Listă de abrevieri [306097]

Cuprins

Listă de abrevieri

µm-[anonimizat]

Å- angstrom

abPPO3-Tirozinază extrasă Agaricus biporus

ADN = [anonimizat]4-[anonimizat]-[anonimizat]- catecol oxidaze

CO2-[anonimizat] A

CuB-ionul de cupru din pozitia B

Cu-[anonimizat]-[anonimizat]

g-[anonimizat]-Glicină

H+-proton

H2SO4- [anonimizat]- [anonimizat]

h-[anonimizat]-[anonimizat]

L-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]- [anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]

ε-coeficient de extincție

Introducere

Una dintre cele mai mari probleme cu care se va confrunta civilizația umană în secolul 21 este asigurarea surselor nutriționale pentru o populație într-o continuă creștere exponențială. Acest proces este însoțit de o [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat] o abordare care sa aibe în vedere respectarea calității produselor. [anonimizat]. [anonimizat] 50% din producția totală.

Tradițional, metoda convențională de protecție implica folosirea colorantului verde de malahit (4-{[4-(Dimethylamino)phenyl](phenyl)methylidene}-N,N-dimethylcyclohexa-2,5-dien-1-iminium clorură) dar care recent a fost interzis din cauza efectelor sale teratogene/ cancerigene pe care s-a constatat că le produce după ce produsele au fost consumate. În consecință, s-a constatat că eliminarea totală a formelor de tratament avut ca efectel o creșterea rapidă a cazurilor de îmbolnăvire. [anonimizat], constituie un subiect abordat de multe instituții de cercetare la nivel mondial.

Această lucrare a [anonimizat] s-a extras și testat capacitatea inhibitorie a Acidului Ellagic asupra Saprolegniei spp. Acest compus polifenolic se găsește în coaja mai multor fructe ceea ce înseamnă că există o disponibilitate enormă dacă stăm să ne gândim doar la cantitățile de resturi de fructe care sunt considerate deșeuri ale industriei sucurilor naturale. [anonimizat] a mediului, procesul de producție fiind unul sustenabil.

CAPITOLUL I.

Saprolegnia parasitica.

Descriere generală a Saprolegnia parasitica

Saprolegnia este un gen alcătuit din protozoare ce mai poarta denumirea în engleza de ”cotton molds” datorită asemănării masei fibroase albe a culturilor în vase Petri cu bumbacul (figura 1).

Figura 1. O colonie de Saprolegnia parasitica (Kinga și Colab., 2015)

Studile recente de taxonomie bazate pe caracterizarea moleculelor de ADN ribosomal au arătat apartenența genului în Familia Saprolegniaceae (Molina și colab., 1995) din Ordinul Saprolegniales, unul din multele ordine ale Clasei Oomicete din Phylumul Heterokontophyta (figura 2). În mod frecvent, oomicetele erau clasificate ca și aparținând Regnului Fungi daorită creșterii lor sub formă de filamente și a altor asemănări cu fungii, însa acum sunt catalogate în grupul Stramenopiles care mai include Diatomeele și grupul Phaeophyta (Kamoun, 2003).

Figura 2. Clasificarea taxonomică a Saprolegnia parasitica (Parr și colab., 2016)

Oomicetele sunt împărțite in trei subclase: Saprolegniomycetidae, Rhipidiomycetidae și Peronosporomycetidae, toate având posibilitatea de a infecta o gamă largă de alte organisme printre care și plante și vertebrate de interes economic.(van West, 2006). Toate oomicetele care parazitează peștii și animalele aparțin ordinului Saprolegniales si fac parte din trei mari genuri (figura 3), Saprolegnia, Achlya și Aphanomyces (van West, 2006).

Figura 3 Saprolegnia parasitica și speciile înrudite pe arborele filogenetic

Saprolegnia, asemenea majorității oomicetelor, este un organism atât necrotrof cât și saprotrof, de obicei hrănindu-se cu celule moarte și alte deșeuri ale peștilor însă vor profita și de alte animale rănite sau într-o stare de vitalitate mai redusă. Saprolegnia este tolerantă la un interval de temperaturi de la 3 pâna la 33 grade Celsius, dar se dezvoltă cel mai bine la temperaturi mai joase. Deși frecvența organismului de a fi găsit este mai mare în apa dulce, poate tolera cu succes rezervoarele de apa salmastră precum lacurile sau mările închise și în condiții prielnice poate supraviețuii și pe solul umed. (Diéguez-Uribeondo și colab., 2007).

Filamentele (hifele) de Saprolegnia sunt lungi cu capete rotunjite ce conțin zoospori. De obicei colonii associate ce aglomereaza una sau mai multe specii pot circula prin masa apei, la început formând o masa de hife individuale pentru ca apoi cu creșterea in mărime se ajunge la stadiul de miceliu care este observabil cu ochiul liber. Deși in majoritatea cazurilor aceste colonii apar de culoare albă, ele pot apărea și gri sub acțiunea bacterilor sau a altor particule ce ajung prinse în rețeaua fibroasă de hife (van West, 2006).

O caracteristică definitorie este aceea că hifele, deși lungi, sunt relativ groase de circa 10 µm în diametru în comparație cu hifele Ascomicetelor sau Basidiomicetelor ale căror hife au un diametru de 2-5 µm (Diéguez-Uribeondo și colab., 1994). Hifele sunt aseptate (coenocitic) cu septe care se formează doar în structurile sexuale (pentru a separa sporangii) (Diéguez-Uribeondo și colab., 1994).

Figura 4. Imagine a unei secțiuni printr-o celulă de Saprolegnia parasitica obținută la microscop electronic de transmisie. CW-perete celular M-mitocondrie. După Bartnicki-Garcia, 1968.

Peretele celular al Saprolegnia este format dintr-o rețea de celuloză și β (1-3) și β (1-6) glucani (Bartnicki-Garcia, 1968). Spre deosebire de speciile de fungi, chitina este aparent absentă în pereții celulari ai hifelor însă au fost identificate activități de chitin sintază în stare activă în vârful hifelor, asadar se consideră ca ar exista un rol al producției de chitină pe parcursul procesului de creștere (Choi și colab., 2013).

Ciclul de viață a Saprolegnia spp.

Saprolegnia spp. în speță S. parasitica urmează tiparul reproducător al oomicetelor astfel înregistrându-se un ciclu de viață caracterizat de existența unei perioade de reproducere asexuată cu formare de sporangi si zoospori și a unei perioade de reproducere sexuată ce rezultă în formarea oosporilor care sunt diferiți din punct de vedere morfologic (van West, 2006).

Reproducerea asexuată și declanșarea formării zoosporilor

Faza asexuată (a zoosporilor) este responsabilă pentru diseminarea zoosporilor liberi ce pot înota în masa apei cu scopul de a găsi o noua gazdă. În același context faza sexuată se consideră că permite supraviețuirea în condiții vitrege de uscăciune și temperaturi crescute sub forma oosporilor care așteaptă revenirea unor condiții mai favorabile urmând germinarea. Zoosporii se formează în structuri denumite sporangi ce sunt localizați la capetele hifelor și sunt separați de către hifă printr-un sept bazal. Se consideră ca factoruii cei mai importanți care declanșează eliberarea zoosporilor din sporangi este lipsa sau nivelul scăzut de nutrienți în imediata vecinătate a mediului sau scăderea bruscă de temperatură. (Fuller și Jaworski, 1987). Au fost observată o creștere majoră a numărului de zoospori dupa 24 de ore precedate de o scădere bruscă de 10 grade Celsius într-o crescătorie de Ictalurus punctatus (Bly și colab., 1992). O astfel de scădere bruscă de temperatură este asociată și cu o scădere a răspunsului imun din partea peștelui ceea ce favorizează infecția cu zoosporii eliberați (Bly și colab., 1992). Fenomenul eliberării de zoospori în condițiile scăderii de temperatură este un fenomen comun tuturor oomicetelor (van den Berg și colab., 2013). După eliberarea lor de către Saprolegnia, zoosporii sunt unicelulari și prezintă doi flageli, acestia se numesc zoospori primari. Zoosporii primari deși prevăzuți cu doi flageli nu sunt considerați înotători abili, ei având simplul rol de a se distanța relativ de colonia mamă atunci cand sunt eliberați de sporange. În continuare are loc un proces de închistare care se desfășoară intr-un timp foarte scurt și presupune pierderea flagelilor și formarea unui perete celular. Chistul rezultat are capacitatea de a elibera noi zoospori acestia fiind zoosporii secundari. Zoosporii secundari au o forma reniformă cu doi flageli situați laterali. În mai multe specii ale Genului Saprolegnia printre care S. Parasitica și S. Diclina acesti zoospori secundari pot suferii mai multe cicluri de închistare și eliberare de zoospori, acest proces este descris ca și „apariție repetată de zoospori” și se numește „Poliplanetism” el reprezentând o adaptare a stilului parazit de viață a specilor dim genul Saprolegnia (Hatai și colab., 1990). Se pare că zoosporii secundari au mai multe sanse să găsească și să colonizeze o gazdă potrivită. Acestia prezintă caracteristici de răspuns la stimuli care le măresc șansele de supraviețuire cum ar fi chemotaxis, pH-taxis, geotaxis și electrotaxis toate demonstrate pe zoospori.(Cameron și Carlile, 1981). De asemenea s-a înregistrat abilitatea de a fi atrași de nutrienții ce se scurg din cadavrele de pești sau de ouăle acestora (El-Feki și colab., 2003). Astfel abilitatea de a înota în direcția sursei de nutrienți îi mareste considerabil șansele de a găsi o potențială gazdă pe care sa se închisteze și să germineze.

Închistarea și germinarea la Saprolegnia

In cazul speciei de S. Parasitica chistul prezintă la suprafața sa un set de fire sau cârlige, forma acestora fiind specific speciei (Burr și Beakes, 1994). Rolul acestor formațiuni variază de la încetinirea fenomenului de sedimentare în cadrul apei până la potențarea atașamentului chisturilor la suprafața gazdei (figura 5).

Figura 5. A-H o imagine realizată la microscopul optic a unui sporangium și eliberarea zoosporilor primari. I-Imagine de microscopie electronică de transmisie a unui zoospor secundar; scara micrometrică reprezintă 10µm (van West, 2006).

Factorii de mediu care sunt responsabili de închistare și germinație sunt diferiți în funcție de specie, dar este propus ca un singur mecanism de reglare controlează atât ciclurile de germinare cât si de închistare (Andersson și Cerenius, 2002). Închistarea zoosporilor este reglată de ionul de Ca2+ în majoritatea specilor de Oomicete (Donaldson și Deacon, 1992).

Stimulii care declanșează închistarea au fost determinați în laborator ca fiind agitație sub forțe mecanice și prezența unor nutrienți precum peptona, mucus de pește, albumină serică bovină sau hemoglobină (Diéguez-Uribeondo și colab., 2007).

Reproducerea sexuată

Reproducerea sexuată a Saprolegnia începe cu formarea unui oogoniu și unei anteridie. Fertilizarea are loc atunci când anteridia crește spre si fuzionează cu oogoniumul. Oosporii sunt eliberați sub forma unor ouă încapsulate ce prezintă un perete gros care le permite supraviețuirea în condiții vitrege (uscăciune, temperatură mare…) astfel specia poate intra intr-o perioadă de „repaus” pentru ca ulterior în cadrul unor condiții prielnice să germineze (Beakes și Bartnicki-Garcia, 1989).

Figura 6 Ciclul de viață al Saprolegnia parasitica (Phillips și colab., 2008)

Oosporii produși în faza sexuată sunt diferiți în funcție de specie ca și număr, mărime și formă. Acestă variație a caracteristicilor oosporilor, anteridiei și a oogonului este singura sursă de variație morfologică ce ne servește la clasificări și identificare. În condiții de laborator, putem induce reproducerea sexuată la un număr de specii de Saprolegnia prin creșterea lor pe medii de cultură sărace în nutrienți precum Mălai-Agar sau prin reducerea temperaturii, însă inițierea reproducerii sexuate este dificilă in vivo de aceea nu ne putem baza extensiv pe identificarea speciilor doar din punct de vedere morfologic, ceea ce face lucrul cu aceste specii dificil (Burr și Beakes, 1994).

Infecții cu Saprolegnia parasitica. Saprolegnioza peștilor

Saprolegnioza a fost observată la numeroase specii de pești de apă dulce. În acvacultură infecția cu Saprolegnia parasitica apare pe bronhile și derma peștilor sub forma unor pete albe sau gri ce seamănă cu bumbacul sau lâna. În cazurile severe suprafața peștelui poate fi acoperită de aceste petice într-o proporție de 80%. Distrugerea epidermei și a țesuturilor imediat subepidermale cauzează peștele să devină letargic și astfel cresc sansele să fie prins de prădători.

Figura 7. A-B leziuni la nivelul capului datorate saprolegniozei a unui specimen de Oncorhynchus tshawytscha din crescătoria „Rapid River Hatchery” Idaho, SUA. C- Imagine a unei secțiuni colorație cu Hematoxilină-Eozina la microscopul optic ce arată infecția cu hife (h) stratul spongios (ss) si stratul compactI (sc). D- Imagine a unei secțiuni colorație cu Gomori la microscopul optic ce arată pătrunderea hifelor în țesutul bazal al unui solz (van West, 2006).

Termenul dermatomicoză este frecvent folosit în locul saprolegniozei (Hatai, 1980). Ultimele stagii ale infecției includ slăbirea osmoreglării, insuficiență respiratorie și rar cedarea sistemică a organelor. Slăbirea osmoreglării este datorată hemodiluției ce survine în urma lezării pielii, iar insuficiența respiratorie este cauzată de infecția extinsă la nivelul branhilor. Aceste stagii târzii sunt greu de observat la peștii sălbatici datorită prădătorilor sau la cei din crescuți din cauza îndepărtării lor încă din stadiile incipiente ale infecției de către acvacultori. Cea mai frecventă țintă a Saprolegniei sunt rănile preexistente sau zonele unde există infecții cauzate de alți patogeni, de aceea este considerat că peștii sănătoși fără răni sau paraziți au un risc scăzut de a fi infectați cu Saprolegnia (Pickering și Willoughby, 1979).

Saprolegnioza icrelor de pește

Saprolegnia parasitica infectează icrele multor specii de apă dulce de pești. Factorul major care influențează susceptilitatea icrelor este mărimea lor, astfel icrele cu un diametru mic cum ar fi cele de Crap (Cyprinus carpio) sau Somn (Pelteobagrus fulvidraco) se infectează în câteva zile pe când icrele mai mari de Somon (Salmo salar) necesită timpi mult mai lungi pentru ca infecția să aibe loc (van West, 2006).

Figura 8. A-Salmo salar B-Icre infectate de Salmo salar C-Icre infectate de Xenopus laevis D-Imagine de microscopie electronică de suprafață ce reprezintă un zoospor secundar. Toate scările micrometrice reprezintă 100µm (Chukanhom și Hatai, 2004).

La momentul de față se consideră ca inițial, icrele viabile ale specilor de somon nu pot fi infectate de către zoosporii Saprolegniei, după cum acvacultorii au raportat faptul că infecția survine asupra icrelor moarte sau nefertilizate, ele devenind un substrat pentru zoospori, ulterior formându-se un strat de micelii care se extinde și consumă în continuare și icrele viabile, fenomenul fiind datorat dezvoltării hifelor. Infecția datorată hifelor este particular distrugătoare pentru crescătoriile care eclozează icre (Thoen și colab., 2011).

Saprolegnioza altor specii

Saprolegnia poate infecta de asemenea și alte grupuri de animale cum ar fi stadiile acvatice ce apar în dezvoltarea amfibienilor (Fernández-Benéitez și colab., 2011). Au fost raportate grave infecții ale speciei de salamandra Ambystoma maculatum, a broastelor Bufo calamita, Rana temporaria, Bufo boreas, de asemenea extincția populaților de Rana pipiens și Bufo terrestris au fost atribuite infecției cu Saprolegnia parasitica (Fernández-Benéitez și colab., 2008).

Un alt grup atacat de Saprolegnia sunt crustaceele. Au fost raportate infecții ale mai multor specii de raci, amfipode și Dafnia (Daphnia pulex) (Wolinska și colab., 2008). Simptomele vizibile sunt pete întunecate pe abdomenul crustaceelor. Răspunsul imun al gazdei este de a melaniza hifele și de a le încapsula hifele care deja au penetrat țesutul pentru a prevenii răspândirea lor. Rata de mortalitatea crește atunci când stratul de cuticula extern este deteriorat (Diéguez-Uribeondoși colab., 1994).

Importanță economică

În ultimii 10 ani, la nivel mondial, producția piscicolă a crescut cu aproximativ 10% pe an, ceea ce înseamnă că acvacultura este industria cu cea mai mare creștere din sectorul primar. Producția a crescut de la 13 milioane de tona în 1990 la 37,9 milioane de tone în 2001 (van West, 2006) ajungând să concureze cu industria cărnii de vită și chiar să o depăsească până la finalul acestei decade. Această creștere la nivel global arată o tendință de schimbare a dietei. În ultimul secol producția proteinelor de origine animală s-a bazat pe două mari sisteme naturale: pescuitul oceanic și fermele de bovine însă în prezent ambele ajung la limitele producției, în special cu fondul piscicol global fiind în scădere datorită poluării și a braconajului. Astfel cresterea cantității de pești livrați provin exclusiv din boom-ul global în acvacultură, în special în țările în curs de dezvoltare, ajungând ca în prezent acvacultura sa asigure peste 30% din sursa de pești consumați (Delgado și colab., 2003). Din aceasta, majoritatea producției provine din acvacultră în apă dulce 58% urmată de acvacultura marină 36% și în apă salmastră 6%. În ritmul actual, acvacultura va continua să joace un rol important in producția de pești, producătorii având doar 2 opțiuni pentru a crește producția: extinderea volumului de apă exploatat sau sporirea randamentului de producție per unitate de volum exploatat. Fără îndoială reducerea procentului de îmbolnăvire imbunătățeste acest randament (van West, 2006).

Saprolegnia parasitica este unul dintre cei mai distructivi patogeni ai peștilor. Ea este prezentă în toate habitatele de apă dulce de pe glob și este responsabilă parțial și pentru declinul populaților sălbatice de somni si alte specii. Recent pierderile specilor de somon în fermele de acvacultură din Scoția, Scandinavia, Chile, Japonia, Canada si SUA sunt estimate la ordinul zecilor de milioane de dolari (Hussein și colab., 2001), doar în SUA Saprolegnia parasitica cauzând pierderi de până la 50% a culturilor de Salmo salar. În Scoția pierderile datorate infecției cu Saprolegnia la 5 milioane de lire sterline anual, însă o estimare la nivel global nu este posibilă datorită variației ratei de infectare in funcție de specie, sezon și locație (Phillips și colab., 2008).

Metodele de protecție împotriva patogenului se bazează pe folosirea unu compus chimic numit Verde de malahit însă, datorită proprietăților sale carcinogene și toxicologice acesta a fost interzis în 2002 în Uniunea Europeană și ulterior la nivel mondial.

În prezent există câțiva compuși care se folosesc în controlul patogenului însă nici unul nu poate oferii protectie peștilor după ce aceștia eclozează din icre. Tratamentul cu clorură de sodiu (NaCl) este o alternativă, Saprolegnia fiind inhibată de cantități destul de mici de sare, însă nici în acest caz protecția nu este perfectă. O altă metodă este tratamentul cu Ozon însă aceasta metodă nu se poate aplica decât în acvarii și nu iazuri sau crescătorii ce prezintă un volum mare de apă. Un alt compus care este folosit în protecția peștilor in fazele timpurii ale dezvoltării lor este Formaldehida însă și aceasta este interzisă in Uniunea Europeană. O soluție viabilă care se află în prezent în stadiul de cercetare în mai multe laboratoare este crearea unu vaccin contra Saprolegnia parasitica însa dezvoltarea lui va fi de durată (van West, 2006).

O altă componentă tipică a peretelui celular din acest gen de microorganisme sunt β 1-3 glucani, micolaminarinele, celuloza și o mică cantitate de chitină. Hernandez-Hernandez și colab. (2003) au raportat prezența a β-3 glucanilor, a zymosanilor și laminarinelor, în paralel cu producția de melanină în mediul solid PDA de creștere a Saprolegnia parasitica.

Melaninele sunt pigmenți de culoare brun-închis la negru, găsiți în animale, plante și microorganisme. Ele nu sunt esențiale pentru creștere și dezvoltare, ci mai degrabă ele sporesc supraviețuirea și abilitățile competitive ale speciilor în anumite medii (Bell și Wheeler, 1986). Asocierea melaninelor cu răspunsuri imune a fost observată pentru plantele (Bell, 1981) și nevertebrate (Soderhall și Ajaxon, 1982).

Figura 9. Structura melaninei din calmar propusă de Nicolaus și colab. (1964). Inelele sunt aromatice. Fiecare pereche de substituenți O-oxigen poate exista fie ca grupări chinonice, hidrochinonice, ori semiquinonice.

Melaninele reprezintă factori de virulență pentru mai multe ciuperci patogene; numărul de exemple fiind în creștere (Jacobson, 2000). Biosinteza și funcția melaninei au fost studiate cel mai frecvent la animale, în primul rând datorită asociației melaninelor cu afecțiuni ale pielii medii (Bell și Wheeler, 1986) și a melanoamelor maligne (Hoogduijn și colab., 2004). Melaninele din ochi și din urechea internă au primit, de asemenea, o atenție considerabilă din cauza interacțiunilor lor cu medicamentele (Ings, 1984).

De altfel, sinteza melaninei din tirozină sub acțiunea tirozinazei este dovedită la animale (Prota, 1988). Tirozinaza, enzima cheie în sinteza melaninelor animale a fost caracterizată cel mai bine în ciupercile comune (Agaricus bisporus) și Neurospora crassa (Espin și Wichers, 1999). În consecință, unii cercetători s-au grăbit să concluzioneze că melaninele fungice sunt de asemenea derivate din tirozină. Importanța melaninelor pentru supraviețuirea și longevitatea fungilor a fost recunoscută de mulți ani (Bell și Wheeler, 1986). Trei descoperiri suplimentare au crescut interesul printre melaninele fungice. În primul rând, căile unice de biosinteză a melaninei au fost descoperite atât în Ascomycotina, cât și în Basidiomycotina. În al doilea rând, investigatorii au descoperit o nouă clasă de fungicide care împiedică pătrunderea directă a țesutului vegetal prin inhibarea biosintezei melaninei în celulele apressoriale. În al treilea rând, s-au descoperit fitotoxinele care sunt produse intermediare în biosinteza melaninei (Jacobson, 2000). Aceste descoperiri indică un potențial de control al bolilor fungice prin inhibarea sintezei melaninei. Astfel, studiul teoretic al tirozinazei este util.

CAPITOLUL II.

Tirozinazele

Aspecte generale

Tirozinazele (EC 1.14.18.1) sunt un grup de enzime ce conțin ionul cupru (II) și care sunt prezente în toate organismele situate pe orice treaptă filogenetică a lumii vii (Claus și Decker, 2006). Ele pot fi găsite într-o serie de organisme procariotele, în plante, în fungi, în animale, artropode etc. În mamifere, tirozinazele sunt biocatalizatorii procesului responsabil de formarea melaninei din piele, ureche, ochi și păr în timp ce în fructe și legume joacă un rol în înegrirea lor ca urmare a deteriorării celulare. În spongieri, multe nevertebrate și unele plante, tirozinazele au un rol important în vindecarea rănilor și răspunsul imun primar. În artropode, tirozinazele îndeplinesc o funție în fenomenul de sclerozare, pe când la bacterii tirozinazele protejează ADN-ul de potențialul nociv al radiaților ultra violete (Faccio și colab., 2012).

Folosind oxigenul molecular, tirozinazele sunt implicate în două reacții enzimatice în mod secvențial: orto-hidroxilarea monofenolilor (activitate monofenolazică sau cresolazică) și oxidarea o-difenolilor (activitate difenolazică sau catecolazică) la chinonele corespunzătoare. În continuare, după o secvență de reacții, respectivele chinone suferă o polimerizare spontană și rezultă melanină (Ramsden și Riley, 2014). Având abilitatea de a oxida moleculele mici ce conțin unități fenolice și de asemenea resturile aminoacidului Tirozină (Tyr) din peptide sau proteine, au fost găsite multe aplicații biotehnologice pentru aceste enzime, de exemplu bioremedierea, producerea de vopseluri și legarea încrucișată a polimerilor (Faccio și colab., 2012).

Figura 10. Implicarea tirozinazei în calea de biosinteză a melaninei. (după Kajiwara și colab. 2006).

Tirozinazele aparțin grupului de enzime „tip-3 Cupru”. În acest grup mai găsim catecol oxidazele (CO) care prezintă doar activitate difenolazică și hemocianinele (Hc) care au funcția de transportori de oxigen în hemolimfa moluștelor și a artropodelor (Decker și colab., 2006). Membrii acestui grup de enzime prezintă un centru catalitic activ (CCA) conservat în evoluție alcătuit din 6 resturi de histidină, care sunt situate într-o conformație helicală ce coordonează 2 ioni de Cupru ( CuA și CuB) (Decker și colab., 2006). Mai multe studii de spectroscopie au confirmat faptul că proprientățiile spectroscopice ale acestor ioni de Cupru sunt similare la toate proteinele „tip-3 Cupru”, sugerând că variațile în activitate se datorează diferențelor de arhitectură a proteinei și a accesibilității substratului în cadrul fiecărei proteine din acest grup.

Deși mecanismul catalitic al tirozinazelor a fost studiat intensiv, iar datele structurale Tirozinază extrasă din ale CO se cunosc încă din 1998, unele aspecte se află încă în stadiul dezbaterii (Klabunde și colab., 1998). În Tabelul 1 sunt adunate câteva date cu privire la structurile elucidate recent in ultimul deceniu a câtorva enzime tip-3 Cupru ce ne permit înțelegerea mai buna a legăturii între structură și funcție.

Tabelul 1. Date structurale, resturi conservate și activitatea diferitelor enzime Tip-3 Cupru.(++ activitate mono și difenolazică) (+activitate monofenolazică). Adaptat după (Kanteev și colab., 2015)

Structura tirozinazelor

Structura în ansamblu a tirozinazei poate fi impărțită în 3 mari domenii: domeniul central, domeniul N-terminal și domeniul C-terminal (van Gelder și colab., 1997). Domeniul central care conține cele 6 resturi de histidină conservate și de asemenea conține și cei 2 ioni de Cupru, CuA si CuB, ei fiind responsabili de procesul de oxidare. Deși e cel mai bine conservat domeniu printre toate tirozinazele CO și Hc, situl CuB este mai bine conservat în evoluție decât CuA. Studiile cu privire la biochimia tirozinazelor din mai multe specii au demonstrat că resturile de Histidină sunt responsabile pentru legarea Cuprului (Schweikardt și colab., 2007).

A fost evidențiată o legătură neobișnuită de tip tioeter între al doilea rest de histidină ce coordonează CuA și restul adiacent de Cisteină în: CO ale cartofului dulce Ipomoea batatas (IbCO), în tirozinaza din Aspergilus oryzae (TyrAo), în Hc din moluște (din rapana Rapana venosa și caracatiță Octopus vulgaris), dar nu și în tirozinazele din Streptomyces castaneoglobisporus (TyrSc), Bacillus megaterium (TyrBm), Mus musculus, Homo sapiens și Hc ale artropode (Decker și colab., 2007). S-a propus că rolul acestei legături este de a stabiliza al doilea rest de histidină al sitului, care este localizat pe o conformație de tip random coil flexibilă, spre deosebire de celelalte resturi de Histidină care sunt situate pe o conformașie stabilă de tip α-helix (Marusek și colab., 2006).

Domeniul N-terminal este de fapt o secvență semnal ce este responsabilă de determinarea localizării finale a proteinei pentru ca apoi sa fie înlăturată proteolitic (Kaintz și colab., 2014). În plante, domeniul N-terminal determină localizarea finală a tirozinazelor la nivelul cloroplastelor, iar in șoareci și oameni este implicat în transferul melanosomului (Lerech, 1988). Tirozinazele de origine fungică sunt enzime citoplasmatice, astfel ele nu conțin o secvență semnal, dar în unele cazuri sunt asociate peretelui celular (Marusek și colab., 2006). În bacterii a fost identificată o secvență semnal TAT la nivelul domeniului N-terminal ce este responsabilă pentru secreția proteinei în mediu la specile Verrucomicrobium sminosum și Streptomyces (Schaerlaekens și colab., 2001).

Starea latentă a tirozinazelor (pro-tirozinaze) este alcătuită din domeniul central și din domeniul C-terminal, cel din urmă blochează intrarea în CCA precum un „dop” datorită unu rest de aminoacid ce intră în CCA asemenea unui substrat sau un inhibitor. In vivo, activarea pro-tirozinazei se desfășoară prin clivarea proteolitică a domeniului C-terminal, dar in vitro se poate realiza o activare printr-un simplu tratament cu detergenți care să determine modificări conformașionale (Mayer, 2006). Un analog al capătului C-terminal se regăsește si în CO si în Hc provenite din moluște, în timp ce în Hc provenite de la artropode domeniul N-terminal este cel care realizează blocarea CCA. Asemeni tirozinazelor și activarea CO și a Hc are loc prin îndepărtarea proteolitică a domeniului ce blochează CCA (Flurkey și Inlow, 2008). TyrSc nu prezintă un domeniu C-terminal, dar blocarea activității lor este efectuată de o proteină ce se asociază cu enzima, de asemenea nici TyrBm nu prezintă un domeniu C-terminal însă acest grup de enzime se află constant în forma activă (Matoba și colab., 2006).

Figura 11. Centrul catalitic activ (CCA) a enzimelor de Tip-3 Cupru. Sferele cu galben reprezintă atomii de Cupru, CCA este reprezentat în planul secundar, iar resturile care intră în componența CCA sunt reprezentate cu linii. (Kanteev și colab.,2015)

Mecanismul catalitic al tirozinazelor

Proprietățile catalitice ale tirozinazelor sunt datorate celor 4 stări de oxidare prin care trece CCA. Tirozinaza nativă se găsește de cele mai multe ori în starea met în care un un ion hidroxil este coordinat de 2 ioni de Cu2+. În această stare trozinaza nu poate oxida fenoli deși poate oxida chinone. În urma oxidării chinonei, tirozinaza este redusă la starea deoxi care prezinta ionii de Cu+ în starea monovalentă. Tirozinaza în starea deoxi atrage legarea Oxigenului rezultând starea oxi în care două molecule de oxigen în configurație peroxi sunt legate de 2 atomi de Cu2+. Deoxi tirozinazele oxidează fenolii și pirocatechinele la o-chinone prin 2 mecanisme diferite de oxidare. Atunci când oxidarea pirocatechinei se realizează prin mecanismul oxidării fenolilor, atomii de Cupru ajung în starea Cu0 rezultând în dezactivarea tirozinazei (Ramsden și colab., 2009).

Comparând structuriile Hc provenite de la crab în starea oxigenată și deoxigenată, s-a observat că în urma oxigenării distanța dintre ionii de cupru s-a micșorat în timp ce poziția rezidurilor de His au rămas neschimbate. Aceste observații au fost repetate în cazul structurii IbCo și TyrSc. Astfel a fost dovedit că în timpul catalizei mediată de tirozinază, se schimbă atât starea de oxidare a Cu cât și pozitia acestuia (Matoba și colab., 2006).

În cazul structurii determinate a TyrSc, a carei activități este modulată prin asocierea cu o proteină ajutătoare), s-a observat faptul că CuB este stabilizat în structura CCA, pe când CuA și restul de His54 de care este coordinat sunt flexibile. S-a sugerat că flexibilitatea CuA și a restului His54 sunt datorate faptului că mișcările His54 nu sunt restricționate de o legătura tioeterică și că această flexibilitate ar putea avea un rol funcțional (Matoba și colab., 2006). În urma mai multor studii de biochimie s-a propus un mecanism al transportului ionilor de Cu (II). Atomii de Cu sunt transferați de la proteina ajutătoare prin intermediul restului de His82, Met84 și His97 la restul de His54 care își schimbă conformația pentru a coordina atomul de Cu și a îl poziționa în CCA. O dată ce Cu a auns în CCA el ocupă mai întâi poziția stabilă CuB și apoi CuA (Matoba și colab., 2011).

Flexibilitatea ionului de cupru din structura tirozinazelor

Plasticitatea ionului de cupru a fost observată și în structura TyrBm (Sendovski și colab., 2011). Flexibilitatea CuA a fost determinată a fi de 2Å, iar mișcările au fost înregistrate concomitent cu mișcările restului His60 de care este coordinat. TyrBm nu posedă o proteină ajutătoare, ceea ce sugerează că există un mecanism diferit pentru incorporarea atomilor de Cu. Kanteev și colaboratorii au propus ca CuA și CuB sunt inserați în CCA de către alte resturi de aminoacizi ce îndeplinesc și ei un rol de suport (Kanteev și colab., 2013). Transportul CuA este facilitat de resturile de Met61 și Met184. Aceste resturi trasferă ionii de Cu la restul His60 care este flexibil și analog restului His54 din TyrSc, poziționează ionul de Cu în CCA. Pe de altă parte CuB este introdus în CCA cu ajutorul resturilor conservate Asn205 și Phe 197. Rolul restului Asn205 este de a stabiliza His204, pentru a permite coordinarea eficientă a CuB la CCA

În tirozinaza provenită de la Agaricus biporus (abPPO4), a fost de asemenea observată flexibiltatea atomilor de Cu, însă spre deosebire de TyrBm sau TyrSc, CuA este cel stabil structural și CuB dă dovadă de flexibilitate și conformații adiționale alături de un al 4-lea rest de His282 (Mauracher și colab., 2014). Este posibilă ca această flexibilitate a CuB în abPPO4 este un rezultat al unei mutații la nivelul unui rest conservat de Asn, acesta fiind înlocuit cu un rest de Asp252. Acest rest Asp252 nu produce interacțiuni polare cu restul His251 care este responsabil de coordonarea CuB în CCA și ca urmare acesta devenind flexibil (Mauracher și colab., 2014).

În urma studiilor asupra tirozinazei izolată din Aspergillus oryzae (TyrAo) au fost elucidate câteva aspecte cu privire la faptul că legătura tioeter dintre restul His94 și Cys92 se formează doar în prezența atomilor de Cu în CCA, în timp ce înlocuirea restului Cys92 cu un rest de Ala micșorează semnificativ rata de coordinare a Cuprului (Fujieda și colab., 2013). De asemenea, un motiv structural al proteinei care este conservat printre proteinele Chaperon, C522XXC525 a fost descoperit în domeniul C-terminal al TyrAo, iar înlocuirea resturilor de Cys din acest motiv a scăzut din nou rata de coordinare a Cuprului, astfel a fost sugerat ca rolul domeniului C-terminal nu este doar în reglarea activității enzimatice ci și în facilitarea transportului cuprului la CCA similar chaperoninelor (Fujieda și colab., 2013). Motivul conservat al resturilor de Cys au fost observate si în Hc de la caracatiță și IbCO sugerând un mecanism similar al incorporării ionilor de Cu în aceste proteine (Fujieda și colab., 2013).

Figura 12. Incorporarea ionilor de Cu în CCA. A-Transportul de Cu de la proteina ajutătoare (bleo) la CCA la TyrSc. B-CCA la TyrBm. C-Motivul proteic conservat ce conține resturi de Cys ce participă în transportul de Cu. D-Cele 2 poziții posibile ale CuB în abPPO4. (Kanteev și colab., 2015).

Deși în literatura de specialitate nu există foarte multe date legate de mecanismele de transport al Cuprului în proteinele de „Tip-3 Cupru”, este vizibil faptul că fiecare proteină are un mecanism diferit de incorporare a Cuprului în funcție de mediul și structura ei. Tirozinazele de origine mamaliană și din drojdii primesc atomii de Cu de la chaperonine și transportori care fac uz de motive structurale ce conțin Cys și Met pentru incorporare (Robinson și Winge, 2010). Altele precum TyrAo și TyrSc conțin astfel de motive structurale în domeniul C-terminal sau primesc ajutor din partea unei alte proteine ajutătoare (Wang și Hebert, 2006).

Mai multe studii au arătat că este necesar ca un proton (H+) să parăsească molecula unui substrat ce conține un monofenol înainte ca acesta să fie supus hidroxilării. Au fost propuse mai multe mecanisme pentru acest scenariu al deproteinizării substratului (Rolff și colab., 2011). dintre care cel mai fezabil din punct de vedere energetic este acela că H+ este transferat unei molecule de apă ,ce face parte din apa de inbibiție a proteinei, apoi unui rest conservat de Acid Glutamic (Siegbahn și Borowski., 2011). În TyrBm această moleculă de apă este activată de 2 resturi conservate, Glu195 și Asn205 și acționează ca o bază ce îndepărtează H+ de pe monofenol. Această moleculă de apă a fost găsită în toate structurile proteinelor de „Tip-3 Cupru” a căror structură este cunoscută.

Faptul că tirozinazele prezintă 2 activități catlitice în CCA spre deosebire de CO care prezintă doar activitate difenolazică, împreună cu observația că există un rest voluminos de Phe în imediata vecinătate a CuA, a dus la speculația că monofenolii se leagă la CuA în timp ce difenolii se leagă la CuB. Studiile recente de cristalografie a structurii TyrBm ce conținea ambele tipuri de substrat în CCA au infirmat această speculație și au arătat că Tirozina si L-dopa sunt orientați similar față de CuA prin interacțiuni de tip π-π, în timp ce L-dopa coordina restul de His208 al CuB (Deeth și Diedrich, 2009). S-a mai observat că pentru a putea intra molecula de substrat, restul „capac” V218 trebuie să se deplaseze cu 1.4Å confirmând rolul lui în orientarea substratului (Goldfeder și colab., 2014).

Figure 13. Orientare similară a tirozinei si L-Dopa în CCA. Gruparea carboxi a lantului lateral formează punți de Hidrogen cu Arg209, A și B atomii de Cu (Kanteev și colab., 2015)

Datorită faptului că moleculele de monofenoli și difenoli ale substratului se leagă în CCA în mod similar, s-a sugerat hidroxilarea monofenolilor în poziția orto are loc printr-un mecanism de substituție electrofilică și este mediat de rotația celor 3 resturi de His care coordinează CuA și reorientarea substratului. Această reorientare nu este posibilă în cadrul CCA a CO din cauza restricționării legăturii tioeter și a restului de Phe situat deasupra CuA (Goldfeder și colab., 2014). Însă hidroxilarea unui substrat difenolic nu necesită un atac electrofilic și astefel nu este necesară reorientarea substratului în CCA al CO. Există și o excepție de la regulă astfel studii recente de cristalografie ale CO de la Aspergillus oryzae (AoCO4) și a polifenol oxidazei din Vitis vinifeera (PPOVv) au pus l-a îndoială absența activității monofenolazice a CO (Goldfeder și colab., 2014). AoCO4 nu prezintă o legătură tioeter care să restrângă posibilitatea de reorientare a substratului însă nu prezintă activitate monofenolazică, iar activitatea difenolazică este de 100 de ori mai mică decât la IbCO. S-a observat că AoCO4 ,în locul a două resturi conservate de Glu și Asn care sunt considerate importante în deprotonare, posedă resturile Gln237 și Gly285. IbCO care de asemenea nu prezintă activitate monofenolazică are restul Ile241 în locul Asn. Astfel putem atribuii faptul că absența activității monofenolazice este datorată lipsei conservării Asn și Glu, iar limitarea activității difenolazice este cauzată de impedimente sterice ale unor α-helix externe de CCA (Fronk și colab., 2015).

CAPITOLUL III.

Terapii convenționale a saprolegniozei

Bolile produse de oomicete sunt considerate a fi cele mai importante deoarece aceste boli afectează peștii de apă dulce (Hatai, 1990. Bruno și Wood, 1999). Saprolegnia parasitica este cel mai important patogen oomicet care parazitează peștii (West, 2006), cunoscându-se că pătrunde în țesuturi epidermice, fiind colonizator în regiunea cozii sau a capului de unde proliferează pentru a acoperi întreaga suprafață a corpului (Willoughby, 1994).

Există un număr redus de substanțe chimice folosite în prezent pentru a controla saprolegnioza la ouăle de salmonide, deși nu există substanțe chimice disponibile, care să poată oferi o protecție suficientă împotriva bolii după eclozarea alevinilor (Fornerisa, 2003).

Inhibitori chimici ai Saprolegnia parasitica produși drept alternative comerciale

Există un număr redus de substanțe chimice ce sunt folosite pentru a trata infecția cu Saprolegnia spp. Astfel, s-a utilizat un tratament cu clorura de sodiu ce s-a dovedit a fi la concentrații ridicate letal pentru Saprolegnia. Un alt tratament utilizat pentru combaterea infecției cu Saprolegnia a fost cel cu ozon al apei. Un pește infectat nu poate fi vindecat prin acest tratament cu ozon. Peroxidul de hidrogen este considerat a fi un promițător produs chimic pentru tratamentul peștilor infectați cu Saprolegnia și având un impact minim asupra mediului (Van West, 2006).

Un număr mare de compuși organici, cum ar fi glicerolul, acidul benzoic, anilina, triptofanul, acidul humic pot servi ca promotori ai generării de H2O2. Producția naturală pe scară largă a H2O2 este considerată a fi limitată la adâncimea penetrării luminii ultraviolete în apă, de obicei nu mai mult de 1 metru. H2O2 a fost utilizată în controlul saprolegniozei ouălelor de păstrav și de somon. O concentrație de 250-500 mg/L de apă oxigenată poate fi un eficient tratament profilactic pentru ouă, iar la o concentrație de 1000 mg/L se observă atât un control al infecției ouălelor cu Saprolegnia cât și o creștere a ratei de eclozare. Totuși tratamentul pare relativ scump.

Antagoniști microbieni și vaccinuri

Bacteriile pot juca un rol în protejarea peștilor și amfibienilor împotriva patogenilor fungici și a oomicetelor așa că introducerea unei microbiote de protecție ar putea fi o potențială strategie pentru a reduce riscul unor boli la pești și la amfibieni. Multe rapoarte au sugerat că inhibiția creșterii ar putea depinde de secreția unui compus chimic sau nutrient care acționează în interrelația bacterie-Saprolegnia. Actinobacteriile au fost propuse ca agenți probiotici în acvacultură. La nivel comercial utilizarea antagoniștilor bacterieni este limitată, deoarece unele dintre aceste bacterii ar putea reprezenta sursa unor noi maladii (McKenzie și colab, 2012).

Pentru a preveni infecția cu Saprolegnia o alternativă ar fi vaccinarea peștilor. Deocamdată nu există niciun vaccin pentru a preveni și trata infecția cu Saprolegnia. Interesant ar fi pentru a preveni aceasta maladie să se dezvole un vaccin ce ar putea lua în considerare inducerea răspunsurilor imune la nivelul suprafețelor mucoase (Beacks și colab., 1994).

În serul de păstrav brun s-au găsit anticorpi specifici în urma injectării cu extracte de proteine antigenice de Saprolegnia parasitica. S-a secretat o proteina SpSsp1 ce are o expresie genică puternică exprimată în toate stadiile de miceliu ale Saprolegniei parasitica ce a fost testată. Anticorpi contra SpSSp1 au prezentat și peștii ce nu aveau saprolegnioze (Kirsty și colab., 2014).

Compuși organici

Compușii organici sunt compuși chimci a căror moleculă conține atomi de carbon. Contaminările cu Saprolegnia au fost ținute sub control prin utilizarea compușilor organici, având atât efecte benefice cât și efecte secundare. Există un număr mic de substanțe chimice folosite în tratamentul saprolegniozei.

Verdele de malachit

Verdele de malachit (figura 14) este un colorant toxic, ce diluat cu apă poate avea acțiune antiseptică locală și este un indicator de pH. Contaminarea peștelui are loc atunci când în crescătoriile piscicole se utilizează colorantul ca antifungic. Pătruns în intestinal peștelui are loc metabolizarea la leuco-malachit, forma lipofilică (depozitare în țesut adipos). Are o structură de compus bazic dar și de compus acid. Structura sub care este cel mai des întâlnit este cea de culoare verde. Absorbit în organism este în formă carbonilică, cu capacitate crescută de penetrare a membranei celulare. Odată pătruns în celulă este transformat în formă toxică leuco-malachit, cu remanență mare în organism, responsabil pentru efectele toxice.

Figura 14. Formele izomere ale verdelui de malachit (A- forma cromatică, B- forma carbinoliă, C-forma leuco)

Verdele malachit s-a utilizat pentru a controla saprolegnioza icrelor într-o concentrație cuprinsă între 3-5 1 mg/L timp de 60 de minute (Marking și colab., 1994). În cazul unor leziuni ușoare o expunere de 15 minute la o doză de 0,25 mg/L la o temperatură de 10°C pare a fi suficientă pentru a distruge miceliile dezvoltate pe pești ( Willoughby și Roberts, 1992).

În anul 2002 verdele de malachit a fost interzis la nivel mondial ( West, 2006). Odată cu interzicerea acestui compus, cercetările în domeniu au fost direcționate spre descoperirea sau îmbunătățirea aplicării unor alternative adecvate (Sun și colab., 2014). La puietul de păstrăv eclozat din ouă tratate cu doze mari de malachit verde au fost raportate anomalii ale coloanei vertebrale, ale capului, aripioarelor și ale cozii (Meyer și Jorgenson, 1983). În plus, a fost raportată alterarea funcției respiratorii la peștii expuși excesiv la tratamentul cu verde de malachit (Alderman, 1994).

Bronopolul

Bronopolul este un compus organic de consistență solidă, de culoare albă utilizat ca antimicrobian. El este produs al bromurării di (hidroximetil) nitrometanului, un biocid care este utilizat pe scară largă drept conservant în produsele medicinale și farmaceutice. Studiile efectuate la diferite ferme de păstrăv au arătat că bronopolul are o activitate terapeutică/profilactică împotriva infecțiilor cu Oomycete în fermele piscicole, dar fără o eficacitate comparabilă cu cea a verdelui de malachit. Studiile au arătat că o îmbăiere/zi cu 15 mg/L protejează în mod eficient peștele de infecția cu Saprolegnia, după cum îmbăierile realizate la concentrații crescute (100 mg/L) pentru 30 min zilnic, bronopolul este capabil să protejeze ouăle fertilizate de păstrăv curcubeu de infecțiile cu Saprolegnia (Pottinger și Day, 1999).

Medicamente antifungice de tipul clotrimazolului

Figura 15 –Clotrimazol

Clotrimazolul este un medicament antifungic ce se utilizează frecvent în tratamentul infecțiilor fungice la animale și la oameni.

Compuși anorganici

Compușii anorganici sunt compuși de origine minerală. Principalele clase de compuși anorganici sunt: săruri, oxizi, baze, acizi.

Formalina (formolul)

Formaldehida (soluția apoasă de formaldehidă 37% fiind cunoscută și sub numele de formol) este cea mai simplă aldehidă și este un gaz incolor cu miros. Formaldehida este o substanță uzuală în fabricarea echipamentelor sportive, a medicamentelor, a alimentelor, a încălțămintei, a componentelor pentru autovehicule, a hârtiei, a produselor textile. Formolul este un dezinfectant puternic folosit pentru distrugerea microorganismelor sau pentru conservarea specimenelor biologice. El a fost utilizat pe scară largă pentru controlul infecțiilor cu Oomycete în acvacultură (Walse și Phelps, 1993). Acesta acționează prin reacția cu proteine provenite din celule și acizi nucleici care modifică atât structura, cât și funcția. Astfel, gruparea aldehidică se poate combina cu atomul de azot sau alți atomi din structura proteinelor, sau cu doi astfel de atomi, dacă aceștia sunt foarte apropiați, formând o punte de legătură numită -CH2 metilenică.

Peroxidul de hidrogen

Peroxidul de hidrogen, (apa oxigenată, este un lichid incolor, cu formula chimică H2O2.) a fost identificat ca fiind un antifungic eficient, compus antibacterian și antiviral și este posibil, să reprezinte un oomicet important, cu impact redus asupra mediului (Marking și colab., 1994). H2O2 se formează și se produce în mod natural în mediul acvatic, fiind prezent la diferite nivele naturale în apă, ca urmare a mai multor procese care implică producția și descompunerea sa naturală precum procesele fotochimice care implică materia organică dizolvată ce absoarbe lumina și oxigenul molecular (Cooper și Zika, 1983, Szymczak și Waite, 1989). Reacția decurge între carbonul organic dizolvat provenit din substanțele humice care este excitat de lumina ultravioletă în mediile cu apă dulce și marină și anionul superoxid care disproporționează și protonează pentru a forma H2O2 și oxigen (Cooper și colab., 1994). Este miscibilă în orice proporție în apă și este solubilă în eter și alcool. H2O2 are o constantă dielectrică mare, apropiată de a apei, fiind un bun dizolvant ionizabil față de săruri, în cazurile în care nu se manifestă ca oxidant. H2O2 este instabilă, se descompune spontan, rezultând apă și oxigen. Viteza de descompunere este influențată de o serie de factori ca: lumină, caldură și catalizatori. Apa oxigenată este utilizată ca antiseptic sub forma unei soluții diluate. H2O2 este clasificată ca fiind de o toxicitate scăzută putând fi utilizat în controlul Oomycetelor asupra tuturor speciilor și etapele de viață ale peștilor (Schreier și colab,1996). Cu toate acestea, eficacitatea H2O2 pare a fi influențată de nivelul de calitate a apei, temperatura și populațiilor de Saprolegnia spp (Barnes și colab, 1998).

Clorura de sodiu/calciu

Clorura de sodiu (sarea de bucătărie ) este sarea sodiului cu acidul clorhidric și are formula NaCl. Clorura de sodiu se obține prin reacția dintre acidul clorhidric și hidroxidul de sodiu. Clorura de calciu este o sare a calciului cu acidul clorhidric cu formula chimică CaCl2. Amestecul de săruri poate reprezenta un mijloc profilactic împotriva saprolegniozelor. Astfel, s-au evidențiat mortalități ale ouălelor reduse după un tratament cu un amestec de clorură sodiu și clorură de calciu (în raport 26:1) care se aplică în cantitate de 20 g/L, timp de 1 oră, de trei ori pe săptămână. Îmbunătățirea ratei de incubație însoțită de o scădere a infecției cu Saprolegnia a fost observată în cazul icrelor de păstrăv expuse la o baie cu NaCl 30g/L. De altfel, clorura de sodiu la concentrații mari, 29g/L este letală pentru Saprolegnia (Marking și colab.,1994; Pickering, 1994) și este eficientă pentru controlul S. parasitica (Willoughby, 1994).

Sulfatul de cupru

Sulfatul de cupru, (CuSO4) este cunoscut și sub numele de piatră vânătă. Sulfatul de cupru (II) se obține în urma reacției oxidului de cupru sau a cuprului cu acidul sulfuric. În industrie se obține prin tratarea cuprului cu acid sulfuric diluat în prezență de aer.

Studiile au arătat că sulfatul de cupru a putut influența în mod semnificativ creșterea miceliului și a zoosporilor de S. parasitica. Astfel, sulfatul de cupru în concentrație ≥0,5 mg/L a inhibat dezvoltarea miceliului în timp ce zoosporii primari nu au fost eliberați la concentrații ≥1 mg/L. Cu toate acestea, din cauza caracterului de sulfat de cupru la care unii pești sunt extrem de sensibili s-a utilizat numai ca aditiv în doze mici pentru a reduce infecțiile cu S. parasitica ( Sun și colab., 2014).

Acidul boric

Formula chimică a acidului boric este H3BO3. Acidul boric este utilizat ca antiseptic și ca insecticid (în combaterea dăunătorilor și ciupercilor). Recent studiile au investigat capacitatea acidului boric de a controla infecțiile cu Saprolegnia. În vitro acidul boric a redus activitatea de sporulare a Saprolegniei și a redus și creșterea miceliului. S-a dovedit că utilizarea acidului boric reduce mortalitatea alevienilor în timpul infecției cu Saprolegnia (Ali și colab.,2015).

Acidul peracetic (PAA)

Este un compus organic ce are formula CH3CO3H. Acidul peracetic similar formolului este considerat a fi un potențial antimicrobian (Pederen și colab.,2013).

Compuși naturali cu activitate inhibitorie a Saprolegnia spp.

Infecțiile cu Saprolegnia sunt dificil de prevenit și de tratat. Există câteva chimicale aprobate pentru a fi folosite în avicultură. Verdele malachit este considerat a fi cel mai eficient chimical pentru controlul Saprolegniei. Totuși, se pare că este cancerigen și poate provoca mutații genetice, substanța este interzisă în mai multe țări. Formalina este de asemenea eficientă în tratarea Saprolegniei și este mai puțin riscantă. Peroxidul de hidrogen este promițător pentru tratarea Saprolegniei, având un impact minim asupra mediului inconjurator. În industriile de acvacultură, infecțiile cu Saprolegnia spp., au fost controlate în mod eficient cu diverse fungicide sintetice (cum ar fi verde malachit, formol sau peroxid de hidrogen) sau biocide (bronopol). Utilizarea acestor tipuri de compuși a dus la o serie de probleme, inclusiv dezvoltarea rezistenței față de fungicide și efectele potențial dăunătoare pentru sănătatea umană. Preocupările publice tot mai mari asupra siguranței utilizării fungicidelor și posibilelor daune asupra mediului au avut ca rezultat o atenție sporită acordată probelor naturale utilizate în controlul și prevenirea bolii. Un model bine cunoscut pentru a reduce proliferarea microorganismelor este cel de utilizare a uleiurilor esențiale sau extracte din plante datorită unor șanse mici de a fi toxice. Astfel, o serie de produse din plante au fost evaluate pentru proprietățile lor toxice împotriva diferitelor ciuperci acvatice, în special sub formă de uleiuri esențiale, care s-au dovedit a fi inhibitori împotriva Saprolegnia sp., în funcție de concentrația lor, metoda de testare și constituenții activi prezenți în preparat. ( Madrid și colab., 2015).

Laureliopsis philippiana (looser) R.Schodde (sinonim Laurelia philippiana) este un arbore, care crește în zonele forestiere din sudul Chilei și Argentinei și sub denumirea de “TEPA” sau “Huanhuan”. Extractele din frunzele sale, flori și scoarța de copac au fost utilizate în mod tradițional de către oamenii Mapuche din Chile ca anti-inflamatoare și pentru tratamentul contra răcelii și durerilor de cap. Inițial studiile s-au axat pe caracterizarea chimică a unor compuși cu aplicații în industria medicamentelor. Studiile fitochimice pe frunze și scoarța de L.philippiana au un conținut ridicat de alcaliozi. Studiile au mai determinat și o activitate antifungică și insecticidă a uleiurilor din frunze de L.philippiana, totuși neexistând nici o informație cu privire la eficacitatea uleiului esențial de L.philippiana împotriva ciupercilor acvatice, în special Saprolegnia spp. ( Madrid și colab., 2015).

Figura 16. Frunze de Laureliopsis philippiana (http://www.patagoniaplants.com/products/trees/laureliopsis-philippiana/detailed-product-flyer.html)

Acidul Ellagic, inhibitor natural al fungilor

Structura Ellagitaninelor și a Acidului Ellagic

Elagitaninele (ET) sunt polifenoli bioactivi abundenți în fructe, nucifere și semințe precum rodii, mure, zmeură, căpșuni, migdale și nuci (Amakura și colab., 2000; Clifford și Scalbert, 2000). ET aparțin taninelor hidrolizabile, o clasă de polifenoli, fiind derivați complecși ai acidului ellagic (EA) (Quideau și Feldman, 1996). Hidroliza ET cu acizi sau baze produce acid hexahidroxidifenic (HHDP), care suferă spontan un proces de lactonizare în EA. Această reacție a fost utilizată pentru detecția și cuantificarea ET ca echivalenți EA în urma hidrolizei acide a probelor alimentare (Daniel și colab., 1989). De asemenea, în tractul gastrointestinal uman, ET ingerați prin dietă sunt hidrolizați, rezultând EA. Atât ET, cât și EA sunt metabolizați de flora microbiană a colonului, fapt observat la diferite mamifere, inclusiv șobolani (Cerda și colab., 2003), porci (Espin și colab., 2007) și oameni (Cerda și colab., 2004). În toate aceste cazuri, atât EA și ET produc dibenzopiranone, cunoscute și drept urolitină A (3,8-dihidroxi-6H-dibenzopiran-6-onă), dar și monoxidroxilatul analog al acesteia, urolitină B (Cerda și colab., 2004). Prin urmare, în intestin, EA poate fi transformat prin reacții de decarboxilare, dehidroxilare sau prin clivarea inelului lactonic (Selma și colab., 2009).

Spre deosebire de distribuția limitată în natură a galotaninelor, ET sunt, în general, în constituția diferitor familii de plante (Niemetz și Gross, 2005). Cu peste 500 de compuși caracterizați până în acest moment, ET constituie cel mai mare grup de tanine cunoscut până acum (Khanbabaee și van Ree, 2001). De asemenea, aceștia joacă un rol important în nutriția umană și sunt dotați cu o gamă variată de proprietăți biologice, inclusiv proprietăți antioxidante (Mullen și colab., 2002), anticancer (Larrosa și colab., 2006), anti-aterosclerotice (Aviram și colab., 2004), anti-inflamatorii (Masamune și colab., 2005), antihepatotoxice (Lin și colab. 2001), antibacteriene (Akyiama și colab., 2001) și anti-HIV replicare (Martino și colab., 2004).

Observația că un număr mare de tanine poate fi fracționat hidrolitic în componentele sale, spre exemplu, prin tratament cu apă fierbinte, acizi, baze sau tanaze, a dus la clasificarea taninelor, precum ”tanine hidrolizabile” (Khanbabaee și van Ree, 2001). Proantocianidinele nonhidrolizabile oligomerice și polimerice sunt clasificate drept tanine condensate (Khanbabaee și van Ree, 2001). Prin urmare, termenul ”tanine hidrolizabile” include atât galotaninele, cât și ET. Trebuie menționat că există ET care nu sunt hidrolizabile, datorită unei cuplări adiționale C-C a restului poligenolic cu unitatea poliol, însă sunt clasificate drept tanine hidrolizabile datorită motivelor istorice (Khanbabaee și van Ree, 2001).

ET alcătuiesc o clasă complexă de polifenoli, caracterizate prin unul sau mai multe fragmente hexahidroxidifenoil (HHDP) esterificate cu un glucid, în general glucoză. Fragmentele HHDP sunt formate prin cuplare oxidativă (cuplare C-C) între resturi vecine galoil (Khanbabaee și van Ree, 2001). Compușii ET au o variabilitate structurală foarte mare datorită diferitelor posibilități de legare ale resturilor HHDP cu fragmentele de glucoză, în special datorită tendinței puternice de a forma derivați dimerici și oligomerici (Niemetz și Gross, 2005). ET sunt în general labile atât în soluție, cât și în spațiu liber, sub acțiunea reacțiilor de hidroliză și polimerizare (Klumpers și colab., 1994). Procesul de polimerizare poate duce la insolubilizarea ET și/sau la atașarea covalentă a acestora la componentele peretelui celular (Helm și colab., 1997). În cazul hidrolizei ET cu acizi sau baze, legăturile esterice sunt hidrolizate, iar gruparea HHDP se rearanjează spontan în EA, care este foarte puțin solubil în apă (Clifford și Scalbert, 2000). EA, un derivat dimeric al acidului galic, este găsit în vacuolele plantelor, fie în formă liberă, ca EA sau derivați ai EA, fie legat, ca ET solubili în apă. (Amakura și colab., 2000). Diverși derivați ai EA există în plante, formați prin metilarea, glicozilarea și metoxilarea grupărilor hidroxil (Maas și colab., 1991). În plus, în cadrul procesării alimentelor, ET se poate modifica în EA liber sau derivați ai EA (Bakkalbasi și colab., 2009). Solubilitatea, mobilitatea și reactivitatea acestori derivați sunt diferite în plante și în sistemele animale. (Rommel și Wrolstad, 1993).

Figura 17. Exemple de ellagitanine (Landete, 2011)

Eficiența ET și a EA drept compuși antioxidanți este dependentă de structura chimică a acestora. Prezența a diferitor funcții hidroxi în poziție orto în cadrul ET este responsabilă pentru abilitatea puternică de a dona un atom de hidrogen și de a susține electronul nepereche (Nicoli și colab., 1999). Eficiența ET și EA ca antioxidanți este corelată în mod direct cu gradul acestora de hidroxilare și scade odată cu prezența fragmentelor glucidice. EA liber, derivații EA și formele legate ca ET apar în natură în diferite specii de plante cu importanță economică, în special în fructe și în nucifere (Clifford și Scalbert, 2000). Cantitatea de EA din alimente este determinată drept EA liber și/sau EA total rămas în urma hidrolizei acide.

Proprietățile Acidului Ellagic

ET și EA sunt consumate constant în fructe, semințe și în alimentele sau băuturile pe bază de sucuri din fructe și gemuri, etc. (Clifford și Scalbert, 2000). Bacele din familia Rosaceae (mur pitic, zmeură și căpșuni) conțin niveluri crescute de echivalenți EA, în timp ce niveluri scăzute se găsesc în cătina albă (familia Elaeagnaceae). Rodia este o sursă bogată în ET. Extractele de zmeură și căpșuni conțin în special sanguiin H-6, precum și variați derivați EA. Extractul de nucă conține, pe lângă multe altele, pedungulagină, dilactona acidului valoneic și casuarictină, sanguiin H-5 din strugure tămâios și vescalagină, castalagină, dar și roburină E din lemn de stejar. Cantități crescute de ET și de EA au fost observate în căpșuni, merișoare, afine și mure (Kahkonen și colab., 2001). Kahkonen și colab. (2001) au demonstrat că în familia Rosaceae, genul Rubus (mur pitic și zmeură roșie), fenolii majori găsiți au fost ET, iar în genul Fragaria (căpșuni), ET erau al doilea cel mai mare grup după antocianine. Nivelul EA libere a fost 40-50% din totalul EA prezent în toatel bacelor analizate, cu excepția murelor Boysen. Nivelul tuturor EA variază de la 47 mg/g în zmeura roșie la 90 mg/g la zmeura neagră. Acești autori au descoperit faptul că murele Boysen sunt unice, datorită faptului că totalul EA este reprezentat de EA liberi.

Rezultatele publicate de către Maattaa-Riihinen și colab. (2004) asupra compoziției totale a ET sunt similare cu compoziția observată de alți autori. Conform acestor rezultate, compoziția (mg/100g masă proaspătă) este aproximativ 65-86 în căpșuni, 190 în zmeura cultivată, 270 în zmeura sălbatică, 390 în Rubus arcticus și 360 în mur pitic. De asemenea, galoil esterii solubili au fost găsiți a fi o clasă fenolică de seamă în căpșuni, Rubus arcticus și mur pitic, dar nu și în zmeură. ET au fost monitorizate în 33 de alimente de către Koponen și colab. (2007), dar au fost observate doar în 5 specii de bace, mai exact în mur pitic, zmeură, măceșe, căpșuni și cătină, conținutul fiind variat, de la 1 la 330 mg/100g. În studii anterioare (Hakkinen și Torronen, 2000), frunzele măceșe (Rosa rugosa) și cătină (Hippophae rhamnoides) s-a observat că prezintă ET. Totalul conținutul în EA din nuci și nuci pecan a fost înregistrat ca fiind 59, respectiv 33 mg/100g cantitate uscată (Daniel și colab., 1989). Fukuda și colab. (2004) au descoperit că proporția de EA din fracția fenolică extrasă din nucă este de 15.8%. EA nu a fost observată în alte specii de struguri cu excepția strugurilor tămâioși (Vitis rotundifolia). Extrasul din strugurii tămâioși roșii este considerat a avea cea mai mare concentrație de EA liberi (49.7 mg/kg) și un total de glicozide EA (86.9 mg/kg) (Lee și Talcott, 2004).

ET se găsesc în vin datorită extracțiilor acestora din butoaie sau surcele de stejar (Puech și colab., 1999). În cadrul îmbătrânirii alcoolului în butoaie de stejar, vescalagina poate fi extrasă din lemn și poate fi transformată ulterior în noi derivați prin reacții chimice. Vescalagina este una dintre cele mai abungente ET extrase din lemnul de stejat cu ajutorul vinului alb. Totodată, stricnina este unul dintre ET extrași din ceai, fiind aproximativ 0-1% din greutatea uscată a acestuia. În merele roșii, portocale, grapefruit, tangerine, piersici, pere, struguri, cireșre, boabe de soc, prune, kiwi, arahide, caju și nuci braziliene, concentrația de EA se consideră a fi sub limita de detecție a sistemelor HPLC (Daniel și colab., 1989). Prezența EA în semințe a fost demonstrată de către Bushman și colab. (2004), care consideră că semințele de zmeură roșie și neagră conțin 8.7 respectiv 6.7 mg/g sămânță EA, iar murele Boysen, murele Marion și murele Evergreen conțin 30, 32, respectiv 21 mg/g. Alte studii au descoperit că extractul etanolic de semințe longan și miez de mango conține 1.6, respectiv 1.2 mg/g sâmănță EA (Soong și Barlow, 2006), în timp ce urme de EA au fost înregistrate în semințele castanelor (Vekiari și colab., 2008).

Polifenolii sunt constituenti des întâlniți în mancare ce provin din plante și reprezintă antioxidanții din dieta alimentară. Consumul alimentar al polifenoilor a fost estimat la aproximativ 1 g/zi de (Scalbert și Williamson, 2000). Studii mai recente au demonstrat că în dieta spaniolă consumul zilnic de polifenoli se înregistrează între 2590 și 3016 mg/zi (Saura-Calixto și colab., 2007). Despre consumul alimentar al polifenolilor nu există date exacte disponibile; numai puține estimări sunt disponibile în literatură, iar cunoștiințele reduse despre conținutul ET și EA în alimente face dificilă evaluarea exacta a consumului.

Fructele roșii precum căpșunii, zmeura și murele reprezintă principalele fructe ce contibuie la aportul de ET în dietele occidentale. Principala sursă alimentară de ET în Franța îl constituie fără îndoială căpșunii. Fracezii consumă anual o medie de 1,7 kg de căpșuni proaspeți și din nou acceași cantintate în produse prelucrate (iaurturi, produse de patiserie, siropuri, dulciuri, conserve). Acest lucru ar coresunde unei consumații zilnice de 0,2-0,3 mg EA numai în cazul consumului de căpșuni proaspeți (Clifford și Scalbert, 2000). Și mai greu de evaluat este contribuția consumului de vinuri (60 L/an în medie în Franța, majoritar vinul roșu) la aportul de ET, deoarece depinde de procesul de îmbătrânire în butoaiele de stejar. Însă, vinul este probabil o sursă minoră de ET deoarce mare majoritate a vinului consumat nu este îmbătrânit în butoaie de stejar și rareori în butoaie noi, boagte în ET. Consumul zilnic de EA de către barbații și femeile bavareze a fost estimat la 4,9 și resprectiv 5,4 mg/zi (Radtke și colab., 1988).

În alimentele finlandeze ET este prezent aproape exculsiv în anumite fructe de pădure ce aparțin de familia Rosaceae și nu în alte fructe sau legume (Koponen și colab., 2007). Rezultatele obținute de Koponen și colab. (2007) sunt disponibile la Finnish Food Composition Database Fineli (disponibil pe http://www.fineli.fi) ținute de Institutul Național al Sănătății Publice din Finlanda. Astfel, estimările de aport zilnic al ET din dieta finlandeză pot fi calculate cu ajutorul acestei baze de date, care arată că aportul zilnic de ET (12 mg/zi) în Finlanda (Ovaskainen și colab., 2008) este mai crescut decât cel din Germania (5 mg/zi) (Radtke și colab., 1988). În cazul ambelor studii s-au folosit fructele de pădure drept surse pentru ET.

Un studiu recent realizat de Tomas-Barberan și colab. (2009) a sugerat că aportul dietetic de ET ar putea fi mai mare decât sugerat anterior, mai ales dacă se consumă periodic alimente bogate în ET.

Cu toate că există foarte puține informații în ceea ce privește absorbția și metabolismul ET la oamnei, studiile realizate pe șobolani, șoareci și porci au condus la elucidarea meatabosimului ET. Studii anterioare realizate pe conținutul intesinal al șobolanilor au arătat că ET intra într-o reacție de hidroliză rezultând EA datorită pH-ului din intestinul subțire si cec (Daniel, Ratnayake, Kinstle, și Stoner, 1991). Acești autori au sugerat că microbiota cecului participă la reacția de hidoliză. Mai mult, s-a constatat că 10% din doza de EA administrată șobolanilor a fost absorbită și excretată sub formă de metabolit în urină și fecale (Doyle și Griffiths, 1980) în timp ce murinelor li s-a administrat o doză mai mare de EA, iar rata de absorbție în cazul acesta este de 28% (Teel și Martin, 1988). Seram, Lee și Heber (2004) au demarat un studiu in vivo în care un subiect uman a consumat suc de rodie; după o oră de la ingestie s-au putut detecta în plasma acestuia EA la concentrație maximă, însă a fost rapid elimiat după 4 ore. Prin urmare, EA liber găsit în plasma umană se poate datora eliberării sale din hidroliza ET, facilitată fie de pH-ul fiziologic fie de mcrobiota intestinală.

Studii recente în ceea ce privește metabolismul ET și EA au fost realizate de González-Barrio, Borges, Mullen și Crozier (2010) în care au oferit zmeură către voluntari umani. Recuperarea EA din lichidul ileal a fost de 241%, indicând hidroliza ET care a avut loc în stomac sau în intestinul subțire. Excreția urinară a EA și a unui EA-O-glucuronid a fost mai mică de 1%, în timp ce forme intacte sau conjugate de ET nu au fost detectate în urină.

Mertens-Talcott, Jilma-Stohlawetz, Rios, Hingorani și Derendorf (2006) și Borges și colab. (2007) a observat și ei modul în care ET dispare rapid după ce a fost consumat. Cerdá și colab. (2003) a arătat cum 3-6% din punicalagina ingerată a fost detectată ca atare sau ca metaboliți în urină și fecale, deși majoritatea ET au fost transformate în metaboliți nedetectabili cum ar fi CO2 sau substanțe care se acumulează în țesuturi neanalizate. Astfel, ET nu este de obicei absorbit și trebuie metabolizat înainte de absorbție.

Cu toate acestea, EA și metaboliții derivați ai EA: urolitină A, hidroxi urolitină A, urolitină A-glucuronidă, au fost găsite de Mertens-Talcott și colab. (2006) după ce sucul de rodie a fost consumat de voluntari. Rezultatele lor au indicat că EA din extract este biodisponibil, cu o concentrație maximă de 33 ng / ml la o oră după administrare. Urolitinele A și B au fost detectate după opt ore și 24 ore la trei din cei 11 subiecți, în timp ce urolitina A-glucuronida a fost detectată la șase din cei 11 subiecți. Hidroxil-urolitina A a fost găsită la trei subiecți la mai multe momente de timp între două și 24 de ore. De asemenea, urolitină A-glucuronida a fost găsită pe o perioadă de 2-24 ore la șase dintre subiecți, în timp ce acidul dimetil glucuronid ellagic a fost detectat la doi subiecți după opt și 24 ore.

Cerda, Periago, Espín și Tomás-Barbera (2005) au investigat metabolismul diferitelor ET dietetice și a derivaților EA în patruzeci de voluntari sănătoși, distribuiți în patru grupe. Fiecare grup a consumat o doză dintr-un anumit produs alimentar care conține ET. Nici ET-urile, nici EA nu au fost detectat în urină. Cu toate acestea, urolitina B conjugată cu acid glucuronic a fost detectată la toți subiecții, indiferent de produsul alimentar consumat. În fiecare grup au fost remarcate diferențe semnificative individuale, identificând "metaboliți excretați ridicați. Conform rezultatelor obținute de Cerda, Periago și colab. (2005a), derivații urolitinei B au fost excretați independent de ET consumat. Recent, González-Barrio și colab. (2010) au observat, de asemenea, modul în care ET au fost catabolizate cu apariția urolitinei A-O-glucuronidă, doi izomeri ai acesteia și urolitinei B-O-glucuronidă, care au fost colectați din urină la 7-48 ore după consumul de zmeură.

Studiile ulterioare arată că urolitinele apar în sistemul circulator uman după câteva ore de la consumul de rodie, atingând concentrații maxime între 24 ore și 48 ore. Sunt prezente în plasmă și în urină până la 72 de ore, în forme libere sau conjugate (Seeram și colab., 2006).

Deși concentrația maximă în plasmă depășește rar 1 mM după consumarea a 10-100 mg dintr-un singur compus fenolic, concentrația totală de fenol din plasmă este probabil mai mare datorită prezenței metaboliților formați în țesuturile organismului sau prin microbiota colonică (Scalbert și Williamson, 2000).

Absorbția fenoliilor alimentari este determinată în primul rând de către structura lor chimică, care depinde de factori precum gradul de glicozilare, hidroxilare, acilare, conjugare cu alțo fenoli, dimensiunea moleculară, gradul de polimerizare și solubilitate (Karakaya, 2004).

Figura 18 Metabolismul ellagitaninelor (Landete, 2011)

Porcii iberici au fost utilizați de Espin și colab. (2007) ca model animal la elucidarea metabolismului ET. Porcii au fost hrăniți cu amimente bogate în ET precurm furaje de cereale, sau cu ghinde. Acest studiu a arătat că ET eliberează în condiții fiziologice in vivo EA și că acesta este apoi treptat metabolizată în intestin, începând din jejun, pentru a produce urolitină D, urolitină C și, în final, urolitină A și urolitină B. Urolitină B este produs în principal în părțile distanțate ale intestinului. În plus, analizele țesuturilor intestinale arată că metaboliții sunt absorbiți preferențial atunci când crește lipofilitatea acestora.

Consumul de ET și EA este asociat cu excreția urinară de metaboliți cu structura dibenzopiran-6-onei, în principal urolitină A și B, care de asemenea sunt întâlniți sub formă conjugată în plasmă după consumul de derivați ai EA (Cerda și colab., 2005). Existând o mare variabilitate între indivizi, aceasta poate fi observată în producerea și excreția metaboliților, iar faptul că uroliții sunt excretați independent din consumul de ET, sugerează că la acei indivizi cu floră microbiană este capabilă de degradarea ET și de transformarea metaboliților în dibenzopiran-6-onă (Cerdá și colab., 2005).

Originea unor fitoestrogeni , precum echol, enterodiol și enterolactonă a fost sugerată și ulterior, demonstrată drept fiind mediată microbian; de fapt, microorganismele care produc acești fitoestrogeni au fost izolate și identificate (Clavel și colab., 2006). Mai mult, originea mediată microbian a urolitinei a fost sugerată si demonstrată din probe de fecale ale unor voluntari (Cerda și colab., 2005); cu toate acestea, microorganismele producătoare de echol nu au fost până acum izolate.

Au existat mai multe studii care au încercat evaluarea capacității microflorei din fecalele umane de a metaboliza EA și produșii acestuia ( ET punicalagin și surse bogate în ET precum extractul de nuc) în vederea producerii unor derivați ai dibenzopiran-6-onei și în special a urolitinei A. Aceasta a fost testată prin adăugarea unor probe de EA și ET la nivelul unor culturi din microbiota colonului uman, crescute din probe de fecale umane donate de mai mulți voluntari sănătoși, pentru observarea ulterioară a producerii de urolitină A prin HPLC-MS (Cerda și colab., 2005).

Pe de altă parte, a fost preparată o suspensie din fecale de șobolani și după centrifugare, supernatantul a fost folosit drept suspensie de microbiotă (Ito și colab., 2008). Un alicot al suspensiei a fost incubat cu ET și după o incubare de 96 ore, amestecul de reacție conținea diferite urolitine.

Cerda și colab. (2005) a observat modul în care urolitina A a fost produsă după fermentație la rate și concentrații de producție foarte diferite. Această mare variabilitate în concentrația de metabolit și în cinetica producerii de metaboliți este consecventă cu marea variabilitate găsită în excreția acestor metaboliți în urină in vivo, după consumul de ET și cu diferențe în compoziția microflorei fecalelor.

Atât ET cât și EA sunt metabolizate în mare măsură de către microbiota colonului diferitelor mamifere, inclusiv cea a șobolanilor (Cerda și colab., 2003), porci (Espin și colab., 2007) și a oamenilor ( Cerda și colab., 2004). În toate aceste cazuri, atât EA cât și ET produc dibenzopiranone cunoscute drept urolitina A ( 3,8-dihidroxi-6H-dibenzopiran-6-onă) și analogul său monohidroxilat cunoscut drept urolitina B (Cerda și colab., 2004). Principalele dibenzopiranone raportate in vivo sunt urolitinele A și B. Prin urmare, în intestin, EA pare să fie transformat de către microorganisme prin scindarea inelului lactonei, decarboxilare și reacții de dehidroxilare.

Studii recente realizate de Gonzalez-Barrio și colab. (2010) au sugerat că există o mare variație de la persoană la persoană în ceea ce privește momentul, cantitatea și tipul de urolitine excretate în urină. Aceste variații dintre indivizi în ceea ce privește excreția urinară a urolitinelor este aproape sigur datorită degradării ET, fiind dependentă de compoziția microflorei colonului. Variabilitate similară a fost observată și în alte studii cu zmeură și suc de rodii ( Cerda și colab.,2004).

Deși se propune originea mediată microbian a urolitinelor, încă sunt necunoscute bacteriile specifice care sunt implicate în aceste procese. Condițiile de mediu de la nivelul colonului implicate în producția urolitinelor au fost descoperite. Deși producția de urolitine a fost stabilită in vitro, motivul pentru eșecul identificării sau izolării bacteriilor poate fi pus pe necesitatea condițiilor de cultura anaerobă și a unor constituenți specifici de mediu.

Rolul Acidului Ellagic

Deoarece Acidul Ellagic prezintă o grupare hidroxil în poziția orto, el poate acționa mai degrabă ca și substrat pentru Tirozinază decât ca și inhibitor. Deoarece Tirozinaza este principala enzimă reglatoare a căii metabolice melanogenă, inhibiția ei de către EA rezultă în inhibiția și reducerea cantității de melanină și de aceea el este folosit în anumite produse cosmetice ce au ca scop albirea tenului (Egawa și colab., 1993).

Un alt efect al EA este datorat puterii antioxidative care interacționează cu o-chinonele și semichinonele din calea metabolică de melanogeneză (Munoz-Munoz, 2009). Puterea antioxidativă a EA este de 20 de ori mai mare decât a acidului ascorbic care reprezintă standardul internațional al puterii antioxidative (Brand-Williams, 1995). Astfel EA inhibă melanogeneza „capturând” o-chinonele, semichinonele și anionii superoxid care au loc în reacțiile acestei căi metabolice și care sunt necesari ulterior pentru producerea moleculelor de melanină.

În acest context scopul lucrării de față l-a reprezentat testarea activității antifungice a unui extract de coajă de rodie îmbogățit în EA asupra unei culturi de Saprolegnia parasitica, izolată de noi.

Capitolul IV:

Materiale și metode

Mediile de cultură folosite pentru creșterea Saprolegnia parasitica

Pentru efectuarea experimentelor s-a utilizat o cultură de Saprolegnia spp. din colecția de microorganisme a Departamentului de Biochimie și Biologie Moleculară a Facultății de Biologie, Universitatea din București, cultură izolată dintr-un acvariu cu pești bolnavi de saprolegnioză.

Ca și medii de cultură s-au folosit:

Mediul Cartof-Dextroză-Agar este un mediu util pentru creșterea fungilor, drojdilor și a oomicetelor. Este un mediu complex, tulbure care asigură necesarul de nutrienți și micronutrienți de care poate avea nevoie microorganismul (mo). Mediul se obține în felul următor: se fierb 100 g cartofi tăiați bucățele 10 minute în 500 ml apă distilată, se recuperează infuzia și se aruncă bucățile de cartofi, se adaugă 10g glucoză și 10g agar, se aduce la un volum final de 500ml cu apă, se sterilizează la autoclav la 1210C timp de 15 minute, apoi când temperatura ajunge la 500C se adaugă 240 mg de Cloramfenicol și se toarnă în plăci Petri sterile. După solidificare plăcile sunt gata de însămânțat. Pentru o mai bună reproductibilitate am înlocuit cele 100g de cartofi cu 25g de fulgi de cartofi, ei rămânând în mediul de cultură. Fulgii de cartofi au fost produși de Compania Indiilor Orientale.

Mediul lichid Peptonă-Glucoză-Sare este un mediu cu o ușoară culoare galben pal, însă este transparent putându-se realiza o citire de turbiditate la spectrofotometru fără ca mediul de cultură să interfereze. De asemenea asigură tot necesarul de nutrienți pentru creșterea mo de interes. Mediul se realizează în felul următor: în 500ml de apă distilată se dizolvă 10g peptonă bacteriană, 5g glucoză, 2,5g NaCl, apoi se ajustează pH-ul la 7,2 utilizând HCl și NaOH. Se sterilizează la autoclav la 1210C timp de 15 minute, se asteaptă răcirea lichidului și se repartizează in vasele de cultură sterile lucrând steril la hota cu flux laminar. După însămânțare culturile sau incubat la 300C.

Figura de mai jos prezintă o imagine cu S. parasitica după o săptămână de la însămânțare.

Figura 19. Imagine cu S. parasitica după o săptămână de la însămânțare.

Procedeul de extracție a acidului ellagic din fructul de Punica granatum

Metoda a fost adaptată după metoda descrisă de Lu și Yuan (2008) urmărindu-se în genberal schema de mai jos:

Figura 20. Schema de izolare a acidului elagic. După Lu și Yuan (2008)

Am realizat extracția de Acid Ellagic în felul următor: Am tăiat o rodie în 4 bucăți egale pe care le-am lăsat la etuvă la o temperatură de 600C timp de 2 săptămâni. Din fructul uscat am ales 10g de coajă pe care le-am taiat în bucăți cât mai mici posibile. Cele 10g le-am mojarat în prezența a 100ml soluție de Etanol 20%. Rezultatul mojarării l-am supus unui tratament pe baie de apă la 800C timp de 2 ore (h). După o agitare manuală de 2 minute, am trecut tot conținutul prin hârtie de filtru, am păstrat filtratul, iar peste materia solidă colectată am adăugat din nou 100ml solutie etanol 20% și am urmat pașii anteriori, ulterior acest al doilea filtrat l-am reunit cu primul.

Figura 21. Prima etapă de filtrare

S-a măsurat volumul acestei soluții și se adaugă acid sulfuric (H2SO4 ) pentru a se ajunge la o concentrație de 5%. Respectivul amestec este supus unui tratament la autoclav la o temperatură de 1150C timp de 3h în cadrul căreia se produce hidroliza ellagitaninurilor în prezența acidului sulfuric și rezultă acid ellagic. Următorul pas este încă o trecere prin hârtie de filtru, filtratul rezultat se centrifughează la 5000g timp de 20 de minute, se colectează supernatantul intr-un pahar Berzelius. Se plaseazâ timp de 2 zile la o etuva la 400C și apoi încă o săptămână la temperatura camerei. Lichidul rezultat este extractul de Acid Ellagic și este foarte vâscos.

Metodă de identificare a Acidului Ellagic-Cromatografie în strat subțire

Cromatografia în strat subțire se realizează în 3 sisteme diferite. Toate sistemele folosesc pentru faza staționară Celuloză, Silicagel și Silicagel cu proprietăți fluorescente atunci când se iluminează la UV. Toate aprovizionate de la firma Sigma. Se realizează manual tăierea cu foarfeca a suporturilor în formă dreptunghiulară de 5cm x 10cm. Pe suporturi se trasează ușor cu creionul o linie la o înălțime de 1,5 cm pe care linie se vor depune spot-urile de migrat. Spoturile sunt mereu de la stânga la dreapta proba, tanin și acid galic. Taninul și acidul galic provin din soluții standard de 5%. După de punearea spot-urilor, suorturile se usucă cu un uscător de păr și sunt introduse in tank-ul unde se află faza mobilă pentru începerea migrării, faza mobilă nu trebuie să depășească linia marcată. Migrarea se lasă pănă când frontul ajunge la 3 sferturi din înălțimea suportului. Proba este de fapt extractul de Acid Ellagic diluat 1:25 cu alcool Etilic absolut.

Fazele mobile ale celor 3 sisteme au fost:

A toluen:acetat de etil:metanol:acid formic în proporție de 10:9:6:5

B cloroform:metanol în proporție de 30:15

C metil etil cetonă:acid formic în proporție de 60:40

Analiza cantitativă a Acidului Ellagic-Metodă spectrofotometrică

Scopul este să măsurăm cantitatea de Acid Ellagic din extract pe baza legii Lambert-Beer DO=ε·c·l unde l este lungimea cuvei de 1cm. Se folosește un tampon:

La 100 ml apă deionizată se adaugă 0,24228g de TRIS și 0,876g de NaCl, după care la un pH-metru se ajustează pH-ul la 7,4 cu ajutorul HCl.

Proba de analizat se realizează: la 1 parte extract obținut de acid ellagic se adaugă 99 părți de soluție tampon. Absorbbanța probei se măsoară la spectrofotometru la lungimea de undă 360 nanometri (nm). Din literatură cunoaștem coeficientul de extincție (ε) al acidului ellagic în acest tampon este de ε360=1.62x104M-1cm-1 (Bock și colab., 1981)

Efectul Acidului Ellagic asupra creșterii Saprolegniei pe icre de pește

Un test practic al efectului Acidului Ellagic asupra creșterii Saprolegniei pe icre de pește este însămânțarea unor icre cu Saprolegnia în prezența unor cantități de acid ellagic, astfel avem 2 tipuri de icre, crap și somon aprovizionate de la Metro®. Tabelul următor prezintă procedura:

Tabel 2. Cantitățile materialelor din eprubete

Figura 22. Eprubetele cu icre de somon la începutul experimentului

Figura 23. Eprubetele cu icre de crap la începutul experimentului

Efectul Acidului Ellagic asupra creșterii Saprolegniei pe mediu solid

O altă metodă de a testa efectul Acidului Ellagic asupra Saprolegniei este un test de inhibiție de creștere pe mediu solid. Astfel am însămânțat în pânză 4 placi Petri cu mediu solid PDA cu 0.3ml inocul de Saprolegnia. O placă reprezintă controlul. Pe celelalte 3 plăci am adăugat în spoturi cantități din extractul de acid ellagic. 3 spot-uri de 5, 10 și respectiv 15 µl. Apoi plăcile se incubează la 300C.

Efectul Acidului Ellagic asupra creșterii Saprolegniei în mediu lichid

Am măsurat efectul EA asupra creșterii în mediul lichid prin realizarea curbelor de creștere. Curbele de creștere au fost realizate prin citirea densității optice (DO) a culturilor la 595nm. S-a folosit o placă cu 24 de godeuri și un cititor Tecan multimode microplate reader. S-a lucrat în triplicat. DO a fost măsurată din oră în oră, timpul de incubare având selectat condițiile unei agitări orbitale ( 4 mm amplitudine și 15 s tremurături ), temperatura de incubare a fost de250C. Concentrațile din fiecare inocul le putem regăsii în tabelul:

Tabel 3. Cantitățile de mediu, extract și inocul folosite la realizarea curbelor de creștere.

Capitolul 5.

Rezultate și discuții

Saprolegnia parasitica este un patogen oomicet al peștelui (mucegai de apă), aparținând ordinului Saprolegniales și cunoscut a infecta o gamă largă de pești, amfibieni, și crustacei relevanți pentru acvacultură și ecosistemele acvatice (Van West și colab., 2008). Aceasta determină saprolegnioza, o boala caracterizată prin pete albe sau gri vizibile de miceliu filamentos pe corp sau pe aripioarele peștelui de apă dulce (van West 2006; Schornack et al 2009.). Saprolegnia spp. este un agent patogen oportunist saprotrofic și necrotrofic (Casadevall și colab., 2000) după cum tulpini de S. parasitica sunt foarte virulente și pot provoca infecții primare (Hill și colab., 1992). Saprolegnia are o toleranță de temperatură destul de larg, cuprins ]ntre 3°C până la 33°C (Irie și colab., 2003) astfel încât, condițile de schimbare bruscă de temperatură a apei fac peștii vulnerabili la infecția cu ea (Casadevall și colab., 2000; Jacobson și colab.,1994). Infecțiile cu Saprolegnia sunt dificil de eradicat, mai ales în incubatoarele de apă dulce și în fermele piscicole, în parte datorită capacității speciilor de Saprolegnia de a forma comunități în biofilm, singure, sau cu alte microorganisme (Jiang și colab., 2013), ultimile fiind mai rezistente la tratamentul cu compuși antibiotici. Infecțiile cu Saprolegnia pot afecta atât icrele cât și pești. ouălele de salmonide sunt deosebit de vulnerabile la infecția cu Saprolegnia în perioada petrecută pe albiilor cu apă dulce înainte de eclozare. Infecțiile inițiale au ca rezultat ouă moarte, peste care se extinde în timp un strat de miceliu pentru a inghiti și icrele vii învecinate (Judelson și colab., 2009), ceea ce conduce la pierderi suplimentare și o potențială infectare a habitatului natural sau a fermei (Judelson și colab., 1991). Pe pești, țesuturi sunt invadate de Saprolegnia, de multe ori începând cu capul sau cu aripioarele și în cele din urmă întinzându-se pe întreaga suprafață a corpului, în final provocând necroza celulară. Cu toate acestea, infecțiile produse de Saprolegnia nu par a fi țesut-specifice iar în cazul în care animalele nu sunt tratate, infecția duce la deces prin insuficiență osmoregulatorie (Schornack et al 2009.).

Melaninele sunt încărcate negativ și sunt compuși hidrofobi cu masă moleculară mare se formează ca urmare a polimerizării oxidative a compușilor fenolici. Acestea sunt insolubile în solvenți apoși sau organici și, prin urmare sunt dificil de studiat biochimic ori biofizic (Casadevall și colab., 2000).

Culturile de Saprolegnia

Tehnica de izolare și Saprolegnia spp după protocolul descris de Parra-Laca și colab. (2015) a condus la obținerea unei tulpini pure, în condițiile creșterii pe mediu PDA suplimentat cu ampicilină, în final neobservându-se alte contaminări cu ciuperci sau vreo creștere bacteriană (figura 17). Pe mediul solid culturile sunt albe asemănătoare cu bumbacul, de unde și denumirea în engleză de „cotton molds”.

Figura 24. Cultura de Saprolegnia după 5 zile de creștere la 300C. Inocularea a fost realizată prin transfer de solid (centru).

După cum se observă în figura 25 tulpina pură de Saprolegnia sp. obținută produce melanină, proces care caracterizează cel mai probail în specia parasitica

Figura 25. Imagine a unei culturi de S. parasitica după 2 săptămâni de la însămânțare, temperatura camerei. Mediul solid a fost realizat din PDA. Se observă apariția unei colorații maronii datorate convesiei tirozinei în DOPA, DOPAcrom respectiv melanină.

Prin utilizarea tehnicii de micdroscopie optică s-a observat că, sub microscop, Saprolegnia spp. a avut miceliu filamentos, hife hialine, largi și coenocitice (celule multinucleate care pot rezulta din mai multe divizii nucleare fără să fie însoțite de citokineză), după cum se observă în figura de mai jos.

Figura 26. Imagine de microscopie optică a Saprolegnia realizată cu obiectivul de 40x. Proveniență din cultură lichidă.

Tehnica de extracție a acidului elegic din coji de rodie și de obținere a preparatului antiungic

Analiza compoziției extractului îmbogățit prin cromatografiei în strat subțire.

După extracția și concentrarea din cojile de rodie s-a analizat compoziția în acid elagic. În Figura 19 se poate vedea că acidul ellagic nu a putut fi scos din linia de start pe când taninurile și acidul galic au migrat. Concluzia este că proba nu conține acid galic și taninuri. În Figura 27 se poate vedea că proba a migrat la o înălțime diferită de punctele unde au migrat acidul galic și taninurile, astfel putem concluziona că extractul conține un compus (acid ellagic) diferit de taninuri și acid galic.

Figura 27. Cromatografie în strat subțire pe Silicagel în sistem A.

În schimb, în sistemul B are loc migrarea componentelor de pe linia de start. Se observă că preparatul obținut (linia 1) conține cel puțin două componente diferite de acidul tannic (2) și de acidul galic (3).

Figure 28. Cromatografie în strat subțire pe Silicagel în sistem B

Analiza spectrală a extractului îmbogățit în Acid Ellagic.

În urma realizării întregului spectru de absorbție a acidului ellagic diluat în tampon diluție de 100 de ori a condus la obținerea spectrului următor (figura 29):

Figura 29. Spectrul de absorbție al Acidului Ellagic în soluție tampon

Se observă prezența unui umăr de absorbți la 360nm, caracteristic acidului ellagic cu o valoare de 0,36255 UA. Din calcule, utilizând coeficientul molar de extincție egal cu 1,62•104M-1cm-1, astfel că s-a putut calcula o concentrație de 0,022 mM.

Analiza profilului curbelor de creștere a S. parazitica

În figura 30 sunt prezentate curbele de creștere a S parasitica în absența inhibitorilor.

Figura 30. Curba de creștere a Saprolegnia în absența inhibitorului (Control)

Adăugarea a 5 µl de extract de acid elagic pare a nu conduce la alterarea creșterii Saprolegnia, după cum se observă în figura 29.

Figura 31. Curba de creștere a Saprolegni în prezența a 5µl extract acid ellagic de concentrație 2,2mM în 2 ml mediu lichid de creștere

De asemenea, prezența extractului concentrat în acid ellagic la o concentrație dublă (10 µl/2 ml mediu lichid de creștere).

Figura 32. Curba de creștere a Saprolegnia în prezența a 10µl extract acid ellagic de concentrație 2,2mM

Creșterea concentrației de extract concentrat de acid ellagic (15µl extract 2,2mM/2 ml mediu de cultură) conduce la inhibiția totală a creșterii Saprolegnia (figura 31).

Figure 33. Curba de creștere a Saprolegnia în prezența a 15µl extract acid ellagic de concentrație 2,2mM

Același efect de inhibiție totală a creșterii s-a constatat la tratamentul cu 30µl extract acid ellagic de concentrație 2,2mM (figura 32, panel A), 50 30µl extract (panel B) și 70µl extract (panel C)

Analiza profilului de creștere a S. parazitica pe mediu solid în prezența de extract îmbogățit în acid ellagic

Analiza creșterii Saprolegniei pe plăci, în prezența a diferitelor concentrații de extract îmbogățit în acid ellagic arată fără tagadă efectul inhibitoe al extractului obținut.

Figura 35. Placa control (A) și placă însămânțată în pânză peste care s-au adăugat. S1-15 µl extract, S2-10 µl extract, S3-5 µl extract. Imaginea s-a preluat după o săptămână de incubare.

Se observă că, asemănător antibiogramelor acidul ellagic are un efect puternic de inhibiție a creșterii care difuzează în cantități destul de mici încât să nu inhibe complet creșterea, devine substrat al tirozinazei și după acțiunea acesteia compusul rezultat este de culoare mov. Aceste date ne conduc la identificarea unei concentrații minime inhibitorii (MIC) mai mică de 11 •10-6 µmoli/µL (11 •10-3 µmoli/mL), valoare situată în același domeniu de măsură detrerminat de către alți autori de care au determinat valori ale MIC cuprinse între 18.75 and 58.33 µg/ml în cazul tulpinilor dermatofite, cu MIC cuprins între 25.0 și 75.0 µg/ml față de tulpinile de Candida testate ori față de fungul filamentos Trichophyton rubrum (MIC = 18.75 µg/ml) (Li și colab., 2015).

De altfel, inducția tirozinazelor (monophenol, O-difenol: oxidoreductazele oxigen, EC 1.14.18.1), enzime bifuncționale, care catalizează o-hidroxilarea monofenolilor și oxidarea ulterioară a o-difenolilor rezultați la quinone (Figura 36).

Figura 36. Reprezentarea schematică a căii de biosinteză a melaninei. Se observă implicarea tirozinazei, melanina fiind produsă din tirozină, un aminoacid neesențial prin mai multe conversii biochimice. Se poate reține că tirozinaza este implicată în două etape, în cele din urmă formând dopachinonă care poate fi convertită în oricare melanină, negru-brună sau roșu-galbenă feomelanină prin diferite căi (după Saraiva și colab., 2014).

În ciclul catalitic, oxigenul molecular este utilizat ca acceptor de electroni care conduce la reducerea lui la apă (Westerholm-Parvinen et al., 2007). Aceste mono-oxigenaze sunt esențiale nu numai în biosinteza pigmenților, de tipul melaninei, ci și în biosinteza al Acidul elagic este un compus fenolic natural care a fost descris ca un inhibitor al procesului de melanogeneză (Le-Thi-Thu și colab., 2014). Acest compus inhibă primele etape ale căii de biosinteză a melaninei, care sunt catalizate de tirozinază. De asemenea, s-a propus un mecanism care explică inhibarea căii de melanogeneză, prin faptul că acidul ellagic acționează drept substrat alternativ la L-tirozină și L-dopa și ca rezultat al puterii sale antioxidante mari, reacționează cu o-chinonele și semiquinochinele care se formează în această cale metabolică. (Ortiz-Ruiz ți colab., 2016).

Verificarea efectului dezvoltării Saprolegniei sp. pe icre de pește în prezență de acid ellagic

În figura de mai jos se poate observa diferența de turbiditate a mediului între controlul pozitiv și 3 concentrații de acid elagic (C+ și C1, C2, astfel în C2 unde concentrația de acid ellagic este cea mai mare, observăm și cel mai transparent mediu. Deși mai dificil, se poate observa același fenomen și în Figura 37.

Figura 37. Eprubetele cu icre de somon după 5 zile. C- control negativ, C+ control pozitiv, C1 concentrația 1, C2 concentrația 2.

Efectul inhibitor al acidului elagic se observă chiar după 5 zile de la însămânțare, ceea ce demonstrrează veridicitatea rezultatelor noastre.

Figura 38 Eprubetele cu icre de crap după 5 zile. C- control negativ, C+ control pozitiv, C1 concentrația 1, C2 concentrația 2.

Capitolul 6

Concluzii

Studiul de față a avut ca scop extracția, caracterizarea și studiul efectelor antifungice a acidului ellagic extras din coajă de rodie asupra unei tulpini de Saprolegnia spp .

Datele prezentate mai sus arată că la concentrațile mici de extract (5 și 10 µl, în concentrație de 2,2 mM) creșterea este mai mică față de creșterea din control, iar în cazul concentraților de peste 15 µl extract, creșterea S. parazitica dispare complet.

Apariția unei culori rozalie pe culturile de S. parazitica ne conduce la ipoteza că acidul ellagic inhibă calea de biosinteză a DOPAcrom-ului din DOPA quinonă, permițând formarea de pheomelanină de culoare galben-roșie, după schema metabolică prezentată mai jos.

Figura 39. Căile metabolice de biosinteză a eumelaninei și pheomelaninei (după Nasti și Timares., 2015).

Această reacție este pentru vizualizată în cazul acestui studiu.

Bibliografie

Akiyama H., Fujii K., Yamasaki O., Oono T., și Iwatsuki K., 2001. Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus. J. Antimicrob. Chemother., 48, 487–491.

Amakura Y., Okada M., Sumiko T., și Tonogai Y., 2000. High-performance liquid chromatographic determination with photodiode array detection of ellagic acid in fresh and processed fruits. J. Chromatogr. 896, 87–93.

Andersson M., & Cerenius L., 2002. Pumilio homologue from Saprolegnia parasitica specifically expressed in undifferentiated spore cysts. Eukaryot. Cell. 1, 105-111.

Aviram M., Rosenblatt M., Gaitani D., Nitecki S., Hoffman A., Dornfield L., 2004. Pomegranate juice consumption for 3 years by patients with carotid artery stenosis (CAS) reduces common carotid intima-media thickness (IMT), blood pressure and LDL oxidation. Clin. Nutr. 23, 423–433

Bakkalbasi E., Mentes O., și Artik N., 2009. Food ellagitannins—Occurrence, effects of processing and storage. Crit. Rev. Food Sci. Nutr.. 49, 283–298.

Bartnicki-Garcia S. 1968. Cell Wall Chemistry, Morphogenesis, and Taxonomy of Fungi. Annu. Rev. Microbiol.. 1, 87-108.

Beakes, G., & Bartnicki-Garcia S. 1989. Ultrastructure of mature oogonium-oospore wall complexes in Phytophthora megasperma: a comparison of in vivo and in vitro dissolution of the oospore wall. Mycol. Res.. 3, 321-334.

Bell A., 1981. Biochemical mechanisms of disease resistance. Ann. Rev. Plant Physiol. 32, 21-81

Bell A., Wheeler M., 1986. Biosynthesis and Functions of Fungal Melanins. Ann. Rev. Phytopathol. 24,411-451,

Bly J., Lawson L., Dale D., Szalai A., Durborow R., Clem L., 1992. Winter saprolegniosis in channel catfish. Dis. Aquat. Org. 1, 50-55.

Bock P., Srinivasan K., Shore J., 1981. Activation of Intrinsic Blood Coagulation by Ellagic Acid: Insoluble Ellagic Acid-Metal Ion Complexes Are the Activating Species. Biochemistry. 20, 7258-7266.

Brand-Williams W., Cuvelier M., Berset C., 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. U-Technol. 28, 25–30.

Burr A., Beakes G., 1994. Characterization of zoospore and cyst surface structure in saprophytic and fish pathogenic Saprolegnia species (oomycete fungal protists). Protoplasma. 4, 142-163.

Cameron J., Carlile M., 1981. Binding of Isovaleraldehyde, an Attractant, to Zoospores of the Fungus Phytophthora palmivora in Relation to Zoospore Chemotaxis. J. Cell Sci., 49, 273-281.

Cerdá B., Espín J., Parra S., Martínez P., Tomás-Barberán F., 2004. The potent in vitro antioxidant ellagitannins from pomegranate juice are metabolized into bioavailable but poor antioxidant hydroxy-6H-dibenzopyran-6-one derivatives by the colonic microflora in healthy humans. Eur. J. Clin. Nutr.. 43, 205–220.

Cerdá B., Llorach R., Cerón J., Espín C., și Tomás-Barberán F. 2003. Evaluation of the bioavailability and metabolism in the rat of punicalagin and antioxidant polyphenol from pomegranate juice. Eur. J. Clin. Nutr.. 2003,18–28.

Cerdá B., Tomás-Barberán F., Espín J., 2005. Metabolism of antioxidant and chemopreventive ellagitannins from strawberries, raspberries, walnuts, and oakaged wine in humans: Identification of biomarkers and individual variability. J. Agric. Food Chem.. 53, 227–235.

Choi J., Kim K., Jeon J., Lee Y., 2013. Fungal plant cell wall-degrading enzyme database: a platform for comparative and evolutionary genomics in fungi and Oomycetes. BMC genomics, 14, 5-7.

Chukanhom K., Hatai K., 2004. Freshwater fungi isolated from eggs of the common carp (Cyprinus carpio) in Thailand. Mycoscience. 1, 42-48.

Claus H., Decker H., 2006. Bacterial tyrosinases. Syst Appl Microbiol 29:3–14. Faccio G, Kruus K, Saloheimo M, Th€ony-Meyer L. 2012 Bacterial tyrosinases and their applications. Process. Biochem. 47,1749–1760.

Clavel T., Borrmann D., Braune A., Doré J., Blaut M. 2006. Occurrence and activity of human intestinal bacteria involved in the conversion of dietary lignans. Anaerobe. 12, 140–147.

Clifford M., și Scalbert A., 2000. Ellagitannins—Nature, occurrence and dietary burden. J. Sci. Food Agr.. 80, 1118–1125.

Daniel, E., Krupnick, A., Heur Y., Blinzler J., Nims, R., Stoner G., 1989. Extraction, stability, and quantitation of ellagic acid in various fruits and nuts. J. Food Comp. Anal. 2, 338–349.

Decker H., Schweikardt T., Nillius D., Salzbrunn U., Jaenicke E., Tuczek F., 2007. Similar enzyme activation and catalysis in hemocyanins and tyrosinases. Gene. 398,183–191.

Decker H., Schweikardt T., Tuczek F., 2006. The first crystal structure of tyrosinase: all questions answered?. Angew. Chem. Int. Ed. 45,4546–4550.

Deeth R., Diedrich C., 2010. Structural and mechanistic insights into the oxy form of tyrosinase from molecular dynamics simulations. J. Biol. Inorg. Chem. 15,117– 129.

Delgado C., Wada N., Rosegrant M., Meijer S., Ahmed M., 2003. Fish to 2020: supply and demand in changing global markets. WorldFish Center Technical Report 62, 11-15

Diéguez-Uribeondo J., Fregeneda-Grandes J. M., Cerenius L., Pérez-Iniesta E., Aller-Gancedo, J., Tellería M., … Martín M., 2007. Re-evaluation of the enigmatic species complex Saprolegnia diclina-Saprolegnia parasitica based on morphological, physiological and molecular data. Fungal Genet. Biol. 44, 585-601.

Diéguez-Uribeondo J., Cerenius L., Söderhäll K., 1994. Saprolegnia-Parasitica and Its Virulence on 3 Different Species of Fresh-Water Crayfish. Aquaculture. 120, 219-228.

Diéguez-Uribeondo J., Cerenius L., Söderhäll K., 1994. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res.. 98, 810-815.

Donaldson S., Deacon J., 1992. Role of Calcium in Adhesion and Germination of Zoospore Cysts of Pythium – a Model to Explain Infection of Host Plants. J Gen Microbiol. 138, 2051-2059.

Doyle B. și Griffiths L. 1980. The metabolism of ellagic acid in the rat. Xenobiotica. 10, 247–256.

Egawa M., Fukuda H., Mitsui M., 1993. Topical preparations containing unsaturated fatty acids and polyphenols, JP patent JP 05271046. 1,15-20

El-Feki M., Hatai K., Hussein M., 2003. Chemotactic and chemokinetic activities of Saprolegnia parasitica toward different metabolites and fish tissue extracts. Mycoscience. 44, 159-162.

Espin J., Wichers H., 1999. Activation of a latent mushroom (Agaricus bisporus) tyrosinase isoform by sodium dodecyl sulfate (SDS). Kinetic properties of the SDS-activated isoform. J. Agric. Food Chem. 47, 3518–3525

Espín J., González-Barrio R., Cerdá B., López-Bote C., Rey A., Tomás-Barberán F., 2007. Iberian pig as a model to clarify obscure points in the bioavailability and metabolism of ellagitannins in humans. J. Agric. Food Chem.. 55, 10476–10485.

Fernández-Benéitez M., Ortiz-Santaliestra M., Lizana M., Diéguez-Uribeondo J., 2008. Saprolegnia diclina: Another species responsible for the emergent disease „Saprolegnia infections” in amphibians. FEMS Microbiol. Lett.. 279, 23-29.

Fernández-Benéitez M., Ortiz-Santaliestra M., Lizana M., Diéguez-Uribeondo J., 2011. Differences in susceptibility to Saprolegnia infections among embryonic stages of two anuran species. Oecologia. 165, 819-826.

Flurkey W., Inlow J., 2008. Proteolytic processing of polyphenol oxidase from plants and fungi. J. Inorg. Biochem. 102,2160–2170.

Fronk P., Hartmann H., Bauer M., Solem E., Jaenicke E., Tenzer S., Decker H., 2015. Polyphenoloxidase from Riesling and Dornfelder wine grapes (Vitis vinifera) is a tyrosinase. Food. Chem. 183,49–57.

Fujieda N., Yabuta S., Ikeda T., Oyama T., Muraki N., Kurisu G., Itoh S., 2013. Crystal structures of copperdepleted and copper-bound fungal pro-tyrosinase: Insights into enogenous cysteine-dependent copper incorporation. J. Biol. Chem. 288,22128–22140.

Fuller, M. S. And A. Jaworski, Eds. 1987. Zoosporic fungi in teaching and research. Southeastern Publishing Corporation. Athens, Georgia.

Goldfeder M., Kanteev M., Isaschar-Ovdat S., Adir N., Fishman A., 2014. Determination of tyrosinase substrate-binding modes reveals mechanistic differences between type-3 copper proteins. Nat. Commun. 5, 120-125

González-Barrio R., Borges G., Mullen W., Crozier A., 2010. Bioavailability of anthocyanins and ellagitannins following consumption of raspberries by healthy humans and subjects with an ileostomy. J. Agric. Food Chem.. 58, 3933–3939

Hatai K., Willoughby L., Beakes G., 1990. Some characteristics of Saprolegnia obtained from fish hatcheries in Japan. Mycol. Res. 94, 182-190.

Hatai, K., 1980. Studies on Pathogenic Agents of Saprolegniasis in Fresh Water Fishes. Special report of Nagasaki Prefectural Institute of fisheries. 8, 1-95

Helm R., Ranatunga T., și Chandra M., 1997. Lignin–hydrolyzable tannin interactions in wood. J. Agric. Food Chem.. 45, 3100–3106.

Hernández-Hernández F, García-Gil F., Rojas-Martínez A., Hernández-Martínez H., Mendoza-Lanzet I., (2003) Carminic acid dye from the homopteran Dactylopius coccus hemolymph is consumed during treatment with different microbial elicitors. Arch. Insect Biochem. Physiol. 54, 37-45.

Hoogduijn M., Cemeli E., Ross K., Anderson D., Thody A., Wood J., 2004. Melanin protects melanocytes and keratinocytes against H2O2-induced DNA strand breaks through its ability to bind Ca2+. Exp Cell Res. 294, 60-7.

Hussein M., Hatai K., Nomura T., 2001. Saprolegniosis in salmonids and their eggs in Japan. J. Wildl. Dis.. 37, 204-207.

Ings R., 1984. The melanin binding of drugs and its implications. Drug Metab. Rev. 15, 1183-121

Ito H., Iguchi A., Hatano T., 2008. Identification of urinary and intestinal bacterial metabolites of ellagitannin geraniin in rats. J. Agric. Food Chem.. 56, 393–400.

Jacobson., Eric S., 2000. Pathogenic Roles for Fungal Melanins. Clin Microbiol Rev. 13, 708–717.

Kähkönen M., Hopia, A., și Heinonen M., 2001. Berry phenolics and their antioxidant activity. J. Agric. Food Chem.. 49, 4076–4082.

Kaintz C., Mauracher S., Rompel A., 2014. Type-3 copper proteins: Recent advances on polyphenol oxidases. Adv. Protein. Chem. Struct. Biol. 97, 1–35.

Kajiwara T., Matsui K., Akakabe Y., Murakawa T., Arai C., 2006. Antimicrobial browning-inhibitory effect of flavor compounds in seaweeds. J. Appl. Phycol., 18, 413–422.

Kamoun S., 2003. Molecular genetics of pathogenic oomycetes. Eukaryot. Cell. 2,191-199

Kanteev M., Goldfeder M., Chojnacki M., Adir N., Fishman A., 2013. The mechanism of copper uptake by tyrosinase from Bacillus megaterium. JBIC. 18,895–903.

Karakaya S., 2004. Biovailability of phenolic compounds. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr.. 44, 453–464.

Khanbabaee K., și van Ree T., 2001. Tannins: Classification and definition. Natural Product Repor. 18, 641–649.

Klabunde T., Eicken C., Sacchettini J., Krebs B., 1998. Crystal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nat Struct Mol Biol. 5,1084–1090.

Klumpers J., Scalbert A., și Janin G., 1994. Ellagitannins in European oak wood: Polymerization during wood ageing. Phytochemistry. 36, 1249–1252.

Koponen J., Happonen A., Mattila P., și Törrönen A., 2007. Contents of anthocyanins and ellagitannins in selected foods consumed in Finland. J. Agric. Food Chem.. 55, 1612–1619

Koponen J., Happonen A., Mattila, P., Törrönen, A., 2007. Contents of anthocyanins and ellagitannins in selected foods consumed in Finland. J. Agric. Food Chem.. 55, 1612–1619.

Landete J., 2011. Ellagitannins, ellagic acid and their derived metabolites: A review about source, metabolism, functions and health. Food Res. Int., 44, 1150-1160.

Larrosa M., González-Sarrías A., García-Conesa M., Tomás-Barberán, F., și Espín, J., 2006. Urolithins, ellagic acid-derived metabolites produced by human colonic microflora, exhibit estrogenic and antiestrogenic activities. J. Agric. Food Chem.. 54, 1611–1620.

Lerch K. 1988 Protein and active-site structure of tyrosinase. Prog. Clin. Biol. Res. 256,85–98.

Le-Thi-Thu, H., Casanola-Martín M., Marrero-Ponce Y., Rescigno A., Abad C., Khan M., 2014. A rational workflow for sequential virtual screening of chemical libraries on searching for new tyrosinase inhibitors, Curr. Top. Med. Chem. 14, 1473–1485.

Li ZJ, Guo X., Dawuti G., Aibai S., 2015 Antifungal Activity of Ellagic Acid In Vitro and In Vivo. Phytother Res. 29,1019-1025

Lin C. și Hsu H., 2001. Antioxidant and hepatoprotective effects of punicalagin and punicalin on acetaminophen-induced liver damage in rats. Phytother. Res., 15, 206–212.

Lu J., Yuan Q., 2008. A new method for ellagic acid production from pomegranate husk. J. Food Proc. Engin. 4, 443-454.

Maas J., Galletta G., și Stoner G., 1991. Ellagic acid, an anticarcinogen in fruits, especially in strawberries. HortScience. 26, 10–14.

Määttä-Riihinen K., Kamal-Eldin A., și Törrönen, A., 2004. Identification and quantification of phenolic compounds in berries of Fragaria and Rubus species (family Rosaceae). J. Agric. Food Chem.. 52, 6178–6187

Martino V., Morales J., Martínez Irujo J., Font M., Monge A., și Coussio J., 2004. Two ellagitannins from the leaves of Terminalia triflora with inhibitory activity on HIV-1 reverse transcriptase. Phytother. Res., 18, 667–669.

Marusek C., Trobaugh N., Flurkey W., Inlow J., 2006. Comparative analysis of polyphenol oxidase from plant and fungal species. J. Inorg. Biochem. 100: 108–123.

Masamune A., Satoh M., Kikuta K., Suzuki N., Satoh K., și Shimosegawa T., 2005. Ellagic acid blocks activation of pancreatic stellate cells. Biochem. Pharmacol.. 70, 869–878.

Matoba Y., Bando N., Oda K., Noda M., Higashikawa F., Kumagai T., Sugiyama M., 2011. A molecular mechanism for copper transportation to tyrosinase that is assisted by a metallochaperone caddie protein. J. Biol. Chem. 286,30219–30231.

Matoba Y., Kumagai T., Yamamoto A., Yoshitsu H., Sugiyama M., 2006. Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis. J. Biol. Chem. 281,8981–8990.

Mauracher S., Molitor C., Al-Oweini R., Kortz U., Rompel A., 2014. Latent and active abPPO4 mushroom tyrosinase cocrystallized with hexatungstotellurate(VI) in a single crystal. Acta. Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 70, 2301–2315.

Mayer A., 2006. Polyphenol oxidases in plants and fungi: Going places?. Phytochemistry. 67, 2318–2331.

Mazurkiewicz-Zapałowicz K. , Twarużek M. , Formicki K. , Korzelecka-Orkisz A. , Wolska M. , Tański A. , Szulc J. 2015. The effect of magnetic field on in vitro development of fungus-like organisms saprolegnia parasitica on selected microbiological media, EJPAU. 2, 02.

Molina F., Jong S., Ma G., 1995. Molecular characterization and identification of Saprolegnia by restriction analysis of genes coding for ribosomal RNA. Antonie van Leeuwenhoek, 68, 65-74.

Mullen W., McGinn J., Lean M., MacLean M., Gardner P., Duthie, G., 2002. Ellagitannins, flavonoids and other phenolics in red raspberries and their contribution to antioxidant capacity and vasorelaxation properties. J. Agric. Food Chem.. 50, 5191–5196.

Munoz-Munoz J., García-Molina F., Varón R., Tudela J., García-Cánovas F., Rodríguez-López J. 2009. Generation of hydrogen peroxide in the melanin biosynthesis pathway, Biochim. Biophys. 1794, 1017–1029.

Nasti T., Timares L., Eumelanin and Pheomelanin: their role in determining the susceptibility to skin cancer 2015. Photochem Photobiol. 91, 188–200.

Nicolaus R., Piatelli M., Fattoruuso E.,1964. On some natural melanins. Tetrahedron. 20, 1163–1172.

Nicoli M. C., Anese M., și Parpinel M., 1999. Influence of processing on the antioxidant properties of fruit and vegetables. Trends Food Sci. Technol. 10, 94–100.

Niemetz R., și Gross, G., 2005. Enzymology of gallotannin and ellagitannin biosynthesis. Phytochemistry. 66, 2001–2011.

Ortiz-Ruiz C., Berna J., Tudela J., Varon R., Garcia-Canovas F.. 2016 Action of ellagic acid on the melanin biosynthesis pathway. J Dermatol Sci. 82, 115-122.

Ovaskainen M., Törrönen R., Koponen J., Sinkko H., Hellström J., Reinivuo H., 2008. Dietary intake and major food sources of polyphenols in Finnish adults. J. Nutr.. 138, 562–566.

Parr C., Schulz K., Hammock J., Wilson N., Leary P., Rice J., Corrigan R., 2016. TraitBank: Practical semantics for organism attribute data. Semantic Web. 7, 577-588.

Phillips, A., Anderson V., Robertson E., Secombes C., van West P., 2008. New insights into animal pathogenic oomycetes. Trends in Microbiology. 16, 9-13

Pickering A., Willoughby L., 1979. Saprolegnia Infections of Salmonid Fish. Director. 6, 38-48.

Prota G. 1988. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med. Res. Rev. 8, 525–556

Puech J., Feuillat F., și Mosedale J., 1999. The tannins of oak heartwood: Structure, properties, and their influence on wine flavor. Am. J. Enol. Vitic.. 50, 469–478.

Quideau, S., și Feldman, K. 1996. Ellagitannin chemistry. Chemical Reviews. 96, 475–503.

Radtke J., Linseisen J., Wolfram G., 1988. Phenolic acid intake of adults in a Bavarian subgroup of the national food consumption survey. Zeitschrift für Ernährungswissenschaft. 37, 190–197.

Ramsden C, Riley P., 2014. Tyrosinase: the four oxidation states of the active site and their relevance to enzymatic activation, oxidation and inactivation. Biorg. Med. Chem. 22, 2388–2395.

Ramsden C., Stratford M., Riley P., 2009. The influence of catechol structure on the suicideinactivation of tyrosinase. Org. Biomol. Chem. 7,3388– 3390.

Robinson N., Winge D., 2010. Copper metallochaperones. Annu. Rev. Biochem. 79, 537–562.

Rolff M., Schottenheim J., Decker H., Tuczek F., 2011. Copper-O2 reactivity of tyrosinase models towards external monophenolic substrates: molecular mechanism and comparison with the enzyme. Chem. Soc. Rev. 40,4077–4098.

Rommel A., și Wrolstad R., 1993. Influence of acid and base hydrolysis on the phenolic composition of red raspberry juice. J. Agric. Food Chem., 41, 1237–1241.

Saura-Calixto F., Serrano J., Goñi I. 2007. Intake and bioaccessibility of total polyphenols in whole diet. Food Chem.. 101, 492–501.

Scalbert A., și Williamson G. 2000. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J. Nutr., 130, 2073–2085.

Schaerlaekens K., Schierova M., Lammertyn E., Geukens N., Anne J., Van Mellaert L., 2001. Twin-arginine translocation pathway in Streptomyces lividans. J. Bacteriol. 183,6727–6732.

Schweikardt T., Olivares C., Solano F., Jaenicke E., Garcia-Borron JC., Decker H., 2007. A threedimensional model of mammalian tyrosinase active site accounting for loss of function mutations. Pigment Cell. Res. 20,394–401.

Seeram N., Henning S., Zhang Y., Suchard M., Li Z., Heber D., 2006. Pomegranate juice ellagitannin metabolites are present in human plasma and some persist in urine for up to 48 hours. J. Nutr.. 136, 2481–2485.

Selma M., Espin J., și Tomás-Barberan, F., 2009. Interaction between phenolics and gut microbiota role in human health. J. Agric. Food Chem.. 57, 6485–6501.

Sendovski M., Kanteev M., Ben-Yosef Adir S., Fishman N., 2011. First structures of an active bacterial tyrosinase reveal copper plasticity. J. Mol. Biol. 405,227–237.

Siegbahn P., Borowski T., 2011. Comparison of QMonly and QM/MM models for the mechanism of tyrosinase. Faraday Discuss. 148, 109–117.

Soderhall K., Ajaxon R., 1982. Effect of quinones and melanin on mycelial growth of Aphanomyces spp. and extracellular protease of Aphanomyces astaci, a parasite on crayfish. J. Invert. Pathol. 39, 105-9

Soong Y., și Barlow P., 2006. Quantification of gallic acid and ellagic acid from longan (Dimocarpus longan Lour.) seed and mango (Mangifera indica L.) kernel and their effects on antioxidant activity. Food Chem.. 97, 524–530.

Teel R., și Martin R. 1988. Disposition of the plant phenol ellagic acid in the mouse following oral administration by gavage. Xenobiotica. 18, 397–405.

Thoen E., Evensen, Skaar I., 2011. Pathogenicity of Saprolegnia spp. to Atlantic salmon, Salmo salar L., eggs. Journal of Fish Diseases. 34, 601-608.

Tomas-Barberan F., Espin J., Garcia-Conesa M., 2009. Bioavailability and metabolism of ellagic acid and ellagitannins. World Scientific. 6, 273–297

van den Berg A., McLaggan D., Diéguez-Uribeondo J., van West P., 2013. The impact of the water moulds Saprolegnia diclina and Saprolegnia parasitica on natural ecosystems and the aquaculture industry. Fungal Biology Reviews. 9, 15-20

van Gelder C., Flurkey W., Wichers H., 1997. Sequence and structural features of plant and fungal tyrosinases. Phytochemistry. 45,1309–1323.

van West P., 2006. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challenges for an old problem. Mycologist. 20, 99-104.

Vekiari S., Gordon M., García-Macías P., Labrinea H., 2008. Extraction and determination of ellagic acid content in chestnut bark and fruit. Food Chem.. 110, 1007–1011.

Wang N., Hebert D., 2006. Tyrosinase maturation through the mammalian secretory pathway: bringing color to life. Pigment Cell Research. 19,3–18.

Westerholm-Parvinen A., Selinheimo E., Boer H., Kalkkinen N., Mattinen M., Saloheimo M., 2007. Expression of the Trichoderma reesei tyrosinase 2 in Pichia pastoris: isotopic labeling and physicochemical characterization. PREP. 55:147–158).

Wolinska J., King K. ., Vigneux F., Lively C., 2008. Virulence, cultivating conditions, and phylogenetic analyses of oomycete parasites in Daphnia. Parasitology. 135, 1667-1678.