VETERINARĂ ION IONESCU DE LA BRAD DIN IAȘI [308510]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ

VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAȘI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

SPECIALIZAREA: [anonimizat]: [anonimizat]

2019

CUPRINS

LISTA FIGURILOR

Figura 1.1. Saccharomyces cerevisiae

Figura 1.2. Saccharomycodes ludwigii

Figura 1.3. Kloeckera taiwanica

Figura 1.4. Candida albicans

Figura 1.5. Torulopsis bacillaris

Figura 1.6. Dependența dintre temperatura de fermenție și durata de acumulare a biomasei de levuri imobilizate

Figura 1.7. Dependența dintre cantitatea de zahăr din must și biomasa de levuri acumulată

Figura 1.8. Dependența dozării de oxigen și cantitatea de biomasă acumulată

Figura 1.9. Schema secțiunii transversale a celulei de levură

Figura 1.10. Fermentația alcoolică

Figura 2.1. Schizosaccharomyces pombe

Figura 2.2. Brettanomyces bruxellensis

Figura 2.3. Metoda de însămânțare «în gazon»

Figura 2. 4. Așezarea plăcilor însămânțate și sigilate la incubare

Figura 2.5. Camera Neubauer îmbunătățită

Figura 2.6. Imaginea zonei pentru numărat celulele a camerei Neubauer

Figura 2.7. Introducerea probei destinate analizei microscopice în camera Neubauer

Figura 2.8. Tehnica de numărare a celulelor în camera Neubauer

Figura 2.9. Masa de lucru la care s-au efectuat cercetările

Figura 3.1. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 31-45

Figura 3.2. Aspectul vinului supus analizelor din probele 31-45 (1)

Figura 3.3. Aspectul vinului supus analizelor din probele 31-45 (2)

Figura 3.4. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 16-30

Figura 3.5. Aspectul vinului supus analizelor din probele 16-30

Figura 3.6. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 1-15

Figura 3.7. Aspectul vinului supus analizelor din probele 1-15

Figura 3.8. Executarea însămânțărilor pe mediile de cultură GPCA și PDA

Figura 3.9. Rezultatele obținute în urma însămânțărilor pe mediile de cultură GPCA și PDA

Figura 3.10. Rezultatele obținute în urma însămânțărilor pe GPCA și PDA

Figura 3.11. Mediile de cultură GPCA și PDA (45 probe luate în analiză)

LISTA TABELELOR

Tabelul 2.1. Ingredientele folosite pentru producerea mediului de cultură MEA

Tabelul 2.2. Ingredientele folosite pentru prepararea mediului de cultură YMA

Tabelul 2.3. [anonimizat] a diverselor băuturi alcoolice. Despre apariția vinului au fost scrise multe legende.[anonimizat], [anonimizat]-vie a fost “sălbatică”, fiind domesticită ulterior.

[anonimizat], pe care ulterior au început să le depoziteze. [anonimizat], [anonimizat], cu un conținut scăzut de alcool.

[anonimizat]. Este vorba despre Georgia (aprox. 6000 î.Hr.), Iran (aprox. 5000 î.Hr.), Grecia (aprox. 4500 î.Hr.) sau Sicilia (aprox. 4000 î.Hr.). [anonimizat], dar amestecați cu alte fructe în China care datează de acum 7000 – 5500 î.Hr.

Mult timp chimiștii priveau fermentația alcoolică ca un proces chimic în care nu participă organisme vii. Însă în anul 1837 Charles Kanyar de La Tour, Theodor Schwann și Friedrich Kutzing independent unul față de altul au elaborat lucrări, în care au demonstrat că microorganismele folosite de-a lungul istoriei în vinificație sunt levuri. Dar, în profida acestui fapt, după aceste studii efectuate mulți savanți continuau să nege rolul microorganismelor vii în fermentația alcoolică. Situația s-a schimbat când Louis Pasteur în anii 1850-1860 a repetat experimentele lui Theodor Schwann și a arătat că fermentația alcoolică o produc microorganisme vii.

Dioxidul de sulf se folosea în vinificație încă din timpurile Greciei Antice și Imperiului Roman. Astăzi dioxidul de sulf și alți conservanți (mai des folosit bicarbonat de dimetil) le adaugă în vinuri în diferite etape de producție a acestora: în procesul de zdrobire a strugurilor, după procesul de fermentație și în procesul de îmbuteliere. Dioxidul de sulf protejează vinul de bacterii și levuri patogene care îi pot modifica gustul, mirosul, corpolența și aspectul, ceea ce duce la oțetirea și alterarea vinurilor. În cazul în care nu se adaugă dioxid de sulf, vinul riscă să fermenteze în sticlă și din cauza prezenței bacteriilor în vin pot apărea gusturi și mirosuri neplăcute.

În această lucrare am ales să studiez efectul dioxidului de sulf și a bicarbonatului de dimetil asupra vinurilor. Folosirea acestor conservanți în diferite concentrații va arăta cât mai eficient și exact posibil acțiunea bicarbonatului de dimetil și a dioxidului de sulf asupra levurilor cu care au fost inoculate vinurile (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis) și asupra bacteriilor din vinuri.

Pentru a se realiza inocularea levurilor în vin, din mediile lichide au fost realizate diluții corespunzătoare protocolului de lucru pus la dispoziție de Laboratorul de Oenologie Pentru a realiza diluțiile necesare s-a folosit metoda diluțiilor succesive, iar verificarea acestora s-a realizat cu ajutorul unei camere Neubauer îmbunătățită.

Pentru reconfirmarea rezultatelor obținute s-au efectuat însămânțări și analize ulterioare. Din fiecare sticlă de vin s-au luat în total de 45 probe și s-au realizat însămânțări la suprafața și în profunzimea mediilor de cultură GPCA (glucoza peptona chloramphenicol agar) și PDA (potato dextrose agar) și apoi a avut loc incubarea acestora.

În cadrul acestor experimente s-a urmărit acțiunea conservantă a bicarbonatului de dimetil și a dioxidului de sulf asupra vinurilor. Rezultatele experimentelor arată perspectivele întrebuințării acestor conservanți în vinificație.

CAPITOLUL 1. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII NAȚIONALE ȘI INTERNAȚIONALE ÎN DOMENIUL MICROBIOLOGIEI VINULUI

Principalele specii de levuri întâlnite în vinificație

Levurile sunt fungi care pot produce fermentația alcoolică a glucidelor fermentescibile și care se îmnulțesc în general, prin înmugurire (mitoză) și în particular, prin ascospori. Levurile se clasifică în două subîncregături: Ascomycotina și Deuteromycotina.

Genul Saccharomycodes, cu specia Saccharomycodes ludwigii, prezintă forme apiculate sau oval-alungite cu dimensiuni până la 20 µm. Posedă o putere alcooligenă de 8-9% vol. alcool etilic. Este osmotolerantă și acidotolerantă. În unele cazuri poate fi agent de alterare a musturilor.

Genul Schizosaccharomyces cuprinde levuri de formă cilindrică, ovală, la care, desprinderea celulei nou-formate prin reproducere are loc prin sciziune. Schizosaccharomyces pombe, cu dimensiuni 5-7 x 3-5 µm, este xerofită, rezistentă la conservanți și poate produce alterarea musturilor.

Genul Zygosaccharomyces cuprinde levuri haploide cu celule ovale, care dețin proprietăți fermentative, osmotolerante. Pot crește și se înmulțească în medii cu aw= 0,62. Pot fermenta musturile concentrate și, de asemenea, siropurile concentrate de zahăr, cu formare de alcool etilic și acid acetic.

Genul Torulopsis deține celule ovale, sferice sau cilindrice. Speciile acestui gen izolate din mustul de struguri (Torulopsis bacillaris, Torulopsis stellata) au putere alcooligenă redusă. Sunt osmotolerante, psihrofile, sulfitorezistente. Pot produce alterări la musturi și vinuri.

Genul Saccharomyces cuprinde 45 de specii cu activitate predominant fermentativă. Se înmulțesc prin înmugurire și sporulare, producând 1-4 ascospori în asce persistente formate din celula diploidă. Dintre speciile reprezentative ale genului, menționăm:

– Sacch. cerevisiae, folosită la fabricarea vinurilor, berii și altor băuturi ce conțin alcool. Celulele au o formă ovală cu dimensiuni medii de 3-7 x 4-14 µm. Fermentează în anaerobioză glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza și maltoza. Aceste levuri au un randament ridicat, pot realiza 1 ml alcool din 1,7 g de zaharuri. Această specie de levuri prezintă puterea alcooligenă de 16% vol. alcool;

– Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus (Sacch. vini) (Fig. 1.1.), de formă elipsoidală cu dimensiuni 3-6 x 6-12 µm. Formează prin fermentare până la 16,8% vol. alcool etilic. Este sulfitorezistentă și poate produce fermentația alcoolică în medii cu până la 300 mg/L, SO2 total. În mustul de struguri în fermentație poate reprezenta 80% din microbiota levuriană. Se poate utiliza în culturi starter pentru vinificație.

Genul Brettanomyces cuprinde levuri anascogene de formă oval-cilindrică cu înmugurire terminală, care în condiții de aerobioză produc acid acetic prin fermentarea glucozei. Produc alterări la vinuri (cu formare de esteri și substanțe cu gust amar).

Genul Kloeckera posedă levuri de formă apiculată (de lămâie sau amforă) care se întâlnesc în microbiota strugurilor. Se dezvoltă în mustul de struguri în prima etapă a fermentației și activitatea lor este inhibată la creșterea concentrației în alcool peste 4-6% vol. alcool. (http://www.chimie-biologie.ubm.ro)

1.1.1 Levuri sporogene

În anul 1970, Lodder a grupat levurile sporogene în 25 de genuri și 190 de specii. (http://www.agriculturaromaneasca.ro/produse/drojdiile-folosite-in-vinificare-1030-t10.html)

În vinificație cele mai întâlnite sunt următoare specii ale genului Saccharomyces:

– Saccharomyces bayanus – are celule alungite, are puterea alcooligenă și rezistența alcoolică mai mici în comparație cu alte specii a genului dat. Saccharomyces bayanus, este acum considerată a fi rezultatul unor hibridizări multiple între trei specii pure, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces cerevisiae și Saccharomyces eubayanus.

– Saccharomyces aceti – are proprietatea de a oxida alcoolul etilic in prezența aerului cu formare de acid acetic.

– Saccharomyces capensis – se folosește pentru declanșarea rapidă a fermentației în vinurile albe sau roșii.

– Saccharomyces bailii – este o levura care nu se găsește pe struguri ci numai pe materialele vinicole. Saccharomyces bailii posedă caracteristici de rezistență pronunțată, permițându-i să supraviețuiască și să se înmulțească în condiții de stres. Saccharomyces bailii preferă medii ecologice caracterizate prin condiții osmotice ridicate.

– Saccharomyces chevalieri – are alcoolorezistență și sulfitorezistență slabe. Este similară cu Saccharomyces cerevisiae, dar nu are capacitatea de a fermenta maltoza. Se întâlnește mai mult pe strugurii și în vinurile roșii decât în cele albe.

– Saccharomyces ellipsoideus – este o levură care domină in fermentațiile provocate prin însămânțări asociate. Aceasta este levura care dă constituția și caracterul vinului.

– Saccharomyces prostoserdovi – a fost izolată în Armenia. Prezintă caractere fermentative instabile.

– Saccharomyces italicus – a fost izolată din mustul de struguri din Valais, Elveția.

(http://vinocenter.ru/osnovnye-rody-i-vidy-drozhzhej-v-vinodelii.html)

Genul Saccharomycodes este reprezentat de singura specie, Saccharomycodes ludwigii.

Vinurile obținute prin fermentația cu această specie au gust și miros neplacut datorită formării de acizi și esteri volatili. Această specie are sulfitorezistență ridicată și, de asemenea, rezistă la concentrații ridicate de acid acetic. Provoacă refermentări vinurilor dulci, de aceea nu este considerate ca specie favorabilă fermentației alcoolice a mustului. Pe de altă parte, această specie de levuri are puterea alcooligenă de 8-9% vol. alcool. Capacitatea acestor levuri de a micșora cantitatea de SO2 liber din substrat ar putea fi luată în considerare ca o posibilitate de desulfitare. În ansamblu însă pe baza celor relatate, Saccharomycodes ludwigii (Fig. 1.2) este considerată o levură patogenă. (Valeriu D. Cotea – Tratat de oenologie vol. I)

Genurile Pichia și Hansenula sunt reprezentate de:

Pichia membranifaciens și Hansenula anomala – au putere alcooligenă slabă. Influiențeaza negativ calitatea vinurilor. Pichia și Hansenula pot crește în mediu cu condiții extreme de stres, cum ar fi: pH scăzut sau ridicat, activitatea apei scăzută, presiune osmotică ridicată și condiții anaerobe (Fredlund, 2002). Datorită acestor caracteristici, aceste levuri pot prezenta un agent de degradare a vinurilor.

Pichia crește sub formă de o peliculă alb-gălbuie, pe suprafața vinului. Cele mai multe specii sunt inhibate aproximativ 10% vol. alcool, totuși, se mai pot regăsi aceste levuri și în vinurile cu concentrația acloolică de până la 13% vol. alcool, în funcție de temperatură.

Hansenula este capabilă să producă cantități mari de acid acetic și acetat de etil. În plus, specia Hansenula anomala este capabilă să utilizeze acidul malic care poate duce la o scădere substanțială a acidității titrabile și la creșterea pH-ului. Hansenula anomala apare sub formă ovoidă-alungită, aproximativ 2-4 x 2-6 μm, și poate fi întâlnită singură, în perechi sau în grupuri mici. Hansenula sp. se reproduce prin înmulțire asexuată, adesea celulele nu se separă, ceea ce duce la formarea de pseudomiceliu. (http://vinocenter.ru/osnovnye-rody-i-vidy-drozhzhej-v-vinodelii.html)

1.1.2. Levuri nesporogene

În 1970, Lodder a grupat levurile nesporogene în 12 genuri si 170 de specii. Cele mai des întâlnite genuri de levuri nesporogene din vinificație sunt următoarele:

– Genul Kloeckera (Fig. 1.3) – levurile din acest gen sunt dominante în faza incipientă a fermentației alcoolice. Levurile se prezintă sub formă de lămâie, au unul sau ambele capete ascuțite, de asemenea sunt numite levuri apiculate.

Reproducerea acestui gen are loc prin înmugurire bipolară. Celulele sunt apiculate, ovoidale sau alungite, iar ascosporele nu sunt produse. Speciile ale acestui gen includ: Kloeckera africana, Kloeckera apiculata, Kloeckera apis, Kloeckera corticis, Kloeckera lindneri și Kloeckera corticis.

Pe struguri apare in faza de pârgă, reprezentând 99% din totalul levurilor. Numeroase studii au demonstrat faptul că aceste levuri formează compuși metabolici care formează buchetul de gusturi și arome a vinului obținut. Levurile genului dat prezintă capacitatea de a produce și secreta enzime în mediu, cum ar fi β-glucozidazele, care eliberează monoterpene derivate din forma lor glicozilată. Acești compuși contribuie la apariția aromelor de fructe în vinurile obținute cu ajutorul acestor levuri. (https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4020-8292-4_14)

Genul Candida (Fig.1.4) – cuprinde specii cunoscute popular sub denumirea de levuri de floare – provoacă boala « Floarea vinului ». Floarea vinului apare din cauza levurilor din genul Candida, care se dezvoltă atunci când vinul vine în contact îndelungat cu aerul. Se recunoaște prin apariția la suprafața vinului a unei pelicule albicioase, subțiri la început, care se îngroașă și prin urmare se depune pe fundul vasului, tulburând vinul. Pe măsură ce boala avansează, vinul capătă un gust dezagreabil și un miros rânced, își pierde din extract și din tăria alcoolică, devenind apos.

Genul Torulopsis – prezintă specii de levuri de formă sferică și ovală, se reproduc prin înmugurire multipolară. Se găsește pe strugurii stafidiți prin intervenția putregaiului nobil.

Genul Torulaspora – în timpul fermentației produce cantități mici de acizi volatili. Genul Torulaspora este folosită ca o cultură starter (asociată cu S. cerevisiae în culturi mixte) pentru anumite aplicații, în special pentru a reduce aciditatea volatilă în fermentațiile cu conținut ridicat de zahăr, cum ar fi vinurile «Sauternes».

Genul Rhodotorula – levurile acestui gen sunt numite mucilaginoase, produc mucilagii în musturi și în vinurile tinere. Se întâlnesc în pivnițele de vinuri în care formează împreună cu unele bacterii și alte ciuperci depuneri mucilaginoase pe pereții umezi. Deși, sensibile la alcool prezintă o rezistență mare la temperaturi ridicate (50-60șC) și la acțiunea substanțelor alcaline (fosfat trisodic 1%). Rezistă la acțiunea acidului boric până la concentrația de 3%.

Genul Brettanomyces – cuprinde specii de levuri de contaminare dăunatoare calității vinului. Mai frecvent se întâlnesc în vinurile bolnave de floare, oțetite. Prezența lor favorizează formarea de acetat de etil și alți compuși ce dau mirosuri intense cu iz de șoarece. (http://www.muhaz.org/microbiologie.html?page=8)

1.1.3. Folosirea levurilor în vinificație. Răspândirea acestora

Levurie sunt larg răspândite în natură. Ele se întâlnesc în apă, sol, pe plante, fructe, flori.

Solul reprezintă habitatul natural și rezervorul principal al levurilor. Numărul levurilor pe gram de sol variază de la zeci de mii la milioane. Variațiile sunt date de tipul de sol, sezon, regiune, umiditate și alți factori. De obicei se întâlnesc în stratul superficial de 2-10 cm, iar în solurile podgoriilor până la 30-40 cm. În microflora solului levurile sunt mai puțin răspândite decât bacteriile. Distribuția levurilor în sol depinde de natura și porozitatea solului, fauna solului (în special insectele) și gradul de descompunere al plantelor și fructelor. Ca atare, doar în condiții similare se poate vorbi de o omogenitate calitativă și cantitativă a microflorei din interiorul aceluiași sol. În dependență de sezon, în sol se întâlnesc atât forme vegetative cât și cele de rezistență (spori).

Din sol au fost izolate specii de Candida, Hansenula, Criptococcus, Lypomyces, Schwanniomyces. În ape se întâlnesc specii de Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Criptococcus care, de asemenea, provin din sol. În rizosfera plantelor se întâlnesc specii de: Rhodotorula, Criptococcus și levuri fermentative ca Saccharomyces pretoriensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces veronae. Pe semințe se întâlnesc specii de Sporobolomyces. Pe flori și în nectarul lor se întânlesc specii de Torulopsis, Candida, Sporobolomyces, Rhodotorula, Criptococcus. În exudate se întâlnesc specii de Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Nadsonia.

Pe struguri, în must și în vin se întâlnesc numeroase specii de levuri. Faptul că în boabă sucul nu fermentează atâta timp cât integritatea pieliței nu este distrusă, demonstrează că levurile se găsesc pe surafața ei. Levurile apar pe boabe în timpul maturării. Răspândirea lor se datorește insectelor, în special musculiței de oțet. Odată cu excrementele sau doar prin simplul contact, insectele depun pe suprafața boabelor levurile consumate cu hrana, sau luate prin contact cu focarele de fermentație (fructe stricate, materii organice în descompunere).

Levurile mai pot ajunge pe struguri prin intermediul particulelor de pământ sau praf în care ele se găsesc ca atare, sau sub formă de spori, precum și prin stropii provocați de ploi. Solul este considerat sediul de iarnă al levurilor. Levurile ce se găsesc pe struguri aparțin mai multor specii iar proporția dintre ele este de asemenea diferită în dependență de starea de sănătate a recoltei, climatul podgoriei. În acest caz, dacă se va lua în considerare proporția sub care se găsesc cele două mari grupe de levuri sporogene și nesporogene, se constată că ele pot fi reprezentate în mod identic sau diferit, după modul în care este situată podgoria, într-un climat mai cald sau în unul mai rece. Ca atare în climatul cald domină formele sporogene, adică cele care sunt capabile să reziste la condiții nefavorabile de creștere și multiplicare (temperatură și secetă ridicate). De asemenea, pe strugurii atacați de putregaiul nobil, unde miceliul secretă un antibiotic antilevuric, microflora levuriană, în care se găsește deseori Torulopsis bacillaris (Fig. 1.5.), este deosebită de cea a strugurilor sănătoși unde această levură este reprezentată mai slab sau deloc.

Fig. 1.5. Torulopsis bacillaris

(https://wineserver.ucdavis.edu/industry-info/enology/wine-microbiology/yeast-mold/)

Pe struguri levurile se găsesc într-un număr relativ mic (1000-100000 celule/ml must rezultat) și repartizate neuniform. În cadrul unui butuc se pot găsi struguri aproape complet lipsite de levuri. În timpul prelucrării recoltei și a manipulărilor, la proporția de levuri de pe struguri se adaugă levurile existente în mustul care acoperă într-un strat subțire mașinile și utilajele de zdrobire, desciorchinare, presare. Acest strat de must având acces la aer oferă condiții optime pentru înmulțirea levurilor. Din aceasta reiese că mașinile și utilajele de prelucrare a strugurilor prezintă un rol deosebit în însămânțarea mustului cu levuri.(Valeriu D. Cotea – Tratat de oenologie vol. I)

Levurile reprezintă cel mai important element care distinge mustul de struguri de vin. În absența oxigenului, levura transformă zaharurile din must în alcool și dioxid de carbon prin procesul de fermentație. Cu cât cantitatea de zaharuri din must este mai mare, cu atât va fi mai mare nivelul de alcool al vinului. Uneori vinificatorii încetează fermentația devreme pentru a lăsa zahăr și dulciuri reziduale în vin, cum ar fi vinurile de desert. Acest lucru se poate realiza prin scăderea temperaturilor de fermentare până la punctul în care levura este inactivă, filtrarea sterilă a vinului pentru a elimina levurile sau fortificația cu brandy pentru a distruge celulele de levuri. Dacă fermentația este oprită în mod involuntar, cum ar fi atunci când levurile devin epuizate de nutrienți disponibili și vinul nu a ajuns încă la uscare, aceasta este considerată o fermentație blocată.

Genul Saccharomyces are cea mai mare importanță și răspândire în vinificație.

Specia Saccharomyces vini în comparație cu alte genuri și specii sunt raspândite în natură mai puțin. În timpul fermentației și maturării această specie reprezintă aproximativ 80% din toate levurile genului Saccharomyces. Celulele au formă rotundă, ovoidă sau ovală. Dimensiunile sunt: 5-7 × 8-11 μm. O trăsătură caracteristică a levurei Sacch. vini reprezintă alcoolorezistența ridicată, 16% vol. alcool. Capacitatea de fermentare a Sacch. vini este mai mare decât cea a altor specii de levuri.

Specia Saccharomyces oviformis se găsește rar în natură. Levurile din această specie sunt adesea găsite în must care fermentează, se acumulează spre sfârșitul fermentației datorită rezistenței mai mari la alcool decât Sacch. vini. Conform caracteristicilor morfologice, levura Sacch. oviformis nu diferă de alte specii din genul Saccharomyces. O caracteristică importantă a acestei specii este capacitatea de fermentare a mustului cu conținut ridicat in zaharuri (conținutul de zaharuri este mai mare de 30 g pe 100 ml de must) pentru obținerea vinurilor cu conținut crescut de alcool, 18-19% vol. alcool. Această specie de levuri prezintă o mare capacitate de a oxida alcoolul. Specia Sacch. oviformis are un rol pozitiv în vinificație atunci când fermentează mustul de înaltă calitate pentru a produce vinuri seci. Levurile acestei specii sunt bine adaptate condițiilor de producție a șampaniei. Aceste levuri cauzează și opacitatea vinurilor îmbuteliate.

Specia Saccharomyces uvarum a fost găsită în diverse fructe și sucuri. Această specie de levuri se dezvoltă lent, prezintă o alcoolorezistență medie, este rezistentă la frig.

Există un număr mare de specii de levuri selectate și utilizate în producție. Fermentația efectuată corect determină calitatea vinului obținut și depinde în cea mai mare măsură de alegerea rațională a speciei de levuri. Levura trebuie să îndeplinească cerințele și condițiile de producție a anumitor tipuri de vinuri (vinuri seci, demidulci, șampanie etc.). O mare importanță în legătură cu aceasta prezintă utilizarea culturilor pure de levuri, care au fost selectate în conformitate cu cerințele producției și condițiile dintr-o zonă anumită.

Numai prin aplicarea unei culturi pure de levuri, se poate obține vinuri cu calități prestabilite. Acest lucru se datorează faptului că cultura pură de levuri nimerește în condiții optime, se inmulțește, suprimă microflora sălbatică, devine dominantă și fermentează rapid zaharurile din must.

Metoda de obținere a culturilor pure de levuri dintr-o celulă izolată a fost dezvoltată în 1881 de botanistul olandez Hansen în legătură cu fabricarea berii. În vinificație culturile pure de levuri pentru prima dată le-a aplicat savantul german Müller-Thurgau.

1.1.4. Factori care influențează dezvoltarea levurilor

Dezvoltarea levurilor în timpul fermentației este influențată de următorii factori: concentrația de zahăr, temperatura și lumina, aciditatea mediului și prezența microelementelor, conținutul de alcool, accesul la oxigen.

1. Temperatura (Fig. 1.6.) și lumina. Pentru majoritatea levurilor, temperatura optimă de fermentație este de 20-26 °C (levurile de bere cu fermentație inferioară necesită 5-10 °C). Intervalul acceptabil este de 18-30 °C. La temperaturi mai scăzute, fermentația este încetinită simțitor, iar dacă valorile temperaturii sunt sub zero levurile intră în starea de anabioză. Pentru a relua procesul de fermentație, este suficient de a ridica temperatura.

Fig. 1.6. Dependența dintre temperatura de fermenție și durata de acumulare a biomasei de levuri imobilizate (http://www.cnaa.md/files/theses/2017/52307/aliona_nazaria_thesis.pdf)

Temperatura prea ridicată distruge levurile. Pragul de anduranță depinde de specie. În general, sunt considerate valori periculoase peste 30-32 °C.

Rezervorul pentru fermentație este lăsat într-un loc întunecat. Absența luminii solare directe ajută la evitarea supraîncălzirii și influențează pozitiv activitatea levurilor de fermentație.

2. Concenția de zahăr (Fig. 1.7.). Pentru majoritatea speciilor de levuri, concentrația optimă în zahăr a mustului este de 10-15%. La concentrații mai mari de 20% fermentația se reduce, iar când concentrația este de 30-35% fermentația este aproape garantat stopată, zahărul devine conservant care împiedică dezvoltarea levurilor.

Fig. 1.7. Dependența dintre cantitatea de zahăr din must și biomasa de levuri acumulată (http://www.cnaa.md/files/theses/2017/52307/aliona_nazaria_thesis.pdf)

3. Aciditatea mediului și prezența microelementelor. Aciditatea de 4,0-4,5 promovează fermentația alcoolică și inhibă dezvoltarea microorganismelor străine. În mediul alcalin, microorganismele secretă glicerol și acid acetic. În mediul neutru fermentația decurge în mod normal, dar bacteriile patogene se dezvoltă activ. Aciditatea mustului este corectată înainte de adăugarea levurilor.

Pe lângă zahăr și apă, levurile necesită alte substanțe – în principiu azot, fosfor și vitamine. Aceste microelemente sunt utilizate de levuri pentru a sintetiza aminoacizii care alcătuiesc proteina lor, precum și pentru reproducere în stadiul inițial de fermentație.

4. Conținutul de alcool. Pe de o parte, alcoolul etilic este un produs al metabolismului levurilor, pe de altă parte – este o toxină puternică pentru levuri. În cazul în care concentrația de alcool în must este de 3-4% vol. alcool, alcoolul începe să încetinească dezvoltarea levurilor, la 7-8% vol. alcool levurile nu se mai multiplică, iar la 10-14% vol. alcool nu mai fermentează zahărul – se stopează fermentația. Aproximativ 1% din zahărul din must conferă aproximativ 0,6% vol. alcool. Aceasta înseamnă că este necesară o soluție cu un conținut de zahăr de 20% (20 × 0,6 = 12) pentru a produce 12% vol. alcool.

5. Accesul la oxigen (Fig. 1.8.). În condiții anaerobe (fără acces la oxigen), levura este destinată supraviețuirii, nu reproducerii. În mediul anaerob se produce cantitatea maximă de alcool, astfel încât în cele mai multe cazuri este necesar să se protejeze mustul de accesul la aer și, în același timp, să se organizeze îndepărtarea dioxidului de carbon din rezervor, pentru a se evita creșterea presiunii. Această sarcină este rezolvată prin instalarea unei garnituri hidraulice.

Fig. 1.8. Dependența dozării de oxigen și cantitatea de biomasă de levuri acumulată (http://www.cnaa.md/files/theses/2017/52307/aliona_nazaria_thesis.pdf)

La contactul constant al mustului cu aerul, există pericolul de alăptare. La început, când fermentația este activă, dioxidul de carbon eliberat împinge aerul de pe suprafața mustului. Dar, la sfârșit de fermentație, când fermentația slăbește și dioxidul de carbon apare mai puțin și mai puțin, aerul intră în recipientul neînchis cu must. Sub influența oxigenului, se activează bacteriile acetice, care încep să transforme alcoolul etilic în acid acetic și apă, ceea ce duce la deteriorarea vinului. De aceea, este foarte important de a închide rezervorul cu o garnitură hidraulică.

Însă, pentru reproducerea levurilor, este necesar oxigen. De obicei concentrația care este în apă este suficientă pentru reproducerea levurilor. (https://www.alcofan.com/osobennosti-spirtovogo-brozheniya.html)

1.1.5. Caracterele morfologice generale ale levurilor

Levurile au diferite forme morfologice: rotunde, eliptice, ovale, cilindrice. Forma și structura sunt nepermanente, ele se pot schimba în legătură cu schimbarea condițiilor de cultură. Levurile sunt alcătuite din: membrana celulară, citoplasma, în iteriorul căreia se gasesc: nucleul, mitocondriile, ribozomii, vacuolele, aparatul Golgi și substanțe de rezervă sub formă de picături de grăsime și boabe de glicogen. (Fig.1.9)

Celulele tinere au o citoplasmă omogenă, uneori un vacuol mic. Odată cu vârsta celulei, apare granularitatea, vacuolul crește. Dimensiunea celulei variază de la 5 la 7 µm în diametru și de la 8 la 12 µm în lungime.

Învelișul celulei se compune din peretele celular, cu grosimea de cca. 10 micrometri, având în compoziție polizaharide omogene și neomogene, glucani, manani, chitină și membrana citoplasmatică cu structura trilamelară similară cu a bacteriilor, compusă din polizaharide, lipoproteine si nucleotide.

Membrana citoplasmatică (plasmalema) are o grosime redusă (8-9 nm), fiind formată din trei straturi de natură lipoproteică. Fracțiunea lipidică este compusă din cca. 30% fosfolipide, acizi grași nesaturați și steroli. Plasmalema are un rol dinamic important în transportul metaboliților, dar importanța ei rezidă și din funcția de regulator a presiunii osmotice celulare prin proprietatea sa – dată de conținutul de grăsimi – de a fi hidrofobă. Ca urmare a acestei proprietăți, unele substanțe foarte necesare celulei, ca de exemplu aminoacizii nepolari, unele vitamine, sterolii liposolubile sunt admise si transferate în celulă.

La celulele tinere membrana citoplasmatică este omogenă spre deosebire de cea a celulelor batrâne care formează pliuri ce maresc suprafața ei.

Citoplasma (protoplasma celulei, exclusiv nucleul), situată între membrana celulară și membrana nucleară, este alcatuită dintr-o matrice citoplasmatică, citoplasma – faza solubilă în care se află organitele citoplasmatice comune și specifice, diverse incluziuni și factorii ereditari responsabili pentru ereditatea extranucleară (plasmagenele). (http://www.eniw.ru/drozhzhi.htm)

În citoplasmă se petrec în fiecare secundă cel puțin 1500 de reactii diferite, cu precizie mult superioară celor mai perfecționate mașini cibernetice, în plus ea având și capacitatea de a se autoreproduce.

Incluziunile de glicogen și trehaloza constituie substanțe de rezervă, pe care levura le sintetizează și acumulează în scopuri energetice și de creștere, ca masură preventivă la eventualele stări de carență nutritivă.

Oleozomii (sferozomii) sunt incluziuni sferice de lipide având rol de rezervă energetică în primul rând, dar și pentru scopuri structurale ale membranelor și coloizilor citoplasmatici poli-hetero-proteici-moleculari.

Acizii nucleici din citoplasmă sunt de tipul ARN: ribozomal, de transfer, transportor, mesager și determină la nivelul ribozomilor acțiunea genelor, decodificând mesajul genetic prin sinteza proteinelor specifice. Se mai intâlnesc și alte tipuri de acizi nucleici ce au rol în sinteza proteinelor cu functii specifice de agenți antimicrobieni, ca de exemplu ARN – k (killer). În acest caz, este inhibată sinteza de proteine prin perturbarea legării ARN – t la complexul ARN – m și generează producerea de proteine anormale prin perturbarea tripletei de la nivelul ARN.

Microtubulii si microfilamentele sunt organite cu structură de rețea tridimensională ce menține configurația arhitecturală a organitelor intracelulare (asemănătoare unei structuri metalice de susținere la construcții).

Sistemul vacuolar cuprinde un vacuom central delimitat de o membrană (tonoplast)* cu o structură electrono-microscopică similară plasmalemei și alte câteva vacuole mai mici amplasate în locuri diferite în citoplasmă sau tangente la vacuomul central. În interiorul vacuomului au loc o serie de reacții biochimice prin care se produc substanțe necesare metabolismului și structurii celulare. Așezarea vacuomului central lângă nucleul celulei sugerează posibilitatea ca în interiorul său să aibă loc reacții de transfer energetic și nutritiv, vacuomul având probabil și rolul de interfață între nucleu si citoplasmă. Vacuomul central este vizibil în faza staționară de creștere iar în faza activă sistemul cuprinde mai multe vacuole de dimensiuni mai mici, formând o rețea, având funcții de menținere constantă a presiunii osmotice. (http://www.scritub.com/biologie/CIUPERCI-MICROSCOPICE65129.php)

Fermentația alcoolică

Fermentația alcoolică, este un proces biologic care transformă zaharurile cum ar fi glucoza, fructoza și zaharoza în energia celulară, producând etanol, dioxid de carbon și produse secundare. Deoarece levurile efectuează această conversie în absența oxigenului, fermentația alcoolică este considerată un proces anaerob. (Fig.1.10)

Fermentația alcoolică este un proces întâlnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantități mai reduse de alcool etilic comparativ cu levurile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, Zymomonas, dar ele nu sunt considerate agenți tipici.

Pentru a putea fi folosite în practică, levurile genului Saccharomyces sunt studiate și selecționate în funcție de unele proprietăți care le recomandă pentru utilizare industrială, cum ar fi:

Puterea alcooligenă care se referă la concentrația maximă de alcool ce se poate acumula când în mediu există un exces de zahăr și la capacitatea levurilor de a continua fermentația la creșterea concentrației de alcool. Levurile sunt sensibile la creșterea concentrației în alcool, și în timp ce levurile cu putere alcooligenă slabă (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentrație în alcool de 4-6% vol. alc. levurile de vin și alcool (Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces cerevisiae) au o putere alcooligenă mare și continuă fermentația alcoolică până se acumulează 16-18% vol. alcool.

Sulfitorezistența este capacitatea levurilor de vin de a produce fermentația alcoolică în prezența unor concentrații de SO2 de 200-500 mg/dm3 care pot influența negativ activitatea altor levuri din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scăderii potențialului de oxidoreducere.

Capacitatea de floculare și pulverulența – proprietăți datorate structurii peretelui celular și a modificării de pH și rH din timpul fermentației. Levurile floculante pot forma asociații ce se depun mai ușor, în timp ce levurile pulverulente se mențin mai mult timp în suspensie și produc o fermentație mai avansată.

Osmotoleranța se referă la capacitatea levurilor de a produce fermentația în mediu cu o concentrație crescută de zahăr. Aceste proprietăți sunt recomandate levurilor folosite la obținerea alcoolului din melasă cu un randament superior în alcool etilic.

Caracterul killer este întâlnit la unele levuri capabile de a sintetiza intracelular o toxină cu efect inhibitor asupra altor levuri sensibile. În selecționarea levurilor de vin culturile care au caracter killer dau randamente superioare, în cursul fermentației are loc o autoselecție naturală.

Influența factorilor fizico-chimici asupra fermentației alcoolice

Compoziția mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate în mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, în funcție de calitatea mustului, care este influențată de soiul și gradul de coacere a strugurilor, apar diferențe de aromă.

Concentrația în zahăr influențează direct proporțional viteza de fermentare atunci când se situează în limitele 5-12% (50-120 g zahăr/dm3). Cu creșterea concentrației de zahăr anumite levuri mai sensibile suferă o inhibare în activitate prin procese de represie catabolică sau prin modificări la nivel de membrană datorate plasmolizei. Levurile de fermentare au în general osmotoleranță și de aceea produc fermentarea în bune condiții a mustului de struguri cu o concentrație de 170-250 g zahăr/dm3.

Concentrația în alcool. În mediile fermentative cu microbiotă naturală, dacă se ajunge la o concentrație alcoolică de 4-6% vol. alcool, se produce o încetinire a fermentației la levuri care nu au rezistență la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuată de levuri alcoolorezistente, acumulându-se 18-20% vol. alcool.

PH-ul are un rol important în formarea compușilor de fermentare, în funcție de pH cunoscându-se două forme ale fermentării: fermentarea alcoolică propriu-zisă, ce se desfășoară la pH 3,5-5 când produsul principal este alcoolul etilic și dioxidul de carbon, cu produși secundari în cantități mici, echilibrate și fermentarea la pH alcalin, când în afară de alcool etilic și dioxid de carbon se formează în cantitate mai mare glicerol (până la 30% din zahărul fermentat).

Temperatura. Enzimele componente ale sistemului enzimatic prezintă fiecare un optim de activitate, iar proprietățile sunt determinate genetic de caracterele speciei. Fermentația alcoolică poate avea loc între 0-35șC. În funcție de specia de levuri predominantă sau folosită în cultură pură temperaturile optime sunt la:

28-30șC, pentru levura de alcool și de panificație (Saccharomyces cerevisiae);

6-12șC, pentru levura de bere (Saccharomyces carlsbergensis);

15-20șC, pentru levurile de vin (Saccharomyces ellipsoideus și Saccharomyces oviformis), care produc o fermentare mai lentă la aceste temperaturi, dar conduc la obținerea unui vin de calitate deoarece la temperaturi mai scăzute se evită pierderile de substanțe volatile.

Zaharoza este un dimer al moleculelor de glucoză și fructoză. În prima etapă a fermentației alcoolice, enzima denumită «invertază» scindează legătura glicozidică dintre moleculele de glucoză și fructoză.

C12H22O11 + H2O + invertază 2 C6H12O6

În timpul fermentației alcoolice, pe lângă produsele principale – alcoolul și CO2, mai apar și multe așa-numite produse de fermentație secundară care provin din zaharuri. Din 100g de glucoză se formează 48,4g alcool etilic, 46,6g dioxid de carbon, 3,3g glicerină, 0,5g acid succinic și 1,2g amestec de acid lactic, acetaldehidă, acetoină și alți compuși organici.

Împreună cu acestea levurile în perioada de reproducere și creștere logaritmică consumă din mustul de struguri aminoacizi, necesari pentru a-și construi propriile proteine. Aceasta produce produse secundare de fermentație, în principal alcooli superiori. (https://conspecte.com/Merceologia-marfurilor-alimentare/procese-metabolice-ale-microorganismelor.html)

1.3 Bicarbonat de dimetil. Generalități și folosirea în industria alimentară

Bicarbonatul de dimetil este un aditiv alimentar utilizat în vinuri, sucuri de fructe, ceaiuri reci și băuturi carbogazoase ca conservant și sterilizator. În vin, se descompune în metanol și dioxid de carbon, care se găsesc și în natură.

Se utilizează ca conservant pentru inactivarea microorganismelor în timpul procesării băuturilor, adică se adaugă în produse după ce au fost prelucrate prin alte metode fizice sau chimice, pentru sterilizarea lor reziduală de microorganisme.

Aditivul alimentar are un efect antimicrobian și antifungic și este aprobat pentru utilizare în UE și în Rusia și este recunoscut ca fiind sigur. În alte țări, de asemenea, permis, dar în cantități mai limitate.

Bicarbonatul de dimetil este un lichid incolor, cu un miros expresiv de fructe. Are un punct de topire de 17°C și un punct de fierbere de 172°C. Se dizolvă în apă și se amestecă cu toluen și, de asemenea, foarte bine se dizolvă în alcool.

Bicarbonatul de dimetil are o formulă moleculară de C4H6O5 și o greutate moleculară de 134,09g/mol.

Pentru a asigura utilizarea sa în condiții de siguranță, se stabilește cantitatea maximă de bicarbonat de dimetil, care poate fi adăugată în băuturi – 250ppm. Bicarbonatul de dimetil prezintă activitatea sa antimicrobiană împotriva următoarelor levuri: Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Rhodotorula, Candida, Pichia, Endomyces și altele.

Bicarbonatul de dimetil este în prezent aprobat ca inhibitor de levuri în diferite băuturi în condiții normale de îmbuteliere sau conservare, atunci când numărul de levuri viabile este de până la 500 pe mililitru (ml) sau mai puțin.

După descompunerea până la metanol și dioxid de carbon, efectul antimicrobian nu este păstrat. Aditivul este destinat utilizării pentru controlul agenților microbiologici în următoarele băuturi:

– în vin, vin alcoolizat și vin cu conținut scăzut de alcool;

– în ceaiuri gata pentru consum;

– în apă carbogazoasă sau necarbogazoasă;

– în băuturi carbogazoase, diluate, care conțin suc, aromă de fructe sau ambele, cu un conținut de suc care nu depășește 50%.

În băuturi Bicarbonatul de dimetil, îi este permisă utilizarea în condiții normale de îmbuteliere, conservare sau alte forme de ambalare finală, în cazul în care încărcătura microbiană viabilă este redusă la 500 microorganisme pe mililitru sau mai puțin, mai întâi prin alte metode de conservare, cum ar fi tratarea termică, filtrarea sau alte tehnologii înainte de utilizarea bicarbonatului de dimetil.

În soluție, bicarbonatul de dimetil hidrolizează rapid și complet și/sau intră în reacție cu diferiții constituenți ai băuturilor tratate și, ca rezultat al acestei reacții, dicarbonatul de dimetil nu rămâne în băutura tratată, gata pentru consum.

Bicarbonatul de dimetil nu nimerește direct în corpul uman, deoarece se dezintegrează imediat în produsul alimentar, dar unii cercetători sugerează că produsele sale de descompunere pot avea un efect negativ asupra sănătății omului.

Riscul asociat utilizării bicarbonatului de dimetil ca aditiv alimentar constă în acționarea metanolului (produsul hidrolizei sale) cu principalele produse de reacție, dar conținutul lor în produsul final este același ca în orice vin și în orice băuturi carbogazoase, fără adăosul aceastei substanțe, deoarece sunt componente naturale ale sucurilor de fructe.

Acest produs este iritant pentru ochi și sistemul respirator, prin inhalare de vapori. Prin urmare, se recomandă de lucrat cu acest aditiv alimentar, în producție, cu utilizarea echipamentului de protecție, cum ar fi măștile și ochelarii de protecție.

Diferite organisme de reglementare internaționale au evaluat bicarbonatul de dimetil și au concluzionat că acest supliment alimentar nu cauzează probleme de sănătate și siguranță atunci când este utilizat în categoriile de băuturi permise și în anumite doze.

Siguranța bicarbonatului de dimetil a fost evaluată de către USFDA în 1988 și aprobată pentru utilizarea în vinuri ca inhibitor de levuri cu o concentrație de 200 mg/l. Comitetul European Științific pentru Alimentație (SCF, 1992) a evaluat E242 (bicarbonat de dimetil) în 1990 și a concluzionat că este potrivit pentru sterilizarea la rece a băuturilor nealcoolice și a sucurilor de fructe cu niveluri de până la 250 mg/l.

În 2001, acest comitet a stabilit o limită superioară de 200 mg/l pentru utilizarea bicarbonatului de dimetil în băuturile alcoolice care conțin deja metanol (SCF, 2001). (https://foodandhealth.ru/dobavki/dimetildikarbonat-e242/)

1.4 Substanțe conservante utilizate în vinificație

Dioxidul de sulf este un gaz incolor, cu miros înțepător și înecăcios și cu gust acru-zgârietor. El nu arde, nu întreține arderea și are proprietăți reducătoare (fixează oxigenul). Dioxidul de sulf se obține prin arderea pucioasei brute, iar în concentrație ridicată este sufocant și toxic; în concentrație mică este considerant printre poluanții cei mai nocivi ai aerului. Este unul dintre aditivii admiși (E 220) pentru conservarea calității alimentelor, constituind un mijloc sigur și imediat de conservare a vinurilor și musturilor.

Dioxidul de sulf constituie în prezent principalul antiseptic cu ajutorul căruia se poate distruge sau inhiba, pentru o perioadă de timp, activitatea și dezvoltarea microorganismelor din vin și must. Acțiunea sa antiseptică nu se manifestă brusc. Chiar în condițiile folosirii unor doze foarte mari, el acționează progresiv în felul unui narcotic care atinge cu timpul toate celulele. Blocând sistemul enzimatic și reacțiile enzimatice ale celulelor, el poate altera cu timpul însăși funcția metabolică a microorganismelor. Pentru unele dintre ele, acțiunea SO2 este considerată biocidă respectiv fungicidă sau bactericidă, pentru celelalte levuri și bacterii are numai acțiune biostatică, respectiv fungistatică sau bacteriostatică. În acest ultim caz, miocroorganismele nu sunt distruse complet, ele trăiesc dar sunt lipsite pentru un anumit timp de funcțiile lor de fermentare și multiplicare.

Acțiunea dizolvantă – în soluție, dioxidul de sulf formează acidul sulfuros H2SO3, care contribuie la solubilizarea substanțelor minerale și extracția materiilor colorante din struguri astfel vinurile devin mai extractive si chiar mai acide.

Ameliorarea insușirilor calitative – dioxidul de sulf asigură conservarea prospețimii aromelor și culorii, participă la formarea buchetului, împiedică fermentările și îmbolnăvirile vinului. Poate permite sistarea fermentației alcoolice pentru obținerea unor vinuri demiseci, demidulci și dulci și este considerat un agent de bonificare.

În prezent nu s-a descoperit nici un produs care poate înlocui complet SO2 în producția vinurilor. În schimb, există substanțe care pot prelua o parte din acțiunile dioxidului de sulf, încât acesta să poată fi utilizat în doze mai reduse.

Acidul sorbic. Se găsește în mod natural în fructele de scoruș. Se comercializaează sub formă de cristale albe, având un miros caracteristic, asemănător untului. Cel mai corespunzător pentru practica vinicolă s-a dovedit a fi sorbatul de potasiu, care conține 75% acid sorbic. Nu are acțiune toxică în organism, deoarece se oxidează în substanțe inofensive pentru sănătatea omului(CO2 și apă).

Acidul sorbic se utilizează numai pentru stabilizarea biologică a vinurilor dulci. La vinuri, doza de acid sorbic variază de la 80 până la 200 mg/l, în funcție de pH, încărcătura levuriană, gradul alcoolic și prezența SO2. Acidul sorbic poate imprima vinului un miros particular de unt rânced.

Acidul ascorbic. Este folosit ca substanță de conservare datorită proprietăților lui reducătoare. În mod natural, el e prezent în struguri și musturi până la 50 mg/l, dar lipsește din vinuri, deoarece este distrus în timpul fermentației alcoolice. Datorită capacității lui de a reacționa direct cu oxigenul, el protejează vinurile împotriva oxidării. Tratamentul este eficient numai la vinurile care ulterior nu mai suportă aerații, respectiv pentru cele care urmează a fi îmbuteliate. În acest caz se aplică și o sulfitare, deoarece acidul ascorbic nu poate prelua și celelalte acțiuni ale SO2.

Tratamentul cu acid ascorbic este autorizat în majoritatea țărilor vitivinicole, doza maximă legală admisă fiind de 100 mg/l. Doza recomandabilă este de 30-50 mg/l, în asociere cu 20-30 mg/l SO2 liber.

Dietilpirocarbonatul (DEP) este cunoscut și sub denumirea comercială de Baycovin. El este un lichid incolor, cu miros puternic eterat și iritant. Folosirea lui se bazează pe acțiunea sa puternic antiseptică față de levuri și față de bacteriile lactice.

Hidroliza lui în alcool etilic și apă este foarte rapidă. În patru ore, la 20șC, se hidrolizează 80% din cantitatea introdusă. Pentru a asigura eficiența acestui tratament, el trebuie aplicat cu cel mult 30 minute înainte de îmbuteliere. O mică parte reacționează cu diferite substanțe din vin, ca de exemplu, acizi organici, compuși fenolici, substanțe azotate, formând etiluretanul, care este considerat toxic, cancerigen. Din această cauză, folosirea lui a fost interzisă.

Au mai fost testate și alte substanțe de conservare ca: izotiocianatul de alil și unele antibiotice, dar care din anumite motive nu au fost admise de legislațiile vinicole a diferitelor țări. (https://www.academia.edu/8279812/Oenologie)

PARTEA A II-A

CONTRIBUȚII PROPRII

CAPITOLUL 2. MATERIAL ȘI METODĂ

2.1. Metode și tehnici pentru testarea bicarbonatului de dimetil folosit în vinificație

Pentru testarea produsului bicarbonat de dimetil în vederea proprietăților sale conservante asupra vinurilor au fost folosite două specii levuriene.

Cele două specii levuriene au fost:

– Schizosaccharomyces pombe

– Brettanomyces bruxellensis

Schizosaccharomyces pombe (Fig. 2.1.), de asemenea cunoscută sub numele de levură de fisiune, a fost descoperită de Lindner în 1983.

Celulele acestei specii se reproduc prin sciziune și au o formă cilindrică, ovală, cu dimensiuni care variază între 3-5 × 5-24 μm.

Rata de creștere este foarte lentă, cu o fază lungă de întârziere și o cerință ridicată în vitamine, dar prezintă o necesitate scăzută în azot. În afară de glucoză Schizosaccharomyces pombe poate utiliza ca surse de carbon, de asemenea, glicerol, zaharoză, rafinoză, și maltoza.

Fig. 2.1. Schizosaccharomyces pombe (original)

O altă particularitate a speciei Schizosaccharomyces pombe este faptul că se poate dezvolta pe medii cu activitate scăzută a apei, este o levură osmofilă și, prin urmare, poate fi găsită în medii cu conținut ridicat de zahăr. Poate să se dezvolte și în medii cu pH foarte scăzut și într-o gamă largă de temperaturi. Mai mult decât atât, este rezistentă la produsele de conservare folosite în vinificație, cum ar fi dioxidul de sulf, acidul benzoic și bicarbonatul de dimetil.

În ceea ce privește caracteristicile sale fermentative, este capabilă să fermenteze glucoza la un nivel alcoolic de aproximativ 10-15% vol. alc., în funcție de temperatură și condițiile de aerare. Specia Schizosaccharomyces pombe este cunoscută prin viteza de creștere lentă și producția excesivă de hidrogen sulfurat în timpul fermentației. Aceste două caracteristici, împreună cu aciditatea volatilă ridicată, sunt principalele motive pentru utilizarea sa limitată în vinificație. (https://www.mdpi.com/2311-5637)

Brettanomyces bruxellensis (Fig. 2.2.) este o levură nedorită în vinificație. Vinul contaminat cu această specie de levuri nu poate fi comercializat cu ușurință și eliminarea acesteia din vinul contaminat este o sarcină dificilă. Brettanomyces bruxellensis produce diverși compuși care afectează nu numai profilul de aromă al vinului, ci și aspectul vinului, ceea ce duce adesea la o pierdere de culoare și corpolență. Compușii nedoriți produși de această levură includ acid acetic, acizi grași și compuși fenolici. Poate fi detectată în vinurile care au suferit tratament nereușit cu conservanți, cum ar fi dioxidul de sulf. (https://www.wineland.co.za/brettanomyces-the-yeast-lurking-in-your-wine/)

Fig. 2.2. Brettanomyces bruxellensis (original)

2.2. Mediile de cultură utilizate pentru dezvoltarea și multiplicarea levurilor cercetate

După recepționarea levurilor acestea au fost multiplicate în condiții aseptice prin insămânțare în medii de cultură specifice:

-medii solide: MEA (malt extract agar) și YMA (yeast malt agar)

– medii lichide: must sterilizat și malt extract.

2.2.1. Mediul de cultură MEA (malt extract agar)

Mediul MEA (malt extract agar) este un mediu solid folosit pentru izolarea și enumerarea levurilor și mucegaiurilor.

Mediul MEA conține concentrație ridicată de maltoză ceea ce îl face potrivit pentru creșterea levurilor și mucegaiurilor. Dextrina și glicerolul sunt surse de carbon și peptona din gelatină este sursă de azot. Agarul este agent de solidificare. Acest mediu are pH acid care este optim pentru creșterea levurilor și mucegaiurilor, în timp ce inhibă dezvoltarea bacteriilor.

(https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/IFU1565)

Tabelul 2.1.

Ingredientele folosite pentru producerea mediului de cultură MEA

Pentru producerea mediului de cultură MEA s-au amestecat ingredientele în proporția din recetă, astfel peste 50 g de mix s-a adăugat 1000 ml de apă distilată și s-a lăsat la înmuiat timp de 15 min. Apoi s-a sterilizat prin autoclavare la 115 șC timp de 10 minute. pH-ul final a fost corectat cu ajutorul soluției 10% de acid lactic.

2.2.2. Mediul de cultură YMA (yeast malt agar)

Mediul YMA este un mediu solid pentru cultivarea levurilor, mucegaiurilor și a actinomicetelor acodofile.

Dextroza, extractul de malț și peptonele prezente în mediu prezintă o sursă de carbon, azot, aminoacizi și alți nutrienți esențiali. Pentru a amplifica selectivitatea în mediu se poate adăuga 10% acid lactic, citric sau tartric.

Penru a prepara mediul de cultură YMA s-au amestecat ingredientele conform rețetei, după care s-au luat 20,5 grame de amestec de ingrediente peste care s-a adăugat 490 ml apă distilată. Apoi soluția obținută a fost încălzită până la fierbere pentru a dizolva complet mediul. În continuare a avut loc sterilizarea mediului care se prepară prin autoclavare la 121 °C timp de 15 minute. După sterilizare mediul s-a amestecat bine și s-a turnat în plăci Petri sterile. (http://himedialabs.com/TD/M424)

Tabelul 2.2.

Ingredientele folosite pentru prepararea mediului de cultură YMA

2.3. Metode de însămânțare folosite pentru identificarea levurilor cercetate

Ca și metode de însamânțare au fost folosite metoda «în gazon» și metoda de încorporare în mediu, iar incubarea a avut loc la o temperatură constantă de 28șC, timp de 5 zile.

2.3.1. Metoda de însămânțare «în gazon»

Inocularea prin metoda «în gazon» (Fig. 2.3.) se practică pentru studiul sensibilității microorganismelor la antibiotice sau substanțe conservante, pentru studiul unor particularități biochimice.

Mod de lucru:

Se recoltează steril cu pipeta Pasteur circa 1,5 ml suspensie celulară (în cazul de față, vin însămânțat cu levuri) și se depun pe suprafața mediului în placa Petri (pe placa Petri se notează tipul de mediu, numărul de ordine, suspensia însămânțată). Placa se înclină pentru umectarea întregii suprafețe a mediului. Surplusul suspensiei celulare de inocul se absoarbe cu pipeta Pasteur. Placa se acoperă cu capacul, se sigilează și se pune la incubare.

Fig. 2.3. Metoda de însămânțare «în gazon» (original)

2.3.2. Metoda de însămânțare prin încorporare

Inocularea prin încorporare se practică pentru cultivarea microorganismelor care necesită o presiune parțială a O2 mai scăzută și pentru studiul relațiilor de antibioză prin factori difuzibili dintre speciile de microorganisme ale unei probe naturale (sol, apă). Metoda este folosită în scopul obținerii unei creșterii confluente „în pânză”, pe suprafața plăcii dacă inoculul are o densitate celulară suficientă. Dacă inoculul e un amestec heterogen de specii de microorganisme, de cele mai multe ori, datorită competiției pentru spațiu și nutrienți, creșterea e discontinuă, adesea limitată la colonii izolate.

Mod de lucru:

Mediul nutritiv se lichefiază prin încălzire la fierbere în baia de apă. Cu pipeta gradată, în fiecare placă Petri se distribuie steril, în picături, o cantitate determinată (0,5-1 ml) din suspensia inocul. Mediul nutritiv după lichefiere se răcește la 47– 48°C. Conținutul unui tub (7-8 ml) se repartizează steril în placa Petri peste inocul. Se agită prin mișcare de rotație pe suprafața plană pentru omogenizarea inoculului în mediu. Se lasă să se răcească, se notează și se face incubarea la termostat cu capacul în jos (Fig. 2.4). Indiferent de tehnica de inoculare, coloniile apar după un interval de timp determinat de rata de diviziune celulară. Dacă proba inoculată a fost heterogenă, coloniile izolate se disting prin formă, dimensiuni.

(https://ru.scribd.com/document/351141842/Proiect-Microbiologie-Metode-de-Inoculare)

Fig. 2.4. Așezarea plăcilor însămânțate și sigilate la incubare (original)

2.4. Metoda de lucru pentru verificarea viabilității levurilor cercetate

Pentru a se realiza infecțiile în vin, din mediile lichide au fost realizate diluții corespunzătoare protocolului de lucru pus la dispoziție de Laboratorul de Oenologie. Astfel, au fost pregătite diluții având concentrații de 30 UFC/ml si 100 UFC/ml pentru fiecare dintre cele două specii (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis). Pentru a realiza diluțiile necesare s-a folosit metoda diluțiilor succesive, iar verificarea acestora s-a realizat cu ajutorul unei camere Neubauer îmbunătățită.

2.4.1. Prezentarea camerei Neubauer îmbunătățită

Camera Neubauer îmbunătățită (Fig. 2.4.) este o placă de sticlă groasă, cu dimensiunea unui diapozitiv de sticlă (30x70x4mm). Regiunea de numărare este formată din două suprafețe rulate în formă de pătrat. Există depresiuni sau șanțuri de pe ambele părți sau între zonele pe care sunt marcate pătratele, dând astfel o formă "H".

Zona pentru numărat celulele este de 3 mm2 împărțită în 9 pătrate mari, fiecare având o suprafață de 1 mm2. Pătratul central mare (care poate fi văzută în întregime cu obiectivul 10X) este împărțită în 25 de pătrate medii cu linii duble sau triple. Fiecare dintre aceste 25 de pătrate este împărțită din nou în 16 pătrate mici cu linii unice, astfel încât fiecare dintre cele mai mici pătrate are o suprafață de 1/400 mm2.

Fig. 2.5. Camera Neubauer îmbunătățită (original)

Capacul reprezintă o sticlă pătrată cu o lățime de 22 mm. Capacul de sticlă este plasat pe partea superioară a camerei Neubauer, acoperind zona centrală. Zona dominată este cu 0,1 mm mai mică decât restul camerei. Astfel, există un spațiu de 0,1 mm (1/10 mm) între amplasarea capacului și zona de rulare.

Fig. 2.6. Imaginea zonei pentru numărat celulele a camerei Neubauer (https://laboratoryinfo.com/manual-cell-counting-neubauer-chamber/)

2.4.2. Folosirea camerei Neubauer

1. Pregătirea probei

În funcție de tipul de probă, trebuie pregătit un preparat dintr-o diluție cu o concentrație adecvată pentru numărarea celulelor. De obicei, intervalul de concentrații pentru un număr de celule cu camera Neubauer este cuprins între 250.000 celule/µl și 2,5 milioane celule/µl. Trebuie utilizată o diluție adecvată a amestecului în ceea ce privește numărul de celule care trebuie numărate. Dacă eșantionul nu este suficient diluat, celulele vor fi prea aglomerate și va fi dificil de numărat. Dacă este prea diluat, dimensiunea probei nu va fi suficientă pentru a face concluzii despre concentrația din amestecul inițial.

2. Pregătirea camerei Neubauer

Se curăță camera Neubauer și capacul cu soluție de etanol 70%. Se pune capacul de sticlă în zona centrală a camerei Neubauer. Se utilizează o suprafață plană pentru a plasa camera, ca de exemplu, o masă de lucru.

3. Introducerea probei în camera Neubauer (Fig. 2.7.)

Cu o pipetă, se ia cu atenție aproximativ 20 µl din amestecul de celule (diluție). Se așează vârful de pipetă la marginea capacului și se expulzează lent lichidul până când camera de numărare este plină. Un volum de 10 µl este suficient pentru a umple o cameră de numărare.

Fig. 2.7. Introducerea probei destinate analizei microscopice în camera Neubauer (original)

Fig. 2.8. Tehnica de numărare a celulelor în camera Neubauer (https://laboratoryinfo.com/manual-cell-counting-neubauer-chamber/)

4. Focalizarea microscopică și numărarea celulelor (Fig. 2.7.)

– Se plasează camera Neubauer pe placa microscopului. Folosind obiectivul 10X, se focalizează pe celulele ce urmează a fi numărate.

– Se numără numărul total de celule găsite în 4 pătrate mari din fiecare colț.

– Se notează numărul de celule numerate.

Dacă celulele ating 4 laturi ale unui colț de pătrat, se numără numai celulele de pe 2 laturi, fie cele două laturi exterioare sau două laturi interioare.

5. Calcularea numărului total de celule

Numărul total de celule pe microlitru de probă poate fi calculat pornind de la numărul de celule numărate și de suprafața dată. Acest lucru se datorează faptului că zonele camerei pentru numărare conțin un volum exact de probă diluată. Deoarece se măsoară doar un volum mic de probă diluată, trebuie utilizată o formulă generală pentru a converti numărul de celule numerate în număr de celule/microlitru.

Celule/microlitru de volum =

Factorul de diluție utilizat în formula este determinat de diluția probei utilizată în numărarea celulelor. Adâncimea utilizată în formulă este întotdeauna 0,1. Suprafața de numărare va varia pentru fiecare tip de numărare de celule și se calculează utilizând dimensiunile zonei de numărare.

Fig. 2.9. Masa de lucru la care s-au efectuat cercetările (original)

2.5 Tehnica de analiză a probelor

Levurile, în concentrațiile de 30 UFC/ml si 100 UFC/ml pentru fiecare dintre cele două specii (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis) plus martor (fără levuri), au fost utilizate pentru a însămânța vin tratat cu dioxid de sulf și bicarbonat de dimetil în diferite concentrații. Astfel, concentrațiile de SO2 au fost 40 mg SO2/l, 80 mg SO2/l și 160 mg SO2/l, iar cele de bicarbonat de dimetil au avut valori de 0, 100 și 200 mg/l.

Inocularea cu levuri si îmbutelierea vinului a avut loc în cadrul laboratorului de Oenologie. După aproximativ 30 zile, 45 sticle de vin au fost aduse la laboratorul de Microbiologie pentru realizarea analizelor microbiologice. Acestea au primit numere de laborator conform tabelului ce urmează.

Tabelul 2.3.

Notația probelor destinate cercetărilor

În crearea acestui tabel am folosit următoarele notații:

Litera de la începutul denumirii probelor indică specia de levuri din probe sau absența acestora. Astfel, litera B indică prezența levurii Brettanomyces bruxellensis în probă, litera S indică prezența levurii Schizosaccharomyces pombe și litera Z (zero) indică absența levurilor adăugate în probă.

Prima cifră din denumirea probelor arată cantitatea de SO2 cu care a fost tratată proba. A doua cifră indică unitățile formatoare de colonii pe mililitru de probă (UFC/ml). A treia cifră arată cantitatea de bicarbonat de dimetil cu care a fost tratată proba.

Astfel, putem observa că probele 1-15 au fost tratate cu 40 mg SO2/L, probele 16-30 prezintă 80 mg SO2/L și probele 31-45 prezintă 160 mg SO2/L.

În probele din prima coloană (1,6,11,16,21,26,31,36,41) nu au fost inoculate levuri, acest fapt îl arată notația literei Z și cifra care arată numărul de UFC/ml este 0. În schimb, a doua coloană (2,7,12,17,22,27,32,37,42) și a patra (4,9,14,19,24,29,34,39,44) prezintă 30 UFC/ml. A treia coloană (3,8,13,18,23,28,33,38,43) și a cincea (5,10,15,20,25,30,35,40,45) prezintă 100 UFC/ml.

Cantitatea de bicarbonat de dimetil în probele 1-5, 16-20, 31-35 este 0 mg/L, în probele 6-10, 21-25, 36-40 este 100 mg/L și, respectiv, în probele 11-15, 26-30, 41-45 este 200 mg/L.

CAPITOLUL 3. REZULTATE OBȚINUTE

3.1 Caracterizarea rezultatelor obținute în urma efectuării analizelor efectului bicarbonatului de dimetil asupra levurilor inoculate în vinuri

Asupra probelor date s-au făcut analize pentru a testa eficiența bicarbonatului de dimetil asura speciilor de levuri (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis) inoculate în vin. Cantitățile diferite de dioxid de sulf, bicarbonat de dimetil și de levuri (UFC/ml) vor arăta cât mai precis posibil acțiunea bicarbonatului de dimetil asupra levurilor din vinurile luate în analiză.

În urma analizelor efectuate s-au obținut următoarele rezultate care au arătat eficacitatea tratării vinului cu dioxid de sulf și bicarbonat de dimetil.

În cazul probelor 31-45, tratate cu 160 mg SO2/L nu au fost puse în evidență levurile Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis (Fig. 3.1.), dar nici alte categorii de microorganisme (ex. bacterii) indiferent de doza de bicarbonat de dimetil utilizată (inclusiv la probele in care bicarbonatul de dimetil nu a fost utilizat). Vinul este limpede, culoare specifică soiului, spumează puternic datorită acumulării de CO2 (Fig. 3.2.- 3.3.).

Fig. 3.1. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 31-45 (original)

Fig. 3.2. Aspectul vinului supus analizelor din probele 31-45 (1) (original)

Fig. 3.3. Aspectul vinului supus analizelor din probele 31-45 (2) (original)

Aceste rezultate demonstrează faptul că dioxidul de sulf în concentrația de 160 mg/L distruge și inhibă dezvoltarea levurilor și bacteriilor din vin.

În cazul probelor 16-30, tratate cu 80 mg SO2/ml nu au fost puse în evidență levurile Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis, și nici alte categorii de microorganisme (bacterii) indiferent de doza de bicarbonat de dimetil utilizată (Fig. 3.4) (inclusiv la probele in care produsul bicarbonat de dimetil nu a fost utilizat).

Fig. 3.4. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 16-30 (original)

Vinul este limpede, culoare mai închisă, spumează puternic datorită acumulării de CO2 (Fig. 3.5).

Fig. 3.5. Aspectul vinului supus analizelor din probele 16-30 (original)

În cazul probelor 1-15, tratate cu 40 mg SO2/ml nu au fost puse în evidență levurile Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis, indiferent de doza de bicarbonat de dimetil utilizată (inclusiv la probele in care produsul bicarbonat de dimetil nu a fost utilizat). În schimb, au fost identificate specii bacteriene care aparțin grupului de bacterii lactice (Fig. 3.6.). Acestea au forme morfologice sferice (coci) și cilindrice (bacili). Vinul prezintă depozit la baza buteliei, spumează puternic datorită acumulării de CO2 (Fig. 3.7.).

Fig. 3.6. Rezultatele analizelor microscopice a probelor 1-15 (original)

Fig. 3.7. Aspectul vinului supus analizelor din probele 1-15 (original)

3.2. Reconfirmarea rezultatelor obținute în urma analizelor efectuate

În urma analizelor microbiologice efectuate, s-a observat absența levurilor inoculate (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis). Acest rezultat demonstrează faptul că doza redusă de SO2 (40 mg//l) influențează negativ multiplicarea acestora. Însă, informațiile bibliografice arată că aceste specii levuriene nu sunt sensibile la concentrații atât de scăzute în dioxid de sulf.

Rezultatele analizelor efectuate sunt diferite față de cele a cercetărilor din surse bibliografice. Pentru reconfirmarea rezultatelor obținute s-au efectuat însămânțări și analize ulterioare. Din fiecare sticlă de vin s-au luat probe (total 45 probe) și s-au realizat însămânțări la suprafața și în profunzimea mediilor de cultură GPCA (glucoza peptona chloramphenicol agar) și PDA (potato dextrose agar) (Fig. 3.8.). Probele au fost incubate timp de cinci zile la 28șC.

Fig. 3.8. Executarea însămânțărilor pe mediile de cultură GPCA și PDA (original)

Rezultatele obținute (Fig. 3.9.- 3.10) au arătat faptul că în cele 45 probe avute pentru analiză în laborator nu au fost identificate levuri. Acest lucru reconfirmează rezultatele obținute anterior. Astfel, tratamentul cu dioxid de sulf (chiar și în concentrații de 40 mg/L) are efect negativ asupra creșterii și multiplicării levurilor din vin.

Fig. 3.9. Rezultatele obținute în urma însămânțărilor pe mediile de cultură GPCA și PDA (original)

Fig. 3.10 Rezultatele obținute în urma însămânțărilor pe GPCA și PDA (original)

Fig. 3.11. Mediile de cultură GPCA și PDA (45 probe luate în analiză)

CONCLUZII

Pentru efectuarea experimentelor s-au inoculat două tipuri de levuri în vin, din mediile lichide au fost realizate diluții corespunzătoare protocolului de lucru pus la dispoziție de Laboratorul de Oenologie. Astfel, au fost pregătite diluții având concentrații de 30 UFC/ml si 100 UFC/ml pentru fiecare dintre cele două specii (Schizosaccharomyces pombe și Brettanomyces bruxellensis). Pentru a realiza diluțiile necesare s-a folosit metoda diluțiilor succesive. Verificarea acestora la microscop s-a realizat cu ajutorul unei camere Neubauer îmbunătățită.

În probele supuse analizelor din prima coloană din tabelul prezentat în lucrare nu au fost inoculate levuri, acest fapt îl arată notația literei Z și cifra care arată numărul de UFC/ml este 0. În schimb, în a doua și a patra coloană au fost inoculate 30 UFC/ml. În a treia și a cincea coloană au fost inoculate 100 UFC/ml.

În privința tratării cu dioxid de sulf, probele destinate analizei au fost tratate cu 40 mg SO2/L, 80 mg SO2/L și, respectiv, 160 mg SO2/L.

Cantitatea de bicarbonat de dimetil în probele supuse analizelor a fost de 0 mg/L, 100 mg/L și 200 mg/L.

În urma experimentelor efectuate s-a constatat faptul că tratamentul cu dioxid de sulf chiar și în concentrații de 40 mg/L are efect negativ asupra creșterii și multiplicării levurilor din vin. Însă, informațiile bibliografice arată că aceste specii levuriene nu sunt sensibile la concentrații atât de scăzute în dioxid de sulf.