Teza Full 2019 Final Forma 1, Dumitru M [307570]
TEZĂ DE DOCTORAT
CERCETĂRI PRIVIND OBȚINEREA PREPARATELOR ENZIMATICE EXOGENE ȘI EFECTELE UTILIZĂRII ACESTORA ÎN HRANA MONOGASTRICELOR
Doctorand: [anonimizat]:
Prof. univ. Dr. JURCOANE Ștefana
BUCUREȘTI
2019
[anonimizat]: [anonimizat]:
Professor univ. Dr. JURCOANE Ștefana
BUCHAREST
2019
THÈSE DE DOCTORAT
LES RECHERCHES SUR L’OBTENTION DE PRÉPARATION D’ENZYMES EXOGÉNES ET LEUR EFFECTS UTILISATION DANS LA NUTRITION MONOGASTRIQUE
Doctorant: DINU G. (DUMITRU) Mihaela
Coordinateur scientifique:
Prof. univ. Dr. JURCOANE Ștefana
BUCAREST
2019
CUPRINS
REZUMAT 12
SUMMARY 17
RÉSUMÉ 22
INTRODUCERE 28
PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC 30
CAPITOLUL I. INTRODUCERE ÎN LUMEA BIOTEHNOLOGIEI 31
1.1. Ce este biotehnologia? 31
1.1.2. Dezvoltarea biotehnologiei ca știință 31
1.1.3. Aplicații ale biotehnologiei în agricultură 32
1.3. Inceputul enzimologiei ca știință 33
1.3.1. Noțiuni generale 33
1.3.2. Enzimologia în zilele noastre 35
1.4. Enzime. Rol și importanță 36
1.4.1. Structura enzimelor 38
1.4.2. Nomenclatura enzimelor 38
1.5. Clasificarea enzimelor 38
1.5.1. Enzime exogene. Noțiuni generale 39
1.5.1.1. Surse de enzime exogene 40
1.5.1.2. Enzime de origine vegetală 40
1.5.1.3. Enzime de origine animală 40
1.5.1.4. Enzime de origine microbiană 40
1.5.2. Cultivarea tulpinii producătoare de enzime 41
1.5.3. Extracția și purificarea enzimelor de interes 41
1.6. Importanța microorganismelor pentru obținerea enzimelor exogene 42
1.6.1. Bacterii 43
1.6.2. Ciuperci microscopice 44
1.6.3. Drojdii 44
1.6.4. Mucegaiurile 45
1.7. Compoziția mediului de cultură pentru culturile microbiene 46
1.7.1. Sursă de carbon și energie 46
1.7.2. Sursă de azot 47
1.7.3. Săruri minerale 47
1.7.4. Factori de creștere 47
CAPITOLUL II. IMPORTANȚA PREPARATELOR ENZIMATICE IN HRANA MONOGASTRICELOR 48
2.1. Enzime de uz furajer 48
2.2. Importanața enzimelor din perspectiva valorii nutriționale 50
2.3. Scopul utilizării enzimelor exogene și efectele produselor enzimatice 51
2.4. Cercetări privind utilizarea preparatelor enzimatice exogene în hrana monogastricelor 52
2.4.1. Carbohidraze 55
2.4.2. Fitaze 58
2.4.2.1. Fitaze de origine vegetală 60
2.4.2.2. Fitaze de origine microbiană 60
2.4.2.3. Factorii de influență asupra activității fitazice 61
2.4.3. Proteaze, amilaze, lipaze 62
2.4.4. Amestecuri de enzime 63
CAPITOLUL III. [anonimizat] 64
3.1. Efectul enzimelor exogene în hrana suinelor 64
3.2. Efectul enzimelor exogene în hrana păsărilor 65
PARTEA a II-a: CERCETĂRI PROPRII 67
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR 60
CAPITOLUL IV. MATERIALE ȘI METODE DE CERCETARE UTILIZATE 63
4.1. Introducere. Cadrul instituțional în care s-au desfășurat cercetările 63
4.2. Material biologic 68
4.2.1. Suine – purcei în criza de înțărcare 68
4.2.2. Păsări – pui broiler de găină 70
4.3. Rețete de nutrețuri combinate utilizate in vivo 72
4.4. Metode de analiză 80
4.4.1. Recoltarea și pregătirea probelor 80
4.4.1.1. Materii prime și furaje 80
4.4.1.2. Probele biologice 81
4.4.2. Metode de analize chimice 82
4.4.3. Metode de analize microbiologice 82
4.5. Metode de determinare a parametrilor zootehnici 82
4.5.1. Parametrii bioproductivi 82
4.6. Metode statistico-matematice utilizate 83
CAPITOLUL V. CERCETĂRI IN VITRO PRIVIND CARACTERIZAREA UNOR TULPINI BACTERIENE ÎN VEDEREA UTILIZĂRII ÎN HRANA MONOGASTRICELOR 84
5.1. Materiale, reactivi chimici, medii de cultură și echipamente utilizate 84
5.2. Metode de analiză 84
5.2.1. Identificarea și caracterizarea tulpinilor bacteriene 84
5.2.1.1. Caractere morfologice 85
5.2.1.2. Caractere culturale 85
5.2.1.3. Caracterele biochimice 85
5.2.1.3.1. Testul catalazei 85
5.2.1.3.2. Testul API 50 CHB/L 86
5.2.1.4. Evidențierea caracterelor de patogenitate. Testul de hemoliză 87
5.2.1.5. Evidențierea activității antibacteriene pentru Bacillus sp. 87
5.2.1.6. Conservarea tulpinilor bacteriene 88
5.2.1.7. Determinarea activității enzimatice din punct de vedere calitativ 88
5.2.1.7.1. Hidroliza amidonului. Reacția cu iodul 88
5.2.1.7.2. Hidroliza cazeinei 88
5.2.1.7.3. Optimizarea mediului fermentativ. Producere de α-amilază 89
5.2.1.8. Determinarea activității enzimatice din punct de vedere cantitativ 89
5.2.1.8.1. Determinarea activității amilolitice prin metoda Hostettler 90
5.2.1.8.2. Determinarea activității celulozolitice 91
5.2.1.8.3. Determinarea activității proteolitice 93
5.2.1.9. Examinarea unor tulpini bacteriene din punct de vedere probiotic în vederea utilizării în hrana monogastricelor 96
5.2.1.9.1. Rezistența la pH acid 96
5.2.1.9.2. Rezistența la săruri biliare 97
5.2.1.9.3. Rezistența la antibiotice 97
5.3. Etapele procesului biotehnologic pentru obținere de biopreparat enzimatic pe bază de Bacillus sp. în vederea administrării în hrana monogastricelor 98
5.4. Etapele procesului biotehnologic pentru obținere de produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere în vederea administrării în hrana puilor broiler de găină 99
5.4.1. Obținerea nutrețului combinat cu adaos de biopreparat bacterian 101
CAPITOLUL VI. METODE DE DETERMINARE A MICROBIOTEI LA MONOGASTRICE102
6.1. Analize bacteriologice 102
6.1.1. Metoda de identificare a lactobacililor 102
6.1.2. Metoda de identificare a enterococilor 103
6.1.3. Metoda de determinare a Salmonella sp. 103
6.1.4. Metoda de determinare a numărului de clostridii 103
6.1.5. Metoda de determinare a numărului de coliformi 104
6.1.6. Metoda de determinare a numărului de Bacillus sp. 104
6.1.7. Metoda de determinare E. coli biotipul β-hemolitic 104
CAPITOLUL VII. REZULTATE ȘI DISCUȚII 105
7.1. Rezultatele cercetărilor in vitro privind caracterizarea tulpinilor bacteriene de Bacillus sp. în vederea administrării în hrana monogastricelor 105
7.1.1. Caractere culturale 105
7.1.2. Caractere morfologice 106
7.1.3. Caractere biochimice 107
7.1.3.1. Testul API 50 CHB 107
7.1.3.2. Testul catalazei 111
7.1.4. Conservarea tulpinilor de Bacillus sp. 111
7.1.5. Evidențierea proprietăților hemolitice 112
7.1.6. Activitatea antimicrobiană 113
7.1.7. Determinarea activității enzimatice 113
7.1.7.1. Optimizarea mediului fermentativ. Producere de α-amilază 113
7.1.7.2. Determinarea activității amilazice 115
7.1.7.3. Celulază 118
7.1.7.4. Protează 120
7.1.8. Evidențierea capacității de hidroliză a amidonului 122
7.1.9. Evidențierea capacității de hidroliză a cazeinei 123
7.1.10. Rezistența la pH 2 și 3 124
7.1.11. Rezistență la săruri biliare 127
7.1.12. Rezistența la temperatură 128
7.1.13. Rezistența la antibiotice 129
7.2. Rezultatele cercetărilor in vitro privind caracterizarea tulpinilor bacteriene de Lactobacillus sp. în vederea administrării în hrana puilor broiler de găină 131
7.2.1. Identificarea caracterelor morfologice, culturale și biochimice ale tulpinilor din genul Lactobacillus izolate din conținutul intestinal pasăre 131
7.2.2. Rezistența la pH 134
7.2.3. Rezistența la săruri biliare 136
7.3. Rezultatele procesului biotehnologic pentru obținerea biopreparatelor bacteriene în vederea utilizării în hrana monogastricelor 137
7.3.1. Bacillus sp. 137
7.3.2. Lactobacillus sp. 139
7.4. Rezultatele cercetărilor in vivo privind administrarea biopreparatelor bacteriene în hrana monogastricelor 142
7.4.1. Structura și caracteristicile nutritive ale rețetelor de nutreț combinat 142
7.4.2. EXPERIMENT I: ,,Efectul administrării tulpinii de Bacillus subtilis ATCC 6051a în hrana purceilor în criza de înțărcare‘‘ 142
7.4.2.1. Performanțe bioproductive 142
7.4.2.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic 142
7.4.2.1.2. Consumul mediu zilnic de nutreț combinat și consumul specific144
7.4.3. EXPERIMENT II: ,,Efectul administrării tulpinii de Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana purceilor în criza de înțărcare” 145
7.4.3.1. Performanțe bioproductive 145
7.4.3.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic 145
7.5. Rezultate asupra microbiotei la purcei în criza de înțărcare 146
7.5.1. Rezultate asupra microbiotei din fecale 146
7.5.2. Rezultate asupra microbiotei intestinale 155
7.5.3. Evoluția pH-ului intestinal la purcei în criza de înțărcare 159
7.6. Incidența diareică a purceilor în criza de înțărcare la adaos de biopreparat bacterian enzimatic exogen 161
7.6.1. Experimentul I 161
7.6.2. Experimentul II 162
7.7. Experiment III: ,,Efectele utilizării unor preparate enzimatice pe bază de B. subtilis ATCC 6051a și B. licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat șrot de soia 163
7.7.1. Performanțe bioproductive 163
7.7.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic 163
7.7.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific 167
7.7.1.3. Microbiota puilor broiler de găină 168
7.7.1.3.1. Microbiota din fecale 168
7.7.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal 169
7.7.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal 171
7.8. Experiment IV: ,,Efectele utilizării unor preparate enzimatice pe bază de B. subtilis ATCC 6051a și B. licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat fasoliță”. 172
7.8.1. Performanțele bioproductive 172
7.8.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic 172
7.8.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific 174
7.8.1.3. Microbiota puilor broiler de găină 176
7.8.1.3.1. Microbiota din fecale 176
7.8.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal 177
7.8.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal 180
7.9. Experiment V: ,,Efectele administrării unei policulturi pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere la puii broiler de găină utilizând în nutrețul combinat surse energo-proteice. 180
7.9.1. Performanțele bioproductive 180
7.9.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic 180
7.9.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific 183
7.9.1.3. Microbiota puilor broiler de găină 185
7.9.1.3.1. Microbiota din dejecții 185
7.9.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal 186
7.9.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal 188
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI 190
BIBLIOGRAFIE 196
WEBOGRAFIE 207
Anexa I 208
Anexa II 221
LISTA DE PUBLICAȚII 231
TABLE OF CONTENTS
ABSTRACT 12
SUMMARY 17
RÉSUMÉ 22
INTRODUCTION 28
PART I, BIBLIOGRAPHIC STUDY 30
CHAPTER I. INTRODUCTION TO THE WORLD OF BIOTECHNOLOGY 31
1.1. What is biotechnology? 31
1.1.2. The development of biotechnology as a science 31
1.1.3. The use of biotechnology in agriculture 32
1.3. The beginning of enzymology as a science 33
1.3.1. General notions 33
1.3.2. Enzimology in our days 35
1.4. Enzymes. Role and importance 36
1.4.1. Structure of enzymes 38
1.4.2. Enzymes nomenclature 38
1.5. Enzymes clasification 38
1.5.1. Exogenous enzymes. General notions 39
1.5.1.1. Exogenous enzyme sources 40
1.5.1.2. Enzymes of vegetable origin 40
1.5.1.3. Enzymes of animal origin 40
1.5.1.4. Enzymes of bacterial origin 40
1.5.2. Cultivation of the enzyme producing strain 41
1.5.3. Extraction and purification of the enzyme of interest 41
1.6. The importance of microorganisms for obtaining exogenous enzymes 42
1.6.1. Bacteria 43
1.6.2. Microscopic mushrooms 44
1.6.3. Yeasts 44
1.6.4. Molds 45
1.7. Composition of the culture medium for bacterial cultures 46
1.7.1. Source of carbon and energy 46
1.7.2. Nitrogen source 47
1.7.3. Mineral salts 47
1.7.4. Growth factors 47
CHAPTER II. THE IMPORTANCE OF THE ENZYMATIC PREPARATIONS IN THE MONOGASTRIC FEED 48
2.1. Feed enzymes 48
2.2. Importance of enzymes from the perspective of nutritional value 50
2.3. Purpose of using exogenous enzymes and their effects 51
2.4. Research on the use of exogenous enzyme preparations in monogastric feed 52
2.4.1. Carbohydrases 55
2.4.2. Phytase 58
2.4.2.1. Phytase of vegetable origin 60
2.4.2.2. Phytase of bacterial origin 60
2.4.2.3. Factors of influence on phytase activity 61
2.4.3. Protease, amylase, lipase 62
2.4.4. Enzymes mixtures 63
CHAPTER III. STUDIES CARRIED OUT IN ROMANIA, ON THE USE OF EXOGENOUS ENZYMES IN THE MONOGASTRIC FEED 64
3.1. The effect of exogenous enzymes in feed of pigs 64
3.2. The effect of exogenous enzymes in the feed of broiler 65
PART II: OWN RESEARCH 67
PURPOSE AND OBJECTIVES OF RESEARCH 60
CHAPTER IV. MATERIALS AND METHODS OF RESEARCH USED 63
4.1. Introduction. The institutional framework in which the research was carried out 63
4.2. Biological material 68
4.2.1. Pigs – piglets in the weaning crisis 68
4.2.2. Poultry – broiler chickens 70
4.3. Feed formula used for in vivo test 72
4.4. Metods of analysis 80
4.4.1. Collection and sample preparation 80
4.4.1.1. Materii prime și furaje 80
4.4.1.2. Biological samples 81
4.4.2. Chemical methods 82
4.4.3. Microbiological methods 82
4.5. Methods for determining the zootechnical parameters 82
4.5.1. Bioproductive parameters 82
4.6. Statistical and mathematical methods used 83
CHAPTER V. IN VITRO RESEARCH ON THE CHARACTERIZATION OF BACTERIAL STRAINS FOR USED IN MONAGASTRIC FEED 84
5.1. Materials, chemical reagents, culture media and equipment used 84
5.2. Metods of analysis 84
5.2.1. Identification and caracterization of bacterialo strains 84
5.2.1.1. Morfological characters 85
5.2.1.2. Cultural characters 85
5.2.1.3. Biochemical characters 85
5.2.1.3.1. Catalase assay 85
5.2.1.3.2 API 50 CHB/L test 86
5.2.1.4. Highlighting the characters of pathogenicity. Hemolysis test 87
5.2.1.5. Highlighting antibacterial activity for Bacillus sp. 87
5.2.1.6. Conservation of bacterial strains 88
5.2.1.7. Determination of enzyme activity qualitatively 88
5.2.1.7.1. Starch hydrolysis. Reaction with iodine 88
5.2.1.7.2. Hydrolysis of casein 88
5.2.1.7.3. Optimization of fermentation medium. Production of α-amylase 89
5.2.1.8. Determination of enzyme activity in terms of quantity 89
5.2.1.8.1. Determination of amylolytic activity by the Hostettler method 90
5.2.1.8.2. Determination of cellulolytic activity 91
5.2.1.8.3. Determination of proteolytic activity 93
5.2.1.9. Examination of probiotic bacterial strains for use in monogastric fee 96
5.2.1.9.1. Resistance to acid pH 96
5.2.1.9.2. Resistance to bile salts 97
5.2.1.9.3. Antibiotic resistance 97
5.3. Stages of the biotechnological process for obtaining enzymatic bioproducts based on Bacillus sp. for administration in monogastric feed 98
5.4. The stages of the biotechnological process for obtaining a probiotic power product form based on Lactobacillus sp. for administration in the broiler feed 99
5.4.1. Obtaining animal feed with the addition of bacterial bioproduct 101
CHAPTER VI. METHODS FOR DETERMINING THE MICROBIOTA OF MONOGASTRIC 102
6.1. Bacteriological analysis 102
6.1.1. Method for identifying lactobacilli 102
6.1.2. Method of identifying enterococci 103
6.1.3. Method of determining Salmonella sp.. 103
6.1.4. Method of determining the number of clostridia 103
6.1.5. Method of determining the number of clostridia 104
6.1.6. Method of determining the number of Bacillus sp 104
6.1.7. Method of determining E. coli β-hemolytic biotype 104
CHAPTER VII. RESULTS AND DISCUSSIONS 105
7.1. The results of in vitro study on the characterization of bacterial strains of Bacillus sp. for administration in monogastric feed 105
7.1.1. Cultural characters 105
7.1.2. Morphological characters 106
7.1.3. Biochemical characters 107
7.1.3.1. API 50 CHB test 107
7.1.3.2. Catalase test 111
7.1.4. Conservation of Bacillus sp. 111
7.1.5. Highlighting the hemolytic properties 112
7.1.6. Antimicrobial activity 113
7.1.7. Determination of enzymatic activity 113
7.1.7.1. Optimization of fermentation medium. Production of α-amylase 113
7.1.7.2. Amylase 115
7.1.7.3. Cellulase 118
7.1.7.4. Protease 120
7.1.8. Highlighting the hydrolysis capacity of starch 122
7.1.9. Highlighting the hydrolysis capacity of casein 123
7.1.10. Resistance to pH 2 and 3 124
7.1.11. Resistance to bile salts 127
7.1.12. Temperature resistance 128
7.1.13. Antibiotic resistance 129
7.2. The results of in vitro research on the characterization of bacterial strains of the Lactobacillus sp. for administration in broiler chickens 131
7.2.1. Identification of morphological characters, cultural and biochemical characteristics of the Lactobacillus strains isolated from poultry intestinal contents 131
7.2.2. Resistance to pH 134
7.2.3. Resistance to bile salts 136
7.3. Results of biotechnological process for obtaining bacterial bioproducts for use in monogastric feed 137
7.3.1. Bacillus sp. 137
7.3.2. Lactobacillus sp. 139
7.4. Results of in vivo research on the administration of bacterial bioproducts in monogastric feed 142
7.4.1. Structure and nutritional characteristics of mixed feed 142
7.4.2. EXPERIMENT I: "The effect of the administration of Bacillus subtilis strain ATCC 6051a in the feeding of piglets in the weaning crisis" 142
7.4.2.1. Bioproductive performance 142
7.4.2.1.1. Evolution of body weight and daily average gain 142
7.4.2.1.2. The average daily consumption and specific consumption 144
7.4.3. E EXPERIMENT II: ,, The effect of Bacillus licheniformis ATCC 21424 strain in weaned piglets in crisis " 145
7.4.3.1. Bioproductive performance 145
7.4.3.1.1. Evolution of body weight and daily average gain 145
7.5. Results on the piglets microbiota in the weaning crisis 146
7.5.1. Results of fecal microbiota 146
7.5.2. Results on the gut microbiota 155
7.5.3. Evolution of intestinal pH in piglets during weaning crisis 159
7.6. The incidence of diarrhea in piglets in the weaning crisis with the addition of exogenous bacterial bioproducts 161
7.6.1. Experiment I 161
7.6.2. Experiment II 162
7.7. Experiment III:,, The effects of enzymatic preparations based on B. subtilis ATCC 6051a and B. licheniformis ATCC 21424 in the broiler chickens feed using more soybean 163
7.7.1. Bioproductive performance 163
7.7.1.1. Evolution of body weight and daily average gain 163
7.7.1.2. Evolution of daily average consumption and specific consumption 167
7.7.1.3. Chicken broiler microbiota 168
7.7.1.3.1. The fecal microbiota 168
7.7.1.3.2. Microbiota from intestinal content 169
7.7.1.3.3. Evolution of intestinal pH 171
7.8. Experiment IV: ,, The effects of enzymatic preparations based on B. subtilis ATCC 6051a and B. licheniformis ATCC 21424 in the broiler chickens feed using more faba bean ”. 172
7.8.1. Bioproductive performance 172
7.8.1.1. Evolution of body weight and daily average gain 172
7.8.1.2. Evolution of daily average consumption and specific consumption 174
7.8.1.3. Microbiota puilor broiler de găină 176
7.8.1.3.1. The fecal microbiota 176
7.8.1.3.2. Microbiota from intestinal content 177
7.8.1.3.3. Evolution of intestinal pH 180
7.9. Experiment V: ,, The effects of a bacterial polyculture based on Lactobacillus sp. in powder form in broiler chickens feed using energy-protein sources. 180
7.9.1. Bioproductive performance 180
7.9.1.1. Evolution of body weight and daily average gain 180
7.9.1.2. Evolution of daily average consumption and specific consumption 183
7.9.1.3. Microbiota puilor broiler de găină 185
7.9.1.3.1. The fecal microbiota 185
7.9.1.3.2. Microbiota from intestinal content 186
7.9.1.3.3. Evolution of intestinal pH 188
CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS 190
BIBLIOGRAPHY 196
Webography 207
Annex I 208
Annex II 221
LIST OF PUBLICATIONS 231
REZUMAT
CERCETĂRI PRIVIND OBȚINEREA PREPARATELOR ENZIMATICE EXOGENE ȘI EFECTELE UTILIZĂRII ACESTORA ÎN HRANA MONOGASTRICELOR
Doctorand: DINU G. (DUMITRU) Mihaela
Conducător științific: Prof. univ. Dr. JURCOANE Ștefana
CUVINTE CHEIE: preparat enzimatic exogen, activitate enzimatică,
monogastrice, parametrii zootehnici, microbiotă
Teza de doctorat este structurată în două părți (studiu bibliografic și cercetări proprii), alcătuite din rezumatul tezei, cuprins, introducere, 7 capitole ce conțin 69 tabele, 44 figuri și 45 imagini proprii, iar bibliografia cuprinde 180 titluri.
PARTEA I, STUDIU BIBLIOGRAFIC cuprinde trei Capitole, structurate astfel:
CAPITOLUL I – INTRODUCERE ÎN LUMEA BIOTEHNOLOGIEI în care se prezintă importanța biotehnologiei ca știință, evoluția și impactul socio-economic al acesteia, cu descrierea noțiunii de enzimă, a structurii și clasificării acestora, cu accent deosebit asupra rolului ocupat de microorganisme, în vederea obținerii de biopreparate enzimatice exogene și administrare ulterioară în hrana monogastricelor (purcei în criză de înțărcare și pui broiler de găină).
CAPITOLUL II – IMPORTANȚA PREPARATELOR ENZIMATICE ÎN HRANA MONOGASTRICELOR, în care sunt descrise aspecte legate de utilizarea enzimelor ca aditivi furajeri și efectele produse de acestea în nutriția animalelor tinere al cărui sistem enzimatic este insuficient dezvoltat.
CAPITOLUL III– STUDII EFECTUATE IN ROMÂNIA, PRIVIND UTILIZAREA ENZIMELOR EXOGENE ÎN HRANA MONOGASTRICELOR, în care sunt descrise rezultatele obținute in vivo cu adaos de biopreparat enzimatic în hrană, prin precizarea efectelor pozitive/negative asupra parametrilor zootehnici.
PARTEA a-II a, CERCETĂRI PROPRII, cuprinde patru capitole care reliefează scopul tezei de doctorat, materiale și metode utilizate pentru atingerea obiectivelor, rezultate obținute și discuții desprinse în urma cercetărilor efectuate prin comparare cu date din literatura de specialitate. Concluziile generale, recomandările și perspectivele privind obținerea și utilizarea preparatelor enzimatice în hrana monogastricelor sunt de asemenea, exemplificate.
CAPITOLUL IV – SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR. În cadrul acestei teze de doctorat, am luat în studiu elaborarea unor biopreparate bacteriene cu rol enzimatic și probiotic cu aplicabilitate de preferință în hrana monogastricelor (purcei în criza de înțărcare, 30±3 zile și pui broiler de găină, o zi), ce pot constitui o alternativă la antibiotice, în vederea îmbunătățirii parametrilor zootehnici, cât și a stării de sănătate cu acțiune benefică asupra microbiotei gastrointestinale (cecum și ileon), precum și a florei din dejecții.
CAPITOLUL IV – MATERIALE ȘI METODE, în cadrul căruia sunt descrise materialul biologic și tehnologia de exploatare și desfășurare a testelor in vivo, compoziția chimică și valoarea nutritivă a materiilor prime din componența rețetelor, precum și structura de nutrețuri combinate corespunzătoare experimentelor derulate, metodele de analiză utilizate (chimice, microbiologice, parametri zootehnici) în vederea îndeplinirii obiectivelor propuse.
CAPITOLUL V – CERCETĂRI IN VITRO PRIVIND CARACTERIZAREA UNOR TULPINI BACTERIENE ÎN VEDEREA UTILIZĂRII ÎN HRANA MONOGASTRICELOR, în care sunt prezentate și caracterizate tulpinile bacteriene și procesul biotehnologic de obținere, prin evidențierea principalelor trăsături probiotice în scopul administrării ca aditiv furajer.
CAPITOLUL VI – METODE DE DETERMINARE A MICROBIOTEI LA MONOGASTRICE, în care sunt redate metodetele utilizate în vederea stabilirii microflorei din fecale și conținut intestinal (ileon și cecum) la monogastrice.
CAPITOLUL VII – REZULTATE ȘI DISCUȚII, în care sunt redate atât rezultatele cercetărilor in vitro asupra tulpinilor bacteriene de Bacillus sp. și Lactobacillus sp. în vederea administrării în hrana monogastricelor, precum și cercetările in vivo asupra animalelor menționațe. Pentru atingerea obiectivelor propuse, prezenta teză de doctorat cuprinde cinci experimente, după cum urmează:
EXPERIMENTUL I a avut ca principal obiectiv evaluarea efectului administrării unui preparat enzimatic pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a, în pondere diferite (1 și 3% v/w, 1,6 x 109 CFU/ml), asupra performanțelor tineretului suin. Experimentul s-a desfășurat pe un număr de 60 de purcei din rasa Topigs hibrid, înțărcați la 30 ± 3 zile, cu o greutate corporală de 8,41 kg. Purceii au fost repartizați aleatoriu în 3 loturi omogene: Lotul Martor M (NC), lotul experimental E1 (NC + BS 1%) și lotul experimental E2 (NC + BS 3%), distribuite în 6 spații de cazare. Durata experimentului a fost de 16 zile.
EXPERIMENTUL II a vizat efectul utilizării unui preparat enzimatic pe bază de Bacillus licheniformis ATCC 21424, în pondere diferite (1 și 3% v/w, 1,5 x 109 CFU/ml), asupra performanțelor tineretului suin. Experimentul s-a desfășurat pe un număr de 60 de purcei din rasa TOPIGS hibrid, cu vârsta de 30 ± 3 zile, la o greutate medie inițială de 8,51 Kg. Purceii au fost repartizați aleatoriu în 3 loturi omogene: Lotul Martor M (NC), lotul experimental E3 (NC + BL 1%) și lotul experimental E4 (NC + BL 3%), distribuite în 6 spații de cazare. Durata experimentului a fost de 16 zile.
EXPERIMENTUL III a urmărit efectele utilizării unor biopreparate pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină, utilizând în nutrețul combinat șrot de soia. Doza de administrare a fost de 5 ml/kg furaj, cu o concentrație de 1 x 1011 UFC/ml. Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 300 de pui broiler de găină din hibridul Ross 308, repartizați în 3 loturi omogene: lotul martor E (NC + șrot de soia), lotul experimental E1 (NC + șrot de soia + BS) și lotul experimental E2 (NC + șrot de soia + BL), pe o perioadă de 42 zile. Rețeta de NC a fost formulată pe bază de porumb, șrot de soia, gluten de porumb, fiind energo-proteică, iar procentul de includere a șrotului de soia în structura NC a fost de 33,10% în faza de start, 31,56% în faza de creștere și 25,10% în faza de finisare.
EXPERIMENTUL IV a urmărit efectele utilizării unor biopreparate pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler, utilizând în nutrețul combinat fasoliță ca resursă proteică locală. Doza de administrare a fost de 5 ml/kg furaj, cu o concentrație de 1 x 1011 UFC/ml. Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 300 de pui broiler de găină din hibridul Ross 308, repartizați în 3 loturi omogene: lotul martor F (NC + fasoliță), lotul experimental F+BS (NC + fasoliță + BS) și lotul experimental F+BL (NC + fasoliță + BL), pe o perioadă de 42 zile. Rețeta de NC a fost formulată pe bază de porumb, fasoliță, gluten de porumb, fiind energo-proteică, conform recomandărilor nutriționale ale hibridului. Procentul de includere a fasoliței în structura NC a fost de 15%.
EXPERIMENTUL V a vizat efectul administrării unei produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. (LS: Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41) obținut sub formă de pulbere prin procesul de atomizare, spre a fi utilizat în hrana puilor broiler de găină. Doza de administrare a fost de 1 gram/kg furaj, cu o concentrație de 1,62 x 108 UFC/gram. Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 400 de pui broiler din hibridul Ross 308, repartizați în 4 loturi omogene: 2 loturi pentru NC + cu șrot de soia (martor E și E+LS) și 2 loturi pentru NC + cu fasoliță (martor F și F+LS), pe o perioadă de 35 zile.
Toatele cele cinci testări in vivo s-au derulat în Biobaza experimentală din cadrul IBNA-Balotești.
CONCLUZII GENERALE
Ponderea de includere a tulpinilor bacteriene în structura recepturilor de nutrețuri combinate destinate purceilor în criza de înțărcare (30±3 zile), respectiv BS 1 și 3% (1,6 x 109 UFC/ml) și BL 1 și 3% (1,5 x 109 UFC/ml), a permis optimizarea parametrilor zootehnici.
Adaosul de BS – 1% vs. BS – 3% a îmbunătățit greutatea corporală a purceilor în criza de înțărcare în prima și ultima săptămână de viață, însă valorile sunt nesemnificative (P>0,05).
Consumul mediu zilnic de furaj/cap a fost mai mai mare în lotul M față de lotul E1 – BS–1%. Conversia hranei a fost de 1,22 ori mai mare în lotul E1 – BS-1% vs. lotul M, respectiv de 1,05 mare mare vs. E2 – BS-3%.
Rezultatele obținute au demonstrat că adaosul de BL 3% în NC contribuie la îmbunătățirea greutății corporale la purcei în criza de înțărcare (46 zile ± 3 zile), însă valorile sunt nesemnificative (P˂0,05). Lotul E4-BL–3% este de 1,06 ori mai mare vs. lotul E3 – BL–1%, respectiv cu 1,8% mai mare față de lotul M.
Suplimentarea hranei la purcei pe durata celor 16 zile, cu biopreparate bacteriene enzimatice a contribuit la diminuarea încărcăturii microbiene din fecale și conținut intestinal, însă rezultatele obținute sunt nesemnificative (P<0,05).
Suplimentarea NC cu BS 1% a contribuit la scăderea incidenței diareice, însă începând cu cea de-a doua săptămână, s-a instaurat prezența de E. coli biotipul β-hemolitic, purceii fiind afectați, dezechilibrele gastrointestinale fiind omniprezente.
NC + BL 3% îmbunătățește microbiota la nivel de ileon cu 14,34% și cu 2,71% în cecum, reduce frecvența enteritelor cu 44% și reduce scorul fecal grad 3 de 6 ori.
Includerea tulpinilor de BS și BL în hrana puilor broiler de găină a influențat semnificativ parametrii bioproductivi (greutate corporală, spor în greutate, consum specific), microbiota intestinală la nivel de cecum și ileon, microflora din fecale, precum și evoluția pH-ului intestinal cu și fără adaos de biopreparat bacterian.
In ceea ce privește consumul specific, în Experimentul III, acesta s-a redus cu 2,28% la lotul E+BS, cât și la E+BL.
Din punct de vedere al acțiunii asupra microflorei din dejecții, la puii broiler de găină, adaosul de BS și BL a diminuat numărul bacteriilor patogene, astfel că E. coli la lotul E+BS a fost cu 1,81% mai redus vs. E; numărul de stafilococi a scăzut la loturile E+BS (cu 1,24%) și E+BL (cu 1,82%) vs. lotul E. In plus, utilizarea de BS și BL, a contribuit la diminuarea numărului de E. coli biotipul β-hemolitic, din conținutul intestinal, acesta fiind micșorat cu 30,47% la adaos de BS și cu 85,13% la adaos de BL.
Suplimentarea nutrețului combinat + fasoliță 15% cu BS și BL, a influențat pozitiv greutatea medie (lotul F+BL de 1,02 ori mai mare vs. lotul F și cu 4,26% mai mare față de F+BS), sporul mediu zilnic (F+BS cu 4,68% mai mare vs. lotul F, iar F+BL cu 6,96% vs. lotul F), consumul mediu zilnic de furaj, consumul specific (5,17% mai redus la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce F+BL a fost cu 9,58% mai mic).
Includerea biopreparatelor bacteriene pe bază de BS și BL a determinat o reducere asupra florei patogene (E. coli, la loturile F+BS și F+BL s-a micșorat cu 0,35% față de lotul F, ceea ce confirmă că speciile de Bacillus sp. pot reprezenta un factor inhibitor, adaosul de BS a scăzut numărul de clostridii cu 0,36% vs. lotul F), fiind, totodată, un plus asupra numărului de Lactobacillus sp. (+ 0,19% la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce lotul F+BL a fost cu 0,29% vs. F).
In Experimentul V, obținerea și includerea ulterioară a probioticului pe bază de Lactobacillus sp. în hrana puilor broiler de găină, nu a influențat semnificativ (P>0,05) greutatea corporală, sporul mediu zilnic, consumul mediu zilnic de furaj sau consumul specific pe toate fazele de creștere, cât și per total perioadă.
In ceea ce privește analiza dejecțiilor de la finalul experimentului, precum și microbiota intestinală, în cazul administrării probioticului LS, la nivel de ileon, au fost remarcate influențe pozitive asupra numărului de lactobacili atât la lotul cu soia, cât și la lotul F+LS (cu 5,36% vs. lotul F), explicația constând în faptul că doza administrată (LS – 1,62 x 108 UFC/ml) ingerată odată cu hrana a acționat eficient prin adaos în furaj. In dejecții, suplimentarea cu biopreparat de LS a contribuit la reducerea semnificativă (P≤0,05) a numărului de E. coli, de stafilococi și a coloniilor de clostridii din conținutul intestinal.
RECOMANDĂRI
În vederea îmbunătățirii parametrilor zootehnici la monogastrice (purcei în criza de înțărcare și pui broiler de găină), respectiv a microbiotei intestinale și a florei din dejecții, propunem următoarele recomandări:
Introducerea tulpinilor bacteriene în structura recepturilor de nutrețuri combinate destinate purceilor în criza de înțărcare (30±3 zile), respectiv BS 1 și 3% (1,6 x 109 UFC/ml) și BL 1 și 3% (1,5 x 109 UFC/ml), a permis optimizarea parametrilor zootehnici.
Suplimentarea NC cu BS 1% a contribuit la scăderea incidenței diareice, însă începând cu cea de-a doua săptămână de experiment, s-a instaurat prezența de E. coli biotipul β-hemolitic, purceii fiind afectați, dezechilibrele gastrointestinale fiind omniprezente.
Nutrețul combinat cu adaos de BL 3% îmbunătățește microbiota la nivel de ileon cu 14,34%, respectiv cu 2,71% în cecum, reduce frecvența enteritelor cu 44% și reduce scorul fecal grad 3 de 6 ori.
Introducerea biopreparatelor bacteriene pe bază de BS și BL în hrana puilor broiler de găină în formula de nutreț combinat contribuie la îmbunătățirea parametrilor zootehnici și a statusului de sănătate.
Adaosul de probiotic pe bază de LS în rețetele de NC energo-proteice optimizează microbiota și flora digestivă a puilor broiler de găină.
PERSPECTIVE
Din cercetările efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat se desprind noi direcții de cercetare în scopul clarificării anumitor aspecte insuficient studiate, prin dezvoltarea unor oportunități de cercetare, precum procentul de includere al biopreparatelor bacteriene cu rol enzimatic și probiotic în hrana monogastricelor în vederea valorificării și optimizării statusului animal și a parametrilor zootehnici.
SUMMARY
RESEARCH ON OBTAINING OF EXOGENOUS ENZYMATIC PREPARATIONS AND THE EFFECTS OF USING IN
MONOGASTRIC FEED
PhD-student: Eng. DINU G. (DUMITRU) Mihaela
Scientific coordinateur: Professor univ. Dr. JURCOANE Ștefana
KEYWORDS: exogenous enzymatic preparation, enzymatic activity,
monogastric animals, zootechnical parameters, microbiota
The doctoral thesis is structured in two parts (bibliographic study and own researches), consisting of the abstract of the thesis, content, introduction, 7 chapters containing 69 tables, 44 figures and 45 own pictures, and the bibliography includes 180 titles.
PART I, BIBLIOGRAPHIC STUDY, comprises three chapters, structured as follows:
CHAPTER I – INTRODUCTION IN THE WORLD OF BIOTECHNOLOGY, in which is presented the importance of biotechnology as a science, its evolution and socio-economic impact, with the description of the notion of enzyme, its structure and their classification, with special role ocurred by microorganisms, in order to obtain exogenous enzymatic products for administration in monogastric feed (piglets in weaning crisis and broiler chickens).
CHAPTER II – THE IMPORTANCE OF ENZYMATIC PREPARATIONS IN MONOGASTRIC FEED, in which are described aspects of enzymes utilisation as feed additives and their effects in the nutrition of young animals whose enzymatic system is insufficiently developed.
CHAPTER III – STUDIES CARRIED OUT IN ROMANIA, CONCERNING THE USE OF EXOGENOUS ENZYMES IN MONOGASTRIC FEED, in which are presented the results obtained by in vivo tests with the addition of enzymatic biopreparation in animal feed, specifying the positive/negative effects on the zootechnical parameters.
PART II, OWN RESEARCH, consists of four chapters that highlight the purpose of the doctoral thesis, the materials and methods used to achieve the objectives, the results obtained and the discussions exposed by the researches carried out, in contrast with data from the literature. The general conclusions, the recommendations and the prospects for obtaining and using the enzymatic preparations in monogastric feed are also showed.
CHAPTER IV – PURPOSE AND OBJECTIVES OF THE RESEARCH ACTIVITIES. Within this PhD thesis, I have studied the development of some bacterial biopreparations with enzymatic and probiotic role, with special applicability in monogastric feed (piglets in weaning crisis, 30 ± 3 days and broiler chickens, one day), which can constitutes an alternative to antibiotics, in order to improve the zootechnical parameters, as well as the status health with beneficial act on the gastrointestinal microbiota (cecum and ileum content), as well on the faecal microflora.
CHAPTER IV – MATERIALS AND METHODS, in which are describing the biological material and the technology testing and exploitation for in vivo tests, the chemical composition and the nutritional value of the raw materials from the feed formula, the analysis methods used (chemical, microbiological, zootechnical parameters) in order to achieve the proposed objectives.
CHAPTER V – IN VITRO RESEARCH ON THE CHARACTERIZATION OF BACTERIAL STRAINS FOR USE IN MONOGASTRIC FEED, in which are presented and characterized the bacterial strains and the biotechnological process, by highlighting the main traits of probiotics, for used them as feed additive.
CHAPTER VI – METHODS OF DETERMINING THE MONOGASTRIC MICROBIOTA, in which are describing the methods used for determine the microflora from faeces and intestinal content (ileum and cecum) on monogastric animals.
CHAPTER VII – RESULTS AND DISCUSSIONS, in which are presented the in vitro research results of Bacillus sp. strains and Lactobacillus sp. for used in monogastric feed, as well as in vivo research. In order to achieve the proposed objectives, the present PhD thesis contains five experiments, as follows:
EXPERIMENT I had as main objective, the effects evaluation of an enzymatic product based on Bacillus subtilis ATCC 6051a (1 and 3% v/w, 1,6 x 109 CFU/ml/kg feed), on the performance’s piglets in the weaning crisis. The experiment was conducted on 60 piglets from Topigs hybrid, 30 ± 3 days, with a body weight of 8,41 kg. The piglets were randomly divided in 3 homogeneous groups: the control group (M), the Experimental group E1 (NC + BS 1%) and the Experimental group E2 (NC + BS 3%), distributed in 6 accommodation spaces, during 16 days.
EXPERIMENT II aimed the effects evaluation of an enzymatic product based on Bacillus licheniformis ATCC 21424 (1 and 3% v/w, 1,5 x 109 CFU/ml/kg feed), on the performance’s piglets. The experiment was conducted on 60 piglets from TOPIGS hybrid, 30 ± 3 days, with an average weight of 8,51 Kg. The piglets were randomly divided into 3 homogeneous groups: the Control group (M), the Experimental group E3 (NC + BL 1%) and the Experimental group E4 (NC + BL 3%), distributed in 6 accommodation spaces, during 16 days.
EXPERIMENT III presents the effects of using Bacillus subtilis ATCC 6051a and Bacillus licheniformis ATCC 21424 in the broiler chickens feed, using more soybean meal as row materials. The dose of administration was 5 ml/kg feed, in a concentration of 1 x 1011 CFU/ml. The experiment was conducted on 300 broiler chickens, from Ross 308 hybrid, divided into 3 homogeneous groups: Control group E (NC + soybean meal), Experimental group E1 (NC + soybean meal + BS) and Experimental group E2 (NC + soybean meal + BL), during 42 days. The feed was expressed based on corn, soybean meal, corn gluten, being energo-proteic, and the percentage of soybean meal included in the NC structure was 33,10% in the starting phase, 31,56 % in the growth and 25,10% in the finishing phase.
EXPERIMENT IV presents the effects of using some biopreparations based on Bacillus subtilis ATCC 6051a and Bacillus licheniformis ATCC 21424 in broiler chickens feed, using more faba bean (15%), as a local protein resource. The dose was 5 ml/kg feed, in a concentration of 1 x 1011 CFU/ml. The experiment was conducted on 300 broiler chickens, from Ross 308 hybrid, divided into 3 homogeneous groups: control group F (NC + faba bean), Experimental group F + BS (NC + faba bean + BS) and experimental group F + BL (NC + faba beans + BL), over a period of 42 days. The feed was based on corn, faba beans, corn gluten, being energo-proteic.
EXPERIMENT V aimed the effects of administration of a probiotic product based on Lactobacillus sp. (LS: Lactobacillus salivarius IBNA 33 and Lactobacillus salivarius IBNA 41) obtained in powder form by the atomization process, for using in broiler chickens feed. The dose of administration was 1 gram/kg feed, with a concentration of 1,62 x 108 CFU/grame.
All five in vivo tests were performed in the IBNA-Balotești Experimental biobase.
GENERAL CONCLUSIONS
The inclusion of bacterial strains in the piglets feed formula, in the weaning crisis (30 ± 3 days), respectively BS 1 and 3% (1,6 x 109 CFU/ml) and BL 1 and 3% (1,5 x 109 CFU/ml), allowed the optimization of the zootechnical parameters.
The addition of BS – 1% vs. BS – 3% improved the piglets body weight in the first and last week of life, but the values are insignificant (P>0,05).
The average daily feed intake was higher in the control group vs. E1 – BS – 1%. Feed conversion was 1,22 times higher in group E1 – BS-1% vs. group M, respectively 1,05 high vs. E2 – BS-3%.
The results showed that the addition of BL 3% in the feed, improves the piglets body weigh, but the values are insignificant (P˂0,05). The group E4-BL-3% is 1,06 times higher vs. group E3 – BL – 1%, respectively 1,8% higher vs. group M.
Supplementation the piglets feed, during 16 days, with the enzymatic bacterial products, contributed to a decrease of the pathogenic bacteria from faeces and intestinal content, but the data are insignificant (P <0,05).
Feed supplementation with BS 1% contributed to the decrease of the diarrheal incidence, but starting with the second week, the presence of E. coli β-hemolytic biotype, was established, the piglets were affected, the gastrointestinal imbalances being omnipresent.
E4 + BL 3% improves the microbiota from ileum content by 14,34%, respectively 2,71% in the cecum, diminishes the frequency of enteritis by 44% and reduces the 3 faecal score 6 times.
The inclusion of BS and BL strains in the broiler chickens feed influenced the bioproductive parameters (body weight, weight gain, feed conversion ratio), intestinal microbiota (cecum and ileum content), faecal microflora, as well the evolution of intestinal pH.
Regarding the feed conversion ratio, in Experiment III, it was reduced by 2,28% in the group E + BS, as well in E + BL.
In the broiler chickens, the addition of BS and BL decreased the number of pathogenic bacteria, so that E. coli in the E + BS group was 1,81% lower vs. E; the number of staphylococci was lower in groups E + BS (by 1,24%) and E + BL (by 1,82%) vs. group E. In addition, the use of BS and BL, contributed to the decrease of the E. coli biotype β-hemolytic, from the intestinal content (-30.47% with BS, respectiveli – 85,13% with BL).
Supplementation the feed formula (+ faba beans 15%) with BS and BL, positively influenced the average body weight (F + BL 1,02 higher vs. F group and 4,26% higher vs. F + BS), the average daily gain (F + BS 4,68% higher vs. group F, and F + BL 6.96% vs. group F), average daily feed consumption, feed conversion ratio (F + BS lower to 5,17% vs. group F, while F + BL was 9,58% lower).
The inclusion of bacterial products based on BS and BL determine a reduction on pathogenic flora (E. coli, in groups F + BS and F + BL decreased by 0,35% vs. F, approving that Bacillus spp. can be an inhibitory factor, the addition of BS decreased the number of clostridia by 0,36% vs. group F), being also an increase over the number of Lactobacillus sp. (+ 0,19% in group F + BS vs. group F, while group F + BL was 0,29% vs. F).
In Experiment V, obtaining and subsequent inclusion of the probiotic based on Lactobacillus sp. in the broiler chickens feed, did not significantly influence (P>0,05) the body weight, weight gain, the average daily feed consumption or the specific consumption on all the growth phases, as well on the total period.
Regarding the faeces analysis and the intestinal microbiota, at addition of LS, were observed positive results at the ileum level, on the number of lactobacilli, the explanation being that the dose used (LS – 1,62 x 108 CFU/ml) and ingested acted effectively by adding in the feed. In faces samples, supplementation with LS decrease significantly (P≤0,05) the E. coli and the staphylococci number and, also, the clostridia number from intestinal contents.
RECOMMENDATIONS
To improve the zootechnical parameters of monogastric (piglets in the weaning crisis and broiler chickens), respectively of the intestinal microbiota and the faecal microflora, we propose the following recommendations:
Introduction of bacterial strains in the feed formula intended for piglets in the weaning crisis (30 ± 3 days), respectively BS 1 and 3% (1,6 x 109 CFU/ml) and BL 1 and 3% (1,5 x 109 CFU/ml), allowed the optimization of the zootechnical parameters.
Supplementation of feed with BS 1% contributed to the decrease of the diarrheal incidence, but starting with the second week of experiment, the presence of E. coli the β-hemolytic biotype was established, the piglets being affected, the gastrointestinal imbalances being omnipresent.
The feed with BL 3% improves the microbiota from ileum level by 14,34%, respectively by 2,71% in cecum, diminishes the frequency of enteritis by 44% and reduces the fecal score grade 3, 6 times.
The introduction of bacterial products based on BS and BL into the broiler chickens feed contributes to the improvement of the zootechnical parameters and health status.
The addition of LS-based probiotic in the feed improves the microbiota and digestive flora of broilers chickens.
PERSPECTIVES
From the research carried out within the present PhD thesis, new research directions are emerging in order to clarify certain insufficiently studied aspects, by developing research opportunities, such the percentage of inclusion of bacterial products with enzymatic and probiotic traits in monogastric feed, for valorization and optimization the health animal status and zootechnical parameters.
RÉSUMÉ
LES RECHERCHES SUR L’OBTENTION DE PRÉPARATION D’ENZYMES EXOGÉNES ET LEUR EFFECTS UTILISATION DANS LA NUTRITION MONOGASTRIQUE
Doctorant: DINU G. (DUMITRU) Mihaela
Coordinateur scientifique: Prof. univ. Dr. JURCOANE Ștefana
MOTS-CLÉS: préparation enzymatique exogène, activité enzymatique, paramètres des animaux monogastriques, zootechniques, micro-biote
La thèse de doctorat est structurée en deux parties (étude bibliographique et travaux de recherches propres), composées du résumé de la thèse, du contenu, de l'introduction, de 7 chapitres contenant 69 tableaux, 44 figures et 45 images des résultats obtenus et la bibliographie qui elle comprend 180 titres consultés.
PREMIERE PARTIE – L’ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE comprend trois chapitres, structurés comme suit :
CHAPITRE I – INTRODUCTION AU MONDE DE LA BIOTECHNOLOGIE
Ce chapitre présente l’importance de la biotechnologie en tant que science, son évolution et son impact socio-économique, avec la description de la notion d’enzyme, sa structure et sa classification, avec un accent particulier mis sur le rôle joué par les microorganismes, bio-préparations enzymatiques exogènes et administration ultérieure dans l’alimentation des animaux monogastriques (porcelets en crise de sevrage et poulets de chair).
CHAPITRE II – L’IMPORTANCE DES PRÉPARATIONS ENZYMATIQUES POUR LA NUTRITION DES ANIMAUX MONOGASTRIQUES
Dans ce chapitre sont décrits des aspects liés à l’utilisation d’enzymes comme additifs alimentaires et à leurs effets sur la nutrition de jeunes animaux dont le système enzymatique est insuffisamment développé.
CHAPITRE III – ÉTUDES EFFECTUÉES EN ROUMANIE CONCERNANT L’UTILISATION D’ENZYMES EXOGÈNES POUR LA NUTRITION DES ANIMAUX MONOGASTRIQUES
Dans ce chapitre sont décrits les résultats obtenus in vivo avec l’ajout des bio-préparations enzymatique dans les aliments, en précisant les effets positifs/négatifs sur les paramètres zootechniques.
DEUXIEME PARTIE- RESULTATS OBTENUS
Cette partie comprend quatre chapitres qui mettent en évidence le but de la thèse de doctorat, le matériel et les méthodes utilisés pour atteindre les objectifs, les résultats obtenus et les discussions découlant des travaux de recherche menés dans le cadre de cette thèse en comparaison avec les données de l’état de l’art. Les conclusions générales, les recommandations et les perspectives d’obtention et d’utilisation de préparations enzymatiques dans l’alimentation des animaux monogastriques sont également illustrées.
CHAPITRE IV – OBJET ET OBJECTIFS DE LA RECHERCHE
Dans cette thèse de doctorat, nous avons étudié l’élaboration de bio-préparations bactériennes à rôle enzymatique et probiotique, à applicabilité préférentielle dans l’alimentation des animaux monogastriques (porcelets en crise de sevrage, 30 ± 3 jours et poulets de chair, un jour), pouvant constituer une alternative aux antibiotiques, afin d'améliorer les paramètres zootechniques, ainsi que l'état de santé ayant une action bénéfique sur le micro-biote gastro-intestinal (caecum et iléon), ainsi que de la flore fécale.
CHAPITRE IV – MATÉRIAUX ET MÉTHODES
Ce chapitre décrit le matériel biologique et la technologie de test et d’exploitation in vivo, la composition chimique et la valeur nutritionnelle des matières premières issues de la composition des recettes, ainsi que la structure des aliments combinés correspondant aux expériences effectuées, les méthodes d’analyse utilisés (paramètres chimiques, microbiologiques, zootechniques) pour atteindre les objectifs proposés.
CHAPITRE V – RECHERCHE IN VITRO SUR LA CARACTÉRISATION DES ESPECES BACTÉRIENNES DESTINÉES À ÊTRE UTILISÉE DANS L’ALIMENTATION DES ANIMAUX MONOGASTRIQUES
Dans ce chapitre sont présentés et caractérisés les espèces bactériennes et le processus biotechnologique de leur obtention, en soulignant les principales caractéristiques des probiotiques.
CHAPITRE VI – MÉTHODES DE DÉTERMINATION DU MICROBIOTE POUR LES ANIMAUX MONOGASTRIQUES.
Ce chapitre décrit les méthodes utilisées pour déterminer la microflore dans les matières fécales et le contenu intestinal (iléon et caecum) chez l’animal monogastrique.
CHAPITRE VII – RÉSULTATS ET DISCUSSIONS, dans lequel les résultats de la recherche in vitro sur les souches bactériennes de Bacillus sp. et Lactobacillus sp. pour l'administration dans l'alimentation des animaux monogastriques, ainsi que pour la recherche in vivo sur les animaux mentionnés. Afin de réaliser les objectifs proposés, dans le cadre de cette thèse de doctorat, cinq expériences ont été réalisés, décrites ci-après :
EXPÉRIENCE I avait pour objectif principal d’évaluer l’effet de l’administration d’une préparation enzymatique à base de Bacillus subtilis ATCC 6051a (BS), en poids différent (1 et 3% v/w, 1,6 x 109 UFC/ml), sur les performances du jeune porc. L'expérience a été menée sur un certain nombre de 60 porcelets de la race hybride Topigs, sevrés à 30 ± 3 jours et pesant 8,41 kg. Les porcelets ont été divisés au hasard en 3 groupes homogènes: le groupe témoin M (NC), le groupe expérimental E1 (NC + BS 1%) et le groupe expérimental E2 (NC + BS 3%), répartis dans 6 espaces de logement. La durée de l'expérience était de 16 jours.
L’EXPERIENCE II visait l’effet de l’utilisation d’une préparation enzymatique à base de Bacillus licheniformis ATCC 21424 (BL), de poids différents (1 et 3% v/w, 1,5 x 109 UFC/ml), sur les performances des jeunes porcs. L'expérience a été effectuée sur un nombre de 60 porcelets de la race hybride TOPIGS, âgés de 30 ± 3 jours, à un poids moyen initial de 8,51 kg. Les porcelets ont été divisés au hasard en 3 groupes homogènes: le groupe témoin M (NC), le groupe expérimental E3 (NC + BL 1%) et le groupe expérimental E4 (NC + BL 3%), répartis dans 6 espaces de logement. La durée de l'expérience était de 16 jours.
L'EXPÉRIENCE III a examiné les effets de l'utilisation de bio-préparations à base de Bacillus subtilis ATCC 6051a et de Bacillus licheniformis ATCC 21424 dans l'alimentation de poulets de chair, en utilisant le tourteau de soja combiné. La dose d'administration était de 5 ml / kg d'aliment, avec une concentration de 1 x 1011 UFC / ml. L’expérience a été menée sur un troupeau de 300 poulets de chair de la race hybride Ross 308, divisé en 3 groupes homogènes : le groupe témoin E (NC + tourteau de soja), le groupe expérimental E1 (NC + tourteau de soja + BS) et le groupe expérimental E2 (NC + soja + BL), sur une période de 42 jours. La recette NC a été formulée à base de maïs, de tourteau de soja, de gluten de maïs, constituant une protéine énergétique, et le pourcentage de tourteau de soja inclus dans la structure de CN était de 33,10% pendant la phase de démarrage, 31,56 % pendant la phase de croissance et 25,10% en phase de finalisation.
L'EXPÉRIENCE IV a examiné les effets de l'utilisation de bio-préparations à base de Bacillus subtilis ATCC 6051a et Bacillus licheniformis ATCC 21424 dans des aliments pour poulets de chair, en utilisant le fourrage combiné de haricots comme ressource protéique locale. La dose d'administration était de 5 ml/kg d'aliment, avec une concentration de 1 x 1011 UFC/ml. L’expérience a été menée sur un troupeau de 300 poulets de chair issus de la race hybride Ross 308, divisé en 3 groupes homogènes : le groupe témoin F (NC + haricot), le groupe expérimental F + BS (NC + haricot + BS) et le groupe expérimental F + BL (NC + haricot + BL), pour une période de 42 jours. La recette NC a été formulée à base de maïs, de haricots, de gluten de maïs, étant une protéine énergétique, conformément aux recommandations nutritionnelles de l'hybride. Le pourcentage d'inclusion de haricots dans la structure NC était de 15%.
L'EXPERIENCE V visait l'effet de l'administration d'un produit probiotique à base de Lactobacillus sp. (LS: Lactobacillus salivarius IBNA 33 et Lactobacillus salivarius IBNA 41) obtenus sous forme de poudre par atomisation, destinés à l'alimentation des poulets de chair. La dose d'administration était de 1 gramme/kg d'aliment, avec une concentration de 1,62 x 108 UFC/gramme. L’expérience a été menée sur un troupeau de 400 poulets de chair de la race hybride Ross 308, divisé en 4 groupes homogènes: 2 groupes pour NC + avec tourteau de soja (contrôle E et E + LS) et 2 groupes pour NC + avec haricot (contrôle F et F + LS), sur une période de 35 jours.
Les cinq tests in vivo ont été réalisés dans la bio-base expérimentale IBNA-Balotești.
CONCLUSIONS GÉNÉRALES
La pondération d’inclusion des souches bactériennes dans la structure des recettes d’aliments combinés destinée aux porcelets en crise de sevrage (30 ± 3 jours), respectivement BS 1 et 3% (1,6 x 109 UFC/ml) et BL 1 et 3% (1, 5 x 109 UFC/ml), a permis l’optimisation des paramètres zootechniques.
L'addition de BS – 1% vs. BS – 3% ont amélioré le poids corporel des porcelets lors de la crise de sevrage au cours de la première et de la dernière semaine de vie, mais les valeurs sont non significatives (P>0,05).
La consommation quotidienne moyenne d'aliments/tête était plus élevée dans le groupe témoin M par rapport au groupe E1 – BS – 1%. La conversion alimentaire était 1,22 fois plus élevée dans le groupe E1 – BS-1% vs. le groupe témoin M, respectivement de 1,05 fois plus élevée vs. le groupe E2 – BS-3%.
Les résultats ont montré que l’ajout de BL 3% dans la CN contribue à l’amélioration du poids corporel chez les porcelets en période de sevrage (46 jours ± 3 jours), mais que les valeurs sont insignifiantes (P≤0,05). Le groupe E4-BL-3% est 1,06 fois plus grand que le groupe E3 – BL – 1%, respectivement 1,8% plus élevé que le groupe témoin M.
Compléter l’alimentation des porcelets pendant 16 jours avec des bio-préparations bactériennes enzymatiques a contribué à la diminution de la charge microbienne de matières fécales et du contenu intestinal, mais les résultats obtenus sont insignifiants (P<0,05).
La supplémentation de NC avec BS 1% a contribué à la diminution de l'incidence des diarrhées, mais à partir de la deuxième semaine, la présence du biotype β-hémolytique de E. coli a été établie, les porcelets étant affectés, les déséquilibres gastro-intestinaux étant omniprésents.
NC + BL 3% améliore le micro-biote au niveau de l'iléon de 14,34% et de 2,71% dans le caecum, réduit la fréquence des entérites de 44% et réduit le score fécal de grade 3 de 6 fois.
L'inclusion de souches BS et BL dans l'alimentation des poulets à griller a eu une influence importante sur les paramètres bio-productifs (poids corporel, gain de poids, consommation spécifique), le microbiote intestinal au niveau du cæcum et de l'iléon, la flore fécale, ainsi que l'évolution du pH intestinal avec et sans addition des bio-préparations bactériennes.
En ce qui concerne la consommation spécifique, dans l'expérience III, elle a été réduite de 2,28% dans le groupe E + BS, ainsi que dans le groupe E + BL.
D’un point de vue de l’action sur la microflore des fèces, chez les poulets de chair, l’ajout de BS et de BL a réduit le nombre de bactéries pathogènes, de sorte que E. coli dans le groupe E + BS était inférieur de 1,81% par rapport au groupe E; le nombre de staphylocoques a diminué dans les groupes E + BS (de 1,24%) et E + BL (de 1,82%) par rapport au groupe E. En outre, l'utilisation de BS et de BL a contribué à la diminution du nombre de biotypes β-hémolytiques d'E. coli du contenu intestinal, celui-ci a été réduit de 30,47% par l’ajout de BS et de 85,13% par l’ajout de BL.
La supplémentation combinée du fourrage + haricots à 15% avec BS et BL a eu une influence positive sur le poids moyen (le groupe F + BL 1,02 fois plus grand que le groupe F et 4,26% plus élevé que le F + BS), l’augmentation moyenne journalière (F + BS 4,68% plus élevée par rapport au groupe F, et F + BL 6,96% par rapport au groupe F), consommation alimentaire quotidienne moyenne, consommation spécifique (diminution de 5,17% par lot) F + BS par rapport au groupe F, tandis que F + BL était inférieur de 9,58%).
L’inclusion de bio-préparations bactériennes à base de BS et de BL a entraîné une réduction de la flore pathogène (E. coli, dans les groupes F + BS et F + BL, a diminué de 0,35% par rapport au groupe F, confirmant que les espèces de Bacillus sp. peut représenter un facteur inhibiteur, l’addition de BS a diminué le nombre de Clostridia de 0,36% par rapport au groupe F), ce qui représente également une augmentation par rapport au nombre de Lactobacillus sp. (+ 0,19% dans le groupe F + BS par rapport au groupe F, tandis que le groupe F + BL était de +0,29% par rapport au groupe F).
Dans l'expérience V, obtention et inclusion ultérieure d'un probiotique à base de Lactobacillus sp. Dans l’alimentation des poulets de chair, il n’a pas eu d’influence significative (P>0,05) sur le poids vif, l’augmentation moyenne par jour, la consommation moyenne journalière d’aliments ou la consommation spécifique sur toutes les phases de croissance, ainsi que pour la période totale.
Concernant l'analyse du fumier à la fin de l'expérience, ainsi que du microbiote intestinal, dans le cas de l'administration probiotique de LS, au niveau de l'iléon, des influences positives sur le nombre de lactobacilles ont été observées à la fois dans le groupe soja et dans le groupe F + LS (avec 5,36% par rapport au groupe F), l'explication étant que la dose administrée (LS – 1,62 x 108 UFC/ml) ingérée avec l'aliment a bien agi en l'ajoutant à l'aliment. Dans le fumier, une supplémentation avec LS bio-préparation a contribué à la réduction significative (P≤0,05) du nombre de colonies de E. coli, de staphylocoques et de Clostridia dans le contenu intestinal.
RECOMMANDATIONS
Afin d'améliorer les paramètres zootechniques chez les animaux monogastriques (porcelets en crise de sevrage et poulets de chair), respectivement du microbiote intestinal et de la flore fécale, nous proposons les recommandations suivantes:
L’introduction de souches bactériennes dans la structure des recettes d’aliments combinés destinées aux porcelets en crise de sevrage (30 ± 3 jours), respectivement BS 1 et 3% (1,6 x 109 UFC/ml) et BL 1 et 3% (1,5 109 UFC/ml), a permis l'optimisation des paramètres zootechniques.
La supplémentation en fourrage avec 1% de BS a contribué à la diminution de l'incidence des diarrhées, mais à partir de la deuxième semaine de l'expérience, la présence du biotype β-hémolytique de E. coli a été établie, les porcelets étant affectés, les déséquilibres gastro-intestinaux étant omniprésents.
Le fourrage combiné à l'ajout de BL 3% améliore le microbiote au niveau de l'iléon de 14,34%, respectivement de 2,71% dans le caecum, réduit la fréquence des entérites de 44% et réduit le score fécal de grade 3 à 6 fois.
L'introduction de bio-préparations bactériennes à base de BS et de BL dans l'alimentation des poulets de chair dans la formule d'aliments combinés contribue à améliorer les paramètres zootechniques et l'état de santé.
L'ajout de probiotiques à base de LS dans les recettes de fourrage à base de protéines énergétiques optimise le microbiote et la flore digestive des poulets de chair.
PERSPECTIVES
Les recherches menées dans le cadre de la présente thèse de doctorat ouvrent de nouvelles pistes de recherche qui permettent de clarifier certains aspects insuffisamment étudiés, en développant des opportunités de recherche, telles que le pourcentage d’inclusion de bio-préparations bactériens à rôle enzymatique et probiotique dans l’alimentation des animaux monogastriques à des fins de valorisation et d’optimisation du bien-être de l'animal et des paramètres zootechniques.
INTRODUCERE
Creșterea continuă a consumului de produse de origine animală a orientat cercetarea în sectorul zootehnic, spre găsirea unor modalități de satisfacere a cerințelor de pe piață, iar hrănirea animalelor constituie o componentă esențială în lanțul alimentar.
In acest domeniu, trebuie să se respecte și să se aplice Normele Europene cu privire la protecția mediului înconjurător, asigurarea unor condiții confortabile animalelor și îndeplinirea cerințelor consumatorului. Accentul în nutriția animală se pune pe înțelegerea mecanismelor și a corelațiilor între nutrienți, pe căi de îmbunătățire a biodisponibilității substanțelor nutritive cu impact pozitiv asupra mediului, și nu în ultimul rând pe posibilitățile de îmbunătățire a ratei de creștere la animale, relația cu sănătatea și calitatea produselor.
Nutriția animală poate fi definită ca ,,știința care se ocupă cu studiul schimburilor nutritive dintre organism și mediu, a transformării substanțelor absorbite în substanțe proprii organismului, precum și folosirea acestora pentru întreținere și realizarea producțiilor” (Pop și col., 2006a).
Intervenția prin alimentație pentru prevenirea îmbolnăvirilor prin suplimentarea nutrețurilor, a devenit un aspect foarte cercetat. Fermierii și nutriționiștii au constatat că sănătatea maternă, starea fiziologică și homeostazia animalului influențează sănătatea și performanța descendenților (Kogan și Kocher, 2007).
Organismul animal nu prezintă capacitate de degradare completă a substanțelor nutritive din hrană, o parte dintre acestea fiind eliminate în mediu, prin dejecții. Cantitățile mari de dejecții pot conduce la contaminarea mediului (apă, sol), fenomen urmat de acumularea excesivă de elemente minerale în sol (fosfor, potasiu, dioxid de carbon, metan, amoniac, compuși cu azot nitrați / nitriți și oxidul de azot) și afectarea pânzei freatice (Lyons și Jacques, 2004).
In ceea ce privește administrarea furajelor la animale, hrana este compusă din proteină, amidon, grăsime și fibră. La animalele monogastrice, componenta fibră a fost considerată a fi ,,risipită”, iar în unele situații componentele numite polizaharide neamidonoase (NSP) greu digerabile, ce derivă din grâu, orz și secară, pot exercita o activitate antinutritivă asupra animalului (50 g/kg). Conținutul cerealelor în NSP variază de la 0,4% în orez, la 37% în tărâțele de grâu (Morgan și Bedford, 1995).
NSP din cereale măresc vâscozitatea conținutului intestinal la suine, reducând digestibilitatea și absorbția substanțelor nutritive; polizaharidele neamidonoase pot fi neutralizate prin adaos de enzimne exogene (Scripnic, 2003).
In 1996, Charlton, susținea că majoritatea ingredientelor din rațiile monogastricelor conțin factori antinutriționali (ANF), iar valoarea productivă a ingredientelor furajere este limitată de conținutul de fibră, dar și de faptul că o anumită cantitate de proteină și amidon trece în intestinul subțire într-o structură complexă, greu digerabilă. Acesta menționează că prezența pentozanilor în grâu, a glucanilor în orz, a oligozaharidelor în soia și a fitaților din toate ingredientele de origine vegetală, contribuie la limitarea digestibilității energiei, a proteinei sau a fosforului din compoziția nutrițională furajeră.
Un an mai târziu, Leeson și Summers au demonstrat că factorii antinutriționali nu conduc, doar la reducerea disponibilității nutrienților din ingredientul utilizat în furaj, ci afectează disponibilitatea nutrienților din rația completă.
Biotehnologia, domeniul utilizat în zootehnie trebuie să găsească alternative naturale de nutriție a animalelor, pentru îmbunătățirea calității furajelor însilozate. Introducera enzimelor exogene sau a complexelor enzimatice ca aditivi furajeri în hrana animală ar putea fi o alternativă cu implicații majore asupra degradării nutrienților și transformării ulterioare a acestora în compuși simpli, ușor asimilabili de către organismul animal (Lyons, 2004).
Enzimele sunt proteine sau proteide fără de care celulele vii nu pot realiza reacții complexe într-un timp scurt, la temperatura mediului înconjurător. Enzimele se întâlnesc în toate organismele vii, de la organismele unicelulare până la cele superior organizate, inclusiv organismul uman, fiind responsabile de toate procesele metabolice care au loc în organism, pentru menținerea vieții: descompunerea substanțelor complexe, sinteza substanțelor cu rol plastic și funcțional, furnizare de energie (Arnaud și col., 1993). Adaosul de enzime ca aditiv furajer, prezintă un rol neutralizant asupra polizaharidelor neamidonoase care poate contribui la îmbunătățirea eficientizării hranei, a calității gunoiului de grajd și al utilizării ingredientelor furajere, la costuri cât mai reduse. Acestea mediază degradarea sau distrugerea substanțelor antinutritive, ce se regăsesc în alimentele cu efecte nocive în digestia și sănătatea animală, contribuie la îmbunătățirea digestibilității nutrețului și a disponibilității nutrienților pentru gazdă, prin completarea echipamentului enzimatic la un tract digestiv imatur (animalele tinere) (Beckers și Piron, 2009) (ex: suplimentarea cu proteaze). Toate aceste aspecte pot influența și echilibra microbiota florei intestinale, ocupând un rol foarte important în homeostaza tractului gastrointestinal la purcei (Ferket, 2003).
Monogastricele produc numai enzime capabile să hidrolizeze carbohidrații amidonici cu legături alfa. Ele nu secretă enzime specifice pentru carbohidrații cu legături beta, care pot descompune NSP în mono- și dizaharide digestibile. Nedigerarea polizaharidelor neamidonoase conduc la procese fermentative și formare de gaze și acizi grași volatili, care nu sunt benefici animalului (Hăbeanu și col., 2009).
În ceea ce privește producția endogenă de enzime, se cunoaște că activitatea pancreatică nu este suficient de eficientă pentru a asigura o biodisponibilitate sporită a substanțelor nutritive, ceea ce justifică administrarea enzimelor exogene ca un aport în completarea producției de enzime endogene.
În acest context, biotehnologiile pot reprezenta o contribuție însemnată la valorificarea superioară a resurselor furajere și implicit la diminuarea deficitului de hrană existent, acestea constituind o mare speranță pentru viitorul omenirii.
PARTEA I: STUDIU BIBLIOGRAFIC
SECTION I: BIBLIOGRAPHIC STUDY
CAPITOLUL I. INTRODUCERE ÎN LUMEA BIOTEHNOLOGIEI
Ce este biotehnologia?
Descoperirile spectaculoase din domeniile biologiei, biochimiei, microbiologiei, geneticii, enzimologiei, precum și necesitatea aplicării acestor cunoștințe în practică au condus la apariția unei științe noi denumită generic “biotehnologie”.
Cuvântul biotehnologie este format din doi termeni: „bio” (viață) și „technos” (metodologie care se ocupă cu studiul tehnic al utilajelor, mașinilor, materialelor). Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biotehnologic”, după cum în chimie este „procesul chimic”.
Cuvântul biotehnologie a fost utilizat pentru prima dată în anul 1919, în Ungaria, de către Karl Ereky (1878-1952) care descrie procesele de transformare a materiei prime în produse utile (ex.: în fermele industriale) (www.f.waseda.jp). Utilizarea acestui termen la nivel științific s-a realizat de cercetătorul Meischer, în analizarea ADN-ului din nucleul celulelor (Samani și col., 2011).
Biotehnologia constă în utilizarea bacteriilor, levurilor, celulelor vegetale și animale, a căror metabolism și capacitate de biosinteză sunt orientate către obținerea de produse inovative esențiale pentru viață.
Dintre toate definițiile biotehnologiei, Federația Europeană de Biologie (1978), a subliniat cel mai bine caracteristicile acestui domeniu de activitate: „utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei și ingineriei în scopul obținerii unei aplicații tehnologice (industriale), cu ajutorul microorganismelor, culturilor de celule și a părților componente a acestora”. Simplificând, putem afirma că biotehnologia presupune „utilizarea organismelor sau a produselor derivate de la acestea în scopuri comerciale” (Jurcoane și col., 2009).
1.1.2. Dezvoltarea biotehnologiei ca știință
Biotehnologia s-a dezvoltat de-a lungul anilor, încă de pe vremea Babilonului și al Egiptului antic (Samani și col., 2011). Locuitorii acestor comunități au găsit modalități pentru producerea de alimente (pâine, vin, drojdii, sos de soia etc.) și băuturi, fără a realiza că activitățile lor sunt de fapt, o direcție către lumea biotehnologiei (Durant și col., 1998).
Informațiile despre biotehnologie au luat o mare amploare, utilizarea acesteia fiind benefică în găsirea unor soluții asupra prelungirii termenului de valabilitate al produselor agricole, îmbunătățirii calității produselor alimentare și al băuturilor (Noorzihan, 2007, citat de Samani și col., 2011).
In perioada 1982-1986, s-a desfășurat primul program european comunitar numit ,,Biomolecular Engineering Programme” (BEP), care prevedea aplicații ale ingineriei genetice și enzimatice în agricultură și agroindustrie. Mai târziu (1986-1989), se continuă programul BEP cu un alt proiect, intitulat ,,Biotechnology Action Programme” (BAP) (Pop, 1997). In 2004, Parveez susține că biotehnologia ca metodă convențională, reprezintă un proces ce utilizează bacterii și ciuperci, fără o cunoaștere prealabilă a genelor (Samani, 2011).
Din punct de vedere al dezvotării, biotehnologia poate fi divizată în trei etape:
biotehnologia veche (înainte de 1800);
biotehnologia clasică (după 1800);
biotehnologia modernă.
Alimentele, îmbrăcămintea, adăpostul reprezintă cele mai importante nevoi pentru omenire, indiferent dacă s-a trăit în perioada antică sau în perioada modernă; singurul factor care s-a schimbat fiind tipul și originea acestora. Produsele alimentare au fost o nevoie inevitabilă, pentru existența omului, precum și pentru existența continuă a ființelor umane. De aproximativ, 6000 de ani, se recurge la procese biotehnologice, pentru prepararea produselor alimentare.
1.1.3. Aplicații ale biotehnologiei în agricultură
Sfera domeniilor de aplicabilitate a biotehnologiilor este foarte mare, datorită varietății proceselor biotehnologice. Principalele direcții de dezvoltare a biotehnologiilor moderne stau la baza descoperirilor recente din domeniul biologiei moleculare și a cerințelor societății, față de anumite aspecte cu care ne confruntăm: criza energetică, epuizarea rezervelor de hrană de pe planetă, probleme ecologice și de bioremediere.
O clasificare a diferitelor tipuri de biotehnologii, în funcție de domeniul în care se aplică sau de tipul de celule utilizate, este greu de realizat. Orice manipulare a viului pentru societate, înseamnă o biotehnologie, indiferent dacă se realizează la nivel de laborator (cu caracter de cercetare fundamentală) sau la nivel industrial (cu caracter aplicativ).
În funcție de tipul celulelor cu care se lucrează există: biotehnologii microbiene, vegetale și animale.
În funcție de domeniul de aplicabilitate a produselor obținute pe cale biotehnologică deosebim:
Biotehnologii industriale (biotehnologii farmaceutice, alimentare și biotehnologii de depoluare).
Biotehnologii agricole (biotehnologii vegetale și biotehnologii în zootehnie).
Biotehnologii medical-veterinare.
Biotehnologiile industriale cuprind procedee de obținere a unor produse de larg interes, la nivel industrial, cu utilizare de microorganisme sau enzime.
Biotehnologiile farmaceutice se ocupă cu producția de enzime, aminoacizi, obținere de probiotice, hormoni, vitamine, polizaharide, producere de biomasă proteică, biosinteza antibioticelor, producție de acizi organici etc. După gradul de puritate, produsele obținute pot fi utilizate atât pentru consumul uman, cât și animal.
Biotehnologiile alimentare cuprind procedeele industriale de prelucrare a legumelor și fructelor, a laptelui și a produselor lactate, a cărnii, prin urmărirea aspectelor fermentative ale acestora.
În cadrul biotehnologiilor de depoluare a mediului sunt incluse metodele și tehnicile de epurare biologică a apelor uzate sau poluate, a aerului sau ale solurilor degradate, extracția de minereuri cu ajutorul microorganismelor, metodele de bioremediere cu ajutorul plantelor sau microorganismelor.
Biotehnologiile agricole reprezintă un domeniu destul de larg, aplicarea acestora presupunând utilizarea unor metode tradiționale de ameliorare a plantelor și animalelor.
In cazul biotehnologiilor moderne, acestea au la bază manipularea controlată a informației genetice a celulelor vegetale (biotehnologii vegetale) sau animale (biotehnologii animale sau medical veterinare – cu aplicații în zootehnie).
Saltul științific înregistrat în fiecare din domeniile biotehnologiei enunțate mai sus nu ar fi fost posibil fără aplicarea tehnicilor noi de biologie moleculară, legate de transferul de gene și clonarea moleculară, pentru obținerea unor noi tipuri de celule și organisme (www.biotehnologii.usamv.ro).
1.3. Inceputul enzimologiei ca știință
1.3.1. Noțiuni generale
Enzimologia este știința care se ocupă cu studiul răspândirii și localizării enzimelor în organismele vii, structura lor chimică, cinetica reacțiilor chimice, mecanismul de acțiune și activitatea enzimatică a acestora, precum și utilizarea practică în diferite domenii de interes biotehnologic (Cojocaru. și col., 2007). Primele noțiuni științifice de enzimologie apar la începutul secolului XIX, însă dezvoltarea rapidă a acestei ramuri, s-a realizat în ultimele decenii.
Când pronunțăm enzimologie, ne gândim la „enzime”. Utilizarea acestora datează de mii de ani (obținerea brânzeturilor cu ajutorul cheagului din stomacul de vițel), fără a se cunoaște rolul în reacții și natura enzimatică. În antichitate, aplicațiile în care se foloseau enzime s-au bazat pe observațiile empirice din popor.
Microorganismele au fost utilizate în diverse procese de fermentație ca surse producătoare de enzime, un exemplu fiind procedeul de obținere a oțetului (utilizat drept conservant sau în scopuri medicinale) care constă în conversia enzimatică a alcoolului etilic la acid acetic. De asemenea, una dintre cele mai importante surse în nutriția popoarelor antice, a fost ocupat de lapte și subprodusele acestuia. De exemplu, prepararea brânzei s-a realizat în urmă cu aproximativ 7000 de ani îC, prin închegarea laptelui în urma acțiunii unor enzime; se utiliza ficină (obținută dintr-un extract de smochin) și renină (obținută sub forma unui precursor din stomacul bovinelor, oilor sau caprelor tinere); cele două procedee au fost descrise de Homer (în Iliada) și Aristotel.
Locuitorii din insulele Pacificului utilizau pentru frăgezirea cărnii sucul de papaia bogat în papaină (enzimă cu activitate proteazică), în timp ce armata navală britanică folosea sucul de papaia, atât pentru frăgezirea cărnii, cât și tratament împotriva viermilor.
La începutul secolului XII – lea, Otto Rohm, în Germania, a descoperit efectul de curățare a pieilor cu excremente de câine și de porc ca sursă enzimatică proteolitică. Mai târziu, acesta a demonstrat că enzimele extrase din pancreasul animal sunt mult mai eficiente decât excrementele, susținând că aceste enzime se pot obține și prin cultivarea fungilor în culturi de suprafață.
Anumite enzime se pot extrage din organe animale (tripsina și chemotripsina din pancreas de porc, alcooldehidrogenaza se extrage din ficatul de cal, în timp ce catalaza din ficatul de bovine) (Jurcoane și col., 2009).
Observațiile asupra fermentației, au fost redate de Helmot von J.B (1577-1644 care recunoaște acțiunile similare ale fermentațiilor din corpul viețuitoarelor, cu acele produse de fermentația mustului. Acesta a studiat o serie de fenomene naturale printre care acrirea laptelui și a stabilit că acest proces se poate datora unor substanțe pe care le-a denumit ,,fermenți”.
Francois Dubois de la Boe (1614-1672) a privit fermentația ca un proces pur chimic; el arată că procesele fermentative din tubul digestiv sunt realizate cu ajutorul salivei, bilei sau secrețiilor din pancreas, fiind similare cu cele de la obținerea alcoolului sau oțetului.
La sfârșitul anilor 1830, chimistul german Gerhardus Johannes Mulder a efectuat analiza elementală a unor proteine din plante și animale. În mod neașteptat, el a descoperit că aproape toate proteinele au aceeași formulă empirică. J.J. Berzelius, profesorul său, a propus termenul de “proteină” pentru aceste substanțe izolate. Mulder, a mers mai departe și a identificat unii aminoacizii, ca fiind drept produșii de degradare al proteinelor.
Datele științifice ce au contribuit la definirea noțiunii de enzimă au apărut pentru prima dată în 1833, fiind oferite de cercetătorii Person și Payen, care au obținut un „principiu activ” din extractele apoase al proteinelor de malț, cu capacitate de hidrolizare a amidonului și formare de mono- și diglucide. Prin utilizarea unei metode de precipitare cu etanol în mod repetat, cercetătorii au reușit să purifice acest „principiu activ” sub forma unei pulberi, pe care au denumit-o diastază.
In 1836, Theodor Schwann descoperă enzima numită pepsină, (prima enzimă animală cunoscută la momentul respectiv), pe care o comentează în lucrarea ,,Űber das Wesen des Verdaungsprozesses”.
In 1837, Berzelius a studiat comportamentul unor ,,fermenți”, introducând termenul de ,,cataliză” și precizează că adaosul de enzimă la un substrat format din unul sau mai mulți compuși implică o modificare în structura chimică a acestuia. 20 de ani mai târziu, Louis Pasteur relatează „Despre esența digestiei”, în lucrarea “Cercetări asupra fermentației”, faptul că fermentația este provocată de microorganisme (fermenți) și nu de reacțiile chimice, așa cum s-a crezut până la momentul respectiv.
In 1860, Berthelot începe recunoașterea localizării intraceulare a enzimelor, prin macerarea drojdiei de bere și separarea prin precipitare a unei enzime capabile de hidroliza zaharurilor.
In 1883, Emil Duclaux, elevul lui Pasteur a propus câteva principii cu privire la nomenclatura enzimelor, printre care denumirea acestora în funcție de substratul asupra cărora acționează, la care se adaugă sufixul –ază.
In 1887, Kuhne introduce termenul de enzimă, pentru numirea unei substanțe catalitice obținute din drojdii (Pop, 2006).
E. Hansen (1888) a introdus noi metode de obținere a fermenților, fiind adoptate de fabricanții de bere. Datorită dezvoltării tehnicilor de separarea a enzimelor și descoperirilor înregistrate în domeniul stereochimiei, în anul 1894 E. Fischer a formulat ipoteza specificității enzimelor potrivit căreia o enzimă acționează asupra unei singure substanțe (substrat) sau a unui grup de compuși cu structură chimică asemănătoare.
J. Takamine (1894) a descoperit taka-diastaza (α-amilază), o enzimă digestivă produsă comercial, cu ajutorul unei culturi de Aspergellius oryzae pe tărâțe de grâu, cu rol de scindare a amidonului din structura suportului utilizat. Acesta a reușit să extragă un amestec enzimatic din orezul fermentat numit ,,koji” (bogat în α-amilază), pe care l-a vândut în Japonia ca adaos digestiv de uz uman (Jurcoane, 2000).
1.3.2. Enzimologia în zilele noastre
Importanța enzimelor în desfășurarea proceselor biochimice a fost cunoscută de multă vreme. In 1926, cercetătorul Sumner a cristalizat ureaza, demonstrând activitatea catalitică a acesteia și totodată s-a stabilit că enzimele sunt de natură proteică. Astfel, enzimele pot fi definite ca fiind proteine cu activitate catalitică.
Începând cu anul 1940, a fost pusă la punct tehnica fermentației în sistem submers, în vase aerate și agitate; s-a dezvoltat mai întâi, pentru antibiotice, fiind o metodă excelentă de cultivare a microorganismelor. Foarte repede această metoda s-a aplicat pentru fabricarea enzimelor, cu ajutorul surselor microbiene.
Până în anii 1960, enzimele de sinteză erau foarte puțin folosite. Utilizarea proteazelor în industria detergenților și a enzimelor coagulante, care au înlocuit cheagul animal, au făcut ca industria enzimelor să ia amploare la începutul anilor 1980 (Sasson, 1983).
Enzimele sunt utilizate în zilele noastre în diverse aplicații precum: sinteza chimică, industria detergenților, truse de curățare a lentilelor de contact etc. Unul dintre cele mai importante aspecte ale enzimologiei moderne, constă în utilizarea inhibitorilor enzimelor în industria farmaceutică, drept medicamente pentru medicina umană și veterinară.
Enzimele sunt prezente în toate organismele vii și în toate tipurile de celule animale, fluide corporale (sânge, limfă, lichid cefalorahidian, lichid intestinal), în unele secreții specifice pentru diferite organe (stomac, pancreas, intestin subțire, rinichi, etc.), plante și totalitatea virusurilor și microorganismelor care populează diferite zone ale Pământului. Recent au apărut numeroase studii cu privire la biosinteza enzimelor, în care se specifică natura microorganismelor producătoare. Lambert în 1983, descrie detaliat tehnica de obținere a enzimelor din fungi, acordând o mare atenție proceselor de fermentație pe mediu solid.
Implicarea enzimelor în procesele metabolice reprezintă factorul cheie în alimentația organismului viu, participând activ la transformarea nutrienților în energie și substanțe necesare dezvoltării acestuia. Cea mai mare parte a enzimelor de sinteză sunt enzime de tip hidrolitic: proteaze, amilaze, celulaze, lipaze, xilanaze, etc. Multe dintre aceste enzime, sunt utilizate în industria detergenților și foarte puține în alte domenii (industria alimentară, hrana animalelor, panificație, industria pielăriei, industria medicamentelor, etc. (Jurcoane, 2000).
După al doilea război mondial, încep să se producă la nivel industrial un număr cât mai mare de enzime, în special amilaza, glucozo-oxidaza, lipaza, streptokinaza, catalaza, celulaza și hemicelulaza, pectina, invertaza și proteaza. Treptat, acestea și-au găsit utilizări în cele mai diverse domenii de activitate: industria alimentară (conserve din legume și fructe, industria laptelui și brânzeturilor, industria de prelucrare a cărnii), aditivi furajeri, panificație, industria textilă, papetărie, industria pielăriei, industria detergenților, industria medicamentelor.
1.4. Enzime. Rol și importanță
Denumirea de enzimă (zymosis = ferment) caracterizează acele substanțe chimice, care intervin în procesele biochimice prin care pe de o parte substanțele complexe ajunse în organismul viu, din hrană, sunt descompuse în substanțe simple, ușor asimilabile, iar pe de altă parte, din substanțele simple sunt sintetizate alte substanțe necesare organismului (substanțe cu rol energetic, plastic și funcțional).
Enzimele sunt catalizatorii cei mai eficace și cei mai utilizați în cele mai diverse domenii: biocataliza industrială (sinteza de aminoacizi, peptide, nucleotide, antibiotice, etc.), tehnologii alimentare (industria laptelui, industria cărnii, aditivi furajeri, etc), industria farmaceutică, bioconversie etc., domenii care necesită enzime cu grad de puritate din ce în ce mai ridicat. Utilizarea enzimelor purificate a fost multă vreme limitată din motive tehnice și economice (Arnaud și col., 1993).
Enzimele, întâlnite în toate organismele vii, sunt molecule proteice cu activitate catalitică, dependentă de substratul specific asupra căruia acționează și de produșii rezultați în urma reacției catalizate (Marți și Rusu, 2012).
Enzimele prezintă un grad ridicat de selectivitate a reacțiilor chimice, majoritatea enzimelor pot cataliza un număr mic de reacții, de multe ori un singur tip de reacție chimică, spre deosebire de catalizatorii anorganici (acizi, baze, metale, oxizi metalici), care activează practic toate reacțiile posibile, însă de un anumit tip. După finalizarea reacției chimice, enzima este eliberată și pregătită să înceapă o nouă reacție. Practic, aceste reacții chimice pot continua permanent, dar în procedeele industriale, majoritatea enzimelor sunt utilizate o singură dată și eliminate imediat ce reacția chimică s-a încheiat. Datorită specificității lor, enzimele conduc la obținerea de produse precise, cu un număr redus de produși secundari nedoriți. Toate procesele care au loc în organism depind de enzime. Acestea sunt principalii catalizatori ai tuturor reacțiilor fizico-chimice, fără de care organismul ar înceta să funcționeze și, deci, să existe.
Enzimele determină digestia, detoxifierea, imunitatea și toate celelalte procese metabolice și regeneratoare; digeră hrana, pe care o descompun în fragmente suficient de mici, pentru a trece în sânge prin porii peretelui intestinal. Pe lângă acțiunea de digerare a hranei, enzimele distrug toxinele, descompun grăsimile și celuloza, metabolizează amidonul și proteinele. Astfel, enzimele proteolitice desfac proteina în aminoacizi, enzimele lipolitice degradează substanțele grase transformându-le în acizi grași și glicerol, iar enzimele glicolitice transformă hidrații de carbon cu moleculă complexă în monozaharide, până la maltoză.
Oamenii de știință au identificat peste 3200 de enzime diferite în stare pură (prin cristalizare) sau sub formă de preparate enzimatice cu diferite grade de puritate (aproximativ 1000 – 1500) (Jurcoane și col., 2009).
Enzimele sunt implicate în orice funcție biochimică și fiziologică dintr-un organism, reprezentând materialul biochimic, pentru ca organismul să poată supraviețui. Toate procesele vieții sunt formate dintr-o rețea complexă de reacții chimice cunoscute sub denumirea de metabolism, iar rolul catalitic aparține strict enzimelor. In organismele vii enzimele contribuie la descompunerea moleculelor mari în molecule mici ușor asimilabile, accelerează procesele metabolice și coordonează etapele ciclului metabolic, impunând ordinea reacțiilor biochimice pentru obținerea rezultatului urmărit.
O importanță deosebită o reprezintă utilizarea enzimelor exogene ca adaos în hrana animalelor. Acest subiect a devenit cel mai căutat și dezvoltat în ultimii 20 de ani. Obiectivul principal constă în îmbunătățirea și dezvoltarea parametrilor zootehnici. Mulți cercetători au investigat utilizarea enzimelor exogene, ca aditivi furajeri, în scopul unei creșteri rapide și intense atât la rumegătoare, cât și la monogastrice, producția și consumul de carne și a subproduselor din carne crescând în mod treptat, cu aproximativ 60 % (Henchion și col., 2014).
În concluzie enzimele reprezintă mijloacele-cheie în menținerea sănătății datorită participării lor la procesul de digestie, de detoxifiere și imunitate, fiind utilizate în alimentația animalelor ca aditiv furajer.
1.4.1. Structura enzimelor
Enzimele sunt alcătuite dintr-o componentă proteică (apoenzima), ce le conferă specificitate de substrat și o parte neproteică (coenzima), necesară pentru manifestarea activității enzimatice, oferind specificitate de acțiune. Enzimele sunt macromolecule, compuse din lanțuri lungi de aminoacizi unite prin legături peptidice, cu masă moleculară cuprinsă între 10000 – 1000000 Daltoni (Pelczar și Chan, 1981).
1.4.2. Nomenclatura enzimelor
In conformitate cu ,,Nomenclatura enzimelor”, cartea emisă de Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaționale de Biochimie, fiecare enzimă este caracterizată nu numai de o denumire, ci și de un cod specific format din patru cifre: prima cifră reprezentând clasa, a doua cifră, subclasa, a treia cifră, subsubclasa, iar ultima cifră a codului numărul de ordine din subsubclasa respectivă. Acest cod este precedat de prescurtarea Enzyme Commission (E.C.). De exemplu, denumirea corectă și completă a catalazei este H2O2: H2O2-oxidoreductază (EC 1.11.1.6).
Denumirea enzimelor se bazează pe doi factori:
Substratul asupra căruia acționează: în acest caz la denumirea biochimică a substratului se atașează sufixul -ază: maltază, amilază, lipază, protează, celulază, xilanază.
Tipul reacției catalizate: în acest caz denumirea se formează din denumirea substratului, urmată de acțiunea chimică a enzimei: piruvat decarboxilază – enzima care separă gruparea carboxil de piruvat.
1.5. Clasificarea enzimelor
Enzimele, din punct de vedere al structurii chimice, pot fi:
a) Holoenzime – enzime simple, alcătuite numai din aminoacizi.
b) Heteroenzime – care pe lângă partea proteică conțin și o parte neproteică, numită coenzimă sau cofactor enzimatic (Arnaud și col., 1993).
Toate enzimele sunt produse în interiorul organismului; unele sunt eliminate în mediul înconjurător.
După locul de sinteză există două tipuri de enzime:
Endogene: endoenzime sau enzime intracelulare, sintetizează în interiorul celulei diverși compuși chimici sau degradează nutrienți în funcție de necesarul energetic și funcțional al celulei.
Exogene: exoenzime sau enzime extracelulare, eliminate în mediul înconjurător cu capacitate de degradare a nutrienților din mediu, a hidraților de carbon, lipidelor, proteinelor, pe care îi transformă în compuși simpli, absorbabili, pentru a traversa cu ușurință membrana celulară.
Creșterea numărului de enzime descoperite și studiate a determinat apariția unei clasificări științifice. Astăzi este valabilă clasificarea propusă în 1964 de către Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaționale de Biochimie care are la bază tipul de reacție pe care îl catalizează o anumită enzimă și mecanismul reacției catalizate. Conform acestui criteriu, enzimele cunoscute până în prezent se clasifică în șase clase principale; după natura procesului catalitic, în clase și subclase, în funcție de unele informații cu privire la grupările chimice ce sunt supuse transformării, dar și natura cofactorilor implicați în reacția pe care o catalizează.
Cele șase clase principale de enzime propuse de către Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaționale de Biochimie sunt:
1) Oxidoreductaze – catalizează reacțiile de oxidoreducere sau reacțiile redox, denumirea lor sistemică fiind donor/acceptor oxidoreductaze, se desfășoară în organismele vii.
2) Transferaze – catalizează reacții de transfer ale unor grupe de atomi, ce pot fi și grupe funcționale de la un substrat la altul, fără ca aceste grupe să se regăsească sub formă liberă în timpul întregului proces, denumirea sistemică gruptransferaze.
3) Hidrolaze – catalizează scindarea pe cale hidrolitică a diferitelor legături covalente (C-C, C-N, C-O sau O-P), din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă; acest tip de reacții implică două substraturi: unul acceptor reprezentat de apă, iar celălalt se numește substrataze (proteaze, celulaze, amilaze) care se referă la substratul asupra căruia acționează.
4) Liazele – catalizează reacțiile de adiție a unor grupe de atomi la molecula substratului sau scindarea acestor grupări cu rearanjarea ulterioară a valențelor, în urma ruperii legăturilor de tipul C-C, C-O sau C-N; denumirea sistemică este substrat grup liază sau produs sintază.
5) Izomeraze –catalizează diferite reacții de izomerizare a substratului, sunt denumite în funcție de tipul de izomeraze și de natura substratului.
6) Ligaze sau sintetaze – catalizează formarea unor noi legături chimice carbon – carbon sau carbon – heteroatom (C-O, C-N), în majoritatea cazurilor utilizându-se energia stocată în legăturile macroergice ale moleculelor de ATP (Cojocaru și col., 2007).
1.5.1. Enzime exogene. Noțiuni generale
Enzimele exogene, exoenzime sau enzimele extracelulare sunt compuși eliminați în mediul înconjurător, cu capacitate de degradare a diferiților nutrienți din mediu, hidrați de carbon, lipide, proteine, pe care îi transformă în compuși simpli, absorbabili, ce traversează cu ușurință membrana celulară. Enzimele exogene sunt ingerate de animale cu hrana și care, odată ajunse în organism, contribuie la suplimentarea enzimelor propria (endogene).
1.5.1.1. Surse de enzime exogene
Enzimele exogene sunt obținute din mediul extern ca rezultat al consumului de produse de origine animală sau vegetală. Enzimele exogene se obțin din surse vegetale, animale sau microbiene.
1.5.1.2. Enzime de origine vegetală
Majoritatea plantelor sau anumite organe vegetale (fructe și frunze) conțin enzime cu acțiune favorabilă asupra aparatului digestiv animal. Cele mai importante enzime obținute din surse vegetale sunt de natură proteolitică: papaina sintetizată de planta Carica papaya din zonele tropicale, bromelina sintetizată din Ananas comous Merr, ficina din Ficus glabatra etc.
1.5.1.3. Enzime de origine animală
La ora actuală, cea mai mare importanță pentru industrie o reprezintă pepsina bovină și porcină. Pepsina bovină este un constituent normal al cheagului, fiind secretată în mod abundent după perioada de înțărcare. Pepsina porcină se regăsește în mucoasa gastrică de porc sub formă inactivă de pepsinogen. In 1993, Scriban menționa că pepsina porcină se poate extrage prin mai multe metode, printre care extracția din mucoasa raclată, cu apă distilată acidulată cu acid clorhidric, în prezență de cloroform. Soluția rezultată se supune filtrării, urmat de liofilizarea supernatantului, obținându-se o pulbere albă, solubilă în apă (Cojocaru și col., 2007).
1.5.1.4. Enzime de origine microbiană
În ceea ce privește stabilirea enzimei ce urmează a se obține este important să se respecte anumite caracteristici ale acesteia, printre care:
– specificitate de și pH-ul optim de acțiune (se aleg enzimele care își mențin activitatea catalitică într-un domeniu cât mai larg de pH);
– concentrația substratului;
– calitatea și cantitate inoculului;
– temperatura optimă de acțiune, de obicei enzimele se inactivează la temperaturi ridicate, de aceea se preferă enzime a căror temperatură optimă de acțiune este cât mai mare posibil;
– selectarea tulpinii bacteriene.
Sursele microbiene selectate pentru producerea de enzime trebuie să îndeplinească anumite condiții:
– să reprezinte o sursă de materie primă, practic inepuizabilă, cu grad mare de multiplicare, cu o creștere masivă pe medii simple, ieftine și ușor de procurat (ex: deșeuri industriale), care să nu necesite adaos de promotori de creștere scumpi (condiții speciale de dezvoltare), toate acestea servind la obținerea de preparate biotehnologice cu costuri reduse;
– să fie stabile din punct de vedere genetic;
– să producă cantități însemnate de enzime într-un timp cât mai scurt;
– să se separe ușor din mediul de biosinteză la sfârșitul procesului fermentativ;
– să fie lipsite de patogenitate și să nu producă substanțe toxice pentru om sau animale;
– să aibă rata de diviziune ridicată și să nu necesite condiții speciale de temperatură, pH, ce ar atrage după sine utilizarea unor instalații complexe și costisitoare;
– să contribuie la obținerea unor randamente ridicate care pot fi îmbunătățite fie prin ameliorarea tulpinilor microbiene folosite, fie prin optimizarea condițiilor de producție cu un consum redus de energie (Jurcoane și col., 2009;Cojocaru și col., 2007).
La scară industrială produsele enzimatice sunt obținute, în principal, cu ajutorul a 4 specii bacteriene: Bacilllus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum și Streptococcus faecium și 3 specii fungice: Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei și Saccharomyces cerevisae (Knowlton și col., 2007).
In Anexa 1 Tab. 2.1, sunt prezentate principalele tipuri de enzime produse la nivel industrial, microorganismele producătoare și utilizările acestora.
1.5.2. Cultivarea tulpinii producătoare de enzime
Microorganismele producătoare de anumite enzime, se întâlnesc în mod natural, în habitaturi care conțin substratul enzimelor respective (ex: tulpinile microbiene producătoare de enzime amilolitice se vor izola din medii naturale bogate în amidon). Pentru izolarea tulpinilor microbiene producătoare de enzime se utilizează creșterea pe medii de îmbogățire urmată de efectuarea pasajelor pe medii selective. Mediul selectiv trebuie să îndeplinească unica sursă din elementele vitale (ex: sursa de carbon).
Obținerea enzimelor de origine microbiană se obțineau, inițial, cu ajutorul culturilor de suprafață pe medii solide sau semisolide. Această metodă este valabilă și pentru obținerea unor enzime de origine fungică: amilaze (Aspergillus sp.), proteaze (Aspergillus sp. și Mucor sp.), pectinaze (Penicillium sp.) etc.
În prezent se preferă culturile submerse, deoarece în cazul culturilor pe mediu solid parametrii de cultivare (temperatură, umiditate, aerare) sunt dificili de controlat.
Utilizarea culturilor în mediul lichid reduce riscul contaminării și permite controlul periodic al parametrilor biochimici și microbiologici (Cojocaru și col., 2007).
1.5.3. Extracția și purificarea enzimelor de interes
După finalizarea etapei de cultivare, enzimele sunt supuse metodelor de extragere din celule sau lichidul de cultură, pentru obținerea preparatelor enzimatice. Metodele aplicate sunt: centrifugarea, filtrarea, evaporarea, precipitarea reversibilă, liofilizarea, iar preparatele enzimatice obținute se pot comercializa sub diferite forme: pudră, soluție, cristale, sub formă imobilizată etc.
Izolarea enzimelor endogene sau intracelulare presupune o extracție mai dificilă, se aplică etape suplimentare de liză a celulelor microbiene, după care metodele sunt similare cu cele aplicate enzimelor exogene sau extracelulare (Cojocaru și col., 2007).
1.6. Importanța microorganismelor pentru obținerea enzimelor exogene
Preparatele microbiene au început să se comercializeze și să se utilizeze în domeniul zoootehnic începând cu anul 1960, utilizarea lor fiind încurajată de restricționarea adminstrării antibioticelor în alimentația animalelor, ca factori de creștere, asociați cu creșterea rezistenței la infecții și îmbolnăviri. Parametrii zootehnici urmăriți sunt reprezentați de creșterea sporului privind greutatea animalelor și reducerea consumului mediu zilnic, paralel cu unele efecte sanitare (diminuarea tulburărilor gastrointestinale, reducerea morbidității).
La începutul anilor 1990, s-a constatat o reducere drastică cu privire la utilizarea microorganismelor vii în hrana animalelor, deoarece mecanismul de acțiune al acestora nu era foarte bine înțeles de către cercetători.
Microorganismele au fost utilizate din cele mai vechi timpuri în procesele fermentative alimentare, fiind responsabile de creșterea proprietăților organoleptice (gust, aromă, culoare), calitatea nutrițională și durata de conservare. Microorganismele reprezintă materia primă, de bază, în procesele tehnologice și sunt utilizate în producerea preparatelor enzimatice sunt reprezentate de specii de bacterii, drojdii și mucegaiuri (Botton și col., 1990).
In 2004 a fost relansată administrarea microorganismelor vii ca aditiv furajer, iar din această perioadă cercetătorii s-au axat pe utilizarea speciilor microbiene și introducerea acestora în hrana animalelor. Microorganismele utilizate ca aditivi furajeri aparțin următoarelor specii bacteriene: Bacillus sp., Bifidobacterium sp., Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Streptococcus sp. și drojdii din genul Saccharomyces.
Din totalul speciile microbiene, aproximativ 71% sunt utilizate ca aditivi furajeri, în special în hrana păsărilor și suinelor (Revista de Zootehnie, 2015).
Suplimentarea enzimatică a hranei la animalele tinere (ex: purceii aflați în criza de înțărcare) contribuie la completarea enzimelor endogene sau la degradarea unor factori antinutriționali, prezenți în unele materii prime furajere. Enzimele acționează numai asupra substratului specific, pe care îl recunosc; pentru a obține rezultate superioare se recomandă administrarea unui complex multienzimatic, comparativ cu preparatele monoenzimatice.
Enzimele furajere trebuie să prezinte termostabilitate (pentru a rezista temperaturii de granulare a nutrețurilor), rezistență la atacul proteolitic din stomac și intestin și să aibă activitate maximă la temperaturi și valori de pH normale fiziologic animalelor.
1.6.1. Bacterii
Bacteriile constituie un grup mare de microorganisme de tip procariot, foarte răspândite în natură, sol, apă, aer, alimente, organisme umane, animale și vegetale, substanțe organice aflate în descompunere. Bacteriile sunt caracterizate de un metabolism foarte intens, fapt care a atras de multă vreme atenția oamenilor de știință.
Caracterizarea bacteriilor se poate face în funcție de morfologia acestora (coci, bacili, virioni), afinitatea față de coloranții de anilină (bacili acido-rezistenți, gram-pozitivi, gram negativi) și de proprietățile biologice (termostabilitate, tipul de nutriție, respirație și gradul de patogenitate).
Cercetările efectuate asupra proprietăților biochimice și metabolice ale bacteriilor au determinat utilizarea lor în combaterea biologică a insectelor, biodegradarea unor poluanți, epurarea apelor uzate, sinteza a numeroase substanțe utile etc. De altfel, bacteriile sunt utilizate în industria de biosinteză în diferite domenii de activitate: medicină (antibiotice, vitamine), industria biochimică (alcooli, acizi carboxilici, aminoacizi, proteine, enzime), industria alimentară (procesele fermentative pentru obținerea derivatelor din lapte), agricultură etc. Un număr mare de specii bacteriene prezintă importanță biotehnologică, iar cele mai importante aparțin genurilor Bacillus și Lactobacillus.
Genul Bacillus cuprinde specii bacteriene aerobe, sporogene, prezente în natură în sol, apă, aer, organisme animale și plante. Aceste microorganisme sunt nepatogene cu un echipament enzimatic complex, care asigură hidroliza amidonului, cazeinei și gelatinei, fermentația glucozei și manitolului, reducerea și metabolizarea nitraților.
Cele mai utilizate specii bacteriene în procesele biotehnologice sunt B. subtilis și B. licheniformis, caracterizate printr-o capacitate de producere a enzimelor exogene, într-un număr foarte mare (amilaze, glucanaze, proteaze neutre și proteaze alcaline). In Tab. 1.1 sunt prezentate produsele cu importanță industrială obținute din utilizarea speciei B. licheniformis.
Tab. 1.1. Metaboliți de interes industrial produși de Bacillus licheniformis (după Chateau și col., 1994)
Tab. 1.1. Metabolites of industrial interest produced by Bacillus licheniformis (after Chateau et al., 1994)
Genul Lactobacillus reunește bacterii sub formă de bastonaș cu lungimi și grosimi variabile, precum și sub formă de cocobacili, așezați în lanțuri de dimensiuni variabile; sunt bacterii anaerobe sau facultativ aerobe, gram pozitive, asporogene, necapsulate, neciliate, lipsite de patogenitate. Lactobacilii prezintă proprietăți glucidolitice pronunțate, o activitate lipolitică și proteolitică redusă; glucidele cel mai bine fermentate sunt lactoza, maltoza și zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare), urmate de glucoză, fructoză și galactoză. Deși cu proprietăți proteolitice reduse, lactobacilii își pot obține azotul necesar dezvoltării, din proteinele laptelui.
Lactobacilii sunt bacterii catalazo-negative și citocromoxidazo-negative, nu reduc nitrații și nu lichefiază gelatina. Aceștia coagulează și acidifică laptele turnesolat, fiind foarte răspândiți în natură, sub formă saprofită în diferite produse de origine vegetală și animală. Reprezentanții principali ai acestui gen sunt: L. acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. paracasei, cu largi aplicații în procesele de biosinteză enzimatică.
L. acidophilus fermentează glucoza, lactoza, maltoza, manoza și nu produce amoniac din arginină.
L. plantarum, nu produce CO2 la fermentarea glucozei, dar produce CO2 din gluconat; fermentează riboza la acid lactic și acid acetic, prezintă activitate aldolazică, glucozo 6P-dehidrogenazică și 6P-gluconatdehidrogenazică. Prin fermentație lactică, produce acid lactic, acid racemic, nu produce NH3 din arginină, acidifică laptele, prezintă spectrul cel mai larg al zaharurilor fermentescibile, descompune acidul glutamic cu formare de acid acetic, descompune glucoza, zaharoza, maltoza, manitolul, nu hidrolizează amidonul. Această tulpină poate reduce azotul dacă pH-ul mediului este mai mare de 6 și în mediul de cultură nu există zaharuri fermentescibile, reduce slab azotitul, nu formează H2O2.
1.6.2. Ciuperci microscopice
Ciupercile microscopice sau micromicetele reunesc microorganisme împărțite în:
micromicetele cu aspect levuriform: levurile sau drojdiile;
micromicetele cu aspect filamentos: mucegaiurile.
1.6.3. Drojdii
Drojdiile sunt microorganisme eucariote, cu activitate metabolică rapidă, caracterizate printr-o viteză mare de creștere și multiplicare, cu răspândire ecologică comparabilă cu cea a bacteriilor. Drojdiile sunt larg răspândite în natură, în ape dulci și sărate, majoritatea speciilor fiind saprofite, trăind din abundență pe medii zaharate (fructe, nectar); sunt organisme osmofile, suportă concentrații mari de săruri și zaharuri.
Drojdiile sunt microorganisme aerobe, facultativ anaerobe. În condiții de aerobioză se multiplică intens și nu fermentează zaharurile din mediul de cultură, iar în condiții de anaerobioză, nu se mai multiplică și fermentează intens zaharurile cu formare de CO2, H2, alcool, apă și alți metaboliți. Această proprietate este cunoscută sub denumirea de "efectul Pasteur" și se bazează pe utilizarea drojdiilor în industria de biosinteză. Ambele căi (aerob/anaerob) prevăd formarea unei cantități de energie necesară creșterii, multiplicării și menținerii funcțiilor vitale ale celulei, dar în cantități diferite (calea aerobă produce mai multă energie) (Matei, 2011).
Celula de drojdie conține 70 – 80 % apă. Substanța uscată este formată din proteine, glucide, lipide, săruri minerale, vitamine (Matei, 2011). Există un număr mare de specii utilizate în biotehnologii, cel mai frecvent fiind folosite speciile genurilor Saccharomyces și Candida.
Genul Saccharomyces prezintă celule de forme variate: sferice, ovale, alungite, cilindrice care, uneori, formează pseudomicelii. Înmulțirea se face pe cale vegetativă prin înmugurire multilaterală și sexuat prin spori. Saccharomyces cerevisiae este specia cea mai cunoscută și cu cea mai largă utilizare, de multă vreme în industria berii și panificație. Cea mai mare parte a drojdiei alimentare și furajere este obținută prin recuperarea acestei drojdii de la fabricile de bere (Markowiak și Ślizewska, 2018).
1.6.4. Mucegaiurile
Mucegaiurile reprezintă un grup heterogen de ciuperci microscopice saprofite, uneori parazite cu structură total diferită de restul microorganismelor: perete celular bogat în chitină, prezența glicogenului ca substanță de rezervă, absența clorofilei sau a alor pigmenți asimilatori. Fiind lipsiți de pigmenți asimilatori, mucegaiurile sunt microorganisme heterotrofe dependente de o sursă de carbon organic și imprimă modificări atât fizice substratului (aspect, gust, miros), cât și chimice (calitățile nutritive). Din punct de vedere al efectului asupra substratului, mucegaiurile se împart:
mucegaiuri utile – utilizate în industrie, pentru a conferii produselor proprietăți organoleptice și tehnologice superioare: Penicillium camemberti, Penicillium candidum și Penicillium roqueforti în industria brânzeturilor, Penicillium nalgiovense în industria de prelucrare a cărnii;
mucegaiuri dăunătoare – alterează substratul și produc substanțe toxice.
Speciile de mucegaiuri utilizate frecvent în biosinteza enzimelor aparțin genului Aspergillus. Principalele specii utilizate la nivel industrial sunt redate în Tab. 1.2.
Activitatea biochimică a microorganismelor și a enzimelor acestora este extrem de importantă. O moleculă enzimatică poate cataliza între 10 și 1000 molecule de substrat într-o oră. Un gram de Micrococcus urea poate descompune până la 1200 g uree/oră, iar un gram de lactobacili până la 14000 g lactoză/oră.
Varietatea enzimelor elaborate de un singur microorganism este foarte mare; în cazul bacteriei Escherichia coli, bacteria cel mai intens studiată, au fost izolate peste 200 tipuri de enzime; Aspergillus oryzae poate produce 22 tipuri de enzime (Tab. 1.3).
Activitatea biochimică specifică microorganismelor oferă imense posibilități industriei de biosinteză. In practică, un rol esențial îl ocupă compoziția mediului de cultură. Eliminarea sau adiția unuia sau a mai multor ingrediente în mediul de cultură oferă posibilitatea obținerii unui număr variat de enzime cu largi aplicații industriale.
Tab. 1.2. Specii de Aspergillus și produse obținute la nivel industrial
(după Simon și Meunier, 1970 citat de Botton și col., 1990)
Tab. 1.2. Aspergillus spp. and products obtained at industrial level
(after Simon and Meunier, 1970; cited by Botton et al., 1990)
Tab. 1.3. Enzime produse de Aspergillus oryzae (după Botton și col., 1990)
Tab. 1.3. Enzymes produced by Aspergillus oryzae (after Botton et al., 1990)
1.7. Compoziția mediului de cultură pentru culturile microbiene
Mediile de cultură trebuie să conțină toate elementele necesare creșterii microorganismelor pentru elaborarea produselor de interes la un nivel productiv maxim. După natura și sursa componentelor din compoziția mediului de cultură, acestea pot fi sintetice, semisintetice, naturale sau organice. Mediile sintetice se utilizează în laboratoare, iar cele semisintetice la nivel industrial.
Fiecare microorganism în parte se dezvoltă pe un anumit mediu de cultură care trebuie să asigure în toate cazurile anumite cerințe: sursă de carbon și de energie, sursă de azot, micro și oligoelemente în concentrații adecvate, necesitățile specifice fiecărui organism (precursori, aminoacizi esențiali, vitamine).
1.7.1. Sursă de carbon și energie
Principalele surse de carbon ce intră în compoziția mediului de cultură sunt reprezentate de:
– monozaharide (glucoză, xiloză);
– dizaharide (zaharoză, melasă din sfecla de zahăr și trestia de zahăr, lactoză, maltoză);
– polizaharide (amidon, dextrină, inulină, celuloză);
– alcooli (etanol, metanol, polialcooli – glicerină), acizi carboxilici (acid acetic, acid succinic), grăsimi, acizi grași, hidrocarburi (metan, n-butan, n-pentan, n-parafine;
– deșeuri din industria laptelui și industria alimentară (zer, tărâțe, făină de cereale etc).
1.7.2. Sursă de azot
Intr-un mediu de cultură sursa de azot este asigurată de surse organice (aminoacizi, proteine, uree) sau din surse anorganice [NH3, (NH4)3PO4, KH2PO4]. Sursa de azot poate fi reprezentată în diferite forme de surse anorganice (amoniac, săruri de amoniu) sau amestecuri complexe (extract de drojdie, extract de porumb, peptonă, făină de soia, de arahide, de bumbac, de orez, de secară, de lucernă etc).
1.7.3. Săruri minerale
In procesele de biosinteză sărurile minerale pot reprezenta surse de:
– elemente constitutive ale produselor (P, S, Cl etc.) și elemente constitutive ale biomaselor (Mg, P, S, Cl, Ca, Fe etc.);
– reglatori ai presiunii osmotice și ai permeabilității membranelor celulare (MgCl2, KCl, NaCl etc.);
– modificatori de pH (NaH2PO4, CaCO3 etc.), agenți de complexare și de precipitare (SO42, HPO42-, CO32-), cofactori pentru sisteme enzimatice – metaloenzime (Mg2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+,Mo2+etc.), săruri furnizoare de microelemente (Mn, Ni, Co, W, Zn) și săruri de oligoelemete (K din KCl/K2HPO4, Mg/MgSO4, Fe/FeCl3, Jurcoane și col., 2009).
1.7.4. Factori de creștere
Compoziția mediului de cultură specific unui anumit microorganism țintă se stabilește în laborator. Un mediu de cultură trebuie să conțină factori de creștere, adică aminoacizi, proteine, vitamine, coenzime. Pentru a avea un randament optim, în faza de biositeză se adaugă în mediu precursori.
Precursorii sunt compuși organici sau anorganici care intervin ca molecule intermediare la creșterea randamentului în faza de biosinteză într-o anumită direcție.
Vitaminele reprezintă coenzimele sistemelor enziamtice cu activitate bine precizată în metabolismul celular, constituie o grupă de compuși organici cu rol în creșterea biomasei și în elaborarea produselor utile (Cascaval și Galaction, 2014).
CAPITOLUL II. IMPORTANȚA PREPARATELOR ENZIMATICE IN HRANA MONOGASTRICELOR
2.1. Enzime de uz furajer
Enzimele sau fermenții sunt biocatalizatori chimici cu rol important în reglarea metabolismului substanțelor nutritive, a proceselor de creștere a țesuturilor la monogastrice. Acestea pot fi de natură endogenă (produse de substanța vie a diferitelor glande sau organe) sau exogenă (eliberate de plante, bacterii, mucegaiuri sau ciuperci).
Adaosul de enzime în hrana monogastricelor are ca scop principal, degradarea polizaharidelor pereților celulelor vegetale (în cazul grâului, orzului, secarei), până la monomeri sau oligomeri cu greutate moleculară scăzută, prin scindarea macromoleculelor nutrienților în forme simple, pentru a putea fi absorbite prin intermediul peretelui intestinal, iar apoi metabolizate, rezultând o valorificare superioară a hranei sau o valoare nutrițională de efect (Pop., 2006).
Preparatele enzimatice se prezintă sub forma unor extracte lichide sau medii deshidratate ale unor culturi bacteriene selecționate, cu activitate enzimatică bine stabilită, constituind o sursă furajeră de interes practic și economic.
Administrarea preparatelor enzimatice ca aditivi furajeri prezintă efecte favorabile în valorificarea superioară a nutrețurilor și în îmbunătățirea performanțelor animaliere, precum:
stimularea vitezei de reacție de natură chimică în metabolismul hidraților de carbon, a protidelor și lipidelor, fără ca acestea să se consume;
adaosul unei cantități mici de enzimă (250 USKB / kg amestec – USKB = Unități Stendet Kneen Blish) intervine în transformarea unor cantități mari de masă furajeră (cereale, paie, coceni etc.) și asigură predigestia enzimatică (proces biochimic cu continuitate în tractusul digestiv);
acționează reversibil, intervin în reacțiile de descompunere a substanțelor nutritive ingerate, cât și în reacțiile de sinteză a țesuturilor și organelor;
accelerează ritmul de creștere cu 5-8 %;
contribuie la diminuarea consumului specific la toate categoriile de porci (sub vârsta de 6 luni) cu 6-7 %, comparabil cu loturile hrănite cu amestecuri pe bază de cereale, fără adaos enzimatic (Marinescu și col., 1977).
Conceptul de a adăuga enzime în furajul animalelor este cunoscut și deja aplicat de mai multe decenii. Enzimele folosite sunt hidrolitice, scindând macromoleculele nutrienților în unele suficient de simple (mici), pentru a putea fi absorbite prin peretele intestinal și apoi metabolizate; glucidele sau hidrații de carbon (amidonul, celuloza) sunt hidrolizate până la zaharuri simple (monozaharide), proteinele până la peptide și aminoacizi, lipidele (grăsimile) până la acizi grași superiori și glicerină (DonKers, 1989, citat de Pop, 2006).
Preparatele enzimatice în hrana monogastricelor, suplimentează enzimele endogene în cazul animalelor tinere (în primele zile din viață, animalul nu prezintă un echipament enzimatic bine dezvoltat) sau degradează prezența unor factori antinutritivi ce se regăsesc în materiile prime furajere (Pop, 2006). De exemplu, unele nutrețuri utilizate în hrana monogastricelor conțin cantități importante de celuloză (șrotul de floarea soarelui) sau polizaharide neamidonoase (orzul și ovăzul conțin β-glucani, grâul conține arabinoxilani și pentozani, secara conține arabinoxilani, β-glucani și pentozani, triticalele prezintă pentozani, șrotul de soia conține rafinoză, stahioză, verbascoză). Datorită complexității chimice, aceste macromolecule sunt foarte puțin digerate de organismul suin care nu prezintă enzime caracteristice degradării acestor structuri complexe, fiind necesar un aport enzimatic exogen de enzime specifice, prin anularea efectelor negative și utilizarea energiei conținute (Crăiniceanu, 2006).
Enzimele acționează doar asupra substratului specific, pe care îl recunosc. Enzimele pot fi adăugate în nutrețuri ca produse „multienzimatice” responsabile de un singur tip de activitate enzimatică, bazată pe acțiunea asupra unui substrat specific al nutrețului (Miles, 2002).
Sistemele multienzimatice (combinarea mai multor enzime: ex: proteaze, carbohidraze, lipaze) sunt mult mai benefice față de sistemele monoenzimatice, mărindu-se, astfel, șansa de a avea rezultate net superioare. Acestea oferă posibilitatea adaptării concentrației anumitor enzime, în funcție de particularitățile nutrețurilor în hrana animalelor (Pană, 2000). Astfel, utilizarea complexelor enzimatice, pe lângă rețetele de nutriție standard (pe bază de porumb), permit utilizarea unor rețete pe bază de orz, rețete pe bază de grâu sau rețete furajere cu 1-2% mai multă celuloză (Pop, 2006). Această posibilitate devine actuală, mai ales, în lunile de vară, când porumbul, ca ingredient de bază, devine deficitar.
Utilizarea eficientă a enzimelor ca aditivi furajeri presupune cunoașterea unor aspecte și anume:
– acționează asupra structurii chimice exacte a materiei prime, pentru degradarea ulterioară prin tratament enzimatic;
– modul specific de acțiune al enzimei; trebuie să se selecționeze acele enzime, care prezintă o temperatură și o valoare de pH optimă, foarte apropiate de condițiile fiziologice ale animalului gazdă;
– starea fiziologică a particularităților de digestie la speciile gazdă și interacțiunile dintre enzime cu secrețiile din tubul digestiv (Donkers, 1989, citat de Pop, 2006).
Enzimele furajere trebuie să îndeplinească anumite condiții:
Termostabilitate (rezistență la temperatura de granulare a nutrețurilor).
Rezistență la atacul proteolitic din stomacul și intestinul animal.
Activitate enzimatică maximă la modificările de temperatură și pH-ul fiziologic al suinelor sau la animalele la care se administrează.
Eficiență maximă, cu capacitate de dispersare rapidă și uniformă, pentru menținerea caracteristicilor timp îndelungat (se preferă produsele sub formă de pulbere uscată, comparativ cu cea lichidă), chiar și în condițiile introducerii lor în premixuri vitamino-minerale sau în alte condiții de stocare (Hăbeanu și col., 2009, adoptat după Marinescu și col., 1977).
Activitatea enzimatică. Viteza de desfășurare a reacțiilor pe care le catalizează enzimele, poate fi multiplicată de 1012-1020), iar la finalul fiecărui ciclu de reacție enzima se regăsește neconsumată.
Siguranță – să nu fie nocive pentru animale și pentru consumatorii produselor de origine animală.
2.2. Importanața enzimelor din perspectiva valorii nutriționale
Un aspect important al implicării enzimelor în alimentația animalelor constă în valoarea nutrițională de efect, pentru optimizarea nutrițional-economică a rației furajere. Această valoare nutrițională rezultă în urma creșterii digestibilității substanței organice din rație ca răspuns al acțiunii enzimelor. Principalii răspunzători de acest factor sunt:
factorii antinutriționali (ex: celuloză, β-glucani, xilani, pentozani etc.) din unele materii prime specifice care s-au degradat;
conținutul celular disponibil în urma degradării pereților celulelor vegetale (ex: grâu, orz, secară – la monogastrice);
suplimentarea cu preparate multienzimatice complexe (amilaze, proteaze, lipaze etc.) a rației furajere, în special la tineretul suin.
În cazul suplimentării rației cu enzime a fost demonstrată experimental, atât la porcine cât și la păsări, o creștere cu 2-7% a valorii energiei metabolizabile aparente a rației (numită energie de efect sau extraenergie), la care se adaugă o creștere cu 3-4% (chiar 10%- Pop, 2002) a cantității de proteină digestibilă, respectiv aminoacizi digestibili din rațiile suplimentate enzimatic; aceste creșteri fiind mult mai evidente în cazul folosirii amestecurilor multienzimatice.
Pop (2000), menționează că reducerea variabilității calității nutrețurilor este un obiectiv urmărit în nutriția animală din perspectiva calității materiilor prime. De exemplu, porumbul boabe are o mare valoare energetică în funcție de soi / hibrid și de diverși factori de cultură (sol), însă suplimentarea cu enzime poare minimiza această variabilitate, pe baza maximizării digestibilității amidonului din porumbul de slabă calitate. Astfel, pentru rații pe bază de porumb-șrot de soia se recomandă utilizarea unui complex enzimatic (amilaze, xilanaze și proteaze) sau alfa-galactozidază în scopul degradării unor oligozaharide (rafinoza și stahioza) cu efect antinutritiv din șroturile de soia (Pop, 2006).
Preparatele enzimatice prezintă o multitudine de caracteristici:
sunt substanțe chimice care fac parte din clasa proteinelor, constituite dintr-o componentă proteică (apoenzimă), care le conferă specificitatea de substrat și o parte neproteică (coenzima) necesară pentru manifestarea activității enzimatice, conferind specificitate de acțiune;
sunt cei mai eficienți catalizatori cunoscuți care acționează în concentrații extrem de mici, însă manifestă o activitate extrem de intensă și reacții foarte rapide;
nu se consumă și nu se transformă în reacțiile catalizate; catalizează reacții termodinamice posibile, ce corespund unei diminuări a energiei libere;
orientează și măresc viteza reacțiilor biochimice, determinând scăderea energiei de activare a moleculelor de substrat asupra cărora acționează;
nu modifică starea finală de echilibru a reacțiilor ci măresc numai viteza cu care se realizează acest echilibru; se disting printr-o specificitate a funcției catalitice, determinând atât mecanismul de producere a unui anumit tip de reacție, cât și capacitatea de a recunoaște numai un anumit reactant denumit substrat;
asigură coordonarea, reglarea și controlul proceselor biochimice la care participă, modulând activitatea metabolismului celular;
acționează prin ameliorarea procesului de digestie și absorbție a substanțelor nutritive în intestinul subțire, ca urmare a degradării parțiale a pereților celulari ai materiilor prime, a reducerii vâscozității conținutului digestiv și prin completarea producției endogene de enzime; una din cele mai remarcabile proprietăți ale enzimelor este capacitatea lor de a acționa preferențial pe anumite substraturi, proprietate denumită specificitate enzimatică (Hăbeanu și col., 2009).
2.3. Scopul utilizării enzimelor exogene și efectele produselor enzimatice
Efectul nutritiv și productiv al produselor enzimatice obținute în urma adaosului ca aditivi furajeri, se materializează prin:
posibilitatea utilizării în proporții mai mari în rațiile monogastricelor a unor componente furajere cu nivele mai ridicate de celuloză brută (orz, ovăz) sau de poliglucide neamidonoase (grâu, orz, secară);
îmbunătățirea substanțelor nutritive;
creșterea cu 6-8% a valorii energiei metabolizabile a grăunțelor de cereale;
îmbunătățirea indicilor de valorificare digestivă a substanțelor nutritive din nutrețurile rației furajere;
creșterea sporului în greutate la tineret cu 5-8%, a producției (de ouă) cu 4-7%, în condițiile reducerii consumului specific cu 6-7%;
reducerea potențialului poluant al dejecțiilor; de exemplu, fitazele diminuează cu peste 30% conținutul în fosfor al dejecțiilor la monogastrice.
2.4. Cercetări privind utilizarea preparatelor enzimatice exogene în hrana monogastricelor
Până la sfârșitul anilor 1980, enzimele furajere au jucat un rol major în îmbunătățirea eficientizării produselor de origine animală prin modificarea profilului nutrițional al ingredientelor furajere (Bedford și Partridge, 2001), iar conceptul de adaos enzimatic în hrana suinelor cu scopul de a mări digestibilitatea nutritivă, se cunoaște și se aplică de mai multe decenii (Kerr și Shurson, 2013). Această tehnologie este într-o continuă dezvoltare, cu impact în deschiderea de noi perspective pentru hrana animalelor.
Enzimele utilizate au capacitate hidrolitică (scindarea macromoleculelor nutrienților în forme simple), absorbabilă (la nivelul peretelui intestinal) și metabolizabilă. Enzimele (endogene și sau exogene) participă la procesele metabolice din organism, având ca rol principal catalizarea reacțiilor biochimice specifice. Toate animalele folosesc enzime pentru a digera hrana. Acestea pot fi enzime produse de organismul animal sau prin intermediul microorganismelor ce se regăsesc în mod natural în intestinul acestora. Cu toate acestea organismul animal nu este 100 % eficient (Bedford și Partridge, 2001).
Enzimele digestive ale monogastricelor pot digera numai o parte din substanțele nutritive ale materiilor prime furajere. Organismul animalului monogastric este incapabil să sintetizeze unele enzime (β–glucanazele, celulazele, fitazele) și să valorifice eficient o serie de substanțe nutritive din nutrețurile vegetale (Rosen, 2000).
Adaosul enzimatic în furajarea suinelor și nu numai, are ca principal obiectiv degradarea poli și oligozaharidelor din pereții celulelor vegetale, până la forme simple cu greutate moleculară scăzută, facilitând procesul de absorbție intestinală. O cantitate însemnată de substanțe nutritive din nutrețuri, nu sunt total digerate de animale fapt ce limitează utilizarea lor în rețetele furajere. Din aceste motive, formulele de nutrețuri destinate porcilor și păsărilor se bazează în principal pe utilizarea uneia sau mai multor surse de amidon combinate cu o sursă de proteină (ex: porumbul și șrotul de soia reprezintă ingredientele standard pentru nutriția animală, Hăbeanu și col., 2006).
In 1999, Lungs și Nielsen, susțin că observarea efectelor benefice ale suplimentării enzimatice la suine sunt mult mai evidente la tineret, mai ales în perioada înțărcării, acestea fiind și o modalitate de minimizare a costului hranei prin reformularea rețetelor de nutrețuri combinate pe tot intervalul de creștere – îngrășare (citat de Pop, 2006). Un exemplu ce întărește afirmația efectului adaosului de enzime în rețetele starter de nutreț combinat pentru tineretul porcin este prezentat în Tab. 2.1. Astfel, rezultatele sintetice a celor trei experiențe au fost pozitive, în toate cazurile, purceii cu rația suplimentată enzimatic au realizat sporuri în greutate mai mari și au prezentat o mai bună conversie a hranei în sporul de creștere, cu o reducere a incidenței diareice.
Tab. 2.1. Rezultate experiment pe tineret suin, cu hrană suplimentată enzimatic (după Inborr, 1989, citat de Pop, 2006)
Tab. 2.1. Results of some experiments on young swine, feed supplemented with enzymes (after Inborr, 1989, cited by Pop, 2006)
* – . % Kemzyme PS, CS = consum specific, SMZ = spor mediu zilnic.
Există mai multe modalități de includere a preparatelor enzimatice în hrana animală, precum:
Introducerea directă în furajul uscat administrat animalelor. Produsul enzimatic adăugat ca atare ca orice alt aditiv furajer, începe să acționeze în tractul digestiv animal, datorită contactului cu anumiți parametrii (apă, temperatură și pH).
Produsul enzimatic se prezintă sub formă:
– solidă (pulbere sau granule), însă prezintă dezavantaje legate de mecanismul de omogenizare, separare;
– lichidă, se poate aplica prin pulverizare pe furajul finit după granulare; această tehnică este de regulă mai ieftină și mai ușor de gestionat;
Pretratarea materiilor prime determină startul acțiunii enzimelor înainte de procesul de producere/preparare a furajului, are loc o adevărată predigestie a unor nutrienți (se pot pierde anumite forme nutriționale de interes).
Includerea în sistemele de hrănire umedă sau lichidă, situație în care enzimele încep să „muncească” în furajul hidroscopic și continuă în tractusul gastro-intestinal animal.
Utilizarea enzimelor exogene în nutriția monogastricelor urmărește rezolvarea următoarelor probleme:
Creșterea valorii nutritive din materia primă (Classen și col., 1985; Bedford, 2000).
Diminuarea variației calității nutrienților din ingrediente. Răspuns benefic la adaos de enzime exogene în materiile prime slabe din punct de vedere calitiativ, respectiv minimizarea incidenței de așternut umed. Hrana bogată în orz, secară, ovăz, triticale și într-o măsură mai mică în grâu, conduce, de cele mai multe ori, la apariția unui gunoi de grajd vâscos (Bedford, 2000).
Inhibarea acțiunii factorilor antinutriționali prezenți în nutrețuri (responsabili de efectele dăunătoare asupra procesului de digestie și asupra sănătății animalelor).
Creșterea accesibilității enzimelor endogene la substanțele nutritive.
Compensarea organismului animal tânăr, la nivelul tubului digestiv imatur, care nu deține enzime capabile să scindeze unele legături chimice. La animalele tinere maturizarea enzimatică este progresivă, iar una din perioadele cele mai critice este înțărcarea (îndepărtarea puiului de mamă). În acest interval scurt se produce o trecere bruscă de la regimul alimentar lactat (laptele matern) la cel uscat, mai exact o furajare bogată în amidon (ex: porumb) și celuloză brută. Astfel, pentru digestia acestor poliglucide sunt necesare cantități mari de amilaze (pentru amidon) și de celulaze, care pot fi adăugate ca suplimente alimentare în nutrețul animalului.
In principiu, adăugarea preparatelor enzimatice ca aditivi furajeri urmărește găsirea unor soluții în rezolvarea situațiilor neplăcute precizate anterior. In Tab. 2.2 sunt redate sintetic mai multe cercetări cu privire la utilizarea enzimelor furajere în hrana porcinelor.
Tab. 2.2. Rezultate privind utilizarea enzimelor la suine (după Pop, 2006)
Tab. 2.2. The results of using enzymes in swine nutrition (after Pop, 2006)
* = cu semnificație statistică a diferențelor. S-au îmbunătățit următorii indicatori: LWG = spor în greutate vie; FCR = consum specific de hrană; DDM = digestibilitatea substanței uscate; DST = digestibilitatea amidonului; DP = digestibilitatea proteinei; DE = digestibilitatea energiei; DF = digestibilitatea grăsimilor; DBG = digestibilitatea beta-glucanilor.
Enzimele exogene utilizate curent în hrana suinelor sunt: carbohidraze, fitaze, amilaze, proteaze, lipaze, precum și siteme multienzimatice (amestecuri de enzime).
În Tab. 2.3 sunt prezentate o parte dintre enzimele furajere, modul de acțiunea al acestora, substraturile specifice și domeniul de aplicabilitate.
Tab. 2.3. Enzime de uz furajer (după Crăiniceanu, 2006)
Tab. 2.3. Enzymes used as feed additives (after Crainiceanu, 2006)
2.4.1. Carbohidraze
In general, în masa furajeră predomină următoarele structuri complexe: fibre, proteine, amidonul și acidul fitic.
Carbohidrații din plante, numiți și hidrați de carbon sau glucide, pot fi clasificați în trei categorii:
zaharuri simple și conjugatele acestora (glucoză, fructoză, maltoză etc.);
compuși de stocare sau de rezervă (amidon);
carbohidrați structurali (celuloză, hemiceluloză, lignină).
Zaharurile simple și conjugatele acestora sunt digerate în principal, în tractul gastrointestinal superior al porcilor, însă nu complet; în timp ce carbohidrații structurali sunt degradați doar parțial de către microflora din cecum și intestinul gros. Cea mai mare parte a amidonului este îndepărtat din porumb, pentru producerea etanolului și producția de zahăr, iar din grâu pentru producția de făină. In urma acestui proces se obțin produse secundare bogate în proteine, minerale și fibre (Cowieson și Bedford, 2006). Principalul motiv pentru care se utilizează carbohidraze, constă în capacitatea acestora de a hidroliza complexul carbohidraților din hrana animalelor nerumegătoare, atunci când ingredientele din rația animală conțin cantități relative de fibră.
Prin fibră se înțelege structura complexă din ingredientele furajere, greu digerabilă de organismul animal (Kerr și Shurson, 2013). De exemplu, diferite fibre din hrana suinelor nu vor fi bine digerate de organismul acestora, iar ca rezultat, o mare parte de fibră va trece aproape intactă prin intestinul subțire. Singura posibilitate de descompunere a fibrei stă la baza procesului fermentativ realizat de către bacteriile și drojdiile de la nivelul cecumului și al intestinului gros. Degradarea peretului celular dur al furajelor fibroase de către enzimele exogene, conduce la un acces mai ușor al enzimelor proteolitice și celulolitice endogene, pentru digerarea proteinelor și a carbohidraților (Asmare, 2014).
Clasificarea enzimelor se realizează după substratul asupra căruia acționează (Bedford și Partridge, 2001); pot fi enzime care descompun fibre (polizaharide fără amidon = NSP), proteine, amidon și fitați (Asmare, 2014).
In urma administrării unei diete mai sărace în nutrienți, adminstrarea enzimei carbohidrază în nutrețul monogastricelor, diminuează în mod substanțial variația dintre eșantioanele bune și cele rele (de la efectiv la efectiv), contribuind la îndeplinirea cerințelor nutritive ale animalului (Bedford, 2000).
Bedford, în lucrarea sa din anul 2000, clasifică enzimele în trei categorii distincte, în funcție de substratul asupra căruia acționează:
a) Cereale vâscoase (secară, grâu, ovăz, triticale și orz).
b) Cereale nevâscoase (porumb și sorg).
c) Fitază.
Cerealele vâscoase și cele nevâscoase sunt, în general, produse bogate în carbohidrați.
Enzimele ce descompun carbohidrații (acționează asupra hidraților de carbon și îi descompun în zaharuri simple, monozaharide) se numesc carbohidraze: amilaza, maltaza, celulaza, hemicelulaza.
Cerealele păioase posedă calități nutriționale ridicate datorită conținutului bogat în glucide; de obicei sunt puțin utilizate în hrana porcilor și păsărilor. Aceste cereale conțin cantități însemnate de compuși din grupul hemicelulozelor (arabinoxilani, glucani), ce nu pot fi degradați de enzimele endogene ale animalelor. In cazul unei furajări cu cereale păioase, ingerarea masivă a acestor compuși are efecte negative asupra performanțelor zootehnice, având ca rezultat scăderea calitativă a carcasei.
Hemicelulozele intră în constituția membranei celulei vegetale și nu pot fi degradate de enzimele endogene ale animalului. Din aceste motive hemicelulozele sunt încadrate drept factori antinutriționali. Pentru rezolvarea acestor probleme, se incorporează în nutreț enzime exogene (glucanaze, xilanaze), cu potențial inhibitor asupra acestor factori antinutritivi. Aceste preparate enzimatice au rolul de a hidroliza hemicelulozele transformându-le în molecule mai mici (polizaharide). Rezultatele experimentelor pe animalele supuse unui hrăniri pe bază de cereale grosiere, suplimentate sau nu cu preparat enzimatic și compararea performanțelor de creștere (spor mediu zilnic, consum mediu zilnic) au demonstrat importanța acestor enzime în alimentația animalelor (Beckers șiThéwis, 2004).
In prezent, xilanazele și glucanazele sunt curent utilizate în nutrețurile monogastricelor (grâu, orz, secară, triticale), pentru ameliorarea valorii energetice și proteice a hranei. Eficacitatea acestor enzime este variabilă în funcție de hrana administrată, natura enzimei utilizate, activitatea microbiană din tubul digestiv, vârsta animalelor, eventualele tratamente termice la care au fost supuse nutrețurile (Garcia și col., 2008; Kiarie și col., 2007).
Cereale cu consistență vâscoasă. Din categoria enzimelor polizaharidice neamidonoase (NSP), carbohidrazele au primit cea mai mare atenție. Cerealele vâscoase induc creșterea vâscozității intestinale, caracteristică ce încetinește rata de digestie. Structura fizică a pereților celulari endospermici, poate împiedica accesul enzimelor endogene la conținutul cerealelor. Adăugarea enzimei potrivite poate diminua aceste constrângeri, permițând digestiei să aibă loc într-un ritm mai rapid și complet. Vâscozitatea intestinală ridicată cauzată de solubilitatea β-glucanilor și arabinoxilanilor (pentozani) din cerealele vâscoase poate fi depășită prin adăugarea β-glucanazelor și xilanazelor, în vederea îmbunătățirii performanțelor animalelor (Bedford și Morgan, 1996).
Cereale nevâscoase (porumb și sorg). S-a demonstrat că variabilitatea porumbului are un impact mult mai benefic decât aceea observată la grâu și orz (Leeson și col., 1993, citat de Bedford, 2000).
Indiferent de mecanismul de acțiune, utilizarea enzimelor asupra cerealelor nevâscoase (greu digerabile) impune o creștere a digestibilității nutritive:
– din punct de vedere calitativ, reducerea variației dintre utilizarea unor probe cu cereale foarte bune, comparativ cu probe care conțin și boabe mai proaste calitativ;
– creșterea conținutului nutrițional din cereale.
Răspunsul la adăugarea de enzime este mediat prin îmbunătățirea extracției nutrienților în intestinul subțire de către celula gazdă, printr-o digestie accelerată și prin reducerea activității microbiene, ca urmare a limitării substratului în ileon. Studiile au arătat că suplimentarea cu enzima carbohidrază a contribuit la îmbunătățirea digestibilității substanței uscate (Nortey și col., 2007), a substanței organice și a energiei (Yin și col., 2000), a aminoacizilor la rețetele pe bază de grâu (Vahjen și col., 2007) și orz în nutriția animalelor monogastrice (citat de Asmare, 2014). De asemenea, s-au raportat studii că adaosul de carbohidrază poate răspunde pozitiv sau negativ, în urma suplimentării hranei la animale (Tab. 2.4).
Tab. 2.4. Suplimentarea hranei la monogastrice cu carbohidrază (Asmare, 2014)
Tab. 2.4. Monogastric feed supplementation with carbohydrase (Asmare, 2014)
2.4.2. Fitaze
Majoritatea cerealelor conțin cantități apreciabile de fosfor (element chimic foarte important pentru dezvoltarea oaselor și esențial în procesele metabolice la monogastrice), component anorganic puțin asimilabil de porci și păsări (12-50%), care se regăsește sub formă de acid fitic sau fitați (60-80%) (forma de stocare în plante) (Crăiniceanu, 2006).
Acidul fitic constituie principala sursă de fosfor pentru germinare (acidul fitic conține 282 g P/kg). Cunoscut ca acid myo-inozitol hexafosforic (IP6), inozitol polifosfat sau săruri ale acidului fitic a fost descoperit în 1903 ca un acid ciclic saturat, fiind compus dintr-un radical inozitol esterificat prin radical 6-fosfat. Se regăsește în toate tipurile de cereale integrale (orez, ovăz, mei, secară, grâu, triticale, sorg), leguminoase (linte, fasole, năut, soia), semințe oleaginoase (floarea – soarelui, in, susan, rapiță etc.), semințele de cereale (reprezintă în medie 70 % din fosforul total (Pop, 2006).
Fitatul este o sare a acidului fitic, un compus polianionic, cu capacitate de chelare a cationilor încărcați pozitiv, în special calciu, fier și zinc (Humer și col., 2015), stabil și complex, acesta se produce în mod natural în plantele furajere (boabe, porumb, soia, Ricciardi, 2010). Reprezintă în medie 70% din fosforul total. Fitatul se regăsește în cea mai mare parte în ingredientele furajere vegetale într-o concentrație de la 5 la 25g/kg furaj și în majoritatea semințelor (5 g kg până la 20 g/kg, Asmare, 2014); cu toate acestea hrana monogastricelor conține între 8-12 grame de acid fitic/kg furaj (Selle și col., 2003).
Cercetătorul Ricciardi (2010) menționează că fitații compromit utilizarea altor nutrienți alimentari, inclusiv proteine, amidon și lipide. La animale există patru surse enzimatice fitice: fitază de la nivelul mucoasei endogene, fitază din microflorala intestinală, fitază vegetală și fitază microbiană exogenă.
S-a demonstrat că fitații, mai mult decât fibrele (celuloza, hemiceluloza, pectine, etc.) sunt responsabili de problemele de disponibilitate a mineralelor în special Ca (calciu), Mg (magneziu), Zn (zinc), Fe (fier), Cu (cupru).
La porc, maladiile precum osteofibroza, parakeratoza (carența în Zn datorită unui consum excesiv de cereale) constituie un exemplu clasic al efectului fosforului fitic alimentar în exces, asupra indisponibilității mineralelor de interes nutrițional. O moleculă de acid fitic captează în medie 3-6 moli de Ca în fitat de calciu (formă insolubilă prin care ambele minerale devin indisponibile pentru organismul animal) (Pop, 2006, citat de Hăbeanu și col., 2009).
Bedford (2000) menționează că ingredientele furajere din punct de vedere al conținutului fitic variază considerabil, disponibilitatea fitatului pentru hidrolizarea fitazei exogene variând de la ingredient la ingredient (Ravindran și col., 1999, citat de Bedford, 2000). Acidul fitic reprezintă o parte din rezerva de fosfor și glucide care sunt utilizate de plantele în germinație. În acest caz, acidul fitic sau fitații de Na (sodiu), K (potasiu), Mg (magneziu), trebuie să fie hidrolizate pentru eliberarea ortofosfaților și inozitolului, enzimele responsabile fiind fosfatazele, fitazele. În cereale, acidul fitic este asociat structurii particulare a bobului. În orez și grâu, este prezent în bobul de germinare, dar înainte de toate în înveliș (pericarp, coajă și aleuron), principalul strat de acumulare fiind stratul aleuronic. La porumb acidul fitic se află în germeni, în timp ce la leguminoase este dispersat în cotiledon, fiind asociat cu masa proteică.
Conținutul mediu de P fitic este în jur de 0,2% în substanță uscată (SU) cu variații destul de puține de la o cereală la alta. Proporția în P vegetal total este de la 50 la 85% și poate avea consecințe asupra fosforului vegetal nefitic (fosfolipide, fosfoproteine, nucleoproteine), considerat disponibil, adică utilizabil de către animal.
Fosforul fitic pentru a fi absorbit de către organismul animal, trebuie să fie degradat, hidrolizat, cu ajutorul uneia sau a mai multor enzime fitice.
Fitazele sunt enzime exogene cu rol în descompunerea prin hidroliză a grupărilor de acid fitic (fitat) nedigestibil, insolubil, ce se regăsește în boabele și semințele oleaginoase, în molecule de ortofosfat și fosfați inozitolici, disponibile pentru absorbția în intestin (McDonald și col., 2010). Fitazele sunt prezente în plante în mod natural sau sunt induse de microorganisme.
2.4.2.1. Fitaze de origine vegetală
Fitazele vegetale nu prezintă importanță practică în nutriția animală, deoarece sunt sensibile la tratamentele termice aplicate fabricării nutrețurilor (granulare) și au activitate redusă la pH acid. Trebuie menționat faptul că se urmărește obținerea de plante modificate genetic în direcția producerii de fitaze bacteriene (Nyannor și col., 2009).
Studii efectuate cu fitaze au arătat că aceste enzime influențează pozitiv digestibilitatea aminoacizilor în intestinul subțire, precum și digestibilitatea calciului alimentar (Selle Ravindran, 2007, 2008); de altfel, includerea fitazei în rația suinelor a crescut disponibilitatea fosforului fitic într-o dietă pe bază de porumb – soia de la aproximativ 15% la 45% (sursă: www.agronext.iastate.edu).
Intr-un studiu pe suine la finisare, s-a raportat că suplimentarea hranei cu fitază a determinat o creștere liniară a digestibilității tuturor aminoacizilor, cu excepția prolinei și glicinei (Zhang și Kornegay, 1999).
Semințele din cereale conțin proporții însemnate de fosfor fitic. În absența enzimelor specifice –fitaze, fosforul fitic nu poate fi utilizat de către monogastrice, regăsindu-se direct în dejecțiile acestora (Pop, 2006). Fitazele vegetale au fost izolate din diferite surse: grâu, porumb, orz, orez, triticale, fasole, dovlecei, activitatea fitazică variând considerabil de la o specie vegetală la alta.
2.4.2.2. Fitaze de origine microbiană
Utilizarea fitazelor a început în 1990, în hrana suinelor (Selle și Ravindran, 2008) și a păsărilor (Selle și Ravindran, 2007). Fitazele de interes sunt cele de natură microbiană, fiind sintetizate de bacterii, drojdii și mucegaiuri.
In cele mai multe cazuri, fitazele comercializate sunt de natură fungică, fiind produse de Aspergillus niger (prima enzimă comercializată cu activitate fitică a fost Natuphos) și Peniophora lycci. Acestea se localizează la nivelul stomacului (la porc) sau la nivelul gușii (la păsări). Există studii care arată că fitazele de origine bacteriană (E. coli) ar putea fi mai eficace, pentru extragerea fosforului din fitați, datorită rezistenței ridicate la proteoliză, ceea ce le oferă posibilitatea de a acționa până în intestin.
Fitaza microbiană diferă de fitaza vegetală prin profilul „in vitro”, cu pH optim 2 sau 2,5, față de 5,5 la fitaza vegetală, care amplifică câmpul de acțiune la nivelul digestiei animalului. Asemănător cu fitazele din cereale, fitazele microbiene sunt inactivate la temperaturi crescute. Temperatura de păstrare a fitazei este 50C, pentru a se menține activitatea declarată la un nivel de 95%, timp de 2 ani. Datele precizează că anumite procedee de fabricație sau de distribuție a furajelor pot, fie să amorseze hidroliza fitazică, fie să inhibe enzima (căldura prea mare la granulare), modificând considerabil digestibilitatea fosforului fitic, iar enzima se dovedește a fi mai activă la nivel gastroduodenal, la un pH inferior de 6 (Jongbloed, 1992).
In prezent, fitazele sunt incluse în hrana porcilor și păsărilor în cantitate de minim 500 UI/kg nutreț. Adaosul de fitaze, la doze uzuale (500-1000 UI/kg) favorizează digestibilitatea fosforului și diminuează excreția cu până la 30%, fapt ce reduce concentrațiile de fosfor total în hrana monogastricelor și cererea de fosfor anorganic, necesarul de fosfor fiind acoperit de fosforul organic din nutreț (Pointillart, 1993).
Utilizarea fosforului mineral implică costuri ridicate pentru fabricarea nutrețurilor, iar pe de altă parte, porcii și păsările elimină cantități apreciabile de fosfor prin dejecții, fapt ce ridică probleme de mediu în zonele unde se găsesc crescătorii de monogastrice; putem spune că excesul de fosfor se concentrează în gunoiul animal, care poate fi utilizat ca îngrășământ pentru diferite culturi vegetale. Datele existente în literatură demonstrează că fiecare porc elimină între 1 și 1,3 kg fosfor în timpul vieții, reține, în medie 36% din fosforul ingerat, excretă 55% pe cale fecală și 9% pe cale urinară. In prezent fitazele disponibile sunt capabile să extragă fosforul din fitați, în procent de mai puțin de 35% la păsări (Selle și Ravindran, 2007) și de aproximativ 50% la suine (Selle și Ravindran, 2008).
Posibilitatea obținerii unor fitaze care să extragă mai mult fosfor ar însemna o imensă realizare în ceea ce privește acoperirea necesarului de fosfor organic, pentru hrana monogastricelor, deoarece porcii sănătoși nu reușesc să-l digere complet (Ricciardi, 2010). Aceste enzime ar diminua eliminarea fosforului prin dejecții și ar reduce utilizarea resurselor neregenerabile de fosfor anorganic.
Bedford (2000) susține că adaosul de fitază, a fost inițial utilizat pentru creșterea disponibilității fosforului fitic din plante, reducerea poluării cu fosfor și utilizarea unor cantități mai mici de fosfat anorganic. Pop (2006) a specificat, în schimb, că suplimentarea cu fitaze microbiene a hranei animalelor, poate contribui la reducerea consumului de suplimente minerale bogate în fosfor (în general fosfați).
Fitaza nu este o sursă bună de fosfor pentru tineretul suin, deoarece organismul acestora este incapabil de a utiliza acest compus, chiar dacă enzimele fitice au fost izolate din intestinul subțire al acestuia (Bedford, 2000). Fitazele desfac grupările fosfat ale fitaților, iar moleculele de fosfat rezultate prin procesul de hidroliză, devin disponibile pentru absorbția în intestin. S-a demonstrat că aceste enzime acționează în sensul păstrării unui echilibru calciu – fosfor apropiat de valoarea 1 (Selle și col., 2009).
2.4.2.3. Factorii de influență asupra activității fitazice
Activitatea fitazică poate fi influențată de următorii factori:
umiditatea: fitaza este o enzimă hidrolitică ce acționează conjugat cu aerul cald și umiditatea saturată, poate hidroliza până la 30% din fitații din grâu și fasole;
pH-ul: fitazele vegetale sunt active la pH = 5 și sunt foarte sensibile la variații ale pH-ului prea acid sau prea alcalin. Fitazele vegetale nu pot fi active în stomacul animalelor, acest fapt a fost confirmat la porc cu ajutorul canulelor duodenale (Pointillart, 1994).
căldura: pentru grâu, porumb, triticale și fasole optimul de activitate este situat în jur de 500C; în practică, supunerea ingredientelor furajere la cald (granulare) poate fi o problemă decisivă în conservarea activității fitazice și cu consecințe asupra digestibilității fosforului fitic din acestea;
frigul: nu afectează activitatea fitazică, însă congelarea antrenează formarea cristalelor de gheață care se așează între enzimă și substrat, conducând la ruperea membranelor.
Activitatea fitazică poate fi influențată și de alți factori:
calciul și anumiți ioni metalici formează fitați stabili rezistenți la atacul enzimelor;
combinarea fitaților cu proteinele, sub formă de complexe;
conținut ridicat în fitați la anumite făinuri de cereale pot să inhibe acțiunea fitazelor (Pop, 2006).
In concluzie, putem spune că adaosul de enzime de tipul fitazelor, poate fi o posibilitate de îmbunătățire a performanțelor productive, în special pentru monogastrice.
2.4.3. Proteaze, amilaze, lipaze
Proteaza este termenul general utilizat pentru enzimele responsabile de degradarea legăturilor peptidice proteice, până la aminoacizi. Acestea pot cataliza și reacția inversă de sinteză a unor legături peptidice. Prima utilizare a proteazei în nutriția suinelor a fost raportată de Cunningham și Brisson (1957), care au efectuat o predigestie a ingredientelor furajere cu adaos proteazic, însă nu s-a înregistrat o îmbunătățire a performanțelor de creștere ale suinelor
Proteazele au fost adăugate în hrana monogastricelor de foarte mulți ani, sub formă de amestec enzimatic compus din xilanaze, pectinaze, glucanaze, amilaze etc. (Cowieson și Adeola, 2008; citat de Asmare, 2014), pentru a descompune proteinele din diverse materii prime vegetale, respectiv elementele proteice antinutritive din proteina vegetală. O mare parte din componenții din hrana animalelor nu sunt descompuși de enzimele digestive endogene, iar animalul pierde astfel, unii nutrienți potențiali (McDonald și col., 2010, citat de Asmare, 2014).
Fuller (2004) menționează că enzimele se utilizează ca aditivi furajeri în general în hrana nerumegătoarelor (monogastrice), dar acestea pot fi adăugate și în hrana rumegătoarelor. In creșterea monogastricelor pe lângă adaosul de enzime care lipsește din echipamentul enzimatic al acestor animale (fitaze, xilaze, glucanaze, etc.) se practică și adaosul de enzime exogene de origine bacteriană sau fungică (amilaze, proteaze, lipaze) cu scopul de a ridica potențialul enzimatic, pentru îmbunătățirea biodisponibilității substanțelor nutritive. Efectul urmărit în acest caz constă în eficientizarea hranei, materializată prin creșterea performanțelor zootehnice. Majoritatea studiilor privind efectele nutriționale ale amilazelor, lipazelor și proteazelor exogene s-au efectuat cu amestecuri de enzime (sisteme multienzimatice), cel mai adesea xilanază + amilază + protează. Există puține studii în care se urmărește efectul unei singure enzime.
Caine și col., (1997) într-un experiment pe purcei în criza de înțărcare, au tratat făina de soia cu specia Bacillus subtilis, cunoscută ca producătoare de protează, în scopul diminuării efectelor adverse provocate de factorii antinutritivi din aceasta. Aceștia au observat că proteaza induce scăderea aminoacizilor digestibili de la 68,7 % la 63,9%.
Rolul proteazelor de origine fungică (Aspergillus sp.) sau microbiană (Bacillus sp.) nu constă numai în mărirea capacității enzimatice a organismului animal; studiile experimentale cu utilizare de proteaze au demonstrat că cele de origine fungică sau bacterienă pot inactiva in vitro unii factori antinutriționali (inhibitorii de tripsină și lectină) din boabele crude de soia (Hong și col., 2002) și pot reduce efectele imunologice ale unor proteine (Thorpe și Beal, 2001).
2.4.4. Amestecuri de enzime
Adaosul de enzime exogene în hrana suinelor și păsărilor urmăresc în general efectul amestecurilor de enzime (sisteme complexe sau multienzimatice). Cel mai adesea se utilizează preparate enzimatice compuse dintr-o fitază asociată cu o enzimă care hidrolizează hidrații de carbon (alții decât amidonul), preparate enzimatice constituite dintr-o protează și o amilază etc. Studiile sunt efectuate în scopul obținerii de aditivi furajeri, pentru a stabili dacă asocierea diferitelor tipuri de enzime au efect sinergic sau antagonist asupra performanțelor zootehnice ale animalelor.
Un aspect interesant privind utilizarea amestecurilor de enzime îl reprezintă asocierea unor enzime exogene care să mențină performanțele animalelor, în cazul administrării unor rații alimentare cu deficit energetic și proteino-mineral sau a unor rații pe bază de porumb și șrot de soia (Tahir și col., 2008; Olukosi și col., 2007a, 2007b).
Hong și col., (2002) au demonstrat că utilizarea unui complex enzimatic format din xilanază, amilază și protează, contribuie la mărirea digestibilității rației bazate pe porumb-șrot de soia, la pasări. Adăugarea de fitază în preparatul enzimatic menționat mai sus, determină o creștere cu 50% a performanței păsărilor, acest procentaj fiind datorat adăugării de fitază; s-a constatat că adaosul de enzime exogene la o vârstă mai tânără este mult mai benefic, iar retenția nutrienților a scăzut cu înaintarea în vârstă la puii de găină.
In Finlanda, s-au efectuat cercetări pe suine, în care s-au înlocuit ingredientele furajere tratate termic din rețeta starter cu ingrediente netratate termic, dar suplimentate enzimatic cu produsul Porzyme (celulază și xilanază de Trichoderma reesii și alfa-amilază de Bacillus subtilis). Rezultatele obținute nu au evidențiat o reducere a performanței productive; s-a înregistrat o îmbunătățire a vitezei de creștere, plus o valorificare superioară a hranei, în cazul lotului ce a primit Porzyme (Donkers, 1989, citat de Pop, 2006).
CAPITOLUL III. STUDII EFECTUATE IN ROMÂNIA, PRIVIND UTILIZAREA ENZIMELOR EXOGENE ÎN HRANA MONOGASTRICELOR
3.1. Efectul enzimelor exogene în hrana suinelor
Sectorul agricol suin ocupă un loc important în economia lumii, dat fiind consumul ridicat de carne de porc și a subproduselor acestuia. Bogată în proteine și minerale de calitate superioară, carnea de porc contribuie la funcționarea în parametrii normali al corpului uman. Caracteristicile nutriționale din carnea de porc sunt în strânsă corelație cu mai mulți factori, cum ar fi: specia animalului, sexul, vârsta, hrana, sezonul și metodele de prelucrare și preparare a cărnii destinate consumului uman (Soare și col., 2015).
România are o tradiție îndelungată în ceea ce privește creșterea porcinelor în sistem gospodăresc, dar și în sistem industrial. Înainte de 1989, se creșteau 18-19 milioane de porci, majoritatea destinați exportului, iar după 1989, multe dintre unitățile profitabile în creșterea suinelor s-au privatizat sau au renunțat la această activitate.
Potrivit bazei de date ,,Food and Agriculture Organization” (FAO), în 2010, România a ocupat locul 10 în producția de porcine, având 3,1% din numărul de porci existent în Europa. Germania este țara cu cel mai mare număr de porci, fiind urmată de Spania, Federația Rusă, Polonia, Franța, Danemarca, Olanda, Italia, Ucraina, Belgia, România etc. (http://www.dce.gov.ro). Pentru îmbunătățirea și eficientizarea productivității zootehnice, în biotehnologiile actuale se folosesc enzime libere, enzime și celule microbiene imobilizate. Comparativ cu enzimele libere, enzimele imobilizate simplifică mult procesul biotehnologic, reducând considerabil costurile și permițând realizarea continuității procesului. Celulele microbiene imobilizate reprezintă un mijloc de biocataliză industrială, deoarece în acest caz acționează sisteme polienzimatice, pentru obținerea unui produs final și a unui sistem ce permite regenerarea cofactorilor enzimatici (Raicu și col., 1990).
În 1977, Marinescu și col. au testat influența administrării unor enzime furajere românești-proteaza bacteriană și celulaza Cx, obținute de ICCF București, asupra performanțelor de creștere și eficientizarea utilizării hranei la tineretul porcin. Rezultatele experimentelor efectuate au dovedit că administrarea proteazelor ICCF la purcei înțărcați, a influențat pozitiv ingestia de hrană și sporul mediu zilnic, prin îmbunătățirea hranei și conversia proteinei în spor cu peste 10%.
Intr-un studiu, în care s-a urmărit reducerea fosforului anorganic din nutreț combinat (NC), valorificarea eficientă a potențialului bioproductiv al resurselor vegetale prin adaos de enzimă microbiană (fitază) și reducerea fosforului din dejecții, rezultatele obținute au arătat că reducerea cu 50% a fosforului anorganic din NC și adaosul de fitază nu au modificat performanțele zootehnice ale animalelor. Cantitatea de Ca, Mg și Zn absorbită a fost mai mare la loturile ce au primit fitază, iar analiza dejecțiilor a aratat că loturile care au primit enzimă în furaj, a eliminat o cantitate de Ca și Fe mai mare, iar cantitatea de P și Mg eliminată s-a redus (Hăbeanu și col., 2001).
Studiul comparativ a 2 structuri de nutreț pentru tineret porcin cu mazăre + șrot de rapiță și șrot de soia + șrot de rapiță, cu adaos de preparat enzimatic Kemzyme VP Dry (1 kg/1000 kg NC), compus din: α-amilază, bacilolizină, endo-β-glucanază, β-glucanază și endo-β-xilanază a demonstrat că preparatul enzimatic a îmbunătățit potențialul bioproductiv al resurselor proteice materializat prin performanțe superioare, față de loturile care nu au primit enzimă. Adaosul enzimatic Kemzyme VP Dry a îmbunătățit conversia hranei, fiind explicată prin creșterea gradului de absorbție a substanțelor nutritive (Hăbeanu și col., 2006).
Hăbeanu și col., (2009) a studiat influența a două preparate enzimatice complexe, asupra performanțelor productive ale tineretului porcin. Cele două preparate enzimatice utilizate au fost: VEGPRO (un complex enzimatic: protează, amilază și celulază) produs de Alltech și SUINZIM (un complex plurienzimatic: protează, amilază și celulază) obținut din cultură de Aspergillus oryzae în INCDBNA Balotești. Preparatele enzimatice au condus la îmbunătățirea performanțelor zootehnice: creșterea greutății corporale față de martor a crescut cu 4% în cazul utilizării SUINZIM și cu 2% în cazul utilizării VEGPRO; creșterea sporului mediu zilnic față de martor a crescut cu 6% în cazul utilizării SUINZIM și 3% în cazul utilizării VEGPRO; consumul specific s-a redus cu 2% față de martor la lotul care a primit SUINZIM. Influența SUINZIM asupra performanțelor productive a fost superioară produsului VEGPRO, posibil datorită concentrației mai mari de enzime.
Utilizarea unui preparat multienzimatic (amilază, protează și celulază), depus pe zeolit, obținut din cultura de Aspergillus niger cmgb 401, produs de INCDSB și BIOTECHGEN a fost introdus în cantitate de 2 și 5 kg/tona NC, pentru evaluarea influenței preparatului asupra purceilor în criza de înțărcare și stabilirea nivelului optim de administrare a preparatului. Din rezultatele obținute s-a constatat că preparatul enzimatic nu a avut influențe semnificative asupra parametrilor zootehnici, probabil datorită faptului că nutrețul a fost echilibrat din punct de vedere nutrițional. S-a înregistrat o creștere a conversiei hranei cu 1,52% și 4,04% la loturile care au primit 2 grame de preparat enzimatic, respectiv 5 g/1000 kg NC. Rezultatele obținute sugerează că eficiența preparatului enzimatic ar fi mai pronunțată în cazul administrării ei în formule de nutreț cu deficit nutrițional (Hăbeanu și col., 2006).
3.2. Efectul enzimelor exogene în hrana păsărilor
În scopul diminuării poluării din halele de creștere a broilerilor în Biobaza INCDBNA a fost derulat un experiment în care s-a utilizat, adaosde fitază în hrană în cantitate de 0,1 și 0,3 g/kg NC. Rezultatele înregistrate au evidențiat faptul că suplimentul de 0,1 g fitază/kg NC în rația broilerilor cu nivel de 0,45/0,42 % fosfor disponibil, determină obținerea unor greutăți vii distinct semnificative (P<0,01) mai mari, comparativ cu varianta nesuplimentată. În plus, consumul specific a fost influențat benefic de prezența fitazei în furaj, iar adiția de 0,3 g fitază/kg NC a condus la diminuarea cantitativă de calciu și în special de fosfor din dejecțiile puilor la 20 și 40 de zile cu 2,13/1,55 față de lotul martor. Concentrația dejecțiilor și așternutului în amoniac, determinată la 22 și 45 de zile a relevat o scădere a acestuia prin adaosul în NC a dozei de 0,1 g și în special 0,3 g/kg fitază; depozitul de fier în ficat la 45 de zile a fost mai mare la variantele cu supliment de enzimă; nivelul de cenușă, calciu și fosfor din tibia puilor a fost influențată de cantitatea de fosfor total din rețetă, dar și de suplimentul cu fitază (Borcea, 2000, date nepublicate).
Un studiu pe puii broiler, privind evaluarea efectelor productive a diferitelor niveluri de șrot de rapiță, ca sursă alternativă la șrotul de soia în structura rețetelor de nutrețuri combinate, cu și fără adaos de complex enzimatic Kemzyme VP Dry (un complex enzimatic constituit din α-amilază, bacilolizină, endo-β-glucanază, β-glucanază și endo-β-xilanază) a demonstrat că:
suplimentarea rețetelor de nutrețuri combinate cu complexul enzimatic Kemzyme VP Dry nu a influențat semnificativ performanțele puilor broiler;
suplimentarea rețetelor de nutrețuri combinate cu complexul enzimatic Kemzyme VP Dry nu a influențat semnificativ performanțele puilor broiler (Gheorghe și col., 2005).
Utilizarea fitazei în hrana găinilor ouătoare în concentrație de 0,5 și 1,5 g/kg NC în variante de furaj cu cantități diferite de fosfor anorganic a condus la următoarele:
reducerea cu 50% a fosforului anorganic (fosfat monocalcic), nu a avut niciun efect în detrimentul producției de ouă sau a calității oului din punct de vedere comercial la adaos de fitază microbiană;
dieta pe bază de porumb și șrot de soia, nesuplimentată cu fosfor anorganic, dar cu adaos de fitază microbiană (Allzyme Phytase), în doza de 0,5 g/kg NC a susținut o performanță productivă maximă (Ciurescu, 2000).
Un studiu comparativ a 2 preparate enzimatice, Kemzyme HF (50mg/kg) și Allzyme Vegpro (50 mg/kg) a fost efectuat la găini ouătoare, pentru evaluarea performanțelor productive ale găinilor și calitatea ouălor în urma administrării unui nutreț în care șrotul de soia a fost înlocuită cu mazare netratată (Ciurescu, 2000). Din rezultatele obținute se constata că: înlocuirea șrotului de soia cu mazăre netratată nu a prezentat schimbări semnificative în performanța găinilor și consumului de hrană. Rata de producere a ouălor și calitatea acestora nu au fost influențate, excepție în cazul culorii galbenușului de ou care a fost mai intensă la rețeta cu mazăre. Rezultatele obținute au arătat că adaosul de preparat enzimatic Allzyme Vegpro, amestecul de enzime (Kemzyme HF + Allzyme Vegpro) și rația bazată pe mazăre, au îmbunătățit performanța găinilor. Adăugarea preparatului enzimatic Kemzyme HF nu a prezentat modificări în dieta pe bază de mazăre. Calitatea ouălor la găinile hrănite cu supliment enzimatic nu a prezentat diferențe semnificative, față de rația pe bază de mazăre fără adaos de enzimă și aceea pe bază de făină de soia.
PARTEA a II-a: CERCETĂRI PROPRII
SECTION II: PERSONAL RESEARCH
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR
Studiile experimentale efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat ,,Cercetări privind obținerea unor preparate enzimatice exogene și efectele utilizării acestora în hrana monogastricelor”, au ca obiectiv general elaborarea unor biopreparate bacteriene cu rol enzimatic și probiotic cu aplicabilitate de preferință în hrana monogastricelor (purcei în criza de înțărcare, 30±3 zile și pui broiler de găină, o zi), ce pot constitui o alternativă la antibiotice, în vederea îmbunătățirii parametrilor zootehnici.
Cercetările aprofundate pentru argumentarea temei de doctorat au vizat următoarele obiective majore:
Stabilirea ingredientelor furajere cheie și elaborarea recepturii de NC cu o valoare nutrițională adecvată.
Determinarea compoziției chimice a materiilor prime din NC, cât și analizarea acestora din punct de vedere microbiologic.
Analizarea in vitro a tulpinilor bacteriene, din punct de vedere calitatic (cultural, morfologic, biochimic, hemolitic) și cantitativ (enzimatic, rezistență pH, inducerea sucului gastric, rezistență la săruri biliare etc.) cu rol de aditiv furajer.
Obținerea de preparat enzimatic și stabiliriea procentului de includere în hrana purceilor în criza de înțărcare și a puilor broiler de găină.
Izolarea, identificarea și caracterizarea in vitro a 2 tulpini de Lactobacillus sp. din conținutul intestinal al unor păsări.
Obținerea de produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere prin parcurgerea etapelor unui proces biotehnologic (proces de atomizare).
Stabilirea microbiotei la monogastrice, atât la nivel de conținut intestinal (cecum și ileon), cât și din fecale, însoțită de evaluarea statistică a încărcăturii microbiene.
Analizarea parametrilor zootehnici în urma adaosului de preparat bacterian în hrana monogastricelor.
Prezenta lucrare oferă o serie de informații asupra unor probleme complexe cu implicații majore în creșterea și dezvoltarea monogastricelor, al căror sistem enzimatic este slab dezvoltat, cu precădere purcei în criza de înțărcare și pui broiler de găină. Administrarea unor surse enzimatice exogene și probiotice a reprezentat una dintre cele mai importante strategii, pentru îmbunătățirea eficacității utilizării substanțelor nutritive și pentru reducerea costurilor de hrănire în domeniul zootehnic (Zuo și col., 2015). Din acest motiv, oamenii de știință caută soluții care să permită intensificarea producției alimentare, reducând simultan costurile de producție prin respectarea standardelor de calitate și siguranță (atât pentru oameni, cât și pentru mediul înconjurător, Markowiak și Ślizewska, 2018).
Cele mai importante surse în producția de enzime a fost ocupat de microorganisme. Un randament ridicat al enzimelor bacteriene este redat de selectarea organismului potrivit, acesta ocupând un rol cheie pentru animalul gazdă (Pramod și Vishwanatha, 2010, citat de Dumitru și col., 2018).
Schimbarea dramatică a hranei de la furajare lichidă (colostru inițial, însoțit de lapte după naștere), la furajare solidă (îndepărtare de lângă scroafă, consum de NC), trebuie efectuată treptat, purcelul trecând printr-o serie de modificări fiziologice (Pluske și col., 2018; Pluske, 2017).
Suplimentarea hranei la purcei cu biopreparate enzimatice exogene poate contribui la îmbunătățirea valorii nutriționale a ingredientelor furajere, până când capacitatatea secretorie a enzimelor endogene (ɑ-amilază, proteaze și lipaze) se activează și se dezvoltă (Torres-Pitarch și col., 2017). Biopreparatele bacteriene au rol probiotic, permite utilizarea unor ingrediente a căror introducere în rație este limitată datorită conținutului în factori antinutriționali, fără a afecta performanțele bioproductive (greutatea corporală, spor mediu zilnic, consum specific, Bimrew, 2014).
Rațiile pe bază de plante sunt bogate în NSP, fiind greu digerabile și disponibile pentru monogastricele tinere, datorită structurilor complexe de la nivelul pereteleui celular. Suplimentarea cu carbohidraze poate contribui la creșterea digestibilității substraturilor prezente în fracția NSP-urilor (O’Neill și col., 2014). Majoritatea energiei disponibile în boabele de cereale provine din amidon, însă acest glucid este stocat la nivel intracelular, fiind parțial inaccesibil. Suplimentarea hranei la animale cu enzime exogene îmbunătățește procesul de digestie, acestea având capacitatea de a degrada NSP-urile de la nivelul peretelui celular, permițând accesul enzimelor pancreatice la nivelul componentelor nutritive blocate în interiorul peretelui. Odată cu adaos de enzime, din structura peretelui celular se eliberează oligozaharide sau chiar monozaharide, ce ar putea fi direct absorbite sau degradate de microflora intestinală cu eliberare de acizi grași volatili (VFA), animalul putând utiliza această sursă energetică (Bedford, 1995; O’Neill și col., 2014).
O atenție deosebită în practicile de gestionare a hranei, trebuie acordată perioadei de înțărcare, considerată etapa critică din viața purceilor, aceștia putând fi înțărcați înainde de maturizarea sistemelor imune și digestive, prin introducerea treptată a furajelor (Hăbeanu și col., 2016). Astfel, purceii pot fi înțărcați la 21, 28 sau 35 de zile, însă echipamentul enzimatic incomplet dezvoltat, provoacă modificări semnificative în fiziologia tractului gastrointestinal (GIT) însoțit de tulburări alimentare, fiziologice și imunologice (Choi și col., 2011; Pluske, 2013). La purcei, perioada după înțărcare, cât și în cazul tineretului avicol în primele zile de viață, apar diminuări ale greutății corporale însoțite de un consum redus de hrană, frecvență ridicată de tulburări digestive cu instalarea stărilor diareice (de origine bacteriană și/sau dietetică), și în final a morbidității și/sau mortalității animale (Heo și col., 2018). Pentru a ajuta la depășirea acestor dezechilibre, s-a recurs la introducerea unor aditivi furajeri în hrană, având ca puncte forte îmbunătățirea productivității, sănătății și bunăstării monogastricelor, cu efecte majore în ameliorarea controlului creșterii și reducerea severității problemelor digestive (Pluske, 2013).
De asemenea, Lactobacillus sp. reprezintă o alternativă la antibiotice fiind considerate surse probiotice cu impact benefic asupra sănătății, performanțelor și productivității puilor de găină (Shokryazdan și col., 2014). Tulpinile de Lactobacillus au o capacitate ridicată de a se atașa la epiteliul intestinal, fiind capabile să stabilizeze microflora puilor încă din prima zi după eclozare (Kizerwetter-Świda și Binek, 2016); lactobacilii pot fi considerați a fi flora bacteriană normală a tractului gastrointestinal (GIT). Tulpinile bacteriene utilizate ca probiotice trebuie izolate din microflora naturală GIT a aceluiași tip de animal pe care se intenționează a-l cerceta.
Pornind de la aceste considerente, conform datelor din literatura de specialitate, cu privire la eficientizarea hranei la monogastrice, prezenta lucrare cuprinde atât cercetări in vitro asupra tulpinilor bacteriene cu potențial probiotic, cât și validarea datelor prin testare biologică pe purcei în criza de înțărcare (hibrid Topigs, 30±3 zile) și pui broiler de găină (hibrid Ross 308, o zi) cu evaluarea performanțelor bioproductive la adaos de biopreparat bacterian în hrana acestora.
CAPITOLUL IV. MATERIALE ȘI METODE DE CERCETARE UTILIZATE
4.1. Introducere. Cadrul instituțional în care s-au desfășurat cercetările
Cercetările efectuate pentru elaborarea prezentei teze, s-au desfășurat în perioada 2016-2019, în cadrul Institutului Național de Cercetare Dezvoltare pentru Biologie și Nutriție Animală – IBNA Balotești (INCDBNA-IBNA), fiind în strânsă colaborare cu Laboratorul de Biotehnologii fermentative, Facultatea de Biotehnologii din Universitatea de Științe Agronomice și Medicină – Veterinară București. De asemenea, o parte din analize, respectiv obținerea policulturii probiotice pe bază de Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41) sub formă de pulbere s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biotehnologii fermentative din cadrul Institutului de Științele Vieții (ISV) Regele Mihai I al României din cadrul Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară (USAMV) din Cluj, 13-17 mai 2019, perioadă în care doctoranda a participat la un stagiu de pregătire și formare profesională în vederea consolidării cunoștințelor privind metoda de microîncapsulare a unui produs bacterian. Pentru realizarea și atingerea obiectivelor propuse, experimentele s-au desfășurat atât in vitro, cât și in vivo.
INCDBNA-IBNA este singurul institut național din zootehnia românească care în cei peste 45 de ani de activitate și-a dobândit un solid prestigiu național și internațional prin gama largǎ de activitǎți de cercetare-dezvoltare tehnologicǎ din domeniul nutriției și biologiei animale și a cǎrui strategie elaboratǎ pentru viitor ține seama de particularitǎțile agriculturii românești în corelație cu cerințele Uniunii Europene și mondiale. Institutul dispune de o biobază zootehnică experimentală, adaptată pentru realizarea de teste de nutriție pe principalele specii/categorii de animale de fermă (bovine, ovine, porcine, păsări); laborator de analiza nutrețurilor, produselor animale și probelor biologice acreditat ISO 17025, laborator pentru analize micotoxicologice, analize de serologie și imunonutriție animală, laborator de biotehnologie, linie de fabricație a NC, adaptată pentru realizarea de NC experimentale (șarje mici, variante experimentale numeroase); facilități de comunicare (calculatoare noi, bibliotecă, internet de mare viteză, amfiteatru, săli de ședinte, etc., Foto 4.1).
Cercetări in vitro. La nivel de laborator s-au analizat două tulpini din genul Bacillus (Bacillus subtilis ATCC 6051a-BS și Bacillus licheniformis ATCC 21424-BL) din punct de vedere cultural, morfologic, biochimic, hemolitic, enzimatic (determinarea activității amilazice, celulazice și proteazice), precum și unele proprietăți probiotice (rezistență pH 2 și 3 prin inducerea sucului gastric, rezistență săruri biliare, rezistența sporilor la temperatură, rezistența la antibiotice) în scopul administrării ca preparate enzimatice exogene în hrana monogastricelor (purcei în criza de înțărcare și pui broiler de găină). De asemenea, obținerea unui produs probiotic sub formă de pulbere pe bază de Lactobacillus salivarius, cercetări in vitro ce sunt detaliate în subcap. 5.4, reprezintă obiectivul principal al activităților prevăzute în Experimentul V.
Inainte de demararea experimentelor, materiile prime din componența recepturii de NC au fost analizate atât biochimic, în vederea evidențierii potențialului lor nutrițional pentru formularea unei rații furajere corecte, care să asigure cerințele specifice animalelor monogastrice, cât și microbiologic, pentru a se depista gradul de contaminare al acestora cu respectarea standardelor minime de siguranță.
Cercetări in vivo
Experimentul I (august – septembrie 2018) – a urmărit efectul utilizării unui preparat enzimatic pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a, în pondere diferite (1 și 3% v/w cu o concentrație de 1,6 x 109 CFU/ml), asupra performanțelor tineretului suin.
Experimentul s-a desfășurat pe un număr de 60 de purcei din rasa Topigs hibrid [(Large White× LargeWhite×Pietrain) × (Talent, preponderent Duroc)], înțărcați la 30 ± 3 zile, cu o greutate corporală de 8,41 ± 0,92 kg. Purceii au fost repartizați aleatoriu în 3 loturi omogene: Lotul Martor M (NC), lotul experimental E1 (NC + BS 1%) și lotul experimental E2 (NC + BS 3%), distribuite în 6 spații de cazare cu câte 20 purcei/lot (3 loturi x 2 repetiții x 10 purcei/lot). Durata experimentului a fost de 16 zile.
Experimentul II (august – septembrie 2018) a vizat efectul utilizării unui preparat enzimatic pe bază de Bacillus licheniformis ATCC 21424, în pondere diferite (1 și 3% v/w, 1,5 x 109 CFU/ml), asupra performanțelor tineretului suin.
Experimentul s-a desfășurat pe un număr de 60 de purcei din rasa TOPIGS hibrid [(Large White× LargeWhite×Pietrain) × (Talent, preponderent Duroc)], cu vârsta de 30 ± 3 zile, la o greutate medie inițială de 8,51 Kg, 16 zile. Purceii au fost repartizați aleatoriu în 3 loturi omogene: Lotul Martor M (NC), lotul experimental E3 (NC + BL 1%) și lotul experimental E4 (NC + BL 3%), distribuite în 6 spații de cazare cu câte 20 purcei/lot (3 loturi x 2 repetiții x 10 purcei/lot). Durata experimentului a fost de 16 zile.
Experimentul III (iunie – iulie 2019) a urmărit efectele utilizării unor biopreparate pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină, utilizând în nutrețul combinat șrot de soia. Doza de administrare a fost de 5 ml/kg furaj, cu o concentrație de 1 x 1011 UFC/ml.
Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 300 de pui broiler de găină din hibridul Ross 308, repartizați în 3 loturi omogene: lotul martor E (NC + șrot de soia), lotul experimental E1 (NC + șrot de soia + BS) și lotul experimental E2 (NC + șrot de soia + BL), cu câte 100 pui/lot (3 loturi x 4 repetiții x 25 pui/lot), pe o perioadă de 42 zile. Rețeta de NC a fost formulată pe bază de porumb, șrot de soia, gluten de porumb, fiind energo-proteică, conform recomandărilor nutriționale ale hibridului. Procentul de includere a șrotului de soia în structura NC a fost de 33,10% în faza de start, 31,56% în faza de creștere și 25,10% în faza de finisare. Structura și caracteristicile nutritive ale rețetei de NC, pe faze de creștere, utilizate în Experimentul III sunt prezentate în Tab. 4.3.
Experimentul IV (iunie – iulie 2019) a urmărit efectele utilizării unor biopreparate pe bază de Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler, utilizând în nutrețul combinat fasoliță ca resursă proteică locală. Doza de administrare a fost de 5 ml/kg furaj, cu o concentrație de 1 x 1011 UFC/ml.
Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 300 de pui broiler de găină din hibridul Ross 308, repartizați în 3 loturi omogene: lotul martor F (NC + fasoliță), lotul experimental F+BS (NC + fasoliță + BS) și lotul experimental F+BL (NC + fasoliță + BL), cu câte 100 pui/lot (3 loturi x 4 repetiții x 25 pui/lot), pe o perioadă de 42 zile. Rețeta de NC a fost formulată pe bază de porumb, fasoliță, gluten de porumb, fiind energo-proteică, conform recomandărilor nutriționale ale hibridului. Procentul de includere a fasoliței în structura NC a fost de 15%. Structura și caracteristicile nutritive ale rețetei de NC, pe faze de creștere, utilizate în Experimentul IV sunt prezentate în Tab. 4.4.
Experimentul V (iunie – iulie 2019) a vizat efectul administrării unei produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. (LS: Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41) obținut sub formă de pulbere prin procesul de atomizare, în hrana puilor broiler de găină, utilizând în nutrețul combinat atât varianta cu șrot de soia, cât și cu fasoliță. Ambele tulpini bacteriene au fost izolate, identificate și caracterizate (subcap 7.3.2) în cadrul Laboratorului de Biotehnologii din IBNA Balotești, acestea regăsindu-se în Colecția de tulpini bacteriene a Institutului. Procesul biotehnologic de obținere a policulturii probiotice de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere este detaliat în subcap. 7.3.2. Doza de administrare a fost de 1 gram/kg furaj conform datelor din literatura de specialitate, cu o concentrație de 1,62 x 108 UFC/gram. Experimentul s-a desfășurat pe un efectiv de 400 de pui broiler din hibridul Ross 308, repartizați în 4 loturi omogene: 2 loturi experimentale pentru varianta cu șrot de soia (lotul martor E hrănit cu NC + șrot de soia și lotul E+LS hrănit cu NC + șrot de soia + LS) și 2 loturi experimentale pentru varianta cu fasoliță (lotul martor F hrănit cu NC + fasoliță și lotul F+LS hrănit cu NC + fasoliță + LS), cu câte 100 pui/lot (4 loturi x 4 repetiții x 25 pui/lot), pe o perioadă de 35 zile; s-a utilizat aceeași rețetă de NC din Experimentul III și IV, martorul fiind comun conform variantei experimentale testate. Ințelegerea mai rapidă a cercetărilor desfășurate și a conexiunilor dintre acestea, poate fi urmărită prin intermediul schemei experimentale generale prezentate în Fig. 4.1.
NC = rețetă convențională pe bază de nutreț combinat; BS = Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL = Bacillus licheniformis ATCC 21424; LS = L. salivarius IBNA 33 + L. salivarius IBNA 41; aa =aminoacizi; NTF= număr total de fungi; NTG = număr total de germeni aerobi mezofili.
Fig. 4.1. Schema experimentală generală
Fig. 4.1. General experimental design
4.2. Material biologic
4.2.1. Suine – purcei în criza de înțărcare
In experimentele derulate în vederea atingerii obiectivelor vizate s-a folosit ca material biologic, preluat din Biobaza Experimentală a Institutului purcei din rasa hibridului comercial Topigs format pe linie maternă din încrucișarea porcilor a două rase (Large White și Pietrain), iar pe linie paternă din vierul terminal Talent. Vierul terminal Talent are în descendență rasa Duroc (Fig. 4.2).
Animalele au fost tratate în acord cu Legea 305/2006 privind manipularea și protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale și cu Protocolul experimental aprobat de Comisia de etică INCDBNA Balotești.
Potențialul genetic al animalului, sexul, vârsta, starea fiziologică, conținutul rației în substanțe nutritive, calitatea furajelor, nivelul de furajare, microclimatul din adăpost, sistemul de hrănire sunt principalele particularități de care trebuie să se țină cont cu privire la nutriția suinelor (Cuc și col., 2006).
Rațiile de hrană utilizate în experimente au avut în componență nutrețuri combinate, fabricate în cadrul FNC-ului ce aparține Institutului. NC administrat purceilor aflați în perioada de înțărcare a fost formulat, astfel încât să se asigure necesarul de substanțe nutritive. Această perioadă este cunoscută ca interval de stres pentru purcei, principalii factori constând în separarea purcelului de scroafă și trecerea de la furajarea lichidă, la furajarea grosieră.
X
Loturile experimentale. Animalele au fost repartizate în loturi omogene din punct de vedere al concordanței mediilor și varianțelor, pe variante experimentale, fiind cântărite individual la începutul, mijlocul și sfârșitul experimentului, dimineața pe nemâncate. Furajarea s-a efectuat în două tainuri (dimineață și prânz). De asemenea, consumul de hrană și resturile neconsumate au fost înregistrate zilnic pe tot intervalul derulării experimentului (Foto 4.2).
Foto 4.2. Recoltarea și înregistrarea resturilor furajere (Original)
Photo 4.2. Harvesting and recording of forage residues (Original)
Cazarea animalelor. Pentru toate loturile s-au asigurat condiții identice de adăpostire, experiențele fiind derulate în spațiu închis cu factori de mediu controlabili automat (temperatură, umiditate, luminozitate etc., Foto 4.3).
Hrănirea. Administrarea furajelor s-a făcut „ad-libitum” în două tainuri, furajul a fost administrat în formă măcinată, acesta fiind un caracter ce influențează cantitatea de furaj ingerată și implicit performanțele de producție.
Adăparea. Accesul purceilor la apă a fost permanent (pipete de sugere).
Sacrificarea animalelor. La finalul experimentelor (16 zile), s-a sacrificat un număr de 10 animalele (purcei în criza de înțărcare), accesul la hrană fiind restricționat (înainte cu 12 ore purceii nu au mai primit hrană), în vederea recoltării de probe conținut intestinal (ileon și cecum), în urma cărora s-a stabilit microbiota la adaos de preparat enzimatic exogen (Foto 4.4).
Foto 4.3. Cazarea purceilor pe toată durata experimentală (Original)
Photo 4.3. Piglets accommodation during experiment (Original)
Foto 4.4. Sacrificarea și prelevarea probelor de conținut intestinal (cecum și ileon) de la purcei (46 ± 3 zile) (Original)
Photo 4.4. Sacrifice and sampling prelevation of intestinal contents (cecum and ileum) from piglets (46 ± 3 days) (Original)
4.2.2. Păsări – pui broiler de găină
Experimetele derulate pe pasăre s-au efectuat pe pui broiler de găină, din hibridul comercial Ross 308.
Ross 308 este un hibrid robust, cu dezvoltare rapidă, conversie eficientă a furajului și cu randament bun al carcasei. Caracteristicile acestor hibrizi constă în creștere rapidă, conversie maximă a hranei și rezistența sporită la factorii de stres. Performanțele productive ale hibridului Ross 308, conform ghidului de creștere, sunt prezentate în Tab. 4.1 (Ross 308 Broiler – Broiler Management Guide, 2014).
In Fig. 4.3, conform Broiler Management Guide, 2014, se observă o creștere liniară până la vârsta de sacrificare.
În cele trei experimente s-au utilizat, în total, 800 de pui de carne, ne-sexați, din hibridul Ross 308. La vârsta de o zi, puii broiler au fost împărțiți în loturi omogene, formate prin cântărire individuală, astfel încât fiecare să conțină grupe (repetiții) de pui cu greutatea medie (greutate totală la ecloziune/număr total pui), mai mică și mai mare, față de cea medie. Durata experimentelor a fost de 42 zile pentru Experimentul III și IV, respectiv 35 de zile pentru Experimemtul V.
Tab. 4.1. Performanțe pui ne-sexați
Tab. 4.1. Chicken performance as hatched
Sursa: Ross 308 – Broiler Management Guide, 2014.
Fig. 4.3. Curba teoretică de creștere a hibridului Ross 308 Broiler
Fig. 4.3. Theoretical curve of growth of the Ross 308 hybrid Broiler
Inainde de începerea experimentelor s-a derulat planul de igienizare al halei iar popularea halei s-a realizat respectând principiul „totul plin, totul gol”.
Puii au fost cazați într-o hală cu condiții de microclimat similare unui adăpost dintr-o fermă de producție cu creștere la sol, pe așternut permanent (talaș) și în țarcuri separate pentru fiecare lot. Fiecare țarc are o suprafață de 10 m2, fiind dotat cu câte o eleveuză. Temperatura inițială a fost de 33°C, fiind redusă săptămânal cu 3°C, în conformitate cu ghidul de creștere al hibridului. Programul de iluminat a fost de 23 h lumină : 1 h întuneric, pe toată perioada experimentală. Vaccinarea puilor s-a efectuat conform programului sanitar-veterinar specific acestei categorii de păsări.
Hrănirea. Accesul puilor la furaj s-a făcut ad-libitum (la discreție). Furajul s-a prezentat sub formă măcinată. Au fost utilizate hrănitori tronconice, cu înălțime reglabilă (Foto 4.5). Cu 12 ore înainte de sacrificarea puilor, hrana a fost retrasă. Broilerii au fost furajați cu rețete trifaziale de NC, în funcție de vârstă: start (0 – 10 zile), creștere (11 – 24 zile) și finisare (25 – 42 zile).
Adăparea. Accesul puilor la apă s-a făcut continuu, utilizând liniile de adăpare prevăzute cu adăpători tip picurător (niplu) cu cupe de protecție (Foto 4.5).
Sacrificarea păsărilor. La finalul experimentelor III, IV și V, s-a sacrificat un număr de 56 de pui pentru prelevare probe de conținut intestinat (cecum și ileon) în vederea stabiliri microbiotei la adaos de biopreparat bacterian (BS, BL și LS), respectiv măsurarea pH-ului la nivelul acestor organe (Foto 4.6). Probele recoltate în recipiente sterile au fost transportate în condiții corespunzătoare (în lada frigorifică, la gheață), la laborator pentru recepție și condiționarea analizelor ulterioare.
Foto 4.5. Hrănirea și adăparea puilor broiler de găină, în primele 7 zile (Original)
Photo 4.5. Feeding and drinking of broiler chickens, 7 days of life(Original)
Foto 4.6. Prelevare conținut intestinal, pui broiler de găină, 42 zile, (Original)
Photo 4.6. Collect of intestinal content from broilers chickens, 42 days, (Original)
4.3. Rețete de nutrețuri combinate utilizate in vivo
Fabricarea nutrețurilor combinate s-a realizat în stația pilot a INCDBNA-Balotești, pe linia de preparare a furajelor pentru monogastrice. În formularea rețetei de NC s-a ținut cont de compoziția chimică brută a materiilor prime furajere (porumb Turda – Zea mays, sorg Albanos – Sorghum, mazăre furajeră- Pisum sativum L., șrot de soia – Glycine max, fasoliță -Phaseolus vulgaris), pe baza căreia s-a determinat valoarea nutritivă și compoziția chimică brută pentru derularea experimentelor la purcei în criza de înțărcare (Tab. 4.2) și la pui broiler de găină (Tab. 4.3, 4.4 și 4.5), corespunzător fazelor de creștere: starter (0-10 zile), creștere (11-24 zile) și finisare (24-42 zile).
Tab. 4.2. Structura și compoziția chimică a rețetei de NC, Experimentul I și II purcei
Tab. 4.2. Compound feed f and chemical composition, Experiment I and II, piglets
*Unde: 1Premixul de vitamine minerale/kg furaj conține: 10 000 UI vitamina A; 2 000 UI vitamina D3; 30 UI vitamina E; 3 mg vitamina K3; 2 mg vitamina B1; 6 mg vitamina B2; 20 mg vitamina B3; 13,5 mg vitamina B5; 3 mg vitamina B6; 0,06 mg vitamina B7; 0,8 mg vitamina B9; 0,05 mg vitamină B12; 10 mg vitamina C; 30 mg Mn; 110 mg Fe; 25 mg Cu; 100 mg Zn; 0,38 mg I; 0,36 mg Se; 0,3 mg Co; 60 mg antioxidant. 2pe baza compoziției chimice a materiilor prime furajere.
BS- Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL -Bacillus licheniformis ATCC 21424; M: lot Martor; E1: lot experimental hrănit cu NC cu adaos de BS 1%; E2: lot experimental hrănit cu NC cu adaos de BS 3%; E3: lot experimental hrănit cu NC cu adaos de BL 1%; E4: lot experimental hrănit cu NC cu adaos de BL 3%.
Tab. 4.3. Structura și compoziția chimică a rețetei de NC pentru Experimentul III
Tab. 4.3. Compound feed formula and chemical composition for Experiment III
*Unde: 1Premixul de vitamine minerale/kg furaj conține: 10 000 UI vitamina A; 2 000 UI vitamina D3; 30 UI vitamina E; 3 mg vitamina K3; 2 mg vitamina B1; 6 mg vitamina B2; 20 mg vitamina B3; 13,5 mg vitamina B5; 3 mg vitamina B6; 0,06 mg vitamina B7; 0,8 mg vitamina B9; 0,05 mg vitamină B12; 10 mg vitamina C; 30 mg Mn; 110 mg Fe; 25 mg Cu; 100 mg Zn; 0,38 mg I; 0,36 mg Se; 0,3 mg Co; 60 mg antioxidant. 2pe baza compoziției chimice a materiilor prime furajere.
BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424; E: Lot Martor hrănit cu NC pe bază de șrot de soia; E+BS: lot experimental cu adaos de BS 5 ml/kg furaj, 1 x 1011 UFC/ml; E+BL: lot experimental cu adaos de BL 5 ml/kg furaj, 1 x 1011 UFC/ml.
Tab. 4.4. Structura și compoziția chimică a rețetei de NC pentru Experimentul IV
Tab. 4.4. Compound feed formula and chemical composition for Experiment IV
*Unde: 1Premixul de vitamine minerale/kg furaj conține: 10 000 UI vitamina A; 2 000 UI vitamina D3; 30 UI vitamina E; 3 mg vitamina K3; 2 mg vitamina B1; 6 mg vitamina B2; 20 mg vitamina B3; 13,5 mg vitamina B5; 3 mg vitamina B6; 0,06 mg vitamina B7; 0,8 mg vitamina B9; 0,05 mg vitamină B12; 10 mg vitamina C; 30 mg Mn; 110 mg Fe; 25 mg Cu; 100 mg Zn; 0,38 mg I; 0,36 mg Se; 0,3 mg Co; 60 mg antioxidant.
2pe baza compoziției chimice a materiilor prime furajere.
BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424; F: Lot Martor hrănit cu NC pe bază de fasoliță; F+BS: lot experimental cu adaos de BS 5 ml/kg furaj, 1 x 1011 UFC/ml; F+BL: lot experimental cu adaos de BL 5 ml/kg furaj, 1 x 1011 UFC/ml.
Tab. 4.5. Structura și compoziția chimică a rețetei de NC pentru Experimentul V
Tab. 4.5. Compound feed formula and chemical composition for Experiment V
*Unde: 1Premixul de vitamine minerale/kg furaj conține: 10 000 UI vitamina A; 2 000 UI vitamina D3; 30 UI vitamina E; 3 mg vitamina K3; 2 mg vitamina B1; 6 mg vitamina B2; 20 mg vitamina B3; 13,5 mg vitamina B5; 3 mg vitamina B6; 0,06 mg vitamina B7; 0,8 mg vitamina B9; 0,05 mg vitamină B12; 10 mg vitamina C; 30 mg Mn; 110 mg Fe; 25 mg Cu; 100 mg Zn; 0,38 mg I; 0,36 mg Se; 0,3 mg Co; 60 mg antioxidant. 2pe baza compoziției chimice a materiilor prime furajere; LS – policultură de Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41), 1g/kg furaj cu o concentrație de 1,62 x 108 UFC/g; E: lot martor hrănit cu NC + șrot de soia; E+LS: lot experimental hrănit cu NC+șrot soia+ LS; F: lot martor hrănit cu NC + fasoliță; F+LS: lot experimental hrănit cu NC+fasoliță+ LS.
Conținutul rației în substanțe nutritive trebuie să respecte cerințele specifice fiecărei categorii de animale în concordanță cu perioada de creștere, starea fiziologică și nivelul productiv (Cuc și col., 2006). Compoziția chimică în aminoacizi și analiza microbiologică a materiilor prime furajere sunt redate în Tab. 4.6, 4.7a, 4.7a, 4.7b, 4.8a și 4.8b.
Tab. 4.6. Compoziția în aminoacizi a materiilor prime furajere
Tab. 4.6. Amino acids composition of raw materials
In alcătuirea rației furajere la monogastrice trebuie să se țină cont, conform exprimării lui Cuc și col., (2006), de așa numiții factori limitativi (substanțe necesare în cantități foarte mici, a căror lipsă poate perturba metabolismul organismului, valorificarea hranei și starea de sănătate), aceștia fiind reprezentați de lizină, metionină, triptofan, treonină (aminoacizi care se găsesc în cantități mici în cereale, însă pot fi asigurați prin folosirea unor surse proteice bogate în aceste elemente sau prin intermediul utilizării unor aminoacizi sintetici).
Tab. 4.7a. Analiza bacteriologică a materiilor prime furajere-Experiment purcei
Tab. 4.7a. Bacteriological analysis of raw materials-Piglets experiment
*Unde: MO 362 bis/28.05.2003, Recomandări UE, limite maxime admise:
NTG – număr total de germeni: 1,5 x 107 UFC/g; Coliformi totali: 3 x 103 UFC/g; Escherichia coli: 1 x 102 UFC/g; Salmonella sp.: negativ; NC 01 B: nutreț combinat administrat purceilor în criza de înțărcare.
Tab. 4.7b. Analiza micologică a materiilor prime furajere – Experiment purcei
Tab. 4.7b. Mycological analysis of raw materials – Piglets experiment
*Unde: MO 362 bis/28.05.2003, Recomandări UE; NTF – număr total de fungi, limite maxime admise: materii prime furajere 5 x 103 (5000 col/g); nutreț combinat (NC) 5 x 104 (50000 col/g); specii de fungi cunoscute ca producătoare de micotoxine 5 x 102 (500 col/g).
Tab. 4.8a. Analiza bacteriologică a materiilor prime furajere – Experiment pasăre
Tab. 4.8a. Bacteriological analysis of raw materials – Poultry experiment
*Unde: 1: faza starter; 2: faza de creștere; 3: faza de finisare; BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformios ATCC 21424; LS: Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41); NC-01 E: NC cu șrot de soia; NC-01 E+BS: NC cu șrot de soia + BS; NC-01 E+BL: NC cu șrot de soia + BL; NC-01 E+LS: NC cu șrot de soia + LS; NC-01 F: NC cu fasoliță; NC-01 F+BS: NC cu fasoliță + BS; NC-01 F+BL: NC cu fasoliță + BL; NC-01 F3-LS: NC fasoliță + LS. *limitele maxime admise (MO 362 bis/2003): NTG: maxim 15×106 col/g; E. coli: maxim 100 col/g; Coliformi totali: maxim 3000 col/g; Salmonella sp. : absent.
Tab. 4.8b. Analiza micologică a materiilor prime furajere – Experiment pui
Tab. 4.8b. Mycological analysis of raw materials – Poultry experiment
*Unde: MO 362 bis/28.05.2003, Recomandări UE; NTF – număr total de fungi, limite maxime admise: materii prime furajere 5 x 103 (5000 col/g); nutreț combinat (NC) 5 x 104 (50000 col/g); specii de fungi cunoscute ca producătoare de micotoxine 5 x 102 (500 col/g).
BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformios ATCC 21424; LS: Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41); NC-01 E: NC + șrot de soia; NC-01 E+BS: NC cu șrot de soia + BS; NC-01 E+BL: NC + șrot de soia + BL; NC-01 E+LS: NC + șrot de soia + LS; NC-01 F: NC + fasoliță; NC-01 F+BS: NC + fasoliță + BS; NC-01 F+BL: NC + fasoliță + BL; NC-01 F+LS: NC cu fasoliță + LS.
4.4. Metode de analiză
Analizele chimice, microbiologice, biochimice și imunologice au fost efectuate în cadrul laboratorarelor de la INCDBNA Balotești – Romania.
4.4.1. Recoltarea și pregătirea probelor
4.4.1.1. Materii prime și furaje
Pentru toate tipurile de analize, probele au fost recoltate în pungi/recipiente de plastic sterile, din trei puncte diferite ale lotului/variantei experimentale, fiind bine omogenizate pentru determinarea probei medii. Cantitatea de probă medie necesară pentru determinarea compoziției chimice brute a fost de 200 g/probă/analiză.
Pentru determinarea compoziției chimice brute și a compoziției în aminoacizi (%), au fost procurate și prelevate probe din următoarele ingrediente furajere: porumb, sorg, mazăre, șrot de soia și fasoliță. Pentru determinarea încărcăturii microbiologice s-au analizat toate componentele ce au servit la formularea rețetei de NC: porumb, sorg, mazăre, șrot de soia, fasoliță, gluten de porumb, lapte praf și nutrețul combinat realizat pentru variantele experimentale (Foto 4.7).
Foto 4.7. Materiile prime furajere
Photo 4.7. Compound feed used in the experiment
4.4.1.2. Probele biologice
Probele de fecale (N=6; 3 probe/repetiție) au fost recoltate de 3 ori pe durata experimentală, din diferite locuri ale boxei, în recipiente de plastic, sterile, ce au fost transportate în ladă frigorifică, pe pat de gheață în cel mai scurt timp posibil. La recoltare, purceii au avut vârsta de 30 ± 3 zile (prima zi de experiment), 44±3 zile și 46±3 zile.
Probele de dejecții, la puii broiler de găină au fost recoltate la sfârșit de experiment (N=20, 5 probe/lot – Experiment V; N=36, 6 probe/lot – Experiment III și IV), în recipiente de plastic, sterile, ce au fost transportate în ladă frigorifică, pe pat de gheață în cel mai scurt timp posibil.
Sacrificarea animalelor. La sfârșitul fiecărei variante experimentale, au fost sacrificați 2 purcei/lot (N=10) pentru recoltare conținut intestinal (cecum și ileon) în vederea determinării microbiotei intestinale, respectiv 56 de pui broiler de găină.
4.4.2. Metode de analize chimice
Materiile prime utilizate la formularea rețetelor de nutrețuri combinate și furajele experimentale au fost analizate în ceea ce privește conținutul de substanță uscată (SU), proteină brută (PB), grăsime brută (GB), celuloză brută (CB), cenușă brută (Cen.B), aminoacizi (AA), calciu (Ca) și fosfor (P) conform protocoalelor experimentale propuse de Criste și col., (2003).
4.4.3. Metode de analize microbiologice
Materiile prime utilizate la formularea rețetei de NC au fost analizate din punct de vedere bacteriologic: număr total de germeni (NTG; SR 13178-1), Coliformi totali (SR 13178-2), Escherichia coli (SR 13178-2), Salmonella sp. (SR EN 12824) și micologic: număr total de fungi (NTF, STAS 6953-81).
Analizele biochimice s-au efectuat în cadrul compartimentului de biochimie al Laboratorului de Biologie Animală, din cadrul INCDBNA-Balotești.
4.5. Metode de determinare a parametrilor zootehnici
4.5.1. Parametrii bioproductivi
În cadrul experimentelor efectuate la monogastrice (purcei – hibrid Topigs și pui broiler de găină – hibrid Ross 308) au fost vizați următorii parametrii de producție:
greutate corporală (kg);
sporul mediu zilnic (kg/zi);
consumul mediu zilnic de nutreț combinat (kg/zi);
consumul specific (kg nutreț combinat/kg spor).
Greutatea corporală a fost determinată prin cântăriri individuale la începutul și la finalul experimentului.
Sporul mediu zilnic a fost calculat la sfârșitul perioadei de testare după următoarea formulă:
Consumul de nutreț combinat a fost înregistrat zilnic.
Consumul specific a fost calculat raportând cantitatea de nutreț combinat consumată de porci (kg) la sporul în greutate (kg).
Mortalitatea animalelor a fost înregistrată pe toată perioada experimentală pentru a face corecțiile necesare în calculul consumul de furaje și a consumului specific.
4.6. Metode statistico-matematice utilizate
Analizele in vitro s-au desfășurat în cadrul laboratoarelor din INCDBNA Balotești – România. Datele brute au fost prelucrate statisic în sistemul de operare Windows XP, cu programul STAT VIEW (SAS, version 6.0), cu estimarea parametrilor de dispersie (media aritmetică, eroarea standard, deviația standard și indicele de probabilitate – P, Foto 4.8). S-a emis ipoteza nulă și ipoteza alternativă după care s-au aplicat teste de semnificație (P>0.05 rezultate nesemnificative, P≤0.05 rezultate semnificative pentru un nivel de încredere 95%). În vederea testării omogenității mediilor probelor și a varianțelor au fost utilizate testele: Anova (în cazul experiențelor bifactoriale în vederea stabilirii nu numai a semnificației diferențelor între medii, ci și a interacțiunii între factorii de influență), Student și Fisher. Rezultatele obținute au fost interpretate și pe baza acestora s-au elaborat concluziile și recomandările.
Experimentul a fost de tip bifactorial, cu două tratamente aplicate. Factorul fix a fost reprezentat de nutrețul combinat administrat tuturor animalelor supuse testării, în timp ce variabila a constitui-o procentul de preparat enzimatic exogen cu rol probiotic, BS (1 și 3%) pentru Experimentul I, BL (1 și 3%) pentru Experimentul II, BS și BL (1 x 1011 UFC/g, 5 ml/kg furaj pe bază de soia) pentru Experimentul III, BS și BL (1 x 1011 UFC/g, 5 ml/kg furaj pe bază de fasoliță) pentru Experimentul IV, respectiv LS (L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41; 1,62 x 108 UFC/gram furaj pe bază de soia, cât și fasoliță) pentru Experimentul V.
Foto 4.8. Secvență din programul StatView
Photo 4.8. Sequence from the StatView program
CAPITOLUL V. CERCETĂRI IN VITRO PRIVIND CARACTERIZAREA UNOR TULPINI BACTERIENE ÎN VEDEREA UTILIZĂRII ÎN HRANA MONOGASTRICELOR
5.1. Materiale, reactivi chimici, medii de cultură și echipamente utilizate
Pentru desfășurarea activităților din prezenta lucrare, în vederea obținerii de biopreparate bacteriene cu capacitate enzimatică și probiotică pentru administrarea ulterioară în hrana monogastricelor (purcei în criza de înțărcare, hibrid Topigs, 30±3 zile și pui broiler de găină, hibrid Ross 308, o zi), s-au achiziționat două tulpini bacteriene din genul Bacillus sp. din colecția de microorganisme American Type Culture Collection (ATCC) sub formă liofilizată. De asemenea, în urma cercetărilor in vitro, s-au izolat, identificat și caracterizat două tulpini de Lactobacillus sp., care prin procesul de biosinteză într-un bioreactor Bio Flo 320 și aplicarea etapei de atomizare, s-a obținut pulbere bacteriană ce a fost adăugată ca sursă cu potențial probiotic în hrana puilor broiler de găină.
Nivelul de includere al preparatelor bacteriene în hrana monogastricelor s-a stabilit în urma cercetărilor in vitro, fiind în concordanță cu date din literatura de specialitate. Pentru desfășurarea activităților au fost necesare materiale și sticlărie de laborator, reactivi chimici, medii de cultură (compoziția chimică și modul de preparare este detaliat în Anexa 2, Tab. 1 și Tab. 2) și echipamente de lucru (Anexa 2, Tab. 3).
5.2. Metode de analiză
5.2.1. Identificarea și caracterizarea tulpinilor bacteriene
Caracterizarea fenotipică a tulpinilor bacteriene (Bacillus subtilis ATCC 6051a, Bacillus licheniformis ATCC 21424 și Lactobacillus sp.) s-a realizat prin examinarea caracterelor culturale, morfologice și biochimice, conform Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, soft-ului ABIS on line (Stoica și Sorescu, 2017) și soft-ului apiwebTM API50 CHB/L, BioMerieux (France).
Pentru determinarea unităților formatoare de colonii (UFC/ml), tulpinile luate în lucru, au fost supuse tehnicii diluțiilor zecimale (10-5 – 10-12, 1:10) în ser fiziologic steril (NaCl 0,85%, w/v, Dumitru și col., 2018, Dumitru et col., 2019). După etalarea probei diluate pe mediul de cultură selectiv (1 ml suspensie diluată/placă, 3 plăci/diluție x 3 repetiții) ce a fost repartizat în plăci Petri, în condiții aseptice, probele au fost incubate 24-48 de ore, aerob, la temperatura optimă de dezvoltare a tulpinii, conform fișei ATCC respectiv a genului Lactobacillus. In urma incubării, s-a determinat numărul de germeni viabili (UFC/ml) existenți în tulpinile analizate, prin înmulțirea numărului mediu de colonii cu valoarea inversului diluției la care s-a făcut însămânțarea.
N = n * d unde: N = nr UFC (celule viabile /ml probă)
n = nr mediu de colonii rezultate după incubare
d = inversul diluției
Tulpinile bacteriene din genul Bacillus au fost analizate și din punct de vedere al activității hemolitice, enzimatice calitativ (hidroliza amidonului, cazeinei) și cantitativ (amilază, celulază, protează), fiind supuse unor teste de verificare a proprietăților probiotice (rezistență pH, inducerea sucului gastric la pH 2 și 3, rezistență la săruri biliare etc., rezistența la antibiotice).
5.2.1.1. Caractere morfologice
Caracterele morfologice s-au analizat prin colorația Gram a frotiurilor efectuate din culturile aerobe de 24-48 ore/370C din bulion nutritv (BN, Merck) și geloză nutritivă pentru Bacillus sp. ATCC, respectiv cultură de 24 de ore/370C din MRS bulion (Man, Rogosa, Sharpe, Oxoid) pentru tulpinile izolate din genul Lactobacillus sp., prin examinarea microscopică a acestora. S-a urmărit, în principal, forma bacteriilor, afinitatea tinctorială, sporularea, modul de grupare și puritatea acestora.
5.2.1.2. Caractere culturale
Analiza caracterelor culturale a urmărit, în cazul culturilor în mediu lichid, turbiditatea, depozitul și prezența formațiunilor de suprafață, iar în cazul culturilor de pe mediul agarizat dimensiunile, tipul, forma și pigmentarea coloniilor.
5.2.1.3. Caracterele biochimice
Analizarea profilului biochimic s-a efectuat prin testul catalazei (Dumitru și col., 2017) și a evidențierii fermentării carbohidraților prin galeriile API 50CHB/L, Biomerieux (France), conform indicațiilor producătorului.
5.2.1.3.1. Testul catalazei
Testul catalazei. Evidențierea enzimei catalază dintr-o cultură bacteriană (solidă sau lichidă) de 24 de ore, se face în prezența peroxidului de hidrogen (H2O2) într-o concentrație de 3%. Pe o lamă de sticlă, în prezența becului de gaz, se adaugă o picătură de H2O2, peste care, cu ajutorul unei anse sterile, se adaugă cultura bacteriană (Foto 5.1). Enzima catalază facilitează descompunerea H2O2 în oxigen și apă (2H2O2 + Catalază → 2H2O + O2), iar în cazul unei reacții pozitive se observă o efervescență (bule vizibile), datorită eliberării rapide a oxigenului bivalent.
Foto 5.1. Testul catalazei (Original)
Photo 5.1. Catalase test (Original)
5.2.1.3.2. Testul API 50 CHB/L
API 50 CHB/L. Denumirea testelor ,,API” este o prescurtare a denumirii din limba engleză Automatised Processes Identification, iar alegerea sistemului potrivit se face în funcție de natura și originea materialului microbian supus examinării (Biomerieux, France). Mediul API 50 CHB/E este destinat identificării speciilor din genul Bacillus, precum și speciilor Gram-negative, aparținând familiei Enterobacteriaceae și Vibrionaceae, în timp ce mediul API 50 CHL este destinat pentru identificarea genului Lactobacillus. Caracteristica de bază este redată de fermentarea a 49 de carbohidrați, primul test fiind martorul.
Principiul metodei constă în obținerea unei suspensii bacteriene cu microorganismul ce urmează a fi identificat și inocularea fiecărui godeu din galeriile casetei de plastic, cu noua suspensie obținută. In timpul incubării, carbohidrații sunt fermentați în acizi, cu producerea unei scăderi de pH, detectabilă prin virajul culorii indicatorului de la roșu la galben pentru API 50 CHB, respectiv de la albastru la galben pentru API 50 CHL. Identificarea speciilor din genul Bacillus și Lactobacillus implică parcurgerea unor etape, ce sunt prezentate în protocolul de lucru al producătorului.
Interpretarea rezultatelor. Se consideră test pozitiv virajul culorii mediului bazal roșu fenol la GALBEN pentru Bacillus sp. și albastru bromcrezol la GALBEN pentru Lactobacillus sp. Testul esculinei (numărul 25) este pozitiv, dacă culoarea bazală se modifică la negru. Citirile se interpretează atât la 24, cât și la 48 de ore. Dacă un test pozitiv devine negativ la 48 de ore, se ia în calcul citirea de la prima lectură (această modificare este cauzată de o alcalinizare cauzată producției de amoniac din peptonă). Incubarea galeriilor s-a realizat astfel: 300C – BS și 370C – BL în aerobioză, respectiv 370C – Lactobacillus în anaerobioză, timp de 48-72 (Foto 5.2).
Identificarea tulpinilor din genul Bacillus și Lactobacillus s-a realizat pe baza caracterelor morfologice, culturale și al testului catalazei. Identificarea speciei s-a realizat prin soft-ul apiwebTM API50CHB/L, BioMerieux (France) și prin soft-ul ABIS online (Stoica and Sorescu, 2017), se ia în considerare doar acele rezultate, la care identificarea speciilor bacteriene este mai mare de 85% probabilitate (ID).
Foto 5.2. Testele biochimice API 50 CHB/L – identificarea speciilor de Bacillus sp. (stânga) și Lactobacillus sp. (dreapta) înainte de incubare (Original)
Photo 5.2. API 50 CHB/L tests used in order to identify bacterial species from Bacillus (left) and Lactobacillus (right) before incubation (Original)
5.2.1.4. Evidențierea caracterelor de patogenitate. Testul de hemoliză
Testul de hemoliză pune în evidență patogenitatea tulpinii cercetate (distrugerea hematiilor din mediul utilizat). Anumite specii de microorganisme, sunt capabile să lizeze hematiile unor specii animale, datorită prezenței unor enzime numite hemolizine.
Principiul metodei. Capacitatea de hemoliză a unui microorganism se poate evidenția în urma însămânțării pe un mediu nutritiv agarizat cu hematii (ex:geloză- sânge, TSA- agar-tripticază-soia îmbogățit cu sânge de oaie 5-10%, Anexa 2, Tab. 1). Interpretarea probelor se efectuează prin incubarea plăcilor însămânțate la 37°C, 24 de ore (Jeon și col., 2018, citat de Dumitru și col., 2018; Dumitru și col., 2019). Apariția unei zone transparente, clare, asemenea unui halou, determină o hemoliză totală (β-hemoliză), zonă verzuie în jurul coloniei semnifică o hemoliză parțială (α-hemoliză), iar nicio hemoliză se consideră γ-hemoliză.
5.2.1.5. Evidențierea activității antibacteriene pentru Bacillus sp.
Testarea activității antibacteriene a sensibilității unui germen la un agent patogen s-a determinat după metoda descrisă de Ritter și col. (2018) cu anumite modificări. Tulpinile de analizat (BS și BL) cu o concentrație de 1011 UFC/ml în PBS, au fost inoculate cu ajutorul unui tampon steril pe plăci Petri cu geloză nutritivă, ștergând suprafața mediului cu acesta (striuri orizontale distanțate la aproximativ 1 cm). Perpendicular, pe centrul plăcii, cu ajutorul unei anse sterile, s-a prelevat și s-a inoculat cultură de agent patogen (în cazul nostru specia de E. coli β-hemolitică dezvoltată pe TSA sânge, în urma analizării microbiotei intestinale la purcei, fiind confirmată ulterior prin teste biochimice (TSI, MIU, CITRAT, http://www.tgw1916.net/). Placa obținută s-a incubat la 37°C, 24 de ore, în condiții de aerobioză. Zonele de inhibiție (intersectare) au fost măsurate, diametrul determinat reprezentând gradul de sensibilitațe al tulpinii de Bacillus sp. la agentul patogen testat.
5.2.1.6. Conservarea tulpinilor bacteriene
In urma revitalizării și analizării caracterelor morfo-funcționale, tulpinile bacteriene ATCC au fost conservate (luni) în tuburi cu geloză nutritivă, în vederea stabilirii viabilității la 4°C și temperatura camerei (din 3 în 3 luni). Conservarea tulpinilor de Bacillus sp. ATCC, pe termen lung a fost făcută la -80°C, cu adaos de glicerol 20%, fiind depozitate în colecția de tulpini a INCDBNA Balotești, sub un alt cod de referință, a cărei viabilitate bacteriană va fi evaluată la 2 ani (Sorescu și col., 2019).
5.2.1.7. Determinarea activității enzimatice din punct de vedere calitativ
5.2.1.7.1. Hidroliza amidonului. Reacția cu iodul
Principiul metodei. Derivații rezultați în urma procesului de hidroliză a amidonului ce sunt incluși într-un mediu de cultură agarizat, devin reactivi cu soluția Lugol.
Reactivi necesari. Pentru bacteriile nepretențioase se utilizează mediul de cultură selectiv cu adaos de amidon (Anexa 1).
Mod de lucru. Tulpina de interes se însămânțează pe placa Petri, ce conține mediul selectiv cu adaos de amidon 1%, se incubează 24-48 de ore, în condițiile optime specifice izolatului de analizat; se inundă placa cu soluție Lugol (Anexa 1).
Interpretare. Se consideră pozitiv sau cu capacitate de hidroliză a amidonului, atunci când la developarea cu soluție Lugol, apare o zonă transparentă clară în jurul culturii, fondul mediului de cultură devenit albastru datorită nehidrolizării amidonului (Dumitru și col., 2018).
5.2.1.7.2. Hidroliza cazeinei
Procesul de hidroliză a cazeinei se poate pune în evidență prin utilizarea unui mediu de cultură ce conține geloză-lapte. La geloza repartizată în tuburi, sterilizată și lichefiată, se adaugă lapte steril smântânit, în cantitate de 1-2 ml lapte la 10 ml mediu. Amestecul format se repartizează în plăci Petri. Se însămânțează placa în suprafață cu tulpina de interes și se incubează prin respectarea parametrilor optimi de dezvoltare. Apariția unei zone transparente în jurul coloniilor la adaos de TCA 25%, demonstrează capacitatea proteolitică a tulpinii de interes (Dumitru și col., 2018).
5.2.1.7.3. Optimizarea mediului fermentativ. Producere de α-amilază
Optimizarea mediului de biosinteză pentru producere de α-amilază de către Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424, s-a desfășurat după metoda Swain și col. (2006) modificată. Mediul de biosinteză compus din bulion nutritiv (Merck) suplimentat cu surse diferite de carbon (1% w/v amidon, fructoză, glucoză și lactoză, compoziție Anexa 2), ajustat la pH= 7 înainte de autoclavare, s-a sterilizat la 121°C, 15 minute. Mediul de biosinteză obținut (20 ml în balon Erlenmayer de 100 ml) a fost inoculat în condiții sterile în raport de 1:10 cu inocul de 24 de ore format din celule tinere, bine dezvoltate aflate în faza logaritmică de creștere și incubat într-un orbital shaker 24 de ore, 37°C, 150 rpm (Foto 5.3). Dezvoltarea tulpinilor de Bacillus sp. s-a analizat prin tehnica diluțiilor zecimale (UFC/ml), în scopul determinării viabilitatății acestora.
Foto 5.3. Dezvoltarea tulpinilor de Bacillus sp. ATCC în orbital shaker (Original)
Photo 5.3. The development of Bacillus spp. ATCC strains, orbital shaker (Original)
5.2.1.8. Determinarea activității enzimatice din punct de vedere cantitativ
Conform Comisiei de Biotehnologii din cadrul IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), metodele recomandate ca proceduri standard pentru determinarea și evaluarea sistemelor enzimatice sunt:
Metoda Hostettler (1951), determinare activitate amilolitică.
Metoda descrisă de Petterson și Porath (1963), determinare activitate celulozolitică.
Metoda Anson (1939), determinare activitate proteolitică.
Activitarea enzimatică este frecvent exprimată în unități (U), astfel că o unitate reprezintă cantitatea de enzimă ce catalizează transformarea a 1 µmol de substrat într-un minut în condițiile de reacție. Se acceptă exprimarea activității enzimatice în nmoli/min sau µmoli/min.
Unitatea internațională sistematică a activității enzimatice este Katal (Kat) care reprezintă transformarea unui mol de substrat pe secundă.
1 U = 1 µmol/min
1 Katal = 1 mol/s
5.2.1.8.1. Determinarea activității amilolitice prin metoda Hostettler
Pentru dozarea activității α-amilazei s-a aplicat metoda descrisă de Hostettler și colaboratorii săi.
Principiul metodei. Metoda se bazează pe hidroliza amidonului de către α-amilază, la pH 6,9 și temperatură de lucru de 30°C. Hidrolizatul format din maltoză, reacționează datorită grupărilor reducătoare semiacetalice, cu acidul 3,5 – dinitrosalicilic, cu formare de acid nitroaminosalicilic ce poate fi măsurat colorimetric și este proporțional cu activitatea enzimatică. Conform acestei metode, o unitate amilazică corespunde unei cantități de maltoză (µmol) eliberată sub acțiunea a 1 ml preparat enzimatic, într-un minut, la 30°C.
Reactivi și soluții
Soluție tampon fosfat 0,2 M cu pH 6,9
Amestecul format se dizolvă și se aduce la un litru de soluție cu apă distilată sub agitare continuă, până la dizolvare completă. Valoarea pH-ului se ajustează cu soluție HCl 1N sau soluție NaOH 20%. Pentru determinarea activității amilolitice la alte valori de pH se folosesc soluțiile tampon corespunzătoare.
Soluție amidon 1%. Un gram de amidon se dizolvă în 100 ml soluție tampon (1).
Reactiv acid dinitrosalicilic (DNS). 10 g DNS se dizolvă la cald în aproximativ 300 de ml apă distilată. Se adaugă400 ml soluție NaOH 1N și 300 g tartrat de sodiu și potasiu, sub agitare continuă. Se aduce la semn într-un balon cotat de 1000 ml.
Soluție NaOH 1N. Se dizolvă 40 g NaOH în puțină apă distilată într-un balon cotat de 1000 ml, apoi se aduce la semn.
Soluția etalon de maltoză 0,1% sau 100 mg%. 0,1 g de maltoză monohidrat se imersează într-un balon cotat de 100 ml, se dizolvă în apă distilată și se aduce la semn.
Construirea curbei de etalonare
Din soluția etalon de maltoză se pipetează în 6 eprubete, conform Tab. 5.1.
Tab. 5.1. Modul de lucru pentru obținerea curbei de etalonare, metoda Hostettler
Tab. 5.1. The procedure for obtaining the calibration curve by Hostettler method
*Unde: AD = apă distilată; DNS = acid dinitrosalicilic; D.O. = densitate optică; C = concentrație
Proba de analizat
Paralel cu proba de analizat, se lucrează un martor, pentru a determina concentrația de maltoză existentă în aceasta, înainte de începerea reacției enzimatice.
Amestecul de soluție enzimatică și amidon 1% este incubat în soluția tampon, timp de 10 minute, la 30°C, după care reacția se stopează cu 2 ml DNS. Martorul se realizează în aceleași condiții, singura diferență fiind că cei 2 ml DNS sunt adăugați înaintea probei analizate. Proba și martorul se incubează 10 minute la 30°C, după care reacția probei se stopează cu 2 ml DNS. In continuare, probele se mențin 5 minute pe baie de apă la fierbere, se răcesc și se diluează până la 12 ml cu apă distilată. După 20 de minute se determină valoarea extincției la 546 nm, față de martor (Vintilă și Dinu, 2015). Modul de lucru pentru probă față de martor este prezentat pe scurt în Tab. 5.2.
Tab. 5.2. Modul de preparare al probei și al martorului
Tab. 5.2. Method for preparation the sample and the blank
Calculul rezultatelor
Activitatea enzimatică se exprimă și se calculează astfel:
A.E. (U/ml/min) = m x D/ e x 10 sau A.E. = Cx x 5 x 1/10, unde:
m = µmoli maltoză, determinați din curba de etalonare ca fiind rezultatul diferenței dintre µmolii de maltoză din probă și µmolii de maltoză din martor;
D = factorul de diluție al probei (în cazul de față s-a efectuat o singură diluție);
e = ml de soluție luați în lucru (0,5 ml probă de analizat);
10 = timpul de incubare;
Cx = concentrația probei de analizat (rezultă din curba de etalonare, cu ajutorul ecuației de regresie).
5.2.1.8.2. Determinarea activității celulozolitice
Principiul metodei. Determinarea activității celulozolitice se efectuează după metoda descrisă de Petterson și Porath. Metoda se bazează pe hidroliza enzimatică a carboximetil celulozei (CMC) și dozarea grupărilor reducătoare eliberate cu reactiv dinitrosalicilic (DNS).
Unitatea de activitate Cx celulozolitică (UE) reprezintă cantitatea de enzimă care eliberează dintr-o soluție de CM-celuloză, o cantitate de glucide reducătoare, ce dau cu reactivul dinitrosalicilic (DNS), aceeași densitate optică, similară cu cea a unui miligram de glucoză.
Reactivi și soluții
1. Soluție tampon: Na2HPO4– acid citric 0,1 M, pH= 6,4. Intr-un alt balon cotat de 100 ml, se cântăresc 19,21 g acid citric (0,1 M), se agită până la dizolvarea completă și se aduce la semn cu apă distilată (soluția A).
7,17 g Na2HPO4 x 12H2O se introduc într-un balon cotat de 100 ml, se agită până la dizolvare completă și se aduge la semn (soluția B).
Pentru a forma soluția tampon fosfat-citrat 0,1M, pH=6,4 se procedează astfel: într-un balon de 100 ml, se adaugă 15,4 ml din soluția A, 34,6 ml din soluție B și se aduce la semn cu apă distilată. Se ajustează pH-ul la 6,4 (NaOH 1N sau H3PO4 85%).
2. Soluția carboximetil-celuloză (CMC) 1%. 1 g CMC se dizolvă în 100 ml soluție tampon; se agită până la dizolvarea completă.
3. Reactiv DNS. 20 g DNS + 4 g fenol proaspăt distilat + 1 g Na2SO3 + 400 g tartrat de Na și K. Amestecul se dizolvă în 1 litru NaOH 2%, soluția se aduce la 2 litri cu apă distilată.
4. Soluție glucoză 0,1%. 1 g glucoză se dizolvă în 100 ml apă distilată și se agită până la dizolvarea completă.
Construirea curbei de etalonare. Din soluția de glucoză 0,1% se prepară 10 etaloane cu un volum final de 2,2 ml, în apă distilată, la care se adaugă reactiv DNS (câte 3 ml DNS/eprubetă cu diluție), conform Tab. 5.3. Probele sunt incubate 15 minute, pe o baie de apă la fierbere, răcite și colorimetrate la 640 nm, față de apă distilată.
Tab. 5.3. Prepararea diluțiilor de glucoză
Tab. 5.3. Preparation of glucose dilutions
Proba de analizat
Amestecul de reacție, ce constă din 2 ml soluție de substrat și 0,2 ml preparat enzimatic, este incubat 10 minute la temperatura de 50°C, după care reacția enzimatică se stopează, prin adăugarea a 3 ml reactiv DNS. Probele sunt incubate apoi, 15 minute pe o baie de apă la fierbere, răcite și colorimetrate la 640 nm față de apă distilată, conform Tab. 5.4. Fiecare probă este însoțită de un martor, în care sunt dozate glucidele reducătoare preexistente în amestecul de reacție prin introducerea reactivului DNS înaintea preparatului enzimatic cu activitate celulozolitică (proba de analizat). Astfel, pentru martor se pipetează 2 ml soluție de substrat (CMC), 3 ml reactiv DNS, iar în final se adaugă 0,2 ml soluție enzimatică. După incubare, timp de 15 minute pe o baie de apă la fierbere și după răcire, se determină extincția la 640 nm, față de apă distilată.
Tab. 5.4. Modul de lucru pentru obținerea probei de analizat, față de martor
Tab. 5.4. Method for preparation the sample and the blank
Calculul rezultatelor
Valorile densității optice măsurate la spectrofotometru pentru probe și martor, se transformă cu ajutorul curbei etalon în mg glucoză. Formula de calcul este următoarea:
(mg glucoză probă – mg glucoză martor) x 5 x 1/10 = U/ml/min/50°C unde:
5 = factorul de transformare pentru 1 ml de enzimă
1/10 = timpul de incubare
5.2.1.8.3. Determinarea activității proteolitice
Principiul metodei. Activitatea proteolitică se determină după metoda Anson modificată pe substrat de cazeină. Enzimele proteolitice catalizează hidroliza caseinei în acid tricloracetic (TCA), permițând formarea unor compuși solubili. Conținutul în tirozină și triptofan, din compușii formați, se determină spectrofotometric cu ajutorul reactivului Folin – Ciocâlteu.
O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în condițiile de reacție indicate, eliberează 1 µmol tirozină/minut.
Reactivi și soluții
Tampon fosfat 0,2 M, pH 7,0. 39,0 ml soluție NaH2PO4 0,2 M + 61,0 ml soluție Na2HPO4 0,2 M reprezintă soluția tampon fosfat. Ajustarea pH-ului la 7,0 se face cu soluție H3PO4 85% sau soluție NaOH 1N.
Soluție de cazeină 2%. 2 g de cazeină se dizolvă pe un agitator magnetic, în aproximativ 30 ml NaOH 1N. Se neutralizează cu H3PO4 85%, adăugat în picătură, sub agitare continuă. Se ajustează pH-ul la 6,5 și se completează cu tampon fosfat (pH 7 în cazul proteazelor neutre) până la 100 ml.
Soluția L-tirozină 1mM. Se dizolvă 181,19 mg tirozină în 1000 ml HCl soluție 0,2 N.
Soluție de HCl 0,01 N – 0,06 N – 0,2 N.
Soluție de NaOH 0,5 N.
Soluție acid tricloracetic (TCA) 5%. 5 grame de TCA se dizolvă în 100 ml apă distilată
Reactivul Folin – Ciocâlteu. 10 g Na2WO4 x 2H2O + 2,5 g Na2MoO4 x 2H2O + 15 g Li2SO4 + 10 ml HCl concentrat + 5 ml H3PO4 concentrat se dizolvă în 100 ml apă distilată. Înainte de utilizare, se diluează o parte din această soluție cu două părți apă distilată.
Preparat enzimatic cu activitate celulazică.
Construirea curbei de etalonare
Se pipetează în 11 eprubete curate și uscate 0, 40, 80, 120, 160, 200, 240, 280, 320, 360 și 400 µl soluție L-tirozină. Se completează la 2 ml cu HCl 0,2 N. Se adaugă câte 4 ml soluție NaOH 0,5N, sub agitare puternică și 1,2 ml reactiv Folin-Ciocâlteu. Se lasă la temperatura camerei 30 minute, apoi se citește absorbanța la 660 nm, față de apă distilată. Se scade absorbanța martorului. Se construiește un grafic cu extincția citită la 660 pe ordonată și µmoli L – tirozină pe abscisă, conform Tab. 5.5.
Tab. 5.5. Obținerea diluțiilor de L – tirozină
Tab. 5.5. Procedure for obtaining L-tyrosine dilutions
Proba de analizat
Într-o eprubetă se termostatează la 37˚C, 0,2 ml soluție enzimatică și 0,8 ml soluție tampon. La timpul zero se adaugă sub agitare, 2 ml soluție substrat (cazeină) și se incubează 10 minute la 37˚C. Reacția se stopează cu 4 ml soluție TCA. Martorul se realizează în aceleași condiții ca proba, diferența fiind că soluția TCA se adaugă înaintea cazeinei. Adăugarea TCA se face sub agitare puternică. Probele se lasă la temperatura camerei 30 minute, apoi se filtrează pe hârtie de filtru. Din filtrat, se iau probe pentru reacția de culoare și anume se pipetează în ordine: 1 ml filtrat, 1 ml HCl 0,2 N, 1 ml soluție NaOH 0,5 N și 1,2 ml reactiv Folin-Ciocâlteu (diluat 1:2). După adăugarea fiecărui reactiv probele se agită. Se lasă în repaus 30 minute, la temperatura camerei, pentru fixarea culorii, apoi se citește extincția la 660 nm, față de apă distilată. Din curba de etalonare se determină µmolii de tirozină, corespunzători la extincția măsurată (Tab. 5.6).
Tab. 5.6. Modul de lucru pentru realizarea probei și a martorului
Tab. 5.6. Method for preparation the sample and the blank
Calculul rezultatelor
Metoda Anson definește o unitate enzimatică, drept cantitatea de enzimă care eliberează în mediu, prin hidroliza hemoglobinei, 1mM tirozină/minut, la 37˚C. Pentru ușurința calculelor, se poate lua o valoare de lucru de 1000 de ori mai mică, raportul făcându-se la 1µmol tirozină. Din curba de etalonare se determină µmoli tirozină, corespunzători extincției măsurate. Activitatea enzimatică se calculează cu formula:
(µmoli Tyr. Probă – µmoli Tyr. Martor) x 7/10 x 0,2 x 1 = µmoli tyr./ml/min
unde:
0,2 – volumul soluției enzimatice luat în lucru (ml)
1 – volumul filtratului luat în lucru (ml);
7 – volumul total la incubare (ml);
10 – timpul de incubare (min);
5.2.1.9. Examinarea unor tulpini bacteriene din punct de vedere probiotic în vederea utilizării în hrana monogastricelor
5.2.1.9.1. Rezistența la pH acid
Tulpinile de Bacillus sp. și Lactobacillus sp. înainte de a fi adăugate în hrana purceilor, au fost examinate din punct de vedere probiotic. Tulpinile luate în lucru, au fost investigate prin testarea rezistenței la pH acid (simulare suc gastric la pH 2 și 3, SSG). S-a urmărit metoda descrisă de Lee și col. (2012), modificată de Dumitru și col. (2018).
Bacillus sp. 1 ml de cultură bacteriană crescută în bulion nutritiv (BN), 24 de ore, la 37°C, 120 rpm, reprezentând aproximativ 1010 CFU/ml, s-a transferat în 9 ml de mediu SSG [0,5% NaCl, 0,3% pepsină (din mucoasă gastrică, Sigma), 0,1% peptonă], care a fost ajustat la pH 2 și 3 (pH-metru portabil Waterproof, pH 7+DHS) cu HCl 1N, etapă urmată de autoclavare la 121°C, 15 minute. Proba rezultată (1 ml cultură + 9 ml SSG) s-a incubat 0, 30, 60, 90, 120 de minute la 37°C, 120 rpm (Tab. 7.11 și 7.12). După finalizarea timpului de incubare, s-au efectuat diluții zecimale (10-12), în ser fiziologic steril (1:10, NaCl 0,85%). S-a determinat numărul de celule viabile (CFU/ml) pe agar nutritiv, prin incubare la 37°C, 24 de ore. Numărul de bacterii a fost calculat în conformitate cu standardul ISO 7218 (2007).
Lactobacillus sp. Rezistența la pH a fost examinată după metoda Shokryazdan și col., 2014), readaptată după Kizerwetter-Świda & Binek (2016). Cultura bacteriană de 24 de ore (7-8 log UFC/ml în PBS), crescută în anaerobioză, s-a inoculat (1 %, v/v) în MRS steril ajustat la pH =3, cu HCL 1N 37%. Flaconul ajustat la pH=3 și inoculat, se incubează anaerob la 37°C timp de 0 h, 1 h:30 min și 3 h. După incubare la 0 h, 1 h:30 min și 3 h s-au efectuat diluții succesive până la 10-10, în PBS steril. Pentru determinarea numărului de colonii (UFC/ml), s-au etalat 100 µl de la 10-4 până la 10-7 pe plăci cu MRS agar (3 plăci/diluție), etapă însoțită de incubarea plăcilor la 37°C, 24 de ore, în anaerobioză (jar Oxoid 2,5 L, cu plicuri de CO2). Se consideră probă control, cultura dezvoltată în MRS bulion Oxoid (pH= 6,2±0,2) și se compară valoarea acesteia cu CFU/ml obținut în urma expunerii la pH=3, la timpi de incubare diferiți.
Procentul sau rata de supraviețuire (%) pentru tulpinile bacteriene a fost exprimat atât pentru rezistența la pH acid (2 și 3), cât și la săruri bililare, după formula (Ritter și col., 2018) redată mai jos:
R (%) = x 100
unde:
R (%) = rata de supraviețuire a tulpinii la condițiile de mediu.
= numărul de celule viabile (ex: după expunere la pH acid și săruri biliare).
= numărul de celule inițiale (bulion nutritiv, pH=7).
5.2.1.9.2. Rezistența la săruri biliare
Bacillus sp. Rezistența la săruri biliare s-a determinat cu ajutorul metodei descrise de Lee și col. (2012), modificată de Dumitru și col. (2018). 10 ml de cultură bacteriană (aproximativ 109 CFU/ml), crescută în BN (pH=7), 24 de ore, la 37°C, 120 rpm, s-au centrifugat la 5000 x g, 20 de minute, 4°C. In urma îndepărtării supernatantului, peste biomasa rezultată -se adaugă un volum de PBS steril și se recentrifughează la aceeași parametrii. Supernatantul obținut se îndepărtează, iar peste biomasa nouă se adaugă bulion nutritiv [BN, pH=7, cu adaos de 0,3% oxgall (săruri minerale, BD Science]. Suspensia bacteriană se incubează timp de 0, 30, 60, 90, 120 de minute, la 37°C, 120 rpm. S-a determinat numărul de celule viabile prin efectuarea diluțiilor zecimale (10-10) în ser fiziologic steril pe agar nutritiv, prin incubarea plăcilor la 37°C, 24 de ore. Numărul de bacterii a fost calculat în conformitate cu standardul ISO 7218 (2007). Procentul de supraviețuire pentru tulpinile de Bacillus ATCC a fost exprimat atât pentru rezistența la pH acid (2 și 3), cât și la săruri bililare conform fiecărei metode.
Lactobacillus sp. Rezistența la sărurile biliare a tulpinilor izolate (7-8 log UFC/ml în PBS) și confirmate atât fenotopic, cât și genotipic, s-a verificat prin incubare anaerobă în MRS bulion cu adaos de 0,3% săruri biliare (oxgall, Sigma), la 37°C timp de 0 h, 1 h:30 min și 3 h. Viabilitatea tulpinilor de Lactobacillus spp. s-a determinat prin estimarea numărului de colonii, prin diluții succesive în PBS steril (104 până la 107) pe plăci cu MRS agar (3 plăci/diluție), incubare 37°C, 24 de ore, în anaerobioză. Se consideră probă control, cultura dezvoltată în MRS bulion Oxoid (pH= 6,2±0,2, comuna și pentru determinarea rezistenței la pH acid).
5.2.1.9.3. Rezistența la antibiotice
Rezistența tulpinilor de Bacillus sp. ATCC la antibiotice a fost testată prin metoda difuzimetrică conform European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST 2011), metodă ce a fost modificată (Dumitru și col., 2019). Cu ajutorul unui tampon steril (ex: cel utilizat la exudatul faringian) se prelevează cultura de 24±2 ore a microorganismului a cărei sensibilitate se dorește a se identifica și se introduce într-un tub cu 2 ml de apă ultrasterilă, formând astfel soluția concentrată. Într-un alt tub de 5 ml cu apă ultrasterilă, se adaugă în picătură soluție concentrată din tubul de 2 ml, cu ajutorul unei pipete Pasteur sterile, tubul fiind comparat cu densitatea standardului de turbiditate McFarland 0,5. Metoda în sine, constă în ștergerea suprafeței mediului de cultură (GN, de 3 ori din puncte diferite ale plăcii) cu cultură de BS, respectiv BL, prin utilizarea unui tampon ce a fost ulterior suspendat în soluția tubului de 5 ml. După 5-10 min. de repaus, timp destinat uscării suprafeței mediului, se trece la depunerea discurilor impregnate cu antibiotice. După 24 de ore, la 37°C, se măsoară diametrul zonei de inhibiție și compararea datelor conform Nithya și Halami (2013).
5.3. Etapele procesului biotehnologic pentru obținere de biopreparat enzimatic pe bază de Bacillus sp. în vederea administrării în hrana monogastricelor
Tehnologia de obținere a preparatului enzimatic probiotic cu tulpină de Bacillus subtilis ATCC 6051a, Bacillus licheniformis ATCC 21424 în vederea administrării în hrana monogastricelor (material biologic – purcei în criza de înțărcare și pui de carne) constă în parcurgerea la nivel de laborator a următoarelor etape:
Etapa 1. Obținere preinocul bacterian sub formă de monocultură
Tulpina selecționată (Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424) sub formă liofilizată a fost revitalizată în condiții aseptice: cu ajutorul unei pipete Pasteur sterile se preia 1 ml de apă distilată sterilă ce se omogenizează cu pulberea bacteriană. Suspensia obținută se însămânțează pe mai multe tuburi cu geloză simplă (GN, Merck) în plan înclinat și pe mediul lichid, bulion nutritiv (Merck, Anexa 2). Culturile rezultate se incubează la 30°C pentru B. subtilis ATCC 6051a, respectiv la 37°C pentru B. licheniformis ATCC 21424, timp de 24 de ore, în condiții de aerobioză, etapă însoțită de verificarea purității (frotiu Gram – morfologic x1000 și dispersie pe plăci Petri cu geloză nutritivă). Culturile pe mediul solid reprezintă cultura stoc de întreținere și se păstrează la 4°C. Conform tehnicii de lucru prezentată de Vintilă și Dinu (2015), din cultura-stoc se inoculează 2 tuburi cu GN, se incubează la temperatura optimă de dezvoltare a microorganismului, 24 de ore, acestea reprezentând cultura de preinocul.
Etapa 2. Obținere inocul și creșterea biomasei bacteriene
Inoculul de Bacillus sp. ATCC s-a obținut în condiții aseptice prin recoltarea cu ansa sterilă, a unei cantități de biomasă din preinocul și însămânțarea acesteia în baloane Erlenmayer de 100 ml, sterile, 37°C, 24 de ore, 150 rpm, pentru obținerea unei suspensii omogene. De asemenea, preinoculul și inoculul se verifică microscopic înainte de însămânțare (colorație Gram). Obținerea preparatelor bacteriene sub formă lichidă (cultură de 24 de ore) trebuie să fie bine dezvoltate, formate din celule tinere, aflate în faza logaritmică de creștere. Viabilitatea tulpinilor s-a determinat prin tehnica diluțiilor zecimale (1012UFC/ml), iar ulterior concentrația bacteriană utilizată pentru testarea in vivo a fost ajustată cu soluție fiziologică sterilă conform datelor prezentate de Dumitru și col., (2019), în concordanță cu datele din literatura de specialitate.
Etapa 3. Inoculare și obținere preparat bacterian cu rol de aditiv furajer.
Inocularea mediului fermentativ sau de biosinteză (în cazul de față mediul selectiv este BN) se realizează în condiții sterile prin respectarea parametrilor de cultivare: raport de inoculare (1:10 v/v), temperatura optimă, pH inițial (6,8±2), agitare (150 rpm), timp (24 de ore). Pentru urmărirea bioprocesului s-a determinat:
Menținerea purității culturilor bacteriene de Bacillus sp. ATCC prin efectuare de frotiuri Gram.
Acumularea biomasei bacteriene la sfârșitul procesului biotehnologic.
Determinarea UFC/ml, atât prin incubare statică, cât și sub agitare continuă a tulpinilor analizate.
Determinarea rezistenței sporilor la temperatură: se prelevează o cantitate exactă de mediu de biosinteză și se menține timp de 1-3 ore la 80°C-100°C, interval de temperaturi specifice procesului de granulare a materiilor prime furajere la nivel industrial. Determinarea viabilității sporilor de Bacillus sp. se efectuează la intervale de timp diferite 0, 30, 90 și 120 min., prin tehnica diluțiilor zecimale pe mediul selectiv (Chaiyawan și col., 2010).
Evoluția pH-ului și reprezentarea grafică a acestuia în timp.
Biomasa umedă și substanță uscată.
Etapa 4. Prelucrarea mediului de biosinteză. Separarea biomasei și pregătirea matricei de atomizare.
Etapa 5. Microîncapsularea probioticelor prin procesul de atomizare.
Derularea etapei 4 și 5 a avut loc doar pentru Experimentul V: obținere produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere și administrare în hrana puilor broiler de găină (subp 5.4).
De menționat că tulpinile de Bacillus sp. ATCC au prezentat o viabilitate mult mai ridicată decât UFC/ml prezentate mai sus, valoare ce a fost ajustată la concentrația afișată în ser fiziologic steril pentru testarea ulterioară in vivo. Preinoculul și inoculul s-a verificat microscopic (1000X) înainte și după însămânțare prin frotiuri Gram.
5.4. Etapele procesului biotehnologic pentru obținere de produs probiotic pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere în vederea administrării în hrana puilor broiler de găină
Pentru obținerea produsului probiotic pe bază de Lactobacillus sp., etapele de izolare, identificare, conservare și testare in vitro sunt detaliate în subcap 7.2.
Tehnologia de obținere a unor produse probiotice de Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41) sub formă de pulbere în vederea administrării în hrana puilor broiler de găină constă în parcurgerea la nivel de laborator a următoarelor etape:
Etapa 1. Obținerea inoculului și creșterea biomasei.
Tulpinile de Lactobacillus sp. au fost incubate 18-24 h, 37°C, în condiții de aerobioză (raport de inoculare 1:10 v/v, pentru obținerea unui volum de 200 ml/flacon inocul), în urma căruia s-a determinat viabilitatea acestora prin tehnica diluțiilor succesive în ser fiziologic steril 0,85% (w/v).
Etapa 2. Separarea biomasei și pregătirea matricei de atomizare.
Inoculul de Lactobacillus sp. rezultat în urma primei etape este supus procesului de separare a biomasei bacteriene prin centrifugare la 8000 rpm, 5-10 min., 4°C. Supernatantul rezultat se elimină, iar biomasa obținută se resuspendă în apă distilată sterilă, se omogenizează și se recentrifughează (se respectă aceeași parametrii); această etapă se repetă de 3 ori. In paralel se pregătește matricea numită și CARRIER pentru procesul de atomizare (maltodextrină 24% + glucoză anhidră 4% pentru un volum de 1 L apă distilată), matrice ce se autoclavează la 121°C, 15 min., după care se răcește sub jet de apă continuă. In matricea formată se încorporează biomasa bacteriană rezultată prin centrifugarea inoculului obținut în bioreactorul Eppendorf Bio Flo 320 în urma procesului fermentativ, în urma celor 3 centrifugări succesive în apa distilată sterilă.
Etapa 3. Microîncapsularea probioticelor prin procesul de atomizare.
Flaconul cu matrice+biomasa bacteriană este supus procesul de atomizare (trecerea masei lichide, inocul bacterian în cazul nostru, în formă solidă – PULBERE) derulat în SPRAY-DRYER. Pe toata durata acestei etape, flaconul cu matrice este omogenizat continuu pe un agitator magnetic. Pentru o parcurgere mai ușoară a etapelor enumerate anterior, în Fig. 5.1 este redat fluxul tehnologic de obținere produs probiotic bacterian sub formă de pulbere, activitate concretizată printr-un stagiu de formare profesională desfășurat în incinta Institutului de Științele Vieții (ISV) Regele Mihai I al României din cadrul Universității de Științe Agricole și Medicină Veterinară (USAMV) din Cluj, departamentul Biotehnologii fermentative.
Fig. 5.1. Fluxul tehnologic pentru obținerea pudrei probiotice bacteriene
Fig. 5.1. Technological flow for obtaining bacterial probiotic powder
5.4.1. Obținerea nutrețului combinat cu adaos de biopreparat bacterian
Ingredientele prezentate în formula rețetelor furajere (Tab. 4.3, 4.4, 4.5 și 4.6) se dozează corespunzător, după care se macină într-o moară cu ciocanele. Materiile prime se introduc într-un malaxor pentru omogenizare (Foto 5.4). Se continuă amestecarea adăugându-se premixul vitamino-mineral și restul ingredietelor. Se omogenizează 6 min. Nutrețul combinat obținut este sub formă de făină cu o granulație de 2,80 mm.
Foto 5.4. Omogenizator materii prime – obținere NC (Original)
Photo 5.4. Homogenizer of raw materials for obtaining animal feed (Original)
CAPITOLUL VI. METODE DE DETERMINARE A MICROBIOTEI LA MONOGASTRICE
6.1. Analize bacteriologice
Pentru stabilirea microbiotei din fecale și conținut intestinal (cecum și ileon) la purcei și la puii broiler de găină s-a respectat metoda Mountzouris (Mountzouris et al., 2007) completată de (Sorescu și col., 2019) prin colorația Gram a frotiurilor efectuate din coloniile care apar pe mediile selective, pentru confirmare morfologică, în urma examinării microscopice (Foto 6.1).
Foto 6.1. Colorația Gram a frotiurilor (Original)
Photo 6.1. Gram staining (Original)
Suine. S-au recoltat 3 probe fecale/repetiție/lot (N=30 probe) la 30±3 zile, 44±3 zile și 46±3 zile, respectiv 20 de probe conținut intestinal (10 cecum + 10 ileon), în urma sacrificării a 2 purcei/lot (Experimetul I: M, E1–BS 1%, E2–BS 3%; Experimentul II: M, E3–BL 1%, E4–BL 3%; martorul a fost comun). Din probele de fecale și conținut intestinal (cecum și ileon), s-a determinat: numărul prezumtiv de lactobacili, prezența enterococilor, prezența Salmonellei sp., numărul de coliformi, numărul de Clostridii, prezența E. coli β-hemolitică, număr de stafilococi etc.
Păsări. S-au recoltat 56 probe dejecții (N= 20 probe, 5 probe/lot la 35 zile, pentru Experimentul V cu 4 loturi: E, E+LS și F, F+LS; N= 36 probe, 6 probe/lot la 42 de zile, pentru Experimentul III și IV), respectiv 72 probe de conținut intestinal (36 cecum + 36 ileon), în urma sacrificării a 6 păsări/lot.
6.1.1. Metoda de identificare a lactobacililor
Recoltarea probelor. Un 1 g de conținut intestinal (ileon și cecum)/cap animal, crescuți în biobaza experimentală IBNA – Balotesti, a fost prelevat în condiții aseptice și omogenizat cu un volum de 7 ml BHI bulion Oxoid (Anexa 1) și 2 ml glicerol, urmat de congelarea tubului la -20C, până la prelucrare (maxim 3 luni). Pentru identificarea lactobacililor, proba se decongelează și se efectuează diluții zecimale în PBS Oxoid până la 10-7. Din ultimele trei diluțiile se însămânțează câte 0,1 ml pe câte 3 plăci cu MRS (Man, Rogosa, Sharpe) agar Oxoid (Anexa 2, Tab. 1). Se va incuba anaerob 48 ore la 370C, în jar Oxoid cu Anaerogen 2,5 L (Anexa 2, Tab, 2). Plăcile rezultate se vor examina din punct de vedere cultural și se va determina densitatea bacteriilor, prin numărarea coloniilor apărute pe fiecare placă în parte. Rezultatul va fi exprimat ca medie a celor trei numărători, de înmulțit cu inversul diluției la care s-a efectuat estimarea (UFC/g probă). De asemenea, se vor număra coloniile din fiecare tip cultural, prin efectuare de frotiuri colorate Gram, pentru examenul caracterelor morfologice și confirmarea morfologică a încadrării în genul Lactobacillus.
6.1.2. Metoda de identificare a enterococilor
Recoltarea probelor se face asemănător metodei pentru determinarea lactobacililor. Pentru identificarea enterococilor, proba se decongelează; se vor efectua diluții zecimale în PBS Oxoid până la 10-6. Din ultimele trei diluții din fiecare probă, se vor însămânța câte 0,1 ml pe câte 3 plăci cu Slanetz Bartley agar Oxoid (Anexa 2, Tab. 1). Se va incuba anaerob 48 de ore la 370C, în jar Oxoid cu Anaerogen 2,5 L. In urma însămânțării pe mediul Slanetz-Bartley agar, speciile din genul Enterococcus formează colonii de culoare roșu, roz-maro. Prezumtiv toate aceste colonii sunt posibil enterococi, însă se consideră pozitiv doar coloniile de culoare roșu intens închis. Plăcile rezultate se vor examina din punct de vedere cultural; prin efectuare de frotiuri colorate Gram, pentru examenul caracterelor morfologice și confirmarea morfologică a încadrării în genul Enterococcus sp. Rezultatul va fi exprimat ca medie a celor trei numărători, de înmulțit cu inversul diluției la care s-a efectuat estimarea (UFC/g probă).
6.1.3. Metoda de determinare a Salmonella sp.
Pentru determinarea genului Salmonella sp. din probele de conținut intestinal (cecum și ileon) se respectă protocolul de lucru conform SR EN 12824: 2001 (ASRO).
6.1.4. Metoda de determinare a numărului de clostridii
Mediul de cultură Agar clostridium (Anexa 2, Tab. 1) este utilizat pentru cultivarea și creșterea clostridiilor, specii anaerobe, fiind recomandat pentru specia Clostridium perfringens, conform Uniteed States Pharmacopeia (USP). Recoltarea probelor se va face asemănător metodelor prezentate anterior. Pentru identificarea numărului de clostridii, se vor efectua diluții zecimale în PBS Oxoid până la 10-6. Din ultimele trei diluțiile din fiecare probă, se vor însămânța câte 0,1 ml pe câte 3 plăci cu Mediul Agar Clostridium Oxoid. Se va incuba anaerob 48 de ore la 370C, în jar Oxoid cu Anaerogen 2,5 L. In urma însămânțării pe mediul Agar Clostridium, genul Clostridium sp., fiind cunoscute ca specii sulfitoreducătoare, imprimă dezvoltarea unor colonii punctiforme, negre. Plăcile rezultate se vor examina din punct de vedere cultural; s-a efectuat colorația Gram, pentru examinarea caracterelor și confirmarea morfologică a încadrării în genul Clostridium sp. Se va determina densitatea bacteriilor, prin numărarea coloniilor apărute pe fiecare placă în parte. Rezultatul va fi exprimat ca medie a celor trei numărători, de înmulțit cu inversul diluției la care s-a efectuat estimarea (UFC/g probă).
6.1.5. Metoda de determinare a numărului de coliformi
Mediul de cultură MacConkey agar (Anexa 2, Tab. 1) Oxoid este utilizat pentru identificarea numărului de coliformi. Recoltarea și modul de lucru este asemănător metodelor prezentate anterior. Se vor efectua diluții zecimale în PBS Oxoid până la 10-6. Din ultimele trei diluțiile din fiecare probă, se vor însămânța câte 0,1 ml pe câte 3 plăci cu mediul MC și se incubează aerob 48 de ore la 370C. In urma însămânțării pe mediul MC, prezența coliformilor imprimă dezvoltarea unor colonii roșu intens, vișinii, de mărime medie, perfect rotunde. Plăcile rezultate se vor examina din punct de vedere cultural; se va determina densitatea bacteriilor, prin numărarea coloniilor apărute pe fiecare placă în parte. Rezultatul va fi exprimat ca medie a celor trei numărători, de înmulțit cu inversul diluției la care s-a efectuat estimarea (UFC/g probă).
6.1.6. Metoda de determinare a numărului de Bacillus sp.
Mediul de cultură agar nutritiv (GN, Anexa 2, Tab. 1) Merck este utilizat pentru identificarea coloniilor de Bacillus sp.Recoltarea și modul de lucru este asemănător metodelor prezentate anterior. Se vor efectua diluții zecimale în PBS Oxoid până la 10-4. Din ultimele trei diluțiile din fiecare probă, se vor însămânța câte 0,1 ml pe câte 3 plăci cu agar nutritiv și se incubează aerob 48 de ore la 370C. Prezența coloniilor de Bacillus sp. imprimă dezvoltarea unor colonii de tip R, di dimensiuni mari, mate, albicioase, uneori cu tendința de invadare a mediului. Rezultatul va fi exprimat ca medie a celor trei numărători, de înmulțit cu inversul diluției la care s-a efectuat estimarea (UFC/g probă).
6.1.7. Metoda de determinare E. coli biotipul β-hemolitic
Mediul de cultură TSA agar sânge (Anexa 1, tabelul 1) Sanimed a fost utilizat pentru identificarea coloniilor de E. coli, biotipul β-hemolitic. Din proba concentrată (10-1), s-a însămânțat 0,01 ml pe o placă cu mediul TSA și se incubează aerob 24 de ore, la 370C. Prezența de E. coli biotipul β-hemolitic imprimă dezvoltarea unor colonii de tip S, perfect rotunde, gri-lucioase, cu zonă de hemoliză de jur împrejurul coloniei. Pentru confirmare, se solicită efectuarea unor teste biochimice, pe TSI, MIU, CITRAT (Anexa 1). Modul de lucru și interpretare se realizează conform http://www.tgw1916.net
CAPITOLUL VII. REZULTATE ȘI DISCUȚII
In acest subcapitol sunt prezentate rezultatele cu privire la principalele caracteristici (culturale, morfologice, biochimice, hemolitice, enzimatice) ale tulpinilor bacteriene, precum și analizarea unor proprietăți probiotice (rezistență pH 2 și 3, rezistență săruri biliare) în vederea stabilirii nivelului de includere în hrana monogastricelor. Tulpinile analizate sunt: Bacillus subtilis ATCC 6051a (BS), Bacillus licheniformis ATCC 21424 (BL) și două tulpini de Lactobacillus sp. (L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41).
7.1. Rezultatele cercetărilor in vitro privind caracterizarea tulpinilor bacteriene de Bacillus sp. în vederea administrării în hrana monogastricelor
7.1.1. Caractere culturale
Tulpinile de Bacillus sp. din Colecția de microorganisme American Type Culture Collection (ATCC), sub formă liofilizată (Foto 7.1), au fost revitalizate în mediul selectiv (bulion nutritiv -BN Merck) și menținute pe geloză nutritivă (GN – Merck), incubate aerob, 24 de ore la temperatura optimă de dezvoltare (30°C – BS, 37°C – BL).
In urma incubării, tulpina de BS determină formarea de colonii rotunde, opace, pigmentate, albicioase, de tip R, suprafață mată, rugoasă, cu margini neregulate, burjeonate, 1,2-1,5 mm diametru, în timp ce BL pe GN imprimă dezvoltarea unor colonii rotunde, opace, pigmentate, albicioase, de tip R, cu margini neregulate, zimțate, 0.7-0.9 mm diametru, aderente de suprafața mediului (Foto 7.1).
Foto 7.1. Aspecte culturale pe GN în urma revitalizării liofilizatelor de Bacillus sp. ATCC în bulion nutritiv (BS-foto stânga și BL-foto dreapta) (Original)
Photo 7.1. Cultural aspect on agar plate after revitalization in nutrient broth of Bacillus spp. ATCC (BS-photo left and BL-photo right) (Original)
In bulionul simplu, BS prezintă o turbiditate intensă, omogenă, cu depozit abundent, ușor omogenizabil la agitare, fără formațiuni de suprafață; în cazul BL turbiditatea și depozitul este absent, se observă o peliculă rugoasă, roz palidă (Foto 7.2).
Foto 7.2. Aspecte culturale în bulion nutritiv în urma revitalizării liofilizatelor de Bacillus sp. ATCC (BS-foto stânga și BL-foto dreapta) (Original)
Photo 7.2. Cultural aspect on agar plate after revitalization in nutrient broth of Bacillus sp. ATCC strains (BS-photo left and BL-photo right) (Original)
7.1.2. Caractere morfologice
In urma colorației Gram, s-au examinat caracterele morfologice pentru tulpinile de Bacillus sp. (Tab. 7.1).
Tab. 7.1. Aspecte morfologice pentru tulpinile de Bacillus sp. ATCC (Gram 1000x)
Tab. 7.1. Morfological aspects from Bacillus spp. ATCC (Gram staining, 1000x)
*Unde: a = frotiu din cultură BN, 24 de ore; b = frotiu din cultură de GN, 24 de ore
Bacilii prezintă capacitate de sporulare, pot rămâne viabili sute de ani (Liao și Nyachoti, 2017). Această caracteristică a genului Bacillus, de a forma spori, contribuie la mărirea stabilității de supraviețuire în condiții nefavorabile de dezvoltare (rezistență crescută la factorii de mediu, la agenții fizici, chimici, coloranți etc.), al pH-ului scăzut de la nivelul tractului gastrointestinal (GIT), precum procesarea termică și depozitarea hranei (Elshaghabee și col., 2017). Odată adăugat în furaj, sporul este ingerat de animalul gazdă, iar metabolismul sporului se reactivează dacă întâlnește condiții favorabile de viață, obținându-se, conform datelor menționate de Cutting (2011), efecte pozitive.
Această ipoteză este întărită de Merchant și col., (2011) care afirmă că Bacillus sp. poate fi utilizat ca aditiv furajer cu proprietăți probiotice în nutriția animalelor, deoarece valoarea pH-ului în intestinul subțire este de 6 – 7, aceasta fiind optimă dezvoltării și germinării sporilor. Genul Bacillus, prin capacitatea de a forma spori, este implicat în sinteza unor enzime de interes biotehnologic, rezistând la degradarea enzimatică și starea acidă a stomacului.
Bernardeau și col., (2017) a raportat că suplimentarea hranei la animale cu anumite tulpini specifice de Bacillus, datorită prezenței sporilor, contribuie la o serie de beneficii: îmbunătățirea digestibilității, a microbiota intestinale, modularea imunității și a performanței de creștere etc.
7.1.3. Caractere biochimice
7.1.3.1. Testul API 50 CHB
Identificarea tulpinilor de Bacillus sp. s-a efectuat pe baza caracterelor biochimice, cu ajutorul kitului API 50CHB (bioMerieux, Franța), prin respectarea protocolului de lucru. Capacitatea de fermentare a carbohidraților a fost observată prin decolorarea mediului bazal, de la roșu la galben, ca răspuns pozitiv (Foto 7.3) al fermentării substraturilor (Aruwa și Olatope, 2015).
Foto 7.3. Kit API 50CHB, identificare Bacillus sp. ATCC (a=BS; b=BL) (Original)
Photo 7.3. API 50CHB, identification of Bacillus spp. ATCC (a=BS; b=BL) (Original)
Rezultatele obținute prin API 50 CHB au fost înregistrate ca interpretare finală după 48 de ore, la 37°C (Tab. 7.2).
Tab. 7.2. Rezultatele obținute cu API 50 CHB/E pentru Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.2. Results obtained by API 50 CHB from Bacillus spp. ATCC
*Unde: – = negativ; += pozitiv; ?= dubios, slab pozitiv
Tulpinile de Bacillus sp. au fost identificate cu ajutorul programului informatic API web (bioMérieux) 50 CHB V 4.0 (B. subtilis very good identification, % ID 99,4; B. licheniformis very good identification, % ID 99,9; Foto 7.4) și ABIS online soft (B. subtilis~92% similaritate; B. licheniformis~90,6% similaritate, Foto 7.5). Se ia în considerare doar acele rezultate, la care procentul de identificare este mai mare de 85% probabilitate.
Conform Tab. 7.2, B. subtilis ATCC 6051a fermentează D-glycerol, salicin, D-celobioza, D-maltoza, L-arabinoza, D-riboza, D-melibioza, D-xiloza, D-zaharoza (sucroza), D-trehaloza, D-rafinoza, D-glucoza, amidonul, D-fructoza, glicogen, D-manoza, gentibioza, D-turanoza, inositol, D-manitol, D-sorbitol, metil-αD-glucopiranosid, amigdalina, arbutina și esculina. Aceasta nu hidrolizează D-arabinoza, D-lactoza, L-xiloza, D-adonitol, metil-βD-xilopiranosid, D-melezitoza, D-galactoza, xilitol, L-sorboza, L-rhamnoza, dulcitol, D-lixoza, D-tagatoza, D-fucoza, L-fucoza, methyl-αD-manopiranozid, D-arabitol, L-arabitol, N-acetilglucozamin, gluconat de potasiu, 2-cetogluconat de potasiu și 5-cetogluconat de potasiu. In schimb, B. licheniformis ATCC 21424 fermentează esculina, glicerol, salicin, D-celobioza, D-arabinoza, D-maltoza, L-arabinoza, D-lactoza, D-riboza, D-melibioza, D-xyloza, D-zaharoza (sucroza), D-trehaloza, D-rafinoza, amidonul, D-glucoza, D-fructoza, glicogen, D-manoza, D-turanoza, inositol, D-tagatoza, D-manitol, D-sorbitol, metil-αD-glucopiranozid, amigdalin și arbutin. Tulpina nu fermentează eritritol, D-arabinoza, L-arabinoza, D-lactoza, D-melibioza, L-xyloza, D-adonitol, inulin, metil-βD-xilopiranozid, D-galactoza, D-melezitoza, xilitol, L-sorboza, gentibioza, dulcitol, D-lixoza, D-fucoza, L-fucoza, metil-αD-manopiranosid, D-arabitol, L-arabitol, gluconate de potasiu, 2-cetogluconat de potasiu, 5-cetogluconat de potasiu și N-acetilglucozamin. Testul API 50 CHB oferă informații despre capacitatea unei tulpini de a acționa asupra unui substrat și de a-l fermenta; de asemenea acest test biochimic reprezintă o alternativă asupra evidențierii echipamentului enzimatic bacterian, datorită decolorării mediului basal (roșu la galben).
Foto 7.4. Identificarea tulpinii de BS prin API50CHB, V 4.0 și Abis online
(Stoica și Sorescu, 2017) (Original)
Photo 7.4. Strain identification of BS by API50CHB V 4.0 and Abis online
(Stoica and Sorescu, 2017) (Original)
Foto 7.5. Identificarea tulpinii de BL prin API 50 CHB, V 4.0 și Abis online
(Stoica și Sorescu, 2017) (Original)
Photo 7.5. Strain identification of BL by API 50 CHB V 4.0 and Abis online
(Stoica and Sorescu, 2017) (Original)
7.1.3.2. Testul catalazei
In ceea ce privește testul catalazei, rezultatul a fost pozitiv pentru ambele tulpini de Bacillus sp., prin generarea unor bule de gaz (efervescență) pe lama de sticlă, după adăugarea de H2O2 3%. Această caracteristică diferențiază genul Bacillus de bacteriile sporogene anaerobe (ex: Clostridium sp., Barbosa și col., 2005). Prezența catalazei poate stimula, conform (Hosoi și col., 2011) dezvoltarea și rezistența speciilor de Lactobacillus de la nivelul tractului gastrointestinal animal.
7.1.4. Conservarea tulpinilor de Bacillus sp.
In urma testării viabilității tulpinilor de Bacillus sp. ATCC, s-a observat că acestea rezistă foarte bine atât la 4°C, cât și la temperatura camerei (Tab. 7.3). Conservarea pe termen lung a fost efectuată la -80°C, în bulion nutritiv cu adaos de 20% glicerol ca agent de crioconservare.
Tab. 7.3. Testarea viabilității tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.3. Testing the viability of Bacillus spp. ATCC
7.1.5. Evidențierea proprietăților hemolitice
Anumite specii bacteriene produc enzime extracelulare care lizează hematiile (celulele roșii din sânge) proces numit hemoliză cu eliberarea unor hemolizine. Prezența hemolizinelor (exotoxine) implică o difuzare radială spre exteriorul coloniei, determinând degradarea totală sau parțială a celulelor roșii până la produse incolore. Astfel, apariția unei zone transparente in jurul coloniilor determină un răspuns pozitiv.
In urma însămânțării tulpinilor de Bacillus sp. pe mediul geloză – sânge de oaie 5% (TSA agar Sanimed), astfel încât să apară colonii cât mai izolate, probele au fost incubate, 24 de ore, la 37°C. In jurul coloniilor nu s-a observat nicio zonă de hemoliză (β-hemoliză, Foto 7.6), asemenea unui halou, fapt ce imprimă un grad nepatogen tulpinilor de Bacillus sp. care, ulterior, au fost administrate în hrana purceilor în criza de înțărcare.
Foto 7.6. Testul de hemoliză pe TSA (BS – stânga, BL – dreapta)
după Dumitru și col., (2018) (Original)
Photo 7.6. Hemolysis test (BS – left, BL – right) after Dumitru et al., (2018) (Original)
Date similare au fost înregistrate de Sorokulova și col., (2008), privind activitate nehemolitică (nepatogenă) pentru unele specii de Bacillus pe placa de agar sânge suplimentată cu 5% sânge de oaie, care după Jung și Chang (2012) se consideră a fi unul dintre principalele criterii pe care trebuie sa-l îndeplinească un organism probiotic. De asemenea, tulpinile din genul Bacillus sunt cunoscute drept potențiale surse cu rol probiotic implicate în îmbunătățirea sănătății animale (Guo și col., 2006; Abduhul și col., 2015). Șeker (2010) afirmă că înregistrarea unei γ-hemolize și α-hemolize, confirmă nepatogenitatea unor specii de microorganisme, fiind considerate posibile surse probiotice.
7.1.6. Activitatea antimicrobiană
Testarea activității antibacteriene a tulpinilor de BS și BL s-a efectuat față de bacteria patogenă Escherichia coli biotipul β-hemolitic (Foto 7.7). Prezența tulpinii de Bacillus subtilis ATCC 6051a limitează pH-ul local, inhibând dezvoltarea agentului patogen E.coli. In schimb BL nu prezintă rezistență față de E. coli, motiv pentru care după 24 de ore, la 37°C pe placa însămânțață cele două culturi s-au intersectat.
Foto 7.7. Activitatea antimicrobiană pentru Bacillus sp. ATCC (BS-stânga; BL-dreapta)
Photo 7.7. Antimicrobial activity of Bacillus spp. ATCC (BS-left; BL-right)
Conform datelor afirmate de Tabuc și col. (2016), acțiunea antimicrobiană constă în inhibarea dezvoltării bacteriilor patogene și poate fi realizată în mai multe moduri:
– producerea de acizi organici (acid lactic, acid acetic, etc.), din glucidele prezente în rația alimentară, care contribuie la micșorarea pH-ului intestinal creând un mediu nefavorabil dezvoltării unor specii patogene precum Escherichia coli și Salmonella sp.;
– producerea de peroxid de hidrogen în medii umede (tract intestinal), favorizând inhibarea multor specii bacteriene patogene;
– producerea de bacteriocine (peptide antimicrobiene cu greutate moleculară mică) cu acțiune inhibitorie asupra agenților patogeni.
7.1.7. Determinarea activității enzimatice
7.1.7.1. Optimizarea mediului fermentativ. Producere de α-amilază
Efectul sursei de carbon asupra producerii de amilază de către tulpinile de Bacillus sp. s-a determinat, în prima etapă, prin includerea în mediul de creștere al acestora (bulion nutritiv) a unor substraturi glucidice, în proporție de 1% (w/v). In ceea ce privește viabilitatea tulpinii de BS pe mediul cu geloză nutritivă la adaos de substrat glucidic, s-au înregistrat diferențe semnificative din punct de vedere statistic (P<0,05) între toate sursele de carbon (amidon, fructoză, glucoză și lactoză, Tab. 7.4).
BS a prezentat un grad ridicat de dezvoltare la adaos de amidon în mediul de creștere, urmat de lactoză, glucoză și fructoză, după cum se poate observa și în Foto 7.8. In schimb, tulpina de BL s-a dezvoltat atât pe mediul nutritiv simplu, cât și la suplimentare cu glucoză, urmat de amidon, lactoză și fructoză.
Tab. 7.4. Determinarea viabilității tulpinilor de Bacillus sp. ATCC (Log10 UFC/ml) pe mediul selectiv cu adaosul unor surse diferite de carbon
Tab. 7.4. Log10 CFU/ml of Bacillus spp. ATCC on minimal medium containing different carbon sources
*Unde: a,b,c,d Mediile din coloană care au aceeași literă diferă semnificativ (P<0,05).
Foto 7.8. Dezvoltarea tulpinilor de Bacillus sp. pe mediul GN cu adaos de substrat glucidic (1%, w/v, 1: glucoză; 2: amidon; 3:- lactoză; 4: fructoză) (Original)
Photo 7.8. The growth of Bacillus spp. strains on nutrient agar medium containing different carbon sources (1: glucose; 2: starch; 3:- lactose; 4: fructose) (Original)
BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformis ATCC 21424
Rezultatele optimizării mediului fermentativ pe bază de bulion simplu cu adaos de glucid 1% în urma inoculării cu tulpinile de Bacillus sp. ATCC sunt asemănătoare cu cele raportate în literatura de specialitate de către Swain și col., (2006).
7.1.7.2. Determinarea activității amilazice
Determinarea capacității amilazice a tulpinilor de Bacillus sp. s-a realizat prin respectarea metodei de lucru prezentate în subcap. 5.2.1.8. Astfel, în urma centrifugării mediului fermentat (bulion nutritiv suplimentat cu sursele glucidice prezentate la subcap. 7.3.1.) la parametrii 8000 rpm, 20 min., 4°C, s-a obținut supernatantul, acesta fiind, de fapt, extractul enzimatic crud (proba de analizat). De asemenea, acumularea biomasei bacteriene pe parcursul procesului de biosinteză pentru tulpinile de BS și BL, s-a determinat atât spectofotometric (DO la 600 nm la Spectofotometrul Eppendorf, Anexa 1), cât și prin tehnica diluțiilor zecimale pentru determinare UFC/ml. In Tab. 7.5 sunt prezentate rezultatele obținute pentru tulpinile de Bacillus sp., în urma incubării la 37°C, 24 h, 150 rpm, inocul ce a fost utlizat la însămânțarea mediului de biosinteză în raport de 1:10.
Tab. 7.5. Acumularea biomasei bacteriene a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.5. Accumulation of bacterial biomass of Bacillus spp. ATCC strains
Pentru determinarea activității amilazice s-a construit curba etalon (Fig. 7.1), iar cu ajutorul ecuației de regresie (y = 0.1293x + 0.0971) s-a determinat AE a tulpinilor de Bacillus sp. prezentate în Tab. 7.6.
Producția de enzime de către microorganisme este puternic influențată de compoziția mediului de fermentație, substrat, temperatură, pH, concentrația inoculului și timpul de incubare (Pant și col, 2015).
Tulpina BS în bulion nutritiv cu 1% amidon a prezentat o activitate amilazică de 2,88 mai mare vs. mediul suplimentat cu fructoză, respectiv de 8,66 mai mare față de mediul cu lactoză. Din cele 4 surse glucidice, adaosul de amidon a înregistrat cea mai mare activitate amilazică. In schimb, BL a prezentat o ușoară activitate amilazică doar în mediul cu fructoză (0,05 U/ml). Astfel, putem spune că, un factor foarte important asupra secretării de enzime amilolitice este ocupat de sursa de carbon sau glucide (substrat).
Capacitatea enzimatică a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC s-a determinat pe toate materiile prime ce au intrat în componența NC corespunzător experimentelor in vivo, cât și pe structura de NC; compoziția mediului de fermentație fiind redată în ANEXA 2, Tab. 7. In Tab. 7.7 se prezintă activitatea amilazică a tulpinilor de BS și BL, la pH=7, în urma incubării 37°C, 24-72 de ore, 150rpm.
Fig. 7.1. Curba etalon pentru determinarea activitatii amilazice
Fig. 7.1. Standard curve for determine the amylase activity
Tab. 7.6. Activitatea amilazică pentru BS și BL pe medii diferite
Tab. 7.6. Amylase activity of BS and BL on different medium fermentations
*Unde: na=nu se aplică/absent; BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformis ATCC 21424.
Tab. 7.7. Activitatea amilazică a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.7. The amylase activity of Bacillus spp. ATCC strains
*Unde: NC = nutreț combinat administrat purceilor în Experimentul I și II; BL = Bacillus licheniformis ATCC 21424; BS = Bacillus subtilis ATCC 6051a
In Fig. 7.2 se poate observa că BS după 72 de ore produce de 1,72 ori mai multă amilază în mediul de biosinteză cu NC comparativ cu BL. La 72 de ore, tulpina de BL prezintă în mediul de biosinteză cu NC, o activitate de 6,63 U/mL, fiind cu 89,42% mai mare vs. mediul fermentativ incubat 24 de ore.
Fig. 7.2. Evidențierea activității amilazice pentru tulpinile de Bacillus sp. ATCC pe diferite substrate energo-proteice
Fig. 7.2. The amylase activity of Bacillus spp. ATCC strains on different energy-protein substrates
In schimb, la adaosul de 2% porumb, BL, după 72 de ore, a înregistrat o activitate amilazică de 19,43 U/ml, fiind cu 47,3% mai eficient decât BS. Boabele de porumb datorită conținutul ridicat de amidon, imprimă tulpinilor de Bacillus sp. ATCC o maximizare în ceea ce privește sinteza de enzime hidrolitice extracelulare.
Mediul cu sorg a fost mult mai eficient pentru BL pe parcursul celor 72 de ore, comparativ cu BS unde activitatea amilazică a fost de 2,89 ori mai mică după 24 de ore, de 2,82 ori după 48 și 72 de ore. BL după 72 de ore. a prezentat o activitate de 11,6 U/ml în mediul cu mazăre, în timp ce în mediul su soia a fost estimată o valoare de 18,36 U/ml, fiind de 2,51 ori mai mare vs. BS.
Suplimentarea hranei la monogastrice, conform datelor din literatură (Bimrew, 2014; Yuan și col., 2017), cu specii de Bacillus producătoare de amilaze contribuie la îmbunătățirea procesului digestiv la animalele tinere prin completarea sistemului digestiv imatur. In cazul purceilor în criza de înțărcare unde secreția de amilază are loc mult mai tartiv, adaosul unor tulpini producătoare de enzime poate fi un plus de beneficii asupra descompunerii carbohidraților sau a NSP-urilor din materiile furajere, în zaharuri simple (maltoză) ușor asimilabile de organismul gazdă.
7.1.7.3. Celulază
Pentru determinarea activității celulozolitice s-a construit curba etalon (Fig. 7.3), iar cu ajutorul ecuației de regresie (y = 0,6328x + 0,0209) s-a determinat AE a tulpinilor de Bacillus sp. prezentate în Tab. 7.9.
Fig. 7.3. Curba etalon pentru determinarea activității celulozolitice
Fig. 7.3. The standard curve for determining cellulolytic activity
Nutrețul combinat prin aportul celulozic, poate fi mai ușor digerat dacă se utilizează un preparat enzimatic bacterian cu capacitate de descompunere a componentei fibroase în glucide asimilabile. Ambele tulpini de Bacillus sp. prezintă activitate celulozolitică la pH=6,4 și 7, comparativ cu pH 3, unde nivelul este scăzut, ceea ce demonstrează că acest parametru de cultură este foarte important.
Lignoceluloza este componenta majoră a plantelor, dificil de degradat, compusă din 3 polimeri: celuloză, hemiceluloză și lignină (Dumitru și col., 2018). Datorită structurilor complexe β-glicozidice, celuloza sau fibra, nu poate fi absorbită sub această formă de către animalul tânăr, fapt pentru care se suplimentează hrana cu biopreparate enzimatice bacteriene. Tulpina de BL în urma ajustării mediului fermentativ la pH 6.4, 7 si 3 a atins valoarea maximă a sintezei de enzime celulozolitice în mediul cu pH 6.4, pH-ul fiind și un factor limitativ, deoarece conform Fig. 7.4, la pH=3 s-a remarcat cea mai scăzută activitate celulozolitică.
Tab. 7.8. Activitatea celulozolitică a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.8. Cellulolytic activity of Bacillus spp. ATCC strains
BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformis ATCC 21424
Fig. 7.4. Evidențierea activității celulozolitice pentru tulpinile de Bacillus sp. ATCC pe diferite substrate energo-proteice
Fig. 7.4. The cellulolytic activity of Bacillus spp. ATCC strains on different energy-protein substrates
7.1.7.4. Protează
Pentru determinarea activității proteolitice s-a construit curba etalon (Fig. 7.5), iar cu ajutorul ecuației de regresie (y = 1.2634x + 0.1) s-a determinat AE a tulpinilor de Bacillus sp. (Tab. 7.9). La 72 de ore, Bacillus licheniformis ATCC 21424 prezintă o activitate proteolitică în mediul cu nutreț combinat de 97,75 U/mL, fiind de 1,03 ori mai mare comparativ cu mediul incubat la 48 ore, respectiv de 36,33 ori mai mare comparativ cu mediul incubat la 48 de ore (Fig. 7.6).
Fig. 7.5. Curba etalon pentru determinarea activității proteolitice
Fig. 7.5. The standard curve for determining the protease activity
Tab. 7.9. Activitatea proteolitică a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.9. The proteolytic activity of Bacillus spp. ATCC strains
*Unde: BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformis ATCC 21424
Creșterea timpului de incubare (72 h) mărește capacitatea enzimatică a tulpinii de BL reflectată printr-o creștere logaritmică și implicit segregare de enzime exogene proteolitice în mediul fermentativ, cu rol catalitic asupra legăturilor complexe din structura nutrețului combinat, respectiv scindarea legăturilor peptidice până la forme simple, ușor asimilabile de organism (aminoacizi).
Din analiza datelor asupra activității proteazice a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC pe materiile prime din structura NC administrat purceilor în criza de înțărcare (30±3 zile), după 72 de ore de incubare, BL produce de 350% ori mai multă protează față de BS; activitate acestuia fiind 0,28 U/ml. Capacitatea proteazică a tulpinii de Bacillus licheniformis ATCC 21424 a fost confirmată și de Maghsoodi și col., (2013), unde se prezintă mediul de biosinteză, mediu ce a fost modificat în studiul de față prin introducerea materiilor prime în procent de 2% și evaluarea ulterioară a acestora din punct de vedere enzimatic.
Fig. 7.6. Evidențierea activității proteolitice pentru tulpinile de Bacillus sp. ATCC pe diferite substrate energo-proteice
Fig. 7.6. The proteolytic activity of Bacillus spp. ATCC strains on different energy-protein substrates
De asemenea, acumularea biomasei bacteriene pe parcursul procesului de biosinteză, s-a determinat atât spectofotometric (DO 600 nm la Spectofotometrul Biomate 3, Anexa 1), cât și prin tehnica diluțiilor zecimale pentru determinare UFC/ml.
In Tab. 7.10 sunt prezentate rezultatele obținute pentru tulpinile de Bacillus sp., în urma incubării la 37°C, 24 h, 150 rpm.
Tab. 7.10. Acumularea biomasei bacteriene a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.10. The accumulation of bacterial biomass of Bacillus sp. ATCC
7.1.8. Evidențierea capacității de hidroliză a amidonului
Culturile bacteriene de B. subtilis ATCC 6051a, respectiv B. licheniformis ATCC 21424 au fost testată pentru evidențierea capacității amilolitice prin testul de hidroliză al amidonului. S-a utilizat ca mediu de cultură GN cu adaos de 1, 2 și 3% amidon. In urma însămânțării, incubării 24 de ore la temperatura optimă de dezvoltare, ambele tulpini au hidrolizat amidonul (Foto 7.9a, 7.9b).
Foto 7.9a. Testul de hidroliză al amidonului – B. subtilis ATCC 6051a(Original)
Photo 7.9a. Screening of hydrolysis amylase of B. subtilis ATCC 6051a(Original)
Foto 7.9b. Testul de hidroliză al amidonului – B. licheniformis ATCC 21424 (Original)
Photo 7.9b. Screening of hydrolysis amylase – B. licheniformis ATCC 21424(Original)
Această caracteristică a fost evidențiată prin apariția unui halou de jur împrejurul coloniei dezvoltate, fapt ce sugerează capacitatea tulpinilor de Bacillus sp. de a produce enzime amilolitice capabile să scindeze amidonul, până la monozaharide (maltoză și glucoză). De asemenea, procesul de hidroliză, la adaos de soluție Lugol, a fost mult mai evident pe mediul de cultură cu 1% amidon, zona de halou fiind mult mai pronunțată.
Singh și col. (2015) afirmă că genul Bacillus este un grup cu proprietăți înalte de a sintetiza amilază, fiind plasat drept important producător de enzime industriale. În studiul lor, Mishra și Behera (2008) au prezentat date similare privind evidențierea hidrolizării amidonului, cu o zonă transparentă în jurul coloniilor de Bacillus sp., fapt ce imprimă capacitatea acestora de a secreta enzime amilolitice în mediul nutritiv, fiind tot odată și o direcție pentru selectarea corectă a componentelor furajere, dacă cercetările au la bază adaos de preparat enzimatic exogen pe bază de Bacillus.
In general, tulpinile genului Bacillus sunt surse enzimatice extracelulare din clasa hidrolaze, cu implicații majore în procesele digestive (Davis și col., 2008).
Purceii în criza de înțărcare au un sistemul enzimatic incomplet dezvoltat. Trecerea de la furajarea lichidă (lapte scroafă) la furajarea solidă (nutreț combinat), implică o absorbție ineficientă a substanțele nutritive din hrană, proces observabil prin dezechilibre gastrointestinale cu consecințe majore asupra performanțelor de creștere și a stării de sănătate a purceilor (Campbell și col., 2013).
Suplimentarea hranei cu preparate enzimatice exogene contribuie la degradarea structurilor complexe din formula rețetei furajere. Lei și Kim (2014) au raportat că la adaos de Bacillus sp. în hrana purceilor (rețetă pe bază de porumb), s-a îmbunătățit performanța de creștere, sistemul imunitar, microbiota intestinală și digestibilitatea polizaharidelor neamidonoase, datorită secretării unor enzime exogene bacteriene la nivel de intestin sau a enzimelor endogene disponibile în celula bacteriană, care sunt eliberate în urma lizării de pH-ul acid al stomacului gazdei (Ortiz și col., 2015).
7.1.9. Evidențierea capacității de hidroliză a cazeinei
Tulpinile de Bacillus au fost supuse testului de hidroliză a cazeinei, pentru a evidenția capacitatea acestora de a secreta enzime proteolitice capabile să hidrolizeze cazeina din lapte. In urma însămânțării, incubării 24 de ore, la temperatura optimă de dezvoltare a tulpinilor, plăcile pe mediul cu cazeină (1%) și lapte praf (1%), au fost inundate cu soluție de acid triclor acetic (TCA 25%) și menținute 15 minute, la 45°C, conform metodei (Sudipta, 2010). Ambele tulpini de Bacillus prezintă capacitatea de a sintetiza cazeina din lapte, aceasta fiind observată printr-o zonă de halou de jur împrejurul coloniilor (Foto 7.10). Lee și col., (2012) a raportat că adaosul unor enzime microbiene extracelulare cu proprietăți probiotice, poate îmbunătății procesul de digestie, de exemplu, proteazele exogene pot reprezenta o opțiune pentru reducerea nivelului proteic, cât și valorificarea performanțelor zootehnice. Rezultatele obținute în urma examinării unor proprietăți probiotice pentru tulpinile de Bacillus sp. în vederea utilizării ca preparat enzimatic exogen în hrana purceilor în criza de înțărcare.
Foto 7.10. Testul de hidroliză a cazeinei (BS: 1 – cazeină 1%, 2 – lapte praf 1%; BL: 3 – cazeină 1%, 4 – lapte praf 1%) (Original)
Photo 7.10. Screening hydrolysis protease (BS: 1 – casein 1%, 2 – milk power 1%; BL: 3 – casein 1%, 4 – milk power1%) (Original)
7.1.10. Rezistența la pH 2 și 3
Tulpinile de Bacillus sp. conservate pe geloză nutritivă la 4°C și temperatura camerei, au fost testate din punct de vedere al rezistenței la pH 2 și 3, prin simularea sucului gastric conform metodei (Lee și col., 2012), în condiții de agitare (37°C, 24 de ore, 120 rpm, Tab. 7.11 și 7.12).
Tab. 7.11. Efectul sucului gastric (pH 2 și 3) asupra viabilității tulpinii de Bacillus subtilis ATCC 6051a sub expunere constantă la agitare timp de 120 min
Tab. 7.11. The effect of synthetic gastric juice (pH 2 and 3) for Bacillus subtilis ATCC 6051a strain viability during 120 min under a constant agitation exposure
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei; a,b,c,d Mediile din coloană care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Tulpinile de Bacillus sp. conservate în condiții diferite (4°C și temperatura camerei) prezintă o rată bună de supraviețuire, în urma incubării la 120 min., atât la pH 2, cât și 3. Ambele tulpini au înregistrat diferențe semnificative la pH 2, la toate timpurile de incubare (0, 30, 60, 90 și 120 min.). In urma incubării la pH 3, 4°C, viabilitatea tulpinii de BL nu s-a modificat semnificativ.
Tab. 7.12. Efectul sucului gastric (pH 2 și 3) asupra viabilității tulpinii de Bacillus licheniformis ATCC 2142 sub expunere constantă la agitare timp de 120 min
Tab. 7.12. The effect of synthetic gastric juice (pH 2 and 3) for Bacillus licheniformis ATCC 21424 strain viability during 120 min under a constant agitation exposure
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei; a,b,c,d Mediile din coloană care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Rezultatele rezistenței la pH acid sunt asemănătoare cu cele din literatura de specialitate (Lee și col., 2012); în schimb datele raportate de autor sunt mult mai scăzute pentru tulpinile de Bacillus sp. pe parcursul incubării timp de 30 min., la pH 2. In urma conservării la 4°C și temperatura camerei, tulpini ATCC analizate au înregistrat o rezistență ridicată la pH 2 și 3, după incubarea la 120 min. Comparativ cu date prezentate de Thi și col. (2016), unde supravieúirea tulpinilor de Bacillus sp. la pH acid a fost redusă semnificativ, în cazul de față ambele tulpini ATCC sunt capabile să supraviețuiască la pH 2 și 3.
Similar, Ritter și col., (2018) în conformitate cu FAO/WHO raportează că rezistența la aciditatea gastrică și sărurile biliare, sunt două dintre cele mai importante teste in vitro în scopul administrării unui organism sub formă de probiotic în hrana monogastricelor. In Foto 7.11 sunt prezentate tulpinile de BL și BS în urma expunerii la pH, 7, 2 și 3 conform metodei Lee și col. (2012), modificată de Dumitru și col. (2018).
Din rezultatele obținute asupra rezitenței la pH acid, tulpinile de Bacillus sp. ATCC (BS și BL) conservate la 4°C și temperatura camerei au avut o rată de supraviețuire mai mare de 70% (Fig. 7.7) după incubare la pH 2 și 3, 120 min. BS vs. BL, a tolerat pH-ul acid mult mai bine, 88,18% fiind remarcat la pH-ul 3 de la temperatura camerei. Rezultatele obținute sunt în concordanță cu cele raportate în literatura de specialitate (Ritter și col., 2018; Manhar și col., 2016).
Foto 7.11. Rezistența tulpinilor de Bacillus sp. ATCC la pH 2 și 3 (Original)
Photo 7.11. Bacillus spp. ATCC strains resistance at pH 2 and 3 (Original)
Fig. 7.7. Procentul de supraviețuire pentru tulpinile de Bacillus sp. ATCC la pH 2 și 3, 120 min. incubare
Fig. 7.7. The survival rate of Bacillus spp. ATCC strain to pH 2 and 3 after 120 min. of incubation
7.1.11. Rezistență la săruri biliare
Conform Tab. 7.13, tulpinile de Bacillus sp. ATCC (BL și BS) au tolerat foarte bine mediul nutritiv cu adaos de săruri biliare 0,3% pe parcursul celor 4 ore de incubare, înregistrând o pierdere lentă a viabilității. Tulpina de BS conservată la 4°C și temperatura camerei, a tolerat excelent adaosul sărurilor biliare în mediul nutritiv, nefiind înregistrate diferențe semnificative (P<0,05) pe parcursul celor 4 ore de incubare la 37°C, putând fi considerată o potențială sursă probiotică. In cazul tulpinii BL, pe parcursul celor 4 ore de incubare, s-a remarcat o ușoară scădere a viabilității, însă datorită prezenței sporilor, considerați și formă de rezistență, aceștia au capacitatea de a germina fără a fi inhibați de adaosul de sare biliară, afirmație susținută și de Guo și col.,(2006), Liu și col., (2017).
Rezultatele din lucrarea de față, sunt în concordanță cu literatura de specialitate (Ritter și col., 2018), unde Mohkam și col. (2016)(Manivasagan și col., 2013) afirmă că unul dintre cele mai importante criterii pentru supraviețuirea și creșterea bacteriilor la nivel de tract gastrointestinal (GIT) constă în rezistența la săruri biliare (oxgall 0,3%), concentrație considerată critică pentru evaluarea unor proprietăți probiotice (Elshaghabee și col., 2017).
In Foto 7.12 se observă că ambele tulpini tolerează adaosul de săruri biliare (0,3%) în compoziția mediului de cultură. BS prezintă un procent de supraviețuire de 1,2 ori mai mare vs. BL la temperatura camerei, respectiv de 1,29 ori mai mare prin conservarea la 4°C, diferențele fiind nesemnificative. Din punct de vedere al tolerării sărurilor biliare, BS conservat la 4°C, cât și la temperatura camerei a înregistrat peste 80% rată de supraviețuire (Fig. 7.8).
Tab. 7.13. Efectul sărurilor biliare asupra viabilității tulpinilor de Bacillus sp. ATCC pe parcursul celor 4 ore de incubare.
Tab. 7.13. Effect of oxgall bile salt on Bacillus spp. ATCC strains viability for 4 hours exposure.
S-a comparat viabilitatea tulpinilor (log10 CFU/ml) de la 1, 2, 3 și 4 ore cu aceea de la 0 h.
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei; a,b,c,d Mediile din coloană care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Foto 7.12. Toleranța tulpinilor Bacillus sp. ATCC la săruri biliare 0,3% (Original)
Photo 7.12. The tolerance of Bacillus spp. ATCC strains to bile salts 0,3% (Original)
Fig. 7.8. Rata de supraviețuire a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC la adaos de săruri biliare 0,3%, 4 ore de la incubare
Fig. 7.8. The survival rate of Bacillus sp. ATCC to bile salts 0,3% oxgall, after 4h
7.1.12. Rezistența la temperatură
Rezistența la temperatură este o altă caracteristică a probioticelor destinate utilizării în nutriția animală. Rezultatele obținute confirmă viabilitatea sporilor de Bacillus la temperatura de 80°C. In Tab. 7.14 se observă că sporii de BS și BL tolerează temperatura de 80°C; viabilitatea tulpinii de BS fiind de 1,22 ori mai mare față de BL după 120 min.
Viabilitatea sporilor, atât pentru BS, cât și pentru BL, este invers proporțională cu timpul de incubare (Fig. 7.9), aceasta fiind redusă mai mult în cazul BL după 120 min. de expunere la 80°C.
Rezultatele obținute sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate (Chaiyawan și col.,2010), care au raportat că expunerea tulpinilor de Bacillus sp. la temperatura de 80°C prin incubare pe baie de apă, confirmă rezistența celulelor vegetative datorită prezenței sporilor, ca formă de rezistență.
Tab. 7.14. Rezistența sporilor de Bacillus sp. ATCC la temperatura de 80°C.
Tab. 7.14. The spores resistance of Bacillus spp. ATCC strains at 80°C
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei; a,b,c,dMediile din același rând care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05). BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424.
Fig. 7.9. Rezistența la temperatură a tulpinilor de Bacillus sp. ATCC
Fig. 7.9. The spores resistance of Bacillus spp. ATCC strains at 80°C temperature
7.1.13. Rezistența la antibiotice
Rezistența tulpinilor BS și BL la antibiotice a fost evaluată folosind discuri impregnate cu vancomicină (30 μg), eritromicină (15 μg), clindamicină (2 μg), gentamicină (10 μg), amoxicilină (25 μg), cloramfenicol (30 μg) , ciprofloxacină (5 μg), amikacină (25 μg), tetraciclină (30 μg) și kanamicină (30 μg). Rezultatele testului de sensibilitate la antibiotice sunt prezentate în Tab. 7.15 și Foto 7.13.
BS este sensibil (16-25 mm Ø) la eritromicină, clindamicină, amoxicilină, cloramfenicol, ciprofloxacină, amikacină și kanamicină, cu o sensibilitate (S+) mai mică la vancomicină, gentamicină și tetraciclină. In schimb, BL este rezistent la clindamicină, S+ la vancomicină, gentamicină, amoxicilină, cloramfenicol și tetraciclină, respectiv S++ la eritromicină, ciprofloxacină, amicacină și Kanamicină.
Rezistența bacteriană la o gamă de antibiotice este foarte importantă de studiat. De exemplu, dacă s-a administrat un aditiv furajer pe bază de cultură bacteriană în hrana animalelor, administrarea unui antibiotic poate înlătura efectele beneficii ale probioticului bacterian de interes.
Tab. 7.15. Rezistența tulpinilor de Bacillus sp. ATCC la antibiotice
Tab. 7.15. Antibiotic susceptibility of the Bacillus spp. ATCC strains
Rezistență (R): 0–5 mm; Sensibil (S +): 6-15 mm; Sensibil (S ++): 16-25 mm; Sensibil (S +++): 26–35 mm. BS: Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL: Bacillus licheniformis ATCC 21424
Foto 7.13. Toleranța tulpinilor de Bacillus sp. ATCC la antibiotice (Original)
Photo 7.13. The antibiotics resistance of Bacillus spp. ATCC strains (Original)
Rezultatele cercetărilor in vitro privind caracterizarea tulpinilor bacteriene de Lactobacillus sp. în vederea administrării în hrana puilor broiler de găină
7.2.1. Identificarea caracterelor morfologice, culturale și biochimice ale tulpinilor din genul Lactobacillus izolate din conținutul intestinal pasăre
Incadrarea taxonomică în genul Lactobacillus s-a realizat pe baza unor caractere morfologice (bacili Gram pozitivi nesporulați), culturale (capacitatea de a crește anaerob) și biochimice (catalază negativ) esențiale. Identificarea speciilor de Lactobacillus s-a realizat pe baza caracterelor biochimice. Astfel, cele două tulpini izolate din conținutul intestinal (ileon si cecum) al păsărilor sunt:
L. salivarius IBNA 33 – izolată din conținutul cecal al unui pui broiler de găină, 26 de zile, clinic sănătos, ce a fost hrănit într-un experiment anterior derulat în cadrul IBNA Balotești, cu NC în care soia a fost înlocuită cu o concentrație de fasoliță mai mare.
L. salivarius IBNA 41 – izolată din conținutul ileal de la un pui broiler de găină în vârstă de 26 zile, clinic sănătos, ce a fost hrănit într-un experiment anterior derulat în cadrul Biobazei IBNA, cu NC IBNA în care soia a fost înlocuită cu năut. Caracterele morfologice, culturale și biochimice ale acestor tulpini sunt prezentate în Tab. 7.16.
Tab. 7.16. Analizarea caracterelor morfologice, culturale și biochimice a tulpinilor de Lactobacillus sp. izolate din conținut intestinal de la pui broiler
Tab. 7.16. Morphological, cultural and biochemical characteristics of the Lactobacillus strains isolated from intestinal contents of broiler chicken
*Unde: a= bacil Gram pozitiv, nesporulat, grupat în lanțuri scurte; b= bacil Gram pozitiv scurt, cu capete rotunjite, nesporulat, dispus în grămezi neregulate/palisadă; x=colonii mici, 1,0-1,5 mm în diametru, tip S, rotunde, semitransparente/transparente, albicioase/nepigmentate; y=colonii mari, 2,0-4,0 mm în diametru, tip S, rotunde, opace, albe; – = negative; += pozitiv; ?= dubios, slab pozitiv. 1 – LS IBNA 33; 2 – LS IBNA 41.
Din analiza Tab. 7.16 se observă faptul că singura diferențiere a tulpinilor de Lactobacillus izolate s-a realizat pe baza capacității de fermentare a esculinei. Capacitatea de fermentare a tulpinilor izolate de Lactobacillus sp. din conținutul intestinal al puilor broiler de găină și identificarea biochimică cu testul API 50 CHL s-a confirmat prin virajul culorii mediului bazal, albastru, la galben, în urma incubării la 37°C, 24-48 de ore, în anaerobioză (Foto 7.14).
Foto 7.14. Identificarea caracterelor biochimice a tulpinilor de Lactobacillus sp. prin API 50 CHL (stânga: LS IBNA 33, dreapta: LS IBNA 41) (Original)
Photo 7.14. Biochemical identification of Lactobacillus strains by API 50 CHL
(left: LS IBNA 33, right: LS IBNA 41) (Original)
De menționat faptul că, pentru izolare, identificare și ulterior conservare la -80°C cu glicerol 20% (pe termen lung, cu controlul viabilității la 2 ani) a speciilor de Lactobacillus s-au efectuat două pasaje/tulpină, acestea fiind prezumtiv în cultură pură (un singur tip de colonie).
În Tab. 7.17 sunt prezentate rezultatele identificării în paralel a tulpinilor bacteriene prin soft-urile API50CHL V.5.1, BioMerieux (France) și prin soft-ul ABIS on line. Pentru apiweb se prezintă % ID (procentul identificării), iar pentru ABIS % SIM (procentul de similaritate cu specia respectivă).
Tab. 7.17. Rezultatele identificării în paralel a tulpinilor bacteriene prin soft-urile API50CHL V.5.1, BioMerieux (France) și prin soft-ul ABIS on line.
Tab. 7.17. The results of parallel identification of strains by apiwebTM soft, API50CHL V.5.1, BioMerieux (France) and ABIS online software.
7.2.2. Rezistența la pH
Conform Tab. 7.18, L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41 prezintă rezistență la pH acid cu o acumulare ridicată de biomasă bacteriană în urma incubării la 37°C, 24 de ore. Din analiza datelor obținute, dezvoltarea tulpinilor izolate a fost influențată semnificativ de pH-ul mediului nutritiv. După cum se poate observa și în Foto 7.15, LS IBNA 41 a crescut mult mai bine la pH 3, comparativ cu LS IBNA 33 unde gradul de multiplicare a încărcăturii bacteriene a fost mai redus după 3 ore de incubare, în anerobioză. Valori mai scăzute ale toleranței la pH decât cele obținute în studiul nostru, au fost relatate de Kizerwetter-Świda și Binek (2016), însă Blajman și col., (2015), în urma izolării a 8 tulpini de L. salivarius din tractul gastrointestinal al puilor broiler la diferite vârste, confirmă că această tulpină prezintă capacitatea de a tolera atât pH-ul acid, cât și sărurile biliare, lucru confirmat și în cercetarea de față.
Tab. 7.18. Toleranța tulpinilor de Lactobacillus sp. la pH 3
Tab. 7.18. The resistance of Lactobacillus spp. at pH 3
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei. a,b,c Mediile din același rând care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Una dintre proprietățile cruciale ale probioticelor pe bază de lactobacilli constă în capacitatea de supraviețuire la pH-ul scăzut al stomacului și la concentrații ridicate de săruri bilare la nivel de tract gastrointestinal (GIT), fiind considerate ca indicatori excelenți pentru viabilitatea microorganismelor benefice în GIT, astfel încât aceste caracteristici trebuie evaluate, pentru examinarea preeliminară a unor potențiale tulpini probiotice Kizerwetter-Świda și Binek (2016).
In Fig. 7.10 se observă că tulpinile de Lactobacillus sp. izolate din conținut intestinal pasăre tolerează pH-ul acid după 3 ore de incubare conform metodei. L. salivarius IBNA 41 este de 1.33 ori mai rezistent vs. L. salivarius IBNA 33, procentul de supraviețuire fiind aproape de 100%.
Elmacı și col., (2015) afirmă că toleranța potențialelor tulpini probiotice la pH acid este considerată o cerință esențială. Rezultatele studiului de față sunt superioare celor menționate de Ahmed și col. (2019) unde încărcătura celor 16 tulpini de Lactobacillus sp. era între 7,74±7,69 log10 UFC/ml, iar survivabilitatea în cazul tulpini izolate în cercetarea de față, LS IBNA 41, după 4 ore de incubare, fiind mult mai ridicată față de valorile prezentate.
Foto 7.15. Evidențierea caracterelor culturale (pH 3)- Lactobacillus sp. (Original)
Photo 7.15. The cultural character (pH 3) of Lactobacillus spp. (Original)
Fig. 7.10. Procentul de supraviețuire al tulpinilor de Lactobacillus sp. la pH 3, după 3 ore de incubare
Fig. 7.10. The survival rate of Lactobacillus spp. strain to pH after 3 h of incubation
Rezistența la săruri biliare
Diferențe semnificative (P˂0,05) au fost înregistrate între martorul tulpinilor de LS și valorile corespunzătoare timpului de incubare (Tab. 7.19). LS IBNA 41 și LS IBNA 33 tolerează adaosul de sare biliară (oxgall 0,3%) în mediul MRS bulion, lucru confirmat și de multitudinea coloniilor pe placa cu agar (Foto 7.16). După 3 ore de incubare, ambele tulpini de L. salivarius au avut o dezvoltare direct proporțională cu timpul de incubare, indicele de supraviețuire fiind 97,71% după 3 ore (Fig. 7.11).
Tab. 7.19. Toleranța tulpinilor de Lactobacillus sp. izolate din conținut intestinal pasăre la săruri biliare
Tab. 7.19. The resistance of Lactobacillus spp. isolated from poultry intestinal content at bile salts
*Unde: SEM: eroarea standard a mediei; a,b,c,d Mediile din același rând care au aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Foto 7.16. Caracterele culturale la săruri biliare-Lactobacillus sp. (Original)
Photo 7.16. The cultural character of Lactobacillus spp. on bile salts (Original)
Ambele tulpini de L. salivarius au prezentat o rată de supraviețuire >70% la 0,3% sare biliară, date confirmate și în literatură (Shokryazdan și col., 2014).
Fig.7.11. Rata de supraviețuire a tulpinilor de Lactobacillus sp. la săruri biliare 0,3%, 4 ore de la incubare
Fig. 7.11. The survival rate Lactobacillus sp. strains to bile salts 0,3%, after 4 h
Rezultatele procesului biotehnologic pentru obținerea biopreparatelor bacteriene în vederea utilizării în hrana monogastricelor
In urma testelor in vitro și parcurgerii etapelor enumerate la subcap. 5.4, Bacillus subtilis ATCC 6051a, Bacillus licheniformis ATCC 21424 și policultura probiotică pe bază de Lactobacillus sp. (L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41) s-au utilizat în hrana monogastricelor (purcei în criza de înțărcare și pui broiler de găină) în scopul îmbunătățirii parametrilor zootehnici și a sănătății animale.
7.3.1. Bacillus sp.
Tulpinile de Bacillus sp. ATCC se dezvoltă diferit în condiții de incubare statică și sub agitare (30°C – BS și 37°C – BL). Ambele tulpini bacteriene au fost influențate de parametrul agitare, comparativ cu incubația statică unde creșterea logaritmică a fost mai redusă (Fig. 7.12, Dumitru și col., 2018; Dumitru și col., 2019).
Conform rezultatelor obținute, inoculul bacterian dezvoltat în condiții de agitare s-a păstrat la 4°C, timp de 3 zile. Menținerea la frigider poate implica unele modificări asupra încărcăturii bacteriene, fapt pentru care s-au efectuat frotiuri Gram și diluții zecimale (Tab. 7.20).
Datele din literatura de specialitate (Liu și col., 2018) confirmă că tulpinile de Bacillus sp. pot fi administrate în hrana monogastricelor ca sursă producătoare de enzime, contribuind la îmbunătățirea performanțelor de creștere. De asemenea, rezultatele redate în subcap. 7.1.7.2 asupra activității enzimatice demonstrează că BS și BL produce amilaze, proteaze și celulaze cu capacitate de hidrolizare a materiilor prime furajere din formulele nutrețului combinat.
Fig. 7.12. Viabilitatea tulpinilor de Bacillus sp. ATCC în condiții diferite
Fig. 7.12. The viability of Bacillus spp. ATCC in different conditions
Tab. 7.20. Evidențierea caracterelor morfologice și a ratei de multiplicare , prin păstrare la 4°C a inoculelor de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.20. Highlighting the morphological characters and growth rate of Bacillus spp. ATCC strains by keeping at 4°C
In urma centralizării tuturor rezultatelor testelor in vitro asupra tulpinilor BS și BL în concordanță cu datele din literatură, cu privire la administrare în hrana monogastricelor ca sursă probiotică, s-a hotărât, prin respectarea ghidului EFSA Journal (2017), următoarele concentrații (Tab. 7.21):
Tab. 7.21. Doza de administrare a tulpinilor bacteriene în hrana monogastricelor
Tab. 7.21. The concentration of bacterial strains used in monogastric animals feed
*Unde: BS – B. subtilis ATCC 6051a; BL – B. licheniformis ATCC 21424; NC – nutreț combinat; NC* – nutreț combinat cu șrot de soia; NC** – nutreț combinat cu fasoliță
7.3.2. Lactobacillus sp.
Tulpinile de Lactobacillus sp. (L. salivarius IBNA 33 și L .salivarius IBNA 41) izolate, identificate, caracterizate fenotipic, genotipic și probiotic au fost expuse pentru obținerea și optimizarea de produse bacteriene cu rol de aditiv furajer în hrana puilor broiler de găină.
După parcurgerea etapelor prezentate în subcap 5.4, biomasa inoculului de LS IBNA 41 și LS IBNA 33 a fost supusă procesului de biosinteză într-un bioreactor EPPENDORF BIO FLO 320 (Foto 7.17) cu capacitate de 5L, prin urmărirea schemei prezentate și a parametrilor de cultivare. In funcție de acumularea de biomasă (Fig. 7.13), tulpinile prezentate au fost investigate în vederea parcurgerii Etapei 2 și 3 din subcap. 5.4.
In urma procesul de atomizare, s-au obținut următoarele cantități de pulbere probiotică pentru tulpinile studiate:
Lactobacillus salivarius IBNA 41: 340 g
Lactobacillus salivarius IBNA 33: 360 g (Foto 7.17).
De precizat că procesul de atomizare nu înregistrează un randament 100%, deoarece pe pereții vaselor rămân urme de pudră ce sunt raportate ca pierderi.
Tulpinile de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere au înregistrat prin tehnica diluțiilor zecimale, 1,6 x 108 UFC/ml pentru LS IBNA 33 și 1,62 x 108 UFC/ml pentru LS IBNA 41. Doza de administrare a policulturii bacteriene sub formă liofilizată utilizată în hrana puilor broiler de găină este menționată în Tab. 7.22.
Foto 7.17. Bioreactor EPPENDORF BIO FLO 320 din ISV Cluj
Photo 7.17. Bioreactor EPPENDORF BIO FLO 320 from ISV Cluj
Foto 7.18. Tulpinile de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere probiotică
(stânga- LS IBNA 33, dreapta – LS IBNA 41)
Photo 7.18. Lactobacillus spp. strains in the form of probiotic power
(left – LS IBNA 33, right – LS IBNA 41)
Fig. 7.13. SPRAY-DRYER din cadrul ISV Cluj. Obținere pulbere probiotică pe bază de Lactobacillus sp., tulpini din colecția INCDBNA Balotești
Fig. 7.13. SPRAY-DRYER from ISV Cluj. Obtaining probiotic power from Lactobacillus spp., from INCDBNA Balotești Strains Colection
Tab. 7.22. Concentrația tulpinilor Lactobacillus sp. în hrana puilor broiler de găină
Tab. 7.22. The concentration of Lactobacillus spp. strains in the feed of broiler chickens
*Unde: LS (L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41); NC – nutreț combinat; NC*
Rezultatele cercetărilor in vivo privind administrarea biopreparatelor bacteriene în hrana monogastricelor
7.4.1. Structura și caracteristicile nutritive ale rețetelor de nutreț combinat
Înainte de demararea testării biologice, ingredientele furajere au fost analize chimic și microbiologic. Structura și compoziția chimică a NC, compoziția în aminoacizi și analiza microbiologică a materiilor prime sunt prezentate în subcapitolul 5.4, Tab. 5.1, 5.2, 5.3 și 5.4.
Structura NC-ului utilizat în experimentele prezentate reprezintă o asociere a unor ingrediente energo-proteice, la care se adaugă amestecul de vitamine și minerale, într-o proporție care să permită satisfacerea cerințelor nutriționale specifice categoriei de vârstă și greutate. Acest tip de nutreț asigură funcția primară a hranei, respectiv necesarul de nutrienți pentru creștere, dezvoltare și obținerea de produse (Tab. 5.1).
Preparatul bacterian utilizat stă la baza a două tulpini de Bacillus sp. (Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424) al cărui proces de obținere și doză administrată/experiment este redat în subcap. 7.3.1, Tab. 7.21.
7.4.2. EXPERIMENT I: ,,Efectul administrării tulpinii de Bacillus subtilis ATCC 6051a în hrana purceilor în criza de înțărcare‘‘
7.4.2.1. Performanțe bioproductive
7.4.2.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic
Testul biologic s-a derulat pe 60 purcei TOPIGS cu vârsta de 30 ± 3 zile, la o greutate medie inițială de 8,51 Kg, timp de 16 zile. Evoluția performanțelor bioproductive (greutate corporală și sporul mediu zilnic) pe parcursul derulării Experimentului I la adaos de BS 1% și 3% este redată în Tab. 7.23, Fig. 7.14 și 7.15.
La finalul experimentului, s-a observat că adaosul de BS nu a influențat semnificativ greutatea corporală (BW) sau sporul mediu zilnic (ADG). După 16 zile de experiment, ADG a fost de 1,13 ori mai mare la lotul BS-1% comparativ cu lotul Martor, respectiv de 1,04 ori mai mare față de BS-3%.
Tab. 7.23. Performanțe bioproductive
Tab. 7.23. Bioproductive performances
*Unde: *BW – greutate medie inițială; ADG – sporul mediu zilnic; BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; NS – nesemnificativ; P**>0,05 diferențe nesemnificative între loturi experimentale; SEM -eroarea standard a mediei; loturi experimentale: M (NC), E1-BS 1% (NC+BS 1%), E2-BS 3% (NC+BS 3%).
Adaosul de BS–1% vs. BS-3% îmbunătățește BW a purceilor în criza de înțărcare în prima și ultima săptămână de viață, însă valorile sunt nesemnificative (P>0,05).
Rezultatele obținute asupra BW, ADG și G/F (Tab. 7.23) sunt similare cu datele raportate de Giang și col. (2012), unde în urma utilizării unui produs probiotic pe bază de Bacillus cu o concentrație de 2 x 109 UFC/kg NC, doză aproximativ egală cu cea din studiul de față, nu s-au înregistrat diferențe semnificative între loturile experimentale.
Fig. 7.14. Dinamica greutății corporale
Fig. 7.14. Body weight evolution
Fig. 7.15. Evoluția sporului mediu zilnic
Fig. 7.15. Average daily weight gain evolution
7.4.2.1.2. Consumul mediu zilnic de nutreț combinat și consumul specific
Consumul mediu zilnic de furaj/cap (Tab. 7.4, Fig. 7.16) este de 1,08 mai mare în lotul Martor față de lotul BS – 1%. Conversia hranei a fost de 1,22 ori mai mare în lotul E1-BS – 1% vs. lotul M, respectiv de 1,05 mare mare față de E2-BS – 3%.
Tab. 7.24. Consumul mediu zilnic de nutreț combinat și consumul specific
Tab. 7.24. Average daily intake of compound feeds and the feed conversion ratio
*Unde: ADFI – consum mediu zilnic de NC (kg/zi); G:F – rata de conversie a hranei sau consum specific (kg NC/kg spor); loturi experimentale: M (NC), E1-BS 1% (NC+BS 1%), E2-BS 3% (NC+BS 3%).
Fig. 7.16. Consumul mediu zilnic de NC și rata de conversie a hranei
Fig. 7.16. Average daily intake of compound feeds and the feed conversion ratio
EXPERIMENT II: ,,Efectul administrării tulpinii de Bacillus licheniformis ATCC 21424 în hrana purceilor în criza de înțărcare”
Performanțe bioproductive
Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic
Testul biologic s-a derulat pe 60 purcei TOPIGS cu vârsta de 30 ± 3 zile, la o greutate medie inițială de 8,41 Kg, timp de 16 zile. In Tab. 7.25 și Fig. 7.17 sunt prezentate performanțele de creștere ale purceilor în criza de înțărcare, 30±3 zile în urma suplimentării hranei cu BL 1% și 3%. Rezultatele obținute au demonstrat că adaosul de BL-3% în NC contribuie la îmbunătățirea greutății corporale la purcei în criza de înțărcare (46 zile ± 3 zile), însă valorile sunt nesemnificative (P˂0,05). Lotul BL 3% este de 1,06 ori mai mare vs. lotul BL 1%, respectiv cu 1,8% mai mare față de lotul M.
Tab. 7.25. Performanțe bioproductive
Tab. 7.25. Bioproductive performances
*Unde: *BW – greutate medie inițială; ADG – sporul mediu zilnic; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424;* diferențe semnificative (P≤0,05); loturi experimentale: M (NC), E3-BL 1% (NC+BL 1%), E4-BL 3% (NC+BL 3%).
Fig. 7.17. Dinamica greutății corporale
Fig. 7.17. Body weight evolution
7.5. Rezultate asupra microbiotei la purcei în criza de înțărcare
7.5.1. Rezultate asupra microbiotei din fecale
Rezultatele examenului bacteriologic din fecale (Lactobacillus sp., Coliformi, Clostridium sp., Enterococcus sp., Bacillus sp., Salmonella sp. și E. coli) la purcei în criza de înțărcare (30±3 zile), pe toată durata experimentală (16 zile), probe ce au fost recoltate conform protocolului stabilit și prezentat în Capitolul VI, sunt redate în Tab. 7.26 (Experiment I) și Tab. 7.27 (Experiment II).
Pentru identificarea bacteriilor acidolactice s-a utilizat mediul MRS agar Oxoid. Din analiza datelor privind populația de Lactobacillus sp., considerată floră intestinală benefică (Pluske și col., 2018), care datorită secretării de acid lactic în urma procesului fermentativ contribuie la reducerea pH-ului intestinal, inhibând astfel agenții patogeni enterici cu îmbunătățirea sistemului imunitar al organismului gazdă (de Lange și col., 2010, citat de Liu și col., 2018), nu s-au înregistrat diferențe semnificative (P˂0,05) asupra numărului de lactobacili din fecalele purceilor (30±3 zile) la niciun lot experimental. In schimb, la a doua recoltare (a 14 zi de experiment, după administrare preparat enzimatic, 44±3 zile), în Experimentul I, numărul de lactobacili diferă semnificativ între toate loturile experimentale cu procente mai scăzute față de lotul Martor, și anume: E1-BS 1% cu 15,80%, E2-BS 3% cu 18,86%. Se poate afirma că adaosul de preparat enzimatic pe bază de B. subtilis ATCC 6051a a implicat o diminuare a numărului de lactobacili din fecale vs. prima recoltare unde valorile estimate (8-9 Log10 UFC/g) sunt aprobiate cu datele prezentate de Zhang și col., (2014). De menționat că tratamentul aplicat pe bază de Bacillus sp. a fost analizat din punct de vedere al rezistenței la pH acid și săruri biliare (Dumitru și col., 2018; Dumitru și col., 2019), supraviețuirea sporilor fiind o altă provocare la nivel de tract gastrointestinal (Elshaghabee și col., 2017). La ultima recoltare (47±3 zile), Lactobacillus sp. nu a fost influențat semnificativ la niciunul dintre loturile Experimentelor I și II.
Pentru estimarea numărului de lactobacili s-au efectuat frotiuri colorate în scopul unei determinări cât mai corecte conform metodei Mountzouris și col. (2007), modificată de Sorescu și col. (2019) (Foto 7.19).
Datele de specialitate (Gresse și col., 2017), afirmă că perioada de înțărcare la purcei este ,,un eveniment brusc, scurt și complex, caracterizat prin modificări sociale, nutriționale și de mediu, acestea fiind cunoscute ca factori de stres cu un impact major asupra sănătății sugarilor, conducând la diminuarea parametrilor zootehnici, uneori mortalitate”. Trecerea de la furajarea lichidă la cea solidă mai puțin digerabilă și mult mai complexă, trebuie făcută cu o atenție deosebită, deoarece echipamentul enzimatic intestinal și al glandelor anexe este incomplet dezvoltat, iar digestia completă a proteinelor, glucidelor și lipidelor fiind asigurată după vârsta de 5 săptămâni (Ciuc și col., 2006).
Tab. 7.26. Microbiota din fecale la purcei în criza de înțărcare, Experiment I
Tab. 7.26. Microbiota from piglet’s faeces in the weaning crisis, Experiment I
*Unde: I: prima zi de experiment, înainte de administrare preparat enzimatic (30±3 zile); II: a 14 zi de experiment, după administrare preparat enzimatic (44±3 zile); III: a -16 zi de experiment, după administrare preparat enzimatic(47±3 zile); Abs – absent; Preparat enzimatic: BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a și BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424; nd: nedetectabil (E. coli ˂1×103 UFC/g, absent), NC – nutreț combinat; BS 1% și 3%: adaos de Bacillus subtilis ATCC 6051a, doză 1,6 x 109 UFC/ml/ kg NC; BL 1% și 3%: adaos de Bacillus licheniformis ATCC 21424, doză 1,6 x 109 UFC/ml/kg NC; Loturi: M (martor, NC), E1-BS 1%; E2-BS 3%; E3-BL 1%; E4-BL 3%; a,bMediile din același rând cu aceeași literă diferă semnificativ (P≤0,05).
Foto 7.19. Aspecte caracteristice (stânga) și morfologice (colorația Gram, x 1000, dreapta) ale coloniilor dezvoltate pe mediul MRS agar (Original)
Photo 7.19. Features of colonies developed on MRS agar medium (left) and morfological aspects (Gram stain, x 1000, right) (Original)
Tab. 7.27. Microbiota din fecale la purcei în criza de înțărcare, Experiment II
Tab. 7.27. Microbiota from piglet’s faeces in the weaning crisis, Experiment II
Pentru identificarea numărului de coliformi s-a utilizat mediul selectiv MacConkey agar Oxoid (MC, Foto 7.20). Rezultatele obținute asupra numărului de bacterii coliforme în Experimetul I, diferă semnificativ între loturile M și E1-BS 1% vs. recoltarea II și III unde adaosul de Bs la loturile E2 și E3, nu a semnalat diferențe semnificative (P˂0,05). In schimb, suplimentarea hranei la purcei cu BL 1% a înregistrat diferențe semnificative (P˂0,05) între M și E3-BL 1%.
Foto 7.20. Aspecte caracteristice (stânga) și morfologice (colorația Gram, x 1000, dreapta)ale coloniilor dezvoltate pe mediul MC (Original)
Photo 7.20. Features of colonies developed on MC agar medium (left) and morfological aspects (Gram stain, x 1000, right) (Original)
In mod curent determinarea numărului probabil de bacterii coliforme se referă la enterobacteriacaeele din care face parte specia Escherichia coli, biotipul β-hemolitic cunoscut ca fiind agentul etiologic al enterotoxiemiei colibacilare, cu manifestări diareice.
După cum se observă în Tab. 7.26, în Experimentul I, recoltarea II, incidența germenilor de Clostridium sp. diferă semnificativ între toate loturile experimentale. De asemenea, pentru exprimarea corectă a UFC/gram probă s-au efectuat frotiuri Gram pentru confirmarea morfologică a coloniilor dezvoltate pe placa cu agar clostridium Oxoid (Foto 7.21).
Foto 7.21. Aspecte caracteristice (stânga) și morfologice (colorația Gram, x 1000, dreapta) ale coloniilor dezvoltate pe mediul Agar Clostridium dificile Oxoid
Photo 7.21. Features of colonies developed on Clostridium difficile agar Oxoid medium (left) and morfological aspects (Gram stain, x 1000, right) (Original)
Genul Clostridium cuprinde microorganisme potențial patogene, strict anaerobe, sub formă de bacili mari Gram pozitivi, formatoare de spori cu dispunere centrală, terminală sau subterminală cu diametrul mai mare decât al celulei vegetative. Aceste bacterii sunt prezente în flora intestinală normală la animale cu capacitatea de a supraviețui în condiții nefavorabile de mediu (Glenn și Uzal, 2005).
Pentru identificarea Enterococcus sp. s-a utilizat mediul Slanetz-Bartley agar Oxoid, mediu selectiv pentru enumerarea streptococilor fecali. Se observă că numărul de enterococci din fecale atât în Experimentul I, cât și Experimentul II, diferă semnificativ (P˂0,05) între toate loturile experimentale, rezultatele fiind estimate după efectuarea prealabilă a frotiurilor Gram în scopul exprimării corecte a numărului prezumtiv de Enterococcus sp. (Foto 7.22).
Enterococii sunt bacterii comensale care contribuie la îmbunătățirea digestiei și ale funcțiilor metabolice intestinale la animale (Byappanahalli și col., 2012), făcând parte din microbiota normală (Sorescu și col., 2019).
Foto 7.22. Aspecte caracteristice(stânga) și morfologice (colorația Gram, x 1000, dreapta) ale coloniilor de pe Slanetz-Bartley agar Oxoid (Original)
Photo 7.22. Features of colonies developed on Clostridium difficile agar Oxoid medium (left) and morfological aspects (Gram stain, x 1000, right) (Original)
Pentru identificarea Bacillus sp. s-a utilizat mediul simplu geloză nutritivă. Din rezultatele obținute, nu s-au înregistrat diferențe semnificative (P˂0,05) la niciuna din cele 3 recoltări (Tab. 7.26 și 7.27), iar suplimentarea hranei la purcei cu tulpini de Bacillus ATCC în doze diferite nu a implicat vreo modificare asupra microbiotei din fecale (Foto 7.23).
Foto 7.23. Aspecte caracteristice (stânga) și morfologice (colorația Gram, x 1000, dreapta) ale coloniilor dezvoltate pe geloză nutritivă (Original)
Photo 7.23. Features of colonies developed on nutrient agar medium (left) and morfological aspects (Gram stain, x 1000, right) (Original)
Datele din literatura de specialitate confirmă că unul dintre obiectivele primordiale de a utiliza preparate enzimatice bacteriene ca aditivi furajeri constă în îmbunătățirea parametrilor zootehnici pentru gazdă și reducerea, pe cât posibil, a factorilor patogeni care pot provoca boli infecțioase animalelor (Mountzouris și col., 2010). Identificarea germenilor din familia Enterobacteriaceae denotă posibila contaminare a fecalelor cu germeni patogeni din familia Salmonella, Yersinia, Escherichia (WHO, 1995). Având în vedere aspectele menționate anterior, în urma prelucrării rezultatelor obținute, nu s-a confirmat prezență de Salmonella sp. la Experimentul I și II (Foto 7.24).
Foto 7.24. Aspecte caracteristice ale coloniilor dezvoltate pe mediul Salmonella-Shigella agar Oxoid (Original)
Photo 7.24. Features of colonies developed on Salmonella-Shigella Oxoid agar (Original)
In prima zi de experiment, din analiza statistică a rezultatelor asupra prezenței germenilor patogeni de Escherichia coli β-hemolitică nu s-a confirmat dezvoltare de colonii cu zonă de hemoliză pe placa TSA sânge (Foto 7.25) comparativ cu recoltarea II și III unde încărcătura de E. coli s-a confirmat cultural, morfologic cât și biochimic prin testele TSI, MIU și CITRAT (TMC, subcapitolul ).
Rezultatele obținute au relevat prezența de E. coli la toate loturile experimentale, dar din prelucrarea datelor la final de experiment (fecale purcei la 47±3zile), s-a constatat vs. lotul M o scădere cu 8,5% la E1 la adaos de BS 1%, 6,77% la E2 cu adaos de BS 3%, 6,98% la E3 la adaos de BL 1% și cu 9,83% la lotul E4 la adaos de BL 3%. De precizat că demonstrarea prezenței de E. coli β-hemolitică în probele de fecale a reprezentat evidențierea factorului principal în instalarea problemelor gastrointestinale la purcei cu apariția stărilor diareice, deci a enterotoxiemiei colibacilare.
Ințărcarea este un moment critic din viața purceilor datorită factorilor de stres la care sunt supuși, perioadă ce se caracterizează prin tulburări gastrointestinale (Dong și col., 2014), Din rezultatele obținute, o reprezentare grafică asupra evoluției încărcăturii bacteriologice din fecale pe toată durata experimentală (16 zile) poate fi observată în Fig. 7.18 pentru Experimentul I, respectiv Fig. 7.19 pentru Experimentul II.
Foto 7.25. Aspecte caracteristice, morfologice (Gram, x 1000) și confirmare biochimică ale coloniilor dezvoltate pe mediul TSA sânge Oxoid (Original)
Photo 7.25. Features of colonies developed on Clostridium difficile agar Oxoid medium, morfological (Gram stain, x 1000) and biochemical tests (Original)
Rezultatele redate anterior asupra microbiotei din fecale la purcei prezintă valori mai mari decât cele raportate de cercetătorii Giang și col. (2012), având însă valori asemănătoare cu cele prezentate de Dong și col. (2014b) asupra populației de lactobacili și E. coli.
Fig. 7.18. Evoluția încărcăturii bacteriologice din fecale la purcei în criza de înțărcare (30±3 zile), Experiment I
Fig. 7.18. Total count evolution of bacterial load from piglets faeces in the weaning crisis (30 ± 3 days), Experiment I
Fig. 7.19. Evoluția încărcăturii bacteriologice din fecale la purcei în criza de înțărcare (30±3 zile), Experiment II
Fig. 7.19. Total count evolution of bacterial load from piglets faeces in the weaning crisis (30 ± 3 days), Experiment II
7.5.2. Rezultate asupra microbiotei intestinale
Pentru determinarea microbiotei intestinale (cecum și ileon) au fost sacrificați 2 purcei (46±3 zile)/lot (un mascul și o femelă, N=10) cu utilizare de tranchilizant pentru reducerea suferinței animalelor, etapă însoțită de sacrificare (V, 125mA), sângerare și eviscerarea organelor la nivelul cavității abdominale.
Rezultatele examenului bacteriologic asupra microbiotei intestinale (Lactobacillus sp., Coliformi, Clostridium sp., Enterococcus sp., Bacillus sp., Salmonella sp. și E.coli) la nivel de ileon și cecum, sunt prezentate grafic în Fig. 7.20 și 7.21 (Experiment I), respectiv Fig. 7.22 și 7.23 (Experiment II).
In Experimentul I, adaosul de BS 1% în NC a redus numărul de Lactobacillus sp. la nivel de ileon în lotul E1 – BS 1% (7,64 lg UFC/g conținut intestinal) vs. lotul E2 – BS 3% unde microbiota a fost îmbunătățită de 1,04 ori vs. lotul M. In schimb, la nivel de cecum suplimentarea NC cu BS-1% a mărit abundența lactobacililor cu 17,76% față de
M, însă NC cu BS-3% a înregistrat un număr mult mai ridicat de bacterii acidolactice respectiv 25,17% vs. lotul M.
In Experimentul II, la nivel de ileon, numărul de Lactobacillus sp. prin utilizarea NC cu BL-1% a ajuns la 8,85 lg UFC/g conținut intestinal, ceea ce înseamnă o creștere de 1,06 ori față de un nivel de 1% produs zootehnic, respectiv cu 14,34% față de nutrețul fără produs. Microbiota în acest segment intestinal s-a îmbunătățit. La nivelul cecumului, numărul lactobacililor a fost îmbogățit cu adaos de BL-3% de 1,08 ori comparativ cu BL-1% și 1,27 față de lotul M. De asemenea, în cecum, abundenta lactobacililor este de 2,71% mai pronunțată față de ileon. De asemenea, NC suplimentat cu BL-3% modifică pozitiv ecosistemul bacterian, reprezentat de bacterii din genul Bacillus sp. La nivel de ileon și cecum, prin utilizarea produsului bacterian pe baza de Bacillus licheniformis ATCC 21424 se remarcă o pierdere a diversității microbiene cu un impact asupra bacteriilor anaerobe (Clostridium sp., Enterococcus sp.) și facultativ anaerobe E. coli în cazul în care nu se utilizează BL-3%.
In conformitate cu EFSA (2008) Salmonella sp. a fost evidențiată drept pericolul major în ceea ce privește contaminarea microbiană furajelor, urmată de Listeria monocytogenes, Echerichia coli O157: H7 și Clostridium sp. Aceste microorganisme sunt implicate în modificări ale microbiotei intestinale la purcei, evidențiate prin tulburări gastrointestinale. In cazul utilizării NC+BL-3%, conform metodei ISO 6579-1 (2017), Salmonella sp. nu s-a identificat la niciun lot experimental.
Rezultatele obținute în lucrarea de față confirmă cele afirmate de Jensen (1998) care menționează că odată cu înțărcarea purceilor, numărul lactobacililor la nivel de intestin scade în timp ce populația patogenă de E .coli este într-o continuă creștere logaritmică, acest fenomen se poate observa la lotul martor.
Giang și col. (2012) au evidențiat valori ale microbiotei intestinale în urma suplimentării rației furajere cu un complex probiotic cu Bacillus subtilis H4 la nivel de colon cu valorile prezentate în lucrarea de față.
Fig. 7.20. Microbiota intestinală a purceilor la nivel de ileon (46±3 zile) la adaos de Bacillus subtilis ATCC 6051a, Experiment I
Fig. 7.20. Piglets intestinal microbiota at ileum level (46 ± 3 days) with addition of Bacillus subtilis ATCC 6051a, Experiment I
Fig. 7.21. Microbiota intestinală a purceilor la nivel de cecum (46±3 zile) la adaos de Bacillus subtilis ATCC 6051a, Experiment I
Fig. 7.21. Piglets intestinal microbiota at cecum level (46 ± 3 days) with addition of Bacillus subtilis ATCC 6051a, Experiment I
Fig. 7.22. Microbiota intestinală a purceilor la nivel de ileon (46±3 zile) la adaos de Bacillus licheniformis ATCC 21424, Experiment II
Fig. 7.22. Piglets intestinal microbiota at ileum level (46 ± 3 days) with addition of Bacillus licheniformis ATCC 21424, Experiment II
Fig. 7.23. Microbiota intestinală a purceilor la nivel de cecum (46±3 zile) la adaos de Bacillus licheniformis ATCC 21424, Experiment II
Fig. 7.243Piglets intestinal microbiota at cecum level (46 ± 3 days) with addition of Bacillus licheniformis ATCC 21424, Experiment II
7.5.3. Evoluția pH-ului intestinal la purcei în criza de înțărcare
In urma sacrificării celor 10 purcei (46±3 zile), conform schemei experimentale, s-a determinat pH-ul la nivel de conținut intestinal (ileon și cecum) cu ajutorul un pH-metru portabil (model Waterproof, pH 7+DHS, Tab. 7.28, Fig. 7.24).
PH-ul intestinal este unul dintre factorii de control în menținerea echilibrului gastro-intestinal la suine (Kiarie și col., 2016). S-a dovedit că un pH gastric scăzut menține un intestin sănătos, deoarece împiedică trecerea agenților patogeni în intestinul subțire (Heo și col., 2018). În schimb, un pH gastric mai mare favorizează introducerea agenților patogeni și colonizarea ulterioară a intestinului, ceea ce conduce la inițierea colibacilozei la purcei după înțărcare (Owusu-Asiedu și col., 2010).
Tab. 7.28. Evoluția pH-ului intestinal la purcei în criza de înțărcare cu și fără adaos de biopreparat bacterian pe bază de Bacillus sp. ATCC
Tab. 7.28. Evolution of intestinal pH in weaning piglets crisis with and without addition of Bacillus spp. ATCC product
M: martor hrănit cu NC; E1-BS 1%: lot hrănit cu NC+BS 1%; E2-BS 3%: lot hrănit cu NC+BS 3%; E3-BL 1%: lot hrănit cu NC+BL 1%; E4-BL 3%: lot hrănit cu NC+BL 3%. F – femelă; M – mascul.
Fig. 7.24. Evoluția pH-ului intestinal la purcei în criza de înțărcare
Fig. 7.24. The evolution of intestinal pH in the crisis of weaning piglets
Suplimentarea hranei cu biopreparate bacteriene cu rol probiotic a determinat o creștere a producției de acizi grași cu lanț scurt, care imprimă o scădere a pH-ului digestei și, ulterior, împiedică creșterea bacteriilor patogene (Gibson, 1999). Cu toate acestea, în studiul curent, valorile pH-ului ileonului și cecumului au fost diferite între tratamentele aplicate. La nivel de ileon, pH-ul s-a situat între 4,89-8,2, în timp ce la nivel de cecum s-au înregistrat valori între 5,05-7,82.
7.6. Incidența diareică a purceilor în criza de înțărcare la adaos de biopreparat bacterian enzimatic exogen
7.6.1. Experimentul I
In Experimentul I, nu s-a observat o tulburare digestivă gravă la purcei pe durata celor 16 zile. O eficacitate mai mare s-a remarcat la suplimentarea NC-ului la lotul E1 – BS-1% (Fig. 7.25). Adaosul de BS-1% a scăzut incidența diareică cu 7,6% comparativ cu grupul M (P>0,05) și cu 3,8% față de grupul BS-3%. 23,4% dintre purcei au avut fecale moi, 43,75% au scor 2 (diaree ușoară) și 32,81% au avut scor 3 (diaree severă); cu toate acestea, nu s-au înregistrat diferențe semnificative între grupuri (Dumitru și col., 2019).
Fig. 7.25. Incidența diareică și scor de severitate diareic
Fig. 7.25. The incidence of diarrhoea and severity score
Animalele au fost monitorizate zilnic. Incidența diareei = numărul mediu de zile cu diaree raportat la numărul total de zile de monitorizare.
În studiul actual, unii purcei din toate loturile experimentale au fost afectați de diaree, scorul ușor fiind predominant. Purceii hrăniți cu dietă suplimentată cu BS-1% au avut o frecvență mai mică a diareei decât lotul M și BS-3%, însă nu s-au remarcat diferențe semnificative (P> 0,05). Adăugarea de B. subtillis ATCC 6051a în furajul purceilor nu a avut ca rezultat o îmbunătățire a frecvenței stării diareice.
Înțărcarea este o perioadă de stres din ciclul de viață al tineretului suin, fiind asociată cu modifcări în hrana animalului, al mediului și morfologiei intestinale, ce poate conduce la o scădere a greutății corporale, o incidență crescută a diareei și microecologie intestinală dezechilibrată (Giang și col., 2012b). Pluske și col., (2018) a afirmat că perioada de înțărcare este un moment critic din viața purceilor, datorită separării de scroafă, schimbării brusce de hrană,alături de factori de mediu necunoscuți.
Modificările dramatice ale GIT după înțărcare, însoțite de adaptarea animalului la furajarea solidă, poate provoca o infecție gastro-intestinală, în principal colibaciloză, care produce o morbiditate și / sau mortalitate extinsă (aproximativ 17% din totalul purceilor născuți în Europa sunt afectați) conform datelor redate de Vladu și col., (2017).
Cuc și col., (2006) afirmă că boala numită colibaciloză este de tip infecțios, atribuită în principal bacteriilor de E. coli, fiind des întălnită la purceii sugari și la cei în jurul perioadei de înțărcare. Diverse cercetări cu adaos de B. subtilis în hrana purceilor pot constitui direcții pentru sănătatea GIT prin echilibrarea bacteriilor benefice, reducerea incidenței diareice și îmbunătățirea parametrilor zootehnici (Hu și col., 2014; Hăbeanu și col., 2017).
7.6.2. Experimentul II
Nutrețul combinat cu BL are ca obiectiv principal reducerea frecvenței enteritelor prin rolul imunomodulator și de modificare a compozției microflorei intestinale (subcap 4.6). La un nivel de includere de 3% reducerea frecvenței enteritelor cu 44% se corelează foarte semnificativ cu scorul fecal, R = 1, P<0,0001.
Nutrețul combinat BL -3%, reduce de 6 ori scorul fecal cu grad 3, respectiv cazurile cu diaree agresivă. După ingerare, datorită prezenței sporilor ca forma de rezistență, tulpina vie de Bacillus licheniformis ATCC 21424 din nutrețul combinat începe procesul de germinare în intestinul animal, servind drept biocatalizator de tip enzimatic, prin elaborarea unor enzime bacteriene ce acționează asupra glucidelor, lipidelor și proteinelor, favorizând astfel, absorbția substanțelelor nutritive la nivelul mucoasei intestinale. La nivel plasmatic markerii biochimici proteici, lipidici, minerali și enzimatici, care reprezintă indicatori ce ne dau informații cu privire la starea de sănătate, au fost situați între limitele de referință.
Obiectivul subsidiar constă în îmbunătățirea performanțelor bioproductive. Greutatea corporală și sporul mediu zilnic sunt îmbunătățite fiind negativ și semnificativ corelate cu frecvența enteritelor, respectiv R = -0,72 pentru corelația Pearson între greutatea finală și frecvența enteritelor, iar între sporul mediu zilnic și frecvența enteritelor R = – 0,86. In continuare sunt prezentate în Tab. 7.29, performanțele de creștere și corelația acestora cu frecvența enteritelor și scorul fecal.
Tab. 7.29. Performanțele de creștere și corelația acestora cu frecvența enteritelor și scorul fecal
Tab. 7.29. Growth performance and their correlation with the frequency of enteritis and fecal score
*Unde: 1Scor fecal grad 1 – diaree ușoară, consistență usor moale; scor fecal grad 2 – consistenta mijlocie; scor fecal grad 3 – diaree severă; BL-1 și 3% – Bacillus Licheniformis ATCC 21424-1 și 3%, **diferențe foarte semnificative (P≤0,0001); * diferențe semnificative (P≤0,05)
7.7. Experiment III: ,,Efectele utilizării unor preparate enzimatice pe bază de B. subtilis ATCC 6051a și B. licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat șrot de soia
7.7.1. Performanțe bioproductive
7.7.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic
Efectele utilizării preparatelor enzimatice pe bază de B. subtilis ATCC 6051a și B. licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat șrot de soia asupra performanțelor bioproductive, corespunzător fazelor de creștere pe durarata a 42 zile, conform protocolului experimental sunt prezentate în Tab. 7.30.
La vârsta de 10, 24 și 42 de zile, dinamica greutății corporale a înregistrat diferențe semnificative (P>0,05) între loturile experimentale, greutatea medie a puilor la 10 și 24 de zile fiind de 1,04 ori mai mare la lotul E+BS vs. E+BL și E. La finalul experimentului, greutatea medie la lotul experimental E+BS a fost de 2785,65 g, fiind de 1,02 mai mare față de lotul E hrănit fără adaos de biopreparat bacterian pe bază de BS (Fig. 7.26, Foto 7.26).
În ceea ce privește evoluția sporului mediu zilnic (SMZ) (Tab. 7.30, Fig. 7.27), în perioada de creștere (11-24 zile), adaosul de BS a determinat o creștere semnificativă (P≤0,05) cu 5,71% vs. lotul E, respectiv de 1,03 ori mai mare față de lotul E+BL, în timp ce la lotul E+BL parametrul zootehnic precizat nu a fost influențat semnificativ, însă suplimentarea cu BL a realizat un spor cu 2,03% mai mare vs. lotul E.
SMZ în fazele de creștere, finisare, cât și pe întreaga perioadă experimentală (0-42 zile), nu a fost influențat semnificativ (P≤0,05) între toate loturile experimentale; în schimb în faza de finisare s-a înregistrat o creștere cu 1,05% la lotul E+BL vs. lotul E.
Din punct de vedere statistic, NC cu adaos de soia (starter – 33,10%, creștere – 31,56%, finisare – 25,10%) și suplimentat ulterior cu biopreparate bacteriene pe bază de BS și BL a determinat obținerea unui SMZ mai ridicat față de lotul E.
Tab. 7.30. Performanțele zootehnice obținute în Experimentul III
Tab. 7.30. The zootechnical performances obtained in Experiment III
*Unde: BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; BL – Bacillus Licheniformis ATCC 21424, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; loturi: E (martor, NC+soia), E+BS (NC+soia+BS), E+BL (NC+soia+BL); na= nu se aplică. a,b,c,ddiferențe semnficative (P≤0,05); SEM: eroarea standard a mediei.
Fig. 7.26. Greutatea corporală
Fig. 7.26. Body weight evolution
Fig. 7.27. Sporul mediu zilnic
Fig. 7.27. Weight gain evolution
Rezultatele obținute în Experimentul III asupra SMZ sunt superioare datelor precizate de Gao și col. (2017) care a raportat că utilizarea de NC cu soia (30,20% în perioada 1-21 de zile, respectiv 28,20% în intervalul 22-42 de zile) și suplimentarea cu Bacillus subtilis (≥2×1010 UFC/g), a determinat un SMZ de 48,57 g la 42 de zile, respectiv o greutate de 2,070 kg/pui fiind de 1,34 ori mai scăzută vs. lotul E+BS.
Suplimentarea hranei la păsări cu tulpini de Bacillus sp. poate contribui, conform rezultatelor din literatură (Yadav și col., 2018; Reis și col., 2017; Vazquez, 2016; Ahmed și col., 2014) la îmbunătățirea parametrilor zootehnici, factorul principal fiind sporul ca formă de rezistență, cu capacitate de supraviețuire la condițiile tractusului gastrointestinal animal.
Foto 7.26. Cântărire pui broiler de găină, vârstă 0-42 de zile (Original)
Photo 7.26. Evolution of broiler chickens, 0-42 days (Original)
7.7.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific
Consumul mediu zilnic de furaj (Tab. 7.31, Fig. 7.28) pe parcursul celor 3 faze de dezvoltare nu a fost influențat semnificativ la niciun lot experimental (P≤0,05), însă
s-a remarcat o scădere asupra consumului de furaj, și implicit o îmbunătățire economică cu 1,06% pentru lotul E+BS și 2,08% la E+BL, pe total perioadă experimentală.
In Fig. 7.29, în faza de creștere, se poate observa o diminuare a consumului specific la lotul E+BS cu 6,41%, respectiv cu 4,40% la lotul E+BL vs. lotul M. De asemenea, pe toată perioada experimentală, consumul specific s-a redus cu 2,28% atât pentru lotul E+BS, cât și pentru E+BL. Rezultate similare au fost raportate de Gao și col. (2017), Li și col. (2016) care au constatat o scădere a consumului în urma suplimentării hranei cu aditivi furajeri pe bază de Bacillus sp.
Tab. 7.31. Efectul adaosului de BS și BL asupra consumului mediu zilnic și al consumului specific
Tab. 7.31. The effect of the addition of BS and BL on the average daily feed intake and feed conversion ratio
*Unde: BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; BL – Bacillus Licheniformis ATCC 21424, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; loturi: E (martor, NC+soia), E+BS (NC+soia+BS), E+BL (NC+soia+BL); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
Fig. 7.28. Consumul mediu zilnic de furaj
Fig. 7.28. Average daily feed intake
Fig. 7.29. Consumul specific
Fig. 7.29. Feed conversion ratio
7.7.1.3. Microbiota puilor broiler de găină
7.7.1.3.1. Microbiota din fecale
Evaluarea microbiologică a dejecțiilor recoltate la 42 de zile a urmărit determinarea numărului de Enterobacteriaceae sp., numărului de colonii de E. coli, stafilococi, prezența sau absența coloniilor de Salmonella sp. și lactobacili. Rezultatele obținute sunt redate în Tab. 7.32.
In fecale, prezența Enterobacteriaceae sp. la loturile cu adaos de biopreparate bacteriene (E+BS și E+BL) a înregistrat diferențe foarte semnificative (P≤0,0001) vs. lotul E.
Evaluarea numărului de E. coli în studiul de față, a înregistrat o scădere la lotul E+BS cu 1,81% față de lotul E, în timp ce E+BL din punct de vedere statistic, a prezentat o medie de 11,19 log10 UFC/ml.
Scăderea numărului de stafilococi este vizibilă la loturile E+BS (cu 1,24%) și E+BL (cu 1,82%) vs. lotul E.
Tab. 7.32. Microbiota broiler de găină din fecale
Tab. 7.32. Microbiota of broiler chickens from faces
*Unde: E (martor, NC+soia), E+BS (NC+soia+BS), E+BL (NC+soia+BL); diferențe semnificative (P≤0,05); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
Se constată că tulpinile utilizate în hrana puilor broiler de găină au acțiune inhibitorie asupra microorganismelor patogene și conduc la scăderea semnificativă a acestora din probele de dejecții prelevate și odată cu acestea la scăderea nivelului de contaminare a mediului de creștere a broilerilor, datele fiind asemănătoare cu cele raportate de Tabuc și col. (2016).
7.7.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal
Din analiza datelor, privind microbiota intestinală (cecum și ileon, Tab. 7.33) a puilor broiler de găină se pot afirma următoarele aspecte:
Adaosul de cultură bacteriană de BS și BL, nu a determinat modificări asupra numărului total de Lactobacillus sp. la nivel de conținut intestinal, implicit asupra numărului de Coliformi.
La nivel de ileon, suplimentarea hranei cu BS a influențat semnificativ (P≤0,05) pozitiv nr. de Enterococcus sp.în lotul E+BS cu 17,51% față de lotul M, în timp ce în conținutul cecal s-a înregistrat o medie de 1,08 ori mai mare la lotul E+BS vs. lotul M. De asemenea, adaosul de BL a determinat în ileon creșterea numărului de enterococi de 1,07 ori, respectiv cu 15,24% în cecum la lotul E+BL comparativ cu lotul M.
Numărul de Bacillus sp. atât în conținutul ileal, cât și cecal a fost semnificativ mai mare față de lotul M, la adaos de culturi bacteriene de BS și BL; în ileon, BS a determinat o creștere cu 37,71% vs. lotul E+BL.
Salmonella sp. nu a fost confirmată la niciun lot experimental.
Numărul de E. coli biotipul β-hemolitic, la loturile E+BS și E+BL, a fost mult mai scăzut comparativ cu lotul M. In ileon, adaosul de BS a determinat o scădere cu 30,47%, în timp ce BL a diminuat cu 85,13%, fiind de 1,41 ori mai eficient vs. BS. De asemenea, în conținutul cecal, suplimentarea cu BS și BL a micșorat numărul bacteriilor patogene de E. coli (de 2,9 ori în E+BS și de 7,95 în E+BL).
Chen (2012) a raportat că suplimentarea hranei la broiler cu probiotice pe bază de Bacillus sp. contribuie la reducerea numărului de bacterii patogene, afirmație confirmată și în studiul de față prin înregistrarea unei scăderi asupra E. coli biotipul β-hemolitic. In plus, adaosul de BS și BL a scăzut atât numărul de E. coli, cât și Clostridium sp. în conținutul cecal asemănător cercetării lui Hassan și col. (2014).
Studiile anterioare au indicat că adaosul de Bacillus sp. în hrana păsărilor, ar avea un efect benefic asupra microbiotei intestinale și, prin urmare, va îmbunătății performanțele de creștere și totodată raportul de conversie a furajelor la animale (Lei și col., 2015). De asemenea, Sanders și col. (2003) afirmă că Bacillus sp. prezintă o multitudine de efecte benefice datorită capacității de a produce amilaze, proteaze, lipaze și aminoacizi, contribuind astfel, la îmbunătățirea digestiei și absorbția substanțelor nutritive.
Tab. 7.33. Microbiota broiler de găină la nivel de conținut intestinal
Tab. 7.33. Microbiota of broiler chickens from intestinal content
*Unde: I – conținut ileon; C – conținut cecum; SEM = eroarea standard a mediei; a,bdiferențe semnificative (P≤0,05); E (martor, NC+soia), E+BS (NC+soia+BS), E+BL (NC+soia+BL); na= nu se aplică.
Administrarea culturilor bacteriene de Bacillus sp. (ex: B. subtilis, B. licheniformis etc.) în nutriția animală, pot reprezenta adevărate surse cu înalt potențial probiotic (Barbosa și col., 2005) datorită stabilității ridicate a sporilor, tolerării temperaturilor ridicate în timpul procesării furajelor, rezistenței la condițiile dure gastrointestinale, toate acestea îmbunătățind starea de sănătate a gazdei (Mazanko și col., 2018).
7.7.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal
Evoluția pH-ului intestinal la puii broiler de găină este prezentată în Tab. 7.34, Fig. 7.30. La păsări, un pH acid al tractului gastrointestinal este în strânsă corelație cu starea de sănătate a puilor, felul nutrienților din rația furajeră și cel mai important aspect microflora GIT.
Tab. 7.34. Evoluția pH-ului intestinal la puii broiler de găină
Tab. 7.34. Evolution of intestinal pH value of broiler chickens
*Unde: E (martor, NC+soia), E+BS (NC+soia+BS); E+BL (NC+soia+BL); BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424; SEM = eroarea standard a mediei; diferențe semnificative (P≤0,05).
Fig. 7.30. PH-ul intestinal la puii broiler de găină
Fig. 7.30. Intestinal pH of broiler chickens
Nivelul pH-ului în anumite zone ale intestinului se modifică, fiind un factor important în ceea ce privește populația microbiană și implicit asupra digestibilității și nivelului de absorbție a substanțelor nutritive la nivelul vilozităților GIT. Majoritatea agenților patogeni se dezvoltă într-un pH apropiat de 7 sau puțin mai mare. În schimb, microorganismele benefice trăiesc într-un pH acid (5,8-6,2) și concurează cu agenții patogeni (Ferd, 1974). În plus, scăderea pH-ului cu acizi organici îmbunătățește absorbția de nutrienți (Boling și col., 2001).
Experiment IV: ,,Efectele utilizării unor preparate enzimatice pe bază de B. subtilis ATCC 6051a și B. licheniformis ATCC 21424 în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat fasoliță”.
7.8.1. Performanțele bioproductive
7.8.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic
Efectele utilizării preparatelor enzimatice pe bază de BS și BL în hrana puilor broiler de găină utilizând în nutrețul combinat fasoliță 15% asupra performanțelor bioproductive, corespunzător fazelor de creștere pe durarata a 42 zile, conform protocolului experimental sunt prezentate în Tab 7.35.
La vârsta de 10, zile, adaosul de biopreparat bacterian pe bază de BS, respectiv BL cu rol enzimatic asupra formulei de NC și implicit a componentei furajere fasoliță cunoscută drept materie primă energo-proteică, nu a înregistrat diferențe semnificative (P>0,05) între loturile experimentale asupra greutății corporale a puilor broiler de găină (Fig. 7.31). In schimb, la 24 de zile, suplimentarea NC cu BL a determinat o greutate medie de 1056,90 g, fiind de 1,02 ori mai mare față de lotul F.
La finalul experimentului, greutatea medie la lotul experimental F2-BL a fost îmbunătățită de 1,04 ori comparativ cu lotul F și cu 4,26% mai mare față de F1-BS.
Tab. 7.35. Performanțele zootehnice obținute în Experimentul IV
Tab. 7.35. The zootechnical performances obtained in Experiment IV
*Unde: BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; BL – Bacillus Licheniformis ATCC 21424, 1×1011 UFC/ml, 5 ml/kg furaj; loturi: F (martor, NC+fasoliță), F+BS (NC+fasoliță+BS), F+BL (NC+fasoliță+BL); abcdiferențe semnificative (P≤0,05); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
În ceea ce privește evoluția SMZ (Tab. 7.35, Fig. 7.32) s-au înregistrat diferențe semnificative (P≤0,05); în faza de creștere, lotul F+BL a fost de 1,01 ori mai mare față de lotul F, în timp ce la finisare lotul F-BS a prezentat un SMZ cu 4,68% mai mare vs. lotul F, în timp ce lotul F-BL a fost cu 6,96% și de 1,02 ori mai ridicat comparativ cu lotul F+BS.
Per total perioadă experimentală, se poate afirma că adaosul de BS și BL în hrana puilor broiler de găină a determinat un SMZ în lotul F+BL cu 4,68% mai mare față de lotul F, însoțit de o greutate finală de 2776,12 g/pui vs. 2655,10 g/pui.
Fig. 7.31. Greutatea corporală
Fig. 7.31. Body weight evolution
Fig. 7.32. Sporul mediu zilnic
Fig. 7.32. Weight gain evolution
7.8.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific
Consumul mediu zilnic de furaj (Tab. 7.36, Fig. 7.33), per total perioadă la lotul F+BS a fost 108,54 g/pui/zi, iar la lotul F+BL de 108,75 g/pui/zi, față de lotul F (113,86 g/pui/zi), diferențele fiind nesemnificative de (P>0,05), însă putem afirma că nutrețul combinat cu un procent de 15% fasoliță și suplimentat ulterior cu tulpini de Bacillus sp. ATCC, cunoscute ca surse cu potențial enzimatic și probiotic, contribuie la îmbunătățirea procesului de digestie, lucru confirmat de un consum mediu zilnic de furaj redus cu un procent ridicat asupra parametrului greutatea corporală.
Introducerea fasoliței în formula recepturii de nutreț combinat (NC) reprezintă o alternativă energo-proteică cu un potențial excelent, fiind o sursă valoroasă de energie datorită conținutului de amidon (Nalle și col., 2010). Pe de altă parte, Drazbo și col., (2018) au menționat că prezența factorilor antinutriționali (taninuri, inhibitori proteici, oligozaharide și NSP) în fasoliță reduc valoarea nutritivă a acesteia, diminuând astfel, absorbția în mod corect a substanțelor nutritive și totodată îmbunătățirea performanțelor zootehnice (Dumitru și col., 2018; Hejdysz și col., 2016).
Tab. 7.36. Efectul adaosului de BS și BL asupra consumului mediu zilnic și al consumului specific
Tab. 7.36. The effect of the addition of BS and BL on the average daily feed intake and feed conversion ratio
*Unde: loturi: F (martor, NC+fasoliță), F+BS (NC+fasoliță+BS), F+BL (NC+fasoliță+BL); BS-Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL-Bacillus licheniformis ATCC 21424; diferențe semnificative (P≤0,05). na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
De asemenea, la final de experiment, consumul specific înregistrat în urma suplimentării cu biopreparate bacteriene pe bază de BS și BL a fost cu 5,17% mai redus la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce lotul F+BL a avut un consum cu 9,58% mai scăzut față de martorul F (Fig. 7.34).
Introducerea biopreparatelor bacteriene pe bază de BS și BL în hrana puilor broiler de găină a îmbunătățit parametrii zootehnici până la sfârșitul perioadei de creștere, date confirmate și în literatură (Dumitru și col., 2018; Yadav și col., 2018; Bai și col., 2017; Li și col., 2016). De asemenea, Bacillus subtilis și Bacillus licheniformis fără a avea un impact deosebit asupra performanțelor de creștere, greutății, lungimii, robusteții și procentului de calciu al tibiei la puii de carne, ameliorează, totuși, grosimea peretelui median și lateral al tibiei și procentul de cenușă (Eren, 2006, citat de Tabuc și col., 2016).
Fig. 7.33. Consumul mediu zilnic de furaj
Fig. 7.33. Average daily feed intake
Fig. 7.34. Consumul specific
Fig. 7.34. Feed conversion ratio
7.8.1.3. Microbiota puilor broiler de găină
7.8.1.3.1. Microbiota din fecale
Determinarea microflorei puilor broiler de găină din conținutul fecal este prezentată în Tab. 7.37. Adaosul de BL în hrana păsărilor a scăzut semnificativ numărul de Enterobacteriaceae sp. (P=0,0003) vs. lotul martor (F) hrănit cu nutreț combinat cu fasoliță 15% pe toată perioada de creștere (42 zile) și derulare experimentală.
Tab. 7.37. Microbiota broiler de găină din fecale
Tab. 7.37. Microbiota of broiler chickens from faces
*Unde: F (martor, NC+fasoliță), F+BS (NC+fasoliță+BS), F+BL (NC+fasoliță+BL); diferențe semnificative (P≤0,05); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei; abs.=absent.
De asemenea, E. coli, la loturile F+BS și F+BL s-a micșorat cu 0,35% față de lotul F, ceea ce confirmă că speciile de Bacillus sp. pot reprezenta un factor inhibitor împotriva bacteriilor patogene, cu acțiuni benefice asupra microbiotei animalelor (Mountzouris și col., 2010). Tabuc și col, (2016) susține de altfel, că administrarea preparatelor vii în hrana animalelor reprezintă principalele surse responsabile de o serie de parametrii zootehnici (creșterea sporului de greutate, reducerea consumului mediu zilnic), concomitent cu unele efecte sanitare (diminuarea tulburărilor gastrointestinale, reducerea morbidității, reducerea numărului de microorganisme din mediul de creștere al animalelor).
In conținutul fecal, prezența numărului de Lactobacillus sp. a fost mai mare cu 0,19% la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce lotul F+BL a fost cu 0,29% mai pronunțat față de F. Cu toate acestea, genul Lactobacillus, este caracterizat printr-o mare diversitate de specii, reprezentând astăzi aproximativ 71% din tulpinile utilizate ca aditivi furajeri în alimentația suinelor și păsărilor, în timp ce speciile aparținând genurilor Bacillus și Enterococcus sunt utilizate în proporție 29% (Tabuc și col., 2016; Dumitru și col., 2018).
Salmonella sp. a fost absentă la toate loturile experimentale.
7.8.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal
In Tab. 7.38 este redată microbiota gastrointestinală în urma suplimentării hranei (+ 15% fasoliță) la puii broiler de găină cu Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424.
In ceea ce privește numărul de lactobacilli, nu s-au înregistrat diferențe semnificative (P≤0,05) la adaos de biopreparat bacterian, însă se poate observa o modificare în conținutul cecal în lotul F+BL, unde lactobacilii au fost mai evidenți cu 1,53% vs. lotul F (Foto 7.27).
Tab. 7.38. Microbiota broiler de găină la nivel de conținut intestinal (cecum și ileon)
Tab. 7.38. Microbiota of broiler chickens from intestinal content (cecum and ileum)
*Unde: I – conținut ileon; C – conținut cecum; SEM = eroarea standard a mediei; a,bdiferențe semnificative (P≤0,05); E (martor, NC+fasoliță), F+BS (NC+fasoliță+BS), F+BL (NC+fasoliță+BL); na= nu se aplică.
Foto 7.27. Aspecte culturale ale coloniilor de lactobacili – MRS agar (Original)
Photo 7.27. Cultural aspects of the lactobacilli colonies from MRS agar (Original)
In ceea ce privește numărul de coliformi, la nivel de ileon, rezultatele au fost semnificative (P≤0,05), lotul F+BS a înregistrat cu 43,34% mai multe colonii vs. lotul F, iar F+BL de 1,19 ori față de F. In schimb, în conținutul cecal, lotul F+BS a prezentat un număr de coliformi de 1,05 ori mai ridicat comparativ cu martorul, în timp ce E+BL cu 9,11% vs. lotul F.
Clostridium sp. caracterizat printr-un grad ridicat de patogenitate și leziuni necrotice la nivel de intestin fiind factorul principal asupra enteritelor necrozabile la puii broiler; imprimă modificări fizice la nivel de intestine și asupra sistemului imunitar prin perturbarea microbiotei GIT etc. (Lacey și col., 2018). In experimentul de față, adaosul de BS și BL a scăzut numărul de Clostridium sp. astfel:
în ileon față de lotul E, experimentalul E+BS a fost cu 0,36% mai mic, în timp ce lotul E+BL cu 29%, valorile fiind nesemnificative (P≤0,05);
în cecum față de lotul E, E+BS a fost cu 18,81% mai mic, iar lotul E+BL de 1,13 ori, numărul de Clostridium sp. fiind diferit semnificativ.
Din analiza datelor privind numărul prezumtiv de Enteroccocus sp., se confirmă că la nivel de ileon, adosul de BL a accelerat dezvoltarea de enterococci cu 3,32%, iar BS cu 6,32%, ambele loturi față de lotul E. In cecum, rezultatele obținute au fost nesemnificative, însă adaosul de BL a determinat creșterea numărului de enterococi cu 9,65% vs. lotul E.
Rezultatele analizelor microbiologice efectuate din conținutul intestinal asupra Bacillus sp. confirmă prezența sporilor. la loturile E+BS și E+BL, astfel:
în ileon lotul E+BS a prezentat cu 30,28%mai multe colonii caracteristice genului Bacillus față de lotul E, în timp ce E+BL a fost cu 74,03% vs. lotul E și de 1,33 ori comparativ cu E+BS;
în cecum, s-au înregistrat diferențe semnificative (P≤0,05), lotul E+BS marcând un numărul de bacilli de 5,53 ori mai mult vs. lotul E, iar lotul E+BL de 3,72 ori față de E (Foto 7.28).
Foto 7.28. Aspecte culturale ale coloniilor de Bacillus sp. (Original)
Photo 7.28. Cultural aspects of Bacillus spp. colonies (Original)
Rezultatele determinărilor bacteriologice privind Salmonella sp., se încadrează în limite normale, conform Normei din 15 Aprilie 2003 publicata in Monitorul Official nr. 362 bis/28 Mai 2003, aceasta nefiind prezentă la niciun lot experimental.
Bacteriile patogene E. coli biotipul β-hemolitic, la nivel de ileon au fost absente la loturile cu adaos de preparat bacterian, în timp ce lotul E a manifestat stările caracteristice ale acestui agent infecțios, fiind asociate cu boala colibaciloză și totodată cu dezechilibrele gastrointestinale însoțite de dejecții apoase severe la păsări (Stella și col., 2016).
7.8.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal
PH-ul digestiv este unul dintre factorii gastrointestinali majori care influențează biodisponibilitatea nutrienților și microbiota intestinală (Morgan și col., 2014). In Tab. 7.39 este redat pH-ul intestinal la nivel de ileon și cecum la puii broiler de găină în urma suplimentării hranei cu biopreparate bacteriene pe bază de BS și BL.
Tab. 7.39. Evoluția pH-ului intestinal la puii broiler de găină
Tab. 7.39. Evolution of intestinal pH value of broiler chickens
*Unde: F (martor, NC+fasoliță), F+BS (NC+ fasoliță +BS); F+BL (NC+ fasoliță +BL); BS – Bacillus subtilis ATCC 6051a; BL – Bacillus licheniformis ATCC 21424; SEM = eroarea standard a mediei; adiferențe semnificative (P≤0,05).
La nivel de ileon, valorile obținute asupra pH-ului intestinal diferă semnificativ (P≤0,05) între lotul F și F+BS (mai redus de 1,16 ori), respectiv cu 13,21% mai scăzut față de lotul F+BL. In cecum nu s-au înregistrat diferențe semnificative între loturile experimentale, datele fiind asemănătoare cu cele raportate de Gheorghe și col. (2019). De asemenea, limitele normale raportate la monogastrice pe diferite segmente ale tractului intestinal este între 5,5-6,5
Determinarea exactă a pH-ului digestiv la puii broiler este un parametru foarte important, cu un potențial ridicat asupra sănătății intestinelor însoțită de o accelerare a nutrienților și în final la maximizarea parametriilor de interes (Morgan și col., 2014).
Fonseca și col. (2010) afirmă că este important să existe un nivel scăzut de pH, deoarece întâlnirea unor astfel de condiții previn sau diminuează colonizarea cu agenți patogeni în tractul digestiv. Duke (1994) confirmă că intervalul de referință al unui pH normal este între 4 – 5, fără o vârstă specifică a animalului.
Experiment V: ,,Efectele administrării unei policulturi pe bază de Lactobacillus sp. sub formă de pulbere la puii broiler de găină utilizând în nutrețul combinat surse energo-proteice.
7.9.1. Performanțele bioproductive
7.9.1.1. Evoluția greutății corporale și a sporului mediu zilnic
Administrarea unor preparate probiotice pe bază de Lactobacillus sp. (LS: L. salivarius IBNA 33 și L. salivarius IBNA 41), produs obținut sub formă de pulbere (procesul biotehnologic descris în subcap. 5.4), în hrana puilor broiler de găină, utilizând în NC surse energo-proteice (soia și fasoliță) asupra performanțelor bioproductive, pe durarata a 35 de zile, conform protocolului experimental sunt prezentate în Tab 7.40.
Tab. 7.40. Performanțele zootehnice obținute în Experimentul V
Tab. 7.40. The zootechnical performances obtained in Experiment V
*Unde: E (martor, NC+soia), F (martor, NC+fasoliță), E+LS (NC+soia+LS), F+LS (NC+fasoliță+LS); LS-L. salivarius IBNA 33 și IBNA 41; diferențe semnificative (P≤0,05). na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
Dinamica greutății corporale pe faze de creștere și per total perioadă experimentală, nu a înregistrat diferențe semnificative (P>0,05), însă suplimentarea NC+soia, respectiv NC+fasoliță cu produs probiotic LS a influențat greutatea și sporul mediu zilnic, după cum urmează: lotul E+LS a prezentat o greutate finală medie de 1804,15 g vs. lotul E (1794,38 g) , comparativ cu greutatea lotului F (1804,15 g) care a fost mai mică cu 0,71% față de adiacentul său F+LS (1816,99 g) (Fig. 7.35, Foto 7.29).
Fig. 7.35. Greutatea corporală
Fig. 7.35. Body weight evolution
Foto 7.29. Cântărire pui broiler de găină, vârstă 0-35 de zile (Original)
Photo 7.29. Evolution of broiler chickens, 0-35 days (Original)
Shokryazdan și col. (2014) confirmă că suplimentarea hranei la pui broiler de găină cu produs probiotic pe bază de Lactobacillus salivarius, ce a fost izolat din conținut intestinal pasăre, identificat și analizat in vitro din punct de vedere al rezistenței la condițiile tractulusului gastro intestinal animal (pH, săruri biliare), teste efectuate, de altfel și în lucrarea de față, a determinat obținerea unor rezultate pozitive asupra performanțelor zootehnice.
SMZ în faza de finisare a fost mai ridicat la lotul F+LS (de 1,07 ori mai mare vs. lotul F), în timp ce lotul E+LS a prezentat un SMZ de 1,01 față de lotul E, rezultatele obținute în ambele situații fiind nesemnificative.
La final de experiment, SMZ la lotul E+LS a fost cu 0,52% mai mare vs. lotul E, în timp ce experimentalul F+LS a determinat un spor cu 0,75% mai ridicat față de lotul F (Fig. 7.36).
Fig. 7.36. Sporul mediu zilnic
Fig. 7.36. Weight gain evolution
7.9.1.2. Evoluția consumului mediu zilnic și al consumului specific
Consumul mediu zilnic de furaj, cât și consumul specific înregistrat pe toate fazele de creștere, cât și per total perioadă (Tab. 7.41), nu a determinat obținerea unor valori cu diferențe semnificative între loturile experimentale la adaos de probiotic pe bază de LS (Fig. 7.37, Fig. 7.38).
Introducerea produsului probiotic pe bază de Lactobacillus salivarius, în urma izolări, identificării fenotipice și obținerii sub formă de pulbere a îmbunătățit parametrii zootehnici până la sfârșitul perioadei de creștere, însă valorile obținute sunt nesemnificative (P≥0,05).
Tab. 7.41. Efectul adaosului policulturi pe bază de Lactobacillus sp. asupra consumului mediu zilnic și al consumului specific
Tab. 7.41. The effect of the Lactobacillus sp. addition on the average daily feed intake and feed conversion ratio
*Unde: E (martor, NC+soia), F (martor, NC+fasoliță), E+LS (NC+soia+LS), F+LS (NC+fasoliță+LS); LS-L. salivarius IBNA 33 și IBNA 41; diferențe semnificative (P≤0,05); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei.
Fig. 7.37. Consumul mediu zilnic de furaj
Fig. 7.37. Average daily feed intake
Fig. 7.38. Consumul specific
Fig. 7.38. Feed conversion ratio
7.9.1.3. Microbiota puilor broiler de găină
7.9.1.3.1. Microbiota din dejecții
Evaluarea bacteriologică a dejecțiilor recoltate la 35 de zile, în urma suplimentării hranei la puii broiler de găină cu biopreparat probiotic pe bază de policultură sub formă de pulbere – LS (Lactobacillus salivarius IBNA 41 și Lactobacillus salivarius IBNA 33) este prezentată în Tab. 7.42.
Din rezultatele obținute se constată că administrarea de LS contribuie semnificativ la scăderea florei patogene astfel:
numărul coloniilor de E. coli la lotul hrănit cu NC+soia+LS s-a micșorat cu 0,26% vs. lotul E, în timp ce lotul F+LS a înregistrat cu 0,17% mai puțin față de lotul F;
rezultatele obținute asupra numărului de stafiloci diferă semnificativ între loturile experimentale (P≤0,05), lotul E+LS fiind cu 0,17% mai mic vs. lotul E, în timp ce lotul F+LS a prezentat o ușoară creștere;
Salmonella sp. nu a fost prezentă la niciun lot experimental.
Rezultate nesemnificative au fost obținute asupra numărului de colonii de Lactobacillus sp., însă se poate observa o îmbunătățire a numărului de lactobacili la loturile unde s-a adăugat pulbere probiotică de LS.
Tab. 7.42. Microbiota broiler de găină din dejecții
Tab. 7.42. Microbiota of broiler chickens from faces
*Unde: E (martor, NC+soia), F (martor, NC+fasoliță), E+LS (NC+soia+LS), F+LS (NC+fasoliță+LS); LS-L. salivarius IBNA 33 și IBNA 41; diferențe semnificative (P≤0,05); na= nu se aplică; SEM: eroarea standard a mediei; abs.=absent.
*Microflora digestivă: E. coli: ˃109; Salmonella sp.: absent; Lactobacilli: ˃ 108; Stafilococi: ˃106-107: după Gournier-Chateau și col., (1994).
7.9.1.3.2. Microbiota din conținut intestinal
In Tab. 7.43 sut prezentate rezultatele obținute asupra numărului de colonii de lactobacili, coliformi, clostridii, enterococi, Salmonella sp. și E.coli, în urma recoltării probelor de conținut intestinal (ileon și cecum) la puii broiler de găină, vârstă 35 de zile (Fig. 7.39 și 7.40).
La nivel de ileon, administrarea probioticului LS nu a îmbunătățit numărul de lactobacili la lotul hrănit cu soia, comparativ cu lotul F+LS unde s-a înregistrat o creștere semnificativă cu 5,36% vs. lotul F, explicația constând în faptul că doza administrată (LS – 1,62 x 108 UFC/ml) ingerată odată cu hrana a acționat eficient în nutrețul combinat cu fasoliță. Dat fiind prezența lactobacililor în tractul digestiv al păsărilor, reprezentând totodată grupul major de bacterii benefice (Dumitru și col., 2018), există multe rapoarte de cercetare care afirmă că administrarea de probiotice pe bază de lactobacili conferă efecte dezirabile asupra sănătății și performanțelor la păsări (Saint-Cyr și col., 2017).
La nivel de cecum, reduceri semnificative se observă asupra numărului de coliformi, în mod evident la lotul F+LS cu 30,34% vs. lotul F, în timp ce lotul E+LS cu 0,89% față de lotul E. De asemenea, la nivel de ileon, numărul coloniilor de clostridii a fost semnificativ micșorat la loturile E+LS (cu 4,47%) și F+LS (cu 2,44%) față de loturile martor ale acestora. La nivel de ileon și cecum, s-au observat reduceri asupra numărului de enterococi, precum și al numărului de colonii de E. coli biotipul β-hemolitic la loturile experimentale cu adaos de LS, date asemănătoare fiind înregistrate și de către Rada și col. (1995).
Salmonella spp. nu s-a confirmat la nicio variantă experimentală, la nivel de conținut intestinal.
Tab. 7.43. Microbiota puilor broiler de găină – conținut intestinal (cecum și ileon)
Tab. 7.43. Microbiota of broiler chickens – intestinal content (cecum and ileum)
*Unde: I – conținut ileon; C – conținut cecum; SEM = eroarea standard a mediei; a,b,c,d,ediferențe semnificative (P≤0,05); E (martor, NC+soia), F (martor, NC+fasoliță), E+LS (NC+soia+LS), F+LS (NC+fasoliță+LS); LS-L. salivarius IBNA 33 și IBNA 41; na= nu se aplică.
Fig. 7.39. Microbiota intestinală la puii broiler de găină, ileon (35 de zile)
Fig. 7.39. Broiler intestinal microbiota from ileum intestinal content (35 days)
Fig. 7.40. Microbiota intestinală la puii broiler de găină, cecum (35 de zile)
Fig. 7.40. Broiler intestinal microbiota from ileum intestinal content (35 days)
Meimandipour și col. (2009) raportează că adaosul de probiotic pe bază de L. salivarius în hrana puilor broiler, contribuie la reechilibrarea microbiotei gastrointestinale, prin prevenirea colonizării cu bacterii patogene enterice (ex: Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Salmonella enterica, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Oakley și col., 2014) ce sunt caracterizate printr-o mare capacitate de aderare la mucoasa intestinală (Collado, și col., 2008; Zulkifli și col., 2000).
Microorgansmele probiotice sunt considerate vectorii unor substanțe, pe care le sintetizează (enzime, componente ale peretelui celular, substanțe antibacteriene) și care devin active în tractusul digestiv al animalelor. Conform datelor din literatura de specialitate, efectele acestor substanțe pot fi directe sau indirecte în ceea ce privește microflora intestinală și sistemul imunitar (inhibarea bacteriilor patogene, neutralizarea unor substanțe toxice, ameliorarea digestibilității, stimularea imunității) (Tabuc și col., 2016).
7.9.1.3.3. Evoluția pH-ului intestinal
PH-ul GIT la păsări este influențat de tipul de furaj administrat, capacitatea de secreție a acidului gastric, săruri biliare, secrețiile pancreatice și microbiota intestinală (Reis și col., 2017). In experimentul de față, administrarea probioticului pe bază de amestec de Lactobacillus salivarius (1 gram/kg furaj) a determinat modificări semnificative între loturile E+LS și F+LS la nivel de ileon. In ileon, adaosul de LS la lotul F+LS a micșorat valoarea de pH cu 10,93% vs. lotul F, în timp ce lotul hrănit cu NC+soia+LS a crescut (+0,16). In cecum nu s-au înregistrat diferențe semnificative asupra valorilor de pH (Tab. 7.44, Fig. 7.41).
Tab 7.44. Evoluția pH-ului intestinal la puii broiler de găină
Tab. 7.44. Evolution of intestinal pH value of broiler chickens
*Unde: I – conținut ileon; C – conținut cecum; SEM = eroarea standard a mediei; a,b,diferențe semnificative (P≤0,05); E (martor, NC+soia), F (martor, NC+fasoliță), E+LS (NC+soia+LS), F+LS (NC+fasoliță+LS); LS-L. salivarius IBNA 33 și IBNA 41; na= nu se aplică.
Fig. 7.41. Evoluția pH-ului intestinal la puii broiler de găină
Fig. 7.41. Evolution of intestinal pH of broiler chickens
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI
Centralizând datele din prezenta teză intitulată ,,Cercetări privind obținerea unor preparate enzimatice exogene și efectele utilizării acestora în hrana monogastricelor”, putem evidenția următoarele informații conform studiilor din literatura de specialitate:
Enzimele reprezintă motorul organismului fără de care acesta nu poate funcționa (lupta împotriva infecțiilor, participarea continuă la procesul de: digestie, absorbție a elementelor nutritive, transformare a nutrienților în energie).
Enzimele exogene se obțin din surse vegetale, animale și microbiene. Sursele microbiene au un grad de interes biotehnologic foarte ridicat, datorită nivelului de multiplicare foarte rapid și al costului scăzut.
Principalele surse microbiene sunt reprezentate de tulpini de bacterii (Bacillus spp. și Lactobacillus spp.), drojdii (Saccharomyces spp. și Candida spp.) și mucegaiuri (Aspergillus spp., Penicillium spp.).
Enzimele sunt responsabile de procesele proteolitice, amilolitice și fibrinolitice din organism, participarea lor fiind factorul cheie în alimentația animalelor, cu rol în descompunerea nutrienților în compuși simpli ușor de asimilat.
Principalele enzime utilizate ca aditivi furajeri fac parte din clasa hidrolazelor, având numeroase beneficii în dezvoltarea și îmbunătățirea performanțelor zootehnice.
Enzimele industriale, de interes biotehnologic sunt reprezentate de: amilaze, proteaze, lipaze, xilanaze, celulaze, fitaze, dar și de amestecuri de enzime.
Utilizarea preparatelor enzimatice în nutriția animalelor are ca perspectivă rezolvarea unor probleme ce țin de sănătatea animalului (microbiota intestinală), creșterea disponibilității substanțelor nutritive ce se găsesc în nutrețuri, accesibilitatea animalelor tinere ce nu dețin un echipament enzimatic bine dezvoltat.
Adaosul de enzime în hrana animală, în special la monogastrice, contribuie la degradarea polizaharidelor neamidonoase din structura pereților celulari vegetali, până la structuri cu greutate moleculară scăzută (monomeri sau oligomeri) cu un grad ridicat de absorbție la nivelul membranei intestinale. Odată cu absorbția are loc și eliberarea unor substanțe nutritive prin pereții celulari degradați de enzimele exogene, rezultând per total o valorificare superioară a ingestei.
Suplimentarea enzimatică a hranei poate avea și alte scopuri, printre care completarea echipamentului enzimatic la animalele tinere, la care producția de enzime endogene este limitată atât din punct de vedere calitiativ, cât și cantitativ.
Enzimele exogene degradează anumiți factori antinutritivi ce se regăsesc în materiile prime furajere, facilitând utilizarea unor ingrediente furajere mai ieftine, se reduc costurile de producție.
Includerea enzimelor în hrană (fitaze) poate implica o creștere a valorii nutritive a materiilor prime, urmată de o reducere a poluării, prin limitarea pierderilor de substanțe minerale prin dejecții.
Enzimele exogene au rol în îmbunătățirea conversiei hranei; s-a constatat că enzimele endogene din tractusul intestinal nu prezintă o eficiență îndelungată datorită efectelor negative provocate de vâscozitatea intestinală care determină o diminuare a proceselor de absorbție.
Adaosul de enzime în hrana animalelor poate avea o influență pozitivă la nivelul microbiotei intestinale (ex: animalele tinere) cu favorizarea proliferării bacteriilor utile în detrimentul celor patogene.
Adaosul amestecurilor plurienzimatice ca aditivi furajeri a implicat un grad ridicat de biodisponibilitate a nutrienților, determinând obținerea unor rezultate superioare comparabil cu preparatele monoenzimatice.
Suplimentarea alimentației cu enzime furajere a contribuit la obținerea unor sporuri în greutate mai mari la animalele tinere (purceii aflați în criza de înțărcare), cu o eficientizare a conversiei hranei și un nivel scăzut de apariție a fenomenului de diaree.
La consolidarea celor menționate mai sus, prin parcurgerea cercetărilor in vitro și in vivo, se consideră că s-au atins obiectivele de referință propuse prezentului studiu și se prezintă în sinteză următoarele concluzii și recomandări:
Analizarea caracterelor morfo-funcționale (cultural, morfologic, biochimic, hemolitic, enzimatic) a tulpinilor Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424, confirmă identitatea prin APIweb soft și ABIS online, precum și puritatea acestora, cu înregistrarea unui nivel ridicat de viabilitate.
Tulpinile Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424 datorită prezenței sporilor ca formă de rezistență, tolerează pH-ul acid (2 și 3) mai mult de 120 min., sărurile biliare (oxgall 0,3%, pH = 6.5) în cele 4 ore de incubare, temperatura de 80°C prin expunere timp de 120 min., cu o rata de supraviețuire ˃70%.
Analizarea caracterului de nepatogenitate se confirmă la ambele tulpini de Bacillus sp. ATCC, prin înregistrarea unei γ-hemolize în jurul coloniilor dezvoltate pe mediul TSA agar sânge. Nu se dezvoltă colonii β-hemolitice cu zonă transparentă, sub formă de halou.
Bacillus liceniformis ATCC 21424 prezintă activitate enzimatică, remarcată prin secretare de protează în formula de NC administrat purceilor în criza de înțărcare (97, 75 U/ml), amilază (6,63 U/ml) și un nivel mai mic de celulază (2,3 U/ml, pH=6,4).
Bacillus subtilis ATCC 6051a, atinge nivelul maxim de amilază în NC utilizat în Experimentul I și II, la 48 de ore (11,38 U/ml), fiind dublu față de BL. De asemenea, BS prezintă și activitate celulozolitică la pH=7 (2,39 U/ml), fiind cu 12,57% mai mare față de BL.
Din punct de vedere calitativ, ambele tulpini de Bacillus sp. ATCC prezintă capacitate de hidrolizare a amidonului și cazeinei, proprietate confirmată prin dezvoltarea unei zone de halou în jurul coloniilor dezvoltate pe placa cu agar.
Izolarea, identificarea și conservarea celor 2 tulpini de Lactobacillus sp. (Lactobacillus salivarius IBNA 33 și Lactobacillus salivarius IBNA 41) din conținut intestinal pasăre a reprezentat materialul biologic utilizat ca sursă potențială probiotică în hrana puilor broiler de găină, hibrid Ross 308.
Cele 2 tulpini de Lactobacillus sp. în urma supunerii la pH 3 și săruri biliare, după 3 ore de incubare, au înregistrat un grad ridicat de viabilitate, motiv pentru care au fost utilizate pentru obținere de produs probiotic în hrana puilor broiler de găină.
Produsul zootehnic bacterian pe bază de Bacillus sp. s-a obținut sub formă lichidă, cultura de 24 de ore, bine dezvoltată, formată din celule tinere, aflate în faza logaritmică de creștere, în timp ce produsul probiotic pe bază de Lactobacillus sp. s-a obținut sub formă de pulbere, prin procesul de liofilizare-atomizare.
Din punct de vedere microbiologic, materiile prime din structura recepturilor de nutrețuri combinate s-au încadrat în limite corespunzătoare; formula de NC a fost echilibrată izo-energoproteic pentru satisfacerea cerințelor nutriționale specifice categoriei de vârstă și greutate.
Ponderea de includere a tulpinilor bacteriene în structura recepturilor de nutrețuri combinate destinate purcei în criza de înțărcare (30±3 zile), respectiv BS 1 și 3% (1,6 x 109 UFC/ml) și BL 1 și 3% (1,5 x 109 UFC/ml), a permis optimizarea parametrilor zootehnici.
Adaosul de BS – 1% vs. BS – 3% a îmbunătățit greutatea corporală a purceilor în criza de înțărcare în prima și ultima săptămână de viață, însă valorile sunt nesemnificative (P>0.05).
Consumul mediu zilnic de furaj/cap a fost mai mai mare în lotul Martor față de lotul E1 – BS–1%. Conversia hranei a fost de 1,22 ori mai mare în lotul E1 – BS-1% vs. lotul M, respectiv de 1,05 mare mare față de E2 – BS-3%.
Rezultatele obținute au demonstrat că adaosul de BL 3% în NC contribuie la îmbunătățirea greutății corporale la purcei în criza de înțărcare (46 zile ± 3 zile), însă valorile sunt nesemnificative (P˂0,05). Lotul E4-BL–3% este de 1,06 ori mai mare vs. lotul E3 – BL–1%, respectiv cu 1,8% mai mare față de lotul M.
Suplimentarea hranei la purcei pe durata celor 16 zile, cu biopreparate bacteriene enzimatice a contribuit la diminuarea încărcăturii microbiene din fecale și conținut intestinal, însă rezultatele obținute sunt nesemnificative (P<0,05).
Suplimentarea NC cu BS 1% a contribuit la scăderea incidenței diareice, însă începând cu cea de-a doua săptămână de experiment, s-a instaurat prezența de E. coli biotipul β-hemolitic, purceii fiind afectați, dezechilibrele gastrointestinale fiind omniprezente.
Nutrețul combinat cu adaos de BL 3% îmbunătățește microbiota la nivel de ileon cu 14,34%, respectiv cu 2,71% în cecum, reduce frecvența enteritelor cu 44% și reduce scorul fecal grad 3 de 6 ori.
In Experimentul III:
Dinamica greutății corporale a puilor broiler de găină în urma suplimentării cu BS a fost îmbunătățită (2785,65 g), fiind de 1,02 mai mare față de lotul E.
În ceea ce privește evoluția sporului mediu zilnic (SMZ), în perioada de creștere (11-24 zile), adaosul de BS a determinat o creștere semnificativă (P≤0,05) cu 5,71% vs. lotul E, respectiv de 1,03 ori mai mare față de lotul E+BL, în timp ce lotul E+BL a realizat un spor cu 2,03% mai mare vs. lotul E.
Din punct de vedere statistic, NC + de soia cu adaos de biopreparate bacteriene pe bază de BS și BL a determinat obținerea unui SMZ mai ridicat vs. lotul E.
Consumul mediu zilnic de furaj nu a fost influențat semnificativ la niciun lot experimental (P≤0,05), însă s-a remarcat o scădere asupra consumului de furaj, și implicit o îmbunătățire economică cu 1,06% pentru lotul E+BS și 2,08% la E+BL, pe total perioadă experimentală.
Consumul specific s-a redus cu 2,28% la lotul E+BS, cât și la E+BL.
In fecale, prezența Enterobacteriaceae sp. la loturile cu adaos de biopreparate bacteriene (E+BS și E+BL) a înregistrat diferențe foarte semnificative (P≤0,0001) vs. lotul E.
Evaluarea numărului de E. coli a înregistrat o scădere a acestora la lotul E+BS cu 1,81% față de lotul E, în timp ce E+BL din punct de vedere statistic, a prezentat o medie de 11,19 log10 UFC/ml.
Adaosul de BS și BL a avut un impact pozitiv asupra numărului de stafilococi, prin scăderea acestora la loturile E+BS (cu 1,24%) și E+BL (cu 1,82%) vs. lotul E.
Adaosul de BS și BL, nu a determinat modificări asupra numărului total de Lactobacillus sp. la nivel de conținut intestinal, implicit asupra numărului de coliformi.
La nivel de ileon, suplimentarea hranei cu BS a influențat semnificativ (P≤0,05) pozitiv nr. de Enterococcus sp. în lotul E+BS cu 17,51% față de lotul E, în timp ce în conținutul cecal s-a înregistrat o medie de 1,08 ori mai mare la lotul E+BS vs. lotul E.
Numărul de Bacillus sp. atât în ileon, cât și cecum a fost semnificativ mai mare față de lotul E, la adaos de culturi bacteriene de BS și BL; în ileon, BS a determinat o creștere cu 37,71% vs. lotul E+BL.
Numărul de E. coli biotipul β-hemolitic, la loturile E+BS și E+BL, s-a diminuat cu 30,47% la adaos de BS și cu 85,13% la adaos de BL, fiind de 1,41 ori mai eficient vs. BS. De asemenea, în conținutul cecal, suplimentarea cu BS și BL a micșorat numărul bacteriilor patogene de E. coli (de 2,9 ori în E+BS și de 7,95 în E+BL).
Experiment IV:
La 24 de zile, suplimentarea NC+fasoliță cu BL a determinat o greutate medie de 1056,90 g, fiind de 1,02 ori mai mare față de lotul F. Greutatea medie la lotul F+BL a fost îmbunătățită de 1,04 ori vs. lotul F și cu 4,26% mai mare față de F+BS.
In faza de creștere, adaosul de BL a determinat un SMZ de 1,01 ori mai mare față de lotul F, în timp ce în faza de finisare lotul F+BS a prezentat un SMZ cu 4,68% mai mare vs. lotul F. Suplimentarea hranei la puii broiler de găină cu BL a determinat un SMZ cu 6,96% vs. lotul F, respectiv de 1,02 ori mai ridicat vs. lotul F+BS.
Per total perioadă experimentală putem afirma că adaosul de BS și BL în hrana puilor broiler de găină a determinat un SMZ la lotul F+BL cu 4,68% mai mare față de martorul F, însoțit de o greutate finală de 2776,12 g/pui vs. 2655,10 g/pui (lotul F).
Consumul mediu zilnic de furaj per total perioadă la lotul F+BS a fost 108,54 g/pui/zi, iar la lotul F+BL de 108,75 g/pui/zi, diferențele fiind nesemnificative (P>0,05), față de lotul F (113,86 g/pui/zi), însă putem afirma că NC cu 15% fasoliță și suplimentat ulterior cu tulpini de Bacillus sp. ATCC, cunoscute ca surse cu potențial enzimatic și probiotic, contribuie la îmbunătățirea procesului de digestie, lucru confirmat de o reducere asupra consumului mediu zilnic de furaj, însă cu un procent ridicat asupra parametrului greutatea corporală.
Consumul specific înregistrat în urma suplimentării cu biopreparate bacteriene pe bază de BS și BL a fost cu 5,17% mai redus la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce lotul F+BL a avut un consum cu 9,58% mai mic față de martorul F.
Adaosul de BL în hrana păsărilor a scăzut semnificativ numărul de Enterobacteriaceae sp. (P=0,0003) vs. lotul martor (F) hrănit cu NC+fasoliță, pe toată perioada de creștere (42 zile).
E. coli, la loturile F+BS și F+BL s-a micșorat cu 0,35% față de lotul F, ceea ce confirmă că speciile de Bacillus sp. pot reprezenta un factor inhibitor împotriva bacteriilor patogene, cu acțiuni benefice asupra microbiotei animalelor.
In conținutul fecal, prezența numărului de Lactobacillus sp. a fost mai mare cu 0,19% la lotul F+BS vs. lotul F, în timp ce lotul F+BL a fost cu 0,29% mai pronunțat față de F.
In ceea ce privește numărul de coliformi, la nivel de ileon, rezultatele au fost semnificative (P≤0,05), lotul F+BS a înregistrat cu 43,34% mai multe colonii vs. lotul F, iar F+BL de 1,19 ori față de F.
Adaosul de BS, la nivel de ileon, a contribuit la micșorarea numărului de clostridii cu 0,36% vs. lotul F.
Din analiza datelor privind numărul prezumtiv de Enteroccocus sp., se confirmă că la nivel de ileon, adosul de BL a accelerat dezvoltarea de enterococci cu 3,32%, iar BS cu 6,32%, față de lotul F. In cecum, rezultatele obținute au fost nesemnificative, însă adaosul de BL a determinat creșterea numărului de enterococi cu 9,65% vs. lotul F.
In ileon lotul F+BS a prezentat cu 30,28% mai multe colonii caracteristice genului Bacillus față de lotul F, în timp ce F+BL a fost cu 74,03% vs. lotul F și de 1,33 ori comparativ cu F+BS.
Experiment V:
Dinamica greutății corporale pe faze de creștere și per total perioadă experimentală, nu a înregistrat diferențe semnificative (P>0,05), la adaos de biopreparat bacterian pe bază de Lactobacillus sp. în loturile E+LS, respectiv F+LS.
Adaosul de LS a acționat asupra greutății corporale și a sporului mediu zilnic, după cum urmează: lotul E+LS a prezentat o greutate finală medie de 1804,15 g vs. lotul E (1794,38 g), comparativ cu greutatea lotului F (1804,15 g) care a fost mai mică cu 0,71% față de F+LS (1816,99 g).
SMZ în faza de finisare a fost mai ridicat la lotul F+LS (de 1,07 ori mai mare vs. lotul F), în timp ce lotul E+LS a prezentat un SMZ de 1,01 față de lotul E, rezultatele obținute în ambele situații fiind nesemnificative.
La final de experiment, SMZ la lotul E+LS a fost cu 0,52% mai mare vs. lotul E, în timp ce experimentalul F+LS a determinat un spor cu 0,75% mai ridicat față de lotul F
Adaosul de LS nu a determinat modificări semnificative asupra consumului mediu zilnic de furaj sau a consumului specific pe toate fazele de creștere, cât și per total perioadă.
Introducerea produsului probiotic pe bază de Lactobacillus salivarius, în urma izolări, identificării fenotipice și obținerii sub formă de pulbere a îmbunătățit parametrii zootehnici până la sfârșitul perioadei de creștere, însă valorile obținute sunt nesemnificative (P≥0,05).
Numărul coloniilor de E. coli la lotul hrănit cu NC+soia+LS s-a micșorat cu 0,26% vs. lotul E, în timp ce lotul F+LS a înregistrat cu 0,17% mai puțin față de lotul F.
Rezultatele obținute asupra numărului de stafilococi diferă semnificativ între loturile experimentale (P≤0,05), lotul E+LS fiind cu 0,17% mai mic vs. lotul E.
La nivel de ileon, administrarea probioticului LS nu a îmbunătățit numărul de lactobacili la lotul hrănit cu soia, comparativ cu lotul F+LS unde s-a înregistrat o creștere semnificativă cu 5,36% vs. lotul F, explicația constând în faptul că doza administrată (LS – 1,62 x 108 UFC/ml) ingerată odată cu hrana a acționat eficient în nutrețul combinat cu fasoliță.
La nivel de cecum, reduceri semnificative se observă asupra numărului de coliformi, în mod evident la lotul F+LS cu 30,34% vs. lotul F, în timp ce lotul E+LS cu 0,89% față de lotul E. De asemenea, la nivel de ileon, numărul coloniilor de clostridii a fost semnificativ micșorat la loturile E+LS (cu 4,47%) și F+LS (cu 2,44%) față de loturile martor ale acestora.
Salmonella sp. nu a fost prezentă la niciunun din cele 5 experimentale.
BIBLIOGRAFIE
AHMED S.T., ISLAM M.M., MUN H.S., SIM H.J., KIM Y.J., YANG C.J., 2014. Effects of Bacillus amyloliquefaciens as a probiotic strain on growth performance, cecal microflora, and fecal noxious gas emissions of broiler chickens. Poult. Sci. 93(8): 1963–1971. https://doi.org/10.3382/ps.2013-03718
AHMED Z., VOHRA M.S., KHAN M.N., AHMED A., KHAN T.A., 2019. Antimicrobial role of Lactobacillus species as potential probiotics against enteropathogenic bacteria in chickens. J. Infect. Dev. Ctries. 13(2): 130–136. https://doi.org/10.3855/jidc.10542
AQUINO A.C.M.M., JORGE J.A., TERENZI H.F., POLIZELI M.L.T.M., 2003. Studies on athermostable a-amylase from thermophilic fungus Scytalidium thermophilum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61(4): 323-328.
ARNAUD A., BERSET J., BOCQUET C., BOUIX M., CERISIE Y., CUVELLIER E, G.F., DE NETTANCOURT D., și col., 1993. Biotechnologies. 4ièn' ed., Scriban R., Editura Technique et Documentation, 904, Franța.
ARUWA C., OLATOPE S., 2015. Characterization of Bacillus Species from Convenience Foods with Conventional and API Kit Method: A Comparative Analysis. J. Appl. Life Sci. Int. 3(1): 42–48. https://doi.org/10.9734/JALSI/2015/17406
ASGHAR M., ASAD M. J., REHMAN S., LEGGE R.L.A., 2006. Thermostable -amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing. Journal of Food Engineering, 79(3): 950–955.
ASMARE B., 2014. Effect of common feed enzymes on nutrient utilization of monogastric animals. International Journal for Biotechnology and Molecular Biology Research, 5(4), 27 – 34, Bahir Dar University, Ethiopia.
BAĞDER ELMACI S., TOKATLI M., GÜLGÖR G., ÖZÇELIK F., ARSLANKOZ İȘLEYEN N., 2015. In Vitro Properties of Potential Probiotic Indigenous Lactic Acid Bacteria Originating from Traditional Pickles. Biomed Res. Int., 1–8. https://doi.org/10.1155/2015/315819
BAI, K. HUANG Q., ZHANG J., HE J., ZHANG L., WANG T., 2017. Supplemental effects of probiotic Bacillus subtilis fmbJ on growth performance, antioxidant capacity, and meat quality of broiler chickens. Poult. Sci. 96(1): 74–82. https://doi.org/10.3382/ps/pew246
BARBOSA T.M., SERRA C.R., LA RAGIONE R.M., WOODWARD M.J., HENRIQUES A.O., 2005. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol., 71(2): 968-978. https://doi.org/10.1128/AEM.71.2.968-978.2005
BECKERS Y., PIRON F., 2009. Utilisation des enzymes exogènes en alimentation porcine et avicole. Unité de Zootechnie Gembloux Agro-Bio Tech, Université de Liège Passage des Déportés, 2, B-5030 Gembloux, Belgique
BECKERS Y., THÉWIS A., 2004. Influence sur les performances zootechniques de quatre xylanases ajoutées à un régime riche en froment chez le poulet de chair. Rapport final sur la prestation de service entre l’Unité de Zootechnie de la Faculté universitaire des Sciences agronomiques à Gembloux et la société Beldem s.a., 10.
BEDFORD M.R., 1995. Mechanism of action and potential environmental benefits from the use of feed enzymes. Anim. Feed Sci. Technol. 53(2): 145–155. https://doi.org/10.1016/0377-8401(95)02018-U
BEDFORD M.R., 2000. Exogenous enzymes in monogastric nutrition – Their current value and future benefits. Anim. Feed Sci. Technol. 86(1-2): 1–13. https://doi.org/10.1016/S0377-8401(00)00155-3
BEDFORD M.R., MORGAN A.J., 1996. The use of enzymes in poultry diets. World Poult. Sci. J., 52: 61-68.
BEDFORD M.R., PARTRIDGE G.G, 2001. Enzymes in farm animal nutrition. 2nd edition. Library of Congress Cataloging-in-Publication Data, UK.
BEHERA N.M., MISHRA S., 2008. Amylase activity of a starch degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes. African J. Biotechnol., 7(18): 3326-3331. https://doi.org/10.5897/AJB08.582
BERNARDEAU M., LEHTINEN M.J., FORSSTEN S.D., NURMINEN P., 2017. Importance of the gastrointestinal life cycle of Bacillus for probiotic functionality. J. Food Sci. Technol., 54(2): 2570–2584. https://doi.org/10.1007/s13197-017-2688-3
BIMREW A., 2014. Effect of common feed enzymes on nutrient utilization of monogastric animals. Int. J. Biotechnol. Mol. Biol. Res., 5(4): 27–34. https://doi.org/10.5897/IJBMBR2014.0191
BLAJMAN J., GAZIANO C., ZBRUN M.V., SOTO L., ASTESANA D., BERISVIL A., SCHARPEN A.R., SIGNORINI M., FRIZZO L., 2015. In vitro and in vivo screening of native lactic acid bacteria toward their selection as a probiotic in broiler chickens. Res. Vet. Sci., 101: 50-56. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2015.05.017
BOTTON B., BRETON A., FÈVRE M., GAUTHIER S., GUY P., LARPENT J.P., REYMOND P., SANGLIER J.J., VAYSSIER Y., VEAU P., 1990. Moisissures utiles et nuisibles, Importance industrielle, Ed. Masson, Paris.
BYAPPANAHALLI M.N., NEVERS M.B., KORAJKIC A., STALEY Z.R., HARWOOD V.J., 2012. Enterococci in the Environment. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 76(4): 685–706. https://doi.org/10.1128/mmbr.00023-12
CAINE W.R., SAUER W.C., TAMMINGA S., VERSTEGEN M.W, SCHULZE H., 1978. Apparent ileal digestibilities of amino acids in newly weaned pigs fed diets with protease treated soybean meal. J.of Animal Science, 75(11): 2962-2969, Australia.
CAMPBELL J.M., CRENSHAW J.D., POLO J., 2013. The biological stress of early weaned piglets. J. Anim. Sci. Biotechnol., 4(1): 19. https://doi.org/10.1186/2049-1891-4-19
CASCAVAL D., GALACTION A.I., 2014. Bioprocese alimentare și farmaceutice. Editura Gr. T. Popa, Iași.
CHAIYAWAN N., TAVEETEPTAIKUL P., WANNISSORN B., 2010. Characterization and probiotic properties of Bacillus strains. Spore, 40(2): 207–214.
CHATEAU N.A.M., DESCHAMPS A.H. SASSI., 1994. Heterogeneity of bile salts resistance in the Lactobacillus isolates of a probiotic consortium. Lett. Appl. Microbiol., 18: 42–44.
CHEN K., 2012. Effects of probiotics and antibiotics on diversity and structure of intestinal microflora in broiler chickens. African J. Microbiol., 6(37) Res. https://doi.org/10.5897/ajmr12.105
CHOI J.Y., SHINDE P.L., INGALE S.L., KIM J.S., KIM Y.W., KIM K.H., KWON I.K., CHAE B.J., 2011. Evaluation of multi-microbe probiotics prepared by submerged liquid or solid substrate fermentation and antibiotics in weaning pigs. Livest. Sci., 138(1-2): 144–151. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2010.12.015
CIUCĂ (LEFTER) NICOLETA AURELIA, 2013. Cercetări privind utilizarea unor materii prime furajere nonconvenționale în hrana porcilor la îngrășat. Teză de doctorat.
CIURESCU G., MOLDOVAN I., IDA A., 2000. Effects of dietary phosphorus level of microbial phytase addition on layer performance and egg quality. Proceedings of the XXI World’s Poultry Congress, Montreal, 234, Canada.
CLASSEN H.L., SCOTT T.A., IRISH G.G., HUCK P., SWIFT M., BEDFORD M.R., 1995. The relationship of chemical and physical measurements to the apparent metabolisable energy (AME) of wheat when fed to broiler chickens with and without a wheat enzyme source. In: Proceedings of the Second European Symposium on Feed Enzymes, 65-69.
COJOCARU D.C., OLTEANU Z., CIORNEA E., OPRICĂ L., COJOCARU S.I., 2007. Enzimologie generală. Editura Tehnopress, 3: 17, 43, Iași.
COLLADO M.C., MERILUOTO J., SALMINEN S., 2008. Adhesion and aggregation properties of probiotic and pathogen strains. Eur. Food Res. Technol., 226(5): 1065–1073. https://doi.org/10.1007/s00217-007-0632-x
COWIESON A.J., ACAMOVIC T., BEDFORD M.R., 2006. Supplementation of corn-soy-based diets with an Eschericia coli-derived phytase: Effects on broiler chick performance and the digestibility of amino acids and metabolizability of minerals and energy. Poult. Sci., 85(8): 1389–1397. https://doi.org/10.1093/ps/85.8.1389
COWIESON A.J., RAVINDRAN V., 2008. Sensitivity of broiler starters to three doses of an enzyme cocktail in maize-based diets. Br. Poult. Sci., 49: 340-346.
CRĂINICEANU E., MATIUȚI M., CRĂINICEANU D., 2006. Nutriția animalelor. Editura Brumar, 6: 230, Timișoara.
CUC A., ROȘU I., POTECEA V., 2006. Creșterea porcinelor de la A la Z. Ed. Agrotehnica.
CUNNINGHAM H.M., 1959. Digestion of starch and some of its degradation products by newborn pigs. J. Animal Sci., 18: 964-975.
CUTTING S.M., 2011. Bacillus probiotics. Food Microbiol., 28(2): 214–220. https://doi.org/10.1016/j.fm.2010.03.007
DAVIS M.E., PARROTT T., BROWN D.C., DE RODAS B.Z., JOHNSON Z.B., MAXWELL C.V., REHBERGER T., 2008. Effect of a Bacillus-based direct-fed microbial feed supplement on growth performance and pen cleaning characteristics of growing-finishing pigs. J. Anim. Sci., 86(6): 1459–1467. https://doi.org/10.2527/jas.2007-060
DE LANGE C.F.M., PLUSKE J., GONG J., NYACHOTI C.M., 2010. Strategic use of feed ingredients and feed additives to stimulate gut health and development in young pigs. Livest. Sci., 134(1-3): 124–134. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2010.06.117
DONG X., ZHANG N., ZHOU M., TU Y., DENG K., DIAO Q., 2014a. Effects of dietary probiotics on growth performance, faecal microbiota and serum profiles in weaned piglets. Anim. Prod. Sci., 54(5): 616–621. https://doi.org/10.1071/AN12372
DONKERS W., 1989. Enzymes are nature’s teeth Pigs, nr. 11.
DUMITRU M., SORESCU I., HABEANU M., TABUC C., IDRICEANU L., JURCOANE S., 2018a. Preliminary characterisation of Bacillus subtilis strain use as a dietary probiotic bio-additive in weaning piglet. Food Feed Res. 45: 203–211. https://doi.org/10.5937/FFR1802203D
DUMITRU M., SORESCU I., HABEANU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2019. Preliminary characterization in vitro of Bacillus licheniformis strain for used as a dietary probiotic. Series F. Biotechnologies, 23: 164-172.
DUMITRU M., SORESCU I., JURCOANE Ș., 2017. Assessing of Morphological, cultural, biochemical profile and enzymatic activity of a Lactobacillus paracasei CCM 1837 strain. Academy of Romanian Scientists Annals Series on Biological Sciences, 6(2): 22-31.
DUMITRU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2018b. Obtaining a feed additive based of Lactobacillus plantarum strain. Scientific papers, Series A. Agronomy, LXI: 115–122.
DUMITRU M., TABUC C., SORESCU I., VASILACHI A., 2018c. Researches concerning the level of fermentable sugars from feed materials in relation with cellulase hydrolysis by carbohydrase enzyme. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XXII: 205-208.
DURANT J., BAUER M., GASKELL G., 1998. Biotechnology in the public sphere: A European source book.: Science Museum Press, Londra.
ELSHAGHABEE F.M.F., ROKANA N., GULHANE R.D., SHARMA C., PANWAR H., 2017. Bacillus as potential probiotics: Status, concerns, and future perspectives. Front. Microbiol., 8: 1–15. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01490
EREN M., 2006. The effect of dietary probiotic supplementation on tibial bone characteristics and strength in broilers. Poult. Sci., 85: 1621-1625. https://doi.org/10.1093/ps/85.9.1621
EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION, 2007. ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations. Int. Stand. Organ. https://doi.org/10.1007/s11367-011-0297-3
FERKET P., 2003. Menținerea sănătății intestinale ântr-o lume fără antibiotice. Aplicații practice ale biotehnologiilor. Al 17-lea turneu de Conferințe Alltech prntru Europa, Orientul Mijlociu și Africa. Editura Coral Sanivet, 53 -76, București.
FONSECA B.B., BELETTI M.E., SIQUEIRA M., SILVA L., DUARTE I.N., ROSSI D.A., 2010. Microbiota of the cecum, ileum morphometry , pH of the crop and performance of broiler chickens supplemented with probiotics. Revista Brasileira de Zootecnia, 39(8): 1756–1760.
FULLER M.F., 2004. The encyclopedia of farm animal nutrition. CABI Publishing.
GAO Z., WU H., SHI L., ZHANG X., SHENG R., YIN F., GOONERATNE R., 2017. Study of Bacillus subtilis on growth performance, nutrition metabolism and intestinal microflora of 1 to 42 d broiler chickens. Anim. Nutr., 3(2): 109–113. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.02.002
GARCIA M., LAZARO R., LATORRE M.A., GRACIA M.I., MATEOS G.C., 2008. Influence of enzyme supplementation and heat processing of barley on digestive traits and productive performance of broilers. Poultry Science, 87: 940-948.
GHEORGHE A., CIURESCU G., MOLDOVAN I., 2005. Productive effect of replacing the dietary soybean meal by various levels of rapeseed meal in broiler diets supplemented with enzyme preparations. Arhiva Zootechnică, 8: 107-112.
GHEORGHE A., HĂBEANU M., TABUC C., MARIN M., 2019. Effects of dietary pea seeds (pisum sativum l. Cv. Tudor) on performance, carcass traits, plasma biochemistry and intestinal microflora in broiler chicks. AgroLife Sci. J., 8(1): 99-106.
GIANG H.H., VIET T.Q., OGLE B., LINDBERG J.E., 2012a. Growth performance, digestibility, gut environment and health status in weaned piglets fed a diet supplemented with a complex of lactic acid bacteria alone or in combination with Bacillus subtilis and Saccharomyces boulardii. Livest. Sci., 143(2-3): 132–141. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2011.09.003
GRESSE R., CHAUCHEYRAS-DURAND F., FLEURY M.A., VAN DE WIELE T., FORANO E., BLANQUET-DIOT S., 2017. Gut microbiota dysbiosis in postweaning piglets: understanding the keys to health. Trends Microbiol., 25: 851–873. https://doi.org/10.1016/j.tim.2017.05.004
GUO X., LI D., LU W., PIAO X., CHEN X., 2006. Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs. Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol., 90(2): 139-146. https://doi.org/10.1007/s10482-006-9067-9
HĂBEANU M., HĂBEAN V., STOICA I., 2009. Enzime furajere: elemente de impact în nutriția suinelor. Editura Ars Academica, București.
HĂBEANU M., HEBEAN V., MOLDOVAN I., BEM C., MIHĂILĂ C., 2001. Research on dietary phosphorus bioavailability in weaned piglets using exogenous enzymes. Arhiva Zootehnică, 6.
HĂBEANU M., HEBEAN V., STOICA I., MOLDOVAN I., NEAGU M., 2006. Efectul suplimentării cu enzime a rețetelor de nutreț combinat pe bază de porumb, șrot de soia sau de rapiță, asupra performanțelor porcilor în îngrășare-finisare. Analele IBNA, vol. 2, Balotești.
HABEANU M., LEFTER N., GHEORGHE A., TABUC C., DUMITRU M., CIURESCU G., PALADE M., 2017. Effects of dietary peas mixed with linseed (3:1) on the growth performance, enteritis and certain serum parameter in weaned piglets. Food Feed Res., 44(2): 173–180. https://doi.org/10.5937/FFR1702173H
HĂBEANU M., TABUC C., GHEORGHE A., ROPOTA M., DUMITRU M., CĂLIN L., MIHALCEA T., PALADE M., 2016. Preliminary study on the interrelation between sow milk quality and litter performance in relation to their health. Sci. Pap. Sci. Ser. Științifice – Ser. Zooteh., 66: 35–40.
HASSAN H.M.A., YOUSSEF A.W., EL-DALY E.F., ABD EL-AZEEM N.A., HASSAN E.R., MOHAMED M.A., 2014. Performance, caecum bacterial count and ileum histology of broilers fed different direct-fed microbials. Asian J. Poult. Sci., 8(4): 106-114. https://doi.org/10.3923/ajpsaj.2014.106.114
HEJDYSZ M., KACZMAREK S.A., RUTKOWSKI A., (2016). Extrusion cooking improves the metabolisable energy of faba beans and the amino acid digestibility in broilers. Animal Feed Science and Technology, 212: 100–111. doi:10.1016/j.anifeedsci.2015.12.008
HENCHION M., MCCARTHY M., RESCONI V.C., DECLAN T., 2014. Meat consumption: Trends and quality matters. Meat Science; 98(3): 561–568.
HEO J.M., PLUSKE, J., KIM J.C., HAMPSON D.J., 2018. Gastrointestinal health and function in weaned pigs : A review of feeding strategies to control post-weaning diarrhoea without using in-feed antimicrobial compounds. J. of Animal Physiol. and Animal Nutrition, 97(2): 207-237. https://doi.org/10.1111/j.1439-0396.2012.01284.x
HONG D., BURROWS H., ADEOLA O., 2002. Addition of enzyme to starter and grower diets for duks. Poultry Science, 81: 1842-1849.
HONG D., BURROWS H., ADEOLA O., 2002. Addition of enzyme to starter and grower diets for duks. Poultry Science, 81: 1842-1849.
HOSOI T., AMETANI A., KIUCHI K., KAMINOGAWA S., 2011. Improved growth and viability of lactobacilli in the presence of Bacillus subtilis (natto), catalase, or subtilisin. Can. J. Microbiol., 46(10): 892-897. https://doi.org/10.1139/w00-070
HU Y., DUN Y., LI S., ZHAO S., PENG N., LIANG Y., 2014. Effects of Bacillus subtilis kn-42 on growth performance, diarrhea and faecal bacterial flora of weaned piglets. Asian-Australasian J. Anim. Sci., 27(8): 1131–1140. https://doi.org/10.5713/ajas.2013.13737
HUMER E., SCHWARZ C., SCHEDLE K., 2015. Phytate in pig and poultry nutrition. Journal Anim. Physiol Anim. Nutrition. Sursă: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25405653.
INBORR J., 1989. The use of oligosaccarides in broiler diets. Proc. of 12-th European Symp. On Poultry Nutrition, Veldhoven, NL.
JEON H.L., YANG S.J., SON S.H., KIM W.S., LEE N.K., PAIK H.D., 2018. Evaluation of probiotic Bacillus subtilis P229 isolated from cheonggukjang and its application in soybean fermentation. Lwt, 97: 94–99. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.06.05
JONGBLOED A.W., 2003. The impact of nutrition of environmental pollution by pigs. III
JUNGJ.H., LEE M.Y., CHANG H.C., 2012. Evaluation of the probiotic potential of Bacillus polyfermenticus CJ6 isolated from meju, a Korean soybean fermentation starter. J. Microbiol., 22(11): 1510-1517. Biotechnol. https://doi.org/10.4014/jmb.1205.05049
JURCOANE Ș., 2000. Biotehnologii. Fundamentale. Bioreactoare. Enzime. Editura Tehnică, București.
JURCOANE Ș., SĂSĂRMAN E., ROȘU A., BANU A., LUPESCU I. și col., 2009. Tratat de biotehnologie. Editura Tehnică, I, 19-21: 25-27, Bucuresti.
KERR BRIAN J., SHURSON G.C., 2013. Strategies to improve fiber utilization in swine. Journal of Animal Science and Biotechnology, 4(1), USA.
KIARIE E., NYACHOTI C.M., SLOMINSKI BA., BLANK G., 2007. Growth performance, gastrointestinal microbial activity, and nutrient digestibility in early-weaned swine fed diets containing flaxseed and carbohydrase enzyme. J. Anim. Science, 85: 2982-2993.
KIARIE E., WALSH M.C., NYACHOTI C.M., 2016. Performance, digestive function, and mucosal responses to selected feed additives for pigs. J. Anim. Sci., 94(3): 169–180. https://doi.org/10.2527/jas2015-9835
KIZERWETTER-ŚWIDA M., BINEK M., 2016. Assessment of potentially probiotic properties of Lactobacillus strains isolated from chickens. Pol. J. Vet. Sci., 19(1): 15–20. https://doi.org/10.1515/pjvs-2016-0003
KNOWLTON K.F., TAYLOR M.S., HILL S.R., COBB C., WILSON K.F., 2007. Manure nutrient excretion by lactating cows fed exogenous phytase and cellulase. J. Dairy Science, 90: 4356-4360.
KOGAN G., KOCHER A., 2007. Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health protection. Livest. Sci., 109(1-3): 161–165. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2007.01.134
LACEY J.A., STANLEY D., KEYBURN A.L., FORD M., CHEN H., JOHANESEN P., LYRAS D., MOORE R.J., 2018. Clostridium perfringens-mediated necrotic enteritis is not influenced by the pre-existing microbiota but is promoted by large changes in the post-challenge microbiota. Vet. Microbiol., 227: 119-126. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.10.022
LEESON S., SUMMERS J.D., 1997. Commercial Poultry Nutrition. 2nd Edition. University Books, Guelph, Ontario, 13-96, Canada.
LEI X., PIAO X., RU Y., ZHANG HONGYU, PÉRON A., ZHANG HUIFANG, 2015. Effect of Bacillus amyloliquefaciens-based direct-fed microbial on performance, nutrient utilization, intestinal morphology and cecal microflora in broiler chickens. Asian-Australasian J. Anim. Sci., 28(2): 239-246. https://doi.org/10.5713/ajas.14.0330
LEI Y., KIM I.H., 2014. Effect of Phaffia rhodozyma on performance, nutrient digestibility, blood characteristics, and meat quality in finishing pigs. J. Anim. Sci., 92(1): 171-176. https://doi.org/10.2527/jas.2013-6749
LI Y., XU Q., HUANG Z., LV L., LIU X., YIN C., YAN H., YUAN J., 2016. Effect of Bacillus subtilis CGMCC 1.1086 on the growth performance and intestinal microbiota of broilers. J. Appl., 120(1): 195-204. Microbiol. 120, 195–204. https://doi.org/10.1111/jam.12972
LIAO S.F., NYACHOTI M., 2017. Using probiotics to improve swine gut health and nutrient utilization. Anim. Nutr., 3(4): 331-343. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.06.007
LIU P., ZHAO J., GUO P., LU W., GENG Z., LEVESQUE C.L., JOHNSTON L.J., WANG C., LIU L., ZHANG J., MA N., QIAO S., MA X., 2017. Dietary corn bran fermented by Bacillus subtilis MA139 decreased gut cellulolytic bacteria and microbiota diversity in finishing pigs. Front. Cell. Infect. Microbiol., 7: 1–9. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017.00526
LIU W.C., YE M., LIAO J.H., ZHAO Z.H., KIM I.H., AN L.L., 2018. Application of Complex Probiotics in Swine Nutrition – A Review. Ann. Anim. Sci., 18: 335–350. https://doi.org/10.2478/aoas-2018-0005
LIU Y., ESPINOSA C.D., ABELILLA J.J., CASAS G.A., LAGOS L.V., LEE S.A., KWON W.B., MATHAI J.K., NAVARRO D.M.D.L., JAWORSKI N.W., STEIN H.H., 2018. Non-antibiotic feed additives in diets for pigs: A review. Anim. Nutr., 4: 113–125. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2018.01.007
LYONS TP., JACQUES KA., 2004. Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industries Alltech. Simpozionul al XX-lea, Editura Nottingham University, Content Pig Science, 121-131, SUA.
MAGHSOODI V., KAZEMI A., NAHID P., YAGHMAEI S., SABZEVARI M.A., 2013. Alkaline protease production by immobilized cells using B. licheniformis. Sci. Iranica, 20(3): 607–610. https://doi.org/10.1016/j.scient.2013.01.007
MANHAR A.K., BASHIR Y., SAIKIA D., NATH D., GUPTA K., KONWAR B.K., KUMAR R., NAMSA N.D., MANDAL M., 2016. Cellulolytic potential of probiotic Bacillus Subtilis AMS6 isolated from traditional fermented soybean (Churpi): An in-vitro study with regards to application as an animal feed additive. Microbiol. Res., 186–187: 62–70. https://doi.org/10.1016/j.micres.2016.03.004
MANIVASAGAN P., VENKATESAN J., SIVAKUMAR K., KIM S.K., 2013. Production, characterization and antioxidant potential of protease from Streptomyces sp. MAB18 using poultry wastes. Biomed Res. Int., 1-12. https://doi.org/10.1155/2013/496586
MARINESCU A., GHEORGHE M., MIHĂILESCU C., BĂDUCU N., 1977. Aditivi furajeri. Ed. Ministerul industriei chimice I.P.A.C., București.
MARKOWIAK P., ŚLIZEWSKA K., 2018. The role of probiotics, prebiotics and synbiotics in animal nutrition. Gut Pathog., 10(1): 0–20. https://doi.org/10.1186/s13099-018-0250-0
MARȚI R., RADU – RUSU R.M, 2012. Micotoxinele que vadis? Editura Biomin, 54-57, Austria.
MATEI F., 2011. Microbiologie aplicată. Ed. Printech, 71, București.
MAZANKO M.S., GORLOV I.F., PRAZDNOVA E.V., MAKARENKO M.S., USATOV A.V., BREN A.B., CHISTYAKOV V.A., TUTELYAN A.V., KOMAROVA Z.B., MOSOLOVA N.I., PILIPENKO D.N., KROTOVA O.E., STRUK A.N., LIN A., CHIKINDAS M.L., 2018. Bacillus probiotic supplementations improve laying performance, egg quality, hatching of laying hens, and sperm quality of roosters. Probiotics Antimicrob. Proteins, 10(2): 367–373. https://doi.org/10.1007/s12602-017-9369-4
MEIMANDIPOUR A., SHUHAIMI M., HAIR-BEJO M., AZHAR K., KABEIR B.M., RASTI B., YAZID A.M., 2009. In vitro fermentation of broiler cecal content: The role of lactobacilli and pH value on the composition of microbiota and end products fermentation. Lett. Appl. Microbiol., 49(4): 415-420. https://doi.org/10.1111/j.1472-765X.2009.02674.x
MERCHANT H.A., MCCONNELL E.L., LIU F., RAMASWAMY C., KULKARNI R.P., BASIT A.W., MURDAN S., 2011. Assessment of gastrointestinal pH, fluid and lymphoid tissue in the guinea pig, rabbit and pig, and implications for their use in drug development. Eur. J. Pharm. Sci., 42(1-2): 3-10. https://doi.org/10.1016/j.ejps.2010.09.019
MILES R.D., 2002. Utilizarea enzimelor furajere în nutriția și alimentația păsărilor. Ghid practic de nutriția păsărilor. Ed. Ceres, București.
MOHKAM M., RASOUL-AMINI S., SHOKRI D., BERENJIAN A., RAHIMI F., SADRAEIAN M., KHALVATI B., GHOLAMI A., GHASEMI Y., 2016. Characterization and in vitro probiotic assessment of potential indigenous Bacillus strains isolated from soil rhizosphere. Minerva Biotecnol., 28(1): 29-32.
MORGAN A., BEDFORD M., 1995. Advances in the development and application of feed enzymes. Australian Poultry Science Symposium 7: 109-115.
MORGAN N.K., WALK C.L., BEDFORD M.R., BURTON E.J., 2014. The effect of dietary calcium inclusion on broiler gastrointestinal pH: Quantification and method optimization. Poult. Sci., 93(2): 354–363. https://doi.org/10.3382/ps.2013-03305
MOUNTZOURIS K.C., TSIRTSIKOS P., KALAMARA E., NITSCH S., SCHATZMAYR G., FEGEROS K., 2007. Evaluation of the efficacy of a probiotic containing Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, and Pediococcus strains in promoting broiler performance and modulating cecal microflora composition and metabolic activities. Poult. Sci., 86(2): 309–317. https://doi.org/86/2/309 [pii]
MOUNTZOURIS K.C., TSITRSIKOS P., PALAMIDI I., ARVANITI A., MOHNL M., SCHATZMAYR G., FEGEROS K., 2010. Effects of probiotic inclusion levels in broiler nutrition on growth performance, nutrient digestibility, plasma immunoglobulins, and cecal microflora composition. Poult. Sci., 89(1): 58–67. https://doi.org/10.3382/ps.2009-00308
N. GOURNIER-CHATEAU J.P., LARPENT M.I., CASTELLANOS J.L. LARPENT, 1994, Les probiotiques en alimentation animale et humaine. Capitol 1: La microflore intestinale et son role.
NALLE C.L., RAVINDRAN V., RAVINDRAN G., 2010. Nutritional value of faba beans (Vicia faba L.) for broilers: Apparent metabolisable energy, ileal amino acid digestibility and production performance. Anim. Feed Sci. Technol., 156(3-4): 104–111. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2010.01.010
NATARAJASEENIVASAN K., GANESH M., ANBARASU K., KANAGAVEL M., VANITHAMANI S., ABDHUL K., SHANMUGHAPRIYA S., 2015. Bacteriocinogenic potential of a probiotic strain Bacillus coagulans [BDU3] from Ngari. Int. J. Biol. Macromol., 79: 800–806. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2015.06.005
NGUYEN Q.D., REZESSY-SZABO J.M., CLAEYSSENS M., STALS I., HOSCHKE A., 2002. Purification and characterisation of amylolytic enzymes from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus strain ATCC 34626. Enzimes Microbial Technol., 31(3): 345-352.
NITHYA V., HALAMI P.M., 2013. Evaluation of the probiotic characteristics of Bacillus species isolated from different food sources. Ann. Microbiol., 63(1): 129–137. https://doi.org/10.1007/s13213-012-0453-4
NORTEY T.N., PATIENCE J.F., SIMMINS P H., TROTTIER N.L., ZIJLSTRA R.T., 2007. Effects of individual or combined xylanase and phytase supplementation on energy, aminoacid, and phosphorus digestibility and growth performance of grower swine fed wheat-based diets containing wheat. J. Anim. Science, 85: 1432-1443.
NYANNOR E.K., WILLIAMS P., BEDFORD M.R., ADEOLA O., 2009. Corn expressing an Escherichia coli-derived phytase gene: A proff-of-concept nutritional study in pigs. Journal of Animal Science, 85: 1946-1952.
O’NEILL H.V.M., SMITH J.A., BEDFORD M.R., 2014. Multicarbohydrase enzymes for non-ruminants. Asian-Australasian J. Anim. Sci., 27(2): 290–301. https://doi.org/10.5713/ajas.2013.13261
OAKLEY B.B., LILLEHOJ H.S., KOGUT M.H., KIM W.K., MAURER J.J., PEDROSO A., LEE M.D., COLLETT S.R., JOHNSON T.J., COX N.A., 2014. The chicken gastrointestinal microbiome. FEMS Microbiol. Lett., 360(2): 100-112. https://doi.org/10.1111/1574-6968.12608
OLUKOSI O.A., BEDFORD M.R., ADEOLA O., 2007a. Xylanase in diets for growing swine and broiler chicks. Can. J. Anim. Science, 87: 227-235.
OLUKOSI O.A., COWIESON A.J., ADEOLA O., 2007B. Age-related influence of a cocktail of xylanase, amylase, and protease or phytase individually or in combination in broilers. Poult. Science, 86: 77.
OLUKOSI O.A., COWIESON A.J., ADEOLA O., 2008. Energy utilization and growth performance of broilers receiving diets supplemented with enzymes containing carbohydrase or phytase activity individually or in combination. Br. J. Nutr., 99: 682-690.
OWUSU-ASIEDU A., SIMMINS P.H., BRUFAU J., LIZARDO R., PÉRON A., 2010. Effect of xylanase and β-glucanase on growth performance and nutrient digestibility in piglets fed wheat-barley-based diets. Livest. Sci.,134(1): 76–78. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2010.06.102
PANĂ C.O., 2000. Biotehnologii în nutriția și alimentația animalelor. Editura Coral Sanivet-București.
PANT G., PRAKASH A., PAVANI J.V.P., BERA S., DEVIRAM G.V.N.S., KUMAR A., PANCHPURI M., PRASUNA R.G., 2015. Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. J. Taibah Univ. Sci., 9(1): 50–55. https://doi.org/10.1016/j.jtusci.2014.04.010
PEIXOTO S.C., JORGE J.A., TERENZI H.F., POLIZELI M.L.T.M., 2003. Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis: a thermotolerant fungus with potential for production of thermostable amylases. Int. Microbiol., 6(4): 269-273.
PELCZAR M.J., CHAN E.C.S., 1981. Éléments de microbiologie. Traduit et adapté par J. Fontaine, Éditions I RW Ltee, Montreal, 515, Canada.
PLUSKE J., 2017. Invited review : Aspects of gastrointestinal tract growth and maturation in the pre- and postweaning period of pigs. J. of Animal Science, 94(3): 399–411. https://doi.org/10.2527/jas2015-9767
PLUSKE J.R., 2013. Feed- and feed additives-related aspects of gut health and development in weanling pigs. J. Anim. Sci., 4(1): 1-7. Biotechnol. https://doi.org/10.1186/2049-1891-4-1
PLUSKE J.R., TURPIN D.L., KIM J.C., 2018. Gastrointestinal tract (gut) health in the young pig. Anim. Nutr., 4(2): 187–196. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2017.12.004
POINTILLART A., 1993. Phytates, phytases: leur importance dans l’alimentation des monogastrique. Le Point Veterinaire, 25(157): 877-884.
POP I.M., 1997. Biotehnologii în alimentația animalelor, Iași.
POP I.M., 2002 „Aditivi furajeri”, Ed. Pim-Iași.
POP I.M., 2006. Aditivi furajeri. Ed. Tipo Moldova, Iași.
RADA V., MAROUNEK M., RYCHLÝ I., ŠANTRŮČKOVÁ D V.K., 1995. Effect of Lactobacillus salivarius administration on microflora in the crop and caeca of broiler chickens. J. Anim. Feed Sci., 4(2): 161–170. https://doi.org/10.22358/jafs/69790/1995
RAICU, 1990. Biotehnologii moderne. Ed. Tehnică, București.
RAVINDRAN V., CABAHUG, S., RAVINDRAN G., BRYDEN W.L., 1999. Infuence of microbial phytase on apparent ileal amino acid digestibility of feedstuffs for broilers. Poult. Science, 78: 699-706.
REIS M.P., FASSANI E.J., GARCIA A.A.P., RODRIGUES P.B., BERTECHINI A.G., BARRETT N., PERSIA M.E., SCHMIDT C.J., 2017. Effect of Bacillus subtilis (DSM 17299) on performance, digestibility, intestine morphology, and pH in broiler chickens. J. Appl. Poult. Res., 26(4): 573–583. https://doi.org/10.3382/japr/pfx032
RICCIARDI M., 2010. Meet Enviropig – a cleaner, greener transgenic pig. Sursă: http://planetsave.com/2010/09/06/meet-enviropig-a-cleaner-greener-transgenic-pig/.
RITTER A.C., PAULA A., CORREA F., VERAS F.F., BRANDELLI A., 2018. Characterization of Bacillus subtilis available as probiotics. J. of Microbiology Research, 8(2): 23-32. https://doi.org/10.5923/j.microbiology.20180802.01
Rosen G.D., 2000. Feed Additive Nomenclature. Poultry Int., vol. 35, nr. 5.
SAINT-CYR M.J., HADDAD N., TAMINIAU B., POEZEVARA T., QUESNE S., AMELOT M., DAUBE G., CHEMALY M., DOUSSET X., GUYARD-NICODÈME M., 2017. Use of the potential probiotic strain Lactobacillus salivarius SMXD51 to control Campylobacter jejuni in broilers. Int. J. Food Microbiol., 247: 9–17. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.07.003
SAMANI M.C., AMIN L. ȘI REZALI N.I., 2011. Using media to educate public on biotechnology. Malaysia. Sursă: www.sciencedirect.com.
SANDERS M.E., MORELLI L., TOMPKINS T.A., 2003. Sporeformers as Human Probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 2(3): 101–110. https://doi.org/10.1111/j.1541-4337.2003.tb00017.x
SASSON A., 1983. Biotehnologiile, sfidare si promisiuni. Ed. Tehnica, 139-182, București.
SCRIPNIC I., 2003. Influența preparatelor enzimatice Porzyme tp 100 și Porzyme 9300 asupra digestibilității și utilizării substanțelor nutritive la tineretul suin. Ed. Punct. Lucrările Simpozionului Institutului de Biologie și Nutriție Animală, Balotești.
ȘEKER E., 2010. Identification of Candida species isolated from bovine mastitic milk and their in vitro hemolytic activity in western Turkey. Mycopathologia, 164(4): 303-304. https://doi.org/10.1007/s11046-009-9255-z
SELLE P.H., COWIESON A.J., RAVINDRAN V., 2009. Consequences of calcium interactions with phytate and phytase for poultry and pigs. Livestock Science, 124(1-3): 126-141.
SELLE P.H., COWIESON A.J., RAVINDRAN V., 2009. Consequences of calcium interactions with phytate and phytase for poultry and pigs. Livest. Sci., 124(1-3): 126-141. https://doi.org/10.1016/j.livsci.2009.01.006
SELLE P.H., RAVINDRAN V., 2007. Microbial phytase in poultry nutrition. Animal Feed Science and Technology, 135(1-2): 1-41.
SELLE P.H., RAVINDRAN V., 2008. Phytate –degrading enzymes in pig nutrition. Livestock Science, 113(2-3): 99-122.
SELLE P.H., WALKER A.R., BRYDEN W.L., 2003. Total and phytate-phosphorus contents and phytase activity of Australian-sourced feed ingredients for swine and poultry. Aust. J. Exp. Agric., 43(5): 475-479.
SHOKRYAZDAN P., SIEO, C.C., KALAVATHY R., LIANG J.B., ALITHEEN N.B., FASELEH JAHROMI M., HO Y.W., 2014. Probiotic potential of Lactobacillus strains with antimicrobial activity against some human pathogenic strains. Biomed Res. Int., 1-16. https://doi.org/10.1155/2014/927268
SINGH V., SHARMA R., & SHARMA P., 2015. Isolation , screening and optimization of amylase producing Bacillus sp . from soil. Asian Pac. J. Heal. Sci., 2(3): 86–93.
SONGER J., UZAL F.,2005. Clostridial enteric infections in pigs. J. Vet. diagnostic Investig., 17(6): 528–536.
SORESCU I., DUMITRU M., CIURESCU G., 2019a. Lactobacillus spp. and Enterococcus faecium strains isolation, identification, preservation and quantitative determinations from turkey gut content. Rom. Biotechnol. Lett., 24(1): 41–49. https://doi.org/10.25083/rbl/24.1/41.49
SOROKULOVA I.B., PINCHUK I.V., DENAYROLLES M., OSIPOVA I.G., HUANG J.M., CUTTING S.M., URDACI M.C., 2008. The safety of two Bacillus probiotic strains for human use. Dig. Dis. Sci., 53(4): 954-63. https://doi.org/10.1007/s10620-007-9959-1
STELLA A.E., OLIVEIRA M.C. DE, FONTANA V.L.D. DA S., MALUTA R.P., BORGES C.A., ÁVILA F.A., 2016. Characterization and antimicrobial resistance patterns of Escherichia coli isolated from feces of healthy broiler chickens. Arq. Inst. Biol. (Sao. Paulo)., 83: 1–5. https://doi.org/10.1590/1808-1657000392014
SUDIPTA K.M., 2010. Screening of substrates for protease production from Bacillus Licheniformis. I. J. of Engineering Science and Technology, 2(11): 6550-6554.
SWAIN M.R., KAR S., PADMAJA G., RAY R.C., 2006. Partial characterization and optimization of production of extracellular α-amylase from Bacillus subtilis isolated from culturable cow dung microflora. Polish J. Microbiol., 55(4): 289–296.
TABUC C., DUMITRU M., GHEORGHE A., 2016. Evaluarea unui biopreparat pe baza de microorganisme vii privind reducerea gradului de poluare microbiologică din halele de creștere a broilerilor. Arhiva Zotehnică, 31: 79–86.
TAHIR M., SALEH F., AMJED M., OHTSUKA A., HAYASHI K., 2005. Synergistic effect of cellulase and hemicellulase on nutrient utilization and performance in broilers fed a corn–soybean meal diet. J. of Animal Science, 76(6): 559–565.
THI H., NHI H., HUONG N.T., 2016. Examining some probiotics activities of Bacillus subtilis Natto. IJMER, 6(5): 33–37.
THORPE J., BEAL J.D., 2001. Vegetable protein meals and the effects of enzymes. In Bedford. M. R., Partridge, G. G. Ed. Enzymes in farm nutrition. CAB international, 125-144.
TORRES-PITARCH A., HERMANS D., MANZANILLA E.G., BINDELLE J., EVERAERT N., BECKERS Y., TORRALLARDONA D., BRUGGEMAN G., GARDINER G.E., LAWLOR P.G., 2017. Effect of feed enzymes on digestibility and growth in weaned pigs: A systematic review and meta-analysis. Anim. Feed Sci. Technol., 233: 145–159. https://doi.org/10.1016/j.anifeedsci.2017.04.02
VAHJEN W., OSSWALD T., SCHÄFER K., SIMON O., 2007. Comparison of a xylanase and a complex of non starch polysaccharide-degrading enzymes with regard to performance and bacterial metabolism in weaned piglets. Arch. Anim. Nutr., 61(2): 90-102.
VAZQUEZ A.P., 2016. Bacillus species are Superior Probiotic Feed-Additives for Poultry. J. Bacteriol. Mycol. Open Access 2: 57–59. https://doi.org/10.15406/jbmoa.2016.02.00023
VLADU S., TOMULESCU C., PETRESCU M., 2017. Antimicrobial activity of newly isolated Bacillus sp. and Pseudomonas sp. Strains and their potential use as biocontrol agents. Scientific Buletin, series F. Biotechnologies, 21: 81–86.
YADAV MANOJ, DUBEY M., YADAV MAOUSAMI, SHANKAR K.S., 2018. Effect of Supplementation of Probiotic (Bacillus subtilis) on Growth Performance and Carcass Traits of Broiler Chickens. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci., 7: 4840–4849. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2018.708.510
YIN Y.L., MCEVOY J.D.G., SCHULZE H., HENNIG U., SOUFFRANT W.B., MCCRACKEN K.J., 2000. Apparent digestibility (ileal and overall) of nutrients and endogenous nitrogen losses in growing swine fed wheat (var. Soissons) or its by-products without or with xylanase supplementation. Livest. Prod. Science, 62(2): 119-132.
YUAN L., CHANG J., YIN Q., LU M., DI Y., WANG P., WANG Z., WANG E., LU F., 2017. Fermented soybean meal improves the growth performance, nutrient digestibility, and microbial flora in piglets. Anim. Nutr., 3: 19–24. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2016.11.003
ZHANG G.G., YANG Z.B., WANG Y., YANG W.R., ZHOU H.J., 2014. Effects of dietary supplementation of multi-enzyme on growth performance, nutrient digestibility, small intestinal digestive enzyme activities, and large intestinal selected microbiota in weanling pigs. J. Anim. Sci., 92(5): 2063-2069. https://doi.org/10.2527/jas.2013-6672
ZHANG Z., KORNEGAY E.T., 1999. Phytase effects on ileal amino acid digestibility and nitrogen balance in finishing pigs fed a low-protein plant-based diet. J. Anim. Science, 77 (1): 175.
ZULKIFLI I., ABDULLAH N., MOHD AZRIN N., HO Y.W., 2000. Growth performance and immune response of two commercial broiler strains fed diets containing Lactobacillus cultures and oxytetracycline under heat stress conditions. Br. Poult. Sci., 41(5): 593-597. https://doi.org/10.1080/713654979
ZUO J., LING B., LONG L., LI T., LAHAYE L., YANG C., FENG D., 2015. Effect of dietary supplementation with protease on growth performance, nutrient digestibility, intestinal morphology, digestive enzymes and gene expression of weaned piglets. Anim. Nutr., 1(4): 276–282. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2015.10.003
WEBOGRAFIE
http://www.meat-milk.ro/cum-au-evolut-productia-si-consumul-de-carne-in-2015
http://www.f.waseda.jp/sidoli/STS_Intro_10.pdf
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK207446/pdf/Bookshelf_NBK207446.pdf
http://www.biotehnologii.usamv.ro/images/pdf/Biotehnologie_generala.pdf
https://en.wikipedia.org/wiki/Phytic_acid
www.agronext.iastate.edu/immag/pubs/phytase.doc
http://www.dce.gov.ro/info_business/sectoare/sectcarneprodcarne2012.pdf
www.lamolina.edu.pe./Enzymes%20in%20farm%20animal%20nutrition%202010
http://www.umfiasi.ro/masterate/Suporturi%20de%20curs/Facultatea%20de%20Bioinginerie/Echipamente%20speciale%20in%20biotehnologie%20%20curs%20master.pf
https://www.academia.edu/35470474/Ross_308_Broiler_PO_2014_EN, Broiler Management Guide, 2014.
Anexa I
LISTĂ TABELE DIN TEZĂ
LISTĂ FIGURI ȘI FOTOGRAFII DIN TEZĂ
Anexa II
Materialele, reactivii chimici și mediile de cultură utilizate pentru analizarea in vitro a tulpinilor bacteriene (Bacillus subtilis ATCC 6051a și Bacillus licheniformis ATCC 21424) în vederea administrării ca preparat enzimatic exogen sunt prezentate în Tab. 1 și Tab. 2.
Tab. 1. Materiale, reactivi chimici și medii de cultură
Table 1. Materials, chemical reagents and culture media
Tab. 2. Compoziția mediilor de cultură
Table 2. Compositions of cultures medium
Tab. 3. Aparatură de laborator
Table 3. Lab equipments
LISTA DE PUBLICAȚII
Contribuția științifică personală adusă la dezvoltarea domeniului ,,Nutriție Animală și Biotehnologie” este reflectată, până în prezent, de următoarele articole publicate in extenso și participări științifice:
Articole in extenso:
DUMITRU M., HĂBEANU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2019. Bacillus subtilis probiotic: an alternative to antibiotics for monogastric animal nutrition. Articol trimis spre publicare, Bulletin of the University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Animal Science and Biotechnologies Cluj-Napoca.
SORESCU I., DUMITRU M., CIURESCU G., 2019. Lactobacillus spp. strains isolation, identification, preservation and quantitative determinations from gut content of 26 days old chickens. Romanian Biotechnological Letter, articol trimis în curs de publicare.
SORESCU I., DUMITRU M., CIURESCU G., 2019. Lactobacillus spp. and Enterococcus faecium strains isolation, identification, preservation and quantitative determinations from turkey gut content. Rom Biotechnol Lett., 24(1): 41-49.
GHEORGHE A., HĂBEANU M., A. LEFTER N., DUMITRU M., GRIGORE D.M., 2019. Aspects of plasma biochemistry and intestinal health of weaned piglets fed dietary extruded linseed and walnut meal mixture. 46 (1): 147-153.
DUMITRU M., SORESCU I., HABEANU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2019. Preliminary characterization in vitro of Bacillus licheniformis strain for used as a dietary probiotic. The International Conference of the University of Agronomic Science and Veterinary Medecine of Bucharest, ,,Agriculture For Life, Life For Agriculture”, Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, 23: ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364.
DUMITRU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2018. Obtaining a feed additive based of Lactobacillus plantarum strain. Scientific papers, Series A. Agronomy, 61(2): 115-122.
DUMITRU M., SORESCU I., HĂBEANU M., TABUC C., IDRICEANU L., JURCOANE Ș., 2018. Preliminary characterisation of Bacillus subtilis strain use as dietary probiotic bio-additive in weaning piglet. J. Food and Feed Research, 45 (2): 203-211. Novi Sad, Serbia, 23-25 octombrie, prezentare poster.
DUMITRU M., TABUC C., SORESCU I., VASILACHI A., HĂBEANU M., PETRE S., JURCOANE Ș., 2018. Researches concerning the level of fermentable sugars from feed materials in relation with cellulase hydrolysis by carbohydrase enzyme. Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, 22: ISSN 2285-1364, CD-ROM ISSN 2285-5521, ISSN Online 2285-1372, ISSN-L 2285-1364, section Industrial and Environmental. Biotechnology, pag. 205-208. Simpozionul International ,,Research and Education in an Innovation Era”, Arad, 17-20 mai, prezentare poster.
DUMITRU M., JURCOANE Ș., 2017. Researches concerning the enzymatic action of byproduct grapes. Scientific bulletin, series f, Biotechnologies, 21: 206-209. The International Conference of the University of Agronomic Science and Veterinary Medecine of Bucharest, ,,Agriculture For Life, Life For Agriculture”, 8-10 iunie, prezentare poster.
GHEORGHE A., HĂBEANU M., TABUC C., DUMITRU M., LEFTER N.A., 2017. Blood parameters, digestive organ size and intestinal microflora of broiler chicks fed sorghum as partial substitute of corn. Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 74(2): 162-168, Cluj.
DUMITRU M., SORESCU I., JURCOANE Ș., CÂMPEANU G., TABUC C., HĂBEANU M., 2017. Assessing of morphological, cultural, biochemical profile and enzymatic activity of a Lactobacillus paracasei CCM 1837 Strain. Academy of Romanian Scientists Annals Series on Biological Sciences,6(2): 22-31.
HABEANU M., NICOLETA LEFTER N.A., GHEORGHE A., TABUC C., DUMITRU M., CIURESCU G., PALADE M., 2017. Effects of dietary peas mixed with linseed (3:1) on the growth performance, enteritis and certain serum parameter in weaned piglets. Food and Feed Research, 44 (2): 173-180.
DUMITRU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2016. Evaluarea activității enzimatice a unor specii bacteriene utilizate în biopreparate enzimatice pentru hrana animalelor. Analele IBNA Balotești, 31: 93-101.
TABUC C., MIHAELA DUMITRU M., GHEORGHE A., 2016. Evaluarea unui biopreparat pe bază de microorganisme vii privind reducerea gradului de poluare microbiologică din halele de creștere a broilerilor. Analele IBNA, 31: 79-86.
HĂBEANU M., TABUC C., GHEORGHE A., ROPOTA M., DUMITRU M., CĂLIN L., MIHALCEA T., PALADE M., 2016. Preliminary study on the interrelation between sow milk quality and litter performance in relation to their health. Revista Lucrări Științifice – Seria Zootehnie, 66: 35-40, Iași.
Lucrări de popularizare și asimilate
DUMITRU M., TABUC C., 2018. Aspecte privind utilizarea enzimelor în hrana monogastricelor. Revista ,,Lumea satului”, seria Zootehnie.
https://www.lumeasatului.ro/articole-revista/cresterea-animalelor/4487-aspecte-privind-utilizarea-enzimelor-in-hrana-monogastricelor.html.
TABUC C., DUMITRU M., HĂBEANU M., 2017. Cercetări privind influența unei monoculturi de Lactobacilus acidophilus asupra purceilor în criza de intarcare. Revista de Zootehnie, 14(3-4): 27-31.
Comunicări științifice:
DUMITRU M., HĂBEANU M., TABUC C., JURCOANE Ș., 2019. Bacillus subtilis probiotic: an alternative to antibiotics for monogastric animal nutrition. Comunicare poster, 18th International Conference Life Sciences for sustainable development, 26-28 septembrie 2019, USAMV-Cluj-Napoca, Romania. Prezentare poster.
DUMITRU M., SORESCU I., CIURESCU G., TABUC C., HĂBEANU M., CHELARU N.R., 2019. In vitro probiotic properties of a lactic acid bacteria isolated from a broiler chicken. Symposium "MODERN ANIMAL HUSBANDRY – FOOD SAFETY AND DURABLE DEVELOPMENT", 17-18 octombrie, Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iași. Prezentare poster.
CHELARU N.R., DUMITRU M., SORESCU I., HABEANU M., 2019. In vitro evaluation of probiotic properties of a lactic acid bacteria isolated from piglet. Symposium "MODERN ANIMAL HUSBANDRY – FOOD SAFETY AND DURABLE DEVELOPMENT", 17-18 octombrie, Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iași. Prezentare poster.
TÂRNOVEANU E., DUMITRU M., HĂBEANU M., 2019. Changes in the gut microbiota of broiler chickens after Lactobacillus sp. probiotic treatments. Symposium "MODERN ANIMAL HUSBANDRY – FOOD SAFETY AND DURABLE DEVELOPMENT", 17-18 octombrie, Faculty of Animal Sciences, University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iași. Prezentare poster.
DUMITRU M., HĂBEANU M., TABUC C., 2019. Bacillus licheniformis as feed additive: in vitro evaluation of potential probiotic in animal nutrition. 15th International Symposium of Animal Biology and Nutrition (IBNA Balotesti), 27 septembrie. Prezentare poster.
TABUC C., DUMITRU M., HĂBEANU M., 2019. Effects of bioaditive based on Lactobacillus strains in weaning piglets. ,,International Symposium of Mediterranean pig”, Florența (Italia), 16-19 octombrie. Prezentare poster.
DUMITRU M., HĂBEANU M., SORESCU I., TABUC C., 2019. Effects of Bacillus subtilis use as dietary probiotic in weaning piglets. ,,Congress of Biotechnology”, 11-13 aprilie, Valencia (Spania). Prezentare poster.
LEFTER N.A., HĂBEANU M., GHEORGHE A., DUMITRU M., TABUC C., IDRICEANU L., 2018. Certain serum and faecal parameters of weaned piglets fed millet grain (Panicum Miliaceum) diet. Book of Abstract, pag. 47, FoodTech Congress 23-25 Octombrie, Novisad (Serbia). Prezentare orală.
GHEORGHE A., HĂBEANU M., LEFTER NICOLETA A., DUMITRU M., GRIGORE D.M., 2018. Plasma Biochemistry and intestinal health of weaned piglets feed dietary extruded linseed and walnut meal mixture. Book of Abstract, pag. 38, 23-25 octombrie, Novi sad (Serbia). Prezentare poster.
CIURESCU G., SORESCU I., DUMITRU M., VASILACHI A., HĂBEANU M., 2018. Effect of cowpeas and probiotics on broiler chicks’ performance and gut microflora populations. Dubrovnick, 27-31 august. Book of Abstract. Prezentare poster.
GHEORGHE A., TABUC C., HĂBEANU M., DUMITRU M., LEFTER N.A., 2018. Effect of dietary supplementation with probiotic mixture based on Lactobacillus strains on performance, gastrointestinal development and ileal microflora in broilers. ,,Congress of Biotechnology”, 26-28 aprilie, Grecia. Prezentare poster.
TABUC C., DUMITRU M., CRISTE R.D., OLTEANU M, PANAITE T, 2018. Obtaining a biomass of Rodothorula glutinis enriched with Zinc. ,,Congress of Biotechnology”, 26-28 aprilie, Grecia. Prezentare poster.
DUMITRU M., JURCOANE Ș., TABUC C., HĂBEANU M., PETRE S., 2018. Researches concerning the fermentable sugars production from feed materials in relation with protein hydrolysis by proteolytic enzymes. Sesiunea Științifică de primăvară, 1(1): ISSN 2601-510. Volum de rezumate, 30 martie, Conferința Științifică al Academiei Oamenilor de Știință din România (AOSR), București. Prezentare orală.
DUMITRU M., SORESCU I., TABUC C., HĂBEANU M., JURCOANE Ș., CIURESCU G., 2017. Assessing the morphological, cultural, biochemical profile and enzymatic activity of a Lactobacillus acidophilus strain isolated from turkey ileum intestinal content. 14th International Symposium of Animal Biology and Nutrition (IBNA Balotesti) 28-29 septembrie. Prezentare orală.
DUMITRU M., SORESCU I., JURCOANE Ș., CÂMPEANU G., TABUC C., HĂBEANU M., 2017. Assessing of morphological, cultural, biochemical profile and enzymatic activity of a Lactobacillus paracasei CCM 1837 strain. Academy of Romanian Scientists (AOSR), Timisoara, 12-14 octombrie. Prezentare orală.
HĂBEANU M., GHEORGHE A., TABUC C., ROPOTĂ M., DUMITRU M., VASILACHI A., 2016. Interrelația dintre nutriția scroafelor de reproducție și performanțele purceilor. Simpozionul (Multiplier Event), "HRĂNIREA PE BAZE ȘTIINȚIFICE A ANIMALELOR DE FERMĂ", 16 decembrie, Balotești. Prezentare orală.
HĂBEANU M., TABUC C., GHEORGHE A., ROPOTA M., DUMITRU M., CĂLIN L., MIHALCEA T., PALADE M., 2016. Preliminary study on the interrelation between sow milk quality and litter performance in relation to their health. Simpozionul Științific Internațional „ZOOTEHNIA MODERNĂ – SIGURANȚĂ ALIMENTARĂ ȘI DEZVOLTARE DURABILĂ” 20 – 22 octombrie, Iași.
Stagii de pregătire și formare profesională:
Stagiu de pregătire privind metoda de microîncapsulare produs bacterian, Institutul de Științele Vieții (ISV) Regele Mihai I al României din cadrul Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară (USAMV) din Cluj, departamentul Biotehnologii fermentative, 13-17 mai 2019.
Certificat de participare: ,,Metodologii pentru estimarea valorii de ameliorare la ovine în conformitate cu procedurile recomandate de I.C.A.R.", 24-27 mai 2018.
Certificat de participare: INRA, 2018. 10 th International Symposium on the Nutrition of Herbivores, 02-07 septembrie 2018, Clermont Fernand (Franța).
Stagiu de pregătire în cadrul unui program de mobilitate STSM (Short Term Scientific Mission), având ca grup țintă tinerii cercetători. Acest program permite efectuarea unui stagiu de specializare într-una din instituțiile partenere, prin intermediul Proiectului European COST Action FA1401 – European network on the factors affecting the gastro-intestinal microbial balance and the impact on the health status of pigs – (PiGutNet), 01-31 martie 2017.
Certificat de participare: ,,Recent developments in genomics and current applications” by Associate Prof. Dr. Raluca Mateescu, University of Florida, 25 – 27 september 2017.
***
Depunere brevet
DUMITRU MIHAELA, HĂBEANU MIHAELA, LEFTER NICOLETA, SORESCU IONUȚ, TABUC CRISTINA, GHEORGHE ANCA, IDRICEANU LAVINIA, 2019. Nutreț combinat îmbunătățit prin adaos de aditiv zootehnic bacterian pentru purcei în criza de înțărcare.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Teza Full 2019 Final Forma 1, Dumitru M [307570] (ID: 307570)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.