PrOF. UNIV. dr. farm. Jurca tünde CONF. UNIV. DR. PALLAG ANNAMARIA ABSOLVENT Neagu Oana Mihaela ORADEA 2019 UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE… [308245]

UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

PROGRAMUL DE STUDIU FARMACIE

FORMA DE ÎNVĂȚĂMÂNT IF

Lucrare de licență

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC

PrOF. UNIV. dr. farm. Jurca tünde

CONF. UNIV. DR. PALLAG ANNAMARIA

ABSOLVENT: [anonimizat]

2019

UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

PROGRAMUL DE STUDIU FARMACIE

FORMA DE ÎNVĂȚĂMÂNT IF

ACTIVITATEA antioxidantĂ a speciilor Primula vERIS L. ȘI pRIMULA VULGARIS L.

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC

PrOF. UNIV. dr. farm. Jurca tünde

CONF. UNIV. DR. PALLAG ANNAMARIA

ABSOLVENT: [anonimizat]

2019

PARTEA TEORETICĂ

I. INTRODUCERE

II.1. Premise

Multe plante din flora spontană reprezintă o sursă importantă de compuși bioactivi cu beneficii pentru sănătatea umană. În ultimii ani tot mai multe studii științifice au demonstrat prezența substanțelor bioactive în compoziția chimică a florilor sălbatice și ornamentale. Frecvent, florile sălbatice constituie o [anonimizat]. [anonimizat] o oferă alimentelor și băuturilor. [1]

Radicalii liberi sunt atomi sau grupe de atomi care au unul sau mai mulți electroni liberi și care tind să atingă o [anonimizat]. [anonimizat]. [anonimizat], reprezentând cauza îmbătrânirii premature și a apariției diverselor boli. Cei mai cunoscuți sunt radicalii liberi derivați din oxigen. [2]

[anonimizat]. [anonimizat] a [anonimizat]. [anonimizat] o [anonimizat], flavonoidele, vitamina C și polifenolii. [2]

O [anonimizat], polifenolii, – carotenul, care se găsesc adesea în concentrții asemănătoare cu cele din fructele și legumele comune.[1]

Numeroase studii științifice au demonstrat eficacitatea farmacologică a primulelor datorită prezenței în compoziția acestora a numeroaselor substanțe naturale bioactive. [anonimizat] C și – caroten care prezintă caracter antioxidant. [1]

II.2. Scop

Scopul acestei lucrări este de a evidenția caracterul antioxidant al extractelor alcoolice obținute din florile speciilor Primula veris L., respectiv Primula vulgaris L., [anonimizat], precum și stabilirea unei concentrții optime în vederea utilizării extractelor în diferite produse cu acțiune antioxidantă.

Avantajele utilizării florilor ca sursă de antioxidanți constă în evitarea efectelor secundare datorate excipienților folosiți în formele farmaceutice comercializate și totodată reprezintă o sursă de antioxidanți naturali la costuri reduse.

II. DATE BOTANICE

II.1. Încadrare sistematică

Regnul: Plantae

Subregnul: Cormobionta

Încrengătura: Magnoliophyta (Angiospermatophyta)

Clasa: Magnoliatae (Dicotyledonatae)

Subclasa: Dilleniidae

Ordinul: Primulales

Familia: Primulaceae

Subfamilia: Primuloideae

Gen: Primula

Specii: Primula veris L. sin. Primula officinalis Hill, Primula vulgaris L. sin. Primula acaulis L.[3,4]

Figura nr.II.1 Primula veris L Figura nr.II.2 Primula vulgaris L.

sin. Primula officinalis Hill [5] sin. Primula acaulis L.[6]

II.2. Descriere

Familia primulelor cuprinde peste 500 de specii. În România, cele mai cunoscute specii sunt Primula veris L., sinonim cu Primula officinalis Hill, cunoscută sub numele de Ciuboțica cucului și Primula vulgaris L., sinonim cu Primula acaulis L., denumită Anglicel. [3, 4, 7]

Speciile de Primula sunt plante ierboase, perene, majoritar terestre, cu înălțimea de până la 30 cm. Elementele după care pot fi recunoscute sunt frunzele alungite dispuse sub formă de rozetă și florile, care pot fi solitare sau grupate în inflorescențe, de culoare galben-pal sau galben auriu. [7, 8]

Primula veris L. și Primula vulgaris L. sunt răspândite în Europa și Asia de vest (Turcia), în flora spontană sau în culturi supravegheate. În flora spontană se găsește pe câmpii, poieni, pajiști, păduri, dealuri și până la zonele montane (Munții Apuseni – Primula vulgaris L.). În România este răspândită în Crișana, Moldova, Muntenia, Oltenia și Transilvania, Banat. Are preferințe față de solurile umede și locuri luminoase sau semiumbroase. Nu este o plantă pretențioasă, suportând orice tip de sol și rezistă la temperaturi foarte scăzute în perioada iernii. [8, 9, 10, 11]

Cele două specii apar primăvara devreme, de obicei la începutul lunii martie. Primula vulgaris L. înflorește mai repede, spre sfârșitul lunii martie, în timp ce Primula veris L. înflorește în luna aprilie.

De la ambele specii se recoltează în special rădăcina, Primulae rhizoma cum radicibus, dar și florile (Primulae flos) și frunzele (Primulae folium). Florile se pot recolta cu sau fără caliciu, Primulae flos cum calycibus sau Primulae flos sine calucibus. [12, 10, 9, 13]

Florile primulelor se recoltează în aprilie – mai, cu sau fără caliciu, dar fără peduncul floral. Acestea trebuie uscate bine pentru a nu mucegăi, iar apoi se păstrează în condiții corespunzătoare, ferite de lumină și de umezeală. Rădăcinile se pot recolta din aprilie până în octombrie, se spală și se usucă, pentru conservare. [14]

Primula veris L. se recunoaște în mod special datorită așezării caracteristice a florilor. Inflorescențele de culoare galben – auriu sunt dispuse într-o umbelă florală, situată pe o tulpină erectă, păroasă, aeriană, deasupra unei rozete de frunze ovate, cu margine crenată. Pe partea inferioară a frunzelor prezintă nervuri proeminente și păroase. Sistemul rădăcinos este reprezentat de un rizom cilindric din care pornesc numeroase rădăcini alb – gălbui. Fructul acestei specii se prezintă sub formă de capsulă elipsoidal, cu semințe mici, de culoare brun – negru și formă poliedrică. [3, 7, 15, 16]

Primula vulgaris L. este o specie ușor de identificat, cu dimensiuni de până la 20 de centimetri. Florile sunt de culoare galben – pal, mai mari decât ale speciei Primula veris L. Fiecare floare este prinsă de rizom prin pedunculul floral, fiind lipsită de tulpină aeriană. Frunzele sunt dispuse într-o rozetă, au formă ovală cu margini iregular zimțate și sunt păroase. Organul subteran prezintă radicule ramificate. [3, 7]

Formula florală a speciilor din ordinul Primulales este:

K(5) [C(5)A0+5] G(5) [3]

II.3. Istoric și denumiri populare

„And in the wood, where often you and I,

Upon faint primrose-beds were wont to lie…”

William Shakespeare – A Midsummer Night’s Dream [17]

Încă din cele mai vechi timpuri Primula veris L. și Primula vulgaris L. erau cunoscute pentru efectele benefice asupra tractului respirator. În Moldova, tradiția spune că prin înghițirea a 3 flori de ciuboțica – cucului poți scăpa de gâlci (amigdalită). [18]

Maria Treben povestește într-una dintre cărțile sale cum vecinul ei a reușit să scape de insomnie prin recomandarea ei de a utiliza un ceai cu ciuboțica – cucului. Totodată, mama autoarei obișnuia să culeagă în fiecare primăvară această plantă datorită efectelor liniștitoare asupra inimii și nervilor. [19]

Preotul Sebastian Kneipp, adept al leacurilor naturiste, recomanda în secolul al XIX-lea ciuboțica cucului persoanelor cu gută și boli reumatice. Medicii elvețieni foloseau această specie în tratarea afecțiunilor respiratorii. [19, 20]

În vremurile străvechi, ciuboțica cucului a fost numită „Herba paralysis”, fiind considerată benefică în toate bolile paralitice. Rădăcina a fost numită „Herbale radix arthritica, datorită efectului benefic în reumatism. [21]

Poezia lui William Shakespeare, Visul unei nopți de vară, face referire la faptul că florile de Primula veris L. au avut efecte miraculoase asupra tenului, aspect care poate reprezenta caracterul antioxidant al acestei specii. [21]

Primula veris, este simbolul orașelor Northamptonshire, Worcestershire and Surrey din Anglia. În limbajul florilor, Primula veris L. simbolizează frumusețea. Unele nume vernaculare includ denumirile lacrimi de aur și florile zânelor. [22]

Ciuboțica cucului are și o legendă religioasă, legată de anatomia acestei specii. Într-o zi, Sfântul Petru scapă setul de chei de la porțile raiului, iar în locul unde acestea ajung pe pământ se nasc florile de Ciuboțica cucului. Din această legendă provin și denumirile de cheia de flori, cheile Sfântului Petru sau floarea Sfântului Petru. [21]

Primula veris L., sinonim cu Primula officinalis Hill, cowslip în engleză, este cunoscută cu numele de ciuboțica cucului adevărată, dar și cu denumirea de aglică, aglicel, țâță – vacii, țâța – oii, țâța – caprei, anghelină, calce, cinci – foi, cizma – cucului, talpa – gâștei, urechița – ursului. [8, 19]

Numele de Primula vulgaris derivă din latină de la sintagma „prima rosa”, care înseamnă primul trandafir al noului an, „primrose” în engleză. Apariția acestei specii este simbolul venirii primăverii. În Marea Britanie această specie se mai numește trandafirul timpuriu, trandafirul împrumutat, trandafirul de Paști, trandafirul de unt, trandafirul de aur, stele de aur. În limbajul florilor, Primula vulgaris simbolizează tinerețea. [17]

Primula vulgaris este o plantă nativă din Marea Britanie și a fost aleasă floarea județului Devon, din sud – vestul Angliei. Începând cu anul 1981, în 19 aprilie este sărbatorită ziua Primulei, fiind aniversarea morții premierului Benjamin Disraeli a cărui floare preferată a fost Primula vulgaris. [17]

Primula vulgaris L. sau Primula acaulis L., este des întâlnită sub denumirea de anglicel, agrijel, brebenel, griceorel. [7, 8, 11]

Fundația Loki Schmidt din Germania a desemnat ciuboțica cucului planta anului 2016, datorită faptului că este o specie pe cale de dispariție. Atât Primula veris L., cât și Primula vulgaris L. sunt ocrotite de lege, fiind specii pe cale de dispariție din cauza distrugerii habitatelor naturale prin utilizarea pășunilor și folosirea chimicalelor din agronomie. [23, 8]

III. COMPOZIȚIE CHIMICĂ

Speciile de Primula sunt cunoscute pentru conținutul bogat în saponozide triterpenice, dar și a altor substanțe precum flavonoide, glicozide fenolice, taninuri, pigmenți carotenoizi, heterozide, ulei volatil, vitamina C. [24]

III.1. Flavonoide

Flavonoidele sunt substanțe naturale polifenolice, derivați de 2 – fenil – benzopiran, răspândite în regnul vegetal. Flavonozidele sunt pigmenți de culoare galbenă, având o parte glucidică și un aglicon. [25]

În speciile Primula veris L., respectiv Primula vulgaris L., principalele flavonozide sunt quercetina, luteolin, kemferol și apigenin, identificate cu preponderență în flori. [9]

Figura nr.III.1 quercetina Figura nr.III.2 luteolin

Figura nr.III.3 kemferol Figura nr.III.4 apigenin

La doze terapeutice, flavonoidele sunt lipsite de toxicitate și prezintă mai mult de 40 de acțiuni farmacologice. Unul dintre rolurile fiziologice ale flavonoidelor este de a proteja țesuturile vegetale de acțiunea nocivă a radiațiilor UV. Astfel, caracterul antioxidant al acestor compuși polifenolici se caracterizează prin protejarea lipidelor și acidului ascorbic împotriva oxidării și radicalilor liberi. Flavonoidele, împreună cu acidul ascorbic, participă la sisteme redox conform schemei din figura nr.III.5. [25]

Figura nr.III.5 Sistem redox flavonoide – acid ascobic [25]

III.3. Taninuri catehice

Taninurile sunt compuși naturali polifenolici, răspândiți în regnul vegetal la plantele superioare și au proprietăți antioxidante. În speciile de Primula, aceste substanțe se găsesc în flori, frunze și rădăcină. [26, 3]

III.4. – Caroten

Carotenoidele din regnul vegetal se mai numesc și provitamine A datorită faptului că în organism acestea se transformă în vitamina A. -carotenul este un pigment de culoare galben – portocaliu și se găsește atât în florile, cât și în frunzele de primula. Acest pigment acționează ca și antioxidant, prin neutralizarea sau înlăturarea radicalilor liberi. Se presupune că un consum excesiv de vitamina A poate duce la apariția osteoporozei, motiv pentru care se recomandă consumul de -caroten natural. [27, 2, 9]

Figura nr.III.5 – Caroten

III.5. Acidul ascorbic

Acidul ascorbic sau vitamina C se află printre cele mai răspândite vitamine din regnul vegetal și se găsește în frunzele primulelor. Vitamina C are un rol deosebit în procesele de oxido-reducere din organism. Funcția de antioxidant se datorează sistemului redox ascorbat – dehidroascorbat, prezentat în figura nr. III.6. [9, 28]

Figura nr.III.6 Sistem redox ascorbat – dehodroascorbat [28]

III.6. Saponozide triterpenice

Saponozidele triterpenice din primule sunt reprezentate acidul primulic A (primulina A) care are ca și aglicon primulagenina A și se găsesc cu preponderență în rădăcină, dar și în flori. Saponozidele se folosesc în special pentru efectul expectorant. [26, 9, 13]

Figura nr.III.7 Primulagenina A [29]

III.7. Glicozide fenolice

În compoziția rădăcinilor și florilor de primule există heterozide generatoare de ulei volatil, precum primverozida (primverina) și primulaverozida (primulaverina). Aceste glicozide fenolice, în prezența enzimei primveraza pun în liberate o oză compusă din glucoză și xiloză – primveroza și agliconul. În cazul primverozidei agliconul este p-metoxi-salicilatul de metil, respectiv m-metoxi-salicilatul de metil la primulaverozidă. [13, 9, 26, 29]

Figura nr.III.8 Primverozida și Primulaverozida [13]

IV. ACȚIUNE TERAPEUTICĂ ȘI UTILIZARE

Dintre cele două specii de Primula, ciuboțica – cucului este mai cunoscută și utilizată în scop terapeutic. Principala acțiune terapeutică a speciei Primula veris L. este cea expectorantă, fiind des întâlnită în preparatele cu efect bronhosecretolitic.

Principala acțiune a speciei Primula veris L. se datorează saponozidelor triterpenice. Extractele de ciuboțica cucului au acțiune expectorantă, fluidizând și facilitând eliminarea secrețiilor bronșice de pe tractul respirator, dar, în același timp, are și efect antiseptic și emolient asupra căilor respiratorii, calmând iritațiile de la acest nivel. [20]

Datorită acestor efecte terapeutice, ciuboțica cucului se utilizează în afecțiuni respiratorii precum bronșite acute, bronșite cronice, tuse productivă, astm, pneumonii. [24, 12]

Florile de Primula veris L. conțin un ulei volatil numit „primula camfor”, datorită căruia prezintă efectul sedativ și relaxant. Datorită acestui compus, florile au acțiune adjuvantă în tratamentul insomniei, în sindromul de hiperactivitate la copii și sunt indicate în stări de tensiune și excitabilitate nervoasă. La administrarea internă manifestă și efect diuretic, fiind utilizată în afecțiuni renale și gută. [20, 24, 9]

Comitetul pentru produse medicinale din plante a stabilit că preparatele din flori de ciuboțica cucului pot fi utilizate ca și expectorant doar de adulți și copii cu vârsta de peste 12 ani. Deși nu există suficiente studii clinice care să dovedească eficacitatea și siguranța acestor preparate, ciuboțica cucului a fost utilizată de peste 30 de ani. Preparatele ce conțin flori de ciuboțica cucului nu trebuie utilizate de pacienții alergici la aceasta sau la alte specii din familia Primulaceae. [30]

Extern, ciuboțica – cucului are efect antipruriginos, cicatrizant și hemostatic, utilizându-se în zgârieturi, înțepături de insecte, contuzii și alte afecțiuni dermatologice, sub formă de cataplasme calde din flori și frunze. Sub formă de unguent, florile de Primula veris L. au efect calmant în arsurile solare. [24, 20, 31, 9]

Flavonoidele din florile de ciuboțica cucului au acțiune antioxidantă puternică și acționează prin neutralizarea radicalilor liberi. [9]

Datorită compușilor fenolici, florile de primula pot prezenta proprietăți antimicrobiene și citostatice. S-a demonstrat că, datorită prezenței saponinelor, extractele de primula au efect antiinflamator, antiastmatic, antifungic și antiviral. [32, 33]

Anumiți autori afirmă că planta s-ar putea utiliza și în nefrite, cistite, gută, afecțiuni reumatice și dureri de dinți. [10, 34]

Primula vulgaris L. se utilizează în afecțiuni respiratorii, dar acționează și împotriva candidozelor datorită saponozidelor triterpenice conținute în rizomi. [18, 3]

Datorită prezenței flavonoidelor în flori, Primula vulgaris L. prezintă activitate antioxidantă, fiind o sursă importantă de antioxidanți naturali. Această specie poate fi utilizată în industria farmaceutică, alimentară și cosmetică. [35]

Datorită prezenței saponozidelor, în cantități mari, atât Primula veris L., cât și Primula vulgaris L., au acțiune emetică. [11, 36, 9]

Prezența vitaminei C și a -carotenului a condus la utilizarea frunzelor de primula în alimentație, pentru a evita scorbutul și carența de vitamina A. În urma unor cercetări, speciile de Primula au fost încadrate între principalele plante cu un conținut semnificativ de vitamina C în frunze. [26, 15]

În medicina tradițională speciile de primula se folosesc în diverse moduri, toate părțile plantei fiind folositoare. [9, 31]

Infuzia din flori de ciuboțica cucului se utilizează în afecțiuni respiratorii, afecțiuni nervoase, afecțiuni cardiace, reumatism, gută, iar extern se folosește în caz de răni cu hemoragii. [9]

Decoctul din rizomi se folosește în afecțiuni respiratorii. [9]

Vinul din flori de ciuboțica cucului – se prepară din vin alb natural, turnat într-un recipient de 2 l cu inflorescențe de Primula veris L., astfel încât să le acopere, se închide neetanș și se lasă 14 zile la macerat. Se utilizează în afecțiuni cardiace, până la 3 linguri pe zi. [14, 19]

Apa din inflorescențele de ciuboțica cucului se utilizează ca loțiune de corp. [9]

Frunzele tinere și florile de Primula vulgaris L. se pot consuma în salate. [8, 31]

În exces, speciile de Primula pot provoca tulburări gastrice. Polenul acestor plante poate duce la apariția dermatitelor de contact. [8, 9]

V. FORME FARMACEUTICE CU CIUBOȚICA CUCULUI

Ciuboțica cucului, în asociere cu alte plante cu acțiune sinergică, se găsește în comerț sub diferite forme. Produsul medicinal sub formă de rădăcini, de la specia Primula veris L., este oficinal atât în Farmacopeea Română ediția a X-a, cât și în Farmacopeea Europeana ediția a 9-a.

V.1. Ceai de ciuboțica cucului

Părțile aeriene de ciuboțica cucului se găsesc sub formă de ceai atât singure, cât și în asociere cu alte plante și au rol în tratarea afecțiunilor respiratorii și în combaterea pneumoniei. Infuzia se prepară din 2-3 lingurițe de produs vegetal și se consumă 2-3 căni pe zi. [37]

V.2. Sirop cu cioboțica cucului

Ciuboțica cucului se găsește în siropuri sub formă de extract, atât din rădăcini, cât și din părți aeriene. Aceste extracte au acțiune secretolitică și expectorantă, adjuvante în tusea productivă și rol reepitelizant la nivelul tractului respirator. Prin aportul crescut de vitamina C, cu rol antioxidant, facilitează refacerea organismului după o infecție respiratorie și ajută la stimularea sistemului imunitar. [38, 39, 40]

Câteva dintre siropurile ce conțin ciuboțica cucului, existente pe piața din România, sunt Bronhoklir – sirop pentru tuse productivă cu Ciuboțica cucului și Cimbru de cultură, Calmotusin – balsam pentru căile respiratorii și Sirop Nera Plant Multiplant. În toate aceste produse ciuboțica cucului este asociată cu alte plante cu acțiune sinergică. [38, 39, 40]

Siropul se administrează de 3 ori pe zi câte 5 ml, timp de o săptămână în cazul siropului Bronhoklir. În cazul celorlalte, la copii se administrează o linguriță de trei ori pe zi, iar la adulți o lingura de trei ori pe zi. Siropul nu este indicat persoanelor diabetice. [38, 40]

Ciuboțica cucului, asociată cu alte produse vegetale, se mai găsește și în siropuri cu acțiune adjuvantă în insomnii, precum Siropul Nera Pland Calmiplant. [41]

V.3. Tinctură

Ciuboțica cucului este întâlnită și în tincturile pulmonare, cu acțiune expectorantă, utilizate în bronșite și alte afecțiuni respiratorii. [42]

V.4. Capsule cu ciuboțica cucului

Sub formă de capsule, ciuboțica cucului are rolul de a fluidifica secrețiile bronșice, acțiunea fiind expectorantă. Se administrează trei capsule pe zi timp de o lună, în mai multe cure pe an. [43]

V.5. Comprimate masticabile

Condiționată sub formă de comprimate de supt, ciuboțica cucului are rol benefic asupra mucoasei tractului respirator, alături de alte specii vegetale cu efect sinergic. În această formă, ciuboțica cucului manifestă acțiune expectorantă, dar și calmantă. La adulți se pot administra până la patru comprimate pe zi. [44]

V.6. Spray

Alături de celelate componente (produse vegetale, propolis, argint coloidal), ciuboțica cucului își exercită acțiunea antibacteriană la nivelul tractului respirator. [45]

V.7. Pimulae Rhizoma cum Radicibus

În Farmacopeea Română ediția a X-a este descrisă monografia „Pimulae Rhizoma cum Radicibus”, fiind descris produsul medicinal care poate conține rădăcina și rizomul speciei Primula veris L., având acțiune expectorantă. [46]

PARTEA PRACTICĂ

VI. ANALIZA MACROSCOPICĂ

Am analizat cele două plante din punct de vedere al morfologic, urmărind caracteristicele specifice fiecăreia. Părțile anatomice au fost fotografiate cu o cameră digitală cu ajutorul microscopului Cooling tech.

Deși fac parte din aceeași familie și același gen, diferențele dintre cele două specii se pot observa cu ochiul liber. Primula veris L. atinge o înalțime de 20 – 30 cm, în schimb Primula vulgaris L. ajunge la o înălțime de 10 – 15 cm.

Figura nr.VI.1 Primula veris L. Figura nr.VI.2 Primula vulgaris L.

Florile celor două specii prezintă o serie de deosebiri vizibile cu ochiul liber, precum dimensiunea, modul în care acestea sunt dispuse, culoarea și forma.

La ciuboțica cucului, inflorescențele de culoare galben – auriu sunt cuprinse într-o umbelă florală, situate pe o tija florală, păroasă, erectă, cu o lungime de până la 30 cm. Pe această tulpină se găsesc chiar și 20 de inflorescențe cu corola lungă și tubuloasă, fiecare având un pedicel de 1 cm. Spre deosebire de Primula veris L., Primula vulgaris L. prezintă între 5 și 15 flori solitare, fiecare peduncul floral pornind de la baza plantei, având lungimea de 5 cm. Floarea acestei specii este mai mare, de culoare alb – gălbui, iar în interior galben auriu.

Figura nr.VI.3 Floare Primula veris L. Figura nr.VI.4 Floare Primula vulgaris L.

În ce privesțe structura florală, ambele specii au florile pentamere, cu simetrie radiară, alcătuite din 5 petale și 5 sepale.

Figura nr.VI.5 Floare Primula veris L. Figura nr.VI.6 Floare Primula vulgaris L.

Staminele, în număr de 5, sunt scurte, fixate pe corolă cu ajutorul filamentelor, iar anterele prezintă saci polenici. Pistilul este alcătuit din ovar superior, stil și stigmat.

Figura nr.VI.6 Floare Primula veris L. Figura nr.VI.7 Floare Primula vulgaris L.

În cazul frunzele celor două specii, de culoare verde închis, există multiple asemănări. La ambele plante frunzele formează o rozetă la baza solului. Forma frunzelor este oval – obovată, cu margine crenată și vârful obtuz. În ambele cazuri, pe fața inferioară se pot observa nervuri proeminente, reticulate și numeroși peri la nivelul nervurilor. Perii tectori au fost fotografiați cu ajutorul camerei digitale.

Deosebirile dintre frunze constau în dimensiunea și aspectul diferite pe care le prezintă. Frunzele speciei Primula veris L. ating o lungime de până la 25 cm, iar lățimea poate ajunge la 5 cm în partea de mijloc. Deși la prima vedere par sesile, frunzele acestei specii prezintă un pețiol care se constrânge lent spre rădăcină. Frunzele speciei Primula vulgaris sunt sesile, cu o lungime de până la 20 cm și lățime de 7 cm în zona mediană, la maturitate.

În cazul speciei Primula veris L., partea superioară a frunzei prezintă un aspect neted, spre deosebire de Primula vulgaris L. unde se observă aspectul de „coajă de portocală”.

Figura nr.VI.9 Frunză Primula veris L. Figura nr.VI.10 Frunză Primula vulgaris L.

Figura nr.VI.10 Peri tectori P. veris L. Figura nr.VI.11 Peri tectori P.vulgarsi L.

Partea subterană este reprezentată de un rizom de la care pornesc numeroase radicule ramificate, subțiri, de culoare alb – gălbui.

Figura nr.VI.12 Rădăcină P. veris L. Figura nr.VI.13 Rădăcină P.vulgarsi L.

A fost păstrat un exemplar din fiecare specie în ierbarul laboratorului de Botanică al Facultății de Medicină și Farmacie din Oradea.

Figura nr.VI.14 Ierbar

VII. ANALIZA MICROSCOPICĂ

Analiza microscopică a celor două specii de primula s-a efectuat la microscopul optic OPTIKA ITALY, iar pozele le-am efectuat cu telefonul mobil. Pentru realizarea secțiunilor de analizat am folosit lame, lamele, lame pentru tăiat, pipete, apă distilată, soluție de albastru de metilen 1% și soluție de Roșu de Congo.

VII.1. Analiza microscopică a speciei Primula veris L.

Secțiune prin frunză

În urma secționării transversale a frunzei am evidențiați la obiectiul 10X pe partea dorsală a frunzei, la nivelul epidermei inferioare, peri tectori pluricelulari simpli și perii secretori, În figura nr.VII.1 se pot observa componente frunzei identificate la microscopul optic.

Figura nr.VII.1 – Secțiune transversală prin frunza de Primula veris L. 100X

a. epiderma superioară; b. țesut asimilator palisadic; c. țesut asimilator lacunar;

d. epiderma inferioară; e. peri tectori pluricelulari; f. peri secretori.;

În secțiunea prin jupuire a epidermei superioare am identificat stomate de tip anizocitic, cu patru celule anexe identice celulelor epidermice, conform figurii nr.VII.2.

Figura nr.VII.2 – Secțiune prin jupuirea frunzei de Primula veris L.100X

a. stomată; b. celule anexe;

Secțiune prin petalele florii

Prin secționarea transversală a petalelor florii de Primula veris L. am identificat cu obiectivul 40X un țesut secretor format din papile secretoare și peri secretori. În țesutul fundamental se observă cromoplaste cu pigmenți carotenoizi.

Figura nr.VII.3 – Secțiune transversală prin floarea de Primula veris L.400X

a. papile secretoare; b. păr secretor; c. țesut fundamental cu cromoplaste;

Secțiune prin peduncul floral

Prin secționarea transversală a pedicelului floral am fost observat la obiectul 10X epiderma cu numeroși peri tectori pluricelulari simpli, scoarța cu exodermă și endodermă și cilindrul central în care se poate observa periciclul, 5 fascicule libero-lemnoase și parenchimul cortical fără lacună centrală.

Secțiunea a fost lăsată timp de 15 minute într-un vas cu apă și albastru de metilen. La nivelul pedunculului floral nu au fost evidențiate structuri anatomice specifice, nici prezența cristalelor minerale.

Figura nr.VII.4 – Secțiune transversală prin pedunculul floral de Primula veris L.100X

a. epiderma cu peri tectori pluricelulari; b. scoarța cu exodermă și endodermă;

c. cilindrul central; d. fascicule libero – lemnoase; e. parenchim cortical;

Secțiune prin tija florală

În secțiunea transversală a tijei florale am observat la obiectul 10X structuri specifice, precum epiderma cu peri tectori pluricelulari simpli, neramificați, țesut clorofilian, scoarța (la nivelul căreia se observă exoderma și endoderma), cilindrul central, cu periciclul în care sunt înglobate 19 fascicule libero – lemnoase și parenchim cortical cu lacună centrală.

Figura nr.VII.5 – Secțiune transversală prin tija florală de Primula veris L. 100X

a. epiderma cu peri tectori; b. țesut clorofilian; c. scoarță; d. fascicule libero – lemnoase;

e. parenchim cortical cu lacună centrală;

Secțiunea a fost lăsată timp de 15 minute într-un vas cu apă și Roșu de Congo, colorându-se astfel fasciculele liberiene, dispuse la exterior.

Figura nr.VII.6 – Secțiune transversală colorată prin tija florală de Primula veris L. 100X

a. țesut liberian; b. țesut lemnos;

Secțiune prin rădăcină

Prin secțiunea transversală la nivelul rădăcinii am identificat la obiectivul 10X rizoderma, scoarța cu țesut de depozitare și cilindrul central cu fascicule libero – lemnoase.

Fig. nr.VII.7 – Secțiune transversală prin rădăcina de Primula veris L. 100X

a. rizodermă; b. scoarță; c. cilindrul central;

Analizarea polenului

Polenul l-am analizat la obiectivul 40X, observând forma sferică cu ornamentații.

Fig. nr.VII.8 – Polen Primula veris L. 400X

VII.2. Analiza microscopică a speciei Primula vulgaris L.

Secțiune prin frunză

Am analizat secțiunea transversală prin frunză la obiectivul 10X, unde am evidențiat pe partea dorsală a frunzei, la nivelul epidermei inferioare, numeroși peri tectori, dar și peri secretori.

Perii tectori pluricelulari sunt neramificați, grupați câte 6-10 în mănunchiuri. Perii secretori, de dimensiuni mai mici și formă diferită sunt într-un număr mai mic decât perii tectori și au fost observați atât pe epiderma inferioară, cât și pe epiderma superioară.

Fig. nr.VII.9 – Secțiune transversală prin frunza de Primula vulgaris L.100X

a. epiderma superioară; b. țesut asimilator palisadic; c. țesut asimilator lacunar;

d. epiderma inferioară; e. peri tectori pluricelulari grupați în smocuri;

f. peri secretori;

Prin jupuirea epidermei superioare am identificat stomate de tip anizocitic, cu patru celule anexe identice cu celulele epidermice.

Fig. nr.VII.10 – Secțiune prin jupuirea frunzei de Primula vulgaris L. 400X

a. stomată; b. celule anexe;

Secțiune prin petalele florii

La secțiunea transversală prin petalele florilor de Primula vulgaris L. am identificat la obiectivul 40X numeroase papile secretoare.

Fig. nr.VII.11 – Secțiune transversală prin floarea de Primula vulgaris L. 400X

a. papile secretoare; b. țesut fundamental cu cromoplaste;

Secțiune prin peduncul floral

Prin secționarea transversală a pedunculului floral am observat la obiectul 10X structuri specifice precum: epiderma, scoarța cu exodermă și endodermă și cilindrul central.

La nivelul epidermei am evidențiat peri tectori pluricelulari și peri secretori într-un număr mai mic comparativ cu frunza. În cadrul cilindrului central se poate observa periciclul, 5 fascicule libero-lemnoase și parenchimul cortical fără lacună centrală.

Fig. nr.VII.12 – Secțiune transversală prin pedunculul floral de Primula vulgaris L. 100X

a. epiderma cu peri tectori pluricelulari; b. scoarța cu exodermă și endodermă;

c. cilindrul central; d. fascicule libero – lemnoase; e. parenchim cortical;

Secțiunea a fost lăsată timp de 15 minute într-un vas cu apă și albastru de metilen. La nivelul pedunculului floral nu au fost evidențiate structuri anatomice specifice sau cristalele minerale.

Secțiune prin rădăcină

Prin secțiunea transversală la nivelul rădăcinii am identificat la obiectivul 10X rizoderma cu perișori absorbanți, cu rol în absorbția apei și a sărurilor minerale, scoarța cu țesutul de depozitare și cilindrul central cu 5 fascicule libero – lemnoase.

Fig. nr.VII.13 – Secțiune transversală prin rădăcina de Primula vulgaris L. 100X

a. rizoderma cu perișori absorbanți; b. scoarță; c. cilindrul central;

Analizarea polenului

Am analizat polenul la obiectivul 10X unde s-a observat forma sferică și aspectul neted al acestuia, dar la obiectivul 40X se observă ornamentații.

Fig. nr.VII.14 – Polen 100X. Fig. nr.VII.15 – Polen 400X

VIII. DETERMINAREA CARACTERULUI ANTIOXIDANT

Caracterul antioxidant al celor două specii de Primula a fost determinat prin cinci metode: determinarea conținutului de polifenoli, determinarea conținutului de flavonoide, metoda de reducere a radicalilor liberi, metoda de reducere a ionilor de cupru și determinarea clorofilei a, b și carotenoizilor.

VIII.1. Materiale și metode

Aparatură

Aparatură și ustensile de laborator pe care le-am folosit au fost: spectrofotometru UV/VIS 70+, agitator magnetic VELP – Vortex Mixers ZX3, baie de ultrasonare Elmasonic S100H, centrifugă Hettich Universal 320R, râșniță electrică, eprubete de sticlă, eprubete conice, baloane cotate, hârtie de filtru, micropipete, cuve de cuarț.

Figura nr.VIII.1 Spectrofotometru UV/VIS 70+

Figura nr.VIII.2 Pipete automate Figura nr.VIII.3 Cuve de cuarț

Figura nr.VIII.4 Centrifugă Figura nr.VIII.5 Agitator magnetic Hettich Universal 320R VELP – Vortex Mixers ZX3

Reactivi

Reactivii utilizați la primele patru determinări au fost acid 6 – hidroxi – 2,5,7,8 – tetrametilcroman – 2 – carboxilic (Trolox), persulfat de potasiu, Folin – Ciocâlteu, DPPH (2,2 – difenil – 2 – picril – hidrazil), CUPRAC (neocupreină), acidul galic , etanol 70%, carbonatul de sodiu, azotit de sodiu, clorură de aluminiu, hidroxid de sodiu, metanol, clorură de cupru (II) și acetat de amoniu. Pentru determinarea clorofilei a, clorofilei b și carotenoizilor s-au folosit dietileter 95%, metanol 96% și acetonă 100%. Apa deionizată folosită a fost obținută cu un sistem Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, SUA). Toți reactivii utilizați au fost de puritate analitică.

Produsul vegetal

Frunzele și inflorescențele speciilor Primula veris L. și Primula vulgaris L. le-am cules în luna martie din satele Stejeriș, județul Cluj, respectiv Lazuri de Beiuș, județul Bihor. Florile au fost uscate la temperatura camerei și s-au mărunțit cu o râșniță electrică. Pentru determinarea clorofilei a, clorofilei b și carotenoizilor am folosit frunze și flori proaspete.

Figura nr.VIII.6 Primulae species flores Figura nr.VIII.7 Primulae species folium

Figura nr.VIII.8 Pulbere din flori de Primula sp.

Prepararea extractelor

Am preparat două extracte alcoolice de concentrație 10% și 20%. Principiile active din 10g, respectiv 20g de produs vegetal uscat (inflorescențe) s-au extras cu soluție alcoolică de etanol 70 până la 100g, utilizând un mixer magnetic în etape de 45 – 45 – 20 de minute, iar apoi probele au fost sonicate timp de 5 minute. Extractele s-au lăsat în repaus 10 zile la 2 – 8C, apoi s-au filtrat prin hârtie de filtru Whatmann nr.1 și s-au păstrat la frigider.

Figura nr.VIII.9 Extracte alcoolice de Primulae flos

Pentru determinarea clorofilei a, clorofilei b și carotenoizilor am preparat extracte din produse vegetale proaspete. Am cântărit la balanța analitică câte un gram de frunze proaspete, respectiv flori proaspete și le-am pus separat în șase pahare Berzelius, peste care am pus acetonă 100%, dietil-eter, respectiv metanol. La 1 gram de produs vegetal am pus 20 ml reactiv, obținând extracte de concentrație 5%. Peste recipiente am aplicat o folie, pentru a evita evaporarea solventului, iar apoi am omogenizat probele cu ajutorul agitatorului magnetic VELP – Vortex Mixers ZX3, timp de 5 minute. Am transvazat extractele în eprubete conice și le-am centrifugat timp de 3 minute cu ajutorul centrifugei la 1000 de rotații pe minut, după care le-am filtrat. [47]

Figura nr.VIII.10 Extractele din flori, respectiv frunze proaspete cu diferiți solvenți

Figura nr.VIII.11 Centrifugarea extractelor

Determinarea conținutului de polifenoli

Am determinat conținutul total de polifenoli prin metoda Folin-Ciocâlteu. Prezența polifenolilor în extracte a fost pus în evidența prin intermediul compușilor albaștri formați între grupările hidroxil din proba luată în lucru și reactivul Folin – Ciocâlteu, în mediu alcalin, ajustat cu carbonat de sodiu. [48]

Probele le-am obținut din 0,5 ml extract alcoolicde 10%, respectiv 20%, 0,5 mL apă deionizată și 0,5 mL reactiv Folin – Ciocâlteu, care se agită ușor, iar după 2 minute am adăugat 0,5 mL soluție de carbonat de sodiu 100 mg/mL. Eprubetele cu soluții se agită și se lasă în repaus timp de 2 ore.

La lungimea de undă de 765 nm, denistatea optică crește proporțional cu numărul de grupări hidroxil din structura polifenolilor (antocianilor). Absorbanța soluțiilor de culoare albastră a fost măsurată spectrofotometric la 765 nm, față de proba martor.

Determinarea conținutului de flavonoide

Cantitatea totală de flavonoide am determinat-o printr-o metodă colorimetrică.

Probele de analizat au fost obținute astfel: am introdus într-un balon cotat de 10 mL, 1 mL de soluție extractivă amestecată cu 4 mL apă deionizată, iar apoi am adăugat 3 mL soluție de azotit de sodiu 5%. După 5 minute am adăugat 0,3 mL soluție de clorură de aluminiu 10%, iar peste 6 minute 2 mL de soluție de hidroxid de sodiu 1M. Am completat balonul cotat până la semn cu apă deionizată și l-am agitat. [49]

Determinarea conținutului de cvercetină a fost realizată prin metoda spectrofotometrică, citind extincția la lungimea de undă de 510 nm. Proba martor a fost compusă din apă deionizată, 3 mL soluție de azotit de sodiu 5%, 0,3 mL soluție de clorură de aluminiu 10%, 0,3 mL soluție de clorură de aluminiu 10% și 2 mL de soluție de hidroxid de sodium.

Activitatea antioxidantă prin metoda DPPH

Depistarea și reducerea radicalilor liberi s-a efectuat prin metoda DPPH. Cu această metodă am determinat capacitatea antioxidantă prin testarea abilității extractelor de a neutraliza radicalii liberi. Metoda DPPH este des utilizată pentru cuantificarea antioxidanților din sitemele biologice complexe. [50]

DPPH este un compus violet, stabil la temperature camerei și care prezintă absorbție caracteristică la lungimea de undă de 517nm. Radicalul liber de azot al DPPH este redus cu ușurință de un complex antioxidant până la un complex galben, și anume 1,1 – difenil – 2 – picril – hidrazină.

Am determinat capacitatea extractelor de a reduce compusul 2,2 – difenil – 2 – picril – hidrazil printr-o metodă colorimetrică. DPPH poate reacționa cu o substanță antioxidantă care poate dona hidrogen și reduce DPPH.

Soluția de DPPH în metanol 6 x 10-5 a fost proaspăt preparată, înainte de efectuarea determinărilor spectrofotometrice. Din această soluție am luat 3 mL, pe care i-am amestecat cu 3 mL extract alcoolic de concentrație 10%, respectiv 20%.

Probele au stat 15 minute la întuneric, după care am măsurat scăderea absorbanței. Absorbanțele au fost înregistrate la 517 nm față de proba martor. Proba martor a fost soluția de DPPH.

Reducerea ionilor de cupru (Cu2+)

Capaciteatea antioxidantă a extractelor față de ionii cuprici (Cu2+) am determinat-o prin metoda Cuprac.

Acest experiment se bazează pe modificările caracteristicilor de absorbție ale complexului Neocupreină (Nc), când este redus de un antioxidant. Potențialul de reducere al probei constă în conversia ionilor Cu2+ la ioni Cu1+. [51]

Am obținut probele din 0,25 mL soluție de clorură de cupru (II) 0,01M, 0,25 mL soluție etanolică de neocupreină 7,5 x 10-3 M și 0,25 mL soluție tampon de acetat de amoniu 1M, adăugând apoi 0,25 mL extract alcoolic din flori și 2 mL de apă deionizată. Eprubetele au fost închise și păstrate la temperatura camerei timp de 30 de minute.

Absorbanțele s-au citit la lungimea de undă de 450 nm față de proba martor, obținută din solvenții utilizați la prepararea probelor, în cantitățile corespunzătoare. O densitate optică ridicată a probelor denotă o capacitate de reducere crescută a extractelor.

Determinarea cantitativă a clorofilei a, clorofilei b și carotenoizilor

În urma procedeul de extracție am obținut șase soluții extractive din flori și frunze, pe care le-am filtrat prin tifon, urmând să citesc absorbanțele fiecăreia la lungimile de undă 662, 646 și 470, cu ajutorul spectrofotometrului. Probele martor au fost cei 3 solvenți utilizați la prepararaea extractelor pentru această metodă.

VIII.2. Rezultate și discuții

Determinarea conținutului de polifenoli

Conținutul total de polifenoli a fost exprimat în echivalenți de acid galic, pentru care s-a utilizat acid galic standard.

Figura nr.VIII.12 Curbă de calibrare acid galic

Conținutul de polifenoli totali din extracte a fost calculată din ecuația de regresie și exprimată în mg echivalenți acid galic (GAE)/100 g proba uscată. Rezultatele conținutului de polifenoli sunt prezentate în tabelul VIII.1. În extractul de concentrație 10% conținutul de polifenoli a fost de 535, 41 mg acid galic/100g probă uscată, iar în extractul de concentrație 20% a fost de 613,55 mg acid galic/100g probă uscată.

Prin creșterea concentrației extractului de la 10% la 20% cantitatea de polifenoli crește doar cu 14,55%.

Tabel nr.VIII.1 Rezultate conținut polifenoli

Determinarea conținutului de flavonoide

Curba de calibrare (figura nr.VIII.13) pentru realizarea determinărilor a fost trasată folosind standard quercetin. Conținutul de flavonoide din extracte a fost calculată din ecuația de regresie rezultată din grafic și exprimată în mg quercetina (QE)/100 g proba uscată.

Figura nr.VIII.13 Curbă de calibrare standard quercetin

Rezultatele obținute în urma citirii la spectrofotometru se găsesc în tabelul nr.VIII.2. Cantitatea de quercetină din 100 g probă uscată a fost de 15,31 mg în extractul de 10%, respectiv de 17,65 mg în extrcatul de 20%.

Prin dublarea cantității de plantă uscată în extract se observă o creștere a cantității de flavonoide cu 15,28%.

Tabel nr.VIII.2. Rezultate conținut flavonoide

Reducerea radicalilor liberi

Reducerea radicalilor liberi se observă prin schimbarea culorii soluțiilor de la violet închis la galben deschis. Decolorarea este stoechiometrică cu numărul de electroni câștigați.

Procentul de inhibiție al DPPH a fost calculat ecuației de mai jos:

% Inbibiție = [(Abs. martor – Abs. probă) x 100 ] / Abs. martor [48]

Rezultatele obținute sunt trecute în tabelul VIII.3. Procentul de inhibiție este cuprins între 86,65% și 88,46%. Capacitatea antioxidantă a extractului alcoolic de 20% este mai puternică doar cu 2,08%.

Tabel nr.VIII.3. Rezultatele metodei DPPH

Reducerea ionilor de cupru (Cu2+)

Curba de calibrare a fost generată folosind o soluție de concentrație cunoscută de Trolox, iar rezultatele au fost exprimate în echivalenți Trolox.

Figura nr.VIII.14 Curbă de calibrare Trolox

Rezultatele obținute sunt reprezentate sub formă de mol echivalenți Trolox/g probă uscată. Caracterul antioxidant al extractului de 10% este mai mare cu 4,54%, spre deosebire de extractul de 20%.

Tabel VIII.4. Rezultatele metodei Cuprac

Determinarea cantitativă a clorofilei a, clorofilei b și carotenoizilor

Cantitatea de pigmenți a fost calculată cu ajutorul ecuațiilor tricromatice determinate de Lichtentaler și Wellburn.

Formulele utilizate având ca solvent acetona:

Clorofila a = Ca = 11,75 x A662 – 2,35 x A646

Clorofila b = Cb = 18,61 x A646 – 3,96 x A662

Caroten total = Cx+c = [1000 x A470 – 2,27 x Ca – 81,4 x Cb] / 227 [47]

Formulele utilizate având ca solvent dietil-eterul:

Clorofila a = Ca = 10,05 x A662 – 0,766 x A646

Clorofila b = Cb = 16,37 x A646 – 3,140 x A662

Caroten total = Cx+c = [1000 x A470 – 1,280 x Ca – 56,7 x Cb] / 230 [47]

Formulele utilizate având ca solvent metanolul:

Clorofila a = Ca = 15,65 x A662 – 7,34 x A646

Clorofila b = Cb = 27,05 x A646 – 11,21 x A662

Caroten total = Cx+c = [1000 x A470 – 2,86 x Ca – 129,2 x Cb] / 245 [47]

Rezultatele obținute se găsesc în tabelul VIII.5 și sunt exprimate în mg/g produs proaspăt. Cantitatea de caroten total s-a determinat prin calcul cu ajutorul rezultatelor obținute la clorofila a și b, prin intermediul formulelor. Cantitatea de caroten din frunze este mai mare cu 67,13% decât în flori, în cazul extractelor cu acetonă. La extractele din flori și frunze în dietileter, precum și la extractul din frunze în metanol am obținut valori negative. În metanol, cantitatea de caroten extrasă este de 80, 82 mg/g flori proaspete.

Tabel nr.VIII.5. Rezultate clorofila a, clorofila b și caroten total

VIII. CONCLUZII

Antioxidanții au un rol important în combaterea radicalilor liberi, fiind indispensabili pentru organismul uman.

În urma analizelor botanice se pot diferenția categoric cele două specii studiate, atât macroscopic, cât și microscopic. Deosebirile și asemănările celor două plante se pot compara cu atlasele de specialitate.

Prin metodele efectuate am determinat prezența a trei clase importante de compuși cu activitate antioxidantă în florile de Primula veris L. și Primula vulgaris L., și anume polifenoli, flavonoide și carotenoizi, iar în frunzele celor două specii s-au evidențiat carotenoizii.

Carotenul total din florile acestor specii s-a extras cel mai bine cu ajutorul metanolului. În cazul frunzelor extracția a decurs mai bine în prezența acetonei.

Rezultatele obțiunte prin metoda de reducere a radicalilor liberi și metoda de reducere a ionilor de cupru confirmă caracterul antioxidant al extractelor de Primula veris L și Primula vulgaris L. și sinergismul de acțiune al acestor specii.

Capacitatea antioxidantă a extractului de 20% este mai mare 2,09%, respectiv cu 4,54% decât a extractului de 10%, în funcție de metoda utilizată. Se poate constata astfel că deși concentrația extractului este de două ori mai mare, capacitatea antioxidantă crește cu un procent foarte mic.

Conform rezultatelor obținute, atât florile, cât și frunzele speciilor de Primula pot fi utilizate în diferite preparate farmaceutice, dar pot fi consumate și în stare proaspătă.

Datorită diferențelor mici între valorile celor două concentrații, extractul alcoolic din florile de Primula sp. 10% reprezintă o concentrație optimă pentru combaterea stresului oxidativ și poate fi utilizată în diferite preparate cu caracter antioxidant.

IX. BIBLIOGRAFIE – WEBGRAFIE

Jurca, Tűnde, Marian, Eleonora, Vicaș, Laura, Neagu, Oana, Pallag, Annamaria, Bioactive compounds and antioxidant capacity of Primula veris L. Flower extracts, Analele Univresității din Oradea, Fascicula: Ecotoxicologie, Zootehnie și Tehnologii de Industrie Alimentară, Vol.XIV B, 2015, p.235-241

Balch, Phyllis A., Vindecare prin nutrție, Editura Litera, București, 2014, p. 27 – 28, 71, 75

Szabó, Ildikó, Botanică farmaceutică: Sistematica plantelor, Editura Universității din Oradea, Oradea, 2009, p. 303 – 304

Preda, Milea, Dicționar dendrofloricol, Editura Științifică și Enciclopedică, București, 1989, p. 434

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Illustration_Primula_veris0_clean.jpg, consultat la 02.02.2019

https://www.rhsprints.co.uk/image/670752/kilburn-william-c-1745-1818-engraver-and-artist-primula-acaulis, consultat la 02.02.2019

Enciclopedia ilustrată a florilor și florei sălbatice, Editura Aquila `93, Oradea, 2008, p. 64 – 65

1000 de plante medicinale, Editura Aquila `93, Oradea, 2007, p. 253 – 254

Scarlat, Mihai-Alin, Tohăneanu, Monica, Bazele Fitoterapiei, Editura World Galaxy, Ploiești, 2009, p. 49 – 53

Ardelean, A., Mohan, Gh., Nedelcu, G., Plante medicinale din banat, Editura Mirton, Timișoara, 1997, p. 63 – 65

Crăciun, Florentin, Bojor, Ovidiu, Alexan, Mircea, Farmacia naturii vol. II, Editura Ceres, București, 1977, p. 11

Oroian, Silvia, Botanică farmaceutică: Plante medicinale și aromatice, Editura University press, Târgu-Mureș, 2004, p. 144

Mogoșanu, George Dan, Bejenaru, Ludovic Everard, Bejenaru, Cornelia, Popescu, Honorius, Farmacognozie – Fitoterapie vol. II, Editura Sitech, Craiova, 2015, p. 19, 128, 134 – 135

Laza, Doru, Îndreptar profilactic și terapeutic de medicină naturistă, Editura Păzitorul Adevărului, Brașov, 2000, p. 23

Coiciu, Evdochia, Rácz, Gabriel, Plante medicinale și aromatice, Editura Academiei Republicii Populare Romîne, București, 1962, p. 497 – 498

Sava, Daciana, Atlas botanic, Editura Steaua Nordului, Constanța, 2007, p. 133

https://www.plantlife.org.uk/uk/discover-wild-plants-nature/plant-fungi-species/primrose, consultat la 05.05.2019

Butură, Valer, Enciclopedia de etnobotanică românească, Editura Științifică și Enciclopedică, București, 1979, p. 26, 69

Treben, Maria, Sănătate din Farmacia Domnului, Editura Hunga-Print, Budapesta, 1993, p. 15 – 16

https://fares.ro/dictionar-plante/ciubotica-cucului/, consultat la 05.05.2019

https://botanical.com/botanical/mgmh/c/cowsl112.html, consultat la 05.05.2019

https://www.plantlife.org.uk/uk/discover-wild-plants-nature/plant-fungi-species/cowslip, consultat la 05.05.2019

https://www.deutschland.de/en/topic/environment/landscapes-habitats/the-plants-of-the-year-2016, consultat la 05.05.2019

https://neraplant.ro/breviar/index/info?id=15, consultat la 05.05.2019

Bejenaru, Ludovic Everard, Mogoșanu, George Dan, Bejenaru, Cornelia, Popescu, Honorius, Farmacognozie – Fitoterapie vol. I, Editura Sitech, Craiova, 2015, p. 267, 270

https://botanical.bg/en/bilki/iglika/, consultat la 05.05.2019

Pallag, Annamaria, Botanică farmaceutică – Citologie, histologie și organografie, Editura Gutenberg Univers, Arad, 2013, p. 30

Mitrea, Niculina, Margină, Denisa, Arsene, Andreea, Grădinaru, Daniela, Burta, Călin M., Biochimie: vitaminele în procesele metabolice, Editura Didactică și Pedagogică, București, 2008, p. 250 – 251

Goina, T., Constantinescu, E., Ciulei, I., Rácz, G., Grigorescu, E., Petcu, P., Farmacognozie, Editura Didactică și Pedagogică, București, 1967, p. 161 – 162

https://www.ema.europa.eu/en/documents/herbal-summary/primula-flower-summary-public_en.pdf, consultat la 05.05.2019

Bojor, Ovidiu, Ghidul plantelor medicinale și aromatice de la A la Z, Editura Fiat Lux, București, 2003, p. 96

Baczek, Katarzyna, Przybyl, Jaroslaw L., Mirgos, Malgorzata, Kosakowska, Olga, Szymborska – Sandhu, Izabela, Weglarz, Zenon, Phenolic in Primula veris L. and P. elatior (L.), International Journal of Analytical Chemistry, 2017

Muller, Andrea, Ganzera, Markus, Stuppner, Hermann, Analysis of phenolic glycosides and saponins in Primula elatior and Primula veris (primula root) by liquid chromatography, evaporative light scattering and mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1112, 2006, pp. 218

Mohan, Gheorghe, Atlasul plantelor medicinale din România, Editura Corint, București, 2007, p. 18

Demir, Nazan, Gungor, Azize Alayli, Nadaroglu, Hayrunissa, Demir, Yașar, The antioxidant and radical scavenging activities of Primrose (Primula vulgaris), European Journal of Experimental Biology, 2014, pp. 395-396

https://phytochem.nal.usda.gov/phytochem/ethnoPlants/show/1782?qlookup=primula+vulgaris&offset=0&max=20&et=, consultat la 03.05.2019

http://www.plafar.com/ceai-de-ciubotica-cucului/, consultat la 03.05.2019

http://nomenclator.amed.md/med_files/09f49677-ecd9-11e4-8c0c-00155d2a0718/15.09.2015%2010_14_39/Herbion%20sirop%20de%20ciubotica%20cucului%20RCP%20%2019.08.2015%20R.pdf, consultat la 03.05.2019

https://neraplant.ro/magazin/sirop-nera-plant-multiplant-250ml.html, consultat la 03.05.2019

https://bronhoklir.ro/tuse_productiva/, consultat la 03.05.2019

https://neraplant.ro/magazin/sirop-nera-plant-calmiplant-250ml.html, consultat la 03.05.2019

http://www.poieniplant.ro/Tinctura-pulmonara-bio_54.html, consultat la 03.05.2019

http://pro-natura.ro/ciubotica-cucului-x-60-cps-ceai-x-20-doze/, consultat la 03.05.2019

https://fares.ro/produs/plantusin-calmant-r44-comprimate-masticabile/, consultat la 03.05.2019

https://www.daciaplant.ro/calmotusin-cu-argint-coloidal-fara-alcool-spray-20ml.html, consultat la 03.05.2019

Farmacopeea Română ediția a X-a, Editura Medicală, București, 2014, p. 787, 789

Dere, Șűkran, Gűnes, Tohit, Sivaci, Ridvan, Spectrophotometric Determination of Chlorophyll – A, B and Total Carotenoid Contents of Some Algae Species Using Different Solvents, 1997

Padmanabhan, P., Jangle, S.N., Evaluation of DPPH Radical Scavenging activity and Reducing Power of Four Selected Medicinal Plants and Their Combination, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, 2012, p. 143 – 146

Kim, D.O., Chun, O.K., Kim, Y.J., Moon, H.Y., Lee, C.Y., Quantification of polyphenolics and their antioxidant capacity in fresh plums, J. Agric. Food Chem. 51, p. 6509, 6515

Brand – Williams W., Cuvelier, M.E., Berset, C., Use of free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensm Wiss Technology, 28, 1995, p. 25 – 30

https://www.oxfordbiomed.com/sites/default/files/spec_sheet/FS02.pdf, consultat la 02.02.2019

Mulțumiri pentru ajutorul oferit doamnei profesor dr. farm. Laura Vicaș – Disciplina Tehnologie farmaceutică, doamnei șef lucrări dr. farm. Pașca Bianca – Disciplina Botanică farmaceutică și domnului șef lucrări dr. farm. Sebastian Nemeth – Disciplina Farmacognozie.