Rolul Lui Lmx1a In Organism Licenta Capitolul 2.3 [307184]

2.1. Familia proteinelor LIM

Proteinele LIM pot fi împărțite în două clase majore : proteine LIM citoplasmatice și proteine LIM nucleare . [anonimizat] . Marea majoritate a proteinelor LIM citoplasmatice au rol în reglarea citoscheletului . [anonimizat] , au fost prima dată descoperite ca oncogene în leucemia umană asociată celulelor T [anonimizat] o [anonimizat] a influența expresia genică . [anonimizat]. [anonimizat]

2.1.1 Proteinele LMO (Lim Only Nuclear)

[anonimizat] ( LIM only nuclear) – [anonimizat] a [anonimizat] o funcție importantă în dezvoltare . Domeniile LIM ale LMO prezintă o secvență de aminoacizi diferită față de domeniile LIM care au rol în organizarea citoscheletică . De asemenea, s-a arătat faptul că proteinele LIM nucleare sunt implicate în realizarea oncogenezei .

Figura 1. Diagramă schematică a proteinelor LMO care arată aranjamentul în tandem ale celor două domenii LIM. [anonimizat] 4 resturi de aminoacizi. [anonimizat] (imagine preluată după

Pînă în prezent s-au descoperit 12 gene ale domeniilor LIM și 4 proteine aparținînd clasei LMO ; proteinele LMO sunt: LMO-1, LMO-2, LMO-3 și LMO-4. Proteinele LMO-1 și LMO-2 au fost inițial descoperite la pacienți care suferă de leucemia asociată limfocitelor T, prin intermediul locației acestora la nivelul punctelor de întrerupere a translocării. În urma acestor translocări s-au putut evidenția expresiile anormale ale acestor proteine în timus și în limfocitele T, aceste tipuri celulare exprimînd doar un nivel scăzut al lui LMO-1 și LMO-2. Prin supraexpresia lui LMO-1 sau LMO-2 în timusul animalelor transgenice s-a putut dovedi faptul că acestea pot provoca apariția unor modificări ale limfocitelor T. [anonimizat]-2 [anonimizat] a unei gene. Astfel, în lipsa proteinei LMO-2, șoarecii sunt incapabili de a [anonimizat].

Figura 2.Rolul lui LMO2 în dezvoltare la șoareci. Gena LMO2 [anonimizat]. LOM2 are un rol esențial în hematopoieza primitivă (a) (Warren și colab., 1994) , cît și în cea definitivă (b) și este ubicuitară pentru remodelarea rețelelor vasculare ca parte a angiogenezei (c) . S-a arătat că LMO2 este exprimat în sistemul nervos în timpul dezvoltării . (imagine preluata dupa Chambers și Rabbitts, 2015)

Domeniile LIM ale proteinei LMO-2 interacționează cu factorii transcripționali TAL1-47 și GATA1 , formîndu-se astfel un complex de legare a ADN capabil de a activa procesul transcripțional. TAL1-E47 are rolul de a recunoaște secventele de ADN-Ebox, iar GATA1 recunoaște secvențele ADN-GATA. În urma acestui proces se formează un complex LMO-2 – TAL1- E-47 – GATA1 , acesta fiind capabil de a recunoaște secventele GATA E-box din cadrul ADN, ducînd la transcrierea genelor specifice necesare procesului de hematopoieză. Activarea transcripției este dependentă de interacțiunea dintre LMO-2 și adaptorul nuclear, NLI, dar și de homodimerizarea lui LDB1. De asemenea, LMO-2 interacționează și cu GATA2, cu proteina Tal1/Scl, aceștia fiind factori de transcripție care aparțin clasei bHLH ( basic helix-loop-helix). De exemplu, la soarecii de tip knock-out , s-a demonstrat că acești factori de transcripție au și un rol fiziologic, deoarece aceșția pot inhiba realizarea eritropoiezei. La animalele duble transgenice, unde au loc modificări ale limfocitelor T, proteina Tal1 este supraexprimată împreună cu LMO-2, demonstrîndu-se astfel un potențial sinergic al ambelor proteine.

Figura 3. Reprezentare grafică a complexelor proteice LMO2. (A) LMO2 se găsește la la nivelul complexelor factorilor transcripționali care leaga ADN-ul, incluzînd proteinele TAL1/SCL, E47, LDB1 și GATA1 în celulele eritrocitare normale și în (B) are loc un complex diferit la nivelul celulelor T tumorale de la nivelul proteinei LMO2 la șoarecele transgenic, acest complex fiind alcătuit din Lmo2, Tal1/Scl, E47 și Ldb1 (imagine preluată după Nam și Rabbitts, 2006)

LMO-4 prezintă în structura sa două domenii LIM, unite între ele printr-o legătură scurtă. Prin cristalografie cu raze X s-a arătat faptul că nu există legături stabile între cele două domenii, dar în momentul în care LMO-4 este complexată de partenerul său de interacție, orientarea domeniilor devine fixă. Totuși, datorită faptului că nu este cunoscută întreaga structură si lungime a proteinei LMO-4, nu se poate spune cu exactitate dacă orientarea devine fixă în momentul legării de proteina țintă sau după legare. In vivo, LMO-4 poate interacționa cu mDEAF ( factorul autoreglator epidermic deformat ) și DEAF1. În plus, domeniile LIM din componența proteinelor LIM nucleare nu interacționează doar cu factori transcripționali, ci și cu cofactori, dintre aceștia făcînd parte : CLIM1/Ibd2 si CLIM2/Ibd1/NLI/Chip. În urma acestor interacții și pe baza testelor experimentale se poate constata faptul ca proteinele LIM nucleare au rol în formarea complexelor multiproteice de la nivelul moleculei de ADN, din care rezultă faptul că au importanță și în realizarea procesului de transcripție.

2.1.2 Proteinele LIM kinaze

Proteinele LIM kinaze sunt , de fapt, serin/treonin kinaze care conțin în structura lor două domenii LIM aflate în regiunea N-terminală , aceste domenii LIM legîndu-se la un domeniu kinazic C-terminal ( Bernard și colab.,1994; Mizuno și colab.,1994; Okano și colab., 1995; Stanyon și Bernard, 1999) . Descoperirea proteinelor LIM kinazice a avut la bază fosforilarea cofilinei, factorul de dezasamblare al actinei, evidentiîndu-se rolul acestora în reorganizarea citoscheletului de actină . Pînă în prezent au fost descoperite două LIM kinaze, Lmk1 și Lmk2 ( Bernard și colab., 1994; Mizuno și colab., 1994; Okano și colab. , 1995; Stanyon și Bernard, 1999) . În interiorul acestor LIM kinaze există secvențe țintă, astfel încît acestea pot fi direcționate în citoplasmă sau în nucleu sau pot fi transferate între ambele compartimente, cum este în cazul lui Lmk1 .

Lmk1 prezintă un rol central în procesul de organizare al scheletului de actină și acesta este fosforilat de catre factorul Rho GTP-azic asociat cu kinaze (ROCK) , acesta fiind implicat în reorganizarea indusă de Rho a citoscheletului de actină (Maekawa și colab., 1999).În plus, Lmk1 are capacitatea de a activa factorul de răspuns seric (SRF), acest factor fiind implicat în procesul de transcripție și în reglarea mai multor gene inductibile seric și specific-muscular (Bach,2000). Activarea factorului de răspuns seric de către LMK1 este dependentă de modificarea dinamicii actinice (Sotiropoulos și colab., 1999) , fiind astfel reprezentat rolul pe care Lmk1 îl exercită în morfogeneza și motilitatea celulară .

Figura 4. Căile de semnalizare intracelulară. Membrii subfamiliei Rho din clasa GTP-azelor, care includ Rac, Rho și Cdc42 , mediază răspunsurile chemotropice prin rolul său la nivelul dinamicii citoscheletului (Hall și Lalli, 2010). Rac și Rho activează LIM kinaza (LIMK) prin intermediul PAK ȘI ROCK, iar LIMK reglează depolimerizarea actinei indusă de cofilină

Autoinhibiția reprezintă un fenomen care implică deletia unui singur domeniu în timp ce alt domeniu prezintă o activitate îmbunătățită . De exemplu, deleția sau mutația la nivelul resturilor de zinc coordinate la nivelul proteinei Lmk1 duce la creșterea activității kinazice , iar domeniile LIM care au fost obținute în trans pot interfera cu activitatea kinazică prin legarea în mod direct la domeniul kinazic . În plus, pe lîngă ROCK, Lmk1 poate fi fosforilată și de către PAK1 , unde ROCK și PAK1 reprezintă efectori în aval ai lui Rho si, respectiv, ai lui Rac , ceea ce semnifică că autoinhibarea LIM-dependentă poate fi afectată în mod direct de către fosforilare .

2.1.3 Alte tipuri de proteine LMO

La vertebrate , au fost descoperite mai multe proteine multi LIM care fac parte din clasa de proteine bogate în cisteină (CRP) , acestea fiind reprezentate de CRP1, CRP2, CRP3/MLP și CRIP. Proteina CRP are în componență doar un singur domeniu LIM, în timp ce celelate proteine, CRP1-CRP3 contin fiecare cîte două domenii LIM (Perez-Alvaro și colab., 1996 ; Dawid și colab., 1998). La CRP1 și CRP2, cele două domenii LIM se împachetează independent, neexistînd o orientare preferențială ori legături stabile între ele, ceea ce susține ideea de modularitate a domeniului LIM . Zona de interacție dintre cele două domenii LIM ale proteinelor CRP1 si CRP2 este flexibilă , conține o cantitate mare de glicină și prezintă o structură mai mare de 50 de resturi de aminoacizi, deși , de obicei, proteinele multi-LIM au în componență între 8 și 10 resturi de aminoacizi. La om, au fost identificate proteinele CRP1, CRP2 și CRP3. CRP1 și CRP2 se găsesc cu precădere în mușchiul neted, in timp ce CRP3 este specifică mușchiului striat, fiind cunoscută și sub denumirea de proteina LIM musculară (MLP). Aceste proteine sunt asociate cu citoscheletul de actină deoarece ele interacționează cu α-actinina. La fel ca celelate tipuri de proteine LIM, proteinele CRP , odată ajunse în nucleu, participă la expresia genică, de data aceasta muscular-specifică. Mecanismul prin care proteinele CRP favorizează expresia genică este cel mai bine explicat la proteinele CRP1 și CRP2, deoarece acestea cuplează factorul de răspuns seric cu domeniul LIM din regiunea N-terminală și factorii GATA , în principal GATA4 și GATA6 cu domeniul LIM din regiunea C-terminală, această cuplare avînd loc într-o manieră cooperativă. Astfel, se formează un complex terțiar, denumit SRF-CRP-GATA, acesta avînd rol în evidențierea expresiei markerilor de diferențiere ai mușchiului neted, în timp ce un complex binar prezintă o expresie genică mai scăzută. Datorită rolului pe care proteinele CRP îl exercită în contracția musculară și în reglarea transcripțională, membrii familiei CRP contribuie la homeostazia sistemului muscular și pot fi folosiți ca markeri pentru evidențierea stării fiziologice a acestuia.

În momentul în care muschiul se află într-o stare de stres sau este lezat, proteinele CRP transmit semnale celulare nucleare astfel încît să se inițieze repararea zonei sau țesutului lezat prin intermediul unei gene specific musculaă. De aceea, se presupune că CRP3 poate fi o componentă a unui factor de stres localizat în discurile Z ale cardiomicetelor. În momentul în care funcționează necorespunzator, la oameni poate apărea boala denumită cardiomiopatie dilatativă. Atunci cînd cardiomicetele interceptează factorii de stres mecanic , are loc o modificare la nivelul expresiei genice, aceste modificări putînd duce la apariția hipertrofiei. De exemplu, la șoarecii la care hipertrofia a fost indusă , in vitro, se poate observa o relocalizare nucleară a proteinei CRP3. Mai mult, la speciile de șoareci care nu prezintă gene pentru această proteină există disfuncții atît la nivelul mușchiului cardiac, cît și la nivelul mușchiului scheletic. Membrii familiei de proteine CRP reprezintă componenți esențiali ai mecanismelor reglatoare multicomponente și pot fi priviți drept conectori, aceștia făcînd legătura între citoschelet si nucleu.

De asmenea, exista si un alt grup de proteine LIM, denumit grupul divergent 3 din care fac parte Ril, Enigma, Zyxin,Prickle si Paxilin. Proteina Ril contine un domeniu LIM, Enigma, Zyxin si Prickle au in structura sa trei domenii LIM, iar Paxilin prezinta patru domenii LIM conservate din punct de vedere evolutiv. Toate proteinele care fac parte din acest grup divergent prezinta in structura lor domenii aditionale, localizate in regiunea amino-terminala Interactiile proteice care sunt mediate de domeniile LIM ale Enigma si omologului sau includ receptorul de insulina, receptorul tirozin kinazelor si protein kinaza C (PKC) (Wu și Gill, 1994, Kuroda și colab., 1996, Wu și colab. ., 1996). Un numar mare proteine LIM se poate gasi la nivelul adeziunilor focale sau structurilor analoage, un exemplu fiind situsurile de legare ale muschilor, aceste proteine fiind reprezentate de migfilina – este cunoscuta ca fiind proteina LIM de legare a filamentelor- si NRAP ( nebulin-related actin-binding protein) . Migfilina reprezinta un membru mai indepartat al familiei proteice Xyzin si aceasta contine 3 domenii LIM localizate in regiunea carboxi-terminala, unde are loc legarea factorului integrin de adeziune focala MIG2, iar regiunea sa amino-terminala leaga proteina Filamin, care reprezinta o molecula de actina reticulata. Acest mecanism explica rolul integrinei in exercitarea functiei citoscheletice.

NRAP reprezintă o proteină din familia de proteine LIM asociată cu domeniul SH3; este alcătuită dintr-o regiune N-terminală în care se găsește domeniul LIM și o regiune C-terminală . Regiunea N-terminală are rolul de a lega o proteină, denumită Talin, aceasta avînd o funcție reglatoare a activității integrinei , în timp ce regiunea C-terminală este implicată în reglarea actinei. NRAP este o proteină care se găsește la nivelul țesutului muscular , astfel ea apare la nivelul joncțiunilor miotendinoase în mușchiul scheletic, în timp ce în mușchiul cardiac este localizată în discurile intercalare . De asemenea, această proteină poate forma complexe cu alte proteine astfel încît să aibă loc transmiterea tensiunii în mușchi prin ancorarea filamentelor de actină terminală din miofibrile

Proteinele LIM de adeziune focală, pe lîngă funcțiile de legare și de reglare a citoscheletului de actină, au capacitatea de a semnala integrina. De exemplu, proteina Paxilina are o structură formată din 5 motive LD în regiunea N-terminală și 4 domenii LIM în regiunea C-terminală, aceasta legîndu-se de proteine citoscheletice și de proteine de semnalizare și este o structură importantă din punct de vedere al adeziunii dinamice deoarece controlează motilitatea . S-a demonstrat faptul că Paxilina are capacitatea de a coordona transmiterea semnalului care este dependentă de starea sa de fosforilare . Paxilina poate fi dezasamblată prin fosforilarea sa cu complexe kinazice de adeziune focală (PAK) și se poate întîlni și la nivelul nucleului, împreună cu HIC5 care este un membru foarte înrudit al acesteia, putînd interacționa in vitro cu receptorii nucleari ai hormonilor androgeni și glucocorticoizi (Kasai și colab., 2003; Fujimoto și colab., 1991; Yang și colab., 2000)

O altă proteină care are rol în adeziunea focală este reprezentată de PINCH, aceasta fiind constituită numai din 5 domenii LIM . Pe langă rolul de adeziune, aceasta este un factor important în răspîndirea și supraviețuirea celulelor , astfel, prin interacția cu ILK și NCK2 este capabilă să se lege de cascadele de semnalizare ale integrinelor și de factorul de creștere (Tu , Wu și colab., 1999; Tu , Li și Wu, 1998). În momentul în care apar disfuncționalități la nivelul lui PINCH, poate avea loc moartea embrionară , apărînd modificări la nivelul legăturilor actinice din membrană și la nivelul aderenței dependente de integrină (Clark, McGrail și Beckerle , 2003; Hobert și colab., 1999)

2.1.4 Proteine LIM ce prezintă homeodomeniu

O altă clasă de proteine LIM este reprezentată de familia de proteine LIM cu homeodomeniu, denumite LIM-HD, acestea făcînd parte din categoria factorilor transcripționali. Proteinele LIM-HD contin două domenii LIM aflate în regiunea N-terminală și un homeodomeniu, dispus central, unde homeodomeniul are rol de partener de interacție cu moleculele de ADN din genele țintă Familia de proteine LIM-HD este conservată din punct de vedere evolutiv si s-au descoperit pana in prezent 12 gene la mamifere si 5 gene la Drosophila melanogaster, aceastea avand capacitatea de a codifica proteinele LIM-hd, în timp ce la organismele nevertebrate s-a descris o singură gena, aceasta fiind reprezentata de gena lim-6 de la C. elegans . Gena lim-6 este intalnita la nivelul unor neuroni postmitotici , in celulele endoteliale din structura uterului si in anumite regiuni ale sistemului excretor. Aceasta gena are rolul de a determina traiectia axonala corecta unui grup de neuroni GABA-ergici și de asemenea este implicat in sinteza neurotrasmitatorului GABA ( acidul gama-aminobutiric)

Cel mai important grup al familiei de proteine LIM-Hd este reprezentat de grupul Lhx, din care fac parte Lmx1b si, respectiv, Lmx1a. Grupul Lhx prezintă un rol important in dezvoltarea neuronala deoarece se dezvolta odata cu formarea structurilor complexe de la nivelul creierului . De asemenea, membrii acestui grup sunt implicați modelarea structurilor in timpul dezvoltarii embrionare si prezinta un rol deosebit de important in specificitatea neuronala

Proteina Lhx1, denumita si LIM1 , se gaseste in timpul dezvoltarii embrionare timpurii la nivelul mezodermului, apoi pe parcursul dezvoltarii se afla la nivelul sistemului genital, rinichiului, ficatului si sistemului nervos (Barnes și colab.,1994; Dong și colab., 1997; Fujii și colab., 1994). In dezvoltarea sistemului nervos, Lhx1, impreuna cu Lmx1b, reprezinta o gena importanta pentru directionarea traiectului axonal al nervilor motori de la nivelul membrelor. S-a observat in embrionii de soareci ca o deletie a acestei gene poate duce la un fenotip anencefalic, unde structurile anterioare ale capului, cat si rinichii si gonadele lipsesc (Shawlet și Behringer,1995). Gena Lhx1 umana prezinta omologie in secventa aminoacizilor de 87% cu gena de la soarece si pana in prezent nu s-a descoperit mutatii la nivelul acesteia. O gena foarte inrudita cu Lhx1este Lhx5, care prezinta o structura asemanatoare cu acesta si s-a demonstrate faptul ca functiile acestora se suprapun in sistemul nervos.

O alta proteina Lhx, Lhx2, se gaseste la nivelul ficatului, in regiunile diencefalica si telencefalica in timpul dezvoltarii sistemului nervos, la nivelul organelor olfactive si audtive si in linii celulare ale limfocitelor B si T (Wu și colab.,1993). Un situs de exprimare al acestei gene este intalnit si la gena Apterous de la Drosophila, sugerandu-se astfel rolul similar pe care aceste proteine il au indiferent de specie (Rincon-Rimas și colab.,1999). S-a descoperit faptul ca Lhx2 este un marker important in leucemia mielogena cronica , deoarece s-a descoperit ca un nivel de expresie crescut al acestei gene este un efect al hipometilatiei de la nivelul locusului genei (Wu și colab.,1996). Pe langa Lhx2, o alta gena importanta in dezvoltarea sistemului nervos este reprezentata tot de o proteina din aceeasi clasa si anume Lhx3, care este exprimata la nivelul maduvei spinarii ventriculare, puntii, bulbului rahidian. La om exista trei izoforme ale acestei gene, aceste izoforme se leaga diferit la ADN, prezentand astfel si functii diferite (Sloop și colab.,2001). Un grup de proteine LIM-HD foarte asemanator cu Lhx3 in privinta secventei in aminoacizi este Lhx4, acestia prezentand omologie de secventa in domeniile LIM de 77% si respectiv 86% si 95% in ceea ce priveste homeodomeniul (Yamashita și colab.,1997). Lhx4 este exprimat la nivelul maduvei spinarii, cortexului cerebral si glandei pituitare. Soarecii homozigoti care prezinta o intrerupere a acestor doua gene mor la scurt timp dupa nastere datorita malformatiilor aparute la nivelul sistemul respirator, fiind asemanator cu distresul respirator la om (Li și colab.,1994)

Tabelul 1. Localizarea genetică a proteinelor LIM-HD la om și soarece (imagine preluată după Hunter și Rhodes,2005)

Cei mai importanti membrii ai grupului Lhx sunt Lmx1a, Lmx1b si Pitx3. La soarece, Lmx1a este prima data exprimat incepand cu ziua embrionara 8.5 ( E.8.5) in placa dorsala a tubului neural In schimb, Lmx1b este exprimat, in timpul dezvoltarii sistemului nervos, inca din ziua E.7.5 in jumatatea anterioara ca embrionului. De asemenea, in ziua embrionara E.8.5 apare la granita ponto-pedinculara , iar in ziua embrionara E.9.5 apare exprimat in istm . Precum Lmx1a, Lmx1b este si el exprimat in timpul dezvoltarii embrionare si are un rol esential in modelarea dorso-ventrala a membrelor, dar si in organogeneza, fiind implicat in dezvoltarea epiteliului visceral al glomerulului vascular din rinichi, cat si in formarea segmentului anterior al ochiului

La fel ca alți factori de transcripție, Lmx1a și Lmx1b sunt paralogi,aceștia avand o specificitate de legare a ADN-ului identică. În plus, aceștia prezintă o secvență de aminoacizi asemănătoare, conservarea de la nivelul homeodomenilor fiind de 100% și o similitudine a domeniilor LIM de 67% și respectiv 83%

S-au efectuat cercetări care arată faptul că polimorfismele din genele pentru Lmx1a și Lmx1b sunt legate de Boala Parkinson, dar și de schizofrenie , astfel încat s-a demonstrat asocierea dintre polimorfismele de nucleotide unice cu schizofrenia; de asemenea, s-a demonstrat că 5 polimorfisme de nucleotide unice care sunt prezente la bolnavii de schozofrenie sunt de asemenea exprimate și la pacienții care prezintă Boala Parkinson

Figura 5. Reglarea proceselor celulare mediate de proteinele care conțin domenii LIM (imagine preluată după

2.2 Organizarea structurala a genei și proteinei Lmx1a

Proteina Lmx1a face parte din grupul Lhx din familia proteinelor LIM care conțin homeodomeniu și denumirea provine de la termenul “LIM homeobox transcription factor 1 alpha” . Lmx1a a fost clonat pentru prima dată la hamster, evidențiindu-se rolul acestuia în legarea promotorului care codifică insulina.

La soarece , Lmx1a este exprimat incepand cu ziua embrionara E 8.5 in mai multe tesuturi , printre care placa dorsala a tubului neural, fiind implicat in dezvoltarea sistemului nervos, in veziculele otice, notocord si pancreas. La nivelul sistemului nervos central, Lmx1a controleaza formarea si dezvoltarea adecvata a SNC posterior si poate actiona si cu alti factori de la nivelul placii dorsale, cum ar fi MafB, Gdf7, Bmp6 si Bmp7. Mutatii sau deletii a acestei gene poate duce la modificari la nivelul interneuronilor Dl1.La om, Lmx1a este exprimat si in muschiul scheletic, tesutul adipos, glandele mamare si hipofiza. Totusi, inca nu s-au detectat mutatii la nivelul genei Lmx1a la oameni.

Gena LMX1A umană este localizată pe cromozomul distal 1q22-q23 și este alcatuită din 382 de aminoacizi, contine o regiune N-terminală în care se găsesc două domenii LIM dispuse în tandem, o regiune centrală în care se află homeodomeniul , fiind conservate pe tot parcursul evoluției și o regiune C-terminală cu rol în activare sau represie.

La șoarece, ADN-ul genomic al lui Lmx1a conține 8 sau 9 exoni, care diferă doar prin exonul inițial din capătul 5’. De asemenea, sunt prezente două izoforme al acestei gene, dar ambele au aceeași structură și codifică același număr de aminoacizi. În schimb, la om s-au identificat 4 izoforme ale genei Lmx1a, Lmx1a-001 și Lmx1a-002 conțin 9 exoni și au o lungime de aproximativ 3350 pb, în timp ce Lmx1a-003 prezintă 8 exoni, iar Lmx1a-004 7 exoni și este un transcript necodificator

Figura 6. Structura genelor Lmx1a la soarece si reprezentarea schematica a structurii proteinelor LIM-HD (imagine preluata dupa Doucet-Beaupré și colab., 2015)

Denumirea de LIM provine de la numele primelor trei proteine la care s-a descoperit această structură, și anume Lin11, Isl-1 și Mec-3 . Domeniul LIM prezintă două subdomenii și este alcătuit din 55 de aminoacizi și 8 resturi de aminoacizi, reprezentate în principal de cisteină și histidină, conservate din punct de vedere evolutiv, acestea avînd rolul de a lega zincul. Astfel, resturile 1-4 leagă primul ion de zinc, iar resturile 5-8 cel de-al doilea ion de zinc, ceea ce îi conferă modelul de structură secundară “degete de zinc” , care sunt dispuse în tandem.

Domeniul LIM se găsește într-o mare varietate de organisme eucariote, ca de exemplu se întîlnește la nevertebratele C.elegans și D. melanogaster, cît și în anumite drojdii și mucegaiuri unde se găsesc proteine care conțin domenii LIM. La om, de exemplu , domeniul LIM poate avea aceeași distribuție ca domeniile SH3 și SH2 si pot conține proteine care au în structură pînă la 5 domenii LIM. În schimb, la organismele procariote , domeniul LIM este absent deoarece acestea nu prezintă structură nucleară individualizată

Figura 7. (a) Structura consensus a domeniului LIM; (b) Topologia legării ionilor de Zinc ( imagine preluată după Kadrmas și Beckerle , 2004)

Domeniul LIM este un motiv de interacțiune de tip proteină-proteină și prezintă un rol fundamental în realizarea funcțiilor biologice, prin formarea de complexe multiproteice. Proteinele care conțin domeniu LIM mediază procesele biologice prin legarea acestora de proteinele țintă, acestea funcționînd ca molecule adaptor, pot fi competitori, inhibitori sau pot determinara localizarea celulară.Domeniul LIM se pot lega de domeniile PDZ , cît și de domenii kinazice; de asemenea, s-a demonstrate ca acesta se poate lega de motive tirozinice care nu necesită fosforilare. Astfel de interacție a fost descrisă la proteina LIM Enigma, care conține un domeniu PDZ în regiunea N-terminală și 3 domenii LIM in regiunea C-terminală.

Domeniul LIM prezintă și anumite funcții în patogeneză, de exemplu în oncogeneză, unde deleții sau mutații la nivelul său poate duce la apariția de boli umane. În plus, față de interacțiunile proteice pe care le confer domeniul LIM, acesta poate media proprietățiile proteinelor care se leagă la ADN și poate conferi și functii de transactivare

Homeodomeniul din structura proteinelor LIM-HD se află în regiunea centrală și este alcătuit din 60 de aminoacizi care formează o structură de tip helix-turn-helix , unde două alfa-helixuri sunt unite prin regiuni sub formă de buclă. Cele două helixuri din regiunea N-terminală sunt antiparalele și helixul aflat C-terminal este aproape perpendicular pe axele formate de cele două helixuri, acesta interacționînd direct cu molecula de ADN prin punți de hidrogen și interacții hidrobe, dar și indirect prin moleculele de apă formate de lanturile laterale și expuse fosei majore ale ADN-ului .

Proteinele LIM care contin homeodomeniu pot actiona prin legarea cu mare afinitate a domenilor LIM de cofactori, astfel încît acestea duc la formarea unor complexe transcriptionale care regleaza transcriptia intr-un mod specific, functionand sinergic pentru a determina soarta neuronală. .

Figura 8. Diferite tipuri de complexe de cofactori în care sunt implicate proteinele LIM-HD. Complexele formate in a-c vor duce la activarea transcripție, în timp ce complexul prezentat in (d) duce probabil la represiatranscripțională (imagine preluată după Hobert și Westphal,2000)

Unul dintre cei mai importanți cofactori care mediază legarea la ADN este reprezentat de CLIM , acesta fiind implicat în inhibarea genelor țintă sau în activarea sinergică, aceste procese fiind realizate în funcție de natura promotorului (Bach și colab., 1997; Jurata și Gill, 1997).De exemplu, la Drosophila melanogaster s-a demonstrat că o anumită valoare a expresiei cofactorilor CLIM/chip influențează dezvoltarea aripei ( Fernandez-Funez et al., 1998; Milan et al., 1998; Milan and Cohen, 1999; van Meyel et al., 1999).

Adaptorul de interacție nucleară, NLI,numit si LDB1 ( LIM domain binding protein 1) are rolul de a recunoaște domeniile LIM care se leagă cu afinitate mare, legarea avand loc prin intermediul promotorilor sau activatorilor de la nivelul moleculelor de ADN, oferind astfel o activitate transcriptionala maxima. NLI este format din regiuni hidrofobe în regiunea N-terminală și regiuni helicale în regiunea C-terminala, aceste regiuni avînd roluri importante în interacțiunea proteică. Regiunea N-terminală este format din 200 de aminoacizi, la nivelul ei avînd loc formarea complexelor homodimerice si tetramerice de tipul 2LHX-2LDB1. De asemenea, NLI este exprimat impreuna cu Isl1 pntru diferentierea neuronilor motori si se pot asocia si cu alti factori de transcriptie reglatori, cum ar fi proteinele Otx . Pentru a putea face posibilă legarea la ADN, proteinele LIM cu homeodomeniu necesită NLI drept punte de interacțiune, singura interacțiune directă avînd loc doar între Lhx3 și Isl .

2.3 Rolul pe care proteina Lmx1a il exercita in organismele vertebrate

Proteina Lmx1a reprezinta un factor de transcriptie care are un rol esential in organismul vertebratelor , cum ar fi la nivelul sistemului nervos, pancreasului, membrelor si urechii interne, descriindu-se astfel activitatea sa ubicuitara in procesele de dezvoltare al acestor organe

2.3.1 Actvitatea lui Lmx1a la nivelul sistemul nervos

2.3.1.1 Rolul lui Lmx1a în dezvoltarea fosei romboide și hemului cortical (telencefal)

În momentul dezvoltării sistemului nervos, generarea neuronilor se realizează la nivelul a două zone germinale: fosa rombică și hemul cortical (ambele telencefalice), acestea contribuind într-un mod substanțial la diversitatea neuronală din sistemul nervos central. Aceste zone germinale sunt localizate în regiunea dorso-medială, mărginesc plexul coroid și definesc marginile unui neuroepiteliu.

Fosa romboidă se găsește în regiunea dorsala a Rh1 (rombomera 1) și dă nastere mai multor tipuri de neuroni, printre care și neuronii cerebeloși și neuronii sistemului precerbelar, dar contribuie și la formarea plăcii dorsale a ventriculului al patrulea și la formarea derivațiilor plexului coroid. Prin analiza de mutanți și folosirea de hărți genetice, s-a descoperit faptul că Lmx1a , pe langa rolul său în inducția non-neurală a plăcii dorsale de la nivelul tubului neural și diferențierea neuronilor dopaminergici din mezencefal , acesta are și un rol major în reglarea neurogenezei în aceste zone germinale.

In Rh1, Lmx1a reprezintă un marker specific al plăcii dorsale, iar în ziua embrionară E10.5 este exprimat împreună cu Gdf7 ,dar pe parcursul dezvoltării embrionare, Lmx1a se extinde în fosa romboidă pînă în E12.5, în timp ce Gdf7 rămîne exprimat în plexul coroid.Expresia lui Lmx1a în fosa romboidă începe cu ziua embrionară E12.4 și pentru a putea observa expresia lui Lmx1a în fosa romboidă, s-a comparat expresia acestuia cu cea a lui Atoh1, care reprezintă un marker pentru întreaga populație neuronală din fosa romboidă. Pe baza acestui studiu s-a constatat faptul că, deși, atît în E 12.5 cît și în E16.5, unele celule coexprimă Atoh1, majoritatea celulelor Lmx1a subexprimă acest marker, ceea ce demonstrează faptul că expresia acestuia nu este dependentă de cea a lui Atoh .De asemenea, prin această observație s-a putut demonstra și o mare heterogenitate la nivelul cerebelului, deoarece Lmx1a este exprimat și în alte populații celulare/neuronale din cerebel, în afară de expresia sa în fosa romboidă și placa dorsală, exemple de populații celulare fiind reprezentate de celulele “c3”, expresia Lmx1a în aceste celule fiind inițiată începand cu ziua embrionară E12.5 (Fig, 1B) sau populatia de celule UBC, expresia acestuia fiind evidențiată prin locația sa, modul de migrare și expresia lui Tbr2.

Prin studiile efectuate pe specia de șoareci Dreher, s-a arătat faptul că Lmx1a generează celulele progenitoare granulare și, în lipsa expresiei Lmx1a, acești progenitori ies mult mai devreme din fosa romboidă și migrează în vermisul anterior. Așadar, un rol pe care îl are Lmx1a în fosa romboidă este acela de a preveni această ieșire a celulelor progenitoare din fosa romboidă și de a inhiba în mod autonom această migrare . Tot prin studiile realizate pe șoarecii dreher în analogie cu șoarecii de tip salbatic, s-a arătat că migrarea progenitorilor într-o etapă timpurie duce la reducerea semnificativă a fosei romboide la șoarecii dreher.

Fig. Lmx1a este exprimat în fosa rombică independent de Atoh1 în E10.5 (imagine preluată dupa

Expresia lui Lmx1a poate fi observată și în altă zonă germinală, și anume hemul cortical. Spre deosebire de fosa romboidă, în hemul cortical expresia lui Lmx1a nu poate fi mediată de catre Atoh, deoarece acesta nu este exprimat la nivelul telencefalului. În plus, prin studiile efectuate pe șoarecii dreher, s-a putut demonstra că Lmx1a nu este necesar pentru inductia hemului cortical, structura acestuia fiind observată prin folosirea unui marker specific al hemului cortical, Wnt3a. În schimb, față de fosa romboidă, lipsa expresiei lui Lmx1a poate duce la modificări substanțiale, și anume că celulele progenitoare ale hemului cortical nu mai au capacitatea de a produce neuroni de tip Cajal-Retzius, ci fenotipul acestora se schimbă, adoptînd o soartă neuronală hipocampală.

2.3.1.2 Neuronii dopaminergici din mezencefal si rolul lui Lmx1a in etapele diferentierii acestor tipuri de neuroni

In sistemul nervos central, majoritatea neuronilor dopaminergici, aproximativ 75% din totalul acestora , provin din mezencefalul ventral (Blum,1998; German si colab.,1983; Pakkenberg si colab.,1991). In timpul dezvoltarii embrionare, acesti neuroni se formeaza la nivelul placii dorsale a mezencefalului ( Ono si colab.,2007) si sunt generate in trei zone distinct: campul A8, care reprezinta substanta neagra partea compacta si regleaza functiile motorii voluntare prin intermediul caii nigro-striatale, campul A9 – zona tegumentara ventrala (VTA) si A10- campul retrorubral ,neuronii din zonele A9-A10 inervand striatumul ventral si cortexul frefrontal prin intermediul canalului mezocortolimbic (Lees si colab.,2009; Toulouse si Sullivan,2008; Tzschentke si Smidt,2000).

Fig . Neuronii dopaminergici din Sistemul Nervos Central. Ilustrare schematica a neuronilor TH+ apartinand grupurilor A8-A15. Grupurile A16-A17 nu sunt prezentate (cer-cerebel; d-dorsal;dm-dorso-medial; l-r1- regiunea istmica; lge- eminescenta ganglionica lateral; m-corpul mamilar; Mb-mezencefal; mge – eminescenta ganglionica mediala; ob – bulbul olfactiv; or- fosa optica; p-prosomere; sP- prozencefalul secundar) ( imagine preluată după Ang,2006)

Dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal se realizeaza prin intermediul mai multor factori transcriptionali si implica mai multe etape: inductia, specificarea, diferentierea, maturarea si mentinerea (Abeliovich si Hammond,2007).

In timpul embriogenezei, inductia neurala incepe in momentul in care celulele mezodermale trimit semnale catre ectoderm, astfel incat acesta sa devina neuroectoderm, acest process relizandu-se in momentul in care se activeaza cascadele de semnalizare (Moreau si Lecler,2004).

Primul semnal care induce un fenotip al neuronilor dopaminergici este dat de catre Sonic hedgehog (Shh), o proteina care este secretata de catre placa dorsala incepand cu ziua embrionara E8.5. Totusi, printr-un studiu efectuat de catre Andersson si colab. in 2006, s-a demonstrat ca doar expresia acesteia nu este suficienta pentru dezvoltarea acestor neuroni, astfel in timpul acestei etape se observa si expresia factorului de crestere al fibroblastelor Fgf8. Fgf8 provine din santul ponto-peduncular si functioneaza cooperativ cu Shh pentru a induce sinteza neuronilor dopaminergici. Expresia lui Fgf duce la suprimarea altor molecule de semnalizare si activarea markerilor specifici neuronilor dopaminergici. In plus, Shh induce si expresia proteinelor Lmx1a si Msx1/2, aceste proteine fiind implicate in specificarea si diferentierea neuronilor dopaminergici.

Un alt factor transcriptional implicat in inductia celulelor progenitoare ale neuronilor dopaminergici este Wnt1. Wnt1 este o glicoproteina secretata in istm si este exprimata incepand cu ziua embrionara E9.5 (Wilkinson și colab., 1987). Prin studii in vitro, s-a aratat ca Wnt1 regleaza proliferarea celulelor progenitoare din mezencefalul ventral si, de asemenea, poate duce la o crestere a numarului de neuroni generati in aceste celule.

Toti acesti factori functioneaza cooperativ: Shh si Fgf8 genereaza o soarta neuronala dorso-ventrala, in timp ce Wnt1 una antero-posterioara, ducand la activarea altor factori transcriptionali, de exemplu Otx2, Lmx1a /b, En1/2, Msx1/2, Ng2 si Mash (Ang,2006).

In etapa de specificare a neuronilor dopaminergici, Otx2 joaca un rol destul de important. Otx2 este prima data exprimat in epiblast, apoi incepand cu ziua embrionara E7 la soarece se poate vedea modelul sau de expresie in neuroectodermul anterior, acesta din urma dand nastere rombencefalului si mezencefalului (Broccoli et al, 1999; Simeone et al., 2002) .Expresia lui Otx2 este indusa de catre Wnt1 prin intermediul β-cateninei (Chung și colab., 2009) si aceasta reprima activitatiile factorilor Gbx2 si Nkx2.2 pentru a putea delimita celulele progenitoare dopaminergice de cele serotonergice. Pe baza studiilor de deletie la soarecii soarecii knock-out a genei Otx2 (Otx2 -/-) s-a observat ca in absenta acestei gene se genereaza un numar mult mai mic de neuroni dopaminergici la nivelul mezencefalului (Puelles și colab., 2004) si poate duce chiar si la incapacitatea de a dezvolta prozencefalul sau mezencefalul (Acampora et al, 1995).

Proteina Shh si molecula de semnalizare Wnt1 induc expresia lui Lmx1a, aceasta functionand cooperativ si, cateodata, avand functii suprapuse cu Lmx1b in etapele de specificare si diferentiere a neuronilor dopaminergici. Astfel, Lmx1a reprezinta un factor cheie al dezvoltarii neuronilor mDA, aceasta inducand expresia lui Msx1. Msx1 induce exprimarea factorilor Ngn1 si Nurr1 si, de asemenea, reprima expresia lui Nkx6.1, impiedicand astfel generarea de alte subtipuri neuronale pornind de la aceste celule progenitoare (Chung și colab., 2009). In plus, Lmx1a regleaza si activitatea factorului transcriptional Pitx3, care are capacitatea de a activa enzima tirozin-hidroxilaza (Chung și colab., 2009).

Fig Shh induce expresia lui Msx1 si Lmx1a in vitro . A- ilustrare schematica a nivelelor axiale . B-E- sectiuni transversale care arata expresia Lmx1a si Msx1/2 (B), Msx1.2 si Nurr1 (C), Lmx1a si Lmx1b (D) si tirozin-hidroxilaza(TH) si Nurr1(E) (F-prozencefal; M- mezencefal; H-rombencefal; D-dorsal; V- ventral; A- anterior; P-posterior) (imagine preluata dupa Andersson și colab.,2006)

In timpul diferentierii timpurii a neuronilor dopaminergici din mezencefal, celulele progenitoare ies din ciclul celular si si genereaza neuroni dopaminergici imaturi postmitotici , intre E9.5 si E13.5 la soarece (Bayer et al., 1995). In aceasta etapa expresia lui Lmx1a este in continuare activa, deoarece aceasta joaca un rol esential in diferentierea neuronilor mDA, acesta inducand si expresia lui Nurr1 si En1/2 (Simon și colab., 2001; Alberi și colab., 2004).

Nurr1 este un membru al familiei de receptori nucleari si face parte din clasa factorilor de transcriptie intracelulari. In ceea ce priveste structura sa, Nurr1 prezinta patru domenii: primul domeniu reprezinta domeniul de legare la ADN, care este conservat in randul membrilor familiei din care provine si prezinta doua motive de tip „degete de zinc” care permite activarea transcriptiei; cel de-al doilea domeniu are rol in legarea liganzilor , in timp ce urmatoarele doua domenii se afla in regiunea N-terminala, respectiv C-terminala, fiind denumite AF1 si AF, acestea avand rol si in interactia acestora cu cofactori, pe langa cel de activare al transcriptiei (Alavian și colab., 2014). S-a aratat ca Nurr1 induce expresia tirozin-hidroxilazei (TH) prin legarea sa la secventa NRBE din promotorul genei TH (Kim și colab., 2003, Sakurada și colab., 1999) . De asemenea, acesta poate induce expresia DAT (transportorul de dopamina), dar printr-un mecanism independent de NRBE (Sacchetti et al., 2001). S-a demonstrat faptul ca FoxA1 si FoxA2 participa la reglarea expresiei sale si actioneaza sinergic cu acesta in timpul neurogenezei dopaminergice la nivelul mezencefalului ventral si ca Nurr1 actioneaza dependent de Shh, deoarece FoxA2 este un factor in aval (downstream) al lui Shh. O pierdere a expresiei FoxA2 a determinat o crestere a numarului de celule Nurr+ si TH- in mezencefalul ventral (Ferri et al., 2007).

Doi factori de transcriptie ce prezinta un domeniu homeobox de legare la ADN sunt En1 si En2 (Engrailed 1/2) . Acestia regleaza activitatea lui Fgf8 si sunt factori importanti atat in diferentierea, cat si in mentinerea neuronior, deoarece sunt implicati in mod direct in apotoza (Ang, 2006).

In etapa de diferentiere tarzie, denumita si maturare, neuronii mDA imaturi incep sa migreze spre zona de manta, in urma acestui proces devening neuroni mDA maturi. La nivelul acestori neuroni se observa in continuare activitatea factorului Nurr1, care regleaza activitatea TH, AADC (L-aromatic aminoacid decarboxilaza) si DAT. Printr-un studiu efectuat pe embrioni de soarece, s-a concluzionat ca absenta acestei gene nu afecteaza dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal, ci doar fenotipul acestora. FoxA1 si FoxA2 regleaza activitatea lui Nurr1 si poate influenta si activitatea lui Lmx1a sau Lmx1b (Bergman și colab.,2009).

In aceasta etapa de maturare a neuronilor dopaminergici din mezencefal, Lmx1b este exprimat impreuna cu Pitx3 si regleaza expresia acestuia, actionand snergic cu Nurr1 pentru reglarea activitatii TH, WMAT2 si DAT (Bergman și colab.,2009).

Lmx1a este un factor prezent in toate stadiile dezvoltarii neuronilor dopaminergici din mezencefal, unde in etape de maturare regleaza activitatea lui Nurr1 si Pitx3 si actioneaza asupra DAT in mod direct (Chung si colab.,2013)

2.3.1.2 Importanta genei Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem

Celulele stem reprezinta un tip de celule nespecializate care se gasesc la organismele vertebrate si care au capacitatea de a se diferentia in diferite tipuri celulare. Celulele stem au capacitatea de a se reinnoi prin intermediul diviziunii celulare, unde pot ramane la stadiul de celula stem sau pot fi induse pentru a deveni celule specializate si ,astfel , a ocupa diferite functii in organism, aceasta proprietate fiind denumita drept potenta. Pentru a putea da nastere unor celule mature, o celula stem trebuie sa fie toti- sau multipotenta. Aceasta capacitate de reinnoire a celulelor stem este mentinuta cu ajutorul unei replicari asimetrice, unde o celula stem se imparte intr-o celula mama identica cu celula stem originara si o celula fiica care este diferentiata, si a unei diferentieri aleatorii, unde o celula stem se diferentiaza in doua celule fiice apoi o alta celula stem intra in mitoza si produce alte doua celule stem identice cu cea originara.

2.3.1.2.1 Rolul lui Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem embrionare

Neuronii dopaminergici din mezencefal iau nastere din celule progenitoare neuronale, unde acestea impreuna cu diferiti marker de semnalizare, Shh, Fgf8 si Wnt, si factori transcriptionali, Otx2, Lmx1a, Foxa1/Foxa2, Ngn2, Pitx3 si Nurr1, contribuie la dezvoltarea adecvata a acestor tipuri de neuroni.

Cunoscand rolul esential pe care il are Lmx1a in dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal s-au efectuat mai multe studii in legatura cu generarea de neuroni mDA din celule stem emprionare. Un prim studiu a fost realizat de catre Andersson și colab. in 2006, dovedindu-se astfel implicarea lui Lmx1a in generarea acestor tipuri de neuroni din celule stem embrionare, dar doar sub anumite conditii. Astfel, pentru a format neuroni mDA din celule stem embrionare, acestea necesita sa adope o soarta neuronala dorsala, acest proces fiind realizat de Shh (Andersson si colab.,2006).

In 2009, s-a realizat un protocol de catre Filing si colab pentru producerea de neuroni mDA, folosind atat celule stem embrionare umane (hESC), cat si celule stem embrionare de soarece (mESC). Astfel, folosind un vector ce prezinta enhancer Neston pentru mESC si un vector viral cu promotor PGK asupra hESC, acestia au indus o expresie fortata a lui Lmx1a .

In ceea ce priveste celulele stem embrionare de soarece, de la nivelul acestora s-au generat neuroni TH+, acestia avand intre 70 si 90% sansa de a reusi.In plus, majoritatea neuronilor TH+ au exprimat si factorii cheie ce participa la dezvoltarea mDA: Lmx1a, Lmx1b, Pitx3, Nurr1 si Foxa2. De asemenea, s-a observat si un numar foarte scazut de neuroni serotonergici, ceea ce arata ca expresia lui Lmx1a impiedica producerea acestor neuroni.

Pe baza analizelor efectuate ulterior s-a demonstrat ca celulele/neuronii TH+ exprima atat DAT, cat si VMAT2. Dupa ce s-au produs neuronii mature, acestia au fost transplantati in creierul soarecilor , apoi la 4 saptamani dupa transplantare s-au efectuat studii care arata ca in zonele unde celulele transplantare au putut supravietui, diferenta dintre neuronii TH+ proveniti din celulele stem embrionare de soarece si neuronii mDA este aproape imperceptibila, aceste celule exercitand exact aceeasi functie.

In concluzie, Lmx1a are un rol esential in producerea neuronilor dopaminergici din mezencefal care provin din celule stem embrionare, deoarece expresia acestuia poate induce formarea acestor neuroni daca exista si activitatea factorului Shh.

2.3.1.2.Rolul lui Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem pluripotente induse

Celulele stem pluripotente (iPSC) s-au format din celule somatice mature prin intermediul reprogramarii, devenind astfel pluripotente. Primele celule stem pluripotente induse s-au obtinut de catre Yamanaka si colab in 2006. Prin reprogramarea fibroblastelor de la soareci prin intermediul factorilor transcriptionali Oct3/4, Sox2, c-Myc si KLF, acestia au obtinut celule pluripotente.

Pentru a se putea obtine neuroni indusi in vitro, este necesara reprogramarea celulelor folosite, de exemplu fibroblaste, hepatocite sau astrocite, cu factori pan-neuronali, cum ar Brn1, Ascl1 si Mytl1 (BAM). In contrast cu aceasta, reprogramarea celulelor dopaminergice induse se realizeaza folosind doar factorii specifici Lmx1a, Ascl1 si Nurr1 (LAN), sau acestia se pot folosi impreuna cu alti factori suplimentari , Foxa2,En1 si Pitx3. In ambele cazuri, celulele rezultate au prezentat un model de expresie mai asemanator cu neuronii mDa decat cu tipul celular de unde provin. Celulele iDA au exprimat endogen Lmx1a, Nurr1 sau Pitx2, precum si eGFP din locusul endogen al lui Pitx3 (Caiazzo și colab., 2011; Kim si colab.,2011).

In 2008 s-a efectuat un experiment de catre Werning si colab pentru a transforma celulele pluripotente induse in neuroni mDa. Astfel, celulele pluripotente induse au fost adaugate intr-un mediu ce contin fibroblaste embrionare de soarece (MEF). Dupa expansiunea celulara, in etapele ulterioare celulele MEF se indeparteaza, celulele iPS sunt transferate intr-un mediu neaderent si sunt puse in contact cu Fgf2, dand nastere celulelor neuroepiteliale , eliberand si factorii specifici ai acestor celule : Sox2,Brn2 si Nestin. Dupa ce Fgf2 a fost indepartat si in mediu s-a adaugat Shh si Fgf8, s-au obtinut celulele de beta-tubulina III +, o parte dintre aceste celule au exprimat VMAT2,Pitx3,Nurr1 si En1/2 si deci, au devenit neuroni TH+.

Prin urmare, celulele stem pluripotente induse necesita expresia Lmx1a pentru a da nastere neuronilor dopaminergici din mezencefal. De asemenea, prin studiul realizat asupra acestor tipuri de celule stem , s-ar putea realiza reprogramarea celulelor pentru a putea repara sau inlocui tesuturile lezate din corpul uman

2.3.1.3 Activitatea Lmx1a in dezvoltarea placii dorsale

In sistemul nervos central, placa dorsala reprezinta un centru important in dezvoltarea posterioara/dorsala a acestuia, avand rol de centru de semnalizare. Celulele placii dorsale iau nastere din precursori mitotitici multipotenti care se gasesc intr-o stare biologica activa la nivelul crestelor si tubului neural. Aceasta regiune in care se gasesc celulele placii dorsale dau nastere si la celulele crestelor neurale si celulele precursoare ale interneuronilor dorsali dI1 (Bronner-Fraser și Fraser, 1988; Echelard et al., 1994 , Lee și Jessell, 1999, Helms și Johnson, 2003). La nivelul maduvei spinarii se observa existenta mai multor factori de transcriptie, Pax3,Pax7 si Msx1/2, acestia avand rol in dezvoltarea placii dorsale, dar si in formarea crestelor neurale si interneuronilor dorsali (Lee și Jessell, 1999; Knecht și Bronner-Fraser, 2002) , cat si existenta unor cascade de semnalizare, Bmp4/Bmp7 si Wnt7.

Activitatea lui Lmx1a in dezvoltarea placii dorsale este dependenta de semnalizarea Bmp si nu este afectata atunci cand WNT prezinta o expresie scazuta. S-a aratat ca in momentul in care BMP este activata, zona in care poate induce placa dorsala se poate extinde, putand include chiar intreaga axa dorso-ventrala a maduvei , in timp ce Lmx1a poate induce formarea placii dorsale doar in regiunea posterioara a tubului neural.

Fig. Expresia lui Lmx1a in timpul dezvoltarii maduvei spinarii (imagine preluata dupa Chizhikov și Millen,2004)

De asemenea, Lmx1a prezinta un rol dual in maduva spinarii deoarece pe langa rolul pe care il exercita in dezvoltarea acesteia, acesta poate separa si celulele progenitoare ale placii dorsale de cele ale interneuronilor dorsali dl. Astfel, Lmx1a induce formarea interneuronilor dI1 , in timp ce celulele inhiba intr-un mod autonom exprimarea lui Math1 (Cath1), impiedicand astfel ca celulele din linia mediana dorsala sa adopte o soarta neuronala de interneuroni dI1. Se poate concluziona astfel ca Lmx1a regleaza in mod negativ expresia Math1 si astfel participa la delimitarea dintre placa dorsala si interneuronii dorsali dl1.

Fig . Lmx1a inhiba in mod autonom formarea interneuronilor dI1 (imagine preluată după Chizhikov și Millen,2004)

Prin studiile efectuate pe soarecii dreher, s-a observat ca in lipsaLmx1a placa dorsala nu se poate dezvolta, ducand astfel la un numar necorespunzator de interneuroni dI1 . In plus, precursorii postmitotici ai interneuronilor dI1 nu pot dezvolta o polaritate axonala normala si nu pot migra pentru a forma nucleii mediali si laterali, aceste procese fiind esentiale in mentinerea starii fiziologice normale a maduvei spinarii.

In concluzie, Lmx1a are un rol esential in timpul dezvoltarii maduvei spinarii deoarece acesta duce la formarea placii dorsale si a interneuronilor dl1, lipsa expresiei acestei gene avand urmari destul de grave, asa cum s-a observat in studiile efectuate pe mutantii dreher.

2.3.2 Rolul lui Lmx1a în dezvoltarea urechii interne

Dezvoltarea urechii interne începe în momentul formării placodei otice prin intermediul îngroșării ectodermului care se află adiacent de rombencefal. În etapa următoare, placoda otică suferă o serie de modificări morfogenetice, care duc la formarea veziculei otice, și în final dau naștere unei structure complexe ce prezintă șase organe senzoriale : trei canale semicirculare, două macule vestibulare și cohleea (Bryant și colab.,2002; Barald și Keley,2004). Expresia timpurie a lui Lmx1a se realizează în ziua embrionară E8, apoi este exprimat în urechea internă începînd cu ziua embrionară E10.5, în stadiul de otocist și se suprapune cu expresia lui Pax2, acesta fiind implicat în formarea și specificarea canalului cohlear, în special în regiunea dintre epiteliul cohlear senzitiv și stria vascularis (Burton și colab.,2004). Spre deosebire de Pax2, Lmx1a este exprimat exclusiv în regiunea non-senzorială, inclusiv în epiteliul vestibular tranzitoriu, peretele saculei, celulele întunecate, stria vascularis și proeminența strială. Epiteliile non-senzoriale unde este observată expresia lui Lmx1a sunt implicate în urmatoarele procese: a)separă și participă la contricția sacului endolimfic prin formarea canalului endolimfic; b) separă și formează utricula din saculă prin intermediul formării foramenului utriculo-sacular; c) separă și formează cohleea din saculă și canalul semicircular posterior prin intermediul formării ductului reunions.De asemenea, se poate observa și rolul pe care Lmx1a îl exercită în dezvoltarea ductului endolimfatic, care reprezintă o structură esențială în menținerea homeostaziei fluidului la nivelul urechii interne. La acest nivel, există o genă esențială care ajută la formarea și dezvoltarea ductului endolimfatic, Gbx2, care reglează și modul de expresie a lui Dlx5 și Wnt2b. Aici, Lmx1a funcționează independent de Gbx2 și reglează în mod indirect expresia celorlalte două gene, Dlx5 și Wnt2b (Lin și colab.,2005; Everett și colab.,2001; Karet și colab.,1999).

Fig. Expresia proteinelor LIM-HD la nivelul urechii interne în E10.5 (A,B) , E12.5 (C-H) și E14.5(I-0) (imagine preluată după Huang și colab., 2008)

Pe baza studiilor efectuate pe mutanții dreher s-a observat că Lmx1a reprezintă o genă esențială în menținerea domeniilor funcționale la nivelul urechii interne, deoarece lipsa acestei gene poate avea urmatoarele consecințe: a) zonele neurogenice vestibulare și auditive să fie foarte slab delimitate sau să existe o limită anormală între acestea; b) organele senzoriale pot avea mărimi și forme neobișnuite; c) o extindere a regiunii neurogenice. De asemenea, s-a observat că Lmx1a poate regla expresia Sox2, aceasta avînd capacitatea de a delimita teritoriile senzoriale de cele non-senzoriale.

Prin urmare, Lmx1a este descrisă ca fiind o gena functională esențială în morfogeneza urechii interne, deoarece lipsa acesteia poate duce la malformații sau diferite fenotipuri la nivelul acestei structuri.

2.3.3 Rolul lui Lmx1a la nivelul pancreasului

La organismele vertebrate și inclusiv la om, promotorul insulinei este transcris la nivelul celulelor B în insulele Langerhans de la nivelul pancreasului (Clark și Steiner 1969; Giddings și colab., 1985). Prin studii de deleție efectuate asupra promotorului, s-a observat că promotorul genei insulinei acționează în cis, avînd și un rol reglator la nivelul transcripției (Edlund și colab., 1985, Karlsson și colab., 1987, Crowe și Tsai 1989, Whelan și colab., 1989, Boam și colab., 1990) și acesta prezintă în structura sa două elemente, Far și FLAT, acestea funcționînd sinergic în activarea și transcripția genei insulinei. Secvența FLAT prezintă două elemente : FLAT-E și FLAT-F, dintre care unul dintre aceste elemente este necesar pentru o funcționare completă a complexului mini-enhancer (German și colab, 1992). Proteinele bHLH Pan-1 și Pan-2, care sunt echivalente cu proteinele E47 și E12 la om, recunosc complexul specific de legare al elementului Far și se leaga la acesta (Nelson și colab., 1990; (Aronheim și colab., 1991; Cordle și colab., 1991, German și colab., 1991; Sheih și Tsai 1991). Astfel, la nivelul pancreasului, Lmx1a este deosebit de important deoarece acesta se leagă prin intermediul homeodomeniului la secvența FLAT și , împreuna cu proteina Pan-1, formează un complex minienhancer, ceea ce duce la activarea genei insulinei și astfel la începerea procesului de transcripție (German și colab,1992).

2.3.4 Rolul lui Lmx1a la nivelul membrelor

La vertebrate, dezvoltarea membrelor începe în mezodermul dorsal și , prin studiile realizate, s-a descoperit modul de formare al acestora. Aici, Lmx1a este analizat împreună cu un alt factor de transcripție LIM-HD, și anume Wnt7a. Astfel, s-a descoperit că Wnt7a este esențial pentru menținerea axei dorso-ventrale în momentul formării membrelor și că expresia ectopică a acestuia poate induce expresia Lmx1a atît in vivo, cît și in vitro. In vivo, expresia lui Lmx1a reprezintă un răspuns la semnalizarea Wnt7a și, astfel, acesta reglează dezvoltarea membrelor dorsale/posterioare. Concomitent cu studiul Lmx1a și Wnt7a, s-a descoperit o altă proteină LIM-HD la Drosophila melanogaster și anume Apterous (Ap) aceasta găsindu-se la nivelul formațiunilor care vor da naștere aripilor, aceasta fiind implicată în dezvoltarea acestora.

Fig. Relațiile spațiale și temporale între Lmx1a și Wnt7a (imagine preluată după Riddle și colab., 1995)

Astfel, se poate concluziona că Lmx1a reprezintă un element important în modelarea dorso-ventrală a membrelor, deoarece lipsa expresiei acestuia duce mai degrabă la o dezvoltare ventrală și nu dorsală a membrelor

2.4 Patogeneza Lmx1a

2.4.1 Asocierea lui Lmx1a în boli neurologice

Boala Parkinson este o boala neurologică ce se caracterizează prin degenerarea neuronilor dopaminergici, adică neuronii dopaminergici se distrug pe tot parcursul dezvoltării acestei afecțiuni. Pentru a putea observa corelația dintre Lmx1a și fiziopatologia bolii Parkinson, s-a efectuat un studiu pe trei SNP-uri din gena Lmx1a (rs4657411, rs4657412 și rs6668493) și un SNP din Lmx1b (rs10987386), care au arătat că aceste gene sunt implicate în creșterea susceptibilității de a dezvolta această boală. De asemenea, o serie de SNP-uri corelate cu boala Parkinson care au fost studiate in functie de gen au arătat că boala Parkinson este mai răspîndită în rîndul bărbaților, deoarece la femei estrogenul are un rol neuroprotector, incidența în rîndul femeilor fiind astfel mai mică.

Tot pe baza studiului SNP-urilor, s-a descoperit că dintre SNP-urile care au fost asociate inițial cu boala Parkinson, două dintre acestea sunt prezente și la pacientii care suferă de schizofrenie. Schizofrenia reprezintă o tulburare mentală heterogenă, fiind asociată cu simptome severe, cum ar fi psihoza și halucinații. Alelele genelor prezente în boala Parkinson sunt comune și în schizofrenie. Pe baza ipotezei dopaminergice care stă la baza acestei afecțiuni, mai mulți autori au precizat că există o disfuncție care poate duce la un dezechilibru la nivelul căilor de transmitere a dopaminei, ceea ce ar putea conduce la o manifestare a schizofreniei chiar din timpul procesului de maturare al creierului (Murray și Lewis, 1987; Sesack și Carr,2002). Astfel, se poate concluziona că SNP-urile din gena Lmx1a pot duce și la creșterea susceptibilității de a dezvolta această boală neurologică severă.

Pe lîngă schizofrenie și boala Parkinson, s-a observat că Lmx1a este un factor implicat în scolioza congenitală, deși nu prezintă un rol esențial în dezvoltarea acestei malformații de la nivelul coloanei vertebrale. Prin studiul SNP-urilor de la nivelul genei Lmx1a, Rs1354510 și rs16841013 au fost semnificativ asociate cu o predispoziție congenitală a scoliozei în rîndul populației chineze Han , de asemenea acestea au prezentat diferențe semnificative între grupul de control și subiecții testați. Prin urmare, se poate spune că Lmx1a prezintă un rol ]n scolioza congenitală, deși acesta nu este unul major în cauza genetica care duce la apariția acestei boli.

2.4.2 Asocierea lui Lmx1a cu diferite tipuri de cancer

Recent, s-a observant că Lmx1a prezintă un rol major în diferite tipuri de cancer. De exemplu, acesta a fost identificat drept supresor metastazic în cancerul cervical și ,de asemenea, hipermetilarea acestuia în regiunea promoter duce la pierderea functiei genelor tumorale supresoare. În plus, metilarea este cea mai frecventă în țesuturile carcinoamelor și este corelată cu recurența sau supraviețuirea în rîndul pacienților cu cancer ovarian. Lmx1a a fost observată și într-o linie celulară HCT-115, care reprezintă cancerul de colon.

În cancerul gastric, Lmx1a poate fi privit drept un potential biomarker tumoral, deoarece expresia lui Lmx1a este mult mai redusă în țesuturile cancerului gastric în comparație cu țesuturile normale din punct de vedere fiziologic și hipermetilarea acestei gene este o anomalie epigenetică comună în rîndul tumorilor de acest tip.

Lxm1a poate fi corelat și cu cancerul ovarian epitelial, deoarece o expresie crescută a acestuia îi conferă acestui cancer o chemorezistentă mai scăzută și o natură metastazică mai mică , iar pacienții, după o intervenție chirurgicală citoreductivă, pot avea mai multe beneficii, printre care și rata mai mică de recidivism. De asemenea, tot o expresie crescută a lui Lmx1a este corelată cu stadiul patologic și natura histologică în adenocarninoamele pancreatice.

În afară de rolul de supresor metastazic al celulelor cancerului de col uterin, s-a arătat că proteina Sp1 și EZHZ2 sunt implicați în mod direct în reglarea expresiei acestei gene la nivelul celulelor cancerului de col uterin. S-a dovedit astfel că Sp1 se leagă în mod direct de promotorul genei Lmx1a și este implicat în exprimarea sa endogenică, în momentul în care este supus stresului oncogen în timpul dezvoltării cancerului de col uterin, ceea ce duce la o supresie a celulelor canceroase și la o metastaziere întîrziată.

Prin urmare, expresia lui Lmx1a în diferite tipuri de cancer prezintă are un rol important deoarece acesta poate stopa procesul de metastaziere și poate împiedica apariția de celule tumorale.