Biomateriale pe bază de polizaharide modificate, micronanopaticule și sub formă de film, pentru eliberarea controlată a principiilor active [309149]

UNIVERSITATEA TEHNICĂ “GHEORGHE ASACHI” DIN IAȘI

FACULTATEA DE INGINERIE CHIMICĂ ȘI PROTECȚIA MEDIULUI ,, CRISTOFOR SIMIONESCU ,,

[anonimizat]

-[anonimizat], micro/[anonimizat] a [anonimizat]-

Conducători științifici

Prof. em. dr. ing. dr. h. c. Marcel Popa

Prof. dr. Christelle Delaite

Doctorand: [anonimizat]. dipl. Corina-Lenuța Savin

Iași

2018

Teza de doctorat a fost realizată cu sprijinul financiar al proiectelor:

Sisteme inovative de eliberare controlata sub formă de particule pentru țintirea segmentului posterior ocular ,,OCULOMAT” (PN-II-PT-PCCA-2013-4)

[anonimizat], [anonimizat] (Grant Agreement No.: 18428).

Mulțumiri din suflet…

[anonimizat] o [anonimizat], [anonimizat], în momentele cheie, a [anonimizat], [anonimizat], m-[anonimizat], doresc să le adresez mulțumiri.

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat]-a inspirat-o asupra a [anonimizat], această teză de doctorat nu ar fi fost posibilă. Sunt numeroase momentele în care am realizat rolul de „catalizator” al înțelegerii pe care prezența și îndrumarea sa de excepție l-a avut pentru mine.
[anonimizat], pentru oportunitatea pe care mi-a oferit-o de a realiza o [anonimizat], [anonimizat], din Mulhouse.

[anonimizat]. [anonimizat].dr.ing. [anonimizat]. Horia Iovu și domnul prof.dr. Ionel Marcel Popa pentru atenția și exigența profesională acordate prin recenzarea lucrării.

[anonimizat]. bioing. [anonimizat], [anonimizat], sprijinul permanent și încrederea pe care mi-a acordat-o [anonimizat] a [anonimizat], de îndată ce observa că nu mai întrevăd finalul mult dorit.

Această teză de doctorat nu ar fi fost completă fără ajutorul esențial și necondiționat al domnului dr. bioing. [anonimizat] a [anonimizat]-a îndrumat inegalabil pașii în sensul „schimbării” și formării mele ca cercetător. Expresie a [anonimizat]rea accordată în cadrul stagiului de mobilitate Erasmus în cadrul Laboratorului de Fotochimie și Inginerie Macromoleculară din cadrul Universității Haute-Alsace, din Mulhouse, domnului profesor Gérard Riess.

Domnului dr.ing. Cornel Stan vreau să-i mulțumesc pentru încrederea, suportul și sfaturile oferite.

Tuturor colegilor și prietenilor mei, care prin sprijinul lor mi-au fost alături de-a lungul acestor ani, le adresez recunoștința mea. În special prietenei mele, Liana Alupei, îi ofer toată afecțiunea mea pentru că mi-a fost alături și m-a încurajat în toți acești ani. Prietenei mele, Camelia Tincu vreau să-i mulțumesc pentru anii de prietenie, sprijinul, încurajările și gândurile bune oferite în momentele dificile de pe parcursul doctoratului și nu numai. Mulțumesc în mod special colegii mele Petronela Horlescu, pentru sprijin, optimism și momentele de veselie oferite care m-au încurajat și ajutat în ultima perioadă.

În mod deosebit țin să le mulțumesc mamei și tatălui meu că m-au creascut independentă, cu înțelegere și răbdare, pentru susținerea, înțelegerea și liniștea pe care mi-au acordat-o pe parcursul acestor ani de studiu, consider cuvintele insuficiente pentru a le arăta toata dragostea mea.

Îi mulțumesc logodnicului meu, Ovidiu, pentru răbdarea, devotamentul, încrederea pe care o avut-o în mine, iubirea și dăruirea necondiționate pe care mi le-a dăruit. Mătușii mele, Lenuța, și unchiului mei, Cătălin, le dăruiesc pentru totdeauna dragostea și devotamentul meu.

În cele din urmă doresc să dedic aceste realizări tuturor celor care au avut încredere în mine, celor care m-au îndrumat, încurajat și m-au sprijinit le ofer cele mai bune gânduri și recunoștință.

Introducere

Biomaterialele, definite în mod tradițional ca materiale utilizate în dispozitivele medicale, au fost folosite încă din antichitate, dar în ultimii ani gradul lor de sofisticare s-a amplificat semnificativ. Interesul tot mai crescut al cercetătorilor a condus la progresul remarcabil al biomaterialelor cu funcții din ce în ce mai complexe utilizate în domeniul biomedical.

Biomaterialele fabricate în prezent sunt capabile să încorporeze componente biologic active derivate din natură. Acestea au roluri cruciale în fabricarea de dispozitive pentru screening-biologic, în studiile științifice de bază și într-o varietate de domenii non-medicale. Astfel de materiale sofisticate sunt deseori concepute pentru a imita un subgrup al proprietăților fizico-chimice al materialelor naturale. Din ce în ce mai mult, natura inspiră nu numai materialele, ci și mijloacele și metodele prin care sunt fabricate. Selecția unui biomaterial eficient pentru o anumită aplicație nu este un lucru banal. Aceasta necesită atât cunoașterea detaliată a proprietăților materialului, cât și o înțelegere aprofundată a modului în care corpul va răspunde la prezența sa. Realizările în domeniul biomaterialelor au la bază știinte precum chimia, fizica, biologia și știința materialelor, aplicațiile tehnice sau ”punerea în operă“ culminând cu realizările clinice.

Biomaterialele pe bază de polimeri naturali sau sintetici au fost utilizate în domeniul biomedical încă din cele mai vechi timpuri, jucând un rol important în succesul dezvoltării dispozitivelor medicale și a sistemelor de transport de medicamente care odată introduse în corpul uman sunt capabile să contribuie la îmbunătățirea calității vieții atât prin creșterea eficienței tratamentului cât și a confortului pacientului

Tehnologia modernă a sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor datează doar de 60 de ani, evoluția acesteia desfășurându-se aproape în paralel cu dezvoltarea chimiei polimerilor. Progresele fără precedent în domeniul genomicii și al biologiei moleculare, folosirea metodelor moderne de sinteză chimică (cum ar fi chimia combinatorie) au permis dezvoltarea și sintetizarea de noi medicamente, respectiv a diverse forme de dozare adecvate sau sisteme de administrare a medicamentelor ce permit aplicarea efectivă, sigură și fiabilă a acestor compuși bioactivi către pacient. În ceea ce privește forma de prezentare, tehnologiile actuale permit obținerea de sisteme polimer-substanță biologic activă cu design foarte variat, de la filme, geluri și hidrogeluri, soluții injectabile și tablete până la sisteme particulate micro- și nanometrice. Dintre acestea, sistemele sub formă de hidrogeluri/particule posedă cea mai mare pondere datorită numeroaselor avantaje pe care le prezintă din punct de vedere al modului de administrare.

Teza de doctorat intitulată "Biomateriale pe bază de polizaharide modificate, micro/nanopaticule și sub formă de film, pentru eliberarea controlată a principiilor active" este structurată în două părți: prima parte (capitolele 1,2,3,4) este destinată studiului bibliografic. Partea a II-a este dedicată prezentării rezultatelor originale.

Aceasta debutează cu capitolul 5, unde sunt prezentate materiale, metode și tehnici de lucru utilizate în partea originală a cercetării.

Capitolul 6 prezintă rezultatele proprii obținute în ce privește prepararea rețelelor polimerice pe bază de doi polimeri poliglobalidă și copolimerul de poli(etilenglicol) modificat cu acid tiomalic prin reacția de tip adiție tiol-enă, completat în final, de concluzii parțiale.

Capitolul 7, raportează rezultatele originale obținute referitoare la prepararea sistemelor micro/nanoparticulate pe bază de chitosan grefat cu metacrilat de poli(etilenglicol) prin tehnica de dublă reticulare în emulsie inversă; fiind încheiat de concluzii parțiale.

Capitolul 8, raportează rezultatele proprii originale obținute la prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de chitosan grefat cu metil eter acrilat de poli(etilen glicol) prin dublă reticulare în emulsie inversă; fiind încheiat de concluzii parțiale.

Lucrarea de doctorat este completată în final, de o parte de concluzii generale și de anexe privind modul de valorificarea rezultatelor și abrevierile utilizate.

Teza este desfășurată pe 313 pagini, conține 140 figuri, 53 tabele și 431 referințe bibliografice.

PARTEA I. STUDIU BIBLIOGRAFIC

Capitolul 1. Biomateriale – noțiuni generale

Capitolul prezintă o serie de aspecte generale cu privire la biomateriale pe bază de polimeri naturali, sintetici și derivați ai acestora și sisteme polimere cu eliberare controlată a principiilor biologic active. De asemenea, sunt evidențiate metodele de modificare ale polizaharidelor, și câteva exemple de biomateriale utilizate pentru realizarea sistemelor cu eliberare controlată sub formă de filme (geluri) și micro/nanoparticule, întrucât în partea a doua a acestei lucrări vor fi prezentate rezultatele originale obținute.

Biomaterialele au fost utilizate pentru a ,,repara,, corpul uman încă din antichitate. Acestea au fost cercetate în moduri și momente diferite și numai istoricii pot scrie o istorie completă, evoluția acestora putând fi urmărită prin intermediul progreselor realizate în artă și știință. Realizările în domeniul biomaterialelor au la bază discipline precum chimia, fizica, biologia și știința materialelor, aplicațiile tehnice sau ”punerea în operă“ culminând cu realizările clinice. Cu toate că biomaterialele au o istorie îndelungată și au fost utilizate în scopuri medicale încă dinaintea anului 3000 î.Hr., abia la mijlocul secolului al XX-lea a fost introdusă terminologia de "biomaterial". Există diverse definiții ale biomaterialelor exprimate în moduri diferite prezentate în literatura de specialitate, acestea având mai mult sau mai puțin același înțeles.

O primă definiție a biomaterialelor a fost dată în anul 1976 de către Comitetul Consultativ al Universității Clemson și anume – "o substanță inertă sistemic și farmacologic destinată implantării sau încorporării în sisteme vii,, . În 1980, Bruck afirmă că biomaterialele sunt "materialele de natură sintetică și de origine naturală care intră în contact cu țesuturile, sângele și cele biologice și sunt destinate utilizării în aplicații protetice, de diagnostic, terapeutice și de depozitare fără a afecta în mod negativ organismul viu și componentele acestuia“ .

Biomaterialele se mai definesc și ca ,,materiale care urmează să fie utilizate pentru a înlocui un țesut sau organ dintr-un sistem viu care nu funcționează pe deplin sau pentru a susține sistemul biologic în funcția sa în timp ce este în contact intim cu țesuturile într-un mod sigur, fiabil, economic și fiziologic acceptabil,, . O altă definiție a biomaterialelor a fost promovată de către Williams (1987) și Black (1992) – "biomaterial – material utilizat ca dispozitiv medical, destinat interacționării cu sistemele biologice" .

În prezent, conform unei definiții general valabilă și acceptată de comunitatea științifică internațională, biomaterialele sunt ’’materiale de origine naturală sau sintetică, care pot fi folosite pe o perioadă de timp bine determinată, ca un întreg sau ca o parte componentă a unui sistem care tratează, grăbește, sau înlocuiește un țesut, organ sau o funcție a organismului uman’’ , .

Dovezile utilizării biomaterialelor sub formă de implanturi sau proteze în scopuri medicale sunt prezente încă din antichitate, pe parcursul ultimelor două secole au fost evidențiate pe schelete sau cranii umane ca urmare a săpăturilor în situri atribuite diferitelor civilizații ale antichității: egiptean, roman, grec și etrusc. Implanturile medicale au fost posibile încă de timpuriu însă fără succes datorită lipsei cunoștințelor în ceea ce privește controlul infecției și binențeles al biocompatibilității materialelor,. Dicționarul Williams al biomaterialelor definește biocompatibilitatea drept "capacitatea unui material de a produce un răspuns adecvat al gazdei într-o situație specifică".

Primele întrezăriri ale beneficiilor biomaterialelor au fost surprinse și prezentate la sfârșitul secolului XIX datorită cercetărilor care au revoluționat acest domeniu dezvăluind că utilizarea materialelor cu succes într-un sistem biologic era condiționată de cunoașterea biocompatibilității acestora. Lapuyade și Sicre (1775) au fost fondatorii celei mai vechi tehnici de fixare a fracturilor osoase cu sârmă de metal. La sfârșitul secolului al XIX-lea începutul secolului al XX-lea, un grup de medici a început explorarea biocompatibilității a diferitelor tipuri de materialele implantate. Biocompatibilitatea implanturilor de metal (aur, argint, plumb și platină) și fixarea acestora pe oase la câini a fost cercetată de Levert’s (1800). În 1508 Leonardo da Vinci a evidențiat posibilitatea realizării lentilelor de contact din sticlă, însă acestea au fost elaborate pentru prima dată în 1888 de către Adolf Fick. Studiile realizate în această epocă au demonstrat că anumite tipuri de materiale sunt tolerate de către organism, lucru care a condus rapid la recunoașterea potențialului utilizării materialelor artificiale pentru a trata o varietate de probleme, conducând către domeniul biomaterialelor așa cum este cunoscut astăzi .

Utilizarea biomaterialelor în medicină și biotehnologie s-a realizat încă de la începutul secolului XX, iar evoluția acestora s-a datorat interesului tot mai crescut al cercetătorilor și a faptului că biomaterialele existente în acel moment au fost înlocuite cu altele noi, revoluționare care au oferit multe avantaje specifice fiecărei aplicații . Evoluția biomaterialelor a fost posibilă în urma apariției a trei categorii definitorii și anume:

Biomateriale sintetice (metale, polimeri și biopolimeri, ceramica și bioceramica, materialele compozite);

Biomaterialele semi-sintetice sau hibride;

Biomaterialele naturale, din care fac parte trei tipuri de biopolimeri:

Proteinele – formate din lanțuri de aminoacizi (mătasea, colagenul, elastina, fibrina);

Polizaharidele – formate din lanțuri de glucoză (chitina, glicozaminoglicani);

Polinucleotidele – formate din lanțuri de nucleotide (ADN, ARN) .

Majoritatea biomaterialelor dezvoltate disponibile în prezent sunt utilizate fie singure, fie în combinație cu materialele din aceste clase, prezentând proprietăți structurale, fizice, chimice și mecanice diversificate deci, prin urmare, oferind diferite alternative pentru diverse aplicații biomedicale. În cele ce urmează sunt prezentate câteva exemple de biomateriale.

Cuvântul "polimer" semnifică "multe părți" (și provine de la grecul poli, care înseamnă "multe" și meros, adică "părți"). Polimerii prezintă o structură chimică în care merul este unitatea structurală care se repetă de mai multe ori, compușii având o masă moleculară mare . Polimerii reprezintă materiale convenabile pentru aplicațiile biomedicale fiind utilizate pentru fabricarea de dispozitive cardiovasculare pentru înlocuirea și proliferarea diferitelor țesuturi moi, proteze mamare, materiale dentare, sisteme de dializă, lentile de contact, sisteme de transport pentru medicamente ,,.

Metalele și aliajele lor, această clasă de materiale este cunoscută pentru rigiditate, ductilitate, rezistența la uzură, conductivitatea termică și electrică, și sunt utilizate pentru fabricarea implanturilor, a dispozitivelor medicale și accesoriile aferente. Datorită fiabilității lor mecanice, biomaterialele metalice ca de exemplu oțelul inoxidabil, titanul și aliajele, aliajele de cobalt crom, aliajele de aluminiu, zirconiu sunt greu de înlocuit cu înlocuitori ceramici și polimeri ,.

Materiale compozite, sunt formate din cel puțin două faze de natură diferită fizic și/sau chimic care sunt combinate într-o asemenea manieră încât formează un material nou înzestrat cu o combinație superioară de proprietăți diferite de cele ale materialelor componente individuale . Materialele compozite pot fi fibroase, laminate, hibride, stratificate, speciale, armate cu fibre sau particule. De exemplu materiale compozite armate cu fibre pot fi utilizate în general în cazul problemelor dificile cum ar fi regenerarea tisulară, reconstrucția craniană, repararea: fracturilor de osoase, genunchi, glezna, dentare, șold și alte aplicații de înlocuire a articulațiilor .

Materialele ceramice, reprezintă o altă clasă de materiale utilizate pentru proiectarea biomaterialelor. Utilizarea acestora a fost motivată de inerția lor în organism, de capacitatea lor de prelucrare într-o varietate de forme și porozități, rezistență mare la compresiune și caracteristici excelente de uzură. Ceramica este utilizată ca parte a sistemului musculo-scheletic, proteze de șold, genunchi artificiali, grefe osoase, implanturi dentare și ortopedice și acoperiri pentru îmbunătățirea biocompatibilității implanturilor metalice, .

Proteinele, sunt substanțe complexe, biomolecule mari sau macromolecule, constând din unul sau mai multe lanțuri lungi de resturi de aminoacizi, prezente în toate organismele vii. Proteinele prezintă o mare valoare nutrițională și sunt implicate direct în procesele chimice esențiale pentru viață. Importanța acestora a fost recunoscută de către cercetătorii chimiști la începutul secolului al XIX-lea, chimistul suedez Jöns Jacob Berzelius, fiind cel care în 1838 a introdus termenul de proteină, un cuvânt grecesc, ce semnifică "ocuparea primului loc" . Caracterul tunabil al biomaterialelor bazate pe proteine permite adaptarea independentă a unei game de proprietăți biomateriale, creând o alternativă atrăgătoare la matricile suport polimerice sintetice sau naturale care pot fi utilizate în aplicații ca imagistica biomedicală de diagnostic și transportul terapeutic țintit .

Polizaharidele sunt biopolimeri unici cu o diversitate structurală nemărginită, derivați din surse regenerabile, cum ar fi plantele, animalele, ciupercile, algele și microorganismele. Proprietățile unice ale acestora le transformă în materiale atractive pentru o gamă variată de aplicații biomedicale și anume: excipienți farmaceutici, proteze, sisteme de transport a principiilor biologic active și aplicații imagistice , .

O moleculă de polinucleotidă reprezintă un biopolimer compus din 13 sau mai mulți monomeri nucleotidici (ADN, ARN) legați covalent într-un lanț . În general, acestea sunt utilizate în domeniul terapiei genice care a cunoscut progrese semnificative din 1990 (prima terapie genică somatică) până în prezent. Terapia genică reprezintă metoda terapeutică care implică administrarea polinucleotidelor (ADN, ARN, oligonucleotide anti-sens și ARN) cu interferență mică, fie local, fie sistemic pentru a trata o boala genetică sau pentru a modifica un comportament celular (ex. cancerul, sindromul imunodeficienței umane dobândite).

Biomateriale pe bază de polimeri naturali și derivați ai acestora

Studiile de literatură raportate până în prezent, dovedesc interesul major al cercetătorilor din ultimele decenii în ceea ce privește utilizarea polimerilor naturali ca materiale pentru suporturi inovatoare în diferite aplicații datorită proprietăților lor. Aplicabilitatea biomaterialelor pe bază de polimeri naturali este întâlnită la scară largă în domenii precum industria farmaceutică, cosmetică, textilă, a alimentației și nutriției, a biocombustibililor și în medicină .

Avantajele biomaterialelor polimerice în comparație cu alte clase de materiale sunt (i) ușurința de fabricare, (ii) posibilitatea prelucrării caracteristicilor acestora, (iii) prezintă proprietăți mecanice și fizice dorite și (iv) cost redus. Polimerii utilizați în aplicațiile biomedicale pot fi clasificați în două categorii, și anume sintetici și naturali. Sistemele polimerice naturale includ, proteinele, polizaharidele și polinucleotidele, iar cele sintetice includ acrilați, poliamide, poliesteri, poliolefine, polisiloxani, poliuretani, etc. Deși prelucrarea este mai ușoară în cazul polimerilor sintetici, principalul dezavantaj al acestora este lipsa biocompatibilității în majoritatea cazurilor, utilitatea acestora fiind adesea asociată cu reacții inflamatorii . Această condiție poate fi depășită prin utilizarea polimerilor naturali. Spre exemplu, polimerii naturali precum chitosan, caragenan, pululan și alginați sunt intens utilizați în aplicații biomedicale, pentru regenerarea țesuturilor și sisteme de administrare a medicamentelor.

Biomaterialele pe bază de polimeri utilizate în scopuri terapeutice trebuie să prezinte anumite caracteristici fizico-chimice, biologice legate de interacțiunea și efectele reciproce în sistemul organism-implant. Proiectarea și selectarea materialelor care pot fi utilizate în diferite aplicații ale domeniului biomedical trebuie să țină cont de următoarele condiții esențiale: răspunsul dat de către organism în momentul contactului cu implantul, biocompatibilitate, biodegradabilitate, biofuncționalitate și bioinerție (figura 1.1).

Figura 1.1. Condiții esențiale ale unui material utilizat în domeniul biomedical

Indiferent de tipul de material utilizat ca biomaterial în aplicații biomedicale, fie ca dispozitiv pentru înlocuirea organelor, matrice suport pentru regenerarea tisulară sau sistem pentru eliberarea de principii active, este necesar ca acesta să fie înzestrat cu caracteristici specifice, care să nu stimuleze sau provoace inflamații, reacții toxice și simptome alergice în organism ,. Dintre acestea cele mai importante caracteristici sunt biocompatibilitatea și biodegradabilitatea materialului.

Pentru îndeplinirea condiției de biocompatibilitate, materialul utilizat trebuie să fie un produs sterilizabil, non-carcinogen, nepirogenic, netoxic, nealergenic, compatibil cu sângele (netrombogen) impunându-se neafectarea tabloului sangvin, nemodificarea mecanismului de coagulare a sângelui, de asemenea materialul nu trebuie să provoace apariția fenomenului de respingere din partea organismului, a sedimentării în țesuturi și a efectelor alergice, teratogene, toxice și cancerigene ,.

În cazul biodegradabilității biomaterialului este necesar ca aceasta să fie corelată cu procesul de degradare a polimerului în mediul biologic, produșii secundari rezultați în urma degradării fiind necesar să fie absorbiți sau eliminați din organism, astfel evitându-se acumularea în țesuturi care favorizează iritarea sau inflamarea acestora.

Biofuncționalitatea materialului, deține un rol important în termeni fizici și mecanici. Pentru materialele cu o biofuncționalitate de lungă durată, acestea nu trebuie să se degradeze la contactul cu țesutul (cu excepția cazului când acest proces este dorit, de exemplu suturi bioabsorbabile) deoarece astfel, și-ar pierde parțial funcționalitatea; de asemenea este necesar să își păstreze, stabilitatea chimică și mecanică pe parcursul întregului proces. Biomaterialul trebuie să îndeplinească o serie de condiții de proiectare în exploatare și anume:

transmiterea și distribuția stresului, rezistența la alungire (de exemplu: înlocuitor de tendon)

articulare pentru a permite mișcarea (de exemplu: articulația artificială a genunchiului)

controlul fluxului de sânge și fluid (de exemplu: inima artificială)

umplerea spațiului (de exemplu, chirurgia cosmetică)

stimuli electrici (de exemplu, stimulatorul cardiac)

transmiterea luminii (de exemplu, lentile de contact)

transmisia sunetului (de exemplu, implantul cohlear)

De asemenea, biomaterialul este necesar să fie bioinert, stabil din punct de vedere fizic și chimic în momentul în care interacționează cu organismul, să nu producă sau să elibereze componente solubile în organism (cu excepția cazului în care această eliberare este voită), să fie pur,.

Succesul utilizării unui biomaterial pentru o aplicație medicală este strict legat, de respectarea criteriilor enumerate mai sus, cât și de alegerea tipului de biomaterial care este asociată cu funcția pe care acesta o va îndeplini și perioada de contact cu corpul uman, având la bază combinația proprietăților sale fizice, chimice, mecanice și biologice. Proprietățile fizice, compoziția și proprietățile chimice ale unui biomaterial influențează tipul legăturii la nivel celular, determinându-se astfel și stabilitatea, respectiv reactivitatea chimică a biomaterialului.

Proprietățile fizice ale biomaterialelor sunt fundamentale având impact asupra comportamentului și răspunsului la nivel celular. Reacțiile fizico-chimice care apar în momentul în care suprafața biomaterialului intră în contact cu o celulă, sunt influențate la rândul lor de factorii de mediu și proprietățile suprafeței (higroscopicitate, flexibilitate, rigiditate, compoziția chimică).

Din punct de vedere al proprietăților chimice alegerea tipului de biomaterial este influențată de masa moleculară care este necesar să fie selectată astfel încât să fie exclus pericolul sedimentării în organism, de structura chimică care poate fi liniară sau ciclică, ramificată, reticulată, de toxicitatea polimerului, produșii rezultați în urma degradării sau a compușilor bioactivi, a aditivilor încorporați.

În ceea ce privește proprietățile mecanice ale biomaterialelor progresele în inginerie și medicină au condus la dezvoltarea de biomateriale cu proprietăți special țintite pentru un anumit tip de aplicație. Pentru un biomaterial cu aplicabilitate mecanică specifică, sunt studiate proprietăți precum modulul Young, ductilitatea, rezistența la tracțiune, rezistența la curgere, rezistența la compresie. În majoritatea aplicațiilor, în general concurența polimerilor în comparație cu alte tipuri de materiale este mică sau deloc. Proprietățile unice ale biomaterialelor sunt:

posibilitatea de modificare și funcționalizare a suprafeței;

ușurință în prelucare;

biocompatibilitate;

biodegradabilitate;

"bioactiv", interacționează cu mediul gazdă;

flexibilitate;

compoziție și proprietăți fizice și mecanice adecvate;

proprietăți temice și electrice îmbunătățite;

transparență optică pentru anumite strategii de cercetare;

abilitatea de a include microstructuri sau principii biologic active ;

conferă stabilitate principiilor biologic active, la acțiunea pH-ului, sau la stimuli externi (temperatură, solvenți, lumină etc);

obținerea sistemelor de transport condiționate (unguente, aerosoli, supozitoare, creme, tablete, pilule, capsule, etc.) cu eliberare controlată a principiilor active, a implanturilor biocompatibile;

realizarea de suporturi pentru atașarea și creșterea celulelor (ingineria țesuturilor).

rezistență la atacurile biochimice .

Polimeri naturali

Dezvoltarea biomaterialelor având la bază polimeri naturali poate fi considerată un proces progresist. Studiile raportate privind utilizarea polimerilor naturali ca biomateriale datează de mii de ani, cel mai des utilizate fiind în aplicațiile biomedicale (excipienți farmaceutici, protetică, sisteme cu eliberare controlată de medicamente, și aplicații de imagistică) . Polizaharidele, proteinele și poliesterii cu origini vegetale și animale, constituie familia de polimeri naturali .

Proteinele

Nanotehnologia este un factor-cheie în ultimele decenii, iar aplicațiile sale au revoluționat domeniul biomedical. Dezvoltarea dispozitivelor de transport caracterizate printr-o precizie ridicată, siguranță și eficiență rămâne principala provocare pentru transportul direcționat de medicamente . Proteinele sunt o clasă de molecule naturale care prezintă proprietăți unice și potențiale aplicații atât în domeniul biologic, cât și în cel al materialelor.

Biomaterialele bazate pe proteine prezintă avantaje ca biodegradabilitatea, metabolizarea și în special avantajul posibilității modificării chimice ulterioare. Caracterul tunabil al biomaterialelor bazate pe proteine permite adaptarea independentă a unei game variate de proprietăți fizico-chimice, devenind o alternativă atrăgătoare ca matrici suport polimerice sintetice sau naturale . Cele mai utilizate tipuri de proteine pentru prepararea sistemelor cu eliberare controlată sunt prezentate în tabelul 1.1.

Tabel 1.1. Proteine utilizate pentru sinteza sistemelor de transport

Polizaharidele

Arhitectura polizaharidelor este formată din resturi de monozaharide unite prin legături O-glicozidice, unitățile repetitive fiind de obicei monozaharide formate din 6 carboni, iar formula generală poate fi reprezentată de (C6H10O5)n, unde 40≤ n ≤3000 . Polizaharidele sunt biopolimeri unici care prezintă o diversitate structurală nemărginită, derivați din resurse regenerabile, cum ar fi plante, animale, ciuperci, alge, și microorganisme.

Din punct de vedere chimic, structura unică a polizaharidelor combinată cu proprietăți precum hidrofilicitatea, biocompatibilitatea, biodegradabilitatea, bio-tolerabilitate, stereo-regularitatea, multichiralitatea și capacitatea lor de polifuncționalizare, respectiv modificarea prin reacții chimice variate a grupelor funcționale hidrofile (în principal hidroxil (OH−), amino (NH−) și carboxil (COOH−)), toate acestea contribuie la captarea interesului cercetătorilor în ceea ce privește investigarea lor. De asemenea, proprietățile de bioadeziune, mucoadezivitate și circulația prelungită în sânge a sistemelor de transport pe bază de polizaharide sunt dependente de proprietățile hidrofile ale acestora.

Clasificarea polizaharidelor poate fi realizată în funcție de criterii cum ar fi: structura, solubilitatea, compoziția chimică, sursele de proveniență, precum și în funcție de aplicațiilor lor (figura 1.2.).

Figura 1.2. Criteriile de clasificare a polizaharidelor

Datorită prezenței diferitelor grupări funcționale ca substituienți la catena principală, polizaharidele pot fi modificate atât chimic cât și biochimic, conducând la o varietate de tipuri de derivați polizaharidici. Ca și biomateriale naturale, polizaharidele sunt foarte stabile, sigure, netoxice, hidrofile și biodegradabile. În plus, sunt disponibile din abundentă în natură, prezintă costuri reduse în prelucrarea lor fapt ce le face sa fie fundamentale în aplicațiile farmaceutice. În tabelul 1.2 sunt prezentate câteva exemple de polizaharide utilizate pentru sinteza sistemelor de transport.

Tabel 1.2. Polizaharde utilizate pentru sinteza sistemelor de transport

Derivați ai polizaharidelor

Polimerii naturali, în special polizaharidele, datorită structurii lor chimice prezintă calități fundamentale pentru utilizarea în scopuri / aplicații biomedicale: biocompatibilitatea, lipsa de toxicitate, biodegradabilitatea, abundența, costul relativ scăzut și natura regenerabilă. Apariția nanomedicinei, a condus la o creștere a cererii de dezvoltare a biomaterialelor cu proprietăți diversificate implicit la necesitatea de a modifica structura acestor polimeri pentru a introduce proprietăți noi, controlabile (rezistența la tracțiune și de a crește/reduce solubilitatea în apă) și, prin urmare, pentru a diversifica spectrul de aplicații . Grupările funcționale disponibile pe catena principală fac posibile modificările chimice, fizice sau biologice, care conduc la obținerea de noi derivați pe baza cărora se pot obține materiale micro- și nanoparticulate cu aplicații în nanomedicină pentru diagnosticarea, prevenirea și tratamentul bolilor, unde administrarea medicamentelor clasice nu a demonstrat o eficacitate bună. Reacțiile de modificare studiate au inclus reticularea și substituțiile specifice pentru a funcționaliza lanțurile de polimeri .

Principalele tipuri de modificări ale polizaharidelor raportate până în prezent sunt:

Chimice: esterificări, eterificări, alchilări, sulfonări, fosforilări, acetilări, carboximetilări, amidări, reticulări – aceste modificări permit introducerea de noi substituienți responsabili de solubilitate, bioactivitate, hidrofobizare, obținerea de rețele polimerice tridimensionale;

Fizice: scindări sub acțiunea ultrasunetelor, expunerea la microunde, iradieri gama – rezultatul final al reacțiilor de modificare fiind reducerea masei moleculare, creșterea solubilității în apă a polimerului;

Biologice: degradare enzimatică–reducerea masei moleculare, scăderea văscozității .

Având în vedere importanța lor în aplicațiile biomedicale, în cele ce urmează vor fi prezentate exemple de derivați ai chitosanului, caragenanului și pululanului.

Chitosanul

Chitosanul (CS) este produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare alcalină a chitinei, (β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucoză), este un polimer linear natural semi-cristalin, semi-sintetic, policationic, compus din unități (1→4)-2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucan(N-acetyl-D-glucozamină) și (1→4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucan(D-glucozamină) (figura1.3). Unitățile deacetilate sunt în proporție majoritară (mai mult de 50%), iar distribuția lor de-a lungul lanțului permite dizolvarea în soluții apoase diluate cu caracter usor acid . Denumirea de CS este atribuită chitinei, care are peste 60% resturi D-glucozaminice, ceea ce corespunde unui grad de deacetilare de 60% .

Una dintre cele mai importante particularități structurale ale CS este prezența unităților cu grupe aminice care pot fi ionizate devenind cationice în medii acide, care promovează astfel dizolvarea chitosanului și comportamentul polielectrolit în soluție. CS este unul dintre cei mai valoroși polimeri naturali datorită proprietăților sale excelente: biodegradabilitate, biocompatibilitate, netoxicitate, mucoadezivitate, grupări amino și hidroxilice reactive ideale pentru modificarea chimică, de asemenea acesta deține și o activitate biologică importantă, care include proprietăți antivirale, antifungice și antibacteriene, efect hipocolesterolemic, transfecție cu material genetic, promotor de vindecare a rănilor, etc. , . Datorită naturii policationice, CS este capabil să dezvolte interacțiuni cu proteinele, lipidele, moleculele anionice și alți compuși biologici. Toate aceste avantaje impun CS ca un polimer adecvat pentru o gamă variată de aplicații în domeniul ingineriei tisulare, al sistemelor de transport și eliberării controlate a medicamentelor, protecția mediului și alte aplicații biomedicale , .

Cu toate acestea, principalul dezavantaj al CS este solubilitatea sa limitată în apă, fiind solubil numai în soluții acide diluate cu un cu pH < 6 (pKa sub 6,5), moment în care are loc protonarea grupărilor aminice primare, creșterea pH-ului peste 6, conducând la deprotonarea grupele amino, polimerul pierzându-și caracterul solubil . O soluție fiabilă pentru îmbunătățirea proprietăților CS (solubilitatea în apă sau activitatea sa biologică) o reprezintă modificarea chimică a acestuia posibilă datorită prezenței grupărilor funcționale –NH2– și –OH– în structura sa, de obicei aplicația sau proprietatea vizată determină tipul modificării. Studiile de literatură raportează patru mari strategii de modificare chimică a CS:

Modificarea chimică a grupărilor funcționale –OH– care include: esterificarea, eterificarea, acetilarea, oxidarea;

Modificarea chimică a grupărilor funcționale –NH2 – include: amidarea, alchilarea, tiolarea, fosforilarea, reacția de adiție Michael, condensarea;

Realizarea de copolimeri bloc și grefați care include: condensarea cu un polimer cu grupări finale funcționale, grefarea prin reacția Michael, copolimerizarea cu monomeri nesaturați;

Oxidarea și scindarea inelului glucopiranozic ,, .

În general, modificarea chimică a acestuia a fost realizată cu scopul îmbunătățirii proprietăților: solubilitate, bioadezivitate, activitate antibacteriană, antifungică, etc. Exemplificarea pe scurt, a unor derivați ai CS cu aplicații în nanomedicină este prezentată în tabelul 1.3.

Figura 1.3. Structura chimică a chitosanului

Tabel 1.3. Derivați ai chitosanului utilizați pentru obținerea sistemelor de transport

Carageenan

Carageenanul (CRG) este o polizaharidă naturală sulfatată, denumită și ,,little rock,, (Stanley, 1987) extrasă din alge roșii . Principalele alge roșii, utilizate pentru producția de CRG sunt C. crispus, C. ocellatus, Gigartina stellata, G. radula, G. acicularis, G. skottsbergii, Eucheuma cottonii, E. spinosum, Furcellaria fastigata, și Hypnea muscifonnis . CRG este un galactan sulfatat liniar, hidrofil cu o masă moleculară ridicată de peste 100 kDa, compus din lanțuri liniare lungi de D-galactoză și D-anhidrogalactoză grupe ester-sulfat unite prin legături alternative alternante glicozidice. Până în prezent, pe baza conținutului de grupări sulfat, au fost identificate 20 de unități repetate de caragenan , . În mod tradițional, carageenanii sunt clasificați în șase forme de bază: Kappa (κ)-, Iota (τ), Lambda (λ)-, Mu ( μ)-, Nu (ν)- and Theta (θ)- CRG și în trei grupe majore în funcție de numărul maxim (1, 2, respectiv 3) și poziția de grupe sulfat per unitate repetitivă dizaharidică corespunzătoare unor structuri ideale: kappa, iota, lambda (figura 1.4) , , .

Proprietățile CRG sunt influențate în principal de numărul și poziția grupărilor ester-sulfat și de conținutul de 3,6-anhidrogalactoză. Studiile raportate au demonstrat că CRG este netoxic, neiritant, necarcinogen și poate fi utilizat în condiții de siguranță în industria alimentară. CRG, se regăsește sub forma unei pulberi de culoare alb-gălbuie până la incolor, fără gust și inodoră, solubilă în apă rece sau caldă; solubilitatea depinzând de tipul de CRG și de cationul legat de radicalul sulfat. Soluțiile apoase de CRG sunt stabile la pH neutru sau alcalin. La un pH scăzut, stabilitatea soluțiilor scade și în special la temperaturi ridicate, datorită hidrolizei care duce la pierderea vâscozității și a proprietății de gelifiere; dacă gelul este deja format, procesul de hidroliză nu intervine și gelul este stabil chiar și la pH 3,5/4 .

O proprietate unică prezentată în special de hidrogelurile iotta-CRG este comportamentul tixotropic la concentrații scăzute. Acestea pot fi fluidizate prin agitare magnetică sau prin acțiunea ultrasunetelor, formându-se hidrogeluri elastice când sunt lăsate în stare de repaus. Proprietatea tixotropică este deosebit de utilă pentru suspendarea particulelor insolubile . De asemenea, CRG prezintă proprietăți farmaceutice, inclusiv activități antitumorale, imunomodulatoare, antihiperlipidemice, anticoagulante . Proprietățile fizico-chimice ale CRG precum, biocompatibilitate, biodegradabilitate, capacitatea de retenție a apei au contribuit la extinderea domeniului de aplicații bazate pe CRG în special ca material suport pentru transportul și eliberarea controlată sensibilă la pH/temperatură ca răspuns la mediile fiziologice de medicamente oftalmice, bucale și vaginale, vindecarea rănilor și ingineria tisulară .

În pofida proprietăților sale excepționale în soluție, CRG nu este, de obicei, modificat chimic și/sau aplicat foarte mult în aplicații biomedicale din cauza vâscozității sale ridicate, ca urmare numai câteva lucrări menționează utilizarea acestuia (tabel 1.4). Modificările chimice ale CRG prin grefare reprezintă o metodă promițătoare pentru atingerea proprietăților polimerului dorite , . Funcționalizarea CRG se realizează prin intermediul grupării hidroxilce, iar reticularea covalentă a k-CRG cu alți compuși conduce la derivați stabili. Spre exemplu, hidrogeluri fotoreticulate pe bază de k-CRG pentru aplicații în ingineria tisulară prin substituția grupărilor hidroxil ale k-CRG cu grupări metacrilat au fost sintetizate de către Mihailă și colab..

Un alt exemplu ar fi, nanoparticule pe bază de complex polielectrolitic format între CS și CRG care pot fi obținute într-un mediu apos în condiții foarte ușoare, pe baza interacțiunii electrostatice, evitând utilizarea solvenților organici sau a altor procese agresive. Astfel, nanoparticulele CS-CRG au aplicații potențiale nu numai în livrarea de medicamente, ci și în ingineria tisulară și medicina regenerativă , . Câteva exemple de derivați ai CRG utilizați pentru obținerea sistemelor de transport sunt evidențiate in tabelul 1.4.

Figura 1.4. Structura chimică a carageenanului (kappa, iota, lambda)

Tabel 1.4. Derivați ai carageenanului utilizați pentru obținerea sistemelor de transport

Pululan

Pululanul (figura 1.5) este o polizaharidă naturală, liniară, compusă din unități de maltotrioză repetate condensate (legate) prin legături α-(1→6), unitățile de maltotrioză fiind formate din legături α-(1→4)-D-glucoză. Acesta se regăsește sub formă de pulbere de culoare albă ne-higroscopică solubilă extrasă din ciuperca Aureobasidium pullulans . Exopolizaharida a fost descoperită de către Bauer în 1938 din Pullularia pullulans, fiind extras și caracterizat abia în 1959 de către Bender și colab. săi, iar după analiza elementelor pululanul deține formula chimică (C6H12O5)n. Principalele avantaje, caracteristici specifice ale pululanului sunt profilul său neimunogen, nemutagen și necancerigen, netoxic, compatibilitate cu sângele, biodegradabil, nehigroscopic, adeziv, inodor, insipid, comestibil și o masă moleculară care variază în intervalul 100-200 de kDa, respectiv o masă moleculară medie gravimetrică (Mw) de aproximativ 362-480 kDa, acestea variază în funcție de sursa de proveniență, de pH .

Pululanul este utilizat în principal în industria alimentară, dar și în aplicații biomedicale. Prin urmare, în ultimii ani cercetările au fost orientate către obținerea derivaților de pululan cu proprietăți hidrofobe, utilizările ulterioare a acestora fiind ca materiale polimerice pentru transportul, direcționarea/eliberarea de principii biologic active sau gene, în aplicații ale ingineriei tisulare și în imagistică pentru diagnosticare folosind particule quantum dots .

Derivații pululanului prezintă caracteristici interesante în ceea ce privește sistemele polimerice de transport/eliberare controlată de medicamente, și anume solubilitate în apă, formarea unor soluții apoase cu vâscozitate relativ scăzută și adezivitate. Funcționalizarea pululanului cu grupări carboxilice sau aminice/amidice conduce la obținerea de derivați anionici/cationici care interacționează eficient cu medicamentele atât de natură cationică cât și anionică eliberarea acestora fiind realizată prin controlul pH-ului .

Modificarea pululanului prin intermediul substituirii grupării hidroxil cu monomeri cum ar fi metacrilat, acrilamida, L-lactida sau derivați de oxazolină au condus la obținerea de hidrogeluri. Diverse studii au demonstrat că proprietățile hidrogelurilor pe bază de derivați de pululan pot fi modificate, astfel încât acestea să fie amfifile, ionice, termoreceptive calificându-se astfel ca și suporturi fiabile pentru dezvoltarea de noi tipuri de nanotransportatori a principiilor biologic active , .

Derivați de pululan s-au obținut prin tratarea pululanului cu agenți de reticulare, agenți ester sau eter, amestecarea pululanului cu alți polimeri sau grefarea a diferiți monomeri pe catena principală a pululanului . Diferite studii cu privire la tipurile de modificări chimice ale pululanului, cum ar fi oxidarea, esterificarea, eterificarea, carboxilarea, copolimerizarea, succinoilarea, palmitoilarea și derivații colestelici și cianoetilarea pentru utilizarea ca suport de transport a principiilor biologic active, sau includerea de proteine, etc, au fost dezvoltate și brevetate. Câteva exemple sunt evidențiate în tabelul 1.5 , , .

Figura 1.5. Structura chimică a pululanului

Tabel 1.5. Derivați ai pululanului utilizați pentru obținerea sistemelor de transport

Polimeri sintetici

Biomaterialele pe bază de polimeri sintetici sunt utilizate în domeniul medical, acestea jucând un rol important în succesul dezvoltării dispozitivelor medicale și a sistemelor de transport de medicamente care odată introduse în corpul uman sunt capabile să contribuie la îmbunătățirea calității vieții atât prin creșterea eficienței tratamentului cât și a confortului pacientului , . Polimerii , în general, s-au dovedit a fi pietrele de temelie pentru aplicațiile terapeutice, precum și cea mai mare și versatilă clasă de biomateriale. Unul dintre avanajele utilizării polimerilor sintetici este acela că aceștia pot fi proiectați și sintetizați cu o varietate largă de structuri și proprietăți fizice și chimice adecvate pentru aplicații specifice.

Istoria scrisă a încercărilor timpurii de a implanta materiale artificiale în corpul uman este presărată de povești de succes, dar și de eșecuri groaznice. Un caz remarcabil merită amintit aici cel al medicului Harold Ridley, care lucrând cu foști aviatori în cel de-al doilea război mondial a observat că fragmentele din copertina cabinei de pilotaj pătunse în ochi erau tolerate, făcând astfel o primă evaluare formală a ,,biocompatibilității”. Mai târziu acesta creează o lentilă intraoculară implantabilă din același material și anume poli(metacrilat de metil) (PMMA). Chiar și în zilele noastre lentilele intraoculare artificiale nu s-au schimbat fundamental față de designul original al lui Dr. Ridley .

În 1940 polimerii naturali și cei sintetici încep să fie luați în considerare de către cercetători ca biomateriale, un exemplu fiind PMMA care a fost utilizat și în cazul reparațiilor defectelor osoase. De asemenea, celuloza a fost utilizată ca material în cazul filtrelor de dializă, iar suturile au început să fie realizate cu fire de nailon. În 1947 Ingraham et al. a publicat o lucrare cu privire la utilizarea poli(etilenei) ca material pentru implanturi, iar în 1952 a fost concepută din metale și polimeri prima valvă mecanică pentru inimă . În ultima vreme polimerii sintetici au devenit atractivi atât din punct de vedere tehnic, cât și din punct de vedere medical, din diverse motive precum:

stabilitatea proprietăților fizice și chimice ale polimerului final care pot fi reglabile în funcție de alegerea monomerilor, reacțiilor de polimerizare și structura copolimerilor;

prezența proprietăților mecanice avansate, din această categorie făcând parte polimerii cu memoria formei, polimerii sensibili la un stimul special, care poate fi extern de obicei pH, temperatură, câmp magnetic, lumină, respectiv simuli chimici sau biochimici precum medicamentele, metaboliți, antigeni sau concentrații de enzime;

caracteristicile funcționale specifice ale polimerilor care permit funcționalizarea ulterioară;

pot fi menținuți în mod ideal în organism un timp specific și apoi pot fi eliminați fără a fi necesară o intervenție chirurgicală secundară;

procesul de degradare hidrolitică este relativ invariant de la un pacient la altul;

degradarea enzimatică este modul tipic de degradare a biopolimerilor, și este utilizată în principal în ingineria tisulară ca înlocuitor al matricei extracelulare ;

În funcție de proprietățile lor de degradare polimerii sintetici utilizați în domeniul biomedical pot fi clasificați în biodegradabili și non-biodegradabili.

Polimerii biodegradabili au incluse în structurile lor chimice legături sensibile hidrolitic și / sau enzimatic cum ar fi de exemplu poli(esteri), poli (eter-ester), poli(anhidride), poli(carbonați), poli(amide), poli(acetali) și poli(uretani) .

Principalele clase de polimeri sintetici non-degradabili utilizați în aplicațiile biomedicale includ poli(olefine), poli(uretani), poli(carbonați), poli(siloxani), poli(amide), poli (eteri), poli(esteri) .

Proprietatea de biodegradabilitate a polimerilor sintetici poate fi ameliorată fie prin combinarea acestora cu polimeri naturali, fie prin introducerea de compuși care prezintă proprietăți biodegradabile.

În general, polimerii sintetici sunt utilizați în diverse aplicații biomedicale și anume în ortopedie (înlocuirea totală a articulațiilor, plăci osoase și șuruburi), chirurgia estetică, oftamologie (lentile de contact), chirurgia maxilo-facială (umpluturii dentare, coroane, implanturi), cardiologie (stimulatoare cardiace, valve cardiace artificiale) și sisteme de transport pentru medicamente (sisteme de administrare injectabilă, orală, sisteme micro- și nanoparticulate, fibre și hidrogeluri, etc.). Practic toate specialitățile medicale numără mai puțin de 400 de produse diferite și 10% din activitățile medicale necesită utilizarea de biomateriale în scopuri de: diagnosticare, prevenție și terapie , , . Tabelul 1.6. prezintă câteva exemple de polimeri sintetici utilizați pentru obținerea diverselor sisteme de transport.

Tabel 1.6. Polimeri sintetici utilizați pentru obținerea a diverse sisteme de transport

Capitolul 2. Sisteme cu eliberare controlată

2.1. Apecte generale

Tehnologia sistemelor cu eliberare controlată a medicamentelor a progresat în ultimele șase decenii, apariția primului sistem cu eliberare susținută fiind raportată în 1952. Studiile științifice relatează faptul că anii 1950-1980 cercetătorii s-au axat pe dezvoltarea sistemelor de transport cu eliberare susținută orală și transdermică, studiul influenței proprietăților fizico-chimice și stabilirea mecanismelor de eliberare controlată a medicamentului pentru aplicații clinice, acestă perioadă fiind numită și prima generație a sistemelor de eliberare a medicamentelor. Atenția cercetătorilor pe parcursul celei de-a doua generații (1980-2010) a fost îndreptată către dezvoltarea sistemelor de transport cu eliberare care urmează cinetica de ordin zero, a polimerilor ,,smart” sau a sistemelor de transport cu eliberarea de medicamente sensibile la schimbarea factorilor de mediu cum ar fi pH-ul, temperatura, semnale electrice sau luminoase, ultrasunete, enzime sau glucoză (de exemplu hidrogelurile, microparticule biodegradabile, implanturi). În plus, ultimii zece ani ai celei de-a doua generații au fost definitorii în ceea ce privește dezvoltarea sistemelor de transport cu eliberare a compușilor bioactivi având la bază nanotehnologia, în special a sistemelor nanoparticulate care să depășească barierele biologice, .

Sistemele de transport al medicamentelor a treia generație (din 2010 până în prezent) au fost concepute pentru a depăși atât barierele fizico-chimice, cât și cele biologice. În ultimii anii, cele mai cercetate sisteme de eliberare de medicamente sunt cele sub formă nanoparticulată. Reprezentarea schematică prezentată de figura 2.1 oferă o imagine de ansamblu a cercetării privind transportul principiului activ (cel mai important factor), care totuși prezintă o eficiență îmbunătățită în prezența unui sistem adecvat de administrare. Așa cum evidențiază figura 2.1, trebuie luați în considerare numeroși parametri și interdependența acestora pentru a dezvolta cu succes sisteme de transport a medicamentelor pentru aplicațiile biomedicale, .

Transportatorul ideal de medicamente pare a fi de domeniul științifico-fantastic, în principiu, acesta este injectat în organism cu scopul de a ajunge la o țintă vizată (cum ar fi celule tumoarale) fiind capabil să elibereze în mod controlat doza necesară organului țintit. Acest concept idealizat a fost propus inițial de Paul Ehrlich la începutul secolului al XX-lea și a fost denumit conceptul "bullet magic". Odată cu apariția nanotehnologiei și a nanomedicinei, acest vis a devenit rapid o realitate. Nanotehnologia, este deja utilizată în aplicații ale transportului de medicamente și cosmetice prin utilizarea tehnologiei liposomale, iar nanoparticulele și nanotuburile reprezintă în prezent o alternativă interesantă și promițătoare .

Figura 2.1. Reprezentarea schematică a dezvoltării unui sistem de transport a medicamentelor de la cercetarea de bază la aplicațiile clinice

Nanotehnologia deschide noi oportunități terapeutice pentru un număr mare de compuși bioactivi care utilizați ca formulări convenționale prezintă o eficiență scăzută, datorită unei biodisponibilității scăzute. Matricile micro/nanostructurate asigură protecția principiilor active predispuse la degradarea fiziologică în timpul circulației sistemice sau eliminarea din corp, respectiv prelungesc procesul de eliberare a medicamentelor foarte solubile sau, accelerează dizolvarea agenților terapeutici hidrofobi în urma degradării matricei polimere, în beneficiul pacienților a căror complianță este îmbunătățită .

La baza evoluției nanotehnologiei stau trei mari tehnici esențiale pentru știința medicală și, anume :

direcționarea activă – utilizată pentru conjugatele de tip: sisteme de transport de medicamente – liganzi către celule tumorale specifice;

direcționarea pasivă – utilizată în aplicații ale terapiei cancerului în cazul țesuturilor tumorale solide pentru efectul de creștere a permeabilității și retenției (EPR – permeabilitate și retenție crescută).

conjugate polimer-medicament (acestea reprezintă procesul atașării covalente sau necovalente a lanțurilor de polimer (de exemplu poli(etilen glicol)) de molecule și macrostructuri, cum ar fi un medicament, o proteină terapeutică sau transportatori de medicamente);

Conceptul de conjugat polimer-compus bioactiv a fost introdus pentru prima dată în anul 1970 de către Helmult Ringsdorf, care a raportat atașarea unui medicament anticancer la catena principală a polimerului printr-o moleculă de legătură (figura 2.2). Ingeniozitatea sistemelor conjugate polimer-compus bioactiv, în a implica sensibilitatea receptorilor țesuturilor afectate la liganzi ai purtătorilor de medicamente este o direcție care revoluționează cercetarea în domeniul biomedical .

Figura 2.2. Modelul Ringsdorf pentru conjugatele polimer-medicament

2.2. Principiile generale ale eliberarii controlate de medicamente

2.2.1. Eliberarea controlată a principiilor biologic active

Farmacoterapia este definită ca tratamentul și prevenirea afecțiunilor prin intermediul medicamentelor de natură chimică sau biologică. Aceasta este una dintre cele mai importante metode de tratament, împreună cu intervențiile chirurgicale, tratamentul fizic, radiațiile și psihoterapia .

Progresele fără precedent în domeniul genomicii și al biologiei moleculare, folosirea metodelor moderne de sinteză chimică (cum ar fi chimia combinatorie) au permis dezvoltarea și sintetizarea de noi medicamente. În același timp, o mai bună înțelegere a sistemului imunitar și progresul rapid în biologia moleculară, biologia celulară și microbiologia au permis dezvoltarea de medicamente, vaccinuri moderne împotriva afecțiunilor vechi și noi. Cu toate acestea, este totuși necesară realizarea de forme de dozare adecvate sau sisteme de administrare a medicamentelor pentru a permite aplicarea efectivă, sigură și fiabilă a acestor compuși bioactivi către pacient .

Dezvoltarea primelor sisteme cu eliberare controlată a medicamentelor a început la sfârșitul anilor 1940. Adevărata dezvoltare a tehnologiei de eliberare controlată a început la sfârșitul anilor 1960 după ce Higuchi și alții cercetători au demonstrat principiul de bază al eliberării controlate din suporturi solide prin modelarea matematică. În anii 1970, începutul anilor 1980, deja un număr considerabil de sisteme noi de transport a medicamentelor a fost dezvoltat și comercializat cu succes .

În prevenirea și tratamentul bolilor care utilizează farmacoterapia, medicamentul ales este, evident, un factor-cheie. Cu toate acestea, locul și durata administrării medicamentului, viteza de eliberare a medicamentului, profilul farmacocinetic și efectele secundare ale medicamentului joacă un rol esențial în reușita unei intervenții medicale. Din aceste motive, dezvoltarea unor forme de dozare adecvate sau a unor sisteme de livrare a medicamentelor este strict necesară pentru orice principiu biologic activ, pentru a permite o administrare sigură, eficientă și fiabilă a medicamentelor la pacienți .

Pentru a exercita un efect terapeutic, un medicament este necesar să dețină o afinitate și o selectivitate ridicată pentru ținta biologică dorită. Spre exemplu, medicamentele, enzimele sau coenzimele, celulele microbiale, proteinele sau complexele de principii active, în sau pe un anumit tip de celule ar trebui să atingă o concentrație suficientă la locul vizat. În general, medicamentul trebuie transportat de la locul de aplicare până la locul de acțiune, eliberat din sistemul de administrare, biotransformat și în cele din urmă eliminat prin intermediul metabolismului din organism. Conceptele studiate în ceea ce privește transportul în masă și ingineria chimică, împreună cu știința materialelor polimerice, contribuie la proiectarea și dezvoltarea unor matrici/suporturi adecvate capabile să elibereze medicamente într-o manieră controlată.

Viteza și gradul de absorbție a unui medicament în organism, determină biodisponibilitatea acestuia. Biodisponibilitatea medicamentelor este influențată de factori fiziologici, precum și de caracteristicile fizico-chimice ale medicamentului în sine. Cu toate acestea, factorii asociați cu calea de administrare și proprietățile formei de dozare au, de asemenea, o influență majoră asupra biodisponibilității unui medicament.

Terapia convențională poate fi realizată utilizând diferite tipuri de forme de dozare, incluzând tablete, capsule, creme, unguente, lichide, aerosoli, injecții și supozitoare. Majoritatea acestor sisteme convenționale asigură eliberarea imediată a medicamentului, fără a avea un control asupra vitezei de eliberare. Pentru a atinge și menține concentrațiile de medicament eficiente din punct de vedere terapeutic, este necesară administrarea unor doze repetate, fapt ce conduce la variații semnificative ale concentrațiilor terapeutice, durata efectului terapeutic depinzând de frecvența administrărilor medicamentului precum și de timpul de înjumătățire al acestuia. Datorită apariției acestor variații ale concentrațiilor terapeutice ale medicamentului, nivelul de medicament poate scădea sub concentrația eficientă minimă (între două doze administrate succesiv) sau să depășească concentrația toxică minimă, astfel conducând la apariția efectelor secundare nedorite sau la lipsa efectului terapeutic dorit pentru pacient , .

Putem, deci afirma că realizarea unor sisteme retard a devenit, ca urmare, o necesitate evidentă a medicinii moderne, consecință a faptului că formele de dozare convenționale sunt în mod vădit dezavantajoase încât sunt incomode; dificil de monitorizat; este necesară utilizarea unor cantități mari de medicament care pot fi "pierdute", astfel neajungând la locul țintit; imposibilitatea menținerii principiului activ la o concentrație constantă în sânge, ceea ce poate conduce la creșterea nivelului toxic al acestuia; dozarea clasică asigură nivelul terapeutic pentru o perioadă scurtă de timp ceea ce implică necesitatea unei administrări repetate; obișnuința agenților patogeni; medicamentul poate fi adsorbit neuniform, incomplet sau ajunge la celule nețintite și poate provoca efecte secundare scăzând astfel complianța pacienților . De asemenea, în cazul farmacoterapiei convenționale se utilizează medicamente a căror absorbție și biodisponibilitate depind de numeroși factori, precum: solubilitate; masă moleculară; stabilitate chimică; temperatură; pKa și pH.

Depășirea restricțiilor și a neajunsurilor impuse de terapia convențională poate fi realizată prin: (i) micșorarea solubilității medicamentelor; (ii) adăugarea unor compuși micmoleculari cu rolul de a încetini absorbția principiului activ în organism în favoarea unei eliberări la țintă; sau (iii) prepararea unor sisteme retard polimer-medicament cu eliberare controlată. Conceptul de eliberare controlată presupune o bună predicție și o reproductibilitate în cinetica de eliberare a medicamentului. Un astfel de sistem controlează pătrunderea în corp în conformitate cu specificațiile profilului necesar de eliberare a medicamentului. Cu alte cuvinte, viteza și durata eliberării sunt concepute pentru a atinge concentrația dorită , , .

Cercetările în domeniul sistemelor cu eliberare controlată de medicamente au fost focusate în principal pe proiectarea și obținerea unor dispozitive de administrare a principiilor active care să dețină următoarele proprietăți:

capacitate de eliberare prelungită sau susținută a medicamentelor;

capacitate de eliberare controlată a substanțelor medicamentoase în cantitatea și cu viteza dorite;

transportul compușilor bioactivi la locul acțiunii vizate, urmat de eliberarea controlată a acestora;

biocompatibilitate;

toxicitate redusă, efecte secundare diminuate , , .

Scopul și provocarea principală a realizării sistemelor cu eliberare controlată sunt acelea de a realiza un profil de eliberare a compușilor bioactivi care să se mențină la un nivel terapeutic în sânge pentru o perioadă cât mai lungă de timp. În cazul sistemelor cu eliberare controlată concentrația principiului activ se menține constantă și în doză optimă pentru un timp mai îndelungat, comparativ cu cazul administrării convenționale când concentrația medicamentului în sânge crește rapid după fiecare doză de administrare, urmată de o scădere la fel de bruscă.

Profilul celor două curbe de concentrație specifice medicamentelor tradiționale și a sistemelor cu eliberare controlată poate fi urmărit în figura 2.3 ,.

Figura 2.3. Profilul tipic pentru eliberarea principiilor active în sânge: a) în administrarea convențională; b) în administrarea unui sistem cu eliberare controlată

Astfel, comparativ cu terapia tradițională, sistemele de eliberare controlată oferă numeroase avantaje în comparație cu formele de dozare convenționale, incluzând :

eficacitatea farmaceutică a medicamentului este mult îmbunătățită;

reducerea efectelor adverse și a toxicității;

îmbunătățirea confortului pacientului;

reducerea variațiilor concentrației de medicament, in vivo;

utilizarea optimă a cantității de medicament;

reducerea dozelor de medicament administrate;

menținerea nivelului de principiu activ în intervalul dorit;

agentul bioactiv poate fi combinat cu alte componente și / sau materiale polimerice inerte pentru realizarea sistemului de eliberare;

acestea includ o componentă care poate fi proiectată pentru a regla o caracteristică esențială, cum ar fi durata eliberării, viteza de eliberare sau țintirea;

prezintă o durată de acțiune mai mare de o zi;

reducerea costurilor de îngrijire a sănătății.

Pe lângă avantajele prezentate trebuie menționat însă că sistemele cu eliberare controlată prezintă și o serie de dezavantaje:

costuri ridicate de preparare a sistemelor sub diferite forme;

posibilă toxicitate dată de materialele utilizate;

apariția toxicității cauzate de o posibilă eliberare a unei fracțiuni mai mari decât cea obișnuită a dozei.

încapsularea medicamentelor poate conduce la o scădere a activității lor terapeutice;

necesitatea, în cele mai multe cazuri, a unei administrări pe cale parenterală;

necesitatea unei intervenții chirurgicale pentru implantarea sau îndepărtarea sistemului/dispozitivului;

apariția unor produși secundari nedoriți în urma degradării sistemelor;

limitarea trecerii sistemelor la nivel celular sau subcelular , .

2.3. Clasificarea sistemelor de transport/vectori pentru eliberarea controlată a principiilor active

Winfred Phillips, afirma: "Trebuie să fii capabil să fabrici lucruri, să poți analiza lucrurile, trebuie să te poți ocupa de lucruri mai mici decât decât ți-ai imaginat în moduri care nu au mai fost făcute până acum" .

Noțiunea de nanotehnologie a fost introdusă în 1959 de către fizicianul Richard P. Faynman (Laureat al premiului Nobel în fizică, 1965) prin afirmația, " There’s plenty of room at the bottom " , acesta subliniind rolul esențial al nanotehnologiei în evoluția și progresul generațiilor viitoare.

Progresul în domeniul nanotehnologiei și al aplicațiilor sale în domeniul biomedical a revoluționat secolul al XX-lea. Nanotehnologia reprezintă știința care se ocupă cu studiul structurilor extrem de mici. Prefixul "nano" este un cuvânt grecesc care înseamnă "pitic", respectiv dimensiune foarte mică sau miniaturală .

"Nanomedicina " reprezintă știința care permite controlul materialelor la nivel atomic și molecular, astfel determinând dezvoltarea tehnologiei de diagnosticare, tratare și prevenire a bolilor și leziunilor traumatice, de ameliorare a durerii și de conservare și îmbunătățire a sănătății umane, folosind materiale structurate la scară nanometrică, biotehnologie și inginerie genetică și, eventual, nanomateriale și dispozitive nano cu proprietăți speciale. În ultimele decenii cercetătorii au reușit proiectarea de sisteme simple sau sofisticate la scară micro- și nano- îmbinând materiale polimerice naturale, sintetice sau hibride cu sistemele biologice dinamice. O înțelegere mai bună a naturii și a mecanismelor de acțiune a afecțiunilor, precum și a acțiunii compușilor bioactivi asupra acestora a condus la proiectarea și realizarea de sisteme de transport eficiente și sigure a medicamentelor .

După cum s-a menționat și anterior, obiectivele principale ale proiectării sistemelor de transport cu eliberare controlată sunt: îmbunătățirea eficienței și activității terapeutice a medicamentelor în corpul uman, de protecție împotriva degradării fiziologice (în timpul circulației sistemice, înainte de a realiza țintirea țesutului bolnav) sau eliminării din organism, reducerea dozelor de medicament administrate cu scopul de a îmbunătăți confortul pacienților.

În general, sistemele de transport de medicamente influențează proprietățile formulărilor medicamentoase prin reducerea variațiilor concentrației de medicament, astfel are loc o încetinire a cineticii de eliberare prelungită sau susținută a medicamentelor foarte solubile, sau sporirea dizolvării agenților terapeutici hidrofobi în urma degradării matricei polimere .

În 1970, Hoffman a realizat separarea sistemele cu eliberare controlată a medicamentelor în trei mari clase în funcție de dimensiunile acestora:

sisteme cu eliberare controlată macro (sistemele de tip rezervor), în acest caz eliberarea principiul activ decurge cu o viteză constantă de "ordin zero";

sisteme cu eliberare controlată micro (sistemele de tip matrice), eliberarea principiului activ este susținută și au la bază polimeri degradabili;

sisteme cu eliberare controlată nano, medicamentul este eliberat din sistem în mod direcționat, matricea polimeră având rol dublu: controlul cineticii de eliberare a compusului bioactiv și transportul activ sau pasiv al acestuia .

Sistemele cu eliberare controlată pot fi clasificate în funcție de o serie de criterii după cum se poate observa în figura 2.4 și respectiv tabelul 2.1.

Figura 2.4. Criterii de clasificare a sistemelor de transport/vectori pentru eliberarea controlată a principiilor active

Tabel 2.1. Clasificarea sistemelor cu eliberare controlată

2.4. Materiale polimere utilizate pentru obținerea sistemelor cu eliberare controlată

Un sistem de transport ideal asigură disponibilitatea la locul de acțiune pentru o perioadă de timp adecvată a principiului biologic activ, fără ca acesta să prezinte efecte fiziologice în sine. De asemenea, trebuie să aibă ca scop asigurarea concentrațiilor de medicament la locul de acțiune care sunt peste concentrația minimă eficientă, dar sub concentrația maximă tolerată (concentrația toxică minimă) – deci în domeniul terapeutic. Factorii care controlează concentrația medicamentului includ calea de administrare, proprietățile farmacologice ale medicamentului, afecțiunea care trebuie tratată, concentrația și durata terapeutică, frecvența administrării, metabolizarea medicamentului și ratele de clearance și, cel mai important, forma de dozare în sine. Prin urmare, în practica clinică, este necesar să se ia în considerare atât tratamentul medicamentos, cât și proprietățile de eliberare necesare ale medicamentului . Selecția strategiei de direcționare depinde de caracteristicile afecțiuniilor, ale celulelor/țesutului/organului și de proprietățile biologice și chimice ale medicamentului. Figura 2.5 ilustrează profilul curbelor concentrațiilor medicamentelor funcție de modul de eliberare al acestora din formele de dozare.

Figura 2.5. Curbele concentrațiilor medicamentelor în funcție de modul de eliberare

În ultima vreme, un interes aparte a fost accordat sistemelor complexe utilizate pentru transportul și eliberarea controlată de medicamente pe bază de polimeri sau combinații de polimeri. Datorită, proprietăților farmacocinetice îmbunătățite precum capacitatea de gelifiere, de adeziune, solubilitatea dependentă de pH și cea în medii organice precum și proprietățile de barieră, aplicațiile farmaceutice ale polimerilor sunt diverse variind de la utilizarea acestora ca agenți de legare în cazul comprimatelor la agenți de control al debitului în lichide, suspensii și emulsii. De asemenea, aceștia sunt utilizați și în cazul acoperirilor de filme pentru a masca gustul neplăcut al unui medicament, pentru a îmbunătăți stabilitatea medicamentului și pentru a modifica caracteristicile de eliberare a medicamentului ,.

Caracteristicile esențiale ale unui polimer utilizat în scop farmaceutic sunt:

biocompatibilitate și biodegradabilitate;

produșii rezultați în urma degradării polimerului trebuie să fie netoxici și să nu creeze răspuns inflamatoriu din partea organismului

procesul de degradare a polimerului este necesar să se producă într-o perioadă rezonabilă de timp ;

masa moleculară ;

aspectul structurii : liniară sau ciclică, ramificată, reticulată, etc.

relația polimer – principiu activ:

tipul de legătură: covalentă, ionică sau complexă

încorporarea în matricea polimeră;

localizarea unității farmacologică-activă în polimer: în lanț sau ca ramificație

fenomene stereochimice;

natura chimică a polimerului;

compoziția chimică;

solubilitatea în sisteme apoase;

încărcarea ionică;

solubilitatea în fluidele corpului.

În cazul obținerii sistemelor cu eliberare controlată de medicamente pot fi utilizați atât polimeri naturali, sintetici, combinați sau modificați. Datorită proprietăților unice precum biocompatibilitate, biodegradabilitate, non-toxicitate, bioactivitate polimerii naturali sunt utilizați ca suporturi pentru medicamente. Polimerii naturali utilizați ca suport pentru eliberarea controlată de medicamente, cel mai frecvent, aparțin uneia din următoarele clase:

proteinele (colagenul și gelatina)

polizaharidele (chitosan, pululan, caragenan, alginat, xantan, dectran, gelan etc.)

Totuși, utilizarea polimerilor naturali în acest domeniu prezintă câteva limitări precum: proprietăți mecanice slabe, eliberarea compușilor bioactivi încapsulați prea rapidă, biodegradarea prematură. Prin urmare, cercetătorii și-au îndreptat atenția spre polimerii sintetici, aceștia fiind selectați datorită proprietăților lor, după cum urmează :

poli(metacrilatul de metil): transparența și rezistența fizică;

poli (siloxani) sau siliconi: capacitatea de izolator

poli(etilena): duritate și capacitatea sa minimă de umflare;

Poli (vinil pirolidonă): capacitatea de a forma suspensii

poli(alcoolul vinilic): hidrofilicitate și rezistența fizică;

poli(uretanii): elasticitate;

poli( etilen glicolii), poli(lactidele), poli(anhidride): proprietatea de biodegradare.

Cel mai mare avantaj al acestor polimeri biodegradabili este faptul că produși rezultați în urma procesului de degradare nu sunt toxici pentru organism, sunt metabolizați și eliminați din corp printr-un proces metabolic fiziologic .

2.5. Tipuri de mecanisme și cinetica de eliberare a principiilor active din sistemele cu eliberare controlată– modele matematice

2.5.1. Mecanisme de eliberare a medicamentelor din sistemele cu eliberare controlată

Sistemele cu eliberare controlată sunt concepute pentru a spori eficiența terapeutică a medicamentelor. Dezvoltarea unor sisteme cu eliberare controlată, are la bază motivații precum controlul superior al rezistenței în timp prelungită în organism, stabilitatea medicamentului cu scopul de a depăși barierele fiziologice, protecția medicamentului împotriva eliminării premature din organism și transportul acestuia până la locul de acțiune dorit, reducând în același timp efectele secundare, etc. Mecanismele utilizate pentru atingerea acestor obiective sunt diverse și complexe și depind de aplicația vizată. De fapt, mai multe mecanisme pot funcționa simultan sau în diferite etape ale procesului de eliberare. O înțelegere a acestor mecanisme este importantă în proiectarea și realizarea sistemelor cu eliberare controlată , , , .

Principalele mecanisme de eliberare a medicamentelor din sistemele cu eliberare controlată sunt reprezentate în figura 2.6.

Figura 2.6. Reprezentarea schematică a principalelor mecanisme ce guvernează eliberarea controlată de medicamente

Sisteme cu eliberare controlată de difuzie

Acest tip de sistem, este format dintr-un un polimer insolubil în apă care controlează fluxul de apă și eliberarea ulterioară a medicamentului eliberat din forma de dozare. Procesul de difuzie apare în urma mișcării haotice a moleculelor medicamentului în momentul expunerii la diverși stimuli externi astfel obligându-le să părăsească matricea polimerică prin intermediul porilor sau al ochiurilor rețelei de polimer. Acestea sunt în general împărțite în două categorii: dispozitive rezervor și matrice (sau monolit). Mecanismele de bază a eliberării principiului activ din aceste două sisteme sunt fundamental diferite, .

Dispozitivele rezervor sunt formate dintr-un nucleu de medicament care este înconjurat de membrana polimerică insolubilă. Viteza de eliberare a medicamentului este controlată de tipul, și dimensiunea membranei.

Eliberarea medicamentului din aceste dispozitive urmează cinetica Michaelis–Menten conform căreia dacă medicamentul este dispersat în matrice (figura 2.7), concentrația inițială de medicament este mai mare decât solubilitatea medicamentului, prevenind astfel dizolvarea imediată a medicamentului și, prin urmare, reducerea forței motrice pentru difuzie, după care concentrația scade până la o valoare constantă, aceasta fiind cunoscuta sub denumirea de eliberare de ordinul zero. Procese suplimentare, cum ar fi interacțiunile medicament-matrice, pot apărea, de asemenea, în timpul eliberării. De exemplu, cationii de medicament încărcați pozitiv ar putea interacționa cu o matricea polimerică încărcată negativ .

Figura 2.7. Reprezentarea unui sistem tip rezervor

Sistem matrice (monolit)

În dispozitivele de tip matrice, medicamentul sau compusul bioactiv este dispersat în matricea polimerică pentru a forma un sistem omogen (figura 2.8). Procesul de difuzie începe atunci când medicamentul este eliberat din matricea polimerului în mediul extern. În sistemele monolitice, viteza de eliberare depinde de concentrația inițială a medicamentului în matricea polimerică poroasă sau neporoasă. Dacă concentrația medicamentului este sub limita de solubilitate în matrice, procesul de difuzie prin matrice limitează viteza de eliberare și, iar în cazul în care concentrația medicamentului este peste limita de solubilitate în matrice, dizolvarea medicamentului în matricea polimerului limitează viteza de eliberare. Deoarece eliberarea medicamentului este continuă, viteza de eliberare scade în mod normal, odată ce substanța activă difuzeză din interiorul dispozitivului, prin urmare, necesită un timp mai lung de difuzie pentru eliberare, .

Figura 2.8. Sisteme tip matrice sau monolit

Dispozitivele monolitice (tip matrice) sunt probabil cele mai utilizate dintre dispozitivele pentru controlul eliberării medicamentelor, deoarece sunt relativ ușor de preparat, în comparație cu dispozitivele de tip rezervor, și nu există pericolul eliberării accidentale unei doze mari de medicament având ca rezultat concentrații mari în sânge, care ar putea rezulta din ruperea membranei unui dispozitiv de tip rezervor .

Sisteme cu eliberare controlată de degradare/eroziune

"Degradarea" și "eroziunea" polimerilor sunt factori importanți pentru roate tipurile de polimeri. Polimerii biodegradabili sunt supuși scindării hidrolitice formându-se produse degradabile în apă, care se pot dizolva într-un mediu apos, ducând la eroziunea polimerilor. Degradarea este un fenomen chimic, iar eroziunea cuprinde fenomene fizice, cum ar fi dizolvarea și difuzia. Degradarea polimerilor este calea principală de eroziune. Eroziunea polimerilor este cu mult mai complexă decât degradarea, deoarece depinde de multe alte procese, cum ar fi degradarea, umflarea, dizolvarea și difuzia oligomerilor și monomerilor și modificările morfologice, figura 2.9 , .

Figura 2.9. Tipurile de eroziune a matricii polimerice: a) Eroziunea în suprafață a unei matrice polimerice omogene; b) eroziune în suprafață eterogenă; c) Eroziunea în masă a matricei polimerice

Eliberarea principiilor active din sistemele ce au la bază polimeri biodegradabili decurge în trei etape: o primă fază de eliberare mai rapidă corespunzătoare procesului de difuzie, urmată de o etapă mai lentă, ca în final procesul de eliberare controlată să fie determinat de degradarea matricei polimerice. Eroziunea unei matrici polimerice poate avea loc prin trei mecanisme fizice alternative: (a) eroziunea de suprafață , (b) eroziune de suprafață eterogenă și (c) eroziunea în masă, figura 2.9. În cazul eroziunii suprafeței, viteza de eroziune este constantă și proporțională cu suprafața exterioară, iar în cazul eroziunii în masă nu există o viteză de eroziune constantă, .

Sisteme cu eliberare controlată de umflare

Aceste sisteme sunt guvernate de o etapă de umflare principală acesta fiind singura care influențează viteza de eliberare, însă nu este exclusă nici apariția altor procese de transport de masă, spre exemplu dizolvarea medicamentului, respectiv a polimerului. În majoritatea cazurilor sistemele cu eliberare controlată de umflare au la bază polimeri hidrofili care în stare uscată prezintă o rețea densă cu o mobilitate a macromoleculelor limitată. Prin urmare, la contactul cu apa/solvent lanțurile polimere se relaxează conducând la o creștere semnificativă a mobilității macromoleculelor și a volumului matricei polimerice. Procesul de umflare este complex, depinzând atât de difuzia solventului în polimer cât și de relaxarea fizică a lanțurilor polimere. Condițiile mecanismului de transport al medicamentului sunt complet diferite în funcție de modificarea stărilor fizice ale polimerului, încărcarea medicamentului în starea fizică a polimerului poate fi utilizată pentru a controla cu exactitate viteza de eliberare a medicamentului încorporat .

Sisteme cu eliberare controlată de osmoză

Ca o alternativă la dispozitivele bazate pe dizolvare/difuzie, pompele osmotice au fost concepute pentru a asigura o eliberare pentru perioade prelungite, urmând o cinetică de ordin zero. În 1974, Theeuwes a descris pentru prima dată o pompă osmotică elementară (figura 2.10 A). Aceasta este asemănătoare cu un dispozitiv de tip rezervor, însă conține un agent osmotic (agent activ sub formă de sare). De obicei, acestea le regăsim sub formă de tablete sau capsule care dețin un miez de medicament înconjurat de o membrană care este semipermeabilă, dar mai permeabilă la apă decât la compușii bioactivi sau agenții osmotici .

Presiunea osmotică din interiorul dispozitivului forțează compusul bioactiv în afara acestuia printr-un orificiu, volumul intern al dispozitivului rămânând constant. Medicamentul din interiorul dispozitivului este în exces (soluție saturată), viteza de eliberare rămâne constantă, eliberându-se un volum egal cu volumul de solvent absorbit. În acest caz, medicamentul este eliberat prin membrana semipermeabilă. Acest tip de eliberare este independent de proprietățile principiului activ și prezintă o viteză constantă obișnuit mai mare decât a sistemelor cu eliberare controlată prin difuzie. Acestea pot conține unul sau mai multe compartimente și pot fi implantabile sau administrate oral, fiind potrivite doar pentru eliberarea medicamentelor solubile în apă.

Pentru depășirea limitărilor pompei osmotice elementare, în 1980 a fost conceput sistemul „push-pull” (figura 2.10 B) care prezintă capacitatea de a eliberarea cu o viteză constantă atât medicamente solubile în apă cât și a celor cu solubilitate limitată. Dispozitivul este format din două straturi situate între polimerul solubil în apă și orificiul de ieșire, unul dintre straturi conține compusul bioactiv și celălalt un agent osotic și unul expandabil. Pe măsură ce apa traversează membrana semi-permeabilă, medicamentul se dizolvă. Procesul de umflare a celui de al doilea strat și a polimerului, cauzată de osmoză, împinge medicamentul către exterior prin orificiu ,.

Figura 2.10. Reprezentarea schematică a eliberării principiului activ din dispozitive controlate prin osmoză: A) pompă psmotică elementară; B) pompă osmotică push-pull

Sisteme polimere cu eliberare controlată prin schimb ionic

Denumite și rășini schimbătoare de ioni, acestea au fost utilizate cu succes în domeniul biotehnologic, fiind formate prin complexarea unui medicament de natură ionică cu o rășină schimbătoare de ioni care prezintă un contraion. În ultima vreme, acestea au primit o atenție considerabilă, fiind utilizate în aplicații farmaceutice datorită proprietăților lor versatile ca vehicule de transport a medicamentelor. Există două clase de rășini schimbătoare de ioni: cationice și anionice (figura 2.11). Rășinile cationice conțin grupe funcționale negative legate covalent și schimbă ioni încărcați pozitiv. Pe de altă parte, rășinile anionice posedă grupe funcționale positive care schimbă ioni încărcați negativ. Principiul activ este eliberat prin schimbul ionilor încărcați corespunzător în contact cu rășinile schimbătoare de ioni. Această tehnică este aplicabilă medicamentelor care au caracteristici particulare în ceea ce privește relativ afinitatea lor pentru utilizarea polimerilor , , .

Figura 2.11. Reprezentarea schematică a unui sistem polimer controlat prin schimb ionic

2.5.2. Modele cinetice

Modelele matematice cu privire la studiile care descriu modul de eliberarea a unui compus bioactiv joacă un rol important, deoarece acestea oferă informații asupra mecanismului de eliberare a medicamentelor și oferă noi imformații generale pentru dezvoltarea unor noi viitoare sisteme. În general, cele mai multe aplicații de eliberare a medicamentului, implică procese precum difuzie, dizolvare, eroziune sau alte mecanisme și determină eliberarea agenților bioactivi. Unele formulări moderne sunt complexe și relația dintre variabilele de formulare, proces și profilurile de eliberare nu sunt în întregime înțelese .

Până în prezent, a fost dezvoltată o gamă variată de sisteme de transport a medicamentelor. Astfel, modelele matematice diferite sunt o cale pentru o mai bună înțelegere a eliberării principiilor active din diferite sisteme de transport. Modelarea matematică și simulările numerice ale transportului de compuși bioactivi în interiorul vaselor de sânge și în interiorul peretelui arterial uman pot contribui la o mai bună înțelegere a eficacității tratamentului și pot conduce către proiectarea unui sistem mai eficient. Totuși, modelarea eliberării medicamentului in vivo rămâne o sarcină dificilă cu multe provocări datorită complexității și eterogenității fenomenelor fizice implicate, atât în peretele arterial, cât și în sistemul de administrare. Metodele dependente de un model sunt bazate pe diferite funcții matematice care descriu profilul dizolvării medicamentului .

Dezvoltarea modelelor matematice, care pot prezice performanța procesului de eliberare, facilitează optimizarea sistemelor de transport. În general, modelele matematice sunt concepute pentru a îndeplini următoarele obiective:

proiectarea de noi sisteme de transport a medicamentelor;

elucidarea influenței efectului parametrilor de proiectare cum ar fi forma, dimensiunea și compoziția asupra vitezei de eliberare a medicamentului;

optimizarea cineticii de eliberare;

elucidarea mecanismelelor care stau la baza transportului în masă;

stabilirea cu exactitate a profilului de eliberare al medicamentului și îmbunătățirea eficacității și siguranței terapeutice a medicamentelor.

Un număr mare de modele matematice au fost dezvoltate pentru a descrie viteza de eliberare a principiilor bioactive din diferite sisteme polimerice de transport, cele mai importante modele fiind descrise în cele ce urmează .

Modelul difuzional

Procesul de difuzie se referă la mișcarea aleatoare a moleculelor ca urmare a energiei lor cinetice asociată cu un gradient de concentrație, și caracterizează fenomenele de transport a medicamentelor din organismul uman. Fenomenul de difuzie este explicat de cele două legi ale lui Fick, care susțin faptul că fluxul se deplasează de la o regiune cu o concentrație mai mare la una cu o concentrație mai mică pentru atingerea stării de echilibru, proporțional cu gradientul de concentrație conform relației , :

J – cantitatea de substanță care trece perpendicular pe unitatea de arie în timp;

D – coeficientul de difuzie ;

dc/dx – gradientul de concentrație iar semnul negativ indică faptul că difuzia a avut loc în direcție opusă față de creșterea concentrației.

Modelul de ordin zero face referire la dizolvarea medicamentului din formele de dozare fără dezagregare și eliberarea lentă a medicamentului care poate fi reprezentată de ecuația, , :

Qt – cantitatea de medicament dizolvată în timp;

Q0 – cantitatea inițială de medicament în soluție (de cele mai multe ori Q0=0);

K0 – constanta vitezei de eliberare de ordin zero;

Modelul de ordin unu

Acest model este utilizat pentru a descrie absorbția și eliberarea medicamentului care urmează cinetica de ordinul întâi, poate fi exprimată prin ecuația , :

K – constanta vitezei de ordinul întâi exprimată în unități de timp la puterea -1;

Modelul Higuchi

Higuchi a propus acest model în 1961 pentru a descrie eliberarea medicamentelor din sistemele de tip matrice. Modelul Higuchi se bazează pe ipotezele :

(i) concentrația inițială a medicamentului în matrice este mult mai mare decât solubilitatea medicamentului;

(ii) difuzia medicamentului are loc numai într-o singură dimensiune (efectul de margine trebuie să fie neglijabil);

(iii) particulele de medicament sunt mult mai mici decât grosimea sistemului;

(iv) umflarea matricei și dizolvarea sunt neglijabile;

(v) difuzivitatea medicamentului este constantă;

(vi) sunt atinse întotdeauna condiții de absorbție perfecte în mediul de eliberare.

Modelul Higuchi este dat de ecuația:

Qt – cantitatea de medicament eliberată la timpul t;

kH – constanta vitezei de eliberare pentru modelul Higuchi.

Modelul Korsmeyer–Peppas

O ecuație simplă care descrie eliberarea medicamentului dintr-un sistem polimeric a fost prezentată de Korsmeyer și colab. în 1983. Pentru a stabili mecanismul de eliberare a medicamentului, sunt luate în considerare doar primele 60% din date experimentale de eliberare a medicamentului , , :

Mt/M∞ – fracția de medicament eliberată la timpul t,

k – constanta vitezei de eliberare

n – exponentul de eliberare.

Valoarea exponentului “n” se utilizează pentru caracterizarea modurilor de eliberare difuzională din matrici polimere conform tabelului 2.2.

Tabelul 2.2 Exponentul difuzional și modurile de eliberare din diferite forme de dozare

Pentru determinarea valorii “n” trebuie analizate datele din curba de eliberare pentru care Mt/M∞ < 0,6.

Modelul Hixson–Crowell

Modelul Hixson-Crowell, descrie eliberarea medicamentului prin dizolvare din sistemele de transport, în care există schimbări ale ariilor și diametrelor particulelor sau tabletelor :

Q0 -cantitatea inițială de medicament din forma de dozare;

Qt – cantitatea de medicament eliberată la timpul t;

KHC – constanta vitezei de eliberare a ecuației Hixon-Crowell ca rădăcină de ordinul trei a procentului de medicament rămas în matrice, funcție de timp.

Modelul Weibull

Modelul Weibull este aplicat în general pentru dizolvarea sau eliberarea medicamentului din formele de dozare. Fracția acumulată a medicamentului M în soluție la momentul t este dată de ecuația lui Weibull :

M – cantitatea de medicament dizolvată în funcție de timpul t,

M0 – cantitatea totală de medicament eliberată;

T – decalajul de timp ca rezultat al procesului de dizolvare;

a – parametru de scară care descrie dependența de timp;

b – descrie alura curbei de solubilizare.

Modelul Baker–Lonsdale

Acest model derivă din modelul Higuchi și este utilizat în mod extensiv pentru liniarizarea datelor de eliberare din matrici sferice, exprimată ca :

Constanta de eliberare, k, corespunde pantei dreptei.

Modelul Hopfenberg

Hopfenberg a dezvoltat un model matematic pentru a corela eliberarea medicamentului din sisteme polimerice (tablete, sfere și forme cilindrice) prin mecanism de eroziune eterogenă erodare. Fracția cumulată a medicamentului eliberată la momentul t a fost descrisă ca :

Mt/ M∞ – fracția de medicament dizolvată;

k0 – constanta vitezei de eroziune;

C0 – concentrația inițială a medicamentului în matrice;

a0 – raza inițială a sferei, cilindrului sau jumătate din grosimea tabletei;

Valoarea lui n poate fi 1, 2 sau 3.

Modelul Gompertz

Modelul Gompertz este un model simplu care descrie profilul de dizolvare in vitro printr-o ecuație exponențială mai simplă :

X(t) – procentul dizolvat la timpul t împărțit la 100

Xmax – cantitatea maximă dizolvată

α – fracția dizolvată la timpul t =1

β – viteza de dizolvare pe unitatea de timp

Acest model are o creștere abruptă inițial și converge asimptotic spre maximul dizolvării. Modelul Gompertz este util pentru compararea profilurilor de eliberare a medicamentelor care prezintă o bună solubilitate și o viteză de eliberare intermediară.

Capitolul 3. Hidrogeluri (geluri) pentru transportul la țintă al medicamentelor

3.1. Aspecte generale. Avantaje și clasificare

Medicina modernă utilizează o varietate de materiale naturale și /sau sintetice, respectiv dispozitive pentru tratarea afecțiunilor medicale. Dispozitivele biomedicale, cum ar fi stenturile coronariene, grefele vasculare, valvele cardiace, dializoarele renale, cateterele, protezele de șold, protezele genunchiului, lentilele intraoculare și de contact, implanturile cohleare și cele dentare au în mod definitiv un rol important transformând și îmbunătățind calitatea vieții oamenilor. Progresele realizate în conjugarea proteinelor cu medicamente, terapia genică, transportul de medicamente țintite și ingineria tisulară prezintă potențialul de a revoluționa medicina clasică. Pielea artificială pentru tratarea victimelor cu arsuri, pancreasul artificial pentru persoanele cu diabet zaharat și a patch-urilor cardiace pentru a regenera mușchiul cardiac afectat de un atac de cord, nu mai par a fi obiective greu de atins, datorită dezvoltării ingineriei tisulare. Astfel, o gamă largă de materiale naturale și/sau sintetice sunt utilizate pentru a evalua, trata, mări sau înlocui orice țesut, organ sau funcție a corpului .

Hidogelurile există de mai bine de jumătate de secol. Cuvântul "hidrogel", în conformitate cu Lee, Kwon și Park, a fost utilizat pentru prima dată într-un articol publicat în 1894, însă, materialul descris nu era un hidrogel așa cum este descris astăzi, materialul descris fiind doar un gel coloidal realizat cu săruri anorganice.

Primul material cu rețea reticulată – “ hidrogel “ care a apărut descris în literatura de specialitate de către Wichterle și Lim în 1954, a fost realizat din poli(hidroxi etil metacrilat) (pHEMA) care prezenta o afinitate ridicată față de apă, și care a fost dezvoltat mult mai târziu, în 1960, cu obiectivul ambițios de a fi utilizat în aplicații ale ingineriei tisulare, .

În prezent, hidrogelurile reprezintă un subiect fascinant pentru oamenii de știință și cercetătorii din domeniul biomedicinei, tehnologiile de obținere a hidrogelurilor cunoscând o evoluție deosebită, datorită implicării lor în multe domenii ce variază de la produse farmaceutice la aplicații biomedicale, cum ar fi terapia celulară, vindecarea rănilor, regenerarea cartilajului/oaselor și eliberarea susținută a medicamentelor, implanturi biomedicale. Acest lucru se datorează biocompatibilității lor și asemănării proprietăților lor fizice cu țesutul natural .

Hidrogelurile reprezintă rețele (matrici) polimere care au capacitatea de a absorbi cantități de apă mari datorită structurii lor hidrofilice, rămânând insolubile datorită proceselor de reticulare fizice și chimice între lanțurile polimere individuale , . Un gel se formează deci prin utilizarea unui agent de reticulare (fizic sau chimic) sau prin asociere supramoleculară pentru a crea punți de legătură în matricea polimerică, rezultând hidrogeluri sau organogeluri . Comparativ cu matricile polimere de natură hidrofobă [de exemplu poli (acid lactic), poli (acid lactic-co-glicolic)] care prezintă o capacitate limitată de absorbție a apei, hidrogelurile dețin o serie de avantaje pentru utilizarea lor în domeniul biomedical datorită proprietăților fizico-chimice unice precum:

Capacitate de încludere a biomacromoleculelor (proteine, peptide, oligonucleotide și ADN-ul), datorită absenței interacțiilor hidrofobe ce ar putea modifica proprietățile acestor specii fragile;

Sunt biocompatibile/bioresorbabile;

Condițiile de obținere sunt relativ accesibile și sigure, majoritatea aplicațiilor necesitând temperaturi ambientale, iar utilizarea solvenților organici este rareori necesară;

Prezintă capacitate de gelifiere „in situ” precum și capacitate de încapsulare a compușilor bioactivi, celule și factori de creștere;

Pot fi proiectate astfel încât să fie sensibile la diferiți factori de mediu (pH, temperatură, lumină);

Pot fi proiectate astfel încât sa fie bioadezive pentru a facilita eliberarea principiului activ, în special prin membrane de mucus;

Pot fi injectate ,, in vivo “ ca un lichid care gelifiază la temperatura corpului;

Pot prezenta caracteristici de „camuflare in vivo” a medicamentului datorită naturii hidrofilice care conduce la prelungirea timpului de circulație a sistemului de eliberare prin „evitarea” răspunsului imun și descreșterea activității fagocitare;

Sunt ușor de modelat în diverse forme, dimensiuni și prezintă structură poroasă , .

Pe lângă avantajele prezentate trebuie menționat însă și faptul că hidrogelurile prezintă și câteva dezavantaje:

Posibilitatea de a fi greu de manevrat;

Pot prezenta proprietăți mecanice slabe;

Dificultate la reticulare in vitro ca matrice prefabricată după ce au fost încarcate medicamente și celule;

Pot fi dificil de sterilizat.

Hidrogelurile prezintă o varietate de proprietăți, cum ar fi capacitate de absorbție a unor cantități de apă mari, stabilitate și degradare, bioaderență și bioactivitate, permeabilitate, proprietățile mecanice, optice și de suprafață, care le transformă în materiale promițătoare pentru diverse aplicații biomedicale .

Dintre proprietățile menționate anterior, cea mai importantă este capacitatea de umflare (retenție a apei) în medii apoase. Metoda gravimetrică care constă în măsurarea greutății hidrogelului umflat este calea cea mai facilă pentru a determina atât gradul de umflare precum și studiul cinetic de umflare. Gradul de umflare (Q) este parametrul ce caracterizează capacitatea hidrogelurilor de a reține apa și a-și mări volumul, și se poate exprima după cum urmează:

Q, % = (mS – mD)/ mD

unde: mS, mD masa hidrogelului umflat, respectiv uscat.

Proprietățile de umflare ale hidrogelurilor sunt influențate de o serie de factori, precum tipul și compoziția monomerului/polimerului, gradul de reticulare, natura mediului de umflare, temperatura, pH-ul și tăria ionică. Atunci când o rețea de biopolimeri este în contact cu o soluție apoasă sau cu un fluid biologic, rețeaua începe să se umfle, datorită compatibilității termodinamice a lanțurilor de polimeri și a apei. Forța de umflare este contrabalansată de forța de retragere indusă de rețeau reticulată. Echilibrul gradului de umflare este atins în momentul în care aceste două forțe sunt echivalente. Densitatea de reticulare a hidrogelului este la rândul său legată de alte caracteristici importante cum sunt rezistența mecanică și permeabilitatea.

Proprietățile mecanice ale hidrogelurilor pot fi variate și ajustate în funcție de obiectivul final al materialului. Există posibilatea de a se obține un gel cu rigiditate mai ridicată astfel crescând gradul de reticulare sau scăzând-o prin încălzirea materialului. Modificările proprietăților mecanice se pot realiza prin creșterea densității de reticulare sau prin copolimerizarea cu monomeri hidrofobi, acestea depinzând de anumite variabile și cauze, fiind necesară efectuarea unei serii de analize diferite în funcție de material, de condițiile și de scopul final al studiului.

3.2. Clasificare, metode de obținere și caracterizare hidrogeluri/geluri

Clasificare

Termenul "hidrogel" a fost inventat pentru a descrie starea unui gel umflat cu apă sau soluții apoase (de exemplu fluide corporale). Flory (1974) a propus o clasificare a gelurilor pe baza criteriilor structurale:

structuri lamelare bine ordonate, inclusiv mezofaze de gel;

rețelele polimerice covalente, complet dezordonate;

rețele de polimeri formate prin agregare fizică, predominant dezordonat, dar cu regiuni de ordin local; și,

structuri particulare, dezordonate.

În figura 3.1 sunt prezentate cele mai importante criterii de clasificare a hidrogelurilor precum: proprietăți fizice, mecanismul umflării, preparare, sarcină ionică, sursa polimeri, comportare la degradare, natura reticulării, porozitate , , .

Figura 3.1. Criterii de clasificare a hidrogelurilor

Metode de obținere

Un gel/hidrogel polimeric reprezintă o rețea formată din lanțuri flexibile reticulate. Structurile de acest tip pot fi obținute prin procese chimice sau fizice (figura 3.2). Unele geluri pot fi reticulate chimic prin legături covalente (gel chimic), în timp ce altele sunt reticulate fizic prin intermediul forțelor slabe, cum ar fi legăturile de hidrogen, forțele van der Waals sau interacțiunile hidrofobe și ionice (gel fizic) .

În general, pentru prepararea hidrogelurilor sunt utilizați fie monomeri hidrofili, fie hidrofobi pentru a modifica proprietățile pentru aplicații specifice. De asemenea, hidrogelurile pot fi preparate și din polimeri sintetici sau naturali. Polimerii sintetici de natură hidrofobă, din punct de vedere chimic sunt mai puternici în comparație cu cei naturali. Rezistența lor mecanică are ca rezultat o viteză lentă de degradare, dar, pe de altă parte, rezistența mecanică asigură durabilitatea. Aceste două proprietăți opuse ar trebui să fie echilibrate printr-un design optim. De asemenea, polimerii sintetici pot fi utilizați în prepararea hidrogelurilor pe bază de polimeri naturali, cu condiția ca acești polimeri să prezinte grupe funcționale adecvate sau să fi fost funcționalizați anterior cu grupări funcționale polimerizabile. Tabelul 3.1. evidențiază tipurile cele mai utilizate de polimeri naturali și monomeri sintetici pentru prepararea hidrogelurilor.

Figura 3.2. Metode de preparare geluri/hidrogeluri

Tabel 3.1. Polimerii naturali, sintetici și monomerii utilizați pentru obținerea hidrogelurilor

Hidrogelurile diferă în funcție de mărime, arhitectură și scop, împreună, aceste caracteristici dictează modul în care acestea sunt utilizate ca sistem de transport de medicamente.

Metode de obținere a hidrogelurilor prin reticulare fizică

Prin intermediul legăturilor de hidrogen

Hidrogelurile prezintă o structură reticulată datorită joncțiunilor ce se formează prin legăturile chimice care pot fi de natură covalentă sau ionică, prin intermediul unor rețele polimerice „încâlcite”, prin formarea de microcristalite sau prin interacțiuni mai slabe de genul legăturilor de hidrogen . Legăturile de hidrogen se pot forma între hidrogen și atomii de carbon, azot, oxigen și halogeni. Exemple de polimeri ce formează legături de hidrogen sunt: poli(alcoolul vinilic), amestecuri poli(alcool vinilic)/ poli(etilenoxid), gelatina și altele. Cu ajutorul tehnicii îngheț/dezgheț se pot obține hidrogeluri pe bază de poli(alcool vinilic), ce au la bază legăturile de hidrogen .

Hidrogelurile formate prin punți de hidrogen stau la baza multor formulări injectabile, cu proprietăți vâscoelastice superioare polimerilor constituienți, aceste proprietăți fiind puse pe seama interacțiunilor labile. Rolul legăturilor de hidrogen în elaborarea de hidrogeluri inteligente a fost demonstrat de către Phadke și colab., prin intermediul hidrogelurilor covalente capabile de auto-refacere (self-healing) după ruperea prealabilă a acestora. Principiul are la bază atașarea pe catena polimerică a unor lanțuri laterale mobile hidrocarbonate cu grupări funcționale special menite de a forma punți de hidrogen reformabile în anumite condiții de pH . În mediu apos rețelele polimerice ce au la bază punțile de hidrogen se pot dizolva și dispersa într-un timp foarte scurt .

Prin intermediul interacțiunilor hidrofobice

Interacțiuni hidrofobice au fost utilizate pe scară largă pentru obținerea agenților aglutinanți, cum ar fi uretanii etoxilați hidrofobici. Macromoleculele amfifile, părțile hidrofobe sunt capabile să se auto-asambleze în micele cu structură ca o floare cum ar fi în soluții apoase, acest lucru conducând la creșterea vâscozității datorită formării unei structuri fizice temporare a rețelei. Pe baza reologiei uretanilor etoxilați, se preconizează că introducerea interacțiunilor hidrofobe în sistemele de tip hidrogel creează legături încrucișate reversibile, care dau gelurilor capacitatea de a curge și oferă un mecanism de disipare eficientă a energiei, crescând rezistența la rupere. Okay și colab. au demonstrat că interacțiunile hidrofobe reversibile în hidrogelurile pe bază de poli(acrilamidă) contribuie la îmbunătățirea proprietăților mecanice .

Comparativ cu elastomerii termoplastici, multibloc, utilizarea copolimerilor care prezintă segmente hidrofobe pentru realizarea de geluri conduce la obținerea unui sistem cu elasticitate mai mare și un fluaj redus. Meijer și colab. au raportat formarea unor hidrogeluri reticulate fizic prin intermediul legăturilor de hidrogen ale 2-ureido-4[1H]-pirimidinonă și unitățile hidrofilice ale copolimerului de PEG. Matricea hidrofilă PEG combinată cu segmente hidrofobe nanoscopice, datorită apariției fenomenului de separare a microfazelor, prezintă rezistență ridicată și elasticitate atunci când este supusă procesului de deformare .

Prin complexare ionică

Hidrogelurile obținute prin complexare ionică implică interacțiunea unui polimer de natură ionică cu un cation, pentru inițierea reticulării fizice. Spre deosebire de ionii monomerilor simpli, interacțiunea unui polianion cu cationi (sau policationi cu polianioni) nu poate fi explicată complet prin principiul electro-neutralității. Structura tridimensională și prezența altor grupări influențează capacitatea cationilor (sau anionilor) de a se conjuga cu funcționalități anionice (sau cationice) constatându-se o anumită selectivitate.

Stereo-complexare

Această metodă se referă la interacțiunile sinergice care pot apărea între lanțurile de polimeri sau molecule mici de aceeași compoziție chimică, dar cu o stereochimie diferită. De o importanță deosebită, hidrogelurile formate in situ cu module de stocare ridicate (până la 14 kPa) pot fi preparate prin exploatarea interacțiunii puternice dintre catenele principale de poli(lactide) (PLA) cu stereochimie L și D . Dendrimeri formați din PEG-PLA cu mai multe ramificații sau copolimerii dibloc cu structură stea pot fi reticulați utilizând această interacțiune stereospecifică pentru a forma hidrogeluri cu temperaturi de tranziție cuprinse între 10 și 70° C, în funcție de concentrația polimerului și de lungimea catenei principale PLA. Polimerii naturali pot fi, de asemenea, reticulați prin grefe de stereocomplexare . De asemenea, grefarea oligomerilor de L-lactidă și D-lactidă cu dextran conduce la o gelifiere spontană în apă, hidrogelurile obținute prezentând o biocompatibilitate și biodegradabilitate excelentă, fără a fi necesară utilizarea unor condiții de reacții dure (de exemplu utilizarea de solvenți organici) .

Metode de obținere a hidrogelurilor prin reticulare chimică

(Co) polimerizare a unor monomeri multifunctionali

În general, cele trei părți integrante ale hidrogelului sunt monomerul, inițiatorul și agentul de reticulare. Pentru a avea control asupra temperaturii de polimerizare și proprietățile finale ale hidrogelurilor, poate fi utilizată apa sau alte soluții apoase ca diluanți. Finalizarea reacției este urmată de un proces de purificare în care masa de hidrogel este spălată pentru a îndepărta impuritățile rămase din procesul de preparare. Acestea includ monomerul nereacționat, inițiatorii, reticulanții și produsele nedorite rezultate din reacțiile secundare. Copolimerizarea monomerilor hidrofili și a comonomerilor polifuncționali, acționând ca agenți de reticulare, va conduce la formarea unor structuri hidrofile de tip rețea. Cei mai utilizați monomeri sunt acrilații/metacrilații sau acrilamidele/metacrilamidele ,. Figura 3.3 prezintă obțininerea unui hidrogel plecând de la un monomer solubil în apă.

Figura 3.3. Reprezentarea schematică a obținerii hidrogelurilor plecând de la monomeri

Reticulare chimică a polimerilor preformati

Prepararea prin intermediul agenților de reticulare

Hidrogelurile de natură chimică sunt rețele macromoleculare tridimensionale formate prin introducerea de legături chimice de tip ionic sau covalent între lanțurile componente. Astfel de hidrogeluri pot fi preparate prin reticulare ionică sau/ și covalentă.

Obținerea hidrogelurilor prin reticulare ionică

Polimerii de natură ionică pot fi reticulați prin interacția contraionilor di- sau trivalenți, dând astfel naștere „punților de sare”. Agenții de reticulare ionici utilizați pentru obținenea hidrogelurilor sunt de natură anorganică precum sulfații, citrații, fosfații sau ioni metalici [22], [23]. Procesul de reticulare ionică poate avea loc fie prin amestecarea soluției polimerice cu soluția de reticulant, fie prin imersarea acestuia în soluția cu reticulant ionic. Hidrogelurile obținute se umflă în mediu apos și eventual se dizolvă. În această categorie intră atât hidrogelurile în care polimerii sunt reticulați cu molecule ionice cât și complexele polielectrolitice. Hidrogelurile fizice preparate prezintă un comportament mecanic diferit față de cel al hidrogelurilor chimice care prezintă un comportament elastic la deformare, comportament pus pe seama migrării apei din rețea, în timp ce legăturile ionice disociază și se formează în altă parte prezentând un comportament caracteristic deformării plastice. Acest fapt a fost demonstrat pe hidrogeluri ionice și covalente pe bază de alginat de sodiu [24]. Datorită reversibilității și a biocompatibilității mărite a agenților de reticulare ionici în comparație cu cei chimici hidrogelurile obținute prin reticulare fizică sunt preferate în cazul unor aplicații farmaceutice care nu necesită stabilitate mecanică mare. Avantajul acestui procedeu constă în faptul că nu este necesară utilizarea catalizatorilor sau inițiatorilor, reacția desfășurăndu-se în mediu apos și condiții moderate, fapt ce permite încărcarea medicamentelor în timpul formării hidrogelurilor [25], [26], [27].

Obținerea hidrogelurilor prin reticulare covalentă

Hidrogelurile reticulate fizic prezintă avantajul de a forma geluri fără a fi necesare modificările chimice sau adiția unor agenți de reticulare in vivo, însă acestea prezintă totuși unele limitări. Deoarece rezistența hidrogelului reticulat fizic este direct legată de proprietățile chimice ale precursorilor utilizați, este dificilă separarea variabilelor precum timpul de gelifiere, dimensiunea porilor rețelei, funcționalitatea chimică și timpul de degradare, doar prin limitarea flexibilității din proiectarea acestor hidrogeluri. În plus, timpul de contact al hidrogelurilor cu țesutul este adesea redus datorită diluției urmată de disiparea acestuia. Un avantaj al reticulării covalente este faptul că previne atât diluția matricei de hidrogel cât și difuzia polimerului mai departe de locul aplicării sale. Hidrogelurile reticulate covalent pot fi obținute prin utilizarea unor molecule mici de reticulant adăugate în soluția de polimeri (figura 3.4), prin conjugarea directă cu aceștia, prin polimerizare secundară sau prin iradiere. O serie de variante de obținere a hidrogelurilor in situ au fost explorate, cele mai uzuale dintre acestea fiind rezumate în figura 3.5.

Figura 3.4. Reprezentarea schematică a obținerii hidrogelurilor prin reticulare covalentă

Figura 3.5. Modalități de reticulare covalentă in situ: (a) reacția unei aldehide si a unei amine pentru a forma o bază Schiff; (b) reacția unei aldehide și a unei hidrazide pentru a forma o hidrazonă; (c) reacția de adiție Michael a unui acrilat și fie o amină primară, fie un tiol pentru a forma o amină secundară sau o sulfură.

Procesul de reticulare covalentă poate avea loc fie în cazul lanțurilor polimerice ale unui singur polimer (reticularea având loc la unitățile structurale ce aparțin aceluiași lanț polimeric sau de pe lanțuri diferite), fie în cazul unui amestec de polimeri (fiecare polimer contribuind la reacție cu o grupare funcțională). Astfel, se pot obține rețele de tip interpenetrat prin introducerea în sistem a unui polimer diferit care poate participa separat la o reacție de reticulare formându-se astfel rețele full-IPN (Interpenetrated networks) sau poate rămâne dispersat în gelul format de primul polimer reticulat formând rețele semi-IPN . Cea mai mare problemă în acest caz este reprezentată de utilizarea reticulanților covalenți, care pot induce o posibilă toxicitate materialului prin existența unor eventuale urme de reticulant rămase în urma etapei de purificare . Din acest motiv hidrogelurile sunt supuse unor etape de purificare riguroase pentru a îmbunătăți biocompatibilitatea cu organismul, ceea ce complică procesul și ridică costul de producție al unui biomaterial. În plus, pe lângă toxicitatea aldehidelor, utilizarea unor enzime ca transglutaminaza și genipina (agent de reticulare natural) este destul de costisitoare . Toate aceste limitări pot fi evitate prin utilizarea unor polimeri pre-funcționalizați cu grupări funcționale reactive. În funcție de viteza de reticulare dorită și de biodegradabilitatea conjugatului se pot realiza mai multe tipuri de legături covalente între lanțurile polimere care pot fi generate prin:

reticularea prin reacții chimice ale grupărilor funcționale ale polimerilor, de exemplu polimerii de natură hidrofilă care prezintă anumite grupări și anume NH2, COOH, OH pot fi utilizate pentru dezvoltarea hidrogelurilor;

reticulare prin reacții de adiție: reacția de adiție Michael între un nucleofil (o grupare aminică sau tiolică) și o grupare vinilică prezintă avantaje datorită timpului de reacție rapid, flexibilitate în formarea de multiple tipuri de legături (epiclorhidrina, diizocianat, etc.);

reticulare prin reacții de condensare (dialdehide, compuși organici bi- și polifuncționali). Poliesterii și poliamidele pot fi sintetizate prin reacții de condensare între grupările -OH sau -NH2 cu grupări -COOH sau, respectiv, derivații acestora;

reticulare enzimatică (de exemplu transglutaminazele, peroxidazele, tirozinaza, fosfoanteteinil transferaza, lizil oxidaza, amida oxidaza din plasmă și fosfataze). O metodă atrăgătoare pentru a prepara geluri pe bază de PEG prin utilizarea unei enzime a fost raportată de către Sperinde și colab. Aceștia au functionalizat tetrahidroxi-PEG cu grupările glutaminil ale poli(lizină-co-fenilalanină). Adăugarea transglutaminazei în soluția apoasă a condus la formarea rețelelor PEG ;

reticulare cu radiații de înaltă energie, radiații gamma, X pot fi utilizate pentru polimerizarea substanțelor nesaturate .

De exemplu, un PEG diacrilat poate fi utilizat pentru procesul de reticulare a unui PEG ditiolat sau a unor polimeri naturali funcționalizați cu grupe tiolice incluzând acid hialuronic, sulfat de condroitină și gelatină, timpul de gelifiere fiind cuprins între 2 și 6 minute . Cai și coloab. săi au raportat un amestec format din heparină modificată cu grupe tiol și acid hialuronic modificat cu tiol reticulat cu PEG diacrilat care condus la formarea unui hidrogel capabil să prelungească procesul de eliberare a factorului de creștere a fibroblastelor in vivo.

Prepararea hidrogelurilor prin intermediul iradierii

Reticularea prin iradiere a polimerilor este o metodă utilizată la scară largă întrucât nu implică utilizarea aditivilor chimici și prin urmare menține biocompatibilitatea biopolimerului rezultat (figura 3.6). Controlul facil al procesului, posibilitatea îmbinării formării hidrogelului și a sterilizării într-o singură etapă tehnologică, nu este necesară adăugarea unui inițiator sau agent de reticulare etc., care poate fi dăunător și dificil de îndepărtat, costuri de preparare relativ scăzute, ceea ce face ca metoda iradierii să fie o alegere potrivită pentru sinteza hidrogelurilor(gelurilor), în special pentru utilizarea biomedicală (deși, cu siguranță, această tehnică are, de asemenea, unele limitări și nu orice tip de hidrogel, poate fi sintetizat prin acestă metodă) . Există trei căi de obținere a hidrogelurilor prin iradiere după cum urmează:

în stare lichidă (soluții apoase foarte diluate de polimeri);

în stare de pastă (soluții apoase foarte concentrate de polimeri);

în stare solidă a polimerilor, monomerilor.

Figura 3.6. Reprezentarea schematică a obținerii hidrogelurilor prin intermediul iradierii

Exemple de polimeri sintetici utilizați pentru prepararea de hidrogeluri prin intermediul iradierii sunt poli(vinil alcool), poli(vinil pirolidonă), poli(etilen oxid), poli(etilen glicol), poli(acril amidă), poli(acid acrilic) și poli(vinil metil eter). Gelurile pe bază de poli(acid acrilic) și poli(vinil metil eter) prezintă un interes deosebit ca și componente ale "biomaterialelor inteligente", deoarece proprietățile lor sunt sensibile la stimuli de mediu – pH, putere ionică (PAA) și temperatură (PVME), .

Carenza și colab. săi au studiat eliberarea controlată a peptidelor și proteinelor din hidrogeluri obținute prin polimerizarea indusă de radiații a 2-hidroxietil metacrilatului la o temperatură scăzută. Aceștia au constatat că gradul de eliberare a scăzut progresiv, odată cu creșterea masei moleculare a proteinei. Totuși, o viteză crescătoare a eliberării proteinei a fost înregistrată în momentul realizării polimerizării în prezența poli(etilen glicolului). Mai mult, numai în prezența PEG-ului cu o masă moleculară mare s-a reușit eliberarea proteinelor cu masă moleculară mare . Diferențele dintre hidrogelurile obținute prin metodă fizică sau chimică sunt prezentate în tabelul 3.2, ,, :

Tabel 3.2. Diferențele dintre hidrogelurile fizice și cele chimice

Căi de administrare a hidrogelurilor ca sisteme cu eliberare controlată de medicamente

Cerințele de proiectare sunt în mod obișnuit comune cu cele ale sistemelor de transport, altele pot fi specifice aplicației terapeutice dorite. În general, proiectarea hidrogelurilor ca și sisteme de transport cu eliberare controlată a medicamentelor trebuie să mențină bioactivitatea medicamentului, iar prin încapsulare, transport și depozitare, atât medicamentul, cât și hidrogelul trebuie să fie stabile din punct de vedere chimic și fizic. Hidogelurile pot fi administrate prin diverse căi, cum ar fi implantarea chirurgicală, administrarea locală, sistemică sau intravenoasă (figura 3.7). Alegerea căii de administrare pentru aplicația dorită se bazează pe maximizarea eficacității principiului activ și a complianței pacientului .

Figura 3.7. Reprezentare schematică a diferitelor rute de administrare

hidrogelurilor

Mecanismele de eliberare a principiilor active din structuri de tip hidrogel

Gelurile/Hidrogelurile reprezintă un tip de sistem de administrare a medicamentelor deosebit de atractiv acestea fiind utilizate în foarte multe ramuri ale medicinei, inclusiv cardiologie, oncologie, imunologie, vindecarea rănilor și ameliorarea durerilor. O primă etapă importantă în proiectarea unui sistem de tip hidrogel este reprezentată de selecția precursorilor și a metodei de prepararea rețelelor polimere, acestea stabilind viteza și mecanismul de eliberare a compușilor bioactivi încapsulați în matricea hidrogelului. De asemenea, pentru designul unui hidrogel destinat eliberării controlate de principii active trebuie să fie luate în considerație o serie de criterii importante (figura 3.8).

Figura 3.8. Criteriile de design ale unui hidrogel

Simultan, pe lângă criteriile de design mai trebuie ținut cont și de paramentri precum masa moleculară a polimerului, respectiv dimensiunea moleculei; densitatea de reticulare; interacțiile dintre molecula de medicament și materialul polimeric; viteza de degradare a polimerului; concentrația de agent de reticulare/inițiator; temperatură, pH, tărie ionică; proprietăți mecanice; concentrația grupărilor funcționale care determină degradabilitatea polimerului; citotoxicitatea și biocompatibilitatea hidrogelului. Proprietățile de transport ale hidrogelului sunt dependente de coeficientul de difuzie al medicamentului, care la rândul său este dependent de dimensiunea moleculelor transportate și de caracteristicile rețelei polimere. Proprietățile fizice și densitatea de reticulare afectează capacitatea de eliberare a principiului activ inclus în hidrogel. Spre exemplu, masa moleculară a polimerului, compoziția și raportul polimer/agent de reticulare sau inițiator afectează capacitatea hidrogelurilor de umflare și de degradare. Un alt factor care influențează cantitatea și viteza de eliberare a principiului activ, este răspunsul rețelei polimere la anumiți stimuli externi (pH, temperatură, lumină). Înțelegerea mecanismelor de transport a compușilor bioactivi și a proprietăților fizice ale hidrogelurilor polimere sunt esențiale pentru procesul de eliberare al acestora.

Hidrogelurile pe bază de polimeri sunt materiale atractive încă din anii 1950. Acestea sunt înzestrate cu avantaje precum ,,inteligență”, posibilitate de a fi declanșate de factori din exterior și prezintă un mecanism de eliberare spatiotemporală. Datorită vitezei de difuzie controlabilă și rapidă, acestea sunt considerate vehicule promițătoare pentru includerea și eliberarea controlată a principiilor active în diferite condiții fiziologice, pentru aplicații cum ar fi terapia cancerului, osteoartrita, diabetul, infecții virale și bacteriane, boli cardiace etc. Principalul avantaj oferit de hidrogeluri ca sistem transportator de medicamente este administrarea medicamentului în mod controlat pentru o perioadă lungă, permițând astfel agentului farmaceutic să fie activ pentru o perioadă mai îndelungată. Procesul de eliberare controlată a compusului bioactiv din diferite sisteme are loc în principal prin mai multe căi, cele mai utilizate fiind: difuziune; umflare; osmoza; schimb ionic; chimic.

Sistemul de eliberare prin difuziune controlată este cel mai acceptat și mai răspândit dintre toate modelele mecanismelor de eliberare a medicamentelor disponibile, medicamentul fiind încărcat în matrici polimere insolubile (sisteme de tip „monolit”) sau în dispozitive de tip „rezervoare” acoperite cu o membrană polimerică insolubilă în apă. Eliberarea principiului activ din aceste sisteme prin membrana polimerică respectă prima lege a difuziei Fick. Sistemul de tip matrice implică distribuirea uniformă a medicamentului în structura generală a hidrogelului, iar procesul de eliberare a medicamentului are loc prin porii matricei hidrogelului, viteza de eliberare în acest caz fiind proporțională cu rădăcina pătrată a timpului, în loc să fie constantă și independentă de timp așa cum se întâmplă în sistemele de rezervoare .

În cazul dispozitivelor cu o eliberare controlată de procesul de umflare, medicamentul este dispersat într-un polimer transparent, similar cu cazul dispozitivului de tip matrice, iar când polimerul intră în contact cu un biofluid materialul începe să se umfle, extinzându-se apoi dincolo de limita sa, permițând astfel ca difuzia medicamentului să se realizeze odată cu relaxarea lanțurilor de polimeri. Acest proces este denumit și transport non-Fickian (cazul II) și prezintă o cinetică de eliberare constantă, independentă de timp. Acest mecanism este cunoscut și ca "transport anormal", procesul de eliberarea controlată este combinat cu cel de eliberare prin difuzie controlată .

În cazul sistemelor cu o cinetică de eliberare controlată de osmoză, miezul sistemului este realizat dintr-un hidrogel, acesta constituind sursa presiunii osmotice. De asemenea, sistemele cu eliberare a principiului activ prin schimb ionic sunt realizate prin reticularea polielectroliților solubili în apă, astfel hidrogelurile obținute prezintă densități mari de reticulare, ceea ce reduce procesul de umflare al acestora. Procesele de eliberare controlată prin mecanisme de difuziune, osmoză și schimb ionic permit controlul și predeterminarea riguroasă a vitezei de eliberare.

Mecanismul de eliberare controlată chimic este influențat în principal de reacțiile chimice care apar în interiorul dispozitivului. Procesul de eliberare a unui compus bioactiv din sistem depinde de reacții, precum, cele de degradare hidrolitică sau enzimatică (intervine clivajul lanțului polimeric) sau reacții reversibile/ireversibile care pot avea loc între rețeaua polimerică și medicamentul ce urmează a fi eliberat. Având în vedere aplicații diferite, hidrogelurile pot fi preparate astfel încât acestea să fie sensibile și să răspundă la diverși stimuli din organism cum ar fi pH-ul, rezistența ionică și temperatura.

Hidrogeluri sensibile la diverși stimuli

Hidrogelurile sensibile la diverși stimuli reprezintă o clasă de hidrogeluri proiectate astfel încât să prezinte proprietăți care răspund la diverse schimbări de mediu (factori externi) precum: temperatura, pH-ul, lumina și chiar la prezența unor molecule specifice (de exemplu, glucoza), acestea fiind numite și „hidrogeluri inteligente”.

Diferiți stimuli fizici sau chimici externi (de exemplu: termice, magnetice, ultrasunete, electrochimice, presiune, lumina, pH, reacții redox, complexe supramoleculare și reacții determinate de biocatalizatori, enzime) aplicați acestor tipuri de hidrogeluri conduc la modificarea în mod reversibil a volumului, datorită tranziției de fază sau a tranziției sol-gel . Spre exemplu în cazul utilizării unui hidrogel inteligent pentru transportul de principii active acesta prezintă proprietatea de a-și modifica capacitatea de retenție a apei (în sensul scăderii acesteia) în momentul modificării pH-ului, lucru care conduce la facilitarea procesului de difuzie a moleculelor de principiu activ în rețeaua polimeră. De asemenea, în cazul modificării temperaturii sistemului poate interveni contracția matricei polimerice astfel încât procesul de eliberare a principiului activ devine rapid .

Au fost raportate numeroase aplicații ale hidrogelurilor inteligente, precum utilizarea acestora ca matrici funcționale pentru aplicații biomedicale (de exemplu eliberarea controlată a compușilor bioactivi), inginerie tisulară și imagistică. Câteva exemple de hidrogeluri sensibile la diverși stimuli sunt prezentate în tabelul 3.3.

Tabel 3.3. Exemple hidrogeluri sensibile la stimuli externi

Hidrogeluri cu memorie a formei

Termenul de "memorie a formei" al polimerilor se utilizează atunci când o formă "programată", formată prin aplicarea unor forțe exterioare și stabilizată prin condiții de mediu adecvate, deține capacitatea de a reveni la forma inițială. Termenul "hidrogeluri cu memorie a formei " este utilizat în general pentru a descrie sistemele formate din polimeri cu o densitate de reticulare relativ scăzută sau soluții apoase cu grad ridicat de absorbție, care prezintă comportament de memorie a formei .

Hidrogelurile cu memoria formei sunt rețele de polimerice elastice care sunt echipate cu ,,comutatoare,, adecvate sensibile la stimulii externi. Acestea prezintă aplicații în diverse domenii variind de la ingineria tisulară și instrumentele medicale până la sisteme de transport de medicamente. Lendlein a raportat obținerea unui polimer cu memorie pe bază de poli(caprolactonă) care a prezentat potențial în aplicațiile medicale . Un alt exemplu de hidrogel cu memoria formei a fost raportat de Yakacki și colab. pentru stentul cardiovascular . De asemenea, Wischke și colab. au raportat prepararea unui hidrogel cu memoria formei pe bază unui co-poliester uretan care a fost utilizat ca dispozitiv cu eliberare controlată de medicamente (enoxacină, nitrofurantoină și lactat de etiridină) .

Hidrogeluri cu imprimare moleculară

Imprimarea moleculară reprezintă o metodologie care are la bază introducerea principiului recunoașterii moleculare în materiale polimerice. Această tehnică permite obținerea de ansambluri moleculare cu structură și proprietăți predeterminate, respectiv a unor centre de recunoaștere selectivă a unui ligand într-un polimer sintetic. Prezența centrelor de recunoaștere într-o matrice polimerică permite obținerea unor performanțe inedite pentru o varietate de aplicații, precum separarea cromatografică chirală, legarea liganzilor în senzori sau sorbenți, cu o specificitate ce rivalizează cu cea a anticorpilor , .

Procesul de preparare a unui polimer cu imprimare moleculară implică trei etape: formarea unei legături covalente ușor hidrolizabile sau a unui complex între o moleculă imprimată (șablon) și monomer(i) sau polimer; polimerizarea acestui conjugat monomer-templat; îndepărtarea templatului din polimer . În sinteza unui polimer cu imprimare moleculară sunt utilizate ca suporturi reactive, robuste, grupe protectoare, catalizatori, atât de natură organică, cât și anorganică. Imprimarea moleculară este o etapă crucială pentru obținerea unei selectivități optime. Polimerii cu imprimare moleculară pot fi obținuți utilizând diferite abordări precum imprimarea covalentă (un număr adecvat de molecule de monomer funcțional se asamblează în jurul moleculei-templat într-o manieră ordonată, specifică, prin legare covalentă) sau necovalentă (molecule de monomer funcțional se asamblează în jurul moleculei-templat în baza unor interacțiuni necovalente (legături de hidrogen, interacțiuni electrostatice, hidrofobe, cu transfer de sarcină, etc.) .

Tipuri de monomeri care pot fi utilizați pentru materialele cu imprimare moleculară necovalentă, ar fi acid metacrilic, metil metacrilat, 4-vinil piridină, acrilamidă, stiren. . De asemenea, în imprimarea moleculară covalentă pot fi utilizați monomeri precum 4-vinil benzaldehidă, 4-vinil benzilamină, 4-etil fenil acid boric.

Hidrogeluri cu imprimare moleculară se formează atunci când amestecul de reacție este fie polimerizat și reticulat, fie numai reticulat în condiții blânde. Îndepărtarea ulterioară a moleculei imprimate din matricea polimerică lasă o cavitate ce păstrează memoria dimensiunii, structurii și forma templatului care oferă calități de receptor, respectiv capacitate de a (re)lega mai târziu molecule similare eficient și selectiv. Diferite medicamente și molecule semnificative din punct de vedere biologic au fost imprimate în hidrogeluri pentru a le transforma în hidrogeluri cu imprimare moleculară .

Caracterizarea hidrogelurilor

Caracterizarea hidrogelurilor reprezintă o etapă fundamentală pentru scopul final al acestora. Astfel, pentru înțelegerea și justificarea proprietăților sistemelor de tip hidrogel se pot utiliza mai multe tehnici și metode de investigare care vizează următoarele aspecte , , , , , , , ,, :

Structurale (Spectroscopia în Infraroșu cu Transformantă Fourier, (FT-IR), Rezonanță Magnetică Nucleară (RMN), Difractometrie de raze X (XPS);

Morfologice (Microscopie electronică de baleiaj (SEM), Microscopie electronică de transmisie (TEM);

Proprietăți vâscoelastice -studii reologice

Proprietăți termice (ATG, DSC);

Proprietăți fizico-chimice (caracteristici de umflare în medii apoase, includere/eliberare de principii active)

Caracteristici de biomaterial (toxicitate, biodistribuție, biocompatibilitate, biodegradabilitate)

3.3. Stadiul actual al cercetărilor în domeniul biomedical

Hidrogelurile au fost studiate de-a lungul anilor și au fost utilizate ca matrici în ingineria tisulară, în diverse aplicații biomedicale ca și sisteme de transport de medicamente, senzori biomoleculari, ca materiale funcționale pentru producerea lentilelor de contact, implanturi etc. Datorită proprietăților lor, precum capacitatea de retenție a apei/solvenți, structura flexibilă, biocompatibilitate, biodegradabilitate, hidrofilicitate, tensiune interfacială scăzută în contact cu fuluidele biologice, hidrogelurile au devenit potențiale alternative pentru înlocuirea țesuturilor naturale .

Reacția dintre compușii cu sulf și compușii cu dublă legatură a fost descoperită în 1839 de Goodyear, și denumită reacție de adiție tip tiol-enă aceasta fiind folosită pe scară largă în secolul XX ca metodă de sinteză a rețelelor reticulate, pentru sintetizarea și funcționalizarea diferitelor tipuri de materiale polimerice pentru obținerea de hidrogeluri, nanogeluri, micele, nanoparticule. Reacția presupune adiția radicalică a grupării sulfidrilice la legăturile duble carbon-carbon neactivate și poate fi supusă fie mecanismelor radicalice, fie nucleofilice. Adiția tiol-enă radicalică are loc printr-un mecanism de reacție în lanț similar cu mecanismul de polimerizare și anume prima etapa este reprezentată de propagarea radicalilor RS către dubla legătură și reacția de transfer de lanț, care implică atracția unui radical hidrogen din tiol (figura 3.9). În ceea ce privește inițierea reacției, generarea radicalilor poate fi realizată termic sau fotochimic, constatându-se că utilizarea condițiilor fotochimice conduce la o reacție mai rapidă. O reactie de tip tiol-enă ideală pentru obținerea unor rețele polimere impune evitarea reacțiilor secundare ce pot surveni prin cuplarea radicalilor RS, ceea ce conduce la formarea de legături disulfurice. Avantajele acestei tehnici constau în: conversie mare, sunt rapide, condiții blânde de reacție, reacționeaza cu diferiti solvenți .

Figura 3.9. Reprezentarea schematică a) reacțiilor tiol-click, b) mecanismul reacției de adiție tiol-enă

Versatilitatea inerentă a chimiei tiol-enă conduce la prepararea rețelelor reticulate (figura 3.10), degradabile/nedegradabile într-o manieră facilă și foarte eficientă. Această tehnică a fost, de asemenea, exploatată de grupurile de cercetători Anseth și Bowman în aplicațiile biomedicale. Gelurile pe bază de PEG de natură biodegradabilă pot fi formate în prezența sistemelor biologice sensibile și utilizate pentru încapsularea celulelor pentru studierea efectului structurii rețelei și al modificării chimice asupra interacțiunilor celule-material. Lucrările raportate demonstrează clar condițiile de reacție ușoare asociate cu chimia tiol-enă și compatibilitatea procesului cu grupări funcționale sensibile și procese biologice . Eficiența reacției de adiție tiol-enă a permis, de asemenea, ca tehnica să fie utilizată și în cazul funcționalizării polimerilor care dețin grupări alchenice cu grupări tiol. În esență, orice grupă funcțională legată chimic la o moleculă tiol poate fi cuplată fie la catenele laterale, fie la cele terminale . Prin urmare, au fost utilizate o gamă variată de materiale polimerice precum homopolimeri, copolimeri și/sau copolimeri bloc, pe bază de metacrilați, stiren și poli(etilenglicol). Schlaad și colab. săi au demonstrat abilitatea unui derivat de poli(oxazolină) cu grupări alchenice de fi funcționalizat cu o serie variată de grupări tiolice pe catena principală a polimerului . David și Kornfield au elaborat un protocol similar pentru prepararea și funcționalizarea unei serii de poli(butadiene) .

Figura 3.10. Reprezentarea schematică a unei rețele ideale de hidrogel obținută prin intermediul reacției de adiție tiol-enă

Aplicații în ingineria tisulară

Ingineria tisulară este un domeniu științific care face legătura între știința materialelor și inginerie, medicină și biologie. Aceasta s-a dezvoltat foarte rapid în ultima perioadă, fiind utilizată pentru a crea, a repara și/sau a înlocui celulele, țesuturile și organele prin utilizarea celulelor și/sau a combinațiilor de celule cu biomateriale și/sau molecule biologic active care ajută la producerea de materiale care prezintă caracteristici asemănătoare cu țesuturile native ale organismului. Terapiile curente ale ingineriei tisulare au revoluționat și îmbunătățit calitatea vieții pacienților. Biomaterialele pe bază de polimeri naturali și/sau sintetici utilizate în ingineria tisulară în general sunt sub formă de hidrogeluri și/sau structuri tridimensionale (scaffold-uri naturale și sintetice). În prezent, proiectarea și obținerea de hidrogeluri biopolimerice și bio/non-degradabile utilizabile în ingineria tisulară reprezintă un subiect de cercetare important deoarece oferă un mediu temporal și spațial pentru creșterea celulară și tisulară .

Reacția de adiție tiol-enă prin foto-polimerizare, pentru aplicații biomedicale, a fost de asemenea, în ultimii ani prezentată ca un mecanism nou pentru formarea de hidrogeluri. În momentul proiectării hidrogelurilor pentru aplicații în regenerarea țesuturilor, alegerea mecanismului de polimerizare și structura rețelei rezultată prezintă potențial de a influența/ a avea impact asupra comportamentului celular. De exemplu, Anseth și colab. săi au exploatat tehnica de adiție tiol-ene prin foto-polimerizare pentru prepararea unor hidrogeluri degradabile sensibile în prezența unei enzime capabile să încapsuleze și să elibereze proteine (albumină serică bovină, lizozim, elastaza neutrofilă umană). Studiul raportează obținerea hidrogelurilor degradabile prin reacția de adiție tiol-enă prin foto-polimerizare în concentrații echimolare a PEG funcționalizat cu 5-norbornen-2-acid carboxilic cu bis-cisteină-proteină în prezență de 2-hidroxi-1-[4-(hidroxietoxi)fenil]-2-metil-1-propanonă. Pentru obținerea hidrogelurilor, soluția vâscoasă a fost expusă la 365 nm timp de 10 minute. Autorii au cercetat avantajul acestui sistem cu mecanism de erodare la suprafață de a elibera proteine cu dimensiuni diferite, demonstrând astfel ca proteinele încapsulate își păstrează 93% din bioactivitate chiar și după reacția de foto-polimerizare. Sistemul astfel realizat prezintă potențiale aplicații în tratarea anumitor afecțiuni precum diabet, artrita reumatoidă sau cancer .

Ates și Heise au raportat investigarea sistematică a sintezei unor sisteme sub formă de filme funcționale, biodegradabile obținute din macrolactone nesaturate utilizând chimia tiol-enă. Metoda raportată de aceștia implică în primă etapă polimerizarea enzimatică a monomerului globalidă, urmată de reticularea poli(globalidei) prin intermediul reacției tiol-enă și mai apoi de funcționalitatea suprafeței filmului cu N-Acetilcisteamină. Autorii demonstrează că reacțiile au avut loc cu succes, respectiv posibilitatea unei conjugări ulterioare. Sistemele astfel obținute pot fi utilizate ca și materiale regenerabile și degradabile, în aplicații biomedicale avansate .

Roberts și Bryant au realizat două tipuri de hidrogeluri pe bază de PEG prin foto-polimerizarea radicalilor liberi ai acrilaților (prin creșterea lanțului) sau a tiol-norbornenelor (prin creștere în trepte) pentru a investiga impactul sistemului hidrogel (mecanismul de polimerizare și structura rețelei) asupra dezvoltării/fabricării unui nou cartilaj. Studiul demonstrează că procesul de încapsulare a condrocitelor bovine în hidrogeluri are loc foarte rapid (în 10 minute), ceea ce conduce la un efect dramatic pe termen lung asupra calității țesutului fabricat. Pe termen lung, cantitatea de glicozaminoglicani sulfați și colagenul total a fost mai mare în sistemul acrilat, dar calitatea seamănă cu cea a cartilajului hipertrofic cu colorare pozitivă pentru agregan, colagen I, II și X și catabolism. Sistemul de tiol-norbornen a condus la fabricarea unui cartilagiu asemănător hialinei, în special sub sarcină mecanică, cu colorare pozitivă pentru agregan și colagen II și colorare minimă pentru colagenii I și X și catabolism. De asemenea, rezultatele acestui studiu confirmă faptul că mecanismul de polimerizare și structura rețelei sunt esențiale și au efecte pe termen lung asupra calității cartilajelor construite, respectiv în cazul rezultatelor ingineriei tisulare .

Aplicații în oftalmologie

Foto-polimerizarea tiol-enă, realizată cu o intensitate mai scăzută de ultraviolete (UV) și cu un conținut mai redus de fotoinițiator, a fost introdusă mai întâi în aplicații precum prepararea lentilelor intraoculare injectabile (IOL), astfel deteriorarea ochiului datorată radiației ultraviolete și a toxicității fotoinițiatorilor a fost mult redusă. Zhu și Yang au constatat că reacția de adiție tiol-enă prin foto-polimerizare a fost mai potrivită pentru prepararea IOL în comparație cu procesul de homopolimerizare, datorită condițiilor reacției menționate anterior. Probele au fost obținute prin reacția de fotopolimerizare tiol-enă dintre poli(etilen glicol) diacrilat (PEGDA) și tetrakis(3-mercapto propionat de pentaeritritol) (PTMP). Autorii au constatat că probele PEGDA-PTMP au avut o transparență similară și o hidrofilicitate similară celor realizate doar cu PEGDA prin homofotopolimerizare. De asemenea, în momentul când a fost adăugat PTMP în PEGDA, modulul de elasticitate al eșantioanelor a fost redus și flexibilitatea sa a fost mult îmbunătățită. Rezultatele experimentale raportate au demonstrat faptul că fotopolimerizarea tiol-enă este metoda care prezintă potențial ridicat pentru obținerea IOL-urilor injectabile ideale .

Aplicații în terapia antitumorală

Încorporarea medicamentelor de natură hidrofobă cu mase moleculare mici și/sau mari în matrici de tip hidrogel prezintă provocări suplimentare datorită solubilității lor limitate în apă. Introducerea unităților hidrofobe în rețeaua de hidrogel a fost utilizată pentru a îmbunătăți eficiența încapsulării medicamentului și pentru a influența comportamentul de umflare al hidrogelurilor. De exemplu, Harth și colab. au raportat hidrogeluri obținute prin reacția tiol-enă pe bază de poli(carbonat) pentru eliberarea susținută a paclitaxelului, un medicament chimioterapeutic utilizat pentru tratamentul cancerului ovarian și al sânului. Pentru a încorpora medicamentul hidrofob și pentru optimizarea timpului acestuia de staționare în matricea de hidrogel, poli(carbonatul) a fost încorporat în hidrogel ca o componentă suplimentară hidrofobă. Un sistem cu trei componente (poli(carbonat), poli(etilen oxid) și poli(glicidil)) a fost utilizat pentru a optimiza echilibrul dintre hidrofilicitate și hidrofobicitate, controlând astfel comportamentul de umflare al hidrogelului și cinetica eliberării medicamentului. Hidrogeluri care se supun procesului de hidroliză a legăturii esterice s-au format utilizând reacții tiol-enă mediate de lumină prin reacția policarbonaților funcționalizați cu grupări alil cu poli(etilen oxid) funcționalizat cu grupări tiol. Paclitaxelul a fost încapsulat în rețea în timpul formării hidrogelului cu o eficiență ridicată de încărcare (> 98%) și a fost observată o eliberare de ~ 7% până la ~ 30% din medicament timp de 7 zile, în funcție de gradul de umflare inițială a hidrogelului .

Shen și colegii au raportat utilizarea hidrogelurilor preparate prin intermediul reacției tiol-enă pentru eliberarea camptotecinei, un medicament anticancer hidrofob. Poli[oligo(etilen glicol)mercaptosuccinat] a fost reacționat cu poli[oligo(etilen glicol)maleat] pentru a forma filme (grosime ~ 10-35 nm). Camptotecina a fost conjugată pe catena principală polimerică prin intermediul unor legături esterice clivabile hidrolitic pentru eliberarea controlată a medicamentului pentru perioade scurte de timp (~ 24 ore) .

Capitolul 4. Micro/nanoparticule pentru transportul la țintă al medicamentelor

Capitolul are ca scop prezentarea aspectelor generale privind sistemele polimere particulate cu aplicații biomedicale, clasificarea și avantajele utilizării lor și este efectuată o succintă trecere în revistă a stadiului actual al cercetărilor în domeniu.

4.1. Micro/Nanoparticule polimere pentru eliberarea controlată de principii active

4.1.1. Aspecte generale. Avantaje și clasificare

În ultimii ani, s-au înregistrat progrese importante în domeniul biologiei, medicinei și științei materialelor, care au condus la dezvoltarea de diverse sisteme inovative micro- și nanoparticulate pe bază de polimeri naturali sau sintetici pentru transportul de medicamente. Acest lucru se datorează faptului că diverse medicamente noi necesită sisteme inovatoare de transport. Dezvoltarea unor astfel de sisteme de administrare a medicamentelor este capabilă să: îmbunătățească eficacitatea terapeutică a medicamentelor, reducă efectele secundare ale acestora și costurile aferente, etc. .

Beneficiind de progresul rapid al nanotehnologiilor și nanomaterialelor, cercetările din domeniul științei ingineriei materialelor au condus la dezvoltarea de sisteme de transport biodegradabile, biocompatibile, sensibile la diferiți stimuli și capabile să transporte la țintă biomolecule terapeutice (medicamente, proteine și gene) într-o manieră controlată. Totuși, dintre sistemele sub formă micro/nanopaticulată dezvoltate până în prezent, doar o parte sunt eficiente, în ciuda eforturilor depuse doar o cantitate mică de material injectat prezintă potențial de a ajunge la ținta dorită. O strategie promițătoare pentru sporirea eficienței sistemelor nanoparticulate constă în modificarea suprafeței acestora sau a materialului polimeric utilizat .

Studiile de literatură menționează diverse tipuri de sisteme transportatoare de medicamente cum ar fi: particule lipidice (lipoproteine cu densitate mică și de înaltă densitate, respectiv LDL și HDL), micro/nanocapsule, micro/nanosfere, micro/nanoparticule, micele polimerice, dendrimeri și lipozomi, farmozomi, niozomi, nano/microemulsii, β-ciclodextrine, lentile de contact încărcate cu nanoparticule , . Prin urmare, este necesar de menționat și faptul că sistemele particulate încărcate cu medicament pot fi: nedirecționate (capsule, sfere sau nanoparticule pe bază de PEG), direcționate/țintite (prin cuplarea receptorilor la suprafața particulelor prin intermediul liganzilor) și teranostice (nanoparticule cu rol dublu de diagnoză precum și de terapie) . În tabelul 4.1 sunt evidențiate principalele tipuri de micro/nanoparticule precum și dimensiunile acestora:

Tabel 4.1. Clasificarea în funcție de dimensiuni a sistemelor particulate

Microsferele și nanosferele sunt sisteme de tip matrice în care medicamentul este dispersat fizic și uniform. Microcapsulele și nanocapsulele sunt recipiente minuscule compuse dintr-un miez în care este solubilizat sau dispersat medicamentul înconjurat de o membrana polimerică care acționeză ca o barieră pentru procesul de difuzie sau dizolvare. Acestea pot avea formă sferică sau nonsferică și se împart la rândul lor în patru categorii: microcapsule cu interior solid, lichid, cu micro-/nanodomenii solide, cu micro-/nanodomenii lichide .

Sistemele veziculare sunt structuri foarte ordonate compuse din unul sau mai multe straturi duble lipidice concentrice formate ca urmare a autoasamblării blocurilor amfifile constituente, în prezența apei. Sistemele veziculare au fost raportate pentru prima dată în 1965 de către Bingham, acestea fiind denumite și ,,corpuri Bingham”. În funcție de compoziție, acestea pot fi lipoidale sau non-lipoidale. Din categoria veziculelor lipoidale, fac parte: lipozomi, emulsomii, enzimozomii, transferozomii și etozomii, ufazomii, virozomii, cochleatele, sphingozomii, niozomii, aquazomii , , .

Lipozomii sau veziculele pe bază de lipide sunt sisteme veziculare de formă sferică cu dimensiuni mici (50-200 nm), constituiți din unul sau mai multe straturi duble lipidice unilamelare (ULV) sau multilamelare (MLV), care se formează ca rezultat al autoasamblării fosfolipidelor naturale netoxice într-un mediu apos rezultând o structură bilaterală închisă (figura 4.1). Datorită dimensiunii lor și a caracterului hidrofob și hidrofil (segmentul hidrofil este orientat înspre exterior, iar cel hidrofob înspre interiorul veziculei) lipozomii sunt sisteme promițătoare pentru transportul de medicamente. Proprietățile lipozomilor diferă considerabil prin compoziția lipidelor, mărimea și metoda de preparare. De asememenea, aceștia sunt biocompatibili, versatili și prezintă o capacitate mare de încapsulare a compușilor bioactivi atât în interior cât și în stratul dublu lipidic sau în suprafața polară , , .

Figura 4.1. Tipuri de lipozomi: MLV- lipozomi multilamelari cu dimensiuni de 300-5000 nm, LUV – lipozomi unilamelari cu dimensiuni de 100-300 nm , SUV – lipozomi unilamelari cu dimensiuni de 20-100 nm

Primul sistem de eliberare controlată de tip lipozomal-Doxil aprobat de FDA în 1995, administrat pe cale intravenoasă a avut încapsulat ca principiu activ amphotericină B . Potențialul utilizării lipozomilor în terapia oculară a fost raportată mai întâi de către Smolin și colab. (1981) care au descris avantajul lipozomilor asociați cu idoxuridinei comparativ cu soluția simplă de medicament în tratamentul cheratitei herpetice la iepure. Au urmat studii care au dovedit eficiența sistemelor de transport liposomale precum Stratford și colab. (1983) prin încapsularea de adrenalină, respectiv Singh și Mezei care au raportat încapsularea dihidrostreptomicinei sulfat pentru tratarea afecțiunilor corneei și a conjunctivei .

Recent, Mehanna și colab. săi au raportat eficiența unui gel termosensibil pe bază de lipozomi încărcat cu ketorolac-trometamină ca medicament antiinflamator puternic pentru tratamentul afecțiunilor oculare cu eliberare prelungită, dovedind capacitatea sistemului de a elibera medicamentul controlat pentru o perioadă de 24 ore . Depășirea limitărilor impuse de sistemele lipozomale a determinat apariția unor entități lipidice derivate din lipozomi precum:

emulsomii → entități lipidice a căror structură este alcătuită din lipide și trigliceride care sunt stabilizate sub formă de emulsie prin adăugarea lecitinei în concentrație foarte mare, care prezintă atât caracteristicile lipozomilor cât și ale emulsiilor;

enzimozomii → structuri rezultate în urma complexării enzimelor cu lipidele;

transferozomii și etozomii → agregate supramoleculare lipidice ultraflexibile formate din cel puțin un compartiment apos interior înconjurat de un strat dublu de lipide, cu proprietăți adaptate special, care sunt capabile să penetreze bariera membranară. Au fost proiectate cu scopul de a transporta transdermal medicamente cu masă moleculară mică, precum și cu masă moleculară mare ;

farmacozomi → sunt dispersii coloidale de medicamente legate covalent la lipide sub formă de agregate ultrafine veziculare, micelare sau hexagonale, în funcție de structura chimică a complexului medicament-lipidă ;

ufazomii → vezicule pe bază de straturi duble lipidice de acizi grași nesaturați (acid oleic, acid linoleic) și specii ionizate (surfactanți) în prezența soluțiilor tampon cu un pH cuprins între 7 și 9. Secvențele hidrocarbonate ale acizilor grași sunt orientate spre interior în timp ce grupele carboxil vin în contact cu mediul apos;

virozomii → lipozomi imuno-modulatori constituiți dintr-un strat lipidic dublu în care este inclusă o glicoproteină virală;

cochleatele → microstructuri formate din straturi duble lipidice răsucite în formă de spirală ca urmare a condensării lipozomilor unilamelari încărcați negativ;

sphingozomii → sisteme veziculare obținute din sphingolipide naturale sau sintetice, care prezintă o stabilitate mult mai mare la hidroliză (conțin legături amidice sau eterice) decât lipozomii;

niozomii sau veziculele de surfactant neionic → structuri lamelare microscopice formate atunci când agenții tensioactivi neionici (în principal din clasa de alchil sau dialchil poliglicerol eter) se adaugă peste colesterol, urmată de o hidratare ulterioară în mediu apos ;

discozomi → niozomi solubilizați în soluție de surfactant de natură neionică (din clasa polioxietilencetil eter) ;

aquazomii → nanostructuri trifazate autoasamblate care prezintă o fază solidă formată dintr-un miez nanocristalin care asigură stabilitatea structurală, acoperit cu un film oligomeric (format din carbohidrați) pe care pot fi adsorbite sau legate chimic molecule bioactive. Acestea mai sunt denumite și nanoparticule ceramice. Alte exemple de vezicule non-lipoidale: proniozomii, bilozomii sau aspazomii .

Microemulsiile sunt sisteme izotrope, stabile, termodinamic, transparente (sau translucide) de ulei, apă și agent tensioactiv, frecvent combinate cu un co-agent surfactant, cu o dimensiune a picăturilor, de obicei în intervalul 20-200 nm, acestea prezintă interes pentru eliberarea medicamentelor aplicate local datorită proprietăților intrinseci și a structurii specifice. Au fost descrise pentru prima dată în 1943 de Hoar și Shulman raportând o emulsie spontană de apă și ulei la adăugarea unui agent tensioactiv puternic . Metoda de preparare (emulsificare) accesibilă, precum și sterilitate, stabilitatea termodinamică, capacitatea de dizolvare ridicată a medicamentului determină utilizarea lor în aplicații biomedicale.

Emulsiile sunt obținute prin același procedeu ca și micro/nanoemulsiile și anume prin dispersarea moleculelor de apă și/sau a moleculelor organice într-o fază continuă nemiscibilă cu prima fază. Dimensiunile acestora pot fi cuprinse între 200 ÷30.000 nm, iar medicamentul poate fi dispersat în faza apoasă sau chiar în ambele faze.

Micelele polimerice sunt nanostructuri supramoleculare sferice, coloidale, formate în urma autoasamblării copolimerilor bloc amfifili – care prezintă atât segmente hidrofobe cât și segmente hidrofile – într-un mediu apos. Autoasamblarea structurilor miez-manta este favorizată entropic având loc deasupra concentrației critice micelare. Partea hidrofobă a copolimerului formează miezul în timp ce segmentul hidrofil constituie coroana .

Dendrimeri sunt structuri unimoleculare, hiperramificate, cu o morfologie tridimensională, un grad ridicat de simetrie și un număr mare de grupe functionale periferice (dispunere controlată) (figura 4.2). Aceștia pot fi obținuți prin două metode:

metoda divergentă : unde miezul multifuncțional al edificiului arhitectonic final interacționează cu un număr corespunzător de molecule de monomer (deține minim 2 centre de ramificare protejate). Construcția se dezvoltă pe baza unor cicluri repetate deprotejare-reacție-protejare. Fiecare treaptă reprezentând o generație.

metoda convergentă: construcția structurii începe dinspre periferie spre interior. Dendronul obținut se cuplează în final la centru. Permite controlul riguros asupra numărului și dispunerii grupelor funcționale periferice.

Dendrimeri pe bază de poli(amido amine), poli(propilen imină), și de lipid-lisină au fost utilizați cu succes pentru încapsularea și eliberarea de medicamente. Acestea au demostrat o eficientă bună de eliberare controlată și susținută a medicamentului în segmentul posterior al ochiului, îmbunătățirea penetrabilității corneei.

Figura 4.2. Formarea dendrimerilor până la generația a IV-a : (a) Structura dendrimerică în care s-a inclus medicament ; (b) cu medicament încapsulat

Microparticule sunt particule coloidale solide formate din polimeri naturali, sintetici, hibrizi sau lipide, cu dimensiuni cuprinse între 1-1000 µm, în care medicamentul este dizolvat, înglobat sau atașat.

Nanoparticulele (NP) sunt particule coloidale cu dimensiuni cuprinse între 10 – 1000 nm, însă totuși există și unii cercetători care limitează dimensiunile acestora doar până la 100 nm, justificarea acestora fiind: cu cât dimensiunea NP este mai mare, cu atât probabilitatea ca acestea să se comporte ca microparticule este mai mare. Acestea sunt realizate din materiale de natură anorganică sau organică care pot fi sau nu biodegradabile. Principiul activ poate fi dizolvat, înapsulat, înglobat, adsorbit sau legat la suprafața NP. Mecanismul de eliberare a principiului activ din matricea polimerică se realizează prin difuzie, umflare, eroziune, degradare sau prin controlul permeabilității membranei , . În funcție de materialul din care sunt preparate, NP se împart în: organice; anorganice; hibride . Diferența dintre microparticule (MP) și NP constă în arhitectură și morfologie. În funcție de materialul care stă la baza obținerii lor, NP pot fi de mai multe tipuri: polimere lipidice solide, pe bază de carbon, metalice, magnetice.

NP polimere pot prezenta forme sferice, ramificate sau cu structura miez-manta și sunt confecționate de obicei din polimeri naturali, sintetici sau conjugați. Câteva exemple de polimeri utilizați în fabricarea NP, sunt:

polimeri biodegradabili și biocompatibili naturali: celuloză, gelatină, pululan, chitosan, alginați.

polimerii biodegradabili sintetici: acid polilactic, PLGA, poli(anhidride), poli(ɛ-caprolactonă), poli(alchil-cianoacrilați).

polimerii sintetici nebiodegradabili: poli(metacrilat de metil) și PMMA care a fost utilizat pe scară largă într-o varietate de aplicații farmaceutice și medicale. Biodegradabilitatea și biocompatibilitatea sunt proprietăți importante ale materialelor polimerice care trebuie injectate sau implantate în organism. NP non-biodegradabile pot fi utilizate pentru eliberarea controlată a medicamentelor și, de asemenea, în domeniul complementar al imagisticii de diagnosticare .

NP lipidice solide sunt alcătuite din lipide solide dispersate într-o fază apoasă sau solvent, stabilizată de agenți tensioactivi. Lipidele utilizate pot fi trigliceride (tri-stearină), gliceride parțiale, acizi grași (acid stearic, acid palmitic) și steroizi (colesterol) și ceruri (palmitat de cetil), acestea fiind în stare solidă atât la temperatura ambientală cât și la temperatura corpului. Diferiți agenți tensioactivi și / sau combinații ale acestora (Pluronic F 68, F 127) au fost utilizați cu scopul de a împiedica aglomerarea particulelor și pentru a stabiliza faza apoasă lipidică .

NP ceramice sunt formate în principal din oxizi, carburi, fosfați și carbonați ai metalelor și metaloidelor, cum ar fi calciu, titan, siliciu etc. NP ceramice sunt utilizate în diverse aplicații datorită proprietăților cum ar fi rezistența ridicată la căldură, inerția chimică. Prin urmare, datorită dimensiunilor mici (aprox. 50 nm) care împiedică eliminarea de către sistemul reticulo-endotelial din organism, în domeniul biomedical, NP ceramice sunt considerate a fi suporturi excelente pentru includerea de medicamente, gene, proteine, agenți de imagistică, etc. NP ceramice au fost utilizate cu succes ca sisteme de administrare a medicamentelor împotriva infecțiilor bacteriene, glaucomul etc., și, cel mai frecvent, în terapia cancerului .

NP pe bază de carbon (nanotuburile de carbon) sunt alotropi ai carbonului cu formă cilindrică cu dimensiuni cuprinse între <1 nm și 50 nm, fulerenele prezentând formă sferică goală. Acestea prezintă proprietăți excelente electrice, magnetice, termice și mecanice, prin urmare sunt cele mai utilizate pe scară largă în prepararea nanocompozitelor pentru numeroase aplicații cum ar fi componente optice neliniare, catozi de baterii, nanofire și fibre, senzori și alte sisteme .

NP metalice prezintă diametre cuprinse între 1-100 nm și pot fi compuse din metale nobile, grele sau fier având proprietăți dependente de dimensiune. NP din aur și argint sunt cele mai studiate pentru dezvoltarea tehnicilor de diagnosticare, imagistică și transport de medicamente .

NP magnetice sunt formate dintr-un miez magnetic constituit din metale pure (Co, Ni, Mn, Fe), aliaje sau oxizi, care poate fi acoperit cu diverse materiale: polimeri, aur, silan, etc., astfel rezultând particule biocompatibile, stabile și care pot fi utilizate drept suport pentru transportul biomoleculelor. Acestea sunt utilizate intens în aplicații legate de diagnosticul și tratamentul cancerului .

Cercetările recente, sunt concentrate în principal pe identificarea "nanosistemului ideal" prin investigarea proprietăților fizico-chimice ale structurii și a interfeței biologice. În general, obiectivele principale de cercetare în domeniul nanomedicinei sunt: geometria structurii, prelucrarea suportului și a materialelor alese pentru dispozitiv, eliberarea principiului activ, mediul biologic. Absorbția nanoparticulelor și eliberarea medicamentului la nivel celular sunt influențate de acești parametri (figura 4.3). Răspunsurile celulare și, în cele din urmă, degradarea suportului polimeric depind de contactele inițiale ale receptorilor celulari, care pot include, printre alți factori, extinderea sau comprimarea membranei celulare și interacțiunile dintre proteine și ligand. Toate aceste răspunsuri sunt legate de compoziția chimică, geometria, funcționalizarea NP și mediul celular, care include membrana celulară și proteinele transmembranare ulterioare, matricea extracelulară înconjurătoare și morfologia celulelor țintă . Natura materialului utilizat, a principiului activ precum și mediul biologic pentru eliberarea acestuia sunt cei mai importanți parametri ce influențează mecanismul de eliberare.

Figura 4.3. Factorii esențiali care influențează eliberarea principiului activ din sistemele particulate

Dimensiunea NP reprezintă una dintre cele mai importante caracteristici ale sistemelor de tip nanoparticulat. Aceasta poate fi controlată prin intermediul factorilor de selecție a materialelor (de exemplu, polimer, agent tensioactiv și concentrații) și diferiți factori ai procedeului de preparare (de exemplu tipul, diametrul sistemului de picurare, debitul, monomerul, inițiator, procesul de polimerizare și tipul emulsiei). Studiile raportate au demonstrat faptul că NP prezintă mai multe avantaje în comparație cu MP cum ar fi: NP prezintă o absorbție intracelulară relativ mai mare; datorită dimensiunii mici NP prezintă un grad de mobilitate mai ridicat ceea ce conduce la țintirea unei game mai variate de celule. Prin urmare, NP dețin o suprafață de contact mai mare procesul de eliberare a medicamentului fiind mai rapid în comparație cu MP care permit încapsularea a două tipuri de medicamente care difuzează lent. Particulele mai mici au, de asemenea, un risc mai mare de aglomerare în timpul depozitării și a transportului dispersiei de NP .

Cercetările științifice au demonstrat că funcțiile de circulație, direcționare, degradare, toxicitate și mecanismul de absorbție sunt corelate cu dimensiunea particulelor. Dimensiunea NP influențează semnificativ interacțiunile membranei celulare-particule ce pot fi afectate de calea de absorbție a NP, care poate fi definită în două etape consecutive: un proces de aderare a particulei la membrana celulară și un proces de adsorbție , .

Un alt factor important care influențează atât aderența cât și transportul particulelor este forma particulelor. NP polimerice cu formă sferică sunt cel mai frecvent studiate, însă nu au fost neglijate nici nanoarhitecturile polimerice asimetrice și nonsferice utilizate în nanomedicină ca o cale pentru îndeplinirea unor sarcini mai complicate sau pentru reproducerea unor sisteme biologice complexe. Abilitatea de a adapta caracteristicile geometrice ale particulelor oferă posibilitatea de a modifica proprietățile fizice și chimice ale acestora .

Capacitatea de a „ținti” anumite organe, în general, aceste sisteme, pot fi utilizate pentru transportul medicamentelor în scopul „țintirii” unor organe vizate (celule, organe sau țesuturi), suprafața NP fiind funcționalizată cu liganzi de direcționare (anticorpi sau fragmente ale acestora, aptameri, peptide, zaharide, polizaharide sau biomolecule mici precum biotina sau acidul folic) specifici unor receptori situați pe suprafața celulelor „țintă” pentru îmbunătățirea specificității și acumulării acestora în zonele de interes. Utilizarea NP ca sisteme de administrare a medicamentelor oferă numeroase avantaje , , , , precum:

caracteristicile de eliberare controlată și degradare a particulelor pot fi ușor controlate prin alegerea materialului polimeric utilizat pentru realizarea matricei;

posibilitatea de control asupra dimensiunii și potențialului de suprafață;

favorizează încapsularea unei cantități considerabile de principiu activ în matrice, fără a fi necesară o reacție chimică, fapt ce conduce la conservarea efectului terapeutic al medicamentului;

îmbunătățirea considerabilă a eficienței terapeutice comparativ cu formele clasice orale sau injectabile;

protejarea medicamentului împotriva proceselor de degradare pe durata transportului;

creșterea sbabilității compușilor terapeutici volatili;

capacitatea de transport a medicamentelor de natură hidrofilă, hidrofobă, precum și a macromoleculelor;

abilitate de eliberarea controlată și susținută a medicamentului pe durata transportului până la zona vizată;

permit creșterea concentrației principiului activ în zonele de acțiune, respectiv îmbunătățirea timpului de înjumătățire și de circulație al medicamentului în sânge;

capacitate de penetrare a barierelor biologice din interiorul organismului;

împiedicarea răspândirii medicamentului în țesuturile normale;

evitarea răspândirii medicamentului în țesuturile normale eliminând astfel efectele adverse și crescând indicele terapeutic;

posibilitatea direcționării specifice prin conjugarea în suprafață a liganzilor de direcționare;

sunt versatile și pot fi proiectate astfel încât să dețină o anumită cinetică pentru a obține un anumit răspuns din partea organismului;

sistemul de transport poate fi administrat pe diverse multe căi;

reduc la minim reacțiile iritative la locul injectării;

metode facile și accesibile de preparare cu un cost redus;

pot fi sterilizate termic, prezintă o stabilitate mai bună în timp și au un timp de depozitare sau stocare mai bun comparativ cu alte sisteme de eliberare controlată;

Pe lângă avantajele prezentate trebuie menționat și faptul că NP prezintă și anumite limitări precum:

dimensiunea mică și suprafața de contact mare pot conduce la aglomerarea particulelor, ceea ce face dificilă manipularea fizică a NP în forme lichide sau uscate;

dimensiunea mică a particulelor are ca rezultat o posibilă încărcare limitată a medicamentului și apariția așa-numitului “burst effect” datorat eliberării medicamentului din suprafața sa .

Sistemele de transport a medicamentelor pot fi clasificate în funcție de modul de vectorizare, (subcapitolul 2.3), prin urmare din același punct de vedere, NP pot fi direcționate astfel :

pasiv (ca urmare a permeabilității și retenției crescute);

activ (prin intermediul liganzilor de direcționare);

fizic (transportul și modul de eliberare a medicamentului este mediat de stimuli externi precum: câmp magnetic, pH, UV, lumină, câmp electric, etc.);

Proiectarea unui sistem de transport a medicamentelor inovativ presupune simultan luarea în considerare a mai multor factori. De exemplu, după selectarea tipului de medicament, este necesar să se facă selecția materialelor constituiente ale matricei polimere în care va fi inclus medicamentul, a unei căi de administrare adecvată, a unui mecanism de eliberare a medicamentului, respectiv a cineticii de eliberare a medicamentului. Astfel, căiile de administrare a NP pot fi:

local: injecție perioculară, intravitreală, aplicare topică la nivelul pielii, injecție subcutanată, intraperitoneală, intramusculară, intradermală sau intraarticulară;

local la nivelul mucoaselor: bucal, oral, topic, vaginal, rectal, pulmonar, intranazal, oftalmic;

sistemic: intravenos, intraocular, .

4.1.2. Metode de obținere și caracterizare

4.1.2.1. Metode de obținere

Varietatea tipurilor de micro/nanoparticule (MNP) utilizate în domeniul biomedical se datorează diversității tehnicilor inovatoare și avansate de sinteză care conduc la obținerea caracteristicilor necesare sistemelor de transport, proprietățile sistemului fiind optimizate în funcție de scopul final al aplicației vizate. Dimensiunea redusă, suprafața personalizată, solubilitatea îmbunătățită și multifuncționalitatea NP vor continua să deschidă multe uși și să creeze noi aplicații biomedicale.

Totuși, selecția metodei adecvate pentru prepararea MNP depinde de caracteristicile fizico-chimice ale polimerului și medicamentului care trebuie încărcat. De asemenea la baza obținerii unui sistem particulat ideal de transport stau următoarele obviective esențiale: controlul dimensiunii nanoparticulelor, proprietățile de suprafață, capacitatea de umflare în medii apoase respectiv capacitate de încapsulare/eliberare a medicamentului în vederea atingerea efectului terapeutic dorit cu viteza optimă la locul de acțiune ,, , .

Tehnicile de sinteză a MNP purtătoare de medicamente evidențiate de studiile de literatură pot fi clasificate după o serie de criterii:

A) O primă clasificare presupune două abordări diferite de sinteză

,,Bottom-up” – această tehnică are la bază miniaturizarea sistemelor complexe (pornind de la nivelul molecular), prin intermediul unui proces de precipitare care conduce la formarea de nanostructuri. Moleculele de medicament se află în soluție, iar în timpul procesului de precipitare are loc autoasamblarea sistemului, formând aglomerate din ce în ce mai mari și mai stabile. Această tehnică mai este denumită și metoda solvent/antisolvent.

,,Top-down” – este o abordare care presupune convertirea maselor de material (macroscopice, cu proprietăți ce pot fi controlate din exterior) în unități mai mici, care la rândul lor sunt convertite în nanostructuri fine. Comparativ cu tehnica bottom-up în acest caz există o limitare dimensională inetrinsecă mai mare. Printre exemplele tipice se numără tehnica de mărunțire mecanică, gravare chimică și alte tehnici de descompunere , , .

B) În funcție de etapele necesare preparării NP

1. Tehnici de sinteză care necesită două etape de preparare a NP, acestea debutează cu realizarea unei emulsii, urmată de formarea NP prin precipitarea unui polimer sau polimerizarea unui monomer.

2. Tehnici de sinteză într-o singură etapă care au la bază procesul de precipitare a unui polimer care conduce la formarea unei dispersii spontane formată din macromolecule soluției de polimer autoasamblate. Această metodă este utilizată pentru obținerea de nanogeluri, complecși polielectrolitici, etc.

C) În funcție de forma materialului utilizat în sinteză

Metoda polimerizării monomerilor cu formare de NP în soluție apoasă (in situ). Medicamentul poate fi încorporat fie prin dizolvarea sa în mediul de polimerizare, fie prin adsorbția în NP după finalizarea procesului de polimerizare. Suspensia de NP este apoi purificată pentru a îndepărta stabilizatorii și surfactanți utilizați în procesul de polimerizare, prin ultracentrifugare și resuspendarea particulelor într-un mediu fără surfactanți. Dezavantajele acestei tehnici constau în apariția produșilor secundari care afectează biocompatibilitatea sistemului sau conduc la producerea reacțiilor secundare cu medicamentul.

Dispersia polimerilor preformați în solvenții corespunzători urmată de stabilizarea într-o soluție apoasă care constituie mediul de dispersie al NP. Metoda dispersiei polimerilor preformați este preferată din considerente de calitate a materialelor, durata sintezei precum și a disponibilității comerciale a copolimerilor specializați și a polimerilor preformați, , , .

D) Metode de obținere a NP prin metode chimice sau fizice

Studiile raportate prezintă tehnici ingenioase de obținere a formelor particulate, prin metode chimice sau fizice acestea sunt prezentate și detaliate conform schemelor din figurile 4.4 și 4.5,,, .

Figura 4.4. Reprezentarea schematică a metodelor chimice de obținere a nanoparticulelor polimere

Figura 4.5. Reprezentarea schematică a metodelor fizice de obținere a nanoparticulelor

4.1.2.2. Metode de caracterizarea a nanoparticulelor

Evaluarea caracteristicilor NP este o etapă esențială pentru scopul final al acestora. Astfel, pentru înțelegerea și justificarea proprietăților MNP se pot utiliza mai multe tehnici și metode de investigare care vizează următoarele aspecte , , , , ,, , ,, :

structurale (Spectroscopia în Infraroșu cu Transformantă Fourier, (FT-IR), Rezonanță Magnetică Nucleară (RMN), Difractometrie de raze X (XPS);

morfologice (Microscopie electronică de baleiaj (SEM), Microscopie electronică de transmisie (TEM), Analiza dimensională a particulelor prin difracție LASER (SALD, DLS-Malvern zeta sizer), (AFM, evidențierea caracterului de capsulă);

proprietăți termice (ATG, DSC)

proprietăți fizico-chimice (potențial zeta, caracteristici de umflare în medii apoase, includere/eliberare de principii active)

caracteristici de biomaterial (toxicitate, biodistribuție, biocompatibilitate, biodegradabilitate)

Figura 4.6 descrie detaliat tehnicile și metodele de investigare a MNP.

Figura 4.6. Reprezentarea schematică a metodelor de caracterizare a MNP

4.1.3. Stadiul actual al cercetarilor în domeniul biomedical

În ultimele decenii, domeniul nanomaterialelor a devenit unul dintre cele mai active și inovatoare în domeniile de cercetare precum chimie, fizică și medicină. O varietate de metode de preparare au fost raportate. Un număr tot mai mare de structuri au fost elaborate prin combinarea diferitelor tipuri de materiale, de la metale, aliaje, oxizi metalici și materiale semiconductoare la o mare varietate de polimeri naturali, sintetici sau derivați ai acestora.

Tehnologia de dezvoltare a particulelor cu dimensiuni nano oferă multiple proprietăți precum optice, mecanice, electrice, structurale, respectiv prezintă un potențial extraordinar pentru dezvoltarea potențialelor aplicații în nanomedicină. NP care asigură detectarea multimodală și/sau multifuncționalitatea sunt de mare interes în aplicațiile imagistice, țintirea, terapia și diagnosticarea in vitro. Controlul precis al chimiei suprafeței este deosebit de important atunci când nanomaterialele sunt aduse pentru a interacționa cu biologia . O varietate de funcționalități pot fi induse NP prin atașarea liganzilor de direcționare, a agenților reactivi de imagistică, acoperirea suprafaței acestora pentru îmbunătățirea timpului de circulație în sânge sau utilizarea materialelor sensibile la stimui externi care permit eliberarea controlată la locul țintit (figura 4.7).

Încorporarea funcționalităților poate influența reactivitatea (asamblarea/ dezasamblarea) NP în medii biologice cu diferite condiții pH, enzimatice, oxidative și reductive etc. sau ca răspuns la stimuli externi, cum ar fi variația temperaturii, iradierea UV, activarea în prezența câmpurilor magnetice și/sau aplicarea vibrațiilor cu ultrasunete etc. Proprietățile fizico-chimice ale NP polimerice precum distribuția granulometrică omogenă, modificarea facilă a suprafeței, stabilitatea, ușurință de preparare sunt o serie de avantaje care fac posibilă rezolvarea anumitor probleme din domeniul farmaceutic, stomatologic, al medicinei, biologiei și a științei materialelor. Proiectarea NP polimerice depinde de aplicarea terapeutică, de locul țintit (organe, țesuturi, organele celulare sau subcelulare) și de calea de administrare . Figura 4.8 prezintă reprezentarea schematică a diferitelor metode de sinteză a nanoparticulelor pe bază de polizaharide modificate și o parte din aplicațiile acestora în domeniul biomedical .

Figura 4.8. Reprezentarea schematică a diferitelor metode de sinteză a NP pe bază de polizaharide modificate și aplicațiile acestora

Aplicații în terapia antitumorală

Prevalența globală în creștere a cancerului a făcut ca terapia antitumorală să fie unul dintre cele mai cercetate aspecte din ultimii ani. Cele mai importante provocări cu care se confruntă terapia clasică împotriva cancerului sunt toxicitatea sistemică a medicamentelor citotoxice, imposibilitatea localizării tumorii și lipsa distribuției uniforme în tot corpul, inclusiv țesuturile tumorale. În plus, medicamentele anticanceroase, prezintă un timp de înjumătățire scurt în circulația sângelui și un comportament farmacocinetic nedorit sunt printre alte neajunsuri care sunt prezente în calea chimioterapiei cancerului . În ultimii ani, sistemele sub formă particulată pe bază de polimeri naturali și sintetici sunt utilizate ca matrici suport pentru vehicularea medicamentelor către celulele tumorale. Datorită porozității avansate a vascularizațiilor tumorilor și a lipsei vaselor limfatice de drenaj sistemele MNP pe bază de polimerii naturali incluzând polizaharidele (gelatina, chitosanul și acidul hialuronic), proteinele, anticorpii și poli(aminoacizii) și sintetici, precum PEG , PLGA, acid poli (l-lactic acid), poli (ɛ-caprolactonă) (PCL), poli(alchil cicioacrilați) sunt distribuite în celulele maligne și se acumulează în țesutul tumoral datorită efectului îmbunătățit de permeabilitate și retenție crescută al vaselor care traversează tumorile . Indiferent de tipul de sistem de transport sau calea de administrare selectate, principiul activ trebuie să prezinte capacitatea de a localiza țesutul tumoral, să pătrundă în aceasta și să difuzeze în interstiții în concentrație adecvată terapeutic, rămânând în țesut un timp cât mai îndelungat și în doza terapeutică corespunzătoare.

Prima generație de sisteme de eliberare a medicamentelor pentru terapia antitumorală, aprobată clinic, a utilizat lipozomi, și anume daunorubicina lipozomală (DaunoXome®) și doxorubicina (Doxil®) . Însă, apariția și evoluția nanotehnologiei au condus la o dezvoltare rapidă a platformelor nanoparticulate, pentru tratarea celulelor tumorale, de exemplu, Abraxane®, o formulare constând din paclitaxel încapsulat în NP de albumină, aprobat în 2008 pentru tratamentul cancerului de sân, și în 2013 pentru cancerul pancreatic.

Modificarea suprafeței NP cu polimeri hidrofili, cum ar fi PEG, prezintă avantaje de necontestat în tratarea tumorilor: reducerea energiei interfacială într-un mediu apos, prevenind astfel agregarea nedorită datorată interacțiunilor secundare dintre NP, clearence-ul rapid prin intermediul fagocitozei după administrarea intravenoasă și un grad minim de recunoaștere de către macrofagele sistemului fagocitar mononuclear din organism . NP pe bază de PEG modificat cu PCL au fost dezvoltate pentru administrarea sistemică a tamoxifenului pentru cancerul de sân. Studiul raportează faptul că modificarea PEG nu numai că a redus considerabil dimensiunea particulelor și aglomerarea acestora, dar a îmbunătățit semnificativ timpul de circulație în sânge, permițând ca aproximativ 18% din doza injectată să se acumuleze în masa tumorală în decurs de 1 oră, comparativ cu NP fără PEG care într-un model in vivo al adenocarcinomului de sân uman, au prezentat o acumulare doar de 5% din doza injectată . Într-un studiu efectuat de Brigger și colab. s-a descoperit că nanosferele de poli(hexadecil cianoacrilat) acoperite cu PEG încărcate cu doxorubicină cresc doza maximă tolerată de 1,5 ori mai mare comparativ cu NP convenționale, reducând astfel toxicitatea .

Aplicații în ingineria tisulară

Nanotehnologia poate fi utilizată pentru a crea diferite tipuri de sisteme sub formă de nanofibre, nanoscaffoldu-ri și NP cu eliberare controlată cu aplicații în ingineria tisulară, cu rol de a imita țesuturile native, deoarece biomaterialele care urmează a fi preparate prezintă dimensiuni nanometrice, precum fluidele extracelulare, măduva osoasă, țesuturile cardiace, etc. . Biomaterialele utilizate în aplicații ale ingineriei țesuturilor este necesar să îndeplinească calități precum resorbabilitate și să dețină proprietăți ce pot fi controlate/monitorizate în ce privește interacțiunea cu celulele organismului uman.

Zhang și colab. au sintetizat cu succes un nanogel cu proprietăți antibacteriene pe bază de chitosan modificat chimic cu poli(amino etil), astfel crescând numărul de grupe amino din catena principală a CS. Numărul de grupări aminice cationice este legat de activitatea antibacteriană a CS și, prin urmare, un nanogel bazat pe grupări multi-aminice poate avea efecte antibacteriene crescute și, respectiv, un potențial crescut ca material pentru tratarea rănilor. Astfel, rata de inhibare a nanogelului a fost semnificativ mai mare comparativ cu CS pur la aceeași concentrație atunci când a fost testat împotriva a patru dintre cele mai frecvente bacterii care se găsesc în răni după 12 ore de tratament. Ratele minime de inhibare ale nanogelului pe bază de CS modificat au fost de 53,87%, 62,97%, 33,5% și 67,76% împotriva Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa și, respectiv, Staphylococcus epidermidis. Și mai interesant, a fost faptul că ratele de inhibare au fost mai mari pentru bacteriile gram-pozitive decât pentru bacteriile gram-negative. Rezultatele raportate au arătat că grupările multi-aminice ale CS pot îmbunătăți considerabil activitatea antibacteriană a nanogelului obtinut .

Aplicații în oftalmologie

Acest subcapitol prezintă aplicații ale sistemelor MNP în tratarea unor afecțiuni oftalmologice, de asemenea sunt prezentate și aspecte generale cu privire la structura, patologia ochiului, limite ale terapiei clasice care împiedică medicamentul să penetreze structura oculară în drum spre țesutul afectat, precum și modalități de administrare a medicamentelor prin barierele oculare, pe bază de sisteme polimere particulate.

Ochiul este un organ unic (figura 4.9), protejat fizic prin intermediul structurilor rezistente ale sclerei și corneei și izolat anatomic de bariera retiniană sanguină. Structura ochiului poate fi împărțită în două mari segmente: segmentul anterior și segmentul posterior. Segmentul anterior al ochiului ocupă aproximativ o treime din ochi, iar restul porțiunii este ocupată de segmentul posterior. Țesuturile cum ar fi cornea, conjunctiva, umoarea apoasă, irisul, corpul ciliar și lentila fac parte din segmentul anterior. Segmentul posterior ocular include sclera, coroida, retina, nervul optic și umoarea vitroasă. Afecțiunile comune care afectează segmentul anterior al ochiului sunt sindromul ochiului uscat, glaucomul, conjunctivita, uveita anterioară și cataracta. Infecțiile care afectează segmentul posterior al ochiului includ degenerescența legată de vârstă, uveita posterioară, endoftalmita, retinopatia diabetică, ocluzia vasculară retiniană, edemul macular diabetic, vitreoretinopatia proliferativă.

Figura 4.9. Caracteristicile anatomice generale ale ochiului :

1. Conjunctiva; 2. Umoarea aposă în camera anterioară a ochiului; 3. Cristalin; 4. Pupilă; 5. Cornee; 6. Pleoapă; 7. Sclera; 8. Coroida; 9. Nerv optic; 10. Retina;

11. Umoare apoasă în camera postetioară a ochiului

Administrarea medicamentelor către segmentul anterior al ochiului pe cale topică implică în mod obișnuit formele de dozare convenționale, cum ar fi soluțiile (62,4%), suspensiile (8,7%) și unguentele (17,4%), care compun aproximativ 90% formulările oftalmice.

Suprafața ochiului afectează eficacitatea medicamentului, datorită barierelor oculare ca drenajul și filmul lacrimal, umoarea apoasă și structura corneei care împiedică, în general, trecerea substanțelor medicamentoase către structurile interne ale ochiului. Ca urmare a mai multor studii efectuate în ultimii ani, în terapia oculară au fost introduse diferite sisteme de eliberare a medicamentelor care furnizează concentrații eficiente de substanță medicamentoasă atât în regiunea anterioară, cât și în cea posterioară a ochiului. Există trei factori majori care trebuiesc luați în considerare pentru optimizarea biodisponibilității în segmentul posterior al ochiului:

trecerea peste bariera retinală sanguină sau a corneei și intrarea în ochi;

obținerea unui efect local;

extinderea duratei acțiunii substanței medicamentoase, pentru o frecvență redusă a administrărilor , , , .

Afecțiunile segmentului posterior ocular reprezintă cele mai frecvente cauze ale tulburărilor vizuale care pot duce la orbire. Cele mai importante boli sunt degenerescența maculară legată de vârstă, retinita citomegalovirusă, retinopatia diabetică, uveita posterioară și pigmentul retinitei, acestea afectează în mod direct vederea pacientului și, prin urmare, calitatea vieții. Numărul estimat de persoane cu deficiențe vizuale în lume este de 285 milioane, cu 39 de milioane orb și 246 de milioane care suferă de o vedere redusă. Deoarece numărul acestora va continua să crească datorită creșterii populației mondiale, afectarea vederii și orbirea devin cauze omniprezente ale dizabilității . În ultimele decenii, s-au dezvoltat o serie de terapii noi pentru a stopa sau chiar trata unele dintre aceste afecțiuni; totuși, o administrare eficientă oculară a macromoleculelor și compușilor terapeutici genetici rămânând încă o provocare. În prezent, tratamentul bolilor segmentului posterior este limitat de dificultatea de a obține un nivel eficient de medicament în țesuturile țintă, majoritatea metodelor necesitând administrarea repetată pe termen lung a agenților terapeutici. Majoritatea medicamentelor sau formulărilor comerciale pentru tulburări oftalmologice sunt concepute pentru tratamentul bolilor din segmentul anterior, astfel încât există o nevoie permanentă de compuși bioactivi pentru segmentul ocular posterior. În cazul celor existente, medicamentul este administrat prin intermediul a injecțiilor repetate intravitreale care sunt în general asociate cu complicații oculare și cu o reducere a confortului pacientului .

Direcționarea medicamentelor către regiunea posterioară a globului ocular este necesară pentru tratamentul anumitor boli degenerative care pot duce chiar la pierderea totală a vederii. Bolile segmentului posterior al ochiului au în general o evoluție rapidă, după cum se observă în descrierea de mai jos a degenerescenței maculare legată de vârstă, a retinopatiei diabetice și a glaucomului.

Degenerescența maculară legată de vârstă (AMD) este afecținea cea mai frecvent întâlnită, caracterizată prin pierderea vederii ca urmare a celulelor și vaselor de sânge din macula care se distrug, iar depozitele hipertrofice se acumulează în segmentul posterior al ochiului cauzând leziuni ale maculei , . Riscul apariției acestei afecțiuni crește odată cu vârsta, începând de la 50 de ani în aproximativ 90% din cazuri. Există două forme de AMD uscată și umedă. Forma AMD umedă este mai severă și vederea este distrusă într-un ritm mai rapid, totuși această formă este mai puțin comună. În prezent, există puține medicamente cu eficacitate dovedită pentru tratamentul degenerescenței maculare. Cele mai recente studii privind terapia AMD raportează rezultatele obținute după injectarea intravitroasă a inhibitorilor factorului de creștere endotelial vascular, cum ar fi bevacizumab (BEV) și ranibizumab , .

Retinopatia diabetică este o complicație obișnuită a diabetului zaharat care apare la peste 33% în rândul pacienților diabetici. În țările dezvoltate, retinopatia diabetică este principala cauză a orbirii la persoanele între 20 și 65 de ani. Statisticile recente arată că majoritatea pacienților care au suferit de diabet de cel puțin 20 de ani dezvoltă retinopatie diabetică. Retinopatia diabetică are două forme distincte: forma neproliferativă și forma proliferativă. Edemul macular este o complicație care poate apărea în fiecare dintre cele două forme. În stadiile incipiente ale bolii, fotocoagularea directă cu laser a microanevrismelor conduce la rezultate terapeutice bune, în primii 4 ani obținându-se o reducere cu 44 % a riscului de pierdere a vederii . Complicațiile retinopatiei proliferative sunt extrem de grave și pot include hemoragie vitroasă, detașarea retinei și glaucom neovascular. Cele mai recente terapii vizează administrarea intravitroasă a BEV, un anticorp monoclonal care este un inhibitor al factorului de creștere al endoteliului , , . Această substanță activă administrată intravitreal exercită un efect antiproliferativ prin inhibarea formării de noi vase. S-au obținut rezultate favorabile cu implantul intravitreal dexametazonă care reduce edemul macular .

Glaucomul este o neuropatie optică care provoacă moartea celulelor ganglionare retiniene și degenerarea lentă progresivă a axonilor nervului optic care duce la pierderea vederii progresiv și ireversibil. În general, aceasta este asociată cu creșterea presiunii intraoculare, suprafața discului optic și grosimea corneei centrale. Progresia este exprimată prin deformare treptată a capului nervului optic. Studiile epidemiologice sugerează că, până în 2020, se estimează că prevalența glaucomului va crește la 76,0 milioane și la 111,8 milioane până în 2040 la nivel global datorită îmbătrânirii populației. Mai puțin de 10% din cazurile de glaucom sunt cauzate de mutații genetice specifice, iar restul de cazuri sunt transmise ereditar . O combinație de polizaharide a fost realizată de Wadhwa și colab. între chitosan și acid hialuronic obținând astfel NP prin metoda gelifierii ionice care s-au dovedit a fi eficiente pentru creșterea biodisponibilității și eficacității dorzolamidei sau a timolol maleat în tratamentul glaucomului. Formularea prezintă proprietăți mucoadezive, este sigură și non-iritantă și a demonstrat o bună retenție pre-corneană .

Provocarea în elaborarea unei noi formulări pentru tratamentul tulburărilor oculare posterioare este atingerea dozei efective de medicament în țesutul afectat și, în același timp, minimizarea efectelor secundare sistemice și locale. Dificultatea este dată de anatomia și fiziologia unică a ochiului cu barierele sale de protecție care complică toate procesele farmacocinetice . În literatura de specialitate sunt prezentate mai multe studii pentru diferite tipuri de formulări, toate încercând să contribuie la dezvoltarea unui sistem nou și fiabil.

Există patru căi de administrare direcționată a medicamentului către segmentul posterior al ochiului: administrare topică, subconjunctivală, transsclerală și intravitreală (figura 4.10).

Figura 4.10. Reprezentare schematică a diferitelor rute de administrare oculară.

Administrarea locală este calea preferată de pacienți, însă rezultatele terapeutice ale direcționării medicamentului către segmentului posterior ocular sunt minime pe această rută. Practic, datorită caracteristicilor anatomiei ochiului și în special a barierelor oculare, absorbția medicamentului transcorneal este foarte scăzută. Se estimează că mai puțin de 5% din concentrația substanței medicamentoase administrate local intră în contact cu țesuturile intraoculare .

Administrarea medicamentului în diferite forme de dozare (tablete, capsule, soluții intravenoase etc.) către segmentul posterior al ochiului pe cale sistemică este de obicei limitată de existența barierei de sânge-retină (BRB) care limitează accesul substanțelor hidrofile . Biodisponibilitatea medicamentelor redusă datorită BRB conduce la necesitatea administrării unor doze mari de medicamente, și inerent la efecte secundare grave. Cu toate acestea, unele medicamente cu proprietăți lipofile (de exemplu cloramfenicol, minociclină, cefalosporină) care pot penetra bariera sunt administrate sistemic în tratamentul infecțiilor oculare grave. De asemenea, inhibitorii manitolului și anhidrazei carbonice, cum ar fi acetazolamida, sunt administrați intravenos pentru a reduce presiunea intraoculară .

Administrarea intravitreală implică injectarea medicamentului direct în umoarea vitroasă folosind un ac de dimensiuni 30-G . Diverse studii raportează o varietate de forme farmaceutice potrivite administrării prin injectare intravitroasă, cum ar fi soluții apoase, vâscoase preparate cu polimeri hidrofili, suspensii, sisteme de MNP, implanturi biodegradabile și biodegradabile .

Cu toate acestea, eliberarea și direcționarea medicamentelor administrate intravitreal depind atât de proprietățile substanțelor bioactive, cât și de anumiți parametri fiziologici. Este bine cunoscut faptul că substanțele medicamentoase cu masă moleculară mică difuzează rapid și necesită administrări repetate, în timp ce moleculele mari (mai mari de 500 Da) pot persista în umoarea vitroasă timp de câteva zile sau chiar săptămâni. Prin urmare, pentru proiectarea unui sistem de transport de principii active pentru administrarea intravitroasă, trebuie luată în considerare farmacocinetica substanței medicamentoase, astfel încât să fie evitate administrările repetate. Au fost raportate reacții adverse semnificative, inclusiv detașarea retinei cauzată de injecții repetate, hemoragie retiniană, endoftalmită, uveită etc., datorită concentrațiilor mari a dozei administrate .

Injecțiile perioculare reprezintă o cale mai puțin traumatizantă pentru pacienți și prezintă un risc minim de reacții adverse în comparație cu calea intravitroasă. Acumularea unui "depozit" de medicament pe suprafața sclerei poate să apară în urma administrării subconjunctivale a unui sistem de transport a medicamentului. Sclera, comparativ cu conjunctiva, prezintă o permisivitate mult mai mare față de substanțele bioactive, ceea ce permite pătrunderea facilă și difuzia substanțelor medicamentoase. Cu toate acestea, administrarea repetată a injecțiilor perioculare poate conduce la absorbție nespecifică și toxicitate sistemică nedorită, în special atunci când se utilizează medicamente cu indice terapeutic scăzut . Dezvoltarea unor noi sisteme de eliberare a medicamentelor oftalmice cu eliberare modificată este o prioritate în cercetarea medicală cerută de nevoile terapeutice actuale și de patologia segmentului posterior al ochiului.

Pătrunderea pe cale sistemică a medicamentului oftalmic se realizează printr-un proces de difuzie a substanței medicamentoase care începe în sânge și fluidele oculare prin capilarele oculare ale conjunctivei. Din acest motiv, această rută este numită și cale conjunctivală. O a doua cale este aplicarea locală prin instilarea picăturilor de ochi, numită și calea transcorneală, în general este utilizată pentru a trata bolile segmentului anterior. Un alt mecanism care realizează penetrarea substanței medicamentoase în ochi constă în absorbția sa în conjunctivă, urmată de transportul rapid în circulația sângelui periferic la nivelul țesutului ocular (absorbția non-corneană) .

Eficiența unei terapii medicamentoase este afectată în principal de barierele oculare, de pierderea efectului terapeutic al principiului activ în timpul transportului prin circulația sistemică, de efluxul fluidelor lacrimale care elimină principiul activ înainte ca acesta să ajungă la locul vizat. Atunci când medicamentele sunt administrate local, acestea intră în contact cu fluidul lacrimal, corneea și conjunctiva, acestea fiind primele bariere împotriva penetrării substanțelor active . Primul obstacol în calea microorganismelor și a medicamentelor, este filmul lacrimal care capturează reziduurile și, datorită reflexului de clipire repetată, acestea sunt eliminate de pe suprafața oculară, asigurând o distribuție uniformă a peliculei lacrimale. Fiziologic, corneea constă în cinci straturi recunoscute, trei straturi celulare (epiteliu, stroma și endoteliu) și două straturi de interfață (membrana lui Bowman și Descemet). Bariera cea mai critică pentru pătrunderea medicamentului este epiteliul, care este format din șase până la opt straturi de celule și controlează strict permeabilitatea substanțelor dizolvate. Celulele epiteliale devin mai groase în timpul maturizării și, eventual, formează joncțiuni intercelulare strânse, cu un diametru mic de 2,0 nm al porilor paracelulari, rezultând o barieră de difuzie relativ strânsă pentru absorbția medicamentului din fluidul lacrimal în camera anterioară. Prin urmare, transportul medicamentului de-a lungul corneei depinde în principal de caracteristicile fizico-chimice ale moleculei, epiteliul și endoteliul corneal care sunt bogate în lipide, astfel împiedicând trecerea moleculelor hidrofile în umoarea apoasă, permițând în același timp trecerea moleculelor lipofile mici .

Suprafața exterioară a sclerei este acoperită de conjunctivă care este formată din două-trei straturi de celule epiteliale groase între care se realizează joncțiuni strânse, fiind baza țesutului conjunctival vascularizat. Prin urmare, aceasta acționează ca o barieră semnificativă în cazul mai multor medicamente. Compușii bioactivi care intră în sistemul vascular al sclerei și conjunctivei, tind să fie eliminați din zona oculară, în circulația generală, .

Suprafața mare a sclerei (aproximativ 95% din suprafața ochiului total), natura sa hipocelulară, ușurința de acces și caracteristicile de permeabilitate ridicată, se dovedesc a fi o cale promițătoare pentru administrarea medicamentelor cu masă moleculară atât mică cât și mare către retină. Cu toate acestea, în același timp, doar câțiva cercetători au raportat că, compușii cu masă moleculară mare (de exemplu, FITC-dextran, 150 kDa), totuși nu pot ajunge la țesuturile chorioretinale după administrarea intravitroasă, datorită barierei formate de membranele limitatoare interioare, decât în cazul în care se administrează medicamentul prin injectare transsclerală sau se aplică un implant episcleral.

Mediul intraocular, cum ar fi umoarea apoasă, este, de asemenea, protejat de două bariere principale precum:

bariera sânge – umoare apoasă (BAB) care limitează accesul medicamentelor hidrofile spre umoarea apoasă;

bariera sânge – retină (BRB), în acest caz epiteliul pigmentar al retinei limitează accesul medicamentelor către aceasta.

Există două structuri principale implicate în formarea BAB, corpul ciliar și irisul. Stratul de celule nepigmentate al corpului ciliar produce lichidul apos (lichidul din camerele anterioare și posterioare). Componentele apoase sunt diferite de cele ale exsudatelor plasmatice prezente în stroma corpului ciliar. Rolul BAB este de a împiedica deplasarea nedorită a materialelor exogene în segmentul posterior al ochiului, asigurând transparența și echilibrul chimic al fluidelor oculare. De natură lipofilică, moleculele mici sunt eliminate cu ușurință la tranzitarea pasivă prin BAB în comparație cu macromoleculele hidrofile , .

Retina prezintă două zone de interacțiune directă cu sângele, una la nivelul vaselor retiniene și cealaltă la nivelul interfaței epiteliale pigmentară retino-coroidală. Astfel, două structuri cuprind BRB: joncțiuni strânse între celulele endoteliale ale vaselor retinei (BRB interioară) și joncțiuni strânse dintre celulele endoteliale ale epiteliul pigmentar retinal (BRB extern). Joncțiunile înguste realizează legături între cele două subcomponente, permisive doar moleculelor hidrofile. În concluzie, există două tipuri de mișcări moleculare în cadrul BRB. Transportul activ are loc în întreaga BRB, mai ales din corpul vitros în sânge, s-a demonstrat că acesta apare în prezența aminoacizilor, a unei varietăți de anioni organici și fluoresceină. Transportul pasiv prin BRB și în vitros prezintă un gradient de concentrație și este extrem de limitat, dar are loc în prezență de sodiu, fosfat, glucoză și potasiu .

Din punct de vedere anatomic este cunoscut faptul că retina este compusă din două părți: retina neuronală, formată prin suprapunerea a nouă entități structurale stratificate și, epiteliul pigmentar retinian. De asemenea, BRB extern este alcătuită din trei formațiuni structurale: epiteliul pigmentar retinal, coroida/membrana Brunch, și endoteliul fenestrat choriocapilar.

Epiteliul pigmentar retinal și coroida, în special membrana lui Bruch, constituie de asemenea o barieră semnificativă în calea permeabilității macromoleculelor. Epiteliul pigmentar retinal (RPE) este un monostrat format din celule polarizate, localizat între retină și coroid, formând astfel o barieră formidabilă împotriva difuziei moleculelor hidrofile datorită relațiilor de natură chimică ce se stabilesc între medicamentul administrat și melanina din RPE. Mai mult, natura pigmentată a coroidului și afinitatea sa pentru substanțele dizolvate lipofile limitează, de asemenea, disponibilitatea retiniană a acestor molecule (de exemplu, celecoxib) administrate pe cale transsclerală. Totuși, majoritatea medicamentelor sunt administrate pe cale sistemică prin intermediul țesutului coroidal, care este o parte foarte vascularizată a ochiului , .

Retina neuronală este stratul care separă stratul retinal pigmentat de sub umoarea vitroasă. Este o structură cu mai multe straturi, cu membrane de limitare interioare și exterioare care înconjoară inter-fotoreceptorii, formând o barieră în calea trecerii materialelor. Aceste straturi, bogate în glicozaminoglicani, se leagă de moleculele cationice și le limitează transportul prin retină. Pitkanen și colab. au constatat că încărcătura cationică este un factor de limitare mai important decât dimensiunea moleculară pentru transportul prin bariera retiniană .

Având în vedere evoluția nanotehnologiei în ceea ce privește nanotransportatorii de medicamente, dezvoltarea unor noi sisteme de eliberare prelugită, controlată și direcționată a medicamentelor de natură oftalmică care să asigure concentrații eficiente de substanță medicamentoasă atât în regiunea anterioară, cât și în cea posterioară a ochiului, devine un obiectiv important și necesar pentru tratarea afecțiunilor oculare, datorită necesităților terapeutice curente și deasemenea datorită patologiei segmentului posterior al ochiului.

Primele sisteme de eliberare controlată a principiului activ pentru tratarea afecțiunilor de AMD sau împotriva factorilor de creștere vasculară, aprobate de FDA au fost Visudyne, Macugen, Ozurdex. Pentru administrarea medicamentelor la nivel ocular, sunt în prezent investigate căile perioculare sau intraoculare ca și alternative pentru administrarea medicamentului , .

În prezent, sunt utilizate pentru eliberarea medicamentelor destinate țintirii polului posterior al ochiului o gamă variată de sisteme de transport pe bază de lipide, proteine, polimeri naturali ( acid hialuronic, chitosan, acid alginic) și/sau sintetici (PEG, PLGA) sub formă de: implanturi biodegrandabile și/sau nebiodegradabile; formulări liposomale; hidrogeluri, micele, micro/nanoemulsii; micro/nanoparticule. În general, polizaharidele sunt cele mai frecvete materiale utilizate pentru fabricarea sistemelor cu eliberare controlată de medicamente. Putem afirma fără să supraestimăm că cea mai utilizată polizaharidă este chitosanul datorită proprietăților sale biologice excepționale, cum ar fi biodegradabilitatea, netoxicitatea, biocompatibilitatea și mucoadezivitatea.

Rajendran și colab. raportează realizarea de NP pe bază de chitosan prin metoda gelifierii ionotropice care au prezentat o capacitate excelentă pentru încapsularea aciclovirului utilizat pentru tratarea diferitelor infecțiilor oculare. Profilul de eliberare al aciclovirului din NP a demonstrat o eliberare susținută, urmată de cinetică de ordin zero, cu mecanism de difuzie non-Fickiană. Prin urmare, rezultatele experimentale au arătat o interacțiune îmbunătățită a NP cu corneea și alte țesuturi datorită proprietăților mucoadezive ale CS datorată interacțiunii electrostatice dintre nanoparticulele de chitosan încărcate pozitiv și celulele corneale încărcate negativ. Autorii au demonstrat că nanoparticulele de chitosan pot îmbunătăți permeația corneana, timpul de contact și biodisponibilitatea aciclovirului.

Având ca scop eficientizarea tratamentului la nivelul retinei prin creșterea timpului de rezidență a medicamentului la locul afecțiunii și a reduce frecvența administrărilor dozelor medicamentoase, Tahara și colab. au elaborat formulări de sisteme particulate cu mucoadezivitate ridicată. Studiul raportează, obținerea de NP pe bază de PLGA funcționalizate la suprafață cu chitosan, ca posibile sisteme de transport de medicamente către segmentul posterior al ochiului, după administrarea topică. Datele experimentale demonstrează faptul că NP pot fi utilizate ca sitem de administrare de medicamente, acestea fiind încărcate cu cumarin-6 ca marker de fluorescență și analizate in vitro. Studiul relevă faptul că modificarea suprafeței NP cu chitosan a condus la creșterea interacțiunii cu celulele și a îmbunătățit eficiența de administrare a acestora la nivelul retinei, datorită grupărilor aminice ale chitosanului .

O combinație între două polizaharide chitosan și acid hialuronic a fost utilizată de către Wadhwa și colegii săi pentru a obține NP încărcate cu medicamente antiglaucom (de exemplu clorhidrat de dorzolamidă și timolol malate). Autorii demonstrează că acidul hialuronic crește mucoadezivitatea și eficiența NP. Deasemenea prin măsurarea presiunii intraoculare pentru această formulă în comparație cu un produs comercial, s-a constatat scăderea eficientă a acestui parametru în cazul utilizării NP de chitosan-acid hialuronic .

Conform, Aggarwal și colab. niosomii acoperiți cu chitosan și carbopol și încărcați cu maleat de timolol au redus presiunea intraoculară la iepurii albinici într-o manieră controlată timp de 8 ore în comparație cu o soluție de maleat de timolol .

Zhang și colab. au examinat potențialul NP pe bază de PLGA încărcate cu dexametazonă (dimensiune medie: 232 nm) injectate intravitreal la iepuri și au constatat că particulele au prezentat un proces de eliberare susținută până la 50 zile in vitro, cu o concentrație medie relativ constantă de 3,85 mg/l pe parcursul a 30 de zile, comparativ cu soluția de dexametazonă care nu a mai putut fi detectată după 7 zile de la injectare .

Micro/nanoparticule pe bază de poli(l-lactidă) încărcate cu triamcinolon (551 nm, respectiv 2090 nm) au fost comparate, pentru tratarea neovascularizării coroidale indusă experimental, prin administrarea subconjunctivală într-un model pe șoareci. Eficiența de încărcare cu medicament a NP a fost de 14,7 și respectiv 29,5% în cazul microparticulelor. Ambele suporturi au prezentat capacitatea de eliberare susținută a TA timp de aproximativ 45 și, respectiv, 120 de zile in vitro. În cazul studiului in vivo, s-a constatat că microparticulele au fost capabile să elibereze susținut în toate țesuturile intraoculare timp de 2 luni după injectarea subconjunctivală, în comparație cu nanoparticulele sau suspensia simplă de TA unde nivelul de medicament nu a mai fost detectat. De asemenea, studiul arată faptul că o cantitate semnificativă de microparticule sferice a rămas în țesutul periocular chiar și la 2 luni după injectarea acestora. Autorii au concluzionat că administrate pe cale subconjunctivală microparticulele, în comparație cu nanoparticulele, au reușit eliberarea TA mult mai bine .

Cu scopul de a îmbunătăți biodisponibilitatea oculară a medicamentelor studiul realizat de către Shi și echipa sa evidențiază obținerea unei nanosuspensii pe bază de chitosan funcționalizat cu un copolimer poli(etile glicol)-co-poli(ε-caprolactonă) pentru administrarea diclofenacului. Astfel, nanosuspensia obținută a prezentat stabilitate fără modificări aparente ale proprietăților fizice după depozitare la 4°C sau 25°C timp de 20 de zile, dar a fost instabilă în momentul introducerii în soluția de umoare apoasă după 24 de ore de la incubare. Eliberarea susținută a diclofenacului încapsulat din nanosuspensie a avut loc timp de peste 8 ore. Studiile farmacocinetice in vivo au evidențiat o creștere a gradului de retenție și penetrare a corneei a nanosuspensiei .

Un sistem în cadrul altui sistem și anume microparticule pe bază poli(acid lactic-acid-co-glicolic) în care au fost încorporate nanoparticule pe bază de chitosan funcționalizat cu N-acetil-L-cisteină pentru administrarea de medicamente către segmentul posterior al ochiului a fost dezvoltat de către Elsaid și colab. Sistemul a prezentat o capacitate îmbunătățită în mod semnificativ a profilului de încărcare și eliberare a ranibizumabului cu aproximativ 50% mai mult comparativ cu cazul NP simple pe bază numai pe PLGA pe cale intravitreală pentru tratarea leziunilor provocate de afecțiuni precum AMD, edemul macular diabetic și ocluzia venei retiniene .

Aceste câteva exemple menționate, conduc la concluzia că până în prezent cercetătorii au explorat diverse materiale și modalități de a fabrica sisteme particulate cu potențial ridicat ca sistem de eliberare controlată pentru țesuturile oculare, și care prezintă capacitate de încapsulare a medicamentelor existente, care pot îmbunătăți tratamentul prin creșterea biodisponibilității compușilor bioactivi, scăderea toxicității, asigurarea unei aderențe mai bune, a unui transport țintit, precum și a unei durate mai mari de acțiune .

PARTEA II. REZULTATE ORIGINALE

Oviectivele lucrării

Obiectivul general al tezei de doctorat îl constituie obținerea și caracterizarea unor noi siteme polimere sub formă de geluri pe bază de poliglobalidă și sub formă de micro/nanoparticule pe bază de dervați de chitosan pentru transportul și eliberarea controlată a medicamentelor pentru o gamă variată de aplicații biomedicale, precum și al unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului. Pentru îndeplinirea obiectivului principal s-a impus realizarea unor obiective specifice, astfel:

Sinteza poliglobalidei prin metoda de polimerizare cu deschidere de ciclu pe cale enzimatică;

Sinteza unui derivat de poli(etilen glicol) prin introducerea pe capătul catenei polimerului a grupei funcționale de tip tiol printr-o reacție de policondensare;

Sinteza unor derivați de chitosan prin introducerea de segmente hidrofile de tip poli(etilen glicol) pe catena principală a polimerului, prin modificarea chimică a grupelor funcționale aminice;

Caracterizarea structurală a derivaților obținuți prin metode moderne de analiză precum: spectroscopie FT-IR, spectroscopie RMN, GPC sau MALDI;

Obținerea și caracterizarea fizico-chimică a unui nou tip de geluri pe bază de poliglobalidă și poli(etilen glicol) cu funcție de tip tiol terminală, prin reacția de adiție tiol-enă fotoinițiată, în scopul realizării unui transport activ al medicamentelor;

Prepararea, obținerea și caracterizarea fizico-chimică a unui nou tip de micro/nanoparticule pe bază de chitosan grefat cu poli(etilen glicol) metacrilat prin procedeul emulsiei inverse cu dublă reticulare, pentru includerea, transportul și eliberarea unor medicamente destinate tratamentul afecțiunilor segmentului posterior al ochiului;

Prepararea, obținerea și caracterizarea fizico-chimică a unor noi micro/nanoparticule polimere pe baza derivatului de chitosan grefat cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat, prin emulsie inversă cu dublă reticulare, pentru transportul activ al medicamentelor destinate tratamentul afecțiunilor segmentului posterior al ochiului;

Caracterizarea sistemelor polimer-medicament obținute, din punct de vedere al capacității de includere/eliberare a principiilor active și al caracteristicilor de biomaterial.

Capitolul 5. Materiale, tehnici experimentale și de caracterizare

Capitolul are ca scop discuția și prezentarea materialele utilizate, tehnicile experimentale și metodele de caracterizare utilizate în vederea obținerii și caracterizării unor noi siteme polimere sub formă de geluri pe bază de poliglobalidă și sub formă de micro/nanoparticule pe bază de dervați de chitosan originale pentru transportul și eliberarea controlată de principii active pentru o gamă variată de aplicații biomedicale.

5.1. Materiale și reactivi

Deoarece această parte de lucrare vizează obținerea unor rețele polimere sub formă de geluri și a unor sisteme micro/nanoparticule polimere pentru transportul de medicamente, alegerea materialelor utilizate în realizarea acestora a constituit o etapă importantă. Biomaterialele pe bază de polimeri naturali și sintetici au un impact major asupra medicinei actuale. Dintre polimerii sintetici utilizabili în acest scop, poliesterii reprezintă o clasă importantă, fiind foarte versatili și putând fi obținuți prin metode variate pornind de la diferiți monomeri.

Macrolactonele reprezintă o clasă alternativă interesantă de monomeri regenerabili pentru sinteza poliesterilor alifatici cu proprietăți fizice îmbunătățite comparativ cu polimerii lactonelor cu mase moleculare mici și mijlocii . Pentru prepararea rețelelor polimere sub formă de geluri, în lucrare s-a optat pentru reacția de adiție tiol-enă pornind de la o macrolactonă de proveniență naturală – globalida și poli(etilen glicol) cu funcții tiolice terminale, pe baza acestora fiind sintetizați doi polimeri cu scopul introducerii în noile sisteme a unor noi proprietăți specifice precursorilor de plecare. Alegerea monomerului de globalidă (PGL) este justificată prin faptul că prezintă proprietăți precum netoxicitate, degradabilitate hidrolitică sau enzimatică scăzută, este extras din surse naturale, iar prezența dublelor legături în structura de bază a polimerului oferă posibilitatea extinderii în continuare a funcțiilor chimice care pot fi atașate la PGL.

Proprietățile deosebite ale polizaharidelor cum ar fi biocompatibilitate, bidegradabilitate, toxicitate redusă, hidrofilicitatea, capacitatea lor de polifuncționalizare și costul redus de prelucrare le transformă în materiale atractive pentru obținerea de materiale biomedicale avangardiste.

În cazul obținerii sistemelor micro/nanoparticulate s-a optat pentru chitosan și poli(etilen glicol) metacrilat respectiv metil eter acrilat, pe baza cărora au fost sintetizați doi noi polimeri cu scopul introducerii unor proprietăți noi care se răsfrâng și asupra sistemelor de transport obținute pe baza acestora. Proprietățile aparte ale chitosanului, și anume proveniența din surse naturale, biodegradabilitatea, biocompatibilitatea, netoxicitatea, mucoadezivitatea și prezența celor două tipuri de grupe funcționale care oferă posibilitatea esențială de a lua parte la reacții de modificare chimică, justifică selecția acestuia.

Un obiectiv principal a fost încapsularea unor medicamente specifice în gelurile, respectiv micro/nanoparticulele nou obținute ca potențiale suporturi de transport în aplicații din ingineria tisulară, respectiv tratarea anumitor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului. Totodată, în cazul sistemelor MNP pe bază de chitosan modificat un al doilea țel a fost cel de a îmbunătăți solubilitatea chitosanului în medii apoase prin grefarea de segmente hidrofile la catena de bază a chitosanului, fapt ce poate conduce la creșterea timpului de circulație al micro/nanoparticulelor în sânge.

Materialele utilizate pentru sintetiza polimerilor și a sistemelor polimer-medicament au fost achiziționate de la firme specializate, purificarea acestora nefiind necesară.

Poliglobalida (PGL), este un polimerul hidrofob, care poate fi sintetizat prin mijloace chimice sau enzimatice pornind de la monomerul globalidă (GL, figura 5.1), un ester ciclic nesaturat cu 16 carboni care conține o legătură dublă în poziția 11 sau 12, . Lactonele nesaturate cu 14-19 atomi de carboni, cum ar fi globalida, ambretolida, pentadecalactona și hexadecalactona, sunt extrase din surse naturale și utilizate în industria parfumurilor pentru mirosul lor mosc , .

Polimerii acestor lactone naturale, evident de tip poliester sunt cristalini, cu puncte de topire scăzute, netoxice și prezintă degradabilitate hidrolitică sau enzimatică scăzută, fiind caracterizate printr-o hidrofobicitate ridicată . Prin urmare, aceste proprietăți îi recomandă ca fiind buni candidați pentru biomateriale obținute din resurse naturale cu degradabilitate redusă. De asemenea, prezența dublelor legături în structura de bază oferă posibilitatea extinderii în continuare a funcționalității chimice prin atașarea de noi grupe funcționale la poliglobalidă .

Mai mult decât atât, dublele legături pot fi utilizate ca și punct de ancorare pentru alți polimeri, creând astfel ramificații polimerice pe catena de bază a poliglobalidei . Adiția tiol-enă între PGL și un agent de reticulare funcțional cu bis-tiol cu masă moleculară mică, etilenglicol bis (3-mercaptopropionat), în soluție THF, a fost descrisă anterior de Ates și Heise. Reacția a condus la formarea de materiale hidrofobe compacte. Reacția de tip tiol-enă a fost realizată printr-un mecanism radicalic, în topitură, folosind ca fotoinitiator, un amestec de (difenil (2,4,6-trimetilbenzoil)) fosfin oxid și 2-hidroxi-2-metilpropiofenonă. S-a demonstrat anterior că astfel de materiale suferă o degradare enzimatică lentă. Rețeaua pe bază de PGL a fost realizată și prin adiția radicalică tiol-enă, inițiată și în condiții termice în prezență de AIBN .

Claudino și colab. , au studiat, de asemenea, potențialul utilizării GL în sinteza copolimerilor termorigizi prin reacția tiol-enă fotoindusă.

Figura 5.1. Structura chimică a) globalidei și b) poliglobalidei

Pentru îndeplinirea obiectivelor propuse în această lucrare s-a utilizat globalidă (Mn=238 g∙mol-1) primită ca mostră fără valoare de la Symrise.

Câteva metode au fost raportate pentru a sintetiza astfel de polimeri prin polimerizarea: prin metateză cu deschidere de ciclu (ROMP), policondensarea diolilor și diesterilor derivați din acizi grași și reacțiile tiol-enă , . Ca alternativă, polimerizarea cu deschidere de ciclu a lactonelor poate fi utilizată pentru a obține astfel de poliesteri alifatici , . Inițierea polimerizării prin deschidere de ciclu (ROP) a lactonelor poate fi realizată fie catalitic, fie enzimatic. Cu rol de biocatalizator pentru sinteza PGL prin metoda polimerizării cu deschidere de ciclu am utilizat în cercetarea noastră Candida Antarctica, achiziționată de la Sigma Aldrich.

Poli(etilen glicol) (figura 5.2) este un polimer sintetic cu proprietăți fizico-chimice și biologice unice precum: biocompatibil, netoxic, nebiodegradabil, nonimunogenic, non-antigenic. Este frecvent utilizat ca polimer hidrofilic, neionic pentru funcționalizare în aplicații biotehnologice, farmaceutice și biomedicale , .

Figura 5.2. Structura chimică a poli(etilen glicol) diol

PEG este compus din unități repetative de oxietilenice conectate prin legături de eter care dau polimerului stabilitate chimică și enzimatică . Este disponibil în diferite forme în funcție de inițiatorul utilizat pentru procesul de polimerizare și poate avea diferite mase moleculare, care variază în general de la 0,3 kDa ÷ 10000 kDa. Alegerea utilizării PEG pentru conjugarea chimică a diferite tipuri de polimeri are la bază capacitatea sa de a se leaga covalent de lanțurile polimerului ce urmează a fi modificat conducând la materiale hibride. Hidrogelurile pe bază pe PEG sunt atractive, deoarece dispozitivele și sistemele de administrare de medicamente pe bază de PEG au deja aprobarea FDA datorită proprietăților caracteristice ale PEG care limitează aderența proteinelor nespecifice și interacțiunile celulare.

Hidrogeluri pe bază de PEG biodegradabile și biocompatibile au fost obținute cu ușurință prin reacția tiol-enă "click" în condiții fiziologice de către Weipu și colab. săi care au prezentat o metodă ușoară pentru a prepara doi copolimeri conținând grupări multi-tiolice sau multi-enă prin policondensarea directă a PEG cu acid tiomalic (TMA) sau anhidridă maleică utilizând trifluorometansulfonat de scandiu [Sc (OTf)3] drept catalizator foarte eficient și chemoselectiv .

Un alt exemplu de derivați PEG degradabili cu multi-enă și multi-tioli este prezentat de Hong și colab. săi . Huang și alții au raportat, de asemenea, sinteza unei serii de poli (eter-esteri) biodegradabili cu grupări tiol multiple prin policondensarea în topitură a poli(etilen glicol) diol, 1,4-butandiol și TMA utilizând [Sc (OTf)3] ca și catalizator. Studiul prezintă utilizarea TMA pentru prepararea micelelor cu miez reticulate, prin reacția tiol-enă "click" in situ, acestea prezentând potențial ca și nanotransportatori biodegradabili și biocompatibili pentru chimioterapia antitumorală. Avantajele materialelor hibride obținute prin funcționalizarea cu PEG constau în: îmbunătățirea proprietăților farmacocinetice și farmacodinamice ca urmare a rezistenței prelungite în timp în organism, îmbunătățirea solubilității polimerului modificat, un clearence renal redus și o toxicitate limitată, stabilitate a medicamentului împotriva degradării enzimatice .

Combinația polimerilor hidrofili/hidrofobi pentru formarea unei rețele reticulate reprezintă o sarcină dificilă datorită apariției separării fazelor. În general, astfel de rețele de polimeri ce conțin două tipuri de polimeri prezintă proprietăți bimodale, rezultate din diferențele dintre masele moleculare ale celor două componente macromoleculare și, de asemenea, datorită proprietăților diferite ale fiecărei componente.

Prin alegerea poli(etilen glicol) diol (PEG-diol) și a PGL ca reactanți pentru realizarea retelelor polimerice s-a avut în vedere creșterea hidrofiliei rețelelor de poliglobalidă hidrofobe prin cuplarea tiol-enă polimer-polimer, în vederea obținerii unor biomateriale poroase, netoxice cu posibile aplicații ca dispozitive de transport și eliberare de medicamente.

PEG – diol – (Mw = 600 g∙mol-1) a fost achiziționat de la Sigma Aldrich.

Obținerea PEG-ului cu funcții tiolice s-a realizat prin procesul de policondensare a PEG-diol cu TMA în prezența trifluorometansulfonat de scandiu [Sc (OTf)3] drept catalizator foarte eficient și chemoselectiv.

Acidul tiomalic, de masă moleculară 150,15 g∙mol-1 (CAS 70-49-5, figura 5.3) a fost achiziționat de la Sigma Aldrich.

Figura 5.3. Structura chimică a Acid tiomalic

Scandium trifluorometansulfonat, [Sc (OTf)3], de masă moleculară 492,16 g∙mol-1 (CAS 144026-79-9, figura 5.4) a fost achiziționat de la Sigma Aldrich.

Figura 5.4. Structura chimică a trifluorometansulfonat de scandium

Chitosanul, polimer cationic, produsul N-deacetilat al chitinei obținut în condiții alcaline sau hidroliză enzimatică. Chitina este o amino-polizaharidă cristalină, liniară, care a fost descoperită în anul 1811, sursa sa principală de proveniență fiind carapacea crustaceelor, ciupercile, calamarii, scoicile, având o structură liniară alcătuită din unități 2-acetamido-2-deoxi-β-D-glucozamină legate în pozițiile 1-4. Chitina este insolubilă în apă, acizi, baze și o mare parte a solvenților organici, iar materiale obținute din chitină prezentând proprietăți originale cum ar fi biocompatibilitate, biodegradabilitate, netoxicitate, activitate antimicrobiană și imunogenitate scăzută, caracter hidrofil .

CS poate fi considerat o bază puternică, fiind insolubil în apă sau solvenți organici, în schimb prezintă solubililitate în soluții apoase de acizi diluați cu pH < 6 (cu pKa = 6,3) fapt datorat protonării grupelor aminice primare, moment în care apare respingerea între lanțurile macromoleculare încărcate pozitiv ceea ce permite moleculelor de apă să difuzeze și să dizolve polimerul. Creșterea pH-ului peste valoarea 6 conduce la deprotonarea grupelor amino și la pierderea caracterului său solubil. Denumirea de CS este atribuită chitinei, diferența dintre acestea fiind dată de gradul de deacetilare exprimat în procente molare care pentru chitosan este cuprins între 50 ÷ 100%. Figura 5.5, prezintă structura chimică , care atunci când valoarea lui m > 50% resturi D-glucozaminice, este atribuită chitosanului, iar când valoarea lui n > 50%, este atribuită chitinei. Proprietățile fizice ale chitosanului în soluție sunt strict dependente de masa moleculară, gradul de deacetilare și de distribuția grupelor N-acetil pe lanțurile polimerice , . Parametri precum gradul de deacetilare și cel de polimerizare sunt importanți, aceștia stabilind masa moleculară, comportamentul în soluție a chitosanului și implicit utilizarea acestuia în diverse aplicații .

Figura 5.5. Structura chimică a chitosanului

Proprietățile unice ale CS precum biocompatibilitate, biodegradabilitate, non-toxicitatea, bioactivitatea, îl recomandă pentru utilizarea în diverse domenii precum cel biotehnologic, biomedical, farmaceutic, cosmetic, mediu. Solubilitatea chitosanului în soluții slab acide, caracterul policationic și prezența grupărilor –NH2 – și – OH – în structura sa permit o multitudine de strategii de modificări chimice conducând la obținerea de derivați de chitosan cu noi proprietăți fizice sau biologice.

Literatura de specialitate prezintă diverse studii cu privire la utilizarea chitosanului diferit funcționalizat pentru realizarea de sisteme de transport, eliberare țintită de medicamente, gene, în ingineria tisulară, ca și vehicul de transport datorită formării complexelor ionice între acesta și medicamentele anionice sau ADN , , , .

În scopul îndeplinirii obiectivelor propuse s-a utilizat CS de masă moleculară mică cu gradul de deacetilare 81,5% (CAS 9012-76-4) achiziționate de la Sigma Aldrich.

Poli(etilen glicol) metacrilat (PEG-MA, figura 5.6) s-a utilizat pentru funcționalizarea chitosanului și a fost procurat de la firma Sigma Aldrich (CAS 25736-86-1, M= 500 g/mol). Scopul utilizării acestuia este de a crește solubilitatea chitosanului în mediu apos și/sau solvenți organici.

Figura 5.6. Structura chimică a poli(etilen glicol)metacrilat

Al doilea tip de PEG utilizat pentru modificarea chimică a chitosanului a fost poli(etlen glicol) metil eter acrilat (PEG-A, CAS 32171-39-4 , M= 480 g/mol Sigma Aldrich, figura 5.7)

Figura 5.7. Structura chimică a poli(etilen glicol) metil eter acrilat

Agenții de reticulare utilizați pentru prepararea MNP au fost:

Tripolifosfatul de sodiu, Na5P3O10 (CAS 7758-29-4, M= 367.86 g/mol Sigma Aldrich, figura 5.8)

Figura 5.8 Structura chimică a tripolifosfatul de sodiu

sulfatul de sodiu, Na2SO4 (CAS 7757-82-6, figura 5.9), cu rol de reticulant ionic, M = 142,04 g/mol furnizat de Lach-Ner via Chemical Company, Iași.

Figura 5.9 Structura chimică a sulfatului de sodiu

aldehida glutarică, AG (CAS: 111-30-8, figura 5.10 ), M = 100,117 g/mol, cu rol de reticulant

covalent, furnizată de Sigma Aldrich sub forma de soluție apoasă de concentrație 25%. Pentru utilizarea în cadrul emulsiei, aldehida glutarică a fost mai întâi extrasă în toluen.

Figura 5.10. Structura chimică a aldehidei glutarice.

Agenți tensioactivi:

Tween 80, C64H124O26 sau polisorbat 80 ( figura 5.11) este un polietilen sorbitol ester, surfactant neionic pentru fazele apoase, cu masa moleculară de 1310 g/mol și balanța hidrofil-lipofil (HLB) de 15.0, folosit în stabilizarea emulsiilor. În cazul sintezelor prezente a fost utilizat un produs Merck (Lot S5075387 831).

Figura 5.11. Structura chimică a Tween 80

Span 80, C7H11O6-R sau sorbitan monooleat (figura 5.12) reprezintă un agent de emulsifiere, dispersare și lubrifiere al fazelor organice cu valoarea HLB = 4,3, M = 428,68 g/mol și punctul de topire între 52-57 °C. În studiul prezent a fost utilizat un produs Merck (Lot S4992423 826).

Figura 5.12. Structura chimică a Span 80

Alți reactivi:

Acid 5,5'-ditio-bis- (2-nitrobenzoic) (DTNB, 99 %, CAS 69-78-3 , M= 396,35 g/mol, Sigma aldrich)

2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonă (DMPA, 99 %, CAS 24650-42-8, M=256,3 Sigma Aldrich)

Hidroxid de sodiu, NaOH (CAS 1310-73-2), M=40 g/mol, Lach-Ner.

Fosfat disodic, Na2HPO4·12H2O (CAS 10039-32-4), M=358,14 g/mol, Chemical Company.

Fosfat monosodic, NaH2PO4·2H2O (CAS 13472-35-0), M=156,02 g/mol, Chemical Company.

{5-Bromo-1-(2-deoxi-β-D-ribofuranozil)uracil},

{6-[[2-[[4-(2,4-Dicloro-fenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2 pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridincarbonitril}.

{2-[3-(6-Metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5-naftiridin}.

{7β-Acetoxi-8,13-epoxi-1α,6β,9α-trihidroxilabd-14-en-11-onă}.

Solvenți:

Apă distilată ultrapură Milli-Q.

Tetrahidrofuran ( CAS 109-99-9, M= 72.11 g/mol, Merck).

Diclormetan (CAS 75-09-2, M= 84.93 g/mol, Sigma Aldrich).

Dimetilsulfoxid (CAS 67-68-5, M=78.13 g/mol, Sigma Aldrich)

Dietil eter (CAS 60-29-7, M=74.12 g/mol, Sigma Aldrich)

Metanol (Lot CDF 02), M = 32,04 g/mol, Chemical Company.

Dimetilsulfoxid (CAS 67-68-5), M = 78,13 g/mol, Riedel-de Haen.

Acid acetic glacial (Nr. EC: 200-580-7), M=60,05 g/mol, Chemical Company.

Acetonă (Nr. EC: 200-662-2), M = 58,08 g/mol, Chemical Company.

Toluen (CAS 108-88-3, 92.14), M = 92,14 g/mol, Lach-Ner. În procesul de obținere a nanoparticulelor toluenul a constituit faza organică a emulsiei.

Hexan (Lot K38803574 822), M = 86,18 g/mol, Merck.

Substanțe biologic active:

Levofloxacin (CAS 100986854), M = 361,37 g/mol, Sigma Aldrich, figura 5.13), este un antibiotic din familia de medicamente fluorochinolone, utilizat în tratarea diferitelor boli infecțioase cu germeni grampozitivi și gramnegativi, inclusiv din sfera oculară. Structura chimică este dată în figura 4.20 de mai jos.

Figura 5.13. Structură chimică a levofloxacinului

Bevacizumab (25mg/ml, Avastin®, Genentech Inc) molecula – părinte al ranibizumab, un anticorp monoclonal – full-length, structura moleculei de Bevacizumab este prezentată in figura 5.14.

Figura 5.14. Model structural al bevacizumabului

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), Ser fetal bovin, (Gibco, ThermoFisher Scientific, Bratislava, Slovakia).

streptomicină, penicilină și L-glutamină (Gibco, ThermoFisher Scientific, Bratislava, Slovakia).

Bromură de 3- (4,5-dimetil imidazol-2-il) -2,5-difeniltetrazoliu (MTT, Calbiochem)

Dulbecco’s soluție fosfat buffer, Sigma Aldrich.

Fibroblastele 3T3 murine au fost achiziționate de la DSMZ (Braunschweig, Germany).

Celulele endoteliale retiniene de iepure în laboratoarele departamentului de Bioinginerie al Facultății de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa, Iași

Celulele stem induse au fost obținute din fibroblastele adulte de iepure în laboratoarele departamentului de Bioinginerie al Facultății de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa, Iași.

Ser fetal bovin, Sigma Aldrich.

Soluție salină.

soluție tampon salină Hank (HBSS).

Probe de sânge uman donate de un voluntar nefumător sănătos.

5.2. Tehnici de sinteză/obținere

În ultima vreme poliesterii au beneficiat de o atenție deosebită datorită posibilității utilizării într-o serie de aplicații biomedicale, cercetările cheie fiind focalizate în special pe folosirea acestora ca vehicule de transport de principii biologic active degradabile, sau în ingineria tisulară .

Proprietățile materialelor pe bază de poliesteri sunt remarcabile și includ biodegradabilitatea excelentă, biocompatibilitatea și netoxicitatea. În plus, utilizarea poliesterilor ca biomateriale devine o alegere potrivită pentru prepararea produselor biocompatibile degradabile. Poliesterii alifatici pot fi sintetizați: prin procedeu de policondensare, sau polimerizarea prin deschidere de ciclu a esterilor ciclici (lactone) .

Cele mai multe studii au fost orientate spre ce-a de-a doua metodă datorită faptului că poliesterii rezultați prezintă stabilitate ridicată în ceea ce privește masa moleculară, polidispersitatea și structura, în condiții blânde de reacție. O varietate de sisteme catalitice au fost raportate pentru amorsarea polimerizării prin deschidere de ciclu a esterilor ciclici, inclusiv catalizatori organometalici, organici și enzimatici , , .

5.2.1. Sinteza poliglobalidei (PGL)

Procedeul de sinteza utilizat în obținerea poliglobalidei a avut la bază polimerizarea prin deschidere de ciclu pe cale enzimatică a monomerului de globalidă polimerul fiind preparat conform unui protocol raportat anterior , , .

Astfel, 5,0 g (21 mmol) globalidă împreună cu 0,11 g enzimă (Lipază) au fost adăugate într-un balon cu fund rotund de 25 ml, purjat cu argon timp de 10 minute. Apoi, balonul a fost imersat într-o baie de ulei încălzită în prealabil la 600 C, timp de 4 ore. După scurgerea timpului menționat vâscozitatea amestecului de reacție a crescut, confirmând finalizarea reacției. Tetrahidrofuran a fost adăugat peste amestecul de reacție în vederea solubilizării polimerului și stopării activității enzimei. După îndepărtarea enzimei prin centrifugare, soluția de polimer a fost precipitată și spalată repetat în metanol rece. Polimerul obținut a fost separat prin centrifugare și uscat la temperatura camerei în vid, până la atingerea unei greutăți constante. Randamentul final al reacției a fost de 74 %.

5.2.2. Sinteza copolimerului poli(etilenglicol-co-tiomaleat) (PEG-SH)

Copolimerul poli(etilen glicol-co-tiomaleat) a fost preparat conform unui protocol raportat anterior . PEG-SH a fost sintetizat prin policondensare, în masă, în prezența catalizatorului Scandium trifluorometansulfonat, [Sc(OTf)3], la temperatură moderată (1000 C) și presiune redusă. Pe scurt, 20 g (33 mmol) de poli(etilen glicol) diol; 5,0 g (33 mmol) acid tiomalic și 0,16 g (0,33 mmol) [Sc (OTf)3], au fost adăugate întru-un balon cu fund rotund de 100 ml de tip Amber. Apoi, balonul a fost imersat într-o baie de ulei încălzită în prealabil la 800 C, amestecul de reacție fiind menținut în atmosferă inertă de argon sub agitare energică timp de 30 minute până când acesta a devenit transparent. Reacția de policondensare a avut loc timp de 24 ore, la temperatura de 1000 C și la presiune redusă, după finalizarea reacției polimerul obținut a fost solubilizat în diclormetan. În final, volumul de reacție a fost precipitat în dietil eter rece, produsul solid fiind spălat în repetate rânduri cu dietil eter. Polimerul separat a fost uscat timp de 48 ore sub vid până la pond constant. Randamentul final al reacției a fost de 85%.

5.2.3. Sinteza rețelelor polimerice pe bază de PGL și PEG-SH prin reacția de tip adiție tiol-enă

Rețelele polimerice pe bază de poliglobalidă au fost preparate prin reacția de adiție tiol-enă radicalică fotoinițiată dintre PGL și PEG-SH. Materiale pe bază de poliglobalidă cu diferite concentrații (5 %, 10%, 20 %) și rapoarte molare (SH/C=C) au fost preparate prin amestecarea a diferite cantități de polimeri (PEG-SH și PGL) într-un volum de 2,4 ml tetrahidrofuran, în sticluțe de sticlă cu capac. Ulterior, o cantitate calculată (tabel 3.9) de fotoinițiator 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonă (DMPA în funcție de cantitatea totală a amestecului de polimeri) a fost dizolvată în tetrahidrofuran și adăugată în soluția de polimeri, după care amestecul de reacție a fost omogenizat bine cu un Vortex. Concentrația fotoinițiatorului a fost menținută la valoarea de 0,5 % masic față de cantitatea totală de polimeri, pe tot parcursul studiului. Reacțiile de adiție tiol-enă au fost fotoinițiate de o lampă de mercur cu presiune medie Spectramat (Ivoclar AG, Liechtenstein, cu un filtru de sticlă λ = 350−550 nm) cu o intensitate a luminii de 65 mW·cm-2. Intensitatea luminii din poziția probei a fost măsurată cu un aparat Nova Meter Assy de la OPHIR (Israel). Reacția a avut loc prin expunere la lumină UV timp de 25 de minute. După scurgerea timpului menționat s-au obținut geluri transparente. În vederea stabilirii punctului de gelifiere, fiecare probă a fost expusă luminii UV, iar punctul de gelifiere a fost determinat visual conform metodei inversiei tubului, prin întoarcerea flacoanelor de sticlă cu capul în jos și observând modificarea vâzcozității soluției. Pentru înregistrarea timpului de gelifiere a fost folosite un cronometru.

Purificarea probelor a fost realizată în două etape și anume:

în prima etapă probele au fost imersate în THF (20:1 vol/vol) și menținute sub agitare continuă timp de 24 ore, solventul fiind schimbat de două ori în această perioadă, ulterior acestea au fost uscate peste noapte sub vid la temperatura de 500 C;

a doua etapă de purificare a constat în spălarea cu apă a probelor (80:1 vol/vol) timp de 7 zile, apa fiind schimbată la un interval 8 ore zilnic, iar în final probele fiind liofilizate.

Cantitatea de gel recuperat după etapele de purificare au fost calculate cu ecuația (3.1). Fiecare material a fost testat în trei determinări identice.

(5.1)

Unde:

mf – masa gelului în stare uscată după purificare,

mi – masa inițială a cantității totale de polimeri

Ulterior, etapei de purificare probele au fost luate în considerare pentru caracterizare : randamentul reacției, titrarea gupelor SH cu ajutorul tesutului Ellman's, FT-IR, analiza elementală a conținutului de sulf, morfologie – SEM, comportamentul la umflare, citotoxicitate și capacitate de includere și eliberare a principiilor biologic active.

5.2.4. Funcționalizarea chitosanului prin metoda de grefare cu metacrilat de poli(etilen glicol)

Funcționalizarea chitosanului cu metacrilat de poli(etilen glicol) (CS-g-PEG-MA) a fost realizată conform unui protocol raportat anterior de Ma și colaboratorii săi. Sinteza derivatului de chitosan avut la bază reacția de tip adiție Michael .

Pe scurt, 8,0 g chitosan a fost dizolvat într-un volum de 800 ml soluție de acid acetic 1% într-un balon de reacție cu fund rotund de 250 ml echipat cu un condensator de reflux. Balonul cu amestecul de reacție a fost imersat într-o baie de apă încălzită în prealabil la 40° C, amestecul de reacție a fost purjat cu azot și menținut sub agitare continuă timp de 60 de minute. Ulterior, s-a adăugat în picături 24 ml poli(etilen glicol) metacrilat, corespunzător unui raport molar final de NH2/PEG = 1/2. Reacția de adiție Michael a decurs timp de 24 ore, sub agitare continuă la 60 ° C, sub atmosferă de azot. În final, soluția de polimer obținută a fost filtrată prin centrifugare, tranvazată la rotavapor, ulterior fiind precipitată în acetonă pentru a elimina urmele de apă, a concentra soluția de polimer, și pentru a elimina PEG-MA nereacționat. Polimerul astfel obținut, a fost purificat prin spălari repetate (2-3 ori) cu metanol și acetonă, eliminarea produșilor nedoriți fiind realizată prin centrifugare (5000 rpm, timp de 5 minute). Produsul final a fost uscat la etuva cu vid timp de 48 de ore, până la greutate constantă. S-a obținut un polimer de culoare maroniu deschis.

5.2.5. Funcționalizarea chitosanului prin metoda de grefare cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat

Modificarea chimică a chitosanului de poli(etilen glicol) metil eter acrilat (CS-g-PEG-A) a fost realizată conform unui protocolul prezentat în studiul realizat de Han și colaboratorii săi. Sinteza derivatului de chitosan avut la bază reacția de tip adiție Michael .

Modul de lucru este următorul: 6,0 g chitosan de masă moleculară mică a fost dizolvat într-un volum de 300 ml soluție de acid acetic 1%, într-un balon de reacție cu fund rotund de 500 ml. Balonul cu amestecul de reacție a fost imersat într-o baie de apă încălzită în prealabil la 50° C, iar soluția de chitosan a fost purjată cu azot și menținută sub agitare continuă timp de 30 de minute. Ulterior, s-a adăugat în picături un volum adecvat de CS-g-PEG-A, corespunzător unor rapoarte molare finale de NH2/PEG-A – 1/0,75; 1/1; 1/1,5; 1/4. Reacția a decurs timp de 48 ore, sub agitare continuă la 50° C, sub atmosferă de azot. După finalizarea reacției, pH-ul soluției de polimer obținută a fost adus la valoarea pH=8 cu o soluție saturată de NaHCO3. Ulterior, soluția de polimer a fost precipitată în acetonă pentru a elimina urmele de apă, a concentra soluția de polimer, precum și pentru a elimina PEG-A nereacționat. Polimerul astfel obținut, a fost spălat de 2-3 ori cu acetonă, eliminarea produșilor nedoriți fiind realizată prin centrifugare (5000 rpm, timp de 5 minute). Produsul final a fost purificat prin dializă cu apă bidistilată timp de 3 zile pentru îndepărtarea PEG nereacționat. Polimerul a fost izolat prin liofilizare.

5.2.6. Prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de CS-g-poli(etilen glicol) metacrilat / metil eter acrilat prin dublă reticulare în emulsie inversă

Prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de (CS-g-PEG-MA sau CS-g-PEG-A) s-a realizat prin procedeul dublei reticulări (ionică și covalentă) într-un sistem de emulsie de tip apă în ulei (w/o) , , . Această tehnică a fost selecționată în principal datorită necesității obținerii unui sistem cu o toxicitate redusă, condiție obligatorie având în vedere scopul final al micro/nanoaprticulelor și anume utilizarea în domeniul biomedical cu scopul tratării unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului. Sistemul de emulsie tip apă în ulei este eterogen și a decurs prin realizarea fazelor componente ale emulsiei urmată de emulsionarea lor:

faza apoasă, formată din soluția acidă de CS-g-PEG-MA sau CS-g-PEG-MA, filtrată prin centrifugare și apoi stabilizată prin intermediul surfactantului Tween 80.

faza organică, reprezentată de un solvent (toluen) în care a fost adaugat un tensioactiv (Span 80), pentru a elimina riscul coalescenței particulelor.

Emulsionarea celor două faze prin agitare energică (la ultraturax)

Caracteristicile fundamentale ale procedeului de dublă reticulare care au stat la baza selecției metodei sunt următoarele:

reticularea ionică, acesta fiind majoritară (80 %), a grupelor aminice ale derivatului de chitosan, care pot fi cuaternizate în medii ușor acide facilitând reticularea cu polianioni (tripolifosfat) Na5P3O10 sau ioni de sulfat Na2SO4, conducând la obținerea de micro/nanoparticule sferice în condiții de agitare la turații mari (15.000 rpm)

reticularea covalentă realizată cu aldehidă glutarică, care are ca scop menținerea stabilității mecanice și dimensionale a rețelei interconectate/interpenetrate formate. Cantitatea mică de aldehidă glutarică pentru acest studiu a fost stabilită în așa fel încât aceasta să reacționeze cu 20 % din grupele aminice ale amestecului.

Procesul de obținere propriu-zis, a decurs astfel. Mai întâi s-a realizat prepararea fazei apoase formată din 50 ml soluție de CS-g-PEG-MA sau CS-g-PEG-A (de concentrații prestabilite), în acid acetic 1% în care a fost adaugată o cantitate necesară calculată de surfactant (Tween80, 2 %). Soluția de polimer fost adăugată sub formă de picături cu ajutorul unei seringi, în faza organică constituită din 200 mL toluen și o cantitate adecvată de surfactant Span 80 (2 %), sub agitarea constantă a ultraturaxului. După scurgerea timpului de stabilizare a emulsiei (15 minute) a fost picurată soluția de reticulant ionic (soluție de Na5P3O10 sau Na2SO4 , de concentrație 5%), emulsia fiind ulterior transvazată într-un reactor prevăzut cu agitator mecanic de tip ancoră (500 rpm) unde a continuat procesul de reticulare ionică. După un timp prestabilit, soluția de reticulant covalent, aldehidă glutarică (AG) extrasă în toluen (c = 1,12 mg/mL) a fost adăugată în picături în vasul de reacție pentru desăvârșirea procesului de reticulare. După definitivarea acestui proces, micro/nanoparticulele obținute au fost separate din emulsie prin centrifugare la 5000 rpm timp de 1 oră. Particulele decantate au fost supuse unei purificării prin spălarea în cicluri repetate cu apă bidistilată, acetonă și hexan pentru îndepărtarea surfactanților și a excesului de reticulanți. În final particulele obținute au fost uscate la temperatura camerei.

După etapa de purificare micro/nanoparticulele au fost supuse caracterizării, și anume: diametrul și polidispersitate; morfologie; comportament de umflare, încărcare și eliberare de medicament, potențial Zeta, hemocompatibilitate, test de toxicitate și citotoxicitate.

5.3. Metode de caracterizare

5.3.1. Caracterizarea structurală

5.3.1.1. Spectroscopia în Infraroșu cu Transformată Fourier și Raman

Aceste tehnici de analiză structurală sunt untilizate pentru înregistrarea benzilor de absorbție ale radiațiilor infraroșii care duc la identificarea compușilor moleculari și a structurilor acestora. Spectrele FT-IR reprezintă absorbția energiei radiante din domeniul IR de către molecule, în funcție de lungimea de undă sau de frecvența radiației. În cadrul studiului prezent s-a dorit evidențierea legăturilor nou formate în cazul polimerilor obținuți (PGL, PEG-SH, CS-g-PEG-MA și CS-g-PEG-A) utilizați pentru obținerea de rețele polimere, în cazul derivaților de chitosan obținuți precum și a reticulărilor ionice și covalente din structura micro/nanoparticulelor.

În acest scop s-au utilizat două spectrometre (Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA, și IRAffinity-1S Shimadzu, JPN, figura 5.15), prin tehnica pastilării cu KBr pentru înregistrarea spectrelor FT-IR, iar spectrele de spectroscopie FT-Raman au fost obținute folosind un microscop Renishaw inVia Raman. Sistemele sunt proiectate cu o interfață simplă, calculator USB, diagnosticare avansată, și protocoale de certificare și validare. Obținerea pastilelor în bromură de potasiu s-a realizat prin mojararea probelor sub formă de pudră (20 mg) cu KBr anhidră, amestecul rezultat fiind presat cu ajutorul unei prese hidraulice.

Pentru fiecare probă au fost realizate mai multe scanări în domeniul 4000 – 600 cm-1, cu o rezoluție de 4 cm-1. Benzile evidențiate în spectrul de absorbție au fost atribuite unor grupe funcționale corespunzătoare prezente în proba analizată.

Figura 5.15. Spectrofotometru a) Nicolet 6700; b) IRAffinity-1S

5.3.1.2. Rezonanța magnetică nucleară

O altă tehnică de caracterizare care pune în evidență legăturile nou formate în cazul polimerilor sintetizați (PGL, PEG-SH) și a derivaților de chitosan (CS-g-PEG-MA; CS-g-PEG-A) obținuți este spectroscopia RMN. Spectrele compușilor au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrometru Bruker Avance DRX 400 MHz (figura 5.16), la 85 °C, în DMSO sau D2O ca solvent în care au fost adăugate câteva picături de HCl 1M (până la pH = 2 ÷ 4) în cazul derivaților de chitosan, respectiv spectrometru RMN Varian 400 MHz VNMRS echipat cu 5 mm 1 H-19F/15N-31P PFG AutoX DB NB în CDCl3 ca solvent în cazul polimerilor PGL și PEG-SH, referința internă fiind tetrametilsilanul. A fost efectuat un număr de 64 de scanări cu timpul de latență de 5 secunde. Semnalele obtinute au fost raportate în părți per milion. Concentrația compușilor a fost de 10 mg/mL. Spectrometria RMN a fost utilizată, de asemenea, pentru determinarea gradului de substituție al chitosanului și de polimerizre al poliglobalidei.

Figura 5.16. Spectrometru Bruker Avance DRX 400 MHz

5.3.1.3. Cromatografia pe gel permeabil

Cromatografia de permeație prin gel este o tehnică analitică ce are ca scop măsurarea unor proporții relative ale componentelor amestecului. Masa moleculară și polidispersitatea polimerilor au fost estimate prin cromatografie de permeație pe gel (GPC), utilizând două aparate Agilent 1200 Infinity Series (figura 5.17) și Shimadzu, ambele echipate cu software de control GPC și o pompă Waters 515, două coloane PPS SDV 5 mm (d ¼ 8 mm, l ¼ 300 mm, 500 Å + 105 Å) și un detector diferențial de refracție Waters 410, cu THF ca eluant la debitul de 1,0 ml/min. Standardele de polistiren au fost utilizate pentru calibrare. Anisolul a fost utilizat ca standard intern pentru a corecta orice fluctuație a debitului de THF .

Figura 5.17. Cromatograful de permeație pe gel Agilent 1200 Infinity Series

5.3.1.4. Spectrometria de masă

Spectrometria de masă (MS) reprezintă o tehnică de investigare cu aplicații în chimia analitică, pentru determinarea maselor atomice și moleculare, a compoziției izotopice a elementelor; sau pentru identificarea compușilor organici. Spectrele de masă constituie reprezentarea bidimensională a abundențelor individuale ale fragmentelor moleculare ionice generate în procesul de ionizare în funcție de rapoartele masă/sarcină corespunzătoare (m/z). Fragmentele ionice sunt produse în etapa de ionizare a unei probe ce poate reprezenta un compus pur sau un amestec de componenți individuali.

Analiza de ionizare prin desorbție laser asistată de o matrice (MALDI) a fost realizată utilizând un instrument UltrafleXtreme TOF (Bruker, figura 5.18) echipat cu un laser de 358 nm fascicul inteligent-2, capabil să pulseze frecvența de 1 kHz. Spectrometrul de masă a fost operat de software-ul FlexControl 3.3 (Bruker). Probele de polimer au fost dizolvate în THF la o concentrație de 10 mg/ml. Probele au fost amestecate cu o soluție de matrice (10 mg/ml de 1,8,9-antracenetriol-ditranol în THF) la un raport de 1/100 (vol /vol). 1 µl din acest amestec au fost depuse pe un suport din oțel lustruit de tip MALDI (Bruker). Ulterior, spectrele dobândite au fost prelucrate cu ajutorul software-ul Flex Analysis 3.3 (Bruker). Puterea laserului de ionizare a fost ajustată chiar deasupra pragului pentru a produce specii încărcate. Spectrele de masă au fost colectate în cantitate de peste 10000 de spectre.

Figura 5.18. Spectrometrul de masă UltrafleXtreme TOF (Bruker)

5.3.1.5. Analiza elementală

Cantitatea de sulf (% de greutate) din probele sintetizate a fost determinată utilizând analizorul elementar FLASH 2000 organic (CHNS-O) de la Thermo Fisher Scientific. Au fost efectuate câte trei determinări diferite pentru fiecare probă.

5.3.1.6. Spectofotometria UV-Vis. Testul Ellman’s

Pentru a evalua eficiența procesului de reticulare, s-a efectuat o analiză a conținutului de grupări tiolice reziduale din toate probele preparate prin analiza colorimetrică a sulfhidrilului folosind reactivul Ellman's – acid 5,5'-ditio-bis- (2-nitrobenzoic) (DTNB) , .

Reactivul Ellman's este foarte util pentru testarea grupelor sulfhidril datorită particularității sale pentru grupările (-SH) la pH neutru, coeficientul de extincție molar ridicat și timpul scurt de reacție. Reactivul reacționează selectiv cu grupele tiol care formează un produs colorat în galben, acidul 5-tio-2-nitrobenzoic (TNB2-), care prezintă o absorbție ridicată la lungimea de undă de 412 nm. Intensitatea absorbanței la 412 nm crește proporțional cu numărul de grupări tiol, astfel analiza UV-Vis a TNB2- permite determinarea grupărilor tiol disponibile în funcție de o curba de calibrare. Pentru a cuantifica grupările tiol disponibile după purificarea gelurilor, s-a utilizat următoarea procedură: Soluția reactivului Ellman's a fost preparată prin dizolvarea a 4 mg DTNB într-un volum de 1 ml de tampon fosfat de sodiu (PBS, pH=8). S-au introdus 1-3 mg de probă într-o fiolă, peste care s-a adăugat 1 ml de tampon fosfat de sodiu 0,5 M (PBS) la pH = 8 și a fost lăsată la hidratat (umflat) un anumit timp specific (1 oră), la întuneric. După 60 de minute, s-au adăugat 950 µL de PBS și 0,05 ml de reactiv Ellman's. Ulterior, probele au fost incubate timp de 30 de minute în întuneric, la temperatura camerei. După scurgerea timpului menționat proba a fost înlăturată prin centrifugare (5 min/15.000 rpm), iar 7,5 µL din lichidul supernatant au fost transferați pe o placă de microtitrare și s-a măsurat absorbanța la 412 nm cu ajutorul apartului UV–Vis NanoDrop ND-1000 (figura 5.19). Cantitatea de grupări tiol libere a fost calculată pornind de la o curbă standard (figura 5.20) conformă obținută prin analiza UV-Vis a unor soluții de acid tiomalic de concentrații diferite. Cantitatea de grupări tiol libere a fost calculată utilizând ecuația curbei de etalonare (5.2).

Figura 5.19. Spectrofotometrul UV–Vis NanoDrop ND-1000

(5.2)

Figura 5.20. Curba de calibrare a acidului tiomalic

5.3.2. Caracterizarea termică

5.3.2.1. Analiza termogravimetrică -TGA

Analiza termogravimetrică a chitosanului precum și derivatului său (CS-g-PEG-MA) s-a realizat cu ajutorul unui sistem Mettler Toledo TGA/SDTA 851 (figura 5.21). Analiza a constat în monitorizarea pierderilor de masă în procesul destructiv odata cu cresterea temperaturii. Determinările au fost realizate pe intervalul 25 °C – 800 °C cu o viteza de încalzire de 10 °C/min, în atmosferă inertă (N2). Masa inițială a probelor a fost de 2-5 mg.

Figura 5.21. Termogravimetru Mettler Toledo modelul TGA / SDTA 851

5.3.2.2. Analiza calorimetrică prin scanare diferențială (DSC)

Analiza de calorimetrie prin scanare diferențială reprezintă o tehnică termoanalitică, prin cae se realizeză studiul efectelor termice (conversia temperaturii și a entalpiei pentru solide si lichide) survenite în urma tranzițiilor de fază (topire, sticlă, descompuneri exotermice). Analiza DSC a chitosanului, CS-g-PEG-MA și a nanoparticulelor fost realizată cu ajutorul calorimetrului cu scanare diferentială Model Q20 (Q Series™-DSC, figura 5.22). Determinările au fost realizate pe intervalul 25 °C – 300 °C în atmosferă inertă (N2). Masa inițială a probelor a fost de 2-5 mg.

Figura 5.22. Calorimetru cu Scanare Diferentială, Model Q20 (Q Series™ – DSC)

5.3.3. Caracterizare morfologică

5.3.3.1. Microscopie electronică de baleiaj

Caracteristicile morfologice atât ale suprafeței și secțiunii materialelor ale materialelor pe bază de poliglobalidă, precum și dimensiunea, forma sau polidispersitatea micro/nanoparticulelor obținute au fost investigate prin microscopia electronică de baleiaj (SEM). Microfotografiile SEM au fost înregistrate cu ajutorul unui microscop electronic de baleiaj HITACHI SU 1510, Japonia (figura 5.23). Analiza probelor a presupus o etapă de depunere a probelor uscate pe un suport de aluminiu, urmată de metalizarea cu un strat de aur de grosime 6 – 7 nm, utilizând un dispozitiv de pulverizare catodică Cressington 108 înainte de observare.

Figura 5.23. Microscopul electronic de baleiaj HITACHI SU 1510

5.3.3.2. Analiza dimensională a particulelor prin difractometrie laser

Diametrul mediu al micro/nanoparticulelor obținute și distribuția dimensională a acestora a fost analizată prin tehnica difractometriei cu rază laser utilizând difractometrul SHIMADZU-SALD 7001 (figura 5.24). În vederea obținerii valorilor diametrului mediu apropiate de cele în stare uscată, măsurătorile au fost efectuate pe suspensii ale particulelor într-un non-solvent (acetonă), evitânde-se astfel umflarea. Apoi, suspensiile de particule au fost supuse sonicării pe o baie de sonicare Bandeli Sonorex timp de 10 minute la temperature camerei, urmată de introducerea acestora în cuva de cuarț a difractometrului.Pe parcursul deteminărilor acuratețea rezultatelor a fost asigurată prin intermediul sistemului propriu de agitare al aparatului, care menține particulele în suspensie fără ca acestea să se depună pe toată durata măsurătorilor precum și efectuarea mai multor determinări consecutive. Pentru fiecare probă au fost realizate câte 3 determinări consecutive.

Difractometrul este conectat la calculator, iar softul aparatului (WING – SALD) permite afișarea în timp real a datelor în ceea ce privește distribuția-dispersiei particulelor din probă.

Figura 5.24. Difractometru Laser SHIMADZU – SALD 7001

Analizorul utilizează difracția laser violetă mărind astfel acuratețea și rezoluția pentru analiza particulelor sub-micronice și oferă o înaltă performanță pentru analiza distribuției particulelor pe un domeniu de la 0,015 μm la 500 μm. Diferențele de distribuție dimensională pot fi comparate prin suprapunerea a maxim 12 grafice de probe. Semnalele luminoase captează unghiuri de difuzie foarte diferite; senzorul WING are calitatea de a detecta până la 60 de unghiuri de difuzie, ceea ce asigură o măsurare fidelă a rezoluției determinărilor pentru particulele foarte mici, submicronice. Graficele afișează suprapunerea zonelor de distribuție a intensității luminii difuze.

5.3.4. Studii reologice

Proprietățile vâscoelastice ale gelurilor au fost evaluate în triplicat prin utilizarea unui reometru compact Anton Paar MCR 502 (Anton Paar, Austria, figura 5.25) echipat cu un accesoriu UV original (Anton Paar, Austria), inclusiv o lampă UV care funcționează la 365 nm și o intensitate de 12,5 mW·cm-2. Pentru a evalua cinetica în timpul reacțiilor de reticulare, modulele vâscoelastice, cum ar fi modulul de depozitare (G ') și modulul de pierdere (G ") au fost monitorizate on-line în timpul procesului de reticulare. Măsurătorile au fost efectuate în regiunea vâscoelastică liniară atunci când deformația a fost de 1% , frecvența de 1 Hz și temperatura de 23° C în toate cazurile. Volumul total al reacției a fost adaptat pentru a corespunde măsurătorilor după cum urmează: pentru fiecare măsurătoare 250 μL de soluție THF conținând amestecuri de polimeri compuși din PEG-SH și PGL cu concentrații diferite de polimeri (5%, 10%, 20%, 40% și fotoinitiator DMPA în cantități calculate în funcție de conținutul de polimeri. Probele au fost bine omogenizate și introduse în celula de măsurare. În timpul măsurătorilor, picături mici de THF au fost plasate în jurul celulei de măsurare acoperite cu un inel de protecție pentru a asigura atmosfera saturată cu solvent, și pentru a evita evaporarea solventului în timpul reacțiilor dependente de timp.

Figura 5.25. Reometrul compact Anton Paar MCR 502

5.3.5. Proprietăți fizico-chimice

5.3.5.1. Analiza comportamentului la umflare

Studiile privind comportamentul la umflare a gelurilor și micro/nanoparticulelor au fost efectuate prin metoda gravimetrică în apă bidistilată sau THF pentru geluri, și mediu ușor alcalin (pH=7,4) sau acid (pH=3,4) în cazul micro/nanoparticulelor. Aceste determinări au fost realizate în vederea anticipării comportamentului acestora în procesul de includere/eliberare a substanțelor active. Gradul de umflare a fost măsurat la timpi prestabiliți, rezultatele reprezentând media aritmetică a trei determinări diferite. Probele liofilizate au fost cântărite și apoi imersate în fiole care au conținut un exces de apă, PBS, ABS sau THF, la temperatura camerei sub disperie mecanică. După anumiți timpi prestabiliți probele au fost îndepărtate din mediul de analiză, au fost centrifugate (15000 rpm) și cântărite după îndepărtarea supernatantului. Procesul de umflare a fost monitorizat la intervale de timp diferite până când echilibrul a fost atins. Gradul de umflare a fost determinat folosind ecuația (5.3):

(5.3)

Unde:

m1 – reprezintă greutatea probei umflate.

m0 – reprezintă greutatea probei uscate.

5.3.5.2. Capacitatea de includere a principiilor active

Procesul de includere a principiilor biologic active în sistemele pe bază de poliglobalidă și în micro/nanoparticule s-a realizat prin mecanismul difuzional al acestora din soluția în care au fost imersate. Materialele pe bază de poliglobalidă au fost încărcate cu levofloxacin ca model de medicament. Micro/nanoparticulele obținute pe bază de chitosan modificat cu poli(etilen glicol) metacrilat au fost încarcate cu bevacizumab (medicament părinte al ranibizumab) și levofloxacin (antibiotic cu spectru larg de acțiune împotriva infecțiilor bacteriene) ca model de medicament, iar sistemul de micro/nanoparticule pe bază de chitosan funcționalizat cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat au fost încărcate cu levofloxacin ca și model de medicament.

Pentru evaluarea cineticii de încărcare a medicamentele model, cantități determinate de geluri sau particule (0,03 g) au fost suspendate în 1 ml de soluție de medicament de concentrație cunoscută (25-30 mg/ml). Supensiile au fost apoi menținute sub agitare continuă la temperatura de 370 C timp de 48-72 ore. După scurgerea timpului menționat s-a realizat separarea probelor prin ultracentrifugare (15,000 rpm) timp de 5 minute în vederea separării acestora de supernatant, apoi acestea au fost uscate prin procesul de liofilizare. Pentru determinarea cantității de medicament încapsulat au fost prelevate probe din supernatant care au fost supuse analizei spectrofotometrice UV-Vis la lungimile de undă specifice absorbanței maxime a fiecărui medicament ( Bevacizumab 272 nm; Levofloxacin 287 nm). Pentru analiza absorbanței s-a utilizat spectrofotometrul UV-Vis NanoDrop ND-1000. Pentru modelele de medicament utilizate au fost realizate în prealabil curbele de calibrare (figura 5.26). BEV este un medicament model parinte a ranibizumab, un anticorp monoclonal, iar LEV este un antibiotic cu spectru larg de acțiune împotriva infecțiilor bacteriene.

Ecuațiile curbelor de etalonare ale principiilor active au fost următoarele:

în cazul BEV: λ = 272 nm;

(5.4)

în cazul LEV în ABS pH=3,3: λ = 287 nm;

(5.5)

Figura 5.26. (a) Curba de calibrarea a Bevacizumab în apă; (b) curba de calibrare a LEV în tampon acetat, pH = 3,3

5.3.5.3. Capacitatea de eliberare a principiilor active

Procesul de eliberare a principiilor biologic active model din sistemele pe bază de poliglobalidă și din sistemele micro/nanoparticulate a fost studiat prin difuzie în două medii de pH diferit. Pentru materialele pe bază de poliglobalidă a căror aplicație vizează transportul de medicamente la nivel tisular, s-a studiat procesul de eliberare în mediu de pH= 5,5. Pentru celelalte două sisteme micro/nanoparticulate care vizează afecțiunilor segmentului posterior al ochiului, s-a studiat modul de eliberare a medicamentului în pH = 7,4, similar pH-ului sângelui.

Pentru evaluarea cineticii de eliberare a medicamentului, cantități determinate de probe (0,03 g) au fost imersate în soluții de tampon acetat de pH= 5,5 sau tampon fosfat pH= 7,4, și au fost menținute sub agitare continuă la temperatura de 370 C, iar la anumiți timpi prestabiliți probele au fost ultracentrifugate pentru determinarea cantității de medicament eliberat în supernatant pe baza curbelor de calibrarea pregătite anterior la lungimile de undă maxime ale medicamentelor utilizând spectrofotometrul UV-Vis NanoDrop ND-1000.

5.3.5.4. Capacitatea de eliberare a bevacizumabului ex vivo

Studiul cineticii eliberării bevacizumabului în condiții cât mai asemănătoare cu cele in vivo, s-a realizat cu dispozitivul Franz Cell (figura 5.27). Acest dispozitiv reprezintă un sistem realizat din sticlă, cu ajutorul căruia se poate studia difuzia medicamentelor prin porii unei membrane. Compartimentul receptor al dispozitivului poate avea volume cuprinse între 5 și 20 ml. Difuzia principiilor biologic active prin membrana dispozitivului, în cazul nostru fiind cornee bovină, permite analiza penetrabilității membranei de către medicamentul model. Suspensia de particule încărcate cu medicament este plasată în compartimentul donor, iar în timp medicamentul eliberat traversează membrana concentrându-se în compartimentul receptor al dispozitivului. După anumiți timpi prestabiliți sunt prelevate volume de soluție cunoscute (5 µl) care sunt supuse analizei spectrofotometrice pe baza unei curbe realizate, anterior. Analiza cineticii de eliberare a bevacizumabului a fost realizată în tampon fosfat.

Figura 5.27. Franz Cell.

5.3.5.5. Potențialul zeta

Potențialul Zeta (ξ) este o măsură a mărimii electrostatice sau de repulsie/atracție a încărcăturii între particule și este unul dintre parametrii fundamentali cunoscuți că afectează stabilitatea. Potențialul Zeta (ξ) al suspensiilor apoase de micro/nanoparticule a fost determinat cu ajutorul sistemului BEKMAN COULTER – DelsaTM Nano Common (figura 5.28). Determinările s-au efectuat prin suspendarea unei cantități de particule în soluții de electrolit de 0,1 mM KCl pentru a determina comportamentul acestora în soluție de electrolit de tărie ionică constantă. În mod normal, valorile potențialului zeta sunt considerate ca valori ale stabilității coloidale ale materialului analizat, între ±25 și ±30 mV, datorită forțelor de respingere ridicate între particule.

Figura 5.28. Sistemul BEKMAN COULTER – DelsaTM Nano Common

5.3.6. Caracteristici de biomaterial

5.3.6.1. Citotoxicitate

Cultivarea celulelor

Fibroblastele 3T3 murine au fost cultivate într-un mediu DMEM cu creștere completă suplimentat cu FBS, L-glutamină (2 mM), streptomicină (100 µg / ml) și penicilină (100 IU / ml) 10% umiditate la 37 ° C, 5% CO2.

Analiza MTT

Celulele la concentrație de 5000 celule pe godeu au fost însămânțate în plăci de cultură de țesut cu 96 de godeuri și au fost cultivate peste noapte. Toate gelurile au fost sterilizate sub lumină ultravioletă (UV) timp de 30 de minute într-un flux laminar și spălate cu 1 ml de mediu de cultură steril înainte de extracție. Extractele din gel (n=3) au fost preparate prin extracția de 0,1 g de material la 1 ml mediu de creștere celulară la 37 ° C, conform ISO 10993-12: 2012.

S-a evaluat, de asemenea, citotoxicitatea polimerilor PGL și PEG-SH. Citotoxicitatea PGL insolubilă în apă a fost evaluată din extractele obținute după 24 de ore la 37° C în conformitate cu ISO: 10993-12: 2012 și, de asemenea, din pulbere suspendată în mediu de cultură la un interval de concentrație de 0,01-1 mg / ml. PEG-SH solubil în apă a fost dizolvat în mediu de creștere completă în domeniul concentrațiilor de 0,001-10 mg / ml.

Citotoxicitatea extractelor a fost evaluată după 24 de ore de incubare cu extracte 100% (100 mg / ml) și diluțiile acestora (50%, 10% și 1%, corespunzând la 50, 10 și respectiv 1 mg/ml de material extras) în sextuplete (n = 6). După incubare, extractele testate și polimerii au fost înlocuite cu mediu de creștere complet conținând MTT la o concentrație de 0,5 mg / ml și incubate timp de 2 ore. După aceea, mediul a fost îndepărtat și s-au adăugat 100 µl de DMSO. Absorbanța DMSO a fost măsurată la lungimea de undă de 595 nm printr-un cititor de plăci (Labsystems Multiskan MS).

Analiza statistică

Citotoxicitatea polimerilor și a extractelor de geluri polimerice este exprimată ca procentul de celule vii în comparație cu celula de control netratată care a fost luată ca supraviețuire de 100%. Toate rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD ale anlizei realizată în sextuplete (n = 6). Analiza statistică a semnificației în diferențe a fost efectuată utilizând ANOVA cu o singură cale, urmată de testul din Turcia.

5.3.6.2. Hemocompatibilitate

Testarea hemocompatibilitatii s-a realizat după o metodă propusă de Vuddanda și colaboratorii săi . Proba de sânge uman utilizată a fost obținută de la un voluntar sănătos, nefumător, după ce s-a obținut acordul comisiei de etică a instituției. Pentru început, 5 ml de sânge au fost centrifugați 5 min la 2000 rpm. Sedimentul de celule rosii (RBC) a fost separat de stratul superior de plasma și spălat de câteva ori cu soluție salină sterilă. Celulele roșii purificate au fost resuspendate în soluție salină pentru a obtine 25 ml de suspensie RBC. 2 ml suspensie de nanoparticule în soluție salină de diferite concentrații au fost adăugați apoi peste 2 ml suspensie RBC (concentrațiile finale au fost 100 𝜇g NP/ml, 200 𝜇g NP/ml si 400𝜇g NP/ml). Probe control pozitiv (100% liza) și control negativ (0% liza) au fost preparate prin adăugarea de volume egale de Triton X-100 2% și respectiv soluție salină, peste suspensia de RBC. Probele au fost incubate la 37°C pentru 2, 4 și 6 ore. Probele au fost agitate ușor la fiecare 30 min. După timpul de incubare, probele au fost centrifugate la 2000 rpm pentru 5 min și câte 1,5 ml din supernatant a fost incubat pentru 30 min la temperatura camerei pentru a permite oxidarea hemoglobinei. Absorbanța oxihemoglobinei în supernatant a fost măsurată spectrofotometric (PG Instruments T60 UV-Vis Spectrofotometru) la 540 nm.

Procentul de hemoliza a fost calculat după următoarea ecuație (3.6) :

(5.6)

Experimentele au fost realizate în triplicate, rezultatele prezentate fiind media aritmetică a acestora.

5.3.6.3. Studiul efectului antiangiogenic al nanoparticulelor selectate asupra unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului

5.3.6.3.1. Diabetul/Boli inflamatorii ale ochiului – model experimental pe animale

Inflamația ochiului de iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de lipopolizaharid intravenos, 10 g/kg/100 l, la interval de 72 ore, timp de 18 zile, în acord cu literatura de specialitate .

Diabetul zaharat la iepure (5 animale) a fost indus prin injectare de streptozotocină, 180 mg/kg i.p. în injecție unică, în acord cu literatura de specialitate . Evidențierea instalării diabetului s-a făcut prin determinarea glicemiei secvențial după inducere, la o zi, 3 zile, 7 zile, 14 zile și 21 zile.

Pentru ambele tipuri de experiment s-au utilizat iepuri adulți, îngrijiți în condiții obișnuite de laborator, hrăniți cu hrană standard pentru iepuri, tratați în condiții umane și anesteziați cu ketamină/xilazină în vederea sacrificării (fără durere).

Celulele endoteliale retiniene de iepure au fost obținute după cum urmează: s-au utilizat câte 5 retine de iepure, imediat după sacrificare, obținute prin disecție sub microscop. Acestea au fost omogenizate în soluție tampon salină Hank (HBSS), pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+. După centrifugare, sedimentul a fost supus digestiei timp de 1 oră la 37°C, în prezența unui amestec care conține 2 mg/ml colagenază/dispază, DNA-ză tip 1 din pancreasul bovin (20 U/ml) și Tosil lizină clorometil cetonă (50 ng/ml) în HBSS oxigenată și fără Ca2+ și Mg2+, dar cu penicilină, streptomicină și 10 mM HEPES, pH=7,4. După digestie, suspensia a fost filtrată printr-o sită sterilă de nylon de 70 m și structurile microvasculare reținute pe filtru au fost spălate de 2 ori cu HBSS, pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+.

Structurile microvasculare reținute au fost supuse digestiei printr-un număr maxim de 5 cicluri în condițiile descrise mai sus. Pentru evidențierea numărului de celule endoteliale, supernatantele obținute în procesele de separare de mai sus au fost aspirate de mai multe ori printr-un vârf de pipetă de 1 ml pentru dispersie mecanică și apoi incubate la 4o C în tampon fosfat conținând 1% albumină serică bovină și 20 µg/ml lectină legată cu fluoresceină .

După 24 ore, celulele au fost spălate prin centrifugare și fluoresceina liberă îndepărtată, iar celulele endoteliale au fost cuantificate prin microscopie laser confocală. Configurația microscopiei laser confocală (Microradiance, BioRad) a inclus un microscop inversat Nikon Eclipse TE-300 și softul LaserSharp. Filtrul HQ515/530 a fost utilizat ca filtru de emisie pentru excitația de 488 nm.

A fost cuantificată fluorescența verde a fluoresceinei cuplate cu lectina, pentru evidențierea procentuală a numărului de celule endoteliale în condițiile inflamației și diabetului zaharat în condițiile experimentale la iepuri, deja menționate. Practic, am cuantificat numărul de pixeli asociați celulelor endoteliale.

Experimentele au fost realizate în prezență de nanoparticule simple sau încărcate cu bevazucimab, cu un bevazucimab echivalent și cu dexametazonă pe celule derivate din modele inflamatorii și diabetice. Pentru că bevazucimabul nu mai poate fi utilizat din anul 2015 prin lege înafara spitalelor care tratează cancer, acesta a fost înlocuit în experimentele noastre cu un anticorp monoclonal (șoarece) anti-VEGF tip A uman (echivalent bevazucimab). Secvența imunogenă este din mijlocul NP-003367. NP-003367, 27 a.a.-131 a.a. (VEGF) este o proteină parțial recombinantă cu tag-ul GST. Masa moleculară a tag-ului GST singur este 26 kDa. Comparativ, au fost testate nanoparticule încărcate cu bevazucimab.

5.3.6.3.2. Ocluzia venei centrale-model experimental pe animale

Ocluzia venei centrale la iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de Eritrozină B intraperitoneal, 20 mg/kg, soluție 2%, în acord cu literatura de specialitate, dar ușor adaptată . Procesul a fost indus în decurs de 5 minute (interval obținut prin experimentare prealabilă) prin utilizarea focalizată a lungimii de undă a laserului de 532 nm, laser existent în structura configurația de microscopie laser confocală (Microradiance, BioRad). Astfel, fasciculul laser a fost focalizat intraocular (la iepuri) prin detașarea tubului de conducție de la microscop și fixarea în fața ochiului deschis. Un singur ochi a fost utilizat pentru experiment, celălat ochi servind drept martor.

Puterea laserului fiind de 5 mW a fost aplicat iepurilor un tren de 10 spoturi laser cu durată de 5 secunde, spațiate la fiecare 25 secunde. Aceasta a fost rata de succes cea mai mare (aproximativ 95%) pe care am obținut-o în condițiile noastre experimentale.

Pentru experiment s-au utilizat iepuri, adulți, din sursa Băneasa, îngrijiți în condiții obișnuite de laborator, hrăniți cu hrană standard pentru iepuri, tratați în condiții umane și anesteziați cu ketamină/xilazină în vederea sacrificării (fără durere).

În experimentele noastre, celulele endoteliale retiniene de iepure au fost obținute așa cum este descris. Am utilizat câte 5 retine de iepure, imediat după sacrificare, obținute prin disecție sub microscop. Acestea au fost omogenizate în HBSS, pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+. După centrifugare, sedimentul a fost supus digestiei timp de 1 oră la 37°C, în prezența unui amestec care conține 2 mg/ml colagenază/dispază, DNA-ză tip 1 din pancreasul bovin (20 U/ml) și Tosil lizină clorometil cetonă (50 ng/ml) în HBSS oxigenată și fără Ca2+ și Mg2+, dar cu penicilină, streptomicină și 10 mM HEPES, pH=7,4.

După digestie, suspensia a fost filtrată printr-o sită sterilă de nailon de 70 m și structurile microvasculare reținute pe filtru au fost spălate de 2 ori cu soluție HBSS, pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+.

Structurile microvasculare reținute au fost supuse digestiei printr-un număr maxim de 5 cicluri în condițiile descrise mai sus.

Pentru evidențierea numărului de celule endoteliale, supernatantele obținute în procesele de separare de mai sus au fost aspirate de mai multe ori printr-un vârf de pipetă de 1 ml pentru dispersie mecanică și apoi incubate la 4oC în tampon fosfat conținând 1% albumină serică bovină și 20 µg/ml lectină legată cu fluoresceină .

După 24 ore, celulele au fost spălate prin centrifugare și fluoresceina liberă îndepărtată, iar celulele endoteliale au fost cuantificate prin microscopie laser confocală. Configurația microscopiei laser confocală (Microradiance, BioRad) a inclus un microscop inversat Nikon Eclipse TE-300 și softul LaserSharp. Filtrul HQ515/530 a fost utilizat ca filtru de emisie pentru excitația de 488 nm. A fost cuantificată fluorescența verde a fluoresceinei cuplate cu lectina, pentru evidențierea procentuală a numărului de celule endoteliale în condițiile ocluziei venei centrale experimentale la iepuri, deja menționate. Practic, am cuantificat numărul de pixeli asociați celulelor endoteliale.

Experimentele au fost realizate în prezența de nanoparticule simple sau încărcate cu BEV, un echivalent bevazucimab (anticorp monoclonal anti-VEGF tip A uman) și dexametazonă pe celule derivate din modele inflamatorii și diabetice. Utilizarea echivalentului de BEV a fost justificată anterior.

5.3.6.3.3. Studiul efectului antiangiogenic al nanoparticulelor (încărcate cu bevacizumab, dexametazonă, triamcinolone) asupra celulelor stem induse/mezenchimale în diabet, boli inflamatorii ale ochiului, ocluzia venei centrale pentru modele animale

Celulele stem induse au fost obținute din fibroblastele adulte de iepure. Obținerea fibroblastelor s-a realizat prin explant din gingia de iepure netratat prin metoda descrisă anterior .

Astfel, iepurii (1200-1250 g) în număr de 5 au fost sacrificați, iar probele de gingie de la fiecare iepure au fost mărunțite și transferate în eprubete cu ser fiziologic. Eprubetele cu gingia secționatǎ au fost transferate în laborator pe pat de gheațǎ. Probele de gingie au fost mǎrunțite și spǎlate de 6 ori cu PBS (phosphat buffered saline), dupǎ care au fost puse în plăcuțe petri cu mediu de culturǎ DMEM suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum), 1% amestec antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ(0,06 mg / ml penicilină și 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B .

Probele au fost lǎsate între 2 și 7 zile la 37°C și 5 % CO2, dupǎ care gingia a fost îndepărtată iar fibroblastele atașate de peretele vasului au fost lǎsate sǎ se înmulțeascǎ în continuare în mediu proaspǎt la 37°C și 5 % CO2 pentru încǎ 48-72 de ore. Când fibroblastele au ajuns la confluență de 90 % vasele au fost tripsinizate cu 2 ml tripsină EDTA și spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute, dupǎ care au fost resuspendate în 40 ml de mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500 mg/l glucozǎ, 10% FBS (ser fetal bovin), 1% antibiotic penicilinǎ/ streptomicinǎ (0,06 mg / ml penicilină și 0,1 mg / ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B. Mediul în care se aflau celulele a fost agitat și împǎrțit în 4 flascuri de culturǎ. În acest mediu au fost lǎsate pȃnǎ au ajuns la confluența de 90% (aproximativ 7 zile). Dupǎ cele 7 zile toate vasele au fost tripsinizate, spǎlate prin centrifugare la 300xg timp de 5 minute și apoi au fost resuspensionate în 1 ml de mediu și numǎrate. Dupǎ numǎrare, celulele au fost împǎrțite în mod egal în 4 loturi (flascuri, aproximativ 100.000 de celule/flasc). În primul flasc celulele au fost puse în mediu stem suplimentat cu 0,584g/l L-glutaminǎ, 4500mg/l glucozǎ, 10% FBS (fetal bovine serum), 1% antibiotic penicilinǎ/streptomicinǎ (0,06 mg/ml penicilină și 0,1 mg/ml streptomicină sulfat), 1% amfotericinǎ B și a reprezentat lotul martor. Apoi toate flascurile au fost puse la 37°C și 5 % CO2 pȃnǎ ajung la confluențǎ.

Pentru obținerea iPSC din fibroblastele gingivale s-a utilizat tehnica descrisă de Long și colab., respectiv un amestec chimic format din 10 µM 5-bromo-2’-deoxiuridină, 10 µM CHIR99021, 10 µM Repsox și 50 µM forskolin. În plus, s-a utilizat un agonist al receptorului acidului retinoic, AM580, în concentrație de 100 nM, cu un randament mărit al procesului de aproximativ 10 ori, în acord cu tehnica descrisă anterior .

Pentru evidențierea transformării de tip iPSC am utilizat anticorpi specifici anti-fosfatază alcalină, anti-Nanog și anti-SSEA1 și citometrie de flux . Atât celulele iPSC, induse din fibroblastele gingivale de iepure, cât și celulele mezenchimale din creasta iliacă de iepure, au fost separate înainte de experiment prin citometrie de flux selectivă, utilizând anticorpi selectivi marcați cu fluoresceină.

În decursul dezvoltării, ambele linii celulare au prezentat caracteristici morfologice de celule embrionare în cultură, demonstrând încă odată apartenența la acest tip celular. Totuși, celulele stem mezenchimale, obținute din creasta iliacă de iepure au fost mult mai puțin stabile, numărul de pasaje posibile fiind foarte redus.

Pentru obținerea celulelor stem mezenchimale s-a utilizat măduva osoasă obținută prin puncția crestei iliace la iepuri de 1200-1250 g, sub anestezie. Pe scurt, fragmentele de măduvă au fost suspendate în mediu esențial minim α (α-MEM), centrifugate și depozitul celular resuspendat în α-MEM cu 10 % FBS, Celulele nucleate au fost însămânțate pe vase petri de 150 mm diametru și incubate la 37℃ timp de 6 zile. Apoi, celulele neaderente au fost îndepărtate și startul de celule aderente a fost reincubat în mediu complet până la atingerea unei semi-confluențe. Celulele au fost apoi tripsinizate cu 0.25% tripsină-EDTA, resuspendate în mediu complet, reînsămânțate la o densitate de 8.000 cells/cm2 și incubate pentru 3 zile. Monostraturile de celule rezultate, denumite celule stem mezenchimale de șobolan, au fost tripsinizate și celulele rezultate înghețate sau utilizate pentru experimente .

Atât celulele stem induse din fibroblaste, cât și celulele stem mezenchimale, au fost crescute timp de 48 ore în prezența plasmei separate din sângele de iepure, în proporție de 20% în raport cu mediul de cultură. S-a aplicat acest protocol deoarece se sugerează că modalitatea cea mai importantă de comunicare și interacțiune între celulele stem și celelalte celule din diverse țesuturi ar fi reprezentată de transferul paracrin de molecule solubile. Injectarea intraoculară de supernatant de cultură celulară (ambele tipuri celulare) s-a făcut odată cu injectarea nanoparticulelor.

Capitolul 6. Rețele polimere pe bază de poliglobalidă obținute prin reacția de adiție de tip tiol-enă

Capitolul are ca scop prezentarea obținerii unor rețele polimere sub formă de geluri originale încărcate cu principii biologic active pentru o gamă variată de aplicații biomedicale. Sunt discutate în detaliu rezultatele experimentale obținute, tehnicile experimentale și metodele de caracterizare utilizate.

6.1. Rezultate și discuții

6.1.1. Polimeri sintetizați pentru obținerea rețelelor polimere preparate prin reacția de adiție de tip tiol-enă

6.1.1.1. Sinteza și caracterizarea poliglobalidei (PGL)

Acest subcapitol raportează prepararea rețelelor de polimeri prin intermediul reacției de adiție tiol-enă fotoinițiată, prin cuplarea dintre un poliester cu funcții alchenice, cum este PGL, cu un polimer care prezintă pe capetele catenei funcții tiolice, cum este PEG-SH. Reacția decurge în soluție de THF, așa cum este prezentat în schema 6.1. În mod similar, ca și alți poliesteri constând din unități monomere cu lanț alifatic lung, PGL are o hidrofobie pronunțată, făcând-o mai puțin interactivă cu mediul hidrofil.

Schema 6.1. Sinteza poliglobalidei

Justificarea utilizării PGL, după cum s-a, prezentat anterior, are la bază ideea includerii sale într-o rețea polimerică împreună cu un polimer hidrofil, cum este PEG. Calea propusă pentru obținerea PGL este polimerizarea cu deschidere de ciclu catalizată enzimatic de lipază (schema 6.1), în masă. Masa moleculară medie a fost calculată utilizând atât spectrul 1H RMN (figura 6.4), cât și cel al analizei GPC (figura 6.1). Cele două rezultate (tabelul 6.1) au fost în concordanță ambele conducând la o valoare a masei moleculare (Mn) a PGL de aproximativ 6000 g/mol. Se impune a menționa că analiza cromatografică de permeație pe gel a indicat o polidispersitate ridicată, respectiv de 3,4. Acest rezultat era de așteptat datorită particularităților polimerizării în masă cu deschidere de ciclu, utilizată pentru preparare. Conversia monomerului a atins 74%, ceea ce reprezintă o valoare ușor mai mare decât cea descrisă în literatură pentru polimerizarea cu deschidere de ciclu enzimatică în soluție de toluen , .

Figura 6.1. Analiza GPC a poliglobalidei

Tabel 6.1. Caracteristicile moleculare ale PGL

De asemenea, caracterizarea structurală a PGL a fost efectuată și cu ajutorul spectroscopiei FT-IR însă, spectrele din păcate, nu au prezentat modificări chimice relevante, acestea prezentând profile similare, astfel ȋncȃt majoritatea benzilor de absorbție se suprapun. Figura 6.2 ilustrează spectrele FT-IR ale monomerului inițial globalidă și polimerului sintetizat PGL.

Figura 6.2. Spectre FT-IR pentru globalidă și PGL

Benzile caracteristice ale GL și PGL din spectre sunt ilustrate în tabelele ….:

Tabelul 6.2. Benzile de absorbtie caracteristice ale GL

Tabelul 6.3. Benzile de absorbtie caracteristice ale PGL

Spectrele 1H-RMN înregistrate oferă însă informații utile cu privire la structura chimică a polimerului obținut. După cum putem observa din figura 6.3 semnalele caracteristice protonilor din PGL sunt prezentate și marcate. Spectrul a fost înregistrat în CDCl3 utilizând un spectrometru de 400 MHz și este în concordanță cu studiile realizate. Calculul masei moleculare a polimerului format a fost efectuat pe baza semnalelor protonilor b și b’ cu ecuația de mai jos:

Mn= (b/b’)·MGL (3.7)

Figura 6.3. Spectrul RMN al PGL

Poliglobalidă: 1H NMR: δ (ppm) 5.59-5.30 (m, CH=CH), 4.17-3.98 (m, CH2O(C=O)), 3.71-3.60 (CH), 2.43-2.24 (CH2(C=O) O), 2.17-1.93, 1.76-1.55, 1.43-1.19 (m, CH2)

Rezultatul obținut constituie o dovada clară a faptului că procesul de polimerizare a avut loc obținându-se poliglobalida.

Rezultatele analizei MALDI MS au dezvăluit doar o fracție de masă moleculară scăzută datorită polidispersității ridicate a probei. Cu toate acestea, natura lanțurilor PGL a fost dovedită prin diferența vârf-vârf a valorilor m/z (raportul masă-încărcare) de 238 Da, care corespunde cu masa unității monomere. Analiza MS a confirmat că lanțurile PGL sunt inițiate de apă conform structurii prezentate în figura 6.4.

Figura 6.4. Analiza MALDI a PGL

6.1.1.2. Sinteza copolimerului poli(etilenglicol-co-tiomaleat)

Copolimerul poli(etilenglicol-co-tiomaleat) PEG-SH (schema 6.2) a fost preparat printr-o reacție de policondensare similară metodei raportate de Zhu și colaboratorii săi . Masa moleculară a copolimerului fost determinată prin analiza GPC (Tabelul 6.4). Caracterizarea structurală a fost efectuată deasemenea prin FT-IR, Raman, RMN și MALDI MS.

Schema 6.2. Sinteza copolimerului poli(etilenglicol-co-tiomaleat)

Tabel 6.4. Caracteristicile moleculare ale PEG-SH

Nici în acest caz spectroscopia FT-IR pentru PEG-SH nu a reușit să evidențieze grupările funcționale chimice importante de pe catena principală polimerică, respectiv grupările funcționale tiolice. Figura 6.5 ilustrează spectrele FT-IR ale polimerului de plecare PEG și PEG-SH sintetizat. Prin urmare, spectroscopia FT-IR ne-a dezvaluit benzile caracteristice gruparii esterice (C=O) și a celei duble la 1731 cm-1, și un semnal slab al benzii specifice grupării funcționale SH la 2544 cm-1, restul semnalelor benzilor de absorbție prezintǎ profile similare, astfel ȋncȃt majoritatea se suprapun. Prezența benzilor caracteristice ale PEG și PEG-SH care apar în acest spectru sunt prezentate în tabelul 6.5.

Spectroscopia FT-Raman (figura 6.6), a permis, de asemenea obținerea unor informații cu privire la grupările funcționale ale PGL, și anume apariția unei benzi caracteristice în jurul valorii de 1673 cm-1, care rezultă din prezența grupării C=C în catena principala a polimerului. De asemenea în cazul analizei FT-Raman pentru copolimerul PEG-SH spectrul evidențiază apariția benzilor caracteristice cum ar fi : semnalul specific vibrațiilor grupării esterice (O-C= O) la 1673 cm-1 și cel specific grupării funcționale tiolice (SH) la 2570 cm-1.

Figura 6.5. Spectrul FT-IR a PEG-SH

Tabelul 6.5. Benzile de absorbtie caracteristice ale PGL și PEG-SH

Figura 6.6. Spectrul FT-Raman a PGLși PEG-SH

Așa cum era de așteptat în cazul unui proces de policondensare, care implică de asemenea deja oligomeri ai PEG polidisperși, s-a reușit sintetizarea unui copolimer poli(etilenglicol-co-tiomaleat) care prezintă totuși o polidispersitate mare (3,3) și un grad de policondensare mediu de 3,25.

Caracterizarea copolimerului PEG-SH a fost realizată și cu ajutorul spectroscopiei RMN. Spectrul 1H-RMN înregistrat pentru produsul obținut este evidențiat în figura 6.7. Legarea acidului tiomalic pe lanțurile de PEG este justificată de apariția peakurilor specifice de la 2,27 pm care corespund grupărilor funcționale tiolice și sugerează că acestea au fost stabile în timpul procesului de policondensare. Totodată, spectrul a evidențiat și apariția unor peakuri specifice importante la 4,27 ppm care ne confirmă că PEG a fost esterificat prin TMA

În figura 6.9, sunt prezentate picurile specifice ale protonilor ai copolimerului PEG-SH. Rezultatul obținut constituie o dovada clară a faptului că polimerul a fost modificat.

Figura 6.7. Spectrul RMN al copolimerului PEG-SH

PEG-SH: 1H RMN: δ (ppm) 4.37-4.19 (CH2O(C=O)), 3.85-3.77 (PEG backbone) (3.12-2.94 and 2.86-2.74 (CH2(C=O) O), 2.38-2.24 (C-SH)

După cum se poate observa din figurile 6.8 a, b, analiza MALDI MS nu a putut fi utilizată pentru determinarea masei moleculare a copolimerului obținut. Caracterizarea MALDI MS a relevat că proba de copolimer PEG-SH este formată dintr-un amestec de lanțuri macromoleculare cu număr diferit de macromeri PEG și comonomeri tiomaleat. Având în vedere polidispersitatea ridicată a polimerului, rezultatele au fost considerate doar ca o măsură calitativă a probei PEG-SH. Astfel, pot fi observate lanțuri care au un anumit număr de macromeri PEG și un număr corespunzător de unități TMA, care pot fi notate ca PEGxTMAy. Proba analizată este în concordanță cu rezultatul tipic al unor astfel de reacții de policondensare. Atribuirea peakurilor din spectrul MS a fost realizată pe baza creșterea caracteristică a m/z cu 44 (figura 6.8 b), care poate fi observată în general pentru PEG. Astfel, seria principală de picuri poate fi atribuită speciilor PEG-SH încărcate K. Calculul m/z al unui oligomer PEG poate fi realizat utilizând formula generală m / z = 18 (H2O) + 44 (C2H4O) + 39 (K). În cazul copolimerului PEG-SH, caracteristica m/z = 18 (H2O) + 44 (C2H4O) + 39 (K) + 132 (TMA-C4H4O3S).

Figura 6.8 a. Analiza MALDI a PEG-SH

Din păcate, creșterea masei datorată prezenței TMA este, de asemenea, un multiplu de 44, ceea ce face dificilă identificarea directă a numărului de unități de comonomeri TMA printr-o analiză simplă MALDI MS. Cu toate acestea, luând în considerare Mn a oligomerilor PEG inițiali (600 g / mol, ± Ð of 1.37), putem constata că picurile observate corespund structurilor PEG-SH așa cum este prezentat în figura. 3.37 a).

Figura 6.8. b. Analiza MALDI a PEG-SH, imagine detaliată

6.1.1.3. Prepararea rețelelor polimerice pe bază de PGL și PEG-SH prin reacția de tip adiție tiol-enă

Această parte a studiului se referă la prepararea și caracterizarea de noi rețele polimere pe bază de poliglobalidă prin reacția de adiție radicalică tio-enă fotoinițiată.

Literatura de specialitate menționează obținerea rețelelor reticulate pe bază de PGL utilizând compuși bifuncționali tiolici cu mase moleculare mici sau oligomeri bis-tiofuncționali de PEG .

Originaliatatea studiului constă în adiția de tip tiol-enă polimer-polimer realizată prin mecanism radicalic folosind fotoinitiatori, în soluție de tetrahidrofuran. Materialele polimere pe bază de poliglobalidă au fost sintetizate cu ajutorul reacției tiol-enă indusă de UV între cei doi polimeri sintetizați și anume, PGL și PEG-SH, la temperatura camerei. Reacția radicalică tiol-enă polimer-polimer care a stat la baza formării rețelelelor polimere pe bază de PGL este prezentată schematic în schema 6.3.

Schema 6.3. Reprezentarea schematică a sintezei gelurilor prin reacția radicalică tiol-enă

Pentru stabilirea parametrilor optimi de obținere a gelurilor polimerice s-a studiat influența parametrilor reacției de reticulare prin adiția tiol-enă fotoințiată asupra structurii finale și a proprietăților acestora (morfologie, grad de umflare, fracție de gel recuperată a materialelor obținute).

Protocolul experimental și parametrii variați pentru prepararea probelor sunt iluistrați în tabelul 6.6.

Tabelul 6.6. Parametrii inițiali pentru sinteza gelurilor și rezultatele analizei fracției de gel recuperată

Fotoinitiatorul ales, 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonă (DMPA) a fost utilizat pentru a iniția această reacție datorită eficienței sale ridicate pentru generarea de radicali reactivi . O primă observație importantă necesară de menționat este aceea că, atunci când fotoinitiatorul DMPA nu a participat la reacție, procesul de gelifiere nu a avut loc. De asemenea, fiecare polimer a fost testat separat în condiții de iradiere similare, cu și fără DMPA, și nu a fost observată nici în aceste cazuri producerea gelifierii. Inițierea efectivă a reacției depinde de cantitatea de lumină absorbită la lungimea de undă de expunere și de grosimea probei. Particularitatea inițiatorului radicalic specific ales pentru reacția tiol-enă constă în faptul că acesta are un efect semnificativ nu numai asupra vitezei de reacție, ci și asupra procentului de conversie a gelurilor și a formării de produselor secundare de reacție .

Pentru a evidenția eficiența fotoinitiatorului DMPA pentru sistemul studiat, mai întâi, a fost determinat punctul de gelifiere pentru rețele cu diferite rapoarte molareale grupelor funcționale (SH/C=C), concentrații DMPA, precum și două volume de reacție semnificativ diferite, prin metoda inversiei tubului. Rezultatele obținute (tabelul 6.7) au evidențiat valori ale timpului de gelifiere în intervalul de timp 90 – 240 secunde, atunci când concentrația DMPA a fost de 1%, în raport cu cantitatea totală de polimeri și volumul scăzut de reacție (300 µl). Totodată, a fost observat și faptul că timpul de gelifiere a crescut de 5-10 ori mai mult atunci când volumul de reacție a fost crescut la 2,6 ml.

Tabel 6.7. Influența concentrației fotoinițiatorului și a volumului de reacție asupra timpului de gelifiere

Trebuie menționat, de asemenea, faptul că toate probele de geluri umflate cu THF, preparate utilizând un volum de reacție mai mare, în prezența concentrațiilor de fotoinițiator de 0,75 sau 1 %, au fost greu de manevrat și au prezentat o structură instabilă, friabilă. Atunci când concentrația fotoinițiatorului a fost scăzută la valoarea de 0,25 % a fost identificat un timp de gelifiere extrem de mare, care a fost determinat atât pentru volumele de reacție scăzute, cât și pentru cele mari de reacție, în unele cazuri a fost observată chiar absența procesului de gelifiere. Experimentele testului de inversie a tubului au condus la rezultate interesante, demonstrând că, un procent masic de 0,5 % al fotoinițiatorului a condus la o gelifiere relativ rapidă, menținând în același timp și o bună stabilitate a structurii de gel. Prin urmare, pentru toate studiile ulterioare, sistemele pe bază de poliglobalidă au fost preparate în prezența a 0,5% DMPA. Concluzia firească pentru rezultatele obținute în urma testului de inversie a tubului este faptul că punctul de gelifiere este dependent de concentrația de fotoinițiator și volumul de reacție.

Astfel, au fost preparate o serie de probe, având concentrații inițiale de polimeri și rapoarte molare (SH/C=C) diferite în THF (tabelul 6.6). Toate reacțiile au condus la formarea de geluri lipicioase și transparente în stare umflată (figura 6.9 c). Toate probele de geluri, totuși, treptat și-au pierdut transparența și au devenit albe în contact cu mediul de apos în timpul celei de-a doua etapă de purificare (figura 6.9 d).

Figura 6.9. Fotografii cu privire la sinteza gelurilor înainte și după purificarea lor în THF și apă

După cele două etape de purificare, s-a observat că există o dependență între valorile obținute pentru fracțiile de gel recuperate și concentrația totală a polimerilor, cât și raportul molar inițial (SH/C=C, tabelul 6.6). În timpul etapei de purificare a gelurilor cu tetrahidrofuran toți produșii de reacție nereacționați, PGL precum și PEG-SH, teoretic sunt eliminați, însă rezultatele obținute în ceea ce privește procentul de gel recuperat evidențiază doar o ușoară scădere a acestuia după purificarea ulterioară a gelurilor în apă, cauza firescă fiind probabil îndepărtarea unor urme de solvent (THF) sau PEG nereacționat. După cum putem observa din figura 6.10 procentul de gel recuperat a fost mai mare în cazul reacției de adiție tiol-enă realizată la o concentrație totală a polimerilor de 20 % (cele mai bune probe G9 și G12) în comparație cu celelalte două concentrații de 10 și 5 %, independent de raportul molar al grupelor funcționale (SH/C=C).

Figura 6.10. Fracția de gel recuperat pentru probele preparate dependentă de concentrația totală a polimerilor (20%, 10%, 5%) și raportul molar tiol / enă (SH/C=C)

Acest lucru poate fi explicat prin apariția reacțiilor secundare rezultate prin cuplarea radicalilor tiil (RS. ), ceea ce conduce la formarea de legaturi disulfurice și/sau a radicalilor de carbon centrați la concentrații totale de polimeri mai mici .

Pe de altă parte, s-a observat că pentru aceeași concentrație inițială de polimeri, randamentul gelurilor depinde de raportul molar SH/C=C (figura 6.13). În cazul concentrației totale de polimeri de 20 %, fracția de gel recuperată a crescut de la 39% la 55%, odată cu scăderea raportului molar SH/C=C de la 3/1 la 1/4. Datele obținute pot fi corelate cu faptul ca PGL are o masă moleculară mai mare, prin urmare concentrația grupărilor funcționale alchenice este mai mare în comparație cu cea a grupărilor funcționale tiolice. Deci, putem afirma că există o probabilitate ridicată ca PGL comparativ cu PEG-SH, să devină parte a rețelei de geluri. De asemenea, numărul de grupări funcționale (duble legături) de pe catenă este mai mare în cazul PGL, în comparație cu masa moleculară a lanțului polimeric dintre două grupări funcționale consecutive care este mai mică decât perechea sa, PEG-SH; de aici si posibilitatea unei participări mai eficiente a PGL la formarea rețelei de polimeri.

O altă problemă importantă care este necesar să fie discutată o reprezintă consumul legăturilor duble, respectiv tiolice pe parcursul procesului de reticulare. În cazul probelor (G1-3) având o cantitate echivalentă stoichiometrică de legături duble (PGL) și grupări tiol (PEG-SH), în mod ideal, consumul total al grupărilor tiol ar fi posibil.

Totuși, datorită diferiților factori, care pot afecta pierderea radicalilor cum ar fi concentrația polimerilor, interacțiunile sterice ale lanțurilor de polimeri sau aglomerarea sterică în jurul locului de reticulare și mobilitatea diferită a lanțurilor de polimeri, unele fragmete de grupe funcționale, atât tiolice cât și legături duble, pot rămâne nereacționate, astfel încât numărul de grupări tiolice rămase pot oferi informații despre abaterea de la structura de rețea ideală. Un astfel de comportament este caracteristic pentru o reticulare de tip polimer-polimer , .

6.1.1.3.1. Caracterizarea structurală a rețelelor prin FT-Raman

Pentru a înțelege mai bine mecanismul de formare a rețelei, prezența (sau absența) grupărilor funcționale tiol sau alchenă, gelurile au fost mai întâi investigate cu ajutorul spectroscopiei Raman (figura 6.11). Spectrele au evidențiat semnale ale vibrațiilor de întindere specifice legăturii duble (C=C) la 1673 cm-1, reprezentând legăturile duble nereacționate ale PGL și semnale ale vibrațiilor de întindere specifice grupării tiolice (SH) la 2570 cm-1, reprezentând grupe tiol nereacționate. Studiul publicat de Ates și Heise descrie, utilizarea spectroscopiei Raman pentru cuantificarea cantității de legături duble nereacționate, în timp ce pentru determinarea cantitativă s-a utilizat raportul semnalelor specifice benzilor corespunzătoare legăturilor de ester și ale legaturilor duble. Cu toate acestea, în studiul actual, lanțurile PEG-SH conțin de asemenea legături esterice fapt ce împiedică o astfel de evaluare a materialelor reticulate. Prin urmare, rezultatele spectrelor Raman au fost utilizate în acest caz doar ca o evaluare calitativă. Se constată că semnalul benzii de întindere a grupării SH se estompează în mod clar odată cu scăderea raporturilor inițiale SH/C=C, adică cu creșterea conținutului de PGL în amestecul de reacție inițial. În plus, nici excesul de grupări tiol din amestecurile inițiale nu a condus la conversia completă a legăturilor duble. Analiza Raman a raporturilor relative dintre benzile care corespund grupelor tiol și celor alchenice a confirmat calitativ o anumită tendință a interacțiunilor tiol-enă cu formarea legăturilor C-S-C între lanțurile macromoleculare ale PGL și PEG-SH. Adiția tiol-enă poate fi confirmată și de prezența semnalului slab al benzii de la 1001 cm-1 care corespunde legăturilor C-S-C.

Figura 6.11. Analiza FT-Raman a gelurilor cu diferite rapoarte molare SH/C = C

6.1.1.3.2. Analiza elementală

Pentru a evalua amploarea reacției de adiție tiol-enă, caracterizarea suplimentară a gelurilor a fost efectuată prin analiza elementară. Rezultatele obținute sunt prezentate în figura 6.12 și tabelul 6.8.

Figura 6.12. Datele comparative al conținutului de sulf teoretic calculat din compoziția inițială a polimerilor, conținutul total de sulf în probele de geluri (20% concentrație în amestecul inițial) determinat prin analiza elementară și conținutul de sulf sub formă de grupări tiol nereacționate în probele de geluri determinate prin metoda lui Ellman

Tabel 6.8. Analiza elementară a probelor de geluri cu o concentrație de 20% și diferite rapoarte molare inițiale SH/C=C

În mod normal, rapoartele gravimetrice observate între elemente (conținutul de sulf, este luat în considerare în principal), nu ne așteptăm să fie similare cu cele inițiale datorită reacției de adiție tiol-enă incompletă și a procentului ridicat al polimerilor nereacționați îndepărtați din rețelele reticulate prin purificare. În timpul, etapelor de purificare prin care se realizează îndepărtarea polimerilor nereacționați, raportul existent al elementelor din amestecurile inițiale de reacție, poate fi afectat prin eliminarea de cantități ne-proporționale de PEG-SH sau PGL nereacționate față de rapoartele inițiale. Cu toate acestea, așa cum se poate observa din rezultatele analizei elementare a rețelelor reticulate preparate utilizând o concentrație de polimeri de 20% și diferite rapoarte molare inițiale SH/C=C, conținutul de sulf a fost doar puțin mai mic comparativ cu, cel teoretic inițial de sulf calculat din raportul inițial al polimerilor cu privire la fracția de gel de recuperată (figura 6.10). Putem trage astfel o primă concluzie și anume că în timpul purificării, cantitatea de PEG-SH nereacționată a fost doar puțin mai mare decât cea a PGL. Spre exemplu în cazul probei G3 (c= 20%; raport molar inițial SH/C =C de 1/1) există o pierdere de aproximativ 12% din conținutul de sulf (în raport cu conținutul de sulf teoretic), fapt care ar trebui să reflecte pierderea relativă proporțională a PEG-SH în comparație cu conținutul utilizat inițial al amestecului de polimeri.

Abaterea conținutului de sulf pentru toate rețelele reticulate comparativ cu valorile teoretice ale amestecurilor de reacție, se încadrează în general în intervalul de 5 – 10%. O concluzie valabilă pentru toate probele ar fi că tendința ca mecanismul de reacție să producă mai mult PEG-SH nereacționat decât PGL, este în concordanță cu probabilitatea mai mare a PGL de a fi implicat în rețea datorită masei sale moleculare mai mare și densității mari a grupărilor funcționale mare.

6.1.1.3.3. Spectofotometrie UV-Vis (Testul Ellman’s)

O caracterizare suplimentară a gelurilor în ceea ce privește conținutul de grupe funcționale SH libere, a fost efectuată prin analiza spectrofotometrică și anume titrarea grupărilor tiol utilizând metoda testului Ellman’s. Evaluarea grupelor tiol libere din rețelele reticulate s-a realizat prin utilizarea reactivului Ellman (acid 5,5'-ditiobis- [2-nitrobenzoic]) (DTNB). DTNB reacționează cu grupele tiol care formează un produs colorat în galben, acidul 5-tio-2-nitrobenzoic (TNB2-), care are o absorbție ridicată la 412 nm. Intensitatea culorii galbene crește proporțional cu conținutul de grupări tiol libere. Cantitatea de grupe funcționale tiol libere a fost calculată prin extrapolarea rezultatelor obținute cu o curbă standard realizată pe bază de acid tiomalic.

În figura 6.13 poate fi observată și cantitatea relativă de sulf prezentă în geluri sub formă de grupe tiol nereacționate (libere), determinată spectrofotometric. Din datele experimetale obținute se poate trage o primă concluzie, și anume conținutul relativ de sulf descrește odată cu modificarea raportului molar inițial în favoarea legăturilor duble (creșterea cantității de PGL în amestecul de polimeri inițial). Diferența dintre sulful total și sulful din grupările tiol nereacționate este strâns legată de sulful reacționat din grupările tiol transformate, acesta fiind cel mai probabil cel din legăturile C-S-C formate între PGL și PEG-SH, așa cum se poate observa din figura 6.13 însă nu putem exclude complet nici posibilitatea formării unor legături disulfidice (S-S).

Figura 6.13. Conținutul relativ de sulf reacționat din gelurile cu o concentrație totală de polimeri de 20% și diferite raporarte molare inițiale tiol/enă.

Astfel, de exemplu pentru un raport de 1/1 (SH/C=C), 49% din sulful rămas în rețeaua de polimeri a fost implicat în reacțiile de reticulare. Cu toate acestea, este necesar de subliniat faptul că doar 42% din conținutul inițial de polimer a fost recuperat după purificare, și deci, de fapt, cantitatea de grupe tiol implicate în reacțiile de reticulare a fost de numai aproximativ 21%, restul cantității de 79% au rămas fie sub formă de grupări SH nereacționate, fie atașate la rețeaua de polimeri, fie au fost îndepărtate în timpul purificării. Un alt rezultat care ne-a atras atenția a fost că în cazul gelurilor obținute utilizând un conținut inițial ridicat de grupări tiolice, adică raport molar initial SH/C=C de 3/1, cantitatea relativă de grupe tiol determinată este mai mică decât ne așteaptam teoretic, pentru acest caz, cel puțin 66% sulf ar fi trebui să rămână sub formă de grupări funcționale tiol nereacționate. Cu toate acestea, cantitatea determinată de grupe tiol libere a fost de aproximativ 48%, prin urmare, putem presupune că grupele tiol au fost consumate și printr-un alt procedeu decât adiția tiol-enă. Ca un proces secundar principal, care se poate produce, este cuplarea tiol-tiol rezultând formarea legăturilor disulfidice (S-S).

Formarea legăturilor disulfidice nu a fost cuantificată și poate fi luată în considerare pentru toate probele studiate. Cu toate acestea, putem considera că astfel de procese sunt mai predominante în condiții în care PEG-SH este prezent în amestecul de reacție în exces, datorită faptului că lanțurile de PEG-SH sunt mai scurte și, în consecință, au o mobilitate mai mare. Astfel, comparația dintre conținutul de sulf determinat prin analiza elementară și metoda de titrare Ellman’s a grupărilor tiol este realizată cu reținerea că grupările tiol libere pot fi parțial afectate de cuplarea S-S.

De asemenea, a fost observat un consum al grupărilor tiol mai mare pentru probele preparate cu un conținut inițial mai mare de PGL. În momentul utilizării unei cantități de legăturii duble în execs (de 3 sau 4 ori) comparativ cu cele tiol a fost observat faptul că aproximativ 79% din cantitatea de sulf rămâne încorporată în rețelele reticulate după purificare, fiind adiționat la legăturile duble C=C, figura 6.13. Astfel, sistemul de reacție tiol-enă investigat pare să fie limitat la consumul de grupări tiol până la aproximativ 46%, luând în considerare fracția gelului recuperat după purificare. Totuși, aceste calcule nu au luat în considerare faptul că procedeele de purificare pot conduce, de asemenea, la îndepărtarea polimerilor parțial reacționați care nu sunt înglobați în rețeaua formată, dar care prezintă suficientă mobilitate pentru a difuza prin rețea și a fi îndepărtați în timpul purificării.

A fost studiat, de asemenea, și efectul concentrației inițiale a polimerului asupra cantității de grupe tiol nereacționate din gelurile purificate. Analiza conținutului de grupări tiol libere și consumate în timpul formării rețelei pentru toate probele este prezentate prezentată în figura 6.14 și tabelul 6.9. Calculul procentual al conținutului de grupe funcționale tiol libere și a sulfului din legăturile C-S-C s-a reazlizat pe baza următoarelor ecuații 6.1; 6.2; 6.3:

(6.1)

(6.2)

(6.3)

unde:

x – moli de SH calculați prin extrapolarea rezultatelor obținute cu ajutorul curbei de calibrare

y – Absorbanța

z – moli de SH / g probă

Y – SH libere și legături C-S-C %

t – moli teoretici inițiali de SH /g

Figura 6.14. Conținutul de grupe tiol determinat prin metoda de titrare a Ellman’s pentru probele purificate preparate la diferite concentrații inițiale de polimeri și rapoarte molare SH/C=C, precum și conținutul teoretic al SH calculat din cantitatea inițială de PEG-SH introdusă în sinteza gelurilor

Tabelul 6.9. Conținutul de sulf sub formă de grupe tiol libere și sub formă de sulf adiționat la dublele legături din probele purificate, cu concentrații totale de polimeri și rapoarte molare tiol/enă diferite

Concluziile desprinse din rezultatele experimentale obținute pentru probele G1-G18 evidențiate în tabelul 6.9, demonstrează, în mod clar, că, conținutul de grupe tiol libere este dependent atât de concentrația totală de polimeri cât și de rapoartul molar (SH/C=C) utilizat, acesta crescând constant odată cu creșterea concentrației, astfel încât rețelele reticulate preparate la concentrații mai mici conțin o cantitate mai mare de sulf reacționat. Cu toate acestea, recuperarea fracției de gel a scăzut, de asemenea, odată cu scăderea concentrației de polimer (Tabelul 6.6), reducându-se astfel, de asemenea, conversia totală de tioli. În acest moment putem afirma că, odată ce lanțurile de polimeri încep să devină parte a rețelei reticulate, ar putea apărea o anumită separare a fazelor indusă de solubilitatea scăzută. O astfel de separare a fazelor nu este caracterizată de o modificare a transparenței soluției de polimer în THF pe parcursul procesului de adiție tiol-enă fotoindusă, probabil datorită proprietăților bune de umflare ale PGL și PEG-SH în THF, așa cum s-a observat și pentru gelurile finale umflate în THF. Transparența rețelelor reticulate pe bază de PGL a fost, de asemenea, observată și de către van der Meulen și colab. . De aceea, dacă concentrația polimerului este mai mică, în același volum, faza polimerică reticulată ar fi mai dispersată și, ca o consecință, mai ușor disponibilă pentru reacțiile tiol-enă, explicând astfel și conținutul mai mic de tioli liberi din probele purificate preparate la o concentrație inițială de polimeri mai mica.

6.1.1.3.4. Studiu reologic

S-a utilizat în continuare foto-reologia pentru a monitoriza evoluția in situ a proprietăților reologice dinamice ale gelurilor care se formează prin adiția tiol-enă fotoindusă utilizând cantități de 250 μL de soluție THF conținând amestecuri de polimeri compuși din PEG-SH și PGL cu concentrații diferite de polimeri (5%, 10%, 20%, 40%) și fotoinitiator DMPA în cantități calculate în funcție de cantitatea de polimeri. Figura 6.15 prezintă profilul reologic in-situ realizat în timpul cuplării tiol-enă a amestecurilor de soluții polimerice cu concentrații diferite de polimeri pentru raportul 1/3 (SH/C= C).

Figura 6.15. Dependența modulului de stocare G’(simboluri pline) și a modulului de pierdere G” (simboluri goale) în timp, pentru diferite concentrații 5%, 10%, 20%, 40 % și raport molar de 1/3 (SH/C= C)

Așa cum se poate observa din figura 6.18, la începutul procesului de gelifiere modulul de pierdere G " a prezentat valori mai mari decât ale modulului de stocare G ' fapt ce ne-a indicat un comportament de curgere lichid al amestecului de polimer. Totuși, odată cu creșterea timpului, modulul de stocare G' a început să crească rapid, mai târziu depășindu-l pe cel de pierdere G ". Punctul de intersecție a modulelor vâscoelastice, reprezentat de linii verticale punctate în interiorul casetei din figura 6.15, indică începerea procesului de gelifiere (apariția de structuri reticulate). Pentru toate probele, procesul de gelifiere a fost finalizat complet după 25 de minute, când ambele module vâscoelastice au devenit aproape independente în timp sau au atins cel puțin 90% din valoarea lor maximă. Procesele de gelifiere, precum și cinetica de gelifiere, au fost puțin diferite în momentul în care concentrațiile de polimeri (5%, 10%, 20%, 40%) din amestecurile de polimeri au fost variate. De asemenea, se poate observa, că datorită concentrației scăzute de polimer, reacția de reticulare (gelifiere) a început după 4 minute la concentrația polimerului de 5%. Cu toate acestea, odată cu creșterea concentrației de polimeri la 10%, timpul de gelifiere a scăzut sub 1 minut, iar mai apoi a crescut ușor, odată cu creșterea concentrației de polimer în amestec. Creșterea ușoară la 1,2-minute sau 1,8-minute pentru concentrația de 20% și, respectiv, 40% este probabil legată de posibilitatea scăderii gradului de reticulare datorită constrângerilor crescute ale mobilității lanțurilor de polimeri, chiar dacă concentrația polimerului a crescut. Pe baza rezultatelor obținute cu ajutorul analizei foto-reoligice putem afirma că un rol important în tăria structurală a gelurilor este jucat de concentrația totală a amestecului de polimeri. De asemenea, cea mai mare rigiditate, de aproape 10 kPa pentru modulul de stocare, a fost înregistrată pentru gelul cu o concentrație totală de polimeri de 20 %, în timp ce la concentrația totală de polimeri de 40% au fost înregistrate valori apropiate de valorile obținute la concentrația totală de polimeri de 10 %. Aceasta indică că, la fel ca în cazul cineticii de reticulare, de asemenea pentru rigiditatea per ansamblu există un optim în domeniul de concentrație totală de polimeri cuprinsă între 10% și 20%.

6.1.1.3.5. Caracterizarea prin microscopie SEM

Caracteristicile mofologice ale gelurilor polimerice liofilizate au fost analizate cu ajutorul tehnicii de microscopie electronică de baleiaj. Gelurile preparate au fost analizate în secțiune transversală urmărind a stabili influența raportului molar SH/C=C și a concentrației totale inițiale de polimeri asupra morfologiei materialelor.

Pentru început a fost evaluată morfologia secțiunii transversale a probelor de geluri cu un raport molar SH/C=C diferit (figura 6.19).

Se poate observa că probele de geluri preparate cu exces de PEG-SH (figura 6.16 A-C) prezintă o structură macroporoasă cu pori interconectați, având dimensiunea cuprinsă între 10 și 40 µm. Structura poroasă este omogenă, dar poate fi observată și o regiune mică mai puțin poroasă. Apariția structurilor poroase este probabil legată de condițiile specifice de adiție a tiolului, în particular, a conținutului ridicat de PEG-SH în rețea. Creșterea cantității de PGL în raport echimolar SH/C=C a condus la o scădere a preponderenței regiunilor poroase din geluri (figura 6.16 D-F). Astfel, în cazul raportului molar de 1/1 (SH/C=C) a fost observată apariția unor pori mari cu dimensiuni și forme neregulate. De asemenea, gelurile obținute la un raport molar de 1/4 (SH/C=C), având exces de PGL nu au prezentat morfologie poroasă, porii nemaifiind prezenți (figura 6.16 G-I). Cu toate acestea, se poate observa o anumită eterogenitate la o rezoluție mai mare (0,05 mm) (figura 6.16 I) care ar putea fi cauzată de o separare de fază datorită reticulării polimerilor cu proprietăți hidrofile/hidrofobe diferite. Aceste microfaze sunt răspândite uniform, având în medie o dimensiune de aproximativ 1 μm, deci putem afirma că formarea structurilor poroase este dependentă și de concentrația inițială a polimerilor.

Figura 6.16. Imaginile SEM – secțiune transversală a probelor preparate folosind un rapoarte molare (SH/C=C) (A, B, C – 3/1, D, E, F – 1/1 și G, H, I – 1/4) diferite și concentrația totală de polimeri de 20 % prezentate la diferite mărimi (mărire grafică: A, D, G – 1 mm, B, E, H – 0,5 mm și C, F, I – 0,05 mm).

După cum se poate observa din figura 6.17 morfologia gelurilor obținute la un raport molar de 3/1 (SH/C=C) este poroasă cu dimensiuni și forme de pori destul de regulate pentru fiecare concentrație. Materialele obținute la concentrații mai mici prezintă o dimensiune mai mare a porilor, adică aproximativ 30, 60 și 150 µm pentru gelurile obținute la concentrația totală inițială a polimerilor de 20, 10 și respectiv 5%. Așadar, mărimea porilor poate fi controlată utilizând concentrații de polimeri diferite. Deși este evident că procesul de adiție tiol-enă guvernează formarea porilor, în descrierea exactă a mecanismului trebuie luate în considerare interacțiunile dintre polimeri și mediul THF în timpul reacției de reticulare.

Figura 6.17. Imagini SEM – secțiune transversală a probelor preparate folosind raportul molar de 3/1 (SH/C=C) și concentrații totale de polimeri diferite A,B – 20 %, C,D – 10 % and E,F – 5 %) prezentate la diverse marimi (mărire grafică: A,C,E – 0.5 mm, B, D, F – 0.3 mm)

Din informațiile noastre, procesul de formare a porilor în timpul unei reacții de reticulare prin cuplarea tiol/enă fotoindusă a polimerilor hidrofili/hidrofobi (cum ar fi PEG-SH și PGL) nu a fost analizat până în prezent. După cum s-a descris anterior în literatură, polimerii care conțin mezo-/macropori pot fi preparați prin separarea de fază indusă de reacție. Prin urmare, polimerii se separă treptat din soluție pentru a forma micro-faze reticulate care pot fi considerate ca unități ale rețelei, urmate de reticularea covalentă în diferite direcții într-o rețea microscală 3D. Astfel de rețele polimerice poroase sunt preparate de obicei prin polimerizare directă, unde separarea de faze are loc în timpul procesului de polimerizare. Cu toate acestea, în cazul nostru, separarea fazelor apare probabil în timpul reticulării. Abundența fazelor de PEG-SH din THF par să aibă un efect porogen important deoarece structurile poroase sunt obținute pentru un conținut ridicat de PEG-SH în concentrația inițială de polimeri.

Observarea structurii poroase susține, de asemenea, ipoteza noastră conform căreia o anumită fază polimerică reticulată este formată în timpul procesului de adiție tiol-enă, împiedicând conversia mai mare a grupărilor tiol. O astfel de separare a fazei polimerice conduce la captarea locală a speciilor reactive și la consum, în timp ce lanțurile libere de polimeri din soluția THF nu vor fi reticulate prin adiția tiol-ene.

6.1.1.3.6. Analiza comportamentului la umflare

Materialele au fost preparate prin reticularea unui polimer hidrofil și hidrofob. Prin urmare, ar fi de așteptat ca acestea să posede capacitate de a se umfla atât în medii hidrofile sau hidrofobe, capacitate care le-ar include în categoria conectorilor amfifili . Comportamentele de umflare ale probelor realizate au fost studiate prin metoda gravimetrică în apă și THF prin măsurarea cantității de lichid absorbit la intervale de timp prestabilite, până la atingerea echilibrului umflării.

Toate gelurile preparate au avut o absorbție destul de scăzută a apei, cuprinsă în intervalul de 20% până la 70% (figura 6.18). Acest comportament era de așteptat să depindă de conținutul PEG-SH, polimerul hidrofil prezent în amestecul de reacție, însă cel mai bun raport de umflare în apă a fost obținut pentru probele obținute la un conținut ridicat de PEG-SH și la o concentrație inițială totală de polimeri de 20%.

Figura 6.18. Gradul de umflare a gelurilor în apă

Absorbția mai ridicată a apei pentru gelurile obținute la o concentrație mai mare de polimer este contrară așteptărilor noastre, deoarece la o concentrație inițială de polimeri mai scăzută, ar trebui să se formeze o rețea mai liberă, având în vedere porii observați în imaginile SEM, care au fost mai mari pentru concentrațiile polimerice mai scăzute și, deci, ne așteaptam la proprietăți mai bune de umflare.

Prin urmare, putem afirma că apa nu interacționează corect cu gelurile, chiar și în cazul celor care au un conținut mai mare de PEG-SH. Numai în cazul gelurilor preparate la o concentrație inițială de polimeri de 20%, absorbția de apă a crescut odată cu conținutul inițial de PEG-SH. Cu toate acestea, dată fiind prezența PGL (polimer hidrofob) ca parte a rețelei, interacțiunea observată cu apa este o caracteristică remarcabilă.

Spre deosebire de comportamentul gelurilor în apă, au fost observate proprietăți foarte bune de umflare în THF, gradul de umflare a gelurilor fiind cuprins în intervalul 400-1000% (figura 6.19). Gradul de umflare a gelurilor în THF a arătat o dependență atât de raportul molar SH/C=C, cât și de concentrația inițială totală a polimerilor. În cazul gelurilor obținute la concentrații mai mici de polimeri (5% ), s-a observat un grad de umflare mai mare în THF, probabil datorită unei rețele mai relaxate comparativ cu cele două concentrații mai mari (10 și 20%). Valorile gradului de umflare au crescut, de asemenea, odată cu creșterea conținutului de PGL. Astfel, spre deosebire de apa care probabil penetrează rețeaua gelurilor numai în apropierea fazelor de PEG-SH accesibile sau sunt slab reticulate, THF-ul interacționează bine cu toate componentele rețelei, argumentând astfel natura sa hidrofobă. Cineticile gradului de umflare în apă și THF sunt evidențiate în figurile 6.20 și 6.21.

Figura 6.19. Gradul de umflare a gelurilor în THF

Rezultatele experimentale obținute în cazul proprietăților de umflare ale materialelor pe bază de PGL atât în apă cât și în THF ne-au sugerat că PEG-SH nu face parte în totalitate din rețeaua reticulată și există posibilitatea pierderii capetelor de lanț ale polimerului (PEG-SH) nereacționate. Acest lucru este, de asemenea, justificat și de un număr mare de grupări tiol nereacționate. Mai mult decât atât, apa ar putea fi absorbită doar superficial de rețeaua reticulată și, probabil, nu difuzează pe deplin în structura interioară polimerică, care este în mare măsură hidrofobă. Acest comportament este observat chiar și pentru probele preparate cu un exces mare de PEG-SH în amestecul inițial de reacție. Totuși, proprietățile de umflare în apă a unui polimer puternic hidrofob ca PGL pot fi modificate prin cuplarea tiol-enă cu o pereche mai hidrofilă. O astfel de caracteristică ar fi foarte valoroasă în modificarea caracterului hidrofob al altor polimeri prin cuplarea tiol-enă.

Figura 6.20. Cinetica gradului de umflare a gelurilor preparate în apă

Figura 6.21. Cinetica gradului de umflare a gelurilor preparate în THF

6.1.1.3.7. Citotoxicitate

Posibilitatea utilizării materialelor pe bază de PGL pentru aplicații biomedicale a fost deasemenea investigată. În acest sens, a fost evaluată citotoxicitatea pe baza normei ISO 10993-12 a polimerilor sintetizați și utilizați la prepararea gelului, precum și a extractelor de gel. După cum ne așteptam, PEG-SH este un polimer puternic biocompatibil și viabilitatea celulară a fibroblastelor 3T3 tratate cu concentrații de până la 10 mg/ml a fost comparabilă cu viabilitatea celulelor martor netratate (Figura 6.22 A).

Figura 6.22. Cititoxicitatea polimerilor, utilizați la preparare gelurilor, la 3T3 fibroblasts: A) PEG-SH, B) Extracte obținute pe bază de cantități diferite de PGL, C) PGL. Linia punctată reprezintă viabilitatea celulelor de control netratate care a fost considerată a fi de 100%. Semnificația diferențelor la nivel diferit este indicată de asteriscuri: * P > 0.05, și respectiv *** P > 0.001.

Studii similare în care derivați de PEG modificați cu anhidridă maleică (MA) sau acid DL-tiomalic (TMA) au fost sintetizați au demonstrat de asemenea, că acești derivați prezintă o citotoxicitate foarte scăzută la celulele mezoteliale umane Met-5A 2 .

De asemenea, PGL, a fost evaluat din punct de vedere al citotoxicității. Deoarece polimerul PGL este insolubil în apă, extractul de pulbere a fost utilizat pentru evaluarea citotoxicității. În studiul lui van der Meulen et al. viabilitatea fibroblastelor 3T3 a scăzut cu mai mult de 1/3 în comparație cu celulele martor, dacă au fost incubate cu extracte din 0,1 g/ml de PGL.

În prezentul studiu s-au utilizat extracte din 0,2 g/ml de PGL și diluții corespunzătoare în conformitate cu ISO10993-12 (figura 6.22 B). După cum observăm în figură, extractele de 0,2 g/ml sunt deja foarte citotoxice pentru fibroblastele 3T3. Extractele de 0,1 g/ml au scăzut viabilitatea celulelor până la cca. 50%, ușor mai redus ca în studiul lui van der Meulen et al., corespunzând astfel concentrației de inhibitorii (IC50). În plus, a fost testată și viabilitatea celulară atunci când pulberea PGL a fost adăugată direct în mediul de cultură (figura 6.25 C). La o concentrație de 10 mg/ml, viabilitatea celulelor a scăzut la aproximativ 90% corespunzând citotoxicității extractelor de aceeași concentrație.

De asemenea, a fost evaluată citotoxicitatea a trei probe de geluri cu rapoarte molare (SH/C=C) diferite (figura 6.23). Toate rețelele de polimeri testați sunt considerate biocompatibile până la o concentrație de 50 mg/ml de conținut de gel solid în extracte, rezultând o viabilitate celulară mai mare de 80%. Scăderea viabilității celulelor la ~ 80% la un nivel semnificativ statistic (P > 0,001) este valabilă pentru extractele de geluri cu rapoarte molare (SH/C=C) de 1/2 și 1/1. Dacă celulele au fost tratate cu extracte obținute din 100 mg/ml de gel solid, citotoxicitatea a crescut semnificativ în toate cazurile (P> 0,001). Interesant este faptul că, cea mai mare scădere a viabilității celulare este observată pentru raportul molar (SH/C=C) de 1/1, iar cel mai biocompatibil gel a fost cel cu un raport (SH/C=C) de 1/2 care conține cel mai mare conținut de sulf reacționat. Diferențele rezultate pentru citotoxicitate între geluri pot fi atribuite interacțiunii dintre mai mulți factori, care sunt efectele sterice, aciditatea tiolului și stabilitatea anionului tiolat și a radicalului tiil, hidrofilicitatea, interacțiunile proteice și gradul de puritate a polimerilor.

Figura 6.23. Citotoxicitatea extractelor de geluri pentru fibroblastele 3T3 de șoarece. Diferențele statistice semnificative sunt indicate prin asteriscuri: * P> 0,05, ** P> 0,01 și *** P> 0,001

6.1.1.3.8. Capacitatea de includere și eliberare a principiilor active

Potențialul utilizării materialelor pe bază de PGL pentru transportul de medicamente, de asemenea a fost studiat.

Caracteristicile de încărcare și de eliberare a medicamentelor din materialele pe bază de PGL au fost examinate utilizând Levofloxacin (LEV), un antibiotic fluorochinolon din generația a treia, ca model de medicament. A fost investigată influența raportului molar (SH/C=C) și a concentrației inițiale totale de polimeri a gelurilor obținute asupra capacității de încărcare a medicamentului. Astfel, probe diferite au fost încărcate cu LEV în THF și, apoi, LEV eliberat într-o soluție de acetat buffer ABS (pH = 5,5) a fost monitorizat și măsurat.

Cantitatea de LEV încărcată după 48 de ore a variat între 0,32 și 0,41 mg LEV/mg PGN (tabelul 3.13), însă nu a fost observată nici o diferență semnificativă în ceea ce privește influența concentrației inințială totală de polimeri sau a raportului molar (SH/C=C). S-a constatat că probele cu un conținut mai mare de PGL (raportul molar SH/C=C de 1/4) au prezentat o capacitate de încărcare a LEV mai mare, probabil datorită unui grad de umflare mai bun în THF. Pentru a evalua eliberarea LEV, gelurile încărcate cu medicamente au fost spălate ușor cu apă distilată pentru a înlătura THF-ul și clătite ușor cu apă distilată și uscate înainte de a fi adăugate în mediul de eliberare. Datele cinetice din figura 6.24 sunt prezentate ca un exemplu pentru probele G3, G12 și G18). Datele experimentale obținute pentru cinetica de eliberare a medicamentului au evidențiat o fază rapidă care este atinsă în primele 10 ore de eliberare, urmată de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 48 de ore.

Eliberarea susținută a LEV poate fi explicată prin faptul că medicamentul eliberat a fost adsorbit în intimitatea gelului datorită umflării excelente în THF. Prin analiza influenței parametrilor de preparare asupra capacității de eliberare a gelurilor, s-a observat un comportament similar cu cel al încărcării medicamentului. Cantitatea maximă eliberată de LEV a variat între 0,22 și 0,38 mg/mg gel (tabelul 6.10) și nu a fost observată o diferență semnificativă între probele analizate.

Figura 6.24. a) Incărcare LEV; b) Eliberare LEV in vitro pentru probele G3,G12,G18

Tabel 6.10. Cantitățile de LEV încărcate și eliberate pentru probele de geluri analizate

De asemenea, eficiența eliberării LEV pentru probele analizate au evidențiat valori cuprinse între 66 și 100% (figura 6.25, tabel 6.10), cea mai mare eficiență fiind observată pentru proba G17 și G18 care s-a dovedit a fi poroasă și care prezintă, de asemenea, o absorbție de apă ridicată. Analiza cineticii de eliberare a fost realizată pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas (figura 6.26) având următoarea ecuația 6.4:

(6.4)

Unde:

Mt/M∞ – reprezintă fracția de medicament eliberată la timpul t;

k – constanta vitezei de eliberare;

n – exponentul de eliberare.

Prelucrarea rezultatelor obținute în urma analizei cineticii experimentale pe intervalul 0 – 360 minute a permis calculul exponentului difuzional ca fiind n = 0.4811. Aceasta valoare (0.5< n<1.0) sugerează o difuzie Fickiană, procesul de transport/eliberare al medicamentului prin matricea polimeră fiind guvernat de difuzie , , .

Figura 6.25. Eficiența de eliberare a LEV pentru probele G3,G12,G18

Figura 6.26. Aplicarea modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare specifică a probei de gel G3

Rezultatele obținute au demonstrat că materialele pe bază de PGL pot fi sisteme promițătoare și atractive pentru transportul medicamentelor pentru o gamă variată de aplicații biomedicale.

6.2 Concluzii parțiale

Rezultatrele obținute permit a afirma că s-a realizat cu succes adiția tiol-enă radicalică între doi polimeri (PGL și PEG-SH) cu proprietăți hidrofile/hidrofobe foarte diferite, prin reacție fotoinițiată.

A fost studiat efectul parametrilor de sinteză cum ar fi concentrația inițială totală de polimeri și raportul molar SH/C=C asupra structurii și proprietăților gelurilor finale. Fracțiile de gel recuperate au avut cele mai ridicate valori pentru concentrația inițială de polimeri de 20% în amestecul de reacție, acestea având un trend crescător odată cu creșterea conținutului inițial de PGL (scăderea raportului SH/C=C).

Metodele de caracterizare utilizate (Raman, FTIR, analiza elementară și titrarea grupurilor tiol) au evidențiat faptul că rămân nereacționate cantități semnificative de grupări SH. În timp ce, pentru rapoartele 1/4 SH/C=C au rămas nereacționate circa 20% din grupele tiol, pentru un raport molar de 1/1 SH/C=C numai 50% din sulful determinat în produsul final provine din grupările tiol reacționate.

Sistemul de reacție utilizat conduce la formarea de structuri uniforme macroporoase, demonstrate aici pentru prima dată pentru materialul preparat prin reacția tiol-enă fotoinițiată dintre doi polimeri. Formarea unei astfel de morfologii depinde atât de concentrația inițială a polimerilor, cât și de raportul molar dintre polimerii care reacționează. Astfel, excesul de PEG-SH (3/1 SH/C=C) conduce la formarea porilor de interconectați distribuiți uniform, după cum s-a observat prin analiza SEM. Prin creșterea cantității de PGL în amestecul inițial de reacție, caracterul poros al materialelor PGN scade (la 1/1 SH/C=C) până la dispariția completă (1/4 SH/C=C). De asemenea, mărimea porilor depinde de concentrația inițială totală a polimerilor participanți la reacția de adiție tiol-enă.

Materialele preparate au demonstrat un grad de umflare bun în THF și o absorbție destul de limitată de apă.

Citotoxicitatea rețelelor reticulate, determinată utilizând fibroblastele 3T3, a demonstrat că materialele pe bază de PGL posedă o biocompatibilitate ridicată de până la 50 mg/ml de conținut de gel solid în extracte și pot fi luate în considerare pentru utilizarea în aplicațiile biomedicale.

Cinetica de eliberare în buffer acetat (pH=5,5) a unor medicamente model încărcate în geluri din soluție în THF evidențiază o eliberare rapidă în primele 10 ore, urmată apoi de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 48 de ore.

În ansamblu, studiul realizat demonstrează posibilitatea de a încorpora polimeri hidrofili în rețele de poliglobalidă hidrofobe prin cuplarea polimer-polimer tiol-enă, pentru a obține biomateriale poroase netoxice cu posibile aplicații ca dispozitive de transport și eliberare a medicamentelor. Mai mult, porozitatea acestor materiale poate avea importanță pentru aplicațiile de inginerie tisulară.

Capitolul 7. Sisteme micro/nanoparticulate polimer-medicament pe bază de chitosan grefat cu poli(etilen glicol) metacrilat

Capitolul are ca scop prezentarea obținerii unor sisteme polimer-medicament sub formă de micro/nanoparticule originale încărcate cu principii biologic active pentru tratarea unor afecțiuni ale polului posterior al ochiului. Sunt discutate în detaliu rezultatele experimentale obținute, tehnicile experimentale și metodele de caracterizare utilizate.

7.1. Rezultate și discuții

7.1.1. Sinteza și caracterizarea chitosanului grefat cu metacrilat de poli(etilen glicol)

Acest subcapitol raportează prepararea de micro/nanoparticule pe bază de CS-g-poli(etilen glicol) metacrilat (CS-g-PEG-MA) prin dublă reticulare în emulsie inversă.

Funcționalizarea chitosanului cu metacrilat de poli(etilen glicol) (CS-g-PEG-MA) a fost realizată conform protocolului descris detaliat în subcapitolul 5.2.4. Calea propusă pentru a sintetiza derivatul de chitosan avut la bază reacția de tip adiție Michael raportată anterior de Ma și colaboratorii săi. . Reacția de funcționalizare este prezentată în schema 7.1. Etapele preparării chitosanului funcționalizat cu poli(etilen glicol) metacrilat sunt prezentate în figura 7.1. Justificarea utilizării CS, după cum s-a, prezentat anterior, are la bază ideea introducerii unor proprietăți noi polimerului, respectiv sistemelor de micro/nanoparticule obținute. În special, s-a dorit îmbunătățirea solubilității chitosanului în medii apoase prin modificarea chimică a grupărilor aminice de pe catena liniară a chitosanului prin intermediul segmentelor de PEG-MA hidrofile.

Schema 7.1. Reacția de functionalizare a chitosanului cu poli(etilen glicol) metacrilat

Figura 7.1. Etapele preparării chitosanului funcționalizat cu poli(etilen glicol) metacrilat:

a) obținerea soluției de chitosan; b) adăugarea poli(etilen glicolului) metacrilat în soluția de chitosan; c) barbotarea cu azot a amestecului de reacție; d)etapa de rotavapare cu scopul de a eliminare apei din soluția de polimer modificat; e) purificarea derivatului de chitosan funcționalizat/precipitarea soluției de polimer; f) produsul final înainte de uscarea la vid

O primă caracterizare structurală a derivatului de chitosan obținut a constituit-o spectroscopia în Infraroșu cu Transformată Fourier. Spectrele FT-IR ale CS, PEG-MA, PEG-MA-g-CS sunt prezentate în figura 7.2 și tabelul 7.1. În spectrul FT-IR al CS s-a evidențiat un la 3365 cm-1 o bandă de absorbție puternică corespunzătoare vibrației axiale de întindere a grupărilor -OH suprapusă la banda de întindere -NH2 și legăturilor inter- și extra-moleculare de hidrogen ale moleculelor CS, care a scăzut în cazul derivatului de CS. Benzile de absorbție de la 1653, 1423 și 1379 cm-1 sunt corespunzătoare unităților NHAc, amidei I, deformării -NH2 și amidei III . Vibrațiile de întindere caracteristice ale -C-O-C și ale structurii de polizaharidă a CS le regăsim la 1076 cm-1 . Semnalul proeminent al benzii de absorbție de la 1716 cm-1 corespunde vibrațiilor dublei legături ale PEG-MA. Funcționalizarea chitosanului cu poli(etilen glicol) metacrilat este confirmată de apariția a două noi benzi de absorbție. Primul semnal nou care confirmă prezența PEG-MA în structura derivatului de CS se evidențiază la 1730 cm-1 și este atribuit benzii de absorbție al legăturilor duble C=O din gruparea esterică -OCOR. Al doilea semnal nou a apărut la 1651 cm-1 și este caracteristic nucleului glicozidic al chitosanului. A fost observată o ușoară deplasare a benzilor de absorbție pentru produsul modificat comparativ cu produsele inițiale, cauza fiind grupele vecine care influențează lungimea de undă la care apar benzile. Semnalul pentru gruparea aminică secundară care s-a format nu poate fi evidențiat deoarece acesta ar trebui să apară în intervalul 3300 ÷ 3400 cm-1. Atât CS cât și PEG-MA dețin grupe hidroxilice în structură acestea dând un semnal în jurul aceleiași valori de 3300 ÷ 3400 cm-1 care, de asemenea, se suprapun cu benzile grupei aminice secundară (-NH-). Semnalele de la 2941 și 2879 cm-1 sunt caracteristice vibrațiilor de întindere a C-H, dar ele nu sunt semnificative deoarece atât pentru CS cât și pentru PEG-MA au aproximativ aceeași valoare. De asemenea, s-a observat și o scădere în intensitate a benzilor de absorbție la 3435 și 1716 cm-1 datorită participării acestora la reacție.

Tabelul 7.1. Benzile de absorbtie caracteristice ale CS, PEG-MA, CS-g-PEG-MA

Figura 7.2. Spectrele FT-IR comparative ale CS, PEG-MA, CS-g-PEGMA

Caracterizarea structurală a chitosanului funcționalizat cu PEG-MA prin rezonanță magnetică nucleară a evidențiat faptul că spectrul acestuia conține semnale ce provin din ambele structuri ale produșilor inițiali. Adiția PEG-MA la catena principală a chitosanului este confirmată de dispariția peakurilor de la 5,6 și 6,0 ppm corespunzătoare protonilor dublei legături (CH2 = CH) din PEG-MA. În spectrul CS-g-PEG-MA se observă apariția picului de la 1,994 ppm corespunzător legăturii (-NH-CH2 -), apărute în urma grefării chitosanului cu PEG-MA. În spectrul corespunzător chitosanului în intervalul 3,1 – 4,0 se remarcă semnalele de rezonanță ale protonilor carbonilor unității glucozaminice a chitosanului (H2, H3-H6) , . În spectrul chitosanulului de plecare există peack-ul de la 1,962 ppm, corespunzător celor 3 H+ din gruparea acetil (-NH-CO-CH3), specifică resturilor de chitină.

Spectrele 1H RMN și peakurile specifice ale protonilor CS, PEG-MA, CS-g-PEG-MA sunt prezentate în figura 7.3 (a, b, c).

Calculul gradului de substituție s-a realizat conform ecuației (7.1) de mai jos:

DS = 3·I3,1 ppm·(1-DD)/2·I2,0 ppm (7.1)

Gradul de substituție, DS = [3x(10/3)x(1-0,815)]/(2×8.27) x 100 = 11,2%.

Gradul de substituție este suficient de ridicat, având în vedere intenția de a prepara nanoparticule.

Figura 7.3. Spectrul 1H RMN al a) chitosanului; b) PEG-MA; c) CS-g-PEG-MA

Chitosanul și CS-g-PEG-MA au fost caracterizați termic sub aspect al degradării sub acțiunea temperaturii, prin analiza termogravimetrică.

Pierderile de masă în urma degradării termice pentru produsul CS-g-PEG-MA se datorează atât degradării chitosanului, cât și a poli(etilenglicol) metacrilat-ului. După cum se observă din figura 7.4 a chitosanul prezintă trei etape de degradare termică (tabel 7.2) și anume:

– prima etapă (30 ÷100ᴼC) pe care o putem asocia cu eliminarea apei și pierderea compușilor volatili;

– a doua etapă (255÷465 ᴼC) care se datorează descompunerii chitosanului,

– ultima etapă (465 ÷ 800 ᴼC ), care este pusă pe seama degradării integrale a materialului, respectiv calcinării lui când temperatura depășește 800 ᴼC.

De asemenea, termograma produsului CS-g-PEG-MA (figura 4.25 b) evidențiază trei trepte de pierdere de masă:

primele două trepte de pierdere de masă (50 – 350 ᴼC, 44,75 %) sunt caracteristice pierderilor de apă și a compușilor cu masa moleculară mica, volatili, din probă, respectiv degradării termice a produsului.

a treia treaptă are loc la temperatura de 345,24 ᴼC , în care are loc o pierdere de masă de 25,54%, fiind atribuită unor modificări chimice complexe, incluzând deschiderea inelului zaharidic, degradarea lanțului molecular acetaminofen și N- deacetilarea fragmentelor.

O explicație posibilă pentru diferențele apărute între curba termogramei chitosanului și cea a CS-g-PEG-MA poate fi datorată PEG-MA cu care a fost funcționalizată polizaharida. Concluzia care poate fi desprinsă pe baza informațiilor prezentate anterior este faptul că din punct de vedere termic CS-g-PEG-MA este mai puțin stabil comparativ cu chitosanul, efect care este pus pe seama reducerii numărului de legături de hidrogel dintre lanțurile de polizaharid, ca urmare a interpunerii între acestea a grefelor de poli(etilen glicol) metacrilat.

Tabel 7.2. Rezultatele analizei termogravometrică pentru CS, PEG-MA; CS-g-PEG-MA

Figura 7.4. Termograma a) chitosanului b) produsul CS-g-PEG-MA

7.1.2. Prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de CS-g-poli(etilen glicol) metacrilat prin dublă reticulare în emulsie inversă

Această parte a studiului se referă la prepararea și caracterizarea de noi micro/nanoparticule pe bază de chitosan funcționalizat cu poli(etilen glicol) metacrilat (CS-g-PEG-MA).

Prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de CS-g-PEG-MA s-a realizat prin procedeul dublei reticulări (ionică și covalentă) într-un sistem de emulsie de tip apă în ulei (w/o) , , , justificarea selecției acestei tehnici a fost în principal datorită necesității obținerii unui sistem cu o toxicitate redusă, condiție obligatorie având în vedere scopul final al micro/nanoaprticulelor și anume utilizarea în domeniul biomedical cu scopul tratării unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului. Modul de lucru utilizat este descris detaliat în subcapitolul 5.2.6. Protocoalele experimentale cu parametrii observați pentru pregătirea micro/nanoparticulelor sunt prezentate în tabelul 7.3 și 7.4. Micro/nanoparticulele obținute au fost supuse caracterizării, și anume: diametrul și polidispersitate; morfologie; comportament de umflare, încărcare și eliberare de medicament, potențial Zeta, hemocompatibilitate, test de toxicitate și citotoxicitate.

Tabel 7.3. Planul experimental pentru sinteza micro/nanoparticulelor de CS-g-PEG-MA reticulate ionic cu tripolifosfat de sodiu.

Tabel 7.4. Variația parametrilor pentru sinteza micro/nanoparticulelor de CS-g-PEG-MA reticulate ionic cu sulfat de sodiu

7.1.2.1. Caracterizarea structurală a nanoparticulelor prin Spectroscopia în Infraroșu cu Transformată Fourier

Spectroscopia FT-IR a nanoparticulelor obținute a confirmat formarea rețelei polimere ca urmare dublei reticulări. Spectrele FT-IR au fost înregistrate pentru toate micro/nanoparticulele obținute, acestea prezentând profil similar; de aceea au fost alese drept exemplu reprezentativ doar spectrele FT-IR înregistrate pentru două probe MA-8 și MA-H, diferența între acestea fiind tipul de reticulant ionic.

După cum se poate observa din figura 7.6, spectrele celor două probe prezintă semnale caracteristice ale benzilor de absorbție a legăturilor corespunzătoare tipului de reticulant utilizat și confirmă formarea de legăturilor prin procesul de reticulare ionică între anionii sulfat din Na2SO4 și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-MA precum și a legăturii iminice prin procesul de reticulare covalentă între grupele aminice ale polimerilor și grupele carbonil ale aldehidei glutarice. Semnalele benzilor de absorbție corespunzătoare legaturilor iminice –C=N- rezultate în urma reticulării covalente se evidențiază la 1544 cm-1 în cazul probei 5 și la 1548 cm-1 pentru proba E. Pentru proba 8 semnalul benzii de absorbție de la 891 cm-1 este specific legăturilor nou formate prin procesul de reticulare ionică între polianionii de tripolifosfat și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-MA, iar în cazul probei MA-H legătura nou formată se observă la 636 cm-1. Benzile de absorbție caracteristice micronanoparticulelor pe baza chitosanului funcționalizat sunt prezentate în tabelul 7.5 , , , , .

Figura 7.6. Spectrele FT-IR comparative ale CS-g-PEG-MA și micro/nanoparticulelor pe baza derivatului de chitosan

Tabelul 7.5. Benzile de absorbție caracteristice ale CS-g-PEG-MA din micro/nanoparticulele obținute pe baza derivatului de chitosan

7.1.2.2. Analiza de Calorimetrie Prin Scanare Diferențială (DSC)

Conform curbelor prezentate în termograma din figura 7.7 se poate observa că în urma procesului de topire apare un vârf endotermic al chitosanului care se evidențiază la 94,01 șC, al derivatului de chitosan la 102,56 șC și al nanoparticulelor la 106,2 șC. Comparând rezultatele obținute se poate afirma că alura termogramei nanoparticulelor este asemănătoare cu a cea a chitosanului și a CS-g-PEG-MA, sugerând o bună stabilitate termică a acestora. De asemenea, apariția vârfului exotermic la 253,75 șC indică formarea de noi legături chimice în structura nanoparticulelor care pot fi atribuite proceselor de reticulare ionică și covalentă .

Figura 7.7. Termograma pentru chitosan, CS-g-PEG-MA, micro/nanoparticule

7.1.2.3. Caracterizare prin microscopia electronică de baleiaj SEM

O altă metodă importantă de caracterizare a micro/nanoparticulelor preparate conform protocolului experimental prezentat la subcapitolul 7.1.2, este microscopia electronică de baleiaj, care evidențiază proprietățile morfologice și dimensionale ale particulelor. Având în vedere scopul final al particulelor și anume tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior, se impune ca acestea să prezinte dimensiuni submicronice, stabilitate și individualitate.

Este important de reamintit că strategia aleasă în vederea preparării particulelor a constituit-o procedeul de dublă reticulare în emulsie inversă, acesta presupunând în primă etapă un proces de reticulare ionică majoritar de 80 % din grupele aminice ale CS-g-PEG-MA, urmat de etapa de reticulare covalentă a grupărilor aminice în proporție de aproximativ 20 %, cu scopul de a asigura stabilitatea mecanică a particulelor. Microfotografiile SEM ale particulelor obținute în primele etape ale studiului sunt prezentate în figura 7.8. În cadrul sintezelor perioada procesului de reticulare a variat între 10 și 150 minute, cu menținerea constantă a tipului și perioadei procesului de reticulare covalentă (60 respectiv 120 minute). În cazul probelor MA-1, MA-2, MA-3, MA-4 a fost utilizat ca reticulant ionic tripolifosfat de sodiu, iar pentru probele MA-A, MA-B, MA-C, MA-D a fost folosit sulfatul de sodiu. Se poate constata că primele micro/nanoparticule sintetizate indică o formă ușor sferică acestora, fapt ce sugerează că timpul de reacție (reticulare ionică) a fost insuficient pentru evoluția acestora. De asemenea, formarea aglomeratelor cu dimensiuni medii de 2-3 µm și o polidispersitate dimensională destul de largă, dovedește faptul că nu pot fi utilizate pentru administrarea pe cale injectabilă.

După primele etape ale optimizării, care au implicat creșterea raportului reticulant ionic /polimer micro/nanoparticulele preparate prezintă formă sferică, sunt individualizate, diametrul și polidispersitatea sunt mult reduse comparativ cu primele încercări (figura 7.9 și 7.10).

De asemenea, imaginile SEM evidențiază diferențe morfologice importante în funcție de parametrii variați în prepararea micro/nanoparticulelor. Prin urmare, pentru probele MA-5÷8, respectiv MA-E÷H a fost menținută constantă concentrația soluției de polimer (0,5%) și raportul polimer/reticulant, modificându-se viteza de agitare de la 5,000 la 15.000 rpm/min. Se constată astfel că diametrul particulelor este influențat considerabil de viteza de agitare, acesta scăzând odată cu creșterea intensității de agitare. Viteza de agitare reprezintă un parametru decisiv în stabilirea diametrului micro/nanoparticulelor, odată cu creșterea acesteia picăturile fazei apoase fiind dispersate în picături mai mici.

Pentru setul de probe MA-8,9,11, respectiv MA-H,I,K, raportul de polimer/reticulant și viteza de agitare au fost menținute constante, modificându-se concentrația soluției de polimer. S-a observat că și în acest caz diametrul particulelor este influențat de concentrația soluției de polimer fiind mai mare în cazul probelor MA-11, respectiv MA-K, comportament raportat și în alte studii , .

Putem afirma că în momentul creșterii concentrației soluției de polimer, vâscozitatea acesteia crește conducând la obținerea de picături mai mari în faza de emulsie, respectiv în procesul de reticulare. După cum putem observa în cazul probelor MA-9 și I, soluția de polimer fiind mai diluată forma particulelor este neregulată, fapt datorat unei reticulări mai slabe. Pentru probele MA-11 și K, concentrația soluției de polimer a fost crescută la 0,75 %, restul parametrilor fiind menținuți constanți, ceea ce a condus la o creștere a diametrului și a polidispersității particulelor, și o scădere a tendinței de aglomerare. În cazul particulelor MA-10 și J, a fost modificat raportul polimer/reticulant ionic, fapt ce a determinat o creștere ușoară a diametrului particulelor, aspect pus pe seama creșterii densității de reticulare a matricii polimere.

Un alt aspect important evidențiat de fotografiile SEM este faptul că diametrul și polidisperistatea dimensională a particulelor este influențată de natura agentului de reticulare. Astfel, modificarea naturii reticulantului ionic în cazul probelor MA-A÷K fiind folosit sulfat de sodiu, conduce la creștere a diametrului particulelor conform cu așteptărilor noastre.

Figura 7.8. Imagini SEM ale probelor MA-1÷ și MA-A÷D

Figura 7.9. Imagini SEM ale micro/nanoparticulelor optimizate reticulate ionic cu TPP

Figura 7.10. Imagini SEM ale micro/nanoparticulelor optimizate reticulate ionic cu sulfat de sodiu

7.1.2.4. Analiza dimensională a particulelor prin difractometrie laser

Caracterizarea micro/nanoparticulelor prin difractie laser a furnizat informații cu privire la dimensiunea și polidispersitatea dimensională. Dimensiunea particulelor depinde concentrația soluției de polimer și de viteza de agitare în timpul procesului de preparare, fapt confirmat și de microfotagrafiile SEM. Astfel, agitarea la o viteza mai mare de rotatie a ultraturaxului implică o energie mai mare disipată în emulsia supusă agitarii, adica unui transfer de enegie mai mare ceea ce face ca emulsia să se spargă în picături mai mici, din care rezultă particule de dimensiuni nanometrice. Curbele de distribuție granulometrică a particulelor preparate (determinată prin difracție de fascicul laser) prezintă aspect unimodal și un diametru mediu de ordin nanomteric, în funcție de parametrii variați (figurile 7.11; 7.12; 7.13; 7.14 și tabelele 7.6 și 7.7).

Rezultatele obținute sunt în concordanță cu rezultatele analizei de microscopie electronică de baleiaj.

Figura 7.11. Influența concentrației de polimer asupra diametrului particulelor. Curbele de distribuție granulometrică a probelor MA-8 (0,5 %) ,9 (0,35 %),11 (0,75 %)

Figura 7.12. Influența vitezei de agitare asupra diametrului particulelor. Curbele de distribuție granulometrică a particulelor MA-8 (15.000 rpm), 7 (12.000 rpm), 6(9.000 rpm), 5 (5.000 rpm)

Figura 7.13. Influența concentrației de polimer asupra diametrului particulelor. Curbele de distribuție granulometrică a probelor MA-H (0,5 %), I (0,35 %), K (0,75 %)

Figura 7.14. Influența vitezei de agitare asupra diametrului particulelor. Curbele de distribuție granulometrică a particulelor MA-E (15.000 rpm), F (12.000 rpm), G (9.000 rpm), H (5.000 rpm)

Tabel 7.6. Diametrul mediu al probelor MA-5÷11, obținut în urma analizei prin difractometrie laser

Tabel 7.7. Diametrul mediu al probelor MA-E÷K, obținut în urma analizei prin difractometrie laser

7.1.2.5. Comportamentul la umflare

O caracteristică foarte importantă a particulelor cu caracter de hidrogel o constituie capacitatea de umflare în apă, respectiv în medii fiziologice, de diferite valori ale pH-ului. În urma analizei gradului de umflare a micro/nanoparticulelor optimizate în mediu acid (acetat buffer pH=3,4) și mediu bazic (fosfat buffer , pH= 7,4) după 24 ore s-au obținut următoarele rezultate (figurile 7.15 ; 7.16; 7.17 și tabelele 7.8 și 7.9):

Tabelul 7.8. Gradul de umflare al probelor MA-5÷11 în mediu acid după 24 ore

Tabelul 7.9. Gradul de umflare al probelor MA-E÷K în mediu acid după 24 ore

O primă constatare este aceea că pentru probele analizate valorile gradului maxim de umflare în tampon acetat ABS (pH= 3,3) sunt mai mari în comparație cu cele înregistrate în tampon fosfat (PBS, pH= 7,4). În acest caz, fiind în mediu acid, grupările aminice care nu au participat la reacțiile de reticulare devin protonate trecând în cationi amoniu, iar respingerile electrostatice care apar între macromolecule conduc la o creștere a spațiilor dintre ochiurile rețelei polimerice, deci la o retenție de apă mai mare, rezultând un grad de umflare mai ridicat. De asemenea valorile maxime ale gradului de umflare în mediu bazic sunt destul de mari.

După cum se poate observa din figura 7.16 influența vitezei de agitare și a concentrației soluției de polimer reiese clar și din rezultatele experimentale obținute în urma studiului gradului de umflare.

Creșterea concentrației soluției de polimer (figura 7.17) în ordinea MA-9, 8, 11, respectiv MA-I, H, K cu menținerea vitezei de turație constantă duce la modificări:

deși pentru probele MA-9, respectiv MA-I a fost utilizată o concentrație a soluției de polimer mai scăzută (0,35 %), gradul de umflare este cel mai mare; reducerea cantității de polimer este corelată cu reducerea numărului de grupe aminice participante la cele două tipuri de reticulări, astfel densitatea de reticulare scăzând, însă trebuie menționat că valorile sunt apropiate de cele ale gradului maxim de umflare pentru probele MA-8, respectiv MA-H (c= 0,5 %);

creșterea diametrului mediu al particulelor odată cu creșterea concentrației soluției de polimer a condus la o scădere a cantității de apă reținută și deci a gradului de umflare; valorile obținute pot fi puse pe baza tendinței mai mari de aglomerare a particulelor (și deci a unui grad de reticulare mai ridicat).

De asemenea, o scădere a gradului maxim de umflare odată cu creșterea cantității de TPP sau sulfat de sodiu în fapt a raportului molar TPP/grupe aminice sau sulfat de sodiu/grupe aminice a fost înregistrat și în cazul probelor MA-10 și MA-J, deci rezultatul este unul firesc datorită creșterii densității de reticulare.

Pentru toate probele natura reticulantului ionic utilizat nu influențează gradul maxim de umflare în ambele medii apoase, valorile experimentale obținute atât pentru mediul acid cât și pentru cel bazic fiind destul de apropiate, difrențele nefiind majore, atât pentru cazul în care s-a utilizat TPP, cât și cel în care a fost utilizat sulfat de sodiu, contrar așteptărilor noastre.

A fost efectuat studiul cineticii procesului de umflare mediu de pH acid, respectiv bazic, pentru toate probele preparate. Figura 7.15 prezintă ca exemplu cinetica procesului de umflare pentru probele MA-9 și MA-I. Din alura curbei se poate observa o creștere bruscă a gradului de umflare la aproximativ 600%, respectiv 700 % încă din primele 0 – 90 minute urmată de o creștere ușoară în intervalul 90 – 600 minute, pentru ca maximul să fie atins după 24 ore la valoarea de 1100 % în cazul probei MA-9, respectiv 980 % pentu proba MA-I. Alura curbei în mediu bazic este asemănătoare celei din mediu acid, gradul maxim de umflare fiind de 646 % pentru proba MA-9, respectiv 562 % pentru proba MA-I.

Figura 7.15. Cinetica gradului de umflare în tampon acetat, pH = 3,3 și tampon fosfat. pH=7,4 pentru probele MA-9 și MA-I

Figura 7.16. Influența vitezei de agitare asupra gradului maxim de umflare al probelor MA-8 și H (15.000 rpm); 7 și G (12.000 rpm); 6 și F (9.000 rpm); 5 și E (5.000 rpm) în mediu acid (ABS)/bazic(PBS)

Figura 7.17. Influența concentrației de polimer asupra comportamentului la umflare al probelor MA-9 și I (0,35 %), 8 și H (0,5 %), 11 și K (0,75 %), în mediu acid (ABS)/bazic(PBS)

7.1.2.6. Potențial zeta

Pentru a beneficia de informații cu privire la proprietățile electrocinetice și anume stabilitatea suspensiilor de micro/nanoparticulelor în medii apoase, acestea au fost analizate din punct de vedere al potențialului zeta. Determinările au fost efectuate în mediu apos, în duplicat, valorile prezentate în tabelul 7.10 reprezentând media aritmetică a acestora. Rezultatele obținute pentru o serie de pobe optimizate au fost evaluate pe baza ecuației Smoluchowscki și au fost cuprinse între 0,583 și 2,2275 mV. Studiile de literatură raportate cu privire la stabilitatea coloizilor susțin că dispersiile coloidale pot fi instabile termodinamic dacă nu se încadrează în intervalul valorilor de 25–30 mV. Pe baza rezultatelor obținute putem concluziona că sistemul de micro/nanoparticule preparate nu ar avea o stabilitate dorită în mediu apos, natura polimerilor putând fi una din cauzele care influențează valorile potențialului zeta .

Tabel 7.10. Zeta potential

7.1.2.7. Evaluarea caracteristicilor de biomaterial

Având în vedere domeniul de aplicabilitate al nanoaparticulelor obținute, se impune investigarea proprietăților acestora ca și biomaterial. Biocompatibilitatea este definită drept "capacitatea unui material de produce un răspuns adecvat al gazdei într-o situație specifică", ceea ce înseamnă că materialul utilizat trebuie să fie un produs sterilizabil, non-carcinogen, netoxic, compatibil cu sângele, impunându-se neafectarea tabloului sangvin, nemodificarea mecanismului de coagulare a sângelui, de asemenea materialul nu trebuie să provoace apariția fenomenului de respingere din partea organismului, a sedimentarii în țesuturi și a efectelor alergice, teratogene, toxice și cancerigene, , .

În următoarele subcapitole vor fi prezentate trei tipuri de teste toxicitate acută, citotoxicitatea pe celule de tip osteoblaste, respectiv hemocompatibilitate care dovedesc caracteristicile de biomaterial al nanoparticulelor.

7.1.2.7.1. Toxicitatea

În ceea ce privește sinteza nanoparticulelor, selecția polimerilor, a tipului de reticulanți și etapele de purificare au fost realizate cu strictețe pentru a exclude efectele toxice posibil date de acestea. Particulele au fost analizate în primul rând din punct de vedere al gradului de toxicitate. Ca model experimental s-au utilizat șoareci, care au fost monitorizați timp de 7 zile în ceea ce privește comportamentul acestora și efectele adverse. Analiza toxicității s-a efectuat prin metoda Spearman/Kἄrber, utilizând ca relație de calcul ecuația (7.2)

(7.2)

unde:

a – diferența dintre două doze administrate succesiv;

b – numărul mediu al animalelor decedate din două loturi succesive;

n – numărul animalelor decedate dintr-un lot;

DL100 – cantitatea de substanță care provoacă moartea a 100% din animalele testate.

Pentru acest studiu a fost evaluată proba MA-8, toxicitatea fiind evaluată prin valoarea DL50. Valoarea determinată pentru DL50 a fost de 4922 mg/kg, ceea ce ne indică faptul că particulele sunt practic netoxice și pot fi utilizate în aplicații biomedicale.

7.1.2.7.2. Citotoxicitatea

Testul colorimetric de citotoxicitate, MTT a fost efectuat pe linii de culturi celulare de tip osteoblaste la intervale de 24, 48, respectiv 72 ore, fiind în concordanță cu rezultatele obținute prin testul DL50, respectiv probând încă o dată că particulele prezintă o toxicitate redusă. Se poate afirma că micro/nanoparticulele nu sunt citotoxice, datorită proliferării normale a celulelelor în prezența acestora, când se formează un monostrat celular dens după 5 zile de cultură. Observăm din figura 7.18 b, c, că viabilitatea celulară mărită în comparație cu proba martor este probată de evidența proliferarea a celulelelor (figura 7.18 a), fiind de 100 %.

Faptul că celulele au proliferat denotă că particulele supuse testului pe culturi de celulele nu sunt toxice.

Figua 7.18. Evaluarea morfologiei celulelor osteoblaste pentru 5 zile în prezența a 5 mg/ml de particule de CS-g-PEGMA

7.1.2.7.3. Hemocompatibilitatea

Hemoliza este procesul de distrugere a celulelor roșii din sânge cu eliberarea hemoglobinei precum și a altor componente în lichidul înconjurator. Stări patologice periculoase pot fi induse de o creștere a degradării hematiilor. De aceea, toate produsele biomedicale care sunt destinate administrării intraoculare/intravenoase trebuie evaluate pentru a se determina potențialul hemolitic al acestora . Nanoparticulele pe bază de CS-g-PEG-MA obținute pot fi utilizate ca sisteme de eliberare a medicamentelor și pot fi administrate intraocular, de aceea au fost realizate teste preliminare pentru determinarea interacțiunii acestora cu componentele sanguine umane. Nanoparticulele pe bază de chitosan funcționalizat cu PEG-MA obținute prin diferite metode, cu dimensiuni cuprinse între 200 si 400 nm și prezentând sarcini pozitive pe suprafață, sunt hemocompatibile pentru concentrații mai mici de 50 µg/ml, după cum s-a demonstrat și în alte studii , .

Potențialul hemolitic al nanoparticulelor CS-g-PEG-MA a fost evaluat pentru concentrații cuprinse între 100 si 400 µg/ml, cu ajutorul unei metode specrofotometrice. Rezultatele testelor de hemoliză sunt prezentate în Figura 7.19 fiind exprimate ca media ± SD (n = 3).

Figura 7.19. Procentul de hemoliză după 2, 4 si 6 ore de expunere la nanoparticulele CS-g-PEG-MA

În conformitate cu studiile raportate dacă procentul hemolizei este mai mic decat 5% atunci proba analizată este considerată hemocompatibilă . Pentru toate concentrațiile testate a fost obținut un procent al hemolizei mai mic de 5% (figura 4.39) ceea ce indică faptul că nanoparticulele preparate sunt hemocompatibile și pot fi administrate intraocular/intravenos.

7.1.2.8. Capacitatea de includere a principiilor active

Luând în considerare scopul utilizării micro/nanoparticulelor ca posibil sistem de transport de medicamente pentru tratarea unor afecțiuni ale polului posterior al ochiului, a fost studiat potențialul acestora de încărcare/eliberare de medicamente. Selecția tipului de medicament a depins de caracterul de hidrogel al micro/nanoparticulelor, respectiv de principiul de difuzie pentru încapsulare/eliberare, impunându-se utilizarea unui principiu biologic activ hidrosolubil.

Un prim medicament utilizat pentru încărcarea micro/nanoaprticulelor a fost bevacizumabul (BEV), care este molecula "părinte" a ranibizumabului, un anticorp monoclonal care a fost autorizat în 2004 pentru tratamentul chimioterapic al cancerului colorectal metastatic , în 2006 pentru cancer pulmonar celular , iar în 2009 pentru glioblastomul multiform .

BEV este un anticorp monoclonal (un tip de proteina) folosit de obicei pentru a împiedica angiogeneza tumorală. În ultimii ani, medicamentul a fost folosit cu succes si in oftalmologie. Injecțiile intravenoase și intraoculare cu BEV au fost utilizate pentru tratamentul unei game variate de tulburări oculare, cum ar fi degenerescența maculară legată de vârstă (AMD); ocluzia venei retiniene centrale (CRVO); proliferarea retinopatiei diabetice (PDR); pseudofakia edemului macular cistoidic (CME); membrana neovasculară coroidală (CNV) secundară miopiei patologice. Studiile in vivo au evidențiat absența toxicității oculare pentru BEV administrată prin injecție intraoculară , , , .

Datorită structurii sale proteice, BEV deține o anumita sensibilitate la acțiunea agentilor chimici sau a căldurii. Mai mult, medicamentul are un timp de înjumațire redus după administrare oculară prin injecții intravitreene sau sub formă de picături, ca urmare el trebuie administrat la intervale scurte de timp. Pentru a evita deteriorarea ochiului cauzată de injecțiile multiple, ne-am propus folosirea micro/nanoparticulelor de CS-g-PEG-MA ca suport pentru eliberarea de lunga durata a bevacizumabului.

Un al doilea medicament utilizat a fost levofloxacinul (LEV), antibiotic cu un spectru larg antibacterian, care face parte din clasa fluorochinolonelor fiind utilizat în principal pentru tratarea infecțiilor antibacteriene, .

Procesul de încărcare/eliberare a medicamentului a fost realizat prin mecanism difuzional. Metoda de lucru s-a efectuat potrivit protocolului descris în detaliu în capitolul 5.

Rezultatele obținute în urma analizei spectrofotometrice cu privire la cantitățile de medicament incluse în micro/nanoparticule și eficiența de încărcare sunt prezentate în tabelul 7.11. Eficiența de încărcare a medicametului a fost determinată cu ecuația:

Ef. încărcare = [cantit. med. încapsulată/cantit. med. teoretică]x100 (7.3)

Tabel 7.11. Cantitățile de medicament inclus și eficiențele de încărcare

După cum putem observa din tabelul 7.11 cantitatea de LEV inclusă după 72 h a variat între 0,7 și 0,8 mg /mg particule pentru probele reticulate ionic cu TPP, respectiv 0,55 mg și 0,67 mg/mg particule în cazul probelor reticulate ionic cu Na2SO4, eficiența de încărcare prezentînd valori ridicate. Diferențele valorilor cantităților de medicament incluse în ambele tipuri de sisteme sunt destul de apropiate, deci putem afirmă că în acest caz natura reticulantului nu a influențat procesul de încărcare a particulelor. Datele experimentale obținute sunt în concordanță cu valorile obținute pentru gradul maxim de umflare discutate anterior, cantitățile de medicament variind în funcție de acesta.

În urma analizei morfologice și a acestor rezultate a fost selectată proba MA-8 pentru includerea bevacizumabului, cantitatea încapsulată în 30 mg probă fiind de 0,327 mg/mg particule BEV și o eficiență bună de 39 %. Cinetica procesulor de încărcare a medicamentelor model este prezentată în figura 7.20.

Figura 7.20. Cinetica de încărcare a LEV și BEV în particulele MA-8 și H

7.1.2.9. Capacitatea de eliberare a principiilor active

Evaluarea capacității de eliberarea a medicamentelor din sistemele particulate, s-a realizat în mediu bazic pH=7,4, la temperatura de 37 °C. În acest scop probele de particule (30 mg) încărcate cu LEV sau BEV au fost suspendate în 1 ml soluție tampon fosfat, pH=7,4 , cantitatea de medicament eliberată fiind determinată la anumiți timpi prestabiliți prin analiza spectrofotometrică ce are la bază o curbă de calibrare a medicamentului realizată anterior. Spre exemplificare sunt evidențiate, profilul curbelor cineticii de eliberare, cantitatea de medicament eliberată și eficiența de eliberare a probelor MA-8 și H în figurile 7.21; 7.22 și tabelul 7.12.

În ceea ce privește procesul de eliberare a LEV din paticulele MA-8 și MA-H (figura 7.21 a) s-a observat o fază mai rapidă care este atinsă în primele 10 ore de eliberare, urmată de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 120 de ore când se atinge maximul cantității de medicament eliberat, de 78,12 % în cazul probei MA-H, respectiv 59,31 % pentru proba MA-8 din cantitatea reținută (figura 7.21 b). În cazul analizei procesului de eliberare a probei MA-8 încărcată cu Bevacizumab (figura 7.22 a) au fost observate două faze de eliberare, o primă fază mai rapidă care este atinsă în primele 30 minute (30 %), umată de o a doua fază de eliberare mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 583 ore când când s-a atins maximul de 99 % din cantitatea de medicament reținută (figura 7.22 b) . Analiza cineticii de eliberare a fost realizată pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas (figurile 7.23; 7.24; 7.25).

Tabel 7.12. Cantitățile de medicament eliberate și eficiențele de eliberare

Figura 7.21. Capacitatea probei MA-8 și H de a) eliberare a LEV b) eficiența de eliberare a LEV

Figura 7.22. Capacitatea probei MA-8 de a) eliberare a BEV b) eficiența de eliberare a BEV

Figura 7.23. Determinarea valorii parametrilor modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare specifică a LEV din nanoparticulele MA-8

Figura 7.24. Determinarea valorii parametrilor modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare a LEV din nanoparticulele MA-H

Figura 7.25. Determinarea valorilor modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare a BEV din nanoparticulele MA-8

În ceea ce privește procesul de eliberare al principiilor active studiile de literatură raportează faptul că, acesta depinde de factori precum procedeul de obținere al particulelor, dimensiunile și nu în ultimul rând de proprietățile fizico-chimice ale polimerilor utilizați. În urma analizei datelor cinetice experimentale pentru intervalul 0 ÷ 300 minute, a fost posibil calculul exponentului difuzional.

Ecuațiile obținute în urma prelucrării datelor cineticii de eliberare sunt următoarele:

y = 0,4967· x – 1,7476, din care s-au determinat parametrii k = 0.23, n = 0.4967 și R2 = 0.9851.

y = 0,5023·x – 1,7476, din care s-au determinat parametrii k = 0.127, n = 0.5023 și R2 = 0.9968.

y = 0,4968·x – 3,8964, din care s-au determinat parametrii k = 0.053, n = 0.4968 și R2 = 0.9853.

Este cunoscut faptul că valoarea lui n pentru o difuzie normala Fickiană este 0.5 < n < 1.0. Putem afirma că în cazul nostru pentru toate cele trei probe analizate avem o difuzie Fickiană procesul de transport al medicamentului prin matricea polimeră fiind guvernat de difuzie , , . Tabelul 7.13 evidențiază valorile exponenților n și k obținute pentru restul probelor analizate, și putem concluziona că pentru micro/nanoparticulele MA-5,6,11 și MA-E, F, G, K acestea indică o difuzie anormală, non-Fickiană, procesul de transport al medicamentului prin matricea polimeră fiind guvernat atât de procese de difuzie cât și de umflare.

Tabel 7.13. Valorile exponenților n și k obținute pe baza analizei datelor cinetice experimentale pentru intervalul 0 ÷ 300 minute

7.1.2.10. Capacitatea de eliberare a bevacizumabului ex vivo

În figura 7.26 este prezentată evoluția în timp a cantității de medicament eliberat din proba MA-8, respectiv cantitatea de BEV care a reușit să traverseze membrana, în cazul nostru cornee bovină, exprimată ca procent din cantitatea totală de medicament liber existent in nanoparticulele plasate în compartimentul superior al dispozitivului.

Figura 7.26. Capacitatea probei MA-8 de a) includerea a BEV b) eliberare a BEV ex vivo și eficiența de eliberare

În general profilul curbei de eliberare a BEV este liniar, după manifestarea unui „burst effect” caracteristic sistemelor difuzionale, nu foarte pronunțat, atins în primele 6 ore, urmat de o fază de eliberare mai lentă, iar maximul cantității de medicament eliberat plasat în compartimentul celulei care străbate membrana corneană a fost atins la 195 ore (75 %). Datele experimentale obținute conduc către următoarele concluzii:

BEV este capabil să străbată membrana corneană, având astfel posibilitatea de a pătrunde în polul posterior al ochiului, în cantități ce cresc lent în timp;

56 % din cantitatea de BEV eliberat din nanoparticulele plasate în compartimentul superior al celulei Franz străbate corneea în timp de 24 ore.

cunoscând faptul că doza recomandată de BEV este 0,7 mg medicament pe zi, putem determina cantitatea necesară de medicament ce poate fi administrată în suspensie prin injectie intraoculară ;

Se poate deci afirma că nanoparticulele preparate prezintă capacitatea de a elibera de o manieră controlată BEV.

Rezultatele experimentale obținute conduc la concluzia ca sistemele particulate de tip CS-g-PEG-MA încărcate cu medicament prezintă potențial pentru utilizarea în tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului.

7.1.2.11. Studiul efectului antiangiogenic al nanoparticulelor selectate asupra unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului

7.1.2.11.1. Diabetul, Boli inflamatorii / – model experimental pe animale

Modul de lucru în ceea ce privește studiul efectului angiogenic al sistemelor particulate de tip CS-g-PEG-MA este prezentat în detaliu în capitolul 3, subcapitolul 3.4.6.3.1.

Pe scurt, inflamația ochiului de iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de lipopolizaharid (LPS, E. coli 055:B5, Sigma-Aldrich) intravenos, 10 g/kg/100 l, la interval de 72 ore, timp de 18 zile, în acord cu literatura de specialitate .

Toate probele de nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, au fost administrate în suspensie de 1%, prin injecție intraoculară, timp de 72 ore până la sacrificarea animalelor, după realizarea modelului animal de inflamație cu lipopolizaharid sau diabet zaharat.

Tabelul 7.14 și figurile 7.27; 7.28; 7.29; 7.30 prezintă procentual fluorescența fluoresceinei legată de lectină, pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepure. Toate experimentele au fost comparate cu animalele martor, care nu au primit nici un tratament (5 iepuri), considerate ca fiind 100%.

Tabelul 7.14. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu inflamație indusă și diabet zaharat indus, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, la 72 ore (%). P<0,05

După cum se poate observa, suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab și suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) sunt cele mai eficiente ca tratamente anti-angiogenice în modelul diabetului zaharat la iepuri.

Pe de altă parte, suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă comparativ cu celelalte suspensii de nanoparticule prezintă cea mai mare eficiență ca tratament anti-angiogenic în modelul inflamației la iepuri, deși rezultatele obținute nu evidențiază diferențe semnificative față de suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab și suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab).

Figura 7.27. Fluorescența fluoresceinei pentru: a) celulele martor, fără nici un tratament (100%) pentru lotul martor; b) suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab pentru lotul martor; c) suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) pentru lotul martor

Datele obținute plecând de la modele inflamatorii și de diabet pe animale (iepuri) constituie baza de pornire pentru extinderea cercetărilor pe modele combinate in vivo, aplicând anticorpi cu reactivitate cât mai apropiată țesuturilor țintă.

Figura 7.28. Fluorescența fluoresceinei pentru: a) suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă pentru lotul martor; b) celulele martor, fără nici un tratament (100%) pentru lotul cu inflamație, indusă de lipopolizaharid; c) suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab pentru lotul cu inflamație, indusă de lipopolizaharid

Figura 7.29. Fluorescența fluoresceinei pentru: a) suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) pentru lotul cu inflamație, indusă de lipopolizaharid; b) suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă pentru lotul cu inflamație, indusă de lipopolizaharid; c) celulele martor, fără nici un tratament (100%) pentru lotul cu diabet zaharat

Figura 7.30. Fluorescența fluoresceinei pentru: a) de nanoparticule încărcate cu bevazucimab pentru lotul cu diabet zaharat; b) suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) pentru lotul cu diabet zaharat; c) suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă pentru lotul cu diabet zaharat

7.1.2.11.2. Ocluzia venei centrale – model experimental pe animale

Ocluzia venei centrale la iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de Eritrozină B intraperitoneal, 20 mg/kg, soluție 2%, în acord cu literatura de specialitate, dar ușor adaptată . Modul de lucru a fost descris în detaliu în capitolul 5, subcapitolul 5.3.6.3.2.

Toate nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, au fost administrate în suspensie de 1% timp de 72 ore, până la sacrificarea animalelor, după realizarea modelului animal de ocluzie a venei centrale. Tabelul 7.15 și figura 7.31 prezintă procentual fluorescența fluoresceinei legată de lectină, pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepure. Toate experimentele au fost comparate cu animalele martor, care nu au primit nici un tratament (5 iepuri), considerate ca fiind 100%.

Tabelul 7.15. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu ocluzie a venei centrale, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, la 72 ore (%). P<0,05

Rezultatele experimentale obținute (tabelul 4.18) încadrează suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă ca fiind cea mai eficientă pentru tratamentul anti-angiogenic în modelul ocluziei venei centrale la iepuri, deși nu există diferențe semnificative față de suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab și suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab).

Figura 7.31. Fluorescența fluoresceinei pentru: a) celulele martor, fără nici un tratament (100%) pentru lotul cu ocluzia venei centrale; b) suspensia de nanoparticule încărcate cu bevazucimab pentru lotul cu ocluzia venei centrale; c) suspensia de nanoparticule încărcate cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) pentru lotul cu ocluzia venei centrale; d) suspensia de nanoparticule încărcate cu dexametazonă pentru lotul cu ocluzia venei centrale

Datele obținute plecând de la modelul ocluziei venei centrale pe iepuri constituie de asemenea baza de pornire pentru extinderea cercetărilor pe modele combinate in vivo, aplicând anticorpi cu reactivitate cât mai apropiată țesuturilor țintă.

7.1.2.11.3. Studiul efectului antiangiogenic al nanoparticulelor (încărcate cu bevacizumab, dexametazonă, triamcinolone) asupra celulelor stem induse/mezenchimale în diabet, boli inflamatorii ale ochiului, ocluzia venei centrale pentru modele animale

Inflamația ochiului de iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de lipopolizaharid (LPS, E. coli 055:B5, Sigma-Aldrich) intravenos, 10 g/kg/100 l, la interval de 72 ore, timp de 18 zile, în acord cu literatura de specialitate .

Diabetul zaharat la iepure (5 animale) a fost indus prin injectare de streptozotocină (180 mg/kg i.p.), în acord cu literatura de specialitate . Evidențierea instalării diabetului s-a făcut prin determinarea glicemiei secvențial după inducere, la o zi, 3 zile, 7 zile, 14 zile și 21 zile.

Pentru ambele tipuri de experiment s-au utilizat iepuri, adulți, din sursa Băneasa, îngrijiți în condiții obișnuite de laborator, hrăniți cu hrană standard pentru iepuri, tratați în condiții umane și anesteziați cu ketamină/xilazină în vederea sacrificării (fără durere). Celulele endoteliale retiniene de iepure au fost obținute așa cum este descris, anterior. S-au utilizat câte 5 retine de iepure, imediat după sacrificare, obținute prin disecție sub microscop. Acestea au fost omogenizate în soluție tampon salină Hank (HBSS), pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+. După centrifugare, sedimentul a fost supus digestiei timp de 1 oră la 37°C, în prezența unui amestec care conține 2 mg/ml colagenază/dispază, DNA-ză tip 1 din pancreasul bovin (20 U/ml) și Tosil lizină clorometil cetonă (50 ng/ml) în soluție tampon salină Hank (HBSS) oxigenată și fără Ca2+ și Mg2+, dar cu penicilină, streptomicină și 10 mM HEPES, pH=7,4.

După digestie, suspensia a fost filtrată printr-o sită sterilă de nylon de 70 m și structurile microvasculare reținute pe filtru au fost spălate de 2 ori cu soluție tampon salină Hank (HBSS), pe gheață și oxigenată, fără Ca2+ și Mg2+. Structurile microvasculare reținute au fost supuse digestiei printr-un număr maxim de 5 cicluri în condițiile descrise mai sus.

Pentru evidențierea numărului de celule endoteliale, supernatantele obținute în procesele de separare de mai sus au fost aspirate de mai multe ori printr-un vârf de pipetă de 1 ml pentru dispersie mecanică și apoi incubate la 4o C în tampon fosfat conținând 1% albumină serică bovină și 20 µg/ml lectină legată cu fluoresceină . După 24 ore, celulele au fost spălate prin centrifugare și fluoresceina liberă îndepărtată, iar celulele endoteliale au fost cuantificate prin microscopie laser confocală. Configurația microscopiei laser confocală (Microradiance, BioRad) a inclus un microscop inversat Nikon Eclipse TE-300 și softul LaserSharp. Filtrul HQ515/530 a fost utilizat ca filtru de emisie pentru excitația de 488 nm.

A fost cuantificată fluorescența verde a fluoresceinei cuplate cu lectina, pentru evidențierea procentului numărului de celule endoteliale în condițiile inflamației și diabetului zaharat în condițiile experimentale la iepuri, deja menționate. Practic, a fost cuantificat numărul de pixeli asociați celulelor endoteliale.

Experimentele au fost realizate în prezența de nanoparticule simple sau încărcate cu bevazucimab, un echivalent bevazucimab (anticorp monoclonal (șoarece) anti-VEGF tip A uman) și dexametazonă pe celule derivate din modele inflamatorii și diabetice. Utilizarea echivalentului de bevacizumab a fost justificată anterior în capitolul 5.

Toate probele de nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, au fost administrate în suspensie de 1%, prin injectie intraoculară, timp de 72 ore până la sacrificarea animalelor, după realizarea modelului animal de inflamație cu lipopolizaharid sau diabet zaharat.

Tabelul 7.16 (supernatantul celulelor stem induse) și tabelul 7.17 (supernatantul celulelor stem mezenchimale) prezintă procentual fluorescența fluoresceinei legată de lectină, pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepure. Toate experimentele au fost comparate cu animalele martor, care nu au primit nici un tratament (5 iepuri), considerate ca fiind 100%.

Tabelul 7.16. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu inflamație indusă și diabet zaharat indus, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță active, la 72 ore (%). În prezenta supernatantului celulelor stem induse din fibroblaste în mediul de cultură. P<0,05

După cum se poate observa, suspensiile de nanoparticule încărcate cu bevazucimab, cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) și cu dexametazonă ar reprezenta tratamente anti-angiogenice cu oarecare eficiența în modelele inflamatorii și diabetului zaharat la iepuri. Deși sunt mai eficiente în prezența supernatantului culturilor celulare stem induse din fibroblaste, rezultatele obtinuțe nu sunt diferite semnificativ de cele obtinuțe în lipsa supernatantului respectiv.

Tabelul 7.17. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu inflamație indusă și diabet zaharat indus, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, la 72 ore (%). În prezența supernatantului celulelor stem mezenchimale în mediul de cultură. P<0,05

În acelasi timp, par chiar mai eficiente statistic în prezența supernatantului culturilor celulare stem mezenchimale. Acest fapt s-ar datora moleculelor solubile cu acțiune sinergică, cu efect prelungit al nanoparticulelor de inhibare/reducere a angiogenezei retiniene în condiții patologice.

Ocluzia venei centrale la iepure (5 animale) a fost indusă prin injectare de Eritrozină B intraperitoneal, 20 mg/kg, soluție 2%, în acord cu literatura de specialitate, dar ușor adaptată . Ocluzia venei centrale a fost indusă în decurs de 5 minute (interval obținut prin experimentare prealabilă) prin utilizarea focalizată a lungimii de undă a laserului de 532 nm, laser existent în componența configurației de microscopie laser confocală (Microradiance, BioRad). Astfel, fasciculul laser a fost focalizat intraocular (la iepuri) prin detașarea tubului de conducție de la microscop și fixarea în fața ochiului deschis. Un singur ochi a fost utilizat pentru experiment, celălalt servind drept martor. Puterea laserului fiind de 5 mW, s-a aplicat iepurilor un tren de 10 spoturi laser cu durată de 5 secunde, spațiate la fiecare 25 secunde. Aceasta a fost rata de succes cea mai mare (aproximativ 95%) obținută în condițiile experimentale aplicate. Pentru experiment s-au utilizat același tip de iepuri, menționați anterior. Metoda experimentală de obținere a celulelor endeteliale a fost descrisă anterior. Experimentele au fost realizate în prezența de nanoparticule simple sau încărcate cu bevazucimab (mai vechi), un echivalent bevazucimab și dexametazonă pe celule derivate din modele inflamatorii și diabetice.

Toate probele de nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activă, au fost administrate în suspensie de 1% timp de 72 ore, până la sacrificarea animalelor, după realizarea modelului animal de ocluzie a venei centrale.

Tabelul 7.18 (supernatantul celulelor stem induse) și tabelul 7.19 (supernatantul celulelor stem mezenchimale) prezintă procentual fluorescența fluoresceinei legată de lectină, pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepure. Toate experimentele au fost comparate cu animalele martor, care nu au primit nici un tratament (5 iepuri), considerate ca fiind 100%.

Tabelul 7.18. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu ocluzie a venei centrale, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță activa, la 72 ore (%). În prezența supernatantului celulelor stem induse din fibroblaste în mediul de cultură. P<0,05

După cum se poate observa, rezultatele experimentale obținute confirmă faptul că suspensiile de nanoparticule încărcate cu bevazucimab, cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) și cea cu dexametazonă ar putea constitui tratamente anti-angiogenice cu oarecare eficiența în modelul ocluziei venei centrale la iepuri. Totuși, deși sunt mai eficiente în prezența supernatantului culturilor celulare stem induse din fibroblaste, rezultatele obținute nu sunt diferite semnificativ de cele obținute în lipsa supernatantului respectiv.

Tabelul 7.19. Fluorescența fluoresceinei legată de lectină pentru evidențierea celulelor endoteliale retiniene la iepurii martor, cu ocluzie a venei centrale, în prezența tratamentelor cu nanoparticule, încărcate sau nu cu substanță active, la 72 ore (%). În prezența supernatantului celulelor stem mezenchimale în mediul de cultură. P<0,05

În schimb, suspensiile de nanoparticule par chiar mai eficiente statistic în prezența supernatantului culturii celulare stem mezenchimale. Acest fapt s-ar datora, după cum am mentionat deja, moleculelor solubile cu efecte sinergice cu efectele prelungite ale nanoparticulelor de inhibare/reducere a angiogenezei retiniene în condiții patologice.

Testele cu triamcinolon au fost mult mai puțin eficiente din punct de vedere al rezultatelor terapeutice.

7.2. Concluzii parțiale

Rezultatele obținute prin experimentele anterioare discutate conduc la următoarele concluzii:

A fost obținut un nou derivat de chitosan funcționalizat cu PEG-MA prin reacția de adiție Michael, produsul prezintând o solubilitate în apă îmbunătățită;

CS-g-PEG-MA a fost caracterizat din punct de vedere structural prin spectroscopie FT-IR și prin spectroscopie 1H RMN, evidențiindu-se formarea derivatului nou.

Analiza termogravimetrică a relevat faptul că din punct de vedere termic CS-g-PEG-MA este mai puțin stabil comparativ cu chitosanul, efect care este pus pe seama reducerii numărului de legături de hidrogel dintre lanțurile de polizaharid, ca urmare a interpunerii între acestea a grefelor de poli(etilen glicol) metacrilat.

Pe baza CS-g-PEG-MA au fost preparate noi sisteme de micro/nanoparticule prin procedeul de dublă reticulare în emulsie inversă;

A fost studiat efectul parametrilor de sinteză – concentrația inițială de polimer, natura reticulantului ionic și viteza de agitare – asupra proprietățile finale ale micro/nanoparticulelor;

S-a constatat că atât concentrația soluției de polimer cât și viteza de agitare influențează diametrul particulelor, acesta scăzând odată cu creșterea vitezei de agitare și reducerea concentrației de polimer;

Analiza FT-IR a relevat formarea unor noi tipuri de legăturilor prin procesul de reticulare ionică între anionii sulfat din Na2SO4 sau polianioni (tripolifosfat) Na5P3O10 și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-MA și a unor legături iminice prin procesul de reticulare covalentă între grupele aminice ale polimerului și grupele carbonil ale aldehidei glutarice;

Caracterizarea morfologică prin SEM a confirmat obținerea unor micro/nanoparticule cu formă sferică și dimensiuni submicronice, potrivite pentru tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului

Sitemele de micro/nanoparticule au fost testate din punct de vedere al comportamentului la umflare în mediu acid (pH=3,3), respectiv mediu bazic (pH=7,4), demonstrând o capacitate de retenție a apei mai mare în cazul mediului acid, însă și rezultatele obținute prin umflare în mediu bazic au fost suficient de ridicate;

Testul colorimetric de citotoxicitate a evidențiat faptul că particulele obținute prezintă o doză redusă de toxicitate redusă

Micro/nanoparticulele au fost testate în ceea ce priveste caracterul de biomaterial al acestora prin analiza de hemocompatibilitate, rezultatele obținute relevând un procent al hemolizei mai mic de 5%, ceea ce indică faptul că nanoparticulele preparate sunt hemocompatibile și pot fi administrate intravenos.

Ținând cont de obiectivul principal vizat al micro/nanoparticulelor preparate și anume utilizarea ca suport pentru transportul de medicamente pentru tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului, capacitatea de includere/eliberare de medicamente a micro/nanoparticulelor prin procesul de difuzie a fost analizată, acestea au fost încărcate cu două medicamente model BEV și LEV în mediu acid, evidențiindu-se ulterior o eliberare rapidă în primele 10 ore, urmată apoi de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 120 respectiv 258 de ore.

Capacitatea de eliberare a BEV ex vivo, a relevat faptul că acesta este capabil să străbată membrana corneană, având astfel posibilitatea de a pătrunde în polul posterior al ochiului, în cantități ce cresc lent în timp

În cadrul studiilor efectului antiangiogenic a micro/nanoparticulelor selectate asupra unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului s-a constatat că:

Suspensiile de 1 % micro/nanoparticule încărcate cu bevazucimab, cu anticorp anti-VEGF A (echivalent bevazucimab) și suspensia 1 % micro/nanoparticule încărcate cu dexametazonă pot reprezenta, atunci cand sunt administrate prin injecție intraoculară, tratamente eficiente față de angiogeneza care apare în mod obligatoriu în bolile cronice retiniene precum inflamația, diabetul zaharat sau ocluzia venei centrale.

Aceasta eficiență este crescută atunci cand micro/nanoparticulele sunt administrate simultan cu supernatantul de cultura a celulelor stem induse din fibroblaste, dar mai ales simultan cu supernatantul celulelor stem mezenchimale alogenice.

Avantajele majore ale încarcarii bevazucimabului și a dexametazonei (respectiv triamcinolonului) în micro/nanoparticule ar fi reprezentate de: doza mai redusă de administrat (deci reducerea efectelor adverse ale medicamentelor), eliberarea prelungită a acestora (administrarea mult mai puțin frecventa) și eficiența eliberarii locale (care se poate întinde până la 14-30 zile), administrarea țintită a acestora prin injectare locală în apropierea retinei.

Capitolul 8. Sisteme micro/nanoparticulate polimer-medicament pe bază de chitosan grefat cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat

Capitolul are ca scop prezentarea obținerii unor sisteme polimer-medicament sub formă de micro/nanoparticule originale încărcate cu principii biologic active pentru tratarea unor afecțiuni ale polului posterior al ochiului. Sunt discutate în detaliu rezultatele experimentale obținute, tehnicile experimentale și metodele de caracterizare utilizate.

8.1. Rezultate și discuții

8.1.1 Funcționalizarea chitosanului prin metoda de grefare cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat

Modificarea chimică a chitosanului de poli(etilen glicol) metil eter acrilat (CS-g-PEG-A) a fost realizată conform unui protocolul prezentat în studiul realizat de Han și colaboratorii săi. Modul de lucru a fost prezentat în detaliu în subcapitolul 5.2.5. Sinteza derivatului de chitosan avut la bază reacția de tip adiție Michael . Reacția de grefare este prezentată în schema 8.1. Și în acest caz justificarea utilizării CS și PEG-A are la bază ideea introducerii unor proprietăți noi polimerului, respectiv îmbunătățirea solubilității chitosanului în medii apoase slab acide prin intreoducerea de pe catena liniară a chitosanului a segmentelor de PEG-A hidrofile.

Schema 8.1. Reacția de functionalizare a chitosanului cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat

O confirmare a funcționalizării chitosanului cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat a fost obținută prin caracterizarea structurală a derivatului prin Spectroscopia în Infraroșu cu Transformată Fourier. Spre exemplificare sunt ilustrate spectrele FT-IR ale CS, PEG-A, PEG-A-g-CS ( raport molar 1:1) sunt prezentate în figura 8.2 și tabelul 8.1 Spectrul FT-IR al CS fiind descris în detaliu anterior, ne-am axat pe descrierea spectrelor FT-IR PEG-A, respectiv CS-g-PEG-A. Spectrul FT-IR al PEG-A prezintă următoarele semnale caracteristice: unul proeminent al benzii de absorbție de la 1722 cm-1 care este corespunzător vibrațiilor dublei legături, la 2862 cm-1 apariția unui semnal intens caracteristic benzii de absorbție ale grupǎrilor CH, respectiv la 3435 cm-1 observă vibrațiile axiale de întindere ale grupărilor OH ale PEG-A. Modificarea chitosanului cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat este validată de apariția a benzilor de absorbție de la 1720 și 1654 cm-1.

De asemenea, în spectrul CS-g-PEG-A benzile de absorbție corespunzătoare vibrațiilor de întindere ale grupărilor hidroxil, amino și amidă ale chitosanului sunt deplasate ușor, semnalul benzii de absorbție de la 1720 cm-1 redus datorită participării la reacție, este ascociat legăturilor duble C=C din PEG-A, iar banda de absorbție de la 1654 cm-1 este specifică vibrațiilor de deformare ale grupărilor aminice acetilate corespunzătoare chitosanului. Ca și în cazul funcționalizării chitosanului cu poli(etilen glicol) metacrilat semnalul pentru gruparea aminică secundară care s-a format nu poate evidențiat deoarece acesta ar trebui să apară în intervalul 3300 ÷ 3400 cm-1. CS și PEG-A dețin grupări OH în structură acestea dând un semnal în jurul aceleiași valori de 3300 ÷ 3400 cm-1 care de asemenea se suprapun cu valorile grupei aminice secundară (-NH-). Semnalele de la 2941 și 2879 cm-1 sunt caracteristice vibrațiilor de întindere a C-H, dar ele nu sunt semnificative deoarece atât în cazul CS, respectiv PEG-A au aproximativ aceeași valoare.

Tabelul 8.1. Benzile de absorbtie caracteristice ale CS, PEG-MA, CS-g-PEG-MA

Figura 8.2. Spectrele FT-IR comparative ale CS, PEG-A, CS-g-PEGA

Caracterizarea copolimerului CS-g-PEG-A a fost realizată și cu ajutorul spectroscopiei RMN. S-a urmărit influența a diferite rapoarte molare chitosan/acrilat de poli(etilen glicol) metil eter (1:0,5; 1:0,75; 1:1) asupra gradului de substitutie realizat. Spre exemplificare în figura 8.3 (a, b, c) sunt prezentate spectrele 1H RMN care confirmă realizarea grefării polizaharidului.

Figura 8.3 a) prezintă spectrul 1H NMR al chitosanului, fiind înregistrat în D2O la 800 C. Picul corespunzător valorii 1.90 ppm este atribuit protonilor –CH3 din gruparea acetilata specifică resturilor de chitina. Picul corespunzător valorii 3.01 ppm este atribuit protonilor H2 al grupelor deacetilate, iar multipletii de la 3.50 la 3.80 ppm sunt atribuiti protonilor H3, H4, H5, si H6 al grupelor deacetilate și acetilate ale chitosanului.

Spectrul 1H NMR al acrilatului de poli(etilen glicol) metil eter este ilustrat în figura 8.3 b) și prezintă următoarele picuri caracteristice: 6.44 ppm (CH2=CH–COO), 6.24 ppm (CH2=CH–COO), 6,005 ppm (CH2=CH–COO), 4.35 ppm (–COOCH2–), 3.6–3.83 ppm (–COOCH2CH2–, –OCH2CH2–, –CH2CH2OCH3), 3.38 ppm (–OCH3).

Pentru chitosan-g-acrilat de poli(etilen glicol) metil eter, în comparatie cu CH, picurile corespunzatoare protonilor –COOCH2CH2– și –NH–CH2CH2–COO– apar la 4.33 ppm și respectiv la 2.60 ppm. Semnalul clar de la 3.37 ppm corespunde protonilor grupării –OCH3 din unitatea structurală a poli(etilen glicolului). Semnalele protonilor metilenici ai poli(etilen glicolului) se suprapun cu cele ale protonilor H3, H4, H5 si H6 al unităti glucozaminice.

Calculul gradului de substituție (tabel 8.2) a fost realizat utilizand valoarea intensității picului protonilor –COOCH2– (4.33 ppm) și cea a picului protonilor din gruparea acetilat –CH3 (2.00 ppm) specifică resturilor de chitină, și a fost calculat conform formulei de calcul de mai jos (4.3) :

DS = 3·I4,3 ppm·(1-DD)/2·I2,0 ppm (8.1)

Tabel 8.2. Valori ale gradului de substituție CS-g-PEG-A

Valoarea gradului de grefare cea mai ridicată de 16,5 %, fiind atinsă în cazul în care raportul molar chitosan/acrilat de poli(etilen glicol) metil eter a fost de 1:1.

Copolimerul grefat a demonstrat o solubilitate din ce în ce mai ridicată în mediu acid, odată cu cresterea raportului dintre polizaharid și polimerul sintetic, întelegand prin aceasta în primul rând reducerea duratei necesare solubilizării și creșterea concentrației de polimer o dată cu creșterea parametrului menționat.

Important este însă faptul că, pentru copolimerul grefat la raportul molar de 1:1 între componente, s-a reușit solubilizarea sa completă în apa bidistilată, ceea ce a confirmat ipoteza noastră de plecare și a permis concluzia că grefatul a fost optimizat din acest punct de vedere.

Figura 8.3. Spectrele 1H RMN al a) chitosanului; b) PEG-A; c) CS-g-PEG-A

8.1.2. Prepararea micro/nanoparticulelor pe bază de CS-g-PEG-A prin dublă reticulare în emulsie inversă

Pentru prepararea micro/nanoparticulelor pe baza de CS-g-PEG-A s-a respectat același procedeu a emulsiei inverse cu dublă reticulare descrisă în subcapitolul 5.2.6. De asemenea, și în acest caz, ulterior etapelor de purificare probele de micro/nanoparticule au fost luate în considerare pentru stabilirea unor caracteristici precum: diametru și polidispersitate; morfologie; comportament de umflare, încărcare și eliberare de medicament, potențial Zeta, hemocompatibilitate, test de toxicitate și citotoxicitate. Protocoalele experimentale cu parametrii observați pentru pregătirea micro/nanoparticulelor sunt prezentate în tabelul 8.3 și 8.4.

Tabel 8.3. Variația parametrilor pentru sinteza micro/nanoparticulelor de (CS-g-PEG-A) reticulate ionic cu tripolifosfat de sodiu.

Tabel 8.4. Variația parametrilor pentru sinteza micro/nanoparticulelor de (CS-g-PEG-A) reticulate ionic cu sulfat de sodiu

8.1.2.1. Caracterizarea structurală a nanoparticulelor prin FT-IR

Micro/nanoparticulele preparate au fost caracterizate prin Spectroscopie în Infraroșu cu Transformată Fourier, care a demonstrat formarea rețelei polimere prin intermediul dublei reticulări. Au fost înregistrate spectre FT-IR pentru toate micro/nanoparticulele obținute, însă acestea au prezentat un profil similar, motiv pentru care au fost alese reprezentative doar spectrele FT-IR înregistrate pentru două probe A5 și B5, diferența între acestea fiind natura reticulantului ionic.

Tabelul 8.5 prezintă benzile de absorbție caracteristice derivatului de chitosan și a probelor A8, B8. Din spectrele celor două probe evidențiate de figura 8.4 se observă semnalele corespunzătoare benzilor de absorbție ce corespund naturii reticulatului ionic folosit, ceea ce demonstrează formarea de legăturilor prin procesul de reticulare ionică între anionii sulfat din Na2SO4 și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-A și a legături iminice prin procesul de reticulare covalentă între grupele aminice ale polimerilor și grupele carbonil ale aldehidei glutarice. Benzile de absorbție ale legaturilor iminice –C=N- rezultate în urma procesului de reticulare covalentă se evidențiază la 1568 cm-1 în cazul probei A5 și la 1575 cm-1 pentru proba B8. În cazul probei A8 semnalul benzi de absorbție de la 896 cm-1 este specific legăturilor formate în urma procesului de reticulare ionică între polianionii de tripolifosfat și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-A. Spectrul FT-IR al probei B8 evidențiază legătura nou formată la 617 cm-1 , , , , ,.

Figura 8.4. Spectrele FT-IR comparative ale CS-g-PEGA și nanoparticulelor probe A5, B5

Tabelul 8.5. Semnalele caracteristice ale CS-g-PEG-A și a micro/nanoparticulelor pe baza derivatului de chitosan

8.1.2.2. Caracterizarea prin microscopie SEM

Caracterizarea din punct de vedere morfologic a micro/nanoparticulelor realizate potrivit planului experimental detaliat anterior în subcapitolul 8.1.2., a fost realizată prin microscopie electronică de baleiaj. Ținând cont de scopul principal propus anume utilizarea sistemelor de particule pentru tratarea unor afecțiuni ale polului posterior al ochiului, este important ca acestea să prezinte anumite caracteristici precum dimensiuni nanometrice, stabilitate și individualitate.

Așa cum a fost menționat anterior, metoda selecționată pentru prepararea particulelor a fost cea a dublei reticulări (ionică și covalentă) în emulsie apă în ulei, avantajul constituindu-l utilizarea unei cantități mai scăzute de reticulant covalent, fapt ce conduce la scăderea toxicității nanoparticulelor. Principiul fundamental al procedeului este realizarea rețelei interconectate/interpenetrate în primă etapă prin intermediul procesului de reticulare ionică majoritară, urmată de etapa reticulării covalente.

Fotagrafiile SEM ale micro/nanoparticulelor obținute în primele etape ale studiului sunt prezentate în figura 8.5. S-a constatat că primele încercări de a prepara particulele (A-1, A-2, A-3, A-4 și B-1, B-2, B-3, B-4) au condus formarea aglomeratelor, polidispersitatea dimensională fiind destul de largă. Este important de menționat că în cadrul acestor sinteze a fost variat tipul de reticulant ionic și perioada procesului de reticulare între 10 și 150 minute, cu menținerea constantă a tipului și perioadei procesului de reticulare covalentă (60 respectiv 120 minute). În cazul setului de probe A-1,A-2,A-3,A-4 a fost utilizat tripolifosfat de sodiu ca și reticulant ionic, iar pentru probele B-1, B-2, B-3, B-4 a fost folosit sulfatul de sodiu.

Luând în considerație etapele optimizării, și anume creșterea raportului polimer/reticulant ionic micro/nanoparticulele obținute se caracterizează printr-o formă sferică, sunt bine individualizate, diametrul și polidispersitatea sunt reduse în comparație cu primele seturi de probe (figura 8.6 și 8.7). De asemenea, din imaginile SEM înregistrate se constată diferențe importante morfologice și în ceea ce privește dimensiunile particulelor acestea fiind dependente de parametrii variați în prepararea micro/nanoparticulelor. Prin urmare, pentru probele A-5÷8, respectiv B-5÷8, concentrația soluției de polimer (0,5%), respectiv raportul polimer/reticulant au fost menținute constante, modificându-se viteza de agitare de la 5,000 la 15.000 rpm/min. Se remarcă astfel că viteza de agitare are o influență destul de însemnată asupra dimensiunii particulelor aceasta fiind invers proporțională cu viteza de agitare. Concluzia firească ar fi aceea că viteza de agitare este estențială pentru stabilirea diametrului particulelor, acesta scăzând odată cu creșterea intensității de agitare care conduce la o mai bună dispersare și la formarea de picături foarte mici în faza de emulsie.

În cazul eșantioanelor A-8,9,11, respectiv B-8,9,11, concentrația soluției de polimer a variat de la 0,35 % la 0,75 %, restul parametrilor fiind menținuți constanți. Și în acest caz s-a observat o creștere a diametrului de la 0,5 nm la 1,3 µm pentru probele A-8,9,11, respectiv de la 0,6 nm la 1,5 µm în cazul probelor B-8,9,11. Deci, se poate afirma că diamentrul particulelor este clar influențat de concentrația soluției de polimer, acesta fiind mai ridicat în cazul probelor A-11, respectiv B-11, comportament datorat creșterii vâscozității soluției care conduce la formarea de picături mai mari, fapt prezentat și de alte studii , .

După cum se constată în cazul probei B 9, concentrația soluției de polimer fiind mai redusă forma particulelor este mai neregulată, paticulele prezentând tendința de aglomerare, fapt datorat unei reticulări mai slabe. Odată cu creșterea concentrației soluției de polimer la 0,75 %, s-a observat o creșterea considerabilă a diametrului mediu și a polidispersității particulelor, dar și o scădere a tendinței de aglomerare.

Modificarea raportului polimer/reticulant ionic (A-10, B-10) a determinat o scădere ușoară a diametrului particulelor, aspect pus pe seama creșterii densității de reticulare a matricii polimere.

O altă observație importantă evidențiată de imaginile SEM este faptul că diametrul și polidisperistatea particulelor este influențată de natura agentului de reticulare. Astfel, modificarea tipului de reticulant ionic în cazul probelor B-1÷10 fiind folosit sulfat de sodiu, conduce la o ușoară scădere a diametrului particulelor și la formarea de capsule.

Figura 8.5. Imagini SEM ale probelor A-1÷A-4, B-1÷B-4

Figura 8.6. Imagini SEM ale micro/nanoparticulelor optimizate reticulate ionic cu TPP

Figura 8.7. Imagini SEM ale micro/nanoparticulelor optimizate reticulate ionic cu sulfat de sodiu

8.1.2.3. Analiza dimensională a particulelor prin difractometrie laser

Analiza dimensională a micro/nanoparticulelor prin difractie laser, a fost realizată în scopul evidențierii diametrului și a polidispersității dimensionale. Determinarea a fost realizată în acetonă, astfel evitându-se umflarea particulelor. De asemenea, valorile experimentale obținute prin această metodă de caracterizare au confirmat faptul că dimensiunea particulelor este dependentă de concentrația soluției de polimer și viteza de agitare în timpul sintezei particulelor. Astfel, agitarea la o viteza mai mare de rotatie a ultraturaxului implică o energie mai mare disipată în emulsia supusă agitarii, adică unui transfer de enegie mai mare ceea ce face ca emulsia să se spargă în picături mai mici, din care rezultă particule de dimensiuni nanometrice. Curbele de distribuție granulometrică ale micro/nanoparticulelor obținute (determinată prin difracție de fascicul laser) prezintă o alură unimodală și un diametru mediu de ordin nanomteric, în funcție de condițiile sintezei (figurile 8.8; 8.9 și tabelele 8.6; 8.7). Rezultatele obținute sunt în concordanță cu imaginile SEM.

Figura 8.8. Curbele de distribuție granulometrică a probelor A-5÷11

Tabel 8.6. Diametrul mediu al probelor A5-11, obținut în urma analizei prin difractometrie laser

Figura 8.9. Curbele de distribuție granulometrică a probelor B-5÷11

Tabel 8.7. Diametrul mediu al probelor B5-11, obținut în urma analizei prin difractometrie laser

8.1.2.4. Analiza comportamentului la umflare

Studiul comportamentului la umflare a condus către rezultate interesante, valorile obținute pentru gradul maxim de umflare fiind într-o bună corelație cu parametrii procesului de obținere a micro/nanoparticuleleor. Gradul maxim de umflare al particulelor în medii apoase este evident dependent de natura arhitecturii interne a rețelei polimere nou formată. Caracterul hidrofil al micro/nanoparticulelor poate oferi informații importante în preconizarea comportamentului acestora la încărcarea/eliberarea medicamentului prin proces difuzional.

Analiza comportamentului la umflare a nanoparticulelor în mediu acid (pH=3,4) și bazic (pH= 7,4) după 24 ore a dus la următoarele rezultate (figurile 8.10; 8.11;8.12; 8.13 și tabelele 8.8; 8.9):

Tabelul 8.8. Gradul de umflare al probelor A-5÷11 în mediu acid după 24 ore

Tabelul 8.9. Gradul de umflare al probelor B-5÷11 în mediu acid după 24 ore

După o primă analiză a datelor experimentale obținute din studiul gradului de umflare pun în evidență faptul că: valorile gradului maxim de umflare în soluția tampon acetat ABS (pH= 3,3) sunt mai crescute față de cele înregistrate în soluția tampon fosfat (PBS, pH= 7,4), respectiv influența concentrației soluției de polimer, a vitezei de agitare și a raportului polimer/reticulant ionic.

Modificarea concentrației soluției de polimer cu menținerea constantă a vitezei de agitare și a raportului polimer/reticulant ionic conduce la următoarele concluzii:

deși pentru probele A9, B9 a fost utilizată o concentrație a soluției de polimer scazută (0,35 %), gradul de umflare prezintă valorile cele mai ridicate, ca urmare a reținerii apei în aglomeratele polimere formate ( care este evidentă doar în cazul probei B9) și a gradului de reticulare a rețelei care în acest caz este mai mic;

odată cu creșterea diametrului mediu al particulelor, respectiv a concentrației soluției de polimer a condus la o scădere a cantității de apă reținută (A-8 și 11, B-8 și 11) și deci a gradului de umflare, valoarile obținute pot fi puse pe baza unei împachetări mai bune a legăturilor chimice dintre moleculele polimerilor pentru obținerea rețelei, absorbția de apă fiind invers proporțională cu gradul de reticulare al probei.

Un efect similar este înregistrat și în cazul probelor A-10 și B-10, la care s-a constatat o scădere a gradului maxim de umflare odată cu creșterea cantității de TPP sau sulfat de sodiu în fapt a raportului molar TPP/grupe aminice sau sulfat de sodiu/grupe aminice, consecință logică a creșterii densității de reticulare a rețelei.

În cazul setului de probe A-5÷11 valorile gradului maxim de umflare în mediu bazic sunt inferioare celor atinse în mediu acid, comparativ cu valorile eșantioanleor B-5÷11, unde valorile sunt destul de apropiate de cele din mediu acid, acestea fiind dependente de natura reticulantului utilizat și a faptului că majoritatea grupărilor aminice ale chitosanului sunt deprotonate deci, prin urmare, se formează legături de hidrogen în rețeaua polimeră nou formată.

De asemenea, putem constata că natura reticulantului ionic influențează gradul maxim de umflare, valorile experimentale obținute atât pentru mediul acid cât și pentru cel bazic fiind mai mici pentru cazul în care s-a utilizat TPP, și mai ridicate atunci când a fost utilizat sulfat de sodiu. Acest comportament este logic datorită naturii sulfatului de sodiu care este mai puternic reactiv, în comparație cu TPP, ceea ce înseamnă că are tendința de a spori retenția de apă în matricea polimeră.

Pentru toate micro/nanoparticulele preparate a fost analizată și cinetica procesului de umflare în ambele medii, spre exemplificare am ales probele A9, respectiv B9 evidențiate în figura 4.61. Determinările experimentale au evidențiat în cazul mediului acid două faze: o creștere bruscă a gradului de umflare la aproximativ 800 % (A9), respectiv 1000 % (B9) în intervalul 0 – 90 minute, urmată de o creștere ușoară constantă în intervalul 90 – 480 minute pentru ca maximul să fie atins după 24 ore la valoarea de 800 % în cazul probei A-9, respectiv 1200 % pentu proba B-9. Din alura curbelor cinetice înregistrate în mediul bazic s-a observat un efect similar curbelor determinate în mediul acid, gradul maxim de umflare fiind de 669% pentru proba A-9, respectiv 804 % pentru proba B-9.

Figura 8.10. Curbele cinetice de variație a gradului maxim de umflare în tampon acetat, pH = 3,3 și tampon fosfat. pH=7,4 pentru probele A9 și B9

Figura 8.11. Influența concentrației asupra gradului maxim de umflare în mediu acid (ABS, pH=3,4) și bazic (PBS, pH=7,4) pentru sistemele de particule reticulate ionic cu TPP (A) și sulfat (B): A9, B9 (0,35%); A8, B8 (0,5%); A11, B11 (0,75 %)

Figura 8.12. Influența vitezei de agitare asupra gradului maxim de umflare în mediu acid (ABS, pH=3,4) și bazic (PBS, pH=7,4) pentru sistemele de particule reticulate ionic cu TPP (A) și sulfat (B): A5,B5 (5.000 rpm); A6,B6 (9.000 rpm); A7,B7 (12.000 rpm); A8,B8 (15.000 rpm)

Figura 8.13. Influența naturii reticulantului asupra gradului maxim de umflare în mediu acid (ABS, pH=3,4) și bazic (PBS, pH=7,4) pentru toate sistemele de particule reticulate ionic cu TPP (A) și sulfat (B)

4.2.8.5. Capacitatea de includere a LEV

Studiul capacității de includere a principiilor active a micro/nanoparticulelor a fost realizat utilizând ca medicament model levofoloxacinul, un antibiotic de spectrul larg care aparține clasei fluorochinolonelor, folosit în general pentru tratarea infecțiilor antibacteriene. Levofloxacinul, este un medicament hidrofob, prin urmare, un candidat potrivit pentru sistemele particulate realizate pentru transportul medicamentului în regiunea oculară cu scopul reducerii frecvenței de administrare ,.

Încărcarea, respectiv eliberarea LEV a fost realizată prin difuzie, protocolul fiind descris în detaliu în capitolul 5 subcapitolul 5.4.5.2 și 5.4.5.3. Astfel, studiul a demarat cu imersarea unei cantități de 25 mg pudră de micro/nanoparticule în 1 ml soluție LEV de concentrație 25 mg/ml, suspensia fiind menținută timp de 72 h la temperatura de 370 C, sub agitare continuă. După trecerea timpului menționat suspensia de micro/nanoparticule a fost ultracentrifugată la 15.000 rpm, supernatantul fiind colectat separat, iar micro/nanoparticulele încarcate cu medicament au fost supuse unui proces de liofilizare. Conținutul de LEV din supernatant a fost determinat prin spectrofotometrie UV-Vis (287 nm LEV), prin diferență, pe baza curbei de etalonare construita anterior s-a stabilit ca micro/nanoparticulele au reusit sa se încarce între 0,48 ÷ 0,69 mg medicament, ca urmare, eficiențele de încarcare cu medicament au avut valori de 47,0 ÷ 76,0 %, probând o capacitate ridicată a suporturilor polimerice nanoparticulate de a reține compusul biologic activ. Cantitățile de medicament incluse în micro/nanoparticule și eficiența de încărcare sunt evidențiate în tabelul 8.10. În ceea ce privește eficiența încapsulării medicametului a fost utilizată ecuația:

Ef. Încărcare = [cantit. LEV încapsulat / cantita de LEV teoretică] x100 (8.2)

Tabel 8.10. Cantitățile de medicament inclus și eficiențele de încărcare

Valorile obținute în urma analizei spectrofotometrice a supernatantului separat prin centrifugare după diferite intervale de timp, evidențiază faptul că după 72 h cantitatea de LEV a variat între 0,48 ÷ 0,75 mg pentru cazul suporturilor particulate reticulate ionic cu TPP și între 0,6 ÷ 0,89 mg pentru micro/nanoparticulele obținute prin reticulare ionică cu sulfat de sodiu. Eficiența de încărcare a prezentat valori destu de ridicate. Datele experimentale obținute sunt în acord cu cele obținute în cazul comportamentului acestora la umflare discutate anterior, așa cum ne așteptam se poate observa că, dozele de medicament încapsulate de suporturile polimerice reticulate cu sulfat de sodiu sunt mai ridicate. Spre exemplificare, au fost alese 4 probe (A8, A9, B8, B9), cinetica procesului de încărcare a LEV este prezentată în figura 8.14.

Figura 8.14. Cinetica încărcării cu LEV a probelor A8, A9, B8, B9

8.1.2.6. Capacitatea de eliberare a LEV

Eliberarea medicamentului în regiunea oculară este o sarcină dificilă. Doar 1-2% din doza de medicament fiind disponibilă în ochi pentru acțiunea terapeutică, restul de medicament fiind eliminat prin sistemul de drenaj nasolacrimal și alte bariere fiziologice oculare. Conform studiilor de literatură raportate levofloxacinul poate fi administrat local doza fiind de o picătură la fiecare 1-2 ore timp de 3 zile și apoi la fiecare 4-5 ore. Pentru a depăși aceste probleme ale formulărilor de administrare convenționale, au fost explorate noi sisteme de administrare a medicamentelor, cum ar fi sistemele micro/nanoparticulate, creșterea timpului de staționare a medicamentului la nivel ocular fiind obiectivul principal .

Studiul prezent propune administrarea LEV pentru tratarea unor afecțiuni ale polului posterior al ochiului prin intermediul sistemelor particulate pe bază de CS-g-PEG-A. Prin urmare s-a impus studiul capacității de eliberare a LEV din micro/nanoparticulele obținute anterior, acesta fiind realizat prin metoda difuzională, în mediu bazic pH=7,4, la temperatura de 37 °C. Modul de lucru fiind prezentat detaliat în capitolul 5, subcapitol 5.4.5.2. Cantitățile de medicament eliberate și eficiența de eliberare a tuturor probelor sunt evidențiate, în tabelul 8.11. Ca urmare, după analizarea valorilor experimentale obținute atât în cadrul studiului de eliberare cât și includere a levofloxacinului, spre exemplificare au fost alese 4 probe de micro/nanoparticule A8,A9, B8, B9.

În ceea ce privește procesul de eliberare a LEV din paticulele alese (figura 8.15; 8.16 a) și b) s-a observat o etapă în care LEV a fost eliberat mai rapid și anume în primele 10 ore, urmată de o a doua etapă mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 120 de ore când se atinge maximul cantității de medicament eliberat (A8 – 49,22 %; A9 – 59,75% ; B8 – 64,4 % ; B9 – 60,0 %). Analiza cineticii de eliberare a fost realizată, de asemenea și pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas (figurile 8.17 și 8.18).

Tabel 8.11. Cantitățile de medicament eliberate și eficiențele de eliberare

Figura 8.15. Capacitatea probelor A-8 și B-8 de a) eliberare a LEV b) eficiența de eliberare a LEV

Figura 8.16. Capacitatea probelor A-9 și B-9 de a) eliberare a LEV b) eficiența de eliberare a LEV

Figura 8.17. Determinarea valorilor modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare a LEV din nanoparticulele A-8

Figura 8.18. Determinarea valorilor modelului Korsmeyer-Peppas pentru evaluarea cineticii de eliberare a LEV din nanoparticulele B-8

Conform studiilor de literatură, procesul de eliberare al medicamentelor este dependent de metoda de obținere a sistemelor particulate, dimensiunile acestora, respectiv de proprietățile fizico-chimice ale supotului polimeric utilizat.

În urma analizei datelor cinetice experimentale pentru intervalul 0 ÷ 480 minute, a fost posibil calculul exponentului difuzional, pe baza ecuațiilor de mai jos:

y = 0,4294· x – 3,351; din care s-au determinat parametrii k = 0.4214, n = 0.4294 și R2 = 0.9778.

y = 0,5182· x – 3,2; din care s-au determinat parametrii k = 0.189, n = 0.5182 și R2 = 0.9845.

Putem observa că în ambele cazuri (A8, B8), valoarea exponentului n care caracterizează mecanismul de eliberare, este destul de apropiată de 0,5 (0,5 < n < 1,0), ceea ce indică un mecanism de transport/eliberare dominat, practic, de difuzie ,, .

Tabelul 8.12. evidențiază valorile exponenților n și k obținute pentru restul probelor analizate, și putem afirma că micro/nanoparticulele A11, B5, B6 și B11 acestea prezintă o difuzie anormală, non-Fickiană, procesul de transport al medicamentului prin matricea polimeră fiind guvernat atât de procese de difuzie cât și de umflare.

Tabel 8.12. Valorile exponenților n și k obținute pe baza analizei datelor cinetice experimentale pentru intervalul 0 ÷ 480 minute

8.1.2.7. Hemocompatibilitatea

Experimentele de hemoliză au fost efectuate în conformitate cu metoda lui Vuddanda și colab. . Sângele integral a fost recoltat prin puncție venoasă de la persoane voluntare sănătoase, nefumatoare. 5 ml de sânge a fost centrifugat la 3000 rpm timp de 5 minute. Stratul superficial de plasmă (supernatantul) a fost îndepărtat, iar sedimentul de celule roșii din sânge (RBC) a fost separat și spălat cu ser fiziologic. Sedimentul RBC a fost diluat cu 25 ml ser fiziologic. 500 µL suspensie de nanoparticule (în ser fiziologic) cu diferite concentrații (100 µg/ml, 250 µg/ml și 500 µg/ml), au fost adăugați peste 500 µL suspensie de RBC. Separat, au fost preparate probe control pozitive (100% liză) și control negative (0% liză). Probele au fost incubate la 37 ° C timp de 3 ore și au fost agitate ușor o dată la fiecare 30 de minute. După 3 ore, probele au fost centrifugate la 3000 rpm timp de 5 min iar un anumit volum de supernatant a fost prelevat, măsurându-se absorbanța acestuia la 540 nm cu un spectrofotometru UV-VIS. Procentul de hemoliză pentru fiecare probă, a fost calculat cu ajutorul ecuației 8.3:

(8.3)

unde :

Abs probă este absorbanța supernatantului eritrocitelor incubate cu suspensia de nanoparticule, Abs0% hemoliză este absorbanța supernatantului eritrocitelor incubate cu ser fiziologic;

Abs100% hemoliză este absorbanța supernatantului eritrocitelor incubate cu soluție de Triton X-100 în ser fiziologic (2%). Toate probele au fost analizate în duplicat.

Testul de hemoliză este o cerință obligatorie pentru materialele care intră în contact cu sângele, deoarece interacțiunea acestora cu componentele sangvine poate duce la liza eritrocitelor. Din acest motiv au fost evaluate efectele nanoparticulelor preparate asupra sângelui cu ajutorul unui test de hemoliză. Rezultatele obținute în urma acestui studiu au pus în evidență faptul că gradul de hemoliză crește odată cu creșterea concentrației de nanoparticule (figura 8.19). S-a constatat ca nanoparticulele obținute prezintă o bună compatibilitate cu mediul sangvin care se încadrează în limitele normale (< 10% comparativ cu proba control pozitiv) . De asemenea s-a observat o creștere a procentului pentru hemoliză în cazul probelor B8 în acest caz fiind folosit ca și reticulant ionic Na2SO4, o posibilă cauză fiind cantitatea mai ridicată necesare pentru reticularea rețelei (raport molar NH3+/ Na2SO4 – 1/4), în comporație cu proba A8 (raport molar NH3+/ TPP- 1/2).

Figura 8.19. Influența concentrației de nanoparticule asupra gradului de hemoliză

8.2. Concluzii parțiale

Rezultatele experimentale obținute pentru sistemele particulate pe bază de CS-g-PEG-A anterior discutate conduc la următoarele concluzii:

A fost preparat un nou derivat de chitosan grefat cu poli(etilen glicol) metil eter acrilat prin reacția de adiție Michael, care a fost optimizat din punt de vedere al solubilității, realizându-se solubilizarea sa completă în apă bidistilată;

Caracterizarea din punct de vedere structural a CS-g-PEG-A s-a realizat prin spectroscopie FT-IR și prin spectroscopie 1H RMN ambele analize evidențiind formarea derivatului nou.

Au fost preparate noi micro/nanoparticule pe baza derivatului de chitosan prin procedeul de dublă reticulare în emulsie de tip apă în ulei ;

A fost studiat influența parametrilor de preparare cum ar fi concentrația inițială de polimer și viteza de agitare, natura reticulantului ionic asupra proprietățile finale ale suporturilor sub formă de micro/nanoparticulelor;

S-a observat că atât concentrația soluției de polimer cât și viteza de agitare influențează diametrul particulelor, acesta scăzând odată cu creșterea vitezei de agitare și scăderea concentrației de polimer;

S-a constatat că variația naturii reticulantului ionic influențează comportamentul micro/nanoparticulelor la umflare, respectiv capacitatea de includere/eliberare a principiilor biologic active;

Caracterizarea prin FT-IR a evidențiat formarea unor noi legături rezultate în urma procesului de reticulare ionică între polianioni (tripolifosfat) Na5P3O10 sau anionii de sulfat Na2SO4 și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-A și a legături iminice prin procesul de reticulare covalentă între grupele aminice ale polimerului și grupele carbonil ale aldehidei glutarice;

Caracterizarea morfologică prin SEM a confirmat obținerea unor micro/nanoparticule cu formă sferică și dimensiuni submicronice, potrivite pentru tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului

A fost studiat comportamentul particulelor la umflare în două medii apoase diferite: acid (pH=3,3), respectiv bazic (pH=7,4), suporturile polimerice demonstrând o capacitate de retenție a apei mai mare în cazul mediului acid, însă nici valorile experimentale obținute pentru cazul mediului bazic nu au fost foarte mici;

Nanoparticulele au fost testate în ceea ce priveste caracterul de biomaterial al acestora prin analiza de hemocompatibilitate, rezultatele obținute relevând un procent al hemolizei mai mic de 5%, ceea ce indică faptul că sunt hemocompatibile și pot fi administrate intraocular.

Având în vedere scopul final urmărit și anume utilizarea micro/nanoparticulelor ca suport pentru transportul de medicamente pentru tratarea unor afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului, a fost testată capacitatea de includere/eliberare a LEV în micro/nanoparticule prin difuzie; după încărcarea din tampon acetat, s-a constatat o eliberare rapidă în primele 10 ore, urmată apoi de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 120 ore.

Concluzii generale

Prezenta teză de doctorat a avut ca obiectiv principal obținerea și caracterizarea unor noi siteme polimere sub formă de geluri pe bază de poliglobalidă și sub formă de micro/nanoparticule pe bază de dervați de chitosan pentru transportul și eliberarea controlată a medicamentelor în cazul unor afecțiuni specifice ale pielii și afecțiuni ale segmentului posterior al ochiului

Realizarea acestui obiectiv a demarat cu realizarea gelurilor pe bază de poliglobalidă și a copolimerului poli(etilen glicol) cu funcții tiolice prin intermediul reacției de adiție tiol-enă fotoinițiată, respectiv a două tipuri de siteme particulate biocompatibile cu caracter de hidrogel, pe bază de chitosan modificat chimic cu poli(etilen glicol) metacrilat, respectiv poli(etilen glicol) metil eter acrilat prin reacția de adiție Michael, utilizând tehnica dublei reticulări (reticularea majoritară fiind cea ionică urmată de reticularea covalentă cu scopul asigurării stabilității mencanice a particulelor) realizată în emulsie inversă.

Concluziile constatate în urma cercetăriilor, structurate în cele patru capitole, sunt prezentate în cele ce urmează:

S-a realizat cu succes reacția de adiție tiol-enă radicalică între doi polimeri (PGL și PEG-SH) cu proprietăți hidrofile/hidrofobe foarte diferite, prin intermediul fotoinitierii reacției.

pentru sinteza poliglobalidei a fost utilizată metodă de polimerizarea cu deschidere de ciclu enzimatică catalizată de lipază raportată în literatură.

sinteza copolimerului de poli(etilenglicol) cu funcții tiolice s-a realizat prin procesul de policondensare a poli(etilen glicol) diol cu acid tiomalic în prezența trifluorometansulfonat de scandiu [Sc (OTf)3] drept catalizator foarte eficient și chemoselectiv.

analiza structurală FT-IR și FT-Raman a celor doi polimeri a permis obținerea unor informații cu privire la grupările funcționale ale PGL, și anume apariția unei benzi caracteristice în jurul valorii de 1673 cm-1, care rezultă din prezența funcționalității alchenelor C=C în catena principala a polimerului. De asemenea în cazul analizei FT-Raman pentru copolimerul PEG-SH spectrul evidențiază apariția benzilor caracteristice cum ar fi : semnalul specific vibrațiilor grupării esterice (O-C=O) la 1673 cm-1 și cel specific grupării funcționale tiolice (SH) la 2570 cm-1.

caracterizarea prin 1H RMN, a confirmat obținerea celor doi polimeri prin apariția de noi picuri specifice și anume: în cazul PEG-SH legarea acidului tiomalic pe lanțurile de PEG este justificată de apariția peakurilor specifice de la 2,27 pm care corespund grupărilor funcționale tiolice și sugerează că acestea au fost stabile în timpul procesului de policondensare, iar în cazul PGL apariția semnalului picului caracteristic al legǎturilor C=O la 5,5 ppm.

s-a constatat în urma analizelor structurale efectuate (GPC, 1H RMN) că PGL prezintă o masă moleculară (Mn) de aproximativ 6000 g/mol, și o polidispersitate ridicată de 3,4, respectiv o conversie a monomerului ridicată de 74 % comparativ cu alte metode de lucru raportate în literatură.

analiza GPC a copolimerul poli(etilenglicol-co-tiomaleat) (PEG-SH) a confirmat obținerea acestuia prezentând o masă moleculară (Mn) de aproximativ 2400 g/mol, o polidispersitate mare de 3,3 și un grad de policondensare de 3,25.

rezultatele analizei MALDI MS au dezvăluit doar o fracție de masă moleculară scăzută datorită polidispersiei ridicate a probei, și a confirmat masa unității monomere de 238 Da.

în cazul PEG-SH analiza MALDI MS nu a putut fi utilizată pentru determinarea masei moleculare, însă a evidențiat faptul că copolimerul PEG-SH este format dintr-un amestec de lanțuri macromoleculare cu număr diferit de macromeri PEG și comomeri tiomaleat. Datorită polidispersității ridicate a copolimerului, rezultatele au fost considerate doar ca o măsură calitativă a probei PEG-SH.

analiza citotoxică a dovedit că PEG-SH, respectiv PGL sunt polimeri biocompatibili, iar viabilitatea celulară a fibroblastelor 3T3 tratate cu concentrații de până la 10 mg/ml a fost comparabilă cu viabilitatea celulelor martor netratate

S-au obținut 18 tipuri de geluri polimere pe baza de poliglobalidă și poli(etilen glicol) funcționalizat cu grupări tiolice

s-au prepararat noi tipuri de rețele polimere pe bază de poliglobalidă prin intermediul reacției de adiție radicalică tiol-enă polimer-polimer fotoinițiată

caracterizarea gelurilor prin spectroscopie FT-Raman a evidențiat semnalele vibrațiilor de întindere specifice benzii legăturii duble (C=C) la 1673 cm-1, reprezentând legăturile duble nereacționate ale PGL și semnale vibrațiilor de întindere specifice benzii (SH) la 2570 cm-1, reprezentând grupe tiol nereacționate.

rețelele reticulate (gelurile) au fost analizate și prin analiza elementară, astfel pentru G3,6,9,12,15,18 (c=20% și diferite rapoarte molare inițiale SH/C=C, 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 2/1, 3/1), conținutul de sulf a fost doar puțin mai mic comparativ cu, conținutul teoretic inițial de sulf calculat din raportul inițial al polimerilor cu privire la fracția de gel de recuperată.

Spectofotometria UV-Vis (Testul Ellman’s) a evidențiat faptul că, conținutul de grupe tiol libere este dependent atât de concentrația totală de polimeri cât și de rapoartul molar (SH/C=C) utilizat, acesta crescând constant odată cu creșterea concentrației, astfel rețelele reticulate preparate la concentrații mai mici conțin o cantitate mai mare de sulf reacționat. De asemenea, diferența dintre sulful total și sulful din grupările tiol nereacționate este strâns legată de sulful reacționat din grupările tiol transformate, acesta fiind cel mai probabil cel din legăturile C-S-C formate între PGL și PEG-SH, însă nu se exclude complet nici posibilitatea formării și a unor legături disulfidice (S-S).

pe baza rezultatelor obținute prin utilizare analizei foto-reoligice se poate afirma că tăria structurală a gelurilor este dependentă de concentrația totală a amestecului de polimeri. De asemenea, cea mai mare rigiditate, de aproape 10 kPa pentru modulul de stocare, a fost înregistrată pentru G9 (c=20 %, raport molar de 1/3), în timp ce la c=40% au fost înregistrate valori apropiate de valorile obținute la c=10 %, fapt ce indică că, la fel ca în cazul cineticii de reticulare, că pentru stabilitatea gelurilor există un optim în domeniul de concentrație totală de polimeri cuprinsă între 10% și 20%.

Caracteristicile mofologice ale gelurilor polimerice liofilizate au fost analizate cu ajutorul tehnicii de microscopie electronică de baleiaj, aceasta confirmând în cazul G16,17,18 obținerea unor geluri cu structură macroporoasă omogenă cu dimensiuni și pori interconectați cu forme destul de regulate pentru concentrațiile 20 %, 10%, 5%, având dimensiunea cuprinsă între 30, 60 și 150 µm.

comportamentul gelurilor la umflare a dezvăluit valori scăzute în cazul umflării în mediu apos (20 ÷ 70 %) datorită prezenței PGL (polimer hidrofob) ca parte a rețelei, dar proprietăți excelente de umflare în THF unde gradul de umflare a gelurilor a fost cuprins în intervalul 400 ÷1000%

în urma evaluării citotoxicității rețelelor reticulate, determinată utilizând fibroblastele 3T3, s-a constatat că materialele pe bază de PGL posedă o biocompatibilitate ridicată de până la 50 mg/ml de conținut de gel solid în extracte și pot fi luate în considerare pentru utilizarea în aplicațiile biomedicale.

gelurile obținute s-au dovedit a avea capacitate de reținere a LEV prin proces difuzional.

eliberarea medicamentului în mediu apos se face cu un “burst effect” în primele 10 ore de eliberare, urmată de o fază mai lentă (caracterizată printr-o eliberare constantă) până la 48 ore când s-a atins o valoare de aproximativ 0,38 mg/mg gel.

procedura de modelare matematică a datelor cinetice de eliberare pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas a permis calculul exponentului difuzional n a cărui valoare indică un transport al medicamentului guvernat de difuzie.

S-au obținut doi derivați de chitosan prin modificarea chimică a acestuia cu poli(etilen glicol) metacrilat, respectiv poli(etilen glicol) metil eter acrilat prin reacții chimice la gupările aminice primare ale polizaharidei formând compuși cu noi proprietăți care au stat la baza obținerii suporturilor polimere ulterioare.

caracterizarea structurală a derivaților CS-g-PEG-MA, respectiv, CS-g-PEG-A prin spectroscopie FT-IR a confirmat grefarea ambelor tipuri de poli(etilen glicol) pe catena principală a polizaharidei argumentată de deplasarea benzilor de absorbție în spectrul derivaților comparativ cu benzile caracteristice spectrului chitosanului și, de asemenea de apariția unora noi semnale.

caracterizarea celor doi derivați prin spectroscopie 1H RMN a evidențiat prezența celor două tipuri de poli(etilen glicol) în structura noilor compuși prin apariția picurilor specifice protonilor din unitatea structurală a poli(etilen glicolului), care lipsesc în structura chitosanului nativ.

determinarea gradului de substituție a derivaților sintetizați, s-a realizat cu ajutorul intensității picurilor specifice protonilor din unitatea structurală a poli(etilen glicolului) și a chitosanului.

În urma determinării gradului de grefare prin Spectroscopia de rezonanță magnetică (1H RMN) acesta s-a dovedit a fi dependent de raportul molar -NH2/PEG-A.

analiza stabilității termice a derivatului CS-g-PEG-MA evidențiază faptul că din punct de vedere termic CS-g-PEG-MA este mai puțin stabil comparativ cu chitosanul efect care este pus pe seama reducerii cantității de legături de hidrogel dintre lanțurile de polizaharid, ca urmare a interpunerii între acestea a grefelor de poli(etilenglicol) metacrilat

analiza curbelor obținute prin Calorimetrie prin scanare diferențială (DSC) a chitosanului și a CS-g-PEG-MA a sugerat o bună stabilitate termică a acestora.

S-au obținut 14 tipuri de siteme micro/nanoparticule polimere pe baza derivaților CS-g-PEG-MA prin metoda emulsiei apă în ulei cu dublă reticulare. Reticularea ionică a fost majoritară realizându-se între polianioni (tripolifosfat) Na5P3O10 sau anionii de sulfat Na2SO4 și cationii de amoniu ai CS-g-PEG-MA și prin legături iminice formate prin procesul de reticulare covalentă (cu rol de stabilizare mecanică) între grupele aminice ale polimerului și grupele carbonil ale aldehidei glutarice

caracterizarea structurală prin spectroscopie FT-IR a micro/nanoparticulelor a confirmat realizarea celor două tipuri de reticulare (ionică, covalentă) prin prezența benzilor de absorbție caracteristice fiecăreia.

caracterizarea morfologică prin SEM confirmă obținerea unor sisteme particulate cu formă sferică și dimensiuni submicronice, adecvate aplicației vizate.

caracteristicile morfologice ale particulelor s-au dovedit a fi dependente de factorii: concentrația soluției de polimer, raportul molar –NH3+/ TPP sau Na2SO4 și –NH3+/AG, timpul de reticulare ionică și covalentă, respectiv viteza de agitare.

curbele diferențiale de distribuție granulometrică, cu aspect monomodal, sunt în acord cu dimensiunea micro/nanoparticulelor determinată prin microscopia electronică de baleiaj, astfel evidențiindu-se influența concentrației soluției de polimer.

analiza de difractometrie cu radiație laser a micro/nanoparticuleleor a evidențiat un aspect monomodal al curbelor de distribuție granulometrică, cu polidispersitate relativ mică și diametrul mediu al nanoparticulelor cuprins între 90 – 3500 nm, rezultate în acord cu cele înregistrate prin microscopie electronică.

se constată și în acest caz că dimensiunea particulelor și polidispersitatea acestora este dependentă de factori precum concentrația soluției de polimer, natura reticulantului ionic și viteza de agitare.

reducerea diametrului particulelor, este din ce în ce mai pronunțată odată cu scăderea a concentrației soluției și creșterea vitezei de agitare, ca o consecință a densității mai mari de reticulare; se obțin astfel sisteme particulate de dimensiuni reduse și mai bine individualizate.

analiza prin Calorimetrie prin scanare diferențială (DSC) a nanoparticulelor a sugerat o bună stabilitate termică a acestora.

micro/nanoparticulele preparate au dovedit un comportament la umflare bun atât în medii de pH acid cât și ușor bazic.

scăderea concentrației soluției de polimer de la 0,75 % la 0,35 %, respectiv creșterea vitezei de agitare a dus la o scădere a diametrului probelor de la 3500 nm la 100 nm.

scăderea concentrației soluției de polimer conduce la o creștere a gradului maxim de umflare a nanoparticulelor în mediu apos (pH = 3,4), acest comportament influentează capacitatea de încărcare cu medicamente.

caracteristicile de umflare, includere și eliberare a micro/nanoparticulelor pot fi controlate prin modificarea parametrilor studiați.

micro/nanoparticulele obținute s-au dovedit a avea capacitate de încapsulare a LEV și BEV prin proces difuzional.

eliberarea medicamentului în mediu apos (pH= 7,4, care simulează lichide fiziologice) se realizează în primă fază cu un “burst effect”, atingând o valoare de aproximativ 78,12 % LEV și 30 % BEV după 10 ore din cantitatea totală încărcată, manifestând în continuare tendință de eliberare a medicamentului.

procedura de analiza a datelor cinetice de eliberare pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas a permis calculul exponentului difuzional n a cărui valoare indică un transport al medicamentului guvernat atât de difuzie pentru probele MA-8,9 și MA-D,E, respectiv de difuzie cât și de umflare, în cazul celorlate suporturi.

testul de viabiltate celulară exemplificat pe probele MA-5,6,8 demonstrează lipsa de toxicitate a particulelor.

rezultatele testelor de hemoliză pe nanoparticulele de tip MA-8 au dovedit că acestea sunt hemocompatibile și pot fi administrate intraocular.

micro/nanoparticulele obținute s-au dovedit a fi practic lipsite de toxicitate si potential aplicabile ca purtători ai unui anticorp anti-VEGF A, concluzii rezultate în urma efectuării de experimente pe animale de experienta asupra modelului de formare a tuburilor celulelor endoteliale, respectiv efectului antiangiogenic asupra diabetului/boli inflamatorii ale ochiului.

S-au obținut 14 tipuri de siteme micro/nanoparticule polimere pe baza derivaților CS-g-PEG-A prin metoda dublei reticulări în emulsie inversă, utilizându-se aceiași reticulanți ca în cazul anterior.

spectroscopia FT-IR a micro/nanoparticulelor a confirmat formarea de noi legături corespunzătoare celor două tipuri de reticulare (ionică, covalentă) prin prezența benzilor de absorbție caracteristice fiecăreia.

caracterizarea morfologică prin SEM relevă obținerea unor sisteme particulate cu formă sferică și dimensiuni submicronice, corespunzătoare aplicației vizate.

profilul morfologic al sistemelor polimere s-a dovedit a fi dependent de următorii factori: concentrația soluției de polimer, raportul molar –NH3+/ TPP sau Na2SO4 și –NH3+/AG, timpul de reticulare ionică și covalentă și viteza de agitare.

analiza de difractometrie cu radiație laser a micro/nanoparticuleleor a evidențiat un aspect monomodal al curbelor de distribuție granulometrică, cu polidispersitate relativ mică și diametrul mediu al nanoparticulelor cuprins între 90 – 4500 nm, rezultate în acord cu cele înregistrate prin microscopie electronică.

se constată și în acest caz că dimensiunea particulelor și polidispersitatea este dependentă de factori precum concentrația soluției de polimer, natura reticulantului ionic și viteza de agitare.

odată cu scăderea a concentrației soluției și creșterea vitezei de agitare, densitatea de reticulare crește conducând la reducerea diametrului particulelor, obținându-se sisteme polimere particulate mai individualizate de mărimi reduse.

suporturile polimerice obținute s-au dovedit a avea o capacitate bună de umflare atât în mediu de pH acid cât și ușor bazic.

scăderea concentrației soluției de polimer de la 0,75 % la 0,35 %, respectiv creșterea vitezei de agitare a dus la o scădere a diametrului particulelor de la 3500 nm la 100 nm.

scăderea concentrației soluției de polimer de la 0,75 % la 0,35 % conduce la o creștere a gradului maxim de umflare a nanoparticulelor în mediu apos (pH = 3,4), acest comportament influentează capacitatea de încărcare cu medicamente.

proprietățile de umflare, includere și eliberare a medicamentelor din micro/nanoparticule pot fi controlate prin modificarea parametrilor studiați.

micro/nanoparticulele obținute prezintă o capacitate bună de încărcare a levofloxacinului prin difuzie, cantitatea de LEV încapsulată fiind dependentă de concentrația soluției de polimer.

eliberarea medicamentului în mediu apos ( pH= 7,4, care simulează lichide fiziologice) se realizează în primă fază cu un “burst effect”, atingând o valoare de aproximativ 60 % LEV după 10 ore din cantitatea totală încărcată, manifestând în continuare tendință de eliberare a medicamentului până la 120 ore.

analiza a datelor cinetice de eliberare pe baza modelului matematic Korsmeyer-Peppas a permis calculul exponentului difuzional n a cărui valoare indică un transport al medicamentului guvernat atât de difuzie pentru probele A-8,9 și B-8,9, respectiv de difuzie cât și de umflare, în cazul celorlate suporturi.

rezultatele testelor de hemoliză pe nanoparticulele de tip A-8 și B-8 au dovedit că acestea sunt sunt hemocompatibile și pot fi administrate intraocular.

Ținând cont de rezultatele cercetării și de concluziile desprinse pe baza acestora, prezentate anterior, considerăm că obiectivele tezei de doctorat propuse au fost îndeplinite și că sistemele polimere realizate prezintă caracteristici structurale, morfologice, sunt indicate pentru transportul de principii biologic active și au potențial de utilizare atât în aplicații ale ingineriei tisulare cât și în terapia afecțiunilor segmetului posterior al ochiului.

Valorificarea rezultatelor cercetării

Lucrări științifice acceptate spre publicare în reviste cu factor de impact

Modern Drug Delivery Systems for Targeting the Posterior Segment of the Eye, Catalina Anisoara Peptu, Marcel Popa, Corina Savin, Radu Florin Popa and Lacramioara Ochiuz, Current Pharmaceutical Design, Volume 21, Number 42, December 2015, pp. 6055-6069 (15)

Renewable polyglobalide based porous networks containing poly(ethylene glycol) structures by photoinitiated thiol-ene coupling, C. L. Savin, C. Peptu, Z. Kronekova, M. Sedlačík, M. Mrlik, V. Sasinkova, C. A. Peptu, M. Popa, J. Mosnacek, Biomac., 2018

Lucrări științifice trimise spre publicare în reviste cu factor de impact

…..

Lucrări științifice în curs de redactare

………………………

Capitol de carte

Chemically modified polysaccharides with applications in nanomedicine, J. Desbrieres, C.A. Peptu, C. Savin, M. Popa, chapter X, in Biomass as renewable raw materials for bioproducts, Eds. V.I.Popa and I.Volf, 2018

Cerere brevet

Procedeu de preparare a unor suporturi polimerice/nanoparticulate pe baza unui nou derivat de chitosan, pentru includerea și eliberarea de medicamente hidrosolubile Catalina Anisoara PEPTU, Corina Lenuta SAVIN, Lacramioara OCHIUZ, Corneliu Sergiu STAN, Marcel POPA

Comunicări prezentate la manifestări științifice internaționale

În Romania

Corina Savin, Catalina Anisoara Peptu, Marcel Popa, Developing a new system of micro / nanoparticles based on chitosan gelatine for ophthalmology applications, Annual Scientific Session of the Research Institute Acad. Ion Haulica Apollonia jointly with the University of experimental and clinical physiology of the stomatognate system in the Iasi Branch of the Romanian Academy, 2015, Iasi , Romania

Andrițoiu Calin Vasile, Corina Lenuța Savin, Diana Ciubotaru, Peptu Catalina Anișoara, Marcel Popa, Evaluation of The Effect of the Collagen-Based Formulation on Cutaneous lesions, International Congress 7TH National congress with international participation and 33rd annual scientific session of the Romanian society for cell biology, 2015, Baia Mare, Romania

C.A. Peptu, C.L. Savin, G. Andrew, C. E. Iurciuc (Tincu), M. Popa. Poly (ethylene glycol methacrylate) grafted chitosan micro particles for ophthalmic applications, International Conference of materials science and engineering, 9th edition of BRAMAT 2015, Brasov, Romania

C.E. Iurciuc (Tincu), C.L. Savin, A. Savin, M. Popa, P. Martin, Immobilized yeast cells in spherical gellan matrices: a comparative study, International Conference of materials science and engineering, 9th edition of BRAMAT 2015, Brasov, Romania

Corina Savin, Marcel Popa, Manuela Ozturk, Vasile Drug, Danut Costin, Cătălina A. Peptu, Particulated carriers based on poly(ethylene glycol) methacrylate grafted chitosan for administration of levofloxacin at intraocular level, Iasi Academic Days, The XXV-nd Symposium , "Progress in organic and polymer chemistry", “Petru Poni” Institute of Macromolecular Chemistry, 2015, Iasi, Romania

Cătălina A. Peptu, Corina Savin, Jacques Desbrieres, Nela Bibire, Marcel Popa, Micro and nanoparticles based on natural polymers with potential applications in the treatment of ophthalmic diseases, International Congress of University "APOLLONIA" Promoting Excellence in Iasi preparing future XXVI edition of the 3 to 5 March 2016, Iasi, Romania

Savin Corina-Lenuta, Mosnacek Jaroslav, Popa Marcel, Peptu Catalina, Peptu Cristian, Polyglobalide crosslinked networks via photoinitiated thiol-ene coupling, Congresul Internațional al Universității „Apollonia” din Iași, Ediția a XXVIII-a 1-4 martie 2018, IAȘI, ROMANIA

În străinătate

Cătălina A. Peptu, Savin Corina, Marcel Popa, Micro and nanocarriers based on poly(ethylene glycol) methacrylate grafted chitosan for targeting the posterior segment of the eye, 6th Bratislava Young Polymer Scientists workshop, BYPOS, 2016, Slovakia

Corina Savin, Marcel Popa, Jacques Desbrieres, Nela Bibire, Cătălina A. Peptu, Preparation and characterisation of nanoparticles based on poly(ethylene glycol) methacrylate grafted chitosan for intraocular administration of antibiotics, World Biomaterials Congress (WBC) 2016, Montreal, Canada

Corina Savin, Cătălina A. Peptu, Marcel Popa, Christelle Delaite, Gerard Riess, New type of nanoparticles based on PEG methacrylate/acrylate grafted chitosan: a comparative study, XII th French-Romanian Polymer Meeting , 2016, Sophia Antipolis, France

M. Popa, C. Savin, C.Delaite, G.Riess, C.A.Peptu, Poly (ethylene glycol) methacrylate and poly (ethylene glycol) methyl ether acrylate grafted chitosan nanoparticles with potential applications in ophthalmology, Fifth International Symposium Frontiers in Polymer Science,17-19 May 2017, Seville, Spain

C. Peptu, C. Savin, M. Popa, Micro- and nanocarriers based on pooly(ethylene glycol) methacrylate and poly(ethylene glycol) methyl ether acrylate grafted chitosan, Materials, Methods and Technologies, 26-31 june 2017, Elenite, Bulgaria

8 – Postere

4 – Prezentări

Abrevieri

ABS – Soluție fosfat acetat

AG – Aldehida glutarică

AMD – Degenerescența maculară legată de vârstă

BAB – Bariera sânge – umoare apoasă

BRB – Bariera sânge – retină

BEV – Bevacizumab

CRG – Carageenan

Colab. – Colaboratorii

CS – Chitosan

DCM – Diclormetan

DMPA – 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonă

DTNB – Acid 5,5'-ditio-bis- (2-nitrobenzoic)

DSC – Analiza calorimetrică prin scanare diferențială

FT-IR, FT-Raman – Spectroscopia în Infraroșu cu Transformată Fourier și Raman

GL – Globalidă

GlcN – 2-amino-2-deoxi-β-d-glucopiranosil

GlcNAc – 2-acetamido-2-deoxi-β-d-glucopiranosil

GPC – Cromatografie de permeație prin gel

HBSS – Soluție tampon salină Hank

IOL – lentilelor intraoculare injectabile

LEV – Levofloxacin

LPS – lipopolizaharidă

MALDI – Spectrometrie de masă

MP – Microparticule

MNP – Micro/nanoparticule

NP – Nanoparticule

PBS – Soluție tampon fosfat

PCL – poli (ɛ-caprolactonă)

PEG – Poli(etilen glicol)

PEG-A – Poli(etlen glicol) metil eter acrilat

PEGDA – poli(etilen glicol) diacrilat

PEG-MA – Poli(etilen glicol) metacrilat

PEG-SH – copolimerul poli(etilenglicol-co-tiomaleat)

PGL – Poliglobalidă

PLGA – poli(d,l-lactidă-co-glicolidă)

PMMA – poli(metacrilat de metil)

PTMP – tetrakis(3-mercapto propionat de pentaeritritol)

RPE – Epiteliul pigmentar retinal

RMN – Rezonanța magnetică nucleară

TA – Triamcinolon

TGA – Caracterizarea termică – Analiza termogravimetrică

THF – Tetrahidrofuran

TPP – Tripolifosfatul de sodiu

TMA – Acidul tiomalic

SEM – Microscopie electronică de baleiaj

SALD – Analiza dimensională a particulelor prin difractometrie laser