Environmental Risks. În: PLOS ONE, vol. 8(6), e66415;
12. Gillespie P.J., Kanost R.M., Trenczek Tina (1997): Biological Mediators of Insect Immunity. În: Annual Rewiew of Entomology, vol. 42:611-643;
13. Gliński Z., Jarosz J. (2001): Infection and immunity in the honey bee Apis mellifera. În: Apiacta, 36(1), 12-24;
14. Hernández L. J. Schuehly W., Crailsheim K., Riessberger – Gallé U., (2014): Trans-generational immune priming in honeybees. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences;
15. Holt L. Holly, Aronstein A. Katherine and Grozinger M. Christina (2013): Chronic parasitization by Nosema microsporidia causes global expression changes in core nutritional, metabolic and behavioral pathwaya in honey bee workers (Apis mellifera). În: BMC Genimics, 14: 799;
16. Ilyasov R.A., Gaifullina L.R., Saltykova E.S., Posckryakov A.V., Nicolaenko A.G. (2014): Defensis in the honeybee antiinfections protection. În: Journal of Evolutionary biochemistry and Physiology, vol. 49(1);
17. Iordache F., (2013): Mecanisme epigenetice implicate în diferențierea
celulelor stem. Teză de doctorat, Academia Română, Institutul de Biologie și Patologie Celulară “Nicolae Simionescu” București;
18. Jimenez Verde Mayda, Bande M. J. (2013): Principales enfermedades de la abeja melifera medidas de lucha y control. În: es. Slideshare. Net/…/204 – principales – enfermedad…Educación;
19. Krantz R., Arefin B., Theopold U. (2014): Damange signals in the insect immune response. În: Front Plant Sci. vol. 5 pag. 342;
20. Kuster D.R., Boncristiani F.H., Rueppell O. (2014): Immunogene and Viral Transcript Dynamics During Parasitic Varroa destructor Mite Infection of Developing Honey Bee (Apis mellifera) Pupae. În: J Exp Biol, 217 (10), 1710-1718;
21. Mikonranta Lauri, Mappes Johanna, Kaukoniitty Minna and Freitak Dalial (2014): Insect immunity: oral exposure to a bacterial pathogen elicits free radical response and protects from a reccuring unfection. În: Frontiers in Zoologie, 11: 23;
22. Olinescu A. (1989): Elemente de imunologie comparată. Ed. CERES, București;
23. Omar. O.M.M., Moustafa M.A., Ausari J.M., Anwar M. A., Fahmy F. B., Al-Ghandi A. (2014): Antagonistic effect of gut bacteria in the hybrid Carniolan Honey Bee, Apis mellifera carnica, against Ascosphera apis, the causal organism of chalkbrood disease. În: Journal of Apicultural Science, vol. 58, Issue 1;
24. Osborne L. Juliet, Chandler D. (2012): A Strong Immune Response in Zoung Adult Honey bees masks Their Increased Susceptibility to Infection compared to Older Bees. În: PLOS/ pathogens/journal.ppat. 1003083;
25. Pandey J.P., Tiwari R.K. (2012): An overview of Insect Hemocyte Science and its Future Application in Applied and Biomedical Fields. În: Am. J. Biochem. Mol. Biol. 2(3):82-105;
26. Pattabhisamaiah M., Brueckner Dorothea, Witzel P. K., and Reddy M.S. (2011): Wolbachia Endosymbiont in the Workers of European Honeybee Apis mellifera carnica. În: Electronic Journal of Biology, vol. 7(4), pag. 81-85;
27. Paul I. (2007): Probleme de Patologie Generală. Ed. PIM, Iași;
28. Paul I. (1976): Morfopatologie veterinară. Ed. CERES, București;
29. Reumer A., Van Loy T., Schoofs L. (2010): The complexity of Drosophila innate immunity. În: ISJ. 32-44;
30. Ronberg A., B′Diep D., Rudi K., Amdam V. Gro (2012): Paratransgenesis: An Approach to Improve Colony Health and Molecular Insight in Honey Bees (Apis mellifera)?. În: Oxford Journals;
31. Rosengaus B. Rebeca, Traniello F.A.J., Chen T., Brown J. Julie, Karp D. R. (1999): Immunity in a Social Insect. În: Journal Naturwissenschaften, vol. 86, nr. 12, pp. 588-591;
32. Salmela Heli, Amdam V. Gro, Freitak D. (2015): Transfer of Immunity from Mother to offspring Is Mediated via Egg – Yplk Protein Vittelogenin. În: PLOS Pathogenes Journal. ppat. 1005015;
33. Stoenescu A., Perianu T. (1987): Epizootologie generală. Ed. CERES, București;
34. Șuteu E., (2014): Apărarea imună antiparazitară a gazdelor. În: Tratat de Medicină Veterinară. Coordonator: Constantin N., Editura RISOPRINT, Cluj – Napoca;
35. Trauer U., Hilker M., (2013): Parental legacy in insects: variation of transgenerational immune priming during offspring development. dx.plos.org;
36. Vallet-Gely Isabelle, Lemaître B. & Boccard F. (2008): Bacterial strategies to overcome insect defences. În: Nature Reviews Microbiologz, 6, 302-313;
37. Van Loy T., Schoofs L. (2010): The complexity of Drosophila innate immunity. În: ISJ 7:32-44;
38. Vieira Stahl Cecilia, Waniek J.P., Mattos P. Débora, Castro P. Daniele, Mello B. C., Ratcliffe A. N., Garcia S. E., Azambuja Patricia, (2014): Humoral responses in Rhodnius prolixus: bacterial feeding induces differential patterns of antibacterial. În: Parasites & Vectors, 7:232;
39. Vior C., Răducănescu H., Manolescu N., Popoviciu A. (1980): Imunitatea și imunoprofilaxia la animale.Ed. CERES, București;
40. Zanchi C., Troussard J.-P. , Moreau J. și Moret Y., (2012): Relationship between maternal transfer of immunity and mother fecundity in an insect. Proc. R. Soc. B, pag. 3223-3230;
41. Zota I., Vatamanu V. (2010): Morfopatologie Generală, cap. 5: Inflamația. Sub redacția Acad. Anestiadi V. Centrul Editorial – Poligrafic Medicina Chișinău;
42.*** Dushay M., Illinois Institute of Technology: http://www.umbi.umd.edu/~wul/ Dushay M., Illinois Institute of Technology;
43.*** Enterobacteriaceae: http://en.wikipedia.org/wiki/ Enterobacteriaceae;
44. *** NF-kB: http://en.wikipedia.org/wiki/NF-kB;
45. *** Hemocel: http://ro.wikipedia.org/org/wiki/Hemocel;
46.***Bordenstein Lab: bordensteinlab.vanderbilt.edu/IIID /…/pathway… Bordenstein Lab, NSF DEB – 1046149;
47. *** The Honeybee Genome Sequencing Consortium (2006): Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature; 443(7114): 931–949;
48. *** The Honeybee, from Genomics to Social Life: www2.cnrs.fr › … › LIVE FROM THE LABS: The Honeybee : from Genomics to Social Life;
49. ***Epigenetica: www.epochtimes-romania.com/news/ epigenetica-stiinta-care-ne….
50. ***Bird A. (2013): Genetică. www.scientia.ro/biologie/74-genetica/4493-un- fenomen-omniprezent-2..
Stelian ASIMINEI
I.IV. Diagnosticul bolilor la albine: conduită generală
Diagnosticul bolilor întâlnite la albina meliferă este relativ ușor de pus în condiții de laborator, chiar și cu o dotare precară. Un microscop obișnuit, un steriomicroscop, o trusă de colorare Gram, un frigider, un termostat și câteva medii de cultură, sunt suficiente pentru efectuarea examenelor de laborator. Validarea rezultatelor pentru unele afecțiuni (acarapioza, loca americană) se poate face la Laboratorul Național de referință.
Pentru un diagnostic rapid și validat este necesară recoltarea de probe.
I.4.1. Prelevarea, ambalarea și transportul probelor
Felul probelor, cantitatea și calitatea acestora sunt factori esențiali în stabilirea
unui diagnostic precoce, util apicultorului. În Programul național de supraveghere, profilaxie și combatere a bolilor la animale, de prevenire a transmiterii de boli de la animale la om și de protecție a mediului, sunt stabilite normele tehnice privind recoltarea probelor. Pentru examenul de laborator, proba trebuie să conțină minimum 25-50 g albine adulte vii, muribunde sau moarte, faguri întregi sau porțiuni de fagure (20 cm2) cu puiet necăpăcit și căpăcit, rezervă de hrană (19).
În cazul suspiciunii de intoxicații, probele trebuie să cuprindă minimum 100 grame de albine, rezerve de hrană, apă din sursa de adăpare, plante, eventual recipienți sau ambalaje cu resturi de pesticide; întrucât intoxicațiile sunt urmate de litigii, în aceste cazuri se vor recolta și contraprobe. Probele vor fi recoltate de o comisie formată din persoane oficiale: medic veterinar, delegat primarie și reprezentantul organelor de poliție, eventual delegatul A.C.A. județean. Probele trebuie să ajungă la un laborator autorizat, neutru, în cel mai scurt timp. Probele vor fi transportate într-un container cu gheță sau în congelator. Păstrarea, transportul și întârzierea efectuarii analizelor, diminuează șansele stabilirii unui diagnostic corect (15, 17, 19, 20).
Recoltarea probelor de albine se face, în cazul examenelor de supraveghere, în perioada februarie – octombrie astfel : primavara după iernat și toamna, după stuparitul pastoral, la cel puțin 15% din coloniile stupinelor crescatoare de mătci (pepiniere mătci) și de la 5% din coloniile stupinelor de producție. Probele de faguri cu puiet căpăcit și necăpăcit, cuprinse în programul de supraveghere, se recoltează în perioada aprilie – septembrie, în același procent ca și pentru probele de albine lucrătoare (17, 19, 20).
În situația apariției unor îmbolnaviri cu mortalitate, atât la albinele adulte cât și la puiet, probele vor proveni de la coloniile afectate, fiind constituite din albine vii cu semne de boală, albine moarte sau muribunde, precum și, dacă este cazul, din fragmente de faguri sau faguri (rame) întregi cu puiet ce prezintă modificari morfopatologice.
Probele de albine moarte sau muribunde sunt colectate din vecinătatea coloniilor în perioada activă sau din stup în anotimpul rece.
Albinele vii sunt recoltate din stup prin scuturarea unei rame într-un ambalaj (de obicei pungi de hârtie sau polietilenă).
Reziduul este recoltat de pe fundul stupului.
Probele de faguri se ambalează în hârtie și sunt transportate la laborator în cutii de carton.
Probele de albine și probele de faguri, trebuie să fie cât mai proaspete.
Ambalarea și transportul probelor la laborator
Fagurii cu puiet vor fi înveliți în pungi de hârtie, prosoape de hârtie sau ziar și plasați în cutii de carton sau de lemn; vor fi evitate ambalajele de plastic pentru a se evita creșterea fungilor.
Tampoanele cu resturi larvare pot fi puse în tuburi de testare adecvate, cu un capac.
Frotiurile vor fi puse în suporturi care sunt disponibile în comerț.
Albinele adulte pot fi păstrate congelate sau scufundate în etanol 70% în recipiente etanșe în timpul transportului, cu toate că albinele uscate sunt de preferat; un eșantion ar trebui să fie de cel puțin 30 de albine.
Hrana (miere, polen, lăptișor de matcă) poate fi pusă într-o eprubetă sau un vas adecvat, sau înfășurată într-o pungă de plastic, împreună cu lingura de unică folosință cu care s-au recoltat probele. Scurgerea și contaminarea încrucișată a probelor trebuie să fie împiedicată. Dacă este posibil, materialul proaspăt pentru testele de laborator ar trebui să fie trimise refrigerate.
Resturile de pe fundul stupului și ceara trebuie să fie înfășurate într-o pungă de hârtie, vase de plastic acoperite cu un capac de hârtie sau în tuburi de hârtie acoperite cu un capac de plastic.
Ambalajul secundar constă dintr-un sac de plastic ca o protecție împotriva contaminării încrucișate. Probele în vrac pot fi stocate, chiar și în ambalaj terțiar (cutii de carton mari) care le protejează de la deteriorări mecanice (18).
Fiecare probă este identificată prin aplicarea unei etichete cu date despre proprietar (nume și prenume, localitate), nr. familiei de albine, data recoltării. Atunci când sunt mai multe probe se întocmește și un tabel.
În toate cazurile (supraveghere sau necesitate), probele vor fi recoltate de un medic veterinar de liberă practică sau oficial. Acesta, completează și o Notă de însoțire a materialului patologic trimis pentru examene de laborator, în care sunt înscrise datele clinice, anatomopatologice, epizootologice, tratamentele aplicate și rezultatul lor, diagnosticul prezumtiv stabilit după semnele clinice și modificările anatomo-patologice, precum și datele cu privire la hrănire, cazare, îngrijire și alte informații ce pot fi de folos la stabilirea diagnosticului.
În final, medicul veterinar solicită efectuarea anumitor examene și analize de laborator (anatomo-clinic, anatomo-patologic, virusologic, bacteriologic, parazitologic, micologic sau toxicologic) (17, 20).
I.4.2.Diagnosticul de laborator
Conduita medicului veterinar specialist, din laborator, diferă în funcție de datele obținute în urma anamnezei, dacă probele sunt aduse de proprietar, și de cele înscrise în Nota de însoțire a probelor.
Examenul de laborator se efectuează în urmatoarea ordine: – clinic la probele de albine vii sau muribunde și la puietul de albine viu;
– anatomopatologic la toate categoriile de probe;
– bacterioscopic pentru bolile bacteriene;
– parazitologic la toate categoriile de probe;
– micologic la toate categoriile de probe;
– bacteriologic (cultural, morfologic, biochimic), dacă este cazul;
– toxicologic, în cazul suspiciunii de intoxicație;
– virusologic, acolo unde sunt mijloace de diagnostic;
– alte investigații (imunologice, PCR etc.).
I.4.2.1. Diagnosticul bolilor puietului de albine
Puietul albinelor (Apis spp.) este afectat de două boli bacteriene (locă americană și locă europeană), două viroze (virusul de Kashmir, puietul în sac), două parazitoze (varooza și tropilelapsoza) și două micoze (ascosferoza și aspergiloza).
Cu toate că etiologia, semnele clinice și modificările anatomopatologice vor fi prezentate pe larg la fiecare boală în parte, în acest capitol vor fi sintetizate principalele metode de diagnostic bazate pe semnele clinice, modificările morfopatologice mai importante și caracterele morfologice, biochimice sau serologice ale agentului/agenților etiologici, pentru fiecare entitate morbidă, pentru ca specialistul de laborator să aibă o viziune de ansamblu asupra aspectelor menționate, la interpretarea datelor și stabilirea diagnosticului.
Menționăm că examenele de laborator care presupun folosirea mediilor de cultură trebuie să dispună de tulpini de referință. De asemeni, mediile de cultură vor fi testate pentru inocuitate și sterilitate, iar însămânțările se vor face în paralel și cu tulpini de referință, o placă sau un tub cu mediu fiind pusă la incubat fără a fi însămânțată (martor negativ).
I.4.2.1.1.Loca americană; American foulbrood (AFB)
Recoltarea probelor din colonii sau stupine suspecte de boală va fi făcută, de preferință, de un medic specialist din laborator. Specialistul poate colecta direct, cu un tampon steril, din celulele cu larve/pupe bolnave sau moarte, facilitând astfel ambalarea și transportul probelor la laborator. Când se dorește efectuarea numai a unui examen bacterioscopic, atunci se pot realiza frotiuri din resturi de larve moarte, iar după uscare frotiurile sunt expediate la laborator. Dacă nu este posibilă deplasarea unui specialist, atunci se recoltează o porțiune de figure cu puiet mort sau cu modificări de culoare în mărime de 20 cm2.
Dacă examenul clinic relevă modificări anatomopatologice specifice locii americane, atunci coloniile vecine sunt considerate suspecte de boală. În acest caz, sunt recoltate probe de puiet, rezerve de hrană (miere, polen, lătișor de matcă), resturi de ceară și albine lucrătoare doici, pentru a detecta prezența sporilor de Paenibacillus larvae (18).
Izolarea bacteriei Paenibacillus larvae se face din:
faguri cu puiet împrăștiat, dispus neuniform și celule cu căpăcele excavate, de culoare mai închisă, perforate și parțial descăpăcite, cu miros de putrefacție, larve cu consistență și turgescenșă scăzută, de culoare de la alb sidefiu, normal, la galben – maroniu – brun, tegument friabil în stadiul avansat de boală sau larve cu aspectul unei mase vâscoase, filante, aderentă la pereții celulei (fig. I.4.1. a și b);
faguri cu detritusuri larvare deshidratate, uscate, puternic aderente la pereții celulelor (fig. I.4.1., c) (1, 6).
Fig. I.4.1. a, b, c.: Loca americană. Aspecte cu modificările anatomopatologice ( 32, 33)
Mediile de cultură folosite pentru cultivarea bacteriei P. larvae sunt diverse. Cele mai bune rezultate s-au obținut cu PLA (Paenibacillus larvae agar) (Schuch et al., 2001), MYPGP agar (Dingmann & Stahly, 1983), BHIT agar ( mediu infuzie creier-inimă suplimentat cu tiamină) (Gochnauer, 1973), J-agar (Gordon et al., 1973) și CSA (agar Columbia + sânge de oi) (Hornitzky & Karlovskis, 1989) (18).
În mod curent, însămânțările se fac pe BHIT (tiamină 0,1 mg/litru de mediu) cu un pH de 6,6 (15), sau, în lipsa acestuia, pe bulion și agar nutritiv cu adaus de ser normal de cal (10%) (6). Poate fi folosit și mediul Bailey – Lee (1962) care conține extract de drojdie, amidon solubil și glucoză. Mediul poate fi lichid, semisolid (0,3% agar/litru) sau solid (2% agar/litru), creșterea și sporularea fiind satisfăcătoare (15).
Din materialul suspect se realizează o suspensie de spori în apă distilată sterilă (raport 1/9) sau în bulion nutritiv, se termostatează timp de 10 minute la 80ș C sau 3 – 5 minute la 95 – 95ș C, pentru distrugerea formelor bacteriene vegetative, după care sunt însămânțate mediile de cultură cu 0,2 ml suspensie/placă de agar BHIT și apoi se incubează, aerob, timp de 72 de ore, la 34ș C, (15, 18).
Larvele sau pupele rămase în proba de fagure sunt colectate, într-o eprubetă, cu un tampon steril și suspendate în 5 – 10 ml de apă distilată sterilă sau PBS. Apoi proba cu suspensia de spori este împărțită în trei eșantioane:
– fără tratament termic;
– cu un tratament termic la 80 ° C timp de 10 minute, și
– cu un tratament termic la 95 ° C timp de 3 minute.
În eșantioanele primele două eșantioane, formele vegetative ale altor microorganisme vor fi distruse, astfel că se reduce semnificativ riscul ca P. larvae să fie mascat de acești concurenți. Însă bacteriile sporulate ale genului Bacillus (Paenibacillus și Brevibacillus) vor continua să crească pe mediile enunțate mai sus, și atunci trebuiesc adăugate antibiotice (acid nalidixic și acid pipemidic), care-i inhibă.
În eșantionul al trei-lea, care nu a fost supus tratamentului termic se adaugă, în afară de cele două antibiotic și amfotericina B, în concentrație de 16,8 pg/ml de mediu de cultură, pentru evitarea contaminării fungice. Plăcile se incubează la 37 ° C timp de 2- 3 zile (18).
Identificarea speciei Paenibacillus larve se face pe baza caracterelor culturale, morfotinctoriale și biochimice.
Caractere culturale
În mediile lichide Paenibacillus larvae determină o turbiditate neunuformă, moderată și, uneori, inel la suprafață. Prin învechire, în mediu se formează un depozit floconos care la agitare se dezagregă ușor. Unele tulpini pot forma o peliculă fină, încrețită, translucidă.
Pe mediile solide, de cele mai multe ori apar colonii mici de maximum 1-2 mm în diametru, de culoare gri-perlată sau galben pai, de tip R, uneori asemănătoare cu mici granule de nisip (fig. I.4.2., b). Pe mediile îmbogățite apar și colonii mari, opace, relativ mucoase, cu marginea transparentă și cu tendință de difuzare pe suprafața mediului.
Când însamânțările se fac din larve moarte de loca americană, aproape în toate cazurile Paenibacillus larvae se obține în cultură pură, datorită capacității acestuia de a sintetiza, în momentul sporularii, un antibiotic activ față de numeroase bacterii Gram – pozitive, Gram-negative și alcool-acido-rezistente (6, 15, 18).
Fig. I.4.2. a). P. larvae, forma vegetativă (21) b). P. larvae, aspect cultural (22) c). P. larvae, spori (21)
Examenul bacterioscopic
Acest examen se execută din materialul patologic sau din culturi.
Din materialul patologic, după descăpăcirea celulelor de pe fragmentele de fagure , din larvele cu modificări sau din detritusul larvar uscat , se prelevează o mică parte care se etalează pe o lamă împreună cu o picatură de apă distilată. După omogenizarea preparatului, lama de sticlă se lasă la temperatura camerei pentru evaporarea apei, după care frotiul se fixează, prin trecerea lamei de 2 – 3 ori pe deasupra unei flăcări de la becul de gaz. Frotiul astfel fixat se colorează prin metoda Gram , respectându-se timpii de expunere și succesiunea operațiilor astfel:
frotiul uscat și fixat se acoperă cu sol. 1% de violet de gențiană, se ține un minut , după care soluția se varsă;
frotiul se acoperă cu sol. Lügol, contactul fiind de un minut , apoi se varsă; în cazul frotiurilor groase, preparatul poate fi spălat cu apă după vărsarea soluției de violet de gențiană;
frotiul se spală cu alcool – acetonă un timp care variază în raport cu grosimea frotiului și natura germenului , până se produce decolorarea substratului;
după vărsarea soluției de alcool – acetonă, frotiul se spală bine cu apă;
frotiul se acoperă cu soluția de fucsină 1‰ timp de 10 – 30 secunde. Apoi colorantul se varsă, frotiul se spală bine cu apă, se usucă și poate fi examinat la microscop cu obiectiv de imersie.
In frotiurile executate din mediul lichid sau de pe suprafața mediului solid, bacilii sunt dispuși izolat, câte 2-3, în lanțuri lungi sau în filamente, uneori paralele între ele (8).
Caractere morfologice
Paenibacillus larvae este un bacil Gram- pozitiv, lung, subțire, cu capetele ușor rotunjite, dimensiuni cuprinse între 1,5 – 5 µm lungime și 0,5 – 0,6 µm grosime, uneori sub formă de filament (fig. I.4.2., a). Este ciliat, cili numeroși, dispuși peritrich, mobilitatea fiind un caracter variabil de la o tulpină la alta. Este un germen necapsulat, sporulat, sporul fiind dispus central sau subterminal, care deformează corpul bacterian (fig. I.4.2., c). Sporul este elipsoidal cu dimensiuni de 1,1 – 1,3 µm lungime și 0,6 – 0,7 µm lățime și cu margini intens colorate (6).
Paenibacillus larvae are patru genotipuri diferite: ERIC I, ERIC II, ERIC III și ERIC IV. ERIC I și II corespund fostei subspecii P. larvae larvae, iar ERIC III și IV fostei subspecii P. larvae pluvifaciens. Toate cele patru genotipuri diferă din punct de vedere al morfologiei coloniilor și sporilor, al caracterelor biochimice și al virulenței (tabel nr. 4.1).
Tabel nr. 4.1: Caracterizarea fenotipică a bacteriei P. larvae, genotipurile ERIC. Toate genotipurile au sporii elipsoidali și sunt patogene pentru albina meliferă (după Genersch și colab., 2005, citat de 18)
Studiile epidemiologice au arătat că doar ERIC I și ERIC II sunt frecvent izolate de la colonii cu locă americană. Paenibacillus larvae genotipul ERIC I este cel mai frecvent genotip și este prezent în Europa și în America, genotipul ERIC II pare să se limiteze la Europa și genotipurile ERIC III și IV nu au fost identificate în colonii cu locă americană de zeci de ani (18).
Caractere biochimice
Majoritatea tulpinilor de P. larvae nu produc gaz la fermentarea carbohidraților, dar fermentează glucoza, trehaloza și glicerolul cu producere de acid, are activitate redusă față de lactoză, zaharoză, nu fermentează arabinoza, xiloza și salicina, nu hidrolizează amidonul și nu produce indol, nu descompune tirozina, descompune cazeina, lichefiază gelatina, are activitate lipazică și produce hidrogen sulfurat; reacția Voges-Proskauer este negativă, iar activitatea catalazică este negativă.
Reducerea nitraților la nitriți și fermentarea manitolului sunt caractere biochimice care diferă de la o tulpină la alta (6).
Pentru evidențierea rapidă a caracterelor biochimice ale bacteriei P. larvae se poate regurge la o serie de teste biochimice rapide și ieftine. Amintim aici testul Holst, reducerea nitratului și testul catalazei, care coroborate cu datele clinice, morfopatologice, bacterio-scopice și culturale, pot duce la un diagnostic pozitiv, în cazul evoluției bolii.
. Testul Holst. Fragmentele de fagure se descăpăcesc și se extrag larvele cu modificări anatomopatologice specifice (modificări de culoare, consistență, aderență, miros). Larva cu modificări sau detritusul rămas în urma deshidratării se introduce într-o eprubetă în care au fost pipetate, în prealabil, 3 – 4 ml de soluție apoasă 1% de lapte praf degresat. Apoi, eprubeta cu acest conținut, se agită puternic până când se formează o suspensie omogenă, opalescentă. Suspensia astfel obținută, se termostatează la 37ș C timp de 10 – 20 de minute. În cazul prezenței sporilor bacteriei P. larve, soluția se limpezește (15).
Hidroliza cazeinei. Pentru acest test se folosește un mediu care conține agar lapte și tiamină. La un litru de mediu se pun: 20 g de agar, 10 g extract de drojdie. Mediul se sterilizează la 121ș C timp de 15 minute, iar după răcire, la fiecare 70 ml lapte degresat UHT și 1,5 ml soluție de tiamină 0,1%, sterilizată prin filtrare. Plăcile sunt însămânțate și examinate după 5 zile de incubare la 36 ± 1 ° C. Paenibacillus larvae hidrolizează cazeina, astfel că zonele din jurul coloniilor devin clare (18).
Reducerea nitratului. P. larvae reduce nitratul la nitrit. Acest test se aplică pe un mediu de cultură la care se adaugă azotat de potasiu (1-2 mg/l de mediu). După însămânțare și incubare, timp de 72 de ore, în condiții aerobe, se adaugă o picătură din reactivul acid alfa-naftol sulfanilic, iar dacă a avut loc dezvoltarea coloniilor bacteriene și nitratul a fost redus apare culoarea roșie la suprafața mediului de cultură (15).
Testul catalazei. Pe culturi solide de 72 de ore se pune o picătură de soluție de H2O2 3%. În cazul reacției pozitive are loc o reacție cu degajare puternică de O2 cu formarea de spumă în timp de 1-2 minute (9). Paenibacilus larvae este aproape întodeauna negativ la această reacție (15) sau slab pozitiv, în funcție de genotip (18).
Microorganismele pot pierde activitatea catalazei odată cu învechirea culturii, rezultând o reacție fals negativă. Când se folosește ca mediu de cultură agar Columbia cu sânge de oaie, testul nu se poate face pe mediul solid, deoarece prezența sângelui de oaie va provoca o reacție fals-pozitivă. În acest caz, coloniile trebuiesc transferate pe o lamă de microscop curată pentru executarea testului (18).
Producerea acidului din zaharuri. Bacteriile sunt cultivate în bulion-J (pentru un litru de mediu se pun: extract de drojdie 15 g, triptonă 5 g și K2HPO4 3 g). Carbohidrații utilizați sunt: L (+) – arabinoză, D (+) glucoză, D (+) – xiloza și D (+) – trehaloză. Culturile sunt testate la 14 zile prin aspirarea aseptic, cu o pipetă, a unui ml de cultură în mediul-J cu zaharuri și se amestecă într-o placă Petri cu o picătură din soluția alcoolică 0.04% de bromcrezol purpuriu și apoi se observă culoarea indicatorului (18).
În comerț sunt disponibile și kit-uri pentru caracterizarea biochimică a bacteriei P. larvae (18).
Reacții serologice (imunologice). Diferite tehnici bazate pe anticorpi au fost dezvoltate pentru diagnosticarea AFB. Cele mai multe dintre ele se bazează pe serul policlonal de iepure dezvoltat împotriva culturilor pure de P. larve. Serul poate fi folosit pentru identificarea coloniilor bacteriene care rezultă din cultivare sau pentru examinarea directă a larvelor suspecte (18).
Imunodifuzia dublă în gel de agar. Într-un test de imunodifuzie anticorpii interacționează cu antigenul bacterian printr-un proces de difuzie dublă, la contactul dintre reactanți fiind prezentă o linie de precipitare, atunci când evoluează loca americană (18).
Imunofluorescența indirectă (IFI). Antiserul este preparat pe iepure, prin inocularea repetată a unor tulpini pure ale bacteriei P. larvae. Apoi, serul obținut este cuplat cu un colorant fluorescent (fluoresceină).
Frotiul efectuat dintr-un material suspect este pus în contact cu serul hiperimun fluorescent, iar după un anumit timp este examinat la un microscop cu fluorescență. În cazurile pozitive, bacteriile apar ca bastonașe fluorescente pe un fundal întunecat (15, 18).
Testul imunoenzimatic (ELISA), folosește anticorpi monoclonali specifici pentru P. larvae. Acest test există pe piață și poate fi folosit pentru confirmarea AFB (18).
Reacția în lanț a polimerazei (PCR)
PCR poate fi utilizată pentru a identifica coloniile bacteriene ( celule / suspensie de spori) după o etapă de cultivare. Procedura este următoarea: o colonie este suspendată în 50 µl de apă distilată care se încălzește la 95° C, timp de 15 minute. După centrifugare la 5000 g timp de 5 minute, 1- 5 µl de supernatant este folosită ca matriță ADN într-un amestec 50 µl PCR (18).
Spectrometria de masă. O colonie bacteriană (o parte sau întregă) este transferată pe plăci țintă într-un strat subțire; după uscare, la temperatura camerei, aceasta este acoperită cu un µl matrice MALDI (acid cinamonic) și se lasă din nou la uscat. Măsurarea se realizează cu MALDI-TOF MS. Dispozitivul detectează spectrele de masă specifice ale peptidelor ribozomale bacteriene. După compararea spectrelor detectate cu baza de date de spectre cunoscută, tulpina bacteriană este identificată (18).
I.4.2.1.2. Loca europeană; European foulbrood (EFB)
Izolarea bacteriei Melissococcus plutonius se face din:
faguri cu puiet necăpăcit cu modificari de culoare, consistență, miros;
faguri cu larve moarte și deshidratate;
intestinul provenit de la larve cu semne clinice de boală.
Din acest material patologic se fac suspensii apoase care se depun pe suprafața
mediului în plăci sau se inoculează în tuburi cu agar moale la 45ș C, în diluții zecimale, care apoi se toarnă în plăci Petri. Incubația se face în condiții de anaerobioză de 5-10% CO2 la 35ș C timp de aproximativ 4 zile (6). Incubarea în atmosferă de CO2 este esențială (18).
Cultivarea bacteriei Melissococcus plutonius se face pe mediul Bailey (1959) format din 1 g extract de drojdie (Difco),1 g glucoză, 1,35 g dihidrogenofosfat de potasiu (KH2PO4), 1 g amidon solubil, 2 g agar, și apă distilată până la 1000 ml. pH-ul este ajustat la 6,6 cu hidroxid de potasiu (KOH), iar amestecul este autoclavat la 116șC, timp de 20 minute. După Bailey și Collins, 1982 (citați de 15), adăugarea de cisteină (0.1 g / 100ml) îmbunătățește multiplicarea M. plutonius. Izolarea bacteriei M. plutonius pe medii artificiale este dificilă, din cauza creșterii sale lente și a concurenței cu alte bacterii (14). M. plutonius este foarte rezistent în mediu uscat, putând fi păstrat ani de zile, pe frotiu, la 4șC sau la -20ș C (18).
Un alt mediu de cultură pentru M. plutonius (tulpina NCIMB 702443 este întâlnită abundent în stadiile incipiente ale EFB) este compus din: 2 g de agar, 1 g extract de drojdie sau anumite peptone, 0,2 – 2,0 g cisteină sau cistină, 1 g glucoză sau fructoză, 1 g amidon solubil, 10 ml KH2PO4, 1M la pH 6,6 și apă distilată până la 1000 ml. Mediul se autoclavează în flacoane cu dop filetat de 100 ml, la 116ș C, timp de 20 minute și se toarnă în plăci Petri imediat înainte de utilizare (18).
Metodele de păstrare și menținere a viabilității bacteriei M. plutonius sunt:
– Pe frotiuri uscate, efectuate din material patologic, păstrate apoi ani de zile la 4șC sau -20șC. Toată flora de asociație dispare după câteva săptămâni;
– În tuburi cu mediu de cultură înclinat, sigilate, când creșterea bacteriană este vizibilă și apoi păstrate la 4șC timp de 6 luni;
– Liofilizare, după ce culturile au fost suspendate într-un mediu compus din 10% zaharoză, extract de drojdie 5% și 0,1ml, KH2PO4, M, la pH 6,6 (18).
Identificarea bacteriei Melissococcus plutonius
Identificarea germenului se face pe baza caracterelor morfologice, culturale și a proprietăților biochimice.
Caractere morfologice. Melissococcus plutonius este o bacterie ovoidă cu aspect
caracteristic lanceolat, Gram – pozitivă, neciliată, nesporulată (6), capsulată (11), cu dimensiuni de 0,8-1,5/0,8-1,0 µm, dispusă predominant sub forma de lanțuri de lungimi diferite sau în ciorchine. În culturile vechi, bacteria poate avea o formă bacilară cu polimorfism accentuat (6).
Caractere biochimice
Melisococcus plutonius fermentează glucoza, fructoza și mai rar alți carbohidrați,
producând aciditate slabă (pH final 5,3). Produce acid lactic, nu coagulează laptele și nu lichefiază gelatina (6).
Caractere culturale
În mediul lichid, Melissococcus plutonius formează un depozit floconos la fundul eprubetei, în timp ce pe mediul solid formează colonii mici, albe, de 1 mm; dacă însămânțarea s-a facut în profunzimea mediului solid, coloniile cresc în mediu până la 8 mm față de suprafața acestuia (fig. I.4.3., b și c).
Examenul bacterioscopic
Examenul bacterioscopic se realizează pe un frotiu executat din conținutul intestinal, colorat cu nigrosin apos 5%. Cu o ansă de însămânțare se ia o buclă de material patologic, se întinde pe o lamă curată, peste care se pune o ansă de colorant. Se amestecă bine, se usucă frotiul, la temperatura camerei sau la flacără și se examinează la un microscop de mare putere. Prezența de coci lanceolați, de 0,5/1,0 µm, grupați sau izolați, uneori în lanțuri scurte sau câte doi (fig. I.4.3., a) este aproape sigur un diagnostic pozitiv pentru locă europeană.
Preparate similare realizate din suspensii apoase de larve moarte întregi sau în descompunere sunt susceptibile de a prezenta o gamă largă de bacterii în care va fi dificil să se facă distincția între bacteriile de asociație și M. plutonius (18).
Bacterii asociate cu loca europeană
După moartea larvelor de albine, sub acțiunea patogenă a bacteriei Melissococcus plutonius, cadavrele sunt invadate de o floră bacteriană saprofită, răspunzătoare de modificările alterative ale acestora. Bacteriile mai des întâlnite sunt Paenibacillus alvei, Enterococcus faecalis, Achromobacter (Bacterium) eurydice, dar (uneori) și Brevibacillus laterosporus sau Paenibacillus apiarus. Identificarea acestor bacterii din materialul patologic, fără a fi izolat și Melissococcus plutonius reprezintă un mijloc de suspiciune că în stupina respectivă evoluează loca europenă (15).
Paenibacillus alvei este frecvent asociat cu loca europeană. Dimensiunile bacilului diferă în funcție de forma morfologică: în stare vegetativă are 0,5-0,8/2-5 µm, iar în starea de rezistență măsoară 0,8/1,8-2,2 µm. Sporangiumul este atașat la spor (15). Sporii apar în câmpul microscopic grupați sau în stivă și au formă de cometă (9). Forma vegetativă se colorează cu toți coloranții de anilină, iar sporii cu fuxină concentrată la cald. Ca agenți coloranți se mai pot folosi tușul de China sau nigrozin (11).
Paenibacilus alvei este aerob sau facultativ anaerob, crește abundent pe agar nutritiv, degajă un miros de stătut, iar unele colonii sunt mobile (6, 11). P. alvei fermentează glucoza, maltoza, zaharoza, lactoza, mediul de cultură devenind acid, coagulează laptele, nu hidrolizează amidonul, iar unele tulpini produc indol (11).
Paenibacillus (Bacillus) alvei este, în general, mai frecvent decât E. faecalis în coloniile de albine afectate de locă europenă, dar nu este asociat invariabil cu boala și astfel nu poate acționa ca un indicator fiabil al bolii. În coloniile de albine, se multiplică numai în larve moarte, aflate în descompunere, iar apoi sporii lui Paenibacilus alvei predomină, de multe ori asupra altor bacterii, ducând chiar la excluderea lor aparentă. Sporii bacilului sunt foarte rezistenți și devin o prezență obișnuită în coloniile de albine cu locă europenă enzootică. Provoacă un miros stătut, caracteristic.
Fig. I.4.3. Melisococcus plutonius. a). frotiu; b). cultură; c). colonii (23, 24)
Paenibacillus alvei se multiplică slab în condițiile necesare pentru creșterea ,,in vitroˮ a lui M. plutonius. Se dezvoltă colonii transparente, dintre care unele sunt mobile și se deplasează în arc de cerc pe suprafața agarului. Culturile au un miros caracteristic de vechi, care este asociat cu loca europenă, atunci când bacilul este prezent. Sporii sunt formați rapid (18).
Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis, S. apis, S. liquefaciens). Este o bacterie cocoidă, cu dimensiuni de 0,5-1,0 µm, așezate în perechi sau lanțuri scurte. E. faecalis seamănă, din punct de vedere morfologic, cu Melissococcus plutonius și poate prezenta mișcarea browniană (15). Enterococcus (Streptococcus) faecalis,datorită aseamănării morfologice cu M. plutonius, a fost de multe ori confundat cu acesta, deși ambele bacterii sunt diferite cultural și serologic, iar viabilitatea lui în mediul uscat este mică (față de M. plutonius) (18).
Crește pe agar nutritiv la 37șC, în 24 de ore. Coloniile sunt mai mici de 2 mm, netede, convexe, transparente și au o margine bine definită (15). Enterococcus faecalis este un anaerob facultativ. Acesta se multiplică pe o mai multe medii de cultură comune, cu sau fără carbohidrați sau CO2. pH-ul final, în prezența glucozei, este 4,0 (18).
Enterococcus faecalis crește bine în condiții de anaerobioză și pe mediile de cultură pentru M. plutonius, dar poate fi ușor diferențiat prin capacitatea sa de a crește în condiții de aerobioză (18).
Enterococcus faecalis nu se multiplică în larve în absența lui M. plutonius, astfel că prezența sa în număr mare poate fi luată ca o dovadă prezumtivă a evoluției EFB.
Enterococcus faecalis este, uneori, responsabil de mirosul acru al larvelor moarte de locă europeană
Bacterium (Acromobacter) eurydice este un bacil subțire, Gram-negativ, anaerob, facultativ aerob (10), de 0,4-0,7/0,5-1,4 µm, capete rotunjite, vizibili la microscop în perechi sau izolat (6), nesporulat și neciliat. Crește pe agar-glucoză la temperatura camerei sau la 30ș C. Fermentează glucoza și levuloza, acidifiind mediul, nu coagulează laptele și nu lichefiază gelatina (11). Coloniile se dezvoltă lent, sunt convexe, netede (6), de culoare albăstruie și lucioase. Conservarea bacilului necesită pasaje dese. În bulion formează un depozit abundent, vâscos (11). Atunci când crește în anumite medii, se aseamănă, uneori, cu streptococii și a fost confundat cu M. plutonius. Însă caracteristicile sale culturale sunt asemănătoare cu cele ale lui Corynebacterium pyogenes; se înmulțește slab, prezentându-se sub formă de bacili subțiri, în condițiile specifice pentru cultivarea lui M. plutonius (18).
Bacterium (Acromobacter) eurydice populează tractul digestiv al albinelor adulte și apare în număr mic, de obicei, în intestinul larvelor sănătoase. Numărul bacteriilor crește semnificativ în larvele infectate cu M. plutonius. Incidența A. eurydice în albinele sănătoase este foarte scăzută iarna și primăvara devreme, dar crește în timpul verii (18).
Paenibacillus apiarus (Bacillus apiarus) este rar întâlnit în loca europeană. Bacilii au lungimea de 0,6-0,8 µm și de multe ori sunt mai mici la poli. Sporul este rectangular, iar sporangiumul rămâne atașat de spor o perioadă lungă de timp. Crește pe mediul Sabouraud (15).
Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus, Bacillus orfeus) este un bacil ciliat și sporulat, sporul fiind dispus terminal. Dimensiunea acestei bacterii, în stare vegetativă, este de 0,5-0,8/2,0-5,0 µm, iar a sporilor de 1,0-1,3/1,2-1,5 µm. Este o bacterie Gram labilă (11).
Brevibacillus laterosporus crește moderat pe agar nutritiv. Adăugarea de glucoză 1% în mediul de cultură, determină o creștere luxuriantă a culturilor, iar prin învechire, cultura se încrețește (15). Fermentează levuloza și maltoza, coagulează laptele și nu produce indol (11).
Metode imunologice (serologice)
a) Diagnosticul serologic se realizează prin testul de aglutinare în tuburi, care conțin suspensii de bacterii echivalent cu 0,25 mg greutate uscată/ml. Rezultatele se obțin după incubarea lor timp de 4 ore la 37ș C.
Antiserurile necesare sunt preparate pe iepuri prin folosirea culturilor bacteriei M. plutonius. Inocularea bacteriei se poate face intravenos sau intramuscular. Antigenul este amestecat cu un volum egal cu adjuvant Freund incomplet. În cazul administrării intravenoase sunt necesare mai multe inoculări, pe când intramuscular este suficientă o inoculare cu 1 ml antigen (18).
b) Kit-urile pentru detectarea rapidă a anticorpilor anti – M. plutonius sunt disponibile pe piață și oferă posibilitatea confirmării rapide a locii europene (18).
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) poate fi efectuată pe colonii bacteriene suspecte, transferate și crescute în mediu lichid. ADN-ul genomic este preparat conform metodelor standard. Reacția PCR se poate face și cu larve, miere, polen și albine adulte.
Masele moleculare ale produselor PCR sunt determinate prin electroforeză într-un gel de agaroză 1,0-1,5% și colorare cu bromură de etidiu (18).
I.4.2.1.3. Puietul în sac (Sacbrood)
Diagnosticul acestei viroze se pune după modificările anatomopatologice caracteristice și examenul bacteriologic negativ. Se pot utiliza, pentru stabilirea unui diagnostic pozitiv, și tehnici moleculare (PCR) sau ELISA și IFI, după obținerea unui antiser hiperimun pe iepuri (14).
Fig. I.4.4. a, b, c, d). Puietul în sac: aspectul morfopatologic (22, 23, 24, 25).
Din punct de vedere morfopatologic (fig. I.4.4., a, b, c și d) se ține seama de forma saciformă a larvelor pline cu lichid, la debutul bolii, și de cojițe încovoiate (,,papuc chinezesc,,) într-o fază evolutivă avansată (7). Moartea larvelor bolnave se produce atunci când sunt în poziție verticală, chiar înainte de împupare. Dezvoltarea larvelor este întârziată, culoarea capului este mai întunecată decât restul corpului, care devine, treptat, treptat, gri perlată și apoi neagră.
Căpăcelele celulelor, din bombate, devin turtite (15). Boala poate fi confundată cu loca americană. La stabilirea diagnosticului se au în vedere lipsa mirosului și a aderenței larvelor moarte la peretele celulei, precum și absența florei bacteriene în larvele bolnave sau moarte recent (7).
I.4.2.1.4. Ascosferoza (Chalkbrood)
Ascosphaera apis este un micet heterothalic care dezvoltă un spor caracteristic închis într-o ască.
Boala poate fi ușor diagnosticată clinic datorită aspectului larvelor afectate (fig. I.4.5., a, b, c). Acestea pot fi eliminate din celulele de puiet prin atingerea fagurelui pe o suprafață solidă. Acestă îndepărtare ușoară a larvelor diferențiază ascosferoza de alte boli ale puietului.
Într-un stup cu un număr mare de larve infectate, mumiile pot fi găsite la urdiniș sau pe fundul stupului. (15).
Fig. I.4.5. a, b, c.: Ascosferoză, aspectul morfopatologic (28, 29, 30)
Examenul microscopic
Probele de figure se descăpăcesc și se examinează aspectul general, după care se extrag pupele din celule și se examinează macroscopic.
Larvele extrase din celule, cu modificări de consistență și culoare, se mojarează cu 5 – 10 ml de apă distilată. Cu o pipetă Pasteur , se ia câte o picatură din suspensie și se depune pe o lamă de sticlă. Apoi, la preparat se adaugă o picatură de lactofenol pentru clarificare și se acoperă cu o lamelă.
Preparatele se examinează la microscop cu obiectiv 40x,ocular 7x sau 10x .
În câmpul microscopic apar unele formațiuni sferice – ascochiștii – cu diametrul cuprins între 45 – 119 µm, de culoare verde – închis, translucide, în interiorul cărora se găsesc un număr variabil de sfere mici – ascosfere – ce conțin ascospori și hife miceliene. Ascosporii sunt elipsoidali sau ușor reniformi, cu dimensiuni de 1 – 2 µm / 2 – 3,5 µm, refringenți.
Prezența fungilor descriși în câmpul microscopic și a modificărilor anatomopatologice în probele de puiet este permit precizarea diagnosticului de ascosferoză (16).
Examenul cultural
Ascosphaera apis crește luxuriant pe agar+ dextroză+cartof îmbogățite cu 4 g extract de drojdie / litru. Crește, de asemenea, pe malț+ agar, dar mai puțin abundent și fără hife aeriene; aceste caracteristici facilitează repicarea și examinarea la microscop. Ascosphaera apis este izolată ușor din larve infectate recent sau din mumii, care sunt așezate direct pe mediu și sunt apoi incubate la 30ș C, timp de 24 de ore. Din culturile de 24 de ore pot fi luate blocuri mici și transferate în plăci noi pentru obținerea de culturi pure. Culturile au miros de fructe, similară cu cea de piersici fermentate.
Din mumii foarte vechi, Ascosphaera apis poate fi izolată prin depunerea acestora pe agar+apă, fără nutrienți, incubare și apoi transferul lor pe un mediu nutritiv. Diferențierea micetului de alți miceți de contaminare, poate fi făcută prin însămânțarea izolatelor pe părțile opuse ale unei plăci Petri (15). .
I.4.2.2. Boli comune puietului și albinelor adulte
I.4.2.2.1. Virusul de Kashmir (KBV)
Virusul de Kashmir afectează puietul și albinele adulte. Dă reacții serologice încrucișate cu virusul paraliziei acute. Este izolat în mod curent și de la albinele sănătoase.
Diagnosticul bolii se face prin imunodifuzie în gel de agar și prin teste moleculere (PCR) (15).
I.4.2.2.2. Varooza
Acarianul Varroa destructor poate fi găsit pe albinele adulte (fig. I.4.6., c), pe puiet (fig. I.4.6., b) și în reziduul de pe fundul stupului; acesta poate fi ușor observat cu ochiul liber.
Acarienii se atașează de albinele adulte între tergitele abdominale sau între spațiile de legătură dintre segmentele corpului (cap, torace, abdomen). Datorită acestui fapt ei sunt dificil de detectat la albina adultă, dar ușor de observant pe suprafața tegumentului, la pupe.
Fig. I.4.6. a, b, c,: Varroa destructor (34, 35, 36)
Femela acarianului Varroa destructor se recunoaște după urmatoarele caractere morfologice: are corpul plat, transversal oval, lung de 1,1 mm, lat de 1,6 mm, înveliș chitinos de culoare maro – roșcat acoperit cu perișori, are patru perechi de picioare (fig. I.4.6., a) și aparat bucal pentru înțepat și supt.
Acarienii de sex masculin sunt mai mici, culoarea chitinei este cafenie și sunt rar întâlniți.
Varroa destructor poate fi confundat cu insecta Braula coeca și cu acarianul Tropilelaps spp.
Varroa destructor se dezvoltă, de preferință, pe puietul de trântor. Însă în infestațiile masive se înmulțește și în celulele cu puiet de lucrătoare. Deoarece se hrănesc cu hemolimfa larvelor, adulții care se dezvoltă din larvele parazitate au abdomenul mai scurt, aripi și membre deformate, iar greutatea lor este mai mică decât a albinelor care n-au fost parazitate. Acarianul este vectorul virusului aripilor deformate, astfel că aripile deformate sunt considerate a fi un simptom al infecției cu acest virus (fig. I.4.10.) (15).
Examenul macroscopic și microscopic
a). Probele de figure se descăpăcesc și se examinează partea ventrală a căpăcelelor și pereții celulelor, direct, macroscopic sau stereomicroscopic:
→ pupele se extrag din celule și se examinează macroscopic sau se spală în mod repetat cu apă distilată sau de robinet deasupra unei site cu ochiuri de 1 mm care reține paraziții;
→ interiorul celulei se examinează cu stereomicroscopul putând fi depistate toate stadiile de dezvoltare ale parazitului – ou, larvă, protononfă, deutonimfă și adult.
b). Albinele, mătcile și trântorii se examinează macroscopic sau stereomicroscopic, în special la nivelul inserțiilor cap – torace, torace – abdomen, baza aripilor și membranele dintre tergitele abdominale, principalele locuri de elecție ale parazitului pe corpul albinelor adulte.
Albinele omorate cu alcool etilic, eter de petrol sau după spălare cu apă și detergent sunt filtrate prin sită cu ochiuri de 2-3 mm, iar paraziții sunt antrenați de lichid în vasul de sub sită; în cazul prezenței acestora, paraziții sunt detectați cu ochiul liber sau la stereomicroscop, în depozitul de pe fundul vasului.
c). În reziduul supus operațiunii de uscare – spălare, paraziții adulți vor putea fi observați la suprafața vasului, în lichidul de spălare (16, 18).
I.4.2.2.3. Tropilelapsoza
Parazitismul cu Tropilaelaps clareae este, deocamdată, limitat la coloniile de albine din Asia. Acești acarieni parazitează puietul de albine, uneori fiind întâlniți împreună cu Varroa destructor (15).
Primul semn al infestării coloniei de albine cu Tropilaelaps spp. este, adesea, apariția acarienilor mari, alungiți, roșii – maronii pe faguri sau pe albinele adulte. T. clarae (< 1 mm lungime) și T. mercedesae (< 0,9 mm lungime) diferă ca dimensiune a corpului, dar în celelalte privințe sunt asemănătoare. T. koenigerum este puțin mai mic (cca. 0,7 mm lungime) (18).
Acarienii de sex feminin sunt de aproximativ 1 mm lungime și 0,6 mm lățime; masculul este ușor mai mic. Acarienii sunt dificil de detectat din cauza dimensiunii lor mici și culoarea maronie, dar ei pot fi văzuți sub lupă sau folosind un microscop de disecție pentru a examina un figure cu puiet suspectat ca fiind infestat.
Atunci când suprafața de examinare este reprezentată de un borcan iluminat, acarienii pot fi văzuți mișcând pe pereții din sticlă. Acarienii poat fi luați cu o perie fină umezită cu alcool (15).
Femelele se diferențiază morfologic prin structura discului anal ventral și crestătura subapicală a chelicerilor.
Tropilaelaps spp. poate fi recunoscut și diferențiat cu ușurință de acarienii Varroa cu ajutorul stereomicroscopului (fig. I.4.7., a și c). Corpul acarianului Varroa este mai mult lat decât lung și se mișcă încet, în timp ce corpul acarianului Tropilaelaps este alungit, are un scut holoventral, puternic sclerozat și se deplasează cu mare viteză.
Larvele acarianului Tropilaelaps spp. sunt observate cu ușurință pe tegumentul larvelor de albine sau de trântori. Sunt de culoare albicioasă și sunt aproape imobile cât timp se hrănesc pe gazdele lor, timp în care aparatul masticator și picioarele anterioare le sunt fixate de tegumentul albinei (larvei) parazitate. Gradul infestării poate fi stabilit prin descăpăcirea unui numar prestabilit de celule cu larve de albine și/sau trântori, extensivitatea fiind calculată procentual; din total celule cu larve, câte sunt parazitate (18).
Examenul microscopic
Probele de albine vii și cele de fagure cu puiet căpăcit/necăpăcit sunt
pregatite astfel:
̶ albinele vii sunt recoltate, de preferință, într-un borcan cu gura largă. Borcanul se scutură brusc în așa fel încât albinele să cadă pe fundul lui și să formeze un strat de 2,5 – 5,1 cm. Se îndepărtează capacul borcanului și cu un pulverizator se stropesc albinele, timp de 2 secunde, cu eter etilic. În lipsa eterului etilic, albinele se acoperă cu o soluție de alcool etilic de 70% sau apă cu săpun sau se adaugă cca. 25 de grame de zahăr pudră sau făină. Dacă se utilizează eter, se închide recipientul cu un alt capac și se agită sau se răstoarnă borcanul pentru cca. 10 secunde; acarienii ar trebui să adere de pereții borcanului. Dacă se utilizează săpun sau alcool, se agită borcanul și apoi se strecoară albinele printr-un material textil aspru sau printr-o sită; acarienii vor rămâne în lichid. Dacă se utilizează zahăr sau făină, se pune material filtrant la gura recipientului și se scutură acarienii pe hârtie albă în vederea numărării; acțiunea se repetă la fiecare 2 minute. Ultima procedură poate fi finalizată cu o soluție pe bază de alcool sau apă cu săpun, pentru a recolta toți acarienii;
̶ la fagurii cu puiet căpăcit sunt îndepartate căpăcelele celulelor cu un instrument tip furculiță – descăpăcitor – pentru vizualizarea larvelor de albine. În cazul prezenței acarianului, larvele acestuia sunt fixate pe tegumentul larvelor de albine (fig. I.4.7., b);
̶ în afară de aceste metode, acarianii pot fi recoltați și în stup, folosind un suport cu adeziv (scandură, carton, hârtie, unse cu vaselină și acoperite cu o plasă cu ochiuri de 4 – 5 mm; pe margini plasa este prinsă cu bandă adezivă sau capse, pentru a nu permite albinelor să intre sub aceasta). Suportul adeziv se lasă pe fundul stupului timp de 3 zile, după care se examinează reziduul strâns. Pentru grăbirea acțiunii se pun 25 de grame de tutun de pipă în afumător și se afumă colonia de 6 – 10 ori, după care se închide stupul pentru 10 – 20 de minute. Suportul adeziv se scoate după alte 10 minute și se examinează. În loc de tutun se pot folosi acaricide pentru a îndeparta acarienii de pe albine și trântori (18).
Fig. I.4.7.: a). V.destructor/ T.clarae; b). larve parazitate; c). T. clarae, aspect ventral (37)
I.4.2.2.4. Aspergiloza (Stonebrood)
Aspergiloza este o boală care afectează deopotrivă larvele și albinele adulte, fiind produsă de Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, A. niger, și, uneori, sunt asociate și alte specii de Aspergillus.
Acești fungi sunt saprofiți ai solului, și sunt, de asemenea, patogeni pentru alte insecte, mamifere și păsări. Boala este greu de identificat în faza incipientă a bolii. Fungul crește rapid și formează un miceliu albicios-gălbui, caracteristic. Un preparat umed executat din larva infectată arată că miceliul penetrează întreaga insectă. După moarte, larva infectată se întărește și este foarte greu de sfărâmat (puiet pietrificat) (fig. I.4.8., b). În cele din urmă, ciuperca rupe tegumentul larvei și formează un înveliș fals. În această etapă, larva poate fi acoperită cu spori ai fungului, care au aspect de pulbere verde. Sporii de A. flavus sunt galbeni- verzui (fig. I.4.8., c), cei ai A. fumigatus sunt gri-verzui, iar cei de A. niger, negri. Acești spori pot deveni atât de numeroași încât umplu celulele fagurilor cu puiet afectat.
Aspergiloza poate fi, de obicei, diagnosticată pe baza simptomelor (fig. I.4.8., a), dar un rezultat pozitiv se obține prin identificarea fungului în mediul de cultură, în laborator, și
examinarea ulterioară a caracterelor morfologice. Aspergillus spp. poate
fi cultivat pe dextroză + cartof sau mediul Sabouraud geloză+ dextroză (15).
Fig. I.4.8.: Aspergiloza. a, b: aspecte morfopatologice. c). Aspergillus flavus, aspect cultural (38, 39, 40)
Examenul microscopic
Din conținutul intestinal și/sau toracal al albinelor suspecte de îmbolnavire cu Aspergillus spp. , se realizează o suspensie în 5 – 10 ml, în apă distilată; miceliul se obține prin raclarea tegumentului larvelor și / sau albinelor adulte mumificate, cu ajutorul unui bisturiu.
În câmpul microscopic pot să apară miceliile septate ale fungilor din genul Aspergillus, din care se ramifică hife cu un diametru de 2 – 3 µm. Din hife se formează conidioforul cu vezicula aspergilară pe care se găsesc sterigmele. Din fiecare sterigmă iau naștere mai multe conidii, care sunt dispuse în lanț de formă ovală și dimensiuni cuprinse între 2 și 3 µm. Ajunși la maturitate, fungii au diferite culori și nuanțe, în functie de specie: Aspergillus flavus are culoarea galben – verzuie, Aspergilus fumigatus este verde – cenușiu, iar Aspergillus niger este negru.
Din punct de vedere morfologic, formațiunile descrise sunt asemanatoare la cele trei specii implicate în procesul morbid. Evidențierea acestor formațiuni în câmpul microscopic, permite stabilirea diagnosticului de aspergiloză (16).
I.4.2.3. Bolile albinelor adulte
I.4.2.3.1. Paralizia cronică
Din punct de vedere clinic, paralizia cronică se manifestă prin tremurături incontrolabile și imposibilitatea efectuării zborului. Albinele bolnave au aspect de furnică (fig. I.4.9.) și sunt scoase din stup de către congenerele sănătoase sau se plasează pe rama superioară a fagurilor. Tegumentul este de culoare neagră, strălucitor și fără perișori (fig. I.4.9.), acoperit cu o substanță care degajă un miros de pește (7).
Diagnosticul paraliziei cornice se pune pe baza semnelor clinice, prin mijloace serologice și prin reproducerea experimental a bolii.
Fig. I.4.9.Paralizia cronică (41). Fig. I.4.10.Viroza aripilor deformate (42)
Întrucât testele serologice nu sunt disponibile în orice laborator, cel mai la îndemână rămâne xenodiagnosticul. Acesta se poate realiza prin pulverizarea, hrănirea sau injectarea unor albine sănătoase cu un extract apos obținut prin mojararea albinelor bolnave. Extractul este preparat prin mojararea unei albine suspecte de boală într-un mililitru de apă, centrifugarea și apoi filtrarea extractului printr-un filtru cu porozitatea de 0,45 µm, pentru eliminarea bacteriilor. Administrarea extractului se face în sirop de zahăr, raportul fiind de 1:1. Pentru a alimenta 20 de albine sănătoase, plasate în cuști, este nevoie de 2 ml extract și 2 ml sirop de zahăr. Simptomele de paralizie cronică apar după 6 zile de la administrarea extractului suspect. În cazul aplicării extractului prin injectare, acest procedeu se realizează prin inocularea unui µl în hemocel printr-un spațiu dintre segmentele abdominale. Albinele de control, din această experimență, trebuie să fie tratate cu extract din albine sănătoase (15).
I.4.2.3.2. Virusul filamentos
Virusul filamentos poate fi pus în evidență prin examinarea hemolimfei în contrast de fază sau în câmp întunecat. Hemolimfa albinelor bolnave este de culoare alb-lăptos și conține particule virale care au aspect de bastonașe și dimensiune de 0,1-0,4µm (15), vizibile la MO.
I.4.2.3.3. Paralizia acută
Virusul paraliziei acute (APBV) reacționează încrucișat cu virusul de Kashmir, astfel că la infecția cu unul dintre aceste două virusuri, reacția serologică va fi pozitivă și pentru celălalt virus. Virusul paraliziei acute afectează albinele adulte, fiind deseori diagnosticat la albine aparent sănătoase.
Paralizia acută poate fi diagnosticată prin imunodifuzia în gel de agar și PCR (15).
I.4.2.3.4. Septicemia
Septicemia albinelor adulte este produsă de Pseudomonas aeruginosa, care este un bacil Gram-negativ, cu dimensiuni de 0,5-0,8/1,5-3,0 µm, dispus în lanțuri scurte, câte doi sau solitari.
Pseudomonas aeruginosa determină distrugerea țesutului conjunctiv de la nivelul toracelui, membrelor, aripilor și antenelor, astfel că albinele afectate se dezintegrează la cea mai neînsemnată atingere. Albinele bolnave degajă un miros de putrefacție.
Identificarea bacteriei se face prin efectuarea unui frotiu prin detașarea unei aripi, înmuierea ei într-o picătură de apă și apoi glisarea acesteia pe o lamă. După fixare, frotiul se colorează prin metoda Gram (fig. I.4.11.)
Fig. I.4.11.P.aeruginosa,col.Gram(43). Fig. I.4.12. Spiroplasma melliferum, aspect cultural (2)
Izolarea bacilului se face prin însămânțarea pe medii obișnuite sau pe mediul agar Pseudomonas F. Incubarea se face la 37șC. Cultura este caracteristică datorită prezenței pigmentului galben-verzui (piocianina), vizibil în lumina ultravioletă cu lungimea de undă de 260 nanometri (15).
Caractere culturale. În mediul lichid prezintă turbiditate intensă, depozit abundent ușor omogenizabil, peliculă la suprafață, uneori pigment spre suprafața mediului. Pe agar, coloniile sunt rotunde, neuniforme, semitransparente și pigmentate.
Proprietăți biochimice: nu produce indol și nici H2S, nu fermentează fructoza, galactoza, arabinoza, maltoza, zaharoza, dextrina, inulina, glicerolul, manitolul și dulcitolul. Produce hemoliză, reduce nitrații, lichefiază gelatina, reduce albastrul de metilen și roșul neutru, hidrolizează ureea și produce catalază (10).
Xenodiagnosticul se realizează prin obținerea unui extract dintr-o albină suspectă/1 ml apă și scufundarea unui număr de 20 de albine în extractul infecțios sau inocularea intratoracală a fiecărei albine cu câte 1 µl. Albinele mor în decurs de 24 de ore, iar mirosul de putrefacție este resimțit la 48 de ore p.i. (15).
I.4.2.3.5. Spiroplasmoza
Spiroplasma spp. (S. apis și S. melliferum) afectează albinele adulte. Spiroplasmele sunt bacterii helicoidale, uneori filamentoase, mobile, fără perete celular și dimensiuni de 0,7-1,2 / 2,0-10 µm. Sunt izolate din hemolimfa albinelor. Genul Spiroplasma este încadrat în ordinul Entomoplasmatales, familia Spiroplasmataceae. Se întâlnește la plante și insecte. Identificarea spiroplasmelor se face prin efectuarea unui frotiu din hemolimfa obținută prin puncționarea hemocelului cu un vârf de tub capilar (vârful unei pipete Pasteur) a membranei intersegmentale din spatele primei coxe. Cultivarea bacteriei se face pe mediul standard pentru Mycoplasma (GIBCO) sau în mediul Singh cu adios de 20% ser fetal de vițel (fig. I.4.12) (15).
I.4.2.3.6. Amoebioza
Amoebioza este o protozooză a tuburilor Malpighi, întâlnită la albinele adulte și care este produsă de Malpighamoeba mellificae (fig.I.4.13., a, b, c).
Identificarea protozoarului: din proba de 25 – 50 g albine (albină totală sau numai abdomenul separate de cap, torace, aripi și piciorușe) se execută un mojarat cu 5 – 10 ml de apă distilată sau de robinet. Din acest mojarat, cu pipeta Pasteur, se prelevează 1 – 2 picături care se etalează între lamă și lamelă, în așa fel încât între acestea să existe soluție de continuitate.
În cazul în care se face examenul individual, se procedează în felul următor: cu o pensă se prinde ultimul tergit și se extrag astfel tubii Malpighi. Piesa astfel obținută, se etalează pe o lamă într-o picatură de apă sau lactofenol, se aplică lamela și se compresează ușor.
Fig. 4. 13. a). M. mellificae. b). 1. M. mellificae; c). M. mellificae, (44) 2. Nosema apis (45) col. Giemsa (46)
Examinarea preparatelor, și într-un caz și în celălalt, se face la microscopul optic cu obiectiv 40 x , ocular 7 x sau 10 x, condensatorul ușor coborat pentru contrast.
Prezența în câmpul microscopic a chisturilor de formă rotundă sau ovală (fig. I.4.13., a și b), de dimensiuni cuprinse între 6 și 8 µm, cu membrană densă și contur dublu , constituie rezultat pozitiv pentru Malpighamoeba mellificae (16).
I.4.2.3.7. Nosemoza
Nosema apis, forma vegetativă, se dezvoltă în celulele epiteliale ale ventriculului, la albinele adulte. Este un protozoar ai cărui spori ovali (fig. I.4.14.) au dimensiunea de 2-4/4-6 µm. Sporii reprezintă forma de rezistență. Boala apare cu precădere spre sfârșitul iernii și primăvara timpuriu, pînă la sfârșitul lunii mai, începutul lunii iunie.
Clinic, nosemoza se manifestă prin eliminarea de fecale diareice, iar anatomopatologic prin modificări a culorii intestinului (fig. I.4.15.), care din maro-gălbui devine albicios, are consistență scăzută și este plin cu materii fecale lichide, urât mirositoare și gaze.
Diagnosticul de certitudine se pune prin examen microscopic. Pentru ca sporii de Nosema apis să nu fie confundați cu sporii fungilor care se dezvoltă în cadavrele vechi, probele de albine, dacă nu sunt examinate imediat, vor fi conservate în alcool sau vor fi uscate (15).
Examenul microscopic
Examenul coproparazitologic se practică la albinele vii și matcă. În acest caz, albinele sau matca nu sunt sacrificate. Fecalele pot fi colectate pe un suport de sticlă plasat la intrarea în stup, izolarea reginei sau a unor albine vii într-o placă Petri sau într-o eprubetă 18/20 timp de aproximativ o oră. Fecalele obținute, prin oricare procedeu, vor fi plasate pe o lamelă, amestecate cu o picătură de apă, și apoi examinate la un microscop obișnuit (15).
Metoda semicantitativă. Din proba de 25 – 50 g albine (albină totală sau numai abdomenul separat de cap, torace, aripi și piciorușe) se execută un mojarat cu 5 – 10 ml de apă distilată sau de robinet. Din acest mojarat, cu pipeta Pasteur, se prelevează 1 – 2 picături care se etalează între lamă și lamelă, în așa fel încât între acestea să existe soluție de continuitate.
În cazul în care se face examenul individual al conținutului intestinal, se procedează în felul urmator: cu o pensă se prinde ultimul tergit și se extrage tubul intestinal. Piesa astfel obținută, se etalează pe o lamă într-o picatură de apă, se aplică lamela și se compresează ușor pentru a se elimina conținutul intestinal.
Examinarea preparatelor și într-un caz și în altul, se face cu microscopul optic cu obiectiv 40 x sau 20 x , ocular 7 x sau 10 x, condensatorul ușor coborat pentru contrast (16).
Determinarea cantitativă. Din proba de lucru de cel puțin 10 g (200 albine) se realizează minimum 2 eșantioane a câte 60 de albine. Abdomenul a 60 de albine lucrătoare este mojarat în 40 ml de apă distilată, după care este filtrat printr-o sită formată din două straturi de tifon din bumbac, așezate într-o pâlnie care se varsă într-un tub de centrifugă. Apoi se iau încă 20 ml de apă cu care se spală mojarul și pistilul. Această subprobă se toarnă peste mojaratul inițial de 40 ml, realizându-se astfel 60 ml de suspensie de triturat de abdomene de albine. Din această suspensie se iau două eșantioane a câte 10 ml și se introduc în două tuburi de centrifugă de 15 cc. Se echilibrează tuburile de centrifugă și apoi sunt centrifugate la 25ș C, 800 de rotații/minut, timp de 6 minute, după care supernatantul este îndepărtat. În tubul de centrifugă, peste sediment, se adaugă apoi 10 ml de apă, după care se ia o pipetă și se barbotează conținutul tubului pentru omogenizare. Operația de centrifugare se poate relua de două – trei ori, până când conținutul tubului devine clar. La final, se realizează o anumită concentrație de spori de la o albină/ml de apă ( 10 albine/10 ml apă).
Din suspensia de spori obținută, se aspiră cu pipeta automată monocanal de 5 sau 10 µl, în funcție de ce diluție dorim să obținem (1/200 sau 1/100). În prealabil, hemocitometrul se pune pe platanul microscopului, iar lamela se fixează cu ajutorul călăreților. Se încarcă camera de numărat prin depunerea unei picături din suspensia de spori în șanțurile laterale. Prin capilaritate, lichidul pătrunde în camera de numărare. Se lasă 5 minute, apoi se începe numărarea sporilor.
Camera de numărare Thoma are un pătrat mare care include 16 pătrate medii, iar fiecare pătrat mediu are 16 pătrate mici.
Numararea sporilor se face în cinci pătrate medii începând cu primul pătrat din stânga sus, se continuă cu încă trei pătrate medii în diagonală, iar al cincilea pătrat se citește într-un colț opus. În total se citesc 80 de pătrate mici. Citirea pătratelor mici începe cu primul din stânga sus. Se numără toți sporii prezenți în interiorul pătratului mic și cei aflați pe laturile stânga și sus, operațiunea continuând la fel și în urmatoarele pătrate mici, de la stânga la dreapta, la fel și pe rândurile inferioare.
Tabel nr. 4.1. Diferențele morfo-fiziologice dintre Nosema apis și Nosema
ceranae (după Huang, 2011)
Fig. I.4.14. N. ceranae și N. apis (47) Fig. I.4.15. Nosemoză:
sus, intestin parazitat;
jos,intestin neparazitat(48)
În acest fel se numără toate cele 16 pătrate mici din primul pătrat mijlociu. Numărarea sporilor continuă în același mod cu pătratul mijlociu doi, pe diagonală s.a.m.d. Rezultatele numărării se trec într-o fișă de citire care imită forma pătratelor medii și sunt numerotate de la a-1 la a-16, pentru fiecare pătrat mediu.
Trebuie să menționăm că se pot număra și zece pătrate medii, pe hemocitometrele Bürker-Türk, însă rezultatul final se împarte la doi.
Formula de calcul este următoarea : Z = α/β . ε . 250.000, în care : Z = nr. de spori/albină ; α = nr. de spori numărați; β = nr. de pătrate numărate ; ε = factor de diluție.
Examinarea preparatelor, în toate cazurile, se face cu microscopul optic, obiectiv 40 x , ocular 10 x, condensatorul ușor coborat, pentru contrast (18).
Determinarea simultană a sporilor de N. apis și a chisturilor de M. mellificae
Această metodă constă în examinarea individuală a coloniilor folosind 60 de albine per colonie. Abdomenele albinelor moarte sunt mojarate în 5-10 ml de apă; volumul de apă folosit este raportat la numărul și starea albinelor. Suspensia trebuie filtrată pentru a îndepărta resturile care ar interfera rezultatul examinării, printr-o sită cu două filtre ; primul filtru (sită) cu dimensiunea ochiurilor de 100 µm, iar al doi-lea filtru (sită) cu dimensiunea de 40 µm. Fragmentele de tuburi Malpighi trec prin sita cu ochiuri de 100 µm, dar se opresc în sita cu ochiuri de 40 µm. Apoi, fragmentele de tuburi Malpighi sunt colectate de pe sita cu ochiuri mici și sunt trecute într-o cameră de numărare pentru bacterii, fiind examinate la obiectiv 400x. Chisturile de M. mellificae sunt vizibile în interiorul tuburilor malpighieni. Structura tuburilor nu este vizibilă, iar în cazul unei infecții cu M. mellificae, nu toate tuburile sunt parazitate. Pentru un diagnostic pozitiv, în cazul amoebiozei determinată de M. mellificae, numai prezența chisturilor în interiorul tuburilor malpighieni poate fi luată în considerare, deoarece M. mellificae este adesea confundată cu spori de ciuperci sau celule de drojdii (18).
Cultivarea protozoarului Nosema spp. pe culturi celulare. Nosema apis și N. ceranae pot fi cultivate, ,,in vitroˮ, pe celule de lepidoptere. Liniile de celule sensibile sunt: MB-L2 (Mamestra brassicae), Sf-158 și Sf-21 (Spodoptera frugiperda), SPC-BM-36 (Bombyx mori), IPL- LD-65Y (Lymantria dispar), și ITO-Tn-5B1-4 (Trichoplusia ni). Liniile celulare pot fi obținute din colecții naționale de celule, împreună cu protocoalele de însămânțare și întreținere. Procedeele nu sunt încă bine puse la punct, astfel că nu permit creșterea continuă a Nosema spp. pe culturi celulare. Din această cauză, și în continuare, sporii în cantități mari, sunt obținuți tot pe albine (18).
Reacția în lanț a polimerazei (PCR). Sunt disponibile mai multe metode pentru diferențierea speciilor de Nosema. Recent, a fost dezvoltată o metodă de identificare simultană prin PCR a N. apis, N. ceranae și N. bombi (18).
I.4.2.3.8. Acarapioza
Acarapioza este o endoparazitoză produsă de acarieni ai genului Acarapis. Genul Acarapis este format din trei specii: A. woodi, A. externus și A. dorsalis (fig. I.4.19). Acarapis woodi se localizează exclusiv în traheele protoracice și este agentul etiologic al acarapiozei, iar celelelalte două specii se găsesc pe tegument. A. externus populează zona situată între cap și torace, iar A. dorsalis este găsit, de obicei, în canalul dorsal situat între mezoscutum, mezoscutelum și baza aripilor. Aceste două specii nu sunt patogene.
Clinic, simptomele nu sunt caracteristice. Pot fi semnalate: aripi disparate, imposibilitatea efectuării zborului, abdomen balonat.
Diagnosticul se pune numai prin examinarea traheelor (15).
Recoltarea probelor pentru examenul de laborator ar trebui să se facă toamna și iarna, atunci când numărul acarienilor este mai mare. Sunt recoltate albine muribunde sau, la urdiniș, cele ce părăsesc sau revin în stup și au o talie mai mare. Dacă nu sunt examinate imediat, albinele capturate sunt conservate, după care sunt omorâte (15) prin congelare (- 20ș C) sau cu etanol (18), cât se poate de repede, în alcool etilic 70%, alcool metilic sau alcool izopropilic (15). Ele pot fi păstrate o perioadă nedeterminată și în conservantul Oudemann, care are compoziția: acid acetic glacial = 80 ml; glicerol = 50 ml; etanol 70% =870 ml (18).
Examenul microscopic
a) Examenul microscopic direct a trunchiurilor traheale. Albinele vii sau muribunde se țin la frigider 2 – 3 ore sau vor fi omorate cu cloroform sau eter. Apoi, fiecare albină se fixează între degetul mare și arătătorul mâinii stângi , iar cu ajutorul unui bisturiu sau foarfeci , se detașează capul împreună cu prima pereche de piciorușe,punându-se astfel în evidență trunchiurile traheale. Piesele astfel pregătite, se fixează prin torace cu un ac cu gămălie la marginea suportului circular din parafină, cu partea ventrală în sus , ușor recurbate. Se pregătesc minimum 25 de piese (16).
b) Examenul microscopic direct a traheelor toracice.
Se detașează abdomenul și capul cu primele perechi de piciorușe de torace. Rămân descoperite trunchiurile traheale, care sunt examinate la stereomicroscop sau lupă binoculară la o mărire de 20-30x. Apoi se scoate scleritul pleural al primului segment toracic și o parte din al doi-lea tergit toracic. După îndepărtarea musculaturii de deasupra, sunt expuse cele două trahee toracice. Diagnosticul pozitiv constă fie din prezența melanizării pe unul sau pe ambele trahee sau a prezenței corpurilor ovale translucide (ouă, larve, protonimfă, deutonimfă, adulți) în trahee (fig. I.4.18.). Pentru examinare la microscop, se scot traheele și se pun pe o lamă, înt- o picătură de apă. Preparatul se examinează cu ocular 10x, obiectiv 10x (17).
c) Examenul traheelor toracice obținute prin macerare. Prin această metodă obținem discuri toracice subțiri, secționate cu o lamă ascuțită, după ce au fost îndepărtate capul, prima pereche de piciorușe și gulerul care înconjoară deschiderea gâtului, pentru a vizualiza traheele. Se verifică apoi prima pereche de stigme (acarienii intră în trahee prin stigme) pentru a vedea dacă nu sunt acarieni, în acest fel descoperindu-se infestațiile slabe. Infestările puternice sunt ușor vizibile datorită culorii maro închis sau negre a traheelor și prezenței acarienilor. După ce am examinat prima pereche de stigme, efectuăm secțiuni fine, transversale, pe torace, cu o lamă de ras bine ascuțită și astfel obținem niște discuri, care au la exterior exoscheletul toracic, iar în interior traheele. Discurile vor fi tratate pentru îndepărtarea țesutului muscular astfel: prin încălzirea ușoară într-o soluție de 8% de hidroxid de potasiu timp de aproximativ 20 minute, după care sunt examinate, sau digerarea musculaturii în aceeași soluție, dar fără încălzire. Acestea din urmă vor fi examinate a doua zi. Piesele obținute sunt examinate la un stereomicroscop sau lupă bioculară la o mărire de 18-20x. Discurile (traheele) pot fi examinate și la MO, cu obiectiv 10x, ocular 10x. pe o lamă cu o picătură de glicerină sau apă. Acarienii sunt ușor de văzut prin peretele transparent și apar ca organisme mici, ovale.
Aceasta este cea mai simplă și mai sigură tehnică de diagnostic de laborator a acarapiozei, permițând detectarea infestațiilor incipiente și intensitatea acestora (slabă, puternică, masivă) (18).
d) Examenul depozitului de centrifugare după mărunțirea toracelui albinelor.
Această metodă este ușor de executat, dar mai puțin precisă, deoarece în depozitul de centrifugare se pot afla și acarieni externi (A. externus, A. vagans și A. dorsalis), care nu sunt patogeni pentru albine, dar se pot confunda cu Acarapis woodi. Prin urmare, această metodă ar trebui să fie aleasă numai în cazul în care este necesară o estimare aproximativă a gradului de infecție într-o regiune. Nu este adecvată pentru stabilirea unui diagnostic într-un focar nou.
Mod de lucru. Se iau, aleatoriu, aproximativ 200 de albine din colonii suspecte, li se îndepărtează capul, abdomenul, aripile și piciorușele, iar toracele sunt puse într-un recipient de capacitate 100 ml, umplut cu apă 1/4. Această suspensie este omogenizată de trei ori, de fiecare dată timp de câteva secunde, într-un omogenizator la 10000 rpm, cu adaos de apă. Suspensia rezultată este măcinată printr-o sită ( 0.8 mm), după care sita este clătită cu apă până la un volum final de aproximativ 50 ml. Filtratul este centrifugat la 1500 g timp de 5 minute, după care fluidul supernatant este îndepărtat. Câteva picături de soluție de acid lactic nediluat se adaugă la resturile de pe fundul fiolei de centrifugare, care, posibil, v-a conține acarieni. Acest amestec este lăsat timp de 10 minute, pentru a se dizolva fibrele musculare. După acest interval, depozitul este transferat pe lame de microscop pentru examinare (18).
e) Evidențierea acarianului A. woodi prin colorare cu albastru de metil.
Pentru evidențierea acarianului prin colorare cu albastru de metil, albinele vii sau muribunde sunt omorâte în același mod. Apoi albinele sunt fixate pe suportul din parafină, pe partea dorsală; capul și aripile sunt îndepărtate cu ajutorul unei pense, iar cu un bisturiu bine ascuțit se execută două secțiuni fine, transversale , de 1 – 1,5 mm grosime, prin toracele albinei. Prima secțiune se execută în zona membranei din spatele perechii anterioare de picioare, pentru a le îndeparta împreună cu capul, iar a doua în dreptul perechii mijlocii de picioare, la baza aripilor. Se pregătesc 50 de piese (albine).
Piesele pregătite sunt examinate la stereomicroscop , urmărindu-se fiecare trunchi traheal. În cazul unei probe suspecte, se extrag traheele prin îndepărtarea musculaturii toracale cu ajutorul unui ac de disociere, prin manipulări fine sub lupă. Apoi, traheele sunt etalate într-o picătură de apă distilată pe o lamă de sticlă. Piesa se acoperă cu o lamelă și se examinează la microscop cu ob. 40x , oc. 7x sau 10x (16). Traheele mai pot fi examinate și după ce peste ele a fost pusă o picătură de acid lactic 85% (15).
Fig. I.4.18. Acarapis woodi Fig. I.4.19. a): Acarapis dorsalis; b): A. externus în trahee (51) c): A. woodi (52)
Piesele anatomice (torace) prelevate sunt mojarate timp de 10 minute , prin mișcări ușoare în hidroxid de potasiu, sol. 8%, până când țesutul intern este disociat și îndepărtat de țesutul chitinos care rămâne intact. Mojaratul se filtrează prin tifon sau sită triplă pentru îndepărtarea țesutului chitinos, se spală cu apă de robinet și apoi se colorează prin imersie în baia de colorare cu albastru de metil salin 0,85%, timp de 1 – 2 minute. După scurgerea acestui timp, secțiunile sunt diferențiate în apă distilată 2 – 5 minute, după care se clătesc într-o baie de alcool etilic de 70ș. Ulterior, piesele sunt introduse în trei băi de alcool etilic de 96ș, timp de 6 ore. Secțiunile astfel colorate sunt montate, între lamă și lamelă, într-un lichid uzual (ex.sol. Ringer). Preparatele astfel obținute sunt examinate la microscop cu ob. 80x sau 100x, ocular 7x sau 10x (16).
f) Diagnosticul imunoenzimatic (ELISA) este posibil, dar dă rezultate fals – pozitive, astfel că este recomandat numai pentru efectuarea examenelor de supraveghere (sondaj) (18).
g) Determinarea guaninei. Guanina este o bază purinică azotată prezentă în excrețiile acarienilor. Se poate determina prin analize chimice (18).
Identificarea parazitului și diagnosticul diferențial
Traheele normale sunt de culoare albă – sidefie, transparente, tubulare, cu segmentația evidentă, curate și elastice. Când acestea prezintă modificări anatomopatologice sub formă de aglomerări cretacee, incrustații ruginii, pete maron – negricioase, proba este suspectă de acarapioză și traheea trebuie să fie examinată la microscop.
In cazul infecției cu Acarapis woodi, în interiorul traheei, acarianul apare perfect vizibil, de formă ovală, segmentat și cu dimensiuni cuprinse între 123 – 180 / 70 – 100 µm femela și 85 – 116 / 57 – 85 µm masculul ; în trahee, uneori, pot fi observate stadiile de dezvoltare ale acarianului (ou, larvă, nimfă). Ouăle au dimensiuni cuprinse între 60 și 120 µm.
Prin colorare cu soluția salină de albastru de metil, paraziții au o culoare albastră intens, iar traheea este de culoare albastru mai deschis (16).
Tabel nr. I.4.2. Diagnosticul diferențial al speciilor genului Acarapis (după Ritter, 1996, citat de 18)
I.4.2.3.9.Gregarinoza
Gregarinele (fig. I.4.21) care afectează albina meliferă fac parte din ordinul Gregarinida. Acestea sunt: Monoica apis, Stammeri apigregarina, Rousseaui acuta și Leidyana apis. Formele morfologice imature ale gregarinelor (cefalonți) au dimensiuni cuprinse între 16-44 µm, iar sporonții (forma matură) între 35 și 85 µm. Cefalonții au formă ovală și sunt formați din două structuri distincte, segmentul posterior fiind mai mare. Forma matură a gregarinelor are segmentul anterior mai mic. Gregarinele parazitează la nivelul epiteliului intestinal.
Diagnosticul gregarinozei se pune prin examinarea intestinului, între lamă și lamelă într-o picătură de apă, la un microscop compus, cu obiectiv low-power (15).
I.4.2.3.10. Flagelatoze
La albine parazitează specii de flagelate din genul Crithidia (Leptomonas). Dimensiunea lor variază de la 5 la 30 µm, la unele flagelii fiind dispuși peritrih, la altele flagelul este lung, iar unele flagelate sunt rotunde și fără flageli.
Examenul microscopic direct se face pe intestinul obținut după separarea de rect, între lamă și lamelă, într-o picătură de apă sau pe maceratul realizat prin mojararea intestinului (14). Crithidia mellificae a fost izolată și cultivată pe mediul NNN modificat cu mediul Cowper-Thwaite, pH între 4,5 și 5,5 (optim pH 5). În acest mediu de cultură și cu pH optim, critidiile supraviețuiesc timp nedefinit (4). Crithidia bombi parazitează la bondari (fig. I.4.20).
Fig. I.4.20. Crithidia bombi (58) Fig. I.4.21: Ciclul biologic la Gregarina spp.
Trofozoit cu epimerite; b. gamonți uniți;
Gametociți în faza de sporulare;
Sporoblaști (14)
I.4.2.4.Interacțiuni patogene
Nu de puține ori, practicienii se confruntă cu infecții mixte, astfel că trebuie să prioritizeze importanța fiecărui agent patogen în declanșarea procesului morbid. În astfel de situații este importantă deplasarea specialistului în stupină, examinarea clinică a coloniilor de albine bolnave și recoltarea probelor concludente pentru stabilirea unui diagnostic valid.
Infecțiile mixte mai des întâlnite sunt: ascosferoză + puiet în sac sau ascosferoză + puiet în sac + locă americană, cu toate că se cunoaște că o colonie de albine nu poate fi infectată de mai mulți agenți infecțioși. De acest aspect trebuie să se țină seama la eșantionarea probelor ajunse în laborator (15).
Paenibacillus larvae produce substanțe inhibitorii de tipul antibioticelor care elimină bacteriile asociate cu bolile puietului de albine. Din această cauză, loca americană și loca europeană sunt foarte rar întâlnite în aceeași colonie de albine, cu excepția situațiilor în care puietul este deja bolnav de locă europeană (15).
Ascosphaera apis produce acid linoleic care inhibă creșterea bacteriilor Paenibacillus larvae și Melissococcus plutonius. În SUA, incidența îmbolnăvirilor de locă europeană a scăzut foarte mult de la introducerea ascosferozei în coloniile de albine, însă incidența locii americane a rămas constantă (15).
Infecțiile mixte sunt mai frecvente la albinele adulte. Se întâlnesc destul de des, infecțiile cu Nosema spp., virusuri sau Spiroplasme, precum și infestații cu una sau mai multe specii de acarieni (15).
I.4.2.5.Intoxicațiile
I.4.2.5.1.Intoxicațiile cu pesticide
Intoxicațiile cu pesticide apar din primăvară până în toamnă, ca urmare a efectuării tratamentelor cu substanțe chimice în livezi, vii și culturi agricole.
Fig. I.4.22. Intoxicație cu pesticide (albine lucrătoare moarte în jurul stupului și la urdiniș).
Clinic, intoxicațiile acute se manifestă prin mortalitate crescută în rândul albinelor adulte (fig. I.4.22). Acestea mor pe teren sau în apropierea stupilor. Albinele devin agresive, iar la urdiniș au loc lupte similare cu cele din furtișag. Albinele intoxicate sar, se rotesc, se târăsc și se curăță necontenit; la unele aripile sunt răsucite și apar convulsiile successive, după care mor cu trompa prolabată. Albinele mor și în afara stupului și în stup, caz în care se poate bloca urdinișul (11).
În intoxicațiile subacute și cronice, mortalitatea albinei adulte este mai mică și ca urmare, coloniile devin mai slabe, prin reducerea numărului de albine culegătoare. În scurt timp apare mortalitate și la puiet, astfel că albinele doici scot în afara stupului un număr mare de larve și pupe moarte. Regina depune din ce în ce mai puține ouă de albine lucrătoare, populația stupului se micșorează treptat, astfel că în final, colonia de albine moare (11, 15).
I.4.2.5.2.Intoxicațiile cu plante
Intoxicațiile cu plante otrăvitoare apar în anumite zone, pentru perioade scurte de timp, limitată la perioada de înflorire a plantei respective, cînd nectarul este toxic sau se prelungește până când dispare polenul din faguri, în cazurile în care acesta este toxic.
La ora actuală nu există metode pentru diferențierea intoxicațiilor de natură chimică de cele datorate polenului sau nectarului toxice.
O suspiciune de intoxicație cu plante toxice poate fi invocată în cazul în care aceasta apare în aceeași zonă, în aceeași perioadă, în fiecare an, în timp ce intoxicațiile cu pesticide apar în mod aleatoriu. Dintre plantele otrăvitoare pentru albine amintim Cyrilla racemiflora, Aesculus californica, Asclepias spp. (15), precum și plantele ce fac parte din ordinele ranunculaceelor, tiliaceelor și hipocastanaceelor (7).
I.4.2.6.Dăunătorii albinelor
I.4.2.6.1.Infestația cu Braula coeca
Brauloza este o parazitoză produsă de Braula coeca (fig.I.4.17), care are importanță
practică doar pentru că agentul etiologic seamănă cu Varroa destructor (fig. I.4.16), iar larvele insectei pot deteriora aspectul comercial al mierii.
Examenul de laborator. Probele de fagure se descăpăcesc și se examinează partea ventrală a căpăcelelor, direct, macroscopic sau stereomicroscopic; femela dipterului depune ouă sub căpăcele. După extragerea mierii se examinează interiorul celulei la stereomicroscop, unde pot fi depistate stadiile de dezvoltare ale parazitului; ou, larvă și nimfă. Resturile de ceară și de propolis se examinează pentru evidențierea ouălor.
Albinele, mătcile și trântorii se examinează macroscopic sau stereomicroscopic și trebuiesc avute în vedere inserțiile torace – abdomen și cavitatea de la baza glosei extinse a albinei, lângă deschiderea ductului glandelor salivare, zonă în care se hrănește parazitul.
Albinele omorâte cu alcool etilic, eter de petrol sau după spălare cu apă și detergent, sunt filtrate prin sită. În acest mod paraziții sunt antrenați de lichid în vasul de sub sită; în cazul prezenței acestora, sunt detectați cu ochiul liber sau la stereomicroscop, în depozitul rămas pe sită.
Fig. I.4.16: sus = B. coeca, dreapta = V. destructor, Fig. I.4.17. B. coeca, vedere dorsală (50)
Jos = T. clarae, stânga = Multtiphis alvearius (49)
În reziduul supus operațiunii de uscare – spălare, paraziții adulți vor putea fi observați la suprafața vasului, în lichidul de spălare.
Parazitul adult se recunoaște după următoarele caractere morfologice:
corp aproape sferic, lung de 1,5 mm, lat de 0,9 – 1 mm, înveliș chitinos de culoare brun-roșcată, acoperit în întregime cu perișori negri;
trei perechi de picioare terminate cu mici ventuze de prindere;
aparat bucal adaptat pentru supt și lins.
Oul are dimensiuni de 0,76/0,37 mm, de formă ovală și este de culoare alb-mată.
Larva este ovală, în lungime de 0,8-2 mm, este de culoare alb-transparentă și are două cârlige bucale tipice (16).
I.4.2.6.2. Infestația cu gândacul mic de stup (Aethina tumida)
Aethina tumida este întâlnit frecvent în stupinele din Africa de Sud, la care, însă, nu produce pagube economice.
În sudul SUA, coleopterul determină pagube economice însemnate prin distrugerea coloniilor de albine și alterarea produselor stupului. După ecloziune, larvele parazitului se hrănesc cu polen, miere și puiet de albine. Mierea din fagurii pe unde au trecut și s-au hrănit larvele coleopterului se decolorează, fermentează și capătă miros de fructe putrede (15).
Parazitul adult se recunoaște după urmatoarele caractere morfologice: culoare galben – maronie, aspect luminos la cei tineri, pentru ca în scurt timp chitina să devină maro – închis și în final neagră. Dimensiunea acestuia este de 0,5/0,25 cm, aripile sunt scurte și chitinoase, chitina este de culoare neagră și acoperită de peri fini (fig.I.4.23) . Trăiesc până la 6 luni.
Oul are dimensiunile de 1,4 / 0,26 mm, formă ovală și culoare alb-sidefie. Pot fi întâlnite oriunde în interiorul unui stup (inventar apicol și faguri).
Larva este alungită, de cca 1 cm lungime (fig. I.4.24.), de culoare alb-gălbuie, cu aspect sidefiu, prevazută cu trei perechi de picioare anterioare.
Pupa este la început de culoare albă, după care începe să se pigmenteze (18).
În cazul în care probele recoltate pentru stabilirea diagnosticului, nu ajung repede la un laborator, vor fi păstrate în alcool etilic de 70ș (15).
Examinarea oualor, larvelor și pupelor coleopterului
Ouăle sunt albe și au formă de bob de fasole (cca 2/3 din mărimea unui ou de albină) și sunt depozitate în grămezi de până la 210 bucăți, în crăpăturile sau pe fundul stupului, pe faguri și sub stup. Larvele sunt albicioase, adeseori acoperite cu un strat subțire lipicios, au până la 1,2 cm lungime (faza de migrare), trei perechi de picioare și spiculi dorsali. Larvele pot fi găsite săpând galerii în faguri sau în detritusuri.
În migrare, larvele lasă urme uleioase în interiorul și în exteriorul coloniei. Astfel de larve migratoare și pupe (albicioase, cca. 5 mm lungime și 3 mm lațime) pot fi găsite în mici camere de împupare, în pământ la 1 – 20 de cm adâncime, de obicei în imediata apropiere a coloniilor (<180 cm).
Fig. I.4.23. Aethina tumida (53) Fig. I.4.24. Aethina tumida (larve) (54)
Examinarea coloniei. Examinarea stupului poate asigura indicii timpurii ale infestării cu Aethina tumida. Adulții pot fi observați ascunzându-se în celule și în detritus.
Examinarea coloniilor începe prin îndepărtarea capacului stupului și plasarea acestuia cu fundul în sus pe sol, alături de stup. Se îndepărtează caturile superior și inferior și se așează pentru câteva minute pe capacul răsturnat. Deci, se plasează stupul cu urdinișul în sus. După câteva minute se îndepartează caturile și se caută gândacii pe suprafața interioară a capacului răsturnat. Apoi se examinează fagurii, unul câte unul pentru a depista adulții, larve și ouă. În perioadele reci, adulții stau în apropierea sau în ghemul de albine. În sezonul activ, gândacii se găsesc mai des pe fundul stupului sau pe ramele dinspre exterior.
Examinarea stupului cu ajutorul capcanelor. Un diagnostic care implică mai puțină muncă este posibil prin utilizarea unor capcane în stup. Capcanele, constituite din bucăți de carton de ambalaj (15 / 15 cm) cu o suprafață desprinsă pentru a expune ondulațiile părții intermediare, sunt plasate pe fundul stupului, cu fața ondulată în sus. Cartonul se acoperă cu lemn pentru a-i fixa marginile pe fundul stupului. Acest tip de capcană permite gândacilor să se ascundă în pliuri, dar împiedică intrarea albinelor. Capcana se lasă în stup timp de 3 zile, după care se scoate și se examinează în vederea depistării adulților și larvelor de A. tumida. Pentru omorârea gândacilor din aceste capcane se pot folosi acaricide. Detritusurile și toate zonele în care albinele nu au acces trebuie de asemenea examinate cu atenție (18).
I.4.2.6.3. Moliile cerii
Fagurii sunt distruși în cea mai mare parte de Galleria mellonella care este cel mai grav dăunător al stupului. Pagube mai mici produc Achroia grisella și molia de făină mediteraneană (Kuehniella anagasta).
Fig. I.4.25; Galleria mellonella Fig. I.4.26. Galleria mellonella
(pupă) (pupă)
Acești dăunători au o rată de înmulțire mare în zonele cu temperaturi tropicale și subtropicale. Femelele moliilor depun ouăle în ascunzișuri, de obicei în crăpăturile sau în structura de lemn a stupului. Distrugerea fagurilor este realizată de larve. Acestea se hrănesc cu miere, cămășile de năpârlire din celule, polen și alte impurități prezente în ceara fagurilor. Prin urmare, fagurii vechi sunt cei mai expuși la atacul moliilor (15).
I.4.2.6.4. Apocephalis borealis
Apocephalus borealis (fig. I.4.27), este un artropod încadrat în clasa Insecta, ordinul Diptera, familia Phoridae, tribul Metopininae, genul Apocephalus (61), ale cărui larve se dezvoltă în corpul albinelor, după ce femela își depune ouale în abdomenul acestora (fig. I.4.28).
După ecloziune, larvele migrează în creierul albinelor, pe care-l lezează, apoi, după o săptămână, larvele ies prin gât și se împupează. Ciclul biologic complet al insectei este de aproximativ 28 de zile.
Fig. I.4.27. Apocephalis borealis (55) Fig. I.4.28. Apocephalis borealis depune ouă în abdomenul albinei(56)
Afectarea creierului albinelor determină tulburări nervoase și de comportament; acestea sunt dezorientate, se învârt în cerc, prezintă paralizii ale membrelor, zboară pe timp de noapte și în condiții de vreme nefavorabilă, acest proces patologic ducând la moartea albinelor în câteva ore (3, 57).
I.4.2.7.Afecțiuni polifactoriale
I.4.2.7.1. Colapsul coloniilor de albine Colony collaps disorder (CCD)
Colapsul coloniilor de albine se manifestă prin pierderea masivă de albină adultă,
care dispare pur și simplu, rareori fiind găsite câteva albine moarte în jurul stupului sau în
stup. Puietul, regina cu puține albine și rezervele de hrană rămân intacte.
CCD este considerat un sindrom polifactorial, fiind cauzat de aproximativ 61 de factori patogeni și de stres. Printre aceștia, agenții patogeni de natură virală sau parazitară, expunerea la pesticide, lipsa diversității genetice și pierderea habitatului, slăbesc statusul imun al coloniilor de albine, imunosupresia ducând la moartea albinelor (13).
Datele obținute în urma acestor examene de laborator sunt corelate, în final fiind trase concluziile, prin stabilirea cauzei pierderilor prin îmbolnăviri sau mortalitate. Nu trebuie omis, în stabilirea diagnosticului, că afecțiunea depistată privește întreaga stupină, iar măsurile de combatere vor viza toate coloniile de albine.
I.4.3.Bibliografie
Bailey Leslie (1981): Patologia albinelor. Academic Press, Anglia, traducere Aneta Mardare si Gabriela Chioveanu IDSA Bucuresti,1993;
Clark T. B., Whitcomb R. F., Tully J. G., Mouches C., Saillard C., Bove J. M., Wroblewski H., Carle P., Rose D. L., Henegar R. B., Williamson D. L. (1985): Spiroplasrna melliferum, a New Species from the Honeybee (Apis mellifera) INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, p. 296-308;
Huang Z., (2011): Effects of Nosema on Honey Bee Behavior and Physiology. American Bee Journal and in Bee Culture;
Jonas Gabrielle (2014): One of the Apocephalus borealis fly creates ,,Zombie Bees,, out of East Coast Honey Bees. În: International Science Times;
Langridge, D. F. , Barclay Mc Gheer R. (1967; 2007 ): Crithidia mellificae n. sp. an Acidophilic Trypanosomatid of the Honey Bee Apis mellifera. The Journal of Protozoology Vol. 14, (3), pag. 485–487,
Mardare Aneta , Chioveanu Gabriela (1992): Metode de diagnostic în bolile albinelor și viermilor de matase,IDSA Bucuresti;
Ogradă I. (1978): Bolile și dăunătorii albinelor. A.C.A., Redacția publicațiilor apicole, București;
Oneț E., Constantinescu Virginia (1978): Diagnosticul de laborator în medicina veterinară. Editura CERES, București;
Popa Al. (1965): Bolile albinelor si viermilor de matase., Ed. Agro-Silvica, București;
Răducănescu H., Bica Popii Valeria (1973): Bacteriologie veterinară aplicată. Ed. CERES, București;
Ritter W. (2000): Bolile albinelor. Ed. M.A.S.T., București, pag. 49;
Ruth Waite, Helen Thompson, M. Brown, M. Watkins, M. Bew: Präliminärstudien über neue Entdeckungsmethoden der Krankheitserreger der Honigbiene Ständige Kommission für Bienenpathologie, XXXVIII-th International Apicultural Congress of Apimonida in Ljubljana, Slovenia;
Sagili R., Hooven Louisa, (2015): Bee Colony Collapse Disorder. În: Pesticides and the Environment;
Shajahan Johny, Amber Merisko, Douglas W Whitman (2007): Efficacy of eleven antimicrobials against a gregarine parasite (Apicomplexa: Protozoa). Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials.
Shimanuki H., Knox A. D., (2005) Diagnosis of Honey Bee Diseases www.ars.usda.gov/…/honeybeediseases/honeyb;
*** IDSA București (2000): Metode de diagnostic omologate;
*** HOTĂRÂRE nr. 1.156 din 23 decembrie 2013 pentru aprobarea acțiunilor sanitar-veterinare cuprinse în Programul acțiunilor de supraveghere, prevenire, control și eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului, de identificare și înregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor, caprinelor și ecvideelor, a acțiunilor prevăzute în Programul de supraveghere și control în domeniul siguranței alimentelor, precum și a tarifelor aferente acestora. EMITENT: GUVERNUL. PUBLICAT ÎN: MONITORUL OFICIAL nr. 8 din 7 ianuarie 2014. Data intrarii in vigoare : 17 ianuarie 2014;
*** Manualul de standarde al testelor de diagnostic si vaccinurilor;Oficiul International de Epizootii,anul 2014, Sectiunea 2.2 ;
***ORDIN nr. 25 din 19 martie 2008 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind metodologia de prelevare, prelucrare primară, ambalare și transport al probelor destinate examenelor de laborator în domeniul sănătății animalelor, PUBLICAT ÎN: MONITORUL OFICIAL nr. 341 din 2 mai 2008;
*** ORDIN Nr.29/25 februarie 2014 pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Programului acțiunilor de supraveghere, prevenire, control și eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului, de identificare și înregistrare a bovinelor, suinelor, ovinelor, caprinelor și ecvideelor, precum și a Normelor metodologice de aplicare a Programului de supraveghere și control în domeniul siguranței alimentelor. A.N.S.V.S.A. București;
***Paenibacillus larvae: http://beediseases.weebly.com/uploads/1/3/8/3/13835017/ 1675945.jpg;
***Paenibacillus larvae: http://files.mojevcely.eu/200000554-7f0147ffb9/plarvae difco.jpg;
*** Melisococcus plutonius: http://www.coloss.org/beebook/II/efb/figure-6-1/image_ preview;
***Melisococcus plutonius: http://www.coloss.org/beebook/II/efb/figure-6-1/image_ preview;
***Puietul în sac: http://www.coloss.org/beebook/II/efb/figure-4/image_preview;
***Puietul în sac: http://www.ent.uga.edu/bees/disorders/images/Sacbroodfig1_000.jpg;
***Puietul în sac: http://fitzbrown12.wikis.birmingham.k12.mi.us/file/view/ Sacbrood.jpg/375361852/Sacbrood.jpg;
***Ascosferoză: http://www.cornwallhoney.co.uk/images/chalkbrood1.jpg;
***Ascosferoză: http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/aug98/k8144-3i.jpg;
***Ascosferoză: http://www.bushfarms.com/images/Chalkbrood.jpg;
***Paenibacillus larvae: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/eb/ Paenibacillus_larvae.jpg;
***Paenibacillus larvae: https://sslsites.de/www.b-gis.at/pictures/Paenibacillus _larvae_3.jpg;
***Paenibacillus larvae: https://sslsites.de/www.b-gis.at/pictures/Paenibacillus_ larvae_2.jpg;
***Varroa destructor:https://encryptedtbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQNKLfg YMtJcEFYt8hG79gm7O3IvDah3O2AVcIvuDqsUcGXHBhNVQ;
***Varroa destructor: http://blogs.plos.org/biologue/files/2014/08/5048094767_ 2951f10008_o1.jpg;
***Varroa destructor: https://c2.staticflickr.com/4/3747/8856545015_ee85f344b5_b.jpg;
***Tropilelaps: http://4.bp.blogspot.com/SgatGqxqQHQ/UQWPzateOVI/ AAAAAAAACc 4/OI –RYAIfWE/s400/Tropilaelaps-2.png;
***Aspergiloză: http://www.beekeepers.amazingbees.com.au/images/chalkbrood2.jpg;
***Aspergiloză: http://www.coloss.org/beebook/II/fungal/figure-2/image_preview;
***Aspergillus flavus: http://2.bp.blogspot.com/u8k_26sX9iE/Ty2IMCCGU9I/AAAAAAAAG1M/hMi3HmpYE50/s1600/Aspergillus%2Bflavus%2BSAB_72hr.JPG;
***Paralizia cronică: http://www.ent.uga.edu/bees/disorders/images/chronic_paralysis. jpg;
***Viroza aripilor opace: http://www.ent.uga.edu/bees/disorders/images/DWVfig1.jpg;
***Pseudomonas aeruginosa: http://www.stopsprayingcalifornia.com/images/pages /Pseudomonas_Aeruginosa_image023.jpg;
***M. mellificae: http://www.nationalbeeunit.com/displayImage.cfm?id=278;
***M. mellificae, N. apis: http://mvl-saratov.ru/wp-content/uploads/2011/03/13.jpg;
*** M. mellificae: http://mvl-saratov.ru/wp-content/uploads/2011/08/21-250×171.png;
***N. ceranae, N. apis, Varroa destructor: http://scientificbeekeeping.com /images/stories/varroa/psugar 1-10.jpg;
***Nosemoza: https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQAazqLYfe2-QdEy6_ulDO7fQNIP9O8bPAx-QdE6br323JTK-QIwg;
***Braula coeca: http://adventuresinbeeland.files.wordpress.com/2013/03/braula-coeca-cfm.jpg?w=640&h=467;
***Braula coeca: http://img.latvijasdaba.lv/content/kukaini/braula-coeca-nitzsch-420×300.jpg;
***Acarapis woodi: http://bugwoodcloud.org/images/384×256/5310007.jpg;
***Acarapis woodi: http://www.coloss.org/beebook/II/tracheal/figure1.jpg/image_ large;
***Aethina tumida: http://www.apiservices.com/sante-de-labeille/articles/pictures/ aethina_2.jpg;
***Aethina tumida: https://www.extension.org/sites/default/files/Ellis_Bugwood_ 5025044-SMPT.png;
***Apocephalus_boreali:https://www.zombeewatch.org/static/images/male_zombiefly .png;
***Apocephalus_borealis:https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f0/Female_Apocephalus_borealis_ovipositing_into_the_abdomen_of_a_worker_honey_bee.png/220pxFemale_Apocephalus_borealis_ovipositing_into_the_abdomen_of_a_ worker_honey_bee.png;
*** Apocephalus_borealis: https://en.wikipedia.org/…/Apocephalus_boreali..;
***Crithidia:http://www.ethlife.ethz.ch/archive_articles/100719_neuer_parasit_per/100719 _crithidia_l.jpg?hires
Stelian ASIMINEI
I.V. Profilaxia în bolile albinelor
Profilaxia reunește totalitatea măsurilor nespecifice și specifice care se aplică pe un anumit areal, la animale, în vederea prevenirii apariției, a răspândirii, precum și pentru eradicarea bolilor infecto – contagioase.
I.5.1. Măsurile nespecifice de prevenire a bolilor se bazează pe respectarea tehnologiei de creștere a coloniei de albine. Acest lucru are în vedere asigurarea unor condiții de creștere și dezvoltare cât mai apropiate de cele naturale în exploatarea semiintesivă și intensivă a coloniilor de albine.
I.5.1.1. Amplasarea stupinei
În alegerea vetrei stupinei se v-a ține cont de doi factori: resursele melifere și microclimatul.
a) Flora se apreciază prin examinarea terenului pe o raza de 1000 – 1500 m sau prin utilizarea hărților de teren cu vegetația care crește preponderant pe suprafața respectivă. Cu cât vegetația este mai variată și înflorirea ei este etapizată , cu atât amplasamentul este mai valoros. Densitatea optimă pe km² este de 20 – 30 de colonii.
b) Microclimatul este apreciat în funcție de clima generală a regiunii. Stupina este amplasată într-o anumită zonă, dacă se ține cont de expunere, pantă, vânturile dominante, curenții de aer, umiditatea, sursele de apă. Pentru iernare, stupina trebuie să fie protejată de vânturi spre est, vest și nord, să aibă expunere sudică, sursă de apă, livadă și o pajiste în apropiere, precum și lipsa poluanților industriali. Întreținirea coloniilor în aer liber este de preferat pavilioanelor, în tot cursul anului (15).
I.5.1.2. Pastoralul
Amplasarea unei stupine pentru un an întreg pe aceeași locație este din ce în ce mai rară. Și aceasta datorită dezvoltarii intensive a agriculturii. S-au produs defrișări, desecări, se practică monoculturile, iar buruienile sunt distruse de erbicide. Pentru a suplini lipsa polenului și a nectarului se practică transhumanța sau pastoralul. Este o metodă de dislocare a stupinei în diferite zone, cu o anumită structură a florei: salcie, salcâm, tei, conifere, culturi furajere sau plante tehnice. Pentru a exclude posibilitatea transmiterii de boli de la o stupină la alta, transportul coloniilor trebuie sa fie însoțit de certificate de sănătate, obținute de la autoritatea veterinara, iar amplasarea stupinelor, în transuhumanță, să fie făcută la distanța rezonabilă față de alte stupine, pentru a se evita furtișagul și transmiterea bolilor (15).
I.5.1.3. Întreținerea familiilor de albine
Regula generală, care trebuie să fie în atenția permanentă a apicultorului, este reducerea la minim a intervențiilor în coloniile de albine. Familia de albine trebuie deranjată cât mai puțin.
Coloniile de albine sunt întreținute în diverse tipuri de stupi. Acest lucru nu impietează asupra sănătății albinelor. Importante sunt vechimea fagurilor, izolarea coloniei în timpul iernii, umiditatea , curenții de aer, spațiul cuibului, înalțimea fundului de stup, hrănirea stimulatorie, schimbarea mătcii și selecția.
a) Fagurii mai vechi de 2 – 3 ani n – ar mai trebui folosiți. Micșorează randamentul coloniei, prin eclozarea unor albine subponderale și corp adipos subdezvoltat, iar agenții etiologici ai nosemozei, micozelor sau bacteriozelor persistă în stup perioade îndelungate.
b) Izolarea coloniei de albine în timpul iernilor din România trebuie să fie minimă. Peste podișor se aștern 3 – 4 straturi de hârtie peste care se pune o pernă din vată sau din papură. De o parte și de alta a cuibului se așează câte o ramă cu miere căpăcită în proporție de 80 – 90%; o astfel de ramă asigură o izolație cât un perete gros de 20 cm.
În ultima perioadă se practică izolarea cuibului cu o folie de polietilenă așezată peste podișor sau sub podișor, cu rolul de ,,păstrare a căldurii”. Este o procedură total greșită, deoarece condensul care se formează pe partea inferioară a foliei duce la creșterea umidității în stup, iar ventilația devine imposibilă.
c) Umiditatea crescută în stup are efecte nocive asupra sănătatii coloniei de albine. Agenții patogeni se înmulțesc, în special fungii, rezerva de hrană poate fermenta, iar răcirea exterioară a cuibului se accentuează, mai ales primăvara.
d) Curenții de aer se formează în stup atunci când pereții sunt crăpați sau capacul este permeabil. În stup, singura sursă de circulație a aerului trebuie să fie ventilația realizată de albine. Curenții de aer în combinație cu umiditatea crescută duc la răcirea cuibului.
e) Spațiul cuibului în perioadele de cules sau de repaus trebuie să fie optim. Un spațiu prea mare în timpul iernii sau prea mic în sezonul culesului afectează starea de sănătate a coloniei în primul caz, sau puterea familiei de albine și constituirea rezervelor de hrană în cazul al doi-lea.
f) Înalțimea fundului de stup trebuie să fie potrivit scopului său, încât să permită introducerea suportului pentru benzile cu varachet, controlul eficacități tratamentului contra varroozei și autocurățirea după iernare. Un fund de stup prea înalt nu stimulează albinele să îndepărteze cadavrele și reziduurile, ceea ce îngreunează munca apicultorului și menține o sursă permanentă de agenți patogeni (15).
g) Hrănirile suplimentare ale albinelor urmăresc diverse scopuri, fiind clasificate în hrăniri de completare, de stimulare, de dresaj sau terapeutice (9).
Hrănirea de stimulare este controversată. Stimularea dezvoltării coloniei de albine prin hrăniri secvențiale, cu sirop de zahăr sau miere, trebuie folosită cât mai puțin. Și mai ales suplimentarea necesarului de hrană cu făinuri proteice ( soia, lapte praf degresat etc). Cea mai eficientă creștere de colonii sănătoase este asigurarea unui cules continuu de polen și nectar. Însă, stimularea dezvoltării coloniilor de albine este necesară în primăverile târzii, când trebuie să existe suficientă albină culegătoare la înflorirea salcâmului, precum și în lunile august – septembrie, în anii secetoși, în vederea obținerii unor familii puternice pentru iernare. În ultimul caz, stimularea este cuplată cu hrănirea de completare, asigurându-se astfel și rezerva de hrană pentru iarna care urmează.
Hrănirea de stimulare se poate face cu faguri cu miere descăpăcită (1-4 dm²/familie, la interval de 2-3 zile , în funcție de puterea acesteia) sau sirop de zahăr 1/1 (0,200 – 0,300 l/familie, la interval de 2-3 zile).
Hrănirea de completare poate fi facută primăvara, dacă situația impune, odata cu efectuarea controalelor de rutină sau toamna pentru asigurarea rezervei de hrană pentru iernare ( 15 – 18 kg de miere/colonie). Acest tip de hrănire este realizat cu miere, sirop de zahăr sau cu miere căpăcită și păstură. Prepararea siropului de zahăr este destul de simplă. În funcție de perioada administrării, concentrația acestuia poate fi de 1/1, 1,5/1 sau 2/1, în cantitate de 2-5 kg/familie de albine, la interval de două sau trei zile. Pentru ca efortul albinelor să fie minim, zahărul trebuie invertit cu acid citric (sare de lămâie), în concentrație de <1‰ (sub 1 g de sare de lămâie la un litru de sirop).
Hrănirile terapeutice, profilactice sau curative sunt aplicate pentru prevenirea apariției unor boli sau pentru combaterea unor boli aflate în evoluție. Acest tip de hrănire, se practică pentru prevenirea sau combaterea amoebiozei, varroozei și nosemozei albinelor.
Prevenirea nosemozei și a amoebiozei se realizeazaă prin utilizarea extractului apos sau alcoolic de pelin amar ( Artemisia absinthium) sau din nafurică (pelinul dulce = Artemisia annua). Principiul activ este o lactonă sesquiterpenică cu punte endoperoxidică și cu efect pariziticid, folosit în tratamentul malariei, în China și Africa (16, 6).
Pelinul amar se recoltează în perioada de înflorire (iulie – august). Se usucă în locuri aerisite, la umbră și se păstreaza la loc uscat în saci de pânză sau hârtie. Extractul apos se obține prin infuzarea a 5 g de pelin într-un litru de apă. Este procedura de obținere a ceaiului. Extractul de ceai (infuzia) este administrată imediat prin prepararea unui sirop de zahăr sau de miere 1:1 ( una parte miere sau zahăr invertit, la una parte ceai de pelin).
Extractul alcoolic se obține prin utilizarea alcoolului alimentar de 40 – 70 grade. Într-un vas de sticlă cu dop, cu o capacitate de minimum 1 l, se pune iarbă (Herba) de pelin, mărunțită ( 2/3 din înalțimea vasului) , peste care se toarnă alcoolul. Perioada de contact este de zece zile. În acest interval, vasul se agită zilnic. În a zecea zi este separat extractul de partea ierboasă, se stochează în vase de sticlă de culoare închisă, până la utilizare. Extractul alcoolic se administrează în același mod, doza fiind de ≈ 20 ml/l de sirop.
Atenție! La pelin, extractul apos este de preferat în locul extractului alcoolic. Alcoolul extrage principii toxici, ca de exemplu thionina (11). Depășirea dozei recomandate de extract alcoolic duce la moartea coloniei de albine.
Doza / familie este de 200 – 250 ml sirop, de patru ori, la interval de 2 zile. După o pauză de două săptămâni, procedura se repetă, dacă este necesar. Tratamentele profilactice se fac în luna august – septembrie, după terminarea culesului la flora meliferă, și înainte de formarea ghemului de iernare. Primăvara, se reia administrarea extractului de pelin, în luna martie, după ce temperatura exterioară ajunge la 12° C. Nu se fac mai mult de patru administrari/ familie.
Preparatul KAS – 81, omologat în Rusia din anul 1986, este un amestec de extracte din plante medicinale, obținut prin decocție și macerație. Plantele medicinale folosite sunt pelinul (Artemisia absinthium) și ramurile de pin (Pinus silvestris L.).
Pelinul se recoltează înainte de înflorire și în perioada de înflorire. De la pin se folosesc vârfurile ramurilor, recoltate cu tot cu spini, în lungime de cca 4 cm, în lunile ianuarie, februarie și martie. Și pelinul, și ramurile de pin, se usucă și se păstrează în saci de pânză sau hârtie.
Din aceste droguri se obținute un extract apos care se folosește imediat după preparare. Compoziția preparatului KAS – 81 este:
pelin recoltat înainte de înflorire = 50 g;
pelin recoltat în timpul înfloririi = 900 g;
ramuri de pin = 50 g.
Acest amestec, bine mărunțit, se pune într-un vas cu 10 litri de apă fierbinte și se contină fierbierea, la foc mic, încă 2 – 3 ore, după care se lasă în repaus 6 – 8 ore și apoi se filtrează. Din extractul obținut se iau câte 30 – 35 ml și se adaugă la un litru de sirop obținut din dizolvarea a 1,5 kg zahăr într-un litru de apă. Doza de sirop pe stup Dadant este de 5 – 6 litri, iar la cei multietajați și orizontali se pot administra până la 10 litri. Acțiunea preparatului este îndelungată, însă acțiunea acaricidă, preponderentă, se manifestă în primele 15 zile de la administrare. Tratamentul se aplică la sfârșitul lui august, începutul lui septembrie (21).
h) Selecția coloniilor de albine productive și rezistente la boli este de mare importanță. Într – o stupină nu trebuie să păstrăm familii de albine cu populație redusă numeric, mătci ineficiente și cu albine slab culegătoare. O colonie slabă va fi cu siguranță bolnavă sau purtatoare de agenți patogeni.
I.5.1.4. Dezinfecția profilactică este o procedură de distrugere a agenților patogeni în stupinele indemne de boli virotice, bacteriene, micotice sau parazitare și are în vedere suprimarea eventualilor germeni prezenți pe inventarul apicol. Această acțiune se realizează o data pe an, de obicei primăvara, și se execută în mai multe etape.
a) Curațenia mecanică este prima operațiune. Se îndepărtează ceara și propolisul din stupi și de pe rame, resturile de cadavre de pe fundul stupilor, se topesc fagurii vechi, se face curățenie în anexele stupinei etc.
b) Dezinfecția propriu-zisă este realizată cu mijloace fizice și chimice.
Mijloacele chimice de dezinfecție sunt reprezentate de soluții slabe dezinfectante: soda caustică 1%, carbonat de sodiu 2 – 3%, aldehida formică 2%. Cu unul din aceste dezinfectante se spală riguros, cu o perie, inventarul apicol, cu excepția fagurilor. Fagurii din rezerva stupinei se dezinfectează cu vapori de acid acetic glacial în concentratie de 60%. La un litru de volum se folosesc 2 ml de acid acetic glacial. Dezinfectantul se pune într-un recipient deschis peste stiva de faguri. Dezinfecția se face în spații închise, timp de 6 zile, la temperatura de 18 – 20° C. Se poate folosi și aldehida formică 40%, la temperatura mediului ambiant (nu în anotimpul rece), în camere sau dulapuri etanșe. Se folosesc 150 ml de aldehidă formică (formol) pentru fiecare 25 litri de volum, timpul necesar sterilizării find de 14 – 17 zile.
Inventarul apicol din lemn se dezinfectează și prin flambare, cu un arzător care folosește drept combustibil gazul metan sau benzina.
I.5.1.5. Îngrijirea sezonieră a coloniilor de albine
I.5.1.5.1. Pregătirea pentru iernare
O măsură de mare importanță, a profilaxiei nespecifice, este pregătirea familiilor de albine pentru iernat și, implicit, asigurarea producției de miere pentru anul care urmează. Spunem aceasta deoarece, în multe cazuri, nu este înțeles bine rolul măsurilor pregătitoare care trebuie, luate începând cu sfârșitul lunii iulie – începutul lunii august, de către toți apicultorii. Iar consecințele sunt, de cele mai multe ori, dramatice: pe lângă acțiunea insidioasă a multor factori patogeni nespecifici sau specifici, este favorizată, din neglijență sau necunoaștere, evoluția unor boli care decimează stupinele în primăvara următoare (nosemoză, amoebioză).
Procedura prin care ajungem la dezideratul expus mai sus este obținerea unui număr mare de albine tinere, care vor asigura popularea optimă a stupului, la intrarea în iarnă, și consecutiv, hrană suficientă și de bună calitate pentru perioada inactivă. Și aceasta se realizează prin:
înlocuirea, în peroada optimă (mai-iunie), a mătcilor bătrâne, uzate sau slab ouătoare. Schimbarea mătcilor se face anual în stupinele care practică pastoralul, iar în cele staționare la doi, cel mult la trei ani;
asigurarea stupului cu faguri în care au fost crescute două sau trei generații de puiet, deoarece mătcile nu ouă, în perioada de toamnă, în fagurii noi;
deblocarea cuibului, în cazul existenței culesurilor târzii, prin introducerea săptămânală a unui figure, mai vechi, cu celule de albină lucrătoare;
scoaterea fagurilor care nu sunt acoperiți de albine, amplasarea celor cu miere după diafragmă și descăpăcirea lor. După golirea lor de către albine, fagurii de după diafragmă vor fi scoși din stup;
deplasarea stupinei în zone care asigură un cules târziu de polen, deoarece este mai economic, din punct de vedere financiar, și mult mai eficient decât hrănirea stimulativă;
izolarea cuibului, la apariția nopților reci de toamnă;
hrănirile stimulative, prin care este creată senzația de cules continuu, menținând astfel activă colonia de albine toată perioada pregătirii pentru iernat sau, în primăverile târzii, când colonia de albine poate fi găsită nepregătită la încălzirea bruscă a vremii și apariția culesului la salcâm (8).
I.5.1.5.2. Pregătirea pentru culesurile de primăvară-vară
Perioada activă, de început (între 20 ianuarie și ≈20 aprilie), reprezintă faza premergătoare intervalului productiv al coloniei de albine (mai-iulie), în care se produce înlocuirea albinelor de iarnă cu cele de viață scurtă (≈ 40 de zile), culegătoare. Este o perioadă grea pentru familia de albine deoarece se produc schimbări majore în cuib: temperatura interioară trebuie menținută la 34 – 35°C, crește consumul de hrană, albina bătrână moare, iar cea tânără încă nu este în număr suficient pentru a suplini în totalitate pierderea. De aceea, apicultorul trebuie să intervină prin activități specifice în vederea contracarării efectelor negative. Și aceasta se realizează prin:
prima revizie a familiilor de albine se face, de obicei, în decada a III-a a lunii februarie, în timpul zborului de curățire, când temperatura mediului ambiant este de peste 13°C. Aceasta este o vizită scurtă (pentru a se evita răcirea puietului), și dă informații despre stărea generală a coloniei de albine (existența puietului, rezerva de hrană, pierderile de albine bătrâne prin mortalitate, starea de sănătate etc.).
Controlul general de primăvară se efectuează când temperatura exterioară este de minim 20°C. În țara noastră acestă temperatură este întâlnită după data de 20 martie. Controlul general vizează:
reorganizarea cuibului;
amplasarea rezervei de hrană de o parte și de alta a cuibului. Acum se evaluează cantitativ rezerva de hrană și se aplică hrăniri stimulative sau de completare familiilor de albine aflate în dificultate;
restrângerea cuibului prin eliminarea unor rame;
menținerea termoizolației până când temperatura nocturnă trece de 10°C;
curățarea fundului de stup de albinele moarte și ceara reziduală. Această manopera este necesară la familiile de albine de putere slabă sau medie. Familiile de albine puternice își curăță singure fundul de stup. Tot acum înlocuim stupii uzați cu unii noi sau în bună stare.
La terminarea reviziei fiecărui stup, sunt notate în fișa stupului toate constatările făcute pentru a avea o evidență strictă asupra dezvoltării și stării de sănătate a coloniilor de albine din stupină. Evidența stupilor ajută apicultorul în redresarea stărilor anormale și în munca de selecție și de ameliorare a mătcilor (13).
I.5.1.5.3. Sezonul activ și stupăritul pastoral
Perioada din an în care albinele adună în stup nectar și polen pentru satisfacerea nevoilor proprii de hrană, precum și stocarea excedentului în miere și păstură care poate fi folosită de om în alimentație se numește sezon activ. În această perioadă, coloniei de albine trebuie să-i fie asigurate spațiul necesar dezvoltării puietului și pentru depozitarea mierii și păsturii, iar pentru obținerea unor producții mari de miere, menținerea și intensificarea activității acesteia.
Exploatarea intensivă a coloniilor de albine, impune luarea unor măsuri compensatorii, care se referă în primul rând, la asigurarea mătcilor de înlocuire și a unor condiții de exploatare adecvate. Slăbirea coloniilor de albine, duce, inevitabil, la aparițiia bolilor și pierderi masive, prin mortalitate, în primăvara următoare.
I.5.2. Profilaxia specifică
Măsurile de profilaxie specifice vor fi tratate pe larg la prezentarea bolilor virale, bacteriene, parazitare, micotice și a celor nespecifice. Vom face însă precizarea că prezentarea în extenso a mijloacelor terapeutice pe bază de antibiotice sau al altor compuși chimici obținuți pe cale industrială, prin sinteză, nu reprezintă punctul nostru de vedere. Autorii acestui volum recomandă utilizarea cu precauție, în tratamentul bolilor bacteriene, al protozoozelor sau altor afecțiuni, a antibioticelor sau al altor mijloace terapeutice de natură chimică.
I.5.3. Plantele medicinale și rolul lor în profilaxie
Vindecarea bolilor cu plante medicinale este o practică străveche, folosită pe scară largă de toate popoarele, acestea fiind utilizate atât la om cât și la animale.
Această însușire a plantelor medicinale este atribuită unor compuși chimici, sintetizați de celulele și țesuturile unor organe ale plantelor sau de toate organele acelor plante și care devin tămăduitoare după extragerea lor prin diverse procedee.
5.3.1. Substanțele biologic active
Principiile active din vegetale fac parte din clasele de substanțe ale chimiei organice, cele mai importante pentru profilaxia bolilor la albine fiind reprezentate de fenoli, terpenoide, uleiuri esențiale, alcaloizi, lectine, polipeptide, poliacetilene și vitamine. Unele substanțe, cum sunt fitoncidele (antibiotice vegetale) și insecticidele vegetale pot fi folosite ca mijloace terapeutice în multe afecțiuni ale albinelor.
Toate aceste substanțe trec și în miere, contribuind la creșterea valorii biologice a produsului. Rawhi M. A. Abdalla (2012), clasifică substanțele biologic active din miere după cum urmează :
pigmenți vegetali (carotenoizi, compuși fenolici, pigmenți chinonici,
pigmenți indolici, antrachinone);
fitohormonii și fitoestrogenii;
produșii de metabolism (uleiuri volatile, terpene – rășini, balsamuri, ceruri,
gume, alcaloizi, glicozide, taninuri, derivații glucidelor, lipidelor și proteinelor).
În cele ce urmează ne vom referi, pe scurt, la compoziția chimică a substanțelor biologic active din plante, la răspândirea, modul de acțiune și rolul lor în asigurarea vigorii și în prevenirea sau combaterea unor afecțiuni ale coloniilor de albine. Recomandările noastre au la bază experiența folosirii plantelor medicinale pentru prevenirea și combaterea bolilor la om și la animale.
I.5.3.1.1. Fenolii sunt derivați hidroxilați ai carburilor aromatice, fiind răspândiți în țesuturile vegetale sub formă mono-, di-, tri- și polifenoli, în stare liberă sau combinată. Cele mai cunoscute subclase, cu proprietăți antimicrobiene sunt fenolii simpli, acizii fenolici, chinonele, flavonoidele, flavonele, flavonolii, taninurile și cumarinele.
I.5.3.1.1.1. Fenolii simpli sunt printre cei mai întâlniți compuși fitochimici bioactivi, fiind formați dintr-un singur inel fenolic substituit. Dintre aceștia, acizii cinamic și cafeic sunt reprezentanții comuni ai unui grup larg de substanțe derivate din fenilpropan. Tarhonul și cimbrul conțin acid cafeic, care este eficient împotriva virusurilor, bacteriilor și fungilor.
Fenolii hidroxilați (catecolul și pirogalolul), sunt toxici pentru microorganisme. Catecolul are două grupe hidroxil (-OH), iar pirogalolul are trei, numărul de grupări hidroxil la gruparea fenol fiind considerate a fi legate de toxicitatea lor în raport cu microorganismele patogene. Mecanismele responsabile pentru toxicitatea fenolică asupra microorganismelor sunt inhibarea enzimelor de către compușii oxidați, eventual prin reacția cu grupări sulfhidril sau prin interacțiuni nespecifice cu proteinele (5).
I.5.3.1.1.2. Chinonele sunt un grup de compuși chimici derivați din benzen, care conțin una sau mai multe grupări C=O într-un inel benzenic nesaturat (21), fiind omniprezente în natură, foarte reactive și ca intermediar în sinteza melaninei. Transformarea difenolului (sau hidrochinonă) în dicetonă (sau chinonă) are loc prin reacții de oxidare și reducere. Potențialul redox individual al perechii chinonă- hidrochinonă este foarte important în multe sisteme biologice; ubichinona (coenzima Q) are rol în sistemele de transport de electroni la mamifere. Vitamina K este o naftochinonă complexă, activitatea sa antihemoragică fiind legată de ușurința oxidării în țesuturi. Aminoacizii hidroxilați pot fi transformați în chinone în prezența enzimelor adecvate, cum ar fi polifenoloxidaza. Pe lângă furnizarea unei surse de radicali liberi stabili, chinonele formează compuși ireversibili cu aminoacizii nucleofili din proteine, ceea ce duce adesea la inactivarea proteinei și pierderea funcției. Din acest motiv, gama de efecte potențial antimicrobiene din chinone este mare. Ținte probabile în celula microbiană sunt adezinele de suprafață, polipeptidele pereților celulari și enzimele legate de membrană. Hipericina, o antrachinonă extrasă din sunătoare (Hypericum perforatum), are proprietăți antimicrobiene generale (5).
I.5.3.1.1.3. Flavonele sunt structuri fenolice care conțin o grupare carbonil, iar prin adăugarea unui grup 3-hidroxil rezultă un flavonol. Flavonoizii sunt cele mai hidroxilate substanțe fenolice, având o unitate C6-C3 legată de un inel aromatic. Aceste substanțe sunt sintetizate de plante ca răspuns la acțiunea agenților patogeni; formează complexe cu proteinele solubile extracelulare și cu membranele celulare bacteriene, același proces perturbător al membranei celulare fiind întâlnit și la flavonoidele lipofile.
Catechinele, prezente în ceaiul verde, inhibă dezvoltarea în vitro a unor bacterii (Vibrio cholerae, Streptococcus mutans), inactivează toxina bacteriei Vibrio cholerae și glucosyltransferazele bacteriene izolate de la S. mutans prin complexare.
Flavonoidele prezintă efecte inhibitorii impotriva mai multor virusuri. Swertifranchesidele, glicirizina (din lemn dulce) și crizolul au acțiune anti- HIV, iar derivații de flavone sunt inhibitori ai virusului sincitial respirator (VSR). Cercetări experimentale efectuate de Kaul și colab., 1985 (citat de 5) au relevat modul de acțiune ale unor flavonoide (quercetinei, naringin, hesperetin și catechine) pe culturi celulare. Cu toate că naringinul nu a inhibat virusul herpes simplex tip 1 (HSV-1), poliovirusul tip 1, virusul paragripal tip 3, sau VSR, celelalte trei flavonoide au fost eficiente în diverse moduri: hesperetinul a redus replicarea intracelulară a tuturor celor patru virusuri, catechinele au inhibat infectivitatea dar nu replicarea intracelulară a VSR și HSV-1, iar quercetinul a inhibat infecțiozitatea tuturor virusurilor luate în studiu. Alpinumisoflavone (isoflavonă izolată dintr-o leguminoasă din Africa de Vest), previne infecția cu schistosome atunci când este aplicat local, iar floretinul izolat din unele soiuri de mere, are activitate inhibitorie împotriva unor microorganisme patogene. Galanginul (3,5,7-trihydroxyflavone), obținut din planta perenă Helichrysum aureonitens, are activitate litică față de bacterii Gram-pozitive, fungi, virusuri (în special HSV-1 și virusul Coxsackie B, tip-1).
Mecanismul de acțiune al flavonelor și al flavonoidelor este contradictoriu. Flavonoidele lipsite de grupările hidroxil sunt mai active împotriva microorganismelor decât cele cu grupări -OH; această constatare sprijină ideea că ținta lor este membrana celulară, iar compușii lipofili sunt mai activi în dezorganizarea acestei structuri. Cu toate acestea, mai mulți autori susțin contrariul; adică hidroxilarea, are cea mai mare activitate antimicrobiană (5).
I.5.3.1.1.4. Taninurile sunt un grup de substanțe fenolice polimerice de origine vegetală, cu acțiune astringentă și greutate moleculară de la 500 la 3.000. Se găsesc în coajă, lemn, frunze, fructe și rădăcini ale plantelor
După tipul legăturilor dintre polifenoli și acizii fenolici, taninurile sunt împărțite în două grupe:
taninuri hidrolizabile și
taninuri condensate (nehidrolizabile).
Taninurile hidrolizabile au structura de bază axată pe acidul galic (5) sau un derivat al acidului galic, respectiv acidul elagic (10), de obicei ca multipli esteri cu d-glucoză, în timp ce taninurile condensate (adesea numite proantocianidine) sunt derivate din monomerii flavonoidelor. Taninul este format prin condensările derivaților de flavan sau prin polimerizarea unităților de chinone.
Taninurile stimulează activitatea fagocitelor (10), formează complexe inactive cu proteinele de transport și adezinele, inactivează enzimele microbiene, se leagă de proteinele de membrană celulară, complexează iodul metalic etc. De asemenea, are acțiune inhibitorie directă asupra microorganismelor: concentrații scăzute de tanin modifică morfologia fungului Moniliophthora perniciosa, inhibă creșterea insectelor și perturbă digestia la ierbivorele rumegătoare (5). Scalbert, 1991 (citat de 5) arată că taninurile pot fi toxice pentru fungii filamentoși, drojdii și bacterii, iar la virusuri inhibă inverstranscriptaza.
I.5.3.1.1.5. Cumarinele sunt substanțe fenolice formate din nuclee benzenice și α-piron, condensate. Ele sunt responsabile de mirosul caracteristic de fân. Au activitate antitrombotică, antiinflamatoare, vasodilatatoare și antivirală. Warfarina este o cumarină deosebit de bine cunoscută, care este utilizată atât ca anticoagulant oral, cât și ca rodenticid. Alte cumarine au proprietati antimicotice (inhibă Candida albicans) sau estrogenice, stimulează activitatea macrofagelor (previne recidivele herpetice cauzate de HSV-19).
Acizii hydroxycinnamic, legați de cumarine, par a fi inhibitori pentru bacteriile gram-pozitive. De asemenea, fitoalexinele produse de morcovi, care sunt derivați hidroxilați ai cumarinelor, au activitate antifungică (5). Plantele medicinale bogate în substanțe cumarinice trebuiesc evitate la prepararea extractelor destinate prevenirii bolilor la albine.
I.5.3.1.2.Terpenoide și uleiuri esențiale
Terpenele sunt hidrocarburi nesaturate rezultate din combinarea mai multor unități izoprenice. Unitatea izopren are formula CH2=C(CH3)CH=CH2 (20). Terpenele au structura chimică generală C10H16 și se găsesc în plante sub formă de monoterpene (C10), diterpene (C20), triterpene (C30), tetraterpene (C40), hemiterpene (C5), sesquiterpene (C15), sesterterpenoizi (C25) sau politerpenoide (carotenoide și gume). Terpenele, în care grupările metal au fost mutate sau eliminate și înlocuite cu atomi de oxigen, se numesc terpenoizi (alcooli, aldehide, cetone). Mecanismul de acțiune al terpenelor nu este pe deplin înțeles, însă se presupune că dezintegrează membrana celulară prin compușii lipofili (5).
Terpenoidele sunt sintetizate din unități acetat și, ca atare, își au originea în acizii grași. Însă se deosebesc de acizii grași prin ramificațiile extinse și structuri ciclizate.
Cele mai întâlnite terpenoide comune sunt metanolul, canforul (monoterpene), farnesolul și artemisinul (sesquiterpenoide). Artemisinul și derivatul său α-arteether, cunoscut sub numele de qinghaosu, sunt folosite curent ca antimalarice (5) sau în tratamentul nosemozei albinelor (1). Terpenoidele sunt active împotriva bacteriilor, fungilor, virusurilor și protozoarelor.
Uleiurile esențiale (eterice) sunt substanțe uleioase naturale cu miros plăcut specific, constituite, în principal, din terpene (mono- și sesquiterpene) (5), hidrocarburi aromatice, alcooli, acizi organici, pigmenți, eteri, esteri etc., un ulei eteric putând conține și 50 de substanțe diferite, cei mai importanți fiind terpenele și derivații lor (mircenul, geraniolul, limonenul, mentolul, camforul, borneolul s.a.m.d. (10). Monoterpenele cu funcții alcoolice sunt geraniolul, linaloolul, mentolul, terpineolul, borneolul, cei cu funcții aldehidice sunt citroneolul, geraniolul, neralul, cu funcție cetonică sunt cunoscute mentona, carvona, puleogona, dintre eteri 1,8-cineolul (eucalyptol), mentofuranul, iar dintre esteri acetatul de linalil, acetatul de bornil. Sesquiterpenele din uleiurile volatile sunt reprezentate de farnesol, farnesan, bisabolen, cariofilen. Timolul,, carvacrolul, eugenolul, aldehida anisică, aldehida cinamică sunt compuși ai uleiurilor volatile. Uleiurile eterice sunt volatile, liposolubile și antrenabile cu vapori de apă, incolore, gălbui și mai rar colorate, au densitate subunitară (excepție uleiul de cuișoare și scorțișoară) și temperatura de fierbere între 150ș și 300ș C. Au proprietăți dezinfectante, antiseptice, antiemetice, stomahice, carminative etc. și sunt răspândite în unele familii de Magnoliophyte (Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Laurceae, Rutaceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rosaceae) (11). Eugenolul este extras din uleiul de cuișoare și este considerat bacteriostatic și antifungic (5).
Uleiurile vegetale se pot obține prin antrenare cu vapori de apă (distilare), cu solvenți apolari volatili, cu lichide supercritice, cu ajutorul grăsimilor sau prin presare. Uleiurile vegetale se găsesc în proporții ridicate în mugurii de jneapăn (Pinii Montana turiones), fructele de ienupăr (Juniperi baccae), fructele de umbelifere (chimion, coreandru, fenicul, anason), florile de levănțică, mușețel, coada șoricelului, frunzele de mentă, rozmarin, roiniță, cimbru, jaleș de grădină, eucalypt, rizomii de obligeană, iarba de cimbrișor și busuioc, mugurii florali de cuișoare, scoarța arborelui de scorțișoară, lemnul de camfor (11).
Produșii de oxidare ai uleiurilor volatile sunt rezinele sau rășinele, unele din ele având și acțiune farmacodinamică (4). Sunt utilizate în cosmetică, industria alimentară sau farmaceutică (21).
I.5.3.1.3. Alcaloizii sunt substanțe organice azotate (N inclus într-un heterociclu), sintetizate din aminoacizi sau compuși apropiați, cu pH alcalin, prezente în plantele toxice, multe din ele având proprietăți terapeutice importante. Primul alcaloid izolat din mac (Papaver somniferum), în anul 1805, a fost morfina. Cei mai importanți alcaloizi sunt papaverina, chinina, codeina, stricnina, coniina, tropanul, nicotina, cocaina, atropina, morfina, cofeina (10), colchicina, ergotamina, sparteina, citizina, hiosciamina, scopolamina, berberina, chelidonina, rezerpina, teofilina, teobromina, aconitina ș.a.m.d. (11).
Pe lângă alcaloizi, în plante se mai găsesc protoalcaloizi (N în afara heterociclului, într-o catenă laterală), pseudoalcaloizii (nu derivă din aminoacizi) și aminele biogene ( provin din decarboxilarea aminoacizilor).
Alcaloizii sunt substanțe bioactive puternice, care sunt distribuite prin farmacii, active în doze bine stabilite și, în general, nu sunt recomandate pentru prepararea de ceaiuri medicinale.
Alcaloizii se găsesc în plante din familiile Apocynaceae, Berberidaceae, Erythroxylaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Loganiaceae, Rubiaceae, Ranunculaceae, Solonaceae și sunt localizați în vacuolele celulare în combinație cu taninuri sau formează săruri solubile cu unii acizi organici.
Plantele care conțin alcaloizi, prezente în România, sunt:
Solanaceae ( Atopa beladona, Scopolia carniolica, Datura stramonium, Hyosciamus niger) care conțin alcaloizi tropanici (atropina, scopolamina);
Fabaceae (salcâmul galben = Cytirus laburnum, drobul = Sarothamnus scoparius) care conțin citizină sau sparteină;
Papaveraceae (macul de grădină, rostopasca= Chelidonium majus) de la care se extrag papaverina, morfina, codeina sau chelidonina, coptizina și sanguinaria;
Apocynaceae (saschiul = Vinca minor), de la care se folosește vincamina.
Pseudoalcaloizii se formează pornind de la acidul mevalonic și sunt reprezentați de alcaloizii monoterpenici, sequiterpenici, diterpenici și triterpenici.
Alcaloizii monoterpenici au o structură iridoidă, grupul fiind reprezentat și de gențiana, sintetizată în specii ale genului Gențiana, iar alcaloizii diterpenici sunt răspândiți în specii de Acontium (acontina) și Delphinium (delfinina).
Protoalcaloizii (alcaloizii neheterociclici) sunt reprezentați de amine (efedrina, mescalina, tiramina, serotonina) și amide (colchicina și capsaicina. Aceștia provin din fenilalanină, tirosină sau din triptofan (11).
Cei mai mulți alcaloizi sunt folosiți în medicina umană și cea veterinară, aceștia nefiind utilizați în profilaxia bolilor la albine.
Alacaloizii au acțiune bactericidă, sunt activi în infecția cu HIV, în infecțiile intestinale asociate cu SIDA sau în protozooze (Giardia și Entamoeba). Alcaloizii diterpenoizi sunt, de obicei, izolați din plantele familiei Ranunculaceae, în special Ranunculus gracialis. Alcaloizii cuaternari (berberina și harmane) sunt eficace împotriva trypanosomelor și plasmodiilor. Mecanismul de acțiune este atribuit capacității lor de a intercala cu ADN-ul sau cu peretele celular (5).
I.5.3.1.4. Peptidele acționează ca inhibitori ai dezvoltării microorganismelor, prin formarea canalelor ionice în membrana celulară sau prin inhibarea competitivă a adeziunii proteinelor microbiene, care au în structură receptorii polizaharidici.
Thioninele sunt peptide care se găsesc în orz și grâu, având în structură 47 de resturi de aminoacizi. Acestea sunt toxice pentru fungi, bacterii Gram-negative și bacterii Gram-pozitive. Thioninele AX1 și AX2 din sfeclă de zahăr sunt active împotriva ciupercilor, nu însă și asupra bacteriilor, iar fabatinul, o peptidă identificată în fasole, inhibă multiplicarea bacteriilor E. coli, P. aeruginosa și Enterococcus hirae, însă nu și Candida sau Saccharomyces (5).
Lectinele cu moleculă mare, includ lectin-manoza specifică, prezentă în mai multe plante, MAP30 din pepenele amar, GAP31 din Gelonium multiflorum, și jacalinul. Aceste substanțe sunt inhibitorii proliferarării virale (HIV, citomegalovirus), prin inhibarea interacțiunii virale cu componente critice ale celulei gazdă (5). Unele lectine se combină cu oligozaharide specifice de pe suprafața celulelor, provocând aglutinarea acestora (globule roșii) sau identificarea celulelor mutante din culturi celulare. Se găsesc în semințele și țesuturile unor legume, fiind percepute ca toxine (21).
I.5.3.1.5. Vitaminele sunt indispensabile vieții, acestea fiind catalizatorii tuturor reacțiilor metabolice din organismele animalelor. Utilizarea plantelor medicinale ca surse de vitamine din complexul B, provitamina A, vitaminele C, F, K, P și PP este, așadar, esențială. Includerea plantelor medicinale bogate în precursori sau vitamine hidrosolubile și liposolubile, este benefică pentru prelungirea vieții albinelor.
I.5.3.1.6. Fitoncidele (antibioticele vegetale) sunt sintetizate de plante și prezintă acțiune antibiotică mult mai scăzută față de cele sintetizate de fungi sau bacterii. Se cunosc peste 50 de fitoncide, cele mai importante fiind allicina, dihidroallina, acidul benzoic, alil-senevolul, acidul p-hidroxil-benzoic, acidul vanilic, acidul cafeic, acidul ferulic etc. Allicina este extrasă din usturoi, iar dihidroallina din ceapă.
Fitoncidele au acțiune bacteriostatică, bactericidă, unele din ele și antitumorală (acidul p-hidroxil-benzoic, acidul vanilic, acidul cafeic, acidul ferulic etc.).
Prezența fitoncidelor secretate de plante poate fi observată prin plantarea unui puiet de pom și a unui băț oarecare, în apropiere. În timp ce bățul este distrus, în scurt timp, de microorganismele prezente în sol, puietul crește și se dezvoltă sub influența benefică a mediului (10).
I.5.3.1.7. Insecticidele vegetale sunt sintetizate de plante superioare, iar din punct de vedere chimic pot fi cetoalcooli nesaturați (piretrolona), esteri ciclici nesaturați (piretrina, cinerina), benzo-pirani (rotenona), glicozide (scilirozida), senevoli (senevolul fenil-etilenic extras din sfeclă) sau amide ramificate nesaturate (10). Pot prezenta interes în tratamentul acariozelor la albine.
I.5.3.1.8. Glicozidele sunt formate dintr-o componentă glucidică (monoglucidică, diglucidică sau oligoglucidică) și dintr-un aglicon (componenta neglucidică aparține alcoolilor, fenolilor, sterolilor, tioalcoolilor, hidrochinonelor, pigmenților, substanțelor cu azot etc.). Glicozidele se găsesc în toate plantele superioare, fiind extrase din frunze, flori, fructe, semințe, rădăcini sau lemn. Sunt folosite, în doze mici, ca medicamente sau ca otrăvuri, în doze mari. Cele mai cunoscute glicozide sunt O-glicozidele (arbutina, salicina, coniferina, amigdalina, glicoalcaloidele, glicozidele flavonoidice, carotenoglicozidele, glicozide xantonice, glicozide indolice etc.), O-glicozidele steroidice (glicozidele cardiotonice, saponinele), glicoalcaloidele, S-glicozidele din crucifere (sinigrina din muștar negru, hrean, ridichi, rapiță) sau N-glicozidele (nucleozidele și nucleotidele (10). Nu prezintă importanță pentru profilaxia în bolile albinelor. De aceea trebuiesc evitate plantele care conțin glicozide în prepararea infuziilor, decocturilor sau tincturilor destinate albinelor.
Multe substanțe fitochimice nemenționate au proprietăți antimicrobiene. Dintre acestea amintim: poliaminele (în special spermidina), izotiocianații, thiosulfinatele sau glucozidele. De asemenea, poliacetilenele merită o mențiunene specială. Estevez-Braun și colab., 1994 (citat de 5) au izolat o poliacetilenă cu structura chimică C17 din planta Bupleurum salicifolium, endemică în Insulele Canare. Compusul 8S-heptadeca-2 (Z), 9 (Z) -dienă-4,6-diyne-1,8-diol, a inhibat dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive (B. subtilis și S. aureus), dar nu și bacteriile Gram-negative sau fungi. Acetilena și flavonoidele din plante utilizate în mod tradițional în Brazilia pentru tratamentul malariei si a febrei hepatice au fost, de asemenea, asociate cu activitatea împotriva malariei. Folosirea plantelor medicinale bogate în acești compuși, nu este indicată în prevenirea bolilor la albine.
I.5.3.2. Intoxicațiile cu plante medicinale
Intoxicațiile cu plante medicinale, în general, și la albine, în special, se produc din trei cauze:
Necunoașterea proprietăților toxice ale plantelor medicinale;
Necunoașterea caracterelor botanice și morfologice, în primul rând, ale plantelor medicinale;
Depășirea dozelor la plantele cu principii puternic active (11).
Plantele medicinale care conțin saponine în concentrație mare sunt iritante pentru mucoasele tractului digestiv, accentuând astfel tulburările morfologice și funcționale ale tubului digestiv.
Depășirea dozelor recomandate pentru plantele medicinale poate cauza fenomene toxice sau chiar letale. Plantele medicinale cu principii puternic active (alcaloizi, heterozide, unele uleiuri volatile) sau altele mai puțin active, trebuiesc administrate în dozele prescrise. Sunt și plante medicinale lipsite de efecte toxice, cum sunt, de exemplu, fructele de măcieș, de cătină, frunzele de mentă, de nalbă mare (11).
Alteori, intoxicațiile se produc datorită folosirii unor plante medicinale care în doze mici au acțiune terapeutică sau sunt farmacologic active, iar în doze mari au acțiune toxică sau mortală.
În cazul plantelor medicinale cu conținut de tanin, depășirea dozelor poate duce la constipație și afectarea mucoasei tractului digestiv ( iritații, leziuni).
Pentru unele plante medicinale sunt indicate numai extractele de principii active apoase, deoarece tincturile (extractele alcoolice) conțin subsanțe toxice, așa cum este cazul pelinului (alcoolul extrage tuiona), și care sunt toxice pentru albine (11).
I.5.3.3. Recoltarea și condiționarea plantelor medicinale
Cu toate că albinele, prin natura activității lor (culegătoare de polen, nectar și propolis), sunt în contact permanent cu substanțele active terapeutic din plante, uneori trebuie să intervenim, cu efectul lor benefic, în prevenirea și tratarea unor maladii sau pentru asigurarea unei dezvoltări normale a coloniei de albine. Însă, pentru a interveni eficient, trebuie să cunoaștem câteva reguli care stau la baza obținerii și păstrării calității substanțelor active ale plantelor medicinale. Aceste aspecte se referă la:
cunoașterea organului din plantă care conține cea mai mare concentrație de subtanță activă farmacodinamic;
momentul optim de recoltare;
metoda de recoltare (2);
condițiile de uscare și de păstrare;
metodele de extracție a principiilor active;
procedee de administrare a extractelor de principii active în hrana albinelor.
I.5.3.3.1. Concentrația în principii activi în organele aceleași plante este variabilă. În unele plante compușii bioactivi sunt uniform distribuiți, pe cînd în altele este inegală. De acest fapt trebuie să se țină cont la recoltarea plantelor. Unele plante sunt recoltate în totalitate în perioada de înflorire, la altele numai florile sau frunzele, fructele, rizomii, rădăcina sau coaja.
Ținând cont de aceste aspecte, se recoltează:
planta în totalitate în perioada de înflorire la sunătoare, răchitan, urzică moartă, pelin, troscot;
tulpina aeriană în perioada de înflorire la coada șoricelului, cimbrișor, coada calului, talpa gâștei, coada racului;
florile la gălbenele, mușețel, coada șoricelului, tei, sulfină, levănțică, urzică moartă, albăstrele;
frunzele la izmă, roiniță, urzică, pătlagină, păpădie, anghinare, salvie, afin, mur, zmeur, fag, mesteacăn, nuc, gutui, dud;
fructele la cătină, măceș, afin;
coaja la stejar (12).
I.5.3.3.2. Momentul optim de recoltare este condiționat de stadiul de vegetație al
plantelor, perioada din zi și condițiile meteorologice. În general, toate plantele medicinale sunt recoltate dimineața sau după amiază, pe timp uscat, excepție făcând cele care conțin uleiuri volatile, care se recoltează pe timp noros sau dimineața, înainte de răsăritul soarelui.
O condiție esențială este conservarea florei medicinale spontane prin recoltarea selectivă, în așa fel încât să rămână organele de înmulțire ale unor părți dintre acestea, în vederea perpetuării speciilor respective (2).
I.5.3.3.3. Recoltarea plantelor medicinale obligă culegătorii să posede cunoștințe temeinice privind încadrarea botanică a speciilor utile. Eventualele greșeli, pot avea consecințe grave asupra albinelor. În funcție de bogăția în principii active, se recoltează:
organele subterane (rădăcini, rizomi, bulbi, tuberculi) primăvara timpuriu sau toamna târziu;
părțile aeriene (Herba) în perioada îmbobocirii sau înfloririi plantelor;
mugurii florali (Gemmae sau Turiones) primăvara devreme, la începutul perioadei vegetative a plantelor;
coaja sau scoarța (Cortex) de pe rădăcini, tulpini sau ramuri, primăvara timpuriu, înainte de îmbobocirea plantelor;
frunzele (Folium) când ajung la dezvoltare maximă;
florile (Flores) la începutul înfloririi sau în timpul înfloririi, dar înainte de ofilirea acestora;
fructele (Fructus) când dau în pârgă (măceșe) sau la coacere, până la căderea brumei;
semințele (Semen) înainte de completa maturizare (2, 4).
I.5.3.3.4. Condițiile de uscare și de păstrare sunt esențiale în menținerea activității farmacodinamice a substanțelor active din plantele medicinale. Imediat după recoltare, materia primă vegetală este sortată de corpurile străine, după care se usucă.
Pentru uzul casnic, plantele medicinale sau părți ale acestora, sunt depozitate, pentru uscare, în locuri uscate, aerate, în poduri, șoproane sau magazii, așezate în snopuri mici, suspendate de grinzi, căpriori, leațuri sau întinse, în strat subțire, pe hârtie, rogojini sau prelate.
Uscarea la umbră este recomandată pentru părțile aeriene ale plantelor medicinale (Herba, Folium, Flores, Fructus); pentru cele subterane (Radix, Rhizoma, Bulbus, Tubera) și semințe se preferă uscarea la soare. Părțile aeriene ale plantelor medicinale pot fi uscate și la soare dacă straturile de materie vegetală sunt acoperite cu hârtie.
Uscarea și depozitarea plantelor medicinale puternic mirositoare se face separat de cele fără miros, deoarece ultimile împrumută mirosul celor dintâi. Un produs de bună calitate, după uscare, trebuie să-și păstreze culoarea, mirosul natural, este întreg și neamestecat cu alte specii sau corpuri străine (2, 4). Din acest moment, planta medicinală sau părți ale acesteia, capătă denumirea de drog (12) sau, mai nou, produs vegetal medicinal (11).
După uscare, organele plantelor medicinale (drogurile) vor fi ambulate în materiale textile sau de hârtie (saci, pungi, cutii de carton) și depozitate în locuri uscate.
I.5.3.3.5. Extracția principiilor active din droguri se realizează cu ajutorul unor solvenți, fiind utilizate diverse procedee.
Solvenții folosiți pentru extracția substanțelor active din produsele vegetale medicinale sunt apa, alcoolul, vinul, oțetul sau uleiurile vegetale. Substanțele extrase cu ajutorul apei sunt: antocianinele, amidonul și feculele, taninurile, saponinele, terpenoidele, polipeptidele și lectinele, iar cu alcool taninurile, polifenolii, poliacetilenele, flavonolii, terpenoidele, sterolii sau alcaloizii (5).
Metodele principale prin care se obțin extractele sunt infuzia, decocția, macerația și digestia.
Infuzia sau ceaiul este procedeul obișnuit de extracție a principiilor active termostabile și greu solubile la rece, din flori și frunze sau planta întreagă. În acest scop, drogul sau amestecul de produse vegetale medicinale, tocate, sunt ținute în contact cu apa clocotită timp de 15 – 30 de minute, timp în care se amestecă de mai multe ori, după care sunt strecurate printr-o sită sau tifon. Apoi, ceaiul este folosit la obținerea siropului de zahăr invertit cu extract de plante medicinale.
Decocția sau fiertura este procedeul prin care substanțele biologic active din organele plantelor medicinale sunt extrase prin fierbere cu apă, durata fiind determinată de natura drogului: 10 – 15 minute pentru flori, frunze și planta întreagă sau 30 – 40 de minute pentru scoarța și organele subterane ale plantelor. Și decoctul poate fi folosit pentru constituirea siropului invertit cu extract de plante medicinale.
Macerația sau plămădeala la rece folosește un solvent pentru extracție. Produsele vegetale medicinale rămân în contact cu solventul timp de 3 – 6 ore, când se folosește apa sau 5 – 10 zile când se folosesc alcoolul, vinul sau oțetul. În această perioadă, recipientul este agitat din când în când.
În funcție de solventul utilizat, extractul poartă diverse denumiri: tincturi, pentru extractul alcoolic, oțeturi aromatice pentru extractul cu acid acetic, vinuri medicinale pentru extractul cu vin etc. După scurgerea perioadei de extracție, maceratul se strecoară și se utilizează la constituirea siropului de zahăr invertit cu extract de plante medicinale.
Tincturile, oțeturile aromatice sau vinurile medicinale pot fi păstrate timp îndelungat, în sticle de culoare închisă, la temperatura camerei, în timp ce extractul apos trebuie utilizat imediat.
Digestia sau plămădeala la cald realizează extracția principiilor active din produsele vegetale medicinale (mușețel, sunătoare) la temperatura de 40 – 60°C, pe baie de apă, timp de 2 – 3 ore. Solvenții folosiți sunt apa, alcoolul etilic concentrat și uleiurile vegetale. După extracție și strecurare, soluțiile obținute sunt depozitate la rece și întuneric, cu excepția extractului cu apă, care trebuie folosit în maximum 24 de ore.
I.5.3.3.6. Procedee de administrare a extractelor de principii active în hrana albinelor
Tratamentele cu extracte din plante medicinale pot fi preventive și curative.
Pentru prevenirea bolilor și stimularea dezvoltării coloniei de albine administrarea extractului de plante medicinale se face primăvara timpuriu și toamna, la sfârșitul sezonului activ, când flora spontană lipsește din peisaj. Se fac 3 – 4 administrări săptămânale de sirop de zahăr invertit 1:1 cu extract din plante medicinale la care se adaugă câte 25 ml de suc de ceapă/litru de sirop. Recomandăm folosirea primelor plante din fiecare grupă farmacodinamică (de exemplu: Rp/ cătina 60 g; mușețel 60 g; pelin 20 g; gălbenele 60 g.) în cantitate totală de 200 g drog/10 litri de sirop, odată pe săptămână, câte 0,500 l/familie.
Procedura de preparare a ceaiului și a siropului de zahăr invertit o redăm în continuare.
Pentru obținerea, de exemplu, a unei cantități de 10 litri de sirop de zahăr invertit 1:1, cu ceai de pelin, se procedează astfel:
se pun 4 litri de apă într-un vas emailat sau din inox și se lasă la foc iute până dă în clocot;
se stinge focul și se adaugă 20 de grame din produsele vegetale medicinale mărunțite, se amestecă cu apa clocotită și se acoperă infuzia cu un capac, amestecându-se periodic;
după 15 – 30 de minute, ceaiul se strecoară și se amestecă cu 6 litri de sirop 2:1, care este obținut astfel:
într-un alt vas emailat se pun 2,600 litri apă la foc mic și se încălzește la 70 – 80°C;
se adaugă treptat 5,200 kg zahăr tos și conținutul unui plic de 8 grame de acid citric (sare de lămâie), amestecul fiind agitat continuu, cu un făcăleț sau lingură de lemn, până când zahărul se topește în totalitate. Atenție! Compoziția nu trebuie să fiarbă!
În continuare, se amestecă cele două soluții și se obțin 10 litri de sirop de zahăr invertit 1:1, cu o concentrație de extract de plante medicinale de aproximativ 0,02%o.
La acestă compoziție se poate adăuga, după răcire, câte 25 ml de suc de ceapă/litru de sirop, după care se amestecă bine. Apoi, siropul obținut se administrează, călduț (35 – 40°C), câte 0,500 litri/familie de albine, săptămânal, de trei sau patru ori, consecutiv, primăvara și toamna, când temperatura exterioară este de minimum 12°C.
În cazul folosirii tincturilor la prepararea siropurilor din zahăr invertit se pune câte o lingură de supă/litru de sirop, doza pe familie și intervalul de administrare fiind specificată mai sus. Sucul de ceapă poate fi administrat în orice tip de combinație medicinală, fiind respectate, însă, recomandările de mai sus. Administrarea sucului de ceapă este benefică, deoarece experiențele efectuate au demonstrat că mărește durata de viață a albinelor.
Pentru intervenții curative în nosemoză și amoebioză, principiul preparării siropului de zahăr invertit cu ceai de pelin este cel prezentat mai sus. Se administrează câte 0,200 litri sirop/familie, din două în două zile, timp de două săptămâni. După o pauză de două săptămâni, tratamentul se poate relua, dacă semnele de boală persistă.
I.5.3.4. Plantele medicinale utile în profilaxia bolilor la albine
Folosirea plantelor medicinale în afecțiunile mamiferelor și mai ales în medicina umană este binecunoscută, grupele de principii active conținute de produsele vegetale medicinale fiind utilizate pentru remedierea funcțiilor unor organe, țesuturi, aparate sau sisteme și pentru tratarea unor boli. Însă, la albine, aceste aspecte sunt încă puțin cunoscute și, ca atare, administrarea unor grupe de compuși este inoportună.
De aceea, sunt folosiți compușii chimici care au acțiune stimulatorie generală (vitaminele, acizii organici), cele care au acțiune bacteriostatică sau bactericidă (fitoncidele, uleiurile esențiale) sau stimulează funcția digestivă (substanțele tanante și cele amare). Excepție face pelinul amar (Artemisia absinthium) și pelinul dulce (Artemisia annua), care sunt utilizate în profilaxia și tratamentul nosemozei și amoebiozei (1).
În acest sens, Ogradă (1978) a făcut o clasificare a plantelor medicinale folosite în terapia apicolă, în funcție de acțiunea acestora asupra albinei, ca individ, și a coloniei, ca entitate organizată social. Această clasificare cuprinde:
plante cu acțiune trofică și stimulatorie generală: cătina, măcieșul, urzica, sunătoarea, păpădia, talpa gâștei, afin, mur, zmeur, fag, nuc etc.;
plante cu acțiune antibacteriană: usturoi, ceapă, coada șoricelului, mușețel, sunătoare, pătlagină, răchitan, anghinare, pelin, roiniță (mătăciune), izmă, tei, cimbrișor, levănțică, gălbenele, urzică moartă, zmeur, fag, coada calului, talpa gâștei, coada racului;
plante cu acțiune astringentă (antidiareică), antiseptică și stimulatorie asupra aparatului digestiv: pelin, roiniță, coada șoricelului, gălbenele, izmă, cimbrișor, răchitan, coada calului, măcieș, păpădie, anghinare, urzică moartă, stejar, nuc, mesteacăn, albăstrele, salvie, fag, zmeur, mur, afin, gutui, dud, coada racului, talpa gâștei, levănțică, troscot, cozi de cireșe și de vișine.
În această ordonare a plantelor medicinale, se observă că unele dintre ele sunt prezente în două sau trei grupe farmacologic active, chiar dacă concentrația în substanțe biologic-active este redusă. În alcătuirea unei rețete se va ține seama de ordonarea lor în grup, aceasta fiind făcută în funcție de bogăția în principii active, în ordine descrescândă. Deducem astfel, că atunci când dorim să facem un extract apos (ceai) compus din plante medicinale, ai căror principii activi au acțiune stimulentă, antibacteriană și astringentă, vom alege usturoiul sau ceapa, cătina sau măcieșul și pelinul.
După cum s-a văzut mai sus, principiile active din plante sunt variate și cu acțiune farmacodinamică polivalentă. Compușii fitochimici utili se găsesc în toate plantele medicinale în proporții variabile, uneori cuplați cu substanțe toxice, care administrați în cantitate mare pot dăuna sănătății albinelor. De asemenea, unele asocieri pot da naștere la compuși inactivi farmacodinamic. De aceea, în cele ce urmează, vom prezenta câteva plante medicinale și principiile active ce le conțin, utilizate în terapia apicolă, precum și asocierile mai frecvent recomandate. Ca regulă generală, o asociere de droguri (plante medicinale) trebuie să conțină:
vitamine și săruri minerale;
terpene (sesquiterpene) și uleiuri esențiale;
taninuri și flavone.
I.5.3.4.1. Afinul (Vaccinium myrtillus L., fam. Ericaceae) (fig.I.5.1.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
frunza (Folium Myrtilli);
fructul (Fructus Myrtilli).
Fig. I.5.1. Afinul (18); Fig. I.5.2. Ceapa (18); Fig. I.5.3. Cătina (18)
Momentul recoltării:
frunzele împreună cu ramurile se culeg în perioada mai – septembrie;
fructele se culeg când ajung la maturitate deplină (iulie – august).
Principii active:
frunzele conțin taninuri catehinice, derivați flavonici;
fructele conțin taninuri, derivați antocianici (mirtilina a și b), vitamina C, vitaminele din grupul B, vitamina E, provitamina A, principii bacteriostatice (4, 7).
Compoziție chimică:
frunzele conțin tanin, arbutină, hidrochinonă, mirtilină (insulină vegetală), neomirtilină, acid chimic, miristic și palmitic, ericolină, derivați flavonici, acizi triterpenici, tiamină, săruri minerale;
fructele conțin tanin, pectine, mirtilină (insulină vegetală), zaharuri, provitamina A, vitamina C, acizi organici (citric, malic, oxalic, succinic, lactic), săruri minerale (potasiu 50 mg%, calciu 10 mg%, fosfor 8 ing%, sulf 8 mg%, magneziu 6 mg%, clor 5 mg%, mangan 3 mg%, fier 1 mg%), pigmenții coloranți de natură glicozidică, printre care cei mai reprezentativi sunt delfmidina, cianidina, petumidina și malvidina (3, 7), .
Mod de utilizare:
infuzie din frunze;
decoct din frunze și fructe
suc din fructe (3, 18).
I.5.3.4.2. Ceapa (Allium cepa L., fam. Liliaceae) (fig. I.5.2.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
bulbul (Bulbus Allii).
Perioada de recoltare:
iunie – iulie.
Principii active:
alicina, enzime, ulei volatile, vitamine.
Compoziția chimică:
săruri minerale (sodiu, potasiu, fier, sulf, iod, siliciu, fosfat); principii antibiotice (alicina), glucide, lipide, zaharoză; acizi organici, enzime, steroli; vitamine (vitamina C, vitamine din grupul B, vitamina E); ulei volatil, saponine; disulfură de alil și propil.
Mod de utilizare:
Infuzie, decoct;
Suc, 25 ml la 1 litru de sirop (9).
I.5.3.4.3. Cătina (Hippophaë rhamnoides L. fam. Elaeagnaceae) (fig.I.5.3.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
fructul (Fructus Hippophaë).
Momentul recoltării:
de la coacere până la lăsarea primului ger.
Principii active:
vitamine, carotinoide, acid folic, izoramnetol (4)
Compoziție chimică:
fructele conțin monozaharide, acizi organici, flavonoide, pectine, polifenoli, taninuri, ulei gras complex; microelemente (P, Ca, Mg, K. Na, Fe, Mn, B, Si, Ti); vitamine liposolubile (A, E, F, D), vitamine hidrosolubile (C, P, K, complexul B), alfa și beta caroten, tocoferoli, fitosteroli; acizi grași esențiali (oleic, linoleic, pantotenic, palmitic, heptadecanoic etc), acizii succinic, malic, maleic etc., licopen, criptoxantină, zeaxantină, taraxantină etc. (3, 7);
– semințele conțin acizi grași nesaturați: linoleic și linolenic;
– frunzele și scoarța conțin sitosteroli și tocoferol (3).
Modul de utilizare:
infuzie de fructe 2 – 3g%;
decoctul din fructe.
I.5.3.4.4. Cimbrișorul de câmp (Thymus serpyllum L., fam. Labiatae) (fig. I.5.4.)
Organe folosite în scopuri medicinal:
părțile aeriene (Herba Serpylli).
Fig. I.5.4. Cimbrișorul de câmp (18); Fig. I.5.5. Coada șoricelului (18)
Mod de utilizare:
Perioada de recoltare:
la înflorire.
Principii active:
ulei volatil, acizii cafeic și rozmarinic, principiu amar (4).
Compoziție chimică:
ulei esențial 0,5-1,2% (bomeol, cineol timol, p-cimol, carvacrol, α-terpineol, mircen, β-cariofilen etc.), acid ursolic, acid cafeic, 4-8% tanin, un derivat flavonoidic, serpilina. săruri ale acidului malic, săruri minerale, mai ales Mn, etc. (3, 7).
infuzie 1-2 g% (4).
I.5.3.4.5. Cimbrul de cultură (Tymus vulgaris L., fam. Labiatae)
Organe folosite în scopuri medicinale:
părțile aeriene (Herba Thymi).
Momentul recoltării:
înainte de înflorirea completă.
Principii active:
ulei volatil, tanin, acid cafeic, flavonoide, triterpenoide, principiu amar (4).
Compoziție chimică:
1,5-2% ulei esențial (carvacrol și timol (60%), p-cimol și borneol; geraniol, linalol, acetat de bornil, alfa-pinen, citral, tuianol; saponozide, acid ursolic, oleanolic, cafeic; derivați flavonici: luteolinâ și lute-olin–7-glicozid; sterine, seruri, triterpene, un princijiiu amar etc. (3).
Mod de utilizare:
infuzie 1-2 g% (4).
I.5.3.4.6. Coada șoricelului (Achillea millefolium L. fam. Compositae) (fig.I.5.5.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
părțile aeriene (Herba Millefolii);
florile (Flores Millefolii).
Perioada de recoltare:
la înflorire.
Principii active:
ulei volatil, proazulene, taninuri, flavonozide, colină, fitoncide (4).
Compoziție chimică:
3-4% taninuri condensate și hidrolizabile; 0,3 – 1,4% ulei esențial (linalol, borneol, camfor, β-caiyofilene, 1,8% cineol; sesquiterpene lactonice compuse din guaianolide, un proazulen (achillicina), achillină, leucodină, germacranolide; lavonoide (apigenină, luteolină, izorhamnetină și rutozid); aminoacizi (alanină, histidină, leucină și lizină); acizi grași (linoleic, palmilic și oleic); acizi fenolici (cafeic și salicilic); vitamine (acid folic și acid ascorbic); alcaloizi și baze alcaloidice (achiceine, achilleine, betaine și colină), alkane, polyacetilene, saponine, steroli, zaharuri și cumarine, săruri de K, P, Mg (3, 7).
Mod de utilizare:
infuzie 2-5 g%, uneori 10 g% (4).
I.5.3.4.7. Gălbenelele (Calendula officinalis L.; fam. Compositae) (fig. I.5.6.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
florile marginale (Flores Calendulae sine receptaculis);
întregul capitul (Flores Calendulae cum receptaculis);
Perioada de recoltare:
la înflorire.
Fig. I.5.6. Gălbenele (18); Fig. I.5.7. Izma (18); Fig. I.5.8. Levănțica (18)
Principii active:
saponozide (triterpenice), carotinoide, flavonoide, substanțe amare (4).
Compoziție chimică:
glicozide de natură flavonolică (izo-vercitrina, narcisina, neohesperozidul și rutozidul; terpenozidele alfa și beta-amirina, longispinogenina, lupeolul și steroli; uleiuri escnțiale (cca 0,02%); arverozida A, pigmenți carotenoidici, caleindulina și polizaharide, gumi-rezine; mucilagii, esteri colesterinici ai acizilor lauric, miristic, palmitic și margaric; vitaminele C, A, K, acid malic, substanțe proteice etc. (3, 7).
Mod de utilizare:
infuzie 2 g% (4).
I.5.3.4.8. Izma sau Menta (Mentha piperita (L., fam. Libiatae) (fig.I.5.7.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
frunzele (Folium Menthae piperitae).
Perioada de recoltare:
la înflorire.
Principii active:
ulei volatil, acelat și valerianat de metil, taninuri,, flavonoide, polifenoli și un principiu amar (4).
Compoziție chimică:
luteolină, hesperidină și rutină, acizii clorogenic, cafeic și rosmarinic, taninuri (până la 12%), colină; alfa- și beta caroten, gumi-rezine, alfa- și beta tocoferol, alfa-amarină, triterpene, felandrene, limonen, cadinen, cincol, aldehidă acetică, alcooli sesquiterpenici, cariofilen etc. uleiul esențial (1,2-3%) din frunzele plantei conține mentol, nientone, mentofuran, alfa-pinen, felandren, limonen, cadinen, cincol, aldehidă acetică și izovalerianică, alcool amilic și izoamilic, timol, carvacrol, vitamine (A, C, D, PP), săruri minerale cu P, K, Ca, Mg, Fe, Mn etc. (3, 7).
Mod de utilizare:
infuzie 0,5- 1,5 g% (4).
I.5.3.4.9. Levănțica (Lavandula angustifolia L; fam. Labiatae) (fig. I.5.8.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
inflorescența, când corola nu este complet deschisă (Flores Lavandulae).
Perioada de recoltare:
la înflorire.
Principii active:
ulei volatil, tanin, principiu amar, flavonoide, terpene (4, 3).
Compoziție chimică
uleiul esențial (0,5-1% – 1,5-3%) are în compoziție 25-55% acetat de linalil, 20-38% linalol, 4-10% cis-beta-ocimen, 2-6% trans-beta-ocimen, 2-6% I-terpinen-4-ol, 0,2-0,5% camfor, 0,2-0,8% alfa-terpineol și 0,1-0,5% limonen; taninuri (5-10%); cumarine; flavonoide; fitosteroli; triterpene; borneol; o substanță amară; săruri minerale (3).
Mod de utilizare:
infuzie 1-2 g% (4).
I.5.3.4.10. Măceșul (Rosa canina L.; fam. Rosaceae)
Organe folosite în scopuri medicinale:
pseudo-fructele (Fructus Cynosbati)
Perioada de recoltare:
înainte de căderea brumei.
Fig. I.5.9. Măceșul (18); Fig. I.5.10. Mușețelul (18); Fig.I.5.11. Păpădia (18)
Principii active:
vitamina C, acid dihidroascorbic, β-caroten, vitaminele B1, B2, K, A, E, P și PP, flavonoide (4, 7).
Compoziție chimică:
vitamina C (conținut: soiurile de la șes 0,30-0,80 g%, cele din zona colinară și submontană 2,5-3,5 g%, în culturi, Rosa rugosa conține până la 5,0 g%, Rosa pendulina (Rosa alpina) 9 g%; pectine; taninuri; zaharuri; acizi organici; săruri minerale; carotenoide; diverși izomeri ai rubixanlinei, licopinci și β-caroten; procianidoli (B1, B2, B3, B4), vitamina E 10%; catechine; flovonoizi; ulei gras; lecitine; zaharuri; ulei esențial (urme); antociani (3, 7).
Mod de utilizare:
decoct 3-5 g% (4).
I.5.3.4.11. Mușețelul (Matricaria chamomilla L, fam. Compositae) (fig.I.5.10.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
florile cu peduncul de cca 1 cm (Flores Chamomillae);
Perioada de recoltare:
pe timp însorit, după ce se ridică roua, iar florile sunt dispuse orizontal.
Principii active:
ulei volatile bogat în chamazulenă, substanțe amare din grupa sesquiterpenică, flavonozide, compuși cumarinici, colină, mucilagii (4).
Compoziție chimică:
8% flavonoide (upigenină și luteolină); ulei esențial între 0,4-2,0% (bisanabol cca 50% și chamazulene între 1,5—15%); sesquiterpene lactonice (matricina, matricarina); mucilagii compuse din polizaharide; aminoacizi; acizi grasi (oleic, linoleic, palmitic, stearic, caprilic); acizi fenolici; colină; cumarine, săruri minerale (cu K, P, Si, Fe, Mg, Ca, Cu), vitamine (B, C) etc. (3, 7).
Mod de utilizare:
infuzie 1-5 g% (4).
I.5.3.4.12. Păpădia (Taraxacum offlcinale Wcb.; fam. Compositae) (fig. I.5.11.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
frunzele (Folium Taraxaci);
rădăcina (Radix Taraxaci);
planta întreagă (Herba Taraxaci cum radicibus).
Perioada de recoltare:
primăvara frunzele sau întreaga plantă;
iulie – august, rădăcina.
Principii active:
în părțile aeriene sesquiterpene lactonice (principiu amar), vitaminele B și C, steroli;
în rădăcină alcooli triterpenici, fitosteroli, inulină, vitaminele A, B, C, D, PP (4).
Compoziție chimică:
în părțile aeriene ale plantei : substanțe amare (sesquiterpene lactonice: eudesmanolizi, germacranolizi și taraxacozid); triterpene (taraxasterolul și acetații lor, 16-hidroxiderivați ai ami-diolului și faradiolului); β-amarina, sitosteroli, stigmasteroli; carotenoide; xantofile; flavonoizi (apigenina și luteolina); acizi hidroxicinamici; acid cicoric, acid monocafeiltartaric, acid clorogenic, acizi grași (oleic, palmitic, stearic), acizi organici (cafeic, folic, fumaric, nicotinic);
în rădăcini carohidrați (inulina în cantitate de 2% primăvara și până la 40% toamna); săruri minerale, în special K, dar și Ca, Fe, Mg, Mn, Se, Zn (3, 7).
Mod utilizare:
infuzie din părțile aeriene, 1-2 g%;
decoct din rădăcină, 2-3 g% (4, 3).
I.5.3.4.13. Pelinul (Artemisia absinthium L.; fam. Compositae)
Organe folosite în scopuri medicinale:
părțile aeriene (Herba Absinthii).
Fig. I.5.12. Pelinul (18); Fig. I.5.13. Pinul (19)
Perioada de recoltare:
în timpul înfloririi (iulie-august).
Principii active:
ulei volatil, substanțe amare (sesquiterpene: anabsintină, astabsină, artametină etc.), flavonoide, tuionă (toxică în doze mari) (4, 3).
Compoziție chimică:
uleiul esențial 1,7% (felandrene, pinene, tuione 3 – 12%). Prin saponificarea uleiului esențial se obțin acid formic și salicilic; sesquiterpene (anabsintină, astabsină, artametină etc.); alcool tuiylic, acetat de luiyl, izovalerianat de tuiyl, bisabolene, palmitat de tuiyl, camfene, cadinene, nerol, camazulene; glicozidul amar absintina, artemarină; acid absintic, acid succinic; taninuri; rezine; amidon; malați și nitrați de potasiu și alte săruri; lactone (arabsină, artabină și ketopelenoide), acizi grași (palmitic, linoleic, lauric, stearic, arahidonic, oleic), vitamine (C, B, A, H), săruri minerale (K, Ca, Fe, Mn) etc. (3, 7).
Mod de utilizare: infuzie 1 g% (4).
I.5.3.4.14. Pinul (Pinns silve.stris L., fam. Pinaceae)
(fig. I.5.13.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
mugurii florali (Gemmae Pini, Turiones Pini, Coni Pini, Strobuli Pini).
Perioada de recoltare:
februarie, de pe ramurile laterale.
Principii active:
ulei volatil, tanin, rezine, vitamina C (4).
Compoziție chimică
uleiul esențial (50-90% monoterpene, ca α-pinene, β-pinene, D-limonene, α-terpinene, γ-terpmene, β-ocimene, myrcene, camfene, sabinene și terpinolene); acetatul de bornyl, borneol, cincol, citral, cadinol, caryofilene, camazulene; acizii valerianic, caproic și izocaproic (3).
Mod de utilizare:
infuzie 3-10 g% (4).
I.5.3.4.15. Roinița (Melissa offuinalis I.; fam. Labiatae) (fig.I.5.14.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
frunzele (Folium Melissae).
Perioada de recoltare:
în perioada de înflorire.
rincipii active:
ulei volatil bogat în citral, acid cafeic, principiu amar (4) glicozide, flavonoide, derivați terpenici, taninuri (7).
Compoziție chimică:
4% acid rosmarinic; acizi polifenolici (acizii cafeic și clorogenic); triterpene și flavonoizi; glicozizi monoterpenici și alte glicozide; ulei escnțial, 0,05-0,30% (citronelal, citral a și b, metiicitronelal, ocimene, citronelol, nerol, linalool, acetat de eugenil, pinen, limonen, ocimen, cariofilen și geraniol); alte sesquiterpene, beta-cariofilene și germacrene, mucilagii, pectine, rășini, rezine, glucide, acizi organici (succinic, cumaric, ferulic, oleanolic), steroli (sitosteroli, campesterol) etc. (3, 7).
Fig.I.5.14. Roinița (18); Fig.I.5.15.Troscotul (18); Fig.I.5.16. Urzica moartă
albă (18)
Mod de utilizare:
infuzie 1 g% (4).
I.5.3.4.16. Troscotul (Pofygonum aviculare L.; fam. Polygonaceae) (fig. I.5.15.)
Organe folosite în scopuri medicinale:
părțile aeriene ale plantei (Herba Avicularis).
Perioada de recoltare:
în timpul înfloririi.
Principii active:
flavonozide (avicularozidă), tanin, substanțe minerale bogate în acid silicic liber și combinat (4).
Compoziție chimică:
1% acid silicic total, respectiv 0,08-0,20% acid silicic solubil prin decocție; 3-4% taninuri; flavonozide: avicularozida, respectiv arabinozida quercetolului și camferitrozida care este o rhamnozidă a camferolului; vitamina C; rezine, ceruri, grăsimi, zaharuri, mucilagii, derivați antrachinonici; ulei esențial (urme); săruri minerale (cu Si liber) (3, 7).
I.5.3.4.17. Urzica moartă albă (Lamium albutn I.; fam. Labiatae) (fig. I.5.16)
Organe folosite în scopuri medicinale:
florile fără caliciu (Flores Lamii albi).
Perioada de recoltare:
în perioada de înflorire.
Principii active:
taninuri, glicozide, ulei eteric, mucilagii, flavonozide, saponozide (4, 7).
Compoziție chimică:
fridoide (lamiozida); saponozide; taninuri; ulei esențial; flavonozide; mucilagii; acizi polifenol-carboxilici (acid rosmarinic, în special); amine biogene: histamină, metil amină și tiramină; vitaminele C și K; carotenoide; săruri minerale, în special de potasiu (3).
Mod de utilizare:
infuzie, 1 – 2 g%.
I.5.3.4.18. Usturoiul (Allium sativum L., fam. Liliaceae)
Organe folosite în scopuri medicinale:
bulbii, compuși din bulbili (Bulbus Allii).
Perioada de recoltare:
iunie – iulie.
Principii active:
ulei volatil (sulfuri de alil, alilpropil), alicină, vitaminele B și C (4).
Compoziția chimică:
săruri minerale; glucide; protide; lipide(0,1-0,5%); acizii organici: citric, malic, piruvic, succinic, glicuronic, citric, aliina, alicina, aliinaza; uleiul eteric (67 de compuși); propantriolul, etil-metil-disulfura, sulfitul etc. (17)
Mod de utilizare:
infuzie (după mărunțire) 1-2 g%,
decoct sau macerat (preferabil tinctură 18-20‰).
Plantele medicinale prezentate fac parte din flora spontană a României și mai puține sunt cultivate. Sunt ușor de recunoscut și extragerea principiilor active este facilă, iar solvenții necesari (apa, uneori și alcoolul etilic) sunt la îndemâna oricui.
Așa cum am arătat mai sus, plantele medicinale nu au o compoziție chimică unitară. Unele sunt mai bogate în terpene, altele în vitamine, multe în fitoncide, astfel că trebuie să facem un amestec echilibrat de droguri (plante medicinale) atunci când preparăm un extract de principii active. Pentru a ușura alegerea, prezentăm în următorul tabel principiile active utile și plantele medicinale care le conțin, precum și asocierile recomandate.
Tabel nr. I.5.1.: Principiile active utile în profilaxia bolilor la albine, plantele medicinale care le conțin și asocierile recomandate (original).
Legendă: *= în toate compozițiile, indiferent de natura lor, în tratamentele preventive și curative contra nosemozei ; **= în toate compozițiile (ori cătină, ori măcieș); *= usturoi+troscot; *=pin+pelin (preparatul KAS-81); *=mentă+păpădie; *=levănțică+roiniță; *gălbenele+mușețel; ***=coada șoricelului+afin; *=cimbru+urzică;
*ceapa= 25 ml suc la un litru de sirop, indiferent de compoziție (9).
I.5.5. Bibliografie
1. Asiminei S., Șpac A.F., Hrițcu A. (2003): Pelinul – plantă medicinală utilă în prevenirea și combaterea nosemozei la albine. Revista Română de Medicină Veterinară, vol. 13, nr. ¾, pag. 384.
2. Bojor O. și Alexan M., (1983): Plantele medicinale și aromatice de la A la Z. Ediția a II-a, Ed. RECOOP București.
3. Bojor O. (2003): Ghidul plantelor medicinal de la A la Z. Ed. FIAT LUX, București.
Constantinescu Gr. și Hațieganu Maria Elena, (1979): Plantele medicinale. Ed. Medicală, București, pag. 21-34.
Cowan Murphy Marjorie (1999): Plant Products as Antimicrobial Agents. Journal List Clin Microbiol Rev, 12(4): pag. 564-582.
Goldman Arlene (1993): Current Views on Malaria Prophylaxis. A Review Article. www.priory.com/malaria.htm;
Milică I. C., Roman Camelia Nicoleta, Troia Daniela (2012): Flora medicinal a României. Ed. DOXOLOGIA, Iași
Miloiu I. (1986): Iernarea familiilor de albine. Asociația Crescătorilor de Albine din România, Redacția publicațiilor apicole, București.
Miloiu I. (1990): Hrănirea albinelor. Asociația Crescătorilor de Albine din România, Redacția publicațiilor apicole, București.
Moța Cristina, Roșu Ana, Câmpeanu Gh. (2015): Substanțe bioactive de origine vegetală. www.selene.ro/articole/substante_bioactive
Muntean L. S., Tămaș M., Muntean S., Muntean L., Duda M. M., Vârlan I. D., Florian S. (2007): Tratat de plante medicinale cultivate și spontane. Ed. RISOPRINT, Cluj – Napoca.
Ogradă, I. (1978): Bolile și dăunătorii albinelor. Asociația Crescătorilor de Albine din România, Redacția publicațiilor apicole, București.
Popescu I., (1998): Starea familiilor de albine și lucrările importante ce trebuie efectuate în perioada de înlocuire a albinelor de iernare. În: România apicolă, nr. 1, pag. 2-5.
Rawhi M. A. A. (2012): Totul despre apiterapie. Editura ALL, București.
Ritter W. (2000): Bolile albinelor. Editura M.A.S.T., București.
***Lista plantelor medicinale: www.esanatos.com › NATURIST › lista plante medicinale
***Afin: http://ro. Wikipedia.org./wiki/Afin
***Plante medicinale: www.sanatatecuplante.ro/plante-medicinale.html
***Legume și plante medicinale: decostyle.mayra.ro › Legume si plante medicinale › Plante medicinal
***Terpene: http://www.pchelovod.info/index.php
***Oxford (1999): Dicționar de biologie. Editura Univers Enciclopedic, București. Traducere: Muică Ileana, Muică Cristina, Nițu Florentina Alina.
Ștefania ANDERCO
II.I. Bolile virale la albine
Viețuitoarele terestre și acvatice sunt gazde pentru diverse virusuri. Fiecare specie de virus are o gazdă consacrată, sau un număr restrâns de gazde.
Dintre animalele terestre, insectele sunt gazde și vectori pentru virusuri.
Unele virusuri se află în stare latentă în insecte, acidul nucleic viral fiind încorporat în acidul nucleic al gazdei, fără a produce simptome de boală. Însă, unii factori fizici (radiații ultraviolete), chimici (pesticide etc.), biologici sau greșeli tehnologice (aglomerarea populațiilor de insecte etc.) produc activarea virusurilor care declanșează epidemii și astfel se produce decimarea populațiilor de insecte, într-un interval scurt de timp.
Albinele atât cele solitare, cât și cele sociale, sunt indispensabile pentru reproducerea celor mai multe plante cu flori, fiind în același timp o sursă de hrană pentru alte animale (26).
Acest proces a dus la creșterea interesului științific și față de infecțiile virale, în special ale albinelor sociale europene (Apis mellifera L.).
II.1.1. Istoric, răspândire
Pe parcursul ultimilor ani, apariția, răspândirea și distribuția virusurilor la albine a fost investigată minuțios în diferite regiuni geografice, din multe țări.
Cercetările efectuate de Davison , S. și colab.,(2003) în Africa de Sud, au pus în evidență și caracterizat, prin tehnica moleculară, 18 virusuri întâlnite la albine, obținându-se și secvența completă a genomului pentru virusurile de tip picorna: virusul paraliziei acute (ABPV), virusul botcilor negre (BQCV), virusul puietului în sac (SBV) și virusul aripilor deformate (DWV) (19), iar Bekesi, L. și colab. (1999) și Bakonnyi, T. și colab. (2002) au evidențiat prin aceeași tehnică incidența infecțiilor virale la albinele din Ungaria cu ABPV, a cărui vector este Varroa destructor. Infecțiile cu mai multe virusuri au fost investigate de Evans (2002), descoperind că ABPV este însoțit frecvent de virusul de Kashmir (KBV).
Pe teritoriul Austriei, sunt prezente mai multe virusuri: cel mai răspândit virus este DWV, prezent în 91% de probe, urmat de ABPV, SBV, și BQCV (68%, 49% și respectiv 30%). Virusul paraliziei cornice (CBPV) a fost detectat în 10% de colonii, în timp ce KBV, nu a fost prezent în nici o probă. În cele mai multe mostre, a fost identificat mai mult de un virus (7).
Distribuția în probe a virusurilor ABPV, BQCV, CBPV și SBV a variat considerabil în
diferite regiuni geografice investigate, în timp ce DWV a avut o largă răspândire în toate regiunile Austriei. La albinele care au prezentat culoare întunecată și dezorientare, a fost întodeauna detectat virusul CBPV. Infectarea simultană cu DWV și ABPV a fost cel mai frecvent observată în coloniile care prezentau adinamie, depopulare și dispariție bruscă a albinelor adulte (7).
În Europa, cel mai răspândit virus al albinelor este considerat DWV; în Franța DWV a fost detectat în 97% din stupinele de la care au fost analizate probe. ABPV, al doilea dintre cele mai răspândite virusuri identificate în Austria este de asemenea răspândit în Europa (58% din stupinele investigate în Franța și 67% din cele investigate în Ungaria).
În cazul BQCV și SBV, densitatea mare a coloniilor de albine, în anumite regiuni geografice, comerțul și transportul intensiv al coloniilor, reginelor (mătcilor), stupinelor sau echipamentului trebuie, de asemenea, luate în considerație ca posibili factori importanți în transmiterea și răspândirea acestor virusuri între albine.
În Franța, unde intensitatea apiculturii și comerțului este mare, SBV și BQCV au fost plasate pe locul doi printre cele mai răspândite virusuri, fiind detectate în 86% dintre stupinele investigate. O importantă observație este faptul că familiile de albine CBPV-pozitive au prezentat constant simptomele bolii. În investigațiile din Franța, CBPV a fost stabilit ca cel mai puțin frecvent virus din probele analizate, după KBV, însă în alt studiu, realizat tot în Franța, rata infecției cu CBPV a fost de două ori mai mare decât la albinele care au prezentat simptomele bolii (22).
Virusul CBPV este larg răspândit în Statele Unite și în Australia. KBV a fost depistat în Germania si în cîteva stupine din Franța.
Deoarece ABVP și KBV prezintă un nivel înalt de similitudine și sunt, de asemenea, legați antigenic, se presupune că ambele virusuri provin de la un strămoș comun și au evoluat independent în regiuni geografice izolate.
În Republica Moldova (2008), prin aplicarea metodelor de biologie moleculară, a fost demonstrată prezența a patru virusuri ARN, cu consecințe nefaste pentru familiile de albine, vectorul acestor virusuri fiind acarianul V.destructor. Dintr-un număr de 47 de probe de albine, originare din diferite zone ale Republicii, au fost identificate virusurile DWV, SBV, BQCV și ABPV (62%, 54%, 37% și respectiv 10%). CBPV și KBV nu au fost detectate (24).
În China, la Apis mellifera ligustica și Apis cerana, au fost descoperite următoarele virusuri: CBPV, DWV, al paraliziei acute Israel (IAPV), SBV, BQCV, ABPV, KBV, cele mai răspândite, la populațiile de albine heterogene, fiind DWV, BQCV, CBPV și SBV, pentru ca albinele omogene din punct de vedere genetic să fie afectate de IAPV și SBV (8). În Japonia CBPV afectează numai albina europeană (Apis mellifera), la Apis cerana japonica nefiind izolat virusul paraliziei cornice. Prevalența infecției cu acest virus la Apis mellifera este redusă (5,6%), față de alte virusuri (IAPV, DWV, BQCV sau SBV) (25)
Pentru a înțelege caracterul insidios al infecțiilor virale, trebuie să cunoaștem unele particularități de structură, replicare și de patogenitate ale virusurilor.
II.1.2. Morfologia virusurilor
Virusurile sunt entități etiologice cu o structură acelulară sau subcelulară, constituite dintr-un număr fix de molecule, lipsite de capacitate de creștere, metabolic inerte, care pot exista în natură sub trei forme biologice, fiecare dintre ele reprezentând în același timp câte o etapă distinctă din circuitul lor în natură. Aceste forme sunt:
Virusul complet, numit și virus matur, particulă virală sau virion, care posedă toate componentele structurale caracteristice virusului respectiv. El este capabil de o existență pe timp limitat în afara celulei sensibile și are ca principală însușire infecțiozitatea – posibilitatea de a pătrunde sau de a inocula acidul nucleic viral într-o celulă gazdă, receptivă, capabilă să-l sintetizeze.
Virusul vegetativ, care reprezintă forma de viață intracelulară a virusului. În această stare virusul este lipsit de o structură proprie, materialul viral fiind dispersat în celula gazdă, inseparabil de conținutul celular. Conform informației genetice, conținute în acidul nucleic viral, celula cu aparatul ei enzymatic, sintetizează componentele virale. În interiorul celulei, virusul vegetativ se transformă, în final, din nou în virusul complet, prin asamblarea componentelor virale. Virionii rezultați din procesele intracelulare de biosinteză sunt eliberați din celulă. După eliberarea lor, virionii, pătrunzând într-o nouă celulă gazdă, reiau circuitul care asigură conservarea virusurilor în natură. În faza de virus vegetativ, dependența virusului de celulă este totală, el nefiind capabil de a supraviețui în afara acesteia.
Virusul integrat sau provirusul, este tot o formă intracelulară total dependentă de celula gazdă, ca și virusul vegetativ, cu deosebirea că sub această formă celula nu sintetizează material viral. Acidul nucleic viral se fixează în genomul celulei sensibile, unde se comportă ca un fragment de material genetic, propriu celulei. Această formă de existență este mai cunoscută la virusurile bacteriofagice și la virusurile tumorale. Genomul viral, ancorat în cromozomul celulei gazdă, conferă acesteia noi însușiri determinate de informația genetică pe care o conține. Virusul se comportă ca un component normal al celulei gazdă. El poate rămâne sub această formă un timp nedefinit. Virusul integrat se poate transforma în virus vegetativ, de obicei sub acțiunea unor factori stresanți pentru celulă, în care caz, genomul viral se desprinde din cromozomul celulei și începe să codifice sinteza de material viral, trecând în forma de virus vegetativ (27).
Virusul complet sau virionul, este forma virală care are o structură proprie, celelalte două forme fiind indisolubil legate de celula gazdă .
Dimensiunile virusurilor variază între limite cuprinse între 8-10 nm până la 300-350 nm. Virusurile cele mai mici, ca de exemplu Picorna și Parvovirusurile se aproprie de dimensiunile unor macromolecule organice, iar virusurile mai mari (Poxvirus), au dimensiuni apropiate de bacteriile cele mai mici. Virusurile au volumul situat între 0,00001 microni3 pentru virusul poliomielitei (Picornavirus) și 0,01 microni3 (Poxvirus).
Virionul este constituit dintr-un înveliș și un conținut.
La toate virusurile învelișul sau capsida virală („kapsa” = cutie) este format din unități proteice numite capsomere („meros” = parte), așezate după un tip de simetrie bine definit. Capsomerele, sunt formate din una sau mai multe molecule proteice, constituite la rândul lor din lanțuri polipeptidice. Numărul capsomerelor este constant pentru un virus, mai ales la virusurile icozaedrale. La unele virusuri, exterior capsidei, se găsește un al doilea strat al învelișului, numit pericapsidă (anvelopă, peplos). Din punct de vedere al prezenței învelișului pericapsidal, virusurile se împart în două categorii: nude și învelite în peplos.
Puține virusuri au capsida constituită din două sau mai multe straturi concentrice.
Compoziția chimică a capsidei este exclusiv proteică. Proteinele constituente ale capsidei sunt antigenice, fiind responsabile pentru structura antigenică specifică fiecărui virus.
La majoritatea virusurilor, cu excepția virusurilor helicoidale prevăzute cu înveliș pericapsidal, capsida este determinantă pentru forma virionului.
Rolul capsidei este de a proteja genomul viral de acțiunea factorilor de mediu. La adăpostul capsidei, acidul nucleic viral este vehiculat de la o gazdă receptivă la alta. Cu toate că în condiții experimentale au putut fi reproduse numeroase infecții virale numai cu acizii nucleici ai virusurilor respective, nu s-a semnalat încă un fenomen similar în condiții naturale, protecția capsidei fiind indispensabilă conservării și circuitului virusurilor în natură.
Pericapsida (anvelopa, peplosul)
Pericapsida, pentru desemnarea căreia se folosesc la fel de frecvent și termenii de anvelopă sau peplos (manta în limba greacă), este un înveliș suplimentar, întâlnit numai la unele virusuri, așezat exterior capsidei.
În funcție de prezența sau absența pericapsidei, corelată cu tipul de simetrie al pericapsidei, virionii sunt de 4 feluri :
virion helicoidal nud;
virion icozaedral nud;
virion helicoidal învelit de pericapsidă;
virion icozaedral învelit de pericapsidă.
Grosimea pericapsidei este în jur de 100-150 Å. Analog capsidei, ea este constituită din unități structurale numite peplomere (,,peplos” = manta).
Compoziția chimică a pericapsidei, predominant proteică, este caracterizată și prin prezența altor compuși organici – glucide, dar mai ales lipide, care împreună cu proteinele formează complexe glico- sau lipidoproteice. Lipidele, compușii chimici ai pericapsidei, concură și ei la determinarea structurii antigenice a virusului.
Originea componentelor pericapsidei poate fi proprie sau derivată din membrana celulei gazdă în care a fost sintetizat virionul. Partea proprie este numită și homeopeplos, iar cea provenită din componenții celulei gazdă heteropeplos.
Pericapsida împreună cu capsida, au rolul de a proteja genomul viral față de acțiunea distructivă a factorilor de mediu și asigură fixarea virionului pe celula gazdă.
Prezența ei conferă însă virusurilor anumite însușiri, absente la virusurile nude. Acestea sunt:
– sensibilitatea la eter și cloroform, datorată componentelor lipidice din structura peplomerelor;
– capacitatea de adsorbție pe diferite substraturi celulare și activitatea hemaglutinantă de care sunt responsabili spiculii (antenele) de pe suprafața capsidei, numiți de aceea hemaglutinine.
Genomul viral
Virusurile conțin un singur tip de acid nucleic: ori acid dezoxiribonucleic (ADN), ori acid ribonucleic (ARN). Ambii acizi nu coexistă în același virion. În funcție de natura acidului nucleic, virusurile se împart în ribovirusuri cu ARN și dezoxiribovirusuri cu ADN. La virusurile fitopatogene acidul nucleic este întotdeauna ARN, în timp ce la virusurile zoopatogene și bacteriofagice, poate fi unul sau celălalt.
Structura acidului nucleic poate fi, în funcție de numărul de lanțuri din care este constituită molecula, monocatenară sau dublucatenară. Ca regulă generală, dezoxiribovirusurile au ADN dublu catenar, cu excepția parvovirusurilor și a fagului X 174, al căror ADN este monocatenar. Ribovirusurile au ARN monocatenar, cu excepția reovirusurilor, al căror ARN este dublu catenar.
În cazul majorității virusurilor, acizii nucleici virali nu diferă biochimic de restul acizilor nucleici prezenți în celula animală sau vegetală. Unii bacteriofagi au însă în compoziția genomului viral o bază azotată 5 hidroximetilcitozina , inexistentă în compoziția acizilor nucleici ai celulei bacteriene, vegetale sau animale.
Genomul viral este componenta esențială a virusului, care poartă informația genetică necesară devierii metabolismului celulei gazdă , în sensul sintezei constituienților virali. Ribovirusurile reprezintă un unicat în biologie în ce privește posibilitatea păstrării informației genetice de către ARN.
Multiplicarea virusurilor. Virusurile nu se multiplică ci sunt sintetizate, ca urmare a pervertirii metabolismului celulei gazdă; acidul nucleic viral transmite informația genetică proprie către genomul celulei gazdă care sintetizează apoi componentele virusului respectiv.
Multiplicarea virusurilor implică patru etape principale:
adsorbția sau fixarea virionului pe celula gazdă;
pătrunderea în celulă a virionului;
multiplicarea intracelulară propriu-zisă a virusului, în cadrul căreia se pot deosebi trei categoirii de procese;
replicarea ADN-ului sau ARN-ului viral;
biosinteza materialului viral;
asamblarea (morfogeneza) noilor virioni;
eliberarea virionilor nou formați din celulă (27).
II.1.3. Etiopatogenie
În anul 2000, Evans, J. D. și Hung, A. K. (citați de 19), au propus o clasificare a virusurilor care produc îmbolnăviri la albine. După acești autori virusurile aparțin ori tipului picorna sau tipului Drosophila (19).
Leat, N. și colab. (2003), au pus în evidență, cu ajutorul RT-PCR, virusul botcilor negre, stabilind în același timp și apartenența acestuia la virusurile de tip picorna.
Până în prezent, au fost depistate 18 specii de virusuri, majoritatea fiind reprezentate sub formă de virioni de aproximativ 30 nm în diametru, care conțin o moleculă monocatenară de ARN sau ADN în calitate de genom.
Virozele produse de virusul paraliziei cronice, virusul asociat paraliziei cronice, virusul paraliziei acute, virusul puietului în sac, virusul botcilor negre, virusul X, virusul Y, virusul albinelor de Egipt, sunt cele care prezintă interes pentru zona continentală în care ne aflăm.
Conform ultimelor date din literatură, cel mai frecvent, în populațiile de albine, se întâlnesc șase specii de virusuri, care pot provoca îmbolnăviri ale familiilor de albine. Acestea sunt: virusul puietului în sac, virusul paraliziei cronice, virusul botcilor negre, virusul aripilor deformate, virusul paraliziei acute și virusul de Kashmir (29).
Virozele albinelor, de cele mai multe ori evoluează subclinic, producând reducerea duratei de viață a albinelor sau, uneori, virusurile pot cauza infecții grave, care se termină cu moartea întregii colonii de albine (19).
Tabel nr. II.1.1. Caracteristicile virusurilor care afectează albinele (după Bailey, 1981)
Legendă: nd = nedeterminat; S20 = coeficient de sedimentare
Virozele pot evolua singure sau asociate, unele predominant în sezonul cald, altele în sezonul rece (26).
Multiplicarea virusului în organismal albinelor produce perturbări mai mult sau mai puțin grave, dar specifice. Fiecare virus produce simptome și leziuni anatomo-patologice caracteristice care ușurează diagnosticul virozei pe care o provoacă. În celula infectată, în jurul sau în interiorul nucleului celulei, apar, de regulă, niște formatiuni caracteristice, numite incluzii celulare, care ajută la identificarea virusurilor.
După citoliză, particulele virale se fixează pe o altă celulă din locul de elecție (țesutul pentru care are preferință), tabloul patologic amplificându-se proporțional cu multiplicarea particulelor virale.
Virusurile specifice albinelor au o rezistență relativ scazută față de agenții fizici și chimici. Căldura umedă de 55-600 C distruge majoritatea virusurilor în 10 -30 de minute.
Când particulele virale sunt înglobate în resturi celulare (materii uscate), temperatura necesară inactivării lor trebuie să depășească 1000 C. Lumina solară ucide virusurile în 1-6 zile vara și într-un timp de zece ori mai mare iarna. Sub acțiunea soluției de sodă caustică sau de formol 2%, majoritatea virusurilor nu rezistă mai mult de 10 minute.
II.1.4. Epidemiologie
Sursa principală de infecție o reprezintă albinele bolnave cât și cele care fac forme inaparente clinic și care elimină virusul în mediul extern prin secreții sau excreții (14). Ca o sinteză, răspândirea agenților virali patogeni se produce prin intermediul albinelor, trântorilor , paraziților albinelor, prădătorilor familiei de albine , apei , mierii și păsturei infectate , fagurilor cu puiet , ramelor , componentelor stupilor , adăpătorilor , hrănitorilor , utilajelor, uneltelor apicole și apicultorului (28).
Virusurile albinelor pătrund în organismul albinelor pe cale digestivă (virusul puietului în sac, virusul botcilor negre, virusul paraliziei cronice, virusul paraliziei acute, virusul filamentos, virusul X, virusul Y ș.a), respiratorie (virusul aripilor opace), prin contact direct ( virusul paraliziei cronice, virusul X) sau prin soluțiile de continuitate create de acarieni (virusul paraliziei cronice, virusul paraliziei acute, virusul aripilor deformate).
Apariția și răspândirea infecțiilor virale la albine este influențată, printre altele, de arealul geografic, climă, originea genetică a familiilor de albine sau prezența altor agenți patogeni, printre cei mai importanți fiind infestarea cu Varroa (11) și Nosema.
Prin tehnica RT-PCR a fost relevat rolul de vector al acarianului Varroa destructor în transmiterea unor virusuri la albine. Dovada cea mai importantă a fost adusă de Bowen -Walker, P. L. și colab., (2002) (citați de19) și de Nordström, S., (2003) în cazul virusului aripilor deformate la albine, în stupinele din Anglia și Suedia.
Parazitul V. destructor, pe lângă faptul că transmite o serie de virusuri prin înțepături (23), reduce și rezistența puietului în creștere și a albinelor lucrătoare, la acțiunea agenților patogeni, prin două mecanisme:
larvele parazitului se hrăniresc cu hemolimfa puietului, și se dezvoltă pînă la faza de adult în celulele de puiet căpăcit, consumând substanțele nutritive necesare dezvoltării larvelor, prin perforarea de către femela Varroa a cuticulei acestora;
femela acarianului Varooa se hrănește cu hemolimfa albinelor adulte, prin perforarea membranelor intersegmentale ale abdomenului (29).
Un grup de cercetători au găsit o stupină izolată geografic (Ouessant Island, France), lipsită de V. destructor, în care nici unul dintre virusurile investigate nu a putut fi detectat (29).
O atenție deosebită a fost acordată și distribuirii virusului la nivelul castelor reproductive (regine și trântori). Virusul aripilor deformate (DWV) este răspândit în întregul corp, inclusiv în ovarele și în corpul gras al reginei, precum și în veziculele seminale ale trântorilor. Această dispersie a DWV în țesuturile reproductive ale reginei și ale trântorilor sugerează faptul că infecția poate avea efect negativ asupra capacității lor reproductive. Prezența virusului în sperma trântorilor, reflectă o posibilă transmitere orizontală, pe cale sexuală a virusului, iar prezența virusului în ovocitele mătcii scoate în evidență posibilitatea transmiterii acestuia la generațiile următoare (24).
Frecvența infecțiilor virale (virusul paraliziei acute și virusul aripilor deformate) este, de asemenea, puternic influențată de amplasarea stupinei și de sezon: în toamna anului 2010, în probele din Finlanda, la toate familiile, nu s-a găsit nici un virus, în timp ce ambele virusuri au fost identificate în toate probele provenite din Bulgaria, incidența acestor viroze fiind mai scăzută în primăvară și mai mare în toamnă.
Evoluția virozelor este condiționată de numerosi factori favorizanți, dintre care amintim:
fond radioactiv crescut;
fond toxic;
nosemoza;
dismetabolii datorate hrănirilor necorespunzatoare;
exploatarea intensă a albinelor și slăbirea imunității;
călduri și secete exce;sive
temperaturi foarte scazute;
prezența unor germeni asociați precum: rickettsii, spiroplasme, bacterii, fungi, protozoare;
facilitarea izbucnirii unor maladii contagioase clasice, ca de exemplu: loca europeană, nosemoza, ascosferoza (26);
intoxicațiile cu insecto-fungicide de natură chimică;
infestația cu acarianul Varroa destructor.
II.1.5. Diagnosticul virozelor la albine
Examenele de laborator folosite în diagnosticul virozelor albinelor sunt: anatomopatologice, histopatologice (metode de colorare clasică: HE, HEA, MGG, PAS, Pappenheim) și examinarea la microscop cu scopul evidențierii diverselor leziuni histopatologice și a unor incluzii virale specifice, virusologice (identificarea și izolarea virusurilor prin tehnicile de cultivare celulară; microscopie electronică), serologice (imunodifuzie în gel de agar pentru detecția antigenului și teste imunoenzimatice, care în mare parte, folosesc anticorpii policlonali și mai puțin anticorpii monoclonali) și tehnici de biologie moleculară (Rt-PCR).
1) Tehnicile de cultivare a virusurilor. Virusurile albinelor au fost cultivate inițial în scop experimental și ulterior pentru producerea de antiser. Antiserul se obține prin inocularea pupelor și albinelor adulte cu suspensie de virus (material patologic).
În vederea inoculării suspensiei de virus la albinele adulte vii, acestea sunt închise în cutii (cuști) speciale, în grupuri de câte 20 de albine, și anesteziate cu ajutorului dioxidului de carbon. Injectarea se efectuează la pupe în vârstă de până la 24 de ore care au rezultat din colonii de albine normale. Pupele sunt recoltate prin descăpăcirea celulelor și extragerea indivizilor care nu prezentă pigmentarea tegumentului.
Pentru cultivarea virusului puietului în sac (VPS) sunt utilizate larve în vârstă de 2 zile, ținute în colonia de albine până când celulele sunt căpăcite, după care sunt inoculate. Inocularea (metoda de infecție) se face în hemocel, prin penetrarea membranei abdominale intersegmentale și prin hrană (virusul puietului în sac, virusul X și Y). Fiecare pupă este inoculată la fel ca și albina adultă, dar fără să fie necesară anestezia cu dioxid de carbon. După inoculare, urmează incubarea acestora la 350 C în spații/cutii speciale concave de tip Petri, înconjurate de o altă cutie, tot concavă, mai mare. Umiditatea se poate realiza și păstra cu ajutorul unor fâșii de hârtie de fitru îmbibate în soluție apoasă de glycerol 13%, după ce au fost creeate condițiile optime pentru realizarea infecției și a replicării virusului în corpul albinelor adulte și pupelor. După aceste etape urmează extracția și purificarea virusurilor de la albine, care se realizează în mai multe etape:
triturarea albinelor în solvenți specifici și soluții tampon. Soluțiile de extracție folosite sunt:
fosfat de potasiu 0,01M pH 7 + 0,02% dietilditiocarbamat (DIECA) + 1 vol. eter urmat de emulsionare cu 1 vol. de tetraclorură de carbon (CCl4) – toate virusurile, cu excepția virusului aripilor opace, tulpina Thai a virusului puietului în sac (VPS) și virusul de Egipt (pentru virusul iridescent fără eter);
fosfat de potasiu 0,5M pH 7 + 0,02% dietilditiocarbamat (DIECA) + 1 vol. dietileter urmat de emulsionare cu 1 vol. de tetraclorură de carbon (CCl4) – pentru: virusul aripilor opace și virusul puietului în sac; pentru VPS- tulpina Thai se adaugă + 0,02M EDTA, iar pentru virusul albinelor de Egipt în plus se utilizează și 1% acid ascorbic + 2% EDTA, în loc de DIECA;
alta soluție de extracție poate fi și acetat de amoniu 0,1 M, pH7 + 0,02% dietilditiocarbamat (DIECA) pentru virusul filamentos.
filtrarea suspensiei printr-un sistem de site fine (din bumbac);
clarificarea suspensiei prin centrifugări ușoare 150 g (virusul filamentos și iridescent) sau 8000g timp de 10 minute (celelalte virusuri);
sedimentarea virusului din fluidul supernatant prin ultracentrifugări (30000 g timp de 30 minute virusul filamentos și iridescent; 75000 g timp de 3,5 ore virusul aripilor opace și virusul asociat paraliziei cronice; 75000 g timp de 3 ore toate celelate virusuri;
resuspendarea depozitului în soluții tampon (fosfat de potasiu 0,01M, acetat de amoniu 0,1 M etc.);
clarificarea depozitului resuspendat prin centrifugare ușoară;
se repetă sedimentarea virusului, resuspendarea depozitului în soluții tampon și clarificarea depozitului cu unele excepții și particularități;
centrifugări joase în gradient de sucroză 10 – 40%(w/v) 10000 g timp de 30 minute la 5oC (virusul filamentos), 45000 g timp de 4,5 ore la 150C (virusul aripilor opace și virusul asociat paraliziei cronice), 45000 g timp de 3 ore la 40C(toate celelate virusuri);
izolarea și colectarea fracțiunilor virale;
dializa fracțiunilor virale în soluții tampon;
sedimentarea virusului prin ultracentrifugare și ulterior examinate electronomicroscopică.
2) Testele de imunodifuzie au fost descrise de Mansi în anul 1958 și pot fi făcute cu virus purificat sau cu extracte proaspete, obținute prin strivirea capului sau abdomenului albinelor, într-un mic tub conic cu 0,05 ml soluție salină 0,85% și o picătură de dietil eter. Agarul folosit trebuie să conțină 0,05M fosfat de potasiu tamponat (pH 7) și 0,005M acetat de diamin-tetra-etil de sodium (EDTA) plus 0,02% azidă de sodium pentru toate virusurile, exceptând tulpina Thai a virusului puietului în sac și virusul de Arkansas. Agarul pentru virusul puietului în sac are aceeași formulă dar la care se adaugă 1-2% clorură de sodiu. Agarul pentru virusul de Arkansas are în compoziție 0,04M borat de sodiu (pH 7) plus 0,85% clorură de sodiu și 0,02% azidă de sodiu.
3) Testul imunoenzimatic (ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) permite efectuarea unui screening rapid privind prezența unui anumit virus la albine și care poate fi un indicator al expunerii la agentul infecțios cercetat.
Testul imunoenzimatic are trei variante:
ELISA directă;
ELISA indirectă;
ELISA competitivă.
Principiul testului ELISA directă
În infecțiile virale, la albine, se folosește, de obicei, tehnica imunoenzimatică directă. Această metodă constă în identificarea reacției antigen (Ag) – anticorp (Ac) specifice prin intermediul unei enzime, de obicei peroxidază, legată de anticorpul specific, obținut pe iepure. Antigenul necunoscut este plasat în godeurile plăcii, care sunt căptușite cu anticorpul cuplat cu enzimă.
Vizualizarea reacției se face prin intermediul unui cromogen și a unui revelator, care este adăugat la finalul reacției, citirea rezultatului (DO = unități densitate optică) fiind făcută la un spectrofotometru (de ex. cititor READER 250). Valoarea DO exprimă, în funcție de intensitatea culorii, bogăția, probei analizate, în virioni.
4). Metodele tradiționale, cum sunt identificarea cu ajutorul microscopiei electronice a particulelor virale, imunodifuzie în gel de agar pentru detecția antigenului, tehnica radioimună sau teste bazate pe ELISA, care folosesc anticorpi policlonali, se pretează la mostre grav infectate sau la un număr redus de mostre, dar nu pot fi aplicate cu ușurință studiilor la scară mare sau la detectarea unor niveluri scăzute de virusuri, așa cum poate fi cazul unor infecții inaparente. În plus, metodele serologice sunt greu de aplicat, deoarece multe preparate ale albinelor sunt amestecuri de virusuri; majoritatea coloniilor conțin unul sau mai multe virusuri. Este dificil să se producă antiseruri specifice pentru fiecare virus al albinelor (24).
În prezent, se consideră că majoritatea metodelor serologice prezintă sensibilitate și specificitate scăzută sau chiar reacții nespecifice. Luând în considerație dificultățile metodelor clasice de diagnosticare a virozelor albinelor (absența culturilor de țesut de albine, dependența de sezonul de obținere a pupelor pentru infestarea experimentală sau cerința de ser specific pentru testele de imunodifuzie în gel de agar), interesul științific s-a orientat spre tehnicile moleculare (19).
Pentru identificarea marker – lor moleculari la albine, trebuie recoltate probe și păstrate la temperaturi scăzute până în momentul extracției ADN – ului (9).
Probele pot fi păstrate la minus 800șC ca atare sau la minus 200șC, după ce au fost introduce, după recoltare, în etanol de 100ș (19).
Bazele tehnicii moleculare PCR au fost puse de Kary Mullis la mijlocul anilor 1980 bazându-se pe caracteristicile replicării ADN – ului (19).
Rezultatele PCR, adică produșii, pot fi verificați și analizați prin electroforeză pe gel de agaroză sau poliacrilamidă, iar identificarea se face după criterii calitative și cantitative (dimensiunea fragmentului de ADN amplificat).
Vizualizarea directă se poate face prin colorare cu bromură de etidiu, cu bromură de argint, marcarea cu izotopi radioactivi sau autoradiografiere (19).
RT-PCR (reverse transcription-PCR) a fost inițial orientată pentru diagnosticarea virusurilor ARN la om și animale; această metodă (RT-PCR) a fost apoi adaptată cu succes pentru identificarea unor virusuri ARN la albine și la acarianul V. destructor.
Utilizarea acestei tehnici performante, necesită cunoașterea prealabilă a genomului organismului țintă, sinteza ADNc și designul primerilor specifici. Pentru un diagnostic cert într-un focar primar, detecția virusurilor se realizează cu ambele metode, în paralel.
Doar în baza rezultatelor obținute cu ajutorul analizei RT-PCR s-a putut vorbi despre variabilitatea virusului puietului în sac provenit din probele colectate din focarele de boală a diferitelor localități.
A fost demonstrată existența potențială a trei grupe distincte de SBV în lume, care, posibil, reflectă izolarea geografică:
genotipul European (cu subtipurile Europei Centrale care a inclus probele din Austria și Germania și subtipul Englez);
genotipul Orientului Îndepărtat (subtipurile Thai care au inclus probele din India și Nepal), și
al treilea genotip distinct este originar din Africa de Sud (24).
Pentru studierea diversității virusului puietului în sac, au fost utilizate mai multe perechi de primeri dintre care ulterior au fost alese trei perechi (SB1 f, SB2 r, SB6 f, SB7 r, SB14 f, SB15 r), care s-au dovedit a fi cei mai utili, amplificând toate tipurile de SBV; primele două perechi pot releva mai bine porțiunile specifice dintre probe, pe când ultima este mai utilă în investigațiile care se referă la divergențe (29).
Disponibilitatea crescută a secvențelor virale, depozitate în bazele de date, cu acces public, cum sunt GenBank și EMBL a permis NBU (National Bee Unit din Anglia) să urmeze o altă tehnică de identificare a virusurilor, denumită TaqMan®, bazată pe PCR în timp real. Autorii acestui proiect afirmă că detectarea virusurilor prin utilizarea Taq-Man® reprezintă un potențial uriaș pentru activitatea viitoare atât în Regatul Unit cât și peste hotare. Astfel, după cum arată studiile, utilizarea tehnologiei TaqMan® depășește problemele legate de disponibilitatea reactivului, face posibilă aplicarea de metode RT-PCR cu înaltă sensibilitate și caracter specific, urmând să fie utilizate cantitativ la un număr mare de mostre, iar utilizarea genei ribozomale 18R a albinei A.mellifera, permite aprecierea eficienței extracției, asigurând că nu vor interveni rezultate negative false. Metodologia dispune de o mare cantitate de mostre-bază, cu câte 1500 teste disponibile în fiecare săptămână, capabile să detecteze simultan patru virusuri diferite. Ca atare, această tehnologie dispune de un mare potențial pentru proiecte de supraveghere, atât în Regatul Unit cât și în străinătate. A fost, de asemenea, pusă la punct o probă ADN pentru identificarea ADN-ul albinei africanizate, în vederea realizării unui studiu asupra acestor albine (29).
Toate cercetările privind prezența virusurilor albinelor în colonii a depins, până acum, de accesul la antiseruri. Astfel, compararea datelor a fost dependentă de specificitatea antiserurilor realizate în diferite laboratoare. Acest lucru este deosebit de important, deoarece albinele și coloniile prezintă frecvent infecții virale multiple (12). Testele cantitative, similare cu ELISA, reclamă, de asemenea, acces la anticorpi adecvați și la preparate virale purificate. În cele mai multe cazuri, studiile efectuate nu au reușit să detecteze infecții inaparente și erau utilizate, mai ales, cu funcție de diagnostic (1). Ca urmare a metodologiilor folosite, ele sunt, de asemenea, limitate și în numărul de mostre folosite, nu întotdeauna oferind rezultate concluzive (22). Tehnologia TaqMan® poate fi aplicată cu succes la detectarea bolilor albinelor.
Toate aceste informații pot stimula dezvoltarea cercetărilor în domeniul virusologiei
și a legităților epizootiilor la albine, permițând astfel, elaborarea unor noi biotehnologii de manipulare a infecțiilor virale la insecte și mai ales la familiile de albine.
II.1.6. Virozele majore ale albinelor
II.1.6.1. Paralizia cronică
Paralizia cronică este o boala infectocontagioasă a albinelor adulte (22), produsă de virusul paraliziei cornice (CBPV),care evoluează sub două forme clinice:
formă manifestată prin incapacitate de zbor, tremurături, aripi desfăcute asimetric, diaree și moarte în câteva zile, și
formă caracterizată prin modificarea culorii albinelor (culoarea neagră a tegumentului cu aspect unsuros) și căderea firișoarelor de păr. Examenul histopatologic evidențiază corpusculi citoplasmatici bazofili în epiteliul intestinului posterior (2).
Istoric, răspândire și importanță economică
Boala a fost descrisă pentru prima dată în anul 1936 de Morisson, în Anglia, iar natura agentului patogen a fost confirmată experimental, la mijlocul anilor 1940, de Butler și Burnside (21).
Virusul paraliziei cronice afectează toate categoriile de vârstă ale coloniei de albine, producând pierderi prin mortalitate în toate anotimpurile, însă în lunile mai și iunie sau toamna, evoluția poate lua aspecte dramatice. Boala poate evolua câteva zile sau să persiste timp de mai multe luni, ceea ce duce la depopularea stupilor (20).
Paralizia cronică este cunoscută în multe țări, de pe toate continentele.
Etiopatogeneză
Virusul paraliziei cronice a fost descoperit prin teste serologice în broiaje de albine, cu semne clince de boală. Investigațiile efectuate pe extracte de albine provenite din colonii, fără manifestari clinice ale bolii, au relevat că virusul este prezent tot timpul anului, fiind cauza a 30% din mortalitatea înregistrată, față de rata normală a pierderilor (2). Analiza filogenetică a virusului paraliziei cronice, izolat în Japonia, demonstrează o separare geografică a tulpinilor virale japoneze, față de cele europene, uruguayan sau al celui izolat de la albinele de pe continentul nordamerican. Lipsa unui schimb major al coloniilor de albine între SUA, Europa continentală și Japonia, în ultimii 26 de ani, ar fi putut duce la separarea geografică a tulpinilor japoneze ale virusului paraliziei cronice (25).
Virusul paraliziei cronice este distinct antigenic față de virusul paraliziei acute (tabel nr.1). Evoluția uneia sau alteia dintre aceste entități morbide, depinde de zestrea genetică a albinelor și de mutațiile care apar în structura genelor.
Localizarea mai frecventă a virusului se înregistrează în creier, neuroganglioni, tubul digestiv și glandele hipofaringiene, mandibulare, postcerebrale și toracice.
Rezistența virusului în cadavre, la minus 70ș C, este de 6 luni, la minus 15ș C de aproximativ o lună, iar la minus 40ș C 3, 4 zile. Temperatura de 60ș C îl inactivează în 30 – 60 de minute, cea de 70ș C în 10 minute, iar la 35ș C este inactivat în 7 zile. Razele ultraviolete îl inactivează într-o oră. Virusul este sensibil la dezinfectantele uzuale.
Virusului paraliziei cornice i se asociază, în infecția naturală, particule virale de 17 nm în diametru, distincte serologic, dar fără capacitate de multiplicare independentă. Sunt considerate supliment de informație genetică în procesul multiplicarii virusului paraliziei cronice. Aceste particule satelit inhibă, pe o perioadă limitată de timp, infectivitatea altor virusuri (2).
Este puțin hazardată încercarea de a trece în revistă patogeneza în paralizia cronică a albinelor, deoarece datele din literatura de specialitate sunt sumare. Însă, vom încerca să creionăm, pe cât posibil, acțiunea virusului asupra celulelor prin unele extrapolari. La pătrunderea virusului în celulă, reacția acesteia este diferită. În cazul unei rezistențe scăzute, acidul nucleic viral este încorporporat în constituienții celulei gazdă, dirijand sinteza exclusivă a materialului nucleoproteic propriu virusului. Acest proces duce la distrugerea celulei gazdă și, implicit, la boală. Dacă albina și colonia de albine, în totalitatea ei, se află într-o stare clinică normală, virionul este asimilat în metabolismul celular, astfel că ia naștere infecția virală inaparentă sau infecția latentă, altfel spus, între virus și organismul gazdă se stabilește un echilibru. În această situație, infecția există în colonia de albine, dar nu evoluează cu semne clinice. Însă factorii debilitanți pot rupe echilibrul dintre virus și colonia de albine, astfel că se poate declanșa boala (4).
Virusul, odată pătruns în organism, se răspândește, prin hemolimfă, în tot organismul, localizându-se cu predilecție în creier, neuroganglioni, tub digestiv și glande faringiene. În această fază se vorbește de viremie. Diseminarea se realizează prin intermediul hemocitelor granulare, același rol putându-l îndeplini și plasmatocitele. Odată răspândiți în organism, virionii se fixează pe celule, pătrund în acestea prin fenomenul de viropexie, se produce decapsidarea lor și începe multiplicarea propriu-zisă a genomului viral. Eliberarea virusului din celula gazdă se face prin înmugurirea membranei celulare, consecutiv morții celulare sau prin trecerea virionilor direct la celula învecinată. Frecvent, în celulele epiteliale ale intestinului, apar structuri corpusculare rotunde sau ovale, cu dimensiune de 1 sau 2 µm, bazofili sau negri (în funcție de colorația folosită), numite incluzii virale (4).
Epidemiologie
Sursa de infecție cu virusul paraliziei cronice este reprezentată de albinele bolnave sau aparent sănătoase, dar purtătoare și eliminatoare de virus, cadavre, miere, polen, inventarul apicol etc. Virusul poate fi izolat, în cantități apreciabile ( de ordinal milioanelor), dintr-o singură albină cu semne clinice de boală. Doza infectantă este variabilă, fiind dependentă de calea de pătrundere a virusului în organismul albinelor (4).
Căile de transmitere a infecției, de la o colonie la alta și de la o stupină la alta, sunt variabile. Trântorii proveniți din colonii bolnave răspândesc infecția la cele sănătoase în cazul împerecherii cu mătcile acestora. Schimbările de activitate ale albinelor și ale sezonului pot determina o creștere a ratei de transmitere a virusului. Virusul poate fi răspândit și prin inventarul apicol nedezinfectat, folosit de la colonii bolnave la cele sănătoase sau dintr-o stupină în alta. Importul de material biologic contaminat cu virusul paraliziei cornice, constituie o cale de transmitere frecventă a bolii de la o țară la alta sau de la un continent la altul. Pe cuprinsul aceluiași stat, transmiterea se realizează prin mișcările necontrolate ale coloniilor de albine (pastoral, schimb de mătci, comerț etc.). În transmiterea bolii nu sunt de neglijat vectorii animați (viespii, șoareci, găselnița), care pot vehicula virusul de la o colonie la alta (2, 4).
Receptivitatea la infecția cu virusul paraliziei cornice este variabilă, depinzând de mai mulți factori. Condițiile atmosferice neprielnice, prelungite, primăvara și vara, determină aglomerarea spațiului din stup și contaminarea unui număr mare de albine cu virioni, aceștia fiind din abundență cantonați la nivelul gușii albinelor și în ghemulețul de polen. Zestrea genetică, respectiv rezistența sau sensibilitatea la infecție, a unor rase sau varietăți de albine este cunoscută (2).
Poarta de intrare, considerată cea mai severă și care necesită un numar mic de virioni, este cea tegumentară. Leziunile provocate de acarianul Varroa destructor în timpul hrănirii cu hemolimfă, constituie poarta de intrare a virusului. Ruperea perișorilor chitinoși de pe cuticulă creează leziuni ale celulelor epiteliale care ușurează penetrarea virusului. Calea digestivă are o mai mică importanță, aceasta deoarece cantitatea de material virulent trebuie sa fie foarte mare (4).
Perioada de incubație în paralizia cronică este de 4 până la 10 zile de la infecție.
Simptomatologie
În această boală simptomul dominant este paralizia. În fața stupului se găsesc albine care nu mai pot zbura; din când în când se observă tremurături ale aripilor, antenelor și picioarelor. Apar albine de dimensiuni mai mici. Abdomenul este contractat, corpul luând forma de furnică (v. fig. I.4.9.), respirația este accelerată, iar acul este prolabat. În primele zile de boală, albinele mai pot zbura. Însă în timpul zborului, sunt atacate de albinele din alte colonii din cauza aspectului lor. În stupul propriu nu sunt lăsate să pătrundă de către albinele paznici. Sunt considerate albine hoațe. În cazul evoluției bolii în sezonul rece, pot apare albine cu abdomenul dilatat, flasc, iar la palpare este eliminat un lichid alb-gălbui-maroniu. Se produce depilarea de pe torace și abdomen, iar chitina capătă o culoare neagră cu luciu metalic și aspect unsuros. Acest aspect este dat de o substanță care degajă un miros de pește, fapt care le determină pe albinele sănătoase să nu le recunoască și să le scoată din stup pe cele bolnave (2, 4, 20, 30).
După o evoluție a bolii de 15 până la 25 de zile, albinele nu-și mai coordonează mișcările, paralizează și mor. Caracteristică este poziția aripilor în acoperiș. Este interesant faptul că, deși în unele cazuri, pînă la 30% din albinele lucrătoare sunt afectate, infecția cu CBPV rămâne uneori nedetectată și coloniile, de obicei, se restabilesc spontan (25).
În Marea Britanie, această formă are mai multe denumiri: ,,hoții negri”, ,,micii negri” sau ,,boala neagră” pe continental european. Aristotel a descris această boală, iar pe albinele bolnave le-a numit ,,hoațe” (2).
Considerăm necesar să prezentăm aici, un sindrom cu evoluție uneori concomitentă paraliziei cronice, respectiv ,,boala de pădure”, asociată însă, de cele mai multe ori, calității nectarului cules din păduri. Etiologia acestui sindrom nu este încă lămurită. Însă manifestările clinice pot fi confundate cu paralizia cronică. Acest sindrom, semnalat de apicultorii europeni de mult timp, evoluează cu depilare și înnegrirea corpului, tremurături și mișcări dezordonate ale aripilor, picioarelor și corpului albinelor bolnave și zbor, de cele mai multe ori, nereușit. Albinele afectate se târăsc în fața stupului, uneori numărul lor fiind destul de mare. În stup, albinele bolnave se strâng sub podișor în formă de ciorchine. Datorită acumularilor de lichid în cavitatea celomică, abdomenul este mărit și, ca atare, crește tranzitul intestinal, iar aripile sunt desfăcute parțial. Moartea albinelor bolnave survine în câteva zile. Sfera de cuprindere este variabilă; câteva albine în cazurile ușoare sau toți indivizii adulți, inclusiv matca și trântorii, în cazurile grave (2, 23).
Literatura de specialitate anglo-saxonă tratează aceste două entități morbide ca fiind sindroame ale paraliziei cornice:
tipul I = ,,boala de pădure”;
tipul II = ,,boala neagră” (2, 24).
Autorii francezi mai descriu aici și ,,boala neagră congenitală”, aspect pe care noi îl vom trata separat (2).
Deseori, paralizia cronică, evoluează împreună cu vorrooza.
Prognosticul în paralizia cronică este rezervat spre grav.
Modificari anatomopatologice
Albinele moarte au aripile dispuse în poziție de acoperiș, depărtate și orientate în jos, chitina este de culoare neagră cu luciu metalic și aspect unsuros, iar perișorii tegumentari sunt absenți.
Histologic, se observă incluziile virale Morison (1936) localizate în citoplasma celulelor epiteliale cilindrice și caliciforme din mucoasa intestinului mediu, la locul de inserție a tuburilor Malpighi, degenerescența granulară interstițială intens bazofilă, degenerarea celulelor gliale din sistemul nervos și aglomerari de melanină în mucoasa intestinală (4).
Diagnostic
Diagnosticul paraliziei cronice a albinelor se pune prin coroborarea datelor epidemiologice, a semnelor clinice, a modificarilor anatomopatologice și histopatologice, electronomicroscopic, a investigațiilor serologice și virusologice, prin determinări genetice și xenodiagnostic.
Din punct de vedere epidemiologic se va ține cont că boala evoluează îndeosebi sezonier, toamna și primavera, putând să apară episoade enzootice.
Clinic, sunt de remarcat tremurăturile și paralizia, corpul albinei bolnave fiind asemănător cu cel de furnică, chitina de culoare neagră, aspect unsuros cu miros de pește și depilație.
Anatomopatologic, distingem marea majoritate a aspectelor descrise la semnele clinice (aspect de furnică, culoarea neagră cu luciu metalic, aspect unsuros, depilație, aripi în acoperiș).
Histopatologic, sunt vizualizați corpusculuii Morison în celulele epiteliale ale intestinului posterior (4), iar electronomicroscopic sunt evidențiați virionii. Pentru evidențierea corpusculilor Morison se folosește colorația cu hematoxilină ferică, după Heidenhein, modificată de A. G. Curevici, prin care incluziile sunt de culoare neagră).
Serologic, se folosește imunodifuzia în gel de agar, utilizand un purificat de particule virale și un extract brut obținut din abdomenul albinelor afectate de paralizia cronică (4).
Pentru identificarea virusului se utilizează electroforeza în gel de polyacrylamida (SDS-PAGE). Este relevată proteina capsidei cu o greutate moleculară de 23.5 kDa.
În ultima vreme, din ce în ce mai mult, se folosesc determinarile genetice prin tehnica RT-PCR (22)
Infecția experimentală (xenodiagnosticul) se realizează cu extract de albine provenit din coloniile suspecte de boală, extracte ce sunt administrate albinelor libere de germeni (4).
Diagnosticul diferențial
Diagnosticul diferențial se face față de paralizia acută, nosemoză, amoebioză, varrooză, acarapioză, aspergiloză și față de intoxicații. Datele epidemiologice, simptomatologia , examenele histopatologice, virusologice, serologice și, în ultimă instanță, tehnica PCR și xenodiagnosticul, permit diferențierea paraliziei cronice de entitățile morbide amintite mai sus.
Bolile parazitare și intoxicațiile, de care se diferențiază paralizia cronică, sunt diagnosticate prin tehnici de laborator mai puțin laborioase, dar de o înaltă precizie.
II.1.6.2. Paralizia acută
Paralizia acută este o boală infectocontagioasă a albinelor adulte, produsă de virusul paraliziei acute. Clinic, evoluează împreună cu varrooza, în sezonul activ, fără o simptomatologie tipică, iar anatomopatologic sunt de consemnat leziunile degenerative ale celulelor sistemului nervos.
Istoric, răspândire și importanță economică
Virusul paraliziei acute a fost descoperit în Anglia, în timpul investigatiilor de laborator privind virusul paraliziei cronice. Pagubele economice înregistrate, ca urmare a evoluției paraliziei acute, fără asocierea cu varrooza, au fost raportate de Rusia și Belgia în anul 1979. În alte țări din Europa, dar mai ales în Anglia, evoluția bolii este concomitentă cu varrooza, pierderile fiind atribuite, deopotrivă, ambelor afecțiuni. Boala nu se dezvoltă dacă virusul nu este inoculat de acarieni în hemolimfă (2).
Etiopatogenie
Boala este produsă de virusul paraliziei acute, specific pentru Apis mellifera. Face parte din familia Dicistroviridae, genul Cripavirus și conține ARN. Este asemănător morfologic cu virusul puietului în sac, dar diferit antigenic. Patogenitatea virusului, fără asocierea cu acarienii Varrooa destructor și Acarapis woodi este pusă la îndoială, cu toate că în Belgia și Rusia se presupune că a fost singura cauză a pierderilor prin mortalitate, în anul 1979. Poate fi izolat din ganglionii centrali și periferici, din glandele salivare toracice, din grăuncioarele de polen sau din gușă la albinele adulte și din glandele hipofaringiene și celulele corpului gras ale larvelor căpăcite. Rezistența virusului la agenții fizici și chimici este slabă.
Virionii paraliziei acute sunt inoculați în cavitatea generală a larvelor sau albinelor, în timpul hrănirii acarienilor cu hemolimfă; există și posibilitatea autoinfecției, cu virioni aflați în corpul gras sub formă represată, migrarea lor din hemolimfă fiind posibilă după infectarea albinei, prin leziunile create de Varroa destructor. Apoi, virusul este eliberat din celulele purtătoare, producându-se reinvadarea hemolimfei. Este faza de viremie. De aici, virusul este transportat de celulele specializate în fagocitoză (hemocitele granulare) la organele vitale, în acest caz sistemul nervos. Pătrund în celulele nervoase, se multiplică și prin distrugerea celulei gazdă, se eliberează, după care pătrund în alte celule. Pe măsură ce procesul înaintează, infecția se manifestă clinic, iar după 4 zile de evoluție, albinele bolnave mor (2, 23).
Epidemiologie
Paralizia acută evoluează, în mod frecvent, în timpul sezonului activ. Albinele aparent sănătoase și care mor de moarte naturală, sunt purtătoare ale virusului aflat sub formă represtă. De obicei, semnele clinice de paralizie acută, apar când infestația cu Varroa destructor este avansată.
Sursele de infecție sunt reprezentate de albinele purtătoare de virus represat, albinele aflate în perioada de incubație a bolii și albinele cu semne clinice de boală.
Calea de transmitere a virusului este hotărâtoare. Numai inocularea virionilor în hemolimfă declanșează manifestarile clinice de boală. În condiții naturale, acest fapt se produce prin intermediul acarienilor, în special Varroa destructor. Într-o colonie puternic infectată, 60% dintre acarienii Varroa destructor transmit virusul larvelor sau de la o albină la alta, în timpul hrănirii cu hemolimfă (23).
Sunt receptive la boală albinele adulte, dar și larvele care sunt infectate odată cu hrănirea lor, în primele zile de viață (larve necăpăcite) (2).
Simptomatologie
Perioada de incubație este scurtă. Paralizia acută evoluează frecvent în sezonul activ și se manifestă printr-un sindrom nervos. Albinele sunt agitate și prezintă tremurături ale antenelor, aripilor și picioarelor și nu pot să zboare. Abdomenul este dilatat, se produce depilație, respirația devine accelerată și acul este prolabat. Tegumentul chitinos este de culoare neagră strălucitoare și are miros de pește. În scurt timp apar parezele și paraliziile, urmate de moarte în 3-5 zile de la debutul bolii (2, 23).
Prognosticul este rezervat.
Modificari anatomopatologice
Din punct de vedere anatomopatologic, modificările sunt necaracteristice, mimând-le, în mare parte, pe cele întâlnite în paralizia cronică. Albinele moarte prezintă aripile în poziție laterală și în jos, iar membrele în extensie, orientate în toate direcțiile. Histopatologic, se observă degenerarea celulelor nervoase, fără a fi semnalate incluzii în celulele epiteliale ale intestinului. Puietul infectat de acarianul Varroa destructor în faza necăpăcit, moare imediat după căpăcire, cu modificari asemănătoare cu cele din loca europeană, dar la examenul bacteriologic nu este evidențiată flora bacteriană specifică (2).
Diagnostic, diagnosticul diferențial
Diagnosticul paraliziei acute se pune pe baza coroborării datelor epidemiologice, clinice, anatomopatologice și histopatologice, electronomicroscopice, serologice, virusologice, genetice și experimentale.
Clinic, evoluția scurtă a bolii și paralizia membrelor, aripilor și antenelor, sunt datele care pot duce la suspiciunea bolii.
Anatomopatologic, modificările sunt asemănătoare cu cele din paralizia cronică, așa că fără examene complementare, boala nu poate fi confirmată.
Examenul histopatologic pune în evidență degenerescența celulelor nervoase, iar cel electronomicroscopic, elementele virale din creier și glandele hipofaringiene.
Prin examene serologice, de tipul imunodifuziei în gel de agar, boala poate fi confirmată, dacă apar liniile de precipitare la contactul dintre serul de cercetat și suspensia virală (2).
În ultimul timp, determinarile genetice prin tehnica RT-PCR, sunt din ce în ce mai utilizate, deoarece sunt de certitudine (3).
Xenodiagnosticul se realizează ușor prin inoculoarea, în hemolimfă, a unei doze mici de virus, recoltat de la albinele suspecte de boală (2).
Paralizia acută poate fi confundată cu paralizia cronică, loca europeană, intoxicațiile, nosemoza, amoebioza, varrooza, acarapioza și aspergiloza.
Examenele de laborator specifice îndepartează orice dubiu privind infirmarea sau confirmarea uneia dintre entitățile morbide menționate mai sus.
II.1.6.3. Puietul în sac – sacbrood virus (SBV)
Este o boală infecto-contagioasă specifică puietului de albine, cu evoluție sporadică, manifestată clinic prin moartea puietului la 4 zile de la căpăcire, iar anatomopatologic prin acumularea unui exsudat între cuticulă și țesutul adipos, larva luând forma unui sac plin cu lichid; prin deshidratare, larva devine brună și are aspect de papuc chinezesc. Culoarea neagră a capului și a regiunii toracice sunt considerate semne patognomonice.
Istoric și importanță economică
Aceasta boală a fost descrisă de White în anul 1917, în SUA, după 15 ani de cercetări. Anterior, a fost semnalată de Langstroth (1857), Dulitle (1881), Jones (1887), Kursteiner (1901) sau de White (1902). Este prezentă în toate țările care practică apicultura. În Anglia, virusul a fost izolat de Bailey și colab. în anul 1963, din probe de albine provenite din Europa, Egipt, Australia, Noua Zeelandă și Noua Guinee. Evoluția bolii, în stupinele din lumea întreagă, este semnalată însă din vremuri îndepărtate. În perioada anterioară izolării virusului, afecțiunea era cunoscută sub denumirea de ,,puiet alterat”, cauza acesteia fiind considerată de natură ereditară.
Pierderile economice, prin mortalitate, determinate de această boală sunt reduse datorită evoluției sporadice, vindecările coloniilor afectate nefiind o raritate, însă este diminuată capacitatea imună a albinelor, se reduce durata de viață și este realizat greu ghemul de iernare.
După părerea unor autori, puietul în sac este, probabil, cea mai comună boală virală la albine, întrucât este cunoscută pe fiecare continent (24).
Etiopatogenie
Deși puietul în sac a fost descris pentru prima dată în 1913 și agentul infecțios, determinant al infecțiilor, patru ani mai târziu (în SUA), virusul a fost caracterizat abia în 1964. Conform datelor din literatura de specialitate, particulele virale ale virusului puietului în sac (SBV) au un diametru de 28 nm, fără anvelopă, cu înfățișare specifică. SBV este primul, dintre virusurile albinelor, care a fost complet secvențiat (23).
Puietul în sac, este o boală produsă de un virus filtrabil, încadrat în familia Picornaviridae, acidul ribonucleic fiind alcatuit din 8832 de nucleotide și conține un singur cadru de citire (ORF= open reading frame), începând din poziția a 179 nt până în poziția 8752 nt, codificând o poliproteină constituită din 2858 de aminoacizi. Are formă sferică sau ovoidală, este filtrabil și se localizează intracitoplasmatic, în celulele mucoasei intestinale ale albinei lucratoare, a larvelor, a pupelor, a prepupelor și a pupelor căpăcite, în celulele glandelor salivare hipofaringiene și în cele toracice ale albinelor adulte, în celulele nervoase și în corpul gras, precum și în lichidul acumulat între epiderma și dermul larvelor căpăcite (24).
Rezistența virusului la acțiunea agenților chimici și fizici este redusă. Razele solare îl distrug în 4 până la 7 ore de expunere, procesele de putrefacție din larve îl descompun în 3 până la 5 zile, iar căldura umedă de 59ș C în 10 minute. În faguri rezistă aproximativ o lună de zile. Dezinfectantele uzuale îl inactivează ușor (20).
Virionii, patrunși în corpul larvelor necăpăcite, odată cu hrana, traversează membrana celulelor din țesutul gras, țesutul muscular și al celor din trahee. Multiplicarea virusului în celulele dermului și epidermului afectează glandele care secretă enzimele cu rol în dezintegrarea tegumentului și trecerea de la o fază a metamorfozei la alta, astfel că larva nu-și mai poate schimba învelișul și moare în stadiul de prepupă. Celulele epidermice, în schimb, reacționează puternic la acțiunea virusului, prin secreția abundentă a unui lichid care se acumulează în interiorul corpului larvar, transformându-l într-un fel de pungă (2, 24).
Epidemiologie
Boala evoluează numai în sezonul activ, în special, primavara și vara.
Sursa principală de infecție este reprezentată de larvele bolnave sau moarte, de la care virusul este răspândit, prin intermediul albinelor, în tot stupul și, mai cu seamă, larvelor necăpăcite în timpul procesului de hrănire. În condiții normale, la sfârșitul sezonului activ, stupul se autosterilizează, deoarece albinele elimină larvele bolnave și pe cele moarte, iar rezistența virusului este redusă. Virusul își menține virulența peste anotimpul rece prin multiplicarea în glandele hipofaringiene ale albinelor tinere, aparent sănătoase. La apariția puietului, în primavara următoare, albinele doici, purtătoare de particule virale virulente, transmit infecția larvelor necăpăcite (2, 23).
Trebuie să amintim că trântorii reprezintă o sursă de infecție importantă, deoarece virusul se multiplică în creierul acestora.
Răspândirea bolii de la o familie la alta și de la o stupină la alta se face prin intermediul albinelor purtătoare și eliminatoare de virus, inventarului apicol nedezinfectat sau schimbului comercial al coloniilor de albine. Apicultorii pot transmite virusul în coloniile sănătoase prin ramele cu miere provenite de la cele infectate (21).
Poarta de intrare a virionilor în organismul albinelor este cea digestivă, prin intermediul nectarului și polenului contaminat, iar în larvele necăpăcite prin hrănirea cu lăptișor de matcă. Contaminarea hranei cu virusul puietului în sac, se realizează în timpul prelucrării acesteia cu secreția glandelor salivare ale albinelor infectate. Pentru declanșarea procesului morbid, doza infectantă trebuie să fie foarte mare. Se consideră că a mia parte dintr-un miligram de virioni, poate infecta o colonie de albine (2, 20).
Sunt mai receptive la infecție coloniile de albine slăbite și albinele care pe parcursul dezvoltarii ontogenetice n-au consumat polen în cantitate suficientă.
Prognostic
Evolutia bolii spre un prognostic favorabil este posibilă în cazul unor colonii de albine puternice, care sesizează apariția bolii de timpuriu și îndepartează larvele bolnave.
Simptomatologie și modificări morfopatologice
Perioada de incubație este variabilă, condițiile nefavorabile grăbind exprimarea clinică a bolii. Într-o stupină, boala cuprinde câteva colonii de albine, puietul murind la 4 zile de la căpăcire. Larvele din colonii sănătoase se transformă în pupă la 4 zile de la căpăcire (2). Larvele afectate de boală, rămân în stadiul de prepupă, se recurbează și se așează cu partea dorsală pe fundul celulei căpăcite. Culoarea larvelor se schimbă, tegumentul din alb-sidefiu devenind galben-cenușiu și apoi maroniu. Între tegument și țesutul adipos se acumulează un lichid care face ca larva, la ridicarea ei din celulă, să aibă o formă de sac. Cadavrul larvei este lipsit de miros, nu aderă la pereții celulei, iar conținutul nu este filant. După moartea larvei, culoarea cuticulei devine maroniu închis, iar capul și toracele se înnegresc. Prin deshidratare, larva se transformă într-o coajă brună, cu aspect de papuc chinezesc. Un fagure căpăcit cu larve bolnave are aspect de puiet împrăștiat, iar căpăcelele celulelor sunt concave și/sau perforate. Atunci când unele larve supraviețuiesc infecției, albinele tinere, rezultate din acestea, nu mai consumă polen, pierd capacitatea de a fi doici și, de cele mai multe ori, au o durată de viață mult redusă față de congenerele sănătoase (2, 20, 23).
Diagnostic – diagnostic diferențial
Tabloul clinic și cel anatomopatologic sunt edificatoare în această boală. Culoarea neagră a capului și a regiunii toracice sunt semne patognomonice. Forma de sac plin cu lichid a larvelor moarte, lipsa aderenței la pereții celulei și a mirosului, iar aspectul de suveică sau papuc chinezesc a larvei dezhidratate, completează aspectele caracteristice bolii. În laborator, se utilizează imunodifuzia în agar moale, microscopia electronică pentru vizualizarea particulelor virale, examenul histopatologic pentru evidențierea lizei celulare și, mai nou, PCR (13).
Diagnosticul diferențial se face față de viroza botcilor negre și loca americană.
Pentru loca americană, examenul bacteriologic este edificator, iar în boala botcilor negre, aspectele clinico-morfopatologice și examenele serologice (imunodifuzia dublă în gel de agar) dau certitudinea unui diagnostic pozitiv.
II.1.6.4. Viroza botcilor negre
Este o boala infecto- contagioasă, produsă de un virus din familia Dicistroviridae, cu evoluție sporadică, caracterizată clinic prin afectarea prepupelor și pupelor de matcă. Anatomopatologic, viroza botcilor negre, se distinge prin culoarea neagră a botcilor.
Importanța economică
Această viroză afectează, în special, crescătoriile de mătci, fiind semnalată în mai toate țările de pe glob. Eclozarea se reduce cu până la 95%. Prezintă importanță deosebită deoarece se asociază cu Nosema apis. Evoluție dramatică întâlnim și în nosemoză, în aceeași perioadă a anului ( primavara și începutul verii).
Etiologie
Boala este produsă de virusul botcilor negre. Este un virus ARN, cu dimensiune de cca 30 nm, fiind constituit din 8550 de nucleotide. Este un virus de tip „picorna” si a fost inițial izolat de la albinele din Africa de Sud (15, 19). Face parte din familia Dicistroviridae, genul Cripavirus. Gazda naturală a acestui virus sunt insectele din ordinul Hymenoptera.
Virusul se înmulțește numai în prepupele și pupele de matcă, cărora le cauzează moartea (5, 19).
Rezistența la agenții fizici și dezinfectantele uzuale este slabă.
Prognosticul este grav, larvele murind la câteva zile de la infectare.
Simptomatologie și modificări anatomopatologice
Viroza botcilor negre evoluează primavara și la începutul verii, cu precădere în pepiniere. Afectează larvele de matcă în stadiul de prepupă și de pupă (24). Mortalitatea acestora ajunge până la 95%. Culoarea larvelor este neagră, aspect care se observă prin pereții botcilor (23). Puietul căpăcit apare diseminat, unele căpăcele fiind perforate. În stadiul incipient al bolii larvele de matcă au o culoare galben – pal, iar tegumentul lor este dur, foarte asemănător cu al larvelor afectate de virusul puietului în sac. Pereții celulelor devin maro închis sau negri. Adesea, virusul este prezent la albinele infectate cu Nosema apis (Allen și colab., 1993, citați de 5).
Diagnostic – diagnostic diferențial
Semnele clinice și modificarile anatomopatologice sunt patognomonice, însă confirmarea bolii se face în laborator prin examene serologice (imunodifuzie dublă în gel de agar), virusologice, microscopie electronică, xenodiagnostic și RT-PCR.
Diagnosticul diferențial se face față de puietul în sac și galerioză. Puietul în sac afectează și larvele de albine lucrătoare, virusul multiplicându-se în albine și trântori, iar în galerioză agentul etiologic este o insectă.
II.1.7. Alte virusuri patogene pentru albine
În această categorie includem o serie de virusuri mai puțin cunoscute, dar care însoțesc entități morbide importante.
II.1.7.1. Infecția cu virusul de Kashmir (KBV)
Virusul de Kashmir a fost inițial detectat la albinele adulte din Asia, Apis cerana ( Bailey și Woods, 1977, citați de 16), dar care ulterior a fost identificat și la Apis mellifera, în Europa (totuși, este mai rar depistat în Europa), Australia și SUA (Allen și colab., 1995; Anderson, 1990; Bruce și colab., 1995; Hung și colab., 1995, citați de 14). Este un virus înrudit antigenic cu virusul paraliziei acute și are o acțiune patogenă similară acestuia (24). Unii autori consideră că acesta ar fi vehiculat de parazitul Varroa destructor (14). Pentru evidențierea KVB au fost utilizate, inițial, metode serologice, însă în momentul de față sunt folosite analize ale secvenței nucleotidice izolate din coloniile de albine infectate. Virusul de Kashmir este foarte patogen, înmulțindu-se accentuat în hemolimfa albinelor adulte sau a puietului, fără a prezenta simptome de boală (24). Albinele adulte, de obicei, mor în câteva zile după infectare, dar larvele pot supraviețui după ingestia virusului, astfel că devin adulte cu infecție inaparentă. După unii cercetătorii, KBV este considerat cel mai virulent dintre toate virusurile cunoscute la albine (19, 24).
II.1.7.2. Viroza aripilor deformate (DWV – deformed wing virus)
Este o anomalie produsă de un virus, denumit virusul aripilor deformate, care a fost inițial identificat, în Japonia, la Apis mellifera, în coloniile infestate cu Varroa destructor. Rolul de vector al acarianului Varroa destructor pentru virusul aripilor deformate a fost confirmat de cercetările efectuate în Anglia de Bowen -Walker și colab. (1998) și de van Oers și colab. (2000), în Olanda (19, 24).
Virusul are o perioadă îndelungată de înmulțire (24). Pentru a se reproduce și să declanșeze boala, în pupele albinelor, virusul are nevoie de o anumită doză infectantă.
Albinele din coloniile afectate, au aripile slab sau foarte slab dezvoltate vezi fig, I.4.10). În cazul infectării ouălor, la scurt timp după eclozare, larvele mor; puietul moare în stadiile de dezvoltare timpurie, iar dacă infecția se produce la albinele adulte, acestea nu prezintă malformații, dar este afectată viabilitatea lor. Virusul îmbolnăvește și coloniile de albine neinfestate cu Varroa destructor, căile de transmitere de la familiile bolnave la cele sănătoase fiind similar cu cele întâlnite la virusul paraliziei acute (Ball, 1989, citat de 16).
II.1.7.3. Infecția cu virusul de Egipt
Această boală este întâlnită numai în Egipt și este produsă de virusul albinelor din Egipt. Cunoștințele actuale, legate de epidemiologie și de patogenitate, sunt insuficiente (2, 16).
II.1.7.4. Paralizia lentă
Paralizia lentă este produsă de virusul paraliziei lente. Albinele infectate mor la 12 zile post infecție, prin inocularea virusului în hemolimfă. Înainte ca albinele infectate să moară, primele două perechi de membre paralizează. Infecția cu virusul paraliziei lente este potențată de infestarea coloniilor de albine cu Varroa destructor (16, 19).
II.1.7.5. Infecția cu virusul filamentos
Virusul filamentos a fost identificat de Clark (1978), în SUA, la albinele infectate cu Nosema spp. Virusul se localizează în corpul gras și în țesutul ovarian al albinei adulte. La albinele cu infecție severă, hemolimfa devine alb – lăptos (19).
II.1.7.6. Infecția cu virusul Y
Virusul Y al albinelor însoțește infecția cu Nosema spp., calea de infecție fiind cea digestivă. Evoluează mai ales la începutul verii, semnele clinice nefiind cunoscute (16, 19).
II.1.7.7. Infecția cu virusul X
Virusul X al albinelor este înrudit serologic cu virusul Y, însă infecția nu este condiționată de prezența microsporidiilor Nosema spp., ci de infecția cu Malpighamoeba mellificae. Poarta de intrare a virusului în organism este cea digestivă, iar evoluția virozei este semnalată în anii în care iarna este lungă. Virusul se răspândește în colonia de albine și în stupină prin intermediul fecalelor diareice eliminate de albinele bolnave. Viroza reduce durata de viață a albinelor, iar când este însoțită de infecția cu M. mellificae, moartea albinelor se produce mai repede (16, 19).
II.1.7.8. Virusul aripilor opace
Viroza aripilor opace este o afecțiune cu evoluție relativ ușoară, caracterizată prin pierderea transparenței aripilor și prin apariția unei culori închise a acestora. Virusul se transmite prin contact direct sau prin aerosolii din stup și se înmulțește în creierul și toracele albinelor bolnave. Produce o mortalitate redusă, agravându-se doar în cazul evoluției unor endoparazitoze la albine. Infecția cu acest virus duce la scurtarea vieții albinelor, iar coloniile cu infecție puternică devin inactive după care mor la scurt timp (16)
Diagnosticul acestei boli poate fi stabilit doar serologic (19).
II.1.7.9. Infecția cu virusul iridescent
Virusul iridiscent este un Iridiovirus identificat, în India, la Apis cerana. Viroza evoluează vara și se manifestă prin inactivitatea albinelor, urmată de moarte în aproximativ două luni de la debutul bolii.
Virusul se localizează în corpul gras, tractusul digestiv, glandele hipofaringiene și ovarele albinelor (16, 19).
II.1.7.10. Infecția cu Virusul de Arkansas
Virusul a fost izolat de la albine sănătoase, în statul nord-american Arkansas (SUA). Un virus asemănător a fost descris și de Lomme și colab. (1985), în California, dar care a fost denumit virusul Berkely al albinelor (16, 19).
II.1.7.11. Tratamentul bolilor virale
În paralizia cronică, ca de altfel în toate virozele albinelor, nu există medicație specifică. Credem, că singura metodă viabilă de stăpânire a bolii, este distrugerea coloniilor afectate, dezinfecția inventarului apicol și repopularea stupinei cu material biologic liber de paralizie cronică.
Pentru limitarea evoluției paraliziei acute, va fi ținută sub control varrooza și acarapioza, agenții etiologici ai acestor parazitoze fiind vectorii virusului paraliziei acute.
În puietul în sac, îmbunatățirea condițiilor de microclimat în colonie, asigurarea unui cules abundent cuplat, eventual, cu hrăniri stimulative, înlocuirea mătcilor bătrâne, schimbarea și topirea ramelor cu puiet bolnav, sunt măsuri suficiente pentru combaterea bolii.
In viroza botcilor negre, se înlocuiesc botcile afectate prin grefarea de mătci din alte colonii, mai ales dacă afecțiunea este incipientă. Colonia de albine poate fi stimulată cu sirop de zahăr cu ceai de pelin în care se adaugă și suc de usturoi (vezi cap. I.5.).
II.1.8. Afecțiuni cu etiologie neprecizată
II.1.8.1. Boala neagră
Boala neagră, evoluează în timpul verii, în perioadele lipsite de cules, apariția ei fiind favorizată de secetă, miere de mană, factori ereditari etc. , fiind produsă, cel mai probabil, de un virus în asociere cu unele bacterii (Pseudomonas fluorescens și Yersinia pseudotuberculosis). Nu sunt excluse nici alte cauze, cel mai frecvent fiind invocate factorul ereditar sau culesul din flora silvatică (23).
Clinic, boala se aseamănă foarte mult cu paralizia cronică, însă nu este contagioasă, iar evoluția ei încetează când stupina este deplasată de la culesul de pădure sau este înlocuită matca (23). De asemenea, trebuie să menționăm că în cazul în care cauza este culesul din pădure, boala cuprinde toată stupina, pe când forma congenitală se manifestă doar la câteva colonii de albine din stupina respectivă.
Diagnosticul urmărește excluderea cauzelor infecțioase.
Tratamentul este paleativ, putându-se folosi sirop de zahăr preparat cu extracte din plante medicinale (vezi cap. I.5), retragerea stupinei din zona silvatică și schimbarea mătcilor (23).
II.1.9. Prevenirea si combaterea bolilor virale la albine
Prevenirea și combaterea bolilor virale la albine presupune, supravegherea importului și tranzitului de material biologic, corelarea numărului de familii de albine cu resursele melifere (20) și realizarea unei întrețineri convenabile a coloniilor de albine pe tot parcursul anului. Acest ultim deziderat se înfăptuiește prin următoarele măsuri:
Supravegherea modulul de iernare și starea famililor de albine prin controale auditive fără a se recurge la deschiderea stupului:
zumzetul moderat și uniform arată că familia de albine este în stare bună și că iernarea decurge normal;
bâzâitul puternic arată ca familia este în suferință;
zumzetul slab, însoțit de zgomotul asemănător foșnetului frunzelor, înseamnă că familia este înfometată;
când zumzetul este foarte slab sau nu se percepe aproape deloc, se va interveni, fără abuz însă, prin lovirea cu mâna a peretelui din față al stupului, iar dacă albinele răspund printr-un zumzet puternic, care însă încetează imediat, înseamnă că familia iernează în condiții bune;
Îndepărtarea fără zgomot a zăpezii neafânate și a gheții de pe scândurelele de zbor ale stupilor și desfundarea urdinișurilor blocate de albinele moarte;
Asigurarea și supravegherea zborurilor de curațire ale albinelor având în vedere că, în sezonul nefavorabil, albinele acumulează în intestinul gros o cantitate importantă de excremente, care dacă nu sunt eliminate, favorizează instalarea nosemozei;
Aprecierea modului de iernare a albinelor după aspectul diferitelor resturi, după cantitatea de albine găsite moarte pe jos, în fața urdinișului, după resturile scoase de pe fundul stupului și aspectul lor:
mortalitatea crescută a albinelor atenționează faptul că familia a iernat cu prea multe albine-vârstnice;
uzura organismului albinelor din cauza unor boli;
prezența albinelor umede, mucegaite, arată că în stup este prea multă umiditate.
Intreținerea în condiții optime a familiilor de albine pe tot parcursul anului, asigurându-se hrană suficientă și de bună calitate, care să le confere o rezistență naturală crescută față de infecțiile virotice;
Tratamentele să se bazeze pe substanțe de origine naturală de tipul izoflavonolilor, sesquiterpenelor, derivaților de fenol etc. (vezi cap. I.5);
Realizarea și menținerea unei permanente stări de igienă în stupi și stupină prin eliminarea și topirea fagurilor vechi, a celor cu puiet mort, neeclozat, strângerea și distrugerea prin ardere a cadavrelor;
Eliminarea schimburilor de material biologic, faguri cu miere și păstura între stupii suspecți de boală și cei sănătoși din cadrul stupinei;
În viroze nu se recomandă tratamente preventive cu antibiotice; acestea nu acționează asupra virusurilor, dar creează o rezistență a germenilor bacterieni față de antibiotic și rămân sub formă reziduală în produsele stupului;
Numai în cazul în care apar semne clinice specifice bolilor clasice – bacterioze, micoze, protozooze și parazitoze supraadăugate virozelor, se vor efectua tratamente cu medicamente bio- , specifice fiecarei boli în parte;
Dezinfecții repetate profilactice și de necesitate cu una din substanțele: sodă caustică, sodă de rufe, formol, săpun, cloramina B și apa oxigenată;
Evitarea aglomerării stupilor în pastoral pentru eliminarea interferenței ce se produce între albinele din familiile bolnave și cele sănătoase ca urmare a rătăcirii acestora, ocazii cu care se face contaminarea și răspândirea generală a bolilor.
Igiena cuibului familiilor de albine se menține prin stimularea producției de ceară și înlocuirea anuală a cel puțin o treime din fagurii mai vechi de un an (28).
II.1.10. Bibliografie
Allen M, Ball B (1996): The incidence and world distribution of honeybee viruses. Bee World 77: 141-162;
Bailey Leslie (1981): Patologia albinelor. Academic Press, Anglia, traducere Aneta Mardare si Gabriela Chioveanu IDSA Bucuresti,1993;
Bakonyi T., R. Farkas, A. Szendroi, M. Dobos – Kovacs, M. Rusvai (2002): Detection of acute bee paralysis virus by RT – PCR in honeybee and Varroa destructor field samples: rapid screening ofrepresentative Hungarian apiarie, Apidologie, vol. 33, 63 – 74;
Ball B. V. (1989): Paralysys. IACR – Rothamsted, Harpenden, Herts., AL5 2JQ, UK https://www.researchgate.net/…/237105770_Par… -;
Benjeddou M.,N. Leat, M. Allsopp, and S. Davison (2002): Detection ofAcute Bee Paralysis Virus and Black Queen Cell Virus fromHoneybees by Reverse Transcriptase PCR, Applied and EnvironmentalMicrobiology, Vol. 67, No. 52384 – 2387;
Bekesi L., B.V. Ball, M. Dobos – Kovacs, T. Bakonyi, M. Rusvai (1999):Occurrence of acute paralysis virus of the honey bee (Apis mellifera)in a Hungarian apiary infested with the parasitic miteVarroa jacobsoni, Acta Veterinaria Hungarica, vol. 3, no. 47, 319 – 324;
Berényi Olga, Bakonyi T., Derakhshifar Irmgard, Köglberger Hemma and Nowotny N., (2006): Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian. Apiaries Appl. Environ. Microbiol. vol. 72 no. 4 2414-2420;
Bu Y., Li Tianbang Guangda și Kadowaki, Tatsuhiko, (2013): Molecular and phylogenetic characterization of honey bee viruses, Nosema microsporidia, protozoan parasites, and parasitic mites in China.Ecology and Evolution, vol. 3 (2), 298-311;
Châline N., L.W.F. Ratnieks, N.E. Raine, N.S. Badcock, T. Burke, (2004): Non – lethal sampling of honey bee Apis mellifera, DNA using wingtips, Apidologie, vol. 35, 311 – 318;
Davison S., N. Leat, M. Benjeddou, (2003):Development of moleculartools for honeybee virus research: the South Afican contribution,African Journal of Biotechnology, vol. 2, no. 12, 698 – 713;
Denholm C.H., (1999): Inducible honey bee viruses associated withVarroa jacobsoni
, Ph.D. thesis Keele University, Staffordshire, and IACR– Rothamsted, Hertfordshire, UK;
Evans J.D., (2002): Genetic Evidence for Coinfection of Honey Bees bycute Bee Paralysis and Kashmir Bee Viruses, Journal of GeneralVirology, vol. 7., no.4, 1716;
Grabensteiner, E., Ritter, W., Carter, M.J., Davison, S., Pechhacker, H.,Kolodziejec J., O. Boecking, I. Derakhshifar, R. Moosbeckhofer, E.Licek, N. Nowotny, (2001): Sacbrood Virus of the Honeybee (Apis mellifera): Rapid Identification and Phylogenetic Analysis Using Reverse Transcription – PCR, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol. 8, no.1, 93 – 104;
Hung A.C.F., (2000): PCR detection of Kashmir bee virus in honey beeexcreta
, Journal of Apicultural Research, vol. 34, no. 3 – 4, 103 – 106;
Leat N., Ball Brenda, Govan Vandana, Davison S., (2003):Analysis of the completegenome sequences of black queen – cell virus, a picorna – like viruson honey bees, Journal of General Virology, vol. 8, no. 81, 2111- 2119;
Morse R.A., K. Flottum Eds., (1997): Honey Bee Pests, Predators, andDiseases, Third Edition, A.I. Root Company, Medina Ohio, USA;
Noedström S., (2003): Virus infections and Varroa mite infestation inhoneybee colonies, Doctoral Dissertation, Uppsala, Suedia;
von Oers O.M., D. Peters, J.M. Vlak, (2000): Comparative study of anovel virus of the Varroa mite and Deformed Wing Virus (DWV) ofhoneybee, htp://www.wageningen ur.nl/viro/research/baculo%20biology% 20and%20 biotechnoogy.html;
Odagiu Antonia, Oroian Gh. I., (2010):Considerații ecopatologice la insecte,abordare moleculară, Vol. I Apis mellifera L., Editura BIOFLUX, CLUJ –NAPOCA;
Ogradă I.,(1982): Bolile și dăunătorii albinelor. Ediția a II-a, A.C.A., București;
Popa Al., (1965): Bolile albinelor și viermilor de mătase. Editura Agro-Silvică, București;
Ribière M., Faucon J. – P., Pépin M., (2000): Detection of chronic honey bee (Apis mellifera L.) paralysis virus infection: application to a field survey. Apidologie, Springer Verlag, 31 (5), pp.567-577;
Ritter W. (2000): Bolile albinelor. Editura M.A.S.T., București;
Toderaș I., Moraru Olga, Movilă Al., Ciuhrii M., Munteanu Natalia. (2008): Diversitatea și particularitățile diagnosticării virușilor albinelor (Apis Mellifera L.) https://ibn.idsi.md/…/Diversitatea%20si %20particularitatile%20diagnostic;
Tomomi M., Yuriko Kojima, Mikio Yoshiyama, Kiyoshi Kimura, Bu Yang and Tatsuhiko K., (2012): Molecular Identification of Chronic Bee Paralysis Virus Infection in Apis mellifera Colonies in Japan. Viruses, 4, 1093-1103; doi:10.3390/v4071093;
***Patologie apicolă (2002): http://teoalbina.bluepink.ro/patologieapicola.htm
***Virusologie general, (2016): http://www.creeaza.com/familie/medicina /VIRUSOLOGIE-GENERALA-Caractere343.php;
***Bolile albinelor: https://sites.google.com/site/eduard raimund/bolilealbinelor
***Apicultură, Recomandări, Zootehnie, (2014): https://apimentor.wordpress.com/ page/5/?app-download=ios
*** Paralizia cronică: http://www.ent.uga.edu/bees/Disorderes /chronic_bee_ paralysis.htm
Vasile SECAȘIU
II.II. Bolile bacteriene la albine
Bacteriile sunt microorganisme unicelulare cu o structură complexă, încadrate în regnul Procaryota. Au echipament enzimatic care le asigură metabolism propriu, necesar proceselor fiziologice vitale.
În natură, bacteriile se găsesc în cea mai mare parte sub forma vegetativă. Bacteriile au pereți celulari relativ rigizi, conferindu-le o formă specifică, uneori au capsulă și cili sau dezvoltă sporul ca formă de rezistență. Cele mai multe dintre bacterii se cultivă pe medii artificiale, majoritatea fiind saprofite. Unele bacterii sunt patogene pentru animale și insecte.
Insectele sunt gazde pentru multe bacterii, dar cea mai mare parte dintre ele sunt comensale, saprofite sau intervin ca agenți principali sau secundari în unele afecțiuni.
Și albinele sunt colonizate de o gamă largă de bacterii comensale, saprofite sau condiționat patogene, însă cele mai cunoscute bacterii sunt cele care produc loca americană și loca europeană.
II.2.1. Loca americană
American Foulbroud (AFB)
loca malignă, pesta americană
loca vascoasă sau puietul putred
Loca americană este o boală infecto-contagioasă a puietului de albine (Apis mellifera) și a altor specii de albine, din genul Apis, produsă de Paenibacillus larvae și care se caracterizează prin modificări ale puietului privind volumul, culoarea și mirosul, precum și ale fagurelui, concomitent cu slăbirea coloniei de albine.
Istoric
Boala a fost descrisă încă din secolul I d. Hr. de către scriitorul latin Columella în „De re rusticaˮ. Însă, cercetări privind etiologia bolii s-au efectuat doar începând cu secolul al XX-lea. Astfel, în 1904, White evidențiază la puietul bolnav un bacil sporulat pe care-l denumește Bacterium y, reușind să-l cultive pe medii de cultură, după care l-a denumit Bacillus larvae. Burri, concomitent cu White îl identifică, de asemenea, în larvele bolnave, în 1906, cât și în cele moarte. Phillips, tot în 1906, diferențiază, în cadrul bolii albinelor denumită anterior foulbrood (puiet urât mirositor ), două entități nosologice; loca americană și loca europeană , dar , nu după distribuția geografică, ci în raport cu zonele unde s-au efectuat primele cercetări științifice. La propunerea lui Cowan, în 1911, germenul ia denumirea de Bacillus burri. Massen, în 1906, descrie bacteria sub numele de Bacillus brandenburgensis. În 1993 Ash și colab., reclasifică Bacillus larvae, prin transferul din genul Bacillus într – un – ul nou, denumit Paenibacillus (lat. paene =aproape), iar Heyndrick și colab., în 1996, reclasifică Paenibacillus pulvifaciens ca subspecie a lui Paenibacillus larvae, bacterie care produce la albine, în unele zone geografice, foarte rar întâlnită, boala, „powdery scaleˮ ( coajă pulverulentă ), în care larvele devin de culoare gălbuie sau cafenii și sfărâmicioase. La noi în țară a fost diagnosticată de către Begnescu și Cernăianu, și studiată din punct de vedere bacteriologic de V.Bica-Popii și Al. Popa (1957), iar Al. Popa (1957-1965 ) efectuează, un studiu amplu privind diferite aspecte ale bolii.
Răspândirea și importanță economică
Loca americană are răspândire universală, fiind semnalată în toate țările crescătoare de albine, fiind asociată cu prezența speciilor din genul Apis, din diferite continente, cu excepția zonei subsahariene africane (45).
Pierderile economice se datoresc morbidității și mortalității crescute, fiind considerată cea mai gravă boală a albinelor.
Etipatogenie
Agentul etiologic, Paenibacillus larvae (sin. Bacillus larvae) din familia Bacilaceae, genul Paenibacillus, gen cu peste 160 de specii (41) este un bacil lung și subțire de 1,5-6/ 0,5-0,8 µm, drept sau încurbat, cu capetele rotunjite, izolați, sau sub formă de filamente, mobil, peritrih, cu flageli dispuși în jurul celulei bacteriene, uneori, împletiți sub formă de mănunchiuri, sporulat, cu spor oval, central sau subterminal, cu dimensiuni de 1,3-0,6 µm și care nu conține corpi parasporali (11). Când sporulează, bacteria pierde cilii, sporii fiind observați în preparatul colorat, diseminați în câmpul microscopic, sau grupați în mănunchiuri.
Se cultivă numai pe medii speciale care conțin ser sanguin, gălbenuș de ou, extracte de larve de albine, levuri, morcov, glucoză, adaos de organe, lapte etc. La noi în țară, încă din 1957, V. Bica și Al. Popa., au folosit cu rezultate bune geloza și bulionul cu ser de cal, iar Institutul de Cercetare pentru Apicultură, un mediu compus din lapte, gălbenuș de ou, geloză și extract de larve. În ultima perioadă, se folosesc diferite medii de cultură, dintre care frecvent folosit este mediul geloză Columbia cu sânge de cal și lizozim, pe care, după 2-4 zile de incubație la 30-370 C, apar colonii cenușii, cu un contur regulat și diametrul sub 1 mm, înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă. Transplantul pe bulion este negativ. Tot pe geloză Columbia, unele genotipuri ale Paenibacillus larvae, sunt incolore sau gălbui, netede, iar coloniile sunt mai mari, chiar cu diametrul de 3 mm. Se pot transplanta în bulion (11).
Dintre caracterele biochimice, remarcăm: hidroliza cazeinei și gelatinei, acidifierea, fără gaz, a glucozei și trehalozei, nu produce catalază, decât unele tulpini, cu rezultat tardiv și ușor pozitiv, nu dezaminează fenilalanina, nu produce indol – urează, nu acidifică amidonul, arabinoza, maltoza, zaharoza și xiloza. Nu metaboilzează citratul. Unele caractere biochimice sunt variabile : reducerea nitraților, prezența acetil-metil-carbinolului, acidifierea manitolului și salicinei (10).
Mediile de cultură recomandate în ultimul timp sunt (41):
Mediul PLA (Paenibacillus larvae agar ) este o combinație dintre trei medii de bază suplimentate cu gălbenuș de ou și antibiotice;
Mediul MYPGP agar, compus din bulionul Müeller-Hinton, extract de drojdie, piruvat de natriu, la care se adaugă acid pipemidic și acid nalidixic;
Mediul J agar conține agar, extract de drojdie, acid nalidixic și acid pipemidic;
Mediul CSA (Columbia sheep-blood agar ) compus din CSA de bază cu adaos de acid pipemidic și acid nalidixic;
mediul BHIT (brain-heart infusion medium suplemented with thiamine ) agar.
Dintre acestea, mediul MYPGP este folosit în mod curent în activitatea de laborator în diagnosticul locei americane. Pe mediile CSA și BHIT sporularea P. larvae este mai slabă. Mediul PLA este un mediu care are capacitatea de a inhiba majoritatea germenilor din stup și din produsele apicole. Pentru inhibarea miceților se poate introduce în mediile de cultură amfotericină, 16,8 µg/ml mediu.
Incubarea se face la 34-370 C, timp de 2-4 zile, în atmosferă aerobă sau anaerobă (10% CO2), bacteria fiind facultativ anaerobă (44).
Probele de miere trebuiesc incubate 7-10 zile.
Paenibacillus larvae, forma vegetativă, prezintă o sensibilitate la agenții fizici și chimici comparabilă cu a celorlalte bacterii nesporulate. Astfel, rezistă la 600 C 10 minute, în apă sau soluții apoase, iar dezinfectantele obișnuite, respectiv hidroxidul de sodiu și formolul 2% au acțiune nocivă. Dintre antibiotice și sulfamide, cea mai înaltă sensibilitate o prezintă față de teramicină, eritromicină și penicilină, și au antibiosensibilitate medie față de streptomicină și cloranfenicol. Dintre sulfamide s-au dovedit foarte active sulfatiazolul și plurisulfanul (polisulfamidă ) (23).
Sporii de Paenibacillus posedă rezistență remarcabilă față de diverși factori fizico-chimici și biologici, ceea ce reprezintă un mare impediment în combaterea bolii. Astfel, față de căldură rezistența este în funcție de mediul în care se află: în apă rezistă 11 minute la 1000 C, la 950C 15 minute, la 930C 60 și chiar 90 de minute, pe când sub acțiunea căldurii uscate, tot la 1000C, rezistă 8 ore. Sporii mai vechi sunt mai rezistenți comparativ cu cei tineri, iar cei incluși în substanțe protectoare rezistă mai mult decât cei din suspensiile apoase. În mierea nediluată rezistă la 105ș-1070 C timp 40 de minute și timp de 20 de minute în cea diluată 1/1, pe când în ceară la 1200 C, rezistă 30 de minute (37).
Rezistența față de căldură diferă și în funcție de originea geografică, conform observațiilor făcute în SUA și Italia, cât și la noi, constatându-se diferențe între tulpinile recoltate din diferite zone ale țării. Din 27 de tulpini testate, la 70-90 0 C, toate au rezistat 10 minute, pe când la 95-1000 C, numai sporii de la 3 tulpini au rezistat (26).
În mediile de cultură sporii de Paenibacillus larvae supraviețuiesc zeci de ani, iar în cadavrele larvelor uscate, până la 40 de ani. Razele solare directe distrug sporii în 28-41 de ore, pe când cei din miere sunt distruși doar în 4-6 săptămâni. În solul uscat rezistă peste 220 de zile, iar în mierea depozitată, timp de peste un an (19).
Rezistența sporilor este ridicată și față de agenții chimici (substanțele antiseptice și dezinfectante). Fenolul 5% este inactiv chiar după câteva luni de contact, pe când formolul distruge sporii doar în concentrații mari, respectiv 20% în 30 de minute, iar oxidul de etilen în 12-14 ore, sublimatul corosiv 0,1% în 4-5 zile, hidroxidul de sodiu 5% fierbinte în 6 ore, alcoolul 950 în 45 de ore, iar cloramina 10% distruge sporii în 3-5 zile. Sulfamidele, foarte active față de formele vegetative, mai ales sulfatiazolul, chiar la diluții de 0,1%, ,,în vitroˮ, față de spori sunt ineficiente, iar la concentrații de 1%, nici după 15 luni de contact (1). Antibioticele sunt, de asemenea, inactive față de spori.
Cu ajutorul PCR (rep PCR) folosind primeri ERIC 1R și ERIC C2 au fost diferențiate, în cadrul speciei P. larvae, patru genotipuri: ERIC I, ERIC II, ERIC III și ERIC IV ( 11 ), ocazie cu care s-a făcut propunerea de a se renunța la clasificarea pe subspecii, specia fiind definită ca Paenibacillus larvae, fără subspeciile P. l. larvae și P.l. pulvifaciens. Primele două genotipuri ERIC I și ERIC II corespund cu subspecia P.1.larvae iar ERIC III și ERIC IV cu subspecia P.1. pulvifaciens. Cele patru genotipuri diferă prin aspectul coloniilor pe mediile de cultură solide, inclusiv hemoliza, morfologia sporilor, metabolizarea glucidelor și mai ales prin diferența de patogenitate (virulență) (10). Patogenitatea este apreciată prin determinarea LT100, dovedindu-se că genotipul ERIC II este cel mai virulent; tulpinile acestui genotip omoară larvele, în infecția experimentală, în 7 zile, pe când cele din genotipul ERIC I numai după 12 zile, dar cu variabilități individuale (22).
Din punct de vedere epidemiologic, genotipul ERIC I, clasic, este cel mai răspândit, fiind izolat din focare de loca americană din Europa și America, genotipul ERIC II din unele focare din Europa, iar celelalte, ERIC III și ERIC IV, au fost identificate numai la tulpinile de colecție ale diferitelor laboratoare, provenite din diverse focare de loca americană, confirmându-se că toate tulpinile din cele patru genotipuri sunt patogene pentru puietul căpăcit și pot determina loca americană (13, 10).
Caracterele fenotipice (12) ale genotipurilor ERIC ale P. larvae sunt: prezența coloniilor pigmentate la genotipurile ERIC II și ERIC III; hemoliza pe mediul CSA la tulpinile din genotipul ERIC III, dezvoltarea în bulionul nutritiv are loc la toate genotipurile cu excepția genotipului ERIC I; fermentarea manitolului de către toate tulpinile genotipurilor cu excepția celor din genotipul ERIC I, fermentarea salicinei numai de tulpinile genotipului ERIC I, producerea de fosfotază alcalină și fosfotază acidă de către toate tulpinile cu excepția celor din genotipul ERIC II, iar producerea de catalază prezentă în cele din genotipurile ERIC III și ERIC IV, este de slabă intensitate și întârziată, la genotipurile ERIC I, iar la genotipul ERIC II este negativă. Simptomatologia caracteristică din loca americană este produsă de toate tulpinile din cele patru genotipuri, iar LT100, este sub 7 zile la genotipurile ERIC II și ERIC IV, și după 12 zile la tulpinile din genotipul ERIC I (22).
Prin cercetarea genomului tulpinelor ERIC I și ERIC II (20) au fost identificate, la genotipul ERIC I, șapte gene care codifică șapte toxine ( P1x1 – P1x7 ) rezultând, posibilitatea elaborării acestora. Dintre aceste toxine, unele au similitudine cu familia de toxine AB elaborate de Bacillaceae și Clostridiaceae, iar P1x1 cu toxina larvicidă a bacteriei Lysinibacillus sphaericus prezentă la unele insecte; P1x2 are afinități și cu toxina botulinică, ambele cu rol important în patogeneza tulpinilor genotipului ERIC I. De asemenea, P1x4 și P1x5 sunt asemănătoare cu toxinele bacteriilor B. cereus, B. thuringiensis, precum și cu toxinele C. botulinum și C. difficile, iar P1x6 și P1x7 cu ale bacteriilor anaerobe C. botulinum și C. perfringens, tipurile B și D, care elaborează toxina epsilon (16). La genotipul ERIC II s-au identificat locusuri pentru citolizine care reprezintă un grup de toxine specifice genului Paenibacillus cu rol în patogeneză. Din grupul citolizinelor fac parte și hemolizinele acestei bacterii.
Proteazele (colageneza și hialuronidaza) au rol cheie ca factori de virulență la P. larvae prin distrugerea barierei de colagen din matricea intercelulară. Colagenaze s-au evidențiat și la bacteriile din genurile Vibrio și Clostridium, cu rol important în procesele patogenetice, mai ales la unele clostridii cum sunt C. perfringens și C. histolyticum (17 ). Tot din această familie, a proteazelor, s-au identificat la genotipul ERIC I, hialuronidază cu rolul degradării conexiunilor intercelulare prin clivarea legăturilor glicozidice ale acidului hialuronic, hialuronidaza reprezentând, de asemenea, un factor de virulență (factor de difuziune) întâlnită la multe bacterii printre care și la Clostridiaceae (18).
Tot din acest grup fac parte și chitinazele cu care P. larvare distruge membrana peritrofică din intestin, constituită din chitină și glicoproteine, membană care are rolul de protecție a epiteliului față de acțiunea mecanică a alimentelor și a enzimelor digestive, precum și de barieră în calea diferiților microbi și paraziți, înainte de a ajunge la epiteliul intestinal. Tot chitinazele contribuie la degradarea cadavrelor după moartea larvelor în urma infecției, având afinități cu chitodextrinaza de la C. botulinum (34). În genomul acestor două genotipuri s-au evidențiat și gene care codifică metaloendopeptidaze, din familia proteazelor întăritoare, denumite „ enhancin proteinˮ, proteaze decelate și la unele virusuri ( viral enhancin protein ), dar și la alte bacterii (bacterial enhancin-like protein) cum sunt B. thuringiensis, Yersinia pestis, B. anthracis și B. cereus (5). În genomul P. larvae s-au identificat gene ale proteazelor serinice. Serinele influențează o multitudine de funcții în organismul animal, cum sunt digestia, reproducerea, dar și unele conexe cu răspunsul imun ( activarea complementului), inclusiv elaborarea unor substanțe antimicrobiene (peptide antimicrobiene, lizozim) (5). Larvele nu se pot apăra de infecția cu P. larvae, printr-un răspuns imun eficient, bacteria agresoare contracarând rezistența imună a larvelor după elaborarea peptidelor antimicrobiene și a lizozimului (10) .
În genomul P. larvae s-au evidențiat gene ale unor peptide cum sunt PKS ( polyketide synthases) și NPRS (nonribosomal peptide synthetases) cu rol de a produce iturin (familie de lipopeptide cu spectru antifungic și antibacterian) (38). De asemenea, P.larvae posedă unele gene ale unor peptide speciale, lantibiotice. Acestea sunt unica clasă de antibiotice peptidice, alături de subtilină și niacină, care au efect bactericid asupra unor bacterii Gram – pozitive (11).
Sporii ajunși în interiorul intestinului mijlociu al larvei, odată cu hrana, germinează și după 24 de ore se transformă în forme vegetative (bacili), iar după metamorfoza larvei în pupă, ajunge în celulele epiteliului intestinal, după care trece în hemolimfă, unde se multiplică masiv și dezvoltă o adevărată „bacteriemie sistemicăˮ. Acum începe sporularea, iar larva moare, dezintegrâdu-se prin liză.
În infecția experimentală, pentru a infecta larvele, numărul de spori diferă în funcție de vârsta acestora. Pentru larvele de 24 de ore sunt necesari sub 10 spori, pe când pentru cele de două zile sunt necesari milioane de spori (2). DL50 este de 35 spori pentru larvele în vârstă de 24 de ore, iar larvele de 53 de ore nu se mai pot infecta (11).
Formele vegetative (bacilii) nu sunt infectante, probabil, pentru că în procesul de preparare a hranei pentru larve, intervine o substanță bactericidă, secretată de către albinele doici, respectiv acidul 10 –hidroxidecenoic (Blum și col.1959 , citați de 2).
Paenibacillus larvae este un aero-anaerob, particularitate fiziologică confirmată și în biologia bacteriei în tubul digestiv al larvei după infecție. Germinarea optimă a sporilor are loc în larvele foarte tinere, în intestinul cărora sunt condiții de anaerobioză relativă, dar cu o biocenoză nefavorabilă dezvoltării formelor vegetative. Multiplicarea bacililor rezultați după germinare și apoi sporularea lor, necesită condiții de aerobioză, fiind asigurate de larvele mai vârstnice, după căpăcire, dintr-o larvă rezultând 2,5×109 spori (10). În condiții de laborator, Paenibacillus larvae, se dezvoltă și germinează cel mai bine în mediile de cultură într-o atmosferă cu conținut scăzut de oxigen, cu 5-10% CO2 în atmosferă, pH 6,6 și la 36-370 C, condiții cerute, în general, de bacteriile aerobe. În consecință, infecția se realizează mult mai ușor în cazul larvelor tinere ele fiind mai susceptibile, pe când germinarea accentuată a sporilor are loc în intestinul larvelor de 5-6 zile, după căpăcire. În timpul sporulării este sintetizată o proteinază extracelulară care inhibă răspunsul imun al larvei (11).
Epidemiologie
Sunt receptive la infecția cu Paenibacillus larvae puietul albinelor, mătcilor și mult mai rar al celor de trântori, aparținând genului Apis. Albinele adulte nu sunt afectate, ele reprezentând doar vectori mecanici pentru spori. Infecția larvelor căpăcite are loc la trecerea din stadiu de larvă la cel de prenimfă.
Principalele surse contaminante sunt: larvele bolnave sau moarte care conțin spori, precum și difuzarea sporilor de către albine în timpul curățirii în stup și hrănirii larvelor.
Loca americană poate fi introdusă în prisacă și, implicit, în diferite familii, prin intermediul mătcilor, adăpătorilor, prin furtișag, roiuri de albine, stupi, ceară, miere, inventar apicol etc., contaminate. Mătcile pot transmite boala și vertical, pe cale trans-ovariană. De asemenea unii paraziți ai stupilor pot contribui la transmiterea bolii, cum sunt unele coleoptere: gândacul mic de stup (Aethina tumida) (32), (gândacul de slănină (Dermestes lardarius ) ca și unele lepidoptere, molia stupului ( Galleria melonella), unele muscide, păduchele albinelor (Brauela coeca , Drosophila funebris). Experimental, boala a fost transmisă prin administrarea în hrana larvelor excremente de la Galleria melonella; în conținutul intestinului și în excrementele acestor paraziți, evidențiindu-se spori de Paenibacillus larvae.
Receptivitatea la infecție a puietului este ridicată, nefiind influențată decât de puțini factori extrinseci, cum este temperatura ridicată a mediului ambiant din a doua jumătate a verii, care favorizează infecția și evoluția bolii.
În corpul larvelor există un mediu optim pentru dezvoltarea bacteriei, într-o larvă uscată putând exista până la 2,5×109 de spori (26) .
În interiorul familiei boala este răspândită de albinele care curăță fagurii vechi și depozitează hrana (nectar , polen ) pentru puiet. Cadavrele larvelor moarte, uscate și aderente de pereții celulei, sunt îndepărtate din faguri cu mare dificultate de către albinele tinere, manevre în care se murdăresc pe piesele bucale, picioare, aripi și suprafața corpului cu spori, transmițându-i în stup, contaminând și mierea, inclusiv larvele, concomitent cu hrănirea lor, sub formă de lăptișor sau amestec de lăptișor cu polen, în funcție de vârsta larvelor.
Simptomatologie
Perioada de incubație variază, în limite largi, de la câteva zile la câteva săptămâni, în funcție de puterea coloniei de albine. Familiile afectate de locă americană își modifică comportamentul devenind apatice, stare similară cu cea în care lipsește matca.
Primele simptome apar la larvele în stadiul de prepupă, inițial fiind afectate un număr mai mic de larve, pentru ca apoi numărul lor să crească, cuprinzând toată rama. Uneori, mai ales în cazul familiilor puternice și cu un număr mic de larve afectate, la începutul bolii, prin activitatea de curățire a albinelor lucrătoare evoluția bolii poate fi oprită.
Simptomatologia în loca americană constă, în principal, din modificări privind aspectul fagurilor cu puiet bolnav și a larvelor bolnave.
În formele ușoare de boală numărul de larve bolnave este mic, fără să fie observate, mai ales, în familiile puternice. Cu timpul, numărul larvelor bolnave crește, iar albinele lucrătoare nu mai pot curăța eficient celulele cu larve moarte pentru că acestea aderă ferm la pereții celulei, iar mătcile nu mai pot oua în aceste celule. Ramele apar cu puiet neuniform, „împrăștiat” comparativ cu cel al familiilor sănătoase, la care este compact. Culoarea căpăcelelor celulelor cu larve bolnave devine din gălbui și plate, de culoare galben-brună și brună, sunt excavate, perforate sau descăpăcite. Mirosul, consecutiv histolizei larvelor, se modifică devenind asemănător cleiului de tâmplărie încălzit, și apoi chiar , miros de mucegai , de putrefacție , de unde și denumirea de „puiet putred”, miros neîntâlnit în alte boli ale albinelor (23) .
Larvele moarte își modifică forma și culoarea, își pierd consistența, turgescența și se produc modificări de poziție în celule, se produce deshidratarea și în 1-2 luni, apar ca o masă informă, cu un conținut inițial vâscos, care la introducerea unui băț de chibrit se întinde sub forma unui filament de câțiva centimetri („proba bățului de chibrit”). Apoi deshidratarea se accentuează transformându-se într-o crustă, coajă, lipită de peretele celulei, pe care albinele lucrătoare nu o mai pot dezlipi, reprezentând principala sursă de infecție. La intrarea în celulă, în unghiul inferior, după uscare, extremitatea cefalică apare ca un mic tubercul, buton cefalic, care este un element important în stabilirea diagnosticului.
Modificari anatomopatologice
În loca americană se întâlnesc modificări ale fagurelui cu puiet și a larvelor.
Fagurele cu puiet are aspect de ,,puiet împrăștiat” și de ,,puiet pestriț”. Primul aspect este datorat alternanței dintre zonele compacte cu celule căpăcite și cele cu celule descăpăcite, iar aspectul de puiet pestriț este dat de scufundarea, perforarea și modificarea culorii căpăcelelor din celulele cu larve bolnave. Căpăcelele celulelor sunt de culoare închisă (până la maroniu-negricioasă), din convexe devin concave și sunt perforate (25).
Moartea puietului afectat de locă americană se produce, de regulă, după căpăcire, în stadiul de prepupă sau, mai rar, de pupă. Larvele își modifică culoarea la 10 – 15 zile de la infecție, din albe sidefii devenind brun-maronii, iar mirosul emanat este de “clei de oase” sau de pește (putrefacție). Larvele moarte au consistență vâscoasă și filantă. Atât înainte cât și după deshidratare, aderența larvelor la pereții celulei este remarcabilă (24). Prin deshidratare, la aproximativ 30 de zile de la moarte, larvele se transformă într-o cojiță de culoare brun-închis, aderentă de pereții celulei. La intrarea în celulă se observă și butonul cefalic. La încercarea de extragere a conținutului unei celule cu o larvă moartă recent, se formează un filament lung, aderent atât la celulă cât și la bățul de chibrit. Este așa-numita probă a bățului de chibrit (29, 42).
Diagnostic
În loca americană diagnosticul se pune prin coroborarea datelor epidemiologice, clinice, anatomopatologice și a celor oferite de examenul de laborator.
Loca americană evoluează în toată perioada activă a coloniei de albine, însă exprimarea maximă are loc în lunile iulie și august. Căldurile mari din timpul verii favorizează apariția și evolutia bolii.
Clinic și anatomopatologic, loca americană se manifestă prin modificări în aspectul fagurilor cu puiet bolnav și a morfologiei larvelor, și se recunoaște după:
aspectul “împrăștiat” și “pestriț” al puietului pe figure;
moartea larvelor după căpăcire;
dacă moartea larvelor are loc în stadiul de pupă, acestea iau poziție
dreaptă, de “limbă”, așezată în partea de jos a celulei;
consistența vâscoasă și filantă a larvelor moarte;
mirosul de clei de tâmplărie încins;
prezența cojițelor uscate și a butonilor cefalici în cazurile vechi;
aderența larvei moarte la pereții celulei, atât înainte, cât și după uscarea acesteia;
proba bățului de chibrit pozitivă (fig. II.2.3.) (17).
În majoritatea cazurilor, loca americană poate fi diagnosticată în teren, prin examen clinic. Confirmarea diagnosticului se face în laborator (23).
Diagnosticul de laborator se face prin utilizarea mai multor teste, dintre care amintim:
examenul resturilor larvare în spectrul ultraviolet sau în orice alt spectru, expunerea fiind facută la o lungime de undă de 3100-4000 Å;
examenul microscopic al frotiului colorat prin diverse metode: Gram, fuxina bazica etc.;
tehnica cu anticorpi fluorescenți (IF);
lactotestul Holst;
examenul bacteriologic al caracterelor morfologice și biochimice;
tehnici imunoenzimatice;
tehnica de biologie moleculară (PCR) (2, 17, 42).
Diagnosticul diferențial se face față de loca europeană. Se va ține seama de evoluție, categoria de larve afectată, aspectul și mirosul larvelor moarte, precum și de proba bățului de chibrit (40).
Loca europeană este caracterizată prin descompunerea larvelor moarte și apariția unor mirosuri străine, în funcție de bacteria care predomină ; P.alvei imprimă mirosul de putrefacție, iar E. faecalis sau L.eurydice, mirosul de acru. Larvele se descompun, se deshidratează și se transformă într-o coajă cenușie, brună, în interiorul celulelor, ușor detașabilă de pe pereții acestora.
Prognostic
Este rezervat. Prin particularitățile agentului etiologic, Paenibacillus larvae, de a sporula, dotat cu o mare rezistență a sporului la factorii externi, precum și prin unele atribute etologice ale albinelor în colonie, toate contribuie la difuzarea și permanentizarea bolii în stup, prisacă și în zonă, punând mari probleme de prevenire și combatere.
Tratament
Tratamentul cu chimioterapice și antibiotice nu este practicat în multe țări din Comunitatea Europeană. Este în mare parte și ineficient. Medicamentele acționează numai asupra formelor vegetative ale agentului cauzal, sporii persistând în stup mult timp (45).
Cele mai utilizate medicamente în tratamentul bolii au fost plurisulfanul sau suzotrilul, sulfatiazolul, streptomicina, teramicina, tetraciclina, eritromicina și cloramfenicolul. Din această multitudine de medicamente, cele mai eficiente în distrugerea formelor vegetative ale bacteriei Paenibacillus larvae sunt sulfatiazolul și teramicina. Aceste medicamente au fost administrate în doze care diferă de la autor la autor, vehiculul fiind zahărul sub formă de pudră sau sirop. Noi nu suntem adepții tratării bolii cu antibiotice sau chimioterapice, deoarece reziduurile acestor produse se regăsesc în produsele stupului, iar consumul de către om a mierii, polenului sau păsturii, dă naștere la tulpini bacteriene, din specii diverse, rezistente la aceste medicamente.
Avându-se în vedere aspectele expuse (antibiorezistență, reziduuri în produsele stupului și ineficiența medicamentelor asupra formelor sporulate) sunt investigate metode alternative pentru combaterea acestei boli (45).
Extractele din plante medicinale (Calendula. officinalis, Cariniana domestica, și Nasturtium officinale) au fost folosite, cu titlu experimental, în profilaxia și tratamentul în loca americană, rezultatele obținute fiind încurajatoare (24). De asemenea, activitate antibacteriană au și geranyflavonoidele din arborele Paulownia tomentosa, extractul alcoolic de propolis, acizii grași polinesaturați omega 3 (45), precum și uleiurile volatile de la cimbrișor, de la pin sau uleiul de mentă (4).
Antagonismul bacterian și bacteriocinele sau selectarea unor mătci care au înscris în codul genetic comportamentul igienic, pot, de asemenea, să fie folosite în contracararea efectului patogen al bacteriei P. larvae. Astfel, entomocinul 110, care este o bacteriocină secretată de Bacillus thuringiensis subsp. Entomocidus HD 110, au efect cid asupra multor bacterii Gram-pozitive și Gram-negative, printre care și P. larvae, iar un număr de șapte specii de bacterii, cele mai multe ale genului Bacillus, printre care și B. subtilis, inhibă dezvoltarea lui P. larvae (46).
Combatere
Ca și în alte bacterioze sporogene, elementul principal în combatere îl reprezintă distrugerea agentului etiologic, dacă este posibil, în habitatul lui. Ori, față de sporul acestei bacterii, atât de rezistent în mediul extern, și chiar față de mijloacele excepționale cu efect bactericid, cea mai eficientă metodă este distrugerea coloniei de albine și a tuturor elementelor din habitatul lor, prin incinerare: inventar, produse etc., urmată de un control bacteriologic al dezinfecției.
În loca americană, distrugerea coloniilor de albine este cea mai eficientă metodă de limitare a extinderii bolii. Procedura implică incinerarea albinelor și a fagurilor cu puiet și a rezervelor de hrană într-un incinerator ecologic sau, în lipsă, într-o groapă adâncă de 2 m. Inventarul apicol aferent, inclusiv cutia stupului, vor fi supuse unui tratament termic prin flambarea cu lampa de benzină sau imersia acestora într-o baie de parafină la temperatura de 150ș C, timp de 10 minute. Fagurii și mierea se vor decontamina prin folosirea unor compuși chimici cu efect cid asupra sporilor bacilului P. larvae. Gurulova și colab. (2007), au testat produsul Huwa-san® TR 50, care este un agent dezinfectant sporocid, cu rezultate bune în dezinfecția echipamentului apicol confecționat din metal, lemn și ceară (45).
În orice caz, cheltuielile aferente procesului de dezinfecție sunt mult mai mari decât valoarea materialului supus acestei acțiuni.
Profilaxie
Prevenirea apariției bolii se face prin respectarea principiilor enunțate la capitolul I.5.
II.2.2. Loca europeană
European Foulbrood (EFB)
loca benignă,
loca urât mirositoare
Este o boală infectocontagioasă, sporadico-endemică a puietului de albine, caracterizată prin modificări de poziție, culoare, consistență și miros, precum și de slăbirea coloniei de albine și mortalitate .
Istoric, răspândire geografică și importanță economică
Prima descriere a agentului etiologic principal al bolii a fost făcută de White în intervalul anilor 1912 – 1920. Apoi, au existat o multitudine de controverse legate de importanța bacteriilor implicate în etiologia bolii, pentru ca în anul 1957, Bailey să stabilească că Melissococcus plutonius este agentul etiologic principal, iar celelalte bacterii au rol secundar în declanșarea afecțiunii.
Loca europeană a fost diagnosticată în toate țările crescatoare de albine, excepție făcând Noua Zeelandă. Afectează Apis mellifera, iar în India sau Japonia și Apis cerana.
Pagubele economice sunt determinate de moartea puietului de albină în lunile mai – iunie și consecutiv, reducerea numărului de indivizi în colonie, consecința fiind producții slabe de miere, ceară etc.
Etiopatogenie
Etiologia în loca europenă a fost mult discutată, considerându-se, totuși, în ultimii ani, că agentul etiologic este reprezentat de Melisococcus plutonius ( Bacilul pluton , Streptococcus pluton ) (fig. II.2.1., II.2.2.).
Genul Melisococcus a fost creat de Bailey și Collins (1982) pe baza analizei secvențelor 16SARNr, rezultând că grupurile acestui gen sunt filogenetic mai apropiate de genul Enterococcus, însă patogenitatea este diferită, astfel că s-a considerat că este oportună crearea unui gen propriu, cu o singură specie, respectiv Melisococcus plutonius (42, 28). Este un germen sub formă de coci lanceolați, cu dimensiunile de 1/0,5-0,7µm , dispuși izolați , perechi , lanțuri scurte sau filamente sub forma unor mărgele dintr-un rozariu (40), imobil, nesporulat, Gram – pozitiv, labil. Posedă antigene D-Lancefield (28). Se cultivă pe medii speciale cu cisteină, cistină, cartof, extract de larve de albine, în condiții de microaerofilie (5% CO2) la 340C, pH 6,6 -6,8. Pe mediul cu cartof (Alexandrova) după 24 de ore în aerobioză, formează colonii punctiforme și transparente, care devin albe și opace (26). Bailey propune mai multe medii cu geloză, amidon, glucoză, extract de drojdie, pe care coloniile sunt albe sau translucide, netede sau granulare și cu centru mai dens (5). M. plutonius nu fermentează glucidele și nu lichefiază gelatina. Rezistă în suspensie apoasă, la temperatura camerei, 7-10 zile, în siropul de zahăr 16-20 de zile, iar în cadavrele larvelor 5 luni, pe când în cele uscate până la un an (26).
În Japonia s-au izolat, încă din 1980, din focarele de loca europeană, din larvele bolnave, tulpini de M. plutonius –like, cu caractere morfofiziologice similare cu M. plutonius , dar cu poziție taxonomică incertă. Prin testul PCR s-a confirmat apartenența acestor tulpini la specia M. plutonius, cu care sunt identice din punct de vedere taxonomic. Deoarece M. plutonius cuprinde tulpini tipice și atipice, aceste tulpini de M. plutonius-like, cu unele caracteristici fenotipice și genotipice distincte, au fost incluse în grupa tulpinilor atipice de M. plutonius. Acestea își mențin virulența și ,,în vitroˮ, pretându-se la efectuarea infecției experimetale pe larve (42).
Loca europeană este cauzată de M. plutonius, alături de care intervin și alți agenți
secundari, microfloră de asociație, în principal Paenibacillus alvei, Achromobacter ( Bacterium ) euridice și Bacillus laterosporus (40), fără a avea vreun rol în etiologia bolii, aceștia fiind responsabili de unele simptome secundare din loca europenă, cum sunt mirosul și consistența larvelor moarte (26).
Fig.II.2.1.: P. alvei și M. plutonius (40) Fig. II.2.2. : Melissococcus
plutonius (40)
Bacteriile cu rol secundar în loca europeană sunt (26) :
Lactobacillus eurydice (Achrombacter eurydice , Bacterium eurydice ) frecvent întâlnit în tubul digestiv al albinelor și în intestinul mijlociu al larvelor, mai ales al celor infectate cu M. plutonius. Este o bacterie sub formă de bastonaș, iar în culturi este pleomorf, uneori sub formă de streptococi, izolată sau în perechi, de 1,2-1,5 µm, nesporulată, imobilă , Gram pozitivă, uneori Gram variabilă în mediile de cultură, posibil a se confunda cu alte bacterii. Este anaerob și facultativ aerob, cultivându-se pe medii obișnuite, la pH 6,8, chiar la temperatura camerei. Pe mediile solide formează colonii cu diametrul de 1-2 mm, netede, strălucitoare, albăstrui. În bulion formează un depozit vâscos. Fermentează glucoza și fructoza, fără a modifica laptele și gelatina (26). Lactobacillus eurydice este un comensal al albinelor în tubul digestiv, la adulte și larvele sănătoase, unde vara se multiplică intens. În polenul proaspăt se conservă numai câteva zile pe când extractul apos de polen este favorabil dezvoltării.
Paenibacillus alvei (Bacillus alvei), a fost considerat în trecut principalul agent etiologic al locei europene, el fiind în realitate doar un germen din cadrul microflorei de asociație a acestei boli. Este un bacil cu dimensiunile de 1,2-5/0,5 -0,8 µm, sporulat cu sporul oval și dispus central sau subterminal, fără să posede cristale parasporale, deformând celula vegetativă. În infecțiile recente se găsesc formele vegetative, pe când în cele vechi se evidențiază în larve numai spori atașați de bacili cu aspect de cometă, iar alteori unul lângă altul, amintind de aspectul de palisadă. Este Gram – pozitiv, frecvent Gram variabil, mobil, aero-anaerob, cultivându-se pe medii obișnuite. Pe mediile solide, formează colonii mici, netede și translucide, iar în cele lichide, turbiditate, cu o peliculă fină la suprafață care se depune la fundul tubului. Adaosul de lizozim la mediile de cultură este favorabil dezvoltării. Se obțin reacții pozitive la testele catalazei și oxidazei, hidrolizează amidonul, cazeina și gelatina și acidifică fără producere de gaz glucoza, dar nu acidifică arabinoza, manitolul și xiloza, nu asimilează citratul și nu posedă nitrat-reductază, dezaminfenilalanină și nici arginindihidrolază. Se remarcă unele caractere biochimice variabile, cum este descompunerea tirozinei, iar culturale, prin dezvoltarea în prezența a 5% NaCl în mediile de cultură.
Față de factorii fizico-chimici sporii prezintă o mare rezistență, supraviețuind 36 de minute la 100o C; permanganatul de potasiu în concentrație slabă îi distruge în 7 ore, iar 5% după mai mult de o oră (26). În crustele larvelor moarte și deshidratate, sporii P. alvei, împreună cu cei ai P. larvae se conservă mult timp. Uneori, P. alvei se multiplică rapid, sporuleză și în crustă se găsesc numai spori, în cultură pură (2). P. alvei a fost decelat și în prepupele care au murit datorită virusului puietului în sac. Majoritatea tulpinilor sunt mobile, având tendința de a invada mediul solid (fenomenul de roire).
P. alvei este capabil să se dezvolte în larvele moarte, a căror prezență este indicator al bolii în aceste familii de albine, emanând în stup mirosul de putrefacție. P. alvei stimulează, ,,in vitroˮ, producerea toxinei botulimice F, precum și dezvoltarea C. botulinum în miere. Administrarea mierii la copii, contaminată cu C. botulinum, poate cauza botulismul infantil, cu tipurile A, B și C ( 21). Tot la om, P. alvei este considerat responsabil de unele infecții oculare, pulmonare, mai ales la persoanele cu imunodeficiență (11).
Brevibacillus laterosporus (Bacillus laterosporus , Bacillus orpheus ) este un bacil cu dimensiunile de 2,0-2,5/ 0,5-0,8 µm, sporulat, cu sporul de 1,0-1,3/1,2-1,6 µm, de formă asimetrică, excentrică pe o singură latură a celulei bacteriene și cu prezența pe suprafața sporului a unor rugozități, ambele fiind specifice pentru B. laterosporus. Se cultivă pe medii obișnuite în condiții de aerobioză; pe agar formează colonii gri-albăstrui, iar în bulion turbiditate, cu formarea ulterioră a unui depozit pe fundul tubului de cultură. Fermenteză maltoza și levuloza, dar nu și glucoza, arabinoza, lactoza, manitolul și zaharoza, nu produce indol, dar coagulează laptele. Este Gram labil. Elaborează antibiotice, laterosporinele, studiate de Stamatin (1966), fiind folosite la prepararea unor medii selective pentru unele bacterii patogene pentru mamifere și păsări, respectiv Fusobacterium necrophorum și Haemophilus gallinarum și alte bacterii (27). Având o toxicitate redusă, aceste antibiotice ar putea fi folosite și în scop terapeutic .
Paenibacillus apiarius (Bacillus apiarius) este un bacil de 3-5/0,7-0,8 µm, mobil, sporulat, cu sporul de 1,5-2/0,8-1,1 µm, fără corpi parasporali, rectangulari, cu neregularități pe suprafața lor, forma vegetativă rămânând atașată de spor mult timp (11). Este Gram variabil. Se cultivă pe mediile obișnuite la 280 C, dar nu sub 150 C și nici peste 400 C, fiind o bacterie aero-anaerobă; pe agarul TGY formează colonii de 1mm, netede și nepigmentate. Posedă catalază și nitratreductază, dar nu și oxidază. Hidrolizează amidonul, cazeina, tirozina și ureea, asimilează citratul, modifică fără producere de gaz celobioza, glucoza, galactoza, maltoza, molibioza, salicina, zaharoza și trehaloza, pe când manoza și riboza dau reacții pozitive slabe. Testele negative sunt: Voges Proskauer, hidroliza Tween 80, acidifierea arabinozei, levulozei, lactozei, manitolului, ramnozei, sorbitei și xilozei (11).
Enterococcus faecalis (Streptococcus faecalis , Str.apis , Str.liquefaciens) este foarte asemănător cu M. plutonius cu care se poate confunda foarte ușor.
Prezintă caracterele morfo-fiziologice ale genului Enterococcus, cu peste 50 de specii (40).
Genul Enterococcus, desprins din genul Streptococcus, include germeni Gram – pozitivi, nesporulați, necapsulați, sub 0,2 µm, sferici sau ovoidali, cu unele specii mobile, sub formă de lanțuri în mediile lichide, facultativ anaerobi, unele specii cresc în condiții de anaerobioză, iar pe agar cu sânge formează colonii mici de culoare gri, după o incubație la 350 C; sunt halofili, catalazo-negativi sau slab pozitivi, reacționează pozitiv la testul bilă-esculină și hidrolizează esculina, prezentând rezistență la vancomicină. Sunt CAMP negativi și de regulă, nu hidrolizează hipuratul de sodiu.
În cadrul genului se deosebesc: enterococi alfahemolitici, betahemolitici și enterococi nehemolitici. Din ultimul grup face parte E. faecalis care determină cca. 90% din infecțiile cu enterococi, 10% revenindu-le celor alfahemolitici. E. faecalis hidrolizează arginina dar nu amidonul, metabolizează piruvatul, se multiplică la 100 C, și fermenteză manitolul, sorbitolul și lactoza, dar nu sorboza și arabinoza (27). În mediile de cultură cu glucide, elaboreză cantități mari de acizi ajungându-se chiar la pH de 4, cu aparția unui miros de acru, de fermentație, în colonia afectată de locă europeană.
Cât privește patogeneza, în loca europeană, infecția se produce în primele 2 zile după eclozarea larvelor, M. plutonius fiind evidențiat în intestinul mijlociu cu 2-3 zile înainte de apariția semnelor clinice de boală. În intestin, M. plutonius se multiplică intens, aflându-se într-o competiție cu larva gazdă pentru hrană. Larvele infectate, mor în majoritatea lor, iar cele care supraviețuiesc se transformă în pupe, dar sunt sub greutatea normală. În această competiție apetitul larvelor crește iar albinele doici vor elimina aceste larve „polifagiceˮ din stup (40). În aceste condiții, o familie viguroasă care poate elimina larvele infectate, boala nu va afecta clinic și epidemiologic familia. Însă când larvele primesc hrană la limita de subzistență, boala va difuza în toată colonia de albine.
În intestinul mijlociu M. plutonius se găsește, inițial, în spațiul dintre membrana peritrofică și conținutul alimentar, cu 2-3 zile înaintea apariției semnelor clinice, apoi M. plutonius se multiplică rapid, lizează membrana peritrofică și ajunge la epiteliul intestinal (36). Multiplicarea M. plutonius duce la necrobioză și apoi la necroza celulară, din larve rămânând doar resturi amplasate la baza celulei fagurelui, care aderă, mai mult sau mai puțin, la pereții acesteia, iar celulele căpăcite vor servi drept surse de infecție timp de ani de zile. Aceasta pentru că, odată cu cadavrele și detritusul rămas din larvele moarte, eliminate de albine în timpul curățiri stupului, vor fi eliminați un mare număr de germeni patogeni, ocazie cu care albinele lucrătoare se contaminează difuzând boala în colonie sau chiar la alte colonii. Se consideră că există un echilibru între multiplicarea germenului și transmiterea infecției la larvele sănătoase, ca și între numărul de larve bolnave, eliminate de doici și cele care rămân în celule și care vor fi căpăcite, ele fiind o permanentă sursă de infecție, chiar timp de mai mulți ani. Și aceasta deoarece, în timpul unui episod de boală, afecțiunea nu este sesizată de albinele doici datorită unei simptomatologii sărace, mai ales a lipsei simptomelor caracteristice sau patognomonice ale bolii.
Extinderea infecției într-o colonie de albine este influențată și de nivelul acumularii proteinelor din hrană în glandele hipofaringiene ale albinelor doici (40). În coloniile cu infecție experimentală, fără puiet necăpăcit, se observă o rată a infecției peste media constatată, datorită alimentării larvelor rămase, în mod suplimentar, prin îndepărtarea larvelor bolnave (40). Albinele doici îndepărteză din stup mai multe larve bolnave din colonia contaminată de loca europeană, când există puiet necăpăcit, pentru că la acestea, albinele doici, detectează modificările patologice (23). Dar în evoluțiile rapide ale bolii, în coloniile cu modificări patologice ale larvelor, multe dintre acestea mor anterior detectării lor de către albinele doici, fără a putea fi eliminate, acestea constituind, de asemenea, o continuă sursă de infecție, ceea ce face ca loca europenă să devină endemică. Această situație a fost observată în diferite zone de pe Terra, în care culesul nectarului a fost întârziat datorită sezonului ploios. Drept consecință practică, se poate efectua extragerea puietului bolnav, reducându-se astfel sursa de infecție, iar cuplarea aleatorie, cu posibilitatea culegerii unei cantități mari de nectar de către albine, face ca evoluția bolii să fie mult mai ușoară, colonia de albine revenindu-și la starea de sănătate anterioară declanșării bolii. Aceasta va avea loc în prezența unor mătci prolifice, care conferă coloniei de albine rezistență crescută, datorită în primul rând, creșterii numărului de larve eclozate, comparativ cu mătcile mai puțin prolifice, care nu pot compensa pierderile de larve bolnave și eliminate, situație similară cu a familiilor slăbite datorită lipsei de hrană. Totuși, sunt situații când familiile puternic contaminate, chiar într-un an bun, la care este asigurat nectarul la nivelul necesar, numărul de larve moarte să fie foarte mare. Aceasta se explică, printr-o răspândire intensă a bolii de către albinele doici, care se contaminează cu M. plutonius în timpul hrănirii larvelor infectate și a eliminării larvelor bolnave. La albinele doici, M. plutonius este cantonat la nivelul glandelor salivare, boala fiind transmisă prin hrană, restului coloniei (23).
Epidemiologie
În contrast cu zonele din emisfera temperată, cu anotimpuri și cu un cules discontinuu, în zonele fără anotimpuri și, implicit , cu un cules continuu, evoluția bolii în familiile de albine în care dezvoltarea puietului este uniformă tot timpul anului, morbiditatea și mortalitatea sunt mult mai mici, uneori nesesizabile.
Cu toate că astăzi se consideră că agentul etiologic al locei europene este M. plutonius, mai intervin în unele zone, și microflora secundară, care poate influența evoluția și gravitatea infecției.
Loca europeană afectează larvele tinere, necăpăcite și foarte rar pe cele căpăcite.
Sursele de infecție sunt reprezentate de larvele bolnave și cele moarte. În stup, albinele lucrătoare, care elimină larvele bolnave, se contamineză transmițând-o la restul puietului. De asemenea, albinele doici, care hrănesc puietul, atât pe cel bolnav cât și pe cel sănătos (din glandele salivare ale albinelor doici a fost izolat M. plutonius), transmit bacteria celor din urmă. Deoarece M. plutonius a fost izolat și din ovarele mătcilor, apare încă o sursă de infecție, pe cale transovarină, verticală (40).
Loca europeană evoluează, de regulă, primăvara, în luna mai, în perioadele în care scade temperatura atmosferică, iar culesul de nectar și polen lipsește sau este redus, fiind frecvent afectate familiile slabe, cu hrană insuficientă. Boala se manifestă uneori intermitent sau continuu, prelungindu-se până toamna târziu, odată cu încetarea creșterii puietului. În condițiile unui cules abundent asociat cu căldură , în sezonul de vară, evoluția bolii este mai ușoară sau chiar sistează spontan. În urma unui cules deficitar care nu poate asigura nici măcar „rația de întreținereˮ boala poate reapărea (23).
Un rol important, ca rezervor de germeni, îl reprezintă păstura din faguri în care M. plutonius supraviețuiește până la 6 luni (26). De asemenea, în păstură se găsește și Lactobacillus eurydice, care este prezent și în organismul albinelor adulte, aceasta favorizând apariția și evoluția gravă a infecției.
Transmiterea bolii în familiile unei stupine sau între stupine, se poate face și prin roiurile pachet și cele naturale, sau prin mătcile cu origine necunoscută din punct de vedere sanitar- veterinar, la care se adaugă furtișagul la familiile de albine slăbite din diferite cauze, prin trântori, diferiți paraziți sau prădători, inventar apicol adus din stupine contaminate, ca și prin produsele apicole sau stupăritul pastoral. Apicultorii au un rol important în transmiterea bolii, prin nerespectarea regulilor de igienă, mai ales spălatul mâinilor și a echipamentului de protecție.
Având în vedere specificul biologiei albinei, evoluția în loca europeană, este aproape total dependentă de clima regiunii respective.
În stupinele în care boala evoluează endemic, situate în zone cu primăveri umede și reci și cu dificultăți mari privind culesul de nectar și de polen, boala ia o mare extindere chiar epidemică, cu un număr mare de familii afectate și cu evoluție severă. Evoluția ușoară, benignă, a bolii, apare în golurile de cules, cu pierderi mari în familiile slabe. În coloniile de albine puternice, cu mătci tinere și prolifice, boala devine subclinică, cu morbiditate și mortalitate foarte mică, iar producția stupului este bună, astfel că boala practic nu evoluează. Poate, însă, să reapară când, după un cules bun, culesul principal, nu mai este asigurat unul de întreținere.
În coloniile contaminate, cu evoluția bolii sub aspect endemic, înainte de apariția episoadelor de locă, din primăvară, există un echilibru între multiplicarea lui M. plutonius și difuzarea lui odată cu eliminarea larvelor infectate. Când, datorită vremii nefavorabile, se întrerupe culesul, M. plutonius se multiplică intens în larve și astfel apar simptomele de boală sau, datorită alimentației abundente din perioada anterioară, loca europeană, evoluează asimptomatic. În timpul culesului principal, albinele culegătoare fiind în număr redus, sunt angrenate în aprovizionarea cu polen și nectar și albinele doici, astfel că larvele deja infectate vor muri fără să fi fost detectate „ ante mortemˮ și eliminate , mărind astfel , și cantitativ , nu numai calitativ ( virulența tulpinilor de M. plutonius ) sursa de infecție, odată cu rămânerea acestor larve care conțin un număr considerabil de M. plutonius; apare astfel, din punct de vedere epidemiologic, un focar tipic de boală (39). Neeliminarea acestor larve, la timp, eficient, datorită nedetectării lor de albinele doici, permite bacteriei M. plutonius să se multiplice intens în larve și să fie eliminat prin fecale. Deoarece unele larve supraviețuiesc transformându-se în nimfe, agentul patogen va fi eliminat permanent cu excrementele care aderă de pereții celulelor, unde poate rămâne viabil ani de zile. Aceste nimfe rezultate din larve infectate, la rândul lor, sunt subdezvoltate, iar învelișul protector ( gogoașa de mătase ) din jurul larvei, țesut de larvele sănătoase, lipsește, perioadă care coincide cu eliminarea intensă a M. plutonius prin excretă (23).
Loca europeană, în funcție de aprovizionarea cu hrană, poate să apară sub o formă severă și poate să dispară spontan.
În unele țări, cum este Marea Britanie, loca europeană evoluează enzootic, fiind endemică în unele zone (38). În Elveția, incidența bolii a crescut în ultimii ani; evidențierea genomului M. plutonius prin tehnica moleculară, la albinele din stupinele contaminate, a scos în evidență faptul că 90% dintre ele erau purtătoare ale bacteriei; la albinele aparent sănătoase din stupine necontaminate, din vecinătatea celor contaminate, au fost găsite purtătoare 30%, iar la albinele din stupinele la depărtare de cele contaminate, portajul a fost 0% (40).
Simptomatologie
În funcție de patogenitatea M. plutonius și intervenția microflorei secundare, loca europenă cunoaște 4 căi evolutive (23):
Larvele afectate sunt detectate de albinele doici înainte de căpăcire, fiind eliminate din familie. Larvele sunt infectate cu M.plutonius singur sau este germenul dominant în asociația bacteriană.
Larvele mor înainte de căpăcire și înainte de a fi eliminate de albinele doici, infecția cu M. plutonius este severă și microflora secundară reprezentată de L.eurydice , P. alvei și E. faecalis se dezvoltă rapid, uneori intervind și B. laterosporus sau/și P. apiarius.
Larvele afectate sunt căpăcite, se transformă în pupe și își golesc intestinul de conținut. Când este prezent P. alvei se multiplică în conținutul care a mai rămas și este evidențiat aproape în stare pură, la examenul bacterioscopic, al crustelor din celule.
Larvele infectate se împupează, rezultând albine subdezvoltate sau uneori albine adulte normale, care părăsesc celulele cu detritusuri și fecale contaminate cu M. plutonius și cu microfloră secundară.
În faza incipientă a bolii când mătcile reușesc să înlocuiască larvele bonave eliminate de albinele lucrătoare, iar puietul este depus uniform în faguri, boala este nesesizată. Doar după un timp se depopulează familia și se percepe mirosul străin, de acru sau de putrefacție, care amintește de mirosul peștelui alterat (40). Larvele infectate supraviețuiesc, uneori, și se împupează. Caracteristic este, afectarea numai a puietului necăpăcit, larvele de 3-4 zile care mor înainte de căpăcire. Foarte rar se înregistrează boala și la larvele peste această vârstă, la puietul căpăcit. Depunerea puietului începe să fie neuniformă „puiet împrăștiat „ aspect datorat depunerii de ouă mai târziu în celulele cu puiet bolnav din care a fost eliminat de către albine, apărând astfel un decalaj de vârstă a larvelor.
Larvele care supraviețuiesc și se metamorfozează în nimfe, elimină M. plutonius odată cu fecalele, care se depun pe pereții celulelor unde poate persista luni de zile (39). Nimfele infectate sunt, la rândul lor subponderale, posedă glande sericigene puțin dezvoltate, iar învelișul protector este slab format, cu coconi incompleți, favorizând eliminarea M. plutonius. De asemenea, albinele care rezultă, în ciclul metamorfozei, sunt subdezvoltate și au o durată de viață mai mică.
În familia contaminată, albinele adulte devin mai puțin active, chiar dacă în zonă este un cules bun de nectar și polen.
Larvele bolnave devin mai transparente, învelișul extern devine transparent încât se pot observa sistemul traheal și tubul digestiv (fig II.2.3. a și b). Apoi , corpul larvei își accentuează segmentarea, pierzându-și turgescența și devine flasc. Consecutiv mișcărilor agonice, larva își schimbă poziția în celulă, se răsucește și prezintă partea dorsală sau ventrală spre deschiderea celulei.
Într-o fază mai avansată a bolii, larvele bolnave sau moarte își schimbă culoarea și mirosul. Din alb sidefiu, cum este în stare normală, culoarea devine galbenă, apoi castanie după care se înnegrește. Urmare dezagregării cadavrelor, apar mirosuri străine cu mare semnificație diagnostică, în funcție de complexul etiologic, de bacteria care predomină. P.alvei imprimă mirosul de putrefacție, iar E.faecalis sau L. eurydice, determină apariția mirosului acru.
Uneori larvele moarte sunt de culoare neagră, fără miros, și cu un conținut mucos. În cazul când larvele sunt în celule căpăcite, sunt de culoare cenușie, de consistență moale și fără miros sau în alte cazuri, larvele sunt de culoare castanie, aflate în celule căpăcite, au o consistență păstoasă și chiar filantă, mirosul este neplăcut, dezagreabil, câteodată cu căpăcelele excavate, perforate, de culoare închisă, formă care se poate confunda cu loca americană (23).
În acest proces de descompunere al larvelor, cuticula rezistă un timp și menține în interior conținutul care se dezintegrează, transformându-se între-o masă lichidă sau vâscoasă castanie. Corpul larvei devine moale, se deshidratează, rămânând doar o coajă cenușie sau brună, pe peretele interior al celulelor, care se detașează ușor.
Loca europeană poate evolua și atipic ( 23 ) caracterizându-se prin trei tipuri evolutive :
afectarea larvelor foarte tinere, cu moartea lor înainte de căpăcire, de culoare neagră, fără miros, cu aspect mucos, iar la extragerea larvelor moarte filamentul este scurt, sub cca. 1,5 cm, formă evolutivă care se poate prezenta ca infecție asociată cu loca europeană clasică;
larvele afectate sunt în celule căpăcite, de culoare cenușie, de consistență moale, fără miros, iar crustele nu aderă la pereții celulelor;
larvele infectate sunt în celulele căpăcite de culoare castanie, conținutul este păstos sau vâscos și filant. În funcție de microflora de asociație existentă, mirosul dezagreabil poate fi prezent, cel mai adesea acru, sau lipsește. Căpăcelele celulelor pot fi excavate, perforate și de culoare mai închisă, formă evolutivă care se poate confunda cu loca americană.
Tot o formă atipică de loca europeană este și așa-numita „ paraloca”, când este afectat puietul, înainte și după căpăcire. Simptomatologia la puietul necăpăcit este similară cu cea din loca europeană, iar a celui căpăcit consistența larvelor devine vâscoasă, are miros de putrefacție și culoarea devine gălbuie sau brun-roșietică.
Modificari anatomopatologice
Aspectul fagurelui cu puiet, la declanșarea bolii, este nemodificat. Ulterior, puietul este dispus neuniform (,,puiet împrăștiatˮ). Aceasta deoarece matca depune ouale mai târziu în celulele în care au fost larve bolnave sau moarte, după ce acestea au fost curățate de albinele lucrătoare.
Inițial, larvele bolnave devin mai transparente, turgescente, prin traversul tegumentului fiind vizibile traheele și tubul digestiv (fig. II.2.3., a și b). Apoi, corpul își pierde turgescența, devine flasc și se încrețește. Datorită mișcărilor agonice, larvele infectate se răsucesc în celulă. Culoarea lor se schimbă din alb-sidefiu în galben, apoi galben-cafeniu, în final culoarea devenind maro închis, chiar negricioasă. În situația în care larvele bolnave supraviețuiesc fazei de larvă rasucită, cu puțin timp înainte de a-și țese coconul, intestinul mijlociu se deschide în intestinul posterior (24). În acest caz, larva elimină excremente care sunt depuse pe fața interioară a căpăcelului celulei, vizibile ca o pată neagră strălucitoare. Mucoasa tubului digestiv este acoperită de un material cretaceu, cu aspect mat (40).
Fig. II.2.3. a, b.: Larve afectate de locă europeană: traheele vizibile datorită transparenței cuticulei (40)
Fig. II.2.4 : Locă europeană (40) Fig. II.2.5: Locă americană (40)
In procesul descompunerii, larva, de regulă, nu se transformă într-o masă filantă, vâscoasă, aderentă la pereții celulei (fig. II.2.4.). Prin dezhidratare, corpul larvei se transformă într-o coajă cenușie sau brună, ușor detașabilă.
Diagnostic, diagnostic diferențial
Se stabilește pe baza investigațiilor epidemiologice, morfoclinice, iar diagnosticul de certitudine este pus prin examen de laborator.
Epidemiologic, loca europeană evoluează din primăvară până în toamnă, la puietul necăpăcit, iar gravitatea bolii este influențată de unii factori de mediu.
Clinic și morfopatologic, se remarcă fagurii cu aspect de „puiet împrăștiatˮ, iar larvele prin modificări de culoare ale tegumentului, de consistență, care din turgescente devin păstoase, dar nefilante, neaderente și cu miros de acru, aromat și mai rar de putrefacție.
La examenul bacterioscopic se evidențiază, în detritusul larvelor moarte, M. plutonius, uneori și microfloră de asociație. În cadavrele larvelor infectate recent, se pot observa numai M. plutonius și L. eurydice.
Examenul bacteriologic constă în efectuarea de culturi pe medii adecvate, izolarea speciilor bacteriene și identificarea lor prin teste biochimice (17).
În ultimul timp, pentru diagnostic se mai folosesc metode imunologice, ca ELISA (2), sau de biologie moleculară (PCR) (9), tehnici mult mai sensibile decât examenul bacteriologic. Au avantajul că se poate demonstra prezența M. plutonius în familiile indemne de boală, antigenul fiind reprezentat de larve și albine aparent sănătoase din familia cercetată.
Diagnosticul diferențial se face, mai ales, față de loca americană, caracterizată prin: mirosul de clei încins de tâmplărie, la deschiderea stupului, moartea larvelor după căpăcire, consistența vâscoasă și filantă a larvelor moarte, cu filamentul de cca. 3 cm lungime, prezența crustelor și butonilor cefalici în cazurile vechi, precum și prin aderența larvelor moarte la pereții celulelor.
Prognostic
În familiile de albine viguroase, cu forme ușoare de boală și cu intervenție terapeutică precoce, la primele simptome, prognosticul este favorabil. Este însă nefavorabil pentru familiile slabe, cu posibilități reduse de aprovizionare, cu nectar și polen, datorită vremii nefavorabile.
Tratament
Dacă se optează pentru medicația curativă, antibioticele sunt cele mai active bactericide și fac parte din grupa teramicinei. Doza și intervalul de administrare indicate, diferă de la autor la autor, însă nu este recomandată folosirea preventivă a antibioticelor în coloniile fără simptome, nici chiar în stupinele contaminate, deoarece apare antibiorezistența și reziduuri de antibiotic în miere și polen.
Cronologia acțiunilor într-o stupină contaminată (22) începe cu verificarea familiilor existente și identificarea celor bolnave sau slabe și a fagurilor cu puiet bolnav care sunt distruse, se unesc familiile slabe, dar sănătoase, se introduce în hrana albinelor teramicină în sirop de zahăr sau pudră de zahăr, la interval de 7 zile și se înlocuiesc mătcile. Familiile de albine bolnave vor fi mutate în stupi dezinfectați după dispariția semnelor de boală, iar stupii contaminați și inventarul apicol vor fi dezinfectați după mutarea familiilor. În final, se execută dezinfecția profilactică a tuturor stupilor înainte de efectuarea lucrărilor pentru iernare.
În loca europeană, măsurile luate sunt mai puțin drastice. Totuși, și în această boală este necesară evaluarea intervenției terapeutice prin cost/beneficiu. Distrugerea familiilor și a inventarului contaminate este indicată doar în cazurile foarte grave (boala afectează o mare parte din coloniile de albine din stupină) (23).
Profilaxia
Măsurile de prevenire sunt identice cu cele din loca americană.
Combatere
Ca și în loca americană, coloniile de albine afectate de locă europeană trebuiesc incinerate, dacă există pericolul declanșării unei epidemii. Este cea mai bună metodă de combatere a bolii, utilizată și în alte țări (Elveția, Marea Britanie). De altfel, în multe țări din lume, medicația curativă, dar mai ales preventivă este interzisă (40).
oOo
În afară de agenții etiologici ai locilor europenă și americană, aparatul digestiv al albinelor este populat cu o multitudine de bacterii și protozoare, cele mai multe, nepatogene. Aceste microorganisme sunt întâlnite atât în zona pilorică cât și în cea caudală a intestinului posterior, creșterea și dezvoltarea lor făcându-se la suprafața epiteliului.
În această populație se află și bacterii condiționat patogene, care sub influența unor factori favorizanți cerințelor lor de dezvoltare și defavorabili albinelor, penetrează peretele intestinal, pătrund în hemolimfă și determină îmbolnăvirea acestora. În acest sens, au fost semnalate o serie de afecțiuni a coloniilor de albine, în mai multe continente, determinate de Pseudomonas (Bacillus) apisepticus, Hafnia alvei, Spiroplasma spp. (S. apis și S. melliferum), precum și de micoplasme, rickettsii sau chlamidii.
II.2.2. Spiroplasmoza
Este o boală infecțioasă a albinelor adulte, sporadico-endemică, produsă de Spiroplasma apis și Spiroplasma melliferum și caracterizată printr-o simptomatologie nespecifică (imposibilitatea de zbor, mărirea în volum a abdomenului, scăderea producției de miere etc.).
Istoric, răspândire și importanță economică
În 1972, Davis descrie prezența spiroplasmelor ca parazite la unele plante de cultură, iar în 1977, Clark semnalează, în SUA, infecții cu spiroplasme la albinele adulte și la trântori, denumind agentul etiologic Spiroplasma melliferum. În 1983, Mouches descrie „boala de maiˮ, în Franța, la albinele adulte, agentul etiologic fiind Spiroplasma apis. Pe lângă SUA și Franța, spiroplasmoza a mai fost descrisă și în Brazilia.
În coloniile afectate produce pierderi atât prin mortalitate cât și prin scăderea producției de miere.
Etiopatogenie
Boala este determinată de germeni din genul Spiroplasma (S. apis , S. melliferum ) din familia Spiroplasmataceae, ordinul Mycoplasmatales, clasa Mollicutes. Bacteriile din această clasă se caracterizează prin absența peretelui celular, învelișul exterior fiind moale și elastic (lat. mollis =moale, elastic, cutis=piele, înveliș ) și drept consecință, sunt pleomorfe. Dintre bacterii, cele din clasa Molicuttes sunt cele mai mici microorganisme, de cca. 0,2 µm și se pot cultiva ,,in vitroˮ pe medii acelulare (28).
Genul Spiroplasma cuprinde 38 specii (41) și au o morfologie helicoildală, frecvent sub formă de filamente, cu dimensiunile de 0,7/ 1,2 µm și lungimea până la 10 µm, iar formele sferice cu diametrul de 0,3-0,8 µm. Posedă o membrană citoplasmică proteică (spiralin). Celula bacteriană este similară unui tub membranar, cu diametrul de 0,25 µm, cu citoschelet de forma unui șnur plat, compus din 7 perechi de fibrile paralele, o fibrilă având lățimea de 50 Å. Sunt mobile, cu o mobilitate prin rotație și chimiotactism, în care un rol principal îl are citoscheletul din interiorul celulei bacteriene, propulsată după modelul motorului liniar, iar în mediile vâscoase, înaintează după modelul tirbușonului (20).
Pentru multiplicare, majoritatea tulpinelor de spiroplasme au nevoie de prezența, în mediile de cultură, a acidului oleic, de albumină serică bovină și mai ales de colesterol (20). Sunt germeni aerobi-anaerobi facultativi, se dezvoltă la temperaturi de 20-370C, cu optimum 30-370C. Pe mediile solide formează colonii difuze, cu margini neregulate, cu diametrul de 0,4-4 mm, uneori cu prezența de colonii satelite, iar în mediile lichide determină turbiditate.
Dintre caracterele biochimice se remarcă fermentarea glucozei și manozei, hidroliza argininei, dar nu și a ureei și a esculinei. Posedă genele pentru transfomarea glucozo-6-fosfat în piruvat, care poate fi utilizat pentru producerea cisteinei.
Majoritatea spiroplasmelor sunt în relații ecologice de comensalism, mutualism, cu artropodele și plantele și numai un mic procent sunt patogene pentru acestea. În relație de comensalism, față de artropode, se găsesc mai ales în intestin și în hemolimfă, mai puțin frecvent în diferite organe, printre care și glandele salivare (33) ale unor specii de himenoptere, lepidoptere, hemiptere și coleoptere, la care se adaugă unele ixodide, cu posibilitatea de transmiterea transovariană (28, 27). Recent s-au identificat, ca purtători de spiroplasme și unii bondari, din genul Bombus ( B. pratorum-S.apis , B.pratorum ,B. pascuorum-S.melliferum ) (41).
Referitor la relațiile ecologice dintre spiroplasme și albine, se face remarca următoare: spiroplasmele, ca simbionți (mutuali, comensali) facultativi, nu fac parte din microbiota albinei (3).
Spiroplasmele sunt sensibile la tetraciclină și aminoglicozide (negamicină, kanamicină, gentamicină) și rezistente la penicilină, higromicină, kasugamicină și spectinamicină (40).
Serologic, cele două specii, S.apis și S.melliferum, diferă, după cum sunt diferențe între tulpinele aceleași specii izolate de la insecte și între tulpinile izolate de la plante. Tupinile speciei S. apis au unele similitudini cu serogrupul IV de spiroplasme, care grupează tulpini de la plante și de la unele insecte (21).
De-a lungul timpului s-au observat îmbolnăviri și mortalitate determinate de spiroplasme, cum sunt, boala tremurătoare a crabilor (Eriocheir sinensis), sau boala letargică a cărăbușului (Melolontha melolontha), ca și tulburări de reproducere la unele artropode (3).
Cu toate că încă nu s-au pus în evidență, la S.apis și S. melliferum, factorii de virulență, de adeziune și de invazie, aceștia au fost decelați la alte specii de spiroplasme și care pot fi extrapolate la aceste două specii care afectează albinele (3).
Fig. II.2.5. Spiroplasma melliferum (44)
Modalitatea activării răspunsului imun al albinelor la invazia directă a acestor spiroplasme este insuficient cunoscută, dar cercetările făcute cu Drosophila, sugerează că spiroplasmele nu declanșează o reacție imună directă și imediată, însă slăbesc intensitatea acestui răspuns, determinând creșterea susceptibilității gazdei față de diverși agenți microbieni, inclusiv față de spiroplasme. Aceasta se poate datora și intervenției diferiților paraziți , cum sunt cei din genurile Nosema, Varroa etc. Spiroplasmele pătrund în organismul albinelor pe cale digestivă, ajung în intestin și apoi în hemolimfă și diferite organe, unde cauzează diferite modificări, precum și tulburări generale ale organismului, consecința acestor procese patologice fiind reducerea longevității albinelor adulte (3).
În organismul albinei, spiroplasmele pot supraviețui un timp, atât intracelular cât și la nivelul porții de intrare, dar și sistemic, în diferite țesuturi. În hemolimfă, multiplicarea este masivă, uneori până la 1011/ ml, înainte de moartea albinei-gazdă (3).
Faptul că s-au obținut rezultate pozitive la testul PCR pentru Spiroplasma mirum, la probele de creier de la om, ca și pentru Spiroplasma-like, izolată din exudatele oculare a copiilor nou-născuți, prematuri, cu cataractă, ridică problema posibilei patogenități a acestor spiroplasme și pentru mamifere, inclusiv pentru om (20, 28).
Epidemiologie
Boala afectează albinele adulte din genul Apis , cu precădere Apis mellifera, începând din primăvară până în toamnă și se menține de la an la an, în toate sezoanele, mai fecvent în perioada înfloririi plantelor, motiv pentru care se consideră că acestea reprezintă rezervorul de infecție pentru albine, ele fiind „vizitateˮ din primăvară până toamna; printre aceste plante, sunt menționate cele din familiile Magnoliaceae și Asteraceae (21).
Artropodele, care reprezintă gazda naturală a spiroplasmelor, au rol dublu:
de vectori pasivi, cel mai frecvent, dar și de,
vectori activi, când se infectează, prezentând chiar forme clinice.
În această situație este amplificată sursa de infecție, care se adaugă la cea deja existentă pe plante, crescând totodată pericolul pentru albinele care vor culege nectarul contaminat, de pe plantele vizitate și de artropodele vectori pasivi sau activi.
Pe lângă artropodele de la care s-au izolat mai frecvent spiroplasme, acestea au fost semnalate și la alte himenoptere din genul Andrena și Anthophora sau ale genurilor Bombus (B.impatiens, B.pensylvanicus) și Osmia (O.cornifrons) (3), precum și la unele lepidoptere din familia Asilidae și Papilionoidea (3).
Atât difuzarea cât și persistența spiroplasmelor în diferite gazde, prezintă variații mari, influențate de diferiți factori, cei mai importanți fiind cei climaterici, care influențează vegetația, în general, și implicit înflorirea plantelor, din care albinele culeg nectarul. Acestea pot fi contaminate cu diferiți microbi, inclusiv cu spiroplasme. Albinele se infectează deja începând de primăvara timpuriu (6) și continuă până toamna, în funcție de prezența plantelor înflorite. Nu se cunoaște unde rămân spiroplasmele, în stare dormindă, pe timpul iernii (3).
Prin cercetări epidemiologice, inclusiv cu tehnica moleculară de diagnostic, timp de mai mulți ani, în SUA și Brazilia, pe 755 probe, în perioada 2011-2013, a rezultat o contaminare a familiilor de albine de 33% și respectiv 54%, specia S. apis fiind predominantă. În majoritatea focarelor de spiroplasmoză au fost izolate ambele specii de spiroplasme, fiind deci o infecție mixtă.
Simptomatologie și modificări morfopatologice
Primele simptome constatate în coloniile afectate sunt tulburările de zbor până la incapacitatea de a zbura, mersul se transformă într-o târâre a corpului și apar tremurături. Frecvent se formează mici grupuri care pleacă la distanță unde mor (21). Examenul bacteriologic relevă bacteriile implicate, respectiv S. apis și S. melliferum. La examinarea stupilor se observă sute de albine moarte într-un timp scurt, de câteva zile, uneori putând muri întreaga colonie. La simptomatologia dată de S. apis, în Franța, se menționează, în plus, mișcări dezordonate periodice și mărirea în volum a abdomenului (11), uneori constatându-se autovindecarea spontană a familiei infectate (2). Producția de miere poate scădea cu peste 25% la infecțiile cu S.apis (2).
Diagnostic
Tabloul morfoclinic fiind necaracteristic, pentru diagnostic se va recurge la efectuarea examenului de laborator, respectiv examen bacterioscopic și cultural. Însă, având în vedere că unele tulpini de spiroplasme sunt greu cultivabile, metoda recomandată pentru diagnosticul spiroplasmozei albinelor este testul PCR, rapid sensibil și specific, dar, deocamdată, greu accesibil pentru unele laboratoare de diagnostic, prin costul ridicat (7).
Prognostic
Este rezervat, în funcție de virulența tulpinilor de spiroplasme și vigurozitatea coloniilor de albine.
Tratament
Se poate interveni cu un antibiotic eficient, conform antibiogramei, administrat în sirop cu zahăr (27), numai în cazuri excepționale, în funcție de situația clinico-epidemiologică.
Profilaxie și combatere
Deoarece spiroplasmoza este puțin cunoscută și fiind o boală emergentă pentru Europa, la diagnosticarea acestei boli, se vor aplica măsurile generale de profilaxie și combatere.
II.2.4. Septicemia
Este o boală infecțioasă, produsă de Pseudomonas aeruginosa, afectează albinele adulte și are evoluție sporadică, condiționată de factorii de mediu și caracterizată printr-o mare fragilitate a articulațiilor.
Istoric, răspândire și importanță
În 1928, Burnside identifică, la albinele bolnave, un germen pe care-l denumește Bacillus apisepticus, izolat și de Boiko în URSS în 1935, de Kirkor în Franța (1942) și de Kirkor și colab. în Polonia, în 1947. Landerkin și Katznelson în 1959 reclasifică B. apisepticus numindu-l, Pseodomonas apiseptica, considerată astăzi bacterie sinonimă cu Pseudomonas aeruginosa.
Boala este cunoscută în toate țările unde se cresc albine. Are o importanță economică redusă și o răspândire limitată.
Etiopatogenie
Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas pyocyanea, bacilul piocianic, bacilul puroiului albastru) este un germen Gram negativ, de tip bacilar, cu dimensiunile de 1,5-3/ 0,5-0,8 µm, mobil, majoritatea tulpinilor fiind necapsulate și nesporulate.
Ps. aeruginosa, încadrat în genul Pseudomonas, familia Pseudomonadaceae, formează în cadrul genului, grupul pseudomonadelor fluorescente, împreună cu Ps. fluorescens și Ps. putida. (30). Pentru patologia animală, inclusiv a albinelor, prezintă interes și speciile Ps. alcaligenes și Ps. pseudoalcaligenes, întâlnite, uneori, și în alimente, inclusiv în produsele apicole.
Se cultivă pe medii obișnuite, inclusiv în soluție clorurată izotonică (ser fiziologic), și chiar în apă distilată, deoarece asimilează substanțele organice din atmosferă, putând utilza ca singură sursă de energie și carbon, cca. 76 compuși organici, proprietate care lipsește la alte microorganisme. Se cultivă în condiții aerobe la 5-420 C, având temperatura optimă de 370C. Culturile emană un miros plăcut de floare de tei și produc pigmenți care colorează mediile de cultură și țesuturile animale, în cazul infecțiilor cu acest germen. Principalii pigmenți sunt: piocianina (albastru verzui, caracteristic speciei), pigment care posedă acțiune antagonică față de unele bacterii și miceți, apoi, pioverdina (galben-verde, galben brun), fluoresceina (fluorescentă) care degradându-se ia o culoare brună-roșie, piorubina (eritrina) de culoare roșie, piomelanina (pigmentul brun) etc. Pe mediile solide, formează colonii rotunde, semitrasparente, pigmentate, uneori apar plaje similare cu cele produse de bacteriofagi. În bulion produce o turbiditate intensă, peliculă la suprafață, cu depozit abundent care se omogenizează ușor. De regulă, este hemolitic pe agarul cu sânge.
Germenul este gelatinolitic, coagulează laptele și digeră coagulul format, nu produce indol sau hidrogen sulfurat și nici amoniac, și dă reacții negative ale malonatului, gălbenușului de ou și Voges-Proskauer, iar ale catalazei și citocromoxidazei sunt pozitive. Reduce nitrații și albastrul de metilen.
Bacteriile din genul Pseudomonas sunt aerobe nefermentative, folosind glucidele prin oxidare. Oxidează glucoza și manitolul, dar nu și dulcitolul, adonitolul, inozitolul, zaharoza, fructoza, galactoza, arabinoza, maltoza, glicerolul și sorbitolul (28). Comportarea față de fructoză, manitol și trehaloză distinge șase chimiotipuri la tulpinile izolate de la animale (7).
Ps. alcaligenes este nezaharolitic, hemolitic, iar Ps.pseudoalcaligenes oxidează fructoza, pe când unele tulpini maltoza și xiloza, ambele specii având un singur flagel, față de Ps. fluorescens și Ps. Putida, elaboreză fluoresceină, nu piocianină, se multiplică la 40 C, nu la 420 C, și oxidează glucoza, levuloza, ramnoza, galactoza și manoza, și nu oxidează maltoza și lactoza, doar un număr mic de tulpini, precum și esculina sau amidonul.
Ps.aeruginosa are o diversitate de antigene, cum sunt: antigenele „O” de natură polizaharidică (12 grupe , fără a fi strict legate de specie), antigenele „H” din flageli, de natură proteică, pe baza cărora specia se subdivide în 17 serotipuri. Mai sunt semnalate antigene „R” din coloniile de tip R care dau reacții încrucișate cu alte grupe serologice „O”. Tulpinile de Ps. aeruginosa se înrudesc antigenic cu unele specii bacteriene, Gram pozitive și Gram negative, fiind slab imunogene și slab aglutinogene, nepretându-se la prepararea vaccinurilor. Pentru serotipizare se utilizează seroaglutinarea și seroprecipitarea (28, 27).
Prezintă o mare sensibilitate față de factorii de mediu. Astfel, la 00 C supraviețuiește 200 de zile, la 370 C, 300 de zile, iar în materialele patologice uscate, câteva săptămâni. La 600 C sunt distruși în 15 minute, iar la 550 C în 60 de minute. De asemenea, au efect letal asupra bacteriei, majoritatea antisepticelor și dezinfectantele uzuale, cu excepția bromocetului (18). Prezintă o mare rezistență față de alcool și razele ultraviolete.
Față de unele chimiopreparate (antibiotice, chimioterapice) sunt sensibile, cum sunt: plimixina, colimicina, gentamicina, sulfaguanidina, imipenem, cefalosporine de generația a 3-a, uneori și la ofloxacină, streptomicină, și foarte rar la negamicină și kanamicină. Sunt eficace olaquindoxiul și sulfametoprimul (8, 28). Germenul este rezistent la nitrofuran, furazolidonă și la majoritatea sufamidelor (28, 18).
Observațiile, din ultima perioadă, privind rezistența tot mai ridicată a tulpinilor de Ps. aeruginosa la chimiopreparate, chiar de ultimă generație, inclusiv la imipenem, dovedesc faptul că ne aflăm în fața unui adversar de temut în terapeutica infecțiilor cu această bacterie, la om (31) și la animale. Fiind o bacterie condiționat patogenă (oportunistă) infecțiile apar mai ales la organismele imunodeficitare, om sau animale, ca infecții nosocomiale (de spital), greu de prevenit, dar și mai dificil de tratat.
Ps. aeruginosa este un germen ubicvitar, prezent în sol, apă, aer și în tractul digestiv al omului și animalelor, motiv pentru care a fost încadrat, uneori, în rândul enterobacteriaceelor. Se mai găsește în cadavrele aflate în putrefacție, dar chiar și în soluții medicamentoase, dezinfectante și pe instrumentele medicale și alte diverse obiecte (28). Apariția rezistenței la unele antiseptice și decontaminante și transmiterea acestor tulpini de Ps.aeruginosa la animalele și persoanele sănătoase sau aflate în tratament, care pot ajunge chiar și în coloniile de albine, îngreunează și mai mult acțiunile de prevenire și de combatere a acestei infecții.
În mod frecvent, tulpinile de Ps. aeruginosa sunt parazitate de bacteriofagi (virusuri ale celulelor bacteriene). Prin tipizarea fagică (lizotipie) tulpinile de Ps.aeruginosa au fost încadrate în peste 120 de lizotipuri. Pe lângă piocianază (antibiotic) mai elaborează pyocine (bacteriocine) sau antibiotice cu spectru de acțiune îngust, pe baza cărora se pot încadra tulpinile în piocianotipuri, care împreună cu sero- și lizotipia, sunt utile în anchetele epidemiologice, în vederea stabilirii sursei de infecție (27).
Factorii de virulență ai bacteriei sunt: pilii (structuri proteice ca o perie pe suprafața celulei bacteriene care se observă numai la microscopul electronic, cu lungime de 1-20 µm și 3-14 nanometri diametru), unele polizaharide din mucus, lipidul „A”, lipopolizaharidul (antigenul „O” ), exotoxina „A”, proteaze, lecitinaze, colagenaze, precum și o enterotoxină și o neurotoxină (28, 3). Acești factori de patogenitate acționează local sau sistemic prin lezarea țesuturilor diferitelor organe, precum și prin scăderea capacității imunologice a organismului gazdă (28).
Unele tulpini de Ps. aeruginosa produc N heptil -4-hidroxichinolein-Noxid, care împiedică efectul antibacterian al streptomicinei (27).
Ps. aeruginosa poate exacerba patogenitatea altor germeni din nișa ecologică, evidențiată prin teste ,,in vitroˮ și ,,in vivoˮ sau prin testul ansei intestinale ligaturate (35).
În etiologia septicemiei albinelor au mai fost încriminate și bacteriile Seratia marcenses și Hafnia alvei , ambele transmise de Varroa destructor (14).
Epidemiologie
Septicemia afectează albinele adulte, în tot timpul anului, fiind condiționată de factorii de mediu, climatici, de relief, nefavorabili, cu umiditate crescută, atât în atmosferă cât și în stupi, cu ventilație necorespunzătoare, ploi reci, amplasarea stupinei în zone mlăștinoase, care scad rezistența imunologică a albinelor, în condițiile lipsei de cules, sau în prezența și a altor germeni animați dăunători (23, 2).
Difuzibilitatea bolii în stupină și în zonă este lentă, fiind condiționată de prezența și persistența factorilor favorizanți.
Infectarea albinelor se produce pe cale respiratorie, de unde Ps. aeruginosa trece în hemolimfă și declanșează multiplicarea masivă (septicemie), cu prezența în diferite organe și țesuturi, unde provoacă modificări distrofice ale musculaturii diferitelor regiuni (cap, torace, abdomen, aripi, antene, membre) soldate cu dezarticularea și segmentarea lor.
Simptomatologie și modificări morfopatologice
Albinele afectate devin mai puțin active, chiar în perioada culesului, au dificultăți de zbor, sau sunt în imposibilitatea de a-l efectua. Uneori devin agitate și nu se mai alimentează. Datorită dispariției albinelor adulte, se rupe echilibrul socio-ecologic din colonii și implicit, apar influențe negative asupra producției de miere. Albinele muribunde și cadavrele emană un miros neplăcut, putrid iar hemolimfa capătă un aspect lăptos (23). Septicemia evoluează benign, cu vindecări spontane, când dispar factorii favorizanți, sau aceștia se îmbunătățesc (23).
Caracteristic pentru această boală este fragilitatea cadavrelor de albine care se descompun în părțile componente ( cap, torace, abdomen ), inclusiv aripile, membrele și antenele, la cea mai ușoară mișcare sau chiar la atingerea lor.
Diagnostic
Se stabilește prin coroborarea datelor epidemiologice, morfoclinice și de laborator. Modificările de culoare ale hemolimfei în alb-lăptoasă și fragilitatea cadavrelor, sunt definitorii pentru diagnostic, necesitând totuși confirmare prin examen de laborator. În acest scop se recoltează hemolimfă și se însămânțează pe medii de cultură. Pentru a se evidenția pigmentația tulpinii de Ps. aeruginosa, mediul King este de preferat (1, 3). Tot în scop de diagnostic se poate efectua infecția experimentală prin prepararea unui extract, calculând o albină bolnavă sau suspectă de septicemie pentru 1 ml apă sterilă și se injectează în torace (36). Diagnosticul pozitiv constă în apariția după 24 de ore, a mirosului de putrefacție, iar după 48 de ore cadavrul se dezarticulează (31).
Prognostic
Este favorabil. Înlăturarea factorilor favorizanți duce la ameliorarea stării clinico-epidemiologice.
Tratament
Avându-se în vedere rezistența Ps. aeruginosa la o multitudine de chimiopreparate, și faptul că este o boală condiționată, în care rolul major îl dețin factorii favorizanți, precum și pericolul pentru consumul uman al produselor apicole, se va recurge doar la înlăturarea deficiențelor de igienă, mai ales a celor de microclimat și administrarea de hrănă stimulativă.
II.2.5. Hafnioza
Este o boală infecțioasă care afectează albinele adulte, cu evoluție sporadică și cu tablou morfoclinic necaracteristic, fiind produsă de Hafnia alvei.
Istoric, răspândire și importanță economică
Boala a fost descrisă prima dată de Bahr, în 1919, în Danemarca, care a izolat agentul etiologic de la albinele bolnave și moarte. Hafnia alvei este o bacterie patogenă pentru albine dar nu și pentru șoarece și cobai. A fost denumită inițial Bacillus paratyphi alvei, ale cărei tulpini au fost studiate și caracterizate de Möller (1954 ), acesta considerându-le ca făcând parte din „grupul Hafniaˮ familia Enterobacteriaceae și apreciind că tulpinile lui Bahr reprezintă, de fapt, specia tip a bacteriei Hafnia, astfel că-i propune numele de Hafnia alvei, din cadrul familiei Enterobactericeae (14), această încadrare fiind acceptată în anul 1958. În 1961, Sakazaki încadrează H. alvei în genul Enterobacter cu specia E. hafniae , iar în 1974 o reconsideră ca gen cu o singură specie, respectiv Hafnia alvei (3). În perioada de după anul 1940, H. alvei a purtat numeroase denumiri (Paracolon, Aerobacter, Palacolobactrum aerogenoides, Bacillus cadaveris, grupul Hafnia, Enterobacter alvei, Enterobacter aerogenes) (15) .
Boala a fost diagnosticată în Franța, în anii 1936-1937, iar în 1964 în fosta URSS.
Pierderile cauzate de hafnioză, în forma ușoară de boală, sunt reduse. În schimb, în forma acută, acestea sunt importante, fiind înregistrate, uneori, pierderi de până la 50% din efectivul stupinelor contaminate, episod care a fost consemnat în fosta URSS, în anul 1964 (23).
Etiopatogenie
Agentul etiologic este Hafnia alvei ( Bacillus paratyphi alvei ) din genul Hafnia cu două specii (H. alvei , H. paralvei) (43), care este un cocobacil de 2-5/1,0 µm, mobil constant la temperatura de 220C și mobilitate variabilă la 370C, cu cili dispuși peritrih, Gram – negativ. Este aerob și se cultivă pe mediile uzuale, la pH neutru sau ușor alcalin, la temperatura de 25-300 C chiar și la 370 C, tulpinile fiind mai active la 220 C, uneori fiind nevoie ca unele reacții (MP, VP, beta galactozidază și creșterea pe citrat (Simmons) să fie efectuate la ambele temperaturi, pentru a fi încadrate în genul Hafnia (20, 3). Fermentează glucoza, ramnoza, arabinoza, glicerolul, maltoza, manoza, xiloza, trehaloza, dar nu fermentează lactoza, adonitolul, inozitolul, dulcitolul, manitolul și esculina. Metabolizează citratul (mediul Simmons), RM este negativă la 220 C, pe când zaharoza și malonatul dau reacții variabile, nu lichefiază gelatina, nu coagulează laptele, se dezvoltă pe medii cu KCN, este lizin și ornitin decarboxilază pozitiv și fenil – deaminază și urează negativ, indol și SH2 (TSI) negativ.
Pe agar apar, după 24 ore, colonii mici rotunde, albăstrui și semitrasparente, care după 48 de ore confluează, acoperind toată suprafața mediului, care devine opacă, iar cultura vâscoasă. Centrul coloniilor este castaniu cu suprafața striată. În bulion nutritiv produce turbiditate, iar la suprafață se formează o peliculă de culoare cenușie. Crește pe cartof, pe care formează un strat castaniu (26).
Unele tulpini de H. alvei produc bacteriocine numite alveicine (Wertz și Riley, 2004 , citați de 15).
H. alvei are 68 de antigene ,,Oˮ de grup și 34 antigene ,,Hˮ, iar după examinarea de către Matsumoto a peste 300 de tulpini au fost acceptate 197 de serotipuri ale bacteriei (20, 3).
Pe baza fermentării arabinozei și salicinei precum și hidrolizei esculinei și arbutinei au fost descrise, încă din 1969, două biotipuri. Apoi în urma investigațiilor fenotipice și genotipice au fost identificate patru biotipuri (15). În 1976, Steigerwalt stabilește grupa ADN 1 și grupa ADN 2, utilizând pe lângă testele genomice și unele teste biochimice (15). În momentul de față, se consideră suficiente, pentru identificarea celor patru biogrupe ale speciei H. alvei din grupa ADN 1, utilizarea testelor biochimice pentru fermentarea arabinozei și salicinei, precum și hidroliza esculinei (15).
Aceste determinări servesc în anchetele epidemiologice, la mamifere și albine, pentru stabilirea originei infecției și dinamicii acesteia în zonele contaminate.
Au fost evidențiate înrudiri antigenice între antigenele ,,Oˮ ale tulpinilor de Hafnia alvei, cu cele de la Salmonella spp., E.coli , E.cloacae și Klebsiella spp. (3).
Mecanismul patogenetic, incomplet cunoscut, dar asemănător celui de la E.coli (EPEC), acestea fiind și enteropatogene, este confirmat și prin rezultatul pozitiv la testul ansei intestinale ligaturate (20).
În condiții experimentale, boala poate fi reprodusă la albine și viespi, prin administrarea materialului infectant, per os. În schimb, animalele de laborator, șoarecele, șobolanul, cobaiul, iepurele etc., sunt refractare la infectarea pe cale orală. Inocularea la cobai a tulpinilor de H.alvei determină elaborarea de anticorpi aglutinanți, care dau posibilitatea utilizarii acestora în identificarea tulpinilor izolate (26).
Bacteriile din genul Hafnia, comensale pentru tractul gastrointestinal al omului și animalelor, inclusiv al albinelor, sunt larg răspândite în mediul extern (sol, apă, aer, vegetale), putând constitui surse suplimentare de infecție.
H. alvei este sensibilă la aminoglicozide, carbapenem, chinolone și antifolați (trimetoprim-sulfametoxazol) și rezistentă la penicilină, oxacilină, amoxicilină și acid clavulanic. Sensibilitatea la tetracilină și cefalosporine este variabilă.
Rezistența la factorii de mediu este similară celei a salmonelelor. Dacă în perioada dinainte de 1985, tulpinile de H. alvei erau sensibile la ampicilină, cloranfenicol, colimicină, acid nalidixic și aminoglicozide (3), astăzi multe tulpini sunt rezistente la antibioticele convenționale, inclusiv la cefalosporine (20).
Epidemiologie
Boala evoluează mai ales primăvara, rar și în cursul verii, sporadic sau endemic, în condiții atmosferice neprielnice, cu ploi reci și prelungite, asociate cu perioade de vânt, precum și cu schimbări bruște de temperatură și atunci când acești factori sunt asociați cu familii de albine slăbite și cu sistemul imun prăbușit.
Sursele de infecție primare sunt reprezentate de albinele moarte sau bolnave, iar cele secundare, de întreg inventarul apicol din stupină, precum și sursele de apă sau de polen și nectar. Apicultorii pot disemina Hafnia alvei la alte colonii, atât în interiorul stupinei cât și între stupine, când nu respectă regulile de igienă și de profilaxie generală, mai ales în timpul evoluției bolii. Cu toate că H. alvei este o bacterie comensală, cu habitatul în tubul digestiv al albinelor, în cursul evoluție bolii, unele tulpini aduse din alte colonii sau rezidente în colonia respectivă, își exaltează patogenitatea și declanșează boala. Organismul albinelor posedă o capacitate imunulogică scăzută, de imunodeficiență ( imunodepresie ) dobândită, determinată mai ales de factorii favorizanți. Exacerbarea patogenității tulpinilor de H. alvei poate avea loc și în urma trecerii repetate pe albinele imunosupresate ale aceleiași colonii.
Calea de infecție este cea digestivă, bacteria fiind preluată odată cu nectarul și polenul de pe plante, în timpul culesului, dar și de pe diferite obiecte din colonie și stupină. În colonie și stupină, boala se transmite similar celorlalte bolii ale albinelor adulte: furtișag, trântori, paraziți și dăunători ai albinelor etc.
Simptomatologie și modificări morfopatologice
Hafniza evoluează sub o formă ușoară și una acută, gravă.
În forma ușoară, benignă, simptomatologia este nespecifică, fiind întâlnită și în alte boli ale albinelor. Boala evoluează cu diaree, abdomen balonat și incapacitate de zbor, morbiditatea și mortalitatea fiind reduse.
În forma acută, severă, morbiditatea și mortalitatea sunt ridicate, albine moarte și bolnave fiind observate zilnic, în fața stupului. În familiile afectate, datorită mortalității și scăderii longevității albinelor adulte, apare un dezechilibru între ponderea albinelor adulte și puiet, astfel reducându-se rata de înlocuire a albinelor moarte. Se produce depopularea familiilor de albine afectate (23).
Uneori, când factorii favorizanți, în special cei climatici, sunt favorabili, boala își încetează evoluția (26).
Modificările morfopatologice nu sunt caracteristice.
Diagnostic
Diagnosticul se poate stabili numai prin coroborarea datelor clinico-epidemiologice cu cele de laborator, care asigură certitudinea diagnosticului, prin izolarea și identificarea agentului etiologic. În acest scop se recoltează conținut intestinal și hemolimfă de la albinele bolnave, care se examinează bacterioscopic, apoi se fac însămânțări pe medii de cultură. Cu tulpinile izolate și identificate se poate efectua infecția experimentală pe albine.
Tratament
Ca și în alte boli condiționate ale albinelor, în care rolul major în etiopatogenia acestora îl dețin factorii favorizanți, în primul rând se vor respecta condițiile de igienă și se vor întări familiile de albine. Intervenția curativă, de urgență, cu antibiotice și chimioterapice, se va face numai coroborând, observațiile clinico-epidemiologice cu cele de laborator și după efectuarea antibiogramei. Acestea, datorită instalării antibiorezistenței și pericolului pentru om, al reziduurilor de chimioterapice în miere.
II.2.7. Bibliografie
Alippi A.M. (1992): Characterization of Bacillus larvae White the causative agent of American foulbrood of honey-bees. First record of its occurrence in Argentina. Revista Argentina de Microbiologia, 24(2):67-72;
Bailey Leslie ( 1981 ) ; Patologia albinelor Academic Press , Anglia , traducere Aneta Mardare și Chioveanu IDSA ,București 1993;
Bîlbîe,V., Pozgi,N. (1985 ) ; Bacteriologie medicală .Ed.Medicală București
Chan QWT , Melathopoulos AP , Pernal SF , Fosther IJ ( 2009 ) ; The innate immune and systemic response in honey bees to a bacterial pathogen , P. larvae . BMC Genomics . Vol. 10 pag. 387;
Chirila F, Fit N, Rapuntean S, Nadas G, Nistor AC, 2011. A study regarding the Paenibacillus larvae strains sensitivity isolated from some counties in Transylvania to different antibiotics and vegetal essential oils. Cluj Veterinary Journal, 19(1):60-64;
Clark T. B. , Whitcomb R. F., Tully J. G., Mouches C., Saillard C., Bove J., M .,Wroblewki H., Carle P., Rose D.L., Henegar R. B., Williamson D.L. ( 1985 ) ; Spiroplasma melliferum , a New Species from the Honeybee (Apis mellifera ) Int. J. System. Bacteriol. , p. 296-308;
Cristea ,I. ( 1972 ) : Studiu de laborator referitor la unele caracteristici ale tulpinilor de Pseodomonas aeruginoasa izolate de la animale . Teza de doctorat .F.M.V.București
Cristea ,I., Garoiu, M., Secașiu , V . Coman, E.( 1969 ) : Sensibilitatea la câteva antibiotice uzuale a 155 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa .Rev.Zoot.Med.Vet.Vol.19, ( 6 ) , p.84-87;
Djordjevic S.P., Noone K., Smith L. & Hornitzky M.A.Z. (1998). Development of a semi-nested PCR assay for the specific detection of Melissococcus pluton. J. Apic. Res., 37, 165–174;
Djukic , M. , Brzuszkiewicz Elzieta , Funfhaus , Anne , Voss , J. Gollnow K., Popping Lena , Leisegang H. , Garcia-Gonzales , Eva , Genersch , Elke , Daniel, R. ( 2014 ) ; How to Kill the Honey Bee Larva ; Genomic Potential and Virulence Mechanism of Paeinibacillus larvae . Plos One .Vol.9 , ( 3 ), 1-;
Euzėby,J.P.( 1999 ): Dictionaire de Bactériologie Vétérinaire. cidta.usal.es/…/ euzabey%20S.%20moniliformis…. ;
Fünfhaus A , Ashiralieva A , Boriss R , Genersch E. ( 2009 ) ; Use of suppresion subtractive hybridization to identify genetic differences bettween differentially virulent genotypes of P.larvae , the etiological agent of American foulbrood of honey bees .Environ . Microbiol. Rep.Vol. 1 pag. 240-250;
Gunersch , Elke, Eva Forsgren, Jaana Pentikanen , Ainura Ashralieva , Sandra Rauch , Jochen Kilwinski , Ingemar Fries ( 2006 ) : Reclassification of Paienibacillus larvae subsp.pulvifaciens and Paienibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation .Int.J.Syst.Evol.Microbiol.Vol.56 , 501-511;
Glinski , Z., Jarosz ,J. (1990) ; Seratia marcescens contaminating brood and worker honeybees contaminates the Varra jacobsoni mite . J.Apic. Res. , Vol. 29.pag.107-111.
Janda , J.M. , S.L.Abbott ( 2006 ) : The Genus Hafnia : from Soup to Nuts . Clinical Microbilology Reviews Vol. 19 , (1 ) pag. 1-31;
Lövgren A, Zhang M, Engström A , Dalhammar G, Landen R. (1990 ) ; Molecular charaterization of immune inhibitor A, a secreted virulence proteaze from Bacillus thuringiensis . Mol. Micrrrobiol.Vol.4 pag. 2137-2146
Mardare Aneta , Chioveanu Gabriela (1992 ) : Metode de diagnostic în bolile albinelor și viermilor de mătase , IDSA București ;
Moga –Mânzat, R. ( 2001 ) : Boli infecțioase ale animalelor . Ed. Brumar ,Timișoara .
Morrissey ,B. , Helgason , T. Poppinga , L., Fünfhaus , A., Genersch , E., Budge , E.,( 2015 ) : Biogeography of Paenibacillus larvae , the causative agent of American foulbrood, using a new multilocus sequence typing scheme . Environ .Microbiology , vol.17, ( 4 ) ,1414-1424;
Murray, P.R..Holmes , S.B. Auken ,H.M. –Citrobacter, Enterobacter , Klebsiella and other membresof the Enterobacteriaceae ( 2005 ). In : Toplay and Wilson`s Bacteriology vol.2 . Boriello , S.P. , Murray , P.R. , Funke , G. ( coord. ) , Hodder ASM Press,London ,1493-1506;
Mouches C , Bové JM, Tully JG Rose DL , McCoy RE, Carle-Junca P, Garnier M , Saillard C. ( 1983 ) : Spiroplasma apis , a new species from hte honey-bee Apis mellifera. Ann Microbiol ( Paris ) pag.383-397 ;
Nakamura , L.K. ( 1997 ) : Reclassification of „ Bacillus pulvifaciens „ group II as Brevibacillus agri . , Curr. Microbiol. Vol.34 , ( 4 ) , 233-237
Ogradă , I. (1982 ) ; Bolile și dăunători albinelor . A.C.A. Redacția, publicațiilor apicole, București;
Paul, I. ( 2005 ) : Etiomorfopatologia bacteriozelor la animale. Ed. Pim. Iași;
Piana Mariana , de Brum Thiele F. Boligon Aline A. , de Freitas R. B. , Letícia T. Nunes Mossmann Natalia J., Janovik Vanessa, Isus Roberta S., Vaucher R. A., Santos R. C.V. (2015): In vitro growth-inhibitory effect of Brazilian plants extracts against Paenibacillus larvae and toxicity in bees. Anais da Academia Brasileira de Ciências (2015) 87(2): 1041-1047;
Popa , Al.( 1965 ) ; Bolile albinelor și viermilor de mătase Ed.Agro-Silvică București;
Rădăcănescu H., Bica Popii Valeria (1973) : Bacteriologie veterinară aplicată . Ed. CERES , București , pag. 132 ;
Răpuntean , Gh., Răpuntean ,S. (2005); Bacteriologie veterinară specială .Ed. AcademicPres , Cluj-Napoca;
Ritter W. (2000): Bolile albinelor. Ed. M.A.S.T., București;
Sabath,L.D.( 1980 ) : Pseudomonas aeruginosa .Ed. Hans Huber Publishers . Bern-Stuttgart-Vienna;
Sabău , Monica ( 2002 ) : Infecții cu Pseudomonas aeruginosa . În tratat de Epidemiologie a bolilor transmisibile . Ivan , A. ( coord ).Ed. Polirom , Iași ,540-543;
Schäfer M. O., Ritter W., Pettis J. and Neumann P. (2010):Small hive beetles, Aethina tumida, are vectors of Paenibacillus larvae. Apidologie, 41, 14-20;
Schwarz R.S., Weinstein Teixeira Ērica , J.P. Tauber J.P.,.Birke M.Juliane , Fonseca Martins Marta ,Fonseca Isabela ,Evas J.D. (2014): Hohey bee colonies act as reservoirs for two Spiroplasma facultative symbionts and incur complex , multiyear infection dynamics .Microbiology Open Vol.3 , (3) , pag. 341-355;
Sebaihia , M. , Peck MV , Minton NP , Thomson NR , Holden MT , et al. ( 2007 ); Genom sequenc of a proteolytic ( Group I ) Clostridium botulinum strain Hall A and comparative analysis of the clostridial genomes . Genome Res . Vol. 17 pag. 1082-1092;
Secașiu ,V. ( 1985) : Sinergism și antagonism între C.welchii și unele bacterii gram negative . Lucr. ICVB „Pasteur”, Vol.17, pag. 199-211;
Shimanuki H., Knox A. D., (2005) Diagnosis of Honey Bee Diseases www.ars.usda.gov/…/honeybeediseases/honeyb;
Stamatin,N. ( 1957 ): Microbiologie veterinară vol. I. Ed.Agro-Silvică de stat. București;
Thimon L; Peypoux F, Wallach J, Michel G ( 1995 ) ; Effect of the lipopeptide antibiotic , iturin A , on mophology and membrane ultrasructure of yeast ceels . FMS Microbiol. Lett .Vol. 128 pag. 101-106;
Willey JM , van der Donk WA ( 2007 ); Lantibiotics : peptides of diverse structure and function .Annu. Rev.Microbiol. Vol.61 pag.477-501;
Wilson M. și Skinner J. (2013): European Foulbrood: A Bacterial Disease Affecting Honey Bee Brood. articles.extension.org/…/european-foulbrood:-a… ;
***OIE-Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terestrial Animals ( 2004 ), Part 2, sectiunea 2.2., cap. 2.2.2.;
***OIE-Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terestrial Animals (2014), Part 2, secțiunea 2.2., cap. 2.2.3.;
***DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (2015) ,GmbH, Braunschweig, Germany;
***Spiroplasma melliferum (2014): https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/File: Spiroplasma_melliferum.png;
***Loca americană (2016): www.cabi.org/isc/datasheet/109548;
*** Diagnosis of Honey Bee Diseases (2005): www.ars.usda.gov/…/honeybee diseases/honeyb.
Gheorghe PUCHIANU și Stelian ASIMINEI
II.III. Bolile parazitare la albine
Bolile parazitare sunt afecțiunile cele mai grave ale coloniilor de albine, fiind determinate de protozoare și acarieni.
Indiferent de nivelul de organizare morfologică și funcțională, parazitismul reprezintă satisfacerea nevoilor proprii prin intreconectarea funcțiilor la disponibilitățile gazdei. În anumite condiții, între organismul parazit și cel parazitat se stabilește un anumit echilibru, care nu afectează în mare măsură, randamentul productiv și reproductiv al gazdei. Însă, intervenția unor factori care modifică statusul imunitar, determină scăderea puterii de apărare a gazdei și implicit, declanșarea stării de boală.
În cazul albinelor, colonia se comportă ca un tot, multitudinea indivizilor acționând sinergic în lupta contra paraziților. În unele boli parazitare, cum sunt protozoozele, “mulțimea” face puterea, în timp ce în arahno-entomoze capacitatea de apărare scade pe măsura învechirii bolii. De aceea, ca și în lumea vertebratelor, intervenția omului (apicultorului) în ameliorarea stării de sănătate a coloniilor de albine parazitate este salutară.
II.3.1. Protozooze
II.3.1.1. Amoebioza
Malpigameboza
Ameboza albinelor
Amibioza
Este o endoparazitoză a albinelor adulte care evoluează la sfârșitul iernii și începutul primăverii (își face debutul în martie și cunoaște apogeul în mai, ca apoi severitatea ei să diminueze), are aceeași dinamică cu nosemoza și afectează albinele adulte și matca. Este determinată de un protozoar parazit numit Malpighamoeba mellificae.
Evoluția bolii este sporadică sau enzootică, fără tendință de difuzare, fiind caracterizată din punct de vedere clinic prin diaree, iar anatomopatologic prin leziuni localizate la nivelul aparatului urinar. Se asociază frecvent cu nosemoza.
Istoric, răspândire și importanță economică
Boala a fost descoperită de Massen în anul 1916, izolând parazitul din tuburile lui Malphighi la albinele bolnave. A fost confirmată ulterior de Borcheret, Prell, Armbruster, Morgenthaler, etc. Ulterior, Giordani a emis ipoteza că parazitul afectează pe lângă tuburile lui Malphighi și intestinul mijlociu al albinelor (43).
Boala a fost semnalată în apropape toate țările din Europa, în Oceania și în America de Sud. Prezența protozoarului Malhighamoeba mellificae în coloniile de albine este variabilă (de la 0,2% în Italia la 2% în Anglia și Tara Galilor) (6).
În România, Malpighamoeba mellificae este o prezență obișnuită în familiile de albine. Investigațiile noastre au evidențiat o infecție cu acest protozoar de 30 – 35%, variabilă de la un an la altul, marea majoritate fiind infecții mixte cu Nosema spp.
Importanța economică este redusă, atât timp cât nu evoluează împreună cu nosemoza. În cazul infecțiilor mixte (amoebioză + nosemoză ), pierderile prin morbiditate și mortalitate sunt mari, mai ales primăvara.
Etiopatogenie
Agentul patogen este un rhizoflagelat, parazit unicelular care face parte din încrengătura Protozoa, clasa Rhizopoda, ordinul Sarcodina, subfamilia Entamoebinae, numit Malphigamoeba mellificae, protozoar rhizopod unicelular flagelat, care parazitează epiteliul tuburilor Malpighi și intestinul mijlociu al albinelor (43, 19, 30).
Parazitul are două forme de existență:
• vegetativă (trofozoitul), localizată în intestin și în tuburile lui Malpighi. Se întâlnește mai greu și de obicei la începutul bolii, având aspectul unei amibe care emite pseudopode cu ajutorul cărora se deplasează și înglobează hrana, prin osmoză, în masa sa protoplasmatică (43).
• de rezistență (chistul), prezent în tuburile Malpighi și în mediul exterior.
Liu T.P. (1985), descrie două forme de trofozoiți: trofozoiții primari, prezenți printre celulele epiteliale, prinși în procesul penetrării acestora și trofozoiții secundari, observați în lumenul tuburilor Malpighi.
Trofozoiții primari au aspect alungit sau ascuțit, cu un diametru mediu de 3,68 µm, pe suprafața membranei prezintă niște cute, iar în citoplasmă sunt prezente câteva vezicule.
Trofozoiții secundari au dimensiunea și forma variabilă, suprafața lor fiind prevăzută cu numeroase șanțuri și proeminențe. Ca organite de mișcare, trofozoitul emite pseudopode digitiforme sau flagelare.
Chisturile au formă rotundă sau ovală, strălucitoare, refringente, polul posterior fiind puțin mai lat decât cel anterior. Chistul este protejat la exterior de o membrană rezistentă, dură, iar la interior de o membrană fină ce înconjoară protoplasma. În protoplasmă se disting nucleul și câteva vezicule (38). Dimensiunile chistului sunt variabile, cele mai multe forme având între 4 – 4,5 µm și 2,5 – 3 µm. Se întâlnesc și forme gigante de 4,5/7,5 µm. Membrana exterioară este netedă sau, în unele cazuri, cutată. Microscopia electronică evidențiază, pentru chisturi, dimensiuni de 2,65 – 3,62/3,4 – 4,6 µm.
Rezistența chisturilor în mediul exterior este destul de mare. În fecale, pe faguri, rezistă șase luni. Chisturile sunt sensibile la acțiunea acidului acetic glacial ( 56).
Chisturile de Malpighamoeba mellificae ajung în intestin odată cu hrana sau apa, trec în forma de trofozoit primar, emit pseudopode și flageli, după care se deplasează și populează uretrele și tuburile Malpighi. Trecerea din forma de chist în cea de trofozoit se face sub influența sucurilor digestive în zona pilorică a intestinului, după care ajung în punga rectală, iar de aici migrează în aparatul urinar. În aparatul excretor, se plasează în contact direct cu marginea în perie a celulelor epiteliale, unde începe înmulțirea prin diviziune directă (46).
Ciclul de viață al parazitului are o durată de 22 – 24 de zile. În final, numărul acestora devine impresionant (<500.000/albină), încât obturează tubii uriniferi.
M. mellificae acționează asupra organismului mecanic, iritativ și chimico – toxic. Mecanic acționează prin număr, iar iritativ și chimico-toxic prin produșii proprii de metabolism și cei rezultați din distrugeri de țesuturi, precum și din metabolismul albinei afectate (descompunerea acidului ureic nemaiavând loc).
Eliminarea chisturilor în mediul exterior se face prin tubul digestiv, odată cu materiile fecale. La albinele de iarnă, stagnarea fecalelor în rect fiind de lungă durată, chisturile de la acest nivel pot să-și reia ciclul de viață, prin transformarea în trofozoiți și migrarea în tuburile Malpighi (46, 6).
Epidemiologie
Amoebioza este o afecțiune sezonieră, evoluând primavara și mai rar vara sau toamna. Sursele de infecție sunt reprezentate de albinele bolnave, cadavrele, apa, fagurii și stupii, murdărite cu fecale diareice, precum și inventarul apicol ce intră în contact cu sursele principale de infecție.
Apariția și evoluția amoebiozei este favorizată de factori debilitanți ca: igiena deficitară, familii slăbite, iernare necorespunzătoare, primavară capricioasă, perioade lungi cu ploi reci, schimbări bruște de temperatură, hrana de calitate proastă și insuficientă cantitativ etc.
Simptomatologie
Amoebioza evoluează acut sau cronic. De cele mai multe ori însoțește nosemoza. Semnul clinic dominant este diareea puternică, urât mirositoare și eliminată în jeturi la cea mai ușoară excitație (38, 39). Fecalele eliminate murdăresc interiorul stupului, iar în fața stupului sunt multe albine moarte sau muribunde și bolnave. Albinele bolnave, prezintă tremuraturi ale aripilor, au mișcări de destindere și de contracție ale abdomenului; aceste albine au abdomenul balonat, iar la simpla palpare elimină fecale diareice, de culoare gălbuie, sub formă de jet. Colonia de albine își reduce numărul de indivizi, puterea ei scade, iar reluarea activității productive și reproductive este încetinită.
În cazul evoluției amoebiozei împreună cu nosemoza, efectele pentru stupină sunt drastice; multe colonii mor, iar cele care supraviețuiesc se refac foarte greu.
Boala debutează în martie și cunoaște apogeul în mai, ca apoi severitatea ei să diminueze, având aceeași dinamică cu nosemoza (38, 39, 46).
Diagnostic, diagnostic diferențial
În amoebioză, diagnosticul se pune pe baza datelor epizootologice, clinice și de laborator, acesta din urma fiind de certitudine.
Boala afectează albina adultă primavara, cu vârful pierderilor prin mortalitate în luna mai. Evoluează de cele mai multe ori împreună cu nosemoza, având aceleași semne clinice și modificări anatomopatologice. (39, 52).
Din punct de vedere clinic, sunt de reținut descărcările diareice sub formă de jet la cea mai mică excitație și murdărirea interiorului stupului cu fecale lichide, urât mirositoare și de culoare gălbuie – aurie (46).
În laborator se examinează, prin tehnica microscopică directă, tuburile Malpighi strivite între lamă și lamelă, într-o picatură de apă. Chisturile pot fi confundate cu sporii de fungi, cu cei ai protozoarului Nosema spp. sau cu grăuncioarele de polen (46, 56).
În cazul suspiciunii bolii se prelevează probe pentru diagnostic, conform cu prevederile Ordinului Președintelui ANSVSA nr. 25/2008 și anume 10 g de albine vii sau moarte de la urdiniș (50).
Examenele de laborator se efectuează la LSVSA și/sau, după caz, LNR-IDSA prin examen microscopic direct. Diagnosticul de laborator se confirmă prin examen miscoscopic direct prin identificarea endoparazitului Malphigamoeba melificae (50).
Diagnosticul diferențial se face față de nosemoză, atunci când evoluează independent.
Tratament
Se efectuează tratamente cu Fumidil B și /sau protofil (52). Rezultate excelente s-au obținut și cu extractul apos de pelin. Acesta se administreaza atât profilactic cât și curativ, în mai multe reprize (vezi cap. I.5.3.) (4).
Profilaxie și combatere
Combaterea bolii se realizează prin măsuri generale de profilaxie, care fac referire la calitatea și cantitatea hranei, microclimatul din interiorul coloniei de albine, condițiile de iernare etc.
Profilaxia vizează evitarea factorilor de stres, asigurarea unui microclimat optim în stupi, evitarea hrănirilor suplimentare cu turte de zahăr și făinuri proteice pe timpul iernii și primăvara devreme, prin asigurarea necesarului de hrană încă din toamnă, intrarea la iernat cu populație de albine pe șase – șapte rame, igienizarea stupilor, schimbarea mătcilor anual pentru exploatațiile intensive și la doi ani în exploatațiile semiintensive etc. (52).
II.3.1.2. Flagelatoze
Boală produsă de flagelate tripanosome din genul Crithidia (g. krithidion = mic bob de orz, cu picățele), care afectează albinele adulte (în special Apis mellifera) în sezonul de iarnă, producând modificări vizibile la nivelul intestinului.
Se presupune că evoluția bolii duce la scăderea populației de albine sălbatice prin afectarea capacității de discriminare între florile care conțin și cele care nu conțin nectar, astfel că albinele mor de foame.
Istoric, răspândire și importanță economică
C. mellificae a fost descrisă pentru prima dată de Langridge și McGhee (1967), în Australia (44). Ulterior a fost diagnosticată în SUA, Belgia, China (la Apis ceranae), Japonia (la Apis japonica ceranae), Elveția (47). Recent boala a fost diagnosticată și în Italia de către Cersini Antonella și colab., (2015), folosind două protocoale PCR care au vizat secvența b a citocromului mitochondrial (cytB) și secvența subunităților mici ale ARNr (SSUrRNA).
Studii recente arată că C. mellificae, alături de Nosema ceranae și Spiroplasma spp., sunt implicate în evoluția sindromului CCD, C. mellificae fiind mai abundentă de 6,15 ori în coloniile cu CCD față de cele non-CCD (47).
Evans și Schwarz (2014) au descoperit, prin tehnica moleculară, o nouă specie a genului Crithidia, respectiv Lotmaria passim (44).
Etiopatogenie
Crithidia mellificae – face parte din phylum Euglenozoa, clasa Kinetoplasteia, ordinul Tripanosomatida, familia Tripanosomatidae, genul Crithidia (g. krithidion = mic bob de orz, cu picățele). Din același gen mai fac parte C. bombi, C. deanei, C. desouzai, C. fasciculata, C. guilhermei, C. luciliae și C. oncopelti.
Crithidia bombi – este cel mai răspândit parazit la bondari (Bombus terrestris, Bombus muscorum și Bombus hortorum), la care afectează dezvoltarea ovarelor reginei (54 , 19).
Morfologic, critidiile sunt flagelate tripanosome cu kinetosom anteronuclear, dar destul de departe de apex, pentru a permite constituirea unei membrane ondulate. Baza flagelului este situată înaintea nucleului. Flagelul iese lateral din celulă, delimitează o membrană ondulată și merge în lungul corpului până la polul anterior al acestuia. Este o formă morfologică evolutivă a tripanosomelor cu kinetoplastul în poziție juxtanucleară (19).
Ciclul biologic se desfășoară în aceeași gazdă, fazele dezvoltării fiind de amastigot, promastigot și epimastigot. Forma de rezistență a critidiilor este chistul, care are formă rotundă. Infestația se realizează prin ingestia de chisturi.
În intestinul insectelor, critidiile interacționează cu celulele epiteliale prin intermediul flagelului, hrănindu-se prin osmoză. Efectul patogen al acestora asupra albinelor este puțin cunoscut (54 ).
Epidemiologie
Cea mai numeroasă populație de critidii la Apis meliffera este întâlnită iarna, atunci când și pierderile de colonii sunt mai mari (47).
Transmiterea critidiilor la populațiile de albine sălbatice se face prin intermediul albinelor comerciale, scăpate din sere, care, de obicei, sunt purtătoarele acestui parazit (54).
Simptomatologie
Albinele afectate prezintă modificări de culoare și consistență la nivelul intestinului, care constau din apariția unor pete sau cruste de culoare închisă (negre), vizibile ușor (6).
Diagnostic
Diagnosticul se pune prin examen de laborator, utilizând tehnici de biologie moleculară (7).
II.3.1.3. Gregarinoza
Gregarinoza este o afecțiune a albinelor adulte, fiind determinată de mai multe specii de gregarine, cu localizare la nivelul tubului digestiv unde își desfășoară ciclul biologic și determină leziuni necrotico – degenerative (48, 55). Este mai frecvent întâlnită la unele specii de albine solitare – Xylocopa dissimilis (43).
Istoric, răspândire și importanță
Descrierea bolii a fost făcută de către Giovarini (1937) în Italia, însă prima semnalare aparține elvețianului Morgenthaler în 1926. Ulterior, gregarinoza a fost semnalată în mai multe țări, dintre care amintim Canada, SUA sau America de Sud. În România, gregarinoza nu a fost semnalată, și nici nu a fost diagnosticată.
Importanța economică a bolii este redusă, deoarece pierderile datorate exclusiv acestei afecțiuni nu se cunosc. Incidența infecției este considerată a fi sub 5% (6).
Etiopatogenie
Gregarinoza este produsă de patru specii de protozoare care aparțin tribului Cephalina, respectiv Monoica apis, Apigregarina stammeri, Acuta rousseaui și Leidyana apis (57), cea mai frecvent întâlnită fiind Leidyana apis (55). Din punct de vedere morfologic toate formele acestui trib au epimerit. Formele epimeriților sunt extrem de variate, corpul fiind divizat în protomerit și deutomerit.
Leidyana apis face parte din încrengătura Protozoa, subâncrengătura Plasmodroma, clasa Sporozoa, subclasa Gregarinida, ordinul Eugregarinaria, familia Leidyanidae, genul Leidyana. (Giavarini citat de 43). Se deosebește de alte familii ale tribului Cephalina prin prezența sporoductelor. Este solitară, are epimeritul simplu și de formă globulară (30), nucleul este așezat posterior, iar protoplasma este formată din două straturi; stratul extern care are o structură clară și este denumit ectoplasmă și stratul intern, cu structură granulară, numit endoplasmă. Corpul formei vegetative este alungit și este delimitat de o membrană subțire (43) dimensiunile lui fiind de 44/16 µm. Sporul este oval și măsoară 85/35 µm. Nu rezistă la îngheț și la acțiunea dezinfectantelor uzuale (55, 58).
Înmulțirea gregarinelor se face prin schizogonie, gametogonie și sporogonie, caracteristică întâlnită la toate sporozoarele; sporochisturile rezultate după reproducerea sexuată reprezintă elementele de rezistență și de contaminare pentru insecte. În cazul Leidyana api, înmulțirea se face prin spori, a căror formare este precedată de un fenomen de pseudoconjugare denumit și sizigie. După închistare, nucleul se divide în mai mulți nuclei fii, dând naștere la micro- și macrogameți. Prin fuzionarea acestor două tipuri de gameți se formează sporii care sunt eliminați din tubul digestiv odată cu excrementele, prin intermediul cărora va fi contamină o nouă gazdă (43). Ciclul vital al gregarinelor, în organismul albinelor, este de aproximativ 30 de zile. Dezvoltarea gregarinelor are loc intracelular.
Albinele se infectează pe cale digestivă, sporochisturile fiind preluate odată cu hrana infectată. În intestin sporochisturile eliberează sporozoiții sub acțiunea mai multor factori, așa-numiții ,,factori de invazie,, (20). Sporozoiții, fiind elementele active de invazie, pătrund activ în celulele epiteliului intestinal sau sunt fagocitați de către hemocite și transportați în hemolimfă, și de aici în corpul adipos. În celulele epiteliale ale intestinului sau în cele ale corpului gras, uneori și în spermateca reginelor tinere, recent fecundate (58), sporozoiții se transformă în schizont sau meront, care este o celulă multinucleată. Prin diviziunea citoplasmei și prin înmugurire, din schizont iau naștere merozoiții. Merozoiții sunt apoi eliberați din schizont prin ruperea membranei schizontului sub acțiunea tensiunii interne. Merozoiții liberi invadează alte celule din hemocel sau ale epiteliului intestinal , procesul schizogonic reluându-se. După unul sau mai multe cicluri de reproducere asexuată, unii merozoiți pătrund în alte celule epiteliale sănătoase și se transformă în gamonți multinucleați sau mononucleați; din gamonții multinucleați iau naștere microgameții (gamet mascul) și macrogameții (gamet femel). Din unirea gametului mascul cu cel femel ia naștere zigotul, care în mediul extern se transformă în sporochist (43, 58).
Prin desfășurarea ciclului biologic la nivelul celulelor epiteliale ale intestinului, parazitul afectează integritatea morfo-funcțională a tubului digestiv. Se produc dereglări de tranzit intestinal și de schimburi de nutrienți cu hemolimfa, toxinele eliberate de organism și de paraziți amplificând tulburările funcționale. Celulele epiteliale parazitate mor, iar rata de înlocuire scade. Urmare acestui proces patologic se produce autointoxicarea organismului și eliberarea de fecale diareice. Uneori se poate obtura lumenul intestinal datorită dezvoltării unui număr mare de paraziți (43, 48).
Epidemiologie
Gregarinele sunt sporozoare cu patogenitate ocazională pentru albine. De obicei, aceste sporozoare, parazitează la alte insecte, în special la gândaci și molii. După unii autori, se presupune că aceste artropode ar fi rezervorul și vectorul gregarinelor pentru albine. Apariția și evoluția bolii în coloniile de albine este favorizată de factori de stres, timp nefavorabil, lipsa hranei, hrană necorespunzătoare, suplimente alimentare neadecvate etc.
Calea de infecție este cea digestivă, odată cu hrana și apa contaminate cu formele de rezistență. Evoluează mai grav la sfârșitul iernii și primăvara până în mai, inclusiv (55).
Gregorinoza este mai puțin frecventă în familiile de albine, fiind întâlnită mai mult la unele specii de albine solitare – Xylocopa dissimilis. (43)
Simptomatologie
Semnele clinice sunt necunoscute (55).
Modificări morfopatologice
La nivelul intestinului se produc descuamări celulare, iar macroscopic culoarea acestuia devine gri-castanie, uneori negricioasă. Pereții intestinali sunt fragili și se dilacerează foarte ușor la încercările de extragere a tubului digestiv din cavitatea abdominal (43).
Diagnostic
Se pune pe baza examinării intestinului la un microscop compus cu obiectiv low-power (62).
Tratament
Se poate folosi Fumidil B 0,04% (Fumagilin).
Profilaxie și combatere
Măsurile de combatere a bolii și cele de profilaxie sunt identice cu cele din nosemoză și amoebioză.
II.3.1.4. Nosemoza
Nosemoza este una dintre cele mai păgubitoare boli care afectează albina meliferă (Apis mellifera). Până nu demult, în Europa și America de Nord se cunoștea un singur agent patogen, care producea nosemoza la albine, respectiv Nosema apis. Însă, intensificarea schimburilor economice mondiale a oferit noi oportunități agenților patogeni pentru a traversa granițele geografice și pentru a se extinde la noi gazde. Așa s-a întâmplat și cu Nosema ceranae, care era cunoscută ca agent etiologic numai la Apis cerana, în Asia. Dar, nu de mult, nosemoza produsă de Nosema ceranae a fost semnalată în SUA și în mai multe țări din Europa, în special în partea vestică a continentului (9). Acest fapt a declanșat cercetările pentru elucidarea epidemiologiei, simptomatologiei, modificărilor anatomopatologice, precum cele de genetică, pentru cunoașterea aprofundată a noului agent patogen al nosemozei.
Nosema spp. sunt microsporidii parazitare, intracelulare, adaptate unui anumit tip de celule, posedă un echipament enzimatic rudimentar și profită de relații oportuniste pentru înmulțire (60).
Având în vedere aceste considerente, ne-am gândit să prezentăm nosemoza în două lucrări, câte una pentru fiecare agent patogen, deoarece deosebirile între aceste microsporidii (fungi?) sunt mari.
II.3.1.4.1. Infecția cu Nosema apis
Este o sporozooză gravă a albinelor adulte, produsă de Nosema apis (Zander, 1909), un sporozoar parazit care se localizează intracelular, în celulele intestinului mijlociu al albinelor. (19, 14). Are evoluție sporadico-enzootică, iar clinic și anatomopatologic se caracterizează prin diaree cu fecale galben – maronii (43), perturbarea zborului, morbiditate și mortalitate ridicate și leziuni pronunțate la nivelul intestinului (28).
Istoric, răspândire și importanță
Boala există în întreaga lume, iar examinarea albinelor contribuie la prevenirea răspândirii infecției în coloniile sănătoase (61). Este cunoscută de mult timp, fiind descrisă de Zander în 1909. În Italia este raportată o extensivitate a infecției de 2%, în Germania în zona Munții Pădurea Neagră, este raportată o incidență de 60%. În Statele Unite mătcile sunt afectate între 4 și 20%.
În România 64% din județe sunt afectate de nosemoză. Dinamica evoluției focarelor este determinată de: neefectuarea tratamentelor specifice de combatere; neasigurarea necesarului de medicamente specifice de prevenire și combatere la nivelul fondului apicol existent; costul ridicat al tratamentelor complete; nerespectarea măsurilor obligatorii de igienă și sanitare – veterinare.
Aspectele menționate, precum și practicarea stupăritului pastoral în aglomerări temporare de stupine, cu situații epidemiologice diferite, duc la menținerea focarelor de boală și cronicizarea evoluției nosemozei.
Nosemoza determină pierderi mari prin morbiditate și mortalitate. În stupinile cu familii întreținute în condiții necorespunzătoare pot apărea depopulări masive (35).
Etiopatogenie
Nosema apis face parte din filum Microspora, clasa Microsporea, ordinul Microsporidia, subordinul Apansporoblastina, familia Nosematidae, genul Nosema (14). Însă, studiile recente de biologie moleculară par să infirme apartenența genului Nosema la protozoare, ,,orientarea fiind către fungiˮ (28).
Nosema apis, prezintă forme vegetative și sporulate. Sporii se găsesc în conținutul intestinal al albinelor bolnave, fiind eliminați odată cu excrementele în mediul extern (28).
Forma vegetativă (sporozoitul) pătrunde în celulele epiteliale ale intestinului mijlociu, se dezvoltă, și se transformă în trofozoit. Nucleul trofozoitului se divide și astfel apare pansporoblastul, o celulă multinucleată, care prin fragmentarea citoplasmei și generarea membranei, în jurul fiecărui nucleu învelit de citoplasmă, dau naștere sporoblaștilor. Din sporoblaști, prin maturare, iau naștere sporii (36).
Fig. Nr. II.3.1.1. Nosema apis, spor (după http://www.dave-cushman.net/bee/gif/nosemaapis.gif)
Legendă: a). membrana sporului; b). sporoplasma; c). filamentul polar; d). vacuola polară; e). nucleu.
Sporul are o formă ovală, lățit ușor la unul din poli, cu dimensiunile de 4-4,5/2,5 -3 µm, reprezentând elementul exogen, de rezistență și de contaminare. Este format din membrană netedă, fină, de culoare închisă, opacă, cu un micropil la unul din poli. Citoplasma prezintă o vacuolă spre polul lățit, iar la polul opus o vacuolă mică, numită capsulă polară și un filament spiralat, dispus în toată lungimea sporului și lung de 200 – 300 µm. Citoplasma mai conține doi nuclei (14).
Ciclul biologic al protozoarului are o durată medie de 3 – 4 zile, dependent de temperatura mediului ambiant. La 30ș C, durata ciclului vital este de 44 ore, iar la 22ș C, timpul necesar este dublu.
Rezistența sporilor la acțiunea agenților fizici este remarcabilă; 2 luni în apă și miere la temperatura de 22 – 24ș C, 15 minute la 50ș C și 3 săptămâni la 4ș C, iar în cadavre de albine un an și 2 ani în fecale uscate (36). Pe fagurii contaminați sporii sunt viabili până la 2 ani.
Decontaminantele uzuale au acțiune distructivă asupra sporilor: hidroxidul de sodiu 5% distruge sporii în 5 minute; fenolul 4% anihilează sporii în 10 minute, iar vaporii de formol distrug sporii în 48 de ore (28). Mai pot fi inactivați de acidul acetic sau prin expunere la temperaturi de 60ș C timp de 15 minute (61).
Parazitul este omniprezent în organismul albinei si se multiplică cu o rată specifică de-a lungul întregului an, numărul maxim atingându-l în timpul primăverii când se dezvoltă și puietul. Iarna sporii se reduc ca număr și sunt greu de identificat, probabil se găsesc numai la albinele masiv infectate. Stadiile intermediare de dezvoltare ale parazitului din perioada de hibernare sunt greu de depistat microscopic din cauza dimensiunilor foarte mici.
Microsporidia Nosema apis, invadează și parazitează regiunea posterioară a intestinului mijlociu, după care micropilul sporal penetrează membrana peritrofică a acestuia. Primii spori pierd micropilul și pătrund în citoplasma celulelor epiteliale unde se reproduc, având o rată de multiplicare a sporilor foarte mare, într-un timp foarte scurt, numărul acestora/albină, în evoluțiile acute, fiind de >10.000.000 (59).
Protozoarul acționează asupra intestinului distructiv, prin reducerea numărului de celule epiteliale, iritativ și toxic prin acțiunea produșilor proprii de metabolism și al celor rezultați din dezintegrarea epiteliului intestinului mijlociu și a membranei peritrofice.
Sunt consemnate și schimbări de comportament datorită maturizării timpurii a albinelor adulte, proces mediat de producția crescută de hormon juvenil (9).
Epidemiologie
Boala evoluează dramatic de la sfârșitul iernii până la sfârșitul lunii mai, în stupinile în care pregătirea pentru iarnă a coloniilor de albine a fost precară. Nosemoza este o boala de vreme rece, evidențiată de simptomul de dezinterie (40).
Apărarea naturală a coloniilor de albine împotriva unei infecții masive cu parazitul Nosema apis, depinde de puterea acesteia la începutul toamnei, în timpul iernii si de condițiile de hibernare. Dacă aceste condiții sunt nefavorabile, se produce un dezechilibru al balanței hormonale a indivizilor coloniei, reducându-se rezistența acesteia la îmbolnăvire. Se înregistrează o moarte prematură a albinelor pe perioada de iarnă sau la începutul primăverii. În cazurile tipice de boală se produce o depopulare accentuată a familiilor afectate, rămâne doar matca cu câteva albine, iar starea acesteia este confuză și depune ouă în celule gata căpăcite (61).
Nosema apis, invadează și parazitează exclusiv celulele epiteliale ale intestinului mijlociu al albinelor adulte. Infecția se face o dată cu hrănirea sau în timpul efectuării lucrărilor în stup, prin ingestia sporilor existenți în hrană sau pe perișorii de pe corpul albinelor.
Răspândirea bolii de la o familie la alta și de la o stupină la alta, se face prin albinele adulte bolnave, mătcile din familiile infectate, ustensile (28), miere, polen, faguri contaminați, furtișag, trântori, roiuri, stupărit pastoral etc.
Factorii care favorizează evoluția bolii în stupini sunt legați de întreținerea și hrănirea neadecvată a familiilor de albine, în perioada premergătoare iernării, de amplasarea stupilor în timpul iernii pe terenuri cu umiditate crescută și vânturi puternice, izolare necorespunzătoare (folii de polietilenă peste podișor sau rame), care permite menținerea umidității în cuib, molii etc.
Simptomatologie
Clinic nosemoza evoluează acut, cronic sau latent. În faza incipientă a infecției nu sunt semne deosebite care să indice prezența parazitului, observându-se numai colonii slabe, cu o cantitate mare de puiet și numai câteva albine adulte. La albinele afectate, intestinul mijlociu care normal este cafeniu, devine alb si foarte fragil (61).
În formele cu evoluție acută abdomenul albinelor este balonat, acestea prezentând diaree urmată de constipație. Albinele infectate sunt incapabile de zbor și conțin până la 500 milioane de spori. Familiile bolnave sunt neliniștite iar spre finalul perioadei de iernare se aude în colonie un zumzet neobișnuit. Pereții stupului, ramele, fagurii, ceara sunt murdărite cu excremente abundente diareice de culoare maronie, cu miros acid sau de tutun, după ce acestea se usucă. La urdiniș pot fi văzute atât albine vii bolnave cât și albine moarte, procentul mare de pierderi prin mortalitate înregistrându-se în timpul iernii (14, 61).
În infecția medie nu sunt semne clinice deosebite exceptând o depopulare mai evidentă la albinele lucrătoare în comparație cu suprafețele mari de fagure cu puiet care rămân descoperite.
Forma latentă a nosemozei evoluează obișnuit asimptomatic, definită frecvent prin dezvoltarea inegală a familiilor, pierderea mătcilor și mortalitate ușor crescută (28).
Leziuni anatomopatologice
Examenul histopatologic efectuat pe secțiuni de 5 µm din intestinul mijlociu al unor albine cu nosemoză, colorate HE, PAS și Giemsa, au pus în evidență o dinamica lezională, care înregistrează inițial distrugerea membranei peritrofice, după care apar hipertrofii, hiperplazii și vacuolizări ale celulelor epiteliale. Unele celule se desprind de pe membrana bazală și plutesc în lumenul intestinal. Parazitul în diverse stadii evolutive, este localizat în celula epitelială pe care, în final, o dezintegrează (fig. II.3.1.2).
Aceste aspecte fac posibilă afirmația că în patologia albinelor se întâlnesc leziuni distrofice, inflamatorii și productive, similare celor de la mamifere (3).
Fig. Nr. II.3.1.2. Intestin mijlociu la Apis mellifera: membrana peritrofică desprinsă (a), celule epiteliale cu meronți (b) și spori (c) ai microsporidiei N. apis. Col. HEA x100 (după Asiminei și colab., 2003).
Diagnostic
Se suspicionează clinic (fig. II.3.1.3. a și b) și se confirmă prin examenul microscopic al frotiurilor făcute din broiaj de albine (28). Pentru diagnostic se prelevează o probă de 10 g de albine vii sau moarte de la urdiniș (50).
Fig. nr. II.3.1.3. a). Intestinul mijlociu la o albină infectată cu N. apis (sus) și o albină sănătosă ( jos); b). Stup murdărit de fecale diareice în infecțiile cu N. apis (după Huang Z., 2011)
Este necesar să se facă distincție între Nosema și Malpighamoeba mellificae. Există o primă indicație a infecției cu Nosema apis, față de infecția cu Malpighamoeba mellificae și anume, apariția diareei cu fecale apoase, galben – maronii (fig. II.3.1.2. b) și cu miros fetid caracteristic. Infecțiile mixte sunt întâlnite frecvent (61).
Diagnostic diferențial. Sporii parazitului pot fi confundați cu sporii și celulele unor fungi, cu corpusculi de grăsime, cu N.ceranae sau cu chiștii de Malpighamoeba mellificae. După dezvoltare, chiștii de Malpighamoeba mellificae sunt aproximativ de aceiași mărime cu sporii de Nosema apis, având un diametru de 6-7 µm, dar sunt sferici și nu ovali (61). Pentru diferențierea infecției cu N. ceranae vezi fig. II.3.1.5., a și b.
Și intoxicațiile cu miere de mană, siropuri fermentate, zaharuri nedigerabile din siropurile de cola, melasă sau siropul de porumb, pot duce la confuzii, deoarece modificările intestinului mijlociu sunt asemănătoare. Însă, examenul microscopic al intestinului, în aceste cazuri, este negativ pentru Nosema apis (59).
Prognostic
Cel vital este rezervat spre grav în forma acută când morbiditatea este crescută și în perioadele de cules când nu se pot aplica tratamente. În cazul coloniilor puternice, prognosticul poate fi favorabil.
Economic, prognosticul rămâne grav datorită pierderilor prin morbiditate și mortalitate și a celor aferente măsurilor de carantină care se instituie, boala fiind declarabilă și carantinabilă (28).
Tratament
Dintre medicamente s-au dovedit a fi utile Fumidil B (fumagilină) câte un flacon de 25g la 25 l sirop, administrat la o familie 0,5 l sirop medicamentat odată la trei zile, prizele repetându-se de 8 ori. În sezonul de iarnă preparatul se administrează câte un flacon de Fumidil B / 10 kg pastă sau șerbet de zahăr, revenind 0,5 kg / familie, repetat la 7 zile, de până la 4 ori (28).
Se mai poate administra Nosemak (preparat organomercuric) 1 pastilă/l sirop, Nosan (conține trolaval) ), 10% în zahăr praf, flacoane de 25 g amestec, administrat în aceași posologie cu Fumidil B, iar ca stimulent general, protofil.
Tratamentul medicamentos trebuie însoțit de îmbunătățirea măsurilor de igienă și alimentație, decontaminarea ustensilelor de lucru și a stupilor sau înlocuirea acestora cu stupi noi (28).
Experimental, în tratamentul nosemozei s-au utilizat și compuși chimici ai pelinului sub formă de extract apos, administrați în sirop de zahăr sau de miere, toamna și primăvara, în mai multe reprize. Înainte și după aplicarea tratamentului s-au efectuat examene parazitologice pentru evaluarea stării sanitare a coloniilor de albine, constatându-se o reducere a morbidității și a pierderilor prin mortalitate, precum și revigorarea populațiilor de albine (4).
Profilaxie și combatere
Se recomandă măsuri care vizează creșterea rezistenței generale a familiilor de albine prin respectarea tehnologiei de creștere și a măsurilor de igienă, înlocuirea familiilor slăbite cu familii tinere și puternice, asigurarea rezervelor de hrană pentru perioada de iarnă și aplicarea măsurilor de dezinfecție (14).
Pentru prevenirea infecției albinelor, în perioada iernării se poate administra Fumidil B în miere în concentrație de 0,02% (14).
Pentru combaterea bolii se îndepărtează periodic, iarna și primăvara, albinele moarte de pe fundul stupului și se distrug prin ardere, se îndepărtează din stupi fagurii vechi, deformați, cu pete de diaree care se topesc și se înlocuiesc cu faguri noi; mătcile din familiile bolnave se vor înlocui cu mătci sănătoase, deoarece ele constituie rezervor de spori capabili să mențină familia contaminată; familiile trecute prin boală, tratate și fără semne de boală se vor transvaza pe rând în stupi dezinfectați; se execută curățirea mecanică și dezinfecția de necesitate a întregului inventar apicol și a vetrei de stupină. Fagurii din rezerva stpinei vor fi dezinfectați cu acid acetic glacial, formol sau anhidridă sulfuroasă, iar stupii cu soluție de acid acetic, sau ștergerea cu un burete îmbibat în această soluție. După dezinfecție stupii trebuie aerisiți cel puțin 14 zile înainte de repopulare (61, 14).
Dezinfectarea cuprinde următoarele etape de lucru: curățirea mecanică, flambare și dezinfecția chimică cu una din substanțele: hidroxid de sodiu (sodă caustică) 4 %, carbonat de sodiu (sodă calcinată) 5 % sau formol 3-4 % (14).
II.3.1.5. Infecția cu Nosema ceranae
Nosemoza produsă de Nosema ceranae este o afecțiune acută, gravă a albinelor adulte, evoluează enzootico-epizootic, iar clinic se manifestă prin constipație și mortalitate mare. N. ceranae este incriminată și în cauzalitatea sindromului colapsului coloniilor de albine (CCD) (26, 42).
Istoric, răspândire, importanță economică
Nosemoza determinată de Nosema ceranae a fost descrisă pentru prima dată de Fries Ingmar în anul 1995, la Apis cerana, în Asia. Mai târziu (2005), o infecție naturală cu N. ceranae a fost raportată de Huang și colab., în Taiwan, la coloniile de albine ale speciei Apis mellifera. Apoi, în anul 2006, Higes și colab., descriu boala în Spania, Paxton și colab. (2007) în Finlanda, iar Chen și colab. (2007), în SUA. Ulterior, N. ceranae a fost semnalată în China (Liu și colab., 2008), Vietnam (Klee și colab., 2007) sau Canada (Williams și colab., 2008), iar Plischuk și colab. (2009) o descriu, la bondari, în America de Sud (9). În Australia, N. ceranae a fost izolată mai târziu la Apis mellifera (24).
Se pare că Nosema ceranae este mult mai răspândită la Apis mellifera decât s-a anticipat, iar apariția primelor îmbolnăviri să fi fost cu cel puțin 10 ani mai înainte de prima semnalare a bolii în SUA. Astfel, analiza unor probe de albine prin metoda PCR, colectate în anul 1995, au evidențiat prezența microsporidiei Nosema ceranae, așa că se presupune că nosemoza determinată de N. ceranae, evoluează de mai mult timp în SUA (9).
Prevalența infecției cu N. ceranae în SUA era de 16% în anul 1995, pentru ca în 2007 aceasta să ajungă la 50 – 55%.; în același interval, infecțiile cu N. apis sau fost depistate la 18 – 29% dintre coloniile de albine controlate. Aceste aspecte relevă faptul că N. ceranae a devenit agentul etiologic principal al nosemozei, fiind asociat și în etiologia polifactorială a CCD (9).
Pierderile economice determinate de infecția cu N. ceranae sunt deosebit de mari, deoarece boala evoluează tot timpul anului și este frecvent asociată cu CCD.
Fig
Fig. nr. II.3.1.4.: Reprezentarea schematică a ciclului evolutiv la Nosema ceranae (după https://microbewiki.kenyon.edu/…/Nosema_cer…, modificată de noi)
Legendă: Filamentul polar străpunge membrana celulelor epiteliale din intestinul mijlociu, după care injectează sporoplasma în celula gazdă (a). Sporoplasm apare ca un mic corp sferic în celula gazdă (b) care apoi se transformă într-o formă fusiformă, denumită meront (c). Merontul începe să se dividă, și dă naștere la meronții fii (d). Aceste perechi de meronți sunt apoi supuse unei succesiuni de diviziuni (e), din care iau naștere sporonții. Apoi sporonții se separă și se transformă în sporoblaști, după care, ulterior, se dezvoltă membrana plasmatică condensată în jurul sporilor ovali (f). (g) Enterocite cu nucleu picnotic, celulă degenerată și spori care părăsesc celula; sporii pot relua ciclul biologic pe aceeași albină sau părăsesc tubul digestiv odată cu materiile fecale.
Etiopatogenie
Nosema ceranae face parte din filum Microspora, clasa Microsporea, ordinul Microsporidia, subordinul Apansporoblastina, familia Nosematidae, genul Nosema (14). Însă, studiile recente de biologie moleculară par să infirme apartenența genului Nosema la protozoare, ,,orientarea fiind către fungiˮ (28).
În desfășurarea ciclul biologic al microsporidiei Nosema ceranae se disting două forme morfologice: vegetativă și sporulată.
Forma de rezistență în mediul exterior și de infecție este sporul. Sporii microsporidiei Nosema ceranae sunt ovali sau în formă de tijă și au dimensiuni de 3,9 – 5,3 µm lungime/2,0 – 2,5 µm lățime sau, după Chen Y., P., Huang Z., Y., (2010), de 4,4 ± 0,41 µm/2,2 ± 0,09 µm, au doi nuclei, sporoplasmă, vacuolă polară și filament polar, delimitate de o membrană densă. Filamentul polar reprezintă organul de atac prin care sporul transferă sporoplasma și nucleii în citoplasma celulelor epiteliale din intestin (23). Filamentul polar este înfășurat în jurul sporoplasmei, iar numărul de spire este specific fiecarei specii a genului Nosema, acesta fiind unul dintre criteriile de diferențiere morfologică a N. ceranae de N. apis; Nosema ceranae are 18 -21 înfășurări (9), pe când N. apis are > 30 de spire (21, 31).
Fig. nr. 3.1.5.: a). Nosema ceranae (spori); b). Nosema apis (spori) (după Huang Z., 2011).
Sporii de N.ceranae sunt mai mici, mai puțin simetrici și cele două capete sunt mai clare, comparativ cu sporii de N. apis. N. ceranae este mai rezistentă la temperaturi ridicate; la 60° C rezistă timp de o lună, dar sunt sensibili la temperaturi scăzute. Sporii de N. cenarae pierd ~ 90% din infecțiozitate la temperatura de congelare, timp de o săptămână, în timp ce sporii de N. apis își păstrează în totalitate viabilitatea în aceleași condiții (27).
Forma vegetativă rezultă, prin multiplicare, din sporoplasma și nucleii transferați din spor în citoplasma enterocitelor. Organitele citoplasmatice ale microsporidiei sunt reprezentate de ribozomi și un REG slab dezvoltat, care sunt conectate la citoplasma celulei gazdă. Din acest motiv, Nosema spp. utilizează energia rezultată din metabolismul celulei gazdă (9).
Înmulțirea microsporidiei Nosema ceranae , ca de altfel și a N. apis, se face prin diviziune directă (fig. II.3.1.1.). Doza minimă infectantă (DL50) la Nosema ceranae este de 100 spori/albină. În infecțiile supra-acute ciclul biologic se încheie în 2 – 3 zile, iar formele vegetative predomină față de cele sporulate. În formele acute ciclul vital are o durată de 6 – 7 zile (40). Gravitatea infecției depinde de numărul de spori ingerați și de acțiunea altor factori stresanți (34) sau toxici, de natură chimică (1). Cu cât doza infectantă este mai mare cu atât mai gravă este evoluția bolii [34].
N. ceranae provoacă stres energetic albinelor infectate, și sunt speculații că aceast proces ar putea fi motivul principal pentru supraviețuirea redusă a albinelor infectate.
Martin-Hernández și colab. (2011) (citați de 27) au comparat consumul energetic la ambele specii de Nosema și au constatat că mortalitatea și consumul energetic sunt mai ridicate în infecțiile cu N. ceranae.
În celula gazdă, stadiile de dezvoltare ale N. ceranae sunt: meront, sporont, sporoblast și spor matur. Sporii au forme asemănătoare la cele două specii (N. ceranae și N. apis), însă diferă din punct de vedere genetic și al dimensiunii lor, prcum și al numărului de spire ale filamentului polar). Asemănări genotipice sunt între N. cerane și N. vespula, pe de o parte, și între N. apis și N. bombi, pe de altă parte (8).
Nosema cerane nu este parazit obligatoriu pentru un anumit tip de celulă, așa cum este N. apis. După ingestie, sporii microsporidiei Nosema ceranae se multiplică în enterocite, în celulele tuburilor Malpighi, în celulele glandelor hipofaringiene, în celulele glandelor salivare și în cele ale corpului gras [8]. În intestin, după penetrarea și distrugerea enterocitelor, N. ceranae atacă și celulele stratului bazal. Sunt create astfel porți de intrare pentru virusuri, fungi și bacterii patogene (40). Acest politropism are repercursiuni severe asupra organismului albinei parazitate. Sunt afectate funcțiile digestive, excretorii și imune, metabolismul este perturbat și apar astfel produșii toxici care determină intoxicația organismului și imunosupresie, creșterea titrului hormonului juvenil (cu rol în maturizarea albinelor) și reducerea secreției de vitelus (27).
Epidemiologie
Sursele de infecție sunt reprezentate de albine și mătci bolnave, mierea, apa, ceara, polenul contaminate (26), ramele și stupii, uneltele folosite în stupină, materialul biologic importat etc., iar calea de pătrundere a microsporidiei în organism este cea digestivă.
Factorii care influențează dezvoltarea și virulența N. ceranae sunt temperatura ambientală și cea din stup, aglomerația din stup la schimbarea masivă a generațiilor din primăvară, pesticidele etc. În mod normal, temperatura din colonia de albine oferă condiții ideale pentru înmulțirea microsporidiei. Sunt studii care arată că N. ceranae se dezvoltă bine la 25ș C, față de N. apis și pe culturi celulare de mamifere, la 37ș C. Ultimul aspect este îngrijorător, în perspectiva adaptării microsporidiei N. ceranae la om (40).
Infecțiile cu N. cerane apar în tot cursul anului, însă sunt mai des întâlnite primăvara (22,4% – 35,4%), în timp ce toamna incidența bolii scade la 5,2% – 12,7% (25).
Factorii variați de stres acționează sinergic și creează predispoziție la îmbolnăvire prin supresarea sistemului imun (5).
O altă cauză a gravității afecțiuniii, produsă de N. ceranae, este exacerbarea virulenței la trecerea pe alte specii sau rase de albine, fenomen favorizat de amplificarea circulației produselor, animalelor și oamenilor, pe plan internațional. Un studiu efectuat în Finlanda, în anul 2007, arată că ponderea infecțiilor cu N. apis a scăzut în raport cu cele mixte (N. apis + N. ceranae) și s-a diminuat considerabil față de infecțiile unice cu N. ceranae, iar rata pierderilor prin mortalitate a fost de 8% în infecțiile cu N. apis și de 44% în cele cu N. ceranae (42).
Simptomatologie și modificări anatomopatologice
Nosemoza produsă de Nosema ceranae evoluează cu frecvență mai mare vara, însă, de obicei, este semnalată tot timpul anului.
Rareori se observă semne clinice de boală în nosemoza produsă de N. ceranae, deoarece albinele bolnave mor în scurt timp de la debutul bolii, iar populația de albine adulte din colonie scade. Astfel, se reduce producția de miere (23).
Comportamentul albinelor se schimbă; ies din stup, în căutarea hranei, pe timp nefavorabil (temperaturi scăzute), iar dacă li se dau suplimente de hrană, acestea se îneacă în hrănitori. Regina unui stup afectat de boală, nu este receptivă la infecția cu Nosema ceranae (40).
Nosema ceranae are tropism pentru celulele tubului digestiv, glandele anexe ale aparatului digestiv, tuburile Malpighi și corpul gras. Infecția glandelor hipofaringiene determină atrofia acestora, proces care duce la scăderea secreției lăptișorului de matcă. Acest fenomen se răsfrânge negativ asupra hrănirii puietului și reginei, iar afectarea corpului de grăsime determină degenerescența chistică și scăderea, până la pierderea completă a funcției imune (9).
Pierdirile prin mortalitate, în experiențele efectuate în Spania (26), sunt foarte mari (între 94,1% și 100%), după 7 – 8 zile de la inocularea microsporidiei.
Tratament
Fumidilul B conține diciclohexilamoniu fiind un produs de metabolism al micetului Aspergilus fumigatus. Acționează asupra paraziților prin blocarea replicării ADN-ului. Fumagilina este activă în nosemoza produsă de N. apis și mai puțin în cea produsă de N. ceranae (59).
Combatere și profilaxie
Infecția cu Nosema ceranae poate fi limitată prin următoarele măsuri organizatorice:
supravegherea importurilor și tranzitului de material biologic și produse apicole;
monitorizarea coloniilor de albine prin examene de laborator periodice efectuate în conformitate cu programul acțiunilor de supraveghere, prevenire, control și eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului;
supravegherea circulației coloniilor de albine și a produselor apicole în interiorul granițelor țării;
instituirea carantinei și aplicarea măsurilor de combatere specifice, în cazul descoperirii de îmbolnăviri cu Nosema ceranae;
administrarea unui sirop de zahăr în combinație cu extract apos de plante medicinale, pentru creșterea rezistenței la îmbolnăviri (vezi cap. I.5).
congelarea inventarului apicol și a fagurilor disponibili în timpul iernii distruge formele de rezistență ale microsporidiei N. ceranae! (40)
II.3.2. Arahnoze
II.3.2.1. Acarapioza
Acarapiosis
Maladie de “I'ile de Wight”
Acarapioza, este o boală a albinelor adulte tinere (albinele lucrătoare, matca și trîntorii), în vârstă de până la 9 zile, cauzată de un parazit tarsonemid microscopic (Prostigmata) care parazitează în traheea acestora, denumit Acarapis woodi (g. akari = molie, acarian, apis =albină), sinonim Tarsonemus woodi (19).
Istoric, răspândire și importanță
Acarianul Acarapis woodi, a fost semnalat la Apis melifera în Anglia în anul 1904 și a fost descris în anul 1921 de către Rennie. La scurt timp a fost identificat în Europa continentală și apoi în toate continentele, cu excepția Australiei. Morse a semnalat prezența acestui acarian în sudul Texasului în anul 1984 și de atunci până în anul 1994 cel puțin jumătate din populațiile de albine din SUA au pierit. În România nu este încă semnalat.
Parazitismul cu A. woodi duce la scăderea producției de miere, la moartea albinelor, mai ales în timpul iernii, prin perturbarea formării ghemului de iernare (13) și la evoluția bolilor virale paralizante (52).
Etiopatogenie
Din punct de vedere sistematic, Acarapis woodi este încadrat în încrengătura Artropoda, clasa Arachnida, ordinul Acarina, genul Tarsonemidae (19).
Acarapis woodi, are aproximativ 150 µm lungime. Spre deosbire de ceilalți reprezentanți ai genului Acarapis, respectiv Acarapis dorsalis și Acarapis externus, ectoparaziți ai albinelor fără importanță patogenă, Acarapis woodi este deosebit de patogen. Diferențierea celor trei specii ale genului Acarapis se face după unele caractere morfologice; crestătura scutului coxal este întinsă, comparativ cu A. dorsalis și A. externus la care aceasta este adâncă, respectiv scurtă, distanța dintre cele 2 stigme este mai mică și anume 13,9 µm, față de 16,7 µm la A. dorsalis și A. externus, iar lungimea tarsului (perechea IV de picioare, parazit femelă) de 7,5 µm, spre deosebire de 7,6 µm la A. dorsalis și 11,4 µm la A. externus.
Acarapis woodi, este un endoparazit al sistemului respirator, trăiește și se reproduce cu predilecție în traheea principală prototoracică a albinei. Uneori pot fi găsiți și în capul, toracele sau sacii aeriferi abdominali.
După moartea albinelor, durata de viață a paraziților este de aproximativ o săptămână.
Ciclul biologic are loc în interiorul traheei albinelor adulte, unde femela parazitului poate depune 5-20 ouă. Oul se transformă în larvă, apoi în nimfă și adult. Din această pontă eclozează de 2-4 ori mai multe femele decât masculi. Dezvoltarea durează 11-12 zile pentru masculi și 14-15 zile pentru femele.
Acarapis woodi se hrănește cu hemolimfă, care este singura lor sursă de hrană, în mediul exterior nerezistând mai mult de 48 de ore. Accesul la hemolimfă se face prin înțeparea pereților traheali cu ajutorul aparatului bucal, care este prevăzut cu mijloace pentru înțepat și supt. Dacă numărul acarienilor este prea mare, iar sursa de hrănă scade, femelele părăsesc traheele albinei gazdă, se agață de perișorii cuticulari, după care trec pe altă albină și se localizează în traheele acesteia.
Efectele patogene depind de numărul paraziților existenți în interiorul traheei și sunt datorate leziunilor mecanice și perturbărilor fiziologice consecutive obstrucției canalelor aerifere, depunerilor de melanină pe pereții traheali, leziunilor peretelui traheal și pierderilor de hemolimfă. Când populația paraziților crește, pereții traheali care normal sunt albi și translucizi, devin opaci și se decolorează, iar pe suprafața lor apar mici pete negre, zone ce sunt probabil datorate depozitelor de melanină.
Epidemiologie
Boala apare în general primăvara devreme. Răspândirea infecției se realizează de la o albină la alta, prin contact direct. În general, sunt sensibile la boală albinele tinere mai mici de zece zile, la care acarianul pătrunde mai ușor, deoarece lumenul stigmelor este mai mare, iar perișorii de protecție sunt mai rari.
Mortalitatea determinată de acarapioză, poate crește până la valori apreciabile.
Transmiterea parazitului de la o colonie infestată la alta sănătoasă și de la stupină la stupină se face prin intermediul albinelor hoațe, trântori, material biologic infestat, achiziționat clandestin, roiuri provenite de la stupine necunoscute sau prin manevre apicole obișnuite.
Au fost semnalate și familii de albine rezistente la infestarea cu A. woodi, la care auto și alotoaletarea, determină îndepărtarea paraziților de pe corpul gazdelor, comportamentul fiind determinat genetic ( 13).
Activitatea A. woodi variază în funcție de temperatură. La 15°C se mișcă lent, la 30-40°C mișcările sunt normale, iar peste 40°C este foarte activ și moare în absența hranei (13).
În zonele în care anul are patru anotimpuri, iar pe timpul iernii coloniile supraviețuiesc în ghemul de iernare, paraziții trec foarte ușor de la o albină la alta, astfel că se poate produce îmbolnăvirea întregii familii de albine; în starea de semihibernare și imunitatea socială și cea individuală sunt reduse. Acest proces determină moartea albinelor infestate, la începutul primăverii, iar albinele tinere, nou eclozate, vor fi colonizate de acarienii rămași fără gazdă. În acest mod coloniile de albine parazitate dispar.
Simptomatologie și modificări morfopatologie
Evoluția bolii este influențată de numărul acarienilor prezenți în aparatul respirator; un număr mic de acarieni determină o evoluție inaparentă, trenantă, iar un număr mare de paraziți face ca boala să aibă manifestări acute. Traheele sunt obturate, iar produșii de metabolism toxici, eliminați în aparatul respirator al albinelor, determină manifestarea clinică a parazitozei.
Acarapioza evoluează clinic iarna și la începutul primăverii, fiind influențată de vârsta albinelor și de sezon.
Manifestările timpurii ale infecției, în mod normal trec neobservate, exceptând o ușoară depopulare a familiilor de albine. Numai când infestația este puternică, semnele clinice de boală devin vizibile. Ele apar de obicei primăvara timpuriu, după iernare, când paraziții cresc și se multiplică nestingheriți în albinele lucrătoare care au hibernat.
Datele clinice nu sunt specifice, albinele manifestând aceleași simptome ca și în multe alte boli sau în tulburările de metabolism: depopularea familiei de albine, abdomen mărit în volum, semne nervoase, diaree, aripi destinse asimetric, dificultăți de zbor; mișcările albinelor parazitate sunt încetinite, cad și se târăsc în fața urdinișului și se urcă pe firele de iarbă fără să poată zbura (43).
Iarna, prin perturbarea ghemului, apare consumul exagerat de miere și diareea. Vara, familiile parazitate au tendința de a forma roiuri. Efectele asupra albinei depend de numărul de paraziți din trahee și sunt atribuibile atât injuriilor mecanice, cât și perturbărilor fiziologice consecutive obstrucției căilor aerofore, lezării peretelui traheal și depleției hemolimfei.
La începutul îmbolnăvirii, traheele își păstrează culoarea, structura și elasticitatea, însă pe măsură ce boala se învechește, iar infestația capătă accente dramatice, traheele își schimbă textura și culoarea, probabil din cauza impregnărilor melanice (13).
Diagnostic
Diagnosticul acarapiozei se pune prin examinarea traheelor albinelor din colonii suspecte de boală. Vizualizarea paraziților este mai ușoară la albinele bătrâne care au mai mulți paraziți, însă, în general, culoarea neagră a traheelor este suficientă pentru stabilirea diagnosticului.
Se pot recolta probe de mătci, trântori sau albine lucrătoare, dar Acarapis parazitează preferențial trântorii. Perioada optimă de recoltare a probelor este la începutul primăverii sau la sfârșitul toamnei (pentru emisfera nordică) când populația de Acarapis woodi este maximă.
Acestea sunt în principal albine care se târăsc, sunt incapabile de zbor și se găsesc într-o zonă de până la aproximativ 3 m în fața urdinișului.
Pentru diagnostic se poate utiliza și testul imunoenzimatic (ELISA). Acest test poate să dea rezultate fals-pozitive și este recomandat numai pentru examenele de supraveghere.
O altă metodă este cea de determinare a guaninei, produs de dezasimilație, azotat, specific parazitului.
Tratament, prevenire și combatere
Preparatele folosite sunt Folbex sau P.K., posologia fiind cea din prospectul atașat fiecărui produs.
Cristalele de mentol sau pulverizările uleioase făcute cu ulei vegetal (nu cu grăsimi animale) și cu zahăr granulat alb pot menține nivelul parazitismului sub control.
Eficiente sunt fumigațiile și volatilizarea cu amitraz / mentol (52).
Tratamentul medicamentos trebuie asociat și cu măsuri preventive (vezi cap. I.5.). În cazul apariției bolii sunt indicate măsurile radicale de stopare a infestației, în sensul distrugerii familiilor de albine parazitate și instituirea tratamentului profilactic în toate stupinele din zona respectivă.
II.3.2.2. Varooza
Varrooza se caracterizează prin adinamia albinelor adulte, diminuarea activității de hrănire, oprirea pontei la matcă, mortalitate mare primăvara, toamna și iarna, zbor dificil care ulterior devine imposibil (19).
Istoric, răspândire și importanță
Varroa jacobsoni a fost descoperită în anul 1904 în insula Java, de către E. Jacobson. În Europa, prima semnalare a varroozei a fost făcută în anul 1967.
În ultimul deceniu peste 90% din țările în care se cresc albine se confruntă cu probleme grave generate de evoluția acestei boli, determinate de spolierea familiilor de albine și consecutiv favorizarea apariției unor boli bacteriene, precum și de răspândirea unor boli virale (17).
În România 100% din județe sunt afectate de varrooză. Dinamica evoluției focarelor este determinată de: neefectuarea tratamentelor specifice de combatere; neasigurarea necesarului de medicamente specifice de prevenire și combatere la nivelul fondului apicol existent; costul ridicat al tratamentelor complete; nerespectarea măsurilor obligatorii de igienă și sanitare veterinare.
Etiopatogenie
Genul Varrora cuprinde cel puțin 4, dar posibil 7 specii: Varroa jacobsoni, Varroa destructor, Varroa underwoodi, Varroua rindereri. Ele sunt morfologic distincte, se reproduc izolat și prezintă diferențe de specificitate de gazdă și distribuție geografică (13).
În acest sens, Apis koschevnikovi este parazitată de Varroua rindereri, Apis cerana de Varroa jacobsoni și Varroa destructor, iar Apis mellifera de Varroa destructor.
Varroa jacobsoni, este un acarian care atacă albinele adulte și puietul, hrănindu-se cu hemolimfă. Temporar sau acidental poate ataca și viespidele. Este un acarian mesostigmat din familia Laelaptifae, Gamasoidea, cu corpul rotunjit și bombat pe fața dorsală. Aparatul bucal este adaptat pentru înțepat și supt .
Masculul este mai mic decât femela, măsoară 0,90 x 0,80 mm (mai lung decât lat) și are culoare gălbuie, iar după împerechere dispare din colonia de albine.
Femela acarianului Varroa destructor are o durată medie de viață de 2,5-3,5 luni și măsoară 1,5 mm lungime și 1,75 mm lățime, corpul este plat (este mai lată decât lungă), înveliș chitinos de culoare maro – roșcat, acoperit cu peri, are 4 perechi de picioare și aparat bucal pentru înțepat și supt. Membrele se termină cu ventuze voluminoase. Un segment al aparatului său genital este reprezentat de spermatecă în care sunt conservați spermatozoizii, fecundarea ovocitelor realizându-se în camera spermatică atașată ovarului unic (podospermie).
Fecundarea are loc o singură dată, acuplarea permițând transferul a 44 de spermatozoizi în spermatecă, unde sunt stocați, conținutul spermatecal rămânând neschimabat pe parcursul întregului an. În comparație cu alte insecte, fecundarea ovocitului este făcută doar de un spermatozoid, potențialul reproductiv depinzând în special de numărul de spermatozoizi din spermatecă și de ovocite, eșuarea procesului de fecundare determinând o reducere a duratei de viață, deoarece în comparație cu alte specii, femelele de V. destructor, nu sunt capabile să producă descendenți prin partenogeneză (2).
Oul este oval, albicis, de 0,63x 0,45 mm și are coaja subțire. Larva este rotunjită, hexapodă, albicioasă și de 0,50 mm. Nimfa, octopodă, albicioasă, măsoară de la 0,60 până la 1,10 mm lungime și 0,60 mm la 1,60 mm lățime (19).
Ciclul de reproducție se poate desfășura în două faze: de foreză, neobligatorie, cu durată variabilă și de înmulțire, a cărei durată este dependentă de particularitățile de reproducere ale gazdei.
Ouăle sunt depuse de femele fondatoare, fecundate pe suprafața pereților celulelor căpăcite ale lucrătoarelor (5-6 ouă) și ale trântorilor (6-7 ouă) și în mod excepțional în celule ale reginelor, într-un ritm de un ou/30 ore, numărul ouălor depuse de o femelă fondatoare de V. destructor, fiind de aproximativ de 30 în cursul vieții acesteia. După 60-70 ore de la operculare din primul ou depus eclozează un acarian mascul (haploid, dintr-un ou nefecundat, prin partenogeneză arhenotohă), iar din următoarele , femele (diploide, din ouă fecundate).
În celule, formele imature mobile ale parazitului se hrănesc cu hemolimfa nimfei, prin orificul perforat în cuticula gazdei de acarianul femelă.
După ce părăsește celula, acarianul femelă trece pe albinele lucrătoare, trântori și matcă, unde se hrănește cu hemolimfa acestora, fapt ce determină debilitate și moarte prematură. Femela se fixează atât pe torace, pe abdomen (inserțiile cap-torace, torace-abdomen, baza aripilor și membranele dintre tergitele abdominale) cât și pe membre.
Patogenitatea acarianului se manifestă prin acțiuni mecanice, iritative, spoliatorie și ca vector al unor agenți patogeni, în special virusuri (18).
Epidemiologie
Transmiterea interfamilială se bazează pe culegătoare rătăcite, schimb de rame, trântori rătăciți, furtișag, roire, divizare și/sau unire a familiilor și în general pe orice manoperă apicolă, care presupune transportul pasiv, neintenționat al acarianului de la o familie infestată la alta neinfestată.
Transmiterea între stupine se realizează prin comerțul cu roiuri, prinderea de roiuri cu origine necunoscută, prin contacte florale, transhumanță, trântori rătăciți și prin orice alte manvre apicole și comerciale, care pot asigura supraviețuirea femelelor de Varroa un anumit timp.
Evoluția bolii reprezentă una dintre cele mai mari probleme cu care se confruntă apicultura, aceasta cauzând depopularea familiilor de albine, scăderea potențialului productiv și mortalitate crescută.
Aspectele menționate, precum și practicarea stupăritului pastoral în aglomerări temporare de stupine cu situații epidemiologice diferite, duc la menținerea focarelor de boală și reinfestarea permanentă (35).
Infestarea poate declanșa unele viroze, preponderent la sfârșitul sezonului apicol, care induc scăderea imunității gazdei și evoluție clinică gravă și moartea albinelor. Astfel virusul paraliziei acute (ABPV), virusul paraliziei cronice (CBPV), virusul paraliziei lente (LPV), virusul botcilor negre (BQCV), virusul aripilor deformate (DWV) sau virusul de Kashmir (KBV), pot evolua la albine concomitent cu infestarea realizată de acest parazit, pătrunderea virusurilor realizându-se prin rănile produse la nivelul cuticulei albinelor (2).
Simptomatologie și modificări anatomopatologice
Varrooza evoluează inaparent, până când infestarea devine masivă și duce la moartea familiei de albine.
Albinele parazitate prezintă stare de agitație ca urmare a acțiunilor mecanice ale parazitului și spolierii de hemolimfă. Această stare, determină albinele să consume mai multă miere și astfel se produce supraîncărcarea intestinului și declanșarea diareei. O mare parte din albinele tinere, eclozate din puietul puternic infestat, sunt neviabile, cu aripi nedezvoltate, subponderale, cu malformații ale abdomenului și picioarelor, fiind incapabile de zbor. Acestea cad de pe faguri și sunt evacuate din stup de către albinele sănătoase. Când procentul de albine infestate depășește 20 – 30% dintre acestea, colonia slăbește și moare, astfel că la patru ani de la pătrunderea în familia de albine a unui acarian, stupina se autodesființează.
Consecutiv infecției virale se constată pierderi în greutate, hipoproteinemie, transformări morfologice externe cum ar fi aripi deformate și/sau scurtarea abdomenului, involuția gladelor hipofaringiene, modificări comportamentale și reducerea duratei de viață a albinelor (2).
Diagnostic
Încărcătura parazitară a unei colonii de albine o putem determina prin prelevarea de probe și trimiterea acestora la un laborator autorizat și acreditat, precum și prin observații clinice în stupină. Principalele metode de determinare a gradului de infestare cu Varroa a coloniilor de albine sunt observațiile pe fundul antivarroa, tratamentele de control cu acaricide, observațiile pe puietul de trântor și controlul pe albinele vii (18).
Metoda observațiilor pe fund antivarroa este una dintre cele mai importante, fundul antivarroa având rolul de a colecta acarienii căzuți de pe albine, de a reține larvele de insecte, în special moliile, precum și toate resturile care se îndepărtează sau cad în interiorul acestuia. Fundul antivarroa favorizează în același timp eliminarea dioxidului de carbon în timpul iernii și o ventilație corespunzătoare în timpul transporturilor din perioada de stupărit pastoral.
Pentru evaluarea gradului de infestare se utilizează o hârtie lipicioasă de culoare albă care se depune pe tăvița metalică a fundului antivarroa, permițând astfel numărarea cu o frecvență zilnică a paraziților căzuți pe suprafața acesteia.
Căderile naturale de acarieni, permit evaluarea gradului de infestare parazitară a unei colonii de albine pe parcursul celor 3 luni de sezon activ, respectiv 15 mai – 15 august.
Observațiile pe puietul de trântor, se realizează prin descăpăcirea acestuia, putând determina vizual procentul de infestație la 100 de celule. Procentul se corelează cu suprafața de puiet de trântor existent, folosind factorul de multiplicare cu 10 pentru a determina numărul total de acarieni din colonie. Dacă procentul este mai mare de 4% prin raportare la cantitatea de albină din stup (în jur de 40.000), se impune aplicarea de urgență a tratamentului.
Metoda de control pe albine vii, se realizează prin recoltarea unui număr de aproximativ 200 de albine cu ajutorul unui aspirator sau mai simplu prin scuturarea acestora într-o pungă. În stupină, metoda de diagnostic se poate realiza prin congelarea sau uscarea albinelor, iar în funcție de numărul de paraziți căzuți la o sută de albine, se poate stabili procentul de infestare (18).
În afara acestor patru metode care se pot utiliza în stupină , se efectuează și examene de laborator în conformitate cu prevederile programului acțiunilor de supraveghere, prevenire și control al bolilor la animale, al celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului (51).
Pentru examenul de laborator se prelevează o probă de 25 g de albine vii din stup ori 25 g de albine moarte de pe planșeul stupului ori un fragment de 10/15 cm fagure cu puiet căpăcit de trântor sau de albină lucrătoare ori o ramă întreagă cu puiet căpăcit sau detritus de pe planșeul stupului (50).
Metodologiile de diagnostic prin examene de laborator sunt:
examinarea puietului căpăcit prin tehnica spălării cu apă;
examinarea reziduurilor de pe planșeul stupilor prin tehnica flotației în alcool etilic;
examinarea microscopică a detritusului de pe planșeul stupului;
examinarea albinelor prin tehnica spălării cu alcool; amestecul se agită puternic 1500 rpm timp de 30 de minute;
examinarea prin tehnica spălării cu soluție de detergent 0,1%;
metoda centrifugării uscate a albinelor adulte;
metoda detectării paraziților din fagure cu nectar și miere căpăcită; se utilizează 50 g miere în 20 ml apă distilată și filtru cu pompă de vid Buchner;
metoda identificării paraziților din fagurii cu polen; fragmentele de 5/10 cm sunt imersați în alcool de 40°, centrifugați la 250 rpm timp de 30 de minute, urmată de filtrarea amestecului (52).
Diagnosticul diferențial se face față de parazitismul cu Braula coeca și față de tropilelapsoză.
Tratament
Măsurile care se impun sunt corelate cu gradul de parazitare în funție de căderile zilnice identificate, dup cum urmează:
căderi cuprinse între 0 – 8 acarieni, gradul de parazitare slab (sub 100 de acarieni), impunându-se repetarea controlului;
căderi cuprinse între 8 – 15 acarieni, gradul de parazitare moderat (100 – 1000 acarieni), impunându-se instituirea tratamentului;
căderi cuprinse între 15 – 30 acarieni, gradul de parazitare mare (1000 – 2000 acarieni), impunându-se instituirea unui tratament imediat;
căderi mai mari de 3000 de acarieni, gradul de parazitare critic (peste 2000 acarieni), impunându-se instituirea unor măsuri complexe de combatere.
Dacă însă se înregistrează căderi naturale de acarieni în timpul iernii și numărul acestora este mai mare de un acarian la două zile, se impune un tratament de urgență în ghemul de iernare cu utilizarea unei substanțe pretabile momentului, altfel colonia putând pierii până la sfârșitul sezonului (18).
La efectuarea tratamentului trebuie să se ia în considerare factorii esențiali care determină dinamica populației de acarieni din colonia de albine (12).
Pentru combaterea varoozei, s-au încercat diferite metode dar s-a ajuns la concluzia că nu poate fi realizată o eradicare reală, deoarece niciunul dintre acaricidele întrebuințate nu are eficiență de 100% și posibilitățile de refacere a populației de acarieni sunt reale (13).
Tratamentul varroozei se poate face cu multe substanțe acaricide. Cele mai utilizate acaricide, pe plan mondial sunt fenotiazina, acidul formic, acidul lactic, timolul, camforul, uleiul de eucalipt, clorbenzilatul, brompropilatul, cumafosul (Perizin, CheckMite), cimiazolul, amitrazul (Varrachet), Bipin, cianpiretrinoidul de sinteză, fluvalinatul (Apistan, Klartan și Mavrik), flumetrin (Bayvard). Un acaricid nou este carboxamidul (Tubufenpyrad). Este prezentat sub formă de bandelete de plastic integrate. Are activitate varroocidă remarcabilă dar și impact negativ asupra coloniei de albine.
Pentru evitarea rezistenței, care este semnalată din ce în ce mai frecvent, se impune folosirea de substanțe care se găsesc în mod natural în stup: acidul oxalic, acidul formic, acidul lactic și clorurile volatile. Preparatele pe baza acestor substanțe și care se comercializează în prezent sunt: Apiquard, Api-Life-Var, Thimovar, Thymomite, Bee-Vital, Mite-A-Thol, Mite Away II (13).
În România, infestația cu V. destructor a fost tratată mult timp cu Sineacar și Arahnol, în prezent fiind utilizate Varachetul (pe bază de amitraz), Mavrirolul, Apistanul, Fluvirol C (pe bază de fluvalinat) și BeeVital-ul (pe bază de uleiuri eterice) (12).
Modul de administrare al acestor produse este prezentat în prospectul fiecărui produs. Uneori, din cauza supradozării amitrazului se pot produce intoxicații (vezi cap. II.5), consecințele fiind dezastroase pentru apicultor. Amitrazul este eficient, sub formă de fumigație și în parazitismul cu Acarapis woodi.
Flavulinatul, piretroid de sinteză, este de asemenea folosit frecvent ca acaricid, mai multe produse comerciale având ca substanță activă flavulinatul: Apistan, Klartan și Navrik. Și aceste acaricide sunt însoțite de prospect, obligația apicultorului fiind să respecte doza prescrisă și perioada de aplicare a tratamentului.
Produsul Klartan 20 EW soluție 4‰ a fost testat prin impregnarea diferitelor materiale absorbante (lemn, furnir, carton), observându-se că suportul de carton absorbant cu o anumită textură, reține cea mai mare cantitate de flavulinat. S-a observat că prin umezire, la un anumit interval de timp, plăcile de carton sunt descuamate și eliminate din stup, favorizând astfel contactul acestora cu substanța activă. În contact cu placa impregnată cu acaricid, s-a constatat că albinele rețin substanța activă, iar prin schimbul de hrană aceasta este difuzată în toată colonia. Astfel paraziții Varroa sunt eliminați progresiv pe măsură ce albinele eclozează.
Utilizându-se flavulinatul, s-a constatat că ponta mătcii a fost normală, aspectul general al puietului a fost corespunzător (compact) și bine dezvoltat, nu s-au observat modificări de comportament ale coloniei, iar evoluția coloniei de albine a fost bună. În ceea ce privește decelarea prezenței acarianului în colonia de albine în ziua I post-tratament pe dispozitivul de control, au fost prezenți acarieni în număr mare și vii, iar din punct de vedere al prezenței parazitului pe larve de puiet căpăcit, au fost observați unul sau mai mulți paraziți în aproape fiecare celulă cu puiet căpăcit. În zilele 14 și 28 au fost prezenți numeroși acarieni morți și în celulele cu puiet parazitat dar în număr nesemnificativ, iar în ziua 42 au fost prezenți acarieni morți , celule rare cu puiet căpăcit (5-6 pe o latură a ramei) cu albine neeclozate, cu malformații ale aripilor, acarieni lipsă sau morți (18).
BeeVital Hive Clin (BVHC), are o acțiune antiparazitară remarcabilă fiind un produs pe bază de acid oxalic. În urma studierii comportamentului de autodeparazitare la Apis mellifera carpatica împotriva acarianului Varroa destructor, în 5 colonii de albine dintr-o stupină experimentală, acestea au relevat existența unei conexiuni directe între tratamentele cu BVHC aplicate sub formă de picătură și intensificarea comportamentului de autodeparazitare (10).
Tratamentul trebuie să fie organizat și susținut, fiind necesar să se trateze toate familiile dintr-o stupină și toate stupinele pe o rază de cel puțin 1 km (52).
În Franța, în mod tradițional, se realizează unul sau mai multe tratamente suucesive cu acaricide, la jumătatea lunii august, cu scopul reducerii rapide a populației de acarieni la mai puțin de 50 de exemplare într-o colonie, în timpul hibernării, obținându-se astfel generații de albine sănătoase, atât prin scăderea nivelului de infestare, cât și a infecției virale globale.
Medicamentele autorizate și utilizate sunt în număr de șase, având o acțiune remanentă, urmărindu-se acoperirea mai multor cicluri de depunere a ouălor, efectele fiind limitate în principal din cauza lipsei de eficacitate cât și a instalării chimiorezistenței (Tau – flu – valinat, amitrază și thymol).
Având în vedere gravitatea acestei boli și amplificarea fenomenelor de rezistență care limitează acțiunea produselor acaricide disponibile, se impune dezvoltarea unor noi metode prin care această boală să fie controlată. Rezultate încurajatoare sunt obținute prin folosirea unor sușe de albine selecționate în ceea ce privește capacitatea lor de menținere a igienei stupului, de a identifica și vizita fagurii parazitați și întreruperea ciclului biologic al parazitului, favorizând astfel scăderea ratei de parazitare (2).
Profilaxie și combatere
Măsurile de combatere pot fi grupate în: metode biologice și biotehnice, metode fizice și mecanice și metode chimice.
Selecția genetică a albinelor pentru factorul care inhibă reproducerea acarianului pe puietul de lucrătoare, pare o cale ideală, dar până acum în albina europenă nu a fost găsit acest caracter ca fiind dominant genetic.
Există mai multe metode de combatere a puietului de trântor cu Varroa:
prin căldură;
prin îndepărtarea ramelor capcană;
prin detașarea fragmentelor cu celule de trântor căpăcite sau descoperite (când populația de Varroa este redusă);
prin ridicarea temperaturii la 42°C pentru scurt timp când acarienii mor dar este afectat puietul de albină.
S-au mai încercat și metode combinate care constau în administrarea de acaricide în cadrul unor metode tehnologice.
În Franța, varroza se regăsește în lista bolilor catalogate cu gravitate sanitară veterinară de gradul II (2).
Cunoașterea reală a încărcăturii parazitare și combaterea bolii sunt măsuri necesare pentru păstrarea echilibrului biologic al unei colonii infestate (17, 18).
3.2.3. Tropilelapsoza
Este o boală parazitară produsă de acarienii Tropilaelaps clareae și Tropilaelaps koenigerum, care parazitează puietul de albine și determină apariția de puiet malformat, moartea albinelor și consecutiv depopularea coloniei sau părăsirea stupului de către albinele lucrătoare.
Istoric, răspîndire, importanță
Tropilaelaps clareae, descris pentru prima dată de Delfinadă și Baker în anul 1962, poate fi ușor răspândit la Apis mellifera. A mai fost diagnosticat pe A. cerana, A. florea, A. laboriosa. A apărut în Kenia (raportată dar neconfirmată), Afganistan, Bhutan, India, Nepal, Pakistan, China, Hong Kong, Indonezia, Korea de Sud, Malaezia, Myanmar, Filipine, Taiwan, Tailanda, Vietnam, Papua Noua Guinee (Matheson 1997 citat de 45).
Tropilaelaps koenigerum este cunoscut numai în Borneo, Sri Lanka, Nepal, Tailanda și Kashmir ca ectoparazit pe Apis dorsata și A. laboriosa (45).
Tropilelapsoza este o ectoparazitoză nesemnalată încă în România, dar care ar putea fi diagnosticată în viitor (13).
Etiopatogenie
Speciile de Tropilaelaps aparțin familiei Laelapidae (Mesostigmata).
Tropilaelaps clareae este ectoparazit pentru cinci specii de albine: Apis cerana, A. dorsata, A. florea, A. laboriosa și A. mellifera (45). Este un parazit alungit (aproximativ 1 mm lungime), de culoare brun-roșcată.
Tropilaelaps koenigerum este mai mic, având o lungime de aproximativ 0,7 mm.
Se reproduc prin ovoviviparitate, stadiile de dezvoltare succesivă fiind: larva, protonimfa, deutonimfa și adultul. Pentru dezvoltare are nevoie permanent de puietul de albină. Nimfele se hrănesc cu hemolimfa larvelor și nimfelor căpăcite. Adulții ies odată cu albinele nou-născute care de regulă nu pot ecloziona sau sunt deformate. Femelele adulte se atașează de albinele adulte și se hrănesc cu hemolimfa acestora, dar numai pentru două zile, ele nesupraviețuind în lipsa puietului de albină. În stupii infestați, puietul este neregulat distribuit pe faguri (13).
Ciclul de dezvoltare al parazitului durează aproximativ o săptămână, iar răspândirea acestuia este realizată de albine. Femela infestantă a parazitului Tropilaelaps depune 1-4 ouă pe larva albinelor cu puțin timp înainte de căpăcire. Tropilaelaps preferă puietul de trântor și acesta poate fi 100% parazitat, deoarece Tropilaelaps nu poate străpunge membrana tegumentară a albinelor adulte. Femelele parazitului care poartă ponta, mor după 2 zile în cazul în care nu pot depune ouăle.
Descendenții parazitului, de obicei un mascul și mai multe femele, se hrănesc și produc pagube serioase puietului de albine. Dezvoltarea parazitului are loc în aproximativ o săptămână. Adulții, inclusiv femela care a depus ouă, eclozează din celula cu puiet odată cu albina, pentru a parazita o nouă gazdă.
Ciclul de dezvoltare al parazitului de scurtă durată, precum și existența parazitului un timp redus pe albina adultă, explică de ce populația de T.clareae crește mai rapid decât cea a parazitului Varroa. În regiunile cu ierni lungi, în lipsa puietului de albină, supraviețuirea T. clareae nu este posibilă (Woyke, 1987 citat de 13).
Epidemiologie
Gazda naturală pentru ambele specii de Tropilaelaps este albina asiatică gigant: Apis dorsata, dar suplimentar T.clareae a fost colectat de pe A. cerana, A. florea, A. mellifera și A. laboriosa, în timp ce T. koenigerum apare numai pe A. laboriosa și A. dorsata.
Simptomatologie
Infestația cu Tropilaelaps este însoțită de apariția de puiet dispus neuniform și mortalitate la larvele de albine (până la 50%), din care cadavrele pot fi, parțial, ieșite din celule. Pot apărea numeroase albine malformate, cu abdomen distorsionat, aripi incomplete, apode sau cu picioare malformate. Unele dintre albinele afectate se târăsc în fața urdinișului.
Suplimentar, se pot observa celule cu căpăcele perforate, ce reprezintă rezultatul activității albinelor sanitare, care încearcă să elimine pupele sau albinele la eclozare, parazitate. În unele cazuri colonia infestată poate transmite parazitul într-un alt stup.
Diagnostic
Pentru diagnosticul tropilelapsozei, se prelevează o probă de fragment de fagure cu puiet căpăcit de 10/15 cm2 sau o ramă întreagă cu puiet căpăcit ori detritusul de pe fundul stupului (50).
Infestația cu Tropilaelaps, poate fi depistată prin examen macroscopic direct sau prin examinarea reziduului de pe fundul stupului. Se recomandă utilizarea unei lupe cu putere de mărire 10x, amândouă speciile de Tropilaelaps putând fi ușor de recunoscut.
Dispunerea neuniformă a puietului de albine, mort sau cu malformații de creștere, albine cu aripi malformate care se târăsc în fața urdinișului, și în special prezența în stup a paraziților de formă alungită, brun-roșcați, care se deplasează cu rapiditate, sunt elemente de diagnostic care indică prezența speciei T. clareae.
Un diagnostic timpuriu poate fi efectuat după descăpăcirea celulelor cu puiet și observarea paraziților adulți sau imaturi în interiorul acestora.
Diagnosticul de certitudine se poate stabili în cazul în care se folosește un acaricid, iar paraziții sunt colectați pe planșeul lipicios din lemn al stupului. Pentru aceasta se plasează pe fundul planșeului detașabil al stupului o altă planșă acoperită cu grăsime albă cu scopul de a colecta paraziții care se desprind de pe albine.
Alternativ se pot folosi benzi din hârtie de filtru pentru fumigații, preparate prin înmuierea acestora într-o soluție apoasă de 15% azotat de potasiu, la care se adaugă două picături de amitraz (de obicei 12,5 %). După aceea hârtia se usucă, benzile sunt aprinse, lăsate să fumege și ulterior inserate în stup. Fumul determină desprinderea multor paraziți de pe albinele parazitate. Observarea și numărarea paraziților poate fi efectuată macroscopic (61).
Diagnosticul diferențial trebuie făcut față de infestația cu Varroa destructor. Acarianul Varroa este mai mult lat decât lung și se deplasează mai lent, în timp ce Tropilaelaps are corpul alungit, prezintă un scut epiginal (sau haloventral) puternic chitinizat și se deplasează foarte rapid, fiind un parazit cu mobilitate mare.
Tratament
În țările în care s-a semnalat infestația cu T.clareae controlul asupra parazitului se realizează cu ajutorul fluvalinatului, în forme ușor de administrat, sau prin prăfuiri lunare cu sulf și tratamente cu acid formic.
Mai pot fi utilizate și alte acaricide cum ar fi amitrazul și cimiazole (53). Incapacitatea acestui parazit de a se hrăni pe albinele adulte sau de a supraviețui în afara puietului căpăcit mai mult de câteva zile poate constitui principiul unei metode biologice de control (61).
II.3.3. Bibliografie
Alaux C., Brunet J-L., Dussaubat Claudia, Mondet Fanny, Tchamitchan Sylvie, Cousin Marianne, Brillard J., Baldy Aurelie, Belzunces P.L. and Le Conte Y. (2010): Interactions between Nosema microspores and a neonicotinoid weaken honey bees (Apis mellifera). În: Envirion Microbiol., 12(3), 774-782;
Anton Aurelia, (2015): Particularitățile reproducerii la acarianul Varroua destructor – agentul varoozei la albinele domestice. Traducere din Buletin de L'Academie Vétérinaire de France Tom 167, nr. 4/2014. Jurnalul Medical veterinar nr. 126;
Asiminei S., Ursachi Gabriela, Merticariu Ștefania, (2003): Cercetări privind unele aspecte histopatologice în Nosemoza albinelor. Revista Română de medicină veterinară, Vol 13, Nr. 3-4, pag. 384;
Asiminei S., Șpac A.F., Hrițcu A., (2003): Pelinul – plantă medicinală utilă în prevenirea și combaterea nosemozei la albine. Revista Română de Medicină Veterinară, vol. 13, nr. 3-4, pag. 384;
Aufauvre, J., Biron, D. G., Vidau, C., Fontbonne, R., Roudel, M., Diogon, M., Blot, N. (2012): Parasite-insecticide interactions: a case study of Nosema ceranae and fipronil synergy on honeybee. Scientific reports;
Bailey Leslie (1981): Patologia albinelor Academic Press, Anglia, traducere Aneta Mardare si Gabriela Chioveanu IDSA Bucuresti,1993;
Cersini Antonella, Antognetti Valeria, Conti Raffaella, Velletrani Fabiana, Formato G., (2015): First PCR isolation of Crithidia mellificae (Euglenozoa: Trypanosomatidae) in Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) in Italy. Fragmenta entomologica, 47 (1): 45-49;
Chen, Y. P., Huang, Z. Y. (2010): Nosema ceranae, a newly identified pathogen of Apis mellifera in the USA and Asia. Apidologie, 41(3), 364-374;
Chen Y.P., Evans J.D., Murphy C.A., Gutell R., Zuker M., Gundersen-Rindal, D.E., Pettis, J.S. (2009): Morphological, molecular, and phylogenetic characterization of Nosema ceranae, a microsporidian parasite isolated from the European honey bee, Apis mellifera, J. Euk. Microb. 56, 142–147;
Chioveanu Gabriela, Dobre G., Dobrescu C., (2010): Evaluarea comportamentului de autodeparazitare la Apis melifera carpatica în urma tratamentului cu produsul Beevital Hive Clean. Revista Română de Parazitologie, Vol XX, Supliment pag. 20;
Chioveanu Gabriela, Didă I. C., Mardare Aneta, (2000): Actualități și perspective în prevenirea și combaterea varoozei. Supliment la Revista Română de Medicină Veterinară, vol 10, 3;
Chioveanu Gabriela, Mardare Aneta, Ionescu D., (2003): Supravegherea și combaterea integrată a acariozelor la albine. Revista Română de medicină veterinară, Vol 13, Nr. 3-4;
Cosoroabă I. (2014): Arachnoze la albine și viermi de mătase. În: Tratat de Mrdicină Veterinară. Coordonator: Constantin N., Editura RISOPRINT, Cluj – Napoca, pag. 1082 – 1096;
Cozma V, Șuteu I., (2003): Practicum Parazitologic Veterinar. Romvac;
Cozma V., (2014): Protozooze. În: Tratat de Mrdicină Veterinară. Coordonator: Constantin N., Editura RISOPRINT, Cluj – Napoca, pag. 147;
Dărăbuș Gheorghe, Moraru Sorin, Oprescu Ion, Mederle Narcisa, (2006): Parazitologie și boli parazitare. Editura Mirton Timișoara;
Dobre Gheorghe, Chioveanu Gabriela, Botta V., (2002): Date preliminare privind folosirea în combaterea varoozei la albine a piretroizilor (fluvalinat) pe suport de carton absorbant. Scientia parasitologica, 2002, 1, 118 -122;
Dobre Gheorghe, (2008): Aprecierea în stupină a gradului de parazitare cu Varooa. Revista lumea Apicolă, nr. 17;
Dulceanu N., Terinte Cristina, Mitrea L.I., Polcovnicu Carmen. (2000): Dicționar enciclopedic de parazitologie. Editura Academiei Române, ISBN 973-27-0761-1;
Dulceanu N., (1980): Coccidioze și alte sporozooze. Ed. CERES, București, pag. 10;
Fries I. (1989): Observation on the development and transmission of Nosema apis Z. in the ventriculus of the honey bee, J. Apic. Res. 28, 107–117;
Fries, I., Feng, F., da Silva, A., Slemenda, S. B., & Pieniazek, N. J. (1996): Nosema ceranae n. sp.(Microspora, Nosematidae), morphological and molecular characterization of a microsporidian parasite of the Asian honey bee Apis cerana(Hymenoptera, Apidae). European Journal of Protistology,32(3), 356-365;
Fries, I. (2010): Nosema ceranae in European honey bees (Apis mellifera). Journal of invertebrate pathology, 103, S73-S79;
Giersch T., Berg T., Galea F., Hornitzky M. (2009): Nosema ceranae infects honey bees (Apis mellifera) and contaminates honey in Australia, Apidologie 40, 117–123;
Gisder, S., Hedtke, K., Möckel, N., Frielitz, M. C., Linde, A., & Genersch, E. (2010): Five-year cohort study of Nosema spp. in Germany: does climate shape virulence and assertiveness of Nosema ceranae?. Applied and environmental microbiology, 76(9), 3032-3038;
Higes M., García-Palencía P., Martín-Hernández R., Meana A. (2007): Experimental infection of Apis mellifera honeybees with Nosema ceranae (Microsporidia), J. Invertebr. Pathol. 94, 211–217;
Huang Z., (2011): Effects of Nosema on Honey Bee Behavior and Physiology American Bee Journal and in Bee Culture;
Iacob Olimpia, (2014): Microsporidioze. În: Tratat de Mrdicină Veterinară. Coordonator: Constantin N., Editura RISOPRINT, Cluj – Napoca, pag. 336;
Lazăr Șt., Vornicu O.C., (2007): Apicultura. Editura ALFA;
Lepși I., (1965): Protozoologie. Editura Academiei R.S.R.;
Liu T.P. (1984): Ultrastructure of the midgut of the worker honey Apis mellifera heavily infected with Nosema apis, J. Invertebr. Pathol. 44, 103–105;
Liu T.P., (1985): Scanning Electron Microscopy of Developmental Stages of Malpighamoeba mellificae Prell in the Honey Bee. The Journal of Eucaryote Microbiology, vol. 32, 1, pag. 139 – 144;
Lungu T., Vartic N., Dulceanu N., Cosoroabă I., Șuteu I.,(1982): Patologia și Clinica Bolilor Prazitare. Editura Didactică și Pedagocică București.
Malone, L. A., Gatehouse, H. S., & Tregidga, E. L. (2001): Effects of Time, Temperature, and Honey on Nosema apis(Microsporidia: Nosematidae), a Parasite of the Honeybee, Apis mellifera(Hymenoptera: Apidae).Journal of Invertebrate Pathology, 77(4), 258-268;
Mardare Aneta, Chioveanu Gabriela, Simion N., (2000): Aspecte epidemiologice ale varroozei și nosemozei la albine. Supliment la Revista Română de Medicină Veterinară, vol 10, 3;
Mitrea L.,(2002): Boli parazitare la animale. Ed. CERES, editura CERES București;
Niculescu Al., Didă I.C., (1998): Parazitologie Veterinară. Editura CERES, București;
Ogradă I., (1978): Bolile și dăunătorii albinelor. ACA Redacția publicațiilor apicole, București;
Ogradă I., (1982): Bolile și dăunătorii albinelor. ACA Redacția publicațiilor apicole, București;
Oliver R.(2016): Nosema ceranae: Kiss of Death or Much Ado about Nothing? ScientificBeekeeping.com. Beekeeping Through the Eyes of a Biologist scientificbeekeeping.com/nosema-ceranae-kiss-…;
Olteanu Gh., Panaitescu I., Erhan D., (2001): Poliparazitismul la om, animale, plante și mediu. Editura CERES, București;
Paxton, R. J., Klee, J., Korpela, S., & Fries, I. (2007): Nosema ceranae has infected Apis mellifera in Europe since at least 1998 and may be more virulent than Nosema apis. Apidologie, 38(6), 558-565;
Popa Al., (1965): Bolile albinelor și virmilor de mătase. Editura Agrosilvică București;
Ravoet, Jorgen, Schwarz, Ryan S., Descamps, Tine, Yanez, Orlando, Tozkar, Cansu O., Martin-Hernandez, Raquel,Bartolome, Carolina, Smet, Lina de, Higes, Mariano, Wenseleers, Tom, Schmid-Hempel, Regula, Neumann, Peter,Kadowaki, Tatsuhiko, Evans, Jay D., (2015): Differential diagnosis of the honey bee trypanosomatids Crithidia mellificae and Lotmaria passim. Journal of Invertebrate Pathology, vol 130, pag. 21 – 27;
Richard A. Baker, Adrian Hick, Wit Chmielewski., (2005): Aspcts of the history biogeography of the bee mites- Tropilaelaps clareae and T. Koenigerum. Journal of Apicultural Asience, Vol. 49,2;
Ritter W. , (2000): Bolile albinelor. Ed. M.A.S.T., București, pag. 49;
Runckel Ch., DeRisi J., Flenniken L. Michelle, (2014): A Draft Genome of the Honey Bee Trypanosomatid Parasite Crithidia mellificae. PLOS/one, 9(4);
Stejskal. M., (1972): Gregarinas (Protozoa) parásitos de abejas Apis mellifica L. en Venezuela. Turrialba 22 (1): 30-39;
Șuteu I, Cozma V., (1998): Bolile parazitare ale animalelor domestice. Editura CERES, București;
***ORDIN nr. 25/ 19 martie 2008 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind metodologia de prelevare, prelucrare primară, ambalare și transport al probelor destinate examenelor de laborator în domeniul sănătății animalelor, publicat în Monitorul Oficial nr. 341 din 2 mai 2008;
***Ordinul 29/2015 al Președintelui ANSVSA pentru aprobarea Normelor metodologice de aplicare a Programului acțiunilor de supraveghere, prevenire și control al bolilor la animale, al celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului pentru anul 2015 și a Programului de supraveghere și control în domeniul siguranței alimentelor pentru anul 2015;
***Instruire LNR pentru Bolile Albinelor și a altor Insecte Utile, 2014. Metode de diagnostic în principalele boli parazitare. Asigurarea calității rezultatelor;
***M. mellificae: http//www.apivet.eu/2009;
*** Crithidia: https://en.wikipedia.org/wiki/Crithidia;
*** Efermedades parasitarias de los abejas adultas www.aga.cat/ index.php/es?catid=0&id=190. Efermedades parasitarias de los abejas adultas;
*** Amebiasis: https://es.wikipedia.org/…/Amebiasis_en_las_ab;
*** Parasites and Pests of the Honeybee: web.stanford.edu /class/…/AgriVetParasites: Parasites and Pests of the Honeybee;
***Gregarinoza: www.pcheloved.ru/gregarinoz.html;
*** Nosemoza: http://entomology.ucdavis.edu/facutly/ mussen/ beebriefs/index.cfm. (Eric C. Mussen, UC Davis – 3/11/11: Diagnosing and Treating Nosema Disease);
***Nosema ceranae și Nosema apis https://microbewiki.kenyon. edu/…/Nosema_cer…Nosema ceranae and Nosema apis: Nosemosis, The Danger to Honey Bees and Agricultural Pollination. From MicrobeWiki, the student-edited microbiology resource;
***Manualul OIE, Ediția 2013, cap. 2.2.;
***Nosema apis: http://www.dave-cushman.net/bee/gif/ nosemaapis.gif.
Elena IȘAN
II.IV. Bolile micotice la albine
Fungii (miceții) sunt organisme unicelulare sau pluricelulare, cu structură de tip eucariot, hrănire heterotrofă prin absorbție, parazite sau saprofite, imobile și, în general, au perete celular rigid care conține chitină; în cadrul acestei forme de existență, cu importanță în apicultură, se deosebesc următoarele tipuri morfologice:
levurile (fungi imperfecți);
mucegaiurile (fungi perfecți sau filamentoși);
formele intermediare.
Fungii imperfecți (levurile, drojdiile) sunt ciuperci unicelulare inferioare, cu formă rotundă sau ovală, perete gros și rigid, citoplasmă, nucleu și dimensiuni microscopice (3 – 30 µm). Se înmulțesc asexuat sau sexuat, din acest punct de vedere deosebindu-se levuri ascosporate (înmulțire mixtă) și levuri anascosporate (înmulțire asexuată).
Mucegaiurile sunt organisme cu organizare monocelulară sau pluricelulară, iar organul reproducător este diferențiat (de sex masculin și de sex feminin), înmulțirea făcându-se prin spori.
Mucegaiurile se dezvoltă ca filamente ramificate, numite hife, cu structură tubulară, septată sau neseptată și perete rigid. Filamentele formează micelii (talul), care sunt de două feluri: vegetativ, cu rol nutritiv și aerian, reproducător, care dă naștere la spori. Sporii pot fi obținuți sexuat sau asexuat. Sporii sexuați (zigosporii) iau naștere din unirea a doi gameți, iar cei asexuați se găsesc în sporangii sau conidii.
Mucegaiurile descompun materiile organice până la compuși simpli, cu ajutorul unor enzime (amilaze, lipaze, proteaze, celulaze) și sintetizează micotoxine, ca produși ai propriului metabolism (cu rol de apărare în competiția cu alte microorganisme din mediu), care sunt depozitate în spori și micelii sau sunt eliberate în substrat.
Mucegaiurile se dezvoltă pe diverse substraturi nutritive din: sol, plante, legume, fructe, alimente preparate sau crude etc. Unele mucegaiuri sunt inofensive sau benefice (de ex., cele producătoare de antibiotice) altele sunt patogene pentru plante, animale, inclusiv pentru om, prin dezvoltarea unor procese patologice, atunci când secretă produșii de metabolism pe substraturile alimentare, producând micotoxicoze la animale și om (14).
Afecțiunile care apar la animale și la om, ca urmare a dezvoltării mucegaiurilor în corpul sau pe corpul acestora, se numesc micoze.
Insectele pot fi victime ale mucegaiurilor, albinele fiind afectate de trei micoze majore: ascosferoza, aspergiloza și melanoza.
Ascosferoza este afecțiunea micotică poate cea mai frecventă, a puietului de albine, provocând moartea larvelor în primele zile ale stadiului de puiet căpăcit.
Aspergiloza și melanoza sunt micoze mai puțin întâlnite, însă aspergiloza, fiind produsă de specii de miceți care aparțin genului Aspergillus este transmisibilă la om. Datorită acestui fapt, boala este deosebit de periculoasă, apariția ei într-o stupină impunând măsuri radicale de eradicare.
II.4.1. Ascosferoza (Puietul văros, Puietul vâscos)
Este o boală specifică puietului de albine, produsă de micetul Ascosphera apis, caracterizată clinic prin moartea larvelor în celule și transformarea lor într-o masă dură, de culoare albicioasă sau neagră, iar anatomopatologic prin mumifierea larvelor și aspectul mozaicat al fagurelui cu puiet (31). Până în anul 1955, boala a fost denumită „pericystimicoză”, deoarece agentul etiologic era denumit Pericystis apis.
Istoric, răspândire, importanță
Prima descriere a micozei a fost făcută de către Maassen, în Germania, în anul 1913, după care au apărut și alte semnalări în: Germania (Dreher, 1938), Scandinavia, Rusia (Betts, 1932) și Marea Britanie (Heath, 1982, 1985). Cazurile de îmbolnăvire cunoscute sau descrise ca puiet văros au fost rare până în anul 1945 (9). După al doilea război mondial boala s-a răspândit în Europa, fiind descrisă în Elveția, Franța, Norvegia, Belgia, etc. Ascosferoza a evoluat doar în Europa, până în anii 1960, prima semnalare a prezenței micetului în afara Europei, fiind făcută de Seal (1957) și Palmer-Jones (1964) în Noua Zeelandă (1).
În America de Nord, boala a fost descrisă la mijlocul deceniului 60 din secolul XX și din 1971 a început să fie resimțit și impactul economic al bolii (Hitchcock și Christensen, 1972). Primele descrieri din Statele Unite au fost făcute în Utah, în 1965 (Baker și Torchio, 1968) și în California, în 1968 (Hitchcock și Christensen, 1972), cu toate că este posibil ca boala să fi evoluat de mai mult timp (Gilliam și colab., 1997). Din 1969 până în 1975, ascosferoza s-a răspândit în Arizona, Nebraska, Wyoming Montana, Minnesota, Dakota de Nord, Wisconsin, Illinois, Texas, și Florida (Hitchcock și Christensen, 1972; Gilliam și colab., 1978) (21). Ulterior boala a fost raportată în stupinile comerciale din SUA (Reid, 1988), iar din anul 1987, boala s-a răspândit în cea mai mare parte a țării, inclusiv în Alaska și Hawai. Concomitent s-a constatat evoluția bolii și în regiunile vestice din Canada (Hitchcock și Christensen, 1972). În anul 1977 ascosferoza este recunoscută ca fiind micoza cu cea mai gravă evoluție la albine (Heath, 1985) (1).
În America Latină, ascosferoza s-a extins foarte mult, începând cu anul 1978, în Argentina (Reid, 1993), Mexic (Wilson și colab., 1984), apoi în majoritatea zonelor apicole din Chile, America Centrală, Japonia, și Filipine (17).
Ascosphera apis a fost semnalată pentru prima dată în Israel în 1984, fiind prezentă la un nivel foarte scăzut până în anul 1990, când s-a constatat o creștere substanțială a ratei de infecție (Yacobson și colab., 1991) (1) dar se suspectează că multe țări mediteraneene nu au raportat boala, deși cel mai probabil aceasta evolua (Bradbear, 1988).
În România, ascosferoza a fost semnalată pentru prima oară în 1971, până la această dată puietul văros fiind întâlnit sporadic. Ulterior boala s-a extins rapid, cuprinzând în decursul a patru ani zone largi din Transilvania, Banat, Muntenia, Dobrogea și Moldova (12).
Ascosferoza poate provoca pierderi semnificative prin scăderea numărului de albine din stupi și afectarea capacității de cules, influențând productivitatea coloniei (Bailey, 1963; Wood, 1998), reducerea producției de miere fiind cuprinsă între 5% și 37% (1).
În general, boala este fatală pentru larve, dar, de obicei, nu distruge o întreagă colonie. La albinele adulte, evoluția bolii se manifestă prin reducerea efectivului, deoarece scade numărul de larve care eclozează.
Etiopatogenie
Există diferite varietăți ale fungului Ascosphera apis, întâlnite și la alte specii ale genului Apis (9). Agentul etiologic este un micet heterotalic, care are micelii de ambele sexe, feminine și masculine, care se aseamănă foarte mult. Hifele sexuate formează organele sexuale feminine numite oogonii și anteridii (9) sau ascogonii și o celulă nutritivă masculină, denumită trofocit (15). Ambele celule se contopesc.
Organul feminin al conceperii – trychogin se dezvoltă în sporangiu, care are forma unui corpuscul rotund. Sporangiul dezvoltă spori, așezați în formă de bulgărași denumiți ascosfere, în care există ascosporii: spori masculini și feminini. Prin spargerea ascosferelor sunt puși în libertate sporii de ambele sexe, în număr aproximativ egal (15). După fecundarea dintre cele două elemente, oogonia – corpul fructificator și anteridie, rezultă ascele (fig. II.4.1.). Ascele sunt formațiuni capsulare care conțin spori și a căror rezistență și viabilitate este foarte mare. Oogoniile sau corpii fructificatori au diametrul de 60 µm, culoare maro închisă sau neagră și sunt foarte rezistente, păstrându-și patogenitatea cel puțin 15 ani. Corpii fructificatori ai A. apis au fost găsiți în pupe moarte și în învelișul acestora (9).
De la anumite varietăți de A. apis, au fost izolați corpi fructificatori cu diametrul mare de 130 µm, în special din infecțiile mixte cu bacteria Paenibacillus larvae. Această varietate a fost denumită Ascosphera major (Skou, 1972, cit. de 10). Din acest motiv se consideră că, deși este saprofit, este posibil ca A. apis să intervină ca infecție secundară în loca americană, cu rol de agravare a evoluției bolii. Există și alte varietăți de A. apis, diferențiate morfologic atât prin dimensiune cât și prin prezența unor papile vizibile la microscopul electronic (10). Skou (1972) a identificat la albina sălbatică Megachile centicularis specia de micet Ascosphera alvei.
Fig. II.4.1. Ascosphera apis: a). ascosferă Fig.II.4.2.Larve mumificate
b) ascospori ( după Chioveanu – LNR albine-IDSA)
A. alvei prezintă ascochisturi de 30 µm și este cunoscut că evoluează ca mucegaiul polenului (10). Sporii micetului Ascosphaera alvei sunt aduși în stup de albinele culegătoare în perioada caldă, când nu germinează dar se conservă în stup. Sporii germinează numai la răcirea vremii, toamna și iarna, când negăsind puiet atacă păstura, micetul dezvoltându-se în special pe suprafața și în interiorul păsturii deficitar conservate. Polenul afectat are valoarea nutritivă compromisă, fiind impropriu pentru hrănirea larvelor (6, 24).
Temperatura optimă de dezvoltare a ciupercii este de 20-30°C, însă temperatura ideală de formare și dezvoltare a corpilor de fructificare proveniți de la A. apis este de 30ș C, iar pentru corpii de fructificare ai A. alvei temperatura optimă de formare și dezvoltare este de 18ș C (10).
Viabilitatea sporilor de Ascosphaera apis este foarte mare, rezistența lor în mediul exterior fiind de până la 10 – 15 ani, iar în miere de 2 ani (11). În larvele mumifiate A. apis are capacitate de germinare și după 15 ani (15). Rezistă la acțiunea vaporilor de formol și a anhidridei sulfuroase (18).
Calea de contaminare principală este cea digestivă, dar și prin leziunile cutanate. Albinele care asigură igiena cuibului, prin îndepărtarea puietul bolnav, transmit boala larvelor necăpăcite. Sporii consumați de către larve, odată cu hrana, germinează în lumenul intestinului posterior, probabil activați de prezența CO2 (Heath și Gaze, 1987; Bailey și Ball, 1991). Unele enzime produse de A. apis sunt implicate în penetrarea membranei peritrofice a intestinului larvar (Theantana și Chant-awannakul, 2008; citați de 1).
După traversarea membranei peritrofice, micetul dă naștere la unul sau două tuburi germinative, care se ramifică, străpung peretele intestinal și formeză un miceliu. Micetul crește și se hrănește cu diverse țesuturi, producând moartea larvei. Corpii de fructificare apar numai în exteriorul larvei moarte (15). Moartea larvelor se datorează deteriorării mecanice și enzimatice, perturbării circulației hemolimfei și toxinelor eliberate de A. apis (1).
Miceliul se extinde progresiv de la partea posterioară până la capătul anterior al larvelor, acoperind în cele din urmă întreaga larvă cu un strat gros alb (văros). Mai târziu, creșterea fungică este marmorată cu pete maro sau negre, ca urmare a producției de miceliu mixt; extinderea poate varia în dimensiune și culoare.
Epidemiologie
Boala se poate răspândi în anumite condiții de temperatură din stup, constatându-se că puietul răcit, este mult mai sensibil la contaminare, imediat după căpăcire (Bailey, 1967; cit. de 9). Se consideră că scăderile de temperatură cu doar 5șC, chiar pentru o perioadă scurtă de timp, pot determina răcirea puietului, atunci când familiile sunt slabe, deci există puține albine lucrătoare (9). Contaminarea se produce inițial la albinele lucrătoare/culegătoare, care vin în contact cu polenul infectat (24). Boala se poate transmite în aceeași colonie sau se poate răspândi de la o colonie la alta:
în aceeași colonie sporii se răspândesc de la albină la albină prin hrană, dar și prin curenții de aer. Deși inițial colonia se autocurăță, ulterior prin difuzarea continuă a sporilor colonia slăbește;
de la o colonie la alta contaminarea se face cel mai adesea prin introducerea de albine sau mătci contaminate cu spori.
Alte căi de transmitere sunt ustensilele contaminate, schimbul de faguri, utilizarea utilajelor (inclusiv stupii) contaminate etc., dar și prin rătăcirea albinelor provenite din stupine cu puiet bolnav sau prin furtișag (15). Se consideră că speciile de albine sălbatice au un rol mai important în răspândirea infecției cu A. apis decât cele domestice pentru că transmiterea se poate face numai de la albinele sălbatice către cele domestice, nu și invers (9).
Ascosphaera apis afectează în primul rând puietul de trântor, apoi se răspândește la puietul albinelor lucrătoare și uneori poate afecta chiar puietul din botci (10). Acest mod de îmbolnăvire s-ar explica prin faptul că, puietul de trântor se află la periferia fagurilor, unde umiditatea este mai mare, iar temperatura mai scăzută, favorabilă dezvoltării miceților (25-30șC).
Ascosferoza poate evolua concomitent cu alte boli, fiind descrisă posibilitatea de a se dezvolta secundar infecției cu Paenibacillus larvae (19). Boala este favorizată și de utilizarea antibioticelor în scop preventiv/curativ, pH-ul alcalin al nectarului sau al hranei artificiale, condițiile de microclimate etc. Se consideră că acest fung nu se hrănește cu țesuturile larvei sănătoase și nu afectează țesuturile sănătoase, ci numai țesuturile modificate ale larvelor. Unii cercetători suspectează chiar că e posibil ca în etiologia bolii să fie implicată o tulpină nouă de fung, mult mai agresivă, care evoluează în ultimii ani, având în vedere numărul mare de stupine afectate în toată Europa, fiind citat cazul Germaniei (15).
Temperatura și umiditatea influențează dezvoltarea micozei, efectul favorizant fiind mai evident la familiile de albine slabe, puțin numeroase. Evoluțiile grave apar când există și alți factori care favorizează procesul patogen.
Activitățile umane legate de creșterea producțiilor de alimente pot avea efecte directe și indirecte care ar putea fi parțial responsabile pentru tendința răspândirii tot mai mare și a agravării evoluției ascosferozei (1).
Ascosferoza evoluează, de regulă, în lunile aprilie-mai, prezintă intensitate sporită în iunie, după care regresează pe parcursul lunilor iulie-august (8).
Simptomatologie
Micoza evoluează cu modificarea culorii larvelor, înnegrirea acestora fiind observată în stadiile avansate ale bolii. Modificările de culoare sunt datorate invadării larvelor de către A. apis și acoperirii acestora cu miceliu, astfel că larvele devin albicioase, gri, verzui- închis spre negricioase sau chiar negre, segmentația se atenuează sau se pierde, tegumentul se asprește (8). Larvele se întăresc și iau aspectul unor bucățele de cretă. Corpul larvei este acoperit parțial sau total de un miceliu alb, iar extremitatea cefalică apare sub forma unui buton deshidratat. Prin evaporarea apei și prin reducerea volumului, larva moare, se usucă și devine dură, asemănătoare unor „pietricele de var” (fig. II.4.2) (9).
Ascosferoza are evoluție stadială. În prima etapă larva este acoperită cu miceliul moale și pufos, este voluminoasă și are consistență moale. Ulterior larvele afectate se îngălbenesc, își pierd segmentația, tegumentul se întărește și se asprește. Culoarea puietului bolnav devine albă, apoi gri, verde închis spre negricioasă sau chiar neagră. Larvele devin tot mai dure, păstrându-și forma corpului, însă se mumifiază. Este afectat îndeosebi puietul tânăr, necăpăcit, dar acesta este repede curățat de către albine. Ulterior puietul afectat nu mai poate fi eliminat, fiind astfel căpăcit.
Larvele bolnave au culoare alb-gălbuie, atunci când micetul este reprezentat dintr-un miceliu de un singur sex. Pornind de la acest aspect clinic a apărut și denumirea populară de ,,puiet văros". Atunci când miceliile s-au contopit și dau naștere la corpi fructiferi, culoarea larvelor devine verde-murdar. Larvele tinere nu manifestă, de obicei, semne clinice de boală și nu prezintă mortalitate decât în momentul în care întreg corpul acestora este acoperit cu miceliu (12). În fazele avansate ale bolii apare aspectul de puiet mumifiat (19), care este răspândit neregulat pe suprafața unui fagure. Acesta de obicei nu aderă la pereții celulei, putând fi scos de albine. Aspectul fagurilor afectați este recunoscut ușor, fiind denumit „faguri în mozaic”, (fig. II.4.4. a) (12).
Aspectele clinice sunt evidente pe oglinda și la baza stupului, unde se găsesc larve moarte, uscate și mumifiate. Puietul moare de obicei în stadiile de larvă și prenimfă. Fagurele produce un sunet de boabe de fasole agitate într-o pungă de hârtie, atunci când este scuturat (12).
Ascosferoza păsturii se prezintă prin transformarea polenului/păsturii în formațiuni tari, de culoare albicioasă sau gri-verzuie (fig. II.4.4. b), improprii pentru hrănirea puietului (24).
Morfopatologie
Larvele sunt indurate, unele au aspectul unor bucățele de cretă, altele au culoare verde închisă sau neagră, segmentația se atenuează sau se pierde, tegumentul se asprește. Corpul este acoperit parțial sau total cu un miceliu alb, uneori rămânând vizibil capul larvei, care apare ca un buton uscat.
Culoarea larvelor afectate este dată de evoluția bolii. Inițial, culoarea micetului este albă, după care devine gri sau chiar negricioasă. Este caracteristisc aspectul „în mozaic”, datorat alternanței celulelor căpăcite, normale, cu celule care conțin larve mumifiate, de culoare albă (12). Dacă nu se pot forma spori, culoarea miceliului rămâne albicioasă.
Larvele cu modificări morfopatologice din fagure sunt de obicei găsite întinse, tumefiate, având aceeași dimensiune cu cea a celulei (1). Acestea, în cele din urmă arată și sunt cunoscute ca fiind așa numitele mumii, cu aspect uscat și forma specifică, culoare care poate fi albă sau gri, verde închis spre negricioasă sau chiar neagră. Fiecare mumie colorată conține aproximativ 108-109 ascosfere (1).
Diagnosticul în ascosferoză
Monitorizarea bolilor la albine, efectuată la nivel de colonie, este destul de dificilă. Posibilitățile și metodele de observare clinică și de diagnostic aplicate depinzând de condițiile sezoniere. Acest lucru este agravat, în principal, în zonele cu o creștere redusă a puietului în anumite perioade ale anului, mai ales în timpul iernii, precum și de producția inconstantă a produselor apicole. Frotiurile larvare și pupale trebuie să se facă atunci când sunt monitorizate și alte boli ale puietului (22).
Diagnosticul prezumtiv se face pe baza următoarelor semne clinice și modificări morfopatologice:
afectarea prponderentă a puietului de trântor;
aspectul „în mozaic” al fagurilor cu puiet (larve mumifiate, albe, răzlețite);
fagurele produce un sunet caracteristic când este scuturat;
larvele nu sunt aderente la pereții celulelor;
prezența „puietului văros” cu aspectele considerate caracteristice de „pietricele de var” (larve indurate, albe, gri, verde- închis sau negre);
răspândirea cadavrelor mumifiate în fața urdinișului și pe fundul stupului (12).
Boala poate fi foarte repede descoperită și recunoscută, deoarece după aproximativ două săptămâni de la apariția primelor semne, se observă aspectul cretos, văros al larvelor sau de mozaic, ele fiind răspândite în fața urdinișului, pe scândura de zbor (12).
Diagnosticul de laborator se face prin examen microscopic direct, micologic și analize de biologie moleculară, respectiv prin PCR-conventional.
Examenele microscopice și micologice presupun recoltarea probelor de larve, faguri cu puiet suspect (15×20 cm), miere și alte produse ale stupului, precum și alte tipuri de probe (22).
1. Examenul microscopic. Micetul Ascosphaera apis are hifele septate, cu dimensiuni de 2,5-8,0 µm în diametru, cu pronunțate ramuri dihotomice, iar ascosferele au dimensiuni de 47-140 µm în diametru și formă sferică (fig. II.4.1.) (11).
Fig. nr. II.4.3. Aspectul fagurilor în ascosferoza produsă de: a) A. apis și b) A. alvei ,
(după G. Chioveanu, LNR albine – IDSA)
Fig. II.4.4. Ascosphaera alvei – Fig. II.4.5. A. apis, cultură
ascosfere cu ascospori oc.10x, ob.40x;
(după G. Chioveanu, LNR albine-IDSA)
Examinarea microscopică pe preparat direct între lamă și lamelă a mojaratului total de larve mumificate albe relevă, în primul rând, fragmente de miceliu, dar nu există ascochiști detectabili, însă examinarea microscopică a larvelor mumifiate de culoare negricioasă permite evidențierea tuturor structurilor care permit identificarea speciei A. apis: hife miceliene septate, ascosfere și ascochiști (1).
O cultură de A. apis poate fi observată la examinarea microscopică a preparatelor pregătite, frotiuri, cu ocular 10x, obiectiv 40x (1). Examinarea microscopică a A. alvei se face prin pregătirea materialului și examinarea în aceleași condiții, ocular 10x, obiectiv 40x. Examinarea microscopică permite punerea în evidență a caracterelor de diferențiere (fig. II.4.4.).
Colorarea frotiurilor cu lactofenol Aman – blue cotton (LPCB) poate clarifica frotiul și poate spori contrastul pentru o mai bună analiză a morfologiei micetului (1). În urma efectuării acestui examen se poate diferenția specia A. apis de A. alvei, prin morfologia ascochistului (corpul de fructificare). La specia A. apis ascochistul evidențiază o membrană simplă, spre deosebire de A. alvei, la care se pune în evidență membrana dublă a ascochiștilor (fig. II.4.4.).
2. Examenul micologic se execută din probe de faguri cu puiet căpăcit și/sau necăpăcit, albine moarte, cadavre mumifiate, recoltate din fața sau de pe fundul stupilor afectați. Izolarea tulpinilor de Ascosphaera apis se poate face și din larve proaspete sau uscate, colectate direct din fagurii cu puiet, atât din larvele sănătoase, cât și din cele cu modificări de culoare, fiind mai accesibile larvele proaspete. Acestea produc, prin incubare, cu mare ușurință ascochisturi cu spori. Rezultate foarte bune au fost obținute, în laboratoarele din România, pe mediile:
Sabouraud dextroză agar, care conține următoarele ingrediente: glucoză 40,0 g,agar 15,0 g, peptonă micologică 10,0 g (1). Mediul se sterilizează prin autoclavare la 115șC, timp de 15 minute, iar pH-ul final trebuie să fie de 5,6 +/- 0,2. Există și alte medii care sunt recomandate de literatura de specialitate și pot fi utilizate, dar nu sunt suficient de bine cunoscute și/sau testate în țara noastră:
Mediul MY-20 care se prepară prin dizolvarea următoarelor componente, în aproximativ 750 ml de apă deionizată: peptonă 4,0 g, extract de drojdie 3,0 g, glucoză 200,0 g, agar 20,0 g până la volumul final la 1000 ml. Mediul se autoclavează la 115° C, timp de 15 minute (1).
Mediul GLEN este mai puțin cunoscut în România. Acesta este preparat astfel: se dizolvă în 900 ml de apă deionizată următoarele componente: 4,00 g glucoză-dextroză, 7,68 g clorură de sodiu, 6,50 g hidrolizat de lactalbumină, extract de drojdie 5,00 g și 1,952 g MES-tampon 2- (N-morfolino) etansulfonic. Se ajustează pH-ul la 7,0 și volumul la 1000 ml. Se autoclavează la 121° C, timp de 20 minute (1).
A. apis se poate dezvolta în condiții bune și produce colonii pe mai multe categorii de medii, cu compoziție relativ diferită, cum sunt: agar – cartof dextroză (PDA); drojdie – glucoză – amidon agar (YGPSA) și Czapek-Dox, etc., dar micetul crește foarte bine și pe medii cu un conținut ridicat de glucoză (MY- 20) sau pe unii componenți specifici, cum este mediul GLEN (5).
Etapele de prelucrare a materialului patologic sunt următoarele:
se sterilizează suprafața larvelor cu 10% hipoclorit de sodiu, timp de 10 min;
se introduc/e larvele/larva de două ori în apă distilată sterilă timp de 2 minute;
se mojarează fiecare larvă din probă în 3 ml de apă distilată sterilă (ADS), până când se obține o suspensie omogenă;
materialul obținut se însămânțează în 2-3 puncte, prin spotare, într-o placă Petri turnată cu unul din mediile: SDA, PDA, YGPSA sau MY-20;
placa se incubează la întuneric, la 30-34°C, timp de 4-7 zile, până la maxim 14 zile. Creșterea este vizibilă, sub formă de hife, de obicei, în decurs de 2-4 zile; uneori apare după 7 sau mai multe zile (fig. II.4.5.).
Adaosul de compuși antibacterieni (de ex. streptomicină, cloramfenicol, penicilină, cicloheximidă sau dodină) în mediile de cultură, previne dezvoltarea bacteriilor de asociație. Substanțele antibacteriene pot inhiba creșterea micetului Ascosphaera apis, dar fragmentele de larve sau tulpină, transferate înapoi pe medii fără antibiotice, pot recupera tulpina.
Coloniile de albine contaminate cu A. apis, de cele mai multe ori nu au semne vizibile de boală. De aceea, este util să se dispună de tehnici de detectare precoce, precum testele biochimice sau cele de diagnostic molecular, care permit depistarea precoce a agentului patogen la niveluri subclinice. S-au identificat mai multe enzime prezente în A. apis. Printre acestea, aminopeptidaza a fost propusă pentru identificarea micetului în etapa de miceliu. Enzimele ß-galactozidaza și manozidaza au fost propuse pentru identificarea atât a formelor fructificante, cât și pentru tulpinile micelare (1).
Obținerea unui izolat depinde de tipul de fecundare și poate fi determinat cu ajutorul unui test de compatibilitate sexuală. Există două tulpini de referință (AFSEF 7405 și ARSEF 7406) utilizate în testele de compatibilitate.
Utilizarea agarului cultivat cu A. apis care conține hife de un singur sex se poate face prin secționarea unui fragment de formă circulară, care este plasat între două fragmente de agar cu cele două tulpini de referință la o distanță de aproximativ 4 cm. Se incubează placa la întuneric, la 25-30°C, timp de 5-7 zile, când se constată prezența ascochisturilor cu spori de culoare închisă. La citire poate fi observată o zonă neagră, între miceliile celor două tulpini cu tipuri de fecundare diferită, opuse întâlnirii, indicând reproducerea cu succes. Odată obținut un singur izolat, tipul de împerechere poate fi determinat cu ajutorul unui test de compatibilitate sexuală. Se recomandă utilizarea în testele de împerechere a celor două tulpini de referință, specificate mai sus (1).
3. Conservarea „in vitro” a culturilor de A. apis. Tulpinile izolate se pot păstra pe medii de cultură un timp limitat. După 30 de zile, din momentul în care încep să crească, apar semnele de îmbătrânire (Ruffinengo și colab., 2000). Pentru menținerea caracteristicilor inițiale ale izolatelor, este nevoie de transfer lunar al tulpinilor. Transferurile periodice de cultură sunt relativ scumpe, trebuiesc efectuate permanent, respectând intervalele prestabilite, sunt consumatoare de timp și cresc riscul de modificare a unor caractere și de contaminare (7). Mai mult decât atât, tulpinile de A. apis izolate, pot pierde din capacitatea de virulență inițială, dacă sunt păstrate într-o cultură cu transferuri repetate. Din acest motiv este important să se utilizeze tehnici moderne și recunoscute, ca fiind fezabile, pentru depozitarea pe termen lung. Aplicarea acestor tehnici trebuie să fie inițiată la scurt timp după obținerea tulpinii. Există două metode diferite de conservare a tulpinilor bacteriene și/sau micotice, care au fost utilizate cu succes, în decursul timpului:
crioconservarea (7) și
conservarea pe miez de orez (IRK) (Palacio și colab., 2007).
Prevenirea contaminării pe perioada depozitării este mai puțin riscantă prin procedeul de crioconservare la -80°C. În unele situații, totuși, pentru un număr mare de tulpini și pentru laboratoarele care nu sunt dotate cu echipamente adecvate pentru frig, utilizarea miezului de orez, este o alterativă mai bună de conservare (7).
4. Testul de germinare a sporilor se execută în trei etape:
a) se macină sporochisturile pentru a elibera sporii de la nivelul acestora sau se depun direct pe mediile de cultivare, formele de păstrare a acestora pe termen lung, respectiv criobilele;
b) se incubează sporii obținuți în mediu lichid, timp de 32 de ore, la 34°C;
c) se verifică modul de recuperare a sporilor (fig. II. 4.6).
Fig. II.4.6. Ascosphaera apis (MRC_IHEM 3751) cultura de pe criobile, colonii albe și negre, cu potențial de reproducere diferit (după Laboratorul Național de Referință – LNR albine-IDSA)
Tehnica de lucru este simplă: în 5-10 µl apă distilată sterilă (ADS) se macină tulpina care conține chisturile, timp de 1 minut, pentru eliberarea sporilor, apoi la această suspensie se adaugă 50 µl ADS și se macină din nou timp de 1 min., se adaugă ADS în cantitate de 200 µl la suspensia inițială. Se introduce omogenatul obținut într-un tub Eppendorf cu capacitatea de 1,5 ml și o cantitate suplimentară de 750 µl ADS pentru a obține o densitate medie de spori. Se elimină particulele mari, sporochisturile, smocurile de spori etc., din suspensie și se lasă să se stabilizeze timp de 30 minute. Se prelevează cu pipeta, aproximativ 500 µl într-un tub nou, din partea de suspensie care ar trebui să conțină cea mai mare parte a sporilor individualizați. Pentru suspensiile cu densitate mare, se pot pregăti diluții de 10-2 sau 10-3. Aceste diluții pot fi utilizate la numărarea și calcularea concentrației de spori a suspensiei nediluate, prin citirea cu ajutorul unui hemocitometru (15).
Recoltarea sporilor din țesuturile vii se face astfel:
Se pregătește un amestec format din larve bolnave, modificate, cu 5 ml de ADS, se omogenizează manual, timp de 5 minute, într-un mojar din sticlă. Omogenatul obținut se centrifughează, la 3500 rpm timp de 5 minute, se elimină supernatantul și se adaugă 5 ml de povidon-iodat (50% în ADS), pentru a evita contaminarea bacteriană. Se pot utiliza și alte substanțe cu rol de limitare a florei de poluare. Se amestecă timp de 10 minute, se centrifughează la 3500 rpm, timp de 5 minute, se elimină supernatantul. Se spală de trei ori prin adăugarea a 5 ml de ADS și se omogenizează timp de 5 minute. Se amestecă din nou prin cetrifugare la 3500 rpm, timp de 5 minute, după care se adaugă 1 ml de apă. Se prepară diluții de 10-2 sau 10-3, necesare pentru numărarea și calcularea concentrației suspensiei inițiale, nediluate, cu ajutorul unui hemocitometru.
Sporii pot fi recoltați prin măcinare, folosind metoda „in vivo” descrisă, sau se pot racla chisturile cu spori de pe tegumentul larvelor afectate. Pentru a se obține o recoltare și o omogenizare cât mai bună prin tehnica „in vivo” sporii trebuie utilizați în aceeași zi în care sunt pregătiți. Acest mod de lucru este recomandat pentru izolarea tulpinilor micetului A. apis, deoarece în materialul patologic sunt prezente și alte microorganisme, deși povidonul iodat (Betadina) are spectru bactericid larg și este folosit pentru a evita contaminarea bacteriană la prepararea soluției de spori.
Larvele uscate conțin spori viabili, acestea putând fi conservate timp de mai mulți ani (cel puțin 9 ani), atunci când sunt depozitate în atmosferă uscată, eventual într-un flacon închis (7).
5. Testul de verificare a calității inoculării. Sporii pot contamina toate suprafețele stupului și se acumulează în produsele rezultate din activitatea stupului. Ei sunt foarte rezistenți în mediul înconjurător și pot rămâne viabili, cu capacitate de infecțiozitate pentru mai mult de 15 de ani. Cu toate acestea, viabilitatea sporilor scade în timp, ceea ce face ca aceasta să difere de la un izolat la altul și de la un lot la altul. Astfel, este important să se verifice viabilitatea sporilor înainte de efectuarea experimentelor (7).
Viabilitatea sporilor se verifică astfel:
se așează un dispozitiv laminar acoperit cu teflon steril, într-o placă Petri sterilă, care este căptușită cu hârtie de filtru umedă;
se prepară o concentrație de 2,0 x 107 spori/ml, se omogenizează cu 100 µl suspensie de spori în 500 µl mediu GLEN;
se însămânțează 10 µl din amestecul de spori și mediul GLEN pe locul lamelor din teflon;
placa Petri se introduce într-un container etanș și se incubează în atmosferă de CO2 10%. Este nevoie de minim 30 de secunde pentru a fi asigurată concentrația 10% CO2.
Dispozitivul astfel însămânțat se incubează timp de 32 ore, la 34°C. După incubare se plasează o lamelă de acoperire și se citește numărul de spori direct pe lama de teflon, la un microscop cu capacitate de mărire de 400x. Sunt evaluați 100 de spori formați la nivelul tubului de mărire sau germenii din trei domenii diferite, de pe trei lame de citire ale dispozitivului (5).
Pentru incubare este utilizat și sistemul AnaeroGen (Oxoid, UK) în cazurile în care laboratorul nu este echipat cu incubator de CO2. Un pachet care creează anaerobioză este plasat împreună cu vasul Petri într-un recipient sigilat și va genera între 9 și 13% CO2 (5). Această din urmă modalitate de obținere a condițiilor de anaerobioză este frecvent aplicată și în multe laboratoare din România. Cea mai utilizată modalitate este incubarea în anaerostate care creează atmosferă de CO2 în proporții reglabile, controlate și/sau înregistrate, dar se poate efectua incubarea anaerobă în incubatoare de tip LEEC, prin renunțarea la dozajul concentrației de azot și menținerea numai a reglajului pentru CO2, la o concentrație de 10-12%.
6. Testele biologice. Standardizarea biologică este un tip de experiment tot mai utilizat în experiențele științifice, dar și pentru stabilirea unui diagnostic de certitudine pentru multe afecțiuni. Presupun utilizarea animalelor vii sau a plantelor („in vivo”) sau testarea pe țesuturi animale sau celule („in vitro”). Din 1972, cercetătorii au infectat larve de albine de diferite stadii, cu hrană contaminată, în condiții de laborator (31).
Testele biologice de infectare cu A. apis pot fi realizate cu ajutorul larvelor crescute „in vitro” sau pe larve recoltate direct din colonii. Pentru creșterea larvelor „in vitro”, este utilizată hârtia BEEBOOK, metodă care a fost dezvoltată și este utilizată și recomandată în vederea stabilirii unui protocol standard detaliat, aplicabil pentru cât mai multe experiențe (3).
Un test biologic „in vitro” are avantajul monitorizării pe tot parcursul biotestului efectuat. În general, este exclusă variabilitatea de imunitate și permite efectuarea de experiențee repetabile într-un mediu controlat. Pentru abordarea problemelor legate de comportamentul igienic al albinelor sau alte aspecte particulare ale biologiei acestora, ar trebui ca testele biologice să se desfășoare direct în coloniile de albine (7).
Analizele biologice „in vitro” pe larvele crescute în condiții de laborator au fost utilizate de Vojvodic și colab., (20) pentru a evalua diferențele de virulență a diferitelor tulpini de A. apis, pentru a compara răspunsul la temperatură, pentru a testa sensibilitatea diverselor subspecii de albine față A. apis (7) sau pentru explorarea răspunsului gazdei la infecția cu A. apis la nivel molecular (7).
Sporii de A. apis trebuiesc administrați sau ingerați de către larve, prin urmare, ei trebuie să fie încorporați în produse alimentare. Sporii pot fi administrați în două moduri:
larvele sunt alimentate cu o cantitate mică, 5 µl lăptișor de matcă contaminat cu spori, care este administrat și ingerat repede de fiecare larvă hrănită individual, sau
larvele sunt hrănite ,,ad libitum”, cu o cantitate mai mare de hrană, care este suficientă pentru o anumită perioadă de timp.
Avantajul alimentației în cantități mici este dozarea exactă a sporilor administrați larvelor, deci condiții care sunt perfect controlate, iar diferitele doze, de ex. DL50, pot fi corect calculate (7).
În funcție de vârsta larvară, hrănirea suplimentară trebuie să fie efectuată în aceeași zi, cu aproximativ 2 ore mai târziu, după terminarea primei doze de 5 µl. Cu toate acestea, dacă scopul este de a produce un număr mare de larve infectate, este mai eficientă utilizarea surplusului alimentar, tehnica fiind mai puțin consumatoare de timp.
Toate stadiile larvare pot fi infectate cu A. apis, dar este recomandată utilizarea stadiilor 2 – 4. Pentru stadiul 5 termenul este prea scurt, sporii de A. apis având nevoie de o perioadă limitată de timp pentru germinare și penetrare a peretelui intestinal înainte de a defeca albina, iar larvele din primul stadiu de dezvoltare sunt inadecvate.
a. Testul biologic de infectare a larvelor individuale se execută astfel:
se prepară o soluție de spori de 2 x 108 spori/ml în ADS;
soluția de spori obținută, combinată, în proporții egale, cu miere (50% miere: 50% ADS) se aplică pe faguri conținând larve de stadiul cinci, în stup. În plus, fiecare dintre larvele de stadiul cinci sunt hrănite cu 5 µl de hrană contaminată (cantitate care echivalează cu o doză de 5×105 spori distribuiți pe larvă). Se amplasează hrana cu grijă pentru a se evita atingerea larvelor și se urmărește consumul prin observare directă:
după hrănire, bucățile de fagure vor fi stocate timp de 2 ore la 25°C, după care fagurii sunt transferați în stup, astfel încât albinele să evite celulele care conțin larvele inoculate;
se mută din nou fagurii, după cel mult 20 de ore și se păstrează temperatura de 25°C și aproximativ 65% umiditate, timp de 5 zile. Răcirea larvelor va asigura dezvoltarea micetului (reproducerea bolii), iar o placă Petri deschisă care conține ADS, introdusă concomitent în incubator, va oferi o umiditate suficientă;
după 5 zile se citesc celulele identificate inițial și se înregistrează rezultatele (7).
b. Testul biologic de infectare în colonii. Efectuarea infecției în coloniile de albine poate afecta un grup de larve sau poate provoca boala în toată colonia. Procedura diferă pentru fiecare caz în parte.
În primul caz, larvele sunt hrănite direct cu lăptișor de matcă contaminat cu suspensia de spori.
În al doilea caz, alimentarea cu sirop de zahar/miere sau hrănirea cu turte de polen cu spori, vizează întreaga colonie sau zonă care este expusă la infecția cu spori (7).
Se mai poate apela la utilizarea unor fragmente de fagure care conțin puiet de albine și care au fost supuse controlat procesului de refrigerare (4). Astfel, au fost evaluate tehnicile folosite pentru inocularea coloniilor cu spori de A. apis. Mumifierea majorității populației larvare, în proporție de 90,63%, a fost atinsă prin pulverizarea unei soluții care conținea apă și spori peste fagurii cu puiet, iar în coloniile hrănite cu turte de polen cu spori s-a ajuns la un grad de infectare de 86,32%. Utilizarea siropului de zahăr cu spori a atins cote de contaminare de doar 60,13% și s-a dovedit a fi mai puțin eficace.
Testul biologic de infectare a coloniilor de albine cu o suspensie de spori cu apă. Prepararea soluției de spori trebuie să asigure o concentrație de 1,25 x 107 spori/ml în apă distilată sterilă. Se aplică prin spray-ere 10 ml din suspensia pregătită pe suprafața fagurilor. Această cantitate este suficientă în colonii cu 8-10 faguri (4).
Infectarea coloniilor cu spori și polen presupune prepararea unei soluții de 1,25 x 107 spori/ml în ADS. Se adaugă soluția de spori în cantitate de 100 ml la 150 g polen, iar produsul obținut se distribuie în partea de sus a ramelor.
Metoda alternativă, mai simplu de executat, presupune aplicarea acesteia când concentrația de spori nu este foarte importantă sau nu interesează. Suspensia infectantă se obține prin omogenizarea a 15 mumii negre care se amestecă cu 150 g polen (7).
7. Disponibilitatea tulpinilor și izolatelor de referință recomandate
Izolatele microbiene, inclusiv cele fungice, sunt depozitate și stocate în mai multe colecții de culturi din întreaga lume. Acestea sunt disponibile atât pentru uz comercial, cât și științific. Izolatele pot fi comandate direct de la posesorii de colecții de culturi sau de la distribuitori, contra-cost, tariful fiind de obicei mic și dirijat către organizații non-profit.
Tulpinile de A. apis prezintă virulență diferită asupra albinelor (20) și pot prezenta variabilitate în privința altor trăsături biologice. Astfel, pentru a putea compara diferite studii se recomandă utilizarea tulpinilor de referință AFSEF 7405 și ARSEF 7406. Acestea au fost implicate într-un proiect de secvențiere a genomului pentru A. apis (15). Fiecare dintre aceste tulpini deține câte două tipuri de fecundare și ambele pot fi ușor recuperate din colecțiile de culturi ATCC sau USDA-ARSEF (7).
8. Testul PCR – convențional pentru diferențierea tulpinilor de Ascosphaera apis
Există o mare variabilitate genetică a tulpinilor de A. apis, testul fiind absolut necesar pentru diferențierea tulpinilor de proveniență diferită. Pentru a identifica tulpinile izolate de A. apis și markeri microsateliți necesari, au fost dezvoltate metode de amprentare PCR (16). Metoda de amprentare PCR utilizează primeri ai diferiților producători. Prin utilizarea aleatorie în timp și zone geografice, a mai multor tipuri de primeri (BOX, REP și ERIC), s-a demonstrat fidelitatea acestora și rezultatele au stabilit variabilitatea genetică a tulpinilor de A. apis (17).
Recent, au fost verificate mai multe secvențe din regiuni intergenetice sau introni, iar trei dintre acestea s-au dovedit a fi extrem de variate, aceste secvențe fiind desemnate pentru identificarea și diferențierea tulpinilor de A. apis (7). Avantajele secvențializării ADN-ului cu primeri specifici prin amprentare și markeri microsatelit PCR sunt evidente, secvențele obținute într-un studiu putând fi ușor comparate cu cele din alte studii.
Diagnosticul de laborator de tipul PCR-convențional este efectuat de către Laboratorul Național de Referință (LNR) pentru patologia albinelor, din cadrul IDSA București, prin utilizarea primerilor de tip ERIC.
Laboratoarele de referință europene – LRUE, sunt instrumente esențiale pentru gestionarea riscurilor de îmbolnăvire la animale, în acest caz pentru gestionarea problemelor de sănătate ale albinelor. Pentru o testare fiabilă din punct de vedere științific și uniformă ca aplicare, LRUE oferă garanții, fiind un element fundamental în aplicarea măsurilor de combatere și eradicare a bolilor la albine (26).
Diagnosticul diferențial se face față de loca americană, puietul în sac, puietul pietrificat (aspergiloză) și față de ascosferoza păsturii produsă de A. alvei, care nu este patogen pentru puietul de albine. Diferențierea miceților A. apis de A. alvei se face prin colorarea frotiurilor cu lactofenol Aman – blue cotton (LPCB) care clarifică frotiul și poate spori contrastul pentru o mai bună analiză a morfologiei miceților (1). În urma efectuării acestui examen se pot deosebi A. apis de A. alvei, prin caracterele morfologice ale ascochistului (corpul de fructificare). La A. apis ascochistul are o membrană simplă, spre deosebire A. alvei, la care membrana este dublă (fig. II.4.4.).
Profilaxie și combatere
Profilaxia în ascosferoză se realizează prin aplicarea următoarelor măsuri:
asigurarea microclimatului corespunzător, factorii climatici externi, dar mai ales cei de la nivelul stupului fiind favorizanți pentru ascosferoză, dar și alte afecțiuni ale stupului. Condițiile de microclimat pot fi monitorizate prin montarea unor senzori de temperatură și umiditate, în fiecare stup (13).
amplasarea stupilor în perimetrele apărate de vânt, în locuri însorite și la o înălțime de cel puțin 30 cm față de sol.
înlocuirea periodică a fagurilor mai vechi de trei ani sau închiși la culoare, bruni sau negricioși; înnoirea anuală, permanentă a fagurilor stimulează dinamismul albinelor și scade riscul apariției bolilor în familiile de albine (12).
hrănirile de stimulare să fie făcute numai în perioadele recomandate, stabilite printr-un calendar, respectiv martie – aprilie și sfârșitul lunii iulie – începutul lunii septembrie (10). BeeVital MycoStop este un produs care poate fi administrat și preventiv.
ameliorarea subspeciilor de albine rezidente pe teritoriul României, pentru obținerea unor colonii rezistente la ascosferoză. Se consideră că Apis mellifera mellifera este mai susceptibilă la această boală decât Apis mellifera carnica și Apis mellifera ligustica (15).
Combaterea ascosferozei se realizează prin măsuri:
a) organizatorice;
b) biotehnice;
c) chimice, medicamentoase.
a) Potențarea tratamentului medicamentos sau paleativ se efectuează concomitent cu unele acțiuni organizatorice:
administrarea unei alimentații calitative și în cantități suficiente în hrănirile de stimulare, conform calendarului aplicol și condițiilor particulare din fiecare stupină, din fiecare an apicol;
curățirea manuală a fagurilor de larvele moarte, dacă larvele afectate sunt izolate;
reducerea cuibului prin scoaterea fagurilor de prisos, fagurii neocupați de albine sau incompleți, trecerea fagurilor cu puiet bolnav la marginea cuibului, multiplicarea puietului sănătos, înlocuirea/reformarea ulterioară, după eclozionarea puietului sănătos;
impulsionarea activității de curățire a albinelor, prin diferite procedee;
restrângerea cuiburilor;
înlocuirea mătcilor din familiile bolnave cu mătci sănătoase, eventual selecționate, rezistente la îmbolnăviri;
eliminarea fagurilor cu puiet afectat de boală, introducerea fagurilor artificiali sau noi, a fagurilor corect dezinfectați, adunarea și arderea larvelor moarte.
În cazurile cu extensie mare a bolii, fagurii cu mult puiet bolnav se pot arde.
Reducerea la minimum a utilizării substanțelor chimice, combinată cu aplicarea metodelor biotehnice; trebuie respectată obligatoriu în combaterea bolilor albinelor, fiind cunoscută sub denumirea de combatere integrată (15).
b) Măsurile biotehnice de combatere presupun:
îndepărtarea și arderea larvele de pe fundul și din fața stupului;
topirea fagurilor puternic afectați;
dezinfecția stupului;
asigurarea unei ventilații corespunzătoare în stupi, prin deschiderea fantelor de aerisire și ridicarea stupilor de la sol, dacă este cazul;
reducerea umidității din stupi prin diferite metode: plasarea stupilor în zone însorite sau introducerea unui bulgăre de var nestins de cca. 100 g în stup, reduce rapid și semnificativ umiditatea excesivă;
stropirea fagurilor cu sirop de zahar pentru a stimula instinctul de curățire;
menținerea familiilor în stare activă, cu populație numeroasă, practicarea înmulțirii pe cel puțin 4 rame, pe bază de roiuri puternice;
stupul și inventarul apicol din lemn se dezinfectează prin scufundarea în soluție de sodă caustică 4%, la care se adaugă soluție de hipoclorit de sodiu 1%, urmată de 3-4 clătiri abundente cu apă; dezinfecția vetrei stupinei se face cu var stins, iar a fagurilor cu apă oxigenată, prin pulverizare (23);
punerea la dispoziția mătcilor a fagurilor care au numai celule cu albine lucrătoare, concomitent cu limitarea creșterii puietului de trântor (12).
c) Tratamentele medicamentoase precum și aplicarea unor metode de dezinfecție chimică, implică riscuri și trebuie aplicate cu precauție. Astfel de tratamente pot contamina produsele apicole, cum ar fi mierea, ceara și polenul (23).
Există foarte puține produse sau medicamente destinate combaterii ascosferozei („puietului văros”), de obicei specialiștii indicând numai măsuri de igienizare a stupilor și stupinei sau corectarea managementului coloniei respective. De-a lungul timpului în tratamentul puietului văros au fost încercate numeroase medicamente, atât antibiotice, cât și substanțe chimice, fără însă să se obțină rezultate mulțumitoare.
Tratamentele medicamentoase sunt interzise în stupinele bio. Se recomandă soluții naturale, administrarea unor ceaiuri de plante care conțin antibiotice naturale (vezi cap. I.5).
Sporii micetului A. apis sunt ușor de distrus cu ajutorul fumigațiilor, de exemplu, cu etilenă sunt foarte eficiente (24).
Literatura de specialitate recomandă utilizarea unei game largi de substanțe anitmicrobiene și/sau antifungice. Cu rezultate bune se poate utiliza stamicina, griseofulvina, mycostatina, amphotericina, cycloheximida și quixalina. În Belgia se utilizează cu succes acidul ascorbic, propionatul de sodiu, parahidroxibenzoatul de metil, iar în S.U.A. se aplică tratamente pe baza unui amestec de iod și cărbune, administrat prin volatilizare sau prin ardere (12).
Se poate utiliza Fungisanul, un produs medicamentos care are ca substanță activă un antiseptic pe bază de amoniu cuaternar (dodecyl dimethil ammonium bromide- Bromocet), recomandat pentru tratarea bolilor la puiet, inclusiv „puietul văros” (mod de administrare, vezi melanoza).
În literatura din ultimii ani există încercări de renunțare la tratamentul medicamentos și folosirea unor variante de tratamente naturale, absolut necesare pentru obținerea de produse bio, și care inhibă germinărea sporilor de A. apis.
BeeVital MycoStop este un produs ecologic. Se prezintă sub forma unui lichid dulce, de culoare roz închis, compus din zaharoză, acizi organici stabili: acid citric, oxalic, formic și acetic. Din compoziție mai fac parte uleiuri esențiale, mușetel, extract de propolis și apa. Concentrațiile componentelor considerate optime pentru a acționa împotriva ascosferozei, constituie secretul producătorului.
Formula specifica pentru BeeVital MycoStop s-a dovedit a inhiba dezvoltarea fungului Ascosphaera apis, „in vitro” și a fost aleasă pentru a stimula comportamentul de igienizare al albinelor, contribuind în felul acesta la intensificarea activității de eliminare a larvelor mumifiate din celulele fagurilor și din stup (30).
Studiile „in vitro” au stabilit că la concentrații mai mari de 6 %, BeeVital MycoStop are acțiune fungistatică asupra celor 12 tulpini de Ascosphaera apis, testate (Chorbiński P., 2009).
Fig. II.4.7. Schema terapeutică propusă de BeeVital, (2011)
Pentru stupinile contaminate, aplicarea tratamentului prevede o schemă cu o administrare principală de BeeVital MycoStop care se face de două ori pe an, primavara și toamna sau conform schemei concepută de autor (fig. II.4.7). Schema terapeutică poate fi completată în caz de necesitate și cu alte aplicații. Practic produsul poate fi administrat ori de câte ori este nevoie.
Preparatul se încălzește la temperatura de 30-35șC și se utilizează când temperatura exterioară depășește 15șC. Se stropesc fagurii, în zona puietului, dar se poate administra și în zonele cu albine, în cantitate totală de 20-30 ml pentru o colonie. Tratamentul se repetă de 2 – 3 ori, la interval de 7-10 zile. Aplicarea tratamentului chiar și în perioadele de cules, exclude riscul de a contamina produsele apicole obținute (26).
II.4.2. Aspergiloza (Puietul pietrificat)
Aspergiloza afectează larvele, nimfele, dar și albinele adulte, destul de frecvent întâlnită, fiind produsă de miceți ai genului Aspergillus, manifestată clinic prin transformarea larvelor moarte într-o magmă cremoasă, iar anatomopatologic prin colorarea albă sau galben-verzuie a larvelor pietrificate și aderența acestora de pereții celulelor (31).
Istoric, răspândire, importanță
Aspergiloza se întâlnește frecvent în stupinele instalate în locuri umbrite, pe sol umed sau când stupii sunt amplasați aproape de pământ. Unii autori au stabilit o legătură între administrarea antibioticelor și evoluția bolii. Se consideră că dezechilibrul florei intestinale la albinele tratate cu antibiotice sau predispoziția genetică favorizează apariția bolilor fungice în general, inclusiv a aspergilozei (12). Micoza produce pierderi economice și se poate transmite la om (zoonoză), la care afectează mucoasele oculare și ale aparatului respirator (12).
Etiopatogenie
Genul Aspergillus este format din peste 250 de specii dintre care 40 de specii sunt cunoscute pentru rolul de agenți patogeni oportuniști (2). Acești miceți sunt în majoritate saprofiți, trăiesc în sol, pe plante sau pe diferite produse alimentare, dezvoltă miceliul la suprafața sau în interiorul substratului, producând mucegaiurile verzi (31). Agenții etiologici ai aspergilozei sunt Aspergillus flavus, A. fumigatus și uneori A. niger. Miceliul acestor ciuperci comune este de culoare galben-verzui, respectiv verde cenușiu spre negricioasă și produce spori cu rezistență mică la acțiunea căldurii și dezinfectantelor comune (12).
Miceții acestui gen au ascele învelite în cleistoteci sau cleistocarpi, corpuri sporifere complet închise, care la maturitate se dezagregă și pun în libertate sporii. Miceliul este filamentos, ramificat și septat, alcătuit din celule uninucleate.
Speciile din genul Aspergillus, se înmulțesc asexuat prin conidii, care se formează pe conidiofori simpli, măciucați sau ramificați, dispuși izolat sau în grupuri. Îmulțirea sexuată este de tip ascogamie, reproducerea fiind un proces în care ascogonul și anteridiul se împletesc în desăvârșirea înmulțirii, de unde și numele (plectos= împletire) (31). Variabilitatea tulpinilor și implicit, a rolului acestora în etiologia unor boli demonstrează importanța și necesitatea identificărilor genotipice, pentru fungii izolați din stupine și stabilirea modului în care intervin în epidemiologia bolilor.
Studii recente arată că în etiologia aspergilozei, la albine, sunt implicate trei specii, respectiv A. flavus, A. nomius și A. phoenicis (5). Deși s-a demonstrat rolul de factor etiologic doar pentru cele trei specii menționate, au fost identificate zece specii de Aspergillus izolate din miere, care sunt patogene pentru larvele de albine. Albinele melifere adulte sunt extrem de sensibile la infecția cu A. flavus, atunci când sunt hrănite cu alimente care conțin sporii acestei specii. Aspergillus nomius a fost frecvent izolat din insecte, fiind considerat un entomopatogen cunoscut. El produce aflatoxine de tip A și G (Poulsen și colab., 2006; citați de 5).
Testul doză-răspuns care utilizează un izolat de A. phoenicis, demonstrează creșterea mortalității larvelor contaminate, la toate dozele utilizate, fiind prima raportare a patogenității acestei specii de Aspergillus pentru albine. Studiul continuă cu demolarea parțială a rolului de factor etiologic pentru A. niger, deoarece izolatul obținut de autori nu a prezentat patogenitate la testele efectuate pentru tulpinile încadrate în această specie, ceea ce poate fi explicat prin faptul că în natură poate să apară o subtilă variație fenotipică între diferite specii de Aspergillus variații care pot afecta în mod semnificativ virulența acestora. Testele în care au fost utilizate tulpini de A. flavus și tulpini A. nomius, a arătat că A. flavus poate fi patogen la toate dozele care au fost utilizate în studiu (5).
Rezistența fungilor la acțiunea agenților fizici și chimici este mică. Rezistă 30 de minute la 60ș C, iar dezinfectanții uzuali îi distrug în concentrații obișnuite; fenol 2,5%, sublimat corosiv ‰ sau formol 5%.
Epidemiologie
Evoluția bolii în coloniile de albine este influențată de unii factori favorizanți, cel mai frecvent fiind incriminat culesul abundent de polen; în acest caz, polenul nu mai este suficient de bine prelucrat și nici nu este bine compactat în celulele fagurelui, astfel că fungii găsesc condiții prielnice de dezvoltare.
Contaminarea cu Aspergillus spp. este foarte răspândită în natură, fungul fiind întâlnit în special în sol și depozitele de cereale, albinele venind frecvent în contact cu aceștia. Fungii genului Aspergillus infectează, îmbolnăvesc și omoară și alte categorii de insecte, fiind cauza îmbolnăvirilor respiratorii la animale, dar și la om (11).
Miceții sunt aduși în stup, cel mai adesea de către albine, dar stupul poate fi contaminat și de către apicultori, prin manipularea obiectelor de inventar sau prin intermediul vântului. Calea de transmitere este bucală, infectarea făcându-se prin consumul de nectar, polen sau apă contaminate. Boala este influențată de acțiunea unor factori nefavorabili de mediu, fiind agravată, în special, de umiditate (12).
Odată pătrunși în tractul digestiv, sporii germinează, traversează peretele intestinal, pătrund în hemolimfă, iar de aici în toate organele interne unde se dezvoltă și distrug țesuturile, astfel că procesul patologic duce la moartea organismelor infectate. Destul de frecvent, evoluția bolii este rapidă, aspergiloza extinzându-se la puiet și la categoriile de albine adulte.
Simptomatologie
Fungii, inițial, invadează fagurii cu păstură și albinele moarte, apoi trec pe fagurii cu larve. Larvele se deshidratează, iar pe suprafața lor apar micelii de culoare albă – gălbuie sau galben – verzui; culoarea miceliilor este dată de absența sau prezența sporilor. După penetrarea larvelor, fungii își extind dezvoltarea și la pereții celulelor, astfel că se produce o legătură strânsă între larvă și celulă, așa încât albinele nu mai pot îndepărta cadavrele acestora din fagurii cu puiet.
Prin deshidratare puietul devine de consistență dură, de unde denumirea de ,,puiet pietrificat”. Larvele prezintă aspect mumifiat, acestea apărând de culoare albă din cauza existenței unui singur tip de miceliu; la albinele adulte, miceliul invadează suprafața corpului, inclusiv spațiile dintre tergitele abdominale.
Fig. II.4. Fig. II.4.8. Fagure cu aspergiloză Fig. II.4.9. Cladospori ai Aspergillus
(după Chioveanu, LNR – IDSA) spp., MO 100x ( L.S.V.S.A. Iași)
Fig. II.4.10. Aspergillus flavus, MO 40x Fig. II.4.11. Aspergillus niger,
(L.S.V.S.A. Iași) MO 40x (L.S.V.S.A. Iași)
Dacă miceliul este compus din ambele sexe, acestea se reproduc, iar sporii formează micelii de culoare verde, verde închis sau neagră (6). La deschiderea stupului și la recoltarea fagurilor contaminați cu Aspergillus spp., se constată insule de mucegai verde pe suprafața și în celulele fagurilor, iar de multe ori miceliul acoperă suprafața celulelor (fig. II.4.8.).
De pe pereții celulelor fagurilor miceliul se extinde și pe suprafața fagurilor, fiind observat, pe diferite porțiuni, la deschiderea stupilor și examinarea ramelor.
Aspergiloza se manifestă la albinele bolnave prin neliniștite, mișcări anormale, dezordonate ale segmentelor corporale și mandibulelor, albinele nu pot zbura, cad de pe faguri, cad la fundul stupului, paralizează și mor. Invazia fungică începe de la intestin, iese prin orificiile naturale, cuprinde apoi tegumentul și acoperă întreg corpul cu un strat de spori galben-verzui.
Deoarece sporii nu sunt închiși în asce ca la Ascosphera, aceștia sunt liberi la suprafața corpului albinelor, de unde prin curenții de aer pot să invadeze întreg stupul. Acest fenomen explică de ce nu există vindecări spontane în aspegiloză, evoluția bolii ducând, de regulă, la moartea familiei de albine (8, 12).
(după LNR
Morfopatologie
Cadavrele albinelor prezintă abdomenul ușor mărit, pentru ca mai târziu, atât abdomenul cât și toracele să devină indurate. Albinele mor în câteva ore prin toxiemie. La deschiderea stupului se constată insule de micelii galben-verzui sau cenușiu – negricios. Larvele sunt mumifiate, aderente la pereții celulelor, de aspect dur-pietros și consistență sfărâmicioasă. Acestea mor în momentul căpăcirii sau chiar imediat înainte de căpăcire.
Diagnosticul în aspergiloză
Diagnosticul prezumtiv se pune pe baza semnelor clinice, a modificărilor anatomopatologice, iar diagnosticul de certitudine se face prin investigații de laborator: examen microscopic, micologic și teste PCR.
Distingem următoarele aspecte clinice și/sau anatomopatologice specifice:
îmbolnăvirea albinelor adulte și a larvelor;
albinele bolnave sunt agitate, prezintă incapacitate de zbor, cad la pământ, au mișcări dezordonate ale membrelor, ale pieselor bucale sau ale segmentelor corporale;
albinele mor în câteva ore prin toxiemie;
larvele sunt deshidratate, au consistență dură, pietrificată;
larvele afectate sunt puternic aderente de pereții celulelor, acestea mor imediat după căpăcire;
celulele necăpăcite prezintă o pânză micelară de culoare galben-verzuie sau neagră, care înfășoară larva, umple spațiul dintre larve și pereții celulelor;
se constată prezența unor insule sau plaje de mucegai la nivelul fagurilor;
miceliul invadează albinele începând de la intestin, cuprinde apoi tegumentul, iese prin orificiile naturale și acoperă întreg corpul cu un strat de spori galben-verzui.
Diagnosticul de laborator se face prin examene microscopice, micologice și teste PCR. Examenul laborator se realizează pe probe de faguri cu puiet și/sau cu plaje micelare, pe albine moarte, acoperite cu un strat de spori galben-verzui sau direct din larvele afectate de boală. Mierea poate constitui probă destinată examenului de laborator, pentru a verifica posibilitatea transmiterii aspergilozei la om prin consum.
Contaminarea mierii cu spori de Aspergillus spp. poate fi interpretată ca indicator al existenței micetului sau chiar a bolii (aspergilozei), nefiind obligatoriu un criteriu pentru a stabili gravitatea evoluției bolii în stup sau ca un indicator al stării de igienă a mierii, cu trimitere la modul de depozitare al acesteia, în special pentru depozitarea pe termen lung. Mierea de albine este expusă la contaminarea cu o mare diversitate și abundență de conidii fungice, contaminare care este favorizată de condițiile microclimatice favorabile care există în stupul contaminat. S-a constatat o corelație între existența unor contaminări de intensitate mare, cuantificată în unități formatoare de colonii/g (ufc/g) din larve, albinele melifere adulte sau probe de aer, colectate din stup și gradul de contaminare al mierii cu specii de Aspergillus.
Incidența ridicată a speciilor din genul Aspergillus în stupii afectați natural sau contaminați artificial se explică prin prevalența mai mare pentru speciile care produc conidii, comparativ cu cele nonconidiofore (5).
1. Examenul microscopic. Preparatele proaspete colorate cu lactofenol prezintă un număr foarte mare de conidii sau spori vegetativi, generați de conidioforii formați dintr-o columelă rotundă sau ovală, acoperită în totalitate de sterigme dispuse pe un singur rând și înconjurate de conidii (2). Aspectele microscopice sunt bine observate la o mărire de 40x (fig. II.4.10. și fig. II.4.11.). Aspectul microscopic al cladosporilor este indicat a fi examinat pentru a ne ajuta la identificarea genului (fig. II.4.9).
2. Examenul micologic se efectuează pe medii specifice, recunoscute ca având proprietăți care permit/stimulează dezvoltarea miceților, inclusiv pentru reprezentanții genului Aspergillus (22). În mod curent, în laboratoarele din România, cele mai utilizate medii sunt:
Sabouraud dextroză agar conține: glucoză 40,0 g, agar 15,0 g, petonă micologică 10,0 g. Mediul se sterilizează prin autoclavare la 115ș C, timp de 15 minute; pH-ul final al mediului trebuie să fie de 5,6 +/- 0,2;
Mediul OGYE (oxytetracycline-glucose-yeast extract agar) cu formula: glucoză 20,0 g, agar 12 g, extract de drojdie 5,0 g; Necesită suplimente antimicrobiene- gentamicină și oxitetracilină. Mediul se sterilizează prin autoclavare la 115ș C, timp de 15 minute; pH-ul final al mediului trebuie să fie de 7,0 +/- 0,2;
DG 18 (Dichloran Glycerol Chloramphenicol) conține: agar 15,0 g, glucoză 10,0 g, cazeină enzimatică 5,0 g, fosfat de potasiu dehidrogenat 1,0 g, sulfat de magneziu 0,5 g, dichloran (2,6-dichloro-4nitroaniline) 0,002 g, La o cantitate de 500 ml de mediu se adaugă 50 mg cloramfenicol. Mediul se autoclavează la 121ș C, timp de 15 minute; pH-ul final al mediului trebuie să fie 5,6 +/- 0,2;
DRBC (dichloran-rose bengal chloramphenicol) are formula: agar 15,0 g, glucoză 10,0 g, peptonă 5,0 g, fosfat de potasiu dehidrogenat 1,0 g, sulfat de magneziu 0,5 g, dichloran (2,6-dichloro-4nitroaniline), 0,002 g, roz-bengal 0,025 g. Necesită o cantitate de 50 mg cloramfenicol, la 500 ml. Se sterilizează prin autoclavare la 121ș C, timp de 15 minute, pH-ul mediului = 5,6 +/- 0,2;
agar malt extract – MEA cu formula: extract de malț 30,0 g, agar 15,0 g, peptonă microbiologică 5,0 g. Mediul se sterilizează prin autoclavare la 115ș C, timp de 15 minute, pH-ul final al mediului trebuie să fie de 5,6 +/- 0,2;
cartof dextroză agar – conține: glucoză 20,0 g, agar 15,0 g, cartof 4,0 g. Mediul se sterilizează prin autoclavare la 115ș C, timp de 15 minute, pH-ul final al mediului trebuie să fie de 5,6 +/- 0,2;
AFPA agar nu este un mediu strict selectiv pentru Aspergillus spp. Conține: agar 15,0 g, peptonă 10,0 g, extract de drojdie 20,0 g, citrat de fier amoniacal 0,5 g, dicloran 0,002 g. Se sterilizează prin autoclavare la 121ș C, timp de 15 minute. La o cantitate de 500 ml mediu se adaugă 50 mg cloramfenicol. Se ajustează pH-ul mediului la 6,3 +/- 0,2 (5).
Conform tehnicilor standardizate SR ISO, mediile însămânțate pentru obținerea culturilor de miceți se introduc în termostat pentru incubare la întuneric, la 25-28°C, timp de 5-7 zile.
Indiferent de mediul utilizat, aspectul miceților din genul Aspergillus, implicați în etiologia bolii, apare relativ sub aceeași morfologie (fig. II.4.12., fig. II.4.13).
Speciile de fungi care se dezvoltă pe aceste medii trebuie să fie diferențiate în funcție de caracteristicile morfologice comune. O schemă de identificare poate încadra miceții genului în trei secțiuni: secțiunea fumigati: flavus, niger, etc.; secțiunea flavi – cei mai puțin comuni miceți sau secțiunea ,,alți miceți", în funcție de aspectul și de culoarea conidiilor. Culturile pure de Aspergillus s-au obținut frecvent, în special din izolatele cultivate pe agar cu extract de malț (MEA) sau AFPA agar.
3. Testul PCR. Identificarea fungică moleculară este necesară pentru a confirma rezultatele morfologice și micologice și pentru o identificare corectă, sigură, a speciilor implicate în etiologia aspergilozei, dar și pentru identificarea altor specii din genul Aspergillus care pot fi prezente și care pot avea un rol patogen.
Pentru a efectua o estimare a intensității contaminării fungice aspergilare și/sau prezența sporilor acestor fungi, la fiecare probă de larve și albine adulte, se efectuează însămânțări pe medii de cultură și se stabilește numărul de ufc/g, raportat cantitativ prin numărarea ufc din fiecare dintre plăcile însămânțate cu o doză cunoscută.
După obținerea calitativă a izolatelor și identificarea morfologică a acestora se efectuează testele PCR. Pentru a extrage ADN-ul fungic sunt necesare aproximativ 0,05 g de conidie fungică, colectate de pe plăcile proaspete care conțin conidia, la care se adaugă 5% suspensie 200 Chelex și 0,05 g perle zirconiu/siliciu, cu dimensiune de 0,1 mm și plasate într-o Tissue QIAGEN Lyser beadbeater timp de 4 minute la 50 de oscilații/sec. Probele sunt incubate într-o baie de apă al 90̊ C, timp de 20 min, apoi sunt centrifugate timp de 30 min. Supernatantul este curățat pentru îndepartarea inhibitorilor (Zymo Research), înainte de testarea PCR.
Identificarea speciilor se efectuează după secvențierea ADN-ului
(5).
Fig. II.4.12. Aspergillus flavus. Fig. II.4.13. Aspergillus niger.
Culturi pe mediul DG18 (L.S.V.S.A. Iași);
Diagnosticul diferențial se face față de paralizii, intoxicații și puietul văros, alți fungi sau levuri patogene sau saprofite.
Tratamentul este identic cu cel aplicat în cazul ascosferozei. Pentru tratamentul aspergilozei nu este înregistrat nici un agent chimioterapeutic eficient. Deși mulți cercetători au realizat experimente privind utilizarea substanțelor chimice pentru a controla boala, cele mai multe încercări nu au avut succes din cauza toxicității substanțelor chimice la albine, inacceptabilitatea utilizării acestora pentru aceste insecte, iar un alt impediment este constituit de timpul și efortul necesar pentru a dezinfecta, ulterior, toate părțile stupului. Din cauza dificultăților întâmpinate în găsirea unui agent eficient de control chimic și înregistrarea oficială a acestuia, pentru a fi utilizat în tratamentul bolii, au fost inițiate studii cu privire la comportamentul de curățare al unor colonii. Ipoteza este bazată pe posibilitatea controlului genetic al comportamentului de curățare la albine și posibilitatea de a dezvolta rezistență pe baza instinctului igienic din comportamentul acestora (5).
Utilizarea substanțelor medicamentoase de sinteză în tratamentul bolilor la albine este, în principiu, un deziderat considerat depășit. Se obțin rezultate bune în combaterea bolii, dar este afectată calitatea mierii, prin acumularea reziduurilor în produsele finale.
Fungisanul, este un produs medicamentos care are ca substanță activă un derivat de amoniu cuaternar (didecyl dimethil ammonium bromide- Bromocet), fiind recomandat pentru tratarea bolilor la puiet, inclusiv în aspergiloză (vezi melanoza)
Considerăm că apelarea la tratamente naturiste, cu substanțe antimicrobiene obținute din plante medicinale (pelin, crizanteme, levanțică etc.,), corespunde dezideratului de a obține o miere de calitate, care să nu conțină substanțe antimicrobiene de sinteză.
Profilaxie și combatere
Prevenirea transmiterii bolii beneficiază de un set de măsuri care sunt eficiente dacă sunt corect aplicate și respectate. Însă, intervențiile în stupinele contaminate vor fi făcute cu multă precauție; personalul de deservire, din stupină, va purta echipament de protecție și mască de tifon îmbibată într-un antiseptic sau cel puțin în apă, pentru reținerea sporilor, care pot infecta lucrătorii (8).
Combaterea bolii, în stupinile în care aceasta evoluează, se face prin gazare cu bioxid de sulf sau cu formol, fagurii se ard, iar stupii se dezinfectează cu lampa de benzină. Fagurii cu albine neafectați se vor muta în stupi curați, uscați și dezinfectați. Fagurii puternic afectați de aspergiloză, se topesc. Lemnăria care a găzduit sau a venit în contact cu familiile bolnave, fagurii, reziduurile din stupi și stupină se arde (12). Dacă gravitatea și extinderea bolii nu este mare se poate apela la operațiuni de dezinfecție și/sau tratament termic. Însă dacă sunt afectate de aspergiloză și albinele adulte, colonia respectivă este distrusă prin ardere.
Măsura cea mai indicată în cazul aspergilozei, atunci când diagnosticul a fost stabilit cu precizie, prin analize de laborator, este desființarea coloniei contaminate, distrugerea puietului îmbolnăvit și decontaminarea materialului apicol din stupină.
II.4.3. Melanoza
Melanoza este o afecțiune de natură micotică, mai rar întâlnită, care afectează aparatul genital (oviductele, vaginul) și rectul mătcii, iar la albinele lucrătoare glandele salivare. Boala produce sterilitatea mătcilor (29).
Istoric, răspândire, importanță
Prima descriere a bolii a fost efectuată de către Fyg, în anul 1934. Cercetările privind agentul cauzal al melanozei sunt reluate de către Orosi-Pall, în anul 1936, acesta dându-i numele de Melanosella mors apis (12).
Etiopatogenie
Melanosella mors apis, microorganism primitiv, cu o clasificare incertă, este considerat răspunzător de apariția petelor melanice. Microorganismul este ușor de cultivat ,,in vitroˮ, nu reproduce boala pe albinele care ingeră acest agent, ceea ce denotă faptul că acesta este un saprofit și că numai ocazional contaminează albinele.
Melanosella mors apis se localizează în special, la nivelul ovarelor, fiind denumită de Orosi-Pall (1936) melanoza „H”. Ulterior, același autor a descris o altă formă de melanoză, pe care a denumit-o melanoza „B”, parazitează de asemenea organele genitale ale mătcii, dar care, spre deosebire de prima variantă/fază a melanozei, are etiologie bacteriană. Agentul etiologic al melanozei “B” este Aerobacter cloacae (11).
Melanosella mors apis și sporii săi se găsesc răspândiți în natură, inclusiv pe plantele entomofile, contaminarea albinelor fiind realizată la contactul cu aceste plante. Din cavitatea bucală, micetul pătrunde în glandele salivare, se înmulțește și de aici se transmite la matcă odată cu lăptișorul de matcă. Din tubul digestiv, sporii micetului difuzează în hemolimfă, după care se localizează în aparatul genital, unde produc aglomerări pigmentare care obstrucționează lumenul oviductelor (29). Boala evoluează de regulă destul de alert, moartea mătcii producându-se în 5 – 7 zile de la manifestarea primelor semne clinice (12).
Unii autori atribuie rol patogen și altor specii de miceți. Se consideră că Aureobasidium pullulans poate fi implicat în producerea melanozei. Micetul are două forme de prezentare: un pseudomiceliu cu celule individuale și spori și cea de clamidospori. În cazul pseudomiceliului se constată prezența unor celule alungite, separate, dar conectate între ele, cu dimensiuni de 5,6-7,3 x 11,2-20,2 µm. Clamidosporii au dimensiuni de 10 x 14 µm. În culturile tinere apar hifele care au culoare gălbuie, iar în culturi vechi se formează clamidospori groși, de culoare închisă. Clamidosporii rezistă în încăperi neîncălzite timp de 8 luni, iar soluția de hipoclorit de sodiu 2% are efect distructiv abia în 20 minute.
Aureobasidium pullulans poate fi cultivat pe agar dextroză cu cartof, unde produce colonii tinere de culoare roz slab, colonii netede acoperite cu o masă de spori lipicioși. Coloniile mai mari pot să-și schimbe culoarea în negru din cauza producției de clamidospori. Conidiile primare au aspect hialin, neted, aspect elipsoidal și sunt variabile ca formă și mărime; conidiile secundare sunt de dimensiuni mai mici. Micetul crește la 10-35°C, cu o creștere optimă la 30°C (29).
Aureobasidium pullulans are o mare plasticitate fenotipică. Morfologia coloniei poate fi afectată de sursa de carbon, vârsta coloniei, temperatură, lumină și substrat. Aceste modificări sunt potențial influențate de factori epigenetici și condițiile particulare de dezvoltare ale coloniilor. Este, de asemenea, adaptabil la diferite condiții de stres: hipersalinitate, aciditate, alcalinitate, temperaturi scăzute și condiții oligotrofe (30).
Micetul Paecilomyces lilacinus mai poate fi agent cauzal al melanozei albinelor. Infectarea mătcilor se face prin intermediul instrumentarului utilizat la inseminarea artificială. Specia poate crește într- o gamă largă de temperaturi, de la 8 la 38°C, cu o creștere optimă în intervalul 26°C- 30°C. De asemenea, are o toleranță largă la pH și se poate dezvolta pe o varietate de substraturi (29).
Expunerea umană îndelungată la A. pullulans prin umidificatoare sau aer condiționat, poate duce la pneumonie de hipersensibilizare (alveolita alergică extrinsecă) sau ,,plămân umidificatorˮ. Această afecțiune este caracterizată prin dispnee acută, tuse, febră și pneumonie acută. Apariția bolii la om prin intermediul stupilor afectați de melanoză nu a fost demonstrată încă, dar în practica apicolă este recomandat să se respecte măsurile generale de prevenire a transmiterii miceților.
Micetul care cauzează infecții la oameni, cunoscut anterior ca A. pullulans var. melanogenum a fost reclasificat ca specie de sine stătătoare (Aureobasidium melanogenum) (30).
Epidemiologie
Boala apare pe tot parcursul anului, fiind influențată de unii factori de mediu (răceală, umiditate crescută) și/sau mierea de mană.
Melanosella mors apis este larg răspândită în natură, inclusiv pe plantele entomofile; de pe florile acestora sporii fungului sunt luați de albinele lucrătoare odată cu polenul și nectarul și ajung în glandele salivare.
În glandele salivare, Melanosella mors apis se înmulțește și este transmisă reginelor, odată cu lăptișorul de matcă, produs de albinele infectate.
Sunt sensibile la boală toate mătcile, indiferent de vârstă (12).
Simptomatologie
Mătcile afectate de melanoză prezintă letargie, inapetență, volumul uterului se reduce și apoi încetează treptat depunerea pontei, iar abdomenul crește în volum. Letargia și mobilitatea redusă determină căderea de pe faguri. Anusul mătcii este blocat de un dop de excremente uscate. Diminuarea pontei până la încetare și prezența dopurilor de excremente în regiunea anusului sunt simptomele cele mai caracteristice pentru melanoză. Mătcile mor după câteva zile. Dacă boala evoluează cronic, simptomele bolii durează 6-8 luni (8, 12).
Morfopatologic
Mătcile cu melanoză prezintă diferite localizări ale agentului etiologic care determină apariția unor pete bronzante sau negre, care conțin masa granulară cu aceleași colorații. Localizările sunt la nivelul uterului, ovarului, glandei veninului și în intestinul posterior. Mătcile sunt slăbite, mai ales în evoluțiile cronice, au abdomenul mărit, iar la anus prezintă un dop cu excremente uscate. Mătcile care mor după câteva zile, au ovarele atrofiate și pline cu aglomerari pigmentare de nuanță închisă (15).
Diagnosticul
Diagnosticul în melanoză se pune pe baza semnelor clinice sau se poate apela la un laborator de specialitate. Leziunile de culoare negricioasă ale organelor genitale și prezența dopului de excremente în regiunea anală, orientează diagnosticul spre melanoză (12).
Diagnosticul de laborator presupune efectuarea de studii microscopice ale mătcilor, în special examinări la nivelul uterului pentru a fi observate schimbările patologice descrise, urmat de examene micologice.
Examenul micologic. Melanosella mors apis izolată de la nivelul ovarelor sau din alte zone se cultivă în condiții de laborator. Se folosesc medii specifice pentru micologie (vezi aspergiloza). În general, pe aceste medii produce colonii rotunde, cu diametrul de 0,5 mm și culoare galbenă deschisă (12).
Agentul etiologic al melanozei ,,B” este Aerobacter cloacae, o enterobacterie de aspect bacilar, care poate fi ușor identificată microbiologic prin cultivare pe medii pentru enterobacterii și confirmată prin teste biochimice standardizate (de exemplu galerii de tip 32E).
Aureobasidium pullulans formează pe agar cu cartof și glucoză, colonii mari, de până la 6 mm, umede, lucioase, de culoare gri. Incubarea se face timp de 3 zile. În a 3-a zi de incubare se observă creșterea coloniilor în mediu și înnegrirea acestora sub formă de raze (radial) și periferic. Cultura poate fi conservată în agar nutritiv, pe termen mediu, aceasta având un aspect negru. Tulpinile de micet caracterizate prin formarea clamidosporilor se identifică prin măsurarea dimensiunilor acestora, de 10×14 µm. În cazul pseudomiceliului se constată prezența unor celule alungite, separate, dar conectate între ele, cu dimensiuni de 5,6-7,3×11,2-20,2 µm. Acestea sunt celule în devenire (29).
Diagnosticul diferențial trebuie făcut și față de alte levuri, care se pot izola și identifica de la albinele bolnave. În literatura de specialitate sunt citate cazuri în care s-a izolat Saccharomycopsis lipolytica, o levură comună, de la albinele bolnave, însă încercările de a reproduce experimental boala nu au avut rezultate (9).
Totodată trebuie exclusă posibilitatea contaminării cu specii de Torulopsis, în mod deosebit T. candida (Giordani, 1952).
Unele specii de levuri contaminează în mod natural intestinul albinelor. Deși nu a fost dovedită patogenitatea acestora, unii autori menționează necesitatea excluderii contaminării corpului (intestinului) albinelor cu acești saprofiți (9).
Tratament
Se poate folosi Fungisanul, un produs medicamentos care este recomandat și în aspergiloză. Se administrează 2 ml fungisan la 1 litru de sirop 1/1. Pentru pulverizare se adaugă 10 ml fungisan la 1 litru de apă fiartă și răcită. Producătorul recomandă utilizarea unei diluții de 2 ml per litru în administarea pe cale orală, în hrana albinelor. Pentru pulverizarea ramelor de la rezervă și a stupilor vechi se poate folosi o diluție de 10 ml/l. Pulverizarea fagurilor de la rezervă se face înainte de introducerea lor în stupi, concomitent cu pulverizarea pereților și a fundurilor stupilor înainte de popularea acestora cu albine.
Bolile puietului sunt produse de ciuperci microscopice care se dezvoltă în mediul umed și întunecos al stupului. Folosirea fungisanului inhibă dezvoltarea acestor ciuperci, deci se poate utiliza și în prevenirea bolilor micotice (28).
Profilaxie
Efectuarea examenului micologic periodic al coloniilor de albine este recomandat de specialiștii în apicultură și este absolut necesar pentru monitorizarea stării de sănătate a albinelor (9). Se urmărește eliminarea factorilor favorizanți pe de o parte și recurgerea la înlocuiri planificate de mătci. Rezistența în mediu a agenților etiologici descriși este diferită.
Dacă se practică inseminarea artificială a mătcilor, instrumentarul utilizat (capilare, microseringi, etc.) trebuie decontaminat în soluție de monoclorură de iod 2%, timp de minimum 5 minute și soluție de iod 0,1% în alcool de 70%, timp de minimum 10 minute. Reziduurile de iod se îndepărtează cu bisulfit de sodiu 1% și soluție salină sterilă.
Combaterea melanozei
Este necesară stabilirea cât mai rapidă a diagnosticului afecțiunilor stupului.
Dispariția mătcilor bolnave din cadrul familiilor de albine se produce natural atunci când diagnosticul întârzie. Se recomandă recurgerea la îndepărtarea mătcilor afectate pentru a limita efectele bolii.
II.4.4. Bibliografie selectivă
1. Aronstein K.A., Murray K.D., (2010): Chalkbrood disease in honey bees. Journal of Invertebrate Pathology Honey Bee Research Unit, USDA-ARS, Weslaco, 103, S20–S29;
2. Coman I., Constantinescu Maria, Miron L., Gogu Mihaela (2008): Elemente de standardizare în micologie și micotoxicologie. Ed. Ion Ionescu de la Brad Iași;
3. Crailsheim K, Brodschneider R, Aupinel P, Behrens D, Genersch E, Vollmann J, Riessbergergallé U. (2013): Standard methods for artificial rearing of Apis mellifera larvae. In: Dietemann V, Ellis JD, Neumann P, editors. The COLOSS BEEBOOK, Volume I: standard methods for Apis mellifera research Journal of Apicultural Research. 1. Vol. 52;
4. Flores JM, Ruiz JA, Ruz JM, Puerta F, Bustos M, Padilla F, Campano F. (1996): Effect of temperature and humidity of sealed brood on chalkbrood development under controlled conditions. Apidologie;27:185–192;
5. Foley K., Fazio G., Jensen B. A., Hughes O.H.W. (2014): The distribution of Aspergillus spp. opportunistic parasites in hives and their pathogenicity to honey bees, Veterinary Microbiology, nr. 169, pp. 203–210;
6. Gilliam Martha, Iii S.T., Richardson G. V., (1983): Hygienic behavior of honey bees in relation to chalkbrood disease. Apidologie, Springer Verlag, 14, (1), pp. 29-39;
7. Jensen Bruun A., Aronstein K., Flores J. M., Vojvodic S., Palacio M. A., Spivak M. (2013): Standard methods for fungal brood disease research, J. Apic. Res., 52(1): 10.3896/IBRA.1.52.1.13.;
8. Lazăr Șt, Vornicu C. O., (2007): Apicultura, Ed. Alfa, București;
9. Mardare Aneta, Chioveanu Gabriela, (1993): „Patologia albinelor” – traducere după Leslie Bailey. Laboratorul Central Veterinar de Diagnostic. Laboratorul de patologia albinelor și a viermilor de mătase; pp. 45-52, 105;
10. Miloiu I., (1990): Hrănirea albinelor. Asociația Crescătorilor de Albine. Redacția publicațiilor apicole. București;
11. Odagiu Antonia, Oroian GH. I., (2010): Considerații ecopatologice la insecte, abordare moleculară, -vol. I, Apis mellifera, Ed. Bioflux, Cluj –Napoca;
12. Ogradă I., (1982): Bolile și dăunătorii albinelor, Ed. aII-a, Asociația Crescătorilor de Albine din R. S. România, București;
13. Olah I., Vornicu C.V., Nicoleta Ștefania Hulea, (2011): Echipamente și tehnici de monitorizare utilizate în domeniul apiculturii, Ed. ALFA, Iași;
14. Ordeanu V. (2012): Microbiologie generala si farmaceutica-curs – Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” Bucuresti https://ro.scribd.com/doc/…/CURS-16-Micete-levuri-si-fungi-micotoxine;
15. Qin X, Evans JD, Aronstein KA, Murray KD, Weinstock GM. (2006): Genome sequences of the honey bee pathogens Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis . Insect Molecular Biology;15(5):715–718;
16. Rehner SA, Evans JD. (2009): Microsatellite loci for the fungus Ascosphaera apis: cause of honey bee chalkbrood disease. Molecular Ecology Resources;9:855–858;
17. Reynaldi FJ, Lopez AC, Albo GN, Alippi AM. (2003): Differentiation of Ascosphaera apis isolates by rep-PCR fingerprinting and determination of chalkbrood incidence in Argentinean honey samples. Journal of Apicultural Research;42:68–76;
18. Ritter W., (1994): Bolile albinelor. Editura Verlang Eugen Ulmer & Co., Stuttgart, Germania – Traducere Irina Vasile, 2000 – Ed. M.A.S.T., București;
19. Shimanuki H., Knox A. D., (2005): ,,Diagnosis of Honey Bee Diseases” www.ars.usda.gov/…/honeybeediseases/honeyb;
20. Vojvodic S., Jensen A.B., Markussen B, Eilenberg J., Boomsma J.J. (2011): Genetic variation in virulence among chalkbrood strains infecting honey bees. PLoS ONE;6(9):e25035;
21. Waring Claire & A., (2011): Manual de creștere a albinelor – Ghid complet, pas cu pas, de creștere a albinelor, Ed. M.A.S.T., București, pp. 135-153;
22.***Manualul O.I.E., (2015): secțiunea 1.1. și 2.2.;
23.***Asociația Crescătorilor de Albine, (2013): „Ghid de bune practici în apicultură”. Ed. LSV Crepuscul, Ploiești, pp. 101-106;
24***APIACTA, (1987): Revistă internațională tehnică, economică și de informare apicolă, nr. 3, pp. 74-80;
25.***Asociația Crescătorilor de Albine, (2012): Manualul cursantului, Ed. LSV Crepuscul, Ploiești;
26.*** Ghid normativ al apicultorului de succes, (2012): Colecția Afaceri Agricole, Albinele, albinăritul și produsele stupului, Ed. Gramen, București;
27.***Fungisan: www.apiroua.ro/126.fungisan.html;
28.***Bee Vital: http://www.eurohonig.com/index
29.***melanoza: www.miere-bucovina.ro/melanoza-albinelor-diagnostic-tratament.html
30.***Bolile albinelor: www.stuparitul.com/boli daunatori_tratamente _albine.htlm
31.***Bolile albinelor: http://totul-despre-albine.weebly.com/bolile-albinelor
.html
Gheorghe SOLCAN
II.V. Intoxicațiile albinelor
În patologia apicolă intoxicațiile au un rol important, datorită pierderilor mari pe care le provoacă într-un interval scurt de timp, prin acțiunea directă și brutală a unor substanțe ingerate odată cu hrana, pătrunse prin contact extern sau pe căile respiratorii.
În perioada actuală specialiștii sunt din ce în ce mai interesați de efectele subletale ale dozelor foarte mici de toxice, care produc pierderi mari prin tulburările comportamentale -părăsirea stupului de către albinele lucrătoare (sindromul colapsului coloniei -SCC).
Intoxicațiile pot fi clasificate în două mari categorii :
de origine naturală, provocate prin hrănirea cu polen toxic, nectar toxic sau cu miere de mană;
antropice, survenite în urma intervențiilor umane: cu substanțe chimice folosite în agricultură și silvicultură pentru combaterea dăunătorilor; prin poluarea mediului înconjurător cu reziduuri industriale și prin folosirea nejudicioasă a unor medicamente (26).
II.5.1. Intoxicații cu principii toxici din plante
Deși există o multitudine de specii de plante care conțin diverși principii toxici, unele chiar insecticide (tutunul, piretrul etc.), în mod obișnuit acestea sunt evitate de albine.
Practicarea agriculturii intensive, care a dus la diminuarea florei spontane, a redus, de asemenea, riscul unor astfel de intoxicații de origine naturală. Riscul crește în zonele reci sau când primăvara condițiile climatice nefavorabile provoacă întârzierea înfloririi plantelor melifere sau perturbări în producerea manei. În lipsa unei hrane de bună calitate, albinele sunt obligate, să culeagă un nectar, polen sau mană devenite toxice din cauza condițiilor climatice nefavorabile sau produse de plante pe care ele nu le vizitează în condiții normale.
Concentrația în principii toxici și natura acestora depinde de specia plantei, dar și de condițiile pedoclimatice, în general aceasta fiind mai crescută în anii secetoși, când și posibilitățile de hrănire prin polenizarea plantelor de cultură sunt mai limitate.
Principalii principii toxici din plante sunt: alcaloizii, glicozizii, saponinele ș.a.
II.5.1.1. Alcaloizii sunt compuși organici de naturã vegetalã, care au caracter bazic, imprimat de prezența în moleculã a azotului. Atomul de azot este legat în moleculã într-un heterociclu, în cazul alcaloizilor propriu-ziși (heterociclici) sau în catena lateralã (alcaloizi neheterociclici). Aceștia din urmã sunt reprezentați de amine, amide și betaine.
Numele alcaloizilor derivã de la numele științific al genului sau al speciei plantei. Alcaloizii au stabilitate chimicã relativ crescutã la factorii de mediu, toxicitatea păstrându-se și după uscarea plantelor.
II.5.1.1.1. Teiul (cu frunza lată, argintiu) (Tiliaceae), conține alcaloizi xantinici cu acțiune excitantă sau, dimpotrivă depresoare asupra sistemului nervos: teofilina, teobromina etc. (32). Poate produce în unii ani nectar, polen sau mană toxică, care determină stare de somnolență, pierderea capacității de a zbura și paralizie. Când intoxicația se datorează polenului, ea afectează în primul rând albinele tinere și larvele, respectiv doicile care prepară în gușă amestecul de miere și polen precum și puietul care consumă acest amestec. Manifestările albinelor bolnave variază în funcție de natura toxicului produs de plantele care au furnizat polenul, în unele cazuri predominând simptomele de agitație, în altele cele de paralizie. În majoritatea cazurilor albinele nu pot zbura, fac salturi mici, prezintă tremurături corporale și au abdomenul mărit. La presiune elimină o mare cantitate de conținut intestinal de culoare gri-gălbuie și de consistență păstoasă. Pe capacul stupilor se observă excrementele albinelor, care au aspect caracteristic -păstrează forma intestinului posterior.
Când intoxicația se datorează nectarului, ea afectează în primul rînd albinele culegătoare. Acestea nu pot zbura, se mișcă greu, se învârtesc în cerc bătând din aripi și, într-o fază mai avansată, prezintă semne de paralizie. Întrucât aceste semne sunt comune și altor boli, diagnosticul ar putea fi pus numai în laborator, prin hrănirea în cușcă a unor albine sănătoase cu miere luată de la familia bolnavă și prin excluderea unei intoxicații cu pesticide.
Dacă intoxicația se datorează manei, afectează de asemenea a1binele culegătoare. În timpul sezonului activ asemenea intoxicații sunt rare, din cauză că albinele elimină principiile toxice prin defecare. Iarna însă mierea de mană acționează toxic asupra albinelor chiar și atunci când ea provine dintr-o secreție vegetală normală, datorită cantității mari de săruri pe care o conține (de potasiu îndeosebi). Iernarea pe miere de mană, mai ales atunci când aceasta nu este amestecată și cu miere florală, produce diaree la albine, prin necroza epiteliului intestinal, hipersecreția glandelor aferente și supraîncărcarea rectumului cu materii fecale și gaze. S-a dovedit că în cazul hrănirii cu sirop de zahăr supraîncărcarea intestinului și necesitatea defecării survine la sfârșitul lunii martie; în cazul mierii florale, albinele simt nevoia defecării în cursul lunii februarie; iar în cazul iernării cu miere de mană supraîncărcarea are loc începând chiar din luna decembrie (26).
Pierderile determinate de mierea de mană sunt agravate de faptul că tulburările digestive pe care le provoacă favorizează apariția bolilor infectocontagioase, în special a nosemozei. Recunoașterea de către apicultori a mierii de mană este posibilă folosind una din următoarele metode :
Metoda cu alcool: se pune într-o eprubetă o cantitate din mierea de analizat, o cantitate egală de apă și de 10 ori mai mult alcool rectificat. Dacă mierea conține și mană, soluția se va tulbura, datorită unui precipitat cu aspect de firișoare alburii; altfel, soluția rămîne limpede (26).
Metoda cu apa de var: se pune la început într-o eprubetă miere și apă, în părți egale, amestecându-le bine. Se adaugă apă de var în cantitate dublă și se fierbe. Dacă mierea este de mană soluția se tulbură și precipită, altfel ea rămîne limpede (39).
II.5.1.1.2. Tutunul (Nicotiana tabacum) (Fig. II.5.1) are ca principal principiu toxic nicotina, alcaloid cu acțiune insecticidă, dar și neurotoxică pentru mamifere și alte vertebrate. Extractele de tutun au fost folosite ca insecticide, dar datorită riscului crescut de intoxicație la mamifere, inclusiv om, utilizarea în acest scop este extrem de limitată, fiind înlocuite cu insecticide neonicotinoide de sinteză, cu toxicitate selectivă mult mai mare pentru insecte (v. II.5.3.1.1.3. Neonicotinoidele).
Fig. II.5.1.Tutunul (Nicotiana Fig II.5.2. Măselarița
tabacum) (53); (Atropa belladonna) (55)
II.5.1.1.3. Măselarița (Hyosciamus niger) (Fig. II.5.2) conține alcaloizi cu nucleu tropanic, reprezentați de atropinã și substanțele înrudite (tropina, apoatropina, beladonina, scopina, scopolamina, hiosciamina, hioscina). Aceiași alcaloizi se gãsesc în: mãtrãgunã (Atropa belladonna) (Fig.II.5.3), laur sau ciumãfaie (Datura stramonium) și mãtrãguna mică (Scopolia carniolica). Alcaloizii se găsesc în toate părțile plantelor, inclusiv în polen și au acțiune neurotoxică.
.
Fig. II.5.3. Mãtrãgunã Fig. II.5.4.Ricin
(Hyosciamus niger)(54) (Ricinus communis)(56)
II.5.1.1.4. Ricinul (Ricinus communis) este cultivat în țările tropicale și în regiunile mediteraneene. Numele său latin “ricinus”, înseamnă “căpușă”, în raport cu forma semințelor sale. Îi mai este dată denumirea comună de “palma lui Hristos”; englezii o numesc “castor bean”, sămânță de castor. Este o plantă anuală, erbacee, de 1,5 – 2 m înălțime. În regiunile tropicale ea este plurianuală. În țara noastră este cultivat mai ales în sud, ca plantă decorativă, pentru frumusețea florilor și frunzelor, adesea acoperite de pigmenți roșii. Frunzele sunt palmatilobate, divizate în lobi ascuțiți și dințați, purtate de lungi pețiole (fig.II.5.4).
Principiul toxic al ricinului este o fitotoxină glicoproteică, ricina. Este una din substanțele toxice cele mai violente (dintre cele cunoscute). Fitotoxinele au o puternică acțiune antigenică și induc formarea anticorpilor protectori din partea organismului animal în care ele sunt introduse. Totodată irită puternic epiteliile tubului digestiv. Ea declanșează și tulburări ale sistemului nervos. Posedă, de asemenea, capacitatea de hemoaglutinare.
II.5.1.1.5. Aconitul sau omagul (Aconitum napellus, A. tauricum (fig. II.5.5), A. moldavicum) conține alcaloizi terpenoidici extrem de toxici: aconitina, aconina și napelina. Plantele din genul Delphinium: D. consolida (nemțișor de câmp) și D. ajacis (nemțișor de grãdinã, surgug) conțin preponderent delfininã, delzolinã, ajaconinã, ajacinã și alți alcaloizi înrudiți cu aconitina (28).
Aconitina este consideratã una dintre cele mai toxice otrăvuri naturale, doza letalã fiind de 10 – 12 mg pentru cal sau 2 – 3 mg pentru câine (45).
La albine alcaloidul are acțiune iritantã asupra epiteliilor digestive și paralizantã asupra sistemului nervos.
II.5.1.1.6. Știrigoaia (Veratrum album și V. nigrum, fig. II.5.6) conține alcaloizi steroidici: veratrinã, protoveratrinã, germeninã, veratraloinã etc. Veratrina are acțiune extrem de iritantã și neurotoxicã.
Fig. II.5.5. Aconit, omag Fig. II.5.6. Știrigoaia
(Aconitum tauricum) (57) (Veratrum album ) (58)
Diagnosticul intoxicațiilor cu plante care conțin alcaloizi
Diagnosticul prezumtiv se bazeazã pe datele anamnetice, coroborate cu analiza botanicã a culturii și semnele clinice.
Confirmarea se realizeazã prin identificarea și dozarea alcaloizilor din plante și din materiale patologice (albine, miere). În țara noastră, pentru identificarea alcaloizilor din plante verzi și alte materiale este omologată metoda descrisă de Bianu și Nica (46).
Principiul metodei. Alcaloizii se extrag într-un solvent adecvat, după care se identifică prin reacții generale de precipitare sau prin reacții speciale, proprii fiecărui alcaloid.
Reactivi necesari:
reactivul Buchardat: se dizolvă 2 g iodură de potasiu în câțiva ml de apă, se adaugă 2 g iod și după dizolvare se aduce la 100 ml cu apă;
reactivul Mayer: la 20 ml soluție de iodură de potasiu 5% se adaugă 50 ml soluție fierbinte de clorură mercurică 10%. Se răcește, se filtrează și se completează cu apă pãnă la 100 ml;
reactivul Hager: soluție de acid picric 1%;
reactivul Dragendorff: se suspendă 5 g carbonat de bismut în 50 ml apă. Se adaugă 10 ml acid clorhidric concentrat și 25 g iodură de potasiu în 40 ml apă. Iodura de bismut formată, Bil3, neagră-brună, se dizolvă în excesul de iodură de potasiu, apărãnd o colorație roșie-portocalie;
reactivul Mandelin: 1 g sulfovanadat de amoniu în 100 ml acid sulfuric concentrat.
Modul de lucru. Izolarea alcaloizilor din mediile biologice sau din corpuri delicte se face prin extracție cu eter sau cloroform (sau alți solvenți organici potriviți) în mediu alcalin (pH 8).
Lichidele pot fi folosite fără alte prelucrări, doar după o simplă diluare cu apă. Materialele solide se omogenizează prin mojarare și se dizolvă sau se suspendă într-o cantitate mică de apă (aproximativ 25 ml). Soluția rezultată se filtrează la vid printr-o pâlnie Buchner, iar filtratul apos se supune extracției. Pentru a efectua extracția alcalină, extractul apos se alcalinizează la pH8 cu soluție de hidroxid de sodiu sau carbonat de sodiu 10%, după care se extrage de mai multe ori în pâlnie de separare sau în vas de extracție cu agitare magnetică, cu eter sau cloroform, prin agitare blândă.
Extractele reunite se usucă pe sulfat de sodiu anhidru și se filtrează. În continuare, reziduul rămas pe sticla de ceas, după evaporarea solventului, se reia cu câteva picături de acid clorhidric sau acid sulfuric diluat și se evaporă la sec, pe baia de apă. Reziduul, care reprezintă alcaloidul salifiat va fi supus reacțiilor generale de precipitare a alcaloizilor.
Pentru identificarea alcaloizilor se folosesc în practica de laborator reactivi generali, care dau precipitate sau colorații specifice cu cantități foarte mici de alcaloizi. Aceste reacții nu au însă valoare absolută deoarece în extractul organic pot trece din soluția alcalină și unele proteine sau produsele lor de degradare, cu care reactivii generali ai alcaloizilor dau reacții fals pozitive. În plus, precipitatele obținute sunt solubile uneori în exces de reactiv, reacția negativându-se de multe ori chiar în momentul obținerii unui test pozitiv. De aceea este necesară efectuarea mai multor reacții de identificare pe aceeași probă.
Reacțiile se execută pe lamă de microscop sau sticlă de ceas. Peste reziduul care reprezintă alcaloidul salifiat, se adaugă câteva picături de reactiv de precipitare, când în prezența alcaloizilor pot să apară: opalescență, precipitat sau zone colorate.
Principalii reactivi de precipitare ai alcaloizilor sunt următorii:
reactivul Bouchardat, care formează cu alcaloizii precipitate roșii-brune sau brune, solubile în alcool și în iodură de potasiu 10-20%;
reactivul Mayer formează cu alcaloizii precipitate albe sau alb-gălbui, cristaline sau amorfe;
reactivul Dragendorff formează cu alcaloizii precipitate roșii amorfe solubile în alcool, eter și alți solvenți organici;
reactivul Hager formează cu alcaloizii precipitate galbene, solubile la cald, care reprecipită la răcire.
II.5.1.2. Glicozizii sunt reprezentați de numeroase substanțe organice de naturã vegetalã, care prin hidroliza enzimaticã sau acidã se descompun în:
componenta glucidicã, netoxicã (una sau mai multe -oze) și
componenta neglucidicã, denumitã aglicon sau geninã, responsabilã de acțiunea toxicã.
II.5.1.2.1. Intoxicații cu plante care conțin glicozizi steroidici. Digitala (Digitalis purpurea., fig. II.5.7) și alte plante înrudite conțin glicozizi steroidici, care se împart în douã grupe: glicozizi cardiotonici și saponine, care se pot gãsi simultan în aceeași plantã. Se cunosc peste 50 glicozizi cardiotonici, cei mai importanți fiind: digoxina, digitoxina din digitală, adonitoxina din Adonis spp. (ruscuța de primãvarã și de varã, fig.II.5.8), oleandrina din Nerium oleander (laur, oleandru, fig. II.5.9), scilarenul din Scilla maritima (ceapa de mare), convalatoxina din Convallaria majalis (lãcrãmioare) etc.
Glicozizii steroidici au acțiune neurotoxică, iar saponinele sunt foarte iritante pentru epitelii.
Saponine se mai pot găsi în nectar și polen de castan (Aesculum hippocastanum).
Acțiunea toxicã a saponinelor este variatã. Majoritatea sunt iritante pentru epiteliul tubului digestiv, iar absorbite în circulație determinã hemolizã. În plus pot inhiba unele enzime digestive. Prin acțiunea tensioactivă (de spumare a lichidelor) produc fermentații anormale în tubul digestiv. După Ogradă (1982) unele specii de castan (de India, de California), prin polen, nectar și mană pot produce intoxicație manifestată prin tremurături și depilație (ca la boala neagră). Larvele care consumă acest polen mor sau dau naștere unor albine neviabile, iar mătcile pot deveni trîntorițe.
Fig. II.5.7. Digitala Fig. II.5.8. Ruscuța de primãvarã
(Adonis vernalis)(60) (Digitalis purpurea) (59)
Fig. II.5. 9. Laur, oleandru Fig. II.5.10. Ranunculus acris
(Nerium oleander)(61) (piciorul cocoșului) (62)
Fig. II.5.11. Pelinița Fig. II.5.12. Laptele câinelui (alior)
(Artemisia annua) (63) Euphorbia cyparissias (64)
II.5.1.2.2. Intoxicații cu plante care conțin glicozizi lactonici. Aceștia au ca reprezentant principal ranunculina, care se gãsește în numeroase specii de plante din familia Ranunculaceae: Anemone spp. (floarea paștelui, pãștițã, oițã), Pulsatilla spp. (dedițel), Ranunculus spp. (boglari, leușteanul broaștei, floare broșteascã, gãlbenele, piciorul cocoșului, scãișor, fig. 9), Caltha laeta (calcea calului), Trolius europaeus (bulbuci) etc.
Ranunculina, sub acțiunea enzimelor eliberate în tubul digestiv, se transformã în protoanemoninã, substanțã cu acțiune foarte iritantă. Prin uscarea plantelor, ranunculina se transformã în anemoninã netoxicã (45).
Ranunculaceele în general înfloresc primăvara devreme, astfel că își exercită acțiunea când începe depunerea puietului în familia de albine și dacă din stupi lipsesc proviziile de miere sau de polen.
II.5.1.3.1. Pelinița (Artemisia annua) (fig. II.5.11.) conține ca principiu activ artemisina, o lactonă sesquiterpenică cu proprietăți antiseptice, antiparazitare și chiar antitumorale. Pentru fundamentarea științifică a proprietăților antimalarice, cunoscute în medicina chineză încă din antichitate, dar studiate pe baze moderne începând din 1972, în 2015 s-a acordat premiul Nobel cercetătoarei chineze Youyou Tu. Noi am întâlnit însă un episod sever de mortalitate la albine în urma administrării eronate a unui ceai de peliniță, probabil prea concentrat, primăvara timpuriu, pentru prevenirea diareei. Unii autori (4, 23) arată că extractul apos nu este toxic, ci numai cel alcoolic. Tuiona, unul dintre principii toxici din speciile Artemisia, ar fi nociv numai când este extras cu alcool. Trebuie totuși luat în considerare faptul că concentrația în principii toxici depinde foarte mult de condițiile pedoclimatice, fiind mai mare în primăverile secetoase.
II.5.1.3.2. Laptele câinelui (alior) (Euphorbia spp., fig. II.5.12). Genul cuprinde numeroase specii, caracterizate prin faptul că latexul și semințele conțin euforbiosteroizi, euforboni și triterpeni care sunt substanțe foarte iritante, chiar vezicante.
II.5.1.4. Intoxicația cu tioglicozizi (ceapă). Ceapa de bucătărie (Alium cepa) conține în toate părțile plantei un derivat sulfat, disulfura de alil propil care acționează toxic asupra hematiilor. Determină o denaturare oxidativă ireversibilă a hemoglobinei (blocarea respirației celulare), dar și oxidarea lipidelor membranare, ducând la hemoliză.
Dintre plantele melifere sunt semnalate intoxicații după culesul pe floarea-soarelui, cu manifestare fie lentă, tradusă prin apatia albinelor, rămânerea pe floare în timpul nopții și uzură neobișnuită, fie acută, exprimată prin mortalitate masivă. Acestea pot fi cauzate atât de alterarea secreției nectaro-polenifere sub influența factorilor climatici, cât mai ales de prezența unor reziduuri de substanțe toxice provenite din îngrășămintele și ierbicidele cu care a fost tratată parcela respectivă sau insecticidele cu care au fost tratate semințele și pe care planta le extrage din sol. Acestea din urmă vor fi tratate separat în subcapitolul dedicat intoxicațiilor cu pesticide (v. cap. II.5.3).
Prevenirea intoxicațiilor de origine vegetală este greu de realizat. Distrugerea plantelor toxice din păduri și pășuni cu ajutorul tratamentelor fito-hormonale este dificilă și costisitoare, prezentând riscul afectării culturilor vecine și a arborilor. Mai simplă și eficace este utilizarea primăvara timpuriu, în regiunile unde se produc frecvent asemenea cazuri, a unor hrăniri suplimentare, pentru a compensa absența hranei din natură. Aceleași hrăniri se recomandă și în scop curativ, pentru a dilua hrana necorespunzătoare recoltată de albine. Se mai pot aplica și colectoare de polen pentru a evita stocajul unei mari cantități de polen toxic în stup și prelungirea manifestării în toxicație la albinele tinere și puiet.
În majoritatea cazurilor mierea din familiile care au suferit intoxicații de origine naturală nu este toxică pentru om. (26).
II.5.2. Intoxicația cu alcool etilic (etanol)
Efectele alcoolului asupra albinelor au fost recunoscute de foarte mult timp. Etanolul este produs în mod natural prin fermentația zaharurilor din fructe sau, posibil din siropul utilizat pentru hrănire, în prezența unei enzime, cozimaza, produs metabolic al drojdiei Saccharomyces cerevisiae.
Consumul de etanol determină la albine tulburări de echilibru, dezorientare în mers și în timpul zborului. O manifestare frecventă este evidențierea limbii sau trompei (proboscisul) (fig. II. 5.13).
Albinele intoxicate petrec mai mult timp în zbor. Dacă o albină este suficient de intoxicată va sta pe spate cu picioarele răsucite. Au loc accidente în zbor. Unele albine care consumă etanol nu mai pot găsi drumul înapoi spre stup, și astfel vor muri. Abramson, Bozic și col. (2006) au constatat că alcoolul consumat de către albine perturbă căutarea hranei și comportamentul social și are unele efecte similare intoxicației cu insecticide. Unele albine devin mai agresive după consumul de alcool.
Fig. II.5.13: Intoxicație cu alcool la albină (Apis mellifera) (65)
Expunerea la alcool poate avea un efect prelungit asupra albinelor, cu o durată de până la 48 de ore. În 2007 a fost descris un efect prelungit similar "mahmurelii" la albinele melifere consecutiv consumului de etanol, ca și la musculița de oțet (Drosophilla spp.). Pe baza acestor observații Sandeman și col. (1999) au utilizat albine ca modele de intoxicație experimentală cu etanol la vertebrate și chiar la oameni. Progresele din ultimele trei decenii în înțelegerea sistemului nervos sunt impresionante și provin dintr-o abordare multifactorială a studiului atât la vertebrate cât și la nevertebrate. Un rezultat colateral neașteptat al studiului paralel al sistemului nervos al vertebratelor și nevertebratelor, a dus la concluzia că există o rețea complexă de omologie și convergență evolutivă în structura și funcția sistemului nervos al acestor două grupuri mari de animale.
Comportamentul albinelor intoxicate cu etanol este studiat de oamenii de știință de la Universitățile din Ohio, Oklahoma, Ljubljana, ș.a. ca un model potențial al efectelor alcoolului asupra oamenilor. Abramson și col. (2003) au descoperit corelații semnificative între reacțiile albinelor si a altor vertebrate în urma expunerii la etanol. Experimentele privind consumul, locomoția și învățarea sugerează că expunerea la etanol influențează comportamentul albinelor melifere în mod similar cu cel observat la experimentele realizate cu vertebrate. S-a constatat astfel că sistemul nervos al albinelor melifere reacționează similar cu cel al vertebratelor. Aceste similitudini sunt suficiente chiar și pentru a obține informații cu privire la funcționarea creierul uman, observând cum albinele reacționează la anumite substanțe chimice.
Mustard (2004), conchide că: la nivel molecular, creierul albinelor melifere și al oamenilor funcționează similar. Știind cum consumul cronic de alcool afecteaza genele si proteinele din creierul albinelor melifere s-ar putea desluși modul în care alcoolul afectează memoria și comportamentul la om, precum și bazele moleculare ale dependenței. Alcoolul afectează albinele și oamenii în moduri similare, afectând funcționarea motorie împreună cu procesul de învățare și memorie. A fost, de asemenea, testată interacțiunea albinelor cu Antabuse (disulfiram), un medicament comun administrat ca tratament al alcoolismului la om.
II.5.3. Intoxicații cu pesticide
Cele mai grave intoxicații ale albinelor sunt determinate de pesticide, ca urmare a efectuării unor tratamente fitosanitare la culturile agricole (plante melifere sau alte specii, inclusiv buruieni înflorite) aflate în apropierea vetrei de cules.
Pesticidele sunt definite ca:
a) orice substanțe sau amestecuri de substanțe destinate prevenirii, reducerii sau respingerii oricăror dăunători: insecte, rozătoare, nematode, buruieni, alte plante acvatice sau terestre, microorganisme (bacterii, virusuri, fungi, alte microorganisme, cu excepția celor care trăiesc în sau pe om și animale);
b) orice substanță sau amestec de substanțe utilizate în scopul limitării creșterii plantelor, ca defoliante sau desicante (12, 14).
Deși există numeroase controverse privind necesitatea utilizării pesticidelor, în condițiile expansiunii fără precedent a populației planetei și a necesității corespunzătoare a asigurării resurselor de hrană, se impune abordarea rațională a problemei, prin prisma recunoașterii riscului dinainte asumat.
Beneficiile utilizării pesticidelor:
prevenirea sau combaterea unor boli grave la om: malaria, holera, tifosul exantematic, frigurile galbene etc. Descoperitorul efectelor insecticide ale DDT-ului, chimistul P. Müeller, a fost răsplătit în 1948 cu Premiul Nobel, ca urmare a contribuției esențiale la eradicarea tifosului exantematic din Europa, descoperirea fiind considerată printre cele mai importante pentru sănătatea umană, alături de sulfamide și penicilină (12);
sporirea recoltelor și îmbunătățirea lor calitativă;
protejarea stocurilor de alimente împotriva dăunătorilor.
Dezavantaje:
contaminarea alimentelor, furajelor și animalelor până la niveluri la care devin dăunătoare pentru consumatori (animale și om);
crearea unor dezechilibre ecologice, prin distrugerea unor specii sensibile (inclusiv albine) și crearea unui avantaj competitiv pentru speciile rezistente; reducerea biodiversității etc.
distrugerea unor recolte sensibile la o substanță chimică care se constituie în nor și ajunge accidental pe culture.
II.5.3.1. Insecticidele formează categoria pesticidelor cu cea mai mare toxicitate pentru albine. Acestea sunt considerate indicatori ecologici pe baza mai multor caracteristici biologice și comportamentale: capacitatea mare de reproducție și intervalul redus dintre generații în perioada culesului, mobilitate mare, capacitatea de a zbura pe distanțe mari și de a vizita numeroase flori într-o singură zi etc. În plus, coloniile de albine acoperă întregul ansamblu teritorial al țării și starea lor este atent supravegheată de apicultori. Numeroase studii pe plan internațional au utilizat albinele pentru determinarea prezenței în mediu a pesticidelor, elementelor radioactive, a metalelor grele sau a altor toxice (16, 36).
După originea lor insecticidele pot fi clasificate în:
minerale: arsenicale, floruri, etc.;
vegetale: nicotina, piretrina, etc.;
organice de sinteză: organoclorurate, organofosforice, carbamați, piretrinoide, neonicotinoide etc.
II.5.3.1.1. Insecticidele organice de sinteză sunt cele mai utilizate la ora actuală în agricultura intensivă, cele minerale fiind prohibite datorită remanenței în mediu, iar cele vegetale având eficiență economică și selectivitate reduse. Insecticidele de sinteză sunt substanțe liposolubile, concepute pentu a străbate cuticula chitinoasă a insectelor. Majoritatea se acumulează în țesutul adipos al albinelor odată cu consumarea de către acestea a polenului și păsturii, adusă de albinele culegătoare și depozitată în faguri. În intoxicațiile acute, substanțele aflate în polen pot determina moartea albinelor culegătoare. Substanțele mai puțin toxice pot să nu le influențeze imediat supraviețuirea, până când aceste albine nu ajung să consume din rezerva de grăsime în timpul iernii, pentru a menține temparatura ghemului de iernare constantă (32). La hrănirea larvelor cu lăptișor, prin intermediul hranei produse de doici, reziduurile de pesticide ajung în corpul acestora determinându-le moartea. În cazul în care stupii ajung să ierneze cu astfel de albine, există riscul ca întreaga familie de albine să dispară (16).
Remanența pesticidelor și implicit perioadele de izolare a albinelor sunt influențate în primul rând de condițiile meteorologice. Astfel, dacă tratamentul fitosanitar se execută la o temperatură scăzută și o umiditate ridicată a aerului, remanența este mai mare și, în consecință, izolarea albinelor trebuie prelungită cu 24—48 ore.
Intoxicațiile cu insecticide se caracterizează, în general, prin mortalitate masivă, generală și bruscă, spre deosebire de bolile infecțioase sau parazitare, în care pierderile sunt mai reduse, nu cuprind totalitatea stupilor și se produc în timp. În primul rînd sunt afectate albinele culegătoare, care mor la scurt timp după ce au venit în contact cu substanța toxică.
Dacă expunerea a fost mai puțin severă, albinele au timp să ajungă la stup și să depoziteze toxicul în rezervele de hrană. În acest caz pierderile se extind și asupra albinelor tinere și a larvelor, continuând pînă când întreaga familie este distrusă, atât din cauza intoxicației propriu-zise, cât și din cauza altor boli care survin ca urmare a scăderii rezistenței coloniei. Amploarea pierderilor depinde de mai mulți factori, dintre care cei mai importanți sunt:
natura insecticidului folosit și gradul de selectivitate a produsului;
forma de administrare a acestuia;
remanența toxicului;
condițiile meteorologice din momentul aplicării tratamentului;
stadiul fenologic al culturilor tratate; forma corolei florii stropite care poate reține cantități diferite din picăturile de produs chimic;
distanța dintre stupină și suprafețele supuse tratamentului;
existența și a altor surse de cules și de apă necontaminate (26).
Timpul frumos sau aplicarea insecticidelor dimineața măresc pericolul intoxicării. Din contră, timpul rece sau aplicarea tratamentului chimic după ce albinele au încetat zborul intens diminuează riscul. Aplicarea tratamentelor în stadiul de înflorire a plantelor de cultură sau buruienilor provoacă pierderi deosebit de grave. Cu cât distanța dintre stupină și suprafețele tratate este mai mare, cu atât numărul de zboruri efectuat de albine este mai mic. Dacă în jurul stupinei există și surse de cules necontaminate, acestea rețin albinele, împiedicându-le să viziteze culturile tratate.
Familiile mai puternice înregistrează pierderi mult mai mari decât familiile slabe.
Depopularea familiilor prin moartea albinelor culegătoare face ca ramele cu puiet să rămână descoperite iar puietul este expus răcelii sau subalimentării.
Mecanismele de apărare anti-xenobiotice. Albinele sunt vulnerabile la insecticide, iar pierderile suferite sunt importante. Efectele acestora asupra coloniei de albine sunt letale și subletale.
Letalitatea interesează albinele culegătoare, care intră în contact cu sursa de pesticide în timpul recoltării nectarului și a polenului.
Efectele subletale apar mai târziu și afectează toate categoriile de albine, inclusiv puietul coloniei. Acumularea pesticidelor de contact în substanțele lipofile (lipidele din ceară și polen) determină:
pervertirea mirosului și a simțului orientării la albina lucrătoare;
dezvoltarea insuficientă a larvelor;
scade fecunditatea mătcii;
miere toxică datorită migrării pesticidelor din ceară.
Apis mellifera posedă mijloace enzimatice limitate pentru detoxifiere, comparativ cu Anopheles și Drosophila, astfel că este mult mai sensibilă la anumite pesticide.
Albina are în genomul său mai puține gene care codifică enzimele carboxilesteraza (CCE), citocromul P540 (P450) și glutation S-transferaza (GTS). Aceste enzime, dar mai mult GST, au rol major în metabolizarea pesticidelor. Genele GSTs, asociate cu rolul cel mai mare în detoxifierea organismului, sunt responsabile de codificarea enzimei GST. Numărul lor este de peste 20 la Anopheles și Drosophila, în timp ce la Apis mellifera, există un singur membru. În mod asemănător, genele P450 sunt reduse la jumătate în genomul albinei, iar genele CYP4 la 20%, față de genomul de la D. melanogaster.
Genele CYP4, sunt puternic asociate cu rezistența la piretroide, la alte specii de insecte.
De semnalat este faptul că genele din aceleași familii, respectiv CCE, P450 și GST, care nu au rol în detoxifierea organismului, sunt în același număr, sau chiar mai mare, la Apis mellifera, față de alte insecte. Explicația acestei variații, rezidă în sistemul genetic haplodiploid și al expunerii la selecția asociată castei haploide (51).
Simptome
Semnul cel mai important al intoxicațiilor cu pesticide este mortalitatea mare și rapidă în întreaga stupină, precum și la stupinele din jur și care duce la pierderea a numeroase familii de albine. În fața stupilor și în interiorul acestora se găsesc numeroase albine moarte, care au, în majoritatea cazurilor, picioarele adunate, aripile întinse și limba desfășurată. Dacă examinarea se face în timp scurt pot fi surprinse multe alte albine bolnave, prezentând la început o stare de excitație, urmată imediat de imposibilitatea de a zbura, incoordonarea mișcărilor, paralizie și moarte. Chiar și atunci când numărul albinelor moarte găsite în fața stupilor este relativ redus, se constată totuși diminuarea populației albinelor adulte, o disproporție între acestea și cantitatea de puiet când mortalitatea masivă a albinelor s-a produs departe de stupină. Dacă numărul de albine moarte existente în fața stupilor este mare, atunci se poate constata mortalitate și în cadrul puietului. Larvele intoxicate își modifică poziția în celulă și își schimbă culoarea din alb-sidefiu în cenușiu-gălbui.
În formele cronice mortalitatea albinelor este mai mică, însă continuă o perioadă lungă de timp. Activitatea familiilor de albine în astfel de cazuri este redusă și dezordonată.
Dacă dintre albinele ieșite la cules nu se mai întorc decât câteva, atunci sunt semne de suspiciune că, contrar regulamentelor, se stropesc plantele înflorite cu diferite substanțe chimice fără a fi înștiințați apicultorii. Dacă intoxicația este subletală și albinele reușesc să ajungă în stup, ele sunt înconjurate de celelalte albine care le miros și le pipăie cu antenele, cele bolnave elimină nectarul infectat, iar cele sănătoase le hrănesc cu miere curată. Albinele care supraviețuiesc mai adună nectar câteva zile, dar vor avea o viață mai scurtă decât cele neintoxicate (26).
Diagnostic
Diagnosticul de intoxicație cu pesticide se stabilește pe baza semnelor clinice – mortalitatea masivă, bruscă și generală -, prin anchetă (cercetarea de către medicul veterinar a tratamentelor fitosanitare executate în împrejurimi și a situației din stupinele vecine), precum și prin examen toxicologic de laborator.
În cazul în care se constată mortalitatea în masă la toate stupinele din jur, diagnosticul este ușor de pus. În cazul când mortalitatea este mai redusă, când ea afectează numai o parte din familiile de albine sau numai o stupină, atunci diagnosticul este mai dificil și suspiciunea de intoxicație chimică trebuie confirmată sau infirmată de laborator, prin analiza toxicologică.
Tratament
Tratamentul intoxicațiilor este ineficace, întrucât nu există nici un antidot capabil să suprime sau să prevină efectul insecticidelor la albine.
Una dintre puținele măsuri care s-ar putea lua în astfel de cazuri este deplasarea stupinei în afara zonei periculoase, scoaterea fagurilor cu păstură din stupi și hrănirea (în cazul când la noua vatră nu există surse pentru cules natural), cu sirop de zahăr. O altă măsură ar fi instalarea colectoarelor de polen, care rețin o mare parte din polenul toxic, împiedicându-l să ajungă în hrana puietului. Ogradă (1982) recomandă ca albinelor care au supraviețuit unor episoade de intoxicații să li se asigure hrană nepoluată chimic sub formă de sirop 1:1 din miere salubră cu adaos de Protofil 17-20 ml/l sirop sau în paste, 34 ml /kg pastă și de vitamina C, câte 200 mg/ l de sirop cu Protofil sau kg. pastă cu Protofil, repetat de 4-5 ori. De asemenea familiile se întăresc prin unificare și prin asigurarea unei igiene corespunzătoare. Tratamentele pentru bolile infecțioase și parazitare se fac strict sub supravegherea autoritaților sanitare veterinare, pentru a nu stresa suplimentar familia de albine.
Prevenirea intoxicațiilor chimice prezintă o importanță și o eficiență mult mai mare decât tratamentul acestora. Profilaxia se realizează prin scoaterea familiilor din zona periculoasă sau prin închiderea lor. Cel mai important lucru de care trebuie să se țină seama atunci când albinele sunt ținute închise pe timp călduros este evitarea sufocării lor. În acest scop se recomandă:
suplimentarea spațiului din interiorul stupilor, prin adăugarea de corpuri sau caturi suplimentare;
înlocuirea podișoarelor cu rame cu plasă metalică, deschiderea fantelor de ventilație din capac, închiderea urdinișurilor cu blocuri de urdiniș cu plasă metalică;
umbrirea stupilor sau vopsirea capacelor în alb;
aprovizionarea cu rezerve suficiente de hrană și apă;
eliberarea albinelor seara și închiderea dimineața, înainte de începerea culesului (26).
Până la utilizarea unor insecticide netoxice pentru albine, dar cu același efect pentru distrugerea dăunătorilor agricoli, singura posibilitate de prevenire a intoxicațiilor la albine constă în respectarea legislației în vigoare privitoare la interzicerea stropirilor când plantele melifere sunt în perioada de înflorire. Dacă sunt tratate anumite suprafețe agricole sau forestiere cu insecticide în perioada înfloririi culturilor sau a buruienilor, familiile de albine trebuie transportate la cel puțin 5 km de zona în care se aplică combaterea, sau se închid pe întreaga perioadă de tratare și de remanență a insecticidului pe plante.
Dacă o singură albină lucrătoare aduce polen contaminat în stup poate perturba viața familiei și moartea unui număr mare de albine. Albinele doici nu mai pot secreta suficient lăptișor pentru a hrăni matca, iar aceasta își încetinește ritmul ouatului. Familiile rămase fără matcă sau slăbite nu supraviețuiesc peste iarnă.
Momentul ales pentru aplicarea insecticidelor, cu privire la intoxicarea albinelor, este influențat de condițiile nefavorabile de mediu. Dacă temperaturile sunt foarte scăzute după aplicarea tratamentelor, reziduurile de pesticide pe plante rămân toxice pentru albine pe o perioadă dublă de timp comparativ cu aplicarea în condiții prielnice de mediu. Nu se aplică pe culturi sau buruieni înflorite.
Principalele măsuri de prevenire a intoxicațiilor cu pesticide ale albinelor sunt prevăzute de un Ordin comun dat de: Ministerul Agriculturii și Alimentației (Ord. nr. 45/ 1991), Ministerul Mediului, Ministerul Transporturilor, Departamentul pentru Administrația Locală și Președintele Asociației Crescătorilor de Albine din Romania, Ordin care a intrat in vigoare la 5 februarie 1992 (52).
II.5.3.1.1.1. Insecticidele organoclorurate
Organocloruratele (OCl) sunt substanțe organice cu structură alchilică, ciclică sau aromatică, substituite cu unul sau mai mulți atomi de clor. Primul OCl sintetizat a fost DDT. Ulterior gama OCl s-a îmbogățit cu derivați ai DDT (DDD), HCH, Aldrin, Dieldrin, Toxofen etc. Actualmente OCl au fost prohibite în majoritatea țărilor, ca urmare a numeroaselor efecte adverse induse de remanența foarte mare în mediu și a potențialului cancerigen, singurii compuși care se mai utilizează fiind derivații HCH (Lindan). Cu toate acestea, datorită eficacității crescute împotriva insectelor dăunătoare (gândacul de Colorado ș.a.) persistă riscul de a fi utilizate în mod fraudulos, în zone vecine granițelor cu țări extracomunitare (Ucraina, R. Moldova).
Sursele de toxic sunt OCl utilizate în tratamentele fitosanitare (intoxicație iatrogenă). OCl, mai ales din grupul DDT, au o remanență mare în sol, putând trece în plante, reprezentând astfel o sursă de contaminare a animalelor și a omului.
Calea de pătrundere în organism a OCl este atât digestivă, cât și prin contact, datorită liposolubilității. În organism sunt depozitate de preferință în țesutul gras.
Au acțiune puternic neurotoxică, perturbând trecerea influxului nervos la toate speciile. Lindanul (HCH) acționează drept competitor al receptorului acidului gama aminobutiric (GABA), neuromediator important atât la albine cât și la vertebrate.
Diagnosticul se stabilește prin coroborarea datelor clinice și epidemiologice, confirmarea realizându-se prin analiză de laborator a OCl prin gazcromatografie.
Efectele utilizării de durată a OCl asupra mediului
1. Reziduurile de OCl din mediu. OCl, mai ales cele din grupul DDT sunt substanțe cu proprietăți cumulative, cu T 1/2 în mediul extern de ani sau zeci de ani. Din acest motiv ele au devenit aproape ubicvitare – se găsesc în sol, apă etc., fiind preluate de către plantele de cultură sau din flora spontană și de vietățile acvatice, acestea fiind o sursă de contaminare pentru animalele de interes economic și om. Numeroase lucrări demonstrează prezența în plantele de cultură și în țesuturile animalelor a reziduurilor de OCl la intervale de ordinul anilor sau zecilor de ani după încetarea utilizării lor (14, 30). Deși utilizarea OCl este actualmente prohibită în majoritatea țărilor, pe plan internațional funcționează încă normative foarte riguroase privind cantitățile maxime de pesticide admise în diferite produse alimentare (Codex Alimentarium-FAO-OMS)..
2. Sporirea biologică a concentrației OCl în lungul lanțului trofic (magnificația biologică). S-a constatat că reziduurile de OCl cresc, de la niveluri reduse în mediul extern și în viețuitoarele situate la baza piramidei trofice, la nivele din ce în ce mai mari către vârful piramidei, unde se află și omul. Fenomenul este valabil și pentru alte toxice cumulative, liposolubile. Are o importanță practică deosebită. Animalele de interes economic se află spre vârful piramidei trofice, concentrând OCl, în special, în țesutul gras.
3. Producerea unor dezechilibre ecologice.
Reziduurile de OCl din mediu au afectat supraviețuirea unor specii, mai ales dintre cele situate în vârful piramidei trofice. În unele țări dezvoltate (SUA., Marea Britanie) a devenit alarmantă scăderea populației unor păsări răpitoare. Această scădere este consecința a două tipuri de efecte nocive ale reziduurilor de OCl:
efecte asupra reproducției;
efecte asupra comportamentului.
II.5.3.1.1.2. Insecticidele organofosforice și derivații carbamați
Insecticidele organofosforice și carbamații sunt pesticide frecvent utilizate în agricultură, care acționează prin blocarea acetilcolinesterazei, determinând acumularea excesivă a acetilcolinei la nivelul sinapselor neuronale. Acetilcolina este un neuromediator important atât la vertebrate, cât și la insecte (11). Cercetări mai recente arată că neurotoxicitatea OP și a OCl se exercită și prin intermediul stresului oxidativ- inducerea formării de radicali peroxizi, care peroxidează membranele celulare neuronale (12).
II.5.3.1.1.2.1. Organofosforicele (OP) sunt esteri ai acidului fosforic sau tiofosforic. Primul compus din această clasă, produs la scară industrială, a fost tetraetilpirofosfatul (TEPP), utilizat în timpul celui de al doilea război mondial ca substanță toxică de luptă. Este cel mai toxic OP. Ulterior a fost sintetizat parationul. La ora actuală se cunosc peste 200 de compuși, printre cei mai utilizați fiind: parationul, malationul, neguvonul, clorofosul, diclorvosul, cumafosul, ruelenul, dimetoatul, neocidolul, pirimifos, clorpirifos, fosmet, fluvalinat etc.
Toxicitatea selectivă a OP se exprimă prin raportul dintre DL50 pentru șobolan și DL50 pentru musca de casă. Acest raport este de 4 pentru paration, 5 pentru clorfenvinfos, 20 pentru metilparation, 390 pentru dimetoat și 1315 pentru ronnel (22).
Reziduurile de OP în țesuturile vegetale și animale depind de natura compusului, fiind în general detectabile la 14 zile și nedetectabile la 21 zile de la expunere (22).
Pesticidele fluvalinat și cumafos găsite ca reziduuri în probele de ceară din stupi, după ce au fost folosite pentru a încerca eradicarea acarienilor Varroa, au fost considerate responsabile de reducerea semnificativă a longevității populației de albine.
II.5.3.1.1.2.2. Carbamații sunt derivați ai unei substanțe ipotetice- acidul carbamic, în care unul sau mai mulți atomi de H sunt substituiți cu radicali organici. În medicina veterinară se utilizează produsele: Carbaryl, Carbofuran, Propoxur, Fenoxicarb, metiocarb etc. Unii carbamați sunt foarte utilizați în agricultură, în locul OP, față de care au avantajul remanenței mai mici în mediul extern.
Diagnosticul intoxicației se suspicionează prin coroborarea datelor epidemiologice și clinice.
Confirmarea se face prin identificarea și determinarea cantitativă a insecticidelor.
Pentru identificarea pesticidelor OP din apă, plante verzi, și albine C.T.O.M.D.P.M.V. a omologat metoda cromatografiei în strat subțire (46).
Se introduc 20-25 g de probă mărunțită într-un mixer, peste care se adaugă 350 ml amestec de 35% apă în acetonitril. Se omogenizează timp 5 minute, se iau 250 ml filtrat și se introduc într-o pâlnie de separare. Peste extractul apos se adaugă 100 ml eter de petrol. Se agită amestecul 2 minute. Se adaugă 10 ml soluție saturată de NaCl și 600 ml apă, agitându-se energic, după care se lasă straturile să se separe. Se aruncă faza apoasă, iar stratul de solvent se spală de două ori cu câte 100 ml apă. Faza eterică se trece într-un pahar Erlenmayer de 100 ml cu dop. Se adaugă 15 g Na2SO4 anhidru și se agită. Nu se lasă mai mult de o oră cu Na2SO4, deoarece poate avea loc o adsorbție a reziduurilor de insecticide pe acesta.
Extractul se filtrează și se concentrează la un volum de câțiva ml.
Observație: dacă extractul este colorat, se poate purifica pe o coloană cu florisil.
Determinarea cantitativă se realizează prin gazcromatografie.
II.5.3.1.1.3. Neonicotinoidele sunt insecticide de sinteză cu o toxicitate selectivă foarte mare pentru insecte și redusă pentru mamifere, deoarece pe de o parte au o mare specificitate pentru subtipurile de receptori nicotinici specifici insectelor, iar pe de altă parte nu străbat bariera hematoencefalică. La mamifere mai au avantajul că se metabolizează și se elimină rapid, având astfel un grad ridicat de siguranță în utilizare (12).
Reprezentanții principali sunt: imidacloprid (Confidor, Kohinor), tiacloprid (Calypso), acetamiprid, nitenpyram etc. În agricultură se mai utilizează combinații de neonicotinoide și piretrinoide.
Toxicitatea extrem de ridicată și selectivă a neonicotinoidelor pentru insecte preocupă foarte mult comunitatea științifică în ultimul timp, fiind obiectul unor dispute între producătorii de pesticide, apicultori, agricultori și ecologiști.
Cercetările din ultimii ani incriminează neonicotinoidele în etiologia sindromului colapsului coloniei de albine (SCC), un sindrom complex și polifactorial. Este definit ca fenomenul care apare atunci când majoritatea albinelor lucrătoare dintr-o colonie dispar și lasă în urmă regina, alimente și câteva albine lucrătoare care au grijă de albinele imature rămase și de regină. Deși astfel de dispariții au mai avut loc de-a lungul istoriei în apicultură și au fost cunoscute sub diverse denumiri (boala dispariției, diminuarea de primăvară, boala de mai, colapsul de toamnă și diminuarea de toamnă), sindromul a fost redenumit colapsul coloniei de albine la sfârșitul anului 2006 corelat cu o creștere drastică a numărului de dispariții de colonii de albine (Apis mellifera) din America de Nord.
Simptome. În coloniile afectate, sindromul colapsului coloniei este suspectat atunci când se constată absența completă a albinelor adulte, fără sau cu puține albine moarte prezente în stup sau în fața stupului. O colonie afectată este în general caracterizată prin următoarele condiții care apar simultan:
prezența puietului în coloniile abandonate. Albinele în mod normal nu abandonează stupul până când nu eclozionează tot puietul;
prezența depozitelor de hrană în stup, atât miere cât și polen:
care nu este imediat jefuit de către alte albine;
care, atunci când este atacat de dăunători, cum ar fi molia de ceară sau gândacul mic de stup, atacul este vizibil întârziat;
Prezența mătcii: dacă aceasta nu este prezentă, stupul a murit din cauză că a fost orfan, acest lucru nefiind similar cu sindromul colapsului coloniei.
Simptomele precursoare care pot apărea înainte de prăbușirea finală a colonie sunt:
forță de muncă insuficientă pentru a menține puietul prezent;
forța de muncă pare a fi alcătuită din albine adulte tinere;
Membrii coloniei sunt reticenți în a consuma hrana furnizată, cum ar fi siropul de zahăr și suplimentul de proteine.
Un studiu din 2013 a concluzionat că neonicotinoidele utilizate în cantitățile uzuale dăunează albinelor, necesitatea unor alternative fiind urgentă [37]. În același timp, alte surse sugereaza că dovezile nu sunt concludente, și că faptele sunt denaturate de diversele grupuri de interese (19). Oamenii de știință au fost mult timp preocupați de faptul că pesticidele, incluzând posibil și unele fungicide, pot avea efecte subletale asupra albinelor, afectându-le dezvoltarea și comportamentul. Un interes deosebit îl prezintă clasa insecticidelor neonicotinoide, care conțin imidacloprid ca ingredient activ, și alte substanțe chimice similare, cum ar fi clotianidin și tiametoxam. Albinele melifere pot fi afectate de aceste substanțe chimice atunci când sunt utilizate pentru tratamentul semințelor plantelor de cultură, deoarece acestea ajung ca reziduuri în flori sau nectar. Majoritatea porumbului cultivat în SUA este tratat cu neonicotinoide.
Un sondaj realizat în 2010 a raportat 98 de pesticide si metaboliți detectate în concentrații de până la 214 ppm în polenul de albine la peste jumătate din stupine. Pesticidele care contaminează hrana albinelor afectează preponderent albinele adulte, care mor (sau părăsesc colonia) și nu puietul, deși posibilele efecte ale polenului contaminat consumat de tineret pot fi observate abia după ce acesta s-a dezvoltat în stadiul adult.
Imidaclopridul aplicat pe sol și preluat în țesuturile plantelor, incluzând polenul și nectarul are efect imunosupresor și mai determină dezorientarea albinelor.
În 2005, o echipă de cercetători de la Institutul National de Apicultură din Bologna, Italia, au relevat că polenul obținut din plante provenite din semințe tratate cu imidacloprid conține niveluri semnificative de insecticid, și au sugerat că polenul poluat ar putea duce la moartea coloniei de albine melifere (5). Analiza culturilor de porumb și de floarea soarelui provenite din semințe asupra cărora s-a utilizat imidaclopridul sugerează existența unor cantități mari de insecticid care vor fi transportate înapoi în coloniile de albine.
Dozele subletale de imidacloprid în soluția de zaharoză au fost, de asemenea, asociate cu afectarea activităților specifice stupului precum și cu cele de colectare a polenului la albinele melifere (6). Imidaclopridul în soluție de zaharoză, administrat albinelor din laborator, a afectat mijloacele de comunicare pentru câteva ore. Dozele subletale de imidacloprid din probele de laborator și din teren au dus la scăderea capacității de zbor și a discriminării olfactive, cu afectarea performanței de asociere olfactivă (40).
Secvențializarea genomului albinelor melifere a oferit o posibilă explicație pentru sensibilitatea albinelor la pesticide. Genomul este deficitar în numărul de gene care codifică enzimele de detoxifiere, inclusiv monooxigenazele citocromului P450 (P450s), glutation-S-transferazele și carboxilesterazele (32).
S-a demonstrat că expunerea la doze subletale de imidacloprid a albinelor melifere le face semnificativ mai sensibile la infecția cu Nosema, sugerând astfel o posibilă legătură cu sindromul colapsului coloniei, având în vedere că Nosema este considerată ca contributoare majoră la apariția SCC (29).
Tapparo și col. (2012), au constatat că utilajele pneumatice de foraj, care plantau semințele tratate cu clotianidin și imidacloprid, eliberau cantități mari de pesticide în aer, cauzând mortalitate semnificativă printre albinele melifere culegătoare. Rezultatele experimentale arată că eliberarea în mediu a particulelor care conțin neonicotinoide poate determina niveluri de expunere ridicate pentru albine, cu efecte letale similare cu fenomenul de colaps al coloniilor. Pesticidele utilizate în mod obișnuit, cum ar fi imidaclopridul, reduc dezvoltarea coloniilor și producția de noi regine în expunerea experimentală adaptată la condițiile de teren (43). Un alt neonicotinoid, tiametoxamul, tulbură capacitatea de localizare a albinelor culegătoare, cauzând mortalitate ridicată (15).
Lu și col. (2012) au dovedit că expunerea la niveluri subletale de imidacloprid din siropul de porumb cu un nivel ridicat de fructoză, utilizat pentru a alimenta albinele atunci când hrana nu este disponibilă, produce simptome similare sindromului de colaps al coloniei la 23 de săptămâni după administrare. Palmer și col. (2013) arată că neonicotinoidele afectează memoria albinelor pe termen lung și pe termen scurt, ceea ce sugerează o cauză pentru incapacitatea de revenire la stup. Într-un alt studiu realizat în 2013, s-a demonstrat că expunerea la pesticidele neonicotinoide (clotianidin și imidicloprid) au drept rezultat creșterea nivelului unei anumite proteine la albine, proteină care inhiba o molecula cheie implicată în răspunsul imun, ceea ce face ca insectele să fie mai sensibile la atacul virusurilor (48).
În 2012, mai multe studii independente au arătat că expunerea albinelor la neonicotinoide, nedetectată anterior (la doze subletale), inclusiv prin praf, polen și nectar a condus la imposibilitatea de a reveni la stup, fără mortalitate imediată (35). Studiul a aratat, de asemenea, remanența în mediu, respectiv în canalele agricole de irigație și sol (17). Aceste rapoarte au solicitat o revizuire formală a legislației de către Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară, care a declarat, în ianuarie 2013, că unele substanțe neonicotinoide prezintă un risc ridicat inacceptabil pentru populațiile de albine, în cazul utilizării tratamentelor pentru semințele de porumb, rapiță și cereale, ca și prin expunerea la reziduurile din nectar și / sau polen.
La începutul anului 2013, Autoritatea Europeană pentru Siguranță Alimentară a emis o declarație în care se specifică faptul că trei pesticide neonicotinoide prezintă un risc ridicat pentru albine, iar Comisia Europeană (CE) a propus o interdicție de doi ani pentru acestea. (42). David Goulson, care a condus unul dintre studiile cheie din 2012, a declarat că decizia ,,ridică următoarea întrebare: ce s-a întâmplat atunci când aceste substanțe chimice au fost inițial aprobate?" În aprilie 2013 Uniunea Europeană a adoptat o restricție de doi ani privind utilizarea insecticidelor neonicotinoide (imidacloprid, clotianid și tiametoxam) asupra culturilor atractive pentru albine (49, 50).
În Statele Unite ale Americii există de asemenea inițiative pentru interzicerea neonicotinoidelor. În martie 2013, apicultorii profesioniști și ecologiștii au depus împreună un proces împotriva Agentiei pentru Protecția Mediului (EPA) din Statele Unite deoarece a continuat să permită utilizarea neonicotinoidelor în S.U.A. Procesul solicită în mod special suspendarea utilizării de clotianidin și tiametoxam și a fost inițiat după ce un număr mare de colonii de albine au murit, unii apicultori pierzându-și până la 50% din stupi (44).
II.5.3.1.1.4. Insecticide fenilpirazolice (Fipronil). Ca și neonicotinoidele Fipronilul face parte dintr-o nouă clasă de insecticide (generația a II-a), fiind preferat pentru utilizarea în agricultură deoarece acționează prin mecanisme diferite față de insecticidele clasice, de primă generație (OCl, OP), având o toxicitate selectivă foarte mare pentru insecte și foarte redusă pentru mamifere. În medicina veterinară cel mai cunoscut este produsul comercial Frontline, utilizat pentru combaterea ectoparaziților la animale de companie, dar și în locuințe, pentru combaterea furnicilor, moliilor, termitelor (în regiunile tropicale) etc.
În agricultură cel mai folosit este produsul comercial Regent (lufenuron), utilizat atât pe culturi, cât și pentru tratamentul semințelor.
Mecanismul de acțiune este similar la insecte și vertebrate; blochează neurotransmițătorul GABA, care reglează canalele de Cl ale neuronilor (12), însă având toxicitate selectivă foarte mare pentru insecte, riscul pentru mamifere este foarte redus. O altă particularitate este aceea că sub acțiunea razelor solare unul dintre metaboliți (fipronil-desulfinil) este foarte stabil și mult mai toxic decât molecula de origine, atât pentru insecte cât și pentru păsări.
În apicultură, fipronilul este utilizat pentru a elimina insectele similare albinelor, precum Vespula germanica și mulți alți dăunători ai coloniilor de albine, printr-un procedeu de tipul unei "momeli toxice", prin care o insectă care revine la stup, răspândește pesticidul printre puiet.
În Europa, Ministrul francez al Agriculturii a recomandat interdicția parțială a fipronilului (Regent), în 2004. S-a dovedit că dozele non-letale foarte mici din acest pesticid afectează capacitatea albinelor de a localiza stupul, rezultând un număr mare de albine lucrătoare pierdute cu fiecare expediție de colectare a polenului, manifestări care se încadrează în sindromul de colaps al coloniei.
II.5.3.1.1.5 Insecticidele piretrinoide
Piretrinele sunt un grup de principii activi extrași din capitulele florale ale piretrului de Dalmația. Substanțele analoage de sinteză se numesc piretrinoide. Din punct de vedere chimic sunt esteri ai unui acid carboxilic cu nucleu ciclopropanic (acidul crizantemic) substituit cu un alcool sau fenol complex. Au au acțiune insecticidă imediată și toxicitate redusă pentru homeoterme. Tind să înlocuiască insecticidele organoclorurate și organofosforice, față de care au avantajul unei remanențe mult mai mici în mediu, riscul de inducere a dezechilibrelor ecologice fiind mult redus.
Permetrina I, naturală este foarte instabilă la lumina solară, utilizarea acesteia fiind limitată.
Piretrinoidele sintetice sunt mult mai stabile în mediu, fiind utilizate ca insecticide în agricultură și în medicina veterinară.
În agricultură se utilizează ca insecticide, sub diferite forme comerciale (pulberi, soluții) produse pe bază de: deltametrin (Decis, Butox), cipermetrin (Ectomin), alphacypermethrin, teflutrin, cihalotrin, lambda-cihalotrin, ciflutrin, bifentrin, fenvalerat etc. Aceleași produse sunt utilizate uneori pentru dezinsecția locuințelor.
Ca și alte insecticide, piretrinoidele sunt extrem de toxice pentru albine și viermi de mătase.
Mecanismul intim de acțiune a fost elucidat inițial la insecte, dar este valabil și pentru mamifere. Piretrinoidele sunt substanțe neurotoxice, acționând asupra canalelor sodice, asemănător organocloruratelor. Întârzie închiderea acestor canale și perturbă curentul de depolarizare. Derivații cianici (cipermetrin, ciflutrin, deltametrin etc.) pot menține chiar deschise canalele sodice (20).
În intoxicația experimentală a albinelor cu deltametrin administrat în miere, Jivan (2009) arată că primii indivizi au murit la 5 minute după hrănirea cu miere contaminată în concentrații de 0,5% -1,25%. Moartea tuturor indivizilor a survenit la 90 de minute în cazul concentrației de 1,25% și respectiv 1% și la 120 minute la 0,5%. La concentrații mai mici 0,25, respectiv 0,12% primii indivizi au murit la 10 respectiv 15 minute, iar toți indivizii din experiment au murit la 300 de minute, la concentrația de 0,12%.
Cipermetrinul s-a dovedit mai toxic, fiind semnalată moartea tuturor indivizilor după 30 de minute la concentrații de 1,25 și 1% și respectiv după 60 de minute la 0,5%. La concentrația cea mai mică (0.12%) toți indivizii au murit după 300 de minute.
La administrarea mierii contaminate cu lambda cihalotrin moartea primilor indivizi a survenit după 15 minute la concentrații de 1.25, respectiv 1%. La concentrația de 1,25% moartea tuturor indivizilor a survenit la 720 de minute, iar în cazul concentrațiilor de 1 și 0,5% moartea tuturor indivizilor a fost semnalată la 1440 de minute.
Scăderea cantităților de puiet este destul de accentuată în a treia săptămână de intoxicație pentru că atunci s-au observat multe albine culegătoare moarte în câmp. În aceste condiții matca nu a mai depus ouă câteva zile și după aproximativ 10 zile datorită condițiilor climatice favorabile și a unui cules bogat, existent în natură în acel moment, familiile de albine au reușit să se refacă pentru că pesticidul folosit în combaterea dăunătorilor din câmp a omorât numai albinele culegătoare, iar acestea au fost înlocuite după câteva zile.
Primăvara răcoroasă a agravat evoluția intoxicației în condiții de teren, pentru că familiile de albine au crescut puiet mai puțin, iar numărul de albine observate cu polen la urdiniș a fost mai mic. Albinele intoxicate au prezentat simptome specifice cum ar fi: stare marcată de agitație, mișcări neliniștite, dezordonate, dezorientate, stări convulsive caracterizate prin mișcări vibratorii ale aripilor, pesticidele exercitând asupra albinelor efecte paralizante. După eforturi de a încerca să zboare, corpul albinei se contractă și aceasta moare direct pe inflorescențele de floarea-soarelui stropite sau cad pe frunze și sol, cu proboscisul în afară, picioarele adunate și răsucite între ele și aripile întinse. Corpul albinei moarte, datorită intoxicației cu pesticide, este foarte închis la culoare (fig. II.5.14).
Remanența îndelungată a pesticidelor, precum și toxicititatea acestora deosebită față de albine, impune aplicarea unor măsuri drastice, rapide, susținute și coordonate în vederea limitării pierderilor și refacerea stupinelor contaminate. Prima măsură care trebuie luată în astfel de situații este mutarea stupinei la o distanță de minim 10 km de locul contaminat și identificarea cauzelor pierderilor. În funcție de timpul scurs de la contaminare până la aplicarea măsurilor de limitarea pierderilor și de refacere a familiilor de albine, perioadele pot fi variabile, iar în stupinele în care nu se aplică coordonat un set de metode de limitare a pierderilor și de refacere a famiililor de albine, se poate ajunge până la distrugerea stupinelor (16).
Deși au o remanență redusă în mediul extern, piretrinoidele pot induce dezechilibre ecologice în cazul utilizării neraționale, fiind foarte toxice pentru insecte, artropode acvatice și pentru unele specii de pești.
II.5.3.1.1.6. Ierbicidele sunt pesticide utilizate în agricultură, pentru distrugerea buruienilor sau ca defoliante. Constituie grupa de pesticide cea mai puțin periculoasă pentru albine, datorită toxicității reduse, modului de aplicare pe teren, precum și faptului că ele acționează toxic numai prin ingestie. Dintre ierbicidele organice, sunt mai frecvent utilizate: clorfenoxiderivații acizilor grași, compușii triazinici, derivații benzoici, compușii de uree substituită (derivații uronici), dinitrofenolii și compușii dipiridilici.
Clorfenoxiderivații acizilor grași cu acțiune erbicidă pot fi grupați în:
acizi clorfenoxiacetici: acidul 2,4-diclor-fenoxiacetic (2,4-D), acidul 2-metil-4 clor-fenoxiacetic (MCPA, MCP, Methoxon, Phomox), acidul 2,4,5-triclor-fenoxiacetic (2,4,5-T);
acizi clorfenoxipropionici: acidul 2,4-diclor-fenoxipropionic și acidul 2,4,5-triclor-fenoxipropionic (2,4,-TP, Silvex), și
acizi clorfenoxibutirici: acidul 2,4-diclor-fenoxibutiric (2,4-DB, Butoxone, Butyrac) și acidul 2-metil-4 clor-fenoxibutiric.
Clorfenoxiderivații acizilor grași au acțiune iritantă asupra epiteliilor și neurotoxică.
Dintre compușii triazinici, cei mai utilizați în agricultură sunt: Atrazinul (Aatrex, Atratol, Primatol A), Propazinul (Primatol P), Simazinul (Primatol S), Prometonul, Prometrynul etc. Toxicitatea variază în funcție de compus, doza toxică minimă fiind de 10-50 mg/Kg.
Majoritatea ierbicidelor sunt folosite la ierbicidări sistemice, fiind introduse în sol odată cu arăturile sau însămânțările. Ele ar putea prezenta un pericol pentru albine doar în cazul când ierbicidarea s-ar face pe vânt, care le-ar duce pe buruienile înflorite, existente pe suprafața aflată în curs de tratament. În consecință, în cazul ierbicidărilor sistemice de sol se recomandă apicultorilor să țină închise albinele doar în timpul când se execută aceste lucrări.
Ierbicidarea se mai poate face și cu avionul, produsul cel mai des folosit în acest scop fiind 2,4-D. Având în vedere că aviotratamentele determină riscuri mai mari de răspândire a pesticidelor în afara suprafețelor destinate, precum și faptul că produsul 2,4-D are o toxicitate mai ridicată în comparație cu celelalte ierbicide, se recomandă în acest caz apicultorilor să țină albinele închise timp de 48 ore (26, 52).
Derivații dipiridilici (Diquat, Paraquat, produsul comercial Reglone) sunt folosiți ca defolianți sau desicanți, pentru grăbirea coacerii unor legume, fructe și alte plante de cultură: cartof, sfeclă, morcovi, ceapă, vița de vie, rapița, floarea soarelui. În cazul utilizării acestora, se recomandă apicultorilor să țină albinele închise timp de 48 ore.
II.5.3.1.1.7. Fungicidele sunt destinate distrugerii ciupercilor parazite ale plantelor de cultură și au o toxicitate moderată pentru albine. Cele mai frecvent folosite sunt pesticidele pe bază de derivați imidazolici (propiconazol, protioconazol, tebuconazol, difenoconazol), ditiocarbamați (propamocarb, dithianon, iprovalicarb), captan (Merpan, Orthocid), zineb (Perozin, Dithane M-45), pirazofos (Afugan), benomil (Benlate, Fundozol), carbendazim (Derosal), metil tiofanat (Topsin M-70), Mancozeb, sulf (pulbere, muiabil), săruri de cupru (oxiclorură, sulfat) etc. În cazul acestor produse albinele trebuie închise timp de 24 ore.
Cercetări relativ recente (29) au demonstrat că albinele care au consumat polen contaminat cu fungicide au fost de trei ori mai sensibile la infestațiile parazitare. Se arată că fungicidele, considerate anterior inofensive pentru albine, pot juca de fapt un rol semnificativ în apariția sindromului colapsului coloniei, având efect subletal asupra sănătății albinelor. Cercetarea a relevat, de asemenea, că practicile referitoare la pulverizarea pesticidelor ar trebui revizuite, deoarece albinele studiate de autori nu colectau polen din culturi, ci aproape exclusiv din buruieni și flori sălbatice, ceea ce sugereaza că sunt mult mai expuse la acțiunea pesticidelor decât se credea inițial.
II.5.3.1.1.8. Acaricidele sunt destinate distrugerii acarienilor paraziți ai plantelor și animalelor. Acarienii au o rezistență mai scăzută la acțiunea agenților chimici comparativ cu insectele, prin urmare împotriva lor se utilizează pesticide cu toxicitate mai redusă și mai puțin periculoase pentru albine decât insecticidele.
Amitrazul se folosește în medicina veterinară pentru combaterea acarienilor râilor și a căpușelor. Este acaricidul de elecție pentru combaterea varoozei albinelor. Este un derivat disubstituit al metilaminei: N1N dimetilamină (2,4 xilil iminometil), fiind un acaricid puternic și specific, activ și față de unii acarieni rezistenți la insecticide organofosforice.
Amitrazul este comercializat sub diferite forme și denumiri comerciale, cel mai adesea sub formă de concentrat emulsionabil: Taktic, Scabatox, Semcar, Mitaban, Varachet (ultimul pentru combaterea varoozei).
Amitrazul are pH alcalin și se descompune ușor în mediu acid. Acțiunea principală este neurotoxică, constând în inhibiția monoaminooxidazei la nivelul sistemului nervos ducând la depresiune nervoasă și paralizie. În cazul acarienilor blochează neurotransmițătorul octopamina, determinând desprinderea acestora de pe albine și paralizie.
Pentru profilaxia intoxicației la albine este necesară respectarea strictă a dozajului și condițiilor de utilizare recomandate de producător. Dozarea se face în raport de volumul stupului și mărimea familiei de albine. În caz de supradozare se aerisește imediat stupul.
În agricultură se folosesc acaricidele pe bază de dicofol (Kelthane, Dicofol, Milbol), neoron (Aearol, Neoron), omite (Omite), clorfenson (Ovotran, Avex, Polacaricidol) și binapacril (Acricid). Deși în prospectele însoțitoare ale acestor produse se menționează că ele nu sunt periculoase pentru albine, în practică s-au constatat totuși cazuri de intoxicație. Este indicat ca, în cazul utilizării lor, familiile de albine să fie închise pentru o perioadă de 24 ore.
Sunt considerate mai toxice pentru albine acaricidele pe bază de dinobutan (Acrex, Dessin) și clorfenamidină (Fundal, Galecron). În cazul acestora, perioada de închidere a stupilor trebuie să fie de minimum 48 ore (26).
În principiu, remanența pesticidelor și perioadele de izolare a albinelor sunt influențate în primul rînd de condițiile meteorologice. Astfel, în cazul în care tratamentul f'itosanitar se execută la o temperatură scăzută și la o umiditate ridicată a aerului, remanența este mai mare și, în consecință, izolarea albinelor trebuie prelungită cu 24—48 ore.
II.5.4. Diagnosticul intoxicațiilor
Diagnosticul de intoxicație poate fi suspicionat pe baza datelor clinice și ale anchetei epidemiologice/ toxicologice. Confirmarea se face prin examen toxicologic, corborat cu alte analize de laborator, în scopul stabilirii diagnosticului diferențial față de boli infecto-contagiase.
Probele recoltate trebuie să conțină:
Minim 200 g/ probă, albine moarte sau în agonie;
Minim 25g / probă albine vii (după caz);
Fragmente de 18 cm² / probă, fagure cu puiet căpăcit si necăpăcit;
Rama întreagă/ probă, fagure cu rezerva din hrana care există în stup la momentul producerii episodului de intoxicație: nectar, miere căpăcită sau păstură;
Plante întregi sau inflorescențe suspecte de a conține substanțe toxice, 500g /probă;
Apă, 2 litri /probă , din sursa de apă a stupinei;
Miere extrasă 250g/ probă.
Prelevarea probelor se face de către apicultori, în maxim 24 de ore de la sesizarea intoxicației, numai în prezența medicului veterinar, care va sigila probele și în prezența unui delegat neutru. În același timp și din același loc se recoltează și contraprobe. Dacă se înregistrează episodul de intoxicație concomitent în mai multe stupine aflate pe aceeași vatră de cules nu se recoltează probe medii ci numai probe individualizate pe stupine și proprietari.
Conform prevederilor legale, aflate în vigoare, se examinează clinic și se recoltează probe de la 10% din efectivul stupinei în cazul fermelor apicole obișnuite și 15% din efectivul unei stupine crescătoare de mătci, sau autorizată pentru comercializarea de roiuri sau alt material biologic.
Probele se expediază la laborator de către apicultor în maxim 24 de ore de la înregistrarea intoxicației, iar contraprobele sigilate și identificate se păstrează 90 de zile la medicul veterinar în vederea efectuării unor eventuale contraexpertize.
Laboratoarele sanitare veterinare autorizate să efectueze examene și ale căror buletine de analize sunt recunoscute de instanțele din Romania sunt:
Laboratorul de Sănătate insecte utile și Laboratorul de toxicologie din cadrul Institutului de Diagnostic și Sănătate Animală Bucuresti (IDSA)
Institutul de Igienă și Sănătate Publică Veterinară București
Laboratoarele Sanitare Veterinare județene, din cadrul Direcțiilor Sanitare Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor (DSVSA);
Laboratoarele Sanitare Veterinare județene efectuează analizele în regim de gratuitate, dacă probele sunt însoțite de adresă oficială emisă de medicul veterinar de la circumscripția în raza căreia a fost înregistrat episodul de intoxicație și care a sigilat probele recoltate.
La IDSA analizele se efectuează gratuit numai în cazul în care adresa de însoțire a probelor sigilate are ștampila DSVSA pe teritoriul căreia s-a înregistrat episodul de intoxicație.
Intoxicațiile albinelor nu se tratează ci se previn, nu pot fi combătute actualmente, moartea petrecându-se în scurt timp.
Intoxicațiile cronice se caracterizeaza prin:
– mortalitate mai mare decât cea fiziologică, care trenează o perioada mai îndelungată de timp sau chiar tot timpul anului;
– albine incapabile de eclozare;
– schimbarea frecventă a mătcilor;
– slăbirea familiilor prin diminuarea populației, fără semne clinice specifice bolilor infecțioase și parazitare.
Intoxicațiile cronice se datorează generalizării poluării mediului cu diverse substanțe toxice care se cumulează atât în organismul albinelor cât și în rezervele de hrană.
II.5.5. Prevenirea intoxicațiilor
Prevenirea intoxicațiilor este o obligație stipulată prin lege pentru cei care folosesc substanțe toxice în acțiunile de fitoprotecție și în industrie, pentru apicultori și specialiștii în medicina veterinară. Conform acestui Ordin comun al Ministerului Agriculturii ș.c.l. (52) prin art. 10, unitățile cu sector apicol și apicultorii cu stupine personale au urmatoarele obligații:
să anunțe în cel mult 24 ore consiliul local al comunei, orașului sau municipiului și primarul, după caz, pe teritoriul căruia se află stupina, locul de amplasare a acesteia, perioada utilizării vetrei stupinei, numărul familiilor de albine, sediul sau adresa deținătorului de familii de albine, precum și adresa la care acesta urmează să fie anunțat în cazul efectuării unor tratamente fitosanitare;
să închidă sau să îndepărteze la o distanta de peste 5 km de suprafețele supuse tratamentului, familiile de albine atunci când au fost anunțați sau au aflat pe orice altă cale despre efectuarea tratamentelor cu pesticide asupra culturilor agricole, plantațiilor pomicole și pădurilor situate în apropierea stupinei;
stupii ar trebui tinuți închiși între 24-72 ore, în funcție de toxicitatea și remanența pesticidelor folosite în fitoprotecție. Când nu este posibilă închiderea, cea mai bună soluție este schimbarea vetrei de cules odată cu anunțarea efectuării unor tratamente fitosanitare;
să sesizeze imediat, în scris, circumscriptia sanitară-veterinară pe raza căreia este situată stupina în cazul producerii intoxicațiilor la familiile de albine;
conducerea unităților cu sector apicol sau primăriile comunale, orășenesti și municipale pentru gospodăriile populației care dețin familii de albine, să convoace în 24 de ore de la anunțarea cazului de intoxicație la familiile de albine, comisia de constatare, care va fi formată din:
medicul veterinar – în calitate de președinte;
delegatul primăriei;
delegatul unității de protecția plantelor din zonă;
delegatul Asociației Crescătorilor de Albine .
În cazul în care tratamentele s-au efectuat cu aeronave, din comisia de constatare va face parte și reprezentantul Aviației utilitare, dacă se constată ca nu au fost respectate instrucțiunile primite de către comandantul aeronavei.
Deținătorul de stupi afectați, apicultorul sau proprietarul unei gospodării pe teritoriul căreia s-a petrecut evenimentul are dreptul să fie prezent la ancheta sanitară-veterinară și poate să-și expună pretențiile sau obiecțiile, care vor fi obligatoriu consemnate în procesul-verbal.
Apicultorii trebuie să conlucreze cu toți membrii comisiei și este obligatoriu ca procesul verbal încheiat să conțină: date privind proprietatea și adresa proprietarului, elemente privind stupina; numărul de stupi afectați; puterea familiilor de albine; numărul de faguri cu puiet; simptomele observate; mortalitatea înregistrată; starea familiilor; dacă se constată mortalitate în stupinele vecine, la ce distanță și în ce grad. Este necesară identificarea suprafețelor și a culturilor sau zonei forestiere tratate, stabilirea distanței dintre stupină și cultura tratată și starea culturii; produsul utilizat sau suspicionat; data și ora tratamentului; condițiile meteo; persoanele care nu au respectat prevederile Ordinului; evaluarea fizică a pierderilor cauzate.
II.5.6. Manifestări adverse determinate de antibioticele introduse în hrană
În apicultură se practică introducerea în hrană a antibioticelor pentru prevenirea sau combaterea unor boli infecțioase bacteriene (loca europeană și americană).
Prezența repetată a dozelor mici de antibiotice în hrană poate avea efecte negative. În primul rând dozele mici de antibiotice “selectează“ tulpini antibiorezistente ale diferiților germeni patogeni, tulpini care-și transmit ereditar antibiorezistența, prin factorul R și pot deveni periculoase pentru albine. În al doilea rând reziduurile de antibiotice și impuritățile asociate acestora pot determina reacții alergice la consumatorii de produse de origine apicolă.
Administrarea repetată în hrană a antibioticelor, mai ales a celor cu spectrul larg (tetracicline) și sulfamidelor determină dismicrobism digestiv care poate duce la diaree sau determină scăderea rezistenței față de agenții patogeni ai tubului digestiv (Nosema spp.).
II.5.7. Efectul negativ al radiațiilor electromagnetice asupra albinelor
Studiul efectelor negative ale radiațiilor electromagnetice (frecvențelor radio) asupra albinelor melifere (Apis mellifera) ca și asupra organismelor superioare, inclusiv uman, constituie o preocupare de dată recentă a comunității științifice și este subiectul a numeroase controverse, datorită conflictelor cu interesele financiare ale marilor corporații internaționale producătoare de telefoane mobile. Cu toate acestea, s-a stabilit în mod obiectiv că abilitatea albinelor de a localiza stupul poate fi redusă de câmpul electromagnetic de unde scurte și ultrascurte (13). Pe durata studiului, s-a constatat că jumătate din colonii au fost afectate, de radiațiile emise de antenele stațiilor de telefonie mobilă, manifestarea fiind încadrabilă în sindromul colapsului coloniei (13).
Ulterior, ca urmare a polemicilor iscate în jurnalele americane foarte influiente (The Independent ș.a.), prin studii știintifice complexe care au investigat efectele câmpului electromagnetic generat de unde scurte asupra faunei sălbatice, oamenilor și plantelor, în 6 din 7 studii dedicate albinelor, s-au raportat efecte negative ale expunerii la radiațiile electromagnetice, dar aparent nu s-a demonstrat în mod direct legătura acestora cu sindromul colapsului coloniei. Cu toate acestea Sainudeen Sahib (2011) a demonstrat că atunci când telefoanele mobile active erau păstrate în interiorul stupului, albinele lucrătoare nu mai reveneau la stup după 10 zile. Același studiu a relevat scăderea drastică a producției de ouă de către mătci din aceste colonii și s-a conchis că "expunerea la radiațiile electromagnetice oferă o explicație mai bună pentru apariția sindromului colapsului coloniei (SCC) decât alte teorii". Autorii au recomandat recunoașterea câmpului electromagnetic ca agent poluant. Cercetările privind implicațiile undelor electromagnetice în declanșarea sindromului colapsului coloniei ilustrează, odată în plus, conflictele de interese dintre marile corporații financiare și organizațiile care luptă pentru protecția mediului, împotriva poluării nu numai chimice, ci și fizice și biologice.
II.5.8. Bibliografie
1. Abramson CI, Place AJ, Aquino IS, Fernandez A., (2004): Development of an ethanol model using social insects: IV. Influence of ethanol on the aggression of Africanized honey bees (''Apis mellifera L.''), Psychol Rep vol. 94, 3, 1107–15;
2. Abramson C.I., Stone S.M., OrtezR.A., Luccardi A., Vann K.L., Hanig K.D., Rice J., (2000): The Development of an Ethanol Model Using Social Insects I: Behavior Studies of the Honey Bee (''Apis mellifera'' L.): Neurobiological, Psychosocial, and Developmental Correlates of Drinking, Alcoholism: Clinical & Experimental Research, vol. 24, 8, 1153–66;
3. Andreescu Mihaela Elena, Crivineanu V., Goran G.V., Codreanu M.D., (2008): Studies on cypermethrin poisoning in bees, Lucr. St. Medicină Veterinară Timisoara, Vol. 41, 494-503;
4. Asiminei S., Șpac A.F., Hrițcu A., (2003): Pelinul – plantă medicinală utilă în prevenirea și combaterea nosemozei la albine. Rev. Rom. Med. Vet., vol. 13, 3-4, pag. 384;
5. Bonmatin J.M., Marchand P.A., Charvet R., Moineau I., Bengsch E.R. , Colin M.E., (2005): Quantification of imidacloprid uptake in maize crops. J Agric Food Chem. 53 (13): 5336–41;
6. Bortolotti L., Monanari R, Marcelino J and Porrini P., (2003): Effects of sub-lethal imidacloprid doses on the homing rate and foraging activity of honey bees. Bulletin of Insectology 56 (1): 63–67;
7. Bozic J., Abramson C.I., Bedencic M., (2006): Reduced ability of ethanol drinkers for social communication in honeybees (,,Apis mellifera carnica Poll.''), Alcohol vol. 38, 3, 179–183;
8. Bruneton J., (1996): Plante toxiques.Vegetaux dangereux pour l'home et les animaux. Lavoisier Tec. Doc., Paris, 1996;
9. Burgat Sacaze V., Benard P., Petit C., Guerre P., Dossin O., (1993): Impact subletal des polluants sur l’environnement: exemple du DDT. Revue Med. Vet., 144, 6, 515-522;
10. Crivineanu V., Râpeanu M., Crivineanu Maria, (1995): Toxicologie sanitară-veterinară, Ed.Coral Sanivet, București;
11. Eiri D.M., Nieh J.C., (2012): A nicotinic acetylcholine receptor agonist affects honey bee sucrose responsiveness and decreases waggle dancing, The Journal of Experimental Biology 215, 2022-2029;
12. Gupta R.C. (Ed.), (2007): Veterinary Toxicology- Basic and Clinical Principles, Ed. Elsevier, Amsterdam;
13. Harst, W., Kuhn, J., Stever, H., (2006): Can Electromagnetic Exposure Cause a Change in Behaviour? Studying Possible Non-Thermal Influences on Honey Bees – An Approach within the Framework of Educational Informatics Acta Systemica 6 (1): 1–6;
14. Hayes W.J. Jr., (1975): Toxicology of Pesticides. Williams & Wilkins Co, Baltimore, U.S.A., 1975;
15. Henry M., Beguin M., Requier F., Rollin O., Odoux J.-F., Aupinel P., Aptel J., Tchamitchian, S., Decourtye A., (2012): A Common Pesticide Decreases Foraging Success and Survival in Honey Bees. Sciencexpress 336 (6079). p.1. doi:10.1126/science.1215039.
16. Jivan A. S., 2009, Studii și cercetări privind influența pesticidelor asupra albinelor (Apis mellifera L.), Teză de doctorat, USAMVB Timișoara;
17. Krupke C. H., Eitzer B. D., Andino G, Given K et al., (2012): Multiple Routes of Pesticide Exposure for Honey Bees Living Near Agricultural Fields. PLOS One 7 (1): e29268
18.Lu Chensheng, Warchol K.M., Callahan R.A., 2012, In situ replication of honey bee colony collapse disorder. Bulletin of Insectology 65 (1): 1–8;
19. McGrath P.F., (2014): Politics meets Science: The case of neonicotinoid insecticides in Europe, S.A.P.I.EN.S [Online], 7, .1;
20. Milhaud G.E., (1995): Les toxiques neurotropes. E.N.V. Alfort, U.P. de Pharmacie et Toxicologie;
21. Moore MS, DeZazzo J, Luk AY, Tully T, Singh CM, Heberlein U, (1998): Ethanol intoxication in ''Drosophila'': Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway, Cell, vol. 93, 6, 997–1007;
22. Mosha R.D. (1993): The toxicology of organophosphorus insecticides: a review. Veterinary Bulletin, 63, 11, 1039-1050;
23.Muntean L. S., Tămaș M., Muntean S., Muntean L., Duda M. M., Vârlan I. D., Florian S., (2007): Tratat de plante medicinale cultivate și spontane. Ed. RISOPRINT, Cluj – Napoca;
24. Mustard J., (2004): Intoxicated Honey Bees May Clue Scientists Into Drunken Human Behavior, Ohio State University, ScienceDaily. ScienceDaily, 25 October 2004;
25. Nica Daniela, Bianu Elisabeta, Chioveanu Gabriela, (2004): A case of acute intoxication with deltamethrin in bee colonies in Romania, Apiacta 39: 71–7;
26. Ogradă I., (1982): Bolile și dăunătorii albinelor, Ed. II-a, Asoc. Crescătorilor de Albine din RS România, București;
27. Palmer M. J., Saranzewa N., Harvey J., Wright, G. A., Connolly, C. N. et al., (2013): Cholinergic pesticides cause mushroom body neuronal inactivation in honeybees. Nature Communications 4 (3): 1634;
28. Paul I., (2000): Etiomorfopatologie veterinară, vol. II, Ed. „Ion Ionescu de la Brad”, Iași;
29. Pettis J. S., Johnson J., Dively G. et al., (2012): Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Naturwissenschaften 99 (2): 153–8;
30. Popescu O., (1996): Toxicologie clinică veterinară și de diagnostic.In Medicină legală veterinară, vol.II, Enache T., Popescu O., Ed.All, București;
31. Prisăcaru Cornelia, Prisăcaru Anca-Irina, 2013, Ecotoxicologie, Ed. Tehnopress, Iași;
32. Reed J., (2010): Pesticides and honey bee toxicity – USA Apidologie;
33. Sandeman D., 1999, Homology and convergence in vertebrate and invertebrate nervous systems, Naturwissenschaften, vol. 86, 8, 378–87;
34. Sainudeen Sahib, S., (2011): Impact of mobile phone on the density of Honey Bees. Mun. Ent. Zool. Vol. 6, No. 1;
35.Schneider, C. W., Grünewald B., Fuchs S et al., (2012): RFID Tracking of Sublethal Effects of Two Neonicotinoid Insecticides on the Foraging Behavior of Apis mellifera, PLOS One 7 (1): e30023;
36. Sfetcu Ioana, (2007): Salubritatea produselor apicole – un indicator al relației mediu-consumator, Teză de doctorat, USAMV București;
37. van der Sluijs, Jeroen P; Simon-Delso, Noa; et al., (2013): Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services, Current Opinion in Environmental Sustainability, 5 (3–4): 293–305. doi:10.1016/j.cosust.2013.05.007;
38. Solcan Gh., Beșchea Chiriac I. S., (2005): Toxicologie veterinară – manual practic. Ed. Tehnopress, Iași;
39. Șindilar E., Bondoc I., (1998): Igiena produselor alimentare- Manual practic, USAMV Iasi;
40. Thompson H., (2003): Behavior effects of pesticides in bees-their potential for use in risk assessment". Ecotoxicology 12 (1/4): 317–30;
41. Tapparo A., Giorio C., Zanella, A., Soldà, L., Marzaro, M., Vivan, L., Girolami, V., et al., (2012): Assessment of the Environmental Exposure of Honeybees to Particulate Matter Containing Neonicotinoid Insecticides Coming from Corn Coated Seeds, Environmental Science and Technology 46 (5): 2592–9;
42. Warner B., (2013): ,,To Revive Honey Bees, Europe Proposes a Pesticide Ban". Bloomberg BusinessWeek. 19 febr., 2013;
43. Whitehorn P. R., O'Connor S., Wackers F. L., Goulson, D., (2012): Neonicotinoid Pesticide Reduces Bumble Bee Colony Growth and Queen Production, Sciencexpress. p. 1. doi:10.1126/science.1215025;
44. Wozniacka, G., (2013): Beekeepers sue EPA to ban pesticide, protect bees. Associated Press, (21 March 2013)
45. Zanoschi V., Turenschi E., Toma M., (1981): Plante toxice din România. Ed. Ceres, București,.
46. *** Comitetul Tehnic de Omologare a Metodelor de Diagnostic Paraclinic Veterinar-Metode Toxicologice LCSVD București, 1998
47.***. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. Plos One. 2012-05-24.
48.***. Scientists Discover Key Molecule Linking Neonicotinoids to Honey Bee Viruses, Reader Supported News. 2014-06-09.
49.*** European Food Safety Authority, (2013): ,,Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment for bees for the active substance clothianidin" EFSA Journal 11(1):3066.
50.***European Food, Safety Authority, 2012): ,,Assessment of the scientific information from the Italian project 'APENET' investigating effects on honeybees of coated maize seeds with some neonicotinoids and fipronil". EFSA Journal 10 (6): 2792.
51*** The Honeybee Genome Sequencing Consortium, (2006): Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera, Nature, 26 Oct, 443 (7114), 931-949
52***Ordin comun dat de: Ministrul Agriculturii și Alimentației (45/ 1991), Ministrul Mediului (68/ 1992), Ministrul Transporturilor (1786/ 1991), Departamentul pentru Administrația Locala (15b/3404/ 1991) și Președintele Asociației Crescătorilor de Albine din Romania (127/ 1991) privind unele măsuri pentru protecția familiilor de albine împotriva intoxicațiilor cu pesticide.
53 ***tutun-de-casă (2010): https://gradinavisata.wordpress.com/2010/06/02 /tutun-de-casa/
54.*** măselarița : http://www.selene.ro/articole/maselarita
55.*** mătrăguna: http://www.selene.ro/articole/matraguna
56.***http://www.dcnews.ro/cinci-plante-care-te-pot-ucide_225791.html
57.*** omagul : http://www.selene.ro/articole/omagul
58. *** știrigoaie: http://www.satetransilvaniene.ro/veratrum-album-stirigoaie-steregoaie/
59 ***digitala: http://www.wyevalegardencentres.co.uk/
60. ***ruscuța de primăvară: http://www.selene.ro/articole/ruscuta-de-primavara
61.***laur, oleandru: https://www.google.ro/search?q=oleander +(nerium+oleander)
62. *** piciorul cocoșului: https://en.wikipedia.org/wiki/Ranunculus_acris
63. ***pelinița: https://secom.ro/glosar/pelinita/
64.***laptele câinelui, alior: https://en.wikipedia.org/wiki/ Euphorbia_cyparissias
65.*** Editing Bees and toxic chemicals: https://en. wikipedia.org/w/index.php?title=Bees_and_toxic_chemicals&action=edit§ion=2
Gheorghe DOBRE și Stelian ASIMINEI
II.VI. Afecțiunile necontagioase, tulburările de comportament, tehnopatiile și dăunătorii albinelor
II.6.1. Afecțiunile necontagioase
Afecțiunile necontagioase sunt legate adesea de o igienă precară, de material biologic necorespunzător, de condiții de mediu nefavorabile, de tehnologii neperformante și de lipsă de intervenție din partea apicultorului.
Au fost descrise și numeroase boli cu etiologie neprecizată, însă cauza acestora nu a putut fi stabilită prin investigații epidemiologice, clinice sau de laborator. Necunoscâdu-se etiologia, nu au putut fi elaborate scheme de tratament eficace.
II.6.1.1. Dizenteria
Dizenteria este o boală diareică care apare numai la albinele de iarnă ca urmare a supraîncărcării pungii rectale.
Cauzele dizenteriei sunt variate:
vreme capriciosă cu perioade lungi de căldură care alternează cu perioade lungi de ger,
albinele fiind în imposibilitatea efectuării zborului de curățire;
perturbarea liniștii cuibului de iernare datorită dăunătorilor (șoareci, ciocanitori,, etc);
colonii orfane sau boli precum varrooza, nosemoza, amoebioza, etc.;
hrană neadecvată (miere de mană sau miere cristalizată, surse glucidice cu resturi de
oligozaharide, etc).
Simptomatologie
Clinic, sunt semnalate pete de fecale diareice, răspândite în stup (pe pereții interiori, deasupra ramelor, pe faguri) și în afara stupului (pe peretele din față și pe scândura de zbor). Albinele, care spraviețuiesc, au abdomenul mărit, se târăsc în fața urdinișului și își pierd capacitatea de zbor. Abdomenul, dacă este presat ușor, aruncă la distanță, sub formă de jet, excremente maronii. Pe fundul stupului sunt multe albine moarte.
Diagnosticul poate fi pus pe baza semnelor clinice.
Combaterea bolii
Colonia trebuie mutată într-un stup nou cu faguri curați, într-un spațiu cât mai strâmt și hrănită cu o soluție diluată de sirop de zahăr (1:1), pentru a se asigura un nou start în dezvoltarea albinelor. O colonie grav bolnavă, în care se constată o etiologie polifactorială se distruge.
Prevenirea
Perturbările exterioare trebuiesc evitate. Adaosurile de hrană de iarnă să fie cât mai puține. Trebuiesc evitate culesurile târzii de zaharuri extraflorale și de miere de mană. Important este ca numai coloniile puternice și sănătoase să fie pregătite pentru iernare și să se identifice cauza care a dus la declanșarea dizenteriei.(32,38)
II.6.1.2. Indigestia (boala de mai)
Datorită unui consum abundent de polen, în special la albinele tinere, apar indigestii care în final duc la constipație. Apariția bolii este legată de lipsa de apă în timpul unui cules abundent, de timpul nefavorabil care obligă albinele să rămână în stup și de cantitatea mare de puiet care trebuie hrănit. Boala apare numai la unele colonii sau pot fi afectate toate coloniile din stupina respectivă.
Simptomatologie
În colonie sunt afectate numai albinele doici. Albinele tinere nu mai ies din stup, cad la pământ, se târăsc, se adună în grămezi și mor. Abdomenul este umflat, materiile fecale sunt tari, de culoare galbenă până la cafeniu. La schimbarea vremii, uneori, fără nici o intervenție, semnele clinice dispar.
Diagnostic
Diagnosticul poate fi pus pe baza semnelor clinice și pe acumularea de excremente (polen nedigerat) în intestin.
Diagnosticul diferențial se face față de nosemoză, amoebioză și intoxicatiile cu pesticide.
Combaterea
Pe vreme nefavorabilă, în plin cules, trebuie să oferim albinelor apă sau soluție diluată de sirop în hrănitor. De asemenea cu un sirop foarte diluat se pulverizează albinele pe intervalul dintre faguri.
Prevenirea
Indiferent de amplasarea stupinei, se vor monta, în apropiere, adăpători. Când sunt ploi și scăderi bruște de temperatură, albinele vor primi, în hrănitor, sirop foarte diluat (25-30%).
Acoperirea cuibului cu folie de plastic pentru a obține condens este neindicată, deoarece trebuie avute în vedere și dezavantajele acestei măsuri (27, 32).
II.6.1.3. Stresul nutrițional
Carențele nutritive apar tot mai des datorită scăderii biodiversității. Una dintre principalele cauze directe ale declinului biodiversității este schimbarea categoriei de folosință a terenurilor, gestionarea deficitară prin intensificarea utilizării acestora, pe de o parte, și abandonarea terenurilor, pe de altă parte, precum și declinul agriculturii tradiționale și a practicilor silvice.
Între perioadele de înflorire a plantelor există lipsă de cules (polen și nectar), astfel că de cele mai multe ori plantele melifere de bază sunt cele de cultură (rapița, floarea soarelui).
În aceste situații apare o aglomerare exagerată de colonii de albine pe suprafețe mici de teren cultivat; numărul coloniilor de albine care pot fi întreținute în condiții bune, este determinat de baza meliferă din zona respectivă. Aglomerarea stupinelor, în anumite areale, nu asigură dezvoltarea normală a coloniilor de albine și expune permanent albinele stresului nutrițional și îmbolnăvirilor. Căldurile mari și seceta prelungită pot accentua stresul nutrițional.
Ignorarea stresului nutrițional este dăunător dezvoltării normale a coloniilor de albine și afectează starea sanitară a stupinei (16, 29).
a) Carența glucidică și proteică
În condițiile actuale de exploatare intensivă, asociată cu scăderea biodiversității, stresul nutrițional se instalează frecvent. Principala cauză a stresului nutrițional pentru albine este lipsa calitativă și cantitativă a polenului și a nectarului. Polenul conține nutrienți esențiali pentru albine: proteine, lipide, vitamine, minerale.
Colonia de albine, prin reducerea consumului și a creșterii de puiet, economisește hrana dar prin reducerea pontei, scade populația din colonie. În ciuda reacțiilor de protecție din colonia de albine, puietul, care totuși eclozează, este subdezvoltat și are carențe comportamentale.
Hrana larvelor este constituită, în mare parte, din păstură. Păstura este rezultatul fermentării lactice a polenului depozitat în celule. După consumarea păsturii din faguri și a rezervelor de vitelus din organismul doicilor, scade calitatea lăptișorului produs de acestea, scade apoi calitatea larvelor crescute (subdezvoltarea aparatului reproducător, greutate corporală mai mică și o eclozare întârziată), iar în final se ajunge la canibalism. Carențată, colonia, ca supraorganism, este afectată în totalitatea ei.
b) Puietul înfometat
Înfometarea coloniei de albine se întâlnește atunci când la extracția mierii nu se lasă rezerve suficiente în stup, când se pierd brusc albinele lucrătoare care îngrijesc puietul sau când, pe timpul iernii, apar geruri mari, după temperaturi ridicate (ghemul de iernare nu ajunge la rezervele de hrană), precum și atunci când coloniile sunt jefuite toamna târziu; în aceste cazuri puietul moare și apare fenomenul de canibalism.
Afectat de canibalism este, de regulă, numai stadiul larvar. Larvele și pupele, dacă nu sunt consumate de albinele lucrătoare, sunt scoase din celule și eliminate din stup. Din lipsă de hrană, puietul este subdezvoltat sau moare în stadiul de larvă întinsă sau de pupă.
Albinele adulte înfometate mor înfipte în celulele fagurelui.
c) Careța proteică generată de hrana glucidică
În funcție de aportul și de calitatea polenului, în organismul albinelor, proteina somatică variază, în perioada activă, în limite foarte largi (21%-67%). Când nivelul proteinei somatice scade sub 40%, revenirea nivelului proteic din organismul albinelor lucrătoare se face în 2-4 săptămâni.
Scăderea proteinelor din organismul albinelor se produce când există un cules abundent de nectar sau când pastoralul se prelungește. Acest fapt va genera o carență de proteine și scăderea rezervelor de vitelus în populația de albine din colonie. Se diminuiază și cantitatea de păstură din faguri. Această carență de proteină duce la reducerea pontei, iar colonia se depopulează.
La albinele lucrătoare nou eclozate se observă tulburări fiziologice și somatice (hipotrepsie, hipotrofie).
Supravegherea tehnologică și sanitară
Instabilitatea ecosistemelor și capriciile vremii influențează puternic echilibrul biologic al coloniei de albine. Obiectivele avute în vedere sunt starea adecvată de sănatate a coloniei de albine, aportul de substanțe energetice și plastice și puterea de pontă a reginei.
Prevenire și combatere
Pentru stupinile staționare și nu numai, în cazul când nu se asigură pe toată perioada sezonului activ surse de nectar și polen de la flora meliferă locală se recomandă cultivarea unui conveier melifer cu plante a căror înflorire să coincidă cu perioadele lipsite de cules din zona respectivă.
Aflându-ne în zonă temperată, pentru a se asigura o iernare corespunzătoare, o bună dezvoltare a coloniilor de albine, atât primăvara timpuriu cât și pe parcursul verii, se pot face hrăniri suplimentare cu biostimulatori proteici și glucidici.
II.6.1.4. Stresul termic
Colonia de albine este considerată, în zoologie, un supraorganism, în care funcțiile de nutriție, respirație, apărare și reproducție au atât nivel individual cât și social. În stup, în condiții normale, albinele lucrătoare asigură hrănirea și menținerea temperaturii și a umidității, în special, în zona cuibului de albine. Capriciile vremii, tehnologiile sau transporturile neperformante, dar și pierdea albinelor lucrătoare, pot deregla acest mecanism.
Temperatura medie în stup în perioada activă se menține în jur de 32-35ș C Albinele au capacitatea de a regla temperatura și umiditatea din stup, fie generând căldură prin vibrație, fie ventilând aerul din stup. Pe vreme caniculară, când stupul este foarte populat, unele din albinele culegătoare ies afară din stup și formează bărbi.
a) Puietul răcit
Puietul răcit apare ca urmare a unui dezechilibru între numărul de albine adulte aflate în stup și suprafața de puiet. Dezechilibrul se produce datorită pierderilor de albine lucrătoare ca urmare a unor tulburări climatice sau a unor cauze infecțioase, parazitare, toxice sau a unor greșeli de management.
Clinic, larvele afectate se găsesc, de regulă, la marginea ramei, aspectul este uniform și ocupă o suprafață foarte mare, iar puietul mort are o culoare gri sau gri murdar și o consistență flască. Pupele moarte sunt scoase din celule și eliminate din stup.
b) Puietul inversat
Puietul inversat, adică puietul aflat în poziție inversă în celulă, are drept cauză răcirea sau deranjarea larvei întinse. Aceste albine nu pot ecloza și mor în celulă. (28)
c) Puietul supraîncălzit
Pierderea puietului datorită stresului termic variază de la câteva larve moarte, aflate la periferie, până la afectarea unor suprafețe mari de puiet.
Diagnosticul stresului termic se bazează pe investigații epidemiologice, examene clinice și pe examene de laborator.
Prevenirea și combaterea se realizează prin supraveghere sanitară și tehnologică și prin menținerea în stupină a unor colonii puternice.
II.6.1.5. Anomaliile și malformațiile
Anomaliile și malformațiile apar la toate castele de albine. Pot avea cauze multiple, dar este foarte greu să stabilim dacă anomalia a avut o cauză ereditară sau s-a format sub influiența factorilor de mediu.
Anomalia este considerată o abatere, o deviere de la starea normală a individului, datorită unui concurs de împrejurări, iar malformația o anomalie congenitală. Când dezvoltarea în celula de puiet a fost perturbată se pot ivi anomalii și malformații la nivel individual atât intern cât și extern. Acestea sunt observate rar de apicultor deoarece albinele afectate de anomalii sau malformații congenitale părăsesc colonia sau sunt alungate de congenere.
Cu toate că unele anomalii și malformații sunt lipsite de importanță pentru practica apicolă ele merită să fie tratate cu atenție pentru a spori cunoștințele despre embriogeneza și ontogeneza albinei melifere și factorii care o influențează.
Dintre anomaliile și malformațiile somatice putem menționa: aripi boante, trunchiate sau incomplet dezvoltate, albinele nu pot zbura; membre incomplete, albinele nu se pot menține pe faguri; nanism-albine pitice. Uneori din celulele de lucrătoare eclozează trântori pitici, în special în coloniile bezmetice.(26, 33)
a) Ginandromorfismul (albine hermafrodite) Apariția unor caractere ale ambelor sexe pe același individ poartă denumirea de ginandromorfism. În funcție de părțile corpului afectate, ginandromorfismul poate fi bilateral, în mozaic sau transversal.
b) Microcefalia. Presupune apariția de exemplare cu capul mic.
c) Ciclopismul. Indivizi cu un singur ochi datorită poziției mai mult sau mai puțin apropiate a ochilor compuși care se pot contopi într-un singur ochi, fie a lipsei unuia dintre ochi.
d) Ochi albinoși. Este o modificare genetică a culorii normale a ochilor. Fiind o caracteristică moștenită recesiv, malformația este observată mai ales la trântorii care sunt haploizi.
c) Anomalii ale mătcilor
Cele mai des întâlnite anomalii sau afecțiuni ale tractusului genital sunt atrofia, aplazia și hipoplazia ovarelor, hipoplazia oviductelor, anomalii sau afecțiuni ale spermatecii.
Anomaliile și afecțiunile glandelor și tractusului genital, chiar și în cazul când provoacă sterilitate parțială, impun schimbarea mătcii respective.
d) Anomalii ale puietului
Puietul tubulos apare când celulele de lucrătoare au fost prelungite deoarece nimfele au fost ridicate de canalele de hrănire ale moliilor de ceară.
Puietul ghebos apare atunci când sunt depuse ouă de trântori în celule de lucrătoare, iar mărimea celulelor nu este suficientă pentru trântorii în dezvoltare.
Primăvara, după răcirea bruscă a vremii în zonele cu puiet de trântor părăsit de albine, apar exemplare cu un abdomen mai scurt sau cu aripi sau membre deformate.
Diagnosticul se bazează pe investigații epidemiologice, clinice și morfopatologice .
Prevenirea și combaterea se realizează prin selecția și ameliorarea materialului biologic existent sau prin achiziționarea mătcilor din surse sigure și verificate.
II.6.2. Tulburările de comportament
Viața noastră este legată de natură, în strânsă interdependență cu varietatea plantelor și a viețuitoarelor din întreg regnul animal. Aflate într-un mediu natural devenit ostil, fără intervenția omului, albinele sunt pe cale de dispariție. De multe ori ne confruntăm în coloniile de albine cu răspunsuri diferite, la aparent aceleași cauze, datorită, în general, mediului înconjurător schimbat artificial, a tehnologiilor apicole neperformante sau a unui comportament instinctiv hazardat.
Sindromul depopulării coloniilor de albine (Colony collaps disorder = CCD) este omniprezent și considerat de regulă ca o tulburare de comportament, datorită scoaterii albinelor prin tehnologii comerciale din habitatul lor natural sau ca un atac plurifactorial a mai multor agenți infecțioși sau toxici.(6)
II.6.2.1. Colapsul coloniilor de albine
Sindromul depopularii coloniilor de albinelor (CCD)
Colapsul coloniilor de albine este un sindrom polifactorial, cu evoluție enzootico – epizootică staționară, manifestat clinic prin dispariția treptată sau bruscă a albinelor adulte din colonie, cu sau fără albine moarte în cadrul familiei și câte odată, cu prezența nealterată a mătcii, a puietului și a rezervelor de hrană în stup; boala este prezentă în tot timpul anului, însă evoluția ei este dramatică la sfârșitul toamnei, iarna și la începutul primăverii.
Istoric și importanță economică
Dispariția inexplicabilă a albinelor adulte din stupi a fost semnalată încă din anul 1869, ulterior literatura de specialitate consemnând episoade asemănătoare în anii 1880, 1920 și 1960, cele mai multe semnalări fiind înregistrate în SUA.
În statul nord-american Utah, un crescător de albine a pierdut 2000 de colonii de albine după o iarnă grea (1903), iar în iarna anilor 1995 – 1996, în statul Pennsylvania (SUA), s-au pierdut 53% dintre coloniile de albine, fără a fi stabilită o cauză plauzibilă (40). Același comportament bizar al coloniilor de albine a fost semnalat și în anii 1918 și 1919. În anul 1965, în statul nord-american Louisiana, a fost raportată dispariția albinelor adulte, în timp ce rezervele de hrană erau prezente în stupi ( 42 ); pierderile s-au extins și la albinele sălbatice, astfel că, în SUA, în ultimile patru decade ale secolului XX și în prima decadă a secolului XXI, a avut loc o reducere dramatică a coloniilor de albine sălbatice.
Termenul de CCD a fost folosit pentru prima dată în anul 2006, în SUA, anterior sindromul fiind denumit “boala misterioasă” sau “boala disparițiilor”. În toamna anului 2006, un apicultor din Pennsylvania, a semnalat pierderi masive de colonii de albine. Ulterior, rapoartele au fost din ce in ce mai dese, astfel că pierderile asociate CCD la stupinele în pastoral, au variat între 30% și 90% din colonii, iar la cele sedentare de cca 50%. Până în anul 2006, pierderile anuale de familii de albine din SUA, au fost în limita a 17 – 20%, în cifre absolute, numărul de colonii reducându-se de la 5 milioane, în 1940, la 2,5 milioane în momentul de față. În medie, pierderilie de familii de albine în SUA, în anii 2007, 2008, 2009 și 2010 au fost de 34%, pentru ca în iarna anului 2013, numărul coloniilor de albine să scadă numai cu 23%.
Un episod asemănător a avut loc în Anglia, în anul 1906, care, mai târziu, a fost atribuit mai multor factori, printre care apicultura intensivă, condiții meteorologice nefavorabile și/sau infecția cu virusul paraliziei cronice.
Pierderi asemănătoare s-au înregistrat în cinci provincii canadiene, în țări din America de Sud și Centrală, în mai multe țări europene (Belgia, Franța, Olanda, Grecia, Italia, Portugalia, Spania, Elveția, Germania, Irlanda de Nord), dar și în țări din Asia de Sud (Taiwan, Australia). Anglia a raportat, între 2006 și 2008, o pierdere a familiilor de albine de 30%, iar în Italia, pentru aceeași perioadă, mortalitatea raportată de EFSA a fost de 40 – 50%. În Scoția, în iarna anului 2009, un apicultor a pierdut 80% din numărul de colonii de albine pe care-l deținea, adică 960 din 1200 (42).
Raportări similare au fost făcute în Spania, pierderile de colonii de albine situându-se între 30 și 35%, iar producția de miere de albine/colonie a ajuns la jumătate (40).
Reducerea continuă a coloniilor de albine, pe lângă pierderea unor cantități importante de miere de albine, destinată consumului uman, determină creșterea costurilor pentru asigurarea polenizarii culturilor agricole, concomitent cu reducerea producțiilor agricole și, nu în ultimul rând, dispariția unui mare număr de locuri de muncă.
Valoric, pierderile economice directe și indirecte, în SUA, în anul 2007, legate de CCD, au fost estimate la aproximativ 75 de miliarde de dolari (42).
Etiopatogenie
Cauzele CCD nu sunt încă cunoscute, dar se presupune că la evoluția acestui sindrom contribuie mai mulți factori: pesticide, paraziți, virusuri, bacterii, insecte, practici agricole și apicole neadecvate, stresul de transport, pastoralul, malnutriția și imunodeficiențele.
Cert este faptul că nici unul dintre factorii enumerați mai sus nu acționează de unul singur; acești factori acționează în combinație sau sinergic, se potențează reciproc și duc la declanșarea și evoluția CCD în stupine (42).
a) Pesticidele și agenții biotici
Un efect de potențare a efectelor patogene între insecticide și agenții patogeni biotici a fost întrezărită încă de la începutul evoluției CCD. Având în vedere aceste aspecte, a fost investigat efectul cumulativ al acțiunii patogene a unor specii de Nosema (Microsporidia) și imidacloprid, pe trei grupe de familii de albine și o grupă de control. Au fost luate în studiu mortalitatea și nevoile energetice, imunitatea individuală și imunitatea de grup social. Parametrii investigați au fost metabolismul energetic individual, numărul total de hemocite (THC) și activitatea enzimatică a fenoloxidazei (PO) pentru imunitatea individuală și activitatea enzimatică a glucozoxidazei (GOX) pentru imunitatea socială. GOX catalizează oxidarea β – d – glucoză la acid d-gluconic și peroxid de hidrogen (produs cu acțiune antiseptică). Peroxidul de hidrogen este secretat, în lăpișorul de matcă și miere, contribuind la inhibarea dezvoltării agenților patogeni.
Rezultatele studiului au demonstrat că Nosema spp. și imidaclopridul interacționează, potențându-și efectele nocive asupra organismului albinelor din loturile experimentale, față de lotul de control, prin creșterea mortalității, inducerea unui stres energetic, suprimarea activității sistemului imunitar individual (diminuarea activității PO și a populației de hemocite) și scăderea semnificativă a activității GOX, responsabilă de sinteza peroxidului de hidrogen. Așadar, interacțiunea dintre Nosema spp. și pesticide, determină slăbirea coloniei de albine și creșterea ratei de pierderi prin mortalitate (22).
a
Figura 1: Etiopatogenia CCD (original)
Fig. II.6.1. Etiopatogenia CCD (original)
a). Pesticide b). Management defectuos
c). Agenti biotici d). Colonii de albine
e). Stupină depopulată
b) Pesticidele și agenții poluanți
Pesticidele sunt utilizate în toată lumea, pe scară largă, la tratarea semințelor cerealelor și plantelor tehnice, precum și la combatertea buruienilor și dăunătorilor care afectează culturile agricole, pădurile, viile, livezile sau legumicultura.
Pe lângă pesticidele pătrunse în sol odată cu semințele, tehnica agricolă utilizată la însămânțare sau la efectuarea tratamentelor faziale împotriva dăunătorilor, împraștie în atmosferă pesticidele, acestea ajungând pe toate plantele și în solul din vecinătatea terenurilor respective. De pe plante sau din subsol, odată cu subsțantele hrănitoare, pesticidele folosite sunt antrenate spre flori, astfel că polenul și nectarul acestora conțin substanțe toxice.
Albinele preiau pesticidele odată cu polenul și nectarul plantelor, le duc în stup, le prelucrează în păstură și miere, le depozitează pentru utilizare imediată sau târzie și astfel determină o intoxicație subletală, cronică, a tuturor indivizilor din colonie, dar mai ales al albinelor lucrătoare care se hrănesc cu miere.
Poluarea coloniilor de albine este diversă, incluzând aici și tratamentele efectuate în apicultură împotriva acarienilor Varroa cu flumethrin, cumafos, acid formic, cymazol etc., precum și noxele industriale din preajma aglomerărilor urbane și autostrazilor.
Concentrațiile de pesticide din miere, păstură, ceară, cât și diversitatea acestora , diferă de la studiu la studiu și de la țară la țară.
Un studiu realizat în anul 2010 arată că nu mai puțin de 98 de pesticide și metaboliți ai acestora, în concentrații de până la 214 ppm, au fost depistați în polenul recoltat de albine (1).
Experiențele efectuate până acum, de diverse colective de cercetători, au scos în evidență acțiunea toxică a pesticidelor, prin administrarea în doze subletale, perioade lungi de expunere, datorită interferării cu metabolismul și sistemul endocrin, cu impact asupra imunității. Astfel, încorporarea în siropul de porumb cu fructoză a neonicotinoidului imidacloprid, și apoi folosirea acestuia în hrana unor colonii de albine timp de 13 săptămâni, a determinat o mortalitate de 94% a albinelor luate în studiu, în decursul a 23 de săptămâni de la începutul experimentului (23, 24). O altă experiență efectuată în iarna anilor 2012 – 2013, cu imidacloprid și clotianidin, pe câte șase colonii de albine și un grup de șase folosit ca martor, a dus la o mortalitate de 50% în cele două grupe tratate cu neonicotinoide, simptomatologia fiind caracteristică sindromului CCD (37).
În urma experimentelor efectuate de-a lungul timpului, precum și a observațiilor multor apicultori ce au suferit pierderi atribuite CCD, pesticidele sunt considerate ca făcând parte dintre factorii implicați în etiologia colapsului coloniilor de albine.
Modul de acțiune a pesticidelor, prin extrapolare, se bazează pe activitatea de chelator al glifosatului, un compus organic fosfonat, folosit ca erbicid încă din anul 1964. Acest produs imobilizează nutrienții minerali (Ca, Fe, Co, Cu, Mn, Mg, Zn etc.), prin formarea unor chelați în sol și privarea plantelor de nutrienții necesari diverselor sisteme enzimatice utilizate în sinteza substanțelor organice (21). Tot așa, și la albine, pesticidele interferează sinteza enzimelor și hormonilor, determinând tulburări grave la nivelul sistemului nervos, aceasta fiind o explicație a părăsirii în masă a stupului de către albinele lucrătoare. De exemplu, tiametoxamul, un alt neonicotinoid, determină pierderea capacității de orientare a albinelor culegătoare, acestea nemaifiind în stare să- și găsească ,,casa” și mor rătăcite. De altfel, două studii efectuate în anul 2013, relevă că neonicotinoidele afectează albinele pe termen lung și memoria pe termen scurt, ceea ce sugerează eșecul reîntoarcerii albinelor la stup. Un alt studiu, efectuat tot în anul 2013, concluzionează că expunerea la neonicotinoidele clotianidin și imidacloprid determină sinteza unei proteine patologice ce interferează cu acțiunea proteinelor plasmatice implicate în imunitate (42).
Pe lângă acțiunea de chelare a mineralelor din sol, plante și animale, glifosatul posedă și o puternică activitate cidă asupra bacteriilor din tubul digestiv al albinelor, respectiv Lactobacillus și Bifidobacterium. Aceste bacterii au rol mare în digestie și protecție față de agenții patogeni de la nivelul tubului digestiv (21). Fără aceste bacterii, albina este vulnerabilă față de acțiunea patogenă a virusurilor, bacteriilor, paraziților sau fungilor.
Radiația electromagnetică s-ar părea că nu influențează activitatea albinei melifere. Experimentele din anul 2004, cu unde electromagnetice de 1880 – 1900 MHz, n-au produs modificari de comportament în coloniile de albine, iar cercetarile efectuate cu unde electromagnetice de frecvență joasă, au evidențiat doar efectul caloric al acestora asupra albinelor, fără a le fi influențat comportamentul.
Albinele detectează câmpuri magnetice statice de frecvență joasă. Acestea le sunt utile în procesul de orientare în spațiu. A lega câmpurile electromagnetice de CCD, credem că este o greșeală, sau poate nu!? (vezi cap. II.5.7).
c) Agenții biotici și statusul imunitar
Agentii biotici și statusul imunitar au fost luați în calcul, în analizele grupelor de cercetare privind cauzele CCD. Un studiu realizat în anul 2007, de cercetători de la Universitatea de Stat din Pennsylvania, arată că ,,multitudinea de agenți infecțioși detectați în albinele adulte sugerează un anumit tip de imunosupresie”, și mergând mai departe, concluzionează că ,,o combinație patogenă dintre Varroa, virusul aripilor deformate și bacterii diverse, conlucrează la suprimarea imunității și par să fie o cauză a sindromului colapsului coloniilor de albine” (42).
Se știe că atunci când într-o stupină există o colonie de albine slabă sau care a murit deja, albinele din coloniile învecinate intră în stup și jefuiesc rezervele de hrană rămase fără apărare. În depopularea prin CCD, rezervele de hrană rămase nu sunt furate de congenerele din alte colonii, iar repopularea stupului respectiv, cu o colonie de albine sănătoase, nu se poate face decât după ionizare cu raze gamma, pentru distrugerea ADN-ului, altfel sindromul reapare. Acest fapt sugerează că între cauzele CCD, factorii infecțioși nu sunt de neglijat.
Între factorii biotici implicați în declanșarea CCD, un rol major îl are, probabil, Varroa destructor (Arachnida: Acari). Potrivit cunoștințelor actuale, acest acarian reprezintă cel mai distructiv agent patogen al coloniilor de albine, în parte și datorită calității de vector pentru virusul aripilor deformate și pentru virusul paraliziei acute, ambii implicați în etiologia CCD. O componentă majoră a patogenității acarianului este slăbirea sistemului imunitar, datorită pierderilor masive de hemolimfă, știindu-se că V. destructor se hrănește cu hemolimfa albinei.
Un studiu efectuat în Ontario – Canada, în iarna anilor 2007 – 2008, pe un număr de 413 colonii de albine, a evidențiat că din 112 colonii moarte (27%), din total, în 83 a fost depistat acarianul Varroa destructor (85%), aceștia fiind considerați ca o posibilă cauză a dispariției coloniilor de albine.
Studii secvențiale pe ARN, la toate vietățile dintr-o multitudine de colonii de albine, comparate cu baza de date existentă, au dovedit că toate familiile de albine erau infectate cu numeroși agenți patogeni, însă numai virusul paraliziei acute Israel (IAPV) a fost asociat frecvent cu CCD (83%). În coloniile non-CCD, virusul a fost identificat în doar o colonie din 21. IAPV a fost descoperit în 2004 și aparține familiei Dicistroviridae, determinând paralizia acută a albinelor și poate fi transmis de V. destructor prin înțepare, în timpul hrănirii cu hemolimfă. IAPV acționează prin blocarea sintezei proteinelor cu rol imunitar la nivelul ribozomilor și astfel scad efectorii imunității, albina devenind vulnerabilă la diverși agenți patogeni, care altfel n-ar fi letali. Dar, oamenii de știință subliniază că nu există nici o dovadă de cauzalitate între virus și CCD, virusul putând fi un marker și nu un agent cauzal real al sindromului.
A fost sugerată și ipoteza că CCD ar putea fi determinată de loca europeană, loca americană sau Nosema apis. Însă simptomatologia acestor boli este total diferită de cea a CCD.
Nosema ceranae a fost incriminată încă din anul 2000 de Mariano Higes (18, 19), Spania, ca agent cauzal al sindromului CCD. Dar nu toate studiile converg către această ipoteză.
În SUA, doar la ≈50% din coloniile afectate de CCD a fost identificată și Nosema ceranae, același fapt fiind constatat și în Europa. Acest lucru sugerează că CCD este produsă de interacțiunea agenților patogeni cu factorii de stres (12).
O altă ipoteză, apărută recent (octombrie 2010), leagă N. ceranae de iridovirusul tip 6 (IIV-6) din familia Iridoviridae. Această combinație de agenți patogeni a fost gasită în toate coloniile de albine afectate de CCD. Infecțiile experimentale cu virusul IIV-6 sau Nosema ceranae au determinat pierderi parțiale pentru fiecare agent inoculat separat albinelor. Însă, inocularea combinată a virusului și a microsporidiului, a dus la pierderea tuturor albinelor, iar semnele clinice au fost similare CCD. Dar, izolarea iridovirusului tip – 6 din toate probele supuse analizelor prin spectrometrie de masă, în acest experiment, sunt puse la îndoială (42).
Virusurile nu pot produce pagube mari daca nu sunt ajutate de paraziți sau de apicultor prin greșeli tehnologice. Varroa răspândește și transmite prin înțepătură, atunci când se hranește cu hemolimfă, nu numai virusul paraliziei acute ci și virusul albinelor din Kashmir.
Virusurile la care calea de infecție este cea digestivă ( virusul X, virusul Y, virusul botcilor negre) trec bariera intestinală prin leziunile provocate de Malpighamoeba mellificae (Amoebozoa) și de Nosema spp.
În luna ianuarie a anului 2012, Hafernik și colab. (22) au descoperit o insectă, Apocephalus borealis (Diptera: Phoridae), ale carei larve se dezvoltă în corpul albinelor, după ce adultul își depune ouale în abdomenul acestora. După eclozare, larvele migrează spre cap și în final ies la exterior prin gâtul albinei. În drumul lor atacă creierul albinelor și le afectează simțul orientarii, astfel că albinele părăsesc colonia, noaptea, în căutarea hranei și mor în afara stupului. Din acest motiv insecta Apocephalus borealis a fost asociată cu CCD, însă nu toată lumea împărtășește această ipoteză deoarece gazdele consacrate pentru acest dăunător sunt viespiile și bondarii.
d) Managementul defectuos.
Managmentul defectuos poate contribui la apariția și evoluția CCD, aici fiind incluse toate greșelile legate de îngrijirea și întreținerea coloniilor de albine.
e) Transhumanța (deplasarea în pastoral), pe lângă beneficiile aduse, prin asigurarea polenizarii culturilor agricole, reprezintă un factor de stres major pentru coloniile de albine, fiind de asemenea un mijloc ,,eficient” de transmitere a bacteriilor, virusurilor și acarienilor de la o exploatație apicolă dintr-o zonă la alta din altă zonă a țării, sau între țări diferite, pentru coloniile din preajma granițelor statale.
f) Înmulțirea necontrolată a subspeciilor de Apis mellifera, ignorarea particularităților de reproducție specifice, desconsiderarea albinei ca rasă geografică și achiziționarea de regine hibride, amestecul de subspecii în zonele de stupărit pastoral, a dus la uniformizarea genetică a indivizilor (consangvinizare) sau la disjuncția caracterelor, la agresivitate, a scăzut de asemenea rezistența la boli. Fenomenele se transmit din generație în generație și de multe ori se amplifică.
g) Malnutriția este factorul cauzal observat în toate episoadele pierderilor de colonii de albine prin sindromul CCD. Hrănirea insuficientă în perioadele secetoase, dietele cu polen și nectar de pe monoculturi agricole, precum și suplimentele alimentare din timpul iernii, bazate pe sirop de porumb sau de zahar și înlocuitori de polen, duc la slăbirea rezistenței coloniilor de albine. Un studiu publicat în anul 2010, relevă faptul că albinele hrănite cu polen și nectar de la mai multe culturi agricole au o imunitate superioară celor hrănite cu o singură varietate de polen sau nectar, deoarece cele dintâi au cantități mai mari de glucozoxidază și de acid p-cumaric. Glucozoxidaza este o enzimă care transformă glucoza în acid D – gluconic și peroxid de hidrogen (α – D – glucoza + O2+H2O → acid D – gluconic + H2O2). Peroxidul de hidrogen are acțiune antiseptică, iar acidul p-cumaric este un antoxidant care neutralizează unele pesticide, fiind esențiale în aparărea antiinfecțioasă și în inactivarea pesticidelor (42).
Antibioticele, acaricidele și organismele modificate genetic (OMG – urile) sunt incriminate de unii apicultori, dar cele mai multe dovezi nu le plasează între cauzele CCD.
Epidemiologie
Sindromul depopulărilor coloniilor de albine (CCD) este un fenomen caracterizat prin dispariția în decurs de câteva zile până la câteva săptămâni a albinelor lucrătoare dintr-un stup. Albinele dispărute nu sunt găsite moarte în interiorul stupului sau în preajma acestuia. Sunt afectate la început una – două colonii, dar boala în timp, poate afecta întraga stupină.
Analizele efectuate pe probele colectate de la albine CCD și non-CCD, relevă faptul că în primele sunt prezente un număr mare de virusuri, paraziți și pesticide, față de cele non-CCD. Acest lucru sugerează că la baza evoluției fenomenului stă o combinație de factori ce declanșează o cascadă de evenimente stresante, care duc la slăbirea coloniei de albine. Astfel, colonia devine vulnerabilă la acțiunea dăunătorilor și agenților patogeni.
CCD afectează toate coloniile de albine, dar sunt mai vulnerabile coloniile slăbite. Hrănirile cu polen și nectar din monoculturi de pomi fructiferi (meri, peri etc.) , legume (pepene verde, pepene galben etc.), plante tehnice (floarea soarelui, rapiță etc.), practicarea pastoralul excesiv, cu parcurgerea unor distanțe mari între culesuri sau lucrările de ameliorare și selecție exagerate, cu apariția consangvinității, ca și iernile geroase și lungi, umiditatea crescută, variațiile bruște de temperatură, hrănirile de completare cu sirop de porumb, sirop de zahăr și înlocuitori de polen, pesticidele și noxele industriale, slăbesc rezistența coloniilor de albine și acestea devin victime sigure ale agenților biotici; astfel se declanșează CCD.
Boala evoluează tot timpul anului, dar mai drastic în anotimpul rece, când și pierderile sunt mai mari. CCD apare în coloniile din toata lumea și din toate exploatațiile apicole, însă cu pierderi mai mari în stupinile de tip industrial, ce practică pastoralul intensiv.
Sunt afectate cu precădere albinele tinere care în primele zile de viață au nevoie de o cantitate mare de hrană și apă. Cum, de regulă, în luna mai se întâlnesc și cele mai multe albine tinere, iar această lună se caracterizează prin vreme rece și ploioasă, echilibrul lor metabolic este perturbat. Dacă ploile sunt de lungă durată, dezechilibrele nutriționale se accentuează din cauză că albinele nu se pot aproviziona cu apă, polen și nectar și astfel se declanșează afecțiunea (34).
Prognosticul este grav.
Simptomatologie și modificari morfopatologice
Semnele preclinice sunt:
număr insufficient de albină lucrătoare;
lipsa albinelor tinere;
aport redus de nectar sau consum redus de suplimente alimentare.
Clinic, CCD se manifestă prin:
evoluție acută la albinele tinere, în vârstă de 6 – 13 zile. Albinele părăsesc stupul prezentând frisoane, neliniște, incapacitate de zbor și în final mor (34);
puietul este prezent în coloniile abandonate; în mod normal, albinele nu abandonează un stup până când tot puietul eclozează;
rezerva de hrană (păstură, miere) este prezentă;. dacă rezerva de hrană lipsește, se fac investigații pentru descoperirea unui eventual furtișag;
matca este prezentă; în cazul în care regina este absentă, stupul s-a depopulat și datorită lipsei acesteia.
Diagnostic
Diagnosticul este greu de stabilit. Ca orice afecțune polifactorială, numai o comisie de anchetă interdisciplinară poate stabili cu certitudine adevărata cauză a dispariției albinelor lucrătoare din colonii. Totuși, investigațiile de laborator trebuie să includă analizele toxicologice, bacteriologice, virusologice și parazitologice, iar datele clinice pot fi relevante în cazul persistenței rezervelor de hrană, mătcii și puietului, în absența albinelor lucratoare.
Din punct de vedere clinic, trebuie să se țină seama de faptul că albinele au constipație puternică și fecale consistente fără microorganisme patogene, iar hemolimfa este sterilă (34).
Infecția virală nu poate fi diagnosticată decât prin examen de laborator. Prin determinarea titrului viral (DWV) sau al vitelusului, precum și prin investigarea nivelului infecției cu Nosema ceranae sau al infestației cu Varroa destructor sunt obținute informații credibile privind evoluția CCD în stupina respectivă (42).
Studii recente, au arătat că unii agenți patogeni (DWV, Varroa destructor ) și vitelusul pot fi considerați markeri în predicția evoluției CCD în Europa; în Spania este inclusă și Nosema ceranae (42).
Diagnosticul diferențial trebuie făcut față de varrooză, nosemoză, furtișag, atacul gândacului mic de stup, intoxicații acute sau galerioză. Trebuie exclusă infecția virală asociată sau atacul unor dăunători.
În varrooză, albinele părăsesc stupul (11), însă nu rămâne nici matca, dar nici rezerve de hrană, iar puietul lipsește.
În intoxicații, mortalitatea albinelor adulte este masivă și sunt găsite peste tot: în stup, în fața stupului, iar ancheta epidemiologică ne conduce la sursa toxinei (stropiri la culturile agricole, în livezi, legumicultură sau acte criminale).
Atacul gândacului mic de stup și galerioza evoluează mai târziu.
Nosemoza, produsă de Nosema apis, are o evoluție dramatică la sfârșitul iernii, iar clinic se manifestă prin diaree urât mirositoare și moarte (în stup sau în jurul stupului).
Profilaxie și combatere
Măsurile de profilaxie vizează:
monitorizarea coloniilor de albine prin examene clinice și de laborator bianuale;
evitarea unirii familiilor slabe cu familii puternice;
când apare un caz de depopulare masivă, stupul respectiv trebuie scos din
stupină și depozitat într-un spațiu închis la care să nu aibă acces albinele sănătoase (43);
hrănirea stimulativă a albinelor cu sirop de zahăr și infuzie de pelin (2).
distrugerea coloniilor de albine afectate de loca americană sau locă europeană;
dezinfecția stupilor și ramelor cu soluție de sodă caustică 3%;
Analizând datele prezentate, conchidem că CCD este o entitate morbidă determinată de factori de stress (malnutriție, secetă, călduri exagerate, intoxicația cronică cu pesticide, stupăritul pastoral, stres medicamentos, manipulari neadecvate, ,,sâcâirea” coloniei de albine, infecțiile latente cu virusuri și paraziți), care duc la scăderea rezistenței coloniilor de albine și instalarea unor entități morbide virale (virusul aripilor deformate, virusul paraliziei acute Israel etc.) sau parazitare (Varroa destructor, Nosema spp.) cu efect letal.
Această concluzie ne spune că toate acțiunile ce vizează limitarea sau anihilarea factorilor de stres enumerați mai sus, vor duce la reducerea pierderilor de colonii de albine prin CCD.
II.6.2.2. Coloniile bezmetice
Prezența reginei este o condiție sine qua non pentru a păstra echilibrul coloniei de albine. Organizarea internă și viața socială în acest supraorganism, nu se poate desfășura în absența reginei. Regina poate muri de moarte naturală sau din cauza unor boli, poate fi omorâtă accidental de apicultor sau poate fi omorâtă prin înțepare în timpul unui furtișag,.
În lipsa feromonilor produși de matcă și datorită surplusului secrețiilor glandelor faringiene, apar albinele lucrătoare ouătoare.
Deoarece le lipsește materialul seminal și nici nu se pot împerechea, acestea depun numai ouă nefecundate, de regulă mai multe într-o celulă. Larvele de trântori care se dezvoltă din ouăle depuse în celulele de lucrătoare deformează celulele, iar albinele încearcă să le mărească spre partea superioară.
Apariția albinelor lucrătoarelor fertile duce la distrugerea coloniei.
Recomandări pentru prevenire și combatere
Se scutură ramele din stupul bezmetic la 59-60 m depărtare de vatra stupinei. După scuturare, lucrătoarele fertile nu mai pot reveni pe vechiul loc sau nu mai sunt lăsate să pătrundă în cuib. Dacă nu sunt eliminte, acestea vor omorî matca.
Pe locul coloniei bezmetice este pus un alt stup cu rame curate, cu o matcă fecundată sau cu rame cu puiet, cu ouă și cu rezerve minime de miere și păstură.
II.6.2.3 Regina trântoriță
Existența și buna dezvoltare a unei colonii depinde în mare parte de regină. Întrega colonie poate fi afectată sau chiar poate dispărea dacă regina rămâne nefecundată, dacă are defecte congenitale sau corporale, dacă este afectată de germeni infecțioși sau dacă condițiile de creștere au fost nefavorabile. Afecțiunea poate fi cauzată și de deprecierea materialului seminal sau de îmbătrânirea mătcii.
Recomandări pentru prevenire și combatere
Înlocuirea reginei sau desființarea coloniei
II.6.2.4 Roirea necontrolată
Factorii ajutători în declanșarea instinctului de roire sunt generați de lipsa culesurilor de mare intensitate și de supraaglomerarea stupului. Se ajunge la hrănirea disproporționată a puietului, un număr tot mai mare de albine tinere doici rămân inactive și își consumă propriul „lăptișor” (38). Procesele premergatoare roirii se exteriorizează prin inactivitate: apariția bărbilor, regina încetează ouatul și sunt construite botci. Roiul și evoluția sa ca tânăr organism este o expresie a coeziunei populației, reglată de mediatori biochimici și instinct. Roirea necontrolată se pare că este declanșată de tulburarea acestor mecanisme.
Tendința de roire, însoțită obligatoriu de indivizii sexuați, este un caracter ereditar. Când acest instinct un poate fi controlat, primul roi poate fi urmat de un altul secundar, apoi de altul terțiar, și tot așa până la epuizarea (desființarea) coloniei. Multe roiuri, fiind prea slabe ajung să se piardă. Roirea necontrolată diminuiază producția de miere. Unele colonii slab productive pot avea o înclinație deosebită pentru roire. Prinderea roiurilor naturale și folosirea acestora în producție influențează productivitata stupinei care poate scădea considerabil.
Recomandări pentru prevenire și combatere
Roirea naturală nu trebuie lăsată la voia întâmplării. Procesul natural de înmulțire a coloniilor de albine trebuie dirijat și controlat de apicultor în toate fazele de înmulțire artificială, începând cu dezvoltarea coloniei de albine, cu divizarea acesteia, cu asigurarea unei regine selecționate împerecheate și a cel puțin zece mii (1 Kg) de albine lucrătoare.
Dar există și colonii care nu roiesc (fenomenul de anecbalie). Apicultorul care nu dorește înmulțirea familiilor roitoare trebuie să selecționeze și să înmulțească artificial aceste colonii neroitoare (20,38).
II.6.2.5. Furtișagul
În toată perioada activă, dar mai ales în perioadele în care lipsește culesul de nectar și de polen, ajutate și de alți factori favorizanți (atacul altor dăunători), albinele au tendința de a jefui alte colonii de albine. Furtișagul se declanșează spre sfârșitul sezonului de cules, când albinele nu mai găsesc nectar în natură. O colonie slăbită din diferite motive este luată drept țintă.
Albinele își apără stupul în primul rând de coloniile vecine. Fiecare colonie are mirosul său propriu; acest miros permite albinelor să se recunoască. Intrarea în stup este apărată de albinele paznic. Dacă albinele paznic sunt foarte îngădiutoare față de culegătoarele rătăcite, care vin cu o încărcătură de nectar sau față de trântori, nu același lucru se întâmplă cu albinele hoațe.
Hoațele zboară intens în jurul stupului până seara tîrziu, chiar și pe timp nefavorabil. La început, ezită să intre pe urdiniș în stup, dar caută să pătrundă prin crăpături, pe sub capac sau prin alte locuri. Când nu reușesc, intră în luptă cu albinele care fac de pază la urdiniș. Odată înfrâtă apărarea, hoațele omoară albinele care au mai rămas și golesc stupul de conținut. La urdiniș și în fața stupului atacat se observă albine moarte cu abdomenul îndoit.
Furtișagul, când apare, se manifestă violent și poate distruge întreaga stupină (20).
Recomandări pentru prevenire și combatere
Supravegherea permanentă a stupinei esta esențială în prevenirea furtișagului. Coloniile aflate în involuție (slabe sau orfane) trebuiesc întărite, unificate sau desființate. Hrănirea albinelor trebuie să se facă numai seara târziu și cu grijă de a nu rămâne urme de sirop pe stup sau în jurul stupului. Eventualele urme se sterg cu o pânză umedă. Nu se lasă în stupină rame cu miere, făgurași, hranitoare sau vase cu resturi (urme) de miere.
Stupii trebuie să fie de calitate, fără crăpături sau locuri prin care pot trece albinele, iar coloniile să fie puternice, cu rezerve suficiente și fără semne de boală.
Urdinișurile se deschid numai după puterea coloniei de albine și se reduc la maximum în perioadele lipsite de cules. Rezerva de faguri, mierea și ceara se păstrează în locuri inaccesibile albinelor.
Niciodată stupii nu se țin prea mult decoperiți. În perioadele lipsite de cules coloniile sunt controlate numai atunci când este necesar și dacă se poate seara.
Pentru combaterea furtișagului colonia atacată trebuie închisă și mutată de pe locul ei (sau dusă într-o încăpere întunecoasă pentru 2-3 zile unde i se asigură apa necesară și aerisirea). În locul ei este bine să se aducă un stup gol pentru a descuraja hoațele să atace și stupii din jur.
II.6.2.6. Rătăcirea albinelor (deriva)
Afectează stupii din pavilioane sau stupii care sunt așezați prea apropiați sau prea simetric, cât și stupinile din pastoral, amplasate la distanțe prea mici unele față de altele sau cele care se află pe aceeași direcție de zbor.
Greșelile de orientare ale albinelor culegătoare golesc stupii sau, din contră, captează albina culegătoare străină, în funcție de poziția pe care o ocupă stupul, în cadrul stupinei. În general, stupii din mijlocul rândului se depopulează în favoarea celor de pe margine, dar nu este o regulă. Greșelile de orientare în perioade de lipsă de cules duc la lupte între colonii și de aici la furtișag.
Recomandări pentru prevenire și combaere
Deriva poate fi evitată prin așezarea stupilor în forme geometrice nesimetrice și la distanță unii față de ceilalți.
II.6.2.7. Bejenia
Pe măsură ce în celule cresc mai multe generații de albine, dimensiunile acestora se micșorează, iar fagurii din coloniile de albine, dacă nu sunt înlocuiți odată la cel mult doi ani, se învechesc. Micșorarea spațiului de creștere a larvelor, prin învechirea fagurilor din cuib, parazitozele (varrooza, în special), dăunătorii sau alte afecțiuni, determină colonia de albine să părăsească stupul. Părăsirea cuibului de către albine din instinct, este o caracteristică de spraviețuire a colonilor.
Diagnosticul se bazează pe observații clinice și pe investigații de laborator, ori de câte ori este necesar.
Recomandări pentru prevenire și combaere
Prevenirea se realizează prin menținerea echilibrului biologic al coloniilor de albine. Intervențiile tehnologice și terapeutice se vor realiza în funcție de necesități, respectându-se programul de prevenire și combatere a bolilor la albine.
II.6.2.8. Coloniile agresive
În fiecare stupină se întâlnesc colonii agresive, cu care este foarte dificil să se lucreze. Prezența acestora ne obligă la purtarea permanentă a echpamentului de protecție. La deschiderea stupului albinele atacă exploziv și de multe ori nici grosimea echipamntului nu protejează apicultorul de înțepături.
O agresivitate crescută a fost observată în cazul unor hibrizi între Apis mellifera scutellata (subspecie africană) și subspeciile europene A. mellifera ligustica (Italia) sau A. mellifera iberiensis (peninsula Iberică). Colonii de astfel de albine hibride au fost introduse în anii ʼ50 în America de Sud, dar roiuri sălbăticite s-au răspândit rapid până în America de Nord. Caracterul deosebit de agresiv al acestor hibrizi a condus inclusiv la decese, ceea ce le-a atras numele de „albine ucigașe”.
Recomandări pentru prevenire și combatere
Intervenția în colonia de albine trebuie facută cu mișcări sigure, fără lovituri, trepidații sau busculade. Trebuie să se țină cont de sezon și de condițiile atmosferice.
În cazul unor coloni agresive, înainte de intervenție li se schimibă locul iar pe fostul amplasament se aduce un stup gol. Albinele culegătoare se întorc pe vechiul amplasament. După organizare și orfanizare colonia agresivă se poate unifica sau poate primi o nouă regină.
II.6.3. Tehnopatiile
( Deficiențe ale tehnologiilor de întreținere și de exploatare)
II.6.3.1. Colonia de albine
Pentru a îngriji și exploata albinele în concordanță cu modul lor natural de dezvoltare, principala preocupare a apicultorului este menținerea echilibrului biologic al coloniei de albine.
Apicultorul trebuie să asigure în stup spațiu suficient pentru creșterea puietului și pentru depozitarea proviziilor de hrană.
Puterea biologică a coloniilor de albine este dată în primul rând de calitatea reginei (vârstă, aspect fizic, stare fiziologică, prolificitate și modul de depunere a pontei), Într-un stup coabitează zeci de mii de indivizi. Dacă regina e tânără și prolifică și menține echilibru biologic, colonia se dezvoltă frumos și avem și producție, în caz contrar, colonia devine un balast pentru stupina apicultorului.
Când o colonie de albine intră în involuție, trebuie examinată și stabilită cauza care a generat această stare. Existența familiilor de albine orfane, slabe, depopulate, incapabile să se apere de agresiune, cu urdinișuri larg deschise, cu crăpături sau cu organizarea necorespunzătoare a cuibului, constituie o predispoziție sau un semn de boală.
Cauzele care duc la involuție sunt fie o matcă necorespunzătoare (epuizată sau fecundată cu trântori înrudiți), fie faguri vechi, deformați sau atacați de molii, fie boli ale puietului (locă americană sau locă europeană, puiet văros, puiet pietrificat etc.), fie un atac puternic de paraziți (Varroa, Acarapis). Coloniie bolnave pot constitui într-o stupina sau într-un areal, surse potențiale de infecție.
De-a lungul timpului apicultorii cu experiență s-au adresat tuturor deținătorilor de stupi bolnavi (infectați ori murdari): “Curățați sau distrugeți pentru todeauna acești stupi întrucât sunt o sursă de pericol pentru albinele sănătoase și pot contamina toți stupii aflați în apropiere.” O colonie de albine în involuție (slabă, bolnavă) are un aspect deplorabil, depopulată, puiet neuniform, pete de diaree, pânze și larve de găselniță, atac de furnici, detritus și albine moarte pe fundul stupului, iar ultimile rezerve de miere, sunt jefuite, de regulă de albinele din cei mai puternici stupi.
Cuibul coloniei de albine oferă condiții optime de supraviețuire în stup a numeroși agenți infecțiosi și parazitari. Ramele rămase în stup de la un an la altul, pe lângă larve și ouă de Galeria, Braula, Acraea conțin în miere și în păstură spori ai bacteriei Paenibacillus larvae și de Nosema spp. Ramele negre păstrează între cămășile de năpârlire ale larvelor de albine, spori și hife de fungi. În cazul ascosferozei, larvele mumifiate și-au dovedit puterea de germinare chiar și după 15 ani.
Încercând să păstrăm aceste colonii, sau ramele negre și rezervele neconsumate pe timpul iernii, nu facem decat să ne distrugem propria stupină și să contaminăm și celelante stupine din jur. Dacă nu îndepărtăm sursele de infecție, reapariția unei infecții într-un efectiv contaminat anterior este constantă, iar boala se menține endemic în areal (15).
II.6.3.2. Puritatea genetică
Eficiența economică a unei stupine depinde mai mult de mediu (climă, resurse melifere) și de tehnologiile apicole folosite și mai puțin de pontențialul genetic al coloniei de albine. Nu am putut domestici albina. Subspeciile de albine sunt naturale, geografice, adaptate și productive în zona în care s-au format. Genomul albinei s-a adaptat ancestral la o diversitate botanică și la o anumită zonă climatică; dacă nu avem rezultate acum, trebuie să analizăm influența mediului care a fost schimbat și sărăcit de om (15).
În condițiile climatice din România, subspeciile întâlnite în mod natural sunt A. mellifera carnica în regiunea intracarpatică și A. mellifera macedonica în rest (27).
II.6.3.3. Hrănirile
Mediul inconjurator, schimbat artificial, are deficiențe în asigurarea cu hrană a coloniei de albine, iar necesitățile nutritive ale acesteia se schimbă, în funcție de evoluția sa, de la un sezon la altul. Orice scădere în aportul de hrană produce în colonie un dezechilibru biologic. În momentul de față coloniile de albine au șanse mici de supraviețuire, singure, în mediul natural. Dezechilibrele nutriționale apar datorită lipsei de nectar și de polen sau de prezența numai a polenului slab calitativ. De aceea, în hrănirile de stimulare sau de completare, trebuie să se țină cont și de cantitatea sau de calitatea polenului existent în natură.
Dezechilibrele nutriționale se traduc prin întreruperi în creșterea puietului și scurtarea duratei de viață a albinei lucrătoare.
Pentru echilibrarea aportului nutritiv se vor folosi, pe lângă hrana energetică, și înlocuitori de polen de bună calitate și cu valoare nutritivă cunoscută. Completarea rezervelor de hrană nu va fi făcută, pe cât posibil, cu polen și miere, provenită din propria stupină, deorece pot conține spori ai bacteriei Paenibacillus larvae, ai microsporidiului Nosema spp. și/sau spori ai speciei de fungi Ascosphaera apis. De asemenea, vor fi evitate și rezervele de miere și păstură provenite de la coloniile slabe sau de la cele care au murit în timpul iernii. Nu se va folosi miere veche sau fermentată deoarece poate conține reziduuri de fermentare și cantități mari de hidroximetilfurfurol, substanțe care sunt toxice pentru albine sau resturile din industria alimentară, care pot conține zaharuri dăunătoare. Vor fi evitate reciclarea, prin albine, a unor canități de miere compromisă, sau la alte practici dăunătoare, precum „hrănirea la jgheab” a albinelor.
Adjuvanții, biostimulatorii și suplimentele nutritive artificiale asigură productivitatea dar și supravițuirea coloniilor de albine în perioadele dificile ale anului (primăveri târzii și ploioase, secete prelungite, toamne timpurii, ierni atipice) și protecția familiilor de albine împotriva agenților infecțioși.
Asigurarea rezervelor de miere din toamnă și respectarea perioadei de biopauză este vitală în cazul iernilor capricioase. Stimulările în afara ciclului biologic (iarna, în perioada de biopauză) nu favorizează ponta reginei, dar diminuiază rezerva de vitelus a albinelor lucrătoare prin prelucrarea zaharurilor. Acestea, la iesirea din iarnă, mai ales în primăverile târzii, nu mai pot asigura cantitatea necesară de lătișor larvelor tinere, datorită reducerii rezervelor din corpul gras (15).
II.6.3.4. Igiena și decontaminarea în stupină
Aplicarea măsurilor de igienă și decontaminare în stupine trebuie făcută corespunzător situației existente în teren cu respectarea normelor sanitare veterinare. Cu ocazia reviziei de primăvară, este obligatorie o curățenie generală în stupină, operațiune ce presupune curățenia mecanică și îndepărtrarea tuturor resturile organice care se îngroapă sau se ard. Următoarea operațiune este trecerea coloniilor de albine în stupi curați și dezinfectați și îndepărtarea ramelor negre și a celor care mai au resturi de păstură sau de miere, ce nu au fost consumate pe timpul iernii.
Mierea și păstura se valorifică iar ceara obținută se topește. Ramele vechi și componentele care nu se mai pot repara se ard. De asemenea, se ard sau se îngropă detritusul și cadavrele de albine care sunt găsite pe fundul stupului.
În cazul notificării (declarării) unor boli, se impun de asemeni măsuri de igienă și decontaminare în stupine, specifice fiecărei entități morbide, măsuri stabilite pe baza unor strategii elaborate de autorități, pentru eradicarea bolii și pentru protecția și a altor colonii de albine din areal. Măsurile se recomandă să fie aplicate în jurul focarului de boală, pe zone cât mai întinse (13).
II.6.3.5. Stupul
Stupii sistematici (moderni) diferă de regulă prin volum și prin materialele din care sunt confecționați. Ceea ce este foarte important este asigurarea spațiului de circulație al albinelor de aproximativ 6-8 mm în interiorul stupului. În țara noastră, unde avem un climat temperat și ierni capricioase, spațiul de circulație al albinelor de deasupra ramelor este vital. Ghemul de iernare are tendința de a se deplasa pe timpul iernii în sus și lateral pe desupra ramelor. Blocarea acestui spațiu prin împachetare poate duce la pierderea coloniei de albine prin înfometare, deși există în stup rezerve suficiente de miere.
La stupii prevăzuti cu funduri solide din lemn și cu urdinișul inferior, în cazul blocării urdinișului din diferite motive, dioxidul de carbon provenit din respirația albinelor nu se mai poate elimina, iar colonia moare asfixiată. Pentru a evita aceste accidente există și varianta urdinișului superior.
Între componentele moderne ale stupului, se regăsesc fundurile prevăzute cu plasă și cu o tavă glisantă dedesupt (soclul sau fundul antivarroa), funduri apărute din necesitatea de a monitoriza infecția cu varroa. Acestea sunt o mare realizare în tehnologia apicolă. Folosind funduri de control nu numai că se observă evoluția și starea de sănătate a coloniei de albine, dar acestă practică asigură și menține în stup starea de igienă. Fundul antivarroa colectează acarienii căzuți sau îndepărtați de pe albine, reține larvele de insecte și toate resturile căzute din stup, favorizează eliminarea dioxidului de carbon în timpul iernii și asigură o bună ventilație în timpul iernii și în timpul transportului.
Recomandări
In funcție de producție și de parametrii tehnologici obținuti în fiecare stupină, trebuiesc facute investigații și analize pentru fiecare caz în parte. Analizele își pierd din conținut dacă nu există înregistrări în carnetul stupinei privind mișcarea materialui biologic și puterea de pontă a reginei, tratamentele efectuate și producțiile obținute, evoluția vremii, deplasările în pastoral și indicațiile cântarului de control etc.
II.6.4. Dăunătorii albinelor
Albina – sentinelă de mediu- supraviețuirea ei este în interdependență cu zona în care trăiește.
II.6.4.1. Clima
Atmosfera se încălzește, biodiversitatea este în declin, iar poluarea capătă dimensiuni inimaginabile. Marile exploatații agricole bazate pe profit, ignoră impactul devastator asupra mediului al noillor tehnolgii, bazate pe chimizare și moncultură. Fără biodiversitate natura nu mai poate asigura omului, calitativ și cantitativ, servicii optime precum polenizarea culturilor entomofile, păstrarea calității aerului și a apei, protecție împotriva inundațiilor, diminuarea eroziunii solului sau a deșertificării și nici echilibrul natural al speciilor în arealul în care omul acționează.
Tulburențele climatice și marile transformări economice și sociale generate de globalizare, de principiile economiei de piață și de salturile mari ale progresului științific, în diferite domenii, cât și declinul agriculturii tradiționale, în raport cu tehnologiile agricole moderne, nu întodeauna sunt prietenoase cu mediul și favorabile creșterii albinelor.
Putem să ignorăm realitatea, dar în același timp putem să devenim observatori ai naturii, să facem observații fenologice și de faună și să dispunem de o microstație meteo în zona unde avem instalată stupina (16).
Fauna și flora din areal pot acționa și în calitate de paraziți, prădători, dăunători, perturbatori, simbioți sau comensali. Realizarea echilibrului biologic în areal este vitală, noțiunea de dăunător trebuind înțeleasă doar în raport cu interesele economice ale omului
Dăunătorii și prădătorii acționează asupra albinelor în perioada activă și asupra coloniei în perioada de biopauză. Fagurii, stupii cu albine și rezervele de miere sunt atacate permanent.
Păsările sunt ajutoare prețioase în lupta împotriva insectelor dăunătoare. De aceea fauna și flora din areal trebuiesc protejate, cunoscând faptul că multe specii sunt pe cale de dispariție. Apicultura intensivă în momentul de față nu poate fi concepută fără deplasarea în pastoral. Cu toate acestea zonele și spațiul de deplasare pot crea probleme apicultorului din cauza lipsei unui regulament clar și nepărtinitor. Stupăritul pastoral de cele mai multe ori se constituie într-o aglomerare temporară de stupine cu status epidemiologic diferit și de aici până la atacul unor dăunători și prădători sau până la apariția unor focare de infecție nu este decât un pas. Nici transhumanța transfrontalieră în UE nu este reglementată.
Recomandări pentru protecție și combatere
În zona în care este amplasată stupina, cunoașterea diversității botanice și a florei dăunătoare este esențială pentru fiecare apicultor. Sunt descrise plante insectivore precum roua cerului ( Drosera rotundifolia), otrățelul de baltă (Utricularia vulgaris), aldovranda (Aldrovanda vesiculosa) dar și plante la care nectarul și polenul sunt toxice, precum piciorul cocoșului (Ranunculus repens) sau ciumăfaia (Datura stramonium), dar sunt considerate periculoase și genurile Rhododendron, Azalea, Kalmia, Andromeda, Pieris și Triptaleia (3, 20, 31).
În absența unor date certe privind toxicitatea nectarului anumitor specii vegetale, principala măsură de profilaxie este evitarea amplasării stupilor în zonele în care plantele considerate toxice sunt larg răspândite, fie în flora spontană, fie ca plante cultivate.
Vatra stupinei se organizază pe un teren uscat, ferită de curenți și de vânturi predominante și dacă se poate, este bine să fie împrejmuită. Măsuri de protecție deosebite se impun în cazul vetrelor din pădure.
Amplasarea stupinelor în zone nesigure sau puțin cunoscute poate duce în cazul unor turbulențe meteorologice neprăvăzute, la pierderea acestora din cauza inundațiilor, alunecărilor de teren sau a atacului unor dăunători. Se vor evita amplasările stupinelor în zone industriale sau intens poluate (autostrăzi), lângă ferme mari de animale, lângă fabrici de zahăr sau de produse zaharoase. În aceste zone se pierd albine sau sunt contaminate produsele stupului cu reziduuri.
II.6.4.2. Insecte dăunătoare
II.6.4.2.1. Ordinul Lepidoptera
II.6.4.2.1.1. Moliile cerii (găselnița)
Molia mare (Galleria melonella Fabricius, 1798) (36, 14);
Molia mică (Achroea grisella Fabricius, 1794) (36, 14);
Molia de făină mediteraneană (Ephestia kuehniella Zeller, 1879) (46).
Moliile dăunătoare albinelor fac parte din ordinul Lepidoptera, familia Pyralidae. Aceste insecte se întâlnesc în stup sub formă de ou, larvă și nimfă. Galleria melonella (molia mare) depune în medie 700 de ouă iar Achroia grisella (molia mică) depune în jur de 200-300 de ouă. La Galleria melonella, femela măsoară circa 13 mm (9-17mm), masculul este mai mic și măsoară maximum 15 mm. La Achroea grisella, femela măsoară 8mm (7-11 mm).
Dezvoltarea de la ou la fluture depinde mult de tempertura mediului ambiant (50 de zile la 27 ș C și 140 de zile la 20 ș C. În cursul verilor căduroase pot să apară până la 8 generații. În condiții favorabile de temperatură (30-40 șC) ciclul complet de dezvoltare al moliei mari este de circa 44 de zile. Peste iarnă molia nu rezistă ca adult. Molia mică are, la o temperatură asemănătoare, o perioadă de dezvoltare mult mai lungă (145 zile la 29ș C).
Ciclul biologic al moliilor este asemănător. După fecundare, noaptea (din mai până în septembrie), femela, pătrunde în stup sau în încăperile (dulapuri, lăzi) unde sunt păstrați fagurii de rezervă și depune ouăle cu – ,,ovipozitorul "- ei lung, de regulă în locuri greu acesibile pentru albine.
Larva după ecloziune își țese un giulgiu mătăsos unde nu poate fi atacată, iar capul chitinos care a rămas afară nu poate fi înțepat. Pe măsură ce crește, larva înaintează în fagure, făcâdu-și galerii pe care le lărgește și le tapetează cu pâslă. Ajunsă la maturitate încetează hrănirea și se transformă în crisalidă. Nimfa (pupa sau crisalida) este învelită în cocon sau gogoașă. Gogoașa este lipită și chiar adâncită în lemn datorită unei secreții a larvelor care descompune celuloza. Fluturii care eclozează părăsesc stupul, de regulă, noaptea (36, 14).
Supraviețuirea pe timpul iernii în colonia de albine și în depozite este posibilă sub formă de ou sau larvă la Achroia și de ou, larvă sau pupă la Galleria. Rezistența moliilor pe timpul iernii este foarte slabă. La 0°C larva, nimfa și insecta adultă mor în 12 ore. La temperatura de –9°C insecta moare în toate stadiile de dezvoltare după 2 ore iar la –15°C moartea se produce după 45 de minute.
Larvele moliilor atacă diferite produse vegetale sau animale (făină, cereale, viță de vie, tutun, lână, ceară etc.). În stupi, larvele se hrănesc cu substanțe organice din părțile neceroase ale fagurilor și cu polen (36, 14).
Atacul acestor dăunători asupra coloniei de albine este distrugător, iar pierderile atât de mari încât manifestările patologice au fost considerate boală și au fost desemnate de Ogradă (1986) sub denumirea de – galerioză. Molia poate să distrugă în câteva săptămâni conținutul unui stup abandonat sau ale cărui albine nu se pot apăra. În plus moliile constituie și un mijloc de răspândire a virusurilor, bacteriilor, fungilor sau paraziților, atât în stup cât și de la o familie la alta.
Distrugerile suferite pot varia foarte mult în funcție de intensitatea atacului și de puterea coloniei de albine atacate, de la semne discrete de puiet tubulos, sau de zone limitate cu puiet parțial căpăcit, și/sau cu puiet care nu poate să eclozeze, până la faguri distruși, străbătuți de galerii pline cu larve de diferite dimensiuni, împâsliți cu urzeli și pline de coconi.
Atacul găselniței în cuib începe asupra fagurilor laterali, neacoperiți cu albine și se termină cu cei din cuib, unde parazitul își construiește galerii pe sub puietul căpăcit. În final fagurele este distrus în totalitate, fiind transformat într-un fel de pâslă. Familia de albine luptă greu cu puzderia de omizi care atacă fagurii și puietul, nu poate evacua puietul mort și în final este distrusă încetul cu încetul (36, 14).
Găselnița este dăunătoare numai în stadiul larvar, când pătrunde în faguri și sapă galerii, distrugând celulele, consumând păstură, cămășile nimfale și resturi de puiet de albină. Când galeria se află între fundul celulei și puietul de albine, acesta în funcție de vârstă, este afectat prin iritare, când larvele se retrag către partea externă a celulelor, celulele fiind prelungite „în tub” de către albine în scopul de a creea spațiu pentru puiet; -prin înconjurarea cu o mătase fină de către larva dăunătorului, -puietul este împiedicat să iasă din celule de către firele de mătase. Celulele sunt parțial căpăcite iar albinele care încearcă să eclozeze sunt de regulă malformate. În celule se găsesc excremente caracteristice pentru molia de ceară. Excrețiile larvelor pot compromite sau intoxica puietul. De cele mai multe ori larvele sau nimfele mor și pot fi confundate ca puiet atacat de o boală infecțioasă (36, 14).
Diagnostic diferențial
Diagnosticul diferențial trebuie făcut față de larvele gândacului mic de stup (Aethina tumida). Larva de molie (omida) eclozează după circa 10 zile, este de culoare alb gălbuie, capul este brun, are 3 perechi de picioare toracice și 4 perechi de picioare abdominale false.Pe măsură ce larvele cresc consumă din pereții fagurelui și construiesc galerii pe care le tapetează pentru protecție cu o țesătură fină mătăsoasă. Perioada larvară durează circa 30 de zile, după care se împupează, fie în fagure fie în nișele stupului (14, 36).
Recomandări pentru protecție și combatere
a) În familiile de albine
Pentru prevenirea găselniței se recomandă întreținerea unor familii puternice, cu hrană suficientă și de bună calitate, iar cuibul să fie strâmtorat în așa fel încât toți fagurii să fie acoperiți cu albine și cu urdinișul micșorat. De asemenea, este necesară curățirea periodică a stupilor de resturile acumulate pe fund și care nu pot fi îndepărtate de albine.
b) În depozitele cu faguri de rezervă
Încăperile în care sunt depozitați fagurii se curăță și se decontaminează anual. Se pot folosi și capcane lipicioase antimolie aflate în comerț. Ferestrele vor fi prevăzute cu site cu ochiuri mai mici de 1 mm. Dulapurile în care se păstrează fagurii, trebuie să permită circulatia aerului, dar să asigure și o etanșietate perfecă cu ajutorul sitelor. Reformarea anuală a fagurilor vechi purtători de germeni patogeni și de ouă de găselniță este necesară. Fagurii din depozit care conțin miere și sunt infestați cu ouă de găselniță nu vor fi introduși în coloniile mai slabe care necesită stimulare.
Prevenirea apariției găselniței și distrugerea acesteia în fagurii din depozitul stupinei se face prin tratarea acestora cu bioxid de sulf în spații ermetic închise. Bioxidul de sulf poate fi eliberat prin ardere (¼ baton pentru un corp de stup/50 g sulf pentru un metru cub de spațiu), prin evaporarea soluției lichide sau prin folosirea recipientelor sub presiune (5 g bioxid de suf pentru un corp). Deoarece bioxidul de sulf nu omoară ouăle, tratamentul trebuie repetat la fiecare 2-3 săptămâni (14).
Se poate folosi și acidul acetic glacial (mai puțin recomandat) 2-3ml/1000cmc în spații închise ermetic. Dacă tratamentul se face în toamnă fagurii pot fi lăsați asfel până în primăvară. Înainte de folosire se țin 2 zile la aer. Acidul acetic distruge și sporii de Nosema spp.
Alte substanțe chimice folosite în trecut ( naftalina, sulfura de carbon, bromura de metil, paradiclorbenzenul etc.) nu mai sunt de actualitate din cauza rezidurilor și a pericolelor pentru sănatatea omului.
c) În stupină
Se folosesc capcane luminoase pentru atragerea adulților și capcane cu clei și cu atractanți pentru capturarea acestora. Aparatele electrice antiinsecte care acționează prin lumină ultravioletă și electrocutare pot fi încercate (moliile sunt fluturi de noapte) ca un mijloc de combatere nepoluant, dar nu sunt recomandate deoarece distrug și multe alte specii inofensive de fluturi, precum și alte insecte nocturne.
d) În coloniile de albine atacate
Stupii care au găselniță se controlează frecvent. Se îndepărtează fagurii puternic atacați iar la ceilalți se deschid galeriile cu un instrument ascuțit și se distrug larvele pentru a permite albinelor efectuarea operațiunilor de curățire și de refacere a celulelor deteriorate. Se îndepărtează manual larvele, pânzele și gogoșile parazitului. O colonie atacată de găselniță nu poate fi apărată efectiv ci numai ajutată (14).
Combaterea biologică
Studii privitoare la combaterea biologică a moliei cerii s-au făcut folosind germeni sporulați de Bacillus thuringensis și Bacillus cereus (produsele se găsesc pe piață). Metoda microbiologică are o acțiune specifică și se bazează pe faptul că microorganismele patogene pentru unele specii de insecte (în special larve de fluturi) sunt inofensive pentru oameni, animalele domestice și albine. Bacillus thuringensis și Bacillus cereus pot ucide larvele și moliile cerii adulte. Pentru tratament, fagurii sunt stropiți individual cu o soluție apoasă conținând spori bacterieni. Sporii pot rămâne viabili în fagurele artificial peste 18 luni și protejează familia de albine de atacul găselniței. Tratamentul este relativ laborios și costisitor, dar aplicându-se corect – mai ales în depozitele de păstrare – dezvoltarea moliilor este inhibată cel puțin un sezon apicol (8 luni).
Larvele de găselniță pot fi distruse și de alte insecte (ca de exemplu mica viespe parazitoidă Dibrachys cavus) dar metodele nu sunt încă bine puse la punct și standardizate (14, 35).
II.6.4.2.1.2. Fluturile cap de mort (Acherontia atropos Linnaeus, 1758)
Acherontia atropos este un fluture de noapte, activ din amurg până la miezul nopții, fiind atras de lumină. Ouăle le depune în afara stupului pe diferite plante. Larvele se hrănesc cu solanacee iar împuparea de face în sol. Adultul pătrunde ocazional în stup atras de mirosul mierii. Pagubele sunt mici deoarece este omorât și devorat de albine. Nu cantitatea de miere pe care o consumă contează ci neliniștea și deranjul pe care îl produce în colonie, fiind un fluture de talie mare. Atacă de regulă stupii slabi și bolnavi și poate răspândi germeni infecțioși de la coloniile bolnave la cele sănătoase.
Recomandări pentru protecție și combatere
Prevenirea atacului se poate realiza prin instalarea gratiilor de protecție la urdiniș.
II.6.4.3. Ordinul Diptera (muște)
II.6.4.3.1. Musca vivipară (Senotainia tricuspis Meigen, 1838)
Senotainoza, este o miază a albinelor melifere care are drept agent cauzal o insectă din ordinul Diptera, familia Sarcophagidae specia Senotainia tricuspis. Musca este ușor de identificat prin prezența ei pe capacul stupului, este de culoare cenușie și are 6-8 mm lungime. Se diferențiază de musca domestică prin forma triunghiulară a capului și prin benzile albe din jurul ochilor.
Speciile genului Senotainia folosesc albina meliferă, bondarii și albinele sălbatice drept gazdă pentru formele sale larvare. Această specie este răspândită din Portugalia până în Rusia. Apimiaza (senotainoza) a fost descrisă și în țara noastră de Popa (1965), Ogradă (1986) etc.
Larva este depusă pe torace, perforează chitina și pătrunde în circa 20 de minute în hemocel unde, timp de 3-4 zile, se hrănește cu hemolimfă (L1-larvă de stadiul unu), urmează atacul asupra musculaturii toracice (L2), după care trece în abdomen. După moartea abinei își continuă dezvoltarea (L3), consumând țesuturile gazdei aflate în descompunere. După cele trei stadii larva ajunge cel puțin la 8-9 mm lungime, părăsește corpul albinei și pătrunde în sol pentru a năpârli și a-și continua metamorfoza. În verile călduroase pot să apară câteva generații. Un ciclu de dezvoltare a unei generații are o durată de 18 – 35 de zile și depinde de temperatura mediului exterior și de starea fiziologică a gazdei. Afecțiunea este mai gravă atunci când în areal există mai multe specii de muște vivipare.
Pe timpul iernii larvele intră în diapauză și rămân în sol până în primele zile însorite de primăvară când se împupează și apoi se transformă în adult.
Senotainia tricuspis este o muscă vivipară prezentă în stupină din mai până în octombrie. În zilele însorite și foarte călduroase de vară (iulie, august), muștele pândesc pe capacul stupului și la 6-10 secunde, atacă la urdiniș și depun larve (600-700 larve), pe albinele lucrătoare, pe trântorii și chiar pe tinerele regine ieșite sau întoarse de la zborul de împerechere. Pe timp rece și ploios posibilitățile de contaminare sunt reduse.
Albinele spoliate de hemolimfă sunt în incapacitate de a închide aripile în repaus, sunt incapabile de a zbura, au abdomenul umflat, prezintă mișcări de respirație accelerate, se târăsc în fața stupului sau prezintă și alte simptome mai puțin caracteristice urmate de moarte. Albinele culegătoare se debilitează, își pierd capacitatea de zbor și familiile se depopulează rapid. Uneori, la albinele moarte se pot observa trepidații ale abdomenului, datorate mișcărilor pe care le fac larvele parazite din organismul lor în căutarea hranei. Majoritatea albinelor infestate pot muri și în afara stupului în drum spre sursele melifere. Albinele moarte sunt golite de conținut. Colonia intră în involuție, se depopulează și cade ușor pradă furtișagului.
Evoluția bolii în stupine depinde de numărul muștelor a căror dezvoltare este influențată de condițiile climatice din zonă, de sursele de hrană și de condițiile prielnice de dezvoltare. În stupinele puternic atacate și de alte boli, muștele depun larvele și pe cadavre, iar metamorfoza se continuă în stup.
Diagnostic
Diagnosticul se stabilește prin disecția sub lupă a albinelor moarte sau muribunde recoltate din fața stupului. De regulă se pun în evidență larvele în diferite stadii de dezvoltare cu dimensiuni de la câțva milimetri până la aproape 1 cm. În stadiul al treilea larvar (L3) corpul poate ajunge până la 14-15 mm lungime și 3mm diametru.
Specia larvei parazite se poate determina pe baza caracterelor morfologice ale adultului, mai precis prin introducerea acesteia într-un vas cu pământ umezit la tempertaură constantă până când ies muștele adulte (30).
Recomandări pentru protecție și combatere
În stupinile staționare, vatra trebuie bine intreținută din punct de vedere agrotehnic și eventual betonată. Se mai pot folosi, pe capac, capcane speciale pentru insecte având ca atractanți substanțe organice în descompunere, diferite tipuri de benzi de culoare albă (muștele prezintă cromotropism pozitiv pentru alb) prevazute cu substanțe adezive sau impregnate cu insecticide.
Pierderile sunt mai mari în arealele aglomerate și în stupinele exploatate staționar. Prin cosumarea de către larvă a conținutului intern musca poate fi și vector pasiv pentru spori și virusuri (38, 28).
II.6.4.3.2. Infestația cu Braula coeca
Braula caeca (Nitzsch,1818) sau păduchele albinelor (de fapt este o muscă) face parte din ordinul Diptera familia Braulidae. Este o insectă ovipară, fără aripi și cu ochii reduși la o singură omatidie.
Ciclul de dezvoltare al insectei se desfășoară independent de cel al albinelor și un număr mare de ouă, larve și nimfe supraviețuiesc în perioada de iernare în galeriile săpate în ramele cu rezerve din stup. La capătul galeriilor larvele se metamorfozează în pupa caracteristică muștelor. Transformarea în nimfe și adulți se realizează în stup. Întregul ciclu durează 18-21 de zile. Toamna întâlnim pe albine cel mai mare număr de paraziți dispuși pe torace, în special pe regină, pe care o pot sufoca.
Braula coeca consumă hrana albinelor fără să le producă leziuni. Braula caeca se hrănește prin intermediul trompei gazdei, provocând albinelor reflexul de regurgitare (scoaterea din gușă a unei picături de miere), excitând prin prima pereche de picioare aparatul bucal al albinei (buza superioară). Când sunt pe corpul mătcii, în momentul hrănirii acesteia de către albinele doici, Braula coeca profită și se hrănește furându-le lăptișorul de matcă (45).
Produce pagube, deoarece consumă o parte din hrana reginei, produce neliniște sau chiar iritare și poate cauza uneori moartea reginei ca urmare a împiedicării hrănirii și activității acasteia (30).
Epidemiologie
Transmiterea se realizazeză foatre ușor în interiorul stupului, prin trecerea parazitului de la o albină la alta, iar de la o colonie la alta cu ajutorul trântorilor, a albinelor hoațe, a mutării fagurilor cu puiet și miere dintr-un stup în altul, prin unificarea colonilor, prin roire etc.
Paraztul Braula caeca este periculos în interiorul ghemului de iernare, când matca este puternic deranjată. Parazitul irită matca și în perioada activă.
Diagnostic
Diagnosticul se stabilește prin examen clinic, dar nu trebuie confundat cu acarianul Varroa destructor. Pentru evidențierea parazitului se examinează cu lupa fagurele pe fața internă a căpăcelelor (după descăpăcire), precum și resturile de ceară și propolis.
Recomandări pentru protecție și combatere
Combaterea braulozei se bazează pe distrugerea parazitului cu aceleași tehnici cu care se acționează și împotriva acarienilor Varroa și Acarapis. Pentru îndepărtarea paraziților de pe matcă se poate utiliza și fumul de țigară. Pentru aceasta matca se introduce într-un pahar, după care se dau peste ea câteva fumuri de țigară și se ține palma câteva secunde pentru a asigura o oarecare etanșeitate. La scurt timp se poate observa căderea paraziților pe fundul paharului.
O altă modalitate de combatere a paraziților, constă în ungerea mătcii cu miere și pulverizarea, pe toată suprafața ramelor ocupate de albine, de sirop de miere cu apă. Albinele, folosind instinctul de autocurățire, dau jos paraziții care cad pe fundul stupului. Pentru a împiedica urcarea lor din nou pe albine, se foloseste fundul antivarroua.
Numai în caz de nevoie asupra parazitului Braula caeca se poate încerca camphorul și timolul, Tratamentele antiparazitare trebuiesc făcute înainte de formarea ghemului de iernare.
Limitarea extinderii și difuzării dipterului se realizează prin descăpăcirea fagurilor cu provizii și prin îndepărtarea din stup primăvara a fagurilor cu miere și păstură neconsumați (10).
II.6.4.3.3. Infestația cu Apocephalus borealis
Apocephalus borealis Brues, 1924, este o musculiță (ordinul Diptera, familia Phoridae) de mici dimensiuni (0,5 mm), nativă în America de Nord, care depune cu ajutorul ovipozitorului pe abdomen sau în interiorul abdomenului albinei ouă, din care în aproximativ o săptămână ies larve. Acest dăunător a fost observat în SUA, afectând inițial bondarii și viespiile dar s-a extins și la albinele melifere. Este numită și musculița decapitantă, deoarece larvele părăsec albina parazitată pe la nivelul gâtului albinei ceea ce duce la decapitarea albinei parazitate. După dezvoltarea completă își omoară gazdele și sunt posibili vectori ai unor agenți patogeni responsabili de CCD.
Albinele afectate își pierd capacitatea de a zbura și de a se deplasa., Acestea, de regulă, părăsesc stupii pe timpul nopții (29).
Supravegherea sanitară veterinară
Se pot instala capcane pentru a identifica o eventuală pătrundere pe teritoriul țării noastre a musculiței decapitante. Pe timpul nopții se pot folosi capcane luminoase pentru a captura albinele vii parazitate care manifestă tulburări de comportament.
Recomandări pentru protecție și combatere
Pentru protecție și pentru combaterea miazelor se recomandă măsuri drastice de igiena pe vatra stupinei. Deoarece acest dăunător nu a fost semnalat pe teritoriul nostru orice suspiciune trebuie sesizată autorității sanitare veterinare.
II.6.4.4. Ordinul Coleoptera (Gândaci)
II.6.4.4.1. Gândacul mic de stup (Aethina tumida)
Aethina tumida Murray, 1867 (familia Nitidulidae),gândacul mic de stup este un dăunător originar din regiunea sub-sahariană a Africii care s-a extins și pe alte continente. Provoacă pierderi importante stupinelor prin consumul de miere și polen și prin deteriorarea ramelor din stup. Gândacul se adaptează foarte ușor la diferite condiții climatice, mai ales în zona temperată. A pătruns deja în Europa și este posibil să pătrundă și în țara noastră.
Etiopatogenie
Gândacul mic de stup este un coleopter, având deci metamorfoză completă (ou, larvă, pupă, adult). Femela după împerechere, pătrunde în colonia de albine și depune ouă în diferite locuri din stup (crăpături, rame și chiar în celule capăcite cu puiet). După eclozare larvele se hrănesc cu miere păstură și puiet. Larvele își construiesc tunele prin fagurii cu puiet, cu miere și păstură unde se hrănesc și defecă producând mierii modificări de culoare, de gust și de miros. Mierea fermentează iar infestația larvară este asociată cu mirosul de portocală în descompunere. Perioada larvară durează aproximativ 10-14 zile (în funcție de temperaură și hrană) după care larvele părăsesc stupul pentru împupare în sol.
Din pupe apar adulții care părăsesc solul și pot să zboare pe distanțe mari pentru a se împerechea și a găsi noi colonii de albine. Gândacii adulți și-au dezvoltat capacitatea de a stimula cu antenele lor segmente bucale ale albinelor lucrătoare, similar cu stimulările efectuate de trântori, pentru a fi hrăniți și astfel supraviețuiesc în stup perioade mari de timp.
Parazitarea coloniei determină, printre altele, stoparea pontei reginei și părăsirea stupului de către albine.
Diagnostic
Galeriile săpate în interiorul ramelor, puietul distrus parțial sau total, modificarea culorii, mirosului și gustului mierii pot fi indicii de suspiciune pentru atacul gândacului mic de stup.
Diagnosticul presupune identificarea gîndacilor adulți după caracterele lor morfologice și identificarea larvelor și diferențierea lor față de larvele de găselniță care nu au spini dorsali. Sunt observate ouăle, alb sidefii, de mici dimensiuni, depuse în grămezi.
Adulții pot fi confundați și cu alte coleoptere cum este gândacul de polen (Cichramus luteus), care face parte din entomofauna sălbatică a țării noastre și care a fost de asemenea ocazional asociat cu coloniile de albine (39, 7, 8, 29).
Recomandări pentru protecție și combatere
Începând din luna mai până în septembrie se pot introduce capcane speciale pe fundul stupului pentru a putea captura gândacul și alte insecte. În țările unde se semnalează pentru prima dată, eradicarea este posibilă numai prin congelarea inventarului apicol. sau distrugerea stupilor infestați și arderea acestora (7).
În cazul când eradicarea nu este posibilă, congelarea ramelor cu miere și păstură timp de 12 ore pentru distrugerea larvelor și ouălor parazitului poate fi o soluție de limitare a pagubelor (7). Menținerea în stupină a unei igene desăvârșite este esențială.
Combaterea biologică se poate realiza cu ajutorul unor nematode entomopatogene (Heterorhabditis indica și Steinernema riobrave) care acționează în sol și împiedică metamorfoza larvelor în pupă (35).
Profilaxia se referă la interzicerea introducerii în stupină a materialului biologic (regine,roiuri, colonii de albine), indiferent de proveniență, fără documente emise de autoritatea competentă, care să ateste starea de sănătate a acestui material.
Deoarece acest dăunător nu a fost semnalat pe teritoriul României, orice suspiciune trebuie sesizată autorității sanitare veterinare.
II.6.4.4.2. Gâdacul (lupul) albinelor (Trichodes apiarius)
Trichodes apiarius (Linnaeus, 1758) (familia Cleridae) este un coleopter frumos colorant cu zone negre albăstrui și roșii, lung de 10 – 16 mm, care trăiește ca adult în natură, iar ca larvă în stupi. Larva se hrănește cu albine moarte sau își croiește galerii în ramele cu puiet unde se hrănește cu larve și pupe. Iernează ca larvă în coloniile sălbatice și în detritusurile din stupii neîngrijiți și slabi. Prezent în stupine în perioada interbelică , acum este ținut sub control prin tehnologiile moderne (32).
Recomandări pentru protecție și combatere
Pentru protecție și pentru combatere se recomandă măsuri drastice de igienă pe vatra stupinei.
II.6.4.4.3. Meloidele (triungulini)
Meloe proscarabaeus Linnaeus, 1758;
Meloe variegatus Donovan, 1793.
Triungulinoza este o boală de invazie, specifică insectelor polenizatoare. Agentul cauzal este reprezentat de larvele a două insecte din ordinul Coleoptera, familia Meloidae, genul Meloe.
Larvele de Meloe proscarabaeus sunt mai mici, de culoare galbenă și cu extremitatea anterioră a corpului rotundă. Biologia ei este mai puțin cunoscută și pare că nu perforează învelișul extern al albinelor. Trăiesc pe suprafața corpului albinelor ca și Braula coeca.
Larvele de Meloe variegatus contuzionează țesuturile, consumă hemolimfa și cauzează moartea albinei infestate, în timp ce Meloe proscarabaeus produce neliniște albinelor, asemănătoare cu cea provocată de Braula coeca (30)
Epidemiologie
Sursele de contaminare ale albinelor cu Meloe variegatus și Meloe proscarabaeus sunt masivele melifere din anumite zone unde se găsesc aceste insecte în stare adultă și larvară. Se pare că albinele reprezintă doar o gazdă ocazională pentru aceste insecte, neasigurând dezvoltarea completă a ciclului evolutiv (30).
La albina meliferă boala se manifestă prin neliniște, mișcări dezordonate, abdomen mărit și moarte. Pagubele se produc atât prin depopulare cât și prin distrugerea fagurilor cu puiet și a rezervelor de miere și păstură.
Sursele de contaminare sunt prezente, de regulă, în bazine melifere unde se fac deplasări în pastoral și unde insectele se găsesc atât în stare adultă cât și larvară și unde sunt condiții prielnice de mediu pentru întregul ciclu de dezvoltare.
Adulții fitofagi, se întâlnesc frecvent în areale naturale (păduri, pășuni, fânețe), sunt inofensivi pentru albine și sunt cunoscuți sub numele de mamornic ( gândac puturos, clăbuc), deorece la atingere emană o secreție gălbuie, lipicioasă, vezicantă și urât mirositoare.
Femelele depun ouăle în pământ din care ies ,,triungulini”, larve de culoare castanie, foarte agile, cu trei perechi de picioare prevăzute cu trei ghiare(de unde derivă și numele), care se urcă pe florile plantelor unde atacă albinele venite la cules. Triungulinii când atacă albina adultă, perforează tegumentul și se hrănesc cu hemolimfă. Dacă pătrund în stup, larvele de Meloe se hrănesc cu ouăle, puietul, apoi cu mierea și păstura din celulele fagurilor, după care părăsesc stupul și își continuă metamorfoza în pământ sub formă de nimfă (30).
Boala se recunoaște prin aceea că apar albine bolnave în fața stupului, cu mișcări convulsive, necoordonate și care își frecă corpul cu membrele pentru a îndepărta parazitul. Privite cu atenție se pot observa între tergite larvele de Meloe spp.
Diagnostic
Diagnosticul se stabilește pe baza simptomelor și a triungulinelor prezenți pe corpul albinelor infestate (30).
Recomandări pentru protecție și combatere
Larvele de Meloe atacă în special albinele solitare, iar măsurile de prevenire și combatere au un caracter general, sunt dificile și greu de aplicat. Rar se ajunge la o invazie atât de mare încât apicultorul trebuie să intervină. Dacă infestația este puternică trebuie schimbat locul stupinei. Cu o igienă bună a vetrelor de stupină și cu o dezvoltare corespunzătoare a coloniilor de albine această specie nu va putea deveni niciodată o problemă (26).
II.6.4.5. Ordinul Hymenoptera
II.6.4.5.1. Viespi sociale (familia Vespidae)
Etiopatogenie
Din familia Vespidae, în Europa își au habitatul 11 specii. Mai importante sunt genurile Vespa, Vespula și Dolichovespula, iar dintre specii, mai cunoscute sunt Vespa crabro, Vespula germanica, Vespula vulgaris sau Vespa velutina nigrithorax.
Viespile sunt insecte care în unii ani și în anumite împrejurări pot produce daune importante coloniilor de albine. Ele trăiesc în colonii adăpostite în scorburile copacilor, în pământ sau în șoproane, poduri, streșini sau chiar în capacul stupului.
Coloniile de viespi au un ciclu anual, iar noile regine împerechiate hibernează pe durata iernii, adăpostindu-se sub frunziș sau alte materiale izolante.
Gărgăunii (Vespa crabro, Linnaeus, 1758) este cea mai dăunătoare dintre viespi deoarece pândește albinele la urdiniș, le dezmembrează și le consumă în cuib, împreună cu larvele lor.
Viespea asiatică (Vespa velutina nigrithorax, du Buysson, 1905), este o specie invazivă, care a apărut în Franța, în anul 2004, împreună cu un import de ceramică din Asia. Deoarece acest dăunător nu a fost semnalat pe teritoriul nostru suspiciunile trebuiesc anunțate autorității sanitare veterinare.
Recomandări pentru protecție și combatere
Cea mai bună metodă de apărare împotriva viespilor sunt coloniile puternice și luarea unor măsuri de protecție în timpul hrănirii sau verificării coloniilor.
Se pot folosi capcane specifice pentru viespi și eventual schimbarea amplasamentul stupinei, precum și micșorarea intrării la urdiniș.
Distrugerea cuiburilor de viespi, aflate în natură, este costisitoare, iar pentru păstrarea biodiversității este nerecomandată (44)
II.6.4.5.2. Furnicile (familia Formicidae)
Furnicile sunt insecte sociale care se acomodează ușor în diferite zone. Furnicile nu fac prea mult rău coloniilor de albine dar le neliniștesc. Se pot strecura ușor în stupi până la fagurii cu miere, de unde fură mierea, distrug puietul și atacă lemnul stupului
Odată intrate în stup, albinele nu pot să lupte cu ele. La noi în țară nu avem specii de furnici primejdioase pentru coloniile de albine ca în alte părți ale lumii.
II.6.4.5.3. Mutilidele (familia Mutillidae)
Mutilidele (Mutilla europaea, Linnaeus, 1758) datorită înfățișări lor (fără aripi) poartă mai multe denumiri: furnicile albine, furnicile viespi, furnicile păianjen. Femelele se înmulțesc în cuiburile de bondari, iar când nu-și găsesc adăpostul consacrat, pătrund în cuiburile de albine unde produc daune. Pentru a se hrăni mutilidele le cuprind pe albine până varsă conținutul gușii cu miere, după care albinele mor.
Recomandări pentru protecție și combatere.
Dacă furnicile devin incomode într-o stupină, trebiue luate măsuri de protecție. În pădure, stupinile nu trebuie amplasate în apropierea mușuroaielor de furnici.
Combaterea se realizează prin menținerea stupilor pe suporți și prin întreținerea în condiții igenice a vetrelor de stupină. Se pot folosi în jurul stupului sau sub capac frunze de pelin sau frunze proaspete de nuc negru ca formifuge.
II.6.4.5.4. Lupul albinelor (Philanthus triangulum).
Philanthus triangulum (Fabricius, 1775) (Hymenoptera: Crabronidae) se aseamănă cu viespiile sociale, dar este o insectă solitară, mult mai mare (12-16 mm lungime). Își construiește cuibul în pământ și sapă multe galerii în care se va dezvolta ponta. Atacă albinele la urdiniș, în zbor și pe flori. Pe unele le mănâncă iar cu altele își hrănește larvele din cuib.
Recomandări pentru protecție și combatere
Combaterea se realizează prin folosirea unor colonii puternice și a unor capcane specifice (31).
II.6.4.6. Acarienii
În afară de speciile care atacă și parazitează albinele vii și puietul acestora, se cunosc zeci de specii de acarieni care găsesc în stup un mediu favorabil de dezvoltare și folosesc pentru nutriție resturile organice din stup. Pot fi identificați foarte greu doarece unii sunt așa de mici încât nu pot fi văzuți cu ochiul liber. Prezența lor se suspectează atunci când fagurii coloniei de albine par a fi acoperiți cu un praf fin gălbui. Acarienii de polen trăiesc în coloniile de albine fără să producă pagube, Pagubele se produc doar atunci când albinele nu pot curăța fagurii.
Recomandări pentru protecție și combatere
Combaterea se realizează prin menținerea în stupină a unor colonii puternice (5, 11).
II.6.4.7. Nematodele
În organismul albinelor, dar și a altor insecte (viespi) au fost găsiți și viermi cilindrici (Mermis spp., Parachododes spp.). Viermii sunt preluați de albine odată cu apa, pătrund prin peretele intestinului în abdomen unde se dezvoltă. Albinele sunt doar rareori parazitate cu nematode, deci nu trebuiesc luate măsuri speciale.
În cazul efectuării unor disecții, în abdomenul albinelor, poate fi găsit, uneori, un vierme cilindric, lung.
Recomandări pentru protecție și combatere
Pentru prevenirea infestării cu larve de nematode, apa necesară albinelor trebuie să fie schimbată zilnic și să fie pusă la dispoziția lor în adăpători curate și dezinfectate (33).
II.6.4.8. Păsările
II.6.4.8.1. Prigoria (Merops apiaster)
Prigoria, albinărel sau ciuma albinelor (Merops apiaster Linnaeus, 1758), este o pasăre insectivoră care iernează în țările calde. Pasărea are pene viu colorate, trăiește în colonii și atacă în stol.
Prigoria este considerată un specialist în prinderea albinelor și poate provoca stupinelor pierderi mari. Veninul albinelor și viespilor nu afectează organismul prigoriei. Fiind o pasăre insectivoră folositoare agriculturii este protejată.
Recomandări pentru protecție și combatere
Combaterea se realizează prin instalarea unor sperietori tradiționale sau prin montarea unor plase de nylon peste stupi. (25).
II.6.4.8.2. Ciocănitoarea
În țara noastră este considerată doctorul pădurii – și se cunosc mai multe genuri și specii (Jynx, Picus, Dryocopus, Dendrocopos).
Ciocănitoarea are un rol ecologic, folositor, dar poate să producă stricăciuni mari stupinelor, mai ales pe timpul iernii, prin agitarea albinelor.
Recomandări pentru protecție și combatere
Dacă atacurile sunt frecvente se pot fixa sperietori, plase sau gratii pentru îndepărtarea păsărilor. Vara pagubele nu sunt mari.
În perioada pregătirii pentru iernat trebuie înlocuite cutiile de lemn vechi, pline de carii care pot ispiti ciocănitorile.
II.6.4.8.3. Pițigoiul (Parus spp.) poate deranja ocazional colonia de albine mai ales în timpul iernii când ciocănesc la urdiniș.
II.6.4.8.4. Rândunica, Hirundo rustica (Linnaeus, 1758) Rolul ei ca dăunător a fost exagerat. Se pare că prinde în zbor numai trântori.
II.6.4.8.5. Viesparul (Pernis apivorus, Linnaeus, 1758), este o pasăre diurnă migratoare; chiar dacă se hrănește cu insecte, nu sunt necesare măsuri de control ale acesteia.
Alte vertebrate precum broaștele, șerpii, sopârlele etc, trebuie supravegheate pentru a menține un echilibru în zonă, dar nu trebuie combătute doarece nu sunt dăunători majori (28)
II.6.4.9. Mamiferele
II.6.4.9.1. Șoarecii
Șoarecii pătrund la începutul iernii în stup, de regulă prin urdiniș, iar dacă cutile sunt vechi, crăpate și aprope de sol își pot creea prin roadere intrări noi, își instalează cuibul în zone mai retrase, iar dacă nu sunt deranjați și vremea permite se și înmulțesc.
Odată pătrunși în stup, rod înpachetajul și fagurii, consumă mierea și polenul, murdăresc și deranjează albinele. Șoarecii cosumă, de asemeni, capul și toracele albinelor căzute pe fundul stupului. Dacă frigul este prea puternic albinele amorțesc și cad pe fundul stupului de unde sunt consumate de șoareci. Uneori albinele din ghem atacă șoarecii.
Prezența șoarecilor este depistată în momentul controlului fundului de stup (rosături, dejecții), prin prezența găurilor din pereții stupului sau ascultând, în timpul iernii, zgomotele din colonie.
Recomandări pentru protecție și combatere
Pentru protecție sunt suficiente gratiile instalate la urdiniș. Se pot folosi curse. Nu trebuiesc puse momeli otrăvitoare deorece pot fi omorâte și specii utile.
II.6.4.9.2. Chițcanii
Chițcanul (Sorex araneus Linnaeus, 1758) este un mamifer insectivor care semănă cu șoarecele dar are dentiția adaptată pentru perforat chitina insectelor. Trăiește în galerii lângă liziere și păduri, atât la șes cât și la munte. Datorită capului alungit și ascuțit, pătrunde ușor în interiorul stupului, prin urdiniș sau diferite crăpături, și devorează un număr mare de albine, astfel încât colonia se dezorganizează, slăbește și moare,
Recomandări pentru protecție și combatere
Coloniile puternice se pot apăra mai ales pe timpul verii cînd chițcanii nu îndrăznesc să intre în colonie.
Ca măsuri de combatere, atât pentru șoareci cât și pentru chițcani, toamna se folosesc curse, iar ca măsură de prevenție, odată cu pregătirea pentru iernare, se instalează la urdiniș gratii metalice.
II.6.4.9.3. Ursul, bursucul, dihorul
Stupinile amplasate în zone de munte plătesc tribut acestor viețuitoare, mari amatoare de miere. Vânătoarea fiind interzisă, cea mai importantă măsură de protecție sunt gardurile electrice instalate în zonele unde li se semnalează prezența.
II.6.4.9.4. Animalele domestice pot răsturna sau deranja stupii dacă stupina nu este apărată de un gard.
II.6.4.10. Omul
II.6.4.10.1. Greșelile tehnologice
Omul înșuși, poate fi considerat un dușman al albinelor când nu respectă un minimum de reguli tehnologice, atunci când recoltează mierea și nu respectă regulile de igienă și profilaxie pentru a păstra sănătatea albinelor sau când folosește sau manipulează substanțe toxice ce pun în pericol toate viețuitoarele din zonă. Greșelile tehnologice se pot rezolva prin instruire și experiență (4).
II.6.4.10.2. Vandalismul.
Din păcate, ispita, pizma, hoția sau reaua credință a oamenilor pot provoca pagube în stupină. Vandalismul se manifestă prin otrăviri, aruncări cu pietre, răsturnarea stupilor, furturi sau incendieri.
Actele reprobabile pot fi prevenite prin asigurarea supravegherii stupinelor, protejarea stupinelor de priviri indiscrete, anunțarea autorităților la efectuarea deplasărilor în pastoral și cultivarea unor relații de bună vecinătate.
II.6.5. Bibliografie
1. Alaux C., Brunet J-L., Dussaubat Claudia, Mondet Fanny, Tchamitchan Sylvie, Cousin Marianne, Brillard J., Baldy Aurelie, Belzunces P.L. and Le Conte Y. (2010): Interactions between Nosema microspores and a neonicotinoid weaken honey bees (Apis mellifera). În: Envirion Microbiol., 12(3), 774-782;
2. Asiminei S., Șpac A.F., Hrițcu A. (2003): Pelinul – plantă medicinală utilă în prevenirea și combaterea nosemozei la albine. Revista Română de Medicină Veterinară, vol. 13, nr. ¾, pag. 384;
3. Bodoc, I.;Bodoc Diana; Șindilar, E. (1999) Mierea naturală toxică Rev.Rom.Med.Vet. vol.9, nr 3, pag. 289;
4. Bucată, P., Mardare Aneta, (2001): Albine și oameni în pericol. România Apicolă LXXXV, nr.7, pag.12;
5. Chioveanu Gabriela. (2007): Contribuții la studiul etiologiei, prevenirii și combaterii acariozelor la albine. Teză de doctorat, FMV București;
6. Chioveanu Gabriela.(2008): Supravegherea sanitară-veterinară a coloniilor de albine în România. Simpozionul apicol ,,Priorități în apicultura zilelor noastre,, USAMV Bucurști;
7. Chioveanu Gabriela.(2014): O nouă amenințare pentru coloniile de albine din Romănia- Gândacul mic de stup Aethina tumida. Lumea Apicolă VIII, nr. 44, pag.5;
8. Chioveanu Gabriela.(2015): Gândacul mic de stup Aethina tumida versus Cichramus luteus. Lumea Apicolă IX, nr 45 pag. 14;
9. Core A., Runckel C., Ivers J., Quock C, Siapno T., DeNault Seraphina , Brown B., DeRisi J., Smith C. D., Hafernik J. (2012): A New Threat to Honey Bees, the Parasitic Phorid Fly Apocephalus borealis. PLoS ONE 7(1). Editor: Nigel E. Raine, Royal Holloway University of London, United Kingdom;
10. Cosoroabă, I.(1992): Entomologie Veterinară. Editura CERES. București;
11. Cosoroabă I. (1994): Acarologie Veterinară. Ed. CERES, București;
12. Dainat B., Evans D.J., Chen P.Y., Gauthier L., Neumann P. (2012): Predictive
Markers of Honey Bee Colony Collapse. În: PLOS One, vol. 7 (2), e32151;
13. Dobre G. (2011): Măsuri igenice în stupină. Lumea Apicolă, V, nr. 29, pag.22;
14. Dobre G. (2012): Molia cerii (găselnița). Lumea Apicolă, VI, nr. 36;
15. Dobre G. (2013): Tehnopatiile-Deficiențe ale tehnologiilor de întreținere și exploatare. Lumea Apicolă VII, nr. 40;
16. Dobre G. (2014): Albinele, criza biodiversității și poluarea. Lumea Apicolă, VIII, nr. 42;
17. Dobre G. (2015): Degradarea biologică a coloniilor de albine prin depopulare. Lumea Apicolă IX, nr. 48, pag. 13;
18. Higes M., Garcı´a-Palencia Pilar, Martı´n-Herna´ndez Raquel, Meana Ara´nzazu (2006): Experimental infection of Apis mellifera honeybees with Nosema ceranae (Microsporidia). Journal of Invertebrate Pathology;
19. Higes M., Martín-Hernández Raquel, Garrido-Bailón Encarna, González-Porto V. Amelia, García-Palencia Pilar, Meana Aranzazu, del Nozal María J., R. Mayo and Bernal J. L., (2009): Honeybee colony collapse due to Nosema ceranae in professional apiaries. Environmental Microbiology Reports;
20. Hristea C.L, (1935): Stupăritul. Ed I Atelierele Frații Chiriac. Bârlad;
21. Huber M. D. (2010): Ag Chemical and crop nutrient interactions – current
update. Proceedings Fluid Ferilizer Forum, Scottsdale, vol. 27. Fluid Fertilized Fundation, Manhattan, KS;
22. Johnson R. (2010): Honey Bee Colony Collaps Disorder. CRS Report for
Congress;
23. Lu Ch., Warchol M. K., Callahan A. R. (2012): In situ replication of honey
bee colony collapse disorder. În: Bulletin of Insectology, nr. 65(1), pag. 99-106;
24. Lu Ch., Warchol M. K., Callahan A. R. (2014): Sub-lethal exposure to
neonicotinoides impaired honey bees winterization before proceeding to colony collapse disorder. Bulletin of Insectology, nr. 67(1), pag. 125-130;
25. Mardale, I.(2015): Prigoria ,dușman de temut al albinelor. Romania Apicolă, XCIX, nr. 10, pag.20;
26. Mărghitaș, L.A., (1997): .Albinele și produsele lor. Editura Ceres, București;
27. Mărghitaș și colab. 2010. Genetic Diversity of Honeybees from Moldova (Romania). Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 67(1-2): 396-402;
28. Ograda, I., (1986): Bolile și dăunătorii albinelor, Ed.III. Editura ACA, București;
29. Pernal, F. S., Clay, H. Eds. (2013): Honey Bee Diseases And Pests. Ed. III, Capa, Beaverlodge, Ab, Canada;
30. Popa Al., 1965. Bolile albinelor și virmilor de mătase. Editura Agrosilvică București;
31. Popescu, N., Meica, S. (1998): Produsele apicole și analiza lor chimică. Editura Diacon Coresi București ;
32. Ritter W. (2000): Bolile albinelor. Ed. M.A.S.T. București;
33. Ruttner, F., (1980): Creșterea Mătcilor. Editura Apimondia București;
34. Sagili R., Hooven Louisa, (2015): Bee Colony Collapse Disorder. În:
Pesticides and the Environment;
35. Savu, V., Șapcaliu Agripina (2013): Patologia albinelor. Editura Fundației Romînia de Mâine. București;
36. Volcinschi, T., (1988): Ceara. Editura ACA, București;
37. Wheeler M. Marsha and Robinson E. Gene (2014): Diet – dependent gene
expression in honey bees: honey vs. Sucrose or high fructose corn syruo. Scientific Reports/Article, nr. 4, 5726;
38. * * * A.C.A. Manualul apicultorului (2004): Ed VII . Editura Apimondia București.
39. ***Aethina tumida: OIE (World Organization For Animal Health) (2014): Manual Of Diagnostic Tests And Vaccines For Terrestrial Animals. also on: www.oie.int
40. ***Agroecologia (2008): Colony Depopulation Syndrome and Employment of Pesticides;
41. ***Honey Bee Health and colony collapse disorder (2012). În: Report on the National Stakeholders Conference on Honey Bee health www.ars.usda.gov/news/docs.htm?docid=15572;
42.***https//en.wikipedia.org/wiki/Colony_collapse_…(2013): Colony collapse disorder;
43. *** Colony collapse disorder ( CCD): https://agdev.anr.udel.edu/maarec/2007/…/back…
44. * * *viespi: https://ro.wikipedia.org/wiki/viespi
45. ***Braula coeca: https://ro.wikipedia.org/wiki/Braula_coeca
46.*** Ephestia kuehniella: https://en.wikipedia.org/…/Mediterranean_flour…
Anexa 1
Genele implicate în imunitate la Apis mellifera (după Evans D.J. și colab., 2006, modificată de noi)
Lista abrevierilor
Ac anticorp
ADN acid dezoxiribonucleic
ADNc acid dezoxiribonucleic complementar
Ag antigene
AMP peptide antimicrobiene
ARNi acidul ribonucleic interferență, inhibă expresia genelor determinând distrugerea specifică a ARNm. Calea ARNi este activată de enzima Dicer care descompune lanțurile lungi de ARN dublu catenar (dsARN) în fragmente scurte, dublu catenare de aproximativ 20 de nucleotide (siARNs). Aceste siRNAs sunt apoi separate în șuvițe unice și integrate într-un complex activ numit RISC.
ARNm acid ribonucleic mesager
ARNr acid ribonucleic ribosomal
Cactin componente intracelulare ale căii Toll care au rolul transmiterii semnalului antigenic
Cactus (IkB) inhibitor nuclear
Caudal inhibitor nuclear
CET proteine care conțin tiolester
DAP acid diaminopimelic
DIF factor de transcripție
DIFP DIF fosforilat
Dom receptorul de citokine domeless
DOPA dihidroxifenilalanina
Dorsal (NF-kB) factor de transcripție al căii Toll
DSCAM molecula celulei de aderență în sindromul Down
DUOX dual oxidaza reglează producția de ROS și RNS
EATER proteina transmembranară
G+ bacterii Gram – pozitive
G- bacterii Gram – negative
GNBP-1 receptor al căii Toll pentru Ag bacteriene și fungice
GNBPs receptori pentru recunoașterea bacteriilor Gram negative
GPCR receptor cuplat cu proteina G care activează diverse căi de semnalizare (de exemplu, calea JNK)
βGRP receptori pentru recunoașterea β-1,3 glucani
GPI glicosilphosphatidilinositol
H2O2 peroxidul de hydrogen
5-HPETE acidul 5- hydroperoxyicosatetraenoic, intermediar al acidului arahidonic din care sub acțiunea lipooxigenazei rezultă LTA4, apoi LTB4 ș.a.m.d.
IkBa proteina inhibitoare
IKK enzima kinazaIkB
IMD cale de recunoaștere și de transmitere a semnalului antigenic al bacteriilor Gram- negative, Gram- pozitive și fungilor, prezentă în celulele epiteliale
JAK/STAT cale de recunoașterea antigenelor, implicată în sinteza complementului și a PPA și diferențierea hemocitelor în fagocite
JNK cale de control a expresiei unor gene AMPS, reglarea cicatrizării leziunilor și în procesul melanizării. Este activată de factori stresanți, citokine inflamatorii, factori de creștere și agoniști GPCR
Kappa B factor de transcripție nuclear
LYSO-PAF metabolit al factorului de activare a trombocitelor, are activitate antibacteriană (bacterii Gram- pozitive)
LOX lipooxigenaza
LPS-proteine lipopolizaharide-proteine
LPS lipopolizaharide
LTA4 leucotriena A4
LTB4 leucotriena B4
LTC4 leucotriena C4
LTD4 leucotriena D4
LTE4 leucotriena E4
MyD88 (Myd88) factor al căii Toll, are rolul transmiterii semnalului antigenic
NEC factor al căii Toll pentru transmiterea semnalului antigenic
NF°B KappaB nuclear
NF-kB calea majoră a semnalului de transducție pentru căile Toll și IMD
NF-kB-like factor de transcriere
NODca receptori citoplasmatici pentru persefone
NO oxidul nitric
·NO oxidul nitric
NO2 nitrat
N O‾2 azotat
NOX nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (NADPH) oxidaza, declanșează sinteza ROS și RNS
O‾2 anion superoxid
OH radicalul de hidroxil
OONO‾ peroxynitrit
OONOH acid peroxynitrous
PAF-acetyl-transferaza enzimă cu rol în acetilarea LYSO-PAF
PGRPs receptori pentru recunoașterea peptidoglicanilor
PGRP-LC proteina de recunoaștere a peptidoglicanului
PGG prostaglandina G
PGD2 prostaglandina D2
PGE2 prostaglandina E2
PGF2 prostaglandina F2
PAF factorul de agregare a trombocitelor
PAF-acetyl-hidrolaza enzimă cu rol în degradarea PAF și regenerarea LYSO-PAF
PAMPs modele moleculare (Ag) asociate microorganismelor patogene
PAP proteinază care hidrolizează PPO cu formarea de PO
Pelle (IRAK) factor al căii Toll, are rolul transmiterii semnalului antigenic
Pellino componente intracelulare ale căilor IMD și Toll care au rolul transmiterii semnalului antigenic
PGI2 prostaglandina I2
PGN peptidoglicani
PGH2 prostaglandina H2
PGRP-LC receptor extracelular pentru recunoașterea peptidoglicanului bacteriilor Gram-negative și a paraziților
PGRP-LE receptor intracelular al căii IMD pentru recunoașterea peptidoglicanului bacteriilor Gram-negative
PGRP-SA receptor al căii Toll pentru Ag bacteriene
PGRP-S1 receptor al căii IMD pentru Ag bacteriene
PGRP-S2 receptor al căii Toll pentru Ag bacteriene
PGRP-S3 receptor al căii Toll pentru Ag bacteriene
PIAS proteină inhibitoare
PLA2 fosfolipaza A2
PPA polipeptide antimicrobiene
PRRS receptori pentru PAMPs
PRRS receptori pentru PAMPs care sunt asociați agenților patogeni sau componentelor rezultate după moartea celulelor
PO fenoloxidaza
PPO profenoloxidaza
Pro-PAP precursorul proteinazei este hidrolizat de o serin-protează rezultând proteinaza
Pro-PPAE enzima proprophenoloxidaza, responsabilă de activarea PPO
Psh persefone (citokinele țesutului mort)
PSH serin protează, are rolul recunoașterii antigenului
Ptp61F tirozin fosfataza (XP 392429)
Relish factor de transcripție pentru căile de semnalizare Toll și IMD
RISC complex proteic activ care include siARNs
RNS specii reactive de nitrogen
ROS specii reactive de oxygen
SOCS supresor de citokine
SOD superoxid dismutaza
SPZ moleculă de cytokine-like Spätzle care activează receptorul transmembranar PGRP-LE
STATP STAT fosforilat
STAT92E factor de transcripție
TCT citotoxina traheală
TEP7 factor de semnalizare al căii JAK/STAT
TEPA factor de semnalizare al căii JAK/STAT
TEPB factor de semnalizare al căii JAK/STAT
TEPs tiolester de complement
TGIP trans-generational immune priming
TLR receptori Toll-like
TNF receptor antigenic
Tollip componente intracelulare ale căii Toll care au rolul transmiterii semnalului antigenic
Toll (TLR) receptori de antigen
Toll-like cale de recunoaștere și de transmitere a semnalului antigenic al bacteriilor Gram- positive și al paraziților
TRAF-2 receptor TNF asociat factorului 2, ajută la exprimarea principalilor factori care au rol în activarea căii Toll
TRC receptori de antigen
Tot gena Turandot
Tube factor al căii Toll, are rolul transmiterii semnalului antigenic
VTS vitelus
UPD proteina glicozilată extracelulară
WEB 2086 antagonist specific al PAF. Tratarea hemocitelor cu WEB 2086 duce la scăderea fagocitozei și a formării monostratului cellular
WD40 bromoproteină
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Colectiv de autori [310316] (ID: 310316)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.