Utilizarea ultrasonografiei multimodale de înaltă frecvență în evaluarea răspunsului terapeutic al tumorilor induse la șobolani Wistar [306510]

Universitatea de Medicină și Farmacie

“Iuliu Hațieganu”

Cluj-Napoca

Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENȚĂ

Utilizarea ultrasonografiei multimodale de înaltă frecvență în evaluarea răspunsului terapeutic al tumorilor induse la șobolani Wistar

Îndrumător:

Șef Lucr. Dr. Mihai SOCACIU

Absolvent: [anonimizat]

2018

Cuprins

Partea generală………………………………………………………………….3

Introducere……………………………………………………………..3

Modelul animal………………………………………………………..4

Generalități………………………………………………………….4

Avantajele si dezavantajele utilizării șobolanilor ca model animal………………………………………………………6

Ultrasonografia……………………………………………………….7

Definiție și generalități…………………………………………7

Micro-ultrasonografia………………………………………….9

Ultrasonografia cu contrast……………………………….12

Aplicații ale ultrasonografiei în patologia tumorală la animale de experiență……………………………………………15

Partea specială……………………………………………………………….21

Introducere……………………………………………………………21

Materiale și metodă……………………………………………….22

Modelul animal și modelul tumoral……………………22

Urmărirea ultrasonografică……………………………….23

Anatomia patologică………………………………………….27

Rezultate……………………………………………………………….29

Discuții………………………………………………………………….41

Concluzii……………………………………………………………….44

Bibliografie………………………………………………………………………45

Partea generală

Introducere

Studiile „in vivo” sunt o treaptă importantă în cercetarea și dezvoltarea de noi medicamente și tratamente. Fiind o punte de legătură între studiile „in vitro”, [anonimizat], dar mai ales în oncologie.

Aprecierea efectului dar și a toxicității medicamentelor este un pas important în evaluarea noilor terapii și acestea pot fii observate cel mai bine pe animale de laborator. Având în vedere toxicitatea crescută a medicamentelor utilizate în oncologie se justifică încă o dată utilizarea studiilor „in vivo”.

De ce e importantă ultrasonografia? În primul rând este o metodă neinvazivă de urmărire a evoluției unei tumori sau eficienței unui tratament. [anonimizat], [anonimizat]. În al 2-[anonimizat] a se vedea efectul tratamentului în dinamică. Tot datorită acestui fapt vom putea compara datele provenite de la același individ la sfârșitul studiului.

Modelul animal

Generalități

Animalele au fost folosite încă din antichitate în studii observaționale pentru a înțelege mai bine fiziologia umană. De la începutul secolului XX utilizarea animalelor în domeniul medicinei a devenit mai mult experimentală decât observațională.(1)

Modelele animale sunt folosite în aproape toate domeniile cercetării biomedicale, incluzând, fiziologie, imunologie, boli infecțioase, oncologie și psihologie comportamentală.

Odată cu secvențierea genomului șobolanilor, în anul 2004, au început să se creeze prin consangvinizare indivizi identici genetic pentru a fi folosiți în diferite experimente. (1) Astfel s-au creat mai multe linii de rozătoare cu particularități și predispoziție pentru anumite afecțiuni. Cu toate acestea s-a constat că există diferențe între indivizii din aceeași rasă, spre exemplu, între șobolanii Wistar proveniți de la diferiți crescători. (2)

Șobolanul Wistar face parte din rasa de șobolani albino. Această rasă a fost dezvoltată la Institutul Wistar în 1906 pentru a fi utilizată în cercetarea biologică și medicală. Este de asemenea primul șobolan dezvoltat pentru a servi ca model animal într-un moment în care laboratoarele foloseau în principal șoarecii de casă ca modele animale. Mai mult de jumătate din toate tulpinile de șobolani de laborator sunt descendente din colonia inițială stabilită de fiziologul Henry Donaldson. Șobolanul Wistar este în prezent unul dintre cei mai populari șobolani utilizați pentru cercetarea în laborator. El se caracterizează prin capul lat, urechile lungi și lungimea cozii, care este întotdeauna mai mică decât lungimea corpului. Anumite rase de șobolani, cum ar fi Sprague Dawley și Long-Evans, au fost dezvoltate din șobolani Wistar. (3)

Figura 1: Șobolan din rasa Wistar albino (3)

În domeniul oncologiei au fost dezvoltate mai multe modele de rozătoare pentru a studia cancerul. Modelele folosite sunt în general stabilite pentru a studia etiologia și mecanismele de carcinogeneză și pentru a examina răspunsurile la terapiile convenționale. Aceste modele experimentale de șoarece pot fi împărțite în trei categorii principale: tumori transplantabile (xenogrefe), modele modificate genetic/ transgenice și modele umanizate de cancer la șoareci. (4) Cele mai utilizate sunt tumorile transplantabile și modelele modificate genetic. Cu toate acestea, modelele animale folosite pentru studiul cancerului nu reliefează complet acest spectru de boli genetice care constituie cancerul uman.(5)

Avantajele și dezavantajele utilizării șobolanilor ca model animal

Rozătoarele sunt probabil animalele cel mai frecvent utilizate în cercetarea științifică. Există numeroase beneficii ale utilizării lor. În primul rând, capacitatea de a lucra cu un număr mare de animale permite o valabilitate statistică mai bună, făcând studiul mai ușor de validat. În același timp, ciclul de viață relativ scurt și rata mare de reproducere a acestor animale reduc durata studiilor și astfel rezultatele se obțin mai repede fără afectarea calității.

În comparație cu animale mai mari, cum ar fi câinele sau pisica, rozătoarele sunt ușor de manevrat, relativ ieftine, pot fi genetic manipulate și au un grad relativ ridicat de suprapunere genetică cu oamenii. Este deasemenea important că, spre deosebire de câini și pisici, mai multe feluri de rozătoare imunodeficiente genetic sunt disponibile pentru a fi utilizate în studiile cu xenogrefe. (6)

Xenogrefele de cancer folosite pe modele animale sunt o metodă relativ ieftină pentru generarea de tumori „in vivo”. Aceste modele permit testarea „in vivo” și dezvoltarea unor terapii de succes pentru cancer. (7)

Dezavantajele majore ale utilizării șobolanilor ca modele animale pentru studiul cancerului includ: eficacitatea medicamentelor antineoplazice specifice numai față de anumite tumori, vascularizația superficială a tumorilor de tip xenogrefă și lipsa interacțiunilor stromă-tumoră. (7) Limitarea majoră a acestor modele este aceea că șobolanii folosiți au sistemul imun compromis, deci nu reprezintă în totalitate comportamentul natural al cancerului la om. (6, 7) Tot important de menționat ar fi faptul că ei trăiesc într-un mediu artificial creat în laborator și nu în mediul lor natural. Acestea ar fi câteva dezavantaje și impedimente în găsirea modelului animal perfect pentru studiul cancerului.

Fiind animale mici și ușor de crescut, rozătoarele au fost studiate mai mult și deci, se știe mai mult despre ele decât despre alte animale folosite în studii. În același timp dimensiunile reduse ale lor sunt un dezavantaj când vine vorba de folosirea ultrasonografiei în urmărirea răspunsului terapeutic. Dacă ar fi să comparăm șoarecii cu șobolanii, cei din urmă sunt mai potriviți. Având în vedere că șobolanii sunt mai mari și tumora poate crește la dimensiuni mai mari și astfel prelungind timpul în care poate fi urmărită ecografic.

Tulburările induse animalelor de experiență pot avea o variabilitate proprie în plus față de variabilitatea biologică normală. Este esențial să se înțeleagă și să se minimalizeze variabilitatea "normală" înainte de a se încerca să se lucreze cu patologii mai complexe. (8)

Ultrasonografia

Definiție și generalități

Ultrasunetele sunt sunete cu frecvență de peste 20 000 Hertz, înafara câmpului auditiv uman. Frecvențele de 1-30 megahertzi sunt tipice pentru ultrasunetele de diagnostic.

Formarea imaginilor pe ecran depinde de analiza computerizată a undelor de ultrasunete reflectate, care construiesc imagini fine ale structurilor interne ale corpului. Rezoluția este mai mare cu cât lungimile de undă sunt mai scurte, lungimea de undă fiind invers proporțională cu frecvența. Cu toate acestea, utilizarea undelor de mare frecvență este limitată de atenuarea lor mai mare în țesut (pierderea puterii semnalului) și astfel rezultând o adâncime de penetrare mai mică. (9) Procesul de formare a imaginii include unele aproximări, care dau naștere la imperfecțiuni și limitări în sistemul de imagistică. Transductorul este dispozitivul care transformă efectiv impulsurile electrice de transmisie în impulsuri ultrasonice și, invers, impulsurile de ecou ultrasonic în semnale electrice de ecou.

Ultrasonografia este una dintre cele mai răspândite modalități de diagnostic utilizate în clinică. Aplicația sa variază de la examinări ale abdomenului și alte țesuturi moi până la endosonografie prin esofag sau tractul genital feminin și aplicațiile intravasculare. Examinările cu ultrasunete pentru diagnostic sunt de obicei efectuate fără agenți de contrast. (10)

Fiind o metodă neinvazivă, relativ ușor de utilizat, ultrasonografia este o metodă imagistică de mare folos în diagnostic și urmărirea evoluției. În ultimii ani, imagistica preclinică non-invazivă a cunoscut o importanță semnificativă în descoperirile din domeniul biomedical. (11)

Există 3 moduri de operare: A, B și M. Cel mai utilizat este modul B. O imagine în modul B este o imagine transversală prin țesuturile și organele din corp. Aceasta este construită din ecouri, care sunt generate de reflectarea undelor de ultrasunete. Fiecare ecou este afișat printr-un punct din imagine, care corespunde poziției relative a originii sale în secțiunea transversală. (12)

Utilizarea modului B nu permite însă vizualizarea vascularizației țesuturilor și organelor, fiind necesară și examinarea Doppler. Efectul Doppler permite utilizarea ultrasunetelor pentru a detecta mișcarea sângelui. Efectul Doppler constă în variația frecvenței unei unde emise de o sursă de oscilații, dacă aceasta se află în mișcare față de receptor. Frecvența măsurată crește când sursa se apropie de receptor și scade când sursa se îndepărtează de receptor.

Ecografia Doppler ne ajută în deosebirea arterelor de vene, ne indică felul curgerii sângelui, laminar sau turbulent, precum și gradul de vascularizație al unui organ sau țesut.

Micro-ultrasonografia

Micro-ultrasonografia este o metodă imagistică utilizată pentru studierea modelelor animale de mici dimensiuni. S-a dovedit utilă în studiile care examinează dezvoltarea normală, precum și în cele care studiază dezvoltarea anormală a modelelor de șobolani modificați genetic. Pentru ca ultrasonografia să poată fi folosită pe animale mici de experiența trebuie făcute câteva ajustări. Frecvența ultrasunetelor, dimensiunea ferestrei imaginilor și profunzimea rezoluției au fost optimizate pentru șoareci datorită rolului vizibil în creștere al acestei specii în cercetare. Micro-ultrasonografia de mare frecvență a evoluat considerabil deoarece este o metodă relativ ieftină pentru studiul dezvoltării normale și a patologiilor umane induse la animalele mici de experiență. (11)

În domeniul oncologiei rezultatele terapiilor sunt încă modeste în ceea ce privește supraviețuirea. În prezent, mecanismele de acțiune sunt destul de controversate și depind în mod clar de tipul medicamentului, căile prin care acționează, natura agentului (de exemplu, moleculă mică față de anticorp) și specificitatea medicamentului. Micro-ultrasonografia este potrivită pentru a testa unele din aceste teorii pe modele animale mici. (11)

Figura 2: Sistemele de micro-ultrasonografie de înaltă frecvență; sistemele anterioare (partea de sus a imaginii) s-au bazat pe transductorul cu un singur element; mai recent (partea de jos a imaginii), aparate ce folosesc transductori cu o penetranță mai mare. (11)

Micro-ultrasonografia 3D oferă o combinație a caracteristicilor necesare evaluării modelelor animale. Punctele forte și punctele slabe ale micro-ultrasonografiei sunt similare cu avantajele și dezavantajele ultrasonografiei utilizate în clinică. Micro-ultrasonografia este neionizantă, oferă un contrast bun al țesuturilor moi și o rezoluție spațială mare fără a fi nevoie de agenți de contrast. Evaluarea în timp real, combinată cu utilizarea unei sonde portabile, permite utilizatorului să exploreze rapid un organ pentru leziuni, îmbunătățind astfel eficiența studiilor longitudinale cu animale multiple. Aparatele de micro-ultrasonografie sunt portabile și economice, astfel încât sunt ușor de încorporat în laboratoarele de cercetare. Dezavantajele acestei metode includ: adâncimea de penetrare și fereastra de vizualizare mai mici decât la tomografia computerizată sau imagistica prin rezonanță magnetică, incapacitatea de a vizualiza anatomia structurilor osoase sau a cavităților cu aer și calitatea dependentă de operator a imaginii. Ca și în cazul ultrasonografiei clinice, adâncimea de penetrare este limitată de atenuarea dependentă de frecvență a impulsului de ultrasunete, astfel încât micro-ultrasonografia nu produce imagini transversale ale corpului întreg al șobolanilor, așa cum se poate la tomografia computerizată și imagistica prin rezonanță magnetică. (13)

Micro-ultrasonografia este o metoda imagistică care poate fi utilizată pentru vizualizarea, caracterizarea și cuantificarea xenogrefelor ortotopice și subcutanate și a tumorilor spontane la șoareci și șobolani. Tumorile pot fi monitorizate și cuantificate de la început, trecând prin etapele lor de creștere și până la metastazarea în organele distale, ganglionii limfatici și alte țesuturi. Sistemele actuale de imagistică permit vizualizarea și măsurarea în timp real a tumorilor în două și trei dimensiuni. Imagistica tridimensională se realizează prin atașarea sondei la o scară automată disponibilă ca accesoriu pe scaner. Fluxul de sânge, arhitectura vasculară și evaluarea vaselor de neoangiogeneză pot fi cuantificate utilizând Doppler-ul (pentru vasele mai mari de 30 µm). Perfuzia tumorală și fluxul micro-vascular pot fi evaluate folosind agenți de contrast „in vivo”. Fluxul micro-vascular este deosebit de important în studiile terapeutice antiangiogenice.(11)

Una dintre cele mai importante măsurători în oncologie este cuantificarea modificării volumului tumoral în timpul progresiei bolii și a modificărilor legate de răspunsul tumoral la terapia antineoplazică. Deoarece micro-ultrasonografia este neinvazivă, creșterea tumorală și modificările pot fi monitorizate în mod repetat și longitudinal în același animal, care poate servi drept control propriu, mărind astfel acuratețea experimentului și reducând numărul de animale necesare.

Imaginile de la micro-ultrasonografia tridimensională se corelează strâns cu histologia seriată. Mai mult, măsurătorile de la micro-ultrasonografia tridimensională au confirmat cu exactitate dimensiunea și forma acestor mase tumorale „in vivo”. Tehnica este reproductibilă deoarece sensibilitatea și specificitatea detecției tumorale sunt de peste 90%.

În cercetarea preclinică, cunoașterea detaliată a microvascularizației și a hemodinamicii în modelele animale contribuie la cuantificarea atât a fiziologiei normale cât și a progresiei bolii. Investigarea noilor terapii și a combinațiilor de terapii poate fi efectuată pentru a ghida dezvoltarea strategiilor adecvate pentru investigația clinică.

Din punct de vedere clinic, evaluarea microcirculației oferă posibilitatea de a caracteriza progresia bolii și de a determina răspunsul la terapie, permițând modificări în timp util ale strategiei terapeutice.

Rezultatele imaginilor pot conține, de asemenea, informații prognostice care sunt importante pentru managementul pacientului. O componentă cheie a studiului cancerului pe modele animale este înțelegerea modului în care medicamentele specifice afectează angiogeneza.

Ultrasonografia cu contrast

Agenții de contrast sunt substanțe cu o densitate diferită față de țesuturile organismului, administrate în vederea facilitării diagnosticului cu ajutorul metodelor de radiologie și imagistică. Agenții de contrast utilizați în ultrasonografie îmbunătățesc imagistica prin introducerea unui material cu proprietăți acustice diferite față de cele ale țesuturilor. Cea mai răspândită este injectarea intravenoasă de mici bule de aer sau gaze (microbule) care potențează semnalul Doppler de la vasele de sânge. (14)

Microbulele funcționează nu numai pentru că furnizează o interfață sânge / gaz puternic reflectogenă, ci și pentru că rezonează cu fasciculul cu ultrasunete, contractându-se și dilatându-se ca răspuns la schimbările de presiune ale undei de sunet. Acest lucru le face să fie mai reflectogene decât sângele normal, amplificând semnalele atât în scală gri, cât și la Doppler color. (14)

Cele care sunt libere, adică microbulele fără înveliș, se dizolvă rapid în sânge. Adăugarea unui învelis asigură supraviețuirea microbulelor la trecerea prin plămâni și către organul țintă. În preparatele comerciale învelișul microbulelor este fie format din lipide (lipidic), fie din proteine (pe bază de albumină) deoarece trebuie să fie biocompatibile. (12)

Microbulele pot ajuta la vizualizarea fluxului în vase mai mici, chiar și la nivel capilar, în special atunci când se utilizează și ecografia Doppler. Ca și în cazul semnalelor Doppler convenționale, modificările produse de microbule pot fi de asemenea cuantificate.

Principalele cerințe ale unui agent de contrast: să fie ușor de introdus în sistemul vascular, stabil pe durata examinării, toxicitate scăzută și să poată fi detectat de către aparatul de ultrasunete.

În trecut, detectarea perfuziei tumorale s-a realizat numai prin proceduri invazive, cum ar fi microscopia intravitală sau cu ajutorul modalităților costisitoare, cum ar fi tomografia computerizată, tomografia cu rezonanță magnetică sau utilizarea combinată a tomografiei cu emisie de pozitroni și a tomografiei computerizate. Ultrasonografia oferă posibilitatea vizualizării non-invazive a organelor fără utilizarea radiaților ionizante și este disponibilă la scară largă. Cu toate acestea, ultrasonografia Doppler nu permite detectarea microcirculației tumorale. Introducerea ultrasonografiei cu contrast, precum și a noilor sonde de înaltă frecvență au făcut posibilă detectarea și cuantificarea microcirculației tumorale la o rezoluție înaltă. (15)

Abordările numeroase dezvoltate la frecvențele utilizate în clinică pentru imagistica de contrast pot fi aplicate eficient și pe modelele animale, dar la frecvențe mai mari. Acest lucru permite evaluarea neinvazivă a perfuziei relative și a volumului de sânge, fără a fi necesară biopsierea țesuturilor, colorarea imunohistochimică și numărarea efectivă a vaselor. Este important de mentionat că, în mod paradoxal, chiar dacă tratamentul este considerat antiangiogen și suprimă fluxul în timpul perioadei de tratament, fluxul sanguin este în cele din urmă mai mare la animalele tratate decât la cele netratate și controlul tumorii este mai bun. (11) Acest lucru conduce la întrebări importante cu privire la utilizarea ultrasonografiei cu contrast ca predictor precoce al răspunsului terapeutic.

Analiza densității microcirculației tumorale și a numărului de vase sunt metode alternative pentru evaluarea neovascularizației tumorale. Cu toate acestea, aceste metode nu reflectă cu acuratețe eficacitatea terapiei antiangiogenice. Ultrasonografia cu contrast evaluează cu exactitate viteza fluxului sanguin, volumul sângelui și parametrii fluxului sanguin prin modele matematice. O analiză comparativă a parametrilor reflectă indirect fluxul sanguin și modificările „in vivo” ale perfuziei tumorale. Această metodă eficientă poate oferi mai multe informații cantitative ale perfuziei pentru a ajuta la alegerea tratamentului. (16)

Toate examinările imagistice au avantaje și dezavantaje. Ultrasonografia cu contrast este o tehnică imagistică în timp real, ideală pentru animale mici, datorită gamei foarte largi de aplicații și a rezoluției lor spațiale și temporale, precum și a costurilor reduse. Accesul la animalul de experiență în timpul unei sesiuni de imagistică este facil, iar el poate fi monitorizat continuu în timpul unei proceduri. (8)

Ca și în cazul altor modalități imagistice, este necesară minimalizarea variabilității. Astfel se naste necesitatea unui protocol riguros, pas cu pas, pentru: prepararea și utilizarea agentului de contrast, manipularea și monitorizarea animalelor (anestezie, temperatură), injectarea substanței de contrast, determinarea setărilor platformei ultrasonografului și achiziționarea de date. Protocolul standardizat privind utilizarea va limita variabilitatea între operatori și centrele de cercetare. Standardizarea este o condiție prealabilă pentru acceptarea unor rezultate noi, prin eliminarea unor factori de confuzie care ar putea distorsiona rezultatele și prin îmbunătățirea reproductibilității dintre centrele de cercetare și studii. În plus, fiziologia animalelor trebuie să fie atent luată în considerare pentru a nu periclita calitatea rezultatelor și pentru a respecta recomandările etice. (8)

Aplicații ale ultrasonografiei în patologia tumorală la animale de experiență

Ultrasonografia este folosită la scară largă pe animale de experiență, deoarece este ieftină, portabilă, permite vizualizarea în timp real și o intervenție convenabilă în vedere efectuării de biopsii.

În prezent, nu există un model care să fie cel mai bun pentru studierea cancerului. Studiile privind cancerul la om sunt de folos pentru identificarea presupuselor gene implicate în cancer și testarea medicamentelor antineoplazice, dar oferă puține informații despre mecanismele de dezvoltare a tumorii și cum acționează genele. Studiile pe animale de experienta intervin tocmai pentru a acoperii aceste neajunsuri. (17)

Una dintre cele mai importante măsurători în oncologie este cuantificarea modificării volumului tumoral în timpul progresiei bolii și a modificărilor legate de răspunsul la terapia antineoplazică. (11) A fost demonstrat faptul că micro-ultrasonografia este o metodă de o acuratețe mai mare în determinarea volumul tumoral decât măsurătorile externe. (18)

O condiție esențială pentru creșterea tumorală, invazia și metastazarea, este angiogeneza. Angiogeneza reprezinta formarea de noi vase de sânge din cele preexistente și a fost identificată ca fiind o amprentă importantă a cancerului. Ea permite tumorilor să crească peste dimensiunea de 1-2 mm. Angiogeneza a fost caracterizată ca un proces complex, multistrat care implică numeroși factori angiogenici și citokine. (19)

Medicamentele antiangiogenice acționează prin întreruperea căilor de semnalizare care conduc la formarea de noi vase de sânge și prin inhibarea factorilor care sunt necesari pentru integritatea structurală a endoteliului imatur, în timp ce medicamentele antivasculare distrug vasele de sânge existente. (14)

A fost demonstrat faptul că micro-ultrasonografia 3D cu contrast poate evalua răspunsul tumoral timpuriu după tratamentul antiangiogenic. Modificările parametrilor cantitativi au fost predictive pentru răspunsul la tratament într-un model animal de cancer de colon. Deoarece ultrasonografia 3D cu contrast furnizează o platformă imagistică longitudinală, robustă și reproductibilă, sunt în curs de desfășurare studii clinice pentru a testa dacă această tehnică poate fi aplicată în clinică și ar permite detectarea timpurie a modificărilor la pacienții supuși terapiilor antiangiogenice și altor terapii. (20)

Atunci când se decide un model animal cu metastaze, obiectivele studiului vor dicta complexitatea modelului ales. Dacă se investighează mecanismele biologice, poate fi necesar doar un număr mic de animale experimentale și poate fi utilizat un model mai complex. Dacă se evaluează un agent terapeutic, numărul animalelor din grupul studiat trebuie să fie mai mare pentru a avea semnificație statistică și deci, poate fi preferat un model mai puțin complex. Acesta din urmă poate totuși să cuprindă doar o anumită fază a metastazării, mai degrabă decât să reflecte toate aspectele cascadei metastatice.

În ceea ce privește metastazele, rolul ultrasonografiei depinde de localizarea lor. Metastazele localizate în organe parenchimatoase (ex.: ficat, plămân) pot fi evaluate cu ajutorul ultrasonografiei cu contrast. Unele studii arată că vizualizarea 3D în timp real a metastazelor tumorale și a angiogenezei, utilizând ultrasonografia cu contrast, poate îmbunătății considerabil înțelegerea interacțiunilor tumoră-gazdă care apar în timpul procesului metastatic în organele animalelor vii. Se anticipează că această metodă imagistică non-invazivă va putea detecta metastazele încă din stadiul incipient și va evalua răspunsul la terapie prin monitorizarea gradului de angiogeneză înainte, în timpul și după chimioterapie. (21)

Metastazele osoase spontane sunt mai puțin frecvente la rozătoare, câini și pisici pentru majoritatea tipurilor de tumori, inclusiv cancerul mamar. Metastazele osoase apar la câinii cu cancer de prostată și sporadic cu alte tipuri de cancer. De aceea, cele mai multe modele animale de metastaze osoase necesită injectarea „in vivo” a celulelor neoplazice. Injectarea ortotopică are potențialul de a oferi un model mai cuprinzător al procesului metastatic, de la creșterea tumorii primare până la metastazare și proliferare la distanță. Din păcate micro-ultrasonografia cu contrast nu poate fi utilizată în evaluarea metastazelor osoase din cauza țesutului osos care nu permite vizualizarea lor. În acest sens cele mai utilizate metode sunt: imagistica cu fluorescență, radiografia de înaltă rezoluție și tomografia micro-computerizată, dar poate fi folosită și tomografia cu emisie de pozitroni și tomografia cu emisie de un singur foton. Micro-IRM-ul (imagistica prin rezonanță magnetică) este mai puțin utilizată. (6)

Ultrasonografia cu contrast poate detecta și metastazele din ganglionii secundari după injectarea directă de substanță de contrast (Sonazoid) în ganglionul santinelă. Ganglionii limfatici secundari care au fost identificați prin ultrasonografia cu contrast au avut o mai mare probabilitate să conțină metastaze decât cei de la disecția radicală. Beneficiul clinic în acest caz este posibilitatea dezvoltării unei metode de imagistică minim invazivă care poate fi utilizată pentru a identifica drenajul limfatic al tumorii prin ganglionii limfatici. (22)

Tot pentru evaluarea ganglionilor limfatici alți autori au ales să compare caracteristicile ultrasonografice ale ganglionilor limfatici în stadiul incipient al metastazării cu cele ale ganglionilor limfatici dar care nu prezintă celule tumorale. De asemenea este sugerat faptul că tumora într-un nod limfatic din amonte poate induce alterarea structurilor vasculare ale ganglionilor limfatici care nu conțin metastaze. (23)

Micro-ultrasonografia cu contrast a fost folosită și pentru a arăta modificările vasculare, după injectarea unui medicament antineoplazic, într-o tumoră de prostată la un model animal. Modificările vascularizației tumorii pot fi observate înainte de modificările dimensiunii ei. În viitor se așteaptă ca diferite tehnici de imagistică să poată avea rol de biomarker imagistic al efectelor medicamentelor în tratarea cancerului. Dintre aceste tehnici, ultrasonogafia cu contrast are avantajul de a fi sigură, neinvazivă și reproductibilă, precum și de a permite examinări repetate ale aceluiași individ. (24)

Nu doar rezultatele terapiilor medicamentoase pot fi evaluate cu ajutorul ultrasonografiei ci și ale altor tipuri de terapii. Eficacitatea ultrasonografiei cu contrast a fost testată și în evaluarea tumorilor după iradiere prin ablația cu ultrasunete în cazul xenogrefelor de cancer pancreatic la șoareci. După iradiere, perfuzia cu agent de contrast a rămas la fel doar la periferia tumorii, în interiorul ei, aceasta fiind neregulată. (25)

Un alt studiu a arătat efectele terapiei cu Endostar (endostatina umană recombinantă) și radioterapie, individual sau în combinație, asupra fluxului sanguin în țesutul tumoral la șoarece utilizând ultrasonografia. Modificările perfuziei sanguine tumorale au fost cuantificate prin evaluarea parametrilor ultrasonografiei cu contrast. Rezultatele au reflectat indirect schimbarea în gradul angiogenezei tumorale după intervenția experimentală. Ultrasonografia cu contrast a arătat în mod eficient amploarea schimbărilor în vascularizație și curgerea sângelui. (16)

Ultrasonografia cu contrast a fost încercată și în depistarea precoce a nodulilor hepatici maligni într-un model de șobolan experimental cu steatohepatită non-alcoolică care progresează la hepatocarcinom. Rezultatele au arătat o precizie de 70% în diferențierea nodulilor benigi și maligni. Au fost de asemenea și rezultate negative și fals pozitive. Nodulii fals negativi au fost noduli bine diferențiați de hepatocarcinom sau noduli displazici. (26)

Un grup de cercetători din Germania a încercat fuziunea imaginilor de la ultrasonografie cu IRM pe un model animal pentru a detecta necroza tumorală și pentru a dovedi o mare precizie a acestei metode în tumori extrem de mici (~ 318 mm³). Fuziunea imaginii IRM și ultrasonografia cu contrast oferă o îmbunătățire semnificativă pentru o diferențiere clară între diferitele zone ale țesutului tumoral și simplifică investigarea prin prezentarea morfologiei și a macro-/microvascularizației țesutului înconjurător. Utilizând ultrasonografia cu contrast este posibil să se descrie și să se diferențieze țesutul viabil de cel non-viabil, ceea ce este deosebit de important pentru detectarea răspunsului sau a neresponsivității la terapia antiangiogenică. (27)

Un alt studiu a evaluat nivelul de expresie al unui marker angiogenic tumoral bine descris, adică VEGFR-2, într-un model animal de tumoră tiroidiană, comparativ cu tiroida normală sau noduli tiroidieni benigni și dacă ultrasonografia cu contrast permite evaluarea non-invazivă a acestui marker. Legarea „in vivo” a agentului de contrast de VEGFR-2 în tumorile tiroidiene a fost substanțial mai mare comparativ cu controlul și nodulii benigni. Această diferență de retenție a confirmat specificitatea agentului de contrast conjugat cu VEGFR-2 pentru ținta endotelială. (28)

În concluzie, micro-ultrasonografia poate fi folosită pentru monitorizarea oricărui tip de cancer solid la animale de experiență. Fie că este vorba de xenogrefe, cancer indus, apărut de novo sau metastaze, micro-ultrasonografia cu contrast ajută la cuantificarea vascularizației și a răspunsului terapeutic chiar și în tumori de mici dimensiuni.

Partea specială

Introducere

Pe măsura trecerii anilor, cancerul a devenit o afecțiune tot mai răspândită la nivel global și mai ales la nivelul țărilor dezvoltate. Astfel este necesară dezvoltarea de noi medicamente și terapii dar și îmbunătățirea metodelor de detecție și cuantificare a răspunsului terapeutic.

Studiile privind cancerul la om sunt de folos pentru identificarea presupuselor gene implicate în cancer și testarea medicamentelor antineoplazice, dar oferă puține informații despre mecanismele de dezvoltare a tumorii și cum acționează genele. Studiile pe animale de experiență intervin tocmai pentru a acoperii aceste neajunsuri. (17)

Una dintre cele mai importante măsurători în oncologie este cuantificarea modificării volumului tumoral în timpul progresiei bolii și a modificărilor legate de răspunsul la terapia antineoplazică. (11)

A fost demonstrat faptul că micro-ultrasonografia este o metodă de o acuratețe mai mare în determinarea volumul tumoral decât măsurătorile externe. (18)

Scopul acestui proiect este demonstrarea utilității examinării ecografice cu contrast în aprecierea răspunsului tumorii hipervasculare la tratamentul chimioterapic. Deasemenea, lucrarea de față își propune să arate și gradul de corelație dintre evaluarea imagistică și anatomopatologică a tumorii.

Materiale și metodă

Design-ul studiului este unul intervențional prospectiv. Examinările ecografice au fost făcute în centrul de cercetare și dezvoltare Biodiatech din Cluj (S.C. Proplanta SRL). Examinările histopatologice au fost făcute la Disciplina de Anatomie Patologică a Facultății de Medicină Veterinară USAMV Cluj-Napoca.

Modelul animal și modelul tumoral

În vederea realizării studiului s-au utilizat 20 de șobolani, masculi din rasa Wistar albino. Șobolanii aleși, vârstă de 6 luni și cu o greutate de 200g ± 20g au fost împărțiți aleator în două loturi de câte 10 șobolani fiecare. Animalelor li s-au însămânțat fragmente de carcinosarcom Walker 256 subcutanat la nivelul coapsei drepte. În ceea ce privește hrănirea animalor, aceasta s-a făcut cu un regim standard, iar accesul la apă nu a fost restricționat.

În ziua 0 a studiului, șobolanilor li s-a inoculat o doză de 106 celule tumorale pe mililitru de soluție de NaCl isotonică, subcutanat, la nivelul coapsei drepte, după anestezia intramusculară prealabilă cu Ketamină, 80 mg/kg și Xylazină, 8 mg/kg. După un interval de 4 săptămâni, șobolanii au fost împărțiți aleator în două loturi de câte 10 șobolani fiecare. Lotul 1, lotul martor, a avut parte de hrană normală, în timp ce lotul 2 a primit 40 mg/kg corp de Sunitinib per os, timp de 2 săptămâni, la interval de 3 zile o administrare față de alta.

Urmărirea ultrasonografică

Examinările ultrasonografice s-au realizat în zilele 1, 7 și 15 pentru șobolanii tratați cu Sunitinib și în zilele 1 și 15 pentru șobolanii din lotul martor. Examinările tuturor animalelor, atât cele din lotul martor cât și cele tratate au fost făcute de același examinator cu experiență în domeniu.

Pentru realizarea studiului a fost folosit sistemul ecografic Visualsonics Vevo 2100 la care a fost atașat un transductor cu o frecvență maximă de 24 MHz. Examinările s-au efectuat în modul B, Doppler Color (CFM) (PRF = 1,5 kHz, frecvență centrală = 16MHz) și CEUS (Power = 4%, frecvență = 18MHz), cu imagine în mod dual.

Animalele din studiu au fost anesteziate cu Ketamină (80 mg/kg corp) și Xylazină (8 mg/kg corp) intramuscular, apoi au fost poziționate pe o măsuță cu formațiunea tumorală în sus. Pentru a oferii stabilitate imaginii, transductorul a fost fixat deasupra măsuței de examinare printr-un sistem de cleme. Această fixare nu este una rigidă, ea permite totuși rotații și angulații ale planului de examinare. (Figura 3)

Șobolanii au fost scanați în zona coapsei drepte, pe o suprafață ce cuprinde diametrul tumoral maxim și țesutul muscular al coapsei. În zona respectivă s-a aplicat un strat de gel de aproximativ 0,5 cm pentru a împiedica comprimarea țesutului de către transductor. Măsurătorile s-au făcut pe imagini în scară de gri și Doppler color obținute de la nivelul formațiunilor. Au fost luate în vedere diametrele, ariile și volumele formațiunilor tumorale.

Figura 3: Sistemul de cleme care ajută la fixarea transductorului

Pentru examinarea cu contrast a fost nevoie de cateterizarea uneia din venele cozii cu o branulă de 26G. (Figura 4) Permeabilitatea ei a fost verificată cu ajutorul unei seringi cu ser fiziologic, iar apoi a fost fixată cu leucoplast de tegumentul șobolanilor.

Figura 4: Cateterizarea venei cozii șobolanilor cu o branulă de 26G

Pentru examinarea ultrasonografică cu contrast a fost folosit SonoVue ca și agent de contrast. Modul de administrare a fost 0,2 ml în bolus, urmat de 0,5 ml de soluție NaCl isotonică.

Examinările în scară gri și cu contrast au fost înregistrate în 3 clipuri a câte 60 de secunde fiecare prin care s-a urmărit prezența contrastului la nivelul vaselor coapsei. Software-ul SonoLiver (Bracco®) a fost folosit pentru procesarea datelor, iar curbele de calibrare au fost obținute din pachetul VevoCQ. (Figurile 5, 6 și 7)

În ceea ce privește selectarea regiunilor de interes, aceasta a fost făcută la nivelul parenchimului tumoral, de unde au fost analizate mai multe regiuni și la nivelul țesutului muscular adiacent, care a ținut loc de referință. La nivelul tumorii au fost trasate de asemenea regiuni de interes la nivelul zonelor cele mai hipercaptante și hipocaptante. Compararea rezultatelor a fost făcută cu secțiunile obținute la anatomie patologică.

Figura 5: Vizualizarea tumorii la ultrasonografie standard (stânga) și ultrasonografie cu contrast (dreapta)

Figura 6: Hărțile parametrice pentru Imax (intensitatea maximă; stânga) și TTP (time to peak; dreapta)

Figura 7: Curbele TIC (time intensity curves)

Anatomia patologică

Șobolanii au fost eutanasiați în ziua 15 după începerea tratamentului cu Sunitinib iar tumora extirpată s-a secționat în planul în care a fost vizualizată ecografic. (Figura 8) Piesele de rezecție au fost fotografiate și cântărite. Fixarea s-a făcut în formaldehidă 10% pentru 24 de ore și apoi inclusă în parafină. Secțiunile de la parafină au avut o grosime de 4 µm iar colorația a fost făcută cu hematoxilină-eozină. (Figura 9)

Figura 8: Planul de secțiune al tumorii

Figura 9: Colorația cu hematoxilină-eozină

A fost realizat și un studiu imunohistochimic cu ajutorul anticorpilor anti-CD34 (diluția 1:10, R&D Systems, Minneapolis, USA) (Figura 10). Secțiunile obținute s-au întins pe lame învelite cu Poly-L-lizină. Protocolul a fost realizat cu ajutorul sistemul automat Leica Bond Max. S-a folosit microscopul Olympus BX41 cu o cameră foto Olympus UC30 și un Olympus Stream Basic software. Densitatea microvasculară (MVD) a fost determinată folosind un obiectiv de 10X. Au fost luate în considerare 3 dintre câmpurile cu cele mai multe capilare, atât din stroma conjunctivă de la nivelul tumorii cât și din capsula acesteia. Cu un obiectiv de 20X s-au numărat aceste capilare și s-a făcut o medie între aceste câmpuri. S-au măsurat și ariile vaselor de calibru mediu și mare.

Figura 10: Marcare cu anticorpi anti-CD34

Analiza statistică a datelor s-a realizat utilizând programul Microsoft Excel 2016.

Rezultate

Studiul de față a început cu 20 de șobolani. Din cei 20, însămânțarea tumorală a avut loc cu succes la doar 17 dintre ei. Opt au fost încadrați în lotul martor iar 9 în lotul care a primit tratament. Pe parcursul studiului, din lotul tratat un șobolan a murit în cursul tratamentului iar un al 2-lea a murit în urma anesteziei. Deamenea și din lotul martor un șobolan a murit în urma anesteziei, în final rămânând 7 animale în fiecare lot.

Comparând rezultatele anatomopatologice ale tumorii pentru greutate, arie, arie vasculară și MVD între lotul martor și cel tratat, putem observa diferențe între cele 2 grupuri, cu p-uri semnificativ statistice pentru greutate (p=0,01) și arie (p=0,027). (Tabel 1)

Tabel 1: Medianele parametrilor anatomopatologici între lotul tratat (caz) și lotul martor. Semnificația diferențelor medianelor pe baza testului Mann-Whitney. Q1 = percentila 25%; Q3 = percentila 75%

Distribuția parametrilor anatomopatologici între lotul tratat și lotul martor se poate vedea de asemenea în figura 11.

Parametrii ultrasonografici (AUC – aria de sub curbă, Imax – intensitatea maximă, RT – rise time, TTP – time to peak și mTT – mean transit time) din ziua 15 s-au corelat și ei cu rezultatele de la anatomie patologică. În urma aplicării testului de corelație Spearman am obținut un p<0,05 pentru AUC și Imax. (Tabel 2)

Tabel 2: Coeficienții de corelație Spearman (ρ) și semnificația lor statistică (p) între parametrii anatomopatologici și cei ultrasonografici

Figura 11: Distribuția parametrilor anatomopatologici (greutate, arie, arie vasculară, MVD) în lotul tratat față de lotul martor

De asemenea regresiile liniare pentru parametrii care s-au corelat cel mai bine sunt prezentate în figurile 12, 13, 14 și 15.

Figura 12: Regresia liniară pentru corelația dintre Imax și MVD

Figura 13: Regresia liniară pentru corelația dintre AUC și MVD

Figura 14: Regresia liniară pentru corelația dintre mTT și greutate

Figura 15: Regresia liniară pentru corelația dintre TTP și MVD

Parametrii ultrasonografici s-au măsurat în zilele 1, 7 și 15 pentru lotul tratat și în zilele 1 și 15 pentru lotul martor. Urmărirea în dinamică a tumorii a avut ca scop cuantificarea răspunsului terapeutic. Distribuția parametrilor în dinamică în cele 2 loturi este reprezentată în figurile 16, 17, 18 și 19.

Tabel 3: Semnificația diferențelor medianelor pe baza testului Mann-Whitney. Q1 = percentila 25%; Q3 = percentila 75%; D Parametru = (Parametru ziua 15 – Parametru ziua 1)

Figura 16: Imax în evoluție pe parcursul celor 15 zile (ziua 1 și 15 pentru lotul martor și ziua 1, 7 și 15 pentru lotul celor tratați)

Figura 17: AUC în evoluție pe parcursul celor 15 zile (ziua 1 și 15 pentru lotul martor și ziua 1, 7 și 15 pentru lotul celor tratați)

Figura 18: TTP în evoluție pe parcursul celor 15 zile (ziua 1 și 15 pentru lotul martor și ziua 1, 7 și 15 pentru lotul celor tratați)

Figura 19: mTT în evoluție pe parcursul celor 15 zile (ziua 1 și 15 pentru lotul martor și ziua 1, 7 și 15 pentru lotul celor tratați)

La examenul histopatologic se poate observa scăderea numărului de vase și a calibrului lor în lotul tratat față de lotul martor, atât la colorația cu hematoxilină-eozină (Figura 20) cât și la marcarea cu markeri vasculari anti-CD34 (Figura 21).

Figura 20: Examenul histopatologic în colorația cu hematoxilină-eozină. Diferența dintre martori (stânga) și tratați (dreapta)

Figura 21: Examenul histopatologic după aplicarea markerilor vasculari (anti-CD34). Diferența dintre martori (stânga) și tratați (dreapta)

În continuare, sunt exemplificate imagini obținute la șobolani din grupul martor (Fig. 22), respectiv dintre cei tratați (Fig. 25), la debutul și la sfârșitul tratamentului. Se remarca păstrarea dimensiunii tumorilor și reducerea umplerii cu contrast la șobolanul tratat în ziua 15, spre deosebire de creșterea dimensiunii și păstrarea captării în tumoră în ziua 15 la șobolanul fără tratament. De asemenea, se poate aprecia diferența obținută între cele 2 cazuri după măsurarea curbelor timp intensitate, cât și între hărțile parametrice vizibile în Fig. 23, 24, 26 și 27.

Figura 22: Captarea contrastului la unul din șobolanii din lotul martor în zilele 1 și 15. Ecografie nativă (stânga) și ecografie cu contrast (dreapta)

Figura 23: Ecografie nativă și ecografie cu contrast la un șobolan din lotul martor în ziua 1. Hărțile parametrice (sus) și măsurarea curbelor timp intensitate (jos).

Figura 24: Ecografie nativă și ecografie cu contrast la un șobolan din lotul martor în ziua 15. Hărțile parametrice (sus) și măsurarea curbelor timp intensitate (jos).

Figura 25: Captarea contrastului la unul din șobolanii din lotul celor tratați în zilele 1 și 15, comparând o zonă din tumoră (culoarea roz) cu una din mușchiul adiacent (culoarea roșie) . Ecografie nativă (stânga) și ecografie cu contrast (dreapta)

Figura 26: Ecografie nativă și ecografie cu contrast la un șobolan din lotul celor tratați în ziua 1. Hărțile parametrice (sus) și măsurarea curbelor timp intensitate (jos).

Figura 27: Ecografie nativă și ecografie cu contrast la un șobolan din lotul celor tratați în ziua 15. Hărțile parametrice (sus) și măsurarea curbelor timp intensitate (jos).

Discuții

Acest studiu și-a propus să demonstreze utilitatea examinării ecografice cu contrast în aprecierea răspunsului tumorilor hipervasculare la tratamentul chimioterapic. Tumora Walker 256 este un carcinosarcom cu o creștere rapidă uniformă, ce nu prezintă regresie sau regresează foarte puțin spontan și se adaptează ușor la studii de angiogeneză.(29) Din cauză că nu prezintă regresie spontană este un model tumoral bun și diferențele care se observă sunt datorate aproape exclusiv terapiei.

Sunitinib (comercializat sub numele de Sutent de către Pfizer) este un inhibitor al receptorilor tirozin kinazici cu o moleculă mică. Sunitinib inhibă semnalizarea celulară prin țintirea receptorilor de tirozin kinaze. Aceștia includ toți receptorii pentru factorii de creștere derivați din plachete (PDGF-R) și receptorii factorului de creștere endotelial vascular (VEGFR), care joacă un rol atât în angiogeneza tumorală, cât și în proliferarea celulelor tumorale. Inhibarea simultană a acestor ținte reduce vascularizația tumorală și declanșează apoptoza celulelor canceroase și are ca rezultat micșorarea tumorii. (30)

Micro-ultrasonografia este o metodă imagistică utilizată pentru studierea modelelor animale de mici dimensiuni. S-a dovedit utilă în studiile care examinează dezvoltarea normală, precum și în cele care studiază dezvoltarea anormală a modelelor de șobolani. Micro-ultrasonografia este neionizantă, oferă un contrast bun al țesuturilor moi și o rezoluție spațială mare. Evaluarea în timp real, combinată cu utilizarea unei sonde portabile, permite utilizatorului să exploreze rapid un organ pentru leziuni, îmbunătățind astfel eficiența studiilor longitudinale cu animale multiple. (31)

Ne-am propus să urmărim evoluția formațiunii tumorale cu și fără tratament antiangiogenic prin ecografie nativă și cu contrast.

Rezultatele ecografice s-au comparat cu parametrii urmăriți în cursul examenului anatomopatologic. Dintre aceștia s-au măsurat macroscopic greutatea tumorală și aria, iar microscopic, aria vasculară și MVD.

Comparând parametrii anatomopatologici între lotul cu tratament și lotul martor s-a constatat o corelare bună a greutății (p=0,01) și ariei tumorale (p=0,027) cu apartenența la cele 2 loturi. Astfel, șobolanii netratați au avut tumori cu greutate și arie semnificativ mărite. Acest lucru demonstrează eficiența terapiei la finalul tratamentului. Probabil din cauza numărului mic de șobolani din fiecare lot nu s-au obținut diferențe semnificativ statistice între cele 2 loturi în cazul ariei vasculare (p=0,1) și MVD (p=0,12). Totuși, atât aria vasculară cât și MVD au fost mai mari în cazul șobolanilor fără tratament.(32)

În cazul examinării cu contrast s-au prelucrat curbele timp intensitate și s-au calculat de la nivelul formațiunii tumorale parametrii: AUC, Imax, , mTT și RT. S-a constatat o bună corelație cu o relație liniară între AUC și Imax pe de-o parte, respectiv greutate, MVD și aria vasculară pe de altă parte. (vezi Tabel 2) În cazul celorlalți parametri de perfuzie nu s-a obținut o corelație de tip liniar. Dependențe de tip liniar similare au fost observate și în cazul tumorilor pulmonare Lewis la șoareci. (33)

La compararea valorilor parametrilor obținuți pe parcursul studiului (ziua 1 și ziua 15 pentru lotul martor, respectiv ziua 1, 7 și 15 pentru lotul celor tratați), se observă următoarele:

– o creștere netă a parametrilor Imax și AUC la șobolanii fără tratament;

– o scădere a parametrilor de timp (mTT și RT), în cazul TTP valoarea crescând ușor la a 2-a examinare în lotul celor fără tratament;

– o scădere a parametrilor Imax și AUC în urma tratamentului;

– o creștere a parametrilor de timp (mTT, RT și TTP) în lotul celor tratați.

Pentru a verifica statistic valabilitatea acestor diferențe obținute între lotul martor și cel tratat, am calculat pentru fiecare parametru diferența între valoarea finală (ziua 15) și valoarea inițială (ziua 1). Aceste valori au fost apoi comparate folosind testul hi-pătrat, avându-se în vedere că la numărul scăzut de cazuri nu ar fi fost valabil un test destinat valorilor numerice continue (ca de exemplu t-Student).

Am obținut o diferență semnificativ statistică între creșterea acestor parametrii și apartenența la cele 2 loturi în cazul parametrilor Imax (p=0,003) și AUC (p=0,003). Deși valorile probabilităților au fost peste pragul de semnificație statistică (dar cu p-uri mai mici de 0,1), și parametrii de timp (TTP, mTT și RT) au furnizat valori destul de mari ale hi-pătrat. În aceste condiții este posibil ca la un lot mai mare aceste diferențe să fi fost semnificative statistic. (vezi Tabel 3)

Parametrii Imax și AUC reflectă cantitatea de contrast acumulată la nivelul tumorii în momentul de traversare a bolusului, respectiv pe parcursul întregii examinări, acești parametri putând fi numiți parametri de volum.

Parametrii ce țin de timpul încărcării cu contrast (TTP, mTT, RT) reflectă viteza de încărcare, respectiv de tranzitare a contrastului prin patul vascular și pot fi considerați parametri de debit.

Diferențele descrise pot să fie vizibile și pe graficele box plot unde se remarcă o separație bună între valorile cuprinse în intervalul Q1 și Q3 (reprezentate prin dreptunghiuri) pentru parametrii care au semnificație statistică.

Având în vedere rezultatele bune obținute în cazul parametrilor de volum (Imax și AUC) în discriminarea dintre tumorile care au răspuns la tratament și tumorile netratate, aceste teste s-ar putea utiliza în viitor pentru a preciza mai rapid răspunsul la tratament al tumorilor. Acest lucru ar putea scurta și ușura mult studiile fundamentale în cazul terapiilor oncologice, respectiv ar putea duce mai repede la excluderea unor terapii ineficiente din procesul de testare. Aceste inovații în cazul studiilor fundamentale ar putea accelera în final descoperirea de noi substanțe antitumorale eficiente.

Avantajele ultrasonografiei în comparație cu alte tehnici imagistice în experimentele pe animale mici constau în lipsa iradierii, examinarea facilă, în combinație cu sisteme moderne de monitorizare a funcției respiratorii și cardiace a animalului. (11)

Ultrasonografia prezintă și limitări. Cea mai importantă este aceea că necesită un operator instruit și evaluarea tuturor subiecților de către același examinator pentru a obține secțiuni repetabile, de calitate bună și a evita diferențele legate de manoperă. Chiar dacă metoda poate obține imagini de calitate din care se pot extrage informații cu privire la structură și funcție, în studiile de biologie moleculară ea este inferioară tehnicilor de medicină nucleară (SPECT, PET). (34)

Concluzii

Ecografia nativă și cu contrast folosind aparate dedicate pentru animale de experiență este un bun instrument de evaluare și urmărire a modelelor tumorale la rozătoare, cu aplicare relativ ușoară și fără riscuri pentru subiecți sau participanții la experiment.

Pe loturile studiate cuprinzând șobolani inoculați cu tumori Walker 256 aflați sub tratament cu Sunitinib, respectiv fără tratament, s-au obținut diferențe semnificative statistic la măsurarea ariei și greutății în urma sacrificării.

Parametrii histopatologici microscopici legați de vascularizație (aria vasculară și MVD) nu au diferit semnificativ între cele 2 loturi, probabil din cauza numărului redus de cazuri.

Dintre parametrii de perfuzie măsurați în urma ecografiei cu contrast, AUC și Imax s-au corelat cel mai bine printr-o relație de tip liniar cu parametrii anatomopatologici (greutatea tumorală, MVD și aria vasculară).

Comparând evoluția parametrilor ecografici de perfuzie la începutul și sfârșitul studiului, între lotul martor și cel cu tratament, s-a obținut o diferență semnificativă statistic între cele 2 loturi în cazul Imax și AUC, respectiv diferențe fără semnificație statistică în cazul parametrilor de debit (TTP, mTT, RT).

Utilizarea parametrilor de volum (Imax și AUC) obținuți în urma examinării cu contrast a formațiunii tumorale ar putea fi o metodă utilă în aprecierea răspunsului la terapiile antitumorale, cu impact posibil în accelerarea descoperirii de noi substanțe anti-angiogenice eficiente.

Bibliografie

1. Ericsson AC, Crim MJ, Franklin CL. A Brief History of Animal Modeling. Missouri medicine. 2013;110(3):201-5.

2. Palm S, Hävermark Å, Meyerson BJ, Nylander I, Roman E. When is a Wistar a Wistar? Behavioral profiling of outbred Wistar rats from five different suppliers using the MCSF test. Applied Animal Behaviour Science. 2011;135(1-2):128-37.

3. [Available from: http://www.wistar.org/about_wistar/history.html.

4. Budhu S, Wolchok J, Merghoub T. The importance of animal models in tumor immunity and immunotherapy. Current opinion in genetics & development. 2014;24:46-51.

5. Ruggeri BA, Camp F, Miknyoczki S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochemical pharmacology. 2014;87(1):150-61.

6. Simmons JK, Hildreth BE, 3rd, Supsavhad W, Elshafae SM, Hassan BB, Dirksen WP, et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary pathology. 2015;52(5):827-41.

7. Cekanova M, Rathore K. Animal models and therapeutic molecular targets of cancer: utility and limitations. Drug design, development and therapy. 2014;8:1911-21.

8. Hyvelin JM, Tardy I, Arbogast C, Costa M, Emmel P, Helbert A, et al. Use of ultrasound contrast agent microbubbles in preclinical research: recommendations for small animal imaging. Investigative radiology. 2013;48(8):570-83.

9. Harald Lutz EB. Manual of diagnostic ultrasound. second ed2011.

10. Kiessling F, Fokong S, Koczera P, Lederle W, Lammers T. Ultrasound microbubbles for molecular diagnosis, therapy, and theranostics. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 2012;53(3):345-8.

11. Foster FS, Hossack J, Adamson SL. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface focus. 2011;1(4):576-601.

12. Peter Hoskins KM, Abigail Thrush. Diagnostic Ultrasound Physics and Equipments. 2 ed2010.

13. Wirtzfeld LA, Wu G, Bygrave M, Yamasaki Y, Sakai H, Moussa M, et al. A new three-dimensional ultrasound microimaging technology for preclinical studies using a transgenic prostate cancer mouse model. Cancer research. 2005;65(14):6337-45.

14. Weskott H-P. Contrast-enhanced ultrasound. second ed. Bremen: UNI-MED; 2013.

15. Paprottka PM, Zengel P, Ingrisch M, Cyran CC, Eichhorn M, Reiser MF, et al. [Contrast-enhanced ultrasound in animal models]. Der Radiologe. 2011;51(6):506-13.

16. Ge W, Zheng Y, Tao Z. Contrast-enhanced ultrasound analysis of tissue perfusion in tumor-bearing mice following treatment with endostatin combined with radiotherapy. Experimental and therapeutic medicine. 2014;7(5):1359-63.

17. Cheon DJ, Orsulic S. Mouse models of cancer. Annual review of pathology. 2011;6:95-119.

18. Ayers GD, McKinley ET, Zhao P, Fritz JM, Metry RE, Deal BC, et al. Volume of preclinical xenograft tumors is more accurately assessed by ultrasound imaging than manual caliper measurements. Journal of ultrasound in medicine : official journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 2010;29(6):891-901.

19. Baetke SC, Rix A, Tranquart F, Schneider R, Lammers T, Kiessling F, et al. Squamous Cell Carcinoma Xenografts: Use of VEGFR2-targeted Microbubbles for Combined Functional and Molecular US to Monitor Antiangiogenic Therapy Effects. Radiology. 2015;278(2):430-40.

20. Zhou J, Zhang H, Wang H, Lutz AM, El Kaffas A, Tian L, et al. Early prediction of tumor response to bevacizumab treatment in murine colon cancer models using three-dimensional dynamic contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 2017;20(4):547-55.

21. Horie S, Chen R, Li L, Mori S, Kodama T. Contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging of early stage liver metastasis in a preclinical mouse model. Cancer letters. 2013;339(2):208-13.

22. Liu JB, Merton DA, Berger AC, Forsberg F, Witkiewicz A, Zhao H, et al. Contrast-enhanced sonography for detection of secondary lymph nodes in a melanoma tumor animal model. Journal of ultrasound in medicine : official journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 2014;33(6):939-47.

23. Sato T, Takemura T, Ouchi T, Mori S, Sakamoto M, Arai Y, et al. Monitoring of Blood Vessel Density Using Contrast-Enhanced High Frequency Ultrasound May Facilitate Early Diagnosis of Lymph Node Metastasis. Journal of Cancer. 2017;8(5):704-15.

24. Lee HJ, Hwang SI, Byun J, Kong HY, Jung HS, Kang M. Ultrasound contrast-enhanced study as an imaging biomarker for anti-cancer drug treatment: preliminary study with paclitaxel in a xenograft mouse tumor model (secondary publication). Ultrasonography (Seoul, Korea). 2017.

25. Gao YH, Wu L, Wang R, Guo Q, Chen YN, Hu B, et al. Contrast-enhanced ultrasound evaluation of pancreatic cancer xenografts in nude mice after irradiation with sub-threshold focused ultrasound for tumor ablation. Oncotarget. 2017;8(23):37584-93.

26. Carvalho CF, Chammas MC, Souza de Oliveira CP, Cogliati B, Carrilho FJ, Cerri GG. Elastography and Contrast-enhanced Ultrasonography in the Early Detection of Hepatocellular Carcinoma in an Experimental Model of Nonalcoholic Steatohepatitis. Journal of clinical and experimental hepatology. 2013;3(2):96-101.

27. Paprottka PM, Zengel P, Cyran CC, Paprottka KJ, Ingrisch M, Nikolaou K, et al. Evaluation of multimodality imaging using image fusion with MRI and CEUS in an experimental animal model. Clinical hemorheology and microcirculation. 2015;61(2):143-50.

28. Mancini M, Greco A, Salvatore G, Liuzzi R, Di Maro G, Vergara E, et al. Imaging of thyroid tumor angiogenesis with microbubbles targeted to vascular endothelial growth factor receptor type 2 in mice. BMC medical imaging. 2013;13:31.

29. Oliveira AG, Gomes-Marcondes MC. Metformin treatment modulates the tumour-induced wasting effects in muscle protein metabolism minimising the cachexia in tumour-bearing rats. BMC cancer. 2016;16:418.

30. Abrams TJ, Lee LB, Murray LJ, Pryer NK, Cherrington JM. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer. Molecular cancer therapeutics. 2003;2(5):471-8.

31. Deshpande N, Ren Y, Foygel K, Rosenberg J, Willmann JK. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 2011;258(3):804-11.

32. Irimie A, Szora AT, Socaciu M, Tăbăran AF, Vidrighinescu R, Cătoi C. The Morphological Evaluation of Walker 256 Tumors after Antiangiogenetic Therapy in Rats. 2014. 2014;71(2):4.

33. Hwang M, Hariri G, Lyshchik A, Hallahan DE, Fleischer AC. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. Journal of ultrasound in medicine : official journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 2010;29(4):597-607.

34. Coatney RW. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR journal. 2001;42(3):233-47.