Maria Cristina Bucur (fosta Mihaila) [307279]

UNIVERSITATEA BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator:

Conf. dr. Beatrice Mihaela Radu

Absolvent: [anonimizat] 2018

UNIVERSITATEA BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

ANALIZA HISTOPATOLOGICĂ A VASCULARIZATIEI GLIOBLASTOMULUI

Coordonatori:

Conf. dr. Beatrice Mihaela Radu

Absolvent: [anonimizat]:[anonimizat]: CLASIFICAREA HISTOLOGICĂ A TUMORILOR PRIMARE CELEBRALE

2.1 Astrocitomul………………………………………………………………………………

2.2 Glioblastomul…………………………………………………………………………….

2.3 Meningiomul……………………………………………………………………………..

CAPITOLUL III: ANGIOGENEZA SI NEOGENEZA VASCULARA A GLIOBLASTOMULUI

3.1 Modificari la nivelul vascularizatie glioblastomului evidentiate prin anatomopatologie

3.2 Modificari la nivelul vascularizatiei glioblastomului evidentiate prin radiologie

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL IV: MATERIALE ȘI METODE

3.1. Tehnica de realizare a preparatelor histologice………………………………….

3.2. Tehnica colorării………………………………………………………………………………

CAPITOLUL V: REZULTATE

CAPITOLUL VI: CONCLUZII…………………………………

BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………………………………..

Introducere

Cancerul este a doua cauză de mortalitate în Romania. Speranta de viata de la aflarea rezultatului depinde de stadiul in care se descopera tumora precum si tipul de cancer.

Printre cele mai agresive cancere cu un prognostic nefast indiferent de stadiul la care este descoperit este reprezentat de glioblastom.

Metodele de tratament chiar daca sunt combinate: neurochirurgie impreuna cu radioterapie si chimioterapia confera o [anonimizat]. Acesta este si principalul motiv pentru care cercetatorii isi canalizeaza eforturile pentru intelegerea mecanismelor tumorale de supravietuire si gasirea unor medicamente eficiente.

[anonimizat] o trasatura caracteristica distincta cu formarea de noi vase care ajuta la cresterea rapida a masei tumorale.

De multe ori pacientii mor datorita edemului cerebral care este datorat cresterii permeabilitatii barierei hematoencefalice de la niveul vascularizatiei glioblastomului.

Intelegerea vascularizatiei glioblastomului poate ajuta in gasirea de noi medicamente eficiente in tratarea acestui tip de cancer.

In elaborarea acestei lucrari am folosit preparate histologice din tesut tumoral uman la nivelul carora s-a analizat vascularizatia tumorala.

CAPITOLUL I: ALCATUIREA SISTEMULUI NERVOS CENTRAL

Celule sistemului nervos central

Sistemul nervos are rol de a detecta schimarile din mediul exterior si interior ca apoi impreuna cu sistemul endocrin sa ajute organismul sa faca fata la aceste schimbari. Celulele de la nivelul sistemului nervos sunt de doua tipuri: celulele gliale si celulele neuronale.

Celulele gliale se gasesc la nivelul sistemului nervos central in raport de 3 /1 si au rolul de susținere a neuronilor, de hrănire a acestora, de transmitere a influxului nervos, de digestie a resturilor neuronale (Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, et al., editors- Neuroscience. 2nd edition). Celulele gliale sau nevrogliile cum mai sunt numite sunt capabile de diviziune, spre deosebire de neuroni fiind de mai multe tipuri:

-astrocite

-oligodendroglie

-microglie

-celule ependimare

Toate aceste celule se gasesc in sistemul nervos central. Celulele gliale pot face parte si din sietemul nervos periferic :

-nevroglii satelite din ganglionii periferici

-celule Schwann

Figura 1.1A Major types of glial cells in the nervous system. (Image: Blausen.com staff / CC BY 3.0 via Commons.)

Astrocitele sunt celule în formă de stea, de mari dimensiuni care controlează mediul chimic din jurul neuronilor, fiind implicate în răspunsurile imune ale țesutului nervos. Sunt cele mai mari dintre nevroglii cu numeroase prelungiri și nucleu sferoidal situat central. Ele sunt unite prin joncțiuni de tip gap, formând astfel un sincițiu funcțional.

Astrocitele au numeroase roluri foarte importante pentru buna functionare a sistemului nervos central:

– izolator electric și reglarea transmiterii impulsurilor electrice în creier;

– suport metabolic

-suport pentru neuroni, fiind cele mai abundente celule care sunt asociate cu sinapsele neuronale;

-reglarea concentrației ionilor în spațiul extracelular

-realizarea barierei hematoencefalice;

-menținerea homeostaziei locale;

-repararea sistemului nervos și cicatrizare unei leziuni neuronale, celulele gliale reumplu spațiul ocupat de neuron, formând cicatricea glială

Figura 1.1B, coloratie GFAP care pune in evident prelingirile citoplasmatice, http://neuropathology-web.org/chapter1/chapter1bAstrocytes.html

Oligodendrogliile sunt de mai mici dimensiuni decat astrocitele cu prelungiri mai numeroase si mai scurte. Rolul lor este reprezentat de sintetizarea tecii de mielina.

Oligodendrogliile sunt prezente atat in substanta alba cat si in substanta cenusie. Prelungirile lor nu vin in contact cu capilarele, intre ele intrepunandu-se prelungirile lamelare ale astrocitelor.

Figura 1.1C, Oligodendroglial cells in white matter. Note the clear cytoplasm, http://neuropathology-web.org/chapter1/chapter1cOligodendroglia.html

Celulele ependimare sunt celule modificate cu microvili. Au proprietati de captusire a sistemului ventricular. Prelungirile celulelor ependimare se unesc cu cele ale astrocitelor, rezultand membrana limitanta interna. Celulele captusesc plexurile coroidale si intervin in formarea LCR. Au rol important in transport, realizat de celulele ependimare ale neurohormonilor si factori eliberatori si inhibitori – secretor, realizat de celuele secretoare.

Celulele Schwann au ca rol secretia mielinei la niveul sistemului nervos periferic astfel formand teaca Schwann. Intre doua astfel de celule se afla cate o strangulatie Ranvier. Rolul lor major este in conducerea impulsului nervos si in regenerarea periferica.

Celulele satelite se gasec la nivelul ganglionilor senzitivi unde formeaza capsule in jurul celulelor nervoase (neuroni) avand rol de protectie si de control al mediului chimic al acestora.

Celula neuronala este o celula speciala care este capabila sa primeasca si sa genereze semnale electrice formand adevarate circuite.

Neuronii se pot gasi la nivelul sistemului central care include si maduva spinarii dar si in periferie formand sistemul nervos autonom si somatic. O celula este constituita din corpul celular (soma), dendrite si axon. Cei mai multi neuroni primesc informatii prin intermediul dendritelor si trimit mai departe informatia prin semnal electric sau chimic prin termediul axonilor.

Figura 1.1D

Neuronii se impart dupa functia lor in neuroni senzitivi, motori sau neuroni de asociatie or dupa forma lor : unipolari, bipolari, multipolari sau purkinje.

Figura 1.1E

Neuronii sunt generati de celulele stem in timpul vietii intrauterine sau dezvoltatii neuronale din copilarie iar dupa acesta perioada mai pot fi generati la nivelul hipocampusului sau bulbului olfactiv.

1.2 Meningele

Meningele este format din trei membrane conjunctive care acopera encefalului și a măduvei spinării cu rol in special de protectie. Cele trei foite sunt : dura mater, arahnoida si pia mater.

Dura mater este o membrana fibroasa, putin extensibila si care adera stans la niveul oaselor craniului. Prezinta doua straturi care adapostesc sinusurile vonoase. La nivelul spinal constituie un tub al carui extremitate superioara se ataseaza la muchia gaurii occipitale mari si la fetele posterioare ale corpilor vertebrali C2, C3 precum si prin benzi fibroase la ligamentul longitudinal posterioar. Tubul dural se ingusteaza la marginea inferioara a vertebrei S2 (A . T. Ispas).

Arahnoida este o membrana subtire, avasculara care patrunde in santurile de pe suprafata emisferelor cerebrale.

De la nivelul arahnoidei pornesc prelungiri care patrund prin dura mater, sinusurile venoase formand vilozitatile arahnoidiene care contin lichid cefalorahidian. Aceste vilozitati se pot calcifica cu varsta, transformandu-se in granulatii arahoidiene S2 (A . T. Ispas).

Pia mater este o membrana vasculara, subtire, ce adera strans la suprafata creierului si care patrunde in toate santurile si fisurile. Pia mater participă la formarea plexurilor coroidiene care au rol în secreția lichidului cefalorahidian, cu rol trofic și de protecție mecanică.

.

1.3 Bariera hematoencefalica

Schimburile intre tesuturi si sange se desfasoara la nivelul capilarelor sanguine. Aceste sunt de trei tipuri la nivelul corpului uman: cele care au membrana bazala pe toata lungimea lor si nu prezinta fenestratii (piele si plamani), cele care au membrana bazala continuu dar prezinta pori (fenestratii) intre celulele endoteliale (la nivelul intestinal si a glandelor endocrine) si cea de a treia clasa cea la care membrana bazala este discontinua si exista si pori intre celulele endoteliale (ficat).

Bariera hematoencefalica este termenul folosit pentru a define proprietatile unice ale microvascularizatiei sistemului nervos central. Vasele sanguine sunt de tipul celor cu membrana bazala continu fara pori intre celulele endoteliale plus o serie de proprietati aditionale care ii confera functia de a selecta foarte riguros schimburile intre sistemul nervos si sange. (Zlokovic 2008;Daneman 2012).

Barierea hematoencefalica este formata din jonctiuni stranse intre celulele epiteliale, pericite si prelungirile astrocitelor (figura 1.3A).

Desi majoritatea regiunile cerebrale sunt vascularizate de capilare care intrunesc aceasta caracterizare exista si regiuni cu capilare care prezinte pori intre celulele endoteliale. Aceste zone se gasesc la nivelul glanda pineala, tavanul ventricolului III si IV, aceste zone avand un schimb intens de substante intre sange si SNC sau lichidul cefalorahidian si sange (figura 1.3B).

Figura 1.3A Figura 1.3B

http://fblt.cz/en/skripta/regulacni-mechanismy-2-nervova-regulace/12-likvor-hematoencefalicka-a-hematolikvorova-bariera

Membrana hematoencefalica este formata din celule capilare endoteliale, membrana bazala si celule murale. Celulele murale includ celulele musculare netede si pericitele. La bariera hematoencefalica mai participa si prelungirile astrocitelor.

Legatura stansa intre celulele endoteliale capilare este intrerupta pe anumite portiuni in cazul bolilor cu substrat inflamator, infectioas, parazitar, neurodegenerative, dar mai cu seama in metastazarea tumorilor secundare tumorilor primare sau in invazia locala a tumorilor primare.

Figura 3.1C, CNS Anticancer Drug Discovery and Development Conference White Paper, Neuro-Oncology 17(suppl 6):vi1-vi26 · September 2015

Bariera hematoencefalică, produce însă greutăți la administrarea medicamentelor necesare in tratarea bolilor neurologice asa incat cercetatorii au incercat sa gasearca solutii pentru a gasi o cale de administrare de medicamente care sa ocoleasca bariera hematoencefalica sau sa o modifice.

Majoritatea medicamentelor destinate SNC in practica medicala sunt liposolubile, de mici dimensiuni cu o medie de doar 400 Da. Din totalul de 6 000 de medicamente inregistrate pana in present doar 6% intrunesc cele doua criterii (William M Pardridge) si pot sa treaca bariera hematoencefalica.

Existenta unor transportori transmembranari la nivelul barierei hamatoencefalice a fost foarte evidenta atunci cand cerectatori au descoperit faptul ca celulele de la nivelul sistemului nervos central nu contin mARN pentru insulina si cu toate acestea sistemul nervos central are nevoie de insulin. Insulina care se gaseste la nivelul SNC provine din periferie si trebuie sa strabata bariera hematoencefalica pentru a ajunge la destinatie. Acum se stie clar ca mecanismul este via RMT prin intermediul unui receptor care se gaseste la nivelul barierei hematoencefalice. Sistemul RMT este important si pentru pasajul transferinei de la nivelul sangelui la nivelul SNC ; (Drug transport across the blood–brain barrier) .

Mecanismele prin care moleculele pot sa strabate bariera hematoencefalica au incercat sa fie elucidate pana acum s-a juns la conluzia ca moleculele pot strabate prin trei mecanisme principale (The Blood-Brain Barrier and Neurotherapeutics) :

-transportul mediat prin carausi (Carrier-mediated transporters =CMT)

-receptori transmembranari care mediaza transportul intracelular de la nivelul endotelial (Receptor-mediated transporters =RMT)

– transportor de eflux- ATP dependent (Active efflux transporters (AET)

Figura 3.1D, Yang Yi, I-Yun Hsieh, Xiaojia Huang, Jie Li, Wei Zhao, Glioblastoma Stem-Like Cells: Characteristics, Microenvironment, and Therapy

Sistemele CMT si AET de obicei transporta molecule de mici dimensiuni si sunt responsabile in general pentru transportul nutrientilor de la nivelul sangelui la nivelul sistemului nervos central.

Doar o mica parte din sitemul de transport prin CMT si AET este cunoscut (The Blood-Brain Barrier and Neurotherapeutics)

Moleculele de mari dimensiuni ca insulina, leptina si transferina folosesc calea de intrare via RMT. In plus anticorpi monoclonali peptidomimetici receptor specific folosesc aceeasi cale.

Aceasta cale de transport este cea mai promitatoare fiindca peptidele endogene sau anticorpii peptidomimetici pot fii folositi ca caii troiani sa transporte medicamente sau gene atasate de ei.

Cercetataorii au incercat gasirea unei cai de administrare care sa ocoleasca bariera hematoencefalica. Astfel s-a incercat de a administra transnazal medicamente la animalele de laborator. La nivelul mucoasei cornetului superior care reprezinta mucoasa olfactiva, de culoare galbuie, avand la om suprafata de 5 cm2 se gasesc neuroni bipolari (celule olfactive). Axonii celulelor olfactive formeaza nervul olfactiv care strabat lama ciuruita a osului etmoid si ajung la nivelul bulbul olfactiv de la nivelul SNC.

Daca medicamentele pot traversa epiteliul nasal si membrana arahnoida ajungand la nivelul celulelor bipolare atunci prin intermediul tractului olfactiv pot ajunge cu usurinta la nivelul SNC. Medicamente trebuie sa fie formate din molecule de mici dimensiuni si liposolubile ( Pardridge WM si Brightman MW).

Atunci cand a fost studiata aceasta calea de administrare de medicamente parea foarte atractiva, totusi au aparut multiple probleme pe parcurs. Experimentele s-au desfasutat pe rozatoare care au simtul oflactiv bine dezvoltat comparativ cu al omului, depinzand de acest pentru supravietuire . Nu este de mirare ca 50% din mucoasa epiteliala la rozatoare este reprezentata de regiunea olfactiva  comparativ cu 3 pana la 5% la oameni (Merkus P si Westin U).

CAPITOLUL II: CLASIFICAREA HISTOLOGICĂ A TUMORILOR PRIMARE CELEBRALE

2.1 Astrocitomul

Astrocitoamele de grad I si II constituie intre 25% si 30% dintre glioamele cerebrale fiindca o tumora care creste lent, cu caracter infiltrativ si cu tendinta de a forma cavitati mari sau pseudochisti (Adams).

Astrocitoamele sunt clasificate in functie de caracteristicele histologice: protoplasmic sau fibrilar, gemistocitic cu celule mari destinse cu hialina si material eozinofilic , pilocitic cu celule alungite, bipolare sau tipuri mixte astrocitom-oligodendrogliom Celulele tumorale contin proteina acida gliala fibrilara (GFAP) care este un marker diagnostic util.

(Adams).

In functie de gradul de severitate, Organizatia Mondiala a Sanatatii a clasificat patru forme diferite de astrocitoame:

Astrocitomul pilozotic (OMS gradul I): benign, cu dezvoltare lenta, sanse bune de vindecare

Astrocitomul difuz (OMS gradul II): inca benign, crestere lenta, se poate transforma in tumoare maligna

Astrocitom anaplazic (WHO Grad III): malign, crestere rapida, necesita interventie chirurgicala, tratament radiologic si chimioterapie.

Prezentarea depinde de localizarea tumorii. In fosa posterioara pot apara semne de presiune intracraniana ridicate produsa de hidrocefalia obstructiva iar apoi se instaleaza fenomenele de afectare cerebeloasa ca nistagmusul, dismetria index nas, sindromul vertiginos. Daca este localizat la nivelul chiasmei optice se pot produce tulburari de vedere.

2.1.1 A 2.1.1B

PathologyOutlines.com, Pilocytic astrocytoma – grade I, Eman Abdelzaher, M.D., Ph.D

2.2 Glioblastomul

Glioblastomul este o tumora cerebrala primara cu evolutie dramatica, mai putin de 20 % supravietuiesc peste 1 an de la debutul simptomatologiei si doar aproximativ 10% traiesc peste 2 ani (Adams). Tumora apare in substanta alba profunda care se poate extinde catre suprafata meningelui sau peretele ventricular, lucru care determina modificari la nivelul LCR. Proteinorahia poate fi mai mare de 100 mg/dL, pleiocitoza ocazionala 10-100 celule, majoritatea limfocite (Adams).

Metastazele extranevraxiale sunt foarte rare; de obicei pot sa apara dupa o craniotomie. Aproximativ 50% din glioblastoame ocupa mai mult de un lob al unei emisfere.

Macroscopic: aspect gri, tarcat, rosu sau brun in functie de gradul de necroza si de prezenta hemoragiei (figura 2.2.1)

Microscopie: hipercelularitate cu pleomorfism celular si atipii nucleare, celule tumorale gigantice si celule in mitoza, hiperplazia celulelor endoteliale ale vaselor mici, hemoragia si tromboza vaselor sanguine (Adams). Un fenomen specific glioblastomului este reprezentat de pseudopalizarea celulelor tumorale in jurul zilelor de necroza (Figura 2.2.2).

Imagistic glioblastomul apare la RMN cerebral efectuat cu substanta de contrast ca o formatiune tumorala hipo-T1, hiper-T2 și FLAIR, cu zone hemoragice la interior și efect de masă important – deplasarea structurilor liniei mediene, priza de contrast in periferie (figura 2.2.3).

Tratamentul este unul chirurgical urmat de radio si chimioterapie. O abordare promitatoare pentru glioblastoamele recurente este utilizarea medicamentelor care tintesc reteaua vesculara a tumorii. Dintre agenti cei mai promitatori amintim bevacizumab, un inhibitor de VEGF, administrat uneori in combinatie cu chimioterapie.

Figura 2.2.2 (PathologyOutlines.com , Eman Abdelzaher, Glioblastoma multiforme) .Se observa pseudopalizarea celulelor care inconjoara o zona de necroza precum si proliferarea microvascularizatiei.

2.2.3 ( https://radiopaedia.org/images/363725 ) Sectiune coronara la nivelul sistemului nervos central, T1, gadolinium pozitiv-formatiune tumorala hipodensa care are efect de masa si comprima ventricolul lateral cu deplasarea structurilor mediene cerebrale spre stanga.

2.3 Meningioamul

Meningioamele reprezinta aproximativ 15% din tumorile primare intracraniene, avand un varf de aparitie in decada sasea sau saptea de viata, fiindca mai frecvente la femei. Incidenta crescuta la sexul feminin poate fii explicata prin prezenta receptorilor pentru estrogen si progesteron dar si tendinta lor de a creste in timpul sarcinii si asocierea meningiomului cu cancerul de san (Adams).

Exista o corelatie intre radioterapie craniului si cresterea incidentei dezvoltarii meningioamelor, precum si o scadere a varstei de aparitie (Adams).

Celulele tumorale de la nivelul meningioamelor secreta o varietate de proteine solubile, dintre care unele au caracter angiogenic ca VEGF. Acest fapt explica vascularizatia bobata a acestor tumori, cat si edemul inconjurator (Adams ).

Din punct de vedere anatomopatologic celulele meningioamelor sunt relativ uniforme, cu nuclei rotunzi sau alungiti, membrana citoplasmatica vizibila si o tendinta caracteristica de a se inconjura una pe alta, formand spirale si corpi psamomatosi. La nivelul microscopiei electronice se pot observa interdigitatii foarte complexe intre celule si prezenta dezmozomilor (Adams).

Cel mai important factor prognostic este reprezentat de tipul histologic al meningiomului. Meningioamele benigne operate, au un prognostic excelent, nemodificând semnificativ speranța de viață în raport cu populația generală spre deosebire de meningioamele atipice tratate care au speranța de viață la 5 ani este de aproximativ  80% și la 10 ani de cca 50%. Cel mai prost prognostic este pentru meningioamele maligne supraviețuirea cu tratament fiind de aproximativ 45% la cinci ani și de cca 15% la 10 ani.

Alți factori prognostici importanți sunt reprezentați de rezecția totală a tumorii, vârsta <60 de ani la diagnostic, și starea generală și neurologică la momentul tratamentului.

Fig. 2.3 A Fig 2.3 B, Fig 2.3 C

2.3A-fibroblastic meningioma, 2.3B- trazitional meningiomas, 2.3C-meningiom psamomantos , http://neuropathology-web.org

CAPITOLUL III: ANGIOGENEZA SI NEOGENEZA VASCULARA A GLIOBLASTOMULUI

3.1 Modificari la nivelul vascularizatie glioblastomului evidentiate prin antomopatologie

Astrocitoamede de grad I si II au o supravietuire in medie de 7 ani lucru care este diferit cand vine vorba de glioblastom (Elizabeth B. Claus).

Glioblastomul este o cea mai agresiva tumoare primara cerebrala cu o medie de supravietuire de doar 14 luni fara tratament si 60 de luni daca pacientul primeste radioterapie si chimioteratie dupa interventia chirurgicala.Rezistenta crescuta la radioterapie si chimioterapie este bine cunoscuta in ciuda tratamentelor existente (Stupp R).

Caracterul sau agresiv este dat de capacitatea de a forma noi vase, gliobastomul fiindca printre cele mai vascularizate tumori solide. Formarea de vase noi reprezinta un semn patologic caracteristic printre celelalte tumori primare cerebrale (Brem S)

Mecanismul prin care se formeaza vascularizatia in cadrul gliobastoamelor este inca discutabila si pana acum mai multe mecanisme au fost propuse: cooptarea vascularizatiei deja formate (figura 3.1.4, figura 3.1.5) angiogeneza si vasculogeneza, mimetismul vascular si transdiferentierea (plasticitatea) celulelor tumorale (figura 3.1.8 si 3.1.9). Aceste mecanisme nu sunt independente ci interconectate intre ele (Matthew E. Hardee).

Studierea transformarii astrocitomului de grad II sau III care nu prezinta vascularizatie bogata in glioblastom a adus noi informatii utile. Celulele tumorale sufera transformari importante care pun bazele procesului de neogeneza vasculara atat de important in dezvoltarea tumorala ulterioara.

La niveul astrocitoamelor de grade I, II si III celulele tumorale primesc oxigen si nutrieti prin cadrul vaselor sanguine intacte (Daniel Brat). Pe masura ce tumora creste in dimensiuni are loc o distrugere a capilarelor vasculare cu distrugerea membranei bazale a capilarelor sanguine si totodata cresterea permeabilitatii barierei hematoencefalice (Daniel Brat).

O data cu cresterea agresivitatii tumorale si transformarea in glioblastom, celule tumorale incep sa produca factori procoagulatori care patrund la nivelul circulatiei si determina tromboza intravasculara(figura 3.1.1). Membrana bazala a capilarelor sanguine se distruge producandu-se edemul perivascular. Este deja demonstrata frecventa crescuta a coagulapatiilor la pacientii cu glioblastom care prezinta o crestere cu 30% mai mult a riscului pentru tromboza venoasa profunda sau trombembolism pulmonar (Walsh dc). Distrugerea barierei hematoencefalice este pusa in evidenta si radiologic prin trecerea substantei de contrast din circulatie la nivel tumoral (Daniel Brat ). Capilarele devin fenestrate cu detașamentul pericitelor si alterarea matricei extracelulara (Dinda AK).

In jurul vaselor trobozate nivelul oxigenului scade si celule tumorale incep sa migreze creeand impresia unei unde de celule tumorale care se poate vedea pe lamele din tesut tumoral(figura 3.1.6, figura 3.1.7, Danil Brat ).

Figura 3.1.1

Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 65, Issue 6, 1 June 2006, Pages 529–539,

Celulele tumorale formeaza un aranjament de celule cu nuclei la diferite inaltimi in jurul zonelor de necroza, aranjare care poarta numele de peudopalisada . Aceste celule se multiplica mai lent decat celelalte celule tumorale, au un nivelul de apoptoza crescut comparativ cu celulele tumorale dar si o crestere a expresiei genei HIF-1 si a celor pentru proteaze matricei extracelulare MMP-2 si uPAR . Gena care va activa productia de factori proangiogenici :VEGF , il-8  (figura ;;;;;)

Figura 3.1.2 Figura 3.1.3

Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 65, Issue 6, 1 June 2006, Pages 529–539,

3.1.2 Coloratie cu hematoxilin eosinofil care pune in evidenta tromboza intravasculara intr-un vas care si-a marit calibru (sageata). Perivascular exista o zona de necroza colorata in roz cu edem vasogenic. La peiferie se observa celule tumorale pseudopalisadice; 3.1.3 Imunohistochimie pentru HIF-1 alfa, a sectiunii precedente indicand o adaptare la nivelul celulelor pseudopalisadice la hipoxie cu expresia crescuta intranucleara a acestui factor (varf de sageata).

Primul mecanism prin care globlastomul isi formeaza vascularizatia este prin co-optarea vascularizatiei deja formata de la periferia tumorala. Celulele canceroase pseudopalisadice care au suferit fenomenul de migratie se distribuie ca un manunchi in jurul vaselor deja existente (Holash J si  Zagzag D)

Figura 3.1.4 Figura 3.1.5

Mechanisms of Glioma-Associated Neovascularization, Matthew E. Hardee⁎ and David Zagzag

Cooptarea vaselor in prima faza poate explica de ce tratamentul impotriva angiogenezi nu are eficienta scontata. Aceste tratamente se adreseaza vaselor noi formate prin angiogeneza care implica alte cai de semnalizare. Intelegerea mecanismului prin care glioblastomul coopteaza vasele deja existente poate sa degeneza noi tratamente eficiente. (Allegra CJ)

Figura 3.1.6 Figura 3.1.7

Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 65, Issue 6, 1 June 2006, Pages 529–539,

Coloratie hematoxilin eozinofil, 2x se observa zone intinse de celule pseudopalisadice, unele dintre ele avand forma alungita care poate sugera un proces vascular in formare (sageata). In centru zona de necroza colorata in roz . In figura 2.b in stanga sus este prezenta o zona de necroza cu edem intersitiar, zona inconjurata de celule in pseudopalisada (varf de sageata) iar la distanta angiogeneza celulara cu hiperplazia vascularizatiei existente (sageata).

Cooptarea vasculara este urmata de formarea de vase noi din cele deja existente, proces care se numeste angiogeneza.

Metaloproteazlle distrug memebrana celulara si legaturile intre celule iar ANG-2 si VEGF determina migrarea si proliferarea celulelor endoteliale cu formarea de noi vase. Celulele endoteliale activate secreta factor de crestere plachetar (PDGF)

.

Figura 3.1.8 Figura 3.1.9

Mechanisms of Glioma-Associated Neovascularization, Matthew E. Hardee⁎ and David Zagzag

Celulele tumorale pot forma retele care sunt asemanatoare cu vasele sanguine fenomen numindu-se mimetism vascular. Aceasta particularitate poate explica rezistenta la radioterapia a vasculaturii tumorilor.

Aceata proprietate este evidenta in special in cazul melanoamelor, dar este prezinta si in cazul tumorilor primare cerebrale.

Figura 3.1.10 (A, B, C, D)

Mechanisms of Glioma-Associated Neovascularization, Matthew E. Hardee⁎ and David Zagzag

3.2. Sustinere corelatiei dintre vascularizatie si gradul de malignitate a tumorilor cerebrale cu ajutorul RMN-ului

Implicarea vasularizartiei in cresterea si agresivitatea tumorii poate fi pusa in evidenta si prin RMN (magnetic resonance imaging). Astfel astrocitoamele de grad mic prezinta un hipersemnal in Flair sau T2 si nu prezinta prize de contrast la nivelul tumoral (figura a si b). Tumora prezinta edem perilezional discret. Trecerea substantei de contrast de la niveul patului vascular este posibila prin distrugerea barierei hematoencefalice sau prin formarea de vase de neoformatie si este corelata cu gradul de malignitate (figura c si d). In periferia tumorii substanta de contrast capata aspectul unui inel in cazul glioblastomului ( Daniel J Brat and Erwin G Van Meir).

CAPITOLUL IV: MATERIALE ȘI METODE

3.1. Tehnica de realizare a preparatelor histologice

Examinarea morfo-functionala a celulelor tumorale se face pe preparate microscopice prelevate de la niveul tumori si asezate pe o lama de sticla acoperita cu o lamela. Lama pe care se aseaza preparatele se mai numeste si « lama port-obiect » cu laturi paralele si dimensiuni de 76/26mm si 1.5-2mm grosime. Lamela care acopera preparatele este din sticla , are forma patrata sau dreptunghiulara, cu dimensiuni variabile de 18/18, 22/22 sau 22/32mm si o grosime de 0.16-0.18mm.

Proba de studiat este reprezentata de un fragment de tesut sau o cantitate mica dintr-un lichid corporal, aduse prin sectionare, respectiv etalare la o grosime de cativa microni permitand astfel lumina microscopului otpic sa strabata proba. In functie de starea celulelor de studiat, preparatele microscopice se clasifica in :

3.1.1 Preparate proaspete , temporare sau extemporanee

Aceste preparate le realizam atunci cand vrem sa studiem structura unui tesut sau organ in stare vie.

In acest scop se recolteaza din organismul animal in timpul vietii (biopsie) un fragment foarte subtire de organ sau tesut pe care-l disociem pe lama intr-un lichid natural sau artificial, favorabil mentinerii vietii celulelor in timpul examinarii (plasma, limfa, lichid amniotic, ser fiziologic).

Acoperim apoi preparatul cu o lamela ale carei margini le lipim cu parafina topita, pentru a evita uscarea tesutului.

Acest tip de preparat se mai foloseste si in studiul culturilor de tesuturi. Pe astfel de preparate proaspete extemporanee, putem examina celulele sau elementele tesutului respectiv necolorate sau colorate printr-o metoda numita coloratie vitala.

Coloratia vitala intrebuinteaza diferite substante colorante putin toxice, care nu altereaza viata celulelor.

Colorantii vitali se impart in :

–   Colorantii vitali bazici

–   Colorantii vitali acizi

Examenul in stare vie sau proaspata are marele avantaj de a permite studiul celulelor in viata, de a urmari diferite aspecte functionale ale acestora in desfasurarea lor, de a studia unele aspecte ale dinamicii celulare.

3.1.2  Preparate permanente sau durabile, care permit un studiu amanuntit al celulelor pe piese fixate si colorate; ele rezista in timp si se pot realiza prin:

a)-metoda efectuarii sectiunilor fine

b)-metoda etalarii materialului biologic in monostrat (frotiu, amprente de organ)

Sectiunea este un preparat permanent in care se urmareste mentinerea tesuturilor cat mai asemanatoare cu aspecutul lor din timpul vietii si durabilitatea in timp.

Obtinerea sectiunilor necesita efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare dintre ei avand o influenta hotaratoare asupra reusitei finale. In ordinea executarii lor acestia sunt:

-recoltarea

-fixarea

-spalarea

-decalcifierea (in cazul tesuturilor dure)

-includerea

-sectionarea

-aplicarea sectiunilor pe port-obiect

-colorarea

-montarea

-etichetarea

Recoltarea si orientarea pieselor

Fragmentele de organe sau tesuturi recoltate in timpul vietii, (printr-o interventie chirurgicala, biopsie, sau imediat postmortem, pentru a evita modificarile cadaverice. Piesele obtinute sunt taiate la o grosime de 2-3 mm si orientate astfel incat sa permita un studiu cat mai complet.

Recoltarea se face :

-pe o placa de pluta sau PVC

-cu pense fine pentru a nu strivi preparatul

-fasonarea piesei se face cu lame ascutite degresate ( daca tesutul recoltat este moale, de exemplu SNC, iar fasonarea poate produce strivirea pieselor, se vor fixa fragmente mai mari de tesut, apoi se fasoneaza).

Fixarea

Are ca scop conservarea constituientilor celulari intr-o stare cat mai apropiata de cea din timpul vietii, conservand forma, structura si compozitia chimica precum si raporturile reciproce existente in stare vie si pregatirea lor in vederea manevrelor ulterioare (includere, colorare). Fixarea omoara si imobilizeaza celulele intr-un anume moment al activitatii lor.

Aceasta depinde in primul rand de proteine, principalii constituienti ai materiei vii, ceea ce inseamna ca un bun fixator histologic trebuie sa fie in primul rand un bun fixator al proteinelor. Mecanismul fixarii proteinelor nu este perfect cunoscut. Se cunoaste faptul ca fixatorii histologici determina o coagulare sau o insolubilizare a proteinelor si in majoritatea cazurilor un anumit grad de polimerizare a structurilor organice. O consecinta importanta a acestei coagulari a proteinelor este ca se realizeaza blocajul reactiilor enzimatice, impiedicand astfel digestia autolitica a tesuturilor.

Fixarea trebuie privita diferit in functie de :

-gradul conservarii morfologice pe care dorim sa-l obtinem : fixarea se realizeaza in mod diferit pentru microscopia electronica fata de cea fotonica ; in primul caz trebuiesc pastrate relatiile intre constituientii celulei la scara moleculara.

-de natura constituientilor chimici ce trebuie conservati : anumite structuri macromoleculare sunt mai usor de conservat (de exemplu proteinele), in timp ce altii sunt foarte labili si dificil de fixat, (oligozaharidele).

-de volumul fragmentelor tisulare ce trebuiesc conservate : fixarea unui frotiu celular este diferita de cea a unui organ (de exemplu encefalul) unde patrunderea fixatorului devine elementul esential al fixarii.

-de tipul reactiilor histochimice sau de culoarea pe care dorim sa le efectuam : fixarea este diferita cand folosim o coloratie simpla, topografica sau cand incercam decelarea lipidelor sau enzimelor.

Un bun fixator trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :

– sa aiba putere mare de patrundere

-sa produca o cat mai mica retractie a pieselor, evitand modificarea taliei, formei, raporturilor dintre celule

–   sa nu determine aparitia de artefacte, adica modificari ale piesei care nu corespund realitatii (retractari, umflari, vacuolizari)

–   sa confere o anumita consistenta piesei

–   sa permita colorarea pe care dorim sa o efectuam

–   sa nu fie toxic pentru cel care il manevreaza

–   sa depaseasca piesa ca volum de 30-40 de ori.

Fixarea se face cu agenti fizici sau chimici :

Agentii fizici utilizati : caldura, desicarea sau congelarea

Agentii chimici sunt cel mai frecvent utilizati, fie ca fixatori simpli, fie sub forma de amestecuri fixatoare.

Reguli generale ale fixarii :

-Evitarea alterarilor autolitice- fixarea trebuie facuta cat mai repede posibil dupa recoltarea materialului biologic.

-Spalarea fragmentelor, intr-o solutie fiziologica. Nu se foloseste apa, deoarece produce umflarea tesuturilor.

-Evitarea uscarii tesuturilor, manevrele se fac in mediu umed.

-Facilitarea la maxim a penetrarii fixatorului in organe si tesuturi. Se vor utiliza vase mari, cu fundul plat si dop rodat, nu se va lasa sange sau mucus la suprafata piesei, se agita din timp in timp sa nu se lipeasca de peretii flaconului.

-Piesele se introduc in amestecul fixator ambalate in tifon si purtand numar de identificare.

-Durata fixarii, variaza in functie de compozitia agentului fixator, structura, dimensiunea pieselor.

-Un fixator odata folosit nu se va folosi la fixarea altei piese.

Tratamentul pieselor imediat dupa fixare

Cand se alege un fixator, se are in vedere structura ce va fi studiata, stiind ca anumite tesuturi si componente celulare implica folosirea anumitor fixatori sau contraindica folosirea altora.

Pentru glicogen nu se folosesc fixatori aposi.

Pentru fixarea grasimilor nu se folosesc solventi ai acestora.

Spalarea

Este operatiunea in care se opreste fixarea si se indeparteaza excesul de fixator si a unor eventuale structuri false ce pot apare in preparat datorita unor defecte de fixare.

Se poate face cu diferite substante in functie de fixatorul folosit :

-apa curgatoare pentru formaldehida

-alcool pentru fixatori cu dicromat de potasiu

-alcool absolut pentru fixatorii pe baza de alcool, amestecul Carnoy

La alcoolul in care spalam piesa se adauga in mod obligatoriu si solutie iod iodurata sau tinctura de iod pentru a se elimina precipitatele pe care le formeaza sublimatul in tesuturi in timpul fixarii.

Includerea

Este etapa in care piesa , odata fixata, este procesata intr-o forma care sa permita efectuarea de sectiuni subtiri. Aceasta se realizeaza prin inglobarea si impregnarea pisei cu o substanta solidificabila, rezultand un bloc cu consistenta solida, omogena.

Cel mai frecvent e utilizata parafina, cu o densitate asemanatoare tesuturilor, ce permite obtinerea de sectiuni cu grosimi de 3-10microni.

Alte substante folosite : celoidina, gelatina, iar pentru microscopia electronica rasinile sintetice.

Includerea la parafina- etape :

-deshidratarea

-clarificarea

-impregnarea cu parafina

-includerea propriu zisa

Deshidratarea este operatiunea in care se indeparteaza apa din piesa. Acest pas este necesar deooarece parafina nu e solubila in apa.

De obicei de face cu alcool in bai de concentratii succesiv crescute (70%, 95% si 100%). In acest fel alcoolul inlocuieste treptat apa din tesuturi.

Volumul alcoolului din baia de deshidratare trebuie sa fie de aproximativ 10 ori mai mare decat volumul piesei.

Durata depinde marimea fragmentelor, in medie de 2-3 ore pentru fiecare baie de alcool. Ultima baie trebuie sa se faca intotdeauna in alcool absolut nou.

Clarificarea, este operatiunea in care alcoolul din piesa este inlocuit cu o substanta care are proprietatea de a fi miscibila atat cu alcoolul cat si cu parafina.

Dintre aceste substante mentionam xilenul, benzenul, toluenul, cloroformul. Cel mai folosit e xilenul.

Clarificarea consta , de asemenea in bai succesive de aceeasi substanta , de obicei 3 bai de xilen cu durata de 3-6 ore in functie de marimea fragmentului.

La sfarsitul operatiunii de carificare, piesa devine translucida.

Impregnarea la parafina- se utilizeaza parafina cu punct de topire 56°C, care e mentinuta la aceasta temperatura printr-un termostat.

Se trec piesele prin cel putin 3 bai de parafina pentru a se indeparta orice urma de solvent din piese.

Includerea propriu –zisa, sau turnarea blocului, consta in inglobarea pieselor in parafina noua, neutilizata, turnata intr-o forma ; frecvent se folosesc barele paralele Leuckhardt. Piesa se introduce in parafina topita cu fata care va fi sectionata spre fundul formei. Prin racire la temperatura camerei blocul se solidifica si va putea fi sectionat.

Exista inconveniente pentru preparatele ce contin mult tesut conjuntiv, care se sectioneaza greu. Recomandat a se folosi incluziune in celoidina.

Sectionarea

Piesele histologice pot fi sectionate :

a)-imediat dupa fixare, fara a fi incluse

b)-imediat dupa ce au fost incluse

a)Sectionarea piesei neincluse se face in mod curent in urma intaririi ei prin congelare sub actiunea vaporilor de bixid de carbon, proveniti dintr-o bomba mecanica, pusa in legatura printr-un ventil cu un microtom special pentru acest scop, numit microtom pentru sectiuni de gheata.

Sectionarea la gheata este foarte expeditiva si este folosita in histologie, in histochimie, histoenzimologie. Cu ajutorul ei se usureaza punerea in evidenta a unor componenti celulari : grasimi, enzime, care dispar in metodele de incluziune. Sectiunile sunt in general groase, mai mari de 10 microni.

b)Sectionarea pieselor incluse la parafina se realizeaza cu ajutorul unui alt tip de microtom. Acesta are la baza un cutit foarte ascutit prevazut cu un mecanism care se deplaseaza de-a lungul blocului inclus in parafina, avansand cu o distanta standard. Prin miscarea repetata a blocului in lungul cutitului se obtin sectiuni seriate, de cativa microni (obisnuit 4-6), care adera una de alta, formand o panglica.

Etalarea

Este o operatiune prin care sectiunile se aplica pe lama portobiect bine degresata. Pe lama de sticla se aplica o picatura de albumina Mayer sau solutie apoasa de gelatina si se intinde bine de-a lungul lamei.

Din panglica de sectiuni se taie fragmente de 3-4 care se aplica cu fata lucioasa pe suprafata unsa cu albumina Mayer a lamei. Se picura apa distilata la una din extremitatile panglicii astfel incat sectiunile sa pluteasca, apoi se aseaza pe o platina incalzitoare, unde, in cateva secunde, sectiunile se descretesc si se intind complet. Lamele se tin apoi, 24 de ore la termostat, 37°C, pentru ca sectiunile sa se usuce si sa se lipeasca.

Astfel procesate, preparatele permanente pot fi pastrate necolorate, ferite de praf si lumina timp indelungat.

Decalcifierea

Pentru a efectua preparate din piese ce contin in ele formatiuni impregnate cu saruri de calciu, cum sunt oasele sau dintii este necesar dupa fixare sa procedam la decalcifierea acestora.

Dupa fixare, spalam bine piesa in apa curgatoare, respectiv cu alcool, apoi o trecem printr-o serie de alcooluri cu concentratii crescande pana la 96°, apoi din nou in apa. Apoi se trece la decalcifiere. Piesele sunt trecute prin cateva bai de solutie decalcifianta pana se demineralizeaza.. Dupa decalcifiere, piesele sunt trecute pentru neutralizare printr-o solutie de sulfat de Na 5% timp de 24h, apoi bine spalate in apa curgatoare, 48h.

Unii fixatori, Bouin, Zenker, actioneaza si ca solutii decalcificatoare dar doar la piese foarte mici.

Consideram incheiata decalcificarea cand piesele sunt moi si se pot taia usor.

Dupa decalcificare, piesa e supusa tehnicii de impregnare ca orice alt tesut necalcificat.

Colorarea sectiunilor

Sectiunile piselor incluse in parafina si lipite pe lama, nu pot fi colorate in aceasta stare , deoarece solutiile colorante nu le pot patrunde , din cauza parafinei cu care a fost impregnata piesa in timpul incluziei. De aceea aceste sectiuni trebuiesc in prealabil deparafinate si apoi hidratate pentru a le face apte de a fi colorate cu diferite substante colorante , care sunt folosite in majoritatea lor , in solutii apoase.

Deparafinarea, se face prin trecerea lamelor pe care sunt lipite sectiunile , prin 3 bai successive care contin unul din solventii parafinei amintiti la incluzie, xilen, benzene, toluene, pentru a elimina parafina.

In fiecare vas cu xilen se va tine lama aproximativ 1, 3 minute. Apoi, lamele sunt trecute mai departe prin 3 bai de alcool de 96° cu scopul de a elimina solventul parafinei.. In fiecare baie de alcool, lama va fi lasata 1, 2 minute.

In sfarsit, lamele sunt cufundate intr-un vas cu apa pentru a fi rehidratate sectiunile.

Colorarea propriu zisa, ocupa un loc important in tehnica histologica. In stare vie, constituientii tisulari , au indici de refractie practic asemanatori, din care cauza la examenul cu microscopul obisnuit apar omogeni. La fel raman tesuturile si dupa fixare. Principiul coloratiei histologice este de a folosi substante colorante care se combina in mod selectiv numai cu una sau o parte din structurile unui tesut , pe care in acest fel le pune in evidenta. Folosirea a doi sau mai multi coloranti intr-o metoda va da o imagine de ansamblu diferentiata a diferitilor componenti tisulari.

3.2. Tehnica colorării

1.Colorantii folositi in histologie sunt de doua feluri dupa modul de obtinere :

-naturali (hematoxilina, colorant de origine vegetala, carminul, colorant de origine animala)

-artificiali

2.Dupa capacitatea de actiune a gruparilor continute se clasifica in :

-coloranti acizi , care coloreaza structurile celulare cu reactie alcalina, cum sunt citoplasmele. Exemple : eozina, fuxina acida, orange G, albastrul de anilina, verdele de lumina.

– coloranti bazici, ce coloreaza structurile nucleare. Exemple :albastrul de metil, fuxina bazica, hemalaunul, albastrul de toluidina.

– coloranti neutri, ce rezulta dintr-un amestec in anumite proportii dintr-un colorant acid cu unul bazic si coloreaza diferite incluziuni citoplasmatice cu reactie neutra. Exemple : eozinatul de albastru de metilen.

– coloranti indiferenti, nici acizi ,nici bazici, nnici neutri, ei actionand printr-un fenomen fizic de absorbtie pe un substrat tisular. Exemple : Sudan III, ce loreaza grasimile in rosu-portocaliu.

3.Dupa modul in care se realizeaza coloratia se clasifica in :

-coloratii progresive, in care coloratia se face progresiv, urmarind rezultatul

-coloratii regresive, in care se realizeaza supracolorarea, apoi se scoate excesul de colorant cu ajutorul unor substante diferentiatoare.

4.Dupa numarul colorantilor folositi se clasifica in :

-coloratii simple : presupun folosirea unui singur colorant. Exemple : albastrul de metilen

-coloratii combinate : presupun folosirea a 2-3 coloranti, atat nucleari cat si citoplasmatici.

5.Dupa modul in care colorantul actioneaza asupra tesuturilor se clasifica in:

-coloranti directi

-coloranti indirecti sau prin mordansare

6.Dupa afinitatea electiva a colorantului pentru anumite structuri tisulare, se clasifica in:

-ortocromatici, coloreaza structurile in aceeasi culoare cu a lui

-metacromatici, coloreaza structurile in alta culoare

Coloratia hematoxilin-eozina

Solutiile care contin acesti coloranti trebuiesc preparate anterior.

-hematoxilina, 1g

-iodat de potasiu, 0.2g

-alaun de potasiu, 50g

-apa distilata, 1000cc

Se dizolva intai alaunul de potasiu in apa, apoi se adauga hematoxilina si la urma se pune iodatul de potasiu pentru a grabi oxidarea hematoxilinei. Eozina se foloseste in solutie apoasa de 1%.

Timpii coloratiei :

Sectiunile deparafinate si hidratate sunt introduse succesiv in :

1.      solutie de hemalaun, 5-10 min.

2.      spalare in apa 5-10 min.

3.      solutie de eozina, 1-2min.

4.      spalare in apa distilata, cateva secunde

5.      deshidratare in alcool de 90%s si alcool absolut

6.      xilen fenicat, pentru clarificare, 5-10 min.

7.      clarificare in xilen pur, cateva minute.

8.      montare, se pune pe sectiunea colorata si clarificata o picatura de balsam de Canada si se acopera cu o lamela de marime potrivita.

Rezultate :

1.      nuclei, albastru-violet

2.      nucleoli, rosu

3.      citoplasma, roz

4.      granulatiile bazofile, albastriu-violet

5.      granulatii acidofile, rosu caramiziu

6.      matricea cartilaginoasa si osoasa, roz intens

Coloratie van Giemsa

Sectiunile deparafinate si hidratate sunt introduse succesiv in :

solutie de hematoxilină Weigert (2 părți hematoxilină + 1 parte mordant) – 5 minute

2. spalare in apa 5-10 min

3. diferentiere rapida in alcool-acid clorhidric

4. spalare in apa

5. contrastare în solutie saturata de Li2CO3

6. colorare cu picrofucsină – 2-5 minute

7. spalare

8. deshidratare

9. clarificare

10 . montare

Rezultate :

1. nucleii-negri

2. citoplasma-galben

3.citoplasma-galben

CAPITOLUL V: REZULTATE ȘI DISCUȚII

A fost analizate lamele obtinute postoperator a doi pacienti de sex masculin care au fost tratati in cadrul departamentului de Neurochirurgie al Spitalului Municipal de Urgenta Bucuresti.

Obtinerea lamelor s-a facut respectand protocolul descris in capitolul materiale si metode, iar coloratia folosita a fost hematoxilin eozinofil sau Van Giemsa.

Histologic glioblastomul prezinta celule polimorfe cu atipii nucleare si activitate mitotica crescuta sau celule gigante multinucleate. Un aspect caracteristic este reprezentat de proliferarea microvasculara care se asociaza cu tromboza sau necroza intravasculara (Maria Sajin). Toate aceste trasaturi explica caracterul agresiv al tumorii si raspunsul partial la radio si chimioteratie cu o supravietuire redusa din momentul diagnosticului.

Cazul I

Pacient in varsta de 46 de ani diagnosticat cu astrocitom anaplazic si operat in urma cu 3 ani, se prezinta pentru hemipareza stanga la Spitalul Municipal de Urgenta Bucuresti nou aparuta. La examenul CT cerebral cu substanta de contrast se observa recidiva tumorala locala la niveul frontotemporal stang.

Pe lamele obtinute in urma operatiei s-a observat transformarea astrocitomului anaplazic in glioblastom precum si o vascularizatie importanta cu formarea de vase noi (Figura 4.1.2, figura 4.1.6, figura 4. 1.7). Celulele au aspect pleiomorf cu nuclei hipercromi si multiple atipi celulare.

Se observa zone de necroza cu pseudopalidizarea celulara la periferie, cu staza vasculara (Figura 4.1.1) , precum si edem perivascular datorita distrugerii barierei hematoencefalice la nivelul capilarelor sanguine (figura 4.1.4 si figura 4.1.5).

Formarea de manunchiuri de vase sanguine care iau forma glomerulara reprezinta o modalitate de a forma noi vase si o trasatura caracteristica glioblastomului (Figura 4.1.2).

Vascularizatia foarte bogata poate explica cresterea tumorala importanta si caracterul agresiv al glioblastomului precum si raspunsul slab la chimio si raditerapie.

Staza sanguina la nivelul glioblastomului cu distrugerea barierei hematoencefalica

Figura 4.1.1, coloratie Van Gieson, 10 X

In figura 4.1.1 se observa celule cu aspect pleiomorf, nuclei hipercromi, multiple atipi celulare specifice glioblastomului. Vasele sanguine prezinta pereti hialinizati cu tromboza intravasculara lucru care determina hipoxie accentuata. In jurul vaselor apare pseudopalisadizarea celulelor tumorale dar si migrarea lor de alungul vasului sanguin in aval de obstructie. Staza vasculara este posibila datorita distrugerii barieirei hematoencefalica cu patrunderea factorilor protrombotici in circulatia vasculara.

Figura 4.1.2, coloratie Van Gieson, 40 X

In figura 4.1.2 se poate observa o retea de capitare sanguine sub forma glomerulara.Vasele sanguine au mai multe straturi decat in mod normal cu peretii ingrosati prin depuneri de hialina iar in interiorul unor vase se observa staza vasculara.

4.1.3 Coloratie Van Gieson 10 X

Vase sanguine au peretii ingrosati prin hialinizare masiva cu tendinta la a forma tromboze intraluminale. Celule sunt de mici dimensiuni si prezinta atipii si mitoze cu distributie haotica, fara a fi prezente celule neuronale.

Distrugerea barierei hematoencefalicecu aparitia edemului perivascular

Figura 4.1.4, Coloratie hematoxilin eozinofila, 4X

Bariera hematoencefalica de multe ori este distrusa in cazul glioblastoamelor cu transvazarea apei de la nivel vascular la nivelul tesutului nervos cu aparitia edemului. Edemul este la inceput perivascular, apoi se extinde. Pe sectiunea tumorala (figura 4.1.4 ) se observa edemul perivascular.

4.1.5, Coloratie hematoxilin eozinofila, 4X

La periferia tumorala se observa edem important privascular. Edemul vascular este principala cauza de deces prin presiunea care o exercita asupra sistemului nervos intr-un spatiu care nu poate sa isi modifice diametrele cum este cutia craniana. Celulele tumorale pot sa treaca in interiorul vasului sanguin intrucat bariera hematoencefalica este distrusa.

Formarea de vase noi prin angioneogeneza sau mimetism celular

Figura 4.1.6, Coloratie cu hematoxilin eozinofil, 40X

Nuclei hipercromi, pleimorfism celular, numeroase atipi celulare. Se pot vedea vase de neoformatie dar si vase formate prin aglomerare de celule tumorale care incearca sa creeze un lumen vascular prin ‘mimetism vascular’ (figura 4.1.6).

Figura 4.1 7, Coloratie hematoxilin eozinofil,

In centru figurei 4.1.7 se observa un vas de neoformatie, cu un singur strat de celule alcatuind peretele vascular.

Figura 4.1.8 , Coloratie hematoxilin-eosina, 4X

Retea vasculara aberanta la marginea procesului tumoral, adiacent substanta cerebrala cu edem difuz. Vasele de neoformatie se formeaza in special la periferia tumorala, iar celulele canceroase avand un rol important fiindca secreta factori de angiogeneza si au capacitarea unele dintre ele sa formeze ele vase sanguine.

Toate aceste trasaturi explica supravietuirea foarte scurta in cazul glioblastomului.

Cazul II

Pacient de sex masculin in varsta de 36 de ani se prezinte pentru crize convulsive la Spitalul Municipal de Urgenta Bucuresti, simptomatologie pentru care este internat pe sectia de Neurologic. Pe perioada internarii se initiaza tratament anticovulsivant si se efectueaza examen computer tomograf cerebral cu substanta de contrast. In urma examenului CT cerebral se deceleaza o formatiune tumorala la nivel temporal drept cu edem important perilezional, priza de contrast neomogena si zone de hipersemnal la nivelul leziunii, compatibile cu microsangerare intratumorala.

S-a stabilit un diagnostic posibil de glioblastom si se practica biopsia stereotactica. Pe lamele realizate din tesut tumoral, este pus in evidenta multiple mitoze, celule de mici dimensiuni cu nucleu hiperintenst, arii de hemoragie, precum si proliferari vasculare.

Toate aceste sunt sugestive pentru diagnostic de glioblastom.

Figura 4.1.9, Coloratie hematoxilin -eosina, 10X

Polimorfism celular, zona de necroza cu pseudopalisadizare la periferie (steluta), vase de neoformatie cu forma glomerulara (sageata) dar si prin formarea peretilor celulari din celule tumorale

Figura 4.1.10, Coloratie hematoxilina eozina 10 X,

Celule de mici dimensiuni cu numeroase mitoze, neogeneza vasculara cu vase in formare fara structura bine diferentiata

Figura 4.1.11, Coloratie hematoxilin eosina 40X,

In centru figurii se observa o acumulare de hematii si staza vasculara. Acest lucru este posibil datorita distrugerii barierei hematoencefalice si patrundere de factori procoagulanti produsi de celulele tumorale.

Acest fenomen explica frecventa crescuta de accidentele vasculare cat si de tromboza profunda sau pulmonara la pacientii cu glioblastom.

Figura 4.1.12, Coloratie hematoxilin –eosina

Pe lamele cu tesut tumoral se observa un vas trombozat inconjurat de o zona de necroza cu pseudopalizarea celulelor care inconjoara o zona de necroza. Aceste celule care migreaza la distanta de zona necroza vor ajuta sau forma o retaa capilara la priferia tumorii.

CONCLUZII

Cazul I este reprezentat de o tumora de grad II care s-a transformat si a capatat caractere de malignitate suplimentare. Dezvoltarea unei retele de vase noi este princilala caracteristica a glioblastomului si cauza princilala raspuns slab la tratamentele existente. Acest fenomen are la baza celulele hipoxice din centru tumorii primare care formeaza ele ele insele retele vasculare sau pot sa secrete factori de crestere endoteliala, substante care recruteaza celule endoteliale la nivelul vaselor existente.Punerea in evidenta a acestor lucruri este esentiala intrucat inca exista controverse cu privire la tipul de tratament care trebuie urmat in cazul unei tumori cu grad mic de malignitate. Multa vreme tratamentul a constat in urmarirea imagistica si excizia chirurgicala si radioterapie doar atunci cand existau semne de transformare maligna intr-o alta clasa.

Preparatele histologice arata transformarea maligna agresiva a unui astrocitom cu formarea unei retele de vase noi. Reteaua de vase noi este prezenta in special la periferia tumorii lucru care explica si priza de contrast la periferie ca un inel prin trecerea substantei din patul vascular la nivel tumoral. Reteaua de vase noi formate nu respecta regurile barierei hematoencefalice, avand permeabilitatea crescuta cu patrunderea celulelor tumorale in patul sanguin si a substantelor procoagulare produse de acestea. Mortalitatea este crescuta datorita si edemului cerebral sau a incidentei crescute a accidentelor vasculare ischemice sau a tromembolismului pulmonar.

Bibliografie

Adams, Allan Ropper, Martin Samuels : Principiile si practica neurologiei clinice

Allegra CJ, Yothers G, O'Connell MJ, Sharif S, Petrelli NJ, Lopa SH, et al. Bevacizumab in stage II-III colon cancer: 5-year update of the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project C-08 trial. J. Clin. Oncol. 2013;31:359–364.

Brem S., Cotran R., Folkman J. Tumor angiogenesis: a quantitative method for histologic grading. J Natl Cancer Inst. 1972;48:347–356)

Elizabeth B. Claus, PhD, Kyle M. Walsh, John Wiencke, Annette M. Molinaro, Joseph L. Wiemels et al. Survival and low grade glioma: the emergence of genetic information?

Holash J., Maisonpierre P.C., Compton D., Boland P., Alexander C.R et al. . Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science. 1999;284:1994–1998.

Ispas , G Lupu: Anatomia omului –sistemul nervos central, Editura universitara Carol Davila

Matthew E. Hardee⁎ and David Zagzag. Mechanisms of Glioma-Associated neovascularization,

Merkus P, Guchelaar HJ, Bosch DA, Merkus FW. Direct access of drugs to the human brain after intranasal drug administration? Neurology 2003; 60 : 1669–1671. 25

Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 2005;352:987Y96

Zagzag D., Amirnovin R., Greco M.A., Yee H., Holash J., Wiegand S.J., Zabski S., Yancopoulos G.D., Grumet M. Vascular apoptosis and involution in gliomas precede neovascularization: a novel concept for glioma growth and angiogenesis. Lab Invest. 2000;80:837–849

Pardridge WM: The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development.NeuroRx 2005;2 : 3–14.2

Westin U, Piras E, Jansson B, Bergstrom U, Dahlin M, Brittebo E et al. Transfer of morphine along the olfactory pathway to the central nervous system after nasal administration to rodents. Eur J Pharm Sci 2005; 24 : 565–573.

William M Pardridge, Drug transport across the blood–brain barrier, Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2012) 32, 1959–1972, 2012 ISCBFM

William M. Pardridge, The Blood-Brain Barrier and Neurotherapeutics,

Yuan Rong, Donald L. Durden, Erwin G. Van Meir, Daniel J. Brat, ‘Pseudopalisading’ Necrosis in Glioblastoma: A Familiar Morphologic Feature That Links Vascular Pathology, Hypoxia, and Angiogenesis, Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 65, Issue 6, 1 June 2006, Pages 529–539,