CERCETARI AVANSATE PENTRU CARACTERIZAREA UNOR BIOCOMPLEXE VEGETALE CU ACTIUNE IN PATOLOGII DEGENERATIVE CUTANATE [309705]

[anonimizat], reprezintă un factor declanșator al unor perturbări biochimice și fiziologice care se propagă în lanț și sunt implicate în patogeneza unor maladii degenerative sistemice sau cu țintă particulară la nivel de țesut sau organ. Pielea are o expunere mare la agresiunile externe fizice (ex.: radiația UV) și chimice (ex.: agenți xenobiotici) [anonimizat], cu repercursiuni patologice: fotosensibilitate, arsuri, [anonimizat]. [anonimizat] (ex.: inflamație, [anonimizat], reepitelizare, progresie tumorală).

Scopul cercetărilor desfășurate este acela de a identifica, caracteriza, [anonimizat], [anonimizat].  [anonimizat]-inflamatorii, ubicuitare ca raspândire și cauzalitate în patologiile degenerative.

Obiectivele acestui studiu se referă la:

[anonimizat].

Validarea acestor modele experimentale prin testarea unor antioxidanți cunoscuți (ex.: N-acetil-Cisteina, vitamina C), [anonimizat] (ex.: Metotrexat), [anonimizat] (dexametazona) și aplicarea lor în caracterizarea unor biocomplexe vegetale cu privire la activitatea lor la nivel celular și molecular.

[anonimizat].

[anonimizat] (linii standardizate și culturi primare normale și tumorale) [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat].

Un alt aspect de inovare concretă pe care il propune această lucrare este reprezentat de  valorificarea în produse destinate afecțiunilor dermatologice a [anonimizat], Corylus avellana și a [anonimizat], [anonimizat] o consecință clară a acțiunilor evidențiate în cadrul studiului.

PARTEA I: [anonimizat] o [anonimizat], cu care se confruntă din mediul exterior. Aceștia includ căldura, frecarea, radiațiile UV, microorganismele patogene, compușii chimici și materialele toxice. Pielea este constituită dintr-o rețea multicelulară complexă ce asigură comunicarea celulară plastică și dinamică pentru menținerea mai multor procese vitale sau pentru a combate factori perturbatori. Procesele incadrate in această categorie se refera la: inflamație, raspunsul imun incluzând inducerea toleranței și prevenirea bolii, vindecarea rănilor și angiogeneză. Mai mult decât atât, pielea indeplinește și funcții fiziologice importante, incluzând apărarea imună, termoreglarea, funcția senzorială pornind de la mecanoreceptori și mecanismele endocrine și metabolice pentru a menține o stare de sănătate optimă [Jia și colab.,2015].

Pielea este împărțită în trei straturi distincte: epiderm, derm și hipoderm sau țesutul subcutanat (Fig. 1). Epidermul este alcătuit din mai multe straturi și conține patru tipuri majore de celule – keratinocite, melanocite, celule Langerhans, și celulele Merkel. Straturile epidermului (de la exterior la interior) sunt: stratul cornos (stratum corneum), stratul granulos (stratum granulosum), stratul spinos (stratum spinosum) și stratul bazal (stratum basal). Principala funcție a epidermului este de a proteja pielea de amenințările potențiale periculoase din mediu, oferind imunitate fizică, chimică, biochimică (imunitate antimicrobiană, înnăscută) și bariere imunologice adaptative. Bariera fizică este constituită în principal din stratum corneum, deși joncțiunile intercelulare și proteinele asociate citoscheletului din straturile inferioare furnizează și alte componente importante. [Baroni și colab., 2012]

Fig. 1. Reprezentarea grafică a straturilor de bază ale pielii umane [adaptare dupa].

Bariera chimică și biochimică este reprezentată de lipide, acizi, enzime hidrolitice, peptide antimicrobiene și macrofage. Bariera imunologică este compusă din componente umorale și celulare ale sistemului imunitar. Celulele stratului bazal sunt responsabile pentru reînnoirea continuă a epidermului, dar numai 15% sunt implicate constant în acest proces, deoarece celulele rămase se află într-o stare de repaus. Acestea intervin atunci când este necesară proliferarea sporită, așa cum se întâmplă la răni sau intervenția medicului pentru întinerirea pielii [Baroni și colab., 2012].

Keratinocitele constituie elementul major al stratului epidermic, și în funcție de gradul de maturare, formează cele patru straturi ale epidermului. Pe lângă caracterul lor structural, studiile au demonstrat implicarea lor în imunitatea innăscută și adaptativă. Impreună cu neutrofilele și celulele epiteliale, keratinocitele reprezintă o sursă majoră de peptide antimicrobiene, molecule mici cationice și amfipatice, acționând ca o prima linie de apărare [Matejuk, 2018]. Keratinocitele sintetizează și exprimă diferite proteine structurale și lipide în timpul maturizării lor. Etapele finale ale diferențierii keratinocitelor sunt asociate cu schimbări profunde în structura lor, ducând la o transformare în celule scuamoase plate și anucleate ale stratului cornos , care acționează în principal cu filamente de keratină și sunt înconjurate de un înveliș celular compus din proteine (proteine din stratul cornos), precum și un înveliș lipidic legat covalent. În plus, desmosomii, care interconectează keratinocitele adiacente, sunt importanți pentru coeziunea celulelor în straturile nucleate și sunt eliminate în timpul procesului de descuamare. Importanța unui astfel de echilibru se bazează pe constatarea faptului că anumite afecțiuni ale pielii apar din proliferarea și procesele de descuamare.[Matt, 2011]

Pe lângă keratinocite, alte tipuri de celule importante pot fi găsite în epiderm ca populații rezidente sau ca răspuns la condiții tranzitorii: celule Langerhans, celule Merkel, melanocite și limfocite. Ele migrează în epiderm în embriogeneza timpurie (melanocite și celule Langherans) sau se diferențiază in situ, probabil dintr-o celulă progenitoare ectodermică/ keratinocitică (celula Merkel). Celulele Langerhans sunt elemente imunocompetente derivate din măduva osoasă, esențiale pentru bariera imună a epidermului și participă, în principal, la dermatita alergică de contact. Celulele Merkel participă la constituirea componentei nervoase senzoriale a pielii.[Harder și colab., 1997]

Melanocitele provin din creasta neuronală și se află în stratul bazal al epidermului. Ele produc granule de pigment numite melanozomi care conțin melanină. Melanocitele au funcția importantă de a proteja pielea de radiațiile ultraviolete și de a conferi culoare pielii. De fapt, odată ce melanozomii sunt transferați la keratinocite, ei protejează nucleul celulelor epidermice împotriva luminii ultraviolete. Limfocitele și leucocitele polimorfonucleare, care sunt de asemenea recunoscute în epiderm în condiții anormale, sunt componente ale sistemului imunitar celular al pielii implicate în răspunsuri imune specifice [Natarajan și colab., 2014]. În mod conștient, epidermul, compus în principal din keratinocite, are o abundență mai mare a enzimelor antioxidante ca superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) și glutation peroxidaza comparativ cu stratul dermic [Shindo și colab., 1997] De asemenea, variațiile sezoniere (vară vs. iarnă) au fost raportate pentru CAT, în timp ce activitatea enzimatică a SOD rămâne stabilă, atunci când pielea umană este expusă la lumină UV [Hellemans și colab., 2003]. Antioxidanții biosintezați, glutathionul, acidul anduric, antioxidanții derivați din alimente, vitamina D și vitamina E (tocoferolii), sunt prezenți la concentrații mult mai mari în epiderm comparativ cu stratul dermic [Shindo și colab., 1994], astfel, stratul epidermic conține cea mai mare concentrație de antioxidanți și este linia majoră de apărare antioxidantă în piele [Natarajan și colab., 2014; Shindo și colab., 1994].

In timp ce epidermul reprezinta prima linie de apărare, dermul conferă scheletul sau fibrele structurale ale pielii. Dermul este un strat dens și neregulat al tesutului conjunctiv, de 2-3 mm grosime și de obicei de 15-40 de ori mai gros decât epidermul [Kolarsick și colab., 2011]. . Conține receptori mecanosensoriali, glandele sudoripare și sebacee precum și principalele sale componente hidrofile, adică acidul hialuronic și glicozaminoglicanii suport care mențin o sănătate optimă a pielii [Farage și colab., 2010]. Dermul este compus dintr-o matrice extracelulară care conține colagen și elastină, compus în primul rând din colagen de tip I, cu structuri vasculare și terminații nervoase. Plexurile neurovasculare asigură circulația, nutriția și sensibilitatea cutanată. Dermul este împărțit în derm papilar și reticular. Dermul papilar este o zonă subțire care se află în apropierea epidermului și este compus din colagen liber. Dermul reticular mai gros este localizat sub dermul papilar și se sprijină pe grăsimea și țesutul subcutanat. Fibrele elastice, sunt împrăștiate pe tot epidermul asigurând flexibilitate. În plus, există glande apocrine și ecrine care se găsesc în derm. Dermul conține patru tipuri majore de celule rezidente: fibroblaste, celule dermice dendritice, macrofage și celule mastocitare. Diferite celule inflamatorii infiltrative pot fi, de asemenea, găsite în derm în condiții diferite. Matricea extracelulară a dermului constă în principal din trei componente produse de fibroblaste: fibre de colagen, fibre elastice și substanțe măcinate. Colagenul este cel mai abundent țesut conjunctiv din derm și este responsabil pentru asigurarea rezistenței și a elasticitatii la nivelul pielii. Dermul papilar conține în primul rând colagen de tip III aranjat în mănunchiuri subțiri, slab organizate, în timp ce dermul reticular conține în primul rând colagen de tip I aranjat în mănunchiuri mari, groase și bine organizate.[Barbieri și colab., 2014]

Hipodermul este cel mai adânc strat al pielii și se află sub derm și deasupra mușchilor bazali. Izolează corpul și îl protejează de leziuni mecanice și servește ca o rezervă de energie. Principalele celule ale hipodermului sunt adipocitele dispuse în lobuli separați prin septul tesutului conjunctiv. Grosimea acestui strat prezintă variație anatomică și individuală reflectând starea nutrițională a individului. [Khavkin și colab., 2011]

Pielea este o țintă majoră pentru atacul toxic de către o gamă largă de agenți fizici (de exemplu radiații UV) și agenți chimici (xenobiotici) care sunt capabili să-i modifice structura și funcția.

IMPACTUL RADIAȚIEI UV ȘI FOTOÎMBĂTRÂNIREA

Consecințele îmbătrânirii umane, sunt vizibile predominant la nivelul pielii (riduri, căderea și pierderea elasticității pielii). Deși este neplăcut din punct de vedere cosmetic/ aspectual, îmbătrânirea pielii este asociată de asemenea și cu afecțiuni fizice ale țesutului cutanat. S-a demonstrat că îmbătrânirea apare ca o perturbare a funcției de barieră a pielii, printr-un aspect uscat și o creștere a riscului de apariție a leziunilor pielii, precum și a afecțiunilor maligne. Cunoașterea mecanismelor implicate în procesul de îmbătrânire cutanată, este foarte importantă pentru dezvoltarea produselor de îngrijire ce pot încetini fotoîmbătrânirea și reduce efectele acesteia. Procesul de îmbătrânire este indus atât de factori intrinseci cât și de factori extrinseci, toți având rol în reducerea integrității structurale și pierderea funcției fiziologice a pielii.[Berneburg și colab., 2000]

Fotoîmbătrânirea sau îmbătrânirea extrinsecă a pielii, este un proces generat de expunerea cumulată la radiația UV sub acțiunea căreia are loc degenerarea țesutului cutanat, care este dependentă de frecvența, durata și intensitatea expunerii la radiații, precum și de protecția naturală prin pigmentarea pielii. Printre leziunile provocate de radiațiile solare la nivelul pielii umane, se numară arsurile solare, imunosupresia (răspunsul acut la expunerea excesivă la soare), îmbătrânirea prematură (fotoîmbătrânire), cancerul (leziuni acumulate în urma expunerii repetate). Pielea fotoîmbătrânită este caracterizată prin riduri, pierderea elasticității, pigmentare neuniformă, pete maronii etc. Studii histologice și ultrastructurale, au arătat că leziunile de la nivelul pielii fotoîmbătrânite, se găsesc în țesutul conjunctiv dermic [Fisher și colab., 1997].

Expunerea pielii la ionizare și radiații UV și/sau xenobiotice/ medicamente generează specii reactive de oxigen (SRO) în cantități excesive care pot capta repede antioxidanții de țesut și alte căi de degradare a oxidantului. Eliberarea necontrolată a SRO este implicată în patogeneza unui număr mare de afecțiuni ale pielii umane, iar agenții care produc stresul oxidativ în piele pot include gazele din mediul înconjurător, poluanții generați de automobile și alte surse industriale, radiații UV, contaminanți alimentari/ aditivi/ conservanți, produse cosmetice, medicamente [Athar, 2002].

În ultimii ani, incidența diferitelor boli și tulburări legate de radiațiile solare ultraviolete a crescut alarmant și continuă să crească, conducand la un interes crescut al specialiștilor spre investigarea efectelor biologice ale radiațiilor UV solare. Expunerea cronică a pielii mamiferelor la radiațiile UV induce un număr de răspunsuri biologice, incluzând dezvoltarea eritemului, edemului, formarea de arsuri solare, hiperplazia, suprimarea imunității, deteriorarea ADN-ului, fotoîmbătrânirea și melanogeneza. Aceste modificări sunt implicate direct sau indirect în dezvoltarea cancerului de piele [Marionnet și colab., 2015].

Spectrul radiației solare este compus din unde electromagnetice de diferite lungimi de undă, de la radiații ultraviolet (UV) la lumina vizibilă sau radiații în infraroșu. Radiația UV reprezintă 5% din spectrul total al luminii solare, și este împărțită în trei domenii: UV-C (190-290 nm), UV-B (290-320 nm) și UV-A (care este subdivizată în UV-A1 =340-400nm si UV-A2= 315-340nm). Radiația UV-B, are energie mai mare, dar penetrează doar straturile superficiale ale pielii, până la stratul bazal al epidermului, spre deosebire de radiația UV-A, care deși are o energie mai joasă, penetrează pielea în profunzime, până la dermă (fig. X).

Fig. X. Impactul radiatiilor spectrului solar asupra straturilor pielii [adaptare după Dupont și colab., 2013; Krutmann și colab., 2017]

Radiația UV-B este filtrată parțial de către stratul de ozon, este biologic activă ea penetrând stratul epidermal al pielii unde se generează specii reactive de azot și oxigen (SRN/ SRO), rezultând un efect inflamator, arsura solară și o amplificare a procesului de fotoîmbătrânire cutanată. SRO sunt generate în urma eliberării energiei după ce lumina este absorbită de cromoforii din piele de tipul melaninei. Deși are o energie mai joasă decât radiația UV-B, radiația UV-A, penetrează stratul dermic al pielii și este absorbită de cromofori, generând specii reactive ce afectează proteinele, lipidele și ADN-ul. Stresul oxidativ, contribuie la îmbătrânirea prematură a pielii și indirect crește riscul de cancer de piele prin formarea de baze de ADN oxidate.[Dupont și colab., 2013] Efectele fotobiologice ale iradierii cu UV-A, sunt cumulative și conduc la schimbări atât la nivel epidermal (subțierea stratului corneum, potențial imun scăzut), dar și la nivel dermal (inflamație, deteriorarea țesutului conjunctiv, depozitarea lizozimului, elastoza, efecte asupra colagenului și glicozaminoglicanilor). Toate acestea contribuie la procesul de fotoîmbătrânire, dar și la generarea unor leziuni de tipul eritemelor sau reacțiilor fotoalergice și fototoxice. Radiația UV-B, generează la nivel cutanat leziuni de tipul arsurilor solare insoțite de un efect inflamator, fotoîmbătrânire, imunosupresie, leziuni la nivelul ADN-ului (fotoleziuni ce pot induce modificări genetice și transformări celulare).[ Sjerobabski și colab., 2008; Marionnet și colab., 2015].[]

Fotoîmbătrânirea este un proces degenerativ multisistem, ce implică pielea și sistemul suport cutanat (oase, cartilaj, compartimente subcutanate), fiind caracterizată printr-o serie de transformări ale țesutului cutanat în timp, în urma expunerii la radiații UV.[Han și colab., 2014]

Din punct de vedere clinic, fotoîmbătrânirea este caracterizată de apariția ridurilor, lăsarea pielii, aspectul îngroșat al pielii, formarea blisterelor, vindecarea neregulată a rănilor. La nivel histologic, pielea îmbătrânită intrinsec, prezintă o atrofie generală a matricei extracelulare cu scăderea elastinei și dezintegrarea fibrelor elastice. Deoarece rezidă capacitatea enzimatică pentru degradarea matricei extracelulare în fibroblastele dermice și în celulele inflamatorii în care sunt crescute de asemenea, s-a depus mult efort pentru a studia reglarea dependenței de UV a acestor procese degradative. [Thiele și colab., 2001]

Factorii de mediu cum ar fi radiațiile (UV) de la soare, expunerea la fumul de țigară și poluanți, precum și procesul natural de îmbătrânire, contribuie la generarea SRO care stimulează procesul inflamator al pielii. Unul dintre evenimentele primare în inflamația mediată de SRO este activarea factorilor de transcripție care reglează degradarea proteolitică a matricei extracelulare a pielii (ECM). Pielea fotoîmbătrânită prezintă o activare proteolitică crescută și un turnover anormal a ECM, ceea ce duce la o degradare crescută a colagenului și a fibrelor elastice din derm, ducând la pierderea capacității pielii de a rezista la întindere [Pillai și colab., 2005].

Radiația UV induce genele pro-inflamatorii. Inflamația este un mediator important în procesele de fotoîmbătrânire și fotocarcinogeneză. Mediatorii inflamatori sunt eliberați din keratinocite, fibroblaste, celule tumorale, leucocite și mucoasă endotelială a vaselor de sânge. Mediatorii includ mediatorii plasmatici (bradikinină, plasmină, fibrină), mediatorii lipidici (prostaglandine, leucotrienele și factorul de activare a trombocitelor) și citokinele inflamatorii IL-1, IL-6 și factorul de necroză tumorală TNF-α. Mediatorii lipidici, COX-2 (ciclooxigenaza-2) și prostaglandina E2 (PGE2) sunt de asemenea activate de SRO. Radiația UV participă, de asemenea, la activarea enzimei ornitin-decarboxilaza, care scade activitatea diferitelor poliamine care reglează proliferarea celulelor. Procesul inflamator declanșează SRO și SRN (specii reactive de azot), care generează peroxidnitrit care declanșează ștergerea și rearanjarea ADN. Procesele de reparare a ADN-ului, ciclul celular și apoptoza sunt modificate pentru a favoriza progresia tumorii. În plus, radiațiile UV modifică expresia factorului de creștere transformant-β (TGF-β), care este regulatorul predominant al metaloproteinazelor care remodelează matricea extracelulară pentru fotoîmbătrânirea pielii și diseminarea tumorii [Bosch și colab., 2015].

Consecințele expunerii la radiațiile UV, se referă la alterarea structurii cutanate care este însoțită de deshidratare și reducerea elasticității, dar și la apariția și dezvoltarea unor tumori, cu evoluție posibil letală. Tumorile cutanate pot fi în funcție de originea lor celulară, de tip melanom (melanocite), sau tip carcinom, numite și cancere tip non-melanom (keratinocite).[]

Expunerea pielii la UV are ca rezultat generarea de specii reactive de oxigen. SRO sunt generate în mod constant în keratinocite și fibroblaști și sunt îndepărtate rapid prin substanțe anti-oxidante nonenzimatice și enzimatice. Acestea împiedică efectele nocive ale SRO și mențin un echilibru pro-oxidant/ antioxidant, rezultând stabilizarea celulelor și țesuturilor. SRO cuprinde un număr de metaboliți activi, incluzând radicalul hidroxilic, anionul superoxid și radicalul peroxil și precursorii lor activi, și anume oxigenul singlet, hidrogen peroxidul și ozonul. Oxidul nitric și dioxidul nitric, speciile reactive de azot (SRN), sunt, de asemenea, generate. Excesul de radicali liberi are ca rezultat o cascadă de evenimente care mediază deteriorarea progresivă a structurii și funcției celulare și acest lucru poate duce la pierderea integrității celulare prin modificarea ADN și, de asemenea, la expresia genică anormală. ROS afectează membranele celulare prin peroxidarea acizilor grași din structura fosfolipidică a membranei. Deși pielea posedă un sistem antioxidant elaborat pentru a face față stresului oxidativ indus de UV, expunerea extinsă și cronică la UV poate depăși capacitatea antioxidantă cutanată, ducând la afectarea oxidantă care poate determina tulburări ale pielii, imunosupresie și îmbătrânirea prematură a pielii [].

O abordare a protecției de efectele dăunătoare ale iradierii UV este utilizarea principiilor active din plante cu acțiune fotoprotectivă. În ultimii ani, compușii naturali au câștigat o atenție considerabilă ca agenți de protecție. Vitaminele C[], E[] și β-carotenul[] au fost încorporate, de exemplu, în multe produse de îngrijire a pielii. Multe flavonoide cum ar fi quercetinul, luteolinul și catechinele prezintă un efect fotoprotector mai pronunțat datorită poprietăților lor antioxidante, de absorbție a radiațiilor UV, precum și de modulare a diferitelor căi de semnalizare[]. Prin urmare, fenolii pot fi utili în prevenirea generării de radicali liberi induse de UV și a peroxidării lipidelor, adică evenimente implicate în stări patologice, cum ar fi fotoîmbătrânirea și cancerul de piele.

Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 3 (09), pp. 129-141, September, 2013 Available online at http://www.japsonline.com DOI: 10.7324/JAPS.2013.3923 ISSN 2231-3354 Photoprotection of natural flavonoids Nisakorn Saewan* and Ampa Jimtaisong

ARSURI CHIMICE SI TERMICE – IMPLICATII IN INFLAMATIA LA NIVELUL PIELII

Arsurile reprezintă un tip de leziune care poate fi cauzată de căldură, îngheț, electricitate, substanțe chimice, radiații sau fricțiune. Ranile provocate de arsuri sunt foarte variabile în ceea ce privește afectarea țesutului, severitatea și complicațiile care rezultă. În funcție de zona afectată și de boală, o victimă arsă poate prezenta un număr mare de complicații potențial letale, inclusiv șoc, infecție, dezechilibre electrolitice și insuficiență respiratorie. Dincolo de complicațiile fizice, arsurile pot duce, de asemenea, la o tulburare severă psihologică și emoțională datorită spitalizării pe termen lung, cicatrizării și deformării.

Fiecare tip de arsura, prezinta trei faze in procesul de vindecare: inflamatie, proliferare si remodelare. Raspunsul debuteaza cu eliberare de histamina, radicali liberi si citokine inflamatorii, ce potenteaza vasodilatatia si edemul tisular. Acestea favorizeaza patrunderea neutrofilelor si monocitelor la situsul leziunii, care in schimb furnizeaza semnalul chemotactic pentru recrutarea macrofagelor. Celulele inflamatorii, apoi tesutul necrotic din faza de fagocitoza, protejeaza impotriva patogenilor si produc factori de crestere ce initiaza procesele de migrare si proliferare. Urmeaza reepitelizarea ranii de catre keratinocite, iar tesutul granular vascularizat este refacut de catre celulele endoteliale si fibroblasti. In paralel fibroblastii se diferentiaza in miofibroblasti, contribuind la contractia arsurii si depunerea si realinierea fibrelor de colagen, determinand flexibilitatea tesutului cicatrizat.[]

Deteriorarea pielii provocată de expunerea la anumiti factori din mediul înconjurător este în mare parte atribuită unei cascade complexe de reacții în interiorul pielii inițiată de generarea speciilor reactive de oxigen (SRO), care provoacă leziuni oxidative la nivelul componentelor celulare cum ar fi proteine, lipide și acizi nucleici. Celulele pielii deteriorate inițiază raspunsuri inflamatorii care duc la eventualele leziuni manifestate în pielea expusă cronic. Multi dintre markerii inflamatiei asociate cu procesul de imbatranire, respectiv IL-1β, IL-6, TNF-α), prezinta de asemenea un rol central in raspunsul inflamator dupa arsuri. []

Inflamația protejează organismele împotriva invadatorilor patogeni și curăță celulele deteriorate după rani pentru a preveni alte leziuni tisulare. Astfel, agenții nocivi sunt identificați și eliminați și vindecarea ranilor este inițiată pentru restabilirea homeostaziei tisulare. Rezistența și durata răspunsul inflamator depinde însă de stimul și de context, iar pașii inițiali sunt stereotipați ca parte a raspunsului imun innascut.[]

Afecțiunile inflamatorii ale pielii variază de la erupții cutanate acute cu mâncărime și roșeață la afecțiuni cronice cum ar fi dermatită (eczemă) și psoriazis. Inflamația cutanată acută poate să apară după expunerea la, radiații UV (arsuri solare), alergeni, răni fizice sau contact cu iritanti chimici și e poate vindeca în aproximativ două săptămâni cu leziuni minore ale țesuturilor. În contrast, inflamația cronică a pielii rezultă dintr-un răspuns inflamator susținut, exagerat, care afectează în mod negativ sănătatea pielii.

În plus, s- a demonstrat că radiația UV a luminii solare generează SRO care duc la stresul oxidativ al pielii datorită epuizării enzimelor antioxidante endogene. Nu s-a demonstrat nicio diferenta intre pielea expusa la soare in mod continuu față de pielea protejată de soare în ceea ce privește nivelele de exprimare a superoxide-dismutazei (SOD) și catalazei. Cu toate acestea, expunerea la soare a determinat o creștere semnificativă a expresiei hem-oxigenazei. SRO generate de radiațiile UV provoacă în primul rând deteriorarea ADN-ului prin modificări și mutații oxidative, dar și prin inducerea expresiei diferitelor gene, cum ar fi cele care codifica metaloproteinazele matriceale și colagenazele, afectând astfel integritatea colagenului și îmbătrânirea pielii. În plus, generarea SRO mediată de UV afectează indirect, de asemenea, funcția celulară și supraviețuirea prin efectul său asupra căilor de semnalizare celulare. De exemplu, activarea protein-kinazelor (MAPK – protein kinaza mitogen activata) are loc după expunerea la radiații UV, sugerând că acestea poate fi responsabil pentru executarea efectelor stresului oxidativ indus de UV.[]

Excesul de SRO duce la modificări patologice în celule și țesuturi, exemplificate de afectiuni inflamatorii ale pielii cum ar fi psoriazisul. Psoriazisul este o afectiune cronica inflamatorie a pielii caracterizata prin roseata, piele ingrosata si scuamoasa datorita hiperproliferarii cutanate si este produsa de o multitudine de factori genetici, imunologici sau din mediul inconjurator. Patogeneza psoriazisului include interactiuni complexe intre piele si celulele imune, in concordanta cu factorii de crestere, citokinele proinflamatorii si chemokinele, dar mecanismul de baza al acestei afectiuni inca nu a fost elucidat. Stresul oxidativ are un rol cheie in patogeneza psoriazisului, manifestat prin cresterea generarii de SRO de catre leucocitele infiltrate in leziunile psoriatice. In sangele pacientilor cu psoriazis, s-au identificat niveluri scazute de antioxidanti impreuna cu o crestere a markerilor peroxidarii lipidice, precum si potentarea activitatii catalazei serice si a superoxid-dismutazei.[]

Arsurile cutanate, reprezinta afectiuni inflamatorii posttraumatice cu efecte vizibile atat la locul leziunii cat si in imediata apropiere, urmate de eliberarea mediatorilor proinflamatori si a oxidantilor ce contribuie la lezarea tesutului si necroza tisulara ischemica. Lichidul continut de basicile de la nivelul pielii cu arsuri, contin o cantitate semnificativa de IL-1β (citokina proinflamatorie secretata de keratinocite). Inducerea fazei inflamatorii si atragerea celulelor imune, conduce la producerea de SRO, exacerband lezarea tesutului. Pe langa efectele locale, arsurile initiaza reactiile inflamatorii sistemice prin producerea de SRO, conducand la deteriorarea oxidativa a lipidelor si proteinelor. Producerea patologica de SRO, poate afecta caile de semnalizare celulare de la situsul leziunii, afectand astfel celulele si biomoleculele. Peroxidarea lipidica mediata de SRO este o cauza importanta a disfunctiei membranei celulare si a morti celulare ulterioare aparitiei arsurilor, iar studiile au semnalat o corelare intre peroxidarea lipidica si gradul complicatiilor. Se pare ca aceste efecte patologice coplesitoare sunt cauzate de o dereglare a sistemelor antioxidante, cu scaderea capacitatii de captare a antioxidantilor si scaderea nivelelor SOD, GSH si bilirubinei, ca o incercare de contracarare a stresului oxidativ.

Arsurile dermice profunde, se vindeca lent sau deloc si depinde de gradul mare de migrare a keratinocitelor din jurul pielii lezate. Biologia regenerarii epidermale, este in prezent un subiect de interes. Ranile cauzate de arsuri, contin o varietate de celule, inclusive plachetele, neutrofilele, limfocitele, macrofagele si fibroblastii a caror activitate este reglata de interactiunea dintre anumite cytokine si mecanismele neuroendocrine gazda.

Eliberarea citokinelor proinflamatorii (TNF-α, IL-1, IL-6), reprezinta un mecanism foarte important in reglarea fazei acute a raspunsului la ranire. TNF-α este o citokina declansatoare care induce cascada citokinelor secundare si a factorilor umorali care conduc apoi la leziuni locale si sistemice, fiind implicata si in generararea starii de soc asociata cu leziunile termice si septicemie. IL-1 este o citokina pleiotropica, cu activitati biologice variate, inclusiv reglarea raspunsului inflamator, actiune pirogenica, activitate chemotactica, inducerea maturarii si activarii granulocitelor si a celulelor B si T. De asemenea, IL-6 este tot o citokina pleiotropica cu o importanta vitala in maturarea celulelor B, inducerea proteinelor de faza acuta si reglarea activarii celulelor T. Expresia IL-6 este crescuta semnificativ dupa arsuri si in septicemie, corelandu-se cu suprimarea imunitatii mediata celular si cresterea mortalitatii. []

Principalii regulatori moleculari care controleaza evolutia ranilor provocate de arsuri sunt: factorul de crestere endothelial vascular (VEGF), factorul de crestere plachetar (PDGF) si factorul de crestere transformator (TGF-β).

TGF-β este esential in procesul de activare si proliferare a fibroblastilor de-a lungul etapei initiale in procesul de vindecare a ranilor. []

INFECȚII FUNGICE ȘI BACTERIENE CUTANATE CU PROIECȚIE ÎN DISFUNCȚII STRUCTURALE ȘI FUNCȚIONALE DERMO-EPIDERMICE

În condiții homeostatice, suprafața pielii este colonizată de o diversitate de microorganisme, cum ar fi bacterii, viruși, fungi, artropode, etc. Cu toate acestea, un echilibru dinamic și sănătos între epidermă și populația microorganismelor este reglementat prin producerea de compuși antibiotici și antifungici prin sebocite dermice, precum și prin însuși microorganismele implicate [].

Pielea umană servește drept prima linie de apărare împotriva infecțiilor microbiene, prin secreția sebumului cu pH acid și a acizilor grași pentru inhibiția patogenilor și prin posedarea propriei flore normale, împiedicând astfel colonizarea de către alte organisme patogene. Bacteriile, inițial în numar mic, colonizează straturile pielii (epiderma, derma, țesuturile subcutanate și adipoase, fascia musculară). Odată cu creșterea numărului de bacterii, în locul în care bariera tegumentară este intreruptă, se dezvoltă și invazia acestor bacterii colonizate [].

Cei mai cunoscuți agenți patogeni ai pielii sunt Staphylococcus aureus și grupul A din clasa spreptococci β-hemolitici. Herpex simplex reprezintă cea mai comună afecțiune virală a pielii, iar dintre fungii dermatofiți, Trichophyton rubrum este cea mai prevalentă cauza a infecțiilor de la nivelul unghiilor si pielii [].

Printre arsenalul bacterian al proteinelor virulente, toxinele sunt cele mai puternice și responsabile pentru boala clinică (19). Există două clase principale de toxine – endotoxine și exotoxine. Endotoxinele sunt lanțurile lipopolizaharidice găsite abundent în pereții celulelor bacteriene gram-negative. În cantități modeste, lipopolizaharidele pot fi benefice prin activarea sistemului imunitar. Ele determină eliberarea chemoattractanților și sporesc activarea limfocitelor T prin inducerea expresiei moleculelor co-stimulatoare. Elaborarea masivă a lipozaharidelor poate totuși să conducă la o suprasolicitare dăunătoare a sistemelor imune și inflamatorii ale gazdei. De exemplu, endotoxina potentă exprimată de Vibrio vulnificus produce, de obicei, progresia rapidă a infectiilor pielii si a esuturilor moi, conducând la fasciita necrozantă (21) și culminând cu șoc septic, coagulare intravasculară diseminată și sindrom de destresare respiratorie la adult.

Exotoxinele, pe de altă parte, sunt proteine secretate activ care provoacă leziuni sau disfuncții tisulare prin diferite mecanisme []. Acestea pot provoca leziuni tisulare prin reacții enzimatice, dereglare celulară sau formare de pori, cu liza celulară ulterioară. Un grup special de exotoxine este rerpezentat de superantigeni. Acestea sunt cele mai importante produse de tulpinile virale S aureus și S pyogenes []. Acești antigeni leagă porțiuni conservate de receptori ai celulelor T și, prin urmare, sunt capabili să activeze un număr mare de limfocite T. Eliberarea masivă a citokinelor determină un răspuns inflamator puternic exagerat. SSTI cauzate de aceste tulpini se dezvoltă rapid și sunt asociate cu necroze tisulare severe. Acest fenomen precipită sindromul șocului toxic.

Cealaltă porțiune a procesului de infectare implică răspunsul gazdei la invazia țesuturilor și deteriorarea acestuia. Ca răspuns protector, scopurile inflamației sunt de a scăpa corpul organismelor incitate și de a începe reparația țesuturilor. Invazia microbiană sau deteriorarea tesutului cutanat si a țesuturilor moi determină modificări ale tonusului vascular pentru a crește fluxul sanguin către locul accidentat. Modificările suplimentare în microvasculatură promovează și ajută extravazarea proteinelor și leucocitelor plasmatice. Aceste celule și proteine migrează, se acumulează și se activează la locul leziunii. Cu activare, celulele fagocitează și distrug materia străină, țesutul mort sau microbii. Anumite citokine sau exotoxine pirogenice determină răspunsul febril. Orchestrarea celulelor și a citokinelor este extrem de sofisticată și dincolo de sfera prezentei revizuiri. În cele din urmă, locul rănirii este pus în carantină, curățat și reparat treptat.

DEREGLĂRI HIPERPROLIFERATIVE – MELANOM

Melanomul malign cutanat, reprezinta cauza a peste 75% din decesele asociate cancerului de piele si apare cel mai frecvent in randul tinerilor, fiind caracterizat prin capacitatea mare de invazie si metastazare. O contributie semnificativa la dezvoltarea si progresia bolii, o au atat factorii genetici, cat si expunerea la radiatiile UV si micromediul tumoral.[]

Expunerea repetata a tesutului cutanat la radiatia UV, influenteaza functionarea si supravietuirea multor tipuri de celule, fiind factorul cauzativ al aparitiei cancerului de piele. Pigmentarea pielii este cel mai important factor fotoprotectiv, datorita melaninei care pe langa absorbtia radiatiilor UV, prezinta si proprietati de reglementare asupra homeostazei epidermice, eliminarea radicalilor liberi pentru a proteja împotriva leziunilor oxidative și, eventual, chiar activitatea antimicrobiană. []

Sinteza melaninei este limitată la melanocit, care este derivat din creasta neurală și reprezinta a doua cea mai abundentă celulă din epidermă. De fapt, melanocitele se găsesc atât în dermă cât și în epidermă. Melanocitele epidermice sunt în general poziționate în stratul bazal deasupra membranei bazale. Melanocitele se regăsesc, de asemenea, în foliculii de păr pentru a conferi pigment părului nativ si în nevi (alunite) []. Melanogeneza este un proces complex, in urma caruia se formeaza intermediari ce pot avea roluri importante in mecanismele de reglare cutanata. Cele doua forme chimice ale melaninei sunt eumelanina (pigment intunecat, sintetizat in special in cazul persoanelor cu piele si par inchise la culoare, cu rol fotoprotector mult mai eficient) si fenomelanina (pigment regasit in special la indivizii cu par roscat si piele deschisa la culoare, care sunt cei mai susceptibili la aparitia tumorilor cutanate. [].

Radiatia UV este absorbita de catre acizii nucleici, proteine sau alti cromofori endogeni de tipul porfirinelor, flavinelor si melaninei, inducand mutatii la nivelul melanocitelor si schimbari in micromediul imun, jucand astfel un rol important in dezvoltarea melanomului cutanat. []

Unul dintre cele mai evidente efecte acute ale radiatiei UV pe piele este inducerea inflamației. UVB induce o cascadă de citokine, mediatori vasoactivi și neuroactivi în piele care împreună duc la un răspuns inflamator și cauzează arderea pielii []. Radiatiile UV au rol reglator in producția și acumularea de pigment melanina în piele, rol in inducerea unei stări imunodepresive sau imunosupresoare și producerea de vitamina D, mediaza procesul de inflamare a tesutului cutanat care debuteaza cu colorarea inițială a pielii (modificări moleculare ale pigmentilor de melanina epidermici existenți). Spectrul luminii solare este alcatuit, în cea mai mare parte, din radiatii UVA și UVB, dar fiecare componentă UV poate avea efecte diferite și distincte asupra pielii. UVB, de exemplu, este un stimulent puternic al inflamației și formării de fotoeleziuni la nivelul ADN, în timp ce UVA este un potențial precursor al leziunilor cauzate de radicalii liberi oxidativi asupra ADN și alte macromolecule. Astfel, fiecare poate contribui la carcinogeneza prin mecanisme diferite [].

Degradarea proteolitică a matricei extracelulare (ECM) poate elibera și activa citokinele legate de ECM și fragmente de ECM (matricine) care moduleaza creșterea celulara, migrația și angiogeneza. În condiții fiziologice, expresia metaloproteinazelor matriceale (MMP) este scăzută în majoritatea celulelor; totuși, multe tipuri de tumori prezintă o suprapresiune dramatică a acestor enzime. Aceasta, la rândul său, produce o proteoliză hiperactivă a ECM și a membranei bazale, care promovează invazia cancerului printr-o varietate de biochimice, biofizice, și mecanisme de transducție a semnalului. []

Radiatia UV potenteaza expresia metaloproteinazelor matriceale la nivelul pielii, ele fiind responsabile de degradarea proteinelor matricei extracelulare (ECM), cum ar fi colagenul, fibronectina, elastina si proteoglicanii, dar si in procesul de fotoimbatranire. MMP-urile au un rol crucial in fotocarcinogeneza prin reglarea sau afectarea unor procese asociate progresiei tumorale incluziv aparitia, cresterea, angiogeneza si metastazarea tumorala. Pe baza structurii lor si a specificitatii de substrat, MMP-urile in 5 subcategorii: colagenaze (MMP-1, MMP -8, MMP -13), gelatinaze (MMP-2, MMP -9), stromelizine (MMP-3, MMP-10, MMP-11), matrilizine (MMP-7, MMP-26), proteinaze membranare -MT (MMP-14, MMP-15, MMP-16). []

Expresia si rolul metaloproteinazelor matriceale in melanom, au fost studiate extensiv, utilizand linii celulare melanomice, modele murinice sau probe de tesut de la pacienti cu melanom metastatic primar. Expresia colagenazelor MMP1 si MMP13 si a gelatinazelor in particular a fost asociata cu progresia melanomului. [] Studiile efectuate de Candrea si colab. au evidentiat ca expresia MMP 2 in forma activa sau inactiva, este corelata cu malignitatea tumorilor cutanate. []

Gelatinazele MMP-2 si MMP-9, in primul rand actioneaza asupra colagenului de tip IV considerandu-se ca au un rol crucial in progresia celulelor melanomice, astfel supraexpresia MMP-2 este corelata cu degradarea arhitecturala, progresia atipica si metastaza hematogenica, iar MMP-9 este puternic exprimata in celulele inflamatorii ca macrofage, neutrofile si mastocite. Reglarea activitatii MMP reprezinta una dintre strategiile de prevenire a leziunilor provocate de radiatia UV, prin adoptarea unor solutii terapeutice care utilizeaza substante antioxidante/ antiradicalice ce au proprietatea de a inhiba axpresia si activitatea acestor metaloproteinaze matriceale, diminuand astfel efectele nocive ale radiiatiilor solare si prevenind fotoimbatranirea declansata de iradierea UV. []

Predicția comportamentului biologic al melanoamelor maligne este dificilă pe baza criteriilor histologice, cunoscut fiind faptul ca melanomul subtire poate dezvolta metastaze și melanoamele groase pot rămâne localizate timp de mulți ani. Interacțiunea dintre tumora și stromă este considerată critică în carcinogeneza, invazia tumorală și metastazare. Inducerea formării unor noi vase sanguine dintr-un pat vascular preexistent a fost raportată ca un parametru al valorii prognosticului potențial în tumorile solide, ceea ce poate facilita creșterea tumorală și metastazarea. Angiogeneza tumorală este controlată de o varietate de factori angiogenici. Factorul de creștere dominant care influenteaza angiogeneza este factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) []. VEGF este asociat cu proliferarea, diferentierea, degradarea, si migrarea celulelor endoteliale, conducand la formarea unor noi canale in matricea extracelulara care sunt necesare neovascularizarii. []

Expresia VEGF este absentă în melanocite normale, dar este reglată în celulele melanomului malign. Cu toate acestea, valoarea prognostică potențială a VEGF în melanomul cutanat uman, precum și corelația cu progresia tumorii este încă nerezolvată și unele studii nu au arătat nici o valoare prognostică semnificativă pentru acest marker. Unele dintre aceste rezultate contradictorii ar putea fi explicate prin evaluările nestandardizate ale VEGF. Prezența unei relații semnificative între exprimarea VEGF și progresia tumorii în melanoamele cutanate va face VEGF o țintă bună pentru tratamentele antiangiogenice în melanomul pielii. []

Mai multe citokine serice, inclusiv IL-6 joacă un rol important în dezvoltarea și progresia melanomului; cu toate acestea, funcțiile biologice specifice ale IL-6 în progresia melanomului sunt necunoscute. Câteva studii au indicat faptul că IL-6 inhibă creșterea melanocitelor in vitro. IL-6 inhibă creșterea celulelor tumorale izolate din melanomul localizat, nemetastatic, în timp ce IL-6 stimulează proliferarea celulelor tumorale izolate din melanomul metastatic, indicând o schimbare de la stimularea paracrină la creșterea autocrină sau crescând rezistența la IL-6 ca regulator de creștere negativă. S-a demonstrat, de asemenea, că celulele metastatice de melanom au expresii mari atât ale IL-6 cât și ale receptorului IL-6, în timp ce celulele melanomului primar subțiri au o expresie mică atât a IL-6, cât și a receptorului său [].

Deși terapiile moderne au ameliorat gestionarea malignităților cutanate, o strategie mai sigură, mai accesibilă și mult mai eficienta pentru chemoprevenție și tratament, este clar necesară pentru îmbunătățirea tratamentului cancerului de piele. Fitoscompușii biologic activi derivați din plante au un rol benefic în lupta împotriva cancerului pe măsură ce aceștia exercită efecte anticancerigene și sunt disponibile pe scară largă, extrem de tolerate și rentabile. Proprietățile anticarcinogene ale produselor fitochimice se datorează proprietăților lor antioxidante, efecte antiinflamatorii, antiproliferative și antiangiogenice. []

STRES OXIDATIV – NUMITOR COMUN IN DEREGLARI FUNCTIONALE ALE TESUTULUI CUTANAT

RADICALII LIBERI SI SISTEME ANTIOXIDANTE

De-a lungul timpului, cercetările au dezvaluit că îmbogățirea sistemelor organismului uman cu antioxidanți naturali poate corecta dezechilibrul homeostaziei si poate preveni debutul și trata boli provocate și/ sau stimulate de stresul oxidativ mediat de radicalii liberi. Aceste considerente au accelerat căutarea, izolarea si perfectionarea principiilor active antioxidante. Extractele de plante sunt din ce în ce mai utilizate ca fitoterapeutice și sunt surse importante de antioxidanti naturali. Antioxidanții naturali întăresc apărarea antioxidantă endogena impotriva leziunilor provocate de speciile reactive de oxigen (SRO) și restabilesc echilibrul optim prin neutralizarea acestor specii reactive.

Există un număr de probleme asociate în prezent cu aplicarea practica a terapiei antioxidante cum ar fi: alegerea naturii antioxidanților, doza și durata tratamentului care urmează să fie utilizat, livrarea la locul specific, specificitatea pentru radicalii liberi. Mai mult decât atât, utilizarea irațională a antioxidantilor poate, de asemenea crește riscul de toxicitate potențială, deoarece mulți antioxidanți pot acționa ca prooxidanți într-o serie de circumstanțe, mai ales ca este încă dificil de stabilit dacă radicalii liberi sunt cauza sau consecința patologiei și nu exista suficiente dovezi pentru a susține eficacitatea terapeutică a diferitilor antioxidanți.

Stresul oxidativ este definit ca un dezechilibru intre aparitia speciilor reactive de oxigen/ azot (SRO/ SRN) si capacitatea organismului de a contracara actiunea lor prin intermediul unor sisteme de protectie antioxidative. Acest dezechilibru duce la deteriorarea biomoleculelor și celulelor importante, cu impact potențial asupra întregului organism. Stresul oxidativ rezulta din generarea crescuta a SRO/ SRN sau dintr-o scadere a abilitatii protective antioxidanta, fiind caracterizat de capacitatea redusa a sistemelor endogene de a lupta impotriva atacului direct asupra biomoleculelor tinta.[]

Degradarea indusa de radicalii liberi in stresul oxidativ, a fost confirmata ca fiind un contributor la patogeneza si patofiziologia multor afectiuni cronice, cum ar fi cele neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer, Huntington, scleroza amiotropica laterala), bolile cardiovasculare si inflamatorii, cataracta, cancerul. S-a demonstrat ca stresul oxidativ este corelat cu peste 100 de afectiuni, fie ca sursa, fie ca rezultat. Progresia ireversibila a degradarii oxidative cauzata de SRO, de asemenea exercita o influenta negativa asupra statusului biologiei imbatranirii, constand in afectarea functiilor fiziologice, promovarea incidentei bolilor si reducerea sperantei de viata.[]

Studiile efectuate de-a lungul timpului, au demonstrat ca radicalii liberi, nu mai pot fi considerati doar agenti daunatori, ei fiind factori ce influenteaza in mod real functionalitatea normala a sistemelor organismelor vii.

Radicalii liberi sunt produsi continuu în sistemele biologice și există dovezi substanțiale pentru implicarea lor in multe procese patofiziologice, în care antioxidantul poate juca un rol foarte important. Radicalii liberi sunt atomi, molecule sau ioni cu electroni neimperecheati care sunt extrem de instabili și activi in reacțiile chimice cu alte molecule. Ei sunt derivati din trei elemente: oxigen, azot și sulf, creând astfel specii reactive de oxigen (SRO), specii reactive de azot (SRN) și specii de sulf reactive (SRS).

Tabelul 1. Clasificarea radicalilor liberi

Speciile reactive de oxigen si azot (SRON) sunt produse de toate celulele aerobe, iar generarea lor nu se limitează numai la determinarea efectelor dăunătoare ci și la extracția de energie din molecule organice, în apărarea imună și în procesul de semnalizare. []

Sursele endogene de SRON includ nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADPH) oxidaza, mieloperoxidaza (MPO), lipoxigenaza si angiotensina II. NADPH oxidaza este sursa prevalenta a anionului radical superoxid (O2•-) care este format prin reducerea cu un singur electron din oxigen molecular, cu electroni furnizați de NADPH, în timpul respirației celulare. Majoritatea (O2•-) este dismutat în peroxidul de hidrogen (H2O2) de către superoxid dismutaza (SOD). H2O2 nu este un radical liber deoarece nu are electroni neparticipați, dar este capabil să formeze ionul hidroxil foarte reactiv (OH•) prin reacția Fenton sau Haber-Weiss. []

Sursele exogene de RONS care în interiorul corpului sunt metabolizate în radicali liberi, sunt reprezentate de poluarea aerului și a apei, tutunul, alcoolul, metalele grele sau tranzitorii, medicamentele (de exemplu, ciclosporina, gentamicina și bleomicina), solvenții industriali, gătit (de exemplu, carne afumată, uleiuri uzate și grăsimi); și radiația.[]

Radicali liberi ai oxigenului – reprezintă cea mai importanta clasa de specii reactive generate de organisme. Datorita prezentei acestui element nu numai in atmosfera, dar si in aproape toate substantele care compun organismul, interactia radicalilor liberi cu oxigenul este inevitabila. Generarea intracelulară de SRO cuprinde în principal radicali de oxigen, precum superoxidul (O2•-); peroxid (O2•=), care în mod normal există în celule ca hidrogen peroxid (H2O2); și radicalul hidroxil (OH•). Superoxidul, peroxidul și radicalul hidroxil sunt considerati SRO primare și au declanșat cercetări majore asupra rolului radicalilor liberi în biologie și medicină.

Radicali ai azotului. Celulele sistemului imunitar produc atât anioni superoxid cat și oxid nitric în timpul declansarii procesului de oxidare în timpul proceselor inflamatorii. In aceste condiții, oxidul nitric (NO) și anionul superoxid pot reacționa împreună pentru a produce cantități semnificative de mult mai mult molecule oxidative active, anionul peroxinitrit (ONOO-), fiind un agent de oxidare puternic care poate cauza fragmentarea ADN-ului și oxidarea lipidelor.

SURSE EXOGENE DE STRES OXIDATIV CU IMPACT CUTANAT

Mulți poluanți de mediu sunt ei înșiși oxidanți sau catalizeaza direct sau indirect producerea de specii reactive de oxigen (SRO). SRO activează semnalizarea proliferativa și supraviețuirea celulară care poate modifica căile apoptotice implicate în patogeneza unui număr de afecțiuni ale pielii, inclusiv fotosensibilitate și unele tipuri de malignitate cutanată. SRO acționează în mare parte prin câteva căi moleculare importante care joacă roluri semnificative în diverse procese patologice inclusiv leziunea de reperfuzie ischemică, ateroscleroza și răspunsurile inflamatorii. []

Pielea posedă o serie de mecanisme de apărare care interacționează cu substanțele toxice pentru a evita efectul lor dăunător. [] Acestea includ molecule enzimatice si nonenzimatice care funcționează ca antioxidanți puternici sau sisteme de degradare a oxidantului. Din păcate, aceste mecanisme de apărare homeostatice, deși foarte eficiente, au o capacitate limitată și pot fi copleșite astfel ducând la creșterea SRO în piele, care poate favoriza dezvoltarea de boli dermatologice. O abordare pentru prevenirea sau tratarea acestor tulburări mediate de SRO se bazează pe administrarea diferitilor antioxidanți, în efortul de a restabili homeostazia. Deși mulți antioxidanți si-au demonstrat eficacitatea substanțiala în sistemele de culturi celulare și în modelele animale cu leziuni oxidante, confirmarea neechivocă a acestor efecte benefice în rândul populațiilor umane s-a dovedit evaziva. []

Sisteme de apărare antioxidante au co-evoluat, de asemenea, cu metabolismul aerobic pentru a contracara efectele distructive ale SRO pentru a minimiza potențialul lor de a provoca leziuni tisulare. În ciuda acestor mecanisme de apărare antioxidante, care sunt probabil programate genetic, deteriorarea proteinelor dependenta de SRO, a ADN-ului și altor macromolecule se acumulează pe toata durata de viață a tuturor organismelor aerobe. Este cunoscut faptul că multe boli dependente de vârstă cum ar fi ateroscleroza, osteoartrita, tulburări neuro-degenerative, și cancerul implică SRO în timpul unei anumite etape a progresiei lor. De-a lungul timpului, studiile au vizat elucidarea rolului metabolismului oxidant cutanat în carcinogeneza pielii și evaluarea fezabilității de utilizare a antioxidantilor ca agenți anticancerigeni.[]

2.3.SURSE ENDOGENE DE RADICALI LIBERI GENERATOARE DE PERTURBARI FUNCTIONALE ALE PIELII

Radicalii liberi se formeaza la nivelul pielii in urma expunerii la stimulii din mediul inconjurator si din reactiile imune. In plus, generarea SRO in piele, are loc in mod natural ca parte a metabolismului celular normal, cum ar fi respiratia mitocondriala, activitatea enzimatica sau sub actiunea radiatiilor UV. Tesutul cutanat contine sisteme de aparare antioxidanta enzimatice sau non-enzimatice, cu rol reglator al nivelurimor SRO, mentinand astfel homeostazia fiziologica. []

Antioxidanții endogeni joacă un rol crucial în menținerea funcțiilor celulare optime și, astfel, la mentinerea sănătatii sistemice. Cu toate acestea, în condiții care promovează stresul oxidativ, antioxidanții endogeni pot sa nu fie suficienți, fiind necesar un aport antioxidant dietetic pentru a mentine funcțiile celulare optime. Sistemele de antioxidanti enzimatici implică superoxid dismutaza (SOD), catalază (CAT) și glutation-peroxidaza (GSH-Px). (O2) este transformat in prezenta SOD în H2O2, care este descompus în apă și oxigen de CAT, prevenind producerea radicalilor hidroxil. În plus, GSH-Px transformă peroxizii și radicalii hidroxil în forme nontoxice prin oxidarea glutationului redus (GSH) în disulfură de glutation și apoi redus la GSH prin glutathion reductaza. Alte enzime antioxidante sunt glutathion-S-transferaza și glucozo-6-fosfat dehidrogenaza.[] []

Figura 2. Reacțiile majore prooxidant – antioxidant relevante în sisteme biologice

Anionul superoxid (O2•̶ ) produs din diferite surse actioneaza ca specie reactivă primară. (O2•̶ ) reacționează rapid cu oxidul nitric (NO•) pentru a produce peroxinitrit (ONOO-) sau este catalizat de superoxide dismutaza pentru a produce peroxid de hidrogen (H2O2), care poate fi neutralizat prin catalază sau glutation peroxidaza. Cu toate acestea, în prezența ionilor metalici tranzitionali, precum fierul (Fe2+) și cuprul (Cu+), radicalii liberi hidroxil foarte toxici (OH•) pot fi produși din H2O2 prin reacția Fenton. [] []

Superoxid dismutaza (SOD), (EC 1.15.1.1) este unul dintre cei mai eficienti antioxidanti enzimatici intracelulari ce catalizeaza conversia anionilor superoxid la oxigen molecular și peroxid de hidrogen. Superoxid dismutaza există în mai multe izoforme, care diferă în functie de natura centrului metalic activ, compoziția in aminoacizi, co-factorii și alte caracteristici. Sunt trei forme de SOD prezente la om: Cu,Zn-SOD citosolic, Mn-SOD mitocondrial și SOD extracelular. Superoxid dismutaza neutralizează anionul superoxid prin trecerea prin cicluri succesive de oxidare și de reducere a ionilor metalelor de tranziție de la situsul activ.[] Deoarece SOD sunt jucători cheie în apărarea antioxidantă, există un interes crescut pentru rolurile lor în diferite afectiuni și potențialul pentru cresterea nivelurilor de SOD in utilizarea terapeutică. De fapt, modificări în nivelul de exprimare sau în activitatea catalitică a SOD se regasesc într-o varietate de condiții patologice, inclusiv unele dintre cele mai frecvente boli dependente de vârstă, cum ar fi boli cardiovasculare, boli neurodegenerative și cancer. []

Catalaza (EC 1.11.1.6) (CAT) este o enzimă tetramerică alcătuită din patru subunitati identice de 60 kDa aranjate tetraedric care conține o singură grupă ferriprotoporfirinica pe subunitate și are o masa moleculara de aproximativ 240 kDa. Este exprimata in majoritatea celulelor, organelor si tesuturilor, gasindu-se in concentratii mari in ficat si eritrocite si are una dintre cele mai mari rate de fluctuație pentru toate enzimele: o moleculă de catalază poate converti aproximativ 6 milioane de molecule de peroxid de hidrogen în apă și oxigen în fiecare minut. Catalaza protejează celulele de peroxidul de hidrogen generat în ele. Chiar daca CAT nu este esențială pentru anumite tipuri de celule în condiții normale, joacă un rol important în dobândirea toleranței la stresul oxidativ în răspunsul adaptiv al celulelor. []Catalaza este implicata in procesele de imbatranire intrinseca si de fotoimbatranire la nivel cutanat, dar este si un factor important in inflamatie, mutageneza, prevenirea apoptozei, etc. []

Glutation peroxidaza, este o enzima ce exista sub două forme, una care este seleniu dependenta (GPx, EC1.11.1.19) și cealalta, care este independenta de seleniu (glutation-transferaza, GST, EC2.5.1.18). Diferențele sunt date de numărul de subunități, mecanismul catalitic și legarea seleniului la centrul activ. Metabolismul glutationului este unul dintre cele mai importante mecanisme de apărare antioxidante prezente în celule. Există patru glutathion peroxidaze Se-dependente prezente la om, care au capacitatea de a adăuga doi electroni pentru reducerea peroxizilor prin formarea de selenoli (Se-OH), iar proprietățile antioxidante ale acestor seleno-enzime le permit eliminarea peroxizilor ca substraturi potențiale pentru Reacția Fenton. Glutation peroxidaza Se-dependenta actioneaza in asociere cu tripeptidglutationul (GSH), care este prezent în concentrații mari în celule și catalizează conversia peroxidului de hidrogen sau a peroxidului organic în apă sau în alcool în timp ce are loc oxidarea simultană a GSH. De asemenea concurează cu catalaza pentru peroxidul de hidrogen ca substrat și este sursa majoră de protecție împotriva nivelurilor scăzute de stres oxidativ.

2.4.RESTABILIREA HOMEOSTAZIEI OXIDATIVE PRIN APORT EXOGEN DE PRINCIPII ACTIVE NATURALE

Termenul "antioxidant" se referă la orice moleculă capabila să stabilizeze sau să dezactiveze radicalii liberi înainte de a ataca celulele. Organismul uman a dezvoltat mai multe sisteme complexe antioxidante (enzimatice și nonenzimatice), care funcționează sinergic și combinate pentru a proteja celulele și sistemele de organe ale corpului împotriva atacului radicalilor liberi. Antioxidanții pot fi endogeni sau obținuți exogen, de exemplu, ca parte a unei diete sau ca suplimente dietetice. Unii compuși alimentari care nu neutralizeaza radicalii liberi, dar sporesc activitatea endogena pot fi, de asemenea, clasificati ca antioxidanți.

În prezent însă, antioxidanții biologici presupun o definiție mai generala pentru a include sisteme de reparare cum ar fi proteine de transport cu ioni de fier (de exemplu, transferină, albumină, feritină și ceruloplasmină), enzime antioxidante și factorii care afectează homeostazia vasculară, transducția semnalului și expresia genelor. Antioxidanții își pot exercita efectele prin diferite mecanisme, cum ar fi suprimarea formării speciilor active prin reducerea hidroperoxizilor (ROO•) și H2O2 și, de asemenea, prin imobilizarea ionilor metalici, captarea radicalilor liberi activi, repararea și/ sau deteriorarea leziunilor. În mod similar, unii antioxidanți induc, de asemenea, biosinteza altor antioxidanți sau enzime de apărare. Bioactivitatea unui antioxidant este dependent de mai mulți factori, cum ar fi structura lor, caracteristicile fizico-chimice și conditii de generare a radicalilor in vivo. Un antioxidant funcționează prin întârzierea oxidării. În biologie, oxidarea este adesea declansata de radicalii liberi. Rolul unui antioxidant este de a capta un radical liber inainte sa poata reacționa cu substratul.

Antioxidantii acopera diferite clase de compusi care pot interfera cu ciclurile oxidative pentru a inhiba sau a intarzia deteriorarea oxidativa a biomoleculelor. Sistemele antioxidante sunt clasificate in două grupuri majore, antioxidanți protectori sau enzimatici și antioxidanți nonenzimatici.

Clasele principale de compusi cu activitate antioxidanta sunt: vitamine (vitamina C si vitamina E), carotenoide (carotene si xantofili) si polifenoli (flavonoide, flavonoli, flavone, flavanone, antociani, izoflavone, acizi fenolici, tanini, stilbene si lignani).[]

Acidul ascorbic (Vitamina C), unul dintre cei mai omniprezenti antioxidanti hidrosolubili, este inzestrat cu activitate sporita, fiind usor oxidat in acid dehidroascorbic. Enantiomerul L al acidului ascorbic, este implicat in mentinerea integritatii tesutului vascular si a celui conjunctiv, in absorbtia fierului si biosinteza colagenului, neuroprotectie, dar si in hematopoieza si in functionarea leucocitelor. Este un agent eficient in eliminarea radicalilor liberi din creier, capteaza radicalii hidroxil, alcoxil si superoxid in mediu biologic. Vitamina C (acid L-ascorbic) este cel mai important antioxidant hidrofilic, fiind foarte efficient in captarea radicalilor superoxid. Eficienta ascorbatului este mai mare la concentratii mici (o molecula de ascorbat poate capta 2 molecule de radical peroxil) in timp ce la concentratii mari, eficienta sa este 0. Acidul ascorbic are si o activitate prooxidanta, manifestata in prezenta cationilor metalelor tranzitionale: ascorbatul poate reduce ionii trivalenti la forma lor divalenta, fiind el insusi oxidat la dehidroxiascorbat. Astfel, ionul metalic poate fi redus, reoxidat si redus din nou, intr-un ciclu redox generator de specii reactive de oxigen. In prezenta oxigenului molecular, se formeaza anion de radical superoxid care se descompune in apa oxigenata si oxigen molecular.

Vitamina E (α-tocoferol) actioneaza impotriva peroxidarii lipidelor din membranele celulare si poate opri lantul radical prin formarea unui derivat cu reactivitate scazuta incapabil pentru a ataca substraturile lipidice. Astfel, vitamina E isi indeplineste rolul in conservarea membranei impotriva leziunilor provocate de radicalii liberi, promovata de densitatea scazuta de lipoproteine. Poate modifica pozitiv biomarkerii de stres oxidativ, imbunatateste eritropoieza sau poate scadea doza necesara de eritropoietina. S-a estimat ca prin administrarea de doze mari de suplimente de vitamina E, poate fi realizata o inhibare a proceselor proaterogenice, prin eliberarea anionilor superoxid si a IL-1β de catre monocitele activate, oxidarea lipidelor, agregarea plachetara, proliferarea celulelor musculare netede in vivo si adeziunea monocitelor la endoteliu. Vitamina E contribuie la stabilizarea placii aterosclerotice.

Carotenoide: beta-carotenul este un inactivator puternic al oxigenului singlet, care este responsabil pentru deteriorarea UV a pielii, cataracta, degenerare maculara, si a caror adaugare la structurile dienice conduce la endoperoxid. Rolul beta-carotenului in fotoprotectia sistemica, provenit de la proprietatile lui antioxidante, este contracarat de unele efecte prooxidante raportate. Studiile s-au concentrat catre un alt carotenoid puternic, licopenul si prezenta sa in plasma si ser a fost invers asociata cu riscul de cancer. Au fost stabilite corelatii comparabile pentru markerii bolilor cardiovasculare, osteoporoza, functia cognitiva si greutatea corporala. A fost stabilit ca 40 g pasta de tomate incorporeaza o cantitate aproximativa de 16 mg de licopen si consumul acestuia pentru o perioada mai lunga de 8 saptamâni are efecte benefice in eritemele induse de UV. Ardeiul clopot s-a dovedit capabil sa previna cataracta, datorita prezentei beta-carotenului si a vitaminei C. S-a constatat ca activitatea antioxidanta a licopenului este superioara activitatii beta-carotenului si alfa-tocoferolului. Activitatile preventive ale licopenului sunt bazate pe capacitatea sa de stingere a oxigenului singlet, care a demonstrat ca este cel mai bun dintre toate cele 600 carotenoide naturale si se datoreaza, de asemenea, structurii sale.

Derivati de stilben. Resveratrolul a fost clasificat ca antioxidant, inhibitor al ciclooxigenazei, un fitoalexin, un stimulator al receptorului de peroxizom proliferator activat, inductor al sintetazei oxidului nitric endothelial. Cele mai importante surse sunt reprezentate de cojile de struguri si vinul rosu. Acest derivat de stilben, capteaza SRO, actioneaza ca un chelator de metal si moduleaza activitatea enzimatica. Atât vinul rosu, cât si resveratrolul s-au dovedit capabile sa scada peroxidarea lipidica in hipocampul sobolanilor diabetici. Aceste proprietati antioxidante au fost expuse in aceasta regiune a creierului si au fost certificate cu o activitate crescuta de catalaza.

Acizi fenolici (derivati ai acidului benzoic si ai acidului cinamic). Rezultatele unei investigatii comparative au demonstrat capacitatea acidului galic si a esterilor acestuia de a capta acidul hipocloros si de a reduce peroxidarea fosfolipidelor oxidate la nivelul creierului in solutie de etanol. Studii comparative privind rezistenta antioxidanta a compusilor fenolici non-flavonoidici prezenti in dieta, s-au concentrate asupra acidului clorogenic si a acidului cafeic. Studiile cinetice au aratat capacitatea de a stinge radicalii superoxid si hidroxil. Acidul clorogenic a determinat inhibarea peroxidarii lipidelor in lant, prin captarea radicalului peroxil. A fost de asemenea stabilit ca acidul clorogenic poate reactiona rapid cu peroxiniritul, in functie de concentratie si pH.

Flavonoidele. Quercetinul si rutinul reprezinta doua dintre cele mai studiate flavonoide. Comportamentul lor antioxidant in sistemele de peroxidare a lipidelor, a fost investigat si comparat cu cel al altor flavonoide. Quercetinul si rutinul, dar si apigenina si naringina au manifestat activitatea antioxidanta impotriva anionului superoxide. Hesperidinul, naringenina si naringina, prezente in principal in citrice, au prezentat activitate antioxidanta scazuta in sistemele de peroxidare a lipidelor.

O investigatie comparativa asupra activitatii de captare a radicalilor peroxil de catre compusii fenolici prezenti in semintele sau coji de struguri, au indicat urmatoarea clasificare: resveratrol> catechin> epicatechin = gallocatechin> acid galic = acid ellagic. Cei trei fenolii majori prezenti in semintele de struguri au prezentat mai putin de 26% din capacitatea antioxidanta evaluata ca capacitate de absorbtie a radicalului oxigen, bazându-se pe concentratiile corectate de acid galic, catechina si epicatechina in produsele secundare din struguri. Procyanidinele dimerice, trimerice, oligomerice sau polimerice sunt in mare parte responsabile pentru capacitatea antioxidanta ridicata a semintelor de struguri.[]

BIOCOMPLEXE VEGETALE – SURSA MULTIPOTENTA IN TERAPII CUTANATE

3.1. CLASE DE COMPUSI BIOACTIVI SI EFECTUL LOR TERAPEUTIC: CORELATII STRUCTURA – FUNCTIE

Plantele sunt surse potențiale de antioxidanți naturali. Acestia absorb radiația soarelui și generează niveluri mari de oxigen ca metaboliți secundari ai fotosintezei.Oxigenul este ușor de activat prin radiații ultra violete (UV) și căldură de la lumina soarelui pentru a produce specii toxice de oxigen reactiv(ROS). Aceste ROS sunt foarte bunei reactivi deoarece pot interacționa cu un număr de molecule celulare și metaboliți conducând astfel la un număr de procese distructive care cauzează daune celulare. Plantele produc diferiti compuși antioxidanti, enzimatici și nonenzimatici, pentru a contracara și detoxifia aceste ROS pentru a supraviețui. Prin urmare, fitocompusii naturali care au proprietăți antioxidante par să contribuie cu activitatile lor chimiopreventive sau chimioprotectoare, în beneficiul ființelor umane.

Mulți compuși antioxidanți se găsesc în fructe și legume, inclusiv fenoli, carotenoide, antociani și tocoferoli. Aproximativ 20% dintre plantele cunoscute au fost utilizate în studiile farmaceutice, care afectează sistemul de sănătate în moduri pozitive, cum ar fi tratamentu cancerului și bolilor dăunătoare. Plantele sunt capabile să producă un număr mare de compuși bioactivi. Concentrațiile ridicate de substanțe fitochimice, care pot proteja împotriva daunelor provocate de radicalii liberi, se acumulează în fructe și legume. Plantele care conțin substanțe fitochimice benefice pot fi suplimente nevoile corpului uman prin acționarea ca antioxidanți naturali. De exemplu, vitaminele A, C, E și compușii fenolici cum ar fi flavonoide, tanini și lignine, găsite în plante, toate acționează ca antioxidanți. Consumul de fructele și legumele au fost asociate cu mai multe beneficii pentru sănătate, un rezultat al proprietăților medicinale șio valoare nutritivă ridicată. Antioxidanții controlează și reduc deteriorările oxidative din alimente prin întârzierea lor sau inhibarea oxidării cauzate de speciile reactive de oxigen (ROS), în final crescând durata de conservare și calitatea acestor alimente. Beta carotenul, acidul ascorbic și multi compusi fenolici joacă roluri dinamice în întârzierea îmbătrânirii, reducerea inflamației și prevenirea anumitor forme de cancer. Creșterea consumului din fructe și legume a fost recomandat de multe agenții și sisteme de sănătate în întreaga lume. Obiectivul acestei lucrări este de a oferi o analiză a studiilor fitochimice care s-au adresat extragerii, măsurarii și identificarii compușilor bioactivi ai plantelor.

Compușii din plante sunt împărțiți în metaboliți primari și secundari. Metaboliții primari, cum ar fi acizii organici, aminoacizii, lipidele și alți compuși sunt implicați direct în creșterea și dezvoltarea sau alte funcții primare. Dimpotrivă, metaboliții secundari nu sunt direct implicati în funcțiile primare. Ei au roluri specifice, cum ar fi protecția împotriva infecțiilor și atractanților de polenizare. Acești compuși organici sunt distribuiti pe scară largă în regatul plantelor. Mai mult, mulți dintre acești compuși au efecte biologice asupra sănătății umane și sunt sugerati ca medicamente. Astfel, ele sunt denumite de obicei "produse naturale vegetale".

Metaboliții secundari pot fi clasificați în trei clase majore: terpenoide(55%), alcaloizi (27%) și compuși fenolici (18%). Metaboliții secundari sunt în principal sintetizați prin două căi: acidul mevalonic și acidul shikimic sau aminoacizii aromatici.

3.1. CLASE DE COMPUSI BIOACTIVI SI APLICATIILE LOR TERAPEUTICE:

Alcaloizii sunt produși de o varietate largă de organisme, cum ar fi plantele, bacteriile, ciupercile și animalele și au fost folosite în medicină încă din cele mai vechi timpuri. Acestea au multe efecte incluzând efectele antimalariene (chinină), antiastmatice (efedrină), vasodilatatoare (vincamină), antihipertensive (rezerpine), antitumorale (vinblastină și vincristină) și anti-aritmice (chinidină). De asemenea, alcaloizii posedă activități psihotrope și stimulente (cocaină, cafeină și nicotină) și pot exercita un efect ananalgezic, cum ar fi în morfină. Nu în ultimul rând, sunt efectele antibacteriene și anti-virulente ale alcaloizilor. În ceea ce privește activitatea antibacteriană a alcaloizilor, multe dintre ele au demonstrat că mulți dintre acești compuși ar putea juca un rol în tratarea multor boli infecțioase. Un alcaloid care prezintă activitate antibacteriană este sanguinarină. De mult timp a fost cunoscut faptul că sanguinarina, un alcaloid benzofenantridinic derivat din rizomii Sanguinaria canadensis, are o activitate antimicrobiană largă și proprietati antiinflamatorii. De fapt, studiile in vitro au arătat că sanguinarina este capabilă să inhibe aderența bacteriană la suprafața dinților, exercitând acțiune anticoagulară. Acest alcaloid exercită activitatea antibacteriană prin perturbarea formării inelului Z bacterial și inhibarea citokinezei bacteriene

Terpenoizi

Terpenoidele reprezintă o mare clasă de compuși din plante, caracterizate prin activitate antimicrobiană. Terpenoizii sunt derivați din unități izopenice cu cinci atomi de carbon; majoritatea terpenoidelor au structuri multi-ciclice care se diferențiază unul de celălalt în grupurile lor funcționale și în scheletul de bază. Monoterpenii sunt o clasă de terpeni care constă în două unități de izopren, găsite în uleiurile esențiale extrase din mai multe plante. În ultimele două decenii, activitatea antimicrobiană a acestor compuși a fost studiată și mai multe lucrări arată că timolul și carvacrolul (monoterpenoidele fenolice) sunt capabile să inhibe creșterea multor bacterii.

Carotenoizi

Carotenoidele, cunoscute și ca tetraterpenoide, sunt formate din 8 unități isoprenoide. Acestea joacă două roluri cheie în plante: absorb energia luminii pentru utilizare în fotosinteză și contribuie la fotoprotecție. Carotenoizii sunt compuși solubili în grăsimi și eliberarea lor in plante apare atunci când celulele vegetale sunt perturbate, cum ar fi preparatele alimentare sau în timpul masticării (Faulks and Southon, 2005). Carotenoidele (aproximativ 600 de carotenoide identificate și compușii înrudiți) pot fi împărțite în două clase, carotene (cum ar fi caroten, caroten și licopen) și xantofile (cum ar fi criptoxantina, luteina și zeaxantina) și sunt responsabile pentru culorile galben, portocaliu și roșu din legume și fructe. Carotenoidele sunt bine cunoscute pentru proprietățile nutriționale și beneficiile pentru sănătate.

Polifenoli

Polifenolii constituie o mare parte a fitocompusilor care se găsesc abundent în fructe, legume, nuci, semințe, tulpini, flori și băuturi, cum ar fi cafeaua, ceaiul și vinul roșu. În ultimii ani, polifenolii dietetici au fost evaluați cu succes ca agenti chemopreventivi și terapeutici datorită acțiunii lor direct antimicrobiene și activității de modulare a antibioticelor. Efectele protectoare ale dietelor bogate în fructe și legume au fost atribuite prezenței acestor compuși. Glicozidele flavonoidice, sunt atribuite unei activități antioxidante semnificative și efectului inhibitor asupra producției de oxid de azot (NO) (mediator inflamator) în macrofage.

Până în prezent au fost studiate mai mult de 8000 de structuri fenolice și pot fi împărțite în mai multe subgrupuri în funcție de structura lor chimică, sursa de origine și funcțiile biologice. În ceea ce privește structura lor chimică, polifenolii pot fi clasificați ca flavonoizi și non-flavonoizi. Flavonoidele sunt un grup mare de compuși găsiți în multe fructe, legume și leguminoase. Multe flavonoide naturale au fost raportate ca având diferite proprietăți farmacologice, cu utilitate potențială în chemoprevenirea diferitelor boli asociate stresului oxidativ, cum ar fi cancerul, boala cardiovasculară și neurodegenerativă. În plus față de activitatea antioxidantă, flavonoidele prezintă, de asemenea, o bună activitate antibacteriană atât împotriva tulpinilor gram-pozitive cât și gram-negative, probabil datorită abilității de a inhiba giraza ADN, funcția membranei celulare și metabolismul energetic bacerial.

Replicarea ADN este una dintre funcțiile biologice cele mai de bază și ar trebui să fie o țintă primordială în dezvoltarea antibioticelor. În ultimii ani, flavonoidele au fost studiate pentru capacitatea lor de a interacționa cu helicaze ADN, proteine esențiale pentru replicarea, repararea și recombinarea ADN și pentru a împiedica legarea dNTPs. În special, Chen și Huang (2011) au studiat 4 flavonoide (galangin, kaempferol, quercetin și myrecetin la 10 M)Printre flavonolii, unii compuși cum ar fi quercetin, galangin, kaempferol și myrecetin au demonstrat activitate antimicrobiană împotriva bacteriilor gram-negative și gram-pozitive. Quercetinul este principalul flavonol prezent în dieta noastră. Acesta se găsește în cea mai mare parte în ceapă și propolis și este flavonolul cel mai studiat datorită proprietăților sale biologice, inclusiv activităților anti-canceroase, antiinflamatorii și antibacteriene.

Majoritatea fenolilor naturali sunt acizii cinamic, acizi benzoici, flavonoide, proantocianidine, cumarine, lignani și lignine și stilbenuri. Monofenolii, cum ar fi acidul p-cumaric, nu sunt polifenoli, dar au multe proprietăți și caracteristici asemanatoare, fiind astfel cunoscuți ca "polifenoli funcționali". Grupările hidroxilice fenolice sunt buni donatori de hidrogen: antioxidanții care dau hidrogen pot reacționa cu speciile RO și RN, care întrerupe ciclul de generare de noi radicali. Interacțiunea cu speciile reactive inițiale, o formă radicală a antioxidantului este produsă, având o stabilitate chimică mult mai mare decât radicalul inițial. Formarea acestor radicali relativ de lungă durată este capabilă să modifice procesele de oxidare . Capacitatea antioxidantă a compușilor fenolici este de asemenea atribuită capacității lor de a chela ionii metalici implicați în producerea radicalilor liberi. Cu toate acestea, fenolii pot acționa ca pro-oxidanți prin chelarea metalelor într-o manieră care menține sau crește activitatea lor catalitică sau prin reducerea metalelor, crescând astfel capacitatea lor de a forma radicali liberi.

Structurile fenolice au adesea potențialul de a interacționa puternic cu proteinele, datorită inelelor lor benzenoide hidrofobe și potențialului de legare la hidrogen a grupărilor hidroxil fenolice. Aceasta conferă fenolilor capacitatea de a acționa ca antioxidanți și datorită capacității lor de a inhiba unele enzime implicate în generarea radicală, cum ar fi izoformele citocromului P450, lipoxigenazele, ciclooxigenaza și xantin oxidaza. În plus, au fost descrise efectele sinergice ale fenolilor cu alți antioxidanți, și anume acidul ascorbic, β-carotenul și α-tocoferolul (Croft. 1998) și reglarea nivelurilor intracelulare de glutation.

Flavonoidele sunt caracterizate de o structură chimică fenilbenzopiran. Centrul heterociclului central există cel mai frecvent în una din cele trei forme: piran, piriliu sau y-pironă. Conform poziției inelului aromatic la fragmentul benzopiran, flavonoidele pot fi grupate în patru clase: flavonoide principale (2-fenilbenzopirani), isoflavonoide (3-benzopirani), neoflavonoide (4-benzopirină) și flavonoide minore. În plante, acești compuși apar în aproape toate speciile, de obicei ca urmare a proprietăților lor de screening UV, constituind astfel o protecție a plantei. De asemenea, capacitatea lor de a atrage polenizatori este bine stabilită. Din ce în ce mai mult, flavonoizii devin obiectul cercetării medicale. S-au raportat că posedă multe proprietăți utile, incluzând antiinflamatorii, estrogenice, inhibitori enzimatici, antimicrobieni, antialergici, vasculare și citotoxice antitumorale și activitatea antioxidantă atribuită flavonoidelor. Activitatea antioxidantă a flavonoidelor este, de asemenea, responsabilă pentru alte activități biologice în care prevenirea stresului oxidativ este benefică.

De exemplu, activitatea anticanceroasă a unor compuși se datorează capacității lor de a scuti radicalii liberi, evitând astfel etapele timpurii ale promovării cancerului. Pe lângă acest mecanism, s-a raportat că flavonoidele acționează ca agenți anticanceroși prin reglarea căilor de transducție a semnalului de creștere și proliferare celulară, suprimarea oncogenei și formarea tumorilor, inducerea apoptozei, modularea activității enzimatice legate de detoxifiere, oxidare și reducere,stimularea sistemului imunitar și a ADN-ului repararea și reglarea metabolismului hormonilor. Alte clase de flavonoide acționează de asemenea ca molecule puternice pentru tratamentul altor patologii. Unele isoflavone, a căror capacitate asemănătoare cu estrogenul este acum bine stabilită, activitatea acestor compuși este legata de similitudinea lor cu estradiolul, un estrogen pentru tratamentul condițiilor în care efectul agonist în receptorii estrogeni este benefic, cum ar fi condițiile menopauzei. Câteva preparate care conțin acești compuși, în principal derivate din soia, sunt acum utilizate în terapeutică.

Acizii cinamici

Acizii cinamici: L-fenilalanina și L-tirozina, ca blocuri de construcție C6C3, sunt precursori pentru agamă largă de produse naturale. În plante, afrecvența primă este eliminarea amoniaculuidin lanțul lateral pentru a genera corespunzătoracid trans- (E) -cinamic. În cazul fenilalaninei, aceasta ar da acid cinamic, în timp ce tirozina poate produce acid 4-cumaric (p-cumaric acid). Toate plantele par să aibă capacitatea de a deamina fenilalanina prin fenilalanin amoniu liază (PAL) enzima, dar transformarea corespunzătoare a tirozinei este mai restricționată, limitându-se în principal la membri din familia de iarbă (Graminae / Poaceae). Cel mai obișnuit acid cinamic este acidul cafeic, apare în fructe și legume în principal ca un ester cu acid chinic (acid clorogenic sau 5-acidul caffeoilchinic). Activitatea antioxidantă este legată de numărul și poziția grupărilor hidroxil. Eficiența antioxidanta a monofenolilor este puternic îmbunătățită prin introducerea unei a doua grupări hidroxil la pozițiile orto- sau para- , și este mărită cu una sau două substituții metoxi în pozitia orto în ceea ce privește gruparea hidroxil. Contrar flavonoizilor, un număr mare de acizi fenolici sunt disponibili comercial, astfel permițând o identificare definitivă. Dar metodologia asta nu se aplică acizilor fenolici derivați cu acizi chinici sau tartrici sau celor glicozilați. Majoritatea polifenolilor, acizii cinamici prezintă, de asemenea, proprietăți puternice antioxidante. Această activitate poate fi exprimată în mai multe moduri.

Din punct de vedere istoric, produsele naturale au fost sursa ingredientelor active ale agenților terapeutici, în special în domeniile bolilor infecțioase și terapiei tumorale. Produsele naturale joacă un rol de neînlocuit în descoperirea de noi medicamente și de noi precursori de medicamente, fiind o sursă importantă de structuri noi și un rol unic în compușii anti-tumorali. În prezent, mai mult de jumătate dintre medicamentele anti-cancer utilizate pe scară largă in lume provin din surse naturale. Multe produse naturale active și derivații lor cu activitate ridicată și efecte secundare reduse pot fi obținute prin modificarea și transformarea structurii. În special în domeniul medicamentelor anti-tumorale și anti-SIDA, cercetarea și dezvoltarea de noi medicamente din produse naturale arată o vitalitate în plină expansiune și o perspectivă atractivă.

Produsele naturale derivate din fructe, legume, ierburi și produse marine ne-au servit bine în combaterea cancerului. Compușii sunt bine caracterizați ca având o mare varietate de proprietăți anti-tumorale, de exemplu, inducerea apoptozei și autofagiei și inhibarea proliferării celulare. Ingredientele active, cum ar fi alcaloizi, flavonoide, terpenoide, polizaharide și saponine obținute din produse naturale, au proprietăți biologice puternice, cum ar fi activități antitumorale, analgezice, antiinflamatoare, imunomodulare, antivirale etc. Organismele marine, nevertebratele și algele oferă surse bogate de agenți anti-cancerigeni cu compuși bioactivi diferiți structural și metaboliți secundari bioactivi care posedă diverse activități antitumorale; alcaloizii indolici fiind cei mai obișnuiți. O serie de produse au fost descoperite pentru prima oară din microbi, cum ar fi antibioticele, care au activitate antitumorală. Activitatea antitumorală a majorității medicamentelor anti-neoplazice naturale nu duce deseori la distrugerea celulelor tumorale, ci reglementează funcția imunitară umană pentru a atinge scopul sau ambele. Diviziunea și duplicarea reprezintă o serie de evenimente importante în ciclul celular, iar o dereglare a ciclului celular poate avea efecte asupra dezvoltării cancerului (Wang and Ren, 2010). ADN topoizomeraza I (TopoI) este o enzimă esențială implicată în creșterea celulelor. Inhibarea TopoI este o cale importantă împotriva cancerului. De asemenea, un număr mare de medicamente anti-cancer combat cancerele prin stoparea ciclului celular, inducerea apoptozei și diferențierea, precum și prin inhibarea creșterii și proliferării celulare sau o combinație a două sau mai multe dintre aceste mecanisme (Abubakar și colab. 2012). Căutarea de medicamente noi este încă o țintă prioritară pentru terapia cancerului datorită faptului că rezistența la medicamente chimioterapeutice devine din ce în ce mai frecventă.

3.2. DIVERSITATEA FITOCHIMICA A PLANTELOR MEDICINALE – BAZA DEZVOLTARII DE PRODUS CU ACTIUNE TERAPEUTICA MULTIFACTORIALA

Salvia officinalis L. (salvia) este un membru al familiei Lamiaceae și este o planta aromatica, medicinala, ornamentale sau culinara. Este una dintre plantele esentiale cu un gust savuros și ușor piperat, fiind cultivat in special pentru metabolitii lor secundari, utilizati pentru producerea de uleiuri esentiale. Salvia prezinta activitati biologice diferite, ca cele antibacteriene, antivirale si antifungice. Frunzele de salvie sunt utilizate in industria farmaceutica, alimentara si parfumerie. Uleiul esential de salvie este utilizat adesea in tratamentul diferitelor afectiuni cum ar fi, cele ale sistemelor nervos, cardiovascular, respirator, digestiv, metabolic si endocrin.

Analizele fitochimice au indicat ca uleiul esential de salvie conține monoterpene (α- si β-tujona, 1,8-cineol, borneol, camfor si linalol), sesquiterpene (α-humulen) si fenoli. Frunzele de salvie contin acid taninic, acid oleic, acid ursonic, acid ursolic, niacina, nicotinamida, flavone, glicozide flavonoidice, carnosol, acid carnosic, acid fumaric, acid clorogenic, acidd cafeic si substante estrogene. Sunt studii care arata ca diterpenele o-difenolice –carnosol si acid carnosic sunt mai abundente, prezentand un puternic caracter antioxidant, proprietati anti-inflamatorii si anticarcinogenice. Pe langa acesti compusi, in extractele de salvie au fost descoperite si alte clase de principii active ca terpenoidele, flavonoidele si acizii fenolici.

Acidul ursolic este una dintre substanțele cele mai promițătoare de origine biologică când vine vorba la prevenirea și tratamentul cancerului. Noile strategii farmacologice nu se bazează numai pe distrugerea celulelor tumorale, dar și modularea metabolismului lor pentru a preveni angiogeneza și metastazele, să aplice diferențierea celulelor și să protejeze țesuturile sănătoase împotriva inflamației și stresului oxidativ care poate duce la formarea de neoplasme. Acidul ursolic, cunoscut de asemenea ca si urson, prunol, micromerol si malol, este un compus triterpenic pentaciclic care se gaseste in forma naturala intr-un numar mare de plante medicinale. Acidul ursolic, este un compus de interes in aria cercetarii oncologice datorita proprietatilor sale citotoxice, de inducere a diferentierii, anti-mutagenice, antivirale si anti-invazive. Are activitate citotoxica puternica si produce inhibarea cresterii in diverse sisteme celulare, dar mecanismele moleculare ale activitatii anti-tumorale sunt insuficient studiate. Interfera de asemenea cu numeroase enzime, incluzand pe cele implicate direct in sinteza ADN. Conform studiilor prezentate in literatura de specialitate, acidul ursolic a fost testat in sisteme celulare diverse. Acest fapt este important, pentru ca in fiecare din aceste sisteme pot apare interactii specifice datorita prezentei unor corepresori/ coactivatori. Un exemplu similar il furnizeaza hormonii glucocorticoizi, care pot avea efect pro- sau anti-apoptotic, in functie de celulele asupra carora actioneaza. fibrozei.

Cu toate acestea, sunt necesare investigații suplimentare pentru a elucida componenta (ele) responsabilă și pentru a stabili rolul potențial benefic al S. officinalis asupra inhibării angiogenezei in vivo.

Arctium lappa (brusture) face parte din familia Asteraceae si este utilizat in medicina alternativa pentru efectele sale diuretice, depurative, ca stimulant digestiv si anti-inflamator. Studiile farmacologice arata ca radacina de brusture prezinta o gama larga de activitati biologice, in special anti-inflamatorii, antidiabetice, antimicrobiene, antivirale, antioxidative si de scavenger pentru radicalii liberi. Cele mai importante principii active izolate din brusture sunt: taninurile, arctigenina, arctiina, b-eudesmolul, acidul cafeic, acidul clorogenic, inulina,, diarctigenina

Radacinile de brusture ce sunt utilizate ca plante alimentare in Japonia, sunt bogate in special in acetilene alifatice si ditiofene acetilenice. Majoritatea acetilenelor alifatice ce s-au izolat din radacinile de brusture sunt larg raspandite in familia Asteraceae, in timp ce ditiofenele izolate din aceste specii nu sunt foarte comune si numai cateva au fost izolate din alte specii. Ditiofenele sunt biosintetizate pornind de la poliacetilena C13-pentan-enica urmata de aditia de doua ori a H2S sau a echivalentilor metabolici. O particularitate interesanta este existenta ditiofenelor acetilenice legate de lactonele sesquiterpenice de tip guianolide, in brusturele comestibil. Acetilenele alifatice izolate din radacinile de brusture sunt biosintetizate pornind dela acizii C18- acetilenici prin doua α-oxidari legate de precursorii C14- acetilenici.

Radacinile de brusture contin aproximativ 27-45% inulina, mucilagii, 0,06-0,18 uleiuri esentiale, poliacetilene antibacteriene cu sulf si alifatice, substante amare,polifenoli: acid cafeic, clorogenic; acizi volatili. Brusturele este utilizat in mod traditional pentru uz topic pentru eczeme, psoriazis, chelie, dar inca nu s-au realizat studii stiintifice care sa dovedeasca aceste efecte. Utilizarea topica a radacinilor de brusture este legata in special de problemele la care toxicitatea reprezinta factorul cheie- de exemplu in acnee, furuncule, abcese, infectii locale ale pielii, eczeme, psoriasis.

Activitatea antibacteriana a radacinilor de brusture a fost atribuita prezentei poliacetilenelor, studiile realizate in vitro demonstrand eficienta fata de bacteriile gram negative inclusiv E. coli, Shigella flexneri, si Shigella sonnei. Studii in vitro realizate de diferiti cercetatori, au demonstrat inhibitia infectiilor cu virusul HIV-1.

Experimentele in vivo pe soareci, au demonstrat capacitatea extractelor din radacina de brusture de inhibitie a promovarii tumorilor de catre virusul Epstein-Barr, determinand necroza hemoragica si lichefierea tumorilor. Activitatea desmutagenica a brusturelui a fost evidentiata prin studii in vitro fata de diversi agenti mutageni – 4-NO2-1, 2-DAB, ethidium bromide si a fost atribuita arctigeninei. De asemenea exista studii care sugereaza faptul ca sucul proaspat de brusture inhiba dezvoltarea modificarilor cromozomiale anormale induse de DMBA. Administrarea subcutanata a unui extract brut de radacina de brusture, in model experimental a determinat scaderea edemului indus, precum si activitate anti-radicali liberi. Studii preliminare in vivo de evaluare a activitatii falcarinolului, dehidrofalcarinol si dehidrofalcaridinol pe melanom de soarece, au demonstrat potentialul antitumoral al acestor compusi, utimul fiind cel mai active.

Corylus avellana (alun) este un arbust, care face parte din familia Betulaceae si este bogat in acizi grasi nesaturati, minerale esentiale (potasiu, calciu, magneziu, seleniu), complex de vitamina E si B, steroli, compusi fenolici, tocoferoli. Prezinta un puternic efect antioxidant, cardioprotector, anticancerigen, antimicrobian. Studiile arata ca alunul prezinta un continut bogat de acizi benzoic si cinamic, care stimuleaza producerea de taxol (paclitaxel) in diferite linii celulare, aceasta fiind corelata cu cresterea activitatii antioxidante. Taxolul este un alcaloid diterpenic si este unul dintre cele mai utilizate medicamente in tratamentul cancerului ovarian, de san si plamani. Oliviera et all., 2007, au demonstrat ca extractul di frunze de alun poate fi utilizat ca agent antimicrobian impotriva unei bacterii responsabila pentru infectiile gastrointestinale si ale tractului respirator.

Solanum lycopersicum (tomate) fac parte din familia Solanaceae si sunt cunoscute ca fiind surse importante de compusi fenolici, antioxidanti, pigmenti, alcaloizi steroidieni, flavonoide totale, carotenoide și clorofilă. Compusii fenolici din fructele de tomate, sunt asociati cu capacitatea lor antioxidanta si de asemenea, ei previn schimbarile oxidative de la nivel celular prin reducerea nivelului de radicali liberi []. Studii epidemiologice sugereaza o corelare directa intre capacitatea antioxidanta a tomatelor si scaderea riscului de dezvoltare a bolilor cardiovasculare si cancerului. De asemenea si plantele de tomate prezinta componente bioactive cu proprietati farmacologice si nutritionale []. Cuticulele, coaja, pulpa, semintele, tulpinile si frunzele plantei sunt surse potentiale de compusi antimicrobieni, antivirali si antioxidanti, de tipul fenolilor, flavonoidelor si vitaminelor. α-tomatina este un glicoalcaloid alcatuit dintr-un lant agliconic (tomatidina) si un lant tetrazaharidic (β- licotetraoza) compus din doua molecule de glucoza, una de galactoza si una de xiloza. Desi se cunoaste faptul ca un numar de agenti patogeni fungici, produc enzime ce hidrolizeaza zaharurile din structura tomatinei (cunoscute ca tomatinaze), biosinteza si metabolismul tomatinei si tomatidinei nu sunt pe deplin elucidate. Indepartarea zaharurilor de pe saponine este asociata cu scaderea activitatii antimicrobiene. α-tomatina si produsii sai de hidroliza, sunt asociati cu diferite efecte asupra sanatatii umane: toxicitate, scaderea colesterolului, cresterea raspunsului imun ca agenti anticancerigeni, protectia impotriva unor fungi patogenici si altor microorganisme.[]

PARTEA II. CONTRIBUȚII PROPRII

INTRODUCERE

În restabilirea homeostaziei celulare afectate de impactul progresiv al radicalilor liberi exogeni sau endogeni sunt implicate mecanisme de reglare ce implică procese strict direcționate prin molecule semnal, factori și interacțiuni intra- și inter- celulare ce pot fi modulate de către compuși naturali ce reușesc prin complexitatea lor structurală un impact multiplu prin căi convergente de acțiune.

Ideea centrală a acestor cercetări pornește de la evidențierea unor complexe vegetale, active în combaterea stresului oxidativ la nivel cutanat, cu acțiune complementară în mecanisme degradative conexe, generatoare de patologii dermatologice grave, cu largă incidență. Aceste procese celulare se referă la: apoptoză, proliferare și rata de turn-over, modulare citokinică a inflamației și corelare la nivel de endoteliu vascular cu expresia moleculelor de adeziune, raport sinteză/ degradare enzimatică în formarea matricei proteice extracelulare, diferențiere keratinocitară, invazie tumorală.

Pentru selecția complexelor vegetale active s-au luat în studiu plante din speciile Salvia officinalis, Corylus avellana, Arctium lappa, Solanum lycopersicum, Trifolium pratense, Vitis vinifera, orientându-ne către valorificarea unor structuri de tip polifenolic (resveratrol din struguri, miricetina și antocianii din alun, acid cafeic, acid clorogenic din brusture), triterpenic (acid ursolic din salvie), glicoalcaloidic (glicoalcaloizi steroidici din Solanum), pigmenți carotenoidici (compuși clorofilieni din salvie), izoflavone (genisteina, daidzeina, formononetin, biochanina din trifoi roșu), poliacetilene din brusture.

Cercetările debutează cu un screening general, la nivel acelular, privind acțiunea antioxidantă/ antiradicalică a unor extracte vegetale din Salvia officinalis (SvU – extract cu componente triterpenice majoritare; SvPG – extract cu polifenoli și acizi triterpenici; SvCC – extract cu compuși porfirinici); Corylus avellana (Al – extract de acizi polifenilcarboxilici, flavone); Arctium lappa (Br – extract de acizi polifenilcarboxilici, sesquiterpene); Solanum lycopersicum (Sol-T – extract de glicoalcaloizi steroidici); asocieri de componente active din deșeuri vegetale din Vitis vinifera (TES – extract polifenolic) și Trifolium pratense (ET – extract fitoestrogenic), pentru a stabili potențialul lor de combatere a atacului oxidativ. Rezultatele vor direcționa studiile experimentale ulterioare către aprofundarea efectelor antioxidante la nivel celular, în sistem enzimatic (superoxid dismutaza și catalaza) și al radicalilor liberi oxigenați (anion superoxid și peroxid de hidrogen). Pe de altă parte, vor fi investigate mecanisme caracteristice patologiilor degenerative cutanate, definitorii pentru progresia bolii (ex. inflamație, proliferare și apoptoză, refacere matrice proteică extracelulară, reepitelizare, malignizare și metastazare în melanom).

Modelele experimentale dezvoltate și aplicate în cadrul studiului prevăd stimularea specifică în vederea mimării in vitro a unei condiții patologice particulare:

TNF-α – stimul pro-inflamator puternic, generator de inflamație nespecifică – relevant în maladii dermatologice cu componentă inflamatorie: dermatite, psoriazis, răni de diferite etiologii, etc;

LPS – lipopolizaharid, generator al inflamației asociate invaziei bacteriene, implicat în micoze cutanate și suprainfectarea rănilor;

PMA – (forbol miristat acetat) stimul ce generează stres oxidativ asociat inflamației;

UV-A și UV-B cu intensitate controlată, pentru mimarea impactului radiant asupra țesutului cutanat – fotosensibilizări, arsuri solare.

Rezultatele pe care le avem în vedere vor contribui la evidențierea unor mecanisme celulare inter-relaționate în progresia patologiilor dermatologice cu mare incidență, având ca factor declanșator central stresul oxidativ. Un aspect important va fi acela al demonstrării unor efecte la nivel de celulă și moleculă semnal induse de complexe biologic active din plante indigene și deșeuri vegetale, pe baza carora se pot configura scheme terapeutice sau de prevenție relevante.

METODOLOGIA GENERALĂ A CECETĂRII

Materiale vegetale studiate

Salvia (Salvia off.) –este o plantă aromatică, usor picantă, din care se pot obține uleiuri esențiale cu un conținut bogat în cineol, borneol, tuiona, ce pot fi utilizate în tratamentul diferitelor afecțiuni, datorită multiplelor proprietăți antimicrobiene, antimutagenice, citotoxice, antifungice [Russo și colab., 2013]. Frunzele de salvie conțin cantități importante de compuși ca acidul tanic, acizi triterpenici (acidul oleic, acidul ursonic, acidul ursolic), acizi polifenolici (acidul rosmarinic), niacina, nicotinamida, flavone, glicozide flavonoidice, acid clorogenic, acid cafeic, substanțe estrogenice [Behradmanesh și colab, 2013]. Frunzele de salvie, au proprietăți astringente și antiinflamatoare, datorită conținutului bogat în acid ursolic și rosmarinic, extractul de salvie fiind des utilizat pentru tratarea inflamațiilor ușoare cutanate sau inflamațiilor de origine bacteriană de la nivelul pielii [Baricevic și colab., 2001]. Pe lângă acești compuși triterpenici, în urma procedeelor de extracție se obține și un compus secundar bogat în pigmenți carotenoidici, clorofilieni, lipide, etc.

Brusturele (Arctium lappa), este o plantă utilizată atât în alimentație (Japonia) cât și în medicina tradițională pentru proprietățile sale curative în diferite afecțiuni (diabet zaharat, afecțiuni cutanate – dermatite, eczeme, acnee). Efectele sale benefice se datorează metaboliților secundari bioactivi de tipul flavonoidelor și lignanilor. Studii farmacologice indică proprietăți hepatoprotectoare, antiinflamatoare, antiradicalice atribuite derivaților acidului clorogenic conținut de rădăcinile de brusture [Predes și colab., 2011]. Din punct de vedere al compoziției fitochimice, brusturele este o plantă bogată în: uleiuri volatile, lignani (actigenina – izolată din frunze, semințe și rădăcini), lactone sesquiterpenice, derivați ai acidului cafeic (acid clorogenic și isoclorogenic – izolați din tulpina, frunze, și coaja rădăcinii), polizaharide, compuși terpenici (izolați din fructele de brusture), taninuri [Al-Snafi, 2014].

Alunul (Corylus avellana) este o plantă bogată în acizi grași nesaturați, minerale esențiale (potasiu, calciu, magneziu, seleniu), complex de vitamina E și B, steroli, compusi fenolici, tocoferoli. Prezintă un puternic efect antioxidant, cardioprotector, anticancerigen, antimicrobian [Schmitzer și colab., 2011]. Studiile arată că alunul prezintă un conținut bogat de acizi benzoic și cinamic, care stimulează producerea de taxol (paclitaxel) la nivelul diferitelor linii celulare, aceasta fiind corelată cu creșterea activității antioxidante. Taxolul este un alcaloid diterpenic și este unul dintre cele mai utilizate medicamente în tratamentul cancerului ovarian, de sân și plămâni [Oliveira și colab., 2008].

Solanum lycopersicum (tomate) fac parte din familia Solanaceae și sunt cunoscute ca fiind surse importante de compuși fenolici, antioxidanți, pigmenți, alcaloizi steroidieni, flavonoide totale, carotenoide și clorofilă. Compușii fenolici din fructele de tomate, sunt asociați cu capacitatea lor antioxidantă și de asemenea, ei previn schimbările oxidative de la nivel celular prin reducerea nivelului de radicali liberi. Plantele de tomate (frunzele de Lycopersicum esculentum Mill., Solanaceae) conțin un amestec complex de substanțe bioactive, cum ar fi fenolii, alcaloizii și carotenoidele. Acești compuși ar putea fi o resursă mai acceptabilă de inhibitori enzimatici, deoarece anumiți compuși fenolici s-au adresat deja unor activități biologice remarcabile, incluzând capacitatea de a inhiba colinesterazele (ChEs) și/sau α-glucozidază și α-amilază [Helmja și colab., 2008].

Extractul de tescovină din Vitis vinifera – deșeuri din vinificație (TES): Tescovina este deșeul vegetal rezultat din procesul de vinificație (coji, sâmburi, codițe) și este o sursă importantă de compuși polifenolici (derivați ai acidului hidroxicinamic și acidului hidroxibenzoic, flavonoide, antociani, taninuri, proantocianidine, stilbeni) [Agustin-Salazar și colab., 2014]. Dintre acestea, flavonoidele sunt cele mai abundente și studiate pe scară largă, cu proprietăți biologice, incluzând activități antioxidante, antiinflamatoare, anti-canceroase, antimicrobiene, antivirale, cardioprotectoare, neuroprotectoare și hepatoprotectoare.

Trifoiul roșu (Trifolium pratense L.) este cunoscut în practica etnomedicinală, pentru proprietățile sale estrogenice în special, fiind utilizat în tratamentul bronșitelor, arsurilor, în vindecarea rănilor, sindromul ovarului polichistic, afecțiunilor cardiace, diabetului sau ca laxativ [Kolodziejczyk-Czepas, 2016]. Din punct de vedere al compoziției fitochimice, extractul de trifoi este o sursă importantă de fitoestrogeni, metaboliți secundari din plante ce pot mima sau modula acțiunea estrogenilor endogeni. Au fost identificate trei clase de fitoestrogeni: izoflavone, cumestroli și lignani. Elementele structurale esențiale pentru acțiunea estrogenică a izoflavonelor sunt nucleele fenolice și grupările hidroxil din anumite poziții. Formononetinul și biocanina A sunt cele mai abundente izoflavone din extractul de trifoi, dar se mai regăsesc în concentrații mai mici și alte izoflavone ca daidzeina și genisteina. Pe lângă activitatea lor estrogenică, izoflavonele au și proprietăți antioxidative, extractul de trifoi fiind adesea utilizat în tratamentul eczemelor, tusei convulsive, astmului, afecțiuni oculare [Sazdanić și colab., 2018].

Principiile active studiate au fost obținute prin procedee de extracție standardizate dezvoltate anterior în laboratoarele Biotehnos din speciile de Salvia officinalis, Corylus avellana, Arctium lappa, Solanum lycopersicum, asocieri de biocomponente din Vitis vinifera (deșeuri de vinificație – tescovina) – și fitoestrogeni din Trifolium pratense.

Tabel nr. Y. Descrierea extractelor vegetale testate

Material biologic utilizat în studiile experimentale

Pentru demonstrarea efectului terapeutic al fitocompușilor conținuți de extractele bioactive studiate, testele in vitro s-au realizat pe linii celulare standardizate relevante:

Linia celulară HaCaT (keratinocit uman normal) []. Keratinocitele sunt celule scuamoase epiteliale, cu un potențial regenerativ marcant, ce suferă un proces de diferențiere pe parcursul migrării sale de la nivelul stratului bazal germinativ până la stratul cornos, descuamativ. Acest tip celular păstrează caracteristicile specifice zonei din care a fost recoltat, astfel că, în regiunea palmelor și a tălpilor, acesta prezintă o structură unică, prezentă doar în aceste zone. Datorită faptului că celulele umane nu-și modifică proprietățile în cultură, păstrându-și capacitatea de diferențiere, după recoltare și creșterea pe mediul de cultură, keratinocitul poate fi transplantat în orice altă regiune a corpului, el conservându-și proprietățile originale, specifice locului de unde a fost prelevat [Boukamp și colab., 1988].

Linia celulară normală HS-27 (Fibroblast dermic) []. Fibroblaștii sunt celule cu capacitate proliferativă mare, culturile celulare ajung la confluență relativ repede, (80% confluență în 3 zile). În monocultură, fibroblaștii formează clustere. Principala funcție a fibroblaștilor este menținerea integritățtii structurale a țesutului conjunctiv prin sinteza componentelor matricei extracelulare și, în special, a colagenului de tip I și II. La nivel local și extrapolat la nivel sistemic, celulele sunt expuse, în condiții patologice, la stimuli exogeni/ endogeni nocivi, generatori de stres oxidativ și procese inflamatorii care contribuie la menținerea și evoluția stării de dezechilibru homeostatic [].

Linia celulară HUVEC (celule endoteliale). Celule endoteliale normale prelevate din vena ombilicală umană sunt de origine micro-vasculară și sunt utilizate la studii de transport macromolecular, coagularea sangelui, fibrinoliza; sunt responsabile de stimularea citokinelor la exprimarea moleculelor de adeziune celulară, având rol în angiogeneza tumorală, vindecarea rănilor, inflamație [].

Linia celulară B16-F10 (melanom murin) – sunt celule producatore de melanină din țesutul epitelial murin, cu rată mare de supraviețuire posttransplantare in vivo. Datorită proprietății lor de metastazare în piele, plămâni și splină, sunt utilizate în studiile de elucidare a mecanismelor metastatice. Din punct de vedere al aspectului, sunt celule de culoare gri deschis (datorita melaninei), cu forma poliedrica [].

Tabel nr. Y. Condiții de cultivare a liniilor celulare utilizate în cadrul studiilor experimentale

Reactivi și echipamente

Tabel nr. Y: Reactivi și soluții utilizate în protocoalele de lucru aplicate

Tabel nr. Y: Kit-uri utilizate în metodele analitice

Tabel nr. Y: Echipamente și materiale utilizate

METODE UTILIZATE ÎN DEZVOLTAREA MODELELOR EXPERIMENTALE

TESTAREA EXTRACTELOR BIOACTIVE APICÂND METODE ANALITICE ÎN SISTEM ACELULAR

Evaluarea statusului antioxidant total (TAS)

Principiul metodei:

Metoda de analiză a capacității antioxidante echivalent-Trolox (TEAC), a fost dezvoltată de Miller și colab. în 1993 [Miller și colab., 1993] și este cea mai des întâlnită metodă colorimetrică de determinare a statusului antioxidant total utilizând radicalul ABTS (2,2’-azinobis (3-etilbenzothiazolin-6-sulfonic acid). La expunerea la peroxidul de hidrogen, metmioglobina și methemoglobina sunt activate la forma de feril. Aceste specii sunt reduse înapoi la metmioglobină sau methemoglobină cu agenți reducători (donori de electroni sau de hidrogen). În dezvoltarea acestei metode s-a avut în vedere exploatarea activității peroxidazice a metmioglobinei, combinată cu interacțiunea sa cu un compus fenotiazinic și cu peroxid de hidrogen, formând radicalul cationic cu durata de viață relativ îndelungată, ABTS•+:

HX-FeIII + H2O2 X-[FeIV=O] + H2O

ABTS + X-[FeIV=O] ABTS*+ + HX-FeIII

unde: HX-FeIII – metmioglobin

X-[FeIV=O] – ferilmioglobin

ABTS – 2,2’-Azino-di-[3-etilbenztiazolin-6-sulfonat]

Un număr mare de radicali liberi, cum ar fi radicalul hidroxil, peroxil, alcoxil și radicalii anorganici, reacționează rapid cu ABTS pentru a forma această specie. Când peroxidaza este metmioglobina, formarea radicalului cationic ABTS•+ din interacțiunea cu metmioglobina ferilica are maxime de absorbție la 650, 734 și 820nm, dincolo de regiunea de absorbție a proteinelor hem. Forma cationica a radicalului oxidat este verde in solutii apoase, iar captarea radicalior o transforma in solutie incolora. În prezența reducatorilor antioxidanți și donori de hidrogen, în soluția pură sau în plasmă, absorbanța acestui radical cationic este scazuta într-o măsură legată de capacitatea antioxidantă a fluidului adăugat (în absența compușilor interferenți). Principalii compusi de apărare antioxidanta din plasmă includ ascorbatul, proteinele tiolice, bilirubina, uratii și α-tocoferolul. De asemenea, plasma conține antioxidanții "preventivi", caeruloplasmina și transferina, proteinele care scot fier, a căror contribuție la capacitatea antioxidanta totala este de a preveni disponibilitatea fierului.

Mod de lucru:

In vederea obtinerii radicalului stabil de culoare albastru-verzui ABTS•+ ce poate fi cuantificat prin masurarea absorbantei la = 600 nm, se incubeaza o solutie de ABTS si H2O2, in prezenta peroxidazei. În această analiză, 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazol-6-sulfonat) (ABTS) este incubat cu metmioglobina și peroxidul de hidrogen pentru a produce ABTS•+. Această specie este de culoare albastru-verzui. Antioxidanții prezenți în proba determină o reducere a absorbției proporțională cu concentrația lor. Valoarea capacitatii antioxidante totale a probelor testate este exprimată ca echivalent de concentrație milimolară a soluției Trolox.

Evaluarea potentialului antiradicalic – metoda de reducere a radicalului DPPH (1, 1-DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZYL)

Principiul metodei:

Printre metodele de cuantificare a capacitatii andioxidante, se numara metoda ce foloseste radicalul liber, stabil DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), descrisa de Blois (1958). Aceasta este, de asemenea, o metoda spectrofotometrica rapidă, simplă și ieftina în comparație cu alte modele de testare. Molecula DPPH este caracterizata ca fiind un radical liber stabil în virtutea delocalizării electronului de rezervă peste molecula ca întreg, astfel încât molecula să nu dimerizeze, cum ar fi cazul majorității celorlalți radicali liberi.

Figura .Mecanismul reactiei de reducere a radicalului liber DPPH..

Delocalizarea de electroni, de asemenea, dă naștere la culoarea violet profund, caracterizata printr-o bandă de absorbție în soluție alcoolică centrata la aproximativ 517 nm si devine incolora sau galben pal cand este neutralizat.

Mod de lucru:

S-a folosit drept control o solutie de 1 mg/ml Vit C in apa. Rezultatele sunt prezentate ca % de inhibiție calculat cu formula:

% Inhibiție = (ADPPH –Aproba)/ADPPH )*100

unde: ADPPH – absorbanța DPPH în absența substanței de testat

Aproba – absorbanța probei minus absorbanța blank-ului ce conține proba

Determinarea activitatii pro si antioxidante a extractelor prin chemiluminiscenta

Principiul metodei:

Chemiluminiscenta (CL) este un proces fizico-chimic in care in urma unei reactii chimice exergonice se elibereaza energie sub forma de lumina. Acest proces face parte din clasa proceselor de luminiscenta ce au ca scop relaxarea moleculelor aflate pe stari energetice excitate, in stare fundamentala.

Principiul fundamental al testelor de chemiluminiscenta, se bazeaza pe reactia oxidantilor radicalici cu compusi de marcare pentru a produce specii in stare excitata ce emit chemiluminiscenta. Orice compus ce reactioneaza cu radicalii liberi, inhiba producerea luminii. Sursele oxidante de radicali peroxil, includ peroxidaza din hrean si hemin-H2O2. []

Aparitia unor emisii chemiluminiscente (CL) in timpul unor reactii chimice este cunoscuta de mult timp si este strans legata de formarea unor radicali liberi intermediari. Astfel chemiluminiscenta a fost observata in cursul oxidarii hidrocarburilor policiclice aromate, dar mai ales a reactiei apei oxigenate cu o gama de compusi: cum sunt aminoacizii, proteinele, omogenatele din ficat, riboflavina, polifenolii. In procesele mentionate H2O2 este un component, iar al doilea pare sa fie una din speciile de compusi oxidabili de tip tirozina, riboflavina, polifenoli.

Cel mai utilizat marker pentru captarea oxidantilor si pentru conversia emisiilor slabe in emisii de lumina intense, stabile si prelungite, este luminolul. Si alti compusi ca lucigenina, proteinele bioluminiscente ca Pholasin, sunt tot mai des utilizati ca markeri luminiscenti.

In literatura se folosesc mai multe sisteme generatoare de chemiluminiscenta: luminol – H2O2 , ftalhidrazida – H2O2, acridina radiolizata – KO2, acridina radiolizata – NaOH. Intensitatea semnalului chemiluminiscent depinde de: natura si concentratia reactantilor, pH-ul mediului, temperatura mediului, volumul de proba.

Cuplul generator cel mai frecvent utilizat este luminol – apa oxigenata. Emisia de lumină apare atunci când substratul chemiluminiscent, luminol este oxidat de către apa oxigenată, într-o reacție catalizată de către HRP (peroxidaza din hrean). Producerea luminii continue depinde de generarea constantă de intermediari ai radicalilor liberi derivați din luminol si oxigen, produs în reacția de descompunere a apei oxigenate catalzată enzimatic.(fig. X).

Fig. X. Mecanismul reactiei de chemiluminiscenta. (adaptare după…..)

Mod de lucru

Caracterul pro sau antioxidant se determina prin introducerea in sistemul generator de chemiluminescenta a unei substante si urmarirea variatiei intensitatii semnalului chemiluminescent. Daca intensitatea semnalului chemiluminescent a probei analizate este mai mare decat semnalul chemiluminescent a martorului, proba respectiva are caracter prooxidant, in schimb daca intensitatea semnalului chemiluminescent a probei analizate este mai mica decat semnalul chemiluminescent al martorului proba are caracter antioxidant. Semnalul este inregistrat si serveste la stabilirea evolutiei semnalului chemiluminescent in timp, curba fiind de tipul CL = f(t).

Evaluarea cantitativa a activitatii antioxidante (AA%) sau a stingerii chemiluminescentei se determina cu relatia:

% AA =

unde: I0 – intensitatea semnalului martorului

I – intensitatea semnalului probei

METODE DE TESTARE IN VITRO A EXTRACTELOR BIOACTIVE IN SISTEME CELULARE TINTA

Studii de citotoxicitate

Evaluarea efectului citotoxic se realizeaza prin stabilirea corelatiei dintre scaderea viabilitatii celulare (testul MTS) si cresterea activitatii enzimatice in mediul de cultura (testul LDH). Aceasta metoda se bazeaza pe degradarea membranei celulare, determinand eliberarea de citoplasma in mediul extracelular ca urmare a expunerii celulelor la actiunea compusilor/ produsilor testati.

Eliberarea lactat-dehidrogenazei în mediu celular, marker de citotoxicitate.

Principiul metode:i

Lactat-dehidrogenaza (LDH) este o enzimă citosolică prezentă în toate celulele, care în condiții fiziologice normale ale membranei plasmatice rămâne în citoplasmă. Eliberarea în vitro a LDH asigură o modalitatea precisă de măsurare a integrității membranei celulare și, implicit, a viabilității celulelor [1]. Eliberarea LDH în supernatantul culturii celulare se măsoară printr-un test în care au loc două reacții enzimatice cuplate, catalizate de LDH și diaforaza, ce determina conversia unei sari de tetrazolium într-un compus roșu de formazan [2].

Fig.1: Reactia de eliberare a LDH. Eliberarea LDH in supernatantul culturii celulare se masoara printr-un test de 30 min, in care au loc doua reactii enzimatice cuplate, catalizate de LDH si diaforaza, ce determina conversia unei sari de tetrazoliu (INT) intr-un compus rosu de formazan. Cantitatea de celule lizate este proportionala cu cea de compus rosu format.

In scopul testarii efectului citotoxic al unui ingredient/ compus de testat asupra unei culturi celulare, celulele sunt expuse la concentratii crescatoare ale respectivelor produse, pe o anumita perioada de timp, in functie de caracteristicile metabolice ale celulelor folosite in testari.

Mod de lucru:

Experimentul se realizeaza in placi de 92 godeuri, in care sunt distribuite celulele cu o densitate de 7000 celule/godeu, astfel incat in fiecare placa sa existe probe in triplicat pentru fiecare concentratie de produs testat, martor celular in triplicat si martor de mediu in triplicat. Se incubeaza timpi diferiti in absenta si apoi in prezenta ingredientului/ compusului de testat, in functie de tipul de celula pe care se lucreaza/ produsul de testat, de la cateva ore pana la cateva zile.

La sfarsitul perioadei de incubare se scot cate 25 µl de supernatant din fiecare godeu si se transfera pe o alta placa de 96 godeuri cu partea de jos plata, se adauga 25µl din substratul reconstituit in fiecare godeu, se incubeaza la intuneric si la temperatura camerei timp de 30 minute. Se adauga apoi 25 µl de Stop Solution din kit in fiecare godeu si se citeste absorbanta la 490 nm intr-un interval de maxim 1 ora de la stoparea reactiei.

Pentru calcularea rezultatelor si obtinerea curbelor de citotoxicitate, se scad valorile medii de absorbanta obtinute pentru triplicatul de mediu fara celule (background) din valorile de absorbanta medii ale triplicatelor fiecarei probe in parte, inclusiv ale martorului celular netratat si se calculeaza raportul proba/ martor care se reprezinta grafic in functie de concentratiile probei testate.

Reducerea MTS, marker al viabiltatii celulare

Unul din parametrii utilizati pentru aceasta metoda colorimetrica este activitatea metabolica a celulelor viabile. Distrugerea celulara este inevitabila ca rezultat al pierderii abilitatii celulei de a mentine si asigura energie pentru activitatea metabolica a functiei si cresterii celulei. Estimarea activitatii metabolice se bazeaza pe activitatea mitocondriala.

Principiul metodei:

Tratarea celulelor cu MTS, o sare de tetrazolium 3(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-H-tetrazoliu permite evaluarea metabolismului oxidativ si a raspunsului unei populatii celulare la factori externi ce pot avea un efect pozitiv sau negativ asupra vietii celulelor in cultura. Din acest motiv testul MTS este folosit in studiile de viabilitate și proliferare celulară []. Conversia MTS în formazanul solubil în apă are loc sub acțiunea enzimelor (dehidrogenaze) ce se găsesc în celulele metabolic active. Cantitatea de formazan produsă, măsurată ca absorbanță la 490 nm, e direct proporțională cu numărul de celule vii din cultura [].

Fig.2: Reactia de reducere a MTS

Mod de lucru:

Testul MTS se efectueaza in cadrul aceluiasi model experimental cu testul LDH, astfel: la cei 65µl supernatant ramasi in placa in care sunt celulele aderate, se adauga 10µl MTS, se incubeaza 2h la 37șC, in incubator, formandu-se un compus de culoare bruna. Se inregistreaza absorbanta la 490 nm si se aplica acelasi mod de prelucrare a datelor ca in cazul testului LDH.

Rezultatele obtinute se reprezinta grafic, curbele de toxicitate indicand astfel efectul compusului de testat asupra viabilitatii celulare (rezultatele testului MTS) si respectiv, citotoxicitatea acestuia (rezultatele testului LDH) in functie de concentratiile folosite. Astfel, prin corelarea testului MTS cu cel de eliberare a LDH se poate cuantifica corect efectul unui compus/ produs asupra viabilitatii celulare.

Determinarea activitatii enzimatice a catalazei

Principiul metodei:

Catalaza (EC 1.11.1.6) este o enzimă tetramerica importantă care acționează pentru a disocia peroxidul de hidrogen (H2O2) în oxigen molecular (O2) și apă (H2O). Catalaza are o greutate moleculara egală cu 250 kDa și constă din patru grupuri hemoproteine. Ca și alte enzime antioxidante, catalaza este de asemenea prezenta în plante și în celulele animale asemenea eritrocitelor, celulelor renale și celulelor hepatice [].

Catalaza exercita o actiune duala deoarece pe de o parte catalizeaza descompunerea H2O2 cu formare de H2O si O2 (activitate catalazica), iar pe de alta parte favorizeaza oxidarea donorilor de hidrogen (metanol, etanol, acid formic, fenoli) cu consumarea unui mol de peroxid (activitate peroxidazica).

Din punct de vedere cinetic, aceasta enzima are o comportare diferita de cinetica clasica tip Mihaelis Menten deoarece pe de o parte, nu este posibila saturarea enzimei cu substrat in cadrul domeniului de concentratii realizabil (pana la 5 mol/l), iar pe de alta parte are loc o inactivare rapida a catalazei la concentratii de H2O2 mai mari decat 0.1 mol l-1, cand complexul activ I enzima – H2O2 este convertit in complexele inactive II sau III. In acest caz, determinarea activitatii enzimatice la saturare cu substrat sau determinarea lui Ks este imposibila.

Descompunerea apei oxigenate este o reactie de ordinul I, a carei viteza este intotdeauna proportionala cu concentratia de peroxid. Ca urmare, pentru a evita o scadere rapida a vitezei initiale de reactie, determinarile sunt efectuate la concentratii de H2O2 relativ scazute (aproximativ 0.01 mol/l).

Reactia predominanta depinde de concentratia donorului de H si de viteza de producere a H2O2 in sistem.

2H2O2 Catalaza 2H2O + O2

Fe3+ + H2O2 k1 Complex I + H2O

Complex I + H2O2 k2 Fe3+ + H2O + O2

In ambele cazuri, se formeaza Complexul I catalaza activa-H2O2. Descompunerea H2O2, in care o alta molecula de H2O2 serveste ca donor de H pentru complexul I, prezinta o viteza de reactie foarte mare, in timp ce reactiile peroxidative sunt relativ lente.

Secretul unei bune determinari a activitatii catalazei este acela de a mentine concentratia de enzima suficient de mare astfel incat timpul de injumatatire pentru descompunerea peroxidului sa fie de 30s sau chiar mai mic. Avand in vedere faptul ca energia de activare pentru descompunerea H2O2, catalizata de catalaza, este foarte scazuta (2500-7100 kJ/mol), exista numai o slaba dependenta de temperatura (Q10 = 1.05-1.12). Descompunerea H2O2 urmeaza initial (circa 0-30s) o reactie de ordinul intai, concentratiile de H2O2 situandu-se in domeniul 0.01-0.05mol/l. Constanta de viteza (k) pentru reactia globala este data de:

k = s-1

unde t = t2-t1 reprezinta intervalul de timp masurat;

[S1] si [S2] reprezinta concentratiile de H2O2 la timpul t1 respectiv t2.

Constanta k poate fi utilizata ca o masura directa a concentratiei de catalaza. In studiile cu preparate enzimatice purificate, activitatea specifica (k1’) este obtinuta prin impartirea lui k cu concentratia molara a catalazei [E].

k1’ = k/[E] l*mol-1*s-1

Mod de lucru:

Activitatea catalazei in probele celulare a fost determinata conform protocolului descris de Aeby H [Aeby H, 1984] cu mici modificari, urmarind spectrofotometric scaderea absorbantei probelor la = 240nm, ca urmare a descompunerii sub actiunea catalazei a H2O2 in apa si oxigen. Pentru a evita inactivarea enzimei in timpul desfasurarii determinarilor (30s in mod obisnuit) si formarea de bule in cuva din cauza eliberarii de oxigen, este necesara utilizarea unor concentratii scazute de H2O2. Amestecul de reactie a fost format din 0.010ml lizat celular si 2.990 ml 10mM H2O2 (solutie preparata in tampon fostat 50mM, pH=7). Diferenta de absorbanta (A240) pe unitate de timp fiind o masura a activitatii catalazei. O unitate va descompune 1.0 μmol de H2O2/minut la pH 7.0 si 25°C.

Determinare activitate enzimatica superoxid dismutazei (SOD)

Principiul metodei:

Pentru evaluarea activitatii enzimatice a SOD s-a utilizat o metoda indirecta prin cuplarea reactiei de descompunere a anionului superoxid in prezenta SOD cu reactia de reducere a citocromului c de catre radicalul superoxid (produs enzimatic in reactia dintre xantina si O2)

O unitate enzimatica va scadea viteza de reducere a cytocromului c cu 50% intr-un sistem cuplat xantina/xantin-oxidaza.

Mod de lucru:

Pentru determinarea activitatii enzimatice a superoxid-dismutazei din lizate celulare, s-a aplicat protocolul de lucru de la Sigma, astfel: se prepara un cocktail de reactie din 23ml apa purificata, 25ml tampon fosfat, 1ml solutie EDTA, 1ml cytocrom C si 50ml solutie xantina, cu ajustarea pH-ului la 7.8 la 25°C. Amestecul de reactie se prepara astfel incat in 3ml de reactie, reactivii sa aiba urmatoarele concentratii: tampun fosfat-50mM, EDTA-0.1mM, 0.01mM Cytocrom c, xantina-0.05mM, xantin-oxidaza-0.005U, superoxid dismutaza-1U. Se prepara blankul ce contine cocktailul de reacttie si apa purificata), o proba fara inhibitor (test1) ce contine cocktailul de reactie si solutia de xantin oxidaza si o proba ce contine in plus inhibitorul (test2) (superoxid dismutaza din lizatul celular sau din sursa bovina). Se citeste absorbanta la 550nm la inceputul reactiei si se monitorizeaza timp de 5min modificarea absorbantei (ΔA).

Mod de calcul:

ΔA = (T5-T0)/5’

%Inhibitie = ((ΔAtest1- ΔAtest2)/ ΔAtest1) x 100

%Inhibitie – trebuie sa fie cuprins intre 40% – 60%

ΔAtest1 = 0.025÷0.005

Identificarea simultana a radicalilor oxigenati intracelulari (anion superoxid si apa oxigenata) prin citometrie in flux

Principiul metodei:

Metoda ce utilizeaza 2’, 7’ – diclorofluorescein diacetate (DCFH-DA) pentru a măsura producția de apă oxigenată, ce oxideaza proba nonfluorescenta la una fluorescenta ce este detectata prin citometrie in flux. DCFH-DA este incorporat in regiunile lipidice hidrofobe ale celulei, unde enzimele hidrolitice, scindeaza gruparile acetat, eliberand molecula nefluorescenta DCFH, captata apoi in celula datorita polaritatii sale. Dupa activarea celulara, NADPH oxidaza catalizeaza reducerea oxigenului molecular (O2) la anion superoxid (O2-) care este apoi redus la apa oxigenata. H2O2 impreuna cu peroxidazele au capacitatea de a oxida DCFH captat la DCF, compus puternic fluorescent la 530nm. Producerea fluorescentei verzi este proportionala cu cu cantitatea de apa oxigenata generata.

Hidroxietidina (HE) este utilizata pentru determinarea anionului superoxid si poate fi utilizat atat singur cat si in combinatie cu DCFH-DA. HE patrunde usor in membrana celulara, apoi este oxidat la bromura de etidiu, care este captata in nucleu prin intercalarea in catena ADN si emite la 620nm (PE_A).

Evidențierea, în coordonate FSC /SSC a populației celulare normale, apoi a subpopulațiilor respondente la activarea celulară a apei oxigenate (FITC –A), respectiv a anionului superoxid (PE-A), este reprezentata in figura de mai jos:

Fig. X. Evaluarea diferentiata, pe subpopulatii, a raspunsului celular la radiatia UV, prin compararea mediilor canalelor de fluorescenta FITC-A pentru cadranul Q1(sub-populatia marcata cu albastru) respectiv FITC-A si PE-A pentru cadranul Q2 (sub-populatia marcata cu rosu).

Exista 2 categorii de raspuns celular in ceea ce priveste formarea intracelulara a anionului superoxid si a apei oxigenate, ceea ce duce la diferentierea a 2 subpopulatii: una dintre ele caracterizata doar prin prezenta anionului superoxid, cu o granularitate scazuta (evenimentele albastre din reprezentarea punct cu punct), alta mai granulata ca morfologie si cu formare simultana de apa oxigenata si anion superoxid(evenimentele albastre din reprezentarea punct cu punct) .

Mod de lucru:

Acest protocol masoara simultan cantitatea de apă oxigenată (FITC – A mean), respectiv anionul superoxid intracelular (PE-A mean). Celulele se spala de trei ori cu tampon HBSS pentru a indeparta orice urma de mediu de cultura. Peste suspensia celulara se adauga mai intai 5µl de DCFH-DA 20mM si se incubeaza timp de 10 min. In acelasi tub se adauga 1µl HE si se incubeaza timp de 5min la 37șC. Se seteaza citomerul in flux astfel: pe filtrul de 488nm cu emisie la 525±20nm pentru DCFH-DA, respectiv 620nm pentru HE.

Evaluarea statusului inflamator: determinarea citokinelor (IL-6, IL-8, IL1-α) si evidentierea expresiei factorului pro-angiogenic VEGF

Principiul metodei:

Citometria in flux este un instrument de analiza care permite discriminarea diferitelor particule pe baza dimensiunilor si culorilor (semnalului fluorescent). Multiplexarea reprezinta analiza simultana a mai multor analiti intr-o singura proba. CBA –kitul utilizeaza o serie de particule cu intensitati de fluorescenta discrete pentru detectia simultana a mai multor analiti solubili (citokine inflamatorii). Fiecare particula (beads) din kit are o suprafata de captura pentru o proteina specifica. Beads-ii de captura, anticorpii de detectie conjugati si standardele recombinate sau probele de testat sunt incubate impreuna pentru a forma un complex de tip „sandwich” care se vizualizeaza in coordonate APC-A/PE-A in urma achizitiei de citometrie in flux [].

Kiturile utilizeaza pentru detectia analitilor solubili particule cu intensitati de fluorescenta diferite. Beads-ii de captura de o anumita intensitate de fluorescenta sunt legati de anticorpi specifici pentru o anumita proteina solubila, in cazul nostru IL1α si VEGF, respectiv citokine inflamatorii de tipul IL6, IL8, TNF-α.

Mod de lucru:

Citokinele inflamatorii si VEGF sunt analizate din supernatantul de culutra. Standardele de citokine precum si amestecul de beads-uri de captura a citokinelor, se prepara conform indicatiilor din protocolul de lucru al kit-ului.

In urma prepararii, diluarii standardelor si mixarii beads-urilor de captura, se transfera acesti reactivi impreuna cu probele de testat la tuburile de analiza corespunzatoare in vederea incubarii si analizei. Analiza rezultatelor si evaluarea cantitativa a interleukinelor prezente se face cu softul FCAP Beads Array.

Evaluarea expresiei proteice a VCAM-1 SI ICAM-1 prin studii de citometrie in flux

Principiul metodei:

In procesul de inflamatie la nivel vascular, celulele endoteliale sunt activate si exprima molecule cu rol in adeziunea monocitelor la endoteliu: VCAM-1 SI ICAM-1. Desi expresia ambelor molecule este crescuta in inflamatie, VCAM-1 are un rol predominant in initierea acestui proces. ICAM -1 este exprimat cu preponderenta in microvasculatura, lipsind in vene sau artere de mari dimensiuni.

Unul dintre cele mai elocvente teste „in vitro” privind efectul anti-inflamator la nivel vascular este evaluarea expresiei acestor doua molecule de adeziune in culturi de celule endoteliale standardizate (HUVEC), stimulate cu citokine (TNF-α) pentru a mima procesul urmarit.

Mod de lucru:

Celulele se desprind prin tripsinizare (Tripsina/ EDTA 0.1g%) si se marcheaza fluorescent cu anticorpii corespunzatori pentru ICAM-1 respectiv VCAM-1. Suspensia celulara se marchaza cu APC Mouse Anti-Human CD54 pentru evidentierea ICAM-1 (intracellular-adhesion molecule), se incubeaza la temperatura camerei, la intuneric timp de 20 minute, se spala cu 2 ml. Staining Buffer (BD Pharmingen) prin centrifugare, sedimentul se reia in 0.5mL Staining Buffer si se citeste la flow-citometru. Acelasi protocol de lucru se aplica si in cazul marcarii cu PE Mouse Anti-Human CD106 pentru evidentierea VCAM-1 (vascular-cell-adhesion molecule).

Rezultatele sunt achizitionate cu citometrul in flux FACS CANTO II si softul FACS Diva 6 sub forma de reprezentari „punct cu punct” pentru vizualizarea populatiei celulare si histograme de fluorescenta pentru evidentierea expresiei ICAM-1 (parametrul APC), respectiv VCAM-1 (parametrul PE). Rezultatele se analizeaza comparandu-se media canalului de fluorescenta APC, respectiv PE pentru probele achizitionate.

Evaluarea procesului de apoptoza celulara

Principiul metodei:

Determinarea cantitativa a procentului de celule apoptotice dintr-o populatie celulara se bazeaza pe pierderea asimetriei membranare – fenomen caracteristic stadiului timpuriu al apoptozei. Fosfatidil-serina membranara este translocata din interior catre exteriorul membranei plasmatice. Metoda utilizeaza Anexina V- o proteina care se leaga cu mare afinitate de fosfatidil serina externalizata in celulele apoptotice. Anexina V este cuplata cu FITC- in vederea detectiei fluorescente. Iodura de propidiu (PI) este utilizata pentru a distinge celulele viabile de cele non-viabile, doar celulele moarte putand fi permeabile pentru acest colorant.

Mod de lucru:

Celulele, cultivate conform protocolului experimental, se desprind de pe suport prin tripsinizare si se transfera 1×105 celule intr-o eprubeta pentru citometru in flux. Se spala de 2 ori cu PBS (FACS flow) rece (prin centrifugare la 1200rpm, 5 min, 5oC, indepartarea supernatantului si resuspendare). Celulele se resuspenda in 100µl tampon de legare din kitul de detectie, diluat de 10 ori. Se adauga 5 µl Anexina si 5µl iodura de propidiu. Se vortexeaza usor si se incubeaza timp de 15 minute la temperatura camerei, la intuneric. Se adauga 400 µl tampon de legare diluat de 10 ori la fiecare tub. Probele se achizitioneaza la citometrul in flux BD FacsCantoII, nu mai tarziu de o ora de la marcare.

Dupa selectarea populatiei celulare de interes in coordonate FSC / SSC (informatii la nivel de dimensiune / granularitate), analiza evenimentelor caracteristice apoptozei se realizeaza dupa urmatoarele criterii:

Se traseaza histograma in coordonata FL1 care ofera informatii despre marcarea specifica;

Se traseaza coordonatele FL1/FL2 in sistemul de analiza ”dot plot”, prin care se vizualizeaza celulele in 4 stadii de evolutie: vii, apoptoza timpurie, apoptoza tarzie, necroza – datorita dublei marcari cu anexina – FITC (apoptoza timpurie si tarzie – externalizarea fosfatidil-serinei) si cu PI (moarte celulara cu distrugerea membranei, necroza). Se selecteaza un marker, acelasi pentru fiecare proba analizata, care delimiteaza patru cadrane corespunzatoare celor 4 stadii mai sus mentionate ale celulelor, cu ajutorul caruia se obtin date obiective privind procentul de celule din fiecare cadran al diagramei.

Se traseaza histograma de fluorescenta corespunzatoare marcarii cu fluoroforul de interes (Anexina V-FITC)

Procentul de celule vii ( negative atat la marcarea cu anexinaV, cat si cu PI), in apoptoza timpurie (pozitive la marcarea cu anexinaV-FITC, negative la marcarea cu PI), in apoptoza tarzie (pozitive atat la marcarea cu anexinaV, cat si cu PI), moarte prin necroza (negative la marcarea cu anexina V, pozitive la marcarea cu PI – se determina in analiza, cu softul de citometrie Diva 6 sau cu alt soft specific.

Testarea in vitro a capacitatii proliferative prin evidentierea generatiilor celulare succesive prin marcare fluorescenta cu CFSE

Principiul metodei:

CFSE (carboxy fluorescein diacetat succin imidil ester ) este un colorant incolor, nefluorescent care difuzează pasiv în celulă. Aici , gruparea di-acetat este scindată de către esterazele intracelulare, rezultând forma puternic fluorescentă a compusului. Aceasta reacționează cu aminele intracelulare, formând conjugați fluorescenți care sunt reținuti în celulă. În timpul diviziunii celulare acești conjugați fluorescenți sunt distribuiți egal între celulele fiice, permițând rezoluția generațiilor celulare formate succesiv până la 8 cicluri de diviziune. Intensitatea de fluorescență scade pe masură ce generațiile sunt mai indepărtate de populația mamă. Rezultatele se estimează ca Indice de Proliferare sau ca variație a procentului de celule în populația mamă.

Mod de lucru:

După marcarea cu CFSE 1µM (incubare 15 min. la 37oC, spălare cu mediu bogat în proteine pentru îndepărtarea colorantului din mediul extracelular), celulele se cultivă în prezența substanțelor de testat (24, 36, 48 h. – conform protocolului specific). La finalul cultivării se analizează prin citometrie în flux încorporarea colorantului fluorescent în generațiile succesive de celule. Intensitatea de fluorescență a CFSE se achiziționează sub forma semnalelor emise de fotomultiplicatorii de tip fluorescență verde FITC – A, generația 0 având intensitate maximă de fluorescență. Se utilizează reprezentări de tip punct cu punct (în coordonate de fluorescență și granularitate) sau histogramă (pe fluorescență emisă de CFSE), ambele evidențiind subpopulațiile corespunzătoare generațiilor în diviziune.

În contextul analizei acțiunii unor compuși asupra proliferării celulare, este important de comparat Indicele de Proliferare care reprezintă suma celulelor din fiecare generație împărțită la numărul calculat al celulelor din generația părinte. Modificarea acestui indice este un parametru semnificativ al actiunii antitumorale a unui produs medicamentos. Datele de citometrie in flux obtinute in urma achizitiei si prelucrarii primare a datelor cu soft-ul DIVA, sunt evaluate statistic cu soft-ul specializat FCS Express – modulul pentru proliferare.

Analiza secventialitatii ciclului celular

Principiul metodei:

Citometria în flux oferă posibilități de investigare și monitorizare a secvențialității ciclului celular și a cineticii celulare specifice pentru populații de celule normale și transformate malign. Măsurătorile și analiza cantității ADN prin citometrie în flux furnizează cea mai modernă metodă pentru obținerea distribuției celulelor în diferite faze ale ciclului celular. Spre exemplu, într-o populație tumorală existentă unui procent mare de celule în faza de sinteza S, implică o proliferare rapidă a populației de celule transformate malign.

Dizolvarea membranei celulare cu un detergent neionic, eliminarea citoscheletului si a proteinelor nucleare cu tripsina, digestia enzimatica a ARN celular si stabilizarea cromatinei nucleare cu spermina. Iodura de propidiu (PI) este legata stoichiometric la ADN purificat, care este apoi analizat cu ajutorul citometriei in flux. Nucleii marcati cu PI emit fluorescent la lungimi de unda intre 580 si 650 nm. Detectorul FL2 este utilizat pentru a analiza lumina emisa intre 564 si 606 nm de catre celulele marcate. Histogramele rezultate pot fi analizate pentru a detecta prezenta anomaliilor ADN (aneuploidie).

Mod de lucru:

Se spala suspensia de celule (centrifugare la 400xg 5 min la temperatura camerei);

Se adauga 250 μL Solutie A la fiecare tub si se agita usor manual; se incubeaza 10 min;

Se adauga 200 μL Solutie B la fiecare tub si se agita usor manual; se incubeaza 10 min

Se adauga 200 μL Solutie C (racita pe gheata) la fiecare tub si se agita usor manual. Se incubeaza 10 min la intuneric pe gheata. Se analizeaza intr-un interval de 3 ore dupa marcare pe BD FACSCanto II.

Metoda analitica de evidentiere a nivelului de diferentiere celulara

Principiul metodei:

Prin aceasta metoda se urmareste evidentierea gradului de diferentiere a keratinocitelor in cultura (linia celulara HaCaT) si a nivelului de proliferare in stadii timpurii de maturitate a keratinocitelor sub actiunea unei substante de testat.

Mod de lucru:

celulele se resuspenda intr-un ml de PBS rece la care se adauga 100µl de solutie paraformaldehida 4% timp de 15 minute, 4șC;

se spala suspensia cu PBS cu 0,2%Tween 20 prin centrifugarea 5minute, 1000rpm;

se adauga 100µl de agent de permeabilizare, se incubeaza timp de 15 minute, 4șC;

se spala suspensia cu PBS cu 0,2%Tween 20 prin centrifugarea 5minute, 1000rpm;

se blocheaza situsurile de legare nespecifice prin adaugarea de 5% ser sau BSA, timp de 15-30minute;

se spala suspensia cu PBS cu 0,2%Tween 20 prin centrifugarea 5minute, 1000rpm;

se adauga cantitatea corespunzatoare de anticorpi si se incubeaza suspensia timp de 15-45 minute, 4șC;

se spala suspensia cu PBS cu 0,2%Tween 20 prin centrifugare 5minute, 1000rpm;

se resuspenda celulele in 300µl PBS rece pentru achizitie prin citometrie in flux.

Metode analitice de evaluare a homeostaziei matricei proteice structurale

Evaluarea cantitativa a colagenului biosintetizat in cultura – prin determinarea hidroxi-prolinei rezultate in urma hidrolizei colagenului din mediul de cultura

Principiul metodei:

Metoda consta in determinarea colorimetrica a hidroxiprolinei, dupa o hidroliza totala a lanturilor polipeptidice. Hidroxiprolina eliberata prin hidroliza este oxidata la pirol cu ajutorul agentului oxidant cloramina B, iar pirolul formeaza cu p-dimetilaminobenzaldehida un cromofor cu maxim de absorbtie in domeniul 555-560 nm.

Mod de lucru:

Determinarea colorimetrica a hidroxiprolinei s-a facut dupa metoda Woessner, modificata de noi astfel: probele s-au hidrolizat in acid percloric 72%, la 1200C, timp de 7 ore. Dupa hidroliza, pH-ul probelor s-a ajustat la 6,0 cu o solutie de NaOH 2N. Amestecul de 1 mL proba cu 1 mL solutie cloramina B (0,352g cloramina B, 7,5 mL alcool isopropilic, 5 mL apa distilata, 12,5 mL tampon citrat, pH 6,0) se agita si se mentine la temperatura camerei 20 minute. In final, s-a adaugat 1 mL solutie p-DMABA si eprubeta de testare s-a incubat 30 minute la 600C. Dupa racire s-a citit absorbanta probelor la 560 nm, cu un spectrofotometru CECIL 1020. Valorile hidroxiprolinei au fost determinate de pe o curba standard, utilizând concentratii de hidroxiprolina intre 0,0 si 10 µg/mL. Cantitatea de colagen s-a determinat tinând cont ca 1 mg de colagen contine, in medie, 0,122 mg hidroxiprolina.

Dozare colagen intracelular si proteine totale prin colorare cu kit-ul SIRIUS RED/ FAST GREEN

Principiul metodei:

Sirius Red se leagă în mod specific la structura elicoidală [Gly-X-Y]n a colagenului fibrilar, cum ar fi colagenul de tip I la V și se utilizează pentru detectarea tuturor tipurilor și speciilor de colagen, în timp ce Fast Green se leagă de proteinele non-colagenoase. Prin exploatarea caracteristicilor unice ale acestor coloranti, kit-ul permite testarea semi-cantitativă pentru determinarea cantităților de colagen și proteine non-colagenoase în culturi celulare in straturi și secțiuni de țesut. Deoarece această analiză nu necesită solubilizare a colagenului, este folosită pe scară largă pentru măsurarea conținutul total de colagen în diferite țesuturi [].

Deoarece Sirius Red și Fast Green au absorbții la 540 nm și respectiv 605 nm, valorile OD ale coloranților extrași pot fi folosiți pentru calculul colagenului și a conținutului de proteine non-colagenoase în fiecare secțiune. Pentru studiile histologice generale în care sunt secțiuni de țesut cu 10-20 µm grosime, sensibilitatea analizei pentru colagen și proteine non-colagenoase este mai mare de 3 µg / secțiune și respectiv 50 µg / secțiune.

Mod de lucru:

Placile in care sunt cultivate celulele se mentin pe gheata pe tot parcursul testului. Se indeparteaza mediul de cultura, se spala de doua ori cu PBS rece, se fixeaza cu metanol mentinut la congelator aprox 1h; celulele se mentin la -20°C timp de aprox 30 min, se indeparteaza metanolul si se spala de doua ori cu PBS. Fiecare godeu se usuca foarte bine, astfel incat sa nu mai ramana urme de solutie de spalare.

Se coloreaza cu Sirius Red; pentru placile de 24 godeuri se adauga 200 µl colorant (trebuie sa se acopere complet intreaga suprafata a godeului). Se mentine 30 min la temperatura camerei, la intuneric, cu agitare. Se indeparteaza colorantul si se spala cu solutie de HCl 0.01 N (aprox 500µl). In aceasta etapa se pot face fotografii: cu roz se vad colora colagenul si cu verde proteinele.

Dupa indepartarea solutiei de HCl, se adauga 1ml NaOH 0.1 N, se transfera in cuve si se citeste absobanta la la spectrofotometru la lungimile de unda de 540 nm (colagen/Sirius Red) si la 605 nm (proteina non-colagenoasa/Fast Green).

Mod de calcul:

Pentru a calcula cantitatea de colagen, mai întâi, corectați valoarea Abs la 540 scăzând contribuția Fast Green la 540 nm, ceea ce reprezintă 29,1%din valoarea Abs la 605. Echivalența de culoare (valorile Abs / μg proteină) este 0,0378 pentru colagen și 0,00204 pentru proteina non-colagenoasa la λ=540nm și la λ=605nm.

µg colagen = [A540 – (A605*0.291)]/ 0.0378

µg proteina = A605/0.00204

Determinarea activitatii enzimatice a metaloproteinazelor matriceale (MMP) secretate in mediul de cultura

Principiul metodei:

Zimografia este o tehnica ce se bazeaza pe electroforeza in gel de poliacrilamida ce contine un substrat copolimerizat in matricea gelului. Metoda de estimare a concentratiei de gelatinaze (MMP2 si MMP9) din mediul conditionat ce se bazeaza pe capacitatea acestor enzime de a se renatura dupa migrarea electroforetica in geluri de poliacrilamida-SDS copolimerizate cu gelatina si indepartarea SDS-ului prin spalari repetate cu Triton X-100, enzimele exercitandu-si astfel activitatea proteolitica asupra substratului copolimerizat pe parcursul a 18 h de incubare la 37°C intr-un tampon de developare.Zimogramele sunt scanate si analizate semi-cantitativ prin densitometria benzilor proteice cu activitate enzimatica ce apar ca plaje de liza, iar identificarea tipului de MMP se realizeaza pe baza maselor moleculare.

Mod de lucru:

Prepararea gelului si migrarea electroforetica a probelor (2 geluri)

Se asambleaza gelulrile in sistemul de electroforeza, controlandu-se etanseitatea incintei superioare (se toarna prima data tamponul de migrare urmarind cu atentie daca exista scurgeri in incinta inferioara, dupa care se adauga tampon de migrare, pana la nivelul indicat pe tanc, functie de numarul de geluri).

Se incarca probele in godeuri.

Unitatea se acoperă cu capacul de protecție și se conectează firele la bornele pozitive, respectiv negative ale sursei de curent continuu. Se pornește sursa și se fixează la 20mA pentru 70 minute. Sursa se deconectează când frontul de migrare ajunge la marginea de jos a plăcilor.

Renaturarea zimogramei: Procesul de renaturare a zimogramei are ca scop îndepărtarea SDS-ului (provoacă inactivarea reversibilă a enzimei) cu ajutorul unei soluții de renaturare formată din 5% Triton x-100 (v/v) in apa distilată. Pentru eliminarea cantitativă a SDS este necesară menținerea gelului în această soluție timp de 80 minute la temperatura camerei.

Incubare peste noapte in tampon de developare: Gelurile vor fi lasate timp de 18 ore la 370C in tampon de developare

Gelurile se coloreaza cu solutia de colorare si se decoloreaza pana la observarea pe suprafata gelului a benzilor de liza incolore pe fundal albastru.

Pentru a stopa decolorarea gelurile se spala cu o solutie de acid acetic 2% in apa distilata – 2 incubari a cite 10 minute cu agitare usoara

REZULTATE SI DISCUTII

Studii de citotoxicitate: profil citotoxic al complexelor bioactive din Salvia officinalis, Corylus avellana, Arctium lapa, Solanum lycopersicum, Trifolium pratense, Vitis vinifera

Limitele de citotoxicitate, ale principiilor active studiate asupra liniilor celulare utilizate in modelele experimentale prezentate in cadrul acestui studiu, se evalueaza prin stabilirea corelatiei dintre scaderea viabilitatii celulare (testul MTS) si cresterea activitatii enzimatice in mediul de cultura (testul LDH). Protocolul de lucru este descris in cadrul capitolului 5 (metoda 5.2.1.)

Evaluarea citotoxicitatii compusilor luati in lucru, s-a realizat la nivelul liniilor celulare standardizate de fibroblast uman normal (HS-27), keratinocit uman (HaCaT), celule endoteliale normale (HUVEC), celule de melanom murin (B16-F10), in functie de actiunea tintita la nivel celular.

Rezultatele sunt prezentate in imaginile de mai jos, punctul de inflexiune in care activitatea metabolica scade sub indicatorul de toxicitate celulara fiind considerat limita de la care dozele de compus testat devin citotoxice.

Efect citotoxic la nivel de keratinocit uman normal – HaCaT

Celulele au fost lasate la aderat la o densitate de 7000 celule/ godeu timp de 24h., apoi tratate cu dilutii succesive de extract timp de 48h. Keratinocitele au fost tratate cu dilutii seriale din fiecare extract astfel: extractul SvU a fost testat in intervalul 0,5 – 32.5µM; extratul SvPG a fost testat pe un interval de concentratii procentuale cuprins intre 0,006% – 1%; extractele Br si Al au fost diluate intre 0,25 – 20 µl extract/ml; extractul sol-T a fost diluat pe domeniul 0,2 – 10 µg/ ml. Dupa marcare si citirea absorbantei, rezultatele au fost prelucrate matematic si s-a reprezentat grafic raportul dintre efectul probelor/ efectul solventului in functie de concentratia testata.

Fig. X. Evaluarea efectului citotoxic prin stabilirea corelatiei dintre scaderea viabilitatii celulare (testul MTS) si cresterea activitatii enzimatice in mediul de cultura (testul LDH), la nivel de keratinocit (HaCaT): a. Extract de salvie. cu continut de agliconi triterpenici – SvU; b. Extract de salvie standardizat in propilenglicol – SvPG; c.Biocomplexe cu continut ridicat de componente polifenolice din brusture – Br; d.Biocomplexe extrase din alun– Al; e.Extract de glicoalcaloizi steroidici obtinuti din deseuri de tomate – Sol-T.

SvU – manifesta efect citotoxic incepand cu doza 12,5 µM datorita edificarii diferentelor de absorbanta optica intre cei doi parametrii de viabilitate/ liza celulara.

SvPG – In intervalul de concentratii 0,1% – 0,006% nu prezinta actiune citotoxica asupra keratinocitelor datorita mentinerii la un nivel ridicat a MTS ca indicator biochimic al viabilitatii celulare concomitent cu stabilitatea structurala si fiziologica a membranei celulare dovedita prin absorbanta scazuta a parametrului LDH. Incepand cu concentratia de 0,1%, nivelul LDH creste semnificativ, concomitent cu scaderea absorbantei pentru MTS ceea ce denota reducerea viabilitatii celulare si dezintegrarea invelisului celular.

Br – prezinta tendinta citotoxica incepand cu o concentratie de 2.5 µl extract/ml mediu de cultura.

Al – Pragul de citotoxicitate este de 1,61 µl extract/ ml mediu, incepand cu aceasta doza evidentiindu-se o crestere a cantitatii de LDH eliberata in mediu, impreuna cu o reducere a MTS.

Sol-T – Extractele glicoalcaloidice din Solanum au fost solubilizate in DMSO, pornind de la un stock de concentratie maxima de 80mg/ml. S-au testat dilutii succesive, remarcandu-se un grad mare de toxicitate incepand cu concentratia de 0.8μg/ml cand activitatea metabolica celulara revine la normalul caracteristic martorului celular, eliberarea de lactat dehidrogenaza scazand considerabil.

Efect citotoxic pe linia celulara HUVEC (endoteliu vascular):

Celulele au fost lasate la aderat la o densitate de 7000 celule/ godeu timp de 24h., apoi tratate cu dilutii succesive de extract timp de 48h. Celulele endoteliale au fost tratate cu extractele vegetale in urmatoarele intervale de concentratii: SvU: 0,18µM – 40 µM; SvPG: 0,006% – 1%; Br si Al: 0,25 µl/ml – 10 µl/ml; Sol-T: 0,14 µg/ml – 3,5 µl/ml. Dupa marcare si citirea absorbantei, rezultatele au fost prelucrate matematic si s-a reprezentat grafic raportul dintre efectul probelor/ efectul solventului in functie de concentratia testata.

Fig. X. Profil citotoxicitate la nivel de endoteliu vascular (HUVEC): a. Extract triterpenic – SvU; b. Extract standardizat de salvie – SvPG; c. Biocomplexe din extract de brusture – Br; d. Biocomplexe din extract de alun– Al; e. Extract de glicoalcaloizi steroidici– Sol-T

SvU – prezinta efect citotoxic incepand cu o concentratie 12 µM, la nivelul celulor endoteliale HUVEC.

SvPG – In intervalul de concentratii 0,1% – 0,006% nu se evidentiaza actiune citotoxica a extractului de salvie asupra celulelor endoteliale HUVEC, 0,1% fiind limita citotoxica.

Br, Al – Asupra liniei celulare HUVEC biocomplexele nu au fost citotoxice pe un domeniu restrans de concentratii (0.25 ÷ 1 µl extract/ml mediu de cultura).

Sol-T – Pe domeniul de doze 0,14 ng – 0.7 ng/ml, nu s-a manifestat un efect citotoxic asupra culturii, activitatea metabolica a celulelor HUVEC fiind usor amplificata iar eliberarea de LDH a fost extrem de scazuta.

Efect citotoxic la nivel de fibroblast uman normal – HS-27

Celulele au fost lasate la aderat la o densitate de 7000 celule/ godeu timp de 24h, apoi tratate cu dilutii succesive de extract (SvU: 2-20µM; Br: 0,25-40µl/ml; Al: 0,25-5µl/ml; Sol-T: 0,02-0,5µg/ml; combinații de TES:ET 0,1–1µl amestec/ml) timp de 48h. Dupa marcare si citirea absorbantei, rezultatele au fost prelucrate matematic si s-a reprezentat grafic raportul dintre efectul probelor/ efectul solventului in functie de concentratia testata.

Fig. X. Evaluarea citotoxicitatii compușilor luați în studiu pe linia celulara standardizata HS-27 (fibroblasti dermici umani): a. Extract triterpenic – SvU; b. Biocomplexe din extract d e brusture – Br; c. Biocomplexe din extract de alun– Al; d. Extract de glicoalcaloizi steroidici– Sol-T; Complex antioxidant din tescovina asociat cu extract de trifoi rosu – TES:ET (e. TES:ET_A1 = 1:9; f. TES:ET_A2 = 1:5; g. TES:ET_A3 = 1:3; h. TES:ET_A4 – 2:9).

SvU – Limita de citotoxicitate este de 4 µM pe fibroblasti, remarcandu-se incepand cu aceasta doza, valori crescute ale eliberarii extracelulare de LDH si printr-o scadere a activitatii metabolice.

Br – tendinta citotoxica se manifesta pe o plaja mare de concentratii (0.25 ÷ 5 µl extract/ml mediu de cultura).

Al – se observa absenta unei stari proliferative induse asupra HS27 datorita faptului ca valorile obtinute la reducerea MTS sunt apropiate de valoarea martorului netratat.

Sol-T – prezinta activitate citotoxica incepand cu doza de 0,100 µg/ml

TES:ET – dintre cele 4 combinatii de complex antioxidant din tescovina asociat cu extract de trifoi rosu, A4 nu prezinta citotoxicitate la niciuna dintre dozele aplicate, celelalte 3 combinatii avand limita de citotoxicitate pe un interval apropiat de concentratii, respectiv 0.02 – 0.03µlextract/ml.

Efect citotoxic pe linia celulara B16-F10 (melanom murinic):

Celulele au fost lasate la aderat la o densitate de 7000 celule/ godeu timp de 24h., apoi tratate cu dilutii succesive de amestec extract TES:ET (0,1–1µl amestec/ml) timp de 48h. Dupa marcare si citirea absorbantei, rezultatele au fost prelucrate matematic si s-a reprezentat grafic raportul dintre efectul probelor/ efectul solventului in functie de concentratia testata.

Fig. X. Efectul citotoxic al complexului obtinut in urma acocierii extractelor de tescovina si trifoi asupra celulelor de melanom murinic: a. TES:ET_A1 = 1:9; b. TES:ET_A2 = 1:5; c. TES:ET_A3 = 1:3; d. TES:ET_A4 – 2:9

Tabel nr. Y. Concluzii limitele de citotoxicitate pentru biocomplexele studiate pe liniile celulare tinta:

Activitate antioxidantă/ antiradicalică a extractelor bioactive din Corylus avellana, Arctium lappa, Salvia officinalis, Trifolium pratense, Vitis vinifera studiate în sistem acelular

Speciile reactive de oxigen (SRO) sunt generate endogen în mod continuu în procesele celulare normale și exogen, de către factorii din mediul exterior. La concentrații fiziologice, radicalii liberi prezintă un rol esențial într-o serie de funcții biologice importante cum ar fi: acțiunea ca moleculă de semnalizare celulară; influențarea raspunsului celular; controlul viabilității celulare, migrației și diferențierii; protecția celulelor împotriva agenților patogeni și infecțioși prin inactivarea lor []. Un nivel de SRO mai ridicat decât cel fiziologic, cauzează un dezechilibru oxidativ-antioxidant și stres oxidativ, inducând astfel afecțiuni ca ateroscleroza, boli cardiovasculare, diabet, inflamații, îmbătrânire, leziuni cutanate, artrită reumatoidă și boli neurologice []. Când antioxidanții endogeni de natură enzimatică sau non-enzimatică, nu mai sunt capabili să înlăture SRO din corp, este esențial ca organismul să primească un aport de antioxidanți naturali exogeni de tipul acizilor fenolici, tocoferolilor, flavonoidelor, etc. care să își exercite efectul prin diferite mecanisme ca inhibiția cedării atomilor de hidrogen, legarea ionilor metalelor tranziționale, captarea radicalilor (rol de “scavenger”), dezintegrarea peroxizilor []. Unul dintre cei mai importanți factori care influențează capacitatea antioxidantă este abilitatea antioxidanților de a ceda electroni. Activitatea de captare a radicalilor liberi este foarte importantă datorită efectelor dăunătoare ale radicalilor liberi în sistemele biologice și in produsele alimentare. Agenții antiradicalici (scavengeri) pot reacționa direct cu radicalii liberi pentru a elimina radicalii peroxidici, îmbunătățind astfel stabilitatea și calitatea produselor alimentare și a medicamentelor, și pentru a termina reacțiile de peroxidare în lanț.

Pentru evidențierea capacității antioxidante/ antiradicalice a extractelor obținute prin aplicarea unor metode special concepute pentru izolarea cât mai eficientă a compușilor de interes din materialul vegetal, au fost realizate o serie de experimente în sistem acelular ce au vizat potențialul acestora de eliminare a speciilor reactive din mediul de testare.

Screening-ul antioxidant/ antiradicalic s-a realizat pentru urmatoarele extracte:

SvCC – Biocomplexe de pigmenți carotenoidici, clorofilieni din salvie

Br, Al -Biocomplexe cu conținut ridicat de componente polifenolice de tipul flavonoide, acizi polifenolcarboxilici și proantociani

ET – extract cu conținut ridicat de fitoestrogeni

TES – extract polifenolic obținut din tescovină (deșeuri de struguri)

În contextul investigării in vitro a potențialului efect al extractelor asupra stresului oxidativ, acțiunea antioxidantă/ antiradicalică a biocompușilor studiați în sistem acelular s-a realizat prin intermediul următoarelor metode analitice descrise în capitolul 2:

Determinarea concentrației totale de antioxidanți existenți în extracte – TAS ( metoda 5.1.1.)

Determinarea activității antiradicalice – metoda de reducere a radicalului DPPH (metoda 5.1.2.)

Determinarea activității antioxidante prin chemiluminiscență utilizând cuplul luminol-peroxidază (metoda 5.1.3.)

Determinarea activității antiradicalice utilizând radicalul liber DPPH:

Prin aplicarea metodelor de evaluare capacității antioxidante/ antiradicalice a biocomplexelor izolate din Corylus avellana (Al), Arctium lappa (Br), Salvia officinalis(SvCC), Trifolium pratense(ET), Vitis vinifera(TES) se urmărește verificarea obținerii de biocomplexe cu conținut ridicat de compuși cu activitate antioxidantă.

Capacitatea de captare a radicalilor DPPH este determinată prin măsurarea scăderii absorbanței (după ce au fost menținute 30 min, la întuneric) la lungimea de undă λ=520 nm (maxim de absorbție a DPPH-ului) ce este proporțională cu concentrația de radicali liberi reduși din soluție.

Fig. X. Evoluția absorbanței DPPH-ului în soluție metanolică în funcție de doza de extract Al (a.), Br (b.), SvCC (c.), ET (d.) și TES (e.) introdusă în sistem

Determinarea activității antioxidante prin chemiluminiscență utilizând cuplul luminol – peroxidază

Evaluarea cantitativă a activității antioxidante (AA%), prin urmărirea variației semnalului chemiluminiscent, s-a putut realiza doar pentru extractele Al și ET (extracte cu conținut ridicat de componente polifenolice, respectiv estrogenice), iar rezultatele obtinuțe sunt reprezentate în figura următoare:

Fig. X. Evaluarea activității antioxidante a extractelor Al și ET: a,c) evoluția semnalului chemiluminescent a probelor analizate comparativ cu a martorului de solvent propilenglicol; b,d) % stingerea semnalului chemiluminescent în prezența compușilor antioxidanți (AA%).

Tabel nr. Y. Evaluarea concentrației totale de antioxidanți și a efectului antioxidant/ antiradicalic

Datorită capacității sale de a reduce semnalul chemiluminescent al sistemului luminol – H2O2 – peroxidază, extractul Al poate fi utilizat atât ca scavenger pentru prevenirea stresului oxidativ prin captarea radicalilor liberi cât și ca antioxidant „preventiv” prin captarea ionilor metalelor tranziționale prevenind reacția Fenton. În plus conține cantitatea cea mai mare de antioxidanți (TAS – 197.75 mol/ml), spre deosebire de extractul de brusture Br cu o compoziție săracă în antioxidanți (TAS – 5.925).

În urma analizei matematice a datelor experimentale obținute prin aplicarea metodei de determinare a caracterului reducător s-a constatat o acțiune reducătoare a extractului SvCC (EC50 = 20.298 µg pastă/ml) asupra radicalului liber stabil DPPH. Tinând cont de faptul că extractul SvCC conține 5,065mg CuNa clorofilă/100 mg pastă, atunci în cele 19,102 µg produs/ml necesare reducerii DPPH-ului cu 50%, se regăsesc 0.968 µg/ml CuNa clorofilă, practic CuNa clorofilă este responsabilă de aproximativ 71,15% din răspunsul antiradicalic observat, restul aparținand altor componente ale complexului clorofilian.

În urma prelucrării datelor experimentale obținute prin aplicarea celor trei metode analitice, s-a constatat faptul că extractul de trifoi ET prezintă un conținut ridicat de antioxidanți, având în același timp și un efect puternic reducător asupra DPPH. Extractul TES, prezintă de asemenea un efect antiradicalic/ antioxidant prin reducerea radicalului liber DPPH (EC50 = 48 µl extract/ml), corelat cu cantitatea de antioxidanți regasită în extractul apos (TAS – 112.76).

Concluzii studiu:

Supraproducția de specii reactive de oxigen la nivelul țesuturilor, poate cauza leziuni ale ADN-ului și poate contribui la procese de mutageneza sau carcinogeneza. Mecanismele de apărare antioxidante ale organismului uman, nu sunt întotdeauna capabile să combată stresul oxidativ indus de SRO, de aceea este necesar un aport de compuși cu caracter antioxidant. Datorită proprietăților lor de autoapărare împotriva radiațiilor UV, plantele sunt tot mai des utilizate ca ingrediente naturale în produsele de protecție cutanată. []. Dintre cele cinci extracte bioactive evaluate din punct de vedere al capacității antioxidante/ antiradicalice în sistem acelular, doar extractele de Al, ET și TES prezintă un conținut semnificativ de compuși antioxidanți, corelat cu acțiunea reducătoare a radicalilor liberi, putând fi astfel utilizate, pentru rolul protector împotriva leziunilor provocate stresul oxidativ exo- sau endogen.

Modularea stresului oxidativ intracelular de către extractele de Salvia officinalis, Corylus avellana, Arctium lapa, Solanum lycopersicum, în sisteme celulare cu relevanța dermo-epidermică

Stresul oxidativ este definit ca un dezechilibru între apariția speciilor reactive de oxigen/ azot (SRO/ SRN) și capacitatea organismului de a contracara acțiunea lor prin intermediul unor sisteme de protecție antioxidativă. Acest dezechilibru duce la deteriorarea biomoleculelor și celulelor importante, cu impact potențial asupra întregului organism. Stresul oxidativ rezultă din generarea crescută a SRO/ SRN sau dintr-o scădere a abilității protective antioxidantă, fiind caracterizat de capacitatea redusă a sistemelor endogene de a lupta împotriva atacului direct asupra biomoleculelor țintă [].Speciile reactive de oxigen sunt responsabile în principal de reacțiile oxidative deteriorante. Mai mult decât atât, SRO sau SRN sunt văzute nu doar ca specii capabile să provoace distrugerea biomoleculelor. Sistemele enzimatice sintetizează specii reactive nu numai pentru apărarea chimică sau detoxifiere, dar și pentru semnalizarea celulară și reacțiile biosintetice.

Condițiile de stress oxidativ, sunt asociate cu degradarea oxidativă a biomoleculelor, de tipul proteinelor, lipidelor, acizilor nucleici, stresul oxidativ jucănd un rol important în dezvoltarea de boli cronice și degenerative care pot afecta întreg organismul uman.

Evaluarea efectului antioxidant al extractelor asupra a două enzime oxidative de faza I implicate în reducerea stresului oxidativ intracelular: catalază – superoxid dismutază, s-a realizat prin două metode spectrofotometrice de determinare a activității enzimatice a catalazei (reacție de descompunere a apei oxigenate în apă și O2) –metoda 5.2.2. și a superoxid dismutazei (monitorizarea inhibiției procesului de reducere a citocromului c de către radicalul superoxid) – metoda 5.2.3.

Evaluarea stresului oxidativ intracelular s-a realizat prin monitorizarea speciilor reactive de oxigen (peroxid de hidrogen și anion superoxid– marcare cu DCFH-DA, respectiv HE) și analiza de citometrie în flux (metoda 5.2.4. descrisă în capitolul 5).

În cadrul acestui model experimental, s-a urmărit evaluarea stresului oxidativ intracelular la nivelul liniilor celulare de fibroblaști dermici (HS-27), keratinocite (HaCaT) și celule de endoteliu vascular (HUVEC), atât în condiții bazale cât și în condiții de stimulare: inflamație bacteriană: LPS (un lipopolizaharid extras din bacteria Escherichia coli – 1μg/ml 18 ore de stimulare) și inflamație sistemică nespecifică (TNF-α), însoțită de declanșare de stres oxidativ (PMA) – (TNFα 15ng/ml + PMA 0.1μM, 24 ore de stimulare).

Evaluarea activității enzimatice a enzimelor intracelulare: catalaza (CAT) și superoxid dismutaza (SOD) secretate de fibroblaști, în prezența extractelor bioactive Al, SvU și ET.

Stabilirea concentrației de extract introdusă în mediul de cultură la extinderea modelului în sistem celular pe linia HS-27, s-a realizat pe baza intervalului de doze ce nu afectează viabilitatea celulară calculat din studiile de citotoxicitate. Datele experimentale obținute sunt prezentate mai jos:

Tabel nr. Y. Modularea activității enzimatice a catalazei și superoxid dismutazei la nivelul celulelor HS27 nestimulate de către extractele Al, SvU și ET

Concluzii studiu evaluare activitate enzimatică la nivel intracelular:

Biocomplexul Al, intervine asupra activității enzimelor oxidative prin amplificarea lor, astfel contracarând atacul radicalilor liberi, atât prin eliminarea anionilor superoxid sub acțiunea SOD cât și a apei oxigenate catalizate de CAT.

Pentru menținerea rezistenței celulare împotriva stresului oxidativ este necesară păstrarea unui echilibru între factorii antioxidanți, în special între cei enzimatici (spre exemplu o creștere doar a activității SOD are efecte toxice asupra celulelor ca urmare a supraproducției / acumularii de apă oxigenată). Extractul SvU (1µM) restabilește acest echilibru, prin activarea CAT (429,66 nmol/min/ml), a cărei acțiune biologică a fost drastic diminuată în prezența DMSO.

Caracterul antioxidant al extractului ET a putut fi observat și la nivel celular, pe linia HS-27, prin capacitatea acestuia de a interveni în cascada enzimatică activând enzimele intracelulare antioxidante de faza I.

Comparativ cu Vitamina C (utilizată ca substanță de referință în aceste experimente datorită capacității sale consacrate de antioxidant) se constată că toate cele trei extracte administrate în doza cea mai mică manifestă un efect similar cu al referinței și anume amplifică atât activitatea CAT cât și a SOD.

Evaluarea stresului oxidativ intracelular prin monitorizarea speciilor reactive de oxigen (peroxid de hidrogen și anion superoxid – marcare cu DCFH-DA, respectiv HE) și analiza de citometrie în flux.

Rezultatele sunt prezentate în graficele de mai jos, astfel: cantitatea de apă oxigenată, respectiv anionul superoxid intracelular corespund variației mediilor canalelor de fluorescenta in cele 2 coordonate: FITC – A mean – pentru apă oxigenată și PE-A mean – pentru anionul superoxid. Pentru evidențierea acțiunii antioxidante a fitocompusilor, testele efectuate, s-au realizat în următoarele condiții de stimulare:

• inflamație sistemică nespecifică (TNF-α), însoțită de declanșare de stress oxidativ (PMA) – TNFα 15ng/ml +PMA 0.1μM, 24 ore de stimulare.

inflamație bacteriană: LPS, un lipopolizaharid extras din bacteria Escherichia coli – 1μg/ml 18 ore de stimulare.

stimulare cu PMA (acetat de forbol miristat) 1µM timp de 24h, ca stimul oxidativ endogen sub acțiunea concomitentă și potențial preventivp a substanțelor active de testat.

Linia celulară HaCaT – keratinocit uman normal

Modificările procentuale ale speciilor reactive generate intracelular la nivel de keratinocit uman în prezența extractelor SvPG, SvU și Sol-T, sunt reprezentate în graficele de jos:

a.

b.

Fig. X. Evidențierea acțiunii fitocompușilor asupra stresului oxidativ celular prin citometrie în flux la nivelul liniei celulare HaCaT: SvPG – stimulare TNFα+PMA (a.); SvU – stimulare cu PMA (a.); Sol-T- stimulare cu TNFα+PMA și LPS+PMA (b.). S-au utilizat ca martori pozitivi, dexametazona, N-Acetil-cisteina și vitamina C

Extractul de salvie SvPG prezintă un efect puternic reducător asupra apei oxigenate și a anionului superoxid generați intracelular de inflamația nespecifică, demonstrând astfel un puternic efect antioxidant la nivel celular.

SvU determină reducerea speciilor reactive de oxigen (O2.si H2O2) la doza de 7µM în condiții de simulare a stresului oxidativ endogen.

Sol-T acționează asupra procesului de formare de radicali oxigenați în keratinocitele stimulate nespecific cu TNFα și PMA astfel: reduce cantitatea de apă oxigenată generată în sistem, dar nu influențează generarea anionului superoxid. În cazul keratinocitelor stimulate cu LPS și PMA, este de menționat efectul reducător al Sol-T la o doză de 2µg/ml, care în condiții inflamatorii asociate cu stimuli bacterieni (LPS), reduce cu până la 45% cantitatea de apă oxigenată generată ducând la protecția celulară în patologii cutanate cu componenta inflamatorie.

Linia celulară HS-27 – fibroblast uman

Efectul extractelor bioactive SvPG și Sol-T asupra speciilor reactive de oxigen celulare, la nivelul liniei celulare HS-27, este reprezentat în graficul de mai jos, ca variație procentuală față de martorul corespunzător:

Fig. X. Evidențierea acțiunii fitocompușilor asupra stresului oxidativ celular prin citometrie în flux: SvPG – stimulare TNFα+PMA, Sol-T – stimulare TNFα+PMA. S-au utilizat ca martori pozitivi, Dexametazona și N-acetil- cisteina

La nivelul fibroblaștilor dermici, extractul de salvie SvPG 0,02%, reduce cu până la 17% formarea anionilor superoxid, în schimb nu influențează formarea apei oxigentate generată la nivel celular. De asemenea, se remarcă extractul Sol-T 50 ng/ml, prin scăderea concentrației de apă oxigenată din sistem cu până la 75%, cu acumulare de anioni superoxid.

Linia celulară HUVEC – endoteliu vascular

Efectul extractelor bioactive SvPG și Sol-T asupra speciilor reactive de oxigen celulare, la nivelul liniei celulare HUVEC este reprezentat în graficul de mai jos ca variație procentuală față de martorul corespunzător:

Fig. X. Evidențierea acțiunii fitocompușilor asupra stresului oxidativ celular la nivelul celulelor endoteliale, prin citometrie în flux: SvPG – stimulare TNFα+PMA, Sol-T stimulare TNFα+PMA și LPS (1µg/ml). S-au utilizat ca martori pozitivi, dexametazona și N-acetil- cisteina

Extractul de salvie SvPG, inhibă producerea de specii reactive de oxigen în celulele endoteliale stimulate cu TNFα și PMA, efectul fiind unul comparabil cu cel al martorului pozitiv testat în aceleași condiții experimentale. Extractul glicoalcaloidic Sol-T, indică un efect reducător asupra anionului superoxid în ambele condiții de stimulare, observându-se o scădere a concentrației de anion superoxid cu 18% in celulele tratate cu Sol-T 70ng/ml și stimulate cu TNFα și PMA, respectiv cu 12% în celulele tratate cu Sol-T 70ng/ml și stimulate cu LPS. În aceleași condiții, extractul Sol-T generează o acumulare de apă oxigenată în sistem, ceea ce poate avea ca rezultat o modificare a reactivității vasculare și poate conduce la toxicitate și la alterări ale homeostaziei la nivel vascular.

Concluzii studiu evaluare stres oxidativ intracelular prin citometrie în flux:

Monitorizarea speciilor oxidative celulare la nivelul keratinocitelor umane normale, s-a realizat în prezența extractelor de salvie (SvPG și SvU), tomate (Sol-T), în condiții de stimulare oxidativă cu TNFα și PMA și stimulare bacteriană cu LPS. Dintre cele trei extracte bioactive testate, extractul SvPG 0.025%, demonstraza un efect antioxidant pronunțat la nivel celular, prin reducerea speciilor oxidative evaluate (O2-•.și H2O2). De asemenea, este de menționat efectul reducător al extractului Sol-T la o doză de 2µg/ml, care atât în condiții inflamatorii asociate cu stimuli bacterieni (LPS) cât și în cazul inflamației nespecifice (TNFα și PMA), reduce cu până la 45% cantitatea de apă oxigenată generată ducând la protecția celulară în patologii cutanate cu componenta inflamatorie.

La nivelul fibroblaștilor dermici stimulați cu TNFα și PMA, a fost evaluată acțiunea extractelor SvPG și Sol-T. Extractul SvPG prezintă o acțiune ușor reducătoare asupra anionului supreoxit, dar nu influențeaza generarea apei oxigenate la nivel celular. În schimb, extractul Sol-T, își păstrază caracterul puternic reducător asupra peroxidului de hidrogen, cu acumulare de anioni superoxid, efectul fiind unul asemănător cu cel al antioxidantului utilizat ca martor pozitiv, N-acetil-cisteina.

Pentru evaluarea impactului extractelor vegetale SvPG și Sol-T, asupra stresului oxidativ la nivel vascular, au fost utilizate celule de endoteliu vascular (linia celulară HUVEC) tratate cu două tipuri de stimuli: TNFα și PMA, respectiv LPS (doar Sol-T).

Extractul de salvie SvPG, își menține capacitatea inhibitorie asupra producerii de specii reactive de oxigen manifestată și în celulele endoteliale stimulate cu TNFα și PMA, efectul fiind unul comparabil cu cel al martorului pozitiv testat în aceleași condiții experimentale. Extractul glicoalcaloidic Sol-T, indică un efect reducător asupra anionului superoxid în ambele condiții de stimulare, dar generează o acumulare de apă oxigenată în sistem, ceea ce poate avea ca rezultat o modificare a reactivității vasculare și poate conduce la toxicitate și la alterări ale homeostaziei la nivel vascular.

Concluzii model experimental de evaluare stres oxidativ intracelular la nivel dermo-epidermic:

Extractele de alun (Al) și salvie (SvU) actionează în sensul menținerii rezistenței celulare împotriva stresului oxidativ pentru care este necesară păstrarea unui echilibru între factorii antioxidanți, în special între cei enzimatici, manifestându-și astfel efectul protector împotriva atacului radicalilor liberi la nivelul fibroblaștilor dermici (prin reducerea anionului superoxid și a apei oxigenate). La nivelul keratinocitelor, extractul Sol-T își manifestă acțiunea antioxidantă prin reducerea cantității de apă oxigenată generată intracelular în urma stimulării oxidative, dar cu acumularea anionilor superoxid.

Evaluarea stresului oxidativ intracelular s-a realizat și prin monitorizarea speciilor reactive de oxigen prin citometrie în flux în prezența extractelor de salvie SvU și SvPG și tomate Sol-T. Pentru demonstrarea activității antioxidante a biocomplexelor studiate, la nivelul sistemelor celulare s-au aplicat scheme de stimulare relevante pentru efectul țintit (inflamație nespecifică – TNFα sau bacteriană -LPS, respectiv stres oxidativ endogen – PMA). Rezultatele obținute indică efect antioxidant semnificativ indus de extractele de Salvia off. și Solanum sp, atât în cazul inflamației de origine bacteriană (infecții cutanate), cât și al inflamației sistemice asociate leziunilor cutanate. S-a demonstrat astfel utilitatea extractelor vegetale testate în potențarea capacității antioxidante a celulelor pielii, prevenind astfel escaladarea fenomenelor inflamatorii și pro-oxidante cauzate de diverși factori nocivi.

Simularea condițiilor pro-inflamatorii la nivelul țesutului cutanat pentru evaluarea impactului complexelor vegetale din Solanum lycopersicum, Salvia officinalis și Arctium lappa în patologii dermatologice

Inflamație dermo-epidermică

Inflamația și stresul oxidativ sunt procese aflate în interdependență, ce se pot desfășura simultan sau succesiv în patogeneza multor boli cronice. Deși identificarea și tratamentul disfuncțiilor primare sunt importante din punct de vedere clinic, statusul patologic este combătut cu dificultate datorită faptului că inflamația și stresul oxidativ acționează concertat, potențându-se reciproc pentru a induce daune progresive.

Astfel, doar terapia antioxidantă este puțin probabil să prevină bolile cauzate de stresul oxidativ, cum ar fi complicațiile cardiovasculare și diabetice, bolile neurodegenerative, cancer sau îmbătrânire. O atenție deosebită trebuie acordată selecției agenților antioxidanți si a dozei pentru a nu produce efecte dăunătoare. Pe de altă parte, în testarea compușilor, se impune cuantificarea statusului redox și inflamator pentru interpretarea corectă a rezultatelor [Biswas, 2016].

Dacă numărul de celule activate este mare și inflamația se manifestă pentru prea mult timp pot rezulta disfuncții grave. Artrita reumatoidă și alte afecțiuni cronice inflamatorii sunt condiții patologice în care aceste efecte pot apărea. Cu toate acestea, aceste probleme sunt cu mult mai complexe, deoarece există unele dovezi ale rolului antiinflamator jucat de RONS (radicali liberi ai oxigenului, azotului si sulfului) eliberați de fagocite, care pot implica contribuția la chemotaxia și repararea țesutului afectat, precum și modularea răspunsului imun [].

Este cunoscut faptul că o serie de citokine și factori de creștere sunt implicați în procesul de vindecare a rănilor care cuprinde trei etape generale: etapa inflamatorie ce constă în extravazarea componentelor sangvine producându-se agregarea plachetară, coagularea sângelui și migrarea celulelor inflamatorii la locul leziunii; etapa proliferativă ce implică migrarea și proliferarea keratinocitelor, fibroblaștilor și celulelor endoteliale, conducând la reepitelizarea și formarea țesutului granular și etapa de remodelare care durează un timp mai îndelungat [].

IL-1α, IL-6 și TNFα sunt citokine reprezentative puternic exprimate în procesele inflamatorii de la nivelul țesutului cutanat lezat. În procesul de vindecare a rănilor un rol activ îl au și chemokinele (IL-8), prin stimularea migrării celulelor inflamatorii, contribuind astfel la reglarea reepitelizării, remodelării tisulare și în angiogeneză. În timpul procesului de vindecare a rănilor, angiogeneza are un rol esențial în formarea țesutului granular nou în faza proliferativă, fiind evaluată prin monitorizarea expresiei factorului de creștere proangiogenic VEGF (factor de crestere endotelial vascular)[].

Testările s-au realizat în cadrul a două modele experimentale, caracteristice țesutului dermo-epidermic, simulându-se agresiuni inflamatorii ce pot apărea în condițiile atacului fungic sau bacterian, respectiv inflamație de etiologie nedeterminată. Astfel, s-a mimat inflamația corelată cu stresul oxidativ celular prin 2 tipuri de stimulare:

Inflamație bacteriană: LPS, un lipopolizaharid extras din bacteria Escherichia coli – 1μg/ml 18 ore de stimulare

Inflamație sistemică nespecifică (TNF-α), insoțită de declanșare de stres oxidativ (PMA) – TNFα 15ng/ml +PMA 0.1μM, 24 ore de stimulare.

Statusul inflamator s-a evaluat prin determinarea secreției citokinelor pro-inflamatorii (IL6, IL8) pe ambele tipuri celulare (keratinocite și fibroblaști), și a factorul VEGF, promotor de angiogeneza (metoda 5.2.5.).

Evaluare citokine pro-inflamatorii IL6, IL8, IL1α și factor proangiogenic VEGF în condiții de stimulare nespecifică– linia celulară HaCaT

Pentru evaluarea efectului antiinflamator, keratinocitele tratate cu extractul Sol-T, au fost stimulate atat cu TNFα – 40ng/ml (mimează inflamația sistemică nespecifică), cât și cu LPS – 1µg/ml (stimul bacterian). S-au testat trei concentrații diferite de extract respectiv 20ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, comparativ cu un martor pozitiv – dexametazona 200ng/ml (antiinflamator cunoscut). Rezultatele sunt reprezentate în graficele de mai jos ca variație procentuală față de martorul corespunzător:

Fig. X. Variația procentuală a citokinelor pro-inflamatorii în prezenta extractului Sol-T pe linia celulară HaCaT: a. stimulare TNFα (40ng/ml); b. stimulare LPS (1µg/ml)

Extractul Sol-T, la concentrația de 20ng/ml, acționează asupra expresiei citokinelor Il6, IL8 și IL1α, stimulate cu TNFα, demonstrând astfel un efect protector împotriva leziunilor inflamatorii la nivelul keratinocitelor epidermale, comparativ cu cel al martorului pozitiv (dexametazona). De asemenea acționeaza asupra factorului de creștere VEGF, împiedicând fenomenul de angiogeneză. În cazul celulelor stimulate cu LPS, extractul Sol-T la doza cea mai mică aplicată, inhibă secreția citokinelor IL8 și IL1α și a factorului VEGF, manifestând și un efect antibacterian la nivelul țesutului epidermic.

Extractul SvPG, a fost testat din punct de vedere al efectului antiinflamator la nivel de keratinocit uman (HaCaT), în prezența stimulilor TNFα și PMA, iar rezultatele sunt reprezentate grafic ca modificare procentuală față de martorul corespunzator astfel:

Fig. X. Variația procentuală a citokinelor pro-inflamatorii în prezența extractului SvPG, la nivelul keratinocitelor (linia celulară HaCaT)

În condiții de inflamație nespecifică, asociată cu disfuncții ale țesutului epidermal, extractul de salvie SvPG, prezintă efect antiinflamator semnificativ prin reducerea cu 27% a semnalizării extracelulare prin IL6 pentru dozele cele mai mari testate. Se remarcă de asemenea, un efect anti-angiogenic indus de SvPG la cea mai mare concentrație testată.

Evaluare citokine pro-inflamatorii IL6, IL8, în condiții de stimulare nespecifică cu TNFα și PMA – model inflamație – linia celulară HS-27

Pentru evaluarea efectului antiinflamator, fibroblaștii tratați cu extractul Sol-T, au fost stimulați cu TNFα + PMA. S-au testat două concentrații de extract respectiv 50 ng/ml și 100 ng/ml, comparativ cu un martor pozitiv – dexametazonă 200ng/ml (antiinflamator cunoscut). Rezultatele sunt reprezentate în graficele de mai jos ca variație procentuală față de martorul corespunzător:

Fig.X. Variația procentuală a citokinelor pro-inflamatorii pe linia celulara HS-27 în prezența extractului glicoalcaloidic Sol-T

La nivelul fibroblaștilor stimulați cu TNFα + PMA, extractul Sol-T inhibă secreția în mediul extracelular a citokinei IL-6 cu până la 55%, manifestându-și rolul protector în condiții de infamație cutanată.

Concluzii studiu inflamație dermo-epidermică:

Extractul glicoalcaloidic Sol-T inhibă eliberarea extracelulară a citokinelor IL6, IL8, IL1α, demonstrând efect antiinflamator și antiiritativ prin blocarea căilor de semnalizare coordonate de aceste citokine. Scăderea factorului pro-angiogenic VEGF eliberat de keratinocite în condițiile stimulării cu TNFα și creșterea acestuia sub acțiunea LPS bacterian recomandă acest compus în afecțiuni dermatologice fără leziuni active (ex. dermatite, iritații cutanate, etc), respectiv vindecarea rănilor suprainfectate (induce formarea microvasculaturii dermice). Extractul de salvie stopează semnalizarea extracelulară generată de citokina IL6, cu relevanță inclusiv în maladii dermatologice grave de tipul psoriazis.

Inflamație vasculară, importanță în procese de regenerare și refacere post-traumatică

Celulele endoteliale din derm sunt implicate în vindecarea rănilor, inflamație, angiogeneză tumorală, și sunt predominant de origine micro-vasculară, fiind de proveniență și funcționalitate distincte față de celulele endoteliale din vasele mari, utilizate pentru cercetarea in vitro vasculară. Creșterea și turn-overul celulelor endoteliale în piele este fundamentală nu numai în cadrul dezvoltării normale, dar și în vindecarea rănilor, ciclul foliculilor piloși, metastaza celulelor tumorale, și a diferitelor stadii ale patologiei cutanate. Celulele endoteliale in vitro capătă o formă ușor elongată epiteloidă. În studiile recente, cultivarea in vitro a celulelor endoteliale primare se realizează prin încorporarea unui factor de crestere mitogen (VEGF) care funcționează ca un factor de supraviețuire a acestor celule prin supraexpresia Bcl-2. Există componente celulare, in vitro și in vivo care sintetizează și eliberează VEGF.

Procesul inflamator prelungit poate provoca leziuni ale țesutului și este cauza multor boli cronice. O componentă critică de inflamație este infiltrarea celulelor inflamatorii, cum ar fi neutrofilele, monocitele și limfocitele, până la locul stimulului. Infiltrarea leucocitelor în locul inflamației este un proces foarte bine coordonat care implică mărginirea, rularea și aderarea leucocitelor la nivelul endoteliului vascular, transmigrarea în interiorul endoteliului și migrarea spre un stimul chimiotactic. Participarea unui număr de molecule de adeziune, inclusiv selectine, molecula de adeziune intercelulară-1 (ICAM-1) și molecula de adeziune a celulei vasculare-1 (VCAM-1) și respectivii receptori leucocitari și chemokinici cum ar fi proteina chemoatractantă de monocite-1 (MCP-1) sau interleukina-8 (IL-8) este crucială pentru infiltrarea celulară inflamatorie. La locul inflamației celulele inflamatorii activate eliberează multe enzime (proteaze neutre, elastază, colagenază, hidrolaze acide, fosfataze, lipaze etc.), specii reactive (superoxid, peroxid de hidrogen, radical hidroxil, acid hipocloros, etc.) și mediatori chimici (eicosanoizi, componente complement, citokine, chemokine, oxid nitric etc.) și prin aceasta, provoacă leziuni tisulare și stres oxidativ.

Unul din mecanismele fundamentale ale progresiei inflamației este dereglarea extravazării leucocitare de-a lungul endoteliului vascular și infiltrarea în țesutul adiacent. Leucocitele infiltrate secretă un nivel mare de mediatori de inflamație, perpetuând raspunsul inflamator, ceea ce are ca rezultat degradarea țesutului inflamat. Pentru invazia tisulară de către celulele inflamatorii este decisivă transmigrarea acestora de-a lungul endoteliului microvascular, proces mediat de moleculele de adeziune exprimate pe suprafața celulelor endoteliale din clasa CAM (cellular adhesion molecules) și de către receptorii lor corespunzători din leucocite. Datele de literatură evidențiază un rol diferențiat al moleculelor de adeziune ICAM și VCAM, inhibiția ICAM-1 fiind benefică pentru complicațiile dermice, în timp ce terapiile ce au ca țintă VCAM-1 combat maladiile cerebrale.

Exista mai multe aspecte privind fiziologia vasculaturii dermice și implicarea acesteia în homeostazia țesutului cutanat. Dintre acestea enumerăm:

Inflamația vasculară, caracterizată de adeziunea între limfocit și endoteliu declanșată de exprimarea unor molecule de adeziune –markeri de inflamație și secreția de citokine pro-inflamatorii.

implicarea anumitor citokine, esențială în cadrul activării endoteliale, a vindecării leziunilor provocate de radiația UV sau a rănilor cutanate. De exemplu GM-CSF și IL1α și β induc proliferarea celulelor endoteliale, iar IFN– γ si TNFα activează endoteliul prin expresia HLA-DR și ICAM-1.

fenomenul de angiogeneză și proliferare celulară

Agenții antiinflamatori la nivel cutanat acționează prin inhibarea expresiei TNFα și a VCAM-1, inhibiție reversibilă. În mod similar, are loc și inhibiția VCAM-1 în celule endoteliale stimulate cu TNFα și IL1α. Retinoizii inhibă proliferarea celulelor endoteliale, iar efectorii HLA-DR, induc expresia ICAM-1 prin IFN γ, TNFα și IL1α. Efectul anti-inflamator al retinoizilor se poate explica și prin inhibiția expresiei genice a VCAM-1 și a legării celulelor T la celulele endoteliale tratate cu citokine.

Cultura de celule endoteliale se verifică înainte de demararea experimentelor dacă exprimă factorul Von Willebrand, o glicoproteină specifică cu rol în adeziunea trombocitelor endoteliale în procesul de hemostază și vindecare a ranilor, particularitate a acestui tip de linie celulară care asigură păstrarea funcționalității celulare specifice.

Marcarea celulelor pentru evidențierea acestui factor se face cu anticorpi specifici și analiză de citometrie în flux. Celulele ce exprimă factorul Von Willebrand emit fluorescent în coordonate FITC și pot fi evaluate sub formă de histogramă FITC.

Sistemele experimentale utilizate au constat în stimularea diferențiată a celulelor endoteliale cu LPS, lipopolizaharid ce mimează infecția bacteriană, respectiv cu TNFα – stimul nespecific pentru inflamația sistemică. LPS este o componentă majoră a bacteriilor gram negative ce acționează ca endotoxină la nivel de organism animal, inducând un puternic raspuns imun și producând secreția citokinelor pro-inflamatorii. TNFα face parte din grupul citokinelor care stimulează reacția de inflamație de fază acută.

Parametrii relevanți pentru fiziologia țesutului cutanat pe care îi vom urmări sunt:

stimularea cu LPS 1μg/ml, stimul bacterian, urmată de analiza expresiei ICAM (caracteristic pentru microvasculatura dermică), citokinele inflamatorii IL6 și IL8.

stimularea cu TNFα 20 ng/ml, stimul sistemic nespecific, urmată de analiza expresiei VCAM (caracteristic pentru vasele sanguine mari), citokinele inflamatorii IL6 și IL8.

În cele ce urmează vom prezenta rezultatele obținute pentru principalele tipuri de efecte urmărite.

Efect antiinflamator în condițiile stimulării cu TNFα și LPS, (mimarea infecției bacteriene în cazul leziunilor acneice) –Extract SvU

In graficele de mai jos sunt prezentate valorile procentuale ale parametrilor de interes (expresia ICAM evaluată ca mediană de fluorescență a histogramelor corespunzatoare, respectiv concentrația de citokine IL6 și IL8 în pg/ml) față de martorul corespunzator pentru compușii analizați: SvU, comparativ cu martorul de cultură, martorul de solvent (DMSO) și martorul pozitiv (Dexamethazona 0.6μg/ml)

Fig. X.Efectul antiinflamator al extractului SvU la nivel de celulă endotelială (HUVEC): Stimulare cu TNFα – Citokine IL6 și IL8 (a.), ICAM și VCAM (b.); stimulare cu LPS – Citokine IL6 și IL8 (c.), ICAM și VCAM (d.)

Extractul SvU 5µM, scade atât secreția citokinelor IL6 și IL8, cât și a moleculelor de adeziune ICAM și VCAM în mediul extracelular de către celulele exdoteliale stimulate cu TNFα. În cazul stimulării bacteriene asupra celulelor endoteliale, extractul SvU nu influențează semnificativ expresia citokinelor pro-inflamatorii si a moleculelor de adeziune.

Evaluare efect antiinflamator la nivel de celule endoteliale, prin monitorizarea expresiei citokinelor proinflamatorii IL6, IL8 și a moleculelor de adeziune ICAM, VCAM, în condiții de stimulare oxidativă nespecifică cu TNFa și PMA dar și cu mimarea infecției bacteriene cu LPS – Extract Sol-T.

Fig. X. Status inflamator –celule endoteliale (HUVEC): stimulare cu TNFα pentru evaluarea expresie moleculelor de adeziune ICAM,VCAM (b.) și cu TNFα asociat cu PMA pentru evaluarea citokinelor proinflamatorii IL6 și IL8 (a.)

Un efect semnificativ asupra parametrilor cu rol în evaluarea statusului inflamator celular, îl prezintă extractul Sol-T la o concentrație de 70ng/ml, care în condiții de inflamație nespecifică indusă de TNFα, acționează prin reducerea semnalizării extracelulare direcționată de IL6 și IL8 în sensul reducerii expresiei lor, manifestând astfel un efect antiinflamator la nivel de celulă endotelială. În cazul stimulării nespecifice cu TNFα, toate dozele testate de Sol-T reduc expresia VCAM (molecula de adeziune endoteliu-monocit specifică vaselor mari), precum și expresia ICAM caracteristică microvasculaturii.

Fig. X. Status inflamator –celule endoteliale (HUVEC) stimulate cu LPS

În cazul stimulării cu LPS (mimare atac bacterian) cel mai activ component antiinflamator pe vase sanguine mici este Sol-T 50ng/ml, având efect reducător asupra expresiei ICAM cu pana la 20%, parametru caracteristic acestui tip de vascularizare.

Testarea acțiunii asupra inflamației vasculare exprimată prin propagarea IL6 și IL8 și expresia moleculelor de adeziune ICAM și VCAM – Extract Br

Fig. X. Efectul extractului de Br asupra inflamației vasculare în condiții de stimulare cu TNFα: a. evaluarea moleculelor de adeziune ICAM și VCAM; b. evaluarea citokinelor proinflamatorii IL6 și IL8

Extractul Br, prezintă acțiune inhibitorie asupra citokinelor proinflamatorii secretate de celulele endoteliale, în condiții de stimulare cu TNFα (2ng/ml), manifestând astfel un efect protector împotriva inflamației indusă de stresul oxidativ.

Acest efect protector împotriva inflamației generată de stresul oxidativ, completează studii anterioare efectuate in cadrul grupului nostru de cercetare (Dumitriu/Olariu et al…..de pus trimitere) care au demonstrat efectul protector al extractului de brusture în condiții de inflamație bacteriană (celule endoteliale stimulate cu LPS).

Evaluare molecule de adeziune endoteliu – monocit, ICAM, în condiții de stimulare nespecifică cu TNFα și PMA – Extract SvPG

Expresia membranară a ICAM și VCAM a fost evaluată prin marcarea cu anticorpi fluorescenți și achiziție de citometrie în flux. Media intensității de fluorescență PE, respectiv APC a fost comparată cu cea a controalelor izotipice pentru verificarea legării nespecifice. Rezultatele se regasesc in graficele de mai jos:

Fig. X. Efectul extractului SvPG asupra inflamației la nivel de celulă endotelială – linia celulară HUVE

Expresia membranara a ICAM creste in urma stimularii, fiind inhibata cu 11% – 25% de catre extractul de salvie. Rezultatele demonstreaza un efect antiinflamator vascular indus de acest produs, manifestat preponderent la nivel microvascular.

Concluzii studiu inflamație vasculară:

Pentru evaluarea efectului extractelor vegetale SvU, SvPG, Sol-T și Br asupra statusului inflamator celular, celulele de endoteliu vascular (linia calulară HUVEC) au fost stimulate pro-inflamator cu TNFα și bacterian cu LPS. Dintre extractele testate, Sol-T prezintă un efect semnificativ în condiții de inflamație nespecifică indusă de TNFα, acționează prin reducerea expresiei extracelulare a citokinelor IL6 și IL8, manifestând astfel un efect antiinflamator la nivel de celulă endotelială. În aceleași condiții de stimulare, toate dozele testate de Sol-T reduc expresia VCAM (molecula de adeziune endoteliu-monocit specifică vaselor mari), precum și expresia ICAM caracteristică microvasculaturii. Atacul bacterian la nivel endotelial (stimulare cu LPS), este contracarat de extractul glicoalcaloidic Sol-T care prezintă efect reducător asupra expresiei ICAM, parametru caracteristic vaselor sanguine mici.

Influența extractelor vegetale de Solanum lycopersicum, Salvia officinalis, Corylus avellana și Arctium lappa asupra interacțiunilor keratinocit – radiație UV

Mecanismele foto-oxidative dependente de speciile de oxigen reactive produse de radiația solară sunt principalele cauze ale foto-îmbătrânirii pielii și ale foto-carcinogenezei. Cercetarea din domeniul fotobiologiei se orientează preferențial asupra efectelor nocive ale radiației UVB și UVC implicate în carcinogeneza, dar în ultimii ani a apărut necesitatea studiilor privind rolul radiației UVA și a celei în vizibil apropiat în fotodegradare și fotoîmbătrânire.

Radiația UV-A induce creșterea nivelului de apă oxigenată intracelular și produce degradarea ADN-ului. Anionul superoxid (O2•-) reprezintă substratul pentru producerea apei oxigenate catalizată de superoxid dismutază. Conversia apei oxigenate la radicalul OH este etapa care stă la baza tuturor degradărilor oxidative induse de radiația UV-A. Deși organismul posedă un sistem propriu de antioxidanți intrinseci, acesta este de multe ori depășit de intensitatea sau timpul mare de expunere.

Citometria în flux oferă posibilitatea detecției simultane a apei oxigenate și a anionului superoxid eliberate intracelular prin dubla marcare fluorescentă cu DCFH-DA (emite în coordonate FITC-A și marcheaza apa oxigenată) și HE (emite în coordonate PE-A și marchează anionul superoxid).

Radiația UV duce la suprareglarea VEGF (vascular endothelial growth factor) , un factor activ pro-angiogenic, pe calea de semnalizare MAPK/ERK kinase-ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2), ceea ce duce la nivel in vivo la creșterea în dimensiune a vaselor de sange, a densității vasculare și a zonei de țesut dermic ocupate cu micro-vasculatura. De asemenea, radiația UV-A, dar și UV-B suprareglează VEGF și la nivelul keratinocitelor imortalizate (linia celulară HaCaT), acționând indirect și asupra sintezei și eliberării de IL-1, TNF-α, și a altor citokine pro-inflamatorii. Supraexpresia VEGF duce la creșsterea vascularizării pielii, la apariția microvasculaturii dermice fragile și sinuoase. Astfel, VEGF secretat de keratinocite trece prin membrana bazală epidermo-dermică ajungând la microvasculatura din derm. Epidermul normal exprimă un nivel scăzut al VEGF, în timp ce perturbări patologice de tipul psoriazisului, dermatitei de contact sau vindecarea rănilor suprareglează expresia VEGF în keratinocite.

Astfel, în cadrul studiilor privind patogeneza fotoîmbătrânirii sunt important de analizat următorii parametrii celulari: apoptoza celulară; perturbări ale secvențialității ciclului celular, stres oxidativ (apa oxigenată eliberată intracelular și anion superoxid); inflamație (citokine pro-inflamatorii IL6 și IL8; IL1α); angiogeneza (factorul VEGF)

Modularea mecanismelor celulare sub influența radiației UV, s-a realizat în baza unui protocol experimental dezvoltat în cadrul unor cercetări anterioare [trimitere] în care s-au stabilit dozele optime de iradiere. Selecția condițiilor de iradiere, selecția s-a realizat în funcție de % de celule apoptotice formate: dozele să nu inducă modificări majore ireversibile, dar să existe diferențe semnificative față de statusul normal. Se remarcă scăderi ale dimensiunii și granularității celulare și externalizarea fosfatidil-serinei și permeabilizarea membranei induse diferențiat în funcție de dozele de radiații.

Sistemul experimental este alcătuit din 3 serii experimentale, dupa cum urmează:

Tabel nr. Y: Doze de iradire UV-A și UV-B

Iradierea s-a realizat în condiții reproductibile cu un echipament de iradiere controlată: sistem Bio-Sun (producator Vilber-Lourmet).

În cadrul acestui model experimental, s-a urmărit studiul mecanismelor celulare implicate în afecțiuni degenerative ale țesutului cutanat, având ca material celular cultura de keratinocite (HaCaT), prin următoarele metode (descrise în capitolul special destinat): evaluarea procesului de apoptoză celulară (metoda 5.2.7.), testarea in vitro a capacității proliferative prin evidențierea generațiilor celulare succesive prin marcare fluorescentă cu CFSE (metoda 5.2.8.), analiza secvențialității ciclului celular (metoda 5.2.9.), identificarea simultană a radicalilor oxigenați intracelulari și evaluarea statusului inflamator (metodele 5.2.4. și 5.2.5).

Efectele biocompușilor asupra procesului de apoptoză pe linia celulara HaCaT (keratinocite), sunt reprezentate în graficul de mai jos:

Fig. X. Evoluția apoptozei în condiții de iradiere cu radiații UV-A (365nm; 9 J/cm2), respectiv UV-B (312nm; 0.02J/cm2)

Dintre extractele evaluate, extractele de salvie SvU și SvPG, acționează în sensul reducerii procentului de celule apoptotice timpurii, atât în cazul iradierii cu UV-A, cât și cu UV-B. De asemenea și pigmenții clorofilieni induc protecție semnificativă față de progresia apoptozei, în special fata de radiația UV-A.[]

Evaluarea efectului extractelor Al, SvU asupra perturbărilor secvențialității ciclului celular: []

Fig. X. Influența extractelor Al și SvU asupra ciclului de diviziune celulară în urma iradierii UV.

Extractul de alun Al stopează progresia în ciclul celular, atât în cazul UV-A cât și UV-B, dar corelate cu datele de inducere a apoptozei, acest fenomen semnifică o amplificare a degradării celulare în aceste condiții specifice și nu o protecție a celulelor normale în sensul prevenției malignizării și a stopării proliferării aberante.

Ambele doze de fitocompus SvCC anulează aneuploidia indusă de radiația UVB, simultan cu scăderea fazei S pentru doza cea mai mare, în sensul stopării proliferării aberante a celulelor afectate. De asemenea, compusul induce și scăderea procentului celular în punctul de intrare în mitoză, stopând diviziunea celulară a celulelor iradiate UVA.

Extractul SvU prezintă un efect remarcabil de frânare a proliferării aberante a celulelor, declanșată de expunerea în special la UVB, nefiind observate efecte de propulsare semnificativă a celulelor în etape avansate ale apoptozei. Astfel că fitocompusul SvU are rol de prevenție imediată a proceselor oxidative induse de radiațiile UVA și UVB.

Evaluare stres oxidativ celular în prezența extractelor bioactive Al, SvPG, SvU

Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos, dupa cum urmează: cantitatea de H2O2, respectiv O2- intracelulare corespund variației mediilor canalelor de fluorescență în cele 2 coordonate: FITC – A – pentru H2O2 și PE-A – pentru O2-.

a.

b.

c.

Fig X. Influența extractelor asupra speciilor reactive de oxigen generate la nivel celularî condiții de iradiere UV-A și UV-B: a. extractul Al; b. extractul SvPG; c. extractul SvU

Extractul Al, prezintă efect de reducere intracelulară a speciilor de oxigen reactive în special țn condițiile iradierii UV-B, nemodificând impactul UV-A la acest nivel.

Extractul de salvie SvPG este deosebit de activ la nivelul reducerii radicalilor liberi oxigenați, apa oxigenată și anion superoxid, inducând scăderea intracelulară a acestora cu până la 60% în cazul apei oxigenate generate de iradierea UV-A, și cu 32% a anionului superoxid generat de UV-B. Extractul SvU, prezintă un efect de inhibiție intracelulară a ambelor specii de oxigen reactive, efect ce persistă atât în cazul UV-A cât și UV-B.

Evaluare efect antiinflamator – citokine pro-inflamatorii IL6 și IL8, citokina pro-iritativa IL1α, precum și asupra factorului VEGF eliberate în condiții de iradiere UV

a.

b.

Fig. X. Efectul extractelor bioactive Al (a.) și SvPG (b.) asupra expresiei citokinelor și factorilor de creștere asupra keratinocitelor iradiate cu UV-A și UV-B

Extractul Al duce la scăderea fenomenului inflamator propagat mai ales prin intermediul IL8, în ambele cazuri de iradiere și are efect anti-iritativ în cazul iradierii cu UV-B.

De asemenea s-a demonstrat acțiunea antiangiogenică a extractului Al în cazul radiației UV-A, în schimb în condițiile iradierii UV-B nu prezintă activitate antiangiogenică.

În condiții de iradiere UV, extractul de salvie SvPG induce un efect antiinflamator doar față de UV-B și la doza maximă testată, prin inhibarea eliberării IL8 cu 17% față de martorul celular.

Concluzii studiu iradiere UV:

Expunerea la radiația UV, poate induce efecte genotoxice, ce pot contribui nu doar la procesul de fotoîmbătrânire, dar și la carcinogeneză []. Principiile active extrase din salvie (SvU și SvPG), acționează prin împiedicarea progresiei apoptozei timpurii în celulele iradiate cu UV-A sau UV-B. Extractul SvU prezintă un efect remarcabil de frânare a proliferării aberante a celulelor, declanșată de expunerea în special la UVB, nefiind observate efecte de propulsare semnificativă a celulelor în etape avansate ale apoptozei. Astfel că fitocompusul SvU are rol de prevenție imediată a proceselor oxidative induse de radiațiile UVA și UVB.

Extractul de salvie SvPG este deosebit de activ la nivelul reducerii radicalilor liberi oxigenați, apa oxigenată și anion superoxid, inducând scăderea intracelulară a acestora cu până la 60% în cazul apei oxigenate generate de iradierea UV-A, și cu 32% a anionului superoxid generat de UV-B. Extractul SvU, prezintă un efect de inhibiție intracelulară a ambelor specii de oxigen reactive, efect ce persistă atât în cazul UV-A cât și UV-B.

Extractul Al, prezintă efect de reducere intracelulară a speciilor de oxigen reactive în special în condițiile iradierii UV-B, nemodificând impactul UV-A la acest nivel. Extractul de alun Al nu acționează asupra procesului apoptotic de la nivelul keratinocitelor iradiate, în schimb stopează progresia în ciclul celular, atât în cazul UV-A cât și UV-B, ceea ce semnifică o amplificare a degradării celulare în aceste condiții specifice și nu o protecție a celulelor normale în sensul prevenției malignizării și a stopării proliferării aberante. Extractul Al duce la scăderea fenomenului inflamator și de asemenea prezintă o acțiune antiangiogenică în cazul radiației UV-A.

Evaluarea acțiunii extractelor vegetale din Solanum lycopersicum, Corylus avellana Arctium lappa, Trifolium pratense și Vitis vinifera asupra regenerării cutanate

Regenerare epidermală prin stimularea procesului de diferențiere keratinocitară

Linia celulară HaCaT este imortalizată spontan și reprezintă principalul model de studiu în biologia pielii. În condiții tipice de cultivare celulele au un fenotip parțial sau complet diferențiat datorită conținutului mare de calciu din mediul de cultură și din serul fetal bovin. În condiții de cultivare la concentrații mici de calciu, celulele suferă o transformare reversibilă la fenotipul bazal, de la care, în condiții controlate prin concentrații progresive de calciu se pot induce stadii de diferențiere bine definite corespunzătoare stratului bazal, spinos, granulos sau corneum.

Determinarea acestor stadii de diferențiere se face prin evidențierea anumitor proteine exprimate specific, dupa cum urmează: Involucrina (stratul corneum și granulos), Transglutaminaza (stratul spinos), keratina K14 (stratul bazal). Concentrația externă de calciu reglează diferențierea keratinocitelor in vitro. Keratinocitele cultivate în mediu cu ioni de calciu 1.2mM și 2.4mM sintetizează involucrina și transglutaminaza înainte de a fi confluente, fiind capabile la confluența să formeze invelișul cornificat.

Celulele au fost tratate cu substanțele de interes timp de 5 și respectiv 7 zile. Evidențierea celor trei proteine membranare – markeri de diferențiere a fost realizată prin marcarea cu anticorpi specifici (Anticorp pt citokeratina 5/14 conjugat cu PE; Anticorp primar pt involucrina cuplat cu anticorp secundar conjugat FITC; Anticorp primar pt transglutaminaza-1 cuplat cu anticorp secundar conjugat PE) și vizualizarea prin citometrie în flux.

Rezultatele privind evidențierea markerilor de diferențiere în prezența extractului Sol-T sunt prezentate în tabelele urmatoare.

a.

b.

Fig. X. Evidențierea efectului extractului Sol-T asupra procesului de diferențiere keratinocitară dupa 5 (a.) și 7 (b.) zile de tratament

Status proliferativ indus de extractul Sol-T in condiții de cultivare în medii de diferențiere (cu concentrații diferite de calciu):

Fig. X. Secvențialitatea ciclului celular în condiții de diferențiere keratinocitară variabilă

Extractul Sol-T induce preponderent supraexpresiei transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos. Compușii bioactivi stimulează turn-overul keratinocitelor atât în condiții nediferențiate (mediu sărac în calciu), cât și în condiții de inducere a diferențierii (12mg calciu), efect ce susține procesul de regenerare epidermală.

Testarea compușilor bioactivi din complexul TES s-a realizat pe ambele mecanisme.

Celulele se tratează cu extractul bioactiv de struguri (TES) dupa 24h de la aderare și se analizează procesul de diferențiere dupa 7 zile de cultivare, schimbându-se mediul din 3 în 3 zile. Rezultatele sunt prezentate în graficele de mai jos:

Fig. X. Expresia celor trei markeri de regenerare epidermică (Involucrina – strat corneum și granulos; transglutaminaza – strat spinos; citokeratina – strat bazal) în condiții de diferențiere keratinocitară variabilă

Secvențialitatea ciclului celular în condiții de diferențiere keratinocitară variabilă, este prezentată în graficele de mai jos:

Fig. X. Efectul extractului TES asupra secvențialității ciclului celular la diferite concentrații de calciu

Extractul de struguri TES stimulează expresia citokeratinei, inducând diferențiere keratinocitară înca din stratul bazal, fără selectivitate în privința aportului de calciu în mediul extracelular. Aceasta sugerează un rol de inducere a regenerării intrinseci, independent de promotorii externi de diferențiere. Se remarcă, de asemenea, supraexpresia transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos, dar și a involucrinei, caracteristică stratului corneum complet diferențiat, ambele în special în condițiile unui aport extracelular de calciu. TES stimulează turn-overul keratinocitelor atât în condiții nediferențiate (mediu sărac în calciu), cât și de inducere a diferențierii (12mg calciu), efect ce susține procesul complet de regenerare epidermală .

Pentru a evidenția la nivel in vitro acest proces de reînnoire a epidermei s-au analizat în prezența extractului ET mai mulți markeri de diferențiere apartinând diferitelor etape evolutive: keratina 5/14 – molecula care se exprimă doar în stratul bazal; transglutaminaza-1 în stratul spinos și involucrina în stratul granulos, stratul cornos fiind format numai din celule anucleate, neviabile.

Fig. X. Evidențierea procesului de diferențiere la nivelul keratinocitelor tratate cu extractul de trifoi roșu ET

Extractul ET stimulează diferențierea acestora datorita impactului pozitiv asupra expresiei tuturor markerilor moleculari analizați în diferite stadii de cornifiere a pielii. Astfel este reliefat un aport important al fitocompușilor la procesul de reînnoiere a epidermei și implicit la prevenția și încetinirea progresiei proceselor degenerative de îmbătrânire a pielii, precum și refacere post traumatică în leziuni de diferite etiologii (arsuri, răni, infecții cutanate, etc).

Studii asupra homeostaziei matricei extracelulare secretată de fibroblaști dermici

Degradarea controlată a ECM este un proces necesar pentru migrarea celulelor, angiogeneza, reepitelizarea, degradarea provizorie a matricei și remodelarea tesutului granular nou format în timpul reparației plăgii. ECM este compusă dintr-un amestec complex de molecule insolubile incluzând colagen, laminine, fibronectina, entactin/ nidogen și proteoglicanii de tip heparan-sulfat, oferind un suport solid pentru celule. ECM de asemenea, acționează ca un rezervor pentru citokinele încorporate și factorii de creștere și pentru căile de comunicare între moleculele care alcătuiesc rețeaua ECM și facilitează migrarea celulară, aderența, contracția rănii și epitelializarea. Turnoverul și remodelarea ECM trebuie să fie strict reglementată deoarece proteoliza necontrolată contribuie la o dezvoltare anormală și generează multe condiții patologice caracterizate prin degradarea excesivă, cum ar fi ulcerele cronice sau lipsa de degradare a componentelor ECM care conduc la fibroză [].[].

Vindecarea leziunilor cutanate este un proces fiziologic complex, care presupune interacțiuni coordonate între diferitele sisteme biologice și imunologice, implicând o cascadă de pași și evenimente foarte precis organizate, ce se corelează cu apariția anumitor tipuri de celule la locul țesutului afectat de-a lungul diferitelor faze ale procesului de vindecare []. Refacerea leziunilor cutanate poate fi împărțită în mai multe etape dinamice incluzând: (i) formarea cheagului fibrinic și răspunsul inflamator; (ii) formarea țesutului granular care include reepitelizarea și angiogeneza; și (iii) formarea și remodelarea matricei extracelulare. Un echilibru dinamic între celulele endoteliale, trombocite, coagulare și fibrinoliza reglează hemostazia și determină cantitatea de fibrină depozitată la locul rănilor, influențând astfel progresul proceselor reparative [] [].

Pentru refacerea stratului dermic, este necesară sinteza de către fibroblaști a fibrelor de colagen, a fibrelor elastice și a componentelor substanței de bază, dar și stabilirea unui raport optim activare / inhibiție pentru enzimele implicate în remodelarea matriceală. Sub acțiunea factorilor de creștere, (în special TGF-β), fibroblaștii secretă colagen în spațiul extracelular pentru formarea de țesut granular. Fibrele de colagen, regăsite în țesutul granular, sunt de tip I și III, iar la nivelul țesutului cicatrizant rezultat în urma procesului de remodelare matriceala, se regăsesc cu preponderență fibre de colagen de tip I [].

Procesul de refacere a țesuturilor lezate este controlat de anumite mecanisme reglatoare în vederea menținerii echilibrului între degradare și sinteză, conducând în final la o vindecare normală. Metaloproteinazele matriceale (MMP), produse de neutrofile, macrofage și fibroblaști, sunt direct implicate în procesul de degradare a colagenului, activitatea lor fiind strâns legată și reglată de agenți inhibitori []. MMP nu sunt exprimate constitutiv în piele dar sunt induse temporar ca răspuns la semnale exogene ca citokine, factori de creștere, interacțiuni celulă – matrice, sau celulă – celulă. În procesul de refacere dermală, MMP sunt implicate în înlăturarea țesutului devitalizat, interacțiuni epidermo-mezenchimale în timpul migrării keratinocitelor, angiogeneza, remodelarea țesutului conjunctiv nou sintetizat în timpul procesului de maturare, reglarea activității anumitor factori de creștere [].

Reglarea matricei extracelulare implică un echilibru între sinteza componentelor sale structurale și degradarea lor sub acțiunea catalitică a MMP – urilor a căror funcție biologică este modulată de inhibitori tisulari specifici ai metaloproteinazelor matriceale (TIMP). Suprareglarea activității MMP, favorizează degradarea proteolitică a membranei bazale și a matricei extracelulare, fiind corelată cu creșterea tumorală și metastaza, precum și cu angiogeneza asociată tumorilor, în timp ce inhibarea activității MMP pare a restricționa aceste procese [].

De-a lungul timpului, s-au realizat numeroase studii privind rolul extractelor vegetale ca agenți de refacere a țesutului cutanat. Acești compuși bioactivi de tipul alcaloizilor, uleiurilor esențiale, flavonoidelor, taninurilor, terpenoidelor, saponinelor și compușilor fenolici, sunt cunoscuți ca fiind implicați în diferite faze ale procesului de vindecare, și datorită proprietăților lor multifuncționale (antiinflamatoare, antioxidante, etc.) [].

În cadrul acestui model experimental, au fost selectate extractele bioactive Sol-T (conținut de compuși glicoalcaloidici), Br (compuși polifenolici), Al (acizi polifenilcarboxilici), a căror activitate antiinflamatoare și antioxidantă a fost demonstrată în cadrul experimentelor efectuate în acest studiu.

Pentru evaluarea rolului extractelor vegetale în procesul de remodelare dermală, au fost utilizate metodele relevante, descrise în capitolul dedicat. Evaluarea procesului de sinteză de colagen în prezența extractului Sol-T s-a realizat prin determinarea colagenului intracelular total (prin marcare cu kit-ul sirius Red/ Fast Green – metoda 5.2.11.1.) cât și prin metoda spectrofotometrică de dozare a colagenului secretat în mediul extracelular (dozarea hidroxiprolinei rezultată în urma procesului de hidroliza a colagenului – metoda 5.2.11.2). Pentru extractele Br și Al, s-a determinat doar colagenul extracelular. Evaluarea metaloproteinazelor matriceale secretate în mediul de creștere de către fibroblaștii dermici, s-a realizat prin zimografie (metoda 5.2.12)

Determinarea colagenului total – marcare cu Sirius Red/Fast Green

Fibroblaștii (HS27) au fost cultivați timp de 24 h în plăci cu 24 de godeuri în mediu de cultură DMEM, suplimentat cu 10 % ser fetal bovin și 1% antibiotic. Celulele au fost tratate timp de 48h dintre care 24h cu stimuli TNFα și PMA. Dupa cele 48h, se colectează mediul de cultură (se va determina spectrofotometric colagenul secretat în mediu precum și activitatea metaloproteinazelor). Rezultatele sunt reprezentate grafic ca variație procentuală față de martorul corespunzător:

Fig. X. Dozarea colagenului intracelular cu kit-ul Sirius Red/ Fast Green

În urma cuantificării colagenului total, s-a observat o creștere a sintezei de colagen în celulele tratate cu Sol-T 100ng/ml cu un procent de 187% în celulele nestimulate, în timp ce în celulele stimulate cu TNFα și PMA, se pastrează aceeași tentință de stimulare a sintezei de colagen dar creșterea este doar cu 118%.

Dozarea colagenului biosintetizat în mediul de cultură de către fibroblaști

A doua metodă de determinare a colagenului total, pe care am utilizat-o pentru confirmarea rezultatelor, este o metodă ce se bazează pe proprietatea hidroxiprolinei (rezultată din procesul de hidroliză acidă a colagenului) de a se oxida sub acțiunea agentului oxidant cloramina T la pirol, compus ce formează cu p-dimetilaminobenzaldehidă un cromofor cu maxim de absorbție în domeniul 550-560 nm.

Fig. X. Dozarea spectrofotometrică a colagenului secretat în mediul de creștere a fibroblaștilor

Această tehnică susține rezultatele obținute, evidențiind o creștere semnificativă a cantității de colagen secretat în fibroblaștii tratați cu Sol-T 100ng/ml.

Fig. X. Influența extractelor Al, Br, ET și TES asupra sintezei de colagen la nivelul fibroblaștilor normali

Extractul Al la o doza de 0,66µl/ ml stimulează sinteza colagenului secretat în mediul extracelular cu până la 40%, în timp ce extractul de brusture Br, potențează sinteza de colagen cu până la 20% la doza cea mai mare aplicată față de martorul corespunzător. Extractul ET nu prezintă un aport semnificativ în procesul de sinteză a colagenului, în timp ce fibroblaștii tratați cu extractul TES 6mg/ml secretă o cantitate ușor mai mare de colagen în mediul de cultură, comparativ cu martorul celular.

Identificare și dozare metaloproteinaze matriceale

Este o metodă de estimare a concentrației de gelatinaze (MMP-2 și MMP-9) din mediul condiționat se bazează pe capacitatea acestor enzime de a se renatura după migrarea electroforetică în geluri de poliacrilamida-SDS copolimerizate cu gelatina și îndepărtarea SDS prin spălări repetate cu Triton X-100, enzimele exercitându-și astfel activitatea proteolitică asupra substratului copolimerizat pe parcursul a 18h de incubare la 37°C într-un tampon corespunzător. Zimogramele au fost scanate și analizate semi-cantitativ cu softul ImageJ prin densitometria benzilor proteice cu activitate enzimatică ce apar ca plaje de liză, iar identificarea tipului de MMP s-a realizat pe baza maselor moleculare.

Expresia metaloproteinazelor matriceale în prezența extractelor Sol-T, Al, Br, TES și ET, este redată în figura de mai jos:

a.

b.

c.

Fig. X. Influența extractelor bioactive asupra activității enzimatice a MMP secretate de fibroblaști: a. Sol-T (HS-27 stimulate cu TNFα și PMA); b. Al și Br; c. TES și ET

Extractul Sol-T la doza de 100 ng/ml, acționează asupra metaloproteinazelor în sensul scăderii activității acestora atât în condiții de bază cât și în urma stimulării cu TNFα și PMA. Ambele extracte Al și Br prezintă activitate inhibitorie asupra MMMP 9 și 2 într-o manieră doza-efect, extractul Br remarcându-se în sensul scăderii semnificative a activității MMP 2. Același efect inhibitor asupra metaloproteinazelor matriceale, îl manifestă și extractele TES și ET, în cazul TES, efectul fiind mai pronunțat.

Concluziile studiului:

În cadrul acestui model experimental, a fost evaluat efectul extractelor bioactive din Solanum lycopersicum (Sol-T), Corylus avellana (Al), Arctium lappa (Br), Trifolium pratense (ET) și Vitis vinifera (TES) asupra procesului de regenerare cutanată prin monitorizarea a două fenomene importante la nivel dermo-epidermic, respectiv diferențiere keratinocitară și remodelare matriceală la nivel de fibroblast dermic.

Din analiza datelor experimentale, atât în condiții de inducere a diferențierii (prin aport de calciu în mediul extracelular), cât și în mediu sărac în calciu, este reliefat un aport important al fitocompușilor testați la procesul de reînnoiere a epidermei și implicit la prevenția și încetinirea progresiei proceselor degenerative de îmbătrânire a pielii, precum și refacere post traumatică în leziuni de diferite etiologii (arsuri, răni, infecții cutanate, etc). Dintre extractele testate, se remarcă: extractul Sol-T induce preponderent supraexpresiei transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos; extractul de struguri TES stimulează expresia citokeratinei, inducând diferențiere keratinocitară înca din stratul bazal și supraexpresia transglutaminazei-1, deci progresia stratului spinos, dar și a involucrinei, caracteristică stratului corneum complet diferențiat; extractul ET stimulează diferențierea keratinocitară datorită impactului pozitiv asupra expresiei tuturor markerilor moleculari analizați în diferite stadii de cornifiere a pielii.

Fitocompușii bioactivi conținuți de extractul din specii de Solanum – Sol-T, se remarcă printr-un efect stimulant al sintezei de colagen la nivelul fibroblaștilor dermici, atât în condiții bazale, cât și in condiții de stimulare nespecifică cu TNFα și PMA, contribuind astfel la procesul de regenerare dermică.

Metaloproteinazele matriceale au o importanță deosebită în remodelarea tisulară și în vindecarea rănilor, dar reprezintă și un element important în progresia bolilor inflamatorii și în invazia tumorală (activitatea proteolitică a protein-enzimelor fiind corelată cu potențialul metastazic al celulelor tumorale).

În urma evaluării activității enzimatice a metaloproteinazelor matriceale secretate în mediul de cultură extracelular de către fibroblaștii dermici, în prezența extractelor bioactive, se remarcă urmatoarele: extractul Sol-T la doza de 100 ng/ml, inhibă activitatea MMP atât în condiții de bază cât și în urma stimulării cu TNFα și PMA; extractele Al și Br prezintă activitate inhibitorie asupra MMP 9 și 2 într-o manieră doza-efect; extractele TES și ET, prezintă de asemenea efect inhibitor asupra activității MMP.

MMP-urile sunt responsabile de degradarea proteinelor matricei extracelulare (ECM) cum ar fi colagenul, fibronectina, elastina și proteoglicanii, contribuind la procesul de fotoîmbătrânire. []. MMP-9 (gelatinaza B), este produsă de keratinocitele umane și acționează asupra colagenul de tip IV, o componentă importantă a membranei bazale în piele. Ca și MMP-9, MMP-2 (gelatinaza A) este capabilă să scindeze colagenul de tip IV. În plus, ambele gelatinaze pot degrada alte substraturi cum ar fi colagenul de tip V, VII și X, fibronectina și elastina. Acestea sunt esențiale în degradarea fragmentelor de colagen fibrilar după degradarea lor inițială prin colagenaze []. În timpul procesului de îmbătrânire, proteinele matricei extracelulare sunt susceptibile la activitate excesivă a enzimelor proteolitice-metaloproteinaze matriceale (MMP), fiind legate în cea mai mare parte la colagen și elastină. În condiții fiziologice adecvate, enzimele sunt reglate la nivel transcripțional și prin inhibitori proteici. Dezechilibrul în homeostazie duce la pierderea integrității țesutului pielii, ceea ce poate duce la formarea ridurilor.

Mecanisme implicate in progresia melanomica modulate de asocieri de fitocompusi biologic activi din trifoi rosu si deseuri de struguri

Citokinele eliberate in procesele de degradare a matricei extracelulare (ECM), moduleaza procesele de proliferare celulara, migrare celulelor si angiogeneza. Prin urmare, elucidarea modului în care membrana bazala și ECM se degradează este un punct esențial pentru înțelegerea migrarii celulelor canceroase, invazia și formarea metastazelor [].

Incidenta cancerului de piele este are la baza o serie de agenti cauzali, dintre care cel mai important fiind radiatia UV, dar si anumiti virusi, compusi mutageni din produsele alimentare sau din substante chimice, susceptibilitatea genetica, joaca un rol la fel de important in aparitia acestei afectiuni. Aparitia cancerului de piele poate fi prevenita prin eliminarea acestor factori externi si poate fi îndepărtat eficient prin împiedicarea aprovizionării cu sânge a tumorii (anti-angiogeneză), stopand astfel creșterea tumorală și astfel creste rata de supraviețuire a pacientului. Majoritatea celulelor canceroase dezvoltă modalități de evitare a apoptozei sau prezintă mecanisme de apoptoză defectă, permițând astfel dezvoltarea necontrolata a celulelor. Melanomul malign al pielii este cea mai grava formă de cancer de piele, apare in melanocitele epidermale si este o malignitate refractară la tratament și metastază, a cărei incidență a crescut constant și semnificativ în ultimele decenii [].

Melanocitele epidermice sunt în general poziționate în stratul bazal deasupra membranei bazale, dar se mai gasesc si in foliculii de păr pentru a conferi pigment părului nativ. Sinteza melaninei, o cale multiplă și foarte bine reglată, reprezintă o funcție diferențiată majoră a melanocitelor normale și maligne. Deși principala funcție a melaninei este de a proteja împotriva leziunilor induse de UV, pigmentul de melanină poate regla și homeostazia epidermică și astfel poate afecta comportamentul melanomului [].

Numeroase afectiuni patologice sunt cauzate de întreruperea echilibrului între metaloproteinazele matriceale (MMP) și inhibitorii membranari specifici (TIMP). MMP sunt, de asemenea, implicate în creșterea tumorala și metastazare, activitatea lor fiind upregulata in aproape toate tipurile de cancer uman. Multe metaloproteinaze sunt implicate în remodelarea țesuturilor normale, dar, de asemenea joacă un rol în resorbția tisulară în afectiuni patologice. Pentru a preveni degradarea tesutului de către un dezechilibru intre MMP si TIMP, este important să se stie ce tip de MMP și TIMP sunt implicate în procesele specifice ale bolii [].

În cultura de celule de melanom uman expresiile crescute ale MMP-1, MMP-2 și MMP-9 s-au dovedit a fi corelate cu migrația și invazia tumorala. În leziunile melanocitare umane s-a demonstrat o corelație pozitiva între progresia tumorii și expresia MMP-2. Creșterea expresiei MMP-9, pe de altă parte, a fost găsită în principal în faza de creștere radială a melanomului primar, indicând faptul că expresia MMP-9 se corelează cu invazia timpurie a melanomului [].

Relatia intre exprimarea factorului de crestere proangiogenic VEGF si progresia tumorala, in melanoamele cutanate, determina abordarea VEGF ca o țintă bună pentru tratamentele antiangiogenice în melanomul pielii. Mai multe citokine serice, inclusiv IL-6 joacă un rol important în dezvoltarea și progresia melanomului; cu toate acestea, funcțiile biologice specifice ale IL-6 în progresia melanomului sunt necunoscute. Câteva studii au indicat faptul că IL-6 inhibă creșterea melanocitelor in vitro [].

Efectele adverse severe al agentilor chimioterapeutici precum si dezvoltarea unei rezistente a organismului la mai multe medicamente utilizate in terapia cancerului, au determinat dezvoltarea unor strategii de eliminare a acestora, strategii ce abordeaza utilizarea nanoparticulelor, lipozomilor și vehiculelor de eliberare miceliară a medicamentelor, cu unele succese raportate [].

Datorita acestor efecte nedorite asociate cu terapia cancerului conventional, de-a lungul timpului a devenit tot mai prezenta necesitatea unor scheme de tratament alternative, cat mai naturale. Compușii fitochimici din extracte de rădăcini, bulbi, scoarțe, frunze, tulpini de plante și altele au arătat potențial promițător ca medicamente anti-cancer sau pentru a servi drept compuși de legatura în sinteza de noi medicamente. Acestea sunt adesea utilizate ca medicamente tradiționale sub formă de tincturi de uz casnic, ceaiuri sau extracte brute. Dezavantajele produselor naturale și medicamentelor tradiționale includ variații în metodele de preparare și, de asemenea, compoziția chimică, determinarea și ajustarea dozelor și calea adecvată de administrare [].

Compusii fitochimici care au proprietăți anti-inflamatorii, imuno-modulatoare și anti-oxidante, au, în general, cel mai mare potențial de a manifesta comportamente chimio-preventive în cancerele de piele. S-au făcut numeroase încercări pentru a găsi corelația dintre proprietățile antioxidante ale fitocompusilor și potențialul lor anti-cancer. Deși nu s-a constatat nici o dovadă concretă a unei astfel de corelații, activitatea antioxidantă a unui fitocompus este considerată ca o indicație a potențialei activități anticanceroase. Carotenoizii, flavonoidele și terpenoidele sunt unele dintre grupurile de fitoccompusi cu potențial ridicat anticancerigen [].

Resveratrolul (compus regasit in cantitati semnificative in struguri) a fost investigat ca agent anti-cancer și s-a constatat că acesta este capabil să inhibe creșterea celulelor melanotice și amelanotice prin inducerea apoptozei. Potența resveratrolului a fost demonstrată prin capacitatea sa de a induce apoptoza în celulele melanomului murin rezistent la doxorubicină și capacitatea sa de a inhiba creșterea tumorilor melanomului rezistent la doxorubicină la șoareci. Resveratrolul are un potențial anti-metastatic, deoarece s-a raportat că inhibă tranziția epitelială indusă de lipopolizaharide până la tranzitia mezenchimala, posibil prin inhibarea semnalizării NF-kB. Există, de asemenea, potențialul de aplicare a resveratrolului ca sensibilizator la radiații în tratamentul melanomului, deoarece s-a observat că celulele melanomului rezistent la radiatii au răspuns bine la o combinație de tratament de resveratrol și radiație [].

Pielea este un tesut responsiv la actiunea estrogenilor, iar o buna intelegere a reglarii hormonale in fiziologia pielii, precum si in procesul de imbatranire, reprezinta o baza in dezvoltarea de noi tratamente hormonale in imbatranirea pielii []. Trifoiul rosu (Trifolium pratense) este o planta medicinala utilizata traditional in tratamentul afectiunilor cronice ale pielii, ce contine cel putin patru izoflavone estrogenice: formononetin, biocanina A, daidzeina si genisteina. Pe langa activitatea lor estrogenica, fitoestrogenii prezinta de asemenea si activitati nonhormonale ca cea antioxidanta dar sunt si potentiali agenti anticancerigeni. De exemplu, s-a demonstrat efectul anticarcinogenic al genisteinei in vitro, datorat probabil activitatii inhibitorii asupra protein-tirozinaz-kinazei si asupra angiogenezei [].

Cercetari anterioare [] au demonstrat potentialul antioxidant si antiinflamator al fitocompusilor din extractul de tescovina (deseu rezultat in urma procesului de vinificatie) – TES, dar si al extractului de trifoi – ET, precum si aportul lor in modularea diferitelor mecanisme ce intervin in diferite afectiuni patologice [].

Modelul experimental realizat pentru studiul melanomului procese celulare si moleculare din patologia dereglarilor hiperproliferative: producerea melaninei, principal parametru indicator al malignizarii in cancerele de piele, promotori ai caracterului invaziv tumoral: metaloproteinaze (MMP 2 si 9), factorii solubili VEGF (pro-angiogenic) si IL6 (citokina pleiotropica, modulator al unor cascade de semnalizare inter-celulare ce converg catre un prognostic agravant in melanomul malign), proliferare si apoptoza in conditiile iradierii UV.

Linia celulara standardizata utilizata este cea de melanom murin – B16-F10 – cu relevanta si predictibilitate in patologia umana. Celulele au fost cultivate în mediu de cultura DMEM cu 10% ser fetal bovin, 1% soluție antibiotic/ antimicotic, în condiții standard (37°C, 95% aer umidificat și 5% CO2) 24 de ore înainte de tratament si 48 de ore cu substanțe testate.

Cele doua extracte de testat s-au combinat in urmatoarele proportii: TES:ET_A1= 1:9; TES:ET_A2 = 1:5; TES:ET_A3= 1:3; TES:ET_A4 = 2:9.

Experimentele s-au realizat in triplicat, datele prezentate fiind media valorilor obtinute in cele 3 serii experimentale succesive, avand ca martori pozitivi: Metotrexat 10mg/ml – agent antiproliferativ cu spectru larg; Colchicina 2μM – antitumoral activ in blocarea ciclului de diviziune celulara.

Mecanismele tinta studiate in vederea completarii profilului citotoxicitate / eficacitate sunt: Sinteza de melanina ca parametru indicator al malignizarii; Invazivitate tumorala exprimata prin activitatea metaloproteinazelor (MMP 2 si MMP 9), semnalizare inter-celulara prin factorul pro-angiogenic VEGF, si citokina IL6; Status proliferativ si pro-apoptotic in melanom in conditiile iradierii UV (metode descrise in cadrul capitolului special dedicat ).

Evaluarea melaninei ca parametru indicator al malignizarii:

Pigmentii melaninici sunt produsi la mamifere in special ca protectie fata de radiatia UV, in special UV-B, direct absorbita de ADN-ul celular. Radiatia UV-A actioneaza in special prin fotosensibilizare, generand specii radicalice ce degradeaza ADN-ul si alte componente celulare. UV-A penetreaza in derm, mai profund decat UV-B, fiind sursa majora de radiatie UV responsabila de producerea unor anumite tipuri de cancer de piele [].

Continutul de melanina a fost determinat in acord cu procedura descrisa de Komiyama [], care consta in urmatoarele etape de prelucrare a suspensiei celulare:

Celulele de melanom murin B16-F10 au fost insamantate in placi cu 6 godeuri , la o densitate de 25 000 celule/godeu, apoi cultivate timp de 5 zile (2 zile aderare, 3 zile tratare cu substantele de interes).

Dupa desprinderea cu tripsina de pe suportul de cultivare, suspensia celulara se centrifugheaza (10 min / 10 000 xg) si sedimentul se reia in NaOH 2M pt 15min la 60oC.

Se lasa peste noapte la frigider, iar a doua zi se sonicheaza 6 min. la treapta 9, la 26oC, apoi se aduce la evaporare la 80oC 30 min.

Absorbanta pigmentilor melaninici se citeste la 450nm (cititor in placi Berthold – Tristar)

Rezultatele relevante pentru actiunea compusilor TES si ET, singulari si asociati in proportiile selectate sunt prezentate in tabelul de mai jos:

Fig. X. Determinarea sintezei de melanina secretata de celule B16-F10 in prezenta combinatiilor TES:ET. Absorbanta pigmentilor melaninici se citeste la 450nm.

Asocierea biocomplexului cu puternic efect antioxidant TES, cu extractul fitoestrogenic ET, acționează în sensul reducerii cantității de melanină (-16% in prezența extractului TES:ET_A2 0.2%) produsa de celulele de melanom murin B16-F10, efectul fiind unul similar cu al martorilor pozitivi anti-tumorali testați comparativ.

Evaluarea indicatorilor de invazivitate: VEGF, IL6, Metaloproteinaze (MMP)

Screeningul la nivel de factor pro-angiogenic VEGF si citokina IL6 s-a realizat initial in conditii bazale de dezvoltare in cultura a melanomului din linia celulara B16-F10, conform descrierii anterioare. Rezultatele sunt prezentate in tabelul de mai jos:

Fig. 5: Determinarea VEGF si IL6 in linia celulara B16-F10 in prezenta combinatiilor TES:ET.

Extractele asociate, in combinatia A2 inhiba IL 6 cu 9%, iar VEGF scade cu 1%.

Colchicina este singurul agent chimioterapic cunoscut care duce atat la scaderea VEGF cat si a IL6, demonstrand un efect complex anti-melanom.

Expunerea culturii celulare la radiatia UV-A si UV-B s-a realizat in doze controlate (UV-A – 10J/cm2; UV-B – 1J/cm2, system BIOSUN / Vilber Lourmat).

Rezultatele sunt prezentate in tabelul de mai jos:

Fig. 6: Determinarea VEGF si IL6 in linia celulara B16-F10 neiradiat/ UV-A/ UV-B in prezenta extractelor TES:ET_A2 si TES:ET_A3.

Amestecul TES:ET_A3 intervine doar in conditiile iradierii UV-A in cascadele de propagare tumorala coordonate de IL6, prin inhibarea acestora, extractele nefiind active dupa iradierea UV-B.

Evaluarea efectului extractelor TES:ET asupra activitatii enzimatice a MMP secretate in mediul de cultura B16-F10:

Melanomul cutanat reprezinta cea mai des intalnita tumora maligna la tineri si se caracterizează printr-o capacitate mare de invazie și metastază. În acest proces degradarea ECM și membranei bazale cu enzime proteolitice este un pas esențial, în care MMP joacă un rol important. Supraexpresia, MMP-2 și MMP-9 a fost implicat în migrația și invazia celulelor de melanom S-a arătat că o activitate crescută a MMP-2 este asociată cu progresia tumorala în mai multe tipuri de tumori (tumori cerebrale, carcinom gastric). În leziunile melanocitare, s-a constatat o corelație intre exprimarea metaloproteinazei MMP-2 și slabirea structurii arhitecturale, crestere atipica și metastaze hematogene. Spre deosebire de MMP-2, care a fost asociata cu progresia melanomului, MMP-9 a fost exprimată numai în melanoamele primare avansate și a fost absenta în liniile celulare in etapa incipienta leziunilor primare. [].

In urma migrarii electroforetice, zimogramele au fost scanate si analizate semi-cantitativ cu softul ImageLab prin densitometria benzilor proteice cu activitate enzimatica ce apar ca plaje de liza, iar identificarea tipului de MMP s-a realizat pe baza maselor moleculare. Rezultatele sunt reprezentate in graficele de mai jos, ca modificare procentuala fata de martorul corespunzator.

Fig. 7: Determinarea activitatii MMP in linia celulara B16-F10 neiradiat in prezenta combinatiilor TES:ET.

Amestecurile celor doua extracte au un efect inhibitor mai pronuntat asupra activitatii MMP, comportament asemanator cu cel al martorilor testati in paralel (Metrotrexat si Colchicina).

În condițiile iradierii UV, activitatea enzimatică a MMP secretate în mediul de cultură de celulele melanomice, au fost testate doua dintre cele patru combinații de extracte, respectiv TES:ET_A2 și TES:ET_A3. Zimogramele și cuantificarea benzilor de liză, sunt reprezentate în figura de mai jos:

Fig. 6: Determinarea activitatii MMP in linia celulara B16-F10 iradiat cu UV-A/ UV-B in prezenta combinatiilor TES:ET

In conditii de iradiere UV, se observa un efect inhibitor mai pronuntat asupra MMP 9 si MMP 2, in cazul celulelor tratate cu cele doua amestecuri de extracte, astfel:

TES:ET_A2 0.2%, reduce activitatea proMMP9 si MMP 9 cu 26%, respectiv 10% si MMP 2 cu 24% in cazul celulelor neiradiate. In urma iradierii UV A, efectul inhibitor nu este la fel de semnificativ, se observa o usoara crestere a activitatii metaloproteinazelor, in schimb in urma aplicarii unei doze de radiatii UV B, prezinta un efect protectiv impotriva radiatiilor UVB prin inhibarea activitatii MMP 9 cu 20% si MMP 2 cu 9%, contribuind astfel la atenuarea invaziei tumorale.

In cazul celulelor tratate cu TES:ET_A3 0.2%, fara iradiere activitatea metaloproteinazelor este redusa cu 20% (proMMP9), 8%(MMP9), respectiv 9%(MMP2). In prezenta unui flux de radiatii UV B, activitatea MMP scade, atenuand caracterul invaziv al melanomului murin.

Status proliferativ si pro-apoptotic in melanom in conditiile iradierii UV

Expunerea pielii la radiatia UV este principalul factor declansator al mutatiilor maligne, acumularea acestora ducand la forme extrem de invazive de cancer si cu o evolutie rapida. Desi are o incidenta de 4-5% fata de celelalte tipuri de cancer, induce mortalitate in procent de 71-80% []. Impactul radiatiei UV in producerea melanomului se realizeaza prin modificari ale micromediului epidermal la nivel de factori de crestere si interactiuni melanocite – keratinocite – matrice extracelulara, respectiv melanocite – fibroblast – endoteliu. Stressul oxidativ este implicat în dezvoltarea cancerului, și promovează migrarea tumorala, invazivitatea și metastazarea [].

Studiile au urmarit evidentierea principalelor procese implicate in progresia tumorala (apoptoza si secventialitatea ciclului celular) in linia celulara de melanom murin B16-F10, in model experimental de iradiere UV.

Mecanismele urmarite in testarea acestor extracte, in cadrul modelului de iradiere, au fost urmatoarele: evaluare a procesului apoptotic; evaluare a statusului proliferativ prin evidentierea generatiilor succesive si a secventialitatii ciclului celular.

S-au realizat 3 serii experimentale ce au constat in celule B16-F10 neiradiate, iradiate UV-A (9J/cm2) si UV-B (1J/cm2). Celulele au fost lasate sa adere 24h, apoi tratate cu extractele timp de 6h, iradiate si cultivate inca 24h in prezenta extractelor. Au fost analizate apoptoza si secventialitatea ciclului celuler, conform metodelor descrise in cadrul capitolului dedicat. Rezultatele sunt prezentate in tabelele de mai jos:

Fig. X. Apoptoza celulelor de melanom murin B16-F10 in prezenta TES:ET

Fig. X. Secventialitatea ciclului celular in conditii de iradiere cu UV-A si UV-B pe linia de melanom murin B10-F16

Secventialitatea ciclului celular nu se modifica in conditiile de iradiere testate, mentinand aceeasi rata de multiplicare accelerata specifica melanomului. Combinatiile de tip A2 si A3 asigura un efect concertat de reducere a propagarii tumorale pe cele doua mecanisme mai sus mentionate. In conditii de iradiere, extractele actioneaza doar in cazul UV-A, mentinand tendinta observata in stadiul bazal. Radiatia UV-B este mult mai agresiva, inducand apoptoza in majoritatea populatiei celulare, prin generare de specii de oxygen reactive. In acest context, prin caracterul sau antioxidant, complexul TES protejeaza celula de melanom murin fata de apoptoza generate de stress oxidative, effect contrar terapiei antitumorale.

Concluziile studiului:

Modelul experimental realizat pentru studiul proceselor celulare si moleculare din patologia dereglarilor hiperproliferative (melanom), cuprinde: evaluarea cantitativă melaninei, principal parametru indicator al malignizarii in cancerele de piele, evaluarea unor parametri promotori ai caracterului invaziv tumoral (MMP 2 si 9, factorul proangiogenic VEGF si citokina pleiotropica IL6), status proliferativ si apoptoza in conditiile iradierii UV.

Studiile s-au realizat pe linia celulară standardizată de melanom murinic B16-F10, prin testarea biocomplexelor TES și ET asociate, atât in condiții normale cât și in urma iradierii cu radiații UV.

Pigmentul de melanină poate afecta comportamentul celulelor de melanom, de aceea o analiză cantitativă a conținutului de melanină, ar putea facilita determinarea simplă și precisă a fenotipului metastatic celular. Deși principala funcție a melaninei este de a proteja împotriva leziunilor induse de radiația UV, pigmentul de melanină poate regla și homeostazia epidermică și astfel poate afecta comportamentul melanomului. Prezența pigmentului de melanină a afectat proprietățile elastice ale celulelor, precum și abilitățile de transmigrație, iar efectele inhibitorii sunt de natură mecanică [Sarna și colab., 2014]. [12] Asocierea biocomplexului cu puternic efect antioxidant TES, cu extractul fitoestrogenic ET, acționează în sensul reducerii cantității de melanină (-16% in prezența extractului TES:ET_A2 0.2%) produsa de celulele de melanom murin B16-F10, efectul fiind unul similar cu al martorilor pozitivi anti-tumorali testați comparativ.

Inducerea formării unor noi vase sanguine dintr-un pat vascular preexistent a fost raportată ca un parametru al valorii prognosticului potențial în tumorile solide, ceea ce poate facilita creșterea tumorală și metastazarea. Angiogeneza tumorală este controlată de o varietate de factori angiogenici. Prezența unei relații semnificative între exprimarea VEGF și progresia tumorii în melanoamele cutanate recomanda VEGF drept o țintă bună pentru tratamentele antiangiogenice în melanomul pielii. [24]. IL-6 joacă un rol major în patogeneză și dezvoltarea afecțiunilor maligne. Promovează creșterea tumorilor prin inhibarea apoptozei și induce angiogeneza tumorală. În plus, lumina ultravioletă (UV) modifică expresia multor gene din liniile celulare din celule scuamoase de carcinom c, cu eliberarea constanta a citokinelor, cum ar fi IL-6, sugerând că expunerea la lumina soarelui ar putea crește nivelurile IL-6 în piele [26]. Screeningul la nivel de factor pro-angiogenic VEGF si citokina IL6 s-a realizat initial in conditii bazale de dezvoltare in cultura a melanomului din linia celulara B16-F10, remarcându-se efectul inhibitor al amestecului TES:ET_A2 asupra IL-6 și VEGF. In conditiile iradierii UV-A, amestecul TES:ET_A3 intervine doar in cascadele de propagare tumorala coordonate de IL6, prin inhibarea acestora, extractele nefiind active dupa iradierea UV-B.

În cultura de celule de melanom uman expresiile crescute ale MMP-1, MMP-2 și MMP-9 sunt corelate cu migrația și invazia. În leziunile melanocitare umane s-a demonstrat o corelație pozitiva între progresia tumorii și expresia MMP-2. Creșterea expresiei MMP-9, pe de altă parte, a fost găsită în principal în faza de creștere radială a melanomului primar, indicând faptul că expresia MMP-9 se corelează cu invazia timpurie a melanomului [23]. In conditii de iradiere UV, se observa un efect inhibitor mai pronuntat asupra MMP 9 si MMP 2, in cazul celulelor tratate cu cele doua amestecuri de extracte, atenuand caracterul invaziv al melanomului murin.

Studiile au urmarit si evidentierea principalelor procese implicate in progresia tumorala (apoptoza si secventialitatea ciclului celular) in linia celulara de melanom murin B16-F10, in model experimental de iradiere UV. Amestecurile de tip TES:ET_A2 si TES:ET_A3 asigura un efect concertat de reducere a propagarii tumorale pe cele doua mecanisme mai sus mentionate. In conditii de iradiere, extractele actioneaza doar in cazul UV-A, mentinand tendinta observata in stadiul bazal. Radiatia UV-B este mult mai agresiva, inducand apoptoza in majoritatea populatiei celulare, prin generare de specii de oxygen reactive.

CONCLUZII FINALE

Cercetarile initiate au realizat un studiu privind impactul unor extracte vegetale asupra sistemului pro si anti – oxidant acelular, cu proiectie in sisteme celulare ale tesutului cutanat, pentru restabilirea homeostaziei proceselor fiziologice si patologice grav afectate de actiunea radicalilor liberi si aduc plus-valoare in sfera cunoasterii potentialului terapeutic si a valorificarii unor compusi naturali din Salvia of., Arctium lappa, Corylus avellana si a unor deseuri vegetale din specii deSolanum, si Vitis vinifera.

Au fost elaborate modele experimentale „in vitro” ce descriu cu acuratete procese fiziologice si patologice reprezentative pentru status celular disfunctional:generare de radicali liberi „in situ” pentru evaluari acelulare; stimulare pro-inflamatorie diferentiata, patologic-specifica:TNF-α (localizare sistemica, prima linie de generare a cascadelor de propagare a inflamatiei), PMA (pro-oxidant, promotor de inflamatie), LPS ( infectie bacteriana in leziuni cutanate); expresie molecule de adeziune monocit-endoteliu si corelatii cu eliberare citokinica in inflamatia vasculara; fenomene pro-oxidative si pro-inflamatorii generate de radiatia UV cu impact in proliferare si apoptoza la nivel de celula normala- keratinocit, respectiv melanom; regenerare dermo-epidermica post-lezionara, exprimata prin diferentiere keratinocitara si raport optim sinteza / degradare colagen.

Complexitatea mecanismelor investigate, precum si inter-relationarea efectelor demonstrate pentru compusii testati se regasesc in tabelul centralizator nr…..

Actiuni evidentiate  – asocieri – scheme terapeutice in afectiuni dermatologice (aici sa mai lucram)

BIBLIOGRAFIE