Dizertațe Mali 11iulie [307200]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

MASTER

Specializarea: Expertiza produselor agroalimentare

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Conducători științifici:

Prof.dr. Dana TĂPĂLOAGĂ

Conf.dr. Carmen-Daniela PETCU

Absolventă:

Mali-Sanda CRISTEA (MANOLE)

2017

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

MASTER

Specializarea: Expertiza produselor agroalimentare

METODE DE CERCETARE PRIVIND IDENTIFICAREA UNOR PATOGENI DIN SEMINTELE DESTINATE CONSUMULUI UMAN

Conducători științifici:

Prof.dr. Dana TĂPĂLOAGĂ

Conf.dr. Carmen-Daniela PETCU

Absolventă:

Mali-Sanda CRISTEA (MANOLE)

2017

Declarație pe propria răspundere privind autenticitatea lucrării de dizertație

Subsemnata/ul __[anonimizat]_____________________________________________,

Legitimate cu ____________, seria____ _______, nr. ___________,

CNP________________________________, autorul lucrării: „METODE DE CERCETARE PRIVIND IDENTIFICAREA UNOR PATOGENI DIN SEMINȚELE DESTINATE CONSUMULUI UMAN”_, elaborată în vederea susținerii examenului de finalizare a studiilor de _____________________

__________________________________, [anonimizat]:

Medicină Veterinară / …………………………………. [anonimizat] ________________________

a anului universitar _________________________, [anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat] a convențiilor internaționale privind drepturile de autor.

Declar, [anonimizat] a mai fost prezentată în fața unei alte comisii de examen de dizertație.

În cazul constatării ulterioare a [anonimizat], respectiv, anularea examenului de dizertație.

Data: [anonimizat],

CUPRINS

INTRODUCERE …………………………………………………………………………………………………………..4

PARTEA DOCUMENTARĂ

Capitolul 1. Considerații generale privind sortimentul de semințe destinate consumului uman

Varietatea semințelor pentru consum și generalități privind patologia acestora ………..…..6

Boli datorate consumului de semințe contaminate cu patogeni ……………………..………8

Prelevarea și constituirea probelor probelor …………………………………………..….…9

Capitolul 2. Studiul privind principalele microorganisme care pot deprecia calitatea semințelor

2.1. Produși rezultați prin colonizarea semințelor cu patogeni………………..…………..…….12

2.2. Posibilități de contaminare în timpul perioadei de vegetației………………………..………18

CONTRIBUȚIA AUTORULUI

Capitolul 3. Metode de identificare a patogenilor și a micotoxinelor de pe semințe

3.1. Generalități …………………………………………………………………………..…….20

3.2. Controlul microbiologic al semințelor………………………………………………………..21

3.3. Metode moderne de analiză și control al conținutului de fungi și a micotoxinelor din produsele alimentare……………………………………………………………………..………24

3.3.1. ELISA – metoda imunoenzimatică de determinare a micotoxinelor (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)…………………………………………………………………..…….25

3.3.2. Cromatografie Lichidă de înaltă performanță – (High Performance Lichid chromatography-HPLC)…………………………………………………………………..…….26

Capitolul 4. Rezultate și discuții. Aplicație practică

4.1. Identificarea surselor primare de ciuperci patogene………………………………..……….28

4.2. Determinări efectuate asupra unor sortimente de produse ambalate (semințe) destinate vânzării în supermarket…………………………………………………………………….……..37

4.2.1. Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri…………………………….…….38

4.2.2. Determinare a numărului total de germeni (NTG)………………………………….……38

4.2.3. Determinarea numărului de bacteriilor coliforme………………..…………..……………39

4.2.4. Determinarea numărului de Escherichia coli……………………………………….……40

4.2.5. Determinarea numărului de Salmonella…………………………………………….……41

4.2.6. Determinarea numărului de Enterobacteriaceae ………………………………………..42

CONCLUZII …………………………………………………………………………………………………………………46

BIBLIOGRAFIE ……………………………………………………………………………………………………………48

INTRODUCERE

Semințele, datorită bogăției lor în elemente nutritive, pot constitui adevărate medii de cultură pentru microorganisme. În anumite condiții de umiditate și temperatură acestea se multiplică, iar în semințe se pot produce diferite transformări care pot avea consecințe majore din punct de vedere calitativ și comercial.

Consumatorul, din toate timpurile, a fost preocupat ca alimentele consumate să fie de o calitate igienico-sanitară corespunzătoare și să nu ii provoace îmbolnăviri. Atenția deosebită acordată contaminării semințelor cu patogeni (mucegaiuri), este datorată caracteristicilor anumitor patogeni de a elibera micotoxine (ca metaboliți secundari). Micotoxinele, posedă o structură chimică puțin cunoscută, cu o capacitate mare de a modifica unele structuri, având efecte nocive asupra organismului uman și nu numai.

Contaminarea semințelor cu micotoxine este inevitabilă. Organizația pentru Alimente și Agricultură, estimează că 25% din culturile alimentare de la nivel mondial sunt semnificativ contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezintă riscuri semnificative pentru sănătatea umană, sunt sintetizate de mucegaiuri care cresc pe semințele de cereale (grâu, orz, ovăz, orez și porumb).

Contaminarea cu diverși patogeni a semințelor este asociată cu producerea de micotoxine cu efecte toxice prin indigestie.

În fiecare zi, odată cu alimentele ingerăm și un mare număr de microorganisme, care sunt ființe vii (cu excepția virusurilor), cu dimensiuni mai mici de 50 microni, invizibile cu ochiul liber. Produsele alimentare, de origine vegetală, au un aport natural de microorganisme, ceea ce se constituie în microbiota lor originală (primară). Majoritatea microorganismelor nu numai că nu sunt periculoase, aceste microorganisme sunt saprofite în general, însă uneori accidental pot fi însoțite și de unele microorganisme patogene având ca origine plante contaminate sau purtătoare de microorganisme.

Alimentele, pe parcursul procesului tehnologic, respectiv de desfacere, sunt expuse diverselor surse de contaminare microbiană, în general cu microorganisme potențial patogene, cu risc crescut pentru consumator, care se constituie în microbiota secundară de contaminare (Avram E, 2008).

Microbiota naturală patogenă a plantelor este constituită în general dintr-o microfloră saprofită, constituită din: drojdii: Saccharomyces, etc; mucegaiuri: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Penicillium; bacterii Gram-: Pseudomonas, Erwinia, etc; Gram+: Lactobacillus, Streptococcus. Microflora la plante diferă fiind în funcție de mediu și de tratamentele fitosanitare aplicate acestora.

Pentru detectarea și cuantificare patogenilor și a micotoxinelor, există numeroase laboratoare specializate, care au întreprins numeroase cercetări în vederea dezvoltării a noi metode și tehnici, care ar putea fi utile și practice.

Având în vedere importanța deosebită a cunoașterii nivelului de contaminare cu micotoxine a semințelor, studiul a avut ca scop evidențierea metodelor de determinare și detecție a patogenilor și micotoxinelor prezente în semințele destinate consumului uman, punând în evidență tendința actuală și perspectiva de viitor a acestui domeniu.

CAPITOLUL 1

STUDII PRIVIND SEMINȚELE DESTINATE CONSUMULUI UMAN

Varietatea semințelor și generalități privind patologia acestora

Obținerea unor produse de calitate lipsite de agenți contaminanți naturali sau reziduuri (produși de sinteză- micotoxine), în condițiile exploziei demografice actuale, reprezintă o prioritate în asigurarea siguranței alimentare umane. Hrana de bază pentru o bună parte a populației o reprezintă pâinea. “Pâinea cea de toate zilele” conține o parte însemnată a necesarului proteic, energetic și mineral, dar care, din păcate, prezintă riscul pătrunderii în organismul uman a metaboliților secundari produși de bolile care atacă cerealele sau mucegaiurile care se pot instala pe boabele depozitate (Pop A.I., 2013).

Un obiectiv principal al industriei alimentare este aprovizionarea populației cu alimente de calitate superioară. Uniunea Europeană prevede insistent pentru țările membre respectarea regulilor de calitate severe, stipulate în acordurile internaționale, evidențierea factorilor de risc, evaluarea riscului și prezentarea acestora societății pentru producția de alimente și materii prime. Astfel producătorii trebuie să fie preocupați de calitatea alimentelor și, pe de altă parte, instituțiile statului trebuie să protejeze sănătatea consumatorilor, precum și interesele producătorilor, prelucrătorilor și vânzătorilor împotriva concurenței nedrepte (Măruțoiu C, 2005).

Cunoașterea patologiei semințelor, a metodelor de analiză sanitară a acesteia, face posibilă: prevenirea introducerii de noi agenți patogeni cu semințele importate, calitatea lotului de semințe din punct de vedere sanitar și stabilirea modului de valorificare a acestora (Raicu C., 1978).

Noțiunea de sămânță cu o valoare nutritivă ridicată include și o stare sanitară corespunzătoare acesteia.

Semințele ocupă un loc importat în orice dietă, deși de cele mai multe ori, sunt neglijate. Ele sunt bogate în fibre, vitamina E și grăsimi mononesaturate, care previn bolile de inima și multe alte afecțiuni. Semințele reprezintă și o bună sursă de proteine, minerale, zinc și alți nutrienți, mai multe studii arătând că previn îngrășarea și creșterea colesterolului.

Dintre atâtea varietăți, cele mai sănătoase sunt, conform Global Healing Center (www.globalhealingcenter.com), următoarele:

Semințele de grâu: este campionul cerealelor. Conțin fosfor, magneziu, fier, zinc, cupru, seleniu, potasiu, complexul vitaminic B (B1, B2, B3, B5, B6) și vitaminele E si K. Asigură un aport de antioxidanți. Asemenea fructelor și legumelor, semințele de grâu contribuie semnificativ la aportul zilnic de antioxidanți, compușii care ne protejează celulele de acțiunea negativă a radicalilor liberi.

Semințele de porumb: pot fi consumate ca atare (prăjite) sau sub formă de cereale. Conține multe hidrocarburi, amidon, albumine, foarte multe vitamine din grupa B, vitamina E, fier, fosfor, magneziu, zinc și potasiu.

Semințele de orz: orzul este un tip de cereală integrală bogată în fibre și proteine care oferă numeroase beneficii pentru sanatate celor care il consuma. Semințele de orz sunt bogate în mangan, seleniu, fosfor, cupru, magneziu, fier, zinc si potasiu, însă cantitatea de calciu, vitamina C din compoziția sa, este destul de redusă. Orzul este bogat in vitamina B6, diamina, niacina, riboflavina si acid folic. Consumul a 100 grame de orz oferă unei persoane 352 calorii. Aceste cereale integrale sunt bogate în proteine, vitamine, minerale și aminoacizi esențiali pentru sănătate.

Semințele de orez: sunt bogate în proteine (orezul are cel mai mic conținut de proteine dintre toate cerealele, carbohidrați, folați, fosfor, magneziu, potasiu, sodiu; vitamine B1 și E (orezul alb este sărac în vitamine, mâncărurile din orez alb trebuie consumate alături de salate de crudități; ideal este consumul de orez brun sau de orez integral).

Semințele de ovăz: se consumă in combinații cu alte cereale sub formă de fulgii de ovăz. Ovăzul reprezintă unul dintre cele mai sănătoase alimente pe care le putem consuma la micul dejun ori în cadrul gustărilor, deserturilor, meselor de dietă. Conține: fibre, calciu, seleniu, fosfor, mangan, potasiu, fier, vitamina E, proteine, magneziu, grăsimi sănătoase, vitamine din complexul B.

Semințele de in: sunt o sursa bună de fibre dietetice și acizi grași esențiali Omega 3. Fibrele din semințele de in se găsesc în principal în învelișul semințelor. vitamine si minerale, inclusiv vitaminele din grupul B, magneziu si mangan. Semințele de in sunt o sursa excelenta de acid alfa-linolenic. Uleiul din semințe de in este format în proporție de 50% din acid alfa-linolenic – de cinci ori mai mult decât uleiul de nuca sau canola, alte surse importante de acid alfa-linolenic.

Semințele de cânepă: sunt încărcate cu o lista impresionantă de nutrienți, având un echilibru perfect între rațiile de omega 3 si omega 6. Conțin 10 aminoacizi esențiali, fiind in proporție de 30% compuse din proteina pură. Au și în jur de 40% fibre, cea mai mare cantitate găsită în vreun aliment.

Semințele de floarea-soarelui: Sunt bogate și în acid folic, grăsimi bune, vitamina E, seleniu și cupru, elemente esențiale.

Semințele de susan: sunt bogate în calciu, magneziu, zinc, fier, B1 și fosfor, fiind unice în ceea ce privește structura lor chimică.

Semințele de dovleac: sunt bogate în omega 3 și zinc, fitosterol.

Semintele de chia: extrem de mici, dar incredibil de potente, semințele de chia sunt pline de fibre, proteine, nutrienți și diverși antioxidanți, dar si calciu. Aceste mici semințe sunt in proporție de 34% pline de acizi grași omega 3.

Semințele de arahide: Conțin în special: grăsimi (în cantitate mare, aproape 50% din conținut), protide (de asemenea în cantitate mare – 30%), numeroase săruri minerale, acid folic, vitaminele a, B1, B2, E, F, tanin.

Boli datorate consumului semințelor contaminate cu patogeni

Recunoașterea problemelor de sănătate datorate micotoxinelor a fost un prim pas spre crearea și implementarea programelor de prevenire și control (Food and Agriculture Organization of the United Nations 2004).

Patogenii toxicogeni produc intoxicații denumite micotoxicoze cu o perioadă de incubare prelungită, încât este dificilă asocierea îmbolnăvirii cu alimentul incriminat. Mucegaiurile pot forma colonii la suprafața produsului și în etapa de creștere colonială, o dată cu apariția sporilor, pot să sintetizeze produși secundari de metabolism de natură hidrocarbonată cu o toxicitate deosebit de ridicată. Trebuie subliniat că, termenul general pentru îmbolnăviri ale omului, cauzate prin ingerarea de alimente contaminate, întâlnit în literatura de specialitate prin traducere din limba engleză (Food poisoning) este cel de toxiinfecție alimentară sau intoxicație alimentară.

Micotoxicozele sunt o problemă reală pentru sănătatea omului, datorită incidenței micotoxicozelor, cât și a mecanismelor de acțiune a acestora (Ciocoiu, E., 2011).

Omul și animalele pot să sufere intoxicații prin consum de alimente mucegăite, intoxicații care se manifestă prin îmbolnăviri ale diferitelor organe (ficat, rinichi etc).

Dintre bolile produse prin consum involuntar de micotoxine fac parte:

ergotismul,

aleucie toxică alimentară (ATA),

hepatocarcinogeneza,

nefrotoxicoze,

sindromul hemoragic,

poliurie ș.a.

Boli produse de micotoxine de cele mai importante micotoxine:

Aflatoxicoze: micotoxina ingerată cu alimentele ce produce toxicitate hepatică și renală, acțiune aspra sistemului nervos și a funcței de reproducere. Manifestări clinice: anorexie (lipsa poftei de mâncare), scădere ponderală, dureri abdominale, scaune diareice cu sânge, icter, tulburări de coagulare a sângelui

Fusariotoxine: Nu sunt inactivate de procesarea alimentelor,iar prin consumul grâu contaminat cu Fusarium spp. se pot declanșa vome, diaree, crampe abdominale, infecții, anemie, hemoragii, necroze pe mucoase. Bolnavii se simt bine, dar este distrusă măduva osoasă,

Ochratoxina A (O.A.): omul se contaminează prin: pâine din grâu, orz, secară puternic contaminate; acțiune: nefrotoxică, insuficiență renală acută și cronică, embriotoxică, carcinogenă, imunosupresivă.

Diagnosticul micotoxicozelor:

simptome nespecifice;

evoluție cronică → greu de stabilit alimentul cauzal;

medicii nu le cunosc foarte bine;

laboratoarele nu pot detecta micotoxinele;

procesele neoplazice atribuite altor factori și nu micotoxinele.

Prevenirea micotoxicozelor:

prevenirea infestării nutrețurilor și alimentelor cu mucegaiuri

recoltarea și depozitarea alimentelor în condiții optime

supravegherea alimentelor de origine vegetală – determinare de micotoxine

Prelevarea și constituirea probelor

(REGULAMENTUL (CE) NR. 401/2006 AL COMISIEI din 23 februarie 2006 de stabilire a modalităților de prelevare de probe ș i a metodelor de analiză pentru controlul oficial al conținutului de micotoxine din produsele alimentare )

O condiție esențială în lucrările de determinare a patogenilor și a produșilor acestora, este luarea probelor, acestea trebuind să reprezinte cât mai fidel întreaga masă din care au fost extrase, numai așa rezultatele obținute la analiză exprimă valoarea întregului lot din care s-a luat proba (Raicu C.,1978).

Prelevarea probelor este realizată de către o persoană specializată în acest sens. Toate loturile care urmează să se examineze fac obiectul unei eșantionări separate. În conformitate cu normele specifice de prelevare a probelor, loturile mari sunt împărțite în subloturi din care se prelevează probe separat.

„lotul”: cantitate identificabilă de produs alimentar livrată la un moment dat și pentru care agentul responsabil stabilește că are caracteristici comune, cum ar fi originea, varietatea, tipul ambalajului, ambalatorul, expeditorul sau marcajul;

„sublot”: parte dintr-un lot mare căreia i se aplică metoda de prelevare și care a fost desemnată în acest sens; fiecare sublot trebuie să fie separat fizic și identificabil;

„probă elementară”: cantitate de materie prelevată dintr-un singur punct al lotului sau al sublotului;

„probă globală”: totalul combinat al tuturor probelor elementare prelevate dintr-un lot sau sublot;

„probă de laborator”: probă destinată laboratorului.

În timpul prelevării și pregătirii probelor, se iau precauții pentru a evita orice modificări care ar putea afecta:

— conținutul de microorganisme/micotoxine, determinarea analitică sau reprezentativitatea probei globale;

— siguranța alimentară a loturilor din care se prelevează probe.

În afară de aceasta, trebuie să se adopte toate măsurile necesare pentru a garanta siguranța persoanelor care efectuează prelevarea probelor.

Pregătirea probei globale: se obține prin însumarea probelor elementare. Probele identice destinate măsurilor executorii, comerțului (apărării) și arbitrajului se prelevează din proba globală omogenizată, în măsura în care această procedură nu contravine legislației statelor membre privind dreptul agenților economici din sectorul alimentar.

Ambalarea și transportul probelor. Fiecare probă se introduce într-un recipient curat dintr-un material inert, care oferă o protecție adecvată împotriva riscurilor de contaminare și împotriva deteriorării ce poate surveni în timpul transportului. Se iau toate precauțiile necesare pentru a evita modificarea compoziției probei, care ar putea să apară în timpul transportului sau depozitării.

Sigilarea și etichetarea probelor. Fiecare probă oficială se sigilează la locul prelevării și se identifică în conformitate cu dispozițiile în vigoare în statul membru. Pentru fiecare prelevare de probe, se întocmește un proces verbal care să permită identificarea sigură a fiecărui lot din care se prelevează probe și în care să se specifice data și locul prelevării probelor, precum și orice alte informații suplimentare care ar putea să fie de ajutor specialistului.

Metoda de prelevare a probelor pentru cereale și semințe. Această metodă de prelevare trebuie utilizată pentru controlul oficial al conținuturilor maxime de aflatoxină B1, aflatoxine totale, ochratoxină A și toxine de Fusarium, stabilite pentru cereale și produse cerealiere.

Greutatea probei elementare este de aproximativ 100 de grame, cu excepția cazului în care există alte specificații. Pentru unitățile de vânzare cu amănuntul cântărind mai mult de 100 grame, proba globală va cântări, prin urmare, mai mult de 10 kg.

Greutatea probei elementare este de aproximativ 300 grame pentru arahide.

Pregătirea probelor și metodelor de analiză utilizate pentru controlul oficial al conținutului de micotoxine din produsele alimentare. Deoarece micotoxinele sunt în general distribuite într-un mod eterogen, este necesară o atenție deosebită la pregătirea și, în special, omogenizarea probelor. În cursul analizei aflatoxinelor, este necesar să se evite pe cât posibil lumina zilei, deoarece aflatoxina se descompune progresiv sub influența luminii ultraviolete. Fiecare probă de laborator se macină fin și se amestecă atent printr-un procedeu care asigură o omogenizare completă.

CAPITOLUL 2

Studiul privind principalele microorganisme care pot deprecia calitatea semințelor

Produși rezultați prin colonizarea semințelor cu patogeni

Termenul de sămânță se referă nu numai la sămânța propriu-zisă din punct de vedere botanic, provenită din ovul, ci și la unele fructe uscate indehiscente (cariopsa- la toate cerealele din familia botanică Graminee, achenă la floarea soarelui și păstaie indehiscentă- la alunele de pământ).

Patogenii se pot atașa la exteriorul semințelor (sub formă de spori), intern: în tegument, în embrion sau pot fi externi: prezenți în amestecul de semințe fără să adere la ea (prin scleroți).

Sămânța sănătoasă este sămânța liberă de patogeni (Raicu C, 1978), dar și de produșii toxici produși de aceștia.

Micotoxinele [mycos (gr.) – ciupercă, toxicum (lat.) – otravă] sunt metaboliți toxici elaborați de fungi filamentoși toxigeni printr-o serie de reacții catalizate de enzime în condiții specifice precum: capacitatea genetică substratul, umiditatea, pH-ul substratului, temperatura, aerația, luminozitatea, perioada de timp de la contaminare, etc.

Exista cca 300 – 400 micotoxine ce aparțin la 24 de grupe chimice de toxine care pot apărea în condiții diferite în producțiile agricole și în diferitele alimente.

Fungii sunt implicați în patologie în trei categorii: micoze (boli produse de către ciuperci), micotoxicoze (boli produse prin ingerarea produselor ce conțin toxine produse de ciuperci) și alergie fungică (un sindrom determinat de sporii produși de către ciuperci).

Micotoxinele se găsesc pe o mare varietate de produse de origine vegetală, care sunt substraturi foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri. Contaminarea se poate realiza încă din perioada de vegetație a plantelor, dar și în depozite. Datorită diversității efectelor toxice, cât și a proprietarilor lor sinergice, metaboliții toxici prezintă un risc major pentru consumatorul acestor alimente contaminate.

Ținând cont de potențialul patogen existent pe întreg lanțul alimentar, urmărirea calității alimentelor în fiecare etapă a procesului de producție în scopul acumulării unei baze de date care să permită elaborarea unei strategii antimitotice adaptată situației zonale existente reprezintă o prioritate actuală a comunității științifice (Pop A.I., 2013).

Pentru a demonstra această ipoteză, Șerdaru M. (2010) a realizat un studiu efectuat care a avut ca obiectiv realizarea unui screening micotoxicologic care s-a finalizat prin analiza a 39 probe din diverse nutrețuri (cereale, fibroase, leguminoase). Conținutul principalelor micotoxine (aflatoxine, ochratoxine, zearalenone, fumonisine, deoxinivalenol, toxina T-2) s-a determinat prin testul imunoenzimatic ELISA. Rezultatele obținute au indicat depășirea limitelor maxim admise pentru conținutul de zearalenone la 69,23% din probe și respectiv aflatoxine, ochratoxine, toxina T-2 la 7,69% din probe.

Israel F., 2010 a realizat un studiu din punct de vedere micologic și micotoxicologic a unor cereale (grâu, orz, ovăz și porumb) provenite din S-E României, unde a constatat că speciile de fungi, cele mai frecvente, aparțin genurilor Aspergillus și Fusarium. Dintre speciile toxicogene identificate, cele mai frecvente au fost: A. flavus, A. ochraceus, A. niger, A. fumigatus, F. graminearum, F. culmorum și F. verticillioides. Toxine determinate prin metoda imunoenzimatică ELISA, au fost identificate: aflatoxina B1 (AFB1), deoxinivalenolul (DON), zearalenona (ZEA), fumonisina (FUMO) și ochratoxina A (OTA). Peste 90% din probele analizate au fost contaminate cu cel puțin una dintre micotoxinele cercetate. Dintre cerealele analizate, porumbul este cel mai puternic afectat de infestarea fungică și contaminarea cu micotoxine. Din totalul probelor contaminate cu aflatoxină 84,21% sunt probe de porumb. Ochratoxina A a fost regăsită numai în porumb în procent de 14,86%. Toxinele produse de genurile speciei Fusarium, DON, ZEA și FUMO s-au regăsit în porumb în proporție de 47,36%, 83,33% și respectiv 39,13% din totalul probelor contaminate cu aceste micotoxine.

Într-un alt studiu, realizat de Pop I.A., 2013 pe cereale provenite din Transilvania, a constatat prezenta ridicată a fungilor toxicogeni de tipul Penicillium spp. -27.6%, Aspergillus spp– 14% și Fusarium spp. 57.8%.

Genurile cu incidență în produsele vegetale-semințe, aparțin regnului Fungi, claselor Zygomycetes, Ascomycetes și Deuteromycetes (Fungi impertecti).

Un studiu privitor la infecțiile fungice responsabile cu calitatea și siguranța produselor de panificație a avut ca scop monitorizarea incidenței speciilor de ciuperci într-o brutărie românească, unde, Cornea și colaboratorii (2011) au arătat prezența fungilor Aspergillus spp., Penicillium, Alternaria spp., Fusarium spp. în făină.

Genul Aspergillus – reprezentanții genului produc aflatoxine denumite astfel de la specia Aspergillus flavus (a- de la Aspergillus, fla- de la flavus). Aflatoxine totale (AFLA).

Se cunosc 12 aflatoxine dintre care cele mai toxice sunt: B1, B2, G1, G2. Inițialele provin de la fluorescența pe care o dau aceste toxine prin expunerea plăcii cromatografice la radiații UV cu λ = 360 nm (blue = albastru, green = verde), în timp ce numerele se referă la ordinea de migrare pe cromatogramă. Metode de determinare pot fi TLC, HPLC sau ELISA.

Aspergillus ochraceus produce ochratoxina Metodele validate au fost dezvoltate pentru analiza ochratoxinei A din porumb, orz, secară, grâu, tărâțe de grâu, grâu integral, făină și se bazează pe cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție prin fluorescență (HPLC-FLD). (http://www.micotoxinas.com.br/).

Aspergillus fumigatus specie termofilă, se găsește în substraturi a căror temperatură este foarte mare de aprox. 500C, mai ales substraturile care au intrat în descompunere. Produce fumagilina, care în funcție de doză poate avea acțiune antibiotică (pentru combaterea amibelor la om). Mai produc aflatoxine unele tulpini ale speciilor Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus wenti. Aflatoxinele au efect toxicogen asupra oamenilor și produc ciroze în 3 săptămâni de la ingerarea acestora cu 1 mg/kg corp. Încălzirea la 120șC, timp de 4h, nu distruge în totalitate aceste micotoxine. Aflatoxinele nu sunt solubile în apă, ci în solvenți organici, dar aceștia nu pot fi folosiți pentru îndepărtarea micotoxinelor deoarece prin extracție se pierde valoarea alimentară a produsului.

Genul Alternaria este un gen comun cu o serie de specii care pot invada culturile în stadiul pre- și post-recoltare și pot cauza pierderi considerabile din cauza putrezirii semințelor afectate (figura 2.1). În condiții adecvate, poate duce la producerea unei game de micotoxine precum și alți metaboliți mai puțin toxici (Douglas, 1984). Unele specii sunt destul de specifice pentru anumite culturi. A. alternata este, probabil, cea mai importantă specie producătoare de micotoxine și are loc pe cereale- înnegrirea embrionului- black-point , semințe de floarea soarelui, rapiță etc. Datorită unui număr mare micotoxinelor este similară cu Fusarium. Micotoxinele genului Alternaria s-au dovedit a produce în mod natural: acid tenuazonic, alternariol, altenuene și altertoxin I. Iso-altenuene și altertoxin II.  Toxinele AAL sunt produse de A. alternata f. sp . Lycopersici și sunt înrudite structural cu fumonisine (Logrieco, A., 2009).

Figura 2.1. Cultură de Alternaria spp., pe mediu PDA (Manole, original)

Genul Claviceps (purpurea) produce cornutină, ergotină, ergotoxină. Scleroții pot să apară la grâu, secară și orez (figura 2.2). Aceste substanțe provoacă contractarea mușchilor netezi și au acțiune vasoconstrictoare. Oamenii care consumă semințe sau făină de secară, în care se află scleroți amestecați și sfărâmați, pot prezenta simptome de intoxicare (ergotism). Ergotina poate fi folosită și în scop terapeutic ca hemostatic și pentru obținerea acesteia se fac infecții artificiale în cultura de secară (cu Claviceps purpurea). (Ciocoiu, E., 2011).

Figura 2.2. Spice atacate cu Claviceps purpurea, (Manole, original)

Genul Penicillium – specii ale genului pot produce peste 60 de toxine mai ales când se dezvoltă pe cereale (grâu și orez). Dintre speciile producătoare fac parte: P. islandicum care se dezvoltă pe orez și produce 2 micotoxine: islanditoxina și luteoskirina. Penicillium viridicatum poate produce ochratoxina (OTA; C20H18ClNO6, Mw=403.82 g/mol). Se poate dezvolta pe cereale și produse de panificație (figura 2.3). P.citrinum produce citrinina pe orez decorticat.

Figura 2.3. Penicillium spp., pe mediu PDA (Manole, original)

Genul Fusarium: este prezent pe semințele de grâu, porumb, orz, orez, secară. Fusarium tricinctum produce trichothecină care pot fi sintetizată și la temperaturi scăzute, deosebit de rezistente în timp (mucegaiurile pot să moară dar toxina rezistă ani de zile).

Fusarium sporo-trichoides produce sporofusariogenina producătoare de ATA (alimentary toxic aleukia) ce se manifestă prin apariția pe piele a unor pete specifice, angină pectorală, diateze hemoragice, afecțiuni ale măduvei, dând simptome similare cu cele produse prin iradiere cu radiații ionizante sau otrăvirea cu benzen. F.nivali se dezvoltă în special pe cereale și produce trei tipuri de toxine: fusarenona, fusarenona X și nivalenolul, toxine care determină în organismul uman o proliferare anarhică a celulelor, hematopoeză și simptome similare ATA (aleukie toxică alimentară). Fumonizine cu efect toxic asupra organismului uman sunt următoarele: FB1, FB2, FB3 si FB4

Fusarium graminearum produce vomitoxina (deoxynivalenol), Zearalenona (ZEA) – toxina ce poate fi prezentă în porumbul recoltat târziu ( figura 2.4). Porumbul infectat administrat în hrana animalelor produce acestora stări de vomă. Prezența zearalenonei a fost identificată în aproape toate produsele agricole dar și într-o varietate mare de alimentate ce conțin porumb, precum cereale pentru micul dejun, bere de porumb, făină de grâu, pâine și nuci și în hrana pentru animale produse (http://www.micotoxinas.com.br/zearalenone).

Figura 2.4. Știulete de porumb cu miceliu de Fusarium graminearum, cultură de Fusarium in vitro (Manole, original)

Genul Rhizopus – specii ale genului produc micotoxine ce dau stări de oboseală și poliurie. Apare în general pe toate substraturile vegetale (figura 2.5).

Figura 2.5. Semințe de cereale Figura 2.6. Spice atacate

atacate de Rhizopus spp. (Manole, original) de Cladosporium spp. (Manole, original)

Genul Cladosporium – poate produce la temperaturi scăzute toxine de tipul acizilor tricarboxilici nesaturați care dau simptome caracteristice ATA. Prezent pe cerealele recoltate târziu (figura 2.6).

Genul Trichothecium formează colonii cu aspect pufos de culoare roz-portocaliu. Dintre cele 4 specii ale genului Trichothecium roseum este cel mai întâlnit pe reziduuri vegetale, ca agent al putrezirii semințelor. Este întâlnit pe suprafața boabelor de cereale: grâu, orz, porumb și poate produce mucegăirea pâinii.

Aspecte legislative cu privire la limite maxime admise în Uniunea Europeană de micotoxine în semințele destinate consumului uman sunt prezentate în tabelul 2.1(Dobre, 2015).

Tabelul 2.1

Limite maxime admise Uniunea Europeană

Distribuția micotoxinelor în diferite zone ale globului (http://proalimente.com) se caracterizează prin următoarele:

în regiunile reci (Canada, nordul SUA și majoritatea țărilor Europene) domină aflatoxinele (excepție fac produsele de import provenite din țările calde) dar foarte importante sunt:vomitoxina, zearelenona, ochratoxina A, DAS, toxina T-2 și toxina HT2;

în sudul și centrul Europei, unde se cultivă porumb (Suedia, Austria, Ungaria), domină fusariotoxinele (vomitoxina, zearalenona, toxina T-2); în nordul Europei (Danemarca, Polonia) pe primul loc se află ochratoxina A;

în regiunile calde și umede din America Latină, Asia, Africa și anumite zone din Australia, mai răspândite sunt aflatoxinele.

Posibilități de contaminare în timpul perioadei de vegetației.

Majoritatea cercetătorilor preocupați de acest domeniu clasifică micoflora din substraturile vegetale în trei grupe: micoflora de câmp, micoflora intermediară și micoflora de stocaj.

Apariția și evoluția micotoxinele poate avea loc în toate stadiile, pornind din câmp și până la consumul acestora, fenomen influențat de mai mulți factori.

Factori ce favorizează în câmp pătrunderea micotoxinelor în lanțul alimentar sunt:

Factori biologici: Utilizarea hibrizilor susceptibili la fungi toxicogeni. Speciile fungilor de câmp care colonizează plantele în timpul perioadei de vegetație aparțin genurilor Alternaria spp, Helminthosporium spp., Fusarium spp., Cladosporium spp., Claviceps purpurea.

Factorii tehnologici: sistemul de cultivare: monocultura, densitate mare la semănat, soluri nisipoase (cu conținut ridicat de nisip), semănat întârziat, controlul buruienilor nepotrivit.

Factori de mediu:

Temperatura: pentru producerea aflatoxinelor, temperaturile ridicate sunt mai importante decât umiditatea sau precipitațiile din acea perioadă (F. graminerum, F.culmorum, F. cerealis, F. equiseti, F. Avenacum – infectează cerealele înainte de recoltare, perioada înfloritului, dar contaminarea poate apărea și la depozitare în condiții de umiditate > 22%). Exemple: Aspergillus flavus, Aspergillus ochraceus și Aspergillus ochraceus au ca temperatură minimă de dezvoltare 10oC. Penicillium expansum și Penicillium cyclopirum au ca temperatură minimă de dezvoltare 0oC. Fusarium roseum are ca temperatură minimă de dezvoltare 15oC (DanV., 1975, Tofan C., 2002, Bahrim G., 2002, Nicolau A., 2012).

umiditatea, reprezintă un factor important pentru dezvoltarea ciupercilor și pentru producerea micotoxinelor.

Insectele și rozătoarele: intervin direct în producția de micotoxine, ele pot deteriora tegumentul semințelor prin rozături și perforări ale acestuia, fiind vectori direcți ai sporilor. Semințele sunt protejate de mediul exterior, de tegumente care reprezintă o barieră foarte eficace împotriva penetrării microorganismelor.

Recoltare: perioada și metodele de recoltare. Contaminarea este cumulativă, iar întârzierile la recoltare pot influenta negativ problema contaminării, maturarea semințelor este in jurul 30-32% umiditate, recoltarea la 15% umiditate reduce denaturarea boabelor.

Condițiile de depozitare: temperatura și umiditatea. Boabele contaminate reprezintă principala contribuție la contaminarea cu aflatoxine la depozitare. Mucegaiurile existente în depozite se înmulțesc la o umiditate relativă a aerului cuprinsă între 80-85% și temperatura depășește 25%. Fungii de depozit care se dezvoltă pe semințe umede de porumb, grâu, orez, orz, ovăz, arahide, pot fi specii ale genurilor Aspergillus spp., Penicillium spp. și miceții alterării avansate, precum Fusarium graminearum etc.

Dinamica și formarea micotoxinelor pe semințe presupune o serie de etape: etapa inițială în care se produce infestarea cu mucegai, etapă care este favorizată de temperaturile ridicate umiditatea ridicată a solului. Etapa a doua este etapa care presupune colonizarea semințelor cu patogeni, etapă favorizată de prezența insectelor care distrug pericarpul semințelor și pătrunderea patogenului în interiorul semințelor.

Modalități de prevenire a contaminării cu micotoxine:

Rotația culturilor, semănatul în epoca optimă, cultivarea soiurilor și hibrizilor de cereale și a celorlalte plante tolerante la infestația fungică (Epure l., 2010).

Tratamentul semințelor înainte de semănat și utilizarea semințelor certificate (Gheorhieș C., 2001).

Controlul privind starea fitosanitară a culturilor și controlul infestației cu micotoxine înainte de recoltarea cerealelor prin practici agronomice ce reduc acumularea micotoxinelor pe câmp, irigații corespunzătoare, tehnologie aplicată corespunzător și fertilizarea, distrugerea insectelor.

Inhibarea creșterii și dezvoltării mucegaiurilor prin metodele de recoltare, uscare, stocare și procesare, care să prevină supraîncălzirea acestora pe timpul depozitării (Roman G.V., 2010).

CAPITOLUL 3

METODE DE IDENTIFICARE A PATOGENILOR ȘI A MICOTOXINELOR DE PE SEMINȚE

3.1. Generalități

Aplicarea principiilor moderne pentru evaluarea calității microbiologice a alimentelor, în acord cu conceptele metodei HACCP (Hazard Analysis Control Critical Points) și utilizarea criteriilor de apreciere recomandate de Comisia Internațională de Specificații Microbiologice pentru Alimente (ICMSF) presupun analiza unui număr mare de probe, prin metode rapide, care să ofere răspunsuri prompte și ușor de interpretat (Harrigan și Park,1991).

Uniformizarea criteriilor de evaluare a calității microbiologice a alimentelor a fost posibilă prin elaborarea standardelor internaționale și a specificațiilor microbiologice, general valabile, care includ o prezentare generală a microorganismelor și a toxinelor pe care acestea le-ar putea elabora, descrierea strategiilor de eșantionare, a metodelor analitice (pentru recoltarea probelor, omogenizarea și realizarea diluțiilor), a mediilor de cultură și a condițiilor de termostatare, precum și indicații privind interpretarea rezultatelor.

Aprecierea corectă a parametrilor de calitate, în acord cu cerințele prevăzute de aceste standarde, se va putea realiza numai respectând condițiile analitice impuse de aceste normative, ceea ce constituie garanția realizării corecte a analizelor și interpretării cât mai fidele a rezultatelor (Tofan și colab., 2002).

Principiile moderne de evaluare a calității microbiologice în industria alimentară vizează în principal trei categorii de proceduri analitice:

tehnici de evaluare calitativă, pentru evidențierea selectivă a unor microorganisme indicatori, prin teste care să ateste prezența sau absența acestora;

tehnici de evaluare cantitativă, pentru determinarea încărcăturii microbiene, care să reflecte microbiota totală sau pe grupe specifice de microorganisme;

tehnici de izolare și caracterizare a unor microorganisme din microbiota nespecifică, în special pentru evidențierea potențialului patogen, toxicogen sau de alterare.

Literatura de specialitate prezintă numeroase posibilități de evaluare rapidă a parametrilor microbiologici recomandați pentru aprecierea calității materiilor prime, pe faze de fabricație, precum și a produselor finite (Raugel, 1993). În general, în alegerea celei mai adecvate metode de analiză trebuie să se țină seama de următoarele criterii (Bibek, 1996):

– sensibilitate înaltă pentru concentrații reduse de celule;

– acuratețe și precizie;

– rapiditate;

– să implice o metodologie de lucru simplă, ieftină, nelaborioasă, universal aplicabilă;

– să ofere un răspuns prompt, ușor interpretabil și reproductibil productibil.

În prezent specialiștii consideră că nu există metode general valabile care să îndeplinească cerințele particulare pentru analiza specifică a diverselor produse alimentare. Singurele metode care asigură condiții pentru evaluarea simultană din punct de vedere cantitativ, calitativ și caracterizare a microbiotei sunt cele bazate pe examen cultural. Evaluările de acest tip prevăd stabilirea gradului de contaminare microbiană, prin determinarea numărului de unități formatoare de colonii (UFC), când examenul cultural este corelat cu studii calitative de izolare și caracterizare a microorganismelor contaminante.

În prezent, tehnicile culturale de analiză microbiologică au fost mult perfecționate, aspectele vizate fiind: rapiditatea, simplificarea condițiilor de analiză și posibilitatea obținerii unui răspuns prompt, ușor interpretabil în sensul creșterii acurateței și reproductibilității rezultatelor. Au fost îmbunătățite de asemenea tehnicile destinate evidențierii microorganismelor patogene, prin perfecționarea examenului cultural și corelarea acestuia cu determinări imunologice, de biologie moleculară ș.a. (Jordano și Medina,1999; Bahrim G, 2003).

Trebuie remarcat că rapiditatea tehnicilor culturale moderne nu survine în toate cazurile ca urmare a reducerii perioadei de termostatare, comparativ cu metodele clasice, ci este efectul simplificării metodologiilor de lucru. Astfel, prin inoculare directă se elimină etapele de recoltare și pregătire a probelor pentru analiză, iar prin utilizarea de medii de cultură specifice, cât mai adecvate scopului propus, se asigură dezvoltarea selectivă a microorganismelor studiate.

3.2. Controlul microbiologic al semințelor

Scopul controlului microbiologic este de garantarea siguranței de consum alimentar și obținerea unor produse de calitate bună.

Prin „criteriu microbiologic” se înțelege un criteriu care definește gradul de acceptabilitate al unui produs, al unui lot de produse alimentare sau al unui proces, pe baza absenței, prezenței sau numărului de microorganisme, și/sau a cantității toxinelor/metaboliților acestora, pe unitate(unități) de masă, volum, suprafață sau lot.

„Criteriul siguranței alimentare” înseamnă un criteriu care definește gradul de acceptabilitate al unui produs sau a unui lot de produse alimentare, aplicabil produselor introduse pe piață.

Prin controlul semințelor se urmărește păstrarea la un nivel minim a microorganismelor, punând în evidență tipul de microorganisme, numărul de microorganisme și compușii rezultați prin activitatea microbiană (aciditate, nitriți, etc)

Analizele microbiologice trebuie să fie: rapide și specifice, sensibile, reproductibile, convenabile.

Metodele calitative –prin însămânțare directă.

Metodele cantitative sunt folosite pentru identificarea numerică a unui grup specific de microorganisme din alimente, identificarea microorganisme cu potențial patogen

Tipuri de metode prin care se poate aprecia numărul de germeni din produse alimentare:

Metode care necesită cultivare pe diferite substraturi (medii):

aerobic plate count (standard plate count);

evaluarea numărului de coliformi, fungi și levuri;

anaerobic plate count;

evaluarea microcoloniilor prin filtrare epifluorescentă;

filtrare prin membrane;

filtrare prin grile.

Metode care nu necesită cultivare pe medii de cultură:

examen microscopic direct;

filtrare epifluorescentă;

turbidimetru.

Standard plate count (numărarea directă): pentru determinarea numărului de bacterii dintr-un produs (colony forming units – CFU) este cea mai folosită metodă. Pentru acesta este necesară crearea unor diluții succesive din produsul de testat (0,1-1 ml din fiecare diluție se folosește pentru cultivare, figura 3.1). Incubarea se realizează timp de 48 ore la 32°C. Mediul de cultură cel mai utilizat are în compoziție: triptona 5,0g, Extract de drojdie 2,5g, Glucoza anhidra 1,0, Agar-agar, 12,0-18,0g, Apa până la 1000ml, pH=7,2. Evaluarea CFU pentru numărare se aleg plăcile și se numără manual sau automat coloniile (figura 3.2).

Figura 3.1. Prepararea diluțiilor Figura 3.2. Numărător de colonii

(original, Manole, 2017)

Filtrarea prin membrane principiul metodei constă în utilizarea unor membrane cu porozități suficient de mici (0,4 um) ce rețin bacteriile și fungii. Metoda poate fi aplicată prin filtrare pasivă, dar dezavantajul este acela că filtrul se înfundă relativ rapid, chiar dacă se folosește volum mic de suspensie lichidă, fie prin vidare, iar filtrul încărcat cu microorganisme se depune pe mediu de cultură adecvat și se incubează în condiții optime apoi coloniile formate pot fi identificate, numărate și izolate (figura 3.3).

Figura 3.3. Filtrarea prin membrane

Criterii microbiologice și de igienă care se aplică produselor alimentare, altele decât cele menționate în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005 al Comisiei din 15 noiembrie 2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare pentru categoria derivate din cereale. Ordinul 27/2011 reglementează următorii indicatori microbiologici: (tabel 3.1)

Tabel 3.1

Criterii de siguranță a produselor alimentare

http://www.legex.ro/Ordin-27-2011-113325.aspx

n = numărul de unități care constituie proba.

c = numărul de unități de probă care dau valori între m și M.

*) Se folosește ediția cea mai recentă a standardului.

Criterii de interpretare a rezultatelor:

Rezultatul analizei poate fi:

satisfăcător, în cazul în care toate valorile obținute sunt < m;

acceptabil, în cazul în care numărul maxim al valorilor c din valorile n obținute se situează între m și M, iar restul valorilor observate sunt < m;

nesatisfăcător, în cazul în care una sau mai multe valori obținute sunt > M sau dacă valorile situate între m și M sunt mai mari decât valoarea c.

3.3. Metode moderne de analiză și control al conținutului de fungi și a micotoxinelor din produsele alimentare

Se utilizează metode standardizate conform organismelor de standardizare – AOAC (Asociația Oficială a Chimiștilor Analiști), IUPAC (Uniunea Internațională de Chimie Pura si Aplicata) ISO (Organizația Internațională de Standardizare), CEN (Comitetul European de Standardizare), si asociațiile naționale de standardizare .

Cele mai utilizate metode pentru evidențierea și determinarea cantitativă a micotoxinelor sunt:

Metoda imunoenzimatică – ELISA.

Cromatografia Lichidă de Înaltă performanță – HPLC.

Cromatografia în strat subțire – TLC.

Cromatografia de gaze – GC.

Cromatografia de gaze cuplată cu Spetrofotometrul de masă – GS-MS.

Procedura tipică de determinare a micotoxinelor în probe solide: (Regulamentul CE nr. 401/2006, nr. 178/2010): Eșantionarea probe reprezentative, proba de laborator (lot, sublot, proba elementară, proba globală), măcinare/omogenizare-1, extracție-2, filtrare-3, pipetare-4, incubare, spălare-5, detecție/determinare-6 (figura 3.4).

http://docplayer.gr

Figura 3.4. Aparatura necesară determinărilor

3.3.1. ELISA – metoda imunoenzimatică de determinare a micotoxinelor (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

Principiul metodei ELISA se bazează pe reacția antigen – anticorp, urmând succesiunea etapelor astfel :

Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu anticorpi captură, direcționați împotriva anticorpilor anti-micotoxină.

In fiecare godeu (atât pentru standard, cât și pentru probă) se adaugă conjugatul enzimatic si anticorpii anti-micotoxină.

Micotoxina liberă și conjugatul enzimatic concurează pentru situsurile de legare ale anticorpilor de acoperire ale godeurilor (metoda imunoenzimatica competitiva).

Conjugatul enzimatic nelegat este îndepărtat în faza de spălare.

Se adaugă substratul/cromogen, observându-se virarea culorii de la roșu la albastru.

Adăugarea soluției de stopare a reacției determină modificarea culorii albastre în galben.

Citirea probelor se realizează la 450 nm, iar absorbanța este invers proporțională cu concentrația micotoxinei din probă.

Metoda are atât avantaje: procedeul are sensibilitate ridicată, se poate analiza simultan un număr mare de probe, etapa de preparare a probei este simplă, nu necesită specialiști, folosită pentru etapa de screening, cât și dezavantaje: se pot contamina ușor probele, rezultate fals pozitive/negative de aceea sunt necesare analize de confirmare (HPLC)

Prin acestă metodă se poate detecta și cuantifica:

micotoxinei deoxinivalenol, prin metoda Elisa Cereale, (PS M 13, ed. 1, rev. 4 R – Biopharm – Ridascreen®DON

micotoxinelor aflatoxine totale, prin metoda Elisa Cereale, (PS M 14, ed. 1, rev. 3 R – Biopharm – Ridascreen®Aflatoxin Total

micotoxinei zearalenona, prin metoda Elisa Cereale, (PS M 15, ed. 1, rev. 3 R – Biopharm – Ridascreen®Zearalenon

micotoxinei ochratoxina A, prin metoda Elisa Cereale PS M 16, ed. 1, rev. 3 R – Biopharm – Ridascreen® Ochratoxin A 30/15 (Ghid de utilizare kit imunoenzimatic).

3.3.2. Cromatografie lichidă de înaltă performanță – (High Performance Lichid chromatography-HPLC)

Este o metoda modernă de referință și poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat în cantități foarte mici (ng). În funcție de polaritatea micotoxinelor de separat sau dozat se utilizează HPLC normală sau inversă RF-HPLC.

În prezent cea mai utilizată metodă este HPLC cu detectoare spectrofotometrice în UV/VIS sau fluorescență.

Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare și unul de detecție. Totodată metoda HPLC separă un amestec de compuși prezenți într-un extract dintr-o probă prin afinitatea relativă a acestora pentru o coloana staționară și un solvent mobil. Compușii eluați din coloană trec printr-un detector (fluorescență sau ultraviolete), iar detectorul determină cantitatea compușilor specifici prezenți în proba analizată. Unele dintre toxine prezintă fluorescență naturală: OTA, AFT, acestea putând fi detectate direct în HPCL-FD, Modele de protocoale utilizate în detectarea micotoxinelor prin HPLC sunt redate în tabelul 3.2.

Avantaje: sensibilitate, selectivitate și repetabilitate ridicate, dar și o analiză rapidă.

Dezavantaje: procedeu costisitor care necesită specialiști.

Tabel 3.2

Modele de protocoale utilizate în detectarea micotoxinelor prin HPLC

a

CAPITOLUL 4

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Aplicație practică

4.1. Identificarea surselor primare de ciuperci patogene

În câmp au fost identificate în fenofaza umplerii bobului, diferite stadii de manifestare ale patogenului Fusarium graminearum în timpul vegetației. Spicele afectate prezintă zone de alternanță verde-roz pe care se dezvoltă pernițe de culoare roz-portocalie (sporodochiile ciupercii cu conidiofori și conidii), tipice atacului de Fusarium (figura 4.1). Semințele recoltate prezintă aspectul caracteristic dat de patogen: sunt șiștave și au tegumentul zbârcit. Pe știuleții de porumb a fost identificată ciuperca Gibberella zeae f.c. Fusarium graminearum (figura 4.2).

Figura 4.1. Fusarium graminearum- semințe și spice atacate (original, Manole 2017)

Figura 4.2. porumb atacat de Gibberella zeae, f.c. Fusarium graminearum

(original, Manole 2017)

Analizele microbiologice sunt necesare și indispensabile atât pentru semințele destinate consumului uman, cât și pentru semințele destinate reînsămânțării.

Probele supuse analizei a fost colectate din piețele de cereale. Astfel s-a luat 10 probe de grâu, 10 probe de orz, 8 probe de porumb și 6 probe de floarea soarelui din diferite zone. Pentru a nu influenta determinările microbiologice ale semințelor, acestea au fost ambalate corespunzător după prelevare, în pungi de hârtie (Petcu, 2014).

Semințele nu au fost dezinfectate înainte, deoarece s-a dorit identificarea agenților patogeni pe suprafața semințelor. Au fost utilizate două metode. Semințele au fost plasate pe hârtie de filtru umedă-metoda pliseu (BP-PP) și metoda rulou (BP), (câte 100 semințe/probă, orz și grâu, porumb 50 semințe fl soarelui.) și în plăci Petri de 90mm diametrul (câte 4 semințe/vas/probă) pe mediul de cultură cartof-glucoză-agar (PDA)/(figura 4.3).

Probele pe hârtie de filtru și plăcile Petri inoculate au fost incubate la o temperatură de 22oC timp de 7 zile. La probele amplasate pe hârtie de filtru umiditatea a fost întreținută prin pulverizări la intervale de două zile.

Pentru obținerea culturilor pure s-au efectuat izolări și repicări succesive pe mediul de cultură PDA, (Hulea, 1969). Mediul a fost preparat după rețeta standard: 40gr pulbere de PDA la 1000ml apă, sterilizat prin autoclavare la 121oC, 1,2 atm, 20 min. Când mediul a ajuns la temperatura de 45±1oC a fost turnat în plăcile Petri(20 ml/placă), lăsat apoi la răcit și solidificat.

Repicarea s-a realizat cu ansa microbiologică prin prelevarea unei porțiuni din miceliu și amplasarea acestuia în zona centrală a plăcilor, apoi introduse la incubat la temperatura de 24oC.

Identificarea micromicetelor a fost realizată pe baza literaturii de specialitate (Constantinescu O., 1974, Raicu A, 1978; Hulea A, 1986).

Figura 4.3. Montarea experiențelor

.

Figura 4.4. Colonizarea semințelor cu fungi

Coloniile au fost examinate atât macroscopic cât și microscopic (figura 4.4). Au fost identificate ciuperci ce aparțin genurilor Fusarium spp, dar și specii ale genurilor Alternaria, Penicillium (figurile 4.5, 4.6., 4.7, 4.8), Aspergillus, Cladosporium și Rhizopus. Prepatatele au fost executate la microscopul Kruss optics (40x).

Figura 4.5 Fusarium graminearum -Cultură pură și conidie, (original)

Figura 4.6. Alternaria spp -Cultură pură și conidii, (original)

Figura 4.7. Penicillium spp in vitro, conidiofor palmat cu conidii, aspect microscop 40x (original)

Figura 4.8. Cladosporium spp in vitro, conidii- aspect microscop 40x (original)

Din totalul de probe analizate(tabelul 4.1), la grâul s-a constatat cea mai mare incidență de patogeni la nivelul cariopselor, aceasta fiind de 60%. Cariopsele de porumb au prezentat un procent de 40%, iar pentru probele de orz și floarea soarelui s-a constatat o incidență a patogenilor de 30%.

Tabelul 4.1.

Incidența probelor contaminate cu ciuperci patogene

Pentru probele de grâu au fost identificate ciuperci precum Fusarium spp, Aspergillus spp, Cladosporium spp și Rhizopus spp. Fusarium spp a predominat într-un procent de 50%, Aspergillus spp 20%, Cladosporium spp și Rhizopus spp în procente egale de 15% (figura 4.8).

Figura 4.9. Incidența fungilor la probele de grâu

Din punct de vedere micotoxicologic, jumătate din probe au fost testate prin metoda HPLC, iar cealaltă jumătate prin metoda ELISA.

Dintre cele 10 probe de grâu analizate prin metoda HPLC, deși o probă a prezentat aflatoxina B1, cu o valoare de 9017,39% µg/Kg(-) și aflatoxine totale cu 15617,75% µg/Kg(-), rezultatele au fost declarate satisfăcătoare (tabel 4.2).

Tabel 4.2

Identificarea unor micotoxine din probele de grâu testate

Pentru probele de orz au fost identificate ciuperci precum Aspergillus spp, Alternaria spp Fusarium spp și Penicillium spp. Aspergillus, spp a predominat într-un procent de 50%, Fusarium spp 30%, Alternaria spp cu 15% și Penicillium spp în procente de 5% (figura 4.9).

Figura 4.9. Incidența fungilor la probele de orz

Din punct de vedere micotoxicologic, toate probe de orz au fost testate prin metoda ELISA, și nici una dintre acestea nu au prezentat urme de micotoxine, rezultatele fiind satisfăcătoare (tabel 4.3).

Tabel 4.3

Identificarea unor micotoxine din probele de orz testate

Pentru probele de porumb au fost identificate ciuperci ale genurilor Fusarium spp, Aspergillus spp. Alternaria spp.. Fusarium spp. a predominat într-un procent de 60%, Aspergillus spp 20%, Alternaria spp în procente de 20% (figura 4.10).

Figura 4.10. Incidența fungilor la probele de porumb

Din punct de vedere micotoxicologic, jumătate din probe au fost testate prin metoda HPLC, iar cealaltă jumătate prin metoda ELISA.

Dintre cele 8 probe de porumb analizate nu au fost detectate aflatoxina B1 sau aflatoxine totale pentru care s-au solicitat analize, rezultatele fiind satisfăcătoare (tabel 4.4).

Tabel 4.4

Identificarea unor micotoxine din probele de porumb testate

Pentru probele de floarea soarelui au fost identificate ciuperci precum Fusarium spp într-un procent de 50%,, Alternaria spp 30%, Aspergillus spp 10% și Rhizopus spp. 10% (figura 4.11).

Figura 4.11. Incidența fungilor la probele de floarea soarelui

În probe analizate s-a constatat că au predominat speciile genurilor Fusarium în procente cuprinse între 30% și 60%, iar la Aspergillus spp. 10% și 50%. Cea mai mică pondere a fost înregistrată la Penicillium spp, aceasta fiind de 5%.

La examinarea micotoxicologică, toate probele au fost testate prin metoda HPLC, acestea nefiind contaminate cu aflatoxina B1 sau aflatoxine totale, rezultatele fiind satisfăcătoare (tabelul 4.5).

Tabel 4.5

Identificarea unor micotoxine din probele de floarea soarelui testate

Determinări efectuate asupra unor sortimente de produse ambalate (semințe) destinate vânzării în supermarket.

Colectarea probelor: S-au supus examinării probe luate din produsele afișate la rafturile supermarketurilor, iar determinările au fost realizate prin metodele specifice într-un laborator de profil specializat.

Astfel au fost luate în studiu:

Arahide coaja roșie prăjite și sărate; Arahide fără coajă prăjite și sărate;

Semințe de dovleac prăjite și sărate; Semințe de dovleac prăjite;

Semințe floarea soarelui negre, prăjite și sărate; Semințe floarea soarelui negre, prăjite; Semințe floarea soarelui pestrițe sărate;

Miez floarea soarelui crud;

Musli cu 30% semințe (figura 4.12).

a b c d ef g h i j

Figura 4.12. Eșantioane analizate (original)

Determinarea numărului total de drojdii și mucegaiuri (SR ISO 21527-1/2009)

Acest parametru este un indicator microbiologic sanitar (este o metodă orizontală) se referă la cuantificarea numărului de microorganisme care se dezvoltă în aerobioză, la 25oC±0,1oC , după incubare de 5 zile.

Principiul metodei: Se stabilește gradul de contaminare microbiană al probei de analizat prin incorporarea unei cantități de proba în mediul solid și incubare la 25oC±0,1oC în aerobioză. Se numără coloniile crescute și se raportează la mililitru sau gram de produs în funcție de produsul analizat (SR ISO 21527-2/2009).

Medii de cultură și diluanți: ser fiziologic, ser fiziologic peptonat mediu de cultura solid, glicerol agar- DG-18 (Beuchat L.R., 2001, Deak T, 2001), se mai poate utiliza și DBRC dicloran-rose bengal cloramfenicol agar (King Jr, 1979).

Diluarea probei: Se realizează schema de diluții corespunzătoare produsului analizat

Însămânțarea: fiecare diluție obținută se lucrează în două repetiții, folosind două placi Petri (90mm diam). In fiecare placă se toarnă aproximativ 15 ml mediu nutritiv, topit și răcit la 45±0,5oC, apoi se omogenizează conținutul plăcii Petri prin mișcări de rotație și se lasă în repaus până la solidificarea mediului. In fiecare placă se repartizează aseptic cate 1 ml proba nediluată sau 1 ml din diluțiile decimale.

Incubarea: la 25±1oC, 3-5 zile, cutiile se introduc cu capacul în jos.

Interpretarea și exprimarea rezultatelor: Numărarea coloniilor se face cu lupa sau cu ochiul liber, luând în considerare numai plăcile Petri care conțin 15 – 300 colonii (Beuchat L.R., 2001).

ΣC – suma coloniilor numărate in toate cutiile reținute;

n1 – numărul de cutii reținute dintr-o diluție

n2 – numărul de cutii reținute din diluția succesiva

d – factorul de diluție corespunzător primei diluții din care s-a realizat reținerea plăcilor.

Rezultatele calculate se rotunjesc la doua cifre semnificative. Se exprimă gradul de contaminare printr-un număr cuprins între 1,0 si 9,9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuita lui 10.

Determinare a numărului total de germeni -NTG, (SR EN ISO 4833-1/2014).

NTG reprezintă un indicator microbiologic sanitar, care poate furniza informații asupra stării sanitare de contaminare a semințelor destinate consumului uman.

Principiu. Stabilirea gradului de contaminare cu germeni a unei probe de analizat prin însamanțarea unei cantități de produs în mediul gelozat. Se incubează mediul însămânțat în aerobioza timp de 3 zile, după care se numără coloniile vizibile de levuri tipice după morfologia macroscopică și se raportează la un gram (1 cm) probă.

Medii de cultura și diluanți: ser fiziologic, ser fiziologic peptonat- agar cu triptona- extract de levuri- glucoza (P.C.A.)

Diluarea probei: determinarea se face pe probă, prin diluții zecimale ale acesteia (se ia 1ml. și se introduce într-o eprubetă cu 9ml. de ser fiziologic turnat în prealabil, obținându-se diluția 10-1. Se fac în continuare diluții pana numărul de diluții stabilite.

Însămânțarea:  produsele lichide și fiecare diluție obținută se lucrează în două replici, folosind două plăci Petri. In fiecare placă se repartizează aseptic câte 1 ml proba nediluată sau 1 ml din diluțiile decimale. In fiecare placa se toarnă aproximativ 15 ml mediu nutritiv PCA, topit și răcit la 45±0,5oC, apoi se omogenizează conținutul plăcii Petri prin mișcări de rotație și se lasă în repaus până la solidificarea mediului.

Incubarea: la 35±1oC, 48±2h.

Interpretarea si exprimarea rezultatelor: Numărarea coloniilor se face cu lupa sau cu ochiul liber, luând in considerare numai plăcile Petri care conțin 15 – 300 colonii.

Confirmarea prezentei după perioada de incubare se numără coloniile dezvoltate în fiecare placă Petri. Pentru a afla numărul de germeni se înmulțește numărul de colonii existente într-o placă cu diluția respectivă.

Calculul și exprimarea rezultatelor: numărarea coloniilor de levuri dezvoltate pe întreaga suprafața a mediului însămânțat se face cu ochiul liber, luându-se în considerare numai plăcile Petri în care s-au dezvoltat între 15 și 300 colonii.

ΣC – suma coloniilor numărate in toate cutiile reținute;

n1 – numărul de cutii reținute dintr-o diluție;

n2 – numărul de cutii reținute din diluția succesivă;

d – factorul de diluție corespunzător primei diluții din care s-a realizat reținerea plăcilor.

Determinarea numărului de bacteriilor coliforme (SR ISO 4832/2009).

Principiu. Se toarnă în două plăci Petri mediul de cultură selectiv solid, împreună cu o cantitate specifică dintr-o suspensie inițială în cazul altor produse. Alte două replici de plăci Petri cu mediu de cultură selectiv solid sunt preparate în aceleași condiții, folosind diluții zecimale din suspensia inițială. Plăcile Petri sunt incubate la 35/37°C timp de 24/48 h.

Coloniile caracteristice sunt numărate iar dacă este necesar, numărul de colonii este confirmat prin testul fermentării lactozei. Numărul de colonii pe mililitru sau pe gram din proba este calculat după numărarea coloniilor caracteristice dezvoltate în plăcile Petri folosite.

Medii de cultură și reactivi:

– diluanți (ser fiziologic peptonat, apa peptonată tamponată, citrat de sodiu 2%);

– agar-cristal violet-roșu neutru-bila-lactoza (VRBL); bulion-verde briliant-bila-lactoza (BBLV); bulion cu triptoză și lauril sulfat (LST).

Modul de lucru: recoltarea probelor și efectuarea diluțiilor se face conform STAS-ului (SR ISO 4832/2009).

Inocularea și incubarea: se pregătesc două plăci Petri pentru fiecare diluție aleasă. Se transferă cu o pipeta sterila 1 ml din produsul lichid sau diluția adecvată în centrul fiecărei plăci. Se folosește o altă pipetă sterilă pentru a inocula fiecare diluție în plăcile Petri. Se efectuează între două straturi de mediu. Se distribuie aproximativ 15 ml de VRBL încălzit la 44°C, in fiecare placă Petri. Perioada de timp între prepararea diluțiilor și momentul în care mediul este turnat în plăcile Petri nu trebuie sa depășească 15 minute. Inoculul se omogenizează cu atenție în mediul turnat și se lasă sa se solidifice, având grijă ca plăcile Petri sa fie plasate pe o suprafață orizontală rece. De asemenea, se pregătește o placa martor cu 15 ml mediu pentru verificarea sterilității mediului. După completa solidificare, se toarnă aproximativ 4 ml mediu VRBL, încălzit la 44- 47°C, pe suprafața mediului inoculat. Se lasă sa se solidifice conform descrierii de mai sus. Se întorc plăcile astfel preparate și se introduc în termostat la o temperatura de 37° C timp de 24 ore.

După perioada specifică de incubare, se selectează, dacă este posibil, plăcile Petri care conțin intre 10 și 150 de colonii. Se numără coloniile roșii purpurii cu un diametru mai mic de 0,5 mm (uneori acestea sunt înconjurate de o zona roșie de precipitare a bilei). Acestea sunt considerate ca fiind colonii tipice de coliformi și nu necesită o altă confirmare.

Determinarea numărului de Escherichia coli (SR ISO 16649-2/2007).

Principiu. Se toarnă în două plăci Petri mediul de cultură selectiv solid, împreună cu o cantitate specifică dintr-o suspensie inițială în cazul altor produse. Alte două replici de plăci Petri cu mediu de cultură selectiv solid sunt preparate în aceleași condiții, folosind diluții zecimale din suspensia inițială. Plăcile Petri sunt incubate la 35/37°C timp de 24/48 h. Coloniile caracteristice sunt numărate iar dacă este necesar, numărul de colonii este confirmat prin testul fermentării lactozei. Numărul de colonii pe mililitru sau pe gram din proba este calculat după numărarea coloniilor caracteristice dezvoltate în plăcile Petri folosite.

Medii de cultură și reactivi:

– diluanți (ser fiziologic peptonat, apa peptonată tamponată, citrat de sodiu 2%);

– bulion-verde briliant-bila-lactoza (BBLV); bulion cu triptoză și lauril sulfat (LST).

Modul de lucru: recoltarea probelor și efectuarea diluțiilor se face conform STAS-ului (SR ISO 16649-2/2007).

Inocularea și incubarea: se pregătesc două plăci Petri pentru fiecare diluție aleasă. Se transferă cu o pipeta sterila 1 ml din produsul lichid sau diluția adecvată în centrul fiecărei plăci. Se folosește o altă pipetă sterilă pentru a inocula fiecare diluție în plăcile Petri. Se efectuează între două straturi de mediu. Se distribuie aproximativ 15 ml de BBLV încălzit la 44°C, in fiecare placă Petri. Perioada de timp între prepararea diluțiilor și momentul în care mediul este turnat în plăcile Petri nu trebuie sa depășească 15 minute. Inoculul se omogenizează cu atenție în mediul turnat și se lasă sa se solidifice, având grijă ca plăcile Petri sa fie plasate pe o suprafață orizontală rece. De asemenea, se pregătește o placa martor cu 15 ml mediu pentru verificarea sterilității mediului. După completa solidificare, se toarnă aproximativ 4 ml mediu BBLV, încălzit la 44- 47°C, pe suprafața mediului inoculat. Se lasă sa se solidifice conform descrierii de mai sus. Se întorc plăcile astfel preparate și se introduc în termostat la o temperatura de 37° C timp de 24 ore.

După perioada specifică de incubare, se selectează, dacă este posibil, plăcile Petri care conțin intre 10 și 150 de colonii. Se numără coloniile roșii -violacee, cu centrul mai închis la culoare, cu reflexe metalizate auriu –verzui.

Determinarea numărului de Salmonella (SR ISO 6579/2003/AC/2009).

Principiu. Pentru prepararea suspensiei inițiale se folosește ca lichid de diluție mediul selectiv de preîmbogățire apa peptonată tamponată (A.P.T.), în cantitate de 225 ml și (ml) de proba analizată. Daca proba de analizat recomandată nu este de , se utilizează cantitatea necesara de mediu de preimbogatire pentru a se obține o diluție aproximativ 1:10 (masa volum).

Plăcile Petri sunt incubate la 37°C± timp de 18 h ± 2 h. După incubarea suspensiei inițiale (preîmbogățire ) timp de 18 h ±2h, se transfera 0,1 ml din cultura obținută într-o eprubeta cu 10 ml bulion RVS (primul mediu de îmbogățire selectiv) și se incubează timp de 24 h± 3h la 41,5șC±. De asemenea se transfera 1 ml din cultura obținută în 10 ml mediu cu bulion MKTT (al doilea mediu de imbogatire selectiv) și se incubează la 370C±, timp de 24 ore.

Medii de cultură și reactivi:

– diluanți (ser fiziologic peptonat, apa peptonată tamponată);

– mediu cu bulion RVS; mediu cu bulion MKTT; agar XLD; Rambach (Cromogen agar).

Modul de lucru: recoltarea probelor și efectuarea diluțiilor se face conform STAS-ului (SR ISO 6579/2003/AC/2009).

Inocularea și incubarea: se pregătesc două plăci Petri pentru fiecare diluție aleasă. După incubare de 24 h±3 h, folosind cultura obținută in bulion RVS, se inoculează cu ajutorul unei anse suprafața unei placi Petri de dimensiuni mari care conține primul mediu selectiv de izolare (agar XLD), astfel încât sa se obțină colonii bine izolate.

Se procedează în același fel cu al doilea mediu de îmbogățire selectiv, pe al doilea mediu de izolare selectiv Rambach, folosind o ansa sterila si cutii Petri ca mai sus. Plăcile se pun in incubatorul fixat la 370C cu fundul in sus.

După incubare timp de 24 h±3 h, se examinează plăcile pentru prezenta coloniilor tipice de Salmonella si coloniile atipice ce ar putea fi Salmonella. Se marchează poziția lor pe spatele plăcii.

Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar XLD au un centru negru și o zona transparenta luminoasa de culoare roșiatica datorata schimbării culorii indicatorului. Variantele de Salmonella H2S-negative crescute pe agar XLD sunt roz cu centrul roz închis. Salmonella loctoza-pozitiva crescuta pe agar XLD este galbena cu sau fara negreala.

Se incubează cel de-al doilea mediu selectiv solid Rambach la temperatura corespunzătoare si se examinează după un timp corespunzător pentru a verifica prezenta coloniilor care, prin caracteristicile lor, sunt considerate a fi prezumtiv Salmonella, colonii de culoare roz- roșu.

Determinarea numărului de a Enterobacteriaceelor – ISO 21528-2/2007.

Principiu. Se iau două cutii Petri sterile. Cu o pipeta sterilă se trece în fiecare cutie cate 1 ml proba, dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din suspensia inițială, în cazul altor produse.

Se iau încă două cutii Petri sterile. Cu o altă pipetă sterilă, se trece câte 1ml din diluția 10-1 (produs lichid) sau câte 1 ml din diluția 10-2, in fiecare cutie. Dacă este necesar procedeul se repetă și cu alte diluții, folosind de fiecare dată o pipeta sterilă.

Medii de cultură și reactivi:

– diluanți (ser fiziologic peptonat, apă peptonată tamponată);

– agar-cristal violet-roșu neutru-bila-glucoză (VRBG);

Modul de lucru: recoltarea probelor și efectuarea diluțiilor se face conform STAS-ului

Inocularea și incubarea: Se toarnă în fiecare placă Petri aproximativ 10 ml mediu VRBG, topit în prealabil și menținut la 440C în baia de apă.

Timpul scurs intre inocularea în placa Petri și momentul în care mediul este turnat în cutiile Petri, nu trebuie să depășească 15 minute.

Inoculul este amestecat cu grijă cu mediul și amestecul este lăsat să se solidifice, așezând cutiile Petri pe o suprafața orizontală, rece.

După solidificarea completă a amestecului, se adaugă un strat deasupra de aproximativ 15 ml mediu VRBG, apoi răcit pentru a preveni împrăștierea și pentru a realiza condiții semi- anaerobe. Se lasă să se solidifice.

Cutiile sunt așezate cu capacul în jos, în incubator, la 37oC pentru 24h±2h.

Confirmare: Coloniile caracteristice sunt roz pana la roșu închis (cu sau fără zona de precipitare-halou). Se selectează cutiile care conțin mai puțin de 150 colonii.

În următoarele tabele (tabelele 4.6-4.) sunt prezentate rezultatele de laborator privind drojdiile și mucegaiurile, numărul total de germeni, bacteriile coliforme, Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Aflatoxina B1 și Aflatoxine totale.

Probele analizate corespund din punct de vedere al indicatorilor testați.

Suplimentar s-au analizat numărul total de germeni ce reprezintă un indicator sanitar al produsului și implicit al fluxului tehnologic de producție. Prezența acestora indică faptul că beneficiarul produselor trebuie să ia masuri de igienă corespunzătoare.

Tabelul 4.6

Tabelul 4.7

Tabelul 4.8

Tabelul 4.9

Tabelul 4.10

Tabelul 4.11

Tabelul 4.12

Tabelul 4.13

Miez floarea soarelui crud (f)

Tabelul 4.14

Tabelul 4.15

Musli cu 30% semințe (k)

Figura 4.13. Probe pe mediu DBRC și mediu DG 18

CONCLUZII

Siguranța și calitatea semințelor destinate consumului uman poate deveni un fapt real dacă ea constituie responsabilitatea tuturor celor implicați în domeniul alimentar, de la producători la consumatori.

Pentru ca semințele, luate ca atare sau ca materii prime pentru alte alimente, care ajung pe masa consumatorului, să fie sănătoase și sigure, lipsite de riscul contaminării, atunci de-a lungul procesului de obținere, trebuie să fie implementate diverse proceduri și mecanisme de control.

Principalele ciuperci patogene identificate, care produc pagube însemnate culturilor de cereale, transformând recoltele în surse de contaminare cu micotoxine, aparțin următoarelor genuri: Fusarium (fuzarioze), Claviceps purpurea (cornul secarei), Penicillium spp, Alternaria spp, Aspergillus spp (mucegaiuri).

Pentru culturile de câmp s-au identificat patogeni care produc micotoxine aparținând genului Fusarium spp. la grâu și porumb (în timpul perioadei de vegetație și la produsele depozitate).

În urma determinărilor din laborator realizate asupra semințelor de grâu, orz, porumb și floarea soarelui, s-au constatat următoarele: un procent de 60% probe infectate cu patogeni la grâu, la porumb procentul s-a situat la valoarea de 40%, iar la orz și floarea soarelui, probele au prezentat o incidență a patogenilor de 30%.

Prezența fungilor toxicogeni de tipul Fusarium spp, Alternaria spp, Rhizopus spp, Penicillium spp., Aspergillus spp și Cladosporium spp. a fost apreciată ca fiind cuprinsă între 5% la specii ale genul Penicillium (orz) și 60% la Fusarium spp (porumb).

În probe analizate s-a constatat că au predominat speciile genurilor Fusarium în procente cuprinse între 30% și 60%, iar la Aspergillus spp. 10% și 50%.

O probă de grâu, analizată metoda HPLC, a prezentat toxine într-un procent de 9017,39% µg/Kg(-) și aflatoxine totale cu un procent de 15617,75% µg/Kg(-). Aceste valori se încadrează în limitele de referință, rezultatul fiind satisfăcător.

Din punct de vedere micotoxicologic, toate probe de orz, porumb și floarea soarelui testate prin metoda ELISA, nu au prezentat urme de micotoxine, rezultatele fiind satisfăcătoare.

În probele de semințe achiziționate din supermarket-uri rezultatele de laborator privind drojdiile și mucegaiurile, bacteriile coliforme, Escherichia coli, Salmonella, Enterobacteriaceae, Aflatoxina B1 și Aflatoxine totale s-a constatat că probele analizate corespund din punct de vedere al indicatorilor testați.

Suplimentar s-au analizat numărul total de germeni ce reprezintă un indicator sanitar al produsului și implicit al fluxului tehnologic de producție. Prezența acestora indică faptul că produsele în timpul procesului de transport/condiționare nu au beneficiat de condiții corespunzătoare, astfel trebuie luate măsuri de igienă corespunzătoare.

BIBLIOGRAFIE

Avram E., 2008, Importanța și rolul microorganismelor în alimente, Studia Universitatis, Seria Științe Inginerești și Agro-Turism Nr. 3/2008

Bahrim G., 2003, Evaluarea calității microbiologice a alimentelor prin utilizarea petrifilmelor, Buletinul AGIR nr. 3/2003, iulie – septembrie

Bara C., – 2005, Microbiologia alimentelor – Editura Universității din Oradea

Bibek R., 1996, Fundamental Food Microbiology. CRC Press, Boston,Londra, New York.

Beuchat LR, Frandberg E, Deak T, Alzamora SM, Chen J, Guerrero AS, López-Malo A, Ohlsson I, Olsen M, Peinado JM, Schnurer J, de Siloniz MI, Tornai-Lehoczki J. 2001, Performance of mycological media in enumerating desiccated food spoilage yeasts: an interlaboratory study. Int J Food Microbiol. Oct 22;70(1-2):89-96.

Ciocoiu Emilia, Manole Mali Sanda, Geamăn Ioan, 2012. Microbiologie, Ed. Printech, Bucuresti.

Cârstocea, Isabela Mădălina (2016), Lucrare disertație: Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine/ Conducător științific: Prof. univ. Dr. Aneta Pop

Constantinescu O., 1974, Metode și tehnici în micologie. Ed. Ceres, București,

Cole, R.J. (1986), Modern methods in the analysis and structural elucidation of mycotoxins. Academic press, Orlando.

Cornea, C. P., Ciuca, M., Voaideș, C., Gagiu, V., Pop, Aneta (2011), Incidence of fungal contamination in a Romanian bakery: a molecular approach. Romanian Biotechnological Letters, 16(1), 5863-5871.

Dan Valentina, Oancea Ioana, Kramer Cristina, Zara Margareta, Tofan Clemansa. 1991, Controlul microbiologic al produselor alimentare. Universitatea Galați.

Dan, Valentina. 1999, Microbiologia produselor alimentare. Vol. I. Ed. Alma. Galați.

Deak T, Chen J, Golden DA, Tapia, Tornai-Lehoczki J, Viljoen BC, Wyder MT, Beuchat LR., 2001, Comparison of dichloran 18% glycerol (DG18) agar with general purpose mycological media for enumerating food spoilage yeasts. Int J Food Microbiol. 2001 Jul 20;67(1-2):49-53.

Douglas King A., Jr., John E. Schade 1984, Alternaria Toxins and Their Importance in Food, Journal of Food Protection, Vol. 47, No. 11, Pages 886-901

Dobre I.R., 2015, Legislație privind expertiza produselor agroalimentare, Editura Printech, București.

Harrigan, W.F., Park, R.W. , 1991, Making safe food. A management guide for microbiological quality. Academic Press, Londra, New York.

Hulea Ana, 1969, Ghid pentru laboratoare de micologie și bacteriologie, Editura Agro-Silvică.

Gheorghieș C., Cristea S., 2001, Fitopatologie, Editura Ceres, București

Georgescu N., Savu C., 2004, Siguranța alimentelor, riscuri și beneficii, Editura Semne, București.

Israel-Roming F., Rotaru S., Luta G., Gherghina E., Balan D., Simion V., 2010, Prezența deoxinivalenolului si a ochratoxinei A in porumb. Simpozion "Perspective în prevenirea și combaterea miceților și micotoxinelor", Târgu Mureș

Jordano, R, Medina, L. 1999, „ Petrifilm – An Enhanced cultural technique”.In: Robinson, RK; Batt, CA; Patel, PD .eds. Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3, p.2095-2100, Academic Press.

Jordano, R. et al. 1995.Comparison of Petrifilm method to conventional methods for enumerating aerobic bacteria, coliforms, Escherichia coli and yeasts and molds in foods. J. Food Prot., 51, p. 658-662,

King Jr, A.D. Hocking A.D., pitt J.I. 1979, Dichloran- rose bengal medium for enumeration and isolation of mold from food. Appl. Environ. Microbilo. 37. Pp 959-964

Lawley, R., 2010. Alternaria. Factsheet. European Mycotoxin Awareness Network, EMAN. http://www.mycotoxins.org.

Logrieco A, Moretti A, M. Solfrizzo 2009, Alternaria toxins and plant diseases: an overview of origin, occurrence and risks, World Mycotoxin Journal Vol. 2, No. 2, pp. 129-140

Măruțoiu, C., Tofană M., Delia Nica-Badea, Andreea Popescu, 2005, Cromatografia pe strat subțire, Analiza produselor alimentare, Editura Etnograph, Cluj-Napoca

Morgan, M.R.A. 1989, Mycotoxin immunoassays: with special reference to ELISAs. Tetrahedron, 45, 2237-2249.

Papuc C., 2016, Note de curs.

Park, J.Ch., Zong, M.S., & Chang, I.-M. 1991, Survey of the presence of the fusarium mycotoxins nivalenol, deoxynivalenol and T-2 toxin in Korean cereals of the 1989 harvest. Food Additives and Contaminants, 8(4), 447-451.

Petcu C.D., 2014. Ambalaje utilizate in industria alimentara, cap. Materiale celulozice, 56-60, Ed Granada, Bucuresti, ISBN 978-606-8254-55-5.

Popescu O., Coman I., 1965- Micotoxine și micotoxicoze, Editrura Cres, București

Pop I.A. 2013, Comportarea unor soiuri de cereale păioase și hibrizi de porumb la atacul ciupercilor fitopatogene și gradul de infestare cu miceți și micotoxine în condițiile pedoclimatice din centrul Transilvaniei, Teza de doctorat, USAMV Cluj

Proboteanu, Paula (2016), Lucrare disertație: Determinarea unor micotoxine din probe de făina/ Conducător științific: Dr. Gheorghe Valentin Goran/ Disciplina: Inocuitatea produselor alimentare/ Specializarea: CEPA /

Raicu C., Baciu D., 1978, Patologia seminței. Editura Ceres, Bucuresti.

Raugel, N. 2002, Nouveaux outils et nouvelles méthodes d'analyse rapide en agro-alimentaire. Tech. Et Doc, Lavoisier, Paris.

Roman Gh..V., Epure L., Toader M., Ionescu A.M., 2010, Tehnologia obținerii și valorificării produselor de origine vegetală. Manul de lucrări practice. Editura Universitară, București.

Serdaru M., 2010, Impactul unor micotoxine asupra sănătății și producției la vacile de lapte, Simpozion "Perspective în prevenirea și combaterea miceților și micotoxinelor", Târgu Mureș.

Tăpăloagă D., 2013, Controlul calității produselor agroalimentare de origine vegetală. Caiet de lucrări practice. Editura Granada, București.

Tofan, C., Bahrim, G., Nicolau, A., Zara, M. Microbiologia produselor alimentare. Tehnici și analize de laborator. Editura AGIR, București, 1993.

Upman, M., Bonaparte, C. Rapid methods for food hygiene inspection. In: Robinson, RK; Batt, CA; Patel, PD .eds., Encyclopedia of Food Microbiology, vol.3, p.1887-1895, Academic Press, 1999.

***Parteneriate în domenii prioritare – Contract nr. 5.1.1/2008 Sistem integrat pentru reducerea contaminarii cu fungi si micotoxine in industria panificației, in scopul creșterii siguranței alimentare

***Plan sectorial ADER 2020 – ADER 8.1.1./2011 Evaluarea riscului privind contaminarea cu micotoxine a producțiilor anuale de grâu din România

*** SR EN ISO 6579/2003, SR EN ISO 6579 AC/2009, Metoda orizontală pentru detectarea bacteriilor din genul Salmonella.

*** SR EN ISO 16649-2/2007, Metoda orizontală pentru numărarea Escherichia coli pozitivă la β-glucuronidază.

Surse Web:

http://www.micotoxinas.com.br/Aflafacts.pdf

http://www.micotoxinas.com.br/

http://www.wageningenacademic.com/doi/pdf/10.3920/WMJ2008.x013

http://proalimente.com/contaminarea-micotoxicologica-orzului/

http://www.rasfoiesc.com/educatie/biologie

http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2006R1881:20100701:RO:PDF

http://www.justice.gov.md/file/Centrul%20de%20armonizare%20a%20legislatiei/Baza%20de%20date/Materiale%202012/Legislatie/32006R0401.PDF

http://www.ansvsa.ro/download/legislatie/zoonoze/Regulament-2073_2005-criteriile-microbiologice-pentru-produsele-alimentare-forma-consolidata_RO.pdf

http://www.legex.ro/Ordin-27-2011-113325.aspx

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/RO/TXT/?uri=celex:32005R2073

http://docplayer.gr/35824588-Impactul-micotoxinelor-asupra-lantului-alimentar-metode-moderne-de-analiza-si-control-al-continutului-de-fungi-si-micotoxine-din-produsele-alimentare.html