Teza Adc Teza Finala 10 Octombrie 2018 [308743]
MULȚUMIRI
LISTĂ DE ABREVIERI
5-HT = serotonină (5-hidroxi-triptamină)
5HT4 = receptorul 4 al serotoninei sau 5-hidroxi-triptaminei
5HT6 = receptorul 6 al serotoninei sau 5-hidroxi-triptaminei
5HTA1 = receptorul 1A al serotoninei sau 5-hidroxi-triptaminei
Ach = acetilcolină
AchE = acetilcolinesterază
ACTH = hormonul adrenocorticotropinic (adrenocorticotropina, corticotropina)
AD = Boala Alzheimer (Alzheimer's Disease)
ADN = acid dezoxiribonucleic
ADNI = Inițiativa de combatere a bolii Alzheimer (Alzheimer Disease Neuroimaging Intiative)
AINS = antiinflamatoare nesteroidiene
AMPA /QUIS = receptorul acid D,L-α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazolpropionic sau (AMPAR), cunoscut și sub denumirea de receptor quisqualat
AMPc = adenozin-monofosfat ciclic
Ang I = angiotensină I
Ang II = angiotensină II
Ang IV = angiotensina IV
APP = proteina precursoare β-amiloidului
ARN = acid ribonucleic
AT1R = receptori AT-1 ai ang II
AT2R = receptori AT2 ai ang II
ATP = adezin trifosfat
Aβ = peptide β-amiloide agregate
AβPP = model murin de boală Alzheimer
BA = boala Alzheimer
BADGE = bisfenolul A diglicidil eter
BDNF = factor neurotrofic cerebral (brain-derived neurotrophic factor)
BHE = bariera hematoencefalică
BRA = blocanți ai angiotensinei II la nivelul receptorilor AT-1
CA = catecolamine
CE = cortex entorhinal
CGA = cortexul cingulat anterior
CGDM = celule granulare dentate de maturitate
CGRP = peptidă asociată genei calcitoninei (calcitonin gene related peptide)
CLM = [anonimizat] = carboximetilceluloză sodică
CND =candesartan
COMT = catecol-O-metil-transferaza
COX-2 = ciclooxigenază-2
CPF = cortexul prefrontal
CPL = captopril
CREB = proteina de legare a elementului de răspuns AMPc
CRH /CRF = factor de eliberare a corticotropinei
CRP = proteina C reactivă
CT = calcitonina
DOX = doxepină
DTL = depresie pe termen lung
ECA = enzima de conversie a angiotensinei
EMP = efect maxim posibil
eNOS =sintetaza oxidului nitric endotelială
ESM = eroarea standard a mediei
FAAH = hidroliza amidelor acizilor grași
GABA = [anonimizat] = girus dentat
GFAP = proteina acizilor fibrilați gliali
GHRH = hormonul de eliberare a hormonului de creștere (somatocrinină)
GMP = guanozin monofosfat ciclic
GPCR = receptorii cuplați cu proteină G
GPX = glutation peroxidaza
GR = receptori glucocorticoizi
GW 9662 = 2-clor-5 nitro-N-fenilbenzamidă
HDAC = [anonimizat]-1α = factorul inductor de hipoxie (Hypoxia-Inducible Factor)
HPA = [anonimizat]-suprarenală
HTA = hipertensiune arterială
i.c.v. = intra-cerebro-ventricular
i.n. = intranazal
i.p. = intraperitoneal
IASP = Asociația Internațională pentru Studiul Durerii (International Association for the Study of Pain)
IB = ibuprofen
IC50 = 50% din rata de inhibiție
ICAM = molecule de adeziune intercelulară
IECA = inhibitori ai enzimei de conversie ai angiotensinei I
IL-6 = interleukina 6
IL-8 = interleukina 8
ISP = inhibitoare de sinteză proteică
KA = receptorul kainat
KCl = clorură de potasiu
KYNA = acidul kinurenic
LCR = lichid cefalorahidian
LCT = leziuni cerebrale traumatice
MAPK = protein kinaze activate de mitogen
MCI = deficit ușor cognitiv (Mild Cognitive Impairment)
MDA = malondialdehidă
MR =receptori mineralocorticoizi
MSH = hormonul stimulator de melanocite
NA = noradrenalina
NADP = nicotinamida-adenina-dinucleotid fosfat
NADPH = nicotinamida-adenina-[anonimizat] = Uniunea internațională a Comitetului de bază și farmacologie clinică privind Nomenclatorul receptorilor și clasificarea medicamentelor
NECA = 5' –(N-etilcarboxamido) adenozină
NF-kB = factorul nuclear kappa al celulelor B
NK = neurokinine
NMDA = N-metil-D-aspartat
NO = oxid nitric (monoxid de azot)
NOS = sintetaza oxidului nitric
NT = neurotensina
NTR = nortriptilină
ORL-1 = receptorul opioid (Opioid Receptor Like-1)
p.o. = per os
PAB = proteină amiloid β
PACAP = peptidul activator de adenil-ciclaza din hipofiză
PD = boala Parkinson
PD 123319 = hidrat de sare de di (trifluoracetat)
PET = tomografie pe bază de emisie pozitronică
PI3K/Akt (PkB) = fosfatidiliozitol 3-kinază/treonin kinază
PIA = (-) – N6- (R-fenilizopropil) adenozină
POMC = pro-opio-melanocortina
PRAR = proliferatorul peroxizomului
PRARy / PPARG = proliferator de peroxizom activat al recetorului gama (receptorul glitazonei)
PS1 = presenilina 1
PTL = potențare pe termen lung
PTSA = tulburarea de stres post-traumatic
PVN = nucleul paraventricular
RAAS =sistemul renină-angiotensină-aldosteron
RAVLT = testul auditor verbal de învățare Rey
RCA = testul răspunsului constrictiv abdominal
RML = ramipril
RMN = imagistică prin rezonanță magnetică
ROK = receptorii opioizi kappa
rpm = rotații pe minut
s.c. = subcutanată
SCPA = substanța cenușie peripeductală
SNC = sistemul nervos central
SNRI = inhibitoarele recaptării serotoninei și norepinefrinei
SOD = superoxid dismutaza
SP = substanța P
SPW-Rs = reverberații acute de scurtă durată (sharp wave-ripples)
SRA = sistemul renină-angiotensină
SRO = specii reactive de oxigen
SSRI = inhibitori selectivi de recaptare ai serotoninei
SST = somatostatina
STDP = plasticitate dependentă de timpul stimulării (Spike-Timing Dependent Plasticity)
TBA = acid 2-tiobarbituric
t-Bu-OOH = teț-butil-hidroperoxid
TCA = antidepresive triciclice
TGFβ = factor de creștere tumorală beta sau limfotoxina (Tumor Necrosis Factor)
TNFα = factor de necroză tumorală α (Tumor Growth Factor)
TRH = hormonul care eliberează tirotropina sau factor de eliberare a tireotropina (TRF) sau tiroliberină
TRIS = hidroximetilaminometan
TRPMC = Transient Receptor Potential melastatin 7 Channel
VEGF = factorul de creștere endotelial vascular
VIP = polipeptidul vasoactiv intestinal
WMS –R = testul de memorie logică
WST = sarea de tetrazoliu a lui Dojindo’s
STADIUL CUNOAȘTERII
CAPITOLUL I
MEMORIA: ORGANIZARE ȘI CONTROL
Există la ora actuală două puncte de vedere în ceea ce privește memoria și anume unul care presupune că amintirile sunt stocate sub formă de asociații individuale, iar celălalt presupune că informațiile noi sunt integrate în structuri organizaționale preexistente (1).
Mandler (2), a propus trei tipuri de organizare a memoriei:
structură asociativă, în care evenimente multiple sunt legate în rețea prin asocieri directe și indirecte
structură secvențială ce implică organizarea temporală a unor evenimente înseriate
structură schematică ce implică organizarea ierarhică a datelor.
Oricum, este foarte dificil de asociat aceste tipuri organizaționale cu structuri sau elemente neurale identificabile, și foarte puțini autori și-au făcut iluzii că așa ceva ar fi posibil. Mai degrabă, au încercat să-și justifice ipotezele prin studii care să identifice tipurile de organizare a memoriei prin consecințele unor judecăți bazate pe memorie.
Cercetările neuroștiințifice asupra memoriei sunt dominate de patru teme majore:
Conexiunile – care reprezintă cel mai de bază nivel al analizei funcțiilor de memorie, adică circuitele cerebrale ale memoriei și cum comunică între ele diversele zone cerebrale pentru realizarea memoriei.
Cercetările recente au ajuns la concluzia că memoria (amintirile) sunt codificate dinamic prin plasticitatea celulelor nervoase și a conexiunilor dintre ele (3). Pe de altă parte, se lucrează foarte intens la identificarea “întrerupătorului” biologic care activează formarea de noi conexiuni și deci de noi amintiri. Factorul transcripțional Zif268/Egr1, a fost implicat cel mai recent în dezvoltarea de noi amintiri (4).
Identificarea unor astfel de factori ne-ar putea duce la descoperirea unor noi mecanisme de reglare și influențare biochimică, hormonală sau farmacologică a memoriei.
Cogniția (cunoașterea) se referă la natura amintirilor la nivelul de analiză psihologică. Este foarte dificil de separat între amintirile evocate de stimuli (pozitivi sau negativi) și amintirile zise cognitive, deoarece experimentele pe animale nu ne oferă acces decât la memorii condiționate (5).
Compartimentalizarea –se adresează problemelor de localizare a amintirilor. Ideea generală actuală este că memoriile sunt distribuite în întregul creier (cortex), dar formarea lor și accesarea acestora este realizată de către module cerebrale specific, corticale și /sau subcorticale. Această funcție este de o importanță aparte, deoarece studiul structurilor de tip “poartă” este esențial pentru “declanșarea” amintirilor pierdute, pentru evaluarea efectelor lezionale localizate sau difuze asupra memoriei ș.a.m.d. (6)
Consolidarea – reprezintă permanentizarea amintirilor în cadrul unui proces dinamic, generativ, transformativ și de lungă durată care echilibrează menținerea experiențelor utile, trecute prin filtrul intern cu necesitatea de a adapta aceste reprezentări la o lume extinsă într-o perpetuă schimbare. Consolidarea este dependentă de gradul de distanță între informația nouă și cunoașterea deja disponibilă (7).
1.1.IPOTEZE ASUPRA MECANISMELOR MEMORIEI
Mecanismele memoriei au reprezentat o enigmă încă din urmă cu secole, și au existat o serie întreagă de teorii și ipoteze în ceea ce privește mecanismele și funcționarea acesteia. În urmă cu mai mult de o sută de ani, biologul german Richard Semon emitea teoria “engramei” (8). Termenul reprezintă o variantă neogreacă a noțiunii de “inspirație”: și prin el autorul propunea teoria că fiecare “excitație simultană” a sistemului nervos își lăsa asupra acestuia o urmă cu fel de “impresiune”, ca o ideogramă ce reprezintă o amintire. Cu cât secvența de stimulare se repetă mai frecvent, cu atât engrama devine mai bine “imprimată” în creier, ducând la apariția de amintiri din ce în ce mai bine fixate și mai greu de șters .
Semon nu avea la îndemână mijloacele tehnice și cognitive de a-și verifica teoria, dar după o perioadă de uitare, ea a fost redescoperită și o pleiadă de oameni de știință folosesc cele mai noi descoperiri ale biologiei teoretice și ale biologiei celulare și moleculare pentru a-și dovedi sau nu validitatea.
Direcțiile de lucru cele mai utilizate în studiul memoriei sunt orientate astfel:
este abordul cognitiv – compartimental, prin care sunt studiate la animale și au mecanismele prin care se produc comportamentele dobândite și cum se obțin și se stabilizează acestea
este abordul celular și subcelular, care încearcă să coreleze observațiile histologice, subcelulare, moleculare și conectica intercelulară neuronală pentru a identifica suportul fizic al memoriei.
Din această direcție de studiu face parte studiul sinapselor și a plasticității acesteia pentru generarea de noi circuite neuronale. Descoperirea fenomenelor de Potențare pe Termen Lung (PTL) și a Depresiei pe Termen Lung (DTL) a adăugat material de lucru la teoria sinaptică a memoriei, făcându-l pe Kelsey Martin să considere că sinapsele sunt sediul memoriei, iar elementele pre și post-sinaptice împreună cu “microvecinătatea” glială formează o unitate de memorie (9).
Pe de altă parte, și nucleii neuronilor ce fac parte din aceste “unități engramatice” prezintă modificări după DTL și PTL, ceea ce i-a făcut pe Rudenko și Li Huei-Tsai (10) să considere că modificările epigenetice ale neuronilor se află la baza amintirilor. Este ușor apoi să se ajungă la concluzia că sinteza și îndepărtarea proteinelor de către gene speciale ar putea reprezenta substratul chimic al memoriei. Să ne imaginăm ce uriașe efecte ar avea sinteza de amintiri specifice sub formă de proteine, care apoi să fie administrate pe o cale sau alta și să ajungă neschimbate la siturile memoriei!
1.1.1. STADIILE DE PROCESARE ALE AMINTIRILOR
Codificarea reprezintă procesarea informației pentru crearea de trasee de memorie. Are două sub-etape distincte: achiziția, care reprezintă preluarea stimulilor senzoriali mai puternici și consolidarea, în timpul căreia se stabilizează amintirea, pentru a deveni memorie pe termen lung.
Stocarea este rezultatul consolidării – îndosarierea definitivă a informației.
Recuperarea – accesarea informației stocate și folosirea ei pentru a crea o reprezentare conștientă sau executarea unui act martor.
1.1.2. FORME DE MEMORIE
Memoria pe termen scurt.
Stimulii senzoriali, mai ales auditivi, persistă o vreme în bufferul de memorie, și dacă se încearcă recuperarea lor rapidă, uneori se pot găsi. De exemplu, când cineva vorbește, dar nu-l ascultăm fiind preocupați de altceva, dar în momentul când devenim motivați, de exemplu de o ridicare a vocii interlocutorilor sau ceva ce se percepe ca amenințător, ne putem aminti despre ce vorbește respectivul, în grade variabile de fidelitate. Acestea se numesc amintiri echivoce, pentru stimulii auditivi, sau iconice, pentru cei vizuali. Durata este de 9-10 sec. pentru memoriile echivoce, și doar de 500 ms – 1 sec pentru cele iconice (Tabel 1.1.).
Amintirile pe termen scurt
În urma experiențelor lui Miller (1956) s-a ajuns la concluzia că numărul maxim de itemi reținuți în memoria pe termen scurt este de 7. Mai mult de 7 elemente în secvență nu mai pot fi reamintite cu precizie. Pe de altă parte, creierul uman are capacitatea de a „arhiva” informația, prin cuplarea elementelor de informație. De exemplu, memoria de scurtă durată poate reține doar până la 7 litere în secvență, dar dacă subiectului i se prezintă o listă de 7 cuvinte cu o dimensiune medie de 10 caractere, el va fi capabil să le redea, astfel remarcând mai mult de 70 de caractere, sub formă de cuvinte.
O concluzie interesantă a cercetărilor în domeniul memoriei pe termen scurt este că aceasta s-ar putea să nu fie neapărat necesară pentru memoriile pe termen lung.
Memoria de lucru
Conceptul de memorie de lucru a fost creat pentru a extinde noțiunea de amintire pe termen scurt și de a identifica procesele ce au loc când informația este reținută mai mult de câteva secunde.
Memoria de lucru poate realiza 2 procese: mentenanță (păstrarea unor noțiuni pe o perioadă scurtă de timp) și manipulare (folosirea acestor noțiuni pentru realizarea de operațiuni mintale). Sursele acestor informații pot fi senzoriale externe ( ca de exemplu când ni se dă un calcul simplu de făcut și realizăm acest calcul) sau pot fi recuperate din memoria pe termen lung (ca de exemplu, la magazinul de mobilă ne amintim dimensiunile mobilei noi) în funcție de acesta. Memoria pe termen lung este foarte dependentă de tipul de stimul prin care sunt transmise informațiile, pentru cele auditive activarea realizându-se la nivelul cortexului prefrontal ventrolateral stâng, în timp ce pentru stimulii spațiali (vizuali) mai ales în zonele inferioare și posterioare ale emisferei drepte (11).
Tabel 1.1. Tipuri de memorie (tradus și adaptat după (12)
Forme de memorie pe termen lung
Memoria declarativă este cea pentru evenimente și fapte la care avem acces și pe care le putem declara verbal sau comportamental. În anii '90 E. Tulving separă memoria declarativă în memorie episodică și memorie semantică. Memoria episodică este cea a experiențelor proprii, când ne putem aminti un eveniment (ce?), când s-a produs (când?) și persoanele implicate (cine?)(13, 14) .
Pe de altă parte, memoria semantică este în cea mai mare parte a memoriei non-personale, în cadrul căreia cunoaștem date, fapte și evenimente, dar nu știm de unde. De exemplu cunoaștem populația totală a pământului sau geografia Europei, dar nu o cunoaștem din experiență personală, ci prin memorarea de elemente de semnificație (semantice) – litere, cuvinte, pagini, ore de curs, lecturi, etc.
În ceea ce privește animalele, psihologii consideră că memoria lor pe termen lung nu poate fi împărțită în cele 2 tipuri de mai sus.
Memoria non – declarativă
Se mai numește și memorie implicită, la care nu avem acces conștient. Ea are mai multe forme:
Memoria procedurală – memorie motorie bazată pe repetiție (mers pe bicicletă, înot, citit, scris, etc). Este dependentă în mod esențial de ganglionii bazali (corpii striați) la nivelul cărora iau naștere buclele motorii cortico – medulare prin intermediu cărora se realizează procedurile motorii.
O altă formă de memorie nondeclarativă este amorsarea (priming). Reprezintă creșterea capacității de identificare a unor obiecte, noțiuni, forme prin observarea autentică a unor obiecte sau noțiuni similare. De exemplu, o imagine a unei biciclete luată dintr-un unghi bizar va fi recunoscută mai repede dacă subiectului i s-a arătat înainte o imagine cu o bicicletă clasică. Acest exemplu este pentru „amorsare” perceptuală deoarece face apel la percepții, dar se poate realiza și „amorsare semantică” sau „amorsare conceptuală”.
Memoria relațională este cea care poate indica dacă un item a fost întâlnit undeva, și chiar unde și când. De exemplu, dacă vedem pe stradă o personalitate, o recunoaștem, chiar dacă nu l-am mai văzut nici o dată decât la TV sau am citit în ziare. Această memorie relațională este dependentă de hipocamp, deoarece pacienții cu leziuni la acest nivel nu pot recunoaște.
Consolidarea amintirilor
Reprezintă stabilizarea memoriei în timp și este dependentă de lobii medio-temporali, mai ales hipocamp. În decursul timpului, amintirile sunt transformate în ceea ce se numește „trasee de memorie”, ce sunt apoi transferate lent către alte localizări din hipocamp.
Teoria „ traseelor” multiple, propusă de L. Nadel sugerează că de fiecare dată când o amintire este recuperată, se realizează un nou traseu, până când fiecare traseu, cu caracteristici ușor diferite, se sumează și formează „ideea principală” a amintirii, care poate fi mai mult sau mai puțin congruentă cu experiența reală. Multiplele reprezentări inexacte pot duce la apariția de „memorii false”, care sunt din ce în ce mai bine stabilite, până înlocuiesc amintirea adevărată (Figura 1.1.) ((15).
Figura 1.1. Tipuri de memorie (modificat după (16))
1.2. STOCAREA AMINTIRILOR
Seria de evenimente implicată în plasticitatea sinaptică necesită 2 faze separate (17). În faza de codificare, numită și PTL precoce, se produce o creștere a concentrației intracelulare de calciu, mediată de receptorii post- sinaptici NMDA, prin creșterea conductanței receptorilor AMPA. Acest fenomen produce creșterea rapidă a numărului de spine dendritice (18). Cea de a doua fază, numită PTL tardivă, este caracterizată printr-o sinteză crescută de proteine.
Până cu puțin timp în urmă, singura modalitate de a studia memoria a fost cea farmacologică. Recent, a apărut o modalitate de a “marca” celulele “engramatice”, folosind exprimarea prin inserția genei rodopsinei în celulele nervoase (19). Stimularea celulei prin engramare duce la exprimarea de rodopsină vizibilă la microscopie optică și electronică, după excitarea cu lungimi de undă specifice. Această nouă ramură a cercetării se numește optogenetică, dar nu este disponibilă pentru multe laboratoare din lume, ce necesită să se limiteze la unealta farmacologică.
Una din descoperirile interesante ale investigației optogenetice a fost că faza tardivă a potențării pe termen lung, caracterizată prin sinteza de proteină nu este absolut necesară pentru a crea amintiri, și nici pentru accesarea acestora. Administrarea de Inhibitoare de Sinteză proteică (ISP) la șoareci nu a inhibat reamintirea completă în condițiile în care a fost nevoie de acestea.
Descoperirea că amnezia retrogradă indusă de către ISP este reversibilă a dus la apariția teoriei că nu neapărat proteinele sunt suportul amintirilor, ci modelele de conectivitate sinaptică. Astfel, chiar dacă sprijinul celular sprijinul celular este redus, păstrarea sinapselor ar putea reactiva accesarea amintirilor. Ca urmare, orice modalitate de a activa sinapsele ar putea stimula memorizarea și ar îmbunătăți recuperarea amintirilor (20).
1.2.1. LOCALIZĂRI CEREBRALE ALE MEMORIEI
Prima identificare istorică a localizării cerebrale a memoriei a fost realizată la un pacient american bolnav de epilepsie, în anii 50. Întrucât crizele deveneau din ce în ce mai dese, iar pacientul nu răspundea la tratament s-a hotărât o intervenție radicală, și anume lobectomia temporală bilaterală.
Operația a reușit, crizele comițiale au încetat, dar pacientul a dezvoltat amnezie completă pe termen mediu și lung. Deși amintirile vechi nu erau afectate, iar identitatea personală, chestiunile procedurale și capacitatea profesională au fost păstrate, toate amintirile începând cu aproximativ 2 ani înainte de intervenție s-au pierdut.
În plus, deși memoria pe termen scurt funcționa, pacientul nu mai era capabil de a forma amintiri pe termen scurt și lung, capacitatea sa de retenție reducându-se la aproximativ o oră.
Ca urmare, de atunci, nici un neurochirurg nu a mai realizat o lobectomie temporală bilaterală, și nici cele unilaterale nu sunt permise cu ușurință.
Din punct de vedere cognitiv, această istorie adevărată este prima viziune pe care au avut-o neuroștiințele moderne asupra localizării anatomice a memoriei (Figura 1.2.).
Figura 1.2. Localizările cerebrale ale memoriei (modificat după (21)
1.2.2. FORMAREA MODELELOR SPECIFICE DE CONECTIVITATE ALE ENGRAMELOR
Amintirile pot fi definite ca circuite specifice care generează răspunsurile comportamentale și motorii specifice ca răspuns la stimuli externi (22).
Una din căile prin care s-ar putea obține acest efect ar putea fi activarea de așa numite conexiuni sinaptice “tăcute” (23). O altă variantă ar fi apariția de noi sinapse cu ajutorul sintezei proteice locale, la nivelul dendritelor.
1.2.3. SUPORTUL BIOLOGIC CELULAR AL MEMORIEI
Studii pe memorie folosind pești și rozătoare au demonstrat că memoria pe termen lung necesită sinteză proteică, în vreme ce memoria pe termen scurt nu o necesită (24).
Studii de biologie moleculară au identificat mai multe gene ce contribuie la plasticitatea neuronală și la memoria pe termen lung (gene precoce imediate) de tip c-fas, arc, și altele (25). ARN-urile lor mesager au fost localizate în dendritele distale și în sinapse, iar blocarea lor cu substanțe specifice in vitro a dus la inhibiția plasticității de învățare (26).
Folosind o cultură de neuroni de Aplysia (un melc marin de mari dimensiuni), grupul lui Kelsey Martin a ajuns la concluzia că neuronii nu sunt unități de plasticitate, ci sinapsele. Având în vedere că sinapsele sunt unități non-autonome, ce implică complexul pre-sinaptic, pe cel post-sinaptic dar și glia înconjurătoare, a apărut ideea că glia poate transforma informația genetică de la o celulă la alta, sub formă de ARN de transfer și micro ARN. Această ipoteză a adăugat un strat suplimentar la complexitatea acestui punct de vedere asupra memoriei (9).
Punctul de vederea al biologului celular este însă limitat din chiar cauza acestei complexități teoretice: se vorbește de transcriptorul neuronal, apoi de transferul de gene prin veziculele sinaptice, interacțiunile între moleculele de adeziune celulară și dinamicile matricei extracelulare. S-a ajuns la nivelul la care unii cercetători au propus ca suportul fiziologic a amintirilor să fie modelul de găuri de la nivelul rețelei perineuronale, o structură matricială extracelulară ultraspecializată care se formează la sfârșitul perioadelor critice pentru creier (27).
1.2.4. AMORSAREA EPIGENETICĂ ÎN NEURONII ENGRAMATICI
Noțiunea de “amorsare” epigenetică reprezintă sinteza de noi proteine prin activarea de gene dominante (epigenetică) de la nivelul celulei. Încercările de a identifica localizarea fizică a amintirilor au dus la încercarea de a oferi diverselor tipuri de fenomene biochimice neurale rolul de suport fizic al memoriei.
Acetilarea histonelor poate fi un astfel de efect. Mutațiile genei CBS, care este esențială pentru acetilarea histonelor, produce retard intelectual sever atât la oameni cât și la șoareci (28). Aceste efecte pot fi îmbunătățite de inhibitori de histon-deacetilază (HDAC), care ameliorează deficitele cognitive, ba chiar au redus deficitul de memorie de la modelele murine de boală Alzheimer (29). Alte mecanisme prin care s-ar putea fixa memoria sunt metilarea și hidroximetilarea ADN-ului, modificările topologice ale cromatinei sub influența topoizomerazei II β (30).
Un scenariu plauzibil privind mecanismul subcelular neuronal de formare a amintirilor ar putea fi următorul:
Faza inițială produce un eveniment de memorare ce este dependent de sinteza proteică;
În faza de consolidare a amintirilor se produc modificări pe termen lung a cromatinei și histonelor prin acetilare, metilare, etc.
Recuperarea repetată a amintirii semnalizează celulelor engramatice să înceapă sinteza de noi proteine și să-și organizeze noi sinapse.
Circuitele sinaptice nou create reprezintă engramele noi, ce vor fi întărite de fiecare dată când amintirea respectivă este re-accesată. De aceea, prin acest mecanism s-ar putea explica de ce după neurodegenerescențe considerabile, precum în Alzheimer, cele mai vechi și mai accesate amintiri sunt încă disponibile, spre deosebire de cele noi, incomplet fixate.
Acest set de ipoteze nu reprezintă însă decât un scenariu plauzibil, dar incomplet.
1.2.5. FENOMENE SUPRACELULARE IMPLICATE ÎN MEMORIE ȘI FORMAȚIUNI CORTICALE ȘI SUBCORTICALE
Memoriile (amintirile) nu reprezintă imagini statice ale unor momente fixe în timp, ci generalizări bazate pe experiențe similar. Astfel, când identificăm o persoană într-o mulțime, am identificat un model cunoscut (persoana) și l-am completat cu datele de moment (îmbrăcăminte, localizare, etc). Aceste 2 fenomene nu stau la baza funcționării memoriei: separarea modelelor și completarea modelelor.
În ultimii ani, s-a identificat formațiunea numită Girus Dentat (GD), din hipocamp ca fiind poarta principală a informației către hipocamp, ceea ce stă la baza formării amintirilor. Pe de altă parte, recent s-a dovedit că GD este unul dintre cele 2 localizări unde neuronii se divid și formează noi neuroni (31).
Hipocampul este împărțit în patru regiuni majore. GD primește informații de la cortexul entorhinal (CE). Această zonă se numește astfel datorită faptului că se găsește interior de șanțul (sulcusul) rinal. Calea este numită perforantă, iar nivelul CE se realizează amintirile declarative (semantice, autobiografice și episodice) și mai ales memoria spațială (32).
Apoi, din GD se proiectează pe calea fibrelor mossy în hipocamp, în straturile C1 și C3, formând calea clasică trisinaptică. Pe de altă parte, în hipocamp și în girusul dentat neuronii se divid, producând așa – numitele celule granulare dentate de maturitate (CGDM).
Aceste celule se nasc și se maturează local, aproximativ la 4-6 săptămâni de la naștere. Ele prezintă o excitabilitate mai mare, sunt mai puțin inhibate de interneuronii locali, cu o cantitate mai mare de stimuli de intrare, și prezintă o plasticitate sinaptică mai mare decât celulele mature.
De aceea, se pare că GDGM – urile sunt mai capabile de a realiza sarcini computaționale specifice hipocampului, mai ales separația comportamentală a modelelor (33).
1.2.6. MECANISMELE DE MEMORARE ALE SECVENȚELOR TEMPORALE ȘI ALE INTERVALELOR
În memoria procedurală și episodică, localizarea temporală și ordinea evenimentelor sunt esențiale. De unde și cum se stochează informațiile în creier rămâne un mister.
Postulatul lui Hebb (34) stipulează că o activitate generată de o experiență perceptuală reverberează de-a lungul unor căi sinaptice specifice. Repetarea acestor descărcări produce localizarea sinaptică a momentului în timp, conform principiului “celulele care se descarcă împreună se cuplează împreună”. Fenomenul de STDP (Spike-Timing Dependent Plasticity) sau de plasticitate dependentă de timpul stimulării reprezintă apariția de sinapse suplimentare datorate stimulării rapide (spike-timing). Considerate inițial ca fiind suportul fiziologic celular al PTL, STDP este considerată de asemenea și o explicație potențială pentru crearea de rețele polisinaptice. Experimente folosind neuroni hipocampici în cultură, supuși la stimulări rapide, au demonstrat că aceștia creează rețele spontane între celulele independente. Aceasta a dus la ipoteza lanțurilor de neuroni cu descărcare sincronă (lanțuri synfire) care ar putea codifica intervale temporale (35, 36).
Memoria pe termen scurt nu poate fi însă explicată prin STDP, spre deosebire de cea pe termen lung.
Totuși, studii recente au demonstrat în hipocamp existența unor “celule cronometru”, care se descarcă la intervale regulate (37).
Descoperirea unui “cronometru” intim ar fi o descoperire fundamentală în neurofiziologia memoriei, întrucât memoria episodică și cea a datelor și timpului sunt esențiale pentru generarea tuturor celorlalte tipuri de amintiri. De asemenea, timpul subiectiv este diferit de cel real, percepția evenimentelor fiind mai lentă sau mai rapidă în funcție de impactul emoțional al experienței. Pe de altă parte, circuitele corticale dependente de timp par a fi și ele foarte sensibile la degenerescențele neurologice, amintirile dependente de timp fiind de cele mai multe ori cel mai frecvent afectate de bolile neuro – degenerative.
1.2.7. ÎNVĂȚAREA PRIN EXPERIENȚĂ UNICĂ
Amintirile nu se fixează imediat, ci evoluează în timp. Există o multitudine de capacități complexe ce nu pot fi stăpânite decât după sute sau mii de repetiții (dans, mers pe bicicletă, etc), în vreme ce evenimente unice sunt reținute în detalii foarte fine, fără repetiții (o întâlnire esențială, etc).
Creierul reușește astfel de performanțe prin repetarea de sute de ori a evenimentului sau a unor segmente ale acestuia, la nivel subconștient, în timpul stărilor ne-atenționale ale creierului (reverie). Aceste repetiții se numesc sharp wave-ripples (SPW-Rs) hipocampice și s-ar putea traduce ca reverberații acute de scurtă durată. Aceste SPW-Rs sunt folosite pentru a comprima temporal evenimentul și apoi pentru a-l distribui celorlalte regiuni ale creierului (38).
Complexele SPW-Rs sunt prezente la toate mamiferele și sunt cele mai sincrone evenimente din creierul uman și animal.
Aceste fenomene apar când creierul este într-un repaus parțial, sau cel puțin într-o perioadă de activitate minimă (în timpul alimentației sau în timpul somnului cu unde lente). De asemenea, este nevoie ca nivelul neuromodulatorilor să fie cât mai scăzut în această perioadă.
CAPITOLUL 2
ÎNVĂȚAREA
Scopul învățării de la reacțiile automate ale nevertebratelor până la fenomenele complexe ale învățării la om, este de a îmbunătăți adaptarea organismului la schimbările continue din mediul înconjurător prin apelarea la situații anterioare similar. Trăim într-o lume repetitivă care este guvernată de cicluri nesfârșite, fie ele fiziologice, nictemerale, alimentare până la cele sociale.
Caracteristica unui ciclu este că se alcătuiește dintr-o serie de evenimente înlănțuite, care, cu puține excepții, duc la consecințe similare. Astfel, creierul (și sistemele nervoase în general) au tendința de a reține parțial sau total secvențele de evenimente, astfel putând anticipa rezultatele și a le folosi într-o mai bună șansă de supraviețuire și evoluție.
Studii multiple de-a lungul anilor au demonstrat că există o multitudine de sisteme neurale disociabile pentru memoria motorie, evenimente emoționale, recompensă sau evitare, percepții senzoriale etc., lucru demonstrat prin fenomene amnezice de diverse tipuri după traumatisme sau după intervenții farmacologice (39). Orice amintire este un hibrid alcătuit dintr-o multitudine de circuite neurale.
Există o multitudine de ipoteze care presupune că în creierul de mamifer există multiple sisteme de memorizare (40).
Una din teoriile cele mai complexe este cea sprijinită de Eichenbaum (1) care separă memoria procedurală de cea declarativă. Memoria declarativă necesită achiziția, consolidarea și recuperarea de informații ce permit flexibilizarea exprimării comportamentale. Memoria procedurală reprezintă aceleași fenomene dar exprimate comportamental într-o manieră inflexibilă.
Învățarea procedurală este dependentă de nucleii dorsali ai striatului (caudat-putamen). Aceste date sunt obținute prin studii farmacologice și lezionale sau electrofiziologice (41, 42). La acest tip de memorie pot fi asociate și condiționarea cerebrală clasică a musculaturii scheletice sau învățarea bazată pe relația stimul–afect, ce implică amigdala bazo-laterală (43).
Învățarea declarativă/cognitivă este dependentă de hipocamp, deoarece leziunile acestuia la șobolan sau la maimuță le afectează, în timp ce sarcinile ce necesită doar învățare procedurală sunt păstrate (44).
2.1. HABITUAREA
Habituarea este definită ca o scădere a unui răspuns comportamental care apare datorită stimulării repetate și nu implică oboseala senzorială și sau motorie (45, 46).
Există nouă caracteristici ale habituării care au fost descrise de Thompson și Spencer (1966)(47):
Aplicarea repetată a unui stimul duce la scăderea progresivă a unui parametru de răspuns în memoria asimptomatică.
Dacă stimulul este oprit după scăderea răspunsului, răspunsul se recuperează cel puțin parțial (“recuperare spontană”).
După o serie multiplă de repetări și recuperări spontane, scăderea răspunsului devine din ce în ce mai rapidă și/sau mai pronunțată (potențarea habituării).
Stimulare mai frecventă produce o scădere mai pronunțată a răspunsului.
Cu cât stimulul este mai slab, cu atât habituarea este mai pronunțată.
Cu cât stimularea se repetă mai mult, cu atât habituarea este mai importantă.
Habituarea răspunsului la un stimul dat produce generalizarea efectului și la alți stimuli.
Aplicația unui stimul suplimentar duce la creșterea răspunsului (dishabituare).
La aplicarea repetată a stimulului de dishabituare, apare fenomenul de “ habituare a dishabituării”.
Habituarea a fost descrisă inițial pentru răspunsurile reflexe, dar studii ulterioare au demonstrat că și proprietățile senzoriale sau comportamentale se pot habitua (48) sau chiar și cele neuro-endocrine (49), de exemplu axul hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenal.
Habituarea a fost descrisă pentru prima oară în fabula lui Esop, acum 2500 de ani despre “băiatul care striga lupul!”. Repetarea inutilă a unui stimul, în cazul acesta alerta, a dus la scăderea răspunsului la stimulare până la ignorarea acestuia, fenomen care s-a dovedit fatal pentru nefericitul protagonist.
Contrariul habituării este sensibilizarea, caracterizată prin creșterea sensibilității la un stimul după expuneri repetate. Aceasta este eficientă, în condițiile în care evită repetarea de episoade potențial periculoase (50).
2.2. CONCEPTE ÎN INVESTIGAREA EXPERIMENTALĂ A MEMORIEI ȘI ÎNVĂȚĂRII
2.2.1.EXTINCȚIA
Este un fenomen care apare atât în comportamentul condiționat, și anume când comportamentul operant nu mai este ranforsat, atunci se produce evitarea de frică (fear avoidance) datorită unui stimul neplăcut, din momentul în care intrarea în camera de stimulare nu mai este însoțită de stimulul neplăcut, reacția de evitare slăbește în timp, până dispare.
În psihologie/psihiatrie se consideră că stările anxioase, fobiile și PTSA (Tulburarea de stres post-traumatic) sunt datorate extincției deficitare.
2.2.2. REACȚIA DE EVITARE DE FRICĂ (FEAR CONDITIONING)
Este o paradigmă experimentală în care animalele învață să prezică evenimente adverse. Este de obicei realizată prin asocierea unui stimul neutru (o cameră nouă, un miros, un sunet) cu un stimul advers (un șoc electric).
Animalul poate reacționa fie prin reacția de înghețare (freezing) sau prin reflexul de spaimă (startle).
Condiționarea prin evitare este dependentă de amigdală și hipocamp și este supusă regulilor de învățare hebbiană, precum și fenomenului de extincție.
2.2.3. CONDIȚIONAREA
Este o procedură de învățare în care un stimul puternic biologic (de obicei hrană) este împerecheat cu un stimul neutru. Stimulul biologic se numește stimul necondiționat, cel neutru devine stimul condiționat.
Condiționarea poate fi anterogradă sau retrogradă. Condiționarea anterogradă este mai rapidă către învățare.
Ea are mai multe variante:
Condiționarea întârziată – stimulul condiționat este prezentat și apoi stimulul necondiționat este introdus. După câteva repetări, animalul este condiționat.
Condiționarea pe traseu (trace conditioning).
Când se aplică un stimul condiționat și după un interval se aplică și stimulul necondiționat, intervalul de timp se numește traseu. Lungimea intervalului, sau a traseului, este și ea dependentă de factori interneuronali.
Condiționarea simultană – când ambii stimuli sunt prezentați în același timp.
Condiționarea de ordinul doi sau superioară. Odată cu stimulul condiționat este introdus și un stimul suplimentar. Când animalul reacționează și la acest stimul, atunci apare condiționarea de ordinul II.
Modularea memoriei
Cercetarea modulării memoriei a început cu studierea efectelor substanțelor medicamentoase asupra învățării și recuperării amintirilor. Primele cercetări au fost cele ale lui Lashley, în 1917, privind efectul stricninei asupra șobolanilor într-un labirint.
Substanțele care pot modula învățarea și memoria sunt multiple, printre ele însă sunt o serie de substanțe endogene esențiale (51).
Adrenalina
Gold și Van Buskirk au raportat primii, în 1975 și 1978 că adrenalina crește retenția evitării inhibitorii atunci când este administrată după testare. De vreme ce catecolaminele nu prea trec bine prin BHE, s-a emis ipoteza că ele acționează mai ales prin intermediul adrenoreceptorilor periferici, localizați pe aferenți vagali ce se proiectează prin intermediul NTS (nucleul tractului solitar) către locus coeruleus și creierul anterior. De asemenea, s-a demonstrat că preadministrarea de sotalol, un β – blocant cu penetrare redusă în BHE, reduce efectele stimulatoare ale adrenalinei asupra memoriei și învățării, ceea ce vine în sprijinul ipotezei β –adrenoreceptorilor periferici (52).
Glucocorticoizii
Injecții post – antrenament de glucocorticoizi stimulează retenția și învățarea. Hormonii glucocorticoizi sunt foarte lipofili, trec ne-afectați prin BHE și se leagă de receptorii mineralocorticoizi (MR) și pe receptorii glucocorticoizi (GR). Hormonii glucocorticoizi acționează prin intermediul efectelor genomice și produc stimularea transcripției genice direct sau prin activarea de factori transcripționali precum precum jum și fos.
De principiu, cele 2 grupe de hormoni acționează sinergic, atât adrenalina cât și cortisolul. Efectul permisiv al adrenalinei asupra eliberării de glucoză din ficat, precum și efectul glucoenergetic al cortisolului și corticosteronului au fost implicați în activarea consolidării memoriei. Administrarea de propranolol a inhibat consolidarea indusă de cortisol, în vreme ce administrarea de yohimbină (agonist α2 adrenoreceptor) crește retenția.
Influențe colinergice asupra învățării și memoriei
Administrarea de antagoniști sau agoniști colinergici la nivel amigdalian produc stimularea sau reducerea memoriei pentru toate tipurile de învățare, inclusiv evitarea de inhibiție, condiționarea pavlovniană de frică, preferința de localizare condiționare și condiționarea pozitivă de recompensă. În plus, lezarea nucleului bazal, care este sursa majoră de inervație colinergică amigdalo-hipocampică, reduce retenția de evitare, în vreme ce injecțiile bazale de oxotremorină (medicament parasimpatomimetic) sau fizostigmină (alcaloid colinomimetic de tip inhibitor de colinesterază) atenuează tulburările de memorie (53).
2.2.4. IMPLICAȚII NEURONALE PENTRU HABITUARE
Serotonina modulează habituarea la animalele inferioare până la rozătoare. Scăderea medicamentoasă a medierii serotoninergice hipocampice duce la scăderea fenomenului de habituare (54). Administrarea de agoniști ai receptorilor 5HT a crescut habituarea. Este clar că există un rol semnificativ pentru serotonină în mecanismul habituării, dar funcțiile și localizările exacte ale receptorilor 5HT cerebrali implicați în acest proces nu sunt încă clare.
Acetilcolina are un rol clar în învățare și memorie. Șobolanii tratați cu scopolamină au demonstrat deficite de habituare. Pe de altă parte, administrarea de tacrin, un inhibitor nespecific de colinesterază, direct în nucleul accumbens, a crescut habituarea (55). Aceste rezultate, împreună cu studiile folosind nicotină au demonstrat un rol în memoria legată de habituare. Acetilcolina hipocampică are de asemenea un rol important în consolidarea memoriei, deoarece blocarea receptorilor colinergici cu scopolamină după sarcina de habituare produce amnezie retrogradă la șobolani (56).
2.3.SUBSTANȚE IMPLICATE ÎN ÎNVĂȚARE
2.3.1. DOPAMINA
Studiile folosind șoareci knockout pentru receptorii dopaminergici cerebrali D1 și D3 au demonstrat hiperactivitate locomotorie și habituare crescută (57).
Rezultatele privind învățarea și receptorii dopaminergici sunt contradictorii, iar consensul general este că mediația dopaminergică afectează habituarea și alte mecanisme ale învățării în mod indirect, mai ales modificând procesele atenționale și motivația, care ar putea crește sau scădea învățarea și memoria (58).
Ca și noradrenalina, dopamina crește în aplicarea de stresori și crește retenția, în vreme ce micro injecțiile de blocanți ai receptorilor D1 sau D2 scad retenția. De asemenea, studii de microdializă au demonstrat că există o corelație cantitativă între cantitatea de dopamină și retenția de memorie la șobolani la 2 zile după evitarea de inhibiție (59).
2.3.2.ENDOCANABINOIZII
Cercetări experimentale au demonstrat că semnalizarea endocanabinoidă în amigdală, cortexul prefrontal și hipocamp sunt implicate în mod esențial în consolidarea amintirilor emoționale (60). Se pare că polimorfismul unei gene ce lizează endocanabinoizii (FAAH) (hidroliza amidelor acizilor grași) este responsabil pentru creșterea nivelului endocanabinoizilor și crește extincția la șoareci (61), iar administrarea de canabinoizi exogeni a crescut extincția fricii condiționate.
2.3.3.RECEPTORII NMDA
Acțiunile glutamatului la nivelul receptorului NMDA sunt esențiale pentru majoritatea formelor de plasticitate neuronală și memorie, și antagoniștii de NMDA inhibă extincția fricii condiționate. Antagoniștii NMDA, de tip cicloserină au efecte inverse, anxiolitice prin reducerea extincției. Pe de altă parte, receptorii NMDA pot avea efecte excitotoxice la nivel neuronal, ceea ce le scade valoarea ca țintă a stimulării permanente. Totuși, mai multe studii au arătat că administrarea de D- cicloserină are efecte benefice în cazuri de anxietate socială, tulburări obsesiv-compulsive și tulburări de panică.
Receptorii AMPA sunt responsabili pentru curenții rapizi excitatori din creier, dar au și ei un risc important de excitotoxicitate.
Totuși, în ultimii ani s-au dezvoltat o serie de medicamente, denumite generic ampakine, care modulează alosteric activitatea la nivelul acestor receptori. Ei pot acționa prin 2 mecanisme: în primul rând, crescând răspunsul la nivelul receptorilor AMPA; ei sunt stimulatori cognitivi de fază acută; în al doilea rând, prin creșterea răspunsului postsinaptic, ei pot stimula mecanismele de lungă durată ale memoriei (62).
2.3.4. GLUTAMATUL
Acesta afectează retenția memoriei la administrarea intra-hipocampică după ce s-a realizat habituarea, în vreme ce antagoniștii receptorilor NMDA scad retenția (63). Când se administrează direct în nucleul accumbens, antagoniștii de receptori NMDA afectează procesarea informației spațiale (64).
Blocanții de receptori AMPA interferă cu habituarea și retenția acesteia când este administrată în hipocamp (65). Aceste rezultate sugerează că mediația glutamatergică este implicată în activitatea motorie, habituare și retenția habituării (figura 2.1.).
Figura 2.1. Cascada de semnalizare a mediației glutamatergice (modificat după (66))
2.3.5. ALTE SUBSTANȚE
Glucoza și insulina are efecte opuse asupra habituării, cu glucoza crescând habituarea iar insulina scăzând-o. Kopf și Baralti (1999) au demonstrat în aceste studii că medierea atât prin glucoză cât și influența insulinei au fost mediate prin mecanisme colinergice (67) .
Fragmentele de colecistokinină Bac-CCK-4 și CCK-85, administrate periferic, au îmbunătățit retenția (68).
Cafeina administrată înainte de training a alterat în sens negativ habituarea, dar nu a avut nici un efect la administrarea post-antrenament (69).
2.3.6. MONOXIDUL DE AZOT
Oxidul nitric pare a avea și el un rol în habituare. Șobolanii ce au primit L-NMDA, un inhibitor de NOS (nitric-oxid-synthase) au prezentat deficit de habituare (70). Șobolanii bătrâni, de cel puțin 18 luni, care prezintă un deficit al eNOS (NOS endotelială) asociat cu vârsta, prezintă deficit de habituare (71).
2.3.7. ANGIOTENSINA
Efectele angiotensinei II pot fi separate în 2 categorii:
Efectele vasculare ale angiotensinelor și receptorilor angiotensinergici asupra circulației sanguine cerebrale și asupra evoluției și supraviețuirii celulelor diverselor structuri celulare
Efectele directe ale mediației angiotensinergice asupra celulei nervoase, gliei și ansamblurilor celulare ce stau la baza memoriei, comportamentului, șamd.
Studiile cele mai multe și mai frecvente au fost realizate pe pacienți cu boli neurodegenerative, precum Alzheimer, Parkinson, demențe vasculare, etc., precum și pe modele animale ale acestora, fie chimice, moleculare sau lezionale. Deși este destul de dificil de separat cele 2 categorii de efecte, multe studii citează angiotensina ca factor cauzal în tulburările neurodegenerative și /sau afectările de memorie adiacente (72).
Nivelele crescute de ang II duc la creșterea activării AT1R, pe care mai multe studii le-au asociat cu acumularea de amiloid β (Aβ) și proteina tau (τ) (73).
Și studiile epidemiologice sugerează că administrarea prelungită de IECA (Inhibitori de Enzimă de Conversie) sau de blocanți de receptori AT1, mai ales în scopul tratării hipertensiunii arteriale cronice, au avut și efecte protectoare împotriva declinului cognitiv (74).
Pe de altă parte, mai multe studii sugerează că de fapt declinul cognitiv nu este exclusiv datorat Ang II, ci și altor fragmente angiotensinice mai ales a angiotensinei IV (75).
Mecanismele prin care angiotensinele induc deficit cognitiv nu sunt încă elucidate. Studii imagistice au demonstrat atrofie semnificativă a lobului mediotemporal al cortexului, acolo unde este localizat hipocampul, formațiune esențială pentru memorie (76).
La nivelul hipocampului se găsește una dintre puținele localizări ale regenerării sistemului nervos și locul unde se produc noi neuroni (77). La acest nivel se găsesc celule stem neurale hipocampice ce se pot divide și forma noi trasee corticale, generate de stimuli comportamentali. Studii de lezare a neurogenezei hipocampice prin mijloace farmacologice sau iradiere au evidențiat efect de reducere a memoriei (78).
Un studiu interesant a demonstrat că administrarea de Ang II pe culturi de celule stem neurale hipocampice a indus moartea apoptotică a acestora, fenomen dependent de AT1R (79), și de asemeni a crescut cantitatea de specii radicale ale oxigenului (SRO) prin devierea metabolismului mitocondrial, ceea ce a activat PPAR ᵧ (80).
S-a demonstrat de asemeni că BRA (blocanți de receptori angiotensinici sunt puternici inhibitori ai cascadei moleculare a acidului kynurenic (KYNA), care este la rândul său un blocant ubiquitar pentru receptorii ionotropici Glu, NMDA și Kainat. Nivele corticale crescute de KYNA în cortex au efecte lezante asupra memoriei și comportamentului, fiind descoperite la schizofrenici și la modelele animale de tip schizofrenie. Este posibil astfel ca din căile prin care ARB (losartan, candesartan, irbesartan, etc) să aibă efecte pozitive asupra memoriei și comportamentului (81).
Situsuri de cuplare pentru Ang II au fost descoperite în cortex, hipocamp și diencefal (82), iar efectele administrării acesteia, atât sistemice cât și locale au produs achiziția memoriei și reducerea potențării pe termen lung în hipocamp (83).
S-au observat în unele studii și îmbunătățiri ai parametrilor cognitivi, dar s-au dovedit că efectele benefice s-au datorat sintezei imediate de AT IV (84) la locul injecției. Un studiu a demonstrat că blocajul AT1R cu candesartan a fost dependent de vârstă și de tipul de test. Studiile aversive au fost îmbunătățite de candesartan la șobolanii în vârstă, dar nu și la cei tineri, în schimb studiile cu stimuli pozitivi au fost îmbunătățite indiferent de vârstă (85).
Pe un model de boală Alzheimer cu streptozocină, s-a demonstrat că atât captoprilul cât și valsartanul au atenuat radicalii liberi ai oxigenului și azotului. Astfel, inhibiția ACE poate îmbunătăți sistemul de apărare antioxidant (86), iar blocarea efectelor Ang II prin intermediul AT1R este responsabilă pentru reducerea leziunilor neuronale de origine mitocondrială, mediate prin PPAR ᵧ.
Angiotensina II cerebrală este propusă pentru implicarea în fiziopatologia bolii Alzheimer. Administrarea de ang II intracerebral la șoarece prin canulă i.c.v. și pompă osmotică au fost însoțite de teste care să evalueze controlul motor și coordonarea senzomotorie, de tip retard. Pentru evaluarea învățării spațiale și a funcției memoriei, s-a folosit testul acvatic Morris.
S-a măsurat perfuzia cerebrală folosind o sondă laser, după care s-a efectuat histologia pe creiere, măsurarea superoxidului cerebral și evaluarea gradului de permeabilizare a BHE.
În sfârșit, depunerea de proteină amiloid β, măsurarea fibrozei cardiace și a fibrei musculare de gastrocnemian au fost realizate, având în vedere înrudirea funcțională între boala Alzheimer și insuficiența cardiacă prin fibroză miocardică difuză și cu sarcopenia (87).
Rezultatele au demonstrat că șoarecii transgenici cu dezvoltare spontană de BA prezentat o susceptibilitate mai mare la tulburările cognitive induse de ang II. De asemenea, Ang II a indus atrofie a mușchilor scheletici și leziuni cardiace de tip fibrotic, ceea ce sugerează că ang II de origine cerebrală poate trece în direcție inversă prin BHE.
Depunerea de proteină amiloid β (PAB) a fost semnificativ crescută la șoareci cu BA congenitală, deși la șoarecii de tip sălbatic nu s-a întâmplat acest lucru.
Această constatare a dus la ideea că nivele crescute de Ang II nu sunt neapărat cauzative pentru BA, ci mai degrabă agravante pentru un individ cu predispoziție sau pentru cazuri în care evoluția Bolii Alzheimer a și început deja (88).
Un studiu molecular recent (89) a demonstrat că șoarecii care au primit Ang II au prezentat o creșterea a numărului de celule gliale (glioză) sau modificări fenotipice ale celulelor gliale. Acest fenomen nu a fost dependent de hipertensiune indusă de Ang II, ci a fost un fenomen de sine stătător. Pe de altă parte, microglia a demonstrat diferențe ultrastructurale semnificative față de martori, iar cantitatea de interleukine proinflamatorii a fost crescută (TNF-α și IL-6). Concluzia acestui studiu extensiv a fost că Ang II induce inflamație hipocampică și glioză cerebrală. Aceste fenomene ar putea explica efectele dăunătoare ale Ang II asupra memoriei și comportamentului, ca și efectele benefice ale blocării mediației angiotensinergice cerebrale cu BRA (90).
Sistemul renină-angiotensină cerebral este independent de SRA sistemic și conține fiecare precursor și enzimă necesară pentru sinteza de Ang II și Ang IV (91). De vreme ce BRA au avut efecte benefice asupra memoriei, potențării pe termen lung și a fluxului sanguin cerebral (FSC), se pare că Ang IV, prin receptorii săi (AT4R) mediază aceste efecte benefice (92).
Studiul lui Royea și col (2017) (93) a demonstrat că beneficiile cognitive ale losartanului au fost inhibate de blocarea receptorilor AT4R folosind divalinal (94). Acesta a inhibat învățarea spațială și memoria. Pe de altă parte, nici administrarea de losartan nici divalinal nu au afectat patologia Aβ la șoarecii transgenici de tip C57BL/6 ce exprimă proteina precursor amiloidă (APP).
Aceste rezultate demonstrează că performanța memoriei (95) și memoria spațială sunt dependente de AT4 (96), în timp ce depunerea de Aβ și τ nu sunt dependente de acestea.
2.3.8. ANGIOTENSINA 1-7 ȘI EFECTELE SALE LA NIVELUL SISTEMULUI NERVOS. IMPLICAREA ANG. 1-7 ÎN CEREBROPROTECȚIE, ÎNVĂȚARE ȘI MEMORIE
Percepția liniară a sistemului renină – angiotensină s-a modificat în mod semnificativ în ultimele decenii. În locul unei cascade dintre Angen –Ang I – Ang II – ATR, aceasta se bifurcă în funcție de fragmentul implicat și linia sa de semnalizare: Ang II/AT1R și Ang 1-7/mas (97). De asemeni, ang III, IV și ang 1-9 sunt peptide biologice active, cu receptorii și localizările lor și efectele lor specifice (98).
Ang 1-7 este peptidul angiotensinic cu cea mai mare distribuție în SNC și are o expresie aproape ubiquitară în creier, mai ales în hipocamp, amigdală și hipotalamus. Cea mai mare expresie a ang. 1-7 este în hipocamp, iar blocada receptorilor Mas de la acest nivel duce la deficite de recunoaștere a obiectelor (99). Una din căile moleculare posibile este sinteza de NO (monoxid de azot), esențial pentru memoria de recunoaștere a obiectelor, deoarece ang. 1-7, prin intermediul său Mas, crește densitatea expresiei “NOS” (NO-sintaza –neuronală) (100). De asemenea, Mas poate modula fluxul sanguin cerebral și micro circulația prin mai multe mecanisme, astfel protejând împotriva ischemiei cerebrale (101).
Angiotensina 1-7 se dovedește a fi un peptid de o importanță esențială în învățare și memorie, astfel că studiul său pe modele de neuro-degenerescență este plin de rezultate potențiale și trebuie continuat, folosind aceleași metode de investigație sau scara lor trebuie lărgită în mod semnificativ.
2.4. ABORDURI FARMACOLOGICE LA NIVELUL SRA ÎN COGNIȚIE, MEMORIE ȘI ÎNVĂȚARE
2.4.1. EFECTE ALE INHIBITORILOR ENZIMEI DE CONVERSIE
Pe un model de amnezie indus de scopolamină, bine-cunoscută ca mimând efectele cognitive și comportamentale ale bolii Alzheimer, (102), folosind teste de tip Elevated plus maze (103), testul de evitare pasivă, testul labirintului acvatic Morris, lisinoprilul și fosinoprilul au scăzut latența de transfer, retenția memoriei, dar nu au îmbunătățit în mod semnificativ parametrii învățării și memoriei în labirintul acvatic Morris (104).
Pe un studiu care a folosit administrarea intracerebroventriculară (i.c.v) de colchicină (105) și perindopril, s-a demonstrat că blocarea ECA a redus inhibiția memoriei la șoarecii tratați cu colchicină. Se știe că colchicina este un agent inhibitor al diviziunii celulare prin tulburarea dezvoltării microtubulare, care produce alterări microtubulare și, la nivelul sistemului nervos duce la disfuncția transportului axonal și în final la moartea neuronilor (106). De asemenea are și efecte prooxidante și antiinflamatorii. Toate aceste efecte fiind reduse de administrarea de IECA, este de considerat că medicația angiotensinergică este esențială în funcționarea memoriei și comportamentului, iar inhibiția are efecte benefice.
Un studiu interesant și cuprinzător a investigat efectele IECA asupra efectelor comportamentale și cerebroinflamatoare la șobolani (107).
Studiul a investigat efectele administrării de enalapril, perindopril și ramipril, comparativ cu martorul piracetam asupra șobolanilor ce au primit scopolamină, pe labirintul acvatic Morris și testul de cățărare, după care s-au efectuat studii biochimice. Toate trei substanțele IECA au îmbunătățit parametrii comportamentali, ca și parametrii oxidativi cerebrali. Cel mai bun efect asupra retenției de memorie l-a avut perindoprilul.
Toate aceste rezultate sunt în concordanță cu datele de pe ARB, mai ales la nivel cantitativ. Se pare însă că fie generarea de Ang II cerebrală are un efect foarte semnificativ comparativ cu cea sistemică, sau penetrarea IECA prin BHE nu este la fel de eficientă ca a sartanilor, sau lipsa efectului asupra PPAR-Y al IECA este importantă cantitativ întrucât toate rezultatele au fost mai puțin evidente cantitativ decât pentru sartani.
2.4.2. NOȚIUNI DE FARMACOLOGIE A INHIBITORILOR ENZIMEI DE CONVERSIE A ANGIOTENSINEI
Inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei sunt indicați în:
Hipertensiune
Insuficiență cardiacă
Disfuncție ventriculară stângă asimptomatică
Post infarct miocardic
Mecanismul exact al inhibitorilor ECA nu este pe deplin cunoscut. Aceștia intervin la nivelul sistemului renină-angiotensină-aldosteron, dar efectul lor nu este direct legat de nivelul reninei din sânge.
Inhibitorii ECA blochează enzima de conversie a angiotensinei care convertește angiotensina I în angiotensină II. Creșterea scăzută a angiotensinei II îmbunătățește natriureza, reduce presiunea arterială și previne remodelarea mușchilor netezi și cardiaci. Valoarea redusă a presiunii arteriale și venoase reduce atât presarcina cât și postsarcina. De asemenea, se presupune că inhibitorii ECA interferează cu degradarea bradikininei care este o peptidă care provoacă vasodilatație.
Inhibitorii ECA disponibili sunt grupați în trei grupe principale, în funcție de structura lor chimică:
Inhibitori ECA care conțin sulfhidril, – Captopril
Inhibitori ECA dicarboxilici: benzapril, enalapril, lisinopril, moexipril, perindopril, quinapril, ramipril și trandolapril
Inhibitor ECA care conține fosfor, din care există doar unul, fosinopril
Lisinoprilul și captoprilul sunt singurii inhibitori ECA care nu trebuie să fie activați în organism pentru a fi eficienți. Toți ceilalți inhibitori ECA sunt pro-droguri și necesită activare. Cele mai multe dintre acestea ating maximele serice ale serului în decurs de o oră după ingestie. Activarea are loc în ficat (108).
2.4.3. EFECTE DIRECTE ALE BLOCANȚILOR DE RECEPTORI AT1 ASUPRA MEMORIEI ȘI ÎNVĂȚĂRII
Efectele neuroprotectoare ale BRA au fost demonstrate pe modele animale și studii clinice. BRA administrate periferic trec BHE și au efecte centrale directe, reduc inflamația și remodelarea cerebrovasculară, ameliorează efectele accidentelor vasculare cerebrale prin protejarea fluxului de sânge cerebrovascular, reduc leziunile cognitive după iradierea cerebrală totală la șobolani și protejează împotriva componentelor comportamentale asociate cu boala și depresia (109).
Este cunoscut faptul că stresul cronic prelungit este un inhibitor al memoriei și învățării, și este implicat în leziuni microscopice la nivelul structurilor cognitive cerebrale (110). Stresul implică activarea axului hipotalamo-hipofizo-adrenal, care la rândul său activează SRA. Această creștere a stimulării angiotensinergice produce creșterea activării SRA cerebral și crește expresia AT1 în zona hipocampo – amigdaliene (111).
Telmisartanul este unul dintre cele mai folosite medicamente din seria blocanților de receptori AT1, datorită unei serii de caracteristici farmacologice favorabile. Are cea mai lungă semiviață dintre ABR și în același timp este cel mai lipofil, ceea ce-i face trecerea prin bariera hemato-encefalică (BHE) mai ușoară. Studii recente au demonstrat și existența de acțiuni neuroprotectoare directe (112).
Într-un studiu essential asupra comportamentului la șobolanii tratați cu BRA, Braszko și Winczewicz (113) au demonstrat că administrarea de candesartan a ajutat în mod eficient la recuperarea funcțiilor cognitive alterate de stres și a scăzut fenomenele amnezice observate la testele de evitare pasivă și recunoaștere a obiectelor, fără a avea și efecte anxiolitice.
Comparat cu un alt BRA din același grup, pentru candesartan s-a observat și un efect procognitiv asupra loturilor de animale netratate, fenomen probabil explicabil tot prin caracteristicile farmacodinamice ale celor două substanțe (114).
O altă caracteristică interesantă a receptorilor pentru Ang. II este că, cel puțin la nivel cerebral, AT1 nu se co-localizează cu AT2, ceea ce ar putea sugera că o blocare mai eficientă a AT1 ar putea duce la o depresie a AT2, cu efectele sale bine – cunoscute atât asupra markerilor inflamatori cât și asupra parametrilor cognitivi și de memorie (115). De asemeni, potențialul efect al telmisartanului asupra stimulării PPARy ar putea fi luat în calcul.
În ultimii ani s-a dovedit că blocanții de receptori angiotensinici au puternice efecte anti-imflamatorii la nivel cerebrovascular (116).
Este cunoscut faptul că hiperactivitatea receptorilor AT1 este un factor determinant în ceea ce privește inflamația necontrolată și excesivă, modificări ale activității cerebro-vasculare și răspunsurile patologice la stres (117).
Blocarea sistemică a AT1 cu BRA a scăzut în mod semnificativ inflamația cerebrală asociată cu administrarea la LPS hipertensiune arterială și stroke , hemoragii cerebrale și tulburări ischemice (118). Mecanismele prin care se realizează aceste efecte sunt multiple, monitorizate prin reducerea producerii și eliberării de citokine proinflamatorii, reduc cantitatea de corticoizi antiinflamatori, reduc cantitatea de aldosteron circulant, ceea ce reduce stimularea receptorilor mineralocorticoizi (RM) și producerea excesivă de SRO NADPH –oxidativ – dependentă (119).
De asemenea, BRA reduc permeabilitatea BHE și astfel penetrarea acesteia de către macrofage și celulele T către parenchimul cerebral (120).
Cu certitudine, majoritatea efectelor benefice ale BRA sunt indirecte, dar există și rezultate care dovedesc că administrarea sistemică nu numai intracerebrală sau i.c.v. este eficientă. De asemenea, rezultatele în cultură sunt sugestive pentru efecte directe ale BRA (109).
Dacă efectele asupra presiunii arteriale și asupra fluxului sangvin cerebral sunt cunoscute și discutate (121), efectele neuroprotectoare ce depășesc sfera vasculară sunt multiple. Telmisartanul are efecte protectoare asupra fenomenelor cognitive la șobolanii injectați cu amiloid β. De asemenea, BRA sunt protectori pe modelele transgenice de boală Alzheimer la șoarece și reduc declinul memoriei pe modelele de diabet zaharat la șobolan. BRA reduc comportamentul de tip patologic, caracterizat prin izolare, scăderea interacțiunilor sociale.
Într-un studiu recent, Ongali și col. (122) au încercat să co-administreze atât BRA cât și IECA, pe un model murin de boală Alzheimer (AβPP), în speranța că tratamentul va fi mai eficient în manieră combinată decât administrat separat. Au administrat enalapril împreună cu losartan, care are penetrație cerebrală bună. Au studiat funcția cerebro-vasculară, nivelele de metabolism oxidativ, histologia cerebrală, depunerea de proteină τ și amiloid, glioza și nivelele de expresie ale receptorilor AT1 și AT4.
În sfârșit, au testat performanța cognitivă a animalelor. Nici unul dintre tratamente nu a îmbunătățit performanța cognitivă, deși efectele asupra metabolismului oxidativ, vascularizației și inflamației neurale au fost semnificative.
Concluzia lor a fost că enalaprilul nu a avut efecte semnificative, și doar co-administrarea cu losartan a produs efectele amelioratoare observate, deci fie IECA nu reușesc să reducă metabolismul cerebral în mod semnificativ pentru ANG II, fie penetrarea lor prin BHE nu este suficient de bună.
Având în vedere că mulți autori au sugerat că efectul sartanilor este legat mai ales de PPAR ᵧ, autorii au administrat și un antagonist de receptori PPAR ᵧ – GW 9662 și au observat că efectul neuroprotector persistă, deci nu este legat în mod obligatoriu de funcția PPAR ᵧ.
În plus, administrarea i.c.v. de BRA a redus nivelele de noradrenalină plasmatică asociate cu stresul, ceea ce pare că SRA cerebral este conectat în mod semnificativ și cu stresul adrenergic. În plus, antagonismul AT1R a fost asociat și cu suprareglarea BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) (123), ceea ce sprijină eligibilitatea SRA cerebral ca țintă a noilor medicamente.
Efectul direct al stresului asupra cogniției nu este încă suficient cunoscut. În orice caz, blocarea receptorilor AT1 reduce activarea axei HPA la subiecții stresați, ceea ce la rândul său reduce cortisolul plasmatic, reduce nivelele de substanță P, nivelele crescute de SRA ca factori de fundal ai proceselor dăunătoare pe fondul cărora se produce inhibarea memoriei și învățării în stres.
Un alt studiu, al lui Villapol, (124) trece în revistă efectele neuroprotectoare ale BRA în urma leziunilor cerebrale traumatice (LCT). Acest studiu a demonstrat că tratamentul anterior leziunii experimentale reduce volumul lezional și moartea celulară. De asemeni, reduce activarea microglială, ce semnifică reactivitate inflamatorie crescută, fără a afecta astrocitele sau oligodendrocitele mature. Pretratarea cu candesartan crește fluxul sangvin cerebral dar nu modifică în mod semnificativ presiunea arterială. Din punct de vedere al markerilor moleculari se observă o reducere a TGFβ (beta), iar din punct de vedere comportamental s-a îmbunătățit funcția motorie, gradul de învățare spațială și rezultatele testelor de memorie după LCT. În general, tratamentul cu candesartan pare a fi o terapie valabilă pentru LCT.
Un alt studiu (125) ce a folosit lisinopril și telmisartan pe un model de Alzheimer indus cu streptozocină a demonstrat că administrarea de ramipril, losartan și /sau donepezil (inhibitor reversibil de colinesterază, folosit în tratamentul bolii Alzheimer) ca și control a îmbunătățit parametrii de învățare pe labirintul acvatic Morris. Aceste efecte au fost datorate în principiu acțiunii antiinflamatoare ale IECA, combinat cu efectul antioxidant al telmisartanului. În același studiu, s-a realizat și o pre-tratare cu BADGE, un antagonist selective al PPARᵧ. Co-administrarea sau pre-tratarea cu BADGE a redus sau chiar anulat efectele benefice ale substanțelor anti-angiotensinice asupra învățării, memoriei și parametrilor biochimici. Pe de altă parte, efectele donepezilului nu au fost reduse de co-administrarea de BADGE, ceea ce demonstrează că efectul benefic asupra metabolismului cholinergic nu are componentă PPARᵧ.
Un studiu efectuat pe pacienți hipertensivi care au primit tratament cu ARB, fără semne de demență sau diagnosticați cu deficit cognitiv ușor (Mild Cognitive Impairment –MCI) și care, conform bazei de date ADNI (Alzheimer Disease Neuroimaging Intiative) primează terapia antihipertensivă cu BRA, au fost testați cu o serie de teste neuropsihologice de tip:
WMS – R (Testul de memorie logică)
RAVLT (Testul Auditor Verbal de învățare Rey)
Scala de inteligență Wechsler pentru adulți și altele, la care s-a adăugat evaluarea gradului de atrofie corticală prin RMN.
Toate studiile au demonstrat că:
Primitorii de BRA au avut rezultate mai bune pe toate scalele;
Combinația de IECA cu ABR nu a avut efecte mai bune decât ABR singure;
Cu cât capacitatea de pasaj a substanțelor prin BHE a fost mai mare, cu atât măsurătorile memoriei efective au fost mai bune [Ho, 2012].
2.4.4. NOȚIUNI DE FARMACOLOGIE A INHIBITORILOR DE RECEPTORI AT1
Telmisartan
Este unul dintre cei mai folosiți BRA, cu profil de siguranță și tolerabilitate foarte bună. Are cea mai lungă semi-viață plasmatică, cea mai mare lipofilie și cea mai puternică afinitate de legare la receptori din toată clasa. Îmbunătățește sensibilitatea la insulină la pacienții cu hipertensiune arterială și datorită acțiunii de agonist PPARγ, poate îmbunătăți gradul de inflamație vasculară, reduce grăsimea viscerală și crește adiponectina serică.
Olmesartan
Este un alt antagonist AT1R utilizat de mai mult de un deceniu și are un profil favorabil de siguranță și eficacitate în tratamentul hipertensiunii arteriale. Are o moleculă aparte, cu catenă dublă, care îl face mai eficient ca agent antihipertensiv în comparație cu celelalte ARB-uri. Există rapoarte privind efectele sale adverse, cum ar fi enteropatia de tip sprue și riscul de mortalitate (126).
Candesartan cilexetil
Este un blocant AT1R nepeptidic, puternic, foarte selectiv. Efectul său de blocare al AT1R reduce mortalitatea și evenimentele cardiovasculare, și specific pentru candesartan poate împiedica apariția fibrilație atrială de novo. Reduce progresia miocarditei autoimune, iar în cazul DZ de tip 2, candesartanul poate favoriza supraviețuirea celulelor β (127).
Losartanul
Este antagonistul AT1R de primă generație, un pro-medicament care este activat în ficat cu producerea a doi metaboliți dintre care unul blochează AT1R, în timp ce celălalt ar fi responsabil de caracteristicile auxiliare, cum ar fi reducerea stresului oxidativ și reducerea disfuncției mitocondriale. Este și un agonist parțial pe receptorul bradykinin B2 (B2R), ceea ce ar putea oferi o cardioprotecție suplimentară. Losartanul are o bună tolerabilitate, și are o eficiență uricosurică și nefroprotectoare semnificativă (128)
Valsartan
Este un alt ARB, care inhibă activarea genei HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor) și a redus factorii patogeni asociați cu nefropatia diabetică, îmbunătățind astfel evoluția leziunilor renale. Un raport sugerează că valsartanul afectează angiogeneza stimulată de Ang II a celulelor stem din măduva osoasă prin inactivarea căii AT1R/PI3K/Akt (129). Astfel, poate apărea ipoteza utilizării valsartanului în timpul terapiei cu celule stem.
Irbesartan
Acest medicament oferă un control eficient al presiunii arteriale pe o durată de 24 de ore la pacienții cu hipertensiune esențială. Irbesartanul a îmbunătățit sensibilitatea insulinei la pacienții cu insuficiență cardiacă și DZ asociat, a blocat complet generarea ROS produsă de glicozilare și exprimarea genelor VCAM -1 (Vascular Cell Adhesion Molecules), și a stimulat activarea PPARγ (130).
Azilsartan
Azilsartan medoxomil, un ARB recent aprobat, este un pro-medicament care este hidrolizat rapid la partea activă azilsartan, care este un antagonist puternic și selectiv al AT1R. În plus are potențialul de a neutraliza hipertrofia cardiacă, fibroza cardiacă și rezistența la insulină, împreună cu renoprotecția îmbunătățită și stabilizarea plăcii aterosclerotice, care nu pot tolera alte medicamente antihipertensive. Deoarece este un medicament mai nou, cu mai puține dovezi privind eficacitatea acestuia în ceea ce privește morbiditatea și mortalitatea CV, sunt necesare studii suplimentare pentru a confirma valoarea sa în raport cu aceste afecțiuni (131).
Fimasartan
Este un BRA recent dezvoltat, care pare a fi eficace în încetinirea progresiei aterosclerozei și a acumulării de macrofage din plăcile aortice, poate preveni disfuncția mitocondrială și apoptoza ce însoțește fenomenele de ischemie/reperfuzie (132).
Eprosartan
Este un agent antihipertensiv bine tolerat și eficient, cu beneficii în prevenirea secundară a evenimentelor cerebrovasculare, independent de efectele de scădere a BP. Eprosartanul are un potențial scăzut de evenimente adverse grave și nu a fost asociat cu interacțiuni medicamentoase semnificative din punct de vedere clinic (125).
2.4.5. RECEPTORII AT2 ȘI EFECTELE ACESTORA
Deși din tot ce s-a scris până acum, angiotensina II, prin intermediul receptorului AT1, este un mediator foarte dăunător și duce, mai devreme sau mai târziu, la degenerescență nervoasă, pierderi de memorie, tulburări comportamentale și așa mai departe, funcțiile sale nu sunt nici pe departe atât de nocive pe cât s-ar putea deduce din cele de mai sus.
Pe de altă parte, ang II mai are un receptor, și anume AT2, tot de tip GPCR, exprimat în aceleași zone și în densități similare precum AT1. Totuși, acțiunile sale sunt mult mai discrete și de obicei sunt observabile doar in vitro sau după blocarea AT1 cu sartani, sau folosind animale transgenice (133).
AT2 a fost studiat în mod extensiv în ultimul deceniu, și s-a demonstrat că este foarte prevalent mai ales în viața intrauterină și la naștere, după care expresia sa scade (134). În ceea ce privește distribuția sa în sistemul nervos, este prezent în zone bine stabilite, precum bulbul (unde este implicat în controlul funcțiilor vegetative), amigdala și septul (asociate cu comportamentul de tip anxios), talamusul (percepția senzorială), nucleii subtalamici și cerebelul (funcții motorii). Recent, s-a demonstrat expresia sa în substanța neagră, implicată în boala Parkinson (135) și în hipocamp.
O altă caracteristică importantă este că AT2 nu se exprimă decât în neuroni, nu și în glie (136).
Efectele esențiale ale AT2 au fost studiate mai ales pe culturi celulare. Activitatea sa duce la reducerea influxului de Ca2+ și la creșterea curenților tranzitori de K+, ceea ce scade excitabilitatea neuronală și pe de altă parte are un efect neuroprotector.
Un alt efect esențial al AT2 este inducerea creșterii de neurite, asociată cu o creștere a receptorilor ADN-ului lezat (137).
Un alt efect al AT2R este inducerea migrației celulare, mai ales în prezența losartanului, și inhibate de PD 123319. Aceste efecte ar putea fi implicate în faza de consolidare a memoriei, când se presupune că apar modificări în rețele neuronale.
S-a demonstrat deja că AT2 este asociat cu îmbunătățirea funcției cognitive în leziunile neuronale post-ischemice (115). De asemeni, poate preveni declinul cognitiv pe modele de șoareci injectați cu Aβ, reducând gradul de NFT (Neurofibrillary Tangles) în asociere cu producerea de NO și GMP (137).
Concluzia este că probabil multe dintre BRA-uri nu-și exercită funcția protectoare doar prin efecte proprii, ci și prin efectul permisiv pe care-l acordă receptorului AT2, în condițiile păstrării concentrației locale de Ang II.
2.4.6. STIMULATORII COGNITIVI
Stimulatorii cognitivi se mai numesc și „droguri deștepte” sau agenți nootropici care au fost dezvoltați pentru a îmbunătăți atenția, învățarea și memoria.
Inhibitorii de colinesterază precum donepezil, rivastigmină sau galantamină sunt folosite pentru demențe ușoare până la moderate, mai ales de tip Alzheimer, unde degenerescența căilor colinergice este o caracteristică esențială.
Memantina este un antagonist necompetitiv al receptorilor NMDA voltaj-dependent, care încearcă să reducă nivelele crescute de glutamat care duc la deficiențe cognitive. Este folosit în Alzheimer ușor spre moderat.
Psihostimulanți de tip L sau D-amfetamină (Adderall) sau inhibitori de recaptare dopaminergică de tip metilfenidat (Ritalin) pot stimula memoria de lucru și flexibilitatea cognitivă. Un alt medicament inhibitor al recaptării noradrenalinei este atomoxetina (Straterra), care îmbunătățește atenția.
Modafinilul este folosit în narcolepsie și ADHD, îmbunătățind memoria verbală, performanța de planificare și controlul extinctiv inhibitor, dar mecanismul său farmacologic de acțiune nu este încă bine definit.
Inhibitorii selectivi de recaptare ai serotoninei (SSRI) de tip fluoxetină (Prozac), citalopram și paroxetină par a promova neurogeneza hipocampică, ceea ce poate îmbunătăți performanțele de memorie.
Ampakine de tip aniracetam, modulator alosteric pasiv pentru receptorul AMPA, crește expresia sa în timpul potențării pe termen lung și poate crește plasticitatea sinaptică.
D- Serina și D-cicloserina sunt substanțe care stimulează situl co-agonist al glicinei de pe receptorii NMDA. Îmbunătățește condiționarea la frică și reduc disfuncțiile cognitive.
Tolcapon și entacapon sunt inhibitori de Catecol–O–metil–transferază (COMT) un inhibitor specific al lizei catecolaminelor, pot crește performanțele memoriei de lucru la rozătoare și primate.
Piracetamul îmbunătățește memoria prin mecanisme necunoscute, dar are efecte limitate la subiecți umani.
Agoniștii receptorilor 5-HT (serotoninergici) de tip buspiram si tandospirona, precum și o serie de agoniști/antagoniști experimentali de înaltă selectivitate pentru 5HT4 și 5HT6 acționează asupra neuronilor serotoninergici din nucleul raphe și cortexul prefrontal, ceea ce duce la reducerea funcției serotoninergice și facilitarea cogniției.
Invers, activarea receptorilor 5HTA1 inhibitori din hipocamp și regiunile septale reduce activitatea glutamatergică și/sau colinergică, inhibând cogniția (138).
CAPITOLUL 3
DUREREA
În 1979 Asociația Internațională de Studiu al Durerii a propus următoarea definiție pentru durere:
”Durerea este o experiență senzorială și emoțională dezagreabilă determinată de o leziune tisulară veritabilă sau potențială sau de o descriere cu termeni ce se referă la o asemenea leziune”.
Încă din 1987, cercetători importanți din domeniu (139) separă trei elemente funcționale în fenomenul dureros:
elementul senzorial discriminativ reprezintă capacitatea de analiză a durerii, a localizării ei, a intensității și a duratei de acțiune.
elemental emoțional, constă în reprezentările psihogenice al bolnavului, exprimarea simbolică a durerii, ce are un spectru semantic foarte extins, la care se adaugă componentul onomasiologic, acompaniat de reacții gestuale.
Elementul cognitiv și evaluativ care este alcătuit prin implicarea atenției, evaluarea actualizată prin prisma experiențelor dureroase anterioare și anticiparea riscurilor pentru durere.
Tabel 3.1. Definiții esențiale în studiul durerii
(sursa: IASP – International Association for the Study of Pain)(140)
Teoriă recentă actuală a controlului inhibitor de poartă a sensibilității dureroase „Gate control theory” lui Melzack și Wall din 1965 este bazată pe ideea că nu excitația excesivă este cauza percepției dureroase, ci deficitul de inhibiție al căilor de transmisie nervoase. Bazele neuroanatomice ale reacțiilor nociceptive psihoemoționale, somato-vegetative și endocrino-metabolice sunt reprezentate de formațiunile nervoase de la nivelul segmentelor periferice, medulare și cerebrale ale căilor spino-talamo-corticale specifice sensibilității dureroase (141).
În anii 1999, Melzack, după îndelungate observații și studii comportamentale pe pacienți propune teoria matricei neuronale “Neuromatrix theory” care reprezintă o viziune novatoare a componentei neurale centrale a percepției dureroase. Evoluând de la percepția ”membrului fantomă” și de la durerea cronică resimțită de pacienți cu secțiuni medulare, care nu ar trebui să mai aibă percepții dureroase, autorul a propus ipoteza percepției dureroase printr-un mecanism propriu al sistemului nervos central, fără implicarea aferențelor senzoriale extranevraxiale (142).
3.1.PERCEPȚIA NERVOASĂ A DURERII
Se face de către terminații nervoase specifice, numite receptori somatosenzoriali, alcătuite din celule neuroepiteliale încapsulate sau terminații noarvoase libere care au o sensibilitate caracteristică pentru stimuli algogeni. Aceste structuri pot transforma modificările din mediu care reprezintă stimulii, în semnale electrice, numite potențiale de receptor, care apoi vor declanșa potențiale de acțiune în fibrele nervoase care le inervează.
Receptorii durerii, numiți și nociceptori datorită faptului că sunt sensibili la stimuli nocivi potențiali, apar sub forma de terminații libere nervoase, difuze, extracelulare sau sub formă de structuri încapsulate numite corpusculi (Golgi, Meissner, Vater, Paccini, Ruffini, Krause).
Componentele de percepție a durerii la nivelul segmentului periferic sunt reprezentate de :
Nocicepția cutanată (superficială) – somatică.
Nocicepția musculară, articulară și osoasă (profundă) – somatică.
Nocicepția viscerală (internă)
Nocicepția cranio-facială (extremitatea cefalică)
3.1.1.TRANSMISIA LOCALĂ A DURERII
Cercetările experimentale au evidențiat că dendritele pentru recepția durerii sunt separate în două categorii: fibre amielinice C cu grosimea 0,5 – 1,2 microni și viteza de conducere a impulsului nervos 0,5 – 2,3 m/s și fibre A-delta slab mielinizate cu grosimea 2,5 – 5 microni și viteza de conducere a impulsului nervos 5 – 30 m/s (Figura 3.1.).
Figura 3.1. Tipurile de fibre nervoase prin care se poate realiza transmisia durerii (modificat după (143))
Fibrele grupului A mielinizate, au un diametru de 1-16 microni și o viteză de conducere de 10-120 m/sec. În cadrul grupului A, se deosebesc, după grosime fibrele , ; dintre acestea, fibrele și mai ales sunt algogene care dau naștere la durerea imediată cu caracter ascuțit, înțepător, ce dispare repede.
Fibrele grupului B sunt vegetative, preganglionare și se deosebesc greu de fibrele grupului A.
Fibrele grupului C nemielinizate, cu diametru sub 1 micron, au o viteză de conducere de 1-2 m/sec și transmit durerea întârziată, surdă, profundă, persistentă (Figura 3.1).
3.1.2.NOCICEPTORII
Sunt receptorii sensibili la elemente nocive sau stimuli nocivi potențiali. Nociceptorii sunt considerați specifici iar stimulii nocivi nu sunt specifici. Nu s-a putut încă identifica o senzație dureroasă cu o structură histologică precisă. Nociceptorul în sine este reprezentat de terminațiile libere arborescente ale fibrelor aferente, ce se introduc în structurile de percepție.
Din experimente pe om și animale s-a demonstrat că există două variante de percepției: frecvența de excitare a nociceptorilor și percepția subiectivă a intensității dureroase sunt direct proporționale cu puterea stimulării, și există o corelație între percepția suferinței subiective și aprecierea intensității dureroase.
Transmiterea mesajelor nocive la primul neuron din SNC depinde de trei factori: apariția unor semnale nociceptoare, convergența unor aferențe periferice cu efect direct de amplificare sau diminuare a semnalului și influența sistemelor centrale de control asupra acestui neuron.
Stimulii nocivi sunt reprezentați de variații – în limite ce le depășesc pe cele – ale parametrilor de mediu exterior sau interior și conțin informații energetice diferite – mecanice, electrice, termice, chimice, etc (144).
În timpul acestor lezări se eliberează substanțe pe care numim algogene în apropierea receptorilor, substanțe ce pot stimula în mod semnificativ excitabilitatea nociceptorilor chiar la stimuli de intensitate scăzută. Dintre substanțele algogene cu acțiune directă (factori algogeni primari) se citează: K+, prostaglandine, acetilcolina, citokine, enzime locale, factorul Hageman al coagulării, kinine precum bradikinina, serotonina, histamina, substanța P.
Substanțele algogene secundare vor stimula nociceptorii prin prostaglandine și alți derivați arahidonici, leucotriene, AMP etc. Aceste substanțe nu au acțiune algogenă per se dar vor coborî pragul de excitație al nociceptorilor. De exemplu: histamina asupra receptorilor polimodali, prostaglandinele asupra termoreceptorilor, kininele și serotonina în afecțiuni inflamatorii, arsuri etc. Ele sunt implicate și în fenomenele locale de hiperalgie, dureri prelungită sau dureri extrasegmentare. Nociceptorii sunt prezenți în toate țesuturile, cu excepția celor osos, hepatic, splenic, renal și nervos central (145).
3.2.TRANSMISIA EXCITAȚIEI DUREROASE ÎN MĂDUVA SPINĂRII
Prima stație pe calea transmisiei nociceptive este reprezentată de neuronii din coarnele posterioare mendulare. Pe această cale, stimulii dureroși se încrucișează și cu alte aferențe periferice (somatice, viscerale) și centrale. Aici se găsesc și neuronii intercalari de tip inhibitor sau excitator cu rol în percepția dureroasă sau nedureroasă și în fenomenele anexe ale percepției nociceptive.
Din cornul posterior pornesc căile centrale ale percepției dureroase. Aceste căi sunt rapide, cu axoni lungi (oligosinaptice) și cu conductibilitate rapidă, topografie bine stabilită, cu localizarea spațială cu exactitate a durerii. Acesta este tractul spino-talamic.
Ce-a de-a doua cale de perceție dureroasă are distanțe intersinaptice mici, cu mulți neuroni intercalari, cu conducție lentă, fără o somatotopie bine definită, așa cum este tractul din formația reticulară ascendentă.
Durerea este transmisă de axonii scurți ai protoneuronilor din ganglionul spinal asociați fibrelor aferente A-delta (monomodale) și C (polimodale) care parcurg segmentul ventrolateral al rădăcinilor posterioare și ajung în cornul posterior al măduvei unde fac sinapsă cu deutoneuronii nociceptivi specifici și nespecifici.
Figura 3.2. Fascicolele cordoanelor posterioare și fascicolul spino-reticulo-talamic (modificat după (146))
Din axonii acestor deutoneuroni spinali specifici și nespecifici din straturile I, II și V se desprind cele 2 fascicule principale de transmitere a durerii (Figura 3.2.):
fasciculul spino-talamic (sau fasciculul neo-spino-talamic)
fasciculul spino-reticulo-talamic (sau fasciculul paleo-spino-reticulo-talamic)
La acestea se adaugă calea (tractul) spino-mezencefalică, ce reprezintă o parte a căii spino-reticulate, mai corect calea spinotectală (147).
3.3.TRANSMISIA DURERII LA NIVELUL TRUNCHIULUI CEREBRAL
Centrii supraspinali sunt reprezentați de trunchiul cerebral, diencefalul și cortexul. Dintre tracturile ascendente de transmisie nociceptivă medulară principala conexiune din trunchiul cerebral o are tractul spino-reticulo-talamic. Acest fascicol ajuns în mezencefal și punte trimite colaterale la diferiți nuclei ai formațiunii reticulate în trunchiul cerebral:
La nucleul bulbar reticulat lateral gigantocelular, conectat cu nucleul reticulat magnus al rafeului median
La nucleul reticulat dorsal, localizat în substanța cenușie periapeductală mezencefalică
La nucleul cuneiform, prezent în substanța cenușie mezencefalică din zona pretectală, ce se conectează la nucleul arcuat din substanța cenușie periventriculară, din imediata apropiere a hipotalamusului.
3.4.PROCESAREA DURERII LA NIVEL CORTCAL
Scoarța cerebrală are aproximativ 125 trilioane de sinapse și la 4.7 biți/sinapsă, o capacitate informațională de cca. 1 TB (Terabit). Cortexul are astfel o mare capacitate de percepție a informației. Folosind un număr mare de relee asociative și de feed-back-uri, metabolismul neural produce proteine ce asigură stocarea și prelucrarea informației. Informația nociceptivă poate fi percepută logic prospectiv și anticipativ, în funcție de circumstanțele de mediul extern și intern.
Talamusul este nucelul de releu pentru toate informațiile senzitivo-senzoriale înainte de a fi transmise în scoarța cerebrală. Informația de percepție dureroasă este supusă la numeroase acțiuni de modulare, la nivelul spinal (cornul posterior al măduvei) și supraspinal (trunchiul cerebral, hipotalamus, ganglioni bazali). După integrarea ei în talamus, ajunge prin proiecțiile sale în ariile corticale primare (3, 1, 2 Broadmann) din lobul parietal.
Codificarea percepției dureroase și a informațiilor senzitivo-senzoriale este supusă unei analize complexe în care se realizează trei etape importante:
Etapa discriminativă care reprezintă capacitatea cortexului de a analiza natura stimulului nociceptiv (mecanic, termic, chimic), de a localiza în spațiu zona de leziune, de a aprecia natura actului agresiv și de a estima durata lui de acțiune.
Etapa motivațională ce dă durerii caracterul dezagreabil și declanșează percepțiile afectiv-emoționale. În această etapă se pare că acționează bazal lobul temporal (amigdala).
Etapa de evaluare cognitivă, implicată în transformarea informației dureroase în senzație și în fenomenul de stocare la nivelul memoriei, ceea ce permite anticiparea prin reflexe condiționate pentru a se lua măsuri de evitare a altor situații de percepție nocivă.
3.4.1.STRUCTURI CORTICALE IMPLICATE ÎN PERCEPȚIA DURERII
aria corticală senzitivă și motorie
cortexul premotor
cortexul parietal
cortexul prefrontal
cortexul cingulat
insula
cortexul occipital
Percepțiile nociceptive se proiectează și într-o multitudine de structuri subcorticale:
talamus
putamen
nucleul caudat
hipotalamus
amigdala
substanța cenușie periventriculară
nucleul roșu
vermisul din cerebel (148)
3.4.2.TEORIA “CONTROLULUI DE POARTĂ” (GATE CONTROL THEORY)
În teoria clasică, măduva spinării era considerată o simplă cale de transmitere, însă la ora actuală se aduc din ce în ce mai multe dovezi asupra complexității sale, anatomic, electrofiziologice și biochimice, ce realizează nu numai recepția și transmisia semnalelor neurale ci și modularea informațiilor, atât senzoriale generale cât și nociceptive (Figura 3.3.).
3.4.3.NEUROMATRIXUL
După Melzack., durerea "fantomă", care apare la membrele inexistente de la pacienții amputați, "membrele fantomă" sau alterările de perceție corporală dintr-o serie de psihoze se pot explica printr-o teorie apelată modernă, cea a "neuromatricei".
Conform autorilor, corpul este perceput ca o entitate de componente diferite în diverse momente, care acționează ca un sistem unificat ce produce un model "pattern" de neuro-semnătură în tot corpul, și care conferă persoanelor noțiunea de ”sine”. Acest nou concept, al unui mecanism cerebral unificat, constituie centrul unei noi teorii și după Melzack cuvântul "neuromatrice" o caracterizează cel mai bine. Cea mai importantă contribuție la teoria ”porții de control”, în percepția durerii, a fost accentul asupra mecanismelor neurale centrale. Lucrul cel mai important este înțelegerea funcției encefalice, care devine alterată odată cu intervențiile asupra segmentelor corporale, fie ele permanente sau temporare.
"The body self – neuromatrix"- este o rețea neuronală ce integrează multipli stimuli senzitivi pentru a reproduce un modelul cerebral care evocă durerea (Figura 3.4.).
Figura 3.3. Teoria controlului de poartă (modificat după (142))
Figura 3.4. Ipoteză schematică a “Neuromatricei” (modificat după (142))
Arhitectura sinaptică a neuromatrix-ului este determinată de influențe genetice și senzitivo-senzoriale. "Neurosemnătura" produsă în neuromatrix (modele de impulsuri nervoase cu dimensiuni temporale și spațiale variate), se produce din programe neurale genetice constituite în cadrul neuromatricei și determină percepțiile particulare și celelalte proprietăți ale experienței dureroase și comportamentului nopciceptiv.
3.3.BAZELE NEUROUMORALE ALE DURERII
Receptorii nociceptivi sunt stimulați de stimuli mecanici, termici și chimici endogeni (ex.: bradikinina, histamina, serotonina, kalikreina, catecolaminele, ionii de K+, Ca2+, H+, ATP și produșii săi de hidroliză) sau exogeni atunci când depășesc nivelurile prag de intensitate sau concentrație.
Una din cele mai caracteristice dureri de acest tip este cea produsă de hipoxia ischemică. Hipoxia locală produce acidoza prin acumularea de CO2, iar de la un prag de pH de 6,2 durerea începe să fie percepută, ajungând la maxim la un pH de 3,2. În zona ischemică se adună substanțe endogene care acționează atât sub asupra terminațiilor vasculare cât și asupra formațiunilor vasculare, cunoscute sub numele de substanțe vasoneuroactive, dintre care cea mai importantă este bradikinina, ca produs de metabolism al kininogenului plasmatic sub acțiunea kalicreinei.
La aceste fenomene se adaugă permeabilizarea hipoxică a membranelor celulare din țesuturile din regiunea ischemică, ceea ce crează premisele necesare pentru acumularea locală a ansamblului complex de substanțe enumerate.
Dintre substanțele implicate în transmisia, integrarea și modularea durerii fac parte cele trei grupe cu acțiuni pre și postsinaptice (Tabel 3.2.):
Neurotransmițători (neuromediatori)
Neuromodulatori
Neurotransmițători și modulatori (substanțe ce îndeplinesc ambele roluri) (149, 150).
3.4.MEDIAȚIA AMINOACID-ERGICĂ
3.4.1.AMINOACIZI EXCITATORI:
Acidul glutamic
Acidul aspartic-KA
Acidul alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol proprionic-AMPA
Acidul demoic.
Receptorii aminoacizilor excitatori principali (acidul glutamic și acidul aspartic) sunt clasificați după mecanismul de transducție în:
Receptori ionotropi – sunt reprezentați de un canal cationic care se deschide la fixarea de liganzi agoniști specifici (Figura 3.5.):
Receptori NMDA
Receptori non-NMDA reprezentați de:
Receptor AMPA
Receptor Kainat
Receptorii NMDA
Sunt alcătuiți dintr-un proteină transmembranară cu mai multe situsuri de legare și un canal ionic de calciu, sodiu sau și potasiu. Există două subtipuri, denumite NR1 și NR2 și fiecare subtip alte variante, notate cu a, b, c și d. În stare de inactivare, canalul receptor NMDA nu intervine în transmisia sinaptică, fiind blocat de ioni de magneziu. Depolarizarea membranei înlătură ionul de MG2+ și deschide canalul permițând influxul ionic. Receptorii NMDA se găsesc mai ales în cornul posterior al măduvei, hipocamp și bulbul olfactiv. Receptorii NMDA spinali intervin în facilitarea eliberării substanței P și a CGRP (calcitonin-gene-related-peptide) și in facilitarea inflamației neurogene.
Tabel 3.2. Clasificarea neurotransmițătorilor și neuromodulatorilor implicați în durere (151)
Potențarea de lungă durată la nivel central produsă de activarea repetitivă a receptorilor NMDA din hipocamp, este implicată în producerea proceselor neurochimice de consolidare a memoriei și în învățare. Ketamina și fenciclidina sunt antagoniști selectivi ai receptorilor NMDA și au efecte psihomimetice de tip amnezic și sedativ.
NMDA, ca un complex receptor-canal, este format dintr-o asociație heterodimetrică a două familii de subunități proteice NR1 și NR2; familia NR1 cuprinde 7 proteine sintetizate sub controlul unei singure gene, iar NR2 cuprinde 4 proteine de care răspund 4 gene (NR2-A-D)(152).
Figura 3.5. Tipuri de receptori ai glutamatului (modificat după (153))
Receptori non-NMDA (AMPA/KA)
Receptorul AMPA este distribuit în mod difuz în întregul SNC, prezintă efecte post-sinaptice excitatorii rapide și de scurtă durată (3-8 msec.). Asupra lui nu acționează antagoniștii NMDA, ceea ce înseamnă că situsurile de legare sunt diferite, iar blocantul sinaptic selectiv este dietilesterul glutamatului și 6-ciano-7-nitroquinoxalin-3:3-diona (CNOX). Acest receptor ionotrop activează, similar cu receptorii KA, canalele cationice monovalente, în vreme ce ionii bivalenți (Ca2+, Mg2+) nu trec prin canal, ceea ce induce ideea unei bariere de permeabilitate diferite (154).
Receptorilor AMPA nu li se cunosc antagoniști selectivi și din punct de vedere a recepției nociceptive au un rol foarte important în transmiterea durerii prin intermediul sinapselor glutamatergice. Ei sunt bine reprezentați în sistemul nervos central, cu o arie largă de distribuție, ce cuprinde: cornul posterior medular, cerebel, hipocamp, corpii striați, bulbii olfactivi și cortexul anterior.
Receptorul kainat (KA) este deschis de către acidul kainic, care este un analog structural al glutamatului. Distribuția lui este mai redusă la nivelule SNC-ului, fiind în strânsă legătură cu prezența receptorilor NMDA și AMPA. Receptorii KA sunt predominanți în cerebel în celulele Purkinje, cât și în celulele gliale ale acestuia. Activarea lor de către kainat produce efecte depolarizante, prin deschiderea canalelor ionice membranare numai pentru cationii monovalenți (Na+ și K+). Concomitent cu activarea receptorilor KA, acidul kainic inhibă captarea presinaptică a glutamatului și aspartatului.
Receptorii KA sunt activați de kainați, acid demoic și acidul L-glutamic. Nu există încă antagoniști selectivi. Recptorii kainat nu sunt afectați de liganzii pentru celelalte canale NMDA și sunt asociați canalelor permeabile de cationi. Sunt localizați presinaptic în sistemul nervos central și facilitează eliberarea de glutamat și aspartat. Unii autori îi condireră variante funcționale ale aceluiași recepetor și de aceea îi numesc canale AMPA/KA. Se găsesc mai ales în hipocamp, corpii striați și în celulele piramidale din cornul lui Amon (155).
b. Receptorii metabotropi (mGluR) fac parte din familia receptorilor cuplați cu proteine G.
Activarea lor produce cascade biochimice ce modifică excitabilitatea membranară atât la nivel sinaptic cât și somatic. Există opt tipuri, ce aparțin a trei grupuri. Mulți dintre ei sunt implicați în procesul de excitotoxicitate, dar funcțiile lor nu sunt încă bine clarificate, deși se presupune că sunt implicați în modularea neurotransmisiei dopaminergice și adrenergice, plasticitate sinaptică și potențare pe termen lung (156).
3.4.2.AMINOACIZI INHIBITORI
Acidul Gama-Aminobutiric (GABA)
Glicina
Taurina
Acidul Gama-Aminobutiric (GABA)
Se sintetizează prin decarboxilarea acidului glutamic sub efectul enzimei glutamat-decarboxilază, având ca și co-enzimă pyridoxal-fosfatul. GABA reprezintă principalul neurotransmițător cu efect inhibitor în cele mai multe formațiuni cerebro-spinale.
Căile neuronale care au GABA ca neuromodulator inhibitor sunt reprezentate abundent în sistemul nervos central la nivelul tuturor vertebratelor și mai ales la mamifere. La primate și om se găsește în mod esențial în situsuri cortico-subcorticale, hipocampice, talamice și în nucleii bazali. GABA este detectabil în cantități importante împreună cu dopamina, în căile extrapiramidale subcorticale și în mod deosebit în nucleul caudat, nucleul putamen și în globus palidus. În hipocamp, girusul dentat este cel mai abundent în GABA. Prin tehnici de imunoreactivitate, a mai putut fi observat și în nucleii talamici și îndeosebi grupul nuclear anterior, nucleii intratalamicii precum pulvinarul, corpii geniculați și nucleul reticular talamic.
Receptorii GABA-A sunt receptori ionotropi cuplați cu un canal ionic specific pentru Cl-. Efectul acestuia este de stimulare și neutralizare a potențialului negativ intracelular și de inhibiție neuronală. Ei sunt activați de către GABA și de glicină, determinând inhibiție postsinaptică. Efectele lor sunt potențate de benzodiazepine și blocate de bicuculină.
Receptorii GABA-B sunt receptori metabotropi cuplați cu AMP ciclic. Receptorii GABA-B realizează fenomene de inhibiție tardivă și de lungă durată, cu ajutorul activării sistemelor de mesageri sencunzi intracelulari. Prin intermediul acestor două tipuri de receptori GABA, fibrele gabaergice sunt răspunzătoare de cea mai mare parte a inhibiției la nivelul SNC, atât cortical cât și medular (157, 158).
Glicina
Glicina sau glicocolul este un aminoacid neesențial al cărui rol posibil de mediator chimic inhibitor a fost semnalat pentru prima dată de către Curtis și Watkins în 1960.
Sursa esențială de glicină poate fi serina fosforilată de către serin-hidroximetil-transferază sau de unele componente ale proceselor de glicoliză și îndeosebi ai fosfohidroxi-piruvatului. Glicina se găsește în special în măduva spinării, trunchiul cerebral și retină. Activarea receptorilor pentru glicină produce influx intraneuronal de clor, provocând un potențial postsinaptic inhibitor. Stricnina este un antagonist puternic al receptorilor glicinici ionotropici. Glicina este un co-agonist împreună cu glutamatul pentru receptorii NMDA. Spre deosebire de rolul inhibitor al glicinei la nivel medular, acest comportament este facilitat la receptorii glutamatergici (NMDA) excitatori. Intoxicația cu glicină de obicei, cauzează deces prin hiperexcitabilitate. Distribuția cerebro-spinală a glicinei este mai redusă decât a GABA, cele mai mari concentrații găsindu-se în trunchiul cerebral, cerebel și coarnele anterioare ale măduvei spinării. Numeroase terminații nervoase de la acest nivel prezintă capacitatea de a capta sau sintetiza, stoca și elibera glicina (159, 160).
Taurina
Este un aminoacid sulfurat ce trece prin bariera hemato-encefalică și este implicată într-o gamă largă de fenomene neurofiziologice, ce includ neurotransmisia inhibitoare, potențarea pe termen lung în striat/hipocamp, protecția împotriva excitotoxicității glutamatului. Taurina are un efect anxiolitic și poate acționa ca agent modulator inhibitor al excitabilității neuronale.
Mediația peptidergică excitatorie a durerii
Se realizează prin neuropeptide excitatorii de tip:
Tahikinine:
substanța P
neurokinina A și B
neuropeptidul Y
neuropeptidul K.
Substanța P
Una dintre primele neuropeptide neopioide identificate încă din 1931 de Von Euler și Gaddum în celulele enterocromafine ale tubului digestiv este substanța P, denumită inițial enteramină. Substanța P a fost numită astfel de la ”pain” (durere), în momentul în care rolul său în transmisia și percepția durerii a început să fie suspectat. Tahikininele sunt reprezentate de cinci peptide cu greutate moleculară mică, formate din 10-12 aminoacizi, denumite astfel: substanța P, neurokinina A, neurokinina B, neuropeptidul K și neuropeptidul gamma. Toate tahikininele (peptide cu acțiune rapidă) au caracteristici fizio-farmacologice asemănătoare (161). Cea mai importantă dintre tahikinine (neurokinine) neuroactive este substanța P.
O oligopeptidă alcătuită din 11 aminoacizi, substanța P are o largă distribuție în sistemul nervos central și periferic. Cele mai mari cantități de substanță P pot fi identificate la nivelul căilor nervoase implicate în transmisia și percepția senzațiilor dureroase, din cornul posterior medular, nucleii senzitivi ai trigemenului și al tractusului solitar și până la căile ascendente talamo-corticale. La nivel medular, substanța P se poate găsi în filamentele terminale ale neuronilor senzitivi de tip A, B și C amielinici. În ganglionii simpatici, substanța P apare ca neurotransmițător al fibrelor senzitive care prezintă terminații sinaptice la acest nivel. Acțiunile substanței P sunt în general de tip excitator, la nivel presinaptic cît și la nivelul membranelor postsinaptice (162).
Neurokinine (NK)
Receptorii pentru NK sunt în prezent deja clonați și identificați molecular, admițându-se existența a trei subclase de receptori tahikininici: NK1-NK2-NK3 care au afinitate înaltă pentru SP, neurokinina A și respectiv neurokinina B. Receptorii NK1 sunt dens distribuiți în neuroniilor din lamina superficială și în cei din straturile profunde ale cornului dorsal (163).
Neuropeptidul Y
Este un neuropeptid care se găsește în creier și în tubul digestiv la mamifere și la nevertebrate. Mai este denumit și NPY. Este un peptid omolog polipeptidului pancreatic, constituit și acesta din 36 de aminoacizi, care se găsește în cantități foarte mari atât în țesutul nervos al sistemului nervos central, cât și la nivelul terminațiilor sinaptice periferice, fiind deseori co-localizat cu noradrenalina (164).
3.4.4.HORMONII GASTRO-INTESTINALI CU ACȚIUNI NEUROTROPE NOCICEPTIVE
Familia secretinei:
VIP
secretina
glucagonul
glicentina
Peptidul vasoactiv intestinal (VIP)
Contribuția sa în transmisia și modularea durerii a fost semnalată inițial datorită faptului că stimulările cutanate și ale nervului sciatic cresc cantitatea de VIP în aferențele primare senzitive din cornul dorsal, prezența VIP fiind determinată imunohistochimic. Imuninoreactivitatea pentru VIP a fost confirmată la nivelul numeroșilor neuroni din sistemul primar aferent al toracelui, zonei lombo-sacrate și al nervilor cranieni ce inervează viscerele.
Descoperit în anii 70 în mucoasa intestinului subțire, peptidul vasoactiv intestinal (VIP) este un oligopeptid alcătuit din 20 de aminoacizi, răspândit în întreg tubul digestiv, de la glandele salivare și esofag până la colon, precum și în ale localizări viscerale multiple. Cele mai mari concentrații au fost găsite în fracția sinaptosomială a stratului al III-lea din scoarța cerebrală (165).
În general, existența unei distribuții cu precădere a acestui neurotransmițător în fibrele aferente viscerale, sugerează implicarea sa în durerea cu origine în organele interne (166).
Familia bombezinei:
bombezina
neurotensina.
Bombezina
A fost inițial izolată din extracte din pielea broaștei europene Bombina bombina și mai târziu s-a dovedit a avea un omolog în mamifere în neurotransmitatorul care eliberează gastrină (GRP). Secvența nonapeptidică carboxi-terminală a GRP este identică cu cea a bombezinei. Bombesinul și GRP au acțiuni identice la mamifere, deoarece terminalele carboxi aproape identice din peptide activează situsurile de legare atât pentru bombesină, cât și pentru GRP. Cele mai mari concentrații se găsesc la nivel hipotalamic, îndeplinind rol modulator asupra proceselor neurofiziologice care controlează activitatea gastro-intestinală, comportamentul alimentar, glucoreglarea și termoreglarea. La administrare ICV, bombezina produce eliberare de hormon somatotrop și prolactină, hipotermie, analgezie, prin mecanisme neurohormonale insuficient cunoscute. O mare parte din aceste acțiuni sunt inhibate de somatostatin (167).
Neurotensina
Neurotensina (NT) este un peptid cu treizeci de aminoacizi descoperit în 1973 de către Carraway și Leeman în hipotalamus și tractusul gastro-intestinal. Mai târziu, s-a descoperit că are și o distribuție abundentă dar neomogenă în sistemul nervos central și glandele anexe endocraniene. Cele mai mari concentrații de neurotensină au fost găsite la nivelul hipotalamusului anterior și al complexului hipotalamo-hipofizar. Are proprietăți analgezice, probabil explicabile prin mecanisme opioid-independente, și este de asemeni implicată în modularea neuronilor colinergici de la nivelul sistemului limbic, participanți la realizarea proceselor neurochimice de memorizare și învățare (168).
3.5.MEDIAȚIA PEPTIDERGICĂ MODULATORIE A DURERII
Se compune din mediația peptidergică modulatorie opioidă și non-opioidă.
Sisteme opioide endogene (distribuție în organism)
Descoperirea esențială pentru identificarea mecanismelor de modulare prin substanțe morfin-like opioide a durerii a fost identificarea receptorilor specifici pentru morfina de natură exogenă și pentru substanțele derivate sau sintetizate cu acțiuni de tip opioid.
Existența de receptori farmacologici care să cupleze substanțele derivate din morfină a fost bănuită din 1970, dar identificarea lor exactă a avut loc în 1973, de grupurile Snyder-Simon și Terenius. Existența acestor receptori în creier și în alte țesuturi, capabili de a lega specific liganzi exogeni din grupul morfinelor a dus la cealaltă descoperire, sugerată de ipoteza existenței unor substanțe endogene care să fie recunoscute specific de receptorii menționați mai sus.
Biosinteza opioidelor endogene are loc pornind de la trei precursori polipeptidici identificați după studii realizate pe ADN recombinat și ARN-ul mesager corespunzător ajuns la nivelul ribozomial și anume:
Proenkefalina (în medulosuprarenală);
Pro-opio-melanocortina (POMC) (în hipofiză);
Sistemul enkefalinergic
Enkefalinele sunt pentapeptide opioide endogene care sunt produse în principal în sistemul nervos central. Există două enkefaline cu structură diferită: Met-enkefalina (YGGFM) și Leu-enkefalina (YGGFL). Acestea sunt generate de o proteină precursoare numită proenkefalină prin clivare proteolitică. Astfel, activitatea genei proenkefalinei este amplificată prin producerea de peptide multiple de encefalină. Dintre cei trei receptori opioizi clasici, peptidele enkefalinei se leagă preferențial de receptorul opioid-δ.
Sistemul nervos enkefalinergic este format din neuroni cu densitate mare la nivelul nucleilor striați, diencefalului, trunchiului cerebral și măduvei. Există două căi enkefalinergice lungi, una striato-palidală, iar alta care face legătura între nucleul central al amigdalei și stria terminală.
Peptidele enkefalinice au fost identificate în LCR, substanța gri pericisternală, nucleii accumbens, nucleii caudat, putamen, amigdalian, paraventricular, supraoptic, în regiunea perifornicală, hipotalamusul lateral, formațiunea reticulară.
Sistemul endorfinergic
Endorfinele derivă și ele dintr-un precursor comun, pro-opiomelanocortina (POMC) adenohipofizară. Aceasta este o proteină alcătuită din 263 de aminoacizi, care prin clivare proteolitică eliberează ACTH, MSH și beta-lipotropină. Endorfinele sunt mai puțin abundente și larg distribuite decât enkefalinele. Se găsesc concentrate în nucleul arcuat din hipotalamus și în hipofiză. La nivel hipofizar predomină în lobii anterior și intermediar. În hipotalamus, endorfinele și, îndeosebi -endorfina, au sediul cel mai important la nivel medio-bazal, cu tracturi axonale subțiri ce le conectează cu nucleul infundibulo-tuberian, locus coeruleus și formația reticulată.
Dinorfinele
Dinorfinele sunt peptide opioide (dinorfina A-17 aminoacizi și dinorfina B-13 aminoacizi) care acționează în principal la nivelul receptorilor opioizi kappa (ROK) și sunt în general, asociate cu stări emoționale negative. Sistemul dinorfină/ROK modulează transmisia GABA-ergică. Dinorfinele scad transmisia sinaptică mediată de GABA-A și atenuează creșterile induse de alcool acut în transmisia GABA-ergică prin reducerea eliberării GABA presinaptice. Sistemul dinorfine/KOR promovează, în general, un comportament asemănător cu anxietatea și pot avea implicații asupra comportamentelor de dependență. Dinorfinele reprezintă cea de a treia familie de peptide opioide endogene rezultate din clivarea enzimatică a pro-dinorfinei. Dintre produșii de scidare a acesteia, s-au dovedit neuroactive.
Receptori opioizi
Receptorii (miu) au afinitate pentru compușii de tip morfină like clasici, precum și pentru beta-endorfină și enkefaline. Folosind un derivat de Naloxon, și anume Naloxazon, s-a pus în evidență existența a două tipuri de receptori , și anume μ1 și μ2. Receptorii sunt principalii implicați în analgezia de origine supraspinală, au o afinitate înaltă pentru morfină și sunt antagonizați de naloxon și de naloxazon.
Receptorii (delta) sunt sensibili mai ales la enkefaline, în special la Leu-enkefalina, Met-enkefalina-Arg-Gly-Leu și mai puțin cu Met-enkefalina și Met-enkefalina-Arg-Phe. Funcția lor esențială este cea de modulare a receptorilor miu, dar este prezentă o afinitate și pentru beta-endorfină, care este similară cu cea prezentă la nivelul receptorilor miu. Studiile moleculare asupra receptorilor delta au identificat două subtipuri: delta 1 și delta 2. Demonstrarea existenței subtipurilor receptorului delta a fost posibilă după descoperirea agoniștilor și antagoniștilor selectivi.
Receptorii (kappa) k (ketazolinici) au o afinitate de farmacologică pentru agoniștii de tip benzomorfanic (substanțe de sinteză narcotice – analgezice nepeptidice, cum sunt ketazocina, bremazocina, nalorfina), dar și pentru derivații de pro-dynorfină (169). Efectele date de activarea acestor receptori sunt analgezia la nivel spinal, sedare, inducerea de somn, fenomene de tip catalepsic sau ataxic, depresia respirației, mioză și defecația. Distribuția acestor receptori are localizare primară în cortexul cerebral.
Receptorii (sigma) au fost identificați cu prilejul cercetărilor asupra derivaților de benzomorfan cu efecte adictive nesemnificative, în vederea utilizării lor ca psihomimetice. Proteina receptoare izolată nu prezintă însă o specificitate absolută.
Receptorii (epsilon) au fost inițial văzuți ca subtipuri de receptori , prezentând afinitate pentru beta-endorfine, dar în ultimul timp a fost sugerată existența unor subtipuri de receptori (1 și 2) și k (1 și 2). În general, distribuția receptorilor opioizi nu concordă în unele cazuri cu a neuropeptidelor respective.
Receptorii ORL-1 (Opioid Receptor Like-1)
Opioidele clasice nu au afinitate pentru acest receptor, dar prezintă un ligand endogen (denumit nociceptin sau orfanin FQ) pe care îl cuplează.
Receptorul ORL-1 este un receptor cuplat cu proteine G. Din punct de vedere structural, nociceptinul pare a fi un peptid opioid asemănător dinorfinei A, sintetizat dintr-un precursor (pre-pro-nociceptin) larg distribuit în SNC. A fost descoperit în 1995 și este un neuropeptid cu acțiune inhibitorie ce acționează presinaptic prin scăderea eliberării neurotransmițătorului și/sau post-sinaptic prin scăderea excitabilității neuronale.
3.5.1.MEDIAȚIA PEPTIDERGICĂ MODULATORIE NON-OPIOIDĂ A DURERII
Somatostatina
Descoperită inițial în hipotalamus, ca inhibitor al secreției hipofizare de hormon somatotrop somatostatina (SST), este un peptid format din 14 aminoacizi, ce are proprietăți inhibitorii asupra unui mare număr de formațiuni nervoase și glandulare. Peste 90% din SST cerebrală se găsește distribuită în afara hipotalamusului. SST determină reducerea activității motorii, prelungirea efectelor sedative, analgezice și hipotermizante ale benzodiazepinelor și inhibă descărcările neuronale prin hiperpolarizare potasică, atunci când este aplicată iontoforetic (170).
Galanina
Galanina este un neuropeptid cu 29-30 de aminoacizi care posedă receptori larg răspândiți în creier, cele mai mari concentrații de galanină constatându-se în hipotalamus și amigdala. În hipotalamus, galanina este exprimată în multe populații neuronale, inclusiv în nucleul paraventricular (PVN), nucleul dorsomedial și nucleul arcuat. Galanina reprezintă încă un neuropeptid destul de puțin cunoscut, ca și implicații funcționale. Au fost identificate cel puțin trei subtipuri de receptor de galanină: GALR1, GALR2 și GALR3; ele sunt larg exprimate în celulele musculare netede gastrice și intestinale, în pancreas și în SNC. Galanina reglează aportul alimentar, memoria și cunoașterea, și antinocicepția, și modulează multiple sisteme neuroendocrine în hipofiza, pancreas și intestin.
Galanina este un peptid inhibitor co-localizat cu substanța P și CGRP în mare măsură la nivelul aferențelor primare senzitive. Galanina funcționează ca un antagonist al SP în diferite tipuri de durere (171).
Calcitonina (CT)
Calcitonina este un hormon secretat de celulele parafoliculare C din tiroidă și care are ca funcție esențială fixarea calciului în oase, și de aceea este folosită în multe afecțiuni decalcifiante, în special boala Paget osoasă, osteroporoza de menopauză, fie stenoza canalului spinal, neuropatia diabetică, neuropatia indusă de chimioterapie și sindromul durerii regionale complexe. Deoarece efectele analgezice ale calcitoninei au un domeniu larg, mecanismele care stau la baza ameliorării durerii de către calcitonină sunt în mare parte necunoscute. Acțiunea analgezică a calcitoninei poate fi mediată prin normalizarea expresiei canalului de sodiu în nervii periferici deteriorați, care prezintă hiperexcitabilitate datorită expresiei anormale a subtipurilor de canale Na+. În plus, în neuropatia periferică indusă de chimioterapie, este propusă ca acțiune anti-alodinică inhibarea semnalelor la receptorul tranzitoriu de tip ankyrin-1 și melastatin-8. Rezultate încurajatoare au fost obținute chiar la pacienți la care terapia cu opioide nu mai avea rezultate (172).
3.5.2. MEDIAȚIA AMINERGICĂ MODULATORIE A DURERII
Serotonina
Serotonina mai este numită și 5-hidroxitriptamina (5-HT), care este o amină serică vasoconstrictoare). Serotonina nu este numai un mediator din sistemul nervos central, la nivelul mediației serotoninergice, și este produs la nivelul celulelor enterocromafine din tubul digestive.
La nivel central, neuronii serotoninergici se găsesc mai frecvent la nivelul nucleilor raphé din trunchiul cerebral. De semeni, axonii lor mai fac legătură și cu cele nouă nuclee subcorticale ce cuprind nucleii magnus, pontin, caudal, dorsal, median și reticular ai rafeului, precum și aria postremă și substanța cenușie periventriculară.
Axonii ascendenți și descendenți ai neuronilor serotoninergici se proiectează atât în formațiuni neuronale, cât și non-neuronale. În timp ce neuronii din nucleii magnus, pontin, și caudal se proiectează spre măduva spinării în coarnele dorsale (senzoriale) și ventrale (motorii), cei ce aparțin nucleilor dorsal, median și reticular ai rafeului precum și aria postremă formează sistemul serotoninergic ascendent. Acesta este reprezentat de tractul dorsal ai cărui axoni inervează striatul, coliculii superiori și inferiori, precum și de tractul ventral, cu proiecții în talamus, nucleul accumbens, amigdală, hipocampus și nucleul suprachiasmatic din hipotalamus.
În SNP, neuronii serotoninergici sunt predominanți în ganglionii și nervii care asigură inervația vegetativă a tubului digestiv. În afara țesutului nervos și a țesuturilor cromafine intestinale, serotonina se mai poate găsi în trombocite (173).
Acțiunile sinaptice ale serotoninei. Serotonina are efecte post-sinaptice inhibitorii asupra rețelelor de tip senzorial de la nivelul cornului medular posterior sau din nucleii geniculați laterali ai talamusului și are acțiune activatoare (de facilitare) la nivelul neuronilor motori.
Inhibiția serotoninergică se datorează hiperpolarizării membranare produsă de creșterea conductanței pentru potasiu, iar acțiunea facilitatoare a acesteia este consecința depolarizării produse de scăderea conductanței potasice. Elementul comun al efectelor sinaptice ale serotoninei pare a fi alterarea permeabilității canalelor de potasiu. Prin acest efect, serotonina modulează excitabilitatea neuronală postsinaptică. Implicarea serotoninei ca mediator chimic sau modulator al transmiterii adrenergice și gaba-ergice este, de asemenea, cunoscută atât în realizarea unor manifestări psihoafective normale și patologice, cât și în producerea efectelor antideprimante ale drogurilor triciclice (imipramină, amitriptilină etc.).
Mecanismul de producere a proprietăților sinaptice ale serotoninei are la bază participarea a trei tipuri de receptori serotoninergici (5-HT1, 5-HT2 și 5-HT3) divizate, la rândul lor, într-un număr variabil de subtipuri. În timp ce toate subtipurile 5-HT1 și 5-HT2 se găsesc în creier, cele trei subtipuri de receptori 5-HT3 sunt localizate numai în sinapsele vegetative periferice.
Catecolamine (CA)
Transmiterea neuronală a impulsurilor nervoase simpatico-adrenergice se realizează cu ajutorul catecolaminelor reprezentate de noradrenalină, adrenalină și dopamină. Acestea sunt substanțe biologic-active cu nucleu catecolaminic, rezultate din metabolizarea succesivă a tirozinei până la stadiul final de arenalină.
Împreună cu serotonina și histamina, catecolaminele fac parte din categoria aminelor biogene cu rol atât de mediatori chimici, cât și de hormoni circulanți.
Receptorii catecolaminergici
Receptorii adrenergici (cunoscuți și sub numele de adrenoreceptori, AR) aparțin superfamiliei receptorului de legare a grupei nucleotid-guaninei G (GPCR) și sunt receptori membranari care activează proteinele G heterotrimerice. Semnalizarea prin GPCR inhibată este terminată prin fosforilarea domeniilor intracelulare ale receptorului de către familia receptorilor kinazelor cuplate cu proteină G (GRK). Au fost identificate două clase de receptori adrenergici: αAR și βAR. Subfamilia a1AR (receptori cuplați cu Gq) constă din trei subtipuri foarte omoloage, incluzând α1A-, α1B- și α1D-AR. Subfamilia α2AR (cuplată cu Gi) cuprinde trei subtipuri: α2A-, α2B- și α2C-AR.
În familia de receptori adrenergici β există trei subtipuri de receptori: β1AR se găsește la cele mai înalte niveluri în inimă, β2AR este distribuit în întreg corpul și β3AR este exprimat în principal în țesutul adipos alb și brun. Toate cele trei variante sunt cuplate la Ga și la căile aferente legate de cAMP.
Receptorii sunt legați de sistemul inozitol-fosfat și de inhibarea AMP ciclic, în timp ce receptorii β sunt implicați în stimularea AMP ciclic. Receptorii alfa-1 sunt localizați post-sinaptic în creier și au concentrații moderate în ganglionii bazali. Receptorii α-2, pe de altă parte, sunt localizați atât postsinaptic cât și presinaptic pe terminalele sinaptice ale neuronilor care conțin noradrenalină. Receptorii β sunt localizați în creier, un număr semnificativ în globus pallidus și în nucleul caudat și putamen (174) .
Acetilcolina
Neuronii colinergici sunt extrem de abundenți în structurile sistemului nervos central, fie difuzi, răspândiți ca formațiuni inter-neuronale, fie sub aspectul de nuclei colinergici, ce prezintă structuri și funcții aparte.
Interneuronii se găses mai ales la nivelul corpilor striați, unde sunt implicați activ în procesele de motricitate extrapiramidală, formând tracturi de legătură între terminațiile dopaminergice nigro-striate și celulele gaba-ergice striato-palidale și striato-nigrice.
Dintre nucleii colinergici fac parte nucleii colinergici denumiți generic Ch1-Ch4 din prozencefalul subfrontal (banda diagonală a lui Broca, nucleul preoptic, substanța nenumită, nucleul bazal a lui Meynert și nucleii septului) precum și nucleii de tip Ch5-Ch6 din trunchiul cerebral (nucleii cuneiform, peduncular, parabrahial și tegmental lateral).
Terminațiine axonale ale acestora formează căile dorso-tegmentale ascendente, către nucleii talamici, habenulari, coliculii superiori și septul cerebral. Aceticolina deține un rol esențial în realizarea diverselor forme de activitate somato-vegetativă, pentru că asigură mediația chimică colinergică atât la nivel periferic, cât și în nenumărate structuri subcorticale (talamus, hipocampus, nuclei bazali, bulbi olfactivi etc.) (175).
Receptorii colinergici
Clasic, se admite existența a două tipuri de situsuri active cu afinitate specifică pentru acetilcolină, ca principal neurotransmițător colinergic. Datorită activării acestora de către nicotină sau muscarină, receptorii colinergici au fost numiți nicotinici și muscarinici.
Spre deosebire de receptorii nicotinici, care sunt receptori ionotropi și predomină la nivelul joncțiunilor neuromusculare, receptorii muscarinici sunt receptori metabotropi și se găsesc mai ales la nivelul sistemului nervos central.
Receptorii Nicotinici
Din punct de vedere structural, receptorul nicotinic este un pentamer glicoproteic cu greutate moleculară de 250kDa, compus din cinci subunități (două subunități și câte o subunitate și )(176).
Receptorii Muscarinici
Au structură, distribuție și funcții diferite de ale receptorilor nicotinici. Ei sunt glicoproteine cu greutate moleculară de aproximativ 80.000 Da. Cu ajutorul diverșilor agoniști și antagoniști farmacologici au fost indentificate cinci subtipuri de receptori.
O anumită participare modulatorie a transmisiei nociceptive este realizată și cu contribuția mediației colinergice. Există astfel raportări privind implicarea mediației colinergice din nucleul magnum al rafeului în sistemul analgezic opioid al acestuia. Un exemplu spectaculos îl oferă atropina (antagonist muscarinic) care anulează brutal efectul analgezic al administrării sistemice a morfinei, la fel fentolamina (antagonist neselectiv), în timp ce methisergidul (antagonist serotoninic) rămâne fără efect (177).
3.5.3.MEDIAȚIA MODULATORIE PURINERGICĂ A DURERII
Adenozina și ATP
Adenozina și ATP sunt principalii derivați purinici și au funcții intracelulare esențiale la nivelul tuturor țesuturilor și organelor. De când s-a observant eliberarea de ATP de către stimularea fibrelor aferente sensitive, (178) a postulat implicarea acestuia în implicarea medierii modulatorie a durerii.
Conceptul de sinapse purinergice, ce folosesc ATP/ADP ca neurotransmițător, a fost fundamentat ulterior de către Burnstock în 1972 (179). Acesta a precizat că nu numai ATP, ci și adenozina extracelulară rezultată din procesele de dez-energizare influențează excitabilitatea neuronală centrală. Adenozina inhibă acțiunile stimulante centrale ale metilxantinelor (cafeină, teofilină), ATP exercită efecte de tip excitator folosind doi receptori selectivi: P1 pentru adenozină și P2 pentru ATP.
ATP acționează asupra receptorilor purinergici de tip P2 înainte de a fi inhibat prin defosforilare succesivă, până se transformă în adenozină, folosind ectonucleotidaze (ATP-aza, 5-nucleotidază). În cazul eliberării în același timp cu un alt neuromodulator, ATP potențează efectele post-sinaptice ale acestuia.
Concentrațiile mari de K+ sau glutamat sau stimularea electrică extraneuronală produc eliberarea de Ca2+ într-o manieră dependentă de adenozina din sinaptosomi, care are efecte hiperpolarizante, producând neurosedare și antinocicepție. După administrarea sistemică sau inctracerbroventriculară, analogii structurali ai adenozinei (PIA, NECA) produc și ei, efecte antinociceptive, ce sunt inhibate de cofeină și teofilină. Aceste efecte sunt mediate de către două subtipuri de receptori adenozinici: A1 și A2, echivalenți cu tipurile P1 și P2 descrise la început (180).
3.5.4. MONOXIDUL DE AZOT (NO) ÎN PERCEPȚIA DURERII
Mediația nitrinergică este noul concept, apărut în anii 90, care sumează semnificațiile funcționale ale monoxidului de azot (NO) ca mesager intercelular, ce este susținut de numeroase dovezi experimentele, care tind să impună NO ca nou mediator interneural, cu importață esențială în neuroștiințe.
NO este o moleculă gazoasă mică, foarte reactivă și cu o semi-viață foarte scurtă (perioada de înjumătățire de ordinul secundelor).
NO se sintetizează în organism din arginină (aminoacid esențial), care, în prezența nitric oxid sintetazei (NOS) constituționale și inductibile, este hidrolizată și apoi oxidată, producând citrulină și NO(181).
NO acționează asupra GMP ciclic, implicându-se în sistemele de transducere a semnalelor inter și intracelulare, și totodată realizează funcții de hormon local paracrin și autocrin. Pe această cale dublă, NO în cantități foarte mici, fiziologice, influențează atât plasticitatea neuronală, favorizând potențarea pe termen lung din hipocamp, cât și inhibiția post-sinaptică cerebeloasă, iar în doze mari are efecte neurotoxice. Prin acțiunea asupra potențării de lungă durată, NO participă la realizarea proceselor de memorie și habituare.
Blocada NOS inhibă răspunsul motor la excitațiile dureroase induse de hiper-activarea receptorilor NMDA sau de lezările neurologice cronice; astfel a fost implicată o eventuală existență a unei localizări periferice de acțiune pentru inhibitorii NOS în vederea suprimării hiperalgeziei.
Inhibarea NOS medulare are efecte de potențare a efectului analgezic al morfinei. Blocarea NOS nu reduce numai sinteza și efectele neurotoxice, ci și pe sinteza de substanță P, precum și alți stimuli nociceptivi inflamatori și neuropatici (182).
3.6. IMPLICAȚIILE PEPTIDELOR ANGIOTENSINICE ÎN PERCEPȚIA ȘI MODULAREA DURERII
Pe lângă nenumăratele funcții biologice ale angiotensinelor la nivel vascular și al homeostaziei hidroelectrolitice, componentele SRA din SNC modulează informația senzorială, răspunsuri comportamentale și emoționale, stresul, anxietatea, învățarea și memoria.
Receptorii AT1 și AT2 au o largă distribuție și în zone ce controlează nocicepția, precum cortexul cingulat anterior (CGA), cortexul prefrontal (CPF), talamusul, substanța cenușie peripeductală (SCPA), amigdala, nucleul accumbens și măduva spinării. Există o multitudine de studii ce implică substanța ce alterează SRA asupra diverselor tipuri de durere.
Există rezultate variate, care pe de o parte prezintă efecte benefice ale activării, precum în dureri neuropate și durerea nociceptivă. Pe de altă parte, există o multitudine de dovezi că drogurile blocante ale SRA induc durere.
Angiotensina are un rol de inductor al durerii al SRA, caracterizat prin profilul analgezic al blocanților de SRAA (183). Microinjecțiile de ang II din bulbul ventrocaudal produc efecte hiperalgezice pe testele tail-flick și cu formalină, efecte atenuate de co-administrarea de losartan (184).
Un alt studiu foarte recent a demonstrat că administrarea sistemică continuă de doze subpresoare de ang II induce durere tactilă și hiperalgezie la rece, atenuată de losartan (185).
Administrarea de aliskiren (inhibitor direct al reninei), telmisartan sau spironolactonă a atenuat durerea neuropată din alodinia la rece, alodinia mecanică și hiperalgezia termică din durerea indusă cu leziuni constrictive (186).
Spironolactona a atenuat la rândul ei durerea indusă de modelul cu acid-acetic intraperitoneal la șoarece și în durerea diabetică.
Mecanisme prezumtive
Rolul TNFα (Tumor Necrosis Factor –α )
Este bine cunoscut faptul că în SN periferic, în condiții de iritație cronică, TNFα este up-regulată, mai ales la nivelul celulelor Schwann și în macrofagele perilezionale (187).
Un alt studiu, de la care au evoluat și multe dintre investigațiile noastre, a demostrat că atât captoprilul cât și losartanul au avut efecte hipoalgezice, iar captoprilul a avut efecte mai pronunțate și de mai lungă durată decât losartanul (188).
Într-un studiu pe voluntari umani, (189) au demonstrat o reducere semnificativă a pragului de percepție la durere de către ramipril, spre deosebire de losartan. Pragul maximal de percepție a durerii a fost scăzut în mod similar de ambele substanțe.
Una din ipotezele interesante prin care s-a încercat explicarea efectului antihiperalgezic al aliskirenului (inhibitor specific de sinteză a reninei) a fost aceea că în afară de inhibarea sintezei de angiotensină prin inhibarea reninei, au existat și efecte directe asupra receptorului de prorenină PRR (190). Atât renina cât și prorenina se cuplează la PRR și declanșează o cascadă de semnale proinflamatorii, care crește TGFβ1, COX2, TNF-α, IL-1β, VEGF și ICAM.
O altă variantă de explicație pentru efectele proalgezice ale ang II este aldosteronul. Pe lângă efectele genomice ale acestuia, aldosteronul are și o serie de efecte non-genomice (191). Aceste efecte pot include producția de SRO, activarea NFB și kinazele Rho/Rock 2, care sunt implicate în mai multe tipuri de durere (192). De asemenea, aldosteronul poate produce activarea canalelor cationice de tip TRPMC (Transient Receptor Potential melastatin 7 Channel)(193).
Există o multitudine de studii care demonstrează efectele analgezice sau hipoalgeziante ale substanțelor ce acționează asupra metabolismului angiotensinic.
Tronvik și col. (194) au condus un studiu clinic asupra efectelor enalaprilului și lisinoprilului asupra pacienților cu migrene. În cadrul acestui studiu, s-a demonstrat că orele, zilele cu durere și indicele de severitate al durerii au fost reduse în mod semnificativ (20,17,21%, respectiv) adică în proporție similară.
Într-un studiu anterior al acelorași autori, candesartanul a oferit reduceri similare ale parametrilor durerii migrenoase, cu o medie de + 30%, mai mare decât a IECA.
Mecanismele prezumtive prin care IECA și BRA au efecte inhibitorii asupra durerii
BRA au efecte inhibitorii asupra durerii (Figura 3.6.).
Inhibiția efectelor proalgeziante ale ANG II a fost discutată mai sus, cu toate subpunctele sale:
efecte proinflamatorii
efecte prooxidante
activarea căii MAPK
creșterea expresiei substanței P și a CGRP , toate aceste efecte fiind dependente de receptorul AT2
Stimularea receptorului AT2, este valabilă mai ales la folosirea ARB, care blochează selectiv receptorul AT1. La fel, efectele receptorului AT2 asupra percepției durerii au fost discutate mai sus.
Figura 3.6. Acțiuni analgezice și/sau hiperalgezice ale substanțelor ce blochează SRAA (după(183))
Angiotensina 5-8
Până nu de mult, era considerat un peptid inactiv, dar se pare că are efecte antinociceptive la nivelul SNC (195).
Injecția de ang 5-8 în substanța cenușie peripeductală au avut efecte antinociceptive și antialodinice, blocante de saralazină (un blocant neselectiv de receptor angiotensinici) dar nu de ARB, blocanți de AT2 sau de Mas. ceea ce sugerează mediația printr-un receptor propriu.
Interesant doza de ang 5-8 necesară pentru aceste efecte a fost de 74 de ori mai mică decât doza de morfină necesară pentru a obține aceleași efecte.
Adăugarea de un inhibitor specific de NO-sintază a abolit aceste efecte, sugerând o mediație nitrinergică a efectului ang 5-8.
Efectele angiotensinei 1-7
Receptorii Ang (1-7), numiți Mas se găsesc peste tot în SNC, dar mai ales în NTS, bulbul caudal ventrolateral și rostral și în hipotalamus. Administrarea de ang 1-7 atenuează comportamentul pronociceptiv al Ang II prin inhibiția fosforilării p 38 MAPK.
De asemenea, receptorii spinali sunt co-localizați cu receptorii AT1, în cornul dorsal (196, 197).
Un studiu recent a demonstrat că ang 1-7 induce eliberare de adrenalină și antinocicepție periferică, prin intermediul α2- adrenoreceptorilor. Mai mult, reboxetina, un inhibitor al recaptării de NA și guanetidina, care epuizează veziculele de neuromediator simpatic au redus efectele Ang 1-7 cu cca 70% (198).
3.7. ANTIDEPRESIVE ȘI DURERE
Pacienții cu durere cronică sunt predispuși la depresie datorită unei presiuni permanente exercitată de durere. Datorită naturii comune a durerii și depresiei, s-u încercat mai multe variante de tratamente comune pentru cele două condiții. Cele mai larg folosite substanțe pentru tratamentul durerii cronice sunt antidepresivele triciclice, dar se pare că și unii inhibitori ai recaptării noradrenalinei sau serotoninei pot fi eficienți.
Antidepresivele sunt frecvent utilizate pentru tratarea următoarelor stări de durere cronică: artrită, sindromul durerii centrale, fibromialgia, migrene, leziuni nervoase datorate diabetului zaharat (neuropatii diabetice) și nevralgiile postherpetice. Eficacitatea lor este cel mai bine documentată pentru neuropatia diabetică dureroasă și herpetică.
Studiile clinice au arătat că TCA au tendința de a fi mai eficiente decât anti-convulsivantele de tip gabapentin sau decât opioidele (tramadol și oxicodonă), în timp ce venlafaxina din grupul SNRI pare să fie la fel de eficientă, iar SSRI par să aibă o eficacitate mai scăzută.(199). Mecanismele lor de acțiune nu sunt încă bine stabilite, dar există o serie de ipoteze care prind contur. Sunt blocanți ai receptorilor N-metil-D-aspartat (NMDA), și blochează efectele asupra canalelor de calciu și de sodiu; sunt stimulatori slabi ai receptorilor opioizi μ. Un studiu recent sugerează că efectele antidepresive și analgezice sunt obținute prin reducerea dereglării imunitare și a producției de citokine. Antidepresivele pot reduce nivelele de citokine pro-inflamatorii, cum ar fi factorul de necroză tumorală și interleukina-6. În rezumat, eficacitatea TCA în durerea neuropată este cel mai probabil multimodală (200).
Clomipramina, nortriptilina, doxepina
Clomipramina este un antidepresiv triciclic. Este un inhibitor foarte selectiv al recaptării de serotonină. Este de asemenea și un antagonist al receptorului histaminic H1, al receptorilor colinergici muscarinici și al receptorului α1 adrenergic (201, 202).
Clomipramina acționează ca un analgezic, al cărui mecanism de acțiune este complex și nu încă înțeles pe deplin. Pe un set de experimente incluzând hot-plate, răspuns constrictiv abdominal cu acid acetic și algezimetrie, clomipramina a avut efecte hipoalgeziante pe toate modelele, în doze de 20 mg/kg, presupunând implicarea receptorilor 5HT2 și 5HT3 (203, 204). De asemenea, a redus comportamentele de tip depresiv asociate cu durerea la șobolani (alimentație, locomoție, comportament operativ pozitiv) (205), singur sau în asociere cu opiozi de tip petidină sau tramadol (206). O serie de autori au legat aceste efecte și de expresia nitroxid-sintetazei inductibile (207) și a altor răspunsuri neuroendocrine (208).
Nortriptilina face parte din aceeași familie a antidepresivelor triciclice, ce acționează prin blocarea receptorilor presinaptic noradrenergici, blocând astfel recaptarea acestui neurotransmițător și crescându-i concentrația în fanta sinaptică (209, 210). Are efecte de stimulare a acțiunii opioizilor, precum și efecte per se în durerile de tip neuropatic, precum sindromul dureros post-herpetic, durerea miofascială, neuropatiile periferice induse de citostatice (211, 212). Cele mai bune efecte anti-nociceptive au fost însă identificate în combinație cu opioidele, unde co-administrarea de nortriptilină a redus dozele de opioide de o manieră semnificativă (213).
Studii de tip meta-analiză, folosind bazele de date Cochrane, au identificat eficiența crescută a morfinei la combinația cu nortriptilină, mai mult decât pentru gabapentin. Totuși rezultatele sunt nesistematizate și cu deficiențe metodologice, neimplicând nortiriptilina ca terapie de primă linie (214). Rămâne însă un adjuvant interesant, iar combinația sa cu substanțe ce modifică metabolismul SRAA rămâne de interes, ca în studiul de față.
Doxepina este un inhibitor de recaptare a serotoninei și a noradrenalinei și acționează și ca antagonist al diverșilor receptori serotoninergici, dopaminergici, muscarinici și histaminici (215). Pe modelele de durere neuropată a avut efect de inhibiție a alodiniei (leziune de nerv sciatic), hiperalgeziei (216). Pe testul von Frey și cold-plate folosind un model de leziune constrictivă cronică (Chronic Constructiv Injury), doxepina a atenuat simptomele de durere neuropată și a redus expresia medulară IL6 și IL1β. Efectele însă nu sunt sistematice și o serie de alte medicații sunt cu certitudine implicate în mecanismul de acțiune al doxepinei asupra durerii, precum și a celorlalte antidepresive triciclice (217). Ca și adjuvante, antidepresivele triciclice pot fi considerate utile în terapia durerii, mai ales a celei de tip neuropat, dar cercetările se află la început.
PARTEA PERSONALĂ – CONTRIBUȚII PROPRII
CAPITOLUL 4
INVESTIGAȚII COMPORTAMENTALE ȘI BIOCHIMICE PRIVIND ADMINISTRAREA ACUTĂ ȘI CRONICĂ A UNOR SUBSTANȚE CE MODIFICĂ SISTEMUL RENINĂ-ANGIOTENSINĂ (SRA)
4.1. MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI
O serie de studii cuprinzătoare au fost realizate pe angiotensină și derivații noi în ceea ce privește efectele comportamentale ale acestora (185, 218) dar un studiu sistematic al inhibitorilor enzimei de conversie ai angiotensinei I (IECA) și al blocanților receptorilor angiotensinici AT1 (BRA) asupra parametrilor comportamentali nu a fost încă publicat și de aceea am considerat că este oportun și original.
După cum se știe, tratamentul cu IECA, cu BRA sau cu inhibitori de renină (aliskiren, remikiren, etc.) se administrează continuu, din momentul diagnosticării hipertensiunii arteriale până la sfârșitul vieții. Această administrare de decenii poate avea efecte importante asupra evoluției psiho-comportamentale a pacientului. Există date care sugerează ca enzima de conversie a angiotensinei (ECA) ar putea degrada β-amiloidul, reducând riscul apariției bolii Alzheimer, ceea ce ar putea însemna că un tratament de lungă și foarte lungă durată cu IECA ar putea avea printre consecințe o creștere a riscului de boală Alzheimer (219).
Sistemul renină-angiotensină este un sistem endocrin de importanță capitală în fiziologie și fiziopatologie, cu implicații majore în farmacologie. Orice informații suplimentare care pot fi obținute prin investigarea acestui subiect sunt de importanță teoretică majoră, dar mai ales practică, deoarece terapia cu IECA sau BRA este de lungă durată sau definitivă și cu certitudine cu un impact mai important al evoluției pacienților pe termen lung decât cel simplu cardiovascular (97, 220) (221).
Există foarte multe studii comportamentale pe animale dar cele mai multe dintre ele au folosit pentru administrarea medicației testate, calea parenterală. Scopul acestor studii a fost de a folosi administrarea orală a medicamentelor (IECA și BRA). A fost preferată această cale deoarece acestea au o bună biodisponibilitate și administrarea parenterală ar fi introdus un stress și o durere suplimentară care ar fi putut altera rezultatele. De asemenea, administrarea pe cale orală este utilizată în procedurile terapeutice la om, mărind în continuare similitudinile cu condițiile clinice.
La ora actuală există o abordare nouă în ceea ce privește administrarea de diverse peptide precum (insulina, oxitocina) pe cale intranazală (i.n.) care ar avea efecte asupra SNC. În acest context, am dorit să testăm efectele angiotensinei II la nivel SNC în urma administrării acesteia pe cale i.n.
Pentru realizarea acestei lucrări s-au avut în vedere următoarele obiective:
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării în doză unică și în doze diferite a unor IECA (Captopril, Ramipril) și BRA (Losartan);
Crearea unui model de demență prin administrarea unui antagonist colinergic muscarinic (Scopolamină) în doză unică și în doze diferite precum și evaluarea efectelor privind diverse aspecte comportamentale;
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării în doză unică a unor IECA (Captopril, Ramipril) și BRA (Losartan) la un model de demență indus cu Scopolamină;
Pentru obiectivele enumerate, efectele asupra comportamentului au fost evaluate cu ajutorul unor teste (y-maze, elevated plus, open field), prin care am determinat o serie de parametri specifici: procentul de alternare spontană ca indicator al memoriei de scurtă durată, anxietatea, activitatea locomotorie.
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării cronice a unor IECA (Ramipril) și BRA (Losartan) atât la animalul sănătos cât și la un model de demență indus cu Scopolamină.
Pentru acest obiectiv am utilizat testul radial arm maze, cu ajutorul căruia a fost evaluată memoria de lungă durată.
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării în doză unică, la intervale diferite de timp, pe cale intranazală de Angiotensină II
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării în doză unică, pe cale intraperitonială de Angiotensină II
Compararea efectelor asupra comportamentului la șoarece, în urma administrării în doză unică de Ang. II pe căi diferite (i.p. și i.n.)
Studiul efectelor asupra comportamentului la șoarece în urma administrării în doză unică, pe cale intranazală de Angiotensină II (Ang. II) la loturi ce au fost protejate cu BRA (Candesartan p.o.)
Pentru administrarea Ang. II a fost folosită calea intranazală, deoarece, având structură de peptid, aceasta nu poate fi administrată pe cale orală, fiind inactivată. A fost evitată calea parenterală datorită acțiunii sistemice a angiotensinei (în special la nivel cardiovascular) și pentru a evita stresul indus prin acest tip de administrare. Calea intranazală permite pătrunderea în SNC a peptidelor prin bulbii olfactivi și apariția efectelor la nivel cerebral. Efectele Ang. II au fost de asemenea evaluate din punct de vedere comportamental cu ajutorul testelor y- maze, elevated plus, open field.
Determinări biochimice pentru evaluarea dinamicii unor parametri specifici stresului oxidativ (SOD, GPX, MDA), în urma administrării cronice de IECA, BRA și Scopolamină
4.2. MATERIAL ȘI METODE
4.2.1. ANIMALE DE LABORATOR UTILIZATE
Protocolul experimental a implicat utilizarea de șoareci albi Swiss, masculi, adulți cu greutatea 20-30 g și 30-40 g, repartizați prin randomizare în loturile de studiu. Animalele au fost achiziționate de la Institutul Cantacuzino, București, transportul fiind efectuat în acord cu legislația în vigoare. Contravaloarea pentru achiziția animalelor a fost suportată din fonduri proprii și din programul bugetat de Școala Doctorală.
Condițiile de habitat (tranzit, staționare) au fost asigurate conform cerințelor protocoalelor specifice fiecărui test, în incinta vivarium – ului Disciplinei de Farmacodinamie a Facultății de Farmacie Iași. Astfel, animalele au fost menținute în incinta de cazare la o temperatură constantă (21 ± 2°C) și un ciclu de lumină / întuneric de 12 ore (7.00 AM / 7.00 PM). Animalele au fost plasate în cuști speciale cu dimensiuni adecvate numărului de animale (8 – 16/cușcă). Cuștile sunt prevăzute cu adăpător și suport pentru hrană ce permit asigurarea hranei și apei ad libitum / 24 ore. Animalele de experiență au fost grupate în loturi a câte 8-16 animale/lot.
Având în vedere că procesele cognitive precum (memoria, învățarea) implică reacții comportamentale, pentru animalele luate în lucru am avut în vedere asigurarea unui timp de habitație de 15 zile înainte de experiment. Aceasta a presupus observarea apetitului, consumului de apă, tranzitului digestiv, semnelor neurologice și a comportamentului (socializarea, acceptarea în grup).
Hrana standard și așternutul animalelor au fost achiziționate prin intermediul Institutului Cantacuzino.
Ca animal de studiu, am ales șoarecele, datorită mai multor considerente:
animal mic, ușor de manipulat;
utilizarea unor cantități mici de substanțe medicamentoase;
un număr mic de articole publicate privind acest tip de teste comportamentale, cele mai multe fiind efectuate pe șobolan.
Animalele au fost aduse în camera pentru experiment cu cel puțin o oră înainte de începerea experimentului, pentru acomodare.
Testările din prezentul studiu au fost realizate respectând reglementările bioetice internaționale și reglementările interne UMF Iasi (222, 223).
4.2.2. SUBSTANȚE MEDICAMENTOASE UTILIZATE ÎN STUDIUL EXPERIMENTAL COMPORTAMENTAL
Inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei I (IECA):
Captopril (Sigma-Aldrich), este unul dintre cele mai vechi substanțe inhibitorii (224) ale enzimei de conversie, descoperit în 1977. Spre deosebire de celelalte inhibitoare de ECA, captoprilul nu este un prodrog, ci este o substanță activă în sine, ceea ce îi limitează biodisponibilitatea și îi oferă un profil farmacocinetic destul de deficitar, mai ales datorită unui timp de înjumătățire scurt, ce necesită administrarea de 3-4 ori/zi (225).
Ramipril (Zhejiang Huahai Pharmaceutical, Co., Ltd., China), este un prodrog sau un medicament precursor, care este convertit la metabolitul activ ramiprilat de enzima colinesteraza 1 (226).
Pe lângă acțiunea antihipertensivă, în ultimii ani au fost publicate diverse rapoarte care susțin că utilizarea IECA ar avea proprietăți antioxidante (227).
Blocanții receptorilor de angiotensină II (BRA):
Losartan (Sigma-Aldrich), este un antagonist al receptorilor AT1 de tip competitiv, selectiv, ce antagonizează cuplarea Ang II pe receptorul AT1 și inhibă toate efectele mediate de acesta. Se metabolizează în ficat producând metabolitul său 5-carboxilic, numit EXP3174, care blochează receptorul AT1, de 10-40 de ori mai eficient decât losartanul însuși (228).
Candesartan cilexetil (Zhejiang Huahai Pharmaceutical, Co., Ltd., China), este unul dintre medicamentele antihipertensive standard aparținând grupului de blocanți ai receptorilor AT1 de angiotensină II. Efectele benefice ale acestui medicament în tratamentul hipertensiunii arteriale sunt bine cunoscute. Studii recente susțin că ar putea atenua declinul memoriei legate de vârstă (229).
BRA sunt utilizați pentru efectul antihipertensiv, iar prin blocarea receptorilor AT1 din creier, ar avea efect neuroprotector atât asupra modelelor animale de boală Alzheimer cât și pentru alte tipuri de demență (230).
Având în vedere acțiunea antihipertensivă a substanțelor care influențează sistemul renină-angiotensină (IECA și BRA), o atenție deosebită a fost acordată dozelor utilizate, astfel încât acestea să nu influențeze semnificativ tensiunea arterială.
Administrarea substanțelor înainte de testare s-a făcut la intervale stricte, în funcție de fiecare substanță.
Antagoniști colinergici muscarinici:
Scopolamina (Sigma-Aldrich), un antagonist al receptorilor colinergici muscarinici ce are efecte amnezice profunde la animalele de experiență. Amnezia indusă de scopolamină a fost adoptată la scară largă pe modele animale experimentale pentru a examina medicamente cu potențiale valori terapeutice în demență (231), ce interferează cu transmisia acetilcolinei din sistemul nervos central, ducând la disfuncții colinergice și tulburări de memorie la șobolani și șoareci (232, 233).
Angiotensina II (Sigma-Aldrich), este un peptid activ, puternic vasoconstrictor care face parte din cascada sistemului renină-angiotensină (RAS);
Alte substanțe:
Carboximetilceluloza sodică: derivat de celuloză utilizat ca agent de suspendare în concentrație de 0,1% pentru administrarea substanțelor luate în studiu;
Apa distilată: utilizată pentru prepararea reactivilor de lucru;
Ser fiziologic (Zentiva): utilizat pentru prepararea reactivilor de lucru;
4.2.3. ADMINISTRAREA SUBSTANȚELOR
Pentru acest studiu au fost folosite următoarele căi de administrare: calea orală (p.o.) (IECA. BRA, suspensia de CMC-Na), calea intraperitoneală (i.p.) (Scopolamina și Angiotensina II), calea intranazală (i.n.) (Angiotensina II).
Administrarea pe cale orală a fost făcută cu ajutorul unei sonde metalice speciale (sondă de gavaj), adaptată tractului digestiv superior al șoarecelui. Sonda a fost atașată la o seringă de plastic de unică folosință cu diviziuni de 0,01 ml permițând astfel administrarea de volume mici și precise a substanțelor de cercetat.
Substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în carboximetilceluloză sodică (CMC-Na) 0.1%, volumul administrat fiind de 0,20 ml/10 g animal iar în cazul asocierilor 0,10 ml/10 g animal pentru fiecare compus.
Pentru administrarea pe cale intraperitoneală s-au folosit seringi de unică utilizare cu diviziunea de 0.01 ml și ace de dimensiuni adecvate. Substanțele de cercetat au fost preparate sub formă de soluție, solventul utilizat fiind serul fiziologic, iar volumul administrat fiind de 0,10 ml/10 g animal.
Administrarea pe cale intranazală a fost realizată cu ajutorul unei micropipete analitice la care au fost atașate vârfuri de unică utilizare, de mărime și volum adecvate animalului de experiență. Substanța de cercetat a fost preparată sub formă de soluție, serul fiziologic fiind solventul pentru dizolvare. Volumul administrat pe această cale a fost de 20 μl/șoarece, soluția fiind aplicată la baza ambelor nări. Aplicarea directă în interiorul nărilor a fost evitată datorită caracteristicelor anatomice ale nasului rozătoarelor. În studiul nostru, administrarea intranazală a fost relativ ușoară datorită proprietăților vasoconstrictoare ale Ang II ceea ce a permis facilitarea administrării.
4.2.4. METODE DE CERCETARE
4.2.4.1.Metode de studiu comportamental
Bateria de teste cuprinde: testul labirintului Y (Y-maze test), testul labirintului în formă de plus (elevated plus maze), testul în câmp deschis (open field) și labirintul cu brațe radiale (radial arm-maze).
4.2.4.1.1.Testul labirintului Y (Y-maze test)
Pentru acest test am utilizat un aparat construit special pentru studiul memoriei de scurtă durată a animalelor de experiență. Aparatul constă dintr-un labirint care, privit din partea superioară, are aspectul literei Y, de unde vine și numele testului. Aparatul este confecționat din plexiglas de culoare neagră, având aspectul din figura 4.1.
Figura 4.1. Aparat de tip labirint în formă de Y
(foto laboratorul de Farmacodinamie experimentală – utilizare permisă)
Prezintă o zonă centrală sub formă de triunghi echilateral și trei brațe, îmbinate în unghi egal, fiecare braț al aparatului (notat cu literele A, B, C). Fiecare animal este plasat la capătul unuia din brațe, de regulă în brațul notat cu litera A, și lăsat să se deplaseze liber timp de 8 minute, în care sunt notate secvența brațelor vizitate. Se consideră că un animal a intrat într-un braț, în momentul în care toate cele patru membre ale animalului sunt situate în acel braț. După trecerea celor 8 minute, testul se încheie, iar animalul este scos din labirint.
După testarea fiecărui animal de experiență este necesară îndepărtarea cu alcool a eventualelor urme de feromoni de pe planșeul labirintului, de asemenea, nu se recomandă utilizarea unor agenți de curățare cu miros persistent (234).
Comportamentul de alternare spontană este definit ca intrarea succesivă în cele trei brațe (notată în seturi de triplet: ABC, BCA, CAB, CBA, ACB, BAC). Procentul de alternare spontană este definit ca fiind raportul dintre numărul de alternări efectuate și cele posibile (definit ca numărul total de intrări în brațe minus doi), totul înmulțit cu 100 (235).
Testul este bazat pe tendința rozătoarelor de a explora acel braț care în succesiunea directă a intrărilor a fost cel mai devreme vizitat (236).
4.2.4.1.2.Testul labirintului în formă de plus (elevated plus maze)
Acest test studiază stările de anxietate ca și componentă a proceselor cognitive. Aparatul este constituit din 4 brațe de plexiglas de culoare neagră, dispuse în formă de cruce sau semnul plus și o zonă centrală. Dintre cele 4 brațe, două sunt „deschise” iar două sunt „închise” cu pereți, așa cum se poate observa în figura nr. 4.2.
Figura 4.2.Aparat de tip testul labirint plus ridicat
(foto laboratorul de Farmacodinamie experimentală – utilizare permisă)
Înălțimea aparatului fată de pardoseală trebuie să fie de 40 cm, pentru a nu permite animalului să sară din aparat. Această distanță poate varia în funcție de nivelul de luminozitate al camerei, de consistența pardoselii, dar și în funcție de tratamentul primit de animal (237). Brațele „închise” sunt descoperite la partea lor superioară, pentru a facilita iluminarea si observarea animalului (238).
Principiul testului îl constituie generarea simultană a celor două tendințe conflictuale ale animalului de studiu, de a explora labirintul și de evitare a unui stimul nou ce poate fi agresiv. Se recomandă ca aparatul să fie plasat într-o cameră goală pentru a nu influența în nici un fel comportamentul anxiolitic sau antianxiolitic al animalului.
Fiecare animal este plasat în zona centrală a labirintului, cu capul orientat spre un braț deschis și este lăsat timp de 5 minute să exploreze labirintul. Pe parcursul testării se înregistrează următoarele elemente:
numărul de intrări și timpul petrecut în brațele deschise;
numărul de intrări și timpul petrecut în brațele închise;
timpul petrecut în zona centrală a labirintului;
indicatori specifici ai anxietății (grooming, stretching, rearing, freezing, head dipping)
La fel ca și în cazul labirintului Y, o intrare validă se consideră atunci când animalul este cu toate cele 4 membre în brațul respectiv. Căderea în mod accidental a unui animal din labirint impune scoaterea acestuia din experiment (239).
Având în vedere că acest test este folosit pentru a studia stările de anxietate ca și componentă a proceselor cognitive, el este efectuat o singură dată.
4.2.4.1.3.Testul single unit (open field)
Acest test este utilizat pentru evaluarea anxietății și activității locomotorii la rozătoare. Aparatul se prezintă sub forma unui cadru de formă pătrată, cu latura și înălțimea în funcție de animalele utilizate și cu podeaua împărțită în 16 pătrate trasate cu markerul, în centru fiind trasat un alt pătrat, după cum se poate observa în figura 4.3.
Figura 4.3. Aparat pentru testul labirintului în cîmp deschis
(foto laboratorul de Farmacodinamie experimentală – utilizare permisă)
Animalele sunt aduse în camera de lucru și lăsate un timp de minim o oră pentru acomodare. Experimentul se realizează pe lumină redusă, difuză. Animalul de studiu se plasează în centrul aparatului și este lăsat să exploreze timp de 5 minute, timp în care se înregistrează mai mulți parametri relevanți pentru activitatea locomotorie și gradul de anxietate. După fiecare animal aparatul se șterge cu etanol 70%.
În vederea acomodării animalelor cu mediul nou reprezentat de aparat, acestea sunt lăsate să exploreze în grup aparatul câte cinci minute timp de cel puțin două zile înainte de testarea propriu-zisă.
Parametri evaluați:
line-crossing-uri: de câte ori animalul trece peste o latură a pătratelor marcate pe podea, cu toate cele patru membre – indice al activității locomotorii;
timpul petrecut în pătratul central (+ numărul de intrări/traversări ale laturilor pătratului central) indicator al unui grad redus de anxietate; timpul mai lung petrecut în pătratele (zonele) periferice reflectă stări de anxietate accentuate;
numărul și durata de rearing și stretching: poziții de evaluare a riscului, care indică un grad mai mare de anxietate;
timpul petrecut în grooming: comportament ce apare în situații noi, indică de asemenea apariția unor stări de nesiguranță-anxietate;
numărul de boluri fecale și urme de urină, indici (discutabili în literatură) ai anxietății.
numărul și timpul petrecut într-o anumită arie – freezing (dacă este cazul)
Timpul de testare poate varia între 2-10 minute, iar repetabilitatea testului conduce în cele mai multe cazuri la creșterea indicilor activității locomotorii și de explorare (234, 240).
4.2.4.1.4. Testul labirintului cu brațe radiale (radial arm-maze test)
Labirintul folosit în studiile noastre este alcătuit din 8 brațe, numerotate de la 1 la 8, dispuse radiar în jurul unei suprafețe circulare, după cum se poate observa în figura 4.4.
Labirintul este confecționat din plexiglas de culoare neagră. Aparatul, plasat la o înălțime de 40 cm de suprafața pardoselii, a fost menținut în același loc pe toată durata experimentului și a fost înconjurat de diferite obiecte, a căror poziție a rămas de asemenea nemodificată.
Înainte de începerea testului, animalele au fost supuse unui regim de slăbire, până la 80-85 % din greutatea lor inițială prin reducerea treptată a rației zilnice de hrană, apa fiind în continuare administrată ad libitum (241).
Figura 4.4. Aparat de tip labirint cu brațe radiale
(foto laboratorul de Farmacodinamie experimentală – utilizare permisă)
După atingerea greutății dorite, animalele au fost supuse unei perioade de antrenament (4-5 zile) ce a constat în explorarea liberă a labirintului, timp de 5 minute zilnic, pentru a se acomoda cu incinta aparatului. Pe parcursul antrenamentului, se asigură și o acomodare a animalelor cu pelete speciale de sucroză care vor constitui motivația explorării brațelor. Această habituare se realizează prin reducerea gradată a distribuirii peletelor din tot labirintul până la plasarea lor doar la extremitățile brațelor.
Începând cu prima zi de testare propriu-zisă, distribuirea peletelor va fi făcută selectiv, doar la capătul brațelor 1, 2, 4, 5 și 7, ce sunt marcate prin așezarea la intrarea în brațe a unei hârtii albe. Brațele 3, 6 și 8 nu au fost recompensate cu pelete pe toată durata experimentului.
Acest test permite investigarea memoriei de scurtă durată, memoriei de lungă durată și memoriei spațiale, prin determinarea numărului de erori ale memoriei de lucru, a numărului de erori ale memoriei de referință și respectiv a timpului de explorare a brațelor. Numărul de erori ale memoriei de lucru (o eroare a memoriei de lucru este definită ca reintrarea într-un braț din care hrana a fost consumată anterior) reprezintă un indice al memoriei de scurtă durată, deoarece în timpul testului, animalul de experiență va trebui să memoreze care braț a fost deja vizitat și care nu a fost vizitat (242).
Numărul de erori ale memoriei de referință (o eroare a memoriei de referință este definită ca intrarea într-un braț care nu a conținut niciodată hrană) oferă informații despre memoria de lungă durată, cu referire la informația care va rămâne constantă de-a lungul experimentului, având în vedere că animalul trebuie să memoreze poziția fiecărui braț ce conține hrană (234).
4.2.4.2.Materiale și metode folosite pentru determinările biochimice
4.2.4.2.1. Materiale de cercetare științifică
4.2.4.2.1.1. Pregătirea animalelor
Materialul biologic folosit pentru determinările biochimice a fost reprezentat de probe de sânge și creier ce au fost prelevate de la cele 48 de animale (șoareci albi Swiss, masculi, adulți, cu o greutate cuprinsă între (20-30 g și 30-40 g), ce au constituit loturile necesare administrării substanțelor (IECA, BRA și Scopolamină) în administrare cronică din cadrul testului radial. Prelevarea probelor a fost făcută la 24 de ore de la finalizarea ultimei testări comportamentale.
Testările din prezentul studiu au fost realizate respectând reglementările bioetice internaționale și reglementările interne UMF Iași.
4.2.4.2.1.2. Prelucrarea probelor biologice
Pentru efectuarea dozărilor biochimice, au fost folosite extracte din țesut cerebral astfel: 0,2 grame țesut a fost mojarat cu sticlă pisată până la omogenizare; mojaratul a fost preluat cu un volum de tampon de extracție din țesuturi (0,3028 g TRIS, 1,30462 g KCl2 și apă distilată până la un volum de 200 ml, pH=7,4) în raport 1:10, masă la volum în eprubete de centrifugă și centrifugat 15 minute la 3500 rpm. După centrifugare, a fost preluat supernatantul care a fost ulterior utilizat pentru analizarea biochimică. A fost utilizat ca sursă biologică pentru determinarea activității enzimatice în ziua extracției. Nu se recongelează, se păstrează la frigider maxim o zi.
Probele de sânge au fost lăsate să coaguleze (între jumătate de oră și 2 ore) prin expunere la aer, apoi centrifugate la 3000 rpm, timp de 15 minute. Serul sanguin a fost separat și congelat (-22șC) până la analizare.
4.2.4.2.2. Metode de cercetare științifică
Metoda de determinare a activității superoxid dismutazei (SOD)
Generalități. Determinarea activității enzimatice a superoxid dismutazei a fost efectuată cu ajutorul unui kit de determinare ”SOD assay kit” (Sigma-Aldrich, Statele Unite ale Americii). Acest kit utilizează o metodă indirectă de determinare prin folosirea unui compus care participă la o reacție de culoare măsurabilă în spectrul vizibil (nitroblue-tetrazoliu), fiind cea mai comună și eficientă metodă.
Principiul metodei. se bazează pe utilizarea sării de tetrazoliu a lui Dojindo’s (WST), foarte solubilă în apă care produce o substanță colorată la reducerea anionului superoxid. Rata reducerii cu oxigen molecular este corelată liniar cu activitatea xantinoxidazei și este inhibată de SOD. Prin urmare IC50 (50% din rata de inhibiție a SOD) poate fi determinată prin colorimetrie. Din moment ce absorbanța la 450 nm este proporțională cu concentrația anionului superoxid, activitatea SOD poate fi cuantificată prin măsurarea scăderii vitezei de colorare a mediului de reacție la 450 nm (spectrofotometru seria DU700, Beckman Coulter, Statele Unite ale Americii).
Mod de lucru. Soluțiile de reacție WST și de enzimă se prepară din soluțiile stoc din kit conform cu prospectul reactivilor. Pentru obținerea mediilor de reacție și testarea propriu zisă, se procedează urmărind întocmai pașii descriși în tabelul următor (Tabel 4.1.).
Tabel 4.1. Mod de lucru pentru metoda de determinare a SOD prin tehnica cu tetrazoliu solubil în apă
Calculul rezultatelor: după citirea absorbanțelor, pentru calculul activității enzimatice, se utilizează formula:
Activitate SOD (exprimată ca rată de inhibiție %)=
Limitări ale metodei. Cu toate acestea, există și câteva inconveniente precum solubilitatea insuficientă a formazanului în apă și interacțiunea cu forma redusă a xantinoxidazei. Acidul ascorbic, forma redusă a glutationului sau albuminele în concentrații crescute pot interfera cu rezultatele obținute prin aplicarea acestei metode. De asemenea, este vitală verificarea realizării corecte a mediilor de reacții de control (virajul culorii ar trebui să fie progresiv). În cazul în care reacțiile de control nu sunt conforme, se recomandă reluarea determinărilor.
Metoda de determinare a activității enzimatice a glutation peroxidazei (GPx)
Generalități. Determinarea activității enzimatice a glutation peroxidazei a fost realizată cu ajutorul kitului de determinare ”Glutathione Peroxidase Cellular Activity Assay Kit” (Sigma-Aldrich, Statele Unite ale Americii). Și de această dată, statusul reacțiilor este măsurabil spectrofotometric, dar nu în spectrul vizibil.
Principiul metodei. Kitul utilizează o metodă indirectă de măsurare bazată pe oxidarea glutationului în glutation oxidat, reacție catalizată de enzima glutation peroxidază și cuplată cu reacția inversă (reciclarea glutationului oxidat la forma sa redusă), reacție catalizată de glutation reductază. În tot acest șir de reacții se măsoară modificările de concentrație ale cofactorului enzimatic NADPH. Scăderea absorbanței măsurată la 340 nm în timpul oxidării NADPH la NADP+ este direct proporțională cu activitatea glutation peroxidazei, din moment ce enzima este factorul de modulare a cuplului de reacții. Reacția are loc la 25°C și pH de 8.0 și este inițiată de adăugarea în mediul de reacție a unui peroxid organic, terțbutil hidroperoxidul (t-Bu-OOH).
Mod de lucru. Prepararea reactivilor de tampon reacție, reactiv NADPH și terț-butil-hidroperoxid 30 mM se face conform instrucțiunilor de pe prospectul reactivilor. Pentru obținerea mediilor de reacție și a reacțiilor propriu zise, se procedează conform cu modul de lucru prezentat în prospectul kitului și sumarizat în tabelul următor (Tabel 4.2):
Tabel 4.2. Mod de lucru pentru metoda de determinare a SOD prin tehnica ce utilizează terț-butil hidroperoxid ca substrat organic
Calculul rezultatelor: pentru calculul activității enzimatice se utilizează următoarea formulă:
Activitate enzimatică a GPx (exprimată în unități enzimă pe minut) =
Unde ΔA340= A340/min (blank) – A340/min (probă), DF = factorul de diluție al probei, V = volumul de reacție în mililitri și 6,22 = o constantă a NADPH-ului.
Activitatea enzimatică va fi exprimată sub forma ”unități de glutation peroxidază ce au catalizat formarea a unui micromol de NADP+ din NADPH pe minut la pH de 8.0 și temperatură de 25 °C într-o reacție cuplată în prezența glutationului redus, a glutation reductazei și a tertbutil hidroperoxidului” (unități/minut).
Limitări ale metodei. Detergenții anionici care conțin concentrații crescute de peroxizi pot influența dinamica reacțiilor enzimatice.
Metoda de determinare a concentrației de malondialdehidă, marker al peroxidării lipidice celulare.
Generalități. Metoda utilizată pentru determinarea concentrației de produși ai lipid peroxidării este o tehnică adaptată după literatura de specialitate și extrem de uzuală în laboratorul de biochimie. Peroxidarea lipidelor este un mecanism bine cunoscut și studiat, cauzator al leziunilor celulare ca urmare a apariției stresului oxidativ în celulele și țesuturile vii. Peroxizii lipidici care rezultă din acizi grași polinesaturați sunt extrem de instabili descompunându-se foarte ușor într-o serie de compuși carbonilici reactivi dintre care predomină malondialdehida (MDA).
Principiul metodei. La temperatură ridicată (100șC) și în mediu acid (în prezența acidului triclor-acetic concentrat), malondialdehida rezultată prin descompunerea peroxizilor lipidici are proprietatea de a reacționa cu acidul 2-tiobarbituric (TBA) formând un compus de culoare roz cu maxim de absorbție la 532 nm și coeficient molar de 1,56 ×105cm-1× M-1.
Mod de lucru. Prepararea reactivilor se face, de preferință, extemporaneu și în cantități potrivite. Se prepară soluție acidă de acid tricloracetic 50% (acid clorhidric 0,1N), soluție acidă de acid tricloracetic 20% (acid clorhidric 0,1N), soluție de acid tiobarbituric 26 mM în soluție de acid tricloracetic 20% preparată anterior și soluție etalon de malon dialdehidă 50 nanomoli/ml. Pentru obținerea mediilor de reacție și a reacțiilor propriu zise, se procedează întocmai după pașii descriși în tabelul următor (Tabel 4.3):
Tabel 4.3.Mod de lucru pentru metoda de determinare a concentrațiilor de malondialdehidă prin tehnica ce utilizează acidul tiobarbituric
Pentru realizarea curbei de etalonare (Tabel 4.4), se procedează similar înlocuind adăugarea de ser sanguin cu adăugarea soluției etalon de MDA în concentrații progresive obținute după modelul prezentat în tabelul anterior (Tabel 4.3).
Tabel 4.4. Model de calcul al concentrațiilor soluțiilor de etalonare plecând de la soluția stoc de malondialdehidă (50 nmoli/ml).
Calculul rezultatelor. Absorbanța se introduce în sistemul de etalonare pe bază de curbe standard pentru MDA, iar rezultatul se exprimă în nmol/ml ser/lacrimi
Astfel că extrapolând extincția probei pe curba etalon realizată, se află cantitatea de MDA corespunzătoare volumului de ser analizat (x nanomoli MDA).
Astfel că extrapolând extincția probei pe curba etalon realizată, se află cantitatea de MDA corespunzătoare volumului de ser analizat (x nanomoli MDA). Pentru a afla concentrația de MDA raportată la mililitrul de ser (plasmă, lacrimi sau alte lichide biologice), se calculează cu ajutorul formulei:
unde 0,1 reprezintă volumul de ser luat pentru determinare.
Metoda de determinare cantitativă a proteinelor totale solubile
Generalități. Metoda de deteminare cantitativă a proteinelor totale solubile folosește tehnica clasică Bradford adaptată de Ungureanu și Artenie (243).
Principiul metodei. În mediu acid, colorantul Coomassie Brilliant Blue G-250 formează cu proteinele un complex având maximul de absorbție la 595 nm. Colorantul reacționează mai întâi cu radicalii de arginină și pe urmă cu resturile de histidină, lizină, tirozină, triptofan și fenilalanină din structura proteinelor.
Modul de lucru. Într-o eprubetă de 10/100 mm se măsoară 0,1 – 0,5 ml soluție proteică de analizat (în funcție de cantitatea presupusă de proteină) și se adaugă 0,4 – 0,0 ml soluție tampon de extracție. În eprubetă se introduc 1,5 ml reactiv Bradford, se amestecă conținutul cu atenție și se lasă la temperatura camerei. După 5 minute, dar mai înainte de 15 – 30 minute, se citește extincția probei la un spectrofotometru la lungimea de undă de 595 nm, față de un control al reactivilor preparat în același mod ca și proba, cu excepția că soluția proteică este înlocuită cu soluție tampon de experiență (244).
Calculul rezultatelor. Pentru calcularea cantității de proteine în proba analizată se construiește o curbă etalon cu concentrații cunoscute de albumină serică bovină (ovoalbumină) sau gamma-globulină. După ce se află pe curba de etalonare microgramele de proteină în proba de analizat, se calculează concentrația de proteine în proba analizată, ținând cont de volumul de extract utilizat și de gradul de diluție, dacă este cazul.
Concentrația de proteine în proba de analizat se exprimă în mg / ml în cazul lichidelor biologice sau mg / g pentru țesuturile animale, respectiv vegetale.
4.2.4.3. Metode de analiză și interpretare a datelor
Rezultatele au fost exprimate ca medii ± E.S.M. (eroarea standard a mediei). Datele obținute în prezentul studiu au fost prelucrate și interpretate statistic utilizând testul „t” a lui Student pentru perechi de valori și Standard ANOVA (Single factor și/sau Two-factor with replication). În cazul testului „t” Student, valorile lui p ≤ 0,05 au fost considerate ca semnificative (notate pe grafice cu *). Valorile lui p ≤ 0,01 au fost indicate pe grafice cu **, în timp ce p ≤ 0,001 a fost indicat cu ***.
În cazul testului ANOVA, valorile lui F pentru care p este mai mic decât 0,05 au fost interpretate ca având semnificație statistică (*).
De asemenea, corelațiile Pearson au fost utilizate pentru a stabili legăturile care există între markerii stresului oxidativ și indicii comportamentali.
Wilks 'lambda este o metodă statistică folosită în analiza multivariată a varianței (MANOVA) pentru a testa dacă există diferențe între mediile grupurilor identificate de subiecți pentru o combinație de variabile dependente. Este similară cu testul-F din ANOVA. Lambda este o unitate de măsură a varianței procentuale a variabilelor dependente care nu este definită de diferențele dintre variabilele independente. O valoare de zero a mediilor înseamnă că nu există nicio varianță nedefinită de variabila independentă (care este cazul ideal). Cu alte cuvinte, cu cât valoarea statistică este mai aproape de zero, cu atât variabila în cauză contribuie mai mult la model. Ipoteza nulă se respinge pentru valori ale Wilks 'lambda-ei apropiate de zero și în combinație cu o valoare mică a probabilității (p).
4.3. REZULTATE
4.3.1. STUDIUL EFECTELOR BLOCĂRII SRA PRIN ADMINISTRARE DE IECA (CAPTOPRIL, RAMIPRIL), BRA (LOSARTAN) PRECUM ȘI A EFECTELOR BLOCĂRII SISTEMULUI COLINERGIC PRIN ADMINISTRARE DE SCOPOLAMINĂ EXERCITATE LA NIVEL COMPORTAMENTAL LA ȘOARECE
4.3.1.1. Efectele produse la șoarece în urma administrării de IECA, BRA și Scopolamină asupra memoriei spațiale de scurtă durată analizată cu ajutorul labirintului Y
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 72 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 30-40 g, împărțiți aleatoriu în 9 loturi, a câte 8 animale fiecare. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările, s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea.
Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM.
Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.5.
Tabel 4.5. Dozele de substanțe medicamentoase utilizate pentru testul Y
Toate substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție, iar solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g %. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au preparate “ex tempore”!
Administrarea în doze diferite și unice a unor IECA, BRA și a scopolaminei a avut ca efect apariția unor diferențe între loturi în ceea ce privește procentul de alternare spontană, dar fără semnificație statistică (F (8, 63) = 1.944, p = 0.068), sugerând că administrarea medicamentelor menționate nu modifică semnificativ memoria spațială pe termen scurt. Nu au fost observate diferențe semnificative nici între loturi și nici între dozele diferite ale aceluiași compus (Figura 4.5., Tabel 4.6.).
Figura nr. 4.5. Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra procentului de alternare spontană din testul Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot).
Tabel 4.6. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, asupra procentului de alternare spontană.
Numărul intrărilor în brațele labirintului nu a variat semnificativ între loturi, cu excepția celor două loturi tratate cu scopolamină care au avut mai multe intrări în cele trei brațe. Administrarea scopolaminei, un anagonist specific al receptorilor colinergici muscarinici, în doze de 0,5 mg/kg și respectiv 1 mg/kg (i.p.) cu 30 de minute înainte de testare, a generat o creștere a activității motorii (p < 0,005), așa cum se poate observa prin analiza numărului de intrări în brațe (Figura 4.6, Tabel 4.7). Rolul stimulator al scopolaminei asupra activității motorii din cadrul a diferite teste comportamentale este de altfel cunoscut în literatura de specialitate (245, 246).
Figura 4.6. Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra numărului de intrări în brațele labirintului din testul Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot), ***p < 0,005 vs. control.
Tabel 4.7. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice privind numărul de intrări în brațe.
Loturile tratate cu scopolamină au prezentat un număr mare de intrări în brațe, cu semnificație statistică față de lotul martor (p < 0,004), așa după cum se poate observa în figura 4.7, 4.8., Tabel 4.8., 4.9.):
Figura 4.7. Efectele administrării de scopolamină în doză de 0,5 mg/kg privind numărul de intrări în brațele labirintului din testul Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M.
(n = 8 animale/lot), ***p < 0,005 vs. control.
Tabel 4.8. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de scopolamină în doză de 0,5 mg/kg vs. martor, privind numărul de intrări în brațele labirintului.
Figura 4.8. Efectele administrării de scopolamină în doză de 1 mg/kg privind numărul de intrări în brațele labirintului din testul Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M.
(n = 8 animale/lot), *** p ≤ 0,005 vs. control.
Tabel 4.9. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de scopolamină în doză de 1 mg/kg vs. martor, privind numărul de intrări în brațele labirintului.
4.3.1.2. Efectele produse la șoarece în urma administrării de IECA, BRA și Scopolamină asupra unor parametri afectiv-emoționali în cadrul testului labirintul plus ridicat
Acest test permite evaluarea stării de anxietate, prin monitorizarea unor parametri precum timpul petrecut în brațele deschise sau închise ale labirintului ce servesc drept indici ai stării de dezinhibare sau inhibare.
Studiul a fost realizat pe un număr de 72 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 30-40 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 9 loturi, fiecare lot a câte 8 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările, s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea.
Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM.
Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.10.
Tabel 4.10. Dozele de substanțe medicamentoase folosite pentru testul labirintul plus ridicat
Toate substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție iar solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9 g%. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au fost preparate “ex tempore”!
Scopolamina în doză de 1 mg/kg și Captoprilul în doză de 25 mg/kg au generat o stare de dezinhibare reflectată de perioada mai mare de timp petrecut în brațele deschise ale labirintului (F (8, 63) = 1.832, p = 0.087). S-a observat o diferență semnificativă între cele două doze de scopolamină utilizate (p < 0,04) și între cele două doze de captopril (p = 0,05) (Figura 4.9. Tabel 4.11.).
Figura 4.9. Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra timpului petrecut în brațele deschise. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot), #p <0,04 vs. scopolamină 0.5, ^ = 0.05 vs. captopril 10)
Tabel 4.11. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, asupra timpului petrecut în brațele deschise
Activitatea locomotorie evaluată prin numărul de intrări în brațele închise nu a înregistrat diferențe semnificative între loturi, doar în cazul ambelor doze de scopolamină observându-se un grad mai ridicat de mobilitate similară celei obținute în testul Y.
Faptul că animalele loturilor aferente s-au comportat normal din punct de vedere explorator, asta poate sugera că nu au fost stresate fiind un avantaj în obținerea rezultatelor.
Figura 4.10. Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra numărului de intrări în brațele închise ale labirintului plus ridicat. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot).
Tabel 4.12. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, privind numărul de intrări în brațele închise.
Dintre indicatorii specifici anxietății, se remarcă:
Timpul de grooming (timpul în care animalul își face toaleta, reflectând un grad relativ de anxietate); pentru acest indicator nu au fost observate diferențe semnificativ statistice, cu excepția dozelor de captopril pentru care doza mare (25 mg/kg) a avut un efect pozitiv, diminuând timpul petrecut în grooming (p<0,05) (Figura 4.11., Tabel 4.13.,Tabel 4.14.).
Figura 4.11. Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra timpului petrecut în grooming. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M.
(n = 8 animale/lot), #p<0,05 vs captopril 10)
Tabel 4.13. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, privind timpul de grooming.
Tabel 4.14. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA (captopril 10 mg/kg și captopril 25 mg/kg), în urma administrării în doză unică, privind timpul de grooming.
Head dipping (animalul aflat la extremitatea brațului deschis își întinde capul explorând în afara brațelor; acest parametru indică un grad ridicat de dezinhibare). După cum se observă în figura 4.12. administrarea de IECA (ramipril 2 mg/kg, ramipril 4 mg/kg, captopril 10 mg/kg, captopril 25 mg/kg) și BRA (losartan 20 mg/kg), a afectat semnificativ comportamentul explorator, comparativ cu lotul control (p < 0,05), cu excepția losartanului în doză de 10 mg/kg.
Figura 4.12..Efectele administrării în doze diferite și unice de IECA (captopril, ramipri), BRA (losartan) și scopolamină asupra parametrului Head dipping (animalul își întinde capul și se apleacă peste brațele deschise, în jos). Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M.
(n = 8 animale/lot), *p < 0,05 vs. control, ##p <0,01 vs. losartan 20.
Surprinzător este faptul că mărirea dozei de losartan (20 mg/kg) a redus semnificativ parametrul de head dipping (p <0,01 vs. losartan 10), sugerând un grad ridicat de inhibare (Tablel 4.15).
Tabel 4.15. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, privind parametrul head dipping
4.3.1.3.Efectele produse la șoarece în urma administrării de IECA, BRA și Scopolamină asupra unor parametri afectivi- emoțíonali și ai activității motorii în cadrul testului open field
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 72 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 30-40 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 9 loturi, fiecare lot a câte 8 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările coportamentale s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea. Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM. Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.16
Tabel 4.16. Dozele de substanțe medicamentoase folosite pentru testul open field
Figura 4.13. Efectele diferitelor doze de IECA, BRA și scopolamină asupra timpului petrecut în centru. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M.
(n = 8 animale pe grup), *p <0,05 vs. control, **p <0,01 vs. control.
Toate substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție iar solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g%. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au fost preparate “ex tempore”!
Dintre parametrii evaluați, timpul petrecut în centrul labirintului reprezintă un indicator al stării de anxietate. Cu cât acesta este mai mare, cu atât starea de anxietate este mai redusă sau animalul este chiar dezinhibat. Așa cum se poate observa și în figura 4.13, captopril în doză mare, ramipril și losartan, ambele doze, au determinat o reducere semnificativă a timpului petrecut în centru comparativ cu lotul martor (p < 0,05) (Tabel 4.17).
Tabel 4.17. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, asupra timpului petrecut în centru
Un parametru important pentru acest test îl constituie numărul de crossinguri, indice al activității locomotorii, reprezentând numărul de traversări ale laturilor pătratelor marcate pe podea. După cum se observă în figura 4.14., cele 2 doze de scopolamină au determinat o creștere semnificativă pentru acest parametru vs. control (p<0,001), confirmând încă o dată acțiunea facilitatoare excitatoare a scopolaminei asupra musculaturii striate (Tabel 4.18).
Figura 4.14. Efectele diferitelor doze de captopril, losartan, ramipril și scopolamină privind numărul de crossinguri. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M.
(n = 8 animale pe grup), *** p <0,001 vs. control.
Tabel 4.18. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice asupra numărului de crossinguri.
Un alt parametru important evaluat în acest test îl reprezintă stretching-ul (animalul se ridică pe membrele posterioare pentru a identifica un pericol potențial), o formă de comportament bivalentă sugerând fie o tendință exploratorie similară curozității umane, fie o creștere a stării de anxietate, animalul fiind circumspect la mediul înconjurător. În cazul de față, majoritatea manifestărilor comportamentale de tip stretching au fost evaluate ca fiind de tip anxios. Așa cum se poate observa în figura 4.15, administrarea de IECA și BRA a accentuat comportamentul de stretching, inducând chiar diferențe semnificative vs. control pentru losartan 20 și captopril 10 (p<0,05), pentru ramipril 4 și captopril 25 (p<0,01).
Figura 4.15. Efectele diferitelor doze de captopril, losartan, ramipril și scopolamină asupra numărului de stretching-uri. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n = 8 animale pe grup), *p<0,05 vs. martor, **p<0,01 vs. martor, ***p ≤ 0,001 față de martor.
Pentru ambele doze de scopolamină s-a observat o creștere semnificativă a numărului de stretchinguri vs. (p<0,01 pentru scopolamină 0,5 mg/kg; p<0,001 pentru scopolamină 1mg/kg) (Tabel 4.19.). Aceasta ar putea fi cauzată mai curând de acțiunea facilitatoare excitatoare a scopolaminei asupra musculaturii striate decât de o acțiune inhibitorie anxiogenă.
Un alt parametru în cadrul acestui test îl reprezintă timpul de grooming (când animalul își face toaleta), un indicator de anxietate. După cum se poate observa în figura 4.16. loturile tratate cu IECA și BRA au avut o tendință de a petrece mai mult timp în grooming comparativ cu lotul martor, însă fără valoare semnificativă. Pe de altă parte, timpul de grooming înregistrat pentru loturile tratate cu scopolamină a fost semnificativ redus (p<0,05 vs. martor pentru scopolamină 1mg/kg; p<0,01 vs. martor pentru scopolamină 0,5 mg/kg), fenomen explicabil prin mobilitatea semnificativ crescută (stretching), sau după părerea unor autori scopolamina ar avea efect anxiolitic și antidepresiv (247, 248) (Tabel 4.20.).
Tabel 4.19. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, privind numărul de stretching
Figura 4.16. Efectele diferitelor doze de captopril, losartan, ramipril și scopolamină asupra timpului de grooming. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M.
(n = 8 animale pe grup), *p < 0,05 față de martor, **p < 0,01 față de martor.
Tabel 4.20. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA și scopolamină în urma administrării în doze diferite și unice, asupra timpului petrecut în grooming
.
4.3.2.EVALUAREA UNOR POSIBILE EFECTE PROTECTOARE ÎN URMA ADMINISTRĂRII DE IECA ȘI BRA LA ȘOARECII TRATAȚI CU SCOPOLAMINĂ EXERCITATE LA NIVEL COMPORTAMENTAL LA ȘOARECE
4.3.2.1. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra memoriei spațiale de scurtă durată analizată cu ajutorul labirintului Y
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 80 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 20-30g și 30-40 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 5 loturi, fiecare lot a câte 16 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea. Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM.
Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.21.
Tabel 4.21. Dozele de medicamente folosite pentru testul Y
Toate substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție iar solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g%. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au preparate “ex tempore”!
În ceea ce privește memoria spațială de lucru în labirintul Y, analiza noastră ANOVA a arătat diferențe semnificative (p <0,001) între cele 5 grupe de șoareci, sugerând că tratamentul primit de șoareci în oricare dintre grupurile experimentale a avut o semnificație privind efectele asupra memoriei spațiale de lucru (Tabel 4.22.). În plus, comparațiile post hoc au arătat o scădere semnificativă a procentului de alternări spontane în grupul de scopolamină, comparativ cu grupul martor (p = 0,041) (Tabel 4.23). În plus, toate cele 3 grupuri experimentale care au primit IECA sau BRA au prezentat o creștere semnificativă a procentului de alternanță spontană, comparativ cu grupul de scopolamină (p = 0,017 în comparație cu grupul captopril + scopolamină, p = 0,005 în comparație cu losartan + scopolamină și p <0,001 în comparație cu grupul care a primit ramipril + scopolamină). Totuși, nu s-au găsit diferențe semnificative între orice altă pereche posibilă de grupuri rămase (de exemplu, IECA între ei sau față de șoarecii din lotul martor) așa cum se poate observa în figura 4.17:
Figura 4.17. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra memoriei spațiale de scurtă durată evaluată prin numărul de alternări spontane în testul Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 16 animale/lot (control, scopolamină și losartan + scopolamină), și n= 15 animale/lot (captopril + scopolamină, ramipril + scopolamină), *p = 0,04 vs. control, #p=0,017 vs. scopolamină, ##p=0,005 vs. scopolamină, ###p<0,001 vs. scopolamină.
Tabel 4.22. Variabila dependentă:număr de alternări spontane Tukey HSD
Test Post Hoc – comparații multiple
Tabel 4.23. Analiza statistică ANOVA (comparații multiple) în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra numărului de alternări spontane în testul Y
Activitatea locomotorie în testul Y, exprimată prin numărul de intrări de brațe, nu a fost semnificativ diferită (p = 0,12) atunci când am comparat cele 5 loturi de șoareci. Cu toate acestea, comparațiile post-hoc au prezentat diferențe semnificative numai în grupul martor vs. grupul tratat cu ramipril + scopolamină (Tabel 4.24., 4.25.) (o creștere a șoarecilor tratați cu ramipril + scopolamină, p = 0,004) așa cum se poate observa în figura 4.18.
Figura 4.18. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 16 animale/lot (control, scopolamină și losartan + scopolamină), și n = 15 animale/lot (captopril + scopolamină, ramipril + scopolamină), **p = 0,004 vs. martor.
Tabel 4.24. Analiza statistică ANOVA (comparații multiple) în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Test Post Hoc – comparații multiple
Tabel 4.25. Variabila dependentă: număr de intrări Tukey HSD
4.3.2.2. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra memoriei analizată cu ajutorul labirintului radial cu 8 brațe
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 46 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea medie de 30 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 6 loturi, fiecare lot a câte 8 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum.
Având în vedere că procesele cognitive precum memoria și învățarea implică reacții comportamentale, am urmărit anumiți parametri de habituare timp de 15 zile înainte de experiment, observând apetitul, aportul de apă, tranzitul digestiv, semnele neurologice și comportamentul (socializarea, comportamentul grupului). Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea, pe parcursul celor 8 zile cât s-a desfășurat testarea propriu- zisă.
Dozele menționate mai sus și durata tratamentului au fost selectate utilizând studiile noastre preliminare și datele din literatură privind efectele comportamentale RAS [26-30]. Animalele au fost tratate în conformitate cu orientările privind bioetica animală din Legea privind experimentele pe animale și legile privind sănătatea și bunăstarea animalelor din România și toate procedurile au fost conforme cu Directiva Consiliului Comunităților din 24 noiembrie 1986 (86/609 / CEE) actulizat 63/2010 (CEE). S-au făcut eforturi pentru a minimiza suferința animalelor și pentru a reduce numărul de animale folosite. Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM. Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.26.
Tabel 4.26. Dozele de substanțe medicamentoase folosite pentru testul radial cu 8 brațe
Substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție, solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g%. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au fost preparate “ex tempore”!
Înainte de testarea propriu-zisă, șoarecii din fiecare lot au fost lăsați să exploreze în grup brațele labirintului, timp de 5 minute având acces fără restricții la peletele alimentare din labirint. Hrana a fost inițial distribuită în tot labirintul, fiind limitată gradat la o singură peletă plasată la capătul brațelor. După această perioadă de acomodare, a fost efectuată testarea individuală a animalelor timp de 8 zile. Pe parcursul perioadei de testare, 5 din cele 8 brațe (numerotate cu 1, 2, 4, 5, și 7) au fost prevăzute cu o peletă de hrană, fiind în același timp marcate cu o bandă albă. Celelalte brațe (numerotate cu 3, 6 și 8) nu au fost recompensate și marcate. Fiecare șoarece a fost așezat în centrul labirintului și lăsat liber până când toate cele 5 pelete au fost consumate, sau până la expirarea celor 5 minute (timpul alocat testului).Testul a permis evaluarea memoriei de lucru și a celei de referință. Rezultatele au fost prelucrate statistic cu ajutorul testului ANOVA și Wilks 'Lambda.
Erori ale memoriei de lucru
Referitor la memoria de lucru, așa cum am mai amintit, o eroare a acestui tip de memorie care este o formă a memoriei de scurtă durată, este definită ca o o reintrare într-un braț din care hrana a fost deja consumată. În ceea ce privește numărul de erori ale memoriei de lucru, în brațele labirintului radial efectul de interacțiune grup x timp a fost semnificativ pentru o valoare a Wilks 'Lambda = 0,121, F (35,149) = 2,78, p <0,001. Mai mult, a fost observat un efect principal semnificativ al timpului, Wilks 'Lambda = 0,523, F (7, 3) = 4,563, p = 0,001.
Comparând toate cele 6 loturi , am obținut de asemenea, o diferență semnificativă între ele în ceea ce privește numărul erorilor memoriei de lucru, F (1, 5) = 6,96, p = 0,001.
Prin compararea loturilor în pereche, pentru a vedea dacă a existat o diferență statistică în cadrul grupurilor, pentru fiecare zi a testului, în ceea ce privește erorile memoriei de lucru, am observat diferențe semnificative între ziua 1 și ziua 3 (p = 0,045 ), între ziua 1 și ziua 5 (p = 0,043), între ziua 1 și ziua 6 (p = 0,001) între ziua 7 și ziua 8 (p <0,001), dar nu între ziua 1 și ziua 2 (p = 1) sau între ziua 1 și ziua 4 (p = 0,123).
De asemenea, comparațiile post-hoc dintre loturi au evidențiat o creștere semnificativă în ceea ce privește erorile memoriei de lucru între lotul tratat cu scopolamină față de lotul control (p <0,001) și între lotul tratat cu losartan față de lotul tratat cu scopolamină (p = 0,014) (Figura 4.19.). Cu toate acestea, nu s-a constatat o diferență semnificativă pentru lotul tratat cu losartan + scopolamină față de lotul control, pentru lotul tratat cu ramipril față de lotul control și nici pentru lotul tratat cu ramipril + scopolamină față de lotul control. Lotul tratat cu scopolamină a prezentat un număr semnificativ crescut de erori comparativ cu lotul tratat cu losartan + scopolamină (p = 0,022), a lotului tratat cu ramipril (p = 0,017) și lotului tratat cu ramipril + scopolamină (p = 0,006) (Tabel 4.27, 4.28) .
De asemenea, nu s-a constatat o diferență semnificativă între lotul control și lotul tratat cu losartan. Mai mult, lotul tratat cu losartan nu a prezentat diferențe semnificative în comparație cu oricare dintre loturi, cu excepția lotului martor menționat mai sus. În plus, lotul tratat cu losartan + scopolamină, lotul tratat cu ramipril și lotul tratat cu ramipril + scopolamină au fost semnificativ diferite numai față de grupul scopolamină, așa cum s-a menționat și mai sus. În rest, nu s-au găsit diferențe semnificative când am asociat oricare dintre aceste trei loturi cu orice alt lot experimental posibil (Figura 4.19.).
Figura 4.19. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de erori ale memoriei de lucru . Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot )*p ≤ 0,05 vs. control, **p ≤ 0,001 vs. control, #p ≤0,05 vs. scopolamină, ##p ≤0,001 vs. scopolamină.
Tabel 4.27. Comparații cu date în pereche
Tabel 4.28. Teste multivarianță
Erori ale memoriei de referință
În ceea ce privește numărul de erori ale memoriei de referință din brațele labirintului radial, efectul de interacțiune al grupului timp x a fost semnificativ, Lambda Wilks = 0.175, F (35.149) = 2.1, p = 0.001. În plus, a existat un efect principal semnificativ al timpului, Lambda Wilks = 0,383, F (7, 35) = 8,04, p <0,001.
Când am comparat toate cele 6 loturi, a existat o diferență semnificativă între ele în ceea ce privește erorile memoriei de referință, F (1, 5) = 8.094, p <0.001 (Figura 4.20. )
De asemenea, prin analiza comparativă în pereche a loturilor, pentru fiecare zi cu privire la numărul de erori ale memoriei de referință, a permis observarea unor diferențe semnificative între (erorile memoriei de referință din) ziua 1 și ziua 3 (p=0.018), între ziua 1 și ziua 4 (p <0,001), între ziua 1 și ziua 5 (p = 0,001), între ziua 1 și ziua 7 (p <0,001), ), între ziua 1 și ziua 8 (p <0,001), între ziua 2 și ziua 4 (p = 0,010), între ziua 2 și ziua 5 (p = 0,048), între ziua 2 și ziua 7 și de asemenea ziua 8 (p = 0,011 pentru ambele) (Tabel 4.29.). Aceste rezultate sugerează un efect semnificativ al medicamentelor administrate asupra memoriei pe termen lung.
Figura 4.20. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de erori ale memoriei de referință . Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot ), *p ≤ 0,05 vs. control, #p ≤0,05 vs. scopolamină, ##p ≤0,001 vs. scopolamină
În urma comparațiilor post-hoc între loturi, am obținut o scădere semnificativă a erorilor memoriei de referință în lotul control față de lotul tratat cu scopolamină (p <0,001) și o scădere semnificativă a erorilor memoriei de referință în lotul tratat cu losartan față de scopolamină (p<0,001). În plus, nu s-a constatat o diferență semnificativă între lotul martor și lotul tratat cu losartan + scopolamină, martor și ramipril sau între lotul martor și lotul ramipril + scopolamină (Tabel 4.30).
Tabel 4.29. Comparații cu date în pereche
Tabel 4.30. Teste multivarianță
Lotul tratat cu scopolamină a prezentat, de asemenea, o creștere semnificativă a numărului de erori de memorie de referință comparativ cu lotul tratat cu losartan + scopolamină (p = 0,004) și lotul tratat cu ramipril + scopolamină (p = 0,006) (Figura 4.20.)
Timpul necesar pentru a termina testul radial cu opt brațe
În ceea ce privește timpul necesar pentru finalizarea testului radial cu opt brațe, efectul de interacțiune al grupului timp x a fost semnificativ, Wilks 'Lambda = 0,272, F (35,149) = 1,553, p = 0,037. A existat, de asemenea, un efect principal semnificativ al timpului, Lambda lui Wilks = 0,256, F (7, 35) = 14,496, p <0,001.
În plus, atunci când am comparat toate cele 6 loturi, am obținut o diferență semnificativă între acestea în ceea ce privește timpul necesar pentru a termina testul F (1,5) = 7,616, p <0,001 (Figura 4.21.).
Figura 4.21. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului necesar finalizării testului . Rezultatele sunt exprimate ca medie ± E.S.M. (n = 8 animale/lot ), *p < 0,05 vs. martor, **p <0,001 vs. control, ***p <0,0001 vs. martor.
Când am efectuat analiza comparativă în perechi, pentru a vedea dacă există o diferență statistică în cadrul grupurilor cu privire la timpul necesar pentru finalizarea testului, am observat diferențe semnificative între ziua 1 și ziua 3 (p = 0,021), între ziua 1 și ziua 4 (p = 0,011), între ziua 1 și ziua 5, ziua 6, ziua 7 și ziua 8 (p <0,001 pentru toate zilele menționate anterior), între ziua 2 și ziua 5, ziua 6, ziua 7 și ziua 8 (p<0,001) între ziua 3 și ziua 5 (p = 0,002), între ziua 3 și ziua 6 (p = 0,001), între ziua 3 și ziua 7 și ziua 8 (p <0,001 pentru ambele), între ziua 4 și ziua 5 (p <0,001), între ziua 4 și ziua 6 (p = 0,003), între ziua 4 și ziua 7 (p = 0,001), între ziua 4 și ziua 8 (p <0,001), între ziua 5 și ziua 8 (p = 0,001), între ziua 6 și timpul total pe zi 8 (p = 0,010) (Tabel 4.31. 4.32.).
Tabel 4.31. Comparații cu date în pereche
Tabel 4.32. Teste multivarianță
De asemenea, comparațiile post-hoc dintre loturi au evidențiat un timp semnificativ crescut (exprimat în secunde) necesar finalizării task-ului pentru lotul tratat cu scopolamină comparativ cu lotul martor (p = 0,001), de asemenea și pentru lotul tratat cu scopolamină + losartan comparativ cu lotul martor (p <0,001) ) și pentru lotul tratat cu ramipril + scopolamină (p = 0,003) comparativ cu lotul martor, dar nu între lotul control și lotul tratat cu losartan (p = 0,270) (Tabel 4.32.). Nu s-au observat alte diferențe semnificative pentru oricare alte asociații între loturile de tratament rămase (Figura 4.21.).
4.3.2.3. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra unor parametri afectiv-emoționali cu ajutorul labirintului plus ridicat
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 80 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 20-30g, 30-40g ce au fost împărțiți aleatoriu în 5 loturi, fiecare lot a câte 16 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexigas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările, s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea.
Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM. Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.33.
Tabel 4.33. Dozele de substanțe medicamentoase medicamente folosite pentru testul labirintul plus ridicat
Substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție, iar solventul utilizat a fost serul fiziologic 0,9g%. Toate suspensiile, precum și soluția de scopolamină au fost preparate “ex tempore”!
Rezultatele obținute în urma acestui test, sugerează un nivel ridicat de anxietate la lotul tratat cu scopolamină. Astfel, după cum se poate observa în figura 4.22. timpul petrecut în brațele deschise a fost semnificativ redus pentru acest lot comparativ cu lotul martor (p = 0,0422). Administrarea de IECA și BRA a diminuat efectul anxiogen al scopolaminei, crescând timpul petrecut în brațele deschise. În special ramiprilul a exercitat un rol protectiv, determinând o creștere evidentă a timpului petrecut în brațele deschise comparativ cu lotul tratat cu scopolamină (p=0,0603) (Tabel 4.34., 4.35.).
Figura 4.22. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului petrecut în brațele deschise ale testului elevated plus. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n = 16 animale pe grup), *p= 0,0422 vs. control.
Tabel 4.34. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra timpului petrecut în brațele deschise
Tabel 4.35. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de Scopolamină comparativ cu lotul Martor asupra timpului petrecut în brațele deschise
Numărul de intrări în brațele închise a înregistrat o creștere semnificativă pentru lotul tratat cu scopolamină (p = 0,03) vs. control) sugerând hiperexcitbilitatea indusă de scopolamină la nivelul musculaturii striate. Dintre loturile tratate cu IECA și BRA, se pare că, pentru acest parametru, losartanul nu a protejat lotul de animale față de efectele scopolaminei, lotul respectiv având semnificativ mai multe intrări în brațele închise comparativ lotul control (p = 0,0003) (Figura 4.23., Tabel 4.36, 4.37.,4.38.).
Figura 4.23. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de intrări în brațele închise ale testului elevated plus. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n= 16 animale pe grup),* p= 0,03 vs. control, *** p=0,0003 vs. control.
Tabel 4.36. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra numărului de intrări în brațele închise ale labirintului
Tabel 4.37. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de Scopolamină comparativ cu lotul Martor asupra numărului de intrări în brațele închise ale labirintului
Tabel 4.38. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de Losartan + Scopolamină comparativ cu lotul martor asupra numărului de intrări în brațele închise ale labirintului
Referitor la parametrul Head dipping – indicator al stării de dezinhibare – am observat un puternic efect inhibitor al scopolaminei asupra comportamentului explorator, sugerat de numărul semnificativ scăzut de întinderi în afara brațelor comparativ cu lotul control (p< 0,05). Administrarea de losartan și ramipril la șoarecii tratați cu scopolamină, a avut un efect pozitiv, dublând respectiv triplând numărul de întinderi comparativ cu lotul tratat doar cu scopolamină (Figura 4.34., Tabel 4.39., 4.40., 4.41.).
Figura 4.24. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra parametrului Head dipping (animalul își întinde capul și se apleacă peste brațele deschise, în jos). Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n = 16 animale/lot), *p < 0,05 vs. control.
Tabel 4.39. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu Scopolamină asupra parametrului Head dipping
Tabel 4.40. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de Scopolamină vs. Martor
Tabel 4.41. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) în urma administrării de Captopril și Scopolamină vs. Martor
4.3.2.4. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA în doză unică la șoarecii tratați cu scopolamină, asupra unor parametri afectivi – emoțíonali și ai activității motorii în cadrul testului open field
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 80 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 20-30g și 30-40 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 5 loturi, fiecare lot a câte 16 animale. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexiglas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea. Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM. Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.42.
Tabel 4.42. Dozele de medicamente folosite pentru testul open field
Toate substanțele administrate pe cale orală au fost suspendate în CMC-Na 0,1% și administrate cu ajutorul unei sonde de gavaj. Substanța administrată pe cale intraperitoneală cu ajutorul unei seringi de tip insulină, a fost preparată sub formă de soluție iar solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g%. Toate suspensiile precum și soluția de scopolamină au fost preparate “ex tempore”!
Dintre parametrii evaluați, pentru timpul petrecut în centrul labirintului, nu am obținut diferențe semnificative între loturi așa cum se poate observa în figura următoare (Figura 4.25.). Excepție a făcut lotul tratat cu ramipril + scopolamină pentru care am observant o scădere semnificativă comparativ cu lotul martor (p < 0,05) și cu lotul tratat cu scopolamină (p < 0,05) (Tabel 4.43., 4.44., 4.45.).
Figura 4.25. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului petrecut în centrul labirintului. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M.
(n = 16 animale pe grup), *p <0,05 vs. control, #p <0,05 vs. scopolamină.
Tabel 4.43. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA la șoarecii tratați cu Scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului petrecut în centrul labirintului.
Tabel 4.44. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ramipril+Scopolamină vs. Martor
Tabel 4.45. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ramipril+Scopolamină vs. Scopolamină.
Numărul de crossinguri, indice al activității locomotorii, după cum se observă în figura următoare (fig nr.), a înregistrat o creștere semnificativă pentru loturile ce au fost protejate cu IECA comparativ cu lotul tratat doar cu scopolamină (p < 0,01), precum și pentru lotul protejat cu BRA (p<0,05 vs. scopolamină). De asemenea, în cazul lotului tratat cu ramipril + scopolamină, această îmbunătățire a fost evidentă și față de lotul martor (p <0,05) (Figura 4.36., Tabel 4.46., 4.47., 4.48, 4.49., 4.50.)
Figura 4.36. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de crossinguri. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M. (n=16 animale pe grup), *p<0,05 vs. control, #p<0,05 vs. scopolamină, ##p<0,01 vs. scopolamină.
Tabel 4.46. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de IECA, BRA la șoarecii tratați cu Scolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra numărului de crossinguri
Tabel 4.47. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ramipril+Scopolamină vs. Martor asupra numărului de crossinguri.
Tabel 4.48. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Captopril+Scopolamină vs. Scopolamină asupra numărului de crossinguri
Tabel 4.49. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ramipril+Scopolamină vs. Scopolamină asupra numărului de crossinguri.
Tabel 4.50. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Losartan +Scopolamină vs. Scopolamină asupra numărului de crossinguri.
În ceea ce privește timpul de grooming, important indice de anxietate, am putut observa o creștere evidentă pentru lotul tratat cu scopolamină comparativ cu lotul martor (p = 0,06). De asemenea am putut constata efectul benefic al IECA și BRA, concretizat prin reducerea timpului de grooming până la valori apropiate de cele ale lotului martor (Figura 4.27., Tabel 4.51.).
Figura 4.27. Efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului de grooming. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M.
(n = 16 animale pe grup).
Tabel 4.51. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu Scolamină în doză de 0,5 mg/kg asupra timpului de grooming
4.3.3. EVALUAREA EFECTELOR PRODUSE ASUPRA COMPORTAMENTULUI LA ȘOARECE ÎN URMA ADMINISTRĂRII DE ANG. II ÎN DOZĂ UNICĂ, PE CĂI DIFERITE, LA TIMPI DIFERIȚ, PRECUM ȘI UN POSIBIL ROL PROTECTOR AL UNOR BRA (CANDESARTAN), ÎN ACEST CONTEXT.
4.3.3.1. Evaluarea efectelor produse asupra comportamentului în urma administrării de Ang. II și candesartan asupra memoriei spațiale de scurtă durată testată cu ajutorul labirintului Y
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 35 de șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 30-32 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 6 loturi, componența loturilor fiind specificată în tabelul ce urmează. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexiglas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea.
Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM. Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.52.
Tabel 4.52. Dozele de medicamente folosite pentru testul Y
Angiotensina II a fost preparată sub formă de soluție, solventul utilizat fiind serul fiziologic 0,9g%. Candesartanul a fost suspendat în CMC-Na 0,1%. Toate soluțiile precum și suspensia de candesartan au fost preparate “ex tempore”!
Administrarea de Ang. II precum și de candesartan în scopul blocării receptorilor AT2, a avut ca efect apariția unor diferențe între loturi în ceea ce privește procentul de alternare spontană, cu semnificație statistică de grup p = 0,013. Administrarea de Ang. II pe cale i.n. cu testare la 30 de minute nu a produs modificări semnificative, fapt ce poate justifica metabolizarea rapidă a Ang.II.
Pentru lotul tratat cu Ang.II i.n cu testare la 15 minute, am observat o scădere semnificativă statistic a procentului de alternare spontană (p = 0,044) vs. lotul martor, ceea ce sugerează că angiotensina II, datorită proprietăților sale puternic vasoconstrictoare, ar putea influența în mod negativ memoria de scurtă durată. Și în cazul lotului tratat cu Ang.II i.p. am obținut de asemenea o valoare semnificativ scăzută vs. lotul martor (p = 0,013), acest efect putând fi cauzat de vasoconstricția generalizată a organismului, având în vedere că administrarea pe această cale determină distribuția în tot arborele circulator. În ceea ce privește cele două loturi tratate cu candesartan am observat un efect benefic asupra memoriei doar când testarea s-a efectuat la un interval de 3 ore după administrare, dar nu după 1 oră, astfel, valoarea procentului de alternare spontană a înregistrat o creștere semnificativ statistic vs. lotul tratat doar cu Ang.II i.n. cu testare la 15 minute (p = 0,023). Candesartanul deși atinge concentrația plasmatică la 1 oră de la administrarea pe cale orală, totuși efectul maxim și-l manifestă la 3 ore, ceea ce explică efectele obținute anterior. Același efect benefic al candesartanului testat la 3 ore de la adminstrare l-am constatat și față de Ang.II administrată i.p. (p = 0,005). Administrarea Ang.II pe căi diferite, a înregistrat valori semnificative statistic pentru lotul tratat cu Ang.II i.n. cu testare la 30 de minute comparativ cu lotul tratat cu Ang. i.p. cu testare la 15 minute (p = 0,043) (Figura 4.28., Tabel 4.53., 4.54., 4.55, 4.56, 4.57., 4.58.)
Un aspect important observat de noi în urma comparării loturilor a fost acela că, Ang.II și-a manifestat efectele doar în primele 15 minute de la administrare. Valoarea aproape egală cu cea a lotului martor a procentului de alternare spontană obținută la 30 de minute pentru Ang.II, sugerează că deja la acest interval ang.II este metabolizată și efectele negative sunt estompate.
Figura 4.28. Efectele administrării de Ang.II pe căi diferite precum și de candesartan, cu testare la timpi diferiți la șoareci asupra procentului de alternare spontană. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n =5 animale/loturile 1, 2 și 5), (n=6 animale/loturile 3 și 4) și (n=8 animale/lotul 6), *p<0,05 vs. control, #p<0,05 vs. Candesartan (3h), ##p<0,005 vs.Candesartan (3h), & p<0,05 vs. Ang.II.i.n.(30').
Tabel 4.53. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang. II și Candesartan în urma administrării pe diferite căi asupra procentului de alternare spontană.
Tabel 4.54. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang. II administrată i.n., cu testare la 15 minute vs. lotul martor asupra procentului de alternare spontană
Tabel 4.55. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang. II administrată i.p., cu testare la 15 minute vs. lotul martor asupra procentului de alternare spontană
Tabel 4.56. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de candesartan + Ang.II (i.n.) cu testare la 3 ore de la adminstrare vs. Ang.II i.n. cu testare la 15 minute asupra procentului de alternare spontană
Tabel 4.57. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de candesartan + Ang.II (i.n.) cu testare la 3 ore de la adminstrare vs. Ang.II i.p. cu testare la 15 minute asupra procentului de alternare spontană
Tabel 4.58. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n. cu testare la 30 minute vs. Ang.II i.p. cu testare la 15 minute asupra procentului de alternare spontană
În ceea ce privește numărul de intrări în brațele labirintului, parametru ce reflectă activitatea locomotorie, am putut observa o scădere semnificativă în cazul loturilor Ang.II i.p.(15') (p = 0,0036 vs. martor) și candesartan urmat de administrarea de Ang.II cu testare la o oră (p = 0,0013 vs. martor) (Figura 4.29.). Numărul scăzut de intrări s-ar putea datora vasoconsticției generalizate produsă de angiotensină care probabil a creat un disconfort al întregului organism și respectiv datorită faptului că (așa cum am amintit și anterior) deși concentrația plasmatică pentru candesartan este în mod normal atinsă la 1 oră după administrare, totuși efectul maxim se manifestă la 3-4 ore.
Figura 4.29. Efectele administrării de Ang.II pe căi diferite precum și de candesartan, cu testare la timpi diferiți la șoareci asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y. Rezultatele sunt exprimate prin medie ± E.S.M. (n =5 animale/loturile 1, 2 și 5), (n=6 animale/loturile 3 și 4) și (n=8 animale/lotul 6), *p<0,05 vs. control, **p<0,05 vs. control #p<0,05 vs. Ang.II i.n.(30'), ##p<0,005 vs. Ang.II i.n.(30').
În cazul lotului tratat cu candesartan (3h) și Ang.II (15') am observat o creștere a numărului de intrări în brațe, comparativ cu lotul candesartan (1h) și Ang.II (15'), posibil datorită efectului de blocant al Ang.II al candesartanului. Pe de altă parte, numărul de intrări pentru lotul candesartan (3h) și Ang.II (15') a rămas totuși scăzut vs. lotul martor (p = 0,0216), probabil datorită unui efect vasodilatator al candesartanului. Ang.II administrată i.p. (15') a determinat un număr semnificativ redus de intrări în brațe vs. Ang.II i.n cu testere la 30 de minute (p = 0,04331), explicabil prin faptul că Ang.II după 30 de minute este metabolizată manifestând un efect asemănător lotului martor. De asemenea, am putut observa apariția unei diferențe semnificative statistic în cazul Ang.II cu testare la 15 minute în funcție de calea de adminstrare. Astfel lotul tratat cu Ang.II i.p. (15') a înregistrat un număr de intrări semnificativ redus vs. Ang. II i.n.(15') (p = 0,00219), posibil datorită efectelor generalizate ale acesteia (Tabel 4.59., 4.60., 4.61., 4.62., 4.63., 4.64.,4.65, 4.66.).
Tabel 4.59. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang. II și candesartan în urma administrării pe diferite căi, cu testare la timpi diferiți asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.60. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.p. cu testare la 15' vs. lotul martor asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.61. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de candesartan (1 oră) + Ang.II i.n. (15') vs. lotul martor asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.62. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de candesartan (3 ore) + Ang.II i.n. (15') vs. lotul martor asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.63. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.p. (15') vs. lotul Ang.II i.n. (30') asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.64. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Candesartan (1 oră) + Ang.II i.n. (15') vs. lotul Ang.II i.n. (30') asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.65. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Candesartan (3 ore) + Ang.II i.n. (15') vs. lotul Ang.II i.n. (30') asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
Tabel 4.66. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.p. (15') vs. lotul Ang.II i.n. (15') asupra numărului de intrări în brațele labirintului Y
4.3.3.2. Evaluarea efectelor produse în urma administrării de Ang. II și candesartan în doză unică asupra unor parametri afectiv-emoționali și ai activității motorii în cadrul testului open field
Acest studiu a fost realizat pe un număr de 15 șoareci albi Swiss, masculi, cu greutatea între 30-32 g ce au fost împărțiți aleatoriu în 6 loturi, componența loturilor fiind specificată în tabelul ce urmează. Loturile au fost omogene, animalele fiind adăpostite în cuști de plexiglas într-o încăpere cu temperatură controlată (21°C ± 2°C) și un ciclu de lumină/întuneric (12 ore/12ore). Animalele au primit hrană standard și apă ad libitum. Cu 15 zile înainte de a efectua testările s-a observat comportamentul acestora. Accesul la hrană și apă a fost sistat cu 3 ore înainte de a efectua testarea. Testările au fost efectuate în intervalul orar 9.00 AM – 6.00 PM.
Substanțele de cercetat din acest studiu au fost administrate după cum se poate vedea în tabelul 4.67.
Tabel 4.67. Dozele de substanțe medicamentoase folosite pentru testul open field
În ceea ce privește timpul petrecut în centrul labirintului nu am observat diferențe semnificative între loturi , dar atât lotul tratat cu Ang.II i.n. (15') cât și lotul tratat cu candesartan (3h) + Ang.II i.n. (15') au avut tendința de a petrece mai puțin timp în centru, evitând astfel un spațiu potențial periculos (Figura 4.30. Tabel 4.68.)
Figura 4.30. Efectele administrării de Ang.II i.n (15') și Candesartan (3 h) asupra timpului petrecut în centru. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M.
(n = 5 animale pe grup).
Tabel 4.68. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n și Candesartan (3 h) asupra timpului petrecut în centru.
Pentru activitatea locomotorie reflectată prin numărul de crossinguri, nu am obținut diferențe statistice între cele 3 loturi, însă, am putut observa o ușoară creștere a acestui parametru în cazul lotului Cn (3h) + Ang.II i.n. (15') comparativ cu lotul Ang.II i.n.(15') (Figura 4.31., Tabel 4.69.)
Figura 4.31. Efectele administrării de Ang.II i.n (15') și Candesartan (3 h) asupra numărului de crossinguri. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M. (n = 5animale pe grup).
Tabel 4.69. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n și Candesartan (3 h) asupra numărului de crossinguri.
Analiza timpului petrecut în freezing (unul dintre cei mai importanți indicatori pentru anxietate, când animalul „îngheață” de frică, rămânând nemișcat o perioadă semnificativă de timp), a evidențiat un grad ridicat de anxietate pentru lotul tratat cu Ang.II i.n. (15') care a înregistrat un timp de freezing de 20 de ori mai mare decât lotul martor. Administrarea de candesartan a avut ca efect reducerea timpului de freezing la o treime față de lotul tratat cu doar cu Ang.II i.n (15') (Figura 4.32., Tabel 4.70.)
Figura 4.32. Efectele administrării de Ang.II i.n (15') și Candesartan (3 h) asupra timpului în freezing. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M. (n = 5 animale pe grup).
Tabel 4.70. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n și Candesartan (3 h) asupra timpului petrecut în freezing
De asemenea, lotul tratat cu Ang.II i.n. (15') a petrecut semnificativ mai mult timp în grooming comparativ cu lotul martor (p=0,04) ceea ce reflectă un grad de anxietate ridicat, în strânsă corelație cu timpul petrecut în freezing. La fel ca și cazul freezingului, candesartanul a avut efect benefic (anxiolitic) reducând timpul petrecut în grooming după cum se poate observa în figura 4.33.Tabel 4.71. 4.72.)
Figura 4.33. Efectele administrării de Ang.II i.n (15') și Candesartan (3 h) asupra timpului petrecut în grooming. Rezultatele sunt exprimate prin medii ± S.E.M. (n = 5 animale pe grup).
Tabel 4.71. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n și Candesartan (3 h) asupra timpului petrecut în freezing
Tabel 4.72. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru efectele produse de Ang.II i.n (15') vs. lotul Martor asupra timpului petrecut în grooming
4.3.4. EFECTELE ADMINISTRĂRII CRONICE A SUBSTANȚELOR MEDICAMENTOASE UTILIZATE ÎN STUDIU ASUPRA STATUSULUI OXIDATIV: DETERMINĂRI BIOCHIMICE
4.3.4.1.Dinamica activității enzimatice specifice a SOD la nivel sistemic și central
Activitatea enzimatică a superoxid dismutazei a fost determinată în conformitate cu procedura metodei de cercetare descrisă la Capitolul 4.2.4.2. Materiale și metode folosite pentru determinări biochimice din ser sanguin și extract de creier integral. Rezultatele sunt prezentate ca activitate enzimatică specifică (activitate enzimatică relativă raportată la conținutul proteic decelat).
În tabelul 4.73. sunt prezentate rezultatele medii ale determinărilor enzimatice din ser sanguin și extract de creier integral alături de analiza statistică descriptivă și de tip ANOVA.
Tabel 4.73. Analiză statistică ANOVA (un singur factor) pentru variația activității enzimatice specifice a SOD (UE/ml) (a. în ser sanguin., b în creier)
a. Sumar
b. Sumar
Analiza statistică de tip One-Way ANOVA a arătat o variație modestă a parametrului biochimic decelat din ser sanguin (p = 0.081), în timp ce variația acestuia a fost semnificativă la decelarea din creier (p = 0.0007).
Analiza statistică post-hoc (Testul t pentru două probe cu varianțe egale) a datelor a arătat o scădere statistic semnificativă a activității SOD la administrarea de scopolamină față de grupul martor (p<0.05) și creșteri semnificative ale aceluiași parametru pentru grupurile care au primit losartan (p<0.05) și ramipril (p<0.01) față de grupul care a primit scopolamină. În același timp, diferențe semnificative au fost înregistrate pentru grupurile: losartan versus ramipril (p<0.01) și ramipril + scopolamină (p<0.05) (Figura 4.34.).
Figura 4.34. Dinamica activității enzimatice a SOD, la nivel sistemic, după perioada de administrare a agenților chimici (n=4/lot, Overall ANoVA p=0.08; t-test: two samples assuming equal variances: *p<0.05, **p<0.01)
La nivel central, variația activității enzimatice specifică a SOD înregistrată a fost statistic semnificativă (p = 0.0007) pentru compararea efectelor generale ale substanțelor administrate. Din punct de vedere statistic al testelor post-hoc, s-au observat variații statistic semnificative între următoarele grupuri: creșteri semnificative ale activității enzimatice specifice a SOD în cadrul grupurilor losartan + scopolamină (p<0.05), ramipril (p<0.01) și ramipril + scopolamină (p<0.01), față de grupul martor. De asemenea, scăderi semnificative statistic ale activității enzimatice au fost înregistrate pentru grupurile scopolamină (p<0.01), losartan + scopolamină (p<0.05) și ramipril (p<0.05), față de grupul ramipril + scopolamină. S-a înregistrat creșterea semnificativă a activității enzimatice a SOD la administrarea de losartan + scopolamină față de administrarea de losartan (p<0.05) (Figura 4.35.).
Figura 4.35. Dinamica activității enzimatice specifice a SOD, la nivel central, după perioada de administrare a agenților chimici (n=4/lot, Overall ANoVA p=0.004, t-test: two samples assuming equal varinaces: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
4.3.4.2.Dinamica activității enzimatice specifice a GPx la nivel central
În mod similar, au fost determinate activitățile enzimatice specifice pentru enzima glutation peroxidază în conformitate cu metoda descrisă în Capitolul 4.2.4.2. Materiale și folosite pentru determinările biochimice. Activitatea enzimatică a GPx decelată din ser sanguin a fost situată sub limita de detecție prin metoda utilizată.
În tabelul 4.74. sunt prezentate rezultatele medii ale determinărilor enzimatice din extract de creier integral alături de analiza statistică descriptivă și de tip ANOVA.
Tabel 4.74. Analiza statistică ANOVA (un singur factor) pentru variația activității enzimatice specifice a GPx în creier (UE/ ml) (Sumar)
La nivel central, variația activității enzimatice specifică a GPx înregistrată a fost statistic semnificativă (p=0.004) pentru compararea efectelor generale ale substanțelor administrate. Din punct de vedere statistic al testelor post-hoc, s-au observat variații statistic semnificative între următoarele grupuri: losartan (p<0.05), ramipril (p<0.01) semnificativ mai crescute față de grupul martor; în mod similar losartan + scopolamină (p<0.05) și ramipril + scopolamină (p<0.01) semnificativ mai crescute decât grupul martor. O creștere semnificativă a fost înregistrată pentru compararea scopolamină versus ramipril + scopolamină (p<0.05). De asemenea, o creștere semnificativă a fost observată și pentru grupul ramipril + scopolamină versus losartan + scopolamină (p<0.05) (Figura 4.36.)
Figura 4.36. Dinamica activității enzimatice specifice a GPx, la nivel central, după perioada de administrare a agenților chimici (n=4/lot, Overall ANoVA p=0.004, t-test: two samples assuming equal varinaces: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)
4.3.4.3.Dinamica concentrațiilor de malondialdehidă la nivel sistemic și central
Concentrațiile de malondialdehidă au fost determinate în conformitate cu procedura metodei de cercetare descrisă la Capitolul 4.2.4.2. Materiale și metode de cercetare științifică din ser sanguin și extract de creier integral. Rezultatele sunt prezentate ca milimoli MDA/ml ser sau extract de creier.
În tabelul 4.75. sunt prezentate rezultatele medii ale determinărilor biochimice din ser sanguin și extract de creier integral alături de analiza statistică descriptivă și de tip ANOVA.
Tabel 4.75.Analiză statistică ANOVA (un singur factor) pentru variația concentrațiilor de MDA
(mmoli/ ml) (a. in ser sanguin, b. in creier)
Sumar
Sumar
Analiza statistică de tip One-Way ANoVA nu a arătat o variație statistică semnficativă a parametrului biochimic decelat din ser sanguin (p = 0.49) sau creier (p = 0.17).
Cu toate acestea, analiza statistică post-hoc (Testul t pentru două probe cu varianțe egale) a datelor obținute prin analiza biochimică a serului sanguin a arătat o scădere statistic semnificativă a concentrației de MDA la administrarea de losartan + scopolamină, față de administrarea de scopolamină (p<0.05) și soluție salină (p<0.05) (Figura 4.37.).
Figura 4.37. Dinamica concentrațiilor de malondialdehidă, la nivel sistemic, după perioada de administrarea agenților chimici
(n=4/lot, Overall ANoVA p=0.49; t-test: two samples assuming equal variances: *p<0.05)
La nivel central, prin analiza statistică a datelor (testare post-hoc), s-au observat variații statistic semnificative între următoarele grupuri: scăderi statistic semnificative pentru cupletele losartan versus martor (p<0.05) și ramipril + scopolamină versus martor (p<0.05) (Figura 4.38.).
Figura 4.38. Dinamica concentrațiilor de MDA, la nivel central, după administrarea agenților chimici (n=4/lot, Overall ANoVA p= 0,17; t-test: two samples assuming equal variances: *p<0.05)
4.3.4.4.Dinamica nivelurilor de proteine totale la nivel sistemic și central
Determinarea nivelurilor de proteine totale solubile a fost utilă pentru raportarea activității enzimatice specifice. În tabelul 4.76. sunt prezentate rezultatele medii ale determinărilor biochimice din ser sanguin și extract de creier integral alături de analiza statistică descriptivă și de tip ANOVA.
Tabel 4.76. Analiză statistică ANOVA (un singur factor) pentru variația concentrațiilor de proteine solubile totale (mg/ml) (a. în serul sanguin, b. în creier)
a.Sumar
Nu s-au înregistrat variații statistic semnificative prin analiza statistică preliminară a datelor.
Nu s-au înregistrat variații semnificative la compararea în funcție de substanța administrată, în ser sanguin, prin testare post – hoc (Figura 4.39., 4.40.).
Figura 4.39. Variația concentrațiilor de proteine solubile totale, la nivel sistemic, după perioada de expunere administrare a agenților chimici (n=4/lot, Overall ANOVA p=0.93)
Figura 4.40. Variația concentrațiilor de proteine solubile totale, la nivel central, după administrarea agenților chimici (n=4/lot, Overall ANOVA p= 0,17; t-test: two samples assuming equal variances: *p<0.05)
4.3.4.5. Corelații statistice între parametrii statusului oxidativ
Din analiza matematică a corelațiilor statistice dintre parametrii statusului oxidativ studiați a rezultat o serie de corelații statistice semnificative cu privire la dinamica parametrilor analizați. Astfel au fost obținute corelații moderat pozitive între activitatea celor două enzime antioxidante decelate din creier (r = 0,679; p<0,001) și între concentrația de MDA și proteine totale solubile din creier (r = 0,474; p=0,019). Corelații statistice puternic negative au fost obținute pentru dinamica concentrațiilor de proteine solubile din creier și dinamicile activităților celor două enzime antioxidante (PTS_C versus SOD_C: r = -0,916; p<0,001; PTS_C versus GPx_C: r = -0,706; p<0,001), dar și pentru dinamica concentrațiilor de proteine totale solubile din ser versus activitatea enzimatică a SOD din aceeași sursă biologică (r = -0,804; p<0,001). Corelații moderat negative au fost calculate pentru variația concentrațiilor de MDA din creier și dinamica activității celor două enzime antioxidante (MDA_C versus SOD_C: r = -0,516; p = 0,01; MDA_C versus GPx_C: r = -0,589; p=0,002) (Figura 4.41.).
Figura 4.41. Corelații statistice de tip Pearson între parametrii biochimici studiați (r= coeficient de corelație Pearson, p= semnificația asimptotică, linia punctată reprezintă grafic liniar de regresie probabilistică
4.4 .DISCUȚII
4.4.1. PRIMUL STUDIU: TESTE PRELIMINARE COMPORTAMENT
Angiotensina II (Ang.II) este o octapeptidă produsă din angiotensinogen prin scindări enzimatice de către renină și ACE (245). ACE este o enzimă circulantă care degradează bradikinina în fragmente inactive, reducând nivelul seric al vasodilatatorilor endogeni. Angiotensina II forma liberă contribuie la creșterea tensiunii arteriale și influențează funcția renală prin retenția de sodiu și apă (249, 250). Mai mult, literatura descrie prezența componentelor RAS din mai multe organe, cum ar fi inima (240), rinichii (251), și creierul (250). Alte studii raportează prezența RAS în sistemul limfatic (252) precum și în țesutul adipos (253). Sistemul renină angiotensină local are funcții diferite în fiecare organ și poate funcționa independent așa cum se întâmplă la nivelul glandelor suprarenale și în creier, sau în stânsă legătură cu alte componente ale RAS în formă liberă, cum ar fi de exemplu la nivelul inimii și rinichilor.
În ultimul timp este de asemenea cunoscută și aproape unanim aceptată existența unui RAS complex al creierului, un sistem complet cu precursorii și metaboliții săi proprii, implicat în funcțiile superioare, cum ar fi memoria (75, 220), procesele emoționale (de exemplu, anxietatea) (254, 255), sau procesarea nociceptivă (221). Numeroasele publicații și rapoarte anterioare care au urmărit determinarea efectelor Ang.II și ale blocanților ei asupra funcțiilor de memorie, au obținut o varietate de rezultate controversate. În timp ce unii autori au raportat efecte negative ale acestei neuropeptide asupra funcțiilor cognitive (256, 257), alții au descris efecte pozitive (în special lucrările grupului Braszko din Bialystok) (84, 258, 259), iar alții au raportat lipsa efectelor (260). De asemenea Ang. II pare să fie implicată în manifestări de tip anxios, dar și în acest caz efectele ei sunt controversate, unele rapoarte demonstrând un efect anxiolitic prin blocarea Ang.II (261), altele un efect anxiogenic (262), iar altele sugerând lipsa unor efecte clare și replicabile anxiolitic (263).
În acest context am analizat efectul inhibării Ang.II la nivel central prin administrarea de captopril, ramipril și losartan asupra memoriei spațiale cu ajutorul labirintului Y precum și asupra anxietății cu ajutorul labirintelor plus ridicat și open field la șoarece.
În urma testelor efectuate, doze diferite de captopril, ramipril și losartan au avut efecte de tip anxiogen, dar nu au avut nici un efect asupra memoriei imediate la șoarece.
Datele noastre au arătat că numărul alternărilor spontane nu a fost influențat de medicamentele administrate, indiferent de doză. Procentul de alternare spontană reflectă memoria spațială de lucru, care este o formă a memoriei pe termen scurt, prin urmare putem concluziona că administrarea de scopolamină, captopril, ramipril și losartan nu au avut nici un efect asupra memoriei pe termen scurt. Referitor la rezultatele obținute în cadrul testului plus ridicat, pentru evaluarea stării de anxietate, acestea au fost mult mai concludente, obținându-se diferențe semnificative între lotul martor și celelalte loturi. În acest sens, am constatat că fiecare din dozele losartan 20 mg/kg corp, ramipril 2 mg/kg corp, ramipril 4 mg/kg corp, captopril 10mg/kg corp și 25 mg/kg corp a redus semnificativ parametrul head dipping comparativ cu lotul martor. Singurul medicament pentru care nu am obținut o diferență semnificativă comparativ cu lotul martor a fost cel tratat cu losartan. Cu toate acestea, singura diferență semnificativă când au fost comparate loturile tratate cu același medicament dar în doze diferite, a fost obținută pentru loturile tratate cu losartan. Rezultatul obținut de noi sugerează că o doză mai mică de losartan (10 mg/kg corp) dar nu și losartan în doză de 20 mg/kg corp, poate determina reducerea stării de anxietate. De asemenea, prin evaluarea altor parametri ai anxietății (timpul de îngrijire și întinderea), nu am găsit nici un efect al medicamentelor administrate în comparație cu lotul martor. Cu toate acestea, am constatat că o doză mai mare (25 mg/kg corp) de captopril produce o reducere semnificativă a stării de anxietate comparativ cu captopril 10 mg/kg corp. În acest sens, pentru stabilirea dozei ce ar produce efecul optim, sunt necesare desfășurarea unor noi studii.
În ceea ce privește scopolamina, folosită în acest studiu ca medicament de referință clasic pentru generarea unui declin cognitiv (prin blocarea receptorilor muscarinici colinergici), s-a dovedit că aceasta influențează memoria atât la animale cât și la oameni (264, 265). Scopolamina determină creșterea semnificativă a activității acetilcolinesterazei și a markerilor lipidici de peroxidare și în același timp scade nivelul acetilcolinei din creier (266, 267). Alte sudii au arătat că scopolamina prezintă efect amnezic atât la animale cât și la oameni (268, 269). Probabil cele mai concludente rezultate ale acestui studiu au fost obținute în cadrul testului open field. În acest fel, după cum ne așteptam, rezultatele au confirmat, că șoarecii tratați cu IECA și BRA au beneficiat de efectul protectiv al acestora, concretizat printr-un număr semnificativ mai scăzut de comportamente care sunt considerate a fi indicatori ai anxietății (grooming, freezing) și un număr crescut pentru indicatorii specifici care reflectă starea de dezinhibare (crossing și stretching). Prin calcularea factorului unic Anova pentru toate loturile am găsit diferențe semnificative pentru toți parametrii specifici anxietății prin testarea efectuată în cadrul labirintului open field, cu excepția defecației și micțiunii. În orice caz, aceste două variabile sunt adesea folosite ca indicatori ai anxietății, dar valabilitatea defecației ca măsură de anxietate a fost pusă la îndoială (270, 271). Cu excepția acestor doi indicatori, toți parametrii comportamentali au fost semnificativ modificați de medicamentele administrate așa cum se observă prin rezultatele obținute ( timp petrecut în centru p<0,01, crossinguri p<0,01, întinderi peste brațele deschise <0,01, timp de îngrijire p = 0,01). Rezultatele noastre sunt în acord cu literatura de specialitate, în ceea ce privește prevenirea efectelor dăunătoare ale Ang.II asupra parametrilor locomotori, rezistenței la insulină, nivelurilor de corticosteron induse de stres și mediatori proinflamatori precum factorul de necroză tumorală (TNFα) și proteina C reactivă (CRP) (263). Spre deosebire de telmisartan (272), losartanul nu a avut o influență clară asupra funcțiilor cognitive, însă efectele sale anxiolitice au fost mult mai semnificative în comparație cu candesartanul (273).
4.4.2. AL DOILEA STUDIU: EVALUAREA UNOR POSIBILE EFECTE PROTECTOARE ÎN URMA ADMINISTRĂRII DE IECA ȘI BRA LA ȘOARECII TRATAȚI CU SCOPOLAMINĂ EXERCITATE LA NIVEL COMPORTAMENTAL LA ȘOARECE
4.4.2.1. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină exercitate la nivel comportamental la șoarece cu ajutorul testelor Y și radial
Acest studiu a fost conceput pentru a evalua memoria spațială de lucru (așa cum a fost studiată în labirintul Y) sau atât memoria spațială pe termen scurt, cât și pe termen lung (analizată cu ajutorul testului radial cu 8 brațe), pe un model de deficit de memorie indusă de scopolamină la șoareci, după administrarea orală a doi inhibitori (captopril și ramipril) și un antagonist al receptorilor AT1 (losartan). Rezultatele noastre au arătat un efect protector al acestor compuși – administrați înaintea tratamentului cu scopolamină – asupra alternării spontane comparativ cu lotul ce a primit doar scopolamină. Scăderea numărului erorilor ale memoriei de lucru și a celor de referință observată în cadrul testului radial pentru loturile tratate cu losartan+scopolamină și ramipril+ scopolamină față de lotul tratat doar cu scopolamină, indică de asemenea un efect protector atât al IECA cât și BRA.
Deși la ora actuală se cunoaște că pe lângă rolul esențial jucat de RAAS în modificarea tensiunii arteriale, RAAS de la nivel cerebral exercită o varietate de efecte asupra funcțiilor superioare legate de memorie, anxietate, percepția durerii (cum a fost demonstrat anterior de grupul nostru pentru toate aspectele menționate mai sus) (220, 254, 274) există numeroase controverse cu privire la funcțiile Ang.II în procesele de memorie. De exemplu, grupul Braszko a demonstrat efectele facilitatoare clare obținute prin administrarea Ang. II în cadrul testului de evitare pasivă, posibil prin transformarea ei în Ang. IV (258, 275). Alte grupuri de cercetători au arătat efectele negative asupra proceselor cognitive (256, 257, 276), sau lipsa efectelor (277), atât pentru Ang.II, cât și pentru unii dintre blocanții săi (de regulă menționați în principal pentru efectele lor pozitive asupra funcțiilor de memorie, cum ar fi de exemplu în testul light- dark (278), în labirintul cu apă (279), testul de evitare unidirecțională bazat pe deficiențe genetice și morfologice (276), sau prin evitarere activă (257). Alte grupuri au demonstrat clar în unele situații experimentale, cum ar fi cele descrise de Shepherd și colab. (260), pentru testarea memoriei de lucru, receptorii selectivi AT1 și AT2 nu au prezentat efecte semnificative asupra funcțiilor cognitive.
Aceste diferențe ar putea fi explicate prin varietatea testelor comportamentale utilizate, a dozelor diferite, a instanțelor experimentale sau a modelelor animale implicate.
Mecanismele ce stau la baza acestor efecte ar putea include modificarea stresului oxidativ, după cum a fost demonstrat anterior de grupul nostru (220), când niveluri crescute de malondialdehidă, ca marker de peroxidare a lipidelor și niveluri scăzute ale enzimelor antioxidante din hipocampul șoarecilor, au fost constatate prin administrarea de Ang.II i.c.v., precum și prin efectele antioxidante ale administrării i.c.v. de captopril.
În plus, în alte lucrări s-a demonstrat că blocantele Ang.II atenuează deficitele de memorie induse de lipopolizaharide prin anumite efecte complexe care includ acțiuni antiinflamatoare exercitate în principal asupra unor markeri cum ar fi TNF-α, GFAP, COX-2 și NF-kB, care ar putea fi mediate de expresia și apoptoza BDNF/CRE (280).
De asemenea, review-uri recente (281) subliniază corelațiile dintre ACE, acumularea de β-amiloid și procesele inflamatorii, care ar putea sta la baza unor strategii terapeutice promițătoare în boala Alzheimer pentru IECA menționați anterior (AD).
De fapt, în ultimul timp există un interes justificat pentru legăturile care ar putea exista între RAAS și unele tulburări neuropsihiatrice, începând cu AD (aspecte prezentate de grupul nostru într-un review din 2009) (75). Unii autori propun chiar o legătură între tulburările cognitive ușoare (entitate nosologică propusă ca stadiu intermediar între îmbătrânirea normală și demență, afecțiune pentru care grupul nostru a fost printre primii care au identificat un model similar de scădere a activității enzimelor antioxidante ca în (AD), (282), AD și RAAS (așa cum sunt revizuite de către) (283). Același fenomen apare și în cazul PD (unde nivelurile receptorilor AT1 scad cu 90% în substanța neagră) (284), în anxietate și depresie (255, 274), în autism (pentru care studiile sugerează implicarea diversitățăii genetice RAAS ca factor de risc) (285) sau în alte deficiențe psihiatrice în cazul pentru care procesele de memorie, sunt de asemenea afectate cum ar fi schizofrenia (nivelul ridicat al enzimei de conversie a angiotensinei I, din lichidul cefalorahidian observați la pacienții schizofrenici poate implica un RAAS activat (286, 287).
De asemenea, este necesar să menționăm în acest context o nouă abordare de administrare pe cale i.n. pentru unele peptide, inclusiv cele din RAAS, precum și existența unor rezultate preliminare în acest domeniu de cercetare, nou și restrâns, cum ar fi cele obținute de grupul Danielyan (288) care a demonstrat efectele protectoare ale losartanului administrat i.n. într-un model de APP/PS1 transgenic de șoarece de AD (288).
În ceea ce privește limitările studiului nostru, se poate menționa lipsa Ang.II, însă scopul acestei lucrări a fost de a menține o direcție cât mai aproapiată de stările aparent normale și nu de situațiile clinice în care nivelul de Ang.II este crescut, fie prin sinteză internă, fie din sursă externă.
4.4.2.2. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra unor parametri afectiv-emoționali cu ajutorul labirintului plus ridicat
Este bine cunoscut faptul că administrarea de scopolamină la rozătoare are ca rezultat distrugerea neuronilor colinergici, afectând implicit memoria, dat fiind rolul acetilcolinei în procesul de învățare. Pe lângă amnezie, scopolamina determină anxietate și hiperactivitate locomotorie (289).
În acest context am evaluat efectele unor IECA și BRA asupra stării de anxietate cât și a activității locomotorii cu ajutorul testului plus ridicat.
Din analiza datelor obținute, am putut observa că timpul petrecut în brațele deschise ale labirintului a avut o valoare semnificativ scăzută pentru lotul tratat cu scopolamină comparativ cu lotul martor (p=0,042), ceea ce confirmă încă o dată starea de anxietate indusă de scopolamină.
Numeroase studii au adus dovezi că receptorii AT1 ai Ang.II prezenți în creier au o densitate crescută la nivelul unor structuri cu rol esențial în modularea răspunsului (cognitiv/afectiv) la stres, în special amigdala și hipocampul (290). În acest sens, mai multe studii raportează diminuarea stărilor de anxietate, evaluate comportamental, ca urmare a administrării de Losartan (blocant al receptorilor AT1) (274, 290, 291). Rezultatele noastre confirmă efectul anxiolitic al losartanului care a determinat creșterea timpului petrecut în brațele deschise, fiind astfel atenuată starea de anxietate generată de scopolamină.
Reducerea răspunsurilor la stres și anxietate la rozătoare atât de către BRA (290) cât și de IECA (292) se datorează diminuării activității axei hipotalamo-hipofizo-adrenergice independent de scăderea tensiunii arteriale (290). Un studiu foarte recent din 2018 a arătat că losartanul are efect antidepresiv la șoarece (293), atât prin administrarea sistemică cât și prin injectare țintită la nivelul hipocampului ventral sau a arieriei prelimbice a cortexului prefrontal. Mecanismul prin care losartanul ar manifesta un efect antidepresiv, constă în blocarea receptorilor AT1 ai Ang.II facilitând potențarea efectelor pozitive ale Ang.II la nivelul receptorilor AT2.
Atenuarea stării de anxietate poate fi explicată prin blocarea receptorilor AT1 ai Ang.II de către losartan la nivelul amigdalei, structură nervoasă cu rol în procesele memoriei emoționale (294). Astfel, un studiu recent evaluând starea de anxietate precondiționată prin șocuri electrice la șobolani, cu ajutorul testului plus ridicat, a demonstrat că injectarea de losartan a diminuat starea de anxietate prin creșterea timpului petrecut în brațele deschise. Mecanismul prin care losartanul își exercită efectul anxiolitic presupune reducerea nivelului neurotransmisiei dopaminergice la nivelul receptorilor AT1 ai Ang.II (290).
Din punct de vedere fiziologic, dopamina este un neuromediator implicat în coordonarea mișcărilor voluntare iar modificările cantitative ale acesteia pot determina apariția de afecțiuni patologice precum: schizofrenie, anxietate, depresie, deficit de atenție și boala Parkinson (295).
În ceea ce privește efectele anxiolitice ale IECA (captopril) obținute de noi, acestea sunt confirmate și de alte studii care raportează creșterea numărului de intrări în brațele deschise în testul plus ridicat (292), precum și blocarea deficiențelor de memorie spațială induse de trimetilamină la șobolani (296).
De asemenea, creșterea valorii parametrului head dippingului obținută de noi pentru loturile protejate cu IECA și BRA, a fost susținută și de alți autori (263, 296), care au argumentat că cei doi compuși reduc starea de anxietate prin îmbunătățirea toleranței la glucoză și scăderea nivelulului corticosteronului indus de stres.
Luând în calcul loturile ce au primit scopolamină dar care au fost protejate fie cu IECA, fie cu BRA, putem remarca că acești compuși au contracarat înt-o oarecare măsură efectele anxiogene ale scopolaminei. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu alți autori (297), care au raportat că ramipril și losartan atenuează deficitele cognitive induse de scopolamină, ceea ce ar putea reprezenta o țintă terapeutică pentru pacienții cu diferite tipuri de demență.
4.4.2.3. Evaluarea unor posibile efecte protectoare în urma administrării de IECA și BRA la șoarecii tratați cu scopolamină asupra unor parametri afectiv-emoționali cu ajutorul labirintului open field
Un aspect specific pentru comportamentul rozătoarelor este tendința de a explora mai mult pereții labirintului și de a evita zonele mari sau centrale percepute ca pericol (298), ca fiind rezultatul instinctului firesc de autoapărare. Prin analiza generală a tuturor parametrilor acestui test, am putut observa că starea de anxietate accentuată de scopolamină este contracarată prin administrarea de captopril și losartan, ambele reducând timpul petrecut în grooming și favorizând activitatea exploratorie. Efectul anxiolitic al unor IECA și BRA a fost raportat de unii cercetători la șobolanii hipertensivi în diverse teste pentru anxietate precum open field, elevated plus sau teste de interacțiune socială (299). Comparând IECA și BRA cu diazepamul, Srinivasan și colaboratorii săi, au ajuns la concluzia că losartanul și-ar manifesta efectul anxiolitic prin blocarea receptorului AT1 ai Ang.II, ducând la scăderea nivelului de Ang. II – care doar peste o anumită concentrație (necunoscută la ora actuală) și însoțită de factori de stres, determină amplificarea stării de anxietate (299).
Studii pe animale au arătat că în condițiile expunerii acestora la stres, este mult intensificată cuplarea receptorilor AT1 ai Ang. II la nivelul nucleului paraventricular din hipotalamus generând creșterea anxietății prin stimularea activității axei hipotalamo-hipofizo-suprarenaliene (HPA) (294). Alte studii clinice sugerează că utilizarea de BRA ar putea preveni patologiile cerebrale determinate de stres printr-un efect protectiv asupra cogniției și memoriei (300, 301), efect remarcat și în studiul nostru pentru losartan ce a protejat animalele de efectele negative ale scopolaminei.
Creșterea activității locomotorii, ca rezultat al stării de dezinhibare, observată de noi atât pentru IECA cât și BRA, a fost remarcată și de alți cercetători la șoareci și șobolani în cadrul testului de înot forțat, pentru care ramiprilul și losartanul au redus semnificativ timpul de imobilitate manifestând o acțiune antidepresivă comparabilă cu amitriptilina (302).
Un alt studiu (303) urmărind rolul Ang.II în contextul expunerii la stres de contenție la rozătoare a observat că administrarea de BRA (telmisartan) restabilește activitatea spontană la normal în cazul expunerii acute la stres dar nu și în condițiile unui stres cronic. Aceasta ar putea fi rezultatul rolului dual al Ang. II în inducerea stresului sau în atenuarea stresului, în funcție de perioada expunerii la stres.
O explicație pentru diferențele în ceea ce privește timpul de grooming așa cum se poate observa și din grafic, ar putea fi totuși variabilitatea individuală observată de noi și susținută și de alți autori (304), și constituie un factor ce nu trebuie neglijat deoarece diferențele individuale în studiul comportamental a fost semnalată în mod repetat. Acest grup de cercetători susțin că soluția pentru variabilitatea individuală cât privește aplicarea sa la modelele de boli afective, ar fi o abordare standard. Trebuie însă să remarcăm faptul că timpul de grooming crescut poate semnala un grad ridicat de anxietate determinat de scopolamină. Atât IECA cât și BRA au avut un efect protectiv aspra efectelor induse de scopolamină, reducând timpul de grooming. Aceste rezultate sunt în concordanță cu alte studii care susțin că la nivel cerebral Ang. II interferează cu eliberarea de aceticolină, afectând astfel funcția cognitivă (297). Mecanismele prin care IECA și BRA împiedică acțiunea Ang. II are la bază inhibarea acetilcolinesterazei, enzimă ce metabolizează acetilcolina, facilitarea sintezei de Ang.IV și eliberarea de acetilcolină prin canalele de potasiu.
De remarcat faptul că efectul anxiolitic al IECA nu poate fi generalizat, cel puțin în acest studiu deoarece în mod surprinzător, spre deosebire de testul plus ridicat, în cadrul testului câmpului deschis, ramiprilul a exacerbat comportamentul de tip anxios. O posibilă explicație pentru aceste rezultate contradictorii ar putea fi date de variabilitatea individuală a animalelor testate, fie de paradigmele utilizate. Paucitatea datelor privind efectele ramiprilului asupra comportamentului afectiv-cognitiv face dificilă elaborarea unor ipoteze privind mecanismele de acțiune ale acestuia. Doar un singur studiu din 2008 raportează lipsa efectului anxiolitic al ramiprilului explicată de autori prin faptul acest efect s-ar putea manifesta doar la modele animale cu hipertensiune arterială, nu și la normotensivi (302). Acest studiu argumentează că, creșterea norepinefrinei la nivel central este adesea implicată în anxietate iar efectul anxiolitic al losartanului la model animal (șobolan) de hipertensiune arterială s-ar datora acțiunii selective de blocant al receptorilot AT1 ce conduce la suprimarea eliberării de norepinefrină. Dintre compușii IECA doar captopril și enalapril produc efect anxiolitic la șobolanii hipertensivi dar nu și la cei normotensivi
4.4.3. AL TREILEA STUDIU: EVALUAREA EFECTELOR PRODUSE ASUPRA COMPORTAMENTULUI ÎN URMA ADMINSTRĂRII DE ANG.II ȘI A CANDESARTANULUI
După cum deja se știe RAS exercită un rol esențial nu numai în homeostazia electrolitică și reglarea T.A. ci și în funcțiile superioare cerebrale, cum ar fi cunoașterea, memoria, anxietatea, depresia precum și tulburările neurologice. Supraactivarea RAS a fost asociată cu implicarea sa în accidente vasculare cerebrale și tulburări cerebrale ( demență, tulburări cognitive, A.D. și Parkinson (305).
În literatura de specialitate este consemanat un rol dual al Ang.II atât în inducerea cât și în atenuarea stresului, dar mecanismele exacte responsabile pentru acțiunea diferențială a Ang.II la stresul pe termen scurt sau lung rămân neclare încă. Stresul pe termen scurt determină eliberarea unui nivel redus de Ang. II cu un posibil efect antistres, în timp ce eliberarea unui nivel crescut de Ang.II indusă de stresul prelungit la șoarece exacerbează reacțiile de tip anxios, reduce motilitatea spontană și propensiunea pentru interacțiunile sociale (303).
În studiul nostru, administrarea de Ang.II pe diferite căi cu testare la 15 minute, a produs modificări ale procentului de alternare spontană în sens negativ, aspect menționat și de alți autori care au observat reducerea semnificativă a nivelului de Ach din hipocamp după administrarea de Ang.II i.c.v., reducere corelată cu scăderea performanței în testul de memorie Morris water maze (306).
Tot în acest studiu, a fost semnalată îmbunătățirea semnificativă a procentului de alternare spontană prin administrarea de Candesartan, un blocant al receptorilor AT1, efect pus în evidență și de noi. Dacă Ang.II a cauzat reducerea semnificativă a circulației cerebrale, a nivelului de Ach și creșterea stresului oxidativ la o oră de la injectare, blocarea receptorilor AT1 de către candesartan, a atenuat aceste modificări, confirmat prin determinările biochimice ale unor parametri specifici (SOD, ATP, AchE, Ach din cortex și hipocamp) (306).
Apariția deficitului de memorie prin administrare de Ang.II, este însoțită în unele cazuri și de fenomene inflamatorii cerebrale concretizate prin creșterea nivelului de citokine și a modificării morfologice microgliale (89). Blocarea receptorilor AT1 cu candesartan conduce la reducerea inflamației cerebrale, efect remarcat la un model animal proinflamator la șoarece obținut prin injectarea i.p. de lipopolizaharide (109).
Luate împreună aceste rezultate sugerează complexitatea mecanismelor prin care Ang. II poate cauza deteriorarea memoriei, anxietate și alte afecțiuni ale SNC, ceea ce ar putea contribui la o nouă abordare prin descoperirea de noi strategii terapeutice.
În ceea ce privește efectele vasoconstrictoare ale Ang.II, o posibilă ipoteză ar putea fi că acestea au determinat o reducere a activității locomotorii, reflectată prin numărul de intrări în brațele labirintului.
Astfel, administrarea pe cale i.p. a Ang.II a cauzat cea mai clară reducere a numărului de intrări. Surprinzător, în cazul loturilor care au fost protejatate cu candesartan, numărul de intrări în brațe a fost de asemenea semnificativ scăzut, deși asupra cogniției efectele pozitive au putut fi remarcate prin creșterea parametrului de alternare sponatnă. Mobilitatea redusă ar putea fi explicată ca un efect al scăderii tensiunii arteriale. În acest sens, un studiu recent (85) raportează în mod similar scăderea activității locomotorii la un model experimental de șobolani (pentru studiul efectelor candesartanului în funcție de vârstă) în cadrul testului open field. Efecte contradictorii ale candesartanului sunt menționate de acești autori și în ceea ce privește memoria, diferențele de răspuns apărând în funcție de vârstă, tipul de stimul aplicat și mai ales de prezența/absența HTA, efectul pozitiv al candesartanului fiind condiționat de HTA.
Referitor la funcția de memorie, candesartanul ar preveni amnezia prin restabilirea fluxului sangvin cerebral și prin normalizarea nivelului redus de acetilcolină, fiind modificate prin tratamente anterioare cu scopolamină, streptozocină sau Ang.II. (306).
Gradul ridicat de anxietate observat în studiul nostru după administrarea de Ang.II evaluat prin timpul petrecut în freezing și grooming crescut , a fost atenuat prin administrarea de candesartan. Rolul anxiolitic al candesartanului a fost menționat de un alt studiu recent care a urmărit disfuncțiile cognitive și anxietatea la un model de HTA cronică la șoarece prin perfuzare de Ang.II. După cele 21 de zile de administrare de Ang.II, autorii au remarcat scăderea semnificativă a timpului petrecut în centru, de asemenea un indicator al anxietății similar rezultatelor noastre (307).
Rezultatele noastre sugerează o conexiune între deficitele de memorie evidențiate în testul Y și creșterea stării de anxietate, care sunt adesea însoțite de HTA. Această corelație nu este clar elucidată, de exemplu la șobolani cu HTA spontană observându-se un nivel mai scăzut de anxietate dar și performanțe cognitive scăzute (308).
După cum remarcă (307), un anumit nivel de anxietate este necesar pentru îndeplinirea optimă a sarcinilor de memorie și învățare, dar în același timp un stres excesiv determină un efect opus.
De asemenea, performanțele cognitive-afective pot fi influențate și de alți indicatori fiziologici cum ar fi stresul oxidativ. Producerea speciilor reactive ale oxigenului este favorizată de Ang.II precum și de HTA (309).
4.4.4.EFECTELE ADMINISTRĂRII CRONICE A SUBSTANȚELOR MEDICAMENTOASE UTILIZATE ÎN STUDIU ASUPRA STATUSULUI OXIDATIV
Prin prezentul studiu, am studiat efectele blocării receptorilor pentru angiotensină II și a inhibării enzimei de conversie a angiotensinei, dar și efectele acestora în condiții de stres oxidativ generat prin blocarea receptorilor muscarinici prin adminsitrare de scopolamină.
Astfel, am adus argumente în plus față de efectul prooxidant al scopolaminei prin administrare cronică într-un model animal de șoarece. Administrarea pe o perioadă de 8 zile conduce la modularea în sens negativ a activității SOD, ceea ce indică spre o blocare a primei linii de apărare împotriva stresului oxidativ. Efectul acestei modulări se transmite către stabilitatea și buna funcționare a țesuturilor din care a fost făcută determinarea, din moment ce s-a observat modularea ușor negativă (dar nesemnificativă statistic) a activității enzimei GPx și intensificarea procesului de lipid peroxidare care are ca finalitate lezarea tisulară (tradusă prin modificarea indicelui biochimic al concentrației de MDA).
În acest sens, un studiu recent din 2017 (310), a evaluat efectele neuroprotectoare ale D. integrifolia asupra unui model animal (șoarece) de A.D. indus cu scopolamină, care au afirmat că datorită interferenței acesteia cu Ach de la nivel cerebral, poate genera stres oxidativ cu afectarea cogniției. Rezultatele histopatologice ale acestui studiu au arătat că după o administrare de 10 zile, scopolamina fiind un blocant colinergic, a determinat procese neurodegenerative la nivelul girusului dentat și că tulburările de memorie ar fi rezultatul creșterii activității AchE și a stării de oxidare a creierului.
Datele obținute prin analiza biochimică a eșantioanelor analizate de la animalele din cadrul acestui experiment au arătat că toate substanțele administrate au avut potențialul de a modifica statusul oxidativ. Astfel, această ipoteză a fost susținută de determinări biochimice a unor indici care reflectă statusul oxidativ și, implicit, activitatea unor enzime antioxidante (SOD și GPx), dar și un indice biochimic care reflectă intensitatea fenomenului de lipid peroxidare, unul din efectele dăunătoare și frecvente ale stresului oxidativ marcat prin producerea excesivă și acumularea speciilor reactive de oxigen. Măsurătorile au fost efectuate din două surse biologice de enzime din ser sanguin și extract de creier. Astfel, s-a observat o variație semnificativă a parametrilor biochimici la administrarea de scopolamină, losartan și ramipril (dar și a combinațiilor acestora) în ambele compartimente studiate: central și periferic. Așadar, dacă la nivel periferic se poate vorbi despre evaluarea efectelor substanțelor administrate asupra sistemului circulator, a vaselor de sânge și a lichidului circulant, evaluarea acestor parametri din extract de creier arată efectul lor asupra mecanismelor moleculare implicate în răspunsul la stresul oxidativ a țesutului cerebral, în prezența scopolaminei, a losartanului, a ramiprilului sau a combinațiilor dintre acestea.
Studiile efectuate de alte grupuri de cercetători și raportate în literatura de specialitate arată către o concentrare a atenției asupra compartimentelor tisulare, musculatură, cord și mai puțin asupra componentei circulante a sistemului circulator. Astfel, rezultatele obținute analizând serul sanguin al animalelor conduc către efecte observabile asupra componentei circulante sau asupra vaselor de sânge. De exemplu, în cazul analizei biochimice a activității enzimatice a GPx au fost prezentate rezultate doar pentru activitatea în extractul de creier. În serul sanguin, activitatea enzimei nu a fost decelabilă prin metoda utilizată. Această observație poate fi explicată prin intermediul literaturii de specialitate, o motivație fiind utilizarea unei metode nespecifice pentru sursa biologică aleasă sau manifestarea unei activități scăzute a enzimei analizate din serul sanguin, aceasta fiind activă și prezentă intracelular, dar nu și în ser sau lichid interstițial (311). Acestea reprezintă limitări ale acestui studiu, analiza acestora conducând la o parte din perspectivele de cercetare viitoare care rezultă din prezentul studiu.
În ceea ce privește efectul substanțelor administrate asupra parametrilor biochimici decelați din serul sanguin, s-a observat că variații statistic semnificative nu au fost obținute pentru activitatea enzimatică a SOD, comparând grupuri relevante pentru studiu. Aceste rezultate sunt parțial confirmate din rapoartele din literatura de specialitate, existând studii care susțin influența pozitivă a losartanului și ramiprilului asupra activității enzimative a SOD circulant (312-314). Cu toate acestea, în ceea ce privește intensitatea fenomenului de lipid peroxidare evaluată din ser sanguin, s-au observat variații semnificative în dreptul cupletelor scopolamină versus scopolamină + losartan și scopolamină + losartan versus martor. Aceste rezultate arată un potențial protectiv al losartanului față de efectul negativ al scopolaminei asupra lipid peroxidării. Cu alte cuvinte, la nivel periferic, losartanul poate împiedica parțial efectul negativ al scopolaminei asupra intensității fenomenului de lipid peroxidare (unul din efectele negative ale stresului oxidativ), având un potențial antioxidant puternic chiar în prezența unui agent pro-oxidant. Astfel, literatura de specialitate menționează că losartanul poate juca un rol antioxidant marcant care poate împiedica și diminua efectele stresului oxidativ asupra endoteliului vaselor de sânge, prevenind apoptoza si accidentele vasculare (315).
Efectul administrării cronice de Losartan și Ramipril asupra statusului oxidativ, într-un model animal de administrare cronică de scopolamină
După administrarea cronică de Losartan s-au observat modificări ale statusului oxidativ cu precădere în creierul animalelor studiate. La nivelul sistemului circulator, Losartanul previne legarea angiotensinei II la receptorul specific rezultând scăderea tensiunii arteriale prin prevenirea constricției vaselor sanguine. De asemenea, acțiunea acestuia a fost confirmată și la nivel cerebral, fiind implicat în modularea activității barierei hemato-encefalice, printr-un studiu privind efectele acestuia asupra permeabilității barierei hemato-encefalice într-un model de șobolan cu hipertensiune indusă prin administrare de angiotensină II (316). Tot în această lucrare se sugerează acțiunea angiotensinei II asupra modulării metabolismului și funcțiilor celulare ale oxidului nitric, o importantă componentă a procesului de apoptoză indusă prin stres oxidativ. Conexiunea dintre Losartan, angiotensină II și stres oxidativ a fost explicată și de De-Hua He și col. (317), într-un studiu privind prevenirea leziunilor cerebrale cauzate de accidente vasculare cerebrale modelând hipertensiunea la șobolani.
Având ca ipoteză de lucru faptul că apoptoza poate fi modulată, cel puțin parțial, prin stres oxidativ, studiul demonstrează efectul protectiv al losartanului față de stresul oxidativ care poate genera apoptoză menționând modularea activității enzimei SOD și a unei enzime de tip oxidază pe calea moleculară a producerii de radicali superoxid. În cadrul prezentului studiu, nu s-a observat un efect pregnant al losartanului asupra activității SOD. Totuși creșterea semnificativă a activității GPx indică spre un efect puternic antioxidant al acestui blocant al receptorilor angiotensinei II. Rezultate similare au fost raportate de alte studii de specialitate (318) și (230) alături de sugerarea unui potențial neuroprotectiv cu implicații asupra răspunsului la stres, anxietate, inflamație și atac ischemic. Desigur, literatura de specialitate argumentează un puternic rol antioxidant al Losartanului la nivelul sistemului circulator și în musculatura inimii prevenind atrofia (319), fibroza (320) și hipertrofia (321). Toate acestea indică spre un rol esențial al losartanului în prevenirea leziunilor celulare care pot apărea la nivel cerebral datorită stresului oxidativ, așa cum am arătat și prin rezultatele obținute în acest studiu – scăderea concentrațiilor de MDA fiind corespondentă scăderii intensității fenomenului de lipid peroxidare, un important efect al acumulării de specii reactive de oxigen. De asemenea, corelația matematică observată între variația concentrațiilor de MDA și activitatea enzimatică a GPx, la nivel cerebral, indică o dependență între cele două procese, fiind cunoscut faptul că activitatea enzimatică a GPx nu este corelată doar cu transformarea peroxidului de hidrogen în apă și oxigen, dar și cu reducerea peroxizilor acizilor grași aflați în componența lipidelor membranare atât de abundente în țesutul nervos.
În ceea ce privește efectul benefic al losartanului asupra stresului oxidativ generat de administrarea cronică de scopolamină, am observat creșterea semnificativă a activității enzimatice a SOD la administrarea concomitentă de losartan + scopolamină față de administrarea de losartan. Totuși, scăderea activității SOD la administrarea de losartan și creșterea acesteia la administrarea de losartan + scopolamină nu marchează o variație semnificativă față de administrarea de soluție vehicul. Astfel, se poate observa că, în condițiile blocării receptorilor pentru angiotensină II, scopolamina poate potența activitatea sistemului antioxidant de primă linie. Corelația dintre blocajul receptorilor muscarinici și ai receptorilor pentru angiotensină a mai fost explicată anterior (322), prin aceea că în condiții de salinitate scăzută, eliberarea de vasopresină se află sub controlul inhibitor al receptorilor pentru angiotensină II, însă la schimbarea salinității, un mecanism muscarinic poate fi implicat în stimularea receptorului pentru angiotensină II.
În ceea ce privește modularea activității enzimatice a GPx, se poate observa că losartanul poate contracara efectul negativ al scopolaminei asupra acestei enzime, administrarea concomitentă a losartanului și scopolaminei rezultând într-o activitate enzimatică semnificativ mai crescută față de grupul martor, dar mai scăzută decât la administrarea doar a losartanului. Acest potențial antioxidant al losartanului a fost discutat anterior și poate fi demonstrat și în cazul blocării receptorilor muscarinici, în condițiile în care calea colinică și calea angiotensinei interacționează prin modulare, la un anumit moment.
Corelate cu aceste efecte asupra enzimelor antioxidante sunt și efectele asupra potențialelor leziuni celulare apărute ca efect al stresului oxidativ. În studiul de față am demonstrat că prin blocarea concomitentă a receptorilor pentru angiotensină II și a receptorilor muscarinici se obține un potențial celular antioxidant care diminuează efectele stresului oxidativ. Cu toate acestea, este documentat științific efectul prooxidant al blocării receptorilor muscarinici. În aceste condiții, se poate afirma că blocarea receptorilor angiotensinei II poate preveni efectele prooxidante și distructive ale blocării receptorilor muscarinici, la nivelul țesutului cerebral, demonstrat prin interpretarea datelor obținute din analiza biochimică a unor parametri indicativi pentru statusul oxidativ.
În mod similar, un efect ușor antioxidant a fost sugerat de rezultatele acestui studiu și în cazul Ramiprilului. Ca și în cazul blocantului receptorului angiotensinei II, și în cazul Ramiprilului s-a observat diminuarea leziunilor provocate de stresul oxidativ asupra componentelor lipidice ale țesutului cerebral (variație dedusă din scăderea indicelui biochimic al intensității lipid peroxidării – concentrațiile de MDA) prin modularea activității enzimatice a SOD. Tot în acest context, s-a observat și modularea activității GPx, însă relația de cauzalitate între cele două procese nu este demonstrată prin acest studiu. Efectul antioxidant al Ramiprilului a mai fost argumentat științific de (323), care studiază efectul Ramiprilului și a simvastatinei asupra statusului oxidativ într-un model animal de diabet, (263, 324) privind complicațiile ce pot apărea la nivelul endoteliului vascular într-un model animal transgenic de diabet de tip II. Efectul antioxidant al acestui inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei este discutat pe larg (325), într-un studiu comparativ al efectelor inhibitorilor enzimei de conversie a angiotensinei asupra frecvenței accidentelor vasculare cerebrale discutând implicațiile unor inhibitori în apoptoză și modularea activității sintazei oxidului nitric. Tot astfel, efectul pozitiv al ramiprilului a fost demonstrat și în alte arii de cercetare cum ar fi studiul efectelor acestuia asupra performanțelor cognitive (107, 297). În cadrul acestor studii se trasează fine corelații între performanțele cognitive și statusul oxidativ în administrarea de ramipril, aceste corelații fiind deja cunoscute în condiții fiziologice și în unele boli neuropsihiatrice.
Așadar, se pare că administrarea ramiprilului nu influențează doar la nivel circulator starea oxidativă și procesele fiziologice legate de activitatea angiotensinei, ci și la nivelul țesutului cerebral, prin potențialul său de a modula procesele apoptotice celulare și implicit prin diminuarea acumulării și a efectelor speciilor reactive de oxigen.
În cadrul acestui studiu s-a explorat și efectul ramiprilului la nivel al statusului oxidativ în țesutul cerebral în condițiile blocării receptorilor muscarinici. Astfel, am observat că protejarea cu ramipril a lotului ce a primit scopolamină, corespunzând blocării concomitente a activității enzimei de conversie a angiotensinei și a receptorilor muscarinici, rezultă dintr-o creștere semnificativă a activității enzimelor antioxidante și scăderea ușoară a intensității fenomenului de lipid peroxidare la nivelul țesutului cerebral, față de lotul martor. Cu toate acestea, comparând efectul administrării ramiprilului cu efectul interacțiunii dintre ramipril cu scopolamina, se poate observa o potențare a proprietăților antioxidante. Aceste rezultate pot fi argumentate prin activitatea și proprietățile chimice ale ramiprilului. Astfel, prin faptul că distanța dintre administrarea ramiprilului (administrat întâi) și a scopolaminei (administrate la jumătate de oră înainte de testarea comportamentală, pe fondul perioadei de înjumătățire relativ scurtă a blocantului receptorilor muscarinici) s-a permis urmărirea efectului compusului mult mai activ derivat de la ramipril (ramiprilat), care apare în decurs de x ore de la administrare, perioadă care coincide cu timpul scurs între cele două adminstrări. În aceste condiții se poate afirma că activitatea compusului derivat de la ramipril, (ramiprilat), mult superioară ramiprilului, poate influența dinamica parametrilor biochimici evaluați, într-o manieră pozitivă, chiar și în condițiile blocării receptorilor muscarinici prin administrare de scopolamină, efectul antioxidant fiind cu mult superior în cazul grupului ramipril+scopolamină față de grupul martor, în cazul tuturor celor 3 parametri biochimici studiați.
4.5. CONCLUZII
4.5.1. Studiul I
Administrarea antagoniștilor colinergici muscarinici (scopolamină), IECA (captopril, ramipril) și BRA (losartan) în doză unică nu a indus modificări semnificative ale memoriei pe termen scurt, în testul Y.
La administrarea în doză unică a IECA, BRA și scopolamină, doar doză mică de losartan (10 mg/kg corp), a permis evidențierea unor efecte anxiolitice semnificative statistic, în cadrul testului labirintului plus ridicat.
În cadrul testului câmpului deschis, administrarea în doză unică de IECA și BRA a indus un efect protectiv clar, reducând parametrii anxietății (grooming, freezing) și îmbunătățind comportamentul explorator (crossing și stretching).
Hiperexcitația motorie produsă de administrarea în doză unică a scopolaminei confirmată în literarura de specialitate, observată în toate cele 3 teste efectuate (testul Y, testului labirintului plus ridicat, testul câmpului deschis), poate reprezenta un factor disturbator pentru performanțele cognitiv-afective.
4.5.2. Studiul II
Administrarea cronică de IECA și BRA, ca pre-tratament înaintea injectării de scopolamină, a avut un efect protector asupra memoriei evaluată cu ajutorul testelor Y și radial, în special pentru loturile tratate cu losartan + scopolamină și ramipril + scopolamină față de lotul tratat doar cu scopolamină.
În concordanță cu rezultatele altor autori, administrarea de scopolamină a determinat efecte anxiogene remarcate în cadrul testelor labirint plus ridicat și câmp deschis.
Printre efectele anxiogene ale scopolaminei au fost observate manifestări comportamentale diferite, chiar opuse, în cele două studii (timp de grooming și activitate locomotorie), facilitate de prezența/absența unor efecte secundare ale scopolaminei (hiperexcitație motorie, hiposalivație). Aceste diferențe s-ar datora variabilității individuale așa cum s-a putut observa în graficul nostru, fenomen susținut și de alți autori (304), care pledează pentru o abordare standard cât privește aplicarea sa la modelele de boli afective. Trebuie însă să remarcăm faptul că timpul de grooming crescut ar putea semnala un grad ridicat de anxietate determinat de scopolamină.
Adminstrarea cronică de IECA și BRA, ca pre-tratament înaintea injectării de scopolamină, a avut efect anxiolitic, contracarând starea de anxietate generată de scopolamină – efectul nu poate fi însă generalizat, ramiprilul exacerbând în anumite circumstanțe comportament de tip anxios.
4.5.2.Studiul III
1. Administrarea de Ang.II în doză unică, pe diferite căi, cu testare la 15 minute, a produs modificări ale memoriei pe termen scurt în sens negativ, în concordanță cu studiile din literatura de specialitate, în care se specifică reducerea semnificativă a nivelului de Ach din hipocamp și creșterea stresului oxidativ la nivel cerebral după administrarea de Ang.II.
2. Prin administrarea de Candesartan, blocant al receptorilor AT1 am constatat îmbunătățită semnificativ memoria de scurtă durată, ceea ce, conform literaturii de specialitate, s-ar datora ameliorării activității unor parametri biochimici specifici ai stresului oxidativ (SOD, ATP, AchE) și a nivelului unor neurotransmițători (Ach) din cortex și hipocamp.
Nivelul ridicat de anxietate observat după administrarea de Ang.II în cadrul testului câmpului deschis, prin timpul semnificativ crescut petrecut în freezing și grooming, a fost atenuat prin administrarea de candesartan.
Rezultatele noastre sugerează o conexiune între deficitele de memorie evidențiate în testul Y și creșterea stării de anxietate observată în cadrul testului câmpului deschis, fenomene care sunt adesea însoțite de HTA. Această corelație nu este clar elucidată, de exemplu în unele studii efectuate pe șobolani cu HTA spontană, observându-se un nivel mai scăzut de anxietate dar și performanțe cognitive scăzute.
Biochimie
Datele obținute prin analiza biochimică a eșantioanelor analizate de la animalele din cadrul acestui experiment au arătat că toate substanțele administrate au avut potențialul de a modifica statusul oxidativ. Această ipoteză a fost susținută de determinări biochimice a unor indici care reflectă statusul oxidativ și, implicit, activitatea unor enzime antioxidante (SOD și GPx), dar și un indice biochimic care reflectă intensitatea fenomenului de lipid peroxidare, unul din efectele dăunătoare și frecvente ale stresului oxidativ marcat prin producerea excesivă și acumularea speciilor reactive de oxigen.
Variația semnificativă a parametrilor biochimici la administrarea de scopolamină, losartan și ramipril și a combinațiilor acestora a fost observată în ambele compartimente studiate: periferic (cu efecte asupra sistemului circulator, a vaselor de sânge și a lichidului circulant) și central (cu efect asupra mecanismelor moleculare implicate în răspunsul la stresul oxidativ al țesutului cerebral).
Efectul prooxidant al scopolaminei prin administrare cronică, pe o perioadă de 8 zile, conduce la modularea în sens negativ a activității enzimelor SOD și GPx și intensificarea procesului de lipid peroxidare (tradusă prin modificarea indicelui biochimic al concentrației de MDA). ceea ce indică blocarea liniilor de apărare împotriva stresului oxidativ și creează premizele lezării tisulare.
La nivel periferic, losartanul manifestă un potențial antioxidant puternic chiar în prezența unui agent pro-oxidant, limitând parțial efectul negativ al scopolaminei de inducere a fenomenului de lipid peroxidare, după cum arată rezultatele analizei nivelului de MDA din ser sanguin, pentru cupletele scopolamină versus scopolamină + losartan și scopolamină + losartan versus martor.
La nivel central, creșterea semnificativă a activității enzimatice specifice a GPx și scăderea concentrațiilor de MDA pentru loturile tratate cu losartan, sugerează efectul protectiv al losartanului, în prevenirea leziunilor celulare și apoptozei ce pot apărea la nivel cerebral datorită stresului oxidativ. Efectul protectiv al losartanului nu s-a observat însă și în cazul activității enzimatice specifice a SOD.
La nivel central am observat creșterea semnificativă a activității enzimatice a SOD la administrarea concomitentă de losartan + scopolamină față de administrarea de losartan, ceea ce sugerează că, în condițiile blocării receptorilor pentru angiotensină II, scopolamina poate potența activitatea sistemului antioxidant de primă linie În ceea ce privește modularea dinamicii enzimatice a GPx, administrarea concomitentă a losartanului și scopolaminei a rezultat într-o activitate enzimatică semnificativ mai crescută față de grupul martor, dar mai scăzută decât la administrarea doar a losartanului.
Administrarea ramiprilului a determinat diminuarea leziunilor provocate de stresul oxidativ asupra componentelor lipidice ale țesutului cerebral (demonstrată prin scăderea indicelui biochimic al intensității lipid peroxidării, și prin creșterea activității enzimatice a SOD și GPx.
Efectul antioxidant al ramiprilului s-a manifestat și mai clar în cazul asocierii cu scopolamina, aspect demonstrat prin creșterea semnificativă a activității enzimelor antioxidante și scăderea ușoară a intensității fenomenului de lipid peroxidare la nivel cerebral. Aceste rezultate pot fi argumentate prin potențarea proprietăților antioxidante ale ramiprilului și ale metabolitul său activ ramiprilat, ca urmare a interacțiunii cu scopolamina, care, poate influența dinamica parametrilor biochimici evaluați, într-o manieră pozitivă, chiar și în condițiile blocării receptorilor muscarinici prin administrare de scopolamină.
CAPITOLUL 5
ANALIZA COMBINAȚIILOR FIXE DINTRE SUBSTANȚE CARE MODIFICĂ SISTEMUL RENINĂ-ANGIOTENSINĂ ȘI MEDICAMENTE CO-ANALGEZICE ȘI AINS
5.1. MOTIVAȚIA ALEGERII STUDIULUI
Inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei și blocanții receptorilor angiotensinici AT1 reprezintă o medicație frecvent utilizată în hipertensiunea arterială, în tratament cronic.
Având în vedere faptul că hipertensiunea arterială reprezintă o patologie cronică, tratamentul cu astfel de compuși este de lungă durată, fapt care atrage o serie de reacții adverse.
Deoarece sistemul renină-angiotensină este unul dintre sistemele cu implicații fiziologice și fiziopatologice importante, influențarea acestuia prin agenți farmacologici poate antrena efecte comportamentale. Pe parcursul tratamentului cu astfel de agenți și agenți utilizați pentru patologii asociate, pot apărea o serie de interacțiuni medicamentoase a căror manifestare poate avea semnificație clinică. Pacienții pot avea concomitent sindroame algice, boli reumatice, patologii cu modificări ale sistemului imun sau patologii specifice vârstei. Toate acestea antrenează manifestări dureroase care la un moment dat fac parte dintr-un cerc vicios: durerea cronică care atrage după sine comportament depresiv sau depresia care poate reprezenta o cauză a durerii.
Literatura de specialitate studiază relația controversată încă, între durere și depresie Având în vedere faptul că aceste patologii, la rândul lor, fac parte din categoria bolilor cronice, tratamentele menite să reducă durerea sunt de lungă durată. Pornind de la un fapt observațional citat în literatură (326), pe fond de polipatologie și implicit polimedicație, când s-a constatat că asocierea de antiinflamatoare nesteroidiene (ex: meloxicam) concomitent cu inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei a dus la diminuarea efectelor medicamentelor antihipertensive, am considerat necesar a cerceta influența farmacologică în condiții experimentale a combinațiilor dintre modulatorii sistemului renină angiotensină și medicamente adjuvante în terapia durerii (antidepresive) învestigând în acest studiu acțiunea antinociceptivă. În cercetările de față am utilizat un antiinflamator nesteroidian (frecvent prescris în practică, atât în sindroamele algice acute cât și în durerea cronică), ibuprofenul, compus care prezintă acțiune analgezică, antiinflamatoare și antipiretică (mecanismul de acțiune se bazează pe inhibiția ciclooxigenazei) și care poate demonstra activitatea antinociceptivă în modelele experimentale.
Deși terapia analgezică se bazează predominant pe două grupe mari de analgezice (opioide și non-opioide) prescrise pe scară largă, acestea nu acoperă toate sindroamele dureroase.
În ultima vreme, cercetătorii și-au orientat atenția către o serie de compuși care, deși nu sunt reprezintă analgezice pure, pot îmbunătăți analgezia prin asociere cu analgezicele clasice, cu avantajul că se pot utiliza doze reduse din fiecare medicament.
Astfel de medicamente fac parte din mai multe grupe terapeutice care influențează sistemul nervos central sau periferic și poartă denumirea de co-analgezice și para-analgezice. Generic, acestea se mai numesc adjuvante. În grupa adjuvantelor, sunt incluse medicamente antidepresive, unele relaxante ale musculaturii, o serie de anxiolitice, anticonvulsivante, etc.
Deși în condiții experimentale există modele de nocicepție care pot pune în evidență durerea acută, cronică, inflamatorie, neurogenă, rezultatele pot fi dificil de interpretat. Pentru realizarea unor combinații fixe și analiza efectelor antinociceptive ale acestora, este necesar a se utiliza metode care presupun un algoritm matematic și statistic complex pentru a evalua cantitativ sinergismul, adiția și antagonismul.
Astfel de metode presupun determinarea activității analgezice/antinociceptive a compușilor individuali, urmând ca după aceste determinări să se poată realiza combinația fixă. Studiul de față își propune analiza unor combinații între adjuvante analgezice (antidepresive) și substanțe care influențează sistemul renină-angiotensină (inhibitori ai enzimei de conversie, blocanți ai receptorilor AT1 ai angiotensinei).
Pentru realizarea studiului, s-au avut în vedere următoarele obiective:
Demonstrarea acțiunii antinociceptive pentru fiecare compus pe modele de nocicepție non-inflamatorie, cu stimul chimic și termic și nocicepție inflamatorie cu stimul chimic la șoarece.
Determinarea valorii DE50 pentru fiecare compus pe modele de nocicepție inflamatorie și non-inflamatorie, cu stimul chimic la șoarece; aceste valori sunt necesare pentru studiul și analiza combinațiilor binare în proporție fixă.
Demonstrarea acțiunii antinociceptive a combinației binare în proporție fixă pe modele de nocicepție non-inflamatorie, cu stimul chimic și termic și nocicepție inflamatorie cu stimul chimic la șoarece.
Pentru studiul combinațiilor, s-a avut în vedere demonstrarea tipului de efect: antagonic, aditiv, sinergic al combinațiilor în proporție fixă:
Inhibitori ai enzimei de conversie (captopril, enalapril) – AINS (ibuprofen)
Blocante ale receptorilor angiotensinici AT1 (candesartan) – AINS (ibuprofen)
Inhibitori ai enzimei de conversie (captopril, enalapril) – antidepresive (doxepina, clomipramina, nortriptilina)
Blocante ale receptorilor angiotensinici AT1 (candesartan) – antidepresive (doxepina, clomipramina, nortriptilina)
Cercetările în acest studiu au drept scop evaluarea acțiunii antinociceptive a combinațiilor binare în proporție fixă dintre substanțele care influențează sistemul renină-angiotensină (inhibitori ai enzimei de conversie, blocante ale receptorilor AT1) și medicamente AINS, medicamente antidepresive (adjuvante în analgezie).
5.2. MATERIAL ȘI METODE
5.2.1. ANIMALE DE LABORATOR
În acest studiu s-au utilizat șoareci albi Swiss, masculi, adulți, cu greutatea 20-30 g (grupe cu 20-25 g, 25-30 g și 20-30 g). Aceștia au fost repartizați prin randomizare în loturile de studiu. Condițiile de habitat au fost descrise la capitolul 4.2.1., cu mențiunea că în loturile pentru studiul nocicepției, repartițiile au fost de 6-10 animale pe lot. Cu 15 zile înainte de a efectua protocolul experimental, s-a studiat comportamentul acestora, urmărindu-se: consumul de apă și hrană, tranzitul digestiv, semne neurologice, leziuni ale în regiunea plantară, aspectul blănii și al cozii și aspectul general al tegumentelor. Animalele au fost achiziționate de la Institutul Cantacuzino București din fondurile programului de doctorat și din fonduri proprii. Procedeele experimentale au fost efectuate în concordanță cu directiva 63/2010 reglementările Comisiei de Bioetică U.M.F. „Grigore T. Popa” (222, 223) și reglementările IASP (International Association for the Study of Pain) (327, 328) referitoare la testările realizate pe animale de laborator).
Hrana animalelor de experiență a fost achiziționată prin intermediul Institutului Cantacuzino București și reprezintă hrană standard utilizată pentru animalele de laborator.
Așternutul a fost de asemenea achiziționat de intermediul Institutului Cantacuzino București din fondurile mai sus menționate.
5.2.2. SUBSTANȚE CHIMICE UTILIZATE
5.2.2.1. Substanțe medicamentoase utilizate în studiul experimental privind comportamentul nociceptiv
Inhibitorii enzimei de conversie ai angiotensinei – Captopril, Ramipril
Blocanți ai receptorilor angiotensinei AT1 – Candesartan
Proveniența substanțelor și descrierea acestora a fost efectuată la capitolul 4.2.2.
Studii recente au demonstrat intervenția acestor compuși în nocicepția cu stimul chimic și termic la șoarece (329).
Antidepresive:
Doxepină (Sigma – Aldrich)
Substanță medicamentoasă din grupa antidepresive triciclice al cărui mecanism de acțiune se explică prin intervenția asupra neuromediatorilor noradrenalină, serotonină, mai pregnant noradrenalină. De asemenea compusul intervine asupra receptorilor histaminici H1, dopaminergici D2 (330) receptorilor colinergici, alfa-adrenergici (331).
Clomipramină (Sigma – Aldrich)
Substanță medicamentoasă din grupa antidepresive triciclice a căror acțiune antinociceptivă a fost demonstrată pe unele modele animale (203).
Nortriptilină (Sigma – Aldrich)
Substanță medicamentoasă din grupa antidepresive triciclice al cărui mecanism de acțiune se explică prin intervenția asupra neuromediatorilor noradrenalină, serotonină, mai pregnant noradrenalină. Literatura de specialitate aduce date referitoare la implicațiile acestor compuși în nocicepția indusă cu stimul chimic pe modele experimentale la șoarece (206, 332), modele de durere neuropată (333, 334) etc.
5.2.2.2.Alte substanțe
Carboximetilceluloza sodică (Sigma Aldrich): derivat de celuloză utilizat ca agent de suspendare în concentrație de 0,1% pentru administrarea substanțelor luate în studiu
Apa distilată: utilizată pentru prepararea reactivilor de lucru
Ser fiziologic (Zentiva): utilizat pentru prepararea reactivilor de lucru
5.2.2.3 Administrarea substanțelor
Căile de administrare utilizate au fost calea orală și intraperitoneală (descrise la capitolul 4.2.3.) și calea de administrare subcutanată în regiunea plantară.
Volumele administrate au fost 0,2ml/10g animal și 0,10ml/10 g animal pentru calea orală și intraperitoneală și 0,02 ml pentru calea subcutanată.
Soluțiile și suspensiile de administrat au fost preparate ex tempore.
5.2.3. USTENSILE DE LABORATOR ȘI ECHIPAMENTE UTILIZATE ÎN STUDIUL EXPERIMENTAL PRIVIND COMPORTAMENTUL NOCICEPTIV
pentru calea orală s-a utilizat sonda de gavaj adaptată la p seringă de administrare
pentru căile injectabile s-a utilizat o seringă de insulină cu ace de dimensiuni adecvate căii injectabile selectate
pentru testul la formalină s-a utilizat echipament audio-video
balanță pentru cântărit animale și balanță pentru cântărit substanțe (Kern AEJ, 200-4CM, 220g)
5.2.4. MODELE DE NOCIEPȚIE UTILIZATE
În studiul de față am utilizat modele de nocicepție cu stimul chimic și stimul termoalgezic după cum urmează:
Modele cu stimul chimic
Testul la formalină
Testul răspunsului constrictiv abdominal
Modele de nocicepție cu stimul termoalgezic
Testul plăcii încălzite (testul hot-plate)
Pentru realizarea combinațiilor binare în proporție fixă și evaluarea cantitativă a interacțiunilor s-au realizat perechi de doze, asocieri dintre compuși care influențează sistemul renină-angiotesină cu adjuvante utilizate în tratamentul durerii (antidepresive) și AINS (ibuprofen). Nivelul de activitate selectat în acest studiu este de 50%.
Testul la formalină
Testul permite evaluarea acțiunii analgezice în condiții inflamatorii și constă în administrarea agentului nociceptiv, o soluție de formaldehidă de concentrație 1-5 %. Se notează perioada de latență a reacției la durere timp de 5 minute de la injectarea soluției de formaldehidă și timp de 10 minute după 20 minute de la administrarea soluției de formaldehidă (335, 336). Răspunsul este bifazic, prima fază caracterizând predominant nocicepția, cea de a doua inflamația. Nocicepția se datorează probabil efectului direct al formaldehidei asupra receptorilor senzoriali deoarece formaldehida se cuplează la grupările amino libere și poate modifica, altera proteinele. Faza inflamatorie este produsă datorită eliberării de mediatori proinflamatori de tip histamină, bradikinină, serotonină, prostaglandine din celulele lezate (337). Examinarea histologică oferă aspectul unei reacții inflamatorii acute care începe la aproximativ o oră după injecție și poate dura până la 480 ore (336).
Testul la formalină este foarte util pentru evaluarea analgezicelor ușoare care spre deosebire de cele puternice permit observarea de faze diferite a răspunsurilor la durere. Evaluarea analgeziei se face printr-un test motor comportamental (lingerea-mușcarea labei) care nu este afectat de o eventuală blocare a căilor de propagare a senzației dureroase.
Răspunsul specific (lingerea-mușcarea labei) este ușor de observat și de cuantificat mai ales la șoareci (335).
Testele de durere acută de tip Hot-plate, Tail Flick oferă informații asupra răspunsului la nivele joase ale sistemului nervos ceea ce este informativ mai ales asupra pragului de percepție a durerii. Pe de altă parte un test dublu precum cel la formalină folosește un stimul nociceptiv de lungă durată fiind mai asemănător cu durerea cronică (338).
Testul la formalină presupune administrarea subcutanat în regiunea plantară a unei soluții de formaldehidă și înregistrarea răspunsului timp de 5 minute din momentul administrării agentului iritant și respectiv 10 minute începând din minutul 20 după administrarea agentului iritant.
Având la bază cele două posibilități de evaluare, în studiul de față, testul la formalină a reprezentat un test de screening. Se consideră efect antinociceptiv raportarea procentuală față de animalul martor.
Testul răspunsului constrictiv abdominal (RCA)
Testul este utilizat frecvent în fizio-farmacologia experimentală deoarece se poate aprecia analgezia centrală și periferică. În literatura de specialitate este utilizat adesea ca model de screening pentru evaluarea nocicepției, iar în prezentul studiu este utilizat în completarea testului la formalină. Acest test mai poartă denumirea de ”writing test” (testul zvârcolirii).
Testul se efectuează după metoda lui Siegmund, tehnica lui Koster și col. (339) și constă în injectarea unui agent iritant (acid acetic) capabil să producă un răspuns specific (răspunsul constrictiv abdominal). Acest răspuns caracteristic constă în întinderea și contorsiunea trunchiului. În studiul nostru s-a folosit ca agent iritant o suspensie de Zymosan A deoarece imprimă testului o specificitate ce permite aprecierea durerii inflamatorii. Răspunsurile obținute se înregistrează pe unitatea de timp. Aceste răspunsuri reprezintă manifestări ale durerii viscerale însă inervația peritoneului parietal completează argumentele precum că acest tip de durere este similar cu cel din peritonită și nu numai visceral (340).
Administrarea intraperitoneală a Zymosanului A la șoarece produce un răspuns inflamator manifestat prin întinderi ale trunchiului și contorsiuni abdominale, infiltrare celulară, extravazare de plasmă, biosinteză de eicosanoide (Doherty cit (341)). Eliberarea mediatorilor primari care produc nocicepție este precedată de eliberarea unor citokine proinflamatoare (Poole cit. in (342)). La șoarece răspunsul constrictiv abdominal este mediat prin citokinele TNF-alfa, IL1-beta, IL8 care acționează concomitent și sinergic (Ribierro cit (343)).
Pentru realizarea testului se utilizează o suprafață metalică perforată cu o înălțime de 20-25 cm față de planul mesei de laborator pe care se așează în funcție de condițiile experimentale, incinte de sticlă de dimensiuni adecvate, identice ca diametru și înălțime. Sub incintele de sticlă se plasează cate un animal de experiență (șoarece) (Figura 5.1.). După administrarea agentului iritant se înregistrează timp de 12 minute numărul de răspunsuri constrictive abdominale.
Fig. 5.1. Ansamblul experimental pentru testul răspunsului constrictiv abdominal
(Foto: Laboratorul de Farmacodinamie experimentală – utilizare permisă)
Testul plăcii încălzite (testul hot plate)
Testul plăcii încălzite presupune plasarea animalului de experiență pe o suprafață încălzită conform protocolului de lucru utilizat, suprafață care este delimitată de un cilindru transparent de plexiglas cu înălțime adecvată animalului de experiență utilizat în studiu. Expunerea animalului la temperatura constantă pune în evidență comportamente cu integrare supraspinală, care permit aprecierea durerii. Aceste comportamente constau în lingerea labei posterioare și săritura. Răspunsurile caracteristice pot fi inhibate de medicamente opioide și non-opioide dependent de temperatura de lucru utilizată.
Pentru realizarea testului s-a utilizat aparatul Hot-Plate model 7280-Ugo Basile (Figura 5.2.)
Fig. 5.2. Aparat Ugo Basile Hot Plate model 7280
Testul se efectuează după metoda Woolfe și Mac Donald (1944) modificată de Eddy și Laborit (1953). Acesta constă în evaluarea perioadei de latență a reacției de durere (cut off 30 secunde) la temperatura de 52,5 ± 0,1°C (340). Selectarea animalelor pentru introducerea în test se efectuează cu 45-90 minute înainte de tratament. După administrarea substanțelor de cercetat înregistrarea perioadei de latență s-a efectuat la 30, 60, 90, 120 minute. În analiza finală a datelor s-a luat în calcul timpul unde s-a înregistrat efectul maxim posibil.
5.2.5. ANALIZA ȘI INTERPRETAREA DATELOR
5.2.5.1. Metode de analiză a interacțiunilor cu mecanism farmacodinamic
Evaluarea interacțiunilor cu mecanism farmacodinamic impune o analiza cantitativă riguroasă (farmacometrie). Printr-o astfel de analiză se poate preciza relația dintre doză și efect.
Analiza combinațiilor binare în proporție fixă poate fi apreciată fie prin utilizarea metodei analizei izobolare generalizate care permite analiza combinaților la diferite nivele de efect, fie prin variantele intermediare ale acesteia. În studiul de față s-a utilizat metoda dreptei aditive compuse pentru nivelul de activitate de 50% pornind de la substanțe medicamentoase care, conform literaturii de specialitate au fost menționate ca fiind utile în tratamentul durerii ca adjuvante. Pentru analiza unui alt nivel de activitate decât cel studiat (50%), se utilizează analiza suprafeței de răspuns a efectului farmacodinamic.
Metoda dreptei aditive compuse evaluează combinațiile binare în proporție fixă pe o zona de efecte ceea e duce la rezultate foarte complexe.
Datele obținute se analizează astfel: dreapta de regresie experimentală a relației doză totală – efect al combinației se compară cu dreapta de regresie aditivă compusă într-o analiză de varianță asupra datelor relației doză efect, datele obținute permițând atât constituirea izobologramei cat și trasarea dreptelor de regresie (344).
Sinergismul depinde de proporția substanțelor din combinația fixă. In acord cu metodologia pentru stabilirea dozelor din combinația fixă este necesar să se determine valoarea DE50 a fiecărui compus. Aceasta se obține din analiza datelor experimentale ca valoare DE50 din efectul maxim posibil pe care îl pot avea substanțele de cercetat. Dozele din combinația fixă sunt stabilite ca fracțiuni din fiecare substanță (X; Y) iar suma lor este egală cu unitatea (pX + pY = 1). Combinația formată este privită ca un treilea compus (M/C) Zadd. Acest compus se administrează în doze variabile pentru determinarea cantității reale care produce efectul dorit (Zmix). Valoarea Zmix se estimează din datele relației doză-efect ale compusului C prin analiza de regresie liniară (si/sau non lineară) împreună cu varianța acesteia. Dacă printr-o astfel de analiză diferența Zmix – Zadd nu diferă semnificativ de zero combinația fixă poartă numele de combinație simplu aditivă.
În analiza statistică diferența semnificativă pune în evidență o interacțiune de tip non aditiv după cum urmează:
Sinergism (potențare): Zmix < Zadd,
Subadiție: Zmix > Zadd.
Metodologia modernă introduce un parametru numit indice de interacțiune (γ). Valorile acestuia indică tăria sinergismului (345, 346):
Sinergism: γ < 1
Adiție: γ ≈/= 1
Subadție: γ > 1 (antagonism γ >> 1).
Din rațiuni terapeutice se lucrează cu nivelul de mijloc de 50%. Când rezultatele indică un domeniu diferit de efecte, altul decât cel scontat se poate efectuta o analiză a altor nivele de efect. Toate curbele doza-efect trebuie să fie în acord cu nivelul de activitate studiat, varianțele nu trebuie să fie prea mari cand se detrmină valorile Zadd și Zmix.
De asemenea analiza izobolară se extinde și la alt nivel de efect atunci când sinergismul a fost demonstrat. Reprezentarea grafică tridimensională a acțiunii (analiza suprafeței de răspuns) combinației fixe reprezintă o analiză riguroasă și extrem de laborioasă.
5.2.5.2. Analiza statistică a datelor
În acest studiu am utilizat două tipuri de interpretări ale efectelor farmacologice: efecte gradate și efecte cuantale.
Efectele gradate sunt caracterizate prin faptul că intensitatea efectului crește odată cu creșterea dozei, relația dintre doză și efect exprimându-se printr-o funcție monoton crescătoare.
Efectele cuantale sunt utilizate adesea la evaluarea toxicității substanțelor medicamentoase, se supun „legii tot sau nimic”, sunt efecte binare înregistrarea acestora urmărind absența sau prezenta răspunsului. Efectele cuantale pot fi utilizate la evaluarea unei acțiuni dacă modelul experimental și tipul de acțiune se pretează la o astfel de interpretare. Astfel de interpretări sunt riguroase și prezintă avantajul utilizării unui număr mic de animale pentru lotul de studiu. Deoarece în fiziologia și farmacologia experimentală o serie de modele prezintă o variabilitate mare în răspuns, acestea pot fi transformate din efecte gradate în efecte cuantale.
Pentru testul la formalină interpretarea datelor se face ca procentaj raportat la nivelul de efect maxim posibil (EMP%).
% inhibiție (antinocicepție) =
M- valoarea gradului de inhibiție a lotului martor
T- valoarea gradului de inhibiție a lotului tratat
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal interpretarea datelor se face ca procentaj raportat la nivelul de efect maxim posibil (EMP%.
% (antinocicepție) inhibiție =
Pentru testul plăcii încălzite interpretarea datelor se face ca procentaj raportat la nivelul de efect maxim posibil (EMP%).
% (antinocicepție) inhibiție =
T0 – latența răspunsului măsurată înainte de administrarea substanței de studiat
Tx – latența la diferite intervale de timp consecutive administrării substanței
Tm – timpul maxim permis (cut – off time) pentru a evita apariția leziunilor la animalul de experiență
Metodologia de studiu a interacțiunilor impune determinarea valorii DE50 pentru fiecare compus pentru fiecare model de nocicepție studiat și evaluarea valorii Zadd – Zmix pentru același nivel de activitate. Perechile de doze utilizate pentru analiza datelor doză – efect au valori cuprinse între doza minimă eficace și doza maximă pentru acțiunea cunoscută. Acestea se administrează în progresie geometrică. Reprezentarea datelor se face într-un sistem de coordonate când se înregistrează pe ordonată efectul procentual ca efect maxim posibil (EMP%) pentru efectele gradate și ca valoare probit din efectul maxim posibil pentru efectele cuantale (probit 5 corespunde pentru nivelul de 50% activitate) iar pe abscisă logaritmul dozei. Se obțin astfel dreptele de regresie care se analizează.
Ecuația dreptei de regresie:
y = a + b x
y = ordonata (efectul)
x = abscisa (logaritmul dozei)
a = interceptul (locul pe ordonată unde dreapta de regresie se intersectează cu ordonată: valoarea lui y pentru x = 0)
b = panta dreptei (tangenta unghiului pe care îl formează dreapta fată de abscisă), indică sensul legăturii. Astfel valoarea b arată cu cât se modifică în medie variabila y (efectul) la o creștere cu o unitate a variabilei x (logaritmul dozei).
Coeficientul de corelație Pearson ”R” are valori cuprinse între (-1) (+1) și se utilizează pentru evaluarea relației între două variabile (doza – efect). Dacă valorile ”R” tind către extremele intervalului menționat legătura este intensă, o modificare mică a dozei va da o modificare semnificativă a efectului. Daca valorile tind către 0, legătura între cele două variabile este mai slabă (347). În analiza statistică se utilizează t-test și ANOVA-test (F) pentru a observa dacă abscisa liniei de regresie a combinației fixe diferă semnificativ de linia aditivă compusă pentru nivelul de activitate selectat. Testul F arată dacă cele două linii de regresie (aditivă și a combinației) sunt semnificativ diferite. Se compară valorile obținute (t, F) cu cele tabelare la p = 0,05. Dacă valorile sunt mai mici decât cele tabelare, testul/testele nu este/sunt semnificativ/e. Dacă se demonstrează sinergismul graficul dreptelor de regresie arată o deplasare la stânga a dreptei de regresie a combinației fată de dreapta aditivă compusă (348-350). În analiza statistică pentru toate testele de semnificație statistică, s-a considerat că pentru valori p <0,05 există o diferență semnificativă statistic între grupele comparate.
5.3. REZULTATE
5.3.1. ASOCIERI CANDESARTAN-MEDICAMENTE COANALGEZICE ȘI AINS
5.3.1.1. Asociere Candesartan – Ibuprofen
5.3.1.1.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi Swiss, masculi, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Cu trei ore înainte de experiment s-a sistat accesul la hrană și apă.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan (CND) 0.25 – 2.00 mg/kg, ibuprofen (IB) 12,50-100,00 mg/kg și asocierea acestora 0.99 -7.89 mg/kg. Substanțele de administrat singure sau în combinație au fost preparate ex tempore prin suspendarea în CMC-Na – 0,1% (Tabel 5.1.).
Agentul nociceptiv reprezentat de o soluție salină de formaldehidă 5% s-a administrat pe cale subcutanată în regiunea plantară în volum de 20µl în laba dreaptă. Laba stângă a fost tratată în mod similar cu o soluție salină (ser fiziologic 0,9%) în volum de 20µl.
Durata experimentului din momentul administrării agentului nociceptiv a fost de 30 minute, înregistrarea datelor efectuându-se astfel: timp de 5 minute (din momentul administrării agentului nociceptiv) și timp de 10 minute (din minutul 20 al administrării agentului nociceptiv). Antinocicepția s-a calculat conform descrierii la capitolul 5.2.5.2 față de un lot martor care a primit agentul iritant și 0.2 ml/10g animal CMC-Na – 0.1% p.o..
Datele obținute au permis demonstrarea valorii DE50 pentru candesartan pentru prima fază a testului cu formalină (timp de evaluare 5 minute) și ibuprofen pentru ambele faze ale testului. Pentru timpul de evaluare de 5 minute valorile DE50 pentru cei doi compuși se regăsesc în tabelul 5.2. Aceste valori sunt utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației și demonstrarea valorii Zadd și Zmix. Deși pentru ibuprofen s-a putut demonstra o valoare DE50 pentru faza a doua a testului, raționamentul de constituire a perechilor de doze pentru evaluarea comportamentului nociceptiv s-a efectuat pentru prima fază având în vedere faptul că ambii compuși și-au demonstrat acțiunea antinociceptivă pentru timpul de evaluare de 5 minute.
Tabel 5.1. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.3. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-IB prin testul la formalină
(timp de evaluare 5 minute)
Tabel 5.2. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – ibuprofen prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 1.93 ± 0.35 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0,243.
Aceste date demonstrează sinergismul dintre cele două substanțe asociate. Prin aspectul dreptelor de regresie se pune în evidență sinergismul atunci când dreapta de regresie a asocierii este deplasată la stânga față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.3.) pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 7.92 ± 0.96 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.980, p2 = 0.222). Semnificația statistică a rezultatelor se regăsește în tabelul 5.2.
5.3.1.1.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Cu trei ore înainte de experiment s-a sistat accesul la hrană și apă.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g și 25.00 -30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, ibuprofen 12,50-100,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 1.99 – 15.97 mg/kg (Tabel 5.3.). Substanțele de administrat singure sau în combinație au fost preparate ex tempore prin suspendarea în CMC-Na – 0,1%.
Agentul nociceptiv reprezentat de o soluție salină de Zymosan A 5% s-a administrat pe cale intraperitoneală 40 mg/kg. Durata testării a fost de 12 minute din momentul administrării acestuia. Pe parcursul acestei perioade s-a înregistrat numărul de răspunsuri constrictive abdominale caracteristice. Modelul de nocicepție a fost apreciat cantitativ ca fiind cuantal caracterizat de prezența sau absența numărului de răspunsuri caracteristice.
Datele obținute au permis demonstrarea valorii DE50 pentru candesartan și ibuprofen (Tabel 5.4.) efectul antinociceptiv maxim posibil pentru cele două substanțe fiind candesartan EMP = 67.77 % pentru doza de 2.00 mg/kg și ibuprofen EMP = 100% pentru doza de 100 mg/kg. Antinocicepția s-a calculat conform descrierii la capitolul 5.2.5.2.
Aceste valori sunt utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației în proporție fixă și demonstrarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.4. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.4. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND –IB prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.4. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – ibuprofen prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 3.10 ± 0.72 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.192, aceste valori demonstrând sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție studiat. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a asocierii față de dreapta aditivă compusă demonstrează la rândul său sinergismul combinației CND-IB (Figura 5.4.) pentru secvențele de doze (Zadd = 16.11 ± 2.84 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.957, p2 = 0.043). Semnificația statistică a rezultatelor se regăsește în tabelul 5.4.
5.3.1.1.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Cu trei ore înainte de experiment s-a sistat accesul la hrană și apă.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 – 10 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan (CND) 0.50 – 2.00 mg/kg, ibuprofen (IB) 30.00 -120,00 mg/kg și asocierea acestora 3.89 – 31.15 mg/kg. Substanțele de administrat singure sau în combinație au fost preparate ex tempore prin suspendarea în CMC-Na – 0,1%.
Animalele de experiență au fost supuse stimulului termic (52.5ș ± 0.2șC) cu 60 minute înainte de tratamentul cu substanțele de cercetat. Experimentul s-a desfășurat prin expunerea la stimulul termic la 30, 60, 90, 120 minute după administrarea substanțelor de cercetat.
S-a notat perioada de latență a apariției reacției nociceptive prin expunerea la stimulul termic timp de 30 secunde (cut – off) pentru fiecare domeniu de temperatură. Antinocicepția s-a calculat conform descrierii la capitolul 5.2.5.2.
Efectul antinocieptiv maxim posibil (EMP%) a fost de 72.10% pentru candesartan la 90 minute și 70.00%, 76.00%, 74.15% pentru ibuprofen la 30, 60 și respectiv 90 minute (Tabel 5.5.).
Datele obținute au permis demonstrarea valorii DE50 pentru candesartan (Tabel 5.6.) la 90 minute și ibuprofen la 30 minute. Pentru ibuprofen efectul s-a menținut la 60 și 90 minute, datele obținute permițând demonstrarea a două valori DE50 corespunzătoare celor a două domenii de timp. Dintre cele trei valori determinate s-a ales pentru studiul combinației CND-IB valoarea cea mai mică demonstrată respectând principiile farmacometriei respectiv definiția parametrului cantitativ al acțiunii farmacodinamice – potența (351, 352).
Valorile obținute sunt utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației CND – IB pentru demonstrarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.5. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 8.66 ± 1.29 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.268.
Valorile obținute demonstrează sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție cu stimul termic. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă demonstrează sinergismul combinației CND – IB (Figura 5.5.) pentru secvențele de doze (Zadd = 31.06 ± 3.05 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.983, p2 = 0.017). Parametrii statistici ai analizei de regresie se regăsesc în tabelul 5.6.
Figura 5.5. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND – IB prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.6.Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – ibuprofen prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.1.2. Asociere Candesartan – Doxepină
5.3.1.2.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Descrierea protocolului experimental fost efectuată la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, doxepină (DOX) 2,50 – 20,00 mg/kg și asocierea acestora 0.17 – 1.40 mg/kg. Efectul antinociceptiv maxim posibil a fost de 83.39% pentru candesartan pentru faza I a testului (Tabel 5.7.). Secvența de doze utilizată pentru doxepină nu a făcut posibilă demonstrarea unei valori DE50 pentru această substanță. Astfel, în acord cu metodologia de studiu a combinațiilor în proporție fixă am procedat la modificarea raportului între doze menținând doza de candesartan constantă în timp ce doza de doxepină a variat în progresie geometrică. Raportul CND:DOX – 1: 0.35 a dus la o valoare a efectului antinociceptiv EMP = 52.87% pentru prima fază a testului (timp de evaluare 5 minute). Această valoare a permis stabilirea perechilor de doze care s-au administrat pentru demonstrarea valorilor Zadd și Zmix.
Tabel 5.7. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.6. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND – DOX prin testul la formalină
Tabel 5.8. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – doxepină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Perechile de doze administrate au demonstrat o inhibiție a procesului nociceptiv pentru ambele faze ale testului (Tabel 5.8.).
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 0.40 ± 0.09 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.279. Valorile obținute demonstrează sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție cu stimul chimic formalină 5%. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta de regresie a CND demonstrează sinergismul combinației CND-DOX (Figura 5.6.) pentru secvențele de doze (Zadd = 1.43 ± 0.28 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.241). Parametrii statistici ai analizei de regresie se regăsesc în tabelul 5.8.
5.3.1.2.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris, la capitolul 5.3.1.1.2. modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2., valoarea DE50 a CND pentru modelul de nocicepție a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.2.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 -3 0.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, doxepină 2,50 – 20,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.59 – 4.73 mg/kg (Tabel 5.9.). Efectul antinociceptiv maxim posibil al doxepinei a fost EMP = 83.33 % pentru doza de 20.00 mg/kg (Tabel 5.9.). Datele obținute au demonstrat valoarea DE50 pentru doxepină (Tabel 5.10.). Valorile obținute sunt utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației în proporție fixă și demonstrarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.9. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.7. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-DOX prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.10. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – doxepină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 1.52 ± 0.35 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.321. Aceste valori demonstrează sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție cu Zymosan A. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a asocierii față de dreapta aditivă compusă demonstrează inergismul combinației CND-DOX (figura 5.7) pentru secvențele de doze (Zadd = 4.73 ± 1.01 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.856, p2 = 0.144). Semnificația statistică a rezultatelor obținute se regăsește în tabelul 5.10.
5.3.1.2.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.3., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2., iar valoarea DE50 a CND a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.3.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 -10 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.50 – 2.00 mg/kg, doxepină 5.00 -20,00 mg/kg și asocierea acestora 0.96 – 7.74 mg/kg (Tabel 5.11.).
Tabel 5.11. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Efectul antinociceptiv maxim posibil al DOX în administrare singură a fost EMP% = 59.88 la 60 minute iar datele înregistrate au permis determinarea valorii DE50 (Tabel 5.12.).
Valorile DE50 obținute pentru ambele substanțe au fost utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației CND – DOX pentru demonstrarea valorii Zadd și Zmix.
Perechile de doze administrate au demonstrat un procent de inhibiție crescător începând cu 30 minute de la administrare fără a depăși nivelul de activitate de 50%. Efectul antinociceptiv a fost demonstrabil la 60 minute și 120 minute. Prelucrarea datelor pentru analiza combinației CND-DOX s-a efectuat pentru determinările corespunzătoare timpului de 60 minute.
Rezultatele finale ale combinației au demonstrat un procent de inhibiție a nocicepției de 52.95% care s-a menținut în jurul acestei valori la 90, 120 minute.
Figura 5.8. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-DOX prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.12. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – doxepină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 1.82 ± 0.36 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.282. Valorile obținute demonstrează sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție cu stimul termic. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă demonstrează sinergismul combinației CND-DOX (Figura 5.8.) pentru secvențele de doze (Zadd = 7.74 ± 0.92 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.931, p2 = 0.06au 9). Parametrii statistici ai analizei de regresie se regăsesc în tabelul 5.12.
5.3.1.3. Asociere Candesartan – Clomipramină
5.3.1.3.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1. Descrierea protocolului experimental fost efectuată la capitolul 5.3.1.1.1., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. iar valoarea DE50 a candesartanului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.1.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, clomipramină (CLM) 0.37 – 1.50 mg/kg și asocierea acestora 0.07 – 0.60 mg/kg (Tabel 5.13.)
Clomipramina a demonstrat efect antinociceptiv la pentru nivelul de activitate de 50% pentru pentru faza a doua a testului. Datele obținute au permis determinarea valorii DE50 pentru modelul experimental cu stimul nociceptiv formalină (Tabel 5.14.)
Valorile determinate au fost utilizate la stabilirea perechilor de doze care s-au administrat pentru demonstrarea valorilor Zadd și Zmix.
Tabel 5.13. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.9. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-CLM prin testul la formalină
(timp de evaluare 5 minute)
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.16 ± 0.02 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0,271 (timp de evaluare 5 minute).
Rezultatele finale ale combinației au demonstrat un procent de inhibiție de 54.47%. Parametrii cantitativi ai analizei de regresie au demonstrat semnificația statistică a rezultatelor atât pentru faza 1 (timp de evaluare 5 minute) (Tabel 5.14.) cât și pentru faza a doua a testului (timp de evaluare 10 minute) (Tabel 5.15.).
Combinația binară CND-CLM s-a dovedit a fi sinergică și este demonstrată prin deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.9.) pentru secvențele de doze (Zadd = 0.59 ± 0.05 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.734, p2 = 0.266).
Analizând datele obținute pentru faza a doua a testului cu formalină (timp de evaluare 10 minute), s-au constatat următoarele: Zmix = 0.20 ± 0.04 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.338 (timp de evaluare 10 minute) (Tabel 5.15.).
Tabel 5.14. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – clomipramină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie (timp de evaluare 5 minute)
Figura 5.10 Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-CLM prin testul la formalină (timp de evaluare 10 minute)
Procentul de inhibiție a nocicepției pentru faza II a testului cu formalină a fost de 50.54%.
Combinația binară în proporție fixă CND-CLM s-a dovedit a fi sinergică pentru faza a doua a testului cu formalină (timp de evaluare 10 minute) și este demonstrată prin deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.10.) pentru secvențele de doze (Zadd = 0.59 ± 0.05 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.734, p2 = 0.266). Parametrii cantitativi ai analizei de regresie au demonstrat semnificația statistică a rezultatelor (Tabel 5.15.)
Tabel 5.15. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – clomipramină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie (timp de evaluare 10 minute)
Analizând datele obținute pentru cele două faze ale testului (procentul de inhibiție a nocicepției, valorile Zmix și ale parametrului γ) constatăm că tăria sinergismului este mai pronunțată pentru faza I a testului (γ Faza I < γ Faza II).
5.3.1.3.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. iar valoarea DE50 a CND pentru modelul de nocicepție a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.2.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, clomipramină 0.18 – 3.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.35 – 1.41 mg/kg (Tabel 5.16.).
Tabel 5.16. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Efectul antinociceptiv maxim posibil al clomipraminei a fost EMP = 66.67 % pentru doza de 3.00 mg/kg (Tabel 5.16.). Datele obținute au demonstrat valoarea DE50 pentru clomipramină (Tabel 5.17.).
Valorile DE50 obținute au fost utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației în proporție fixă și determinarea valorilor Zadd și Zmix.
Figura 5.11. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-CLM prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.17. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – clomipramină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Valorile Zmix = 1.26 ± 0.40 mg/kg și index de interacțiune γ = 0.893 sugerează o interacțiune de tip aditiv. Alura dreptei de regresie a combinației CND-CLM și deplasarea acestea la dreapta față de dreapta aditivă compusă sugerează mai curând o interacțiune de tip antagonic (Figura 5.11.). Analizând înregistrările din tabelele 5.16. și 5.17. se observă o inhibiție importantă a procesului nociceptiv. Astfel, am procedat (în acord cu metodologia) la modificarea raportului între doze menținând doza de clomipramină constantă în timp ce doza de candesartan a variat în progresie geometrică. Raportul CLM:CND – 1.00: 0.25 a dus la o valoare EMP = 66.67% (Tabel 5.18.). S-au stabilit perechi de doze care s-au administrat pentru determinarea valorilor Zadd și Zmix.
Analiza statistică a datelor obținute (testul F) și alura dreptei de regresie a combinației CLM-CND față de dreapta de regresie a clomipraminei (Figura 5.12.) susține interacțiunea de tip antagonic între cele două substanțe pentru secvența de doze studiată CLM – CND 0.5 – 0.36 mg/kg (Tabel 5.19.).
Tabel 5.18. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CLM-CND (modificarea raportului între doze) și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.12. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CLM-CND (raport 1:0.25) prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.19. Evaluarea antinocicepției combinației fixe clomipramină – candesartan (raport 1:0.25) prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.1.3.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.3., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. iar valoarea DE50 a candesartanului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.3.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-10 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.50 – 2.00 mg/kg, clomipramină 0.37 – 0.75 mg/kg și asocierea acestora 0.10 – 0.78 mg/kg (Tabel 5.20.).
Efectul antinociceptiv maxim posibil al clomipraminei în administrare singură a fost EMP% = 64.03% la 60 minute pentru doza 0.75 mg/kg. Datele înregistrate au permis determinarea valorilor DE50 (Tabel 5.21.). Valorile DE50 obținute pentru ambele substanțe au fost utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației candesartan – clomipramină pentru determinarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.21 Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.13. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-CLM prin testul plăcii încălzite
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.38 ± 0.29 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.427.
Deși dreapta de regresie a combinației CLM – CND este deplasată către stânga față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.13.), parametrii cantitativi ai analizei de regresie nu susțin semnificația statistică a rezultatelor obținute pentru nivelul de activitate de 50 % (Tabel 5.21.) cu utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 0.78 ± 0.07 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.688, p2 = 0.312).
Tabel 5.21. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – clomipramină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.1.4. Asociere Candesartan – Nortriptilină
5.3.1.4.1. Testul la Formalină
Testul s-a realizat pe șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1., procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1., descrierea protocolului experimental efectuată la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 a candesartanului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.1.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, nortiptilină (NTR) 0.5 – 2.00 mg/kg și asocierea acestora 0.08 – 0.60 mg/kg (Tabel 5.22.).
Nortriptilina a demonstrat efect antinociceptiv pentru nivelul de activitate de 50% pentru prima fază a testului (timp de evaluare 5 minute) (Tabel 5.22.). Datele obținute au permis determinarea valorii DE50 pentru modelul experimental cu stimul nociceptiv formalina (tabel 5.23.)
Valorile determinate au fost utilizate la stabilirea perechilor de doze care s-au administrat pentru demonstrarea valorilor Zadd și Zmix.
Tabel 5.22. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.13 ± 0.03 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.175.
Figura 5.14. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-NTR prin testul la formalină
Tabel 5.23. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – nortriptilină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie (timp de evaluare 5 minute)
Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă pune în evidență interacțiunea de tip sinergic între cele două substanțe (Figura 5.14.) pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 0.57 ± 0.06 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.721, p2 = 0.279). Semnificația statistică a rezultatelor se regăsește în tabelul 5.23.
5.3.1.4.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.2., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. iar valoarea DE50 a CND pentru acest model de nocicepție a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.2.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.25 – 2.00 mg/kg, nortriptilină 0.25- 2,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.12 – 0.98 mg/kg (Tabel 5.24).
Tabel 5.24. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.15. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-NTR prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.25. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – nortriptilină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Nortriptilina a demonstrat activitate antinociceptivă pentru nivelul de activitate de 50 % (Tabel 5.25). Valorile obținute s-au utilizat la constituirea perechilor de doze pentru determinarea valorilor Zadd și Zmix.
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.45 ± 0.10 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.562.
Deși dreapta de regresie a combinației este deplasată la stânga față de dreapta adtivă compusă (Figura 5.15.), parametrii statistici ai analizei de regresie nu pun în evidență semnificația statistică a datelor obținute pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 0.98 ± 0.20 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.691, p2 = 0.309) (Tabel 5.25.)
5.3.1.4.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 a candesartanului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.3.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 – 10 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: candesartan 0.50 – 2.00 mg/kg, nortriptilină 0.25 – 2.00 mg/kg și asocierea acestora 0.09 – 0.76 mg/kg (Tabel 5.26.). Efectul antinociceptiv maxim posibil al NTR în administrare singură a fost EMP% = 63.24% la 60 minute pentru doza 2.00 mg/kg (Tabel 5.26.). Datele înregistrate au permis determinarea valorilor DE50 (Tabel 5.27). Valorile DE50 obținute pentru ambele substanțe au fost utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației CND – NTR pentru determinarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.26. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CND-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.16. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CND-NTR prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.27. Evaluarea antinocicepției combinației fixe candesartan – nortriptilină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.44 ± 0.09 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.578.
Dreapta de regresie a combinației este deplasată la stânga față de dreapta față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.16.) dar parametrii statistici ai analizei de regresie nu pun în evidență semnificația statistică a datelor obținute pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 0.76 ± 0.07 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.662, p2 = 0.338) (Tabel 5.27.)
5.3.2. ASOCIERI CAPTOPRIL-MEDICAMENTE CO-ANALGEZICE ȘI AINS
5.3.2.1. Asociere Captopril – Ibuprofen
5.3.2.1.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1.
Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 pentru ibuprofen a fost determinată la capitolul 5.3.1.1.1.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril (CPL) 0.78 – 6.25 mg/kg, ibuprofen 12,50 – 100,00 mg/kg și asocierea acestora 1.93 – 15.46 mg/kg (Tabel 5.28.).
Captoprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru ambele faze ale testului cu formalină pentru secvența de doze luată în studiu. Valoarea DE50 pentru faza I se regăsește în tabelul 5.28.
Perechile de doze stabilite au condus la determinarea valorii Zadd dar rezultatele înregistrate în tabelul 5.29 nu au demonstrat o valoare Zmix a combinației. Imposibilitatea determinării acesteia au dus la imposibilitatea aprecierii tipului de interacțiune.
Tabel 5.28. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL – IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.29. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – ibuprofen prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie (timp de evaluare 5 minute)
5.3.2.1.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 a IB pentru acest model de nocicepție a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 1.50 – 25.00 mg/kg, ibuprofen 12.50 – 100,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 2.12 – 17.75 mg/kg (Tabel 5.30.).
Tabel 5.30. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Captoprilul a demonstrat activitate antinociceptivă pentru nivelul de activitate de 50 % (Tabel 5.31.). Valorile obținute s-au utilizat la constituirea perechilor de doze pentru determinarea valorilor Zadd și Zmix.
Figura 5.17. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL-IB prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.31. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – ibuprofen prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 7.50 ± 1.31 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.422.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.17.) și parametrii statistici ai analizei de regresie pun în evidență semnificația statistică (Tabel 5.31.). a datelor obținute pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 17.75 ± 0.09 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.832, p2 = 0.168).
5.3.2.1.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1.
Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. iar valoarea DE50 a ibuprofenului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.3.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 -10 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 3.12 – 12.50 mg/kg, ibuprofen 30.00 – 120.00 mg/kg și asocierea acestora 8.42 – 33.69 mg/kg (Tabel 5.32.).
Captoprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă la timpul de expunere de 60 minute (Tabel 5.33.). Valorile DE50 obținute pentru ambele substanțe au fost utilizate pentru realizarea perechilor de doze ale combinației CPL – IB pentru determinarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.32. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 38.03 ± 19.42 mg/kg, Zmix > Zadd, index de interacțiune γ = 1.128.
Figura 5.18. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL – IB prin testul plăcii încălzite
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.18) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Testul F) sugerează o interacțiune de tip aditiv pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 33.69 ± 2.47 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.898, p2 = 0.102) (Tabel 5.33.) la timpul de expunere de 60 minute. Analiza statistică completă nu demonstrează aditivitatea pentru nivelul de activitate studiat. Procentul de inhibiție nociceptivă se poate atribui acțiunii analgezice a ibuprofenului.
Tabel 5.33. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – ibuprofen prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.2.2. Asociere Captopril – Doxepină
5.3.2.2.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 a captoprilului a fost demonstrată la capitolul 5.3.2.1.1.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 0.78 – 6.25 mg/kg, doxepină 2.50 – 20.00 mg/kg și combinația acestora 0.37-3.00 mg/kg (Tabel 5.34). Raportul Captopril – Doxepină 1:0.75 a înregistrat valorile EMP% = 66.07% (faza I), 51.12% (faza II) ceea ce a permis stabilirea perechilor de doze pentru demonstrarea valorii Zadd și Zmix.
Tabel 5.34. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL – DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Perechile de doze administrate au demonstrat o inhibiție a procesului nociceptiv pentru ambele faze ale testului (Tabel 5.35.).
Figura 5.19. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL – DOX prin testul la formalină
Tabel 5.35. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – doxepină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
În urma analizei de regresie s-au obținut următoarele date: Zmix = 0.36 ± 0.01 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ =0.262. Valorile obținute demonstrează sinergismul combinației pentru modelul de nocicepție cu stimul chimic formalină 5%.
Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta de regresie a captoprilului demonstrează sinergismul combinației CPL-DOX (Figura 5.19) pentru secvențele de doze (Zadd = 1.37 ± 0.36 mg/kg) și proporția luată în studiu (f = 0.5, p1 = 0.759). Parametrii statistici ai analizei de regresie se regăsesc în tabelul 5.35.
5.3.2.2.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2., modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2., valoarea DE50 a captoprilului pentru acest model de nocicepție a fost demonstrată la capitolul 5.3.2.1.2. iar valoarea DE50 a doxepinei capitolul 5.3.1.2.2
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 1.50 – 25.00 mg/kg, doxepină 2.50- 20,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 1.78 – 7.12 mg/kg (Tabel 5.36).
Tabel 5.36. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.20. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL-DOX prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.37. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – doxepină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Perechile de doze administrate au permis determinarea valorii Zadd și Zmix (Tabel 5.37). Aspectul deplasării dreptei de regresie a combinației sugerează o interacțiune de tip antagonic. Analiza dreptei de regresie a combinației și parametrii statistici cantitativi ai analizei de regresie nu pun în evidență semnificația datelor obținute (Figura 5.20.).
5.3.2.2.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Valoarea DE50 ale captoprilului a fost demonstrată la capitolul 5.3.2.1.3, valoarea DE50 a doxepinei a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.2.3.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 3.12 – 12.50 mg/kg, doxepină 5.00 – 20.00 mg/kg și asocierea acestora 1.33 – 10.70 mg/kg (Tabel 5.38.).
Perechile de doze au fost utilizate pentru realizarea determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației CPL-DOX.
Tabel 5.38. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CP – DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.21. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL – DOX prin testul plăcii încălzite
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 6.52 ± 1.26 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.609.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.21) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Testul F) sugerează o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 10.70 ± 1.07 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.678, p2 = 0.322) la timpul de expunere de 90 minute. Analiza statistică completă nu demonstrează sinergismul pentru nivelul de activitate studiat (Tabel 5.39).
Tabel 5.39. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – doxepină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.2.3. Asociere Captopril – Clomipramină
5.3.2.3.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. Valorile DE50 pentru captopril și clomipramină au fost determinate la capitolele 5.3.2.1.1, respectiv 5.3.1.3.1.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 0.78 – 6.25 mg/kg, clomipramină 0.37 – 1.50 mg/kg și combinația acestora 0.50 – 2.00 mg/kg (tabel 5.40). Substanțele de administrat singure sau în combinație au fost preparate ex tempore prin suspendarea în CMC-Na – 0,1%. Acestea au fost utilizate pentru stabilirea perechilor de doze în vederea determinării valorilor Zadd și Zmix (tabel 5.41)
Tabel 5.40. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL – CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.41. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – clomipramină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Perechile de doze stabilite au condus la determinarea valorii Zadd, rezultatele înregistrate în tabelul 5.40 nu au demonstrat o valoare Zmix a combinației (Tabel 5.41.). Nu
s-a putut preciza tipului de interacțiune între cei doi compuși.
5.3.2.3.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1, protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 1.50 – 25.00 mg/kg, clomipramină 0.18 – 3.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.48 – 3.81 mg/kg (Tabel 5.42.).
Valorile DE50 ale captoprilului și clomipraminei au fost determinate la 5.3.2.1.2, respectiv, 5.3.1.1.2. Acestea au fost utilizate pentru determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.43.).
Tabel 5.42. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 7.00 ± 7.22 mg/kg, Zmix > Zadd, index de interacțiune γ = 1.81.
Figura 5.22. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL-CLM prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.43. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – clomipramină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.22) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Testul F) sugerează o interacțiune de tip antagonic pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 3.85 ± 1.14 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.804, p2 = 0.196) (Tabel 5.43.) Pentru clarificarea acestor rezultate în acord cu metodologia de studiu am procedat la modificarea raportului dintre doze între cei doi compuși. Raportul CLM-CPL 1:38 a demonstrat acțiune antinociceptivă. S-au stabilit perechi de doze care au fost administrate pentru determinarea valorii Zadd și Zmix (Tabel 5.44).
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.96 ± 0.20 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.116.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta de regresie a clomipraminei (Figura 5.23.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.45.) pun în evidență semnificația statistică a datelor obținute pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 8.27 ± 3.04 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.750, p2 = 0.250).
Tabel 5.44. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CLM-CPL (prin modificarea raportului între doze) și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.23 Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CLM – CPL prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.45. Evaluarea antinocicepției combinației fixe clomipramină – captopril prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.2.3.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 3.12 – 12.50 mg/kg, clomipramină 0.18 – 0.75 mg/kg și asocierea acestora 0.46 – 3.68 mg/kg (Tabel 5.46.). Valorile DE50 ale captoprilului și clomipraminei au fost demonstrate la capitolul 5.3.2.1.3, respectiv 5.3.1.1.3. Perechile de doze au fost utilizate pentru realizarea determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației CPL-CLM.
Tabel 5.46. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.24. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CP – CLM prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.47. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – clomipramină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 1.03 ± 0.06 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.280. Deplasarea la stânga a dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.24.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.47.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 3.68 ± 0.26 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.678, p2 = 0.322) la timpul de expunere de 30 minute.
5.3.2.4. Asociere Captopril – Nortriptilină
5.3.2.4.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. Valorile DE50 ale captoprilului și nortriptilinei au fost demonstrate la capitolul 5.3.2.1.1., respectiv 5.3.1.4.1. S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 0.78 – 6.25 mg/kg, nortriptilină 0,50 – 2,00 mg/kg și combinația acestora 0.48 -1.90 mg/kg (Tabel 5.48.).
Tabel 5.48. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.49. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – nortriptilină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Raportul Captopril – doxepină 1:0.75 a înregistrat o valoare EMP% = 66.07% (faza I), 51.12% (faza II) ceea ce a permis stabilirea perechilor de doze pentru demonstrarea valorii Zadd și Zmix. Perechile de doze administrate au demonstrat o inhibiție a procesului nociceptiv pentru ambele faze ale testului (Tabel 5.48.) și au condus la determinarea valorii Zadd, dar rezultatele înregistrate în tabelul 5.48 nu au demonstrat o valoare Zmix a combinației (Tabel 5.49.). Nu s-a putut preciza tipului de interacțiune între cei doi compuși.
5.3.2.4.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 1.50 – 25.00 mg/kg, nortriptilină 0.25- 2,00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.42 – 3.38 mg/kg (Tabel 5.50.).
Valorile DE50 ale captoprilului și nortriptilinei au fost demonstrate la capitolul 5.3.2.1.2, respectiv 5.3.1.4.2. Perechile de doze administrate au dus la determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.51.)
Tabel 5.50 Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.25. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL-NTR prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.51. Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – nortriptilină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.92 ± 0.22 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.272.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.25.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.51) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze (Zadd = 3.38 ± 0.81 mg/kg) și a proporției luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.910, p2 = 0.090).
5.3.2.4.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Valorile DE50 ale captoprilului și nortriptilinei au fost determinate la capitolul 5.3.2.1.3, respectiv 5.3.1.4.3.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 – 10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: captopril 3.12 – 12.50 mg/kg, nortriptilină 0.25 – 2.00 mg/kg și asocierea acestora 0.43 – 3.51 mg/kg (Tabel 5.52.). Perechile de doze au fost utilizate pentru realizarea determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației CPL – NTR (Tabel 5.52, 5.53.).
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 1.13 ± 0.15 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.317.
Tabel 5.52. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CPL-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.26 Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CPL – NTR prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.53 Evaluarea antinocicepției combinației fixe captopril – nortriptilină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.26.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.53.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 3.56 ± 0.30 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.927, p2 = 0.073) la timpul de expunere de 90 minute.
5.3.3. ASOCIERI RAMIPRIL – MEDICAMENTE CO-ANALGEZICE ȘI AINS
5.3.3.1. Asociere Ramipril – Ibuprofen
5.3.3.1.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv a fost descrisă la capitolul 5.2.5.2. S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril (RML) 0.25 – 2.00 mg/kg, ibuprofen 12,50 – 100,00 mg/kg și combinația acestora 0.99 – 7.97 mg/kg (Tabel 5.48.). Valoarea DE50 a ibuprofenului a fost determinată la capitolul 5.3.1.1.1. Ramiprilul a prezentat acțiune antinociceptivă pentru prima fază a testului (timp de evaluare 5 minute), doza de 2 mg/kg înregistrând o valoare EMP = 82.97 %.
Tabel 5.54. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML – IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.55. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – ibuprofen prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Perechile de doze stabilite au condus la determinarea valorii Zadd = 7.93 ± 0.88 mg/kg, dar rezultatele înregistrate în tabelul 5.54. nu au demonstrat o valoare Zmix a combinației (Tabel 5.55.). Nu s-a putut preciza tipul de interacțiune între cei doi compuși.
5.3.3.1.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: Ramipril 0.50 – 4.00 mg/kg, Ibuprofen 12.50 – 100.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 4.08 – 16.35 mg/kg (Tabel 5.56.).
Valoarea DE50 a ibuprofenuui a fost determinată la capitolul 5.3.1.1.2. Ramiprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă realizând o valoare EMP% = 66,67% pentru doza de 4.00 mg. Perechile de doze administrate au dus la determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.56., 5.57.).
Tabel 5.56. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML – IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.27. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML-IB prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.57. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – ibuprofen prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 13.23 ± 2.54 mg/kg, Zmix > Zadd, index de interacțiune γ = 10.933 (Tabel 5.57.).
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.27.) și valoarea foarte mare a intexului de interacțiune pun în evidență o interacțiune de tip antagonic.
5.3.3.1.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, ibuprofen 30.00 – 120.00 mg/kg și asocierea acestora 3.65 – 29.22 mg/kg (Tabel 5.58.).
Valoarea DE50 ale ibuprofenului a fost demonstrată la capitolul 5.3.1.1.3. Ramiprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru timpul de expunere la stimulul termic de 90 minute.
Tabel 5.58. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-IB și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.28. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML – IB prin testul plăcii încălzite
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 7.31 ± 0.86 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.247. Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.28.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.59.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 7.31 ± 0.86 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.989, p2 = 0.011) pentru timpul de expunere de 90 minute.
Tabel 5.59. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – ibuprofen prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.3.2. Asociere Ramipril – Doxepină
5.3.3.2.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, doxepină 2,50 – 20,00 mg/kg și combinația acestora 0.1 – 1,4 mg/kg (Tabel 5.60.).
Valoarea DE50 a ramiprilului a fost determinată la capitolul 5.3.3.1.1. Perechile de doze administrate au demonstrat o inhibiție a procesului nociceptiv pentru ambele faze ale testului (Tabel 5.60.) în raport de 1:2.5 (RML:DOX).
Tabel 5.60. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML – DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Perechile de doze stabilite au condus la determinarea valorii Zadd = 1.40 ± 0.24 mg/kg, Rezultatele obținute in tabelul 5.60. nu au demonstrat o valoare Zmix a combinației (Tabel 5.61.). Nu s-a putut preciza tipul de interacțiune între cei doi compuși.
Tabel 5.61. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – doxepină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
5.3.3.2.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: Ramipril 0.50 – 4.00 mg/kg, doxepină 2.50 – 20.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.64 – 5.15 mg/kg (Tabel 5.62.).
Tabel 5.62. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.29. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML – DOX prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Valorile DE50 ale ramiprilului și doxepinei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.2., respectiv 5.3.1.2.2. Perechile de doze administrate au dus la determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.62., 5.63.)
Tabel 5.63. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – doxepină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Parametrii cantitativi ai analizei de regresie nu pun în evidență semnificația statistică a datelor obținute (Figura 5.29., Tabel 5.63.).
5.3.3.2.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale au fost în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-8-10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, doxepină 5.00 – 20.00 mg/kg și asocierea acestora 0.96 – 7.74 mg/kg (Tabel 5.64.).
Valorile DE50 ale ramiprilului și doxepinei au fost demonstrate la capitolul 5.3.3.1.3., respectiv 5.3.1.1.3. Perechile de doze au fost utilizate pentru realizarea determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației RML-DOX (Tabel 5.64.,5.65.)
Tabel 5.64. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-DOX și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.30. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML-DOX prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.65. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – doxepină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 1.82 ± 0.36 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.240. Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.30.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.65.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 7.57 ± 1.02 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.956, p2 = 0.044) pentru timpul de expunere de 60 minute.
5.3.3.3. Asociere Ramipril – Clomipramină
5.3.3.3.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, clomipramină 0.37-1.5 mg/kg și combinația acestora 0.16 – 0.66 mg/kg (Tabel 5.67.). Valorile DE50 ale ramiprilului și clomipraminei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.1., respectiv 5.3.1.3.1. Perechile de doze au fost utilizate pentru determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.67., 5.68.)
Tabel 5.67. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML – CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.68. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – clomipramină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Parametrii cantitativi ai analizei de regresie nu pun în evidență semnificația statistică a datelor obținute (Tabel 5.68.) pentru nici una din cele doua faze ale modelului de nocicepție studiat..
5.3.3.3.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: Ramipril 0.50 – 4.00 mg/kg, clomipramină 0.18 – 3.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.22 – 1.80 mg/kg (Tabel 5.69.). Valorile DE50 ale ramiprilului și clomipraminei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.2., respectiv 5.3.1.3.2. Perechile de doze administrate au fost utilizate la determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.69., 5.70.)
Tabel 5.69. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML – CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.31. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML – CLM prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.70. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – clomipramină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Parametrii statsitici ai analizei de regresie nu au pus în evidență semnificația rezultatelor obținute pentru secvența de doze utilizată Zadd = 1.80 ± 0.53 mg/kg (f = 0.5, p1 = 0.589, p2 = 0.411). Având în vedere aspectul dreptei de regresie al combinației, în acord cu metodologia am utilizat o alta secvență de doze prin modificarea raportului dintre acestea (Tabel 5.71.).
Raportul CLM:RML 1:2 a demonstrat acțiune antinociceptivă (Tabel 5.71.) cu o valoare EMP% = 66.67%.
Tabel 5.71. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe CLM – RML și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.32. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă CLM – RML prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.72. Evaluarea antinocicepției combinației fixe clomipramină – ramipril prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.84 ± 0.21 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.150.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta de regresie a clomipraminei (Figura 5.32.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.72.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic între cele două substanțe pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 5.57 ± 2.90 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.390, p2 = 0.610).
5.3.3.3.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 – 10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, clomipramină 0.18 – 0.75 mg/kg și asocierea acestora 0.07 – 0.56 mg/kg (Tabel 5.73.).
Valorile DE50 ale ramiprilului și clomipraminei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.3. respectiv 5.3.1.3.3. Perechile de doze au fost utilizate pentru determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației RML – CML.
Tabel 5.73. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-CLM și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.33. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML-CLM prin testul plăcii încălzite
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.13 ± 0.03 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.242.
Tabel 5.74. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – clomipramină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta de regresie a clomipraminei (Figura 5.33.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.74.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic între cele două substanțe pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 0.57 ± 0.07 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.570, p2 = 0.422) timpul de lucru de 30 minute.
5.3.3.4. Asociere Ramipril – Nortriptilină
5.3.3.4.1. Testul la Formalină
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.1 iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. S-au realizat grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, care au fost tratate cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, nortriptilină 0.50 – 2.00 mg/kg și combinația acestora 0.16 – 064 mg/kg (Tabel 5.75.).
Valorile DE50 ale ramiprilului și nortriptilinei au fost demonstrate la capitolul 5.3.3.3.1., respectiv 5.3.1.4.1.
Tabel 5.75. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Tabel 5.76. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – nortriptilină prin testul cu formalină și parametrii statistici ai analizei de regresie
Parametrii statistici ai analizei de regresie nu au pus în evidență semnificația rezultatelor obținute pentru secvența de doze utilizată Zadd = 0.63 ± 0.05 mg/kg (f = 0.5, p1 = 0.646, p2 = 0.354) (Tabel 5.76.).
5.3.3.4.2. Testul Răspunsului constrictiv abdominal
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale s-au desfășurat în acord cu normele de bioetică descrise la capitolul 5.2.1. Protocolul experimental a fost descris la capitolul 5.3.1.1.2. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2.
Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 25.00 și 25.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: Ramipril 0.50 – 4.00 mg/kg, nortriptilină 0.25 – 2.00 mg/kg și combinația fixă a acestora 0.17 – 1.39 mg/kg (Tabel 5.77.).
Valorile DE50 ale ramiprilului și nortriptilinei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.2., respectiv 5.3.1.4.2. Perechile de doze administrate au fost utilizate la determinarea valorilor Zadd și Zmix (Tabel 5.77., 5.78.)
Tabel 5.77. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.34. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML-NTR prin testul răspunsului constrictiv abdominal
Tabel 5.78. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – nortriptilină prin testul răspunsului constrictiv abdominal și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.39 ± 0.09 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.280.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta aditivă compusă (Figura 5.34.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.78.) pun în evidență o interacțiune de tip sinergic între cele două substanțe pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 1.39 ± 0.09 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.780, p2 = 0.220).
5.3.3.4.3. Testul plăcii încălzite (Hot plate test)
Pentru realizarea acestui test s-au utilizat șoareci albi masculi Swiss, menținuți în condițiile de habitat descrise la capitolul 4.2.1. Procedeele experimentale în acord cu normele de bioetică au fost descrise la capitolul 5.2.1., protocolul experimental la capitolul 5.3.1.1.3. iar modalitatea de calcul a procentului antinociceptiv la capitolul 5.2.5.2. Grupe de șoareci cu greutatea 20.00 – 30.00 g cu o repartiție de 6-10 animale/grup, au fost tratate pe cale orală cu secvențe de doze administrate în progresie geometrică după cum urmează: ramipril 0.25 – 2.00 mg/kg, nortriptilină 0.25 – 2.00 mg/kg și asocierea acestora 0.07 – 0.60 mg/kg (Tabel 5.79.). Valorile DE50 ale ramiprilului și nortriptilinei au fost determinate la capitolul 5.3.3.1.3, respectiv 5.3.1.4.3. Perechile de doze au fost utilizate pentru realizarea determinarea valorii Zadd și Zmix a combinației RML – NTR.
Tabel 5.79. Seriile de doze utilizate pentru studiul combinației fixe RML-NTR și efectul înregistrat prin administrarea acestora
Figura 5.35. Analiza dreptelor de regresie pentru combinația fixă RML-NTR prin testul plăcii încălzite
Tabel 5.80. Evaluarea antinocicepției combinației fixe ramipril – nortriptilină prin testul plăcii încălzite și parametrii statistici ai analizei de regresie
Analiza dreptelor de regresie a pus în evidență următoarele date: Zmix = 0.21 ± 0.02 mg/kg, Zmix < Zadd, index de interacțiune γ = 0.360.
Aspectul dreptei de regresie a combinației față de dreapta dreapta aditivă compusă (Figura 5.35.) și parametrii statistici ai analizei de regresie (Tabel 5.80.) pun în evidență interacțiunea de tip sinergic între cele două substanțe pentru utilizarea secvențelor de doze utilizată (Zadd = 0.60 ± 0.06 mg/kg) și proporțiile luate în studiu (f = 0.5, p1 = 0.549, p2 = 0.451).
5.4. DISCUȚII
5.4.1.Asocieri Candesartan-Medicamente co-analgezice și AINS
Asociere candesartan-ibuprofen
Pentru testul cu formalină ambele substanțe și-au demonstrat acțiunea antinociceptivă după cum urmează: candesartanul a avut efect antinociceptiv pentru prima fază a testului (timp de evaluare 5 minute) în timp ce ibuprofenul a prezentat acțiune antinociceptivă pentru ambele faze. Aceste date pot explica acțiunea analgezică a candesartanului. Pentru ibuprofen sunt cunoscute cele două acțiuni caracteristice analgezică și antiinflamatoare, acest medicament fiind utilizat în stările algice cu sau fără fenomene inflamatorii. Totuși, în literatura de specialitate pentru testul la formalină nu s-a raportat o valoare DE50 la șoarece pentru candesartan. Pentru ibuprofen literatura de specialitate descrie două valori DE50 pentru fiecare fază a testului cu formalină pentru un model de evaluare a durerii orofaciale (353) prin metodologie de analiză izobolară.
Combinația fixă candesartan – ibuprofen s-a dovedit a fi sinergică și a inhibat procesul nociceptiv cu 48.72% pentru prima fază a testului. Datele obținute demonstrează utilitatea acestei combinații în procesele algice acute. Ibuprofenul este cel mai frecvent folosit și mai frecvent prescris AINS. Este un inhibitor ne-selectiv al ciclooxigenazei 1 și 2 și are un puternic rol antipiretic și analgezic, prin reducerea sintezei de prostaglandine inflamatorii din acid arahidonic. De asemenea, începând cu anii 2010, a început să fie folosit în profilaxia bolii Alzheimer și Parkinson, având în vedere componenta inflamatorie cerebrală ce este suspectată în majoritatea afecțiunilor neurodegenerative (354). Acest efect ar putea explica și sinergismul combinației fixe asupra percepției durerii, atât inflamatorii cât și non-inflamatorii, care a putut fi observat de-a lungul întregului studiu atât cu blocanții enzimei de conversie a angiotensinei cât și cu blocanții de receptori angiotensinergici AT1 .
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal ambele substanțe au demonstrat acțiune antinociceptivă. Combinația fixă candesartan – ibuprofen s-a dovedit a fi sinergică și a inhibat procesul nociceptiv cu 70.83%. Literatura de specialitate nu a raportat o valoare DE50 pentru candesartan, pentru testul răspunsului constrictiv abdominal indus cu Zymosan A.
Pentru testul plăcii încălzite ambele substanțe au demonstrat acțiune antinociceptivă. Candesartanul a avut un efect antinociceptiv relevant la timpul de testare 90 minute în timp ce ibuprofenul a prezentat efect începând cu primul timp de testare (30 minute). Acțiunea ibuprofenului s-a menținut pe toată perioada experimentului (60, 90, 120 minute). Literatura de specialitate nu raportează studii care să pună în evidență valoarea DE50 a candesartanului pentru testul plăcii încălzite la temperatura de 52.5șC.
Combinația candesartan-ibuprofen s-a dovedit a fi sinergică pentru timpul de evaluare de 60 minute și a produs o inhibiție a procesului nociceptiv cu 54.39%.
Combinațiile fixe candesartan-ibuprofen au fost sinergice pentru bateria de teste utilizată în acest studiu.
Din cele prezentate mai sus putem observa că pe toate modelele de durere luate în studiu, combinația ibuprofen-candesartan a fost antalgică într-un mod sinergic, ceea ce dovedește, conform definiției sinergismului, că mecanismele farmacodinamice prin care acționează cele 2 substanțe sunt diferite.
Conform datelor prezentate în capitolul introductiv, angiotensina II are un efect proalgezic pe o multitudine de modele de durere (cap.3.6.), toate efectele fiind însă reduse de co-administrarea de BRA (în speță mai ales de losartan, folosit mai frecvent). Candesartanul este folosit mult mai rar în teste ce implică durerea, de aceea și lipsa de studii sistematice din acest domeniu. Animalele prezintă hiperalgezie la rece, alodinie pe modele de durere neuropată, pe testul tail-flick și formalină.
Candesartanul reduce efectele pro-inflamatorii ale angiotensinei II, reduce reglarea pozitivă a TNF indusă de angiotensină II, reduce-efectele prooxidante ale acesteia.
Ibuprofenul, prin efectele sale antiinflamatorii, ar putea contribui la reducerea percepției dureroase determinate de efectele proinflamatoare ale angiotensinei II, și mai reduse prin co-administrarea de candesartan. De asemenea, candesartanul are o foarte bună penetrare a barierei hematoencefalice (BHE), ceea ce ar putea îmbunătăți efectele analgezice prin reducerea efectelor de iritație neurogenă (355). Pe de altă parte, cunoscute fiind efectele de inhibiție de către BRA a căii MAPK, este posibil ca măcar parțial sinergismul să se datoreze și efectului similar al AINS, care s-a dovedit la rândul său un inhibitor ai căii MAPK și al NFKB (356).
Logica asocierii între blocanții de enzimă de conversie și a antiinflamatoarelor nesteroidiene este clară: cea mai mare parte a utilizatorilor de medicamente ce alterează metabolismul angiotensinei sunt persoane care au depășit o anumită vârstă, la care se asociază o serie de manifestări inflamatorii, mai ales articulare, care sunt tratate de obicei cu AINS. Conform literaturii, în vreme ce co-administrarea de BRA cu AINS nu are efecte semnificative asupra evoluției presiunii arteriale (357), efectul antihipertensivelor asupra percepției dureroase este mai puțin cunoscut, ceea ce justifică studiul de mai sus.
Asociere candesartan-doxepină
Conform literaturii de specialitate sunt cunoscute efectele antinociceptive ale doxepinei pe diferite modele de nocicepție însă, pentru testul la formalină, în studiul de față aceasta nu a demonstrat acțiune per se.
Totuși combinația fixă candesartan – doxepină a demonstrat un efect sinergic semnificativ statistic, efectul menținându-se pentru ambele faze ale testului. Inhibiția procesului nociceptiv a fost de 57,17% și 59,06%.
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal doxepina a demonstrat acțiune antinociceptivă realizând un efect maxim posibil comparabil cu al ibuprofenului pentru acest model de nocicepție. Combinația fixă candesartan – doxepină a fost sinergică, inhibiția procesului nociceptiv fiind de 54,16%.
Având în vedere efectele antiinflamatoare prezentate de doxepină, detaliate mai jos, precum și efectele de blocant ale canalelor de sodiu, este de înțeles de ce pentru testul la formalină, cu cel două faze ale sale, rezultatele au fost sinergice. Pe de o parte efectul analgezic asupra terminațiilor neuronilor din GRP, care se bazează pe canale de sodiu și pe ASIC (canale sensibile la protoni) pentru inițierea potențialelor de acțiune și pe de altă parte efectul antiinflamator pe două căi – reducerea citokinelor inflamatoare de către antidepresivul triciclic (chiar dacă pe testul la formalină nu a demonstrat valoare DE50 pentru secvența de doze luată în studiu) și inhibiția percepției dureroase prin reducerea percepției determinată de candesartan explică efectele sinergice, atât în cazul testului la formalină cât și în cazul răspunsului constrictiv abdominal.
În ceea ce privește testul plăcii încălzite, doxepina a demonstrat acțiune antinociceptivă gradată cuantificabilă pentru intervalul 60-120 minute. Combinația fixă candesartan-doxepină s-a dovedit a fi sinergică foarte semnificativ statistic cu o inhibiție a procesului nociceptiv de 52.95% care s-a menținut pentru intervalul de timp 60-120 minute.
În literatura de specialitate nu sunt raportate valori DE50 pentru modelul de nocicepție cu Zymosan și modelul cu stimul termic (testul plăcii încălzite). Există o singură raportare în literatură care include doxepina în determinări antinociceptive la șoarece însă aceasta nu demonstrează o valoare DE50 pentru testul plăcii încălzite (358).
Aceste rezultate ne fac să ne gândim la un mecanism farmacodinamic suplimentar care leagă mecanismele de acțiune ale acestor medicamente.
Receptorii AT1 sunt prezenți pe celulele nociceptive din ganglionul rădăcinii posterioare a nervului spinal și sunt implicați în percepția durerii (359). După ligatură nervului sciatic, receptorul AT1 a fost supra exprimat față de control la 43% din neuronii de mici dimensiuni și la 62% din neuronii de mari dimensiuni. Creșterea totală a neuronilor AT1-imunoreactivi a fost de 38% după 7 zile de ligatură. Toate aceste rezultate demonstrează că angiotensina II este implicată în mecanismele patologice ale durerii (360).
Bulbul ventrolateral caudal este una din structurile ce modulează percepția dureroasă, și există procente semnificative de neuroni cu imunoreactivitate pentru AT1, ce se proiectează în cornul posterior. Administrarea de angiotensină II a produs hiperalgezie atât pe testele tail-flick cât și pe cele cu formalină, hiperalgezie atenuată în mod semnificativ de administrarea concomitentă sistemică sau locală de losartan (184). Pe de altă parte, alte studii au demonstrat că administrarea de losartan inversează ritmul circadian de percepție a durerii, crescând percepția durerii în perioada nocturnă (3 am) și reducând-o în perioada diurnă (361). Pe un model de durere neuropată indus cu streptozotocină, Ogata și col (362) au demonstrat că alodinia tactilă este inhibată de administrarea intratecală de losartan, dar nu și de PD123319 (blocant specific de AT2), ceea ce demonstrează implicarea exclusivă, cel puțin la nivel medulo-bulbar, a receptorilor AT1.
În ceea ce privește considerentele practice, dozele de candesartan folosite au fost inferioare celor antihipertensive (363, 364).
Componenta cantitativă a mediației angiotensinergice, pe de o parte, și cea a mediației neurologice în care sunt implicate antidepresivele triciclice, cu diversele lor mecanisme, este foarte dificil de evaluat. Cu siguranță că, pe lângă efectele farmacodinamice luate în discuție, există și o multitudine de mecanisme farmacocinetice, de importanță redusă în sine, dar care se pot suma la diverse nivele și să altereze rezultatele în sensul reducerii sau creșterii semnificației statistice.
În ceea ce privește doxepinul, o serie de rezultate izolate demonstrează că are efecte interesante și încă neexplicate, de tipul analgeziei în aplicații locale (365-367). Studiile prezentate, au investigat efectul doxepinului și n-metil-doxepinului comparativ cu bupivacaina, și de asemeni, pe un model de voltage-clamp s-au evaluat efectele de blocant ale canalelor de Na ale acestora. Studiul a demonstrat că doxepinul este blocant de canale de Na+, mai puternic chiar decât bupivacaina. Aceste efecte ar putea fi responsabile pentru acțiunile benefice anti-pruriginoase, în nevralgia post-herpetică sau in mucozitele de iradiere post radioterapie (211, 368, 369).
În al doilea rând, efectele centrale ale sunt de inhibiție a recaptării noradrenalinei și a serotoninei, iar metabolitul său activ este desmetildoxepinul (nordoxepin). Un raport izolat prezintă și efectele inhibitoare ale doxepinului asupra Na+/K+ATP-azei neuronale din creierul fetal și de adult (370). Acest fenomen ar putea avea efecte de reducere a potențialului de repaus membranar neuronal, cu efecte încă neprecizate asupra reactivității neuronale. In plus, unii autori au propus efecte antiinflamatoare (371), mai ales prin reducerea eliberării de citokine proinflamatoare, precum IL-1β, IL6, TNF-α și IFN-γ (372).
În concluzie, efectele sinergice asupra percepției termoalgezice ale co-administrării de candesartan ca blocant al receptorului de tip AT1 și ale doxepinului, ca medicament cu multiple efecte neuronale periferice și centrale, ar putea fi explicate prin următoarele ipoteze:
Se cunoaște efectul pro-algezic al angiotensinei II la nivelul neuronilor GRP, a căilor medulare ascendente și al căilor bulbare ventro-mediale de propagare a senzației dureroase. Blocarea receptorilor angiotensinici la aceste nivele prin administrarea orală de candesartan produce reducerea percepției dureroase și explică prelungirea timpilor de răspuns la hot-plate;
Efectul de anestezic local al doxepinului (prin blocarea canalelor de Na+), înainte menționat, ar putea reduce intensitatea percepției la nivelul canalelor de tip Nav de la nivelul terminațiilor nervoase libere și a receptorilor termici, ceea ce se adaugă la efectul analgezic prezentat;
Efectele centrale la nivelul mediației serotoninergice și adrenergice ar putea fi la rândul lor responsabile pentru o reducere a impactului perceptiv și emoțional al stimulării dureroase, cu creșterea efectului analgezic.
La toate acestea, se pot adăuga multitudinea de alte efecte, precum asupra polarizării membranare neuronale și a eliberării de mediatori neurali inflamatori pronociceptivi ai doxepinului, ceea ce ar putea explica sinergismul combinației de față.
Asociere candesartan-clomipramină
Clomipramina a demonstrat efect antinociceptiv pentru faza a doua a testului iar combinația a fost sinergică demonstrabilă pentru ambele faze ale testului la formalină.
În ceea ce privește testul răspunsului constrictiv abdominal, clomipramina a demonstrat acțiune antinociceptivă însă combinația fixă candesartan – clomipramină nu a demonstrat semnificație statistică pentru efectul antinociceptiv.
Pentru testul plăcii încălzite clomipramina a demonstrat acțiune antinociceptivă dar combinația fixă dintre cele două substanțe nu a demonstrat semnificație statistică.
În literatura de specialitate (373) este cunoscut efectul antinociceptiv al clomipraminei pe modelul de nocicepție cu stimul termic și testul la formalină la șoarece dar nu sunt raportări pentru valori DE50 ale clomipraminei pentru testul răspunsului constrictiv abdominal indus prin Zymosan A.
Candesartanul are efecte analgezice, antioxidante, antiinflamatorii și de reducere a sintezei proteice induse de angiotensină ca neuromodulator, efecte prezentate mai sus.
Clomipramina este un inhibitor al recaptării serotoninice cu efecte analgezice încă puțin înțelese. Aceste efecte analgezice sunt explicate prezumtiv prin interacțiunea cu receptorii 5HT2 și 5HT3 (203), mai ales pe sensibilitatea termo-algezică și mecanică, cu mai puține efecte asupra durerii inflamatorii. Aceste date ar putea reprezenta explicația unei interacțiuni nesemnificative la testul răspunsului constrictiv abdominal. Pe de altă parte, cunoscută fiind mediația serotoninergică în percepția afectivă a durerii, aceasta ar putea explica efectele sinergice la testul cu formalină.
Studii recente au demonstrat că în interacțiunea durere-depresie intervine în mod esențial nucleul habenular lateral (NHL). Studii de mare anvergură au demonstrat că NHL este implicat în reglarea a nenumărate funcții, inclusiv ale stresului, durerii, cogniției, circuitelor de recompensă și a răspunsurilor emoționale. Investigații epidemiologice au demonstrat că 34%–66% din pacienții cu depresie au anumite grade de simptomatologie dureroasă, fie cu aspect alodinic, fie de tip hiperalgezic, iar antidepresivele triciclice au avut efecte foarte bune asupra acestor manifestări. Faptul că multe din manifestările dureroase pot fi de asemenea tratate cu placebo, demonstrează că durerea și emoția împărtășesc o serie de mecanisme neurobiologice comune, în care NHL este un jucător-cheie. În acest nucleu există o serie de neuroni activați de percepția dureroasă, care răspund la stimularea dureroasă nocivă prin creșterea frecvențelor de descărcare, iar stimulare acestora scade pragul de percepție dureroasă. Ca urmare, se crede că NHL are un rol esențial în reglarea durerii și mai ales a percepției emoționale a acesteia, iar aproximativ 73% din neuronii cu frecvență mare de descărcare au fost inhibați prin administrarea intraperitoneală de clomipramină. NHL este un reglator esențial al activității neuronilor serotoninergici din nucleul rafeului dorsal, iar inhibiția acestuia de către clomipramină poate explica efecte analgezice la nivelul testelor prezentate mai sus (374). Aceeași referință prezintă efecte analgezice pe testul cu formalină la șoareci, ceea ce poate explica sinergismul descrisă pentru ambele faze ale testului cu formalină.
În ceea ce privește testul constrictiv abdominal, acesta este un studiu asupra nocicepției viscerale indusă de factori inflamatori. Este posibil ca efectele clomipraminei asupra nucleului habenular să fie mai puțin implicate în percepția și efectele psihologice ale acestui tip de durere, deoarece căile durerii viscerale sunt diferite de cele ale percepției somatice, ceea ce ar putea explica lipsa de semnificație statistică a testelor de tip răspuns constrictiv abdominal. Aceasta nu înseamnă decât că la aceste nivele, nu a existat sinergie, și totuși efecte antinociceptive au existat, datorate probabil efectelor celeilalte substanțe din combinație, în acest caz candesartanul.
Asociere candesartan-nortriptilină
Pentru testul la formalină, nortriptilina a demonstrat acțiune antinociceptivă și combinația fixă candesartan – nortriptilină s-a dovedit a fi sinergică. Efectele antinociceptive pentru ambele situații au fost demonstrabile pentru prima fază a testului. Componentele testului la formalină sunt faza iritativă și faza inflamatorie. Acțiunea analgezică a candesartanului a fost dovedită pe ambele faze în experimente prezentate în cadrul acestui capitol. Nortriptilina este un analgezic foarte eficient, prin reducerea percepției dureroase, prin implicarea receptorilor opioizi delta, fie prin inhibiția recaptării noradrenalinei sau a serotoninei. Ca urmare, atât efectul antihiperalgezic al nortriptilinei cât și efectul antiinflamator al candesartanului sunt capabile să explice acest sinergism.
Durerea viscerală are caracteristici clinice ce o fac unică și diferită în mod esențial de durerea somatică. Nu este evocată la nivelul tuturor viscerelor, nu este legată în mod semnificativ de leziuni specifice viscerale, este referită de obicei la alte regiuni, mai îndepărtate de sursa de iritație primară, este difuză și prost localizată și este acompaniată de reflexe motorii și autonome exagerate. În plus, receptorii periferici pentru durerea viscerală nu evocă percepții conștiente și de aceea nu sunt considerați a fi receptori senzoriali în adevăratul sens al cuvântului. În plus, lipsa unei căi separate a percepției viscerale la nivelul măduvei spinării, trunchiului cerebral și creierului însuși nu permite aplicarea acelorași reguli de percepție și transmitere ca la durerea somatică.
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal nortriptilina a demonstrat acțiune antinociceptivă dar combinația fixă candesartan – nortriptilină nu a pus in evidență date semnificative statistic. La fel ca și mai sus, în ceea ce privește clomipramina, implicarea căilor de percepție ale durerii viscerale se pare că este mai puțin sensibilă la mecanismele antidepresivelor triciclice.
În ceea ce privește testul plăcii încălzite nortriptilina a prezentat acțiune antinociceptivă însă combinația fixă candesartan – nortriptilină nu a pus în evidență date semnificative statistic.
Referitor la nortriptilină, în literatura de specialitate există raportări referitoare la acțiunea antinocicepivă a acesteia pentru bateria de teste utilizată în acest studiu. Dintre acestea o singură raportare demonstrează valoarea DE50 a nortriptilinei pentru testul plăcii încălzite în combinație după metodologia analizei izobolare (375) pe un model de nocicepție obținut prin ligatură de nerv sciatic la șoarece (model de durere neuropată) ceea ce presupune administrări repetate. Valoarea diferită obținută de noi în acest studiu reiese din faptul că stimulul termoalgezic a fost aplicat direct pe model de nocicepție acută. Alte studii au demonstrat efectul antinociceptiv marcat al nortriptilinei la șoarece (376, 377) pe modelul cu formalină și acid acetic însă pe modelul indus cu Zymosan A nu există astfel de raportări.
Nortriptilina este un antidepresiv triciclic utilizat în tratamentul durerii neuropate cu mediație complexă. O explicație prezumtivă este că reducerea recaptării serotoninei și/sau a catecolaminelor în SNC are efecte de prelungire a activării sinaptice crescând inhibiția medulară descendentă a căilor nociceptive (200). Mecanismul acțiunii analgezice a nortriptilinei este încă incert, deși a fost implicată atât inhibiția recaptării de serotonină cât și de noradrenalină, dar mecanismul pare a fi diferit de cel prin care se realizează efectele antidepresive, întrucât dozele la care se obține efectele analgezice sunt mult mai reduse decât cele la care se obțin efecte antidepresive. În plus, nu există corelații între efectul antidepresivelor asupra stării de spirit (mood) și percepția dureroasă, iar efectele analgezice sunt similare la pacienții cu sau fără depresie. În studiile pe animale, efectele analgezice nu au produs efecte comportamentale de reducere a anxietății sau efecte motorii, ceea ce înseamnă că nortriptilina acționează la nivele mai joase decât mecanismele nervoase centrale ce guvernează anxietatea și depresia. Este posibil ca și aici efectele asupra canalelor de sodiu să fie prevalente.
Pentru efectul analgezic al nortriptilinei, esențiali sunt receptorii opioizi periferici delta, dar gradul de expresie al acestor receptori în diversele tipuri de durere nu este încă bine cunoscut. Folosindu-se o linie de șoareci knock-out pentru acești receptori, s-a dovedit că existența acestora a fost absolut necesară pentru ca nortiptilina sau un alt antidepresiv triciclic din același familie, și anume duloxetina, sa-și producă efectul pentru un experiment de durere neuropată (378).
Având în vedere că prima fază a testului cu formalină este o fază strict iritativă chimică, produsă de injectarea de formalină, este de așteptat ca efectele nortriptilinei să fie analgezice. Pe de altă parte, efectele candesartanului, de inhibiție a durerii neuropate, prezentate mai sus, ar putea să aibă un efect sinergic cu nortriptilina pe prima fază a testului cu formalină.
Celelalte teste de durere acută, temoalgezică și răspuns constrictiv abdominal nu au demonstrat efecte sinergice, fie probabil datorită faptului că medierea angiotensinergică nu este implicată pe aceste căi iar pe durerea inflamatorie cu Zymosan A mediația catecolaminergică nu are un efect semnificativ.
5.4.2.Asocieri Captopril – Medicamente coanalgezice și AINS
Asociere captopril – ibuprofen
Captoprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă prin utilizarea testului la formalină pentru ambele faze ale testului. Combinația fixă captopril – ibuprofen nu s-a dovedit a fi semnificativă statistic.
Pentru modelul de nocicepție indus cu Zymosan A captoprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă și combinația fixă captopril-ibuprofen s-a dovedit a fi sinergică.
Pentru testul termoalgezic captoprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru timpul de expunere 60 minute însă combinația fixă captopril – ibuprofen nu s-a dovedit a fi sinergică sau aditivă.
Acțiunea antinociceptivă a captoprilului este demonstrată în literatura de specialitate (329) pentru calea de administrare intraperitoneală pentru modelul cu stimul termoalgezic (temperatura de lucru 55șC) la șoarece și testul răspunsului constrictiv abdominal indus cu acid acetic. Pentru modelul indus cu Zymosan A și testul plăcii încălzite cu temperatura de lucru 52.5șC nu sunt studii prezentate.
În 1995 au fost descoperiți receptori membranari cu mare afinitate pentru peptidul angiotensina IV, cu concentrație predominantă în creier, cord și glandele suprarenale. Acești receptori nu au afinitate pentru angiotensina II, alți analogi ai acesteia și pentru blocanții de receptori AT1 de tip losartan sau candesartan. S-a demonstrat că blocada enzimei de conversie de tip I produce creșterea activității enzimei de conversie de tip II (care produce ang 1-7) și a IRAP (aminopeptidaza reglată de insulină- care sintetizează ANG IV). În decursul anilor de la descoperirea acestor situri de legare și ale acestor peptide, s-au obținut numeroase informații suplimentare în ceea ce privește implicarea receptorilor de tip AT4 în percepția dureroasă, în memorie, învățare și stres, demonstrând efectele stimulative și analgezice ale acestora (379).
Ca urmare, este posibil ca blocada enzimei de conversie I atât cu captopril cât și cu ramipril să aibă ca rezultat creșterea nivelelor de angiotensină IV în sistemul nervos al animalelor de experiență, și, având în vedere efectele sale analgezice și de îmbunătățire a percepției, să explice, cel puțin parțial, efectele sinergice cu ale antiinflamatoarelor nesteroidiene, precum și cu celelalte substanțe de tip co-analgezic.
Un alt efect interesant al captoprilului îl reprezintă reducerea nivelelor de TNF pe modele de inflamație chimică (380). Având în vedere că foarte multe dintre modelele de durere experimentală cu mediație inflamatorie implică TNF ca fiind unul dintre mediatorii implicați în percepția nociceptivă, este posibil ca acest efect al captoprilului să fie cel care explică, cel puțin parțial, unele din efectele antinociceptive ale acestuia pe modele de durere inflamatorie. Evident, este însă vorba de efecte cantitative, ce pot fi mai mult sau mai puțin semnificative sau pot varia în timp în decursul experimentului, de la un minut la altul, ceea ce ar putea explica dispersia rezultatelor observate.
Unul dintre mecanismele majore prin care se realizează neuroinflamația și o multitudine dintre efectele negative ale acesteia este creșterea polarizării microgliale. Microglia, conform literaturii, se află într-o stare dormantă (de inhibiție), din care iese sub influența anumitor factori activatori ai acesteia, mai ales citokine proinflamatorii și TNF alfa. Această ieșire din inhibiție se poate realiza însă în două direcții diferite, prin apariția a două fenotipuri microgliale: M1 proinflamator și M2 antiinflamator. Calea clasică Ang II/AT1/Nox prooxidantă și pro-inflamatorie are un rol major în efectele SRA, atât în creier cât și în țesuturile periferice. Totuși, nu se știe încă dacă aceste efecte sunt reglate de către un braț opus al SRA alcătuit din angiotensine diferite de angiotensina II, și anume semnalizarea Ang II/AT2 și/sau semnalizarea Ang1–7/MasR. Date recente, citate de materialul de față sugerează că atât stimularea receptorului AT2 cât și a receptorilor AT IV sau Mas ar putea avea efecte antioxidative și antiinflamatorii.
Ang II, prin receptorul său AT1, este un activator major al căii NADPH-oxidazei, care la rândul ei mediază mai multe aspecte-cheie ale proceselor degenerative și inflamatorii ce sunt implicate în bolile majore neurodegenerative la nivelul țesuturilor periferice. În creier, SRA este implicat în stres și anxietate, afecțiuni depresive și chiar în alcoolism. Inhibitorii de ECA au efecte pozitive într-o serie de procese mediate prin activarea microglială și neuroinflamație.
În plus, mai multe studii demonstrează interacțiuni sau reglări reciproce între SRA și diverși alți compuși ce s-au dovedit a fi implicați în neuroinflamație și polarizare microglială, cum sunt estrogenii, Rho-kinaza, factorul de creștere de tip insulinic-1(IGF-1), TNF-α, fier, PPARγ și citokine (381).
Pentru testul la formalină în literatura de specialitate o serie de studii evidențiază rezultate contradictorii în ceea ce acțiunea antinociceptivă: fie demonstrează lipsa de activitate fie efectul hiperalgeziant (382, 383).
O altă variantă de explicație este inhibiția eliberării de aldosteron (vezi cap 3.6.) de către angiotensina II, cunoscut fiind faptul că aldosteronul activează canale cationice TRPMC (Transient Receptor Potential Melastatin 7 Channel), implicate în activarea potențialelor de acțiune la nivelul terminațiilor nervoase libere și astfel în creșterea percepția durerii.
Suplimentar, unul dintre efectele importante este reducerea sintezei de angiotensină II și creșterea rezervelor pentru sinteza de angiotensină 1-7, al cărui efect antinociceptiv este cunoscut și explicat (384) prin intermediul receptorului său specific Mas.
Acțiunile contradictorii prezentate în literatură în ceea ce privește efectele captoprilului asupra percepției dureroase sunt determinate de acțiunea sa dublă la nivelul enzimei kininaza II (enzima de conversie). Această enzimă este inhibată de captopril, reduce sinteza de ang II, dar inhibă și degradarea bradikinininei, care este un mediator pro-inflamator și hiperalgezic (385). De aceea, pe modelele de durere inflamatorie rezultatele sunt contradictorii.
Bradikinina acționează prin receptorii săi proprii, cuplați cu proteine G: B1 și B2, cu o omologie de 36%. Receptorii B2R sunt exprimați în mod constitutiv pe terminațiile nervoase senzoriale primare, în vreme ce receptorii B1 sunt inductibili, iar prezența și funcționalitatea lor este încă în multe privințe controversată (386).
În rezultatele noastre, efectele de inhibiție a sintezei de angiotensină II au fost mai puternice decât cele pro-bradikininice, demonstrate prin efectele antinociceptive pe testele de durere inflamatorie, dar combinațiile cu ibuprofen ca inhibitor al ciclooxigenazei nu au fost sinergice decât la modelul cu zymosan, ceea ce demonstrează că probabil mediația ciclooxigenazică la acest model este mai eficientă decât cea bradikininică, care este mai importantă la nivel vascular și cutanat.
Asociere captopril – doxepină
Combinația fixă captopril – doxepină pentru testul la formalină s-a dovedit a fi sinergică, foarte semnificativ statistică realizând un procent de inhibiție antinociceptivă de 55.23%. Efectul a fost demonstrabil pentru prima fază a testului, a înregistrat o ușoară descreștere, astfel încât la faza a doua a testului acesta a fost de 48.25%.
Toți inhibitorii de ECA au fost documentați că îmbunătățesc manifestările neurodegenerative induse de radicalii liberi, acumularea de beta-amiloid, reacțiile imune, activarea enzimelor calciu-dependente (ramipril, captopril, perindopril, quinapril, lisinopril, enalapril și trandolapril). IECA interacționează cu toate mecanismele celulare prezentate mai sus. Inhibitorii ECA cu acțiune centrală au efecte asupra durerii de tip somatic și mai puțin viscerale prin mecanisme de tipul: (i) conversia la heptapeptidul neuroprotector Ang 1-7 prin activarea ACE2 datorată inhibiției kininazei ACE 1(ii) contrareglarea receptorilor kininergici B1 la nivelul sistemului nervos periferic, unde sunt responsabili pentru percepția durerii somatice și neuropate (387).
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal combinația fixă captopril – doxepină sugerează o interacțiune de tip antagonic. Explicația unui astfel de răspuns este dificilă, având în vedere că separat ambele substanțe au avut efecte antinociceptive, deși mai puțin importante. Este posibil ca administrarea unuia dintre acestea să producă un răspuns hiperaglezic, ce n u poate fi acoperit de către administrarea celuilalt membru al combinației și astfel, răspunsul să fie redus pentru ambii termeni ai combinației.
Pentru testul plăcii încălzite combinația fixă captopril – doxepină nu a demonstrat acțiune antinociceptivă.
Singurul element care separă doxepina de celelalte antidepresive din familie îl reprezintă efectul său antihistaminic pe receptorii H1 (388). Având în vedere că celelate medicamente din aceeași grupă nu au demonstrat această acțiune sinergică foarte semnificativă, se poate bănui că există o componentă histaminergică a durerii induse cu formalină care poate fi investigată ulterior.
Nu există la ora actuală studii care să evalueze efectele antiinflamatoare și/sau analgezice ale blocanților de receptori H1. Un astfel de studiu cu ketotifen și fexofenadină a demonstrat efecte atât antiinflamatoare cât și analgezice semnificative pe un model de durere indus cu formalină. Efectele au fost destul de slabe, dar totuși suficiente, mai ales că s-au raportat posibile efecte analgezice în mialgiile cronice neurotoxice. Reducerea durerii în situl inflamator al durerii din testul cu formalină ar putea fi realizată prin inhibiția plasticității neuronale la nivelul căii medulare prin scăderea cantității de substanță P și prin eventuale interacțiuni între anithistaminicele H1 și receptorii opioizi (389). Studii mai aprofundate folosind antihistaminice și alte blocante de enzimă de conversie ar fi de dorit pentru elucidarea acestui aspect.
Bradikinina activează căi de semnalizare intracelulară care duc la vasodilatație, chemotaxia neutrofilelor și creșterea permeabilitărții vasculare, precum și evocarea directă a durerii în manieră dependentă de doză, însoțită sau nu de prurit. Administrarea iontoforetică de bradikinină produce hiperalgezie și creșterea sensibilității la temperatură, cu efecte alodinice asupra percepției termice. Pe de altă parte, unele efecte de tip hiperalgezic ale bradikininei par a fi mediate și prin intermediul receptorilor de tip H1, iar inhibiția receptorilor H1 de către clomipramină și doxepină ar putea explica efectele foarte diverse și larga distribuție a rezultatelor atunci când luăm în calcul blocada enzimei de conversie (386).
Asociere captopril – clomipramină
Combinația fixă captopril – clomipramină nu a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru testul la formalină și testul răspunsului constrictiv abdominal. În ceea ce privește testul răspunsului constrictiv abdominal, mecanismele neurobiologice ce mediază durerea viscerală sunt suficient de aparte pentru a nu permite extrapolarea directă a cunoștințelor la nivelul durerii somatice. Toate formele de durere viscerală necesită o anume stare de hiperalgezie, ce își are originea din organul intern ce a fost lezat sau inflamat, sau uneori, chiar în absența unei cauze periferice identificabile, poate chiar ca o consecință a a sensibilizării și hiperexcitării aferenților viscerali datorate unor modificări infinitezimale la nivelul micromediului lor (COX, citokine, ”supa inflamatorie”).
Durerea viscerală este mereu însoțită de hiperalgezie, la care se adaugă plasticitatea sinaptică, cu unele componente moleculare deja identificate, care mediază amplificarea centrală a semnaleleor aferente viscerale.
Pentru testul plăcii încălzite combinația s-a dovedit a fi sinergică semnificativă statistic și a realizat un procent de inhibiție antinociceptivă de 37.50% pentru timpul de lucru de 30 minute.
Pe durerea inflamatorie această combinație nu avut efecte, iar pe durerea termică acută s-a demonstrat un efect sinergic.
Clomipramina este un inhibitor ar recaptării serotoninice cu efecte analgezice încă puțin înțelese. Aceste efecte analgezice sunt explicate prezumtiv prin interacțiunea cu receptorii 5HT2 și 5HT3 (203), mai ales pe sensibilitatea termo-algezică și mecanică, cu mai puține efecte asupra durerii inflamatorii. Aceste date ar putea reprezenta explicația unei interacțiuni nesemnificative la testul constrictiv abdominal și la formalină. Pe de altă parte, cunoscută fiind mediația serotoninergică în percepția durerii, aceasta ar putea explica efectele sinergice la testul plăcii încălzite, în condițiile unei reduceri asociate a durreii de către captopril.
Asociere captopril – nortriptilină
Combinația fixă captopril – nortriptilină nu a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru testul la formalină. Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal și testul plăcii încălzite combinația s-a dovedit a fi sinergică semnificativă statistic realizând un procent de inhibiție de 58.33% pentru testul răspunsului constrictiv abdominal și 52.56% pentru testul plăcii încălzite pentru timpul de lucru de 90 minute.
Nortriptilina este in inhibitor al recaptării de noradrenalină și serotonină, cu preferință al recaptării de catecolamine. Are de asemenea o afinitate foarte mare pentru transportorul de dopamină, ceea ce ar putea explica efectele sale la nivelul mediației termo-algezice. De asemenea, ca și alte antidepresive triciclice, este un slab blocant al canalelor de sodiu, ceea ce este probabil unul dintre motivele ce explică efectele sale analgezice. Toate aceste mecanisme, combinate cu efectele captoprilului, ar putea explica efectele sinergice pe modelul cu placă încălzită. Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal, explicația este mai puțin evidentă, probabil fiind legată de efecte cantitative la nivelul reacției inflamatorii induse de Zymosan A.
Nu se știe exact care este implicarea nortriptilinei în medierea dopaminergică, dar se știe că inhibiția recaptării de catecolamine acționează și asupra nivelelor de dopamină intra-cerebrală. Pe de altă parte, TNF-α este o citokină proinflamatorie ce a fost implicată în patogeneza mai multeor afecțiuni neurodegenerative, ca și în patogenia hiperalgeziei și alodiniei.
În particular neuronii dopaminergici sunt se pare, deosebit de sensibili la efectele neurotoxice ale TNF-α, efecte care au fost crescute de către co-administrarea de angiotensină II. Mai mult, tratamentul cu Ang II a crescut în mod semnificativ nivelul de TNF-α în culturi cerebrale primare, ceea ce a fost blocat de administrarea de administrarea de blocanți de receptori AT1, de NADPH-oxidază și de blocanți de NFK-β. Pe de altă parte, în culturi neuronale pure, unde nu au existat celule microgliale, nivelele de TNF-α nu au fost afectat în mod semnificativ de administrarea de ang II. Aceste rezultate denotă interacțiuni funcționale importante între Ang II and TNF-α, și certifică faptul că TNF-α microglială este un mediator major a neuroinflamației și neurodegenerescenței induse de ang II (390).
Aceste noi informații pot sugera explicații pentru efectele obținute de către combinația captopril nortriptilină pentru testele de durere inflamatorie. Este posibil ca reducerea efectelor enzimei de conversie de tip I să fi redus cantitatea de angiotensină II disponibilă la nivel cerebral și astfel, efectele pro-algezice ale TNF-alfa și ale altor mediatori neuroinflamatori să fie mai puțin penetrante, ceea ce să explice sinergia între captorpil și nortriptilină pe aceste modele.
5.4.3.Asocieri Ramipril – Medicamente coanalgezice și AINS
Asociere ramipril – ibuprofen
Ramiprilul a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru testul la formalină (faza I), testul răspunsului constrictiv abdominal și testul plăcii încălzite pentru timpul de lucru de 90 minute pentru nivelul de activitate de 50%. Literatura de specialitate prezintă o serie de studii care pun în evidență efectul antinociceptiv al ramiprilului însă acestea sunt rezultate în urma cercetărilor efectuate pe modele de durere neuropată și administrare cronică de ramipril (391). Combinația fixă ramipril – ibuprofen a fost antagonică (indice ᵧ = 10.93) pentru testul răspunsului constrictiv abdominal și sinergică pentru testul plăcii încălzite. Inhibiția procesului nociceptiv a fost de 55.35%. Pentru testul la formalină nu s-a putut stabili tipul de interacțiune între cei doi compuși.
Ramiprilul este un IECA mai nou, dar efectele sale pot fi considerate similare cu cele ale captoprilului, și la fel ca și ale acestuia, combinațiile sale cu ibuprofenul nu s-au dovedit a fi statistic semnificative, decât în cazuri izolate și cu variabilitate mare. Într-un studiu asupra efectelor ramiprilului în boala coronară acută (392), nivelurile de MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein – proteina de atracție a monocitelor) și IL-18 au scăzut, iar IL-10 seric a crescut, ceea ce a demonstrat că ramiprilul ar putea ameliora afectarea cardiacă produsă de citokinele proinflamatorii.
Pe lângă efectele de inhibiție ale sintezei de angiotensină II, ramiprilul are efecte importante asupra creșterii concentrației de angiotensină I serică și reduce activarea microglială indusă de angiotensin II în timpul agresiunilor oxidative cerebrale. Crește sinteza de angiotensină IV și de angiotensin 1-7, prin aceleași mecanisme ca și captoprilul, scade metabolismul oxidativ cerebral și reduce percepția nociceptivă prin intermediul substanței P, neurokininelor și crește activarea neuronală la nivelul girusului dentat și cortexului perirhinal, unde sunt cunoscute localizări ale memoriei de lucru și de scurtă durată.
Ramiprilul are efecte inhibitorii asupra eroziunii articulare din artritele inflamatorii, îmbunătățind în mod semnificativ nivelele serice de proteină C reactivă, metaloproteinaze matriciale și proteină matricială oligomerică a cartilajului (COMP), care indică gradul de distrucție articulară din artrite. De asemenea, administrarea de ramipril a redus și efectele inflamatorii la nivelul splinei și ficatului (infiltrație limfocitară, nivele de citokine ș.a.).De asemeni s-a demonstrat efectul protector al ramiprilului pe edemul labei la șobolan indus cu carrageenan, un modulator inflamator tipic.
Efectele imunomodulatorii ale ramiprilului sunt benefice, evidențiate prin modificări în sensul reducerii a nivelelor serice de TNF-α, IL-10 și imunoglobuline. În plus, în vreme ce se știe că angiotensina II are efect de stimulare a mobilizării coloniilor de limfocite splenice, administrarea de ramipril a inhibat și aceste efecte. Pe de altă parte, blocarea receptorilor pentru renină a demonstrat suprimarea producerii de citokine pro-inflamatorii la șobolan (393).
Ca urmare, situațiile în care ramiprilul a redus percepția dureroasă din testele de durere inflamatorie ar putea fi explicate prin aceste efecte antiinflamatorii la nivelul citokinelor.
Studii ulterioare în ceea ce privește interacțiunile între AINS și IECA sunt necesare, pentru a elucida mecanismele prin care acestea se produc, și pentru a identifica fenomenele prin care apar situațiile de sinergism demonstrate în cadrul acestei lucrări.
Asociere ramipril – doxepină
Combinația fixă ramipril – doxepină a demonstrat acțiune antinociceptivă semnificativă statistic pentru testul plăcii încălzite cu un efect antinociceptiv de 45.63% pentru timpul de lucru de 60 minute. Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal indus prin Zymosan A și testul la formalină nu s-au înregistrat date semnificative statistic.
Asociere ramipril – clomipramină
Combinația fixă ramipril – clomipramină nu a demonstrat acțiune antinociceptivă pentru testul la formalină. Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal efectul antinociceptiv a fost semnificativ statistic, realizând o inhibiție a procesului nociceptiv de 63.33%. De asemenea pentru testul plăcii încălzite combinația a fost sinergică, semnificativă statistic și a realizat un procent de inhibiție nociceptivă de 56.95% pentru timpul de lucru de 30 minute.
O serie de autori pun efectele antinociceptive ale ramiprilului asupra durerii neuropate și somatice pe seama activării axei ECA 2 – angiotensină 1-7 – receptor Mas. Deși efectele acestui ax inhibitor asupra durerii inflamatorii au fost mai puțin studiate, o serie de rezultate implică ang 1-7 în analgezia durerii inflamatorii. Receptorul Mas (MasR) se exprimă ubicuitar în sistemul nervos și periferic inclusiv la nivelul ganglionului dorsal al rădăcinii spinale și în măduva spinării. Pe modele de hiperalgezie indusă cu prostaglandine, administrarea de angiotensină 1-7 a indus o atenuare a nocicepției periferice în manieră dependentă de doză, fără implicarea receptorilor opioizi. Reducerea semnalizării prin citokine proinflamatorii cu ajutorul stimulării receptorului de tip Mas duce la rândul său la reducerea semnalizării prin inozitol trifosfat, MAPk și JNK pe mai multe modele de durere (394). În concluzie, este posibil să punem pe seama inhibiției ECA I și activării căii ECA 2 unele dintre efectele analgezice ale ramiprilului, mai ales în cazul testului plăcii încălzite, unde este perfect posibil să fi fost afectată medierea spinală a căii ascendente a durerii, ceea ce a redus nocicepția, la care s-a adăugat efectul antinociceptiv redus dar pre-existent al clomipraminei.
Asociere ramipril – nortriptilină
Pentru testul la formalină combinația ramipril – nortriptilină nu a demonstrat acțiune antinociceptivă. Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal, combinația a fost sinergică, semnificativă statistic, inhibiția procesului nociceptiv fiind de 50%. Pentru testul plăcii încălzite combinația dintre cei doi compuși a fost sinergică demonstrând efect antinociceptiv cu inhibiție 49.67% semnificativ statistic.
După cum s-a explicat mai sus, nortriptilina are efecte inhibitoare asupra canalelor de sodiu, ceea ce reduce potențialul de receptor la nivelul terminațiilor nervoase periferice. De asemeni, are efecte de blocare a recaptării noradrenergice, care pot modifica mediația transmisiei dureroase la nivel spinal. Împreună cu efectele puternice de inhibiție a mediației angiotensinergice ale ramiprilului, care se pot manifesta la nivelul stimulării sintezei de ang 1-7 sau de angiotensină IV, toate acestea ar putea să explice efectele sinergice asupra răspunsului constrictiv abdominal, precum și pe placa încălzită.
Efectele inhibiției sintezei de angiotensină II sunt aceleași ca și la captopril, la care se adaugă efectele antiinflamatoare ale ramiprilului, ceea ce ar putea explica sinergismul demonstrat la testele de durere inflamatorie. Efectele în ceea ce privește percepția nociceptivă acută termoalgezică pot fi explicate prin efectele de inhibiție a acțiunii angiotensinei II fie directe, pro-oxidante și proinflamatorii, fie prin intermediul angiotensinei 1-7 sau prin intermediul efectelor aldosteronului aupra canalelor cationice tranzitorii, implicate în percepția durerii acute.
Concluzii
Pentru testul răspunsului constrictiv abdominal toate substanțele de cercetat au demonstrat acțiune antinociceptivă pentru nivelul de activitate de 50%.
Pentru testul plăcii încălzite toate substanțele au prezentat acțiune antinociceptivă pentru nivelul de activitate de 50%.
Pentru testul la formalină, cu excepția clomipraminei și doxepinei, toate substanțele luate în studiu au demonstrat efect antinociceptiv pentru faza I a testului. Pentru faza a doua a testului la formalină nu au înregistrat efect antinociceptiv următoarele substanțe: ramipril, candesartan, doxepină, nortriptilină.
Combinațiile fixe ale modulatorilor sistemului renină – angiotensină cu substanțele luate în studiu s-au dovedit a fi sinergice, antagonice sau indiferente.
În literatura de specialitate nu sunt raportări referitoare la combinațiile fixe efectuate în cercetările din prezenta lucrare prin metodologia de analiză izobolară sub toate variantele acesteia.
Având în vedere rezultatele obținute privind comportamentul antinocicetiptiv al modulatorilor sistemului renină – angiotensină datele obținute pledează pentru includerea acestora în funcție de compus în grupa coanalgezice și para-analgezice.
5.5. CONCLUZII
Efectele blocanților de enzimă de conversie a angiotensinei (captopril, ramipril) asupra memoriei au demonstrat că aceasta este îmbunătățită de reducerea sintezei de angiotensină II, mai puțin ca și evenimente izolate în cadrul administrării în doză unică, fără intervenția unor elemente perturbatoare ale memoriei, dar semnificative în condițiile în care administrarea acestora a avut loc simultan cu administrarea de substanțe lezate, de tip scopolamină, ceea ce sugerează existența unor mecanisme de exacerbare a pierderilor de memorie determinate de angiotensină și inhibate de blocanți de enzimă de conversie.
Administrarea de angiotensină II direct, în doză unică, are efecte de inhibare a memoriei, așa cum s-a observat din rezultatele testelor de tip labirint. Aceste date sunt în concordanță cu datele din literatură.
Asocierea de blocanți ai receptorilor angiotensinici (losartan) a indus efecte semnificative asupra memoriei, dar a avut un efect protector în condițiile asocierii cu substanțe farmacologice cu efect amnezic (scopolamina).
Candesartanul, un alt blocant de receptori angiotensinici, a îmbunătățit în mod semnificativ testele de memorie de scurtă durată, ceea ce sugerează un efect de protecție împotriva leziunilor mnezice induse de agenți toxici sau prooxidanți.
În ceea ce privește parametrii anxietății, cercetați cu ajutorul markerilor comportamentali specifici, au fost crescuți după administrarea de angiotensină II, fenomene care se corelează cu scăderile parametrilor de memorie.
În concluzie, se poate afirma că angiotensina II are efecte anxiogene și hipomnezice, care se pot corela și cu efecte cardiovasculare dependente de mediația angiotensinergică, de tip hipertensiune arterială și creșterea irigației cerebrale, ceea ce poate duce la o stare de agitație.
În ceea ce privește substanțele ce alterează metabolismul și efectele farmacologice ale angiotensinei II, au dovedit că acestea au un efect anxiolitic clar, atât pentru IECA, cât și pentru BRA, care a redus markerii de anxietate și au crescut parametrii exploratori.
Folosind un agent farmacologic anxiogen și amnezic cunoscut în literatură (scopolamina), am dovedit că efectele acestuia sunt atenuate în mod semnificativ atât de către IECA cât și de BRA.
Studiile biochimice asupra statusului oxidativ au demonstrat că administrarea de scopolamină a crescut parametrii peroxidării lipidice (modificarea parametrului malon-dialdehida) și a redus rezervele antioxidante prin reducerea rezervelor de SOD-supeoxid dismutaza și GPx -glutation peroxidază, în concordanță cu literatura și demonstrând că efectele acesteia asupra memoriei și comportamentului ar putea să fie cel puțin parțial datorate acțiunii prooxidante la nivel SNC.
Parametrii biochimici ai oxidării au fost îmbunătățiți în mod semnificativi de pretratarea cu IECA sau BRA înainte de scopolamină sau de co-administrarea acestora.
Losartanul, ca BRA, a redus MDA și a crescut GPx și SOD, ceea ce semnifică o activare a mecanismelor protectoare în condițiile leziunilor oxidative.
Datele obținute în studiul de față referitoare la acțiunea antinociceptivă a candesartanului pledează pentru includerea acestuia în grupa de medicamente coanalgezice/paraanalegzice.
CAPITOLUL 6
ASPECTE DE ORIGINALITATE, PERSPECTIVE ȘI PRINCIPALELE DIRECȚII DE CERCETĂRI ULTERIOARE
Un element semnificativ de noutate a fost reprezentat de detalierea efectelor antioxidante ale ramiprilului, un agent IECA mai nou, ale cărui acțiuni în condițiile interacțiunii cu SRA nu au fost încă elucidate. Aceste aspecte reprezintă o premieră în literatură.
Candesartanul a prezentat acțiune antinociceptivă demonstrând valori DE50 pentru fiecare model de nocicepție. Aceste date constituie un element de originalitate deoarece în literatura de specialitate nu au fost pană în momentul de față demonstrate valori DE50 ale candesartanului prin administrare pe cale orală la șoarece pentru modelele de nocicepție din acest studiu.
Demonstrarea valorii DE50 a clomipraminei pentru modelul de nocicepție cu Zymosan A la șoarece reprezintă un element de originalitate, în literatura de specialitate neregăsindu-se studii care să demonstreze valoarea DE50.
Demonstrarea valorii DE50 a nortriptilinei la șoarece pe modelul de nocicepție indus cu Zymosan A reprezintă un element de originalitate, nedemonstrat încă în literatura de specialitate. De asemenea demonstrarea valorii DE50 a nortriptilinei prin analiza izobolară pe model de nocicepție acută cu stimul termic reprezintă un element de noutate.
Demonstrarea valorilor DE50 ale Captoprilului pe modelul de nocicepție cu Zymosan A și modelul cu stimul termic (52.5șC) reprezintă un element de noutate.
Demonstrarea valorii DE50 pe modelele de nocicepție luate în studiu pentru administrarea de ramipril, reprezintă un element de originalitate.
Demonstrarea sinergismului, antagonismului sau aditiției reprezintă de asemenea elemente de noutate deorece în literatura de specialitate, la data zilei, nu sunt raportate studii care să fi cercetat combinațiile în proporție fixă din prezenta lucrare prin metoda analizei izobolare sub toate variantele acesteia.
Având în vedere rezultatele obținute privind potențiala utilitate clinică a interacțiunilor studiate, ne propunem următoarele obiective:
Analiza combinațiilor fixe CND – IB pentru testul la formalină faza II care prin mediația caracteristică presupune în mod deosebit durere inflamatorie acută și o specificitate pentru durerea cronică.
Analiza combinațiilor fixe CND – IB pentru alte domenii de temperatură la testul plăcii încălzite și completarea cercetărilor cu modele adiționale ce presupun stimul termic cu integrare supraspinală.
Analiza combinațiilor CND – CLM la alt nivel de activitate decât cel studiat.
Analiza combinației CPL – IB pentru testul la formalină pentru alte secvențe de doze având în vedere comportamentul nociceptiv contradictoriu descris în literatură.
Analiza suprafeței de răspuns a combinațiilor sinergice al căror index de interacțiune este puternic pentru a extinde analiza izobolară la alte nivele de efect.
Testarea IECA și BRA pe model animal de AD.
Dozarea concentrației nivelului de AngII la nivel cerebral și periferic în urma administrării pe cale i.n. la șoarece.
BIBLIOGRAFIE
1. Eichenbaum H. Memory: Organization and Control. Annu Rev Psychol. 2017;68:19-45.
2. Mandler G. From Association to Organization. Current Directions in Psychological Science. 2011;20(4):232-5.
3. Takeuchi T, Duszkiewicz AJ, Morris RG. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2014;369(1633):20130288.
4. Veyrac A, Besnard A, Caboche J, Davis S, Laroche S. The transcription factor Zif268/Egr1, brain plasticity, and memory. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;122:89-129.
5. Fernandez-Rey J, Gonzalez-Gonzalez D, Redondo J. Preventing the return of fear memories with postretrieval extinction: A human study using a burst of white noise as an aversive stimulus. Behav Neurosci. 2018.
6. Packard MG, Goodman J. 3.18 – Neurobiology of Procedural Learning in Animals☆. In: Byrne JH, editor. Learning and Memory: A Comprehensive Reference (Second Edition). Oxford: Academic Press; 2017. p. 313-26.
7. Dudai Y, Karni A, Born J. The Consolidation and Transformation of Memory. Neuron. 2015;88(1):20-32.
8. Semon RW, Simon L. The mneme. London, New York,: G. Allen & Unwin ltd.; The Macmillan company; 1921. 304 p. p.
9. Poo MM, Pignatelli M, Ryan TJ, Tonegawa S, Bonhoeffer T, Martin KC, et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biol. 2016;14:40.
10. Rudenko A, Tsai LH. Epigenetic regulation in memory and cognitive disorders. Neuroscience. 2014;264:51-63.
11. Wager TD, Smith EE. Neuroimaging studies of working memory: a meta-analysis. Cognitive, affective & behavioral neuroscience. 2003;3(4):255-74.
12. Gazzaniga MS, Ivry RB, Mangun GR. Cognitive neuroscience : the biology of the mind. Fourth edition. ed. New York, N.Y.: W. W. Norton & Company, Inc.; 2013. pages cm p.
13. Tulving E. Episodic memory: from mind to brain. Annu Rev Psychol. 2002;53:1-25.
14. Tulving E, Schacter DL. Priming and human memory systems. Science. 1990;247(4940):301-6.
15. Nadel L, Land C. Memory traces revisited. Nat Rev Neurosci. 2000;1(3):209-12.
16. L. M. Types of Memory [Available from: www.human-memory.net/types.html.
17. Mayford M, Siegelbaum SA, Kandel ER. Synapses and memory storage. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012;4(6).
18. Engert F, Bonhoeffer T. Dendritic spine changes associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 1999;399(6731):66-70.
19. Liu C, Placais PY, Yamagata N, Pfeiffer BD, Aso Y, Friedrich AB, et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 2012;488(7412):512-6.
20. Tonegawa S, Pignatelli M, Roy DS, Ryan TJ. Memory engram storage and retrieval. Curr Opin Neurobiol. 2015;35:101-9.
21. Rudy JW. The neurobiology of learning and memory. Second edition. ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc. Publishers; 2014. xx, 435 pages p.
22. Root CM, Denny CA, Hen R, Axel R. The participation of cortical amygdala in innate, odour-driven behaviour. Nature. 2014;515(7526):269-73.
23. Liao D, Hessler NA, Malinow R. Activation of postsynaptically silent synapses during pairing-induced LTP in CA1 region of hippocampal slice. Nature. 1995;375(6530):400-4.
24. Davis HP, Squire LR. Protein synthesis and memory: a review. Psychol Bull. 1984;96(3):518-59.
25. Alberini CM. Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol Rev. 2009;89(1):121-45.
26. Wang DO, Kim SM, Zhao Y, Hwang H, Miura SK, Sossin WS, et al. Synapse- and stimulus-specific local translation during long-term neuronal plasticity. Science. 2009;324(5934):1536-40.
27. Tsien RY. Very long-term memories may be stored in the pattern of holes in the perineuronal net. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(30):12456-61.
28. Korzus E, Rosenfeld MG, Mayford M. CBP histone acetyltransferase activity is a critical component of memory consolidation. Neuron. 2004;42(6):961-72.
29. Ricobaraza A, Cuadrado-Tejedor M, Marco S, Perez-Otano I, Garcia-Osta A. Phenylbutyrate rescues dendritic spine loss associated with memory deficits in a mouse model of Alzheimer disease. Hippocampus. 2012;22(5):1040-50.
30. Rudenko A, Dawlaty MM, Seo J, Cheng AW, Meng J, Le T, et al. Tet1 is critical for neuronal activity-regulated gene expression and memory extinction. Neuron. 2013;79(6):1109-22.
31. Spalding KL, Bergmann O, Alkass K, Bernard S, Salehpour M, Huttner HB, et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 2013;153(6):1219-27.
32. Amaral OB, Luft T, Cammarota M, Izquierdo I, Roesler R. Temporary inactivation of the dorsal hippocampus induces a transient impairment in retrieval of aversive memory. Behavioural brain research. 2007;180(2):113-8.
33. Nakashiba T, Cushman JD, Pelkey KA, Renaudineau S, Buhl DL, McHugh TJ, et al. Young dentate granule cells mediate pattern separation, whereas old granule cells facilitate pattern completion. Cell. 2012;149(1):188-201.
34. Hebb DO. The organization of behavior; a neuropsychological theory. New York,: Wiley; 1949. xix, 335 p. p.
35. Bi G, Poo M. Distributed synaptic modification in neural networks induced by patterned stimulation. Nature. 1999;401(6755):792-6.
36. Abeles M. Role of the cortical neuron: integrator or coincidence detector? Isr J Med Sci. 1982;18(1):83-92.
37. Eichenbaum H. Time cells in the hippocampus: a new dimension for mapping memories. Nat Rev Neurosci. 2014;15(11):732-44.
38. Buzsaki G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 2015;25(10):1073-188.
39. Hicks A, Clay F, Hopwood MJ, James A, Jayaram M, Batty R, et al. Efficacy and Harms of Pharmacological Interventions for Neurobehavioral Symptoms in Post Traumatic Amnesia after Traumatic Brain Injury – A Systematic Review. J Neurotrauma. 2018.
40. Packard PA, Rodriguez-Fornells A, Bunzeck N, Nicolas B, de Diego-Balaguer R, Fuentemilla L. Semantic Congruence Accelerates the Onset of the Neural Signals of Successful Memory Encoding. J Neurosci. 2017;37(2):291-301.
41. Ho JW, Poeta DL, Jacobson TK, Zolnik TA, Neske GT, Connors BW, et al. Bidirectional Modulation of Recognition Memory. J Neurosci. 2015;35(39):13323-35.
42. Pittenger C, Fasano S, Mazzocchi-Jones D, Dunnett SB, Kandel ER, Brambilla R. Impaired bidirectional synaptic plasticity and procedural memory formation in striatum-specific cAMP response element-binding protein-deficient mice. J Neurosci. 2006;26(10):2808-13.
43. Wassum KM, Izquierdo A. The basolateral amygdala in reward learning and addiction. Neurosci Biobehav Rev. 2015;57:271-83.
44. Mishkin M, Appenzeller T. The anatomy of memory. Sci Am. 1987;256(6):80-9.
45. Rankin CH. Introduction to special issue of neurobiology of learning and memory on habituation. Neurobiol Learn Mem. 2009;92(2):125-6.
46. Rankin CH, Abrams T, Barry RJ, Bhatnagar S, Clayton DF, Colombo J, et al. Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation. Neurobiol Learn Mem. 2009;92(2):135-8.
47. Thompson RF, Spencer WA. Habituation: a model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychol Rev. 1966;73(1):16-43.
48. Murphy C, Solomon ES, Haase L, Wang M, Morgan CD. Olfaction in aging and Alzheimer's disease: event-related potentials to a cross-modal odor-recognition memory task discriminate ApoE epsilon4+ and ApoE epsilon 4- individuals. Ann N Y Acad Sci. 2009;1170:647-57.
49. Grissom N, Bhatnagar S. Habituation to repeated stress: get used to it. Neurobiol Learn Mem. 2009;92(2):215-24.
50. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10(9):895-926.
51. KS L. The effects of strychnine and caffeine upon the rate of learning. Psychobiology 1917;1(2):141-69.
52. Introini-Collison IB, Baratti CM. Memory-modulatory effects of centrally acting noradrenergic drugs: possible involvement of brain cholinergic mechanisms. Behavioral and neural biology. 1992;57(3):248-55.
53. Power AE, McGaugh JL. Phthalic acid amygdalopetal lesion of the nucleus basalis magnocellularis induces reversible memory deficits in rats. Neurobiology of learning and memory. 2002;77(3):372-88.
54. Leussis MP, Bolivar VJ. Habituation in rodents: a review of behavior, neurobiology, and genetics. Neurosci Biobehav Rev. 2006;30(7):1045-64.
55. Schildein S, Huston JP, Schwarting RK. Injections of tacrine and scopolamine into the nucleus accumbens: opposing effects of immediate vs delayed posttrial treatment on memory of an open field. Neurobiol Learn Mem. 2000;73(1):21-30.
56. Rosat R, Da-Silva RC, Zanatta MS, Medina JH, Izquierdo I. Memory consolidation of a habituation task: role of N-methyl-D-aspartate, cholinergic muscarinic and GABA-A receptors in different brain regions. Braz J Med Biol Res. 1992;25(3):267-73.
57. Wang X, Zhong P, Gu Z, Yan Z. Regulation of NMDA receptors by dopamine D4 signaling in prefrontal cortex. J Neurosci. 2003;23(30):9852-61.
58. Izquierdo I. Dopamine receptors in the caudate nucleus and memory processes. Trends Pharmacol Sci. 1992;13(1):7-8.
59. LaLumiere RT, McGaugh JL, McIntyre CK. Emotional Modulation of Learning and Memory: Pharmacological Implications. Pharmacol Rev. 2017;69(3):236-55.
60. Morena M, Campolongo P. The endocannabinoid system: an emotional buffer in the modulation of memory function. Neurobiol Learn Mem. 2014;112:30-43.
61. Dincheva I, Drysdale AT, Hartley CA, Johnson DC, Jing D, King EC, et al. FAAH genetic variation enhances fronto-amygdala function in mouse and human. Nat Commun. 2015;6:6395.
62. Lynch G, Palmer LC, Gall CM. The likelihood of cognitive enhancement. Pharmacol Biochem Behav. 2011;99(2):116-29.
63. Izquierdo I, Medina JH, Jeriisalinsky D, Da Cunha C. Post-Training Memory Processing in Amygdala, Septum and Hippocampus: Role of Benzodiazepine/GABAA Receptors, and their Interaction with other Neurotransmitter Systems. Rev Neurosci. 1992;3(1):11-24.
64. Carey RJ, Dai H, Gui J. Effects of dizocilpine (MK-801) on motor activity and memory. Psychopharmacology (Berl). 1998;137(3):241-6.
65. Vianna MR, Izquierdo LA, Barros DM, Walz R, Medina JH, Izquierdo I. Short- and long-term memory: differential involvement of neurotransmitter systems and signal transduction cascades. An Acad Bras Cienc. 2000;72(3):353-64.
66. Irving AJ, Harvey J. Leptin regulation of hippocampal synaptic function in health and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London Series B, Biological sciences. 2014;369(1633):20130155.
67. Kopf SR, Baratti CM. Effects of posttraining administration of insulin on retention of a habituation response in mice: participation of a central cholinergic mechanism. Neurobiol Learn Mem. 1999;71(1):50-61.
68. Gerhardt P, Voits M, Fink H, Huston JP. Evidence for mnemotropic action of cholecystokinin fragments Boc-CCK-4 and CCK-8S. Peptides. 1994;15(4):689-97.
69. Angelucci ME, Vital MA, Cesario C, Zadusky CR, Rosalen PL, Da Cunha C. The effect of caffeine in animal models of learning and memory. Eur J Pharmacol. 1999;373(2-3):135-40.
70. Papa M, Pellicano MP, Sadile AG. Nitric oxide and long-term habituation to novelty in the rat. Ann N Y Acad Sci. 1994;738:316-24.
71. Dere E, De Souza Silva MA, Topic B, Fiorillo C, Li JS, Sadile AG, et al. Aged endothelial nitric oxide synthase knockout mice exhibit higher mortality concomitant with impaired open-field habituation and alterations in forebrain neurotransmitter levels. Genes Brain Behav. 2002;1(4):204-13.
72. Yasar S, Varma VR, Harris GC, Carlson MC. Associations of Angiotensin Converting Enzyme-1 and Angiotensin II Blood Levels and Cognitive Function. J Alzheimers Dis. 2018;63(2):655-64.
73. Kehoe PG, Hibbs E, Palmer LE, Miners JS. Angiotensin-III is Increased in Alzheimer's Disease in Association with Amyloid-beta and Tau Pathology. J Alzheimers Dis. 2017;58(1):203-14.
74. Takeda S, Sato N, Ogihara T, Morishita R. The renin-angiotensin system, hypertension and cognitive dysfunction in Alzheimer's disease: new therapeutic potential. Front Biosci. 2008;13:2253-65.
75. Ciobica A, Bild W, Hritcu L, Haulica I. Brain renin-angiotensin system in cognitive function: pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia. Acta Neurol Belg. 2009;109(3):171-80.
76. Woo MA, Macey PM, Fonarow GC, Hamilton MA, Harper RM. Regional brain gray matter loss in heart failure. J Appl Physiol (1985). 2003;95(2):677-84.
77. Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med. 1998;4(11):1313-7.
78. Balentova S, Adamkov M. Molecular, Cellular and Functional Effects of Radiation-Induced Brain Injury: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(11):27796-815.
79. Kim MS, Lee GH, Kim YM, Lee BW, Nam HY, Sim UC, et al. Angiotensin II Causes Apoptosis of Adult Hippocampal Neural Stem Cells and Memory Impairment Through the Action on AMPK-PGC1alpha Signaling in Heart Failure. Stem Cells Transl Med. 2017;6(6):1491-503.
80. Kroller-Schon S, Jansen T, Schuler A, Oelze M, Wenzel P, Hausding M, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1alpha deletion induces angiotensin II-associated vascular dysfunction by increasing mitochondrial oxidative stress and vascular inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013;33(8):1928-35.
81. Zakrocka I, Kocki T, Turski WA. The effect of three angiotensin-converting enzyme inhibitors on kynurenic acid production in rat kidney in vitro. Pharmacol Rep. 2017;69(3):536-41.
82. Bali A, Jaggi AS. Angiotensin as stress mediator: role of its receptor and interrelationships among other stress mediators and receptors. Pharmacol Res. 2013;76:49-57.
83. Braszko JJ, Kulakowska A, Wisniewski K. Angiotensin II and its 3-7 fragment improve recognition but not spatial memory in rats. Brain Res Bull. 1995;37(6):627-31.
84. Braszko JJ, Walesiuk A, Wielgat P. Cognitive effects attributed to angiotensin II may result from its conversion to angiotensin IV. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2006;7(3):168-74.
85. Trofimiuk E, Wielgat P, Braszko JJ. Candesartan, angiotensin II type 1 receptor blocker is able to relieve age-related cognitive impairment. Pharmacol Rep. 2018;70(1):87-92.
86. de Cavanagh EM, Piotrkowski B, Fraga CG. The interaction between the renin-angiotensin system and peroxisome proliferator activated receptors: a hypothesis including the participation of mitochondria in aging. Front Biosci. 2007;12:1049-62.
87. Tolea MI, Galvin JE. Sarcopenia and impairment in cognitive and physical performance. Clin Interv Aging. 2015;10:663-71.
88. Takane K, Hasegawa Y, Lin B, Koibuchi N, Cao C, Yokoo T, et al. Detrimental Effects of Centrally Administered Angiotensin II are Enhanced in a Mouse Model of Alzheimer Disease Independently of Blood Pressure. J Am Heart Assoc. 2017;6(4).
89. Iulita MF, Vallerand D, Beauvillier M, Haupert N, C AU, Gagne A, et al. Differential effect of angiotensin II and blood pressure on hippocampal inflammation in mice. J Neuroinflammation. 2018;15(1):62.
90. Zhang M, Mao Y, Ramirez SH, Tuma RF, Chabrashvili T. Angiotensin II induced cerebral microvascular inflammation and increased blood-brain barrier permeability via oxidative stress. Neuroscience. 2010;171(3):852-8.
91. Ganten D, Minnich JL, Granger P, Hayduk K, Brecht HM, Barbeau A, et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 1971;173(3991):64-5.
92. Ongali B, Nicolakakis N, Tong XK, Aboulkassim T, Papadopoulos P, Rosa-Neto P, et al. Angiotensin II type 1 receptor blocker losartan prevents and rescues cerebrovascular, neuropathological and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Neurobiol Dis. 2014;68:126-36.
93. Royea J, Zhang L, Tong XK, Hamel E. Angiotensin IV Receptors Mediate the Cognitive and Cerebrovascular Benefits of Losartan in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 2017;37(22):5562-73.
94. Wright JW, Stubley L, Pederson ES, Kramar EA, Hanesworth JM, Harding JW. Contributions of the brain angiotensin IV-AT4 receptor subtype system to spatial learning. J Neurosci. 1999;19(10):3952-61.
95. Tchekalarova J, Kambourova T, Georgiev V. Interaction between angiotensin IV and adenosine A(1) receptor related drugs in passive avoidance conditioning in rats. Behav Brain Res. 2001;123(1):113-6.
96. Albiston AL, Fernando RN, Yeatman HR, Burns P, Ng L, Daswani D, et al. Gene knockout of insulin-regulated aminopeptidase: loss of the specific binding site for angiotensin IV and age-related deficit in spatial memory. Neurobiol Learn Mem. 2010;93(1):19-30.
97. Haulica I, Bild W, Serban DN. Angiotensin peptides and their pleiotropic actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2005;6(3):121-31.
98. Ocaranza MP, Jalil JE. Protective Role of the ACE2/Ang-(1-9) Axis in Cardiovascular Remodeling. Int J Hypertens. 2012;2012:594361.
99. Lazaroni TL, Raslan AC, Fontes WR, de Oliveira ML, Bader M, Alenina N, et al. Angiotensin-(1-7)/Mas axis integrity is required for the expression of object recognition memory. Neurobiol Learn Mem. 2012;97(1):113-23.
100. Yang RF, Yin JX, Li YL, Zimmerman MC, Schultz HD. Angiotensin-(1-7) increases neuronal potassium current via a nitric oxide-dependent mechanism. Am J Physiol Cell Physiol. 2011;300(1):C58-64.
101. Mecca AP, Regenhardt RW, O'Connor TE, Joseph JP, Raizada MK, Katovich MJ, et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp Physiol. 2011;96(10):1084-96.
102. Drachman DA, Leavitt J. Human memory and the cholinergic system. A relationship to aging? Arch Neurol. 1974;30(2):113-21.
103. Sharma AC, Kulkarni SK. Evaluation of learning and memory mechanisms employing elevated plus-maze in rats and mice. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1992;16(1):117-25.
104. Deb D, Bairy KL, Nayak V, Rao M. Comparative Effect of Lisinopril and Fosinopril in Mitigating Learning and Memory Deficit in Scopolamine-Induced Amnesic Rats. Adv Pharmacol Sci. 2015;2015:521718.
105. Awasthi H, Kaushal D, Siddiqui HH. Chronic inhibition of central Angiotensin-converting enzyme ameliorates colchicine-induced memory impairment in mice. Sci Pharm. 2012;80(3):647-62.
106. Kumar A, Naidu PS, Seghal N, Padi SS. Neuroprotective effects of resveratrol against intracerebroventricular colchicine-induced cognitive impairment and oxidative stress in rats. Pharmacology. 2007;79(1):17-26.
107. Jawaid T, Jahan S, Kamal M. A comparative study of neuroprotective effect of angiotensin converting enzyme inhibitors against scopolamine-induced memory impairments in rats. Journal of advanced pharmaceutical technology & research. 2015;6(3):130-5.
108. Herman L, Bhimji S. Angiotensin converting enzyme inhibitors (ACEI) Treasure Island (FL)2017 [Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK431051/.
109. Benicky J, Sanchez-Lemus E, Honda M, Pang T, Orecna M, Wang J, et al. Angiotensin II AT1 receptor blockade ameliorates brain inflammation. Neuropsychopharmacology. 2011;36(4):857-70.
110. Wolf OT. Stress and memory in humans: twelve years of progress? Brain Res. 2009;1293:142-54.
111. Castren E, Saavedra JM. Repeated stress increases the density of angiotensin II binding sites in rat paraventricular nucleus and subfornical organ. Endocrinology. 1988;122(1):370-2.
112. Pang T, Wang J, Benicky J, Sanchez-Lemus E, Saavedra JM. Telmisartan directly ameliorates the neuronal inflammatory response to IL-1beta partly through the JNK/c-Jun and NADPH oxidase pathways. J Neuroinflammation. 2012;9:102.
113. Braszko JJ, Wincewicz D, Jakubow P. Candesartan prevents impairment of recall caused by repeated stress in rats. Psychopharmacology (Berl). 2013;225(2):421-8.
114. Braszko JJ. Participation of D 1-4 dopamine receptors in the pro-cognitive effects of angiotensin IV and des-Phe 6 angiotensin IV. Neurosci Biobehav Rev. 2010;34(3):343-50.
115. McCarthy CA, Vinh A, Callaway JK, Widdop RE. Angiotensin AT2 receptor stimulation causes neuroprotection in a conscious rat model of stroke. Stroke. 2009;40(4):1482-9.
116. Saavedra JM. Angiotensin II AT(1) receptor blockers as treatments for inflammatory brain disorders. Clin Sci (Lond). 2012;123(10):567-90.
117. Phillips MI, de Oliveira EM. Brain renin angiotensin in disease. J Mol Med (Berl). 2008;86(6):715-22.
118. Timaru-Kast R, Wyschkon S, Luh C, Schaible EV, Lehmann F, Merk P, et al. Delayed inhibition of angiotensin II receptor type 1 reduces secondary brain damage and improves functional recovery after experimental brain trauma*. Crit Care Med. 2012;40(3):935-44.
119. Felder RB. Mineralocorticoid receptors, inflammation and sympathetic drive in a rat model of systolic heart failure. Exp Physiol. 2010;95(1):19-25.
120. Ando H, Jezova M, Zhou J, Saavedra JM. Angiotensin II AT1 receptor blockade decreases brain artery inflammation in a stress-prone rat strain. Ann N Y Acad Sci. 2004;1018:345-50.
121. Timmermans PB, Wong PC, Chiu AT, Herblin WF, Smith RD. New perspectives in angiotensin system control. J Hum Hypertens. 1993;7 Suppl 2:S19-31.
122. Ongali B, Nicolakakis N, Tong XK, Aboulkassim T, Imboden H, Hamel E. Enalapril Alone or Co-Administered with Losartan Rescues Cerebrovascular Dysfunction, but not Mnemonic Deficits or Amyloidosis in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 2016;51(4):1183-95.
123. Alhusban A, Kozak A, Ergul A, Fagan SC. AT1 receptor antagonism is proangiogenic in the brain: BDNF a novel mediator. J Pharmacol Exp Ther. 2013;344(2):348-59.
124. Villapol S, Yaszemski AK, Logan TT, Sanchez-Lemus E, Saavedra JM, Symes AJ. Candesartan, an angiotensin II AT(1)-receptor blocker and PPAR-gamma agonist, reduces lesion volume and improves motor and memory function after traumatic brain injury in mice. Neuropsychopharmacology. 2012;37(13):2817-29.
125. Singh B, Sharma B, Jaggi AS, Singh N. Attenuating effect of lisinopril and telmisartan in intracerebroventricular streptozotocin induced experimental dementia of Alzheimer's disease type: possible involvement of PPAR-gamma agonistic property. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2013;14(2):124-36.
126. Catala-Lopez F, Martin-Serrano G, Macia MA, Montero D. Olmesartan for the prevention or delay of diabetic nephropathy: some considerations. Rev Esp Cardiol (Engl Ed). 2012;65(7):678-9; author reply 9-80.
127. Wang HW, Mizuta M, Saitoh Y, Noma K, Ueno H, Nakazato M. Glucagon-like peptide-1 and candesartan additively improve glucolipotoxicity in pancreatic beta-cells. Metabolism. 2011;60(8):1081-9.
128. Arumugam S, Sreedhar R, Thandavarayan RA, Karuppagounder V, Krishnamurthy P, Suzuki K, et al. Angiotensin receptor blockers: Focus on cardiac and renal injury. Trends Cardiovasc Med. 2016;26(3):221-8.
129. Cheng CI, Hsiao CC, Wu SC, Peng SY, Yip HK, Fu M, et al. Valsartan impairs angiogenesis of mesenchymal stem cells through Akt pathway. Int J Cardiol. 2013;167(6):2765-74.
130. Matsui T, Nishino Y, Maeda S, Takeuchi M, Yamagishi S. Irbesartan inhibits advanced glycation end product (AGE)-induced up-regulation of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) mRNA levels in glomerular endothelial cells. Microvasc Res. 2011;81(3):269-73.
131. Perry CM. Azilsartan Medoxomil. Clinical Drug Investigation. 2012;32(9):621-39.
132. Gu N, Kim BH, Lim KS, Kim SE, Nam WS, Yoon SH, et al. The effect of fimasartan, an angiotensin receptor type 1 blocker, on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin in healthy Korean male volunteers: a one-sequence, two-period crossover clinical trial. Clin Ther. 2012;34(7):1592-600.
133. Guimond MO, Gallo-Payet N. The Angiotensin II Type 2 Receptor in Brain Functions: An Update. Int J Hypertens. 2012;2012:351758.
134. Horiuchi M, Iwanami J, Mogi M. Regulation of angiotensin II receptors beyond the classical pathway. Clin Sci (Lond). 2012;123(4):193-203.
135. Grammatopoulos TN, Outeiro TF, Hyman BT, Standaert DG. Angiotensin II protects against alpha-synuclein toxicity and reduces protein aggregation in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2007;363(3):846-51.
136. Gendron L, Payet MD, Gallo-Payet N. The angiotensin type 2 receptor of angiotensin II and neuronal differentiation: from observations to mechanisms. J Mol Endocrinol. 2003;31(3):359-72.
137. Jing F, Mogi M, Sakata A, Iwanami J, Tsukuda K, Ohshima K, et al. Direct stimulation of angiotensin II type 2 receptor enhances spatial memory. J Cereb Blood Flow Metab. 2012;32(2):248-55.
138. King MV, Marsden CA, Fone KC. A role for the 5-HT(1A), 5-HT4 and 5-HT6 receptors in learning and memory. Trends Pharmacol Sci. 2008;29(9):482-92.
139. Besson JM, Chaouch A. Peripheral and spinal mechanisms of nociception. Physiol Rev. 1987;67(1):67-186.
140. IASP Terminology [Available from: http://www.iasp-pain.org/terminology?navItemNumber=576.
141. Melzack R, Wall PD. Pain mechanisms: a new theory. Science. 1965;150(3699):971-9.
142. Melzack R. From the gate to the neuromatrix. Pain. 1999;Suppl 6:S121-6.
143. Types of axons [Available from: https://www.slideshare.com/alisa-cash/nerve-conduction/anatomy_ns_note_1.pdf.
144. Cervero F, Merskey H. What is a noxious stimulus? Pain Forum. 1996;5(3):157-61.
145. Simone DA, Zhang X, Li J, Zhang JM, Honda CN, LaMotte RH, et al. Comparison of responses of primate spinothalamic tract neurons to pruritic and algogenic stimuli. J Neurophysiol. 2004;91(1):213-22.
146. Spinothalamic tracts [Available from: www.medicinebau.com/uploads/7/9/0/4/79048958/anatomy_ns_note_1.pdf.
147. Serpell M. Anatomy, physiology and pharmacology of pain. Surgery – Oxford International Edition. 2006;24(10):350-3.
148. Chen AC. Higher cortical modulation of pain perception in the human brain: Psychological determinant. Neurosci Bull. 2009;25(5):267-76.
149. Argoff C. Mechanisms of pain transmission and pharmacologic management. Current Medical Research and Opinion. 2011;27(10):2019-31.
150. Otsuka M, Yanagisawa M. Pain and neurotransmitters. Cellular and Molecular Neurobiology. 1990;10(3):293-302.
151. Otsuka M, Yanagisawa M. Pain and neurotransmitters. Cellular and molecular neurobiology. 1990;10(3):293-302.
152. Aiyer R, Mehta N, Gungor S, Gulati A. A Systematic Review of NMDA Receptor Antagonists for Treatment of Neuropathic Pain in Clinical Practice. Clin J Pain. 2018;34(5):450-67.
153. Meyer JS, Quenzer LF. Psychopharmacology : drugs, the brain, and behavior. Sunderland, Mass.: Sinauer Associates; 2005. xvii, 555 p. p.
154. Pirotte B, Francotte P, Goffin E, de Tullio P. AMPA receptor positive allosteric modulators: a patent review. Expert Opin Ther Pat. 2013;23(5):615-28.
155. Bleakman D. Kainate receptor pharmacology and physiology. Cell Mol Life Sci. 1999;56(7-8):558-66.
156. Swanson CJ, Bures M, Johnson MP, Linden AM, Monn JA, Schoepp DD. Metabotropic glutamate receptors as novel targets for anxiety and stress disorders. Nature reviews Drug discovery. 2005;4(2):131-44.
157. Lujan R, Shigemoto R, Lopez-Bendito G. Glutamate and GABA receptor signalling in the developing brain. Neuroscience. 2005;130(3):567-80.
158. Wu C, Sun D. GABA receptors in brain development, function, and injury. Metab Brain Dis. 2015;30(2):367-79.
159. Zeilhofer HU, Wildner H, Yevenes GE. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 2012;92(1):193-235.
160. Razak MA, Begum PS, Viswanath B, Rajagopal S. Multifarious Beneficial Effect of Nonessential Amino Acid, Glycine: A Review. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:1716701.
161. Vanden Broeck J, Torfs H, Poels J, Van Poyer W, Swinnen E, Ferket K, et al. Tachykinin-like peptides and their receptors. A review. Ann N Y Acad Sci. 1999;897:374-87.
162. Johnson MB, Young AD, Marriott I. The Therapeutic Potential of Targeting Substance P/NK-1R Interactions in Inflammatory CNS Disorders. Front Cell Neurosci. 2016;10:296.
163. Altamura M. Tachykinin NK2 receptor antagonists. A patent review (2006 – 2010). Expert Opin Ther Pat. 2012;22(1):57-77.
164. Reichmann F, Holzer P. Neuropeptide Y: A stressful review. Neuropeptides. 2016;55:99-109.
165. Delgado M, Ganea D. Vasoactive intestinal peptide: a neuropeptide with pleiotropic immune functions. Amino Acids. 2013;45(1):25-39.
166. Gonzalez-Rey E, Varela N, Chorny A, Delgado M. Therapeutical approaches of vasoactive intestinal peptide as a pleiotropic immunomodulator. Curr Pharm Des. 2007;13(11):1113-39.
167. Guo M, Qu X, Qin X-Q. Bombesin-like peptides and their receptors: recent findings in pharmacology and physiology. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 2015;22(1):3-8.
168. Kleczkowska P, Lipkowski AW. Neurotensin and neurotensin receptors: characteristic, structure-activity relationship and pain modulation–a review. Eur J Pharmacol. 2013;716(1-3):54-60.
169. Herz A, Millan MJ. Opioids and opioid receptors mediating antinociception at various levels of the neuraxis. Physiologia Bohemoslovaca. 1990;39(5):395-401.
170. Enna SJ, Ferkany JW, Strong R. Drug-induced alterations in neurotransmitter receptor binding and function. Advances in biochemical psychopharmacology. 1980;21:253-63.
171. Sauer-Ramirez JL, Ballesteros LM, Hernandez-Perez O. [Galanin, a new neuropeptide. Review]. Ginecologia y obstetricia de Mexico. 1996;64:325-31.
172. Welzel K, Welzel D. Increase of pain threshold by calcitonin during electrical stimulation of the dental pulp. Investigations in healthy volunteers with regard to plasma concentration. Schmerz. 1989;3(3):118-32.
173. Berger M, Gray JA, Roth BL. The expanded biology of serotonin. Annual review of medicine. 2009;60:355-66.
174. Eisenhofer G, Kopin IJ, Goldstein DS. Catecholamine metabolism: a contemporary view with implications for physiology and medicine. Pharmacological reviews. 2004;56(3):331-49.
175. MOHAMMED MS. A REVIEW ON THE PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY OF ACETYLCHOLINE RECEPTORS AT THE NEUROMUSCULAR JUNCTION.
176. Albuquerque EX, Pereira EF, Alkondon M, Rogers SW. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function. Physiol Rev. 2009;89(1):73-120.
177. Kruse AC, Kobilka BK, Gautam D, Sexton PM, Christopoulos A, Wess J. Muscarinic acetylcholine receptors: novel opportunities for drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 2014;13:549.
178. Holton FA, Holton P. The capillary dilator substances in dry powders of spinal roots; a possible role of adenosine triphosphate in chemical transmission from nerve endings. The Journal of physiology. 1954;126(1):124-40.
179. Burnstock G. Purinergic nerves. Pharmacol Rev. 1972;24(3):509-81.
180. Burnstock G. Purinergic signalling–an overview. Novartis Found Symp. 2006;276:26-48; discussion -57, 275-81.
181. Wiesinger H. Arginine metabolism and the synthesis of nitric oxide in the nervous system. Prog Neurobiol. 2001;64(4):365-91.
182. Choi SR, Kwon SG, Choi HS, Han HJ, Beitz AJ, Lee JH. Neuronal NOS Activates Spinal NADPH Oxidase 2 Contributing to Central Sigma-1 Receptor-Induced Pain Hypersensitivity in Mice. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):1922-31.
183. Bali A, Singh N, Jaggi AS. Renin-angiotensin system in pain: existing in a double life? J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2014;15(4):329-40.
184. Marques-Lopes J, Pinto M, Pinho D, Morato M, Patinha D, Albino-Teixeira A, et al. Microinjection of angiotensin II in the caudal ventrolateral medulla induces hyperalgesia. Neuroscience. 2009;158(4):1301-10.
185. Pavel J, Oroszova Z, Hricova L, Lukacova N. Effect of subpressor dose of angiotensin II on pain-related behavior in relation with neuronal injury and activation of satellite glial cells in the rat dorsal root ganglia. Cell Mol Neurobiol. 2013;33(5):681-8.
186. Jaggi AS, Singh N. Exploring the potential of telmisartan in chronic constriction injury-induced neuropathic pain in rats. Eur J Pharmacol. 2011;667(1-3):215-21.
187. Empl M, Renaud S, Erne B, Fuhr P, Straube A, Schaeren-Wiemers N, et al. TNF-alpha expression in painful and nonpainful neuropathies. Neurology. 2001;56(10):1371-7.
188. Rao C, Krishna G. Effects of captopril and losartan on thermal and chemical induced pain in mice. Indian journal of physiology and pharmacology. 2006;50(2):169-74.
189. Kalra J, Chaturvedi A, Kalra S, Chaturvedi H, Dhasmana D. Modulation of pain perception by ramipril and losartan in human volunteers. Indian J Physiol Pharmacol. 2008;52(1):91-6.
190. Kukkar A, Singh N, Jaggi AS. Neuropathic pain-attenuating potential of aliskiren in chronic constriction injury model in rats. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2013;14(2):116-23.
191. Popescu R, Bild W, Ciobica A, Bild V. New evidence for vascular interactions between aldosterone, angiotensin II and antioxidants in isolated smooth muscle cells of rats. Open Medicine. 2012;7(6):704-12.
192. Tatsumi S, Mabuchi T, Katano T, Matsumura S, Abe T, Hidaka H, et al. Involvement of Rho-kinase in inflammatory and neuropathic pain through phosphorylation of myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS). Neuroscience. 2005;131(2):491-8.
193. Yogi A, Callera GE, O'Connor S, Antunes TT, Valinsky W, Miquel P, et al. Aldosterone signaling through transient receptor potential melastatin 7 cation channel (TRPM7) and its alpha-kinase domain. Cell Signal. 2013;25(11):2163-75.
194. Tronvik E, Stovner LJ. Role of angiotensin modulation in primary headaches. Curr Pain Headache Rep. 2014;18(5):417.
195. Guethe LM, Pelegrini-da-Silva A, Borelli KG, Juliano MA, Pelosi GG, Pesquero JB, et al. Angiotensin (5-8) modulates nociception at the rat periaqueductal gray via the NO-sGC pathway and an endogenous opioid. Neuroscience. 2013;231:315-27.
196. Nemoto W, Ogata Y, Nakagawasai O, Yaoita F, Tanado T, Tan-No K. The intrathecal administration of losartan, an AT1 receptor antagonist, produces an antinociceptive effect through the inhibiton of p38 MAPK phosphorylation in the mouse formalin test. Neurosci Lett. 2015;585:17-22.
197. Nemoto W, Ogata Y, Nakagawasai O, Yaoita F, Tadano T, Tan-No K. Angiotensin (1-7) prevents angiotensin II-induced nociceptive behaviour via inhibition of p38 MAPK phosphorylation mediated through spinal Mas receptors in mice. Eur J Pain. 2014;18(10):1471-9.
198. Castor MG, Santos RA, Duarte ID, Romero TR. Angiotensin-(1-7) through Mas receptor activation induces peripheral antinociception by interaction with adrenoreceptors. Peptides. 2015;69:80-5.
199. Eardley W, Toth C. An open-label, non-randomized comparison of venlafaxine and gabapentin as monotherapy or adjuvant therapy in the management of neuropathic pain in patients with peripheral neuropathy. J Pain Res. 2010;3:33-49.
200. Mika J, Zychowska M, Makuch W, Rojewska E, Przewlocka B. Neuronal and immunological basis of action of antidepressants in chronic pain – clinical and experimental studies. Pharmacol Rep. 2013;65(6):1611-21.
201. Cusack B, Nelson A, Richelson E. Binding of antidepressants to human brain receptors: focus on newer generation compounds. Psychopharmacology (Berl). 1994;114(4):559-65.
202. Wander TJ, Nelson A, Okazaki H, Richelson E. Antagonism by antidepressants of serotonin S1 and S2 receptors of normal human brain in vitro. European journal of pharmacology. 1986;132(2-3):115-21.
203. Kostadinov ID, Delev DP, Kostadinova, II. Antinociceptive effect of clomipramine through interaction with serotonin 5-HT2 and 5-HT3 receptor subtypes. Folia medica. 2012;54(4):69-77.
204. Kesic M, Tvrdeic A, Kolaric D, Stojkovic R, Cicin-Sain L. Serotonergic modulation of pain and analgesic responses: a study in rats with constitutionally altered serotonin transporters. Eur J Pain. 2015;19(4):508-15.
205. Rosenberg MB, Carroll FI, Negus SS. Effects of monoamine reuptake inhibitors in assays of acute pain-stimulated and pain-depressed behavior in rats. J Pain. 2013;14(3):246-59.
206. Kariuki HN, Kanui TI, Kioy PG. Antinociceptive potentiation of pethidine (demerol) by clomipramine in the late phase of formalin test in mice. The Pan African medical journal. 2012;12:28.
207. Farghaly HS, Abdel-Zaher AO, Mostafa MG, Kotb HI. Comparative evaluation of the effect of tricyclic antidepressants on inducible nitric oxide synthase expression in neuropathic pain model. Nitric Oxide. 2012;27(2):88-94.
208. Kundermann B, Hemmeter-Spernal J, Strate P, Gebhardt S, Huber MT, Krieg JC, et al. Pain sensitivity in major depression and its relationship to central serotoninergic function as reflected by the neuroendocrine response to clomipramine. J Psychiatr Res. 2009;43(16):1253-61.
209. Fuxe K, Ogren SO, Agnati L, Gustafsson JA, Jonsson G. On the mechanism of action of the antidepressant drugs amitriptyline and nortriptyline. Evidence for 5-hydroxytryptamine receptor blocking activity. Neurosci Lett. 1977;6(4):339-43.
210. Charney DS, Menkes DB, Heninger GR. Receptor sensitivity and the mechanism of action of antidepressant treatment. Implications for the etiology and therapy of depression. Arch Gen Psychiatry. 1981;38(10):1160-80.
211. Hadley GR, Gayle JA, Ripoll J, Jones MR, Argoff CE, Kaye RJ, et al. Post-herpetic Neuralgia: a Review. Current pain and headache reports. 2016;20(3):17.
212. Haviv Y, Khan J, Zini A, Almoznino G, Sharav Y, Benoliel R. Trigeminal neuralgia (part I): Revisiting the clinical phenotype. Cephalalgia. 2016;36(8):730-46.
213. Gilron I, Tu D, Holden RR, Jackson AC, DuMerton-Shore D. Combination of morphine with nortriptyline for neuropathic pain. Pain. 2015;156(8):1440-8.
214. Derry S, Wiffen PJ, Aldington D, Moore RA. Nortriptyline for neuropathic pain in adults. Cochrane Database Syst Rev. 2015;1:CD011209.
215. Singh H, Becker PM. Novel therapeutic usage of low-dose doxepin hydrochloride. Expert Opin Investig Drugs. 2007;16(8):1295-305.
216. Zychowska M, Rojewska E, Makuch W, Przewlocka B, Mika J. The influence of microglia activation on the efficacy of amitriptyline, doxepin, milnacipran, venlafaxine and fluoxetine in a rat model of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 2015;749:115-23.
217. Mika J, Jurga AM, Starnowska J, Wasylewski M, Rojewska E, Makuch W, et al. Effects of chronic doxepin and amitriptyline administration in naive mice and in neuropathic pain mice model. Neuroscience. 2015;294:38-50.
218. Krskova L, Vrabcova M, Talarovicova A, Zeman M. Influence of up-regulated renin-angiotensin system on the exploration, anxiety-related behavior and object recognition. Acta Biol Hung. 2009;60(4):369-83.
219. Jochemsen HM, Teunissen CE, Ashby EL, van der Flier WM, Jones RE, Geerlings MI, et al. The association of angiotensin-converting enzyme with biomarkers for Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2014;6(3):27.
220. Bild W, Hritcu L, Stefanescu C, Ciobica A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2013;43:79-88.
221. Arcan O, Ciobica A, Bild W, Stoica B, Hritcu L, Cojocaru D. The Effects of Central Angiotensin II and Its Specific Blockers on Nociception. Possible Interactions with Oxidative Stress Status/Efekti Centralnog Angiotenzina II I Njegovih Specifičnih Blokatora Na Nocicepciju. Moguće Interakcije Sa Statusom Oksidativnog Stresa. Journal of Medical Biochemistry. 2013;32(1):52-8.
222. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. 2010;L 276/33.
223. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals [Available from: https://www.avma.org/KB/policies/pages/euthanasia-Guidelines.aspx.
224. Heel RC, Brogden RN, Speight TM, Avery GS. Captopril: a preliminary review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy. Drugs. 1980;20(6):409-52.
225. Patchett AA, Harris E, Tristram EW, Wyvratt MJ, Wu MT, Taub D, et al. A new class of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Nature. 1980;288(5788):280-3.
226. Serrano-Rodriguez JM, Gomez-Diez M, Esgueva M, Castejon-Riber C, Mena-Bravo A, Priego-Capote F, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of ramipril and ramiprilat after intravenous and oral doses of ramipril in healthy horses. Vet J. 2016;208:38-43.
227. Gavras HP, Salerno CM. The angiotensin II type 1 receptor blocker losartan in clinical practice: a review. Clin Ther. 1996;18(6):1058-67; discussion 7.
228. Wzgarda A, Kleszcz R, Prokop M, Regulska K, Regulski M, Paluszczak J, et al. Unknown face of known drugs – what else can we expect from angiotensin converting enzyme inhibitors? Eur J Pharmacol. 2017;797:9-19.
229. Nishikawa K, Naka T, Chatani F, Yoshimura Y. Candesartan cilexetil: a review of its preclinical pharmacology. J Hum Hypertens. 1997;11 Suppl 2:S9-17.
230. Saavedra JM. Beneficial effects of Angiotensin II receptor blockers in brain disorders. Pharmacol Res. 2017;125(Pt A):91-103.
231. El-Sherbiny DA, Khalifa AE, Attia AS, Eldenshary Eel D. Hypericum perforatum extract demonstrates antioxidant properties against elevated rat brain oxidative status induced by amnestic dose of scopolamine. Pharmacol Biochem Behav. 2003;76(3-4):525-33.
232. Misane I, Ogren SO. Selective 5-HT1A antagonists WAY 100635 and NAD-299 attenuate the impairment of passive avoidance caused by scopolamine in the rat. Neuropsychopharmacology. 2003;28(2):253-64.
233. Oh JH, Choi BJ, Chang MS, Park SK. Nelumbo nucifera semen extract improves memory in rats with scopolamine-induced amnesia through the induction of choline acetyltransferase expression. Neurosci Lett. 2009;461(1):41-4.
234. Prut L, Belzung C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review. Eur J Pharmacol. 2003;463(1-3):3-33.
235. Ciobica A, Olteanu Z, Padurariu M, Hritcu L. The effects of pergolide on memory and oxidative stress in a rat model of Parkinson's disease. J Physiol Biochem. 2012;68(1):59-69.
236. Obara Y, Haganuma A, Murakami S, Chiba T, Mori K, Nakagawasai O, et al. 5,19-cyclo-9beta,10xi-androstane-3,17-dione promotes neurotrophic factor biosynthesis in 1321N1 human astrocytoma cells and improves passive avoidance learning impairment. Brain Res. 2007;1184:57-64.
237. Ramos A, Pereira E, Martins GC, Wehrmeister TD, Izidio GS. Integrating the open field, elevated plus maze and light/dark box to assess different types of emotional behaviors in one single trial. Behav Brain Res. 2008;193(2):277-88.
238. Walf AA, Frye CA. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2007;2(2):322-8.
239. Dawson GR, Tricklebank MD. Use of the elevated plus maze in the search for novel anxiolytic agents. Trends Pharmacol Sci. 1995;16(2):33-6.
240. van Kats JP, Danser AH, van Meegen JR, Sassen LM, Verdouw PD, Schalekamp MA. Angiotensin production by the heart: a quantitative study in pigs with the use of radiolabeled angiotensin infusions. Circulation. 1998;98(1):73-81.
241. Lanke J, Mansson L, Bjerkemo M, Kjellstrand P. Spatial memory and stereotypic behaviour of animals in radial arm mazes. Brain Res. 1993;605(2):221-8.
242. Durkin TP. Spatial working memory over long retention intervals: dependence on sustained cholinergic activation in the septohippocampal or nucleus basalis magnocellularis-cortical pathways? Neuroscience. 1994;62(3):681-93.
243. Artenie V, Ungureanu E, Negura A. Methods of Investigation Glucidic and Lipidic Metabolism (in Romanian), Ed. Pim; 2008.
244. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248-54.
245. Timmermans PB, Wong PC, Chiu AT, Herblin WF, Benfield P, Carini DJ, et al. Angiotensin II receptors and angiotensin II receptor antagonists. Pharmacol Rev. 1993;45(2):205-51.
246. Brewster UC, Perazella MA. The renin-angiotensin-aldosterone system and the kidney: effects on kidney disease. Am J Med. 2004;116(4):263-72.
247. Jaffe RJ, Novakovic V, Peselow ED. Scopolamine as an antidepressant: a systematic review. Clinical neuropharmacology. 2013;36(1):24-6.
248. Navarria A, Wohleb ES, Voleti B, Ota KT, Dutheil S, Lepack AE, et al. Rapid antidepressant actions of scopolamine: Role of medial prefrontal cortex and M1-subtype muscarinic acetylcholine receptors. Neurobiology of disease. 2015;82:254-61.
249. Kim S, Iwao H. Molecular and cellular mechanisms of angiotensin II-mediated cardiovascular and renal diseases. Pharmacol Rev. 2000;52(1):11-34.
250. Moulik S, Speth RC, Turner BB, Rowe BP. Angiotensin II receptor subtype distribution in the rabbit brain. Exp Brain Res. 2002;142(2):275-83.
251. Kobori H, Prieto-Carrasquero MC, Ozawa Y, Navar LG. AT1 receptor mediated augmentation of intrarenal angiotensinogen in angiotensin II-dependent hypertension. Hypertension. 2004;43(5):1126-32.
252. Iwai N, Inagami T, Ohmichi N, Kinoshita M. Renin is expressed in rat macrophage/monocyte cells. Hypertension. 1996;27(3 Pt 1):399-403.
253. Karlsson C, Lindell K, Ottosson M, Sjostrom L, Carlsson B, Carlsson LM. Human adipose tissue expresses angiotensinogen and enzymes required for its conversion to angiotensin II. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83(11):3925-9.
254. Bild W, Ciobica A. Angiotensin-(1-7) central administration induces anxiolytic-like effects in elevated plus maze and decreased oxidative stress in the amygdala. J Affect Disord. 2013;145(2):165-71.
255. Ciobica A, Hritcu L, Nastasa V, Padurariu M, Bild W. Inhibition of central angiotensin converting enzyme exerts anxiolytic effects by decreasing brain oxidative stress. Journal of Medical Biochemistry. 2011;30(2):109-14.
256. Bonini JS, Bevilaqua LR, Zinn CG, Kerr DS, Medina JH, Izquierdo I, et al. Angiotensin II disrupts inhibitory avoidance memory retrieval. Horm Behav. 2006;50(2):308-13.
257. Inaba S, Iwai M, Furuno M, Tomono Y, Kanno H, Senba I, et al. Continuous activation of renin-angiotensin system impairs cognitive function in renin/angiotensinogen transgenic mice. Hypertension. 2009;53(2):356-62.
258. Braszko JJ. AT(2) but not AT(1) receptor antagonism abolishes angiotensin II increase of the acquisition of conditioned avoidance responses in rats. Behav Brain Res. 2002;131(1-2):79-86.
259. Braszko JJ. Valsartan abolishes most of the memory-improving effects of intracerebroventricular angiotensin II in rats. Clin Exp Hypertens. 2005;27(8):635-49.
260. Shepherd J, Bill DJ, Dourish CT, Grewal SS, McLenachan A, Stanhope KJ. Effects of the selective angiotensin II receptor antagonists losartan and PD123177 in animal models of anxiety and memory. Psychopharmacology (Berl). 1996;126(3):206-18.
261. Braszko JJ, Kulakowska A, Winnicka MM. Effects of angiotensin II and its receptor antagonists on motor activity and anxiety in rats. J Physiol Pharmacol. 2003;54(2):271-81.
262. Okuyama S, Sakagawa T, Inagami T. Role of the angiotensin II type-2 receptor in the mouse central nervous system. Jpn J Pharmacol. 1999;81(3):259-63.
263. Singh B, Mourya A, Sah SP, Kumar A. Protective effect of losartan and ramipril against stress induced insulin resistance and related complications: Anti-inflammatory mechanisms. Eur J Pharmacol. 2017;801:54-61.
264. Jeong EJ, Lee KY, Kim SH, Sung SH, Kim YC. Cognitive-enhancing and antioxidant activities of iridoid glycosides from Scrophularia buergeriana in scopolamine-treated mice. Eur J Pharmacol. 2008;588(1):78-84.
265. Jones RW, Wesnes KA, Kirby J. Effects of NMDA modulation in scopolamine dementia. Ann N Y Acad Sci. 1991;640:241-4.
266. Buccafusco JJ. The Revival of Scopolamine Reversal for the Assessment of Cognition-Enhancing Drugs. In: nd, Buccafusco JJ, editors. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. Frontiers in Neuroscience. Boca Raton (FL)2009.
267. Saito K, Honda S, Egawa M, Tobe A. Effects of bifemelane hydrochloride (MCI-2016) on acetylcholine release from cortical and hippocampal slices of rats. Jpn J Pharmacol. 1985;39(3):410-4.
268. Espallergues J, Galvan L, Lepourry L, Bonafos B, Maurice T, Chatonnet A. Hyposensitivity to the amnesic effects of scopolamine or amyloid beta(25-35) peptide in heterozygous acetylcholinesterase knockout (AChE(+/-)) mice. Chem Biol Interact. 2008;175(1-3):131-4.
269. Malikowska N, Salat K, Podkowa A. Comparison of pro-amnesic efficacy of scopolamine, biperiden, and phencyclidine by using passive avoidance task in CD-1 mice. J Pharmacol Toxicol Methods. 2017;86:76-80.
270. Bindra D, Thompson WR. An evaluation of defecation and urination as measures of fearfulness. J Comp Physiol Psychol. 1953;46(1):43-5.
271. Mineka S, Zinbarg R. Conditioning and ethological models of anxiety disorders: stress-in-dynamic-context anxiety models. Nebr Symp Motiv. 1996;43:135-210.
272. Wincewicz D, Braszko JJ. Telmisartan attenuates cognitive impairment caused by chronic stress in rats. Pharmacol Rep. 2014;66(3):436-41.
273. Wincewicz D, Braszko JJ. Angiotensin II AT1 receptor blockade by telmisartan reduces impairment of spatial maze performance induced by both acute and chronic stress. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2015;16(3):495-505.
274. Ciobica A, Bild V, Hritcu L, Padurariu M, Bild W. Effects of angiotensin II receptor antagonists on anxiety and some oxidative stress markers in rat. Cent Eur J Med. 2011;6(3):331-40.
275. Braszko JJ, Kupryszewski G, Witczuk B, Wisniewski K. Angiotensin II-(3-8)-hexapeptide affects motor activity, performance of passive avoidance and a conditioned avoidance response in rats. Neuroscience. 1988;27(3):777-83.
276. Maul B, von Bohlen und Halbach O, Becker A, Sterner-Kock A, Voigt JP, Siems WE, et al. Impaired spatial memory and altered dendritic spine morphology in angiotensin II type 2 receptor-deficient mice. J Mol Med (Berl). 2008;86(5):563-71.
277. Walther T, Voigt JP, Fukamizu A, Fink H, Bader M. Learning and anxiety in angiotensin-deficient mice. Behav Brain Res. 1999;100(1-2):1-4.
278. Chalas A, Conway EL. No evidence for involvement of angiotensin II in spatial learning in water maze in rats. Behav Brain Res. 1996;81(1-2):199-205.
279. Sharma B, Singh N. Experimental hypertension induced vascular dementia: pharmacological, biochemical and behavioral recuperation by angiotensin receptor blocker and acetylcholinesterase inhibitor. Pharmacol Biochem Behav. 2012;102(1):101-8.
280. Goel R, Bhat SA, Hanif K, Nath C, Shukla R. Angiotensin II Receptor Blockers Attenuate Lipopolysaccharide-Induced Memory Impairment by Modulation of NF-kappaB-Mediated BDNF/CREB Expression and Apoptosis in Spontaneously Hypertensive Rats. Mol Neurobiol. 2018;55(2):1725-39.
281. Rygiel K. Can angiotensin-converting enzyme inhibitors impact cognitive decline in early stages of Alzheimer's disease? An overview of research evidence in the elderly patient population. J Postgrad Med. 2016;62(4):242-8.
282. Padurariu M, Ciobica A, Hritcu L, Stoica B, Bild W, Stefanescu C. Changes of some oxidative stress markers in the serum of patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2010;469(1):6-10.
283. O'Caoimh R, Kehoe PG, Molloy DW. Renin Angiotensin aldosterone system inhibition in controlling dementia-related cognitive decline. J Alzheimers Dis. 2014;42 Suppl 4:S575-86.
284. Lopez-Real A, Rey P, Soto-Otero R, Mendez-Alvarez E, Labandeira-Garcia JL. Angiotensin-converting enzyme inhibition reduces oxidative stress and protects dopaminergic neurons in a 6-hydroxydopamine rat model of Parkinsonism. J Neurosci Res. 2005;81(6):865-73.
285. Firouzabadi N, Ghazanfari N, Alavi Shoushtari A, Erfani N, Fathi F, Bazrafkan M, et al. Genetic Variants of Angiotensin-Converting Enzyme Are Linked to Autism: A Case-Control Study. PLoS One. 2016;11(4):e0153667.
286. Wahlbeck K, Ahokas A, Nikkila H, Miettinen K, Rimon R. Cerebrospinal fluid angiotensin-converting enzyme (ACE) correlates with length of illness in schizophrenia. Schizophr Res. 2000;41(2):335-40.
287. Wahlbeck K, Ahokas A, Miettinen K, Nikkila H, Rimon R. Higher cerebrospinal fluid angiotensin-converting enzyme levels in neuroleptic-treated than in drug-free patients with schizophrenia. Schizophr Bull. 1998;24(3):391-7.
288. Danielyan L, Klein R, Hanson LR, Buadze M, Schwab M, Gleiter CH, et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Res. 2010;13(2-3):195-201.
289. Balmus IM, Ciobica A. Main Plant Extracts' Active Properties Effective on Scopolamine-Induced Memory Loss. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2017;32(7):418-28.
290. Marinzalda Mde L, Perez PA, Gargiulo PA, Casarsa BS, Bregonzio C, Baiardi G. Fear-potentiated behaviour is modulated by central amygdala angiotensin II AT1 receptors stimulation. Biomed Res Int. 2014;2014:183248.
291. Llano Lopez LH, Caif F, Garcia S, Fraile M, Landa AI, Baiardi G, et al. Anxiolytic-like effect of losartan injected into amygdala of the acutely stressed rats. Pharmacol Rep. 2012;64(1):54-63.
292. Yu Z, Zhao W, Ding L, Yu Y, Liu J. Anxiolytic effects of ACE inhibitory peptides on the behavior of rats in an elevated plus-maze. Food Funct. 2016;7(1):491-7.
293. Diniz C, Casarotto PC, Fred SM, Biojone C, Castren E, Joca SRL. Antidepressant-like effect of losartan involves TRKB transactivation from angiotensin receptor type 2 (AGTR2) and recruitment of FYN. Neuropharmacology. 2018;135:163-71.
294. Marvar PJ, Goodman J, Fuchs S, Choi DC, Banerjee S, Ressler KJ. Angiotensin type 1 receptor inhibition enhances the extinction of fear memory. Biol Psychiatry. 2014;75(11):864-72.
295. Labandeira-Garcia JL, Rodriguez-Pallares J, Rodriguez-Perez AI, Garrido-Gil P, Villar-Cheda B, Valenzuela R, et al. Brain angiotensin and dopaminergic degeneration: relevance to Parkinson's disease. Am J Neurodegener Dis. 2012;1(3):226-44.
296. Abareshi A, Hosseini M, Beheshti F, Norouzi F, Khazaei M, Sadeghnia HR, et al. The effects of captopril on lipopolysaccharide induced learning and memory impairments and the brain cytokine levels and oxidative damage in rats. Life Sci. 2016;167:46-56.
297. Nade VS, Kawale LA, Valte KD, Shendye NV. Cognitive enhancing effect of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers on learning and memory. Indian J Pharmacol. 2015;47(3):263-9.
298. Seibenhener ML, Wooten MC. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. J Vis Exp. 2015(96):e52434.
299. Srinivasan J, Suresh B, Ramanathan M. Differential anxiolytic effect of enalapril and losartan in normotensive and renal hypertensive rats. Physiol Behav. 2003;78(4-5):585-91.
300. Amenta F, Mignini F, Rabbia F, Tomassoni D, Veglio F. Protective effect of anti-hypertensive treatment on cognitive function in essential hypertension: analysis of published clinical data. J Neurol Sci. 2002;203-204:147-51.
301. Anderson C, Teo K, Gao P, Arima H, Dans A, Unger T, et al. Renin-angiotensin system blockade and cognitive function in patients at high risk of cardiovascular disease: analysis of data from the ONTARGET and TRANSCEND studies. Lancet Neurol. 2011;10(1):43-53.
302. Nayak V, Patil PA. Antidepressant activity of fosinopril, ramipril and losartan, but not of lisinopril in depressive paradigms of albino rats and mice. Indian J Exp Biol. 2008;46(3):180-4.
303. Bali A, Jaggi AS. Investigations in foot shock stress of variable intensity in mice: Adaptation and role of angiotensin II. Eur J Pharmacol. 2015;761:86-94.
304. Einat H, Ezer I, Kara NZ, Belzung C. Individual responses of rodents in modelling of affective disorders and in their treatment: prospective review. Acta Neuropsychiatr. 2018:1-6.
305. Gironacci MM, Vicario A, Cerezo G, Silva MG. The depressor axis of the renin-angiotensin system and brain disorders: a translational approach. Clin Sci (Lond). 2018;132(10):1021-38.
306. Tota S, Goel R, Pachauri SD, Rajasekar N, Najmi AK, Hanif K, et al. Effect of angiotensin II on spatial memory, cerebral blood flow, cholinergic neurotransmission, and brain derived neurotrophic factor in rats. Psychopharmacology (Berl). 2013;226(2):357-69.
307. Duchemin S, Belanger E, Wu R, Ferland G, Girouard H. Chronic perfusion of angiotensin II causes cognitive dysfunctions and anxiety in mice. Physiol Behav. 2013;109:63-8.
308. Ferguson SA, Cada AM. Spatial learning/memory and social and nonsocial behaviors in the spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley rat strains. Pharmacol Biochem Behav. 2004;77(3):583-94.
309. Bhatt SR, Lokhandwala MF, Banday AA. Vascular oxidative stress upregulates angiotensin II type I receptors via mechanisms involving nuclear factor kappa B. Clin Exp Hypertens. 2014;36(6):367-73.
310. Kouemou NE, Taiwe GS, Moto FCO, Pale S, Ngoupaye GT, Njapdounke JSK, et al. Nootropic and Neuroprotective Effects of Dichrocephala integrifolia on Scopolamine Mouse Model of Alzheimer's Disease. Front Pharmacol. 2017;8:847.
311. Armbruster DA, Gruemer HD. The regional variability of enzymes in the brain: relevance to CSF enzyme determinations. Clin Chim Acta. 1988;175(3):227-38.
312. Fujita H, Sakamoto T, Komatsu K, Fujishima H, Morii T, Narita T, et al. Reduction of circulating superoxide dismutase activity in type 2 diabetic patients with microalbuminuria and its modulation by telmisartan therapy. Hypertens Res. 2011;34(12):1302-8.
313. Pan Y, Qiao QY, Pan LH, Zhou DC, Hu C, Gu HF, et al. Losartan reduces insulin resistance by inhibiting oxidative stress and enhancing insulin signaling transduction. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2015;123(3):170-7.
314. Kiran VU, Rajaiah NV, Krishna DR, Reddy YN. Effect of losartan and ramipril on oxidative stress and anti-oxidant status in South Indian hypertensive patients. Int J Pharmacol. 2010;6(91):6-920.
315. Mitu F, Cojocaru E, Andreea G, Leon M-M. BLOCANȚII RECEPTORILOR PENTRU ANGIOTENSINĂ I ȘI II ȘI REZULTATELE CARDIOVASCULARE. Internal Medicine/Medicina Interna. 2014;11(2).
316. Kucuk M, Kaya M, Kalayci R, Cimen V, Kudat H, Arican N, et al. Effects of losartan on the blood-brain barrier permeability in long-term nitric oxide blockade-induced hypertensive rats. Life Sci. 2002;71(8):937-46.
317. He DH, Zhang LM, Lin LM, Ning RB, Wang HJ, Xu CS, et al. Long-term prehypertension treatment with losartan effectively prevents brain damage and stroke in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Int J Mol Med. 2014;33(2):301-9.
318. Saavedra JM, Sanchez-Lemus E, Benicky J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 2011;36(1):1-18.
319. Osherovich L. New muscle for ARB strategy. Science-Business eXchange. 2011;4(21):587-.
320. Spurney CF, Sali A, Guerron AD, Iantorno M, Yu Q, Gordish-Dressman H, et al. Losartan decreases cardiac muscle fibrosis and improves cardiac function in dystrophin-deficient mdx mice. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16(1):87-95.
321. Xu F, Mao C, Hu Y, Rui C, Xu Z, Zhang L. Cardiovascular effects of losartan and its relevant clinical application. Curr Med Chem. 2009;16(29):3841-57.
322. Hohle S, Culman J, Boser M, Qadri F, Unger T. Effect of angiotensin AT2 and muscarinic receptor blockade on osmotically induced vasopressin release. Eur J Pharmacol. 1996;300(1-2):119-23.
323. Elias JA, Delfino VD, Barbosa DS, Fabris BA, Matsuo T. [Effects of ramipril and simvastatin on the oxidative stress of diabetic rats]. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2008;52(7):1131-8.
324. Liang W, Tan CY, Ang L, Sallam N, Granville DJ, Wright JM, et al. Ramipril improves oxidative stress-related vascular endothelial dysfunction in db/db mice. J Physiol Sci. 2008;58(6):405-11.
325. Dinicolantonio JJ, Lavie CJ, O'Keefe JH. Not all angiotensin-converting enzyme inhibitors are equal: focus on ramipril and perindopril. Postgrad Med. 2013;125(4):154-68.
326. Ascar GIRD, Alicia D.; Silva, Guillermo B.; et al. Frequency of Prescription of Enalapriland Risk Associated with Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs. LATIN AMERICAN JOURNAL OF PHARMACY 2016;35(2):374-8.
327. Zimmermann M. Ethical considerations in relation to pain in animal experimentation. Acta physiologica Scandinavica. 1986;128(Suppl. 554):221-33.
328. Zimmermann M. Ethical principles for the maintenance and use of animals in neuroscience research. Neuroscience letters. 1987;73(1):1.
329. Rohit, Rao C, Krishna G. Effects of captopril and losartan on thermal and chemical induced pain in mice. Indian journal of physiology and pharmacology. 2006;50(2):169-74.
330. Richelson E, Nelson A. Antagonism by antidepressants of neurotransmitter receptors of normal human brain in vitro. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1984;230(1):94-102.
331. El-Fakahany E, Richelson E. Antagonism by antidepressants of muscarinic acetylcholine receptors of human brain. British journal of pharmacology. 1983;78(1):97-102.
332. Miranda HF, Noriega V, Zanetta P, Prieto JC. Isobolographic analysis in mice of the interaction of gabapentin and nortriptyline in relieving orofacial pain. Journal of orofacial pain. 2013;27(4):361-6.
333. Jagla G, Mika J, Makuch W, Obara I, Wordliczek J, Przewlocka B. Analgesic effects of antidepressants alone and after their local co-administration with morphine in a rat model of neuropathic pain. Pharmacological reports : PR. 2014;66(3):459-65.
334. Benbouzid M, Gaveriaux-Ruff C, Yalcin I, Waltisperger E, Tessier LH, Muller A, et al. Delta-opioid receptors are critical for tricyclic antidepressant treatment of neuropathic allodynia. Biological psychiatry. 2008;63(6):633-6.
335. Hunskaar S, Fasmer OB, Hole K. Formalin test in mice, a useful technique for evaluating mild analgesics. Journal of neuroscience methods. 1985;14(1):69-76.
336. Rosland JH, Tjolsen A, Maehle B, Hole K. The formalin test in mice: effect of formalin concentration. Pain. 1990;42(2):235-42.
337. Muir R, Anderson JR. Muir's textbook of pathology. 10th ed. London Chicago: Edward Arnold ; distributed by Year Book Medical Publishers; 1976. xiii, 1046 p. p.
338. Dubuisson D, Dennis SG. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats. Pain. 1977;4(2):161-74.
339. Turner RA, Hebborn P. Screening methods in pharmacology. New York,: Academic Press; 1965.
340. Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacological reviews. 2001;53(4):597-652.
341. Pettipher ER, Hibbs TA, Smith MA, Griffiths RJ. Analgesic activity of 2-amino-4-methylpyridine, a novel NO synthase inhibitor. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society [et al]. 1997;46 Suppl 2:S135-6.
342. Watkins L, Maeir SF. Cytokines and Pain. Basel: Birkhauser Verlag; 1999.
343. Cunha TM, Verri WA, Jr., Silva JS, Poole S, Cunha FQ, Ferreira SH. A cascade of cytokines mediates mechanical inflammatory hypernociception in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005;102(5):1755-60.
344. Vuckovic SM, Tomic MA, Stepanovic-Petrovic RM, Ugresic N, Prostran MS, Boskovic B. The effects of alpha2-adrenoceptor agents on anti-hyperalgesic effects of carbamazepine and oxcarbazepine in a rat model of inflammatory pain. Pain. 2006;125(1-2):10-9.
345. Tallarida RJ. The interaction index: a measure of drug synergism. Pain. 2002;98(1-2):163-8.
346. Tallarida RJ, Stone DJ, Jr., Raffa RB. Efficient designs for studying synergistic drug combinations. Life sciences. 1997;61(26):PL 417-25.
347. Simionovici M, Carstea, AL, Vladescu, C,. Cercetarea Farmacologica si Prospectarea Medicamentelor. Bucuresti: Editura Medicala; 1983.
348. Tallarida RJ, Raffa RB. Testing for synergism over a range of fixed ratio drug combinations: replacing the isobologram. Life sciences. 1996;58(2):PL 23-8.
349. Litchfield JT, Jr., Wilcoxon F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1949;96(2):99-113.
350. Finney DJ. Probit analysis. 3d ed. Cambridge Eng.: University Press; 1971. xv, 333 p. p.
351. Katzung BG, Trevor AJ. Pharmacology. East Norwalk, Conn. Maidenhead: Appleton & Lange; McGraw-Hill; 2003. ix, 176 p. p.
352. Katzung BG. Basic & clinical pharmacology. 9th ed. New York: Lange Medical Books/McGraw Hill; 2004. xiv, 1202 p. p.
353. Miranda HF, Sierralta F, Prieto JC. Synergism between NSAIDs in the orofacial formalin test in mice. Pharmacology, biochemistry, and behavior. 2009;92(2):314-8.
354. Bushra R, Aslam N. An Overview of Clinical Pharmacology of Ibuprofen. Oman Medical Journal. 2010;25(3):155-1661.
355. Khaksari M, Rajizadeh MA, Bejeshk MA, Soltani Z, Motamedi S, Moramdi F, et al. Does inhibition of angiotensin function cause neuroprotection in diffuse traumatic brain injury? Iran J Basic Med Sci. 2018;21(6):615-20.
356. Tegeder I, Niederberger E, Israr E, Guhring H, Brune K, Euchenhofer C, et al. Inhibition of NF-kappaB and AP-1 activation by R- and S-flurbiprofen. FASEB J. 2001;15(3):595-7.
357. Pollock DM, Morsing P. Combined treatment with ibuprofen and the AT1 receptor antagonist candesartan in young spontaneously hypertensive rats. J Am Soc Nephrol. 1999;10 Suppl 11:S116-9.
358. Mannisto PT, Saarnivaara L. Effects of lithium and rubidium on antinociception and behaviour in mice. II. Studies on three tricyclic antidepressants and pimozide. Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie. 1976;222(2):293-9.
359. Pavel J, Tang H, Brimijoin S, Moughamian A, Nishioku T, Benicky J, et al. Expression and transport of Angiotensin II AT1 receptors in spinal cord, dorsal root ganglia and sciatic nerve of the rat. Brain Res. 2008;1246:111-22.
360. Oroszova Z, Hricova L, Stropkovska A, Lukacova N, Pavel J. The Characterization of AT1 Expression in the Dorsal Root Ganglia After Chronic Constriction Injury. Cellular and molecular neurobiology. 2017;37(3):545-54.
361. Pechlivanova DM, Markova PP, Stoynev AG. Effect of the AT(1) receptor antagonist losartan on diurnal variation in pain threshold in spontaneously hypertensive rats. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 2010;32(9):663-8.
362. Ogata Y, Nemoto W, Nakagawasai O, Yamagata R, Tadano T, Tan-No K. Involvement of Spinal Angiotensin II System in Streptozotocin-Induced Diabetic Neuropathic Pain in Mice. Mol Pharmacol. 2016;90(3):205-13.
363. Nixon RM, Muller E, Lowy A, Falvey H. Valsartan vs. other angiotensin II receptor blockers in the treatment of hypertension: a meta-analytical approach. International journal of clinical practice. 2009;63(5):766-75.
364. Callera GE, Antunes TT, Correa JW, Moorman D, Gutsol A, He Y, et al. Differential renal effects of candesartan at high and ultra-high doses in diabetic mice-potential role of the ACE2/AT2R/Mas axis. Bioscience reports. 2016;36(5).
365. Sudoh Y, Cahoon EE, De Girolami U, Wang GK. Local anesthetic properties of a novel derivative, N-methyl doxepin, versus doxepin and bupivacaine. Anesth Analg. 2004;98(3):672-6, table of contents.
366. Blackwell B, Evans W, Gensler F. Local anaesthetic effect of doxepin. Lancet. 1972;1(7747):443.
367. Dworsky ZD, Bennett R, Kim JM, Kuo DJ. Severe medication-induced peripheral neuropathy treated with topical doxepin cream in a paediatric patient with leukaemia. BMJ case reports. 2017;2017.
368. Jayakrishnan R, Chang K, Ugurluer G, Miller RC, Sio TT. Doxepin for Radiation Therapy-Induced Mucositis Pain in the Treatment of Oral Cancers. Oncology reviews. 2015;9(1):290.
369. Sanz R, Calpena AC, Mallandrich M, Gimeno A, Halbaut L, Clares B. Development of a buccal doxepin platform for pain in oral mucositis derived from head and neck cancer treatment. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 2017;117:203-11.
370. Saha UK, Sengupta T, Sirkar A, Sengupta D. Biochemical studies on the in vitro effect of doxepin on Mg2+ & Na+, K+)-ATPases of human foetal & adult brain. The Indian journal of medical research. 1989;90:27-31.
371. Hajhashemi V, Minaiyan M, Banafshe HR, Mesdaghinia A, Abed A. The anti-inflammatory effects of venlafaxine in the rat model of carrageenan-induced paw edema. Iranian journal of basic medical sciences. 2015;18(7):654-8.
372. Janssen DG, Caniato RN, Verster JC, Baune BT. A psychoneuroimmunological review on cytokines involved in antidepressant treatment response. Human psychopharmacology. 2010;25(3):201-15.
373. Bach-Rojecky L. Analgesic effect of caffeine and clomipramine: a possible interaction between adenosine and serotonin systems. Acta pharmaceutica. 2003;53(1):33-9.
374. Li J, Li Y, Zhang B, Shen X, Zhao H. Why depression and pain often coexist and mutually reinforce: Role of the lateral habenula. Experimental Neurology. 2016;284:106-13.
375. Miranda HF, Noriega V, Zepeda R, Zanetta P, Prieto-Rayo J, Prieto JC, et al. Antinociceptive synergism of gabapentin and nortriptyline in mice with partial sciatic nerve ligation. Pharmacology. 2015;95(1-2):59-64.
376. Rojas-Corrales MO, Casas J, Moreno-Brea MR, Gibert-Rahola J, Mico JA. Antinociceptive effects of tricyclic antidepressants and their noradrenergic metabolites. European neuropsychopharmacology : the journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 2003;13(5):355-63.
377. Mico JA, Gibert-Rahola J, Casas J, Rojas O, Serrano MI, Serrano JS. Implication of beta 1- and beta 2-adrenergic receptors in the antinociceptive effect of tricyclic antidepressants. European neuropsychopharmacology : the journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 1997;7(2):139-45.
378. Ceredig RA, Pierre F, Doridot S, Alduntzin U, Salvat E, Yalcin I, et al. Peripheral delta opioid receptors mediate duloxetine antiallodynic effect in a mouse model of neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2018;48(5):2231-46.
379. Singh KD, Karnik SS. Angiotensin Receptors: Structure, Function, Signaling and Clinical Applications. Journal of cell signaling. 2016;1(2):111.
380. Liu HM, Guo YN. Effect of captopril on serum TNF-alpha level in acute lung injury rats induced by HCL. Asian Pac J Trop Med. 2014;7(11):905-8.
381. Labandeira-Garcia JL, Rodríguez-Perez AI, Garrido-Gil P, Rodriguez-Pallares J, Lanciego JL, Guerra MJ. Brain Renin-Angiotensin System and Microglial Polarization: Implications for Aging and Neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 2017;9:129.
382. Correa CR, Calixto JB. Evidence for participation of B1 and B2 kinin receptors in formalin-induced nociceptive response in the mouse. British journal of pharmacology. 1993;110(1):193-8.
383. Tan-No K, Taira A, Sakurada T, Inoue M, Sakurada S, Tadano T, et al. Inhibition of dynorphin-converting enzymes prolongs the antinociceptive effect of intrathecally administered dynorphin in the mouse formalin test. European journal of pharmacology. 1996;314(1-2):61-7.
384. Costa AC, Becker LK, Moraes ER, Romero TR, Guzzo L, Santos RA, et al. Angiotensin-(1-7) induces peripheral antinociception through mas receptor activation in an opioid-independent pathway. Pharmacology. 2012;89(3-4):137-44.
385. Campbell DJ. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors and kinin metabolism: evidence that ACE inhibitors may inhibit a kininase other than ACE. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1995;22(12):903-11.
386. Paterson KJ, Zambreanu L, Bennett DLH, McMahon SB. Characterisation and mechanisms of bradykinin-evoked pain in man using iontophoresis. Pain. 2013;154(6):782-92.
387. Kaur P, Muthuraman A, Kaur M. The Implications of Angiotensin-Converting Enzymes and Their Modulators in Neurodegenerative Disorders: Current and Future Perspectives. ACS Chemical Neuroscience. 2015;6(4):508-21.
388. Yeung WF, Chung KF, Yung KP, Ng TH. Doxepin for insomnia: a systematic review of randomized placebo-controlled trials. Sleep Med Rev. 2015;19:75-83.
389. Anoush M, Mohammad Khani MR. Evaluating the Anti-nociceptive and Anti-inflammatory Effects of Ketotifen and Fexofenadine in Rats. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2015;5(2):217-22.
390. Borrajo A, Rodriguez-Perez AI, Diaz-Ruiz C, Guerra MJ, Labandeira-Garcia JL. Microglial TNF-alpha mediates enhancement of dopaminergic degeneration by brain angiotensin. Glia. 2014;62(1):145-57.
391. Kaur P, Muthuraman A, Kaur J. Ameliorative potential of angiotensin-converting enzyme inhibitor (ramipril) on chronic constriction injury of sciatic nerve induced neuropathic pain in mice. Journal of the renin-angiotensin-aldosterone system : JRAAS. 2015;16(1):103-12.
392. Chen HQ, Tan HY, Yang YW, Qiu L, Liu XQ. Effects of ramipril on serum monocyte chemoattractant protein 1, interleukin-18, and interleukin-10 in elderly patients with acute coronary syndrome. Heart Vessels. 2010;25(2):77-81.
393. Fahmy Wahba MG, Shehata Messiha BA, Abo-Saif AA. Ramipril and haloperidol as promising approaches in managing rheumatoid arthritis in rats. European Journal of Pharmacology. 2015;765:307-15.
394. Forte BL, Slosky LM, Zhang H, Arnold MR, Staatz WD, Hay M, et al. Angiotensin-(1-7)/Mas receptor as an antinociceptive agent in cancer-induced bone pain. Pain. 2016;157(12):2709-21.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Teza Adc Teza Finala 10 Octombrie 2018 [308743] (ID: 308743)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.