În ultimii 30 de ani, progresele înregistrate de tehnicile chirurgicale de revascularizare a organelor afectate de ateroscleroză, atât cele… [305700]

INTRODUCERE

MOTIVAȚIE

În ultimii 30 [anonimizat] a [anonimizat], au determinat o scădere importantă a mortalității și morbidității în populația afectată. [anonimizat], [anonimizat] (montarea de stenturi și angioplastiile cu balon) [anonimizat] o reducere marcată a lumenului vascular și o perioadă de patență scăzută.

[anonimizat] 1980, se raporta o rată de restenoză la 4 luni de 30-60% după procedurile de angioplastie coronariană(1). [anonimizat] a [anonimizat] s-a [anonimizat] a scăzut abrupt de la 42% la valori în jur de 30% (2). Următoarul pas a [anonimizat] 5% [anonimizat], în jur de 17% la 5 ani, [anonimizat] 2010 se estima că în Statele Unite se practică anual peste 200.000 de intervenții pentru restenoze (3).

Și în chirurgia vasculară periferică restenoza rămâne o [anonimizat]-popliteu, unde restenoza apare la 40-60% din pacienții cărora le-a [anonimizat], patența fiind estimată la 22-61% (4). O îmbunătățire a rezultatelor s-a obținut prin introducerea în terapie a [anonimizat], cu scăderea ratei de restenoză la 20-40% în leziunile arterei femurale superficiale de tip TASC C și D (5) și ulterior a [anonimizat] a cazurilor de restenoză la 24% după doi ani (6).

[anonimizat]. Deși în cazul chirurgiei coronariene și a vaselor mari extratoracice patența postprocedurală rămâne mulțumitoare chiar și la 10 ani, [anonimizat], [anonimizat] 50% la 5 ani (7).

[anonimizat], situația actuală nu poate fi mulțumitoare. [anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat], manifestându-[anonimizat] a [anonimizat]. Procedeele chirurgicale determina atât denudare endotelială cât și lezarea unor celule musculare netede din media vasculară. Răspunsul fiziologic în cazul unei leziuni vasculare este cel hemostatic. Astfel, denudarea endotelială expune membrana bazală, determinând aderarea și agregarea plachetară (8). Activarea plachetară are ca efect eliberarea constituenților granulelor citoplasmatice, dintre aceștia de mare importanță în procesul de hiperplazie fiind factorul de crestere derivat plachetar – PDGF. De asemenea, leziunea endotelială determină un important răspuns inflamator, manifestat prin aderarea polimorfonuclearelor și monocitelor la membrana bazală endotelială (9). Acestea, odată activate, eliberează enzime lizozomale capabile să degradeze matricea extracelulară, incluzând membrana bazală și radicali liberi, capabili să detașeze celulele endoteliale restante. Din celulele musculare netede și endoteliale lezate, precum și din matricea extracelulară, se eliberează factorul de creștere fibroblastic bazic (bFGF) (10). Toate aceste procese expuse pe scurt mai sus au rol de declanșator al procesului de hiperplazie intimală. Sub acțiunea bFGF se inițiază un proces de replicare a celulelor musculare netede din media vasului (11). De asemenea, o parte dintre aceste celule, sub acțiunea colagenului de tip I eliberat din matricea extracelulară de către enzimele lizozomale, se transformă din fenotip contractil în fenotip secretor, producând constituenți ai matricei extracelulare și având ca efect îngroșarea mediei. Momentul maxim al proliferării celulelor musculare netede este atins la două zile după injurie, revenind la normal după 14 zile. Degradarea matricei extracelulare și a membranei bazale endoteliale de către enzimele lizozomale leucocitare, a radicalilor liberi și a metaloproteinazelor matriceale permite migrarea celulelor musculare netede din medie în intimă, sub acțiunea puternicului efect chemotactic al PDGF (12). S-a constat că până la 30 % din celulele musculare netede mediale migrează în intimă. La acest nivel, sub acțiunea factorului de creștere transformator beta (TGF – β), celulele musculare netede secretă constituenți ai matricei extracelulare, în principal colagen și proteoglicani, astfel că, la 12 săptămâni după leziune, componența intimei de neoformație este reprezentată de celule musculare în proporție de aproximativ 20 % și de matrice extracelulară în proporție de 80 % (13).

Strategiile terapeutice dezvoltate pentru a limita hiperplazia intimală țintesc procesul în diferite stadii ale acestuia. Efectul antiagregant plachetar al aspirinei a fost unul dintre primele folosite in acest scop (14), dar acidul acetilsalicilic nu are capacitatea de a bloca eliberarea PDGF la nivel plachetar și nici pe cea de a inhiba agregarea plachetară indusă de ADP. Astfel că efectul acidului acetilsalicilic asupra dezvoltării neointimei este parțial. De asemenea, anticorpii monoclonali antiplachetari, care induc trombocitopenie, reduc dar nu blochează procesul. Acidul nitric este un vasodilatator puternic care inhibă proliferarea celulelor musculare netede, interacțiunea dintre leucocite și endoteliu, aderarea și agregarea plachetara. În cazul leziunilor vasculare, endoteliul afectat își pierde capacitatea de a sintetiza acid nitric. Administrarea de L-arginină, un precursor al acidului nitric, reduce dezvoltarea hiperplaziei intimale în studiile pe animale de laborator (15). Unele studii au arătat că heparina are un efect inhibitor asupra proliferării și migrării celulelor musculare netede, prin interferarea cu factorii de creștere vasculari, independent de acțiunea sa anticoagulantă (16). Blocarea efectului proliferativ și secretor al angiotensinei II asupra celulei musculare netede, efect realizat prin stimularea TGF – β, a fost tentată prin administrarea cronică de inhibitori ai enzimei de conversie. Totuși, studii ulterioare au demonstrat că acest efect mitogenic al angiotensinei II este invers proporțional cu profunzimea leziunii vasculare, iar blocarea sintezei de angiotensină II nu reduce apariția hiperplaziei intimale în cazul leziunilor vasculare profunde (14). Terapia genică a fost folosită pentru a controla procesul de replicare sau de sinteză al celulelor musculare netede (17).

Toate aceste intervenții terapeutice țintesc procesul de formare a neointimei în stadiile inițiale sau finale. Elementul central al acestui proces îl constituie proliferarea și migrarea celulelor musculare netede din medie în intimă (14), acțiune dirijată în cea mai mare parte de doi factori de creștere vasculari: factorul de creștere fibroblastic bazic stimulează proliferarea celulelor musculare la nivel medial, iar factorul de creștere derivat plachetar are un important rol in migrarea acestora în intimă. Experimentele realizate pe animalele de laborator au arătat că blocarea interacțiunii dintre acești factori și celulele musculare netede prin administrarea de anticorpi monoclonali exercită un puternic efect inhibant asupra neointimei (18).

OBIECTIVE

În ultimul timp au fost dezvoltați, în scop chimioterapic, o serie de agenți medicamentoși care inhibă acțiunea factorilor de creștere prin blocarea activării tirozinkinazei de la nivelul receptorilor transmembranari ai acestora (19). Eficiența acestor molecule în scăderea proliferării și migrării celulelor netede vasculare a fost insuficient analizată.

PD 173074 reprezintă un inhibitor selectiv al tirozinkinazei, care blochează activarea receptorului bFGF. Capacitatea acestuia de a prevenii progresia tumorală prin inhibarea neovascularizației a fost demonstrată în cazul mai multor tipuri de tumori maligne (20). Din datele din literatură studiate, nu a fost analizată posibila inhibare a procesului de neoformație intimală de către acest compus.

Imatinib este un chimioterapic sintetizat în 1998, utilizat în tratamentul leucemiei mieloide cronice și a tumorilor stromale gastrointestinale care inhibă activarea receptorului PDGF, blocându-i site-ul de acțiune. Unele studii au demonstrat capacitatea acestuia de a scădea intensitatea procesului de hiperplazie intimală (21).

Având în vedere potențialul impact clinic al unui tratament inhibitor eficace al hiperplaziei intimale asupra patenței pe termen lung a procedurilor chirurgicale la nivelul sistemului arterial, dovedirea capacității inhibitorilor receptorilor factorilor de creștere vasculari în limitarea acestui proces ar reprezenta premiza standardizării în viitorul apropiat a unei noi modalități eficace de abord terapeutic. Acest proiect și-a propus să evalueze efectul potențial cumulativ de inhibare a formării neointimei prin administrarea celor două substanțe.

METODOLOGIE

După consultarea aprofundată a literaturii asupra temei de cercetare, următoarea etapă a fost reprezentată de realizarea unui model experimental de inducere a hiperplaziei intimale la animalul de laborator – șobolan. Majoritatea modelelor descrise în literatură presupun denudarea endotelială cu balon a arterelor carotide, însă, este cunoscut rolul important al leziunii mediale în procesul de neoformație intimală. Astfel, am decis realizarea unui nou model animal, care a presupus disecția, secționarea totală a arterei femurale de șobolan și resuturarea termino-terminală a celor două capete. În acest fel se simulează întreaga paletă de leziuni întâlnite atât în chirurgia deschisă cât și în cea endovasculară: leziunile de la nivelul vasa vasorum provocate de disecția adventicei, secționarea mediei și denudarea endotelială prin dilatarea preanastomotică a capetelor arterei. S-au realizat 10 anastomoze pe un lot de 5 animale, care au fost sacrificate după 14 zile și le-au fost recoltate arterele femurale (lotul experimental 1). De asemenea au fost recoltate 6 fragmente de artere femurale de la 3 animale neoperate – lotul martor. Următoarea etapă a fost reprezentată de analiza histologică a specimenelor. Fragmentele bioptice au fost tratate cu coloratie van Gienson, pentru a se pune in evidenta limitanta elastica interna si limitanta elastica externa, apoi s-a calculat prin intermediul programului informatic AutoCAD (Autodesk, San Rafael, CA, USA) următoarele raporturi pentru fiecare probă din ambele loturi:

RIM – raportul dintre suprafața intimei și cea a mediei;

GRADUL DE STENOZĂ DETERMINAT DE INTIMĂ – GSI reprezintă raportul dintre suprafața lumenului și suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă;

GRADUL DE STENOZĂ DETERMINAT DE MEDIE – GSM reprezintă raportul dintre suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă și suprafața circumscrisă de limitanta elastică externă;

GRADUL DE STENOZĂ COMBINAT – GSC reprezintă raportul dintre suprafața lumenului și aria circumscrisă de limitanta elastică externă.

Odată stabilită validitatea modelului experimental în inducerea hiperplaziei, s-a testat eficacitatea administrării concomitente a blocanților receptorilor PDGF și bFGF în inhibarea hiperplaziei intimale. Au fost realizate 26 de anastomoze la 13 animale (lotul experimental 2) și, începând cu a doua zi postoperator, timp de 14 zile, le-a fost administrat zilnic animalelor, prin gavaj, 25 mg/kgc Imatinib și 25 mg/kgc PD 173074. La sfârșitul perioadei de tratament, animalele au fost sacrificate și le-au fost prelevate arterele femurale operate. Analizele histologică și informatică ale fragmentelor recoltate au fost realizate similar.

PARTEA GENERALĂ

STRUCTURA HISTOLOGICĂ VASCULARĂ

Din punct de vedere histologic, peretele vascular prezintă o organizare comună în întreg organismul, fiind format din celule, fibre și matrice extracelulară dispuse într-o structură trilaminară, în proporții variabile (figura 1).

Tunica intimă reprezintă stratul cel mai profund al peretelui vascular, aflat în contact direct cu sângele, fiind delimitat extern de lamina elastică internă. La nivel endoluminal, întreg arborele circulator este tapetat de endoteliu, structură formată din celule endoteliale, de formă poligonală, variind în grosime de la 0,1 µm în capilare la 1 µm în aortă, acoperite de un strat glicoproteic, numit glicocalix, responsabil pentru propietatea antitrombogenă a suprafeței endoteliale. Celulele endoteliale au rol în hemostază, tonusul vasomotor, proliferarea celulară parietală și permeabilitatea vasculară (22). Membrana bazală (MB) oferă suport și conectează endoteliul de țesutul conjunctiv intimal profund și celulele musculare netede. Componentele MB, reprezentate de glicoproteine, molecule de adeziune (laminina, fibronectina, trombospondina, entactina), proteoglicani și fibre de colagen tip IV și V sunt produse și secretate de către celulele endoteliale și se dispun în două zone: lamina rara, internă, conține polimeri de laminină care fixează, prin intermediul entactinei celulele endoteliale de stratul profund al MB, lamina densa, structură alcătuită mai ales din colagen de tip IV dispus într-o rețea poligonală (23). Pe lângă rolul mecanic, MB participă în procesele inițiale ale coagulării și reprezintă o barieră fizică în calea migrației celulare. În componența matricei extracelulare intră mai ales colagen de tip I și III, cu rol de liant între MB și celulele musculare netede din medie. Lamina elastică internă, cu o grosime de 70 – 100 nm, alcătuită din fibre de elastină sintetizate de celulele endoteliale și musculare netede, separă tunica intimă de tunica medie. Fibrele de elastină se dispun în lamele cilindrice fenestrate, separate unele de altele printr-un singur strat de celule musculare netede (24).

Tunica medie, cuprinsă între limitantele elastice internă și externă, este alcătuită din celule musculare netede (CMN), colagen și elastină aranjate ordonat într-o structură tridimensională, această dispoziție fiind responsabilă de distensibilitatea, efectul capacitiv și funcția de încărcare mecanică ale arterelor mari (25). În funcție de proporția fibrelor de elastină, arterele se clasifică în elastice – arterele aortă, iliace, carotide și musculare – ramurile de bifurcație de ordinul II și III. În arterele elastice, elastina se structurează în lamele fenestrate, dispuse concentric spiralat între care se organizează unități funcționale cu rol de ligand interlamelar, formate din CMN, microfibre de elastină, fibre de colagen și glicozaminoglicani. Media arterelor musculare este alcătuită din straturi de CMN dispuse circular într-o rețea de fibre de elastină (26).

Tunica adventice reprezintă stratul extern vascular, fiind alcătuită din fibre de elastină și colagen de tip I, dispuse longitudinal, spiralat sau dezordonat. Fibrele elastice sunt mai proeminente în zona adiacentă mediei, unde fuzionează formând limitanta elastică externă. Adventicea se continuă, fără o delimitare precisă, cu țesutul conjunctiv perivascular și conține rețeaua vasa vasorum și fibrele nervoase vasomotorii (27).

Figura 1. Structura peretelui vascular

DESFĂȘURAREA PROCESULUI HIPERPLAZIC

1. COAGULAREA ȘI INFLAMAȚIA reprezintă prima etapă în răspusul vascular la injurie. După o leziune, în zona de denudare endotelială, plachetele aderă de membrana bazală și marticea extracelulară intimală prin intermediul interacțiunii dintre receptorii membranari glicoproteici Ia/IIa și colagenul parietal pe de o parte și receptorii Ib/V/IX și complexul factor von Willebrand – fibronectină pe de altă parte (28). Aderarea se inițiază rapid, la câteva minute după injurie și durează până la 10 ore. După aderare, plachetele se activează, eliberând conținutul granulelor citoplasmatice: din granulele α se eliberează factorul plachetar 4, β-tromboglobulina, fibronectina, inhibitorul activatorului plasminogenului 1 (PAI 1), α2-antiplasmina, factorii V și XI ai coagulării, proteina S, factorul de creștere derivat plachetar (PDGF), kininogen cu greutate moleculară mare (HMWK) și fibrinogen, din granulele dense calciu, serotonină, ATP și ADP, iar din granulele lisosom – like numeroase hidrolaze acide (29). După formarea cheagului alb plachetar, substanțele eliberate prin degranulare promovează activarea cascadei coagulării, iar fosfolipidele membranare servesc drept suport pentru desfășurarea procesului. Inițial, factorul tisular și factorul VIIa formează un complex care activează factorii IX și X. Factorii Xa și Va formează complexul protrombinazic împreună cu calciul și fosfolipidele membranare plachetare, care clivează protrombina în trombină activă. Trombina activează factorii V, VII, IX, XIII, stimulează degranularea plachetară și clivează fibrinogenul în monomeri de fibrină, care, sub acțiunea factorului XIIIa, polimerizează, formând trombul roșu, insolubil. Odată cu formarea primelor molecule de trombină, se activează și calea intrinsecă. Factorul XIIa formează un complex cu trombina, activând factorul XI, care determină activarea factorului IX. Factorul IXa împreună cu factorul VIIIa formează un complex proteazic care determină activarea suplimentară a factorului X, stimulându-se creșterea sintezei de trombină (8).

Cascada coagulării este controlată prin multiple mecanisme inhibitorii, care acționează la diferite niveluri. În primul rând, producerea trombinei prin calea extrinsecă este controlată de inhibitorul căii factorului tisular (TFPI), care inactivează complexul factor tisular – factor VIIa, blocând astfel activarea factorului X (30). De asemenea, factorul Xa este inactivat direct de TFPI. Prin ambele mecanisme scade conversia protrombinei în trombină. Trombomodulina, o glicoproteină transmembranară endotelială, prezintă o afinitate crescută pentru trombină, blocându-i activitatea litică, stimulând inactivarea acesteia de către antitrombină și permițând degradarea intracelulară (31). Trombomodulina acționează ca și cofactor enzimatic pentru activarea proteinei C de către trombină. Proteina C, având cofactor enzimatic proteina S, inactivează factorii Va și VIIIa (9). Principalul inhibitor al coagulării este reprezentat de antitrombina. Sintetizată în ficat și endoteliu, această glicoproteină inactivează majoritatea proteazelor care participă în cascada coagulării – trombina, factorii Xa, IXa, XIa, XIIa (32).

Dezechilibrele calitative și cantitative ale elementelor implicate la diferite niveluri în procesul de coagulare stimulează proliferarea medială și migrarea intimală. Principalii constituenți granulari plachetari implicați în hiperplazia intimală sunt ADP și PDGF. ADP activează conversia acidului arahidonic în tromboxan A2, care are un puternic efect mitogen asupra celulelor musculare netede mediale și un efect de chemoatracție a acestora în intimă (33). PDGF are de asemenea un important efect chemotactic asupra celulelor musculare netede, neutrofilelor și macrofagelor. În cadrul cascadei coagulării, factorul tisular joacă rol de declanșator. După leziunile profunde, producția de factor tisular este stimulată în celulele musculare netede mediale, proces mediat de PDGF, trombină și angiotensină II. O sinteză crescută a factorului tisular are ca efect un proces procoagulant prelungit, stimulând eliberarea factorilor de creștere și chemotactici ai celulelor musculare netede (34). S-a demonstrat experimental că administrarea TFPI are ca efect inhibarea răspunsurilor trombotic și hiperplazic ale vasului la leziune (35). Calea comună a coagulării este inițiată de trombină. Pe lângă rolul din cascada coagulării, trombina este un puternic mitogen al celulelor musculare netede, având și un efect chemotactic asupra acestora. De asemenea stimulează expresia receptorului urokinazei in celulele musculare netede, urokinaza stimulând migrarea celulară (36).

Denudarea endotelială inițiază și un puternic răspuns inflamator, polimorfonuclearele neutrofile și monocitele aderând de suprafața subendotelială. Acest proces pare să fie stimulat de proteina chemotactică monocitară 1 (MCP-1), proteina sintetizată de celulele musculare netede mediale în primele ore după injurie. Pe lângă efectul chemotactic asupra celulelor adventiceale, această citokină are și un puternic efect stimulant asupra proliferării celulelor musculare netede mediale (37).

2. PROLIFERAREA CELULARĂ

Inițierea, controlul și blocarea proliferării celulelor musculare netede postinjurie sunt procese aflate sub inflența a numeroase citokine și factori de creștere vasculari. În mod normal, celulele musculare netede se găsesc în stare de neproliferare. După injurie, factorii de creștere se leagă de receptorii membranari de tip tirozinkinază, prin intermediul cărora declanșează ciclul celular de replicare, activând factorii nucleari c-fos și c-myc, factori transcripționali pe calea Ras-Raf-MEK-ERK (38). Cel mai puternic efect proproliferativ îl are familia de 23 proteine a factorilor de creștere derivați fibroblastic (FGF). Elementele definitorii ale acestei familii sunt reprezentate de afinitatea crescută pentru heparină și glicozaminoglicanii heparan-like, precum și omogenitatea porțiunii centrale a secvenței de 140 aminoacizi, prezentă la toți membrii familiei (39). În funcție de aciditate, proteinele FGF se împart în acide (aFGF), cu un pH de aproximativ 5,6 și bazice (bFGF), cu ph peste 9. Efectul maxim proliferativ asupra celulelor musculare netede vasculare îl are bFGF, fiind de 100 de ori mai puternic decât cel al aFGF, chiar dacă cele două proteine au aceiași receptori (11). În mod normal, bFGF se găsește atât intracelular, în nucleul și citoplasma celulelor endoteliale și musculare, cât și în matricea extracelulară, legat de heparansulfat. Afinitatea pentru heparansulfat protejează bFGF de degradare de către acizi, căldură și proteaze și, în același timp, creează un rezervor subendotelial de factori de creștere. Postinjurie, acesta este eliberat, fie prin clivarea enzimatică a componentelor membranei extracelulare, fie prin legarea de o proteină transportoare – FGF binding protein (FGF-BP) și se cuplează cu receptorii membranari ai celulelor musculare indemne, inițiind procesul de replicare celulară (10). Pe lângă acest efect cuplarea FGF-FGFR stimulează celula musculară netedă să sintetizeze și expună alți receptori, crescând astfel concentrația membranară și acțiunea promitotică a bFGF. Pe lângă factorul de creștere derivat fibroblastic, un al rol important în proliferare par să îl aibă componentele sistemului renină-angiotensină – aldosteron, mai ales enzima de conversie a angiotensinei. Această enzimă stimulează indirect proliferarea celulară, mai ales în leziunile superficiale, mecanismul principal fiind reprezentat de inactivarea bradikininei și scăderea consecutivă a sintezei de oxid nitric, un important factor antiproliferativ (40).

MIGRAREA CELULARĂ

Ca și în cazul proliferării, migrarea celulară este un proces controlat de multiple chemokine, proteaze și factori de creștere. Motilitatea celulară poate fi de tip aleatoriu, numită chemokinezie, sau dirijată – chemotaxie, ceea ce presupune formarea unei concentrații crescute a chemoatractantului la locul de migrare. Activarea chemotactică a celulelor musculare netede se realizează atât de către factorii de creștere și citokine, prin intermediul agoniștilor receptorilor de tip tirozin-kinază sau proteină G, cât și de componentele matricei extracelulare – osteopontina, colagenul de tip I și IV și laminina, eliberate de către metaloproteazele matriceale (41). În urma activării, celulele musculare netede sintetizează, secretă și activează o serie de proteaze, care eliberează celula din matricea extracelulară, prin liza elementelor matriceale, apare remodelarea citoscheletului prin activarea proteinelor motorii și scade adezivitatea celulă – matrice. Odată eliberată, celula sintetizează noi molecule de adeziune, proteaze și molecule matriceale și se deplasează spre gradientul chemotactic printr-o secvență de atașări și deatașări celulare, emiterea de pseudopode și contracții celulare. Formarea pseudopodelor se realizează prin polimerizarea actinei, sub influența Ca2+, fosfatidil inozitol 4,5 bifosfat și proteinei G, iar extensia acestora este potențată de complexul formine-profiline, eliberate din membrana celulară. Polifilamentele actinice se ramifică, sub influența familiei proteinelor WASP (Wiskott–Aldrich syndrome protein), la polul de înaintare și sunt degradate la polul opus, sub controlul cofilinei, limitându-se astfel lungimea filamentelor și realizându-se turnover-ul monomerilor de actină. La nivelul pseudopodelor sunt expuse membranar molecule de adeziune – kinaza de adeziune focală, vinculină, paxilină și tensină, prin intermediul cărora celula aderă și se propulsează printre componentele matricei extracelulare parțial lizată. Odată fixată de aceste componente, celula dezvoltă forță de tracțiune, generată de miozină prin activarea miozin kinazei de către Ca2+.

Cel mai puternic efect chemotactic pentru celulele musculare netede îl are factorul de creștere derivat plachetar (PDGF). Acesta se prezintă sub forma a 3 izoforme dimerice – AA, BB și AB, compuse din lanțuri A, B, C și D, unite prin legături disulfidice (12). Semnalul chemotactic al PDGF este tradus la nivelul celulelor musculare netede de către două tipuri de receptori (PDGFR), α și β. Pentru a crește afinitatea receptorilor pentru molecula PDGF, este necesară dimerizarea acestora, astfel că receptorul dimerizat αα leagă toate cele trei tipuri de molecule PDGF (AA, BB și AB), receptorul αβ este activat de izotipurile AB și BB, iar receptorul ββ doar de către izotipul BB (26). După legare, receptorul activează celula musculară netedă prin autofosforilarea componentei tirozin-kinazice. Din punct de vedere al capacității de activare, experimentele pe modele animale și in vitro au demonstrat că izoforma PDGF-BB este cea mai implicată în formarea neointimei, această izoformă fiind predominant eliberată prin degranularea plachetară (42).

Procesul de translocare al celulelor musculare netede din medie în intimă, după activarea acestora, se continuă prin liza matricei extracelulare și a trombului de către proteaze. Plasmina are rolul principal în degradarea matricei de fibrină de la nivelul trombului. Această protează este sintetizată prin clivarea plasminogenului de către urokinază, când acesta se găsește dizolvat și de către activatorul tisular al plasminogenului, când acesta este legat de fibrină. Activatorii plasminogenului sunt, la rândul lor, inhibați de către inhibitorii activatorului plasminogenului 1 și 2. Pe lângă degradarea fibrinei, plasmina joacă un rol crucial în activarea metaloproteinazelor matriceale (MMP), aceste proteaze fiind implicate în degradarea matricei extracelulare, permițând migrația celulelor musculare netede din medie în intimă (43). Metaloproteinazele matriceale pot fi clasificate în trei categorii – colagenaze, care degradează colagenul de tip I și III, gelatinaze care degradează gelatina, colagenul de tip IV și elastina și stromolizine, implicate în liza lamininei, fibronectinei și proteoglicanilor (44). Acțiunea proteolitică a metaloproteinazelor este inhibată de inhibitorii tisulari ai metaloproteinazelor (TIMP) 1 și 2. Postinjurie se constată un nivel crescut al MMP 1,2 și 9 la nivelul mediei și adventicei în primele zile, coroborat cu o activitate scăzută a TIMP 1 și 2, nivelul MMP scăzând, iar activitatea TIMP crescând la 14 zile postinjurie (45).

4. REMODELAREA INTIMALĂ

Statusul latent, contractil, neproliferativ al celulelor musculare netede este determinat de arhitectura tridimensională a matricei extracelulare, alcătuită preponderent din colagen de tip IV, laminină, proteoglicani și heparan-sulfat, matrice dispusă ca o anvelopă în jurul celulei (46). Acest status este alterat în momentul în care se produce degradarea matricei extracelulare de către metaloproteinaze și plasmină, celulele se dispun într-un singur strat și se transformă în fenotip secretor (47). Sub acțiunea chemotactică a factorilor de creștere, celulele musculare netede migrează în intimă, unde încep să sintetizeze și secrete cantități crescute de colagen, elastină și proteoglicani. Sinteza componentelor matriceale are ca scop reformarea matricei extracelulare de colagen și tensionarea acesteia în jurul celulei prin legarea încrucișată a fibrelor de colagen și elastină sub acțiunea lisil – oxidazei. Componentele secretate, mai ales colagenul de tip I și heparan sulfatul au efect inhibitor asupra proliferării și migrării celulare, îndeosebi prin sechestrarea proteinelor mitogene din categoria FGF. O altă moleculă inhibitorie asupra replicării și migrării celulare, dar stimulantă asupra sintezei și secreției componentelor matricei extracelulare este reprezentată de proteina TGF – β. Această proteină este activată de plasmină și la rândul său activează activatorul inhibitorului plasminogenului, producând un feedback negativ asupra producției de plasmină și a sintezei de TGF-β. De asemenea, are ca efect inhibarea sintezei de proteaze și creșterea sintezei inhibitorilor tisulari ai metaloproteazelor matriceale (13). Astfel, la 12 săptămâni după injurie, deși numărul de celule musculare din intimă nu crește față de cel de la 14 zile, se constată o acumulare crescută de țesut conjunctiv, responsabil de îngustarea lumenului arterial.

STRUCTURI MOLECULARE

FACTORUL DE CREȘTERE DERIVAT FIBROBLASTIC BAZIC

Factorii de creștere derivați fibroblastic au o largă răspândire în întreg regnul animal, fiind prezenți la vertebrate și nevertebrate, cu secvențe de aminoacizi identice în proporție de 70-80%, iar o genă FGF-like este prezentă în genomul anumitor virusuri, deși proteine FGF-like nu au fost evidențiate la organisme unicelulare (48).

Gena bFGF codează 4 tipuri de molecule bFGF, cu greutăți moleculare de 18, 22,5, 23,1 și 24,2 kDa, molecula de 18 kDa fiind cea mai răspândită, având o structură comună cu aFGF în proporție de 55%. Structura secundară a bFGF este formată din lanțuri β antiparalele unite prin legături de hidrogen intercatenare. În structura terțiară intră 3 copii ale unui motiv β-hairpin format din 4 catene β, rezultând o structură trimerică, triplu simetrică pe axa verticală, având conformația unei piramide închise la capete de lanțurile amino și carboxil terminale (49) (Figura 2). Această formă este rezultatul translației inițiate la nivelul codonului promoter 5’AUG, celelalte 3 forme fiind rezultatul translației inițiate la nivelul codonului CUG. Spre deosebire de ceilalți izomeri FGF, bFGF prezintă două reziduri de cisteină în plus, la nivelul aminoacizilor 70 și 88 (39).

Deși bFGF se găsește atât extracelular cât și intracelular, acesta acționează doar extracelular, prin intermediul receptorilor FGF. Cu toate acestea, moleculei bFGF îi lipsește clasica secvență hidrofobă lider, necesară căii excreției extracelulare a polipeptidelor. Această secvență este recunoscută de o proteină specifică – signal recognition particle (SRP), care oprește translația și transportă polipeptida în reticolul endoplasmatic, unde procesul se reia, iar proteina finală este excretată în lumenul acestuia. Ulterior, pe calea corpusculului Golgi, proteina este împachetată în vezicule și transportată la suprafața celulei. Au fost propuse multiple mecanisme pentru a explica prezența extracelulară a bFGF, în ciuda lipsei acestei proteine, incluzând eliberarea din celulele endoteliale lezate, din leucocitele recrutate la nivelul plăgii, prin șoc termic, dar cea mai plauzibilă ipoteză de secreție este că proteina bFGF este transportată extracelular prin calea interleukinei 1β. Această supoziție se sprijină pe faptul că bFGF și IL-1β au o structură omoloagă în proporție de 30%, nici una din proteine nu a fost evidențiată în vezicule citoplasmatice, ambele prezintă grupări tiol care necesită un mediu reductiv pentru activare, ceea ce presupune ocolirea mediului oxidativ de la nivelul reticolul endoplasmatic și ambele trebuie să evite activarea porțiunii intracelulare a receptorului, pentru a nu produce o acțiune intracrină (39). Caracteristic tuturor membrilor familiei FGF este afinitatea crescută pentru heparină și glicozaminoglicanii heparan-like (HLGAG). Molecula bFGF prezintă două situsuri de legare a heparinei, la nivelul secvențelor aminoacide 24-68 și 106-115, ambele polipeptide fiind capabile să formeze un complex cu heparina și în stare liberă. A fost de asemenea determinat că molecula bFGF este fixată de membrana bazală endotelială doar prin intermediul HLGAG și nu a altor componente, de tipul laminină sau colagen. Rolul acestei asocieri în activarea receptorului specific este descris în continuare.

Figura 2. Structura terțiară a bFGF

Sursa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

RECEPTORII FACTORILOR DE CREȘTERE DERIVAȚI FIBROBLASTIC

Proteinele FGF își realizează efectul mitogenic asupra celulelor țintă prin intermediul receptorilor transmembranari de tip tirozinkinază (FGFR). În prezent sunt cunoscute patru tipuri de receptori, cu structură asemănătoare, dar alcătuiți din aminoacizi diferiți (figura 2). Structura tip a oricărui receptor FGF cuprinde trei domenii extracelulare imunoglobulin-like (IgI, IgII și IgIII), o regiune acidică între IgI și IgII, un domeniu transmembranar și un domeniu intracelular de tip tirozinkinază (39) (Figura 3). Variația aminoacizilor din structura receptorilor FGF este determinată fie de splicing-ul alternativ al aceleiași gene FGFR, fie prin expresia diferitelor gene FGFR. Transmiterea semnalului intracelular se realizează prin dimerizarea a doi receptori de către două molecule FGF, în prezența unui glicozaminoglican heparan-like, ambii receptori devenind capabili de fosforilarea domeniilor citoplasmatice tirozinice, indiferent dacă sunt homo sau heterodimeri (50) (Figura 4). În absența moleculelor FGF, glicozaminoglicanii heparan-like mențin receptorii membranari într-o configurație care nu permite dimerizarea prin blocarea unei secvențe proteice dintre domeniile IgII și IgIII. Legarea moleculor FGF de receptori deblochează această secvență și, odată activat, receptorul recrutează proteinele semnal, care se leagă de domeniul citoplasmatic și care sunt modificate conformațional prin fosforilare, activând astfel diferite secvențe catalitice (51):

a) prin calea mediată de fosfolipaza C gamma se clivează fosfatidil-inozitol 4,5-bifosfat în inozitoltrifosfat, care eliberează calciul din reticulul endoplasmatic și diacilglicerol, care, împreună cu calciul eliberat activează protein-kinaza C. Calea fosfolipazei C gamma are o importanță crescută în alterarea citoscheletului celulei musculare.

b) prin calea proteinei Crk, semnalul este transmis moleculelor Shc, C3G și Cas, determinând un efect mitogenic asupra celulei.

c) prin calea Ras/MAPK, FGFR determină prin intermediul proteinei SNT-1/FRS2 progresia ciclului celular.

Figura 3. Structura domeniului tirozinkinazic al FGFR1

Sursa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

Figura 4. Complexul 2xbFGF-2xFGFR1

Sursa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

FACTORII DE CREȘTERE DERIVAȚI PLACHETAR

Această familie, alcătuită din 4 elemente – PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C și PDGF-D, face parte din superfamilia proteinelor cystine knot, ai cărei membrii prezintă un șablon de 6 reziduuri de cisteină care creează legături disulfidice intra și intermonomerice (52). Toate cele 4 molecule PDGF conțin două legături disulfidice care leagă două lanțuri antiparalele, formând un inel pătruns de a treia legătură disulfidică. Această conformație obligă proteina să adopte un aranjament tridimensional în care reziduuri hidrofobe sunt parțial expuse, fapt care predispune la dimerizare, formându-se fie homo sau heterodimeri (PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB etc.) (53). Cele 4 molecule sunt total inactive biologic în forma monomerică. Toate împart aceiași receptori (PDGFR) – PDGFR-α și PDGFR-β, care dimerizează când sunt activați de un dimer PDGF, rezultând trei combinații posibile – PDGFR-αα, PDGFR-ββ și PDGFR-αβ. Forma PDGF-BB este singura care activează toate cele 3 tipuri de receptori (54). Molecula monomer PDGF-B are în componență 109 aminoacizi, organizați în două lanțuri antiparalele de tip β, conectate în 3 regiuni, buclele I, II și III. La nivelul buclei II se consemnează prezența celor 3 legături disufidice aranjate sub forma de nod, cu puntea Cys16-Cys60 penetrând structura ciclică formată de punțile Cys49-Cys97/Cys53-Cys99(39) (Figura 5).

Figura 5. Structura terțiară a PDGFB.

Sursa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

RECEPTORII FACTORILOR DE CREȘTERE DERIVAȚI PLACHETAR

Cele două tipuri PDGFR, α și β, aparțin familiei receptorilor tip tirozin-kinază, subgrupului III, alături de receptorii c-KIT, FLT3 și factorului stimulator al coloniilor. PDGFRα leagă toate tipurile de monomeri PDGF, mai puțin PDGF-D, pe când PDGFRβ se leagă doar de PDGF-B și PDGF-D. Structural, cele două tipuri de receptori sunt similari, prezentând un domeniu extracelular alcătuit din 5 subdomenii imunoglobulin-like, un domeniu transmembranar și un domeniu intracelular kinazic, alcătuit din două subdomenii unite printr-o balama polipeptidică flexibilă (55). Datorită faptului că molecula PDGF biologic activă este un dimer, activarea unui receptor determină dimerizarea împreună cu un altul. Astfel, molecula PDGF se leagă de primele 3 subdomenii extracelulare Ig-like, stimulând dimerizarea prin legarea celui de-al 4-lea subdomeniu de cel al receptorului vecin. Dimerizarea receptorilor produce apropierea a două domenii intracelulare kinazice, determinând transfosforilarea reziduurilor tirozinice regulatorii. Astfel se inițiază semnale intracelulare prin legarea la aceste situri fosforilate a proteinelor semnal, incluzând proteina transducer activatoare a transcripției, fosfolipaza Cy, fosfatidilinozitol 3-kinaza, SRC kinaza și SHP2 fosfataza (56) (Figura 6).

Figura 6. Complexul 2xPDGF-B – 2xPDGFRβ

Sursa: http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

FACTORII PREDISPOZANȚI AI HIPERPLAZIEI INTIMALE

Așa cum a fost evidențiat în subcapitolele precedente, procesul de hiperplazie intimală este determinat de o pletoră de citokine, factori de creștere și proteaze care interacționează prin multiple mecanisme de augumentare sau inhibare al răspunsului vascular la injurie. Deși elementele implicate sunt aceleași, gradul de stenoză rezultat variază de la pacient la pacient, heterogenitate care datorează existenței unor condiții predispozante la un răspuns hiperplazic accentuat din partea vasului lezat. Acești factori pot fi clasificați în locali și sistemici.

FACTORII LOCALI

CARACTERISTICILE LEZIUNII

Gradul de întindere al peretelui vascular în timpul angioplastiilor cu balon a fost printre primii factori investigați pentru a explica procentul crescut de restenoză rezultat în urma introducerii tehnicilor endovasculare în practica clinică. Un experiment realizat de către Ian J. Sarembock et al în 1989 a presupus practicarea de angioplastii cu balon la iepruri din rasa New Zealand White la care se indusese ateroscleroză femurală. Echipa a demonstrat că, deși s-a obținut o creștere mai mare a diametrului arterial postangioplastie utilizându-se baloane cu un diametru mare și presiune inflatoare mare în comparație cu baloane cu diametru apropiat de cel al vasului și presiune inflatoare mică, incidența trombozei parietale, disecției și necrozei mediale și hiperplazia intimală la 28 de zile a fost mult mai mare în primul grup (p<0,01) (57). Hiroshi Sakamoto a demonstrat că gradul de întindere al peretelui vascular, în cazul angioplastiilor cu balon, este direct proporțional cu gradul de hiperplazie rezultat, până la un punct (58). Acest efect se explică în două moduri. În primul rând, discontinuitățile de structură produse în intimă și medie predispun la tromboză extinsă, un factor important în răspunsul vascular la injurie. În al doilea rând, deoarece în regiunea de stenoză, o parte din circumferința peretelui este alcătuită din plăci de aterom inextensibile, umflarea balonului supraîntinde zona sănătoasă a peretelui și o injurie atât de intensă determină un răspuns proliferativ exagerat. Aceste ipoteze explică foarte bine observațiile clinice conform cărora stenozele foarte strânse și leziunile excentrice determină o incidență crescută a restenozei (59,60).

Profunzimea și lungimea leziunii influențează direct răspunsul vascular la injurie. S-a constatat că, dacă leziunea este limitată la endoteliu, apare hiperplazia medială a celulelor musculare netede, fără hiperplazie intimală, în ciuda aderării plachetelor la zona denudată și a reendotelizării tardive (61). Rezultate total opuse se obțin dacă injuria este realizată intenționat mai profund, implicând media, chiar și în condițiile unei reendotelizări rapide (62). Potrivit acestor dovezi, simpla denudare endotelială nu reprezintă un semnal destul de puternic pentru a induce un răspuns hiperplastic endotelial agresiv, injuria medială fiind crucială în declanșare. P. Gonschior et al, analizând 200 de artere porcine lezate cu un cateter de aterectomie direcțional a confirmat că răspunsul vascular la leziune se declanșează imediat și depinde de profunzimea leziunii. Autorii au constatat că infiltrarea intramurală a leucocitelor polimorfonucleare s-a produs numai în cazul în care media a fost lezată, acest grup dezvoltând și un răspuns mioproliferativ pronunțat (63). Un studiu efectuat de către A. Kastrati et al pe un lot de 2736 pacienți a evaluat corelația dintre lungimea leziunii coronariene și restenoza poststentare, echipa constatând că restenoza a apărut la 36,9% din pacienții cu leziuni mai lungi de 15 mm, în comparație cu 27,9% la pacienții cu leziuni scurte (64). În cazul leziunilor lungi atât suprafața endotelială denudată cât și numărul de celule musculare mediale lezate sunt mai mari, riscul de restenoză crescând direct proporțional.

HEMODINAMICA

Factorii hemodinamici locali influențează major procesul de remodelare vasculară postinjurie. O condiție de bază pentru succesul și patența pe termen lung a unei revascularizări o constituie existența unui runoff de calitate. Christoph Hehrlein a realizat un experiment pe câini, ligaturând artera femurală proximal de trifurcația acesteia, alterând astfel runoff-ul, apoi producând denudări endoteliale cu balon și leziuni mediale termice cu laser. S-a constatat că aria de hiperplazie a fost cu 32% mai mare la animalele cu runoff alterat, în comparație cu lotul de control (p<0,01), independent de severitatea leziunii (65). Tendința de dezvoltare accelerată a țesutului neointimal în condițiile unui runoff precar a fost explicată de Philip Dobrin prin 3 experimente consecutive. Autorul a cuantificat efectele fiecărei forțe care acționează asupra peretelui vascular în modificările histologice subsecvente injuriei și a constatat că hiperplazia intimală apare preponderent în condițiile unui stres (forțe) de forfecare scăzut (66). Stresul de forfecare este direct proporțional cu viteza de curgere a sângelui, care, la rândul ei, este direct influențată de calitatea runoff-ului. Hisham S. Bassiouny et al au demonstrat că la nivelul unei anastomoze termino-laterale se dezvoltă două zone de hiperplazie intimală: la nivelul liniei de sutură și la nivelul planșeului vasului receptor. Realizând un model artificial care simula condițiile de geometrie și pulsatilitate ale unei anastomoze termino-laterale, autorii au arătat că, la nivelul planșeului, există o zonă de stagnare a curgerii, din cauza turbulențelor, spre deosebire de plafon, unde viteza de curgere este mare și se corelează cu lipsa hiperplaziei decelate experimental (67). Intensitatea forței de forfecare este direct proporțională cu sinteza și secreția de către endoteliu a factorilor paracrini vasodilatatori – oxidul nitric și prostacicline, care au un puternic efect antimitogenic (68). În condițiile unui runoff precar, sinteza scăzută a acestor factori permite dezvoltarea excesivă a țesutului de neoformație. În această privință, Morinaga a demonstrat că zonele de hiperplazie se reduc dacă vasul este reimplantat într-un sistem cu parametri de curgere normali (69).

HISTOLOGIA GREFONULUI AUTOLOG ȘI TRAUMA VASCULARĂ

Grefoanele venoase, folosite în revascularizările miocardice sau periferice, prezintă adesea zone cu structură histologică alterată, fie fibros sau varicos. Studiile histologice au decelat în aceste zone o distrugere medială severă, cu transformarea celulelor musculare netede din fenotip contractil în fenotip secretor, o creștere importantă în numărul vasa vasorum și alterarea metabolismului matricei extracelulare (70). Transplantarea acestor grefoane în circulația arterială le supune unor forțe de extensie (tensile) și forfecare (shear) mult mai mari decât cele care acționează în mod normal asupra peretelui venos. Răspunsul fiziologic normal la augumentarea acestor forțe îl reprezintă procesul de arterializare, caracterizat prin hipertrofie transmurală, atât celulară cât și matriceală (71). Acest proces este inițiat prin denudarea endotelială cauzată de forfecare și apoptoza medială determinată de extensia prin pulsație. Atât în zonele de fibroză cât și în cele dilatate varicos, fluxul laminar este perturbat, apar turbulențe majore și deformări tangențiale, care cauzează leziuni extinse endoteliale și mediale (72). Aceste leziuni, apărute într-un perete vascular cu structură histologică alterată, au ca efect o hiperplazie intimală accentuată. A fost demonstrat experimental că stabilizarea fluxului prin stentarea externă a zonelor dilatate varicos atenuează distensia tangențială și limitează răspunsul proliferativ (73).

Trauma vasculară apărută în timpul procesulor de recoltare și preparare ale grefonului reprezintă un alt factor care contribuie la dezvoltarea neointimei. Aceasta are două componente. În primul rând, dilatarea pentru a evidenția efracțiile parietale are ca efect direct o traumă mecanică – denudarea endotelială. În aceste zone aderă plachetele și leucocitele care eliberează citokinele și factorii de creștere prohiperplazici (74). Zonele deendotelizate sunt acoperite în primele 14 zile prin proliferarea și migrarea celulelor endoteliale adiacente (75), dar acest neoendoteliu este disfuncțional, având o capacitate scăzută de producere și secreție a acidului nitric și prostaciclinelor, importanți factori antihiperplazici (76). A doua componentă o reprezintă trauma ischemică, care este direct legată de timpul scurs până la reimplantarea în circulație. Trebuie precizat că oxigenul utilizat în metabolism de endoteliu și media internă provine prin difuziune directă din sânge, în timp ce media externă și adventicea sunt oxigenate din rețeaua vasa vasorum. Inițial, după recoltare, grefonul suferă o ischemie panmurală, fiind afectate toate cele 3 tunici. Odată reinserat în circulație, endoteliul și media internă își reiau metabolismul aerob, în timp ce în media externă și adventice ischemia persistă până la refacerea rețelei vasa vasorum. Injuria ischemică promovează hiperplazia intimală în două moduri. Radicalii superoxid sintetizați prin metabolism anaerob au un puternic efect mitogen (77). Pe de altă parte, a fost demonstrată o tendință de migrare a celulelor musculare netede din media externă în intimă atunci când rețeaua vasa vasorum este lezată, datorită concentrației crescute de oxigen, independent de prezența unei leziuni endoteliale (78).

FACTORI SISTEMICI

ALTERĂRILE METABOLICE

Ca și în cazul aterosclerozei, diabetul are un rol important în proliferarea neointimală. Rata crescută de stenoză coronariană postangioplastie și stentare la pacienții diabetici, în comparație cu cei nediabetici, a fost documentată în numeroase studii (79,80). Hiperinsulinemia tranzitorie pare a fi principala cauză și apare atât la pacienții tratați cu antidiabetice orale care prezintă rezistență la insulină, cât și la cei insulinonecesitanți. Insulina promovează hiperplazia intimală atât prin efectul direct mitogenic pe care îl posedă, stimulând proliferarea celulelor musculare netede prin activarea căii Ras-MAPK (mitogen-activated protein kinases), cât și prin stimularea producției factorilor de creștere (81). A doua cauză o reprezintă produșii finali de glicozilare avansată (AGEs), care se acumulează în țesutul vascular odată cu înaintarea în vârstă, mai ales la pacienții diabetici. Celulele musculare netede mediale prezintă receptori specifici (RAGE), iar interacțiunea AGE-RAGE determină stimularea inflamației, proliferarea celulelor musculare netede și o secreție crescută a componentelor matricei extracelulare (82).

Hipercolesterolemia este un alt factor de risc implicat în restenoza hiperplastică. Efectul de stimulare al procesului este cunoscut de mai bine de 20 de ani și se bazează pe promovarea inflamației (83). În condiții de hipercolesterolemie, proteina chemotactică monocitară (MCP-1), denumită și ligandul chemochinic 2 (CCL2), este exprimată pe membrana celulelor musculare netede în număr crescut, iar receptorul acesteia (CCR2) pe suprafața monocitelor (84). Interacțiunea CCL2-CCR2 reprezintă principala cale prin care monocitele sunt recrutate la locul unei injurii endoteliale, menținând astfel procesul inflamator și stimulând dezvoltarea neointimei (85). Inhibarea interacțiunii prin administrarea anticorpilor monoclonali anti CCL2 a determinat scăderea marcată a ariei neointimei. De asemenea, în experimentele pe animale, s-a demonstrat că, în condiții de hipercolesterolemie, există o expresie crescută a ARN mesager al colagenului de tip I, o secreție crescută a acestuia în matricea extracelulară și o reducere semnificativă a activității metaloproteazelor matriceale (86). Un al treilea efect negativ indus de hipercolesterolemie, strâns legat de stresul oxidativ, îl reprezintă încetinirea procesului de reendotelizare postinjurie (87).

Homocisteina, un aminoacid sulfonat derivat din metionină, neimplicat în formarea proteinelor, poate fi metabolizat în cisteină prin transsulfurare, sau înapoi la metionină, prin remetilare. Creșterea nivelului sanguin al acestui aminoacid se poate datora unui deficit moștenit al activității enzimelor implicate în metabolism, sau datorită deficienței cofactorilor enzimatici – vitaminele B6, B9 și B12 (88). Hiperhomocisteinemie este cunoscută a fi un factor de risc independent pentru ateroscleroză cât și pentru hiperplazie intimală. Mecanismele prin care nivelurile crescute de homocisteină promovează neoformația intimală sunt reprezentate de inducerea unei stări inflamatorii cronice și leziuni endoteliale subsecvente, modularea expresiei a multiple gene prin alterarea metilării, promovarea unei stări procoagulante permanente, accelerarea apoptozei și creșterea sintezei matricei extracelulare (89).

TULBURĂRILE DE COAGULARE

Disfuncționalitățile elementelor implicate în procesul de coagulare pot determina augumentarea hiperplaziei intimale și stenoză subsecventă. Aderarea plachetară la leziunea endotelială și formarea cheagului parietal reprezintă declanșatorii procesului de vindecare vascular. Un răspuns exacerbat la injurie atunci când trombocitemia este crescută patologic a fost documentat în cazul bolilor mieloproliferative cronice, în principal policitemia vera și trombocitemia esențială. Acești pacienți, mai ales dacă prezintă mutația genei JAK2 (Janus kinase 2), prezintă o expresie augumentată a factorului tisular pe membrana plachetară, creșterea sangvină a agregatelor plachete/neutrofile și semne de activare a neutrofilelor, fiind predispuși la accidente trombotice mai ales în teritoriul arterelor de calibru mediu și mic (coronare) și la restenoză accelerată(90).

Factorul Xa formează un complex cu factorul Va și clivează protrombina în trombină activă, care convertește fibrinogenul în monomeri de fibrină. Pe lângă rolul în cascada coagulării, trombina stimulează agregarea și degranularea plachetară prin clivarea receptorilor activați de proteaze (PAR) de pe membrana plachetară. Este, de asemenea, un puternic mitogen pentru celulele musculare netede și are efect chemotactic pentru acestea în intimă, acțiuni realizate prin activarea PAR 1 și 2 de pe membrana acestora (91). Situațiile patologice în care trombina este generată în exces, cum ar fi neoplaziile, trombofilia protrombinică sau terapia hormonală de substituție postmenopauză au fost asociate cu un răspuns hiperplastic intimal accelerat (92,93). Activitatea procoagulantă a trombinei este specific inhibată de antitrombina III în plasmă și de cofactorul heparinic II în spațiul subendotelial, în prezența dermatan sulfatului. Datorită faptului că efectul promitotic al trombinei este neutralizat de acest complex, deficiența genetică a cofactorului heparinic II este asociată cu un răspuns exacerbat la injurie, pe când un nivel plasmatic ridicat al acestuia are acțiune protectivă contra restenozei intrastent (94).

Hiperplazia este de asemenea stimulată când apare o augumentare anormală a fibrinolizei. Plasmina se formează din plasminogen, sub acțiunea unei serii de activatori, cei mai importanți fiind urokinaza în ser și activatorul tisular al plasminogenului (t-PA), legat de fibrină sau expus pe celulele endoteliale perilezionale. Rolul principal al plasminei este lizarea cheagului prin degradarea polimerilor de fibrină, dar produce și proteoliză pericelulară, atât direct, prin degradarea matricei extracelulară, cât și indirect, prin activarea metaloproteazelor matriceale, eliberând în același timp factorii de creștere cu efect chemotactic celular blocați în matrice (95). Pe lângă această acțiune indirectă de facilitare a migrării celulare în intimă, plasmina activează direct celulele musculare netede, prin clivarea receptorului membranar Plg-RKT și are efect chemotactic asupra celulelor proinflamatorii, prin intermediul fragmentelor anafilatoxinice rezultate din degradarea factorilor complementului C3 și C5 (96). Este binecunoscut faptul că ciroza hepatică este asociată cu hiperfibrinoliza. Un studiu efectuat pe un lot de 210 pacienți a relevat o prevalență crescută a restenozei poststentare coronariană la pacienții cu ciroză nonalcoolică (43,3% vs 16%, p<0,001), independent de nivelul LDL colesterol (97). De asemenea o accentuare a fibrinolizei apare în cazul intervențiilor chirurgicale prelungite, durata operației fiind recunoscută drept un factor de pronostic negativ asupra patenței după revascularizările coronariene deschise (98).

FUMATUL

Cunoscut drept principalul factor de risc în progresia aterosclerozei, fumatul joacă un rol important în inițierea și augumentarea hiperplaziei intimale. Expunerea la fumul de țigară determină creșterea numărului de plachete și a capacității acestora de a adera la peretele vascular lezat și le inhibă activitatea mitocondrială (99). De asemenea cauzează neutrofilie și stimulează activarea neutrofilelor de către complement. Deși neutrofilele nu secretă factori de creștere, ele contribuie la injuria parietală prin eliberarea de radicali ai oxigenului și proteaze. Degradarea matricei extracelulare este amplificată de expunerea cronică la fumul de țigară prin creșterea expresiei și a activității metaloproteazelor matriceale (100). Tabagismul cronic crește aderența monocitară în vitro la celulele endoteliale cultivate din vena ombilicală umană, promovând inflamația (101). Celulele endoteliale sunt direct afectate, fumatul interferând cu propietățile regulatorii normale, crescând permeabilitatea membranară, posibilitatea de detașare după injurie, contracția celulară, eliberarea de citokine proinflamatorii și scăzând sinteza de ADN a acestor celule (102). Asupra celulelor musculare netede, fumatul are un efect de stimulare a ratei de proliferare și de creștere a viabilității, efect datorat hidrocarburilor policiclice aromate. Miocardina reprezintă un regulator cheie al diferențierii celulelor musculare netede în paturile vasculare periferice. Cercetările experimentale au relevat că fumul de țigară inhibă expresiei ARNm al miocardinei, sinteza α-actinei, a lanțurilor grele de miozină, dependent de doză, inducând astfel proliferarea celulară și, în același timp, promovând apoptoza (103).

CELULELE PROGENITOARE ENDOTELIALE

Endoteliul vascular este un organ dinamic, format dintr-un strat continuu de celule care acoperă suprafața luminala a vaselor și reacționează la forțele fizice și semnale chimice, afectând vasomotricitatea, tromboza, agregarea plachetară și inflamația. Celule progenitoare endoteliale (EPC) izolate din sângele periferic sunt originare din măduva osoasă. Rolul lor este de a migra, a se diferenția în celulele endoteliale și de a acoperi zonele intimale deendotelizate (104). A fost demonstrată o corelație directă între numărul scăzut de celule progenitoare endoteliale în sângele periferic și progresia bolii coronariene (105). De asemenea, în experimentele de laborator, transplantul autolog de EPC a îmbunătățit proprietățile vasculoprotective ale neoendoteliului, rezultaând inhibarea formării de hiperplaziei intimale (106). Un alt studiu a arătat că stenturile acoperite cu anticorpi anti – caderină endotelială vasculară au capturat celulele progenitoare endoteliale circulante, rezultând astfel o refacere accelerată a endoteliului la nivelul stentului și hiperplazie intimală redusă (107). Numărul de EPC circulante scade la pacienții cu hipercolesterolemie, deficit de vitamina D, nivel scăzut de estrogen în plasmă și este stimulat prin antrenament fizic, administrarea de eritropoietină și statine.

PARTEA SPECIALĂ

SCOPUL ȘI METODOLOGIA STUDIULUI

Conform Organizației Mondiale a Sănătății, bolile cardiovasculare și accidentele vasculare cerebrale sunt responsabile pentru aproape o treime din decesele survenite la nivel mondial în anul 2012 (figura 7). Există o discrepanță marcată între țările sărace și cele bogate, prevalența bolilor cardiovasculare fiind net superioară în statele dezvoltate, unde determină aproape jumătate dintre decese. În ciuda controlului agresiv al factorilor de risc, cât și al progreselor tehnicilor endovasculare de revascularizare, mortalitatea cauzată de bolile cardiovasculare continuă să crească (figura 8).

În acest moment, hiperplazia intimală postintervențională reprezintă principala cauză de eșec al procedurilor de revascularizare deschise și singura în cazul celor endovasculare, pe termen lung. Așa cum a fost descris în capitolele precedente, conform cunoștințelor actuale, fiziopatologia acestui proces poate fi considerată multifactorială, multidirecțională, proporțională cu intensitatea leziunii și slab reversibilă. Coagularea și inflamația rezultate în urma leziunii postprocedurale determină un răspuns din partea peretelui vascular, caracterizat prin replicarea celulelor musculare în medie și migrarea în intimă, unde secretă constituenți ai matricei extracelulare, determinând îngroșarea acesteia și scăderea suprafeței lumenului. Dacă în cazul revascularizărilor cu grefon autolog se poate vorbi atât de hiperplazie cât și de hipertrofie excentrică (remodelare) – arterializarea, în cazul procedeelor endovasculare stenoza post intervențională se datorează exclusiv hiperplaziei. Experimental au fost testate multiple metode de tratament, care vizează blocarea procesului la diferite nivele și care vor fi detaliate pe larg în capitolul dedicat discuțiilor. Transpuse în practica clinică, aceste noi terapii au reușit să crească rata de patență mai ales a procedurilor endovasculare, fără a elimina în totalitate stenozele postintervenționale, fapt care impune obligativitatea continuării cercetărilor în acest domeniu.

În acest scop, studiu prezent și-a propus să evalueze impactul pe care l-ar avea blocarea replicării și migrării celulelor musculare netede asupra gradului de hiperplazie subsecvent. Deși există multipli factori care stimulează celulele musculare netede să devină elementul central al procesului, cercetările anterioare au evidențiat rolurile extrem de importante pe care le au factorul de creștere derivat fibroblastic bazic asupra replicării și factorul de creștere derivat plachetar asupra migrării. Inactivarea acestor factori cu anticorpi monoclonali s-a dovedit a avea un efect benefic asupra gradului de hiperplazie. Cu toate acestea, trebuie ținut cont de faptul că aceste molecule nu sunt sintetizate doar la nivelul leziunii vasculare, ci sunt produși fiziologic de multiple celule din organism (fibroblaști, mioblaști, celule endoteliale, macrofage etc.) ca răspuns la stimuli variați. Astfel, această cercetare a abordat procesul patologic din perspectiva blocării receptorilor acestor factorii. Receptorii sunt sintetizați de celulele musculare netede viabile doar la nivelul leziunii vasculare, mai ales ca răspuns la stimuli paracrini produși prin apoptoza celulelor vecine și detensionarea citoscheletului prin degradarea matricei extracelulare de către macrofage, metaloproteinaze și plasmină.

Medicamentele utilizate pentru a împiedica interacțiunea factor de creștere – receptor au fost Imatinib și PD174073. Imatinib este un medicament sintetizat inițial pentru tratamentul pacienților cu leucemie mieloidă cronică Philadelphia pozitivi prin blocarea autofosforilării tirozinkinazei din componența proteinei de fuziune Bcr-abl. Cercetări ulterioare au evidențiat capacitatea acestui produs de a opri activarea tirozinkinazei de la nivelul tuturor receptorilor PDGF. PD174073 reprezintă un alt produs de sinteză creat inițial pentru a fi testat în tratamentul cancerului pulmonar cu celule mici și a celui ovarian, mecanismul de acțiune fiind reprezentat de inactivarea tirozinkinazei din structura receptorilor factorilor de creștere derivați fibroblastic.

Pentru a evalua capacitatea acestor compuși în a inhiba dezvoltarea hiperplaziei intimale postlezionale, a fost necesar un model experimental de inducere a neoformației intimale după injurie, care să răspundă mai multor necesități:

Să fie ușor de realizat din punct de vedere tehnic.

Ținând cont de faptul că în centrul procesului de hiperplazie se află celula musculară netedă vasculară, vasul țintă care urma să fie lezat trebuia să fie o arteră musculară, arterele elastice – aorta, iliacele – fiind excluse.

Artera lezată trebuia să aibă un diametru suficient de mare, astfel încât, după leziune, să nu apară tromboza totală.

Intervenția chirurgicală prin care urma să se producă leziunea vasculară trebuia să aibă un impact fiziopatologic cât mai mic asupra organismului animalului de laborator, astfel încât acesta să supraviețuiască cel puțin 14 zile postoperator.

Aria anatomică aleasă pentru intervenția chirurgicală trebuia să permită redisecția după 14 zile, în vederea recoltării specimenelor necesare analizelor histologice.

Ținând cont de toate aceste necesități, s-a realizat o evaluare atentă a modelelor experimentale descrise în literatură, cele mai utilizate fiind:

Denudarea endotelială a arterelor carotide comune ale șobolanului. În cadrul acestui model, denudarea se realizează fie cu un cateter Fogarty 2F, fie cu un fir metalic flexibil, fie cu un flux ușor de aer de-a lungul lumenului vasului (108). Deși acest model este ușor de realizat practic, leziunea produsă este reprezentată doar de simpla denudare endotelială, tunica medie nefiind deloc lezată. Așa cum a fost descris într-un capitol precedent, lezarea directă a celulelor musculare netede și apoptoza acestora reprezintă elementul central în schimbarea fenotipului acestora în secretor și în declanșarea migrării acestora spre intimă.

Modelul de leziune a arterei femurale la șobolan prin reacția fotochimică dintre lumina verde transluminală și roșul Bengal administrat sistemic, produce, de asemenea, doar injurie endotelială, fără afectare medială (109).

Toate modelele de leziune la nivelul aortei șobolanului au fost excluse, ținând cont de faptul că aceasta este un vas predominant elastic și nu se pretează ideii de bază a acestei cercetări, de a bloca replicarea și migrarea celulelor musculare netede.

Provocarea de leziuni prin supraîntindere în media arterelor carotide comune ale iepurilor din rasa New Zealand White presupune introducerea unui cateter Fogarty 3F la acest nivel și umflarea balonașului până când artera își dublează diametrul (110). Acest model are avantajul că determină leziuni mediale, dar, în același timp implică o arteră elastică și are dezavantajul unei logistici dificile în asigurarea condițiilor de viață adecvate în perioada postintervențională.

Modelele experimentale pe animale mari – porc, câine, au fost excluse din cauza logisticii dificile care ar fi trebuit implementată.

Având în vedere necesitățile modelului experimental pentru cercetarea propusă și dezavantajele modelelor deja expuse, echipa de cercetare a gândit și a pus în practică un nou model. Acesta presupune disecția ambelor artere femurale comune la șobolan, secționarea totală și reanastomoza termino-terminală a celor două capete, avantajele acestuia fiind următoarele:

Experiența importantă a membrilor echipei de cercetare în microchirurgia vasculară a șobolanului permite realizarea intervenției chirurgicale fără dificultăți și complicații tehnice majore.

Disecția circumferențială a arterelor femurale lezează rețeaua vasa vasorum, așa cum se întâmplă și în chirurgia deschisă umană, iar întreruperea acestei rețele reprezintă un factor dovedit de accentuare a răspunsului hiperplastic.

Secționarea transversală a vaselor are corespondent în chirurgia deschisă umană, iar leziunile produse afectează atât media cât și intima vasculară.

Dilatarea celor două capete în vederea reanastomozei determină denudare endotelială, așa cum se întâmplă în chirurgia vasculară umană în cazul preparării venei folosite ca grefon autolog.

Sutura transfixiantă folosită pentru realizarea anastomozei corespunde cu cea din chirurgia umană și produce atât leziuni mediale cât și intimale.

Posibilitatea de a realiza două anastomoze la același animal permite reducerea costurilor și recoltarea a cel puțin unui specimen, în caz de tromboză a unei artere.

Redisecția în această zonă anatomică, în vederea recoltării specimenelor necesare analizei histologice, este facilă.

Proiectarea studiului a determinat crearea a 3 loturi experimentale:

LOTUL MARTOR a fost compus din două animale, care nu au suferit intervenție chirurgicală și nu au primit medicamentele și de la care s-au recoltat cele 4 artere femurale.

LOTUL EXPERIMENTAL 1 a inclus 5 animale la care s-a intervenit chirurgical, dar care nu au primit medicamente și de la care s-au recoltat 10 artere femurale la 14 zile postoperator.

LOTUL EXPERIMENTAL 2 a fost alcătuit din 13 animale, care au fost operate și care au primit medicamente timp de 14 zile. Conform referințelor din literatură, dozele utilizate în cazul modelului murinic au fost de 25 mg/kgc/zi pentru Imatinib și 2 mg/kgc/zi pentru PD174073. Calea de administrare a fost gavajul gastric. La sfârșitul perioadei de tratament au fost eutanasiate și li s-au recoltat arterele femurale.

Rezultatele au fost evaluate utilizând următorii parametri (figura 9):

RAPORTUL INTIMĂ/MEDIE – RIM a fost calculat ca fracția dintre suprafața delimitată de lumen și limitanta elastică internă – Si și suprafața delimitată de limitanta elastică internă și cea externă – Sm.

În cazul unei artere sănătoase, acest raport este foarte mic, ținând cont de faptul că Si este reprezentat de un strat subțire de celule endoteliale împreună cu membrana bazală pe care acestea repauzează.

GRADUL DE STENOZĂ DETERMINAT DE INTIMĂ – GSI reprezintă raportul dintre suprafața lumenului – Slu și suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă – Slei, adică suma dintre suprafețele intimei și lumenului.

Acest parametru cuantifică participarea intimei la micșorarea suprafeței lumenului. Atunci când celulele musculare netede migrează în intimă și secretă constituenți ai matricei extracelulare, aceștia ocupă spațiu în lumen, astfel că în caz de hiperplazie intimală, acest raport este mai mic decât la o arteră sănătoasă.

GRADUL DE STENOZĂ DETERMINAT DE MEDIE – GSM reprezintă raportul dintre suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă, adică suma dintre suprafețele intimei și lumenului și suprafața circumscrisă de limitanta elastică externă – Slee, adică suma suprafețelor lumenului, intimei și mediei.

Acest parametru calculează contribuția mediei la reducerea suprafeței lumenului și ține cont de faptul, pe de o parte, că limitanta elastică internă nu este o structură rigidă, nemodificabilă structural, iar, pe de altă parte, nu toate celulele musculare netede nou formate în medie migrează în intimă, determinând astfel atât o hiperplazie medială excentrică, spre adventice, cât și una concentrică, spre lumen.

GRADUL DE STENOZĂ COMBINAT – GSC reprezintă raportul dintre suprafața lumenului și aria circumscrisă de limitanta elastică externă.

Acest parametru calculează contribuția combinată a mediei și intimei la reducerea suprafeței lumenului.

Figura 9. Delimitarea suprafețelor tunicilor pentru evaluarea rezultatelor

Pentru că, în cadrul procesului de fixare în parafină a specimenelor recoltate, suprafața lumenului se reduce prin colabarea vasului, s-a realizat calcularea suprafeței unui cerc a cărui circumferință ar fi egală cu perimetrul măsurat, după cum urmează:

Lungimea cercului = perimetrul lumenului = 2

L = 2

r =

Aria cercului

Slu = L2/42

MODELUL EXPERIMENTAL

CONSIDERAȚII ETICE

Experimentele pe animale de laborator, reprezintă, pentru multe zone ale medicinii moderne, cheia înțelegerii mecanismelor fiziopatologice, a dezvoltării de noi strategii terapeutice și a verificării potențialului de vindecare a noilor molecule și medicamente, asigurând astfel progresul acestei științe și îmbunătățirea calității vieții. Intervențiile la care sunt supuse animalele de laborator determină durere, stres psihic și leziuni permanente asupra acestora. De aceea, au fost elaborate la nivel mondial multiple ghiduri și protocoale utilizate în cercetarea pe animale, care se concentrează pe următoarele aspecte (111):

Scopul cercetării trebuie să fie clar enunțat: dobândirea de noi cunoștiințe, obținerea de rezultate benefice pentru sănătatea umană/animală, replicarea unor experimente anterioare în scop didactic. Potențialul științific al experimentului trebuie să fie important, iar cercetătorul trebuie să fie bine informat despre experimentele anterioare și să evalueze toate posibilitățile de cercetare care nu implică animale de laborator.

Personalul implicat în cercetare trebuie să cunoască principiile etice ale cercetării pe animale, noțiuni elementare de îngrijire și manipulare a speciei respective și să nu se angajeze în acțiuni experimentale care le depășesc competența sau experiența.

Toate procedurile efectuate pe animale de laborator vor fi avizate de un comitet local, pentru a se asigura caracterul adecvat și uman al acestora și pentru a limita pe cât posibil suferința și leziunile suferite de animale.

Animalelor de laborator li se vor asigura îngrijiri cu caracter uman și condiții de viață cât mai apropiate de mediul natural pe perioada șederii în laboratorul instituției respective.

În cazul în care este necesară eutanasia la sfârșitul experimentului, se va utiliza o metodă care va produce o moarte rapidă și fără durere.

Toate aceste principii etice au fost luate în considerare în proiectarea studiului care stă la baza acestei lucrări și toate etapele studiului s-au desfășurat sub atenta supraveghere a unui medic veterinar cu experiență.

ANESTEZIA ȘI PREGĂTIREA PREOPERATORIE

Preoperator animalele au fost adăpostite în condiții controlate de temperatură (22oC) și luminozitate (12 ore pe zi de lumină) și nu au avut restricții de alimentație sau hidratare. Metoda anestezică utilizată în cadrul intervențiilor chirurgicale a fost cea inhalatorie. Această metodă permite o manipulare minimă a animalelor, are un cost scăzut, este sigură și permite o trezire rapidă. În figura 10 este expusă organizarea sistemului de anestezie. Anestezicul folosit a fost isofluran (Anesteran, fl 100 ml, S.C. ROMPHARM COMPANY S.R.L). Animalul a fost plasat în camera de inducție, iar vaporizorul (Surgivet/Anesco, SMITHS MEDICAL ASD INC) a fost pornit, asigurând un flux de 1l/min, cu 5 % agent anestezic. După aproximativ 3 minute, s-a verificat profunzimea anesteziei prin aplicarea de stimuli dureroși, iar dacă aceasta era adecvată fluxul a fost scăzut la 300 ml/min, cu 3% agent anestezic și deviat spre circuitul conului nazal. Animalul a fost mutat din camera de inducție pe masa de operație, a fost plasat în decubit dorsal, i s-a montat conul nazal, iar membrele inferioare i-au fost fixate în ușoară extensie cu bande elastice. Ulterior s-a practicat îndepărtarea pilozității de la nivelul membrelor inferioare și a jumătății inferioare a abdomenului – Figura 11.

Figura 10. Sistemul de anestezie

1. Vaporizor cu debitmetru. 2. Cameră de inducție.

3. Tub conector pentru anestezic. 4. Tub conector pentru oxigen

Figura 11. Animalul plasat în decubit dorsal, cu membrele inferioare fixate cu bandelete elastice

INTERVENȚIA CHIRURGICALĂ

Pentru realizarea operației s-a folosit o trusă microchirurgicală standard (S&T AG, Elveția), alcătuită din:

Portac microchirurgical, 14 cm

Foarfec de disecție microchirurgical, 15 cm

Foarfec pentru adventice, 15 cm

Pensă microchirurgicală angulată, 11 cm

Dilatator vascular microchirurgical, 11 cm

Pensă de aplicare a clampilor

Un microaproximator

Doi microclampi vasculari

Foarfec de incizie

Pe lângă aceste instrumente a fost utilizat și un microcauter (Erbe Elektromedizin GmbH, Germania) pentru controlul hemostazei și secționarea micilor ramuri colaterale.

Inițial se practică o incizie oblică de aproximativ 3 cm lungime, în pliul cutanat care delimitează abdomenul de membrul inferior și care reprezintă reperul extern pentru ligamentul inghinal. Se poziționează un retractor peste abdomen, pe o direcție superioară și medială, apoi se disecă și se retractă medial țesutul adipos subcutanat, evidențiindu-se astfel ligamentul inghinal. Se repoziționează retractorul abdominal astfel încât să încarce și ligamentul inghinal și în acest mod se expun în câmpul operator vasele femurale – figura 12. Microdisecția se realizează în totalitate sub microscop, la o mărire de cel puțin 12x. Se începe cu îndepărtarea țesutului conjunctiv perivascular cu ajutorul a două bețigașe de bumbac, apoi se deschide teaca vasculară folosind pensa și foarfecul microchirurgical. Nervul femural se disecă facil de arteră, dificultatea în această etapă a intervenției constând în disecția venei femurale, care aderă strâns de arteră. Artera se poate manipula cu pensa microchirurgicală, prinzând doar adventicea, pe când vena prezintă o adventice foarte subțire și friabilă, de aceea fiind indicată disecția folosind un bețigaș de bumbac. Odată ce artera este preparată circumferențial, se disecă ramura musculară pe aproximativ 3 mm și se cauterizează. Artera epigastrică superficială se poate ligatura/cauteriza dacă împietează cu prepararea arterei femurale.

Figura 12. Pachetul vasculo-nervos femural al șobolanului:

1 – Vena. 2 – Artera . 3 – Nervul femural

La sfârșitul microdisecției artera femurală trebuie să fie preparată pe o porțiune de cel puțin 1 cm (figura 13). În cazul în care apare spasmul arterial, înainte de a începe procedura de secționare și reanastomoză, se indică irigarea plăgii cu o soluție de lidocaină 1% pentru cel puțin 3 minute (112).

Figura 13. Artera femurală a șobolanului disecată circumferențial

Înainte de a trece la etapa de secțiune și reanastomoză, se realizează o hemostază minuțioasă și se lavează câmpul operator pentru a se îndepărta cheagurile formate în timpul disecției. În același timp, se plasează sub arteră, acoperind toate celelalte structuri, o bucată de material hidrofob, de preferat de culoare albastră, pentru a crea un contrast cu artera și o mai bună vizualizare a detaliilor în timpul anastomozei.

După verificarea capacității clampilor microaproximatorului de a se deschide ușor și de a glisa pe bara suport, aceștia, deplasați la cele două capete ale barei suport, se aplică pe arteră, inițial cel distal și ulterior cel cranial, realizându-se astfel o vasodilatație suplimentară. În timpul acestei manevre, artera se manipulează fin cu ajutorul penselor, apucând doar de adventice. Înainte de a aplica clampul proximal se exercită pe arteră o forță de tracțiune longitudinală, în sens caudal, mărindu-se astfel lungimea vasului fixată între clampi. Artera trebuie fixată doar în treimea distală a clampului, unde presiunea de închidere este maximă și nu trebuie să fie torsionată (112).

Secționarea arterei după clampare se realizează cu precizie, dintr-o singură mișcare. Prepararea vasului pentru anastomoză include irigarea, excizia adventicei și dilatarea. Prin irigare se îndepărtează în totalitate sângele din cele două capete arteriale, manevra realizându-se fără a introduce canula în lumen. Ulterior se excizează adventicea în exces de la cele două capete, astfel acestea devenind clar vizibile pentru anastomoză și se evită, în același timp, prinderea acesteia în sutură, o cauză importantă a trombozei precoce. Ultima etapă în pregătirea anastomozei o reprezintă dilatarea, prin care se elimină spasmul și se lărgește diametrul celor două capete, ușurând astfel sutura (figura 14) (112). Înainte de a începe anastomoza, cei doi clampi sunt apropiați de centrul microaproximatorului, astfel încât între capetele arteriale să nu fie o distanță mai mare de 1 mm.

Anastomozele au fost realizate folosind fire monofilament, neabsorbabile, din poliamidă, 10.0 (BBraun Surgical, Germania). A fost folosită tehnica triangulației cu fire separate. Durata anastomozei a variat între 30 și 45 minute. Patența acesteia a fost verificată prin testul de golire și reumplere (figura 15). Înainte de închiderea plăgii s-a practicat o hemostază minuțioasă și lavaj abundent. Incizia a fost suturată în două straturi folosind fire resorbabile din polidioxanonă, 4.0 (BBraun Surgical, Germania). După trezire, animalele au fost monitorizate timp de o oră, apoi transportate în biobază.

Figura 14. Pregătirea arterei femurale pentru anastomoză

Figura 15. Anastomoză patentă

ANALIZA HISTOLOGICĂ ȘI INFORMATICĂ

La 14 zile postoperator s-a practicat redisecția arterelor femurale bilateral, din care s-au prelevat probe de aproximativ 1 cm lungime, centrate pe zona de anastomoză. Ulterior animale au fost eutanasiate prin injectarea intracardiacă a 4 ml soluție de KCl 20%. Fragmentele bioptice au fost lavate cu ser fiziologic, introduse în soluție de formaldehidă 10% și trimise la laboratorul de morfopatologie. După fixarea în parafină s-au realizat câte două secțiuni din fiecare specimen, cât mai apropiate de zona de anastomoză, care au fost apoi preparate folosind colorația hematoxilină-eozină, respectiv elastică van Gieson, urmând protocolul standard.

Ulterior imaginile au fost digitalizate folosind un microscop și un sistem video, apoi au fost analizate folosind programul informatic AutoCAD (Autodesk, San Rafael, CA, SUA). Au fost trasate marcaje pe circumferința lumenului (prin glicocalix), limitanta elastică internă și limitanta elastică externă, programul calculând automat suprafețele delimitate de aceste marcaje. Pentru o mai bună vizualizare a acestor suprafețe, acestea au fost marcate în culori diferite: lumenul hașurat, intima cu galben și media cu roșu (figura 16). Valorile numerice ale suprafețelor măsurate au fost exprimate în unități AutoCAD. Parametrii calculați folosind aceste suprafețe au fost descriși în cadrul capitolului „Scopul și metodologia studiului”.

Figura 16. Model de analiză informatică a imaginilor

MEDICAMENTELE UTILIZATE

IMATINIB – inhibitorul receptorului PDGF

Acest medicament a fost dezvoltat la sfârșitul anilor 1990, de compania Novartis (Novartis Oncology, East Hanover, NJ), pentru a fi folosit în tratamentul leucemiei mieloide cronice la pacienții care prezentau cromozomul Philadelphia. Acești bolnavi prezintă translocația genei care codează proteina Abl1 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) din cromozomul 9 la nivelul genei BCR (breakpoint cluster region) din cromozomul 22. Fuziunea acestor două gene formează oncogena BCR-ABL, care determină în organismul afectat siteza crescută a proteinei de fuziune Bcr-abl. Această proteină conține un domeniu activ de tip tirozinkinază care are proprietatea de a se autofosforila, activând astfel celula afectată pe mai multe căi de transducere a semnalului (RAS, RAF, CRKL, fosfatidilinozitol 3-kinase), rezultatul fiind o transcripție a genelor augumentată, procesarea alterată a ARN mesager și stabilitate proteică scăzută (113). Imatinib reprezintă un derivat al unei molecule mai vechi, 2-fenilaminopirimidina (figura 17) și are propietatea de a inhiba domeniul tirozinkinazic, blocând astfel activitatea acestei proteine.

Figura 17. Imatinib – structură moleculară

Sursa: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/image/fl.html?cid=5291

Pe lângă efectul asupra proteinei BCR-ABL, Imatinib s-a dovedit a fi un inhibitor potent și în cazul domeniilor tirozinkinazice ale proteinelor ABL, c-KIT (factorul celulelor stem – SCF) și a receptorilor PDGF. Mecanismul central de acțiune îl reprezintă blocarea situsului de legare al adenozintrifosfatului la nivelul acestor proteine. Tirozinkinaza transferă fosfatul terminal de la nivelul ATP la nivelul reziduurilor tirozinice, mecanism cunoscut drept fosforilare. Imatinib se atașează de structura proteică aproape de situsul de legare al ATP, împiedicând astfel interacțiunea acestuia cu proteina respectivă și, pe cale de consecință, activitatea enzimatică a tirozinkinazei și a lanțului de semnalizare spre profunzimea celulei, până la nivelul nucleului (figura 18) (114).

Figura 18. Structura cristalografică a complexului tirozinkinază-Imatinib

Sursa: Protein Data Bank. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

Din punct de vedere al farmacocineticii, Imatinib se absoarbe rapid după administrarea orală, concentrația serică maximă de 1,6 mg/l înregistrându-se la 2-4 ore. Biodisponibilitatea este de aproximativ 98%, indiferent de forma de administrare – soluție, capsule, tablete, vârstă, sex sau rasă și nu este afectată de alimentație, indicând lipsa unui efect de primă trecere intestinal sau hepatic. Timpul de înjumătățire este de aproximativ 20 de ore, permițând administrarea într-o doză unică zilnică. Transportul sanguin se face legat de proteine, în principal albumina și mai puțin glicoproteina α1 acidă. Metabolitul circulant activ este reprezentat de derivatul piperazinic N-demetilat. Medicamentul este metabolizat în ficat, prin sistemul citocromului P450, preponderent sub acțiunea enzimei CYP3A4, un rol minor având și enzimele CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 și este eliminat prin bilă (115).

Experimentele pe animale au demonstrat că utilizarea prelungită a medicamentului, mai mult de două săptămâni, poate determina efecte secundare la nivelul ficatului, rinichilor, cordului și poate avea un efect de imunosupresie. Efectele negative la nivelul ficatului includ creșterea nivelului seric al transaminazelor, necroză hepatocelulară precum și necroza și hiperplazia ducturilor biliare. La nivel renal s-a observat mineralizarea și dilatarea focală a tubilor renali și necroză tubulară. Limfopenia și cardiomiopatia dilatativă reprezintă alte efecte secundare decelate. La om, toxicitatea este ușoară spre moderată, în general medicamentul fiind bine tolerat. Cele mai frecvente reacții adverse includ letargie, rash cutanat, retenție lichidiană, dureri osoase și foarte rar insuficiență hepatică și prelungirea intervalului QT (116).

PD173074 – inhibitorul receptorului bFGF

N-[2-[[4-(dietilamino)butil]amino]-6-(3,5-dimetoxifenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N'-(1,1-dimetilethyl)uree (figura 19), comercializat de multiple companii sub denumirea PD173074, reprezintă un inhibitor înalt selectiv al activității tirozinkinazei de la nivelul receptorului de tip 1 al factorilor de creștere fibroblastici.

Figura 19. Structura moleculară a PD173074

Deși cea mai puternică acțiune o are asupra FGFR1, fiind un inhibitor nanomolar al activității acestei structuri, PD173074 are și o acțiune slabă de inhibare a receptorilor factorilor de creștere vasculari endoteliali, fiind un inhibitor submicromolar al acestora (117). Ca și în cazul Imatinib, mecanismul de acțiune este reprezentat de blocarea fosforilării prin indisponibilizarea situsului hidrofob de legare al ATP la structura proteică tirozinkinazică. Acest situs se găsește între cei doi lobi ai kinazei și este ocupat în totalitate de inelul pirido[2,3-d]pirimidinic al PD173074, în timp ce reziduurile hidrofobe ale moleculei realizează două legături de hidrogen cu atomii segmentului care conectează cei doi lobi ai kinazei. De asemenea, atomul de azot N3 de la nivelul inelului pirimidinic al inhibitorului formează o legătură de hidrogen cu gruparea carboxil a aminoacidului Alanină 564 din structura receptorului. Molecula de uree atașată grupării pirido[2,3-d]pirimidină realizează o legătură de hidrogen cu o moleculă de apă, care, la rândul ei, realizează o altă legătură de hidrogen cu unul din lanțurile kinazei, mai exact cu aminoacidul Lisină din poziția 514 (117). Toate aceste legături denotă o complementaritate excelentă a moleculei inhibitorului cu situsul de legare al ATP la nivelul receptorului (figura 20).

Multiple studii in vitro și in vivo au arătat eficacitatea acestei molecule în tratamentul unor anumite tipuri de neoplazii. Mohammadi M et al au demonstrat pe un model murinic de angiogeneză corneană că o administrare de 2 mg/kgc/zi, timp de 14 zile, PD173074 inhibă total angiogeneza (102). Proliferarea tumorală și chimiorezistența din cancerul pulmonar cu celule mici, indusă de factorul de creștere fibroblastic bazic, a fost blocată prin administrarea acestui compus in vitro și încetinită marcat in vivo în funcție de doză. De asemenea s-a constatat creșterea sensibilității celulelor tumorale la chimioterapicele de elecție după administrarea moleculei timp de 28 de zile, mecanismul fiind reprezentat de stimularea apoptozei (118). Același efect de potențare al eficienței medicamentelor citostatice a fost observat și în cazul neoplaziilor endometriale (119). În ciuda acestor rezultate promițătoare obținute, compusul PD173074 nu a intrat în uz clinic. Nu se cunosc date detaliate despre farmacocinetică, biodisponibilitate sau efecte adverse. Toate cercetările asupra proprietăților acestuia s-au limitat la efectele antineoplazice, lipsind total în acest moment o cercetare validă asupra efectelor antihiperplazice.

Figura 20. Complementaritatea dintre PD173074 și situsul de legare al ATP din structura tirozinkinazei.

Sursa: Mohammadi M et al. Crystal structure of an angiogenesis inhibitor bound to the FGF receptor tyrosine kinase domain. EMBO J. 1998 Oct 15;17(20):5896-904.

REZULTATE

LOTUL MARTOR

Au fost prelevate 4 artere femurale de la două animale neoperate – lotul martor.

În figura 21 sunt prezentate secțiunile histologice colorate cu hematoxilină/eozină (coloana stângă), colorație van Gieson (coloana din mijloc) și imaginea prelucrată informatic (coloana din dreapta).

Figura 21. Imagini histopatologice ale arterelor femurale din lotul martor.

Slu = suprafața lumenului; Si = suprafața intimei; Sm = suprafața mediei

Slei = suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă

Slee = suprafața circumscrisă de limitanta elastică externă

În tabelul 1 sunt prezentate valorile parametrilor calculați în funcție de suprafețele măsurate:

Tabelul 1. Valorile parametrilor calculați pentru lotul martor.

LOTUL EXPERIMENTAL 1

Nici unul dintre cele 5 animalele din lotul experimental 1 nu a decedat în perioada postoperatorie. La redisecție, toate arterele femurale erau patente și bine integrate în țesutul înconjurător. Mai jos sunt prezentate imaginile histologice și analiza informatică a acestora.

Figura 22. Imagini histopatologice ale arterelor femurale din lotul exp. 1.

Valorile parametrilor calculați pentru lotul experimental 1 sunt expuse în tabelul 2.

Tabelul 2. Valorile parametrilor calculați pentru lotul experimental 1.

LOTUL EXPERIMENTAL 2

Au suferit intervenții chirurgicale un număr de 13 animale, cărora li s-a administrat ulterior, zilnic, 25 mg/kgc Imatinib și 2 mg/kgc PD174073, timp de 14 zile. Două animale au decedat pe parcursul experimentului, ambele în urma gavajului gastric, primul în ziua a 3-a și al doilea în ziua a 8-a. Restul de 11 animale au fost eutanasiate în ziua a 15-a postoperator și li s-au recoltat arterele femurale bilateral. La examenul histopatologic s-a decelat tromboză totală sau parțială pentru 5 dintre cele 22 artere recoltate. Acestea au fost excluse din studiu. În figura 23 sunt prezentate secțiunile histologice colorate cu colorație van Gieson (coloana stângă), hematoxilină/eozină (coloana din mijloc) și imaginea prelucrată informatic (coloana din dreapta) pentru cele 17 specimene analizate.

Figura 23. Imagini histopatologice ale arterelor femurale din lotul exp. 2.

Slu = suprafața lumenului; Si = suprafața intimei; Sm = suprafața mediei

Slei = suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă

Slee = suprafața circumscrisă de limitanta elastică externă

Valorile parametrilor calculați pentru lotul experimental 2 sunt expuse în tabelul 3. Valorile medii ale acestor parametrii pentru toate cele 3 loturi sunt expuse în tabelul 4.

Tabelul 3. Valorile parametrilor calculați pentru lotul experimental 2.

Tabelul 4. Valorile medii ale parametrilor calculați pentru cele 3 loturi.

ANALIZA STATISTICĂ

Diferența statistică pentru variabilele calculate, între lotul martor și lotul experimental 1, respectiv lotul experimental 1 și lotul experimental 2, s-a efectuat utilizând testul t nepereche (Turkey – Kramer). O valoare a p < 0.05 a fost considerată semnificativă statistic. Analiza variației (ANOVA) parametrilor între cele 3 loturi s-a realizat utilizând programul informatic JMP® Statistical Software (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, SUA

Testul t între lotul martor și lotul experimental 1

Pentru RIM:

p = 0.0056

CI = 95%

Eroare standard = 0,046

Pentru GSI:

p = 0.0002

CI = 95%

Eroare standard = 0,020

Pentru GSM:

p = 0.9456

CI = 95%

Eroare standard = 0,041

Pentru GSC:

p = 0.0042

CI = 95%

Eroare standard = 0,025

Testul t între lotul experimental 1 și lotul experimental 2

Pentru RIM:

p = 0.0001

CI = 95%

Eroare standard = 0,028

Pentru GSI:

p = 0.0001

CI = 95%

Eroare standard = 0,012

Pentru GSM:

p = 0.4766

CI = 95%

Eroare standard = 0,031

Pentru GSC:

p = 0.2314

CI = 95%

Eroare standard = 0,029

Analiza variației pentru raportul intimă/medie între cele 3 loturi

Analiza variației pentru stenoza determinată de intimă între cele 3 loturi

Analiza variației pentru stenoza determinată de medie între cele 3 loturi

Analiza variației pentru stenoza combinată între cele 3 loturi

DISCUȚII

MODELUL EXPERIMENTAL

Deși au trecut aproape 120 de ani de la prima utilizare a șobolanilor ca animale de laborator, de către John Broadus Watson, care în 1903 le-a studiat rata de învățare, introducându-i într-un labirint, datorită caracteristicilor lor, aceștia au rămas până în prezent animalele cele mai utilizate pentru experimentele medicale. Diferitele rase obținute prin încrucișare selectivă (Wistar, Sprague Dawley, Long-Evans sau Lister) diferă major față de ruda sălbatică, fiind mai calmi, mai puțin predispuși spre a mușca, se reproduc rapid și tolerează bine condițiile de viață din laborator. Primul model de inducere a hiperplaziei intimale la șobolan a fost descris de Clowes et al în 1983 (93). Pornind de la observarea corelației între leziunea endotelială și hiperplazia intimală subsecventă, echipa a creat un model experimental în care arterele carotide ale șobolanului erau denudate prin introducerea unui cateter de embolectomie, care era trecut umflat de mai multe ori prin lumen. Acest model și variațiile sale (aortă, femurală) rămâne și în prezent unul dintre cele mai utilizate pentru cercetări în acest domeniu. Cu toate acestea, progresele din ultimii 30 de ani au adus noi informații asupra fiziopatologiei formării neointimei. S-a demonstrat importanța atât a leziunii și necrozei mediale, cât și a distrugerii adventicei în augumentarea procesului. Un alt aspect important în alegerea unui model experimental este acela că manevra descrisă de Clowes nu are corespondent în chirurgia vasculară umană deschisă, decât în cazul operației de embolectomie arterială din sindromul de ischemie acută, fiind o aproximare mult mai apropiată de manevrele din chirurgia endovasculară. Reconstrucțiile arteriale realizate pe cale clasică presupun o disecție atentă a vaselor, prin care se întrerupe rețeaua vasa vasorum, clampare, arteriotomie și anastomoze, manevre prin care sunt lezeate toate cele 3 tunici. Această leziune panmurală a fost principalul aspect care a fost luat în considerație când a fost gândit modelul experimental utilizat în cercetarea de față. Localizarea injuriei la nivelul arterei femurale a ținut cont de abordul facil, impactul fiziologic minim, mărimea suficientă pentru a minimiza riscul de tromboză și ușurința redisecției. Un studiu efectuat de JC Selber et al (120) a relevat faptul că, în cazul anastomozei termino-terminale la nivelul arterei femurale a șobolanului, curba de învățare este foarte rapidă, medicii plasticieni incluși în studiu dublându-și nivelul tehnic în aproximativ 10 luni, în ceea ce privește dexteritatea, disecția, realizarea suturilor și viteza de execuție (figura 24). Din acest punct de vedere, modelul experimental propus poate fi învățat și realizat rapid și de cercetători a căror experiență în intervențiile microchirurgicale este limitată.

Figura 24. Dezvoltarea abilităților microchirurgicale pe parcursul a 10 luni.

Legendă: pătrat negru – august 2010; romb verde – mai 2011

Sursa: Selber JC et al. Tracking the learning curve in microsurgical skill acquisition. Plast Reconstr Surg. 2012 Oct;130(4):550e-557e.

Dintre cele 20 de animale utilizate în studiu, două au decedat în perioada postoperatorie. Decesele au survenit în urma gavajului gastric, nefiind legate de alte complicații. S-au efectuat 36 incizii, 3 (8,33%) prezentând dehiscență, necesitând reintervenție și resutură. Nu s-au observat semne de infecție la nivelul suturilor. În momentul recoltării fragmentelor bioptice, toate plăgile erau vindecate. 5 (15,62%) dintre cele 32 de fragmente arteriale recoltate prezentau tromboză totală, toate din lotul experimental 2. Pe lângă posibilele erori de tehnică, alte aspecte care puteau determina tromboză vor fi discutate în subcapitolul următor.

Calculele statistice au arătat că raportul intimă/medie a crescut cu 250% între vasul normal și vasul operat, de la 0,1049 la 0,2607, valoare semnificativă statistic, cu un p = 0,0056. Ținând cont de faptul că modificările suprafeței mediei între lotul martor și lotul experimental 1 nu au fost semnificative statistic (p pentru GSM = 0,9456), putem considera că această creștere a raportului se datorează doar creșterii suprafeței intimei.

Suprafața lumenului a scăzut, de la 93% din suprafața delimitată de limitanta elastică internă, pentru lotul martor, la 81,5% pentru lotul experimental 1 (p GSI = 0,0002) și de la 55,82% din întreaga suprafață de secțiune a vasului, pentru lotul martor, la 46,85% pentru lotul experimental 1, de asemenea semnificativ statistic, p GSC = 0,0046.

Modificarea nesemnificativă statistic a suprafeței mediei între cele două loturi, p GSM = 0,9456, confirmă multiple alte studii potrivit cărora majoritatea celulelor musculare netede nou-formate în medie migrează în intimă, unde secretă componentele matricei extracelulare, care ajunge să reprezinte peste 80% din neointimă.

Prin urmare, datorită ușurinței în efectuare, ratei scăzute de complicații, similitudinii cu intervențiile deschise din chirurgia umană și capacității de dezvoltare a hiperplaziei intimale, modelul experimental dezvoltat în cadrul acestui proiect poate fi implementat și utilizat cu succes în cercetări ulterioare.

STRATEGII ANTIHIPERPLAZICE ȘI EFICIENȚA MEDICAMENTELOR UTILIZATE ÎN STUDIU

Așa cum remarca Edward J. W. Wallitt, referindu-se la hiperplazia intimală, “Tratamentele menite să restabilească circulația sunt ele însele afectate de aceeași maladie pe care ar trebui să o trateze; se pare că biologiei nu îi lipsește simțul ironiei” (14). Din momentul în care Claude Grondin a făcut prima dată legătura, în 1971, între fibroza intimală și ocluzia tardivă a unui grefon aorto-coronarian (121), comunitatea medicală nu a încetat să creeze și testeze multiple modalități terapeutice contra acestei patologii, variind de la terapii genice antihiperplazice până la formule din medicina tradițională chinezească. Cu toate că procesul fiziopatologic a fost studiat în amănunt, nici până astăzi nu este pe deplin înțeles, dar cunoștințele acumulate în timp au permis realizarea a numeroase modalități de tratament, care au țintit blocarea acestuia la diferite niveluri.

Observația că leziunile hiperplazice reprezintă precursorii plăcilor fibroase pe care se dezvoltă viitoarele leziuni aterosclerotice a determinat o tendință în comunitatea medicală spre un control agresiv al factorilor de risc ai aterosclerozei pentru a prelungi patența revascularizărilor. Deși în privința hipertensiunii, a fumatului și controlului glicemic rezultatele studiilor sunt divergente, unele dintre acestea arătând că patența pe termen lung a grefoanelor venoase folosite în revascularizările coronariene nu este influențată de acești factori (122), în privința tratamentului hipolipemiant dovezile converg spre efectul benefic pe care îl are un control bun al colesterolemiei asupra patenței. În prezent valoarea țintă a LDL după orice tip de revascularizare, recomandată de majoritatea ghidurilor este de 100 mg/dL, un control mai agresiv al LDL, cu valori țintă sub 70 mg/dL neaducând beneficii majore (123). Stabilirea rolului pe care îl au coagularea și inflamația în inițierea și propagarea transformărilor hiperplazice a determinat, pe lângă introducerea tratamentelor antiplachetare, anticoagulante și, uneori, antiinflamatoare în practica clinică de zi cu zi și o rafinare continuă a tehnicilor chirurgicale. A fost înțeleasă importanța recoltării și preparării cât mai atraumatice a grefoanelor autologe, iar unii autori recomandă chiar înlocuirea dilatării cu ser fiziologic, pentru a contracara spasmul, cu aplicarea de substanțe vasodilatatoare, cum ar fi combinația de verapamil sau nicardipină cu nitroglicerină (124). Un studiu care merită menționat este cel realizat de Domingos Souza et al, care au introdus conceptul de “no touch technique” în recoltarea grefoanelor venoase safene, concept care presupune recoltarea acestora împreună cu țesutul adipos înconjurător, lipsa distensiei preimplantare și păstrarea în sânge heparinat. Implementarea acestei tehnici a determinat creșterea patenței grefoanelor venoase la același nivel cu grefoanele mamare interne, după revascularizări coronariene (125). În ultimii ani s-au efectuat numeroase cercetări pe animale care au evaluat și stabilit rolul benefic pe care îl are stentarea externă a grefoanelor venoase în creșterea patenței, această metodă intrând recent în practica clinică. Stentarea externă elimină iregularitățile luminale determinate de dilatațiile varicoase, stabilizând fluxul și, în același timp, reduce tensiunea murală și stimulează dezvoltarea rapidă a unei neoadventice (126).

Utilizarea tratamentelor antiagregante pentru a prelungi patența revascularizărilor s-a bazat pe observația că numeroși factori implicați în declanșarea hiperplaziei intimale sunt concentrați la nivelul leziunii vasculare prin degranularea plachetară, incluzând PDGF, β-tromboglobulina, fibronectina, activatorul inhibitorului plasminogenului 1, α2-antiplasmina și hidrolazele acide. Aprofundarea cercetărilor în domeniu a relevat însă că, pe lângă stimularea de către factorii trombocitari, celulele musculare netede sunt activate pe multiple alte căi și bucle de feedback – endotelial, inflamator, autoactivare, iar sinteza PDGF de către celulele endoteliale și musculare netede nu este influențată de aspirină (127). Cu toate acestea, în cazul antiagregantelor puternice, din clasa tienopiridinelor, s-a observat, atât în cadrul experimentelor de laborator, cât și în studii umane, o capacitate mai bună de a reduce formarea neointimei dacă administrarea se face pe o perioadă îndelungată (128). În prezent, utilizarea pe scară largă a aspirinei, clopidogrelului și dipiridamolului se datorează capacității acestora de a preveni trombogeneza și, implicit, evenimentele ischemice postrevascularizare și mai puțin datorită efectelor antihiperplazice. Pe lângă antiagregantele clasice, un alt medicament cu efecte antiplachetare, Cilostazol, utilizat mai ales pentru creșterea distanței de claudicație la pacienții cu boală arterială periferică, s-a dovedit a fi foarte eficient în diminuarea stenozei intrastent la pacienții diabetici (129). Cerecetările pe animale și studiile pe pacienți umani au relevat că mecanismele principale prin care determină acest efect sunt reprezentate de atenuarea inflamației transmurale și scăderea sintezei de ADN în celulele musculare netede (130).

Dacă în cazul antiagregantelor efectele antihiperplazice sunt minime, nu același lucru se poate spune despre tratamentele anticoagulante. Capaciatatea heparinei nefracționate de a reduce neoformația intimală este cunoscută încă din 1977 (131), mecanismul de acțiune fiind reprezentate de blocarea replicării celulelor musculare netede prin alterarea semnalelor transcripționale pe căile protooncogenelor c-fos, c-myc, calea MAPK (mitogen-activated protein kinases) și proteinkinazei C. Deși în condiții de laborator efectele antihiperplastice, atât ale heparinei sodice, cât și ale heparinelor fracționate, au fost bine documentate, trialurile pe pacienți umani nu au arătat niciun efect benefic, ci chiar efecte prohiperplastice (132). Aceste rezultate contradictorii au fost explicate fie prin diferențele mari interspecii, fie prin faptul că efectul antihiperplastic în condiții de laborator apare la concentrații sangvine care depășesc limitele de siguranță din punct de vedere al anticoagulări. În ciuda rezultatelor negative ale trialurilor clinice, heparina nu a fost abandonată ca potențial medicament antihiperplazic și s-a tentat aplicarea acesteia pe suprafețele endoluminale ale protezelor sintetice utilizate în revascularizări. Tehnologia necesară a apărut la începutul anilor 90, când au fost produse primele proteze PTFE acoperite luminal cu un strat de heparină. Din păcate, legăturile ionice prin care erau fixate moleculele de heparină la structura protezei erau înalt instabile, astfel că medicamentul era spălat de fluxul sanguin în câteva ore. După aproape 15 ani, la sfârșitul anilor 2000, a apărut o nouă tehnologie, Carmeda BioActive Surface (CBAS®), care utilizează legături covalente ca procedeu de fixare, mult mai stabile. Astfel s-au putut produce proteze (Propaten®, W. L. Gore & Associates, Inc., Flagstaff, AZ, USA) utilizabile clinic și care au determinat creșterea cu aproape 50% a patenței față de grefoanele PTFE simple (133) în revascularizările femuro-poplitee. În ceea ce privește anticoagulantele orale, atât antagoniștii vitaminei K (acenocumarol, warfarină), cât și inhibitorii trombinei (argatroban, lepirudin) s-au dovedit a avea efecte antihiperplazice pe modelele animale, dar care nu au putut fi transpuse în trialurile clinice.

Inflamația reprezintă a doua componentă a fazei acute a procesului de vindecare arterială și blocarea acesteia a fost testată în multiple studii ca opțiune terapeutică antihiperplazică. Recrutarea leucocitelor la locul injuriei este stimulată de o paletă largă de citokine, chemokine și molecule de adeziune (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α), fiind urmată de atașarea la nivelul trombului prin interacțiunea dintre ligandul P-selectinei 1 de pe suprafața leucocitară și P-selectina de pe suprafața plachetară. Pătrunderea în peretele vascular este stimulată de proteina chemoatractantă monocitară (MCP-1) și se realizează prin intermediul moleculelor de adeziune intercelulară (ICAM) (134). Flavonoizii, dexametazona sau terapiile genice de blocare a sintezei interleukinelor au dovedit, pe modele animale, capacitatea de a scădea dezvoltarea neointimei, dar nu au intrat în uzul clinic curent. O altă clasă de medicamente care acționează asupra sistemului imunitar, imunosupresoarele, au trecut testul trialurilor clinice, fiind utilizate în prezent ca topice locale administrate prin intermediul baloanelor și stenturilor active medicamentos. Cel mai utilizat medicament din această clasă este rapamicina – Sirolimus. Acesta este un antibiotic macrolid, produs de bacteria Streptomyces hygroscopicus, cu proprietăți imunosupresoare, utilizat mai ales în transplantul de organe. Rapamicina inhibă transmiterea semnalelor receptor-dependente inițiate de către IL-2 și alte citokine la nivelul celulelor țintă, acționând asupra proteinei mTOR (mammalian target of rapamycin), rezultatul fiind blocarea tranziției diviziunii celulare din faza G1 în faza S. Calea proteinei mTOR are un rol extrem de important în creșterea, proliferarea și apoptoza celulară normală, integrând semnalele extracelulare transmise spre nucleu pe multiple căi și în același timp fiind influențată de concentrația citosolică a oxigenului și compușilor energetici (135). Rapamicina formează un compus cu receptorul intracelular al proteinei mTOR, FKBP12, complexul rapamicină- FKBP12 fixându-se în situsul de legare al FKBP12 de la nivelul proteinei, blocându-i acesteia activitatea (136). Capacitatea rapamicinei de a inhiba replicarea celulară a stat la baza utilizării acesteia ca medicament antihiperplazic. Primul stent acoperit cu polimeri care conțineau Sirolimus a fost produs de compania Cordis în 1999 (Bx VELOCITY, Cordis Corporation, Johnson & Johnson, Warren, NJ, USA), intrând în trialuri clinice în anii următori pentru tratamentul bolii coronariene. Rezultatele au fost foarte bune, restenoza, cuantificată drept îngustarea lumenului cu mai mult de 50%, fiind absentă la 4 și 12 luni în cazul tuturor celor 45 de pacienți incluși în studiu efectuat de J. Eduardo Sousa et al. (137) și doar de 5,7% la 4 ani (138). Aceste stenturi s-au dovedit a fi foarte eficiente și în tratamentul leziunilor complexe, cum ar fi leziunile pe vase mici, ocluzii cronice, restenoza intrastent, boală multivasculară și diabet (139). Deși reduc semnificativ restenoza, în comparație cu stenturile bare metal, din cauza acțiunii indiscriminatorii asupra tuturor celulelor aflate în diviziune, determină, ca principal efect secundar, întârzierea marcată a reendotelizării la nivelul leziuni. Acest fapt se traduce clinic prin pierderea capacității arteriale de relaxare endoteliu-dependentă și, consecutiv, vasoconstricție indusă de efort (140), precum și un risc crescut de tromboză. În ciuda acestor dezavantaje, introducerea în practica clinică a stenturilor sirolimus-active a reprezentat un mare pas înainte pentru cardiologia intervențională. În ceea ce privește eficiența acestor stenturi în tratamentul bolii arteriale periferice, rezultate sunt contradictorii, unele studii arătând o eficiență ridicată în inhibarea restenozei (141), pe când altele nu relevă nici o diferență semnificativă statistic, în comparație cu stenturile inactive medicamentos (142). În aceeași categorie a medicamentelor antihiperplazice imunosupresoare se încadrează și derivatul rapamicinic Everolimus, care are o acțiune inhibitoare selectivă pe complexul proteic mTOR1. Acest complex, compus din proteina mTOR, proteina regulatorie a acesteia, RPTOR, subunitatea LST8 (mammalian lethal with SEC13 protein 8) și substratul proteic AKT1, controlează inițierea translației proteinelor atunci când concentrația substraturilor energetic, nutritiv și de oxigen este optimă. Blocând acest mecanism regulator, Everolimus oprește replicarea și proliferarea celulară. Studiile comparative între stenturile de generația I, Sirolimus active și cele de generația a II-a, Everolimus active, au arătat același efect antihiperplazic, dar un risc mai scăzut de tromboză și revascularizări repetate pentru stenturile de generația a II-a (143).

Dacă Sirolimus și Everolimus au atât efecte antiinflamatoare, prin reducerea sintezei interleukinei 2, cât și antiproliferative, prin blocarea ciclului celular, următoarea categorie de medicamente utilizate în reducerea restenozei au doar efecte antihiperplazice. Ținându-se cont de faptul că restenoza are la bază proliferarea fibrocelulară postlezională, la mijlocul anilor 90 s-a evaluat eficacitatea brahiterapiei ca metodă antihiperplastică. Cercetările inițiale au relevat că această metodă nu crește riscul de tromboză sau al dezvoltării unui anevrism (144) și scade rata restenozei după restentare sau angioplastie cu balon (145), rezultate confirmate de trialurile randomizate ulterioare în ceea ce privește eficacitatea mai ales în cazul restenozei intrastent (146). Pe termen lung însă, s-a dovedit superioritatea stenturilor active medicamentos în prevenirea restenozei după restentare față de brahiterapia intravasculară, neexistând diferențe majore între cele două tipuri de proceduri în ceea ce privește efectele adverse, tromboză și mortalitate (147). Paclitaxel este un medicament antineoplazic din familia taxanilor, folosit în tratamentul a multiple tipuri de cancer, incluzând cancerul de sân, ovarian, pancreatic și pulmonar. Acesta oprește replicarea celulară stabilizând citoscheletul prin polimerizarea microtubulilor și împiedecând astfel celula să formeze aparatul normal de mitoză. Astfel, aceasta rămâne blocată în faza G2 a ciclului celular. Principalul avantaj al moleculei de Paclitaxel în fața rapamicinei și a derivaților săi este faptul că structura sa permite absorbția rapidă în peretele vascular, putând fi astfel folosite baloanele de angioplastie ca vehicul și eliminându-se riscurile de tromboză, disecție și fractură, inerente stentării intrastent. Din punct de vedere al reducerii hiperplaziei, eficacitatea este excelentă, fiind raportată o rată de restenoză posttratament mai mică de 5%, în comparație cu rata de restenoză în cazul angioplastiilor cu baloane inactive medicamentos, care se aproprie de 50% la un an (148).

Se poate deduce din paginile precedente că stenturile active medicamentos au revoluționat chirurgia endovasculară, mai ales în teritoriul coronarian, blocând atât remodelarea negativă prin recul elastic, cât și pierderea lumenului prin hiperplazie intimală. Limita apariției restenozei a fost împinsă la peste 5 ani, când se consideră că orice îngustare a lumenului arterial este cauzată de leziuni aterosclerotice de novo și nu prin remodelarea leziunii inițiale. În chirurgia vasculară deschisă restenoza rămâne „călcâiul lui Ahile”, limitând patența, mai ales în revascularizările infrageniculare, la mai puțin de 5 ani. Tehnologia din acest moment nu permite eliminarea totală a procedurilor chirurgicale deschise și înlocuirea loc cu cele endovasculare, iar recomandările actuale ale ghidurilor pentru prelungirea patenței revascularizărilor deschise se limitează la tratament antiagregant și anticoagulant, fără efect pe remodelare, ci doar pe tromboză. De aceea consider că, pentru a elimina remodelarea hiperplazică și din această zonă a chirurgiei vasculare, cercetări aprofundate pentru a dezvolta noi medicamente rămân imperative, linie în care se înscrie și această teză.

Am testat eficiența combinată a inhibitorului receptorului factorului de creștere fibroblastic bazic și al factorului de creștere derivat plachetar în scăderea formării neointimei. Administrarea acestor medicamente a determinat scăderea raportului intimă/medie la 0,1141, față de 0,2607 la animalele din lotul experimental 1, valoare apropiată de cea a arterei sănătoase, de 0,1049, scădere semnificativă statistic cu un p RIM = 0,0001. Această blocare a formării neointimei s-a reflectat în gradul de stenoză determinat de intimă, procentul suprafeței lumenului din suprafața delimitată de limitanta elastică internă crescând de la 81,49% în lotul experimental 1 la 91,10% în lotul experimental 2, de asemenea o valoare apropiată de cea a vasului normal, de 93%, cu un p GSI = 0,0001.

Deși nu a atins nivelul semnificativ statistic, cu un p = 0,2314, raportul dintre suprafața lumenului și suprafața de secțiune a întregului vas – gradul de stenoză combinat (GSC), are pentru lotul experimental 2 o valoare mai apropiată de cea calculată pentru lotul experimental 1 (GSC1 = 0,4685, GSC2 = 0,5037) decât cea calculată pentru vasul normal (GSCmartor = 0,5582). Ținând cont de faptul că în lotul experimental 2 suprafața intimei a scăzut față de lotul experimental 1, așa cum relevă diferențele semnificative statistic pentru RIM și GSI între cele două loturi, care au valori apropiate de vasul normal, putem specula că această stenoză reziduală, chiar dacă nu este semnificativă statistic, poate fi rezultatul a două mecanisme:

Fie calea bFGF a fost blocată complet, dar celulele musculare netede din medie au fost stimulate să se dividă pe alte căi, de exemplu calea factorului de creștere insulin-like;

Fie calea bFGF nu a fost blocată complet și este necesară administrarea unei doze mai mari a PD 173074 pentru acest lucru. În această cercetare a fost administrată dozajul folosit de alți cercetători pentru a evalua capacitățile antineoplazice ale produsului.

În ciuda existenței unei replicări remanente a celulelor musculare netede în medie, putem spune că migrarea acestora în intimă a fost inhibată satisfăcător.

Niciunul dintre animalele din lotul experimental 2 nu a decedat în urma administrării medicamentelor. Cele două decese înregistrate s-au datorat gavajului gastric.

Recoltarea specimenelor și examinarea histologică au relevat prezența trombozei la 5 (22,72%) dintre cele 22 artere în lotul experimental 2. De asemenea, s-au decelat pe lamele de analiză prezența a mici decolări intimale în cazul a 6 specimene (27,27%), tot din lotul experimental 2 (figura 25). Niciunul dintre aceste aspecte nu au fost observate în cazul lotului experimental 1. Ținând cont de faptul că toate anastomozele au fost realizate de autor, explicația cea mai rezonabilă a acestor observații este că au fost cauzate de medicamentele utilizate în studiu. În acest sens, se poate specula existența unei reendotelizări deficitare. Inhibitorul receptorului factorului de creștere derivat plachetar are efecte inhibitoare și asupra factorului de creștere vascular endotelial (VEGF), la concentrații mari. Acest factor are un rol cheie în stimularea replicării celulelor endoteliale viabile de la nivelul leziunii și în atragerea celulelor endoteliale progenitoare din sânge. O scădere a activității acestui factor la concentrațiile medicamentoase utilizate în studiu poate determina o întârziere a reendotelizării zonei lezate, ceea ce predispune la disecții intimale și tromboză.

Figura 25. Zone de decolare intimală

CONCLUZII ȘI DIRECȚII ULTERIOARE DE CERCETARE

Această cercetare s-a axat pe două direcții principale:

Realizarea unui model experimental de inducere a hiperplaziei intimale, apropiat de leziunile produse în chirurgia vasculară umană deschisă;

Evaluarea eficacității inhibitorilor receptorilor bFGF și PDGF în blocarea dezvoltării neointimei postlezionale.

Modelul experimental realizat pe șobolanul de laborator determină o hiperplazie importantă, raportul intimă/medie crescând cu 250% față de vasul normal, iar suprafața ocupată de lumen din suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă scăzând de la 93% la 81%. Acest model este ușor de realizat, determină leziuni la nivelul tuturor tunicilor peretelui vascular și are un impact fiziologic minim asupra animalului, putând fi utilizat cu succes în cercetări ulterioare.

Inhibitorii receptorilor factorilor de creștere derivat fibroblastic și plachetar au determinat scăderea proliferării neointimale până la valori apropiate de vasul normal. Raportul intimă/medie obținut în urma administrării acestor medicamente, de 0,1141, este asemănător cu cel calculat pentru o arteră nelezată, de 0,1049, iar suprafața luminală ocupă un procent de 91,1% din suprafața circumscrisă de limitanta elastică internă, apropiat de cel de 93% al vasului normal.

Hipertrofia medială observată în cazul administrării medicamentelor, chiar dacă nu diferă statistic semnificativ de o arteră nelezată, poate fi cauzată de un dozaj insuficient al PD 173074. Studierea efectelor pe care doze mai mari ale acestui medicament, decât cele utilizate în cercetarea antineoplazică, le au asupra replicării celulelor musculare netede în intimă reprezintă o direcție de cercetare validă. Numărul mare de tromboze și decolări intimale rezultate în urma experimentului poate fi atribuit efectului antiendotelizator al Imatinib. În acest caz există o balanță sensibilă între efectul pozitiv de inhibare a hiperplaziei și cel negativ de întârziere a endotelizării, iar stabilirea dozajului optim reprezintă o altă direcție de cercetare.

Așa cum am arătat de-a lungul acestei teze, procesul de reparare al leziunilor vasculare este controlat de multipli factori, care acționează pe multiple direcții în același sens: stimularea replicării celulelor musculare netede și a migrării acestora în intimă. Dacă în chirurgia endovasculară, stenturile limus-active au dovedit o eficacitate extraordinară, blocând atât remodelarea elastică negativă cât și replicarea celulară și implicit hiperplazia, chirurgia vasculară deschisă rămâne fără un mijloc eficient de prelungire a patenței revascularizărilor. Spre deosebire de chirurgia endovasculară, în chirurgia deschisă nu se poate aplica un mecanism antihiperplazic local. Tot ce se poate face este să se limiteze amploarea fenomenului prin limitarea intensității leziunii produse în scop curativ. Singurul mod de a combate hiperplazia intimală în chirurgia deschisă rămâne dezvoltarea unui medicament sau a unei combinații de medicamente care să poată fi administrate pe cale sistemică. Rezultatele acestui experiment, țintit pe cei doi factori cu rol major în această patologie, pot reprezenta un punct de plecare, în acest sens.

BIBLIOGRAFIE

1. Moliterno DJ, Topol EJ. Restenosis: Epidemiology and Treatment. In Topol EJ, ed. Textbook of Cardiovascular Medicine, 2nd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, 2002, pp 1715-1750.

2. Fischman DL, Leon MB, Baim DS, Schatz RA, Savage MP et al. A randomized comparison of coronary-stent placement and balloon angioplasty in the treatment of coronary artery disease. Stent Restenosis Study Investigators. N Engl J Med. 1994 Aug 25;331(8):496-501.

3. Mehilli J, Byrne RA, Tiroch K, Pinieck S, Schulz S et al. Randomized trial of paclitaxel- versus sirolimus-eluting stents for treatment of coronary restenosis in sirolimus-eluting stents: the ISAR-DESIRE 2 (Intracoronary Stenting and Angiographic Results: Drug Eluting Stents for In-Stent Restenosis 2) study. J Am Coll Cardiol. 2010 Jun 15;55(24):2710-6.

4. Abola MT, Bhatt DL, Duval S, Cacoub PP, Baumgartner I et al. Fate of individuals with ischemic amputations in the REACH Registry: three-year cardiovascular and limb-related outcomes. Atherosclerosis. 2012 Apr;221(2):527-35.

5. Laird JR, Katzen BT, Scheinert D, Lammer J, Carpenter J et al. Nitinol stent implantation versus balloon angioplasty for lesions in the superficial femoral artery and proximal popliteal artery: twelve-month results from the RESILIENT randomized trial. Circ Cardiovasc Interv. 2010 Jun 1;3(3):267-76.

6. Scheinert D, Duda S, Zeller T, Krankenberg H, Ricke J et al. The LEVANT I (Lutonix paclitaxel-coated balloon for the prevention of femoropopliteal restenosis) trial for femoropopliteal revascularization: first-in-human randomized trial of low-dose drug-coated balloon versus uncoated balloon angioplasty. JACC Cardiovasc Interv. 2014 Jan;7(1):10-9.

7. Bradbury AW, Adam DJ, Bell J, Forbes JF, Fowkes FG et al. Bypass versus Angioplasty in Severe Ischaemia of the Leg (BASIL) trial: Analysis of amputation free and overall survival by treatment received. J Vasc Surg. 2010 May;51(5 Suppl):18S-31S.

8. Hoffman M. Remodeling the blood coagulation cascade. J Thromb Thrombolysis. 2003 Aug-Oct;16(1-2):17-20.

9. Petäjä J. Inflammation and coagulation. An overview. Thromb Res. 2011 Jan;127 Suppl 2:S34-7.

10. Duchesne L, Octeau V, Bearon RN, Beckett A, Prior IA, Lounis B et al. Transport of fibroblast growth factor 2 in the pericellular matrix is controlled by the spatial distribution of its binding sites in heparan sulfate. PLoS Biol. 2012 Jul;10(7):e1001361.

11. Yun YR, Won JE, Jeon E, Lee S, Kang W et al. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 2010 Nov 7;2010:218142.

12. Li L, Blumenthal DK, Terry CM, He Y, Carlson ML, Cheung AK. PDGF-induced proliferation in human arterial and venous smooth muscle cells: molecular basis for differential effects of PDGF isoforms. J Cell Biochem. 2011 Jan;112(1):289-98.

13. Suwanabol PA, Kent KC, Liu B. TGF-β and restenosis revisited: a Smad link. J Surg Res. 2011 May 15;167(2):287-97.

14. Wallitt EJ, Jevon M, Hornick PI. Therapeutics of vein graft intimal hyperplasia: 100 years on. Ann Thorac Surg. 2007 Jul;84(1):317-23.

15. Ataya B, Tzeng E, Zuckerbraun BS. Nitrite-generated nitric oxide to protect against intimal hyperplasia formation. Trends Cardiovasc Med. 2011 Aug;21(6):157-62.

16. Bosiers M, Deloose K, Verbist J, Schroë H, Lauwers G et al. Heparin-bonded expanded polytetrafluoroethylene vascular graft for femoropopliteal and femorocrural bypass grafting: 1-year results. J Vasc Surg. 2006 Feb;43(2):313-8.

17. Lv L, Shi Y, Duan R, Xie H, Zhang J et al. Prevention of Neointimal Hyperplasia by Local Application of Lentiviral Vectors Encoding Pin1 shRNA in Pluronic F127. Curr Gene Ther. 2015;15(6):572-80.

18. Coleman KR, Braden GA, Willingham MC, Sane DC. Vitaxin, a humanized monoclonal antibody to the vitronectin receptor (alphavbeta3), reduces neointimal hyperplasia and total vessel area after balloon injury in hypercholesterolemic rabbits. Circ Res. 1999 Jun 11;84(11):1268-76.

19. Yin XF, Wang JH, Li X, Yu MX, Ma ZX, Jin J. Incidence of Second Malignancies of Chronic Myeloid Leukemia During Treatment With Tyrosine Kinase Inhibitors. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 2016 Jun 8.

20. Bai YP, Shang K, Chen H, Ding F, Wang Z et al. FGF-1/-3/FGFR4 signaling in cancer-associated fibroblasts promotes tumor progression in colon cancer through Erk and MMP-7. Cancer Sci. 2015 Oct;106(10):1278-87.

21. Park D, Kim SM, Min SI, Ha J, Kim IG, Min SK. Inhibition of intimal hyperplasia by local perivascular application of rapamycin and imatinib mesilate after carotid balloon injury. J Korean Surg Soc. 2013 Dec;85(6):296-301.

22. Chistiakov DA, Revin VV, Sobenin IA, Orekhov AN, Bobryshev YV. Vascular endothelium: functioning in norm, changes in atherosclerosis and current dietary approaches to improve endothelial function. Mini Rev Med Chem. 2015;15(4):338-50.

23. Stratman AN, Davis GE. Endothelial cell-pericyte interactions stimulate basement membrane matrix assembly: influence on vascular tube remodeling, maturation, and stabilization. Microsc Microanal. 2012 Feb;18(1):68-80.

24. Masuoka T, Hayashi N, Hori E, Kuwayama N, Ohtani O, Endo S. Distribution of internal elastic lamina and external elastic lamina in the internal carotid artery: possible relationship with atherosclerosis. Neurol Med Chir (Tokyo). 2010;50(3):179-82.

25. Selvin E, Najjar SS, Cornish TC, Halushka MK. A comprehensive histopathological evaluation of vascular medial fibrosis: insights into the pathophysiology of arterial stiffening. Atherosclerosis. 2010 Jan;208(1):69-74.

26. Sawabe M. Vascular aging: from molecular mechanism to clinical significance. Geriatr Gerontol Int. 2010 Jul;10 Suppl 1:S213-20.

27. Havelka GE, Kibbe MR. The vascular adventitia: its role in the arterial injury response. Vasc Endovascular Surg. 2011 Jul;45(5):381-90.

28. Tokarev AA, Butylin AA, Ataullakhanov FI. Platelet adhesion from shear blood flow is controlled by near-wall rebounding collisions with erythrocytes. Biophys J. 2011 Feb 16;100(4):799-808.

29. Cosemans JM, Angelillo-Scherrer A, Mattheij NJ, Heemskerk JW. The effects of arterial flow on platelet activation, thrombus growth, and stabilization. Cardiovasc Res. 2013 Jul 15;99(2):342-52.

30. Hackeng TM, Maurissen LF, Castoldi E, Rosing J. Regulation of TFPI function by protein S. J Thromb Haemost. 2009 Jul;7 Suppl 1:165-8.

31. Anastasiou G, Gialeraki A, Merkouri E, Politou M, Travlou A. Thrombomodulin as a regulator of the anticoagulant pathway: implication in the development of thrombosis. Blood Coagul Fibrinolysis. 2012 Jan;23(1):1-10.

32. Olson ST, Richard B, Izaguirre G, Schedin-Weiss S, Gettins PG. Molecular mechanisms of antithrombin-heparin regulation of blood clotting proteinases. A paradigm for understanding proteinase regulation by serpin family protein proteinase inhibitors. Biochimie. 2010 Nov;92(11):1587-96.

33. Liu R, Ma S, Lu Z, Shen H, Sun L, Wei M. The ADP antagonist MRS2179 regulates the phenotype of smooth muscle cells to limit intimal hyperplasia. Cardiovasc Drugs Ther. 2015 Feb;29(1):23-9.

34. Owens AP 3rd, Mackman N. Tissue factor and thrombosis: The clot starts here. Thromb Haemost. 2010 Sep;104(3):432-9.

35. Zhou J, Wang Y, Xiong Y, Wang H, Feng Y, Chen J. Delivery of TFPI-2 using ultrasound with a microbubble agent (SonoVue) inhibits intimal hyperplasia after balloon injury in a rabbit carotid artery model. Ultrasound Med Biol. 2010 Nov;36(11):1876-83.

36. Chen D, Shrivastava S, Ma L, Tham el-L, Abrahams J et al. Inhibition of Thrombin Receptor Signaling on α-Smooth Muscle Actin+ CD34+ Progenitors Leads to Repair After Murine Immune Vascular Injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012 Jan;32(1):42-9.

37. Grudzinska MK, Kurzejamska E, Bojakowski K, Soin J, Lehmann MH et al. Monocyte chemoattractant protein 1–mediated migration of mesenchymal stem cells Is a source of intimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013 Jun;33(6):1271-9.

38. Curcio A, Torella D, Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy. Circ J. 2011;75(6):1287-96.

39. Powers CJ, McLeskey SW, Wellstein A. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling. Endocr Relat Cancer. 2000 Sep;7(3):165-97.

40. Pacurari M, Kafoury R, Tchounwou PB, Ndebele K. The Renin-Angiotensin-aldosterone system in vascular inflammation and remodeling. Int J Inflam. 2014;2014:689360.

41. Gerthoffer WT. Mechanisms of vascular smooth muscle cell migration. Circ Res. 2007 Mar 16;100(5):607-21.

42. Donovan J, Shiwen X, Norman J, Abraham D. Platelet-derived growth factor alpha and beta receptors have overlapping functional activities towards fibroblasts. Fibrogenesis Tissue Repair. 2013 May 10;6(1):10.

43. Deryugina EI, Quigley JP. Cell surface remodeling by plasmin: a new function for an old enzyme. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:564259.

44. Murphy G, Nagase H. Localizing matrix metalloproteinase activities in the pericellular environment. FEBS J. 2011 Jan;278(1):2-15.

45. Chen Q, Jin M, Yang F, Zhu J, Xiao Q, Zhang L. Matrix metalloproteinases: inflammatory regulators of cell behaviors in vascular formation and remodeling. Mediators Inflamm. 2013;2013:928315.

46. Arroyo AG, Iruela-Arispe ML. Extracellular matrix, inflammation, and the angiogenic response. Cardiovasc Res. 2010 May 1;86(2):226-35.

47. Lu P, Takai K, Weaver VM, Werb Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12).

48. Itoh N, Ornitz DM. Fibroblast growth factors: from molecular evolution to roles in development, metabolism and disease. J Biochem. 2011 Feb;149(2):121-30.

49. Zhang JD, Cousens LS, Barr PJ, Sprang SR. Three-dimensional structure of human basic fibroblast growth factor, a structural homolog of interleukin 1 beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Apr 15;88(8):3446-50.

50. Brooks AN, Kilgour E, Smith PD. Molecular pathways: fibroblast growth factor signaling: a new therapeutic opportunity in cancer. Clin Cancer Res. 2012 Apr 1;18(7):1855-62.

51. Venkataraman G, Raman R, Sasisekharan V, Sasisekharan R. Molecular characteristics of fibroblast growth factor-fibroblast growth factor receptor-heparin-like glycosaminoglycan complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Mar 30;96(7):3658-63.

52. Hellberg C, Ostman A, Heldin CH. PDGF and vessel maturation. Recent Results Cancer Res. 2010;180:103-14.

53. Reigstad LJ, Varhaug JE, Lillehaug JR. Structural and functional specificities of PDGF-C and PDGF-D, the novel members of the platelet-derived growth factors family. FEBS J. 2005 Nov;272(22):5723-41.

54. Oefner C, D'Arcy A, Winkler FK, Eggimann B, Hosang M. Crystal structure of human platelet-derived growth factor BB. EMBO J. 1992 Nov;11(11):3921-6.

55. Shim AH, Liu H, Focia PJ, Chen X, Lin PC, He X. Structures of a platelet-derived growth factor/propeptide complex and a platelet-derived growth factor/receptor complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jun 22;107(25):11307-12.

56. Demoulin JB, Montano-Almendras CP. Platelet-derived growth factors and their receptors in normal and malignant hematopoiesis. Am J Blood Res. 2012; 2(1): 44–56.

57. Sarembock IJ, Laveau PJ, Sigal SL, Timms I, Sussman J, Haudenschild C et al. Influence of Inflation Pressure and Balloon Size on the Development of Intimal Hyperplasia After Balloon Angioplasty. A Study in the Atherosclerotic Rabbit. Circulation. 1989 Oct;80(4):1029-40.

58. Sakamoto H, Nozaki S, Misumi K, Kurose M, Sohara H, Amitani S et al. Smooth Muscle Cell Proliferation in the Arterial Intima after Stretch Injury: Relationship betweenthe Severity of Stretch and Intimal Hyperplasia in New Zealand White Rabbits. Exp Anim. 1996 Jan;45(1):89-93.

59. Cassese S, Byrne RA, Tada T, Pinieck S, Joner M, Ibrahim T et al. Incidence and predictors of restenosis after coronary stenting in 10 004 patients with surveillance angiography. Heart. 2014 Jan;100(2):153-9.

60. Nair P, Gruberg L, Beyar R. The eccentric lumenology. Acute Card Care. 2006;8(2):87-94.

61. Tada T, Reidy MA. Endothelial regeneration. IX. Arterial injury followed by rapid endothelial repair induces smooth-muscle-cell proliferation but not intimal thickening. Am J Pathol. 1987 Dec;129(3):429-33.

62. Walker LN, Ramsay MM, Bowyer DE. Endothelial healing following defined injury to rabbit aorta. Depth of injury and mode of repair. Atherosclerosis. 1983 May;47(2):123-30.

63. Gonschior P, Gerheuser F, Gonschior GM, Maier GR, Mack B, Nerlich A et al. – Experimental directional atherectomy injury in arterial vessels: impact of trauma depth on cellular response. Am Heart J. 1995 Jun;129(6):1067-77.

64. Kastrati A, Elezi S, Dirschinger J, Hadamitzky M, Neumann FJ, Schömig A. Influence of lesion length on restenosis after coronary stent placement. Am J Cardiol. 1999 Jun 15;83(12):1617-22.

65. Hehrlein C, Chuang CH, Tuntelder JR, Tatsis GP, Littmann L, Svenson RH. Effects of vascular runoff on myointimal hyperplasia after mechanical balloon or thermal laser arterial injury in dogs. Circulation. 1991 Aug;84(2):884-90.

66. Dobrin PB. Mechanical Factors Associated With the Development of Intimal and Medial Thickening in Vein Grafts Subjected to Arterial Pressure. A Model of Arteries Exposed to Hypertension. Hypertension. 1995 Jul;26(1):38-43.

67. Bassiouny HS, White S, Glagov S, Choi E, Giddens DP, Zarins CK. Anastomotic intimal hyperplasia: Mechanical injury or flow induced. J Vasc Surg. 1992 Apr;15(4):708-16.

68. Rubanyi GM, Romero JC, Vanhoutte PM. Flow-induced release of endothelium-derived relaxing factor. Am J Physiol. 1986 Jun;250(6 Pt 2):H1145-9.

69. Morinaga K, Eguchi H, Miyazaki T, Okadome K, Sugimachi K. Development and regression of intimal thickening of arterially transplanted autologous vein grafts in dogs. J Vasc Surg. 1987 May;5(5):719-30.

70. Badier-Commander C, Couvelard A, Henin D, Verbeuren T, Michel JB, Jacob MP. Smooth muscle cell modulation and cytokine overproduction in varicose veins. An in situ study. J Pathol. 2001 Mar;193(3):398-407.

71. Zwolak RM, Adams MC, Clowes AW. Kinetics of vein graft hyperplasia: Association with tangential stress. J Vasc Surg. 1987 Jan;5(1):126-36.

72. Muto A, Model L, Ziegler K, Eghbalieh SD, Dardik A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: Insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circ J. 2010 Aug;74(8):1501-12.

73. Hynes N, Mahendran B, Tawfik S, Sultan S. Reinforced long saphenous vein bypass graft for infrainguinal reconstruction procedures: case series and literature review. Vascular. 2006 Mar-Apr;14(2):113-8.

74. Eslami MH, Gangadharan SP, Belkin M, Donaldson MC, Whittemore AD, Conte MS. Monocyte adhesion to human vein grafts: a marker for occult intraoperative injury? J Vasc Surg. 2001 Nov;34(5):923-9.

75. Ehsan A, Mann MJ, Dell'acqua G, Tamura K, Braun-Dullaeus R, Dzau VJ. Endothelial healing in vein grafts: proliferative burst unimpaired by genetic therapy of neointimal disease. Circulation. 2002 Apr 9;105(14):1686-92.

76. Fulton GJ, Davies MG, Barber L, Gray JL, Svendsen E, Hagen PO. Local effects of nitric oxide supplementation and suppression in the development of intimal hyperplasia in experimental vein grafts. Eur J Vasc Endovasc Surg. 1998 Apr;15(4):279-89.

77. Li PF, Dietz R, Von Harsdorf R. Differential Effect of Hydrogen Peroxide and Superoxide Anion on Apoptosis and Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells. Circulation. 1997 Nov 18;96(10):3602-9.

78. Barker SG, Talbert A, Cottam S, Baskerville PA, Martin JF. Arterial intimal hyperplasia after occlusion of the adventitial vasa vasorum in the pig. Arterioscler Thromb. 1993 Jan;13(1):70-7.

79. Stein B, Weintraub WS, Gebhart SP, Cohen-Bernstein CL, Grosswald R, Liberman HA et al. Influence of Diabetes Mellitus on Early and Late Outcome After Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty. Circulation. 1995 Feb 15;91(4):979-89.

80. Kip KE, Faxon DP, Detre KM, Yeh W, Kelsey SF, Currier JW. Coronary angioplasty in diabetic patients: the National Heart, Lung, and Blood Institute Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty Registry. Circulation. 1996 Oct 15;94(8):1818-25.

81. Reaven GM. Relationships Among Insulin Resistance, Type 2 Diabetes, Essential Hypertension, and Cardiovascular Disease: Similarities and Differences. J Clin Hypertens (Greenwich). 2011 Apr;13(4):238-43.

82. Yamagishi S. Role of advanced glycation end products (AGEs) and receptor for AGEs (RAGE) in vascular damage in diabetes. Exp Gerontol. 2011 Apr;46(4):217-24.

83. Stevens SL, Hilgarth K, Ryan US, Trachtenberg J, Choi E, Callow AD. The synergistic effect of hypercholesterolemia and mechanical injury on intimal hyperplasia. Ann Vasc Surg. 1992 Jan;6(1):55-61.

84. Yu X, Dluz S, Graves DT, Zhang L, Antoniades HN, Hollander W et al. Elevated expression of monocyte chemoattractant protein 1 by vascular smooth muscle cells in hypercholesterolemic primates. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 6953–6957.

85. Schober A, Zernecke A, Liehn EA, von Hundelshausen P, Knarren S, Kuziel WA et al. Crucial role of the CCL2/CCR2 axis in neointimal hyperplasia after arterial injury in hyperlipidemic mice involves early monocyte recruitment and CCL2 presentation on platelets. Circ Res. 2004 Nov 26;95(11):1125-33.

86. Guarda E, Katwa LC, Campbell SE, Tanner MA, Webel RM, Laughlin H et al. Extracellular matrix collagen synthesis and degradation following coronary balloon angioplasty. J Mol Cell Cardiol. 1996 Apr;28(4):699-706.

87. Rosenbaum MA, Miyazaki K, Graham LM. Hypercholesterolemia and oxidative stress inhibit endothelial cell healing after arterial injury. J Vasc Surg. 2012 Feb;55(2):489-96.

88. Mahalle NP, Garg MK, Kulkarni MV, Naik SS. Differences in traditional and non-traditional risk factors with special reference to nutritional factors in patients with coronary artery disease with or without diabetes mellitus. Indian J Endocrinol Metab. 2013 Sep;17(5):844-850.

89. Tan H, Shi C, Jiang X, Lavelle M, Yu C, Yang X et al. Hyperhomocysteinemia promotes vascular remodeling in vein graph in mice. Front Biosci (Landmark Ed). 2014 Jun 1;19:958-66.

90. Vianello F, Cella G, Osto E, Ballin A, Famoso G, Tellatin S et al. Coronary microvascular dysfunction due to essential thrombocythemia and policythemia vera: the missing piece in the puzzle of their increased cardiovascular risk? Am J Hematol. 2015 Feb;90(2):109-13.

91. Sevigny LM, Austin KM, Zhang P, Kasuda S, Koukos G. Protease-activated receptor-2 modulates protease-activated receptor-1-driven neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Dec;31(12):e100-6.

92. Dubský M, Jirkovská A, Pagáčová L, Bém R, Němcová A et al. Impact of Inherited Prothrombotic Disorders on the Long-Term Clinical Outcome of Percutaneous Transluminal Angioplasty in Patients with Diabetes. J Diabetes Res. 2015;2015:369758.

93. Scarabin PY, Hemker HC, Clément C, Soisson V, Alhenc-Gelas M. Increased thrombin generation among postmenopausal women using hormone therapy: importance of the route of estrogen administration and progestogens. Menopause. 2011 Aug;18(8):873-9.

94. Aihara K. Heparin cofactor II attenuates vascular remodeling in humans and mice. Circ J. 2010 Aug;74(8):1518-23.

95. Eefting D, Seghers L, Grimbergen JM, de Vries MR, de Boer HC et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 2010 Nov 1;88(2):367-75.

96. Syrovets T, Lunov O, Simmet T. Plasmin as a proinflammatory cell activator. J Leukoc Biol. 2012 Sep;92(3):509-19.

97. Shi KQ, Wu FL, Liu WY, Zhao CC, Chen CX et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of in-stent restenosis after bare metal stenting in native coronary arteries. Mol Biol Rep. 2014 Jul;41(7):4713-20.

98. Hess CN, Lopes RD, Gibson CM, Hager R, Wojdyla DM et al. Saphenous Vein Graft Failure after Coronary Artery Bypass Surgery: Insights from PREVENT IV. Circulation. 2014 Oct 21;130(17):1445-51.

99. Messner B, Bernhard D. Smoking and cardiovascular disease: mechanisms of endothelial dysfunction and early atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014 Mar;34(3):509-15.

100. Rom O, Avezov K, Aizenbud D, Reznick AZ. Cigarette smoking and inflammation revisited. Respir Physiol Neurobiol. 2013 Jun 1;187(1):5-10.

101. Dovgan PS, Edwards JD, Zhan X, Wilde M, Agrawal DK. Cigarette smoking increases monocyte adherence to cultured endothelial cell monolayer. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Sep 15;203(2):929-34.

102. Barua RS, Ambrose JA. Mechanisms of coronary thrombosis in cigarette smoke exposure. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013 Jul;33(7):1460-7.

103. Starke RM, Ali MS, Jabbour PM, Tjoumakaris SI, Gonzalez F et al. Cigarette smoke modulates vascular smooth muscle phenotype: implications for carotid and cerebrovascular disease. PLoS One. 2013 Aug 14;8(8):e71954.

104. Richardson MR, Yoder MC. Endothelial progenitor cells: Quo Vadis? J Mol Cell Cardiol. 2011 Feb;50(2):266-72.

105. Briguori C, Testa U, Riccioni R, Colombo A, Petrucci E, Condorelli G et al. Correlations between progression of coronary artery disease and circulating endothelial progenitor cells. FASEB J. 2010 Jun;24(6):1981-8.

106. Kong D, Melo LG, Mangi AA, Zhang L, Lopez-Ilasaca M, Perrella MA et al. Enhanced inhibition of neointimal hyperplasia by genetically engineered endothelial progenitor cells. Circulation. 2004 Apr 13;109(14):1769-75.

107. Lim WH, Seo WW, Choe W, Kang CK, Park J, Cho HJ et al. Stent coated with antibody against vascular endothelial-cadherin captures endothelial progenitor cells, accelerates re-endothelialization, and reduces neointimal formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Dec;31(12):2798-805.

108. Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Lab Invest. 1983 Sep;49(3):327-33.

109. Kikuchi S, Umemura K, Kondo K, Saniabadi AR, Nakashima M. Photochemically induced endothelial injury in the mouse as a screening model for inhibitors of vascular intimal thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998 Jul;18(7):1069-78.

110. Ma T, Ma ZQ, Du XH, Yu QS, Wang R, Liu L. Effect of valsartan on ACAT-1 and PPAR-γ expression in intima with carotid artery endothelial balloon injury in rabbit. Int J Clin Exp Med. 2015 Apr 15;8(4):5527-33.

111. Guillen J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012 May; 51(3): 311–321.

112. Ionac M, Lineaweaver WC, Zhang F. Experimental microsurgery. Practical manual. Orizonturi Universitare, Timisoara, 2004.

113. Marcucci G, Perrotti D, Caligiuri MA. Understanding the molecular basis of imatinib mesylate therapy in chronic myelogenous leukemia and the related mechanisms of resistance. Commentary re: A. N. Mohamed et al., The effect of imatinib mesylate on patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia with secondary chromosomal aberrations. Clin. Cancer Res., 9: 1333-1337, 2003. Clin Cancer Res. 2003 Apr;9(4):1248-52.

114. Iqbal N, Iqbal N. Imatinib: a breakthrough of targeted therapy in cancer. Chemother Res Pract. 2014;2014:357027.

115. Larson RA, Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, Riviere GJ et al. Imatinib pharmacokinetics and its correlation with response and safety in chronic-phase chronic myeloid leukemia: a subanalysis of the IRIS study. Blood. 2008 Apr 15;111(8):4022-8.

116. Mughal TI, Schrieber A. Principal long-term adverse effects of imatinib in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase. Biologics. 2010 Dec 2;4:315-23.

117. Mohammadi M, Froum S, Hamby JM, Schroeder MC, Panek RL et al. Crystal structure of an angiogenesis inhibitor bound to the FGF receptor tyrosine kinase domain. EMBO J. 1998 Oct 15;17(20):5896-904.

118. Pardo OE, Latigo J, Jeffery RE, Nye E, Poulsom R et al. The Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibitor PD173074 Blocks Small Cell Lung Cancer Growth In vitro and In vivo. Cancer Res. 2009 Nov 15;69(22):8645-51.

119. Byron SA, Loch DC, Pollock PM. Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibition Synergizes With Paclitaxel and Doxorubicin in Endometrial Cancer Cells. Int J Gynecol Cancer. 2012 Nov;22(9):1517-26.

120. Selber JC, Chang EI, Liu J, Suami H, Adelman DM, Garvey P et al. Tracking the learning curve in microsurgical skill acquisition. Plast Reconstr Surg. 2012 Oct;130(4):550e-557e.

121. Grondin CM, Meere C, Castonguay Y, Lepage G, Grondin P. Progressive and late obstruction of an aorto-coronary venous bypass graft. Circulation 1971;43:698 –702.

122. Goldman S, Zadina K, Moritz T, Ovitt T, Sethi G et al. Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery: results from a Department of Veterans Affairs Cooperative Study. J Am Coll Cardiol. 2004 Dec 7;44(11):2149-56.

123. Kulik A, Voisine P, Mathieu P, Masters RG, Mesana TG et al. Statin therapy and saphenous vein graft disease after coronary bypass surgery: analysis from the CASCADE randomized trial. Ann Thorac Surg. 2011 Oct;92(4):1284-90

124. He GW. Arterial grafts: clinical classification and pharmacological management. Ann Cardiothorac Surg. 2013 Jul;2(4):507-18.

125. Souza DS, Johansson B, Bojö L, Karlsson R, Geijer H et al. Harvesting the saphenous vein with surrounding tissue for CABG provides long-term graft patency comparable to the left internal thoracic artery: results of a randomized longitudinal trial. J Thorac Cardiovasc Surg. 2006 Aug;132(2):373-8.

126. Taggart DP, Ben Gal Y, Lees B, Patel N, Webb C et al. A Randomized Trial of External Stenting for Saphenous Vein Grafts in Coronary Artery Bypass Grafting. Ann Thorac Surg. 2015 Jun;99(6):2039-45.

127. Landymore RW, MacAulay MA, Manku MS. The effects of low, medium and high dose aspirin on intimal proliferation in autologous vein grafts used for arterial reconstruction. Eur J Cardiothorac Surg 1990;4:441– 4.

128. Kulik A, Le May MR, Voisine P, Tardif JC, Delarochelliere R et al. Aspirin plus clopidogrel versus aspirin alone after coronary artery bypass grafting: the clopidogrel after surgery for coronary artery disease (CASCADE) Trial. Circulation. 2010 Dec 21;122(25):2680-7.

129. Douglas JS Jr, Holmes DR Jr, Kereiakes DJ, Grines CL, Block E et al. Coronary stent restenosis in patients treated with cilostazol. Circulation. 2005 Nov 1;112(18):2826-32

130. Inoue T, Uchida T, Sakuma M, Imoto Y, Ozeki Y et al. Cilostazol inhibits leukocyte integrin Mac-1, leading to a potential reduction in restenosis after coronary stent implantation. J Am Coll Cardiol. 2004 Oct 6;44(7):1408-14.

131. Clowes AW, Karnowsky MJ. Suppression by heparin of smooth muscle cell proliferation in injured arteries. Nature. 1977 Feb 17;265(5595):625-6.

132. Ellis SG, Roubin GS, Wilentz J, Douglas JS, King SB. Effect of 18- to 24- hour heparin administration for prevention of restenosis after uncomplicated coronary angioplasty. Am Heart J. 1989;117:777–782.

133. Lindholt JS, Gottschalksen B, Johannesen N, Dueholm D, Ravn H et al. The Scandinavian Propaten(®) trial – 1-year patency of PTFE vascular prostheses with heparinbonded luminal surfaces compared to ordinary pure PTFE vascular prostheses – a randomised clinical controlled multi-centre trial. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2011;41:668–673.

134. Muto A, Model L, Ziegler K, Eghbalieh SD, Dardik A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: Insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circ J. 2010 Aug;74(8):1501-12.

135. Hoeffer CA, Klann E. mTOR signaling: at the crossroads of plasticity, memory and disease. Trends Neurosci. 2010 Feb;33(2):67-75.

136. Yip CK1, Murata K, Walz T, Sabatini DM, Kang SA. Structure of the human mTOR complex I and its implications for rapamycin inhibition. Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):768-74.

137. Sousa JE, Costa MA, Abizaid AC, Rensing BJ, Abizaid AS et al. Sustained suppression of neointimal proliferation by sirolimus-eluting stents: one-year angiographic and intravascular ultrasound follow-up. Circulation. 2001 Oct 23;104(17):2007-11.

138. Sousa JE, Costa MA, Abizaid A, Feres F, Seixas AC et al. Four-year angiographic and intravascular ultrasound follow-up of patients treated with sirolimus-eluting stents. Circulation. 2005 May 10;111(18):2326-9.

139. Abizaid A. Sirolimus-eluting coronary stents: a review. Vasc Health Risk Manag. 2007 Apr; 3(2): 191–201.

140. Hofma SH, van der Giessen WJ, van Dalen BM, Lemos PA, McFadden EP et al. Indication of long-term endothelial dysfunction after sirolimus-eluting stent implantation. Eur Heart J. 2006 Jan;27(2):166-70.

141. Baerlocher MO, Kennedy SA2, Rajebi MR3, Baerlocher FJ4, Misra S et al. Meta-analysis of drug-eluting balloon angioplasty and drug-eluting stent placement for infrainguinal peripheral arterial disease. J Vasc Interv Radiol. 2015 Apr;26(4):459-73.

142. Duda SH, Bosiers M, Lammer J, Scheinert D, Zeller T et al. Sirolimus-Eluting versus Bare Nitinol Stent for Obstructive Superficial Femoral Artery Disease: The SIROCCO II Trial. J Vasc Interv Radiol. 2005 Mar;16(3):331-8.

143. Park KW, Kang SH, Velders MA, Shin DH, Hahn S et al. Safety and efficacy of everolimus- versus sirolimus-eluting stents: a systematic review and meta-analysis of 11 randomized trials. Am Heart J. 2013 Feb;165(2):241-50.

144. Verin V, Urban P, Popowski Y, Schwager M, Nouet P et al. Feasibility of intracoronary beta-irradiation to reduce restenosis after balloon angioplasty. A clinical pilot study. Circulation. 1997 Mar 4;95(5):1138-44.

145. Teirstein PS, Massullo V, Jani S, Popma JJ, Mintz GS, Russo RJ et al. Catheter-based radiotherapy to inhibit restenosis after coronary stenting. N Engl J Med. 1997 Jun 12;336(24):1697-703.

146. Leon MB, Teirstein PS, Moses JW, Tripuraneni P, Lansky AJ et al. Localized intracoronary gamma-radiation therapy to inhibit the recurrence of restenosis after stenting. N Engl J Med. 2001 Jan 25;344(4):250-6.

147. Benjo A, Cardoso RN, Collins T, Garcia D, Macedo FY et al. Vascular brachytherapy versus drug-eluting stents in the treatment of in-stent restenosis: A meta-analysis of long-term outcomes. Catheter Cardiovasc Interv. 2016 Feb 1;87(2):200-8.

148. Scheller B, Hehrlein C, Bocksch W, Rutsch W, Haghi D et al. Treatment of coronary in-stent restenosis with a paclitaxel-coated balloon catheter. N Engl J Med. 2006 Nov 16;355(20):2113-24.