Tratamentul adjuvant cu Bevacizumab în chirurgia glaucomului [309081]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ și FARMACIE

“CAROL DAVILA” BUCUREȘTI

Facultatea de Medicină

Teza de Doctorat

Tratamentul adjuvant cu Bevacizumab în chirurgia glaucomului

Conducător științific:

Prof. Univ. Dr Liliana Mary Voinea

Doctorand: [anonimizat] 2015

CUPRINS

Cuprins

Introducere

Partea generală

1. Elemente de anatomie oculară 6

1.1 Anatomia globului ocular uman 6

1.2 Elemente de histologie oculară 13

1.3 Procesul de angiogeneză 18

2 Glaucomul 23

2.1 Definiție 23

2.2 Clasificare 23

2.3 Diagnostic 24

2.4 Tratament 27

2.5 Metode de prevenire a cicatrizării trabeculectomiei 31

Partea specială

3 Studiu privind evaluarea eficienței Bevacizumabului administrat subconjunctival la pacienții operați de glaucom 37

3.1 Scopul studiului 37

3.2 Designul studiului 37

3.3 Pacienți și date 37

3.4 Analiza statistică 39

3.5 Metode de evaluare clinică a pacienților operați 40

3.6 Rezultate și discuții 42

3.7 Concluzii 76

4 Studiul efectului unor substanțe cu rol antiangiogenic și antifibrotic asupra chirurgiei filtrante a glaucomului pe modelul animal 79

4.1 Scopul studiului 79

4.2 Justificarea alegerii modelului animal 79

4.3 Modelul animal 79

4.4 Agenți antiangiogenici și antifibrotici utilizați 85

4.5 Metode de evaluare clinică a animalelor de laborator 92

4.6 Metode histopatologice și imunohistochimice de evaluare a animalelor de laborator 93

4.7 Rezultate 94

4.8 Discuții 115

4.9 Concluzii 118

5 Concluzii generale 121

Bibliografie 123

[anonimizat]. În prezent singura abordare dovedită eficientă în păstrarea funcției vizuale în glaucom este reducerea presiunii intraoculare.

Scopul principal al chirurgiei glaucomului este de a obține o presiune suficient de joasă fară terapie medicamentoasă asociată. [anonimizat]/sau laser. Aceasta realizează o “fistulă” între camera anterioară și spațiul subconjunctival.

Factorul determinant pentru controlul pe termen lung al presiunii intraoculare după trabeculectomie este răspunsul natural de vindecare la nivelul fistulei. [anonimizat], de sinteza de colagen. [anonimizat], cu progresia distrucției nervului optic. Pentru a [anonimizat] C și 5Fluorouracil, agenți antifibrotici și antimitotici. [anonimizat].

În prezent se investighează noi compuși ce acționează țintit în procesul de cicatrizare cu scopul de a reduce complicațiile chirurgiei glaucomului asociate cu antimetaboliți. [anonimizat] (Bevacizumab), se poate reduce migrarea și proliferarea fibroblaștilor și astfel se poate încetini procesul de vindecare (cicatrizare) de la nivelul trabeculectomiei. Bevacizumabul poate fi un agent important care să limiteze formarea cicatricii posttrabeculectomie, îmbunătățind astfel rata de succes a operației pe termen lung.

Pe parcursul acestui studiu doctoral am încercat să influențez etapele procesului natural de cicatrizare la nivelul globului ocular folosind agenți antiangiogenici (Bevacizumab) și antifibrotici (Pirfenidona). În acest scop au fost urmărite mai multe direcții de studiu, care au implicat atât experimente pe model animal, cât și prevenția și tratamentul la pacienți umani.

Obiectivele acestui studiu doctoral au fost reprezentate de sporirea cunoștințelor privind vindecarea naturală postchirurgie filtrantă a diferitelor tipuri de glaucom și încercarea de a descoperi noi combinații terapeutice adjuvante trabeculectomiei care să prelungească viabilitatea bulei de filtrare.

Fundamentarea științifică și elaborarea acestei teze de doctorat au fost posibile doar prin prisma unei îndrumări științifice de calitate realizată cu profesionalism și exigență.

Astfel, cele mai profunde gânduri de recunoștința sinceră le adresez Doamnei Profesor Universitar Doctor Liliana Voinea, atât în calitate de îndrumător științific cât și de susținător moral în finalizarea acestei teze, de la care am învățat rigoarea muncii, răbdarea, generozitatea și devotamentul profesional. Pentru mine reprezintă un model personal și profesional ce m-a influențat și mă va influența în întreaga mea cariera.

Mulțumiri sincere adresez Doamnei Profesor Universitar Doctor Sabina Zurac pentru îndrumările realizate din punctul de vedere al expertului anatomopatolog, fără de care cercetarea histopatologică a acestui proiect nu ar fi fost posibilă.

Doresc să adresez mulțumirile cuvenite tuturor celor care, direct sau indirect, prin sugestiile oferite au contribuit la șlefuirea acestui demers științific. Le mulțumesc colegilor din Clinica de Oftalmologie pentru ajutorul acordat în desfășurarea studiilor experimentale precum și colaboratorilor din serviciul de anatomopatologie a Spitalului Clinic Colentina conduși de Doamna Profesor Doctor Sabina Zurac.

Nu în ultimul rând, mulțumesc din suflet familiei care m-a sprijinit pe toată perioada derulării doctoratului meu cu toate suișurile și coborâșurile lui. Dedic această reușită părinților mei care m-au susținut cu dragoste nemărginită și necondiționată în tot ceea ce am realizat.

PARTEA GENERALĂ

Elemente de anatomie oculară

Anatomia globului ocular uman

Vederea este cel mai folosit simț în relația omului cu mediul înconjurător. Ochiul, component al analizatorului vizual periferic și unul dintre cele mai complexe organe ale organismului uman, este sediul celulelor fotoreceptoare. Acestea transformă energia luminoasă în impulsuri nervoase care, pe calea nervilor optici ajung la creier (1).

Ochiul uman, de forma unei sfere, prezintă trei tunici suprapuse care formează peretele lui: la exterior tunica fibroasă, formată din cornee și scleră, tunica mijlocie, vasculară, uveea și tunica internă, nervoasa, retina (1).

Conținutul globului ocular este reprezentat de umoarea apoasă, cristalinul și corpul vitros și formează mediile transparente ale acestuia.

Sclera, rezistentă, dură și inextensibilă la adult are rol de protecție. Ea formează 5/6 posterioare ale tunicii fibroase externe și pornește de la limbul sclerocornean pană la nervul optic. Zona de la nivelul sclerei posterioare pe unde trec fibrele nervului optic se numește „lama ciuruită”. Prezintă în grosimea ei vase de sânge și nervi. Sclera are mai multe surse de vascularizație: Arterele provin din arterele ciliare scurte posterioare și din ciliarele anterioare, iar venele se varsă în venele ciliare anterioare și în venele coroidiene. Inervația este asigurată din nervii ciliari (1),(2). Structura sclerei este bogată în colagen dispus neregulat și în apă (75%), acestea conferindu-i un aspect opac, elasticitate și rezistență. Grosimea sa este neuniformă, fiind minimă la nivelul zonei de inserție a mușchilor drepți (300µm) și maximă la nivelul canalului scleral al nervului optic (1000µm) (1),(2),(3),(4),(5).

Corneea, porțiunea anterioară a tunicii fibroase, este transparentă, conține numeroase fibre nervoase și nu conține vase de sânge. Ea are un rol fundamental în refracția oculară, acționând ca o lentilă (1),(3),(4),(5),(6).

Limita dintre cornee și scleră poartă numele de limb sclero-cornean. Acesta se proiectează în secțiune între linia care trece prin marginile membranelor Descemet și Bowmann și linia perpendiculară pe canalul Schlemm.

Uveea, tunica mijlocie, vasculară, este compusă din coroidă, corp ciliar și iris.

Coroida căptușește fața internă a sclerei între discul optic și ora seratta și reprezintă segmentul posterior al tractului uveal. Este intens vascularizată, asigurând nutriția globului ocular, bogată în melanocite și fibre nervoase (7),(8). Coroida vascularizează retina externă, o porțiune a discului optic și este singura sursă arterială a foveei (1),(9),(10). La nivelul coroidei există un număr mare de melanocite a căror densitate crește de la nivelul straturilor interne către cele externe. Ele sunt localizate în jurul vaselor de sânge noncapilare din straturile coroidiene profunde și din spațiul supracoroidian (11).

Corpul ciliar, formațiune conjunctivo-musculară, se găseste în partea anterioară a coroidei, între ora seratta și rădăcina irisului. Prin mușchiul său corpul ciliar are rol în realizarea acomodației, iar procesele ciliare secretă umoarea apoasă care realizează nutriția țesuturilor lipsite de vase (cristalin și cornee). Partea sa anterioară, corpul ciliar anterior, ce reprezintă 1/3 este alcatuită din mușchiul ciliar și procesele ciliare. Mușchiul ciliar are în secțiune formă triunghiulară cu baza situată anterior și vârful posterior spre pars plana. El prezintă o parte longitudinală, una radială și una circulară. Fibrele părții longitudinale se inseră pe pintenul scleral și pe porțiunile corneosclerală și uveală externă ale trabeculului. Fibrele părții radiale au originea posterior de canalul Schlemm și inserția în partea uveală internă a trabeculului. Contracția întregului mușchi ciliar determină deplasarea spre posterior și interior a pintenului scleral și trabeculului, deschizând spațiile trabeculare, modulând astfel rezistența la scurgere a umorii apoase și arhitectura rețelei trabeculare. Pintenul scleral conține axoni care inervează celulele de la acest nivel și care prezintă caracteristici ultrastructurale de terminații nervoase mecanosenzoriale (12). Procesele ciliare, cu rol în secreția umorii apoase, sunt reprezentate de 70-80 plici rotunjite dispuse radiar (13), cu suprafața de dimensiuni crescute, necesară transportului activ și ultrafiltrării (14). Ele sunt împărțite într-o parte superioară din vecinătatea orei seratta și o porțiune inferioară care formează corona ciliaris. Corpul ciliar posterior sau pars plana este limitat posterior de ora seratta (15). Extern, corpul ciliar se atașează pintenului scleral, între el și sclera se formează astfel un spațiu virtual, spațiul supraciliar (1),(16). Vascularizația corpului ciliar este realizată de cercul arterial intramuscular. Acestea se formează prin anastomoza arterelor ciliare anterioare cu ramuri din arterele ciliare lungi posterioare. Ramuri din arterele ciliare anterioare străbat sclera și se anastomozează la nivelul corpului ciliar cu ramuri ale arterelor ciliare lungi. O parte din aceste ramuri intră și în alcătuirea marelui cerc arterial al irisului.

Irisul este dispus în partea anterioară a uveei și este constituit dintr-o membrană disciformă ce prezintă un orificiu central, pupila. El delimitează posterior camera anterioară ce conține umoarea apoasă, iar fața lui posterioară vine în contact cu camera posterioară și cu cristalinul (1),(17),(5). Vascularizația sa este realizată de artere ce provin din marele cerc arterial al irisului, situat la nivelul stromei corpului ciliar. De la acest nivel pornesc ramuri radiare spiralate pană la marginea pupilară unde se formează micul inel arterial irian.

Retina, tunica internă a globului ocular este de natură nervoasă și cuprinde receptorii pentru lumină. Ea tapetează ¾ posterioare ale globului ocular și prezintă două regiuni importante: papila nervului optic (pata oarbă) și macula lutea (pata galbenă). Papila nervului optic (discul optic) reprezintă zona la nivelul căreia se strâng fibrele nervoase de la nivelul retinei și formează nervul optic. Din centrul său pleacă vasele centrale ale retinei și nu conține receptori pentru lumină. Macula se află la intersecția axului vizual cu retina și are subdiviziunile fovee, parafovee și perifovee. La nivelul foveei predomină celulele cu conuri, fiind cea mai specializată zonă retiniană. Depresiunea centrală a foveei numită foveola este responsabilă de vederea colorată și este zona retiniană responsabilă de acuitatea vizuală maximă (1),(18),(6). Regiunea retinei periferice este reprezentată de retina situată între periferia maculei și ora seratta. Ora seratta este zona de tranziție dintre retină și pars plana a corpului ciliar. Ea are un aspect dințat datorită prelungirilor țesutului retinian în epiteliul nepigmentar ciliar (1). Circulația retiniană are două surse arteriale: pentru 2/3 interne ale retinei sursa este artera centrală a retinei, ram din artera oftalmică, iar pentru 1/3 externă retiniană sursa este reprezentată de coriocapilara (19). Artera centrală a retinei, la nivelul discului optic, se împarte într-o ramură superioară și una inferioară care se divid mai departe, distribuindu-se stratului celulelor ganglionare și mai departe înspre membrana limitantă internă unde se formează bariera sânge-retina. La această barieră participă astrocitele, celulele Muller și mai ales joncțiunile strânse dintre celulele endoteliale. Rețeaua capilare, desprinsă din sistemul arterial, se continuă cu cea venulară. Venele au traiect invers arterelor, astfel vena centrală a retinei iese din globul ocular la nivelul discului optic.

Unghiul camerular este unghiul format de fața posterioară a corneei cu fața anterioară a irisului. În mod normal, unghiul irido-cornean nu poate fi examinat din cauza opacității părții sclerale a limbului și a reflexiei totale a razelor luminoase la nivelul filmului precornean (1),(20).

Elementele unghiului camerular normal sunt următoarele :

Linia Schwalbe marchează extremitatea periferică a descemetului și este limita anterioară a unghiului camerular. Are aspectul unei linii fine, alb-cenușii, refringentă, foarte netedă

Rețeaua trabeculară continuă posterior linia Schwalbe până la pintenul scleral. Ea este subdivizată în două porțiuni, la nivelul joncțiunii dintre cele două aplicându-se impactele în lasertrabeculoplastie: porțiunea anterioară nefuncțională are un aspect mai mătuit, iar porțiunea posterioară de lângă pintenul scleral este translucid-albastruie mai mult sau mai puțin pigmentată, în funcție de vârstă. Treimea posterioară corespunde proiecției canalului Schlemm, care se poate vedea dacă este plin cu sânge sub forma unui inel roșu.

Pintenul scleral constituie reperul cel mai constant al unghiului și apare sub forma unei benzi albe-sidefii, dense, usor strălucitoare, localizată imediat înapoia trabeculului.

Banda ciliară corespunde proceselor ciliare și se află posterior de pintenele scleral. Are o culoare variabilă (de la roz la brună), iar lațimea sa depinde de tipul inserției rădacinii irisului. La persoanele mioape banda ciliară este mai largă, la persoanele hipermetroape este mai îngustă. La acest nivel pot să existe procese iriene, care sunt extensii ale irisului anterior și care nu depășesc trabeculul. Ele sunt mai frecvente la tineri și se diminuează cu vârsta.

Rădacina irisului, de convexitate variabilă (1),(20).

În vârful unghiului camerular, între membrana Descemet și partea anterioară a corpului ciliar este situată rețeaua trabeculară. Trabeculul este subdivizat în trei porțiuni între care nu există delimitari nete: trabeculul uveal este porțiunea care este situată spre camera anterioară, trabeculul corneo-scleral este porțiunea din apropierea canalului Schlemm, iar trabeculul endotelial (țesutul juxtacanalicular) este porțiunea alipită de endoteliul canalului Schlemm. Trabeculul uveal este alcătuit dintr-o rețea de benzi cilindrice (21) ce se întrepătrund și au o dispoziție majoritar radiară, de aproximativ 4 mm diametru. Ele realizează o „plasă” trabeculară ale cărei ochiuri au dimensiuni variabile cuprinse între 25 microni și 75 microni. Fiecare bandă trabeculară are un nucleu de colagen înconjurat de un strat unilamelar de celule endoteliale. Trabeculul corneo-scleral este compus din benzi aplatizate, asemănătoare unor foite cu dispoziție circumferențială. Fiecare bandă are lungimea de 20 microni, grosimea de 3 microni și formează o rețea ce umple unchiul irido-cornean. Lamelele sunt acoperite de celule „endothelium-like” așezate pe o membrană bazală. Lamelele sunt formate din glicoproteine, colagen, acid hialuronic, fibre elastice (22). Ochiurile de formă eliptică ale rețelei sunt mult mai mici decât ale trabeculului uveal având 10-30 microni. Spațiile delimitate de lamele nu sunt superpozabile astfel că aspectul spațiilor rezultate este circumvolut și nu tubular. Dimensiunile spațiilor delimitate de trabecule sunt din ce în ce mai mici pe măsura ce se apropie de canalul Schlemm, reducându-se pâna la 1-2 microni. Trabeculul juxtacanalicular sau endotelial separă trabeculul corneo-scleral de canalul Schlemm. Umoarea apoasă strabate inițial spațiile generoase ale trabeculului uveal, apoi pe cele mai înguste ale trabeculului corneo-scleral și ajunge la nivelul țesutului conjunctiv juxtacanalicular. Acesta este acoperit de un strat de celule endoteliale dispuse spre canalul Schlemm, numite celule juxtacanaliculare. Celulele din rețeaua trabeculară juxtacanaliculară sunt înconjurate de elemente fibrilare ale matrixului extracelular. La acest nivel trabeculele nu formează lamele, au o dispoziție dezordonată (12). Canalul Schlemm este localizat în sclera perilimbica, circumferențial. Peretele său intern este format din celule endoteliale neregulate care conțin vacuole gigante. Tot la nivelul celulelor endoteliale interne s-au observat pori transcelulari, cu diametru de 0,8-1,8 microni (23),(24). Între aceste celule există joncțiuni strânse. Peretele extern este alcătuit din celule turtite, netede și prezintă deschiderile canalelor colectoare cu dispoziție oblică, conectate direct sau indirect cu venele episclerale (1),(20).

Conjunctiva reprezintă o membrană mucoasă transparentă care căptușește suprafața posterioară a pleoapelor (conjunctiva palpebrala), se reflectă la nivelul fundurilor de sac conjunctivale pe scleră formând conjunctiva bulbară care ajunge la limbul sclero-cornean unde se continuă cu epiteliul cornean. Conjunctiva palpebrală este o structură foarte bine vascularizată, aderentă de tars. Profund de conjunctivă se află țesutul conjunctiv subepitelial bogat în țesut limfoid mai ales spre fundurile de sac conjunctivale. La marginile palpebrale conjunctiva se continuă cu tegumentul și cu epiteliul ductelor glandelor tarsale, cu epiteliul canaliculelor lacrimale, al sacului lacrimal, al canalului nazolacrimal și al mucoasei nazale. În unghiul intern conjunctiva bulbară prezintă două mici formațiuni: caruncula lacrimală, o mică proeminență formată din foliculi piloși și glande și cuta semilunară , o mică plică situată lângă caruncula lacrimală. Fornixul conjunctival reprezintă linia de reflexie a conjunctivei de pe fața internă a pleoapei pe globul ocular. Conjunctiva bulbară tapetează sclera, este fină, transparentă, nu prezintă papile și este puțin vascularizată. Vascularizația conjunctivei provine din ramurile arterei palpebrale și ramurile perforante ale arterelor ciliare (1),(3),(25, 26),

Capsula Tenon este o membrană fină care învelește globul ocular de la joncțiunea corneo-sclerală la nervul optic, cu rolul de a separa globul ocular de grăsimea retroorbitară și de a permite rotația liberă a acestuia. Între scleră și capsula Tenon se află spațiul episcleral care conține travee fine de țesut conjunctiv. Posterior, capsula prezintă numeroase orificii străbătute de nervii și vasele ciliare. Atât în dreptul orificiului de trecere al nervului optic, cât și în vecinătatea limbului sclero-cornean capsula Tenon fuzionează cu sclera. În dreptul fiecărui mușchi extraocular capsula Tenon formează teci aponevrotice perimusculare care însoțesc mușchiul (1),(27),(28).

Umoarea apoasă este fluidul secretat de procesele ciliare în camera posterioară care iriga cristalinul și fața posterioară a irisului, apoi trece prin orificiul pupilar și este evacuat prin unghiul irido-cornean din camera anterioară în canalul lui Schlemm. Ea transportă glucoza, aminoacizii și oxigenul necesare cristalinului și corneei. De asemenea contribuie la menținerea presiunii intraoculare (14). Cea mai mare parte a umorii apoase ajunge în circulația venoasă via trabecul, canal Schlemm, canale colectoare sclerale, vene apoase și vene episclerale. Un mic procent ajunge în orbită după ce a strabatut interstițiile muschiului ciliar, spațiul supracoroidian și sclera (29).

La formarea și compoziția chimică a umorii apoase contribuie trei procese fiziologice: difuzia, ultrafiltrarea și secreția activă. Difuzia umorii apoase este mult influențată într-un sistem dinamic cum este cel al proceselor ciliare, în care membranele sunt constituite din celule. Umoarea apoasă este produsă în doi timpi: inițial se formează un filtrat plasmatic în stroma corpului ciliar, apoi se formează umoarea din acest filtrat ce străbate bariera sânge-umoare apoasă. Sunt implicate două mecanisme de secreție, activă și pasivă. Marea majoritate a umorii apoase se formează prin secreție activă. Enzima principală implicată este Na/K ATP-aza care secretă ioni de Na în camera posterioară. Datorită diferenței de presiune osmotica de o parte și de alta a celulelor epiteliale ciliare apa trece pasiv urmand gradientul presional. Ionii de Cl secretați la suprafața statului epitelial nepigmentar reprezintă un factor limitator. Secreția pasivă prin ultrafiltrare și difuziune joaca un rol minor în producerea umorii apoase. Ea depinde de nivelul presiunii hidrostatice de la nivel capilar, de presiunea oncotică și de presiunea intraoculară (20).

Produsă de celulele epiteliale ale corpului ciliar în camera posterioară, o mică parte din umoarea apoasă ajunge în vitros, dar cea mai mare parte trece din camera posterioară în cea anterioară, după ce a suferit mici modificări de compoziție determinate de schimburile metabolice de la nivelul vitrosului anterior și cristalinului. Acest flux hidrostatic este completat de o circulație a umorii apoase în camera anterioară determinată termic, de jos în sus, pe fața anterioară a irisului, mai caldă și de sus în jos pe fața posterioară a corneei, mai rece.

Majoritatea umorii apoase părăseste camera anterioară prin unghiul irido-cornean, sistemul trabecular, canalul Schlemm, canalele colectoare intrasclerale, venele apoase, venele episclerale și sistemul venos general. Se pare că scurgerea umorii apoase este un fenomen pasiv, cu toate că celulele endoteliale ale canalului Schlemm și țesutul juxtacanalicular au o activitate metabolică intensă (30). Studiile morfologice au pus în evidență la nivelul celulelor stratului endotelial al canalului Schlemm spații lacunare asemănătoare unor tunele ce ar reprezenta o veritabilă cale paracelulară de eliminare (31). În condiții de creștere a presiunii intraoculare, aceste spații se lărgesc și sunt mai usor de identificat. S-au identificat vacuole preponderent la capătul intraluminal al celulelor endoteliale și mai puțin la polul juxtacanalicular al acestora. La locul maximei rezistențe la scurgerea umorii apoase funcționează două căi, transcitoplasmatică și paracelulară. Utilizarea pentru eliminare a uneia din cele două căi este influențată de presiunea intraoculară și de fluxul de producere a umorii apoase. Studii experimentale pe maimuțe au arătat că aproximativ 90% din rezistența la eliminarea umorii apoase este localizată între camera anterioară și canalul Schlemm, Peste 50% fiind localizată la nivelul peretelui intern al canalului. Diferența presională între canalul Schlemm și venele episclerale este minimă (32),(33).

Calea uveo-sclerală drenează aproximativ 10% din umoarea apoasă mai ales la tineri și mai puțin la vârstnici. Deoarece nu există nicio barieră între spațiile trabeculare și cele dintre fasciculele muschiului ciliar, apa împreună cu moleculele mari pot trece din camera anterioară în interstițiul muschiului ciliar anterior și de aici în spațiul supracoroidian. De aici este drenat prin circulația venoasă la nivelul coroidei și sclerei în orbită (20). Debitul eliminării umorii apoase prin această cale este de 0,5 microlitri/min (1).

Elemente de histologie oculară

Structura histologică a sclerei

Subdiviziunile sclerale, de la exterior la interior sunt: episclera, stroma sclerală și lamina fusca.

Stratul episcleral este localizat profund de capsula Tenon și conține fibroblaști, fibre de colagen și elastice, substanță fundamentală și melanocite (1),(2).

Stroma sclerală conține fibre de colagen cu diametru mai mare decât cele corneene dispuse circular în benzi fibroase în straturile superficiale în jurul inserțiilor muschilor extraoculari drepți și oblici și a canalului scleral al nervului optic (34),(35),(36). Benzile fibroase au dispoziție meridională în straturile profunde (1),(2). Țesutul conjunctiv scleral conține și proteoglicani (37).

Lamina fusca are în structură un număr mare de melanocite migrate de la nivelul tunicii vasculare oculare, acestea conferind culoarea brună suprafeței interne a sclerei (17).

Structura histologică a corneei

Țesutul cornean prezintă de la exterior la interior următoarele straturi:

Epiteliul cornean scuamos necheratinizat este alcătuit din 7-8 rânduri de celule dispuse în trei straturi. Stratul bazal cuprinde celule dispuse într-un singur rând. Stratul intermediar cuprinde celule „wing cells” dispuse pe două-trei rânduri. Stratul superficial cuprinde câteva rânduri de celule scuamoase pavimentoase apicale. Celulele formează o barieră protectivă atât prin joncțiunile strânse și desmozomii dintre celulele adiacente, cât și datorită citoscheletului intern (38). Microvilii de la suprafață vin în contact cu mucusul filmului lacrimal cu care realizează o suprafață omogenă din punct de vedere optic și vascoelastic. Terminațiile nervoase trigeminale din straturile epiteliale profunde au rol major în sensibilitatea corneană (39),(40).

Membrana Bowmann este un strat subțire și neted (8-12 µm) compus din fibre de colagen orientate la întâmplare. În alcătuirea ei intra colagen de tip I, III, V, VI și este lipsită de celule (41). Membrana bazală a epiteliului este atașată la membrana Bowmann prin complexe de adeziune și hemidesmozomi (38),(42).

Stroma corneană are o grosime variabilă, de aproximativ 450µm central și 900µm la periferie. Ea este alcătuită din substanță fundamentală și fibre de colagen de tip I, III, V, VI. Substanța fundamentală este compusă din glicozaminoglicani și proteoglicani, molecule ce contin keratan și dermatan sulfat (34),(35). Există diferențe de dispoziție și de mărime ale lamelor de colagen între stroma anterioară și cea posterioară. În stroma posterioară lamelele de colagen sunt mai lungi și mai groase și dispunerea fibrelor de colagen este mai ordonată față de stroma anterioară (43),(44),(45).

Stratul Dua reprezintă o nouă componentă corneană evidențiată de studii recente, foarte subțire și acelulară (46).

Membrana Descemet are o grosime de aproximativ 9µm, conține colagen de tip I, III, V, VI și este sintetizată de endoteliul cornean (34),(35).

Endoteliul cornean reprezintă stratul profund al corneei, alcătuit dintr-un singur strat de celule hexagonale care nu se divid și al căror număr scade cu vârsta (47),(48). Celulele sunt unite între ele prin zonula occludens și desmozomi realizând o barieră semipermeabilă. Astfel se împiedică pătrunderea în stroma a apei din umoarea apoasă, dar și extracția apei din stroma corneană printr-un mecanism dependent energetic (3),(49),(34). Celula endotelială are pe suprafața posterioară numeroși microvili care se proiectează în camera anterioară (11). În citoplasmă se găsesc numeroase organite celulare: mitocondrii, reticul endoplasmatic neted și rugos și aparat Golgi bine reprezentat (50).

Zona de la limita de demarcație a celor două structuri ale tunicii oculare externe se numește limb sclero-cornean. Aici se găsesc atât celule epiteliale corneene (51),(52), cât și celule stem stromale (53),(54). Atât epiteliul cornean cât și cel limbic conțin keratocite (55) ce prezintă o morfologie dendritică și adeziuni strânse intercelulare (56),(57). Keratocitele dispuse în stroma mezenchimală de suport au rol în păstrarea transparenței corneene prin producerea de colagen și proteoglicani: mimecan, lumican și keratocan (58),(59),(60),(61, 62),(63).

Structura histologică a uveei

Histologic, irisul prezintă dinspre anterior spre posterior următoarele straturi:

Stratul anterior marginal conține melanocite și fibroblaste într-o rețea densă de colagen. El este discontinuu la nivelul criptelor Fuchs și astfel umoarea apoasă ajunge în contact cu stroma iriană la acest nivel. Fibroblaștii și melanocitele conțin mitocondrii în număr mare, reticul endoplasmic rugos, ribozomi liberi. În plus melanocitele conțin granule de melanina aflate în grade variate de dezvoltare.

Stroma iriană este formată din fibre colagenice dispuse în rețea în ochiurile căreia se găsesc fibroblaste, melanocite, mastocite, macrofage, limfocite și substanță fundamentală. Fibrele de colagen sunt mai dense în jurul vaselor și nervilor stromali. Mușchiul sfincter pupilar, cu o grosime de cca 1 mm este localizat în vecinătatea marginii pupilare. Celulele musculare fusiforme sunt orientate paralel cu marginea pupilei și sunt organizate în fascicule delimitate de septuri. În stroma iriană se află vase provenite din arterele ciliare anterioare și arterele ciliare posterioare lungi distribuite circular ce formează marele cerc arterial al irisului. Distribuția circulară permite dilatarea și contractarea irisului fară alterarea fluxului sanguin. Colaterale din marele cerc arterial sunt trimise radiar către micul cerc arterial al irisului la baza gulerașului pigmentar.

Stratul mușchiului dilatator al pupilei este alcătuit din celule musculare dispuse radiar ce trimit prelungiri anterioare spre mușchiul sfincter al pupilei de care este separat printr-un strat de țesut conjunctiv.

Straturile epitelial pigmentar anterior și posterior sunt alcătuite din celule epiteliale pigmentare piramidale strâns aderente. Pigmentarea stratului pigmentar posterior este mai intensă decât a stratului pigmentar anterior. Culoarea irisului depinde de structura și densitatea stromei iriene, a epiteliului pigmentar irian, conținutul în melanina al melanocitelor iriene și melanina prezentă în stroma superficială (1),(64),(65),(66).

Corpul ciliar, porțiunea intermediară a tractului uveal, prezintă următoarele componente histologice:

Epiteliul ciliar nepigmentat este situat profund și este alcătuit dintr-un singur strat de celule ce continuă stratul epitelial posterior de la nivelul irisului. El vine în contact cu umoarea apoasă (67). Celulele sunt cuboidale și sunt conectate între ele prin complexe joncționale de tip zonula adherens și zonula occludens. Celulele conțin numeroase organite celulare: mitocondrii și reticul endoplasmic neted și rugos (17).

Epiteliul ciliar pigmentat este alcătuit dintr-un singur strat de celule cu numeroși melanozomi, dar sărace în organite celulare (68).

Stroma ciliară este alcătuită din fibre de colagen (tip I, III), elastice, melanocite și fibroblaști într-o substanță fundamentală în care predomină proteoglicanii. Ea conține mușchiul ciliar cu fibre musculare netede. Citoplasma lor conține mitocondrii, reticul endoplasmic, aparat Golgi și miofibrile. Procesele ciliare conțin plexuri vasculare de capilare fenestrate (1).

Între corpul ciliar și lamina fusca sclerală se află spațiul supracoroidian ocupat de țesut conjunctiv lax. Acest spațiu aparține căii uveosclerale de drenaj a umorii apoase. Aceasta străbate stroma ciliară, partea longitudinală a mușchiului ciliar, spațiul supracoroidian, venele ciliare și venele vorticoase (1).

Există numeroase diferențe între celulele epiteliului pigmentar și nepigmentar ciliar. Celulele nepigmentare au dimensiuni mai mari și conțin mai multe mitocondrii, sugerând o activatate metabolică mai intensă. Nu în ultimul rând, celulele epiteliului nepigmentar prezintă numeroase invaginări pe versantul ce priveste spre umoarea apoasă (1),(69).

Coroida prezintă dinspre extern spre intern următoarele straturi:

Stratul supracoroidian (lamina fusca) este un țesut conjunctiv foarte aderent la fața internă a sclerei (70).

Stratul vascular este cel mai gros și este compus din trei subniveluri ce conțin vase al căror diametru luminal crește spre suprafață: stratul coriocapilar sau stratul intern capilar, stratul Sattler ce conține vase de calibru mijlociu, stratul Haller cu vase de diametru mare (1). În ochiurile bogatei rețele de artere și vene se găsesc țesut fibro-elastic și numeroase celule pigmentare și fibroblaste (1),(10).

Membrana Bruch nu conține celule. Este subțire, bine delimitată, alcătuită din fibre colagenice și elastice înconjurate de matrice glico-proteică (1),(71). Are în componența sa cinci straturi dispuse dinspre exterior spre interior astfel: membrana bazală a coriocapilarei, stratul colagenic extern, stratul elastic, stratul colagenic intern și membrana bazală a epiteliului pigmentar (1).

Structura histologică a retinei

Retina este alcătuită din zece straturi celulare (1),(72): membrana limitantă internă, stratul fibrelor nervoase, stratul celulelor ganglionare, stratul plexiform intern, stratul nuclear intern, stratul plexiform extern, stratul nuclear extern, membrana limitantă externă, stratul celulelor fotoreceptoare (conuri și bastonase), epiteliul pigmentar retinian.

Structura histologică a conjunctivei

Conjunctiva palpebrală are un epiteliu scuamos nekeratinizat care la aproximativ 2 mm de la marginea pleoapei formează un șanț. Epiteliul este format din aproximativ cinci straturi celulare. Celulele bazale sunt cuboidale, în timp ce straturile superficiale sunt formate din celule poliedrice turtite, bogate în celule mucoase (goblet) care secretă stratul mucos al filmului lacrimal și în glande lacrimale accesorii responsabile pentru secreția lacrimală bazală. Celulele goblet sunt mai numeroase inferonazal și în fornixuri unde pot ajunge până la 5-10%. Conjunctiva bulbară are un epiteliu scuamos nekeratinizat tristratificat ce conține numeroase celule secretoare de mucus (26). Stroma este alcătuită din țesut conjunctiv lax intens vascularizat. Stratul limfatic superficial se dezvoltă abia la trei luni de la naștere. Glandele lacrimale accesorii Krause și Wolfring sunt localizate profund în stromă (20).

Procesul de angiogeneză

Pentru toate vertebratele, globul ocular prezintă două rețele vasculare care se dezvoltă asincron – rețeaua coroidiană și rețeaua retiniană. Inițial, în perioada fetală, se formează rețeaua coroidiană ce asigura aportul extern de sânge al globului ocular. Rețeaua retiniană se dezvoltă ulterior de la nivelul papilei nervului optic și formează inițial o rețea vasculară primară ce apoi se remodelează și formează plexurile retiniene vasculare intern și extern.

Vascularizația coroidei, unul din cele mai intens vascularizate țesuturi ale corpului, se formează printr-un dublu mecanism de vasculogeneză și angiogeneză, în timp ce vascularizația retiniană se formează doar prin angiogeneză (73), (74), (75). S-a afirmat că formarea vaselor retiniene se realizează prin migrarea astrocitelor spre retină urmată de organizarea acestora într-o rețea trabeculară. Acest proces este urmat, sub influența VEGF, de migrarea celulelor endoteliale care se atașează rețelei și formează structuri tubulare (75), (76). În formarea vaselor de sânge retiniene s-a propus și existența unui mecanism vasculogenetic (77). În dezvoltarea ulterioară definitiva a structurilor vasculare este obligatorie remodelarea vasculară, proces ghidat de angiopoietina-1 și de VEGF (78). VEGF este esential în procesele de remodelare apărute în condiții patologice la nivel retinian, coroidian sau cornean (79).

Atât în procesele de remodelare fiziologice cât și în cele patologice, alături de VEGF și angiopoietina-1 un rol major are și FGF (fibroblast growing factor). FGF este implicat în procesele de neoangiogeneză ale ochiului. S-a demonstrat că la șoarecii transgenici leziunile retiniene provocate de aplicații laser determină apariția unui fenotip transgenic latent (80). Astfel, în anumite circumstanțe, FGF eliberat de celule din matricea extracelulară ar putea induce neovascularizație. În plus, inhibiția activitații FGF la șoarecii transgenici care exprimă antigenul T la nivelul epiteliului pigmentar retinian a demonstrat o creștere încetinită a tumorilor și o scădere a angiogenezei. FGF poate determina anumite răspunsuri la nivelul celulelor endoteliului vascular. De exemplu, FGF-2 stimulează calea kinazei MAP și a kinazei PI-3 la nivelul celulelor endoteliale coroidiene. Aceste răspunsuri sunt mai puternice decât cele determinate de VEGF (81).

FGF și receptorii sai sunt implicați în multiple procese la nivelul globului ocular, cum ar fi diferențierea cristalinului, funcția normală și supraviețuirea epiteliului pigmentar retinian, supraviețuirea fotoreceptorilor în condiții de hipoxie (82). Cu toate acestea, până de curând, dovezile implicării FGF în procesele de angiogeneză normală și patologică la nivel ocular au fost contradictorii. În epiteliul pigmentar retinian sunt prezente mai multe izoforme ale FGF (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-9), toate cu rol în dezvoltarea vasculară. În timpul neovascularizației coroidiene induse experimental, concentrația de FGF-2 prezintă o creștere semnificativa alături de PEDF (pigment epithelium derived factor), angiopoietina-1 și VEGFR-1 (VEGF receptor-1) (83). Receptori de FGF sunt prezenți la nivelul celulelor endoteliale coroidiene, mai ales izoforma FGFRIIIc (84). Totuși nu a fost încă identificat receptorul pentru FGF la nivelul vaselor retiniene, cu toate că acțiunea FGF la acest nivel a fost demonstrată. Pentru retină este mai probabil că FGF stimulează formarea unui schelet de astrocite care ulterior favorizează migrarea celulelor endoteliale și tubulogeneza și reprezintă un model pentru formarea ulterioară a vaselor.

Neovascularizația (formarea de neovase sanguine) constă din două procese, vasculogeneză și angiogeneză. Vasculogeneza se refera la dezvoltarea de novo a vaselor de sânge din celule endoteliale progenitoare sau angioblasti, care se diferențiază în celule endoteliale. Angiogeneza este procesul de formare de noi vase din cele preexistente prin proliferare, migrare și remodelarea celulelor endoteliale diferențiate.

Angiogeneza germinativă (sprouting angiogenesis) este procesul prin care se formează vase din cele preexistente (85). Apărut ca răspuns la semnale specifice, acest proces presupune inițial proliferarea, germinarea și migrarea celulelor endoteliale. Tubul endotelial nou format este ghidat prin migrarea celulelor endoteliale tip cells (ETC). Celulele endoteliale sunt extrem de sensibile la semnalele din mediul extracelular (86). ETC sunt celule mobile, invazive, ce extind dinamic prelungiri filopodiale lungi (87). Celulele stalk cells (88), celule endoteliale suplimentare reprezintă baza germenului vascular. În angiogeneza germinativă, celulele endoteliale trebuie să se orienteze în mediul tisular pentru a invada țesutul eficient și a forma modele vasculare în concordanță cu nevoile locale. ETC răspund la stimularea VEGF-A prin migrare ghidată, iar răspunsul proliferativ la VEGF-A se realizează în trunchiurile germinate (89). Prelungirile ETC acționează precum senzori de mediu, iar ETC evoluează chemotactic către factori angiogenici (85). Apoi au loc următoarele procese: ETC germinative sunt urmate rapid de celulele stalk proliferative care sunt rapid învelite de pericite (90). Pericitele sunt celule periendoteliale polimorfe, alungite, multiplu ramificate, acoperite de aceeași membrană bazală ca și celulele endoteliale. Pericitele pot răspunde la stimuli angiogenici, pot ghida tubii germinați, trimit semnale pentru supraviețuirea celulelor endoteliale și au activitați de tip macrofagic (91). Prin formarea unei matrici perivasculare și recrutarea pericitelor tubii endoteliali nou formați devin stabili. Pericitele influențează stabilitatea vasculară prin depunerea de matrice și/sau prin eliberarea și activarea de semnale care promovează diferențierea celulară endotelială. Mecanismele moleculare prin care pericitele mediază stabilitatea vasculară nu sunt complet cunoscute (91). Este sugerat faptul că celulele endoteliale nu doar formează conducte pasive pentru eliberarea substanțelor nutritive și oxigenul, ci și stabilesc o nișa vasculară instructiva care stimulează regenerarea organelor prin elaborarea de trofogeni paracrini într-un mod asemănător factorilor angiocrini derivați din celulele endoteliale care susțin hematopoieza (92).

Gena factorului de creștere endotelială (VEGF) la oameni este situată pe cromozomul 6, locatia 6p21 (93). Analizele de tio northern blot au precizat că gena prezintă o singură locație majoră de transcripție, iar promoterul conține locații potențiale de fixare a factorilor de transcripție AP-1 și AP-2. Superior de genele VEGF există o locație care poate lega HIF-1 (hypoxia-inducible factor) ce poate acționa ca un facilitator al transcrierii în hioxie (94), (95). Mai mult, un factor de stabilitate indus de hipoxie (HuR) se poate lega de ARN-ul mesager pentru transcripția VEGF și poate crește timpul de înjumătățire al acesteia de trei până la opt ori, crescând astfel cantitatea de VEGF transcrisă (96).

Receptorii VEGF sunt VEGFR-1 și VEGFR-2. Prin experimente în care s-au utilizat forme artificiale selective de VEGF ce acționează doar pe unul din acesti receptori, s-au putut evidenția diferențele de afinitate și de acțiune. Astfel, formele care au acționat doar pe VEGFR-1 nu au avut o acțiune suplimentară față de loturile control. De aici se desprinde concluzia că doar VEGFR-2 sunt capabili sa medieze permeabilitatea, semnalizarea intracelulară, migrația și angiogeneza celulelor endoteliale (97). VEGF165 prezintă o afinitate de 45 de ori mai mare decât VEGF121 în legarea VEGFR-2. De asemenea receptorii neurofilina 1 și 2 (Npn-1, Npn-2) pot fixa VEGF165, nu și VEGF121. VEGF poate avea și acțiuni antiapoptotice la nivelul celulelor endoteliale, mediate prin stimularea kinazei PI-3. Aceasta blochează calea proteolitica a apoptozei mediată prin cascada capsazelor (98), (99).

Concentrația de VEGF este crescută în toate afecțiunile oculare în care este implicată neovascularizația și/sau inflamația cum ar fi retinopatia diabetică proliferativă, glaucomul neovascular, uveite, degenerascența maculară legată de vârsta. În plus VEGF este asociat cu fibroza și cu afecțiunile inflamatorii ca artrita reumatoidă și boala Crohn (100). Un studiu recent a evidențiat o asociere între VEGF și procesul de vindecare a rănilor cutanate. Niveluri crescute de VEGF determină formarea de cicatrici la vindecarea plăgilor cutanate prin creșterea vascularizației și depunerii de colagen, în timp ce neutralizarea VEGF reduce angiogeneza și fibroza cutanată (101). În procesul de vindecare activitatea VEGF este mediată de doi receptori, Flt-1 și KDR, care sunt prezenți pe suprafața celulelor endoteliale, dar și pe celulele non-vasculare. Expresia VEGF și a receptorilor Flt-1 și KDR este crescută în timpul reparației leziunilor de la nivelul dermului (102). În studiul lui Li și colaboratorii s-a observat că nivelul de VEGF este crescut în umoarea apoasă la pacienții cu glaucom, dar că nu există diferențe semnificative în ceea ce priveste concentrația plasmatică a VEGF între pacienții cu trabeculectomie și lotul martor. Nivelul ridicat de VEGF din umoarea apoasă dar nu și din plasmă sugerează că acest factor de creștere este produs local (103). Așa cum s-a demonstrat, VEGF este produs de numeroase tipuri de celule de la nivel ocular, cum ar fi celule epiteliale pigmentare, pericite, celule endoteliale, celule Muller și astrocite (104).

Insuficiența vasculară este implicată în patogenia glaucomului, iar ischemia este un trigger potențial pentru producerea de VEGF (105). Pacienții glaucomatoși primesc medicație topică (analogi de prostaglandină, beta blocanți, inhibitori de anhidrază carbonică, agonisti alfa adrenergici) care pot influența concentrația de VEGF din umoarea apoasă. În studiul lui Hu și colaboratorii s-a demonstrat că nu există corelație între concentrația de VEGF din umoarea apoasă și utilizarea medicației topice. Astfel, se poate concluziona că creșterea de două ori a nivelului de VEGF din umoarea apoasă a pacienților glaucomatoși observată în studiul lui Li și colaboratorii nu este cauzată de utilizarea medicației topice antiglaucomatoase. Tot studiul lor a demonstrat că VEGF este stimulat după trabeculectomie la iepure. Nivelul crește după operație și rămâne ridicat până în ziua 30, cu niveluri comparabile între cele două loturi. După aplicarea Bevacizumabului, nivelul scade în ziua a 4-a fața de lotul control.

Creșterea VEGF în umoarea apoasă a pacienților cu glaucom poate contribui la inflamația și fibroza postoperatorie și la creșterea riscului de eșec al trabeculectomiei.

Procesul de neovascularizație este necesar pentru vindecarea plăgii și pentru a reface fluxul sanguin la nivelul țesuturilor după trauma chirurgicală (106). Inhibarea VEGF poate reduce cicatrizarea postoperatorie, iar acest efect este asociat cu reducerea angiogenezei și reducerea depunerii de colagen (103).

Glaucomul

Definiție

Glaucomul este a doua cauză de orbire în lume și principala cauză de orbire în Europa (107). Se estimează că numărul persoanelor care își vor pierde vederea din cauza glaucomului va ajunge la 11.2 milioane în 2020 (84). Glaucomul reprezintă o neuropatie optică progresivă, multifactorială, caracterizată prin modificări morfologice ale capului de nerv optic și ale stratului de fibre nervoase retiniene care determină în timp afectarea câmpului vizual (20). Inițial, glaucomul cu unghi deschis nu este dureros. Peste 50% din persoanele afectate din tarile dezvoltate nu stiu că au glaucom (108). Factorii majori de risc pentru orbirea cauzată de glaucom sunt speranța de viată și severitatea afecțiunii în momentul diagnosticării (109, 110).

Clasificare

Glaucomul poate fi congenital sau dobândit. După mecanismul prin care este împiedicată eliminarea umorii apoase este clasificat în glaucom cu unghi deschis sau cu unghi închis. În funcție de prezența sau absența unor afecțiuni oculare sau nonoculare ce contribuie la creșterea presiunii intraoculare se împarte în primar sau secundar. Glaucomul secundar cu unghi deschis este împărtit în funcție localizarea obstacolului în eliminarea umorii apoase in: pre-trabecular (glaucomul neovascular), trabecular (glaucomul pigmentar, glaucomul pseudoexfoliativ), post-trabecular (fistula carotido-cavernoasa, sindrom Sturge-Weber). Glaucomul secundar cu unghi închis este determinat de imposibilitatea eliminării umorii apoase prin apoziția peste trabecul a irisului periferic prin forțe anterioare sau posterioare (20).

Diagnostic

Metode de investigație folosite în glaucom

Tonometria (măsurarea presiunii intraoculare) are o importanță majoră deoarece PIO este considerată principalul factor de risc în glaucom, alături de rasă, istoric familial, miopie mare și vârstă. După principiul tonometriei, aceasta poate fi prin indentație și prin aplanație. Tonometria prin aplanație ce utilizează aplanotonometrul Goldmann este considerată metoda cea mai exactă de măsurare a PIO.

Gonioscopia constă în examinarea unghiului camerular cu ajutorul diferitelor tipuri de lentile. Prin această metodă se urmarește stabilirea gradului de deschidere al unghiului irido-cornean și evidențierea unor elemente anormale (neovase, dispersie pigmentară, sinechii, tumori). Conform sistemului Shaffer, gradul de deschidere se apreciază în funcție de vizibilitatea diferitelor structuri ale acestuia, existând cinci grade de deschidere: gradul 4 (35˚-45˚) reprezintă cel mai larg unghi care nu se va închide niciodată și se întâlnesc la persoanele mioape sau aface; se vizualizează toate structurile unghiului, inclusiv corpul ciliar. Gradul 3 (25˚-35˚) este un unghi deschis care nu se va închide, dar nu se mai vizualizează corpul ciliar; în rest se observă celelalte structuri cu usurință. Gradul 2 (20˚) este un unghi cu deschidere medie având posibilă închiderea, dar improbabilă; ca și structuri care se identifică, se observă doar trabeculul. Gradul 1 (10˚) este un unghi foarte ingust cu risc mare de închidere; se identifică doar linia Schwalbe și uneori vârful trabeculului. Gradul 0 (0˚) este un unghi închis, cu irisul în contact cu corneea; închiderea poate fi apoziționala sau prin sinechii, în cel de-al doilea caz unghiul nu se deschide la presiunea cu lentila de gonioscopie. Alături de gradul de deschidere se mai descriu: aspectul irisului periferic ce poate fi convex sau concav, dispersia de pigment la nivelul liniei Schwalbe (linia Sampaolesi) și gradul de pigmentare trabeculară, prezența sinechiilor periferice anterioare.

Oftalmoscopia reprezintă o metodă obiectivă de diagnostic a glaucomului. La nivelul papilei nervului optic, toate fibrele nervoase ganglionare retiniene converg și traversează sclera, având o distribuție specifică: polii superior și inferior ai papilei sunt ocupați de fibrele din regiunea temporală retiniană care au un traiect arcuat. Aceste fibre traversează la nivelul sclerei o zonă de graniță din punct de vedere al vascularizației limită dintre vasele retiniene și cele ciliare scurte posterioare. Ridică suspiciunea de glaucom orice diferență între cei doi ochi a raportului c/d ce depășeste 0.1, deși la 10% din populație pot exista asimetrii ale excavației (20). Uneori aspectul papilei poate sugera tipul de glaucom. Papila cu ischemie focală este caracterizată de ancose la nivelul polului superior sau inferior al inelului neural, se întâlnește mai frecvent la femei glaucomatoase ce au frecvent spasme vasculare și migrene. Papila glaucomatosului miopic asociază crescent temporal fară miopie degenerativă cu ancose polare ale rimului neural și se întâlnește mai frecvent la pacienții mai tineri de sex masculin. La papila sclerotică senilă excavația este superficială, cu trecerea la inelul neural în panta lentă, cu marginea internă a inelului neregulată (ca „roasa de molii”) și cu atrofii peripapilare. Este mai frecventă la vârstnici cu afectari cardiovasculare. Papila cu excavație concentrică prezintă o excavație largă și fară ancose la nivelul inelului. Apare la persoanele cu vârsta de 50-60 de ani fară deosebire de sex. Papila excavată cu hemoragii liniare în regiunea peripapilară semnifică o forma progresivă de glaucom sau un tratament insuficient. Se întâlnește mai frecvent în glaucoamele normotensive (1).

Tehnici imagistice utile în glaucom menționate mai jos permit obtinerea unor date obiective, exacte, care sunt comparate cu datele din baza aparatului și permit stabilirea gradului de leziune și diagnosticul inițial, dar și aprecierea evoluției bolii prin repetarea la anumite intervale de timp (111),(112).

Pentru diagnosticul precoce al glaucomului se folosesc următoarele tehnici de imagistică. Tomografia prin scanare laser folosind sistemul Heidelberg care permite imagini tridimensionale ale papilei și măsurarea grosimii stratului de fibre nervoase retiniene (113),(114). Tomografia prin coerenta optică, asemănătoare ultrasonografiei în mod B, folosește lumina în locul ultrasunetelor și inferometria pentru analiza luminii reflectate de diferitele straturi ale retinei. Prin această metodă se realizează secțiuni bidimensionale la nivelul retinei prin maculă și papilă și se masoară grosimea stratului de fibre optice (115),(116). Prin scanarea prin polarimetrie laser realizată cu analizatorul fibrelor nervoase GDx se măsoară schimbările de polarizare determinate de birefringența axonilor celulelor ganglionare, pe o arie concentrică papilei, permițând măsurarea grosimii stratului fibrelor optice. Sistemul GDxECC măsoară cu o acuratețe mai mare grosimea stratului de fibre nervoase la pacienții miopi și cei cu fundul de ochi mai palid (117),(118).

Perimetria măsoară indirect leziunile glaucomatoase, fiind totuși o metodă subiectivă. Ea nu reprezintă cel mai bun mijloc de diagnostic precoce al afecțiunii. Perimetria trebuie să aibă rezultate reproductibile pentru a putea compara în timp rezultatele repetării investigației. Perimetria cinetică foloseste un stimul de o anumită intensitate și dimensiune ce este prezentat ochiului ce fixează centrul. Stimulul este în mișcare pe o cupolă hemisferică ce are o anumită iluminare de fond. Acest tip de perimetrie manuală nu poate detecta modificările de câmp vizual din glaucomul incipient, are numeroase dezavantaje, depășite de perimetrele computerizate care folosesc perimetria statică. Perimetria statică măsoară sensibilitatea retinei în anumite zone prestabilite. Stimulii sunt imobili, situați în poziții fixe și cu luminozitate variabilă. Perimetria supraliminară (suprathreshold) utilizează stimuli a căror intensitate depășeste pragul considerat normal în diferite puncte ale câmpului vizual. Această metodă se folosește în screening. Perimetria treshold (liminala) permite examinarea mai detaliată a insulei vederii. Funcționează prin proiecția unui stimul care are o luminantă liminală în diferite zone ale câmpului vizual, iar rezultatele sunt comparate cu o distribuție a valorilor considerate normale.

Modificările de câmp vizual apar după pierderea a 40-50% din celulele ganglionare retiniene. Ele se datorează distribuției specifice a fibrelor nervoase la nivel retinian cu respectarea meridianului orizontal, traiectului arcuat al fibrelor temporale ce ocolesc regiunea maculară, dar și vulnerabilității diferite a anumitor fibre. Modificările inițiale sugestive în glaucom constau în variabilitatea răspunsurilor în zona 10-20 grade față de puncul de fixație. Scotoamele arcuate Siedel apar prin fuziunea scotoamelor paracentrale în aria Bjerrum. Treapta nazală Roenne apare datorită separarii orizontale a fibrelor ganglionare, asfel că pot exista asimetrii în ceea ce privește sensibilitatea retiniană deasupra și dedesubtul rafeului orizontal. Modificările tardive apar prin progresia leziunilor glaucomatoase: aprofundarea scotoamelor, apariția de scotoame relative în jurul celor absolute, lărgirea și fuziunea lor. În stadiile finale ale bolii câmpul vizual mai poate prezenta o insulă centrală și o insulă temporală. Apoi rămâne insula temporală, după ce dispare vederea centrală.

Din cauza apariției relativ tardive a modificărilor perimetrice, a fost necesară utilizarea altor dispozitive de depistare precoce a glaucomului: testul dedublare a frecvenței prin contrast de fază (FTD), perimetria automată short-wave (SWAP), dar publicațiile recente au scos în evidență faptul că SWAP este similară, dacă nu inferioară perimetriei automate standard în detectarea precoce a pierderilor de câmp vizual (119),(120),(121).

Tratament

Calitatea vieții este strâns legată de funcția vizuală. Pacienții cu modificări minime de glaucom au o funcție vizuală bună și calitatea vieții usor modificată, în timp ce pacienții cu glaucom avansat au calitatea vieții mult redusă (122). Scopul principal al managementului glaucomului este de a preveni afectarea funcțională a vederii pacientului în cursul vieții, prin încetinirea ratei de pierdere a celulelor ganglionare la o rată cât mai apropiată de cea fiziologică (aproximativ 5000/an) (20). În prezent singura abordare dovedită eficientă în păstrarea funcției vizuale este reducerea PIO.

Examinarea inițială a pacientului glaucomatos cuprinde: acuitatea vizuală, biomicroscopia polului anterior, tonometria prin aplanație, gonioscopia, oftalmoscopia, perimetria, tomografia în coerență optică (122).

Presiunea țintă reprezintă acel nivel al PIO sub care progresia glaucomului este puțin probabilă. Ea este stabilită luând în considerare mai multe variabile: severitatea glaucomului, PIO inițială, rata de progresie a glaucomului, vârsta și starea de sănatate a pacientului (122),(123),(124). Dacă pe parcursul monitorizării se constată o progresie a afecțiunii se stabilește o nouă presiune țintă, mai mică. Progresia este considerată puțin probabilă la o PIO de maximum 16mmHg, în glaucomul primitiv cu unghi deschis (20).

Atingerea presiunii țintă se realizează prin terapie medicamentoasă, laser sau chirurgicală. Modalitatea de tratament trebuie să ia în considerare nu doar reducerea PIO, ci și tolerabilitatea, costul și complianța tratamentului (122).

Terapia medicamentoasă

Reprezintă tratamentul inițial pentru majoritatea pacienților cu glaucom primitiv cu unghi deschis. Înainte de a alege din numeroasele clase de medicamente antiglaucomatoase topice, este important să luăm în considerare nu numai scăderea presională, ci și tolerabilitatea, costul și complianța pacientului. Există numeroase clase de medicamente utilizate în tratamentul glaucomului (prostaglandine/prostamide, betablocante, agoniști alfaadrenergici, inhibitori de anhidrază carbonică, parasimpatomimeticele) și numeroase studii clinice care compară eficiența reducerii PIO și siguranța utilizării preparatelor topice(125),(126),(127). Prostaglandinele/prostamidele sunt folosite ca tratament de primă linie (128) la majoritatea pacienților glaucomatoși. Dacă monoterapia de primă intenție nu este eficientă în scăderea PIO sau nu este tolerată este de preferat shimbarea clasei de medicamente ce poate fi utilizată de asemenea ca monoterapie. Dacă medicamentul este eficient în scăderea PIO, dar nu suficient pentru a atinge presiunea țintă, atunci este necesară adăugarea altei substanțe la tratamentul inițial (122). Din aceste considerente au apărut combinațiile fixe ce conțin doi agenți terapeutici în același recipient. Acestea au numeroase avantaje legate de complianța pacienților și de reducerea efectelor secundare datorită scăderii cantității de conservant (129),(130),(131).

Terapia laser

Trabeculoplastia laser argon poate reprezenta o opțiune de primă intenție în tratamentul glaucomului sau alternativă la adiția medicamentoasă. Prin aplicații laser argon direct pe trabecul la joncțiunea dintre porțiunea anterioară nepigmentată și cea posterioară pigmentată se crește eliminarea umorii apoase având ca rezultat reducerea PIO ce durează minim 6 luni la aproximativ 80% din cei cu tratament medicamentos subcompensat. La 5 ani mai pastrează efectul 50%, iar la 10 ani 30%. Trabeculoplastia laser selectivă folosește laser Nd:YAG dublat în frecvență, ținteste selectiv celulele cu pigment melanic de la nivelul trabeculului, produce leziuni trabeculare mai mici cu posibilitati de repetare ale metodei (132). Iridotomia laser YAG este indicată în glaucoame prin închiderea unghiului în atac, subatac și cronic. Prin cicloablatia cu laser diodă se distruge o parte din epiteliul secretor al părții plicate a corpului ciliar și astfel se scade producerea de umoare apoasă. Trabeculoplastia a fost mai puțin eficientă decât trabeculectomia în controlul PIO la 6 luni și o monitorizare a pacienților de 2 ani (133).

Terapia chirurgicală a glaucomului poate fi nepenetrantă și penetrantă.

Chirurgia filtrantă nepenetrantă realizează o protecție a trabeculului, evitând apariția unor complicații postoperatorii și se poate realiza prin sclerectomie profundă și vâscocanalostomie (134). Alături de sistemele artificiale de drenaj, chirurgia filtrantă nepenetrantă reprezintă o alternativă a trabeculectomiei în tratamentul glaucomului.

Scopul principal al chirurgiei glaucomului este de a obține o presiune suficient de joasă fară terapie medicamentoasă asociată. Operația cea mai des efectuată este trabeculectomia, considerată standardul de aur al chirurgiei incizionale pentru pacienții cu PIO crescută în ciuda terapiei medicamentoase și/sau laser. Aceasta realizează o nouă cale de eliminare a umorii apoase din camera anterioară într-un spațiu protejat de scleră și conjunctivă numită bulă de filtrare (135). Rata de succes a operatiei cu sau fară terapie medicamentoasă asociată este de 90% la 2 ani. În definirea criteriilor pentru stabilirea ratei de succes există largi diferențe (136),(137). Controlul pe termen lung al PIO se realizează în multe cazuri, deși unii pacienți au nevoie de terapie aditională sau de repetarea intervenției chirurgicale.

Indicațiile trabeculectomiei (122):

Când alte forme de terapie (medicamentoasă sau laser) au eșuat

Când alte forme terapeutice nu sunt indicate (complianța scazută sau efecte adverse importante)

Când presiunea țintă pentru prevenirea progresiei bolii nu poate fi atinsă prin mijloace medicale sau laser

In caz de glaucom foarte avansat și PIO mare în momentul diagnosticului, când alte forme de tratament nu ar fi eficiente

Crearea acestei “fistule” între camera anterioară și spațiul subconjunctival presupune asumarea riscului unor complicații și de aceea nu se va realiza decât în situații în care glaucomul este evolutiv sub celelalte forme de tratament și numai în cazurile de boală avansată în funcție de valoarea PIO în raport cu PIO țintă.

Tehnica trabeculectomiei:

se incizează conjunctiva la limb (lambou conjunctival cu baza la fornix) sau la 8-10mm posterior de limb (lambou conjunctival cu baza la limb)

se indepartează țesutul episcleral

se decolează un volet scleral de 2/3 din grosimea sclerei dreptunghiular sau triunghiular de ¾ mm până în corneea transparentă

se realizează paracenteza camerei anterioare în corneea transparentă

se excizează un dreptunghi de 1,5/2 mm din patul scleral de sub volet la nivelul limbului ce conține trabeculul

se realizează o iridectomie periferică

sutura lamboului scleral cu fire separate eventual reglabile

sutura cât mai etanșă a lamboului conjunctival

se injectează ser fiziologic în camera anterioară și se verifică permeabilitatea trabeculectomiei și etanșeitatea suturii conjunctivale

Examinarea histologică a bulei de filtrare funcționale evidențiază țesutul conjunctiv subepitelial dispus lax ce conține spații clare care corespund ca mărime și poziție spațiilor microchistice observate la examinarea clinică cu biomicroscopul. Aceste microchisturi sunt dovada unei bule de filtrare funcționale. Spre deosebire de acestea, trabeculectomiile eșuate prezintă sub epiteliul normal un țesut conjunctiv bogat în colagen dens (138).

Complicațiile precoce ale trabeculectomiei: atalamia (pierderea camerei anterioare), scăderi importante ale vederii, hemoragie coroidiană, filtrare insuficientă, hifemă, endoftalmita bacteriană.

Riscurile pe termen lung ale chirurgiei filtrante: accelerarea progresiei cataractei senile (139), endoftalmita și orbire dacă tratamentul este amânat.

Metode de prevenire a cicatrizării trabeculectomiei

Factorul determinant pentru controlul pe termen lung al PIO după trabeculectomie este răspunsul natural de vindecare la nivelul fistulei.

În majoritatea intervențiilor chirurgicale se dorește o cicatrizare cât mai rapidă a plăgii. În operațiile antiglaucomatoase fistulizante cum este trabeculectomia, cicatrizarea unor incizii (trabeculectomia în sine, voletul scleral) duce la eșecul chirurgical.

Vindecarea după operația filtrantă în glaucom se desfașoară în mai multe etape: faza inițială este caracterizată de inflamație, urmată de o fază intermediară când se formează țesutul de granulație și faza cronică de cicatrizare. Este un proces complex mediat de un complex de factori de creștere, citokine, chemokine, mediatori non-proteici la care participă și numeroase tipuri de celule.

Trabeculectomia reprezintă singura intervenție chirurgicală al cărei succes este dependent de inhibiția vindecării (140). În urma studiilor experimentale și umane s-au stabilit etapele care se succed ducând la închiderea trabeculectomiei (141). După trauma chirurgicală migrează celule inflamatorii (inclusiv monocite și macrofage), fibroblaste și capilare noi într-o matrice formată din proteine plasmatice ca fibrinogen, fibronectina și plasminogen. Macrofagele apar în aproximativ 12 ore, atingând nivelul maxim în jur de ziua a treia și activează limfocitele și fibroblaștii. În ziua a cincea postoperator apar limfocitele T care ating numărul maxim după aproximativ două săptamâni și care eliberează citokine variate ce controlează activitatea și proliferarea fibroblaștilor. Celulele inflamatorii degradează matricea formată din fibrină-fibronectină ce este inlocuită de colagenul interstițial, fibronectina și glicozaminoglicanii sintetizați de fibroblaști luând astfel naștere țesutul de granulație fibrovascular (142),(143),(144),(145),(146). Ulterior fibroblaștii care au proliferat încep sa se diferențieze, proces mediat de numeroși factori de creștere: transforming growth factor (TGF)-beta (147), connective-tissue growth factor (CTGF) (148), Rho-associated serine-threonine kinaza (ROCK1) (149) și matrix-metaloproteinaze (MMP) (150). Fibroblaștii nou diferențiati transformați în miofibroblaști prezintă caracteristici ultrastructurale și biochimice specifice celulelor musculare netede (151) (fascicule de microfilamente și expresia izoformei actinei specifice pentru celulele musculare netede vasculare – alfa-SM actin) (152). Factorul de creștere TGF beta 1 stimulează expresia proteinei alfa-SM actin la nivelul fibroblaștilor diferențiati cu rol major în contracția țesutului de granulație (153). Cu timpul se formează un țesut cicatriceal subconjunctival prin regresia vasculară și disparitia fibroblaștilor, locul fiind luat de țesut colagenic dens.

Factorii de risc potențiali pentru eșecul trabeculectomiei pot fi localizați la joncțiunea episcleră-conjunctivă (proliferarea fibroblaștilor mediată de factori chemotactici reprezentați de limfochine, complement, fibronectină, factori de creștere derivați din plachete (154), alături de sinteza matricii extracelulare și dezvoltarea ulterioară a cicatricii subconjunctivale) sau intraocular, prin blocarea fistulei de către irisul prolabat, vitros sau corp ciliar (155). Succesul unei trabeculectomii ce constă în menținerea unei fistule patente și a unei bule de filtrare subconjunctivale capabile să absoarbă umoarea apoasă implică atât de o tehnică chirurgicală riguroasă cât și măsuri intra și postoperatorii care sa minimalizeze cicatrizarea. Manevrele intraoperatorii trebuie efectuate astfel încât manipularea conjunctivei, capsulei Tenon și irisului sa fie minimă. Realizând hemostaza se asigură reducerea sângerării. Prin sclerectomia internă se crează un canal patent, suficient de larg, neobliterat de resturi de membrană Descemet. Iridectomia bazală previne incarcerarea postoperatorie a irisului la locul de filtrare. Inflamația preoperatorie trebuie tratată cu medicație antiinflamatorie, cel mai frecvent corticosteroidiană, mioticele administrate preoperator trebuie întrerupte cu cel puțin două săptamâni inainte de trabeculectomie din cauza afectarii barierei sânge-umoare apoasă. Postoperator cicloplegicele au efect benefic asupra barierei sânge-umoare apoasă, reducând eliberarea de proteine plasmatice.

În prezent se cercetează noi compuși având ca țintă modularea procesului biologic de cicatrizare cu scopul reducerii complicațiiilor.

Modularea farmacologică a cicatrizarii are ca scop principal supresia proliferării celulare, a fibroblaștilor în special, care ar limita vindecarea la locul trabeculectomiei și în consecință reducerea cicatrizării postoperatorii.

Corticosteroizii modulează vindecarea prin inhibarea activității macrofagelor (fagocitoza și eliberarea de enzime ca activatorul plasminogenului, colagenaze, factori de creștere) astfel suprimând inflamația, proces implicat în faza inițială a vindecării. Efectele antiinflamatorii specifice includ supresia depunerii fibrinei, diminuarea permeabilității vasculare, a migrării leucocitelor (156), inhibarea proliferării fibroblaștilor(157). Studiile pe culturi celulare au evidențiat efectul inhibitor al corticosteroizilor asupra proliferării și adeziunii fiboblaștilor capsulei Tenon (158). Postoperator administrarea de triamcinolon acetonid se poate face injectabil sub-Tenon (159), sau la nivelul bulei de filtrare la sfarșitul trabeculectomiei cu rezultate bune în ceea ce privește controlul PIO la 3 luni (160). Există și studii care au arătat că nu există diferență semnificativă între rata de succes a trabeculectomiei cu și fără administrarea de triamcinolon acetonid sub-Tenon la sfarșitul operației (161). Efectul benefic al corticosteroizilor administrați preoperator este evidențiat de studii care susțin că fluorometholona administrată topic cu o lună înaintea operației are important efect antiinflamator (162), iar medicația topică antiglaucomatoasă adițională nu a mai fost necesară (163).

Antimetaboliții

Pentru a îmbunătați rezultatele procedurii, majoritatea chirurgilor utilizează intraoperator antimetaboliți ca mitomicina C (MMC) și 5Fluorouracil (5FU), agenti antifibrotici și antimitotici, pentru modularea cicatrizării.

5FU inhiba sinteza ADN-ului și blochează proliferarea fibroblaștilor. Administrarea sa se poate face intraoperator sau postoperator (164),(165) și a fost introdus în chirurgia glaucomului de Heuer (166). Concentrația de 5FU utilizată intraoperator este de 50mg/mL aplicată pentru 5 minute.

Rezultate similare între lotul control și lotul care a primit postoperator injecție subconjunctivală cu 5FU (167),(168) pot fi explicate parțial de agresivitatea procesului de vindecare și parțial de locul injectării 5FU, diametral opus față de zona trabeculectomiei.

MMC este mai mult un agent alkilant decât antimetabolic care inhibă selectiv replicarea ADN-ului, sinteza proteinelor și mitozele. Ca și mecanism de acțiune, este comun acceptat faptul că MMC inhibă proliferarea fibroblaștilor ceea ce conduce la o reducere a adeziunii conjunctivale, astfel menținându-se bula funcționala. Timpul de înjumătățire al MMC administrată intravenos în doze de 30, 20, 10 (mg/corp) este de 50, 43 și respectiv 10 minute (169). Administrarea se face numai intraoperator și a fost introdus adjuvant în chirurgia filtrantă a glaucomului de Chen (170). Concentrația de MMC utilizată intraoperator variază între 0,1-0,5mg/mL aplicată la nivelul patului scleral înainte sau după realizarea flapului pentru 2-5 minute în funcție de riscul de eșec al trabeculectomiei. Buretele de celuloză utilizat trebuie aplicat strict pe zona unde se dorește realizarea fistulei și, în consecintă, fluxul de umoare apoasă, nu prea aproape de limb și nu în contact cu marginile plăgii. După ce este îndepartat buretele îmbibat în soluția de MMC zona respectivă este irigată cu o importantă cantitate de soluție salină pentru îndepartarea agentului antifibrotic rezidual. Deoarece în chirurgia glaucomului MMC se folosește în concentrație sub 1% la nivelul sclerei pentru câteva minute, durata de acțiune a acesteia este de doar câteva ore. Așa cum am menționat mai sus, fibroblastele apar și sunt activate de către macrofage și citochine eliberate de celulele-T la 12 ore după operație. Din acest considerent, MMC inhibă mai degrabă proliferarea celulelor mastocitare care declanșează răspunsul inflamator, decât proliferarea directă a fibroblastelor. Astfel, prin inhibarea degranulării mastocitare se obține efectul inhibitor asupra proliferării fibroblastice (171). Efectele sale sunt superioare celor ale 5FU, dar și reacțiile adverse mai periculoase (172),(173),(157).

Din cauza mecanismului de acțiune nespecific al acestor substanțe, care produc moarte celulară neselectivă, pot aparea complicațiii severe postoperator (174):

epiteliopatie și eroziuni corneene persistente

subțierea bulei de filtrare cu risc de fistulizare spontană sau după traumatisme minime și având ca rezultat hipotonie oculară (175),(176)

endoftalmita prin insamânțare pe traiectul fistulei și favorizată de hipotonie (mai frecvente după MMC) (177),(178, 179).

Există pacienți cu factori de risc procicatrizanți (persoanele tinere, afakia, neovascularizația segmentului anterior, inflamația) la care trabeculectomia devine nefuncționala deși se folosesc concentrații mari de 5FU sau MMC. Pentru a depăși aceste neajunsuri este necesară descoperirea unor agenți bine tolerați, siguri, eficienți care să moduleze vindecarea după chirurgia filtrantă a glaucomului.

Modularea imunologică a cicatrizării cu transforming growth factor beta (TGF-beta) Cum TGF-beta este cel mai puternic factor procicatrizant cunoscut din umoarea apoasă, se incearcă descoperirea unui anticorp anti TGF-beta care să moduleze cicatrizarea după operația de glaucom, eliminându-se complicațiiile soluțiilor antimitotice (180). Deși studiile experimentale au avut rezultate promițătoare, în studiile clinice nu s-a demonstrat superioritatea CAT-152 (lerdelimumab), un anticorp monoclonal al TGF-beta2 fața de grupul placebo (181) și acest studiu a fost întrerupt prematur din cauza lipsei eficienței substanței la dozele folosite.

Membrana amniotica poate fi un modulator fiziologic al procesului de vindecare prin acțiunea antiinflamatorie și anticicatriceală și datorită capacitătii sale de a se integra la nivelul bulei de filtrare prevenind astfel complicațiiile prin suprafiltrare (182).

Anticorpii anti factor de creștere vasculară endotelială (anti VEGF):

Bevacizumabul este un inhibitor al angiogenezei dezvoltat de firma Genentech. Este un anticorp monoclonal care inhibă angiogeneza prin blocarea VEGF. Sub denumirea comerciala de Avastin a fost aprobat de FDA ca terapie în cancerele colorectale și apoi în anumite neoplasme pulmonare, renale, ovariene. Ranibizumab reprezintă un fragment din acest anticorp monoclonal. După demonstrarea eficientei Ranibizumab în inhibarea angiogenezei oculare, Bevacizumabul a fost testat off-label și a fost demonstrat ca fiind de asemenea eficient. Există mai multe studii care au comparat eficiența Bevacizumab și Ranibizumab, printre care studiul CATT care nu a fost sponsorizat de firma producătoare, ci de National Eye Institute, studiul IVAN, precum și o metaanaliză care au arătat că între cele două produse nu au existat diferențe semnificative statistic de eficienta când au fost administrate la intervale similare. Reacțiile adverse au fost reduse ca și proporție la ambele produse, dar au fost semnificativ statistic mai frecvente pentru Bevacizumab (183), (184), (185), (186).

Ranibizumab, (denumire comerciala Lucentis) este produsul cel mai utilizat la acest moment pentru inhibarea neovascularizației atât pentru forma exudativa a DMLV, cât și pentru retinopatia diabetică proliferativă și edemul macular diabetic, în glaucomul neovascular, retinopatia de prematuritate, pentru edemul retinian post obstrucții vasculare retiniene, pentru neovascularizația la nivelul polului anterior al globului ocular.

Aflibercept (denumirea comerciala Eylea) este o proteină obținută printr-un proces de fuziune între domeniile extracelulare ale receptorilor VEGFR-1 și VEGFR-2 și respectiv porțiunea Fc a IgG1 (187). Studiile inițiale au demonstrat eficiența sa prin blocarea neovascularizației induse de aplicații laser pe un model animal pe șoarece, precum și reducerea creșterii permeabilitătii barierei hematoretiniene indusă în mod normal de VEGF (188). Studii ulterioare au demonstrat o eficiență și un profil de siguranță bune, astfel încât reprezintă o alternativă eficientă în inhibarea neovascularizației și angiogenezei (189).

PARTEA SPECIALĂ

Studiu privind evaluarea eficienței Bevacizumabului administrat subconjunctival la pacienții operați de glaucom

Scopul studiului

Studiul clinic desfașurat în cadrul tezei mele de doctorat a avut ca scop evaluarea efectelor administrării subconjunctivale de Bevacizumab asupra cicatrizarii posttrabeculectomie.

Designul studiului

Am efectuat un studiu clinic prospectiv randomizat, în care am evaluat două loturi de pacienți internați în Clinica de Oftalmologie a Spitalului Universitar de Urgență București, în perioada ianuarie 2013- ianuarie 2014, în vederea intervenției chirurgicale pentru glaucom.

Pacienți și date

Cohorta este reprezentată de populația din Bucuresti și/sau provincie, de etnii diferite și cu statut socio-economic diferit, ce va fi împărtită în două loturi:

Primul lot cuprinde 35 de pacienți; după operația de trabeculectomie s-a injectat subconjunctival Bevacizumab (Avastin) la sfarșitul operației și la o lună postoperator,acesta reprezentând grupul de studiu

Al doilea lot cuprinde 30 de pacienți cu trabeculectomie fără injecție subconjunctivală cu Bevacizumab, acesta reprezentând grupul martor

Toti pacienții incluși în studiu au îndeplinit următoarele criterii de includere:

pacienți cu vârsta peste 50 de ani de ambele sexe,

cu glaucom refractar cu presiune intraoculară necontrolată ce primesc terapie topică maximala tolerată,

fără intervenție chirurgicală în antecedente,

pacienți care au avut contraindicație sistemică la anumite antiglaucomatoase topice.

Stabilirea criteriilor de excludere:

pacienți cu vârsta sub 50 de ani,

traumatisme oculare sau intervenții chirurgicale oculare în antecedente,

afecțiuni oculare (exceptând glaucomul),

alergie la Bevacizumab,

afecțiuni ce pot crește riscul complicațiiilor (infarct miocardic, accident vascular cerebral),

femei care sunt însărcinate sau alaptează,

tratament sistemic anterior cu Bevacizumab

boli mentale, demență.

Am obținut consimțământul informat al pacienților, atât pentru intervenția chirurgicală, cât și pentru injectarea subconjunctivală a soluției de Bevacizumab.

Studiile din cadrul tezei mele de doctorat au primit avizul Comosiei de Bioetică a Spitalului Universitar de Urgentă București.

În cadrul studiului s-a asigurat anonimatul pacienților și protecția datelor.

S-a aplicat un protocol standardizat de lucru in ceea ce privește intervenția chirurgicală: după realizarea anesteziei retrobulbare, s-a practicat operația de trabeculectomie respectând urmatorii pași: s-a realizat incizia conjunctivei la 5mm posterior de limb și s-a disecat capsula Tenon; s-a efectuat hemostaza; s-a disecat un flap scleral dreptunghiular de jumătate din grosimea sclerei de 4x4mm cu un cuțit de tip crescent (Alcon); s-a realizat sclerectomia profundă de 2x2mm, apoi iridectomia periferică; flapul scleral a fost suturat în două puncte cu fir 10.0; sutura conjunctivei cu fir 10.0 continuu; pacienților din lotul de studiu li s-au injectat 0,05ml Bevacizumab (1,25mg) subconjunctival în zona temporală a bulei de filtrare utilizând o seringă cu ac de 30 gauge; s-a aplicat unguent cu antibiotic local (Tobradex, ung oftalmic, Alcon).

Tratamentul postoperator pentru toți participanții la studiu a inclus antibiotic+antiinflamator steroidian (TobraDex, Alcon), antiinflamator nesteroidian (Indocollyre,  Laboratoire Chauvin), midriatic (Tropicamida 0.5%, Rompharm), câte o picatura de trei ori pe zi, o lună. Medicația antiglaucomatoasă a fost adaugată doar în situațiile în care PIO țintă nu a fost atinsă.

Injectarea subconjunctivală de Bevacizumab s-a efectuat după obținerea consimțământului informat al pacienților. În condiții de asepsie chirurgicală s-au injectat subconjunctival 0,05ml (1,25 mg) Bevacizumab în zona temporală a bulei de filtrare imediat după operație și la o lună de la intervenția chirurgicală.

Analiza statistică

Datele au fost colectate și analizate în mod anonim, cuprinzând următoarele variabile: demografice (vârsta, sex); tipul de glaucom (primar cu unghi deschis, pseudoexfoliativ, neovascular, uveitic); elementele examenului clinic al pacienților cu glaucom; numărul medicației antiglaucomatoase; condiții și diagnostice asociate.

În cadrul studiului efectuat, analiza statistică și reprezentările grafice au fost realizate cu ajutorul programului SPSS 20 (Statistical Package for the Social Sciences), iar testele statistice au fost considerate semnificative pentru p < 0,050.

Analiza datelor statistice s-a făcut pe un eșantion format din 65 de persoane, 35 cu trabeculectomie și Bevacizumab, iar 30 doar cu trabeculectomie.

În cadrul cercetării, pe lângă analiza descriptivă a variabilelor (medie, mediană, valoare modală, abaterea standard, minimul și maximul) având în vedere tipul acestora și obiectivele formulate, am folosit testul t pentru eșantioane independente și testul chi-pătrat.

Pentru o mai bună înțelegere a datelor, prezint câteva informații despre statisticile descriptive:

Mediana este acel parametru care prin poziția sa, se află în mijlocul seriei de date. Ea reprezintă punctul central al seriei, deoarece la stânga și la dreapta ei se situează câte 50% din totalitatea datelor.

Abaterea standard este cea mai cunoscuta și utilizată măsură a variabilității datelor.

Cei 2 coeficienți de mai jos: cel de asimetrie și cel de boltire ne arată măsura în care distribuția analizată se diferențiază de o distribuție normală.

– Coeficientul de asimetrie Skewness (de oblicitate) – ne arată în ce măsură media se îndepărtează de mediană, și implicit, în ce măsură curba de distribuție normală a datelor se depărtează de mijloc, deplasându-se spre stânga sau spre dreapta.

– Coeficientul de boltire Kurtosis – se referă la înălțimea curbei, comparativ cu cea normală. Valorile pozitive indică distribuții „înalte”, leptokurtice, iar cele negative distribuții „plate”, platikurtice.

Testul t pentru eșantioane independente

Acest test este folosit pentru a examina efectele unei variabile independente asupra uneia sau a mai multe variabile dependente, iar folosirea sa este rezervata comparării a două condiții sau grupe (două niveluri ale variabilei independente).

Testul χ2 (chi-pătrat)

Testul chi-pătrat al asocierii se utilizează atunci când dorim să testăm relația dintre două variabile, ambele măsurate pe scală de tip categorial. Facem precizarea că variabilele categoriale, deși sunt, de regulă, de tip nominal, pot fi atât ordinale, cât și de interval sau de raport. Ceea ce caracterizează o variabilă categorială nu este atât scala de măsurare, cât faptul că primește puține valori, care împart distribuția în categorii de valori.

Metode de evaluare clinică a pacienților operați

Pacienții înrolati în studiul asupra efectului Bevacizumabului asociat operației filtrante în glaucom au primit explicații detaliate despre procedurile oftalmologice și a fost obținut consimțământul informat al acestora. Informarea amănunțită a fost utilă și pentru obținerea unei colaborări optime a pacienților.

După o anamneză amănunțită, pacienții din ambele loturi de studiu au fost supuși preoperator unui examen oftalmologic complet:

a fost înregistrată cea mai bună acuitate vizuală, cu corecție,

autorefractometrie cu Zeiss Humphrey Systems Acuitus 5015,

examen biomicroscopic cu o combina oftalmologică Carl Zeiss,

aplanotonometrie cu aplanotonometrul Goldmann,

câmp vizual computerizat cu Optopol, programul Fast Threshold,

grosimea centrală a corneei cu ajutorul pahimetrului încorporat al aparatului Ocuscan

biomicroscopie speculară

examinarea unghiului camerular prin gonioscopie indirectă cu oglinda corespunzătoare a lentilei Goldmann

fotografierea zonei bulei de filtrare și retinofotografie cu retinofotograf Carl Zeiss VisuCam, după dilatarea pupilei prin instilații oculare de tropicamidă 1% (Tropicamida),

tomografie în coerenta optica cu Carl Zeiss Cirrus HD-OCT, programul macular cube 512×128, optic disc 200×200 si anterior segment

ecografie oculară în mod A și B cu Sonomed E-Z scan B5500+.

Pacienții au fost reevaluati oftalmologic la o zi, o săptamână, o lună, trei luni, șase luni, nouă luni și un an postoperator. La fiecare vizită postoperatorie examinarea oftalmologică a inclus:

cea mai bună acuitate vizuală cu corecție,

biomicroscopia polului anterior,

testul Seidel,

măsurarea PIO,

retinofotografie,

fotografierea zonei bulei de filtrare

numărul și tipul medicației antiglaucomatoase aditionale,

prezența complicațiiilor.

Caracteristicile morfologice ale bulei de filtrare s-au stabilit utilizând scala IBAGS (Indiana Bleb Appearance Grading Scale). Aceasta reprezintă un sistem reproductibil pentru clasificarea bulei de filtrare utilizând o fotografie a conjunctivei superioare realizată cu ochiul privind inferior pentru a etala o zonă cât mai mare a conjunctivei (190). Sunt urmariți patru parametri ai bulei:

• Înalțimea H – H0 (plată) până la H4 (inaltă)

• Suprafața S – E0 (mai puțin de un secotr orar) până la E3 (mai mult de patru secoare orare)

• Vascularizația – V0 (avasculară) până la V4 (vascularizație extinsă)

• Testul Siedel – S0 (fară scurgere), S1 (scurgere punctiformă), S2 (scurgere abundentă)

Accentuarea vascularizației, reducerea suprafeței și înălțimii bulei de filtrare, cu sau fară creșterea PIO, reprezintă semnele inițiale ale închiderii bulei de filtrare (191).

Rezultate și discuții

Studiul a inclus 65 de pacienți cu glaucom operați, dintre care 35 au fost incluși în lotul de studiu și au primit două injecții subconjunctivale cu 0,05ml Bevacizumab, prima imediat după trabeculectomie și a doua la o lună postoperator și 30 de pacienți incluși în lotul martor care au fost doar operați.

Toti pacienții înrolati au terminat studiul de 12 luni. Pentru acesti pacienți s-au analizat anumite caracteristici demografice, epidemiologice, clinice și paraclinice. Toate rezultatele obținute au fost prelucrate statistic.

Am definit succesul complet, obținerea unei PIO sub 21mmHg, sau o reducere a PIO de peste 30% fară medicație antiglaucomatoasă aditională.

Am definit succesul parțial, obținerea unei PIO sub 21mmHg, sau o reducere a PIO de peste 30% cu medicație antiglaucomatoasă adițională (192),(193).

Pacienții care au necesitat chirurgie adițională sau care au avut o PIO peste 22mmHg, cu medicație antiglaucomatoasă adaugată, au fost considerați pacienți cu tratament nereușit.

Caracteristicile descriptive ale eșantionului sunt prezentate mai jos:

Sexul

În ceea ce privește distribuția pe sexe a celor două eșantioane, în cel cu trabeculectomie și Bevacizumab predomină subiecții de sex feminin (57,1%) în timp ce în cel de-al doilea grup (cu trabeculectomie), subiecții sunt în proporții egale (50%).

Tabel 3.6-1 : Repartiția pe sexe a pacienților

Figură 3.6-2 : Repartiția pe sexe în cadrul studiului

Vârsta

Se constată că vârsta medie a persoanelor din eșantionul cu trabeculectomie și Bevacizumab este de 70,43 ani. Vârsta subiecților se abate de la medie în plus sau în minus cu 4,93 ani. Modul (valoarea modală) are valoarea de 66 de ani. Acest lucru semnifică faptul că vârsta cea mai frecvent întâlnită la pacienții din eșantion a fost de 66 de ani. Vârsta minimă este de 60 de ani, în timp ce vârsta maximă este de 80 de ani. Valorile formează o curbă asimetrică negativ, înclinată spre dreapta (Coeficientul de asimetrie Skewness -0,139), cu mai multe valori extreme spre stânga și platikurtică (Coeficientul de boltire -0,313), mai plată decât o distribuție normală, având mai multe valori dispersate pe un interval mai mare în jurul mediei.

Subiecții din cadrul eșantionului cu trabeculectomie au vârste cuprinse între 60 și 80 de ani. Vârsta medie a persoanelor cuprinse în eșantion este de 70,63 ani, în timp ce vârsta care apar cel mai frecvent la subiecți a fost de 73 de ani. Vârstele descriu o curbă asimetrică negativ, înclinată spre dreapta (Coeficientul de asimetrie Skewness -0,128), cu mai multe valori extreme spre stânga și platikurtică (Coeficientul de boltire -0,181).

Tabel 3.6-2 : Vârsta pacienților din cele două loturi studiate

Figură 3.6-3 : Vârsta pacienților din lotul control

Figură 3.6-4 : Vârsta pacienților din lotul martor

Se observă că majoritatea pacienților a fost în grupul de vârstă 65-75 de ani atât în lotul control cât și în lotul martor. Acest lucru este normal, deoarece este cunoscut faptul că prevalența glaucomului crește după 60 de ani, după această vârstă crescând și riscul complicațiiilor sistemice (HTA, DZ) care favorizează apariția glaucomului neovascular.

Tipul glaucom

Glaucomul primitiv cu unghi deschis este în proporție de peste 50% în ambele grupuri. În cazul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab, urmează glaucomul pseudo-exfoliativ (20%), glaucomul neovascular (17,1%) și cel uveitic (11,4%), pentru că în cel de-al doilea grup glaucomul primitiv să fie urmat de glaucomul neovascular (23,3%), glaucomul pseudo-exfoliativ (13,3%) și cel uveitic (10%).

Tabel 3.6-3 : Tipurile de glaucom întâlnite la pacienții operați

Figură 3.6-5 : Tipurile de glaucom întâlnite la pacienții operați

Distribuția este în concordanță cu literatura de specialitate care menționează ca cea mai frecventă formă de glaucom pe cel primitiv cu unghi deschis și ca și forme care ajung mai frecvent la intervenție chirurgicală filtrantă pe cel neovascular, pseudoexfoliativ și uveitic.

Acuitatea vizuală cu corecție

Făcând o analiză în funcție de acuitatea vizuală cu corecție, preoperator se constată că valoarea medie în cazul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab a fost de 0,20. Valorile se abat de la medie în plus sau în minus cu 0,15. Modul ne arată că valoarea de 0,10 a fost cea mai des întâlnită la persoanele din acest grup. Boltirea = 0.330, ceea ce indică o distribuție leptokurtică, mai ascuțită decât o distribuție normală, cu valori concentrate în jurul mediei. Coeficientul de asimetrie (1,137), arată o distribuție înclinată spre stânga, având mai multe valori extreme spre dreapta.

Valoarea medie a acuității vizuale cu corecția în cazul grupului cu trabeculectomie se situează la valoarea de 0,20 valoarea cea mai des întâlnită fiind 0,10.

Analizând distribuția valorilor, se observă că acestea se abat de la medie în plus sau în minus cu 0,16. Coeficientul de asimetrie (0,979) ne arată o distribuție înclinată spre stânga, cu mai multe valori extreme spre dreapta. Indicatorul de boltire (Kurtosis=-0,100) ne indică o distribuție ușor platikurtică.

Tabel 3.6-4 Acuitatea vizuală cu corecție preoperator

Figură 3.6-6 : Acuitatea vizuală cu corecție a pacienților din lotul de studiu preoperator

Figură 3.6-7: Acuitatea vizuală cu corecție a pacienților din lotul martor preoperator

Cea mai bună acuitate vizuală postoperator la 12 luni nu a diferit semnificativ între grupuri. Valoarea medie a fost de 0,1 în ambele loturi, cu o abatere standard de 0,16 în lotul control, respectiv de 0,17 în lotul martor.

Grosimea centrală a corneei

Valoarea medie obținută la persoanele cu trabeculectomie și Bevacizumab în ceea ce privește grosimea centrală a corneei se situează la valoarea de 559,97, valoarea cea mai des întâlnită fiind de 561. Analizând distribuția valorilor, se observă că acestea se abat de la medie în plus sau în minus cu 12,22. Coeficientul de asimetrie (0,843) ne arată o distribuție înclinată spre stânga, cu câteva valori extreme spre dreapta. Indicatorul de boltire (Kurtosis=1,117) ne indică o distribuție leptokurtică, mai ascuțită decât o distribuție normală.

Analizând eșantionul cu trabeculectomie, se constată că valoarea medie a grosimii centrale a corneei este de 557,90. Valorile se abat de la valoarea medie în plus sau în minus cu 7,87. Modul ne arată că valoarea de 548 este cel mai des întâlnită la persoanele din eșantion. Boltirea = -1.000, ceea ce indică o distribuție platikurtikă. Coeficientul de asimetrie egal cu 0.234, arată o curbă asimetrică pozitiv, înclinată spre stânga, cu mai multe valori extreme spre dreapta.

Tabel 3.6-5 : Grosimea centrală a corneei la pacienții din studiu

Figură 3.6-8 : Grosimea centrală a corneei în lotul de studiu

Figură 3.6-9 : Grosimea centrală a corneei în lotul martor

Grosimea centrală a corneei s-a situat în limite normale la majoritatea pacienților și nu a necesitat o ajustare semnificativă a PIO.

Numărul medicamentelor antiglaucomatoase preoperator

Analizând eșantionul cu trabeculectomie și Bevacizumab în funcție de numărul medicamentelor antiglaucomatoase preoperator, se constată că media este de 3,06. Rezultatele se abat de la medie în plus sau în minus cu 0,72. Boltirea = -1.015, ceea ce indică o distribuție platikurtică. Coeficientul de asimetrie (-0,088), arată o distribuție înclinată foarte ușor spre dreapta, foarte aproape de o distribuție normală, având mai multe valori extreme spre stânga.

Persoanele din eșantionul cu trabeculectomie folosesc un număr de medicamente antiglaumatoase preoperator cuprins între 2 și 4. Numărul mediu pentru toate persoanele din grup este de 3, în timp ce numărul de medicamente folosit cel mai frecvent de subiecți a fost tot de 3.

Observăm că avem o curbă simetrică (Coeficientul de asimetrie Skewness =0) și platikurtică (Coeficientul de boltire -0,789).

Tabel 3.6-6 : Numărul medicației antiglaucomatoase preoperator

Figură 3.6-10 : Numărul medicației antiglaucomatoase preoperator în lotul de studiu

Figură 3.6-11 : Numărul medicației antiglaucomatoase preoperator în lotul martor

În ceea ce privește numărul medicației antiglaucomatoase preoperator nu au fost diferențe semnificative statistic între cele două loturi studiate (p=0.399506). Pe lângă medicația topică utilizată preoperator unii pacienți au necesitat și terapie pe cale generală (Acetazolamida în doză de 250-1000mg/zi per os si/sau Manitol 20% în doză de 250-500ml/zi), administrată câteva zile preoperator, pentru a putea realiza intervenția chirurgicală filtrantă cu riscuri minime.

Numarul medicatiei antiglaucomatoase postoperator

In cazul medicației antiglaucomatoase, raportate la întregul eșantion studiat, se observă diferențe semnificative statistic între numărul medicamentelor administrate preoperator și numărul acestora administrate postoperator (t=28,880; df=64; p<0,001).

Numărul mediu a scăzut de la 3,03 la 0,11, demonstrând astfel eficiența operației.

Tabel 3.6-7 : Numărul medicamentelor antiglaucomatoase pre și post operator

În cadrul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab, se constată că între numărul medicamentelor antiglaucomatoase administrate pre și postoperator sunt diferențe semnificative: t=23,141; df=34; p<0,001.

Intervalul de încredere al diferenței (95% Confidence Interval of the Difference) este cuprins între 2,737 (limita inferioară) și 3,263 (limita superioară).

Rezultatele obținute demonstrează eficiența terapiei, în urma acestora constatându-se scăderea semnificativă a numărului mediu de medicamente administrate.

Tabel 3.6-8 : Numărul medicamentelor antiglaucomatoase pre și post operator

Și în cadrul grupului cu trabeculectomie, se observă diferențe semnificative statistic între numărul medicamentelor preoperator și numărul acestora postoperator (t=17,750; df=29; p<0,001).

Numărul medicamentelor a scăzut de la o medie de 3, la o medie de 0,17 după intervenție.

Tabel 3.6-9: Numărul medicamentelor antiglaucomatoase pre și post operator

Decizia de a relua medicația antiglaucomatoasă topică a fost bazată pe niveluri medii ale PIO similare în ambele grupuri (18,5mmHg în lotul control, respectiv 19mmHg în lotul martor).

Densitatea celulelor endoteliale preoperator

Analizând eșantionul cu trabeculectomie și Bevacizumab în funcție de densitatea celulelor endoteliale preoperator, se constată că valoarea medie obținută este de 2216,74. Valorile se abat de la valoarea medie în plus sau în minus cu 286,88. Modul ne arată că valoarea de 2521 este cel mai des întâlnit la persoanele din eșantion. Boltirea = 2.770, ceea ce indică o distribuție leptokurtică. Coeficientul de asimetrie egal cu -1.655, arată o curbă asimetrică negativ, înclinată spre dreapta, cu mai multe valori extreme spre stânga.

Valorea medie a densității celulelor endoteliale preoperator la subiecții din grupul cu trabeculectomie se situează la valoarea de 2187,87, valoarea cea mai des întâlnită fiind 2246. Analizând distribuția valorilor, se observă că acestea se abat de la medie în plus sau în minus cu 254,52. Coeficientul de asimetrie (-1,946) ne arată o distribuție înclinată spre dreapta, cu mai multe valori extreme spre stânga. Indicatorul de boltire (Kurtosis=5,387) ne indică o distribuție leptokurtică.

Tabel 3.6-10 : Densitatea celulelor endoteliale preoperator

Figură 3.6-12 : Densitatea celulelor endoteliale preoperator în lotul de studiu

Figură 3.6-13 : Densitatea celulelor endoteliale preoperator în lotul martor

Densitatea celulelor endoteliale postoperator

Densitatea celulelor endoteliale postoperator la subiecții cu trabeculectomie și Bevacizumab ia valori cuprinse între 1308 și 2458. Valoarea medie este de 2156.29, în timp ce valoarea care apare cel mai frecvent la subiecți este de 2452. Observăm că avem o curbă asimetrică negativ, înclinată spre dreapta (Coeficientul de asimetrie Skewness -1,656), cu mai multe valori extreme spre stânga și foarte ascuțită (Coeficientul de boltire 2,772).

Analizând eșantionul cu trabeculectomie, se constată că valoarea medie a densității celulelor endoteliale postoperator este de 1987,87. Rezultatele se abat de la medie în plus sau în minus cu 254,52. Modul ne arată că valoarea de 2046 a fost cel mai frecvent întâlnită la persoanele din eșantion. Boltirea = 5.387, ceea ce indică o distribuție leptokurtică. Coeficientul de asimetrie (-1,946), arată o distribuție înclinată spre dreapta.

Tabel 3.6-11 : Densitatea celulelor endoteliale postoperator

Figură 3.6-14 : Densitatea celulelor endoteliale postoperator în lotul de studiu

Figură 3.6-15 : Densitatea celulelor endoteliale postoperator în lotul martor

Inițial densitatea celulelor endoteliale corneene nu a diferit semnificativ între cele două grupuri. După 12 luni densitatea celulelor endoteliale corneene a scazut în grupul cu Bevacizumab de la 2216,74 la 2156,29, care inseamnă o scădere cu 2,72% față de valoarea preoperatorie, dar diferența nu este semnificativă statistic. Faptul că Bevacizumabul administrat subconjunctival la interval de o lună nu modifică numărul de celule endoteliale susține utilizarea lui în tratamentul glaucomului.

PIO (presiunea intraoculară)

Media valorilor obținute de subiecții celor două grupuri în ceea ce privește presiunea intraoculară în diferitele momente ale măsurării (preoperator, în ziua 1, în ziua 7, după prima lună, după 3 luni, după 6 luni și după un an) sunt prezentate în tabelul următor. Pentru determinarea varianței mediilor presiunii intraoculare la cele 2 grupuri (cu trabeculectomie și avastin și cel doar cu trabeculectomie) am folosit testul Levene.

Am pornit de la cele două ipoteze:

H0 (ipoteza de nul)= Varianțele mediilor celor două grupuri sunt omogene.

H1= Varianțele mediilor celor două grupuri sunt heterogene.

În cazurile în care p>α(0,05), se acceptă ipoteza H0 (varianțele sunt egale), și se citesc în continuare valorile de pe primul rând al tabelului cu rezultatele testului t, în timp ce în cazurile în care p<α(0,05) se acceptă ipoteza H1 (varianțele sunt inegale) și se citesc valorile testului t de pe al doilea rând.

Ipotezele testului t:

H0: Nu există o diferență semnificativă între variabile

H1: Există diferență semnificativă între variabile.

Se observă, în toate momentele măsurărilor, că nu există diferențe semnificative statistic între media valorilor obținute la subiecții din primul grup și media valorilor obținute la subiecții din al doilea grup.

Putem spune că nu există diferențe semnificative între cele două grupuri în ceea ce privește presiunea intraoculară, indiferent de momentul măsurării acesteia.

Tabel 3.6-12 : PIO medie a celor două loturi preoperator și la fiecare vizită postoperatorie

Prin urmare, la sfarșitul studiului, PIO era similară în cele două loturi, dar numărul pacienților cu medicație topică adaugată era mai mare în lotul martor. Aceste rezultate se corelează cu datele din literatura de specialitate care sugerează că utilizarea agenților anti-VEGF nu cresc semnificativ reducerea PIO după trabeculectomie (194).

Luând în considerare rezultatele testului t putem afirma că între PIO preoperator și PIO din ziua 1, raportat la întreg eșantionul, există o diferență semnificativă statistic (t=74,851; df=64; p<0,001).

PIO în ziua 1 de la intervenție este semnificativ mai mic (12,20) față de perioada preoperatorie (31,11).

Tabel 3.6-13 : Comparație intre PIO preoperator și PIO ziua 1 raportat la tot eșantionul

Ca și în analiza anterioară, și în cadrul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab, diferența dintre PIO preoperator și PIO în ziua 1 după operație este semnificativă statistic (t=53,342; df=34; p<0,001). Se constată o reducere substanțială a PIO după efectuarea operației.

Tabel 3.6-14 : Comparație între PIO preoperator și PIO ziua 1 în lotul cu trabeculectomie și Bevacizumab

Rezultatele comparative între PIO preoperator și PIO postoperator în cazul grupului cu trabeculectomie sunt asemănătoare cu cele pentru celălalt grup. Diferența este semnificativă statistic (t=52,243; df=29; p<0,001), PIO postoperator fiind mult mai mica decât înainte de intervenție.

Tabel 3.6-15 : Comparație între PIO preoperator și PIO ziua 1 în lotul cu trabeculectomie

Succesul

Ratele de succes complet sunt ridicate în cazul ambelor grupuri, cu un ușor plus în cazul grupului control (94,3%) față grupul martor (83,33%), însă diferența nu este una semnificativă statistic (p=0,156).

Tabel 3.6-16 : Ratele de succes complet și partial în cele două loturi de pacienți

Tabel 3.6-17 : Distribuția procentuală a succesului complet și parțial în lotul control și lotul martor

În grupul cu Bevacizumab succesul total s-a realizat la 33 de pacienți, succesul parțial la 2 pacienți care au necesitat administarea de medicație topică beta-blocantă. În grupul control, succesul total s-a realizat la 25 de pacienți, succesul partial la 5 pacienți care au necesitat medicație topică beta-blocantă adițională. Acest lucru poate fi explicat pe de o parte prin numărul mic de participanți în fiecare lot, iar pe de altă parte prin perioada de urmarire postoperatorie de numai un an.

Morfologia bulei de filtrare

Caracteristicile morfologice ale bulei de filtrare au fost evaluate conform scalei IBAGS. Sunt urmăriți patru parametri ai bulei: înălțimea, suprafața, vascularizația, testul Seidel.

Înălțimea bulei de filtrare este preponderent mare în cazul ambelor grupuri (51,4% în cazul primului grup și 46,7% în cazul celui de-al doilea grup), urmată de ponderi însemnate în care înălțimea este moderată. Diferența privitoare la înălțimea bulei de filtrare nu este semnificativă statistic între cele două grupuri (p=0,363).

Tabel 3.6-18 : Distribuția procentuală a înălțimii bulei de filtrare în cele două loturi

Figură 3.6-16 : Înălțimea bulei de filtrare în cele două loturi comparativ

Nici în ceea ce privește suprafața bulei de filtrare nu se constată diferențe semnificative între cele două grupuri (p=0,857).

Tabel 3.6-19 : Distribuția procentuală a suprafeței bulei de filtrare în cele două loturi

Figură 3.6-17 : Suprafața bulei de filtrare în cele două loturi comparativ

Privitor la vascularizație, în cazul primului grup predomină vascularizația ușoară (88,6%), în timp ce în cazul celui de-al doilea grup predomină vascularizația moderată (70%). Rezultatele testului chi-pătrat ne arată diferențe semnificative între cele două grupuri (χ2=40,327; df=3, p<0,001).

Tabel 3.6-20 : Distribuția procentuală a vascularizației bulei de filtrare în cele două loturi

Figură 3.6-18 : Vascularizația bulei de filtrare în cele două loturi

Prezența micro leakage este mică în cazul ambelor grupuri, diferențele între cele două nefiind semnificative statistic (χ2=0,533; df=1, p=0,466).

Tabel 3.6-21 : Distribuția procentuală a difuziunii umorii apoase la nivelul bulei de filtrare

Figură 3.6-19 : Rezultatele testului Seidel în cele două loturi de pacienți

În lotul de studiu (trabeculectomie cu Bevacizumab), aspectul bulei de filtrare s-a modificat pe parcursul urmăririi postoperatorii de 12 luni; se observă reducerea numărului de vase și a calibrului vascular în special la nivelul bulei de filtrare care este elevată, hipovascularizată, funcțională. Vascularizația a fost semnificativ mai mare în prima lună postoperator, redu cându-se după a doua injecție subconjunctivală cu 0,05ml Bevacizumab.

ABCDE

Figură 3.6-20 : Aspectul bulei de filtrare pe parcursul urmăririi postoperatorii în lotul control: în prima zi postoperator (A); la o lună postoperator (B); la 3 luni postoperator (C); la 6 luni postoperator (D); la 12 luni postoperator (E) se observă reducerea numărului de vase și a calibrului vascular în special la nivelul bulei de filtrare care este elevată, hipovascularizată, funcțională.

ABCDE

Figură 3.6-21 : Aspectul bulei de filtrare pe parcursul urmăririi postoperatorii în lotul martor: în prima zi postoperator (A); la o lună postoperator (B); la 3 luni postoperator (C); la 6 luni postoperator (D); la 12 luni postoperator (E) se observă căvascularizația bulei de filtrare s-a menținut ridicată până la controlul de 3 luni postoperator, ulterior devenind moderată.

În lotul martor (trabeculectomie simplă), vascularizația bulei de filtrare s-a menținut ridicată până la controlul de 3 luni postoparator, ulterior devenind moderat vascularizată, bula de filtrare fiind de asemenea funcțională.

Complicații postoperatorii

Ponderea complicațiilor apărute la cele două grupuri studiate este asemănătoare: 11,4% în cazul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab și 10% în cazul grupului cu trabeculectomie.

Nici una din complicații nu predomină, acestea fiind împărțite între leakage conjunctival, cataractă, chist capsulă Tenon și leakage conjunctival+cataractă.

Tabel 3.6-22 : Complicațiiile postoperatorii la pacienții din cele două loturi studiate

Nu au existat diferențe statistic semnificative între grupuri în ceea ce priveste complicațiiile postoperatorii.

Un pacient din lotul cu BVC a dezvoltat un chist al capsulei Tenon. Tratamentul topic cu beta-blocant a redus cu succes PIO la niveluri acceptabile. Nici un pacient nu a prezentat hipotonie oculară (PIO<6mmHg). Nu s-au semnalat infecții asociate bulei de filtrare, decompensare corneană, maculopatie hipotonică, leakage tardiv. Datele noastre arată o proportie redusă a leakage-ului comparativ cu alte studii (195),(196).

Figură 3.6-22 : Pacient din lotul control (trabeculectomie cu Bevacizumab): chist al capsulei Tenon apărut la 3 luni postoperator

La doi pacienți din lotul martor s-a observat leakage de la nivelul bulei de filtrare care a durat două săptamâni. Într-un caz a încetat spontan, celălalt caz a prezentat o cameră anterioară mică. După sutura adițională a conjunctivei, camera anterioară s-a adâncit, dar a evoluat cataracta care a fost tratată operator la 9 luni de la trabeculectomie.

In acest studiu a fost aleasă calea subconjunctivală de administrare a Bevacizumabului, având la baza studiile pe animale care susțin că anticorpii anti-VEGF se „leagă” la nivel scleral, crescând astfel timpul de înjumătățire (197) și permitând o eliberare treptată a substanței la nivel conjunctival (198). Deși timpul de înjumătățire la nivelul conjunctivei umane nu este cunoscut, studiile pe animale au arătat că o concentrație eficientă minimă inhibitorie după o administrare subconjunctivală se menține până la 8 săptămâni (197).

Referitor la complicațiii vasculare legate de utilizarea anti-VEGF, trebuie sa fim precauți în legatură cu posibilele reacții adverse vasculare ale agenților anti-VEGF. Utilizarea sistemică este asociată cu variate evenimente vasculare ca: hipertensiunea, hemoragia, tromboembolismul (199). În ceea ce privește utilizarea oculară a Bevacizumabului, au fost observate evenimente rare ca ischemie retiniană, ocluzie de arteră centrală a retinei, hemoragii subretiniene, iar complicații sistemice ca hipertensiune arterială, accident vascular cerebral, infarct miocardic au fost de asemenea raportate cu frecvență redusă în trialuri (200). Prezența VEGF este importanta pentru funcționarea normală și repararea endoteliului vascular, iar blocarea VEGF poate determina disfuncție endotelială (105).

Concluzii

Studiul de față descrie urmărirea pe o perioadă de 12 luni a 65 de pacienți operați de trabeculectomie cu sau fără administrarea a doua injecții subconjunctivale de Bevacizumab, prima imediat postoparator si a doua dupa o luna.

Vârsta medie a pacienților din studiu este de aproximetiv 70 de ani. Vârsta subiecților se abate de la medie în plus sau în minus cu aproximativ 5 ani.

În ceea ce privește distribuția pe sexe a celor două eșantioane, în cel cu trabeculectomie și Bevacizumab predomină subiecții de sex feminin (57,1%) în timp ce în cel de-al doilea grup (cu trabeculectomie), subiecții sunt în proporții egale (50%).

Valoarea medie a acuității vizuale cu corecție, preoperator în ambele loturi este de 0,2 cu o abatere standard de 0,15 în lotul control, respectiv de 0,16 în lotul martor; postoperator, valoarea medie a acuității vizuale cu corecție este de 0,1 cu o abatere standard de 0,16 în lotul control, respectiv de 0,17 în lotul martor.

Valoarea medie a grosimii centrale a corneei este de 559,97±12,22 în lotul cu trabeculectomie și Bevacizumab și de 557,90±7,87 în lotul cu trabeculectomie.

Valoarea medie a densitatii celulelor endoteliale preoperator este de 2216,74±286,88 în lotul control si de 2187,87±254,52 în lotul martor. Postoperator, numarul mediu al celulelor endoteliale a scazut la 2156,29±279,166 în lotul control si la 1987,87±254,521 în lotul martor. Faptul ca Bevacizumabul administrat subconjunctival la interval de o lună nu modifică semnificativ numărul de celule endoteliale susține utilizarea lui în tratamentul glaucomului

Privitor la tipul de glaucom, glaucomul primitiv cu unghi deschis este în proporție de peste 50% în ambele grupuri. În cazul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab urmează glaucomul pseudo-exfoliativ (20%), glaucomul neovascular (17,1%) și cel uveitic (11,4%), pentru ca în cel de-al doilea grup glaucomul primitiv să fie urmat de glaucomul neovascular (23,3%), glaucomul pseudo-exfoliativ (13,3%) și cel uveitic (10%).

Numărul mediu al medicamentelor antiglaucomatoase preoperator în lotul cu trabeculectomie și Bevacizumab este de 3,06±0,72, iar în lotul martor este de 3±0,69. Raportat la întregul eșantion studiat, numărul mediu a scăzut de la 3,03 preoperator la 0,11 postoperator, demonstrând astfel eficiența operației; se observă diferențe semnificative statistic între numărul medicamentelor administrate preoperator și numărul acestora administrate postoperator raportate la întregul eșantion studiat (t=28,880; df=64; p<0,001).

PIO în ziua 1 de la intervenție este semnificativ mai mică (12,20mmHg) față de perioada preoperatorie (31,11mmHg). Putem spune că nu există diferențe semnificative între cele două grupuri în ceea ce privește presiunea intraoculară, indiferent de momentul măsurării acesteia. Valorile postoperatorii ale PIO în orice moment au fost sub 21mm Hg și semnificativ mai mici decât cele preoperatorii în ambele grupuri. La sfârșitul studiului, PIO era similară în cele două loturi, dar numărul pacienților cu medicație topică adaugată era mai mare în lotul martor.

Ratele de succes complet sunt ridicate în cazul ambelor grupuri, cu un ușor plus în cazul grupului control (94,3%) față de grupul martor (83,33%), însă diferența nu este una semnificativă statistic (p=0,156). Succesul partial s-a realizat în proportie de 5,7% în lotul control si de 16,7% în lotul martor, fără diferenta semnificativa statistic (p=0,156). Acest lucru poate fi explicat pe de o parte prin numarul mic de participanti în fiecare lot, iar pe de alta parte prin perioada de urmarire postoperatorie de numai un an.

Înălțimea bulei de filtrare este preponderent mare în cazul ambelor grupuri (51,4% în cazul primului grup și 46,7% în cazul celui de-al doilea grup), urmată de ponderi însemnate în care înălțimea este moderată. Diferența privitoare la înălțimea bulei de filtrare nu este semnificativă statistic între cele două grupuri (p=0,363).

Nici în ceea ce privește suprafața bulei de filtrare nu se constată diferențe semnificative între cele două grupuri (p=0,857).

Privitor la vascularizația bulei de filtrare, în cazul primului grup predomină vascularizația ușoară (88,6%), în timp ce în cazul celui de-al doilea grup predomină vascularizația moderată (70%). Rezultatele testului chi-pătrat ne arată diferențe semnificative între cele două grupuri (χ2=40,327; df=3, p<0,001).

Referitor la testul Seidel, prezența micro leakage este mică în cazul ambelor grupuri, diferențele între cele două nefiind semnificative statistic (χ2=0,533; df=1, p=0,466).

Ponderea complicațiilor apărute la cele două grupuri studiate este asemănătoare: 11,4% în cazul grupului cu trabeculectomie și Bevacizumab și 10% în cazul grupului cu trabeculectomie. Niciuna din complicații nu predomină, acestea fiind împărțite între leakage conjunctival, cataractă si chist de capsulă Tenon.

Întrucât nu există o modalitate unică recomandată si acceptată de administrare a tratamentului anti-VEGF în chirurgia glaucomului, consider că studiul din cadrul tezei de doctorat, deși nu a adus date clare si suficiente care să susțină utilizarea terapiei adiționale cu Bevacizumab în chirurgia glaucomului a ridicat noi întrebări și a deschis noi drumuri de cercetat.

Deși nu există suficiente dovezi care să susțină faptul ca pacienții glaucomatoși sunt mai expuși reacțiilor adverse ale agenților anti-VEGF, utilizarea tot mai frecventă a acestora în terapia glaucomului trebuie sa fie realizată în condiții de maximă siguranță.

Limitele acestui studiu au fost date de numărul relativ redus de pacienți înrolați, fiind necesară urmărirea unor pacienți suplimentari care să urmeze același regim terapeutic pentru a avea rezultate și mai semnificative statistic si de durata de urmărire de numai un an.

Avantajele acestui studiu sunt faptul că regimul terapeutic aplicat nu este toxic cornean, complicațiile locale au fost minime și nu au apărut complicații sistemice.

Studiul efectului unor substanțe cu rol antiangiogenic și antifibrotic asupra chirurgiei filtrante a glaucomului pe modelul animal

Scopul studiului

Cercetarea experimentală din cadrul tezei mele de doctorat urmărește dacă administrarea unor substanțe cu rol antiangiogenic (Bevacizumab) și antifibrotic (Bevacizumab și Pirfenidonă) ca adjuvant al chirurgiei filtrante a glaucomului poate preveni cicatrizarea postoperatorie la un model animal (iepure).

Justificarea alegerii modelului animal

Având în vedere că sunt anumite tipuri de reacții care nu pot fi simulate în vitro (cum ar fi neovascularizația țesuturilor), este necesară configurarea experimentelor pe animalele de laborator, pentru a simula reacția organismului uman la acțiunea substanțelor folosite ca adjuvant în chirurgia glaucomului.

Modelul animal

Cercetarea experimentală din cadrul tezei mele de doctorat s-a realizat pe animale de laborator și anume iepuri. Animalele de experiență utilizate au fost 25 iepuri adulți – Oryctolagus cuniculus, de aproximativ aceeași greutate (2,5-3kg), vârsta 6-12 luni, sex masculin, găzduite la biobaza Universității de Medicină și Farmacie Carol Davila în condiții reglementate de Comisia de Etică a Universității de Medicină și Farmacie, Carol Davila (ANEXA 1).

Este cunoscut faptul că ochii de iepure au o structură similară din multe puncte de vedere cu ochiul uman, dar rata de neovascularizație și neoformație la nivel ocular este mai rapidă ca la om (201),(202).

Globul ocular uman din punct de vedere anatomic are dimensiuni asemănătoare cu ale modelului animal. Orbita umană este citată în literatură ca fiind asemănatoare cu cea a iepurelui, acest lucru fiind demonstrat prin măsurătorile antropometrice și oculoplastice pe care le-am efectuat pe craniu de om și respectiv iepure adult, astfel (203),(204),(205):

Tabel 4.3-1 : Măsuratori antropometrice comparative ale orbitei umane și animale

În privința anatomiei globului ocular la iepure am găsit diferențe față de om (206):

Musculatura extrinsecă a globului ocular este asemănătoare cu mușchii drepți ai globului ocular uman astfel: Mm. Drept superior se inseră în scleră, plecând de deasupra foramenului optic, pe peretele superior al orbitei, intersectând mm oblic superior printr-un tendon de circa 6-8 mm lățime la circa 3 mm posterior de limbul sclerocorneean. Mm drept inferior se inseră la nivelul limbului la circa 2 mm, iar mm drept lateral are un traseu lung, printr-un tendon de circa 6 mm inserându-se în scleră la circa 4 mm de limb. Mm drept intern are originea în fața foramenului optic și se inseră pe scleră la circa 8 mm de limb. Oblicul inferior are originea la nivelul unghiului posterior al osului lacrimal și se inseră oblic la nivelul sclerei, la 2 mm de limb printr-un tendon de circa 4 mm lațime. Oblicul superior are origine pe peretele intern al orbitei ,mergând oblic către trohlee de unde are apoi traiect temporal pentru a se insera pe scleră la circa 6 mm de limb, sub mm drept superior.

Grosimea sclerei este de circa 0,5 mm la limb și se subțiază spre nervul optic unde ajunge la circa 0,2 mm grosime.

Orbita iepurelui conține un sinus venos ce se extinde de la apexul orbitar la ecuatorul globului ocular, ce drenează din sinusul cavernos și pterigoid, explicând sângerarea excesivă din timpul enucleației globului ocular.

Pachetul vascular ce însoțeste nervul optic are o distribuție unică, ele radiază orizontal din nervul optic și însoțește stratul fibrelor nervoase mielinizate

Corneea este mai subțire , cu o grosime medie de 360 µ și lipsește membrana Bowmann (36).

La iepuri rețeaua trabeculară are o dispoziție mai puțin organizata, iar canalul Schlemm este inlocuit cu un plex venos (22).

Aceste date obținute în urma măsurătorilor locale au permis stabilirea unui plan de lucru standardizat pentru toate intervențiile chirurgicale, adaptând tehnica operatorie standard pentru trabeculectomie conform noilor date anatomice găsite.

Condiții de vivariu

Împreună cu personalul din cadrul biobazei UMF Carol Davila am amenajat condiții corespunzătoare pentru creșterea animalelor de laborator, după cum urmează :

– Temperatura ambientală de 15- 21 grade

– Condiții de iluminare normală ( regim diurn / nocturn 12h/12h)

– Cuști speciale individuale din inox de dimensiuni 60/40/40 cm

– În cuști animalele au acces la hrană și apă; hrana animalelor de cercetare este cumpărată de la un furnizor autorizat; fiecare lot de hrană este certificată ca fiind produsă la fel și că hrana este păstrată și exportată în mod corespunzător și conține elemente nutritive corespunzătoare

– Masa este înregistrată pe foaia de activitate zilnică

– Animalele din punct de vedere al stării de sănătate sunt verificate zilnic

– Medicul veterinar a verificat animalele de experiment de două ori pe săptămână

Acest mediu le-a permis cel puțin un grad minim de libertate de mișcare, corespunzătoare pentru sănătatea și bunăstarea lor conform dreptului stipulat în Convenția Europeană pentru protecția animalelor vertebrate utilizate în scopuri experimentale sau alte scopuri științifice, Strasbourg 18.03.1986 și ulterior în Directiva 2010/63/UE. Condițiile de mediu în care animalele au fost crescute, ținute sau utilizate au fost verificate zilnic, iar bunăstarea și starea la sănătate a animalelor au fost monitorizate atent pentru a preveni orice tip durere, suferință, stres sau vătămări de durată prevăzute în Anexa A din Convenția Europeană pentru protecția animalelor vertebrate utilizate în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice – Ghiduri pentru adăpostirea și îngrijirea animalelor, Strasbourg, 15.06.2006 și Directiva 2010/63/UE.

Procedurile au fost efectuate sub anestezie pentru a elimina pe cât posibil durerea, suferința, stresul sau vătămările de durată aplicate pe parcursul procedurii, asa cum este prevăzut în Directiva 2010/63/UE. Animalele utilizate în studiu au experimentat doar un discomfort moderat clasificat în conformitate cu legislația UE (Directiva 2010/63/UE).

Am decis ca înainte de a începe experimentul sa las animalele de laborator sa se obisnuiasca cu noul mediu, durata aclimatizarii fiind de 7 zile.

Metodologia interventiei chirurgicale

Animalele utilizate au fost cântărite apoi, conform normelor de etică aplicate în cadrul studiului pe animale de laborator, anestezia generală a fost realizată cu Xilazină 2% (Xilazin Bio, Maravet Animal Health) 5mg/kgc administrată intramuscular, apoi după 10 minute s-a administrat ketamină intravenos (Ketaminol10 , MSD Animal Health) în doză de 35mg/kgc. Pe toată durata studiului, în scop analgezic am folosit oxibuprocaină solutie oftalmică 0,4%, pentru a minimaliza suferința și stresul resimțit de animal.

După instalarea anesteziei generale am realizat operația de trabeculectomie la ochiul stang respectând următorii pași operatori: am realizat o incizie conjunctivală de aproximativ 5mm la limb în cadranul superior; am disecat conjunctiva și capsula Tenon și am expus sclera; am realizat un flap scleral dreptunghiular de jumătate din grosimea sclerei de aproximativ 3x3mm cu un cuțit de tip crescent; am excizat o suprafață de țesut de aproximativ 2x1mm ce conține sclera internă, trabeculul și cornea periferică, urmată de o iridectomie periferică; am suturat flapul scleral cu două fire separate de vicryl 10.0; am suturat conjunctiva la limb cu fir de vicryl 10.0 în trei puncte. S-a administrat subconjunctival Bevacizumab (Avastin) în zona temporală a bulei de filtrare în doza de 1,25mg (0,05ml) prin injectare cu o seringă de unică folosință cu ac de 30 gauge. S-a aplicat unguent cu antibiotic local (Tobrex, ung oftalmic, Alcon) și s-a administrat o primă doză de antibiotic general (Enrofloxacină-Ganadexil Enro 5%, Industrial Veterinaria SA) 0,5 ml/kgc/zi.

Tratamentul antibiotic general a fost administrat zilnic subcutanat 0,5ml/kgc/zi (Enrofloxacină- Ganadexil Enro 5%, Industrial Veterinaria SA 0,5 ml/kgc/zi) timp de 5 zile, iar tratamentul local a fost administrat de două ori pe zi, 10 zile constând în tobramicină 0.3% (Tobrex, unguent oftalmic, Alcon).

Protocolul de lucru

Animalele de experienta cărora li s-a realizat trabeculectomia (operația filtrantă din glaucom), au fost împărtite în 3 grupuri:

I grup (grupul martor) cuprinde 4 iepuri care sunt tratați cu injecție subconjunctivală cu BSS (ballanced salt solution) la sfarșitul operației de trabeculectomie și la 7 zile postoperator

al II-lea grup cuprinde 10 iepuri; aceștia sunt tratați cu injecție subconjunctivală cu Bevacizumab 1.25mg (0.01ml) la sfarșitul operației de trabeculectomie și la 7 zile postoperator

al III-lea grup cuprinde 10 iepuri; se adaugă administrarea topică de Pirfenidonă în concentrație de 0.5mg/ml de 3 ori pe zi, tratamentului lotului II.

Prepararea și administrarea Pirfenidonei: Pirfenidona (P2116; Sigma-Aldrich, Germania) a fost dizolvată în apă distilată la concentrație de 0.5% (5mg/ml). Ca și conservant pentru soluția cu administrare topică s-a folosit thiomersalul. S-a administrat o picatură de trei ori pe zi în ochiul operat al iepurelui.

Am ales concentrația de 0,5% deoarece s-a demonstrat că este cea mai mică concentrație care este eficientă în administrare topică (207).

Am ales sa administrez soluția de Pirfenidonă de trei ori pe zi, deși în studii este administrată de 6 ori pe zi având în vedere complianța pacienților la tratament într-un eventual studiu clinic și asocierea cu Bevacizumabul, putându-se astfel cumula efectul toxic la administrări mai frecvente.

La 14 și respectiv 28 de zile de la debutul experimentului, jumătate din numărul de animale din fiecare lot este sacrificată și se realizează enucleația globilor oculari la scurt timp de la deces, pentru analiza ultrastructurală. După eutanasierea animalului realizată cu doză letală de fenobarbital (120mg/kg), s-a realizat intervenția chirurgicală cu următorii pași operatori: decolarea conjunctivei perilimbic pe 360˚, urmată de decolarea capsulei Tenon; s-au dezinserat mușchii drepți extraoculari; cu ajutorul lingurii de enucleație prin abord nazal s-a ridicat globul ocular, urmat de secționarea nervului optic prin abord temporal și a pachetului vascular însoțitor, în toate cazurile fiind lezat sinusul venos din spatele globului ocular.

Globii oculari enucleați au fost introduși în soluție de Formol 10% și trimiși serviciului de anatomopatologie a Spitalului Clinic N. Ghe. Lupu unde au fost prelucrați conform protocoalelor în vigoare.

Țesutul ocular este prelucrat pentru analiza histomorfologică și pentru analiza imunohistochimică cu respectarea principiilor generale de tehnica histopatologică și imunohistochimică.

Am ales pentru sacrificarea iepurilor ziua a 14-a, respectiv ziua a 28-a, deoarece Miller și colegii au arătat că la iepuri 94% din bulele de filtrare erau închise în ziua a 17-a, în timp ce într-un studiu al lui Zhong și colegii trabeculectomiile din lotul control au funcționat până în ziua a 12,8+/- 2,2, iar în lotul cu MMC până în ziua a 19,0+/- 2,0. Într-un studiu similar Tina și colegii au concluzionat că trabeculectomiile din lotul control s-au închis în ziua a 16-a. Cordeiro și colegii au arătat ca, în lotul lor control, toate bulele erau închise până în ziua a 14-a.

Zilele stabilite pentru recoltarea țesuturilor au luat în considerare „timpul de închidere a trabeculectomiei” din literatura de specialitate.

Agenți antiangiogenici și antifibrotici utilizați

Anticorpii anti factor de creștere vasculară endotelială (anti VEGF)

Angiogeneza fiziologică, necesară pentru creșterea, dezvoltarea și repararea organismului uman implică o serie de procese biochimice și celulare la care participă variați factori de creștere: factorul de creștere fibroblastică (FGF), basic FGF, TGF-alfa, TGF-beta, factorul de creștere hepatocitară, TNF-alfa, angiogenina, interleukina (IL)-8, angiopoietina (208),(209).

Angiogeneza patologică este asociată frecvent cu inflamația masivă și proliferarea fibroblaștilor și determină distrugerea țesuturilor. Studiile au demonstrat că fibroblaștii conjunctivali din culturile celulare pot fi stimulați de citochine proinflamatorii să producă VEGF (210), iar fibroblaștii capsulei Tenon sunt inhibați de inhibitorii angiogenici (211). Având la bază aceste observații, este de imaginat că o inhibiție selectivă a factorilor de creștere, cum este VEGF, să fie o opțiune în prevenirea sau tratarea unei cicatrizări excesive.

In 1983 a fost descoperit factorul de permeabilitate vasculară (212), care a fost apoi redenumit factor de creștere vasculară endotelială (VEGF) (213). VEGF are mai mulți izomeri (VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD, și factorul de creștere placentară), dintre care VEGFA are rolul major în angiogeneza fiziologică și patologică (214). VEGFA are 6 izoforme (215) (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206), VEGF165 fiind izoforma cea mai importantă pentru angiogeneză (216). Datorită numeroaselor izoforme de VEGF și VEGFA, strategiile terapeutice pot urmări blocarea doar a VEGF165, sau blocarea tuturor izoformelor VEGFA sau a VEGF. VEGF circulant inițiază o cascadă biochimică prin activarea a trei tirozin-kinaze: VEGFR-1, VEGFR-2 și VEGFR-3 (217, 218). Prin stimularea VEGFR-1 se eliberează factori specifici de creștere tisulară, se recrutează progenitori endoteliali se induc matrix metaloproteinaze, iar VEGFR-2 este mediator major angiogenic, mitogenic, anti-apoptotic, crește permeabilitatea vasculară (219).

VEGF este produs de numeroase celule care participă în procesul de vindecare: celule endoteliale (220),(221), fibroblaști (106), celule musculare netede (222),(223), plachete (224), neutrofile (225) și macrofage (226). VEGF acționează inițial asupra endoteliului vascular. Ca răspuns la stimulare, celulele endoteliale proliferează și migrează; eliberarea locala de oxid nitric determină vasodilatație (227); crește permeabilitatea capilară prin crearea de fenestrații celulare (228) și alterarea integrității joncțiunilor intercelulare strânse prin fosforilarea proteinelor intra și extracelulare (229). VEGF induce migrarea celulelor endoteliale prin două mecanisme principale, chemotactismul și vasodilatația. În faza inițială a angiogenezei, celulele endoteliale migrează inainte de declanșarea diviziunii mitotice. Înmugurirea capilară poate persista 4-5 zile doar prin elongație și migrare celulară, fară proliferare (230).

VEGF este un factor vasculogenic și fibrogenic important, cu rol esențial în vindecarea locală postoperatorie. Aceasta depinde de vascularizația conjunctivei, de migrarea și proliferarea fibroblaștilor. Vindecarea postoperatorie cuprinde două faze: o faza inițială de angiogeneză și o faza ulterioară de fibroză. VEGF are un rol major în vasculogeneza și angiogeneza fiziologică și este asociat cu fibroza și inflamația. Ca urmare are un rol crucial în formarea țesutului de granulație (țesut fibrovascular ce conține fibroblaști, colagen și vase de sânge) în procesul de vindecare a plăgii, fiind de asemenea important în epitelizare și depunerea de colagen. Componenta vasculară (vasele nou formate) dependentă de angiogeneză apare în ziua a treia a procesului de vindecare și asigură elementele nutritive și mediatorii necesari vindecării și eliminarea produșilor de metabolism. Inhibarea angiogenezei împiedică vindecarea (231). În timpul fazei proliferative dintre a treia și a saptea zi postoperator, procesele de creștere și diferențiere vasculară ating maximul.

S-a demonstrat că după trabeculectomie, nivelul de VEGF din umoarea apoasă a iepurilor este crescut, atât în lotul control cât și în lotul tratat cu Bevacizumab. După 4 zile postoperator, nivelul de VEGF din umoarea apoasă din lotul de studiu era semnificativ mai mic decât în lotul martor, iar în ziua a 6-a nivelurile din cele două loturi erau comparabile (103). Esson și colegii au raportat o concentrație crescută de VEGF în țesutul de la nivelul bulei de filtrare pe modelul de trabeculectomie la șobolan (232).

Bevacizumabul este un anticorp monoclonal ce inhibă activitatea biologică a tuturor izoformelor VEGF-A, administrat în oftalmologie în special pentru tratamentul afecțiunilor retiniene endovasculare (233),(234) și vascularizației corneene (235),(236). Studiile pe linii de celule umane corneene și fibroblaști conjunctivali tratate cu Bevacizumab au evidențiat modificări morfologice și reducerea adeziunii intercelulare (237).

Injecțiile intravitreene cu Bevacizumab sunt eficiente și larg folosite pentru tratamentul degenerescenței maculare legate de vârstă pentru prevenirea dezvoltării neovascularizației coroidiene (238),(239),(240), pentru prevenirea neovascularizației retiniene în retinopatia diabetică proliferativă (234),(241), pentru tratamentul edemului macular în retinopatia diabetică (242), în ocluzia venoasă retiniană (243) și în uveite (244). În plus, injecțiile intravitreene sunt utile pentru prevenirea și tratamentul neovascularizației iriene (245). Injecțiile cu Bevacizumab, utilizate pentru prima dată în glaucomul neovascular (246), au fost apoi extinse ca adjuvant al chirurgiei penetrante a glaucomului în situații de neovascularizație în camera anterioară (247),(248) sau edem macular persistent. Efectul posibil pe care Bevacizumabul administrat intravitrean îl are pe celălalt ochi poate fi explicat prin pătrunderea substanței în circulația sistemică (249). Cercetările experimentale asupra farmacocineticii Bevacizumabului administrat intravitrean la iepure au demonstrat că timpul de înjumătățire la nivelul vitrosului ochiului injectat este de 4,32 zile, iar concentrații de peste 10microg/ml s-au menținut timp de 30 de zile; concentrația maximă de 37,7microg/ml în umoarea apoasă s-a înregistrat a treia zi de la injecție, iar timpul de înjumătățire a fost de 4,88 zile (250). Trei grupuri de cercetare au demonstrat că după injectare intravitreană, Bevacizumabul penetrează retina la șoarece (251), iepure (252) și maimuță (253). Un alt studiu a demonstrat că injecția intravitreană de BVC a redus concentrația de VEGF în ochiul tratat pentru cel puțin patru săptamâni cu un efect minim sau absent pe ochiul contralateral (254).

Pe langă administrarea intravitreană, Bevacizumabul se administrează și subconjunctival (255),(236),(256),(257) sau topic în neovascularizația corneană la om (258),(259), dar și în modele experimentale de neovascularizație la iepure (235),(260). De asemenea există studii clinice care investighează administrarea topică a BVC în chirurgia glaucomului (261), (262).

Studiile pe culturi celulare au evidențiat efectul antifibrotic al Bevacizumabului pe culturi de fibroblaști umani de la nivelul capsulei Tenon (263).

Studiile histologice au evidențiat că proliferarea fibroblastică subconjunctivală maximă este între a treia și a cincea zi postoperator. Timpul de înjumătățire al Bevacizumabului este de 4-5 zile, prin urmare sunt necesare multiple injecții subconjunctivale (194).

În studiile prospective care au cercetat influența administrării subconjunctivale de Bevacizumab acesta a fost administrat într-o singură doză de 1,25mg la sfârșitul trabeculectomiei (264), în doză dublă imediat postoperator (2,5mg) (265), sau două doze intraoperator (2×1,25mg) și o doză la o săptamâna (266). Toate aceste studii au o perioadă relativ scurtă de urmarire și nu există un studiu comparativ între administrarea uneia sau mai multor doze de anti-VEGF.

În studiile pe animale de laborator dozajul BVC variază de la administrarea de 1,25mg de 1-7 ori subconjunctival, la 2,5mg subconjunctival sau 1,25mg intravitrean (265).

Diferențele între doze, momentul și calea de administrare fac dificilă compararea studiilor. Cu toate acestea, studiile in vitro, pe animale de laborator sau pe pacienți glaucomatoși susțin potențialul beneficiu al BVC ca inhibitor al cicatrizării post trabeculectomie.

În studiul meu, BVC a fost administrat postoperator, imediat după trabeculectomie și în a 7-a zi postoperator, această abordare luând în considerare faptul că noile vase depind de VEGF pentru a supraviețui, iar inhibiția VEGF va determina regresia neovascularizației (214). Reducerea vascularizației bulei a fost observată clinic după prima injecție la nivelul bulei.

Nu există date suficiente care să stabilească momentul optim și calea de administrare a Bevacizumabului ca adjuvant al chirurgiei glaucomului.

Studiile farmacocinetice realizate pe iepuri au arătat că în urma administrării intravitreene sau subconjunctivale se ating concentrații intraoculare suficiente, în timp ce administrarea topică nu realizează acest deziderat (197). Există un studiu în desfasurare care investighează utilizarea topică de ranibizumab de patru ori pe zi timp de o lună după trabeculectomie și ale cărui rezultate pot susține varianta tratamentului local ca opțiune în managementul chirurgiei glaucomului (267). Administrarea topică are avantajul absorbției sistemice mai reduse, dar necesită administrare mai frecventă, în timp ce după o singură administrare subconjunctivală Bevacizumabul poate fi detectat în umoarea apoasă și după două săptamâni (197).

În studiile prospective legate de administrarea anti-VEGF în chirurgia filtrantă a glaucomului, injectarea subconjunctivală este cea mai utilizată cale de administrare, cu excepția unui studiu care utilizează calea intravitreană (264), (265), (266), (268). Injectarea intravitreană are riscurile suplimentare legate de inflamație, decolare de retină, endoftalmită.

Un studiu experimental a arătat că tratamentul combinat Bevacizumab cu 5FU a prelungit supraviețuirea bulei de filtrare (100% durata de funcționalitate pe perioada studiului) față de tratamentul cu fiecare substanță separat (50% în grupul Bevacizumab și 25% în grupul 5FU) (269). Acest rezultat sugerează că tratamentul combinat antimetabolit anti-VEGF poate fi superior utilizării fiecărui agent în parte (270). Acest efect sinergic al combinației antimetabolit anti-VEGF fost raportat și în studiile clinice la pacienții cu cancer colorectal, la care s-a observat o întarziere a vindecării plăgii în grupul tratat cu combinația de agenti față de lotul tratat doar cu 5FU (271). De asemenea, BVC administrat subconjunctival a redus numărul aplicațiilor de 5FU post trabeculectomie (272).

Este important de menționat faptul că nu au fost raportate reacții adverse importante la nivelul polului posterior (273) sau anterior (274) după administrarea BVC.

Pirfenidona

Pirfenidona (5-metil-1-fenil-2-[1H]-piridona) este un nou agent cu efect antifibrotic și antiinflamator. Acest medicament cu administrare orală a fost evaluat în studii clinice extinse pentru tratamentul fibrozei pulmonare idiopatice. Aceasta este o afecțiune fatală din cauza pierderii progresive a funcției pulmonare prin depunerea necontrolată, excesivă a matrixului extracelular. Pirfenidona administrată oral se absoarbe rapid, având o mare biodisponibilitate. La pacienții adulți concentrația plasmatică maximă se atinge după 30 de minute, după administrarea unei doze orale (275). O absorbție rapidă a fost observată și la speciile nonclinice, iar un studiu radiometric pe iepuri demonstrează o bună distribuție în țesuturile bine vasculatizate ca ficat, rinichi, inimă și plămân (276). Un studiu pe iepuri a cercetat farmacodinamica Pirfenidonei după administrarea topică de Pirfenidonă 0,5%. Aceasta se absoarbe rapid și atinge concentrația maximă după aproximativ 20 de minute. Cmax a fost de 9,64mg/g, 9,62mg/g, 34,88mg/l, 0,52mg/l și 2.13mg/g pentru cornee, conjunctivă, umoare apoasă, vitros și respectiv scleră.

Există numeroase studii care cercetează acțiunea Pirfenidonei pe modele animale de fibroză pulmonară, hepatică, renală și cardiacă (277),(278),(279) și s-a demonstrat efectul antiinflamator, antistres oxidativ și antiproliferativ. Este cunoscută acțiunea de modulare a citokinelor și factorilor de creștere implicați în procesul de fobroză. În aceste studii reducerea fibrozei este asociată cu modularea activitații citokinelor și factorilor de creștere, (TGF-beta (280), CTGF (277), PDGF (281), TNF-alfa (282),(283)), cel mai important efect fiind reducerea TGF-beta. Toate aceste citokine au un rol important în procesul de vindecare. Pirfenidona inactivează de asemenea speciile reactive de oxigen și astfel inhibă reparația tisulară (284). În afecțiunile ce implică fibroza intensă, cantitatea de colagen depozitată în țesuturi este controlată de balanța dintre sinteza (controlată la nivel transcripțional și translational) și degradarea colagenului în matrixul extracelular de către matrixmetaloproteinaze care sunt controlate de inhibitorii tisulari ai metaloproteinazelor (TIMP).

La nivelul celulelor epiteliului pigmentar retinian Pirfenidona blochează sinteza de fibronectină mediată de TGF-beta1 (285). În plus Pirfenidona poate reduce nivelul interleukinei-1 care are ca rezultat diminuarea nivelului inhibitorului tisular al metaloproteinazelor (TIMP)-1 și are efect antifibrotic asupra fibroblaștilor orbitali la pacienții cu oftalmopatie tiroidiană (286).

Există studii care au arătat că Pirfenidona poate preveni proliferarea, migrarea și contracția fibroblaștilor capsulei Tenon in vitro (287). Același grup de cercetare a concluzionat că efectul Pirfenidonei asupra fibroblaștilor capsulei Tenon este atins prin inhibarea ARNm și a expresiei proteinelor tuturor izoformelor de TGF-beta (287). De asemenea, viabilitatea culturilor de fibroblaști ai capsulei Tenon este mai mare după tratamentul cu Pirfenidonă comparativ cu tratamentul cu MMC, demonstrând că este mai puțin toxică, dar cu un efect la fel de puternic asupra migrării celulare (288).

Activitatea antifibrotică importantă a Pirfenidonei pe o varietate de modele animale o recomandă ca terapie în afecțiuni cu componentă fibrotică semnificativă. Pe culturile de fibroblaști umani recoltați de la nivelul pterigionului, Pirfenidona administrată în concentrație de 1,0 sau 1,5mg/ml, după 48 de ore a determinat reducerea semnificativă a expresiei TGF-beta, astfel inhibând proliferarea, migrarea și secreția de procolagen la concentrații non-toxice (289). Pe modelul animal de strabism la iepure Pirfenidona administrată sub formă de lipozomi a diminuat procesul inflamator și fibroza postoperatorie (290). Elucidarea mecanismului fibrogenetic este fundamentală pentru descoperirea de noi terapii, iar Pirfenidona poate reprezenta o parghie în intelegerea acestor procese în studii viitoare.

Există informații limitate în ceea ce privește utilizarea sa în oftalmologie, în timp ce eficiența și siguranța administrării orale de Pirfenidonă în tratamentul fibrozei pulmonare idiopatice au fost demonstrate prin studii clinice multinaționale (291).

Pirfenidona (PFD) determină o inhibiție semnificativă dependentă de doză a proliferării și migrării fibroblastelor Tenon umane (HTF) și contracției colagenului. S-au folosit diferite concentrații de Pirfenidonâ și s-a observat că aceasta inhibă izoformele TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3). PFD reduce expresia mRNA a TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. Efectul inhibitor al Pirfenidonei a început la concentrația de 0.15mg/ml și a ajuns la un platou la 0.3mg/ml. S-a concluzionat că doza optimă pentru experiment este PFD în concentrație de 0.15 și 0.3mg/ml. Analiza flow citometrică arată că PFD inhibă creșterea celulară acționând în faza G1. Procentajul celulelor din faza S scade cu creșterea concentrației de PFD, în timp ce procentul celulelor din faza G2 nu este influențat (287).

Referitor la toxicitatea PFD, utilizarea sa ca tratament topic în oftalmologie este probabil sigură, având în vedere deja folosirea ei ca tratament oral la pacienții cu fibroză pulmonară în doză zilnică de 1800mg cu reacții adverse minime.

Pirfenidona ar putea sa moduleze cicatrizarea la nivel conjunctival după operația de trabeculectomie, astfel putând deveni o terapie adjuvanta în chirurgia glaucomului.

Metode de evaluare clinică a animalelor de laborator

Am examinat înainte de începerea studiului toate animalele pentru a verifica și certifica faptul că nu prezintă anomalii oculare. Pentru a evidenția integritatea globului ocular am folosit biomicroscopul portabil cu fantă luminoasă, cu animalele anesteziate în prealabil. Preoperator am examinat animalele cu biomicroscopul portabil și am măsurat presiunea intraoculară sub anestezie topică cu aplanotonometrul Perkins. Am realizat trei măsuratori și am facut media aritmetică.

Controalele postoperatorii au fost efectuate la o zi, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile. Animalele au fost examinate sub anestezie locală la toate vizitele astfel:

Examen de pol anterior cu biomicroscopul portabil la ochiul operat pentru a stabili nivelul inflamației în camera anterioară (0-absentă, 1-celule, 2-fibrina, 3-hipopion), prezența sau absența hifemei și adâncimea camerei anterioare (0-absentă, 1-mică, 2-mare)

S-a măsurat presiunea intraoculară cu aplanotonometrul Perkins , realizându-se trei măsuratori și înregistrându-se media

Stainingul cornean s-a urmărit prin instilarea de fluoresceină și a fost notat prezent sau absent

Imediat postoperator și la 1 zi, 7 zile, 14 zile, 21 zile și 28 zile de la începerea tratamentului, s-au efectuat fotografii pentru a se analiza zona trabeculectomiei. S-au măsurat și notat lațimea și înălțimea bulei de filtrare. Vascularizația de la nivelul bulei de filtrare a fost gradată pe o scala de la 0 la 3 (0-avasculară, 1-vascularizație normală, 2-hiperemică, 3-foarte hiperemică).

Metode histopatologice și imunohistochimice de evaluare a animalelor de laborator

Analiza histopatologică și imunohistochimică a fost realizată pentru a pune în evidență vascularizația, cicatrizarea și fibroza.

După ce a fost fixat în formol 10%, globul ocular a fost prelucrat la parafină. S-au realizat secțiuni de 5microm și s-au realizat următoarele colorații:

Hematoxilina-eozina – pentru analiza histologică generală și celularitatea totală

Masson trichrome-pentru evidențierea fibrelor de colagen

Van Gieson elastic– pentru evidențierea țesutului conjunctiv

Gomori – pentru fibrele de reticulină

CD34 (cluster de diferențiere 34) este o glicofosfoproteină de suprafață care funcționează ca factor de adeziune a celulelor stem medulare de matricea sau celulele stromale ale măduvei și este exprimată în timpul dezvoltării la nivelul celulelor primitive stem limfohematopoietice și progenitoare, la nivelul endoteliilor microvasculare și fibroblaștilor . CD 34 este codată la nivelul cromozomului 1q32, iar procesul de activare este determinat de glicozilarea și fosforilarea sa de către protein kinaza C. CD34 face parte din grupul proteinelor transmembranare sialomucinice a cărei expresie se produce în perioada inițială a formării țesuturilor vasculare și hematopoietice (292).

Celulele CD34 pozitive se găsesc în mod normal în cordonul ombilical și măduva osoasă, dar există o multitudine de celule ce exprimă pe suprafața lor markeri CD34 pozitivi; la nivel ocular le întâlnim în keratocite, celulele stem limbice și celulele mature ale endoteliului cornean

CD31( molecula de adeziune endotelială plachetară 1, PECAM1) este o moleculă de adeziune celulară necesară migrării transendoteliale a leucocitelor în condiții de inflamație. Este codată de gena de pe cromozomul 17q23 și se exprimă pe suprafața plachetelor, neutrofilelor, monocitelor și a unor celule T și participă la o mare parte din joncțiunile intercelulare (293)

Este prezentă și la nivelul țesuturilor oculare în celulele stem limbice și celulele endoteliale din coroidă (294). În determinările imunohistochimice este un martor al prezenței celulelor endoteliale și a angiogenezei.

Toxicitatea oculară a Pirfenidonei administrată topic fost analizată prin testul Draize (295) și examen histopatologic. După administrarea a 50 microL de Pirfenidonă 0,5% am folosit biomicroscopul portabil pentru evaluarea congestiei conjunctivale, opacității corneene și congestiei iriene.

Pentru evaluarea toxicității asupra structurilor oculare (epiteliul cornean, epiteliul conjunctival, corpul ciliar și retina), am utilizat secțiuni colorate cu hematoxilina-eozina și magnificație mare de la iepurii sacrificați în ziua 28, deoarece efectul toxic este maxim la sfârșitul studiului, comparativ cu alte momente intermediare.

Rezultate

Toți cei 24 de iepuri incluși în studiu au finalizat cercetarea experimentală.

Acest studiu a avut ca principale obiective durata de funcționare a bulei, vascularizația acesteia și evaluarea histologică.

Bula de filtrare funcțională a fost definită ca prezența unei dilatații subconjunctivale pline cu lichid.

Bula de filtrare nefuncțională a fost definită ca bula plată, vascularizată, cicatrizată.

PIO nu a fost considerată obiectiv principal, deoarece la acest model animal PIO era normală și înainte de operație.

Au fost urmărite și comparate între grupuri:

Adâncimea și activitatea inflamatorie a camerei anterioare

Presiunea intraoculară

Morfologia și vascularizația bulei de filtrare

Parametrii histologici

Figură 4.7-1: Bula de filtrare funcțională la modelul animal reprezentată de o dilatație subconjunctivală plină cu lichid

Figură 4.7-2: Bula de filtrare nefuncțională la modelul animal, plată, intens vascularizată

Examinarea biomicroscopică a ochiului operat s-a realizat cu biomicroscopul portabil pentru a pune în evidență orice modificare la nivelul segmentului anterior și bulei de filtrare în zilele stabilite.

Usor staining punctat superficial tranzitoriu și edem cornean tranzitoriu în zona plăgii s-a observat în toate grupurile, la câteva animale, fară diferențe între acestea.

Camera anterioară a fost mică la majoritatea animalelor în prima zi postoperator. În următoarele 7 zile aceasta s-a adâncit progresiv. Nu au fost diferențe între cele trei grupuri privitor la timpul necesar pentru adâncirea camerei anterioare. În ceea ce privește inflamația din camera anterioară, aceasta a fost minimă în toate cele trei loturi.

Hifema post iridectomie s-a observat la 4 iepuri în prima zi postoperator, ea resorbindu-se în primele trei-patru zile.

Figură 4.7-3: Hifema totală în prima zi postoperator apărută la un iepure din lotul martor

Figură 4.7-4: Sângerare în camera anterioară în prima zi postoperator apărută la un iepure din lotul cu trabeculectomie și Bevacizumab

Nu s-au observat infecții intraoculare sau cataractă pe perioada studiului în niciunul dintre grupuri.

Tolerabilitatea picăturilor de Pirfenidonă și a injecției subconjunctivale de Bevacizumab a fost foarte bună, fară reacții adverse (roșeață, chemozis sau secreții).

Bula de filtrare

Timpul mediu de supraviețuire a bulei de filtrare a fost:

Lot control: 8+/-1,41 zile (doar o bulă funcțională până în ziua a 10-a)

Lot II: 16,6+/-1,71 zile (doar două bule funcționale până în ziua a 19-a)

Lot III: 22,4+/-1,71 zile (doar o bulă funcțională până în ziua a 25-a)

Aria bulei de filtrare a fost calculată masurând lățimea și adâncimea bulei folosind metoda descrisă de Cordeiro și colegii (296).

În prima zi postoperator suprafața medie a bulei de filtrare a fost asemanătoare pentru cele trei loturi (12-14mm2). În lotul martor suprafața a crescut în ziua a treia la 15mm2, apoi a început să scadă, ajungând sub 5mm2 în ziua a șaptea. Suprafața medie din celelalte loturi s-a mărit pâna în ziua a șaptea (20-22mm2), apoi a început să scadă într-un ritm mai lent în lotul cu BVC+PFD față de lotul cu BVC.

În ceea ce privește înălțimea medie a bulei de filtrare, aceasta a fost în prima zi postoperator similară între cele trei loturi (1,5-2mm). În lotul martor a început să scadă începând cu ziua a treia, devenind plată spre ziua a opta. În celelalte două loturi înălțimea a crescut pâna in ziua a șaptea-a opta, apoi a început să scadă, în ziua a 28-a toate bulele de filtrare fiind plate.

Figură 4.7-5 : Suprafața medie a bulei de filtrare comparativ între cele trei loturi studiate

Figură 4.7-6 : Înălțimea medie a bulei de filtrare comparativ între cele trei loturi studiate

S-au observat bule cu suprafață mai mare și mai înalte în grupurile II și III fața de grupul martor.

Morfologia bulei de filtrare la 7 zile după trabeculectomie. În figură este prezentat câte un animal reprezentativ pentru fiecare grup. Acestea au fost tratate postoperator cu BSS (A), Bevacizumab subconjunctival (B), Bevacizumab subconjunctival+Pirfenidonă topic (C). Loturile tratate cu Bevacizumab și Bevacizumab+Pirfenidonă au prezentat bule elevate, bine reprezentate, cu vascularizație redusă, comparativ cu bula aproape plată, intens vascularizată observată la animalele din lotul martor.

ABC

Figură 4.7-7 : Morfologia bulei de filtrare la 7 zile după trabeculectomie la câte un animal reprezentativ din fiecare grup; în timp ce bula de filtrare din lotul martor este intens vascularizată și aproape plată (A), bulele de filtrare din lotul cu BVC (B), și BVC+PFD (C) sunt elevate și hipovascularizate.

La 14 zile postoperator, tratamentul Pirfenidonă+Bevacizumab este asociat cu bula de filtrare bine formată, elevată, difuză, comparativ cu bula plată, cicatrizată din lotul martor.

ABC

Figură 4.7-8 : Morfologia bulei de filtrare la 14 zile după trabeculectomie la câte un animal reprezentativ din fiecare grup; în timp ce bula de filtrare din lotul martor este nefuncțională, plată (A), bulele de filtrare din lotul cu BVC (B), și BVC+PFD (C) sunt încă elevate, funcționale și hipovascularizate.

La 28 de zile postoperator toate bulele de filtrare din cele trei loturi erau nefuncționale. În lotul martor (A) se observă bula de filtrare cu fibroză în exces la nivel conjunctival și cu vase de sânge pericicatricial; în lotul tratat cu Bevacizumab (B) bula de filtrare este plată, cu fibroză mai redusă și vascularizație minimă; în lotul tratat cu Bevacizumab și Pirfenidonă (C) la nivelul bulei de filtrare se observă fibroză și vascularizație minimă.

ABC

Figură 4.7-9: Morfologia bulei de filtrare la 28 de zile după trabeculectomie la câte un animal reprezentativ din fiecare grup; toate bulele de filtrare sunt nefuncționale; în lotul martor (A) se observă bula de filtrare cu fibroză in exces și cu vase de sânge perilezional; în lotul cu BVC (B) bula de filtrare este plată, cu fibroză mai redusă și vascularizație minimă; în lotul cu BVC+PFD (C) la nivelul bulei de filtrare se observa fibroză și vascularizație minimă.

Vascularizația bulei a fost gradată cu ajutorul fotografiilor, utilizând o scală standardizată cum se observă în tabelul urmator.

Tabel 4.7-1 : Scala vascularizației bulei de filtrare

În ceea ce privește vascularizația bulei, s-a înregistrat o vascularizație mai scăzută în zilele 3-4 și 8-9 postoperator. Această observatie poate fi legată de administrarea injecției de Bevacizumab imediat postoperator și în ziua a 7-a postoperator.

Presiunea intraoculară

Analiza PIO medie a ochiului operat, măsurată preoperator și în zilele 1,7 14, 21 și 28 postoperator, nu arată diferențe între cele trei loturi pe perioada experimentului. Pentru fiecare grup, PIO a fost scazută inițial postoperator, apoi a început să crească ușor.

PIO medie (SD) înainte de operație a fost în lotul martor de 13.0 (1.4)mmHg, în lotul cu BVC de 12.7 (2.5)mmHg și în lotul cu BVC+PFD de 12.5 (1.3)mmHg. PIO medie postoperator in prima zi a fost în lotul martor de 8.6 (1.6) mmHg, în lotul cu BVC de 8.9 (1.3) mmHg, și în lotul cu BVC+PFD de 8.8 (2.0) mmHg; în lotul martor de 11.9 (1.8) mmHg, în lotul cu BVC de 11.3 (1.0) mmHg, în lotul cu BVC+PFD de 11.1 (1.7) mmHg, în ziua a 7-a; și în lotul martor de 12.8 (0.5) mmHg, în lotul cu BVC de 12.0 (0.3) mmHg, în lotul cu BVC+PFD de 12.5 (0.7) mmHg, în ziua 28 după trabeculectomie.

Analiza histopatologică

Analiza histologică a fost realizată la locul sclerectomiei, indicată de localizarea iridectomiei după eutanasierea animalelor și enucleerea ochiului în ziua a 14-a și ziua a 28-a.

La animalele din lotul martor sacrificate în ziua a 14-a s-a observat o cantitate mai mare de fibre de colagen depuse, iar țesutul dens subconjunctival devine evident.

A

BC

Figură 4.7-10

A. focar de inflamație cronică subonjunctivală în jurul unui fir chirurgical monofilament. HE x 100. B. Detaliu – se observă o celulă gigantă multinucleată de corp strain în imediata vecinatate a corpului strain (firul chirurgical); adiacent, țesutul de reparație cicatricială cu foarte numeroase fibre colagen și proliferare vasculară redusă. HE x 200. C. Detaliu – densitate mare de fibre de colagen colorate în albastru – Masson x 200

Analiza din ziua a14-a a loturilor II și III a arătat țesut conjunctiv depus în cantitate mai mică fața de lotul martor.

AB

Figură 4.7-11

A-B. Focar de inflamație cronică cu celulă gigantă de corp strain în citoplasma căreia se identifică fir chirurgical; relativ moderată fibroza. A. HE x 200. B. Masson x 200.

Examenul histopatologic din ziua a 28-a a evidențiat la lotul martor o dezorganizare a structurii normale a sclerei, fibrele colagene au dispoziție neregulată, în mănunchiuri mai groase decât cele din sclera normală, cu dispoziție relativ radiară.

AB

Figură 4.7-12

A. dezorganizare a structurii normale a sclerei; fibrele colagene au dispoziție neregulată, în mănunchiuri mai groase decât cele din sclera normală, cu dispoziție relativ radiară centrată de focarul inflamator. Gomori x 100. B. Subconjunctival, țesut fibros cicatricial cu rare vase de tip capilar. HE x 100

În ceea ce privește vasele de sânge, la lotul martor se constată la 14 zile postoperator vase de sânge numeroase (A), iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară a scăzut, în schimb lumenele vasculare sunt mai mari, bine formate (B).

Figură 4.7-13 : Lotul martor la care se constată la 14 zile postoperator vase de sânge numeroase (A), iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară a scăzut, în schimb lumenele vasculare sunt mai mari, bine formate (B). CD31

În lotul cu Bevacizumab și Pirfenidonă la 14 zile postoperator se constată vase de sânge în număr mai mic, de calibru redus (A), iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară este tot redusă, dar lumenele vasculare sunt mai mari (B).

Figură 4.7-14 : Lotul cu BVC+PFD la care la 14 zile postoperator se constată vase de sânge în număr mai mic, de calibru redus (A), iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară este tot redusă, dar lumenele vasculare sunt mai mari (B).CD31

Figură 4.7-15

Caracteristici histologice de la nivelul zonei de filtrare la 28 de zile postoperator la un ochi din lotul martor. Pe traiectul fistulei închise se identifică vase de neoformație ca și la nivelul bulei de filtrare, iar în unghiul camerular se observă material amorf (probabil talc) CD34 10×10: C-conjunctiva, S-sclera, CC-corp ciliar, B-bula de filtrare, V-vase de neoformație, f-fir chirurgical

A

BC

DE

Figură 4.7-16

A. fire chirurgicale la nivelul țesutului conjunctiv cu focare de infiltrat inflamator cronic gigantocelular. HE x 100. B-D. Detalii. Celulele gigante multinucleate de corp strain în jurul firelor chirurgicale. B-C – se observa numeroase eozinofile în infiltratul inflamator. B, C HE x 200. D. Fibroza cicatricială în care se identifică vase de neoformație perilezional. Masson X 200. E. Dezorganizarea structurii laminare paralele cu apariția de mănunchiuri de colagen în benzi groase cu dispoziție neregulată. Gomori x 200

A

BC

Figură 4.7-17

A. Subconjunctival se observă un focar inflamator cronic cu celule gigante multinucleate de corp strain în jurul unor fire chirurgicale; infiltratul inflamator include limfocite, rare plasmocite și numeroase eozinofile. HE x 100. B. Detaliu – se observă abundență de eozinofile. HE x 200. C. subconjunctival focar de infiltrat inflamator cronic cu celulă gigantă multinucleată de corp strain care a fagocitat un fir chirurgical; infiltratul inflamator include de asemenea eozinofile dar în număr mai redus decât în cazul precedent. HE x 200

Chiar și după vindecarea plăgii sclerale, în ziua a 28-a, se observă reziduuri ale fistulei în lotul III tratat cu Bevacizumab și Pirfenidonă.

AB

CD

Figură 4.7-18

A-B. Traiect de trabeculectomie deschis; focare de inflamație cronică gigantocelulară centrate de fir chirurgical monofilament. A. HE x 100. B. HE x 200. C-D. Traiect de trabeculectomie bordat la capăt de țesut fibros cicatricial centrat de fir chirurgical. C. HE x 100. D. HE x 200.

La animalele sacrificate în ziua a 28-a țesutul cicatricial fibrocelular dens și sclerotomia închisă sunt evidente la lotul martor.

AB

CD

Figură 4.7-19

A-B. Traiect de trabeculectomie închis prin proliferare conjunctivo-vasculară (țesut de granulatie matur); la capătul extern (subconjunctival) se identifică focar de inflamație cronică gigantocelulară centrat de fir chirurgical monofilament. A. HE x 100. B (detaliu). HE x 200. C. Vase capilare mature cu endoteliu turtit și fibroză de remaniere. HE x 200; în stânga (subconjunctival), inflamație cronică gigantocelulară în jurul unor fire chirurgicale. HE x 200. D. Subconjunctival, acumulare de fibre de colagen în jurul unui focar de inflamație cronică centrat de fir chirurgical. Masson x 200

A

BC

Figură 4.7-20

A.subconjunctival, arie de fibroză cicatricială care înlocuiește țesutul lax subconjunctival. HE x 100. B. Detaliu – aria fibroasă cu proliferare fibrocitară și rare limfocite. HE x 200. C. Benzi de colagen groase, dezorganizate. Gomori x 200

Toxicitate

După administrarea Bevacizumabului subconjunctival prin două injecții la interval de o săptamână și a Pirfenidonei topic de trei ori pe zi pe toată perioada experimentului, nu s-au observat modificări semnificative (hiperemie conjunctivală, chemozis, secreții) la iepurii din loturile II și III la examinarea biomicroscopică comparativ cu lotul martor. Corneea a ramas clară și integră. Irisul a fost normal, fară congestie sau edem.

S-a folosit testul Draize (295) pentru a evalua iritația și toxicitatea suprafeței oculare. S-a administrat o picatură de Pirfenidonă 0,5% (50 microL) în ochiul iepurelui și cu ajutorul biomicroscopului portabil s-a evaluat congestia conjunctivală, opacitatea corneană și congestia iriană. Scorul testului Draize a fost 0 pe toată perioada examinării.

S-au folosit secțiuni colorate cu hematoxilină-eozină și magnificație mare pentru a evalua structurile oculare la iepurii eutanasiati în ziua 28. Motivul pentru care am ales această zi a fost faptul că efectul toxic ar trebui sa fie maxim la sfârșitul studiului comparativ cu orice moment intermediar.

Analiza histologică a arătat că nu există leziuni microscopice ale epiteliului cornean, epiteliului conjunctival, corpului ciliar sau retinei.

Figură 4.7-21 Aspect histologic normal al straturilor corneei în lotul tratat cu Bevacizumab și Pirfenidonă la 28 de zile postoperator. HE x 200

Figură 4.7-22 Aspect histologic normal al epiteliului corpului ciliar în lotul tratat cu Bevacizumab și Pirfenidonă la 28 de zile postoperator. HE x 200

Figură 4.7-23 Aspect histologic normal al retinei în lotul tratat cu Bevacizumab și Pirfenidonă la 28 de zile postoperator, fară evidențierea edemului sau necrozei. HE x 200

Discuții

Cicatrizarea postoperatorie care este responsabilă de eșecul chirurgiei filtrante a glaucomului rămâne o barieră majoră în controlul PIO pe tremen lung și în progresia neuropatiei optice (297),(298),(299).

Succesul chirurgiei filtrante a glaucomului este dependent de procesul de vindecare și implicit de cantitatea de țesut cicatricial nou formată. Prin proliferarea și migrarea fibroblaștilor la nivelul plăgii se produce cicatrizarea și închiderea traiectului fistulei. Molecula de VEGF este esențială în procesul de vindecare. Pe lângă rolul esențial din procesul de angiogeneză, VEGF este un factor de creștere și un mediator cheie în cascada evenimentelor ce au ca finalitate migrarea și proliferarea celulelor inflamatorii și fibroblaștilor (300),(301),(302),(101). Astfel, blocând compusul cu rol central în angiogeneză și reparație tisulară se încearcă întarzierea răspunsului de vindecare. Există de asemenea studii care susțin că agenții anti-VEGF în concentrații mari au un efect inhibitor direct asupra fibroblaștilor umani de la nivelul capsulei Tenon determinând moarte celulară in vitro (303).

Există studii in vitro care dovedesc efectul inhibitor al Pirfenidonei asupra proliferării, migrării fibroblaștilor capsulei Tenon și contracției colagenului (287).

Cercetările pe animale de laborator au demonstrat efectul antifibrotic al Pirfenidonei administrată topic de sase ori pe zi. Deși s-a arătat că Pirfenidona are un efect antifibrotic similar cu al MMC, administrarea topică poate fi mai flexibilă, mai sigură, mai bine tolerată (207) și cu mai puține complicații comparativ cu 5FU și MMC (304),(305),(306).

Este cunoscut faptul că la iepure răspunsul de vindecare este mult mai agresiv și exagerat decât la om, iar eșecul trabeculectomiei se instalează în câteva zile – săptamâni de la operație (145),(307), limitând posibilitatea de a observa o bulă funcțională pe o perioadă de timp rezonabilă.

Studiul experimental din cadrul tezei mele de doctorat este primul studiu în care se asociaza Bevacizumabul și Pirfenidona pentru a crește durata de supraviețuire a trabeculectomiei.

Am decis administrarea BVC la sfârșitul trabeculectomiei și la o săptamâna postoperator știut fiind faptul că etapele procesului de cicatrizare sunt maxime în primele zile postoperator, iar timpul de înjumătățire al BVC din umoarea apoasă este de aproximativ 5 zile după administrare subconjunctivală.

Am decis administrarea Pirfenidonei doar de trei ori pe zi și nu de sase ori cum a fost administrată în alte studii având în vedere o eventuală toxicitate cumulată tinând cont de faptul că am asociat-o cu BVC și de complianța pacienților într-un eventual studiu clinic.

Pe acest model de vindecare accelerată am demonstrat că administrarea Bevacizumabului (anticorp anti-VEGF) și a Pirfenidonei poate să îmbunătățească rezultatele chirurgiei filtrante a glaucomului.

Durata medie de supraviețuire a bulei de filtrare în lotul control a fost de aproximativ 8 zile. Administrarea subconjunctivală de Bevacizumab postoperator la sfârșitul trabeculectomiei și după o săptamână a dublat timpul de supraviețuire a bulei, aceasta fiind mai mare și mai difuză, atât la examinarea clinică cât și la cea histopatologică.

În lotul cu BVC au existat bule de filtrare cu vascularizație crescută dar funcționale. Acest lucru poate fi explicat, pe de o parte, de răspunsul agresiv de vindecare la iepure și, pe de altă parte, de efectul Bevacizumabului în blocarea cascadei de evenimente inflamatorii mediate de VEGF decât de efectul sau antiangiogenic. Absența bulelor avasculare poate fi benefică, având în vedere că bulele subțiri, avasculare, întâlnite frecvent când se folosesc agenți antifibrotici ca MMC sunt asociate cu complicații pe termen lung cum sunt endoftalmita și hipotonia tardivă (308).

Nu s-au observat diferențe ale PIO între loturi. PIO nu este un indicator valid la acest model de chirurgie filtrantă deoarece PIO preoperatorie este în limite normale (299). De asemenea, tonometrul poate să masoare inexact PIO la iepure și poate să subestimeze PIO în unele cazuri (309). Din acest motiv, în acest studiu, durata de supraviețuire a bulei de filtrare a fost considerată ca principal obiectiv.

Având în vedere că acest studiu a arătat că nu există o toxicitate aparentă la nivelul corneei, corpului ciliar și retinei la administrarea topică de Pirfenidonă 0,5% și subconjunctivală de Bevacizumab, această combinație poate fi considerată sigură pentru uz oftalmologic.

Acest model animal are limitări semnificative: numărul mic de animale din fiecare lot; trebuie subliniat că rezultatele unui studiu animal pot să nu fie aplicabile direct pe pacienți umani. Totuși iepurele este un model de bază pentru evaluarea noilor tehnici de chirurgie filtrantă a glaucomului (296).

Deoarece procesul de cicatrizare este multifactorial și foarte complex este necesar un studiu pe termen lung care să analizeze efectul anticicatrizant al combinației Bevacizumab-Pirfenidonă în chirurgia filtrantă a glaucomului, pentru a stabili combinația, doza și frecvența administrării și de asemenea studii pe pacienți umani pentru a întelege utilitatea acestei abordări a procesului de cicatrizare.

Tratamentul cu Bevacizumab si Pirfenidonă îmbunătățeste rezultatul chirurgiei filtrante a glaucomului prin inhibarea angiogenezei în timpul fazei inițiale a vindecării și prin reducerea fibrozei în fazele tardive la modelul animal de cicatrizare agresivă posttrabeculectomie.

Prin urmare, o combinație de agenți care poate reduce cicatrizarea la iepure, e foarte probabil să fie eficientă și la oameni la care în general cicatrizarea nu este așa de agresivă (310).

Concluzii

Administrarea subconjunctivală de Bevacizumab postoperator la sfârșitul trabeculectomiei și după o săptămână a dublat timpul de supraviețuire a bulei de filtrare față de lotul martor, iar adăugarea și de Pirfenidonă topic a crescut supraviețuirea de 2,75 ori față de lotul martor.

S-au observat bule cu suprafață mai mare și mai înalte în grupurile cu BVC și BVC+PFD față de grupul martor.

În ceea ce privește vascularizația bulei, s-a înregistrat o vascularizație mai scăzută în zilele 3-4 și 8-9 postoperator în loturile cu BVC și respectiv cu BVC+PFD, posibil legată de administrarea injecției de Bevacizumab imediat postoperator și în ziua a 7-a postoperator.

PIO nu a fost considerată obiectiv principal, deoarece la acest model animal PIO era normală și înainte de operație. Pentru fiecare grup, PIO a fost scăzută inițial postoperator, apoi a început să creasca ușor.

La nivelul polului anterior s-a constatat un ușor staining punctat superficial tranzitoriu și edem cornean tranzitoriu în zona plăgii în toate grupurile, la câteva animale, fără diferențe între acestea, camera anterioară a fost mică la majoritatea animalelor în prima zi postoperator, apoi s-a adâncit progresiv În ceea ce privește inflamația din camera anterioară, aceasta a fost minimă în toate cele trei loturi.

Analizând complicațiile locale, hifema aparută postiridectomie s-a resorbit în câteva zile și nu s-au observat infecții intraoculare sau cataractă pe perioada studiului în niciunul dintre grupuri.

Examinarea histologică din ziua a14-a a evidențiat la animalele loturilor II și III o reducere a celularității tisulare, a depunerii de colagen comparativ cu lotul martor. În ziua a 28-a s-a observat la lotul martor o dezorganizare a structurii normale a sclerei, cu fibrele colagene cu dispoziție neregulată, în mănunchiuri mai groase față de loturile II și III.

În ceea ce privește vasele de sânge, la lotul martor se constată la 14 zile postoperator vase de sânge numeroase, iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară a scăzut, în schimb lumenele vasculare sunt mai mari, bine formate. În lotul cu BVC+PFD la 14 zile postoperator se constată vase de sânge în număr mai mic, de calibru redus, iar la 28 de zile postoperator densitatea vasculară este tot redusă, dar lumenele vasculare sunt mai mari.

Chiar și după vindecarea plagii sclerale, în ziua a 28-a, se observă reziduuri ale fistulei în lotul III tratat cu BVC+PFD. La animalele sacrificate în ziua a 28-a tesutul cicatricial fibrocelular dens și sclerotomia închisă sunt evidente la lotul martor.

Toxicitatea combinației BVC+PFD, a fost evaluată atat prin examinare biomicroscopică cât și prin analiza histologică. Nu s-au observat modificări semnificative (hiperemie conjunctivală, chemozis, secreții) la iepurii din loturile II și III comparativ cu lotul martor. Corneea a rămas clară și integră. Irisul a fost normal, fără congestie sau edem. Analiza histologică a arătat că nu există leziuni microscopice ale epiteliului cornean, epiteliului conjunctival, corpului ciliar sau retinei.

Pe acest model de vindecare accelerată am demonstrat că administrarea Bevacizumabului (anticorp anti-VEGF) și a Pirfenidonei pot sa imbunătățească rezultatele chirurgiei filtrante a glaucomului.

Studiul experimental din cadrul tezei mele de doctorat este primul studiu în care se asociază Bevacizumabul și Pirfenidona pentru a crește durata de supraviețuire a trabeculectomiei.

Având în vedere că acest studiu a arătat că nu există o toxicitate aparentă la nivelul corneei, corpului ciliar și retinei la administrarea topică de Pirfenidonă 0,5% și subconjunctivală de Bevacizumab, această combinație poate fi considrata sigură pentru uz oftalmologic.

Numărul mic de animale din fiecare lot reprezintă o limitare semnificativă a acestui studiu care nu a permis o analiză statistică a datelor obținute; trebuie subliniat că rezultatele unui studiu animal pot să nu fie aplicabile direct pe pacienți umani. Totuși iepurele este un model de baza pentru evaluarea noilor tehnici de chirurgie filtrantă a glaucomului.

Concluzii generale

Ratele de succes complet sunt ridicate în cazul ambelor grupuri, cu un ușor plus în cazul grupului control (94,3%) față de grupul martor (83,33%), însă diferența nu este una semnificativă statistic (p=0,156).

Referitor la PIO, putem spune că nu există diferențe semnificative între cele două grupuri în ceea ce privește presiunea intraoculară, indiferent de momentul măsurării acesteia. Exista diferență semnificativă statistic între valorile medii ale PIO preoperator și valorile medii ale PIO postoperator în orice moment.

În cazul medicației antiglaucomatoase, se observă diferențe semnificative statistic între numărul medicamentelor administrate preoperator și numărul acestora administrate postoperator, atât raportate la întregul eșantion studiat, cât și raportate la fiecare lot în parte.

Evaluarea morfologică a bulei de filtrare a arătat că diferența privitoare la înălțimea, suprafața bulei de filtrare și difuziunea umorii apoase nu este semnificativă statistic între cele două grupuri; în schimb există diferență semnificativă statistic în ceea ce privește vascularizația bulei de filtrare.

Întrucât nu există o modalitate unica recomandată și acceptată de administrare a tratamentului anti-VEGF în chirurgia glaucomului, consider că studiul din cadrul tezei de doctorat, deși nu a adus date clare și suficiente care să susțină utilizarea terapiei adiționale cu Bevacizumab în chirurgia glaucomului a ridicat noi întrebări și a deschis noi drumuri de cercetat.

Identificarea și înregistrarea modificărilor clinice pe care le produce Bevacizumabul asupra PIO și bulei de filtrare pe termen lung pot să ofere informații asupra eficienței și siguranței acestui preparat în chirurgia glaucomului.

Deși nu există suficiente dovezi care să sustina faptul ca pacienții glaucomatoși sunt mai expuși reacțiilor adverse ale agenților anti-VEGF, utilizarea tot mai frecventă a acestora în terapia glaucomului trebuie să fie realizată in condiții de maximă siguranță.

Limitele acestui studiu au fost date de numărul relativ redus de pacienți înrolati, fiind necesară urmărirea unor pacienți suplimentari care să urmeze același regim terapeutic pentru a avea rezultate și mai semnificative statistic.

Avantajele acestui studiu clinic sunt faptul că regimul terapeutic aplicat nu este toxic cornean, complicațiile locale au fost minime și nu au apărut complicații sistemice.

Din componenta experimentală, prin cercetarea diferențelor între loturile de studiu la nivel microscopic, se pot trage concluzii care să explice și să susțină componenta clinică.

Deoarece procesul de cicatrizare este multifactorial și foarte complex în studiul meu doctoral, folosind combinația Bevacizumab-Pirfenidonă, am încercat să descopar o modalitate de a încetini cât mai mult un proces natural de vindecare, contribuind la cercetările privind noi terapii ale glaucomului refractar.

Tratamentul cu Bevacizumab și Pirfenidonă îmbunătățește rezultatul chirurgiei filtrante a glaucomului prin inhibarea angiogenezei în timpul fazei inițiale a vindecării și prin reducerea fibrozei în fazele tardive la modelul animal de cicatrizare agresivă posttrabeculectomie.

Este necesar un studiu pe termen lung care să analizeze efectul anticicatrizant al combinației Bevacizumab-Pirfenidonă in chirurgia filtrantă a glaucomului, pentru a stabili combinația, doza și frecvența administrării și de asemenea studii pe pacienți umani pentru a întelege utilitatea acestei abordări a procesului de cicatrizare.

Prin urmare, o combinație de agenți care poate reduce cicatrizarea la iepure, e foarte probabil să fie eficientă și la oameni la care în general cicatrizarea nu este așa de agresivă.

Bibliografie

1. Dumitrache M. Tratat de oftalmologie. București: Editura Universitară “Carol Davila”; 2005.

2. Poukens V, Glasgow BJ, Demer JL. Nonvascular contractile cells in sclera and choroid of humans and monkeys. Investigative ophthalmology & visual science. 1998;39(10):1765-74. Epub 1998/09/04.

3. American Academy of Ophthalmology. External disease and cornea. San Francisco, Calif.: American Academy of Ophthalmology; 2011. xvi, 512 p. p.

4. American Academy of Ophthalmology. Refractive Management/Intervention Panel. Refractive errors & refractive surgery. San Francisco, CA: The Academy; 2007. 70 p. p.

5. Cernea P, Vladuțiu C. Tratat de oftalmologie. Editura Medicală, București. 1997.

6. Dumitrache M, Anitescu M, Gheorghe L. [The morphological substrate and histogenesis of systemic and ocular atherosclerosis]. Oftalmologia. 1995;39(1):11-7. Epub 1995/01/01. Substratul morfologic și histogeneza aterosclerozei sistemice și oculare.

7. Bill A, Sperber G, Ujiie K. Physiology of the choroidal vascular bed. International ophthalmology. 1983;6(2):101-7. Epub 1983/02/01.

8. Hayreh SS. In vivo choroidal circulation and its watershed zones. Eye (Lond). 1990;4 ( Pt 2):273-89. Epub 1990/01/01.

9. Yanoff M, Fine BS. Ocular pathology. 5th ed. Philadelphia: Mosby; 2002. xxi, 701 p. p.

10. Castro-Correia J. Understanding the choroid. International ophthalmology. 1995;19(3):135-47. Epub 1995/01/01.

11. Hogan MJ, Alvarado JA, Weddell JE. Histology of the human eye; an atlas and textbook. Philadelphia,: Saunders; 1971. xiii, 687 p. p.

12. Tamm ER. The trabecular meshwork outflow pathways: structural and functional aspects. Experimental eye research. 2009;88(4):648-55. Epub 2009/02/26.

13. Smelser GK. Electron microscopy of a typical epithelial cell and of the normal human ciliary process. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 1966;70(5):738-54. Epub 1966/09/01.

14. Brubaker RF, Nagataki S, Townsend DJ, Burns RR, Higgins RG, Wentworth W. The effect of age on aqueous humor formation in man. Ophthalmology. 1981;88(3):283-8. Epub 1981/03/01.

15. Aiello AL, Tran VT, Rao NA. Postnatal development of the ciliary body and pars plana. A morphometric study in childhood. Archives of ophthalmology. 1992;110(6):802-5. Epub 1992/06/01.

16. Becker B, Shaffer RN, Stamper RL, Lieberman MF, Drake MV. Becker-Shaffer's diagnosis and therapy of the glaucomas. 7th ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 1999. xv, 716 p. p.

17. Dumitrache M. Tratat de oftalmologie. București: Editura Universitară “Carol Davila”; 2004.

18. Dumitrache M, Anitescu M, Carstocea B. [Laser treatment in diabetic retinopathy]. Oftalmologia. 1995;39(2):159-69. Epub 1995/04/01. Tratamentul laser in retinopatia diabetica.

19. Harman A, Abrahams B, Moore S, Hoskins R. Neuronal density in the human retinal ganglion cell layer from 16-77 years. The Anatomical record. 2000;260(2):124-31. Epub 2000/09/20.

20. Kanski JJ. Clinical ophthalmology : a systematic approach. 6th ed. Edinburgh ; New York: Butterworth-Heinemann/Elsevier; 2007. vii, 931 p. p.

21. Sihota R, Goyal A, Kaur J, Gupta V, Nag TC. Scanning electron microscopy of the trabecular meshwork: understanding the pathogenesis of primary angle closure glaucoma. Indian journal of ophthalmology. 2012;60(3):183-8. Epub 2012/05/10.

22. Llobet A, Gasull X, Gual A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure? News in physiological sciences : an international journal of physiology produced jointly by the International Union of Physiological Sciences and the American Physiological Society. 2003;18:205-9. Epub 2003/09/23.

23. Bill A, Lutjen-Drecoll E, Svedbergh B. Effects of intracameral Na2EDTA and EGTA on aqueous outflow routes in the monkey eye. Investigative ophthalmology & visual science. 1980;19(5):492-504. Epub 1980/05/01.

24. Eriksson A, Svedbergh B. Transcellular aqueous humor outflow: a theoretical and experimental study. Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie Albrecht von Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 1980;212(3-4):187-97. Epub 1980/01/01.

25. Sellheyer K, Spitznas M. Ultrastructural observations on the development of the human conjunctival epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 1988;226(5):489-99.

26. Steuhl K-P. Ultrastructure of the conjunctival epithelium. Developments in ophthalmology. 1988;19:1-104.

27. Potop V, Dumitrache M. [Principles of treatment in ocular burns regarding the ocular surface and limbal stem cells]. Oftalmologia. 2005;49(2):27-34. Epub 2005/10/26. Principii de tratament ale arsurilor oculare in lumina conceptului de suprafata oculara și celule stem limbice.

28. Watson PG, Young RD. Scleral structure, organisation and disease. A review. Experimental eye research. 2004;78(3):609-23.

29. Bill A. Aqueous humor dynamics in monkeys (Macaca irus and Cercopithecus ethiops). Experimental eye research. 1971;11(2):195-206. Epub 1971/03/01.

30. Brubaker RF. Flow of aqueous humor in humans [The Friedenwald Lecture]. Investigative ophthalmology & visual science. 1991;32(13):3145-66. Epub 1991/12/01.

31. Epstein DL, Rohen JW. Morphology of the trabecular meshwork and inner-wall endothelium after cationized ferritin perfusion in the monkey eye. Investigative ophthalmology & visual science. 1991;32(1):160-71. Epub 1991/01/01.

32. Maepea O, Bill A. The pressures in the episcleral veins, Schlemm's canal and the trabecular meshwork in monkeys: effects of changes in intraocular pressure. Experimental eye research. 1989;49(4):645-63. Epub 1989/10/01.

33. Maepea O, Bill A. Pressures in the juxtacanalicular tissue and Schlemm's canal in monkeys. Experimental eye research. 1992;54(6):879-83. Epub 1992/06/01.

34. Beuerman RW, Pedroza L. Ultrastructure of the human cornea. Microsc Res Tech. 1996;33(4):320-35. Epub 1996/03/01.

35. Doughty MJ, Seabert W, Bergmanson JP, Blocker Y. A descriptive and quantitative study of the keratocytes of the corneal stroma of albino rabbits using transmission electron microscopy. Tissue Cell. 2001;33(4):408-22. Epub 2001/08/28.

36. Doughty MJ, Bergmanson JP. Collagen fibril characteristics at the corneo-scleral boundary and rabbit corneal stromal swelling. Clinical & experimental optometry : journal of the Australian Optometrical Association. 2004;87(2):81-92. Epub 2004/03/26.

37. Rada JA, Achen VR, Perry CA, Fox PW. Proteoglycans in the human sclera. Evidence for the presence of aggrecan. Investigative ophthalmology & visual science. 1997;38(9):1740-51. Epub 1997/08/01.

38. Ronald C. Gentile M, David C. Ritterband, MD, Anaïs L. Carniciu. Corneal Abrasions: Managing a Commonly Occurring Injury2014.

39. Yanoff M, Duker JS, Augsburger JJ. Ophthalmology. 2nd ed. St. Louis, MO: Mosby; 2004. xxii, 1652 p. p.

40. Tasman W, Jaeger EA. Duane's Ophthalmology: ARVO; 2007.

41. Freegard TJ. The physical basis of transparency of the normal cornea. Eye (Lond). 1997;11 ( Pt 4):465-71. Epub 1997/01/01.

42. Gipson IK. Adhesive mechanisms of the corneal epithelium. Acta Ophthalmol Suppl. 1992(202):13-7. Epub 1992/01/01.

43. Freund DE, McCally RL, Farrell RA, Cristol SM, L'Hernault NL, Edelhauser HF. Ultrastructure in anterior and posterior stroma of perfused human and rabbit corneas. Relation to transparency. Investigative ophthalmology & visual science. 1995;36(8):1508-23. Epub 1995/07/01.

44. Patel S, Marshall J, Fitzke FW, 3rd. Refractive index of the human corneal epithelium and stroma. J Refract Surg. 1995;11(2):100-5. Epub 1995/03/01.

45. Komai Y, Ushiki T. The three-dimensional organization of collagen fibrils in the human cornea and sclera. Investigative ophthalmology & visual science. 1991;32(8):2244-58. Epub 1991/07/01.

46. Dua HS, Faraj LA, Said DG, Gray T, Lowe J. Human Corneal Anatomy Redefined: A Novel Pre-Descemet's Layer (Dua's Layer). Ophthalmology. 2013;120(9):1778-85. Epub 2013/05/30.

47. DelMonte DW, Kim T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of cataract and refractive surgery. 2011;37(3):588-98. Epub 2011/02/22.

48. Murphy C, Alvarado J, Juster R, Maglio M. Prenatal and postnatal cellularity of the human corneal endothelium. A quantitative histologic study. Investigative ophthalmology & visual science. 1984;25(3):312-22. Epub 1984/03/01.

49. Albert DM, Jakobiec FA. Principles and practice of ophthalmology: WB Saunders Co; 2000.

50. Tuft SJ, Coster DJ. The corneal endothelium. Eye (Lond). 1990;4 ( Pt 3):389-424. Epub 1990/01/01.

51. Dua HS, Saini JS, Azuara-Blanco A, Gupta P. Limbal stem cell deficiency: concept, aetiology, clinical presentation, diagnosis and management. Indian journal of ophthalmology. 2000;48(2):83-92. Epub 2000/12/16.

52. Kulkarni BB, Tighe PJ, Mohammed I, Yeung AM, Powe DG, Hopkinson A, et al. Comparative transcriptional profiling of the limbal epithelial crypt demonstrates its putative stem cell niche characteristics. BMC Genomics. 2010;11:526. Epub 2010/10/06.

53. Branch MJ, Hashmani K, Dhillon P, Jones DR, Dua HS, Hopkinson A. Mesenchymal stem cells in the human corneal limbal stroma. Investigative ophthalmology & visual science. 2012;53(9):5109-16. Epub 2012/06/28.

54. Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular vision. 2008;14:431-42. Epub 2008/03/13.

55. Hoar RM. Embryology of the eye. Environ Health Perspect. 1982;44:31-4. Epub 1982/04/01.

56. Poole CA, Brookes NH, Clover GM. Keratocyte networks visualised in the living cornea using vital dyes. Journal of cell science. 1993;106 ( Pt 2):685-91. Epub 1993/10/01.

57. Ueda A, Nishida T, Otori T, Fujita H. Electron-microscopic studies on the presence of gap junctions between corneal fibroblasts in rabbits. Cell Tissue Res. 1987;249(2):473-5. Epub 1987/08/01.

58. West-Mays JA, Dwivedi DJ. The keratocyte: corneal stromal cell with variable repair phenotypes. The international journal of biochemistry & cell biology. 2006;38(10):1625-31. Epub 2006/05/06.

59. Marshall GE, Konstas AG, Lee WR. Immunogold fine structural localization of extracellular matrix components in aged human cornea. II. Collagen types V and VI. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 1991;229(2):164-71. Epub 1991/01/01.

60. Chakravarti S, Petroll WM, Hassell JR, Jester JV, Lass JH, Paul J, et al. Corneal opacity in lumican-null mice: defects in collagen fibril structure and packing in the posterior stroma. Investigative ophthalmology & visual science. 2000;41(11):3365-73. Epub 2000/09/28.

61. Meek KM, Boote C. The organization of collagen in the corneal stroma. Experimental eye research. 2004;78(3):503-12. Epub 2004/04/27.

62. Michelacci YM. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix. Braz J Med Biol Res. 2003;36(8):1037-46. Epub 2003/07/30.

63. Fini ME, Stramer BM. How the cornea heals: cornea-specific repair mechanisms affecting surgical outcomes. Cornea. 2005;24(8 Suppl):S2-S11. Epub 2005/10/18.

64. Freddo TF. Ultrastructure of the iris. Microsc Res Tech. 1996;33(5):369-89. Epub 1996/04/01.

65. Imesch PD, Wallow IH, Albert DM. The color of the human eye: a review of morphologic correlates and of some conditions that affect iridial pigmentation. Survey of ophthalmology. 1997;41 Suppl 2:S117-23. Epub 1997/02/01.

66. Eagle RC, Jr. Iris pigmentation and pigmented lesions: an ultrastructural study. Transactions of the American Ophthalmological Society. 1988;86:581-687. Epub 1988/01/01.

67. Do CW, Civan MM. Basis of chloride transport in ciliary epithelium. J Membr Biol. 2004;200(1):1-13. Epub 2004/09/24.

68. Goel R, Murthy KR, Srikanth SM, Pinto SM, Bhattacharjee M, Kelkar DS, et al. Characterizing the normal proteome of human ciliary body. Clin Proteomics. 2013;10(1):9. Epub 2013/08/07.

69. Delamere NA. Ciliary Body and Ciliary Epithelium. Adv Organ Biol. 2005;10:127-48. Epub 2005/01/01.

70. Lee SC, Lee I, Koh HJ, Kim SH, Kwon OW. Massive suprachoroidal hemorrhage with retinal and vitreous incarceration; a vitreoretinal surgical approach. Korean J Ophthalmol. 2000;14(1):41-4. Epub 2000/08/10.

71. Hollenberg MJ, Burt WL. The fine structure of Bruch's membrane in the human eye. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 1969;4(3):296-306. Epub 1969/07/01.

72. Curcio CA, Allen KA. Topography of ganglion cells in human retina. The Journal of comparative neurology. 1990;300(1):5-25. Epub 1990/10/01.

73. Gariano RF. Cellular mechanisms in retinal vascular development. Progress in retinal and eye research. 2003;22(3):295-306. Epub 2003/07/11.

74. Fruttiger M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative ophthalmology & visual science. 2002;43(2):522-7. Epub 2002/01/31.

75. Provis JM, Leech J, Diaz CM, Penfold PL, Stone J, Keshet E. Development of the human retinal vasculature: cellular relations and VEGF expression. Experimental eye research. 1997;65(4):555-68. Epub 1998/02/17.

76. Stalmans I, Ng YS, Rohan R, Fruttiger M, Bouche A, Yuce A, et al. Arteriolar and venular patterning in retinas of mice selectively expressing VEGF isoforms. The Journal of clinical investigation. 2002;109(3):327-36. Epub 2002/02/06.

77. Chan-Ling T, McLeod DS, Hughes S, Baxter L, Chu Y, Hasegawa T, et al. Astrocyte-endothelial cell relationships during human retinal vascular development. Investigative ophthalmology & visual science. 2004;45(6):2020-32. Epub 2004/05/27.

78. Uemura A, Ogawa M, Hirashima M, Fujiwara T, Koyama S, Takagi H, et al. Recombinant angiopoietin-1 restores higher-order architecture of growing blood vessels in mice in the absence of mural cells. The Journal of clinical investigation. 2002;110(11):1619-28. Epub 2002/12/05.

79. Campochiaro PA, Hackett SF. Ocular neovascularization: a valuable model system. Oncogene. 2003;22(42):6537-48. Epub 2003/10/07.

80. Yamada H, Yamada E, Kwak N, Ando A, Suzuki A, Esumi N, et al. Cell injury unmasks a latent proangiogenic phenotype in mice with increased expression of FGF2 in the retina. Journal of cellular physiology. 2000;185(1):135-42. Epub 2000/08/15.

81. Zubilewicz A, Hecquet C, Jeanny JC, Soubrane G, Courtois Y, Mascarelli F. Two distinct signalling pathways are involved in FGF2-stimulated proliferation of choriocapillary endothelial cells: a comparative study with VEGF. Oncogene. 2001;20(12):1403-13. Epub 2001/04/21.

82. Chen S, Li H, Gaudenz K, Paulson A, Guo F, Trimble R, et al. Defective FGF signaling causes coloboma formation and disrupts retinal neurogenesis. Cell research. 2013;23(2):254-73. Epub 2012/11/14.

83. Martin G, Schlunck G, Hansen LL, Agostini HT. Differential expression of angioregulatory factors in normal and CNV-derived human retinal pigment epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2004;242(4):321-6. Epub 2004/01/15.

84. Matsushima M, Ogata N, Takada Y, Tobe T, Yamada H, Takahashi K, et al. FGF receptor 1 expression in experimental choroidal neovascularization. Japanese journal of ophthalmology. 1996;40(3):329-38. Epub 1996/01/01.

85. Tung JJ, Tattersall IW, Kitajewski J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2012;2(2):a006601. Epub 2012/02/23.

86. Melo SA, Kalluri R. Angiogenesis is controlled by miR-27b associated with endothelial tip cells. Blood. 2012;119(11):2439-40. Epub 2012/03/17.

87. Fantin A, Vieira JM, Plein A, Denti L, Fruttiger M, Pollard JW, et al. NRP1 acts cell autonomously in endothelium to promote tip cell function during sprouting angiogenesis. Blood. 2013;121(12):2352-62. Epub 2013/01/15.

88. Adams RH, Eichmann A. Axon guidance molecules in vascular patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(5):a001875. Epub 2010/05/11.

89. Gerhardt H, Golding M, Fruttiger M, Ruhrberg C, Lundkvist A, Abramsson A, et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. The Journal of cell biology. 2003;161(6):1163-77. Epub 2003/06/18.

90. Cullen M, Elzarrad MK, Seaman S, Zudaire E, Stevens J, Yang MY, et al. GPR124, an orphan G protein-coupled receptor, is required for CNS-specific vascularization and establishment of the blood-brain barrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011;108(14):5759-64. Epub 2011/03/23.

91. teicher B, Ellis, LM. Antiangiogenic agents in cancer therapy. second edition ed.

92. Ding BS, Nolan DJ, Butler JM, James D, Babazadeh AO, Rosenwaks Z, et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 2010;468(7321):310-5. Epub 2010/11/12.

93. Robinson CJ, Stringer SE. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. Journal of cell science. 2001;114(Pt 5):853-65. Epub 2001/02/22.

94. Levy AP, Levy NS, Wegner S, Goldberg MA. Transcriptional regulation of the rat vascular endothelial growth factor gene by hypoxia. The Journal of biological chemistry. 1995;270(22):13333-40. Epub 1995/06/02.

95. Abiko T, Abiko A, Clermont AC, Shoelson B, Horio N, Takahashi J, et al. Characterization of retinal leukostasis and hemodynamics in insulin resistance and diabetes: role of oxidants and protein kinase-C activation. Diabetes. 2003;52(3):829-37. Epub 2003/02/28.

96. Levy NS, Chung S, Furneaux H, Levy AP. Hypoxic stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by the RNA-binding protein HuR. The Journal of biological chemistry. 1998;273(11):6417-23. Epub 1998/04/16.

97. Gille H, Kowalski J, Li B, LeCouter J, Moffat B, Zioncheck TF, et al. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1 (VEGFR-1) and KDR (VEGFR-2). A reassessment using novel receptor-specific vascular endothelial growth factor mutants. The Journal of biological chemistry. 2001;276(5):3222-30. Epub 2000/11/04.

98. Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. The Journal of biological chemistry. 1998;273(46):30336-43. Epub 1998/11/07.

99. Kennedy SG, Wagner AJ, Conzen SD, Jordan J, Bellacosa A, Tsichlis PN, et al. The PI 3-kinase/Akt signaling pathway delivers an anti-apoptotic signal. Genes & development. 1997;11(6):701-13. Epub 1997/03/15.

100. Beddy D, Watson RW, Fitzpatrick JM, O'Connell PR. Increased vascular endothelial growth factor production in fibroblasts isolated from strictures in patients with Crohn's disease. The British journal of surgery. 2004;91(1):72-7. Epub 2004/01/13.

101. Wilgus TA, Ferreira AM, Oberyszyn TM, Bergdall VK, Dipietro LA. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2008;88(6):579-90. Epub 2008/04/23.

102. Colwell AS, Beanes SR, Soo C, Dang C, Ting K, Longaker MT, et al. Increased angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor during scarless repair. Plastic and reconstructive surgery. 2005;115(1):204-12. Epub 2004/12/29.

103. Li Z, Van Bergen T, Van de Veire S, Van de Vel I, Moreau H, Dewerchin M, et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor reduces scar formation after glaucoma filtration surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(11):5217-25. Epub 2009/05/29.

104. Aiello LP, Avery RL, Arrigg PG, Keyt BA, Jampel HD, Shah ST, et al. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic retinopathy and other retinal disorders. The New England journal of medicine. 1994;331(22):1480-7. Epub 1994/12/01.

105. Hu DN, Ritch R, Liebmann J, Liu Y, Cheng B, Hu MS. Vascular endothelial growth factor is increased in aqueous humor of glaucomatous eyes. Journal of glaucoma. 2002;11(5):406-10. Epub 2002/10/04.

106. Nissen NN, Polverini PJ, Koch AE, Volin MV, Gamelli RL, DiPietro LA. Vascular endothelial growth factor mediates angiogenic activity during the proliferative phase of wound healing. The American journal of pathology. 1998;152(6):1445-52. Epub 1998/06/17.

107. Cedrone C, Nucci C, Scuderi G, Ricci F, Cerulli A, Culasso F. Prevalence of blindness and low vision in an Italian population: a comparison with other European studies. Eye (Lond). 2006;20(6):661-7. Epub 2005/05/28.

108. Tielsch JM, Katz J, Singh K, Quigley HA, Gottsch JD, Javitt J, et al. A population-based evaluation of glaucoma screening: the Baltimore Eye Survey. American journal of epidemiology. 1991;134(10):1102-10. Epub 1991/11/15.

109. Martus P, Stroux A, Budde WM, Mardin CY, Korth M, Jonas JB. Predictive factors for progressive optic nerve damage in various types of chronic open-angle glaucoma. American journal of ophthalmology. 2005;139(6):999-1009. Epub 2005/06/15.

110. Quigley HA, Jampel HD. How are glaucoma patients identified? Journal of glaucoma. 2003;12(6):451-5. Epub 2003/12/04.

111. Medeiros FA, Zangwill LM, Bowd C, Weinreb RN. Comparison of the GDx VCC scanning laser polarimeter, HRT II confocal scanning laser ophthalmoscope, and stratus OCT optical coherence tomograph for the detection of glaucoma. Archives of ophthalmology. 2004;122(6):827-37. Epub 2004/06/16.

112. Wollstein G, Garway-Heath DF, Fontana L, Hitchings RA. Identifying early glaucomatous changes. Comparison between expert clinical assessment of optic disc photographs and confocal scanning ophthalmoscopy. Ophthalmology. 2000;107(12):2272-7. Epub 2000/11/30.

113. Strouthidis NG, Garway-Heath DF. New developments in Heidelberg retina tomograph for glaucoma. Current opinion in ophthalmology. 2008;19(2):141-8. Epub 2008/02/28.

114. Medeiros FA, Alencar LM, Zangwill LM, Bowd C, Vizzeri G, Sample PA, et al. Detection of progressive retinal nerve fiber layer loss in glaucoma using scanning laser polarimetry with variable corneal compensation. Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(4):1675-81. Epub 2008/11/26.

115. Vizzeri G, Bowd C, Medeiros FA, Weinreb RN, Zangwill LM. Effect of improper scan alignment on retinal nerve fiber layer thickness measurements using Stratus optical coherence tomograph. Journal of glaucoma. 2008;17(5):341-9. Epub 2008/08/16.

116. Chang R, Budenz DL. New developments in optical coherence tomography for glaucoma. Current opinion in ophthalmology. 2008;19(2):127-35. Epub 2008/02/28.

117. Lemij HG, Reus NJ. New developments in scanning laser polarimetry for glaucoma. Current opinion in ophthalmology. 2008;19(2):136-40. Epub 2008/02/28.

118. Greenfield DS, Weinreb RN. Role of optic nerve imaging in glaucoma clinical practice and clinical trials. American journal of ophthalmology. 2008;145(4):598-603. Epub 2008/02/26.

119. Bengtsson B, Heijl A. Diagnostic sensitivity of fast blue-yellow and standard automated perimetry in early glaucoma: a comparison between different test programs. Ophthalmology. 2006;113(7):1092-7. Epub 2006/07/04.

120. Shah NN, Bowd C, Medeiros FA, Weinreb RN, Sample PA, Hoffmann EM, et al. Combining structural and functional testing for detection of glaucoma. Ophthalmology. 2006;113(9):1593-602. Epub 2006/09/05.

121. Sample PA, Medeiros FA, Racette L, Pascual JP, Boden C, Zangwill LM, et al. Identifying glaucomatous vision loss with visual-function-specific perimetry in the diagnostic innovations in glaucoma study. Investigative ophthalmology & visual science. 2006;47(8):3381-9. Epub 2006/08/01.

122. Society EG. Terminology and Guidelines for Glaucomafourd edition.

123. Leske MC, Heijl A, Hyman L, Bengtsson B, Dong L, Yang Z. Predictors of long-term progression in the early manifest glaucoma trial. Ophthalmology. 2007;114(11):1965-72. Epub 2007/07/14.

124. Heijl A, Leske MC, Bengtsson B, Hyman L, Hussein M. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Archives of ophthalmology. 2002;120(10):1268-79. Epub 2002/10/09.

125. van der Valk R, Webers CA, Schouten JS, Zeegers MP, Hendrikse F, Prins MH. Intraocular pressure-lowering effects of all commonly used glaucoma drugs: a meta-analysis of randomized clinical trials. Ophthalmology. 2005;112(7):1177-85. Epub 2005/06/01.

126. Stewart WC, Jenkins JN. Predictive value of the efficacy of glaucoma medications in regulatory trials: Phase I-III to post-marketing studies. Eye (Lond). 2008;22(8):985-8. Epub 2007/06/23.

127. Denis P, Lafuma A, Khoshnood B, Mimaud V, Berdeaux G. A meta-analysis of topical prostaglandin analogues intra-ocular pressure lowering in glaucoma therapy. Current medical research and opinion. 2007;23(3):601-8. Epub 2007/03/16.

128. Stamper RL, Wigginton SA, Higginbotham EJ. Primary drug treatment for glaucoma: beta-blockers versus other medications. Survey of ophthalmology. 2002;47(1):63-73. Epub 2002/01/22.

129. Sherwood MB, Craven ER, Chou C, DuBiner HB, Batoosingh AL, Schiffman RM, et al. Twice-daily 0.2% brimonidine-0.5% timolol fixed-combination therapy vs monotherapy with timolol or brimonidine in patients with glaucoma or ocular hypertension: a 12-month randomized trial. Archives of ophthalmology. 2006;124(9):1230-8. Epub 2006/09/13.

130. Konstas AG, Katsimpris IE, Kaltsos K, Georgiadou I, Kordelou A, Nelson LA, et al. Twenty-four-hour efficacy of the brimonidine/timolol fixed combination versus therapy with the unfixed components. Eye (Lond). 2008;22(11):1391-7. Epub 2007/06/16.

131. Pfeiffer N. A comparison of the fixed combination of latanoprost and timolol with its individual components. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2002;240(11):893-9. Epub 2002/12/18.

132. Stein JD, Challa P. Mechanisms of action and efficacy of argon laser trabeculoplasty and selective laser trabeculoplasty. Current opinion in ophthalmology. 2007;18(2):140-5. Epub 2007/02/16.

133. Rolim de Moura C, Paranhos A, Jr., Wormald R. Laser trabeculoplasty for open angle glaucoma. The Cochrane database of systematic reviews. 2007(4):CD003919. Epub 2007/10/19.

134. Shaarawy T, Karlen M, Schnyder C, Achache F, Sanchez E, Mermoud A. Five-year results of deep sclerectomy with collagen implant. Journal of cataract and refractive surgery. 2001;27(11):1770-8. Epub 2001/11/16.

135. Cairns JE. Trabeculectomy. Preliminary report of a new method. American journal of ophthalmology. 1968;66(4):673-9. Epub 1968/10/01.

136. Stalmans I, Gillis A, Lafaut AS, Zeyen T. Safe trabeculectomy technique: long term outcome. The British journal of ophthalmology. 2006;90(1):44-7. Epub 2005/12/20.

137. Marquardt D, Lieb WE, Grehn F. Intensified postoperative care versus conventional follow-up: a retrospective long-term analysis of 177 trabeculectomies. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2004;242(2):106-13. Epub 2003/12/03.

138. Addicks EM, Quigley HA, Green WR, Robin AL. Histologic characteristics of filtering blebs in glaucomatous eyes. Archives of ophthalmology. 1983;101(5):795-8. Epub 1983/05/01.

139. The Advanced Glaucoma Intervention Study: 8. Risk of cataract formation after trabeculectomy. Archives of ophthalmology. 2001;119(12):1771-9. Epub 2001/12/26.

140. Dvorak HF. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 1986;315(26):1650-9. Epub 1986/12/25.

141. Skuta GL, Parrish RK, 2nd. Wound healing in glaucoma filtering surgery. Survey of ophthalmology. 1987;32(3):149-70. Epub 1987/11/01.

142. Desjardins DC, Parrish RK, 2nd, Folberg R, Nevarez J, Heuer DK, Gressel MG. Wound healing after filtering surgery in owl monkeys. Archives of ophthalmology. 1986;104(12):1835-9. Epub 1986/12/01.

143. Grierson I, Joseph J, Miller M, Day JE. Wound repair: the fibroblast and the inhibition of scar formation. Eye (Lond). 1988;2 ( Pt 2):135-48. Epub 1988/01/01.

144. Reichel MB, Cordeiro MF, Alexander RA, Cree IA, Bhattacharya SS, Khaw PT. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. The British journal of ophthalmology. 1998;82(9):1072-7. Epub 1999/01/20.

145. Miller MH, Grierson I, Unger WI, Hitchings RA. Wound healing in an animal model of glaucoma fistulizing surgery in the rabbit. Ophthalmic surgery. 1989;20(5):350-7. Epub 1989/05/01.

146. Chang L, Crowston JG, Cordeiro MF, Akbar AN, Khaw PT. The role of the immune system in conjunctival wound healing after glaucoma surgery. Survey of ophthalmology. 2000;45(1):49-68. Epub 2000/08/18.

147. Wipff PJ, Rifkin DB, Meister JJ, Hinz B. Myofibroblast contraction activates latent TGF-beta1 from the extracellular matrix. The Journal of cell biology. 2007;179(6):1311-23. Epub 2007/12/19.

148. Sherwood MB. A sequential, multiple-treatment, targeted approach to reduce wound healing and failure of glaucoma filtration surgery in a rabbit model (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 2006;104:478-92. Epub 2007/05/02.

149. Meyer-ter-Vehn T, Sieprath S, Katzenberger B, Gebhardt S, Grehn F, Schlunck G. Contractility as a prerequisite for TGF-beta-induced myofibroblast transdifferentiation in human tenon fibroblasts. Investigative ophthalmology & visual science. 2006;47(11):4895-904. Epub 2006/10/27.

150. Chintala SK, Wang N, Diskin S, Mattox C, Kagemann L, Fini ME, et al. Matrix metalloproteinase gelatinase B (MMP-9) is associated with leaking glaucoma filtering blebs. Experimental eye research. 2005;81(4):429-36. Epub 2005/09/28.

151. Gabbiani G, Ryan GB, Majne G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 1971;27(5):549-50. Epub 1971/05/15.

152. Desmouliere A, Geinoz A, Gabbiani F, Gabbiani G. Transforming growth factor-beta 1 induces alpha-smooth muscle actin expression in granulation tissue myofibroblasts and in quiescent and growing cultured fibroblasts. The Journal of cell biology. 1993;122(1):103-11. Epub 1993/07/01.

153. Serini G, Gabbiani G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Experimental cell research. 1999;250(2):273-83. Epub 1999/07/22.

154. Ross R, Raines EW, Bowen-Pope DF. The biology of platelet-derived growth factor. Cell. 1986;46(2):155-69. Epub 1986/07/18.

155. Maumenee AE. External filtering operations for glaucoma: the mechanism of function and failure. Transactions of the American Ophthalmological Society. 1960;58:319-28. Epub 1960/01/01.

156. Starita RJ, Fellman RL, Spaeth GL, Poryzees EM, Greenidge KC, Traverso CE. Short- and long-term effects of postoperative corticosteroids on trabeculectomy. Ophthalmology. 1985;92(7):938-46. Epub 1985/07/01.

157. Lama PJ, Fechtner RD. Antifibrotics and wound healing in glaucoma surgery. Survey of ophthalmology. 2003;48(3):314-46. Epub 2003/05/15.

158. Nguyen KD, Lee DA. Effect of steroids and nonsteroidal antiinflammatory agents on human ocular fibroblast. Investigative ophthalmology & visual science. 1992;33(9):2693-701. Epub 1992/08/01.

159. Hosseini H, Mehryar M, Farvardin M. Focus on triamcinolone acetonide as an adjunct to glaucoma filtration surgery. Medical hypotheses. 2007;68(2):401-3. Epub 2006/08/22.

160. Tham CC, Li FC, Leung DY, Kwong YY, Yick DW, Chi CC, et al. Intrableb triamcinolone acetonide injection after bleb-forming filtration surgery (trabeculectomy, phacotrabeculectomy, and trabeculectomy revision by needling): a pilot study. Eye (Lond). 2006;20(12):1484-6. Epub 2006/05/13.

161. Yuki K, Shiba D, Kimura I, Ohtake Y, Tsubota K. Trabeculectomy with or without intraoperative sub-tenon injection of triamcinolone acetonide in treating secondary glaucoma. American journal of ophthalmology. 2009;147(6):1055-60, 60 e1-2. Epub 2009/03/31.

162. Baudouin C, Nordmann JP, Denis P, Creuzot-Garcher C, Allaire C, Trinquand C. Efficacy of indomethacin 0.1% and fluorometholone 0.1% on conjunctival inflammation following chronic application of antiglaucomatous drugs. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2002;240(11):929-35. Epub 2002/12/18.

163. Breusegem C, Spielberg L, Van Ginderdeuren R, Vandewalle E, Renier C, Van de Veire S, et al. Preoperative nonsteroidal anti-inflammatory drug or steroid and outcomes after trabeculectomy: a randomized controlled trial. Ophthalmology. 2010;117(7):1324-30. Epub 2010/04/13.

164. Feldman RM, Dietze PJ, Gross RL, Oram O. Intraoperative 5-Fluorouracil administration in trabeculectomy. Journal of glaucoma. 1994;3(4):302-7. Epub 1994/01/01.

165. Parrish RK, 2nd, Schiffman JC, Feuer WJ, Heuer DK. Prognosis and risk factors for early postoperative wound leaks after trabeculectomy with and without 5-fluorouracil. American journal of ophthalmology. 2001;132(5):633-40. Epub 2001/11/13.

166. Heuer DK, Parrish RK, 2nd, Gressel MG, Hodapp E, Palmberg PF, Anderson DR. 5-fluorouracil and glaucoma filtering surgery. II. A pilot study. Ophthalmology. 1984;91(4):384-94. Epub 1984/04/01.

167. Doyle JW, Sherwood MB, Khaw PT, McGrory S, Smith MF. Intraoperative 5-fluorouracil for filtration surgery in the rabbit. Investigative ophthalmology & visual science. 1993;34(12):3313-9. Epub 1993/11/01.

168. Memarzadeh F, Varma R, Lin LT, Parikh JG, Dustin L, Alcaraz A, et al. Postoperative use of bevacizumab as an antifibrotic agent in glaucoma filtration surgery in the rabbit. Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(7):3233-7. Epub 2009/02/03.

169. Fujita H. [Pharmacokinetics of mitomycin C and its derivative (KW-2083)]. Gan to kagaku ryoho Cancer & chemotherapy. 1982;9(8):1362-73. Epub 1982/08/01.

170. Chen C. Enhanced intraocular pressure controlling effectiveness of trabeculectomy

by local application of mitomycin C. Trans Asia Pac Acad Ophthalmol. 1983;9:172-7.

171. Okada K, Sugiyama T, Takai S, Jin D, Ishida O, Fukmoto M, et al. Effects of mitomycin C on the expression of chymase and mast cells in the conjunctival scar of a monkey trabeculectomy model. Molecular vision. 2009;15:2029-36. Epub 2009/10/22.

172. Kitazawa Y, Kawase K, Matsushita H, Minobe M. Trabeculectomy with mitomycin. A comparative study with fluorouracil. Archives of ophthalmology. 1991;109(12):1693-8. Epub 1991/12/01.

173. Wells AP, Cordeiro MF, Bunce C, Khaw PT. Cystic bleb formation and related complications in limbus- versus fornix-based conjunctival flaps in pediatric and young adult trabeculectomy with mitomycin C. Ophthalmology. 2003;110(11):2192-7. Epub 2003/11/05.

174. Weinreb RN. Adjusting the dose of 5-fluorouracil after filtration surgery to minimize side effects. Ophthalmology. 1987;94(5):564-70. Epub 1987/05/01.

175. Greenfield DS, Parrish RK, 2nd. Bleb rupture following filtering surgery with mitomycin-C: clinicopathologic correlations. Ophthalmic surgery and lasers. 1996;27(10):876-7. Epub 1996/10/01.

176. Singh K, Mehta K, Shaikh NM, Tsai JC, Moster MR, Budenz DL, et al. Trabeculectomy with intraoperative mitomycin C versus 5-fluorouracil. Prospective randomized clinical trial. Ophthalmology. 2000;107(12):2305-9. Epub 2000/11/30.

177. Greenfield DS, Suner IJ, Miller MP, Kangas TA, Palmberg PF, Flynn HW, Jr. Endophthalmitis after filtering surgery with mitomycin. Archives of ophthalmology. 1996;114(8):943-9. Epub 1996/08/01.

178. Palanca-Capistrano AM, Hall J, Cantor LB, Morgan L, Hoop J, WuDunn D. Long-term outcomes of intraoperative 5-fluorouracil versus intraoperative mitomycin C in primary trabeculectomy surgery. Ophthalmology. 2009;116(2):185-90. Epub 2008/10/22.

179. Nuyts RM, Felten PC, Pels E, Langerhorst CT, Geijssen HC, Grossniklaus HE, et al. Histopathologic effects of mitomycin C after trabeculectomy in human glaucomatous eyes with persistent hypotony. American journal of ophthalmology. 1994;118(2):225-37. Epub 1994/08/15.

180. Cordeiro MF, Reichel MB, Gay JA, D'Esposita F, Alexander RA, Khaw PT. Transforming growth factor-beta1, -beta2, and -beta3 in vivo: effects on normal and mitomycin C-modulated conjunctival scarring. Investigative ophthalmology & visual science. 1999;40(9):1975-82. Epub 1999/08/10.

181. Khaw P, Grehn F, Hollo G, Overton B, Wilson R, Vogel R, et al. A phase III study of subconjunctival human anti-transforming growth factor beta(2) monoclonal antibody (CAT-152) to prevent scarring after first-time trabeculectomy. Ophthalmology. 2007;114(10):1822-30. Epub 2007/10/03.

182. Sheha H, Kheirkhah A, Taha H. Amniotic membrane transplantation in trabeculectomy with mitomycin C for refractory glaucoma. Journal of glaucoma. 2008;17(4):303-7. Epub 2008/06/17.

183. Subramanian ML, Abedi G, Ness S, Ahmed E, Fenberg M, Daly MK, et al. Bevacizumab vs ranibizumab for age-related macular degeneration: 1-year outcomes of a prospective, double-masked randomised clinical trial. Eye (Lond). 2010;24(11):1708-15. Epub 2010/10/05.

184. Martin DF, Maguire MG, Ying GS, Grunwald JE, Fine SL, Jaffe GJ. Ranibizumab and bevacizumab for neovascular age-related macular degeneration. The New England journal of medicine. 2011;364(20):1897-908. Epub 2011/04/30.

185. Chakravarthy U, Harding SP, Rogers CA, Downes SM, Lotery AJ, Culliford LA, et al. Alternative treatments to inhibit VEGF in age-related choroidal neovascularisation: 2-year findings of the IVAN randomised controlled trial. Lancet. 2013;382(9900):1258-67. Epub 2013/07/23.

186. Jiang S, Park C, Barner JC. Ranibizumab for age-related macular degeneration: a meta-analysis of dose effects and comparison with no anti-VEGF treatment and bevacizumab. Journal of clinical pharmacy and therapeutics. 2014;39(3):234-9. Epub 2014/03/19.

187. Holash J, Davis S, Papadopoulos N, Croll SD, Ho L, Russell M, et al. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002;99(17):11393-8. Epub 2002/08/15.

188. Saishin Y, Takahashi K, Lima e Silva R, Hylton D, Rudge JS, Wiegand SJ, et al. VEGF-TRAP(R1R2) suppresses choroidal neovascularization and VEGF-induced breakdown of the blood-retinal barrier. Journal of cellular physiology. 2003;195(2):241-8. Epub 2003/03/26.

189. Heier JS, Brown DM, Chong V, Korobelnik JF, Kaiser PK, Nguyen QD, et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 2012;119(12):2537-48. Epub 2012/10/23.

190. Cantor LB, Mantravadi A, WuDunn D, Swamynathan K, Cortes A. Morphologic classification of filtering blebs after glaucoma filtration surgery: the Indiana Bleb Appearance Grading Scale. Journal of glaucoma. 2003;12(3):266-71. Epub 2003/06/05.

191. Azuara-Blanco A, Katz LJ. Dysfunctional filtering blebs. Survey of ophthalmology. 1998;43(2):93-126. Epub 1998/10/08.

192. Lopes JF, Moster MR, Wilson RP, Altangerel U, Alvim HS, Tong MG, et al. Subconjunctival sodium hyaluronate 2.3% in trabeculectomy: a prospective randomized clinical trial. Ophthalmology. 2006;113(5):756-60. Epub 2006/05/03.

193. Goulet RJ, 3rd, Phan AD, Cantor LB, WuDunn D. Efficacy of the Ahmed S2 glaucoma valve compared with the Baerveldt 250-mm2 glaucoma implant. Ophthalmology. 2008;115(7):1141-7. Epub 2008/01/01.

194. Jurkowska-Dudzinska J, Kosior-Jarecka E, Zarnowski T. Comparison of the use of 5-fluorouracil and bevacizumab in primary trabeculectomy: results at 1 year. Clinical & experimental ophthalmology. 2012;40(4):e135-42. Epub 2011/06/15.

195. Anand N, Arora S, Clowes M. Mitomycin C augmented glaucoma surgery: evolution of filtering bleb avascularity, transconjunctival oozing, and leaks. The British journal of ophthalmology. 2006;90(2):175-80. Epub 2006/01/21.

196. Alwitry A, Rotchford A, Patel V, Abedin A, Moodie J, King AJ. Early bleb leak after trabeculectomy and prognosis for bleb failure. Eye (Lond). 2009;23(4):858-63. Epub 2008/05/24.

197. Nomoto H, Shiraga F, Kuno N, Kimura E, Fujii S, Shinomiya K, et al. Pharmacokinetics of bevacizumab after topical, subconjunctival, and intravitreal administration in rabbits. Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(10):4807-13. Epub 2009/03/28.

198. Ambati J, Canakis CS, Miller JW, Gragoudas ES, Edwards A, Weissgold DJ, et al. Diffusion of high molecular weight compounds through sclera. Investigative ophthalmology & visual science. 2000;41(5):1181-5. Epub 2001/02/07.

199. Kamba T, McDonald DM. Mechanisms of adverse effects of anti-VEGF therapy for cancer. British journal of cancer. 2007;96(12):1788-95. Epub 2007/05/24.

200. Fung AE, Rosenfeld PJ, Reichel E. The International Intravitreal Bevacizumab Safety Survey: using the internet to assess drug safety worldwide. The British journal of ophthalmology. 2006;90(11):1344-9. Epub 2006/07/21.

201. Los LI. The rabbit as an animal model for post-natal vitreous matrix differentiation and degeneration. Eye (Lond). 2008;22(10):1223-32. Epub 2008/03/11.

202. Nakazawa G, Nakano M, Otsuka F, Wilcox JN, Melder R, Pruitt S, et al. Evaluation of polymer-based comparator drug-eluting stents using a rabbit model of iliac artery atherosclerosis. Circulation Cardiovascular interventions. 2011;4(1):38-46. Epub 2011/01/06.

203. Sheppard LB. The anatomy and histology of the normal rabbit eye with special reference to the ciliary zone. Archives of ophthalmology. 1962;67:87-100. Epub 1962/01/01.

204. Sarnat BG. Eye volume in young and adult rabbits. Acta anatomica. 1980;106(4):462-7. Epub 1980/01/01.

205. Sarnat BG. Orbital volume in young and adult rabbits. Anatomy and embryology. 1980;159(2):211-21. Epub 1980/01/01.

206. Davis FA. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 1929;27:400 2-41. Epub 1929/01/01.

207. Zhong H, Sun G, Lin X, Wu K, Yu M. Evaluation of pirfenidone as a new postoperative antiscarring agent in experimental glaucoma surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2011;52(6):3136-42. Epub 2011/02/19.

208. Folkman J, Shing Y. Angiogenesis. The Journal of biological chemistry. 1992;267(16):10931-4. Epub 1992/06/05.

209. Yancopoulos GD, Davis S, Gale NW, Rudge JS, Wiegand SJ, Holash J. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 2000;407(6801):242-8. Epub 2000/09/23.

210. Asano-Kato N, Fukagawa K, Okada N, Kawakita T, Takano Y, Dogru M, et al. TGF-beta1, IL-1beta, and Th2 cytokines stimulate vascular endothelial growth factor production from conjunctival fibroblasts. Experimental eye research. 2005;80(4):555-60. Epub 2005/03/23.

211. Wong J, Wang N, Miller JW, Schuman JS. Modulation of human fibroblast activity by selected angiogenesis inhibitors. Experimental eye research. 1994;58(4):439-51. Epub 1994/04/01.

212. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM, Perruzzi CA, Harvey VS, Dvorak HF. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 1983;219(4587):983-5. Epub 1983/02/25.

213. Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochemical and biophysical research communications. 1989;161(2):851-8. Epub 1989/06/15.

214. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature medicine. 2003;9(6):669-76. Epub 2003/06/05.

215. Bhagat N, Grigorian RA, Tutela A, Zarbin MA. Diabetic macular edema: pathogenesis and treatment. Survey of ophthalmology. 2009;54(1):1-32. Epub 2009/01/28.

216. Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. The Journal of biological chemistry. 1992;267(36):26031-7. Epub 1992/12/25.

217. Shibuya M, Yamaguchi S, Yamane A, Ikeda T, Tojo A, Matsushime H, et al. Nucleotide sequence and expression of a novel human receptor-type tyrosine kinase gene (flt) closely related to the fms family. Oncogene. 1990;5(4):519-24. Epub 1990/04/01.

218. Terman BI, Carrion ME, Kovacs E, Rasmussen BA, Eddy RL, Shows TB. Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene. 1991;6(9):1677-83. Epub 1991/09/01.

219. Chung AS, Lee J, Ferrara N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews Cancer. 2010;10(7):505-14. Epub 2010/06/25.

220. Uchida K, Uchida S, Nitta K, Yumura W, Marumo F, Nihei H. Glomerular endothelial cells in culture express and secrete vascular endothelial growth factor. The American journal of physiology. 1994;266(1 Pt 2):F81-8. Epub 1994/01/01.

221. Namiki A, Brogi E, Kearney M, Kim EA, Wu T, Couffinhal T, et al. Hypoxia induces vascular endothelial growth factor in cultured human endothelial cells. The Journal of biological chemistry. 1995;270(52):31189-95. Epub 1995/12/29.

222. Brogi E, Wu T, Namiki A, Isner JM. Indirect angiogenic cytokines upregulate VEGF and bFGF gene expression in vascular smooth muscle cells, whereas hypoxia upregulates VEGF expression only. Circulation. 1994;90(2):649-52. Epub 1994/08/01.

223. Stavri GT, Zachary IC, Baskerville PA, Martin JF, Erusalimsky JD. Basic fibroblast growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia. Circulation. 1995;92(1):11-4. Epub 1995/07/01.

224. Banks RE, Forbes MA, Kinsey SE, Stanley A, Ingham E, Walters C, et al. Release of the angiogenic cytokine vascular endothelial growth factor (VEGF) from platelets: significance for VEGF measurements and cancer biology. British journal of cancer. 1998;77(6):956-64. Epub 1998/04/07.

225. Gaudry M, Bregerie O, Andrieu V, El Benna J, Pocidalo MA, Hakim J. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 1997;90(10):4153-61. Epub 1997/11/14.

226. Berse B, Brown LF, Van de Water L, Dvorak HF, Senger DR. Vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) gene is expressed differentially in normal tissues, macrophages, and tumors. Molecular biology of the cell. 1992;3(2):211-20. Epub 1992/02/01.

227. Ku DD, Zaleski JK, Liu S, Brock TA. Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries. The American journal of physiology. 1993;265(2 Pt 2):H586-92. Epub 1993/08/01.

228. Roberts WG, Palade GE. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of cell science. 1995;108 ( Pt 6):2369-79. Epub 1995/06/01.

229. Dejana E, Corada M, Lampugnani MG. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 1995;9(10):910-8. Epub 1995/07/01.

230. Bao P, Kodra A, Tomic-Canic M, Golinko MS, Ehrlich HP, Brem H. The role of vascular endothelial growth factor in wound healing. The Journal of surgical research. 2009;153(2):347-58. Epub 2008/11/26.

231. McGrath MH, Emery JM, 3rd. The effect of inhibition of angiogenesis in granulation tissue on wound healing and the fibroblast. Annals of plastic surgery. 1985;15(2):105-22. Epub 1985/08/01.

232. Esson DW, Popp MP, Liu L, Schultz GS, Sherwood MB. Microarray analysis of the failure of filtering blebs in a rat model of glaucoma filtering surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2004;45(12):4450-62. Epub 2004/11/24.

233. Avery RL, Pieramici DJ, Rabena MD, Castellarin AA, Nasir MA, Giust MJ. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 2006;113(3):363-72 e5. Epub 2006/02/07.

234. Avery RL, Pearlman J, Pieramici DJ, Rabena MD, Castellarin AA, Nasir MA, et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 2006;113(10):1695 e1-15. Epub 2006/10/03.

235. Papathanassiou M, Theodossiadis PG, Liarakos VS, Rouvas A, Giamarellos-Bourboulis EJ, Vergados IA. Inhibition of corneal neovascularization by subconjunctival bevacizumab in an animal model. American journal of ophthalmology. 2008;145(3):424-31. Epub 2008/01/22.

236. Bahar I, Kaiserman I, McAllum P, Rootman D, Slomovic A. Subconjunctival bevacizumab injection for corneal neovascularization. Cornea. 2008;27(2):142-7. Epub 2008/01/25.

237. Guerriero E YJ, Kahook MY. Morphologic evaluation of bevacizumab (Avastin) treated corneal stromal fibroblasts. Investigative ophthalmology & visual science. 2006;47.

238. Bashshur ZF, Haddad ZA, Schakal A, Jaafar RF, Saab M, Noureddin BN. Intravitreal bevacizumab for treatment of neovascular age-related macular degeneration: a one-year prospective study. American journal of ophthalmology. 2008;145(2):249-56. Epub 2007/12/11.

239. Arevalo JF, Fromow-Guerra J, Sanchez JG, Maia M, Berrocal MH, Wu L, et al. Primary intravitreal bevacizumab for subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration: results of the Pan-American Collaborative Retina Study Group at 12 months follow-up. Retina. 2008;28(10):1387-94. Epub 2008/10/02.

240. Avila MP, Farah ME, Santos A, Duprat JP, Woodward BW, Nau J. Twelve-month short-term safety and visual-acuity results from a multicentre prospective study of epiretinal strontium-90 brachytherapy with bevacizumab for the treatment of subfoveal choroidal neovascularisation secondary to age-related macular degeneration. The British journal of ophthalmology. 2009;93(3):305-9. Epub 2008/11/21.

241. Rizzo S, Genovesi-Ebert F, Di Bartolo E, Vento A, Miniaci S, Williams G. Injection of intravitreal bevacizumab (Avastin) as a preoperative adjunct before vitrectomy surgery in the treatment of severe proliferative diabetic retinopathy (PDR). Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2008;246(6):837-42. Epub 2008/02/21.

242. Wu L, Arevalo JF, Berrocal MH, Maia M, Roca JA, Morales-Canton V, et al. Comparison of two doses of intravitreal bevacizumab as primary treatment for macular edema secondary to branch retinal vein occlusions: results of the Pan American Collaborative Retina Study Group at 24 months. Retina. 2009;29(10):1396-403. Epub 2009/11/10.

243. Prager F, Michels S, Kriechbaum K, Georgopoulos M, Funk M, Geitzenauer W, et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for macular oedema secondary to retinal vein occlusion: 12-month results of a prospective clinical trial. The British journal of ophthalmology. 2009;93(4):452-6. Epub 2008/12/17.

244. Ziemssen F, Deuter CM, Stuebiger N, Zierhut M. Weak transient response of chronic uveitic macular edema to intravitreal bevacizumab (Avastin). Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2007;245(6):917-8. Epub 2007/01/16.

245. Wakabayashi T, Oshima Y, Sakaguchi H, Ikuno Y, Miki A, Gomi F, et al. Intravitreal bevacizumab to treat iris neovascularization and neovascular glaucoma secondary to ischemic retinal diseases in 41 consecutive cases. Ophthalmology. 2008;115(9):1571-80, 80 e1-3. Epub 2008/04/29.

246. Jonas JB, Spandau UH, Schlichtenbrede F. Intravitreal bevacizumab for filtering surgery. Ophthalmic research. 2007;39(2):121-2. Epub 2007/02/08.

247. Kahook MY, Schuman JS, Noecker RJ. Intravitreal bevacizumab in a patient with neovascular glaucoma. Ophthalmic surgery, lasers & imaging : the official journal of the International Society for Imaging in the Eye. 2006;37(2):144-6. Epub 2006/04/06.

248. Kahook MY, Schuman JS, Noecker RJ. Needle bleb revision of encapsulated filtering bleb with bevacizumab. Ophthalmic surgery, lasers & imaging : the official journal of the International Society for Imaging in the Eye. 2006;37(2):148-50. Epub 2006/04/06.

249. Sawada O, Kawamura H, Kakinoki M, Ohji M. Vascular endothelial growth factor in fellow eyes of eyes injected with intravitreal bevacizumab. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2008;246(10):1379-81. Epub 2008/06/27.

250. Bakri SJ, Snyder MR, Reid JM, Pulido JS, Singh RJ. Pharmacokinetics of intravitreal bevacizumab (Avastin). Ophthalmology. 2007;114(5):855-9. Epub 2007/05/01.

251. Heiduschka P, Julien S, Hofmeister S, Bartz-Schmidt KU, Schraermeyer U. Bevacizumab (avastin) does not harm retinal function after intravitreal injection as shown by electroretinography in adult mice. Retina. 2008;28(1):46-55. Epub 2008/01/11.

252. Shahar J, Avery RL, Heilweil G, Barak A, Zemel E, Lewis GP, et al. Electrophysiologic and retinal penetration studies following intravitreal injection of bevacizumab (Avastin). Retina. 2006;26(3):262-9. Epub 2006/03/02.

253. Heiduschka P, Fietz H, Hofmeister S, Schultheiss S, Mack AF, Peters S, et al. Penetration of bevacizumab through the retina after intravitreal injection in the monkey. Investigative ophthalmology & visual science. 2007;48(6):2814-23. Epub 2007/05/26.

254. Miyake T, Sawada O, Kakinoki M, Sawada T, Kawamura H, Ogasawara K, et al. Pharmacokinetics of bevacizumab and its effect on vascular endothelial growth factor after intravitreal injection of bevacizumab in macaque eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 2010;51(3):1606-8. Epub 2009/10/31.

255. Awadein A. Subconjunctival bevacizumab for vascularized rejected corneal grafts. Journal of cataract and refractive surgery. 2007;33(11):1991-3. Epub 2007/10/30.

256. Bahar I, Kaiserman I, McAllum P, Rootman D, Slomovic A. Subconjunctival bevacizumab injection for corneal neovascularization in recurrent pterygium. Current eye research. 2008;33(1):23-8. Epub 2008/01/25.

257. Erdurmus M, Totan Y. Subconjunctival bevacizumab for corneal neovascularization. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2007;245(10):1577-9. Epub 2007/04/27.

258. Kim SW, Ha BJ, Kim EK, Tchah H, Kim TI. The effect of topical bevacizumab on corneal neovascularization. Ophthalmology. 2008;115(6):e33-8. Epub 2008/04/29.

259. Uy HS, Chan PS, Ang RE. Topical bevacizumab and ocular surface neovascularization in patients with stevens-johnson syndrome. Cornea. 2008;27(1):70-3. Epub 2008/02/05.

260. Kim TI, Kim SW, Kim S, Kim T, Kim EK. Inhibition of experimental corneal neovascularization by using subconjunctival injection of bevacizumab (Avastin). Cornea. 2008;27(3):349-52. Epub 2008/03/26.

261. Zarnowski T, Tulidowicz-Bielak M. Topical bevacizumab is efficacious in the early bleb failure after trabeculectomy. Acta Ophthalmol. 2011;89(7):e605-6. Epub 2009/11/21.

262. Klos-Rola J, Tulidowicz-Bielak M, Zarnowski T. Effects of topical bevacizumab application on early bleb failure after trabeculectomy: observational case series. Clin Ophthalmol. 2013;7:1929-35. Epub 2013/10/11.

263. O'Neill EC, Qin Q, Van Bergen NJ, Connell PP, Vasudevan S, Coote MA, et al. Antifibrotic activity of bevacizumab on human Tenon's fibroblasts in vitro. Investigative ophthalmology & visual science. 2010;51(12):6524-32. Epub 2010/06/25.

264. Grewal DS, Jain R, Kumar H, Grewal SP. Evaluation of subconjunctival bevacizumab as an adjunct to trabeculectomy a pilot study. Ophthalmology. 2008;115(12):2141-5 e2. Epub 2008/08/12.

265. Nilforushan N, Yadgari M, Kish SK, Nassiri N. Subconjunctival bevacizumab versus mitomycin C adjunctive to trabeculectomy. American journal of ophthalmology. 2012;153(2):352-7 e1. Epub 2011/10/11.

266. Sengupta S. Reply to "safety and efficacy of using off-label bevacizumab versus mitomycin C to prevent bleb failure in a single site phacotrabeculectomy by a randomized controlled clinical trial". Journal of glaucoma. 2013;22(3):266-7. Epub 2013/02/23.

267. Bochmann F, Kaufmann C, Becht CN, Guber I, Kaiser M, Bachmann LM, et al. ISRCTN12125882 – Influence of topical anti-VEGF (Ranibizumab) on the outcome of filtration surgery for glaucoma – Study Protocol. BMC ophthalmology. 2011;11:1. Epub 2011/01/19.

268. Kahook MY. Bleb morphology and vascularity after trabeculectomy with intravitreal ranibizumab: a pilot study. American journal of ophthalmology. 2010;150(3):399-403 e1. Epub 2010/06/24.

269. How A, Chua JL, Charlton A, Su R, Lim M, Kumar RS, et al. Combined treatment with bevacizumab and 5-fluorouracil attenuates the postoperative scarring response after experimental glaucoma filtration surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2010;51(2):928-32. Epub 2009/10/03.

270. Mathew R, Barton K. Anti–vascular endothelial growth factor therapy in glaucoma filtration surgery. American journal of ophthalmology. 2011;152(1):10-5 e2. Epub 2011/05/31.

271. Scappaticci FA, Fehrenbacher L, Cartwright T, Hainsworth JD, Heim W, Berlin J, et al. Surgical wound healing complications in metastatic colorectal cancer patients treated with bevacizumab. Journal of surgical oncology. 2005;91(3):173-80. Epub 2005/08/25.

272. Freiberg FJ, Matlach J, Grehn F, Karl S, Klink T. Postoperative subconjunctival bevacizumab injection as an adjunct to 5-fluorouracil in the management of scarring after trabeculectomy. Clin Ophthalmol. 2013;7:1211-7. Epub 2013/07/03.

273. Bakri SJ, Cameron JD, McCannel CA, Pulido JS, Marler RJ. Absence of histologic retinal toxicity of intravitreal bevacizumab in a rabbit model. American journal of ophthalmology. 2006;142(1):162-4. Epub 2006/07/04.

274. Bock F, Konig Y, Dietrich T, Zimmermann P, Baier M, Cursiefen C. [Inhibition of angiogenesis in the anterior chamber of the eye]. Der Ophthalmologe : Zeitschrift der Deutschen Ophthalmologischen Gesellschaft. 2007;104(4):336-44. Epub 2007/03/21. Antiangiogene Therapie am vorderen Augenabschnitt.

275. Rubino CM, Bhavnani SM, Ambrose PG, Forrest A, Loutit JS. Effect of food and antacids on the pharmacokinetics of pirfenidone in older healthy adults. Pulmonary pharmacology & therapeutics. 2009;22(4):279-85. Epub 2009/03/31.

276. Giri SN, Wang Q, Xie Y, Lango J, Morin D, Margolin SB, et al. Pharmacokinetics and metabolism of a novel antifibrotic drug pirfenidone, in mice following intravenous administration. Biopharmaceutics & drug disposition. 2002;23(5):203-11. Epub 2002/07/13.

277. Hewitson TD, Kelynack KJ, Tait MG, Martic M, Jones CL, Margolin SB, et al. Pirfenidone reduces in vitro rat renal fibroblast activation and mitogenesis. Journal of nephrology. 2001;14(6):453-60. Epub 2002/01/11.

278. Di Sario A, Bendia E, Svegliati Baroni G, Ridolfi F, Casini A, Ceni E, et al. Effect of pirfenidone on rat hepatic stellate cell proliferation and collagen production. Journal of hepatology. 2002;37(5):584-91. Epub 2002/10/26.

279. Lee BS, Margolin SB, Nowak RA. Pirfenidone: a novel pharmacological agent that inhibits leiomyoma cell proliferation and collagen production. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 1998;83(1):219-23. Epub 1998/01/22.

280. Iyer SN, Gurujeyalakshmi G, Giri SN. Effects of pirfenidone on transforming growth factor-beta gene expression at the transcriptional level in bleomycin hamster model of lung fibrosis. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1999;291(1):367-73. Epub 1999/09/22.

281. Gurujeyalakshmi G, Hollinger MA, Giri SN. Pirfenidone inhibits PDGF isoforms in bleomycin hamster model of lung fibrosis at the translational level. The American journal of physiology. 1999;276(2 Pt 1):L311-8. Epub 1999/02/10.

282. Oku H, Nakazato H, Horikawa T, Tsuruta Y, Suzuki R. Pirfenidone suppresses tumor necrosis factor-alpha, enhances interleukin-10 and protects mice from endotoxic shock. European journal of pharmacology. 2002;446(1-3):167-76. Epub 2002/07/06.

283. Nakazato H, Oku H, Yamane S, Tsuruta Y, Suzuki R. A novel anti-fibrotic agent pirfenidone suppresses tumor necrosis factor-alpha at the translational level. European journal of pharmacology. 2002;446(1-3):177-85. Epub 2002/07/06.

284. Giri SN, Leonard S, Shi X, Margolin SB, Vallyathan V. Effects of pirfenidone on the generation of reactive oxygen species in vitro. Journal of environmental pathology, toxicology and oncology : official organ of the International Society for Environmental Toxicology and Cancer. 1999;18(3):169-77. Epub 2004/07/30.

285. Zhang S, Shiels IA, Ambler JS, Taylor SM. Pirfenidone reduces fibronectin synthesis by cultured human retinal pigment epithelial cells. Australian and New Zealand journal of ophthalmology. 1998;26 Suppl 1:S74-6. Epub 1998/07/31.

286. Kim H, Choi YH, Park SJ, Lee SY, Kim SJ, Jou I, et al. Antifibrotic effect of Pirfenidone on orbital fibroblasts of patients with thyroid-associated ophthalmopathy by decreasing TIMP-1 and collagen levels. Investigative ophthalmology & visual science. 2010;51(6):3061-6. Epub 2010/01/08.

287. Lin X, Yu M, Wu K, Yuan H, Zhong H. Effects of pirfenidone on proliferation, migration, and collagen contraction of human Tenon's fibroblasts in vitro. Investigative ophthalmology & visual science. 2009;50(8):3763-70. Epub 2009/03/07.

288. Na JH, Sung KR, Shin JA, Moon JI. Antifibrotic effects of pirfenidone on Tenon's fibroblasts in glaucomatous eyes: comparison with mitomycin C and 5-fluorouracil. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2015. Epub 2015/06/07.

289. Lee K, Young Lee S, Park SY, Yang H. Antifibrotic effect of pirfenidone on human pterygium fibroblasts. Current eye research. 2014;39(7):680-5. Epub 2014/01/10.

290. Jung KI, Choi JS, Kim HK, Shin SY. Effects of an anti-transforming growth factor-beta agent (pirfenidone) on strabismus surgery in rabbits. Current eye research. 2012;37(9):770-6. Epub 2012/06/08.

291. Taniguchi H, Ebina M, Kondoh Y, Ogura T, Azuma A, Suga M, et al. Pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. The European respiratory journal. 2010;35(4):821-9. Epub 2009/12/10.

292. Nielsen JS, McNagny KM. Novel functions of the CD34 family. Journal of cell science. 2008;121(Pt 22):3683-92. Epub 2008/11/07.

293. Kirschbaum NE, Gumina RJ, Newman PJ. Organization of the gene for human platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 shows alternatively spliced isoforms and a functionally complex cytoplasmic domain. Blood. 1994;84(12):4028-37. Epub 1994/12/15.

294. Wright B, Connon CJ. Limbal epithelial stem cell identification using immunoblotting analysis. Methods Mol Biol. 2013;1014:79-99. Epub 2013/05/22.

295. Azuma A, Nukiwa T, Tsuboi E, Suga M, Abe S, Nakata K, et al. Double-blind, placebo-controlled trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. American journal of respiratory and critical care medicine. 2005;171(9):1040-7. Epub 2005/01/25.

296. Cordeiro MF, Constable PH, Alexander RA, Bhattacharya SS, Khaw PT. Effect of varying the mitomycin-C treatment area in glaucoma filtration surgery in the rabbit. Investigative ophthalmology & visual science. 1997;38(8):1639-46. Epub 1997/07/01.

297. Wong TT, Mead AL, Khaw PT. Prolonged antiscarring effects of ilomastat and MMC after experimental glaucoma filtration surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2005;46(6):2018-22. Epub 2005/05/26.

298. Meyer-Ter-Vehn T, Katzenberger B, Han H, Grehn F, Schlunck G. Lovastatin inhibits TGF-beta-induced myofibroblast transdifferentiation in human tenon fibroblasts. Investigative ophthalmology & visual science. 2008;49(9):3955-60. Epub 2008/04/19.

299. Mead AL, Wong TT, Cordeiro MF, Anderson IK, Khaw PT. Evaluation of anti-TGF-beta2 antibody as a new postoperative anti-scarring agent in glaucoma surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 2003;44(8):3394-401. Epub 2003/07/29.

300. Asahara T, Bauters C, Zheng LP, Takeshita S, Bunting S, Ferrara N, et al. Synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 1995;92(9 Suppl):II365-71. Epub 1995/11/01.

301. Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AT, De Bruijn EA. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacological reviews. 2004;56(4):549-80. Epub 2004/12/17.

302. Pollina EA, Legesse-Miller A, Haley EM, Goodpaster T, Randolph-Habecker J, Coller HA. Regulating the angiogenic balance in tissues. Cell Cycle. 2008;7(13):2056-70. Epub 2008/07/22.

303. Qin Q, Van Bergen,N. Anti-VEGF Treatment on Human Tenons’ Fibroblasts Scarring Activity in vitro.2008.

304. Jampel HD, Pasquale LR, Dibernardo C. Hypotony maculopathy following trabeculectomy with mitomycin C. Archives of ophthalmology. 1992;110(8):1049-50. Epub 1992/08/01.

305. Franks WA, Hitchings RA. Complications of 5–fluorouracil after trabeculectomy. Eye (Lond). 1991;5 ( Pt 4):385-9. Epub 1991/01/01.

306. Higginbotham EJ, Stevens RK, Musch DC, Karp KO, Lichter PR, Bergstrom TJ, et al. Bleb-related endophthalmitis after trabeculectomy with mitomycin C. Ophthalmology. 1996;103(4):650-6. Epub 1996/04/01.

307. Gressel MG, Parrish RK, 2nd, Folberg R. 5-fluorouracil and glaucoma filtering surgery: I. An animal model. Ophthalmology. 1984;91(4):378-83. Epub 1984/04/01.

308. Khaw PT, Doyle JW, Sherwood MB, Smith MF, McGorray S. Effects of intraoperative 5-fluorouracil or mitomycin C on glaucoma filtration surgery in the rabbit. Ophthalmology. 1993;100(3):367-72. Epub 1993/03/01.

309. Kalesnykas G, Uusitalo H. Comparison of simultaneous readings of intraocular pressure in rabbits using Perkins handheld, Tono-Pen XL, and TonoVet tonometers. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 2007;245(5):761-2. Epub 2006/11/23.

310. Tahery MM, Lee DA. Review: pharmacologic control of wound healing in glaucoma filtration surgery. Journal of ocular pharmacology. 1989;5(2):155-79. Epub 1989/01/01.