Listă de abrevieri [306448]

Listă de abrevieri

Ac = anticorp

ADN = acid deoxiribonucleic

Ag = antigen

ALP = fosfatază alcalină

ALT = alaninaminotransferază

ARN = acid ribonucleic

AST = aspartataminotransferază

CMV = citomegalovirus

ELISA = enzyme-linked immunosorbent asay/tehnici imunoenzimatice

GGT = gamma glutamil transferază

HAV = hepatită acută virală

i.m. = intramuscular

IgG = imunoglobulină G

IgM = imunoglobulină M

IP = indice de protrombină

MNI = mononucleoză infecțioasă

PCR = polymerase chain reaction

VHA = virus hepatic A

VHB = virus hepatic B

VHC = virus hepatic C

VHD = virus hepatic D

VHE = virus hepatic E

VSH = viteza de sedimentare a hematiilor

VVZ = virusul varicelozosterian

Partea generală

Introducere

Hepatita este o boală a ficatului ce cauzează inflamația și mărirea de volum a acestuia, cu posibile urmări permanente. Pe lângă faptul că hepatita virală are o [anonimizat], consecințele economice pot fi la fel de serioase ca și afecțiunea în sine.

Hepatita virală de tip A este o [anonimizat], rareori cu evoluție fulminantă. Apogeul infecției este atins în timpul unei perioade de 2 săptămâni înainte de debutul incterului sau a [anonimizat]. Concetrația virusului în scaun scade atunci când apare icterul. Copii și sugarii pot să elimine virusul HAV prin scaun pentru o [anonimizat].[anonimizat]-[anonimizat] a ficatului, are incidență până în ziua de astăzi cu precădere în țările în curs de dezvoltare dar și în anumite regiuni mai puțin favorizate ale țărilor dezvoltate.

Neexistând un alt tratament decât cel simptomatic pentru hepatita A, [anonimizat] a acestei afecțiuni. Țara noastră fiind o țară în curs de dezvoltare face parte din zonele cu risc ridicat de a contamina acest virus datorită măsurilor precare de igienă dar și o educație slabă în privința măsurilor de profilaxie manifestată în prezent.

Această parte a lucrării are scopul de a [anonimizat] A, [anonimizat] A poate fi evidențiat în laborator prin prezența serologică a anticorpilor, [anonimizat].

[anonimizat].1.Generalități

Hepatitele acute virale sunt consecința infecției organismului cu unul din virusurile hepatitice: A (VHA), B (VHB), C (VHC), D (VHD), E (VHE), F (VHF) și G (VHG). În afara acestor virusuri hepatitice există și alte virusuri care determină hepatite acute secundare în cadrul unor boli sistemice: [anonimizat] (mononucleoza infecțioasă), virusul citomegalic (VCM), virusul herpes simplex (VHS), virusul varicelozosterian (VVZ), [anonimizat], virusul amaril (febra galbenă), enterovirusul (Coxsackie B) și adenovirusurile. [1]

Tabel II.1.1: Hepatitele virale acute [1]

II.1.1 Definiție: Hepatita virală cu virus hepatic A este o boală infecto-contagioasă acută, benignă, manifestată prin fenomene infecțioase generale, digestive și hepatice, cu o evoluție autolimitantă, cu vindecare spontană și imunitate specifică durabilă dar și cu posibilități variabile după etiologie, de evoluție persistentă și/sau progresivă către forme cronice însoțite sau nu de icter. Este provocată de un virus filtrabil specific, care introdus în organism pe cale digestivă sau accidental, pe cale parenterală, provoacă o îmbolnăvire a întregului organism și, în mod deosebit, a parenchimului hepatic. [1]

II.1.2 Istoric: boala datează încă din secolul al XVIII-lea și al XIX-lea când au fost observate ictere febrile cu caracter epidemic în timpul războaielor, denumite „boala militară” sau „icter soldățesc”. Apoi, afecțiunea a fost observată și între perioadele de epidemii, fiind cunoscută sub numele de „icter infecțios benign”. La sfârșitul secolului trecut, Botkin i-a recunoscut caracterul infecțios și a descris boala, de unde și denumirea de „boala Botkin”. Hepatita virală a fost izolată ca entitate nosologică de circa 30 de ani, cu ocazia ultimului război mondial, când a cunoscut o mare răspândire.

Etapele cele mai importante în cunoașterea hepatitei virale A datează din 1791, atunci având loc prima descriere clinico-epidemiologică a icterului epidemic: Historia Icterorum epidemicorum (Martinus Lange, Brașov):

În anii 1942-1944 au loc primele transmiteri experimentale reușite la om, cu filtrat de conținut intetinal (Voegt, Mac Callum).

În 1943 are loc introducerea termenilor de hepatită infecțioasă (epidemică) și de hepatită prin ser omolog (serică).

1945 este marcat de descoperirea efectului preventiv al gammaglobulinelor asupra hepatitei epidemice de către Stockes și Neefe. În 1947 sunt introduși termenii de hepatită cu virus A și hepatită cu virus B de către MacCallum și precizarea principalelor criterii ce le deosebesc.

1945-1950 apar concepțiile pluralității hepatitelor (Nicolau și Cajal).

1950-1952 este introdusă declararea hepatitei virale în mai multe țări, inclusiv în România.

În anii 1956-1970 experimentele de la școala Willowbrook atestă existența a două tipuri de hepatită: hepatită MS1 (hepatită A) și MS2 (hepatită B, AgHBs pozitivă).

În 1965 se este descoperit antigenul Australia (AgHBs) de către Blumberg.

În 1971-1974 se reușesc transmiteri ale hepatitei umane la animale: Virusul A la moset (animal model), iar virusul B la cimpanzei.

Anul 1975 este remarcat prin apariția testelor serologice de diagnostic al hepatitei A.[3]

II.1.3 Etimologic: boala figurează sub mai multe denumiri: „hepatită infecțioasă”, pentru hepatita cu virus A, și „hepatită serică” A și virus B, cât și cele provocate de alte virusuri decât cel hepatic. În legătură cu calea de transmitere parenterală se vorbește de „hepatită de inoculare”, „hepatită de seringă” sau „posttranfuzională”, care nu trebuie confundată cu hepatita serică, doarece pe cale parenterală se poate transmite oricare dintre virusurile hepatice, nu numai virusul B.[4]

II.2. Etiopatogenie

II.2.1 Etiologie.

Prima hepatită ce a căpătat identitate clinică și epidemiologică prin transmiterea digestivă a primit numele de hepatită A. Presupus virală, în baza observațiilor clinico-epidemiologice încă din anii ”40-50, virusul a putut fi cultivat și studiat abia prin 1973. Virusul A (HVA) este un virus mic și sferic, cu dimensiuni mici (27nm) și cu structură simplă. Este lipsit de anvelopă protectoare, posedă o nucleocapsidă cu 4 proteine distincte și un singur lanț ARN. Este clasificat în familia Picornaviridae, alături de eneterovirusuri (propus chiar a fi încadrat ca enterovirus 72 datorită asemănării de structură, în special a proteinei virale de suprafață VP.1 cu acestea) dar de care se deosebește suficient pentru a fi clasificat separat ca hepadnavirus, genul Hepatovirus.

II.2.2 Structura VHA.

Virusul hepatitic A (VHA) are caracteristicile structurale ale picornavirusurilor. Virionul măsoară 27nm, cu capsidă icosaedrică neînvelită, compusă din patru proteine majore structurale VP1, VP2, VP3 și VP4. Genomul este ARN monocatenar, sens pozitiv, de aproximativ 7470 nucleotide. La capătul 5’ este atașată o proteină VPg, iar la capătul 3’ al genomului se găsește o poliadenozină. Există un singur serotip iar virusul posedă un singur situs pentru anticorpii neutralizanți, localizat pe VP1. [5]

Fig.II.2.2.1: Structura virusului hepatic A [2,3]

II.2.3 Patogenie

După ingestia orală și o primă multiplicare la nivelul orofaringelui, glandelor salivare și intestinului, virusul ajunge pe calea venei porte în ficat. VHA se leagă de un receptor situat pe membrana hepatocitului, pătrunde în interiorul celulei gazdă unde se sintetizează ARN-ul viral și proteazele virale. După asamblarea noilor virioni, părăsirea gazdei se face fără distrugerea acesteia. Replicarea intrahepatocitară este însoțită de o scurtă viremie; concomitent, virusul descărcat din hepatocite în căile biliare va ajunge în materiile fecale. VHA se găsește în scaunul bolnavilor începând din a doua – a șasea săptămână de la infectarea orală și persistă cca. 2 săptămâni de la apariția primelor semne de boală. Virusul nu produce direct modificări citopatogene, dar mecanismul exact prin care se produc leziunile hepatocitelor este incomplet cunoscut. Leziunile hepatice sunt consecința intervenției unor mecanisme imunologice, hepatocitele infectate devenind ținta limfocitelor T citotoxice specifice și a celulelor NK. Eliberarea unor citokine, inclusiv interferon, de către aceste celule stimulate este responsabilă de o parte din simptomatologia de început a bolii (febra, astenia, oboseala, mialgiile, inapetența, grețurile).[2,4,5]

Anticorpii IgM-anti VHA , apăruți încă de la debutul HVA, rămân detectabili 4-6 luni, locul lor fiind luat de anticorpi din clasa IgG, care persistă toată viața și asigură protecția față de reinfecții. Multiplicarea intrahepatică a virusurilor hepatitice pare a fi de tip permisiv și nu conduce direct la leziuni distructive celulare. Se afirmă că în mod obișnuit, virusurile hepatice nu au citopatogenitate directă, în schimb, celulele hepatice multiplicatoare vor afișa submembranar o parte dintre antigenele virale specifice, alături de propriile antigene de histocompatibilitate HLA de tipul I. Aceste celule devin „ținta” reacțiilor de apărare celulară și umorală, suferind o agresiune indirectă, secundară din partea acestora (citotoxică prin limfocitele nK, T citotoxice mediate prin complexe imune (T8 supresoare) și inflamatorie la care participă macrofagele și celulele limfoplasmocitare ce infiltrează spațiile periportale și perilobulare în cazurile de infecție cronică. Sindromul imunologic, declanșat odată cu activarea reacției de apărare împotriva celulelor hepatice multiplicatoare de virus, coincide cu debutul clinic al bolii, fiind responsabil de suferințele celulare. Evoluția poate fi: autolimitantă, către declin, vindecare și imunitate specifică durabilă, datorită unui autocontrol imun eficient (reacțiile de apărare reușesc stoparea circulației și a multiplicării virale cu reparea leziunilor celulare), mod de evoluție specific hepatitelor cu virus hepatic A. Severă, către marea insuficiență hepatica letală, întâlnită în hepatitele cu virus B, B+D și C în mod deosebit, Hepatita A evoluând letal decât excepțional (0.01 și 0.1%). [6,7,]

Infecția persistentă, cu forme de exprimare clinică diverse. Afectare extrahepatică – prin complexele imune celulare ce se depun în diferite structuri (endoteliale, glomerulare, pericapsulare etc. ), cu exprimare clinică de sine stătătoare de tip: periarterită nodoasă, crioglobulinemii cu manifestări cutanate (purpură) și renale secundare, glomerulo-nefrită membrano-proliferativă, tiroidită autoimună, trombopenii autoimune.

II.3. Epidemiologie

Sursa de virus este strict umană, reprezentată de bolnavii acuți cu formă clinic manifestă sau cu infecții inaparente (acestea sunt mult mai numeroase, în special la copii, în jurul unui caz manifest putând exista 20-30 de cazuri de infecție inaparentă). Contagiozitatea începe cu 7-10 zile înaintea debutului și se oprește la circa două săptămâni în faza de stare, când excreția fecală de virus dispare. Transmiterea este fecal-orală. Rezistența în mediu a virusului permite supraviețuirea lui în apă, alimente și pe mâinile murdare: rezistă la clorinarea uzuală a apei potabile sau a apei de piscină (pentru a fi distrus sunt necesare concentrații de clor de 10 ori mai mari) și la dezinfectantele uzuale (solvenți, acizi). La 60 0C, rezistă o oră dar este distrus la fierbere în 5 minute. Aceasta explică apariția atât a cazurilor de contact, sporadice sau în mici focare în colectivități de copii, cât și sub forma epidemiilor hidrice. Legat de transmiterea digestivă, se explică curba sezonieră a bolii cu vârf de morbiditate anuală în perioada de vară-toamnă până în decembrie (la noi în țară unde boala este endemică), receptivitatea fiind generală. Particulară este circulația bolii îndeosebi la copii și tineri, cu imunizare progresivă a populației, astfel că circa 90% devine imună în jurul vârstei de 40 de ani – în țările cu dezvoltare socio-economică slabă și doar 40% în țările bogate. La noi se înregistrează modelul de imunizare accelerată. Global, există 4 tipuri de infecție cu virus hepatic A bazate pe rata seroprevalenței virusului hepatic A specific vârstei. [8,9,10]

Fig.II.3.2: Prevalența zonelor endemice a infecției cu virus hepatic A [6]

Zonele endemice au o rată mai mică a bolii datorită tropismului la copii tineri care sunt deseori asimptomatici. Adulții sunt imuni și epidemiile în zonele endemice mari sunt rare. Zonele endemice sunt definite ca o regiune unde în proporție de peste 90% din copiii sub 10 ani sunt deja infectați, iar majoritatea cazurilor sunt asimptomatice. Zonele endemice sunt zone situate în regiuni sărace, slab salubrizate și cu acces limitat la apă curentă. Variații mari există în țările cu incidență de virus hepatic A. [10,11,12]

În zonele puțin endemice, copii nu vor fi afectați de boală, iar populația adultă va rămîne susceptibilă. În zonele cu endemicitate redusă, prevalența este sub 25%. În țările dezvoltate cu endemicitate redusă, focarele de infecție sunt adesea provocate de produse alimentare contaminate, cum sunt conservele, ce pot conserva virusul, și alte produse alimentare contaminate de manipulatorii infectați. [12,13,14]

II.3.1 Profilaxia hepatitei acute virale A

Profilaxia nespecifică, comună și altor infecții digestive, constau în respectarea igienei personale și colective, cu păstrarea unei sanitații corespunzătoare. Igiena mâinilor, prelucrarea corectă a alimentelor și controlul personalului care le manipulează, izolarea bolnavilor (și folosirea mănușilor protectoare la manevrarea dejectelor acestora în perioada de contagiozitate), contribuie la prevenirea îmbolnăvirilor.

Profilaxia specifică se obține pasib prin imunoglobuline sau activ prin vaccinare anti – HVA. Imunoglobulinele umane standard, administrate i.m în primele 7 zile de la contactul infectant, previn apariția bolii (80-90%), intervenind și în ameliorarea simptomatologiei clinice. Imunoglobulinele umane specifice anti-VHA (cu titru de 100 UI/1ml) administrate i.m., în doze de 0,02 – 0,06 m/kg, asigură protecție 2-6 luni. Anticorpii anti_VHA în concentrații mici împiedică formarea virionilor, neutralizează limfocitele T citotoxice și modificările imune ptologice. Costul ridicat limitează utilizarea acestora.[1,12,13]

Profilaxia pasivă este indicată: la persoane aflate în contact strâns cu surse de infecție (în spitale, familie sau colectivități, prin contacte intime sau sexuale), călătorii sau rezidenții în zone endemice. Administrarea cestei profilaxii nu este o manevră cu repetre de rutină și va fi înlocuită de vaccinarea anti-VHA.[1,15,16]

Vaccinarea anti-HVA se face cu vaccin conținând virus viu cultivat pe celule de mamifere purificat și inactivat cu formaldehidă (Havrix, Vaqta). Vaccinul Havrix conține 1440 EU (unități ELISA)/ml (doza de adult) sau 720 EU/0.5 m (doza pediatrică), hidroxid de aluminiu (adjuvant) și 2-fenoixi-etanol pentru conservare. Administrarea unei singure doze i.m. asigură protecție rapid instalată în 15 zile (ritmul administrării: 0-1-6 luni). Rapelul asigură seroconversie de 95% și imunitate de lungă durată. Au fost încercate și vaccinuri de administrare orală, conținând VHA atenuat, dar nu se poate asigura o atenuare completă, protecția fiind de durată limitată.[17,18]

II.4. Clasificarea hepatitelor virale

Hepatitele sunt infecții cu manifestări hepatice (cu sau fără icter) produse de un grup de virusuri hepatotrope (A, B, C, D, E) ce prezintă două modalități difierite de transmitere : una digestivă pentru virusurile A și E și alta pe cale parenterală pentru virusurile B, C și D.

Hepatita virală A (HVA) – denumită cândva și hepatita epidemică, este cauzată de un enterovirus (HVA) cu transmitere fecal-orală și evoluează de regulă favorabil cu vindecare și imunitate durabilă;[5]

Hepatita virală B (HVB) – denumită cândva serică, datorită transmiterii parenterale a agentului cauzal, (HVB) un dezoxiribovirus cu mare rezistență în mediul extern, evoluează uneori sever, cu deces prin comă hepatică, sau cu cronicizare în 10-15% din cazuri, putând provoca ciroză hepatică. Persistența virusului în sânge și pe tumori pe timp îndelungat și marea lui rezistență conferă bolii particularități epidemiologice;[5]

Hepatita virală C (HVC) – provine din grupul hepatitelor zise non-A, non-B ce se transmite pe cale parenterală, ca și precedenta, survenind mai ales (dar nu numai), posttransfuzional, hepatita virală C fiind cauzată de un flavivirus din familia togaviridae, VHC, un ribovirus cu evoluție similară cu hepatita B, posibil severă și deseori (până la 50%) cu cronicizare;[5,6]

Hepatita virală D (HVD) – sau delta, este o hepatită cauzată de un ARN-virus, defectiv, care nu se dezvoltă decât în prezența VHB cu al cărei inveliș antigenic de suprafață (Ag HBS) se acoperă. Boala evoluează sever, potențându-se cu HVB și se transmite tot parenteral ca și precedentele (B și C);[2,5,6]

Hepatita virală E (HVE) – provine și ea din grupul non-A, non-B, fiind determinată de un ARN-virus, calicivirus, distinct de VHA, deși epidemiologic și simptomatologic se apropie mult de hepatita A.[5,6]

II.5. Manifestări clinice

Incubația este variabilă, între 21-45 de zile. În perioada terminală – ultimele 10-14 zile, își face apariția virusul în fecale, trădând începutul replicării intrahepatice. Debutul clinic poate îmbrăca manifestări extrem de variate, determinând conturarea unor „modele clinice”:[19,20]

Modelul psudeogripal: cu febră moderată și rapid reversibilă (în 2-4 zile) însoțită de cefalee, curbatură și disconfort global. Sugestivă este persistența micilor simptome și după remisiunea febrei, pacientul neregăsindu-și starea de sănătate anterioară. În proporții variable se asociază și alte semne de boală: astenie progresivă, inapetență, grețuri, vome și altele. Pe acest fond își vor face apariția modificările de culoare ale urinii și scaunelor, care preced apariția icterului cu 3-5 zile.[19,21]

Modelul dispeptic – cu inapetență, greață și vomismente facile postprandiale (uneori explozive) și senzație de disconfort înalt epigastric, descris ca un „prea-plin”, alteori chiar ca o durere surdă, exacerbată în poziție șezândă, în mers și alergare, fără iradiere. Ca și în modelul precedent, se pot asocia astenia și modificare progresivă a culorii emonctoriilor.

Modelul durerii, variantă a celui dispeptic, cu dureri ce pot fi localizate în hipocondrul drept, cu iradiere posterioară simulând o colică hepatică, sau în flanc, până în fosa iliacă, simulând o colică ureterală sau chiar apendiculară. Aceeași asociere posibilă cu sindrom dispeptic moderat și cu astenie, urmate de modificările de culoare amintite.[19,22]

Modelul nervos se manifestă doar cu astenie, eventual și cu semne discrete de suferință cerebrală (insomnie nocturnă asociată somnolenței diurne, iritabilitate, lentoare în gândire și exprimare, dificultăți în ideație și concentrarea atenției, putând evolua către tulburări fine ale extremităților etc.) și către o comă reală chiar din debut. [19,21]

Modelul reumatoid apare mai rar în hepatita A și mai frecvent în infecțiile cu virus B și constă în apariția unor artralgii persistente, mai ales nocturne, interesând articulațiile mici ale mâinii și picioarelor, dar și pe cele mai mari (genunchi, glezne, umeri sau coloană). În această formă celelalte semne sunt discrete sau trecute cu vederea, inclusiv modificările de culoare ale urinei (interpretate greșit ca efect medicamentos)[22,23]

Debutul purpuric, deseori completat cu manifestări hemoragipare ale mucoaselor digestivă (gingivoragii, foarte rar hemoragii digestive), nazală și genitală (menometroragii). Exprimă leziuni de perete capilar arterial cu hiperpermeabilizare și viabilitate induse de viursul sau de complexele imune ale acestuia.

Debutul icteric caracterizează cazurile cu simptomatologie de invazie absentă sau atenuată, trecută cu vederea, primul semn clinic aparent al bolii fiind icterul.

Forme excepționale semnalate în debutul unor hepatite acute sunt reprezentate de debutul prin comă diabetică (în absența diabetului zaharat în antecedentele pacientului) și debutul chirurgical, cu fals abdomen acut.

Indiferent de forma clinică de debut, perioada de invazie a bolii prezintă câteva elemente utile diagnosticului în această perioadă: asocierea de regulă a modificărilor de culoare ale urinii și fecalelor, asocierea frecventă a hepatomegaliei moderate, sensibilă la palpare (în 60-70% dintre cazuri) și, mai rar, a splenomegaliei discrete (percutabilă și palpabilă în 20-30% din cazuri, moale și nedureroasă), atenuarea simptomatologiei, în mod caracteristic, odată cu apariția icterului, spontan și de durată. Acest viraj se explică prin depășirea, odată cu apariția icterului, a vârfului de leziune celulară hepatică. [22,23,24]

Perioada de stare a hepatitei cu virus A începe odată cu icterul și se pierde fără delimitare precisă prin declinul bolii și intrarea în convalescență. În această perioadă pacientul recâștigă rapid o stare „de bine”, cu revenirea apetitului, atenuarea asteniei și a celorlalte simptome. La examenul obiectiv se constată de regulă hepatomegalia moderată și sensibilă – apărută încă din invazie, eventual splenomegalie, un grad moderat de depresie psihică, remisă în zilele următoare. Culoarea emonctoriilor se menține modificată un număr variabil de zile pentru ca, o dată cu remisiunea, să înceapă perioada de declin: decolorarea urinii (vizibilă inițial doar vesperal, apoi, urina de dimineață devenind de la zi la zi mai deschisă la culoare) și recolorarea scaunului (urmează îndeaproape virajul de culoare al urinei), aceste modificări survenind aproximativ la 7-10 zile de la instalarea icterului, faza de stare având o durată de 14-21 de zile.[19,22,23]

Convalescența înregistrează o stare de aparentă sănătate, întreaga simptomatologie fiind remisă. Obiectiv, încă mai poate persista o hepatomegalie, și aceasta pe cale de remisiune. Convalescența prezintă paradoxul unei stări clinice total recuperate, pe fondul persistenței unor leziuni celulare reziduale hepatice, încă cu potențial evolutiv, ceea ce comportă riscul unor „accidente” în această perioadă; suprapunerea unor stresuri, operații, infecții intercurente poate împiedica vindecarea sau chiar poate induce o recrudescență sau recădere (rară în hepatita A, frecventă în celelalte tipuri etiologice). În hepatita A vindecarea este regula, neexistând forme evolutive cronice. Durata evoluției clinice este relativ scurtă, invazia fiind de 3-7 zile, faza de stare de 14-21 de zile iar convalescența, până la vindecarea anatomică, este de 1-3 luni.[20,22]

Fig II.5.3. Schema evolutivă autolimitantă în hepatita A [4]

Alte forme clinice:

Forma anicterică reprezintă circa 50-90% dintre cazurile de hepatită la copii, posibilă și la vârstă adultă cu simptomatologie generală diminuată sau absentă în totalitate. Diagnosticul este posibil doar în condiții epidemiologice particulare sau retroactiv, prin depistarea anticorpilor specifici.

Formele prelungite, fie ca formă colestatică, fie ca persistență a sindromului citolitic, sunt mai frecvente în celelalte tipuri de hepatită. Formele colestatice reprezintă 4-10% dintre formele icterice provocate de hepatita A la adult, prin mecanisme încă neelucidate.

Forma fulminantă este o complicație rară a infecției cu virus hepatic A, frecventă în țările în curs de dezoltare. Incidența hepatitei fulminante și a formei fatale crește odată cu vârsta. Hepatita fulminantă în cadrul infecției hepatice cu virus hepatic A este caracterizată clinic prin icter intens, insuficiență hepatică, inhibarea sintezei factorilor de coagulare, encefalopatie severă și în cele din urmă, coma. Pacienții care supraviețuiesc în urma comei hepatice prvocate de virusul hepatic A și care nu au suportat intervenții chirurgicale de transplant hepatic, nu prezintă dovezi ale fibrozei sau cirozei hepatice.[4,8,21,22]

II.6. Diagnostic de laborator

Diagnosticul de laborator se realizează prin două tipuri de teste:

Teste nespecifice reprezentate prin hemoleucogramă, VSH, bilirubină directă și indirectă, proteine serice, testele de citoliză (AST, ALT), gamma glutamil transpeptidază, fosfatază alcalină și indicele de protrombină.

Teste specifice reprezentate de ELISA, Test rapid și PCR (Polymerase Chain Reaction).

II.6.1 Teste de laborator nespecifice:

Examenul de laborator al hepatitei virale A prezintă unele particularități cu valoare diagnostică:

Hemoleucograma nu este modificată sau cel mult pezintă leucopenie moderată cu neutropenie, sugestive pentru infecții virale.

Valoarea VSH-ului este crescută în etapa preicterică a bolii, revine la normal în timpul fazei icterice a bolii și crește din nou odată cu scăderea icterului, VSH-ul revenind la normal odată cu vindecarea completă[5,28]

Bilirubina: Determinarea bilirubinemiei directe (conjugate) și totale arată valori de 1,6-2,5 mg % la bolnavii cu subicter, valori de 5-15 mg % în formele icterice și peste 20-25 mg % în formele colestatice. Creșterea concentrației serice a bilirubinemiei determină apariția în urină a pigmenților biliari (bilirubina directă trecând prin filtrul renal, în timp ce bilirubina neconjugată nu se regăsește în urină deoarece nu este solubilă).

Creșterea valorilor bilirubinei directe (bilirubina conjugată) în ser este asociată cu excreția redusă de pigment conjugat din ficat și bilă și apare în icterele colestatice sau în cele hepatocelulare. Creșterea patologică a bilirubinei directe duce la apariția acestui pigment în urină. Întrucât bilirubina indirectă nu se elimină prin urină, prezența bilirubinei în urină denotă creșterea în ser a bilirubinei conjugate.

Bilirubina neconjugată sau bilirubina indirectă se obține prin diferența dintre valoarea bilirubinei totale și a celei directe. Concentrația plasmatică a bilirubinei neconjugate este determinată de: rata cu care bilirubina nou sintetizată intră în plasmă (turnover-ul bilirubinei) și de rata eliminării bilirubinei de către ficat (clearance-ul hepatic al bilirubinei).[7,8,9,25,26]

Proteinele serice îndeplinesc funcții variate în organism ele constituind o importantă sursă de nutriție, sunt parte componentă ale sistemelor tampon, a agenților imunologici (imunoglobulinele), au rol de cărăuș, asigurând transportul anumitor ioni și molecule (haptoglobina, transferina), au rol de reglare a activității diverselor enzime proteolitice (antiproteaze: alfa1-antitripsina, alfa2-macroglobulina) și în reglarea presiunii osmotice.[7,29,30,32]

Electroforeza proteinelor serice este metoda curentă pentru separarea proteinelor serice utilizată în laboratoarele de biochimie medicală. Se utilizează suporturi solide și pH alcalin, la care toate componentele proteice sunt încărcate negativ și migrează spre polul pozitiv. Pe electroforegramă, dupa colorare, proteinele apar sub formă de benzi cărora li se măsoară densitatea optică, fiecare bandă având un maxim de absorbție. Prin electroforeză, în condițiile amintite mai sus, se obțin cinci fracțiuni: albumina serica, alfa1, alfa2, β, gammaglobuline.

Albumina, alfa1 și β apar sub forma unor benzi omogene, bine definite. Alfa2, și gamma apar ca benzi difuze, iar fracțiunea gamma prezintă în partea sa centrala o zonă mai intens colorată. Testele de disproteinemie uzuale, nespecifice etiologic, dar în contextul clinic și de laborator capătă valoare diagnostică, acceptând drept cauză principală perturbarea proteinelor plasmatice în două direcții: apariția tranzitore a proteinelor de fază acută (globuline alfa1 și alfa2 și β), descărcarea de imunoglobuline M, ce migrează electric în aria gamma, încă din perioada de invazie.

Particulară hepatitei cu virusul A, este pozitivarea intensă și precoce a testelor de disproteinemie, inclusiv a electroforezei proteinelor serice (hiperglobulinemie, mai ales gamma) și a imunogramei (care certifică creșterea mare a Ig.M) [7,8,9,31,32]

Testele de citoliză se modifică încă din debutul bolii, uneori chiar din invazie, semnificativă fiind mărimea titrului circulat al transaminazelor (AST și ALT) de peste 20-100 de ori valorile normale. Curba înregistrată pe parcursul bolii are și valoare prognostică privind șansele de vindecare.

AST – aspartataminotransferaza (TGO) este o enzimă ce face parte din clasa transaminazelor și catalizează transferul gruparii amino de la aspartat grupului cetonic al cetoglutaratului, cu formare de acid oxalacetic. Spre deosebire de TGP care se găsește în principal la nivelul ficatului, TGO este întâlnită în mai multe țesuturi: miocard, ficat, mușchi scheletici, rinichi, pancreas, țesut cerebral, splină, fiind astfel un indicator mai puțin specific al funcției hepatice.[10,28,30,32]

ALT – alaninaminotransferaza sau transaminaza glutampiruvică (TGP) este o enzimă ce face parte din clasa transaminazelor și catalizează transferul reversibil al gruparii amino (NH2) de la un aminoacid (alanina) α–cetoglutaratului ducând la formarea de acid piruvic și glutamat. Se găsește în principal în ficat (la nivelul celulei hepatice aflându-se în special în citosol) și în ordine descrescătoare a concentrației în rinichi, miocard, mușchi scheletici și pancreas. Dacă metabolismul energetic al celulei hepatice este tulburat prin agenți infecțioși (ex. virusurile hepatitei virale) sau toxici, se produce o creștere a permeabilității membranei celulare, cu trecerea în ser a componentelor citoplasmatice (citoliza). ALT este indicatorul de citoliză cel mai frecvent explorat, și după părerea majorității autorilor, cel mai indicat pentru detectarea chiar și a leziunilor hepatice minime. [8,10,28,32]

În hepatita acută virală, când survine o lezare rapidă și relativ moderată a unui număr de hepatocite, creșterea transaminazelor depășește de 10-100 de ori limita normalului, iar de regulă ALT este mai crescut decât AST.[9]

GGT – gamma-glutamiltranspeptidaza catalizează transferul grupului γ–glutamil de la peptide ca glutationul (GSH) către alți aminoacizi. GGT este o proteină heterodimerică, fiecare subunitate constând dintr-un singur lanț polipeptidic. Este localizată la nivelul membranei citoplasmatice a numeroase celule, centrul activ al enzimei fiind situat la exterior. GGT este singura enzimă care clivează cantități semnificative de glutation și conjugați ai acestuia în cadrul ciclului γ-glutamil (glutationul este transportat la nivelul suprafeței extracelulare a membranei, unde este clivat de către GGT în cisteinil-glicină și reziduuri γ-glutamil, care sunt transferate către alți aminoacizi). De asemenea GGT joacă un rol important în metabolismul mediatorilor inflamației, cum ar fi leucotrienele, metabolismul substanțelor carcinogene și toxice.

GGT măsurat în ser provine în special din ficat. Cea mai mare parte este legată de lipoproteine, în special HDL, dar și de LDL. O mică porțiune este hidrosolubilă, fiind asemanătoare GGT eliberat de proteaze din membrana celulelor hepatice. GGT legat de HDL predomină în bolile hepatice non-icterice, în timp ce GGT legat de LDL este crescut în colestază, iar forma hidrosolubilă într-o varietate de boli hepatice.

GGT este îndepărtat din plasma prin bilă, activitatea enzimei în bilă fiind de 10 ori mai mare decat cea plasmatica. O mică parte este degradată de rinichi si eliminată prin urină.

Creșterea nivelului seric al GGT se datorează lezării membranei celulare prin toxice (inclusiv alcoolul), ischemie, infecții de tip hepatite sau detașării enzimei de la nivelul membranei celulare ca urmare a acțiunii detergente a acizilor biliari. GGT este o enzimă specifică ficatului și ductelor biliare. În bolile hepato-biliare GGT se corelează cu nivelurile fosfatazei alcaline. Creșterile nu sunt totuși specifice și pot fi asociate și cu afecțiuni pancreatice, cardiace, renale, diabet zaharat. Dozarea GGT este de asemenea utilă pentru diagnosticul unei hepatopatii în prezența unei afecțiuni osoase, a sarcinii sau în perioada copilăriei (condiții în care valorile fosfatazei alcaline cresc, în timp ce GGT rămâne la valori normale).

În hepatita acuta virală – cresterea GGT este mai mica decat a altor enzime hepatice

Fosfataza alcalină (ALP) este o enzimă ce face parte din clasa hidrolazelor (ortofosfomonoesterfosfohidrolaza) și este capabilă să catalizeze hidroliza esterilor organici și a acidului fosforic (H3PO4) la pH alcalin.

Fosfataza alcalină apare sub forma unor izoenzime cu repartiție diferită: fracțiunea osoasă 50-70%, fracțiunea hepatică 30-50% iar fracțiunea intestinală în procent de 0-20%

Deși se poate face o evaluare rezonabilă în privința originii hepatice sau non-hepatice a creșterii fosfatazei alcaline utilizând doar date clinice, există și metode biochimice ce pot face diferențierea între izoenzime .

Determinarea fosfatazei alcaline este de obicei folosită pentru diagnosticul diferențial al bolilor hepatice. Altă arie de utilizări clinice include afecțiunile osoase, fiind la ora actuală singura enzimă cu importanță practică pentru patologia țesutului osos, și în hiperparatiroidism. În tumorile de diverse etiologii fosfataza alcalină are valoare de marker tumoral.

În hepatitele acute virale, creșterile fosfatazei alcaline moderat crescute. [11,24,31,32]

Indice de protrombină (Timp Quick) evaluează activitatea factorilor implicați pe calea „extrinsecă” și „comună” a coagulării : FVII-proconvertina, FX-factorul Stuart-Prower, FV-proaccelerina, FII-protrombina și FI-fibrinogenul. Factorii coagulării II, VII, IX și X sunt sintetizați în ficat sub forma inactivă (PIVKA). Aceste proteine (alături de proteinele C, S și Z) au în comun reziduurile unice de acid γ-glutamil carboxilic la capătul N-terminal al moleculei, care necesită prezența vitaminei K pentru sinteză și care sunt esențiale pentru legarea calciului, servind ca punte pentru legarea proteinei la suprafața fosfolipidică, respectiv pentru a fi funcționale. Ca urmare IP evaluează atât activitatea factorilor de coagulare dependenți de vitamina K (mai puțin FIX), a factorului V și a fibrinogenului, cât și funcția de sinteză proteică a ficatului, cu implicații diagnostice și terapeutice.

Fig.II.6.1.4. Etapele de activare a cheagului de fibrină prin activarea factorilor de coagulare II, VII, IX, X. [13]

Indicele de protrombină este de obicei prelungit, direct proporțional cu severitatea leziunilor celulare hepatice, permițând chiar avertizarea asupra riscului de agravare (valoarea prognostică deosebită). În mod curent permite încadrarea bolii în forme clinice (ușoare, medii, severe etc), un IP prelungit indicând deficiența unuia sau mai multor factori de coagulare (I, II, V, VII, X) sau prezența unui inhibitor.

Modificările de coagulare sanguină se produc prin deficitul de sinteză a proteinelor cu rol defactori ai coagulării (protrombina, trombina, proconvertina, proaccelerina, factorul Christmas). Determinarea concentrației de protrombină reflectă leziunile hepatice iar valorile sub 50% indică un prognostic rezervat. [5,6,28,32]

II.6.2 Teste de laborator specifice.

Diagnosticul pozitiv se bazează pe testele specifice :

ELISA

PCR

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) reprezintă la ora actuală, una din cele mai des folosite metode, de indentificare și apreciere cantitativ pentru anticorpi și antigene, principiul acestei metode fiind bazat pe reacția antigen-anticorp. Datorită multiplelor aplicații ale metodei imunoenzimatice ELISA, au apărut diferite protocoale pentru executarea acesteia în funcție de particularitățile moleculei de determinat și de modul în care procesele fundamentale ale metodei ELISA se desfășoară, acestea fiind în număr de patru: directe, indirecte, sandwich, competitive.

În tehnicile directe proba de analizat este fixată pe suprafața unei lame, după fixarea acesteia adăugându-se conjugatul imun specific antigenului căutat în probă.

În tehnicile indirecte se folosește alături de anticorpul specific și anti-Ac. Dacă anticorpul specific aparține speciei umane, anti-Ac aparține unei alte vertebrate (iepure, oaie…etc).

În tehnicile sandwich se folosește același tip de Ac provenit de la o singură specie. Un anticorp se utilizează pentru căptușirea godeului, iar celălalt identic cu primul este marcat imun. În proba de analiză se realizează interacția Ag-Ac cu formarea complexului, iar adăugarea ulterioară a conjugatului imun permite constituirea complexeului în care markerul este fixat și care poate să emită un semnal analitic măsurabil.[30,34,35]

Metoda competitivă utilizează anticorpii aceleiași specii, unul marcat provenit din conjugatul imun, iar cel nemarcat provenit din probă, cei doi anticorpi fiind competitivi în vederea legării antigenului care căptușește godeul. Dacă în proba de analizat este o concentrație mai mare de anticorpi liber, acesta va interacționa cu antigenul fixat iar interacția conjugat imun – antigen este mai slabă.

Amplificarea moleculară – PCR (Polymerase chain reactions) este o metodă utilizată larg în stabilirea diagnosticului în bolile infecțioase. Prin această tehnică de diagnostic realizându-se amplificarea acizilor nucleici țintă în vitro într-un timp relativ scurt. Tehnica PCR exploatează fenomenele de denaturare – hibridizare-renaturare și necesită trei etape distincte în desfășurare: Denaturarea termică a dublului helix ADN din proba de analizat, prin încălzirea soluțiilor apoase până la 95 0C.

Răcirea amestecului de reacție la valori ale temperaturii cuprinse între 37-60 0C pentru facilitarea interacțiilor dintre cele două nucleotide cu monocatenele complementare ADN, rezultate în urma denaturării termice.

Creșterea temperaturii mediului de reacție la 72 0C și adaosul ADN-polimerazei pentru catalizarea elongării primerilor, prin complementaritate, în prezența celor patru tipuri de deoxiribonucleotide.

Detectarea directă a VHA în scaun, fluide corporale, ser și țesut hepatic prin microscopie electronică sau PCR (polymerase chain reaction) este laborioasă și scumpă.[23,35,36,37,40]

Diagnosticul pozitiv al hepatitei acute virale prin teste specifice se bazează pe demonstrarea anticorpilor IgM anti-VHA în serul bolnavilor cu suferință acută sau recentă prin metodele imunoenzimatice ELISA, dupa 3-4 luni de la diagnosticare, urmând să apară și anticorpii Ig.G care asigură o imunitate durabilă. Anticorpii anti-VHA-IgG apar rapid în faza de convalescență, rămânând pozitivi zeci de ani, chiar toată viața, și asigură imunitatea de lungă durată împotriva unei reinfecții cu VHA. [4]

Acești anticorpi IgM anti – VHA sunt prezenți la 99% dintre pacienții cu simptomatologia clinică instalată, detecția lor reprezentând “standardul de aur” pentru diagnosticul infecției acute VHA, concentrația anti-VHA-IgM atingând un vârf în a doua lună de boală, apoi aceștia scad lent, până devin nedetectabili, de obicei, după 6 – 12 luni. Uneori acești anticorpi pot persista un timp mai îndelungat, de aceea detecția anti-VHA-IgM la indivizii asimptomatici nu indică neapărat o infecție acută, ci poate fi mai degrabă consecința unui contact asimptomatic VHA recent. [41,42,43]

II.7. Diagnostic diferențial de laborator:

Diagnosticul diferențial al hepatitei cu virus hepatitic A se face cu hepatitele date de celelalte virusuri hepatice: B (VHB), C (VHC), D (VHD), E (VHE), F (VHF), G (VHG) ;i cu hepatitele acute secundare date de alte virusuri din cadrul unor boli sistemice: virusul Epstein-Barr (MNI), virusul citomegalic (VCM), virusul herpes simplex, virusul varicelozosterian (VVZ), virusul reujeolic, virusul rubeolic, virusul amaril (febra galbenă), enterovirusul (Coxsackie B) și adenovirusurile dar și cu alte tipuri din bolile etiopatogenice:

Hepatite autoimune

Hepatite toxice medicamentoase

Hepatite metabolice

Hepatitele provocate de virusul hepatitic B au risc crescut de cronicizare, se transmite parenteral, diagnosticul este seriologic prin detecție de Ag.HBs, și anticorpilor specifici anti HBc IgM prin tehici ELISA, viremie.[44]

Hepatitele provocate de virusul hepatitic C, prinicpala hepatită postransfuzională din grupul nonA-non-B cu eevoluție frecvent anicterică dar cu risc crescut de cronicizare. Diagnosticul virusologic include teste de biologie moleculară pentru determinarea incărcăturii virale și cel serologic se referă la determinarea anticorpilor totali anti-HCV.

Hepatita acută virală tip D (VHD) apare numai în asociere cu infecția produsă de virusul hepatitic B (VHB), în stadiul acut al hepatitei b sau la purtătorii de Ag.HBs producând forme severe. Pentru diagnostic serologic se dozează prin ELISA Ac. Anti VHD IgM și prin tehnici de biologie moleculară se evidențiază ARN-VHD în sânge și țesut hepatic

Hepatitele produse de virusul hepatitic E (VHE) cu transmitere digestivă desprinsă din grupul hepatitelor non-A non-B. Aceasta are multe asemănări cu VHA prin transmiterea orală, absența cronicizării dar și deosbiri prin endemicitate restrânsă i severitatea evoluției la gravide în trimestrul trei de sarcină. Diagnosticul este serologic prin detecție de Ac anti VHE Ig.M și prin tehnici de biologie moleculară (PCR) prin detecția ARN-VHE în fecale..

Hepatita acută virală tip F dată de virusul hepatitic F (VHF) – Frenchs virus, cu severitate clinică și transmitere enterală încă în curs de cercetare.

Hepatita acută virală tip G (VHG) dată de virusul hepatitic G, cu transmitere parenterală, prin sânge sau derivate de sânge, transmitere verticală și posibil sexuală. Diagnosticul se face prin tehnici ELISA și PCR.[40,41,45]

Hepatitele din sindromul mononucleozic în care pe lângă adenopatie și lecucocitoză cu limfomonocitoză. Diagnosticul este serologic cu detecția Ac. Specifici, EBV (Epstein-Barr), respectiv anticorpi heterofili. Anticorpii anti VCA Ig.M – Ig.G, Anticorpi anti EBNA.

Hepatita din infecția cu CMV (citomegalovirus) cu evoluție și severitate în sarcină și la pacienții imunosupresați (HIV, transplante). Diagnosticul este serologic cu detecția Ac. Anti CMV Ig.M sau Ig. G.

Hepatitele satelit din cadrul sindromului ocluziv unde în afară de sindrom icteric, sindrom febril sindrom de hepato-citoliză și colestază, diagnosticul este radiologic cu evidențierea litiazei biliare și diagnosticul serologic este negativ pentru virusurile hepaptitice A, B și C.

Diagnosticul diferențial al hepatitei virale acute cu virus hepatic A se mai face și cu afecțiunile hepatice din sindroamele tumorale primare sau cu localizare secundar-hepatică unde diagnosticul este atât radiologic cât și serologic prin prezența markerilor tumorali specifici și absența markerilor hepatici virali.[43,44,45]

În perioada preicterică deosebim hepatita epidemică de :

dispepsiile febrile

gripă

reumatism articular acut

gastrită

toxiinfecții alimentare

debutul altor boli infecțioase

În perioada icterică diagnosticul va fi făcut cu celelalte afecțiuni însoțite de icter:

mononucleoza infecțioasă

hepatita toxică

icterul produs de colică biliară

icterele hemolitice.

Partea specială

Introducere, Scopul și Obiectivele lucrării

În ultimele decenii, cu precădere din al doilea război mondial, hepatita virală a devenit o problemă de sănătate publică pretutindeni în lume. Hepatita virală este una din cele mai comune cauze de icter la copil și este una din bolile încă neeradicate. În ultimii ani există o mai bună înțelegere a epidemiologiei și a problemelor clinice a hepatitei acute virale ce au putut fi folosite în exprimarea modelelor de control a afecțiunii. Hepatita infecțioasă este o boală cu simptome nespecifice cu mortalitate redusă, totu și cauza comună a mortalității provocate de hepatita virală acută cu virus A este insuficiența acută a ficatului ce conduce la comă și exitus. La copii, cursul obișnuit al bolii este relativ favorabil dar poate conduce la ciroză post-hepatitică, colestază cronică ș i insuficiență de organ hepatic. Hepatita acută virală cu virus hepatic A este o boală infecțioasă specifică omului, produsă de virusul hepatic A cu caracter hepatotrop, și care introdus în organism pe cale digestivă sau parenteral (accidental), provoacă o îmbolnăvire generală a organismului și mai ales a ficatului, manifestată prin simptome generale de tip infecțios, digestiv și hepatic asociate sau nu cu icter, evoluția acestei infecții fiind autolimitantă.

Partea specială evaluază modificările parametrilor de investigare a funcțiilor hepatice prin analizele AST, ALT, GGT, bilirubinilor directe și indirecte, reacția organismului la agentul infecțios viral prin dozarea numărului de leucocite, funcția de coagulare prin indicele de protrombină dar și capacitatea de hemostază prin dozarea trombocitelor în ser. Aceste analize fiind complementare în susținerea diagnosticului pozitiv de hepatită acută virală A, diagnosticul de certitudine este realizat prin testele imunoenzimatice ELISA. Scopul lucrării este reprezentat de evidențierea corelării clinico-biologică a parametrilor analitici în hepatita acută virală, de evidențirea modului de lucru al diagnosticului prin testele ELISA și de a elabora concluziile finale pe baza acestor obiective.

Obiectivele acestei lucrări au fost reprezentate de:

Studierea și prezentarea documentată a tehnici de laborator prin metoda imunoenzimatică ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) utilizată în diagnosticul etiologic al hepatitelor acute virale.

Evaluarea modificărilor unor parametrii de laborator în cursul evoluției hepatiei acute virale cu virus hepatic A

Material și metodă

Studiul a fost efectuat retrospectiv, de tip observațional, pe un lot de 188 pacienți internați cu hepatită acută virală cu virus hepatic A, în Spitalul Clinic de Boli Infecțioase din Brașov în perioada 1.I.2015 – 31.XII.2015.

Au fost analizate următoarele aspecte:

Epidemiologice: vârsta, genul și mediul de proveniență al pacienților

Numărul de leucocite serice

Numărul de trombocite

Valorile transaminazelor serice AST (aspartataminotransferaza) și ALT (alaninaminotransferaza)

Valorile bilirubinei totale și directe

Valorile GGT (gamma-glutamiltranspeptidaza) și a ALP (fosfatazei alcaline)

Indicele de protrombină

Hepatita A nu poate fi diferențiată de alte tipuri de hepatite virale numai pe baza caracteristicilor clinice sau epidemiologice. Testarea serologică pentru detectarea anticorpului imunoglobulinic M (IgM) de pe capsida proteică a HAV (IgM anti-HAV) este necesară pentru aconfirma diagnosticul infecției acute cu HAV. La majoritatea paciențiilor, IgM anti-HAV devine detectabil 5-10 zile înaintea debutului simptomatic și poate persista până la 6 luni după infecție. Imunoglobulina G (IgG) anti-HAV, care apare devreme în cursului infecției, rămâne detectabilă pe toată perioada vieții și oferă protecție pe viață împotriva bolii. Diagnosticul pozitiv de Hepatită acută virală cu VHA a fost evidențiat prin testele imunoenzimatice antigen-anticorp ELISA iar testele pozitive au fost confirmate prin testele rapide de tip imunocromatografic cu flux lateral pentru detecția calitativă a anticorpilor IgM anti-hepatită A din ser.

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay):

A. Principiul metodei

Testul este bazat pe principiul ”captura IgM” unde anticorpii IgM din probă sunt captați primii de către faza solidă căptușită cu anticorpi anti-IgM.

După spalarea tuturor celorlalte componente ale probei și în particular a anticpropilor IgG, anticorpii IgM specifici captați pe faza solidă sunt detectați prin adăugarea unui preparat purificat și inactivat HAV, marcat cu un anticorp conjugat cu peroxidază (HRP).

După incubație, micro plăcile sunt spălate pentru a îndepărta conjugatul nelegat și apoi se adaugă cromogenul/substratul.

În prezența peroxidazei substratul necolorat este hidrolizat într-un produs final colorat, al cărei densitate optică poate fi detectată și este proporțională cu cantitatea anticorpilor HAV prezenți în probă.

B. Componente

Kitul conține reactivi pentru 96 de teste (Fig.1).

Fig.IV.5 Kitul ELISA pentru 96 de teste.

1. Microplacă:

12 stripuri a câte 8 godeuri căptușite cu anticorpul uman anti-IgM, purificat și sigilată într-o pungă cu desicant. Microplaca se aduce la temperatura camerei înainte de a deschide punga. Stripurile nefolosite trebuiesc returnate în punga cu desicant și păstrate la temperatura de 2-80C.

2. Control negativ:

1×2.0 ml/fiolă. Gata de folosire. Conține proteine din ser de capră, 10 mM buffer la pH 6.0 +/- 0.1, 0.1% Tween 20, 0.09% azidă de sodiu și 0.1% Kathon GC ca prezervant. Controlul negativ este incolor.

3. Control pozitiv

1×2.0 ml/fiolă. Gata de folosire. Conține anti HAV IgM, proteine din ser de capră, 10 mM buffer la pH 6.0 +/- 0.1, 0.1% Tween 20, 0.09% azidă de sodiu și 0.1% Kathon GC ca prezervant. Controlul pozitiv este colorat în verde.

4. Calibrator

1 fiolă liofilizat. A se dizolva cu apa distilată în cantitatea indicată de etichetă. Conține anti HAV IgM, 2% BSA, 10 mM buffer pH 6.0 +/- 0.1, 0.09% azidă de sodiu și 0.1% Kathon GC ca prezervant.

5. Buffer concentrat pentru spălare

1×60 ml/sticlă. Soluție concentrată 20x. Odată diluată, soluția de spălare conține 10 nm buffer fosfat pH 7.0 +/-0.2, 0.05% Tween 20 și 0.05% Kathon GC.

6. Enzimă conjugat 20x

1×0.8ml/fiolă. Conține anticorpi HAV specifici conjugați cu peroxidază în prezența a 10 mM buffer Tris pH 6.8+/-0.1, 2% BSA, 0.1% Kathon GC și 0.02% sulfat de gentamicină ca prezervant.

7. Antigen HAV

1x16ml/fiolă. Soluție gata de folosire. Conține HAV inactivat și stabilizat în prezența a 10 mM buffer Tris pH 6.8+/-0.1, 2% BSA, 0.1% Kathon GC și 0.02% sulfat de gentamicină ca prezervant. Reactivul este de culoare roșie

8. Diluent de probă

2×60 ml/fiolă. Soluție tampon proteică pentru diluția probelor. Conține proteine serice de capră, 10 mM buffer pH 6.0 +/- 0.1, 0.1% Tween, 0.09% azidă de sodiu și 0.1% Kathon GC ca prezervant. Reactivul este de culoare albastră.

9.Cromogen/Substrat

1x16ml/fiolă. Conține 50 mM de soluție tamponată de citrat-fosfat pH pH 3.5-3.8, tetra-metil-benzidină sau TMB și 0.02% peroxid de hidrogen H2O2. Se păstrează la întuneric.

10. Acid Sulfuric

1x15ml/fiolă. Conține soluție 0.3 M H2SO4. Atenție: Iritant.

11. Folii de inchidere a plăcilor.

C. Materiale necesare care nu sunt prevăzute în kit

1. Micropipete calibrate de 10μl, 100μl și 1000μl și vârfuri de plastic.

2. Apă distilată.

3.Cronometru cu o valoare de 60 minute sau mai mare.

4. Șervețele de hârtie absorbante.

5. Incubator de plăci ELISA calibrat și setat la +37oC (+/-0.1oC).

6. Cititor de plăci ELISA cu filtru de la 450 nm până la 620-630 nm.

7. Spălător de plăci ELISA calibrat.

8. Vortex sau intrumente asemănătoare.

D. Pregătirea componentelor și avertismente

1. Microplaca căptușită cu anticorpi:

Se permite micropăcii să ajungă la temperatura camerei (aproximativ 1 oră). Se verifică dacă desicantul nu are o culoarea verde închis, care indică un defect de conservare. Stripurile care nu sunt folosite se pun înapoi în punga de aluminiu împreună cu desicantul, se închide punga cu grijă și se păstrează la 2-8oC.

2. Control Negativ:

Gata de folosire. Se mixează cu ajutorul vortexului înainte de folosire.

3. Control Pozitiv:

Gata de folosire. Se mixează cu ajutorul votexului înainte de folosire. Se manevrează acest component ca fiind potențial infecțios, chiar dacă HAV, eventual prezent în control, a fost din punct de vedere chimic inactivat.

4. Calibrator:

Se adaugă volumul de apă distilată înscris pe eticheta fiolei, pentru a dizolva liofilizatul; se lasă să se dizolve în totalitate și apoi se mixează ușor cu ajutorul vortexului. Această soluție nu este stabilă. Se păstrează Calibratorul alicotat la -20oC.

5. Soluția de spălare concentrată:

Tot conținutul soluției concentrate trebuie diluat de 20x cu apă distilată și se mixează ușor înainte de folosire. O dată diluată soluția este stabilă pentru o săptămână la 2-8oC. În timpul preparării se evită a se forma spumă , deoarece bulele de aer pot influența eficiența ciclurilor de spălare.

6. Enzima conjugat:

Se mixează bine cu ajutorul vortexului. Se evită contaminarea lichidului cu chimice oxidante, praf sau patogeni atunci când reactivul este aspirat pentru a fi folosit.

7. HAV Antigen:

Gata de folosire. Se mixează bine cu ajutorul vortexului înainte de folosire. Se manevrează acest component ca potențial infecțios, chiar dacă HAV a fost din punct de vedere chimic inactivat.

6+7. Complex HAV Antigen/Anticorp:

Cu aproximativ 5-10 minute înainte de folosire, se diluează Enzima Conjugat 20x într-un volum potrivit de HAV Antigen necesar pentru testare. Apoi se mixează cu atenție cu ajutorul vortexului. De exemplu dacă se testează 2 stripuri se diluează 100μl de Enzimă Conjugat 20x în 2 ml de HAV Antigen. Imunocomplexul nu este stabil. Volumul rămas se aruncă.

8. Diluent de probă:

Gata de folosire. Se mixează cu ajutorul vortexului înainte de folosire.

9. Cromogen/Substrat:

Gata de folosire. Se mixează cu ajutorul votexului înainte de folosire. Se evită contaminarea lichidului cu chimice oxidante, praf sau agenți patogeni. Nu se expune la lumină puternică, la agenți oxidanți sau suprafețe metalice. Dacă componetul trebuie transferat folosind numai plastic și dacă este posibi,l un recipient steril.

10. Acid Sulfuric:

Gata de folosire. Se mixează cu ajutorul votexului înainte de folosire. Atenție: Iritant!

E. Activități și controale înainte de începerea testului

1. Se verifică data de expirare a kitului care este printată pe eticheta externă. Nu se folosește kitul dacă este expirat.

2. Se verifică dacă componentele lichide ale kitului nu sunt contaminate cu particule vizibile sau cu agregate. Se verifică prin aspirarea unui volum mic cu o pipetă sterilă de plastic, culoarea Cromogenului/Substratului care trebuie să fie transparent sau albastru palid. Se verifică punga de aluminiu în care există microplaca pentru a nu fi deterioarată.

3. Se diluează conținutul soluției de spălare cu concentrație 20x.

4. Se dizolvă Calibratorul și se mixează ușor.

5. Se lasă kitul la temperatura camerei aproximativ o oră și se mixează ușor toate componentele lichide ale kitului.

6. Se setează incubatorul de plăci ELISA la +37oC (+/-0.1oC) și spălătorul de plăci ELISA se setează numărul de cicluri de spălare indicat de kit.

7. Se verifică funcționalitatea cititorului de plăci ELISA cu cel puțin 20 de minute înainte de citire.

F. Procedura de testare

1. Se diluează probele 1:101 prin dispersarea prima dată a 10 μl de probă și apoi 1 ml de Diluent de probă într-un tub de diluție; se mixează ușor cu ajutorul votexului.

2. Se plasează numărul de stripuri necesare în microplaca ELISA. Se lasă primul godeu gol pentru blank.

3. Se dispersează 100μl de Control Negativ în triplu, 100μl de Control Pozitiv intr-un godeu și 100μl Calibrator în dublu. Nu se diluează controalele!

4. Se dispersează câte o 100μl din fiecare probă diluată și apoi se verifică culoarea godeurilor (albastră).

5. Se incubează microplaca pentru 60 minute la +37oC.

Fig.IV.6 Termostatul unde se incubează microplaca, setat la temperatura de 370

6. Cu aproximativ 5-10 minute înainte de folosire, se prepară un imunocomplex HAV Antigen/Anticorp după cum a fost descris anterior.

7. Se spală microplaca cu un spălător automat (Fig.2).

Fig.IV.7 Spălătorul automat de microplăci ELISA.

8. Se pipetează 100μl de complex HAV Antigen/Anticorp în fiecare godeu , exceptând godeul blankului.

9. Se incubează microplaca pentru 60 minute la 37oC.

10. Se spală microplaca cu un spălător automat.

11. Se pipetează 100μl Cromogen/Substrat în fiecare godeu , inclusiv în godeul blankului. Apoi se incubează microplaca la temperatura camerei (18-24oC) pentru 20 de minute (Fig.3).

Fig.IV.8 Placa ELISA cu controlul pozitiv și probele pozitive. Enzima-conjugat este responsabilă pentru transformarea substratului adăugat într-un produs de culoare albastră.

12. Se pipetează 100μl de Acid Sulfuric în fiecare godeu pentru a stopa reacția enzimatică. Adăugarea acidului va transforma controlul pozitiv și probele pozitive din albastru în galben (Fig.4).

Fig.IV.9 Placa ELISA cu controlul pozitiv și probele pozitive. Adăugarea acidului sulfuric va transforma controlul pozitiv și probele pozitive din albastru în galben.

13. Se măsoară intensitatea culorii soluției din fiecare godeu, cu ajutorul unui cititor de microplăci ELISA la 450 nm (Fig.5).

Fig.IV.10 Spectrofotometrul Sunrise Tecan, cititorul de microplăci ELISA.

G. Calcularea Cutt-Off-ului

Rezultatele testului sunt calculate cu ajutorul valorii medii citite la OD450nm a controlui negativ (NC) și a unei formule matematice, pentru a determina valoarea Cutt-Off-ului:

Cutt-Off = NC + 0.250

Valoarea găsită pentru testare este folosită pentr interpretarea rezultatelor.

H. Interpretatea rezultatelor

Rezultatele testelor sunt interpretate ca un raport al absorbanței probei la OD450nm și valoarea Cutt-Off-ului (S/Co = Sample/Cutt-Off) după cum urmează:

Tabel. IV.2: Interpretarea rezultatelor ELISA

Un rezultat negativ indică faptul că pacientul nu prezintă o infecție acută cu HAV. Orice pacient cu un rezultat echivoc, ar trebui retestat după 1-2 săptămâni după prima testare.

Un rezultat pozitiv indică faptul că pacientul prezintă infecție acută cu HAV și ar trebui să fie tratat corespunzător.

I. Sensibilitatea metodei

Sensibilitatea metodei a fost testată prin folosirea unor probe aprobate ca fiind pozitive de către US FDA. Probele pozitive au fost recoltate de la pacienți având infecție acută cu HAV, confirmată prin simptome clinice și prin analize. O valoare totală de 100% a fost determinată într-un studiu realizat dintr-un număr total de 100 de seruri.

J.Specificitatea metodei

Specificitatea metodei a fost determinată pe specimene negative în raport cu kitul de referință, fiind obținute de la pacienți sănătoși și de la donatori de sânge cu origine europeană. Pentru a determina specificitatea au fost folosite atât plasma derivată prin diferite tehnici de preparare standard (citrat, EDTA și heparină), cât și serul. Nu a fost observată nicio falsă reactivitate care să aibă legătură cu metoda de preparare a specimenului. Au fost testate și specimene înghețate pentru a verifica dacă acest lucru intervine în performanța testului. Nu a fost observată nicio interferență în ceea ce privește probele. Au fost examinate și probe provenite de la pacienți cu diferite patologii virale (HCV, HDV, HBV, HEV) și non virale ale ficatului care ar putea sa interfere cu testul. Nu a fost observată nicio reacție încrucișată.

K. Limitele testului

Testele fals pozitive au fost evaluate ca fiind mai puțin de 2% din populația normală, cel mai probabil din cauza unor titruri mari ale RF.

Probele congelate care conțin particule de fibrină sau agregate pot genera rezultate fals pozitive.

Contaminarea bacteriană sau inactivarea probei prin căldură pot afecta valorile absorbanței.

Diagnosticarea unei boli infecțioase nu ar trebui să se bazeze numai pe rezultatul unui singur test. Istoricul clinic al pacientului, simptomatologia ca și alte date diagnostice ar trebui luate în considerare.

Test Rapid de confirmare a diagnosticului hepatitei acute virale A cu VHA.

Scop

Testul rapid HAV IgM este un test imunocromatografic cu flux lateral pentru detecția calitativă a anticorpilor IgM anti-hepatită A (HAV IgM) din ser, plasmă sau sânge integral. Acest test se utilizează în testele de screening și în diagnosticul infecției cu HAV, orice rezultat pozitiv fiind confirmat cu teste care utilizează metode de determinare superioare și cu datele clinice.

Principiul metodei

Testul rapid HAV IgM este un test imunocromatografic cu flux lateral. Dispozitivul de testare constă in:

1) Un suport pentru conjugat de culoare roșu-visiniu, ce conține antigen HAV conjugat cu aur coloidal (conjugate HAV Ag) și anticorpi de control conjugați cu aur coloidal și

2) o membrană de nitroceluloză ce conține o bandă test “T” și o banda de control “C”. Banda T este pre-tapetată cu anticorpi anti-IgM uman de șoarece, iar banda C este pre-tapetată cu anticorpi de control.

Atunci când in godeul destinat probei este pus un volum corespunzător de probă iar în godeul destinat diluantului este pus un volum corespunzător de diluant, proba migrează prin capilaritate de-a lungul casetei. Daca anti-HAV IgM este prezent în probă, se va lega de conjugatele HAV Ag. Imunocomplexul astfel format este capturat pe membrană de către anticorpii anti-IgM de șoarece pre-tapetați, formând în regiunea T o bandă de culoare roșu-vișinie, ceea ce indică un rezultat pozitiv anti-HAV IgM. Absența benzii T indică un rezultat negativ. Testul conține un control intern (în regiunea C) care ar trebui sa dezvolte o bandă de culoare roșu-vișiniu datorită formării imunocomplexului cu anticorpii de control, care se formeaza independent de aparatia benzii T. Dacă nu apare banda C (control), testul este declarat invalid și trebuie refăcut cu un dispozitiv nou.

Componente

1. Kitul conține 30 dispozitive, fiecare sigilat într-o pungă ce conține o casetă și un desicant.

2. Pipete de 5µl

2. Diluent pentru probe (1 flacon, 5 ml).

Materiale necesare, dar nefurnizate

1. Cronometru

2. Lancete (pentru probele de sânge integral)

Fig.IV.11 Componentele kitului test rapid reprezentate de casetă, reactiv și materialul necesar nefurnizat de către producător, cronometrul.

Mod de lucru

Pasul 1: Se aduc probele și componentele kit-ului la temperatura camerei, dacă acestea au fost refrigerate sau congelate.

Pasul 2: Se scoate caseta din recipientul sigilat și se așează caseta pe o suprafață plată, curată.

Pasul 3: Se notează pe casetă numărul de identificare al pacientului.

Pasul 4: Cu ajutorul pipetei, se pipetează proba de testat până la linia de probă marcată pe pipeta de plastic (a nu se depăși). Astfel, volumul probei este de aproximativ 5 µl.

Fig.IV.12 Pipetarea probei de testat pe dispozitivul testului rapid

Pasul 5: Se adaugă apoi 2 picături (aproximativ 60-80 µl) diluant pentru proba în godeul pentru diluant (godeul B), ținând flaconul în poziție verticală.

Fig.IV.13 Adăugarea reactivului în locul prevăzut acestuia.

Pasul 6: Se pornește cronometrul.

Pasul 7: Se citesc rezultatele la 15 minute de la adăugarea probei. Nu se citesc rezultatele după mai mult de 15 minute. După interpretarea rezultatelor se aruncă testul utilizat.

Fig.IV.14 Rezultatul final pozitiv al testului rapid

Controlul de calitate

1. Controlul intern al casetei: Controlul intern al dispozitivului este inclus pe membrana de nitroceluloză, în regiunea C, banda din regiunea C dezvoltându-se după adăugarea probei, în caz contrar se oprește execuția și se repetî testul folosind un dispozitiv nou.

2.Controlul suplimentar: Se recomandă utilizarea controlului pozitiv și negativ, altele decât controlul inclus in trusă, pentru a asigura buna performanță a trusei, mai ales în cazul uneia din situațiile expuse mai jos:

a) Un nou operator folosește această trusă;

b) Se folosește un lot nou;

c) Se folosesc truse dintr-o nouă livrare;

d) Temperatura de pe timpul păstrării kit-ului s-a situat în afara intervalului 2 – 30°C;

e) Temperatura încăperii în care se face testarea nu este cuprinsă în intervalul 15 – 30°C;

f) Pentru a investiga cauza apariției în mod repetat a rezultatelor incorecte.

INTERPRETAREA REZULTATELOR

1. Rezultat negativ: Dacă apare numai banda C, testul indică faptul că în probă nu se găsește HAV IgM la nivel detectabil iar rezultatul este negativ sau ne-reactiv.

2. Rezultat pozitiv: Dacă apar două benzi, una în regiunea C și una în regiunea T, testul indică faptul că HAV IgM este prezent în probă la nivel detectabil, iar rezultatul este pozitiv sau reactiv. Înainte de transmiterea rezultatelor către pacient, probele cu rezultate pozitive trebuiesc confirmate cu metode alternative de testare și date clinice. Nivelurile de factor reumatoid mai mari de 1000 UI/ml pot conduce la rezultate fals pozitive.

3. Rezultat invalid este luat în considerare dacă nu apare o bandă în regiunea C, testul fiind considerat invalid, chiar dacă în regiunea T a apărut o bandă colorată. În acest caz, fiind necesară repetarea testului cu o noua caseta.

Limitele testului

1. La testarea HAV IgM din sînge, ser sau plasmă, se urmează întocmai modul de lucru și interpretarea rezultatelor prezentate în prospectul de lucru. Neîndeplinirea acestor cerințe poate conduce la obținerea unor rezultate incorecte.

2. Aceasta trusă se folosește la testarea calitativă a HAV IgM. Intensitatea benzii T nu se corelează cu titrul anticorpilor din probă.

3. Un rezultat negativ indica absența HAV IgM din proba de testat, însă nu exclude posibilitatea infecției cu HAV.

4. Un rezultat negativ poate apărea dacă cantitatea HAV IgM prezentă în probă este sub limita de detecție a testului sau dacă anticorpii detectați nu sunt prezenți în stadiul bolii în care proba a fost recoltată. Atunci când simptomele persistă se repetă testul la distanță de câteva zile sau se testează cu o metodă de testare alternativă.

5. Titruri mari de anticorpi heterofili sau de factor reumatoid pot afecta rezultatele.

6. Rezultatele obținute cu această trusă trebuiesc interpretate împreună cu alte date și investigații clinice.

Rezultate

Studiul modificărilor unor parametrii de laborator în cursul evoluției hepatitei acute virale cu virus hepatic A

În perioada 1.I.2015 – 31.XII.2015 în Spitalul Cliinic de Boli Infecțioase au fost internați 188 pacienți cu diagnosticul de hepatită acută virală cu virus hepatic A

Repartiția pe grupe de vârstă este prezentată în tabelul V.3 și fig V.15.

Tabel V.3 Repartiția pacienților pe grupe de vârstă a pacienților internați cu HAV cu VHA

Fig.V.15 Frecvența internărilor pentru HAV cu VHA în raport cu vârsta pacienților

Se observă că majoritatea pacienților internați pentru HAV cu VHA au fost copii – 139 cazuri reprezentând 74% din totalul pacienților. Boala a fost înâlnită și la adulți dar într-o proporție mult mai redusă – 49 cazuri ce reprezintă 26% din totalul pacienților internați.

Am analizat distribuția îmbolnăvirilor în funcție de genul pacienților (Tabelul V.4, Fig. V.16).

Tabel V.4 Repartiția pe genuri a pacienților internați cu HAV cu VHA

Fig.V.16 Frecvența internărilor pentru HAV cu VHA în raport cu genul pacienților

Am constatat că ambele genuri au fost afectate în proporții apropiate, genul masculin fiind afectat în proporție de 54% din pacienții internați față de genul feminin afectat în proporție de aproximativ 46%, rezultând o diferență de 12% dintre cele două genuri afectate.

Distribuția pacienților cu HAV cu VHA în raport cu mediul de proveniență al pacienților este prezentată în Tabelul V.5 și Figura V.17.

Tabel V.5 Repartiția pacienților în funcție de mediul de proveniență al pacienților cu HAV cu VHA

Fig.V.17 Frecvența internărilor pentru HAV cu VHA în raport cu mediul de proveniență al pacienților.

Am constatat din repartiția pacienților cu HAV cu VHA că 82% de cazuri au provenit din mediul rural, față de doar 18% din mediul urban.

În ceea ce privește modificările numărului de leucocite serice în cursul evoluției HAV cu VHA acestea sunt prezentate în Tabelul V.6 și Fig. V.18 iar valorile patologice în Tabelul V.7 și Fig.V.19.

Tabel V.6 Repartiția pacienților în funcție de numărul leucocitelor serice în HAV cu VHA

Fig.V.18 Modificările numărului de leucocite serice în HAV cu VHA

Am constatat că la aproximativ 90 % din cazuri numărul de leucocite a fost normal, aceștia însumând un număr de 154 de pacienți din totalul de 173.

Tabel V.7 Numărul pacienților în funcție de valorile patologice ale leucocitelor

Fig.V.19 Modificările patologice ale numărului de leucocite în HAV cu VHA

În proporții foarte reduse au fost prezente lecocitoză în 4,62% din cazuri și leucopenie în 6,35% din cazuri.

Modificărilor numărului de trombocite este precizată în Tabelul V.8 și Fig.V.20

Tabel V.8 Repartiția pacienților în funcție de valorile trombocitelor serice în HAV cu VHA

Fig.V.20 Modificările numărului de trombocite în HAV cu VHA

Se observă că aproximativ 80% dintre pacienții internați cu HAV cu VHA au avut un număr normal de trombocite în cursul evoluției bolii. Într-un procentaj mult mai redus a fost constatată trombocitoza, find prezentă la 12,79% din cazuri și trombocitopenia în procent de 7,55% din cazuri, valorile patologice a trombocitelor cumulând un procent de 20,35%

Modificările patologice ale trombocitelor se poate observa în Tabelul V.9 și Fig.V.21

Tabel V.9 Repartiția pacienților adulți cu valori patologice ale trombocitelor

Fig.V.21 Numărul pacienților ale căror trombocite au fost la nivel patologic.

Dintr-un număr total de 35 de pacienți cu valori patologice ale trombocitelor se poate observa că la un procent de 62,85% dintre aceștia a fost prezentă trombocitoza iar la un procent de 37,14% din cazuri a fost prezentă trombopenia.

Modificările valorilor transaminazelor serice ALT sunt prezentate în Tabelul V.10 și Fig.V.22

Tabel V.10 Repartiția pacienților în funcție de nivelul transaminazei ALT în HAV cu VHA

ALT = alaninaminotransferază

Fig.V.22 Modificările valorii ALT în HAV cu VHA

Se constată din Fig.V.22 o modificare de 100% a valorilor ALT în sens patologic, cazurile cu valori normale ale acestei analize serice nefiind prezente.

Tabel V.11 Repartiția pacienților cu valori patologice ale ALT

Fig.V.23 Intensitatea modificării valorilor ALT în HAV cu VHA

Am constatat intensități variate ale creșterii valorii ALT în cursul HAV cu VHA în proporții apropiate, de la creșeri ușoare (41-300 U/L) la 11,76% dintre pacienți la creșteri medii (300-1500 U/L)-56,14% din cazuri și creșteri marcate (1500-3000 U/L) la 25,66% dintre pacienți. Au existat pacienți încadrați la creșteri foarte mari (peste 3000U/L) la 6,41% din cazuri, aceștia fiind în număr de 12.

Modificările valorilor transaminazei serice AST sunt prezentatae în Tabelul V.12 și Fig.V.24

Tabel V.12 Repartiția pacienților în funcție de valoarea AST în HAV cu VHA

Fig.V.24 Modificările valorii AST în HAV cu VHA

Se observă din grafic, o valoare normală a transaminazei AST prezentă în 1,68% din cazuri (3 pacienți), față de valorile patologice prezente în 98,32 % din cazuri.

Modificările transaminazelor serice AST la nivel patologic se poate observa în Tabelul V.13 și Fig.V.25

Tabel V.13 Numărul pacienților cu valori patologice ale AST în HAV cu VHA

Fig.V.25 Intensitatea modificărilor AST în HAV cu VHA

Din analiza datelor prezente se observă ca și în cazul valorilor ALT, creșteri variate ale valorii transaminazei AST în cursul evoluției HAV cu VHA. Din analiza cazurilor s-au constatat creșteri ușoare (38-300 U/L) într-un procent de aproximativ 30% dintre pacienți, creșteri medii (301-1500 U/L) la 51,12% din cazuri și valori crescute (peste 1500 U/L ) la 18,75% dintre pacienți.

Am analizat valorile bilirubinei totale în Tabelul V.14 și Fig.25

Tabel V.14 Repartiția pacienților în funcție de valorile bilirubinei totale în cursul HAV cu VHA

Fig.V.26 Modificările bilirubinei totale în HAV cu VHA

Majoritatea pacienților au prezentat hiperbilirubinemie în proporție de 84,07% din totalul pacienților. Într-o proporție redusă a fost prezent un procent de 15,93% din totalul cazurilor cu valori normale ale bilirubinei, acest fapt însemnând o evoluție anicterică a HAV cu VHA la 29 de pacienți.

Am analizat valorile patologice ale bilirubinei totale în Tabelul 15 și Fig.V.27

Tabel V.15 Repartiția pacienților în funcție de valorile patologice ale bilirubinei totale

Fig.V.27 Intensitatea modificărilor bilirubinei totale în HAV cu VHA

În cazurile cu hiperbilirubinemie, intensitatea acesteia a variat de la o valoare minimă de (1,2-3 mg/dL) la 35,94% dintre cazuri la medie (3,1-10 mg/dL) în 56,2% din cazuri. Creșteri marcate am constat la 7,84% dintre pacienții ce au prezentat hiperbilirubinemie, aceștia fiind în număr de 12 la o valoare de peste 10,1 mg/dL, doar la 3 pacienți constatându-se și o valoare foarte mare a bilirubinei de peste 15 mg/dL.

Bilirubina directă a fost înregistrată cu valori crescute în 169 de cazuri dintr-un total de 183 de cazuri, așa cum este prezentat in Tabel V.16 și Fig.V.28

Tabel V.16 Repartiția pacienților în funcție de valorile bilirubinei directe în cursul HAV cu VHA

Fig.V.28 Modificările bilirubinei directe în HAV cu VHA

În majoritatea cazurilor, însemnând un procent de 93,34%, bilirubina a fost crescută peste nivelul normal de referință

Tabel V.17 Repartiția pacienților în funcție de valorile patologice a bilirubinei directe în cursul HAV cu VHA

Fig.V.29 Intensitatea modificărilor bilirubinei directe în HAV cu VHA

Creșterea valorilor bilirubinei directe a fost ușoară (0,41-3mg/dL) la aproximativ 57,47% din cazuri, medie (3,1-10 mg/dL) la 39,0 4% din cazuri. O creștere marcată (peste 10 mg/dL) a bilirubinemiei a fost înregistrată la aproximativ 6 pacienți, aceștia reprezentând un procent de 3,55%.

Am analizat modificările valorilor GGT în cursul evoluției HAV cu VHA în Tabelul. V.18 și Fig.30

Tabel V.18 Repartiția pacienților în funcție de valoarea GGT în HAV cu VHA

Fig.V.30 Modificările GGT în HAV cu VHA

Am constatat că la aproximativ 97,04% din pacienți, valorile au fost crescute. Într-un procent mic de 2,96% au făcut parte 5 pacienți ale căror valori ale GGT nu au fost modificate patologic, încadrându-se în intervalul normal de referință.

Modificările patologice ale GGT prezente la pacienții cu HAV cu VHA sunt prezentate în Tabel.V.19 și Fig. V.31

Tabel V.19 Numărul pacienților cu valori patologice ale GGT

Fig.V.31 Intensitatea modificărilor GGT în HAV cu VHA

Creșterile GGT au fost de intensități variabile, de la ușoare (până la 100U/L) într-un procent de 24,39% la mediu (101-250 U/L) în 60,35% din cazuri. Într-un procent de aproximativ 15,23% semnificând 25 din cazuri au existat creșteri marcate ale GGT peste o valoare de 251 mg/dL.

Un alt parametru de laborator ce a prezentat modificări în cursul evoluției HAV cu VHA a fost fosfataza alcalină. Am analizat acreșterile valorilor fosfatazei alcaline atât la copii (Tabelele V.20, V.21 și Fig. V.32, V.33) cât și la adulți (Tabelele V.22, V.23 și Fig. V.34, V.35).

Tabel V.20 Repartiția pacienților copii în funcție de nivelul fosfatazei alcaline în HAV cu VHA

Fig.V.32 Modificările fosfatazei alcaline în HAV cu VHA la copii

La copii am constatat creșterea valorilor fosfatazei alcaline doar în 42,98% din cazuri la un număr de 52 de pacienți.

Tabel V.21 Numărul pacienților cu valori patologice ale ALP la copii

Fig.V.33 Intensitatea modificărilor fosfatazei alcaline la copii în HAV cu VHA

Valori ușor crescute (1000-1200 U/L) ale fosfatazei alcaline au fost înregistrate la 61,53% dintre pacienți, mediu crescute (1201-1400 U/L ) la 11,53% din pacienți. Valori marcat crescute (peste 1400 U/L) și foarte crescute (peste 1600 U/L) ale fosfatazei alcaline au fost înregistrate în proporții egale în câte un procent de 13,46% reprezentând un număr de 7 pacienți.

Tabel V.22 Repartiția pacienților adulți în funcție de valoarea fosfatazei alcaline în HAV cu VHA

Fig.V.34 Modificările fosfatazei alcaline în HAV cu VHA la adulți

La adulți, peste 80% din cazuri au evoluat cu valori crescute ale fofatazei alcaline din totalul de 33 de pacienți adulți, fiind înregistrat un număr de doar 6 pacienți (18,18%) cu valori normale ale fosfatazei alcaline.

Tabel V.23 Repartiția pacienților adulți cu valori patologice ale ALP

Fig.V.35 Intensitatea modificărilor fosfatazei alcaline la adulți în HAV cu VHA

Creșterile peste nivelul normal al fosfatazei alcaline la adulți au fost ușoare (280-300 U/L) la 11,11% dintre pacienți, creșteri medii (301-500 U/L) în 64,03% din cazuri și marcate la un nivel al fosfatazei alcaline de peste 500 U/L în 14,81% din cazuri.

Ultimul parametru de laborator evaluat în cursul evoluției HAV cu VHA a fost indicele de protrombină, indicată de insuficiența hepatică acută. Tabel V.24 și Fig.V.36

Tabel V.24 Repartiția pacienților în funcție de valoarea indicelui de protrombină

Fig.V.36 Modificările indicelui de protrombină în HAV cu VHA

Peste jumătate dintre pacienții cu HAV cu VHA au avut valori scăzute ale indicelui de protrombină 57,59% reprezentând un număr de 91 de pacienți.

Tabel V.25 Repartiția pacienților în funcție de valoarea indicelui de protrombină

Fig.V.37 Modificările patologice ale indicelui de protrombină în HAV cu VHA

Am constatat scăderi ușoare ale indicelui de protrombină (69-50%) la un număr de 80 de pacienți ce reprezintă 87,91% din totalul cazurilor cu valori patologice și scăderi medii (50-30 %) la un procent de 12,08% din cazuri. Pentru acest parametru analitic nu au fost constatate scăderi marcate sub valoare de 30% a indicelui de protrombină.

Concluzii

Studiul modificărilor unor parametrii de laborator la pacienții internați cu HAV cu VHA în spitalul clinic de boli infecțioase din brașov în perioada 1.01.2015-31.12.2015 a permis stabilirea următoarelor concluzii:

1. Internări pentru HAV cu VHA au predominat la copii. Majoritatea pacienților au provenit din mediul rural neconstatându-se diferențe mari între cele două genuri, așa cum este descris și în literatura de specialitate.

2. În majoritatea cazurilor numărul de leucocite serice și de trombocite a fost normal, rezultate din care concluzionăm că hepatita virală acută cu virus hepatic A a avut o evoluție puțin marcantă asupra sistemului imunitar și al răspunsului inflamator sistemic produs de acesta.

3. Hepatocitoliza, obiectivată prin creșterea valorilor transaminazelor serice (AST și ALT) a fost la majoritatea pacienților de intensitate medie, demonstrând hepatotropicitatea virusului; valori marcat-crescute s-au înregistrat la doar un sfert dintre bolnavi.

4. Hiperbilirubinemia a fost constatată la majoritatea pacienților, de intensitate ușoară și medie, atât pentru bilitubină totală cât și pentru bilirubina directă, o mare parte din pacienți având și ca simptom clinic, icterul.

5. Creșteri de colestază, GGT și fosfatază alcalină, au prezentat valori crescut în majoritatea cazurilor, de intensitate predominant ușoară și medie.

6. Creșterea valorilor fosfatazei alcaline a fost frecvent întâlnită la adulți.

7. Insuficiența hepatică acută, exprimată prin scăderea valorii indicelui de protrombină, a fost constatată la peste jumătate dintre pacienți, de intensitate ușoară și medie.

Bibliografie

Prof.Dr. Ileana Rebedea, Boli Infecțioase, București, Editura Medicală București, 2000, ISBN 973-39-0410-4, pg 268-273.

***Hepatitele virale, 12.11.2010 available at http://microbio.ucoz.com/Prelegeri/Romana/HEPATITELE_VIRALE_10.pdf

https://mgsii.files.wordpress.com/2014/09/hepatita-a-si-e.pdf

Codruța NEMET, Elena-Mihaela Constantinescu, Epidemiologie generală și specială, Brașov, 2015, ISBN 978-973-131-324-5, pg 112-114.

Prof.Dr. Mircea Chiotan, Boli Infecțioase, Editura Național, 2006, București

Marin GH. Voiculescu, Boli Infecțioase Vol.2, București, Editura ALL, 2009

Amon, J. J., R. Devasia, G. Xia, O. V. Nainan, S. Hall, B. Lawson, J. Wolthius, P. D. M. MacDonald, C. Shepard, I. T. Williams, G. Armstrong, J. A. Gabel, P. Erwin, L. Sheeler, W. Kuhnert, P. Patel, G. Vaughan, A. Weltman, A. Craig, B. P. Bell, and A. Fiore. 2005. Molecular epidemiology of foodborne hepatitis A outbreaks in the United States, 2003. J. Infect. Dis. 192:1323-1330.

Andersen T T. The etiology of hepatitis epidemica. Acta Med Scand. 1937;93:209–227.

Borundel Corneliu, ,,Manual de medicinǎ internǎ pentru cadre medii",Ed. All,Bucuresti 1998

Gr. Teodorovici – "Epidemiologia bolilor transmisibile" – LITOGRAFIA UMF IASI, 1976

Bell, B.P. 2002. Global epidemiology of hepatitis A: implications for control strategies. In Viral Hepatitis and Liver Disease. H.S. Margolis, M.J. Alter, J. Liang, and J.L. Dienstag, editors. International Medical Press, Atlanta.

Evans,.S. Alfred, R.A. Kaslow – Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 4th Edition, 1997, Plenum Medical Book Company, New York, London

Hepatita acută virala, Manualul Merck de Diagnostic și Tratament, Ed.XVII , (versiune în limba română) 2002, pg.377-384

Aurel Ivan – “Tratat de epidemiologie a bolilor transmisibile”, Ed. Polirom, Iași, 2002.

Thomas H.C., Lemon S. Zuckerman A.J. – Viral Hepatitis, 2005

RA Hope, JM Longmore, TS Hodgetts, PS Ramrakha – „Manual de medicină clinică”, Ed. a III-a, Ed. Medicală, București, 1995

Purcell Rh. Approaches to immunization against hepatitis virus. In: Hollinger Fb, Lemon SM, Margolis H, eds. Viral hepatitis and liver disease: proceedings of the 1990 Internation Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease: contemporary issues and future prospects. Baltimore, Williams &Wilkins, 1991:41-6

Midthun K, Ellerbeck E, Gershman, et al. Safety and immunogenicity of a live attenuated hepatitis A virus vaccine in seronegative volunteers. J.Infect Dis 1991;163:735-9

Lars R. Mathiesen, The hepatitis A virus infection, Liver, 2008, 1, 2, 81 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-0676.1981.tb00027.x/full

Sheila Sherlock – Diseases of the Liver and Biliary System, Blackwell, Science, 2002

Stefan Mauss, Thomas Berg, Jürgen Rockstroh, Hepatology, Dusseldorf, Flying Publisher, 2009

Alexandru Crișan – Curs de boli infecțioase, Timișoara, Editura de Vest, 2015, ISBN 978-973-36-0622-2

Mauss – Berg – Rockstroh – Sarrazin – Wedemeyer, Hepatology – A Clinical Textbook Second Edition, Flying Publisher, 2009, pg23-26.

Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Alkaline Phosphatase, Serum. www.labcorp.com . 2010. Ref Type: Internet Communication.

Gabriel Ivanovici – "Interpretarea analizelor de laborator" – Editura Militară, București, 1995

Frances Fischbach. Effects of the Drugs on Laboratory Tests. in A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 1227-1229.

Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 Ed., 2009, 364-366.

Mandel G.L., Bennett J.E., Dolin R. – Principles and Practice of Infectious Disease 5th Edition, 2000, Ed. Churchill Livingstone, London, New York

Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Bilirubin, Total and Direct, Serum. www.labcorp.com 2010. Ref Type: Internet Communication.

Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott Williams & Wilkins, USA, 8 ed., 2009, 420-422.

Heiman F.L. Wertheim, Peter Horby – Atlas of Human Infectious Diseases,Oxford,Wiley Blackwell, 2012

Ghidul Serviciilor Medicale ale Laboratoarelor Synevo, Ediția a II-a, 2010, București

Lyle W.Horn, Deadly diseases and epidemics, Hepatitis, 2005, Chelsea House Publishers, Philadelphia

James Keogh Nursing Laboratory and Diagnostic Tests, New York University, 2011, Philadelphia, ISBN: 978-0-07-173651-0

Bonita Morrow Cavanaugh, Nurse’s Manual of Laboratory and Diagnostic Tests, F.A. Davis Company,2003, Philadelphia

Buti, M., R. Jardi, A. Bosch, F. Rodriguez, G. Sanchez, R. Pinto, X. Costa, J. F. Sanchez-Avila, M. Cotrina, R. Esteban, and J. Guardia. 2001. Assessment of the PCR-Southern blot technique for the analysis of viremia in patients with acute hepatitis A

Jansen, R.W., Siegl, G. and Lemon, S. M. 1990. Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method. Procedure Natural Academy of Science USA 87: 2867-2871.

Croci, L., De Medici, D., Morace, G., Fiore, A., Scalfaro, C., Beneduce, F. and Toti, L. 1999. Detection of hepatitis A virus in shellfish by nested reverse transcriptionPCR. International Journal of Food Microbiology 48: 67-71.

Baker CJ (2007) Another success for hepatitis A vaccine. N Engl J Med 357(17): 1757–1759. Epub 2007 Oct 18

Costa-Mattioli M, Di Napoli A, Ferre V, et al. (2003) Genetic variability of hepatitis A virus. J Gen Virol 84(Pt 12): 3191–201. Review

Pham B, Duval B, De Serres G, et al. (2005) Seroprevalence of hepatitis A infection in a low endemicity country: a systematic review. BMC Infect Dis 5: 56. Review

Adnan Alatoom, M. Qasim Ansari, Jennifer Cuthbert, Multiple Factors Contribute to Positive Results for Hepatitis A Virus Immunoglobulin M Antibody, Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 2013, 137, 1, 90 http://www.archivesofpathology.org/doi/abs/10.5858/arpa.2011-0693-OA

Sinan Sari, Buket Dalgic, Bilkay Basturk, Sevim Gonen, Oguz Soylemezoglu, Immunogenicity of Hepatitis A Vaccine in Children with Celiac Disease, Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2011, 1

Bocarnea Constantin,  ,,Boli infecțioase și epidemiologie'', Ed.Medicalǎ,București,1999

Abd El Galil, K. H., M. A. El Sokkary, S. M. Kheira, A. M. Salazar, M. V. Yates, W. Chen, and A. Mulchandani. 2004. Combined immunomagnetic separation-molecular beacon-reverse transcription-PCR assay for detection of hepatitis A virus from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 70:4371-4374.