TESTAREA NIVELULUI DE STRES OXIDATIV INDUS DE DIFERITE NANOMATERIALE LA NIVELUL MACROFAGELOR ALVEOLARE NR8383 [308742]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

TESTAREA NIVELULUI DE STRES OXIDATIV INDUS DE DIFERITE NANOMATERIALE LA NIVELUL MACROFAGELOR ALVEOLARE NR8383

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

Prof. Dr.Anca Dinischiotu

ÎNDRUMĂTOR ȘTIINȚIFIC:

Dr. Mihaela Balaș

ABSOLVENT: [anonimizat]

2018

CUPRINS

Introducere

A. PARTEA TEORETICA

Capitolul I Nanoparticule

I.1 Generalități. Surse de nanoparticule.

I.2 Tipuri de nanoparticule

I.3 Proprietăți ale nanoparticulelor

I.4 Aplicații ale nanoparticulelor

Capitolul II. Toxicitateananoparticulelor asupra organismului uman

II.1 Parametrii care influențează toxicitatea nanoparticulelor

II.2 Biodistribuția nanoparticulelor la nivelul organismului

II.3 Mecanisme de internalizare a nanoparticulelor la nivel celular

II.4 Mecanisme de toxicitate induse de nanoparticule la nivel celular

B. PARTEA PRACTICA

Scop și Obiective

CapitolulIII.Materiale și metode

III.1 Nanoparticulele

III.2 Linia celularaNR8383

III.3 Tratamentul cu nanoparticule

III.4 Determinarea nivelului de lactat dehidrogenază eliberată în mediul de cultură

III.5 Determinarea producției de specii reactive de oxigen

III. 6 Dozarea concentrației de β-glucuronidaza eliberată în mediul de cultură

III.7 [anonimizat] a speciei umane a dus la o [anonimizat] a [anonimizat], construindu-se astfel noi izvoare ale cunoașterii.

[anonimizat] a și daune organismelor vii. Acest fapt se datorează în primul rând dimensiunilor foarte mici care penetrează barierele fiziologice și care devin o gazdă pentru întreg sistemul circulator. [anonimizat].[anonimizat], celulelor, a bacteriilor și a virusurilor.

[anonimizat], determinând stresul oxidativ și/ sau chiar boli grave ale unor organe. [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], magneziul, sodiul și potasiul sunt esențiale pentru buna funcțioanare a organismului, [anonimizat].

Poluarea a [anonimizat], noi, indivizii suntem o țintă directă. [anonimizat] o deținem în prezent.

În cadrul părții experimentale s-a realizat un studiu în ceea ce privește capacitatea unor nanomateriale de a induce toxicitate la nivelul celulelor NR8383, având ca scop evaluarea parametrilor și a modificărilor biochimice induse de acestea la nivelul macrofagelor alveolare. Obiectivele urmărite în studiul de fațăanaliza unor radicali liberi implicați în manifestarea stresului celular oxidativmăsurarea de hidrogen;factorului de necroză tumorală (TNF-

PARTEA TEORETICĂ

Capitolul I:Nanoparticule

I.1 Generalități. Surse de nanoparticule

În decembrie 1959 la întâlnirea Societății de Fizică Americană s-a pus prima amprentă asupra a ceea ce o însemnat concept de bază și potențial al nanotehnologiei.Autorul acestei mari “revoluții” este nimeni altul decat fizicianul Richard Feynmann, membru al Institutului de Tehnologie din California si câștigător al premiului Nobel. Acesta a fost întrebat:” Ce s-ar fi întâmplat dacă noi am așeza atomii după bunul nostru plac, unul câte unul?” Discursul său impresionant susține că legile naturii nu limitează abilitatea lucrurilor la nivel molecular, prin manipularea inviduală a atomilor(precizie atomică).”There’s Plenty of Room at the Botton-An invitation to enter a new field of physics” reprezintă titlul discursului pe care l-a susținut marele inventator.

Anul 1974 s-a remarcat prin introducerea în contextul stiințific a denumirii de „nanotehnologie”-termenul a fost adus la suprafață prin intermediul profesorului Norie Taniguchi, descriind procesul de prelucrare al materialelor cu o acuratețe nanometrică. Nanometrul are la baza sa cuvantul „nannos” de origine greacă, care înseamnă “pitic”; se definește ca o miliardime, reprezenând astfel 10-9m, fiind totodată echivalentul a 101 Å.

Figura 1:Dimensiunea unei nanoparticule 1nm=10-9 (http://microcosm.web.cern.ch/microcosm )

Având în vedere faptul că nanoparticulele și microparticulele variază între ele din punct de vedere al dimensiunilor, diferențele sunt mai greu de observat și întocmit. În general, dimeniunile nanoparticulelor sunt comparabile cu cele ale virusurilor, ADN-ului, proteinelor; microparticulele sunt comparabile cu celulele și unele organe. Nanoparticulele pot avea formă amorfă sau cristalină, iar suprafețele lor acționează ca transportatori pentru picăturile lipide și gaze.Exemple de nanomateriale în formă cristalină sunt fullerenele și nanotoburile, pe când formele tradiționale care fac parte din strucura solidă sunt grafitul și diamantul.

Figura 2: Diferite dimensiuni ale nanoparticulelor(Buzea și colab., 2007)

Fiecare individ este expus nanoparticulelor cu fiecare inspirație realizată, cu orice consum de băuturi sau produse alimentare..În concluzie, fiecare organism de pe Pământ este în legătură strânsa cu aceste particule de scară nanometrică. Aceste particule foarte mici au potențialul de a intra, transloca și de a provoca daune multiple la nivelul organelor interne și externe. Această „abilitate” se datorează dimensiunilor minuscule care permit penetrarea unor sau chiar a tuturor barierelor fiziologice și astfel să ajungă la nivelul sistemului circulator. Nanoparticulele sunt comparabile cu dimensiuni ale virusurilor, unde cel mai mic a înregistrat 10 nm; virusul HIV are un diametru de 100nm, fiind astfel numit nanoorganism.

Multe studii recente au scos la iveală faptul că atât nanoorganismele, cât și microorganismele joacă un rol important în apartiția unor boli cronice, datorită unor perturbări ce au avut loc la nivelul factorilor genetici și a modul de viață cât mai dezorganizat. Printre acestea enumerăm: leucemia(cauzată de un virus ARN=retrovirus, un virus ADN=herpes virus), cancerul cervical (virusul Papiloma),cancerul de ficat (virusul hepatic), pietrele la rinichi(nanobacterii), cancerul pulmonar, boli de inimă (Chlamydia pneumoniae), diabetul juvenil (virusul Coxsackie), boli psihice (virusul Borna), ADHD (bacterii streptococcice).

Aceste boli pot fi asociate și cu disfuncțiile proceselor celulare: proliferarea necontrolată a celulelor, moartea celulelor premature și sănătoase. Multe dintre bolile care nu au o cauză precisă, ca : Crohn, Alzeheimer, Parkinson și alte boli autoimune pot fi corelate cu expunerea individul la diverse nanoparticule.Aceste fapte demonstrează că nanoparticulele pot fi dăunatoare. Pe lângă efectele mai puțin plăcute ale nanoparticulelor, ele au și un statut pozitiv; unele proprietăți toxice ale acestor nanoparticule sunt capabile să lupte împotriva unor boli ce au loc la nivel celular.

În zilele noastre se evidențiază o evoluție clară a nonotehnologiei, unde oamenii de știință descoperă diferite moduri prin care se construiesc „cărămizi”de nanoparticule cu un rol destul de important în dezvoltarea noilor sisteme de livrare de medicamente sau surse de electricitate. De-a lungul timpului, nanotehnologia va trece prin mai multe etape de dezvoltare, pretinzându-se că vor apărea nanodispozitive de nivel molecular (Mongillo,2007).

Nanoparticulele sunt structuri care se întălnesc si se utilizează în mod regulat în natură. Particulele din atmosferă pot fi clasificate în particule primare sau particule secundare (Borm și colab.,2006). Particulele primare prezintă emisie directă ce provine de la sursa procesului, care pot fi naturale-incediile, erupțiile vulcanice sau antropogenetice, de unde face parte ramura industrială . Particulele secundare iau naștere în urma conversiei gaz-particulă la nivelul atmosferei.

Furtunile de praf par ar fi unica sursă de nanoparticule din mediul înconjurător. Distanțele lungi de migrare a prafurilor minerale metalifere și poluanții antropogenetici de pe continente au luat o mare amploare în ultimele decade. Aproximativ 50% din aerosolii din atmosferă sunt minerale originare din deșerturile mari de pe Terra; în urma unor studii mai aprofundate s-a demonstrat că doar 10% provin din surse artificiale. Dimensiunile particuelelor produse în timpul furtunilor de nisip variază între 100nm până la câțiva micrometri. Focurile de la nivelul pădurilor au făcut parte din istoria naturală a Pământului, fiind cauzate de trăsnete ori de activitățile umane. În timpul erupțiilor vulcanice, cenușa și gazele emise sunt propulsate în atmosferă, uneori ajungând și la înălțimi de 18 000 m; conțin particule de scară nanometrică și cantitatea prezentă în aer este enormă; o singură erupere vulcanică poate emana 30×106 tone de cenușă.Această erupere prezintă ca produs final particule formate din metale grele, cunoscându-se ca fiind toxice pentru oameni. Cele mai întâlnite afecțiuni sunt evidențiate la nivelul sistemului respirator, al pielii si al ochilor. Aerosolii sau particulele din atmosferă afectează balanța energetică a întregii planetei datorită absorbției radiațiilor provenite de la Soare.

În aer este prezentă o concentrație de nanoparticule cuprinsă între 106-108 nanoparticule/L, care este asemănătoare pentu zonele rurale, cât și pentru cele urbane. La nivelul așezărilor rurale, nanoparticulele se formează prin oxidarea compușilor volatili cu origine biogenică. Zona urbană reprezintă principala sursă de nanoparticule care este remarcată de motoarele Diesel sau mașinile ce au convertoare catalitice defecte( Scenihr,2005). Nanoparticulele se eliberează și în urma arderii în motoarele automobilelor a combustibililor- petrol, respectiv motorina; în general, aceste motoare sunt toxice deoarece au un nivel ridicat de hidrocarburi aromatice polinucleare, carcinogenul fiind benzopirenul. Un număr mare al nanoparticulelor sunt asociate cu zonele cu trafic intens și la viteze mari datorită proceselor concomitente de răcire si de diluție a gazelor de evacuare (Donalson si colab., 2001).

Un exemplu de tehnică industială, sudarea, unde se folosesc temperaturi mari se generează radiații, fum, particule de oxid de aluminiu, cupru, cadmiu si crom, majoritatea fiind solubile în apă (Donaldson și colab., 2001).

Tabelul 1: Măsurarea concentrației nanoparticulelor

I.2 Tipuri de nanoparticule

Nanoparticulele sunt în general clasificate în funcție de dimensiune, morfologie, compoziție, uniformitate și agregare.Nanoparticulele pot fi compuse dintr-un singur constituient ori din mai multe materiale. Nanoparticulele găsite în natură sunt mai mereu aglomerări de materiale cu variații în ceea ce privește compoziția, pe când cele pure-formate doar dintr-un singur material pot fi ușor sintetizate astăzi prin multe metode.Caracterele morfologice trebuie să aibă în calcul parametrii, precum: planeitatea, sfericitatea și un raport al aspectului.

Nanoparticulele se pot clasifica în 3 generații, astfel: prima generație include nanoparticulele de bază, unde molecula biologic activă se află în interior sau absorbită pe suprafața acesteia. Nanocapsulele sunt nanoparticule de tip rezervor, molecula biologic activă fiind dizolvată într-un solvent ce formează un miez acoperit de către un înveliș polimeric. A doua generație reprezezintă nanoparticulele care se formează prin învelișuri polimerice hidrofobe, pe când a 3-a generație include un procedeu de funcționalizare a nanoparticulelor, cu aplicabilitate în nanomedicină (Sanchez și Alonso, 2006).

Figura 3: Tipuri de nanoparticule după Sanchez și Alonso (2006 )

Lipozomii au fost primele nanoparticule cu folosință majoră în tratamentele clinice, comportându-se ca purtători de medicamente. Aceștia au o dimensiune ce variază de la 80 la 300 nm, formă sferică , și o structură complexă ce are în compoziția sa fosfolipide și steroizi. Nanoparticulele constituite din lipide solide sunt purtători de medicamente, studiate pentru diferite administrări de tipul celor dermanle, oculare, respiratorii și rectale. Nanoparticulele polimerice au dimensiuni intre 1-100 nm și sunt sintetizate din polimeri naturali-albumina, ADN sau polimeri sintetici –poliacrilamida. Nanoparticulele de siliciu se clasifică astfel:xerogeliuri și neoparticule mezoporoase, cu aplicații de diagnostic și terapeutice ; cercetările de moment au adus la cunostință faptul că acestea au un grad ridicat de toxicitate. Structura nanoparticulelor joacă un rol destul de important, astfel acestea au fost organizate structural: unidimensioanal, bidimensional și tridimensional , după modelul de organizare al atomilor și al moleculelor (Buzea și colab., 2007). Nanoparticulele unidimensionale au o dimensiune ce se încadrează în scara nanometrică, se găsesc sub forma unor filme subțiri cu aplicabilitate în domeniul electronicii; în optică pentru proprietățile antireflexie pentru fabricarea lentilelor. Nanoparticulele 2D au utilizare în separarea particulelor de dimensiuni mici, pe când nanomaterialele tridimensionale sunt reprezentate de nanoparticulele libere și diferiți coloizi.

Figura 4 : Dimensiuni ale nanoparticulelor (http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleHtml/2010/JM/b911328m )

Fulerena este o moleculă compusă în întregime din carbon, fiind astfel o formă alotipică a carbonului (Holister et al., 2003); fulerenele sunt similare în structură cu grafitul. Prezintă structuri sferice, forme ciilindrice de tip “cușcă” numite nanotuburi.

Figura 5: Nanomateriale de Carbon(http://what-when-how.com/nanoscience-and-nanotechnology/fullerenes-and-carbon-nanotubes-nanotechnology/)

Bazându-se pe proprietățile chimice și electromagnetice, nanoparticulele pot exista ca aerosoli dispersați, ca suspensii/coloizi sau dispersii coloidale.Spre exemple, nanoparticulele magnetice au tendința de a se aduna, formând astfel agregate(Buzea et., colab , 2007):

I.4 Proprietăți ale nanoparticulelor

Nanoparticulele se pot utiliza în diferite sisteme și aplicații (Elaissari,2008) având în vedere anumite roluri și proprietăți. Nanoparticulele pot sau nu să prezinte diferite caracteristici legate de dimensiuni. Odată cu variația dimensiunilor și a formelor, nanoparticulele prezintă culori si proprietăți specifice, factori care au un rol important în bioimagistică (Dreadeu et al., 2012).

Proprietățile nanoparticulelor sunt influențate cel mai mult de caracterele morfologice. Tehnici microscopice, precum: microscopia prin lumină polarizată(TOM), microscopie electronică prin baleaj (SEM), microscopia de transmisie (TEM) sunt printre cele mai importante pentru remarcarea morfologiei acestor particule de scară nanometrică(Khan et al., 2017a,2017b)

Figura 6 :Tehnci microscopice

a. SEM

b. TEM nanoparticule de SiO2

Proprietățile mecanice ale nanoparticulelor le-au permis cercetătorilor să intreprindă anumite aplicații în nanofabricație si nanoproducție. Unii parametrii mecanici, ca: elasticitatea, deformarea, frecarea și adeziunea au avut o mare importanță în descifrarea exactă a naturii mecanice a nanoparticulelor (Guo et al., 2014).

Este bine de știut că nanoparticulele au proprietăți termice în ceea ce constă conductivitatea. Oxidul de aluminiu Al2O3 prezintă conductivitate mai mare decât apa. Spre exemplu, conductivitatea termică a cuprului la temperatura camerei este de 700 ori mai mare decat cea a apei.Recent a fost demostrat că nanofluidele care conțin CuO, Al2O3 prezintă înaintare în conductivitatea termică (Cao, 2002).

Diferite tehnici au fost practicate pentru analiza proprietăților fizice și chimice ale nanoparticuelor: IR, difracția razelor X, teoria BET. Difracția razelor X este cea mai importantă tehnică pentru a dezvălui caracteristicile structurale ale nanoparticulelor; se relevă astfel informații despre cristalinitatea nanoparticulelor(Ullah et al., 2017).

Nanoparticulele ceramice au căpătat o mare atenție în viziunea cercetătorilor deoarece pot fi utilizate în cataliză, fotocaliză, fotodegrare și aplicații de imagistică (Thomas et al., 2015).

Proprietățile optice sunt printre cele mai atractive- spre exemplu, o particulă de 20 nm de Au are culoarea roșie, asemeni vinului. O particula de Ag are culoarea gri-gălbui; nanoparticulele de platină și paladiu sunt negre. Aceste proprietăți optice sunt evidențiate și în cadrul sculpturilor și al picturilor chiar înainte de secolul al IV-lea Î.Hr.

Figura7: Imagine demonstrativă a proprietăților optice ale NP- „Cupa Lycurgus”(aspectul depinde de diferitele culori) (British Museum)

Nanotehnologia este ușor evidențiată și în diferite biserici vechi; culoarea roșu-închis pentru vitraliile din Evul Mediu.

Figura 8: Vitralii Notre Dame-formele si culorile depind de dimensiunea și forma nanoparticulelor de Au si Ag (Jin,R.,Cao 2001).

Aceste nanoparticule au proprietăți magnetice, făcându-se remarcate prin fenomenul de supermagnetism care se manifestă odată cu scăderea dimensiunilor de nanoparticule. Magnerizarea este obținută prin aplicarea unor stimuli externi de natură magnetică(Griffiths et colab., 2011). Nanoparticulele de oxizi de fier prezintă suprafețe hidrofobe care în urma intercațiunilor hidrofobe dintre ele vor forma agregate, toate acestea finalizându-se cu o creștere destul de mare în dimensiuni ale particulelor.

Nanoparticulele pot avea diverse forme( sfere, tuburi, inel), dar cea mai stabila din punct de vedere termodinamic este forma sferică. Cea mai definitorie proprietate este reprezentată de dimensiunea la scară nanometrică. Există un raport invers proprțional între aria și masa acestora. Aria suprafeței de contact a nanoparticulelor este importantă în desfășurarea reacțiilor catalitice; dacă diametrul particulelor va scădea, atunci suprafața acestor molecule va crește (Elaissari, 2008).

Tabelul (2) de mai jos prezintă câteva proprietăți foarte importante prin care se remarcă aceste particule de scară nanometrică, oferindu-le caractere unice (Ellaissari, 2008):

1.3 Aplicații ale nanoparticulelor

În prezent, mai mult de 200 de companii vând și întreprind produse care conțin nanoparticule.Obiectivul de bază al nanoparticulelor este acela de a controla și a manipula biomacromoleculele și ansamblurile supramoleculare-structuri care sunt esențiale pentru celulele vii în scopul de a îmbunătăți calitatea sănătății oamenilor. Prin definiție, acestea includ entități ca: medicamente, proteine, acizi nucleici, celule receptoare și anticorpi.Apariția unor terapii cu nanoparticule va permite o longevitate mai bună a omului prin tratarea unor boli genetice, cardiovasculare, etc.

Micile cantități de metale, precum: cuprul, magneziu, sodiul, calciul, fierul și potasiul sunt esențiale pentru funcțioanrea sistemelor biologice. La doze ridicate, aceste metale pot avea efecte toxice. Bolile asociate cu expunerea la cobalt: astmul bronșic, dificultăți de respirație. Azbestul există sub mai multe forme, aceste variații redau diferite grade de toxicitate. Aluminiul se regăsește în anti-perspirante, ceea ce duce la inițerea cancerului de piept la femei. Fierul este incorporat în numeroase enzime-acestea participă în diviziunea celulară, replicarea ADN-ului, metabolismul celular. Fierul este esențial pentru transportul gazelor respiratorii si schimbul de gaze, dar aceste particule de fier inhalate, câteodată pot fi catalogate ca fiind intruse, astfel cauzează probleme respiratorii de tipul pneumoconiozei.

Nanotehnologia prezintă aplicabilitate atât în știință, cât și în domeniul ingineriei.Întrebuințările acestor nanoparticule și-au făcut apariția de-a lungul timpului, având o evoluție destul de uimitoare, însă cea mai speculată întrebuințare ar fi dezvoltarea unui tratament asupra cancerului.

Nanoparticulele cu proprietăți magnetice pot fi împărțite în metale pure( mangan, fier, cobalt, nichel) sau aliaje (Wilczeweska et al. ,2012). Nanoparticulele de oxid de fier sau agenții de contrast au rol în evidențierea diferențelor între țesuturile bolnave și cele sănătoase. Tomografia prin rezonanță magnetică este o aplicație medicală, însă este limitată de concentrația scăzută a agenților de contrast. Pentru a depăși limita acestora, nanoparticulele de oxid de fier au ca efect creșterea controlului asupra compușilor magnetici. Nanoparticulele magnetice încărcate pozitiv se atașează de vectorul ADN care este încărcat negativ-aplicabilitate în magnetoinfectie. Nanoparticulele supermagnetice sunt utilizate cel mai des în biomedicină, acestea putând prezenta biocompatibilitate și toxicitate redusă.

Particulele de oxid de fier, precum magnetita Fe2O4 sau maghemită Fe2O3 sunt cele mai comune în vederea plicațiilor medicale(Ali et al., 2006). Fe3O4 are rol în purificarea ADN-ului plasmidial de celulele bacteriene(Chiang et al., 2005).

Figura 9: Imagistică medicală cu rezonanță magnetică(National Institute of Health)

A.Structura chimică a magnetitei Fe3O4

B.Fără injectarea nanoparticulelor

C. Injectarea a 300 µg de nanaoparticule supermagnetice

Cele mai multe semiconductoare și nanoparticule metalice au un imens potențial în diagnosticarea cancerului și utilizarea terapiei pe seama SPR-ului (AshaRani et al., 2009)- folosindu-se de dispersia și absorbanța luminii.

TiO2, ZnO, BiVO4 și nanoparticulele care conțin Cu au proprietăți antibacteriene(Qu et al., 2016) și astfel susuțin menținerea în parametrii normali ai sistemului imunitar. Există mai multe săpunuri antibacteriene care folosesc nanoemulsii pentru uciderea bacteriilor. Aceste soluții sunt capabile să înlăture bacilii și substanțele străine organismului uman; acestea sunt non toxice și neimflamabile. Bandajele medicale, prin proprietățile antibacteriene ale argintului au făcut astfel popular acest metal în ceea ce constă vindecarea rănilor și a arsurilor. Bandajele ajută pielea să se trateze, prevenind infecțiile posibile. Pe timpul Imperiului Roman, proprietățile curățătoare ale argintului și-au făcut simțită prezența când monedele de Ag erau folosite pentru purificarea apeii în ulcioare, fiind folosită ulterior pentru gătit. Unele nanopulberi posedă proprietăți antimicrobiene( Koper și colab., 2002) ; când aceste pulberi contactează celulele cu E.coli sau alte specii de bacterii sau virusuri, peste 90% sunt omorâte în doar câteva minute. Datorită acestor efecte antimicrobiene, nanoparticulele de Ag mai mici de 100 nm sunt evaluate ca fiind bune materiale pentru măștile chirurgicale(Li și colab., 2006).

Lipozomii care au vezicule de rangul nanometrului se mai numesc si nanolipozomi (Zhang and Granick, 2006). Câteva aplicații ale acestora sunt evidențiate în tabelul de mai jos:

Tabelul 3:Prezentarea unor lipozomi și rolurile sale

Aplicații medicale ale fulerenelor:

Tabelul 4: Prezentarea unor substanțe care fac parte din gama fullernelor și întrebuințările lor

În industria cosmetică, nanoparticulele sunt preferate pentru diferitele fabricații de creme care previn îmbătrânirea tenului, a estompării ridurilor dar și creme cu protecție solara.Aceste creme folosesc oxidul de zinc( John F. Mongillo).

Materialele nanocristaline sintetizate prin materiale poroase obținute în urma uscării supracritice a unui gel umed(=aerogel) sunt folosite ca materiale de izolare deoarece prezintă o conductivitate termică foarte mică, porozitate ridicată, densitate scăzută, o suprafață foarte mare și o greutate insesizabilă( Hrubesh și Poco, 1995).

Cele mai multe aplicații ale nanoparticulelor în vederea mediului înconjurător se încadrează în trei categorii: remedierea materialelor contaminate cu substanțe periculoase și prevenția poluării (Tratnyek and Jonston, 2006). Datorită activității chimice avansate, nanomaterialele pot fi folosite ca și catalizatori care reacționează cu gazele toxice(monoxid de carbon-CO , și monoxidul de azot-NO) în convertoarele catalitice și a echipamentelor de generare a energiei. Puterea de îndepărtare a metalelor grele, precum: mercurul, plumbul, arseniul și cadmiul din apa naturală a atras atenția datorită efectelor sale adverse asupra mediului și a sănătății indivizilor.Nanoparticulele sunt capabile de înlăturarea din apă, cât și din sol a unor solvenți organici bazați pe clor și convertirea acestora în hidrocarburi non-invazive; clorul reprezentă un puternic agent carcinogen.

Nanaoparticulele speciale făcute din carbon sunt folosite pentru a întări suprafața rachetelor de tenis. Particulele sunt de 100 ori mai rigide decât oțelul și de 6 ori mai ușoare.

În concluzie, nanobiotehnologia prezintă aplicații atât în nanomedicină, cât și în ingineria tisulară prin modificarea suprafeței și a structurilor scaffold bazate pe nanomateriale (Sagău și colab., 2010).Nanofibrele scaffolds pot fi folosite în regenerarea celulelor sistemului nervos central, dar și a alotor organe. Experimetele făcute pe un hamster care avea retezat tractul olfactiv au demostrat că axonul se poate regenra prin intermediul unei peptide de la nivelul nanofibrelor scaffolds( Ellis-Behnke și colab., 2006). O implicație a nanoparticulelor în medicină constă în livrarea de medicamente; se îmbunătățește astfel timpul în circulație prin reducerea imunogenității, reducerea efectelor secundare printr-o eliberare controlată a unor compuși terapeutici și livrarea în același timp a unor compuși( Marco et colab., 2008). O altă abordare: membranele unor nanotuburi acționează ca și canale pentru transportul moleculelor și al ionilor dintre soluțiile care sunt prezente pe ambele părți ale mambranei(Jirage și colab., 1997) .

Capitolul II

-Toxicitatea nanoparticulelor asupra organismului uman-

II.1 Parametrii care influențează toxicitatea nanoparticulelor

Nanotoxicologia este o ramură a bio-nano-științei care are de-a face atât cu aplicațiile, cât și cu toxicitatea nanoparticulelor(K.Donaldson et colab., 2004). Acestea, chiar și atunci când sunt inerte, de exemplu aurul, devin mult mai active la nivelul scării nanometrice.

Unii cercetători sunt complet împotriva folosirii nanoparticulelor în medicina umană, în timp ce alții pledează în favoarea utilizării. Unii oameni de știință cred că efectele lor secundare sunt acceptabile.Având în vedere toate aceste dispute create este necesară evaluarea și testarea acestor nanoparticule cu multă muncă si cercetari, venind în ajutor unele metode moderne de analizare, adică anumite instrumente microscopice prin intermediul cărora se pot descoperi.

Odată cu creșterea producțiilor industriale de nanoparticule, indivizii s-au concentrat pe efectele acestora asupra mediului înconjurător care este în relație strânsă și directă cu individul, prin urmare starea de sănătate a acestuia primând. Spre exemplu, furtunile de praf pot duce la dobândirea unor probleme de sănătate , în special a oamenilor vulnerabili care suferă deja de astm și emfizem pulonar(Taylor, 2002).Prafurile au în compozițiile sale fier sau alte metale care generază speciile reactive de oxigen. Erupțiile vulcanice afectează sistemul respirator (în special iritații ale nasului, ale laringelui și simptome de bronșita), dar și celelalte sisteme prin iritații ale pielii și ale ochilor.

Sunt multe afirmații în contradictoriu în ceea ce privește nocivitatea nanoparticulelor la diferite concentrații. Unele studii atestă că unele materiale nu sunt atât de toxice așa cum s-au precizat în alte cercetări.Comparând testele realizate si toate spusele trebuie luat în considerare că sunt multe diferențe în proprietățile de agregare ale nanoparticulelor în apă și aer, rezultând în urma experimentelor in vitro și a studiilor reprezentate de inhilare și ingestie. Agregarea poate depinde de următorii parametrii:suprafață încărcată, tipul materialului, dimensiune și multe altele. A fost demonstrat că o concentrație mare de nanoparticule poate să promoveze agregarea(J.R.Gurr, A.S.S.Wang, 2005) și reducerea efectelor toxice comparabil cu concentrațiile scăzute(S.Takenaka, 2001).

Doza este definită ca fiind suma se substanță care va intra în organismul uman.Este direct legată de expunerea sau de concentrția substanței din mediu- aer, mâncare, apă- înmulțită cu durata contactului. În general, efectele negative ale nanopartcilelor nu corespund cu dozajul de particulele inhalate de TiO2 cu diferite forme; astfel ca la cea mai mică doză (10mg/m3) corespunzătoare nanoparticulelor cu diametru de 20 nm apare o tumoră, comparând cu o doza ridicată (250mg/m3) a unor nanoparticule de 300nm(P.H.M.Hoet, 2004) unde zona este clară, fără să apară nimic.După cum se observa, nu doza crescută este de vină pentru efectele negative, ci suprafața (T. Stoenger et al., 2006).

Figura 10:A.Inflamația generată de unele nanoparticule cu toxicitate scăzută în funție de suprafață

B.Indicarea oxidării indusă de fluorescența unor nanoparticule, microparticule versus doza

(J.M.Antonini, 2006)

Mai mulți parametrii de natură fizico-chimică au fost evidențiați pentru a scoate la suprafață toxicitatea nanoparticulelor, ca: mărimea, structura cristalină, compoziția chimică, aria suprafeței, statutul de oxidare( Lanone S.,2006). Totuși, nu doar un singur parametru a fost „vinovat ”și responsabil pentru caracterul toxic pe care-l induc acestea. De altminteri, un alt factor important care ar trebui menționat este tipul celulei studiate .Chiar foarte mult, fiecare tip de celulă prezintă propriile funcții și de aceea ele nu pot să răspundă în același mod. Spre exemplu, (Sayas et al., 2007) recent au demonstrat că epiteliile plămânului unui șobolan / L2 și macrofagele alveolare primare expuse la diferite nanoparticule ca: oxidul de zinc, siliciu cu dimensiuni ce variază între 90-500 nm au marcat o diferită sensibilitate din punctul de vedere al proceselor inflamatorii și a viabilității.

Nanoparticulele de oxid de zinc induc cel mai mare rang de toxicitate în celulele epiteliale ale plămânului , dar nu și la nivelul macrofagelor care se remarcă printr-o rezistență mai mare la expunerea cu nanoparticule.În plus, doar siliciul este capabil de a produce citokine antiinflamatorii . (Soto et al., 2007) au demonstrat că macrofagele de origine umană sau animală nu au aceeași sensibiliate ca celulele alveolare în ceea ce privește răspunsul pe care-l induc nanoparticulele sintetizate.Printre toate aceste nanoparticule fabricate- carbonul negru și dioxidul de titan au fost intens studiate pe o durată lungă de timp din punct de vedere al citotoxicității la nivelul macrofagelor, fibroblastelor și al celulelor epiteliale(Limback LK et colab., 2007).

Nanoparticulele de rutil (200nm) au demonstrat că induc leziuni la nivelul moleculei de ADN în absența luminii, pe când nanoparticulele de TiO2/anatase cu același diametru nu induc niciun efect negativ(J.R.Gurr, 2005).

Nanoparticulele își pot schimba structura cristalină după interacțiile cu apa și alte lichide; spre exemplu, s-a demonstrat că particulele de ZnS cu diametru de 3nm, cu un conținut de aproximativ 700 atomi și-a reanjat structura sa cristalină după ce a avut un contact cu apa, devenind chiar o structură mult mai ordonată(H.Zhang, B.Gilbert, 2003).

Cele mai multe studii s-au făcut asupra nanoparticulelor ce au în compoziția sa carbonul.De exemplu, fullerenele și nanotuburile de carbon sunt cele mai vizate în rândul aplicațiilor. S-a prezentat că zeci, ba chiar tone de nanoparticule de carbon sunt utilizate pe întregul glob pe durata a 365 de zile. Fără îndoială va crește riscul expunerii oamenilor la nanomateriale.S-a adus la cunoștință că un tip de nanotub de SWCNT- a determinat o toxicitate la un nivel extrem de ridicat față de nanoparticulele de siliciu, fapte afirmate de către cercetătorii Lam și Warheit. Fullerenele si nanotuburile diferă mai ales prin structura geometrică și proprietățile fizico-chimice. Nanomaterialele au fost catalogate ca fiind bune conducătoare de electricitate, buni reactivi dar totodată și toxice. Carbonul, sub forma grafitului este ușor și maleabil, dar pe scară nanometrică acesta devine un nanotub care este mai dur chiar și decât oțelul. Un fapt remarcabil despre nanoparticule este că prezintă o reactiviate destul de mare, fapt care duce la o concluzie finală, și anume toxicitatea.

Pentru acceasi masă de particule cu aceeași compozițe chimică și structură cristalină, o toxicitate ridicată a fost gasită la nanoparticule comparativ cu omologii lor mai mari și mai avansați. Acest fapt a condus la concluzia: efectul inflamator este dependent de suparafața nanoparticulelor.

Aspectul nanoparticulelor induc efecte toxice, cancerul de plămâni este asociat cu prezența unor fibre de azbest mai lungi de 10 micrometri, mezoteliomul cu fibre mai lungi de 5 micrometri și azbeztoza cu fibre mai lungi decât 2 micrometri,toate având o grosime minimă de 150 nm(M.Lippman, 1990). Particulele care prezintă un raport de lungime-grosime ridicat(SWCNTs) a fost profilat ca fiind foarte toxicîn comparație cu particulele sferice ale carbonului negru(C.W.Lam, 2004).

Figura 11:Indicii de sănătate ai fibrelor care descriu bolile asociate fibrelor de diferite mărimi

(M.Lipmann, 1990)

Studiile in vitro au arătat că particulele foarte mici au cea mai mare putere din punctul de vedere al patologiei și totodată mai disctructive asupra plămânilor. Particulele chimice sunt esențiale în determinarea nocivității nanoparticulelor, acestea se fac remarcate în determinarea stresului oxidativ și a compoziției chimice a celulei; nanoparticulele sunt responsabile de a deține absorbții diferite și o abilitate crescută de a cataliza producțiile speciilor reactive de oxigen(T. Xia et al., 2006).

Suprafața ariei este unul dintre cei mai relevanți parametri când intervine discuția despre reprezentarea cea mai bună a nivelului de toxicitate indus de nanoparticule, suprafețele cationice sunt mult mai toxice decâțt suprafețele încărcate negativ electric; suprafețele neutre din punct de vedere electric sunt biocompatibile(Goodman C M et al, 2004).

Tabelul 5 :Nanomateriale, morfologia acestora și indicele relative de toxicitate (IRC)

(Soto și colab., 2005)

II. 2 Biodistrubuția nanoparticulelor la nivelul organismului

Figura 12: Distribuția nanoparticulelor la nivelul organismului și organele afectate(Buzea și clab., 2007)

Toxicologii susțin că aparatul respirator este o țintă clară pentru nanoparticule. După inhalare, nanoparticulele depozitate la nivelul tractului respirator, începând de la nas și faringe, până la nivelul plămâilor. Plămânii au o suprafață între 75-140m2 , adică 300×106 alveole, lobul pulmonar este unitatea morfo-funcțională a plămânului la nivelul căruia se realizează schimbul de gaze, astfel, plămânul reprezintă prima poartă de intrare a particulelor și a producerii nocivității. Ca fapt remarcat, dimensiunea constituie un factor important în apartiția perturbărilor la nivel respirator. Unele studii au arătat că dimensiunile mai mai ale nanoparticulelor vor crește toxicitatea la nivelul plămânilor.O reducere a dimensiunilor nanoparticulelor prezintă o creștere la nivelul suprafeței, astfel mai multe molecule chimice se atașează de suprafață , fapt care se masoară prin creșterea reactivității și a gradului de nocivitate (G.Oberdorster et colab., 1994).

Figura 13: Diagrama unor mecanisme și căi prin care NP pătrund în plămâni și efectele lor adverse (Vermylan și colab., 2005)

Celulele endoteliale formează o barieră pentru nanoparticule, având joncțiuni foarte strânse, mai mici chiar și de 2 nm(Scwab și Pang, 2000). Cu toate acestea, valorile mai ridicate începând de la 50 nm până la 100 nm depind de organul sau de țesutul respectiv. În prezența inflamațiilor, permeabilitatea endoteliului este crescută , ceea ce denotă o trecere bruscă și imediată a particulelor.Studiile au demonstrat că inhalrea cu particule de mangan de către șobolani este rău-făcătoare deoarece acestea se acumulează în sânge și ficat(Donaldson și colab., 2005). Alte studii arată că purtarea de aparate dentare duce la captarea de nanaoprticule la nivelul ficatului și al rinichilor; mărimea maximă de nanoparticule găsite în ficat au fost de 20 micrometri, pe când la rinichi de 6 micrometri, demonstrând astfel că particulele sunt absorbite de mucoasa intestinală, fiind apoi translocate spre ficat înainte de a ajunge la sistemul circulator, apoi la rinichi.

Sursele endogene de nanoparticule de la nivelul tractului gastr-intestinal sunt derivate din calciu și din secrețiile de fosfat( Lomer și colab., 2004). Aceste surse provin din mâncăruri(coloranți-TiO2 ), produse farmaceutice, apă, pastă de dinți, produse cosmetice. Într-o dietă alimentară consumul înregistrat de nanoparticule estimat a fost de 1012 particule/persoana/zi( Oberdorster, 2005). Tractul gastro-intestinal reprezintă o mare barieră de schimb cu sistemul circulator, fiind cea mai comună și importantă rută prin care macromoleculele pătrund în organism. Cele mai multe studii au arătat că particulele ingerate sunt eliminatr rapid: aproximativ 98% în materiile ficale, dar și prin urină. În tractul intestinal se regăsește un amestec de compuși, enzime, mâncare, bacterii,etc. Acestea pot interacționa câteodată cu particulele ingerate și astfel se reduce toxicitatea( Hoet și colab., 2004).S-a reportat că particulele in vitro sunt mai puțin citotoxice într-un mediu care prezintă o cantitate mai mare de proteine.

Multe studii asupra absorbției nanoparticulelor au demonstrat că acestea ajung în fluxul sanguin și apoi se răspândesc în țesuturi.Un singur studiu realizat a adus la cunoștință că 26% de np cu diametrul de 100nm, 10% cu diametru de 500nm și 33% cu diametru de 50nm p au fost descoperite în mucoasa intestinului și țesuturile limfatice.

Nanoparticulele mai mari de 1 milimetru au fost slab observate, pe când cele cu dimensiuni de 3 nm au fost ocazional vizualizate în țesuturile limfatice.Cercetătorii au concluzionat astfel: nanaoparticulele<100nm, dar nu și nanoparticulele >300 nm sunt absorbite de celulele intestinale. Nanoparticulele cu dimensiuni mai mari de 500 nm pot intra în circulația sanguină. Cercetătorii încă discută despre relația dintre dimensiunea nanoparticulelor și penetratrea lor în glandele mezenterice limfatice, dar până în prezent nu au ajuns la niciun accord.

Pasajul dintre nanoparticule și sistemul nervos este posibil pe calea barierei hematoencefalice;aceasta este o barieră fiziologică, cu o încărcătură negativă la nivelul electronilor, inducând restricție în vederea pătrunderii unor substanțe nocive(P.J.A. Borm et al., 2006).Această rută a fost intens studiată de către marii cercetători ; permeabilitatea barierei este independentă de încărcătura nanoparticulelor(P.R.Lockmann, 2004)-aceasta poate stopa pătrunderea virusurilor și a proteinelor din sistemul vascular al encefalului.Subiecții care dețin următoarele boli: hipertensiune,inflamații ale encefalului și ale tractului respirator au un risc ridicat la expunerea nanoparticulelor deaorece acestea, prin permeabilitatea crescută pătrund prin bariera fiziologică și ajung la creier.

Figura 14: Bariera hemato-encefalică( Simonart, 2004)

Pielea este formată din trei straturi importante : epidermă, dermă și hipodermă. Stratul cornos este un strat gros de 10 micrometri, fiind puternic keratinizat, unde sunt prezente celule moarte și prin care este dificil să pătrundă unii compuși ionici sau alte molecule solubile. Un studiu important a scos la iveală că particulele de TiO2 găsite în produsele cosmetice precum cremele cu protecție solară penetrează pielea(Tsuji și colab., 2006). Spre exemplu, aplicarea unei astfel de creme care conține 8% nanoparticule(10-15 nm) nu pătrunde în straturile pielii, pe când emulsiile uleioase în apă se caracterizează prinr-o absorbție mai mare la nivelul foliculilor piloși.

II.3 Mecanisme de internalizare a nanoparticulelor la nivel celular

Fenomenul de fagocitoză a fost descoperit în anul 1882 de către biologul rus Metchnikoff, pornind de la cuvântul fagocite care înseamnă celule care au capacitatea de a se îngloba în citoplasma particulelor fine cu care au legătură și pe care le distrug prin digestia intracelulară.Fagocitele profesioniste ingeră particulele străine mature și unii receptori specifici, pregătindu-se astfel de opsonizare(Lazăr, 2009).

Fagocitoza este un mecanism important datorită diversității receptorilor-aceștia prezintă dualitate: aderare si internalizare a particulelor(Aderem et colab, 1999).Aceasta prezintă mai mare eficacitate dacă particulelesunt molecule speciale de tipul anticorpilor sau moleculelor de tip complement(Bidani et colab., 2004).

Particulele hidrofobe vor fi acoperite de către opsosine și astfel vor fi gata pentru fagocitoză (Garnet et colab., 2006).Acoperirea particulelor cu polimeri hidrofilici precum polietilen glicol/ macrogol/E1521 dimunează opsonizarea particulelor și în consecință duce la scăderea fenomenului de fagocitare.Prin urmare, particulele neopsonizate sunt fără îndoială fagocitate de către macrofage(Palecanda et colab., 2000).

Din sistemul fagocitar mononuclear fac parte și macrofagele existente la nivelul țesuturilor; acelea care sunt evidențiate la nivelul alveolelor poartă denumirea de macrofage alveolare-plămâni. Macrofagele tisulare sunt celule de dimensiuni mari, acestea prezentând proprietăți specifice proprii,cât și funcții.Macrofagele alveolare sunt expuse unui mediu cu consum de oxigen permanent.Macrofagele au pe suprafața lor aproximativ 30 de receptori membranari, cu rol în răspunsul imun.

Macrofagele alveolare umane măsoară între 14-21micrometri(G.Oberdorster,2002).Nanoparticulele <100/ <200 nm sunt mult mai capabile de sustragere, decât de a fi fagocitate (A.Peters et al., 2006).Studiile in vitro au artătat că nanoparticulele activează fagocitoza, proces care se si petrece odată cu inducerea sa. La concentrații mari, nanoparticulele au tendința de a forma agregate cu dimensiuni mai mari de 100 nm (S.Takenaka et colab., 2001).

Acest sistem fagocitar mononuclear prezintă o caracteristică importantă, și anume capactitatea lui de a realiza procesul de endocitoză;acest fenomen include atât fagocitoza, cât și pinocitoza. Cea din urmă prezintă un tip nespecific de fagocitoză, care are proprietatea de a îngloba toate particulele lichide cu dimensiuni între 0,2-2 micrometri.

Fenomenul de ingestie a substanțelor străine-microorganisme, nanoorganisme – se numește fagocitoză.Aceasta decurge pe mai multe etape, amintim:

Chemotaxia- macrofagele au pe suprafața lor enzime proteolitice pe care le secretă.Substanțele chemotactice sunt reprezentate de factori derivați din ser, C5a-activarea complementului pe baza complexului Ag-Ac.Alte produse chemotactice sunt reprezentate de bacterii(Lazăr).

Opsonizarea-macrofage care prezintă receptori celulari ;opsoninele au un rol important în intensificarea procesului de fagocitoză și sunt prezente în lichidul interstițial pulmonar(A.W.Ng et colab., 2004).

După recunoașterea și legarea particulei străine, macrofagul prezintă o prelungire a membranei celulare/pseudopod.Digestia intracelulară corespunde fazei când particula inglobată este distrusă de lizozomi(Lazăr, 2009). Fagozomul fuzionează cu lizozomul formându-se astfel un fagolizozom; acest proces durează nu mai mult de 30 minute; lizozomul participă la formarea radicalilor liberi și la procesul de oxidază al NADPH-ului(J.B.Park,2003). Dacă particula este digerată de enzimele lizozomale, reziduurile sunt eliminate prin endocitoză; dacă nu, fagocitoza este urmată de o mișcare graduată a macrofagelor. Dacă macrofagul este incapabil de digerarea acestei particule și dacă mai produce și deteriorări la nivelul membranei fagozomale datorită peroxidării, compușii oxidativi vor interacționa cu scheletul celular al macrofagelor și astfel se vor reduce motalitatea celulară și moartea macrofagului(A.E.Porter et colab., 2006).

Macrofagele participă la funcția de monitorizare a organismului, cu rol în remarcarea și eliminarea celulelor mutante pe cale nefagocitară.Omorârea celulelor tumorale se realizează prin căile următoare:citotoxicitatea specifică și cea nespecifică.Mecanismele biochimice care intervin în toxicitatea macrofagelor alveolelor pulmonare sunt: proteina TNF care activează celulele tumorale; metaboliții O2 care induce efectul citotoxic; acțiunea NO3; proteinaze; stimularea celulor natural-killer; arginaza-arginina-efect citostatic(Lazăr, 2009).

Macrofagele prezintă funcții precum : imunitară, participă la reglarea răspunsului imun; funția de epurare care elimină celulele moarte și funcția antixenică care îndepărtează particulele străine prin fagocitoză.

Figura15:Prezentarea schematică a fagocitozei(http://www.scrigroup.com/sanatate/FACTORII-IMPLICATI-IN-IMUNITAT21623.php )

Nanoparticulele sunt capabile să intre în celule și să interacționeze cu structurile subcelulare.Absorbția celulară și abilitatea de catalizare a reacției de oxidare depind de proprietățile chimice, dimensiunile și formele nanoparticulelor. Mecanismul prin care nanoparticulele penetrează celulele fără receptorii specifici de pe suprafețele lor sunt redate de absorbția pasivă și de fenomenul de adeziune. Absorbția este inițiată de forțele van der Waals, încărcătura electrostatică, interacțiile sterice, efectele tensiunii superficiale (Geiser și colab., 2005).Nanoparticulele sunt internalizate nu doar de fagocitele specializate ca macrofagele alveolare (235), ci și de diferite tipuri de celule endoteliale, epitelii pulmonare, gastro-intestinale , hematii, trombocite și celule nervoase. Internalizarea particulelor depinde de diametrele nanoparticulelor. Spre exemplu, particulele din mediu cu dimensiuni ce variază între 2.5-10 µm au fost desemnate ca și colectoare de vacuole citoplasmatice, în timp ce particulele mai mici de 100 nm precum mitocondria a dus la dezorganizarea arhitecturală a acesteia( Li și colab., 2003). Particulele foarte mici, C60 cu diametru de 0.7nm sunt capabile de penetrarea celulei prin alte căi decât fagocitoza celulei, probabil prin intermediul canalelor sau al porilor de la nivelul membranei plasmatice (Porter și colab., 2006). Absorbția depinde și de natura materialului, între timp cercetările nu au avut destule informații să poată concluziona acest subiect.

II. 4 Mecanisme de toxicitate induse de nanoparticule la nivel celular

Atât studiile in vivo, cât și in vitro au arătat că nanoparticulele de compoziție diferite (nanotuburi, fullerene) creează specii reactive de oxigen care deteriorează celulele prin peroxidarea lipidelor, alterarea proteinelor și distrugerea moleculei de ADN (Brown et al., 2004).Stresul oxidativ indus de nanoparticule poate proveni de la diferite surse, una dintre cele mai importante sunt reprezentate de speciile reactive de oxigen pot fi generate direct de la metalele de tranziție( vanadium, crom, cupru, fier); multe nanoparticule intră în mitocondrie(Xia et al., 2006) și astfel se alterează funcțiile acesteia producând dereglări fizice care amplifică prezența stresului oxidative(Sioutas et al., 2005) ; celulele inflamatorii generează specii reactive de oxigen și specii reactive de nitrogen(Long et al., 2004)). Inflamația este răspunsul normal care este adus în prejudiciu sistemului imunitar; inflamatiile stimulează regenerarea țesuturilor, dar în exces acestea pot fi dăunătoare(Donaldson et colab., 2003). Testele in vivo și in vitro au demonstrat că expunerea la nanoparticule de mici dimensiuni sunt asociate cu apartiția inflamației-acestea sunt controlate de o serie complexă de evenimente intra/extracelulare ; stresul oxidativ intervine în urma eliberării de citokine(Donaldson et colab., 2004).

Figura 16 : Schema evenimentelor molecular prin care NP își exercită efectul toxic șa nivel celular (Buzea și colab, 2007)

Superproducția de SRO poate induce stresul oxidativ rezultat în lipsa celulelor pentru menținerea în funcții normale fiziologice(Churg et al., 2003).Răul asupra funcțiilor celulelor include modificări oxidative a proteinelor, generând radicali de proteine(Donaldson et al., 2003), inițiind astfel peroxidarea lipidică și modificarea acizilor nucleici(Gonzales et al., 2003).

Generarea de specii reactive de oxigen pot să distrugă biomoleculele celulare, ca de exemplu molecula de ADN, ducând la apariția de noi mutații ereditare(Peters et colab., 2006). Modificarea chimică a histonelor duce la desfacerea dublului helix al acidului dezoxiribonucleic. Molecula de ADN este o țintă precisă și directă a speciilor reactive de oxigen, deteriorarea sa include lezări ale bazelor azotate și a pentozei, crosslinkul proteinelor, ba chiar rupturi ale fragmentelor de ADN. Radicalii hidroxil pot deteriora chiar și molecula de ADN din vecinătate. În molecula de ADN mitocondrial și nuclear, 7-hidroxi-8-oxo-2’-deoxiguanozina (8-OHdG) este forma predominantă a radicalilor liberi induși de leziunile produse de oxidări. 8-OHdG este folosit ca și biomarker a stresului oxidativ, daune ale molecule de ADN, carcionegeză, marker pentru măsurarea efectului indus de deteriorarea AND-ului prin oxidare(Nel et colab., 2006).

În mitocondrie, ATP-ul este sintetizat de către reducerea moleculelor de O2 din H2O prin intermediul unor protoni cuplați și reacții de transfer al electronilor. În intimpul acestui proces un mic procentaj de oxigen nu este redus compet, ducând astfel la formarea unor superoxizi anionici. Astfel, speciile reactive de oxigen sunt produșii secundari ai metabolismului celular, incluzând : radical anion superoxid, radicali hidroxil, peroxizi de hidrogen si oxigenul molecular(Oberdorster et al., 2001).

A fost demnostrat că speciile reactive de oxigen, cât și stresul oxidativ sunt asociate cu multe boli degenerative legate de vârstă(Knaapen,2004), inclusiv scleroza laterală amiotrofică,artrită, boli cardiovasculare și inflamații, diabet, cancer la nivelul organelor diferite, Alzheimer și Parkinson(Derfus, 2004). McCarthy și colaboratorii săi au găsit că nanoparticulele de siliciu cauzează inflamațiile la nivelul plămânilor; acestea generează SOR și astfel se finalizeazăcu apariția apoptozei și a diminuării celulelor vii. Spre exemplu, cancerul rezultă în urma unor proliferări celulare necontrolate, pe când bolile neurodegenerative sunt cauzate de moartea celulelor premature( Antonini și coalb., 2006).Stresul oxidative a fost implicat în dezvoltarea multor boli cardiovasculare, neurologice, pancreatice și cancere(47).Inflamațiile severe induc prezența bolilor autoimmune: Lupus eritematos, scleroderma și artrită reumatoidă care pot fi associate vu expunerea la unele nanoparticule de Si și azbest (Pfan și colab., 2005).

Generarea SRO depinde de natura chmică a nanoparticulelor(Jarrett et colab., 2006), având o reactivitatea foarte mare-se produc nivele ridicate de SRO rezultând citotoxicitatea și genotoxicitatea(Burgos, 2005). Akhtar et al. au raportat că nanoparticulele de siliciu induc toxicitatea la nivelul celulelor, rezultând inițierea stresului oxidativ care este dependent de doza la care a fost expus (Roy, Kumar & Dwivedi, 2014). Studiile au adus la cunoștință faptul că stresul oxidativ se va ridica odată cu creșterea cantitatea de nanoparticule, astfel se vor produce radicalii liberi și diminuarea antioxidanților(Roy et al., 2014).

Radicalii liberi sunt definiți ca având în structura sa chimică un electron neîmperecheat, minim; această proprietate le oferă reactivitate chimică mare. Acești radicali liberi prezintă un interes larg asupra unor diferite component chimice, ca : azotul, oxigenul. Diversele combinații între elementele chimice pot avea caractere distructive, ca :speciile reactive ale oxigenului. Câteva tipuri de specii reactive cu originea din oxigen sunt : radicalul superoxid, radicalul hidroxil, peroxizii de hidrogen, oxigenul singlet. Printr-o sinteză necontrolată de specii chimice oxidante rezultă apariția sub forma grăbită a reacțiilor redox, instalându-se astfel SRO. Aceste caractere oxidative participă la întreținerea stresului oxidativ, fiind un rău la adresa sistemului biologic- dezechilibrând balanța care are în grija sa homeostazia.Toxicitatea de la nivelul plămânilor este susținută de capacitatea inducerii acestor specii reactive, distrugându-se plasmalema, inactivând funcțiile acesteia.

Oxigenul molecular este un biradical care prezintă o reactivitate chimică minimă; aceasta poate intreprinde formarea de radicali liberi ce prezintă o reactivitate exacerbată. Oxigenul singlet reacționează cu moleculele devenind astfel molecule active, și în acest fel oxigenul revine la forma inițială.Oxigenul singlet este un amestec de peroxid de H și hipoclorit-partea anionică.

H2O2 +OClH2O+ 1O2

Oxigenul singlet se obține prin procesul de fotosensibilizare (testat in vitro). In vitro,compușii care pot genera 1O2 prin fenomenul de fotosintetizare sunt: roșu bengal, alnastru de toluidină și albastru de metilen.Moleculele sunt illuminate cu o lumină căreia îi corepunde o lungime de undă, pe care o absorb și apoi o trece la stadiul de excitație –această energie este transferată unei molecule adiacente de O2 pe care o trece în 1O2. In vivo, compușii care pot genera 1O2 prin fotosintetizare sunt: vitamina A, vitamina B, bilirubina, clorofila de tip a și b. Modificările chimice produse poartă numele de efect fotodinamic (Halliwell, 1986). Efectul fotodinamic ia naște în urma administrării unui compus fotosensibilizator la nivelul unei zone-țintă, și anume țesuturile maligne, această activare a fotosensibilizării presupune fenomene de tip fotochimic, în urma cărora speciile reactive de oxigen distug celulele tumorale. Acestea nu sunt distruse doar prin efectele fotodinamice, se necesită și distrugerea vascularizației tumorale. Efectul fotodinamic atrage la nivelul țesuturilor afectate macrofagele, inducându-se un răspuns imun antitumoral. Celulele tumorale au proprietatea de a prezenta mecanisme care inhibă apoptoza(Barry,1986); terapia fotodinamică are rolul și potențialul de a reduce procesul active-apoptoza/ moartea celulară- la nivelul acestor celule. Speciile reactive de oxigen care apar în terapia fotodinamica provoacă distrugerea fosfolipidelor, glucidelor-care duc la formarea de cetoaldehide, cetoamine; proteinelor, formându-se legături încrucițate între acestea aminoacizii cu un grad ridicat de reducere sunt : cisteina, prolina, lizina și histidina.

Radicalii liberi se manifestă ca urmare a acțiunii unor factori pe care procesele naturale biologice nu le pot controla. Stresul metabolic este principalul tip de factor patologic care intervine în generarea R. I, factorii externi sunt determinați de inhalarea unor particule.

Radicalii liberi formați în organism sunt rezultatul activității metabolice;aceștia posedă roluri: funcțioanle, citolitice dar și nocive datorită reactivității mari.

Radicalul hidroxil este forma neutră a ionului hidroxid format datorită reducerii oxigenului molecular la apă.

H2O H+ +OH-

Radicalul hidroxil este agentul reducător rezultat fiind din hidroliza H2O. Reacția Fenton implică formarea radicalilor hidroxil:

Fe+2 + H2 O 2 Fe+3 +OH. +OH

Acest radical mai poate fi sintetizat și de reacția Hater-Weiss:

O2.- + H2 O 2 OH- +O2 + OH.

Fierul prezintă un profil reducător la un pH fiziologic. Reacția Fenton este considerată de către marii cercetători ca fiind cea mai importantă reacție care atestă daunele oxidative(Lynch, 2006). Superoxidul este un sărac oxidant care este prevăzut cu o reactivitate mare față de cele mai multe molecule biologice; cele mai multe efecte dăunătoare/vătămătoare apar când are loc conversia sa cu radicalii hidroxil.

Procesul prin care macrofagele sunt implicate în procesele inflamatorii este redat de activitatea enzimei NADPH oxidaza. Activarea acestei enzime este generată de anionul superoxid.Membrana celulară este supusă peroxidării, adică degradării datorită radicalilor liberi care implică acizi grași polinesaturați.

Peroxidul de hidrogen are ca surse lanțul mitocondrial și oxidazele care reduc O2 până la H2 O2. Nocivitatea apare atunci când implică reacții cu metale, spre exemplu reacționarea cu Fe2+. Radiațiile UV în prezența peroxidului de hidrogen prezintă și mai mare nocivitate deoarece apa oxigenată în concentrații foarte ridicate degradează mioglobinele, homoglobina și citocromul c.

Antioxidanții joacă un rol important în prevenirea sau limitarea distrugerilor provocate de speciile reactive de oxigen. Singura prevenție împotriva radicalilor liberi vine de la acești antioxidanți. Aceștia din urmă sunt agenți esențiali de reducere a efectelor dăunătoare ; participă la reacțiile redox, donând electroni atomilor de hidrogen, acțiune care le permite celulelor să funcționeze normal.Comparând celulele sănătoase cu cele canceroase, se constată, că cele din urmă au un nivel ridicat de stres oxidativ și de specii reactive de oxigen(McKendry et colab., 2001).Unele specii chimicale utilizate în medicină, mai exact în chimioterapie pot diminua activitatea speciilor reactive .În ceea ce privește tratamentul provocat de citotoxicitatea nanoparticuelor, antioxidanții, medicamentele antiinflamatoare și chelatorii metalici(Liu și coalb., 2006) dezvoltă promisiuni remarcabile ce au ca principal scop reducerea nocivității. A fost raportat că hamsterii care au fost sub instilarea cu nanoparticule la nivelul plămâilor împreună cu antioxidantul-nacystelin a redus inflamația cu 60% , în comparație cu expunerea doar la nanoparticule(Donaldson și colab., 2003).Terapiile cu antioxidanți au fost remarcate ca fiind adevărate scuturi în dezvoltarea bolilor sistemului circulator, ca : hipertensiunea arterială, ateroscleroză, cardiopati ischemică, boli coronariene( Sioutas și colab., 2005).Efectele adverse ale metalelor tranzitionale pot fi diminuate prin intermediul chelatorilor metalici (Brown și colab., 2004).

Figura 17:Structura radicalului liber(http://www.curcumin95.ro/fa-ti-curatenie-in-organism-scapa-acum-de-radicalii-liberi/ )

Prevenirea proceselor oxidative care au la bază stresul oxidativ au emancipat o apărare antioxidantă la nivel celular evitându-se producerea daunelor care perturbă grav organismul uman. Antioxidanții sunt compuși chimici care au sub protecția lor diferite molecule cu acțiune biologică. Aceștia au capacitatea de anihilare a radicalilor liberi; natura lor este una vegetală, naturală, exogenă. Câteva proprietăți esențiale ale antioxidanților: intervin în interiorul celulei la nivelul mitocondriilor, membranelor; regenerează și previn formarea radicalilor liberi. Mecanismele de apărare – enzimele prezintă viteze de reacții exuberante față de radicali, asfel arătându-și eficacitatea. Enzimele acționează la nivelul mitocondriilor, în mediul apos;diontre cele mai renumite ebzime care susțin o apărare de bun augur sunt : catalaza, glutation peroxidaza și transferaza(Perez-Gomez et colab., 1999). Stresul oxidativ depinde de tipul oxidanților, intensitatea, durata reacțiilor de oxidare-reducere, tipul celulei; prezintă și câteva efecte pozitive : proliferare celulară, apoptoză, sinteza enzimelor antioxidante.

Compușii liposolubili de tipul : beta-caroten, alfa-tocoferol, acidul retionic acționează la nivelul membranei celulare, în mitocondrie dar și la nivelul sângelui.Compușii hidrosolubili-acidul ascorbic se reagăsește la nivelul mitocondriei, citoplasmei.

Superoxid dismutaza(SOD) este un antioxidant enzimatic care dismută H2 O 2 conform reacției:

O2.- + O2.- +2H+ H2 O 2 + O2

Organele țintă-țesuturile sunt protejate de către acțiunea antioxidantă a superoxid dismutazei atât pe cale endogenă, cât și exogenă. În compoziția celulelor din Clasa Mammalia s-au remarcat trei tipuri de izofome ale SOD: CuSOD, ZnSOD regăsite în citoplasma celulelor, MnSOD matricea mitocondrială și EcSOD cu localizare extracelulară, la nivelul entoteliului celular(Koyanna și colab., 2013).

Pentru prima izoformă a SOD , cuprul prezintă stări de oxidare Cu(I) ȘI Cu(II), neutralizează peroxidul de H în urma activității enzimelor intracelulare.

Cu+1+O2.- +2H+Cu+2+H2O2

Catalaza intervine în microorganismele consumatoare de O2, adică aerobe, fiind o homoproteină alcătuită din 4 subunități și este cea mai importantă enzimă cu acțiuni asupra compușilor nocivi/ puternic distructive(Liu et al., 2004).

aceasta este obținută astfel :

2H2 O 2 2HOH +O2

Peroxidul de hidrogen este cea mai stabilă dintre toate speciile active ale oxigenului. Aceasta folosește molecula de apă oxigenată ca substrat donator de electroni/încărcare negativă și o alta moleculă acceptoare de electroni, care lasă oxigenul molecular liber.

Glutation peroxidaza este o enzimă ubiquitară care prezintă la nivelul centrului catalitic un rest de selenocisteină; există patru subunități de glutation peroxidază. GSSG/ glutation oxidat și NADPH/ nicotinamidă adenin dinucleotidă fosfat sunt oxidate în același timp de către glutation peroxidaza.Glutation peroxidaza este remarcată în toate țesuturile; catalizează degradarea hidroperoxizilor acizilor grași și neutralizarea H2O2.

Glutationul este un antioxidant neenzimatic de natură neproteică, un tripeptid ce prezintă o mare parte din tiolul intracelular. Apărarea antioxidantă se face prin eliminarea sau neutralizarea radicalilor liberi, a lipid-peroxizilor și a peroxizilor de hidrogen; efectele pozitive induc moartea celulară programată, integritatea mitocondriei, producția de citokine antiiflamatoare. GSH are capacitatea de a reacționa cu unii compuși de natură endogenă, evident fiind faptul că aceștia din urmă prezintă o mare citoxicitate si genotoxicitate.

Acidul ascorbic neutralizează acțiunea radicalilor liberi, fiind un nutrient esențial vieții: acesta are efecte protectoare asupra apariției unor boli periculoase precum cancerul pulmonar . Vitamica C este o vitamină hidrosolubilă, cu solubilitate în apă și în solvenți polari, participând cu precădere în sistemul endiol-dioxo. Acidul ascorbic este un agent de reducere foarte puternic: acid dibazic care conține 2 atomi de carbon asimetrici. Acesta induce sinteza de ADN și proliferarea celulelor; reducând Fe(III) și Fe (II) se remarcă o îmbunătățire a absorbției fierului(Thomas et colab., 2006).

Vitamina C are rolul de a neutraliza oxigenul singlet. Caracteristica importantă a acidului ascorbic este prezența unei grupări eu-diol între C2-C3, aceasta este responsabilă de caracterul acid și de proprietățile reducătoare . Anionul ascorbutat este un bun agent reducător și pot ceda 2 electroni unui oxidant. Prin pierderea protonului și a electronului, ascorbatul se oxidează la radicalul anion se pierde cel de-al doilea electron și se oxidează la acid dehidroascorbutat. Vitamica C are rol în activarea citocromilor P450, oxigenaze hepatice și care au rolul de a cataliza reacțiile de hidroxilare, printre care și transformarea colesterolului hormone steroizi/ acizi biliari; totodată acestea intervin în procesele de eliminare a toxicității unor substanțe. Imposibilitatea omului de a sintetiza vitamica C se datorează enzimelor care intervin în procesele biosintetice: D-glucoronolacton-reductaza și L-gulonolacton-oxidaza. Aceasta se absoarbe în cantitate mică la nivelul cavității bucale și a stomacului; trecerea în mucoasa intestinală se realizeaz- prin mecanisme cu sau fără consum de energie.După absorbție, acidul ascorbic este transportat de la sânge la toate țesuturile și organele, în funcție de necesitățile indivizilor( Marieta Costache, 2004).

Figura 18: Formele structurale ale acidului ascorbic(http://www.creeaza.com/referate/biologie/Vitamine-si-coenzime916.php)

Vitamina E face parte din vitaminele liposolubile, fiind solubile în solvenți organici și în grăsimi. Tocoferolii prezintă modalitatea cea mai bună de a abandona formarea radicalilor liberi. Rolul de donor de H este remarcat de prezența grupării hidroxilice de la C6 din nucleul croman. Printr-o serie de transformări, tocoferolii formează produși stabili, transformându-se în derivați ai peroxizilor lipidici.Glutation peroxidaza cooperează cu tocoferolul deoarece glutationul este o enzimă dependentă de seleniu. Insuficiența tocoferolilor este compensată de aportul crescut de seleniu. Tocoferolii sunt oxidați de radicalii liberi de oxigen: hidroxil, peroxid, anion superoxid.

Tocoferolii sunt transportați în cavitatea bucală odată cu hrana și sunt absorbiți la nivelul intestinului subțire, printr-un mecanism pasiv. După ingestie, tocoferolii urmează metabolsimul; intrarea în circulația limfatică, unde acizii grași eliminați sunt acaparați de către țesuturi și mușchi.În sânge, tocoferolii se leagă de lipoproteinele cu densitatea mică-LDL într-o proporție de 50%, cât și cu densitate mare-HDL în proporție de 35%.%. În general, agenții toxici precum oxigenul singlet, radicalul hidroxil, peroxidul de H și radicalul superoxid destabilizează acizii grași nesaturați. Procesele care stau la baza toxicității acestor radicali sunt lumina, ionii de Cu și Fe .Sub acșiunea radicalilor liberi, AG nesaturați pot forma peroxizi în urma cărora se formează peroxidarea lipidelor(Marieta Costache și Elena Ionica, 2004).

Figura 19 : Metabolsimul vitaminei E (Marieta Costache și Elena Ionica, 2004)

B. Partea Practica

Scop și obiective

Nanomaterialele au fost catalogate ca având numeroase aplicații în diferite domenii, ca: medicina-terapie și diagnosticare-imagistică prin rezonanța magnetică; stomatologie; inginerie.Pe lângă aceste efecte pozitive și pline de folos, nanoparticulelor li se atribuie și un statut negativ, fiind părtașii unor daune asupra omului, respectiv a mediului. Indivizii sunt ținta cea mai clară și care au de suferit datorită expunerii la aceste particule de scară nanometrică care prezintă proprietăți toxice la nivel celular.Se induc astfel diferite modificări și tulburări în întreg organismul uman, confruntându-se cu dezechilibru haosat.

În acest context, scopul acestei lucrări a fost testarea nivelului de stres oxidativ indus de diferite nanomateriale la nivelul macrofagelor alveolare NR8383.

Capitolul III. Materiale și metode

III.1 Nanoparticule

Nanoparticulele utilizate in acest studiu au fost furnizate de parteneri straini implicati prin colaboare intr-un proiect international de tip SIINN ERANET al carui responsabil este D-na Prof. Anca Dinischiotu.

Nanoparticulele au fost fie achizitionate de la Sigma (oxidul de grafena, nanopigment) fie sintetizate in laborator prin metode chimice (nanoparticulele de SiO2). Inainte de utilizare naoparticulele au fost sterilizate cu radiatii gama la Universitatea din Muenster, Germania.

In acest studiu s-au folosit 4 tipuri de nanoparticule dupa cum urmeaza:

1. Nanoparticule de SiO2 cu dimensiuni de 7-8 nm;

2. Nanoparticule de SiO2 cu dimensiuni de 40 nm;

3. Nanoparticule dioxid de grafenă (GO);

4. Nanopigmenti de ftalocianina de cupru de culoare verde.

Pentru pregatirea suspensiilor de nanoparticule 10 mg de pulbere au fost solubilizate in 20 mL mediu de cultura si apoi sonicate cu ajutorul unui sonicator Bandeline Sonoplus HD 2000 timp de 23 min rezultand o suspensie stabila de nanoparticule de concentratie 0.5 mg/mL.

III.2 Linia celulară NR8383

Testele in vitro au fost realizate pe linia celulară NR8383 (CRL-2192 achizitionata de la ATCC) care este o linie de macrofage alveolare din țestul pulmonar, provenite de la specia de sobolan Rattus norvegicus. Aceste celule formeaza o cultura mixta de celule aderente si celule in suspensie, prezentând o morfologie caracteristică pentru macrofage cu forma rotunda. Celulele au fost cultivate in flask-uri de 75 cm2 in mediu de cultura Ham F-12K (mediu Ham F-12 modificat Kaighn) suplimentat cu 15 % ser fetal bovin si mentinute in incubator in atmosfera umeda, la 37°C si 5% CO2.

III.3 Tratament cu nanoparticule

Celulele cultivate in flask-uri au fost colectate si insamantate la o densitate de 3×105 celule/godeu/200 µL in placi cu 96 de godeuri. Dupa un interval de 24 de ore, tratamentul cu nanoparticule s-a realizat prin adaugarea in mediu de cultura a unor cantitati diferite din suspensiile de nanoparticule corespunzatoare pentru concentratiile de 22.5, 45, 90, 180 µg/mL. Dilutia nanoparticulelor in mediu a fost facut serial. Celulele expuse la nanoparticule au fost apoi incubate timp de 16 ore. Pentru Control s-au folosit celule netratate cu nanoparticule.

III.4 Determinaea nivelului de lactat dehidrogenază (LDH) eliberată în mediul de cultură

III.4.1 Principiul metodei

Principiul de determinare a activității LDH se bazează pe o serie de reacții enzimatice: in prima etapă, NAD+ este redus la NADH/H+ prin conversia lactatului la piruvat, reacție catalizată de LDH; în a doua etapă, catalizatorul (diaforaza) transfera ionii H/H+ de la NADH/H+ la sarea de tetrazoliu INT (clorură) care este resusă la formezan (Figura 20).

Figura 20: În prima etapa se urmărește reducerea NAD+ la NADH+ H+ prin oxidarea lactatului la piruvat. În a doua reacție enzimatică, 2H sunt transferati de la NADH+H+ la sarea de tetrazoliu INT, de culoare galben pal.

O creștere a totalului de celule moarte sau deteriorate de la nivelul membranei plasmatice duce la o creștere evidentă a activității enzimatice a LDH, în mediul de cultura. Aceasta din urmă coincide cu valoarea totală a formazanului, care s-a format pe o perioadă limitată de timp. Așadar, intensitatea culorii formate in test este proporțională cu numărul de celule lizate. Colorantul de farmazan este solubil în apă și prezinta un maxim de absorbție la 500 nm, pe când soluția de clorură INT nu prezintă nicio absorbanță la această lungime de undă.

Activitatea LDH a fost determinata cu ajutorul unui kit pentru detectarea citotoxicitatii de la Roche (Cat. No.11 644 793 001). Acest kit este desemnat ca fiind o alternativă calorimetrică precisă, rapidă si simplă pentru cuantificarea celulelor moarte si celulelor lizate, bazata pe măsurări ale LDH preluate din citosolul celulelor deteriorate în supernatant. Kit-ul conține: un flacon cu capac albastru-catalizator pentru diaforeză si un alt flacon cu capac roșu, adică soluția de colorant-INT și lactatul de sodiu.

III.4.2 Reactivi si materiale

Pe langă acest kit au mai fost utilizate si alte materiale si instrumente:

-microplacă cu 96 godeuri-Corning ® Costar CLS3595;

-suspensie de nanoparticule: 0 , 22.5, 45, 90, 180 µg/Ml;

-controlul pozitiv : soluție Triton 1%;

– solutie de stopare de HCl 1N;

– incubator 37°C;

– centrifugă cu rotor pentru microplăci;

– pipete.

III.4.3 Modul de lucru

Seed the cells into 96-well plates at 3 × 105 live cells/well/200 µL and incubate in F-12K medium + 1% Pen/strep supplemented with 15% FBS for 24 h the day before NPs exposure.

Serially dilute stock suspension to obtained required final NPs concentrations: 22.5, 45, 90 and 180 µg/mL using F-12K medium + 1% Pen/strep without serum.

Replace the medium with F-12K medium + 1% Pen/strep (without serum) containing the NPs at concentration of 0, 22.5, 45, 90 and 180 µg/mL, 200 µL/well and incubate 16 h.

Harvest and centrifuge (5 min, 200 g) the cell culture supernatants to remove cell debris.

Take 100 µL of supernatant carefully and transfer into corresponding wells of a new optically clear 96-well flat bottom microplate.

To determine the LDH activity in these supernatants, add 100 µL Reaction mixture (freshly prepared) to each well and incubate for up to 30 min at +15 to +25°C. During this incubation period the microplate should be protected from light.

Add 50 µL/ well of 1 N HCl to stop the enzymatic reaction.

Measure the absorbance of the samples at 490 or 492 nm using an ELISA reader. The reference wavelength should be more than 600 nm.

III.5 Determinarea producției de specii reactive de oxigen (ROS)

III.5.1 Principiul metodei

Testul pentru masurarea ROS, mai precis a peroxidului de hidrogen (H2O2) se bazeaza pe testul Amplex Red, care este o metoda fluorimetrica ce se bazeaza pe reactia dintre peroxidul de hidrogen și a compusului Amplex Red, compus care este incolor, non-fluorescent, reactia fiind catalizata de perozidaza din hrean (HPR). În prezența peroxidazei, Amplex Red reactioneaza cu H2O2 în raport stoechiometric 1:1 si determina formarea unui produs de oxidare de culoare rosu-fluorescent numit rezorufina. Rezorufina are un maxim de excitatie si emisie de aproximativ 571 nm si respectiv 585 nm, iar datorita coeficinetul de extincție molară ridicat (58.000 +/- 5.000 cm-1M-1), testul poate fi realizat fluorimetric sau spectrofotometric. Solutia de Zimosan A, un produs al peretelui celular din Saccharomyces cerevisae este folosit ca si control pozitiv pentru activarea macrofagelor.

Figura 21: În prezența peroxidazei, Amplex Red reactioneaza cu H2O2 si formeaza rezorufina compus rosu-fluorescent

III.5.2 Reactivi si materiale

– Tampon KRPG (Krebs Ringer's Phosphate Glucose): 145 mM NaCl; 5,7 mM Na3PO4; 4,86 mM KCl; 0,54 mM CaCl2; 1,22 mM MgSO4; 5,5 mM glucoză.

– Compus Ampliflu Red (Sigma)

– Solutie de NaN3 (azidă de sodiu)

– Solutie de zimosan 180 µg/mL

– Solutie de H2O2 30 µM

III.5.3 Modul de lucru

Day 1:

1. Seed the cells into 96-well plates at 105 live cells/well/200 µL. Centrifuge 96-well plate at 200g for 10 min to sediment the cells and avoid/limit formation of cell agglomerates.

2. Then replace 1/3 of the medium by new medium Ham’s F12K + 1% Pen/strep containing 15% heat inactivated FBS (final FBS concentration 5%) and let the cells in the incubator for 24 h.

Day 2:

3. Serially dilute stock suspension to obtain a twofold of the required NPs concentrations: 45, 90, 180 and 360 µg/mL using KRPG buffer, since the Amplex Red assay begins with 1:1 dilution step.

4. Replace the medium with 100 µL/well KRPG buffer containing the NPs at concentration of 0, 45, 90, 180 and 360 µg/mL. At this stage only take off the medium and replace it by the medium containing the NPs. Use KRPG buffer only as negative control (Bk) and 360 µg/mL zymosan as positive control. The wells containing both positive control and 180 µg/mL NPs consist in: 50 µL of 720 µg/mL Zymosan solution + 50 µL of 720 µg/mL NPs suspension.

5. Immediately after incubation with NPs suspensions, add 100 µL/well freshly prepared reaction mix containing 0.1 mM Ampliflu, 2 mM NaN3 and 2 U/mL horseradish peroxidase in KRPG buffer and incubate at 37°C for 90 min.

6. Add 30 µM H2O2 standard solution freshly prepared from a 30% H2O2 stock solution in additional wells to control the accuracy of the reaction. Prepare a 30 µM H2O2 working solution from a 30% (9.8 M) H2O2 stock solution by serial dilution in distillated water (3 µL from 100x dil. 30% H2O2 / 10 mL d.w.). Working solution prepared is less stable and should be used within a few hours of preparation.

7. Measure the absorbance of the samples spectrophotometrically at 570 nm and 620 nm (reference value) using an ELISA reader.

The measurements are corrected for background absorbance of cell free-particle controls and converted into absolute concentrations of H2O2 using the molar extinction coefficient of resorufin (54,000 L× mol-1 × cm-1). Final values will be normalized to the positive control, set to 100%, which is obtained from NR8383 cells treated with 180 µg/mL zymosan.

III.6 Dozarea concentrației de β-glucuronidază eliberată în mediul de cultură

III.6.1 Principiul metodei

β-glucuronidaza este o hidrolaza glicozidica de tip 2 ce se gaseste in lizozomi. Macrofagele activate secreta cantitati crescute de hidrolaze lizozomale, inclusiv β-glucuronidaza in fluidul extracelular si astfel masurarea activitatii acestei enzime din mediul de cultura al celulelor NR8383 poate servi ca marker pentru activarea macrofagelor. Testul pentru masurarea activitatii enzimei se bazeaza pe utilizarea compusului P-nitrofenil beta-D-glucoronid ca substrat pentru enzima β-glucuronidaza. Produsul rezultat prin clivarea enzimatica este un cromatofor de culoare galbenă numit p-nitrofenol care absoarbe la 405-410 nm.

III.6.2 Reactivi si materiale

Reactivi:

– mediu de cultura Ham F12K ;

– set fetal bovin;

– tampon de acetat de sodiu 0,2 M preparat in H2O distilată, pH 5.0;

– solutie Triton X-100 2%

– solutie P-nitrofenil-beta-D-glucorinid 13,3 mM;

– solutie NaOH 0.2 M

Instrumente:

– microplăci;

– incubator 37 °C;

– centrifugă;

– pipete sterile;

– cititor de placi FlexStation3

III.6.3 Modul de lucru

1. Day 1: Seed the cells into 96-well plates at 105 live cells/well/200 µL. If possible, centrifuge 96-well plate at 200 g for 10 min to sediment the cells and avoid/limit formation of cell agglomerates. Then replace 1/3 of the medium (66.7 µL) by new medium Ham’s F12K + 1% Pen/strep containing 15% heat inactivated FBS (final FBS concentration 5%) and let the cells in the incubator for 24 h.

2. Day 2: Serially dilute stock suspension to obtained required final NPs concentrations: 22.5, 45, 90 and 180 µg/mL using F-12K medium + 1% Pen/strep without serum.

3. Replace the medium with Ham’s F-12K medium + 1% Pen/strep (without serum) containing the NPs at concentration of 0, 22.5, 45, 90 and 180 µg/mL, 200 µL/well and incubate for 16 h. At this stage only take off the medium and replace it by the medium containing the nanoparticles. Do not wash the cells.

4. Add the 1% Triton X-100 ± NPs (180 µg/ml) to the corresponding wells and mix the medium by several pipetting up and down to ensure that Triton would reach cells embedded in agglomerates and allow a full release of GLU in these positive control conditions.

5. Prepare the positive control by adding 100 µL of Triton 2% in 100 µL Ham’s F-12K medium without serum and mix well

6. Incubate the plate for 16 h.

7. Day 3: Harvest and centrifuge (5 min, 200 g) the cell culture supernatants to remove cell debris.

8. Pipette 50 µL of supernatant into corresponding wells of a new optically clear 96-well flat bottom microplate.

9. Add 100 µL of Reaction mixture and homogenize well.

10. Incubate the plate for up to 2 h at 37 °C.

11. Add 100 µL of NaOH 0.2 N to stop the enzymatic reaction.

12. Measure the absorbance of the samples spectrophotometrically at 405 nm using an ELISA reader.

III.7 Măsurarea nivelului de TNF-alfa eliberat în mediul de cultură

III.7.1 Principiul metodei

Metoda de dozarea a TNF-alfa se bazeaza pe un test ELISA ce implica anticorpi specifici. Astfel, intr-o placa cu 96 de godeuri pre-tratata cu anticorpi specifici sunt adaugate probele si standardele iar TNF-alfa prezent in probe se va lega la anticorpii primari imobilizati in godeuri. Peste acestia se adauga apoi anticorpii secundari biotinilati anti-TNF-alfa si streptavidina conjugata cu enzima HRP care reactioneaza apoi cu o solutie substrat TMB (3,3',5,5'-Tetramethilbenzidina) si produce un semnal masurabil (produs colorat). Intensitatea semnalului este direct proportionala cu concentratia TNF-alfa prezent in probe.

Principiul metodei de masurare a nivelului TNF-alfa prin testul ELISA

III.7.2 Reativi si materiale

– Kit ELISA Rat TNF-alfa de la Invitrogen

– sectrofotometru cititor de placi FlexStation3

III.7.3 Modul de lucru

S-a utilizat kitul TNF alpha Rat ELISA de la Invitrogen

Dupa tratamentul celulelor cu nanoparticule, un volum de 50 µL de mediu de cultura au fost transferati din placa de cultura in placa ELISA tapetata cu anticorpi specifici.

Probele au fost apoi diluate cu 50 µL solutie Sample Diluent din kit

S-a adaugat apoi cate 50 µL/godeu solutie de anticorp secundar biotinilat

Placa a fost apoi incubata 2 ore la temperatura camerei pe un shaker la 400 rpm

Godeurile au fost apoi spalate de 4 ori cu 400 µL Solutie de spalare din kit

S-a adaugat apoi cate 100 µL solutie Streptavidina-HRP

S-a incubat din nou placa timp de o ora la temepratura camerei pe un shaker.

Godeurile au fost spalate din nou godeurile cu 400 µL Solutie de spalare din kit

S-a adaugat 100 µL Solutie substrat TMB din kit

Placa s-a incubat la temperatura camerei, 10 min la intuneric

Reactia enzimatica a fost stopata cu 100 µL Solutie de stopare din kit

In final, s-a citit densitatea optica la 450 nm si 620 nm referinta.

Curba etalon a fost realizata din 8 puncte cu un standard de TNF-alfa utilizand concentratii cuprinse intre 0 – 2500 pg/mL.

Capitolul IV. Rezultate și discuții

Celulele NR8383 dupa 16 ore de incubare

A. Control

Figura 21: Celule NR8383 netratate

B. Control pozitiv

Figura 22: Celule tratate cu Triton 1%

Celulele NR8383 dupa 16 ore de incubare cu SiO2 (40 nm) si SiO2 (7-8 nm)

SiO2 (40nm)

Figura 23: Rezultatele obținute după incubarea celulelor cu SiO2

SiO2 (7-8 nm)

Figura 24 : Rezultatele obținute în urma incubării celulelor cu SiO2

Celule NR8383 dupa 16 ore de incubare cu oxid de grafena si nanopigment verde de ftalocianina de cupru

Oxid de grafenă GO

Figura 25 :Rezultate obținute în urma incubării celulelor cu GO

Nanopigment

Figura 26 : Rezultatele incubării celulelor cu nanopigment

Placi de 96 de godeuri dupa incubarea cu SiO2 (40 nm), SiO2 (7-8 nm), oxid de grafena si nanopigment verde de Ftalocianina de cupru

Figura 27: Rezultatele obținute în urma incubării nanomaterialelor

Parametru analizat : LDH

Tabelul 7: Nivelul de LDH și concentrațiile unor nanoparticule

Parametru analizat :GLU

Tabelul 8: Nivelul de GLU și concentrațiile nanoparticulelor

Parametru analizat: ROS/H2O2

Tabelul 9: Diagramele obținute în urma analizării nivelului de SRO și concentrațiile unor NP

Parametru analizat: TNF-alfa

Tabelul 10: Diagramele obținute în urma analizării nivelului de TNF-alfa și conc. de NP

Aceste teste constituiesc o evoluție în toxicologie pentru că astfel se explică răspunsul celular în urma expunerii la un nanomaterial.

Alveolele macrofage NR8383 s-au incubat la diferite concentrații de nanoparticule: 0, 22.5, 45, 90 și 180 µg/mL timp de câteva ore.

Analizele microscopice ale celulelor s-au realizat la microscopul optic Olympus IX73(Olympus, Tokyo, Japan), cu fază inversată, obiectiv de 10X și folosind un software Cellsens pentru a se putea face diferitele observații ce apar în urma tratamentelor.

Celulele ce nu au fost puse tratamentelor au reprezentat proba de control( celule NR8383 tratate cu Triton 1%).

LDH –ul este o enzimă intracelulară de tip oxidoreductază ( catalizează reacții de transformare acid lactic acid piruvic ) cu o distribuție la nivelul plămâilor , dar și a altor organe. Acesta este un marker nespecific tumoral care indică toxicitatea la nivelul celulelor.Nanoparticulele au obiceiul de a traversa membrana plasmatică, prin urmare influențează capacitatea nanaoparticulelor de a induce toxicitate.

Beta-glucorinidază este o enzimă cu rol important în metabolizarea unor compuși, printre care se află și toxinele din mediu.

Speciile reactive de oxigen sunt cele mai responsabile în producerea leziunelor la nivelul diferitelor macromolecule, o acumulare a acestora duce la inițierea fenomenului numit stres oxidativ. Acesta este generat de unii radicali liberi de tipul peroxidului de hidrogen, radicalului hidroxil și a anionului superoxid. Stresul oxidativ perturbă celulele și astfel induc reacții toxice; oferă un statut distrugător organismului, balanța interna fiind dezechilibrată complet.

TNF-alfa este o citokină proinflamatoare , adică distruge celulele maligne și care induce procesul de necroză. Acest compus stimulează fagocitoza la nivelul macrofagelor.

Concluzii

Partea experimentală a acestei lucrări a urmărit o serie de parametric și modificări induse de diferitele nanoprticule.Experimentele au fost întocmite pe celulele NR8383-macrofage alveolare , utilizându-se astfel diverse concentrații de nanoparticule.

Citotoxicitatea nanoparticulelor, după o expunere de 16 h a fost evaluată de nivelul LDH care a fost de aproximativ de 90% control pozitiv (similar cu nivelul de LDH pentru testul cu nanoparticule de SiO2 nemodificate) în mediul cu celule NR8383 tratate cu SiO2 (Evonick 7-8 nm, 40 nm)-independente de doză. O creștere a avut loc la nivelul dependenței de doză GO și nanopigment până la 80%. Nu sunt diferențe importante/ remarcabile între GO și nanopigment.

Beta-glucorinidază marcat ca fiind un activator al macrofagelor alveolare, din nou cea mai ridicată doză independentă a fost tot la nivelul SiO2 –Evonick (40% pentru SiO2 40 nm și 50% pentru SiO2 7-8 nm ), Doza dependentă GO și nanopigment, 30 % respectiv 40 % din controlul poztiv pentru cea mai ridicată doză.

Toate nanoparticulele testae au fost dependente de doză și nivelul înregistrat pentru celulele NR8383 a fost de 20% din controlul pozitiv pentru cea mai ridicată doză. Nivelul de specii reactive de oxigen indus de nanopigment a sărit peste 20% pentru concentrația de nanoprticule: 90, respectiv 180 µg/ ml.

Nivelul de TNF-alfa după 16 ore de incubare –toate nanoparticulele testate într-o manieră dependentă de doză până la 45 µg/ml a reprezentat aproximativ 50% din controlul pozitiv.Excepție făcând nanopigmentrul, unde creșterea a fost mai lentă și doza dependentă a urcat până la 90m µg/ml. După toate acestea, nivelul de TNF-alfa a început să scadă datorită unei viabilități scăzute a celulelor expuse la 90 și 180 µg/ml doză de nanoparticule( profilul TNF-alfa similar cu rezultatele nanoparticuelor SiO2 netratate, în acordul testelor lui Wiemann).

În conformitate cu cele prezentate mai sus reiese că nanomaterialele produc efecte nocive la nivel pulmonar, fiind dependente de doza administrată.