Comportamentul fibroblastelor și keratinocitelor pe biomateriale destinate vindecării rănilor [306913]

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

Master Biochimie și Biologie Moleculară

Lucrare de disertație

Comportamentul fibroblastelor și keratinocitelor pe biomateriale destinate vindecării rănilor

Coordonator științific: Absolvent: [anonimizat]. [anonimizat],

Dr. Mitran Valentina

CUPRINS

INTRODUCERE…………………………………………………………………………………………………………4

CAPITOLUL I ABORDĂRI TEORETICE

Structura și funcțiile pielii ……………………………………………………………………………………….5

Straturile pielii: țesuturile și celule din componența acestora …………………………………5

Epiderma ………………………………………………………………………………………………5

Derma …………………………………………………………………………………………………..8

Hipodermul ……………………………………………………………………………………………8

Funcțiile pielii: protecție, termoreglare și sensibilitate …………………………………………..9

Procesul de regenare a pielii …………………………………………………………………………….10

Faza hemostatică …………………………………………………………………………………..10

Faza inflamatorie ………………………………………………………………………………….10

Faza de proliferare ………………………………………………………………………………..11

Faza de remodelare ……………………………………………………………………………….12

Abordările terapeutice pentru vindecarea rănilor pe bază de pansamente ……………………..12

Pansamente antimicrobiene ……………………………………………………………………………..13

Pansamente din derivați naturali ……………………………………………………………………….15

Substituenți ai pielii ………………………………………………………………………………………..16

Substituenți de Clasa I …………………………………………………………………………..17

Pansamente cu un singur strat ………………………………………………………17

Materiale cu strat dublu……………………………………………………………….18

Substituenți de Clasa II ………………………………………………………………………….19

Substituenți epidermali ……………………………………………………………….19

Substituenți dermici ……………………………………………………………………19

Substituenți de Clasa III: Dermo-Epidermali …………………………………………….21

[anonimizat] D ……….23

Suplimentare cu magneziu ………………………………………………………………………………23

Suplimentare cu zinc ………………………………………………………………………………………24

Suplimentare cu vitamina D …………………………………………………………………………….24

CAPITOLUL II -ABORDĂRI PRACTICE

Materiale și Metode ………………………………………………………………………………………………25

Pregătirea probelor pentru teste de degradare/ eliberare ……………………………………….25

Pregătirea probelor pentru teste biologice ………………………………………………………….26

Studii prin contact indirect ……………………………………………………………………………….26

Teste de viabilitate celulară …………………………………………………………………..26

Teste pentru evaluarea morfologiei fibroblastelor și keratinocitelor……………..27

Evaluarea biocompatibilității……………………………………………………………………………28

Rezultate și discuții……………………………………………………………………………………………….28

Studiul degradării acoperirilor CPI și al eliberării agentului terapeutic (IBUP)………28

Studiul efectului antimicrobian și a citocompatibilității materialelor suport…………..31

Evaluarea viabilității/proliferării și morfologiei fibroblastelor dermale………..31

Evaluarea viabilității/proliferării și morfologiei keratinocitelor…………………..35

Evaluarea in vitro a adeziunii, morfologiei, viabilității, proliferării celulare și sintezei matricei extracelulare în prezența plasturilor inteligenți și a hidrogelurilor selectate.37

Studii prin contact direct utilizând fibroblastele dermale……………………………38

Studii prin contact direct utilizând keratinocite ………………………………………..40

Concluzii……………………………………………………………………………………………………………..42

BIBLIOGRAFIE………………………………………………………………………………………………………..44

LISTĂ DE FIGURI ……………………………………………………………………………………………………49

LISTĂ DE ABREVIERI……………………………………………………………………………………………..51

Această cercetare a fost finanțată prin grantul de cercetare

PCCDI 65/2017.

Materialele analizate au fost furnizate de partenerii în proiect de la Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, Măgurele.

INTRODUCERE

Pielea și anexele sale (unghii, păr și glande) formează cel mai mare organ din corpul uman, cu o suprafață de 2 m2. Pielea cuprinde 15% din greutatea corporală totală a adultului, iar grosimea sa variază de la mai puțin de 0.1mm la nivelul pleoapelor, la 1,5 mm la nivelul palmelor și tălpilor (Wong și colab., 2016).

Vindecarea rănilor este un proces fiziologic complex care apare în corpul uman și care implică activarea secvențială a mai multor tipuri de celule și a căilor de semnalizare într-un mod coordonat. Rănile cronice și arsurile scad în mod clar calitatea vieții pacienților, deoarece sunt asociate cu o creștere a durerii fizice și a complicațiilor socio-economice. În plus, incidența și prevalența rănilor cronice (spre deosebire de arsuri) a crescut în principal din cauza îmbătrânirii populației, rezultând creșterea costurilor pentru sistemele naționale de sănătate. Astfel, dezvoltarea de noi tehnologii sau terapii, mai eficiente din punct de vedere al costurilor, nu este doar de interes major ci și necesar pentru îmbunătățirea sustenabilității pe termen lung a sistemelor naționale de sănătate (Gonzales și Fuchs, 2017).

Această lucrare cuprinde cunoștințele actuale privind tehnologiile/terapiile recente pentru regenerarea pielii, cum ar fi: pansamente pentru răni și substituenți ai pielii. Beneficiile și riscurile asociate, precum și utilizarea clinică și disponibilitatea sunt toate abordate pentru fiecare terapie.

De o importanță majoră în tratarea defectelor pielii sunt substienții pielii. Substituenții vin într-o varietate de materiale fabricate în diferite forme, cum ar fi filme, hidrocoloizi, hidrogeluri, bureți și membrane. Substituenții dermici bioactivi acționează în vindecarea rănilor fie prin livrarea compușilor bioactivi sau prin construirea lor din materiale care au activitate endogenă. Rata de succes a vindecării este determinată majoritar de procesele celulare și fiziologice de la interfața biomaterial-gazdă. Prin urmare, este important să se construiască strategii cu proprietăți bioactive, pentru a interacționa cu țesuturi și celule pentru a spori vindecarea (Dill și Mörgelin, 2020).

Scopul acestei lucrări a fost de a studia in vitro efectele componentelor care vor intra în componența hidrogelurilor și a plasturilor inteligenți asupra fibroblastelor dermale și keratinocitelor.

Obiectivele au fost testarea citocompatibilității acoperirilor dezvoltate, evaluarea in vitro, utilizând monoculturi celulare specifice, a adeziunii, morfologiei, viabilității, proliferării celulare și sintezei matricei extracelulare în prezența plasturilor inteligenți și a hidrogelurilor selectate.

CAPITOLUL I: ABORDĂRI TEORETICE

Structura și funcțiile pielii

Pielea este un organ complex format din diferite țesuturi care acționează în armonie pentru a oferi protecție față de mediul extern, ce poate cuprinde virusuri, bacterii, praf sau substanțe toxice. Acest organ este format din 3 straturi: epiderma, derma și hipodermul. Orice perturbare a integrității de piele duce la formarea rănilor, care sunt împărțite în 2 categorii principale: răni acute și răni cronice (Rezaie și Momeni-moghaddam, 2019). Astfel, atunci când această barieră este vătămată, o mare coordonare între diferite tipuri de celule, factori de semnalizare, precum și interacțiuni cu matricea sunt necesare pentru a restabili integritatea și funcționarea țesuturilor (Gonzales și Fuchs, 2017).

Straturile pielii: țesuturile și celulele din componența acestora

Figura 1: Structura pielii (după Lawton, 2019)

Epiderma

Epiderma este stratul exterior al pielii, definit ca un epiteliu pavimentos pluristratificat, cuprinzând în principal keratinocite și terminații dendritice (Shpichka și colab., 2019).

Keratinocitele se află în stadii progresive de diferențiere și produc keratină. Deoarece epiderma este avasculară, aceasta depinde în totalitate de dermă pentru transportul de nutrienți și pentru eliminarea deșeurilor prin membrana bazală.

Epiderma adăpostește și o serie de alte populații de celule, cum ar fi melanocitele, celulele Langerhans, și celulele Merkel. Funcția principală a epidermei este de a acționa ca o barieră fizică și biologică față de mediul extern, prevenind penetrarea iritanților și alergenilor. În același timp, previne pierderea apei și menține homeostazia internă (Kolarsick și colab., 2006).

Epiderma se împarte în patru straturi (Fig. 2) în funcție de morfologia și poziția keratinocitelor pe măsură ce se diferențiază, cuprinzând stratul celular bazal (strat germinativ), stratul de celule scvamoase (strat spinos), stratul celulelor granulare (strat granulos), stratul lucid și stratul celular cornos. Cele trei straturi inferioare constituite din celule vii, nucleate, sunt uneori denumite strat Malpighii (Wong și colab., 2016).

Figura 2: Straturile epidermei (după Lawton, 2019)

Procesul de diferențiere, care are loc pe măsură ce celulele migrează de la nivelul stratului bazal spre suprafața pielii, are ca rezultat keratinizarea, un proces în care keratinocitul trece printr-o fază sintetică și printr-o fază degradativă. În faza sintetică, celula acumulează keratină în citoplasmă, un filament intermediar fibros care servește drept componentă a citoscheletului celulei. Filamentele de keratină formează plăcile de atașare intercelulară, cunoscute sub numele de desmozomi. În faza degradativă a keratinizării, organitele se pierd, conținutul celulei este reprezentat de un amestec de filamente, iar învelișul celular este amorf, celula rezultată fiind cunoscută sub numele de corneocit (Qing, 2017).

Stratul bazal, cunoscut și sub denumirea de strat germinativ, conține keratinocite în formă de coloană atașate membranei bazale și dispuse perpendicular față de dermă. La nivelul acestui strat, celule sunt cele mai active mitotic, dând naștere celulelor straturilor epidermei exterioare. Cu toate acestea, nu toate celulele bazale au potențialul de a se divide (Wang și colab., 2018).

Celulele stem epidermale din stratul bazal sunt celule clonogene, cu o durată de viață lungă și care progresează prin ciclul celular foarte lent în condiții normale. În condiții anormale, cum ar fi la apariția rănilor, poate crește numărul de celule ciclice din epidermă, prin stimularea diviziunii în celulele stem (Gonzales și Fuchs, 2017).

Deasupra stratului celular bazal se află stratul celulelor scvamoase, numit și stratul spinos. Acesta este compus dintr-o varietate de celule care diferă ca formă, structură și proprietăți în funcție de locația lor. De exemplu, celulele spinoase suprabazale au formă poliedrică și nucleu rotunjit, în timp ce celulele stratului spinos superior au dimensiuni mai mari și devin mai plate pe măsură ce se deplasează spre suprafața pielii. Acestea conțin granule lamelare, organite legate de membrană, care conțin glicoproteine, glicolipide, fosfolipide, steroli liberi și o serie de hidrolaze acide, inclusiv lipaze, proteaze, fosfataze acide și glicozidaze. Abundența enzimelor hidrolitice indică faptul că granulele lamelare reprezintă un tip de lizozom (Qing, 2017).

Cel mai superficial strat al epidermei care conține celulele vii – stratul granular, este compus din celule aplatizate care conțin granule de keratohialină în citoplasma lor. Aceste celule sunt responsabile de sinteza suplimentară și modificarea proteinelor implicate în keratinizare (Wang și colab., 2018). Granulele de keratohialină sunt bazofile și neregulate ca formă și dimensiune și sunt necesare în formarea atât a matricei interfibrilare care menține filamentele de keratină împreună, cât și a structurii interne a celulelor cornoase. Acțiunea enzimatică a granulelor de keratohialină are ca rezultat producerea de keratină „moale” în epidermă. În schimb, părul și unghiile nu conțin granule keratohialine, iar filamentele care traversează citoplasma celulară se vor întări datorită legăturilor disulfurice, producând keratină „tare” în acele structuri (Qing, 2017).

Corneocitele asigură protecție mecanică straturilor epidermale inferioare și o barieră pentru a preveni pierderea de apă sau pătrunderea corpurilor străine. Corneocitele, care sunt bogate în proteine ​​și sărace în conținut de lipide sunt înconjurate de o matrice lipidică extracelulară continuă. Celulele mari, plate, de formă poliedrică, și-au pierdut nucleele în timpul diferențierii terminale și tehnic sunt considerate moarte (Sorg și colab., 2017).

Melanocitele sunt celule sintetizatoare de pigmenți, derivate din creasta neurală și întâlnite predominant la nivelul stratului bazal. Acestea sunt responsabile de producerea melaninei și transferul acesteia în keratinocite (Kolarsick și colab., 2006).

Celulele Merkel sunt de formă ovală, mecanoreceptori de tip I cu adaptare lentă, localizați în zone cu sensibilitate tactilă ridicată și care se găsesc atașate de keratinocitele bazale prin desmozomi (Wong și colab., 2016).

Derma

Derma formează stratul interior al pielii, are o grosime mai mare decât epiderma (1-5mm) și este situată între zona membranei bazale și stratul subcutanat, rolul său principal fiind de a susține epiderma (Rippa și colab., 2019).

Rețeaua de țesut conjunctiv, care este componenta sa principală, este formată din colagen, în principal, dar și din elastină. Sunt prezente mai multe celule specializate (mastocite și fibroblaste) și structuri (vase de sânge, limfatice, glande sudoripare și nervi) (Wong și colab., 2016).

Dermul este format din două straturi: dermul papilar, situat superficial și dermul reticular situat mai profund. Dermul papilar este stratul mai subțire, format din țesut conjunctiv care conține capilare, fibre elastice și colagen într-un procent mai mic (Haydont și colab., 2020). Dermul reticular este format dintr-un strat mai gros de țesut conjunctiv dens care conține vase de sânge mai mari, fibre elastice strâns legate și mănunchiuri mai groase de colagen. De asemenea, conține fibroblaste, mastocite, terminații nervoase, vase limfatice și apendicele epidermice. În jurul acestor structuri se află un gel vâscos care permite nutrienților, hormonilor și produselor reziduale să treacă prin derm (Qing, 2017).

Fibroblastul este tipul celular major al dermului și funcția principală este de a sintetiza colagen, elastină și gelul vâscos din derm. Colagenul conferă pielii duritatea și reprezintă 70% din derm, fiind continuu descompus și înlocuit, iar fibrele de elastină conferă pielii elasticitatea sa (Wong și colab., 2016).

Mastocitele conțin granule de substanțe chimice vasoactive (principalul fiind histamina), fiind implicate în moderarea răspunsurilor imune și inflamatorii de la nivelul pielii (Rippa și colab., 2019).

Hipodermul

Pe parcursul dezvoltării embrionare, din luna a cincea, celulele adipoase încep să dezvolte țesutul subcutanat. Acești lobuli de celule grase (lipocite) sunt separate printr-un sept fibros format din vase mari de sânge și colagen. Țesutul subcutanat este considerat un organ endocrin și funcționează ca depozit de energie (Wong și colab., 2016).

Funcțiile pielii: protecție, termoreglare și sensibilitate

Funcția principală a pielii este separarea mediului fiziologic intern al corpului de mediul extern. Rolul de barieră fizică este asigurat în primul rând de stratul cornos. Această barieră fizică este responsabilă de reglarea nu numai a intrării de materiale exogene, dar și prevenirea pierderilor excesive de apă din organism. Pielea reprezintă o barieră chimică datorită acidității de la nivelul suprafeței acesteia, având valori de pH între 4 și 6, conferind astfel pielii proprietăți antimicrobiene selective prin menținerea microflorei naturale a pielii și blocând creșterea microorganismelor patogene care prosperă în medii alcaline (Eckhart și Zeeuwen, 2018).

Glandele sebacee din piele, care secretă sebum, îndeplinesc o funcție similară. În urma secreției sale pe suprafața pielii, se formează sebum, o peliculă grasă pe piele, care impermeabilizează pielea pentru a menține hidratarea și suplețea. Sebumul conține, de asemenea, constituenți antimicrobieni (Wong și colab., 2016).

Pielea este de asemenea un organ imun competent. O serie de celule imune, inclusiv celulele Langerhans, celulele dendritice dermice și macrofagele se găsesc la nivelul pielii. Aceste celule sunt capabile să activeze limfocitele T pentru a provoca un răspuns imun primar împotriva antigenelor nou întâlnite (Kolarsick și colab., 2006).

Un alt rol important este în termoreglare, permițând energiei termice să fie disipată sau conservată. Termoreceptorii din piele detectează temperaturile crescute și scăzute, transmit informația hipotalamusului, care inițiază apoi o gamă de mecanisme termoreglatoare pentru obținerea homeostazei. Țesutul adipos din componența stratului subcutanat joacă rolul de izolator termic și previne pierderea excesivă de căldură din corp. Firele de păr din piele asigură o izolare suplimentară prin captarea unui strat subțire de aer pe suprafața pielii. Transpirația secretată prin porii de pe suprafața pielii ajută la reducerea temperaturii corpului prin disiparea căldurii corpului. Are loc vasoconstricție sau vasodilatație pentru a ajusta fluxul de sânge și pierderea de căldură de la nivelul pielii. Aceste mecanisme de termoreglare funcționează împreună pentru a ajuta la menținerea unei temperaturi constante a corpului, de aproximativ 37ș C (Nose și colab., 2018).

În afară de diferențele de temperatură, terminațiile nervoase din derm detectează atingerea, vibrațiile și durerea. Aceste senzații sunt critice pentru alte funcții ale corpului, cum ar fi locomoția și coordonarea. Abilitatea de a simți durerea este crucială pentru supraviețuire. Mai mult, pielea îndeplinește funcții metabolice importante. Adipocitele din hipoderm depozitează surplusul de energie sub formă de grăsime subcutanată, care poate să fie mobilizată rapid în perioada privării de energie (Thulabandu și colab., 2018).

Procesul de regenerare a rănilor

Regenerarea pielii este un proces biologic important datorită funcției sale vitale de menținere a corpului în condiții hemostatice, dar una foarte complexă, deoarece depinde de multiple tipuri de celule și căi biologice. În mod obișnuit, la mamifere apare răspunsul normal în patru stadii suprapuse, dar distincte: hemostază, inflamație, proliferare și faze de remodelare (Shpichka și colab., 2019).

1.3.1 Faza hemostatică

Pentru a preveni pierderile de sânge și lichide, pentru îndepărtarea țesutului necrotic și pentru evitarea infecției, este activată rapid cascada de coagulare, precum și căile inflamatorii și sistemul imunitar (Sorg și colab., 2017). Agregarea trombocitelor se realizează prin intermediul unor activatori, cum ar fi colagenul și factorul tisular, rezultând în eliberarea factorilor de creștere și a factorilor chemotactici pentru a forma cheagul de sânge (Wang și colab., 2018). Printre citokinele implicate (inclusiv factorii de creștere), se numără factorul de creștere derivat plachetar (PDGF), factorul de creștere-β (TGF-β), factorul de creștere endotelială vasculară (VEGF), aceștia putând acționa la nivelul celulelor țintă prin căi endocrine, paracrine, autocrine sau intracrine și stimulează răspunsul celular după legarea la receptorii de suprafață a celulelor și activarea unei căi de semnalizare (Qing, 2017).

Faza inflamatorie

Etapa inflamatorie începe la câteva minute de la deteriorarea țesuturilor (apariția rănilor). Aceasta este urmată de creșterea fluxului sangvin și a permeabilității vasculare rezultând edem și roșeață din cauza creșterii nivelurilor de agenți inflamatori locali (histamină, citokine inflamatorii, fibronectină, etc.), favorizând infiltrarea neutrofilelor, monocitelor și limfocitelor la locul accidentării, fiind necesare pentru a îndepărta țesutul necrotic și pentru a evita apariția unei infecții, prin distrugerea bacteriilor prin fagocitoză (Adler și colab., 2020).

Chemokinele (sau citokine chimiotactice) sunt proteine care leagă heparina și care induc migrarea celulelor inflamatorii către situsul leziunii, prin interacțiunea cu receptorii specifici membranari, iar neutrofilele sunt tipul celular predominant în prima parte a inflamației (48 de ore după accidentare), dar numărul lor se reduce după 24-36 ore, prin apoptoză. În momentul în care monocitele pătrund la nivelul plăgii și se maturează în macrofage, se vor elibera citokine și factori de creștere care stimulează angiogeneza (Patel și colab., 2016). Acest proces este mediat de către chemokine IL-8 eliberate de neutrofile, care atrag macrofagele și alte celule către locul plăgii. Chemokinele sunt clasificate în familii CC, CXC, CX3C și XC, în funcție de prezența a patru resturi de cisteină conservate (Qing, 2017).

Acțiunea macrofagelor declanșează proliferarea celulelor inflamatorii prin orchestrarea citokinelor inflamatorii TNF, IL-6, IL-1, bFGF, etc. Activarea macrofagelor a fost clasificată în 2 stadii, după stimulul activator: M1 și M2. Activarea M1 are ca rezultat un fenotip macrofag extrem de pro-inflamator, iar activarea de tip M2 este mediată de IL-4 și / sau IL-13 care eliberează unii factori de creștere, cum ar fi PDGF, αFGF, bFGF, TGFα, TGFβ, acest fapt sugerând un rol important al macrofagelor activate alternativ (M2), în faza vindecării rănilor (Qing, 2017).

Studiile recente au arătat că autofagia poate juca un rol important în procesul de regenerare celulară, deoarece influențează infecția, inflamația și imunitatea. Limfocitele exercită un răspuns specific împotriva microorganismelor pentru aproximativ 72 ore și secretă limfokine, EGF și bFGF, fiind atrase la acest nivel de către IL-1, care contribuie de asemenea la reglarea colagenazei (Adler și colab., 2020).

Faza de proliferare

Etapa proliferativă începe de obicei la 2 zile de la rănire și se suprapune fazei inflamatorii. Începe cu degradarea matricei fibrino-plachetare și se caracterizează prin migrarea și proliferarea fibroblastelor (fibroplazie) și a celulelor endoteliale până la locul plăgii, unde are loc secreția de citokine și a factorilor de creștere, formarea MEC, angiogeneză și re-epitelializare (Patel și colab., 2016). Fibroblastele au un rol critic în această etapă, deoarece produc proteinele matricei extracelulare ​​(fibronectină, colagen, acid hialuronic și proteoglicani) care sunt esențiale pentru dezvoltarea noii MEC. Acestea ajută, de asemenea, la angiogeneza și migrarea keratinocitelor, care sunt esențiale pentru procesul de re-epitelializare (Thulabandu și colab., 2018).

Matricea de fibrină formată anterior trebuie înlocuită treptat de țesut granular compus din fibroblaste, vase de sânge, macrofage și o matrice liberă bogată în colagen de tip I, fibronectină, glicoproteină și acid hialuronic (Rippa și colab., 2019).

Colagenul este secretat în spațiul extracelular sub formă de procolagen și apoi clivat la nivelul segmentelor terminale, rezultând tropocolagen. Acesta se poate agrega cu alte molecule de tropocolagen pentru a forma filamente de colagen, bogate în hidroxilizină și hidroxiprolină, care îi permit să formeze legături încrucișate puternice. Stabilitatea fibrei de colagen depinde de legăturile intermoleculare care îi conferă rezistența față de distrugere. Cu cât sunt mai multe legături încrucișate intra- și intermoleculare, cu atât mai mare este rezistența la rupere în rănile vindecate. Hidroxilarea resturilor de prolină și lizină depinde de prezența oxigenului, a vitaminei C, a ionului de fier și α-ketoglutaratului (Qing, 2017).

Fibrele de colagen sunt dispuse la nivelul unui schelet de fibronectină care servește și ca ancoră pentru miofibroblaste. Acestea se diferențiază din fibroblaste, care sunt atrase de la nivelul măduvei osoase sau de la marginea plăgii și sunt stimulate de către macrofage. Miofibroblastele joacă un rol important în procesul de contracție a plăgii prin secreția de actină musculară netedă de tip alfa (α AMN) și fibre elastice, fiind întâlnite doar la rănile adulților. În general, această etapă poate dura aproximativ 3 săptămâni (Thulabandu și colab., 2018).

Faza de remodelare

Faza de remodelare se desfășoară pentru o lungă perioadă de timp, de până la 1 an sau mai mult. În această etapă, procesele inițiale angajate după accidentare scad în intensitate până la încetarea completă. Se observă apoptoza macrofagelor și miofibroblastelor, precum și declinul neovasculaturii. Această etapă este marcată atât de contracția plăgii cât și de remodelarea colagenului (degradarea colagenului de tip III și formarea colagenului de tip I). Pe parcusul remodelării, rezistența elastică a rănilor crește treptat ca urmare a acțiunii miofibroblastelor chiar dacă țesutul nu își recapătă niciodată proprietățile inițiale (Sorg și colab., 2017).

Abordările terapeutice pentru vindecarea rănilor pe bază de pansamente

În prezent, mai mult de 3000 de tipuri de pansamente sunt disponibile pe piață. Pansamentele au suferit un proces evolutiv, de la materiale care doar acopereau rana, până la materiale care au menținut un mediu favorabil de hidratare a rănilor, cum ar fi: tifon, pelicule, bandaje (naturale sau sintetice), vată, hidrogeluri, hidrofibre, spume, alginați, înlocuitori ai pielii, etc. Dar pansamentele tradiționale nu pot furniza un mediu umed rănii și astfel au fost înlocuite cu pansamente moderne (Sorg și colab., 2017).

Mai recent, există materiale care furnizează componente active sau care interacționează direct cu celule sau cu substanțele chimice specifice de la nivelul plăgii. În prezent există pansamente disponibile pentru toate tipurile de răni, dar selectarea unui pansament pentru o anumită rană este esențială pentru o vindecare mai rapidă (Wang și colab., 2018).

Un pansament ideal ar trebui să fie capabil să ofere sau să păstreze un mediu umed, să sporească migrația epidermică și să promoveze angiogeneza și sinteza de țesut conjunctiv, precum și să permită schimbul de gaze între țesutul deteriorat și mediu. Alte caracteristici ale unui pansament ideal sunt menținerea unei temperaturi favorabile pentru a îmbunătăți fluxul de sânge, protejarea plăgii față de infecțiile bacteriene, să nu adere la rană și să fie ușor de îndepărtat, să fie sterile, netoxice și non-alergice și, de asemenea, accesibile ca preț (Dill și Mörgelin, 2020).

2.1 Pansamente antimicrobiene

Una dintre cele mai recente inovații în domeniul pansamentelor a fost dezvoltarea pansamentelor antimicrobiene pentru a preveni contaminarea rănilor, deoarece acestea au fost asociate cu rate mari de mortalitate și cu cheltuieli crescute pentru implementarea și gestionarea măsurilor de control al infecțiilor (Simões și colab., 2018).

Aceste pansamente eliberează agenți antimicrobieni în mod continuu la suprafața plăgii, pentru a oferi, pe o durată lungă de timp, acțiune antimicrobiană cu menținerea mediului umed apropiat de cel fiziologic. Pentru a imbunătăți proprietățile antimicrobiene, în structura lor au fost încorporați diferiți agenți. Aceștia sunt reprezentați în general de antibiotice (de exemplu, tetraciclină, ciprofloxacină, gentamicină și sulfadiazină), argint (nanoparticule de argint) și produse naturale (miere, uleiuri esențiale și chitosan) (Fig. 3) (Mohandas și colab., 2018; Sorg și colab., 2017; Semeniuc și colab., 2017).

Figura 3 Pansamente antimicrobiene (după Simões și colab., 2018)

Până acum au fost folosite în pansamente aminoglicozide, beta-lactani, tetracicline, glicopeptide și chinolone. Aceste medicamente interferă cu funcția sau structura bacteriilor sau cu căile metabolice ale acestora, printr-unul dintre următoarele patru mecanisme:

1) inhibarea sintezei peretelui celular bacterian,

2) blocarea cheii căi metabolice,

3) interferarea asupra sintezei proteice,

4) inhibarea sintezei acizilor nucleici

Cu toate acestea, în ciuda faptului că sunt utile în tratamentul rănilor infectate, utilizarea repetată și necorespunzătoare a antibioticelor poate iniția rezistența bacteriană (Negut și colab., 2018).

Pansamente pe bază de argint

Argintul a fost folosit în îngrijirea rănilor mult timp, dar proprietățile sale antibacteriene au fost recunoscute după descoperirea bacteriilor. Acesta are un spectru larg de activitate atât asupra tulpinilor aerobe cât și anaerore, Gram-pozitive și Gram-negative (de exemplu, E.coli, P.aeruginosa, S.aureus și S.pyogenes rezistente la meticilină).

Ionii de argint își exercită activitatea antimicrobiană prin:

(a) legarea la proteine ​​tisulare, provocând o modificare structurală a membranelor celulare bacteriene;

(b) blocarea lanțului respirator, acționând asupra enzimelor respiratorii, cum ar fi citocrom oxidaza și succinat NADH dehidrogenază;

(c) denaturarea ADN / ARN bacterian, împiedicând replicarea;

(d) interacția cu proteine ​​bacteriene;

(e) inducerea producției de specii reactive de oxigen (Lin și colab., 2016).

Un alt mecanism prin care argintul poate spori vindecării rănilor este prin reducerea activității MMP-urilor, care a fost legată de vindecarea întârziată a plăgii și inflamației datorită efectului inhibitor asupra activității zincului. De asemenea, inhibă eliberarea factorului de necroză tumorală alfa (TNF-α) și a altor citokine pro-inflamatorii. Argintul prezintă o toxicitate scăzută în corpul uman, dar expunerea cronică poate duce la depunerea particulelor de argint/sulfură de argint în piele, ochi și altele organe. În ciuda faptului că acestea nu reprezintă un pericol pentru viață, ele nu sunt de dorit din punct de vedere cosmetic (Konop și colab., 2016).

Cercetările indică faptul că pansamentul pe bază de argint este eficient pentru tratarea arsurilor și rănilor cronice (Lin și colab., 2016). De asemenea s-a demonstrat că poate îmbunătăți vindecarea pe termen scurt a rănilor și ulcerelor picioarelor. Datorită rolului său în vindecarea rănilor, argintul a fost impregnat într-o varietate de materiale pentru pansament, cum ar fi alginate de hidrofibră (Aquacel Ag), materiale cu aderență scăzută (Acticoat) și fibre de carbon (Actisorb Silver 220) (Kalantari și colab., 2020; Munteanu și colab., 2016).

2.2 Pansamente din derivați naturali

În zilele noastre, un număr tot mai mare de pansamente a fost impregnat cu compuși obținuți din surse naturale, pentru îmbunătățirea activității lor antimicrobiene. Deoarece există o nevoie continuă pentru a descoperi noi antibiotice, produsele naturale sunt atât surse fundamentale de noi agenți bioactivi cât și de componente integrante ale compendiului farmaceutic (Simões și colab., 2018).

Activitatea antimicrobiană a mierii este atribuită conținutului ridicat de zahăr, conținutului scăzut de apă, acidității și peroxidului de hidrogen endogen, care împreună inhibă dezvoltarea microorganismelor (Cianciosi și colab., 2018). În plus, mierea poate să curețe rănile și să îndepărteze mirosul neplăcut, posedă activitate antiinflamatoare prin creșterea monoxidului de azot și scăderea nivelului de prostaglandină, reduce edemul și previne/minimizează cicatricile hipertrofice, stimulează creșterea țesuturilor epiteliale, grăbind vindecarea rănilor, poate să creeze o interfață neaderentă între rană și pansament, facilitând îndepărtarea acestuia fără durere și fără deteriorarea țesutului nou format (McLoone și colab., 2016).

Mierea s-a dovedit a fi benefică în tratamentul arsurilor și ulcerelor (Saikaly și Khachemoune, 2017). Pansamentele care conțin miere ca agent antimicrobian sunt deja disponibile pe piață, cum ar fi pansamente neaderente la contactul cu rănile și pansamente cu alginat de calciu, pansamente din tifon, neaderente, pansamente moi de alginat și pansamente netede cu vâscoză ușor aderentă (McLoone și colab., 2016).

Uleiurile esențiale sunt produse naturale din metabolismul secundar al plantelor și prezintă un spectru larg de acțiune, inclusiv activități antioxidante, antifungice și antibacteriene. În ciuda faptului că mecanismul de acțiune antimicrobian nu este înțeles complet, se crede că activitatea se datorează hidrofobicității lor și a diferiților constituenți precum cinamaldehidă, geraniol, timol, mentol și carvacrol și multe altele. Se crede că uleiurile esențiale atacă fosfolipidele membranelor celulare și lipidele peretelui celular al bacteriilor, ceea ce duce la creșterea permeabilității și, în cele din urmă, la liza celulară, ceea ce duce la eliminarea citoplasmei, scăderea pH-ului și pierderea proceselor celulare, cum ar fi biosinteza ATP, transcripția ADN și sinteza proteică (Semeniuc și colab., 2017).

Pansamentele pe bază de uleiuri esențiale au fost studiate datorită activității antimicrobiene potențiale împotriva bacteriilor Gram-pozitive și Gram-negative. Un studiu folosind pelicule pe bază de algin, ce conțin uleiul esențial de ardei a arătat o activitate antibacteriană împotriva E. coli, S. aureus (frecvent întâlnită în spital) și B. cereus (Semeniuc și colab., 2017).

Chitosanul este un polimer natural cationic și a fost studiat ca agent antimicrobian pentru prevenirea și tratarea infecțiilor datorită proprietăților sale antimicrobiene intrinseci, în ciuda altor proprietăți benefice, cum ar fi biocompatibilitatea, biodegradabilitatea și non-toxicitatea (Mohandas și colab., 2018).

În consecință, au fost propuse câteva mecanisme de acțiune:

(a) interacțiunea de natură ionică la suprafața celulei, slăbind peretele celular;

(b) inhibarea ARNm și a sintezei proteice prin pătrunderea chitosanului în nucleul bacteriilor;

(c) formarea unei bariere externe și suprimarea schimbului celular și absorbția substanțelor nutritive esențiale (Mohandas și colab., 2018).

Toate aceste mecanisme pot apărea simultan, dar la diferite situsuri. În plus, chitosanul s-a dovedit a fi eficient în grăbirea vindecării rănilor prin îmbunătățirea funcției celulelor inflamatorii, cum ar fi PMN, macrofage și fibroblaste și, astfel, promovarea procesului de granulare (Wang și colab., 2019).

De asemenea, s-a demonstrat creșterea rezistenței mecanice a rănilor datorită chitosanului. Utilizarea sa clinică a arătat că pansamentele de tip plasă cu chitosan promovează aderența eficientă, homeostazia, vindecarea și re-epitelializarea plăgii, iar în timp, are loc reducerea mâncărimii și a durerii. Mai mult, analiza histopatologică a arătat că straturile de celule ale pielii au fost reparate și arhitectura țesuturilor a fost restabilită după 10 zile .

Din aceste motive, pansamentele pe bază de chitosan au fost utilizate pentru a trata rănile moderat sau grav infectate și arsuri, inclusiv pansamente cu hidrogel, pansamente hidrocoloide și pansamente cu fibre de gelifiere hemostatice, care sunt disponibile comercial (Hamedi și colab. 2018).

2.3 Substituenți ai pielii

În cazul unei răni grave, ce duce la o pierdere majoră de teșut, crește probabilitatea de apariție a infecțiilor, pierderea de apă și apariția hipotermiei, ducând la un risc major de mortalitate, la costuri mai mari ale tratamentelor și perioade de spitalizare mai îndelungate însă, uneori, poate fi fatală (Rezaie și Momeni-moghaddam, 2019).

Deși cele mai populare opțiuni de tratament recurg la tehnica alogenă a grefei pielii, problemele apar din cauza că suprafața pielii a donatorului este adesea limitată. Așadar, substituenți ai pielii din substanțe sintetice sau de origine umană reprezintă o alternativă eficientă pentru înlocuirea grefei alogene (Wang și colab., 2018).

Pregătirea substituenților pielii implică celule și/sau MEC. În mod ideal, substituenții de piele sintetizați trebuie să asigure înlocuirea imediată atât a epidermei cât și a dermului cu acoperirea permanentă a rănilor. De asemenea, ar trebui să poată acționa ca o barieră care împiedică evenimentele menționate de mai sus; nu oferă nicio toxicitate; fără antigenicitate pentru a evita orice răspuns imun, să aibă toleranță față de hipoxie, să faciliteze angiogeneza, să prezinte rezistență la forfecare, iar în final, acestea trebuie să fie ușor de aplicat și suficient de agile pentru a se adapta suprafețelor neregulate ale plăgii (Sorg și colab., 2017).

Există moduri diferite de a clasifica substituenții pielii, cum ar fi după durata acoperirii, anatomie, celularitate sau acelularitate, biologic sau sintetic, dar cea mai acceptată și folosită clasificare este după sistemul lui Kumar, format din trei categorii:

Clasa I -Materiale de pansament temporare impermeabile,

Clasa II – Substituenți de piele durabili cu un singur strat,

Clasa III – Substituenți de piele compuși (Kumar, 2008).

Substituenți de Clasa I: Materiale în monostrat și materiale dublustratificate

Substituenții de piele de clasa I funcționează ca o barieră epidermică și în ciuda lipsei de componente celulare, acționează ca o barieră mecanică împotriva infecției bacteriene, reduc pierderile de apă și ajută la producerea unui mediu umed pentru o vindecare mai bună (Kumar, 2008).

Pansamente cu un singur strat

Pansamentele naturale, cum ar fi membrana amniotică umană, formată din patru straturi (strat epitelial, membrană bazală, fibroblaste ale țesutului conjunctiv și un strat gelatinos) (Fig. 4) și s-a raportat că prezintă proprietăți angiogenice. Mai mult, ameliorează durerea, oferă protecție față de infecții, controlează pierderea de electroliți și albumină și favorizează re-epitelializarea. Sunt utilizate mai ales în tratarea arsurilor (Siqueira și colab., 2019).

Pansamentele din materiale sintetice includ membrane sau pelicule din polimeri sintetici, straturi de celuloză biosintetice și straturi de bioceluloză derivate din trestie de zahăr (Sorg și colab., 2017).

2.3.1.2 Materiale cu strat dublu

Transcyte (Fig. 5) este un substituent de piele derivat din fibroblast uman adesea folosit pentru arsuri excizate și este format dintr-o membrană polimerică și celule fibroblastice din prepuț de nou-născut (alogene) cultivate în condiții aseptice in vitro, pe o rețea de nailon. În rețeaua de nailon fibroblastele proliferează și secretă proteine matriceale (fibronectină, colagen de tip I, tenascină, proteoglicani și glicozaminoglicani) și factori de creștere, contribuind la declanșarea angiogenezei și a dezvoltării ulterioare a fibroblastelor. În plus, s-a demonstrat că Transcyte reduce semnificativ durata spitalizării pacienților pediatrici cu arsuri de grad mediu, fiind destul de sigur și eficient (Shpichka și colab., 2019).

Figura 5: Structura Transcyte (după bu.edu/woundbiotech/bioengineered)

Substituenți de Clasa II

2.3.2.1 Substituenți epidermali

Substituenți epidermali ai pielii imită epiderma umană, adică forma și funcția sa. Cu toate acestea, produsele din această categorie sunt predispuse la descompunere și sunt susceptibile la infecții. Singurul produs disponibil în această categorie este autogrefa epitelială cultivată (CEA), Epicel și EpiDex. Ambele implică cultura keratinocitelor autologe (keratinocitele proprii). Din moment ce acești substituenți sunt foarte delicați pentru manevrare, este necesar un sistem de aplicare sau un pansament de susținere (Kleintjes și colab., 2017).

Epicel (Fig. 6) este un substituent epidermal compus din keratinocitele autologe transplantate sub formă de foaie epidermală folosind suport de tifon. Este utilizat mai ales pentru acoperirea permanentă a rănii la pacienții cu arsuri mai mari de 30% din suprafața totală a pielii (Kleintjes și colab., 2017).

Figura 6: Epicel (heraldonline.com/)

Epidex este un substituent epidermal compus din keratinocite autologe izolate de teaca rădăcinii exterioare a foliculilor de păr de la nivelul scalpului și furnizate sub formă de discuri cu un suport cu membrană de silicon. Epidex pare a fi un echivalent epidermal valoros pentru remedierea rănilor cronice greu de vindecat, care prezintă unele țesuturi de granulare, dar nu reușesc să re-epitelializeze, în special, ulcerul cronic venos de picior (Kleintjes și colab., 2017).

2.3.2.2 Substituenți dermici

Substituenții dermici sunt constituiți din substanțe care sunt identice cu cele care se găsesc în dermul uman, cu piele modificată sau fabricate sub formă de matrice de colagen dermic pe lângă alte proteine ale ​​matricei. Aceștia au proprietatea de a crește stabilitatea plăgilor. Produsele din această categorie includ foi de colagen bovin și matrice dermice bovine, matrice dermice umane și foi de colagen porcine (Dill și Mörgelin, 2020).

Kollagen este o matrice acelulară derivată din colagen bovin. Îmbunătățește re-epitelializarea și protejează rana împotriva infecțiilor și pierderilor de lichide. A fost utilizat în tratamentul arsurilor (Dill și Mörgelin, 2020).

Permacol este o foaie acelulară sterilă, umedă și dură, dar flexibilă, formată din fibre de colagen dermice porcine și de elastină reticulate. Permacol poate juca un rol important în managementul pe termen scurt al defectelor peretelui abdominal (Fig. 7). Cu toate acestea, lipsa studiilor pe termen lung și costul ridicat al implantului necesită o evaluare medicală a eficienței costurilor (Sorg și colab., 2017).

Figura 7: Utilizarea Permacol la nivelul peretelui abdominal (www.alamy.com)

OASIS Wound Matrix este o matrice de regenerare dermică derivată din straturile submucoase din jejun porcin. Este compus din glicozaminoglicani, fibronectină, proteoglicani și factori de creștere. Acest înlocuitor al pielii este frecvent utilizat în tratamentul rănilor membrelor inferioare și pare a fi util în ulcerele diabetice (Kirsner, 2016).

Matriderm este o membrană extrem de poroasă formată din colagen de tip I, II și V obținut din derma bovină acoperită cu elastină derivată din ligament bovin. Aceasta crește flexibilitatea și elasticitatea pielii, iar riscul de hematom este scăzut datorită proprietăților sale hemostatice (Fig. 8). Studiile au raportat eficacitatea sa în tratamentul arsurilor asociate cu divizarea grefei de piele autologă și în răni cronice, cum ar fi ulcerul diabetic (Kirsner, 2016).

Figura 8: Utilizarea Matriderm (după medskin-suwelack.com)

Alloderm este o matrice cutanată acelulară compusă din componente derivate din dermul cadaveric crioprezervat uman și anume colagen fibrilar și colagen VI, elastină, hialuronan, proteoglicani, fibronectină și canale vasculare. Acesta servește ca un șablon pentru îngroșarea fibroblastelor gazdă și a țesutului vascular și susține regenerarea țesutului dermic. Cu toate acestea, funcția de barieră a alografelor de cadavru uman, inclusiv Alloderm, nu sunt ideale, deoarece poate exista o contaminare a pielii cadavrelor, care duce la transmiterea bolii. Cu toate acestea, s-a dovedit a fi un opțiune bună în arsuri acute, în defecte de augumentare a țesutui moale facial și, recent, a fost raportat pentru o gamă largă de aplicații, inclusiv reconstrucție a peretelui abdominal și reconstrucție aloplastică a sânului (Greig și colab., 2019).

2.3.2.3 Substituenți de Clasa III: Dermo-Epidermali

Substituenții de piele din clasa a III-a includ acele materiale care înlocuiesc atât dermul, cât și epiderma. Acestea pot fi scaffolduri biologice sau substituenți produși prin inginerie tisulară după cum urmează.

Scaffoldul biologic este o matrice extracelulară de mamifere compusă din laminină, fibrinectină, colagen și elastină obținute de la donator uman – autogrefe și alogrefe – sau donator de origine animală (în principal porcine) – xenogrefe. Principalele diferențe între alogrefe și xenogrefe sunt sursa de țesut, speciile de origine și metodele de prelucrare. Deși alogrefa rămâne standard, s-au făcut mai multe încercări de obținere a unor alternative adecvate. De exemplu, EZ Derm (o dermă porcină reticulată) (Fig. 9) se arată a fi un pansament robust al plăgii care asigură o acoperire durabilă, cu minimul de complicații (Haddad și colab., 2017).

Figura 9: EZ Derm (www.molnlycke.ae)

Integra reprezintă unul dintre substituenții produși prin inginerie tisulară și este format dintr-un șablon de regenerare dermică acelulară, compus din două straturi, unul dintr-o foaie de protecție din silicon care previne pierderile de lichid, iar cealaltă, o matrice compusă din colagen bovin și glicozaminoglicani, care se așează sub stratul de silicon și oferă o bază pentru revascularizare și formarea neodermului. Inițial, a fost creat din necesitatea de a furniza acoperire temporară pentru pacienții care suferă de arsuri extinse. Cu toate acestea, de atunci, aplicațiile clinice s-au lărgit, iar în prezent, este de asemenea utilizat frecvent în tratamentul rănilor mai ușoare sau în răni cronice (Fig. 10) (Chang și colab., 2019).

O alternativă pentru tratamentul rănilor complexe este asocierea substituenților de piele cu keratinocitele în cultură. Exemple de aceste tipuri de piele compozite includ Orcel și Apligraft. Orcel este un înlocuitor compozit al pielii, din fibroblaste însămânțate într-o matrice de colagen de tip I bovină (partea dermică) și keratinocite cultivate la latura epidermică. Acest produs stimulează migrația celulelor gazdă, oferind un aspect favorabil al matricei. De la aprobare, a fost utilizat în principal în tratamentul ulcerului venos și diabetic, ulcerații ale piciorului, precum și în arsuri cu grosime parțială. În ciuda beneficiilor sale, prezintă unele limitări clinice, deoarece nu poate fi utilizat în rănile infectate, la pacienții cu alergie la orice produse animale, din cauza riscului crescut de respingere, și nici la pacienții care sunt alergici la penicilină, gentamicină, streptomicină sau amfotericină B. Un alt dezavantaj asociat cu Orcel este necesitatea de a fi crioprezervat (Tan și colab., 2017).

Apligraf este similar cu Orcel în sensul în care ambele conțin dermă vie și epidermă, fiind compuse din amestecarea fibroblastelor vii din prepuț de la nou-născuți cu colagen bovin de tip I în stratul inferior (stratul dermic) și keratinocitele în stratul superior (strat epidermic) (Fig. 11). Cu toate acestea, Apligraf este supus unui etape suplimentare de încălzire în timpul producției, pentru a obține o matrice liberă care să permită dezvoltarea unei rețelei fibroase dermice, iar ulterior, celulele proliferează pe această matrice fibroasă.

Figura 11: Comparație între structura substituentului Apligraf și structura normală a pielii (după Karr, 2016)

Ca și Orcel, Apligraf a fost utilizat în tratamentul ulcerelor venoase, diabetice și în cazul arsurilor cu grosime parțială. Dezavantajele în ceea ce privește utilizările sale clinice sunt similare cu cele ale Orcel și, spre deosebire de perioada de valabilitate a lui Apligraf (care are o durată de valabilitate de 9 luni), Orcel prezintă o perioadă de valabilitate destul de scăzută (aproximativ 5-10 zile) (Kirsner, 2016; Wang și colab., 2018).

Terapii sistemice prin administrare de suplimente de magneziu, zinc și vitamina D

3.1 Suplimentare cu magneziu

Magneziul joacă un rol important în mai multe funcții biologice, iar nivelurile sale scăzute (hipomagneziemie) reprezintă un factor de risc pentru dezvoltarea ulcerului diabetic la nivelul piciorului.

Un studiu clinic despre utilizarea de magneziu la pacienții cu DFU timp de 12 săptămâni a raportat beneficii în vindecarea rănilor. Printre beneficiile raportate se numără reducerea semnificativă a lungimii, lățimii și adâncimii ulcerului, un metabolism crescut al insulinei și o capacitate crescută de antioxidant plasmatic, probabil datorită scăderii producției de ROS și creșterii activității glutation-peroxidazei (Razzaghi și colab., 2018; Afzali și colab., 2019).

Suplimentare cu zinc

Zincul este unul dintre cei mai importanți micronutrienți din corpul uman. Este un factor cheie în nenumărate funcții biologice, inclusiv vindecarea rănilor. Zincul este prezent în toate etapele de reparare și participă la majoritatea evenimentelor biologice, inclusiv: activarea trombocitară, influxul de PMN, clearance-ul bacterian, apoptoza/fagocitoza, activitatea anti-inflamatorie, eliminarea resturilor tisulare, migrația fibroblastelor și keratinocitelor. De aceea, nivelurile sale scăzute pot afecta vindecarea corectă a rănilor (Lin și colab., 2018).

Un studiu clinic în care s-au evaluat efectele sulfatului de zinc asupra vindecării rănilor și starea metabolică la pacienții cu DFU timp de 12 săptămâni a ajuns la concluzia că, la fel ca vitamina D, zincul a avut efecte benefice asupra suprafeței ulcerului, metabolismului glicemiei și raportului total HDL : colesterol (Momen-Heravi și colab., 2017).

3.3 Suplimentare cu vitamina D

Vitamina D este esențială în diferite procese biologice. Dovezi recente au arătat că nivelurile de vitamina D ale pacienților cu VU și PU sunt scăzute, ceea ce sugerează că ar putea juca un rol important în procesul de vindecare a rănilor (Everett și Mathioudakis, 2018).

Un studiu a raportat efecte benefice asupra vindecării rănilor, atunci când a fost administrată vitamina D timp de 12 săptămâni la pacienții cu DFU. S-a constatat că vitamina D a accelerat închiderea rănii. De asemenea, vitamina D pare să îmbunătățească profilul lipidic, prin reducerea colesterolului total, a LDL, precum și controlul glicemic (Everett și Mathioudakis, 2018; Kirsner, 2016).

CAPITOLUL II – ABORDĂRI PRACTICE

Materiale și metode

Pregătirea probelor pentru teste de degradare / eliberare

Pregătirea materialului utilizat și caracterizarea acestuia s-au realizat la Institutul Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, Măgurele. Au fost utilizate probe pe bază de chitosan (CS), polietilen glicol (PEG) și ibuprofen (IBUP), denumite în continuare „CPI”. Raportul masic de CS și PEG a fost de 1:1, iar raportul masic dintre CS-PEG și IBUP a fost de 5:1.

Probele CPI au fost obținute pornind de la o soluție stoc de chitosan, cu masa moleculară 60.000 – 120.000 g/mol și de concentrație 4.2 mg/mL, preparată în soluție de acid lactic, ce concentrație 20 mM. Ulterior, prin adăugarea de polietilen glicol cu masa moleculară 35.000 g/mol, a fost obținută soluția compozită CS:PEG astfel încât raportul masic să fie 1:1, iar ibuprofenul, utilizat drept agent antiinflamator, în proporție de 5/1 raportat la amestecul polimeric a fost dizolvat în soluția compozită, obținută sub agitare manetică. Peste volumul de soluție apoasă CS:PEG/IBUP rezultat a fost adăugat un volum egal de etanol absolut, astfel încât raportul volumetric dintre soluția apoasă și etanol să fie de 1:1, omogenizarea realizându-se prin agitare magnetică (500 rpm / RT).

Filmele CPI au fost obținute pe substraturi din titan, prin pipetarea unui volum total de 500 µL din soluția compozită finală, urmată de evaporarea solventului în nișa chimică, sub flux laminar.

Studiul degradării acoperirilor CPI și al eliberării agentului terapeutic (IBUP) a fost realizat în regim dinamic pe o perioadă de 96 ore, în condiții biologice simulate (SBF, pH – 7.25, 37oC), utilizând un reactor multicanal conectat la o pompă peristaltică. În fiecare canal al reactorului au fost introduse câte 2 substraturi acoperite cu CPI (selectate astfel încât masele relative ale acoperirii să fie similare), peste care a fost adăugat un volum de 4 mL de SBF. Pentru fiecare interval considerat, probele au fost recuperate, uscate și cântărite (în vederea estimării pierderilor masice), iar soluțiile rezultate au fost colectate și analizate prin spectroscopie de absorbție în UV-VIS (în vederea estimării cantității eliberate de IBUP).

Pregătirea probelor pentru teste biologice

Respectând un protocol similar celui descris anterior, tot în cadrul Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, Măgurele, pentru testările in vitro au fost obținute loturile de probe CP (CS și PEG în raport masic de 1:1), CPI și CPIH (CS și PEG în raport masic de 1:1; CS și PEG în raport masic cu IBUP de 5:1 și CS și PEG în raport cu HA (acid hialuronic) de 8:1. Peste soluțiile apoase CP, CPI și CPIH au fost adăugate volume egale de etanol absolut, astfel încât raportul volumetric soluție apoasă:etanol să fie 1:1, omogenizarea realizându-se prin agitare magnetică (500 rpm / RT).

Probele CP, CPI și CPIH au fost obținute pe substraturi din titan, prin pipetarea unui volum de 100 µL din soluția compozită finală, urmată de evaporarea solventului în nișa chimică, sub flux laminar, peste noapte.

1.3 Studii prin contact indirect

Testarea citocompatibilității acoperirilor dezvoltate, respectiv CP, CPI și CPIH depuse pe discuri de titan, s-a realizat prin studii de contact indirect utilizând fibroblaste dermale (linia celulară CCD 1070SK) și keratinocite (linia celulară CCD 1106 KERTr). Astfel, probele au fost sterilizate pentru 20 de minute în PBS cu 1% penicilină/streptomicină/amfotericină B și ulterior au fost menținute în 2 ml mediu de cultură specific tipurilor celulare utilizate, pentru o oră, 24 de ore și 72 de ore la temperatura de 370C.

Mediile de extracție au fost recoltate și adăugate peste monostratulul celular, crescut în prealabil timp de 24 de ore în mediu specific de cultivare. În paralel, celulele au fost incubate în mediul standard de creștere (controlul negativ de citotoxicitate) și mediul de creștere suplimentat cu 5% DMSO (controlul pozitiv de citotoxicitate).

1.3.1 Teste de viabilitate celulară

Într-o primă etapă, s-a realizat marcarea fibroblastelor și keratinocitelor, menținute pentru 1 zi și 3 zile în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate, cu calceină și homodimer de etidiu pentru a investiga calitativ viabilitatea celulară.

Calceina acetoximetil ester (AM) reacționează cu esterazele intracelulare ale celulelor viabile, rezultând calceina, care emite o fluorescență verde la lungimea de undă 494/517 nm, vizibilă la microscopul cu fluorescență. Homodimerul de etidiu pătrunde în nucleul celulelor cu membrana plasmatică lezată, se intercalează între bazele azotate ale acizilor nucleici și emite o fluorescență roșie la 528/617 nm, detectabilă de asemenea la microscopul cu fluorescență.

Numarul de celule metabolic active a fost cuantificat utilizând testul CCK-8 (Fig. 12), care se bazează pe reducerea de către dehidrogenazele celulare a unei sări de tetrazoliu, WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt], la un formazan de culoare galbenă, solubil în mediul de cultură, care este evaluat spectrofotometric. După incubarea timp de 2 ore la 37° C, densitatea optică a soluției de formazan a fost măsurată la 450 nm. Intensitatea culorii obținute este direct proporțională cu activitatea metabolică a populațiilor celulare și invers proporțională cu toxicitatea materialului și, în consecință, cu extractul acestuia.

Figura 12: Principiul testului CCK8 (după www.researchgate.net)

1.3.2 Teste pentru evaluarea morfologiei fibroblastelor și keratinocitelor

Morfologia fibroblastelor și keratinocitelor menținute în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate, a fost investigată prin microscopie de fluorescență, pentru evidențierea filamentelor de actină. Celulele au fost fixate cu o soluție de paraformaldehidă de concentrație 4%, permeabilizate cu o soluție de BSA de concentrație 2% și TritonX100 de concentrație 1% și colorate cu faloidină cuplată cu Alexa Fluor 488 și examinate prin microscopie de fluorescență atât la 1 zi, cât și la 3 zile de la cultivare.

1.4 Studii prin contact direct

Am evaluat biocompatibilitatea acoperirilor dezvoltate, respectiv PLGA (acid polilactic-co-glicolic), PLGA și IBUP în raport de 2:1 și PLGA și IBUP în raport de 10:1, prin studii de contact direct utilizând fibroblaste dermale și keratinocite care au fost depuse pe discuri de titan.

Biocompatibilitatea a fost investigată prin testul Live&Dead, cu ajutorul testului CCK8 dar și prin observarea adeziunilor focale după marcarea vinculinei utilizând microscopia de fluorescență.

Rezultate și discuții

2.1 Studiul degradării acoperirilor CPI și al eliberării agentului terapeutic (IBUP)

S-a utilizat pentru dezvoltarea acoperirilor chitosan, un polimer bioactiv cu o mare varietate de aplicații datorită proprietăților sale funcționale, cum ar fi activitatea antibacteriană, non-toxicitatea, ușurința modificării și biodegradabilitatea. Acesta derivă din chitină, prin deacetilare și este un polizaharid linear pe bază de D-glucozamină și N-acetil-D-glucozamină legați β 1-4 (Muxika și colab., 2017).

Într-un studiu realizat de Park și colab. (2018) s-a demonstrat accelerarea vindecării rănilor în toate stagiile datorită chitosanului, care de asemenea a previnit sângerarea, a îmbunătățit funcția celulelor inflamatoare și a dus la activarea fibroblastelor, care au format o nouă matrice de colagen în regiunile cu țesut afectat. În plus, membrana de chitosan a menținut un micromediu fiziologic umed care a favorizat vindecarea și formarea de țesut granular, ducând la hemostază.

Într-un alt studiu in vitro de viabilitate celulară folosind HaCaT (o linie de celule a keratinocitelor umane), realizat de Wiegand și colab. (2010), s-a descoperit că eliberarea citokinelor din celulele HaCaT pentru inducerea apoptozei celulare a fost favorizată de către chitosan. Testele imunohistochimice au arătat că sinteza de colagen a crescut. Mai mult, în rănile deschise ale pielii, pansamentele cu chitosan au crescut rata epitelializării și depunerea de colagen la nivelul dermului, și a redus semnificativ numărul de celule inflamatorii in vivo.

Împreună cu chitosanul a fost utilizat polietilen-glicolul (PEG). Acesta este frecvent utilizat, datorită flexibilității structurale ridicate, biocompatibilității și capacității ridicate de hidratare (D’souza și Shegokar, 2016). PEG-urile cu masă moleculară mai mare de 2000 (în prezentul studiu a fost utilizat PEG cu masa moleculară de 35 000 g/mol) sunt substanțe solide, cristaline cu puncte de topire de aproximativ 63 °C. Este un compus polar, solubil în apă și în solvenți organici și anorganici. PEG-urile sunt neutre din punct de vedere electric la orice valoare a pH-ului și sunt inerte în medii biologice (D’souza și Shegokar, 2016).

În acoperirile dezvoltate s-a utilizat ibuprofenul, un medicament antiinflamator nesteroidian utilizat frecvent ca analgezic. S-au realizat cercetări privind administrarea topică de ibuprofen prin scaffold-uri pentru a fi un tratament direct, local al inflamației pielii. Există însă provocări legate de această tehnică, atât legate de caracteristicile scaffold-ului, cât și profilul de eliberare al medicamentului încorporat, ambele aspecte reprezentând roluri critice în procesul de vindecare a rănilor, astfel că este necesară o atentă reglementare. Studiile de viabilitate și proliferare a keratinocitelor umane au sugerat că adăugarea de ibuprofen la scaffold-uri a dus la creșterea numărului de keratinocite viabile după 14 zile, iar cea mai mare viabilitate a keratinocitelor pare să apară la celulele însămânțate pe scaffold-uri cu 20% ibuprofen (Mohiti-Asli și colab., 2017).

Filmele CPI au fost obținute pe substraturi de titan. Titanul și aliajele pe bază de titan sunt cele mai utilizate dispozitive percutanate, datorită rezistenței mecanice, biocompatibilității, non-toxicității și rezistența la coroziune. Multe studii au arătat că suprafața de titan nano-structurată poate îmbunătăți funcționalitatea diferitelor tipuri de celule (Tan și colab., 2017)

Astfel, pentru acoperirile dezvoltate în cadrul Institutului Național de Fizica Laserilor, Plasmei și Radiației, Măgurele s-au realizat câte 3 măsurători pentru fiecare probă, după evaporarea totală a solventului din cei 500 μL de soluție compozită, și au fost obținute următoarele valori: masa de CPI/probă a fost aproximativ 3,1329 mg, masa de CS:PEG/probă a fost 2,61075 mg, iar masa de IBUP/probă a fost 0,52215 mg.

În Fig. 13 sunt prezentate pierderile masice ale acoperirilor, unde graficul include reprezentarea în funcție de timp a variației masei probelor ( Δm = diferența dintre masele inițiale și finale ale probelor, înainte și după testele în regim dinamic; verde) și a variației raportului dintre variația masei probelor și masa CPI ( Δm/mCPI = variația Δm raportată la masa acoperiririi CPI; roșu). După o oră s-au înregistrat pierderi masice semnificative de aproximativ 2 mg (reprezentând 66%), iar ulterior se prezintă sub forma unui platou până la 40 de ore. La finalul celor 96 de ore de evaluare se constată o pierdere de 3,1 mg (aproximativ 93%).

Figure 13: Variația Δm și Δm/mCPI în funcție de timpul de testare în regim dinamic

Ulterior, prin determinarea pierderilor masice s-a estimat o creștere a eliberării de ibuprofen de la 0,33 mg după o oră, până la 0,5 mg după 96 de ore. Prin raportare la volumul de 4 mL de SBF, s-a constatat creșterea concentrației ibuprofenului de la 82,5 μg/mL după o oră, până la 125 μg/mL după 96 de ore. Eliberarea IBUP din probele CPI a fost evaluată prin monitorizarea valorii absorbanței la lungimea de undă de 264 nm (caracteristică medicamentului), graficul obținut prin trasarea dependenței concentrației de IBUP eliberate în funcție de timp fiind inclus în Fig. 14. În primele 40 de ore de testare în regim dinamic se evidențiază o creștere liniară a cantității de IBUP.

Figura 14: Variația absorbanței IBUP (264 nm) în funcție de timpul de testare în regim dinamic

În cazul probelor CPI ce ne-au fost predate pentru testele biologice (obținute după evaporarea solventului din cei 100 µL de soluție compozită; filmele existând doar pe fața superioară a substratului metalic, raportat la poziționarea lor în plăcile Petri predate) au fost estimate următoarele valori de IBUP eliberat (din totalul de aproximativ 0.1044 mg IBUP / probă): 16 µg/mL IBUP per probă după o oră, deci aproximativ 64 µg IBUP în 4 mL după o oră, iar după 96 de ore aproximativ 26 µg/mL IBUP per probă, respectiv 104 µg IBUP în 4 mL.

2.2 Studiul citocompatibilității materialelor suport în vederea selecției componentelor utilizate în obținerea hidrogelurilor și a plasturilor inteligenți

Materialele suport au fost dezvoltate utilizând chitosan, polietilen-glicol și ibuprofen. Cu privire la efectul antimicrobian, s-a demonstrat într-un studiu realizat de Smith și colab. (2010) faptul că, chitosanul cu greutatea moleculara < 305 kDa (respectiv, 305 000 g/mol) a manifestat activitate antimicrobiană atât împotriva bacteriilor gram-negativ, cât și împotriva celor gram-pozitive. În probele dezvoltate (CP, CPI și CPIH), a fost utilizat chitosan cu masa moleculară cuprinsă între 60 000 și 120 000 g/mol.

În același studiu au fost sugerate două mecanisme prin care se manifestă efectul antimicrobian al chitosanului:

(1) polimerul de chitosan blochează în lanț nutrienții care intră prin membrana bacteriană

(2) chitosanul cu masa moleculară scazută intră în peretele celulei bacteriene și întrerupe activitățile fiziologice ale acesteia.

Primul mecanism este observat predominant la bacteriile gram-pozitive, iar al doilea mecanism este observat în cazul bacteriilor gram-negative. Proprietatea antimicrobiană a chitosanului poate fi îmbunătățită prin adăugarea de alte medicamente sau nanoparticule (Smith și colab., 2010).

Evaluarea viabilității/proliferării și morfologiei fibroblastelor dermale

Fibroblastele dermale îndeplinesc un rol esențial în vindecarea rănilor prin popularea plăgii pentru a produce MEC, care formează cicatrice. Acestea se împart în două categorii, în funcție de localizarea la nivelul dermului, identificându-se fibroblaste reticulare și fibroblaste papilare. Fibroblastele reticulare populează selectiv situsul imediat după rănire, în comparație cu cele papilare. Cele reticulare sunt selectate în mod natural datorită capacității lor intrinseci de a produce colagen organizat și cu diametru mare, în comparație cu cel produs de fibroblastele papilare. Migrarea către situtusul rănii este reglată de mediatori ai inflamației precum fibronectină, PDGF, FGF și TGF-β (Thulabandu și colab., 2018). Fibroblastele joacă un rol important în proliferare și migrație ca răspuns la citokinele chimiotactice, mitogene și modulatoare. Fibroblastele dermale secretă mulți factori în mediile lor de cultură cum ar fi factorul de creștere a fibroblastului acid și bazic (FGF-1 și -2, respectiv bFGF). Acest factor de creștere este o proteină de legare a heparinei, care pot interacționa cu proteoglicanii sulfat heparan de la suprafața celulelor și care interve în multiple procese biologice, cum ar fi dezvoltarea creierului, poate controla secreția hormonului proteic ovarian relaxină, poate regla tensiunea arterială a membrelor, dezvoltarea sistemului nervos și prezintă un rol important în vindecarea rănilor și în creșterile tumorale (Abdian și colab., 2015).

Viabilitatea celulară a fost investigată prin marcarea cu calceină și homodimer de etidiu. La o zi după colorare, a fost evidențiat un număr mare de celule viabile, care nu au prezentat modificări morfologice (Fig. 15).

Figura 15: Viabilitatea fibroblastelor menținute pentru o zi în mediile de extracție ale probelor de interes. Cu verde sunt ilustrate celulele vii, iar cu roșu celulele moarte

După 3 zile s-a observat de asemenea un număr mare de celule viabile și fără modificări morfologice, cu excepția controlului pozitiv de citotoxicitate și un numar redus de celule moarte pentru toate condițiile experimentale studiate (Fig. 16). Controlul pozitiv a fost DMSO de concentrație 5%. Dimetilsulfoxidul (DMSO) este o moleculă amfipatică compusă dintr-un domeniu polar reprezentat prin sulfinil și două grupări metilice nepolare, din acest motiv este capabil să solubilizează substanțele polare și nepolare și traversează barierele hidrofobe (De Abreu Costa și colab., 2017). Într-un studiu realizat de Moskot și colab. (2019) privind citotoxicitatea DMSO asupra celulelor, a fost raportat faptul că proliferarea fibroblastelor a fost redusă cu 85% și 57% în cazul unei concentrații de 1% și 2% DMSO, în timp ce 3% a dus la 16% din viabilitate, iar concentrația de 5% a fost letală pentru întreaga cultură.

Figura 16: Viabilitatea fibroblastelor menținute pentru 3 zile în mediile de extracție ale probelor de interes. Cu verde sunt ilustrate celulele vii, iar cu roșu celulele moarte

Numărul de celule metabolic active a fost cuantificat utilizând testul CCK-8, care se bazează pe reducerea de către dehidrogenazele celulare a unei sări de tetrazoliu, WST-8, la un formazan de culoare galbenă solubil în mediul de cultură, care este evaluat spectrofotometric. Intensitatea culorii obținute este direct proporțională cu activitatea metabolică a populațiilor celulare și invers proporțională cu toxicitatea materialului și, în consecință, cu extractul acestuia.

Figura 17 Efectul extractelor acoperirilor analizate asupra viabilității/proliferării fibroblastelor: Testul CCK-8 la 1 zi (a) și 3 zile (b) de cultivare.

Rezultatele testului CCK8 prezentate în Fig. 17 evidențiază o creștere a numărului de celule metabolic active pentru ambele intervale de timp studiate cu excepția controlului pozitiv de citotoxicitate. De asemenea, se remarcă o scădere a activității metabolice a fibroblastelor menținute în extractele probelor ce conțin ibuprofen comparativ cu controlul negativ și extractele celorlalte probe investigate.

Morfologia fibroblastelor menținute în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate, a fost investigată prin microscopie de fluorescență, pentru evidențierea filamentelor de actină. Imaginile de microscopie de fluorescență (Fig. 18 și Fig. 19), relevă faptul că fibroblastele nu au suferit modificări morfologice evidente și adoptă o morfologie tipică, alungită, cu fibre de actină bine reprezentate pentru toate probele analizate. De asemenea, se observă o creștere a numărului de celule de la 1 zi la 3 zile la cultivare.

Figura 18: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate pentru o zi în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colarați cu DAPI (albastru)

Figura 19: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate pentru 3 zile în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru).

2.2.2 Evaluarea viabilitatii/proliferarii si morfologiei keratinocitelor

Keratinocitele au fost studiate îndelung, deoarece suferă multe dintre procesele normale ale diferențierii in vitro. Keratinocitele se măresc pe măsură ce se diferențiază, la fel cum fac in vivo și de asemenea se diferențiază definitiv și formează învelișuri cornoase. Diferențierea definitivă a keratinocitului in vitro necesită calciu, acesta permițând stratificarea prin participarea la formarea de contacte desmozomale și favorizând diferențierea (Smith și colab., 2010).

Imaginile de microscopie în fluorescență prezentate în Fig. 20 și Fig. 21 evidențiază un număr mare de keratinocite viabile care crește cu timpul de incubare pentru toate extractele analizate, cu excepția controlului pozitiv de citotoxicitate. De asemenea, s-a detectat un număr redus de keratinocite moarte pentru ambele intervale de timp analizate.

Figura 20: Viabilitatea keratinocitelor menținute pentru 1 zi în mediile de extracție ale probelor de interes. Testul Live/Dead (celule vii-verde; celule moarte- roșu).

Figura 21: Viabilitatea keratinocitelor menținute pentru 3 zile în mediile de extracție ale probelor de interes. Testul Live/Dead (celule vii-verde; celule moarte- roșu).

Rezultatele testului CCK 8 prezentate în graficul din Fig. 22 indică faptul că numărul de celule metabolic active a crescut odată cu timpul de incubare, respectiv la 3 zile față de 1 zi, pentru toate tipurile de extracte analizate, cu excepția controlului pozitiv. Se observă o activitate metabolică mai scăzută a keratinocitelor menținute în mediile de extracție ale acoperirilor ce conțin ibuprofen, comparativ cu controlul negativ.

Figura 22: Efectul extractelor acoperirilor analizate asupra viabilității/proliferării keratinocitelor: Testul CCK-8 la 1 zi (a) si 3 zile (b) de cultivare.

Imaginile de fluorescență prezentate în Fig. 23 și Fig. 24 relevă morfologia poligonală tipică keratinocitelor, fibrele de stres prezentând tendința de a se distribui spre periferia celulelor.

Figura 23: Microscopie de fluorescenta a keratinocitelor cultivate pentru 1 zi în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru).

Figura 24: Microscopie de fluorescenta a keratinocitelor cultivate pentru 3 zile în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate . Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru).

2.3 Evaluarea in vitro cu monoculturi celulare specifice (fibroblaste dermale, keratinocite) a adeziunii, morfologiei, viabilității/ proliferarii celulare și sintezei matricei extracelulare în prezența plasturilor inteligenți și a hidrogelurilor selectate

Un alt obiectiv al studiilor biologice a vizat investigarea biocompatibilității, acoperirilor dezvoltate, respectiv PLGA, PLGA:IBUP (2:1) și PLGA:IBUP (10:1), prin studii de contact direct utilizând fibroblaste dermale și keratinocite care au fost depuse pe discuri de titan.

Progresele recente din industria biofarmaceutică au facilitat dezvoltarea de
noi terapii pe bază de macromolecule bioactive. Una dintre provocările față de utilizarea clinică a acestor biomacromolecule se află în selectarea transportatorilor adecvați pentru a proteja, livra și a le elibera in vivo pentru a-și maximiza efectele farmacologice. Micro sau nanoparticulele biodegradabile realizate din acid poli D, L-lactic-co-glicolic (PLGA) au fost explorate ca
metode de livrare terapeutică. Datorită biocompatibilității lor excelente și
biodegradabilității controlabile, micro / nanoparticule PLGA ar putea proteja macromoleculele de degradare in vivo, permițând în același timp eliberarea acestora (Ding și Zhu, 2018).

Într-un studiu realizat de Nan și colab. (2019) a fost indicat faptul că aplicarea forței mecanice asupra fibroblastelor cultivate pe scaffold-uri 3D cu PLGA a dus la o creștere semnificativă a proliferării celulare și a expresiei genelor COL-1, precum și o scădere a expresiei MMP-1. Mai mult, aceste efecte au fost mediate, cel puțin parțial prin intermediul căii de semnalizare TGF-β. PLGA ce a fost utilizat este un copolimer de acid poliglicolic (PGA) și acid polilactic (PLA), care prezintă avantajele PGA în ceea ce privește aderența celulară
și ale PLA în ceea ce privește rezistență mecanică.

Scaffold-urile folosite pentru ingineria țesuturilor pielii trebuie să susțină aderența și proliferarea celulelor și să faciliteze distribuția omogenă a celulelor și a matricei extracelulare depuse, pentru a favoriza formarea țesutului pielii. O plasă hibridă subțire, biodegradabilă PLGA-colagen a promovat adeziunea fibroblastelor și a accelerat creșterea și producția de MEC, rezultând în formarea rapidă a țesutului dermic. Într-o structură cu PLGA cu spații inter-fire, utilizată in vitro, s-a demonstrat de asemenea adeziune celulară și proliferare (Chen și colab., 2005).

2.3.1 Studii prin contact direct utilizând fibroblastele dermale

Rezultatele obținute privind viabilitatea celulară realizată cu testul Live& Dead sunt prezentate în Fig 25, unde se observă că numărul de celule crește semnificativ odată cu timpul de incubare în cazul tuturor probelor analizate. De asemenea se observă absența celulelor moarte (marcaj roșu).

Figura 25 Viabilitatea fibroblastelor crescute în contact direct cu suprafața suporturilor de Ti funcționalizate cu PLGA; PLGA:IBUP 2:1 și PLGA:IBUP 10:1 la 1, 3 și 6 zile. Testul Live/Dead (celule vii-verde; nu se observă celule moarte- roșu).

Pentru a cuantifica gradul în care acoperirile realizate pot să moduleze proliferarea fibroblastelor a fost realizat testul CCK8. După cum se poate observa din graficul prezentat în Fig. 26, activitatea metabolică măsurată a crescut semnificativ, în timp, în cazul tuturor acoperirilor analizate.

Figura 26: Influența materialelor testate asupra proliferării celulare evaluată prin testul CCK8. Rezultatele sunt prezentate ca medii±SD (n=2).

Evidențierea adeziunii și morfologiei fibroblastelor pe suprafețele analizate s-a realizat prin marcarea filamentelor de actină la 1, 3 și 6 zile de la însămânțare. Imaginile de fluorescență prezentate în Fig. 27 arată că fibroblastele aderă și se etalează pe suprafața tuturor probelor analizate. Fibroblastele prezintă un aspect morfologic caracteristic, iar fibrele de actină sunt bine reprezentate și orientate paralel între ele și cu axul longitudinal al celulei. Se observă că gradul de proliferare celulară crește cu timpul de incubare pentru toate probele studiate. La 6 zile de la cultivare populația celulară atinge gradul de confluență.

Figura 27: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate direct, pentru 1, 3 și 6 zile, pe suporturile analizate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru).

În continuare a fost investigat gradul de sinteză a colagenului, cea mai abundentă proteină de la nivelul matricei extracelulare implicate în procesul de vindecare a rănilor,în prezența substraturilor analizate. Graficul prezentat în Fig. 28 arată o creștere a sintezei de colagen la 14 zile versus 7 zile. Nu s-au înregistrat diferențe semnificative între probele analizate.

Figura 28: Sinteza de colagen de către fibroblastele cultivate pentru 7 si 14 zile pe suporturile analizate

2.3.2 Studii prin contact direct utilizănd keratinocitele

Un alt obiectiv al studiilor biologice întreprinse a constat în evaluarea adeziunii și etalării keratinocitelor pe suprafețele analizate. Astfel, în studiile noastre interacția keratinocitelor cu substratul a fost evidențiată prin dubla marcarea a vinculinei și a filamentelor de actină la 2h și 24h de la însămânțare (Fig. 29). La 2h de la cultivare se observă discrete adeziuni focale localizate spre periferia celulelor. După 24 h de cultură, analiza în fluorescență a relevat aspectul tipic keratinocitelor. Adeziunile focale sunt mai evidente, având un marcaj punctiform pentru vinculina, pentru toate probele analizate. De asemenea s-a observat dispunerea fibrelor de stres spre periferia celulelor. Aceste rezultate demonstrează că acoperirile studiate sunt capabile să stimuleze adeziunea și etalarea keratinocitelor.

Figura 29: Microscopie de fluorescență a keratinocitelor cultivate timp de 2h și 24h pe suporturile analizate. Microfilamentele de actină (roșu), contactele focale (vinculina, verde).

Rezultatele referitoare la viabilitatea keratinocitelor realizată cu testul Live& Dead sunt prezentate în Fig. 30. Au fost observate celulele viabile (marcaj verde) pe toate acoperirile analizate. De asemenea, se observă că numarul de celule crește semnificativ, odată cu timpul de incubare în cazul tuturor probelor studiate. Important este faptul că nu au fost observate celule moarte (marcaj roșu).

Figura 30: Viabilitatea keratinocitelor în contact cu suprafața suporturilor de Ti functionalizate cu PLGA; PLGA:IBUP 2:1 și PLGA:IBUP 10:1 la 1, 3 si 6 zile. Testul Live/Dead (celule vii-verde; nu se observă celule moarte- roșu).

Pentru a cuantifica gradul în care acoperirile realizate pot să moduleze proliferarea keratinocitelor a fost realizat testul CCK8. După cum se poate observa din graficul prezentat în Fig. 31, activitatea metabolică măsurată prin testul CCK8 a crescut semnificativ, în timp, în cazul tuturor acoperirilor analizate. Cu toate acestea, la 3 zile de la cultivare s-a obținut o densitate optică mai mică în cazul probei de titan, comparativ cu probele acoperite cu PLGA și PLGA:IBUP 10:1. De asemenea, s-a obținut o densitate optică mai mică pentru proba acoperită cu PLGA:IBUP 2:1, comparativ cu cea acoperită cu PLGA, PLGA:IBUP 10:1 și cu proba de titan.

Figura 31: Influența materialelor testate asupra proliferării keratinocitelor evaluată prin testul CCK8. Rezultatele sunt prezentate ca medii±SD (n=2).

Concluzii

Scopul acestui studiu a fost de a investiga in vitro efectele compușilor care vor intra în componența hidrogelurilor și a plasturilor inteligenți asupra fibroblastelor dermale și keratinocitelor.

Studiile prin contact indirect utilizând extractele acoperirilor dezvoltate [CP (CS:PEG în raport masic de 1:1), CPI (CS:PEG/IBUP în raport masic de 5/1) și CPIH (CS:PEG în raport masic de 1:1; CS:PEG/IBUP în raport masic de 5/1; CS:PEG-HA în raport de 8:1)] au arătat că că aceste substrate celulare manifestă un grad ridicat de citocompatibilitate atât cu fibroblastele cât și cu keratinocitele.

Rezultatele studiilor prin contact direct obținute pe fibroblaste dermale și keratinocite epidermale arată că toate probele studiate [(PLGA, PLGA:IBUP (2:1) și PLGA:IBUP (10:1)] susțin adeziunea, viabilitatea, proliferarea și sinteza de colagen într-o manieră similară, dezvoltând un grad ridicat de biocompatibilitate.

Astfel s-au remarcat următoarele:

fibroblastele prezintă un aspect morfologic caracteristic, iar fibrele de actină sunt bine reprezentate și orientate paralel între ele și cu axul longitudinal al celulei;

keratinocitele prezintă morfologia poligonală tipică, iar fibrele de stres au tendința de a se distribui spre periferia celulelor;

activitatea metabolică măsurată a crescut semnificativ, în timp, în cazul tuturor acoperirilor analizate demonstrând potențialul probelor analizate de a susține supraviețuirea și proliferarea celulară;

sinteza de colagen crește la 14 zile față de primele 7 zile, fără să se înregistreze diferențe semnificative între probele analizate.

BIBLIOGRAFIE

Abdian N., Ghasemi-Dehkordi P., Hashemzadeh-Chaleshtori M., Ganji-Arjenaki M., Doosti A., Amiri B., 2015. Comparison of human dermal fibroblasts (HDFs) growth rate in culture media supplemented with or without basic fibroblast growth factor (bFGF). Cell and Tissue Banking, 16(4), 487-495.

Adler M., Mayo A., Zhou X., Franklin R. A., Meizlish M. L., Medzhitov R., Alon U., 2020. Principles of Cell Circuits for Tissue Repair and Fibrosis. iScience, 23(2), 316-328.

Afzali H., Jafari Kashi A. H., Momen-Heravi M., Razzaghi R., Amirani E., Bahmani F., Asemi Z., 2019. The effects of magnesium and vitamin E co-supplementation on wound healing and metabolic status in patients with diabetic foot ulcer: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Wound Repair and Regeneration, 27(3), 277-284.

Chang D. K., Louis M. R., Gimenez A., Reece E. M., 2019. The Basics of Integra Dermal Regeneration Template and its Expanding Clinical Applications. Seminars in Plastic Surgery, 33(3), 185-189.

Chen G., Sato T., Ohgushi H., Ushida T., Tateishi T., Tanaka J., 2005. Culturing of skin fibroblasts in a thin PLGA-collagen hybrid mesh. Biomaterials, 26(15), 2559-2566.

Cianciosi D., Forbes-Hernández T. Y., Afrin S., Gasparrini M., Reboredo-Rodriguez P., Manna P., Battino M., 2018. Phenolic compounds in honey and their associated health benefits: A review. Molecules, 23(9), 2322.

D’souza A., Shegokar R., 2016. Polyethylene glycol (PEG): a versatile polymer for pharmaceutical applications. Expert Opinion on Drug Delivery, 13(9), 1257-1275.

De Abreu Costa L., Ottoni M., Dos Santos M., Meireles A. B., De Almeida V. G., De Fátima Pereira W., Brito-Melo G., 2017. Dimethyl sulfoxide (DMSO) decreases cell proliferation and TNF-α, IFN-, and IL-2 cytokines production in cultures of peripheral blood lymphocytes. Molecules, 22(11), 1-10.

Dill V., Mörgelin M., 2020. Biological dermal templates with native collagen scaffolds provide guiding ridges for invading cells and may promote structured dermal wound healing. International wound journal, January, 1-13.

Ding D., Zhu Q., 2018. Recent advances of PLGA micro/nanoparticles for the delivery of biomacromolecular therapeutics. Materials Science and Engineering, 92, 1041-1060.

Eckhart L., Zeeuwen P. L., 2018. The skin barrier: Epidermis vs environment. Experimental Dermatology, 27(8), 805‐806.

Everett E., Mathioudakis N., 2018. Update on management of diabetic foot ulcers. Annals of the New York Academy of Sciences, 1411(1), 153‐165.

Gonzales K., Fuchs E., 2017. Skin and Its Regenerative Powers: An Alliance between Stem Cells and Their Niche. Developmental Cell, 43(4), 387-401.

Greig H., Roller J., Ziaziaris W., Van Laeken N., 2019. A retrospective review of breast reconstruction outcomes comparing AlloDerm and DermaCELL. Journal of Surgical Reconstruction, 22, 19-26.

Haddad A. G., Giatsidis G., Orgill D. P., Halvorson E. G., 2017. Skin Substitutes and Bioscaffolds: Temporary and Permanent Coverage. Clinics in Plastic Surgery, 44(3), 627‐634.

Hamedi H., Moradi S., Hudson S. M., Tonelli A. E., 2018. Chitosan based hydrogels and their applications for drug delivery in wound dressings: A review. Carbohydrate Polymers, 199, 445‐460.

Haydont V., Neiveyans V., Perez P., Busson É., 2020. Fibroblasts from the Human Skin Dermo- Hypodermal Junction are Distinct from Dermal Papillary and Reticular Fibroblasts and from Mesenchymal Stem Cells and Exhibit a Specific Molecular Profile Related to Extracellular Matrix Organization and Modeling, 9(2), 368.

Kalantari K., Mostafavi E., Afifi A. M., Izadiyan Z., Jahangirian H., Rafiee-Moghaddam R., Webster T. J., 2020. Wound dressings functionalized with silver nanoparticles: Promises and pitfalls. Nanoscale, 12(4), 2268‐2291.

Kirsner R. S., 2016. The wound healing society chronic wound ulcer healing guidelines update of the 2006 guidelines – Blending old with new. Wound Repair and Regeneration, 24(1), 110‐111.

Kleintjes W., Thomas G., Thaele B., Stevenson N, Warren B., 2017. A Novel Technique for Composite Cultured Epithelial Autograft in a Patient with Extensive Burn Wounds: A Case Report. Clinics in surgery, 2, 1579.

Kolarsick P. A., Ann Kolarsick M., Goodwin C., 2006. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses Association, 3(4), 203-213.

Konop M., Damps T., Misicka A., Rudnicka L., 2016. Certain Aspects of Silver and Silver Nanoparticles in Wound Care: A Minireview. Journal of Nanomaterials, 4, 10.

Kumar P., 2008. Classification of skin substitutes. Burns, 34(1), 148‐149.

Lawton S., 2019. Skin 1: the structure and functions of the skin. Nursing Times, 30-33.

Lin P. H., Sermersheim M., Li H., Lee P. H., Steinberg S. M., Ma J., 2018. Zinc in wound healing modulation. Nutrients, 10(1), 16.

Lin Y. H., Hsu W. S., Chung W. Y., Ko T. H., Lin J. H., 2016. Silver-based wound dressings reduce bacterial burden and promote wound healing. International Wound Journal, 13(4), 505-511.

McLoone P., Warnock M., Fyfe L., 2016. Honey: A realistic antimicrobial for disorders of the skin. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 49(2), 161‐167.

Mohandas A., Deepthi S., Biswas R., Jayakumar R., 2018. Chitosan based metallic nanocomposite scaffolds as antimicrobial wound dressings. Bioactive Materials, 3(3), 267‐277.

Mohiti-Asli M., Saha S., Murphy S. V., Gracz H., Pourdeyhimi B., Atala A., Loboa E. G., 2017. Ibuprofen loaded PLA nanofibrous scaffolds increase proliferation of human skin cells in vitro and promote healing of full thickness incision wounds in vivo. Journal of Biomedical Materials Research – Part B Applied Biomaterials, 105(2), 327-339.

Momen-Heravi M., Barahimi E., Razzaghi R., Bahmani F., Gilasi H. R., Asemi Z., 2017. The effects of zinc supplementation on wound healing and metabolic status in patients with diabetic foot ulcer: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Wound Repair and Regeneration, 25(3), 512-520.

Moskot M., Jakóbkiewicz-Banecka J., Kloska A., Piotrowska E., Narajczyk M., Gabig-Cimińska M., 2019. The role of dimethyl sulfoxide (DMSO) in gene expression modulation and glycosaminoglycan metabolism in lysosomal storage disorders on an example of mucopolysaccharidosis. International Journal of Molecular Sciences, 20(2), 1-18.

Munteanu A., Florescu I. P., Nitescu C., 2016. A modern method of treatment: The role of silver dressings in promoting healing and preventing pathological scarring in patients with burn wounds. Journal of medicine and life, 9(3), 306-315.

Muxika A., Etxabide A., Uranga J., Guerrero P., Caba K., 2017. Chitosan as a bioactive polymer: Processing, properties and applications. International Journal of Biological Macromolecules, 105(2), 1358‐1368.

Nan L., Zheng Y., Liao N., Li S., Wang Y., Chen Z., Mo S., 2019. Mechanical force promotes the proliferation and extracellular matrix synthesis of human gingival fibroblasts cultured on 3D PLGA scaffolds via TGF-β expression. Molecular Medicine Reports, 19(3), 2107-2114.

Negut I., Grumezescu V., Grumezescu A. M., 2018. Treatment strategies for infected wounds. Molecules, 23(9), 2392.

Nose H., Kamijo Y., Masuki S., 2018. Interactions between body fluid homeostasis and thermoregulation in humans. Handbook of Clinical Neurology, 156, 417‐429.

Park J. U., Song E., Jeong S. H., Song J., Kim H. E., Kim S., 2018. Chitosan-Based Dressing Materials for Problematic Wound Management. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1077, 527-537.

Patel S., Maheshwari A., Chandra A., 2016. Biomarkers for wound healing and their evaluation. Journal of Wound Care, 25(1), 46-55.

Qing C., 2017. The molecular biology in wound healing & non-healing wound. Chinese Journal of Traumatology – English Edition, 20(4), 189-193.

Razzaghi R., Pidar F., Momen-Heravi M., Bahmani F., Akbari H., Asemi Z., 2018. Magnesium Supplementation and the Effects on Wound Healing and Metabolic Status in Patients with Diabetic Foot Ulcer: a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. Biological Trace Element Research, 181(2), 207-215.

Rezaie F., Momeni-moghaddam M., 2019. Regeneration and Repair of Skin Wounds : Various Strategies for Treatment. The International Journal of Lower Extremity Wounds 18(3), 247‐261.

Rippa A. L., Kalabusheva E. P., Vorotelyak E. A., 2019. Regeneration of Dermis: Scarring and Cells Involved. Cells, 8(6), 607.

Saikaly S. K., Khachemoune A., 2017. Honey and Wound Healing: An Update. American Journal of Clinical Dermatology, 18(2), 237‐251.

Semeniuc C. A., Pop C. R., Rotar A. M., 2017. Antibacterial activity and interactions of plant essential oil combinations against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Journal of Food and Drug Analysis, 25(2), 403-408.

Shpichka A., Butnaru D., Bezrukov E. A., Sukhanov R. B., Atala A., Burdukovskii V., Timashev P., 2019. Skin tissue regeneration for burn injury. Stem Cell Research and Therapy, 10(1), 94.

Simões D., Miguel S. P., Ribeiro M. P., Coutinho P., Mendonça A. G., Correia I. J., 2018. Recent advances on antimicrobial wound dressing: A review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 127, 130‐141.

Siqueira D. S., Rosa F., Fabrício M., Augusto M., Fonseca M., Virgolino G., Mendes R. H., 2019. Review Article Evidence in Practice of Tissue Healing with Latex Biomembrane: Integrative Review. Journal of diabetes research, 7457295.

Smith J. K., Bumgardner J. D., Courtney H. S., Smeltzer M. S., Haggard W. O., 2010. Antibiotic-loaded chitosan film for infection prevention: A preliminary in vitro characterization. Journal of Biomedical Materials Research – Part B Applied Biomaterials, 94(1), 203-211.

Sorg H., Tilkorn D. J., Hager S., Hauser J., Mirastschijski U., 2017. Skin Wound Healing: An Update on the Current Knowledge and Concepts. European Surgical Research, 58(1-2), 81‐94

Tan J., Zhao C., Zhou J., Duan K., Wang J., Lu X., Feng B., 2017. Co-culturing epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts on nano-structured titanium surfaces. Materials Science and Engineering, 78, 288-295.

Thulabandu V., Chen D., Atit R. P., 2018. Dermal fibroblast in cutaneous development and healing. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology, 7(2), 1-13.

Wang P. H., Huang B. S., Horng H. C., Yeh C. C., Chen Y. J., 2018. Wound healing. Journal of the Chinese Medical Association, 81(2), 94‐101.

Wang Y. W., Liu C. C., Cherng J. H., Lin C. S., Chang S. J., Hong Z. J., Chang H., 2019. Biological effects of chitosan-based dressing on hemostasis mechanism. Polymers, 11(11).

Wiegand C., Winter D., Hipler U. C., 2010. Molecular-weight-dependent toxic effects of chitosans on the human keratinocyte cell line HaCaT. Skin Pharmacology and Physiology, 23(3), 164-170.

Wong R., Geyer S., Weninger W., Guimberteau J. C., Wong J. K., 2016. The dynamic anatomy and patterning of skin. Experimental Dermatology, 25(2), 92-98.

LISTĂ DE FIGURI

Figura 1: Structura pielii (după Lawton, 2019) 4

Figura 2: Straturile epidermei (după Lawton, 2019) 5

Figura 3 Pansamente antimicrobiene (după Simões și colab., 2018) 12

Figura 4: Structura membranei amniotice (după cellgenuity.com) 17

Figura 5: Structura Transcyte (după bu.edu/woundbiotech/bioengineered) 18

Figura 6: Epicel (heraldonline.com/) 19

Figura 7: Utilizarea Permacol la nivelul peretelui abdominal (www.alamy.com) 20

Figura 8: Utilizarea Matriderm (după medskin-suwelack.com) 20

Figura 9: EZ Derm (www.molnlycke.ae) 21

Figura 10: Integra Sus, stânga- Vedere intraoperatorie a Integra asupra defectului de la nivelul antebrațului. S-a folosit tehnica de disecție suprafascială. Sus, dreapta- Integra cu stratul său de silicon îndepărtat în 6 săptămâni. Mai jos, stânga- Grefă de piele cu grosime completă peste Integra. Mai jos, dreapta- Apariția grefei de piele vindecată cu grosime completă peste Integra în 3,5 luni. (www.researchgate.net) 22

Figura 11: Comparație între structura substituentului Apligraf și structura normală a pielii (după Karr, 2016) 23

Figura 12: Principiul testului CCK8 (după www.researchgate.net) 28

Figure 13: Variația Δm și Δm/mCPI în funcție de timpul de testare în regim dinamic 29

Figura 14: Variația absorbanței IBUP (264 nm) în funcție de timpul de testare în regim dinamic 30

Figura 15: Viabilitatea fibroblastelor menținute pentru o zi în mediile de extracție ale probelor de interes. Cu verde sunt ilustrate celulele vii, iar cu roșu celulele moarte 32

Figura 16: Viabilitatea fibroblastelor menținute pentru 3 zile în mediile de extracție ale probelor de interes. Cu verde sunt ilustrate celulele vii, iar cu roșu celulele moarte 32

Figura 17 Efectul extractelor acoperirilor analizate asupra viabilității/proliferării fibroblastelor: Testul CCK-8 la 1 zi (a) și 3 zile (b) de cultivare. 33

Figura 18: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate pentru o zi în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colarați cu DAPI (albastru) 33

Figura 19: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate pentru 3 zile în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru). 34

Figura 20: Viabilitatea keratinocitelor menținute pentru 1 zi în mediile de extracție ale probelor de interes. Testul Live/Dead (celule vii-verde; celule moarte- roșu). 34

Figura 21: Viabilitatea keratinocitelor menținute pentru 3 zile în mediile de extracție ale probelor de interes. Testul Live/Dead (celule vii-verde; celule moarte- roșu). 35

Figura 22: Efectul extractelor acoperirilor analizate asupra viabilității/proliferării keratinocitelor: Testul CCK-8 la 1 zi (a) si 3 zile (b) de cultivare. 35

Figura 23: Microscopie de fluorescenta a keratinocitelor cultivate pentru 1 zi în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru). 36

Figura 24: Microscopie de fluorescenta a keratinocitelor cultivate pentru 3 zile în mediile de extracție ale acoperirilor dezvoltate . Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru). 36

Figura 25 Viabilitatea fibroblastelor crescute în contact direct cu suprafața suporturilor de Ti funcționalizate cu PLGA; PLGA_IBU 2:1 și PLGA_IBU 10:1 la 1, 3 și 6 zile. Testul Live/Dead (celule vii-verde; nu se observă celule moarte- roșu). 37

Figura 26: Influența materialelor testate asupra proliferării celulare evaluată prin testul CCK8. Rezultatele sunt prezentate ca medii±SD (n=2). 38

Figura 27: Microscopie de fluorescență a fibroblastelor cultivate direct, pentru 1, 3 și 6 zile, pe suporturile analizate. Microfilamentele de actină (verde), nucleii colorați cu DAPI (albastru). 39

Figura 28: Sinteza de colagen de către fibroblastele cultivate pentru 7 si 14 zile pe suporturile analizate 39

Figura 29: Microscopie de fluorescență a keratinocitelor cultivate timp de 2h și 24h pe suporturile analizate. Microfilamentele de actină (roșu), contactele focale (vinculina, verde). 40

Figura 30: Viabilitatea keratinocitelor în contact cu suprafața suporturilor de Ti functionalizate cu PLGA; PLGA_IBU 2:1 și PLGA_IBU 10:1 la 1, 3 si 6 zile. Testul Live/Dead (celule vii-verde; nu se observă celule moarte- roșu). 41

Figura 31: Influența materialelor testate asupra proliferării keratinocitelor evaluată prin testul CCK8. Rezultatele sunt prezentate ca medii±SD (n=2). 41

LISTĂ DE ABREVIERI

PDGF- Factorul de creștere derivat plachetar

TGFβ – Factorul de creștere transformant β

VEGF – Factorul de creștere vascular endotelial

TNF – Factorul de creștere tumorală

IL-6 – Interleukină 6

FGF – Factorul de creștere fibroblastic

M1/M2 – Macrofage

EGF – Factorul de creștere epidermal

MEC – Matrice extracelulară

CEA – Autogrefă epitelială cultivată

DFU – Ulcerații ale piciorului diabetic

AMN – Actină musculară netedă

MMP – Metaloproteinaze matriceale

PMN – Neutrofile polimorfonucleare

ROS – Specii reactive de oxigen

VU – Ulcer venos

PU – Ulcer de presiune

CPI – Probe cu Chitosan – Polietilen glicol – Ibuprofen

CS – Chitosan

PEG – Polietilen glicol

RT – Temperatura camerei

SBF – Condiții biologice simulate

CPIH – Probe cu chitosan – Polietilen glicol- Ibuprofen – Acid hialuronic

DMSO – Dimetil sulfoxid

AM – Calceina acetoximetil ester

BSA – Albumină serică bovină

PLGA – Acid polilactic-co-glicolic

IBUP – Ibuprofen