Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu CANDIDAT: Sorin Lazăr Iași 2017 Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iași Facultatea de Biologie Specializarea… [306825]

Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iași

Facultatea de Biologie

LUCRARE DE DISERTAȚIE

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu

CANDIDAT: [anonimizat]

2017

Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iași

Facultatea de Biologie

Specializarea Genetică moleculară

TESTUL MICRONUCLEILOR

ÎN EVALUAREA EFECTULUI POLUĂRII
APELOR LA SPECII DE PEȘTI

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

Lect. Dr. Mirela Mihaela Cîmpeanu

CANDIDAT: [anonimizat]

2017

Introducere

Peștii sunt organisme acvatice expuse la o mare varietate de poluanți de diferite concentrații și sunt cunoscuți ca bioindicatori în poluarea apelor deoarece aceștia acumulează substanțele din mediu proces numit bioacumulare (B.A. Markert, A.M. Breure & H.G. Zechmeister).

[anonimizat], ce pot fi reversibile sau permanente. [anonimizat], salinitatea, dar și prezența unor substanțe chimice (insecticide, erbicide și fungicide) (V. I. Lushchak, 2010).

Cele mai studiate specii de pești sunt cele de interes economic. Testul micronucleilor este folosit în genotoxicologie pentru a evidenția prezența compușiilor genotoxici și efectul lor la nivel molecular.

Obiectivul acestui studiu este de a oferi noi informații asupra modificărilor produse la nivelul nucleilor celulelor din branhii la specia de pești (Carassius gibelio) din mediul natural.

[anonimizat]. Dr. [anonimizat], [anonimizat] a-mi oferi sugestii.

Vreau să îi multumesc și domnului Conf. Dr. Habil. Dragoș Lucian Gorgan și doctorand: [anonimizat], proces numit „stres oxidativ”. [anonimizat], nivelul oxigenului și salinitatea pot induce stresul oxidativ în condiții normale sau artificiale prin inducerea dezechilibrului între producția și eliminarea oxigenului reactiv (V. I. Lushchak, 2010).

[anonimizat], cum ar fi ionii metalelor tranziționale (cupru, crom, mercur, arsenic), pesticidele (insecticide, erbicide, fungicide) (V. I. Lushchak, 2010).

[anonimizat] a radicalilor liberi a fost reorientată de la modul descriptiv de acțiune la mecanismele moleculare care sporesc toleranța (V. I. Lushchak, 2010).
[anonimizat] s-au urmărit elaborarea unor tehnici pentru evaluarea acestui proces cum ar fi formarea bazelor oxidate (8-oxoguanina) ce poate fi măsurată prin tehnici HPLC (Kelly et al., 2008) sau imun (Bespalov et al., 1999). Măsurarea 8-oxoguninei a fost aplicată animalelor acvatice (Malins et al., 1996; Gielazyn et al., 2003; Grygoryev et al., 2008). [anonimizat]-ului, a fost aplicată cu succes în pești (Toyoizumi et al., 2008; Cavalcante et al., 2008; Caliani et al., 2009) și alte animale acvatice (Petridis et al. , 2009; Binelli et al., 2009).

I.1. Factorii de mediu

Temperatura

Temperatura afectează toate organismele vii și în cazul animalelor ectotermice are un efect critic. Scăderea sau creșterea temperaturii mediului induc stresul oxidativ prin diferite mecanisme. Creșterea temperaturii duce la un consum ridicat de oxigen și stimulează porcesele metabolice, determinând stresul oxidativ prin produșii secundari obținuți în urma metabolismului intensificat (V. I. Lushchak, 2010).

Creșterea temperaturii mediului înconjurător, induce stresul oxidativ în broaște (Bagnyukova et al., 2003), pești (Parihar și Dubey, 1995; Heise et al., 2006; Lushchak și Bagnyukova, 2006) și alte animale acvatice (Verlecar et al., 2007; Bocchetti et al., 2008). În conformitate cu intensificarea metabolismului oxidativ menționat mai sus se poate aștepta scăderea riscului de inducere a stresului oxidativ la o temperatură scăzută. În unele cazuri, scăderea temperaturii mediului poate determina stresul oxidativ la pești (Malek et al., 2004) și la Semibalanus balanoides (Niyogi et al., 2001).

Nivelul de oxigen

Atât temperatura, cât și disponibilitatea oxigenului sunt parametri esențiali pentru distribuția hidrobionților. Nivelurile crescute de O2 măresc generarea tipurilor de oxigen reactiv datorită probabilității sporite de scăpare a electronilor din lanțurile de transport de electroni pentru combinarea cu oxigenul molecular. Cu toate acestea, organismele posedă mecanisme adaptive specifice pentru a preveni consecințele negative ale nivelelor ridicate de oxigen din mediu. La nivelul comportamentului, acestea pot evita zonele suprapuse de oxigen, în timp ce la nivelul organismului, acestea pot reduce capacitatea lor de a extrage oxigen de mediu (V. I. Lushchak, 2010).

În literatură se mențioanză că expunerea la hiperoxie induce la diferite specii de pești, cum ar fi Carassius auratus (Lushchak et al., 2005), Salmo salar (Olsvik et al., 2005) și Solea senegalensis (Salas-Leiton et al., 2009). Rezultate asemănătoare au fost raportate la Adamussium colbecki și Pecten jacobaeus (Viarengo et al., 1995) și Anthopleura elegantissima (Dykens et al., 1992). Prin urmare, este clar că nivelul crescut de oxigen extern este un inductor al stresului oxidativ la animalele acvatice (V. I. Lushchak, 2010).

Concentrația scăzută a oxigenului poate reduce șansa producerii de radicali liberi în organisme. Scăderea concentrațiilor de oxigen din mediul înconjurător poate provoca stres oxidativ. Expunerea la anoxie duce la o creștere a activității SOD (superoxid dismutaza) și catalază în ficat (Lushchak et al., 2001), care a fost folosită ca o demonstrație a ideii de "pregătire pentru stres oxidativ" (Hermes-Lima et al., 1998). Această ipoteză afirmă că în organismele evoluționiste adaptate la tranzițiile dintre condițiile externe normale și cele extreme, o expunere la cele extreme induce răspunsul adaptiv care îi ajută să supraviețuiască la recuperare. Hipoxia duce la o creștere a activității SOD și catalază în ficatul de Cyprinus carpio (Lushchak et al., 2005).

Stresul oxidativ indus de hipoxie a fost confirmat parțial la Oryzias latipes (Oehlers et al., 2007), în care hipoxia a dus la creșterea nivelului de glutation-S-transferază. În alte lucrări, hipoxia a crescut activitățile catalazei și glutationului peroxidază la Corbicula fluminea (Vidal et al., 2002).

Salinitatea

În organismele acvatice, schimbarea de salinitate determină o varietate de răspunsuri fiziologice, cum ar fi hormonii legați de stres, stimulând metabolismul energetic și tulburarea echilibrului electrolitic. Stresul indus de schimbarea salinității a fost asociat cu generarea oxigenului reactiv, provocând daune oxidative (Liu et al., 2007). Într-un studiu, creveții (Litopenaeus vannamei) au fost supuși unei salinități acută (30 ‰ față de 5, 15, 30 și 50%) timp de 24 de ore și s-au observat schimbări în activitățile superoxid dismutazei, catalazei, glutation-peroxidazei și Na+/K+. Suplimentarea dietei cu doze inerte de vitamina E a sporit rezistența creveților la modificările acute ale salinității, în timp ce dozele sale mai mari nu au fost eficiente. Aceste rezultate au demonstrat că schimbarea salinității ar putea fi toxică datorită inducției stresului oxidativ, iar vitamina E poate fi utilă pentru a preveni scenariul periculos în aceste condiții (Liu et al., 2007).

Într-un experiment s-au expus indivizi de Paralichthys olivaceus timp de 48 de ore la apa de mare (35 ‰) și 17,5, 8,75, 4 și 0 ‰ prin adăugarea apei subterane și s-au studiat expresia glutation-peroxidazei și glutation-S-transferazei prin tehnica qPCR Markeri ai stării fiziologice a peștilor. Ei au concluzionat că ambele enzime studiate au jucat un rol important în detoxifierea oxigenului reactiv (Choi et al., 2008).

La aclimatizarea treptată a sturionilor Acipenser naccarii din apa dulce până la apa de mare (35 ‰ salinitate), activitățile catalazei, glutation-peroxidazei și superoxid dismutazei și nivelurile de peroxid de lipide au fost măsurate în sânge, ficat și inimă (Martínez-Alvarez et al., 2002). După 20 de zile la 35% salinitate, osmolalitatea plasmei, constantele eritrocitare și conținutul de apă musculară au revenit la valori obișnuite pentru salinitatea scăzută a mediului, indicând faptul că procesele osmoregulatorii și-au atins obiectivul. Cu toate acestea, valorile cortizolului, activitățile enzimatice antioxidante din sânge, peroxidarea lipidică din plasmă și proteinele hepatice nu au revenit la valorile inițiale, arătând că procesele osmoregulatorii au provocat modificări fiziologice substanțiale la nivelul peștilor (Martínez-Alvarez et al., 2002).

Ionii metalelor tranzitionale

Ionii metalici sunt cunoscuți inductori ai stresului oxidativ. Ei pot stimula producția de oxigen reactiv prin intermediul a două mecanisme diferite. Prima este legată de interferența proceselor legate de metale, iar cea de-a doua de generarea radicalilor liberi de ioni cu valență variabilă. De fapt, cel de-al doilea mod poate, de asemenea, să interfereze cu primul, dar de obicei principala atenție este acordată efectelor ionilor metalici cu valență variabilă (V. I. Lushchak, 2010).

Informațiile privind generarea stresului oxidativ în hidrobionți de către ionii metalelor de tranziție sunt abundente. Capacitatea acestor ioni de a schimba starea de valență este de fapt cea mai importantă proprietate a acestui grup de ioni (V. I. Lushchak, 2010).

Cei mai importanți și studiați ioni sunt fierul, cuprul, cromul, mercurul și arsenicul, toți producând stres oxidativ în concentrații scăzute sau ridicate (V. I. Lushchak, 2010).

I.2. Pesticidele

Pesticidele sunt agenți fizici, chimici sau biologici destinați uciderii unei plante nedorite și a unor dăunători animale. Clasele principale de pesticide sunt: ​​insecticide, erbicide și fungicide. Este important de observat că majoritatea pesticidelor sunt agenți sintetici, noi pentru mediul înconjurător și pentru oameni și efectele lor asupra sistemelor biologice sunt puțin previzibile (V. I. Lushchak, 2010).

Dupa V. I. Lushchak (2010), acest grup de substanțe toxice poate induce stresul oxidativ prin mai multe mecanisme:

Fiind capabile să intre în cicluri redox (oxidare reversibilă), acceptând sau donând electroni constituenților celulari și pot crește nivelul oxigenului reactiv,

La metabolismul celular unele dintre pesticide pot conduce la scăderea potențialului antioxidant.

Anumite pesticide pot inactiva enzimele antioxidante și asociate, ceea ce duce la scăderea potențialului antioxidant;

Interferența cu procesele de furnizare a energiei poate reduce suplimentul pentru metabolism și detoxifiere

Modificarea proceselor vitale de bază, cum ar fi transcrierea și traducerea, în mod nedirect, poate spori nivelul oxigenului reactiv.

Insecticidele

Acest grup include nu numai insecticide, ci și acaricide. Majoritatea insecticidelor sunt compuși organofosfați (OP) utilizați pentru combaterea insectelor pe culturi, gospodării, produse depozitate și tratarea infecțiilor parazitare externe ale peștilor și animalelor. Mecanismul cunoscut de acțiune este legat de inhibarea enzimei acetilcholinesterazei (AChE), care este responsabilă pentru întreruperea transmiterii impulsului nervos. Acesta este efectul principal al organofosfaților la vertebrate și nevertebrate (V. I. Lushchak, 2010).

Efectele lor prin blocarea hidrolizei neurotransmitatorului acetilcolină (ACh) la sinapsele neuronale centrale și periferice și conduc la acumularea excesivă de ACh și la activarea receptorilor ACh (Shih și McDonough, 1997). Efectele toxice ale organofosfaților se crede că se datorează, în mare măsură, hiperactivității sistemului colinergic ca urmare a acumulării ACh în fantele sinaptice. Pauza semnalizării neuronale și endocrine conduce la influx intracelular de Ca2+, declanșând activarea enzimelor proteolitice, sintazei oxidului nitric și generarea de radicali liberi (Beal, 1995), rezultând stres oxidativ. Deoarece metabolizarea organofosfaților (în special, diclorvos) în ficat este legată de consumul de glutation, putând să declanșeze stresul oxidativ (V. I. Lushchak, 2010).

Mai multe lucrări au descris inducerea stresului oxidativ la peștii tratați cu organofosfați. De exemplu, sa constatat că diclorvosul induce stresul oxidativ la crap (Cyprinus carpio) și somnul pitic (Ictalurus nebulosus) (Hai et al., 1997) și în anghilele europene (Anguilla anguilla) (Pena-Llopis et al., 2003) și trichlorfon în Oreochromis niloticus (Thomaz et al., 2009).

Mecanismele efectelor toxice ale altor grupuri de insecticide, hidrocarburile clorurate incluzând lindanul și DDT (Diclor-Difenil-Tricloretanul) par a fi implicate în inducerea stresului oxidativ în linia celulară de la o tumoră cutanată a crapului Cyprinus carpio (Ruiz-Leal și George, 2004) și hepatocitele de la Hoplias malabaricus (Filipak Neto et al., 2008). Mecanismele implicate aici pot fi legate de generarea de radicali liberi după activarea metabolică cu inducția enzimatică a P450 prin DDT și produsele rezultate pot intra în oxidare reversibilă (Harada et al., 2003).

Inducerea stresului oxidativ poate fi secundară activării metabolice și poate fi un factor cheie în hepatocarcinogeneza inițiată de DDT și poate juca un rol important în promovarea și progresia tumorilor (V. I. Lushchak, 2010).

Erbicidele

Două grupe de erbicide vor fi analizate aici: prima este cunoscută ca fiind direct responsabilă pentru amplificarea generării de radicali liberi, cum ar fi Paraquat cunoscut și ca Viologen, care intră în cicluri redox și generând în mod constant oxigen reactiv, iar a doua, inactivează enzime antioxidante cum ar fi aminotriazol și ditiocarbamați (V. I. Lushchak, 2010).

Sa demonstrat că Paraquat provoacă stres oxidativ în Channa punctata (Parvez și Raisuddin, 2006), Danio rerio (Bretaud et al., 2004) și Oncorhynchus mykiss (Stephensen et al., 2002).

Al doilea grup de erbicide constă din mai multe clase de compuși cunoscuți a fi în principal inhibitori ai enzimelor antioxidante, cum ar fi superoxid dismutaza și catalază. Mecanismul considerat a fi responsabil pentru inducerea stresului oxidativ prin DDC (dietilditiocarbamat) este legat de extracția ionilor de cupru din centrul activ al superoxid dismutazei care conține Cu, Zn. Molinatul a indus, de asemenea, stresul oxidativ la Anguilla anguilla (Peñna-Llopis et al., 2001).

Este important să se menționeaze că erbicidele pot să își exercite activitatea biologică prin inducerea stresului oxidativ. În Carassius auratus, Roundup, un erbicid pe bază de glifosat, a provocat stres oxidativ la concentrații foarte mici (Lushchak et al., 2009).

Fungicidele

Probabil, compușii care conțin cupru sunt printre cele mai importante fungicide. S-a constatat că hexaclorbenzenul (HCB) sau perclorobenzenul induce stresul oxidativ în ficat și creierul la specia Cyprinus carpio (Song et al., 2006).

Deși utilizarea hexaclorbenzenul a fost interzisă la nivel global în temeiul Convenției de la Stockholm privind poluanții organici persistenți, este unul dintre cei mai răspândiți poluanți organici persistenți, deoarece este încă eliberat în mediu ca produs secundar în multe procese industriale. Hexaclorbenzenul se poate lega de citocromi și nu este ușor metabolizat, detașând astfel lanțul de transport al electronului de activitatea mono-oxigenazică și, în consecință, favorizând producerea de specii reactive (V. I. Lushchak, 2010).

Pentaclorfenolul, unul dintre metaboliții principali ai hexaclorbenzenul, este o sursă puternică de oxigen reactiv în timpul metabolizării sale (V. I. Lushchak, 2010).

Gruparea fungicidelor azolice, în special procloraz este un fungicid de contact cu spectru larg. Proclorazul poate genera efecte adverse asupra organismelor acvatice, în special a modulației activităților enzimatice ale citocromului P450 (V. I. Lushchak, 2010).

Capitolul II. Materiale și metode

II.1. Metoda Squash

S-a utilizat protocolul standard după Weili Cai et al. (2010) și a fost adaptat pentru țesutul branhial de la Carassius gibelio.

Materiale necesare:

10 pești (branhii de Carassius gibelio)

Pahare Berzelius

Lame și lamele

Alcool etilic 70%

Fixator 3:1 (Acid acetic glacial:Alcool etilic 98%)

Colorant orceină

Hârtie de filtru

Microscop optic Novex

Ulei de imersie

Modul de lucru:

Indivizii de Carassius gibelio au fost recoltați din județul Tulcea, din bazinul Dunării.

De la indivizii de Carassius gibelio se prelevează arcurile branhiale, se spală și se introduc în pahare Berzelius cu alcool etilic 70%.

Se lasă 24 de ore în alcool etilic 70%, după care se scot arcurile branhiale și se pun în alte pahare Berzelius cu fixator 3:1 (acid acetic glacial:Alcool etilic 98%).

Se păstrează în fixator până când vor fi utilizate pentru realizarea preparatelor microscopice. Pentru realizarea preparatelor microscopice, se prelevează lamele brahniale de pe arcurile branhiale și se pun pe lamă într-o picătură de colorant (orceină).

Lamelele branhiale se fragmentează, iar apoi se pune lamela de sticlă pentru a realiza preparatul microscopic. Se aplică presiune pentru a etala preparatul sub lamelă. Excesul de colorant se îndepărtează cu hârtie de filtru (Figura 1).

Se viziualizează preparatul sub microscopul optic Novex.

A B

C D

E

Figura 1. Metoda squash pentru branhii de Carassius gibelio. A – recoltarea lamelelor branhiale, B – colorant orceină, C – etalarea unei lamele branhiale pe lamă, D – Colorarea lamelei branhiale, E – Presarea preparatului dintre lama și lamelă.

II.2. Extracția ADN-ului din țesut animal – protocolul cu Fenol – Cloroform

Tehnica este folosită pentru extragerea ADN total din țesuturi proaspete, congelate sau păstrate în etanol (Ausubel et al., 1995).

Materiale necesare:

Tampon pentru liza celulară:

Conține: Tris HCl 50mM (pH=8), SDS 1,0%, EDTA 25mM.

Pentru 50ml, într-o eprubetă se introduc 25ml H2O miliQ (apă distilată filtrată prin filtru de carbon, schimbător de ioni etc.) autoclavată, la care se adaugă 2,5ml soluție stoc 1M Tris HCl (pH=8), 5ml 10% SDS, 2,5ml 0,5M EDTA. Se completează volumul cu H2O miliQ până la 50ml și se introduce într-un tub Corning nou cu volumul de 50ml, neautoclavat.

Soluții stoc:

Soluție Tris-HCl 1M (pH=8): – cantitățile sunt calculate pentru un volum de 100ml;

– se dizolvă 12,11g Tris în 80ml H2O miliQ;

– se corectează pH-ul la 8 cu HCl;

– se autoclavează.

Soluție Tris-EDTA (TE) (pH=8,0): -cantitățile sunt considerate pentru un volum de 100ml;

– într-o eprubetă de 100ml se introduce 1ml soluție stoc Tris-HCl 1M (pH=8);

– 200μl EDTA 0,5M;

– se completează cu H2O-miliQ până la 100ml și se autoclavează.

Soluție NaOH 10N (100ml):

– se cântăresc 40g NaOH

– se adaugă 70ml H2O-miliQ autoclavată și se agită până la dizolvare;

– se aduce volumul la 100ml;

– nu se autoclavează.

Soluție SDS 10% (dodecil sulfat de sodiu):

– se introduc 10g SDS în 80ml H2O-miliQ autoclavată și se încălzește soluția la 80șC pentru o mai bună dizolvare;

– se ajustează pH-ul la 7,2 (dacă este necesar), utilizând HCl;

– se aduce volumul la 100ml cu H2O-miliQ;

– nu se autoclavează.

Soluție EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetat:sare disodică):

– se cântăresc 18,61g EDTA, peste care se adaugă 80ml H2O-miliQ;

– se agită puternic și se adaugă 1ml soluție NaOH 10N;

– se adaugă NaOH până când soluția devine alcalină (pH=8,0), iar EDTA este dizolvat complet.

– se aduce volumul la 100ml cu H2O-miliQ și se autoclavează;

Modul de lucru:

Se etichetează tuburi Eppendorf de 1,5ml autoclavate, în care se introduc câte 500μl soluție tampon (tampon pentru liză). Tuburile se țin închise, până în momentul introducerii țesutului. Se cântăresc între 20 – 200mg de țesut proaspăt, congelat sau conservat în alcool etilic 95% (în acest caz, țesutul se usucă înainte de cântărire, pe hârtie de filtru) (Figura 2).

Figura 2. Branhii pentru prelevarea țesutului și extracția de ADN.

Fragmentul de țesut se așează pe o lamă sterilă și se taie mărunt cu un bisturiu sau cu o lamă, sterilizate. Dacă fragmentul este mic (dacă provine de la un individ de 1 – 2cm), această etapă nu este necesară.

Se introduc fragmentele de țesut în tubul Eppendorf (de 1,5ml) corespunzător, care conține 500μl soluție tampon pentru liză. Această etapă se repetă pentru toți indivizii. În fiecare tub, se adaugă câte 10μl proteinază K (10μl reprezintă echivalentul a 200μg proteinază dintr-o soluție stoc 20mg/ml care este preparată și congelată la – 20șC). Se agită fiecare probă pe un vortex și se păstrează peste noapte în etuvă la 37șC.

În ziua următoare, sub nișă, în fiecare tub de 1,5ml se adaugă 600μl de soluție fenol : cloroform : alcool izoamilic (25 : 24 : 1), până la semnul superior al tubului. Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde, apoi se centrifughează (utilizând o centrifugă de masă), la o turație 8000 rotații/minut, timp de 4 minute. În timpul centrifugării, se etichetează noi tuburi Eppendorf de 1,5ml. La sfârșitul centrifugării, tuburile prezintă o fază inferioară de culoare gălbuie care conține solventul organic, o fază superioară care conține ADN și o fază intermediară unde sunt depozitate toate resturile pe care dorim să le eliminăm din soluția de ADN (Figura 3).

Figura 3. Separarea celor trei faze.

Dacă această fază intermediară este foarte mare, se repetă spălarea cu fenol:cloroform:alcool izoamilic urmată de centrifugare. Dacă fazele sunt bine separate, se trece la etapa următoare.

Se separă faza superioară a fiecărui tub, în noile tuburi etichetate; – pentru aceasta se utilizează o pipetă, cu ajutorul căreia se extrag 700μl de ADN. Dacă pipetarea se face repede, iar concentrația ADN este foarte mare în faza superioară a tubului, în momentul pipetării, se pot extrage resturi ale fazei intermediare.

Se extrage faza superioară din fiecare tub menținându-le deschise sub nișă, iar la sfârșit, se adaugă câte 550μl cloroform. Se agită tuburile timp de 30 – 60 secunde, apoi se centrifughează la 8000 rotații/minut, timp de 3 minute, utilizând o centrifugă de masă (Figura 4). În timpul centrifugării, se etichetează noi tuburi.

Figura 4. Cele trei faze dupa adaugarea cloroformului.

Se separă fazele superioare rezultate în urma centrifugării, în noile tuburi, în același mod ca în etapa precedentă, având grijă să nu se preia nimic din faza intermediară de separare (Figura 5).

Figura 5. Separarea fazei superioare (stanga) de fazele intermediare și inferioare (dreapta).

Se adaugă 1 ml etanol rece 95% (păstrat la -20șC) în noile tuburi după separare până la semnul superior al fiecărui tub. Se agită tuburile și se lasă la temperatura de -20șC, timp de 30 – 60 minute, timp în care se va forma un precipitat albicios (ADN total) pe fundul tuburilor (Figura 6).

Figură 6. Precipitarea ADN-ului în etanol (http://www.popsci.com/scitech/article/2009-03/science-forensics).

După precipitarea ADN, se centrifughează tuburile la 10.000 rotații/minut, timp de 5 minute, pentru sedimentare (Figura 7).

Se elimină supernatantul și se așează tuburile deasupra unei hârtii de filtru, astfel încât să se scurgă ultimele picături de alcool.

Urmează uscarea peletelor, mutând tuburile, deschise, într-o centrifugă cu vacuum, unde sunt menținute timp de 10 minute, cu temperatura în scădere. Dacă în acest interval de timp sedimentele nu sunt uscate, se mai lasă tuburile încă 5 minute în centrifugă.

După uscarea peletelor, se adaugă în fiecare tub câte 200μl soluție TE (pH=8,0) și se resuspendă manual sau pipetând de câteva ori. Pentru o mai bună resuspensie, se pot lăsa între 15 și 30 minute la temperatura camerei, la 37șC sau timp mai îndelungat la 4șC. După resuspendarea peletelor de ADN, conținutul fiecărui tub este repartizat în trei tuburi de câte 1,5ml (etichetate anterior), punând câte 50μl din soluția resuspendată.

Din cele trei tuburi ale unei probe, unul se păstrează la 4șC, iar celelalte două se congelează (-20șC – -80șC).

Figura 7. Sedimentarea ADN-ului.

II.3. Electroforeza în gel de agaroză cu bromură de etidiu

Electroforeza în gelul de agaroză reprezintă metoda standard de analiză a acizilor nucleici. Deplasarea moleculelor se face în prezența unui curent electric (acizii nucleici sunt încărcați negativ datorită prezenței grupărilor fosfat și migrează spre electrodul încărcat pozitiv). Mobilitatea electroforetică este influențată de urmatorii factori: concentrația de agaroză, conformația moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrasucit), prezența compusului fluorescent în gel, tamponul utilizat, tipul de agaroză și voltajul aplicat.

Tehnica se foloseste pentru determinarea purității ADN-ului sau ARN-ului, la verificarea existenței produșilor rezultați în urma PCR-ului sau la analiza fragmentelor rezultate dupa clivarea enzimatică (cu ajutorul enzimelor de restrictie) a ADN-ului.

Fragmentele analizate pot avea marimi între 1000 și 23000 pb (perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela că ADN-ul nu este denaturat, păstrându-și intacte elementele structurale. Pentru a evita fragmentarea ulterioară a ADNului manipularea trebuie facută în așa fel încât să se evite contaminarea cu amprente, picături, salivă sau microorganisme. Din acest motiv se preferă utilizarea de materiale sterile (vârfuri, etc). Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza în gelul de agaroză sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris- borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM).

Soluțiile tampon pentru electroforeză se păstrează sub forma unor stocuri concentrate (10X-50X) și păstrate la temperatura camerei. Tamponul de încărcare are în componență un colorant (albastru de bromfenol sau rosu de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare și zaharoza (40%) sau glicerină (30%) pentru a asigura o vâscozitate corespunzatoare la aplicarea probei. Benzile sunt vizualizate cu compuși fluorescenți (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere cu lumină UV. Sensibilitatea variaza între 100 pg si 1 ng/bandă. Datorită faptului că acești coloranți se intercalează între bazele ADN-ului dublu catenar, sensibilitatea detecției depinde de lungimea lanțului acizilor nucleici.

Modul de lucru:

Se toarnă gelul (0,3-3% agaroză în TBE; TBE-tampon) în camera de separare; în prealabil se plasează doua distanțatoare din material plastic care permit delimitarea gelului;

Se incalzeste amestecul timp de 60 sec la microunde;

Se răceste soluția la 50°C (temperatura este controlată cu ajutorul unui termometru digital) și se adaugă 0,5 µl bromură de etidiu 1 mg/ml (substanță fluorescentă care se unește în special cu ADN-ul dublu catenar permițând vizualizarea fragmentelor de ADN separate);

Se așează pieptănul la o distanta de 1 cm de camera în care se află așezat electrodul încărcat negativ, după care se toarnă amestecul răcit la 50°C și se așteaptă cca 20 min., timp în care gelul se solidifică (Figura 8);

Figura 8. Gelul de agatoză solidificat.

Se îndepărtează distanțatoarele din plastic și piaptănul.

Se acopera gelul cu solutie tampon (TBE) aproximativ 2-3 mm.

Se aplică probele de analizat (preparate cu soluția tamponului de încărcare) și probele de referință (amestec de molecule de ADN cu dimensiuni cunoscute – soluție standard 100 pb și 1 Kb) (Figura 9).

Figura 9. Gelul de agaroză cu probele aplicate în electroforeză.

Se migrează probele timp de 40 min la 90V și 75 mA (Figura 10).

Figura 10. Benzile de ADN migrate după electroforeză.

Se îndepartează soluția tampon, se vizualizează benzile separate prin excitare la 254 nm (la întuneric).

Capitolul III. Rezultate și discuții

Au fost luați în considerare micronucleii care sunt mai mici de 1/5 – 1/20 decât nucleii, de dimensiuni sferice.

Nucleii și micronucleii au fost analizați și contorizați în urma observațiilor făcute la microscopul optic, la obiectivul cu imersie (x1000).

S-au obținut poze originale cu preparatele microscopice (Figura 11, Figura 12, Figura 13, Figura 14 și Figura 15).

S-a obținut o frecvență mare de micronuclei în tesutul branhial.

S-a realizat electroforeza ADN-ului total și s-a observat fragmentarea nucleară.

Figura 11. Țesut branhial, lamele branhiale (Carassius gibelio), x400, colorant orceină.

Figura 12. Celule branhiale și micronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius gibelio),

x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină.

Figura 13. Celule branhiale și micronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius gibelio), x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină.

Figura 14. Celule branhiale, nuclei și micronuclei (indicați cu săgeți) (Carassius gibelio.), x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină.

Figura 15. Eritrocite nucleate și micronucleu (indicat cu săgeată) (Carassius gibelio), x1000 cu ulei de imersie, colorant orceină.

Frecvența micronucleilor

Din preparatele realizate, s-au viziualizat câte 3 lame și 3 câmpuri vizuale pentru fiecare individ. S-au contorizat și analizat celulele cu nucleu normal și celulele cu micronuclei. Toate datele obținute se pot observa în Tabelul 1.

Tabelul 1. Cuantificarea micronucleilor și nucleilor la specia Carassius gibelio.

După cuantificarea micronucleilor, s-a realizat frecvența acestora și s-a obținut o frecvența de 3.71% (Figura 16), iar literatura de specialitate se menționează că în condiții de laborator sub acțiunea unor xenobiotici apar cu o frecvență de 1,8% (Hayashi et al.) sau 2,26% (Cavas) la Carassius sp.

Figura 16. Frecvența micronucleilor la nivelul branhiilor la Carassius gibelio.

Extracția de ADN total

În urma analizei extracției de ADN și electrofozei în gelul de agaroză (1%) cu bromură de etidiu, s-a observat că există o fragmentare nucleară mare (Figura 17).

Figura 17. Fragmentare nucleară în gel de agaroză (1%) cu bromură de etidiu

Concluzii

Rezultatele au arătat că, pe langă aspectele de fragmentare nucleară (care pot fi datorate și preparării materialului prin tehnica squash), apar cu o frecvență semnificativă și micronuclei care denotă prezența în apă a unor xenobiotici care au influențat procesul de replicare al ADN-ului și diviziunea celulară.

S-au obținut poze originale cu micronuclei la specia Carassius gibelio.

Frecvența micronucleilor este de 3,71%, iar literatura de specialitate menționează că în condiții de laborator sub acțiunea unor xenobiotici există o frecvență de 1,8% (Hayashi et al.) sau 2,26% (Cavas) la specii de Carassius sp.

Extracția de ADN total și electroforeza a aratăt că există o fragmentare nucleară mare.

Bibliografie

Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., 1995. Protocols in Molecular Biology, 3rd editon., Unit 2.1: page 2-3.

Bagnyukova, T.V., Storey, K.B., Lushchak, V.I., 2003. Induction of oxidative stress in Rana ridibunda during recovery from winter hibernation. J. Therm. Biol. 28, 21–28.

Beal, M.F., 1995. Aging, energy, and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Ann. Neurol. 38, 357–366.

Bespalov, I.A., Bond, J.P., Purmal, A.A., Wallace, S.S., Melamede, R.J., 1999. Fabs specific for 8-oxoguanine: control of DNA binding. J. Mol. Biol. 293, 1085–1095.

Binelli, A., Cogni, D., Parolini, M., Riva, C., Provini, A., 2009. In vivo experiments for the evaluation of genotoxic and cytotoxic effects of triclosan in Zebra mussel hemocytes. Aquat. Toxicol. 91, 238–244

Bocchetti, R., Lamberti, C.V., Pisanelli, B., Razzetti, E.M., Maggi, C., Catalano, B., Sesta, G., Martuccio, G., Gabellini, M., Regoli, F., 2008. Seasonal variations of exposure biomarkers, oxidative stress responses and cell damage in the clams. Tapes philippinarum, and mussels, Mytilus galloprovincialis, from Adriatic sea. Mar. Environ. Res. 66, 24–26.

Bretaud, S., Lee, S., Guo, S., 2004. Sensitivity of zebrafish to environmental toxins implicated in Parkinson’s disease. Neurotoxicol. Teratol. 26, 857–864.

Caliani, I., Porcelloni, S., Mori, G., Frenzilli, G., Ferraro, M., Marsili, L., Casini, S., Fossi, M.C., 2009. Genotoxic effects of produced waters in mosquito fish (Gambusia affinis). Ecotoxicology 18, 75–80.

Cavalcante, D.G., Martinez, C.B., Sofia, S.H., 2008. Genotoxic effects of Roundup on the fish Prochilodus lineatus. Mutat. Res. 655, 41–46.

Cavas, T., 2008. In vivo genotoxicity of mercury chloride and lead acetate: Micronucleus test on acridine orange stained fish cells. Ed. Elsevier, Food and Chemical Toxicology 46, 352–358.

Choi, C.Y., An, K.W., An, M.I., 2008. Molecular characterization and mRNA expression of glutathione peroxidase and glutathione S-transferase during osmotic stress in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Comp. Biochem. Physiol. A 149, 330–337.

Dykens, J.A., Shick, J.M., Benoit, C., Buettner, G.R., Winston, G.W., 1992. Oxygen radical production in the sea anemone Anthopleura elegantissima and its endosymbiotic algae. J. Exp. Biol. 168, 219–241.

F.Ausubel,; Brent, R.; Kingston, R.; Moore, D.; Seidman, J.G.; Smith, J.;Struhl, K. Short, 1995. Protocols in Molecular Biology, 3rd editon., Unit 2.1: page 2-3.

Filipak Neto, F., Zanata, S.M., Silva de Assis, H.C., Nakao, L.S., Randi, M.A., Oliveira Ribeiro, C.A., 2008. Toxic effects of DDT and methyl mercury on the hepatocytes from Hoplias malabaricus. Toxicol. In Vitro 22, 1705–1713.

Gielazyn, M.L., Ringwood, A.H., Piegorsch, W.W., Stancyk, S.E., 2003. Detection of oxidative DNA damage in isolated marine bivalve hemocytes using the comet assay and formamidopyrimidine glycosylase (Fpg). Mutat. Res. 542, 15–22.

Grygoryev, D., Moskalenko, O., Zimbrick, J.D., 2008. Non-linear effects in the formation of DNA damage in medaka fish fibroblast cells caused by combined action of cadmium and ionizing radiation. Dose Response 6, 283–298.

Hai, D.Q., Varga, S.I., Matkovics, B., 1997b. Organophosphate effects on antioxidant system of carp (Cyprinus carpio) and catfish (Ictalurus nebulosus). Comp. Biochem. Physiol. C 117, 83–88.

Harada, T., Yamaguchi, S., Ohtsuka, R., Takeda, M., Fujisawa, H., Yoshida, T., Enomoto, A., Chiba, Y., Fukumori, J., Kojima, S., Tomiyama, N., Saka, M., Ozaki, M., Maita, K., 2003. Mechanisms of promotion and progression of preneoplastic lesions in hepatocarcinogenesis by DDT in F344 rats. Toxicol. Pathol. 31, 87–98.

Hayashi, M., Ueda, T., Uyeno, K., Wada, K., Kinae, N., Saotome, K., Tanaka, N., Takai, A., Sasaki, Y.F., Asano, N., Sofuni, T., Ojima, Y., 1998. Development of genotoxicity assay systems that use aquatic organisms. Ed. Elsevier, Mutation Research 399, 125–133.

Heise, K., Puntarulo, S., Nikinmaa, M., Abele, D., Pörtner, H.O., 2006a. Oxidative stress during stressful heat exposure and recovery in the North Sea eelpout Zoarces viviparus L. J. Exp. Biol. 209, 353–363.

Hermes-Lima, M., Storey, J.M., Storey, K.B., 1998. Antioxidant defenses and metabolic depression. The hypothesis of preparation for oxidative stress in land snails. Comp. Biochem. Physiol. B 120, 437–448.

Kelly, M.C., White, B., Smyth, M.R., 2008. Separation of oxidatively damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18 columns by HPLC-UV-EC. J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 863, 181– 186.

Liu, Y., Wang, W.N., Wang, A.L., Wang, J.M., Sun, R.Y., 2007. Effects of dietary vitamin E supplementation on antioxidant enzyme activities in Litopenaeus vannamei (Boone, 1931) exposed to acute salinity changes. Aquaculture 265, 351–358.

Lushchak, O.V., Kubrak, O.I., Storey, J.M., Storey, K.B., Lushchak, V.I., 2009b. Low toxic herbicide Roundup induces mild oxidative stress in goldfish tissues. Chemosphere 76, 932–937.

Lushchak, V.I., 2010. Aquatic Toxicology, Environmentally induced oxidative stress in aquatic animals. Ed. Elsevier B.V.

Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., 2006. Effects of different environmental oxygen levels on free radical processes in fish. Comp. Biochem. Physiol. B 144, 283– 289.

Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Husak, V.V., Luzhna, L.I., Lushchak, O.V., Storey, K.B., 2005a. Hyperoxia results in transient oxidative stress and an adaptive response by antioxidant enzymes in goldfish tissues. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 1670–1680.

Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Husak, V.V., Luzhna, L.I., Lushchak, O.V., Storey, K.B., 2005a. Hyperoxia results in transient oxidative stress and an adaptive response by antioxidant enzymes in goldfish tissues. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 1670–1680.

Lushchak, V.I., Bagnyukova, T.V., Lushchak, O.V., Storey, J.M., Storey, K.B., 2005b. Hypoxia and recovery perturb free radical processes and antioxidant potential in common carp (Cyprinus carpio) tissues. Int. J. Biochem. Cell Biol. 37, 1319–1330.

Lushchak, V.I., Lushchak, L.P., Mota, A.A., Hermes-Lima, M., 2001. Oxidative stress and antioxidant defenses in goldfish Carassius auratus during anoxia and reoxygenation. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 280, 100–107.

Malek, R.L., Sajadi, H., Abraham, J., Grundy, M.A., Gerhard, G.S., 2004. The effects of temperature reduction on gene expression and oxidative stress in skeletal muscle from adult zebrafish. Comp. Biochem. Physiol. C 138, 363–373.

Malins, D.C., Polissar, N.L., Garner, M.M., Gunselman, S.J., 1996. Mutagenic DNA base modifications are correlated with lesions in nonneoplastic hepatic tissue of the English sole carcinogenesis model. Cancer Res. 56, 5563–5565.

Markert, B.A., Breure, A.M., Zechmeister, H.G., 2003. Bioindicators & Biomonitors, Principles, Concepts and Applications. Ed. Elsevier Science Ltd.

Martínez-Alvarez, R.M., Hidalgo, M.C., Domezain, A., Morales, A.E., García-Gallego, M., Sanz, A., 2002. Physiological changes of sturgeon Acipenser naccarii caused by increasing environmental salinity. J. Exp. Biol. 205, 3699–3706.

Niyogi, S., Biswas, S., Sarker, S., Datta, A.G., 2001. Seasonal variation of antioxidant and biotransformation enzymes in barnacle, Balanus balanoides, and their relation with polyaromatic hydrocarbons. Mar. Environ. Res. 52, 13–26.

Oehlers, L.P., Perez, A.N., Walter, R.B., 2007. Detection of hypoxia-related proteins in medaka (Oryzias latipes) brain tissue by difference gel electrophoresis and de novo sequencing of 4-sulfophenyl isothiocyanate-derivatized peptides by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Comp. Biochem. Physiol. C 145, 120–133.

Olsvik, P.A., Kristensen, T., Waagbø, R., Rosseland, B.O., Tollefsen, K.E., Baeverfjord, G., Berntssen, M.H., 2005. mRNA expression of antioxidant enzymes (SOD, CAT and GSH-Px) and lipid peroxidative stress in liver of Atlantic salmon (Salmo salar) exposed to hyperoxic water during smoltification. Comp. Biochem. Physiol. C 141, 314–323.

Parihar, M.S., Dubey, A.K., 1995. Lipid peroxidation and ascorbic acid status in respiratory organs of male and female freshwater catfish Heteropneustes fossilis exposed to temperature increase. Comp. Biochem. Physiol. C 112, 309–313.

Parvez, S., Raisuddin, S., 2006. Effects of paraquat on the freshwater fish Channa punctata (Bloch): non-enzymatic antioxidants as biomarkers of exposure. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 50, 392–397.

Pena-Llopis, S., Ferrando, M.D., Pena, J.B., 2003. Increased recovery of brain acetylcholinesterase activity in dichlorvos-intoxicated European eels Anguilla anguilla by bath treatment with N-acetylcysteine. Dis. Aquat. Organ. 55, 237–245.

Pena-Llopis, S., Pena, J.B., Sancho, E., Fernandez-Vega, C., Ferrando, M.D., 2001. Glutathione-dependent resistance of the European eel Anguilla anguilla to the herbicide molinate. Chemosphere 45, 671–681.

Petridis, P., Jha, A.N., Langston, W.J., 2009. Measurements of the genotoxic potential of (xeno-) oestrogens in the bivalve mollusc Scrobicularia plana, using the Comet assay. Aquat. Toxicol. 94 (1), 8–15.

Rickwood, D., Hames, B.D.,1984. Gel electrophoresis of nucleic acids:a practical approach. IRL Press, Oxford.

Ruiz-Leal, M., George, S., 2004. An in vitro procedure for evaluation of early stage oxidative stress in an established fish cell line applied to investigation of PHAH and pesticide toxicity. Mar. Environ. Res. 58, 631–635.

Sabzar, A.D., Abdul, R.Y., Masood-ul-Hassan, B., Farooq, A. G., Farooz, A.B., 2014. Investigation of the genotoxicity of endosulfan to freshwater Cyprinid fish Crucian carp (Carassius carassius L.) using the micronucleus and chromosomal aberration as biomarkers. Ed. Archana Sharma Foundation of Calcutta.

Salas-Leiton, E., Cánovas-Conesa, B., Zerolo, R., López-Barea, J., Ca˜navate, J.P., Alhama, J., 2009. Proteomics of juvenile senegal sole (Solea senegalensis) affected by gas bubble disease in hyperoxygenated ponds. Mar. Biotechnol. 11, 473–487.

Shih, T.M., McDonough, J.H., 1997. Neurochemical mechanisms in soman-induced seizures. J. Appl. Toxicol. 17, 255–264.

Song, S.B., Xu, Y., Zhou, B.S., 2006. Effects of hexachlorobenzene on antioxidant status of liver and brain of common carp (Cyprinus carpio). Chemosphere 65, 699–706.

Stephensen, E., Sturve, J., Förlin, L., 2002. Effects of redox cycling compounds on glutathione content and activity of glutathione-related enzymes in rainbow trout liver. Comp. Biochem. Physiol. C 133, 435–442.

Thomaz, J.M., Martins, N.D., Monteiro, D.A., Rantin, F.T., Kalinin, A.L., 2009. Cardiorespiratory function and oxidative stress biomarkers in Nile tilapia exposed to the organophosphate insecticide trichlorfon (NEGUVON). Ecotoxicol. Environ. Saf. 72, 1413–1424.

Toyoizumi, T., Deguchi, Y., Masuda, S., Kinae, N., 2008. Genotoxicity and estrogenic activity of 3,3_-dinitrobisphenol A in goldfish. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72, 2118–2123.

Verlecar, X.N., Jena, K.B., Chainy, G.B., 2007. Biochemical markers of oxidative stress in Perna viridis exposed to mercury and temperature. Chem. -Biol. Interact. 167, 219–226.

Viarengo, A., Canesi, L., Garcia Martinez, P., Peters, L.D., Livingstone, D.R., 1995. Prooxidant processes and antioxidant defence systems in the tissues of the Antarctic scallop (Adamussium colbecki) compared with the Mediterranean scallop (Pecten jacobaeus). Comp. Biochem. Physiol. B 111, 119–126.

Vidal, M.L., Bassères, A., Narbonne, J.F., 2002. Influence of temperature, pH, oxygenation, water-type and substrate on biomarker responses in the freshwater clam Corbicula fluminea (Müller). Comp. Biochem. Physiol. C 132, 93–104.

Weili Cai, Ye Jin, Jack Girton, Jorgen Johansen, and Kristen M. Johansen, 2010. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. Journal of Visualized Experiments, (36): 1748.